FR 2510759 A1 19830204 FR 8213243 A 19820729 De nombreuses substanceschimiques différen- tes sont métabolisées par le corps humain Très fréquem- ment, il se déroule un certain nombre de réactions chimiques et/ou biochimiques qui font subir à un composé précurseur une multiplicité de changements de structure o l'un des composés intermédiaires de celui-ci est un facteur clé dans des filières biochimiques différentes, mais interdépendantes En conséquence, il devient très souhaitable d'être à même de déterminer, d'une façon qualitative et/ou quantitative, la présence de divers intermédiaires métaboliques dans un échantillon de fluide biologique provenant d'un patient. Pour déceler qualitativement et/ou mesurer quantitativement la présence d'un intermédiaire métabo- lique, il est courant de recourir à l'utilisation d'un dosage par fixation compétitive de protéines Ordinaire- ment, pour effectuer un dosage par fixation compétitive, on obtient le métabolite intermédiaire à partir d'une source existant dans la nature et/ou on le synthétise à partir d'un composé précurseur, et on l'utilise sous une forme marquée pour le soumettre à une fixation compétitive à un fixateur ou récepteur complémentaire en compétition avec la quantité inconnue de métabolite intermédiaire non marqué que contient l'échantillon provenant du patient Ceci nécessite la mise en oeuvre d'un métabolite intermédiaire caractérisé par un degré de stabilité suffisant pour lui permettre d'être utilisé comme réactif de dosage, c'est-à-dire d'un métabolite demeurant sensiblement inaltéré pendant une durée de stockage raisonnable, allant par exemple d'au moins une semaine jusqu'à trois ou quatre semaines ou davantage. A titre d'exemple de métabolite intermédiaire du type ci-dessus considéré, on peut mentionner l'acide N-5-méthyltétrahydrofolique, qui est un métabolite intermédiaire de l'acide folique L'acide N-5-méthyl- tétrahydrofolique est un constituant du sang, et il est important de le doser pour diagnostiquer les carences en acide folique En fait, chez l'homme, l'acide folique et la vitamine B 12 sont métaboliquement en interdépen- dance Il est essentiel d'être à m 9 me de déterminer les teneurs du sérum en acide N-5-méthyltétrahydrofolique et en vitamine B 12 pour pouvoir mettre en évidence et traiter l'anémie mégaloblastique chez l'homme Les carences en vitamine B 12 et en folates sont hématologi- quement et cliniquement indiscernables les unes des autres Très fréquemment, on opère des dosages simulta- nés de la vitamine B 12 et de l'acide N-5-méthyltétra- hydrofolique. Le problème de stabilité de l'acide N-5- méthyltétrahydrofolique se trouve aggravé dans le dosage simultané vitamine B 12/folates en raison du fait que le stabilisant qui est prévilégié pour la stabilisation de l'acide N-5-méthyltétrahydrofolique, à savoir l'acide ascorbique, perturbe le dosage de la vitamine B 12 par fixation compétitive. Il est connu dans l'art antérieur de conserver à l'état lyophilisé en ampoules scellées sous atmosphère d'azote les métabolites intermédiaires sensibles tels que l'acide N-5-méthyltétrahydrofolique Une telle technique est très incommode pour la préparation d'un jeu de réactifs, et elle n'est en outre pas à m 9 me de prolonger la stabilité après reconstitution, cette stabilité n'étant que d'environ trois jours à 4 C pour l'acide N-5-méthyltétrahydrofolique. L'un des buts de la présente invention est de fournir un procédé de stabilisation d'un métabolite intermédiaire. Un autre but de l'invention est de fournir un procédé de stabilisation de métabolites intermé- diaires sous la forme d'un réactif pour dosage par fixa- tion compétitive de protéines. Un autre but encore de l'invention est d'obtenir un métabolite intermédiaire stabilisé sans faire appel à un stabilisant chimique classique. 