FR 2500166 A1 19820820 FR 8202669 A 19820218 - 1 - Les progrès en immunochimie de ces dernières années ont conduit à des recherches poussées sur des anticorps encore peu connus dans le passé et on a étudié en détail le mécanisme gouvernant la production d'anticorps, les struc- tures biochimiques et les propriétés des anticorps. En 1975, C. Milstein et ai ont réussi à produire un anticorps monoclonal par fusion cellulaire de cellules myé- lomateuses de souris avec des cellules de rate, produisant de des anticorps. L'anticorps monoclonal est supposé contribuer grandement au développement des recherches fondamentales en immunologie, E des études dans ce domaine ont été sérieuse- ment entreprises. On a déjà utilisé le dosage enzymo-immunologique(EIA) comme méthode de dosage immunologique très sensible et quan- titative. En particulier, la méthode du "sandwich" basée sur ce dosage est fréquemment utilisée en raison de la sim-. plicitédu procédé et de sa sensibilité élevée. Cependant, étant donné que la méthode du "sandwich" demande de 1 à 4 jours pour la réaction, il est souhaitable de réduire le temps de réacton nécessaire. De plus, en raison des récents progrès en médecine clinique, une évaluation rapide des résultats d'essai est demandées pour donner un traitement im- médiat au patient. De ce point de vue également, une réduc- tion du temps de réaction est sérieusement désirée. Mais, selon la méthode classique du sandwich, une réduction du temps de réaction se traduit par une diminution de La sensi- bilité et de la précision du dosage, comme on l'expliquera ci-après, de sorte qu'il n'est pas possible de réduire le temps de réaction de façon significative. La méthode du sandwich, classique, sera maintenant décrite en détail. Bien que la méthode soit expliquée en rapport avec l'EIA tout au cours de cette demande, dans un but de commodité, l'explication peut s'appliquer également à la méthode basée sur le dosage fluoyoimnunolo- gique (FIA). -2- La méthode du sandwich, classique, est effectuée selon la séquence suivants, iiustrae sur ie schéma de la figure 1 des dessins annexes. i) On fait réagir un anticorps insolubilisé 2', obte- nu oar fixation d'un anticorps oDposé à un antigène 3 à cos=r sur un support insoluble (phase solide) 4, avec 1'entigune 3 peur fixer l'antigène 3 de!:anticorps 2' sur la ob3se solide (premiere rfact cn). ii) On lave la ohase solide 4 ooir éliminer les subs- tances qu! n'ont pas réagi. iii) On fait r--agir la phase solide 4 ainsi lavée avec un anticorps marqué 11', obtenu en fizant une enzyme 5 sur un anticorps opposé à l'antigène 3 à doser, pour fixer l'anticorps marqu_ 1' avec un site anti gnique libre de !'antigène 3 qui a été fixe sur la phase solide 4 (deux- ième réaction). iv) On lave la phase solide 4 pour éliminer l'excès d'anticorps marqué 1', puis on ajoute un substrat pour l'enzyme et on soumet à une réaction enzymatique. 2rJ Etant donné que l'antigène 3 et l'anticorps marque 1' ont été fixes sur la phase solide 4, la réaction ean- zymatique es proportionnelle A la quantité d'enzyme pr5- senta. La quantité d'-ntiiène 3 à doser est déterminée à oartir de la nuantit. du rroduit de rxac'.n rsultant. Etant donné aus la méthode du sandwich est générale- ment classée comme un dosage non-comnétitif,on reut suDDo- ser qu'elle n'impliQue pas de réaction compétitive. Mais, cette classificaticn n'exprime pas nécessairement l'état exact des réactions. C'est ainsi qu'en fait, un état d'équilibre -eut exister dans la méthode du sandwich, tel ou'il est illustré schématiquement ci-dessous. Première racticn: a t Ab[ + (Ag-- ( @ - Ag) a"> a' 3 3- euxi:me r acti n: ( Ab -Ag-Ab-,) c -Ag) + (Ab- Bu A + (Ag-Ab*) de (Ib) + Ag) +(Abg-A' "Dans le schéma ci-dessus, Abl represente l'anticorps insolubilisé; Ag repr.sente l'antigène à doser, Ab+ reoré- sente l'anticorps marqué; a, a', b, b', c, c', d, d', e et e' représentent les constantea d'équilibre; et - indique que l'antigène et l'anticorps sont reliés ensemble). Lorsoue le complexe de l'anticorps insolubilisé et de l'antigène à doser réagitavec l'anticorps marqué dans la. deuxième réaction, l'anticorps insolubilisé et l'anticorps maroué se fixent compétitivement sur l'antigène à doser selon leur affinité pour l'antigène (3tant donné que les propriétés de l'anticorps solubilisé et de l'anticorps marqué sont presqu' iduntiques, leurs taux d'affinité pour l'antigène à doser sont considérés comme presqu'équivalents) et on raison ds la ccmpétiticn, le complexe anticorps inso- lubilisé-antigène formé par la oremière rection se dissocie en fermant des complexes de diverse combinaison tel que mont-é ci-dessus. Ceci es mis en évi:ence par l'exoérience suivantó. On fait r:agir un tube à essai en matière plasti-ue sur lecuel est fixé un anticoros