FR 2503714 A1 19821015 FR 8107283 A 19810410 tf01714 "Procédé d'obtention de mucopolysaccharides biologiquement actifs, de pureté élevée, par dépolymérisation de l'héparine" L'invention est relative a. un nouveau procédé d'ob- tention de compositions de mucopolysaccharides de pureté élevée biologiquement actifs par dépolymArisation ménagée de l'héparine. Elle concerne plus particulièrement un procédé du type en question permettant d'obtenir des mucopolysacchari- des(ces produits seront désignés ci-après par l'abréviation MPS) capables notamment de contrôler, de manière hautement spécifique, certaines étapes de la coagulation sanguine et, en particulier, possédant une activité plus sélective que l'héparine vis-à-vis d'un nombre plus réduit de facteurs de la coagulation, notamment du facteur X activé ou facteur Xa du sang. Compte-tenu de leurs propriétés, ces MPS constituent de précieux médicaments, notamment antithrombotiques. On concoit alors l'intérêt, pour les applications thérapeutiques envisagées, de disposer de MPS de pureté élevée, en particu- lier pratiquement totalement débarassAs de tous les conta- minants que peut apporter le milieu de réaction, tout en n'ayant recours, pour leur obtention, qu'à des étapes opéra- toires de mise en oeuvre aisée dont le coût et la réalisation permettent une exploitation à l'échelle industrielle. Pour l'obtention des composés de ce type, les inventeurs se sont plus spécialement intéressés à la dépolymérisation ménagée de l'héparine sous l'action d'un agent chimique ca- pable de fragmenter les chaînes qui la constituent, en parti- culier de l'acide nitreux. Or, d'une manière générale, les procédés de ce type, proposés à ce jour, conduisent à des mélanges de dépolyméri- sation renfermant de nombreux contaminants, notamment des nitrites et des nitrates provenant de l'acide nitreux n'ayant pas réagi. Il s'avère alors nécessaire de purifier avec soin, au cours d'étapes supplémentaires, les compositions de MPS deces mélanges avant de les utiliser en thérapeutique. En outre, la réalisation de la réaction jusqu'au f degré de dépolymérisation souhaité exige un contrôle rigou- reux de la progression de la d4polymérisation afin d'arrêter cette dernière pour empêcher une dépolymérisation plus poussée. La recherche par les inenteurs de moyens permettant d'obtenir les MPS recherchés, de manière plus satisfaisante, les a conduits à étudier des conditions de réalisation de la dépolvmérisation partielle de l'héparine dans des conditions différentes. Les travaux effectués ont permis de constater qu'en choisissant l'un des paramètres et en le faisant varier de manière appropriée, en fonction de la qualité du produit souhaité, il était possible d'obtenir un mélange de dépo- lymérisation pratiquement exempt de contaminants du type nitrite-nitrate et d'éviter durant la réaction le contrôle de la dépolymérisation pour arrêter cette dernière lorsque le degré souhaité est atteint. L'invention a donc pour but de fournir un nouveau procédé permettant d'obtenir des MPS possédant les propriétés biologiques évoquées ci-dessus tout en étant pratiquement exempts de tous contaminants tels cue nitrites et nitrates, qui se trouvent donc par 1 sous forme particulièrement appropriée pour leurs applications en thérapeutique. Elle a également pour but de fournir un procédé permet- tant d'obtenir ces MPS sans avoir a exercer un contrôle ri- goureux de la durée de réaction pour arrêter cette dernière dès que le degré de dépolymérisation souhaité est atteint, le degré de dépolymérisation étant ajusté à volonté. Elle vise également à fournir un procédé dont la mise en oeuvre à l'échelle industrielle est rendue extrêmement aisle en raison des conditions particulières choisies pour la dépolymérisation ménagée de l'hAparine. Le procédé d'obtention de compositions de MPS biolo- giquement actifs selon l'invention est caractérisé par le fait qu'on met en oeuvre l'héparine et l'acide nitreux ou,de manière préférée, les réactifs utilisés pour l'en- gendrer in situ, selon des quantités