FR 2508061 A1 19821224 FR 8210828 A 19820621 Procédé de production d'inosine et/ou de guanosine. L'invention a pour objet un procédé de production d'inosine et de guanosine. L'inosine et la guanosine sont des matières de départ importantes pour la production par synthèse de composés ayant une activité pharmacologique pour la production de 5 '-ribonu- cléotides utilisés comme condiments, et la production de ces matières de départ, à grande échelle et avec un faible prix de revient présente une grande importance commerciale. On connaît plusieurs procédés pour la production de l'inosine et/ou guanosine, un de ces procédés comprend l'ex- traction de ces composés de matières naturelles, tandis qu'un autre procédé comporte la fermentation en utilisant un micro- organisme Cependant, ces procédés présentent de nombreux inconvénients tels que plusieurs stades compliqués de production, l'utilisation de matières premières coûteuses ou faible rendement de fermentation et leur utilisation industrielle ne donne pas entière satisfaction. Les inventeurs ont fait des recherches poussées concernant la possibilité de mise au point de procédés industriels pour la production de l'inosine et/ou guanosine au moyen d'un micro-organisme avec un rendement élevé de fermentation et ils ont découvert que si l'hydrate de carbone qui constitue un composant essentiel du milieu, n'est pas ajouté en bloc selon la pratique habituelle, mais est ajouté soit de façon intermittente, soit en continu, par petites fractions au cours de la culture, en fonction de la consommation contrôlée de l'hydrate de carbone par le micro-organisme, la production de l'inosine et/ou de guanosine est augmentée de façon remarquable L'invention est basée sur cette découverte. L'invention a pour objet un procédé de production d'inosine et/ou guanosine comprenant la culture d'une souche de micro-organisme produisant l'inosine et/ou la guanosine, dans un milieu de culture contenant un hydrate de carbone comme source de carbone et la récolte de l'inosine et/ou guanosine du bouillon de fermentation résultant, caractérisé par le fait que l'hydrate de carbone est ajouté au milieu de culture, soit en continu, soit de façon intermittente de telle sorte que la concentration de l'hydrate de carbone,source de carbone dans le milieu n'est pas supérieur à environ 1 % de façon que la concentration du milieu en hydrate de carbone est maintenue à un niveau ne dépassant pas environ 1 %. Comme exemples d'hydrat Esde carbone ajoutés comme source de carbone, selon l'invention, on peut citer les 1 O sucres; par exemple le glucose, le fructose, le mannose, le sucrose, le maltose, les mélasses, l'amidon, l'hydrolysat d'amidon (par exemple liqueur de saccharification de l'amidon de mals), etc; les alcools de sucre, par exemple le sorbitol et des composés similaires. Selon le procédé de l'invention, l'hydrate de carbone comme source de carbone est ajouté soit par intermittence, soit en continu de façon à maintenir la concentration en hydrate de carbone du milieu à un taux ne dépassant pas environ 1 % La concentration de l'hydrate de carbone comme source de carbone dans le milieu, au début de la culture, peut être inférieure ou supérieure à environ 1 % Dans ce dernier cas cependant, l'addition de l'hydrate de carbone doit démarrer après que le niveau en hydrate de carbone a baissé à environ 1 % ou moins avec le progrès de la culture Il est à noter que la concentration de l'alimentation en hydrate de carbone dans le milieu de départ de préférence n'est pas supérieure à environ 4 %. Comme mentionné ci-dessus, la concentration en hydrate de carbone du milieu est réglée à un taux ne dépassant pas environ 1 %, selon le procédé de l'invention Cependant, la période pendant laquelle la concentration en hydrate de carbone est réglée de la sorte ne doit