FR 2501229 A1 19820910 FR 8104474 A 19810306 250 1 229 PROCEDE D'INCLUSION DE MICRO-ORGANISMES DU GROUPE DES MYCORHIZES ET DES ACTINORHIZES La présente invention a trait à un procédé d'inclusion de micro-organimes du goupe des mycorhizes et des actinorhizes dans une matrice constituée par un gel de polymère, notamment à des fins agronomiques. On a déjà proposé depuis longtemps de fixer des micro- organismes sur un support comme par exemple dans lUS 1 909 622 déposé en 1923 selon lequel on apporte des bactéries fixant l'azote, du genre Rhizobium. Mais en général la culture de micro-organismes est adsorbée sur un support comme dans le brevet belge 521 850 qui préconise l'utili- sation de terre de diatomées et de silice colloïdale pour des Rhizo- bium. On a aussi fait appel à de la bentonite comme dans le GB 1 777 077, à des granulés de plâtre (dans le FR 1 490 046), voire à de la lignite. A G Mais ce mode par adsorbtion présente des inconvénients notam- ment en ce qui concerne la survie du micro-organisme et sa protec- tion lors du transport, du stockage et de la manipulation. On comprend que cette voie n'a abouti qu'à des résultats très limités, et que l'on ait cherché à améliorer les techniques de 2 0 fixation. C'est ainsi que dans le brevet français 1 180 000 dans le cas de la fabrication des préparations riches en bactéries du groupe des Azotobacter on a fait appel à un moût auquel on ajoute des substances à action adsorbante comme la cellulose, la farine d'os, le kaolin, du gel de silice. Mais là encore la solution n'est pas satisfaisante. On a donc cherché à améliorer à la fois la survie des micro-organismes, par exemple par inclusion, et la manière de les amener dans le milieu aux plantes. C'est ainsi que dans le FR 77 10254 du 5 Avril 1977 (correspon- dant à l'US 4 155 737) on a proposé un procédé qui fait appel à un inoculum constitué par un gel de polymère dans lequel est inclus le microorganisme, cet inoculum étant apporté dans la rhizosphère des plantes. Selon ce brevet, le gel de polymère peut être constitué par un gel de polyacrylamide ou un gel de silice. Mais l'on sait que le support doit retenir suffisamment le microorganisme pour le conserver, le protéger, le présenter sous une forme manipulable, tout en permettant son essaimage dans le milieu, et éventuellement en autorisant une aptitude au greffage d'additifs. Par ailleurs ce support doit assurer la viabilité du micro- organisme même après des périodes de temps égales à plusieurs semai- nes et ce dans des conditions d'hygrométrie variables. Ceci veut dire que ce support doit être à même soit de contenir une réserve d'eau -A o suffisante et la libérer à bon escient, soit de se procurer l'eau nécessaire à partir du milieu. Enfin le support ne doit pas être gênant pour le milieu, c'est-à-dire qu'il doit être soit biodegrada- ble, soit non polluant. Cette rapide énurération qui ne prétend pas 9tre exhaustive 4A permet de comprendre pourquoi cette voie n'a pas connu le développe- ment que l'on était en droit d'éspérer. Or, dans la demande francçaise 79 08597 du 5 Avril 1979, la demanderesse a revendiqué une solution particulièrement attrayante qui consiste à inclure le micro-organisme dans un polymère du groupe des polysaccharides et à provoquer une réticulation au moins partiel- le du polymère par exemple par voie thermique, ou par un sel métalli- que ou par synergie grâce à un autre polymère. Cette solution donne des résultats étonnants, et présente en outre l'avantage de montrer une synergie remarquable lorsque l'on fait appel en plus à un composé absorbant et adsorbant tel qu'une silice. La demanderesse a effectué ses premiers travaux en particulier sur Rhizobium japonicum, bactérie non sporulée fixatrice d'azote, très sensible notamment à la dessiccation, à la température et aux facteurs physico-chimiques. Mais certains micro-organismes présentent des difficultés supplémentaires en raison de leur nature filamenteuse comme par exemple les champignons ectomycorhiziens (exemple: Pisolithus, Hebeloma, Tuber, Boletus...) qui en autre ne présentent aucune 3 g forme de résistance lorsqu'ils sont cultivés en culture pure. Les associations mycorhiziennes sont le résultat de l'associa- 2 5 0 1 22 9 tion d'un champignon et d'une racine qui réalise une symbiose vraie. Selon la nature de l'association, on distingue: - les mycorhizes ectotrophes, se rencontrant surtout chez les arbres forestiers (Pinacées, Fagacées), et dont la plupart sont des champignons supérieurs (Ascomycètes et Basidiomycètes) - les mycorhizes endotrophes, qui sont le plus souvent des champi- gnons inférieurs (Phycomycétes), beaucoup plus répandues que les précédentes aussi bien chez les arbres et les arbustes que les plantes herbacées, dans le cas