anti-sous-unité i de L'HCG avec o l'HCG-, peu à peu de la phase solide et migre dans la-phase liquida. Cet &3 est illustré sur la figure 2 des dessins annexes. T:.utefois, si le temps de la prenmière rÈacticn est suffisamment long, la liaison entre l'antigOne et l'anti- corps devient pertiellem.nrt irreversible et le complexe antigqneanticcrps ne se dissocie pas facilement, meme lorsou'on y ajoute l'anticcrps marcué. On sait d'autre part oue si le temps de la deuxièms reaction devient suffisem- ment long, la réacticn conduit à la Formatio-n d'un complèxe de" l'anticorps insolubilisé, l'antigène Z doser et l'anti- corps marqué". Pour ces raisons, il est indispensable dans la méthiode du sandwich, classique, de poursuivre la rÉactien pendant un temps suffisamment long. En consequence, 'si la m.thode du sandwich est effectuée sans la première réaction ou si la durée de temps de la première réaction est extr3- mement réduite (par exemple, lorsque l'anticorps insolubilisé et l'anticorps marqué réagissent simultanément avec l'antigè.q na à doser), la deuxième réaction doit être prolongée et la sensibilité et la précision du dosage sont cependant moindres. Si la durée de la deuxième réactiin est réduite, la sensibilité et la précision sont encore plus réduites. C'est pourquoi il a é-é impossible dans la méthode classique de réduire le temps de-réaction sans entraîner une diminution de la sensibilité et de la précision. A cet égard, Ichihara et al (The Japanese Journal of Clinical Pathology 26, 1027 (1978)) ont rapporté qu' une telle réactitn compétitive existe bien et nue la réaction ne devient partiellement irréversible que si la réaction est poursuivie suffisamment longtemps. C'est ainsi que le système de réaction dans la méthode classique est co.mpliqué et inefficace et demande un long temps de réaction. La présente invention a po r objet de fournir un réactif pour un dosage immunologiQue oui permet une réduction remarquable du temps requis pour le dosage -ans diminuer ls sensibi lité et la p-r-cision. -5- Spécifiquement, la présente invention a poLr objet de fournir un réactif pour la méthode du sandwich, qui comprend un anticorps insolubilisé et un anticorps marqué prépares à partir d'anticorps monoclonaux. L'invention a encore pour objet de fournir une méthode du sandwich perfectionnée qui permet une réduction remar- quable du temps requis pour un dosage, sans diminuer la sen- sibilité et la précision. La figure 1 des dessins annexes représente un schéma illustrant le mode de réaction dans une méthode du sandwich classique, les figures 2 et 3 sont des diagrammes montrant la presence ou l'absence de compétition entre les anticorps, la figure 4 est un diagramme montrant le mode de réaction conformément à l'invention, la figure 5 repr.:ente un diagramme illustrant une comparaison entre la présente invention et la méthode classique. la figure 6 est un diagramme montrant les résultats de l'exemple 1, la figure 7 est un diagramme montrant les résultats de l'exemple 2, et la figure S est un diagramme montrant les résultats de l'exemple 3. Les buts ci-dessus de l'invention sont atteints en utilisant des anticorps monoclonaux pour préparer un anti-' corps insoluble et un anticorps marqué qui se distinguent et se fixent à différents déterminants antigéniqaes sur le mêe antigène, alors que,lans la méthode classique, on utilise des anticorps dits polyclonaux (ob;enus à partir d'animaux immunisés avec le même antigène) pour péparer ces deux anticorps, de sorte qu'ils entrent en compétition pour les mêmes déterminants antigéniques de l'antig.ne. C'est ainsi que l'invention est caractérisée en ce que l'anticorps insolubilisé et l'anticorps marqué comprennent respectivement des anticorps capables de reconnaître, et de - 6- se fiser sur différents déterminants antig-niques du même antigène à doser, ou ils comprennent des anticorps qui dis- tinguent les différents déterminants antigéninues de l'an- tigène de sorte qu'il est possible d'obtenir que les deux anticorps respectifs se fixent sur différents sites anti- géniques sur le même antigène à une distance suffisante l'un de l'autre de façon à ne pas perturber la fixation de l'autre. Comme exemples de tels anticorps, les anticorps mono- clonaux s'avèrent les mieux appropriés. Les anticorps monoclonaux sont obtenus par une fusion cellulaire entre des cellules myélomateuses et des cellules produisant des anticorps par le p bàédé de Milstein et-al (Nature, 256, 495 (1975)).Du faitque ces anticorps sont -produits à partir de cellules produisant des anticorps d'un clone unique, ils sont totalement homogènes et leur spécificité pour les déterminants antigéniques est totale- ment identique. Comme l'antigène à doser comporte géné- ralement plusieurs déterminants antigéniques, si