FR 2511034 A1 19830211 FR 8213623 A 19820804 La présente invention concerne un procédé d'obten- tion d'antibiotiques antifongiques polyéniques, dont certains inconnus jusqu'à cette date, au moyen d'un procédé de fer- mentation d'un nouveau microorganisme appartenant au genre Streptomyces. L'invention a également pour objet un nouvel anti- biotique tétraénique. Les antibiotiques polyéniques sont des substances dont la caractéristique fondanmentale est de posséder une structure à doubles liaisons conjuguées qui leur confèrent quelques propriétés biologiques très intéressantes. Comme exemples de ces composés on peut citer l'amphotéricine B (brevets américains no 2 908 611 et 2 908 612), le complexe de la philipine (brevet anglais n 783 486), la nystatine (brevet anglais n 866 600), la pymaricine, appelée également tennécétine et natamycine (brevet anglais n 852 883 et brevet allemand n 1 024 206), la candicidine (brevet américain n 2 992 162), etc Ces substances peuvent être différenciées les unes des autres par leurs spectres UV et IR et par Chromatographie (papier, couhe mince ou haute pression). Les antibiotiques polyéniques sont produits princi- palement par des microorganismes de l'ordre des Actinomycetales en particulier par Streptomyces et Streptoverticillium La biosynthèse de ces composés ne s'effectue pas habituellement de façon univoque, mais on observe l'apparition de divers polyènes dans le même milieu de culture. Le mécanisme d'action sur les cellules eucaryotiques consiste à agir sur les stérols des membranes, provoquant la lyse de la cellule jusqu'à altérer la perméabilité sélective que lui confèrent ces stérols. L'emploi des polyènes dans le domaine de la médecine est important, bien qu'étant donné leur toxicité par voie intraveineuse, leur principale application ait été pour l'utilisation locale, ou par voie orale puisqu'alors la toxicité est pratiquement nulle. Ce qui fait que les polyènes sont des substances ayant un intérêt actuel est la découverte selonlaquelle il existe une différence d'action sur la perméabilité de la mem- brane des cellules tumorales et des cellules normales Un autre fait intéressant est qu'ils provoquent une diminution des niveaux de cholestérol dans le sang lorsque certains de ces composés (candicidines) sont administrés par voie orale. On sait également que certains polyènes ont une action contre l'hypertrophie de la prostate C'est pourquoi on a entrepris de rechercher des microorganismes producteurs de ces substances. De façon concrète, la présente invention décrit la production de diverses substance polyéniques ayant une activité antifongique parmi lesquelles se détache une nouvelle, appelée par la demanderesse Ab 400, dont la caractéristique biologique principale est d'inhiber la croissance des champi- gnons et des levures ce qui fait qu'elle peut avoir une utilité dans le traitement des infections dues à des micro- organismes pathogènes (appartenant aux classes mentionnées) tant chez les animaux que chez les plantes. La substance Ab 400 est produite dans le milieu de culture par un germe aérobie appartenant au genre Streptomyces dont la dénomination est Streptoinyces sp cepa SF-1 (ASA) En outre une caractéristique de ce microorganis- me est la production d'autres substances polyéniques parmi lesquelles se détache par sa quantité le tétraène déjà con- nu nommé pimarycine (voir notes ci-dessus). Il est égalemement décrit l'extraction et l'iden- tification de ces substances, ainsi que le spectre anti- fongique de la substance Ab 400. Le microorganisme employé a été isolé à partir d'un échantillon de sol provenant des environs de Madrid, et déposé dans la collection d'ANTIBIOTICOS S A à Léon, sous le nom de Streptomyces sp cepa SF-1 (ASA) et