FR 2511033 A1 19830211 FR 8212368 A 19820715 VECTEURS D'EXPRESSION PERMETTANT D'INTRODUIRE UN GENE DANS UN ORGANISME PROCARYOTE Dans le domaine du génie génétique, une technique com- munément utilisée pour réaliser l'expression d'une protéine étrangère par un organisme procaryote consiste à transformer cet organisme à l'aide d'un plasmide qui a été modifié de façon à contenir l'information génétique spécifiant la protéi- ne étrangère souhaitée Divers gènes eucaryotes ont été intro- duits avec succès dans des plasmides et, introduits dans des organismes procaryotes, ils font exprimer par ces organismes une protéine étrangère C'est ainsi que la production de l'interféron humain, de l'hormone de croissance humaine, de l'insuline humaine, de l'ovalbumine de poulet, de la somatos- tatine, et de protéines similaires, par des souches génétique- ment modifiées d'Escherichia coli, a été rapportée par Taniguichi, T, et al, Proc Natl Acad Sci USA, 77, 5230- 5233 ( 1980); Villa-Komaroff, L, et al, Proc Natl Acad. Sci USA, 75, 37273731 ( 1978); et Goedel, D V et al Nature, 281, 544 ( 1979). La construction d'un organisme capable d'exprimer une protéine étrangère met en jeu un certain nombre d'étapes. Avant tout, le gène qui porte les instructions destinées à la biosynthèse de la protéine voulue est identifié et isolé Les modes d'identification et d'isolement des gènes varient d'une manière considérable, mais il est possible de faire appel à tout mode opératoire permettant d'obtenir le gène voulu sous une forme pratiquement pure. Un procédé communément utilisé pour obtenir les gènes eucaryotes commence par l'isolement de l'ARN-messager (AR Nm). La synthèse d'une protéine est déclenchée dans les cellules par le processus de transcription, qui met en jeu la synthèse enzymatique d'une chaîne d'ARN correspondant à un "patron" d'ADN L'ARN ainsi formé interagit avec l'appareil de syn- thèse de protéines de la cellule en produisant la protéine. L'ARN spécifié par un gène particulier (et spécifiant ainsi une protéine particulière) est appelé "ARN-messager" Lorsque 2 2511033 la cellule est en train de produire la protéine, l'AR Nm est présent à des concentrations beaucoup plus grandes que le gè- ne qui porte l'information de synthèse de la protéine De plus, l'AR Nm est généralement sous une forme plus disponible pour l'isolement et la purification que ne l'est l'ADN chromo- somique Des techniques de purification classiques, telles que la sédimentation par gradient de densité, la chromatogra- phie d'affinité, et l'électrophorèse, peuvent être utilisées pour isoler l'AR Nm des lysats ou des homogénéisats de cellu- les Ces techniques ont été employées, par exemple, pour re- cueillir l'AR Nm de l'insuline des cellules pancréatiques (Villa-Komaroff, L, et al, supra) et l'AR Nm de l'interféron des leucocytes humains (Goeddel, D V, et al, Nature, 287, 411 ( 1980)) et des lignes cellulaires de fibroblastes (Taniguchi, T, et al, supra). L'AR Nm ainsi obtenu peut ensuite être utilisé pour pré- parer une molécule d'ADN monocaténaire ou à un seul brin (connue sous le nom d'ADN complémentaire ou AD Nc) (Ullrich, et al, Science, 196, 1313 ( 1977)) La molécule d'ADN mono- caténaire résultante a une structure en épingle à cheveux 3 '-terminale qui fournit une amorce pour la synthèse ultérieu- re d'un second brin d'ADN utilisant l'enzyme ADN-polymérase. On casse ensuite la boucle qui raccorde les deux brins d'ADN (en utilisant par exemple l'enzyme Sl-nucléase), ce qui a pour résultat un segment AD Nc identique au gène d'origine. L'AD Nc résultant est généralement isolé et purifié, par exem- ple par électrophorèse sur gel, et sa structure peut éventuel- lement être vérifiée par analyse séquentielle ou par carte factorielle de restriction Les extrémités des segments d'ADN -30 obtenus de cette manière peuvent être modifiées, comme décrit ci-après, pour faciliter l'introduction dans un vecteur de transfert. Des gènes peuvent éventuellement être introduits dans des cellules procaryotes par l'intermédiaire de vecteurs de transfert, qui sont généralement des plasmides ou des bacté- riophages dans lesquels le gène intéressé a été introduit. Lorsque le but de l'introduction du gène dans un organisme est de développer ce gène (c'est-à-dire d'obtenir des quantités 3 2511033 utilisables du gène par clonage), le vecteur de transfert est parfois appelé "vecteur de clonage" Lorsque le but de l'in- troduction du gène dans un organisme est d'obtenir l'expres- sion d'une protéine, le vecteur de transfert est parfois ap- pelé "vecteur d'expression" La présente invention concerne de nouveaux vecteurs de transfert, et en particulier des vecteurs d'expression de plasmides Les plasmides sont des boucles fermées relativement petites d'ADN Une meilleure compréhension de l'action des enzymes que sont les endonucléa- ses de restriction, ainsi que la découverte et l'isolement d'un certain nombre de ces enzymes, ont permis aux biologistes moléculaires de caractériser les plasmides et de les modifier afin d'accroître leur utilité comme vecteurs de transfert Par exemple, l'ADN indésirable peut être supprimé, ce qui a pour effet de réduire la taille du plasmide; des sites de restric- tion peuvent être ajustés en vue de l'insertion d'un gène et des gènes sélectionnables, par exemple des gènes de résis- tance aux antibiotiques, peuvent être insérés dans un plasmide, Le simple "épissage" d'un gène dans un plasmide n'assu- re pas l'expression