FR 2500753 A1 19820903 FR 8203326 A 19820301 La présente invention concerne une nouvelle substance exerçant une action biologique, un procédé pour préparer cette substance, des compositions innactives la contenant et son utilisation comme médicament. Il a été récemment découvert que le sang circulant d' animaux qui ont été rendus hyperi",muns par un toxoplasme contient des médiateurs quJ inhibent la multiplication du tccxoplasme dans les cellules nonmales de l!ani!al.Il a aussi été trouvé que si l'on cul- tive des cellules de la rate de l'animal rendu hyperimmun par la toxoplasme en présence d'un antigène spécifique, tel qu'un antigène d'un lysat du toxoplasme (désigné ci-après par l'abréviation "TLA"),ou bien d'un mitogène non spécifique comme la concana- valine A (ci-après "Con A") ou la phytohémagglutinine (ci- après "PHA"), le surnageant de la culture obtenue contientdes facteurs qui inhibent la multiplication du toxoplasme dans des cellules homologues (Igarashi I;, Zbl. Bakt. Hyg., J. Abt. Orig. A244, 374-382, 1979; Shirahata T., et al., Z. Parasiteik. 53, 31-40, 1977; et Nagasawa et al., Immunobiology, 157, 307-319, 1980). Le facteur inhibiteur de la multiplication du toxoplas- me est une protéine qui apparaît être une substance produisant des lymphocytes T et qui a une masse moléculaire de l'ordre de 30.000 à 40. 000. Ce facteur, qui est appelé "Toxo-GIF", inhibe la multiplication du toxoplasme dans les cellules homo- logues seulement, étant incapable d'avoir une action inhibi- trice notable dans des cellules hétérologues, et montrantainsi une spécificité d'espèce, et il ne peut donc être employé pour prévenir ou traiter la toxoplasmose chez l'homme ou un animal autre que l'hôte infecté. Cette invention a pour objet une nouvelle substance biologiquement active sans spécificité d'espèce, douée d'immuno- activité pour inhiber la multiplication toxoplasmique également dans des cellules hétérologues, et qui inhibe la multiplica- tion non seulement de toxoplasmesmais aussi des autre proto- zoaires, virus, bactéries, et microorganismes semblables, ainsi que de cellules cancéreuses. L'invention comprend aussi un procédé de préparation de cette nouvelle substance. Elle comprend en outre des médicaments, a savoir des compositions immunisantes, en particulier contre les proto- zoaires, bactéries et virus, et des compositions anti-cancé- reuses, contenant cette substance biologiquement active, ainsi qu'une méthode de prévention et de traitement d'infections et de cancers chez l'homme et l'animal avec ces compositions immunoactives. Plus précisément, la présente invention apporte une nouvelle substance douée d'une action biologique, caractérisée en ce qu'il s'agit d'une glycoprotéine ayant une masse molécu- laire de 3.000 à 5.000, déterminée par une méthode de filtra- tion sur gel, et qui inhibe la multiplication toxoplasmique dans des cellules hétérologues aussi bien que dans des cellules homologues, ainsi qu' un procédé de préparation de cette subs- tance et des compositions immunisantes qui la contiennent. Cette substance biologiquement active possède les pro- priétés physiques et chimiques et les caractéristiquesde struc- ture suivantes: 1) Masse moléculaire La masse moléculaire a été trouvée étre de 3.000 à 5.000, mesurée par une méthode de filtration sur gel, sur Sephadex G-100 (gel de dextranne réticulé de Pharmacia Co., Uppsala, Suede), Toyopearl HW-40 ou HW-50 (gel de type poly- vinylique de Toyo Soda Co., Ltd., Japon) et Sephacryl S-200 (gel d'allyl dextranne réticulé, de Pharmacia Co., Uppsala, Suède), et la masse moléculaire étant déterminée par une com- paraison entre le diagramme d'élution et ceux de substances connues. La masse moléculaire, mesurée par une autre méthode de filtration sur gel avec les produits Séphacryl S-200 et Sephadex G-15 (gel de dextranne réticulé, de Pharmacia Co., Uppsala, Suede), si situe aussi entre 3.000 et 5.000. 2) Solubilité dans l'eau La substance est facilement soluble dans l'eau (d' après la Pharmacopée Japonaise, 10thRev., Rule 22). 3) Solubilité dans les solvants organiques D'après la pharmacopée japonaise 10th Rev., Rule 22, la substance est pratiquement insoluble dans le méthanol, l'é- thanol, l'éther, le benzène, le chloroform et l'acétone. 4) Rapport des teneurs en sucres et protéine La présente substance comprend des glucides, principalement hexose et hexosamine. La teneur en hexose est déterminée par la réaction phénol-acide sulfurique, la teneur en hexosamine par le procédé Elson-Morgan et la teneur en pro- téine au moyen d'un doseur de l'azote total modèle MCI TN-02 (produit par Mitsubishi Kasei Co., Ltd., Japon). Les résultats trouvés,exprimés en pourcentages poids/poids (p/p), sont les sui- vants Protéine 85-90 % p/p Hexosamine 9-13 % p/p Hexose (calculé en glucose) 1- 2 % p/p ) pH Une solution aqueuse de la substance à 1 % en poids par volume a un pH de 7,0 à 7,2. 6) Stabilité à la chaleur Une solution aqueuse à 1 % en poids par volume de la substance, même chauffée d 60 + 0,10 pendant 30 minutes, con- serve encore l'immunoactivité et le pouvoir d'empêcher la mul- tiplication toxoplasmique dans des cellules homologues ou hé- térologues. 7) Spectroscopie d'absorption IR La figure 1 des dessins annexés représente un diagramme d'analyse IR établi avec un comprimé de KBr, diagramme qui mon- tre les absorptions caractéristiques suivantes (cm: 3600-2900 (forte), 1700-1500 (forte) 1440-1380 (moyenne), 1160-1080 (moyenne), 550 (moyenne) 8) Spectroscopie d'absorption UV La figure 2 est un diagramme d'analyse UV établi avec une cellule de 1 cm pour une solution aqueuse à 0,1 % p/v de la présente substance, diagramme qui montre une absorption maximale à 274-276 nm. 9) Réactions colorées Les réactions suivantes ont été effectuées sur une solution aqueuse à 0,1 % p/v de la substance: réaction de Lowry-Folin (liaison peptidique): positive réaction à la ninhydrine (amino-acides): positive réaction phénol-acide sulfurique (saccharides): positive réaction d'Eslon-Morgan (amino-sucres): positive ) Couleur et aspect Substance blanche et amorphe. 