FR 2502954 A1 19821008 FR 8205947 A 19820406 Le but principal du traitement d'un cancer est le traitement de la tumeur primitive de l'éradication totale de sa croissance. Ce traitement s'accompagne de l'inhibition nécessaire de la métastase qui peut être défi- nie comme étant la migration de cellules de la tumeur primitive et leur pénétration subséquente dans le système lymphatique ou dans les vaisseaux sanguins o elles sont transportées. Une telle propagation peut s'effectuer par fixation aux parois endothéliales puis passage à travers ces parois, établissement de tumeurs secondaires dans les tissus périvasculaires et, finalement, propagation des cellules tumorales vers des points éloignés. Bien que l'on ait acquis beaucoup de connaissances sur les manifestations cliniques du processus métastatique, on n'a que peu d'infor- 1 5 mations sur les mécanismes biochimiquesimmunologiques,géné- tiques et hormonaux qui participent à la métastase. En ce sens, on peut considérer la métastase comme un phénomène particulier qui repose sur une succession de processus compliqués. En raison de l'importance aussi bien du traite- ment du développement de la tumeur primitive que de la prophylaxie de la métastase, les cancérologues ont accompli de multiples recherches afin d'éclaircir les interactions liées à la croissance d'une tumeur et à la métastase. L'une des propriétés biologiques que semblent posséder les cellules tumorales est leur faculté d'interaction avec les plaquettes sanguines de l'ha5te et leur aptitude à se fixer à ces plaquettes et à renforcer ainsi le potentiel de la tumeur, à s'établir dans le système microvasculaire et à se fixer à l'endothélium vasculaire. Il a été suggéré comme autre possibilité que les cellules tumorales, après avoir élu domicile, pouvaient déclencher la formation de thrombi de plaquettes à effet protecteur entourant les cellules. Pour qu'une métastase puisse se manifester avec succès, les cellules métastatiques doivent tout d'abord s'établir sur l'endothélium vasculaire et s'y fixer et rester intravasculaires jusqu'à ce qu'elles pénètrent dans le tissu environnant. En raison des similitudes existant entre le processus participant à l'établissement et à la fixation des cellules tumorales sur l'endothélium et la formation de thrombi non tumoraux, de nombreux chercheurs sont arrivés à la conclusion que des plaquettes y jouaient un r8le d'une certaine manière. En raison de cette-participa- tion des plaquettes, de nombreux travaux de recherche ont été effectués pour déterminer l'action d'un traitement aux anticoagulants sur la métastase. Les travaux mentionnés ci-après impliquaient l'administration de composés anti- coagulants qui sont de puissants inhibiteurs d'une agré- gation des plaquettes. Les résultats sont jusqu'ici con- tradictoires. Au sujet de l'héparine, il a été rapporté qu'elle avait pour effet aussi bien d'atténuer que d'accroître la métastase, notamment dans le poumon /voir Cell Biol. Intl.Rep. 2, 81-86 (1963) et Arch. Surg. 91, 625-629 (1965)7. L'aspirine a donné des résultats mitigés /-voir Eur.J. Cancer 8, 347-352 (1972) et Intl. J. Cancer 11, 704-718 (1973)7. Pour la warfarine, il a été montré que cette substance produisait des effets antimétastatiques importants après injection intraveineuse de cellules tumo- rales et dans des tumeurs à métastase spontanée / voir Cancer 35, 5-14 (1975) et Cancer Res. 37, 272-277 (1971)7. Il a été démontré qu'une métastase induite par administra- tion intraveineuse de cellules de mélanome B-16a pouvait être inhibée par l'administration de l'agent anticoagulant appelé prostacycline-/ voir Cell Biol. 87, 649 (1980)7 Un aperçu sur l'utilisation d'anticoagulants pour le traitement de tumeurs est donné par M. B.Donati et collaborateurs dahs Malignancy and the Hemostatic System, pages 103-120, Raven Press, 1981. Il a été présumé que l'utilisation du traitement aux anticoagulants était moins que satisfaisante en partie du fait que les anticoagulants utilisés manquent de spéci- ficité, et parce que quelques-uns d'entre eux exercent sur les cellules tumorales elles-mêmes des effets qui, tout compte fait, peuvent faire cesser l'action avantageuse produite sur les plaquettes sanguines et par conséquent sur la métastase. Conformément à la présente invention, le composé appelé 3-méthyl-1-/ 2-(2-naphtyloxy) -éthyl7-2-pyrazoline-5- one, révélé dans le brevet des Etats-Unis d'Amérique N 4 053 621 et revendiqué comme agent anti-thrombotique thérapeutiquement efficace, s'est montré un puissant agent antimétastatique doué en même temps d'activité anti- néoplastique. La présente invention est axée sur un médicament destiné à réduire la métastase et la croissance néoplastique chez des mammifères. Ce médicament comprend une quantité thérapeutiquement efficace de 3-méthyl-1-/-2-(2-naphtyloxy)- thyl7-2-pyrazoline-5-one. Comme cela a été décrit dans le brevet des Etats- Unis d'Amérique N 4 053 621 précité, le composé