dans la collection "NATIONAL COLLECTION OF INDUSTRIAL BACTERIA" (NCIB), Torry Research Station, d'Aberdeen, Ecosse, sous le n NCIB 11 738. Pour sa caractérisation taxonomique on suit les indi- cations qui apparaissent dans "The Actinomycetales" de SYKES et SKINNER ( 1973) Academic Press, en arrivant à la conclu- sion que ce microorganisme appartient au genre Streptomes, puisqu'il présente un mycélium aérien avec des sporophores avec de multiples spores en chaîne,lesquelles ne sont ni verti- cillées ni en sporanges On n'a pas observé de fragmentation du mycélium. Pour la caractérisation de l'espèce on a suivi les procédés décrits par SHIRLING et GOTTLIEB dans le "Internatio- nal Streptomyces Project" -ISP (Int J Sist Bacteriology 16:313-40, 1966) Au microscope à constrate de phases, on observe que le microorganisme SF1 (ASA) dans les milieux ISP-3 et ISP-4 présente les sporophores en forme de spirale avec de 1 à 6 spires plus pou moins fermées, avec des chatnes de plus de 10 spores ovales de 0,8 x 0,5 p Dans les milieux ISP-2 et ISP-5 ces sporophores ne présentent pas de vérita- bles spirales, mais on observe clairement des crochets plus ou moins fermés qui en certaines occasions arrivent à se fermer en une spire Les spores observées au microscope électronique présentent une surface verruqueuse. Les caractéristiques des cultures dans les divers milieux sont présentées au Tableau I. Toutes les cultures se font à 28 C La désignation des couleurs se fait de deux façons, la premiere selon les planches du "Code universel des couleurs", de E SEGUY ( 1936) éd P LECHEVALIER (Paris) et la seconde en leur donnant des noms de formes subjectives, en employant les noms habituels pour ces couleurs. Le spectre d'assimilation des sources d'azote (N) est donné au Tableau II; comme milieu basal on emploie du glucose à 1 % et de la gélose à 1,5 % (LUEDEMANN G M Int. J Sist Bacteriol 21: 240-47 ( 1971). Le spectre d'assimilation des sources de carbone est fait selon la technique de SHIRLING E B et GOTTLIEB D. (Int J Sist Bacteriol 16: 313-340 ( 1966) Les résultats sont donnés au Tableau III. Les caractères physiologiques sont donnés au Tableau IV. En résumé, la souche étudiée présente les caractères taxonomiques suivants: TABLEAU 1 CARACTERES MORPHOLOGIQUES ET PHYSIOLOGIQUES DES CULTURES DE STREPTOMYCES Sp SF-1 (ASA) Réf Milieu Durée Croissance Mycélium aérien Mycélium substrat Pigment Observations (jours) soluble 1 ISP-2, 21 +++ orange 180 rouge 116 fort, croissance gélose au violet brun noirâtre marron veloutée, malt de jgrisâtre pas d'in sporulation levure dicateur abondante de p H ISP-3, 21 ++ violet 675 violet 687 très croissance gélose à la violet gris châtain léger veloutée farine foncé garance bonne d'avoine sporulation _ _______ __ _______- 1 ISP-M, 21 ++ violet 675 violet 687 peu croissance gélose de violet gris châtain abondant veloutée sels foncé garance sporulation d'amidon régulière 1 ISP-5 21 violet 675 jaune 312 fort croissance gélose violet gris noir marron veloutée glycérol foncé verdâtre pas d'in sporulation asparagine dicateur abondante ______ _____________ _______ de p H Jn' Ln W TABLEAU 1 (suite) CARACTERES MORPHOLOGIQUES ET PHYSIOLOGIQUES DES CULTURES DE STREPTOMYCES Sp SF-1 (ASA) Milieu Durée Croissance Mycéliu Mycélium Pigment Observations (Jours) substrat soluble marron rouge rouge croissance 707 pas d'in veloutée dicateur peu de spores Gélose de 14 ++ noir pourpre violet 641 de p H Si l'on Bennet clair noir de ajoute CO Ca, avec CO Ca bougie le nb de âpo- ( 0,1 %) 3 res augmente Gélose 14 + __ _ croissance Czapek très peu (saccharose) abondante Gélose 14 ++ crème crème négatif croissance Emerson granuleuse avec CO 3 Ca ( 0,1 %) Gélose 14 ++ rouge 41, violet 641 positif sporulation