de la protéine La synthèse d'une protéine exige en effet la présence de divers signaux de commande à proximité du gène (Guarente, L, et al', Cell, 20, 543-553 ( 1980)) Ces signaux déclenchent, règlent et mettent fin à la transcription de l'AR Nm et à la translation (traduction) de l'AR Nm (c'est-à-dire à la synthèse de la protéine) Il a été découvert que les signaux de commande qui sont associés à la synthèse d'une protéine particulière par une bactérie peuvent être utilisés pour maîtriser la synthèse d'une protéine étran- gère par cette bactérie Cette découverte a été utilisée avec profit pour construire des vecteurs universels ou polyvalents d'expression des plasmides (Roberts, T M, et al, Proc Natl. Acad Sci USA, 76, 760-764 ( 1979)); Guarante, et al supra). Les signaux de commande qui sont associés à la synthèse de la protéine sont représentés schématiquement sur la figure l des dessins, laquelle représente un segment d'ADN bicaténai- re ou à double brin associé à la maîtrise des enzymes impli- quées dans la biosynthèse du tryptophane (trp) Sur cette figure, "P" représente une séquence de paires de base connue 4 2511033 sous le nom "région du promoteur" Au cours dela synthèse de la protéine, la région du promoteur signale le déclenchement de la transcription de l'AR Nm "O" représente une séquence de paires de base connue sous le nom de "région de l'opérateur". Cette région, conjointement avec un répresseur, commande le degré de transcription de l'AR Nm Par exemple, dans la bio- synthèse du tryptophane, l'excès de tryptophane interagit avec un répresseur et diminue le niveau de transcription de l'AR Nm du trp La région du promoteur et la région de l'opérateur sont graphiquement représentées comme séparées, mais certai- nes régions d'opérateur peuvent être des sous-séquences à l'intérieur de la séquence du promoteur "S-D" représente une séquence de paires de base connue sous le nom de "séquence de Shine-Dalgarno" Cette séquence est le signal grâce auquel l'appareil de synthèse de la protéine (le ribosome) reconnaît l'AR Nm Aussi, la séquence de Shine-Dalgarno n'est-elle pas requise pour la synthèse de l'AR Nm, mais est-elle requise pour la synthèse de la protéine "ATG" représente le codon méthio- nine ou initiateur Ce codon-est le signal permettant le dé- but de la synthèse de la protéine dans les bactéries. Ces signaux sont, pour une large part, idiosyncratiques en ce sens que des organismes différents utilisent des codes différents Pour cette raison, lorsqu'un-gène eucaryote conte- nant les régions régulatrices des eucaryotes est inséré dans un plasmide puis dans une cellule procaryote, cette cellule ne pourrait exprimer la protéine, ou même l'AR Nm, faute de reconnaître les séquences de commande requises En revanche, une région promoteur-opérateur associée à la synthèse d'une protéine particulière dans un organisme procaryote peut être réunie à un gène eucaryote, et un clone de plasmide contenant une telle combinaison peut utiliser l'appareil de synthèse de protéine de ce même organisme procaryote pour exprimer la pro- téine étrangère. Les biologistes moléculaires ont tiré parti de cette découverte pour synthétiser ce que l'on appelle des "promo- teurs portables" (Roberts, T M, et al, supra) Ces promo- teurs portables, qui sont représentés sur la figure 2, con- tiennent des régions de promoteur, d'opérateur et de Shine- 2511033 Dalgarno qui peuvent être reconnues par un organisme-hôte par- ticulier Elles sont délimitées à chaque extrémité par des séquences spécifiques de reconnaissance des enzymes de restric- tion, qui leur permettent d'être excisées et insérées ailleurs après traitement enzymatique approprié De préférence, les extrémités opposées d'un tel promoteur portable comportent des séquences de paires de base qui correspondent à des enzy- mes de restriction différentes Sur la figure 2, ces extrémi- tés sont repérées X et Y, correspondant à des enzymes de res- triction différentes, arbitrairement désignées par les lettres X et Y Une telle structure garantit l'orientation correcte du promoteur portable par rapport au gène à exprimer, elle permet également l'existence d'un site d'insertion unique dans le plasmide résultant (cormie on le verra plus loin) Un plas- mide, tel que celui qui est représenté sur la figure 3, com- portant des sites de restriction X et Y correspondant à cha- que extrémité du promoteur portable, peut être ouvert par digestion avec des enzymes de restriction appropriées, et le promoteur portable peut y être inséré, par exemple à l'aide de l'enzyme appelée T 4-ligase Le plasmide résultant (figure 4) peut être utilisé comme vecteur d'expression. Pour utiliser un tel vecteur d'expression, on isole le gène voulu, comme décrit ci-dessus, et on modifie chimiquement ses extrémités de façon à avoir des séquences correspondant à l'enzyme de restriction Y Si le gène ne comporte pas de co- dons de début et de fin, il faut impérativement modifier cha- que extrémité pour qu'elle comporte de tels codons Après avoir ouvert le plasmide avec l'enzyme de restriction Y, on peut introduire le gène modifié de façon à obtenir le plasmi- de voulu (figure 5). La transformation d'un organisme procaryote approprié à l'aide d'un tel plasmide peut avoir pour résultat l'expres- sion de la protéine étrangère sous le contrôle des signaux de commande du tryptophane Pratiquement n'importe quelle région bactérienne de promoteuropérateur-Shine-Dalgarno peut être utilisée