FR 2503149 A1 19821008 FR 8205580 A 19820331 La présente invention se rapporte à une nouvelle classe de dérivés de la carnitine et concerne plus particulièrement des esters de mercaptoacyl-carnitines dans lesquels le radical mer- captoacyle dérive de mercaptoacides saturés en C2-C10, un procédé pour leur préparation et leurs utilisations thérapeutiques, notamment sous forme de compositions pharmaceutiques. Les composés selon l'invention répondent & la formule générale (CH)N-CH- CH-CH -COOR (I) 3.3-2, 2 1 1 X OR dans laquelle: X représente un ion halogénure acceptable pour l'usage pharmaceu- tique, de préférence l'ion chlorure, R représente le radical mercaptoacyle d'un mercaptoacide saturé en C2-C10, et R1 représente un radical alkyle & chaîne droite ou ramifiée en C1-C5. Le radical mercaptoacyle est de préférence choisi dans le groupe formé par les radicaux mercaptoacétyle, 2-mercaptopropionyle, 3- mercaptopropionyle, 2-mercaptobutyryle, 4-mercaptobutyryle et 5-mercaptovaléryle. Le radical alkyle est de préférence choisi dans le groupe formé par les radicaux méthyle, éthyle, propyle, isopropyle, butyle et isobutyle. Les esters de mercaptoacyl-carnitine qu'on préfère conformément à l'invention sont les suivants: ester isopropylique de la mercaptoaceétylcarnitine, ester isobutylique de la 2-mercaptopropionyl-carnitine, ester éthylique de la 3-mercaptopropionyl-carnitine, ester isobutylique de la 2mercaptobutyryl-carnitine, ester isobutylique de la 4-mercaptobutyrylcarnitine, et ester méthylique de la 5-mercaptovaléryl-carnitine. Le procédé pour préparer les esters de mercaptoacyl- carnitine de formule (I) comprend les stades opératoires suivants: (a) on fait réagir un ester du chlorhydrate de carnitine avec un chlorure d'halogénoacyle en présence d'un solvant organique inerte dans la réaction, à une temperature allant d'environ à 60 C, cette réaction donnant l'ester correspondant d'halo- génoacyl-carnitine; et (b) on fait réagir à température ambiante l'ester d'halogdnoacyl- carnitine obtenu au stade (a) ci-dessus avec un composé choisi dans la classe des sulfures de métaux alcalins et des sulfures d'acide, an maintenant le pH du mélange de réaction pratiquement à neutralité par addition d'un acide minéral choisi parmi l'acide chlorhydrique et l'acide sulfurique; cette réaction donne 1-'ester de mercaptoacyl-carnitine. Dans le stade opératoire (a), le solvant organique est de préférence choisi dans le groupe formé par l'acide trifluor- acétique, le chlorure de méthylène et le chloroforme. Dans le stade opératoire (b), le composé choisi dans la classe des sulfures de métaux alcalins et des sulfures d'acide est de préférence NaRS. Un autre procédé pour préparer les esters de mercapto- acyl-carnitines de formule générale (I) comprend les stades opéra- toires suivants: (a') on fait réagir un ester du chlorhydrate de carnitine avec un chlorure de mercaptoacyle dans lequel le groupe SH est protégé par un groupe protecteur choisi parmi les groupes trityle et benzyle substitué en para, la réaction donnant l'ester de mer- captoacyl-carnitine correspondant protégé sur le soufre; et (b') on élimine par des modes opératoires connus en soi le groupe protecteur de l'ester de mercaptoacyl-carnitine protégé sur le soufre, obtenu au stade opératoire (a'). Dans le stade opératoire (b'), lorsque le groupe pro- tecteur est un groupe trityle ou p-méthoxybenzyle, on élimine ce groupe protecteur par hydrolyse acide. Si le groupe protecteur est le groupe pnitrobenzyle, on l'élimine de la manière