glucose marron noir de rouge peu abon- asparagine rougeâtre bougie dante extrait de boeuf Gélose 14 +++ violet 606 violet 641 fort lcroissance glucose gris violet noir de Pas d'in veloutée extrait de bougie dicateurde levure couleur avec rouge phosphate Réf. r%) Ln -.1 ui TABLEAU 1 (fin) CARACTERES MORPHOLOGIQUES ET PHYSIOLOGIQUES DES CULTURES DE STREPTOMYCES Sp SF-1 (ASA) Milieu Croissance r i t t Durée (Jours) Gélose à 14 la tyro- sine croissance granuleuse N 172 14 ++ peu peu de ATCC abondant sporulation Gélose 14 +++ rouge 87 rouge 87 positif pas au lait gris d'hydrolyse foncé 1 SHIRLING, E B & GOTTLIEB, D Int J Sist Bacteriol 16:313-40 ( 1966) 3 WAKSMAN, S A "The Actinomycetes", Vol 2 ( 1961) 4 GORDON, R E & SMITH, M M J Bacteriol 69: 147-50 ( 1955). Catalogue de l'"American Type Culture Collection", (ATCC), p 518 ( 1980) 6 LUEDEMANN, G M, Int J Sist Bacteriol 21: 240-7 ( 1971). Lt CD o Réf. Mycélium aérien s Yu c sé tl ri ua mt Pigment soluble Observations 11034 TABLEAU II ASSIMILATION DE SOURCES DE N PAR STREPTOMYCES sp SF-1 (ASA) Témoin NO 3 NH 4 N-Z amine A Extrait de levure Asparagine Acide glutamique Croissance + ++ + + Pigment soluble produit ++ + 14 jours à 28 C TABLEAU Ii ASSIMILATION DE SOURCES DE C PAR STRIEPTOMYCES sp SF-1 (ASA) Source de C Croissance Témoin a * * * Dglucos e ++ Saccharose + Inositol *+ D-Fructose * * + Raf finose a + LArabinose * D-Xylos e ** Dl-Man nitol ***++ 11-Rhamnose - D-Galactose *+ D-.Arabinose GL-Melibios e Glycérol * *+ 0-Lactos e o kmidon o*e*+ D-Ribose ** Cel lobiose * ++ Tréhalose * ++ Sorbos e * * Sorbitol TABLEAU III ('fin) ASSIMILATION DE SOURCES DE C PAR STREPTOMYCES sp SF-1 (ASA) Source de C Mannose Dulcitol Mélécitose 21 jours à 28 C. Croissance ++ TABLEAU IV CARACTERES PHYSIOLOGIQUES DE STREPTOMYCES sp SF-1 (ASA) Production de pigments mélaniques a) ISP-6 b) ISP-7 c) ISP-1 Hydrolyse de la gélatine Hydrolyse de l'amidon. Lait écrémé Réduction des nitrates Résistance à Na Cl Croissance à diverses températures Réponse Référence négative négative négative forte légère hydrolyse négative positive 4 % est la limite mésophile A 14 Jours se produit une forte pigmentation de couleur marron pourpre foncée. 1 SHIRLING, E B & GOTTLIEB, D Int J Sist Bacteriol. 16:313-40 ( 1966). 2 WAKSMAN, S A "The Actinomycetes" Vol 2 ( 1961) The Williams and Wilkins Company. 3 GORDON, R E & SMITH, M M J Bacteriol 69:147-50 ( 1955) 4 LUEDEMANN, G M Int J Sist Bacteriol 21:240-7 ( 1971) TABLEAU V DIFFERENCES TAXONOMIQUES ENTRE STREPTOMYCES PRODUCTEURS DE PIMARYCINE Caractère phénotypique St gilbosporeus St chattanoogensis St natalensis Streptomyces sp. ATC_ 1335 ( 2)NRRL 2 6143 ATCC-13 326 ( 1) ATCC-13358 NRRL 2 651 SF-I (ASA)( 4 Pigment S mélaniques négatif négatif négatif Couleur du mycélium aérien rouge ? jaune ou blanc gris ou rouge rouge ou violet Couleur du mycélium substrat jaune châtain non étudié jaune châtain jaune châtain + rouge Pigment soluble,négatif positif jaune négatif positif rouge Forme des sporo- phores spirale spirale spirale spirale Forme de la paroi des spores épineuse épineuse verruqueuse Réduction des nitrates positive positive non étudié positive Résistance à Na Cl pas de croissance pas de croissance à 3 % à 3 % Utilisation des sources de carbone a) xylose ++ b) saccharose ++ + c) inositol + ++ + r', Ln u 2511 034 1 Brevet anglais no 846 933 ( 1960) 2 SHIRLING, E B et GOTTLIEB, D Int J Sist Bacteriol. 18:69-189 ( 1968) 3 SHIRLING, E B et GOTTLIEB, D Int J Sist Bacteriol. 22: 265-394 ( 1972). 