FR 2509862 A1 19830121 FR 8212372 A 19820715 La présente invention concerne un procédé perfectionné d'exécution d'essais de liaison spécifique Elle concerne en particulier un procédé perfectionné à appliquer d'une manière automatique pour effectuer des essais de liaisai spécifique au cours desquels des phases liquides et des phases solides sont présentes. Comme on le sait, les essais de liaison spécifique sont basés sur le principe qui consiste à mener des réactions de liaison spécifique dans lesquelles la mesure de la liaison est une fonction de la quantité de li- gand inconnu présent, au moyen d'un composant marqué Au nombre des procédés connus, on peut mentionner les procédés de liaison spécifi- que suivants: l'essai de radio-immunologie (RIA), l'essai immunologique de métaux (MIA), l'essai de radicaux libres (FRAT), l'inhibition d'lié- maglutination (HI), l'essai immunologique multiplié d'enzymes (EMIT), l'essai immunologique à fluorescence (FIA) et l'essai immunologique à luminescense (LIA) Selon certains de ces procédés (RIA, MIA, FIA, LIA), on laisse atteindre un équilibre au mélange, qui comporte le ligand non marqué, le ligand marqué et l'anticorps, et le ligand lié à l'anti- corps est séparé du ligand libre Au cours de l'essai de radio-immu- nologie, le ligand ou l'anticorps est marqué par un isotope radio-actif, tandis qu'au cours de l'essai immunologique de métaux, le ligand est marqué par un agent de réaction contenant un métal qui contient égale- ment un groupe fonctionnel convenable à l'aide duquel on peut attacher l'agent de réaction contenant le métal à l'haptène voulu à soumettre à l'essai Une description complète de ce second cas est donnée dans le brevet américain antérieur no 4 205 952, déposé au nom du demandeur. Dans le cas du procédé FIA, l'agent de marquage est un composé fluo- rescent et dans le cas du procédé LIA, l'agent de marquage est un agent chimico-luminescent ou un agent bio-luminescent. L'opération qui consiste à séparer la fraction libre de la fraction liée est d'une grande importance et sa précision détermine la sensibilité et la précision de tout le procédé d'essai de liaison spécifique Lorsqu'on choisit et apprécie une opération de séparation, il est utile de tenir compte des critères qui doivent être observés pour que le résultat voulu soit atteint. ex Les principales conditions requises pour une séparation idéale sont celles qui sont énoncées ci-après: (I) Il faut séparer complètement la fraction liée et la fraction libre, avec une large marge d'erreur dans les conditions appliquées pour la séparation; (II) il ne doit pas y avoir d'interférence avec la réaction principale de liage antigène anticorps; (III) le procédé doit être simple, aisé et rapide; (IV) le procédé ne peut pas être onéreux et il doit être utilisé des agents de réaction et un équipement qui soient facilement dis- p onible s; (V) la marche du procédé ne peut pas être affectée par le plasma ou par le sérum; (VI) toutes les manipulations doivent être effectuées dans un seul tube; (VII) le procédé doit se prêter à l'automation; (VIII) le procédé doit pouvoir être appliqué à une large gamme d'anti- gènes; (IX) les opérations de manipulation, au cours des essais de radio-im- munologie, doivent être prévues de telle sorte qu'elles assurent le maximum de sécurité en ce qui concerne les risques d'irra- diation pouvant provenir de la manipulation du système de réac- tion radio-actif. Il entre dans le cadre de la présente spécification de faire un examen critique de la variété des procédés disponibles et de la mesure dans laquelle chacun des procédés peut satisfaire à toutes les conditions requises idéales mentionnées plus haut ou à certaines de ces conditions. Les procédés utilisés de la façon la plus largement répandue qui appar- tiennent à l'état antérieurement connu de la technique sont les procédés par adsorption (charbon de bois, silicates), les procédés par précipita- tion fractionnée (sulfate d'ammonium, éthanol, dioxane, polyéthylène-gly- col), les procédés à double anticorps et les procédés à phases solides (immuno-adsorbants), qui, tous, correspondent à un système de parti- cules en suspension dans un milieu liquide Le choix d'un procédé par- ticulier quelconque est déterminé en considération de nombreux facteurs présentant une relation entre eux, tels que la solubilité du composé, les caractéristiques de l'antisérum, la fraction à compter, le degré de liai- son non spécifique, le type de radio-isotope Toutefois, l'une des ca- ractéristiques, qui est commune à tous les procédés 4 ui ont été indiqués plus haut, réside dans la nécessité d'une opération de centrifugation pour obtenir l'aggrégation des particules solides se trouvant en suspension, opération qui est suivie d'une opération de décantation (ou d'une opéra- tion d'aspiration) afin que la séparation physique de la phase solide et de la phase liquide soit obtenue. Dans une demande de brevet antérieure (demande de brevet fran- l Oçais no 80 05450, cédée à Technion Research & Development Foundation Ltd), on a décrit un procédé pouvant être utilisé pour l'essai de liaison spécifique selon lequel la séparation de la fraction liée de la fraction libre est effectuée par le procédé d'extraction par solvant, des solvants organiques étant utilisés comme agents d'extraction D'autre part, dans un brevet antérieur (brevet belge no 886 517, aux noms de M Cais, M Shimoni et Technion Research & Development Foundation Ltd), on a décrit un dispositif de conception nouvelle, désigné sous l'appellation de "LIDEX", (dispositif de séparation