FR 2510258 A1 19830128 FR 8212620 A 19820720 La présente invention concerne un procédé pour analy- ser la distribution d'un réactif, consécutivement à sa réac- tion, sous la forme de particules et d'un liquide dans une suspension et selon lequel, plus particulièrement, ladite analyse ne nécessite pas la séparation des particules par rap- port au liquide pour effectuer la mesure de la distribution du réactif. Les mots suivants, tels qu'ils ont été utilisés ci- dessus et tels qu'ils seront utilisés dans la suite de la description, ont la signification suivante: Substance à analyser: substance dans une solution qui est soumiseà une analyse, dont la concentration estinconnue et qui doit être déterminée par la procédure d'examen. Réactif: substance choisiede façon spécifique pour réagir uniquement avec la substance à analyser dans la pro- cédure d'examen. Marque: composition du réactif, qui lui est associée, permettant sa détection par un dispositif de mesure. Distribution de la marque: classification du réactif en parties ayant réagi et en parties n'ayant pas réagi. Ségrégation de la marque: classification apparaissant entre une phase solide et une phase liquide, habituellement par des moyens chimiques. Suspension: un mélange de particules (phase solide) et d'un liquide. Séparation de la-marque:la séparation réelle des particules et du liquide par des moyens physiques. La distribution d'un réactif-consécutive à s'a réac- tion fournissant des particules et un liquide dans une sus- pension est usuelle dans le domaine de la chimie clinique. Des exemples de telles distributions se présentent dans les procédures d'examen radio-immunochimiqueset fluoro-immuno- chimiques Dans ces deux procédures, il faut déterminer la concentration d'une substance à analyser en solution On choisit un réactif, auquel est attachéeune marque,-pour qu'il réagisse de façon spécifique avec la substance à ana- lyser A la suite de la réaction du-réactif avec la solu- tion, une partie du réactif subsiste sans avoir participé à la réaction, tandis qu'une autre partie du réactif a réa- gi avec la substance à analyser On sépare alors le réactif ayant réagi du réactif n'ayant pas réagi, en provoquant une distribution de ces derniers, habituellement en faisant pas- ser l'un des réactifs (ayant réagi ou n'ayant pas réagi) sous là forme d'une phase solide, tandis que l'autre réactif res- te en phase liquide Par exemple ceci-peut être réalisé soit au moyen d'une adsorption du réactif ayant réagi ou du réac- tif n'ayant pas réagi dans une substance en phase solide, telle que des lits recouverts d'anticorps ou du charbon de bois, soit en faisant précipiter le réactif ayant réagi, par-addition de substancesprovoquant une précipitation, tel- lesque du polyéthylèneglycol ou des seconds anticorps Il se forme alors une suspension de réactifs ayant réagi et de réactifs n'ayant pas réagi Il faut scinder physiquement cette suspension en sa phase solide et en sa phase liquide en créant une séparation de la partie du réactif ayant réagi par rapport à la partie du réactif n'ayant pas réagi Une fois effectuée cette séparation, on peut alors mesurer cha- que partie séparée La marque, qui est associée au réactif, est de façon typique un isotope radioactif-dans le cas de l'examen radioimmunochimique et est un matériau fluorescent dans le cas de l'examen fluoro-immunochimique On peut égale- ment utiliser d'autres marques On choisit le réactif de tel- le manière que sa réaction et sa distribution ultérieure soient obtenues uniquement au moyen d'une substance à analyser spéci- fique, dont on détermine la concentration Une marque est atta- chée au réactif de manière que sa distribution puisse être me- surée habituellement à l'aide de moyen de détection par émis- sion Là partie du réactif, qui se répartit avec une distri- bution telle que déterminée par la mesure de sa marque, est une indication de la mesure quantitative de la concentration de la substance à analyser, que l'on détermine par la procédu- re d'examen Dans les deux procédures d'examen radio-immuno- chimique et d'examen fluoro-immunochimique, la partie du réac- tif ayant réagi et la partie du réactif n'ayant pas réagi sont amenées à se séparer suivant deux phases, dont l'une ou l'au- tre peut être mesurée après qu'elles aient été à leur tour sé- parées par des moyens physiques On analyse la partie sous forme de particules ou bien la partie liquide de la suspension de manière à déterminer la mesure quantitative de la-marque qu'elle contient De cette manière il est possible de calculer la concentration inconnue, c'est-à-dire de réaliser la iesure quanti- tative de la