4 Résultats du laboratoire. a) Appartient à la section Spirales. b) Possède des spores à surface verruqueuse. c) Ne produit pas de pigment mélanoide. d) La couleur du mycélium aérien sporulé appartient aux séries violette ou rouge, selon le milieu employé. e) Produit un pigment rouge (marron rougeâtre) soluble qui n'est pas indicateur de p H. f) Le mycélium du substrat présente une coloration qui varie du châtain rougeâtre au châtain violet, selon les milieux. g) Assimile comme source unique de carbone les corps suivants: glucose glycérol inositol amidon fructose cellobiose mannitol tréhalose galactose mannose L'assimilation du saccharose et du raffinose est douteuse. h) Présente comme autres caractères physiologiques: 1 Hydrolyse fortement la gélatine 2 Réduit les nitrates en nitrites 3 N'hydrolyse pas la caséine du lait 4 Résiste jusqu'à 4 % de Na Cl. Est mésophile. i) Produit divers antibiotiques antifongiques tétraéniques. En observant les caractères taxonomiques des espèces de Streptomyces présentent dans "Bergey's Manual of Determi- E native Bacteriology" ( 8 édition 1974 The Williams and Wilkins Company), et en étudiant l'International Streptomyces Project" publié par SHIRLING et GOTTLIEB dans "Cooperative description of Type strains of Streptomyces" (Int J Sist. Bacteriol 18:69-189, 1968; ibid 18:279-392, 1968; ibid. 19:391-512, 1969, et ibid 22:265-394, 1972), ainsi que les publications depuis l'année 1974 jusqu'à cette date, on n'a rencontré aucun microorganisme ressemblant au SF-1 (ASA). On compare en particulier avec les Streptomyces qui produisent également de la piramycine, c'est-à-dire S natalensis, S Chattanoogensis et S gilbosporeus Dans le tableau V sont exposés les résultats de cette étude, d'o l'on conclut que Streptomyces sp SF-1 (ASA) est distinct des autres producteurs de pymaricine. Le microorganisme décrit dans cette invention est la souche sylvestre, mais ses mutants,obtenus tantôt sponta- nément tant 8 t de manière induite par des agents mutagènes, peuvent également produire le groupe d'antibiotiques poly- éniques en conjonction ou séparément, ce qui faitqu'on doit que dans le procédé décrit ci-dessous, on peut employer aussi bien la souche silvestre que ses descendants par muta- tion. La production des tétraènes décrits dans l'invention peut se faire dans des milieux solides ou liquides, bien que ces derniers soient plus appropriés pour obtenir de grandes quantités des composés Dans les milieux liquides on peut obtenir les antibiotiques tant par culture superficielle que submergée, ce dernier moyen étant le meilleur pour l'obtention d'une grande quantité de produit. Le milieu de production doit être composé pour le moins de: a) Une source assimilable de carbone comme le glucose, le fructose, le mannitol, le glycérol, l'amidon, la dextrine, le cellobiose, le tréhalose, le mannose, seuls ou mélangés 11034 b) Une source assimilable d'azote comme les farines de pâtes végétales (soja, coton, arachide, etc), la liqueur de mais macérée, les peptones végétales ou animales, l'a levure, l'urée, les sels d'ammoniac, etc, seuls ou mélangés. c) Des sels minéraux pour conférer un pouvoir amortisseur de p H au milieu ou pour lui fournir des éléments minéraux. d) Des huiles végétales ou animales pour être utilisées comme antimousse ainsi que comme source de carbone Des silicones. L'intervalle de p H de fermentation avec lequel on obtient une production est large, de 5,1 à 8,4 La tempéra- ture optimale est entre 25 et 300 C. Pour obtenir les tétraènes par fermentation, ce qui est l'objet de l'invention, on suit les procédés habituels dans la fermentation pour antibiotiques, c'est-à-dire qu'on ensemence, à partir de spores lyophilisées, des tubes inclinés remplis d'un milieu dans lequel la souche sporule bien, on fait incuber à la température optimale et avec les spores et le mycélium provenant de ces tubes on commence la phase de croissance en culture liquide submergée Ces phases sont plus ou moins grandes et plus