FR 2502496 A2 19821001 FR 8106294 A 19810330 La présente Addition est relative à des perfec tionnements aux fractions obtenues à partir de bactéries aérobies conformes au Brevet principal. Conformément au Brevet principal, on obtient des fractions adjuvantes, immunostimulantes et douées d'activité antibactérienne, à partir de souches de bactéries soumises à un traitement de délipidation et, plus particulièrement, à partir de cellules entières de bactéries aérobies délipidées, telles que celles d'une souche de Corynebactérie aérobie nouvellement isolée, dénommée Coryne bacterium catarrhalis, déposée le 21 Février 1980 sous le nOI-116 auprès de la Collection nationale de Microorganismes tenue par 1'INSTITUT PASTEUR. Lorsque les cellules entières délipidées sont soumises à un traitement d'extraction douce par broyage et homogénéisation en milieu aqueux, en présence ou non d'un détergent non-ionique, un tel traitement d'extraction permet d'obtenir une fraction particulaire insoluble qui pre- sente, outre les propriétés adjuvantes, immunostimulantes et antibactériennes des cellules entières délipidées, également des propriétés inductrices d'interféron ; par contre, la fraction hydrosoluble également obtenue à la suite dudit traitement d'extraction, si elle présente des propriétés inductrices d'interféron, ne présente pas les propriétés adjuvantes, immunostimulantes et antibactériennes que possède en outre la fraction particulaire insoluble susdite. La présente Addition a pour but d'apporter des perfectionnements aux fractions actives conformes au Brevet principal, notamment en permettant leur administration avec un taux d'efficacité très satisfaisant, non seulement par voie intraveineuse, mais aussi par voie sous-cutanée, y compris la fraction nydrcsoluble qui s'était avérée inactive par voie intraveineuse dans le traitement d'infections bactériennes, notamment dans le traitement de l'infection par Listeria monocytogenes chez la souris. La présente Addition a pour objet des agents anti-infectieux, caractérisés en ce qu'ils sont constitués par des fractions actives de bactéries aérobies, notamment de Corynebacteries aérobies et de façon spécifique, de Corynebacterium catarrhalis Selon un mode de réalisation avantageux des agents anti-infectieux conformes à l'invention, leurs fractions actives sont constituées par des cellules entières lavées mises sous une forme permettant leur administration par voie intraveineuse. Selon un autre mode de réalisation avantageux des agents anti-infectieux conformes à la présente Addition, les fractions actives sont constituées par des cellules entières délipidées mises sous une forme permettant leur administration par voie intraveineuse. Selon encore un autre mode de réalisation avantageux des agents anti-infectieux conformes à là présente Addition, les fractions actives sont constituées par des fractions particulaires insolubles extraites de cellules entières délipidées de bactéries aérobies, mises sous une forme permettant leur administration par voie intraveineuse. Selon un mode de réalisation avantageux des agents anti-infectieux conformes à la présente Addition, ceux-ci sont mis sous une forme permettant leur administration par voie sous-cutanée et leurs fractions actives sont constituées par des cellules entières lavées ou par des cèllules entières délipidées de bactéries aérobies, ou bien par des fractions particulaires obtenues par extraction douce de cellules entières délipidées ou encore par des fractions hydrosolubles obtenues par extraction douce de cellules entières délipidées. Selon une modalité préférée de ce mode de reali sation, les fractions actives de l'agent anti-infectieux conforme à la présenté Addition, sont rendues aptes à être administrées par voie sous-cutanée, en les adsorbant sur un gel minéral. Conformément à la présente Addition, le gel minéral sur lequel les fractions actives de bactéries aérai sont adsorbées pour permettre leur administration par voie sous-cutanée, est choisi dans le groupe qui comprend notam- ment les gels de phosphate de calcium et les gels d'hydrox d'aluminium. Comme on le sait, différentes espèces de Coryr bactéries anaérobies se sont avérées des agents stimulants puissants du système réticulo-endothélial. En outre, parmi les Corynebactéries anérobies, le Corynebacterium parvum et le Corynebacterium granulosum se sont avérés augmenter la résistance à diverses infections bactériennes. Comme indiqué dans le Brevet principal, le fractionnement de cellules entières de Corynebactéries