FR 2504928 A1 19821105 FR 8108604 A 19810429 Oligosaccharides à chainnscourtes possédant des propriétés biologiques, leur préparation et leurs anpplications en tant que médicaments. L'invention est relative à des oligosaccharides à chaînes courtes, possédant des propriétés biologi- ques leur permettant notamment de ne contrôler que certaines étapes de la coagulation sanguine. Elle est relative à leur procédé d'obtention et à leurs applications en tant que principes actifs de médicaments. Les inventeurs ont déjà décrit des oligosaccha- rides possédant des propriétés biologiques du type de celles évoquées ci-dessus. Par dépolymérisation de l'héparine par voie chi- mique ou enzymatique, les inventeurs ont notamment obtenu des octasaccharides de grande valeur répondant à la séquence A-B-C-D-E-F-G-H (désignée ci-après par l'abréviation A-H). CO O COO- COQ OOR OR CO OR OR r OR H O O -ly Oi O/ OH OH o 4 /\Oo y s OSO N SO 3 OH NH Ac OH NHSO OSO 3 NH 503 A B C D E F G H dans laquelle R représente un atome d'hydrogène ou un groupe -503. Ces octasaccharides s'avèrent particulièrement précieux en raison de leur spécificité élevée vis-à- vis du facteur X activé ou facteur Xa du sang (mesurée selon le test YinWessler) alors que leur activité sur la coagulation globale (mesurée selon le test USP ou APTT) est très faible. Les références concernant la réalisation de ces différents tests seront données dans les exemples. En poursuivant leurs travaux dans ce domaine, les inventeurs se sont intéressés, notamment, à l'ob- tention d'oligosaccharides à chaînes plus courtes que ces octasaccharides, mais possédant cependant un rap- port avantageux de leur titre Yin-Wessler à leur titre USP ou APTT. Ils ont ainsi été amenés à constater qu'en opérant dans des conditions bien déterminées, il était possible de raccourcir de manière sélective les chaînes actives des octasaccharides A-H et d'obtenir des compositions de grande homogénéité en oligosaccharides actifs à chaînes courtes. L'invention a donc pour but de fournir de nouveaux oligosaccharides à chaînes plus courtes que les octa- saccharides, possédant avantageusement au moins les propriétés biologiques de ces octasaccharides. Elle vise également à fournir un procédé de mise en oeuvre aisée permettant d'éliminer de manière haute- ment sélective des motifs des octasaccharides A-H n'in- tervenant pas de manière essentielle dans l'activité biologique considérée de ces produits Elle a égale- ment pour but de fournir des moyens d'obtention d'une enzyme particulièrement appropriée à la mise en oeuvre de ce procédé Elle vise également à fournir des prin- cipes actifs de médicaments et les médicaments eux- mêmes capables d'inhiber le facteur Xa quand il est présent dans le sang avec un degré de sélectivité éle- vé tout en possédant une très faible activité sur la coagulation totale, et utilisables, de ce fait, pour les traitements antithrombotiques sans risque hémorra- gique pour le patient. Les compositions d'oligosaccharides de grande homogénéité, selon l'invention, sont caractérisées en ce qu'elles sont formées essentiellement d'hexasaccha- rides possédant la séquence C'DEFGH (désignée ci-après par l'abréviation C'-H). OR Cp O OR OR ' o -o o w O \ 40;O> O <> ''O O o _ + o t 1 t OH H OH NH Ac OH NHSO OSO NHSO 3 3 3 C' D E F G H dans laquelle R représente un atome d'hydrogène ou le groupe -503 Les hexasaccharides de l'invention sont caracté- risés par une affinité élevée pour 1 'ATIII. Ils sont, en outre, caractérisés par des spectres RMN comprenant, entre autres, un signal dans la région du carbone en position 2 des résidus N-sulfate-glucosa- mine, qui n'apparalt pas avec l'héparine Ce signal peut être attribué à la présence d'un substituant sur l'atome d'oxygène en position 3, et plus particulière- ment à un groupe 3-O-sulfate sur un résidu N-sulfate-D- glucosamine, (motif F du schéma). Les hexasaccharides de l'invention sont, de plus, caractérisés par des titres Yin-Wessler largement supé- rieurs à ceux de l'héparine Plus spécialement, des compositions hexasaccharidiques de l'invention peuvent présenter des titres YinWessler, supérieurs à 2000 u/ mg, pouvant même atteindre 2500 u/mg environ De ma- nière avantageuse, leur titre APTT ou USP s'avère par- ticulièrement faible, de l'ordre de 10, ce qui corres- pond à des compositions ayant des rapports de leur ti- tre Yin-Wessler à leur titre USP ou APTT aussi élevés que 200, voire 250 environ. Des compositions hexasaccharidiques avantageuses sont formées d'hexasaccharide C'-H dans lesquelles au moins un ou deux des groupes R représentent un groupe -SO 3. L'invention vise également un procédé d'obtention des compositions hexasaccharidiques évoquées ci-dessus. Selon ce procédé, on soumet, dans des conditions 2504928 ' déterminées, des octasaccharides A-H, le cas échéant des compositions octasaccharidiques formées d'une ma- jeure partie de ces octasaccharides A-H, à l'action d'une enzyme. D'une manière inattendue, il s'est avéré que les octasaccharides A-H, qui peuvent être eux-mêmes obte- nus par action d'une enzyme sur les chaînes