11) Amino-acides La partie protéique de la substance comprend les aci- des aminés suivants: acide aspartique, thréonine, sérine, acide glutamique, glycocolle, alanine, cystine, valine, méthio- nine, isoleucine, leucine, tyrosine, phénylalanine, lysine, tryptophane, histidine, arginine et proline. Ces amino-acides sont dosés au moyen d'un analyseur d'amino-acides (la réaction de Neubauer-Rhode [Pharmacopée Japonaise, 10th Rev., C-1108 (1981)] étant appliquée pour le tryptophane). Parmi ces amino- acides, les teneurs en acide aspartique, acide glutamique et lysine sont particulièrement importantes, l'analyse indiquant pour ces trois constituants une proportion de 45 à 65 % de la quantité totale des acides aminés. La substance selon cette invention est en outre carac- térisée par sa capacité exceptionnelle d'inhiber la multiplica- tion toxoplasmique dans des cellules hétérologues ainsi que dans des cellules homologues, les cellules hétérologues étant des cellules de mammifères d'espèce différente de celle du mammifère qui a été choisi pour préparer la présente substance. Cette activité sera révélée par les essais qui seront décrits ci-après. On connait déjà des protéines, comme le facteur Toxo-GIF, qui inhibent la multiplication du toxoplasme dans des cellules homologues (c'est-à-dire des cellules d'animaux appartenant à la même espèce que le mammifère qui a servi à produire la substance), mais une telle substance,à la diffé- rence de celle selon l'invention, a une spécificité d'espèce, elle est inapte à inhiber la multiplication toxoplasmique dans des cellules hétérologues et sa masse moléculaire est d'envi- ron 30.000 à 40.000. Cette substance connue diffère donc net- tement de la présente substance. En réalité, on ne connaît la présence d'aucune substance empêchant la multiplication toxo- plasmique dans des cellules hétérologues, et la glycoprotéine ayant l'activité ci-dessus indiquée et une masse moléculaire de 3.000 à 5.000 a été découverte par la présente demanderesse. La substance selon cette invention, avec les propriétés physico-chimiques et biologiques et les caractéristiques de structure précédemment indiquées, inhibant la multiplication toxoplasmique, est utilisable comme agent toxoplasmicide pour l'homme et autres mammifères. Les recherches de la présente de- manderesse ont en outre établi qu'elle se montre active non seulement sur lestoxoplasmes,mais aussi sur d'autres protozo- aires ainsi que sur diverses bactéries telles que les bactéries grampositives de l'espèce Micrococcus, Bacillus, etc., et les bactéries gramnégatives de l'espèce Escherichia, Proteus, etc., et sur des virus, en empêchant la multiplication de ces micro- organismes dans les cellules, et cette substance s'est de sur- croit avérée active (immunoactivité) pour inhiber la multiDli- cation de cellules cancéreuses. Ainsi, la présente substance peut être employée pour prévenir et traiter des infections de mammifères normaux par ces microorganismes, c'est-à-dire pour lutter contre des protozoaires tels que toxoplasmes,bactéries et virus, ainsi que comme agent anti-cancéreux,et cette inven- tion apporte donc des compositions immunoactives médicamenteu- ses et la manière de les employer. Le procédé de préparation de la présente substance est décrit ci-dessous. Le principe de cette préparation consiste à faire agir une enzyme sur une matière obtenue du sang ou de cellules de divers mammifères, plus précisément une enzyme protéolytique sur une ou plusieurs matières choisies parmi: (A) le plasma sanguin ou le sérum d'un mammifère qui a été hyperimmunisé par un protozoaire tel qu'un toxoplas- me, (B) le surnageant d'une culture de cellules de rate prove- nant d'un mammifère hyperimmunisé avec un protozoaire tel qu'un toxoplasme, et (C) le surnageant d'une culture de cellules de rate d'un mammifère normal, incubé en présence du surnageant (B), d'un antigène spécifique ou d'un mitogène non-spécifi- que, ou de deux de ces matières ou des trois à la fois, puis à chauffer le produit formé pour inactiver l'enzyme et à en séparer la substance, le produit résultant de la protéolyse étant de préférence hydrolysé avant d'être chauffé. On obtient le plasma ou le sérum sanguin (A) par une méthode connue, par exemple en recueillant le sang d'un mammi- fère qui a été hyperimmunisé avec un protozoaire suivant l'une des méthodes que l'on trouve dans la littérature. Des exemples de mammifères pouvant être choisis à cette fin sont les suivants: souris, chien, boeuf ou vache, cheval, chèvre, brebis, lapin, porc ainsi que divers autres, parmi lesquels la souris, le chien et les bovins sont particulièrement préféra- bles. Le type de protozoaire n'est pas particulièrement limité, mais il est néanmoins préférable de prendre un sporozoaire, en particulier un toxoplasme tel que Toxoplasma gondii, une hémo- sporidie comme Plasmodium berghei de la souche NK, ou un piro- plasme tel que Babesia gibsoni, Babesia rhodhaini, Babesia ovata ou Babesia sergenti. Selon la présente invention, à la suite de l'in:ocula- tion de l'un quelconque des protozoaires indiqués à l'une quel- conque des espèces de mammifères ci-dessus, il se forme toujours une substance immunoactive inhibant la multiplication des autres types de protozoaires, ainsi que de celui qui a été inoculé, dans des cellules de mammifères non seulement de la même espèce, mais encore d'autres espèces. Par exemple, une substance prépa- rée selon l'invention par inoculation de Toxoplasma gondii à des souris se montre immunoactive et inhibe la multiplication des protozoaires Toxoplasma, Plasmodium et autres, dans des cellules de souris, chien, bovins et divers autres mammifères. Le mammifère peut être hyperimmunisé avec le protozoaire par simple inoculation, laquelle peut se faire par la voie intrapéritonéale, intraveineuse ou orale, la quantité de proto- zoaires i.noculée n'étant pas particulièrement limitée et pou- vant varier avec l'espèce du mammifère ainsi qu'avec le proto- zoaire et la méthode d'inoculation, mais étant ordinairement d'environ 102 à 108 protozoaires par mammifère. L'inoculation peut se faire en plusieurs fois, généralement en deux ou trois fois, et de préférence, on commencera par inoculer une premiè- re fois par exemple 102 à 108 protozoaires environ, puis, après une période appropriée, environ 104 à 108, ordinairement entre la troisième et la dixième semaine suivant la première inocu- lation. 