telles que lorsque le degré de dépolymérisation souhaité est atteint, l'acide nitreux, le cas échéant, les réactifs utilisés pour le géné- rer in situ, soit totalement consommé, les conditions de la réaction autres que les concentrations en réactifs étant avantageusement ajustées les unes en fonction des autres de manière m permettre l'obtention d'une dépolymérisation par- tielle de l'heparine de départ conduisant aux MPS recherchés et, après arrêt par elle-même de la réaction, on sépare les MPS qui sont précipitables par un solvant alcoolique et on les récupère. L'intérêt de ces dispositions s'avère particulièrement précieux au regard des applications biologiques envisagées pour les produits. En effet, les compositions de MPS récupé- rées du mélange de dApolymérisation sont pratiquement totale- ment exemptes de produits toxiques, en particulier de nitri- tes et de nitrates, la formation de ces dérivés n'ayant pu se produire étant donné la consommation totale de l'acide 2n nitreux et l'élimination sous forme gazeuse de ceux contenant de l'azote, ce qui permetd'éviter toute contamination après la réaction du Droduit formé par des composés nitrés toxiques. Ce procAd& présente, en outre, un avantage considérable au niveau de la technique de réalisation. En effet, grâce aux dispositions utilisées, la réaction de dépolymérisation en quelque sorte "s'autorégule", s'arrêtant d'elle-même lorsque le degré de dépolymérisation voulu est obtenu. On se libère ainsi de la contrainte de la durée des 3n réactions qui est rendue nécessaire dans les techniques an- térieures afin d'éviter une dépolymérisation trop avancée de l'héparine. Conformément à l'invention, au lieu de se conformer à la cinétique de réaction découlant des paramètres utilisés 3 jusqu'alors et, notamment, des quantités de réactifs, on choisit la concentration en produits engendrant l'acide nitreux de manière a obtenir la dépolymArisation recher- chée afin que la dépolymérisation s'arrête du fait de la disparition par consommation totale de l'un des réactifs lorsque les produits souhaités sont obtenus. La quantité d'acide nitreux mise en oeuvre, ou de produits utilisAs pour l'engendrer in situ, doit être suf- fisante pour obtenir un rendement satisfaisant en produits de dépolymérisation,de la qualité sou]aitee mais ne doit pas dépasser une limite au-delà de laquelle, compte-tenu de in la quantité d'héparine mise en oeuvre, l'acide nitreux ne serait pas entièrement consomme. De manière préférée, les conditions mises oeuvre sont choisies de manière à obtenir un rendement quantitafif en unités Yin-Wessler. D'une manière avantageuse, on met ainsi en oeuvre de 0,03M à 0,07M, notamment de 0,03M à 0,05M de NaNO2 avec de l'héparine à 10% environ. Les dispositions ci-dessus sont avantageusement mises en oeuvre dans un procédé de dépolymérisation ménagée d'hé- parine dans lequel, les conditions de la réaction autres que les quantités de réactifs, permettent plus spécialement l'obtention de MPS ayant une activité anti-Xa (Yin-Wessler) d'au moins 200 u/mg, un rapport de leur titre Y-W/USP ou de leur titre YW/APTT d'au moins 2, formés d'une majeure par- tie d'espèces ayant un poids moléculaire de 2000 à 8000 dal- tons. Dans un mode préféré de réalisation de l'invention, on met avantageusement en oeuvre comme matière première une héparine possédant un poids moléculaire de 2000 à 50 OOÈ environ. peut s'agir d'une héparine de qualité pharmaceutique classique, injectable, ou d'une héparine brute telle qu'elle est obtenue à l'issue des opérations d'extraction de ce principe actif a partir de tissus ou d'organes de mammifères, notamment de mucus d'intestins ou de poumons, par exemple de porc ou de boeuf. Elle peut encore être constituée par 250371 4 les produits qui sont normalement écartés lors de la purification d'une héparine en vue de l'obtention d'une héparine de qualité injectable et d'activité spécifique plus élevée. L'héparine mise en oeuvre est soumise, dans des conditions ménagées, à l'action d'un agent chimique, plus