FR 2500165 A1 19820820 FR 8202502 A 19820216 t5OO1z5 La présente invention concerne un procédé et des réactifs d'immunodétermination par polarisation de fluorescence utilisant des carboxyfluorescéines. Plus particulièrement, l'invention concerne un procédé et des réactifs pour déterminer des ligands dans des liquides biolo- giques, tels que le sérum, le plasma, le liquide céphalo-rachidien, le liquide amniotique et l'urine. En particulier, l'invention concerne une immunodétermination par polarisation de fluorescence et des traceurs utilisés comme réactifs dans cette détermination. Le procédé d'immunodétermination par polarisation de fluorescence de l'invention combine la spécificité d'une immunodétermination à la vitesse et la commodité des techniques de polarisation de fluorescence pour permettre la détermination de la quantité d'un ligand particulier présent dans un échantillon. Les immunodéterminations par fixation compétitive pour mesurer des ligands reposent sur la compétition entre un ligand contenu dans un échantillon et un réactif marqué appelé traceur, vis-à-vis d'un nombre limité de sites récepteurs de fixation d'anti- corps spécifiques du ligand et du traceur. La concentration du ligand dans l'échantillon détermine la quantité de traceur fixée spécifi- quement à un anticorps. La quantité de conjugué traceur-anticorps produite peut être mesurée quantitativement et est inversement pro- portionnelle à la quantité de ligand présente dans l'échantillon. En général, les techniques de polarisation de fluores- cence reposent sur le principe qu'un composé marqué fluorescent, lorsqu'il est excité par une lumière à polarisation linéaire, émet une fluorescence ayant un degré de polarisation en relation inverse avec sa vitesse de rotation. Donc, lorsqu'une molécule, telle qu'un conjugué traceur-anticorps, ayant un marqueur fluorescent, est excitée par une lumière à polarisation linéaire, la lumière émise demeure fortement polarisée car la rotation du fluorophore est limitée entre le moment o la lumière est absorbée et celui o elle est émise. Lorsqu'un traceur "libre" (c'est-à-dire non fixé à un anticorps) est excité par une lumière à polarisation linéaire, sa rotation est bien plus rapide que celle du conjugué traceur-anticorps correspondant et les molécules sont orientées au hasard, si bien que la lumière émise est dépolarisée. Donc, la polarisation de la fluorescence fournit un moyen quantitatif de mesure de la quantité de conjugué traceur-anticorps produite dans une immunodétermination par fixation compétitive. On conna!t dans l'art divers composés marqués fluorescents. Le brevet des Etats-Unis d'Amérique n 3 998 943 décrit la préparation d'un dérivé d'insuline à marquage fluorescent utilisant l'isothio- cyanate de fluorescéine (FITC) comme marqueur fluorescent et d'un dérivé de morphine à marquage fluorescent utilisant le chlorhydrate d'amino-4 fluorescéine comme marqueur fluorescent. On a également utilisé la carboxyfluorescéine pour des déterminations analytiques. R.F. Chen, dans Anal. Lett., 10, 787 (1977) décrit d'emploi de carboxyfluorescéine pour indiquer l'activité de la phospholipase. Cependant, la carboxyfluorescéine n'est pas conjuguée comme selon l'invention, elle est encapsulée dans des liposomes de lécithine et ne devient fluorescente que lorsqu'elle est libérée par l'hydrolyse de la lécithine. L'invention comprend un procédé pour déterminer des ligands dans un échantillon qui consiste à mélanger avec ledit échantillon un sel biologiquement acceptable d'un traceur de formule: OH O O I R-C \ o R est un analogue de ligand ayant un radical amino primaire ou secondaire réactif unique qui est fixé au carbone carbonylique de la carboxyfluorescéine, ledit analogue de ligand ayant au moins un épi- tope commun avec ledit ligand de façon à être spécifiquement recon- naissable par un anticorps commun; et un anticorps capable de reconnaître spécifiquement ledit ligand et ledit traceur; puis à déterminer la quantité du conjugué traceur- anticorps selon des techniques de polarisation de fluorescence pour qu'elle constitue une mesure de la concentration dudit ligand dans l'échantillon. L'invention concerne de plus certains nouveaux traceurs et leurs sels biologiquement acceptables, qui sont utiles comme réactifs dans le procédé précédemment décrit. Les procédés et les traceurs de l'invention sont particulièrement utiles pour la surveil- lance quantitative des concentrations des médicaments dans le sérum et le plasma. L'invention va maintenant être décrite de façon détaillée. Dans la présente description, le terme "ligand" désigne une molécule, en particulier un haptène de bas poids moléculaire ayant un radical amino réactif unique, auquel peut se lier ou se fixer un récepteur, normalement un anticorps. Ces haptènes sont des corps ne contenant pas de protéine, généralement de bas poids moléculaire, qui n'induisent pas la formation d'anticorps lorsqu'on les injecte à un animal mais qui réagissent avec les anticorps. On forme géné- ralement les anticorps dirigés contre un haptène en conjuguant tout d'abord l'haptène à une protéine puis en injectant le conjugué à un animal. On isole les anticorps produits selon des techniques clas- siques d'isolement des anticorps. Les ligands déterminables selon le procédé de l'invention ont un poids moléculaire qui varie dans une gamme étendue. Bien que l'on puisse déterminer des ligands de poids moléculaire élevé, on préfère généralement, pour obtenir les meilleurs résultats, employer les procédés de l'invention pour déterminer les ligands de bas poids moléculaire compris généralement dans une gamme de 50 à 4 000. On préfère particulièrement déterminer des ligands ayant un poids moléculaire compris dans une gamme de 100 à 2 000. Les nouveaux traceurs de l'invention comprennent les composés de formule (I) dans laquelle l'analogue de ligand représenté par R comprend des radicaux ayant un poids moléculaire situé dans une gamme de 50 à 4 000. Les nouveaux traceurs préférés comprennent les composés de formule (I) dans laquelle les analogues de ligands représentés par R comprennent des