substance spécifique à analyser Dans le cas de la procédure d'examen radio-immunochimique les particules sé- parées ou le liquide séparé sont analysées grâce à une trans- formation du rayonnement nucléaire émis par la marque en une lumière visible à l'aide d'un cristal à scintillation La l-u- mière visible est ensuite détectée par un tube photomultipli- cateur Dans le cas de la procédure d'examen fluoro-immuno- chimique les particules séparées ou le liquide séparé sont irradiées par un faisceau de rayonnement électromagnétique, de façon typique une lumière:rultra-violette La quantité de marques présentes à l'intérieur des particules séparées ou du liquide est censée produi ealors une fluorescence. La quantité de fluorescence est alors détectée par un tube photomultiplicateur Ainsi, dans le cas de la procédure d' examen immunochimique, il existe une réaction mettant en jeu un réactif possédant une marque avec une distribution et une ségrégation ultérieures de la partie ayant réagi et de la partie n'ayant pas réagi du réactif en des phases solide et liquide La séparation est le lavage de ces phases requièrent des manipulations humaines conséquentes et sont une source d'imprécision et d'erreur dans la procédure d'examen. L'analyse d'imagesau microscope met en oeuvre l'exa- men au microscope d'une suspension contenant des particules, auxquelles on d'intéresse On prend des images de la suspen- / I Sion au microscope, on les transforme sous forme numérique et on les traite par des techniques de formation d'imagesafin d'extraire l'information concernant les composantes sélection- nées de l'image, qui sont intéressantes Un tel appareil a été proposé pour 1 'analyse de particules dans une suspension, tel- le que par exemple du sang La demande de brevet déposée aux Etat S Unis d'Amérique sous le numéro de série 146 064, en da- te du 2 Mai 1980, au Knoms de' Gunner Bolz et Sherman De Forest,: qui sont les inventeurs à la base de la présente demande, con- cerne un tel appareil d'analyse d'images obtenues au microsco- pe. C'est pourquoi, conformément à l'invention, on indi- que un procédé permettant d'analyser la distribution d'-un réactif ayant réagi et d'un réactif n'ayant pas -réagi à l'in- térieur d'une suspension, qui est un mélange de particules et d'un liquide, Au réactif est associée une marque Le procédé in- clut un examen au microscope de la suspension à l'aide de moyens de détection d'images et de reconnaissance de formes. On forme une image de la suspension L'image est transformée en une représentation à l'aide d'un signal électrique La représentation électrique est mémorisée sous forme numérique. L'image est ensuite traitée pour être amenée sous forme numé- rique grâce àun repérage et une quantification des marques. Ainsi la distribution desniarques est représentative de la dis- tribution du réactif entre des particules et le liquide. D'autres caractéristiques et avantages de la présen- te invention ressortiront de la description donnée ci-après prise en référence aux dessins annexés, sur lesquels: La figure 1 est une vue en perspective d'un appareil conçu pour mettre en oeuvre le procédé de la présente inven- tion; la figure 2 est une vue en plan d'une chambre d'écou- lement de l'appareil de la figure 1; la figure 3 est une vue en coupe transversale de l'ap- pareil de la figure 27 prise dans le plan repéré par 3-3 sur la figure 2; la figure 4 est une vue schématique de l'appareil de traitement électronique utilisé dans l'appareil de la fi- gure 1. Le procédé conforme à la présente invention est mis en oeuvre comme suit Un réactif contenant une marque, qui lui est associée, est utilisé dans une procédure d'examen immuno- chimique On choisit le réactif de telle manière qu'il réagis- se avec uniquement une substance spécifiée à analyser, et on doit déterminer la mesure quantitative de cette substance à analyser On provoque une ségrégation de la partie ayant-réa- gi et la partie n'ayant pas réagi du réactif, suivant des par- ticules et un liquide La suspension constituée des particu- les et du liquide, c'est-à-dire le réactif ayant réagi et le réactif n'ayant pas réagi, obtenus à partir de la procédure d'examen immunochimique est ensuite examinée au microsco- pe Au moyen d'un examen optique du champ d'observation de 1 ' image, il est possible de compter le nombre des particules. Moyennant la connaissance de la quantité de réactif que l'on a utilisé dans la procédure d'examen immunochimique, il est possible de calculer la quantité de réatif sous forme liqui- de Etant donné que les particules et le liquide sont des élémentsphysiques du réactif sous deux formes