par extraction de liquide), qui- est destiné à la mise en oeuvre du procédé précité d'extraction par sol- vant Selon l'invention connue par ce brevet, le dispositif "LIDEX" comporte un réservoir mélangeur (A) dans lequel est convenablement monté un séparateur-mélangeur (B) qui présente un canal suivant l'axe vertical Les deux solutions de liquides en substance non miscibles sont introduites dans le réservoir mélangeur et les phases sont complè- tement mélangées par déplacement du mélangeur-séparateur (B), que l'on fait entrer dans le réservoir mélangeur (A) et que l'on retire de celuici. Après la séparation spontanée en une phase supérieure et en une phase inférieure, on retire la phase supérieure en repoussant le mélangeur-sé- parateur, la phase supérieure en question étant accumulée dans un réci- pient collecteur (E). Dans un autre brevet antérieur (brevet belge no 889 565), aux mêmes noms que le précédent, on décrit des séparations par transfert -4 - de masse prévues à différentes fins, et, notamment, à des fins d'essais de liaison spécifique,qui doivent être effectuées à travers des barrières sélectives L'invention en question concerne un dispositif "LIDEX" nou- veau, semblable à celui qui est décrit dans la demande de brevet israé- lien no 58 943, dans le cas duquel une barrière est placée dans le mélangeur-séparateur La résistance opposée à l'écoulement de la phase liquide à travers la membrane dans le mélangeur-séparateur donnera en règle générale lieu à une pénétration du fluide autour de l'élément d'é- tanchéité placé sur le mélangeur-séparateur, au cours du mouvement de l Oglissement vers le bas du mélangeur-séparateur, ce qui, évidemment, gênera complètement la marche de l'essai Afin de remédier à cette déficience, on munit le dispositif de moyens d'accumulation de poches de gaz, par exemple d'une ou de plusieurs rainures horizontales, ver- ticales ou en spirale que l'on prévoit sur le mélangeur-séparateur et dans lesquelles l'air emmagasiné aura pour effet de diminuer la pression exercée sur la barrière, de telle sorte que la pénétration du fluide au- tour de l'élément d'étanchéité qui a été indiquée plus haut sera évitée. Le système proposé par cette invention s'est avéré propre à donner d'excellents résultats dans divers systèmes, pour différentes membranes 2 Oet pour divers types de solvants et/ou de précipités. L'une des principales conditions requises en ce qui concerne l'es- sai d'immunologie est la reproductibilité des résultats, avec une dévia- tion minimum entre deux cas de reproduction, ce qui implique une standardisation totale du procédé, avec un minimum de manipulation et de travail manuel, sans dépendance de facteurs externes Un exemple de tel facteur externe est la mesure de mélange des phases au cours de l'essai Un autre facteur externe est la vitesse de séparation de la phase voulue, qui doit être subséquemment analysée. En ce qui concerne le dispositif Lidex sans barrière, utilisé pour 301 'essai d'immunologie, l'essai nécessite une agitation vigoureuse et com- plète pour qu'il puisse être obtenu un transfert de masse complet et une séparation précise entre les deux phases liquides Comme on le comprendra aisément, l'agitation que l'on obtient en déplaçant à la main le mélangeur-séparatetr (B) pour le faire entrer dans le réservoir mé- langeur (A) et pour le retirer de celui-ci ne peut pas être interprétée quantitativement, en ce sens qu'elle est en fait un élément subjectif, qui dépend du technicien effectuant l'essai d'immunologie La question est encore plus compliquée dans le cas du dispositif Lidex à membrane, pour la raison que chaque système différent peut nécessiter l'emploi d'une membrane spécifique et/ou d'un solvant spécifique et exigera par conséquent une mesure de mélange différente et/ou une vitesse de sépa- ration différente Ceci sera évidemment très difficile, voire même im- l Opossible, par une manipulation manuelle, en particulier dans le cas de l'essai d'immunologie, lorsqu'une haute précision, avec des résultats aussi fidèlement reproductibles que possible, est requise Même un technicien très qualifié dans l'art de l'essai d'immunologie pourrait dif- ficilement assurer qu'un transfert de masse complet a été obtenu après 1 Sune certaine période d'agitation D'autre part, une agitation prolongée pourrait gêner la séparation de phases aisée, lorsqu'il s'agit de deux liquides, ou provoquer un endommagement de la membrane, lorsque des précipités sont présents. L'un des buts de la présente invention est de procurer un procé- dé perfectionné d'exécution des essais d'immunologie Un autre but de la présente invention est de procurer un procédé perfectionné d'exécution des essais d'immunologie selon lequel soient à la fois éliminées les ma- nipulations de centrifugation et les manipulations de décantation Un autre but encore de la présente invention est de procurer un procédé perfectionné d'exécution des essais d'immunologie selon lequel soit éli- minée la détermination subjective de la mesure de l'agitation et qui a- méliore la séparation des phases Enfin, un autre but encore de la présente invention est de procurer un procédé perfectionné d'exécution des essais d'immunologie qui évite le laborieux travail manuel pour le mélange complet nécessaire à un transfert de masse efficace La pré- sente invention a par conséquent pour objet un procédé perfectionné d'exécution des essais d'immunologie dans un dispositif spécialement conçu à cet effet qui comporte un réservoir mélangeur dans lequel est convenablement monté un mélangeur-séparateur