radicaux ayant un poids moléculaire situé dans une gamme de 100 à 2 000. Des exemples caractéristiques de ligands ayant un radical amino réactif unique déterminable selon les procédés de l'invention comprennent des stéroïdes, tels que l'oestrone, l'oestradiol, le cortisol, la testostérone, la prdgestérone, l'acide chénodésoxy- cholique, la digoxine, l'acide cholique, la digitoxine, l'acide désoxycholique, les acides lithocholiques et les esters et amides qui en dérivent; des vitamines telles que la vitamine B-12, l'acide folique; la thyroxine, la triiodothyronine, l'histamine, la séroto- nine, des prostaglandines telles que PGE, FGF et PGA; des drogues antiasthmatiques telles que la théophylline, des drogues antinêopla- siques telles que la doxorubicine et le méthotrexate, des drogues antiarythmiques telles que le disopyramide, la lidocaline, le procaina- mide, le propranolol, la quinidine, le N-acétyl procainamide; des drogues anticonvulsivantes telles que le phénobarbital, la phénytoine, la primidone, l'amide valproique, la cailbamazépine et l'éthlosuximide; des antibiotiques tels que les pénicillines, les céphalosporines et la vancomycine; des drogues antiarthritiques telles que le salicylate; des drogues antidépressives, y compris les composés tricycliques,tels que la nortriptyline, l'amitriptyline, l'imipramine et la désipramine; et similaires ainsi que leurs métabolites. D'autres ligands que l'on peut déterminer selon les procédés de l'invention comprennent les drogues provoquant une toxicomanie telles que la morphine, l'héroine, l'hydromorphone, l'oxymorphone, le métapon, la codéine, l'hydrocodone, la dihydrocodéine, la dihydrohydroxycodéinone, la pholcodine, le dextrométhorphane, la phénazocine et la déonine ainsi que leurs métabolites. Les traceurs de l'invention existent généralement en équilibre entre leur état acide et leur état ionisé et, a l'état ionisé, ils sont efficaces dans le procédé de l'invention. L'invention englobe donc les traceurs à l'état acide ou ionisé et,pour simplifier, la structure des traceurs de l'invention est représentée sous la forme acide. Lorsque les traceurs de l'invention sont présents sous leur état ionisé, ils existent sous forme de sels biologiquement acceptables. On entend ici par "sels biologiquement acceptables" les sels tels que les sels de sodium, de potassium, d'ammonium et similaires qui permettent aux traceurs de l'invention d'exister à l'état ionisé lorsqu'on les emploie dans le procédé de l'invention. Généralement, les traceurs de l'invention existent en solution sous forme de sels, le sel particulier correspondant au tampon utilisé, c'est-à-dire que, en présence d'un tampon au phosphate de sodium, les traceurs de l'invention existent généralement à l'état ionisé sous forme d'un sel de sodium. Les traceurs de l'invention comprennent un analogue de ligand représenté par R lié à un fragment de carboxyfluorescéine de formule OH o -C \ \ /O (II) Lc\ O OH Le terme analogue de ligand utilisé ici désigne un radical mono ou polyvalent dont une proportion importante a la même organisation spatiale et polaire que le ligand pour former un ou plusieurs sites déterminants ou épitopiques capables d'entrer en compétition avec le ligand vis-à-vis des sites de fixation d'un récepteur. Une caractéristique d'un tel analogue de ligand est qu'il possède une similitude structurale suffisante avec le ligand auquel on s'intéresse pour pouvoir être reconnu par un anticorps dirigé contre le ligand. En majeure partie, la structure et la distribution des charges (organisation spatiale et polaire) de. l'analogue du ligand sont les mêmes ou pratiquement les mêmes que celles du ligand auquel on s'intéresse dans une portion importante de la surface moléculaire. Comme fréquemment le site de fixation d'un haptène pour préparer l'antigène destiné à la production d'anticorps est le même que le site de fixation au ligand, la portion de l'analogue du ligand qui constitue la cible de l'anticorps est la même que celle exposée par l'analogue de ligand dans le traceur. En général, la catégorie des analogues de ligand repré- sentés par R dérivent du ligand correspondant par l'élimination d'un atome d'hydrogène réactif, c'est-à-dire d'un atome d'hydrogène fixé à une amine réactive (primaire ou secondaire) ou par formation d'un dérivé amino du ligand o un radical 1ino H remplace un ou plusieurs atomes présents à l'origine dans le ligand, sur le site de fixation avec le fragment de carboxyfluorescéine. Des exemples de ligands qui, par élimination d'un hydrogène réactif, peuvent former les analogues de ligands représentés par R, sont le procalinamide, la thyroxine et la quinidine. Des exemples de ligands dont les dérivés amino sont utiles comme analogues de ligand sont la théophylline, l'acide valproique, le phénobarbital, la phénytoine, la primidone, le disopyramide, la digoxine, le chloramphénicol, le salicylate, l'acétaminophène, la carbamazépine-, la désipramine et la nortriptyline. De plus, on peut modifier la structure d'un ligand par addition ou suppression d'un ou plusieurs groupes fonctionnels pour former un analogue de ligand tout en conservant les sites épi- topiques nécessaires à la fixation avec un anticorps. Cependant, ces analogues de ligand modifiés sont fixés au fragment de carboxy- fluorescéine par un radical imino. On prépare généralement les traceurs de l'invention selon des techniques connues. Par exemple, on traite un composé de formule R - X (IIi) o R a la même définition que ci-dessus et X représente un hydrogène réactif, avec un composé de formule: OH O \ z-C t /. O OH O o R représente un hydroxy ou un ester actif, et o le radical carboxy est de préférence fixé à la position 4 ou 5 du cycle acide benzoîque, en présence d'un solvant inerte pour former un composé de formule (I). On entend ici par "ester actif" un fragment qui est facilement "éliminé" du carbone carboxylique en présence d'un agent de couplage. Ces "esters actifs" de la carboxyfluorescéine sont facilement déterminés par l'homme de l'art et on les prépare par réaction de la carboxyfluorescéine avec un composé tel que le