FR 2499098 A1 19820806 FR 8201664 A 19820202 La présente invention concerne un procédé de couplage enzymatique microbien 'microbial enzymatic coupling process" MEC) pour la production d'esters d'alkyle de (L-aspartyl amino-protégé)- L-phénylalanine. Plus particulièrement, l'invention concerne un procédé pour la production d'esters de (L-aspartyl amino-protégé)-L- phénylalanine dans lequel le produit est séparé et les réactifs sont ajoutés en continu en utilisant un micro-organisme producteur de protéase ou une préparation d'enzyme brute ou purifiée ayant une activité de protéase obtenue à partir d'un micro-organisme.- Les procédés classiques pour la production de peptides comprennent le procédé à l'azide, le procédé à l'anhydride mixte, le procédé au carbodiimide, le procédé à l'ester réactif, le procéd4 au chlorure d'acide, etc. Cependant, on rencontre divers problèmes à l'échelle industrielle dans les procédés classiques, comme la racémisation du composant carboxylique sur le résidu amino C-terminal. D'autres problèmes comprennent des réactions secondaires, le réglage de la température, le choix du solvant, d'autres propriétés des groupes amino-protecteurs et carboxy-protecteurs, les effets des groupes fonctionnels sur les chaînes latérales des amino-acides, les faibles rendements et les difficultés à séparer le produit final désiré. Le procédé par condensation de fragments peut être avantageusement appliqué aux composés contenant la glycine (le seul amino-acide qui ne peut pas être racémisé) sur le groupe terminal carboxyle. Cependant, pour des composés contenant n'importe quel autre amino-acide sur le groupe terminal carboxyle, on ne peut pas éviter la racémisation. Actuellement, le problème de la racémisation est sérieux dans n'importe quelle synthèse de peptides. Lorsque la racémisation se produit, la pureté du produit est diminuée et il est nécessaire de séparer l'isomère indésirable du produit recherché. Cette séparation est un gros inconvénient pour n'importe quelle opération industrielle. Parmi les procédés classiques pour former des liaisons peptidiques, le procédé à l'azide est le seul procédé dans lequel la racémisation ne pose pas un gros problème, et c'est pour cette raison que ce procédé est souhaitable. Cependant, comme le procédé à l'azide comporte des modes opératoires compliqués et parce qu'il y a production d'un dérivé d'urée dans une réaction secondaire, réduisant ainsi le rendement en produit, le procédé à l'azide est également peu satisfaisant. Outre les divers procédés de chimie organique pour préparer des peptides, on a décrit une synthèse de peptidesparticulière utilisant une enzyme, la papaïne ou la chymo- trypsine (voir par exemple J.S. Fruton "Advances in Protein Chemistry", , Academic Press Inc., New York, N.Y. 1949). Iles réactions de ce procédé sont décrites dans le schéma A ci-après. Le problème qui est commun aux réactions I à III dans le schéma A est qu'il est nécessaire de séparer le groupe phénylamino du peptide (III) dans des conditions rigoureuses parce que le groupe phénylamino qui est fixé au groupe C-terminal du composant amino (II) ne peut pas être séparé facilement du peptide et la coupure de la chaîne peptidique est donc possible et désavantageuse. A cause de ce défaut, ce mode de synthèse des peptides ne peut pas être utilisé dans la pratique pour la synthèse des peptides. D'autre part, la réaction (4) s'accompagne de réactions secondaires de transamination et de transpeptidation et n'est donc pas appropriée dans la pratique (voir par exemple R.B. Johnston et coll.; J. Biol. Chem., 185, page 629 (1950) et J.S. Fruton et coll.; J. Biol. Chem., 