pour cela. Ainsi qu'on l'a expliqué ci-dessus, les gènes qui sont insérés dans des vecteurs de transfert déjà connus doivent 6 2511033 porter des signaux de début et de fin Dans le cas de signaux de fin, cette exigence n'est pas particulièrement contraignan- te, car, quand on isole le gêne, on peut choisir une enzyme de restriction telle que le codon de fin y soit compris, et il n'est pas très gênant d'obtenir également de l'ADN supplémentaire (après le codon de fin). En revanche, la distance qui sépare la séquence de Shine-Dalgarno du codon de début peut être très importante (Guarente, L, et al, supra) La découverte d'une enzyme de restriction qui excise un gène d'un brin d'ADN plus long de telle sorte que l'on obtienne le codon de début sans obtenir également des parties "de tête" trop longues d'ADN, est aléa- toire Le plus souvent, le gène est coupé de telle manière que le codon de début et une partie du gène sont perdus. L'ADN perdu, le codon de début et des parties de tête appro- priées doivent habituellement être rajoutés par voie enzyma- tique ou chimique. Conformément à la présente invention, il est procuré un nouveau vecteur d'expression permettant d'introduire un gène dans un organisme procaryote Ce vecteur d'expression comprend une boucle fermée d'ADN, comportant des signaux qui lui permettent d'être repliqué dans une cellule-hôte procaryo- te, et comporte en outre: (a) des séquences de promoteur, d'opérateur et d'ini- tiation (début) de translation, qui peuvent être reconnues par la cellulehôte procaryote; (b) une séquence de Shine-Dalgarno et un codon initia- teur à l'intérieur de la séquence d'initiation de translation; et (c) une séquence de reconnaissance destinée à une en- donucléase de restrictionqui est proche du codon initiateur et qui, après coupure, laisse subsister ledit codon initia- teur, ou son complément, dans la séquence d'initiation de translation. Le nouveau vecteur d'expression selon la présente in- vention est représenté sur la figure 6 des dessins Cette figure représente un plasmide circulaire comportant des ré- gions de promoteur, d'opérateur et de Shine-Dalgarno ainsi 7 2511033 que le codon initiateur méthionine (ATG) Un site des- tiné à une endonucléase de restriction (arbitrairement dési- gnée par Z) est proche du codon initiateur Un tel vecteur de transfert peut être tout à fait polyvalent car, lors de l'ou- verture du plasmide par l'endonucléase de restriction Z et l'insertion d'un gène, le plasmide disposera de tous les si- gnaux nécessaires à la transcription de l'AR Nm et à la trans- lation du gène qui code pour la protéine étrangère voulue. Dans le vecteur d'expression de plasmide selon l'inven- tion, la composition et la longueur du segment qui se trouve entre la séquence de Shine-Dalgarno et le codon initiateur peuvent être maîtrisées de façon exacte et reproductible. C'est ainsi que ce segment peut être ajusté au système parti- culier promoteur-opérateur utilisé, de façon à optimiser l'expression du gène En outre, le vecteur d'expression com- porte un site d'insertion placé de telle sorte que la coupure du plasmide par l'endonucléase de restriction appropriée laisse subsister le codon initiateur dans la séquence d'initiation de translation C'est ainsi que la manipulation du vecteur d'expression en vue de l'insertion d'un gène ne perturbe pas la séquence d'initiation de translation, et que cette séquence demeure intacte, quel que soit le gène inséré L'expression "séquence d'initiation de translation" telle qu'elle est uti- lisée ici comprend la séquence de Shine-Dalgarno (site de fixation du ribosome), le codon initiateur (habituellement ATG) et le segment d'ADN situé entre ces deux séquences. Les vecteurs d'expression selon l'invention peuvent éventuellement être dérivés de plasmides "sauvages" ou de modifications de ces derniers Il est avantageux que le plas- mide choisi comme produit de départ possède des fonctions de replication qui ne soient pas influencées par des manipulations ultérieures Ces fonctions de replication garantissent que le vecteur de transfert final sera soumis au mode voulu de com- mande de replication, c'est-à-dire qu'il sera présent dans des exemplaires multiples ou bien dans un exemplaire unique par cellule ou encore dans un nombre maîtrisable d'exemplaires par cellule Un tel plasmide de départ est également, de pré- férence, relativement petit Du fait qu'il est petit, le 8 2511033 plasmide est capable d'accepter d'importantes insertions de gènes, la transformation des cellules se trouve facilitée, et le plasmide ne détourne pas de trop grandes quantités d'éner- gie cellulaire et d'agents nutritifs vers la production de macromolécules indésirables Il est avantageux que la taille du plasmide soit inférieure à dix kilobases environ, et de préférence comprise entre 2 kilobases environ et 5 kilobases environ. Pour préparer un vecteur d'expression selon la présen- te invention, on introduit dans le plasmide de départ des si- gnaux de commande qui sont associés à la transcription et à la translation de l'ARN Ces signaux de commande peuvent être sous n'importe quelle forme reconnaissable par l'organisme- hôte prévu, mais on préfère certains systèmes L'efficacité des régions de promoteur et d'opérateur qui sont associées à la synthèse de la protéine procaryote varie On préfère gé- néralement un système très efficace, car un tel système a pour résultat un haut degré d'expression de la protéine Les systè- mes