différentes, c'est-à-dire une forme ayant réagi et une forme n'ayant pas réagi, il est possible de calculer la quantité de la substan- ce à analyser, qui a réag'ikavec le réactif Ainsi on peut dé- terminer la concentration de la substance à analyser. Un appareil approprié pour la mise en oeuvre du procé- dé selon la présente invention est représenté sur la figure 1. L'appareil comporte un corps 10 contenant une chambre d'écou- lement possédant une entrée 12 pour une suspension et une sor- tie 14, avec un passage 16 s'étendant l'entrée et la sortie, et une zone de formation d'images 18 Le passage 16 comporte une entrée munie d'un conduit 20 apte à être raccordé à un ré- cipient d'une solution d'entraînement 22 Comme cela est illus- tré sur les figures 2 et 3, l'entrée 12 de la suspension compor- te une aiguille 24 disposée dans le passage 16 en aval du con- duit 20, ladite aiguille 24 étant raccordée à un conteneur 26 apte à contenirla suspension devant être analysée. Un microscope 30 est mis au point sur la surface d' examen 18, qui est éclairée par en-dessous par une lumière d'échantillonnage 32, qui est de préférence un appareil com- mercialisé par la société dite U S Scientific Instrument Corporation, modèle 3018, contenant une lampe désignée sous le sigle 2 UP 1,5 L'image de sortie du microscope 30 est réglée sur une caméra CCD, qui est de préférence une caméra CCD modèle N T 116 OTD, fabriquée par la société dite RCA. Le signal de sortie de la caméra CCD est converti en une sé- rie d'images fixes et l'on utilise des appareils appropriés de traitement électronique pour évaluer ces images Un appa- reil de traitement, qui peut être utilisé, est l'appareil de traitement commercialisé en tant que système d'analyse d'ima- ges, modèle C-1285, par la société dite Hamamatsu Systems, Inc, Waltham, Massachusetts De préférence le signal de sortie de la caméra CCD 34 est transmis à un appareil de traitement électronique 36, qui-est représenté de façon plus détaillée sur la-figure 5 et comporte un moniteur de télévi- sion noir et blanc 38 et un système d'acquisition d'images , qui mémorise les images fixes du sujet observé par la camera CCD Le système d'acquisition d'images est de préfé- rence le système modèle FG 08 fabriqué par la société dite Matrox Corporation, Montréal, dont le signal de sortie est- envoyé à une mémoire de rafralchissement vidéo 42, modèle RGB 256 fabriqué-par la société dite Matrox Corporation, ledit système d'acquisition d'images et ladite mémoire étant accouplésau bus multiple 44 de l'unité centrale de traitement 46, qui est de préférence un calculateur Intel 80/20 Le bus multiple est également accouplé à une mémoire à accès direct 48 à 48 K fabriquéepar la société dite Electronic Solutions Inc, et à une mémoire à accès direct à 16 K à deux portes , modèle RM 117 fabriqué par la société dite Data Corpora- tion La sortie' de la mémoire de raffraîchissement vidéo est également accouplée à un moniteur d'images couleurs 52, que l'on peut utiliser pour obtenir des images vidéo, améliorées du point de vue numérique, d'images fixes individuelles en vue d'un examen de personne. La seconde sortie de la mémoire à accès direct à deux portes 50 est raccordée à un bus multiple 54 qui est relié à une unité centrale de traitement 56 de la société dite Advan- ced Micro Devices, à une mémoire à accès direct à 48 K de la société dite Electronic Solutions, Inc,, 58 et à une mémoire amovible constituée sous la forme d'un système de commande à disquettes, tel que le système modèle 8/8 de la société dite Advanced Micro Devices, et deux unités de stockage à disquettes Shugart 62. Dans le cadre de l'utilisation de l'appareil repré- senté sur la figure 1, on fait passer la suspension des par- ticules et du liquide, qui ont subi la procédure d'examen im- munochimique, depuis le conteneur 26 dans la chambre d'écoule- ment par l'intermédiaire de l'entrée 12 Lorsque la suspension traverse la surface d'examen 18, on prend une image de la sus- pension Comme on peut le voir sur les figures 2 et 3, la chambre d'écoulement possède une largeur et une épaisseur telles que l'image est formée dans la zone d'examen 18 sui- vant une direction essentiellement parallèle à l'épaisseur. L'image est transformée en un signal électrique par la caméra CCD 34 Cette caméra 34 subdivise le signal électrique en plusieurs éléments d'image L'amplitude de chaque élément d' image est mise sous forme numérique ket est mémorisée dans la mémoire à accès direct 48 à 48 K L'unité centrale de traite- ment traite l'image en la mettant sous forme numérique en re- pérant et en quantifiant les marques des réactifs