N- hydroxysuccinimide, l'hydroxy-l benzotriazole hydraté ou le p-nitro- phénol en présence d'un agent de couplage tel que le dicyclohexyl- carbodiimide et d'un solvant. On fait ensuite réagir les esters actifs de carboxyfluorescéine ainsi produits avec un composé de formule (III) pour obtenir un traceur de formule (I). Si le composé de formule (III) est soluble dans l'eau, le mécanisme réactionnel se réalise par réaction directe de la carboxyfluorescéine avec un composé de formule (III) en solution aqueuse en présence d'un carbodiimide soluble dans l'eau tel que le chlorhydrate d'éthyl-l (diméthylamino-3' propyl)-3 carbodiimide comme agent de couplage. La température à laquelle on met en pratique le procédé de préparation des traceurs de l'invention n'a pas de limitation particulière. La température doit être suffisante pour amorcer et entretenir la réaction. Généralement, pour des raisons de commodité et d'économie, la température ordinaire suffit. Pour préparer les traceurs de l'invention, le rapport des composés réagissants n'a pas de limitation stricte. Pour chaque mole d'un composê de formule (I), on doit utiliser 1 mole d'un composé de formule (III) pour obtenir un rendement raisonnable. On préfère utiliser un excès du composé de formule (III) pour faciliter la réaction et la récupération des produits réactionnels. Pour faciliter la manipulation et la récupération des produits, on met en pratique le procédé de préparation des traceurs de l'invention en présence d'un solvant inerte. Des solvants inertes appropriés comprennent les solvants qui ne réagissent pas avec les matières de départ et qui les dissolvent et sont constitués par exemple de l'eau (si le composé de formule (III) est soluble dans l'eau), de diméthylformamide, de diméthvlsulfoxyde et similaires. Si le composé de formule (III) est un sel d'amine réactive, on ajoute une base appropriée au mélange réactionnel pour former la base libre de l'amine réactive. Des bases appropriées comprennent par exemple la triéthylamine. On purifie généralement les produits réactionnels de formule (I) par chromatographie en couche mince ou sur colonne avant l'emploi dans les procédés de l'invention. Selon le procédé de l'invention, on mélange un échantillon contenant le ligand à déterminer avec un sel biologiquement acceptable d'un traceur de formule (I) et un anticorps spécifique du ligand et du traceur. Le ligand présent dans l'échantillon et le traceur entrent en compétition vis-à-vis des sites limitatifs de l'anticorps, ce qui provoque la formation de complexes ligand-anticorps et traceur- anticorps. Lorsqu'on maintient constante la concentration du traceur et de l'anticorps, le rapport du complexe ligand-anticorps au complexe traceur-anticorps est directement proportionnel à la quan- tité de ligand présente dans l'échantillon. Donc, lorsqu'on excite le mélange avec une lumière polarisée et que l'on mesure la polari- sation de la fluorescence émise par un traceur et un complexe traceuranticorps, on peut déterminer quantitativement la quantité de ligand présente dans l'échantillon. En théorie, la polarisation de la fluorescence d'un traceur non complexé avec un anticorps est faible et voisine de zéro. Après la complexation avec un anticorps spécifique, le complexe traceuranticorps ainsi formé acquiert la rotation de la molécule d'anticorps qui est inférieure à celle de la molécule relativement petite de traceur, ce qui accroit la polarisation observée. Donc, lorsqu'un ligand entre en compétition avec le traceur vis-à-vis des sites d'un anticorps, la polarisation observée de la fluorescence du complexe traceur-anticorps a une valeur comprise entre celle du traceur et celle du complexe traceuranticorps. Si un échantillon contient une concentration élevée du ligand, la valeur observée de la polarisation est plus proche de celle du ligand libre, c'est-à-dire est faible. Si l'échantillon contient une concentration faible du ligand, la valeur de la polarisation est plus proche de celle du ligand fixé, c'est-à-dire est élevée. Lorsqu'on excite successivement le mélange réactionnel d'une immunodétermination avec une lumière polarisée verticalement puis horizontalement et qu'on analyse uni- quement la composante verticale de la lumière émise, on peut déter- miner de façon précise la polarisation de la fluorescence du mélange réactionnel. La relation précise entre la polarisation et la concen- tration du ligand à déterminer est établie par mesure des valeurs de la polarisation d'étalons de concentrations connues. On peut extra- poler la concentration du ligand à partir d'une courbe standard ainsi préparée. Le pH auquel on met en pratique le procédé de l'invention doit être suffisant pour que les traceurs de formule (I) existent à l'état ionisé. Le pH peut être compris entre environ 3 et 12 et plus généralement dans la gamme d'environ 5 à 10 et mieux d'environ 6 à 9. On peut utiliser divers tampons pour obtenir et maintenir le pH pendant la détermination. Des exemples de tampons sont les tampons borate, phosphate, carbonate, tris, barbital et similaires. Le tampon particulier utilisé n'a pas de limitations dans l'invention, mais, pour une détermination particulière, on peut préférer un tampon en raison de l'anticorps utilisé et du ligand à déterminer. La portion cationique du tampon détermine généralement la portion cationique du sel de traceur en solution. On met en pratique les procédés de l'invention à des températures modérées, de préférence à température constante. La température est normalement comprise entre environ O et 500C et mieux entre environ 15 et 40C. La concentration du ligand que l'on peut déterminer varie généralement entre environ 10 et 10 M et plus généralement entre environ 10 et 10 M. On peut déterminer des concentrations plus élevées du ligand par dilution de l'échantillon d'origine. En plus de la gamme des concentrations du ligand auquel on s'intéresse, des considérations telles que la nature qualitative, semi-quantitative ou quantitatives de la détermination, l'appareillage utilisé et les caractéristiques du traceur et de l'anticorps déter- minent normalement