ou moins nombreuses selon 'Le volume de bouillon que l'on veut faire fermenter Dans le cas o l'on emploie des cuves de fermentation de grard volume, ces phases pourraient aller jusqu'à 5. Pour la fermentation dans un matras il suffit d'agi- ter sur un plateau agitateur approprié et en chambre clima- tisée; pour procéder en cuve, celle-ci doit comporter des systèmes d'aération, d'agitation, de régulation de p H, de régulation de l'oxygène dissous, de régulation de la tempé- rature et de l'addition d'agents nutritifs, de bases et d'acides, pour que la production soit optimale Tous ces procédés doivent être réalisés dans des conditions de stérilité absolue pour éviter des contaminations avec des microorganismes étrangers Les milieux peuvent être stérilisés dans les récipients, ou on peut les introduire préalablement stérilisés, pourvu que le récipient le soit déjà. La production commence une fois que dans le milieu de culture se trouve une quantité suffisante de mycélium, ce qui se produit à partir de 48 h; cette production augmente lentement jusqu'au 5 e ou 6 e jour de fermentation, l'augmenta- tion s'arrêtant alors. Pour étudier la quantité d'antibiotique existant dans le bouillon, on emploie comme modèle de Ab 400 un échan- tillon purifié qui par chromatographie sur papier et liquide à haute pression (HPLC) indique une seule substance active et qui, par rapport à Saccharomyces cerevisiae ATCC 9767 a une concentration minimale inhibitrice de 0,5 pg/ml Comme modèle de pimarycine on utilise un échantillon fourni par KONINKLIJKE NEDERLANDSCHE GIST & SPIRITUSFABRIEK N V de Delft, Hollande, (Batch 9117 A) de 900 U/mg. Bien que l'existence de la substance Ab 400 n'ait pas été décrite dans les bouillons des microorganismes déjà brevetés, on a fait une étude comparative entre Streptomyces sp SF-1 (ASA), St natalensis NRRL-2651 et St chattanoo- gensis ATCC 13 358 pour savoir si dans la fermentation dans les milieux décrits par les brevets et dans l'un de ceux qui sont employés dans le présent brevet, ladite substance est produite Les résultats sont exposés au Tableau VI Dans celui-ci on peut observer les différences claires entre les souches déjà brevetées, productrices de pimarycine, et celle qui fait l'objet de l'invention, puisque tandis que Streptomyces sp SF-1 (ASA) produit dans tous les milieux essayés, outre la pimarycine, une quantité élevée d'Ab 400, dans 'Les deux souches mentionnées il n'existe pas de production détectable de cette dernière substance Une autre caractéris- tique différentielle de la souche SF-1 (ASA) est de produire dans les bouillons de fermentation une forte odeur de pomme. 2511 1034 TABLEAU VI PRODUCTION DE Ab 400 ET DE PIMARYCINE PAR ST NATALENSIS, ST CHATTANOOGENSIS & ST SP SF-i (ASA) Milieu Microorganisme de fermentation mcg/ml Pi mcg/mi marycine Ab 400 S sp SF-i (ASA) S natalensis NRRL 2651 S chattanoogen- sis ATCC 13 358 (SFMF-3 N MCH 1 x M Na 1 me MF Na-1 MCI{ 1 (MF Na-1 i K Le milieu SFMF-3 contient 4 % de farine de soja, 6 % de glucose, 0, 5 % de 504 NH)2; O 13)de 00 HK 2; 1 % de CO Ca & 0,95 % d'huile de soja p H 6,2. Le milieu appelé MCH-1 est décrit dans le brevet anglais N O 852 883 et contient 2 % de glycérol, 0,5 % de phytone, 0,5 % de peptone, 0,3 % d'extrait de levure, 0,3 % d'extrait de viande et 0,25 % de CO 3 Ca p H 7,6. o o o O Le milieu appelé MF Na-1 est décrit dans le brevet allemand n 1 024 206 sous la dénomination de D et se compose de 5 % de farine de soja; 1 % de glucose; 0,5 % de 504 (NH 4)2; 0,02 % de P 04 H 2 K; 1 % de C 03 Ca; 0,5 % d'huile de so Ja et 0,1 % 4 2 3 de liqueur de mals macérée p H 6,3. Lorsque la fermentation est considérée comme termi- née, la concentration minimale inhibitrice (CMI) du bouillon filtré est normalement