présentant un canal sui- vant l'axe vertical, le procédé consistant en la combinaison des opéra- tions qui sont indiquées ci-après: (a) disposition des réservoirs mélangeurs sur une étagère spéciale- ment conçue pour en contenir un certain nombre, avec les mé- langeurs-séparateurs; (b) introduction des agents de réaction et des produits d'analyse dans les réservoirs mélangeurs précités; (c) couverture des réservoirs mélangeurs précités au moyen des mé- langeurs-séparateurs précités; l O(d) mise à incubation des agents de réaction et des produits d'ana- lyse pendant un laps de temps nécessaire dans les réservoirs mélangeurs précités, couverts des mélangeurs-séparateurs; (e) mise en place de l'étagère portant les dispositifs séparateurs in- diqués plus haut, avec les agents de réaction et les produits d'analyse ayant été soumis à l'incubation, dans un dispositif de presse spécialement conçu pour assurer, à une vitesse réglée, - un mouvement de descente grâce auquel les mélangeurs-sépara- teurs seront poussés vers le bas dans les réservoirs mélangeurs à une vitesse choisie et sur une distance choisie au préalable pour que soient effectués de façon complète le transfert de masse voulu et l'opération de séparation voulue; (f) commande du mouvement de descente du dispositif de presse cité ci-dessus à la vitesse et sur la distance choisie au préalable; (g) retrait de l'étagère après le dégagement du dispositif de presse, et (h) mise en place des dispositifs séparateurs dans l'instrument d'ana- lyse voulu, pour une mesure quantitative ou qualitative de l'une ou de l'autre des phases séparées ou des deux phases séparées, selon le résultat voulu. Le procédé est d'une application très simple en raison de l'ab- sence qui le caractérise de toute opération de centrifugation et de toute opération de décantation, l'ensemble du traitement ayant lieu dans un dispositif à un seul tube En outre, en comparaison des résul- tats que l'on peut obtenir par l'application des procédés connus, qui ap- partiennent à l'état actuel de la technique, les résultats que l'on obtient par le procédé qui fait l'objet de la présente invention s'avèrent très favorable s. L'un des éléments qui permettent d'obtenir la performance du procédé faisant l'objet de la présente invention est l'utilisation du dis- positif de presse à la phase (e) du procédé, dispositif qui est désigné dans la présente spécification par l'appellation "Pressomat" En fait, les opérations manuelles qui sont à effectuer au cours des phases (e), (f) et (g) du procédé sont très simples et elles peuvent facilement être effectuées par un technicien, dans un laboratoire oh celui-ci n'emploiera qu'un nombre relativement peu important de tubes par essai Toutefois, étant donné que chacun des tubes doit être manipulé individuellement, cette opération peut exiger un temps assez considérable dans un labora- toire de routine, o sont effectuées un grand nombre d'analyses C'est là la raison pour laquelle une standardisation du procédé est extrême- ment souhaitable, afin que celui-ci puisse être complètement indépen- dant de facteurs externes Divers prototypes du Pressomat, basés soit sur l'emploi d'un mécanisme pneumatique, soit sur l'emploi d'un moteur électrique, se sont révélés également satisfaisants La figure la des dessins annexés à ce mémoire descriptif représente le Pressomat tel qu'il se présente au début de la séparation, deux étagères de tubes à essai ayant été mises en place et contenant chacune vingt dispositifs Lidex La figure lb des dessins représente le même instrument tel qu'il se présente à la fin de l'opération, alors que les séparateurs B des quarante tubes ont été poussés vers le bas, à l'intervention de la plate-forme de déplacement, de façon qu'ils occupent la position finale voulue, et alors que les bouchons S de tous les séparateurs ont hermé- tiquement fermé tous les récipients collecteurs E Cette opération de fermeture n'a lieu qu'au stade final du déplacement de la plate-forme de pression vers le bas, afin que l'air déplacé dans le Lidex puisse s'échapper Dès le moment o cette opération est achevée (ce qui, selon les expériences effectuées par le demandeur, a lieu en un laps de temps total de moins de trois minutes)) le sens de déplacement de la plate- forme de pression est automatiquement inversé et celle-ci retourne à la position de départ dans l'instrument Les étagères de tubes à essai peuvent être retirées du Pressomat pour être acheminées vers le comp- teur dès que commence le mouvement de levée. Le Pressomat (voir figure 11 des dessins ci-annexés) est réalisé sous la forme d'une presse fermée, dans laquelle le mouvement de la ou plate-forme/plaque de pression(a) est produit par un moteur relié à une plaque mobile qui presse les séparateurs Lidex des étagères (b) par con- lftact direct Le corps du Pressomat supporte les contraintes de traction engendrées par suite de la pression qui est exercée au cours de l'opéra- tion Le moteur peut être un moteur pneumatique, un moteur hydrauli- que, un moteur de type combiné, à la fois pneumatique et hydraulique, ou encore un moteur électrique, et il peut être relié à la plaque mobile, soit directement, soit par l'intermédiaire d'un système de transmission. Le moteur est muni d'un mécanisme de réglage de déplacement (lequel n'est pas représenté dans le dessin), qui permet le réglage de la vitesse du mouvement de descente ou du mouvement de montée de la plaque mo- bile selon la condition requise pour l'opération Le fonctionnement du Pressomat est très simple Dès que l'on presse le bouton de mise