204, page 891 (1953). Dans la réaction (4), le groupe amino primaire de l'amide fixé au groupe terminal du composé amino favorise la réaction de l'amidase catalysée par la papaïne. En conséquence, ces procédés n'ont qu'un intérêt théorique en montrant que la papaïne et la chymotrypsine agissent comme catalyseurs pour la synthèse de liaisons peptidiques, dans laquelle le groupe phénylamino ou amino primaire est utilisé comme groupement protecteur pour le groupe carboxyle terminal du composant amino. Ces procédés ne donnent pas d'indication sur la possibilité de synthèse d'oligopeptides ou de polypeptides recherchés. On sait que les dérivés de peptides ont diverses activités physiologiques et que ces dérivés de peptides peuvent être produits par divers procédés. Les peptides ayant des résidus acides d'amino- acides tels que les esters d'alkyle inférieur d'a-aspartyl-L-phényl- alanine,qui sont utiles comme composés édulcorants,peuvent être obtenus par élimination du groupement amino-protecteur d'un précur- seur ayant un groupe carbobenzoxy comme groupement protecteur terminal. En conséquence, les brevets des Etats-Unis d'Amérique n 4 116 768 et n 4 119 493 décrivent des procédés pour la synthèse d'oligopeptides ou de polypeptides par une méthode simple. Le procédé est un procédé en discontinu dans lequel on fait réagir un amino- acide ou peptide ayant un groupement protecteur N-terminal ou un de ses sels de formule X-A-OH avec un amino-acide ou peptide ayant un groupement protecteur C-terminal ou un de ses sels de formule H-B-Y o A et B sont identiques ou différents et représentent chacun un résidu d'amino-acide ou un résidu de peptide, X représente un groupe- ment protecteur du groupe amino et Y représente un groupement protec- teur du groupe carboxy. On les fait réagir en présence d'une métallo- protéinase dans une solution aqueuse ayant un pH qui conserve l'acti- vité enzymatique de ladite métalloprotéinase. Bien que ce procédé soit efficace, la réaction est limitée au fur et à mesure que la réaction se poursuit et la filtration du produit final est difficile. Un autre procédé est décrit dans le brevet des Etats-Unis d'Amérique n 4 165 311 qui décrit de nouveaux composés d'addition de dipeptides composés de résidus estersd'acide monoaminodicarboxyliquesN-substitués avec des esters d'acides aminocarboxyliques et des procddés pour produire le composé d'addition utilisant une réaction enzymatique et pour décomposer le produit d'addition. Des procédés correspondants pour la récupération des protéases sont décrits dans le brevet des Etats-Unis d'Amérique n 4 212 945 et n 4 212 946, o la protéase est récupérée par iso- lement de la protéase d'un composé d'addition après une synthèse peptidique de dérivés d'amino-acides fixés au peptide en présence de la protéase. La présente invention concerne en particulier un procédé pour la production d'esters d'alkyle de (L-aspartyl amino- protégé)-L-phénylalanine selon le schéma B ci-après dans lequel l'acide Laspartique porte un groupement amino-protecteur RI, la source d'enzyme est un micro-organisme producteur de protéase ou une préparation d'enzyme obtenue à partir d'un micro-organisme ayant une activité de protéase, R est un groupe alkyle en C-C6 inclus, qui comprend les étapes suivantes: on fait réagir la L-phénylalanine carboxy-protégée avec l'acide L- aspartique aminoQ protégé dans des conditions qui favorisent le couplage enzymatique microbien en présence d'une enzyme à un pH qui conserve l'activité enzymatique, on sépare le produit en continu à mesure qu'il se forme; et on ajoute de nouveaux réactifs à mesure que le produit est séparé. On peut