1 Dans une méthode préférable, le mammifère est hyperim- munisé par inoculation du protozoaire puis inoculation d'un antigène spécifique et/ou d'un mitogène non-spécifique, en en- tendant par antigène spécifique un antigène d'un protozoaire ayant une spécificité à l'égard de celui-ci. Les antigènes spé- cifiques-utilisables dans le présent procédé diffèrent d'un protozoaire à l'autre pour le procédé concerné. Par exemple,si le protozoaire choisi est un toxoplasme, l'antigène spécifique peut être le TLA, tandis que dans le cas de Plasmodium, ou de Babesia, des antigènes spécifiques utilisables sont l'antigène d'un lysat de Plasmodium (désigné ci-après par l'abréviation "MLA") et l'antigène d'un lysat de Babesia (ci-après "BLA"> respectivement. Ces antigènes spécifiques sont tous bien con- nus et on peut les obtenir par exemple en traitant le-protozo- aire avec un vibrateur à ultra-sons puis en centrifugeant le mélange pour en séparer les fragments aqueux [voir Jacobs, L. and M.N. Lunde, J. Parasitol., 43, 308-314 (1957), et Ishimine, T., et al., Jap. J. vet. Sci. , 41, 487-493 (1979)1. Par ailleurs, l'expression "mitogène nonspécifique" désigne ici une lectine entraînant la transformation blastoide des lymphocytes, des exemples caractéristiques de tels mitogênes non-spécifiques étant la Con A, la PHA, etc.. L'antigène spécifique ou le mito- gène non-spécifique est ordinairement donné plusieurs semaines après l'incubation avec les protozoaires, jusqu'à dix semaines après ou même un peu plus, et il est préférable d'inoculer les protozoaires en deux fois ou plus et de donner l'antigène spé- cifique ou le mitogène non-spécifique entre la première et la cinquième semaine, de préférence au cours de la seconde semaine environ, qui suivent l'inoculation finale du protozoaire. L'antigène spécifique ou le mitogène non-spécifique est donné par la voie intraveineuse à raison d'environ 5 à 150 pg par Kg de poids corporel du mammifère, la méthode, la quantité ino- culée et le moment de l'inoculation étant naturellement dé- terminés convenablement d'après la nature de l'antigène spéci- fique et/ou du mitogêne non-spécifique, l'espèce du mammifère et autres facteurs. Le mammifère est hyperimmunisé avec le pro- tozoaire ordinairement entre dix jours ou un peu plus et plu- sieurs dizaines de jours ou un peu plus après l'inoculation finale du protozoaire, ou bien au moins 24 heures après quel' antigène spécifique ou le mitogène non-spécifique a été donné. Le plasma sanguin ou le sérum du mammifère peut être séparé d'une manière habituelle, et employé ainsi dans le procédé de préparation de la substance selon cette invention. Le surnageant de culture (B) dont on peut aussi partir dans ce procédé est de préférence préparé par la méthode sui- vante. On commence par hyperimmuniser un mammifère avec le protozoaire par la même méthode que ci-dessus, on retire la rate et on en sépare les cellules suivant la méthode de Conray- Ficoll [Immunol. Cell., 1, 265-268 (1971), Tsuji], et on les lave par centrifugation avec une solution saline équilibrée de Hanks héparinisée, contenant 10 unités/ml d'héparine [Modern Biology Series 23, "Method of Incubating Animal Cells", par Yukiaki Kuroda, Kyoritsu Shuppan, Japon, 1974, ci-après en abréviation "HBSS héparinisée "]. On met ensuite le précipité ainsi obtenu en suspension dans un milieu TC-199 [voir "Igaku no Ayumi (Progress of Medicine)", 62, No.6, August 5, 1967], milieu pouvant contenir environ 104 à 108 cellules/ml et au- quel ont été ajoutés 5 à 20 % p/v de sérum de veau inacti- vé à chaud (désigné ci-après par l'abréviation "HICS") ainsi que des antibiotiques (de préférence 100 unités de pénicilline G et 100 pg de dihydrostreptomycine par millilitre). A ce mi- lieu on ajoute environ 5 à 150 pg/ml, de préférence 80 à 120 pg/ml environ, d'un antigène spécifique et/ou d'un mitogène non-spécifique, et on le fait incuber aux environ de 37"C pen- dant un à deux jours environ, de préférence pendant 48 heures environ, en présence de gaz carbonique, l'antigène spécifique et le mitogène nonspécifique étant les m-mes que ceux qui ont été employés dans la méthode ci-dessus de prépa- ration du plasma ou du sérum sanguin (A). On centrifuge ensuite le milieu pour recueillir le surnageant de la culture de cellu- les de rate du mammifère hyperimmunisé, que l'on utilise ainsi dans le procédé de préparation de la présente substance. Le surnageant de culture (C) est préparé, par exemple, par la méthode suivante. De la même manière que pour le surna- geant (B), on sépare les cellules de rate d'un mammifère normal, on les lave par centrifugation avec la HBSS héparinisée puis on les met en suspension dans le milieu TC-199 contenant du HICS et des antibiotiques. Au milieu, on ajoute ensuite le surna- geant (B) dans une proportion de 60 à 70 % v/v,ou bien un anti- gène spécifique et/ou un mitogène non-spécifique dans la pro- - portion d'environ 5 à 150 pg/ml, de préférence de l'ordre de à 120 pg/ml, antigène et mitogène qui peuvent être les mêmes que ceux qui ont été employés pour obtenir le plasma ou sérum (A), et ce surnageant pouvant être utilisé conjointement avec l'antigène spécifique et/ou le mitogène non-spécifique. Les cellules sont alors cultivées à 37 C pendant environ trois se- maines, période au cours de laquelle on remplace de temps en temps le tiers environ du milieu par du milieu frais, de pré- férence tous les trois jours. Quand l'incubation est terminée, on lave le milieu avec de la HBSS héparinisée puis on lui ajoute de nouveau un antigène spécifique et/ou un mitogène non spécifique dans une proportion d'environ 5 à 150 pg/ml, de pré- férence de l'ordre de 80 à 120 pg/ml, et on le fait encore in- cuber à 370C pendant encore un à deux jours, de préférence pen- dant 48 heures environ,en présence de gaz carbonique. En sui- vant ensuite le même procédé que pour le surnageant (B), on obtient le surnageant de la culture de cellules de rate du mam- mifère normal. Comme on l'a dit précédemment, on obtient la substance selon cette invention en faisant agir une enzyme protéolytique sur la matière (A), (B) ou (C),en hydrolysant si on le souhai- te le produit formé, puis en chauffant le produit pour inacti- ver l'enzyme et en le traitant par des méthodes appropriées de séparation et de purification. Des exemples d'enzymes protéolytiques utilisables sont des protéinases, c'est-à-dire des endopeptidases, exopeptida- ses et endo- et exo-peptidases, comprenant la pronase, la papaTne, la chymotrypsine, la trypsine, l'aminopeptidase, la carboxypeptidase, etc., pouvant être employées individuel- lement ou en mélanges et parmi lesquelles la pronase, la pa- païne et la chymotrypsine soht particulièrement préférables, surtout la pronase. Pour le traitement enzymatique de la ma- tière dont on part, on utilise ordinairement de l'ordre de 0,01 à 0,1 % p/v de l'enzyme, et le traitement est conduit a une température et à unpH qui conviennent pour l'enzyme choisie. Par exemple, avec la pronase, le traitement est conduit aux environs de 36-38oC et à un pH de l'ordre de 7 à 8. Le traite- ment est terminé quand la substance cherchée s'est formée avec un rendement maximal, en général en une période d'environ 6 à 24 heures. Le produit résultant de la protéolyse est ensuite sou- mis au traitement thermique pour en inactiver l'enzyme, trai- tement qui se fait par exemple par chauffage du produit à une température d'environ 95 à 100'C pendant une heure environ, et qui sert aussi à stériliser et à activer la substance formée et à en éliminer par décomposition