des mycorhizes à arbuscules -1 o et à vésicules, et limitées aux Ericacées, dans le cas de mycorhizes à pçlotons. L'action bénéfique de ces champignons mycorhiziens sur la croissance des plantes peut être attribuée à une protection phytosa- nitaire contre les pathogènes du sol, à la production de substances 4 ç de croissance ou de vitamines, à l'amélioration de la nutrition minérale de la plante, en particulier du phosphore par augmentation de la possibilité d'exploration du sol, amélioration de l'absorption en eau en condition de déficit hydrique. Par ailleurs, dans le cas des non légumineuses fixatrices d'azote, des associations symbiotiques de màme type que celles existant entre Rhizobium et légumineuses se caractérisant par la formation de nodosités sur le système racinaire, se rencontrent aussi bien chez des arbres que chez des arbustes ou des plantes herbacées. Le rôle de ces nodules n'est connu que pour certaines plantes ligneuses, colonisant en général les sols pauvres ou dégradés (sables, moraines), o il a été mis en évidence une fixation réelle d'azote atmosphérique. 137 espèces d'Angiospermes appartenant à 12 genres différents, classés dans 7 familles (Bétulacées, Casuarina- cées, Coriariacées, Eléagnacées, Myricacées, Rhamnacées, Rosacées) ont été reconnues (Bond 1974). L'endophyte responsable de la forma- tion de ces nodosités fixatrices d'azote est un Actinomycète (Frankia) qui n'a été isolé en culture pure que depuis 1978 par LALONDE et al. (Université de LAVAL, QUEBEC). L'intérêt de l'utilisation de ces essences forestières fixatri- 1.1 9Z ces d'azote en sylviculture, en particulier dans les sols marginaux, pauvres en azote, sans structure ou à structure modifiée ne fait aucun doute; on peut citer pour mémoire, les exemples suivants: reforestation de tourbière en FRA (Aulne, Myrcia), de moraines glacières dans les Alpes (Aulne), de rejets de mines ou de carrières de shistes bitumineux aux U.S.A.; - fixation de dunes maritimes et continentales au Sénégal (Casua- rina); - aménagement de la Baie-James au Canada - associations Alnus rubra - Douglas dans les systèmes forestiers À 0 N.O. Américains; - - - utilisation d'Alnus glutinosa, A. cordata, A. incana, A. crispa comme plantes d'appoint (nurse-tree) pour favoriser le dévelop- pement d'espèces non fixatrices; - utilisation de Ceanothus, Myrica, Hipophaea, Eleagnus en asso- ciation avec des espèces non fixatrices ou comme productrices d'engrais vert ou de biomasse... L'inoculation est pratiquée traditionnellement au stade pépi- nière par apport de nodules broyés avec l'inconvénient majeur de possibilité d'introduction de germes pathogènes, et de l'impossibi- 2. 0 lité de les conserver meme à basse température par suite d'une oxydation rapide des tanins et des substances phénoliques (composés toxiques pour le micro-organisme). Il n'a pas été possible jus- qu'alors de démontrer de façon formelle la possibilité d'augmenter la productivité de ces espèces par inoculation de l'endophyte déve- loppé en culture pure. De même dans le cas des ectomycorhizes l'ino- culation se pratique traditionnellement par un sol provenant d'une autre pépinière et plus couramment actuellement par des cultures pures de champignons mycorhiziens sur vermiculite; l'inoculation pratiquée de cette façon présente trois inconvénients: difficulté de développer le champignon (Pisolithus ou Hebeloma): - au moins 6 semaines (GRAHAN- LINDERMAN 1980 Can. J. Microb. 26, II) avec obtention d'une culture hétérogène et peu dense en milieu liquide; - au moins 8 à 10 semaines sur vermiculite. I g Dans le cas d'une culture liquide, il est nécessaire de récu- pérer le mycelium et de le broyer avant utilisation, avec les risques que comporte un cisaillement trop poussé (aucune repousse en particu- 250 1229 lier pour Tuber) pqisque le micro-organisme ne présente que des hyphes et aucune forme de résistance. quantité importante d'inoculum à mettre en oeuvre, 2 1/m2 dans le cas de micro-organisme développé sur vermiculite, d'o difficulté de stockage; nécessité d'inoculer avec des inoculums fra!chement préparés ou stockés à 4 C. Ces problèmes ont amené la demanderesse à poursuivre ses recher- ches. Un objet de l'invention est de proposer un inoculum pouvant être stocké à température ambiante et facile à utiliser. Un autre objet est d'améliorer la culture des mycorhizes et des actinorhizes en particulier au niveau de l'homogénéité et de la réduction de la durée de culture (ectomycorhizes). La présente invention a trait à un procédé d'inclusion de micro-organisme dans une matrice constituée par un gel de polymère à base d'au moins un polymère du groupe des polysaccharides, avec traitement de réticulation au moins partiel dudit polymère, caracté- risé par le fait que