anaérobies a donné lieu à des fractions qui présentent les activités immunoadjuvantes de la bactérie intacte. I1 a été démontré par l'un des Inventeurs de l'objet de la présente Addition qu'une fraction particulaire insoluble isolée à partir de Corynebacterium granulosum, désignée sous le nom de fraction P40, présente une activité lmmunostimulante et adjuvante puissante. Contrairement à cela, un certain nombre d'Auteurs ont démontré que lesCorynebactEries aérobies ou bien sont dépourvues d'activité immunostimulante et adjuvante,ou bien présentent une très faible activité de ce type. Comme indiqué dans le Brevet principal,les Ins teurs ont isolé une nouvelle espèce de Corynebactérie aérobie qu'ils ont désignée sous le nom de Corynebacterium Catarrhalis et dont ils ont isolé des fractions à partir de cellules entières délipidées, lesquelles fractions pr6- sentent des activités importantes en tant qu'inducteur d'interféron. Pour démontrer les possibilités d'utilisation en thérapeutique des fractions ainsi isolées, pour la prévention ou le traitement d'infections chez des patients présentant une déficience immunitaire, les Inventeurs ont poursuivi leurs recherches afin de déterminer si les cellules entières ou des fractions de Corynebacterium catarrhalis pourraient augmenter la résistance des souris à Listeria monocytogenes. Comme on le sait, Listeria monocytogenes est un germe' aérobie non sporulé qui est l'agent d'une maladie infectieuse commune à l'homme et aux animaux, la listériose, qui peut atteindre des formes particulièrement graves. Les Inventeurs ont démontré l'action anti-infectieuse exercée par Corynebacterium catarrhalis en mettant en évidence l'action de protection exercée par ce dernier contre l'infection induite par Listeria monocytogenes chez la souris, en procédant comme suit I. Préparation de l'agent anti-infectieux ) Culture des bactéries Corynebacterium catarrhalis a été cultivé dans un fermenteur enquantités de 50 litres. Le milieu de culture était constitué par du bouillon de viande supplémenté par 5 g/litre de Bactopeptone et 2 g/litre d'extrait de levure.1. Le pH a été ajuste à 7,4. Les bactéries ont été récoltées par centrifugation de la culture au commencement de la phase stationnaire. Les bactéries ont été lavées à deux reprises en les remettant en suspension dans de l'eau distillée et en les centrifugeant. Les bactéries lavées désignées sous le sigle BL ont été utilisées soit telles quelles, soit après avoir été délipidées conformément à la méthode de AEBI & Alia, mentionnée dans le Brevet principal ; les bactéries délipidées sont désignées sous le sigle de BD. 2) Fractionnement des bactéries Des cellules entières délipidées de Corynebacterium catarrhalis ont été fractionnées en mettant en oeuvre la méthode de D.MIGLIORE-SAMOUR & Alia mentionnée dans le Brevet principal. La fraction particulaire précipitée à partir d'une solution de sulfate d'ammonium à 40 % de saturation, est désignée sous le sigle de CBAp4O. La fraction hydrosoluble contenue dans le surnageant après précipitation par le sulfate d'ammonium à 70 % de saturation est symbolisée par le sigle CBA-LS. Le CBAp40 et le CBA-LS ont été dialysés jusqu'à épuisement contre de l'eau distillée. Le CBAp40 a été conservé à -200C en tant que produit humide, et le CBA-LS en tant que lyophilisat. II.-Adsorption sur des gels minéraux Des cellules entières aussi bien que des fraction particulaires insolubles et des fractions hydrosolubles ont été adsorbées sur du gel de phosphate de calcium ou d'hydre xyde d'aluminium en mettant en oeuvre l'un des procédés ci-après 1. adsorption sur du gel de phosphate de calcium a) l'adsorption sur du gel de phosphate de calciun a été effectuée par addition, sous agitation, : un volume déterminé de suspension de bactéries ou de CBAp40 ou de solution de CBA-LS dans Na2HP04 0,07 M, d'un volume égal de CaC12 0,07 Le pH du mélange a alors été ajusté jusqu'à neutralité par addition de NaOH 0,1 N. b) On peut également faire adsorber le produit soumis à l'expérimentation, sur un gel de phos phate de calcium préformé qui est préparé de la manière suivante on mélange 100 ml de solution de phosphate di sodique 0,07 M et 100 ml de solution de CaCl2 0,07 M. Le pH est ajusté à 7 par addition de NaOH 0,1 N. Le gel forme est sédimenté par centrifugation et lavé 2 fois avec une solution de NaCl isotonique. A ce gel préformé et lavé, on ajoute le produit à adsorber qui peut être la solution de CBA-LS dans du NaCl isotonique ou une suspension de bactéries ou de CBAp40 en NaCl isotonique. Le mélange est agité pendant 30 minutes avec un agitateur magnétique de façon à permettre l'adsorption du produit. Ce gel est centrifugé et lavé avec du NaCl isotonique. 