de 1/2000, par rapport à Saccharomyces cerevisiae. Le bouillon total, dont le p H oscille entre 5 et 6, est filtré à travers Hyflo-Supercell et le bouillon filtré est ajusté à p H = 8,0 au moyen d'hydroxyde de sodium, en extra- yant continuellement avec un alcool aliphatique non miscible à l'eau comme le butanol. On concentre l'extrait organique sous vide jusqu'à réduire son volume à 1/20 e du volume initial, grâce à quoi il se précipite une poudre blanche, que l'on appelle "antifongique brut" On filtre celle-ci et on la sèche sous vide à la tempé- rature ambiante La CMI de cette poudre, très légèrement jaune, est de l'ordre de 1/1 500 000 ( 0,67 mcg/ml) par rapport à la levure mentionnée Le rendement de ce produit est de 0,7 g par litre de bouillon filtré. L't"antifongique brut" est relativement soluble dans l'eau et il contient, au moins, deux antibiotiques principaux, selon ce qu'on constate au moyen de la chromatographie sur papier, actifs vis-à-vis de Saccharomyces cerevisiae. Si l'on dissout l'"antifongique brut" dans l'eau à une concentration d'environ 4 mg/ml et si l'on ajuste cette solution à p H = 10,2, en la laissant reposer à + 1 pendant 24 heures, il se préciptie une substance blanche qui possède une CMI de 1/10 000 000 ( 0,1 mcg/ml) que l'on appelle "antifongique 1 " et qui correspond au Ab 400 indiqué Cet anti- fongique 1 ou Ab 400 est obtenu avec un rendement de 6,6 % si l'on se réfère à l'antifongique brut" de départ. Le spectre ultraviolet dans le méthanol de l'"anti- fongique 1 " indique qu'il s'agit d'un tétraène et son spectre infrarouge dans le bromure de potassium est semblable bien que non identique à celui de l'antigongique tétraénique pima- rycine. La pimarycine possède un Rf inférieur à celui de l'"antifongique 1 " dans un système chromatographique butanol + éthanol + eau ( 5:4:1, v). Par chromatographie en phase liquide à haute pression (HPLC) avec une colonne de Li Crosorb RP-18 ( 5 u), phase mobile de citrate d'ammonium 0, 06 M, p H = 5,0 + acétonitrile ( 3:1, v) et détection à 300 nm on identifie dans l'"antifongique brut", 7 substances à activité antibiotique vis-à-vis de Saccharomyces cerevisae et à spectres ultraviolets de tétraènes. On trouve que la composition élémentaire centésimale de l'antifongique 1 " est C 54,5 %; H 7,1 %; N 2,9 %; O (dif) ,5 %; ce qui conduit à la formule empirique minimale C 22 H 34011 N et par conséquent à un poids moléculaire minimal de 488,522. ACTIVITE ANTIMICROBIENNE On étudie l'activité antimicrobienne de Ab 400, en observant l'absence d'activité vis-à-vis des bactéries et l'activité positive vis-à-vis des levures: Candida n t et n C ry-pto cocecus n Dlebaryonyces I Geotricunm Hans enula I Pichia I albicans anomala dolonji desusei Melinji pelliculosa pulcherrimna tropi calis albidus difluen s neoformaris hansenii kiaockeriii versiformne Ps eudopelliculosa suaveol ens ps eudopoimio rfa mienbranaefaciens Pour mieux prééiser Ilinvention, on donne les exemples suivants: EXEMPLE 1 On prépare un milieu ayant la composition suivante: Farine de coton 20 g Liqueur de mals macérée 10 " Dext;rine * * * 10 n Glucose 50 " 4 ( 4)2 5 N 0.Na 2,5 g 4 4 2 J PO 4 HE 2 504 Fe 7 H 20 0,05 g 504 Mg7 H 20 0,05 504 MN H 20 0,05 SO 4 Zn 7 H 20 o X 0,1 " Eau distillée q sop 1000 ml On ajuste le p H avec KOH à 6,2. On répartit le milieu dans des erlenmeyer de 1000 ml à raison de 200 ml chacun. On ajoute à chaque erlenmeyer 1 g'de CO 3 Ca. On stérilise à 121 C pendant 30 minutes. On ensemence le milieu ainsi préparé avec une suspen- sion de spores de Streptomyces sp Cepa SF-I (ASA) On prépare cette suspension à partir d'une culture en tube incliné dans t milieu solide quelconque dans lequel on peut sporuler le microorganisme. Une fois ce milieu