FR 2508646 A1 19821231 FR 8211192 A 19820625 Procédé et équipement pour la détermination des protéines glycosylées dans les fluides biologiaues. I 1 est extrêmement important de maintenir 'sous contrôle étroit la quantité de glucose dans le sang chez les diabétiques qui, comme on le sait, manifestent des variations de la glycémie dans un grand nombre de cas. Dans la mesure o l'évolution des complications secon- daires progressives des diabètes est étroitement en rapport avec la fréquence Cu contrôle du comportement métabolique du malade, des paramètres ont été recherchés qui puissent être capables de donner des résultats indépendants des variations rapides de la glycémiecomme mentionné dans la littérature, et qui soient engendrés par un certain nombre de variables. Une voie pour ladéter mination de l'état du contrôle de la glycémie chez ces patients consiste à mesurer les protéines glycosylées par voie nonenzymatique (Yue, K et al, Diabetes, 29: 296, 1980) Une réaction de ce genre est commune à un certain nombre de protéines et est un processus de blocage du glucose (Day, J F et al, J Biol Chem 254: 595, 1979). Le contrôle de ce procédé donne des indications importantes pour établir le degré de contrôle métabolique chez les diabétiques puisqu'il a été montré qu'une augmentation de la glycémie engendre une augmentation persistante du taux glycosylé. Pour la mesure,l'hémoglobine glycosylée (Hb A 1) peut servir comme moyen de contrôle à long terme de la glycémie puisque la vie de cette protéine est très longue (environ 120 jours) Par ailleurs, ce dosage peut s'avérer d'une faible utilité si on désire suivre les progrès d'un traitement thérapeutique Pour ce dernier but, il peut être plus intéres- sant d'évaluer le degré de glycosylation de l'albumine puisque sa durée de vie est plus courte aue celle del'hérmoglobine. l'hémoglobine glycosylée est isolée de l'hémoglobine totale par chromatographie par échange d'ions sur une résine faiblement acide,puis est ensuite mesurée par voie colorimétrique. L'H 1 b A peut égaleoent être déterminéeen dosant, par réaction avec l'acide thiobarbiturique (TBA),la quantité de -hydroxyméthylfurfural (HMF) qui est produit par traitement acide En rapport avec la glycosylation de l'albumine, ce paramètre a été évalué avec des procédés qui prévoient son Isolement par chromatographie d'affinité sur certains colorants particuliers, puis la détermination colorimétrique après la réaction avec le TBA ou;d'une autre manière,par chromatographie par échange d'ions,puis détermination par lecture de la densité optique des fractions ainsi obtenues. Une fois qu'il a été montré qu'une corrélation très étroite existe entre la quantité d'albumine glycosylée et la quantité de protéinessériqu Esglycosiléestoutes les deux étant examinées par voie colorimétrique, un pcocédé de dosage de ces dernières a été proposé, supprimant ainsi la séparation de l'albumine du sérum avec un avantage considérable à la fois du point de vue du temps nécessaire pour l'essai et de la simplicité du mode opératoire. D'une façon tout à fait regrettable, il a été montré plus tard dans ce dosage que le glucose libre (et également d'autres carbohydrates) est un facteur perturbateur et il est absolument nécessaire de l'éliminer. Pour pallieràcet inconvénient, Kennedy et al (Diabetes, 29: 413 ( 1980) ont proposé une dialyse de 15 heures à 4 C contre une solution saline appropriée Suivant ce procédé, le temps nécessaire pour l'analyse est considérablement prolongé et le procédé analytique devient plus compliqué. Pour résumer et en tenant compte de la condition de mise de côté du glucose sérique avant l'analyse, le procédé proposé par Kennedy et al peut être résumé comme suit: Réactifs Essai Essai Détails opératoires à blanc Sérum 1,0 Dialyse 15 heures Sérum dialysé 0,1 0,1 Solution çhysiologique(p H 7,4) 0,9 Solution physiologique +Na BH 4 0,9 Acide oxaliaue 1-molaire 