2. Adsorption sur du gel d'hydroxyde d'aluminium L'adsorption sur du gel d'hydroxyde d'aluminium a été obtenue en mélangeant des quantités d'"ALHYDROGEL" (Superfos Export Co.) et du produit soumis à l'expérimentation, dans des proportions telles que le mélange final contienne 1,365 mg d'A(OH)3/ml et 1 mg du produit soumis à 1 'expérimentation/ml. III.-Doses et voies 1. On a utilisé comme animaux, des souris SWISS femelles pe sant de 17 à 19 g. Les animaux ont été soumis au régime usuel du laboratoire et reçu de l'eau ad libitum. 2. Les produits soumis à l'expérimentation ont été injectés à une dose de 400 pg (poids sec) dans du sérum physiolo gique. a) Les injections ont été effectuées par voie intraveineuse (I.V.) pour ce qui concerne les produits non adsorbés, sous un volume de 0,2 ml, b) les injections ont été effectuées par voie sous cutanée (S.C.) pour les produits adsorbés, sous un vo lume de 0,4 ml. 3. On a injecté à des souris témoins - soit du sérum physiologique par voie intraveineuse, - soit un gel de phosphate de calcium ou d'hydroxyde d'aluminium ne contenant pas les produits soumis à l'expérimentation1 par voie sous-cutanée. IV.-Infection Les souris ont été infectées par Listeria monocytogenes obtenue par culture pendant 18 heures de la souche 1150, par injection intraveineuse à une dilution appropriée (3-4 MLD) ; l'injection a eu lieu six jours après que les souris avaient reçu l'un des produits soumis à l'experimen- tation. Cette dose de Listeria monocytogenes a produit 100 ide mortalité chez les souris témoins en l'espace de 24 à 96 heures. Les décès ont été enregistrés pendant dix jours. Dans certains cas, les souris ont été à nouveau infectées 75 jours après la première infection, par injectio: par voie intraveineuse de 20 MLD de Listeria monocytogenes. V.-Résultats Les résultats obtenus en traitant préalablement des souris par voie intraveineuse, soit par des BL, soit par des BD, sont réunis dans le Tableau I ci-après. TABLEAU I Effect protecteur du traitement préalable par voie intraveineuse de souris à l'aide de cellules entières, soit lavées (BL), soit déplipdées (BD), de Corynebacterium catarrhalis, contre l'infection par Listeria monocytogenes Taux de Produits Décès survenant au jour décès 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 BL 0 0 0 0 0 2 0 0 0 0 2/8 BD 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0/10 Témoins 10 0 0 0 0 0 0 0 0 0 10/10 I1 ressort du Tableau I ci-dessus qu'on a enregistré 100 % de mortalité chez les souris témoins en l'espace de 24 heures après l'infection par Listeria monocytogenes. Contrairement à cela, on a obtenu un degré élevé de protection (75-80s des souris ont été protégées) lorsque les souris avaient été stimulées par infection par voie intraveineuse,soit de BL, soit de BD, cinq jours avant être infectées par Listeria monocytogenes. Ces résultats montrent clairement qu'un traitement préalable des souris par voie intraveineuse par des cellules entières de Corynebacterium catarrhalis peut augmenter de façon effi .cace leur résistance à Listeria monocytogenes. Les résultats obtenus lorsque les souris sont pré-traitées par voie sous-cutanée, soit par des BL, soit par des BD préalablement adsorbées soit sur un gel de phosphate de calcium, soit sur un gel d'hydroxyde d' alumine, sont rassemblés dans le Tableau II qui va suivre. TABLEAU II Effet protecteur contre l'infection par Listeria monocytogenes d'un traitement préalable sous-cutané de souris, soit par des cellules entières lavées (BL) ou délipidées (BD) de Corynebacterium catarrhalis adsorbées soit sur un gel de phosphate de calcium (PC), soit sur un gel d'hydroxyde d'alumine (HA). Produits Décès survenant au jour Taux de décès 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 BL (PC) 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0/10 BL (HA) 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0/10 BD (PC) 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0/10 BD (HA) 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0/10 Sérum physiologique 10 0 0 0 0 0 0 0 0 0 10/10 (PC) seul 0 0 0 4 4 0 0 0 0 0 8/8 (HA) seul 0 0 0 4 2 0 0 0 0 0 6/8 Dans l'expérimentation dont il est rendu compte dans le Tableau II ci-dessus, on a également vérifie que la mortalité des souris infectées par Listeria monocytgenes en l'espace de 24 heures était de 100 %. Les resultats