ensemencé on fait incuber pen- dant 5 jours dans une chambre climatisée à 28 C, et en agitant de manière continue sur un plateau agitateur orbital avec une excentricité de 5 cm et une vitesse d'agitation de 240 tpm L'inoculum ainsi préparé sert à ensemencer le milieu de fermentation, lequel présente la composition suivante: Farine de soja 40 g Glucose 60 " SO 4 (NH 4)2 5 PO 4 HK 2 a a 13 3 3 CO 3 Ca,, 10 n Eau distillée q s p 1000 ml On ajuste le p H avant d'ajouter le carbonate, à 6,2 avec de l'acide sulfurique dilué. On répartit dans des ballons de 1 litre à raison de 200 ml de milieu par ballon. On ajoute à chaque ballon 1 ml d'huile de soja. On stérilise à 121 C pendant 30 minutes. le milieu,une fois stérile, est ensemencé à 5 % avec l'inoculum. On fait incuber à 28 C pendant 4 jours, dans une chambre et sur un plateau agitateur ayant les mêmes carac- téristiques que celles décrites pour l'inoculum. L'analyse du bouillon à la fin de la fermentation indique: p H 5,5 6,5; sucre 2 %; N ammoniacal: 100 mg/l; N total * soluble: 950 mg/l et volume du mycélium: 32. Vis-àvis de Sachh cerevisiae ATCC 9767 il présente une concentration minimale inhibitrice de 1/4 000 à 1/5 000; par HPLC il présente une activité de Ab 400 de 300-500 mcg/ ml et de pimarycine de 1 000 à 1 200 mcg/ml, en employant, comme modèle, de la pimarycine ayant une puissance de 900 U/mg/ 1 1034 EXEMPLE 2 On prépare un milieu ayant la même composition que l'inoculum de l'exemple 1, et que l'on répartit dans des erlenmeyers de 1 litre, à raison de 200 ml de milieu On stérilise à 121 C pendant 30 minutes On ensemence le milieu ainsi préparé avec une suspension de spores du microorganisme objet de l'invention On fait incuber pendant 5 jours à 28 C en chambre climatisée et en agitant continuellement sur un plateau agitateur orbital avec une excentricité de 5 cm et une vitesse d'agitation de 240 tpm. L'inoculum ainsi préparé sert à ensemencer à 0,5 % des cuves de fermentation de 8 litres de capacité avec 4 litres de milieu de même composition que le milieu de fermentation de l'exemple 1 Les conditions de fermentation sont les sui- vantes: température 28 C, aération 0,3 v/v/m, agitation 400 tpm, temps de fermentation 90 heures Le milieu de fermen- tation à ce moment présente une activité de pimarycine de 500-1000 mcg/ml et de Ab 400 de 300-600 mcg/ml On emploie le même type de modèles que dans l'exemple 1. EXEMPLE 3 On filtre 3 540 ml de bouillon total de p H 5,9 à travers une pré-couche de Hyflo-Supercell, en obtenant 2 150 ml de bouillon filtré transparent de couleur rougeâtre et de CMI = 1/2 222 On ajuste à p H 8,0 avec de l'hydroxyde de sodium et on filtre le précipité floconneu Kde la même manière, et on le jette On effectue unepremière extraction de ce bouillon filtré avec 700 ml de butanol, en centrifugeant la phase organique On soumet la phase aqueuse à deux autres extractions avec 350 ml de butanol à chaque fois, de la même manière que ci-dessus h concentre sous vide l'extrait butanolique total, Jaune transparent, jusqu'à réduire son volume à 1/20 du volume initial, grace à quoi il se précipite une poudre blanche qui, une fois filtrée, lavée avec du butanol et séché sous vide à la température ambiante pèse 1,52 g; soit 0,71 g par litre de bouillon filtré Cet "anti- fongique brut" présente une CMI = 1/1 450 000 ( 0,69 mcg/ml). On dissout le produit dans 380 ml d'eau et on ajuste cette solution à p H 10,2 avec de l'hydroxyde de sodium. Au bout de 24 h à + 1 C on filtre le précipité floconneux, on le lave avec de l'eau et on le sèche sous vide à la tempéra- ture ambiante, en obtenant 101 mg d'antifongique 1; 6,7 % par rapport à l'"antifongique brut" de départ La CMI de cet anti- fongique 1 était de 1/10 000 000 ( 0,1 