0,5 0,5 Bain -ma rie bouillant pendant 5 heures Acide trichloracétique 1,0 1,0 Centrifugation Liquide surnageant 1,5 1,5 Acide thiobarbiturique Maintenu 30 minutes à 400 C (TBA) 0,5 0,5 Densité optique lue à 443 nm (microns) Le temps globalexigé pour l'analyse est de 21 à 22 heures (dont 15 sont nécessaires pour la dialyse) et les divers stades opératoires,même quand ils ne sont pas réellement difficilesmontrentau moins dans certains cas,des conditions qui ne s'accordent pas toujours à la routine coutumière. On a souligné précédemment jusqu'à un certain point que la détermination des protéines glycosylées par voie non- enzymatique est sujette à des erreurs d'analyse qui sont dues à des facteurs d'interférence et que la seule mesure corrective qui a été proposée par l'art antérieur est une dialyse prélimi- naire de l'échantillon. La présente invention fournit deux variantes pour la méthode indiquée précédemment, à savoir dansl'une,le stade final de la dialyse est remplacé soit par un stade enzymatique qui supprime les carbohydrates qui ne sont pas liés sur les protéineset dans l'autre l'essai est fait en présence de carbohydrate libre mais dans des conditions analytiques telles (par exemple hydrolyse contrôlée) que ces carbohydrates ne peuvent pas interférer Dans le dernier cas, l'hydrolyse acide est effectuée dans un temps égal à 2 heures 1/2 ou plus court aue cela Si la première de ces deux variantes est choisie, une incubation préliminaire de l'échantillon à examiner est aussi proposée. En fait, un premier objet de la présente invention est la fourniture d'un procédé amélioré pour doser les protéines glycosylées par voie non-enzymatique, présentés dans les fluides biologiques, entre autre dans le sérum sanguin, ledit procédé prévoyant une hydrolyse de l'échantillon à examiner dans un milieu acide et à une température supérieure à 80 C, ladite hydrolyse étant éventuellement précédée d'une incubation préli- minaire,et prévoit l'élimination du carbohydrate et/ou des substances p Detur: riees,la précipitation ultérieure des pro- téines, la séparation de la phase liquide et l'addition à cette dernière d'un réactif pouvant déceler les carbohydrates et/ou leurs dérivéstet la lecture finale des densité optiques à la fois de l'échantillon et de l'essai à blanc. L'élimination des carbohydrates et des substances pertur- bhatr Ices éventuelles de différente nature est effectuée plus par- ticulièrement selon deux directions qui seront décrites ci- après. Selon la première voie, toutes les protéines en jeu peu- vent être précipitées par addition d'agents de précipitation particuliers aui sont choisis parmi un certain nombre de réactifs: ceux-ci appartiennent aux classes des composés organiques tels que les alcools, les polyols, les composés carbonyle, les acides organiques ou leurs sels En plus les sels d'acide minéraux peuvent être également utilisés. Parmi les produits ci-dessus l'acide p-toluène sulfonique, l'acide trichloracétique, l'acide perchlorique, l'acétate d'ura- nyle, l'acide sulfosalicylique, le sulfate d'ammonium et le sulfate de sodium, sont préférés La température est maintenue à des valeurs qui sont celles du milieu ou plus basses. L'élimination des carbohydrates et/ou des autres substan- ces perturhatrlcespeut êtré effectuée par voie enzymatique éventuellement après avoir réglé le p H du milieu sanguin à une valeur appropriée Dans ce cas,des enzymes sont ajoutés (soit séparémment à des moments différents, soit ensemble mélangés entre eux qui ont été choisis d'une façon appropriée afin de convertir ces substances perturhatrl Icesen produits qui n'in- terfèrent plus. Do O Les enzymes peuvent être introduit: tels quels ou immobilisés convenablement,par exemple enfermés dans des fi- bres ou liés (par covalence ou autrement) à des substrats poly- mères naturels (ou synthétiques). Comme indiqué ci-dessus, les opérations reliées à l'élimination