les substances non-enzymo- lysées ou l'antigène spécifique de cellules hétérologues qui se trouvent probablement dans le produit traité. Si on le sou- haite, avant de procéder au traitement à chaud, on peut soumet- tre à une hydrolyse le produit de la protéolyse, hydrolyse qui est de préférence conduite pour décomposer les substances n'a- yant pas été enzymolysées, en général avec de l'hydroxyde de sodium ou de potassium ou un aikali semblable à un pH au moins égal à 12, ou encore avec un acide ordinaire tel que l'acide chlorhydrique, sulfurique ou autres. Dans le mode d'exécution préféré de l'invention, on hydrolyse le produit résultant dela protéolyse en lui ajoutant goutte-à-goutte de l'hydroxyde de sodium 10-N en petites portions en une période d'environ 15 mi- nutes, tout en agitant, de manière à obtenir-un mélange bien agité à pH 12 au moins, et en chauffant ce mélange à une tempé- rature de 95 à 1000C pendant environ 60 minutes, puis on ref- froidit le mélange avec de la glace et on le neutralise ensuite avec un acide approprié tel que l'acide chlorhydrique ou sul- furique. e La substance cherchée est isolée du mélange et purifiée d'une manière usuelle, par exemple par filtration, centrifuga- tion, filtration sur gel, dessalage, ou combinaison de plusieurs de ces méthodes. De préférence, la filtration sur gel est effectuée par exemple avec les produits Sephadex G-100, Toyopearl HW40 et Sephacryl S-200, et le déssalage peut se faire convenablement par exemple par filtration sur gel avec du Sephadex G-15 ou filtration à travers une membrane Millipore NMWL 10 (produit de Nippon Millipore Ltd., Japon). La substance selon cette invention qui a été ainsi pré- parée est ordinairement lyophilisée comme produit et conservée à basse température, aux environs de 2 à 70C, et elle est aussi stérilisée d'une manière appropriée. La présente substance est employée en médecine de la manière suivante. Comme il a déjà été dit, cette substance est immunoactive, à savoir qu'elle inhibe la multiplication de di- vers microorganismes, tels que protozoaires, bactéries, virus, etc., et elle a une action anti-cancéreuse. Elle est peu toxi- que et représente un médicament efficace pour mammifères, hom- me et animaux. Pour son emploi chez l'homme ou l'animal, elle est for- mulée en compositions pharmaceutiques avec des véhicules appro- priés non toxiques, tels que divers diluants ou excipients, suivant le mode d'administration. Des véhicules non toxiques appropriés, pharmaceutiquement acceptables comprennent, sans limitation, l'eau comme l'eau distillée des solutions salines, par exemple une solution de chlorure de sodium, des alcools, polyéthylène glycols, alcool isostéarylique ethoxylé, alcool polyoxyisostéarylique, polyoxyéthylène sorbitol, esters de sorbitanne, gélatine, lactose, amylose, etc.. Les préparations pharmaceutiques peuvent être stérilisées et le cas échéant mé- langées avec des agents auxiliaires tels que solubilisants, tampons, analgésiques, agents de conservation, stabilisants, émulsionnants, sels modifiant la pression osmotique, colorants, parfums et aromatisants, etc., et l'on peut également leur ajouter d'autres médicaments. Bien que cela ne soit pas limitatif, ces compositions sont de préférence des préparations pour l'administration pa- * rentérale et particulièrement appropriées sont des solutions injectables, ainsi que suspensions et émulsions, les injections nouvant se faire de la manière habituelle, par exemple par la voie intraveineuse, de la préparation seule ou associée à une solution auxiliaire ordinaire de glucose, d'un acide aminé ou autres. Si on le souhaite, on peut aussi injecter la prépara- tion seule par la voie intramusculaire, sous-cutanée, intra- cutanée ou intra-péritonéale. Les présentes compositions qui sont préparées sous des formes autres que des préparations in- jectables peuvent être données par la voie orale ou appliquées localement, par exemple en pommades. La teneur de la composition en composant actif (pré- sente substance) et la dose de celui-ci sont déterminées d'a- près la méthode et la forme de l'administration, l'objectif considéré et les symptomes du patient. Dans le cas d'une pré- paration injectable contenant environ 1 à 80 % p/v du composant actif, l'injection se-fera à une dose donnant environ 1 à 1000 mg de ce composant par kg de poids corporel et par jour. Il n'est pas nécessaire de donner la composition en une seulefois par jour, et on peut la diviser par exemple en trois ou quatre doses qui sont données dans la journée. Des compositions sous d'autres formes que des préparations injectables peuvent être administrées à des doses appropriées,déterminées d'après le dosaqe ci-dessus pour les injections. La substance selon cette invention a été étudiée du point de vue pharmacologique comme on le décrit maintenant. I - Essai d'inhibition de la multiplication toxoplasmique Cet essai est effectué d'après les méthodes qui sont décrites dans la littérature suivante: Jap. J. vet. Sci., 37, 235-243 (1975) et Zbl. Bakt. Hyg., I. Abt. Orig. A244, 374-382 (1979). Les échantillons de substance obtenus dans les exem- ples qui sont décrits ci-après sont essayés dans des monocytes canins, des monocytes bovins, des cellules de coeur humain, des cellules de rein de souris et des macrophages péritonéaux de souris, qui sont préparés suivant les méthodes décrites dans la littérature ci-dessus. Les tableaux 1 à 5 ci-après donnent les taux % d'inhibition de la multiplication toxoplas- mique atteintsdans les cellules, c'est-à-dire l pourcentages du nombre de cellules dans lesquelles le nombre de toxoplasmes est 0, 1 à 5, ou > 6, par rapport au total des cellules exami- nées, les taux d'inhibition en pourcentages qui sont indiqués étant représentés par les symboles suivants: à à à 40 à à à à à Inhibition de cytes canins TABLEAU 1 la multiplication toxoplasmique dans des mono- Essai Echan- Concentration Nombre de toxoplasmes dans N tillon de la substance une cellule (_ _ %_) 0 1-5 >-6 1 Exemple 2 0,25 I B A 2 " 2 0,50 J A A 3 " 2 0,75 J A A 4 " 2 1,00 J A A " 6 0,75 I B A 6 " 8 0,50 J A A 7 " 5 1,00 H B B 8 " 7 0,75 F C B 9 " 9 0,75 G C B " 10 0,75 G C B 11 Témoin:: 10 D C D ::Plasma sanguin canin normal. Inhibition de la cytes de bovins. TABLEAU 2 multiplication toxoplasmique dans des mono- Essai Echan- Concentration Nombre de toxoplasmes N tillon dela substance dans une cellule (%) 0 1-5 -k6 1 Exemple 2 0,25 I A A 2 " 6 0,25 J A A 3 " 8 0,50 J B A 4 5 0,50 E D B 7 1,00 J A A 6 9 0,75 J C B 7 " 10 0,75 G C B 8 |Témoin:: 10 E D E ::Sérum sanguin de bovin normal TABLEAU 3 Inhibition de la multiplication toxoplasmique dans des cellu- les de coeur humain