mcg/ml). EXEMPLE 4 On filtre 3 800 ml de bouillon total de p H 5,6 sous vide à travers de l'Hyflo-Supercell, et on obtient 2500 ml de bouillon filtré de CMI = 1/2 000 On ajuste à p H 8,0 avec de l'hydroxyde de sodium et on recommence à filtrer de manière analogue On extrait avec du butanol comme dans l'exemple précédent et on concentre l'extrait butanolique sous vide jusqu'au 1/20 e de son volume de départ. On filtre l'antifongique brut" précipité, on le lave avec du butanol et on le sèche sous vide à la température ambiante, et on obtient 2,0 g de CMI = 1/1 666 000 ( 0,60 mcg/ml). On dissout l'antifongique brut ci-dessus dans 500 ml et on ajuste la solution à p H 10,2 avec de l'hydroxyde de sodium, et on la conserve à + 1 C pendant 24 heures. L'antifongique 1 précipité pèse une fois sec 131 mg; 6,6 % La CMI est alors de 1/10 000 000 ( 0,1 mcg/ml). EXEMPLE 5 A partir de 3750 ml de bouillon total à p H 5,9 on obtient 2 300 ml de bouillon filtré à travers de l'Hyflo- Supercell, avec une CMI = 2 500 On ajuste à p H 8,0, on filtre et on extrait avec du butanol de la même manière que ci-dessus. Après avoir concentré l'extrait organique on obtient 1,9 g d'antifongique brut de CMI = 1/2 222 000 ( 0,45 mcg/ml). On dissout l'antifongique brut dans 475 ml d'eau et à p H ,2 on produit au bout de 24 h à + 1 C 146 mg d'antifon- gique 1, 7,7 % de CMI = 1/10 000 000 ( 0,1 mcg/ml). REVENDICATIONS 1 Procédé d'obtention d'antibiotiques antifongiquespolyé- niques, caractérisé en ce qu'on réalise une fermentation d'un milieu de culture au moyen du microorganisme appelé Streptomyces sp cepa SF-1 (ASA), en extrayant lesdits antibiotiques du mycelium et/ou du milieu de culture. 2 Procédé d'obtention d'antibiotiques antifongiques poly- éniques selon la revendication 1, caractérisé en ce que ladite fermentation est aéropbie, de préférence à une température comprise entre 250 et 300 C et en ce que le milieu de culture contient des sources assimilables de carbone et d'azote et des sels minéraux. 3 Procédé d'obtention d'antibiotiques antifongiques poly- éniques selonla revendication 2, caractérisé en ce que comme sources de carbone on utilise le glucose, le fructose, le mannitol, le glycérol, l'amidon, la dextrine, le cellobiose, le tréhalose, le mannose, seuls ou mélangés, et comme sources d'azote on utilise des farines de pâtes végétales, de la liqueur de ma Is macérée, des peptones végétales ou animales, de la levure, de l'urée, des sels d'ammoniac, seuls ou mélangés. 4 Procédé d'obtention d'antibiotiques antifongiques poly- éniques selon l'une des revendications 1 à 3, caractérisé en ce qu'on filtre le bouillon résultant de la fermentation, en ce qu'on ajuste à p H environ égal à 8, en ce qu'on extrait l'humidité et en ce qu'on concentre sous vide, en précipitant ainsi un complexe d'antibiotiques ouunanti- fongique brut à partir duquel on isole la pimarycine. Procédé d'obtention d'antibiotiques antifongiques poly- éniques selon l'une des revendications 1 à 3, caractérisé 1 1 034 en ce qu'on filtre le bouillon résultant de la fermentation, en ce qu'on ajuste à p H approximativement égal à 8, en ce qu'on extrait l'humidité et en ce qu'on concentre sous vide, en précipitant ainsi un complexe d'antibiotiques ou un antifongique brut, que l'on dissout dans l'eau à une concen- tration d'environ 4 mg/ml, en ce qu'on ajuste la solution à p H approximativement égal à 10,2 puis en ce qu'on obtient par précipitation un antibiotique tétraénique appelé Ab 400. 6 Antibiotique antifongique tétraénique pouvant être obtenu selon le procédé de la revendication 5, de composition élé- mentaire centésimale C 54,5 %; H 7,1 %; N 2,9 %; O - ,5 % et de concentration minimale inhibitrice vis-à-vis de Saccharomyces cerevisiae de 1/10 000 000.