connus de promoteur-opérateur qui sont particulièrement utiles pour synthétiser les nouveaux vecteurs de transfert selon la présente invention sont les systèmes Escherichia per- mettant la maîtrise du métabolisme du lactose (lac) et du tryptophane (trp) et la région promoteur-opérateur (PL) du bactériophage À Les systèmes lac et trp sont généralement préférables pour la synthèse des vecteurs d'expression selon la présente invention. Ces signaux de commande peuvent être obtenus par exci- sion de n'importe quel ADN qui les contient Le procédé d'exci- sion dépendra des enzymes de restriction qui sont disponibles et de la présence de sites de restriction utilisables délimi- tant le système Les régions de promoteur,-d'opérateur et de ShineDalgarno sont de préférence récupérées sous la forme d'un segment intact d'ADN On introduit ensuite dans le plas- mide le segment d'ADN excisé contenant les signaux de commande voulus, en utilisant des modes opératoires classiques pour l'introduction des gènes. Ou bien, on peut utiliser comme produit de départ pour -synthétiser les vecteurs d'expression selon l'invention un 9 2511033 plasmide qui contient déjà les signaux de commande voulus. Un plasmide particulièrement préféré comme produit de départ est désigné par le symbole p GLIOI et est décrit par Guarente, L., et al, supra, cette description étant incorporée ici à titre de référence Ce plasmide, qui est représenté schémati- quement sur la figure 7, contient des sites de restriction pour chacune des enzymes Eco RI et Ecvu II, et porte des gènes de résistance à l'ampicilline Ce plasmide contient également les séquences de promoteur-opérateur-ShineDalgarno d'un opéron de lac d'E coli Le système a été dérivé d'un mutant d'UV 5 de lac par digestion avec une endonucléase de restric- tion d'Alu I La mutation UV 5 rend le promoteur lac insensible à la répression catabolique par la protéine activatrice du gène catabolique (CAP) Les extrémités Al u I du segment promo- teur-opérateur-Shine-Dalgarno ont été modifiées de façon à donner des extrémités captives Eco RI et Bam HI, et ce segment a été introduit dans le plasmide p BR 322 (Bolivar, F, et al, Gene, 2, 74 ( 1977)) après digestion avec Ecor I et Bam HI, pro- duisant ainsi le plasmide p GL 101. Un plasmide, tel que p GL 101, ou bien un segment promo- teur-opérateur-Shine-Dalgarno tel que celui utilisé pour cons- truire le plasmide p GL 101, peut avantageusement être modifié de façon à contenir la configuration codon initiateur-site de restriction des vecteurs d'expression selon la présente inven- tion Pour accomplir cette modification, on peut ajouter au segment contenant les séquences de promoteur-opérateur-Shine- Dalgarno un site d'enzyme de restriction qui contient le codon initiateur (ATG par exemple) en tant que partie de sa séquence de reconnaissance Ou bien, on peut utiliser une séquence de reconnaissance pour une enzyme du type pour lequel la séquence de reconnaissance est séparée de l'emplacement de coupure par un certain nombre de paires de base de nucléotides non spéci- fiques La partie non spécifique de cette séquence contien- drait dans ce cas le codon initiateur Par exemple, l'enzyme de restriction Hga I coupe à 5 et 10 paires de base de la sé- quence GACGC; par conséquent, un site de restriction pour cette enzyme pourrait comprendre le codon initiateur dans le segment non spécifique de 5 à 10 paires de base Le site de 2511033 restriction se trouve avantageusement à une distance maximale de trois paires de base du codon initiateur, et de préférence, le site de restriction est placé de telle sorte que, après coupure avec l'endonucléase de restriction, la séquence d'ini- tiation de translation se termine par le codon initiateur ou son complément. La séquence qui contient le codon initiateur peut com- modément être insérée dans un plasmide ou ajoutée à un segment d'ADN linéaire sous la forme d'un "agent de liaison" synthéti- que à extrémités "émoussées", c'est-à-dire un segment d'ADN synthétisé à partir de nucléotides individuels Par exemple, dans le cas du plasmide p GL 10 i, le plasmide peut être ouvert sur le site de reconnaissance adjacent à la séquence de Shine- Dalgarno, avec Pvu II, et l'agent de liaison synthétique peut être introduit par "ligation" des extrémités émoussées (Note: Pvu II fait des coupures d'extrémité rases) _ Une séquence préférée de reconnaissance de l'enzyme de restriction est celle de l'enzyme Sph I Cette séquence de reconnaissance est un hexanucléotide qui contient le codon initiateur ATG La séquence de reconnaissance de cette enzyme est représentée sur la figure 8, et les emplacements de coupu- res sont représentés par le trait interrompu. Cette nouvelle configuration de site de restriction- codon initiateur procure plusieurs avantages distincts Un site d'insertion unique est introduit dans le plasmide, la présence du codon initiateur est assurée, et la distance entre la séquence de Shine- Dalgarno et le codon initiateur peut être maîtrisée avec précision. Bien que la signification de la distance entre la sé- quence de Shine-Dalgarno et le codon initiateur ne soit pas très bien comprise, on considère qu'elle est très importante pour l'expression efficace de la protéine De préférence, cet- te distance est voisine de la distance naturelle pour le sys- tème promoteur-opérateur utilisé, laquelle se situe générale- ment entre environ O et environ 22 paires de base, et de pré- férence entre environ 3 et