FR 2508487 A1 19821231 FR 8211073 A 19820624 La présente invention concerne un procédé de dosage pour un composant dans un échantillon, par exemple un acide gras libre, un acide gras libre libéré à partir d'un ester d'acide gras, un ester d'acide gras, ou une activité enzyma- tique qui génère un acide gras libre à partir d'un ester d'acide gras L'invention comprend également un procédé pour la production d'une enzyme ayant les activités de l'énoyl- Co A-hydratase, de la 3-hydroxyacyl-Co A-déshydrogénase et de la 3cétoacyl(Co A-thiolase dans une seule protéine enzymatique utilisée à cet effet. Les enzymes connues gusqu'à présent pour la e-oxyda- tion des acides gras et leurs actions enzymatiques sont les suivantes: 15 lRéaction I: acyl-Co A synthètase, EC 6 2 1 3 l R-CH 2-CH 2-COOH + ATP + Co ASH R-CH 2-CH 2-CO-S Co A + AMP + P Pi. lRéaction II: acyl-Co A déhydrogénase, EC 1 3 99 3 l (ou acyl-Co A oxydase) R-CH 2-CH 2-CO-S Co A2 H 2 e R-CH=CH-CO-S Co A Réaction III: énoyl-Co A hydratase, EC 4 2 1 17 l R-CH=CH-CO-S-Co A + H 20 X R-CH-CH 2CO-S Co A OH lRéaction IV: 3-hydroxyacyl-Co A dehydrogénase, EC 1 1 1 35 l R-CH=CH-CO-S Co A + NAD + R-C-CH-CO-S Co A + NADH + H I i OH O lRéaction V: 3-cétoacyl-Co A thiolase, EC 2 3 1 16 l R-C-CH 2-CO-S Co A + Co SH t R-C-S Co A + CH 3-C-S Co A I Il O 0 O Jusqu'à présent les dosages enzymatiques des acides gras dans un spécimen de sérum sont connus sous la forme suivante. On traite un spécimen contenant un acide gras libre avec de l'acyl-Co A-synthétase enprésence de Co ASH (coenzyme A) et d'ATP (adénosine triphosphate) pour générer de l'acyl- Co A, de l'AMP (adénosine monophosphate) et du pyrophosphate. On traite l'AMP formé avec une activité de myokinase en présence d'ATP pour former deux rapports molaires d'ADP (adénosine diphosphate) à partir d'un rapport molaire d'AMP. En outre on traite l'ADP ainsi formé avec du phosphoénolpyru- vate en présence d'une activité de pyruvate kinase pour former de l'ATP et du pyruvate que l'on traite avec de la lactate déshydrogénase et du NAS réduit (nicotine adénine dinucléotide) pour libérer le lactate et le NAD, la quantité de NAD réduit consommée étant mesurée par photométrie avec diminution de la densit 6 optique à 340 nm, et on calcule ainsi les deux rapports molaires de NAS réduit consommé à partir d'un rapport molaire d'acide gras lAnalytical Biochemistry, 98, 341-345 ( 1979 l. On connaît un autre procédé de dosage d'un acide gras libre. On fait réagir l'acide gras libre avec du Co ASH et de l'ATP en présence d'acyl-Co A-synthétase pour former de l'acyl- Co A, de l'AMP et du pyrophosphate L'acyl-Co A formé consomme de l'oxygène en présence d'acyl-Co A-oxydase pour former du 2,3-trans-énoyl- Co A et du peroxyde d'hydrogène On fait réagir le peroxyde d'hydrogène ainsi formé avec de la 4-amino- antipyrine, du 2,4-dibromophénol et de la peroxydase pour former un complexe coloré que l'on mesure par colorimétrie lAnal Biochem, 108, 6-10 ( 1980)l. Ces procédés de dosage ont un certain nombre d'incon- vénients Dans un procédé utilisant l'activité d'acyl-Co A- oxydase, on réduit le peroxyde d'hydrogène formé avec Co ASH et la seconde étape réactionnelle doit être conduite après qu'o, ait remplacé le Co ASH restant de la première étape réactionnelle vers une substance non réductrice par du N- éthylmaléimide La réaction simultanée est donc impossible. Un autre inconvénient est que l'activité de lipase dans le sérum est très faible et donc que la quantité-d'acide gras libre libérée à partir d'ester d'acide gras, substrat du dosage de l'activité de lipase, est très faible Ces procédés ne peuvent pas fournir un procédé de dosage sensible Dans le premier procédé de dosage, la détermination quantitative de la quantité diminuée de 2 rapports molaires de NAD réduit à partir d'un rapport molaire d'acide gras présente une sensibilité insuffisante. On a trouvé que l'on peut doser de façon avantageuse l'acide gras libre ou l'acide gras libre libéré à partir de son ester dans l'échantillon par la combinaison des procédés dans lesquels on transforme l'acide gras en acyl-Co A, qui est transformé en déshydroacyl-Co A, on transforme le déshydroacyl-Co A en hydroxyacyl-Co A, on transforme l'hydroxy- acyl-Co A en cétoacyl-Co A, et en transformant le cétoacyl- Co A en acyl-Co A. L'acyl-Co A produit dans l'étape réactionnel finale possède un acyl-Co A dans lequel le groupe acyle est plus court de 2 atomes de carbone par comparaison avec l'acide gras dans l'échantillon Ledit acyl-Co A est également décomposé en déshydroacyl-Co A, hydroxyacyl-Co A et cétoacyl- Co A pour constituer le cycle qui forme un acide gras plus court de 2 atomes de carbone. Ledit cycle indique le cycle d'ordre supérieur selon le nombre de carbones de l'acide gras dans l'échantillon. Dans les réactions cycliques d'ordre élevé, mnpeut détecter des rapports molaires supérieurs des composants qui se forment ou qui sont consommés en partant d'un rapport molaire d'acide gras, sous forme de modifications détectables par divers procédés. Dans ce procédé de dosage, l'acide gras dans l'échan- tillon est décomposé comme suit. (a) l'acyl-Co A est formé par l'action de l'activité d'acyl- Co A-synthétase en présence d'ATP ou de GTP et de Co ASH; (b) l'acyl-Co A est changé en déshydroacyl-Co A par l'activité d'acyl-Co A-oxydase et l'oxygène; (c) le déshydroacyl-Co A est changé en hydroxyacyl-Co A par l'activité d'énoyl-Co A-hydratase et l'eau; (d) l'hydroxyacyl-Co A est transformé en cétoacyl-Co A par le NAD et l'activité de 3-hydroxyacyl-Co A déshydrogénase; et (e) le cétoacyl-Co A est transformé en un acyl-Co A ayant deux atomes de carbone de moins par Co ASH et la 3-cétoacyl-Co A- thiolase L'acyl-Co A ainsi produit est à nouveau décomposé par l'intermédiaire d'un cycle de 0-oxydation o l'on détecte les changements détectables dans le cycle. On a également trouvé qu'une souche bactérienne appar- tenant au genre Pseudomonas, isolée à partir d'un échantillon de sol recueilli dans un verger de pêchers à Sudama-cho, Kitakoma-gun, Yamanashiken au Japon produit une enzyme ayant des activités enzymatiques multiples d'énoyl-Co*A hydratase de la réaction III ci-dessus, de 3- hydroxyacyl-Co A déshydrogénase de la réaction IV ci-dessus et de 3-cétoacyl- Co A thiolase de la réaction V ci-dessus, dans une seule protéine enzymatique (désignée ci-dessous comme enzyme multi-active), et que ladite enzyme multi-active peut êitre appliquée pour un dosage d'acide gras. La souche bactérienne B-0771 a les propriétés taxono- miques suivantes: (A) Observation macroscopique: ( 1) Plaque de gélose nutritive: Colonies convexes, rondes, bords lisses, semi-lustrées, blanc grisâtre à Jaune pâle Pas de formation de pigment soluble. ( 2) Culture en biseau sur gélose nutritive: Bonne croissance linéaire Semi-lustrée,: blanc grisâ- tre à Jaune pâle Pas de formation de pigment soluble. ( 3) Culture liquide: Précipitation d'un trouble homogène Pas de formation de capsule. (B) Observation microscopique: Bacilles droits ou légèrement courbés Chaines uniques ou doubles, quelquefois longues 0,4-0,6 x 0,5-3,0 pm. Motiles avec flagelle polaire Pas de formation de spore. (C) Caractères physiologiques et biochimiques: Coloration de Gram - Test O F O Catalase + Oxydase + Lécithinase Uréase milieu SSR - milieu de Christensen + Hydrolyse de la gélatine Hydrolyse de l'amidon Hydrolyse de la caséine Hydrolyse de l'esculine - Hydrolyse de l'arginine + Accumulation de poly-B- hydroxybutyrate (PHB - Formation d'indole - Formation de sulfate acide - Formation d'acéto Ine - Test MR - Réduction du nitrate - Utilisation du citrate + Formation d'acide à partir du sucre: Formation d'acide, pas de formation de gaz: L(+)arabinose,-cellobiose, fructose, fucose, galactose, glucose, glycérine, lactose, maltose, mannose, mélibiose, rhamnose, saccharose, tréha- lose, xylose. Pas de formation d'acide, pas de formation de gaz: Adnitol, dulcitol, méso-érythritol, inositol, inuline, mannitol, mélézitose, raffinose, salicine, sorbose, sorbitol, amidon. Comme il est dit ci-dessus, la souche B-0771, ayant des propriétés de Gram-négativité, de motilité avec un flagelle polaire, étant positive visà-vis de la catalase et de l'oxidase, avec la nature aérobie de la décomposition oxydative du glucose, est reconnue comme microorganisme appartenant au genre Pseudomonas. Si l'on se réfère à la description se rapportant à Pseudomonas fragi dans J Gen Microbiol, 25, 379-408 ( 1961), les Bouches sont identiques comme on le voit ci-dessous: Souche Pseudomonas B-0771 fragi Décomposition de l'arginine + + Accumulation du PHB Liquéfaction de la gélatine - Hydrolyse de l'amidon Hydrolyse de la caséine Décomposition de lresculine - Formation d'indole Formation d'H 2 S Formation d'acétoine