de méthyl- pyrazolone utilisé dans la présente invention (représenté par la formule I suivante) peut être obtenu par diverses voies de synthèse, comme illustré ci-après. D'après le procédé A, on fait réagir la 2-(2naphtyloxy)-éthylhydrazine avec un dérivé de l'acide acétyl _acétique; d'après le procédé B, on fait réagir la 3-méthylpyrazolinone-(5) avec un dérivé 2-(2-naphtyloxy)-éthylique; d'après le procédé C, on fait réagir la 2-(2-naphtyloxy)-éthylhydrazine avec un dérivé d'acide tétrolique. A. * I 0-C^2-Cn2/ I2'X CH3 CH, 2 - ( 2 -- aohty l oxy) -- =. vlkvdsrazine 2 o o-. O -' O H3C-C-CH 2-CCCC'H5 Acétylacétate d'éthyle I * B. -8. :jCH3 H 3 -mé thy lpyrazol fne-5-one + O-C H2-CH2-C1 Chlorure de 2-(2-naphtyloxy)éthyle C. I H5C20-C-C =- C-CH3 2-butynate d'éthyle + N C-CH2-CH2-NH-NH2 2- (2-N aphtyloxy)éthylhydrazine r- CH3 6 N ON CH2 CH2 ? X3 I I Parmi les diluants que l'on peut utiliser, on compte tous solvants organiques inertes éventuellement dilués avec de l'eau, par exemple des hydrocarbures tels que le benzène et le toluène, des hydrocarbures halogénés tels que le chlorure de méthylène, des alcools tels que le méthanol et l'éthanol et des bases organiques telles que la pyridine et la picoline. On peut utiliser des agents de condensation basiques ou acides, et on peut faire varier la température de réaction entre 10 et 200 C. Le composé peut être purifié d'une façon simple au moyen de procédés classiques par C-CH3 2Il 3 O NS CH2 ?U I recristallisation dans un solvant convenable. Dans le présent mémoire, l'expression "diluant ou support pharmaceutiquement acceptable" désigne une substance non toxique qui, après mélange avec la ou des substances actives, rend cette matière ou ces matières disponibles sous une forme qui convient pour l'administra- tion. Cette définition exclut de préférence l'eau et des solvants organiques de bas poids moléculaire utilisés ordinairement dans la synthèse chimique, sauf en présence d'autres constituants nécessaires du point de vue pharma- ceutique tels que des sels en quantités convenables pour l'obtention d'une préparation isotonique, des tampons, des agents tensio-actifs, des matières colorantes et des matières modifiant le goût ainsi que des agents conserva- teurs. Des exemples de diluants et de supports solides et liquides convenables comprennent les suivants: tampons aqueux qui peuvent être rendus isotoniques par l'addition de glucose ou de sels; solvants organiques non toxiques tels que paraffines, huiles végétales, alcools, glycols; matières minérales naturelles broyées (par exemple kaolins, oxydes d'aluminium, talc ou craie); matières minérales synthétiques en poudre (par exemple silice ou silicates fortement dispersés); et sucres. L'administration orale peut être effectuée en utilisant des formes posologiques solubles et liquides telles que poudres, comprimés, dragées, capsules, granulés, suspensions, solutions, etc. Dans les cas indiqués, les unités posologiques pour l'administration orale peuvent être microencapsulées afin de retarder la libération ou de la ralentir sur une plus longue période, par exemple par des revêtements ou enrobages de matières. en particules avec des polymères, une cire, etc. L'administration parentérale peut être effectuée en utilisant des formes posologiques liquides telles que des solutions. et des, suspensions stériles qui conviennent à l'injection sous-cutanéeintramusculaire ou intraveineuse. On les prépare par mise en suspension ou dissolution d'une quantité déterminée du composé dans un diluant liquide non toxique qui convient à l'injection, tel qu'un milieu aqueux ou huileux, et stérilisation de la suspension ou de la solution. On peut également ajouter des agents stabilisants, des agents conservateurs et des émulsionnants. En général, la dose quotidienne rapportée au poids corporel s'élève à 0, 01-50 mg/kg, de préférence à 0,1-10 mg/kg pour l'administration parentérale et à 0,1-500 mg/kg, de préférence à 0,5-100 mg/kg pour l'adminis- tration orale. Pour la détermination des propriétés anti- métastatiques et antinéoplastiques de la 3-méthyl-1-/2-(2- naphtyloxy)éthyl/7-2-pyrazoline-5-one, on a adopté le mode opératoire suivant. Le schéma d'épreuve se sert de deux types de tumeurs de la souris sans relation l'un avec l'autre (un mélanome et un carcinome) afin d'exclure au maximum le risque de "monospècificité" des résultats obtenus par rapport à un type unique de tumeur. Ces deux tumeurs sont utilisées de façon classique pour les études fondamen- tales du mécanisme de la métastase et de l'action anti- néoplastique. A. Obtention in vivo des lignées de cellules tumorales On s'est procuré des cellules (B-16a) de mélanome B-16 amélanotique sous-cutané et des cellules (3LL) de carcinome pulmonaire de Lewis auprès de la Division of Cancer Treatment, (NCI), Animal and Human Tumor Bank, Mason Research Institute, Worcester, Massachusetts, Etats- Unis d'Amérique. Les deux types de tumeurs ont été