FR 2504010 A1 19821022 FR 8107596 A 19810415 Médicaments anticancéreux contenant la chaine A de la ricine associée à un anticorps antiméeanome et procédé pour leur préparation. Dans les demandes antérieures no 78 27838 du 28 septembre 1978 et addition N O 79 24655 du 3 octobre 1979, la demanderesse a décrit la préparation de produits anticancéreux dits conjugués obtenus par couplage par liaison covalente de la chaîne A de la Ricine à une structure protéique telle qu'un anticorps, une immunoglobuline ou un fragment d'immunoglobuline capable de recon- naître sélectivement un antigène donné à la surface des cellules porteuses que l'on veut atteindre telles que les cellules cancéreuses. La propriété principale de ces conjugués est d'être des agents cyto- toxiques spécifiques des cellules cibles visées. L'utilisation d'anticorps dirigés contre les anti- gènes de différentiation des cellules cancéreuses avait déjà permis d'obtenir des conjugués présentant une spécificité notable vis-à-vis des cellules cibles La caractérisation d'antigènes associés aux cellules cancéreuses et l'obtention d'anticorps monoclonaux dirigés contre ces antigènes permettentd'envisager des conjugués présentant une spécificité accrue vis-à-vis des cellules porteuses de ces antigènes. La présente invention a pour objet à titre de médi- caments des produits dits conjugués obtenus à partir de la chaîne-A de la Ricine et d'un anticorps monoclonal antimélanome humain. On entend par conjugués des molécules mixtes arti- ficielles dans lesquelles la chaîne A de la Ricine est associée par une liaison covalente de type disulfure à un anticorps antimélanome humain capable de reconnaître sélectivement un antigène associé aux cellules cancéreuses. L'obtention de la chaîne A de Ricine pure a été décrite dans nos brevets antérieurs La préparation d'anticorps mono- clonaux dirigés contre des mélanomes humains a été mentionnée dans la littérature scientifique lon peut se reporter en particulier à Proceedings of the National Academy of Sciences 77 ( 4), 2183-7, ( 1980)l. Pour réaliser les conjugués, il est nécessaire que les protéines à coupler portent chacune au moins un atome de soufre naturellement apte ou artificiellement rendu apte à créer la liaison disulfure recherchée. La chaîne A de Ricine présente naturellement un seul atome de soufre permettant le couplage souhaité C'est celui de la fonction thiol du résidu de cystéine inclus dans la chaîne A et qui assurait la liaison de cette chaîne A à la chaîne B dans la toxine complète. L'anticorps antimélanome ne comporte ni fonction thiol libre ni d'autres atomes de soufre susceptibles d'être utilisés pour le couplage Il conviendra donc d'introduire artificiellement sur la molécule d'immunoglobuline un ou plusieurs atomes de soufre susceptibles d'être engagés ultérieurement dans la liaison disulfure à établir avec une ou plusieurs molécules de chaîne A de Ricine. Selon l'invention, la préparation du conjugué est effectuée en mettant en présence la chaîne A de Ricine porteuse de son groupement SH libre avec l'anticorps dans lequel le groupement SH a été artificiellement introduit sous forme activée et notamment sous la forme d'un disulfure mixte avec un radical organique soufré conve- nable. La préparation du conjugué peut être représentée par le schéma: RA SH +AC S S X 4 RA S S AC + XSH dans lequel: RA désigne la chaîne A de Ricine AC désigne l'anticorps X désigne le radical activateur. L'anticorps substitué par un atome de soufre activé est obtenu à partir de l'anticorps lui-même, par substitution à l'aide d'un réactif lui-même porteur d'un atome de soufre activé selon le schéma: AC + Y R S S X > AC R S S X dans lequel AC désigne l'anticorps Y représente une fonction permettant la fixation covalente du réactif sur la protéine R désigne un groupement pouvant porter simultanément les substituants Y et S S X X désigne le radical activateur. Le groupement fonctionnel Y est une fonction capable de se lier de façon covalente avec l'une quelconque des 215 04 01 O fonctions portées par les chalnes latérales des aminoacides cons- titutifs de la protéine a substituer Parmi celles-ci, les fonctions aminées terminales des radicaux lysyle contenues dans la protéine sont particulièrement indiquées Dans ce cas, Y pourra notamment représenter: un groupe carboxylique qui pourra se lier aux fonctions aminées de la protéine en présence d'un agent de couplage tel qu'un carbodiimide et notamment un dérivé soluble dans l'eau comme l'éthyl-l (diéthylamino-3 propyl)-3 carbodiimide, un chlorure d'acide carboxylique qui est sus- ceptible de réagir directement avec les fonctions aminées pour les acyler, un ester dit "activé" tel qu'un ester d'ortho- ou para-, nitro ou dinitro-phényle ou encore un ester de N-hydroxy- succinimide qui réagit directement avec les fonctions aminées pour les acyler, un anhydride interne d'un diacide carboxylique tel par exemple l'anhydride succinique qui réagit spontanément avec les fonctions amines pour créer des liaisons amides, NH un groupement imidoester C o 1 est un o R 1 groupe alkyle réagissant avec les groupes aminés de la'protéine selon la réaction: H HN N il Prot NH 2 + C R 2 E Prot NH C R 2 + Rl OH R 1 i X désigne un groupement fonctionnel capable de réagir avec un radical thiol libre En particulier, X pourra désigner un groupe pyridyl-2 ou pyridyl-4 éventuellement substitué par un ou des radicaux alkyle, halogène, carboxylique X peut aussi désigner un groupe phényle de préférence substitué par un ou des groupes nitro ou carboxyliques X peut encore représenter un groupe alcoxy- carbonyle tel que le groupe méthoxycarbonyle. Le radical R désigne tout radical capable de porter simultanément les substituants Y et S S X I 1 devra être choisi de façon à ne pas comporter de fonctions susceptibles d'interférer au cours des réactions ultérieures avec les réactifs utilisés et les produits synthétisés En particulier, le groupe R peut être un groupe -(CH 2)n avec N compris entre 1 et 10, ou encore un groupe R 3 CH - CH - R 4 dans lequel R 4 désigne l'hydrogène ou un groupe alkyle ayant de 1 à 8 atomes de carbone et R 3 désigne un substituant inerte vis-à-vis des réactifs utilisés ultérieurement tel qu'un groupe carbamate NH C OR o R désigne un groupe alkyle droit ou ramifié ayant Il 5 5 de 1 à 5 atomes de carbone et notamment le groupe tertiobutyle. La réaction du composé Y R S S X avec l'immunoglobuline est effectuée en phase liquide homogène le plus souvent dans l'eau ou une solution tampon Lorsque la solubilité des réactifs l'exige, il est possible d'ajouter au milieu réaction- nel jusqu'à 20 % en volume d'un solvant organique miscible à l'eau tel qu'un alcool et notamment le butanol tertiaire. La réaction est effectuée à température ambiante pendant un temps variant de quelques heures à 24 heures Après quoi, une dialyse permet d'éliminer les produits de faible masse molécu- laire et en particulier les excès de réactifs Ce procédé permet d'introduire un nombre de groupements substituants par mole de protéine compris entre 1 et 5 si la protéine est une immunoglobuline de classe G, compris entre 1 et 15 si la protéine est une immunoglo- buline de classe M. En utilisant de tels composés, le couplage avec la chaîne A de Ricine est réalisé par mise en présence en solution aqueuse des deux protéines à une température ne dépassant pas 30 'C pendant un temps variant de quelques heures à un jour La solution obtenue est dialysée pour éliminer les produits de faible masse moléculaire, puis le conjugué peut être purifié par diverses méthodes connues. L'exemple suivant permet de mieux comprendre l'in- vention sans en limiter la portée. 5040 10 Exemple 1 Conjugué obtenu à partir d'anticorps antimélanome humain (anticorps dirigé contre l'antigène P 97) substitué par un groupe disulfure activé et la chaîne A de la Ricine. a) Anticorps antimélanome humain (anti P 97). Cet anticorps a été obtenu selon la méthode décrite dans Proceedings of National Academy of Sciences 1980, 77 ( 4), 2183-7. Il subit une ultime purification par dialyse contre du tampon PBS ( 10 m M de phosphate, 140 m M de chlorure de sodium, p H: 7,4). b) Chaîne A de la Ricine La chaîne A de la Ricine a été préparée et purifiée ainsi qu'il a été indiqué dans les demandes antérieures de la deman- deresse (brevet n 78 27838 et addition n 79 24655). c)Aniosi c) Anticorps antimélanome humain activé. A 0,5 ml d'une solution à 20 mg/ml d'acide (pyridyl-2 disulfanyl)-3 propionique dans le tertiobutanol, on ajoute 0,2 ml d'une solution à 60 mg/ml d'éthyl-l (diméthylamino-3 propyl)-3 carbodiimide et laisse 3 minutes à température ambiante. On ajoute 30 1 l de la solution ainsi obtenue à 1,66 ml d'une solution d'anticorps antimélanome à 2,4 mg/ml dans le tampon PBS On laisse l'incubatioa se poursuivre pendant 20 heures à 30 c. On dialyse ensuite la solution en continu pendant 3 jours contre 21 litres de tampon PBS à 4 C On obtient ainsi 4 mg d'anticorps activé à une concentration de 2,3 mg/ml. Par dosage