en marche, la plaque mobile entame son mouvement de descente et elle commence à presser les séparateurs Lidex à une vitesse de descente déterminée au préalable et à une pression choisie au préalable Lorsque 251 a plate-forme (a) atteint le point de descente le plus bas, qui est déter- miné au préalable (voir figure lb), commence le fonctionnement d'un mé- canisme de retardement, qui maintient la plate-forme dans la position la plus basse pendant un laps de temps voulu, déterminé au préalable, afin que soit achevée la fermeture égale de tous les séparateurs Lidex se 3 trouvant sur les étagères de tubes à essai (b) ayant été précédemment introduites dans le Pressornat Après l'écoulement du temps de retard, la plaque de pression (a) se dégage des séparateurs Lidex, elle entame son mouvement vers le haut, à une vitesse voulue, et elle retourne à la' position de départ (voir figure la) A ce moment, le Pressomat est prêt _9 _ à l'opération suivante. La figure 2 des dessins ci-annexés est une représentation sché- matique du séparateur Lidex PS, lequel se prête avec une utilité parti- culière à l'essai d'immunologie, au début (indiqué en 2 a) et à la fin (in- diquée en 2 b) de l'opération de séparation Les particules solides (P), initialement en suspension dans la phase liquide (L), sont complètement séparées et sont retenues au fond du-réservoir mélangeur A La carac- téristique supplémentaire que présente le système représenté sur la fi- gure 2 b réside dans la prévision de la tige de matière plastique R, qui l O est placée dans le canal C prévu suivant l'axe du séparateur B Le rô- le de cette tige de matière plastique R est de déplacer l'équivalent de son volume de la phase liquide pour le faire passer dans le récipient collecteur E Les dimensions de la tige sont telles qu'il ne puisse s'exercer aucune influence gênante sur le libre écoulement de la phase lliquide lors de son passage par le canal C, et qu'en même temps, il ne reste qu'une quantité insignifiante de liquide dans le canal C à la fin de la séparation Il résulte de ceci que la radio-activité partagée entre la phase solide et la phase liquide peut être physiquement séparée pratique- ment en totalité Ceci, joint à l'étanchéité assurée par la fermeture 2 Qhermétique à l'aide des bouchons S, augmente dans une mesure impor- tante la souplesse du protocole d'essai A l'aide de traceurs à émission gamma, il est possible de compter au choix à la fois une phase solide et/ou la phase liquide en plaçant simplement le séparateur dans le ré- servoir du compteur, respectivement dans la position normale ou dans la position le haut en bas. La figure 3 des dessins ci-annexés est une représentation de l'é- tagère chargée des dispositifs destinée à faire apparaître au maximum les réservoirs mélangeurs A au cours des opérations de pipettage manuel de l'essai et destinée au montage convenable dans l'instrument Pressomat. Le protocole d'essai selon lequel est adoptée la méthodologie du séparateur Lidex PS, telle qu'elle est décrite dans la spécification, com- porte les opérations qui sont indiquées ci-après: (I) Une série de réservoirs mélangeurs A, en double, sont placés sur les étagères à tubes à essai, et les agents de réaction de l'essai et les échantillons standards et cliniques sont ajoutés selon les instructions de la trousse; (II) on laisse les réservoirs mélangeurs séjourner pendant la durée d'incubation primaire prescrite; (III) on ajoute l'agent de réaction de précipitation (ou d'adsorption) pour l'essai, en veillant à ce que le volume de réaction total soit de 1,5 2,0 ml; (IV) les séparateurs B, munis du joint torique, de la membrane M, du disque D et de la tige R, et couverts du bouchon S, sont intro- duits dans les tubes A, comme l'indique la figure Za, et on les laisse séjourner pour la seconde incubation (si cette dernière n'est pas nécessaire, on passe directement à l'opération suivante); (V) les étagères portant les tubes à essai: (figure 3), contenant les séparateurs Lidex, sont placées dans le Pressomat et l'opération est entamée; (VI) après que l'opération s'est achevée (au bout de trois minutes), les étagères portant les réservoirs mélangeurs sont retirées du Pressomat, puis les séparateurs Lidex sont acheminés vers le c ompteur. Le problème qui se présente pour les laboratoires de diagnostic qui effectuent des analyses de liaison de protéines compétitives se pose sous de nombreux aspects En effet, les laboratoires ont à faire face à une importante arrivée d'échantillons provenant de différentes sources, à interpréter la signification des résultats pour le clinicien peu expéri- menté, à fournir une large gamme de déterminations, à envoyer les ré- sultats rapidement et, avant tout, à s'assurer que chaque essai a été fait avec précision et exactitude Tout ceci doit être fait en dépit des difficultés d'ordre économique que l'on rencontre lors de l'application d'un procédé qui exige un important travail, qui est compliqué et qui est onéreux en comparaison de certaines autres formes d'essais qui sont adoptées en biochimie clinique La disponibilité de plus en plus grande d'agents de réaction RIA dans les trousses commerciales peut alléger certaines de ces difficultés, pour autant que l'analyste puisse compter sur la qualité des agents de réaction et sur l'exactitude et la précision du protocole d'essai Si l'on dispose d'agents de réaction de haute qua- lité, la séparation entre "lié" et "libre" devient, selon notre opinion, 51 'opération la plus importante du processus de l'essai L'efficacité de la méthodologie nouvelle qui fait