FR 2504150 A1 19821022 FR 8206032 A 19820407 La présente invention concerne un procédé amé- lioré pour la production enzymatique de glucose, à partir d'une solution d'amidon liquéfié. De manière classique, on procède à la sacchari- fication de l'amidon de glucose, comme suit: une suspension d'amidon est liquéfiée à l'aide d'un acide ou d'une lase liquéfiante, puis soumise à l'action d'une glucoamy- lase, ce qui donne une solution d'amidon saccharifiée, à teneur en glucose atteignant jusqu'à 90 à 94 %, rapporté au solide sec (tous les pourcentages mentionnés ci-après s'en- tendent en solide sec) Cette solution est décolorée avec du charbon activé, désionisée au moyen d'un échangeur d'ion, concentrée, et cristallisée; et la masse résultante est ensuite en poudre à teneur élevée en glucose, ou séparée en glucose cristallisé et liqueur mère, selon l'utilisation ultérieure. Récemment, afin de réhausser la teneur en glucose dans la solution d'amidon saccharifié, plusieurs améliora- tions ont été proposées Le brevet japonais, publié sous le no 29 570/79, suggère, qu'au cours de la saccharification de l'amidon en glucose, grâce à un système enzymatique com- prenant glucoamylase et amylo-1,6-glucosidase, une solution d'amidon liquéfié, à ED de 15 à 20, soit soumise à l'action du système enzymatique dans un intervalle de p H compris en- tre 5 et 6,7, intervalle dans lequel est suffisamment suppri- mée la réaction réversible de la glucoamylase Le brevet ja- ponais, publié sous le N O 23 894/81, indique que, lors de la saccharification d'un amidon liquéfié en glucose au moyen de glucoamylase, il est souhaitable d'utiliser, en combinaison avec la glucoamylase, une "-1,6-glucosidase de Bacillus, dans un intervalle de p H compris entre 5 et 7 Le brevet ja- ponais, publié sous le N O 23 895/81, propose également, lors de la saccharification d'un amidon liquéfié avec une gluco- amylase, de laisser agir une "-1,6-glucosidase dans un inter- valle de p H de 5 à 7, sur une solution d'amidon partiellement saccharifiée, dans laquelle le degré de saccharification s'élève jusqu'à 30 à 80 %. Toutefois, bien que dans toutes ces suggestions les saccharifications aient été réalisées à un p H supérieur à 5, on constate que les solutions d'amidon saccharifié ré- sultantes, à teneur élevée en glucose, préparées à l'échel- le industrielle, selon l'une de ces suggestions, sont iné- vitablement susceptibles de subir une réaction de brunis- sement et une contamination microbienne, dans les condi- tions de saccharification classiques, c'est-à-dire tempéra- ture de 500 à 60 C et durée de 40 à 90 heures environ. La présente invention permet d'éviter ces incon- vénients de l'art antérieur, et d'obtenir une solution d'a- midon saccharifié à teneur élevée en glucose, grâce à l'u- tilisation d'un p H inférieur à 5 lors de l'opération de saccharification. Le nouveau procédé selon l'invention consiste à convertir une suspension d'amidon, en solution d'amidon li- quéfié à bas ED, puis à soumettre cette solution à l'action d'une glucoamylase (EC 3,2,1,3) et d'une isoamylase (EC 3,2, 1,68),dans un intervalle de p H compris entre 3,5 et 4,8. L'amidon utilisé conformément à l'invention, peut provenir de racines ou tubercules de pomme de terre, patate douce et cassava, ainsi que de grains de mats, riz ou blé On peut également utiliser d'autres sources d'amidon comme gruau ou pointes de tubercules à teneur élevée en ami- don. En ce qui concerne la concentration de la suspen- sion d'amidon, convient toute concentration, pourvu que l'a- midon soit suffisamment liquéfié et dispersé; on utilise habituellement des concentrations de 10 à 50 %, de préférence entre 20 et 40 %. La liquéfaction de la suspension d'amidon peut s'effectuer selon un procédé classique, et la solution ré- sultante d'amidon liquéfié est