protéger le groupe amino de l'acide L-aspartique au moyen de groupements protecteurs couramment utilisés qui com- prennent mais sans limitation: les groupes oxycarbonyles aliphatiques, tels que carbobenzoxy, t-butoxycarbonyle (CH3)3C-O-CO-et t-amyloxy- carbonyle(CH3)2C(C2H5)-O-CO; les groupes carbobenzoxy substitués au noyau, tels que p-méthoxycarbobenzoxy p-CH30-0-CH2-0-CO-, 3,5- diméthoxycarbobenzoxy 3,5-(CH30)2-0-CH2-0-CO-, et 2,4,6-triméthoxy- carbobenzoxy 2,4,6-(CH30)3-0-CH2-0-CO-, benzoyle 0-CO-, p-toluène- sulfonyle p-CH3-0-S02-; le type uréthanne; et les groupes sulfinyle aromatiques tels que les groupes nitro-0-sulfinyle. Un groupement amino-protecteur préféré est le groupe carbobenzoxy. Les enzymes utilisées selon l'invention sont des protéases et de préférence des métalloprotéases qui ont dans leur centre actif un ion métallique. Des métalloprotéases appropriées sont des enzymes dérivées de micro-organismes comme celles produites par un certain nombre de souches de Bacillus, Streptomyces, Pseudomonas et diverses autres bactéries et certains champignons, en particulier des Aspergillus. Lorsqu'ils sont utilisables, les micro-organismes producteurs de protéases peuvent être utilisés directement. On trouve dans le commerce plusieurs métalloprotéases d'origine micro- bienne, telles que la Thermolysine ou Thermoase (Bacillus thermo- proteolyticus, de la Société Daiwa Kasai), la Microprotéase (B. cereus, de la Société Worthington), la Dispase (B. polymyxa, de la Société Sigma), la Pronase (Streptomyces griseus, de la Société Calbiochem) et la protéase brute fongique (Aspergillus oryzae, de la Société Sigma). Une source préférée d'enzyme pour la présente invention est la souche productrice d'hyperprotéase de B. cereus NRRL B-12315 disponible auprès de la Société A.R.S. Culture Collection Investigations Fermentation Laboratory, 1815N University Avenue, Peoria, Illinois, 61604. Lorsque l'organisme est utilisé directement, on peut éliminer les frais concernant l'isolement et la récupération de l'enzyme. En outre, on peut utiliser une préparation enzymatique dérivée d'un organisme producteur de protéase. Celle-ci peut con- sister en un certain nombre de types différents de préparations. On peut citer à titre d'exemples les bouillons de culture exempts de cellules préparés par séparation des cellules d'un milieu de culture par filtration centrifuge ou d'autres techniques, les préparations enzymatiques brutes dans lesquelles on utilise des étapes supplé- mentaires, telles que floculation (qui peut éliminer les colloIdes) ou filtration bactériologique et les préparations enzymatiques partiellement purifiées qui peuvent comporter la précipitation de l'enzyme par des solvants organiques ou des sels. La quantité de protéase utilisée dans le procédé de l'invention n'est pas essen- tielle, bien que l'on souhaite un certain niveau minimal d'activité enzymatique pour maitenir des vitesses élevées de formation du produit. L'utilité de l'invention provient de divers domaines. Tout d'abord, dans les procédés antérieurs qui étaient des procédés en discontinu, le mélange de réaction se solidifiait au cours du temps, augmentant la difficulté de récupération du produit et rédui- sant la vitesse à laquelle la réaction se déroule. L'invention utilise un procédé continu qui évite la solidification et donne un produit cristallisé qui semble,de manière surprenante et inattendue,plus efficace pour les manipulations des produits, la durée de réaction et l'utilisation de l'enzyme. En second lieu, on peut utiliser de plus faibles concentrations d'enzymes, ce qui ajoute à la simplicité de manipulation de la réaction