la concentration du traceur et de l'anticorps que l'on utilise. Bien que la concentration du ligand dans l'échantillon détermine la gamme de concentration des autres réactifs, c'est-à-dire du traceur et de l'anticorps, normalement, pour optimaliser la sensibilité de la détermination, on doit déterminer empiriquement les concentrations des réactifs individuels. Les concentrations du traceur et de l'anticorps sont facilement déterminées par l'homme de l'art. Comme précédemment indiqué, les traceurs préférés de l'invention sont préparés à partir de la carboxy-5 fluorescéine ou de la carboxy-4 fluorescéine ou de leurs rmélenges et sont représentés par les formules I Z-C \/ \OV / ou OH (VI) Les exemples illustratifs et non limitatifs suivants sont destinés à montrer à l'homme de l'art la façon dont on peut préparer des traceurs particuliers entrant dans le cadre de l'inven- tion. Le symbole (CF) qui figure dans les formules développées illustrant les composés prépares dans les exemples suivants repré- sente un fragment de formule: OH -C (VII) o le radical carbonyle est fixé à la position 4 ou 5 de la formule du fait que l'on utilise comme matière de départ un mdlange de carboxy-4 et -5 fluorescdines. EXEMPLE 1 On dissout 5 mg de m- ou de p-aminophénobarbital et 5 mg de carboxyfluorescéine dans 0,5 ml de pyridine. On ajoute au mélange mg de N, N'-dicyclohexylcarbodiimide. On effectue la réaction pendant 2 h à la température ordinaire puis on purifie deux fois le produit réactionnel par chromatographie en couche ing ce sur gel de silice avec un mélange 2/1 de chloroforrie et de m6Lhanol comme solvant de développement pour obtenir un conjugué aminophénobarbital-carboxy- fluorescéine de formule: i //0 / N-C\ /H2CH3 0 = C C I H N C, / N-4YCF) H 0 EXEMPLE 2 On porte à reflux pendant 2 h une solution ccntenant 1,0 g d'hydroxyde de sodium, 2,5 g de phdnytoine et 2,0 g de bionhydrate de bromo-2 méthylamine dans 100 ml d'éthanol b 100% puis on évapore à sec sous pression réduite. On met le résidu en suspension dans 50 ml d'eau et on ajuste le pH à 11 par addition d'hydroxyde de sodium 6 N pour dissoudre toute phénytoine n'ayant pas réagi, On filtre le précipité restant constitué de P-aminoéth.yl-2 rhénytcrlo, on rince à fond avec de l'eau et on sûche, On prépare un ester actif de carboxyfluoresceine par dissolution de 5 mg de N-hydroxysuccinimide, 7,5 mg de carboxyfluores- céine et 20 mg de N,N'-dicyclohexylcarbodiimCe dans O0,5 ml de pyridine. On laisse la réaction s'effectuer pendant 2 h à la tc:pé- rature ordinaire puis on dissout 10 mg de p-aminothyl-2 phlénytoine dans le mélange réactionnel. On laisse le mélange obtenu réagir pendant une nuit à l'obscurité à la température ordinaire et on purifie deux fois le produit rdactionnel par chromatographie en couche mince sur gel de silice avec un mélange 3/1 de chloroforme et de mdthanol comme solvant de développement pour obtenir un conjugué 9-aminoéthyl-2 phényto'inecarboxyfluorescéine de formule: H \/X /C N-CH2CH2-N-4CF) C C C \C 2 \N \I H O EXEMPLE 3 On laisse reposer à la température ordinaire pendant une nuit une solution contenant 620 mg de carboxyméthyl-2 phénytolne, 248 mg de N-hydroxysuccinimide et 453 mg de N,N'-dicyclohexylcarbo- diimide dans 6 ml de diméthylsulfoxyde anhydre. On filtre le mélange et on ajoute 0,7 ml d'hydrazine à 95% à 4,5 ml du filtrat. Après 4 h à la température ordinaire, on ajoute au mélange réactionnel 40 ml d'eau et 0, 5 ml d'hydroxyde de sodium à 10%. On filtre le précipité constitué de carboxymdthyl-2 phénytoine-hydrazide, on le rince & l'eau, on le sèche et on l'utilise sans autre purification. On ajoute 15 mg de N,N'-dicyclohexylcarbodiimide à une solution de 5 mg de carboxyméthyl-2 phénytoine-hydrazide et 5 mg de carboxyfluorescéine dans 0,5 ml de pyridine. On laisse la réaction s'effectuer pendant 2 h à la température ordinaire, puis on purifie deux fois le produit réactionnel par chromatographie sur couche mince de gel de silice avec un mélange 1/1 de chloroforme et d'acétone comme solvant de développement pour obtenir un conjugué carboxyméthyl-2 phénytolne-hydrazide- carboxyfluorescéine de formule: 0 H H C - N-CH2-C-N-N-4CF) C /N H O EXEMPLE 4 On ajoute 15 mg de N,N'-dicyclohexylcarbodiimide à une solution de 5 mg de 5-aminoéthyl-8 théophylline et 5 mg de carboxy- fluorescéine dans 0,5 ml de pyridine. On laisse la réaction s'effectuer pendant 2 h à la température ordinaire puis on purifie deux fois le produit réactionnel par chromatographie en couche mince sur gel de silice avec un mélange 2/1 de chloroforme et de méthanol comme solvant de développement pour obtenir un conjugué P-aminoéthyl-8 théophyllinecarboxyfluorescéine de formule: O H 0 - H CH3 H t /'"'CH2CH2 N" N -CH3 EXEMPLE 5 On reprend le mode opératoire de l'exemple 4 en utilisant l'aminométhyl-8 théophylline au lieu de la P-aminoéthyl-8 théophylline pour obtenir un conjugué aminonéthyl-8 thdophlylline-carboxyfluoreecelne de formule: O H Il I CH C N H A 11 tCH2-N-"CF) CH3 EXEMPLE 6 On dissout 7,5 g de a -valêrolactame dans 60 ml de tétrahydrofuranne anhydre sous atmosphère d'azote sec et on ajoute goutte à goutte dans le réacteur refroidi avec un bain de glace sèche et d'acétone 90 ml de nbutyllithium 1,6 M dans l'hexane. Après achèvement de l'addition du nbutyllithium, on agite le mélange réactionnel à la température ordinaire pendant 1 h, on porte à reflux pendant 30 min puis on refroidit a la température ordinaire sous atmosphère d'azote sec. On ajoute lentement dans le réacteur 8,0 g de bromo-1 éthane en refroidissant avec un bain glacé. On agite ensuite le mélange pendant 16 h à la température ordinaire puis on ajoute lentement 100 ml d'eau. On agite le mélange obtenu à la température ordinaire pendant 30 min et on sépare la couche organique. On extrait la couche organique avec 50 ml d'éther éthylique, on combine les couches organiques et on sèche sur sulfate de sodium. On évapore le solvant pour obtenir une huile foncée qui cristallise par repos. On recristallise le résidu cristallin dans l'éther de pétrole pour obtenir 3,8 g d'un résidu. On porte le résidu (2,8 g) à reflux