on utilise des anticorps monoclonaux capables de reconnaître, et de se fixer surdifférents déterminants antigéniqueî de l'anti- gène, comme anticorps insolubilisé et anticorps marqué, il n'existe aucune compétition entre ces anticorps et on peut parvenir à un dosage très spécifique de l'antigène. C'est ainsi qu'on peut utiliser également un mélange de deux,ou plus de deux, anticorPs monoclonaux qui se fixent sur différents déterminants antigéniquss, comme anticorps insolubilisé et/ ou anticorps marqué, à condition que ces anticorps n'en- gendrent pas unéitelle, compitition. Le dosage salon l'invention peut être effectué de la même manière que dans la technique antérieure. On doit souligner, cependant, que le mécanisme de réaction est alors plus simple que dans la méthods classique car l'anticorps insolubilisé n'entre pas en compétition avec l'anticorps marqué, tel que montré ci-dessous. 7- [j:-Ag) + (Ab*) CA* Qrr -Ag -Abt) Ab) + CAg - AL,) pAp, P q', >r' q s Ab,.q, Ab" et - ont les mlrmes signific3ticns que ci-dessus, et p, p', q, q, r, r', s, s' reprtsonant res- pectivement des constantes d'éuiibrs). Conme il n'existe pas de competitian entre l'anticorps insolubilis. et l'anticoros marqué lorsqu'ils ont différents sites de fixation sur un antigène, la réaction se déroule de telle sorte que les constituants dans la solution de réaction forment un ccmolexe "ar,'icorps insolubilisé- - antigène - anticorps marqué". Ceci peut être mis en évidence par l'expérience suiv.nte. Dans le m@me système de réaction que la méthode du sandwich classicue, on utilise deux anticorps anti-HCG monoclonaux différents, capables de reconnait-e différents déter2inants l5 in-ti nicues de HCG, en t3nt qu'anticorps insrlubilisé et anticorps marqué et on effectue l'expérience de la même ma- nière. Tel que reorêsent5 sur la fiijure 3, le resultat indicue qu'une fois Gue l'dntigène est fixé sur l'anticorps insolusilisé, il nt so ?issocio pas de l'anticorps insolu- bilisé nh3s:: solide) lorsqu'on y ajo te un anticorps anti-HCG ccrres7on:aint; Des (terrinants antignnicues diffrents. C'est ainsi aoỦ'ii est éviîcnt ou'il na so pro2-_t.-as de ccmo-titii:n entre les anticorps --cur de mcmes sit:es i-tiînicues. E ecnsoucnce, selon l'invention, on obtient des r-sultats semblables lorsque l'anticoros inso- iubili-é,.l'antigène à doser et l'anticoros maerQu rAacis- s.nt simultanément, ou. lorsque l'anticorps insolubilisé et l'antigène sont d'auord mélangés, puis réagissent avec l'anticorps marqué, ou lorsque l'anticorps insolubilis rragit avec l'antigène et quelques temps après on fait r.agir le mélange avec l'anticorps marqué. C'evt ainsi qu'il n'y a aucune restriction suant à la s'quence r-actionnelle. La réacticn effectude selon l'invention es: illustrée tî par un schéma sur la figure 4. Etant donné que l'anticorps insolubilisé 2 et l'anticorps marzué 1 n'entrent pas mutuel- lement en compétition, une plus grand3 quantité de l'anti- corps marqué 1 peut se fixer sur l'antigène 3 en une plus courts période de temps, et il devient alors possible non seulement de réduire la durée du dosagE, mais également d'augmenter la.précision et la sensibilité du dosage. Le tableau 1 résume les avantages du procédé selon l'invention par rapport à la méthode classique utilisant des anticorps polyclonaux dans le dosage de l'c -foeto- protéine (AFP). D'après le tableau, il est évident qu'on peut obtenir de nombreux avantages, tels que la nette réduction de la durée du dosage, la si.plification du procédé de dosage et l'augmentaticn de la précision et de la sensibilité du dosago. - 9- TABLEAU 1 Procédé de l'invention e M4thode classique l' invention On a effectué le dosage au moyen d'un photomètre 3 fluorescence sur le sérum d'une femme enceinte comme échan- tillon à doser, en utilisant un tube à essai en polystyrène comme nhase solide, de la peroxydase de raifort comme enzyme de marquage et de l'acide phlorétique comme substrat. Il est également ponsible que l'un seulement de l'anti- corps insolubilisé ou de l'anticorps marqué soit préparé à partir d'un anticorps monoclonal et que l'autre soit préparé à partir d'un anticorps polyclonal ordinaire. Mais, dans un tel cas, il se produit une compétition sur un déter- minant antigénique commun à l'anticorps monoclonal et à l'anticorps polyclonal et parfois l'affinité du déterminant antigénique oour l'anticorps polyclonal peut être plus forte, ce qui entraîne une diminution dF la précision et de la sensibilité du dosage par rapport à la méthode classique v1le-mêmn et non pas seulement à la méthode o les deux anticoros sont monoclonaux. La figure 5 repr'sente des courbes témoin dans le dosage du CEA (antigène carcinoembryonnaire) lorsque l'anti- rode opér-toire Rtact-n_-lavage 1ère rraction _>lavag -- reaction - 2ème réaction enzymatique lavage ->réaction _____,_.........