d'héparine, sont cependant encore dégradables par voie enzymatique. En opérant dans des conditions déterminées, il est alors possible d'éliminer des motifs n'intervenant pas de manière essentielle dans l'activité de ces produits, et ce avec une grande spécificité, ce qui permet d'ob- tenir des compositions hexasaccharidiques de grande homogénéité structurale. Le procédé selon l'invention est donc caractérisé en ce qu'on met en contact les octasaccharides A-H évo- qués ci-dessus, ou des compositions octasaccharidiques formées d'une majeure partie de ces octasaccharides, ayant un rapport élevé de leur titre Yin-Wessler à leur titre APTT ou USP, avec un agent enzymatique dans des conditions ajustées de manière à fragmenter ces octasaccharides de manière spécifique afin d'éliminer les motifs A-B n'intervenant pas de manière essentielle dans l'activité considérée, cette spécificité condui- sant à l'obtention de mélanges formés pratiquement to- talement d'hexasaccharides actifs. Selon une disposition de l'invention, ces condi- tions comprennent avantageusement la mise en oeuvre de l'enzyme à des concentrations élevées de l'ordre de 0,25 à 1 mg par mg d'octasaccharides traités, de pré- férence de l'ordre de 0,5 mg d'enzyme par mq d'octa- saccharides. Afin de disposer de compositions hexasaccharidi- ques hautement homogènes en hexasaccharides C'-H on a avantageusement recours à un traitement permettant de séparer du mélange de dégradation au moins la ma- jeure partie des hexasaccharides C'-H actifs. Un traitement approprié comporte un fractionne- ment réalisé afin d'éliminer les protéines résultant de la réaction enzymatique et les réactifs n'ayant pas réagi Ce fractionnement peut être réalisé, par exem- ple, par gel perméation selon le poids moléculaire et/ou la densité ionique des produits. Dans un mode préféré de réalisation de l'invention, l'octasaccharide A-H est soumis à l'action d'une enzyme. Comme enzyme appropriée pour obtenir l'élimination sélective des motifs AB de l'octasaccharide A-H, on a avantageusement recours à une hénarinase, plus spécia- lement une héparinase d'origine bactérienne. Une telle héparinase est avantageusement du type des héparinases pouvant être obtenues à partir des bac- téries de Flavobacterium henarinum. Pour une mise en oeuvre satisfaisante du procédé de l'invention d'obtention des hexasaccharides C'-H, on a plus spécialement recours à une héparinase telle qu'obtenue selon un procédé comportant des étapes, no- tamment de culture des bactéries de Flavobacterium heparinum d'extraction de l'héparinase brute à partir de ces bactéries, et des purifications, réalisées de manière à obtenir une héparinase purifiée, ayant une activité suffisamment élevée pour effectuer l'élimina- tion souhaitée des motifs A-B avec des rendements sa- tisfaisants. Avantageusement, l'héparinase mise en oeuvre pos- sède une activité héparinasique d'au moins environ 90 000 unités, de préférence supérieure à 100 000 uni- tés, notamment de l'ordre de 110 000 à 140 000 unités. L'activité de l'enzyme est évaluée, par rapport à l'augmentation de l'absorption d'une héparine titrant au moins 215 ui/mg à 230 nm. Par unités, on entend alors, dans la description et les revendications, la quantité d'enzymes qui en- traine l'apparition d'une augmentation d'un millième d'unité de densité ootique oar minute. Comme déjà indiqué, on met en oeuvre de 0,25 à 1 mg d'enzyme (ayant une activité de l'ordre d'au moins 90 000 unités) par mg d'octasaccharide de préfé- rence environ 0,5 mg d'enzyme. L'étude de l'action de l'enzvnqe sur l'octasaccha- ride a montré qu'il était approprié d'o Dore-r à une température supnerieure à l'ambiante notamment entre 35 et 400 C, de nréfôrence de l'ordre de 370 C. Dans ces conditions, une durée totale d'environ 24 heures apparait satisfaisante. On opère avantageusement, en milieu tampon, de préférence à un p H de l'ordre de 6 à 8, en Darticulier voisin de la neutralité. Compte tenu de la stabilité modérée de l'enzyme, il est préférable, afin d'augmenter son efficacité, de l'ajouter portions par portions, notamment à inter- valles réguliers durant ce laps de temps. On remarquera que, d'une manière avantageuse, le procédé de l'invention utilise un produit de départ, à savoir l'octasaccharide A-H de haute qualité: homo- gène, hautement spécifique. Dans les conditions mises au point par les inven- teurs, cet octasaccharide s'avre donc d(iqradable et ce, de manière sélective, en conduisant à des chaînes plus courtes conservant la séquence responsable de l'ac- tivité de ces produits et possédant donc avantageuse- ment des propriétés biologiques au moins aussi ion Dor- tantes, voire supérieures à celles de l'octasaccharide. De préférence, le procédé de l'invention est mis en oeuvre avec une héparinase obtenue nar induction à partir de bactéries de Flavobacterium heoarinum, ex- traction de l'héparinase brute à partir des bactéries, fractionnement de l'extrait brut d'héparinase obtenu suivi de plusieurs étapes de purifications des frac- tions possédant l'activité héparinasique recherchée. La préparation