dans 25 ml d'acide chlorhydrique 6N pendant 6 h. On évapore l'eau du mélange pour obtenir une huile foncée épaisse constituée d'acide éthyl-2 amino-5 pentanoique que l'on utilise sans autre purification. On prépare un ester actif de la carboxyfluorescéine par dissolution de 5 mg de N-hydroxysuccinimide, 7,5 mg de carboxyfluores- céine et 20 mg de N,N'-dicyclohexylcarbodiimide dans 0,5 ml de pyridine. On laisse la réaction s'effectuer pendant 2 h à la température ordi- naire puis on dissout 20 mg d'acide éthyl-2 amino-5 pentanoique dans le mélange réactionnel. On laisse le mélange obtenu réagir pendant une nuit à l'obscurité à la température ordinaire et on purifie deux fois le mélange réactionnel par chromatographie en couche mince sur gel de silice en employant un mélange 3/1 de chloroforme et de méthanol comme solvant de développement pour obtenir un conjugué acide éthyl-2 amino-5 pentanoique-carboxyfluorescéine de formule: H H !! CH3CH 2 -CH2CH2CH2-N-CF) C=O OH EXEMPLE 7 On prépare un ester actif de la carboxyfluorescéine par dissolution de 5 mg de N-hydroxysuccinimide, 7,5 mg de carboxy- fluorescéine et 20 mg de N,N'-dicyclohexylcarboditmide dans 0,5 ml de pyridine. On laisse la réaction s'effectuer pendant 2 h à la température ordinaire puis on dissout dans le mélange réactionnel mg de (yaminopropylidène)-5 5H-dibenzo[a,d]dihydro-10,11 cyclo-, heptêne. On laisse le mélange réagir pendant une nuit à l'obscurité à la température ordinaire et on purifie deux fois le produit réactionnel par chromatographie en couche mince sur gel de silice en utilisant un mélange 3/1 de chloroforme et de méthanol comme solvant de développement pour obtenir un conjugué (y-aminopropylidène)-5 5H-dibenzo[a,d]dihydro-10,>11 cycloheptène-carboxyfluorescéine de formule: C=CHC22l H2 T,=-4CF) EXEMPLE 8 On porte à reflux pendant 2 h une solution contenant 1,33 g de chlorhydrate de désipramine et 0,8 g de chlorure de chloro- acétyle dans 25 ml de chloroforme. On évapore le chloroforme et on dissout le résidu dans 25 mil d'acétone. On ajoute 0,75 g d'iodure de sodium à lasolution dans l'acétone et on porte la solution à reflux pendant 30 min. On filtre la solution et on rince àA l'acétone le sel précipité. On évapore le filtrat acétonique et on reprend le résidu dans 20 ml de méthanol. On ajoute 20 ml d'hydroxyde d'ammonium concentré à la solution mdthanolique et on porte la solution obtenue à reflux pendant 1 h. On extrait trois fois le mélange réactionnel avec 25 ml de chloroforme, on sèche les extraits combinés sur sulfate de sodium, on filtre et on évapore pour obtenir la N-aminoacétyl- désipramine que l'on utilise sans autre purification. On dissout 5 mg de N-aminoacétyldésipramine et 5 mg de carboxyfluorescéine dans 0,5 ml de pyridine. On ajoute au mélange mg de N, N'-dicyclohexylcarbodiimide. La réaction s'effectue pendant 2 h à la température ordinaire puis on purifie deux fois le produit réactionnel par chromatographie en couche mince sur gel de silice avec un mélange 1/1 de chloroforme et d'acétone comme solvant de développement pour obtenir un conjugué N-aminoacétyldési- pramine-carboxyfluorescéine de formule: / -CH CH CH -N-C-CH NH-*CF) EXEMPLE 9 On laisse réagir à la température ordinaire pendant 4 h une solution contenant 5 mg de N-hydroxysuccinimide, 7,5 mg de carboxy- fluorescéine et 20 mg de N,N'-dicyclohexylcarbodiimide dans 1 ml de pyridine. On précipite un ester actif de carboxyfluorescéine par addition de 10 ml d'éther éthylique au mélange réactionnel. On filtre le précipité, on le rince soigneusement à l'éther éthylique et on le redissout dans 0, 5 ml de diméthylsulfoxyde. On ajoute ensuite 10 mg de L-thyroxine A la solution et on laisse la réaction s'effectuer pendant 2 h à la température ordinaire puis on purifie deux fois le produit rdactionnel par chromatographie en couche mince sur gel de silice avec un mélange 3/1 de chloroforme et de méthanol comme solvant de développement pour obtenir un conjugué L-thyroxine-carboxyfluores- céine de formule: I! 0 II O HO O CHC- N-4CF) H EXEMPLE 10 On agite A la température ordinaire pendant 48 h une solution contenant 0, 89 g d'acétate d'ammonium, 389 mg d'oxo-3 digoxigénine et 63 mg de cyanoborohydrure de sodium dans 5 ml de méthanol. On ajuste le pH de la solution A 1 par addition d'acide chlorhydrique concentré et on évapore à sec sous pression réduite. On reprend le résidu dans 10 ml d'eau et on extrait trois fois avec ml de chloroforme. On ajuste le pH de la couche aqueuse à 11 avec de l'hydroxyde de potassium solide. On extrait cinq fois la solution obtenue avec 10 ml de chlorure de méthylène. On combine les couches organiques, on sèche puis on évapore à sec sous pression réduite pour obtenir l'amino- 3 désoxy-3 digoxigénine que l'on utilise sans autre purification. On prépare un ester actif de carboxyfluorescéine par dissolution de 5 mg de N-hydroxysuccinimide, 7,5 mg de carboxyfluores- céine et 20 mg de N,N'-dicyclohexylcarbodiimide dans 0,5 ml de pyridine. On laisse la réaction s'effectuer pendant 2 h à la tempéra- ture ordinaire puis on isole un conjugué d'amino-3 désoxy-3 digoxi- génine-carboxyfluorescéine de formule: O O CH3 HH C3 OH H N-ECF) On prépare également les traceurs suivants selon les modes opératoires précédemments décrits: EXEMPLE 11 Conjugué O-aminoacétyl propanolol-carboxyfluorescéine O H OCH CH-O-C-CH -N-(CF) 2 2 a) H2-N-CH N H CH3 2500 165 EXEMPLE 12 Conjugué acide propyl-2 amino-5 pentanoique-carboxyfluorescéine H H I! CH CH2CH -C-CH2 CHl2CH -N-(CF) 3 2 Z, 222 *C=O OH EXEMPLE 13 Conjugué acide butyl-2 amino-5 pentanoique-carboxyfluorescéine H H o I CH CH2CH2CH2 -C-CH2 CH CH -N-(CF) C=O OH EXEMPLE 14 Conjugué aminoprimidone-carboxyfluorescéine H H CH2 CH3 H /N C\ / 3 N4CF) CH /C N x\ H O EXEMPLE 15 Conjugué (nitro-4' phényl)-l hydroxy-1 amino-2 hydroxy-3 propane-carboxy- fluorescéine H 502N -CH-CH-N-(CF) OH 1 CH2OH EXEMPLE 16 Conjugué p-aminoph&nol-carboxyfluoresc sine H HO -N-ECF) EXEMPLE 17 Conjugué N-(amino-2 éthyl)-éthosuximide-carboxyfluorescéine CH2. H H N-CH2CH2-N-(CF) CH3CH2 -C, CH 0 EXEMPLE 18 Conjugué N'-déséthyl N-acetyl procafnamide-carboxyfluoresc4ine