Essai Echan- Concentration | Nombre de toxoplasmes N tillon dela substance dans une cellule 0 1-5 >6 1 Exemple 2 0,75 I B A 2 6 1,00 J A A 3 8 0,50 I B A 4 5 0,50 G C B 7 0,50 H B A 6 9 0,75 G C B 7 10 0,75 G C B 8 Témoin: 10 F D B :Sérum de bovin normal TABLEAU 4 Inhibition de la multiplication toxoplasmique dans des cellu- les de rein de souris. Essai Echan- Concentration Nombre de toxoplasmes N tillon de la substance dans une cellule O0 1-5 26 1 Exemple 2 0,50 J A A 2 6 0,25 J A A 3 " 8 0,50 J A A 4 " 9 0,50 I B B 5 0,50 G C B 6 10 0.75 I B A 7 7 0,50 G C B 8 Témoin:: 10 E D E ::Sérum de souris normal TABLEAU 5 Inhibition de la multiplication toxoplasmique dans des macro- phages péritonéaux de souris. Essai Echan- Concentration Nombre de toxoplasmes N tillon dela substance dans une cellule 0 1-5 G 1 Exemple 2 0,25 I B A 2 " 5 0,50 E D C 3 " 7 0,50 F C C 4 " 6 1,00 J A A Témoin:: 10 D E D ::Sérum de souris normal Les tableaux 1 à 5 précédent montrent que la présente substance inhibe efficacement la multiplication toxoplasmique dans des cellules homologues de même que dans des cellules hé- térologues. II - Chimiothérapie d'une toxoplasmose expérimentale aiguë. On divise des souris BALB/c d'environ 18 à 20 grammes en trois groupes de dix animaux chacun pour la chimiothérapie de la toxoplasmose expérimentale, et à chaque souris on mno- cule par la voie intrapéritonéale une solution isotonique de chlorure de sodium contenant 5 x 10 /0,25 ml d'un toxoplasme virulent de la souche S-273. 24 heures après, on donne au grou- pe I (témoin) 0,25 ml de soluté physiologique en une seule fois quotidiennement pendant quatre semaines, on donne au groupe Il (à titre comparatif) par la voie orale de l'acétylspiramycine en solution à la dose de 0,2g/kg de poids corporel par jour, en une seule fois, pendant quatre semaines, et on donne au grou- pe III (groupe pour la présente invention) par la voie intra- péritonéale la présente substance préparée dans l'exemple 6 ci-après, en une seule fois quotidiennement, pendant quatre semaines, à la dose de 1 mg par souris, associée à une adminis- tration orale d'acétylspiramycine à la dose de 0,2 g/kg de poids corporel par jour. Le trentième jour. suivant l'infections on mesure le taux sérique d'anticorps par la méthode du latex et le nombre de kystes cérébraux avec l'appareil approprié, et on calcule la diminution du nombre de kystes d'après la relation Réduction (%) - A - B x 100 A A désignant le nombre de kystes cérébraux du groupe I (témoin) et B le nombre pour le groupe II ou III. A des souris nues (sans poils) de la souche BALB/c on inocule les produits homogénéisés de cervelle des groupes de souris, et on examine la présence du toxoplasme d'après le nom- bre de souris mortes, le tableau 6 indiquant les résultats ob- tenus. TABLEAU 6 Groupe Ncmbre de kystes Taux d'anticorps +HA Nombre de souris .. nues mortes (Rf&iction %) Valeur % I 4302 - 10/10 100 16/16 (témoin) II 26 (99,4) 7/8 87,5 14/14 (compa- ratif) III 0 (100) 0/10 0 0/13 (inven- tion) Le tableau 6 montre que les souris qui ont été soumi- ses à une infection aiguë par le toxoplasme sont difficiles à guérir complètement par la seule administration d'acétylspi- ramycine (groupe II), et bien que le nombre moyen de kystes céré.. ait fortement diminué par rapport au témoin (groupe I), les 14 souris nues auxquelles on a.inoculé l'homogénat de cervel- le meurent néanmoins, ce qui est l'indication de la présence du toxoplasme. Au contraire, la substance selon l'invention (groupe III) réduit à 0 le nombre de kystes et les 13 souris nues auxquelles on a inoculé l'homogénat de cervelle survi- vent toutes, ce qui indique l'absence du toxoplasme. Cette to- xoplasmose provoquée peut donc être guérie totalement. III- Chimiothérapie d'une toxoplasmose expérimentale chroni- que. A des souris BALB/c divisées en 4 groupes de 10 animaux chacun, on donne par la voie intrapéritonéale 0,5 ml de solu- té physiologique contenant 10 toxoplasmes peu virulents (sou- che S 273), quatre semaines après on leur inocule de ncuveau 0,5 ml du même soluté, et quatre semaines plus tard on leur donne la substance selon l'invention qui a été obtenue dans l'exemple 6 et de l'acétylspiramycine, chacune seule cu les deux asso ciées, quotidiennement pendant quatre semaines, tandis qu'à un groupe témoin on ne donne aucun des deux médicaments. Pour la présente substance donnée seule, on administre par la voie intrapéritonéale 0,5 ml de soluté contenant 20 mg de la subs- tance, dans le cas de l'acétylspiramycine donnée seule, on ad- ministre par la voie orale 0..5 ml de soluté contenant 8 mg de ce médicament, et dans le cas de l'administration conjointe des deux médicaments, on donne en même temps, par les mêmes méthodes que ci-dessus, les mêmes quantités des mêmes solu- tions. Les effets obtenus sont évalués d'après les nombres de kystes cérébraux, leur diminution (%) et les taux d'anti-corps qui sont déterminés, une fois que l'administration des médica- ments est terminée, de la même manière que précédemment. Le tableau 7 donne les résultats obtenus. TABLEAU 7 Ce tableau 7 montre que le nombre moyen de kystes, qui est d'environ 1609 pour le groupe témoin I, peut être réduit à une moyenne de 1061 par la seule administration de la présente substance (groupe III), et à une moyenne de 766 l'administration conjointe de cette substance et d'acétylspiramycine (groupe IV), dans ce dernier cas la réduction étant supérieure à 50 %,ce qui Kystes cérébraux GROUPE -. TAUX D'ANTI-CORPS Nombre Réduction {%) I 1608,90 - 1:128 ->1:512 (témoin) II 1052,15 34,61 1:128 ->1:512 (comparatif, cétylspi- ramycine seule) III 1061,43 32,91 1:256 ->1:512 (présente substance seule) IV 765,79 52,40 >1:512 (association) montre que la présente substance exerce une immunoactivité en produisant un effet thérapeutique sur les kystes de souris ayant une toxoplasmose chronique. IV - Action antibactérienne dans des macrophages 1) On laisse agir pendant 30 minutes une bactérie Gram- positive (Bacillus subtilis H IAM 1521) ou Gram-négative (Escherichia coli B sauvage ou Proteus vulgaris HX 19) sur des macrophages péritonéaux d'une souris normale, eton incube pen- dant 24 heures dans du milieu TC-199 contenant 10 % de sérum de veau foetal, chacune des bactéries représentant 50 fois la quantité des macrophages (essai A). On fait ensuite incuber les macrophages pendant encore 2 heures dans le même milieu en présence de 0,75 mg/ml de la présente substance obtenue à l'exemple 6 (essai C), et on recommence les mêmes opérations que pour cet essai C, pour un essai témoin sans la présente substance (essai B). On compte les nombres de bactéries restant dans les macrophages en observant les spécimens de coloration. Le ta- bleau 8 donne les résultats obtenus. TABLEAU 8 Nombre de bacteries Essai A Essai B Essai C dans les macrophages (0 heure) (en 2 hres) (en 2 hres) E. Coli O 0 (%) 1,3 (%) 2,7 (%) 1 - 10 9,7 33,6 56,9 11 20 29,7 36,0 28,8 21 - 30 24,6 17,3 7,7 31 36,0 11,7 4,0 P. vulgaris 0 32,0 (%) 36,2 (%) 50.5 (%) 1 - 10 59,3 57,3 41,8 11 - 20 4,2 3,0 5,0 21 - 30 2,7 2,2 1,3 31 1,8 1,3 1,3 B. subtilis 0 '0 (%) 1,2 (%) 3,2 (%) 1 - l'O 9,5 29,2 34,7 11 - 20 18,5 37,2 33,5 21 - 30 22,8 -21,2 19,3 431 49,2 11,3 9,3 l 21 Ce tableau 8 montre que la substance selon cette in- vention inhibe efficacement la multiplication de bacteries Gramx-Dositives et Grams-négatives dans des macrophages périto- néaux de souris normales. 