suivante: 1) on-convertit le groupe nitro en groupe amino par hydrogénolyse, par exemple par hydrogénation dans un appareil de Parr a une pression de 2,1 à 3,5 bar en présence d'un catalyseur au palla- dium sur charbon; 2) on traite le dérivé S-para-aminobenzylique obtenu par le réactif d'Hopkins et on isole le sel de mercure de mercaptoacylcarnitine ainsi obtenu; et 3) on traite ce sel de mercure par H2S et on isole la mercaptoacyl- carnitine formée. L'exemple qui suit illustre l'invention sans toutefois en limiter sa portée; dans cet exemple, les indications de parties et de pourcentages s'entendent en poids sauf mention contraire. Exemple Préparation de l'ester isopropylique du chlorhydrate de mercaptoacéty carnitine. (a') Préparation de l'ester isopro p1hgue du chlorhydrate de SE:nitrobenzylmercaptoacetXl-carnitine On fait réagir pendant 4 h à température ambiante (au-delà du moment o il s'est formé une solution) une suspension de 8,4 g (0,04 mol) d'acide S-(p-nitrobenzyl) mercaptoacétique et 10,5 ml (0,12 mol) de chlorure d'oxalyle. On évapore l'excès de chlorure d'oxalyle et on lave le résidu avec des petits volumes d'éther éthy- lique anhydre (trois fois 10 ml). Le chlorure de S-p-nitrobenzyl- mercaptoacétyle ainsi obtenu est utilisé tel quel dans la réaction suivante. On fait réagir à 45*C pendant une journée sous agita- tion par barreau magnétique un-mélange pratiquement homogène de 2,4 g (0, 01 mol) d'ester isopropylique du chlorhydrate de carnitine et 7 g (0,03 mol) du chlorure d'acide obtenu ci-dessus. La fin de la réaction est contr6lée par chromatographie sur couche mince. On dilue le mélange de réaction par 30 ml d'acétonitrile et on coule la solu- tion dans 200 ml d'éther éthylique. On fait cristalliser le précipité brut dans le mélange acétonitrile-éther éthylique. Analyse élémentaire (C, H, CI, N, S) conforme à la formule empirique C19H29ClN206S CH Spectre de RMN (D20) 6 = 1,37 (6H, d -CHH) ; 2 CH --3 2,87 - 3,07 (2H,-m. -CH2COO-); + 2 3,47 (11H, s, -N-(CH3)3 et -SCH2-); -4- 3,90 - 4,13 (4H, m, >N-CH2- et CH2Ar); CH32 4,73 - 5,13 (1H, m, -CH/) CH3 ,63 - 6,06 (1H, m, -Cl-); OCO0C0- 7,63 (2H, d, Ar); 8,20 (211, d, Ar). (b') Elimination du groupe Protecteur. On ajoute 1 g de palladium à 10% sur charbon à une solution de 2,2 g (0,0005 mol) d'ester isopropylique du chlorhydrace de la S-p-nitrobenzylmercaptoacétyl-carnitine dans 70 ml d'isopro- panol. On hydrogène le mélange sous une pression de 2,8 bar à l'appareil de Parr en agitant à température ambiante pendant 18 h. On filtre ensuite le mélange de réaction sur Célite et on ajoute de l'éther éthylique au filtrat jusqu'à précipitation complète d'un produit qu'on identifie comme l'ester isopropylique du chlorhydrate de la S-p-aminobenzylmercaptoacétyl-carnitine. Spectre de RMN (D O20); l'intervalle de 6 des protons du groupe aro- matique --S- --N2 est de 7,02 à 7,51 (4H, m). CH2_ 2 On dissout ensuite 1,13 g (0,003 mol) du dérivé S-p-aminobenzylique dans 100 ml d'éthanol et 50 ml d'HCl N. On ajoute à cette solution 75 ml du réactif d'Hopkins (J. Org. Chem. 1972, 37/22 3551): 10% de HgSO04 dans H2S04 à 5%. Au bout de quelques minutes, une substance solide jaunitre commence à précipiter à température ambiante sous agita- tion au barreau magnétique. Une heure plus tard, on sépare ce pré- cipité solide du mélange de réaction par filtration et on le lave avec 20 ml d'eau et 20 ml d'éthanol. On met 1,86 g de ce produit solide en suspension dans 50 ml d'eau et on sature cette suspension d'H2S; au bout de quelques minutes, HgS