ensuite soumise à l'action enzymatique d'une glucoamylase et d'une isoamylase, à une température de l'ordre de 50 à 60 C, et à un p H compris dans l'intervalle de 3,5 à 4,8 Lors de la saccharifica- tion de la solution d'amidon liquéfié, l'isoamylase doit être ajoutée avant que l'ED de cette solution atteigne au maximum 15, de préférence 10. Les glucoamylases (EC 3,2,1,3) utilisables con- formément à l'invention, sont des glucoamylases qui agis- sent sur la solution d'amidon liquéfié dans un intervalle de p H de 3,5 à 4,7, et qui libèrent des unités de glucose; conviennent plus particulièrement en général, en raison de leur p H optimal inférieur ( 4 à 4,5), des glucoamylases du commerce en provenance de moisissures, comme celles du genre Rhizopus et plus particulièrement du genre Aspergil- lus. Conviennent, conformément à l'invention, les iso- amylases (EC 3,2,1,68) qui proviennent de bactéries, comme celles du genre Flavobacterium, Cytophaga et surtout Pseu- domonas. Lorsque la saccharification est terminée, la so- lution résultante est chauffée, afin d'inactiver les enzy- mes présentes, puis on la purifie, par exemple par filtra- tion, décoloration avec du charbon activé, et/ou désioni- sation avec un échangeur d'ions; on la concentre enfin, ce qui donne un sirop d'amido 4 à teneur élevée en glucose La teneur en glucose de ce sirop est très élevée,de l'ordre de -98 %. A la différence de la saccharification selon les procédés classiques, qui est réalisée à un p H égal ou supé- rieur à 5, la saccharification selon l'invention, qui s'ef- fectue dans un intervalle de p H compris entre 3,5 et 4,8 au moyen d'une combinaison de glucoamylase et d'isoamylase, présente les caractéristiques suivantes: raccourcissement de la durée de saccharification, réduction de la contamina- tion microbienne et de la réaction de brunissement pendant la saccharification, et, par voie de conséquence, purifica- tion ultérieure de la solution d'amidon saccharifié rendue beaucoup plus facile Il s'ensuit que l'on peut réaliser facilement à l'échelle industrielle la production d'une solution d'amidon saccharifié à teneur élevée en glucose. Il ressort des avantages décrits plus haut, que la présente invention peut être avantageusement utilisée pour la production de glucose cristallisé, de fructose par isomérisation du glucose,de sorbitol par hydrogénation de glucose, et d'autres produits comme éthanol et L- glutamate monosodique, qui sont obtenus par fermentation de glucose, afin d'augmenter encore la pureté et/ou le rendement. Dans la présente description, les activités enzy- matiques sont essayées comme suit. 1) Glucoamylase (EC 3,2,1,3); l'unité d'activité de glucoamylase est définie comme la quantité de l'enzyme qui libère 1 mg de glucose en 3 minutes, à 40 C, dans un mélan- ge réactionnel comprenant 5 ml de solution aqueuse d'ami- don soluble à 1 % poids/poids, 4 ml de solution tampon acé- tate 1 M (p H 4,5), et 1 ml d'une solution de glucoamylase. 2) Pullulanase (EC 3,2,1,41) ou isoamylase (EC 3,2,1,68); l'unité de pullulanase ou d'isoamylase est définie comme la quantité de l'enzyme qui augmente la capacité d'absorp- tion à 610 nm de 0,01 par heure Plus précisément, à la solution comprenant 5 ml de solution aqueuse à 1 % poids/ poids d'amidon de riz cireux, soluble, on ajoute 1 ml de solution tampon acétate 0,5 M, dont le p H est ajusté à 6 pour la pullulanase, ou à 3,5 pour l'isoamylase,et ce mé- lange est mis à incuber à 40 'C pendant 1 heure Puis on prélève 1 ml de ce mélange réactionnel, on y ajoute 1 ml de solution aqueuse I 2-KI 0,01 M, et ultérieurement du 504 H 2 0,02 N, pour obtenir un volume fina Vde 25 ml 15 minutes après l'addition de l'acide sulfurique, on mesure l'absorbance du mélange à une longueur d'onde de 610 nm, avec une cellulede 1 cm. La teneur en glucose dans