___enzymatique Anticorps Anticorps mono- Anticorps polyclonaux utilisés clonaux Temps requis 30 minutes 270 minutes Sensibilité. 3 ng/ml i 1C ng/ml Pr cision: Erreur intra- expérimentale 2 C.V. dans 10 2,5 % répétit ons Erreur inter- dpérimentale 53,7 % 5,6 % C.V. dans 5 répétitions, - 10 - corps insolubilisé et l'anticorps marqué sont combinés tel qu'inoiqué dans le Tableau 2. I1 est évident que le système de dosage base sur la combinaison conformément à l'invention donne le meilleur résultat. TABLEAU 2 Anticorps Anticorps insolubilisé marque Procédé de l'invention Monoclonal Monoclonal Méthode comparative 1 Monoclonal Polyclonal PtfVahode comparative 2 PRolyclonal Monoclonal M.thode classique Polyclonal Polyclonal Les anticorps monoclonaux utilisés sont obtenus par la technique de la fusion cellulaire à partir de cellules myélomateusesde souris selon l'exemple 2 donné ci-dessous et proviennent de clones correspondant aux différents sites antigéniques. Les anticorps polyclonaux utilisés sont des produits commerciaux de Dako Company (Danemark). Des tubes à essai en polystyrène sont utilisés en tent que support insoluble; l'enzyme est de la peroxydase de raifott; et le substrat de l'o-phénylènediamine. Tout combinaison de cellules myélomateuses et de cel- lules produisant des anticorps peut être utilisée pour obte- nir des anticorps monoclonaux-et l'espèce de l'animal dont proviennent les cellules n'est pas limitée, dans la mesure o les deux types de cellules entrant en combinaison neu- vent ensemble former des hybridomes et produire un anti- corps au cours du développement. Tous les supports insolubles utilisés dans les dosages immunologiques classiques peuvent être employés dans l'in- vention. Comme exemples de supports insolubles, on citera le polystyrène, le polyéthylène, ies résinsE acryliques, le polytétrafluoroéthylène(Teflon),le papier, le verre et la rWlose. Le support insoluble peut avoir la forme d'une pièce en forme de roue dentée, d'une bille,d'une bauoette,d'un disque ou d'ure cuvette. Par exeile, ce peut être une cellule optique, un - 11 - tube à essai, etc. Il oeut é-alment avoir a'eutres formes. Comme agsnts Je marquaic normal2mrent utiiisés, on citera par example, la poroxydase, la ^-O--alactosidase et la phosphata-c aiciline pour i'EIA et l'isothiocyanate de ;.uoresc.ine pcL:r le FI;. Lorsque l'agent de marquage e:l une enzyme, un *-ubstrat s'ev2re nîcessairs Dcur mesurer son activit'. Le substrat paut êtr: tel ue iorsq:'il r '.it avLc l'enzyme corrzspon- cante, la quantitC du prcduit r:sultnnt ou la quantité du substrat rsiduol peut facilement être mesurée. Par exemple, on peut citer l'acide 5-arminosalicylioue-H2C2, l'o-phénylne- diamine-H202, l'acide phlor2tique-H202, etc. comme substrats pour la peroxydase, et la fluorescéine-di(i -D-galactopyra- noside), l'o-nitrophSnol- -D-a3alactoDyranoside, le 4-méthyl- ombllifryle-6-D-galactoside, etc. comme substrats pour la -Dgalactosidase. Les substances qu'on pcut doscr par le xactif de l'in- vention doivent avoir au moins deux déterminants antigéniques dans la molécule. Comme les substances qui ont été dosées par la méthode du sandwich possèdent au moins dû.x détermi- nants antigéniques, pratiquement la totalité des substances qui peuvent être dosées par la méthode classique, peut être dosée selon la présente invention. Comme exemples de ces substances, on ment:onnera des enzymes telles hue la \ tamyl transpeptidase (' -GTP), la phosphatase alcaline et la transglycosidase; des hormones nrot6iques telles que l'hor- mone thyréotrope (thyréostimuline)(TSH), l'hormone luteini- sante (gqondostimuline)(LH), la gonadotrorhine chorionique humaine (HCG), lPinsuline, la secrétine et l'hormone de croissanc. (GH); des protéines plasmatiques telles que le produit de d'5gradatocn de la fibrine (FDP), la protéine C- réactive (CRP), la,. jglycoprotAine acide ',--AG), la(l- antitrypsine (a' 1-AT), l' -antiplasmine (o.2-PI), la 2-microglobuline (2MG) et l'immunoglobuline; des protéines c-rcinoembryonnaires telles que l'à -foetopro- - 12 - téine 'AFP), l'antigène carcinoembryonnaire (CEA) et la ferritine embryonnaire; eÈ des lymphocytes et des cellules bactériennes, des antigènes de surface cellulaire, des fractions cellulaires, etc. Etsnt donné que selon le réactif de l'invention, la séquence des réact cns entre l'anticorps insolubilisé, l'anti4:ne à doser et l'anticorps marqué, n'e.t pas du tout limitée, il est écalement possible de mélanger à l'avance l'anticorps insolubilisé et l'anticorps marqué. Plus scGci- fiquement, il est possible qu'un anticorps insolubilisé fixé sur un support, c'est à dire des billes de plastique, etc. et un anticorps marqué soient contenus dans