Réduction du nitrate d Utilisation du citrate + + En outre, on procède à des études comparatives de la souche B-0771 et de la culture type Pseudomonas fragi ATCC 4973. Le résultat est donné au Tableau 1. Tableau 1 Souche Pseudomonas fragi B-0771 ATCC 4973 Coloration de Gram Motilité + + Flagelle polaire polaire Test O F O O Catalase + + Oxydase + + Uréase SSR/Christensen -/(+) -/(+) Décomposition de l'arginine + Hydrolyse de l'amidon Liquéfaction de la gélatine Hydrolyse de la caséine Décomposition de l'esculine Formation d'indole Formation d'H 2 S Formation d'acéto Ine Réduction du nitrate Utilisation du citrate + + Formation d'acide à partir de sucre: Adonitol L(+) arabinose + Cellobiose + + Dulcitol Mésoérythritol Fructose + + Fucose + + Galactose + + Glucose + + Glycérine (+) + Inositol Inuline Lactose + + Maltose + + Mannitol Mannose + + Mélézitose Mélibiose + + Raffinose L(+) rhamnose (+) + Salicine L-sorbose Amidon Saccharose + + Tréhalose + + Xylose + + Comme on le voit dansle tableau ci-dessus, la souche B-0771 a des propriétés taxonomiques semblables à celles de la souche de culture type Pseudomonas fragi ATCC 4973. La souche B-0771 est désignée comme Pseudomonas fragi B-0771 et a été déposée au Fermentation Institute, Agency or Industrial Technology & Sciences, HM I T I, Japon avec dans sa collection de cultures permanentes n OFERN-P ne 5701. L'invention a été réalisée selon les connaissances exposées ci-dessus. L'inventon a pour objet de fournir un procédé de dosage pour un composant dans un échantillon comprenant les processus réactionnels suivants: (a) un procédé transformant l'acide gras en acyl-Co A; (b) unprocédé transformant l'acyl-Co A en déshydroacyl-Co A; (c) un procédé transformant de déshydroacyl-Co A en hydroxyacyl-Co A; (d) un procédé transformant l'hydroxyacyl-Co A en cétoacyl-Co A; (e) un procédé transformant le cétoacyl-Co A en acyl-Co A; et un procédé détectant les changement détectables. Un autre objet de l'invention est de fournir une com- position pour dosage comprenant au moins: ATP ou GTP; Co ASH; NAD; acyl-Co A-s&nthétase; acyl-Co A-oxydase; énoyl-Co A-hydratase; 3-hydroxyacyl-Co Adéshydrogénase; et 3-cétoacyl-Co A-thiolase. L'invention a encore pour objet de fournir un procédé de production d'uneenzymemultiactive dans lequel on cultive un microorganisme producteur d'enzyme multiactive appartenant au genre Pseudomonas et on isole l'enzyme ainsi obtenue. Un échantillon à doser dans l'invention est au moins un échantillon contenant un acide gras Comme exemples d'acides gras on peut citer l'acide caprolque en C 6, l'acide ca- prylique en C 8, l'acide caprique en C 10, l'acide laurique en C 12, l'acide myristique en C 14, l'acide palmitique en C 16, l'acide palmitoléique, l'acide stéarique en C 18, l'acide oléique, l'acide linolique ou l'acide linolénique. D'autres exemples d'acides gras à analyser sont les acides gras libres ou les esters d'acides gras comme composants dans lesproduits laitiers comme le beurre, la margarine, le fromage, le jambon, le lait ou la mayonnaise; les acides gras libres ou les esters d'acides gras dans un spécimen comme le sang et l'urine; les produits de réaction provenant d'une action enzymatique sur ces corps; l'acide gras libre ou son sel et l'ester d'acide gras comme composants dans la préparation des médicaments; ou l'acide gras comme substrat pour un réactif enzymatique commercial ou l'acide gras libéré à partir de l'action d'un réactif enzymatique du commerce. On peut libérer l'acide gras à partir de l'ester d'acide gras par saponification alcaline en utilisant de l'hydroxyde de sodium ou de l'hydroxyde de potassium, ou par action enzymatique. Dans la combinaison de l'ester d'acide gras et de l'activité enzymatique sur ce corps pour générer l'acide gras, on peut doser l'ester d'acide gras après avoir généré l'acide gras, et on peut également doser l'activité enzymatique en dosant l'acide gras libéré à partir de l'échantillon contenant l'ester d'acide gras Ladite combi- naison ne peut être limitée, et on peut inclure toute combinaison qui libère un acide gras. Dans la combinaison, cet ester d'acide gras est un triglycéride comme le monoglycéride, le diglycéride ou le triglycéride, et l'activité enzymatique est l'activité de lipase; on peut doser le glycéride ou l'activité de lipase en déterminant l'acide gras libéré à partir du glycéride. On applique ces dosages pour le dosage des tri- glycérides dans le sérum et le dosage de la pipase pancréa- tique dans le sérum Dans ce dernier cas, on peut préve- nir un trouble dans le système réactionnel en utilisant de préférence un mono ou un diglycéride et on ajoutant de l'albumine comme l'albumine de boeuf. On trouvera ci-dessous un exemple de système de com- binaison d'ester d'acide gras et d'enzyme agissant sur ledit ester d'acide gras. Ester d'acide gras lécithin e lysolecithine phosphatidate lécithine lcithine Activité enzymatique: phospholipase A 1, phospholipase A 2 ou phospholipase B lysophospholipase phosphatidate phosphatase et lipase phospholipase C et lipase phospholipase D, phospha- tidate phosphatase et lipase acylcholine choline estérase ester de cholestérol lécithine et cholestérol cholestérol estérase lécithine cholestérolacyl- transférase, cholestérol estérase ou lysophospho- lipase. On peut doser les composants qui sont en relation avec l'acide gras comme les substrats et enzymes ci-dessus en dosant l'acide gras Dans les systèmes qui libèrent un acide gras, on choisit comme on le désire les quantités de réactif utilisées en fonction de l'ob Jectif et des conditions réactionnelles, et en principe la quantité d'acide gras libérée par la réaction suffit La température réactionnelle pour libérer l'acide gras est habituellement d'environ 37 C, et la durée de réaction doit naturellement être suffisante pour libérer l'acide gras, et dépasse une minute. On trouvera ci-dessous des mode de réalisation des procédés réactionnels (a), (b), (c), (d) et (e) cl-dessus. (a) Procédé réactionnel changeant l'acide gras en acyl-Coà: Ainsi on peut mentionner un procédé réactionnel consie- tant en une activité d'acyl-Co A-synthétase qui catalyse une réaction à partir d'acide gras, d'ATP et de Co ASBH en acyl-Co A, AMP et pyrophosphate (P Pi), ATP et Co ASH. R-CH 2-CH 2-COOH + ATP + Co ASH (acide gras) o acyl-Co A synthétase ' RCH 2-CH 2 SCA + AMP +Pl (acyl-Co A) (b) Procédé réactionnel changeant l'acyl-Co A en déshyroacyl- Co A: On peut mentionner par exemple un procédé riactionmel consistant en une activité d'acyl-Co A oxydase qui catalyse une réaction à partir d'acyl-Co A et d'oxygène en désbydroacyl- Co A et peroxyde d'hydrogène, avec oxygène. O o R-CH 2-CH 2-C-S Co A + 02 (acyl-Co A) g acyl-Co A oxydase R-CH=CH-C-S Co A + H 202 acyl-Co A oxyase (diydroacyl-Co A) (c) Procédé réactionnel changeant le déshydroacyl-Co A en hydroxyacyl-Co A: Ainsi on peut mentionner m procédé réactionnel consistant en une activité d'énoyl-Co Ahydratase qui catalyse une réaction à partir de déshydroacyl-Co A en hydroxyacyl-Co A en présence d'eau, avec l'eau. on fi R-CH=CH-C-S Co A + H 20 (d&hydroacyl-Co A) OH O à O énoyl-Co A hydratase R-CH-CH 2-C-S Co A (hydroxyacyl-Co A) (d) Procédé réactionnel changeant l'hydroxyacyl-Co A en cétoacyl-Co A: Ainsi on peut mentionner le procédé réactionnel dans lequel la 3-hydroxyacyl-Co A-déshydrogénase catalyse une réaction à partir d'hydroxyacyl-Co A et de NAD en cétoacyl- Co A et NAD réduit, avec du NAD. OH O l I{ R-CH-CH 2-C-S Co A + NAD (hydroxyacyl-Co A) O O I l Il 3-hydroxyacyi-Co A R-C-CH 2-C-S Co A + NAD réduit dàhydrogenase Les enzymes utilisées dans les procédés ci-dessus peuvent être des enzymes provenant d'animaux ou de microorga- nismes On peut utiliser des enzymes que l'on trouve dans le commerce et des enzymes que l'on isole quelle que soit leur origine. On trouvera cidessous des modes de réalisation pour l'origine de l'acyl-Co A-synthétase. Foie de cobaye lJ Biol Chem, 204 329 ( 1953); foie de rat, de souris, de boeuf, de porc (brevet Japonais non soumis à l'inspection publique, n 5574791); Escherichia coli lEur J Biochem, 12, 576 ( 1970)l; Bacillus megaterium lBiochem, 4 ( 1), 85 ( 1965)l; Aerobactoer aerogenes IFO 3318, Seratia marcescens IFO 3052, Proteus mirabilis IFO 3849, Staphylococcus aureus IFO 3060, Pseudomonas aeruginosa IFO 3919, Fusarium oxysporum IFO 5942, Gibberella fujikuroi IFO 6604 et Candida lipolytica IFO 0717 lJ Bacteriol, 105 ( 3), 1216 ( 1971), ibid, 114 ( 1), 249 ( 1973), Brevet Japonais non soumis à l'inspection publique No 55-74790, ibid N 55-99187 l. Un autre mode de réalisation d'acyl-Co A synthétase est une enzyme qui catalyse une réaction à partir d'acide gras, de GTP et de Co ASH en acyl-Co A, GDP et orthophosphate. lfoie de boeuf, J Biol Chem, 