soumis à quatre passages après leur réception. L'un des passages comprenait l'implantation d'un dé de tumeur de 2 x 2 mm dans la région de la cavité axillaire droite (en utilisant un trocard n 13 de 0,33 mm) de mâles de souris-hôtes syngéniques / (C57BL/6J; souche des laboratoires Jackson7. Les souris-hôtes pesaient entre 17 et 22 g (elles étaient âgées d'environ 28 jours) et elles ont été maintenues dans des conditions identiques en ce qui concerne la durée d'action de la lumière, le régime alimentaire, la tempéra- ture, etc. A la suite de l'implantation dans les souris- hôtes syngéniques, on a laissé croître les tumeurs trans- plantées pendant environ 14 jours. B. Isolement et mise en suspension des cellules tumorales Ensuite, des cellules tumorales ont été prélevées dans des conditions aseptiques sur les souris-hôtes et dispersées au moyen d'une digestion séquentielle par la collagénase, comme décrit ci-dessous. Les tumeurs prélevées ont été divisées en dés (4 x 4 mm) et le tissu découpé en dés a été réparti entre 6et 8 fioles d'Erlenmeyer stériles contenant du polycarbonate (environ 500 mg/fiole). Une portion de 10 ml d'une "solution de dispersion de tumeur" (SDT) a été ajoutée dans chaque fiole. composition ci-après. Composition 9,5 g ml/l ml/l 0,35 g/ ,9 g/1 La SDT a été préparée par mélange de la A et de la composition B qui sont décrites A (rapportée à 1 litre) r/1 de "milieu essentiel minimal" (MEM) de Eagle stérile (commercialisé par la firme Gibco, Grand Island, New York), d'aminoacides non essentiels (Gibco), de pyruvate de sodium, /l de bicarbonate de sodium (15 mM), de HEPES (25 mM) = acide 4-(2-hydroxyéthyl)-1- pipérazine-éthane-sulfonique (tampon organi- que; commercialisé par la firme Sigma Chemical, St. Louis, Missouri), unités/ml de pénicilline, gg/ml de sulfate de néomycine. Les antibiotiques ont été ajoutés de manière à exclure une contamination bactérienne éventuelle. La composition B est un mélange en poudre conte- nant de la collagénase ayant peu d'activité en clostripaine et autre activité protéolytique; de la désoxyribonucléase (DNase) pour décomposer la désoxyribonucléoprotéine libérée par les noyaux cellulaires endommagés; des inhibiteurs de trypsine de haricot de Lima ou de fève de soja, pour exclure toute activité résiduelle en trypsine; de la sérum-albumine humaine pour exclure une activité en protéase non spécifique et pour absorber les peroxyacides gras ainsi que les hydroperoxyacides gras qui ont été libérés par les membranes détériorées. Composition B Poids/ml de composi- tion A Collagénase (Worthington type III) 1 mg DNase I (Sigma Chemical) 50 g Inhibiteur de trypsine de fève de soja (Worthington) 100 ig Sérumalbumine humaine (dépourvue d'acides gras; Sigma Chemical) 10 mg La composition B a été pesée et introduite dans un ballon,puis additionnée de 100 ml de composition A. Le tissu découpé en dés dans la suspension SDT a été ensuite dispersé (30 minutes; 37 C) dans l'air dans une secoueuse à métabolisme Dubnoff (90 oscillations/ minute). Les liqueurs surnageantes ont été recueillies à travers un tissu filtrant dans des petits tubes de centri- fugeuse stériles à fond rond en polycarbonate de 50 ml, et centrifugés pendant 10 minutes (à 25 C) à 900 tr/min (100 x g) dans une centrifugeuse Sorvall SS-34. Après la centrifugation, la fraction surnageante a été jetée. La matière cellulaire obtenue (culots) a été lavée deux fois avec une solution de MEM, remise en suspension en milieu MEM et maintenue à 4 C. On a ajouté au tissu en dés restant une portion de 10 ml de SDT et on a fait incuber le tissu dans une secoueuse à métabolisme du type mentionné ci-dessus, excepté que la durée s'est élevée à 60 minutes. On a répété la centrifugation et rassemblé les cellules de nouveau en suspension. La viabilité des cellules a été déterminée par la méthode d'exclusion des colorants vitaux (vital dye exclusion method) / voir Exptl. Cell Res. 13, 341-347 (1957)7. Le nombre de cellules (cell count) a été déterminé dans un hématimètre. Les impuretés cellulaires constituant le stroma, par exemple les macrophages, les hématies, etc., ont été déterminées à l'examen visuel sous le microscope. La suspension cellulaire finalement obtenue était formée à plus de 99 % de cellules monodispersées avec environ % de contamination par des cellules-hôtes du stroma. Des rendements typiques de 3,0 g d'une tumeur B-16a ou 3LL se situaient entre 9. 108 et 1,3. 