FR 2510355 A1 19830204 FR 8213252 A 19820729 La présente invention concerne un milieu servant à diluer et conserver la semence de volaille sans perte cruciale de viabilité et, plus spécialement, un milieu servant à prolonger la durée de vie de la semence de volaille, ainsi qu'un procédé de conservation associé. Il existe dans le commerce un certain nombre de diluants pour semence de dindon qu'utilisent des producteurs pour prolonger la semence (Calif Agric, 15 ao t 1970; Poultry Sci 56, 1054-1056, 1977) Un certain nombre de solutions synthétiques servant à diluer aussi bien qu'à faciliter la conservation de la semence de coq ont été conçues et soumises à des essais (J Reprod Fert 13, 571-575, 1967; J Reprod Fert 57, 149-155, 1977; Poultry Sci 56, 1443-1446, 1977) Les chercheurs ont démontré que les spermatozoïdes de coq et de dindon conservaient leurs pleines capacités de fécondation dans des milieux définis par de larges limites d'osmolarité ( %, 0,455 à 0,736 C) et de niveau de p H ( 6,0 à 8,0) (Beltsville Symposium in Agricultural Research No 3, Animal Reproduction, 1979, Chap 12, p 161). Un but de l'invention est de proposer un milieu permettant de diluer et de conserver la semence de volaille. Un autre but est de proposer un milieu dans lequel des spermatozoïdes de volaille peuvent conserver leur fécondité. Un autre but est de proposer un milieu et un procédé permettant de prolonger la durée de vie de la semence de volaille, en particulier de la semence de dindon. Un autre but est de proposer une substance diluante qui conserve la semence de dindon à une température de 5 a 15 C pendant une durée de 6 à 18 h avant son utilisation pour l'insémination arti- ficielle. Un autre but est de proposer une substance diluante qui permet de maintenir la semence de dindon recueillie pendant une durée pouvant aller jusqu'à 18 h sans aucune perte de fécondité. Selon l'invention, on réalise les buts énoncés ci-dessus au moyen d'un milieu constitué d'un mélange de sels, sucre et amino acides en des quantités effectives en solution aqueuse permettant de 2 510355 de prolonger la viabilité d'un semence contenant des spermatozotdes vivants, le milieu étant chimiquement équilibré de façon à fournir l'équilibre osmotique, la concentration en ions d'hydrogène, l'action chélatante et l'énergie qui sont nécessaires à la prolongation de la viabilité de la semence. La plupart des dindons qui existent dans le monde ont été conçus par insémination artificielle, non en raison de l'avantage génétique qui pourrait être obtenu de l'insémination artificielle, mais principalement parce que la taille que le dindon a acquis par suite de la sélection génétique le rend inapte à effectuer l'accou- plement de manière naturelle Beaucoup d'efforts ont été faits pour procurer un diluant convenable permettant de prolonger la semence afin de réduire les coûts de production Des procédés de stockage de semence pendant une durée d'au moins 6 à 8 h aideraient à atteindre cet objectif Par conséquent, des études importantes ont été entre- prises pour déterminer quels composants et quelles conditions sont néces- saires pour prolonger et conserver la semence de coq et la semence de dindon. Un certain nombre de solutions synthétiques qui assurent la dilution ainsi qu'une aide à la conservation de la semence ont été proposées et soumises à des essais Les formules proposées reposent souvent sur la composition et les propriétés du liquide séminal Il a été déterminé que les composants choisis pour servir de substance diluante de la semence doivent fournir des sources éner- gétiques exogènes, un équilibre osmotique approprié, une capacité de tamponage suffisante, un étroit contrôle de la croissance bactérienne, et une certaine action chélatante visant à la protéger contre des