spectrophotométrique à 343 nm de la pyridine thione-2 libérée par échange avec le glutathion réduit, on constate que l'on a obtenu un anticorps portant 2,6 groupements acti- vateurs par mole d'anticorps. d) Conlu 2 u&. A 1,3 ml d'une solution d'anticorps activé dans le tampon PBS (concentration 2,3 mg/ml, soit 3 mg d'anticorps activé), on ajoute 0,52 ml d'une solution de chaîne A de Ricine dans le même tampon (concentration 5,8 mg/ml) et effectue l'incubation à 25 C pendant 20 heures. On chromatographie le mélange réactionnel sur colonne de gel de Sephadex G 100, Dans chaque fraction, on détermine la concentration en anticorps par spectrophotométrie à 280 nm et celle de la chalne A par son pouvoir inhibiteur de la protéosynthèse mesurée sur un système acellulaire On réunit les fractions identiques contenant le conjugué et on obtient ainsi environ 1 mg du conjugué à la concentration de 0,2 mg/ml. Les déterminations analytiques effectuées permet- tent de montrer que la solution contient 50 ug/ml de chaine A biolo- giquement active, soit environ 1,4 mole de chaîne A par mole d'anti- corps. Une étude effectuée par cytofluorométrie a en outre permis de montrer que l'anticorps antimélanome utilisé, l'anticorps activé correspondant et le conjugué de cet anticorps avec la chaine A de la Ricine présentent des histogrammes de fluorescence très voisins permettant d'affirmer que l'anticorps n'a subi aucune altération importante au cours des réactions d'activation et de couplage auxquel- les il a été soumis et en particulier qu'il reste capable, au sein même du conjugué, de reconnaître l'antigène P 97 contre lequel il est dirigé. Le conjugué, selon l'invention, obtenu précédemment a été étudié en ce qui concerne ses propriétés biologiques et plus spécialement son action anticancéreuse. 1) Inhibition de la protéosynthèse La propriété biologique fondamentale de la chaîne A de Ricine est d'inhiber la protéosynthèse cellulaire par altération de la sous-unité ribosomale 60 S. On a utilisé ici un modèle cellulaire Ce test mesure l'effet des substances étudiées sur l'incorporation de 14 C-leucine dans les cellules cancéreuses en culture. Les cellules utilisées appartiennent à la lignée cellulaire M 1477 issue d'un mélanome humain qui porte l'antigène P 97. Ces cellules, après trypsination,sont préincubées au moins 24 heures afin de permettre la réexpression des antigènes de surface éventuel- lement altérés Après addition de la substance à étudier, on effectue une nouvelle incubation En fin d'incubation, on procède à la mesure du taux d'incorporation de 14 C-leucine par les cellules ainsi traitées. Cette mesure est effectuée selon une technique adaptée de la technique décrite dans Journal of Biological Chemistry 1974, 249 ( 11), 3557-62 utilisant le traceur 14 C-leucine pour la détermination du taux de protéosynthèse La détermination de la radioactivité incorporée est effectuée ici sur les cellules entières isolées par filtration. A partir de ces déterminations, on peut tracer les courbes effets/doses présentant en abscisse la concentration des substances étudiées et en ordonnée l'incorporation de 14 C-leucine exprimée en pourcentage de l'incorporation des cellules témoins en l'absence de la substance à étudier. On peut ainsi déterminer pour chaque substance étudiée la concentration qui inhibe 50 % de l'incorporation de 14 C-leucine ou "concentration inhibitrice 50 " (CI 50). Les résultats obtenus avec le conjugué préparé dans l'exemple précédent (ITHM) sont représentés par la figure 1 Sur cette figure, sont également représentées les courbes obtenues res- pectivement avec la Ricine, la chaîne A de Ricine et un conjugué chaîne A de Ricine anticorps anti radical dinitrophényle (DNP) (DS 10), conjugué qui ne présente aucune affinité pour les cellules testées. On peut constater sur cette figure que le conjugué étudié (ITHM) présente une forte activité cytoxique (CI' 50 = 5 xl O 9 M), environ 400 fois plus importante que celle de la chaîne A de Ricine. Par ailleurs, le conjugué anti-DNP (DS 10) n'a pas d'effet sur les cellules M 1477 jusqu'à la plus haute concentration essayée ( 10 6 M) Par contre, ce même conjugué DJS 10 re révèle cyto- toxique avec une CI 50 voisine de 10 '9 M s'il est mis en présence des mêmes cellules M 1477 préalablement rendues artificiellement por- teuses de radicaux DNP Ces deux dernières conclusions démontrent le caractère spécifique de l'activité cytotoxique du conjugué ITH 4 M. 2) Inhibition de la formation de colonies. Les