109 cellules tumo- rales viables. Les suspensions cellulaires de l'étape finale ont ensuite été soumises à une élutriation centrifuge en vue d'une séparation définitive. Lors de l'élutriation centrifuge, les cellules ont été soumises à l'intérieur d'une chambre de séparation à l'action de deux forces opposées, à savoir un champ centrifuge produit par un rotor en rotation et un contre-courant liquide dans la di- rection opposée (centripète). Un échantillon en suspension dans un milieu entre dans la chambre de séparation. Chaque cellule a tendance à émigrer vers une zone dans laquelle sa vitesse de sédimentation est exactement compensée par la vitesse d'écoulement du liquide à travers la chambre de séparation. La géométrie de la chambre produit un gradient de vitesse d'écoulement d'une extrémité à l'autre; des cellules ayant une large plage de vitesses de sédimentation différentes peuvent être maintenues en suspension. Par l'élévation graduelle de la vitesse d'écoulement du liquide d'élutriation (milieu de séparation) ou par l'abaissement de la vitesse du rotor, des populations successives formées de cellules de grandeur relativement homogène peuvent être extraites de la chambre par lavage. Chaque population contient des cellules qui sont plus grandes ou plus denses (c'est-à-dire qui se sédimentent plus rapidement) que celles de la fraction précédente. L'élutriation centrifuge a été effectuée par mise en suspension des cellules tumorales dans une "solu- tion de resuspension de tumeur" (SRT) qui avait la compo- sition suivante, rapportée à un litre. 9,5 g/l de "milieu essentiel minimal" (MEM) de Eagle stérile (Gibco), ml/l d'aminoacides non essentiels (Gibco), ml/1 de pyruvate de sodium, 0, 35 ml/1 de bicarbonate de sodium (15 mM), ,9 g/l de HEPES (25 mM) (Sigma chemical), unités/ml de pénicilline, 100 gg/ml de sulfate de néomycine. La suspension a été soumise à l'élutriation au moyen d'un rotor d'élutriation Beckman-JE-6 qui a été entratné à la vitesse de 2000 tr/min à 25 C dans une centrifugeuse Beckman-J -2-21. Un milieu de séparation formé d'une solution équilibrée de sels("Hanls Balanced Salt Solution"'a été introduite par pompage dans le système en utilisant une pompe à tuyau flexible du type Cole Palmer Master à tête de pompe n 7014. La botte de commande de la pompe a été modifiée au moyen d'un potentiomètre à 10 spires / voir Anal. Biochem. 98, 112-115 (1979)7. La vitesse de circu- lation a été mesurée à l'aide d'un débitmètre à double bille Brooks. On a préparé la solution de sels ajustée de Hank en prenant 900 ml de solution de composition indiquée ci-après et en mélangeant cette solution avec CaCl2.2 H20 comme décrit dans ce qui suit. g de NaCl 4 g de KC1 0,98 g de MgSO4 0,48 g de Na2HPO4 0,60 g de KH2PO4 On a complété 1,85 g de CaCl2.2 H20 à un volume de solution de 100 ml et on a mélangé cette solution avec les 900 ml indiqués ci-dessus. Environ 1 x 109 cellules ont été injectées dans la chambre de mélange par un raccord en Y placé dans le système d'alimentation. Après une période d'équilibrage de 15 minutes, les débris cellulaires ont été élués à une vitesse d'écoulement de 9 x 10 ml/min. Les cellules tumo- rales ont été éluées en six fractions de 50 ml chacune à des vitesses d'écoulementd'environ 12 à 18 ml/min. Les fractions 2 à 5 contenant les cellules tumorales ont été rassemblées1à nouveau centrifugées (100 x g) et remises en suspension dans 1 à 2 ml de la solution SRT décrite ci- dessus. On a généralement récupéré une proportion de à 75 % des cellules injectées dans la chambre de mélange. C. Action de la 3-méthyl-1-/2-(2-naphtyloxy)-éthyl7-2- pyrazoline-5-one sur la croissance et la métastase de cellules tumorales Les cellules de mélanome B-16a et de carcinome pulmonaire de Lewis obtenues de cette façon ont été utili- sées comme décrit ci-après pour éprouver l'activité anti- métastatique et antinéoplastique du composé de méthyl- pyrazolone. (1) Métastase Comme on l'a déjà constaté ci-dessus, la métastase est un phénomène particulier qui se r:.anifeste par une série de processus compliqués. Deux modèles trouvent actuel- lement une utilisation répandue pour l'étude de la métastase in vivo. Le premier modèle implique l'injection sous- cutanée de cellules tumorales à l'animal. L'injection sous- cutanée de cellules tumorales avec développement subséquent d'une tumeur primitive, suivi d'une métastase spontanée, est considérée comme métastase "totale". Un autre modèle implique l'injection des cellules tumorales dans la veine caudale. En raison de la complexité de la métastase, l'injection dans la veine caudale passe pour un modèle artificiel et partiel seulement, attendu que ce modèle ne reproduit que les processus de la dernière partie de la métastase. Toutefois, le modèle impliquant la veine caudale passe également pour un modèle extrêmement favo- rable en vue d'une normalisation des conditions expérimen- tales /-voir "Methods in Cancer Research", chapitre VII, Academic Press, Inc., 19787. Des souris C57B1/6J (non traitées) utilisées comme animaux témoins ont été soumises à des essais de métastase totale d'après le mode opératoire suivant. Des suspensions de cellules de mélanome B-16a et de carcinome 3LL, qui avaient été obtenues de la manière décrite en A et B ci-dessus, ont été injectées par voie sous-cutanée dans la région axillaire droite des màles de souris C57BL/6J (aiguille de 0,66 mm = n0 26; 0,2 mi). Diverses quantités des suspensions cellulaires