O\\ H O H CH CH 3 C N- C-N-CH2CH2-N-4CF) CH 3 EXEMPLE 19 Conjugué N-déséthyl N'-aminoacétyl N-actyl procainainide-carboxy- fluoresc éine O0 H 0 H CHCH H 2 3, /3 C','C'-NI-CH CH -N-C-CH2-N-"CF) CH3 EXEMPLE 20 Conjugué amino-1 phényl-2 (pyridyl-2')-2 (diisopropylamino)-4 butane- carboxyfluorescéine H CH2-N-4CF) -10 EXEMPLE 21 Conjugué triiodo-3,3',5 L-thyronine-carboxyfluorescéine I O % OH -CH2-C-N-4CF) H H EXEMPLE 22 Conjugué tétraiodo-3,3',5,5' D-thyronine-carboxyfluorescéine 0% /OH C I H CH2-C-N-4CF) H EXEMPLE 23 Conjugué N-aminoacéty1 iminodibenzyl-carboxyfluorescéine CH3 H-C CH3 I HO, I O, H N-C-CH2-N-4CF) EXEMPLE 24 Conjugué carbohydrazinoiminodibenzyle-carboxyfluorescéinerie 0 H H N-C-N-N-"CF) EXEMPLE 25 Conjugué dibenzosubéronehydrazone-carboxyfluorescéine H C=N-N-ECF) EXEMPLE 26 Conjugué amino-5 dihydro-10,11 5H-dibenzo(ad)cyclohept.ne-carboxy- fluorescéine C N-4CF) H Comme précédemment indiqué, les traceurs de l'invention sont des réactifs efficaces utiles dans les immunodéterminations par polarisation de fluorescence. Les exemples suivants illustrent l'utilité des traceurs de l'invention dans des immunodéterminations utilisant des techniques de polarisation de fluorescence. Ces déter- minations sont effectuées selon le mode opératoire général suivant: 1) on introduit dans un tube à essai un volume mesuré d'étalon ou de sérum à étudier et on dilue avec un tampon; 2) on ajoute ensuite a chaque tube une concentration connue d'un traceur de l'invention contenant éventuellement un agent tensio-actif; 3) on ajoute aux tubes une concentration connue d'anti- sérum; 4) on incube le mélange réactionnel à température ordinaire; et 5) on mesure la quantité de traceur fixée à l'anticorps selon des techniques de polarisation de fluorescence pour mesurer la quantité de ligand dans l'échantillon. EXEMPLE 27 Détermination de la phénytoine A) Matériel nécessaire: 1) Tampon GGB constitué de phosphate de sodium 0,1 M, a pH 7,5,contenant 0,01% de yglobuline bovines et 0,01% d'azide de sodium. 2) Traceur constitué de M-aminoéthyl-2 phénytolne-carboxy- fluorescéine à une concentration d'environ 105 nM dans du tampon GGB avec addition de 5% de cholate de sodium. 3) Antisêrum dirigé contre la phênyto'fne, dilué de façon appropriée dans du tampon GGB contenant 0,005% de chlorure de benzalkonium. 4) Echantillons de sérum humain ou d'un autre liquide biologique contenant de la phénytoïne. ) Cuvettes, on utilise des tubes de culture en verre de 10 x 75 mm comme cuvettes. 6) Fluoromètre capable de mesurer la polarisation de la fluorescence avec une précision de - 0,001 unité. B) Méthode de détermination: 1) On place dans chaque cuvette un petit volume d'échantil- Ion (0,366/ul) par pipettage de 15/ul d'échantillon et dilution avec 600/ul de tampon GGB dans un récipient de dilution. Ensuite, on pipette 15/ul d'échantillon dilué dans la cuvette puis 600/ul de tampon GGB. 2) On ajoute le traceur par pipettage de 40/Oul de traceur et de 1000/ul de tampon GGB dans la cuvette. 3) On ajoute l'antisérum pour démarrer la réaction par pipettage de 40/ul d'antisérum dans la cuvette puis 1000/ul de tampon GGB. 4) On mélange soigneusement le contenu de toutes les cuvettes et on laisse incuber pendant 15 min à la température ambiante. ) On lit la polarisation de la fluorescence avec un fluoromètre et on établit une courbe d'étalonnage pour déterminer les concentrations inconnues. C) Les résultats d'une série de sérums standards contenant de la phénytoine à des concentrations comprises entre O et /ug/ml figurent cidessous. Chaque concentration a été déterminée en double et la moyenne a été établie. Concentration de la Polarisation phénytotine (/ug/ml) O 0,222 2,5 0,196 ,0 0,178 10,0 0,154 ,0 0,132 >0 0,110 On voit que la polarisation de la fluorescence diminue de façon régulière lorsque la concentration en phénytoine augmente, ce qui permet de construire une courbe d'étalonnage. On peut effectuer l'analyse quantitative d'échantillons inconnus traités de façon identique en se référant à la courbe d'étalonnage, ce qui illustre l'utilité de la 5amino4thyl-2 phénytoine-carboxyfluorescéine pour la mesure de la phénytoine. EXEMPLE 28 Détermination du phénobarbital A) Matériel nécessaire 1) Tampon GGB (voir phénytoine). 2) Traceur constitué d'aminophénobarbital-carboxyfluores- céine à une concentration d'environ 110 nM dans du tampon tris-HCl à pH 7, 5 contenant O,01% d'azide de sodium, 0,01% de y-globulines bovines et 0,125% de dodécylsulfate de sodium. 3) Antisérum dirigé contre le phénobarbital,dilué de façon appropriée dans du tampon GGB contenant 0,005% de chlorure de benzalkonium. 4) Echantillons de sérum humain ou d'un autre liquide biologique contenant du phénobarbital. ) Cuvettes (voir phénytoine). 6) Fluoromètre (voir phénytoine). B) Protocole de détermination: 1) On place un petit volume d'échantillon (O,196/ul) dans la cuvette par pipettage de 10/ul d'échantillon et dilution avec 500/ul de tampon GGB dans un récipient de dilution. Ensuite, on pipette 10/ul d'échantillon dilué dans la cuvette puis 500 /ul de tampon GCB. 2) On ajoute le traceur par pipettage de 40/ul de traceur et 1000/ul de tampon CGB dans chaque cuvette. 3) On ajoute l'antisérum pour démarrer la réaction par pipettage de 40/ul d'antisérum puis 1000/ul de tampon GGB. 4) On mélange soigneusement le contenu de toutes les cuvettes et on laisse incuber pendant 15 min à la température ambiante. ) On lit la polarisation de la fluorescence sur un fluoromètre et on établit une courbe d'étalonnage pour déterminer les concentrations inconnues. C) Les résultats d'une série de sérums standards contenant du phénobarbital à des concentrations comprises entre O et 80/ug/ml figurent ci-dessous. Chaque concentration a été déterminée en double et la moyenne a été établie. Concentration du Polarisation phénobarbital (/ul) 0 0,250 ,0 0,231 ,0 0,196 ,0 0,150 ,0 0,104 80,0 0,077 On voit que la polarisation de la fluorescence diminue de façon régulière lorsque la concentration en phénobarbital augmente, ce qui permet de construire une courbe d'étalonnage. On peut doser quanti- tativement des échantillons inconnus traités de façon identique par référence à la courbe d'étalonnage, ce qui illustre l'utilité de l'aminophénobarbital-carboxyfluorescéine pour la mesure du phéno- barbital. EXEMPLE 29 Détermination de la théophylline A) Matériel nécessaire: 1) Traceur constitué d'aminoéthyl-8 théophylline-carboxy- fluorescéine 2 nM dans du tampon GGB (voir détermination de la phénytoine) contenant 0,01% de dodécylsulfate de sodium. 