présentés dans ce Tableau montrent, en outre, que le pré-traitement de souris par voie sous-cutanée par des produits adsorbés est extrêmement efficace car il permet d'obtenir une protection à 100 8 contre l'infection des animaux par Listeria monocytogenes. Contrairement à cela, le décès de souris prE- traitée s par voie sous-cutanée soit par un Sel de phosphate de calcium, soit par un gel d'hydroxyde d'aluminium, en l'absence de bactéries, n'a été que retardé après l'infection par Listeria monocytogenes, par rapport au décès des souris témoins infectées de la mime manière. Le pouvoir protecteur des fractions CBAp40 et CBA-I , contre l'infection par Listeria monocytogenes a été mesuré chez la souris. L'activité de CBAp40 et de CBA-LS a été déterminée au cours d'expérimentations dont les résultats sont rassemblés dans le Tableau III ci-apres : TABLEAU II Effect protecteur contre l'infection de souris par Listeria monocytogenes a) du pré-traitement de souris par voie intraveineuse soit par CBAp40, soit par CBA-LS, b) du pré-traitement de souris par voie sous-cutanée soit par CBAp40, soit par CBA-LS adsorbés soit sur du phosphate de calcium (PC), soit sur de l'hydroxyde d'aluminium (HA) Décès survenant au jour Taux de décès Produits Voie 1 4 5 6 7 9 10 (CBAp40) i.v. 0 0 2 0 0 0 0 2/10 (CBAp40) (PC) s.c. 0 0 0 1 0 0 0 1/8 (CABp40) (HA) s.c. 0 0 0 0 0 0 0 0/8 (CBA-LS) i.v. 0 0 0 0 10 0 0 10/10 (CBA-LS) (HA) s.c. 0 1 0 0 0 0 0 1/10 Sérum i.v. 0 10 0 0 0 0 0 10/10 physiologique Les résultats qui sont réunis dans ce Tableau III montrent que l'injection de Listeria monocytogenes aux souris témoins a entrainé 100 % de mortalité des animaux. Le traitement préalable des souris par voie intraveineuse ou par voie sous-cutanée par CBAp40 a assuré la protection de 80 % des animaux.L'activité anti-infectieuse de CBAp40 adsorbée sur un gel de phosphate de calcium ou d'hydroxyde d' alumine a permis de protéger .90-100 % des animaux contre l'infection par Listeria monocytogenes. L'injection par voie intraveineuse de CBA-LS n'a exercé aucun effet protecteur contre l'infection par Listeria monocytogenes. Par contre, l'injection de CBA-LS adsorbée sur du gel de phosphate de calcium ou d'hydroxyde d'-alumine par voie sous-cutanée, a assuré unz protection ef ficace contre l'infection par Listeria monocbtogenes. Les résultats des expérimentations résumés dans les Tableaux I,II et III ci-dessus montrent clairement qu'aussi bien ives cellules entieres que des fractions de Cor bacterium catarrhalis sont capables d'augmenter de façon significative la résistance de l'hcte à infection par Listeria monocytogenes,çju'elles soient injectées par voie in veineuse seul ou par voie sous-cutanée en tant que produit adsorbé soit sur du phosphate de calcium; soit sur de l'hydroxyde d' alumine sous forme de gel. La protection a été obtenue avec des bactéries etdesfractions de Corynebacterium catarrhalis administrées par voie intraveineuse, sauf en ce qui concerne le CBA-LS qui n'a assuré aucune protection par cette voie. La protection s'est également avérée efficace lorsque les produits adsorbés sur du phosphate de calcium ou de l'hydroxyde d' alumine , y compris le CBA-LS, ont été administrés par voie sous-cutanée. En outre, il a été vérin: que l'injection d'un gel soit de phosphate de calcium, soit d'hydroxyde d' alumine en l'absence des produits actifs soumis à l'expérimentation, n'a pas protégé les souris conte l'infection par Listeria monocytogenes. Il semblerait que le mécanisme qui augmente la résistance à Listeria monocytogenes et qui est conféré aux souris aussi bien par les cellules entières que par les cellules délipidees de Corynebacterium catarrhalis,et également par CBAp40 et par CBA-LS, ne soit pas le meme que celui par lequel agit Corynebacterium parvum, qui est une Corynebactérie anaérobie, pour augmenter la résistance des souris à Listeria monocytogenes : en effet, on a attribué l'augmentation de la resistance à Listeria monocytogenes assurée par Corynebacterium parvum à l'activation des macrophages fixés et libres. Toutefois, cette explication ne parait pas exacte pour les cellules entières et les fractions de Corynebacterium catarrhalis, car celles-ci n'augmentent pas l'activité du système réticulo-endothélial, comme c'est le cas pour le Corynebacterium parvum. En tout état de cause, et quel que soit le mécanisme d'action, l'on obtient des médicaments qui augmentent la résistance à l'infection d'individus présentant une déficience immunitaire, qu'il s'agisse de patients pré-- sentant