la solution d'amidon saccharifié est déterminée par analyse classique par chro- matographie sur papier, et elle est exprimée en pourcent pondéral, rapporté à la quantité totale des sucres. Plusieurs formes de réalisation, non limitati- ves, de l'invention sont décrites dans les exemples ci- après. EXEMPLE 1 A une suspension d'amidon de Mais à 28 % poids/poids, on ajoute du carbonate de calcium à raison de 0,05 % rapporté à l'amidon solide sec, ainsi qu'une "-amylase de Bacillus Licheniformis du commerce "Termamyl 6 OL" (Novo Industri A/S, Copenhague) à raison de 0,15 % rapporté à l'amidon so- lide sec, et ce mélange est liquéfié à 98 C pendant 30 mi- nutes,puis on le ramène aux conditions ambiantes, ce qui donne une solution d'amidon liquéfié avec un ED = 4 Apres avoir rapidement réglé le p H à 4,5 et refroidi à 55 C, on place dans des flacons de 1 litre des prélèvements de 500 ml de cette solution, auxquels on y ajoute 4 unités de glu- coamylase d'Aspergillus "XL-128 " (Nagase & Company, LTD, Osaka), et 150 unités de pullulanase d'Enterobacter ou d'i- soamylase de Pseudomonas (Hayashibara Biochemical Labora- tories Inc, Japon) On soumet alors ces prélèvements ad- ditionnés, à 40 heures de saccharification à p H 4,5 et 55 C. L'expérimentation témoin est menée simultanément, et la sac- charification est réalisée de manière identique à ceci près qu'on ne fait intervenir ni pullulanase ni isoamylase. Lorsque la saccharification est terminée, on détermine les teneurs en glucose des prélèvements de solution d'amidon saccharifié Les résultats sont donnés dans le tableau 1. TABLEAU 1 Enzyme saccharifiante essayée Teneur en Glucose (%) Glucoamylase 93,9 témoin Glucoamylase + Pullulanase 94,0 témoin Glucoamylase + Isoamylase 97,4 invention Les résultats expérimentaux, reportés dans ce tableau, con- firment que l'on peut obtenir facilement une solution d'ami- don saccharifié à teneur très élevée en glucose,par saccha- rification d'une solution d'amidon liquéfié, par l'action combinée de glucoamylase et d'isoamylase, à p H 4,5. EXEMPLE 2 Des prélèvements de 500 ml d'une solution d'amidon liqué- fié à ED= 4, obtenus comme dans l'exemple 1, sont placés dans des flacons de 1 litre, et rapidement on règle leur p H à respectivement 3, 3,5 3,8, 4, 4,5, 4,8, 5,1, 5,5 et 6 avec de l'acide chlorhydrique, et l'on refroidit à C Puis on ajoute à ces prélèvements, comme dans l'exem- ple 1, de la glucoamylase et de l'isoamylase, et on met à incuber à 50 C, au p H spécifié, pendant 48 heures, afin de réaliser la saccharification enzymatique. On réalise simultanément l'expérimentation témoin,de maniè- re identique, mais en absence d'isoamylase. Lorsque la saccharification est terminée, on détermine les teneurs eqglucose, ainsi que les degrés de coloration et la contamination microbienne, dans les prélèvements de so- lution saccharifiés Les résultats sont indiques dans le tableau 2. Comme le montre ce tableau, les résultats expérimentaux confirment que la saccharification réalisée au moyen d'une combinaison de glucoamylase et d'isoamylase,dans un inter- valle de p H compris entre 3,5 et 4,8, aboutit à des solu- d'amidon saccharifié tions/prsentant es teneurs en glucose les plus élevées, et que, à p H égal ou supérieur à 5,1, les solutions d'ami- don saccharifié sont très sensibles à la réactiode brunis- sement et à la contamination microbienne. (Voir Tableau 2 à la page suivante). TABLEAU 2 Enzyme p H Teneur en Glucose Degré relatif de Degré de contamination (%) coloration microbienne 3,0 92,1 94 (-)* Glucoamylase 3,5 95,5 96 (-)** 3,8 96,4 96 (-)** 4,0 97,6 98 (-)** + 4,5 97,2 100 (-)** 4,8 96,0 103 (-)** ,1 93,8 118 (* Isoamylase 5,5 92,0 135 (+) 6,0 86,2 254 (+)* _________________________________________________________________________________________ Glucoamylase 4,5 93,9 98 (-* ou