le micro-organisme est du groupe des mycorhizes et des actinorhizes. Ua Selon la présente invention on entend par traitement de réticu- lation au moins partiel un traitement susceptible de modifier la structure du polysaccharide tel que traitement thermique, traitement par un sel métallique ou de synergie au moyen d'un autre polymère et de préférence avec un autre polysaccharide. Avantageusement le polymère est à base d'un hétéro-polysaccha- ride à haut poids moléculaire obtenu par fermentation d'un hydrate de carbone par un micro-organisme du genre Xanthomonas ou Arthobac- ter ou des champignons appartenant au genre Sclerotium. On peut également faire appel à des polymères issus de gommes Et naturelles ou biosynthétiques, de provenances diverses - algues (alginates, carraghénanes, agar), exsudats de plantes (gommes kara- ya, adragante, arabique), de graines (guar, caroube). La farine de graines de caroube (locust bean gum) est un extrait du fruit du caroubier (Ceratonia siliqua L.) arbre de la famille des 6 Caesalpiniaceae (aire géographique: bassin méditerranéen). La farine de graines de caroube est contenue dans l'endosperme de la graine. L'endosperme est séparé de l'embryon par abrasion mécanique ou par procédé chimique. La farine de graines de caroube est un polysaccharide (galacto- mannane) constitué d'unités O.D. mannopyranosyl (liaisons 1-4), une sur 4 ou 5 étant substituée en C6 par a D. galactopyranosyl. La combinaison de la gomme Xanthane et de la farine de graines de caroube par effet synergique accroit la viscosité du gel. On pense que la gomme Xanthane est formée de chaînes hélico!dales et que l'interaction avec le galactomannane entraîne la formation de liaisons entre les chaînes et permet d'obtenir un gel à réseau tridimensionnel. O QLes alginates sont des extraits raffinés d'algues brunes de la classe des Phaeophycées. L'acide alginique est un polymère linéaire de haut poids molécu- laire formé d'une succession de molécules d'acide O.D. mannopyranosy- luronique et d'acide a.L. gulopyranosyluronique. 4^ les régions constituées d'acide guluronique. On obtient ainsi instan- tanément à 250C un gel d'une plus grande viscosité. A l'opposé, l'addition d'ions phosphate permet un retard de la prise en masse, qui peut être intéressant pour une manipulation de la préparation avant la gélification complète. Comme indiqué dans la demande française 79.08597 (EP. 17 565) la concentration en micro-organismes dans la préparation peut être augmentée par filtation ou centrifugation préalable du milieu de culture, remise en suspension du filtrat ou du culot sous faible volume et introduction dans la solution de polysaccharide. Le (ou les) micro-organisme(s) peut être apporté selon des modes opératoires différents qui se caractérisent par le fait que l'on prépare tout d'abord un milieu de culture que l'on ensemence avec le microorganisme et que l'on apporte ensuite ce milieu de culture ou la suspension du micro-organisme obtenue par filtration centrifugation dans la solution de polysaccharide et que l'on forme le gel par refroidissement. Pratiquement, selon un premier mode de mise en oeuvre, on forme tout d'abord une solution de polysaccharide à chaud que l'on ramène à une température de l'ordre de 40 à 450C, et à laquelle on ajoute le milieu de culture renfermant le micro-organisme, ou la suspension du micro-organisme, on refroidit ensuite de manière à former le gel. Selon une autre forme de mise en oeuvre, on apporte séparément le milieu de culture ou la suspension microbienne à chaque solution de polysaccharide dans les mêmes conditions de température, on mélange et on refroidit pour former le gel. On peut aussi, comme dit précédemment, faire appel à un sel métallique, tel que de fer ou d'aluminium, complexé ou non par un polyol. De plus on peut aussi dissoudre le polysaccharide dans le milieu de culture, notamment à température ambiante et former la AO à réticulation in situ. Comme dit précédemment le micro-organisme selon l'invention peut être constitué par une actinorhize telle que l'actinomycète endophyte de non légumineuse ou une mycorhize, ectomycorhize ou endo- mycorhize. Les inoculums peuvent se présenter sous diverses formes: gel, poudre, billes, ou même fibres. Dans le cas de l'actimomycète celui-ci peut être apporté sous forme de culture liquide ou sous forme de nodules broyés. De manière avantageuse on procède à un séchage du gel. Comme )0 dit précédemment, il y a lieu de ne pas détruire le micro-organisme, et l'on sait que celui-ci est généralement très thermosensible. Un séchage tel quel est long et conduit à un film sec facile- ment friable, et qui peut être broyé sans difficulté. De manière préférentielle on additionne le gel d'une substance 21s absorbante à grande capacité d'absorption d'eau, de manière à obtenir une teneur en eau résiduelle dans le mélange gel + absorbant comprise entre 70 et 250 g/100 g d'absorbant et avantageusement entre 100 et g pour 100 g. L'adsorbant est constitué par une matière poreuse telle que %O silice naturelle ou synthétique, silico-aluminates, cellulose etc Le pH est voisin de 7 et les températures de séchage suffisamment basses pour ne pas détruire le micro-organisme, de l'ordre de 20 à 300C. La mise en forme peut être réalisée de diverses façon. 