239 ( 6), 1694 ( 1964)l. Comme modes de réalisation pour l'origine de l'acyl- Co A oxydase, on peut citer: foie de rat I Biochem Biophys Res Comm, 83 ( 2), 479 ( 1978)l; Candida utilis, Candida lipolytica IFO 1548, Candida tropi- calis IFO 0589, Saccharomyces cerevisiae IFO 0213, Saccharo- myces cerevisiae Y 0036 FERM-P No 5174 (DSM 2138) lBrev Jap. non soum à ins publ No 56-61991 l; Eupenicillium javanicum IFO 7992, Monascus sp M-4800 FERM-P No 5225 (DSM 2136) libid, No 56-61991 l; Aspergillus candidus M-4815 FERM-P No 5226 (DSM 2135) libid, No 56-61991 l; Arthrobacter sp B-0720 FERM-P No. 5224 (DSM 2137) (ibid, No 51-61991); Macrophomina phaseoli ATCC 14383, Cladosporium resinae IFO 6367 lArch. Biochemn Biophys, 176, 591 ( 1976),Brev Jap non soum, à insp. Publ No 55-118391, ibid, No 56-8683, ibid, No 56-61991 l. L'acyl-Co A oxydase ci-dessus peut être remplacée par l'acyl-Co A déshydrogénase lEC 1 3 99 3, acyl-Co A: (accepteur) oxydoréductasel On peut obtenir cette enzyme par exemple à partir de foie de porc, de boeuf et de mouton lJ Biol Chein-, 218, 717 22, 475 ( 1956)). Dans la réaction d'acyl-Co A en déshydroacyl-Co A, on utilise un accepteur d'électrons, par exemple le 2,6-dichloro- phénol indophénol-, le chlorure de 2- nitrophényl)-5-phényl-211-tétrazollum CINT), le bromure de 3-( 4,5diméthyl)-2-thiazolyl-2,5-diphényl-2 H-tétrazolium 3,3 '-(I 4, 14 '-biphénylène)-bis tétrazolium> (néo-TB), 3,31-( 3,3 '-diméthoxy-J 4,4 I'- biphénylène)-bislchlorure de 2-(p-nîtrophényl)-5-phényl- 2 H-tétrazolium de 2,5-bis(p-nitrophényl)-2 H-tétrazolîufl (TNTB) ou 3,3 '- ( 3,3 '-dîméthoxy-4#,4 '-biphénylène)-bis-(Chlorure de 2,5- diphényl-2 H 1-tétrazollum) (TB), avec du méthosulfate de phénazine. En outre il peut être préférable d'isoler des tissus qui les contiennent les enzymes présentant une activité d'énoyl-Co A-hydratane, une activité de 3-hydroxyacyl-Co A- déshydrogénase et une activité de 3-cétoacyl-Co A-thiolase. LJ Biol Chein, 218, 971 de 3-hydroxyacyl-Coa-déshydrogénase et une activité de 3- cétoacyl-Co A-thiolase en une seule protéine enzymatique. Comme exemples de microorganismes produisant ledit enzyme, on peut citer Escherichia coli lProc Matl Acad Sci, 74 ( 2), 492 ( 1977)l et Pseudomonas fragi B-0771 FERN-P n* 5701. L'enzyme obtenue à partir de Pseudomonas fragi B-0771-FERM-P n 5701 possède les propriétés suivantes: ( 1) Procédé de dosage de l'activité enzymatique: (a) procédé de dosage de l'activité d'énoyl-Co A-hydratase: tampon Tris-H Cl 0,2 H (p H 9,0) 0,4 ml K Cl 1 m 0,1 ml NAD 40 m N 0,1 ml Palmiténoyl-Co A 15 m M 0,1 ml Sérumalbumine de boeuf à 1 % 0,05 ml Bleu de nitrotétrazolium à 0,25 % 0,1 ml 3-hydroxyacyl-Co A-déshydrogénase U/ml (Boehringer) 0,01 ml Eau distillée 0,04 il Total 1,00 ml On fait préincuber le mélange réactionnel ci-dessus à 37 C pendant 2 minutes, et on y a Joute une solution enzymatique, puis on fait incuber à 37 C pendant 10 minutes. On ajoute du dodécylsulfate de sodium à 0,5 % ( 2,0 ml) pour arrter la réaction et on mesure la densité optique (absorp- tion à AA 550) par la longueur d'onde à 550 nu. On définit une unité ( 1 U) d'enzyme comme la quantité- d'enzyme qui génère un pmole de NAD réduit en une minute. L'activité enzymatique est définie par l'équation suivante: cio 1000 i Activité enzymatique(U/ml) = AA X 50 10 (b) Procédé de dosage de la 3hydroxyacyl-Co A-déshydrogénase: Tampon Tris-H Cl 0,2 M (p H 8,5) 0,5 ml KC 1 1 M 0,05 ml NAD 40 m M 0,1 ml 3-hydroxypalmitoyl-Co A 15 m M 0,1 ml Sérumalbumine de boeuf à 1 % 0,05 ml Bleu de nitrotétrazolium à 0,25 % 0, 1 ml Diaporase 30 U/ml 0, 1 ml Total 1,00 ml On ajoute une solution enzymatique ( 50 pl) au mélange réactionnel ci-dessus, que l'on fait préincuber à 270 C pendant 2 minutes, et que l'on fait incuber à 37 C pendant 10 minu- tes On ajoute du dodécylsulfate de sodium à 0,5 % ( 2,0 ml) pour arrêter la réaction et on mesure la capacité d'absorption à 550 nm (AA 0) Une unité ( 1 U) est définie comme la quantité d'enzyme qui génère 1 pmole de NAD réduit en une minute L'activité enzymatique est définie par l'équation suivante. Activité enzymatique (U/ml) AA 550 X L x 1 00 x 1 550 4 P IO (c) Procédé de dosage de la 3-cétoacyl-Co A-thiolase: Tampon Tris-H Cl 0, 2 M (p H 8,0) 0,2 ml Co ASH 10 m M 0,05 ml 3-cétopalmitoyl-Co A 0,2 m M 0, 1 ml Mg C 12 100 m M 0,1 m I Dithiothréitol 1 m M 0,1 ml Eau distillée 0, 45 ml 1,00 ml Total Au mélange réactionnel dans une cellule de quartz de 1 ml à 37 C on a Joute 20 pl de solution enzymatique et on fait incuber à 37 C On compense à intervalles réguliers la diminution de 3cétopalmitoyl-Co A consommé selon la réaction en changeant la densité optique (capacité d'absopr- tion) à 303 nm (D 0303) On définit une unité ( 1 U) comme la quantité d'enzyme qui consomme 1 pmole de 3-cétopalmi- toyl-Co A en une minute L'activité enzymatique est définie dans l'équation suivante. Activité enzymatique (U/ml) = (OD 303/min) X 1 X 2000 ( 2) Action enzymatique: On observe les activités enzymatiques suivantes. Enoyl-Co A-hydratase: catalyse une réaction qui forme une mole d'hydroxyacyl-Co A à partir d'une mole de déshydroacyl- Co A et d'une mole d'eau. 3-hydroxyacyl-Co A-déhydrogénase: catalyse une réaction qui forme une mole de cétoacyl-Co A et une mole de NAD réduit à partir d'une mole d'hydroacyl-Co A et d'une mole de NAD. 3-acétoacyl-Co A-thiolase: catalyse une réaction qui forme une mole d'acyl-Co A et une mole d'acétyl-Co A à partir d'une mole de cëtoacyl-Co A et une mole de Co ASH. ( 3) Démonstration de l'existence d'une seule protéine enzymatique: On prépare l'enzyme brute à partir de cellules mi- crobiennes de Pseudomonas fragi B-0771 et on purifie à travers plusieurs procédés de purification On mesure chaque activité enzymatique selon les procédés de dosage ci-dessus. Les résultats sont donnés au Tableau 2 ci-dessous. Tableau 2 (L'activité enzymatique est corrigée par une quantité de protéine enzymatique). Chaque activité enzymatique correspond exactement à un rapport d'activité à chaque étape de purification et ces trois activités enzymatiques restent dans la même protéine. Lesdites trois activités enzymatiques sont donc situées dans une seule protéine enzymatique. En outre, l'enzyme purifiée ( 2,0 mg) obtenue dans l'exemple ci-dessus (purifiée par chromatographie sur colonne de Toypeal HW-60) est introduite dans un appareil d'électrophorèse à foyer isoélectrique en utilisant un ampholyte support, et on mesure chacune des activités enzy- matiques On observe trois activités enzymatiques en un seul pic dans une fraction à p H 4,9. Activité Activité de Activité de d'énoyl-Co A 3-hydroxyacyl 3-cétoacyl-Co A hydratase Co A déshydro thiolase (U/mg) génase (Ulmg) (U/mg) , Enzyme brute 36,1 18,2 15,1 Colonne de DEAE-cellu- lose CL-6 B 58,9 30,0 24,5 Colonne de gel d'hy- droxyapatite 210,3 105,0 85,6 Colonne de Tyopeal HW-60 216,5 110,0 90,2 ( 4) Spécificité du substrat: On mesure l'activité de 3-hydroxyacyl-Co A daéshydro- génase en utilisant du 3-hydroxyacyl-Co A ayant les nombres de carbone suivants: Substrat: Activité relative %): 3-hydroxycaproyl-Co A 56 X 5 3hydroxycaprylyl-Co A 88 X 1 3-hydroxycapryl-Co A 99,0 3-hydroxylauryl-Co A 100,0 l O 3-hydroxymyristoyl-Co A 98,0 3-hydroxypalmitoyl-Co A 75,5 3hydroxystéaryl-Co A 30,5 3-hydroxyarachidoyl-Co A 9,5 3-hydroxyolëyl-Co A 57,5 3-hydroxylinolényl-Co A 99 X O L'enzyme possède également au moins une spécificitt de substrat sur palmitoénoyl-Co A et 3-cétopalmitoyl-Co A. ( 5) p H optimal: On utilise le 3-hydroxypalmitoyl-Co A comse substrat. On mesure l'activité de 3-hydroxy-aeyl-Co A en utilisant le tampon tris-H Cl à p H 7,5-9,5 Le résultat est donné dans la figure 1 Le p H optimal est à environ p H 9. ( 6) Stabilité du p H: On fait incuber une solution enzymatique ( 5 U Iml) dissoute dans diverses solutions tampon 10 m N (p H 4-7: tampon diméthylglutarate-Na OH, p H 7,5-9: tampon Tris-HC 1) à 37 C pendant 60 minutes, et on mesure l'activité restante selon un procédé de dosage de l'activité de 3-hydroxyaeyl-Co A déshydrogénase Le résultat est donné dans la figure 2, ou *l'enzyme est stable à p H 5-8. ( 7) Stabilité à la chaleur: On fait incuber une solution enzymatique ( 15 U/ml) dissoute dans un tampon diméthylglutarate 10 m M-Na OH (p H 7,0) à diverses températures pendatn 10 minutes et on mesure l'activité restanteselon un procédé de dosage de l'activité de 3-hydroxyacyl-Co A-déshydrogénase. Le résultat est donné dans la figure 3, o l'enzyme est stable Jusqu'à environ 50 C. ( 8) Point isoélectrique: On applique une concentration isoélectrique en utili- sant un ampholyte support pour mesurer le point isoélectrique de l'enzyme, ce point isoélectrique étant à p H 4,9. ( 9) Effet des ions métalliques: 1 5 On mesure l'effet des ions métalliques sur