dans la plage de 1 x 105 à 1 x 106 cellules ont été injectées. Des essais de métastase partielle ont été effectués par injection de cellules tumorales par la veine caudale aux souris témoins (non traitées). Les animaux ont été maintenus dans des conditions identiques en ce qui concerne la température, la durée d'action de la lumière, la nourriture, etc. Après un intervalle d'observation de 17 à 30 jours, les animaux utilisés pour la métastase totale et pour la métastase partielle ont été sacrifiés et des tissus des poumons, du foie, des reins, de la rate et du cerveau ont été prélevés. Le tissu prélevé a été fixé dans le liquide de Bouin. Le nombre de nodules métastatiques dans chaque organe a été déterminé à l'aide d'un microscope stéréo- scopique à zoom de Bausch et Lomb. La recherche des nodules métastatiques sur les souris témoins a donné des résultats positifs chez 100 % des animaux en ce qui concerne les tumeurs pulmonaires métastatiques; la durée d'incubation pour la production de ces métastases a été de 17 à 21 jours pour les cellules tumorales de 3LL et de 23 à 30 jours pour les cellules tumorales de B-16. Aucun nodule visible n'a été observé dans les tissus du foie, du rein, de la rate ou du cerveau. (2) Activité antinéoplastiaue L'activité antinéoplastique a été déterminée in vitro par mesure de la synthèse de 1'ADU'M tant des cellules du mélanome B-16a que des cellules du carcinome pulmonaire de Lewis par une méthode basée sur l'absorption de.thymidine. Des cellules qui synthétisent de l'ADN préalablement à la division cellulaire sont caractérisées Dar leur aptitude à absorber de la thvmidine. Par conséquent, la proliféra- tion cellulaire est en relation avec la synthèse de l'ADN. Le fait que la quantité d'ADN synthétisé par les cellules tumorales est réduite est un indice de ce que la division cellulaire et par conséquent la croissance de la tumeur ont été inhibées. L'activité antinéoplastique a été déterminée en outre par mesure directe de la croissance des cellules tumorales in vitro dans des cultures de tissus.Cette méthode utilise la technique du "plating" ou inoculation d'un milieu de culture avec un nombre connu de cellules tumorales et la détermination de l'effet de la présence du composé à éprouver sur la prolifération des cellules tumorales. Enfin, l'activité antinéoplastique a été déter- minée in vivo par une méthode selon laquelle des cellules tumorales ont été injectées par voie sous-cutanée aux souris et l'apparition de la croissance de cellules tumo- rales a été déterminée de même que le poids des cellules tumorales en multiplication chez des animaux témoins non traités et chez des animaux traités avec le composé de pyrazolone. L'action de la 3-méthyl-1-/ 2-(2-naphtyloxy)- éthyl7-2-pyrazoline-5-one sur la métastase engendrée par injection de cellules tumorales dans la veine caudale et l'action sur la métastase totale basée sur l'injection sous-cutanée de cellules tumorales sont illustrées res- pectivement dans les exemples 1 et 2. EXEMPLE 1I 3 mg de 3-méthyl-1-/-2-(2-naphtyloxy)-éthyl7-2- pyrazoline-5-one ont été mis en suspension dans 0,6 ml d'alcool éthylique absolu. On a dissous la pyrazolone en suspension en ajustant le pH à 9,5 avec NaOH. La concen- tration finale de la pyrazolone a été réglée par dilution de la solution avec une solution normale de chlorure de sodium (0,9 % de NaCl). Des souris-hôtes C57BL/6J syngéniques ont reçu pendant un intervalle de trois jours une injection quoti- dienne de 0,02 et de 0,08 mg/souris de composé de méthyl- pyrazole-5-one (par voie sous-cutanée). Le quatrième jour, on a injecté à chacune des souris préalablement traitées (et des souris témoins) une suspension, préparée de la manière décrite ci-dessus, de 5 x 104 cellules de tumeur B-16a, par la veine caudale. Les souris témoins et les souris traitées ont été maintenues dans des conditions identiques en ce qui concerne la tempé- rature, la durée d'action de la lumière, la nourriture, etc. Les souris ont été sacrifiées 14 jours après l'injection par la veine caudale et leurs tissus. pulmonaires ont été examines. L'effet de l'injection du composé de pyrazolone chez les souris une heure avant l'injection de cellules de tumeur B-16a a également été examiné. Comme le font apparaître les résultats repro- duits sur le tableau I, l'administration du composé de pyrazolone est efficace en ce que le nombre de colonies de tumeurs pulmonaires, c'est-àdire la métastase, est ainsi réduit d'une façon spectaculaire, à savoir tant au niveau de 0,08 mg qu'au niveau de 0,02 mg. On a supposé que le présent composé de pyrazolone stimulait la libération de prostacycline /-voir The Lancet, pages 518-520 (10 mars 1979)7. On admet qu'une élévation du taux d'acide adénosine-3',5'-phosphorique cyclique (cAMP) dans les plaquettes intervient dans l'action antithrombo- tique de la prostacycline. Il est également reconnu que des composés connus comme inhibiteurs de