3; gSelon le premier mode de mise en oeuvre le gel est séché, puis broyé finement, additionné d'une substance telle que la silice puis homogénéisé. La poudre ainsi obtenue peut alors être mise sous forme de pastilles. Selon une autre forme de mise en oeuvre, on introduit le gel humide et la substance telle que la silice dans un mélangeur ou malaxeur, puis après malaxage, soit on étale et sèche directement le mélange, jusqu'à ce que la perte en eau soit comprise entre 0 et % de son poids, mais de préférence entre 30 et 40 %, on obtient une poudre dont la teneur en eau résiduelle est comprise entre 100 et 150 g pour 100 g d'absorbant soit on introduit le mélange dans ÀO une extrudeuse et on sèche les granulés obtenus à température ambian- te jusqu'à également 'une perte en eau comprise entre 30 et 40 %. Dans le cas o le micro-organisme est constitué par une mycor- hize, avantageusement celle-ci est apportée sous forme d'une culture mycelienne homogène. L4inoculum peut se présenter sous forme de Ài1 billes, fils ou fibres humides. On peut selon une première forme de réalisation transformer le volume de culture liquide en un volume sensiblement identique du volume liquide, de manière à obtenir avantageusement des billes humides. Selon une deuxième forme de réalisation le gel obtenu après 2O inclusion de la culture ou de la suspension du micro-organisme est additionné d'une substance absorbante, de façon a obtenir une poudre facilement manipulable. Avantageusement l'absorbant est constitué par une silice dont le pourcentage en poids par rapport au gel est de 10 à 120 X et de préférence 30 à 50 %. Dans les deux cas de mise en oeuvre, ce procédé présente l'avan- tage considérable de ne faire subir au mycélium aucun traitement mécanique tel que cisaillement ou broyage. De plus ce procédé permet le stockage, en conditions non stériles sans contamination, des inoculums à température ambiante. Mais la présente invention sera plus aisément comprise à l'aide des exemples suivants donnés à titre indicatif, mais nullement limitatifs. EXEMPLE 1: Actinomycète endophyte de non légumineuse 1. Souche - Isolement - Culture - conservation Symbiose étudiée: Alnus glutinosa - Frankia Souches: Frankia ARbNN4b et AgNlag (Collection LALONDE Faculté de Foresterie et de Géodésie, Université de LAVAL-QUEBEC) Isolement de Frankia à partir du nodule (technique LALONDE et al. Proc.Workshop 2.5/4-1979-Corvallis-Oregon). - On stérilise superficiellement une extrémité de nodule coral- loide (H202 30 % durant 5 mn; puis NaC10 5 % durant 30 mn); - On rince à l'eau stérile Ao - On place le nodule dans une salière contenant une solution à 1 %, stérilisée par filtration de polyvinylpyrrilidone PVP + tampon phosphate (PBS (g/l) = NaCl 0,8 Na2HPO4, 7H20 1,14 - KH2PO4 0,2)); - On sectionne la partie inférieure du nodule et tranfère l'extrémité dans une autre salière contenant du PBS (quelques gout- Àj tes); - On écrase le nodule, prélève l'intérieur et ensemence un tube à essai contenant du milieu Q mod* (QUISPEL 1960 modifié LALONDE 1979); *Q mod (g/1): K HPO 0,3 - NaH PO 0,2 - MgSO 7H 20 0,2 - KC1 0,2 2 4 2 4 4 2 2110 Yeast Extract (BBL) 0,5 - Bacto-peptone (DIFCO) 5 - glucose 10 - citrate ferrique (ac.Citrique + citrate ferrique solution 1 %) lml oligo-éléments 1 ml - H20 qsp 1000 ml pH 6,8 - 7,0 - CaCO3 0,1 lécithine mg - stérilisation 20 mn à 120 C. t2- I - On incube deux semaines à 27 C. Culture Après incubation, on fragmente le mycelium avec une seringue et on réinocule 6 tubes; on procède de la même façon toutes les 2 semaines afin de multiplier activement l'Actinomycète (avant chaqte repiquage, on lave la culture au PBS), on prélève la colonie dans le fond du tube avec une pipette et on transfère dans un milieu Q Mod. Conservation - Germination des spores On favorise la germination des spores d'une culture stockée plusieurs mois en plongeant la colonie dans une solution: alanine mg + leucine 60 mg + PBS 50 ml durant 30 mn et en la replaçant dans le milieu Q mod après l'avoir fragmentée. 