l'activité de 3-hydroxyacyl-Co A-déshydrgénase. de 3-hydroxyacyl-Co A-déshydrogénase. I Ion métallique |Activité relative() Témoin 1 O O l m M Ca Ce 2 1 3 1 m M Mg CC 2 11 3 1 I m M Mn CC 2 32 1 m M Zn CC 2 25 1 m M Cu Cú 2 12 1 m M Ba C 2 1 06 1 m M Ni C^ 2 95 1 m M Co Cú 2 34 ( 10) Effet des agents tensioactifs: On mesure l'effet des agents tensioactifs sur l'ac- tivité de 3-hydroxyacyl-Co A-déshydrogénase. Agent tensioactif Activité relative (%) Témoin 100 Triton X-100 à 0,1 % 96 Adékatol SO-145 à 0,1 % 81 Laurylbenzènesulfonate à 0,1 % 0 Laurylsulfate de sodium à 0,1 % O Désoxycholate de sodium à 0,1 % 2 Chlorure de cétyltriméthylammonium à 0,1 % O Chlorure de cétylpyridinium à 0,1 % O Comme il a été dit, l'enzyme multi-active de l'inven- tion possède une activité d'énoyl-Co A-hydratase, une activité de 3-hydroxyacyl-Co A-déshydrogénase et une activité de 3- cétoacyl-Co A-thiolase en une seule protéine enzymatique. On trouvera ci-dessous un mode de réalisation de procédé de production d'une enzyme multi-active. Les microorganismes utilisés pour la production de l'enzyme multi-active ne se limitent pas à Pseudomonas fragi B-0771 FERM-P n 5701 mentionné cidessus, et l'on peut utiliser dans l'invention les autres souches appartenant au genre Pseudomonas produisant l'enzyme multi-active. Dans un mode de réalisation préféré, on cultive les microorganismes producteurs d'enzyme multi-active appartenant à Pseudomonas dans un milieu classique pour la production d'enzyme On peut utiliser une culture solide ou liquide pour la fermentation, cependant on préfère pour la production industrielle une culture aérobie en gélose profonde. On peut utiliser les sources nutritives qui sont utilisées dans la culture classique des microorganismes. On peut utiliser des sources de carbone assimilable comme le glucose, le saccharose, le lactose, l'amidon, le maltose, la dextrine, la mélasse-et la glycérine On peut également utiliser des sources d'azote assimilable comme la liqueur de mals macérée, la poudre de soja, l'huile de graine de coton, le gluten de blé, la peptone, l'extrait animal, l'extrait de levure, la poudre de levure et l'hydro- lysat de caséine On peut utiliser si nécessaire des sels comme le phosphate, le sulfate, etc, de magnésium, de calcium, de potassium, de sodium, de zinc, de fer et de manganèse. 19 Afin d'améliorer la productivité de l'enzyme multi-active, il peut être préférable d'ajouter au milieu des acides gras en C 8 à C 20 comme l'acide oléique, l'acide palmitique et l'acide stéarique. On peut faire varier la température de culture pour cultiver les microorganismes et produire l'enzyme, cette température se situant à 26320 C, de préférence à 30 C. La durée de la culture dépend des conditions employées et varie généralement entre 10 et 40 h La culture doit naturel- lement être terminée lorsqu'on a obtenu le maximum d'activité enzymatique. L'enzyme multi-active ainsi produite est contenue dans les cellules de microorganismes. L'isolement de l'enzyme se fait de la façon suivante. Tout d'abord, on recueille les cellules cultivées par filtra tion ou centrifugation On disloque les cellules par traite- ment aux ultra-sons, à la "presse française", traitement aux perles de verre ou traitement au lysozyme, et on peut éventuellement ajouter des agents tensioactifs comme le Triton X-100 (marque déposée) ou l'Adekatol SO-145 (marque déposée). On précipite l'enzyme en ajoutant un solvant organique miscible à l'eau comme le méthanol, l'éthanol ou l'acétone, et en relargant en ajoutant par exemple du chlorure d'ammonium. On purifie l'enzyme brute précipitée en dissolvant l'enzyme brute, en dialysant avec un tube de cellophane,et on chromatographie en utilisant de la DEAE-cellulose, du DEAE- Sephalose, du CH-Sephadex ou une résine échangeuse d'ion, et on filtre sur gel avec Sephadex G-200, Sephalose CL-6 B, Sephacryl S-200 ou Toyopeal HW-60 On lyophilise l'enzyme obtenue pour obtenir l'enzyme multi-active purifiée. La quantité d'enzyme utilisée dans un tel procédé enzymatique peut être une quantité suffisante pour la réac- tion enzymatique, et on la fait varier selon la quantité et le nombre d'atomes de carbone de l'acide gras dans un spécimen, et cette quantité n'est donc pas limitée Ainsi, lorsqu'on fait réagir un tel spécimen contenant 0,005-0,05 pmole d'acide oléique en C 18 à 370 C pendant 5 à 10 minutes, l'activité d'acyl-Co A-synthétase est généralement supérieure à 1 U, de préférence de 5 à 15 U, et l'enzyme multiactif de l'invention dépasse habituellement 0,1 U, de préférence 1- U. La quantité de réactifs dans les étapes réactionnelles, par exemple ATP ou GTP et Co ASH dans le procédé (a), NAD dans le procédé (d) et Co ASH dans le procédé (e) doit être une quantité suffisante pour le produit de la quantité d'acide gras dans un échantillon et le nombre de cycles de B-oxydation selon le nombre de carbone dans ledit acide gras Ainsi, dans le cas de 0,01 pmole d'acide oléique, la quantité d'ATP ou de GTP dépasse 0,1 paole, de préférence dépasse 0,5 pmole; la quantité de'Co ASH dépasse 0,1 pmole, de préférence dépasse 0,5 pmole; et la quantité de NAD dépasse 0,1 pmole, de préférence dépasse 0,5 pmole. Dans l'étape réactionnelle (b), l'action enzymatique de l'acyl-Co Aoxydase est mise en oeuvre avec de l'oxygène dissous dans un échantillon, et dans l'étape (c), on peut utiliser de l'eau dans l'échantillon. On peut utiliser un sel de magnésium soluble dans l'eau comme le chlorure de magnésium qui génère l'ion magnésium pour la réaction préférée de l'acyl-Co A-synthé- tase Dans l'étape réactionnelle (b), il est préférable de retirer par l'action d'une catalase le peroxyde d'hydrogène généré par l'action d'une acyl-Co A-oxydase. On peut préparer les composants pour le dosage dans lequel on trouve au moins de 1 'ATP ou du GTP et du Co ASH, du NAD, une activité d'acyl-Co A-synthétase, une activité d'acyl- Co A-oxydase, une activité d'énoyl-Co A-hydratase, une activité de 3-hydroxyacyl-Co A-déshydrogénase et une activité de 3- cétoacyl-Co A-thiolase. Dans l'invention, on utilise de préférence l'enzyme multi-active cidessus Comme il a été dit, on ajoute comme composants un sel de magnésium soluble dans l'eau, une catalase et un agent tensioactif non -ionique, comme le Triton X-100 (marque déposée) On prépare la solution en ajoutant de l'eau neutre à faible alcaline ou un tampon. En outre, dans le cas du dosage d'un ester d'acide gras, on ajoute dans les composants des agents libérant les acides gras comme une enzyme ou encore, dans le cas du dosage de l'activité d'une enzyme sur un ester d'acide gras, on ajoute au préalable dans les composants un ester d'acide gras. Ainsi, pour les composants du dosage de l'activité de lipase, on ajoute un glycéride, de préférence un monoglycéride ou un diglycéride dans les composants en vue de ce dosage Il est préférable d'ajouter de l'albumine Pour les composants du dosage d'un triglycéride, par exemple, ajoute une lipase. On trouvera ci-dessous d'autres précisions sur les composants visant à un dosage. Composants pour dosage d'activité de phospholipase A 1 d'activité de phospholipase A 2 et d'activité de phospholi- pase B comprenant de la lécithine comme ester d'acide gras; Composants pour dosage de l'activité de lysophospholipase comprenant de la lysolécithine comme ester d'acide gras; Composants pour dosage d'activité de phosphatase - comprenant du phosphatidate comme ester d'acide gras et une activité de lipase; Composants pour dosage d'activité de phospholipase C comprenant de la lécithine comme acide gras et une activité de lipase; Composants pour dosage de l'activité de phospholipase D comprenant de la lécithine comme acide gras, une activité de phosphatidate phosphatase et une activité de lipase; Composants pour dosage de l'activité de choline- estérase comprenant de l'acylcholine comme ester d'acide gras; Composants pour dosage d'activité de cholestérol- estérase contenant un ester de stérol comme ester d'acide gras; Composants pour dosage de lécithine comprenant une activité de phospholipase A 1, une activité de phospholipase A 2, une activité de phospholipase B, une activité de phos- pholipase C et une activité de lipase, ou une activité de phospholipase D et une activité de phosphatidate phosphatase et une activité de lipase; Composants pour dosage de lysolécitbine contenant une activité de lysophospholipase; Composants pour dosage d'ester de cholestérol conte- nant une activité de cholestérol-estérase; Composants pour dosage d'activité de lécithine - cholestérol-acyl-transférase contenant un ester d'acide gras de cholestérol et de lécithine, et une activité de cholestérol- estérase ou une activité de lysophospholipase; et Composants pour dosage de cholestérol contenant de la