ions' toxiques Un certain nombre des composés les plus courants utilisés comme substances diluantes de la semence de volaille sont présentés dans le tableau 1 ci-après. Bien qu'on ne sache pas quels sont, dans les substances diluantes de la semence, les composants jouant un r Ble crucial pour soutenir la viabilité du sperme pendant le stockage in vitro, les recherches effectuées dans ce domaine ont abouti à la conclusion que les spermatozoïdes de coq et de dindon conservaient leurs pleines capacités de fécondation dans des milieux présentant des limites assez larges en ce qui concerne à la fois l'osmolarité ( 4 E 0,455 à 0,7360 C) et le niveau de p H ( 6,0 à 8,0) Il est apparu que la température optimale de stockage de la semence de dindon non diluée était de 15 C; toutefois, même à cette température, une conservation n'entratnant pas de sérieuses pertes des capacités de fécondation se limite ordinairement à quelques heures La semence de dinson non diluée est extraordinairement sensible aux températures supérieures et inférieures à 15 'C Les spermatozoïdes du dindon périssent ordi- nairement en quelques minutes à l'extérieur du corp, même dans leur propre liquide séminal De fait, avant l'invention, la semence de dindon diluée perdait une part considérable de sa capacité de fécon- dation lorsqu'elle était stockée dans divers diluants pendant 6 h. et cela indépendamment de la température à laquelle elle était main- tenue Ce phénomène s'oppose au fait que les capacités de fécondation de la semence diluée de coq peuvent se maintenir pendant une durée de 24 à 48 h sans pertes sérieuses lorsqu'on la stocke à une tempé- rature de 2 à 50 C. Dans les seuls Etats-Unis d'Amérique, un nombre de 3, 5 millions de dindes subit chaque année l'insémination artificielle pour un coût atteignant 12 millions de dollards L'invention propose un moyen permettant de réduire sensiblement le coût de l'insémination artificielle En diluant la semence au rapport 1:1 dans le milieu selon l'invention, on réduit de 50 % le nombre nécessaire de miles reproducteurs, ce qui économise à l'industrie environs 6 millions de dollards De plus, le travail nécessaire pour l'inséxrination artifi- cielle pourrait être réduit de 30 Z ce qui économiserait encore 2 à 3 millions de dollard. Dans la mise en oeuvre de l'invention, on recueille de la semence contenant des spermatozoïdes vivants à la sortie de l'oiseau, soit directement dans le milieu selon l'invention, soit en la recueillant dans un tube et en l'introduisant dans le milieu, puis on stocke le mélange de semence et de milieu selon l'invention à une température de 5 à 15 WC in vitro jusqu'à son utilisation pour l'insémination de plusieurs femelles Le milieu selon l'invention, baptisé BPSE-II, présente la formule suivante. 2510-355 Constituant poids (g) Diphosphate de potassium, 3 H 20 12,70 Glutamate de sodium 8,67 Fructose (anhydre) 5,00 Acétate de sodium, 3 H 20 4,30 TES(x) 1,95 Citrate de potassium 0,64 Monophosphate de potassium 0,65 Chlorure de magnésium, 6 H 20 0,34 (K) acide N-tris hydroxyméthyl méthyl-2-aminoéthane sulfonique. Lors de la préparation du milieu, on utilise une verrerie, ou un autre type de conteneur, stérile et on effectue le filtrage an système fermé On répartit le milieu préparé dans des conteneurs étanches a l'air On place dans un grand bêcher, ou un autre conte- neur, le poids voulu de chaque constituant et on mélange pendant une durée de 30 à 60 min avec 900 ml d'eau distillée On ajuste le p H du milieu & 6,50 + 0,1 par addition d'acide chlorydrique à 12 N et l'osmolarité à 350 + 10 milliosmoles par addition d'eau distillée. On filtre ensuite le mélange dans un microfiltre présentant une dimensiondepores de 0,22 nanomètre Avantdeconditionner le milieu dans un flacon, ou un autre conteneur