2. CULTURE DES PLANTES (ALNUS GLUTINOSA) Prégermination des graines Cette opération comporte quatre phases: sélection des graines Les graines sont placées dans un bécher contenant de l'hexane (d = 0,66). On récupère et on sèche sur papier filtre celles qui tombent au fond, les graines surnageant sont éliminées; - levée de dormance Les graines sont mises dans de l'eau et placées durant 4 jours à +4 C; - Stérilisation Dans NaC10 à 5% durant 5 mn, mui-vie d'un lavage à l'eau distil- lée stérilisée; - Prégermination Aiç Les graines sont placées sur un milieu gélosé, sur boite de Pétri, renfermant 1 % de gélose, et 1,5 % de saccharose; les boites de Pétri sont disposées à l'envers dans une enceinte saturée en eau et sont maintenues à une température de 28 C à l'obscurité durant 6 jours. Repiquage des plantules Les plantules non contaminées sont repiquées dans des "POUCHES" ou en tubes à essai de 0 22. Repiquage en "POUCHES" On dispose dans un sac en polyethylène (10 x 20 cm) du papier filtre présentant une gouttière à sa partie supérieure; on intro- duit 8 ml de solution de CRONE (modifié LALONDE - 1972 - J. Can. Botanic 5, 25-97), sans azote, diluée au 1/2 dans le sachet, de façon à humecter le filtre en totalité; on perce des trous dans la gouttière et on dispose les plantules, radicelles en face de l'ori- 0 fice et de façon à ce que les cotylédons dépassent de la gouttière; les sachets sont mis en pièce régulée (éclairement 15000 lux, photo- période 14 heures, température comprise entre 19 et 23 C). - Repiquage sur vermiculite Des tubes de 0 22 mm sont remplis de 40 ml de vermiculite lavée à l'eau; on additionne 20 ml de solution de CRONE diluée au 1/2 puis on stérilise l'ensemble 20 mn à 120 C; les plantules sont repiquées et incubées comme précédemment; 3. PREPARATION DES INOCULUMS 3.1 Inoculums avec culture de Frankia incluse O Les colonies de Frankia provenant de 10 cultures en tubes à essais développées durant 15 jours sont prélevées, remises en sus- pension dans 55 ml de PBS et fragmentées; les inoculums sont pré- parés avec cette suspension concentrée, renfermant hyphes, spores et sporanges, de la façon suivante: Inoculum à base d'alginate (AlG) Les concentrations sont données pour la préparation de 45 g de gel. - on dissout 0,45 g d'alginate dans 36 ml de suspension; - on ajoute 9 ml de solution de CaSO4, 2H20 à 6 g/1 sous agita- tion. Le gel obtenu est alors soit séché à l'air jusqu'à déshydrata- tion soit additionné de 40 % de son poids en silice et mélangé jusqu'à obtention d'une poudre humide homogène; cette poudre est ensuite séchée à température ambiante jusqu'à ce que l'inoculum ne contienne plus que 125 g d'eau par 100 g de silice. 24. gInoculum à base de gomme xanthane + farine de graines de caroube (XG) Les concentrations sont données pour la préparation de 45 g de gel. - on dissout 225 mg de gomme xanthane dans 15 ml d'eau distillée à environ 70 C; - on procède de la même façon en remplaçant la gomme xanthane par 225 mg de farine de graines de caroube; - lorsque les deux solutions sont à environ 45 C, on ajoute à chacune, sous agitation, 7,5 ml de suspension; - on verse alors le mélange suspension + graines de caroube dans le mélange suspension + gomme xanthane; - on refroidit et on obtient un gel. Ce gel est soit séché à l'air jusqu'à déshydratation soit additionné comme pour le gel A1G de 40 % de son poids en silice; le mélange est séché à température ambiante jusqu'à ce que la teneur en eau résiduelle soit de 125 g par 100 g de silice. 3.2 Inoculums avec nodules broyés inclus ml de nodules d'Alnus glutinosa fraîchement prélevés sont lavés puis broyés à l'aide d'un mixer de façon à obtenir environ 300 ml d'une suspension homogène qui servira à préparer les gels à base d'alginate ou de gomme xanthane avec nodules broyés inclus. Les gels sont séchés à l'air puis réduits sous forme de poudre. - Inoculums à base d'alginate (A1G) Pour la préparation de 200 g de gel on dissout 2 g d'alginate dans 160 ml de suspension on ajoute 40 ml de CaS04, 2H20 à 6g/l, on obtient un gel. Une partie de ce gel est séchée jusqu'à déshydratation totale, à température ambiante, une autre partie est additionnée de 40 % de son poids de la même silice puis séchée jusqu'à ce que la teneur en eau résiduelle soit de 125 g par 100 g de silice. - Inoculum à base de gomme xanthane + farine de graines de caroube Pour la préparation de 360 g de gel: on dissout 1,8 g de gomme xanthane dans 120 ml d'eau à 70 C, durant 20 minutes, sous agitation, puis on ramène la température à environ 45 C; on procède de la même façon en remplaçant la gomme xanthane par 1,8 g de farine de graines de caroube; 2501229I lorsque les deux solutions sont à environ 45 C, on ajoute à chacune 60 ml de suspension de nodules broyés; on refroidit et on obtient un gel dont une partie est déshy- dratée et l'autre partie additionnée de silice comme pour le gel d'alginate. 