phosphodiestérase ralentissent la décomposition du cAMP. On devrait donc s'attendre à ce que du fait que des inhibiteurs de phospho- diestérase ralentissent la décomposition du cAMP, ils exaltent l'action d'un antithrombotique qui agit selon ce mécanisme. Attendu que des plaquettes peuvent également participer au mécanisme de la métastase, on a étudié le synergisme potentiel avec le composé de pyrazolone d'un inhibiteur de phosphodiestérase bien connu, à savoir la théophylline. Bien que les résultats montrent que l'action antirétastatique peut avoir été renforcée par la théophylline, un synergisme n'a pas été démontré avec certitude, en raison de l'erreur type liée à l'essai. TABLEAU I Effet de la 3-méthyl-1-/ 2-(2-naphtyloxy)-éthyl7-2-pyrazoline-5-one sur la métastase de cellules (a) de mélanome amélanotique B-16a injectées dans la veine caudale Colonies de tu- nmeurs du poumon Témoin 181 + 45b 0,02 mg de 3-méthyl-1-/ 2-(2-naphtyloxy) -éthyl17-2-pyrazoline-5-one 19,3 + 7,5 0,08 mg de 3-méthyl-1-/ 2-(2naphtytloxy)-éthyl7-2-pyrazoline-5-one 2,7 + 1,3 Théophylline 200 ggd 165 + 38 Théoplhyline 200.g + 0,08 mq de 3-méthyl-1-/-2-(2-naphtyloxy)- éthyl7-2-pyrazoline-5-one 33,6 + 18 0,08 mg de 3-méthyl-1-/ 2-(2naphtyloxy)-éthyl/-2-pyrazoline-5-one 65 + 36 a. 5 x 104 cellules injectées par voie intraveineuse dans 50 1l. b. x + erreur type; n = 6. c. Les animaux sont préalablement traités chaque jour pendant 3 jours avant l'injection des cellules tumorales. d. Injectée une heure avant les cellules tumorales. VI Ni %0 VL1 Traitement EXEMPLE 2 On a déterminé comme décrit ci-après l'effet de l'administration du composé de pyrazolone pendant un intervalle prolonaé sur le nombre de colonies pulmonaires métastatiques du mélanome B-16 et du carcinome pulmonaire a de Lewis. 3 mg de 3-méthyl-1-/-2-(2-naphtyloxy)-éthyl7-2- pyrazoline-5-one ont été dissous dans 0,6 ml d'alcool éthylique et le pH de la solution a été ajusté à 9,5 avec de la lessive de soude concentrée. Des souris-hôtes C57BL/6J syngéniques ont reçu par injection sous-cutanée une suspension de 1,8 x 105 cellules B-16a qui avait été préparée de la manière décrite ci-dessus. On a injecté par voie sous-cutanée à un autre i 5 groupe de souris-hôtes C57BL/6J syngéniques une suspension de 1 x 10 cellules de carcinome pulmonaire de Lewis, obtenue de la manière décrite précédemment. A partir du lendemain du jour d'injection des cellules tumorales, on a administré aux souris pendant 28 jours une injection souscutanée d'une dose quotidienne individuelle de 0,01 ou de 0,08 mgdu composé de pyrazolone. Les souris témoins et les souris traitées ont été maintenues dans des conditions identiques de température, de durée d'action de la lumière, d'alimentation, etc. Les souris auxquelles les cellules tumorales B-16a avaient été injectées ont été sacrifiées jours après l'injection des cellules tumorales; les souris auxquelles les cellules de carcinome pulmonaire de Lewis avaient été injectées, ont été sacrifiées 21 jours après l'injection des cellules tumorales. Les résultats expérimentaux obtenus à l'examen du tissu pulmonaire sont reproduits sur le tableau II suivant. TABLEAU II Effet de la 3-méthyl-1-/ 2-(2-naphtyloxy)-éthyl7-2-pyrazoline-5-one sur la métastase spontanée du mélanome (a) amélanotique B-16a et du carcinome (b) pulmonaire de Lewis injectés Traitement Colonies de tumeurs Colonies de tumeurs pulmonaires pulmonaires cellules B-16a cellules polmcnaires de Lewis Témoin 14,1 + 3,1 (12/12) 34,5 + 6,4 (12:12)C 0,01 mg de 3-mdthyl-1-/2-(2-naphtyloxy)- éthyl/-2-pyrazoline-5-one 1,7 + 0,7 (7/12) -- 0,02 mg de 3-méthyl-1-/2-(2-naphtyloxy)- éthyl7-2-pyrazoline-5-one 2,5 + 0,9 (7/12) -- 0,04 mg de 3-méthyl-1-/2-(2-naphtyloxy)- éthyl7-2-pyrazoline-5-one 3,1 + 0,8 (8/12) -- 0,08 mg de 3-méthyl-1-/2-(2-naphtyloxy)- éthyl/-2-pyrazoline-5-one 1,4 + 0,8 (5/12) 0,8 + 0,5 (2/12) a. Injection sous-cutanée de 1,8 x 105 cellules. b. Injection sous-cutanée de 1 x 105 cellules. c. Nombre de colonies de tumeurs en métastase à la surface bilatérale du poumon; X erreur type. d. Injection sous-cutanée quotidienne dans 0,2 ml. ru o Ln g, Comme le montrent les résultats d'essai rassemblés sur le tableau II, le nombre de colonies pulmonaires métasta- tiques tant du mélanome B-16a que du carcinome 3LL est réduit de façon spectaculaire par l'administration du composé de pyrazolone. En ce qui concerne la métastase du mélanome B-16ai * un niveau de dose de 0,01 mg s'est montré presque exacte- ment aussi efficace qu'un niveau de dose de 0,08 mg. Comme on l'a déjà représenté ci-dessus, l'injection sous-cutanée de cellules tumorales et le développement subséquent d'une tumeur primitive, suivi d'une métastase spontanée, sont considérés comme métastase "totale". Attendu que le mode opératoire de l'exemple 2 concernait cette métastase totale, le nombre de colonies de tumeurs pulmo- naires-présentes chez les animaux témoins a été plus faible que le nombre de ces colonies