visibles sur l'image L'analyse de la distribution des marques est re- présentative de la distribution du réactif qui a réagi et du réactif qui n'a pas réagi L'analyse est effectuéeà l'aide de techniques de formation d'images sous forme numérique et de reconnaissance des formes De telles techniques sont bien con- nues (voir par exemple-le brevet déposé aux Etats Unis d'Amé- rique sous le N O 4 097 845). La solution d'entraînement 22 entraîne la suspen- sion 26 entre deux lames dans la zone d'examen 18 En réglant le débit de la solution d'entraînement 22, il est possible de régler l'épaisseur de la suspension 26 au niveau de la zone d' examen 18 A son tour ceci règle la quantité de la suspension 26 visible par la caméra CCD 34, qui détermine le rapport des particules au liquide Ceci a son tour permet de régler le rapport signal/bruit. Un exemple de l'utilisation du procédé selon la pré- sente invention est la détermination de la quantité de thyro- xine 1125 dans un second précipité d'anticorps, à avoir un anticorps de chlore anti-globuline de lapin,dans lequel la globulne de lapin, qui a réagi avec la thyroxine radioactive, peut être observée comme suit Le réactif possède une marque qui est un isotope radioactif et est apte à émettre un rayonne- ment gamma La solution, qui contient un réactif ayant réagi et un réactif n'ayant pas réagi, dans une phase solide et dans une phase liquide émet des rayons gamma Des rayons gam- ma radioactifs provenant de la marque du réactif tombent sur un cristal à scintillation tel que du iodure de sodium acti- vé avec un pour-cent de thallium, ce qui fournit des impulsions lumineuses Une caméra CCD prend une image de ces impulsions lumineuses, qui est représentative de l'emplacement et de la quantité des marques à l'intérieur de l'image A leur tour 1 ' emplacement et la quantification des marques représentent la quantité et-la position des réactifs Simultanément un micro- pcope et la caméra CCD peuvent prendre des images des particu- les dans la suspension La position et le nombre des particu- les ainsi que la position et le nombre des réactifs dans la même image permettraient alors de déterminer la partie du réac- tif, qui s'est sépardeavec ces particules On peut alors cal- culer et utiliser la distribution des réactifs de manière à déterminer la concentration de la substance à analyser. Dans un autre exemple de mise en oeuvre du procédé selon la présente invention, on accumule sur des lits micro- scopiquesplastiques un réactif d'examen fluoro-immunochimique d'un anticorps de chlore anti-immmoglobuline G humaine, posseant une marque d'isothiocyanate de fluorescéine pour déterminer la concentration de l'immunoglobuline G dans le sérum La suspension contenant le réactif ayant réagi et le réactif n'ayant pas réagi, séparés sous la forme d'une phase soli- de (particules) et d'une phase liquide, pénètre à l'intérieur de la chambre d'écoulement par l'entrée 12 et pénètre dans la zone d'examen -18 Une image de la suspension incluant une indi- cation du nombre et de la position des particules dans la sus- pension est prise par le microscope 30 et est enregistrée par la caméra CCD 34 Etant donné qu'il s'agit d'un examen fluoro- immunochimique, on irradie la suspension avec un rayonnement en vue de provoquer une fluorescence des marques, c'est-à-dire en vue de produire une lumière visible en réponse au rayonne- ment rencontrant lesmarques, de façon typique une lumière ul- tra-violette La fluorescence de la marque est également dé- tectée par le microscope 30 et son image est prise par la ca- méra CCD On utilise des filtres-appropriés comme dans un mi- croscope à fluorescence Le nombre et la position des marques, tels que déterminés par la fluorescence et qui sont une indi- cation du nombre et de la position du réactif ainsi que l'ima- ge du nombre et de la position des particules, auxquelles on s'intéresse, facilitent la détermination de la distribution de l'action des réactifs avec la substance à analyser. Dans l'art antérieur, la séparation des réactifs n' ayant pas réagi est obtenue en provoquant une distribution sui- vant deux phases, puis en séparant la phase solide (particu- les) de la phase liquide, avant une quantification de la quantité desréactifsselon la phase solide ou, selon la phase liquide Avec le procédé conforme à la présente invention, on peut voir qu'il n'est pas nécessairede séparer les par- ticules du liquide de la suspension, qui contient les réac- tis auxquels on s'intéresse La quantification des réactifs situés dans le liquide de la suspension, ou des réactifs n' ayant pas réagi, et des réactifs qui sont liés aux