FR 2499985 A1 19820820 FR 8202528 A 19820216 lc,25-dihydroxy-2 -fluorcvitamine D3. L'invention a pour objet un nouveau composé vitamine D. On sait que la vitamine D dirige le métabolisme du calcium et du phosphore chez les animaux et chez l'homme. Il est généralement accepté actuellement que l'action physio- logique de la vitamine D dépend du métabolisme de la vitamine à des formes hydroxylées. Ainsi, la vitamine D3 est hydroxylée in vivo en 25hydroxyvitamine D3 qui à son tour est transformée en lC,25dihydroxyvitamine D3. On pense que c'est ce dernier composé qui dirige de façon spécifique l'homéostasie du calcium et du phosphore, en favorisant le transport du calcium et du phosphore dans l'intestin et la mobilisation des minéraux de l'os. Par suite de leur activité biologique élevée, ces formes hydroxylées de la vitamine D sont importantes et ont trouvé utilisation dans le traitement de divers désordres osseux. On a trouvé que certains analogues, que l'on ne trouve pas dans la nature, de ces métabolites de vitamine D hydroxylée sont très actifs. On a découvert, selon l'invention, de nouveaux dérivés de la vitamine D3, qui présentent une activité biologique très élevée. Ce sont la loC,25dihydroxy-2p-fluorovitamine D3 ainsi que leur 1-, 3-, et 25-acylates, qu'on peut représenter par la formule: R 1RO OR2 F o R, R et R2, identiques ou différents, désignent l'hydrogène ou acyle ayant de 1 à 6 atomes de carbone. La 1,25-dihydroxy-2-fluorovitamine D3 peut être aisément piéparée à partir de la lcc-hydroxy-2p-flucrovitirine D3 par hydroxylation enzymatique in vitro de ce dernier coinpos; sur le carbone 25. Ceci peut être réalisé en faisant incuber ce composé avec un homogénéisat préparé à partir des tissus du foie de rats ayant une déficience en vitamineD, comme indiqué ci-après. La loL-hydroxy-2P-fluorovitamine D3 peut être obtenue par la synthèse de Oshida et al (Tetrahedron Letters, 21,1755-1756 (1980)). Des rats mâles qui viennent d'être sevrés sont nourris pendant un mois avec un régime déficient en vitamine D (Suda et al, J Nutr 100, 1049-1052, 1970). Ils sont ensuite tués, on retire leur foie et on en prépare un homo- nénéisat à ZO% (poids/volume) dans un tampon de phosphate 0,1 M (pH 4), refroidi avec de la glace, contenant 0,25 M de sucrose. L'incubation est mise en oeuvre dans un flacon Erlenmeyer de 125 ml contenant une partie alicote d'homo- généisat de foie représentant 1 g de tissu de foie, en suspension dans lO ml de milieu d'incubation composé des constituants suivants: 0,125 M sucrose, 50 mM tampon phosphate (pH 7,4), 22,4 mM glucose-6-phosphate, 20nl ATP, 160 mM nicotinamide, 25 mM succinate, 0,4 mM NADP, 5 mM MgC12, 0,1 M KC1, lOPg N,N'-diphényl-p-phénylènediamine et 0,5 unités glucose-6-phosphate-déhvdrogénase. La réaction est amorcée par addition de lOpg ot-hydro- xy-2r-fluorovitamine D3 dissous dans 25/,pl d'éthanol à 95%. On fait incuber le mélange à 37 C avec agitation à 100 oscil- lations/min., pendant 2 heures. On arrête la réaction par addition de 20 ml de méthanol et 10 ml de chloroforme. Après une nouvelle addition de 10 ml de chloroforme et de 6 ml de H20, on sépare la phase organique, on la fait évaporer et on soumet le résidu contenant la 1,25-dihydroxy-2tfluorovitamine D3 recherchée à la purification chromatographique. On redissout le résidu dans 1 ml de CHC13: hexane (65:35) qu'on applique à une colonne Sephadex LH-20 (0,7 x 14cm) rempli et équilibré avec le même solvant. On élue la colonne avec 36 ml du même solvant. On jette les premier 11 ml et on recueille et on fait évaporer les 25 ml suivants. On dissout ensuite le résidu dans du 2-propanol à 10% dans l'hexane et on soumet à une chromatographie liquide à haut rendement (modèle ALC/GPC 204, Waters Associates, Medford, MA, USA) utilisant une colonne Zorbax-SIL (4, 6 mm x 25 cm) (Dupont Inc, Wilmington, DE USA), en opérant à une pression de 70 kg/cm2 qui produit un débit de 2 ml/min. Le produit recueilli est à nouveau purifié par une chromatographie à haut rendement utilisant une colonne à base inversée (Richrosorb RP-18; 4,6 mm x 25 mm; E Merck, Darmstadt, RFA), en opérant à une pression de 91 kg/cm2. Le produit élué avec un mélange de solvant H20: méthanol (22:78) est recueilli, évaporé, et chromatographie une fois de plus sur une colonne Zorbax-SIL décrite cidessus, utilisant les mêmes conditions. Après un double recyclage, le produit pur est obtenu pour identifi- cation physique. Le composé présente un maximum d'absorption à 265 nm et un minimum à 228 nm, caractéristique pour la vitamine D, déterminé dans l'éthanol à 95% avec un spectrophotomètre enregistreur Beckman, modèle 24. Ces données indiquent la présence du chromophore 5,6-cis-triène. Le spectre de masse du produit contient un ion molé- culaire à m/e 434 requis pour la 1,25-dihydroxy-2f-fluoro- vitamine D3. Des ions fragments à m/e 416 et 398 représentent l'élimination d'une ou de deux molécules de H20. La perte de toute la chaîne latérale de stéroide (scission de la liaison C17/C20) donne le fragment à m/e 305,1equel par élimination d'une ou deux molécules i2O donne les pics à m/e 287 et 269. Le spectre montre aussi le fragment diagnostic lui-même à m/e 170 (noyau A + C6 + C7),lequel par élimination de H20 donne le pic à m/e 152, tandis que l'élimination alternative de HF donne le pic à m/e 150. De plus, le spectre montre un pic de fragment important à m/e 59 qui résulte de la scission + de la liaison C24/C25 et correspond au ion ((CH3)2C=OH). La présence de ce ion est caractéristique pour la vitamine D hydroxylée en position 25 et ainsi confirme la présence d'un groupe 25-hydroxy dans le produit obtenu. Ces données prouvent que le produit obtenu par hydroxylation enzymatique de la lU-hydroxy-2p-fluorovitamine D3 est la le,25-dihydroxy-2 - fluorovitamine D3. On peut obtenir aisément la]oc,25-dihydroxy-2f-fluoro- vitamine D3 sous forme cristalline par recristallisation à partir d'un solvant approprié ou d'un système de solvant, par exemple l'éthanol. Les dérivés acylés de la 1l,25-dihydroxy- 2-p-fluorovitamine D3 peuvent être facilement préparés par acylation du composé avec des anhydrides d'acyle ou des halogénures d'acyle. Ainsi, la réaction de la ln,25-dihydroxy- 2tfluorovitamine D3 avec l'anhydride acétique dans la pyridine, à la température ambiante, fournit le dérivé 1,3- diacétate, tandis que la réaction à températures élevées (60-100 C) conduit au composé 1,3,25-triacétylé correspondant. En outre, il est possible d'hydrolyser sélectivement certains groupes acyle du dérivé triacylé pour obtenir d'autres produits partiellement acylés. Par exemple, l'hydrolyse basique (KOH/MeOH, à 30-50 C, pendant 1-2 h) donne la IJ,25-dihydroxy-2 ffluoro- vitamine D3-25-monoacétate que l'on peut acyler pour introduire différents groupes acyle en position C-1 et C-3. Il est ainsi évident que par combinaison de réaction d'acylation et/ou d'hydrolyse, on peut préparer une variété de dérivés partiel- lement ou totalement acylés, les groupes acyle étant les mêmes ou différents. L'activité biologique des nouveaux composés analogues peut être démontrée par des essais in vivo chez le rat. Des rats mâles qui viennent d'être sevrés sont alimentés avec un régime à faible teneur en calcium, déficient en vitamine D (J. Nutr. 100, 1045-1052, 1970), pendant 3 semaines. Onles utilise ensuite dans trois groupes de 5-6 rats chacun. On administre aux rats du groupe témoin 0,05 