2510759. L'invention a encore pour autre but de fournir un jeu de réactifs de dosage par fixation compé- titive, tel qu'un jeu de réactifs de radio-dosage, compor- tant des métabolites intermédiaires stabilisés conformé- ment à la présente invention. Un but plus spécifique de la présente inven- tion est de fournir un procédé de stabilisation de l'acide N-5méthyltétrahydrofolique ainsi que de fournir le produit stable qui résulte de sa mise en oeuvre. D'autres buts de la présente invention apparattront au technicien averti à la lecture de la des- cription détaillée de l'invention qui sera donnée plus loin. Selon la présente invention, un métabolite intermédiaire sensible et instable est stabilisé par complexation de celui-ci avec son fixateur ou récepteur complémentaire, formé de préférence par une protéine fixatrice ou réceptrice Plus précisément, selon la présente invention, la complexation est effectuée dans 2 C un milieu liquide, et le mélange est ensuite rapidement congelé et déshydraté à l'état congelé, c'est-à-dire lyophilisé Le produit obtenu est une poudre sèche. Dans une forme de mise en oeuvre préférée de l'invention, le métabolite intermédiaire instable est de l'acide N-5-méthyltétrahydrofolique L'acide N-5-méthyltétrahydrofolique peut gtre complexé avec un fixateur complémentaire protéinique ou non protéinique de celui-ci tel qu'un fixateur obtenu à partir de lait de bovin. Dans d'autres formes de mise en oeuvre préférées de la présente invention, le complexe stable, sous forme lyophilisée, est un réactif de dosage par fixation compétitive de protéines. On va donner un exemple de mise en oeuvre de la présente invention en prenant l'acide N-5-méthyl- tétrahydrofolique comme métabolite intermédiaire. Toutefois, la Demanderesse est convaincue que le cadre de l'invention, plus vaste, englobe d'autres métabolites intermédiaires et leurs fixateurs complémentaires. Par exemple, l'acide N-5-méthyltétrahydrofolique devrait être' remplaçable par d'autres métabolites de l'acide folique, tels que l'acide N-10-formyltétrahydrofolique, l'acide N-5-formiminotétrahydrofolique, l'acide N-5- formyltétrahydrofolique et l'acide N-5, N-10-méthylène- tétrahydrofolique, par des substrats enzymatiques, par la vitamine B 12, par la vitamine D, etc, le fixateur complémentaire leur correspondant étant connu du spécia- liste en la matière. Pour l'acide N-5-méthyltétrahydrofolique, on connaît diverses protéines se fixant aux folates, telles, par exemple, que celles extraites de divers organes d'animaux, et notamment reins, foies et pancréas, que les préparations de P-lactoglobulines, le sérum de dauphin, le lait des bovins, le lait de chèvre et similaires. Bien que la stabilité du métabolite inter- médiaire se trouve accrue du seul fait de la complexation, les pleins avantages de la présente invention ne se trouvent atteints que si le complexe est ensuite congelé et déshydraté pour fournir une poudre sèche Plus pré- cisément, le métabolite intermédiaire et son fixateur sont mélangés dans un milieu liquide, usuellement à base aqueuse, sous des conditions propres à permettre au métabolite de se fixer à son récepteur De telles réactions sont bien connues en biochimie En général, on recourt à des conditions d'incubation douces, par exemple à température allant jusqu'au voisinage de la température ambiante, l'incubation pouvant cependant être opérée à des températures comprises entre le voisinage immédiatement supérieur à la température de congélation du mélange et une température inférieure à celle à laquelle un fixateur sensible à la chaleur tel qu'une protéine se trouverait détruit, pendant une durée brève, de l'ordre par exemple d'environ 15 minutes 10759 à 1 heure D'une façon générale, les températures adoptées sont d'autant plus basses que les durées d'incubation sont plus longues. Il est très commode d'effectuer la complexation dans un milieu liquide présentant une composition semblable ou à peu près identique à celle du milieu dans lequel le complexe est censé être utilisé -sous-forme reconstituée à une-date ultérieure Ainsi, divers additifs tels que des sels de tamponnage, de l'albumine de sérum humain, d'autres protéines et simi- laires, qui devront être présents après reconstitution, peuvent ttre présents dans le liquide contenant le complexe, pour autant que ces additifs ne perturbent pas la formation du complexe ou la lyophilisation qui lui fait suite. Au terme d'une durée d'incubation appropriée, la composition est lyophilisée en procédant d'une façon connue en soi La poudre sèche obtenue peut être