d'héparinase s'effectue à partir d'une culture de Flavobacterium heparinum faite dans les conditions décrites par Payza et Coll (J Biol. Chem 1956, 223, p 853-858). En opérant à une température voisine de l'ambian- te, sous aération et agitation moyenne, une durée de culture de l'ordre de 25 à 30 heures apparait satis- faisante. Les bactéries sont alors récupérées du milieu de culture par exemple par centrifugation, de préférence réalisée à basse température, notamment inférieure à C, de préférence de l'ordre de 40 C. Avant d'extraire l'héparinase, il est avantageux de remettre en suspension les bactéries, puis après les avoir soumises à une opération de dispersion, de les lyophiliser. Les bactéries sont alors soumises à un traitement en vue de l'extraction de l'héparinase Ce traitement comprend avantageusement un broyage puis leur récupé- ration par exemple par centrifugation. Afin d'obtenir une extraction satisfaisante, il convient d'effectuer plusieurs broyages, par exemple, tout d'abord à sec puis en milieu tampon de p H de l'ordre de 6 à 8, avantageusement de 7 ou voisin de 7. L'extrait brut d'héparinase récupéré par centri- fugation est soumis, aux fins de purification, à une étape de fractionnement Pour disposer d'une héparinase possédant l'activité et les propriétés recherchées, on procède avantageusement à des opérations supplémentai- res de purification des fractions successivement obte- nues L'étude de ces processus de fractionnement et de purification a montré qu'il était préférable d'opérer à une température inférieure à l'ambiante, en particu- lier inférieure à 100 C, de préférence de l'ordre de + 4 o C. 2504928 ' L'étape de fractionnement est avantageusement réa- lisée notamment selon un processus de chromatographie d'exclusion à l'aide de DEAE cellulose, en présence de sulfate d'ammonium. Dans une première étape en batch, on utilise avan- tageusement la DEAE cellulose à raison d'environ au moins 3 g par g de cellules bactériennes, de préféren- ce de l'ordre de 5 g. La DEAE cellulose est avantageusement équilibrée au préalable à l'aide d'un tampon de p H de l'ordre de 6 à 8, de préférence de l'ordre de 7. Le sulfate d'ammonium est mis en oeuvre à raison d'environ au moins 3 g/l, de préférence de l'ordre de 6 g/l. La suspension ainsi formée est filtrée et le fil- trat est recueilli, additionné avantageusement des so- lutions de rinçage de la DEAE cellulose Dans une deu- xième étape, la solution préalablement obtenue est soumise à un fractionnement supplémentaire à l'aide de DEAE cellulose, avantageusement prééquilibrée à l'aide du tampon utilisé précédemment Cette étape est réalisée avec avantage par chromatographie dans une colonne, les filtrats étant percolés à un débit de l'ordre de 40 à 60 ml/h. A partir de l'effluent, on récupère l'héparinase, par exemple, par précipitation, notamment à l'aide de sulfate d'ammonium. L'héparinase obtenue à l'issue de cette opération de fractionnement, qui, dans les conditions particu- lières rapportées ci-dessus, se trouve sous forme d'un précipité sulfoammonique, est ensuite avantageusement purifiée selon un processus comportant au moins une mise en contact avec un agarose du type du Sépharose, plus spécialement celui connu sous la dénomination CM Sépharose CL 6 B, suivie d'une mise en contact des fractions purifiées, à activité héparinasique recueil- lies avec un agarose du type de celui commercialisé sous la dénomination ULTRAGEL ACA 54. L'étape de purification à l'aide d'un agarose du type du CM Sépharose CL 6 B est avantageusement réalisée dans une colonne de chromatographie. Il apparaît souhaitable de dissoudre dans de l'eau distillée l'héparinase (qui se trouve sous forme de précipité sulfoammonique), de manière à obtenir une solution ayant une conductivité de l'ordre de 6000 micromhos et d'ajuster son p H à environ 6. L'agarose mis en oeuvre est avantageusement équi- libré au préalable à l'aide d'un tampon de p H de l'or- dre de 5 à 7, de préférence voisin de 6. Après avoir lavé la colonne de préférence à l'ai- de du tampon de lavage, on effectue la chromatographie de la solution d'héparinase et on récupère l'héparinase par élution par un gradient linéaire obtenu avec le tampon utilisé pour le lavage et ce même tampon amené à une force ionique plus élevée. Les fractions possédant l'activité héparinasique recherchée sont récupérées pour recueillir l'héparinase qu'elles renferment On effectue, par exemple, une pré- cinitation notamment à l'aide de sulfate d'ammonium, suivie d'une centrifugation. Comme déjà indiqué, il est avantageux de procéder à une purification supplémentaire de l'héparinase re- cueillie en opérant une nouvelle mise en contact avec un agarose, de préférence, un agarose tel que 1 'ULTROGEL ACA 54 Cette opération est, de préférence, réalisée dans une colonne équilibrée à l'aide d'un tampon de p H de l'ordre de 6 à 8, notamment de l'ordre de 7. Ce tampon est avantageusement utilisé pour déve- lopper la colonne. On récupère ainsi des-fractions à haute activité héparinasique. Comme déjà décrit par les inventeurs, l'octasac- charide A-H