4. RESULTATS 4a. Essai en "POUCHES" La survie du microorganisme après inclusion, séchage et stoc- kage à température ambiante (20 - 25 C), a été contr8ôlée sur des Ao plantules d'Alnus glutinosa selon la technique des "POUCHES" décrite précédemment; les plantules disposées dans les sachets sont dévelop- pées durant 10 jours en conditions contrôlées puis elles sont inocu- lées par dépose, sous l'extrémité de la racine principale, de l'ino- culum à étudier; si l'inoculation est efficace et si le microorga- nisme est vivant, on voit apparaître 10 à 20 jours après l'inocula- tion des renflements puis de petits nodules sur la racine à l'empla- cement de la dépose. Les résultats obtenus avec des inoculums à base de gel A1G ou XG + silice stockés 10 à 20 jours à température ambian- te figurent dans le tableau ci-après. : lueATns neolqel ai suep luanZTi snualqo slellnse se,! (ZRO0 9 ap uoTlnlos) a;oze sues jlTTiznu naTITm + alTInoTma.IA:luumajuail sTessa e saqnl ua oddolaAap esouTJnI snulV ans saala14uoD aig luo (DoZ e oZ) aluuTqume eainledmol e a2ezows la uoisnlzuî saide (qgNN q-w aqunos) amSTUe2iooi$aTm np auaTaTtjal 17a AIlTATZ[UTl aTInaTuuaA mns STuSsg *q- aplnbTI mnlnzouT,p Im çz'0 suep aziodde ellea e ainaT-aJuT SToj 001 e 05 lTos Sm S suep aztiodde ainllno ap !1auergb el anb uatq az'ITS + snIZUT semsTuegooeaiTm 3p JTl.ed e saaedajd smnlnzouT sap se ai suup Z 00I UOiTAueP zsa uoTlelnpou el anb alelsuoD uo m/ZM 08 = lVID - /Zlm oOz = laq oaeujns - aa TdTDamd avTITS (S) (Do) e oZ) alueTqmue ainle adma mneinoouT, ap UoTlenTsuoa (9) uoisnlzuT,I e T.as queXe eanlnn ([) zZI = a 'Tel e azeuqps (z) OZHIm ç/STe salnpou 2m o0I (I) 9/g: m: oz(g) aTITS +: :*: * : SX suep SnluUT: :: : (ú): : 59/9: ITu 'O0: apnbt aln: :: : gelRgV: : /:mg: Ol: alT+: : 6/9 Smç OL:aTIT8 +: :SYV suep snlauT: 6/9: mç O: (S) aeTITS +: ::::DOX suep snlIuT: ::: (ú): */I: uIm0 ' 0:apTnbTI ainzlno: :::: qNNqR: : 1/i: 7E UOXTAU: Oz: (Z) Das: ::OX suBp snlouT: ::: : saXoaq salnpou: :::: (1): : 9/S Tm çZ'O0: saKoaq salnpou: uoTsuadsnS: :: _:: U Tuds: : 1/0: 0: ::anzout uoN: : salueld Ietol -qu/ a:uvld/mnlnDouT: (t) (sano[): mnrnoUI : saoilnpou salueldqu: alTluenb: UoTZAlasuo3: ul ea so::n::u : esouTlnîz snulv,p 162ILOSZ 0% 51& 0Z 0Y uowTelnpou el ans mnInzouTp adil np'p aouunluj 9I salelueuTluoD la soaTiTiew saunp ap uoTleXT3 ap larood un,p aipea al suep le2auaS ne vuTienseD ap spoTd 000 009 ap uoTl -elnvouT.1 2nod aSTlTln a2 luaumulou e '2Tel E oqvas aleuTSlep lag un suep 'euTienseD ap soXoaqsaInpou ap UOTSnDIUTp gpgDood a' slnaTlalxa sluaSs ied uoTIutmwuoa ap awalqoid unane - alueTqme a-nletadmal y a2easols np sinoz ne snlDut sausTueuaooavTm sap 91TATIVoPuTl ap uoI3^alosuoD - samnIoA salqTeg spal ap snos Plqlssod ajAnoo ua asTw - 2alndTuum le aITarJ Papnod ap amo3 snos swnlnzouT - : siuvATns saeluvAu sDI luPe (sapoaq saInpou ap uoTsuodsns no eTlueia ap aind ajnzlnz) aoldopual ap uolsnuluI zaAu swnlnzouI sap iaiedaid E Issnga P uo 'sloj ajaImaid Pl anod 'anbsTnd 'auTewop aa suep auTUeI2a paITIeUTIlTo aun 2ualuaspad siellnspa saD (DoSZ - OZ) alueTqme oanlempdmoa y wnlnDouTl ap UOIIeAlasuoD (z) uoTsnIaul,l E T!Aas lueUX alnllnD (1) : liaA Z9:Z: 0 : aTITS +' ::: :: : DIV suep SnlOJUI. :::: :: OaTITS: :]aPA: 6S: SiS: 9ú: 0ú: + OX suep: enlvuI: ]laA: 9S: 891 7 0ú:: snlz>uj *laaA * ç TS *úE 6 * apTnbTI - ainzInD :asoaol a: z: 61-: O: + lnou :asololua::: :: suou : s::: :: : zun] ln*: :SOaOpo:: av6T:0: - :nlnzoul: :apadl: auuaIg:auuaTle:0:: UoTPasuou : :nalne Sm ua SPT d salnpou qN (sinof OS salnlueld sap aoe) e9OUTlnI snul , p avuessToo Pl la uoTieInpou el ans mninDouTp adX3 np aDuaniui 6ê2-0sz EXEMPLE 2: Mycorhizes 1.1: Souche utilisée - Pisolithus tinctorlus (Marx) 1.2: Culture du microorganisme en milieu liquide L'entretien et la culture du champignon sont pratiqués en règle générale sur milieu MARX modifié MELIN-NORKRANS (MNN)(1) la durée de fermentation dans ces conditions est de 6 à 8 semaines. (1) MNN (g/l): CaC12 0,05 - NaCl 0,025 - K2HPO4 0,5 - (NH4)2HPO4 0,25 MgSO4,7H20 0,15 - Citrate Ferrique 1 ml (1% citrate Fe) - thiamine 100 pm - extrait de malt 3,0 saccharose 10,0 - H20 qsp 1000 ml pH = 5,5 Une des séquences de culture qu'on a adoptée pour Pisolithus est donnée ci-après: SOUCHE D'ORIGINE * Repiquage sur milieu gélosé MARX Ah I Culture inoculum I Stockage à + 4 C en erlem 300 (milieu PEG) 4- '4, Culture inoculum II en erlen 300 (milieu PEG) Culture productrice en fermenteur de 2 litres (milieu PEG) - Entretien de la souche: Sur milieu gélosé MARX (boite de Pétri ou tubes inclines.) - Culture inoculum I récipient: erlen de 300 ml bouché au coton polyuréthane rempli avec 70 ml de milieu de culture; milieu de culture PEG (g/l): peptone 10 - yeast extract 5 - glucose 10 - gélose 1, pH = environ 7, stérilisation 25 mn à 120 C, pH après stérilisation d'environ 6,6; ensemencement