FR 2510409 A1 19830204 FR 8213278 A 19820729 i La présente invention concerne un -procédé de puri- fication de l'interféron. L'interféron est une protéine produite lors d'une infection par des virus ou par une immuno-réaction telle qué la réaction antigène-anticorps L'interféron a un effet antiviral. On connatt plusieurs procédés de publication de l'in- terféron On peut stimuler avec des virus ou des lectines ap- propriés des leucocytes ou des cellules lymphoblastoides. On peut également stimuler avec des virus ou un io acide nucléique synthétique des cellules fibroblastiques. De plus, les progrès récents de la technologie re- ocebinante de l'ADN permettent de produire de l'interféron non pas par culture de cellules de mammifères, mais par culture de micro-organismes tels que Saccharomyces cerevisiae, Escherichia coli et Bacillus subtilis, transformés par un plasmide portant un gène d'interféron. L'interféron est classé en trois catégories se- lon son origine Les leucocytes et les cellules lymphoblastol- des stimulés par des virus produisent l'interféron-c, ces cel- lules stimulées par des lectines produisent 1 'interféron-, et les cellules fibroblastiques stimulées par un acide nucléique synthétique produisent l'interféron-p. Ces dernières années, on a effectué des essais cliniques surces trois types d'interféron, en particulier les types y et P employés comme agents antitumoraux ou antivi- raux Mais actuellement, la pureté des préparations d'interfé- ron d'utilisation clinique est d'environ O,01-1,0 % pour l'in- terféron-k et l'interféron-P On a signalé des effets secondaires tels que fièvre, allergie etc, vraisemblable- ment dus à des contaminants si bien que l'on a souhaité mettre au point des préparations d'interféron très purifiées. De nombreuses recherches visant à purifier l'interféron ont été effectuées, basées, par exemple, sur la chromatographie d'affinité; du verre à porosité contrôlée (CPG) (Edy, V G et coll, J Gen Virol Vol 33, 517-521, 1976), des chélates de zinc (Edy, V G et coll, J Biol Chem, Vol 252, 5934-5935, 1977), la concanavaline A (Davey, M W et coll, Biochem, Vol 15, 704-713, 1976; Carter W A et coll, Pharmac Ther, Vol 8, 359-377, 1980) un anticorps anti-inter- féron (Berg K et coll, J Immunol, Vol 114, 640-644, 1975), ou reposant sur un procédé utilisant du KSCN (Cantell, K et coll, Pharmac Ther C, Vol 1, 369, 1977) Cependant, aucun de ces procédés n'a permis d'obtenir à la fois le taux de récu- pération et la pureté désirés et aucun n'a pu résoudre le di- lemme suivant: la préparation d'un interféron très purifié s'accompagne d'une diminution du taux de récupération, tandis qu'un taux de récupération élevé s'accompagne d'une faible pu- reté. Dans ces conditions, la Demanderesse a poursuivi des études intensives pendant des années et a finalement découvert qu'un adsorbant contenant un haut polymère d'acrylo- nitrile adsorbe de façon spécifique l'interféron On peut faci- lement obtenir de l'interféron très purifié avec un taux de ré- cupération de presque 100 %o par un stade unique d'élution de l'interféron avec un tampon approprié. Le but principal de l'invention est donc de four- nir un procédé de purification de l'interféron suivant lequel on met en contact une solution contenant de l'interféron avec un ou plusieurs adsorbants à haut poly- mère d'acrylonitrile afin d'absorber l'interféron sur l'ad- sorbant, puis l'élue. Un second but de l'invention est de fournir un pro- cédé de purification de l'interféron permettant d'obtenir de l'interféron très pur à un taux de récupération de presque %. Un troisième but est de fournir un procédé de purification de l'interféron dans lequel une solution aqueuse de substances organiques ordinaires est utilisée comme éluant. Un quatrième but de l'invention est de fournir un pro- cédé de purification de l'interúéron dans lequel une protéine, un sucre ou un amino-acide sont ajoutés à l'éluat pour y sta- biliser l'interféron. La présente invention s'applique non seulement à la purification de l'interféron produit par des cellules de mammifères, mais