mis en oeuvre dans le procédé de l'inven- tion peut être obtenu par mise en contact de l'hépa- rine (ou de fractions hépariniques) possédant une activité anticoagulante et des chaînes ayant un poids moléculaire de l'ordre de 2000 à 50 000 environ, avec un agent enzymatique, de préférence une héparinase pu- rifiée, plus spécialement, d'origine bactérienne pos- sédant une activité de l'ordre de 45 000 unités, étant entendu que le dosage est effectué avec une héparine titrant au moins 215 ui/mg Les conditions utilisées Dour la réalisation de cette étape sont ajustées de manière à obtenir un mélange de dépolymérisation con- tenant des chaînes octasaccharidiques ayant une acti- vité anti-Xa (Yin-Wessler) et comprenant une séquence responsable de l'activité spécifique anti-Xa de ces produits. L'enzyme provoque la coupure des chaînes hépari- niques entre le carbone anomère du résidu N-sulfate- glucosamine et du motif acide uronique suivant. Les octasaccharides biologiquement actifs sont alors séparés du mélange de dépolymérisation par ad- sorption sur l'antithrombine III (ATIII) fixée sur un support tel que l'aqarose, dans des conditions permet- tant aux octasaccharides ayant une affinité pour i'ATIII d'être fixés ou retenus sur l'ATIII. Cette étape est avantageusement suivie de l'élu- tion des produits retenus ou adsorbés afin de les récu- pérer et par leur fractionnement, par exemple par gel filtration afin de les isoler. Ces oliqosaccharides apparaissent capables d'exer- * cer une activité antithrombotique puissante En raison de leur activité anticoagulante faible et même prati- quement nulle, les risques d'hémorragie sont avantageu- sement oratiquement éliminés On a de plus constaté que ce type d'oligosaccharides ne provoque aucune réactivité des plaquettes du sang. Les hexasaccharides à chaînes courtes de l'inven- tion sont dépourvus de toxicité L'administration de 10.000 u/kg (titre Yin-Wessler) de C'-H ne provoque chez le lapin aucune réaction toxique, ni d'effet py- rogénique dans le test de pyrogénicité chez le lapin conforme à la pharmacopée française. L'administration à des souris de doses aussi im- portantes que 3200 mg/kg n'a pas permis de déterminer la DL 50. L'invention est donc relative à des préparations pharmaceutiques qui renferment lesdits hexasaccharides à activité anti-Xa élevée. Elle est plus particulièrement relative à des préparations pharmaceutiques dépourvues de substances pyrogènes contenant une quantité efficace de principes actifs en association avec des excipients pharmaceuti- ques. Elle concerne également les compositions dans lesquelles le véhicule pharmaceutique est approprié pour l'administration par voie orale Des formes d'ad- ministration de l'invention appropriées pour l'admi- nistration par voie orale peuvent être avantageusement des gélules gastrorésistantes, des comprimés ou ta- blettes, des pilules, ou encore présentées sous forme de liposomes. D'autres compositions pharmaceutiques comprennent ces oligosaccharides en association avec les excipients appropriés pour l'administration par voie rectale Des formes d'administration correspondantes sont consti- tuées par des suppositoires. D'autres formes d'administration de l'invention sont constituées par des aérosols ou des pommades. L'invention concerne également des compositions pharmaceutiques injectables, stériles ou stérilisables. Ces solutions renferment avantageusement 1000 à 2504928 ' 000 u (Yin-Wessler)/ml d'oligosaccharides, de préférence de 5000 à 50 000, par exemple de 25 000 u/ml, lorsque ces solutions sont destinées à l'injection par voie sous-cutanée Elles peuvent contenir, par exemple, de 500 à 10 000, notamment 5000 u/ml d'oligosacchari- des lorsqu'elles sont destinées à l'injection par voie intraveineuse ou par perfusion. Avantageusement, de telles préparations pharmaceu- tiques sont présentées sous la forme de seringues non récupérables, prêtes à l'emploi. L'invention concerne également les compositions pharmaceutiques contenant lesdits oligosaccharides en association avec un autre principe actif, utilisable en particulier pour la prophylaxie et le traitement de thrombose, tel qu'un agent veinotonique comme la dihydroergotamine, un sel d'acide nicotinique ou un agent thrombolytique comme l'urokinase. Les oligosaccharides à chaînes courtes de l'in- vention sont avantageusement sous la forme de sels d'au moins un métal physiologiquement acceptable tel que le sodium et/ou le calcium et/ou le magnésium. Les compositions pharmaceutiques de l'invention sont particulièrement adaptées pour le contrôle (pré- ventif ou curatif) de certaines étapes de la coagula- tion du sang chez l'homme ou l'animal), notamment dans le cas o le patient est soumis à des risques d'hyper- coagulabilité résultant d'une perturbation en phase intrinsèque, par exemple comme conséquence d'une libé- ration par l'organisme de thromboplastines, par exem- ple, de thromboplastines tissulaires (opérations chi- rurgicales, processus atheromateux, développement de tumeurs et troubles de la coagulation par des activa- teurs bactériens ou