environ 7 paires de base On peut commodément maîtriser cette distance en réglant la taille de l'agent de liaison synthétique utilisé pour l'addition du codon il 2511033 initiateur On peut ensuite optimiser la longueur de la séquen- ce en faisant un choix basé sur la performance des organismes contenant des plasmides dont les séquences ont des longueurs différentes. Comme un gène a rarement un site de restriction parti- culier au début de sa séquence de codage, une certaine modifi- cation du gène est généralement requise avant que l'on puisse l'insérer dans le vecteur d'expression Si les sites de res- triction voulus se présentent près du début du gène et à la fin ou après la fin du gène, la digestion de l'enzyme de res- triction aura pour résultat le recueil d'un segment d'ADN un peu plus long ou un peu plus court que le gêne réel -Le gène * excisé peut commodément être introduit dans le vecteur d'ex- pression, mais la protéine exprimée par l'organisme dans le- quel le vecteur est introduit sera plus ou moins différente de la protéine naturelle; de manière caractéristique, elle aura une séquence d'acides aminés plus courte ou plus longue que la protéine naturelle Dans bien des cas, ces différences ne seront pas significatives, car la protéine résultante aura une activité sensiblement équivalente En revanche, lorsque le structure de la protéine est cruciale, on peut avoir inté- rêt à modifier le gène excisé pour rétablir sa structure d'ori- gine, ou bien on peut modifier la protéine résultante pour obtenir la structure naturelle. Le plus souvent, le gène étranger n'aura pas de sites de restriction commodes correspondant à l'unique site d'inser- tion de restriction du vecteur d'expression Dans ce cas, le gène est alors généralement excisé à l'aide d'une ou plusieurs enzymes de restriction qui coupent à des endroits commodes près du début et de la fin du gène Les extrémités du gène sont ensuite modifiées par "remâchage" à l'aide d'une exo- nucléase pour éliminer l'excès d'ADN, et par addition d'agents de liaison contenant des séquences de paires de base qui cor- respondent au site d'insertioni de restriction du vecteur d'ex- pression Si, en isolant le gène, on élimine des segments du gène lui-même, on peut également rajouter l'information géné- tique contenue dans ces segments (si elle est connue) à l'aide d'agents de liaison synthétiques, le cas échéant. 12 2511033 Afin d'ajouter à chaque extrémité du gène les agents de liaison contenant le site voulu d'enzyme de restriction, on a intérêt à "émousser" chaque extrémité, c'est-à-dire à enlever les prolongements à un seul brin Si les modifications d'extrémités décrites ci-dessus ne permettent pas d'obtenir des extrémités émoussées, on peut émousser les extrémités par des modes opératoires connus (Ullrich, et al, supra) Une fois que l'on a obtenu le gène à extrémités émoussées, on peut ajouter des agents de liaison synthétisés au préalable par ligation des extrémités émoussées, en utilisant par exem- ple l'enzyme appelée T 4-ligase de l'ADN Ensuite, la diges- tion du gène modifié avec l'enzyme de restriction correspon- dant au site contenu dans l'agent de liaison permet d'élimi- ner l'excès éventuel d'agents de liaison et d'obtenir un gène dont les extrémités sont captives On peut ensuite commodément introduire le gène modifié dans le vecteur de transfert, le- quel a été ouvert avec l'enzyme de restriction L'introduction du gène dans le vecteur d'expression selon la présente inven- tion a pour effet de reformer le codon initiateur. Il est évident que les vecteurs d'expression qui sont décrits ici peuvent être tout à fait polyvalents On peut les utiliser pour introduire une large variété de gènes eucaryotes dans des organismes procaryotes L'expression d'une protéine étrangère par de tels organismes peut être mise sous le con- trôle de systèmes promoteur-opérateur efficaces En outre, une fois que l'on a obtenu un plasmide contenant une séquence promoteur-opérateur-Shine-Dalgarno-codon initiateur, on peut commodément cloner et exciser l'ensemble de la séquence en vue de sion introduction dans d'autres vecteurs, en utilisant des techniques connues de génie génétique C'est ainsi que l'on peut ajuster des vecteurs de transfert spécialisés à des situations spécifiques. La présente invention a été décrite relativement à certains plasmides, gènes et séquences de commande spécifi- ques, mais on n'entend pas la limiter ainsi, et on entend qu'elle soit interprétée extensivement conformément aux revendications ci-jointes L'invention est par ailleurs illustrée par les exemples suivants qui ne doivent pas être considérés comme limitatifs. 