également à la purification de l'interféron produit selon toute autre technique, par exemple par une technique utilisant de l'ADN recombinant, etc. L'invention va maintenant être décrite de façon détaillée. Le procédé général de purification de l'interféron de l'invention est le suivant: a) On ajuste à p H 4,0- 8,5, de préférence à 5,0 8,0, une solution contenant de l'interféron, b) on met la solution en contact avec un ou plusieurs adsorbants contenant un haut polymère d'acryloni- trile, selon un procédé en colonne ou un procédé discontinu, pour adsorber l'interféron sur l'adsorbant et c) ensuite on ré- cupère l'interféron avec une solution appropriée. Des adsorbants appropriés que l'on utilise dans l'invention sont de préférence des matières fibreuses contenant un haut polymère d'acrylonitrile, mais les adsorbants ne sont pas limités aux matières fibreuses Les fibres con- tenant de l'acrylonitrile sont classées au Japon selon des rè- glementations indiquant la qualité, c'est-à-dire que celles contenant 50 % en poids ou plus d'acrylonitrile sont appelées "acryl" et celles ayant une teneur moindre "acrylic"; tandis qu'aux Etats-Unis, le terme "acryl" est utilisé pour les fibres contenant 85 % en poids ou plus d'a- crylonitrile et le terme "modacryl" pour celles en contenant de 35 % à 85 % (exclusivement) en poids Dans la présente invention, comme toutes les fibres précédemment indi- quées permettent l'adsorption spécifique et l'élution de l'in- terféron, il est inutile de les différencier et par conséquent toutes ces fibres constituent un adsorbant pour cette invention. On peut citer en exemple les fibres suivantes: Cashimilon (Asahi Chemical) Kanebo Acryl (Kanebo), Kanekalon (Kanebo), Vonnel (Mitsubishi Rayon), Exlan (Japan Exlan), Beslon (Toho Beslon), Toraylon (Toray), Pewlon (Asahi Chemical), Silpalon (Mitsubishi Rayon), Promix (Toyo Spinning), Orlon, Acrilan, Creslan, Zefran, Verel, Dynel, Vinyon N aux Etats-Unis, Courtelle, Teklan, au Royau- me-Uni, Pan, Dralon, en Allemagne de l'Ouest,etc On peut uti- liser toute forme autre que des fibres telles que des épon- ges, des poudres, des paillettes, des granulés poreux, des pel- licules, des produits moulés linéaires ou des produits de trans- formation secondaire de ceux-ci A cet égard, le haut polymère d'acrylonitrile peut également contenir des composants comono- mères tels que l'acrylate de méthyle, le méthacrylate de méthy- le, l'acide acrylique, l'acide méthacrylique, l'acétate de vi- nyle, le chlorure de vinyle, le chlorure de vinylidène etc. Il n'y a pas de limitation particulière relative à l'éluant de l'interféron sous réserve qu'il soit capable d'é- luer l'interféron d'un adsorbant contenant d' haut polymère d'acrylonitrile et on obtient de bons résultats avec une solu- tion aqueuse de substances organiques ou minérales ordinaires telles que le chlorure de sodium, le chlorure d'ammonium, des phosphates, des acétates, des amino-acides, des alcools, des - alkylèneglycols, des polyalkylèneglycols, le diméthylsulfoxyde, etc. Bien qu'on préfère généralement que pour la stabi- lité de l'interféron le p H de l'éluant soit -compris dans la game de 2 à 9, il n'est pas nécessaire de se limiter à cette gamme de p H Par exemple, au Èas o l'on effectue l'élu- tion avec un éluant à p H O 10, il ne se pose aucun problème si le p H de l'éluat est ramené à une valeur appropriée à laquelle l'interféron est stable De plus, on peut stabiliser l'interfé- ron dans l'éluat par addition d'environ 0,005 à 1 % d'une pro- téine telle que la sérum-albumine humaine, la gélatine, etc, environ 1 à 10 % d'un sucre tel que le saccharose, le mannitol, le glucose, etc, ou environ O,0 01 à 1 % d'un amino-acide, tel que la glycine, la cystine, etc, à l'éluat. Une comparaison entre des exemples de l'inven- tion et des procédés classiques est exposée ci-après, mais on notera que l'invention ne se limite pas à ces exemples. Les solutions brutes d'interféron purifiées dans les exemples ont été produites de la façon sulvante: A On cultive des fibroblastes humains en utili- sant le