chez les animaux témoins de l'exemple 1, dans lequel la métastase se dévelop- pait par suite de l'injection des cellules tumorales dans la veine caudale. Toutefois, les résultats de l'exemple 1 aussi bien que ceux de l'exemple 2 ont montré que le composé de pyrazolone possédait une forte activité anti- métastatique. L'activité antinéoplastique du composé de pyrazo- lone a été déterminée par mesure de l'absorption de thymidine comme évaluation de la synthèse de l'ADN. EXEMPLE 3 On s'est procuré des cellules de mélanome B-16a et de carcinome pulmonaire de Lewis de la manière indiquée précédemment. Les cellules dispersées ont été diluées à une concentration de 1 x 105 cellules/ml en milieu MEM dans des fioles d'Erlenmeyer stériles en matière plastique, de 25 ml. De la thymidine marquée au-tritium (3H) ayant une activité spécifique de 1-,85 x 10 8 à 2,96 x 10 8 s 1/mmole (50-80 Ci/mmole) a été ajoutée avec une activité de 7,4 x 10 16 s 1/ml (2 ^Ci/ml) à chaque millilitre de suspension cellulaire. Le composé de pyrazolone a été ajouté en quantités de 0,1, 1,0, 10 et 25 g/ml du volume total à une série de fioles qui contenaient des cellules de mélanome B-16a et de carcinome pulmonaire de Lewis. On a ensuite fait incuber les fioles, conjointement avec des fioles témoins de cellules tumorales qui ne contenaient pas de composé de pyrazolone, à 370C dans un agitateur-secoueur à méta- bolisme Dubnoff (90 oscillations/minute). Quatre portions aliquotes de 1 ml ont été préle- vées à l'aide d'une pipette à des intervalles de temps de 4 heures et de 18 heures et introduites dans de petits tubes coniques en polypropylène de 1,5 ml. Les cellules ont été centrifugées par rotation pendant 8 minutes dans une "minicentrifugeuse" Brinkman (10 000 x g) pour former des culots de centrifugation. La fraction surnageante a été enlevée et jetée dans un récipient à déchets radio- actifs. Une quantité de 1,0 ml d'acide trichloracétique froid (6 % en poids/volume) a été ajoutée à chaque petit tube pour précipiter les protéines présentes, y compris l'ADN et l'ARN. On a fermé les petits tubes à l'aide d'un capuchon et on les a agités par un mouvement tourbillonnaire de manière à détacher les cellules les unes des autres par centrifugation comme décrit ci-dessus. Les culots obtenus contenaient la fraction insoluble dans l'acide, renfermant l'ADN. La liqueur surnageante contenant les composants insolubles dans l'acide a été jetée. L'intérieur de chaque petit tube a été essuyé à l'aide d'un bâtonnet à tampon d'ouate, afin d'éliminer la radioactivité en excès insoluble dans l'acide. Les culots ont été dissous dans chaque petit tube par addition de 50 il d'un solvant histologique que l'on peut se procurer auprès de la firme Amersham Corporation, Del., Arlington Heights, Illinois, sous la dénomination commerciale "NCS". On a fermé les petits tubes à l'aide de capuchons et on les a fait incuber à environ 50'C pendant environ 2 heures ou jusqu'à ce que les culots se dissolvent. Les pointes des petits tubes qui contenaient les culots dissous ont été détachées et leur contenu a été transféré dans des ampoules à scintillation. On a ajouté dans chaque ampoule à scintillation 3 ml d'un liquide visqueux à scintillation en mélange avec du xylène dans le rapport de 2:1. On a bouché et centrifugé chaque ampoule et on a déterminé la quantité de thymidine marquée par la radioactivité qui est absorbée par la synthèse de l'ADN. Les nombres de chocs par minute ont été corrigés à l'aide d'un calculateur Searle-PDS en faisant intervenir l'analyse de correction pour effet 'extincticn (muench-ccrrection analysis) et les résultats ont été exprimés par des pour- centages par rapport aux valeurs témoins. Les résultats expérimentaux obtenus sont repré- sentés sur la figure 1 du dessin annexé. Pour chaque concentration en pyrazolone, la quantité d'ADN synthétisé est rapportée au niveau 100 % pour l'échantillon témoin. Comme le fait apparaître la figure 1, le composé de pyrazo- lone a exercé-une réduction de la synthèse de l'ADN en fonction de la concentration, comme on l'a déterminé au moyen de l'absorption de 3Hthymidine. Cette réduction de la synthèse de l'ADN montre que le composé de pyrazolone possède une activité antinéoplastique. La mise en évidence de l'incorporation de thymidine à l'ADN a été effectuée de la manière décrite dans Biochem. and Biophysical Research Communications, 87, N 3, pages 795-801 (1979). Une autre preuve de l'activité antinéoplastique du composé de pyrazclone a été apportée par la mesure directe de la prolifération de cellules tumorales dans des cultures de tissus. EXEMPLE 4 Des cellules du mèlan.ome B-16a qui avaient été obtenues de la manière décrite ci-dessus ont été transplan- tées dans des boîtes de Pétri de 60 mm comportant un quadrillage, à une densité de 3 x 104 cellules par beote. Les cellules ont été cultivées dans un milieu formé de MEM, de solution basique de sels de Hank et de 10 % de sérum de foetus de veau, ce milieu pouvant être cbtenu auprès de la firme Microbiological Associates, Walkersville, Maryland, Après incubation pendant 24 heures à 37WC, les numérations cellulaires ont été effectuées par comptage visuel dans un microscope à inversion. Le milieu a été changé et remplacé par le milieu indiqué ci-dessus et par de la pyrazolone dans une plage de concentrations allant de 0,1 à 25 gg/ml. Un simple échange de milieu a été effectué pour les groupes témoins. Ensuite, le milieu contenant la pyrazolone a été remplacé tous les deux jours. Au bout de 8 jours, on a effectué des numérations cellu- laires de la manière indiquée ci-dessus et on a déterminé la viabilité des cellules d'après la méthode d'exclusion des colorants vitaux (vital dye exclusive method) mentionnée ci-dessus. Les résultats expérimentaux obtenus sont reproduits sur la figure 2 du dessin annexé. Ces résultats représentent la valeur moyenne du nombre de cellules + l'erreur - type, obtenu dans des essais parallèles portant sur six boites. Le nombre placé au-dessus de chaque trait transversal indique la viabilité des cellules, rapportée à une viabilité de 100 % des cellules. Les résultats montrent que le composé de pyrazo- lone a inhibé la prolifération des cellules tumorales dans la même plage de doses que celle dans laquelle le composé a également inhibé la synthèse de l'ADN. L'indice de viabilité qui s'est situé dans la plage de 96 + 0,9 à 94 + 0, 4, permet de reconnaître que l'effet antinéoplastigue du composé de pyrazolone ne repose pas sur la cytotoxicité du composé. Pour mesurer les effets antinéoplastiques du composé de pyrazolone, on a conduit un autre essai in vivo. EXEMPLE 5 3 mg de 3-méthyl-1-/2-(2-naphtyloxy)-éthyl7-2- pyrazoline-5-one ont été dissous dans 0,6 ml d'alcool éthylique et le pH de la solution a été ajusté à 9,5 avec de la lessive de soude concentrée. On a injecté à des souris-hôtes C57BL/6J syngé- niques, par voie sous-cutanée dans la région axillaire, 1 x 10 (0,2 ml) cellules du carcinome pulmonaire de Lewis. Pprès une période de 24 heures, le composé de pyrazolone a été administré chaque jour pendant 21 jours. L'effet de l'administration de théophylline conjointement avec le composé de pyrazolone a également été examiné. Pendant l'intervalle de temps, les souris ont été maintenues dans des conditions identiques de température, de durée d'action de la lumière, d'alimentation, etc. Les souris ont été sacrifiées 22 jours après l'injection des cellules tumorales et la présence de tumeurs sous-cutanées a été recherchée par un examen nécroscopique total. Les tumeurs présentes ont été retirées et pesées sur une balance analytique. Les résultats expérimentaux obtenus sont rassem- blés sur le tableau III suivant. TABLEAU III Effet de la 3-méthyl-1-/2-(2-naphtyloxy)-éthyl7-2-Pyrazoline-5-one sur la fréquence des tumeurs et sur le poids final, dans le carcinome pulmonaire de Lewis (a) Traitement Fréquence des tumeurs Poids (mg) Nombre % Témoin 25/27 93 3,98 + 0,39 0,01 mg de 3-méthyl-1-/2-(2-naphtyloxy)-éthyi7- 2-pyrazoline-5-one 3/12 25 0,74 + 0,46 0,02 mg de 3-méthyl-1-/2-(2-naphtyloxy)-éthyl7- 2-pyrazoline-5-one 4/12 33 0,49 + 0,27 0,08 mg de 3-mnéthyl-1-/2-(2-naphtyloxy)-éthyl7- 2-pyrazoline-5-one 1/12 8 0,16 250 gig de théophylline c 9/12 75 1,58 + 0, 42 250 gig de théophylline + 0,01 mg de 3-méthyl-1- /2-(2-naphtylcxy)-éthyl7-2-pyrazoline-5-one 2/12 17 0,21 + 0,15 250 gg de théophylline + 0,02 mg de 3-méthyl-1- /2-(2-naphtyloxy)-éthyl7-2-pyrazoline-5-one 0/12 0 -- a. 105 cellules 3LL viables ont été injectées par voie sous-cutanée (0,2 ml) dans la région axillaire. L'administration du médicament a débuté 24 heures plus tard. b. Injection quotidienne sous-cutanée dans 0,2 ml (dans la région du flanc). c. Injection intrapéritonéale quotidienne dans 0,4 ml. r..> o %O Comme le montrent les résultats des essais sur le tableau III, l'administration sous-cutanée du composé de pyrazolone a réduit tant la fréquence d'appa- rition que le poids des tumeurs du carcinome pulmonaire de Lewis; cela démontre l'activité antinéoplastique et corrobore les données in vitro des exemples 3 et 4. La théophylline a renforce apparemment l'action du composé de pyrazolone, peut-être par élévation de la quantité de cxMP. REVENDICATIONS 1. Médicament destiné à réduire la métastase et la croissance néoplastique chez des mammifères, caractérisé en ce qu'il est constitué par ou en ce qu'il contient une quantité thérapeutiquement efficace de 3méthyl-1-/2-(2-naphtyloxy)-éthyl7-2-pyrazoline-5-one ou de l'un des ses sels pharmaceutiquement acceptables. 2. Médicament suivant la revendication 1, caractérisé en ce qu'il est conçu pour l'administration par voie orale. 3. Médicament caractérisé en ce qu'il par voie parentérale. 4. Médicament caractérisé en ce qu'il suivant la revendication 1, est conçu pour l'administration suivant la revendication 1, contient en outre de la théophylline.