lem6meréci- nient, par exemple un tube à essai, ou il est également possible de fixer un anticorps sur la paroi interne d'un r'ci-ient approprié, par exemple un tube à essai, qui sert lui-même de support insoluble, puis d'y introduire un anticorps marqué. L'anticorps marqué peut être sous la forme d'une solution ou d'un produit lyophilisé à partir d'une solution, ou être présent sous foiie de ccaprimés, de granules ou de poudres. En dehors-de l'anticorps insolubilisé et de l'anti- corps marqué, le réactif de l'invention peut contenir divers auxiliaires afin d'augmenter son utilité. Ce peut être par exemple un agent de dissolution pour l'anticorps marqué (lorsqu'il est utilisé sous forme d'un produit lyo- philisé), un liquide de lavage pour laver la phase solide après la réaction entre l'anticorps insolubilisé et l'antigène à doser et après l'autre réaction de l'anticorps marqué, un substrat pour mesurer l'activité enzymatique de l'agent de marquage tlorsque c'est une enzyme) et un. agent de blocage de la réaction pour la réaction enzymatique. Des exemples illustrant l'invention sont décrits ci-après. Expmple 1 Réactif pour le dosage de l'AFP a) Prloar3ticn d'AFP purifiée Cn cbtisnt 16,2 o d'extrait d'AFP brut à partir de 5 - 12 - litres d'ascite de patients souffrant d'hépatome, par relargage, avec du sulfate d'arraoniuni (en fraction, entre 45% et 70% de saturation est recueillie). On purifie l'extrait brut par chromatographie d'af- finité en utilisant 50 ml de Sepharose 4 B sur laquelle on a fixé un anticorps de lapin anti-AFP (1 mg/ml de Sepharose) pour obtenir 924 mg d'AFP purifiée. b) 'réparation d'anticorps anti-AFP monoclonaux On immunise une so:risfemelle BALB/C par injection sous-cutanée de 50pg de l'AFP purifié produit en a) ci-des- sus avec de l'adjuvant complet de Freund. On répète 4 fois l'immunisation à intervalles d'une semaine. On prélève la rate le quatrième jour après l'immunisation finale et on recueille les cellules sphiàniques.On lave les cellules sphléniques avec un milieu de culture MEM modifié de Dulbecco (désigné en abrégé par D-MEM ci-après). On compte 1 x 108 de ces cellules et on mélange avec 1 x 107 de cellules myé- lomateuses de souris (P3-NSI/1-Ag 4,1). On soumet le mélange à une fusion cellulaire pendant 1 minute à 37 C dans 1 ml de D-MEM contenant 42,5 % de polyéthylène glycol 1540 et 7,5 % de diméthyl sulfoxyde. Aux cellules ainsi soumises à la fusion cellulaire, on ajoute 20 ml de milieu HAT (milieu de RPMI-1640 contenant de l'hypoxanthine, de l'aminoptérine, de la thymidine et 10 le de sérum etal de boeuf). Après avoir transvasé des parties aliquotes de 0,2 ml du mélange de cellules dans um microplaque à 96 puits et cultivé pendant, 2 semaines, on d-termine les titres d'anticorps des produits surnageants dans les puits. Puis, on ajoute les cellules des puits o on a observé les anticorps respectivement à 40 ml de milieu RPMI-1640 contenant 10 ' de sérum foetal de boeuf et des thymocytes de souris BALB/c. On t-ansvas; des parties aliquotes de cet:e ncuve!le suspension de cellules dans deux microplaques à 96 puits et on cultive pendant une semaine pour obtenir 9 clones d'hybridomE produisant des anticorps anti-AFP. On transferé dans des cultures à grande échelle et on soumet - 14 - litres de chacun des produits surnageants à une chromato- graohie d'affinité en utilisant 50 ml de Sepharose 4 B sur lequel on a fixé de l'AFP purifié (0,5 mg d'AFP/ml de Sepha- rose). En résultat, on obtient de 4,2 à 11,6 mg d'anticorps monoclonaux qu'on désigne comme lots n0 1 à 9. c) Identifijaticn des sites de reconnaissance antigénicues i) Préparation de tubes à essai sensibilisés avec l'anticorps anti-AFP Dans des tubes à essai en polystyrène lavés avec du PBS (solution saline physiologique tamponnée avec du phosphate 0, 05 M, pH 6,4), on introduit 2 ml de solutions de PBS contenant respectivement 0,2 mg de chacun des lots 1 à-9 d'anticorps anti-AFP monoclonaux. Puis on incube les tubes à 56 C pendant 20 minutes et on lave au PEc pour obtenir des tubes à essai sensibilisés. ii) Préparation des anticorps anti-AFP marqués avec une enzyme On dissout 5 mg de peroxydase de raifort (Qualité 1 de Boehringer Mannheim 6mbH;désignée en abrégé HRPO ci- après) dans 1,0 ml de tampon de bicarbonate de sodium O,03N et à cette solution on ajoute 0,1 ml d'une solution étha- nolique de 1-fiuoro-2,4-dinitrobenzàne à 1 %, puis on laisse le mélange réagir pendant 1 heure. On ajoute au mélange 1,0 ml d'une solution de periodate de sodium 0,06 M et on laisse réagir pendant 30 minutes. On ajoute alors 1,0 ml d'une solution d'éthylène glycol 0,16 M et on laisse iagir pendant 1 heure. On dialyse le mélange réactionnel contre une solution de carbonate de sodium 0,01 M à pH 9,5. A la solution isultante, on ajoute