Milieu Essentiel Minimum de (PEM) Eagle additiorné de 10 % 9 de sérum foetal de veau jusqu'à confluence et on obtient de l'interféron-s (IFN-p) à partir de la culture selon le procédé décrit par Mozes, L W et coll (Virology, Volk 65, 100-11 i, 1975) La teneur en IFN-P est de 6 500 Unités Internationales par millilitre (UI/ml). B On obtient de l'interféron-' (IFN-c) à par- tir de leucocytes humains selon le procédé décrit par Strander, H et coll (Ann Med Exp Fenn Vol 44, 265-273, 1966) La teneur en IFN-d est de 104 000 UI/ml. C A partir d'une lignée de cellules lymphoblas- toldes humaines (Namalwa), on obtient une solution d'interfé- ron contenant principalement de l'IFN-> ( 10 200 UI/ml) selon le procédé décrit par Strander, H et coll, supra. EXEMPLE 1 On ajuste à p H 6,0 avec de l'acide acétique 0,5 N 1 000 millilitres( 6,5 x 106 UI) d'IFN-P obtenu selon le procé- dé A précédemment décrit, et on les fait passer à travers une colonne garnie de 5 g de fibres de polyacrylonitrile (nom com- mercial: Vonnel, Mitsubishi Rayon), pour adsorber l INF-P) sur la colonne On lave la colonne avec 500 ml de tampon au phos- phate O,1 M (p H 7,4), puis on élue l'IFN-P avec 300 ml de chlo- rure d'ammonium 3 M. EXEMPLE 2 On ajuste à p H 8,0 avec de l'ammoniaque 0,5 N 1 000 millilitres ( 6,5 x 106 UI) d'IFN- obtenu selon le pro- cédé A et on les fait passer à travers une colonne garnie de 4,6 g de fibres de polyacrylonitrile (nom commercial: Cashimi- lon, Asahi Chemical), pour adsorber 1 'IFN-3 sur la colonne On lave la colonne avec 200 ml de chlorure de sodium 1 M puis on élue 1 'IFN-p avec 100 ml d'une solution de Na Cl 0,5 M dans de l'éthylèneglycol à 50 %. EXEMPLE 3 On ajuste à p H 7,0 avec de l'acide chlorhydrique 0,01 N 2 000 millilitres d'IFN-B obtenu selon le procédé A et on les fait passer à travers une colonne garnie de 6,5 g de fibres de polyacrylonitrile (nom de marque: Torelon, Toray), puis on lave la colonne avec 450 ml de Na Cl 1 M d'un tampon au phosphate 0,01 M contenant Na C 1 1 M Ensuite on élue 1 'IFN-p de la colonne avec 100 ml d'une solution de Na C 1 1 M dans du propylèneglycol à 60 %. La comparaison des résultats avec ceux de procé- dés classiques figure dans le tableau 1. TABLEAU 1 Rendement Activité de la spécifique récupération ( 57) (UI/mg) Procédé de l'invention Exemple 1 109 2,3 x 10 2 97 6,8 x 107 3 102 9,0 x 107 Procédé classique Concanavaline A * 52 1,0 x 10 Chélate de Zn ** 57 1,3 x 106 * Selon le procédé de Davey, M W et coll,(Biochim, Vol. , 704-713, 1976). ** Selon le procédé de Edy, V G et coll (J Biol Chem, Vol 252, 5934-5935, 1977). Le tableau 1 montre de façon évidente que le pro- cédé de purification de l'invention est supérieur aux pro- cédés classiques en ce qui concerne à la fois le rendement de la récupération et la pureté. EXEMPLE 4 On ajuste à p H 5,5 avec de l'acide chlorhydrique 0,1 N une solution d'interféron-o$ (IPN-" obtenu selon le pro- cédé B) et à 50 ml ( 5 x 106 UI) de cette solution, on ajoute 1,5 g de perles de polyacrylonitrile puis, après 60 minutes d'agitation, on récupère les perles sur lesquelles l'interfé- ron est adsorbé Après lavage des perles avec 30 ml de tampon au phosphate 0,01 M (p H 7,0) on élue l'interféron avec 10 ml de tampon au phosphate O 01 M (p H 8,O)/Na Cl 0,3 Mo EXEMPLE 5 On ajuste à p H 4,0 avec de l'acide acétique 0,1 N, 2 000 millilitres de la solution obtenue selon le procédé C contenant de 1 'IFN X comme composant principal et on les fait passer à travers une colonne garnie de 5 g de fibres de poly- acrylonitrile On lave ensuite la colonne avec 400 ml de tampon au phosphate 0,01 M (p H 6,5), puis on élue avec 150 ml d'une so- lution de tampon au phosphate 0,05 M (p H 7,5)/Na Cl 0,5 M /éthy- lèneglycol à 30 %. TABLEAU 2 Procédé de l'invention Procédé classique Exemple 4 Exemple 5 Procédé de Cantell, K. et call * Rendement de la récupération 108 % 100 f 50 % Activité 7 7 7 spécifique 2 x 10 UI/mg 32 x 10 UI/mg 1,4 x 10 UI/mg * Cantell, K et coll (Pharmac Ther C, Vol 1, 369, 1977) Comme pour le tableau 1, la supériorité de l'invention est