des substances prurbatrilespeuvent être précé- dées d'une incubation de l'échantillon en prévision d'éliminer les facteurs interférents éventuels qui troubleraients'ils venaient à etre libérés ensuite au cours du cycle analytique. Des exemples types sont les traitements préliminaires de l'échantillon avec des enzymes appropriés (tels que la syalidase, la aalactoxidase et dl-autres) ou avec des acides à une température allant de 800 C à 1000 Cet pendant un temps ne dépassant pas 30 minutes. Les acides à utiliser sont choisis de préférence dans le groupe constitué par les acides oxaliquel sulfurique, chlorhydrique, sulfosalicylique et p toluènesulfonique et des mélanges de ces acides entre eux et avec d'autres acides. Le procédé selon la présente invention se déroule ensuite avec un stade d'hydrolyse dans un milieu acide pen- dant une durée supérieure à 2 heures et demie et à une tempé- rature supérieure à 800 C Ensuiteles protéines sont précipi- pées et les mêmes agents de précipitation mentionnés ci-dessus peuvent être utilisés pour réaliser cela Ce stade est suivi de la séparation de la phase solide d'avec le liquide surna- geant, ce dernier étant à son tour séparé dehuftractions A une partie de la phase liquide,on ajoute un réactif détecteur des carbohydrates (et/ou un réactif pour la détection de leurs dérivés,tel que l'acide thiobarbiturique), tandis que l'eau est ajoutée à une autre partie de la phase liquide en question pour obtenir un essai à blanc si on n'utilise pas le Na BH 4. Finalement les densités optiques sont lues (à une longueur d'onde appropriée) à la fois pour l'échantillon et l'essai à blanc Le procédé qu'on vient de décrirecomme indiqué ci- dessus,peut être appliqué à la détermination des protéines glycosylées qui sont contenues dans les liqueurs biologiques de nature et d'origine quelconques. L'adoption de ce procédé s'est révélée être particu- lièrement avantageuse pour doser les protéines glycosylées qui sont contenues dans les échantillons de sérum sanguins et les auteurs de la présente invention, ont estimé utile de li- miter les exemples donnés ici à ce cas spécifique à cause de la nature extrêmement critique d'une telle application Toute- fois, l'utilisation du présent procédé sur des échantillons de différentes origines n'entraîne aucune difficulté quel- conqueet une quelconque extension de la méthode donnée en exemple ici sera une opération nettement routinière entrant dans le cadre et l'esprit de la présente invention. Si la méthode de dosage des protéines glycosylées est un premier objet de la présente invention, un second objet important est la fourniture de moyens à utiliser pour réaliser ce procédé Ces moyens consistent en un équipement qui contient, Isolés dans des récipients séparés,ou bien séparés maisrassemblés dans un seul récipient,des réactifs choisis parmi le groupe comprenant: a) des agents moyennement acidifiants b) des précipitants des protéines c) des agents réducteurs des cétones d) des agents détecteurs des hydrocarbonates et/ou de leurs dérivés. Plus particulièrement l'équipement de réactifs de diagnose selon la présente invention est composé,en tenant compte des indications données précédemment, d'acide oxalique ou d'acide acétique, d'acide trichloracétique (TCA) de borohydrure de sodium et d'acide thiobarbiturique (TBA). Les détails opératoires précédents et d'autres détails opé- ratoires apparaîtront au mieux en utilisant les exemples donnés à titre illustratif mais non limitaitf ci-après. EXEMPLE 1 Une portion de sérum équivalenteà 3,3 mg de protéines est diluée après addition de tracesd'alcool octylique, avec 1 ml de tampon phosphate 0,01 molaire, p H 7,4, contenant Na CI 0,15 molaire (PBS) et du borohydrure de sodium 0,85 molaire L'échantillon est laissé reposé à la température ordinaire pendant 1 heure,puis pendant 18 heures à 4 C Ce procédé est envisagé pour préparer l'essai à blanc. Une