particu- les, peut être réalisée avec les techniques de l'analyse d' images au microscope, et on peut effectuer une détermination de la distribution-des réactifs qui ont réagi et des réactifs qui n'ont pas réagi, sans séparation des particules et du li- quide Ainsi le procédé conforme à l'invention présente des avantages en ce qu'il réduit les manipulations humaines, 1 ' imprécision humaine et une erreur humaine possible En outre naturellement le procédé selon l'invention permet de faire l'économie de temps dans le processus d'analyse et réduit au minimum le danger présenté par les particules succeptibles d'être infectieuses et quelquefois radioactives. Il faut insister sur le fait que l'image de la sus- pe sion peut être réalisée sur une lamelle de microscope ou bien dans une chambre d'écoulement comme représenté sur la figure 1 Naturellement l'utilisation d'une chambre d'écou- lement augmente le rapport signal/bruit En outre là marque peut avoir n'importe qpele composition de sorte qu'il est aisément possible de la détecter, par exemple à l'aide de moyens visuels ou optiques. 2510258 - REVENDICATIONS 1 Procédé pour analyser la distribution d'un réac- tif sous la forme de particules d'un liquide dans une suspen- sion, selon laquelle le réactif possède une marque,-caracté- risé en ce qu'il comprend la formation d'uoe image de ladite suspension, la transformation de cette image en une représen- taticnpar un signal électrique, la mémorisation de ladite re- présentation par un signal électrique sous forme numérique, et le traitement de ladite image sous la forme numérique au moyen d'un repérage et d'une quantification desdites marques, la distribution desdites marques étant représentative de la distribution du réactif sous la forme desdites particules et dudit liquide. 2 Procédé pour déterminer la quantité d'une substan- ce à analyser dans une solution par la mise en réaction d'un réactif possédant une marque avec ladite solution, ledit réac- tif étant choisi de manière à réagir spécifiquement avec la substance à analyser, avec formation d'une suspension, qui se compose d'un mélange de deux phases: des particules (phase solide) et un liquide (phase liquide), lesdits réactifs ayant réagi avec la substance à analyser étant situés dans une phase, tan- dis que les réactifs n'ayant pas réa isont situés dans l'au- tre phase, caractérisé en ce qu'il consiste à former une ima- ge de la suspension, à transformer ladite image en une repré- sentation par un signal électrique, à mémoriserla représenta- tion par un signal électrique sous forme numérique, à trai- ter l'image par quantification des marques associées auxdites -particules ou associées audit liquide, et à calculer la quan- tité de substance à analyser, à partir de ladite quantifica- tion. 3 Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 et 2, caractérisé en ce qu'il comprend en outre une phase d'écoulement de ladite suspension dans une chambre d'écoule- ment ( 12, 14, 16, 18) et formation d'images dans ladite chambre + 4 Procédé selon la revendication 3, caractérisé en ce que la marque est décelable optiquement. -10258 Procédé selon la revendication 4, caractérisé en ce que la chambre d'écoulement possède une largeur et une épaisseur et que ladite image est formée dans une direction essentiellement parallèle à ladite épaisseur. 6 Procédé selon la revendication 5, caractérisé en ce qu'il comprend en outre la phase opératoire de réglage de l'épaisseur de la suspension dans ladite-chambre d'écoulement de manière à régler le rapport particules/liquide à l'endroit o ladite image est formée. 7 Procédé selon l'urnequelconque des revendications 1 et 2, caractérisé en ce qu'il comprend en outre une phase de subdivision de Iadite représentation par un signal élec- trique sous la forme d'un ensemble d'éléments d'image, et une phase de mise sous forme numérique de l'amplitude de cha- que élément d'image 8 Procéd 6 selon la revendication 7, caractérisé en ce que la marque est une substance pouvant être le siège d' une fluorescence 9 Procédé selon la revendication 8, caractérisé en qu'il comprend en outre la phase opératoire d'irradiation du fluide ayant réagi de manière à provoquer la fluorescence de ladite marque. Procédé selon la revendication 7, caractérisé en ce que la marque est une substance pouvantémettre une radio- activité. 11 Procédé selon la revendication 8, caractérisé en ce qu'il comprend en outre la phase opératoire de transforma- tion de ladite radioactivité en un rayonnement électromagnétir que. 12 Procédé selon la revendication 11, caractérisé en ce que le rayonnement électromagnétique est une lumière visible.