2) On prépare des macrophages incubés en répétant l'essai C précédent, sauf que les macrophages sont cultivés pendant 4 heures dans le même milieu en présence de 0,75 ml/mg de la pré- sente substance obtenue à l'exemple 6. Les macrophages sont brisés dans de l'eau distillée puis incubés sur une plaque, et on compte le nombre de cellules vivantes de E.Coli qui subsis- tent dans les macrophages. On recommence les mêmes opérations pour un essai témoin sans la présente substance. La figure 3 des dessins annexés montre les résultats obtenus, la ligne 1 représentant le résultat avec la présente substance et la li- gne 2 le résultat de l'essai témoin. De même que le tableau 8, cette figure montre que la substance selon l'invention inhibe remarquablement bien la mul- tiplication de E. Coli dans des macrophages péritonéauxde sou- ris normales. V - Inhibition de la multiplication de virus. On dissout la substance selon l'invention, préparée à l'exemple 6, dans du milieu essentiel minimum de Eagle (voir "Igaku no Ayumi (Progress of Medicine)", 62, No.6, August 5, 1967) aux concentrations qui sont indiquées au tableau 9 ci- après, et pour stériliser la solution on la filtre à travers une membrane de 0,45 micron d'épaisseur (produit de Nippon Millipore Ltd.). On ajoute 2 ml de cette solution à des cel- lules HEP-2 (106 cellules par plaque) de tumeur' maligne la- ryngée épithéliale humaine. et on fait incuber pendant deux jours, puis on infecte les cellules avec 2 PFU (unité de for- mation de plaque) par cellule du virus de l'Herpes simplex du type II (souche 186), on incube à 370C pendant 18 heures et on refroidit ensuite à -80'C pour arrêter la réaction, et on comp- te le nombre de virus. On répète les mêmes opérations que ci- dessus, sauf que les cellules HEP-2 sont infectées avec 0,2 PFU cellule de virus d'Herpes simplex du type II (souche 186) puis incubées à 370C pendant 25 heures, et on prépare aussi des groupes témoins sans la présente substance. Le tableau 9 donne les résultats obtenus. TABLEAU 9 La différence significative P qui est indiquée au ta- bleau 9 a été déterminée par l'essai t Student. Ce tableau montre que la Présente substance inhibe d'une manière signi- ficative la multiplication du virus aux concentrations de 1 à mg/ml. VI - Action anti-cancéreuse On transplante par la voie intrapéritonéale 0; 1 ml de soluté physiologique contenant 106 cellules de la leucémie de la souris P388 sur des souris mâles BDFI de dix semaines, à la partie médiane de l'estomac, du côté droit de celui-ci. Pendant 9 jours consécutifs après cette transplanta- tion, on injecte dans la même partie, par voie intrapéritoné- ale,la présente substance obtenue à l'exemple 6 et du 1- (2-tétrahydro)-5-fluoro-uracile (Ftorafur, FT 207, produitde TAIHO Pharm. Co., Ltd., Japon), chacun seul ou les deux asso- ciés. La présente substance est donnée une fois par jour à la dose de 3,0 mg/0, 1 ml de soluté/10 g de poids corporel et le Ftorafur 207 une fois par jour à la dose de 1,0 mg/0,1 ml de soluté/10 g de poids corporel. A un groupe servant de témoin, on ne donne aucun médi- cament. On évalue l'action anti-cancéreuse d'après les taux de survie déterminés au moment o toutes les souris de chaque Concentration de la Reproduction des virus substance (mg/ml) (PFU x 104/10 cellules) (PF x10/105 cellules) 2 PFU/cellule 0,2 PFU/cellule 0 (témoin) 196,0+9,5 192, 0+36,0 1 157,0+3,0(P>0,001) 121,0+ 6,0(P>0,001) 94,0+9,0(P>0,001) 38,0+ 2,0(P>0,001) 9,8+0,7(P>0,001) 9,7+ 1,7(P>0,001) groupe sont mortes, par rapport au groupe témoin. Le tableau 10 donne les résultats obtenus, TABLEAU 10 GROUPE Nombre Nombre de jours Nombre moyen Taux de Poids moyen (g) * de de survie de de jours de survie avantlatrans- souris chaque souris survie (%) plantation Témoin 7 9, 9, 10, 10, 9,86+0, 69 O 25,86 , 10, 11 Pr.s.... Présente 7 11, 11, 12, 12, 11,86+0,59 20,29 26,14 substance 300 mg/kg 12, 12, 13 Ftorafur 7 12, 12, 13, 13 13,57+1,51 37,68 26,14 mg/kg 14, 15, 16 Ftorafur mg/kg 7 16, 17, 18, 18 18,00+1,29 82,61 25,86 mg/kg + présente 18, 19, 20 substance 300 mg/kg. ro tn 4' Ln Ce tableau montre que la présente substance exerce une action anti-cancéreuse, même si elle est donnée seule, et qu' elle produit un effet de synergie anti-cancéreux quand elle est associée au médicament anti-cancéreux connu. VII - Toxicité aigue La méthode choisie pour déterminer la toxicité aigue de la présente substance est la méthode de Litchfield et Wilcoxon (J. Pharmacol. Exp. Ther., 90, 99, 1949), appliquée à des souris femelles BALB/c. Une'dose de 4.000 mg/kg par la voie intrapéritonéale, ou de 2.000 mg/kg par la voie intraveineuse, n'entraîne aucu- ne mort. Ainsi, la DL50 de la substance est supérieure à 4.000 mg/kg par la voie intrapéritonéale et supérieure à 2.000 mg/kg par la voie intraveineuse. On donne ci-après des exemples de référence dans les- quels sont préparées les matières dont on part pour produire la substance biologiquement active selon cette invention. Exemple de référence 1 A cinq chiens beagles d'un poids moyen de 10 kg on ino- cule par voie intrapéritonéale, à chacun d'eux, 106 toxoplasmes: (Toxoplasma gondii), dans la cinquième semaine après cette ino- culation on leur inocule de nouveau 106 toxoplasmes de la même souche pour avoir des chiens hyperimmunisés par le toxoplas- - me, et dans la seconde semaine suivant cette seconde inoculra- tion on injecte du TLA aux chiens par la voie intraveineuse à la dose de 10 pg/kg de poids corporel. On recueille le sang 24 heures après cette injection. Le plasma sanguin ainsi obtenu a un titre d'anti-corps d'au moins 1:1000 d'après la méthode de coloration de Sabin- Feldman,et d'au moins 1:4000 déterminé par la méthode immuno- fluorescence indirecte. On ne décèle la présence que d'immuno- globuline G (Ig G). Exemples de référence 2 et 3 On répète l'exemple de référence 1, mais en remplaçant le TLA par la Con A ou par la PHA. Les deux plasmas sanguins ainsi