lécithine comme ester d'acide gras, une activité de léci- thine-cholestérol-acyl-transférase et une activité de choles- térol-estérase ou une activité de lysophospholipase. On peut doser l'acide gras dans un échantillon en utilisant les composante pour le dosage ci-dessus La quan- tité d'échantillon dépasse généralement 5 plet on la mélange ave c plus d'l ml de la solution des composants pour le dosage Le dosage est conduit de façon classique à 370 C. La durée d'incubation dépasse habituellement 1 minute; elle est de préférence de 5 à 10 minutes, et il est préférable qu'elle soit aussi longue que possible pour avoir une sensi- bilité plus élevée. Le milieu servant au dosage est de préférence une solution tampon dans un intervalle de p H stable des enzymes, et est habituellement une solution faiblement acide ou alcaline comme l'eau, un tampon phosphaté à p H 6,5-8, un tampon Tris-H Cl, un tampon imidazole-H Cl, un tampon diméthyl- glutarate-Na OH, ou un tampon de Pipes-Na OH. Après incubation, on détecte les modifications détec- tables de la réaction Lesdits changements détectables signifient au moins une mole de composants consommée ou générée dans un cycle de B-oxydation. Très classiquement, on détermine les changements de la quantité de NAD réduit à partir du NAD dans la réaction. On conduit la détection du NAD réduit en mesurant la capa- cité d'absorption spécifique du NAD réduit Le NAD possède une absorption maximum à 260 nm, tandis que NAD réduit possède une absorption maximum à 260 et 340 nm, et donc on utilise une absorption à 320-360 nm, de préférence à 340 nm. La poursuite de la détermination du NAD réduit est le procédé de dosage calorimétrique fondé sur la coloration d'un système de transfert électronique comme accepteur d'électrons pour le NAD réduit Les modes de réalisation du réactif de coloration du système de transfert électronique sont un accepteur d'électrons, par exemple un sel de tétra- zolium soluble dans l'eau comme INT, MTT, Néo-TB, NTB, TNTB et TB, et ceux-ci sont utilisés de préférence avec de la diaphorase et du méthosulfate de phénazine pour améliorer le transport électronique Le réactif de transfert électro- nique peut être préalablement ajouté dans les composants pour le dosage ci-dessus, ou peut être ajouté après la réaction. On fait réagir le NAD réduit formé-dans la réaction avec les réactifs de transfert électronique pour former un changement de couleur que l'on peut mesurer à sa longueur d'onde d'absorption. Un autre mode de réalisation du dosage du NAD réduit consiste à doser le NAD réduit en utilisant une enzyme comme la NAD réduite-oxydase Ladite enzyme, pour laquelle le NAD réduit est un substrat, est de préférence immobilisée par une technique d'immobilisation classique antérieurement connue. Ladite enzyme immobilisée est assemblée dans l'élec- trode à oxygène pour préparer l'électrode à NAD réduit-oxydase. On peut mesurer électriquement la quantité d'oxygène consommée à partir du NAD réduit qui est généré pendant la réaction. On peut déterminer la quantité d'acide gras sur labase de la quantité de NAD réduit ainsi formé On peut mesurer une autre quantité d'ester d'acide gras ou d'activité enzymatique dans un échantillon par ladite quantité d'acide gras. On peut également doser le réactif consommé comme le Co ASH ou l'acyl-Co A généré, en tant que changements détec- tables. Le procédé de dosage et les composants pour dosage de l'invention cidessus sont utiles avec une sensibilité simple et élevée et peuvent, par exemple, être appliqués 3 O pour le dosage de l'activité de lipase dans les diagnostics cliniques de la fonction pancréatique. Les procédés de dosage de l'acyl-Co A-synthétase et de l'acyl-Co Aoxydase utilisés dans l'invention sont présentés ci-dessous. ( 1) Procédé de dosage de l'activité (I) Mélange réactionnel I: Tampon phosphaté 0,2 M (p H 7,5) ATP 10 m M Mg Cl 2 10 m M Co ASH 10 m M Triton X-100 à 5 % contenant une solution d'acide palmitique 1 m M Eau distillée Total: (II) Mélange réactionnel II: Tampon phosphaté 0,2 M (p H 7,5)- N-éthylmaléimide 20 m M 4-aminoantipyrine 15 m M 3-méthyl-N-éthyl-N-(Bhydroxyéthyl) ( 0-hydroxyéthyl)aniline à 0,3 % Peroxydase ( 100 PPU/ml) Azide de sodium à 0,5 % Acyl-Co A-oxydase ( 120 U/ml) Eau distillée Total 3 o d'acyl-Co A-synthétase: 0,2 ml 0,1 ml 0,1 ml 0,05 ml 0,2 ml 0,35 ml 1, 00 ml 0,5 ml 0,1 ml 0,3 ml 0,25 ml 0,1 ml 0,1 ml 0,1 ml 0,55 ml 2,00 ml On a Joute la solution enzymatique ( 50 pl) au mélange réactionnel I et on fait incuber à 37 C pendant 10 minutes. On y ajoute le mélange réactionnel II, on fait incuber à 370 C pendant 5 minutes et on mesure la capacité d'absorption à 550 nm (AA 550). L'activité enzymatique est définie dans l'équation suivante: Activité enzymatique (U/mg) AA 550/10 -X 305 X C* 32,0 X 1/2 05 XC C*: concentration d'acyl-Co A-synthétase dans uune solution enzymatique (mg/ml). ( 2) Procédé de dosage de l'activité d'acyl-Co A-oxydase: Tampon Tris-H Cl 0,2 M (p H 8,0) 0,1 ml 4-aminoantipyrine 5 m M 0,05 ml Diéthylmétatoluidine 3 m M 0,05 ml Peroxydase 0,5 mg/ml 0,05 ml PalmitoylCo A 25 m M 0,02 ml Eau distillée 0,23 ml Total 0,50 ml On a Joute la solution enzymatique ( 10 pl) au mélange réactionnel ci-dessus et on fait incuber à 370 C pendant 10 minutes On arrêt la réaction en ajoutant de l'urée 4 M ( 0,5 ml), on a Joute du Triton X-100 à 1 % ( 2 ml) et on mesure par colorimétrie à 545 nm pour mesurer la quantité de peroxyde d'hydrogène formée On définit une unité enzyma- tique ( 1 U) comme la quantité d'enzyme qui génère 1 pmole) de peroxyde d'hydrogène en une minute. Les exemples suivants précisent l'invention mais ne sont pas conçus comme limitatifs. Exemple 1 Production d'enzyme multi-active: Dans un erlenmeyer de 500 ml on ajoute un milieu ( 100 ml) comprenant de la peptone à 1,5 %, de l'extrait de levure en poudre à 0,5 %, du K Cl à 0,2 %, du Na Cl à 0,1 %, du K 2 HPO 4 à 0,1 %, du Mg SO 4 à 0,05 % et de l'acide oléique à 0,75 %, p H 7,5 On stérilise au total à 120 C 15 flacons contenant les mêmes milieux cidessus et on inocule Pseudomonas fragi B-0771 FERM-P n 5701 à 300 C que l'on cultive en agitant pendant 20 h dans un agitateur rotatif. On centrifuge le milieu combiné à 5000 tpm pendant 20 minu- tes pour obtenir des cellules bactériennes On ajoute les cellules à une solution de lysozyme ( 360 ml, 1,50 mg dans un tampon phosphaté 10 m M, p H 7,0) pour obtenir une solution brute d'enzyme multi-active ( 340 ml, activité spécifique: 3,0 U/mg comme activité de 3-hydroxyacyl-Co A- déshydrogénase). L'isolement et la purification de l'enzyme se font de la façon suivante. On ajoute de l'acétone préalablement refroidie (-20 C, 290 ml) à une solution d'enzyme multi-active brute ( 290 ml) refroidie dans un bain glacé et on recueille le précipité On dissout le précipité dans un tampon Tris-H Cl m M (p H 7,5) contenant du K Cl 1 M et on centrifuge à 12 000 tpm pendant 10 minutes pour retirer le's fractions insolubles On recueille la solution surnageante ( 45 ml) et on y ajoute une solution saturée de sulfate d'ammonium ( 22,5 ml, p H 7,0) On retire le précipité par centrifugation à 12 000 tpm pendant 10 minutes On a Joute une solution saturée de sulfate d'ammonium ( 28 ml) au surnageant ( 57 ml). On dissout le précipité dans un tampon Tris-H Cl 10 m M (p H 7,5) contenant du K Cl 1 M et on dialyse en utilisant un tube de cellophane contre un tampon Tris-HC 1 10 m M (p H 7,5, 2,0 litres) à 4 C pendant 20 h On lyophilise le dialysat pour obtenir une poudre d'enzyme multi-active ( 77 mg) présentant une activité spécifique de 18,2 U/mg sous forme d'activité de 3-hydroxyacyl-Co A-déshydrogénase. On introduit l'enzyme ( 77 mg) dissoute dans 20 ml d'eau dans une colonne ( 3 x 11 cm) de DEAE-Sephalose CL-6 B (Farmacia Co) équilibrée avec un tampon Tris-H Cl 10 m M et on lave avec le même tampon On conduit l'élution par gradient linéaire avec 500 ml de tampon Tris-HC 1 10 m M et le même tampon contenant du KC 1 0,4 M, à un rythme d'élution de 52 ml/heure On recueille des fractions de 9 ml chacune et on obtient les fractions actives n 71-80 ( 90 ml) présentant une activité spécifique de 30,0 U/mg sous forme d'activité de 3-hydroxy-acyl-Co A-déshydrogénase. On dialyse la fraction active contre une solution de tampon phosphaté 10 m H (p H 7,5, 2 litres) et on l'introduit dans une colonne ( 2 x 10 cm) remplie de gel d'hydroxyapatite. On conduit l'élution par gradient linéaire avec 300 ml de tampon phosphaté 10 a M (p H 7,5) et 300 ml de tampon phosphaté 0,5 H (p H 7,5), avec un débit d'élution de 33 ml/heure. On recueille des fractions de 5 ml chacune et on obtient les fractions actives (n 46-62, 85 ml) (activité d'énoylacyl- Co A-hydratase: 210,3 U/mg, activité de 3-hydroxyacyl-Co A- déshydrogénase: 105 U/mg, activité