1 1033 Exemple 1 L'objectif de l'expérience décrite dans cet exemple était de placer le gène gal K (galactokinase) de E coli sous le contrôle du système opérateur-promoteur de lac (lac o/p) en utili- san L un vecteur d'expression construit conformément à la pré- sente invention En bref, le protocole était divisé en trois opérations: ( 1) On modifiait le vecteur p GL 101 (Taniguichi et al, Proc Natl Acad Sci USA, 77: 5230, 1980) de telle sorte qu'une séquence d'ADN synthétique codant le site de re- connaissance de l'endonucléase Sph I était "ligatée" sur un site Pvu II unique situé à l'opposé du site de fixation du ri- bosome lac, créant ainsi un site d'initiation de translation hybride comprenant le codon ATG, selon le schéma suivant (Note: le nouveau vecteur est désigné par le symbole p GX 951): Site de coupure de Pvu II p GL 1 O 1 lac o/p AGGAACAGGATC TCCTTGTCCTAG Endonucléase Pvu II lac o/p AGGAACAG TCCTTGTC +Sph I agent de liai- son GCATGC CGTACG LIGATION lac o/p AGGAACAGGCATGC TCCTTGTCCGTACG RESTRICTION de Sph I R Site d'initiation , ' de translation p GX 951 lac o/p AGGAACAGGCATG I TCCTTGTCC ( 2) On modifiait un fragment de restriction contenant le gène gal K (galactokinase) de telle sorte que sa séquence N-terminale comprenait un agent de liaison Sph I ligaté qui en- gendrait un complément pour un nouveau codon initiateur ATG et un second codon nouveau, conservant toute la séquence d'origine ultérieure dans le cadre de lecture de la correction Le sché- ma suivant illustre la modification du gène gal K: Codon N-terminal d'origine Site Hind III Fl Site AGAAATGAGTCTGA gène gal K Acc I TCTTTACTCAGACT L I Site de restriction Hinf I Hinf I AGTCTGA gal K Acc I GACT Occupation des extrémités de restriction ADN-POLYMERASE (KLENOW) + d ATP, d CTP, TTP AGTCTGA TCAGACT AAGCATGCTTAGTCTGA TTCCTACGAATCAGACT Sph I nouveau codon + agent de liaison AAGCATGCTT TTCGTACGAA W I Site Sph I ligation AAGCATGCTT TTCCTACGAA n CTTAGTCTGA CTACGAATCAGACT gal K AACGATG TTG ( 3) La ligation de ( 2) et de ( 1) selon le schéma sui- vant permet de reconstituer un site complet d'initiation de translation permettant la synthèse "en phase" de la galacto- kinase: - 2511033 Vecteur: lac o/p _ AGGAACAGGCATG p GX 951 TCCTTGTCC insérer: + CTTAGTCTGA gal K CTACGAATCAGACT LIGATION gai k lac o/p AGGAACAGGCATGCTTAGTC TCCTTGTCCGTACGAATCAG SITE D'INITIATIQN DE TRANSLATION Modes opératoires expérimentaux 1 Préparation du vecteur p GX 951 On a préparé le plasmide p GL 101 comme décrit par Taniguichi, et al, Proc Natl Acad Sci USA, 77: 5230, ( 1980) On a préparé de l'ADN de plasmide purifié à partir de lysats de cellules éclaircies (Hershfield et al, Proc Natl. Acad Sci USA, 71:3455, ( 1974)) par deux rassemblements con- sécutifs dans des gradients de Cs Cl On a préparé un mélange réactionnel ayant un volume de 50 pi et contenant 15 pg d'ADN de plasmide p GL 101, 25 unités d'endonucléase Pvu II (New England Biolabs) et des sels tampons, concentration finale de mmoles de Na Cl, 6 mmoles de Tris-H Cl à p H 7,4, 6 mmoles de Mg C 12, 10 mmoles de mercaptoéthanol et 100 pg de sérumalbumine de boeuf par ml Cette formule de tampon est appelée ici "tampon de sels à 50 mmoles" Après incubation pendant une heure à 37 C, on a ajouté 0,8 unité de phosphatase alcaline d'intestin de veau (Boehringer-M Iannheim), et on a poursuivi l'incubation pendant 30 mn à 65 On a résolu le mélange par électrophorèse dans de l'agarose à 1 % (Sea-Plaque, Marine Colloids) par des méthodes courantes (Selker et ai, J. Bacteriol, 129: 388, ( 1977)) Après l'électrophorèse, on a visualisé le plasmide linéaire par coloration au bromure 16 2511033 d'éthidium, on l'a coupé du gel et on l'a extrait par la métho- de de Langridge et al, Anal Biochem, 103: 264, ( 1980) On a préparé l'oligonucléotide synthétique(GCATGC ("agent de CGTAC Gt liaison") par la méthode du triester (Itakura, et al, J. Biol Chem, 250: 4592, ( 1975)) On a fait subir à l'agent de liaison synthétique un traitement par la kinase dans un volume réactionnel de 20 p 1 contenant 5 pg d'agent de liaison, 1 mmole d'ATP disodique (P-L Biochemicals), 10 unités de T 4- kinase de polynucléotide (P-L Biochemicals), 50 mmoles de tris-H Cl à p H 7,6, 10 mmoles de Mg C 12, 5 mmoles de dithiothréi- tol, 0,1 mmole de spermidine (Sigma) et 0,1 mmole d'EDTA di- sodique (acide éthylènediamine tétraacétique) On fait in- cuber le mélange réactionnel à 37 C pendant une heure, puis à 65 C pendant 5 mn On a ajouté une fraction de 4 p 1 de ce mélange à une solution contenant 2 pg de plasmide p GL 101 cou- pé avec de l'endonucléase Pvu II (ci-dessus), 1 mmole d'ATP disodique, 10 mmoles de dithiothréitol, 100 pg de sérum- albumine de boeuf par ml, 300 unités de T 4-ligase d'ADN (New England Biolabs), 50 mmoles de tris-H Cl à p H 7,6 et 5 mmoles de Mg C 12 dans un volume de 20 p 1 On a fait incuber le mélan- ge réactionnel pendant 14 heures à 12 C On a ensuite utilisé ce-mélange pour transformer la souche N 100 de E coli On a rendu les cellules aptes à la transformation par la méthode de Cohen, et al, Proc Natl Acad Sci, USA, 69: 2110, ( 1972)) On a ajouté une fraction de 10 pl du mélange de li- gation à O; 2 ml d'une suspension de cellules refroidie dans la glace, et on a fait incuber sur de la glace pendant une heure On a fait subir au mélange un choc thermique pendant 2 mn à 42 C et on l'a laissé reposer à 24 C pendant 10 mn On a ajouté 3 ml de bouillon LB ( 10 g de tryptone, 5 g d'extrait de levure, 10 g de Na Cl par litre), et on a fait incuber les cellules pendant une heure à 37 C On a-déposé des volumes de 0,1 ml sur des plaques contenant 1,5 % de gélose, du bouil- lon LB, et 100 pg/mld'ampicilline Après 16 heures d'incuba- tion, on a dénombré environ 200 colonies, contre dix dans un mélange témoin ne contenant pas d'agent de liaison On a cul- tivé dix de ces colonies pendant une nuit dans des volumes de ml de bouillon LB On a préparé des lysats comme décrit. 17 2511033 On a montré que l'ADN isolé était coupé une fois par l'endo- nucléase Sph I, et n'était pas coupé par Pvu II, alors que le plasmide de départ p G Ll Ol n'était pas coupé par Sph I et était coupé une fois par Pvu II Le nouveau plasmide était désigné par le symbole p GX 951 On a coupé une préparation de 50 pg d'ADN purifié par du Sph I et on l'a traitée par de la phospha- tase alcaline d'intestin de veau comme décrit ci-dessus. 