précipite; on le sépare du mélange de réac- tion par filtration. On évapore la solution résiduelle sous vide. Le résidu, repris par la quantité d'eau suffisance pour lte dissoudre, est soumis à percolation sur de la résine IR 45 (activée sous la forme OH) . Après acidification à pH 2-3, on lyophilise l'éluat. On fait cristalliser le produit obtenu dans le mélange isopropanol/éther éthylique; il s'agit du composé recherché. Analyse élémentaire (C, H, CI, N. S) conforme à la formule empirique C12H24CNO4S CH -3 Spectre de RMN (D20) 6 = 1,30 (6H, d, -CH); 2 NCH -Z3 2,93 (2H, d, -CH2COO-); + 3,33 (9H, s, -N-(CH3)3); - 3,47 (2H, s, CH2SH); + 2,74 - 4,00 (2H, m, -CH2N-); CH3 4,73 - 5,27 (1H, m, -CH CH3) CH3 ,47 - 5,90 (1H, m, -CH-). OCO- On a constaté que les esters de mercaptoacyl-carnitine de formule (I) constituaient des médicaments utiles pour le traite- ment des intoxications, des bralures et des maladies de l'épithélium (et d'une manière générale dans tous les cas o il importe de faire revenir à la normale l'équilibre cellulaire métabolique troublé par des facteurs exogènes et endogènes) et en tant qu'agents mucolytiques. On sait que le manque de groupes sulfhydryles SH dis- ponibles pour les exigences du métabolisme ainsi que l'inaptitude de l'organisme à utiliser ces groupes dans des situations patholo- giques spécifiques constitue le facteur principal d'altérations anatomiques et fonctionnelles de certains tissus physiologiques. En fait, l'activité de la plupart des enzymes présentes dans les cellules d'organes vitaux,comme le foie, est en relation avec la présence de groupes SH dans leurs molécules ainsi qu'avec l'acti- vité des groupes SH au niveau des membranes. On sait également que l'organisme lorsque, pour des raisons variées, il est incapable d'utiliser les groupes sulfhydryles indispensables pour que le métabolisme cellulaire se produise régu- lièrement, peut utiliser les groupes sulfhvdrvles provenant de l'administration de composés contenant ces groupes. Il s'est avéré difficile jusqu'à maintenant de trouver des composés capables de traverser les membranes biologiques et de libérer les groupes SH afin de reconstituer les membranes cellulaires et de restaurer l'activité enzymatique. On a maintenant trouvé que les composés selon l'inven- tion possédaient une aptitude remarquable à traverser les membranes biologiques et en particulier les membranes des mitochondries. En outre les mercaptoacyl-carnitines apportent, en plus des groupes SH, l'énergie associée aux groupes acyles (par exemple acétyle) nécessaires pour que des processus métaboliques essentiels puissent se produire. Les caractéristiques de l'activité pharmacologique des composés de formule générale (I) sont décrites ci-après. Toxicité aiguë. On a étudié la toxicité aiguë des composés de formule générale (I) pour la souris par la méthode de Weil (Weil C.S., Biometr. J. 8, 249, 1952). Les valeurs de DL50 de certains composés rapportées dans le tableau I ci-après indiquent que ces composés sont remarqua- blement bien tolérés. TA B L E A U I DL50, en mg kg1, ep chez la souris, de certains esters de mercapto- acyl-carnitines de formule générale (I). Méthode de Weil (N - 5, K - 4) ClI - chlorhydrate. Composés DL Limite de L50 confiance ester isopropylique du mercaptoacétylcarnitine 250 215-285 ci ester isobutylique du 2-mercaptopropionyl-carni274 239-309 tine Cl ester éthylique du 3-mercaptopropionyl-carnitine 228 183-273 ci ester isobutylique du 2-mercaptobutyryl-carnitine 236 195-277 ci ester isobutylique du 