de 3-cétoacyl-Co A-thio- lase: 85,6 U/mg), que l'on concentre par ultra-filtration (Amicon Co XM50) On introduit le concentré sur une colonne ( 1,1 x 90 cm) remplie de Toyopeal HI-60 (Toyo Soda Co.) et on filtre sur gel avec un tampon Tris-H Cl 10 m M, p H 7,5 contenant du K Cl 0,5 M On recueille des fractions de 3,5 ml chacune et on obtient les fractions actives ne 23- 27 ( 17,5 m 1) On lyophilise la solution pour obtenir l'enzyme multi-active purifiée ( 20 mg, 1110 U/mg sous forme de 3- hydroxyacyl-Co A-déshydrogénase). Èxemple 2 On introduit le même milieu ( 30 litres) que dans l'exemple 1 (auquel on a Joute l'anti-mousse silicon KM-72, Shinetsu Chem Co) dans un récipient de fermentation de litres et on stérilise à 120 C'pendant 20 minutes. On inocule un milieu cultivé ( 500 ml) de Pseudomonas fragi B-0771 FERM-P n 5701, et on cultive à 30 C, 300 tpm, 20 1/ minute pendant 17 heures On centrifuge le milieu cultivé pour obtenir les cellules cultivées On traite les cellules avec du lysozyme ( 3 g) dans un tampon phosphaté 10 m M (p H 7,0) pour obtenir la solution d'enzyme multi-active ( 6 litres) ( 15,6 U/ml sous forme d'activité de 3-hydroxyacyl- Co A-déshydrogénase). Exemple 3 Détermination quantitative de divers acides gras: Composition pour dosage: Tampon de Pipes-Na OH 0,2 M (p H 7,3) 0,5 ml NAD 10 m M 0,2 ml Mg C 12 10 m M 0,3 ml ATP 10 m M 0,3 ml Triton X-100 à 3 % 0,1 ml Co ASH 10 m M 0,2 ml Solution d'acyl-Co A 6 synthétase ( 40 U/ml, Toyo Jozo Co) 0, 02 ml Acyl-Co A-oxydase ( 400 U/ml) 0,02 ml Catalase ( 150 U/ml); Sigma Chem Co) 0,05 ml Enzyme multi-active (activité d'énoyl-Co A-hydratase: 400 U/ml; activité de 3-hydroxyacyl-Co A-déshydrogé- nase: 200 U/ml; activité de 3-cétoacyl-Co A-thiolase: 163 U/ml) 0,05 ml Eau distillée 1,26 ml Total 3,00 ml On ajoute un échantillon ( 25 pl) contenant 3 m M/ml d'acide gras ( 0,05 pmole) à la composition pour dosage ci-dessus ( 3,00 ml), on fait incuber à 37 C pendant 5 minu- tes, et on mesure la quantité de NAD réduit par absorption à 340 nm (DO 340 nm) Les résultats sont donnés au Tableau 3. Comme le montre le Tableau, la densité optique à 340 nm est proportionnelle au nombre de carbones des acides gras dans l'échantillon. Exemple 4 Dosage quantitatif de l'acide oléique: On a Joute un échantillon ( 20 pl) contenant de l'acide oléique (respectivement 0,01 pmole, 0,02 pmole, 0,03 pmole, 0,04 pmole et 0,05 pmole) à la composition pour dosage ( 3,00 ml) de l'exemple 3, on fait incuber à 37 C pendant minutes, et on mesure la quantité de NAD réduit par l'absorption à 340 nm Le résultat est donné dans la figure 4 ( e-e) Dans la figure 4, (o-o) désigne le dosage témoin selon un procédé donné dans Anal Biochem, 98, 341 ( 1979). Comme le montre la figure 4, le procédé de dosage de l'invention est supérieur en sensibilité par rapport aux procédés de dosage classiques antérieurs Table 3. nombre de carbones 340 m D O 34 o M Acide gras (nombre d'insa- turations) Acide caprorque 6 ( 0) O 089 Acide caprylique 8 ( 0) O 1 7 5 Acide caprique I O ( 0)) 26 7 Acide laurique 1 2 ( 0) O 356 Acide myristique I 4 ( 0) O 444 Acide palmitique 1 6 ( 0) O 530 Acide palmitoléi 1 6 ( 1) O 529 que Acide stéarique 1 8 ( 0) O 6 2 2 Acide oléique 8 ( 1) O) 62 8 Acide linolique 1 8 ( 2) 0, 6 1 9 Acide linolénique 1 8 ( 3) 0, 6 3 O Exemple 5 Dosage de l'acide oléique: Composition pour dosage: Tampon Pipes-Na OH 0, 2 M (p H 7,3) 0,5 ml NAD 10 m M 0,2 ml Mg C 12 10 m M 0,2 ml ATP 10 m M 0, 2 ml Triton X-100 à 1 % 0,2 ml Co ASH 10 m M 0,2 ml Acyl-Co A-synthétase ( 40 U/ml) 0,02 ml Acyl-Co A-oxydase ( 400 U/Ml) 0,02 ml Enzyme multiactive (énoyl-Co A-hydratase: 400 U/ml, 3-hydroxyacyl-Co Adéshydrogénase: 200 U/ml, 3-cétoacyl-Co A-thiolase: 163 U/ml) 0,01 ml Catalase ( 150 U/Ml) 0,05 ml Diaphorase ( 30 U/ml, Toyo Jozo Co) 0,1 ml NTB à 0,25 % 0,2 ml Eau distillée 1,10 ml Total 3,00 ml On ajoute des échantillons ( 20 pl) contenant de l'acide oléique ( 0,005 pmole, 0,01 pmole, 0,015 pmole, 0,02 pmole et 0,025 pmole, respectivement) à la composi- tion pour dosage ci-dessus ( 3,00 ml) et on fait incuber à 37 C pendant 10 minutes. On mesure l'absorption à 550 nm de la coloration bleue-violet formée correspondant à la quantité de NAD réduit produite selon la réaction (DO 550 nm) Le résultat est donné dans la figure 5 (e-e) Dans la figure 5, (oo) montre le dosage témoin selon le procédé d'Anal Biochem 108, 6 ( 1980) labsorption à 505 nm, DO 505 nml. Les résultats témoignent d'unprocédé de dosage très sensible par rapport à la technique antérieure. Exemple 6 Dosage de l'activité de lipase (lipase Composition pour dosage: Tampon Pipes-Na OH 0,2 M (p H 7,3) NAD 10 m M Mg C 12 10 mm H ATP 10 m M Triton X-100 à 2 % contenant 10 m H de 1,2-dioléylglycéride Co ASH 10 m M K Cl 2 M Sérum albumine de boeuf à 5 % Acyl-Co A-synthétase ( 40 U/ml) Acyl-Co Aoxydase ( 400 U/ml) Enzyme multi-active (énoyl-Co A-hydratane: 400 U/ml, 3-hydroxyacyl-Co A-déshydrogénase: 200 U/ml, 3-cétoacyl-Co A-thioalse: 163 U/ml) Catalase 150 U/ml Eau distillée Total sérique): 0,2 0,15 0,15 0, 15 ml ml ml - ml mi 0,10 ml 0,15 ml 0,1 ml 0,1 ml 0,2 ml 0,02 ml 0,05 ml 0,05 ml 0,08 ml 1,5 ml On mélange la composition pour dosage ci-dessus ( 1,5 ml) avec du sérum humain ( 50 pl), on fait incuber à 370 C et on mesure de façon continue la formation de NAD réduit à 340 nm Le résultat est donné au tableau 4. Tableau 4 Selcn le résultat ci-dessus, il est clair que l'acide gras dans le sérum a réagi avant la réaction de l'acide gras libéré à partir du diglycéride par action de la lipase sérique, et que la réaction de l'acide gras libre dans le sérum est terminée au bout de 7 minutes L'augmentation de l'absorption au bout de ce temps est fondée sur le NAD réduit qui se forme à partir de la 6-oxydation de l'acide gras libéré à partir du diglycéride par l'action de la lipase sérique L'activité de lipase mesurée par un accroissement de l'absorption pendant un intervalle de 5 minutes entre 8 et 13 minutes est donc de 3,44 U/l. On mesure l'activité de lipase selon l'équation suivante: Activité de lipase (U/1) = ADO* X 6,2 X nombre de cycles f X 1 X ioo o x 100010 1,5 X X 1000 Durée de réaction(min D O 340 N m 0 O 120 3 O 3 7 7 O > 400 7 0, 412 8 0) 420 13 0, 476 *ADO désigne la différence entre la DO 340 nm au bout de 13 minutes de réaction et la D 0340 nm au bout de 8 minutes de réaction Le nombre de cycles de 0-oxydation est de 7. Dans le dosage de la lipase sérique, on prepare la composition pour dosage sans ajouter de glycéride, et on y ajoute des échantillons pour dosage de la lipase sérique pour annuler l'effet de l'acide gras libre dans le sérum, puis on peut doser l'activité de lipase en a Joutant le compo- sition pour dosage ci-dessus sans affecter l'acide gras libre sérique. Exemple 7 Composition pour dosage des triglycérides: Tampon phosphaté 0,2 M (p H 7, 5) NAD 10 m M 2 Mg C 12 10 m M ATP 10 m M Triton X-100 à 3 % Co ASH 10 m M Acyl-Co Asynthétase ( 40 U/ml) Acyl-Co A-oxydase ( 400 U/ml) Enzyme multi-active (énoyl-Co A-hydratase: 400 U/ml, 3-hydroxyacyl-Co A-déshydrogénase: U/ml, 3-cétoacyl-Co A-thiolase: 163 U/ml) Catalase ( 150 U/ml) Lipase ( 10 000 U/ml, Toyo Jozo Co) Eau distillée Total 0,5 ml 0,3 ml 0,4 ml 0,3 ml 0,1 ml 0,4 ml 0,03 ml 0,03 ml 0,07 ml 0,07 ml 0,03 ml 0,77 ml 3,00 ml La composition pour dosage des triglycérides peut être utilisée comme suit. On ajoute lé sérum ( 30 pl) à la même composition pour dosage que dans l'exemple 3, qui est utile pour annuler l'effet de l'acide gras libre sérique, on fait incuber à 37 C pendant 10 minutes et on recueille l'échantillon ( 1 ml, correspondant à 10 pl dans le sérum) On mélange ledit échantillon avec la composition pour dosage des triglycérides cidessus et on mesure l'augmentation de l'absorption à 340 nm Ou encore on mélange directement la composition pour triglycéride avec le sérum ( 10 pl) et on mesure l'augmenta- tion d'absorption à 340 nm au bout de 10 minutes de réaction. Exemple 8 Composition pour dosage de l'activité de phospholipase A 1 de l'activité de phospholipase A 2 ou de l'activité de phospholipase B: Dans l'exemple 3, on remplace l'eau-distillée ( 1,26 ml) dans la composition pour dosage par une solution de lécithine 10 m M ( 0,2 ml) et d'eau distillée ( 1,06 ml) pour préparer la composition pour doser les activités enzymatiques ci-dessus. Exempl Composition pour dosage de l'activite de lysophospho- lipase: Dans l'exemple 3, on remplace l'eau distillée ( 1,26 ml) par une solution de lysolécithine 10 m M ( 0,2 ml) et d'eau distillée ( 1,06 ml) pour préparer la composition pour doser l'activité de lysophospholipase. Exemple 10 Composition pour dosage de l'activité de phosphatase: Dans l'exemple 3, on remplace l'eau distillée ( 1,26 ml) par une solution de phosphatidate 10 