cellules en culture de mélanome M 1477 sont décollées de leur support par de la solution de Versene (tampon PBS contenant de l'acide éthylène diamine tétracétique) ou par trypsini- sation Ces cellules sont ensemencées A raison de 2 x 104 cellules par botte de Pétri de 5 cm de diamètre contenant le milieu de culture sui- vant: 2 O f 4010 Milieu RPMI 1640 (Mérieux) additionné de glutamine 2 m M, bicar- bonate de sodium 2 g/l, 15 % de sérun foetal de veau inactivé (Seromed) et d'antibiotiques (penicilline, streptomycine et amphotericine B). Après 24 heures, les cellules sont traitées avec des concentrations variées du conjugué à étudier. A titre de comparaison la même série d'expériences est effectuée avec de la Ricined'une part, avec la chaîne A de Ricine,d'autre part,et enfin avec un conjugué non spécifique de cette lignée cellulaire (conjugué entre la chaîne A de Ricine et un anti- corps anti-DNP (DS 10)). Après à nouveau 24 heures, le milieu de culture est éliminé et remplacé par le même milieu frais, exempt de toute substance cytotoxique. 10 à 15 jours plus tard, le nombre de colonies qui se sont développées est déterminé après coloration avec une solution de cristal violet à l'aide d'un compteur automatique de colonies (système Artek 880). Cette méthode permet la détection d'une quantité aussi faible que 10 cellules viables par boite ainsi que cela a pu être vérifié en utilisant des cultures de contrôle Il a été égale- ment démontré que la formation de colonies est strictement propor- tionnelle à la concentration initiale des cellules, au moins dans la limite de 10 à 10 cellules par ml. Les résultats obtenus sont présentés dans la figure 2, sur laquelle on a porté, en ordonnée et en coordonnées logarithmiques,le nombre de colonies par boite et en abscisse la concentration du produit Les essais ont été effectués pour la Ricine, la chaîne A de la Ricine et le produit conjugué selon l'in- vention (ITHM). Le conjugué ITHM présente une haute activité puisque la dernière cellule de mélanome est tuée à une concentration d'environ 2 x 10 9 M en conjugué Cette concentration est tout à fait comparable à celle de la Ricine ( 1 x 10-9 M) alors que pour la chaîne A de Ricine il faut atteindre 10 6 M pour obtenir le même effet. ? 5 " 4010 ' On peut également noter que le conjugué DS 10 n'a aucune activité jusqu'à 2 x 10 M la plus forte concentration à laquelle il ait été testé. Les conclusions de cette expérience confirment entièrement celles de l'expérience d'inhibition de protéosynthèse. Les conjugués préparés selon l'invention présentent donc une forte spécificité d'action vis-à-vis des lignées cellulaires de mélanome humain Ils peuvent donc être utilisés en thérapeutique humaine dans le traitement des mélanomes et éventuellement d'autres affections, cancéreuses ou non, qui seraient sensibles à l'anticorps utilisé. Ces conjugués sont conditionnés pour être utilisés par voie injectable Ils peuvent être utilisés soit seuls soit associés à un autre traitement de l'affection cancéreuse concernée et, en particulier, associés à d'autres médicaments immunodépresseurs afin de retarder et d'affaiblir la réaction immunitaire naturelle du patient visà-vis de la protéine étrangère à son organisme que représente le conjugué. Visant à éliminer la totalité des cellules cancé- reuses, le traitement devra être effectué avec une dose suffisante de conjugué et la durée du traitement devra être déterminée dans chaque cas en fonction du sujet et de la nature de l'affection à traiter. l O REVENDICATIONS R E V E N D I C A T I 0 N S 1 Médicaments utiles notamment pour le traitement des mélanomes caractérisés en ce qu'ils contiennent une substance active qui est une molécule dans laquelle la chalne A de la Ricine est associée,par une liaison covalente de type disulfure, à un anticorps antimélanome humain. 2 Médicaments selon la revendication 1, caractérisés en ce qu'ils sont conditionnés en vue d'une administration par voie injectable. 3 Procédé de préparation de la substance active du médicament selon la revendication 1, caractérisé en ce que l'on fait réagir la chalne A de Ricine chalne représentée par la formule RASH - avec un dérivé de l'anticorps AC de formule AC-S-S-X dans laquelle X désigne un radical activateur. 4 Procédé selon la revendication 3, caractérisé en ce que le radical X désigne un groupement apte a agir avec un radical thiol libre et notamment un groupe pyridyl-2 ou -4 éventuellement substitué, un groupe phényle ou un groupe alcoxycarbonyle.