LM (Suite du Tableau 2) Note: 1) "Le degré relatif de coloration" est calculé par l'é- quation: Degré relatif de coloration (%) = B x 100 A dans laquelle A est l'absorbance du filtrat, à la longueur d'onde de 420 nm, avec une cellule de 1 cm, qui est obtenu par saccharification d'une solution d'amidon liquéfié à p H 4,5 à l'aide d'une combinaison de glucoamylase et d'iso- amylase,suivie de la filtration de la solution résultante d'amidon saccharifié au moyerde papier filtre; et B est la capacité d'absorption obtenue comme pour A, à ceci près que la solution d'amidon liquéfié est saccharifiée à un au- tre niveade p H, avant d'être réglée à p H 4,5. 2) "Le degré de contamination microbienne" est déter- miné après achèvement de la saccharification, par la mesure du nombre de colonies microbiennes dans la solution d'ami- don saccharifié; (+) indique que l'on trouve plus de 1000 colonies dans 1 ml de solution d'amidon saccharifié, (+) entre 100 et 1000 colonies, et () moins de 100 colonies dans 1 ml. 3) () * désigne un produit témoin et ()** un produit selon l'invention. EXEMPLE 3 Des prélèvements à ED différents, de solution d'amidon de tapioca liquéfié, à 35 % poids/poids, obtenus comme dans l'exemple 1, sont ajustés à p H 4,5 avec de l'acide chlorhy- drique et refroidis rapidement à 60 C Puis on ajoute à ces prélèvements 5 unités d'une glucoamylase d'Aspergillus du commerce "Amyloglucosidase 150 L" (Novo Industri A/S Danemark), et 75 unités d'isoamylase de Pseudomonas (Haya- shibara Biochemical Laboratories Inc, Japon), et on met à incuber ces mélanges à 60 C et p H 4,5 pendant 36 heures, a- fin de réaliser la saccharification enzymatique. On réalise simultanément l'expérimentation témoin, de ma- nière identique, mais en l'absence d'isoamylase. Lorsque la saccharification est terminée, on détermine les teneurs en glucose dans les prélèvements de solution d'amidon saccharifié résultante Les résultats sont repor- tés dans le tableau 3. Comme le montre ce tableau, les résultats expérimentaux confirment que lors de la conversion de l'amidon en glu- cose à 1 l'aide d'une combinaison de glucoamylase et d'iso- amylase,pour obtenir une solution d'amidon saccharifié à teneur la plus forte en glucose, il faut ajouter ED de la solution d'amidon liquéfié de départ, à moins de 15. TABLEAU 3 E.D Glucoamylase Glucoamylase _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ + Isoamylase 1,9 92,5 %* 96,2 %** 4,2 93,8 %* 97,0 %** 8,8 93,7 %* 96,7 %** ,0 93,3 %* 96,2 %** 14,2 92,8 %* 95,1 %** 19,6 92,4 %* 93,8 %* 21,4 92,1 %* 93,2 %* Note: *), témoin; **), présente invention. Nota: l'abréviation conventionnelle, ED, utilisée dans la des- cription qui précède, désigne l'équivalent de dextrine; quant aux enzymes leur numéro de Classification des Enzy- mes, EC est donné entre parenthèses. Revendications 1 Procédé de production de glucose, qui consiste à saccharifier de l'amidon liquéfié à l'aide d'une combinai- son de glucoamylase et d'une enzyme débranchante, carac- térisé en ce que l'on soumet une solution d'amidorliqué- fié à ED inférieur à 15, à l'action conjuguée d'une gluco- amylase et d'une isoamylase, à un p H compris entre 3,5 et 4,8. 2 Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que l'isoamylase provient des genres Flavobacterium, Cytophaga ou Pseudomonas. 3 Procédé selon une des revendications 1 ou 2, carac- térisé en ce que la glucoamylase provient des genres Rhizo- pus ou Aspergillus. 4 Procédé selon 'une des revendications 1 à 3, carac- térisé en ce que la solution d'amidon liquéfié a un ED égal ou inférieur à 10. Procédé selon une des revendications 1 à 4, carac- térisé en ce que la solution d'amidon liquéfié est soumise aux actions enzymatiques de la glucoamylase et de l'isoamy- lase à une température comprise entre 50 et 60 C, pendant à 50 heures.