2 Ligation d'un agent de liaison synthétique avec un fragment préparé contenant gal K La source de gal K était l'ADN du plasmide p KO-I, puri- fié comme ci-dessus Les données concernant le plasmide et la restriction ont été obtenues du Dr Keith McKenney (McKenney, K., et al,) On a obtenu le gène gai K à partir d'un fragment de restriction délimité par des sites Hind III et Acc I (figure 9) Le mélange réactionnel contenait un "tampon de sels à 50 nmoles" (voir ci-dessus), 50 ig d'ADN de plasmide p KO-I et 70 unités d'endonucléase Hind III (Bethesda Research Labs) dans un volume de 125 pl Au bout de 2 heures à 37 C, on a fait précipiter l'ADN avec deux volumes d'éthanol, on l'a recueilli par centrifugation, on l'a séché et on l'a redissous dans 55 pl d'eau On a ajouté un volume de 20 pl de sels de tampon ("tampon de sels à 50 mioles" cinq fois concentré) plus pil d'endonucléase Acc I ( 10 unités, New England Biolab) On a effectué l'incubation pendant 2 heures et demie à 37 C, puis à 65 C pendant 5 mn On a fait à nouveau précipiter l'ADN avec de l'éthanol comme ci-dessus, et on l'a à nouveau séché On a ensuite procédé à une digestion partielle avec l'endonucléase Hinf I; on a fait cela parce que, en plus du site particulier Hinf I à la terminaison N de gal K, il y a un site Hinf I interne qui devait rester intact Le mélange réactionnel de 240 pl con- tenait 5,7 unités de Hinf I (Bethesda Research Lab), 9,6 pg de l'ADN du fragment Hind III Acc I, et le "tampon de sels à 50 mroles". On a réalisé l'incubation pendant 2,5 mn à 37 C, puis pendant mn à 65 C On a extrait l'ADN avec 50 pl de phénol, on a éliminé avec de l'éther le phénol résiduel et on a fait préci- piter l'ADN avec 2 volumes d'éthanol On a lavé la boulette obtenue avec 4 volumes d'éthanol à 70 % et on l'a séchée sous vide On a ensuite "bouché" le mélange "partiel" à l'aide 18 2511033 d'ADN-polymérase pour transformer les extrémités de restric- tion collantes en extrémités émoussées en vue de la ligation par l'agent de liaison Un mélange réactionnel de 40 pi con- tenait 3,2 pg de l'ADN "partiel" de Hinf-I, voir ci-dessus, 4 pl de tampon de polymérase (trousse de translation de Bethesda Research Labs), 10 mmoles de Mg C 12, 4 unités d'ADN- polymérase "Klenow" (Boehringer-Mannheim) et 0,2 mmole de d ATP, d CTP, d GTP et TTP (Bethesda Research Labs) On a fait incuber ce mélange pendant 20 mn à 23 C, puis pendant 15 mn à 65 C On a procédé à une ligation d'un oligonucléotide syn- thétique AAGCATGCTT après le traitement de l'agent de liaison TTCGTACGAA par la kinase comme ci-dessus Un mélange réactionnel de p 1 contenait le "tampon de sels à 50 noles" comme ci-dessus ( 1), 3 pg du résultat de la digestion partielle de l'ADN, 2 pg de l'agent de liaison traité par la kinase et 1500 unités de T 4-ligase d'ADN (New England Biolabs) On a fait incuber ce mûlnge pendant 20 heures à 20 C, puis pendant 15 mn à C -u mélange refroidi on a ajouté 20 unités d'endonucléa- se Sph I et on a poursuivi l'incubation à 37 C pendant 1 heure. On a extrait le mélange avec 20 pl de phénol, on a éliminé avec de l'éther le phénol résiduel, et on a utilisé 2 volumes d'éthanol pour faire précipiter l'ADN Apres lavage avec de l'éthanol à 70 % et séchage sous vide, on a redissous l'ADN dans 20 pi de tampon de ligase (comme cidessus) contenant 2,5 pg du plasmide p GX 951 (coupé avec Sph I et "phosphatasé" comme ci-dessus), 1000 unités de T 4-ligase d'ADN (New England Biolabs), et 0,5 mmole d'ATP On a fait incuber le mélange pendant 16 heures à 20 C, puis pendant 15 mn à 65 C Après refroidissement, on a ajouté 10 unités d'endonucléase Sma I (Bethesda Research Labs) pour rendre linéaires les molécules contenant éventuellement une séquence comprise entre les si- tes Hind III et Hinf I (figure 9) L'incubation a duré 1 heure à 37 C Apres 15 mn à 65 C, on a utilisé le mélange refroidi pour transformer 200 pl de gal K de souche N 100 de E coli rendu apte et transformé comme ci-dessus On a déposé les cel- lules sur de la gélose de McConkey contenant 1 % de galactose et 100 pg/ml d'ampicilline Apres 16 heures d'incubation, on a observé des colonies On a purifié les colonies rouges qui 19 2511033 étaient alors en mesure d'exprimer le gène gal K et on a ef- fectué des préparations d'ADN comme ci-dessus On a fait subir à l'ADN une analyse de restriction pour vérifier le patron at- tendu La carte de restriction du plasmide p KO-I dans la ré- -5 gion de gai K est représentée sur la figure 9 des dessins. Les nombres de la figure 9 désignent les distances en paires de base Symboles: E = endonucléase Eco RI, H = Hind III, HF = Hinf I, A = Acc I, S = Sma I La ligne repérée "gai K" mon- tre la position du gène gal K (galactokinase) La souche pro- ductrice de galactokinase préparée par ce mode opératoire a été désignée par le symbole p GX 951, et a été déposée dans l'American Type Culture Collection, Rockville, sous le numéro ATCC 31917. Revendications 1 Vecteur d'expression permettant d'introduire un gène dans un organisme procaryote, caractérisé en ce qu'il comprend une boucle fermée d'ADN, comportant des signaux qui lui permettent d'être repliqué dans une cellule-hôte procaryo- te, et en outre (a) des séquences de promoteur, d'opérateur, et d'initiation de translation qui peuvent être reconnues par la cellule-hôte procaryote; (b) une séquence de Shine-Dalgarno et un codon ini- tiateur à l'intérieur de la séquence d'initiation de transla- tion, et (c) une séquence de reconnaissance destinée à une endonucléase de restriction qui coupe à proximité du codon initiateur en laissant subsister ce dernier, ou bien son com- plément, à l'intérieur de la séquence d'initiation de trans- lation. 