4-mercaptobutyryl-carnitine 231 179-283 Cl ester méthylique du 5-mercaptovaléryl-carnitine 219 176-262 Cl Protection contre l'exposition aux rayons X. On a étudié l'effet des composés de formule (I) sur les dommages provoqués par une exposition à des rayons X. Les animaux d'expérience, des rats albinos Wister, traités par les composés soumis aux essais (20 à 25 mg.kg 1 1 h avant -*1 irradiation et 10 mg.kg par jour dans les 20 jours suivants) ont été irradiés et surveillés pendant une durée suffisante pour détec- ter le début des effets toxiques et la durée de survie par rapport au groupe témoin. On a rapporté dans le tableau II ci-après le pourcen- tage de survivants aux 10e, 15e et 20e jours après irradiation. T A B L E A U I-I Effet protecteur de certains esters de mercaptoacyl-carnitine de formule générale (I) sur les dommages provoqués par l'irradiation chez les rats. Pourcentage d'animaux survivants à des intervalles varies après irradiation. Car. = carnitine; es. = ester Régénération cutanée. On a étudié sur des lapins l'aptitude des composés de formule (1) à accélérer la régénération cutanée après brûlure. On a brûlé une région cutanée de 4 cm2 sur la zone supérieure moyenne du dos de l'animal d'expérience. On a administré les composés par voie orale en solu- -1 tion aqueuse à la dose de 25 mg.kg une fois par jour pendant 7 jours. On a ensuite mesuré la zone de régénération cutanée, Composés Jours de survie 15 20 Témoin 85 20 10 es. isopropylique de mercaptoacétyl-car. Cl 80 55 30 es. isobutylique de 2-mercaptopropionyl-car. Cl 85 70 45 es. éthylique de 3mercaptopropionyl-car. Cl 90 85 60 es. isobutylique de 2-mercaptobutyrylcar. Cl 95 65 50 es. isobutylique de 4-mercaptobutyryl-car. CI 100 75 55 es. méthylique de 5-mercaptovaléryl-car. Cl 85 60 40 2503149. c'est-à-dire la surface du tissu nouvellement formé. Les résultats sont rapportés dans le tableau III ci-après. T A B L E A U III Effet des composés de formule (I) sur la régénération cutanée. Pour- centage de tissu régénéré au 4e et au 8e jour de traitement. Car. = carnitine; es. = ester Composés ou 4e 8e On a également déterminé les activités expectorantes et mucolytiques des composés de formule (I). Activité expectorante. Les essais ont été effectués sur des lapins mâles pesant de 2 à 3 kg anesthésiés par de l'éthyluréthanne, selon le mode opératoire décrit par Perry et collaborateurs (J. Pharm. Exp. Ther. 72 65, 1941). Les animaux anesthésiés, attachés avec la tête en arrière sur une table d'opération à une inclinaison de 60 , avaient une canule insérée dans la trachée. Chacune des canules était reliée à un dispositif d'alimentation délivrant un débit constant d'air pré- chauffé (à 36-38 C) et à humidité constante (80%.). A l'extrémité infé- rieure de chaque canule, on avait adapté une éprouvette graduée dans laquelle on a recueilli la sécrétion bronchique. Tous les animaux respiraient spontanément et par conséquent réglaient d'eux-mêmes l'admission d'air convenant pour une respiration normale. Une hture après l'insertion de la canule, on a administré aux animaux par vciu orale (au moyen d'une sonde oesophagienne) les composés de formule générale (I) en solution dans l'eau distillée aux doses indiquées dans le tableau IV ci-après. Chaque dose de médicament a été adminis- trée à 5 animaux. Les animaux témoins (8) ont reçu de l'eau pure. Témoin 20 55 es. isopropylique de mercaptoacétyl-car. CI 30 70 es. isobutylique de 2-mercaptopropionyl-car. Cl 25 65 es. éthylique de 3mercaptopropionyl-car. Cl 40 100 es. butylique