certaines tumeurs malignes qui augmentent leur susceptibilité aux infections par des bactéries et des fungi, ou qu'il s'agisse de patients auxquels on administre des traitements immunosuppresseurs tels que la chimiothérapie intensive. ou la radiothérapie. REVENDICATIONS 1.Médicamentsanti-infectieux caractérisés en ce qu'ils sont constitués par des fractions actives de bactéries aérobies, notarrrnent de Corynebactéries aérobies et de façon séécifiçue,di Corynebacteriwn catarrhalis selon la Revendication 8 du Brevet principal 2. Médicaments anti-infectieux selon la Revendication 1, caractérisés en ce que leurs fractions actif sont constituées par des cellules entières lavées mises sous une forme permettant leur administration par voie intraveineuse. 3. Médicaments anti-infectieux selon la Revendication 1, caractérisés en ce que leurs fractions actives so constituées par des cellules entières délipidées mises sous une forme permettant leur administration par voie intraveineuse. 4. Médic.ements anti-infectieux selon la Revendication 1, caractérisés en ce que les fractions actives sont constituées par des fractions particulaires insolubles extraites de cellules entières délipidées de bactéries aérobies, mises sous une forme permettant leur administration par voie intraveineuse. 5. Médicaments anti-infectieux selon la Revendication 1, caractérisés en ce qu'ils sont mis sous une forme permettant leur administration par voie sous-cutanée et en ce sue 14 fractions actives sont constituées par des cellules entières lavées ou par des cellules entières délipidées de bactéries aérobies, ou bien par des fractions particulaires obtenues par extraction douce de cellules entières délipidées ou encor par des fractions hydrosolubles obtenues par extraction douce de cellules entières délipidées. 6.Médicaments anti-infectieux selon la Revendication 5, caractérisés en ce que les fractions actives dudit médicament anti-infectieux sont rendues aptes à etre admi nistrées par voie sous-cutanée, en les adsorbant sur un gel minéral. 7. Médicaments anti-infectieux selon la Reven dication 6, caractérisés en ce que le gel minéral sur lequel les fractions actives de bactéries aérobies sont adsorbées pour permettre leur administration par voie sous-cutanée est choisi dans le groupe qui comprend notamment les gels de phosphate de calcium et les gels d'hydroxyde d'aluminium. 80- Procédé de préparation des médicaments antiinfectieux aptes à être administres par voie sous-cutanée selon la Revendication 6 ou la Revendication 7, caractérisé en ce que l'adsorption des cellules entières délipidées ou non, ou des fractions particulaires insolubles ou des fractions hydrosolubles qui constituent les fractions actives desdits médicaments sur du gel de phosphate de calcium est réalisée par addition, sous agitation, dlun volume déterminé de Caca2, 0,07 M, à un volume égal de suspension desdites cel lulés ou fractions particulaires insolubles ou de solution de fractions hydrosolubles, le pH du mélange étant alors ajusté jusqu'à neutralité par addition de NaOH-0,1 N. 9 - Procédé de préparation des médicaments antiinfectieux aptes à être administrés par voie sous-cutanée selon la Revendication 6 ou la Revendication 7, caractérisé en ce que:-au cours d'une première étape, on prépare un gel préformé par mélange volume à volume d'une solution de phosphate disodique 0,07 M et d'une solution de CaCl2 0,07 M, ajustement du mélange à pH 7 environ par addition de NaOH 0,1 N, sédimentation du gel formé et lavage par une solution de chlorure de sodium isotonique ; - au cours d'une deuxième étape, on ajoute au gel préformé, lavé, la fraction active à adsorber - suspension de bactéries entières ou de fractions particulaires insolubles ou solutions de fractions hydrosolubles -, puis on agite le mélange pendant un temps suffisant pour permettre l'adsorption du produit sur le gel, après quoi le produit fini est centrifugé et lavé par une solution isotonique de NaCl. 100- Procédé de préparation des médicaments antiinfectieux aptes à être administrés par voie sous-cutanée, selon la Revendication 6 ou la Revendication 7, caractérisé en ce que les fractions actives desdits médicaments - suspension de bactéries entières ou de fractions particulaires insolubles ou solutions de fractions hydrosolubles - sont adsorbées sur du gel d'hydroxyde d'aluminium par mélange de gel d'hydroxyde d'aluminium et desdites fractions actives dans des proportions telles que le mélange final contienne 1,365 mg d'Al(OH)3/ml et 1 mg de fraction active/ml.