pas concerner toute la durée de la culture, mais une période limitée, par exemple la période allant d'environ 12 heures après le début de la culture jusqu'à la fin de la culture; au cours de cette période, la production de l'inosine et/ou de la guanosine est maximale. Afin de régler la concentration de l'hydrate de carbone du milieu à un taux prédéterminé, il est nécessaire de connaître constamment la quantité résiduelle d'hydrate de carbone dans le milieu On peut dans ce but contrôler la concentration en hydrate de carbone du milieu directement en utilisant un réactif classique pour hydrate de carbone ou indirectement en mesurant la concentration de l'oxygène ou de l'anhydride carbonique dans le milieu ou dans le gaz effluant au moyen d'un capteur Cette dernière méthode qui détermine la concen- tration de l'hydrate de carbone dans le milieu en utilisant un capteur est plus commode car il permet de régler automati- quement la concentration en hydrate de carbone à un taux donné,en associant le capteur avec le moyen d'alimentation en hydrate de carbone. Le micro-organisme utilisé selon l'invention peut être choisi parmi n'importe quelles souchesde micro-organismes capable de produire de l'inosine et/ou de la guanosine Parmi les exemples spécifiques de telles souches de micro-organismes, on peut citer les espèces du genre Bacillus, du genre Brevibacterium, et du genre Corynebacterium. On peut ainsi citer Bacillus pumilus et Bacillus subtilis comme exemples d'espèces Bacillus Plus particuliè- rement, Bacillus pumilus n 158-A-17 et Bacillus subtilis ATCC 13956. Bacillus pumillus n 158-A-17 a été déposé le 4 juin 1981 à l'Institut de Recherche de la Fermentation, Agence de Science et Technologie Industrielle, Ministère du Commerce Extérieur et de l'Industrie,-Japon (IRF), sous le numéro d'admission FERM BP-7 conformément aux prescriptions du traité de Budapest et a été déposé dès le 11 janvier 1967 à l'Institut de Fermentation d'Osaka (IFO) Japon,sous le numéro d'admission IFO 12477 Bacillus subtilis ATCC 13956 a également été déposé dès le 27 mai 1941 à IFO sous le numéro d'admission 14124 Le numéro ATCC mentionné ci-dessus est le numéro d'admission à làa "American Type Culture Collection" (USA). La souche IFO 12477 sus-mentionnée figure dans la demande de brevet japonais (examinée) n 46839/1976 La souche ATCC 13956 figure au "American Type Culture Collection Catalogue of Strains I, 14 ème édition, 1980. Comme exemples de souches de genre Brevibacterium, on peut citer Brevibacterium ammoniagenes ATCC 21477, ATCC 21478, ATCC 21479 et ATCC 21480 (toutes ces souches figurent au catalogue des souches ATCC, 14 ème édition, 1980). En plus de la source ou de sources de carbone, on incorpore au milieu diverses sources d'azote et d'autres constituants, de façon habituelle Les sources d'azote peuvent être des matières azotées organiques telles que la liqueur de macération de mais, les tourteaux de grairs de coton, l'extrait de levure, levure sèche, farine de poisson, extrait de viande, peptone, acide casamino, etc; des composés azotés minéraux tels que gaz ammoniac, ammoniaque en solution aqueuse, sulfate d'ammonium, chlorure d'ammonium, carbonate d'ammonium, nitrate d'ammonium, phosphate d'ammonium, etc et des composés azotés organiques tels que l'urée, les acides aminés, etc En plus des sources de carbone et d'azote sus- mentionnées, on incorpore au milieu également d'autres substances, en quantité appropriée, telles que des métaux variés, des vitamines, des acides aminés, etc qui sont nécessaires pour la croissance du micro- organisme et pour l'accumulation de l'inosine et/ou de la guanosine. La culture est mise en oeuvre dans des conditions aérobies, par exemple sous agitation ou dans des conditions de culture immergée aérée La température d'incubation est généralement