de 2-mercaptobutyryl-car. Cl 35 70 es. isobutylique de 4-mercaptobutyryl-car. Cl 25 75 es. méthylique de 5-mercaptovaléryl-car. Ci 45 100 On a déterminé la quantité de sécrétionsl h, 2 h et 4 h après l'admi- nistration. Les résultats rapportés dans le tableau IV ci-après montrent que les composés de formule générale (I) n'ont pas d'acti- vité expectorante. Activité mucolytique. Les essais ont été effectués in vitro par le mode opératoire décrit par lorandini et collaborateurs (Lotta contro la tubercolosi 47, n 4, 1977). On a utilisé un thrombo-élastographe pour suivre les variations induites par les composés de formule géné- rale (I) et l'acétylcystéine sur les propriétés rhéologiques du crachat humain. Les résultats obtenus rapportés dans le tableau V ci-après montrent que les composés soumis aux essais provoquent une diminution de la densité du crachat humain beaucoup plus forte que celle provoquée par l'acétylcystéine. T A B L E A U IV Effets des composés de formule générale (I) sur la sécrétion bron- chique. Variations en pour- centage + e.t. de la sécrétion bron- Nombre chique par rapport d'animaux Composés aux valeurs normales aux intervalles de 1 h 2 h 4 h après administra- tion. 8 témoins + 0,6 + 1,2 + 2,4 ester isopropyliquedemercaptoacétyl- + 0,5 + 0,7 + 2,1 carnitine Cl, 15 mg p.o. 5 ester isobutylique de 2-mercaptopro- - 0,1 - 0,1 + 0,5 pionyl-carnitine Cl, 15 mg p.o. ester éthylique de 3-mercapto-propio- + 0,6 + 0,8 + 1,0 nyl-carnitine Cl, 20 mg p.o. ester isobutylique de 2-mercaptobuty- 0,2 - 0,4 + 02 ryl-carnitine Cl, 20 mg p.o. ester isobutylique de 4-mercaptobuty- + 0,5 + 0,9 + 2,1 ryl-carnitine Cl, 25 mg p.o. ester méthylique de 5-mercapto-valé- + 0,3 + 0,5 + 1,0 ryl-carnitine Cl, 20 mg p.o. 25031 49 T A B L E A U V Activité mucolytique in vitro des composés de formule générale (I) et de l'acétylcystéine; modifications de la densité du crachat humain. car. = carnitine. Diminution o + e.t. du tracé par rapport au pic maximal (à) Composés après addition de 1 ml d'une solution à 10% des composés soumis aux essais aux dilu- tions de 1/30 1/60 ester isopropylique de mercaptoacétyl 82,5 + 5 44,3 + 3 car. Ci ester isobutylique de 2-mercaptopro- 80,4 + 7 42,8 + 4 pionyl-car. CI ester éthylique de 3-mercaptopropio- 798 + 4 39,5+ 5 nyl-car. Cl ester isobutylique de 2-mercaptobuty- 95,9 + 5 51,2 + 3 ryl-car. CI 95,9 + 5 51, 2 + 3 ester méthylique de 5-mercapto-valé- 90,2 + 6 48,4 + 4 ryl-car. CI 0 2 + 6 4, acétylcystéine 75,6 + 7 23,8 + 5 *) indice d'activité mucolytique. Effet sur l'activité ciliaire. On a étudié l'aptitude des composés de formule (I) à agir sur la motilité ciliaire en observant au microscope le mouve- ment ciliaire d'anneaux de trachée de rats immergés dans des solu- tions des composés soumis aux essais. Cette technique permet d'étudier, en relation avec la concentration du composé et la durée de contact, le blocage du mouvement ciliaire provoqué par les composés soumis aux essais, lequel est en relation avec l'évacuation du mucus à partir de l'épi- thélium ciliaire. Les substances qui doivent être utilisées à l'état de solution ne doivent pas permettre que ce blocage se produise en moins de 15 min à partir du contact. Des solutions aqueuses à 2% des composés de formule(I) ont provoqué le blocage du mouvement ciliaire en 18 à 20 min. 25031 49 Comme on l'a montré par l'expérience, les composés selon l'invention modifient dans une mesure importante les pro- priétés Théologiques du crachat. L'examen attentif des résultats obtenus montre une diminution