chacun des neuf lots d'anticorps anti-AFP produits en b) ci-dessus, en une quantité de 5 mg et on fait réagir le mnlan- ge à la température ambiante pendant 3 heures. Puis, on ajoute 5 mg de borohydrure de sodium et on laisse réagir pendant une nuit. On dialyse respectivement les mélanges réactionnels contre du PBS 0,01 M à pH 7,2 pour obtenir des anticorps anti-AFP marqués à la HRPO. - 15 - iii) Identificetion des sites de reconnaissance de l'an- ticène Dans chacun des tubes à essai sensibilisés avez l'anti- corps anti-AFP produits en i) ci-dessus, on ajoute 1,5 ml de PBS, 0,1 ml de solution de rgfcrence d'AFP produite en a) ci-dessus qu'on a diluée avec du PES à 1lC ng/ml et 0,4 ml d'articorps anti-AFP marqués à la HRPO produits en ii) ci-dessus et on dilue 10C fois, puis on f.-it réagir le mé- lance penceTnt 30 minutes. Acrès la racticn, on lave les tubes à essai avec du lquids de lavage, m on ajoute dans chacun d'eux 3 ml de la solution de substrat contenant L mg/dl d'o-phénylènediamine et 0,01 '- de peroxyde d'hy- drogène. On effectue la réaction enzymaticue pendant 30 minutes, et on ajoute 0,05 ml d'acide sulfurique 4 M po,,r arrêter la réacticn enzymatique. On mesure l'absorbance du mélange réactionnel à 450 nm. Dans le tableau 3, les combinaisons induisant des réa.ctions positives sont marquées du signe + et celles i'induisant pas de réaction du signe -. TABLEAU 3 Anticorps Anticorps marqué à la HRPO Insolubilisé a 1 2 3 4 5 6 7 8 9 1 - - - + - + - + + t 2 - - - + - + - + + 3 3- - - + - + - + + 4 + + + - + + + - - - - - + - + - + + 6 + + + + + - + + + 7 - - - + - + - + + I + + + - + + + - _ 9 + + + - + + + - Selon les differences relatives aux sites de reconnais- sance de l'antigène, les 9 lots d'anticorps anti-AFP mono. * clonaux obtenus en b) ci-dessus peuvent être divisés en 3 - 16 - grounes, le premier groupe étant constitué des lots n 1#,2, 3,5 et 7, le second groupe étant constitué du lot n 6 et le trosième groune étant constitub des lots na 4, 8 et 9. Ces grcupes d'anticorps sont désignés rcspectivement comme les anticorpsAJ-, /BI et /Ct!. d) Preparation d'un iactif pour le dosage de l'AFP in prépare des tubes à essai szrs.bilisés avec un anti- corps anti-AFP selon le ?rocédA c-i) ci-dessus utilisant l'anticorps /A/ monoclonal. On marque l'anticorps /t/ monoclonal avec de la HRJ par le procédé c-ii) ci-dessus et on dilue dans le raouort 1:10 avec du PS5. Dans le tube à essai sensibilisé, on introd.2it 2 ml de l'anticorps maroué, dilué. Après avoir lyophilisé le contenu du tube à essai, on scelle pour obtenir un réactif pour le dosage de -l'AFP. e) Dosage de l'AFP Dans le tube à essai sensibilisé avec un anticorps anti-AFP produit en d) ci-dessus, on ajoute 1,8 ml de PBS et 0,1 ml de la solution de référence d'AFP produite en a) ci-dessus et on dilue à des concentrations de 1000 o, iLOG, 10, 1 et 0 ng/ml avec le sérum d'un sujet bien portant, puis on ajoute encore 0,1 ml d'une solution d'anticorps anti-AFP marqué à la HRPO produite en d) ci-dessus dans 2 ml d'eau distillée. On laisse réagir pendant 20 minutes. Après la réaction, on lave le tube à essai avec une solution saline physiologique contenant 0, 005% de Teen 20 (appelée ci-après agent ds lavage). Puis, on ajoute 3 ml d'une solution de substrat pour l'enzyme contenant 5 mg/ml d'o-phénylène- diamine et 0,01 %u de peroxyde d'hydrogène et on laisse réagir pendant 10 minutes. Au mélange réactionnel, on ajoute O,G5 ml d'acide sulfurique 4 N pour arrêter la réaction enzy- matique. On mesure l'absorbance du mélange réact'cnnel à 450 nm avec un photom-tre. La courbe De rforence r'sult-rt -st reoroduite sur la figure 6. Exemnole 2 Réactif pour le dosage du CEA a) Préparation de C E A purifié On homogénéise 40 g de tissus cancéreux du gros intestin avec un homogénéiseur après addition d'eau dis- tillée. On ajoute à l'homogénéisat la même quantité d'aci- de perchlorique 1,2M, et on extrait pendant 30 minutes en agitant. On dialyse le surnageant centrifugé contre de l'eau distillée pour obtenir un extrait de CEA brut. On concentre l'extrait brut à lOml, on lui fait su- bir une filtration sur gel en utilisant du Sepharose 4B équilibré avec une solution saline physiologique et on recueille la première fraction. On procède à nouveau à une filtration sur gel sur du Sephadex G-200 équilibré de la même manière et on recueille la seconde fraction. On la concentre à 2 ml dans lesquels on obtient 135 Pg de CEA purifié. b) Préparation d'anticorps monoclonaux anti-CEA Huit clones d'hybridomes producteurs d'anticorps anti-CEA sont obtenus en utilisant le CEA purifié pro- duit en a) ci-dessus, par un procédé similaire à celui de l'exemple lb). On immunise des souris en utilisant 30jug du CEA purifié à chaque immunisation. On inocule 1 x 106 hybri- domes