2) Antisérum dirigé contre la théophylline,dilué de façon appropriée dans du tampon GGB. 3) Echantillons de sérum humain ou d'un autre liquide biologique contenant de la théophylline. 4) Cuvettes (voir détermination de la phénytotne). ) Fluoromètre (voir détermination de la phénytoine). 250 0 165 B) Protocole de détermination: 1) Introduire 1,O/ul de traceur dans toutes les cuvettes. 2) Introduire 2,0 /ul d'échantillon dans toutes les cuvettes. 3) Introduire 1,0 ml d'antisérum dans toutes les cuvettes. 4) Mélanger soigneusement et incuber pendant 15 min & la température ambiante. 5) Lire la polarisation de la fluorescence sur un fluoro- mètre et construire une courbe d'étalonnage. C) Les résultats d'une série de sérums étalons contenant de la théophylline à des concentrations comprises entre O et 40/ug/ml figurent ci-après. Chaque concentration a été déterminée en double et la moyenne a été effectuée. Concentration de la Polarisation théophylline (/ug/ml) O 0,158 2,5 0,118 5 0,105 0,091 0,076 0,063 On voit que la polarisation de la fluorescence diminue de façon régulière lorsque la concentration en théophylline augmente, ce qui permet de construire une courbe d'étalonnage. On peut doser quanti- tativement des échantillons inconnus traités de façon identique par référence à la courbe d'étalonnage, ce qui illustre l'utilité de l'aminoéthyl-8 théophylline-carboxyfluorescéine pour la mesure de la théophylline. EXEMPLE 30 Détermination de la digoxine A) Matériel nécessaire: 1) Tampon GB constitué de phosphate de sodium 0,1 M à pH 7,5 contenant 0,01% de yglobulines bovines et 0,01% d'azide de sodium. 2) Traceur constitué de digoxine-carboxyfluorescéine à une concentration d'environ 2 nM dans du tampon GGB. 3) Antisdrum de lapin dirigé contre la digoxine, dilué de façon appropriée dans du tampon GGB. 4) Echantillons de sérum humain ou d'un autre liquide biologique contenant de la digoxine. ) Réactif précipitant: acide trichloroacétique à 5% dans l'eau. 6) Cuvettes, on utilise comme cuvettes des tubes de culture en verre de 10 x 75 mm. 7) Fluoromètre capable de mesurer la polarisation de la fluorescence avec une précision de- 0,001 unité. B) Protocole de détermination: 1) Dans un tube à essai, on ajoute à 100/ul d'acide trichloro- acétique à 5%7. 100/ul de standard ou d'échantillon inconnu. On bouche les tubes contenant l'échantillon et on les agite en formant un vortex. 2) On centrifuge les tubes contenant le standard ou l'échantillon dans l'acide trichloroacétique. 3) Dans un tube à essai contenant 1,8 ml de tampon GGB et /ul d'antisérum à 35 C, on ajoute 150/ul de la solution surnageante d'acide trichloroacêtique. 4) On incube les tubes à essai contenant l'antisérum et le surnageant pendant 6 min à 35 C puis on mesure la polarisation de fluorescence des tubes. Cette mesure constitue la polarisation de fluorescence de base du standard ou de l'échantillon inconnu. 5) 10 min après l'addition du surnageant à l'antisérum, on ajoute 25/ul de traceur dans le tube à essai. 6) 6 min après l'addition du traceur, on mesure la pola- risation de la fluorescence des tubes étalons et des tubes échantillons et on soustrait la valeur de base de la polarisation de la fluorescence précédemment mesurée pour obtenir la polarisation de la fluorescence du complexe anticorps-traceur formé. 7) Les résultats d'une série de sérums étalons contenant de la digoxine à des concentrations comprises entre O et 5 ng/ml figurent ci-dessous. On a analysé quatre échantillons pour chaque concentration et établi la moyenne. Concentration de la digoxine (ng/ml) O 0,5 1,0 2,0 3,0 ,0 Polarisation 0, 142 0,134 0,123 0,106 0,092 0,070 On voit que la polarisation de la fluorescence diminue de façon régulière lorsque la concentration de la digoxine s'accroit, ce qui permet de construire une courbe d'étalonnage. On peut doser quanti- tativement des échantillons inconnus traités de façon identique par référence à la courbe d'étalonnage, ce qui illustre l'utilité de la digoxine-carboxyfluorescéine pour la mesure de la digoxine. Le tableau suivant résume les diverses déterminations par polarisation de fluorescence que l'on a effectuées selon les modes opératoires précédemment décrits avec des traceurs préparés dans les exemples précédents. Les traceurs utilisés sont identifiés par le numéro de l'exemple et les ligands particuliers déterminés sont indiqués. Exemple n 5 10 Ligands Phénobarbital Phénytoine Phénytoine Théophylline Théophylline Acide valproique Nortriptyline; amitriptyline Imipramine; désipramine Thyroxine Digoxine Exemple n 14 19 24 Ligands Propanolol Acide valproique Acide valproique Primidone Chloramphénicol Acé taminophène Ethosuximide N-acétylprocainamide N-a c tylprocainamide Disopyramide Triiodothyronine Thyroxine Imipramine; désipramine Imipramine; désipramine Nortriptyline; amitriptyline Nortriptyline; amitriptyline Comme le montrent les résultats ci-dessus, les traceurs de l'invention sont des réactifs efficaces dans les immunodétermina- tions par polarisation de fluorescence. En plus des propriétés précitées, les traceurs de l'invention possèdent un degré élevé de stabilité thermique, un degré élevé d'action sur la polarisation, des rendements quantiques élevés et ils sont relativement faciles à produire et à purifier. Bien entendu, diverses modifications peuvent être apportées par l'homme de l'art aux dispositifs ou procédés qui viennent d'être décrits uniquement à titre d'exemples non limitatifs sans sortir du cadre de l'invention. 