comprise entre 200 C et 450 C et doit être favorable à la croissance et la multiplication du micro- organisme et à l'accumulation de l'inosine et/ou de la guanosine Le p H du milieu est de préférence compris entre environ 5 et 9 Pour régler le p H du milieu dans l'intervalle sus-indiqué, on peut ajouter de l'acide sulfurique, de l'acide chlorhydrique, du gaz ammoniac, de l'ammoniaque aqueuse, de l'hydroxyde de sodium aqueux, de l'hydroxyde de potassium aqueux, du carbonate de calcium, de l'oxyde de calcium et des produits similaires Lorsque le micro-organisme est cultivé dans ces conditions pendant environ 48 à 120 heures, gêné- ralement une quantité importante d'inosine et/ou de guanosine s'accumule dans le milieu On peut facilement isoler l'inosine et/ou la guanosine ainsi accumulées dans le milieu par des procédés de purification classique, tels que résine échangeuse d'ions ou chromatographie sur charbon actif, précipitation, extraction par solvant, etc Plusieurs publications existent sur la production par fermentation de l'inosine et/ou de la guanosine au moyen de micro-organismesmais dans ces procédés, la quantité totale de l'hydrate de carbone, source principale de carbone, est ajoutée invariablement en bloc au milieu,avant le commencement de la culture Voir,par exemple,Nogami et al Amino Acids & Nucleic Acids 17, 66, 1967, Jho et al-: Amino acids and Nucleic Acids 16, 100, 1967. On a également essayé pour la production de certains composés dérivés d'acidesnucléiques par fermentation, d'ajouter une quantité supplémentaire d'hydrate de carbone au cours de la culture de façon à augmenter la fixation d'hydrate de carbone. Voir, par exemple, Kotani et al: Agric Biol Chem 42, 399, 1978 Le procédé cependant se propose d'éviter de tels résultats, par exemple une déviation du taux d'hydrate de carbone dumilieu du Ioya Ide la gamme de concentration normale et une suppression conséquente de la croissance du micro-organisme et ne se propose pas du tout de régler la concentration d'hydrate de carbone du milieu à un niveau donné. Au contraire,)Ans le procédé selon l'invention, on cultive un microorganisme produisant de l'inosine et/ou de la guanosine dans un milieu dont la concentration en hydrate de carbone est réglée à un niveau prédéterminé d'environ 1 % au maximum au cours de l'élaboration de l'insosine et/ou guanosine. Ainsi, le procédé selon l'invention est un nouveau procédé tout à fait différent des procédés connus cités ci- dessus et ce procédé est capable de produire un rendement amélioré en inosine et/ou guanosine par rapport à l'hydrate de carbone consommé. Etant donné que le procédé selon l'invention permet d'augmenter le rendement en produit(s) de fermentation par rapport à la consommation en hydrate de carbone, il devient possible-de réduire la consommation en hydrate de carbone, matière première Ainsi, l'invention fournit une technologie de production utile pour 1 ' industrie. L'invention sera mieux comprise à l'aide des exemples non limitatifs ciaprès Dans ces exemples, sauf mention contraire, les pourcentages marqués (%) signifient pourcentages poids/volume (pds/v %). Exemple 1 On ensemence un milieu de culture stérilisé et contenant 2 % de sorbitol, 0,1 % KH 2 PO 4, 0,3 % K 2 HP 04 et 2 % de levure sèche avec Bacillus pumilus n 158-A-17 (FERM BP-7, IFO 12477) provenant d'une plaque d'agaragar et le milieu ensemencé est incubé sous agitation à 37 C pendant 18 heures On introduit ensuite dans un récipient de fermentation d'une capacité de 5 litres,2 litres de milieu de production stérilisé contenant 0,8 % de glucose, 0,8 % de (NH 4)2504, 0,5 % de glutamate de sodium, 0,05 % de KH 2 PO 4, 0,1 % de KC 1, 0,2 % de Ca C 12 2 H 20, 0,003 % de Mn SO 4 4 H 20, 0,03 % d'histidine, 200 Oug/1 de biotine, 0,2 % de Mg SO 4 7 H 20, 0,25 % d'acide ribonucléique (pureté ,3 %) et 1 % de liqueur de macération de mals, et on transfère ml de ce milieu de culture au milieu de production dans le récipient de fermentation On commence la culture à une tempé- rature de 38 C avec un agitateur rotatif à 1000 tours/minute et avec un taux d'aération de 1,2 "/min Pendant la période de culture, on introduit automatiquement dans le récipient de fermentation 25 % (v/v) d'ammoniaque aqueuse pour maintenir le milieu à p H 6,4 La solution de glucose constituant la source de carbone a été ajoutée de la façon suivante: Méthode A: En commençant à la 9 ème heure après le début de la culture, lorsque la concentration en glucose dans le milieu a décru à un taux inférieur à 0,1 %, on ajoute en continu une solution stérilisée de glucose à 80 %, la concentration en glucose dans le milieu étant contrôlée de façon enzymatique en utilisant du glucose oxydase à 2 heures d'intervalles, de façon que la concentration de glucose est maintenue entre 0,005 % et 0,1 % La culture est ensuite conduite pendant 56 heures La quantité de glucose consommé pendant cette période est de 160 grammes. Méthode B: On ajoute le glucose en continu, comme dans le procédé A, afin de maintenir la concentration en glucose du milieu à un niveau ne dépassant pas 1 % La culture est ainsi conduite pendant 48 heures La quantité de glucose consommé pendant cette période-est de 150 grammes. Méthode C: Comme dans la méthode A, on ajoute du glucose en continu à partir du commencement de la culture, de façon à maintenir la concentration en glucose du milieu entre 1,8 % et 2,2 % La culture a été ainsi conduite pendant 40 heures La quantité de glucose consommé est de 140 grammes. Méthode D: g de glucose sont ajoutés au début de la culture et on continue la culture pendant 42 heures, et à la fin de cette période,le glucose est complètement consommé. Les quantités d'inosine et de guanosine obtenues par les variantes de culture ci-dessus ont été déterminées par chromatographie liquide hautement performante Les résultats figurent sur le tableau 1. Tableau 1 a Rendement Rendement par Méthode d de combiné en rapport à d'adio de inosine et _l'hydrate de glucose MC nnginp (ó/LI carbone (%) Exemple 1-1 Méthode A 34,4 21,5 Exemple 1-2 Méthode B 28,6 17,9 Exemple comparatif 1-1 Méthode C 16,3 10,2 Exemple comparatif 1-2 Méthode D 12,2 7,6 Remarque: Le rendement combiné en inosine et guanosine figurant au tableau représente les valeurs obtenues en corrigeant le rendement par le rapport entre la quantité de liquide à la fin de la culture et la quantité de liquide au début de la culture. Exemple 2 Un milieu de culture ayant la même composition que dans l'exemple 1 est inoculé respectivement avec les souches figurant au tableau 2, l'inoculation étant effectuée sous agitation à 380 C pendant 18 heures Chacune des cultures résultantes est ensuite transférée à un milieu de production ayant la même composition que dans l'exemple 1 et on conduit la culture de la même façon que dans l'exemple 1 Du glucose est ajouté par la méthode A et par la méthode D, comme indiqué dans l'exemple 1 Après la culture, on détermine l'inosine et la guanosine dans le bouillon de culture, par le procédé mentionné dans l'exemple 1 et le rapport relatif à l'hydrate de carbone consommé es Icalculé Les résultats figurent au tableau 2. Tableau 2 Méthode Durée de Rendement par Souche d'addition la culture rapport à de glucose (heures) lhydrate de carbone (%) Bacillus puiilus Méthode A 58 21, 5 No 158-A-17 (FERM BP-7, IFO 12477) Méthode D 42 7,6 Bacillus subtilis Méthode A 64 17,3 ATCC 13956 (IFO 14124) Méthode D 48 12,0 Exemple 3 On introduit dans un réservoir de culture d'une capa- cité de 200 litres, 100 litres d'un milieu de culture ayant la même composition que celle indiquée dans l'exemple 1 et on stérilise le milieu et on le