enzymatiques, etc). Afin d'illustrer l'invention, on indique, ci- après, un exemple de posologie utilisable chez l'homme: cette posologie comprend, par exemple, l'administration au patient de 1000 à 25 000 u (Yin et Wessler) par voie sous-cutanée, deux ou trois fois nar jour, selon le niveau des risques d'hypercoaqulabilité ou la con- dition thrombotique du patient, ou de 1000 à 25 000 u/ 24 heures par voie intraveineuse, en administrations discontinues à intervalles réguliers, ou continues par perfusion, ou encore de 1000 à 25 000 u (trois fois par semaine) par voie intramusculaire ou sous-cutanée (ces titres sont exprimés en unités Yin-Wessler) Ces doses peuvent être naturellement ajustées pour chaque patient en fonction des résultats et des analyses de sang effectuées auparavant, la nature des affections dont il souffre et, d'une manière générale, son état de santé. L'invention se rapporte également à l'application des oligosaccharides de l'invention et des fractions qui les renferment, à la constitution de réactifs bio- logiques, utilisables en laboratoires, notamment comme éléments de comparaison cour l'étude d'autres substan- ces dont on souhaite tester l'activité anticoagulante, notamment au niveau de l'inhibition du facteur Xa. Elle vise également l'anolication des fractions et oligosaccharides en médecine nucléaire, en tant que produits radiopharmaceutiques Les oligosaccharides et fractions définis ci-dessus sont marqués par des traceurs choisis parmi ceux couramment utilisés dans ce domaine, et notamment à l'aide de technétium 99 m. A cet effet, on transforme le technétium 99 m ob tenu à partir de générateurs du commerce, sous forme de pertechnétate de sodium de valence 7 non réactif, en technétium réduit de valence 4 qui serait la forme la plus réactive du technétium Cette transformation est effectuée grâce à un système réducteur réalisé à partir de sels détain (chlorure stanrieux), de sels de fers (sulfate ferreux), de sels de titane (trichlorure de titane) ou autres sels. La plupart du temps, cette simple réduction du technétium suffit dans des conditions de o H données, à réaliser la fixation du technétium sur la molécule considérée. On peut utiliser les produits de l'invention, qui constituent en quelque sorte un support, à des doses de l'ordre de 100 à 200 ui Yin-Wessler. Pour l'élaboration de ces réactifs radiopharmaceu- tiques, on Deut opérer conformément à la méthode de P V KULKARNI et al dans The Journal of Nuclear Mede- cine 21, N 2, p 117-121. Les produits ainsi marqués sont avantageusement utilisés dans des tests in vivo pour la détection et le diagnostic d'extension des thromboses et des états thrombotiques. EXEMPLE 1. Procédé d'obtention des hexasaccharides actifs C'-H par action d'une héparinase sur l'octasaccharide A-H. Ce procédé comporte les trois étapes 1 à 3 sui- vantes: 1) la préparation de l'héparinase; 2) l'action de l'héparinase sur l'octasaccharide A-H aux fins de dégradation sélective, suivie par 3) le fractionnement du mélange de dégradation par filtration sur gel, et la récupération des frac- tions renfermant les hexasaccharides recherchés. Ces étapes sont réalisées comme suit: 1) Préparation de l'hénarinase. On utilise des enzymes provenant de la culture de flavobacterium heparinum obtenues en procédant comme suit: Dans un fermenteur de 18 litres, du type de celui commercialisé sous la marque BIOLAFFITE, on réalise la culture de flavobacterium heparinum ATCC 13125, durant 26 heures dans un bouillon de culture réDondant à la composition suivante (en grammes par litre d'eau dis- tillée). Bouillon de culture de Flavobacterium heparinum arrivé en phase stationnaire: 500 ml Phosphate de sodium monosodique 2,5 Phosphate de sodium disodique 25 Sulfate d'ammonium: 1 K Cl: 0,1 Héparinate de sodium de titre égal ou supérieur à 150 ui/mg qualité Codex 3 Chlorure de calcium 0,01 Chlorure ferrique: 0,01 Sulfate de magnésium: 0,01 Chlorure de manganèse: 0,01 Molybdate de sodium: 0,01 Le p H du bouillon est finalement ajusté à 7,0 avec de l'acide phosphorique ou de la soude. Cette culture est réalisée à une température de + 240 C sous aération et agitation moyenne. Après 26 heures de culture, le milieu est refroi- di à + 40 C en un laps de temps d'environ 2 heures. Les bactéries sont récupérées par centrifugation à 50.000 t/mn, sur une centrifugeuse du genre de la cen- trifugeuse SHARPLESS pneumatique type T 313 A et ce durant 2 heures Le culot de centrifugation est repris dans 1 litre d'eau distillée froide, soumis à une dis- persion par turbine ULTRA-TURAX à vitesse maximum pen- dant 5 minutes, puis lyophilisé La durée totale de cette opération est d'environ 36 heures Dans ces con- ditions, on obtient 4,1 grammes de cellules. 