2500 165 R E V E N D I C A T I O N S 1.. Procédé pour déterminer des ligands dans un échan- tillon, caractérisé en ce qu'il consiste a mélanger avec ledit échan- tillon un traceur de formule OH R-C 0 \OH \ o R représente un analogue de ligand ayant un radical amino primaire ou secondaire, réactif, unique, fixé à un carbone carbo- nylique d'un fragment de carboxyfluorescéine, ledit analogue de ligand ayant au moins un épitope commun avec ledit ligand de façon a être spécifiquement reconnaissable par un anticorps commun; et un anticorps capable de reconnaître spécifiquement ledit ligand et ledit traceur; puis à déterminer la quantité de traceur fixée à l'anticorps selon des techniques de polarisation de fluorescence pour mesurer la quantité de ligand dans l'échantillon. 2. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que ledit ligand est une drogue ou un métabolite correspondant. 3. Procédé selon la revendication 2, caractérisé en ce que le radical carbonyle fixé au radical R est également fixé a la position 4 ou 5 du fragment de carboxyfluorescéine. 4. Procédé selon la revendication 3, caractérisé en ce que ladite drogue est un stérotde, une hormone, un antiasthmatique, un antinéoplasique, un antiarythmique, un anticonvulsivant, un anti- arthritique, un antidépresseur, un glucoside agissant sur le coeur ou un de leurs métabolites. 5. Procédé selon la revendication 4, caractérisé en ce que R a un poids moléculaire compris dans la gamie de 50 à 4 000. 6. Procédé selon larevendication 5, caractérisé en ce que R a un poids moléculaire compris dans la gamme de 100 a 2 000. 7. Procédé selon la revendication 6, caractérisé en ce que ladite drogue est un anticonvulsivant. 8. Procédé selon la revendication 7, caractérisé en ce que ladite drogue anticonvulsivante est le phénobarbital. 9. Procédé selon la revendication 7, caractérisé en ce que ladite drogue anticonvulsivante est la phÉnytotne. 10. Procédé selon la revendication 7, caractérisé en ce que ladite drogue anticonvulsivante est la primidone. 11. Procédé selon la revendication 6, caractérisé en ce que ladite drogue est un stéronde. 12. Procédé selon la revendication 11, caractérisé en ce que ledit stérorde est la digoxine. 13. Procédé selon la revendication 6, caractérisé en ce que ladite drogue est un antiarythmique. 14. Procédé selon la revendication 13, caractérisé en ce que ladite drogue antiarythmique est le propranolol. 15. Procédé selon la revendication 6, caractérisé en ce que ladite drogue est un antiasthmatique. 16. Procédé selon la revendication 15, caractérisé en ce que ladite drogue antiasthmatique est la théophylline. 17. Composé caractérisé en ce qu'il répond à la formule OH 1,0A c o R est un analogue de ligand ayant un radical amino primaire ou secondaire, réactif, unique, qui est fixé à un carbone carbony- lique d'un fragment de carboxyfluorescéine et qui a un poids 2500 1 65 moléculaire compris dans la gamme de 100 à 2 000; ledit analogue de ligand ayant au moins un épitope commun avec un ligand de façon à être spécifiquement reconnaissable par un anticorps commun. 18. Composé selon la revendication 17, caractérisé en ce que le radical carbonyle fixé au radical R est également fixé à la position 4 ou 5 du fragment de carboxyfluorescéine. 19. Composé selon la revendication 18, caractérisé en ce que R dérive d'un ligand choisi parmi les stérotdes, les hormones, les antiasthmatiques, les antinéoplasiques, les antiarythmiques, les anti- convulsivants, les antiarthritiques, les antidépresseurs et les glu- cosides agissant sur le coeur. 20. Composé selon la revendication 19, caractérisé en ce que R dérive d'un anticonvulsivant. 21. Composé selon la revendication 20, caractérisé en ce que R dérive du phénobarbital. 22. Composé selon la revendication 21, caractérisé en ce que R répond à la formule: H O \ N _ C \ / CH2CH3 C C 23. Composé selon la revendication que R dérive de la phénytotne. 24. Composé selon la revendication que R répond a la formule suivante: , caractérisé en ce 23, caractérisé en ce -0 0 H H C N--4CH 4-(C-N) -N- C 2n m N C H / o n est un nombre entier de 1 à 3 et m est 0 ou 1. Composé selon la revendication 24, caractérisé en ce que n est 2 et m est 0. 26. Composé selon la revendication 20, caractérisé en ce que R dérive de l'acide valprotque. 27. Composé selon la revendication 26, caractérisé en ce que R répond à la formule suivante: 0 H H C-C-CH CH CH -N- I-,, 2 22 HO (CH2)p H o p est un nombre entier de 2 à 4. 28. Composé selon la revendication 20, caractérisé en ce que R dérive de la primidone. 29. Composé selon la revendication 28, caractérisé en ce que R répond à la formule suivante H o N -C CII2CH3 H N -C C 30. Composé selon la revendication 19, caractérisé en ce que R dérive d'un stéro!de. 31. Composé selon la revendication 30, caractérisé en ce que R dérive de la digoxine. 32. Composé selon la revendication 31, caractérisé en ce que R répond à la formule suivante o O CH3 33. Composé selon la revendication 19, caractérisé en ce que R dérive d'une drogue antiasthmatique. 34. Composé selon la revendication 33, caractérisé en ce que R dérive de la théophylline. 35. Composé selon la revendication 34, caractérisé en ce que R répond à la formule suivante: O H CH " ' 3 C N H 2n-n- N- c> "N CH3 dans laquelle n est égal à 1 ou 2. 36. Composé selon la revendication 19, carat que R dérive d'un antiarythmique. 37. Composé selon la revendication 36, cara, que R dérive du propranolol. 38. Composé selon la revendication 37, cara, que R répond à la formule suivante: O H I.. I OCH CH-O-C-CH -N- 2 2 X J CH3 CH CNH-CH 3 2 1,1CH3 N 4 H 3 39. Composé selon la revendication 19, cara que R dérive d'une hormone. 40. Composé selbn la revendication 19, cara que R dérive d'un antiarthritique. 41. Composé selon la revendication 19, cara, que R dérive d'un glucoside agissant sur le coeur. 42. Composé selon la revendication 19, cara. que R dérive d'un antidépresseur. 43. Composé selon la revendication 19, cara que R dérive d'un antinéoplastique. 44. Composé selon la revendication 18, cara que R répond a la formule: R' I O C-OH H I I HO O CH -C-- N- 2 i H RI e I I o R' représente un atome d'hydrogène ou un radical iodo. ctérisé en ce ctérisé en ce ctérisé en ce ctérisé en ce ctérisé en ce ctérisé en ce ctérisé en ce ctérisé en ce ctérisé en ce