particulièrement de l'acide nitreux. Cet acide peut être ajouté à l'héparine ou formé in situ par addition, selon des quantités contrôlées, d'un acide, à un dérivé de l'acide nitreux, en particulier, un sel éther-sel, plus spécialement un sel alcalin ou.alcalino-terreux. Dans un mode de réalisation avantageux de l'invention, on utilise comme sel de l'acide nitreux, du nitrite de sodlium NaN02. Pour engendrer in situ l'acide nitreux, on ajoute des quantités contrôlées d'un acide comportant des anions biologiquement acceptables tels que l'acide acétique et plus spAcialement-l'acide chlorhydrique. L'action de l'acide nitreux sur l'héparine est effectuée en milieu aqueux. Conformément I l'invention, les concentrations en héparine et en acide nitreux sont choisies de manière telle que lorsque le degré de dépolymérisation souhaité est atteint, l'acide nitreux soit totalement consommé, les autres para- 2r, mètres intervenant pour la réalisation de cette réaction, en particulier la température et le pH étant ajustés les uns aux autres afin d'obtenir les produits désirés dans les conditions expérimentales les plus satisfaisantes. L'étude de ces conditions expérimentales par les in- 3( venteurs a montré qu'il est avantageux de mettre en oeuvre l'héparine et les produits engendrant l'acide nitreux selon des quantités conduisant à une concentration finale en hépa- rine d'au moins 8%, avantageusement de l'ordre de 8 à 12%, spécialement voisine de 10%, la concentration finale en ni- trite de sodium étant alors de 0,02M a 0,1NM environ et de préférence de 0,05M. Compte-tenu des concentrations élevées 250371 4 en héparine, les volumes à manipuler pour la mise en oeuvre du procédé d'autorégulation selon l'invention, sont considérablement réduits, d'un facteur d'au moins 5, par rapport aux techniques chimiques habituelles. Les essais réalisés ont montré qu'il était approprié de recourir à une température de l'ordre de 0 à 100C, de préférence voisine de 40C. Comme déjà souligné, ces conditions permettent de se libérer d'un contrôle rigoureux de la durée de la réaction. Les conditions mises en oeuvre sont telles qu'elles per- mettent une autorégulation de la réaction de dépolymérisa- tion partielle, selon un principe qui se distingue de celui mis en oeuvre dans les procédés connus, ce qui se traduit par une différence au niveau des résultats, à savoir l'absence denitrite dans le milieu réactionnel en fin de réaction, les composés azotés formés étant volatils. Lorsque l'acide nitreux mis en oeuvre est épuisé, le degré de dépolymérisation souhaité est atteint et on préci- pite du milieu de dépolymérisation ceux des produits qui sont précipitables par l'alcool. Auparavant, on réajuste avanta- geusement le pH à une valeur voisine de la neutralité. Pour l'opération de précipitation, on a avantageusement recours è de l'éthanol absolu. Les essais effectués ont permis de constater qu'en utilisant environ 2 volumes d'éthanol, on obtenait la précipitation souhaitée des MPS biologiquement actifs. Le précipité formé est récupéré et, en vue de son utilisation, lavé et séché. La mise en oeuvre des dispositions qui précèdent permet d'obtenir des produits caractérisés notamment par les points suivants. Ces produits sont solubles dans un milieu hydro-alcooli- que (eau-éthanol), ayant un titre de 55-610GL, de préférence de 580GL; ils tendent vers l'insolubilité dans un milieu eau-éthanol dont la teneur en alcool est plus élevée; ils sont insolubles dans l'alcool pur; ils présentent des titres Y-W d'au moins 200 u/mg, et des rapports de titre YW/USP d'au moins 2, notamment d'au moins 3, de préférence d'au moins supérieur i 6, voire à 10; ils comportent des motifs terminaux possédant la structure de base 2,5-anhydro-D-manno dont la fonction alcool-primaire en 6 est substituée ou non par un groupe -SO3. Ce motif terminal répond à la formule suivante: 2 2 Lo ou -0 R1 o R1 représente un groupement fonctionnel choisi notamment parmi des groupements aldéhyde, alcool ou acide carbo- xylique ou leurs dérivés, notamment les