de la densité du crachat aux fortes doses (ou aux faibles dilutions) et aux faibles doses (ou aux fortes dilutions) qui est en permanence supérieure à celle provoquée par l'acétylcystéine. Par contre, aucun des composés n'accroit la sécrétion bronchique et ne bloque le mouvement ciliaire de l'épithé- lium des préparations d'anneaux de trachée dans des intervalles inférieurs à ceux autorisés. Les composés selon l'invention peuvent être utilisés en thérapeutique pour le traitement des brûlures et des maladies de l'épithélium, pour le traitement des maladies des voies respiratoires et d'une manière générale chaque fois qu'il importe dé ramener à la normale l'équilibre cellulaire métabolique d'un épithélium troublé par des facteurs exogènes et endogènes. Aux patients dont l'état le nécessite, on administre une quantité thérapeutique efficace d'un ester de mercaptoacyl-carnitine de formule générale (I) par voie orale ou parentérale. La dose d'ester de mercaptoacyl-carnitine de formule générale (I) administrée par voie orale ou parentérale se situe en général entre environ 2 et 20 mg/kg de poids corporel/jour, mais on peut administrer des doses plus fortes ou plus faibles sous la sur- veillance du médecin tenu compte de l'ge, du poids et des conditions générales du patient, et dans un jugement professionnel sain. Dans la pratique, les esters de mercaptoacyl-carnitine sont administrés par voie orale ou parentérale sous l'une quelconque des formes pharmaceutiques usuelles contenant les excipients, édul- corants, etc. usuels, ces formes étant préparées par des modes opé- ratoires classiques et bien connus des spécialistes en matière de technologie pharmaceutique. Parmi ces formes, on citera des formes d'unité de dosage solides et liquides pour administration par voie orale telles que des comprimés, des capsules, des solutions, des sirops et formes analogues, et des formes injectables, par exemple des solutions stériles pour ampoules et fioles. R E'V E N D I C A T I O; S 1. Esters de mercaptoacyl-carnitines, caractérises en ce qu'ils répondent à la formule générale (CH3)3N-CH12-CH-CH2-COOR1 (J) (3 3 2, 2 1(I X OR dans laquelle: X est un ion halogénure acceptable pour l'usage pharmaceutique; R est le radical mercaptoacyle d'un mercaptoacide saturé en C2-C10; et R est un radical alkyle à chaîne droite ou ramifiée en C1-C5. 2. Esters selon la revendication 1, caractérisés en ce que: X représente l'ion chlorure; R est choisi parmi les groupes mercaptoacétyle, 2mercaptopropionyle, 3-mercaptopropionyle, 2-mercaptobutyryle, 4mercaptobutyryle et 5-mercaptovaléryle; et R est choisi parmi les groupes méthyle, éthyle, propyle, isopropyle, butyle et isobutyle. 3. Ester selon la revendication 1, pris dans le groupe formé par les suivants: ester isopropylique de la mercaptoacétyl-carnitine, ester isobutylique de la 2-mercaptopropionyl-carnitine, ester éthylique de la 3mercaptopropionyl-carnitine, ester isobutylique de la 2-mercaptobutyrylcarnitine, ester isobutylique de la 4-mercaptobutyryl-carnitine, et ester méthylique de la 5-mcrcaptovalhryl-carnitine. 4. A titre de médicaments nouveaux, utiles notamment pour le traitement des maladies des voies respiratoires, des brûlures et des maladies de l'épithélium, et en tant qu'agents mucolytiques, les composés selon la revendication 1. 5. Compositions thérapeutiques pour l'administration orale ou parentérale. caractérisées en ce qu'elles ccntiennent au moins un composé selon la revendication 1 avec un excipient accep- table pour l'usage pharmaceutique.