m M ( 0,2 ml), de lipase ( 10 000 U/ml, 0,05 ml) et d'eau distillée ( 1,01 ml) pour préparer la composition pour doser l'activité de phosphatase. Exemple 11 Composition pour dosage de l'activité de phospholi- pase C: Dans l'exemple 7, on remplace l'eau distillée ( 0,77 ml) dans la composition pour dosage des triglycérides par une solution de lécithine 10 m M ( 0,2 ml) et d'eau distillée ( 0,57 ml) pour préparer la composition pour l'activité de phospholipase C. Ladite composition est également affectée par les gly- * cérides et donc lorsqu'on utilise un échantillon contenant un glycéride, il faut déduire la quantité d'acide gras provenant du glycéride. Exemple 12 Composition pour dosage de l'activité de phospholipase C: On prépare une composition pour une réaction de libération d'acide gras ( 2,0 ml) comprenant une solution de lécithine 10 m M ( 0,2 ml), de la lipase ( 5 000 U/ml, 0,08 ml), une solution de tampon phosphaté 0,2 M (p H 7,5, 0,50 1 ml) et d'eau distillée ( 1,22 ml). On dispose ladite composition et la composition pour dosage de l'exemple 3 pour doser l'activité de phospholipase C. On ajoute la composition pour la réaction libérant l'acide gras ( 2,0 ml) à l'échantillon contenant la phospho- lipase C ( 20 pl) et on fait incuber à 37 'C pendant 10 minutes. On y ajoute la composition ( 3,00 ml) de l'exemple 3, on fait incuber à 37 C pendant 5 minutes, et on mesure l'absorption à 340 nm. Exemple 13 Composition pour dosage de l'activité de phospholipase On prépare une composition pour la réaction libérant l'acide gras ( 2,0 ml) comprenant une solution de lécithine m M ( 0,2 ml), de la phosphatidate phosphatase ( 50 U/ml, Toyo Jozo Co, 0,05 ml), de la lipase ( 10 000 U/ml, 0,05 ml), du tampon Tris-H Cl 0,2 M (p H 7,5, 0,6 ml) et de l'eau distil- lée ( 1,1 ml) On utilise ladite composition avec la composi- tion de l'exemple 3 pour la composition pour dosage de la phospholipase D. Exemple 14 Composition pour dosage de l'activité de choline estérase: Dans l'exemple 3, on remplace l'eau distillée ( 1,26 ml) par une solution 2 m M d'ester de palmitoyl-chcline ( 0,2 ml) et d'eau distillée ( 1,06 ml) pour préparer la composition pour dosage de l'activité de choline estérase. Exemple 15 Composition pour dosage de l'activité de cholestérol estérase: Dans l'exemple 3, on remplace l'eau distillée ( 1,26 mi) par une solution 5 m M d'ester de 3-oléoyl-cholestérol ( 0,2 ml) et d'eau distillée ( 1,06 ml) pour préparer la composition pour dosage de l'activité de cholestérol estérase. Exemple 16 Composition pour dosage de l'activité de lécithine-cholesté- rol-acyl-transférase: On prépare une composition pour réaction de libération d'acide gras ( 2,0 ml) comprenant une solution de cholestérol m M ( 0,2 ml), une solution de lécithine 5 m M ( 0,2 ml), de la lysophospholipase ( 80 U/ml, 0,05 ml) et du T Riton X-100 à 0,3 % dans un tampon phosphaté 0,1 M (p H 7,5, 1,55 ml). On utilise ladite composition avec la composition de l'exemple 3 pour doser l'activité de lécithine-cholestérol- acyl-transférase. Exemple 17 Composition pour dosage de l'ester de cholestérol: Dans l'exemple 3, on remplace l'eau distillée ( 1,26 ml) par la cholestérol estérase ( 350 U/ml, Toyo Jozo Co, 0,2 ml) et de l'eau distillée ( 1,06 ml) pour préparer la composition pour dosage de l'ester de cholestérol. lExemple de production d'acyl-Co A oxydasel: On introduit dans un tube à essais après stérilisation un milieu ( 10 ml) contenant de l'acide oléique à 1 %, de l'ex- trait de levure à 0,25 %, de la peptone à 1 %, K Cl à 0,2 %, K 2 HPO 4 à 0,1 %, Mg 504 7 H 20 à 0,05 % et un anti-mousse (Disfoam BC-51 Y) à 0,2 % On inocule Arthrobacter sp B-0720 FERM-P N 5224 et on cultive à 30 C pendant la nuit tout en agitant. On transfère ladite culture dans le même milieu ( 5 l) dans un récipient de fermentation de 8 1 et on conduit une culture aérobie submergée à 30 C pendant 20 h, à 600 tpm en aérant à raison de 5 1/min On recueille les cellules cultivées par centrifugation et on les met en suspension dans un tampon phosphaté 10 m M (p H 7,0), EDTA 2 m M et 0,5 mg/ml de lysozyme, puis on agite à 37 C pendant 60 minutes. On y ajoute de la DNA-ase ( 5 mg), on agite pendant 10 minutes et on centrifuge à 10 000 tpm pendant 20 minutes. On ajoute de l'acétone ( 200 ml) au surnageant, on centrifuge et on ajoute à nouveau l'acétone ( 1,8 litre) On dissout le précipité obtenu par centrifugation dans un tampon phosphaté 10 m M (p H 7,0, 200 ml) On retire les fractions insolubles par centrifugation et on ajoute une solution saturée de sulfate d'ammonium au surnageant à 30-75 % de saturation On dessale le précipité dissous dans un tampon phosphaté 10 m M (p H 7,0, 40 ml) en l'introduisant dans une colonne de gel d'acrylamide (Biogel P-2, Biorad Co). On l'introduit ensuite dans une colonne de gel de phosphate-de calcium, on lave et on élue par élution à gradient linéaire avec un tampon phosphaté 0,05-0,5 M (p H 7,0). On recueille les fractions actives (environ 0,45 M), on concentre par ultrafiltration (membrane Diaflow PH-10, Amicon Co), et on lyophilise pour obtenir l'acyl-Co A oxydase (activité spécifique: 5,5 U/mg, activité totale: 850 U, rendement: 8,5 %). 4 Brève légende des dessins: Fig 1-: p H optimum de l'activité de 3hydroxyacyl-Co A déshydrogénase dans l'enzyme multi-active préparée à partir du Pseudomonas fragi B-0771 FERM-P n 5701. Fif 2: stabilité du p H de l'activité de 3-hydroxyacyl- Co A-déshydrogénase dans l'enzyme multi-active Fig 3: stabilité à la chaleur de l'activité de 3- hydroxyacyl-Co A-déshydrogénase dans l'enzyme multi-active. Fig 4: Courbe de dosage standard de l'acide oléique. Fig 5: courbe de dosage standard de l'acide oléique. REVENDICATIONS 1 Procédé de dosage d'un composant dans un échantillon comprenant les procédés suivants: (a) un procédé réactionnel pour transformer l'acide gras en acyl-Co A; (b) un procédé réactionnel pour transformer l'acyl-Co A en déshydro-acyl-Co A; (c) un procédé réactionnel pour transformer le déshydroacyl- Co A en hydroxyacyl-Co A; (d) un procédé réactionnel pour transformer l'hydroxyacyl- Co A en cétoacyl-Co A; et (e) un procédé réactionnel pour transformer le cétoacyl-Co A enacyl-Co A, et le procédé pour mesurer les changements détectables. 2 Procédé de dosage selon la revendication 1 o lesdits procédés réactionnels sont: (a) un procédé réactionnel comprenant un acide gras, Co ASH, ATP ou GTP et une activité d'acyl-Co A-synthétase; (b) un procédé réactionnel comprenant un acyl-Co A, de l'oxygène, et une activité d'acylCo A oxydase; (c) un procédé réactionnel comprenant un déshydroacyl-Co A, de l'eau et une activité d'énoyl-Co A hydratase; (d) un procédé réactionnel comprenant un hydroxyacyl-Co A, du NAD et une activité de 3hydroxyacyl-Co A-déshydrogénase; et (e) un procédé réactionnel conmprenant un cétoacyl-Co A, du Co ASH et une activité de 3-cétoacyl-Co A-thiolase. 3 Procédé de dosage selon l'une des revendications 1 ou 2, o lesdits procédés réactionnels (c), (d) et (e) sont fondés sur l'activité enzymatique de l'enzyme multi-active compre- nant une activité d'énoyl-Co A-hydratase, une activité de 3-hydroxyacylCo A-déshydrogénase et une activité de 3-cétoacyl-Co A-thiolase dans une seule protéine enzymatique. 4 Procédé de dosage selon la revendication 3 o ladite enzyme multi-active est une enzyme obtenue à partir de micro- organismes producteurs d'enzyme multi-active de souche appartenant à Pseudomonas fragi. Procédé de dosage selonla revendication 4 o ladite souche productrice d'enzyme multi-active appartenant à Pseudomonas fragi est Pseudomonas fragi B-0771 FERM-P no 5701. 6 Procédé de dosage selon l'une des revendications 1, 2 ou 3, o ledit procédé pour mesurer les changements détectables est un procédé de détermination quantitative de la quantité de NAD réduit qui se forme dans le procédé réactionnel. 7 Procédé de dosage selon la revendication 6 o ladite détermination quantitative de la quantité de NAD réduit est conduite non par une longueur d'onde d'absorption spécifique du NAD mais par une longueur d'onde dans la région de la longueur d'onde d'absorption spécifique du NAD réduit. 8 Procédé de dosage selon la revendication 7, o ladite longueur d'onde dans la région de longueur d'onde d'absorp- tion est d'environ 320 nm-360 nm. 9 Procédé de dosage selon la revendication 8 oladite longueur d'onde dans la région de longueur d'onde d'absorption est d'environ 340 nm. 10 Procédé de dosage selon la revendication 7 o ladite détermination quantitative de la quantité de NAD réduit est conduite par colorimétrie du chromogène de transfert d'atome d'hydrogène, accepteur d'atome d'hydrogène du NAD réduit. 