à partir d'une culture sur gélose (fragments de gélose + mycélium); conditions: incubation 10 à 15 jours sur table d'agitation Ao tournant à 100-140 t/mn, excentration du plateau 25 mm, température 28 C. - Culture inoculum II Les conditions de culture sont les mêmes que précédemment mais l'ensemencement se fait à partir d'une culture I à raison de 5 à 10 Z la durée d'incubation est réduite à une semaine. - Culture productrice en fermenteur de 21 (Biolafitte) remplissage: 1000 ml milieu: PEC décrit ci-dessus ensemencement: 1 à 10 % À conditions: agitation par une turbine tournant à 250-300t/imn aération 20 1/heure, température 25 à 30 C. RESULTATS Après 8 à 13 jours de culture en fermenteur de 2 litres, on obtient une culture homogène et dense, ce qui évite un broyage ultérieur du mycélium avant préparation de l'inoculum; la quantité de biomasse (poids sec à 105 C) obtenue par litre de milieu est voisine de 2,5 g/l. 2501229i 1.3 Préparation d'inoculums avec microorganismes inclus Les champignons ectomycorhiziens ne présentant aucune forme de résistance lorsqu'ils sont cultivés en culture pure, il est néces- saire de conserver lors de la préparation de l'inoculvm une certaine teneur en eau résiduelle de façon à assurer la survie du mycllum; ce type d'inoculum a été réalisé soit par adjonction de silices au gel, après inclusion du champignon dans un gel à base de polysac- charides, soit en mélangeant la suspension mycglienne avec de l'al- ginate et en laissant tomber goutte à goutte ce mélange dans une solution concentrée de CaC12 selon le principe décrit par HACEL 1977 appliqué à l'immobilisation de Rhizobium (brevet FR 79.28956 - 1979). - Inoculums sous forme de poudre - La culture développée en fermenteur de 2 litres est filtrée ou centrifugée, lavée puis mise en suspension dans de l'eau physiolo- gique; cette suspension est utilisée pour préparer des gels à base d'alginate ou de gomme xanthane selon les procédés décrits antérieu- rement pour Frankia. Ces gels sont ensuite additionnés de silice synthétique ou naturelle malaxés puis séchés jusqu'à ce que la teneur en eau rési- duelle soit comprise entre 70 et 250%, de façon à obtenir des poudres humides ou partiellement déshydratées qui sont conservées en flacons bouchés. - Inoculums sous forme de billes d'alginate On dissout dans la suspension mycélienne 1 à 2 g/l d'alginate puis on laisse tomber goutte à goutte le mélange dans une solution concentrée de CaC12 à 170 g/1; on récupère rapidement les billes formées qui sont ensuite lavées à l'eau du robinet et conservées en flacons bouchés. La survie du champignon (Pisolithus tinctorius), en particulier 250122P9 dans le cas des billes d'alginate, est supérieure à 6 mois, à tempé- rature ambiante; le test utilisé pour apprécier la survie repose sur le principe de la détermination colorimétrique de l'activité respirométrique par réduction du Nitro Blue Tetrazolium en formazan, composé coloré en bleu. Le contr8le de l'infectivité et de l'effi- cience de ces inoculums est effectué sur Pinus caribaea ou Pinus pi- naster après remise en solution des billes à l'aide d'un décomplexant tel que phosphates, citrate, lactate...... Ces essais illustrent les progrès spectaculaires réalisés dans la préparation d'inoculums avec ectomycorhizes: - par amélioration des conditions de culture en milieu liquide d'un champignon mycorhizien utilisé couramment: production de biomasse homogène et réduction de 4 à 6 semaines de la durée de fermentation; Arg - par la préparation d'inoculums faciles à mettre en oeuvre et permettant la survie du microorganisme durant plusieurs mois. Les exemples précédents ne sont pas limitatifs de la présente invention, en particulier, on ne sortirait pas du cadre de ladite invention en appliquant le procédé de préparation d'inoculums avec Frankia et ectomycorhizes à l'inclusion d'endomycorhizes à pelotons développées en culture pure et à l'inclusion de broyats de racines mycorhizées par des endomycorhizes à vésicules et à arbuscules, des inoculums préparés par inclusion de racines infectées puis broyées (mycelium + spores) dans des gels XG ou A1G additionnés de silice concervent leur infectivité: présence du champignon endomycorhizien à vésicules et arbuscules sur les racines de la plante test inoculée par ce procédé. REVENDICATIONS 1) Procédé d'inclusion de micro-organismes dans une matrice constituée par un gel de polymère à base d'au moins un polymère du groupe des polysaccharides, avec traitement de réticulation au moins partiel dudit polymère, caractérisé par le fait que le micro- organisme est du groupe des mycorhizes et des actinorhizes. 2) Procédé d'inclusion de rmicro-organismes selon la revendica- tion 1, caractérisé par le fait que la réticulation du polymère est obtenue par traitement thermique. 