évidente. Comme décrit ci-dessus, le procédé de purifica- tion de l'invention est très efficace Il permet ainsi de récupé- rer de l'interféron très pur avec un taux de récupération d'en- viron 100 % selon une opération unique simple Le procédé de purification de l'invention s'applique de façon générale à la purification de l'interféron Ce procédé est très utile non seulement pour purifier l'interféron produit à partir de cellu- les de mammifères, mais également celui produit par tout au- tre procédé autre que ceux ci-dessus, par exemple l'interféron obtenu selon une technique utilisant de 1 'ADN recombinant,etc. R E V E N D I C A T IONS 1 Procédé de purification d'interféron caracté- risé en ce qu'on met en contact une solution contenant de l'inter- feron avec un ou plusieurs adsorbants qui contiennent un haut polymère d'acrylonitrile pour adsorber l'interféron sur ledit adsorbant puisqu'on élue avec un éluant pour produire un éluat. 2 Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que l'adsorbant comprend une matière fibreuse contenant un haut polymère d'acrylonitrile. 3 Procédé selon la revendication 1 ou 2, carac- térisé en ce que la matière fibreuse contenant un haut poly- mère d'acrylonitrile est une matière choisie parmi: le Cashi- milon, le Kanebo Acryl, le Kanekalon, le Vonnel, l'Exlan, le Beslon, le Toraylon, le Pewlon, le Silpalon, le Promix, l'Or- lon, l'Acrilan, le Creslan, le Zefran, le Verel, le Dynel, le Vinyon N, le Couttelle, le Teklan, le Pan et le Dralon. 4 Procédé selon la revendication 1 ou 2, carac- térisé en ce que le haut-polymère d'acrylonitrile contient comme composant comonomère un ou plusieurs membres du groupe constitué par l'acrylate de méthyle, le méthacrylate de méthy- le, l'acide acrylique, l'acide méthacrylique, l'acétate de vi- nyle, le chlorure de vinyle et le chlorure de vinylidène. Procédé selon la revendication 3, caractérisé en ce que le haut polymère d'acrylonitrile contient comme com- posant comonomère un ou plusieurs membres du groupe constitué par l'acrylate de méthyle, le méthacrylate de méthyle, l'acide acrylique, l'acide méthacrylique, l'acétate de vinyle, le chlo- rure de vinyle ou le chlorure de vinylidène. 6 Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que l'éluant de ltinterféron est une solution aqueuse de substances organiques ou minérales ordinaires. 7 Procédé selon la revendication 6, caractérisé en ce que lesdites substances minérales sont choisies parmi le chlorure de sodium, le chlorure d'ammonium et des phosphates. 8 Procédé selon la revendication 6, caractérisé en ce que lesdites substances organiques sont choisies parmi des acétates, des amino-acides, des alcools, des alkylène- glycols, des polyalkylèneglycols et le diméthylsulfoxyde. 9 Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que le p H de l'éluant est ajusté dans la gamme de p H de 2,0 à 9,0. Procédé selon la revendication 9, caractérisé en ce que le p H de 1 ' ltéluant est ajusté dans la gamme de p H de 5,0 8,0. 11 Procédé selon la revendication 1, caractéri- sé en ce que le p H de l'éluat est immédiatement ramené au voi- sinage de la neutralité si le p H de l'téluant sort de la gamme de p H de 2,0 à 9,0. 12 Procédé selon l'une quelconque des revendica- tions 1, 6, 7 et 8, caractérisé en ce qu'on ajoute une protéi- ne, un sucre ou un amino-acide à ltéluat pour stabiliser l'in- terféron dans l'éluat. 13 Procédé selon la revendication 12, caractéri- sé en ce que la protéine est la sérum-albumine humaine ou la gélatine. 14 Procédé selon la revendication 13, caractéri- sé en ce que ladite protéine est ajoutée à raison de 0,005 à 1 %. Procédé selon la revendication 12, caractéri- sé en ce que le sucre est le saccharose, le mannitol ou le glu- cose. 16 Procédé selon la revendication 15, caractéri- sé en ce que ledit sucre est ajouté à raison de 1 à 10 %. 17 Procédé selon la revendication 12, caractéri- sé en ce que l'amino-acide est la glycine ou la cystine. 18 Procédé selon la revendication 17, caractéri- sé en ce que ledit amino-acide est ajouté à raison d'environ 0,01 à 1 %.