3 Extraction des cellules. Les cellules, lyophilisées, obtenues selon l'étape précédente, sont broyées vigoureusement à sec, au mor- tier, en présence de 2 g d'alumine calcinée, pendant 1 heure On ajoute alors 10 ml de tampon 1) (tampon acétate de sodium 0,1 M, p H 7) Le broyage au mortier de la pâte alors obtenue est poursuivi pendant 30 mi- nutes à + 40 C On ajoute ensuite 450 ml de tampon 1) froid et on laisse l'ensemble sous agitation pendant 1 heure à + 40 C La suspension obtenue est centrifu- gée sur une centrifugeuse du type SORVALL RC 2 B, à 18 000 t/mn à + 40 C, pendant 20 minutes Les culots de centrifugation composés d'alumine et de débris cellulaires sont écartés On recueille le surnageant (jaune orangé et visqueux) qui constitue l'extrait cellulaire brut, et correspond à un volume de 470 ml. La suite des manipulations est effectuée à + 40 C. y Chromatographie d'exclusion par DEAE cellulose. Sous agitation, à + 40 C, on ajoute 2,82 g de sul- fate d'ammonium au surnageant précédemment obtenu, puis 21 g de DEAE cellulose préalablement équilibrée en tampon 2) (tampon acétate de sodium 0,1 M, p H 7 contenant 6 g/l de sulfate d'ammonium On soumet l'en- semble à agitation durant 2 heures à + 40 C avec con- trôle et ajustement éventuel du p H 7,0 On séoare en- suite la DEAE cellulose par filtration sur b chner et on la lave avec du tampon 2) froid, jusqu'à absence de protéines dans les solutions de lavage On passe l'ensemble filtrat et solutions de lavage ( 680 ml) sur une colonne de 400 ml ( 23 = 5 cm) de DEAE cellu- lose prééquilibrée en tampon 2), à + 40 C, à un débit de 50 ml/h La colonne est finalement rincée par du tampon 2), jusqu'à absence de protéines dans les solu- tions de rinçages On réunit les effluents de colonne et les solutions de rinçages, ce qui correspond à un volume de 1100 ml et on ajoute 715 g de sulfate d'am- monium, sous agitation On recueille par centrifuga- tion à 7000 t/mn les protéines précipitées et ce du- rant 30 minutes, sur une centrifugeuse du genre SORVALL On recueille 2,5 g de précipité très humide qui constitue l'héparinase Ce précipité peut être stocké à 200 C durant plusieurs semaines. c Chromatoqraphie sur CM Sémharose CL 6 B. On dissout le précipité sulfoammonique précédem- ment obtenu dans de l'eau distillée froide utilisée en quantité suffisante pour obtenir une conductivité finale de 6000 micromhos On ajuste le p H de la solu- tion obtenue à 6,0 par de l'acide acétique ou de la soude 2 N Le volume final est de 440 ml La solution est alors percolée à + 4 C sur une colonne de 70 ml ( 15 x 2,6 cm) de CM Sépharose CL 6 B préalablement é- quilibrée en tampon 3) (tamoon acétate de sodium 0,1 M, Na Cl 0,22 M, p H 6,0), à un débit de 25 ml/h On rince la colonne par le tampon 3) jusqu'à absence de protéi- nes dans l'effluent Les effluents de colonne sont écartés. L'héparinase est ensuite éluée à 60 ml/h à l'aide d'un gradient linéaire formé à partir de 600 ml de tampon 3) et de 600 ml de tampon 3) ajusté à 0,34 M de Na Cl. Les protéines sortant de la colonne sont détec- tées par enregistrement en continu de la densité opti- que (D O) à 280 nm et l'éluat est recueilli par frac- tions de 5 ml à l'aide d'un collecteur de fractions. Sur la figure 1, on a représenté le gra Dhique d'élution obtenu par enregistrement de la D O à 280 nm de l'effluent de colonne. L'activité héparinasique de chaque fraction est dosée On regroupe les fractions 45 à 48 (partie D du graphique) à haute teneur en héparinase Ces fractions correspondent à un volume de 45 ml. On précipite les protéines par addition de 30 g de sulfate d'ammonium et on les récupère par centrifu- gation à + 40 C à 15 000 t/mn, durant 10 minutes. Gel filtration sur ULTROGEL ACA 54. On dissout le culot de centrifugation précédemment obtenu dans de l'eau distillée froide et on obtient un volume final de 5 ml Cette solution est déposée au sommet d'une colonne ( 1 m x 26 mmn) d'ULTROGEL ACA 54 équilibrée en tampon acétate de sodium 0,1 M, Na Cl 0,33 M, p H 7 La colonne est développée par ce même tampon à un débit de 15 ml par heure Comme précédem- ment, les protéines sortant de la colonne sont détec- tées à 280 nm, et l'effluent de colonne est recueilli par fractions de 5 mi Le graphique d'élution est re- présenté sur la figure 2 L'activité héparinasique de chaque fraction est dosée Les fractions 32 à 37 (par- tie F du graphique), qui contiennent l'activité hépa- rinasique, sont regroupées, ce qui correspond a un volume de 60 mi Cette solution contient 7 mg d'hépari- nase purifiée, présentant une activité de l'ordre de 000 à 110 000 unités/mg (On considère, comme unité d'enzyme, la quantité d'enzyme qui fait apparaltre à 231 nm, un millième d'unité de densité optique Dar mn lorsqu'on met en contact à 380 C, de l'héparinase avec de l'héparine titrant au moins 215 ui/mg 0,065 X en tampon tris-H Cl, O,125 M, p H 7, dans lequel on ajoute du chlorure de calcium Ca C 12). La solution obtenue est conservée et congelée à OC. 2) Dégradation de l'octasaccharide par l'héparinase. On dissout 10 mg d'octasaccharide A-H (lot BC IV 135), obtenu selon le procédé décrit dans la demande dar la demanderesse de brevet déposée/nh Grande-Bretagne le 2 Juillet 1980 N 80/21749, ayant une activité anti-Xa (Yin-Wessler) de 2100 u/mg, dans 10 ml de tampon acétate de sodium 0,1 M de chlorure de calcium p H 7,2. La solution est incubée à + 370 C L'addition d'hé- parinase est effectuée comme suit. Au temps t = O, on ajoute 17 ml de la solution d'héparinase obtenue précédemment (soit 2 mg d'hépari- nase): au temps tl = 8 heures, on ajoute de nouveau 17 ml de solution d'héparinase: au temps t 2 = 16 heu- res, on ajoute finalement 8,5 ml de solution d'hépari- nase Au temps t 3 = 24 heures, on procède à l'évapora- tion à sec sous vide à 40 C, des 52,5 ml de solution sur un appareil du type Rotavapor BUCHI. 