approprié, stérile, on effectue des essais par la technique du milieu de perfusion cerveau-coeur de façon à s'assurer qu'il ne contient aucune contamination microbienne. On vérifie également à ce moment le p H et l'osmolarité. La composition dite BPSE-II présente une composition identique à celle de la substance diluante qui s'est révélée utile pour prolonger la fécondité de la semence de coq, à savoir sa compo- sition BPSE-I (Poultry Science 56, 1443-1446, 1977) De fait, la seule différence existant entre les compositions BPSE-I et BPSE-II réside dans le p H et l'osmolarité des milieux Toutefois, alors que la composition BPSE-I donne de bons résultats avec la semence de coq dans les conditions décrites, la semence de dindon perd une partie considérable de sa capacité de fécondation lorsqu'elle est stockée dans la composition BPSE- I pendant 6 h De plus, avec la composition BPSE-II, on a découvert que l'on pouvait maintenir de hauts niveaux de fécondité ( 93 %O) sur tout le cycle de reproduction de la dinde, c'est-à-dire sur 24 semaines Avec la composition BPSE-I, le niveau de fécondité commence à décliner au cours de la e semaine Ainsi, la composition BPSE-II produit une amélioration importante par rapport à la composition BPSE-I. Les performances fortement améliorées de la composition BPSE-II par rapport à la composition BPSE-I sont présentées sur le tableau 2 ci-après, o les effets des compositions BPSE-I et BPSE-II sur la fécondité de la semence de dindon sont comparés sur 15 semaines d'un cycle de production d'oeufs La semence est recueillie de plusieurs dindons, une moitié de cette semence est mélangée, au rapport 1:1, avec la composition BPSE-I, et l'autre moitié est mélan- gée au rapport 1:1 avec la composition BPSE-II, chaque milieu étant maintenu à 15 'C Pour chacun des milieux diluants, on a utilisé la semence fraîchement recueillie pour pratiquer l'insémination artifi- cielle sur des dindes Une partie de chaque milieu diluant contenant de la semence de dindon a été utilisée immédiatement, c'est-a-dire à la date de stockage O, pour inséminer un groupe de dindes, et une deuxième partie a été stockée à 150 C pendant 6 h avant d'être utilisée pour inséminer un deuxième groupe de dindes On a répété le processus chaque semaine en utilisant les mêmes dindons et les deux mêmes groupes de dindes pendant la période de 15 semaines Pour chaque insémination, on a utilisé 0,05 ml de mélange diluant-semence Eu égard au fait que, comm e oté ci-dessus, les chercheurs ont établi que les spermatozoïdes de dindon conservaient leur totale fécondité dans des milieux présen- tant de larges intervalles d'osmolarité et de niveau de p H, les perfor- mances notablement améliorées de la composition BPSE-II par rapport à celles de la composition BPSE-I sont à la fois surprenantes et inattendues. De plus, on a également découvert que de la semence de dindon fraîchement recueillie contenant des spermatozoïdes vivants pouvait être stockée in vitro dans la composition BPSE-II sans pertes de fécondité pendant 18 h à 50 C Cette découverte donne une température convenable et une durée de stockage pendant laquelle la semence de dindon peut être stockée sans pertes de fécondité. Dans la mise en oeuvre de l'invention, on a préparé le milieu diluant de la manière décrite ci-dessus On a recueilli la semence de plusieurs mâles, soit directement dans le milieu, soit en la recueillant dans un tube puis en la mélangeant avec le milieu. La semence et le milieu ont été mélangés dans un rapport volumétrique 1:1 Le mélange de la semence contenant des spermatozoïdes vivants et du milieu peut être conservé in vitro à 150 C pendant une durée qui peut atteindre 6 h, et à 50 C pendant une durée qui peut atteindre 18 h, sans pertes de la capacité de fécondation Le