obtenus ont le titre d'anti-corps: Coloration: au moins 1:1000 Immunofluorescence indirecte: au moins 1:4000 (l'anti-corps Ig G est seul décelé). Exemple de référence 4 On répète l'exemple de référence 1 mais en remplaçant Toxoplasma gondii et le TLA par un piroplasme (Babesia gibsoni) et le BLA respectivement, pour obtenir des plasmas de chiens rendus hyperi-muns par le piroplasme. Le titre d'anticorps du plasma est d'au moins 1:1000 déterminé par la méthode d'immuno- fluorescence indirecte. Exemple de référence 5 A des veaux de six mois on inocule par voie intramus- culaire cervicale 2,5 x 108 toxoplasmes (Toxoplasma gondii), dans la cinquième semaine suivant cette inoculation on leur inocule de nouveau 5 z 108 toxoplasmes de la même souche, et dans la seconde semaine qui suit cette seconde inoculation on leur injecte du TLA par voie intraveineuse à la dose de 1 Vg/kg de poids corporel. On recueille le sang 24 heures après cette injection pour obtenir le sérum, lequel a un titre d'anticorps d'au moins 1:2048, déterminé par agglutination de latex. Exemple de référence 6 On recommence l'exemple de référence 5 mais en rempla- çant Toxoplasma gondii et le TLA par un piroplasme (Babesia spp.) et du BLA, respectivement: pour obtenir des veaux hyperim- munis s par le -. piroplasme. Les sérums obtenus ont des titres d'anti-corps de 1:256 à 1000, déterminés par la méthode d'immu- nofluorescence indirecte. Exemple de référence 7 On inocule à des souris par la voie intrapéritonéale 1 x 106 toxoplasmes (Toxoplasma gondii, d'une souche peu viru- lente), dans la cinquième semaine après cette infection on leur inocule de nouveau 1 x 106 toxoplasmes de la même souche, et dans la seconde semaine qui suit la seconde inoculationon leur injecte du TLA par voieintrapéritonéale à la dose de 10 pg/kg de poids corporel. 24 heures après cette injection on recueille le sang des souris ainsi rendues hyperimmunes par le to- xoplasme pour obtenir le sérum, lequel a un titre d'anticorps d'au moins 1:4000, déterminé par la méthode d'immunofluorescence indirecte. Exemple de référence 8 On recommence l'exemple de référence 7 mais en rempla- çant Toxoplasma gondii et le TLA par un piroplasme (Babesia Rhodhaini) et du BLA, respectivement, pour obtenir des sérums de souris hyperimmunes, sérums aui ont des titres d'anti-corps d'au moins 1:4000,déterminés par immu- nofluorescence indirecte. Exemple de référence 9 On répète l'exemple de référence 7 mais en remplaçant Toxoplasma et le TLA par Haemosporidia (Plasmodium berghei, souche NK) et du MLA, respectivement, pour obtenir le sérum de souris rendues hyperimmunes par Haemosporidia, sérum qui a des titres d'anti-corps d'au moins 1:1000 déterminés par immu- nofluorescence indirecte. Exemple de référence 10 On lave à deux reprises par centrifugation, avec de la HBSS héparinisée contenant 10 unités/ml d'héparine, des cellu- les de rate d'une souris qui a été rendue hyperimmune par du toxoplasme, puis on met la matière sédimentée en suspension dans du milieu TC-199 à 20 % de sérum de veau thermo-inactivé (HICS) et contenant des antibiotiques, à savoir 100 unités de pénicilline G et 100 pg de dihydrostreptomycine par ml du mi- lieu, de manière que celui-ci contienne 1 x 107 cellules/ml, et après avoir ajouté 50 pg/ml de TLA on incube les cellules à 37 C pendant 48 heures. On sépare ensuite le surnageant de la culture par centrifugation à 4 C pendant 30 minutes, à 3.000 tours/minute. Exemple de référence 11 On retire la rate d'une souris normale, on en sépare les cellules par la méthode Conray-Ficoll et on les lave deux fois par centrifugation avec de la HBSS héparinisée à 10 unités d'héparine/ml. On met la matière sédimentée en suspension dans du milieu TC-199 à 20 % de sérum de veau thermo-inactivé (HICS) et contenant des antibiotiques, à savoir 100 unités de pénicil- line G et 100 pg de dihydrostreptomycine par ml du milieu, de manière que celui-ci contienne environ 107 cellules/ml, et après avoir ajouté 66 % en volume du surnageant de culture obtenu à l'exemple de référence 10 précédent, on incube les cellules pendant trois semaines, en remplaçant tous les trois jours le tiersdu milieu par du milieu frais. L'incubation terminée, on lave la culture avec de la HBSS héparinisée à 10 unités d'hépa- rine/ml, on lui ajoute 100 pg/ml de TLA et on fait incuber les cellules pendant encore 48 heures à 37 C. On sépare ensuite le surnageant de la culture par centrifugation à 4 C pendant 30 minutes à 3000 tours/minute. Exemple de référence 12 On obtient un surnageant de culture de la même manière que dans l'exemple de référence 11 précédent, sauf que le sur- nageant de l'exemple de référence 10 est remplacé par 100 pg/ ml du TLA. On donne maintenant quelques exemple de préparation de la présente substance. EXEMPLE 1 On ajoute 0,1 g de pronase (Pronase P, produitde Kaken Chemical Co., Ltd., Japon) à 100 ml du plasma sanguin quiaété obtenu dans l'exemple de référence 1, et on traite ce plasma avec l'enzyme en incubateur à 370C pendant 12 heures, tout en agitant, puis on chauffe le mélange pour inactiver l'enzyme et on le refroidit ensuite avec de l'eau glacée. Le plasma qui a été ainsi traité avec l'enzyme est alors soumis à une filtration sur gel de Sephacryl S-200, avec 18,6 ml/h d'une solution tamponnée au phosphate 0,01 M à pH 7,2, pour obtenir une fraction active inhibant le toxoplasme. On soumet ensuite cette fraction brute à une filtration sur gel de Toyopearl HW40, puis on déssale la fraction active ainsi obtenue sur une colonne de 1,2 cm x 40 cm de Sephadex G-15 avec de l'eau redistillée, ce qui donne 0,6 g de la subs- tance selon cette invention présentant les propriétés physico- chimiques et biologiques qui ont été précédemment indiquées. On la stérilise par filtration, on la lyophilise et on la conser- ve à 4 C. EXEMPLE 2 On traite avec une enzyme, de la même manière que dans l'exemple 1 précédent, une autre partie du plasma sanguin obte- - nu à l'exemple de référence 1. A 100 ml du plasma ainsi traité, on ajoute 10 ml de NaOH 10N tout en agitant et on poursuit l'agitation du mélange d'une manière continue pendant 60 minutes à 90-100 C puis onle refroidit et on lui ajoute 10 ml d'HC1 10N pour amener le pH à 7,0. On filtre alors le mélange sur un papier filtre Toyo Filter Paper No.5C (produit de Toyo Roshi Co., Ltd., Japon), et on centrifuge le filtrat pendant 20 minutes à 10.000 tours/minute pour recueillir le surnageant. On soumet ce surnageant à une filtration sur gel de Sephacryl S-200 (sur une colonne de 0,9 cm x 90 cm), en faisant passer sur la colonne une solution de tampon au phosphate 0,01 M à pH 7,2, au débit de 18,6 ml/h, ce qui donne une fraction brute. On