3) Fractionnement du mélange de dégradation par fil- tration sur gel. On dépose le mélange obtenu à l'issue de l'étape de dégradation au sommet d'une colonne de Séphadex G-50 superfine ( 200 x 2, 5 cm) On procède à l'élution des produits à l'aide de chlorure de sodium 0,2 M Les produits sont détectés par leur absorption à 230 nm. On rapporte sur la figure 3 le diagramme d'élution ob- tenu On distingue 3 fractions principales La première est constituée par du matériau de départ non dégradé ( 4 mg), la deuxième renferme les hexasaccharides recher- chés ( 7 mg) et la troisième des disaccharides On dis- tingue également une fraction de moindre importance dans la région des tétrasaccharides entre les pics des hexa et des disaccharides. On rassemble les fractions hexasaccharidiques, on élimine les sels et on les lyophilise. Etude de la structure des hexasaccharides des frac- tions recueillies. On procède à une étude de structure de ces frac- tions par analyse colorimétrique des fragments obtenus par dégradation à l'aide d'acide nitreux suivie d'une gel filtration La dégradation, à l'aide d'acide ni- treux, est effectuée selon la méthode de SHIVELY et CONRAD décrite dans Biochemistry, vol 15, N 12, 1976, p 3932 à 3942. L'action de l'acide nitreux se traduit par une coupure des liaisons glycosidiques entre les motifs N-sulfate-glucosamine et l'acide uronique suivant et transforme les motifs sulfate-glucosamine en résidus 2,5anhydromannose. L'hexasaccharide est alors transformé en tétra- saccharide et en disaccharide On sépare ces deux oligosaccharides par filtration sur une colonne ( 200 x 0,6 cm) de Séphadex G-50 Superfine, éluée avec du chlorure de sodium 0,2 M Sur la figure 4, on rapporte les valeurs de la densité optique mesurée à 230 nm, des fractions éluées (courbe a) en traits continus) ainsi que leur teneur en groupes 2,5anhydromannose (courbe b) en pointillés), acides uroniques (cour- be c) en tirets) et N-acétyl-glucosamine (courbe d) en tirets alternant avec des points - - -) (pour la détermination de ce dernier groupe, on effectue des mesures avant et après hydrolyse acide, la différence obtenue correspondant à la teneur en groupes N-acétyl- glucosamine). Il ressort de l'examen de la figure 4 (la flèche sur la figure 4 indique le volume d'élution pour l'he- xasaccharide original) que les motifs acide uronique insaturé qui absorbent la lumière à 230 nm sont conte- nus dans la fraction tétrasaccharidique tandis que la fraction disaccharidique est pratiquement totalement dépourvue de tels composés. De la même manière, il apparait que les groupes N-acétyl-glucosamine sont seulement présents, comme prévu, dans la fraction tétrasaccharidique. La teneur en groupe acide uronique apparaît deux fois plus importante dans la fraction tétrasaccharidi- que que dans la fraction disaccharidique. On constate, par ailleurs, que les groupes 2,5- anhydromannose sont présents de manière équivalente dans les deux fractions, ce qui implique que les disac- charides et les tétrasaccharides sont obtenus dans un rapport molaire 1/1 Ces résultats montrent qu'une coupure a été opérée sur l'hexasaccharide, donnant lieu au disaccharide ne portant pas de double liaison et au tétrasaccharide (coupure entre F et G). En outre, ces résultats établissent que la frac- tion hexasaccharidique est presque exclusivement cons- tituée par une seule espèce qui porte un motif N-sul- fate-glucosamine à son extrémité réductrice, un motif acide uronique insaturé à son extrémité non réductrice. La comparaison avec la structure de l'octasaccha- ride de départ permet de conclure que deux autres mo- tifs de glucosamine dont l'un est N-acétylé et l'autre N-sulfaté-3-0-sulfaté, et deux autres résidus d'acide uronique (un glucuronique et un iduronique-2-0-sulfaté) complètent la séquence hexasaccharidique. Etude de l'activité bioloaique in vitro et in vivo de la fraction hexasaccharidicue obtenue selon le procédé décrit ci-dessus. On détermine l'activité anti-Xa selon le test de Yin-Wessler décrit par ses auteurs dans J Lab Clin. Med 1976, 81, 298-300. L'activité anticoagulante globale est mesurée selon le test USP ou la méthode APTT. Le test USP est décrit dans "Pharmacopea of the United States of America", XIX, pages 229-230 (voir également le deuxième supplément USP-NF, page 62, et le quatrième supplément USP-NF, page 90, respectivement intitulés "Drug substances" et "Dosage forms"). Le titre APTT est mesuré selon la méthode de J. CAEN et al dans l'Hémostase, expansion scientifique française, Paris, 1968, pages 133-135. L'activité antithrombotique in vivo est étudiée en utilisant la méthode de Wessler et al décrite dans J of appl physiol 1959, 14, 943-946, en