mélange de semence et de milieu diluant a été utilisé pour inséminer plusieurs femelles. Un des avantages important conféré par l'invention est la réduction de la main-d'oeuvre nécessaire pour l'insémination arti- ficielle d'un grand nombre de femelles Il n'est pas nécessaire d'utiliser immédiatement la semence recueillie; elle peut être recueillie et conservée pendant une durée pouvant atteindre 18 h sans perte des capacités de fécondation, jusqu'à son utilisation. Ainsi que cela a précédemment été noté, lors du processus d'insémination artificielle de plusieurs femelles a l'aide d'un mélange 1:1 de semence et de la composition BPSE-II qui a été stocké à 15 C pendant 6 h avant d'être utilisé, il est apparu, de façon inattendue, que les niveaux initiaux de fécondation, à savoir les niveaux de fécondation de la semence utilisée immédiatement après son recueil et mélangée dans le rapport 1:1 avec le milieu diluant (temps de stockage zéro) a été maintenu pendant le cycle de reproduction des dindes, durant 24 semaines Le même processus a été utilisé pendant ce cycle de reproduction de 24 semaines en relation avec la période de production des oeufs, qui est de 15 semaines, ainsi que cela est montré sur le tableau 2 ci-après. Alors que l'on a utilisé 0,05 ml de mélange diluant- semence pour chaque insémination en ce qui concerne les résultats notés ci-dessus, il a également été découvert que cette quantité pouvait être ramenée à la moitié, c'est-à-dire 0,025 ml par insé- mination, et cela sans aucune perte d'efficacité. Bien entendu l'homme de l'art sera en mesure d'imaginer, à partir du milieu et du procédé dont la description vient'd'être donnée à titre simplement illustratif et nullement limitatif, diverses variantes et modifications ne sortant pas du cadre de l'invention. TABLEAU 1 Fonction principale Constituant tampon ES( phosphates (de NA ou K), "TRIS"( 2) source énergie fructose, glucose inositol> raffinose agent chélatant glutamate, albumine, lait équilibre osmotique chlorure de magnésium et acétate de sodium, citrate de potassium et chlorure de sodium agent antibactérien gentamycine, pénicilline streptomycine ( 1) acide N-tris hydroxyméthyl méthyl-2-aminoéthane sulfonique ( 2) tris (hydroxyméthyl aminométhane) T A B L E A U 2 Semaines dans la production des des oeufs - Substance p ( 1) Stockage 6 diluante H (heure) 1-5 6-10 11-15 1-15 0 6 0 6 O 6 O 6 fécondabilité (%) BPSE-I 7,5 333 94 92 93 82 K) 95 63 () g 94 79 () BPSE-II 6,5 350 95 94 96 97 87 93 93 95 (x) il est que P ( R E V E N D I C A T I 0 N S 1 Milieu destiné à conserver de la semence de dindon in vitro et à prolonger sa durée de vie utile, caractérisé en ce qu'il comprend un mélange de sels, de sucre et d'amino acides en quantités efficaces dans une solution aqueuse pour étendre la viabilité de la semence, ledit mélange de sels, sucre et amino acides étant chimiquement équilibré de façon à fournir l'équilibre osmotique approprié, la concentration en ions d'hydrogène, l'action chélatante et l'énergie qui sont nécessaires à la prolongation de la viabilité de la semence, et en ce que le p H de la solution est d'environ 6,5 et l'osmolarité d'environ 350 milliosmoles. 2 Milieu selon la revendication 1 caractérisé en ce qu'il est mélangé avec de la semence contenant des spermatozoïdes vivants. 3 Milieu destiné à prolonger la fécondité de la semence de dindon pendant une durée pouvant atteindre 6 heures lorsqu'il est maintenu in vitro à 15 C et pendant une durée pouvant atteindre 18 heures lorsqu'il est maintenu in vitro à 5 C, caractérisé en ce qu'il comprend un mélange de diphosphate de potassium, de gluta- mate de sodium, de fructose, d'acétate de sodium, de monophosphate de potassium, de citrate de potassium, de chlorure de magnésium et de TES (acide N-tris hydroxyméthyl méthyl-2-aminoéthane sulfonique), ledit mélange ayant le p H et l'équilibre osmotique, ou osmolarité, appropriés pour prolonger la fécondité de la semence, et en ce que le p H de la solution est d'environ 6,5 et l'osmolarité d'environ 350 milliosmoles. 