11 Procédé de dosage selon la revendication 10 o ledit chromogène de transfert d'atome d'hydrogène, accepteur d'atome d'hydrogène du NAD réduit, est un système de transfert d'atome d'hydrogène qui contient une diaphorase et un sel de tétrazolium soluble dans l'eau. 12 Ptrocddédedosageselonl'une des revendications 1 à 11 o le composant dans l'échantillon à doser est un acide gras. 13 Procédé de dosage selon la revendication 12 o ledit acide gras dans l'échantillon à doser est un acide gras libéré à partir d'un échantillon contenant un ester d'acide gras par acctivité enzymatique qui génère un acide gras à partir d'un ester d'acide gras. 14 Procédé de dosage selonla revendication 13 o ledit dosage est soit un dosage d'ester d'acide gras, soit un dosage d'activité enzymatique. Procédé de dosage selon l'une des revendications 13 ou 14 o ledit ester d'acide gras est un monoglycéride, un diglycéride ou un triglycéride, et o l'activité enzyma- tique est une activité de lipase. 16 Procédé de dosage selon la revendication 15 o ledit dosage d'activité de lipase est conduit en ajoutant de l'albumine. 17 Procédé de dosage selon l'une des revendications 13 ou 14 o ledit acide gras est la lécithine et o l'activité enzymatique est l'activité de phospholipase A 1, l'activité de phospholipase A 2 ou l'activité de phospholipase B. 18 Procédé de dosage selon l'une des revendications 13 ou 14 o ledit ester d'acide gras est la lysolécithine et l'activité enzymatique est une activité de lysophospholi- pase. 19 Procédé de dosage selon l'une des revendications 13 ou 14 o ledit ester d'acide gras est l'acide phosphatidique et o l'activité enzymatique est l'activité d'acide phospha- tidique-phosphatase et l'activité de lipase. Procédé de dosage selon l'une des revendications 13 ou 14 o ledit ester d'acide gras est la lécithine et o l'activité enzymatique est l'activité de phospholipase C et l'activité de lipase. 21 Procédé de dosage selon l'une des revendications 13 ou 14 o ledit ester d'acide gras est la lécithine et o l'ac- tivité enzymatique est l'activité de phospholipase D, l'ac- tivité d'acide phosphatidique -phosphatase et l'activité de lipase. 22 Procédé de dosage selon l'une des revendications 13 ou 14 o ledit ester d'acide gras est l'acylcholine et o l'activité enzymatique est l'activité de choline estérase. 23 Procédé de dosage selon l'une des revendications 13 ou 14 o ledit ester d'acide gras est l'ester de stérol et o l'activité enzymatique est l'activité de cholestérol-esté- rase. 24 Procédé de dosage selon l'une des revendications 1 à 11 o ledit acide gras est libéré à partir d'un échantillon comprenant de la lécithine et du cholestérol par une activité de lécithine:activité de cholestérol acyltransférase ou activité de lysophospholipase. Procédé de dosage selon la revendication 24 o ledit dosage est conçu pour doser la lécithine, le cholestérol ou une activité enzymatique. 26 Composition pour dosage comprenant au moins: ATP ou GTP, Co ASH, NAD, Activité d'acyl-Co A-synthétase, Activité d'acyl-Co A-oxydase, Activité d'énoyl-Co A-hydratase, Activité de-3-hydroxyacyl-Co A-déshydrogénase, et Activité de 3-cétoacyl-Co A-thiolase. 27 Composition pour dosage selon la revendication 26 o ladi- te composition contient un sel de magnésium soluble dans l'eau qui génère l'ion magnésium. 28 Composition pour dosage selon l'une des revendications 26 ou 27 comprenant une composition pour doser un acide gras. 29 Composition pour dosage selon l'une des revendications 26 ou 27 o ladite composition pour dosage implique au moins de contenir un ester d'acide gras ou une activité enzymati- que qui génère l'acide gras à partir de l'ester d'acide gras, et une composition pour doser l'un quelconque des composants dudit ester d'acide gras et ladite activité enzymatique. 30 Composition pour dosage selon la revendication 29 o ladi- te composition pour dosage est une composition pour doser l'activité de lipase comprenant un monoglycéride, un digly- céride ou un triglycéride comme ester d'acide gras. 31 Composition pour dosage selon la revendication 30 o ladite composition pour doser la lipase contient de l'albumine. 32 Composition pour dosage selon la revendication 29 o ladi- te composition pour dosage est une composition pour doser un ester d'acide gras comprenant l'activité enzymatique de la lipase. 33 Composition pour dosage selon la revendication 32 com- prenant une composition pour doser un triglycéride. 34 Composition pour dosage selon la revendication 29 o ladite composition pour dosage est une composition pour doser l'activité de phospholipase A 1, l'activité de phospholipase A 2 ou l'activité de phospholipase B comprenant de la lécithine comme ester d'acide gras. Composition pour dosage selon la revendication 29 o la- dite composition pour dosage est une composition pour doser l'activité de lysophospholipase comprenant de lysolécithine comme ester d'acide gras. 36 Composition pour dosage selon la revendication 29 o ladite composition pour dosage est une composition pour doser l'activité d'acide phosphatidique-phosphatase comprenant l'acide phosphatidique comme ester d'acide gras. 37 Composition pour dosage selon la revendication 29 o ladite composition pour dosage est une composition pour doser l'activité de phospholipase C comprenant la lécithine comme ester d'acide gras et la lipase comme activité enzy- matique. 38 Composition pour dosage selon la revendication 29 o o ladite composition pour dosage est une composition pour doser l'activité de phospholipase D comprenant la lécithine comme ester d'acide gras et la phosphatase d'acide phospha- tidique et la lipase comme activités enzymatiques. 39 Composition pour dosage selon la revendication 29 o ladite composition pour dosage est une composition pour doser l'activité de choline-estérase comprenant l'acylcholine comme ester d'acide gras. Composition pour dosage selon la revendication 29 o ladite composition pour dosage est une composition pour doser l'activité de cholestérolestérase comprenant l'ester de cholestérol comme ester d'acide gras. I 41 Composition pour dosage selon la revendication 29 o ladite composition pour dosage est une composition pour doser la lécithine comprenant les activités enzymatiques de la phospholipase A 1, de la phospholipase A 2, de la phospholipase B, de la phospholipase C et de la lipase, ou les activités enzymatiques de la phospholipase D, de l'acide phosphati- dique-phosphatase et de la lipase. 42 Composition pour dosage selon la revendication 29 o ladite composition pour dosage est une composition pour doser l'ester de cholestérol comprenant l'activité enzymatique de la cholestérol-estérase. 43 Composition pour dosage selon la revendication 29 o ladi- te composition pour dosage est une composition pour doser la lécithine: activité de cholestérol acyltransférase comprenant du cholestérol et de la lécithine comme esters d'acide gras et l'activité enzymatique de la cholestérol-estérase ou de la lysophospholipase. 51. 44 Composition pour dosage selon la revendication 29 o ladi- te composition pour dosage est une composition pour doser le cholestérol comprenant la lécithine comme ester d'acide gras, et les activités enzymatiques de la lécithine: choles- térol acyltransférase et de la cholestérol-estérase ou de la lysophospholipase. Composition pour dosage selon l'une des revendications 26 à 44 o l'activité enzymatique est une enzyme mult-iactive compre- nant une activité d'énoyl-Co A hydratase, une activité de 3-hydroxyacylCo A-déshydrogénase et une activité de 3-cétoacyl-Co A-thiolase dans une seule protéine enzyma- tique. 46 Composition pour dosage selon la revendication 45 o ladite enzyme multi-active est une enzyme obtenue à partir d'un micro-organisme producteur d'enzyme multi-active appartenant à Pseudomonas fragi. 47 Composition pour dosage selon la revendication 46 o ladite souche productrice d'enzyme multi-active est Pseudo- monas fragi B-0771 FERM-P n 5701. 48 Composition pour dosage selon l'une des r xevendications 26 à 47 o ladite composition pour dosage contient un chromogène de transfert d'atome d'hydrogène, accepteur d'atome d'hy- drogène du NAD réduit. 49 Composition pour dosage-selon la revendication 48 o ledit chromogène de transfert d'atome d'hydrogène comprend la diaphorase et un sel de tétrazolium soluble dans l'eau. Procédé de production d'une enzyme dans lequel on cultive des microorganismes appartenant au genre Pseudomonas produisant une enzyme ayant une activité d'énoyl-Co A- hydratase, une activité de 3-hydroxyacyl-Co A-déshydrogé- nase et une activité de 3-cétoacyl-Co A-thiolase, et on isole l'enzyme à partir de ces microorganismes. 51 Procédé selon la revendication 50 o ledit mieroorganis- me est une souche appartenant à Pseudomonas fragi. 52 Procédé selon la revendication 51 o ledit microorga- nisme est Pseudomonas fragi B-0771 FERH-P né 5701.