ml d'éthanol 95% par injection intrajugulaire. On administre aux rats du second groupe, de la même façon, une dose de 650 pmole de 1l,25-di- hydroxy-2 t-fluorovitamine D3 (lOC,25-(OH) 2-2e-F-D3) dissous dans 0,05 ml d'6thanol à 95%, tandis qu'on injecte aux rats du troisième groupe une dose de 650 pmole de lo,25-dihydro- xyvitamine D3(lo,25-(OH)2D3), en vue d'essais comparatifs. Vingt quatre heures après l'administration, on détermine l'effet des composés essayés sur le transport du calcium intestinal et sur la mobilisation du calcium osseux (mesuré par l'élévation de la concentration du calcium dans le sérum) par des procédés selon Martin & DeLuca(Am. J. Physiol. 216, 1351-1359 (1969)) et selon Tanaka et al. (Biochemistry 14, 3293-3296 (1975)) respectivement, les résultats étant les suivants: Activité biologique de l",25-(OH)2-2P-F-D3 Composé Transport du calcium Mobbilisation du intestinal calcium osseux (Ca séreuse/Ca muqueuse) Calcium dans le sérum (mg/100 ml) EtOH(contrôle) 3,4 + 1,0*'a 4,3 + 0,1 l,25-(OH)2-2-F-D3 6,0 + 06 5,1 + 0,4 lc(,25-(OH)2D3 5, 3 + O,9 5,1 + 0,3e 2, +03e Déviation normale de la moyenne Unification de la différence: b à a, p p Les données précédentes indiquent que la 1,25-dihydro- x.-2(-fluorovitamine D3 est active à la fois dans l'intestin e dans les os et qu'en outre, ce nouveau composé est au moins si efficace que la l, 25-dihydroxyvitamine D3 que l'on considère comme le métabolite connu le plus actif de la vitamine D3, rendant ce composé approprié pour le traitement de désordres osseux. On peut administrer aisément la 1,25-dihydroxy-Zp-fluoro- vitamine D3 par injection de solutionsparentéralesstérilE ou par le canal alimentaire sous forme de dosesorales ou par des suppositoires. Des doses d'environ O,1 pg à environ 2,5 pg/ jour apparaissent efficaces pour obtenir des réponses d'équi- libre de calcium physiologique caractéristiques de l'activité du type vitamine D, les doses d'entretien d'environ 0,1 à environ O,5pm étant appropriées. On peut préparer des doses administrables du composé en combinant ce dernier avec un véhicule connu non toxique pharmaceutiquement acceptable. De tels véhicules peuvent être, soit des solides, soit des liquides, par exemple l'nMine de mais, le lactose, le sucrose, l'huile d'arachide, l'huile d'olive, l'huile de sésame et l'eau. Si l'on utilise un véhicule solide, les composés peuvent être administrés sous forme de comprimés, capsules, poudres, pastilles. Lorsqu'on utilise un véhicule liquide, les formes administrées peuvent se présenter sous forme de capsules de gélatine, des suspensions liquides ou sirops, des émulsions ou solutions. Les formes administrées peuvent également renfermer des adjuvants tels que des agents conservateurs, des stabili- sants, des mouillants, des émulsifiants, des activateurs de dissolution ainsi que d'autres substances thérapeutiquemrent utiles. Il est bien entendu que malgré l'indication de doses générales, des doses particulières peuvent être administrées selon la maladie spécifique et l'état du malade, le résultat recherché ainsi que d'autres facteurs connus desmédecins. Z499985 REVENDI CATIONS 1. Composé de formule: OP] RO o R, R1 et R2, identiques ou différents, désignent hydrogène ou un groupe acyle ayant de 1 à 6 atomes de carbone. 2. Composé selon la revendication 1, caractérisé par le fait que le groupe acyle est un groupe acétyle. 3. lk,25-dihydroxy-2 -fluorovitamine D3. 4. Le composé de la revendication 3 sous forme cristalline. 5. Procédé de préparation d'un composé selon l'une quelconque des revendications 1 à 4, caractérisé par hydro- xylation enzymatique de la Ym-hydroxy-2 -fluorovitamine D3 en position C-25 et éventuellement acylation du produit.