tout en diminuant les coûts de production. Troisièmement, l'utilisation directe de l'enzyme micro- bienne réduit notablement la durée, l'effort et le coût par rapport à l'enzyme isolée. Enfin, le procédé MEC selon l'invention a l'avantage de la spécificité. Il y a deux groupes carboxyle dispo- nibles et donc deux isomères théoriquement possibles (a et P). L'isomère a est formé facilement, ce qui réduit la nécessité d'une étape de séparation. Le produit dérivé peut être utilisé dans la fabrication de l'ester méthylique de L-aspartyl-L-phénylalanine, édulcorant artificiel environ 200 fois plus sucré que le sucre de table. On y parvient en éliminant le groupement amino-protecteur par un procédé connu comme l'hydrogénation catalytique. Les procédés et produits pour la préparation et la détermination des bouillons enzymatiques de B. cereus utilisés dans les exemples sont les suivants: A. Préparation de l'inoculum On dégèle une culture congelée de B. cereus NRRL B-12315 et on utilise 2 ml pour inoculer 200 ml de bouillon trypticase-soja (Société BBL, Cockeysville, Md.) contenu dans un ballon de 1 litre à chicanes. On fait incuber la culture à 30 1 C pendant 16-24 h à 200 tr/min sur une secoueuse rotative ayant une orbite circulaire de 5,08 cm. B. Préparation du bouillon d'enzyme On ajuste à pH 7,3 par l'hydroxyde de potassium à 45% en poids/volume un milieu consistant en 10,0 g d'amidon soluble, ,0 g de farine de soja, 2,0 g d'extrait de levure, 7,5 g de phosphate de potassium dibasique, 1,0 g de 'Tween 80", 1,0 g de chlorure de calcium, 0,001 g de sulfate de magnésium monohydraté, 0,001 g de sulfate ferreux et 0,001 g de sulfate de zinc dans 1 litre d'eau distillée,avant de le passer à l'autoclave sous 1 bar pendant min. On inocule des portions de 100 ml de ce milieu dans des ballons de 500 ml à chicanes avec 5 ml de la culture d'inoculum. Après incubation pendant 24 h, on centrifuge les cultures à 12000 g pendant 10 min dans une centrifugeuse réfrigérée. On décante le liquide surnageant et on le conserve à 4 C jusqu'à l'emploi. Si on le désire, on concentre l'enzyme exemptede cellulesen utilisant des filtres CX (Société Millipore Corp., Bedford, Mass.). C. Détermination de l'activité du bouillon d'enzyme On détermine l'activité enzymatique du bouillon de culture exempt de cellules dans une détermination spectrophotomé- trique en continu sensiblement comme décrit par Feder [Biochem. Biophys. Res. Commun., 32, page 326 (1968)], sauf que la concentra- tion du substrat, l'amide de furylacryloyl-L-glycyl-L-leucine -4 (FAGLA), est abaissée à 5. 10 M. L'activité enzymatique est exprimée en unités FAGIA (A345/min.ml). Les produits et modes opératoires dans l'analyse de l'aAcPM par chromatographie sur couche mince sont les suivants: A. Plaque Gel de silice E. Merck avec indicateur fluorescent activé 254 nm (Société EM Laboratories, Inc., Elmsford, NY). B. Système solvant Chloroforme 60% en volume Méthanol 30% en volume Eau 4% en volume Acide formique 2% en volume C. Techniques de détermination Après avoir appliqué des taches du bouillon sur la plaque et les avoir développées dans le système solvant ci-dessus, on sèche la plaque à l'air pendant 30 min et on l'examine de la manière suivante: 1. exposition en lumière ultraviolette de courte longueur d'onde, et 2. exposition à un excès d'hypochlorite de t-butyle,puis évaporation du réactif en excès, pulvérisation avec l'iodure de potassium à 0,5% en poids/volume et l'amidon_à 0,5% en poids/volume dans l'eau et visualisation en lumière blanche. Les produits et techniques utilisés dans les analyses par chromatographie en phase liquide à haute performance (CLHP) des réactifs et des produits du procéddé MEC sont les suivants: A. Colonne "Partisil PXS 10/25 ODS" (250 mm x 4,6 mm de diamètre intérieur) fourni par la Société Whatman, Inc. (Clifton, N.J.). B. Phase mobile 33% de têtrahydrofuranne (distillé dans le verre); 67% d'eau distillée contenant de l'acide pentanesulfonique 0,005M. C. Instrument Chromatographe en phase liquide de la Société Waters Associates (Milford, Mass.) muni d'une pompe modèle M-600 A, d'un détecteur modèle 440 (UV, 254 nm à 0,1 AUFS) et d'un auto-injecteur WISP modèle 710A fbnctionnant avec un débit de 2 ml/min. D. Mode opératoire On dilue de manière convenable dans-la phase mobile des portions pesées de matières solides et des volumes mesurés de matières liquides et on les chromatographie. On identifie les pics et on les quantifie par référence avec des étalons connus. Dans les exemples suivants, tous les rendements sont donnés en 7% par rapport à la quantité théorique correspondant à la quantité de départ de Z-Asp dans le mélange de réaction. Les spectres en infrarouge et de RMN connus de l'a APM sont les suivants: Spectre IR (procédé à la pastille de KBr): -1 - 3350 cm (vibration d'allongement de N-H); 3070, 3036, 2960 cm (al- longement de NH3, large et superposé avec les vibrations d'allon- gement de C-H), 1742 cm1 (C=O, ester, allongement), 1672 cm (C=O, amide); 1553 (NH3+, déformation symétrique, C-N-H. amide); 1500 et 1450 cm1 (allongement du noyau aromatique); 1381 cm' (C-O2, allon- gement symétrique), 1235 cm (C-O, ester, allongement asymétrique; NH+ rock), 1037 cm-1 (C-O, ester, allongement symétrique); 923 cm1 (C-C-N, amino-acide, allongement); 751 cm (torsion, 5H voisins, -1 phényle mono-substitué) et 702 cm (flexion du noyau, phényle mono- substitué). Spectre de RMN, & 0 II (1) 3,07 ppm (triplet apparent, 4H,-CH2-C- et 0CH2-); (2) 3,70 ppm (singulet, 3H, O-CH3); (3) 4,52 ppm (triplet, 1H, J = 5,92Hz, CH); (4) 4, 83 ppm (triplet, 1H, J = 6,1Hz, CH); (5) 7,25 ppm (singulet, 5H, H aromatiques). Les exemples suivants illustrent l'invention sans toutefois en limiter la portée. EXEMPLE 1 Ester méthylique de carbobenzoxy-L-aspartyl-L-phénylalanine (Z-APM): (schéma B, o R1 = carbobenzoxy et R = méthyle) 2 ye On dissout dans l'eau distillée 38 g (284 millimoles) d'acide carbobenzoxy-L-aspartique (Z-Asp), 77 g (714 millimoles) de chlorhydrate d'ester méthylique de Lphénylalanine (PH, 'HC1) et 1,68 g d'acétate de calcium, on ajuste le pH à 6,8 par 21 g de carbo- nate de sodium et on complète le volume à 250 ml par l'eau. On ajoute la solution résultante à un égal volume de bouillon de culture de B. cereus exempt de cellules ayant une activité FAGLA de 4,0 unités. On place ensuite ce mélange dans un récipient convenable en verre et on agite à 40OC pendant 6 h. On recueille le produit en continu par filtration à mesure qu'il se forme et on renvoie le filtrat par pompage dans le récipient de réaction. On arrête la réaction et on combine le résidu solide restant avec le précipité recueilli et on lave à l'eau. Apres séchage et recristallisation dans un mélange solvant méthanol-eau (1:2), on obtient 64,52 g (rendement 74,7%) d'un composé d'addition de Z-APM et PM (1:1). On broie le sel Z-APM,PM en une poudre fine dans un mortier, on le met en suspension dans 350 ml d'eau et 127 ml d'acide chlorhydrique IN et on agite vigoureusement pendant 2 h à la tempé- rature ambiante. On filtre la suspension résultante et on lave le précipité par plusieurs portions d'eau. Apres séchage, on obtient 44,8 g de Z-APM (rendement global 73,6%) et 22,63 g de PM (récupé- ration 29%). On ajoute la totalité des 44,8 g de Z-APM à 746 ml d'eau et 