par voie intrapéritonéale à une souris femelle BALB/c à qui on administré par voie intrapéritonéale 0,5 mole de pristane (2,6,10,14tétraméthylpentadécane; produit de Wako Pure Chemicals, CO., Ltd.). Deux semai- nes plus tard, on recueille les ascites. On soumet les ascites à une chromatographie sur DEAE-cellulose équili- brée avec un tampon de phosphate 0,01 M à pH 7,0, et on obtient une fraction non adsorbée comme anticorps mono- clonal anti-CEA. Par un test d'identification des sites de reconnais- sance antigéniques pratiquement comme décrit à l'exemple l-c), on peut classer les anticorps obtenus en trois groupes, à savoir 5 lots, 2 lots et 1 lot qui sont dési- gnés respectivement comme anticorps anti-CEA IV,Zb8 et /?j c) Préparation de tubes à essai sensibilisés avec un - 1a - anticorps anti CEA. On lave des tubes à essai en polystyrène avec du PBS et on introduit dans chacun d'eux 2 ml de l'anticorps anti- CEA [A] (1 mg/ml) nroduit enb) ci-dessus, puis on fait réagir à 56 C pendant 20 minutes. Après la réaction, on lave le tube à essai avec du PBS pour produire un tube à essai sensibilisé avec un anticorps anti-CEA (A7. d) Préparation d'un réactif pour le dosage du CEA On obtient un anticorps anti-CEA -BJ marqué à la HRPO en utilisant l'anticorps anti-CEA JbJ produit en b) ci-des- sus, selon l'exemple 1-c-ii). On dilue l'anticorps marqué à 1:50 avec une solution saline physiologique et dans chacun des tubes à essai sensibilisés avec l'anticorps anti-CEA (A] obtenus en c) ci-dessus, on ajoute 0,2 ml de l'anticorps dilué et on lyophilise pour former uniactif pour le dosage du CEA. e) Dosage du CEA On dilue le CEA purifié préparé en a) ci-dessus avec le sérum d'un sujet en bonne santé à des concentrations de 100, 30, 10, 3 et 1 ng/ml, respectivement. Au réactif pour le dosage du CEA produit en d) ci-dessus, on ajoute simultanément 0,2 ml du CEA dilué et 0,8 ml d'eau distillée et on laisse réagir pendant 20 minutes en agitant. Après la réaction, on lave le tube à essai avec l'agent de lavage et on ajoute 3 ml d'une solution de sub- strat contenant 300 mg/dl d'acide phlorétique et 0,01 % de peroxyde d'hydrogène. On fait réagir pendant 10 minutes, puis on ajoute 0,1 ml de sulfite de sodium à 5 % pour arrêter la réaction enzymatique. On mesure ensuite l'intensi- té de la fluorescence à une longueur d'onde d'excitation de 323 nm et une longueur d'onde de fluorescence de 420 nm au moyen d'un fluorophotomètre. La courbe de référence resul- tante obtsnue est représentée sur la figure 7. Exemple 3 Iéactif pour le dosage de l'HCG- a) Preparation de la sous-unité p de l'HCG - 19 - On dissout 1 g d'HCG (2000 UI/mg) dans 2 ml d'un tam- pon de phosphate 0,025 M (pH 5,6) et on fract2onne la solu- tion par chromatographie sur colonne de DEAE-Sephadex A-50 (3 g), préalablement équilibrée avec le même tampon. On recueille la fraction eluée avec un tampon de phosphate 0,05 M (pH 5,6) et on dialyse confie de l'eau distill e pour obte- nir une solution contenant 308a mg d'HCG purifie qu'on lyo- philise ensuite. On dissout 300 mg de l'HCG lyophilise dans 1C ml d'urée 1' M (pH 4,5) et on fait r agir p2ndant 1 heure È 40 C. On fractinnne le mélange réactionnel par chromato- graphie sur colonne de DEAE-Sephadex A-S0 (2 g) préalablement équilibrée avec une solution contenant O,U3 M de glycine et 1O M1 d'urne. On dialyse la fraction éluée avec une solution contenant 0,2 M de glycine, 1 M de NaCl et a M d'urée, contre une solution saline physiologique pour obtenir 146 mg de sous-unité e de l'HCG. b) Préparation des anticorps anti-HCG-P On prépare 11 lots d'anticorps anti-HCG-P selon la procédé de l'exemple 2-b), si ce n'est ou'on utilise des rats de souche WJistar comme animaux pour l'administration de l'antigène au lieu de souris BALB/c. On identifie les sites de reconnaissance de l'antigàne pratiquement selon le procéd( de l'exemple 1c). Les anticorps résultants sont classés en deux groupas, à savoir un groupe constitué de a lots d'anticorps anti-HCG-p fA/ et un autre groupe constitué de 3 lots d'anticorps anti-HCG- fB7. c) Préparation de billes sensibilisées avec un anticorps anti-HCG(support insoluble) A 1k.; ml de PBS contenant 50 mg de l'anticorps anti- HCG- S [A] produit en b) ci-dessus, on ajoute 1CO billes de polyethylène et on fait réagir à 56 C pendant 20 minutes. Puis, on lave les billes de pol thylène pour obte'nir des billes sensibilisés avec un anticorps anti-HCG-\ /A/. d) rréoaraticn d'anticorps anti-HCG-,3 maroués avec une enzyme On réoèta le procéd de l'exsmple 1-c-ii) en utilisant oo0016 - 20 - -2O- les anticorps anti-HCS- /BJ produits en b) ci-dessus. Après avoir dilué à 200 fois le volume avec du PBS, on obtient des anticorps anti-HCG- /BI marcués à l'HRPO. e) Préparction de l'agent de. lavage On pèse