autre partie du sérum dans la même quantité de protéines est diluée avec 1 ml du tampon phosphate usuela p H 7 mais sans l'agent réducteur Les deux échantillons sont traités avec 1 ml de TCA à 40 % et,après un repos de 15 minutes à la température ordinaire,les échantillons sont centrifugés pendant 15 minutes à 2500 g ( 2500 fois l'accélération de la pesanteur) Le précipité,repris en suspension dans 1,5 ml d'acide acétique 2 fois normal, est maintenu 24 heures à C En refroidissant,la suspension est traitée avec 0,5 ml de TCA à 40 % et centrifugé pour récupérer le liquide surnageant clair Des portions de 1,5 ml chacune de la solution claire sont mises à réagir avec 0,5 ml de TBA pendant 30 minutes à C La différence entre les densités optiques (D O) prise à 443 nm de l'essai à blanc et de l'échantillon est reportée sur un graphique approprié,(un graphique d'étalonnage établi avec 5-HMF ( 5-hydroxyméthvlfurfural),de façon à ce que les millimoles de 5-HMF contenuesdans l'échantillon puissent être calculées Le procédé peut être résumé comme suit: Réactifs Essais à Echantillons Détails opératoires blanc Sérum 0,05 ml 0,05 ml PES 1 ml PBS+Na HBH 4 1 ml Laissé 1 h à la tem- pérature ordinaire plus 18 h à 4 C TCA à 40 % 1 ml 1 ml Centrifuger Acide acétique 2 N 1,5 ml 1,5 ml Maintenu 24 h à 1 CO C TCA 0,5 ml 0,5 ml Centrifuger Liauide 1,5 ml 1,5 ml surnageant TBA 0,5 ml 0,5 ml Lu à 443 nm après min à 40 C EXEMPLE 2 Un modèle opératoire peut être adopté qui comprend un traitement préliminaire pendant 15 minutes à 100 C puis la précipitation des protéines avec TCA (concentré à 40 %). Une portion de sérum ( 0,4 ml) est diluée dans un rapport allant de 1:2 à 1:20 ( 1:5 est préféré) avec de l'acide oxalique 0,6 normal directement dans un tube à essai muni d'un bouchon vissé ettout en agitant,on la maintient pendant 15 minutes à la- 1000 C Apres refroidissement à/température ordinaire, on ajoute 2 ml de TCA à 40 % L'échantillon est agité,laissé au repos pendant 15 minutes à la température ordinaire;puis centrifugé à 2500 g pendant 10 minutes Le liquide surnageant est rejeté le en laissant l'essai dns/%de retourné, reposerpendant quelques minutes sur des tampons de papier filtre On ajoute ensuite au résidu 2,8 ml d'acide oxalique 0,6 normal etaprès avoir scellé boullant les tubes à essai 1 on les maintient sur un bain-marie pe nnin/5 h. de façon à ce que le glucose lié aux protéines soit trans- formé en 5-hydroxyméthylfurfural ( 5-HMF) Les divers tubes à essais sont refroidis à la température ordinaire dans un bain d'eau pendant 10 minutes et 1 ml de TCA à 40 % est ajouté à chaque tube Apres 10 minutes supplémentaires à la tempéra- ture ordinaire, la centrifugation est effectuée à 2500 g Le liquide surnageant clair est recueilli et est divisé en deux portions de 1,5 ml chacune A une portion, on ajoute de l'acide thiobarbituriaue 0,05 molaire, tandis l'autre por- tion on ajoute seulement de l'eau, ceci est l'essai à blanc. Le dosage de la quantité de 5-HMF qui est contenu dans l'échantillon est effectué en calculant la différence entre les densités optiques respectives à 443 nm de l'échan- tillon et de l'essai à blanc,et en comparant la différence ainsi trouvée avec une courbe étalon obtenue avec du 5-HMF étalon. Le procédé selon cet exemple peut être résumé de la manière suivante Réactifs Détails opératoires Sérum 0,4 ml Acide oxalique 0,6-nor 1,6 ml 15 min à 100 C TCA à 40 % 2 ml Centrifuger Acide oxalique 0,6-nor 2,8 ml Maintenu 5 h à 1000 C TCA à 40 % 1 L O ml Centrifuger ECHANTILLON D'ESSAI ECHANTILLON TEMOIN Liquide surnageant 1,5 ml 1,5 ml TBA 0,5 ml - Eau 0,5 ml,D O lue à 443 nm après min à 40 C REVENDICATIONS 1 Procédé pour déterminer les protéines glycosylées contenues dans les fluides biologiques comprenant le traitement de l'échantillon à essayer dans un milieu acide à une température supérieure à 80 'C, précédé au non par une incubation pré liminai- re combinée avec l'élimination des carbohydrates et/ou d'autres substances perturbatr Icek la précipitation ultérieure des protéi- nes, la séparation de la phase liquide, l'addition à celle-ci d'un réactif décelant la présence des carbohycrates et/ou de leurs dérivés (échantillon), l'addition d'eau ou d'une solution appropriée une portion de la phase liquide (essai témoin) si on n'utilise pas l'agent réducteur,, Na BH 4 et la lecture finale des densités optiques de l'échantillon et de l'essai témoin. 