2240 ml de méthanol et on hydrogène le mélange résultant sous 3,5 bars en présence de 4,48 g de charbon palladié à 5% comme cata- lyseur. Apres 2 h, on sépare le cacalyseur par filtration et on concentre le filtrat jusqu'à un volume de 500 ml sous pression réduite à une température ne dépassant pas 50"C. On cristallise l'a-aspartyl-Lphénylalanine (aAPM) en refroidissant la solution à 0OC pendant 2 h. On obtient par filtration 25,14 g de produit; la chromatographie sur couche mince montre qu'il s'agit d'cAPM. On obtient un second jet de 3,60 g en concentrant encore les liqueurs, pour un rendement total de 96,5% d'oAPM dont l'analyse par chroma- tographie sur couche mince montre que 82% consistent en produit de haute qualité. Les propriétés physiques et les résultats de l'analyse élémentaire de l'cAPM sont les suivants F. 247-2480C Analyse élémentaire (C 14H18 N2 051/2 H20) C(%) H("/) N(l) Calculé 55,44 6,31 9,24 Trouvé 55,56 6,15 9,24 Les spectres IR et de RMN du produit présentent les mêmes caractéristiques que ci-dessus. EXEMPLE 2 On répète le procédé de l'exemple 1 avec un bouillon de culture de B. cereus exempt de cellules contenant 3 unités FAGLA/mI, sauf que l'on divise le mélange résultant enzyme/réactif en deux portions égales. Après 6 h, on obtient un total de 34,60 g du composé d'addition de Z-APM et de PM (1:1) dans la réaction o le produit est séparé à mesure qu'il se forme (réaction en continu). On met en suspension le sel Z-APM,PM dans 125 ml d'eau et 51 ml d'acide chlorhydrique IN et on agite vigoureusement pendant 1 h 30 min pour obtenir 16,82 g de Z-APM (rendement global 55,2% de la théorie). La détermination CLHP montre que le précipité fin résultant a une pureté de 100%. On traite la seconde portion du mélange enzyme/réactif de manière identique, sauf que le produit n'est pas séparé pendant la durée de réaction de 6 h (réaction en discontinu). On obtient un total de 17,34 g du composé d'addition et on le met en suspension dans 85 ml d'eau et 35 ml d'acide chlorhydrique IN. Après avoir agité vigoureusement pendant 1 h 30 min, on obtient 11,65 g (rende- ment global 38,2%) de Z-APM (pureté 100% d'après l'analyse CLUP). 1l EXEMPLE 3 On répète 1'exemple 2, sauf que l'on effectue la réaction à la température ambiante. La réaction continue donne un total de 30,57 g du composé d'addition que l'on met en suspension dans 150 ml d'eau et 60,4 ml d'acide chlorhydrique 1N et on agite vigoureusement pendant 1 h. On obtient 20,08 g (rendement global 59,7% de la théorie) de Z-APM (pureté 90,67% d'après l'analyse CLHP). La réaction en discontinu correspondante donne 21,94 g du composé d'addition que l'on met en suspension dans 110 ml d'eau et 43,3 ml d'acide chlorhydrique 1N. Après avoir agité vigoureusement pendant 1 h, on obtient 14,3 g (rendement global 46,2% de la théorie) de Z-APM (pureté 98,7% d'après l'analyse CLHP). EXEMPLE 4 On répète le procédé de l'exemple 1 avec un bouillon de culture de B. cereus exempt de cellules contenant 4,7 unités FAGLA/ml, sauf que l'on effectue la réaction è la température ambiante et on prépare également un second lot de 500 ml de mélange enzyme/réactif. On ajoute le mélange supplémentaire au récipient de réaction conte- nant les 500 ml de mélange enzyme/réactif de départ par portions de 15 ml à des intervalles d'environ 10 min à partir de 3 h après le début de la réaction. Après 11 h 30 min, on réunit le résidu restant dans le mélange de réaction avec le précipité recueilli, on lave à l'eau et on sèche. On obtient un total de 115,4 g du composé d'addition qui consiste en 87,3 g (75,67. de Z-APM) et 35,7 g (30,9X de PM) déterminés par analyse CLHP pour