l'objet de la présente invention, basée sur le dispositif de séparation Lidex PS, et les caractéristiques d'auto- matisation assurées par l'instrument Pressomat (voir figure 1) ont été mises à l'épreuve avec certains des systèmes d'agents de réaction de l Oséparation les plus largement répandus des trousses qui sont disponibles dans le commerce. Les trousses commerciales 1 I-RIA, choisies de façon à procu- rer une variété d'agents de réaction de séparation couramment utilisés, qui, tous, exigent la centrifugation et la décantation dans le protocole de 151 a trousse, sont groupées en quatre catégories, suivant l'agent de réac- tion de séparation: (a) double anticorps (DAB) (trousses Prolaction et FSH); (b) double anticorps / polyéthylène-glycol (DAB/PEG) (trousses de ferritine, oestriol, cortisol, testostérone, progestérone, P-1 HCG, insuline et h PL); (c) phase solide (anticorps T 4 insolubilisé); (d) charbon de bois activé (trousse de digoxine). Tout ceci rend bien évidentes la possibilité d'application et l'effi- cacité de la méthodologie de la séparation par le Lidex sans centrifuga- tion Il est important de souligner que tous les résultats qui sont indi- qués ici ont été obtenus sans aucun travail antérieur propre à optimiser 251 'adaptation des agents de réaction des trousses commerciales pour leur emploi avec le dispositif séparateur Lidex PS Dans les cas o les ex- périences furent menées à l'aide d'agents de réaction de haute qualité et effectuées dans les meilleures canditions du protocole d'essai Lidex (temps d'incubation, volumes de réaction, agent de réaction de précipita- tion), les résultats de l'essai par la méthodologie Lidex PS se sont ré- vélés favorables par rapport à ceux que l'on obtient à partir du proto- cole d'essai à l'aide des trousses commerciales. Les résultats préliminaires indiquent qu'à l'aide de membranes 12découpées convenables, il pourrait être possible d'utiliser le dispositif séparateur Lidex immédiatement après l'opération d'incubation primaire, sans qu'il soit nécessaire dé prévoir l'addition d'un agent de réaction de précipitation ou d'adsorption. Dans le préambule de cette spécification, on a énuméré les prin- cipales conditions requises d'un procédé de séparation idéal, telles qu'elles sont formulées dans la technique antérieure Sur base des ré- sultats qui ont été obtenus, on peut dire que la méthodologie qui fait l'objet de la présente invention offre les avantages qui sont énoncés l Oci-après (I) elle assure la séparation complète, ou quasi complète, de la frac- tion liée et de la fraction libre, avec une large marge d'erreur dans les conditions appliquées pour la séparation; (II) elle ne gêne aucunement la réaction de liaison primaire antigène- anticorps; (III) elle est d'une application simple, facile et rapide; (IV) elle est peu onéreuse et permet l'emploi d'agents de réaction et d'un équipement qui sont facilement disponibles (ou qui peuvent le devenir); (V) elle n'est pas affectée par le plasma ou par le sérum; (VI) toutes les manipulations sont effectuées dans un dispositif sépara- teur à un seul tube; (VII) elle se prête dans une très ample mesure à l'automation; (VIII) elle peut trouver son application à une large gamme d'antigènes; (IX) la méthodologie et le modèle du dispositif séparateur éliminent pratiquement toutes possibilités de contact avec le mélange de réaction radio-actif, ce qui garantit le maximum de sécurité en ce qui concerne les risques d'irradiation. Bien que la présente invention ait été décrite dans son application à des formes de réalisation spécifiques, il est bien entendu qu'elle peut faire l'objet de modifications, et la présente demande de brevet est des- tinée à couvrir toutes variantes, toutes applications et toutes adaptations de l'invention qui n'ont pas été décrites ici et elle englobe toutes celles-ci, telles qu'elles peuvent se présenter dans la pratique courante et habituelle de la technique à laquelle l'invention se rapporte, en appli- cation des caractéristiques essentielles qui ont été énoncées plus haut et dans le cadre défini par les revendications qui sont fofmulées en fin de ce mémoire Afin de mieux illustrer la nature de la présente invention et la façon de mettre celle-ci en oeuvre, on en donnera ci-après des exemples d'application, et ce, aux seules fins de la faire comprendre clairement et sans que ces exemples n'aient aucune portée limitative. Exemple s La méthodologie qui fait l'objet de la présente invention a été l Oappliquée avec les agents de réaction de séparation qui sont indiqués ciaprès: a) double anticorps; b) double anticorps / PEG; c) essai phase solide, et d) charbon de bois activé. Dans chacun des cas, au moins deux expériences ont été effectuées en parallèle: l'une des expériences a été menée exactement suivant les directives de la trousse, y compris les opérations de centrifugation et de décantation; dans le cas de l'autre expérience, les directives de la trousse ont été suivies en ce qui concernait l'addition des agents de réaction, les échantillons standard, les échantillons cliniques et les temps d'incubation, si ce n'est que des séparateurs Lidex PS, des tubes à essai et l'instrument Pressomat ont été utilisés pour la séparation entre "lié" et "libre" De plus, les volumes de réaction totaux ont été réglés com- me cela était nécessaire: a) les courbes standard qui ont été obtenues pour les essais I-FSH et 125 I Prolactine (HPRL) sont indiquées sur les figures 4 b et 4 a respectivement Les valeurs de sérums cliniques obte- nues au cours des deux essais sont comparées dans