2 Procédé pour déterminer les protéines glycosylées contenues dans les fluides biologiques selon la revendication précédente, caractérisé par le fait que le traitement acide de l'échantillon est la première opération et qu'il est effectué pendant une durée qui ne dépasse jamais 2 heures et demie. 3 Procédé pour déterminer les protéines glycosylées contenues dans les fluides biologiques selon la revendication 1, caractérisé par le fait qu'il comprend les stades suivants a) une incubation préliminaire de l'échantillon b) l'élimination des carbohydrates et/ou des substances perturbatrices c) le traitement acide du résidu du stade précédent pendant une durée supérieure à 2 heures et demie d) la précipitation des protéines e) la séparation ae la phase liquide avec le précipité f) l'addition à une portion de la phase liquide d'un réac- tif décelant les carbohydrates et/ou leurs dérivés g) l'addition d'eau ou d'une solution appropriée à une portion de la phase liquide dans les mêmes proportions que dans le stade précédent, et 6 h) la lecture de la densité optique de l'échantillon et de l'essai témoin. 4 Procédé pour déterminer les protéines glycosylées selon l'une quelconque des revendications précédentes, caracté- risé par le fait que le stade b) est effectué en précipitant les :: - protéines contenues dans l'échantillon. Procédé selon la revendication précédente, caractéri- sé par le fait que la précipitation est effectuée en ajoutant l'échantillon un agent de précipitation choisi parmi le groupe constitué par des composés organiques tels que des alcools, des polyols, des acides, des sels d'acides organiques, des composés carbonyle 6 Procédé selon la revendication précédentecaractérisé parle fait que la précipitation est effectuée en ajoutant des sels minéraux à l'échantillon. 7 Procédé selon la revendication 3, caractérisé par le fait que le stade b) est effectué en ajoutant les enzymes spécifiquesdes carbohydrates à éliminer, soit chacune seule individuellement, soit en mélange et/ou à des moments diffé- rents. 8 Procédé selon la revendication précédente,caractérisé par le fait que le stade b) est effectué en utilisant des enzymes immobilisés 9 Procédé selon la revendication 3, caractérisé par le fait que le stade d'incubation préliminaire est effectué à une température comprise entre 80 C et 1000 C. Procédé selon la revendication précédentecaracté- risé par le fait que l'incubation est effectuée en présence d'un acide choisi parmi le groupe constitué par les acides oxalique; acétique, sulfurique, chlorhydrique,sulfosalicylique, p.toluènesulfonique et des mélanges de ces acides. 11 Procédé selon la revendication 3, caractérisé par le fait que l'opération de précipitation de protéinesdu stade d) est effectuée en ajoutant un des agents précdipitants men- tionnés dans les revendications 5 et 6. 12 Equipement de réactifs de diagnostic pour la détermi&ú nation des protéines glycosylées dans les fluides biologiques comprenant seuls en récipient sépare ou bien sépare mais mssem- blés dans un seul récipient 1 les réactifs choisis parmi le groupe constitué par: a) des agents moyennement acidifiants b) des agents précipitant les protéines c) des réactifs pour déoeeler des carbohycrates et/ou leurs dérivés. il 13 Equipement selon la revendication précédente, caractérisé par le fait que les réactifs sont les acides oxalique, trichloracétique et thiobarbiturique.