un rendement global de 71,56% de Z-APM. EXEMPLE 5 On répète le procédé de l'exemple 4 avec un autre bouillon de culture de B. cereus exempt de cellules contenant 4,7 unités FAGLA/ml, sauf que l'on prépare un lot supplémentaire de 750 ml de mélange enzyme/réactif. On ajoute le mélange résultant par portions de 25-50 ml à partir de 4 h après le début de la réaction. On contrôle périodiquement le pH pendant la réaction et on ajoute des portions supplémentaires de 5-10 ml de mélange de réaction du mélange des réactifs à pH non contrôlé selon le besoin pour maintenir le pH au-dessous de 7 (on ajoute un total de ml du mélange de réactifs à pH non contrôlé). Après 17 h, on termine la réaction en combinant le résidu restant dans le mélange de réaction avec le précipité recueilli et ensuite on lave et on sèche. On obtient 203,05 g du composé d'addition qui consiste en 66,2% (134,42 g) de Z-APM et 28, 4% (57,66 g) de PM, déterminés par analyse HPLC, pour un rendement global en Z-APM de 73,4%. Il est entendu que l'invention n'est pas limitée aux modes de réalisation préférés décrits ci-dessus à titre d'illustration et que l'homme de l'art pourra y apporter des modifications sans sortir du cadre de l'invention. SCHEMA A + H-Leu-NHO II Papalne Bz-Leu-Leu-NHO III + Papatnhe Bz-Leu-Gly-NH0 III Chymotrypsine H-Gly-NH0 II H-Gly-NH0 II Bz-Tyr-Gly-NH0 III Z-Phe-Gly-OH I + PapaTne Z-Phe-Gly-Tyr-NH2 III (1) Bz-Leu-OH I (2) (3) Bz-Leu-OH I BzTyr-OH I (4) H-Tyr-NH2 II SCHEMA B H O ! Il R -N-CH-CH -C-OH 1, 2 Co2H (acide L-aspartique amino-protégé) + 0-CH 2-CH-CO 2R2 NH21HC1 (chlorhydrate d'ester d'alkyle de L-phénylalanine, PA,HC1) H O H H enzymeI Il I i enzyme, R. -N-HCH-CH -C-N-C-CH -0 C02, PA Co2R2 (composé d'addition de l'ester d'alkyle de (L-aspartyl amino-protégé)phénylalanine, 1APA,PA) (2) R1APA,PA R1APA+PA (1) R E V E N D I C A T IONS 1. Procédé pour la production d'un ester d'alkyle de (L-aspartyl aminoprotégé)-L-phénylalanine selon le schéma suivant (1) H O ! I! R 1-N-CH-C --OH + 0-CH2-CH-CO2R2 C02H NH2)HC1 (acide L-aspartique (chlorhydrate d'ester amino-protégé) d'alkyle de Lphénylalanine, PA,HC1) H OHH1 enzyme H. H H R1-N-CH-CH 2-C-N-C-CH 2-0 R1, 2 C, C2 C02PA C02R2 (composé d'addition de l'ester d'alkyle de (L-aspartyl amino-protégé)phénylalanine, R1APA,PA) e+ (2) É 2) R1APA,PA, > RAPA+PA dans lequel l'acide L-aspartique porte un groupement amino-protecteur R1, la source d'enzyme est un micro-organisme producteur de protéase ou une préparation enzymatique obtenue à partir d'un micro-organisme ayant une activité de protéase, R est un groupe alkyle en C1-C 2 1 6 inclus, ledit procédé étant caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes: on fait réagir la L-phénylalanine carboxy-protégée avec l'acide L-aspartique amino-protégé dans des conditions qui favo- risent le couplage enzymatique microbien en présence d'une enzyme à un pH qui conserve l'activité enzymatique, on sépare le produit en continu à mesure qu'il se forme; et on ajoute les nouveaux réactifs à mesure que le produit est séparé. 2. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que la source d'enzyme est un micro-organisme producteur de protéase. 3. Procédé selon la revendication 2, caractérisé en ce que le microorganisme producteur de protéase est un Bacillus, un Streptomyces ou un Aspergillus. 4. Procédd selon la revendication 3, caractérisé en- ce que le micro-organisme producteur de protéase est Bacillus cereus NRRL B-12315. 5. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que l'enzyme est une préparation d'enzyme brute ou partiellement purifiée obtenue à partir d'un micro-organisme ayant une activité de protéase.