les tableaux 1 (FSH) et 2 (HPRL) L'agent de réaction de précipitation était le double anticorps (I G). g b) Le double anticorps / PEG ( 20 %) a été utilisé comme agent de 14 réaction de précipitation pour l'essai 125 ferritine, qui a donné I les courbes standard indiquées sur la figire 4 c et les valeurs de sérums cliniques données dans le tableau 3 L'utilisation du sys- tème de précipitation a nécessité deux pipettages et une incubation complémentaire de 15 minutes (après l'addition du double anticorps). Il a été constaté qu'un seul pipettage d'un agent de réaction double anticorps / PEG ( 8 %) mélangé au préalable donnait lieu à une précipitation immédiate à la température ambiante et qu'aucune incubation secondaire n'était nécessaire L'efficacité de cet agent de réaction en liaison avec la méthodologie par les séparateurs Lidex est démontrée d'une manière semblable par les courbes standard qui ont été obtenues pour le I oestriol (voir figure 6 a), pour le cortisol (voir figure 6 b), pour la 125 I-testostérone (voir figure 6 c), pour la I-progestérone (voir figure 6 d), pour le 125 125 2 I HCG (voir figure 5 c), pour la 15 I-insuline (voir figure 5 d), pour le 25 I-h PL (voir figure 5 a), pour le h FSH (voir figure 5 b), pour la gastrine (voir figure 7 a), pour le h LH(voir figure 7 b), pour le P A P (voir figure 7 c) et pour l'alpha FETO protéine (voir figure 7 d). c) La méthodologie par le séparateur Lidex se prête éminemment à être utilisée pour les essais d'immunologie en phase solide A titre d'exemple, on peut citer son application à un essai en phase solide 125 I-thyroxine (anticorps immobilisé) Les courbes stan- dard sont représentées sur la figure 4 d Même si les deux cour- bes (méthode de la trousse et méthode Lidex) ne sont pas aussi superposables que dans le cas des exemples antérieurs, les va- leurs de sérums cliniques, calculées à partir de Ieurs courbes respectives, sont presque identiques (tableau 4). d) L'utilisation de charbon de bois activé, comme agent de réaction adsorbant, en liaison avec la méthodologie de séparation à l'aide du Lidex, a été démontrée avec une trousse de I 25 digoxine. Dans le cas de cet exemple, on a effectué en parallèle trois ex- périences dont les résultats, que l'on a obtenus en suivant exacte- - mentiles directives de la trousse (centrifugation et décantation de 20 minutes) pnt été comparés à ceux que l'on a obtenus par un essai avec utilisation d'un procédé d'extraction par solvant à l'aide de séparateurs Lidex LS et à ceux que l'on a obtenus par un essai avec utilisation des séparateurs Lidex PS nouveaux, comme barrière sélective Dans le cas de la deuxième expé- rience, on a compté la fraction liée transportée avec la phase liquide dans le récipient collecteur E des séparateurs en plaçant les séparateurs Lidex PS bouchés, le haut en bas, dans le réser- voir du compteur Les courbes standard qui ont été obtenues dans le cas des trois expériences sont représentées sur la figure 6 Les concentrations en digoxine des échantillons de sérums cliniques ont été déterminées au cours des trois essais par une expérience aveugle, pour comparaison avec les résultats qui a- * vaient été obtenus pour les mêmes sérums dans un autre labora- toire (laboratoire du Sheba Government Hospital) à l'aide d'une autre trousse commerciale (produits de diagnostic) Les résul- tats sont donnés dans le tableau 5. Des expériences semblables, pour la comparaison des résultats obtenus à l'aide de trousses connues, ont été effectuées au moyen de di- vers sérums cliniques et sont présentées dans les tableaux 1 à 14. Tableau 1 FSH Tableau 2 HPRL (prolactine). Tableau 3 Ferritine. Tableau 4 Thyroxine. Tableau 5 Digoxine. Tableau 6 Oestradiol. Tableau 7 Pregstat. Tableau 8 h PL. Tableau 9 h LH. Tableau 10 Oestrogène urinaire total - Tableau 11 T 3. Tableau 12 h Tg Ab. 16 - Tableau 13 TSH. Tableau 14 FSH (trousse Biodata). Des tests de comparaison ont été effectués de façon semblable pour le système HPL nosticon eliza de l'essai d'immunologie d'en- zymes, et pour l'essai d'immunologie à fluorescence en phase solide GENTA- MISINE. -17 - Tableau 1 Comparaison des valeurs de sérums cliniques PSH (m IU/ml) obtenues par le protocole de la trousse (centrifugation) et par la méthodologie Lidex PS Code du sérum Protocole trousse Protocole Lidex Hypolab M 9 L H H Q n + ( 1 nénop. : 2) "l 1:2 il 1:4 Q e'1 CE 7 LHRH Stm 0 ' "i 30 ' " 60 ' Ortho III Ortho IV Ortho 1 OT 10 ZA Ortho 1 OT 10 2 B Ortho 1 OT 10 2 C , 67 3, 75 59, 48 59, 68 47,19 53,10 0, 04 6,1 O 0, 61 3, 07 4,19 8,11 11,69 14,98 , 69 4,21 9,26 4,45 3,64 16, 03 3,47 57,59 53, 45 37,15 37, 04 44, 04 7, 01 0, 62 -3,32 ,19 9,10 1 0, 78 14,35 4,31 3,84 11,87 4, 62 2,77 18 - Tableau 2 Comparaison des valeurs de sérums cliniques HPRL (ng/ml) obtenues par le protocole de la trousse (centrifugation) et par la méthodologie Lidex PS Code du sérum Protocole trousse Protocole Lidex Hypolab M 9 11,68 13,96 M 7 1 O, 00 9, 67 L 4, 07 5, 08 H 76, 42 100, 77 H ( 1:2) 75, 64 79,80 O'o 7 Z 2,40 2,65 Ci 5,28 6,18 4, 02 4, 43 9,94 10,73 ménop $ 7,31 7, 71 ménop 9 4, 70 6,78 Ortho-Ligand T 10 2 A 1,89 1,90 T 10 ZB 1,58 1,53 1 OT 10 2 C 1,84 2,76 19 - Tableau 3 Comparaison des valeurs de sérums cliniques ferritine (ng/nl) obtenues par le protocole de la trousse (centrifuga- tion) et par la méthodologie Lidex PS no du sérum Protocole trousse Protocole Lidex Hypolab 1 t 20 2 3 71,4 70, 3 4 32,1 36,3 135,7 131 6 56,7 65,4 7 8 - Tableau 4 Comparaison des valeurs de sérums cliniques thyroxine (pg %) obtenues par le protocole de la trousse (centrifuga- tion) et par la méthodologie Lidex PS Code du sérum Protocole trousse Protocole Lidex Hypolab M 9 6, 76 6, 62 L 1,70 1,30 M 22,44 > 20 Plasma-5 9, 66 9, 80 Plasma-18 16,84 17,80 Plasma-6 9, 76 1 0,58 Plasma30 5, 05 4, 53 Plasma-20 7, 00 7, 75 Ortho-Ligand 1 OT 10 2 0, 61 0,67 1 OT 10 2 7,24 6, 74 1 OT 10 2 C 13,61 15,25 2,1 Tableau 5 Comparaison des valeurs de sérums cliniques digoxine (ng/ml) obtenues par le protocole de la trousse (centrifugation), avec le Lidex LS (extraction par solvant), par la méthodologie Lidex PS et (indépendamment) au laboratoire du Sheba Hospital (trousse différente avec centrifugation) Concentration de digoxine (ng/ml) no du Directives Lidex PS Lidex LS Sheba Hospital sérum d'essai (Membrane) (extraction (Produits de diag- Becton par solvant) nostic) Directives Dickinson d'es S ai 1 0,5 0,3 0,5 0,4 2 1,8 2,3 1,9 2,2 3 0,7 0,9 0,9 1,0 4 0,5 0,7 0,6 0,6 1,4 1,5 1,6 1,6 6 1,0 1,4 1,4 1,3 7 0,3 0,7 0,7 0,5 8 0,7 1,1 1,2 1,4 9 4,1 4,1 3,4 5,7 22 - Tableau 6 Comparaison des valeurs de sérums cliniques oestradiol (pg/ml) obtenues par le protocole de la trousse Biodata et par la méthodologie Lidex Système d'essai BIODATA LIDEX Valeurs de % PEG PEG 8 %/DAB référence Liaison max. (%) 32,2 29,0 45 N S B 3,7 6,9 9, 5 Concentrations COURBE STANDARD - Conc entr ation s 31,2 pg/ml 70,0 68,4 62,5 68,0 57,5 ,0 " 54,7 50,1 250 " 42,2 40,7 500 " 34, 3 33, 2 1000 " 28,9 24,7 2000 " 19,7 19,3 ECHANTILLONS CLINIQUES - SEROTEST 37 25047 BrS 56 SEROTEST 374, 2 477, 5 BrS 57 23 - Tableau 7 Comparaison des valeurs de sérums cliniques Preg/stat ob- tenues par le protocole de la trousse Serono et par la métho- dologie Lidex Trousse Lidex Lidex Remarques Serono PEG/DAB 8 % PEG/DAB serono Liaison 40,7 % 41,3 % 44,1 % max. C.R 1,19 1,23 1,18 1 0,93 0,94 1,06 - 2 0,96 0,99 1,03 - 3 0,96 0,97 1,0 - 4 0,94 0,97 0,99 - 0,98 1,0 1,03 - 6 0,96 0,99 1, 01 - 7 0,97 0,99 0,97 - 8 1,11 1,12 1,13 intermédiaire 9 1,12 1,16 1,19 intermédiaire 1,31 1,35 0,94 + 11 1,81 1,92 0,92 + 12 3,46 4,54 5,05 + 13 3,58 4,76 4,41 + 14 1,35 1,43 1,48 + 1,81 1,93 1,15 + 16 1,46 1,61 1,74 + -24 - Tableau 8 Comparaison des valeurs de sérums cliniques h PL (ng/ml) obtenues par le protocole de la trousse Hypolab et par la méthodologie Lidex Système d'essai HYPOLAB LIDEX Valeurs de PEG 11 % PEG 8 %/DAB référence Liaison max. (%) 69,8 73,8 65,7 N.S B 5,7 6,4 4,1 Concentrations COURBE STANDARD - Concentrations 12, 5 ng/ml 102 94,2 " 90,4 83,2 " 79,1 73,8 " 62 62 " 42 40 400 " 26,5 26 800 " 17 14,5 ECHANTILLONS CLINIQUES - SÉROTEST 94, 7 77,9 89,1 1) > 800 > 800 > 800 2) 8,1 15,6 3) 16,2 19,0 4) > 800, 800 ) 66,5 98 6) 68,0 61,3 - Tableau 9 Comparaison des valeurs de sérums cliniques H 1 H (m IU/ml) obtenues par le protocole de la trousse Hypolab et par la méthodologie Lidex Système d'essai HYPOLAB LIDEX Valeurs de PEG 8 %/DAB référence Liaison max. (%) 23,6 28,8 39,2 N.S B 2,0 5,5 1,7 COURBE STANDARD - Concentrations 2 m IU/ml 85,7 89,9 " 63,9 69,6 " 49,0 51,3 " 34,4 33,7 " 21,1 22,3 " 5,5 7,2 ECHANTILLONS CLINIQUES - SEROTEST 22,4 19,13 17,2 a) 147 13,6 14,2 2,7 b) 170 49,5 58,0 64,5 c) 180 51,5 32,6 90 d) 4,29 9, 28 e) 197 4,2 5,7 6,9 f) 202 12,1 11,2 16,5 g) 205 26,2 25,73 39,8 h) 219 6,93 8,8 11,4 i) 228 2,8 3,4 5,3 j) 230 2,3 3,4 2,8 divisa par 1 2 ( 6 ' - Tableau 10 Comparaison des valeurs de sérums cliniques T U E. (oestrogène urine total) (ng/ml) obtenues par le protocole de la trousse Hypolab et par la méthodologie Lidex Système d'essai HYPOLAB LIDEX Valeurs de Sérum support PEG 8 %o/DAB référence +PEG 20 % Liaison max. (%) 39, 4 22,8 35,9 N.S B 3,8 4,2 3,8 COURBE STANDARD - Concentrations 0, 5 ng/ml 82,8 83, 6 1 " 71,6 75,3 2 " 62, 6 64, 2 4 " 33,4 37,5 8 " 14,6 16,1 16 " 7,2 8,5 ECHANTILLONS CLINIQUES - SEROTEST 47, 3 44, 9 29,4 38, O (MHAN) 48, O femelle 54,82 49,14 mâle 47,1 42,6 Tableau 11 Comparaison des valeurs de sérums cliniques T-3 (ng/ml) obtenues par le protocole de la trousse Biodata et par la méthodologie Lidex Système d'essai BIODATA LIDEX Valeurs de PEG 20 % PEG 8 %/DAB référence Liaison max. (%) 62,9 % 60,2 % N S B 2,0 % 4,4 Concentrations COURBE STANDARD - Concentrations 0, 125 ng/ml 96, 2 96, O 0,25 " 92, 6 94,5 0,5 " 82, 1 83,2 1,0 " 59,9 61,9 2,0 " 42,7 38,9 4,0 " 25,9 26,1 8,0 " 13,4 14,3 ECHANTILLONS CLINIQUES - SEROTEST 0,82 0, 68 DIL 1,2 1,02 0,6 ng/ml ng/ml a) 0, 97 0, 96 b) 0, 52 0,71 c) 0,77 0,92 d) 1,34 1,33 e) 0, 69 0,68 f) 0, 86 0, 95 Valeurs norma- les 0,6 1,7 ng/ml : 8 - Tableau 12 Comparaison des valeurs de sérums cliniques h Tg-Ab obte- nues par le protocole de la trousse Hypolab et par la mé- thodologie Lidex Système HYPOLAB % liaison LIDEX % liaison d'essai Comptes corr Comptes corr. moyenne CM moyenne CPM T.C T C. T.C 18889,55 18887,9 Concentra COURBE STANDARD - Concentra- tions 1:1 1686,2 8,9 % 2625,7 13,9 % 1:20 2014,6 10,6 % 3902,5 20,6 % 1:100 2917,05 15,4 % 5982,25 31,6 % 1:1000 3326,95 17,6 % 7120,85 37,7 % 1:10000 5245,35 27,7 % 8347,35 44,1 % 1:20000 6269,2 33,1 % 9102,55 48,1 % 1:50000 7324,25 38,7 % 9239,1 48,9 % ECHANTILLONS CLINIQUES - P.C 4726,9 25,02 7891,5 41,7 % N.C 886,9 4,6 1880,15 9, 9 % a) 1650,15 8,7 1540,45 8,1 % b) 1570,96 8,3 1955,9 10,3 % c) 1777,25 9,4 % 29 - Tableau 13 Comparaison des valeurs de sérums cliniques TSH (,IU/ml) obtenues par le protocole de la trousse Hypolab et Sar la méthodologie Lidex. Système d'essai HYPOLAB LIDEX Valeurs de DAB/H 20 PEG 8 %/DAB référence Liaison max. (%) 40,3 % 41,8 % 58, 6 % N.S B 2,0 % 4,8 % 2,3 % COURBE STANDARD - Concentrations 0, 62 IU/ml 98, 6 95,8 1,25 " 85,7 87,2 2,5 " 76, 3 78, 6 ,0 " 49,7 59,8 ,0 " 28,1 29,8 ,0 " 14,0 18,2 ECHANTILLONS CLINIQUES - SEROTEST 4, 62 7, 94 5,1 Dil 1:2 4, 2 4, 37 4, 4 HYPOLAB LIDEX jl IU/ml ILIU/ml a) 2, 06 2,41 b) 1,78 1,98 c) 2,91 3, 05 d) 2,86 3,3 e) 2,06 2, 23 f) _ _ _ _ _ _ _ _ 1,58 1,99 cc 0- FSH Tableau 14 Comparaison des valeurs de sérums cliniques/(mn Iu/ml) ob- tenues par le protocole de la trousse Biodata et par la méthodologie Lidex BIODATA LIDEX Valeurs de PEG 11 %/DAB PEG 8 %/DAB référence Se r ono RAMBAN/HYPOLAB a) 151 2, 79 3,53 2, 7 b) 168 8,78 9,48 6, 6 c) 227 6, 55 6, 73 5, 6 d) 228 5,97 7,51 5, 6 e) 256 31,9 34, 74 34 f) 268 81,18 72, 75 60 g) 277 33,17 31,0 25 h) 651 2,4 2, 66 - i) 658 1,39 2,56 2 j) 661 1,98 2, 64 2,4 k) 681 8,98 10,56 7,8 31 - REVENDICATIONS 1 Procédé perfectionné d'exécution d'essais d'immunologie sans centrifugation, dans un dispositif spécialement conçu à cet effet, qui comporte un réservoir mélangeur dans lequel est convenablement monté un mélangeur-séparateur présentant un canal suivant l'axe vertical, le procédé étant caractérisé en ce qu'il consiste en la combinaison des opé- rations qui sont indiquées ci-après: (a) disposition des réservoirs mélangeurs sur une étagère spéciale- ment conçue pour en contenir un certain nombre, avec les mé- langeurs-séparateurs; (b) introduction des agents de réaction et des produits d'analyse dans les réservoirs mélangeurs précités; (c) couverture des réservoirs mélangeurs au moyen des mélangeurs- séparateurs précités; (d) mise à incubation des agents de réaction et des produits d'analyse pendant un laps de temps nécessaire dans les réservoirs mélan- geurs précités, couverts des mélangeurs-séparateurs; (e) mise en place de l'étagère portant les dispositifs séparateurs indi- qués plus haut, avec les agents de réaction et les produits d'ana- lyse ayant été soumis à l'incubation, dans un dispositif de presse spécialement conçu pour assurer, à une vitesse réglée, un mou- vement de descente grâce auquel les mélangeurs-séparateurs se- ront poussés vers le bas dans les réservoirs mélangeurs à une vitesse choisie et sur une distance choisie au préalable pour que soient effectués de façon complète le transfert de masse voulu et l'opération de séparation voulue; (f) commande du mouvement de descente du dispositif de presse cité ci-dessus à la vitesse et sur la distance choisie au préalable; (g) retrait de l'étagère après le dégagement du dispositif de presse, et (h) mise en place des dispositifs séparateurs dans l'instrument d'ana- lyse voulu, pour une mesure quantitative ou qualitative de l'une ou 250 '9862 de l'autre des phases séparées ou des deux phases séparées, se- Ion le résultat voulu. 2 Procédé suivant la revendication 1, caractérisé en ce que le procédé d'essai d'immunologie est choisi parmi les procédés d'essai de radioimmunologie, d'essai à chimico-luminescence, d'essai bio-immu- nologie d'enzymes, d'essai à fluorescence, d'essai immunologique de métaux et des combinaisons de ceux-ci. 3 Procédé suivant la revendication 1, caractérisé en ce que le dispositif de presse est construit sous la forme d'une presse fermée dans 0 llaquelle le déplacement de la plaque de pression est produit par un mo- teur. 4 Procédé suivant la revendication 3, caractérisé en ce que le moteur est actionné par voie pneumatique, par voie électrique, par voie hydraulique ou par un moyen consistant en une combinaison de ces modes d' actionnement. Procédé suivant la revendication 1, caractérisé en ce que l'é- tagère est conçue de façon à faire apparaître au rmaximum le réservoir mélangeur tel qu'il se présente au cours de l'essai. 6 Procédé suivant la revendication 1, caractérisé en ce que le mélangeur séparateur est muni d'une barrière 7.Procédé suivant l'une quelconque dès revendications 1 à 6,ciractérisé en ce qu'il est mis en oeuvre d'une manière automatique. 8-Procede suivant l'une quelconque des revendications 1 à 7,caracterisg en te aue l'essai d'immunologie ' est utilisé pour la détermination d'an- tigènes, d'hormones, de barbiturates, de stéroides, de vitamines, de tranquilliseurs, de médicaments et d'alcaloides. 9 Procédé suivant la revendication 8, caractérisé en ce qu'il est appliqué au FSH. Procédé suivant la revendication 8, caractérisé en ce qu'il est appliqué au HPRL. 11 Procédé suivant la revendication 8, caractérisé en ce qu'il est appliqué à la ferritine. 12 Procédé suivant la revendication 8, caractérisé en ce qu'il 33 - est appliqué à la thyroxine. 13 Procédé suivant la revendication est appliqué à la-digoxine. 14 Procédé suivant la revendication est appliqué à l'oestradiol. Procédé suivant la revendication est appliqué au pregstat. 16 Procédé suivant la revendication est appliqué au h PL. 17 Procédé suivant la revendication est appliqué à l'oestrogène urinaire total. 18 Procédé suivant la revendication est appliqué au T 3. 19 Procédé suivant la revendication est appliqué au h Tg-Ab. Procédé suivant la revendication est appliqué au TSH. 21 Procédé suivant la revendication est appliqué au système HPL nosticon eliza d'enzymes. 8; caractérisé en ce qu'il 8, caractérisé en ce qu'il 8, caractérisé en ce qu'il 8, caractérisé en ce qu'il 8, caractérisé en ce qu'il 8, caractérisé en ce qu'il 8, caractérisé en ce qu'il 8, caractérisé en ce qu'il 8, caractérisé en ce qu'il de l'essai d'immunologie 22 Procédé suivant la revendication 8, caractérisé en ce qu'il est appliqué à l'essai d'immunologie à fluorescence en phase solide GENTAMISINE. 23 Procédé suivant l'une auelconnue des revendications 1 c ?, carac- térisg en ce au'il Dermet d'effectuer l'essai d'immunoloie sans centrifugation.