2 Vecteur d'expression selon la revendication 1, ca- ractérisé en ce que ladite endonucléase de restriction coupe à une distance maximale de trois paires de base du codon ini- tiateur ou de son complément. 3 Vecteur d'expression selon la revendication 1, ca- ractérisé en ce que l'endonucléase de restriction coupe de telle sorte que la séquence d'initiation de translation se termine par le codon initiateur ou par son complément. 4 Vecteur d'expression selon la revendication 1, ca- ractérisé en ce que le codon initiateur se trouve à l'inté- rieur de la séquence de reconnaissance destinée à ladite en- donucléase de restriction. 5 Vecteur d'expression selon la revendication 1, ca- ractérisé en ce que ledit codon initiateur se trouve dans la séquence de reconnaissance destinée à l'endonucléase de res- triction Sph I. 6 Vecteur d'expression selon la revendication 1, 2 ou 3, caractérisé en ce que la séquence de reconnaissance des- tinée à ladite endonucléase de restriction est séparée du site de coupure de l'endonucléase de restriction par plusieurs pai- res de base de nucléotides non spécifiques. 7 Vecteur d'expression selon la revendication 6, carac- térisé en ce que l'endonucléase de restriction est Hga I. 8 Vecteur d'expression selon l'une quelconque des re- vendications 1 à 5, caractérisé en ce que le codon initiateur est séparé de la séquence de Shine-Dalgarno par un nombre de paires de base compris entre O et 22 environ. 9 Vecteur d'expression selon la revendication 8, carac- térisé en ce que le codon initiateur est séparé de la séquence de Shine-Dalgarno par un nombre de paires de base de trois en- viron à sept environ. Vecteur d'expression selon la revendication 1, ca- ractérisé en ce que ledit gène est un gène procaryote, un gène eucaryote, ou une séquence d'ADN synthétique qui code pour un polypeptide spécifique. 11 Vecteur d'expression selon l'une quelconque des re- vendications 1 à 5, caractérisé en ce que la cellule hôte pro- caryote est Escherichia coli, et en ce que les séquences de promoteur, d'opérateur et de Shine-Dalgarno dérivent des opé- rons lac ou trp de E coli. 12 Vecteur d'expression selon l'une quelconque des re- vendications 1 à 5, caractérisé en ce que la cellule-hôte pro- caryote est Escherichia coli, et en ce que les séquences de promoteur, d'opérateur et de Shine-Dalgarno dérivent d'un bac- tériophage. 13 Bactérie du genre Escherichia, caractérisée en ce qu'elle contient le vecteur d'expression selon la revendica- tion 11. 14 Bactérie du genre Escherichia, caractérisée en ce qu'elle contient le vecteur d'expression selon la revendica- tion 12. Segment d'ADN pratiquement pur, caractérisé en ce qu'il se compose essentiellement de: (a) des séquences de promoteur, d'opérateur et d'initiation de translation qui peuvent être reconnues par un organisme hôte pzocaryote; (b) une séquence de Shine-Dalgarno et un codon ini- tiateur à l'intérieur de la séquence d'initiation de transla- tion; et (c) une séquence de reconnaissance destinée à une endonucléase de restriction qui coupe à proximité du codon initiateur en laissant subsister ce dernier, ou son complément, à l'intérieur de la séquence d'initiation de translation. 16 Segment d'ADU selon la revendication 15, caractéri- sé en ce que ladite endonucléase de restriction coupe à une distance maximale de trois paires de base du codon initiateur ou de son complément. 17 Segment d'ADN selon la revendication 15, caractéri- sé en ce que l'endonucléase de restriction coupe de telle ma- nière que la séquence d'initiation de translation se termine par le codon initiateur ou par son complément. 18 Segment d'ADN selon la revendication 15, caractéri- sé en ce que le codon initiateur se trouve à l'intérieur de la séquence de reconnaissance destinée à ladite endonucléase de restriction. 19 Segment d'ADN selon la revendication 15, caractéri- sé en ce que ledit codon initiateur se trouve dans la séquence de reconnaissance destinée à l'endonucléase de restriction Sph I. Segment d'ADN selon la revendication 15, 16 ou 17, caractérisé en ce que la séquence de reconnaissance destinée à ladite endonucléase de restriction est séparée du site de coupure de l'endonucléase de restriction par plusieurs paires de base de nucléotides non spécifiques. 21 Segment d'ADN selon la revendication 20, caractéri- sé en ce que l'endonucléase de restriction est Hga I. 22 Segment d'ADN selon l'une quelconque des revendica- tions 15 à 19, caractérisé en ce que le codon initiateur est séparé de la séquence de Shine-Dalgarno par un nombre de pai- res de base compris entre 0 et 22 environ. 23 Segment d'ADN selon la revendication 22, caractéri- sé en ce que le codon initiateur est séparé de la séquence de Shine-Dalgarno par un nombre de paires de base de 3 à 7 envi- ron. 24 Segment d'ADN selon l'une quelconque des revendi- cations 15 à 19, caractérisé en ce que les séquences de pro- moteur, d'opérateur et de Shine-Dalgarno dérivent des opérons lac ou tr P de E coli. Segment d'ADN selon l'une quelconque des revendi- cations 15 à 19, caractérisé en ce que les séquences de pro- moteur, d'opérateur et de Shine-Dalgarno dérivent d'un bac- tériophage.