4 Milieu selon la revendication 3, caractérisé en ce qu'il est mélangé avec de la semence contenant des spermatozoïdes vivants. 5 Milieu destiné à conserver de la semence de dindon contenant des spermatozoïdes vivants et à prolonger, in vitro, sa durée de vie utile, tout en maintenant de hauts niveaux de fécon- dité tout au long d'un cycle de reproduction de dinde, caractérisé en ce qu'il possède la formule: Constituant Poids (g) diphosphate de potassium, 3 H 20 12,70 glutamate de sodium 8,67 fructose (anhydre) 5,00 acétate de sodium, 3 20 4,30 TES(x) 1,95 citrate de potassium 0,64 monophosphate de potassium 0,65 chlorure de magnésium, 6 H 20 0,34 (x) N-tris hydroxyméthyl méthyl-2-aminoéthane sulfonique et en ce que le milieu est mis en solution aqueuse et présente un p H de 6,5 + 0,1 et une osmolarité de 350 + 10 milliosmoles. 6 Procédé de conservation de semence de dindon, caracté- risé en ce qu'il consiste à mélanger de la semence de dindon conte- nant des spermatozoïdes vivants avec un milieu aqueux contenant un mélange de sels, de sucre et d'amino acides en quantités efficaces en solution aqueuse pour étendre la viabilité de la semence, le mélange de sels, sucre et amino acides étant chimiquement équilibré de façon à fournir l'équilibre osmotique approprié, la concentration d'ions d'hydrogène, l'action chélatante et l'énergie qui sont néces- saires à la prolongation de la viabilité de la semence, et en ce que le p H de la solution est d'environ 6,5 et l'osmolarité d'environ 350 milliosmoles. 7 Procédé selon la revendication 6, caractérisé en ce que l'on recueille la semence de plusieurs nmles directement dans ledit milieu aqueux A l'intérieur d'un récipient et on utilise le mélange de semence et de milieu après stockage dans le conteneur pour inséminer plusieurs femelles. 8 Procédé selon la revendication 6, caractérisé en ce que l'on stocke le mélange de semence et de milieu à 15 C. 9 Procédé selon la revendication 6, caractérisé en ce que l'on stocke le mélange de semence et de milieu à 5 C. 10 Procédé destiné à conserver de la semence de dindon contenant des spermatozordes vivants et à maintenir de hauts niveaux de fécondité tout au long d'un cycle de reproduction de dinde, caractérisé en ce qu'il consiste à mélanger la semence de dindon avec un milieu ayant la formule: Constituant Poids (g) diphosphate de potassium, 3 H 20 12,70 glutamate de sodium 8,67 fructose (anhydre) 5,00 acétate de sodium, 3 H 20 4,30 TES 1,95 citrate de potassium 0,64 monophosphate de potassium 0,65 chlorure de magnésium, 6 H 20 0,34 (x) N-tris hydroxyméthyl méthyl-2-aminoéthane sulfonique et en ce que ledit milieu possède un p Hli de 6,5 + 0,1 et une osmola- rité de 350 + 10 milliosmoles. il Procédé de préparation d'un composition permettant d'étendre la durée de vie utile de la semence de dindon, caractérisé en ce qu'il consiste & fabriquer une composition ayant la formule: Constituant Poids (g) diphosphate de potassium, 3 H 120 12,70 glutamate de sodium 8,67 fructose (anhydre) 5,00 acétate de sodium, 3 H 20 4,30 TES(K) 1,95 citrate de potassium 0,64 monophosphate de potassium 0,65 chlorure de magnésium, 61 H 20 0,34 (x) N-tris hydroxyméthyl méthyl-2-aminodthane sulfonique et en ce que cette composition est formée en solution aqueuse, la solution aqueuse étant ajustée à un p H de 6,5 + 0,1 et une osmo- larité de 350 + 10 milliosmoles. 12 Procédé selon la revendication 11, caractérise en ce qu'on ajuste le p H en ajoutant de l'acide chlorydrique à 12 N et l'osmolarité en ajoutant de l'eau.