soumet à nouveau cette fraction brute à une filtra- tion sur gel deToyopearl HW40, puis on déssale la fraction ac- tive ainsi obtenue sur une colonne de Sephadex G-15 de 1,2 cm x 40 cm avec de l'eau redistillée, ce qui donne 0,54 g de la présente substance ayant les propriétés physico-chimiques et biologiques précédemment indiquées. On la stérilise par filtra- tion, on la lyophilise et on la conserve à la température de 4 C. EXEMPLES 3 à 13 On prépare la substance selon l'invention de la même manière qu'à l'exemple 2, mais en employant le plasma sanguin, le sérum ou le surnageant (100 ml) qui ont été préparés dans les exemples de référence 2 à 12. Exemple N Exemple de référence N pour la matière d'origine 3 2 (beagle Toxoplasma-hyperimmun) 4 3 ( " " ") 5 4 (beagle Piroplasma-hyperimmun) 6 5 (veau Toxoplasma-hyperimmun) 7 6 (veau Piroplasma-hyperimmun) 8 7 (souris Toxoplasma-hyperimmune) 9 8 (souris Piroplasma-hyperimmune) 10 9 (souris Haemosporidia-hyperimmune) 11 10 (cellules de rate de souris Toxoplasma-hyperimur 12 11 (cellules de rate de souris normale) 13 12 (cellules de rate de souris normale) La substance qui est obtenue dans chacun de ces exem- ples est identique à celle obtenue à l'exemple 2 en ce qui con- cerne les propriétés physiques, chimiques et biologiques. On a en outre étudié par la méthode suivante la solubi- lité dans des solvants organiques de la substance obtenue à l'exemple 6. On ajoute 100 mg de cette substance à 5 ml d'un solvant organique, on secoue le mélange pendant 30 minutes, puis on le centrifuge pendant 10 minutes à 3000 tours/minute pour le sépa- rer en un surnageant et une fraction insoluble. On sèche ces fractions et on ajoute à chacune d'elles 1 ml d'eau pure pour déterminer le poids total d'azote. On a ainsi obtenu les résul- tats suivants: Surnageant Fraction Surnageant (pg) insoluble (%) lig Ethanol 2,10 56,06 3,6 Méthanol 49,41 6,72 88,0 Ether 0,01 59,75 0 Benzène 0,02 58,75 0 Chloroforme 1,72 63,79 2,6 Acétone 0,14 66,91 0,2 EXEMPLE 14 La présente substance est préparée de la même manière que dans l'exemple 2, sauf que la pronase a été remplacée par la même quantité de papaine (produit de Wako Pure Chemical Industries, Ltd., Japon). La substance ainsi obtenue présente des propriétés identiques a celles de la substance obtenue à l'exemple 2. EXEMPLE 15 La substance est préparée comme dans l'exemple 2, sauf que la pronase a été remplacée par la même quantité de chymo- tripsine (produit de Miles-Feravac., Ltd.). La substance obte- nue a encore des propriétés identiques à celles de la substance obtenue à l'exemple 2. REVENDICATIONS 1. Susbtance douée d'activité biologique, caractérisée en ce qu'elle est une glycoprotéine ayant une masse moléculaire de 3.000 à 5.000, déterminée par une méthode de filtration sur gel, et inhibant les multiplications de toxoplasmes dans des cellules hétérologues.. 2. Substance selon la revendication 1, caractérisée en outre par les propriétés physiques et chimiques suivantes: (a) solubilité: facilement soluble dans l'eau, mais pratiquement insoluble dans le méthonol, l'éthanol, l'éther, le benzene, le chloroforme et l'acétone; (b) teneurs en sucres et protéine: protéine 85-90%, hexosamine 9-13 % et hexose 1-2 % (calculée englucose); (c) acides aminés de la partie protéique: acide aspar- tique, thréonine, sérine, acide glutamique, glycocolle, alanine, cystine, valine, méthionine, isoleucine, leucine, tyrosine, phénylalanine, lysine, tryptophane, histidine, arginine et proline; (d) teneurs en acide aspartique, acide glutamique et lysine, par rapport au total des acides aminés: 45 à % en poids; (e) pH: 7,0 à 7,2 (pour une solution aqueuse à 1 % en poids par volume); (f) stabilité à la chaleur: quand on chauffe pendant 30 minutes à 60 + 0,1 C une solution aqueuse à 1% p/v de la substance, la solution conserve toujours son immu- noactivité pour inhiber les multiplications toxoplasmi- ques dans des cellules homologues ainsi que dans des cellules hétérologues; (g) absorption IR: absorptions caractéristiques aux -1 nombres d'ondes suivants (cm): 3600-2900 (forte), 1700-1500 (forte), 1440-1380 (moyenne), 1160-1080 (mo- yenne) et 550 (moyenne); (h) absorption UV: absorption maximale à 274-276 nm pour une solution aqueuse à 0,1 % p/v; (i) réactions colorées: positives pour la réaction de Lowry-Folin, la réaction à la nihydrine la réaction phénol-acide sulfurique et la réaction de Elson-Morgan; (j) couleur et aspect: blanche et amorphe. 3. Procédé de préparation de la substance biologiques ment active selon la revendication 1 ou 2, procédé caractérisé en ce qu'on fait agir une enzyme protéolytique sur une ou plu- sieurs matières choisies parmi: (A) le plasma sanguin ou le sérum d'un mammifère qui a été hyperimmunisé par un protozoaire (B) le surnageant d'une culture de cellules de rate prove- nant d'un mammifère hyperimmunisé avec un protozoaire; et (C) le surnageant d'une culture de cellules de rate d'un mammifère normal, incubé en présence du surnagenat (B), d'un antigène spécifique ou d'un mitogène non-spécifi- que, ou encore de deux d'entre eux ou des trois à la fois, puis on chauffe le produit formé pour inactiver l'enzyme et on en sépare la substance. 4. Procédé selon la revendication 3 dans lequel la réac- tion avec l'enzyme est suivie d'une hydrolyse du mélange obtenu avant de chauffer le produit. 5. Procédé selon la revendication 4, dans lequel le pro- tozoaire est choisi parmi: Toxoplasma, Plasmodium et Babesia, et l'enzyme protéolytique parmi la pronase, la papaIne, la chy- motrypsine, la trypsine, l'aminopeptidase et la carboxypepti- dase. 6. Procédé selon la revendication 5, dans lequel le pro- tozoaire est un toxoplasme. 7. Procédé selon l'une quelconque des revendications 3 à 6, dans lequel la matière dont on part est (A) un plasma san- guin ou un sérum d'un mammifère qui a été hyperimmunisé avec le protozoaire. 8. Procédé selon l'une quelconque des revendications 3 à 6, dans lequel la matière dont on part est (B) un surnageant de culture de cellules de rate d'un mammifère qui a été hyper- immunisé avec le protozoaire. 9. Procédé selon l'une quelconque des revendications 3 à 6, dans lequel la matière dont on part est (C) un surnageant de culture de cellules de rate d'un mammifère normal, incubé en présence du surnageant (B),d'un antigène spécifique ou d'un mitogène non-spécifique, ou bien des trois à la fois ou de deux d'entre eux. 10. Substance douée d'activité biologique, qui a été obtenue selon l'une quelconque des revendications 3 à 9. 11. Composition immunoactive comprenant comme composant actif une substance selon la revendication 1 ou 2 avec un véhi- cule non toxique pour usages pharmaceutiques.