avec précision 9 g de NaCl et 50 pl de Tween 20 et on dissout dans de l'eau désionisée pour former lO0 ml de solution. On verse la solution dans une fiole qui est ensuite bouchée; l'agent de lavage est ainsi preéare. f) Preparation du substrat pour-l'enzyme On mélange 2,40 g d'acide 5aminosalicylique, 54,34 g de phosohate monopotassique et 5,72 g de phosphate disodique et on pulvérise dans un mortier. On pèse avec précision 550 mg du mélange et on verse dans une fiole. On dilue 1,5 ml de peroxyde d'hydrogène (solution à 3G %) avec de l'eau désionisée pour obtenir 100 ml de solution. On introduit 1 ml de la solution dans une ampoule qu'on scelle par fusion. Le substrat pour l'enzyme est alors-prt. g) Préparation d'un agent de blocage pour la réaction enzy- matique On pèse avec précision 2 g d'azoture d- sodium et on dissout dans 100 ml d'eau distillée. On introduit 2 ml de la solution dans une ampoule qu'on scelle par fusion pour obtenir un agent de blocage pour la réaction enzymatique. h) Préparaticn d'un réactif de dosage de 1'HCG On prépare un réactif de dosage cour i'HCG en combinant les matériaux produits en c) à g) de la manière suivante. 1. Billes sensibilisées avec un anticorps anti-HCG-@ 2. Anticorps antiHCG- VBJ marqué à 1'HRPG 3. Agent de lavage (solution 10 fois concentrée) 4. Substrat pour l'enzyme (acide 5-amino-salicylique- peroxyde d'hydrogène) 5. Agent de blocage p.ur la r.action enzymatique i) Dosage de i'HCG On effectue le dosage suivant en utilisant le réactif pour le dosage de l'HCG préparé en h) ci-dessus. Dans un p - 21 - tube à essai, on introduit 0,4 ml de l'anticorps anti-HCG-(A; marqué à l'HRPO et on ajoute un morceau d'une bille sensibilisée avec un anticorps anti-HCG-1 /;[/. On ajo4te resoectivement 0,1 ml d'une solution de référence obtenue en diluant de l'HCG,décrite dans Japanese Pharmacopoeia, avec le sérum d'un sujet bien portant à des concentrations de 1E OCC, 1 000, 1GO, 10 et 1 mUI/ml, et on fait réagir pendant 15 minutes. Après la réaction, on dilue l'agent de lavage à 10 fois son volume avec de l'eau distillée et on lave la bille avec l'agent de lavage dilué. ruis, on ajoute 3 ml de la solution c substrat préparée en dissolvant la totalité du substrat pour l'enzyme dans 150 m} d'e3u distil- lée et on fait réagir pendant 30 minutes. On ajoute alors b,025 ml de l'agent de blocage pour arrêter la réaction et on mesure l'absorbance du milieu réact:onnel à 500 nm. La courbe étalon résultante est représentée sur la figure B. -22 PR E V E N D I C A T I 0 N S 1. Réactif pour un dosage immunologique d'antigènes basé sur la méthode du sandwich, caractérisé en ce qu'il comprend un anticorps monoclonal insolubilisé et un anti- corps monoclonal marqué, lesdits anticorps monoclonaux étant respectivement capables de distinguer, et de se fixer sur, les différents déterminants antigéniques de l'antigène à doser. 2. Réactif selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'on utilise comme support de l'anticorps insolubilisé des billes ou un récipient en matière plastique ou en verre. 3. Réactif selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'une enzyme est utilisée comme agent de marquage pour produire l'anticorps marqué. 4. Réaetif selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'on utilise une substance fluorescente comme agent de marquage pour produire l'anticorps marqué. 5. Réactif selon la revendication 1, caractérisé en ce que l'anticorps marqué et l'anticorps insolubilisé sont contenus dans le même récipient. 6. Réactif selon la revendication 1 ou 5, caractéri- sé en ce que l'anticorps marqué est contenu dans un réci- pient en matière plastique ou en verre qui est utilisé comme support pour l'anticorps insolubilisé. 7. Réactif selon l'une quelconque des revendications 1, 5 et 6, caractérisé en ce que l'anticorps marqué est lyophilisé. 8. Réactif pour un dosage immunologique d'antigènes basé sur la méthode du sandwich, caractérisé en ce qu'il comprend un anticorps monoclonal insolubilisé et un anti- corps monoclonal marqué, lesdits anticorps monoclonaux étant respectivement capables de distinguer, et de se fixer sur, les différents déterminants antigéniques d'un antigène à doser, et de 1 à 4 agents auxiliaires choisis parmi un agent de dissolution, un agent de lavage, un substrat et un agent de blocage de la réaction. -23- 9. Méthode du sandwich perfectionnée pour le dosage immunologique d'antigènes, caractérisée en ce que le perfectionnement consiste à faire réagir simultanément l'anticorps insolubilisé et l'anticorps marqué avec un antigène à doser, lesdits anticorps insolubilisé et anticorps marqué étant des anticorps monoclonaux capables de distinguer, et de se fixer respectivement sur, diffé- rênts déterminants antigéniques dudit antigène.