utili- sant un stimulant thrombogénique différent. Activité anti-Xa (Yin-Wessler): 2400 u/mg. Titre USP et titre APTT inférieurs à 10 u/mg. L'activité de cette fraction hexasaccharidique a été étudié in vivo sur le lapin selon le modèle de Wessler L'administration de 250 u anti-Xa par kg avant administration de 25 u/kg d'un complexe thrombo- génique (complexe cencentré de prothrombinc vendu sous 2504928 ' le nom de Konyn par Cutter Laboratories, U S A), empêche la formation de thrombus. REVENDICATIONS 1 Compositions d'oligosaccharides à chaînes courtes, caractérisées en ce qu'elles sont formées essentiellement d'hexasaccharides possédant la séquence désignée ci-après par labréviation C'-H: OR CO OR OR 0 O O O O OH o X o XR o o ,? o H El OH NH Ac OH H 53 3 NHS C' D E F G H dans laquelle R représente un atome d'hydrogène ou le groupe -503 et leurs sels physiologiquement acceptables. 2 Compositions selon la revendication 1, caracté- risées en ce que lesdits hexasaccharides possèdent des titres Yin-Wessler supérieurs à 2000 u/mg, avan- tageusement 2500 u/mg. 3 Compositions selon la revendication 1 ou 2, caractérisées par des titres APTT ou USP de l'ordre de 10. 4 Compositions selon la revendication 2 ou 3, caractérisées par des titres Yin-Wessler et des titres USP ou APTT dans un rapport de l'ordre de 200, voire de 250 environ. 5 Compositions selon l'une quelconque des reven- dications précédentes, caractérisées en ce qu'elles sont formées d'hexasaccharides C'-H dans lesquelsau moins un ou deux des groupes R représente un groupe -SO 3 6 Procédé de préparation de compositions selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce qu'on met en contact des octasacchari- des répondant à la séquence ABCDEFGH (désignée ci-après a par l'abréviation A-H), de formule COO OR OR COO o R OR OR ORO 0 ooo l O k J r) O H O ttv t Oi 1 O V 9 O'O OJ\It 1OH OSO 3 N SO 3 OH NH Ac OH NHSO OSO 3 3 3 3 3 A B C D E F G H ou des compositions octasaccharidiques formées d'une majeure partie de ces octasaccharides, ayant un rapport élevé de leur titre Yin-Wessler à leur titre APTT ou USP, avec un agent enzymatique dans des conditions ajustées de manière à fragmenter ces octasaccharides de manière spé- cifique afin d'éliminer les motifs A-B. 7 Procédé selon la revendication 6, caractérisé en ce qu'on met en oeuvre comme enzyme, une héparinase, plus spécialement une héparinase d'origine bactérienne telle que celle pouvant être obtenue à partir des bactéries de Flavobacterium heparinum. 8 Procédé selon la revendication 7, caractérisé en ce que l'héparinase mise en oeuvre possède une activité héparinasique d'au moins environ 90 000 unités, notamment de l'ordre de 110 000 à 140 000 unités (le dosage étant effectué avec une héparine titrant au moins 215 ui/mg à 230 nm),cette enzyme étant mise en oeuvre à des concen- trations de l'ordre de 0,25 à 1 mg par mg d'octasaccharides traités de préférence de l'ordre de 0,5 mg d'enzymes par mg d'octasaccharides. 9 Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que, pour disposer de compositions hexasaccharidiques hautement homogènes en hexasaccbarides Cl H, on soumet le mélange résultant de la réaction enzymatique, à un fractionnement par exemple par gel perméation selon le poids moléculaire et/ou la densité ionique du produit. 10 Procédé selon l'une quelconque des reven- dications 6 à 9, caractérisé en ce qu'on opère à une tem- pérature supérieure à l'ambiante, notamment entre 35 et C, de préférence de l'ordre de 37 C, en milieu tampon de préférence à un p H de l'ordre de 6 à 8, en par- ticulier voisin de la neutralité. 11 Procédé selon l'une quelconque des reven- dications 6 à 10, caractérisé en ce qu'on ajoute l'enzyme portion par portion, notamment à intervalles réguliers. 12 Médicaments, caractérisés en ce qu'ils renferment une quantité efficace d'au moins une composi- tion d'oligosaccharides selon l'une quelconque des reven- dications 1 à 5. 13 Médicaments selon la revendication 12, caractérisés en ce qu'ils se présentent sous des formes appropriées pour l'administration par voie orale, avanta- geusement sous forme de gélules gastrorésistantes, de comprimés ou tablettes, de pilules, ou encore sous forme de liposomes, ou encore sous forme appropriée pour l'administration par voie rectale, sous forme de supposi- toires, ou bien sous forme d'aérosols ou de pommad es ou encore sous forme de compositions injectables, utilisa- bles Dour le traitement préventif ou curatif de thromboses. 14 Médicaments selon la revendication 13, caractérisés en ce qu'ils se présentent sous forme de compositions pharmaceutiques injectables renfermant de 1000 à 100 000 u (Yin-Wessler) par ml d'hexasaccharides, de préférence de 5 000 à 50 000, notamment de 25 000 u/ml lorsque ces solutions sont destinées à l'injection par voie sous-cutanée et de 500 à 10 000, notamment de 5000 u/ml d'hexasaccharides lorsqu'elles sont destinées à l'injection 2504928 ' par voie intraveineuse ou par perfusion. Utilisation des médicaments selon l'une quelconque des revendications 12 à 14, en tant que produits radiopharma- ceutiques.