acétals, amides, éthers, esters ou sels correspondants et R2 un atome d'hydrogène ou un groupe S03. Dans un aspect avantageux de l'invention, R1 est constitué par un groupe aldéhyde, acide carboxylique ou alcool. De préférence encore, les produits obtenus selon l'invention sont constitués par une majeure partie d'espèces de poids moléculaire de 2000 à 8000 daltons environ, ce qui correspond à des structures ayant de 8 à 40 entités saccha- ridiques. Tels qu'ils sont obtenus,ces produits sont dépourvus de nitrates-nitrites contaminants. D'une manière générale, ces produits sont particu- lièrement précieux, en raison de leurs propriétés pharma- cologiques de grand intérêt. Ils possèdent, en effet, une activité anti-Xa YW au moins égale à celle de l'hépa- rine de départ alors que leur titre USP ou APTT (qui traduit l'activité anticoagulante globale) est inférieur à celui de l'héparine, ce qui facilite leur utilisation et diminue les risques d'accidents hémorragiques. De plus, leur faible poids moléculaire par rapport à celui de l'hparine de départ leur confère une pharma- cocinétique retardée d'un grand intérêt en thérapeutique. Ils peuvent en outre être avantageusement utilisés par voie orale. A titre illustratif, on indique ci-après un exemple de réalisation du procédé de l'invention. EXAMPLE 1 Dépolymérisation auto-régulée de l'hAparine et obtention de MPS de bas poids moléculaire - Dans 15 litres d'eau distillée à +4 C, on dissout 1500 grammes d'héparine commerciale ayant un rapport YW/USP voisin de 1 et un titre USP de 160 ui. On ajoute 51,8 g de nitrite de sodium dissous dans 300 ml d'eau distillée, et immédiatement le pli est abaissé à 2,5 par de l'acide chlorhydrique pur. La réaction s'opère alors. Au bout de 40 minutes, on détermine la présence ou l'absence d'ions nitreux dans le milieu réactionnel a l'aide de papier iodoamidonné, toutes les 5 minutes. Au bout d'envion 60 minutes de réaction, l'acide nitreux a été entièrement consommé et il ne subsiste plus d'ions NO 2- dans le milieu réactionnel. Le pH est alors ajusté à 7 par de la soude pure, et les produits de la réaction sont récupérés par addition de 31 litres d'étha- nol pur (2 volumes). Le précipité formé est collecté par centrifugation, lavé à l'éthanol et séché à 60 C sous vide. On recueille des produits présentant les caractéristi- ques suivantes: Titre USP.................. 19 ui/mg Titre APTT *......... .... 13 ui/mg Titre Yin et Wessler....... 202 u/mg Teneur en nitrites/nitrates 4 ppm..DTD: abréviation des termes anglais "activated partial thrombo- plastin time, (equivalent du temps de Cephaline kaolin Caen J et al. l'hemostase, édit. Expansion Scientifique 1976,p. 169-170). EXEMPLE 2 - En procédant comme dans l'exemple 1, en partant d'une solution d'héparine à 10% (100 g/l), on obtient des MPS présentant les rapports YW/USP selon la quantité de NaNO2 mise en oeuvre, à savoir: NN2 NaNO2 Rapport des titres YW et USP des MPS 0,03M 2,7 (140/51) 0,04M 8 (214/26) 0,05M 12 (230/19) 0,06M 16 (194/12) 0,07M 22 (201/9) 0, 08M 19 (132/6,4) 0,1M 44 (110/2) Des MPS préférés correspondent à ceux obtenus en utilisant de 0,03 à 0,07M, notamment de 0,03 b 0,05M. 2 f 3 7 1 4 REVENDICATION Procédé d'obtention de compositions de mucopolysac- chari lep, ou MPS, biologiquement actifs, de pureté élevée, caractérisé par le fait qu'on met en oeuvre l'héparine et l'acide nitreux, ou, de manière préférée, les réactifs uti- lisés pour l'engendrer in situ, selon des quantités telles que lorsque le degrA de dépolymérisation souhaité est atteint, l'acide nitreux, le cas échéant les réactifs utili- sés pour le générer in situ, soit totalement consommé, les conditions de la réaction autres que les concentrations en réactifs étant avantageusement ajustées les unes en fonc- tion des autres de manière à permettre l'obtention d'une dépolymérisation partielle de l'héparine de départ conduisant aux MPS recherchés et, après arrêt par elle-même de la réaction, on sépare les MPS qui sont précipitables par un solvant alcoolique et on les récupère.