refroidit de façon habituelle Le milieu du réservoir est ensuite inoculé avec Bacillus pumilus No 158-A-17 (FERM BP-7, IFO 12477) à partir d'un flacon Sakaguchi et on conduit la culture à 37 C, 180 tours/minute et une aération de 50 Z/minute On introduit séparément, dans un réservoir de fermentation de 2 000 litres, 900 litresd'un milieu de production similaire à celui de l'exemple 1, sauf qu'à la place de 0,8 % de glucose on utilise 4 % de liqueur de saccharification d'amidon de mais On stérilise ensuite le milieu de production, on le refroidit de façon habituelle et on transfère dans le milieu 100 litres de la culture de souche ci-dessus préparée et on commence la culture à 38 C, 240 tours/ minute et une aération de 800 E/minute A partir de la 20 ème heure après le début de la culture, on ajoute de la liqueur de saccharification de l'amidon de mais, de façon intermittente, à des intervalles de 10 minutes, la concentration en glucose du milieu étant contrôlée toutes les heures par le procédé au glucostat, de sorte que la concentration en glucose du milieu est maintenue entre 0,001 % et 0,1 % On continue la culture pendant 71 heures Pendant cette période, 20 % de la liqueur de saccharification, exprimé en glucose, a été consommé par rapport à la quantité de glucose contenu dans le milieu au début de la culture Pendant toute la période de l'incubation, le p H du milieu est maintenu de façonc automatique entre 6,3 et 6,5 au moyen d'ammoniaque aqueuse à 25 % A la fin de la culture, le titre en inosine et guanosine du bouillon est déterminé par chromatographie liquide à haute performance On trouve respectivement 29,6 g/, et 4,2 g/L Le rendement combiné de ces deux métabolites par rapport à l'hydrate de carbone est de 21,3 %. On ajuste le p H d'une portion de 1 000 litres du bouillon de culture susindiqué à p H 10 au moyen d'hydroxyde de sodium et on filtre Le filtrat ( 900 litres) est passé à travers une colonne d'Amberlite IRA-402 (forme Cl) , une résine échangeuse d'anion (Rohm & Haas Co) et on effectue l'élution avec du HC 1 0,2 N à SV 1, et on obtient des fractions con- tenant de l'inosine et/ou de la guanosine (au total:-4000). On combine ces fractions et on les adsorbe sur une colonne chargée avec 850, de charbon actif et on effectue l'élution avec du butanol-eau 5 % v/v Les fractions contenant l'inosine et/ou guanosine (au total: 5100 t) ainsi obtenues ont été réunies, neutralisées avec de l'hydroxyde de sodium et con- centrées sous pression réduite On obtient 140 Ce concentré est refroidi à 5 C, et on en obtient 22 kg d'inosine et 2,9 kg de guanosine. il REVENDICATIONS 1 Procédé de production d'inosine et/ou de guanosine comprenant la culture d'une souche de micro-organisme pro- duisant de l'inosine et/ou de la guanosine,dans un milieu de culture contenant un hydrate de carbone comme source de carbone,pour obtenir que le micro-organisme produise et accumule de l'inosine et/ou de la guanosine dans le bouillon de fermen- tation résultant et lx récolte de l'inosine et/ou guanosine, caractérisé par le fait que l'hydrate de carbone est ajouté au milieu de culture, soit en continu, soit de façon intermittente, de telle sorte que la concentration de l'hydrate de carbones source de carbone dans le milieu rente inférieure à environ 1 %, de façon que la concentration du milieu en hydrate de carbone est maintenue en-dessous d'environ 1 %. 2 Procédé selon la revendication 1, caractérisé par le fait que l'addition de l'hydrate de carbone est commencée lorsque l'hydrate de carbone, source de carbone, dans le milieu est consommé progressivement et que sa concentration tombe en- dessous d'environ 1 %. 3 Procédé selon la revendication 1, caractérisé par le fait que la concentration initiale en hydrate de carbone, source de carbone,dans le milieu, ne dépasse pas environ 4 %.