3) Procédé d'inclusion de miero-organismes selon la revendica- ÀO tion 1, caractérisé par le fait que la réticulation est effectuée par action d'un sel métallique. 4) Procédé d'inclusion de micro-organismes selon la revendica- tion 1, caractérisé par le fait que la réticulation est obtenue par traitement de synergie par un autre polymère, avantageusement un autre polysaccharide. ) Procédé d'inclusion de micro-organismes selon l'une des revendications 1 à 4, caractérisé par le fait que le polymère est à base d'un hétéropolysaccharide à haut poids moléculaire obtenu par fermentation d'an hydrate de carbone par un micro-organisme du genre lio Xanthomonas ou Arthrobacter ou des champignons appartenant au genre Sclerotium. 6) Procédé d'inclusion de micro-organismes selon la revendica- tion 5, caractérisé par le fait que le gel de polysaccharide com- prend également au moins un autre polysaccharide du groupe de la farine de graine de caroube et des gommes d'origine naturelle. 7) Procédé d'inclusion de micro-organismes selon l'une des revendications 5 à 6, caractérisé par le fait que l'on prépare tout d'abord un milieu de culture que l'on ensemence avec le micro- organisme et que l'on apporte ensuite ce milieu de culture ou la suspension de micro-organismes obtenue par centrifugation ou filtra- tion du milieu de culture dans la solution de polysaccharide et que l'on forme le gel par refroidissement. 8) Procédé d'inclusion de micro-organismes selon l'une des revendications 5 à 6, caractérisé par le fait que l'on prépare tout d'abord une solution de polysaccharides à chaud, que l'on ramène à une température de 40-450C et que l'on ajoute le milieu de culture renfermant le micro-organisme ou la suspension de micro-organisme et que l'on refroidit ensuite de manière à former un gel. 9) Procédé d'inclusion de micro-organismes selon l'une des revendications 1 à 3, caractérisé par le fait que l'on apporte séparément le milieu de culture ou la suspension de micro-organismes à chaque solution de polysaccharide. ) Procédé d'inclusion de micro-organismes selon la revendica- tion 3, caractérisé par le fait que l'on dissout, à température ambiante, le polysaccharide dans le milieu de culture ou la suspen- sion de micro-organisme et que l'on forme la réticulation in situ. 11) Procédé d'inclusion de micro-organismes selon l'une des revendications I à 10, caractérisé par le fait que le micro-organis- me est constitué par un actinomycète endophyte de non légumineuse. 12) Procédé d'inclusion de micro-organismes selon la revendica- iS tion 4, caractérisé par le fait que l'actinomycète est apporté sous forme de culture liquide. 13) Procédé d'inclusion de micro-organismes selon la revendica- tion 11, caractérisé par le fait que l'actinomycète est apporté sous forme de nodules broyés. 14) Procédé d'inclusion de micro-organismes selon la revendica- tion 11, caractérisé par le fait que l'on additionne le gel d'une substance à grande capacité d'absorption d'eau de manière à obtenir une teneur en eau résiduelle dans le mélange gel + absorbant com- prise entre 70 et 250 g et de préférence 100 à 150 g/100 g d'absor- bant. ) Procédé d'inclusion de micro-organismes selon la revendica- tion 14, caractérisé par le fait que l'absorbant est constitué par une silice dont le pourcentage en poids est de 10 à 120 % par rap- port au gel et de préférence 30 à 50 %. 16) Procédé d'inclusion de micro-organismes selon l'une des revendications 1 à 10, caractérisé par le fait que le micro- organisme est constitué par une mycorhize apportée sous forme d'une culture mycelienne homogène. 17) Procédé d'inclusion de micro-organismes selon la revendica- tion 16, caractérisé par le fait que l'on transforme le volume de culture liquide sensiblement dans le même volume solide. 18) Procédé d'inclusion de micro-organismes selon la revendica- tion 16, caractérisé par le fait que l'on forme un inoculum se présentant sous forme de billes, fils ou fibres humides. 19) Procédé d'inclusion de micro-organismes selon la revendica- tion 16, caractérisé par le fait que l'on additionne le gel d'une substance à grande capacité d'absorption d'eau de manière à obtenir une teneur en eau résiduelle dans le mélange gel + absorbant com- prise entre 70 et 250 g pour 100 g d'absorbant et de préférence 100 et 150 g. À0 20) Procédé d'inclusion de micro-organismes selon la revendica- tion 19, caractérisé par le fait que l'absorbant est constitué par une silice dont le pourcentage en poids par rapport au gel est de 10 à 120 %, et de préférence 30 à 50 %. 21) Procédé d'inclusion de micro-organismes selon l'une des revendications 19 et 20, caractérisé par le fait que l'on forme un inoculum présentant l'aspect d'une poudre.