conser- vée dans tout récipient approprié, de préférence herméti- que et arr 9 tant la lumière Comme on le verra dans les exemples ci-après, la conservation peut s'effectuer à la température ambiante ou à une température plus basse Si le complexe ne doit pas ttre utilisé pendant un long intervalle de temps, il est préférable que la température de stockage soit basse. Pour la reconstitution, il suffit d'ajouter à la poudre sèche lyophilisée le même liquide ou un liquide autre que celui utilisé lors de la formation du complexe, puis de mélanger On peut par exemple faire appel à un mélangeur à tourbillon ' Très fréquemment, il est souhaitable d'uti- liser le métabolite intermédiaire dansson état chimique libre, si bien qu'il devient nécessaire de libérer le métabolite intermédiaire du fixateur et d Uempecher le complexe de se reformer Ceci peut 9 tre effectué de nombreuses façons différentes Lorsqu'on recourt à un fixateur protéinique, le mode de libération le plus simple est de chauffer le produit reconstitué à une température et pendant une durée suffisantes pour donner lieu à la destruction de la protéine fixatrice, à savoir par exemple à environ 95 C pendant environ 10 à 30 minutes dans de nombreux cas. Les exemples ci-après illustrent l'application de la présente invention à un métabolite intermédiaire type constitué par l'acide N-5-méthyltétrahydrofolique. EXEMPLE I: Dans cet exemple sont utilisées six paires d'échantillons de valeur étalon d'acide N-5-méthyl- tétrahydrofolique qui contiennent les concentrations d'acide N-5méthyltétrahydrofolique qui contiennent les concentrations d'acide N-5méthyltétrahydrofolique indiquées dans le Tableau 1 ci-après Chaque échantillon de valeur étalon a un volume de 100 microlitres, et sa composition comprend, en plus de l'acide N-5-méthyl- tétrahydrofolique, des sels tampons, du chlorure de sodium, de l'azoture de sodium, du merthiolate et de l'albumine de sérum humain. A l'un des échantillons de chaque paire est ajoutée la quantité de protéine fixatrice de folate d'origine bovine indiquée dans le Tableau 1 Après mélange, on fait incuber l'échantillon à 4 C pendant 3 heures Immédiatement après, chaque échantillon est lyophilisé pour fournir une poudre sèche Chaque échan- tillon est reconstitué au jour O en utilisant de l'eau désionisée, et la quantité de folate qui y est présente est évaluée par radio-dosage au jour 0, au jour 4, au jour 8 et au jour 14 Pendant la durée de l'étude, tous les échantillons reconstitués sont maintenus à 4 C. Le jour O est le jour de la lyophilisation En recourant à une technique de réduction de données, on détermine la quantité d'acide N-5méthyltétrahydrofolique (en ng/ml) pour chaque échantillon Les résultats sont indiqués dans le Tableau 1. 0 % L'I rl- CD Lré CIJ TABLEAU 1 Sans protéine fixatrice de folate *Valeur étalon **Protéine nominale fixatrice ajoutée Avec protéine fixatrice de folate Jour 4 8 -0906 0106 01,60 0 $ 62 199 155 397 211 8,3 6 t 4 1358 11,7 Jour 2,2 4,5 -0108 ot 84 14 O O $ 03 2 tl 21 ti -01)04 O.à 84 2,3 21 6 2.j 5 O ,0 16 $ 6 33,2 66,4 ng/ml d'acîde N-5-m'thyltétrahydrofolique ** mierogrammes par ml EXEMPLE 2: Une fraction de chacun des échantillons reconstitués de l'Exemple I a été conservée à la tempé- rature ambiante pendant 8 jours et on l'a analysée en procédant comme à l'exemple 1 Le Tableau 2 ci-après indique les résultats obtenus Les valeurs au jour O sont bien entendu les m 9 mes qu'à l'Exemple 1. TABLEAU 2 Valeur Protéine étalon fixatrice nominale de folate (ng/ml) ajoutée (g/ml) Sans protéine fixatrice de folate Jour Avec protéine fixatrice de folate Jour 0 O I 5,5 2,5 8,5 5,0 16,6 ,0 3355,2 ,0 66,4 EXEIPLE 3:' -0,10 0,30 0,85 1,9 ,4 6,6 0,28 0,30 0,41 0,87 1,5 2,6 -0,01 0,66 2,4 4,7 ,1 18,5 0,24 0,87 2,0 3,6 8,4 18,6 Des échantillons d'acide N-5-méthyltétra- hydrofolique complexé avec une protéine fixatrice de fo- late sont préparés comme à l'exemple 1, et conservés après reconstitution à 40 C Leur concentration en acide N-5-méthyltétrahydrofolique est déterminée en procédant comme à l' Exemple 1, mais au bout de 0, 2, 5, 4, 5, 6, 7 et 8 semaines Les résultats obtenus sont rassemblés dans le Tableau 5 ci-dessous. TABLEAU 3 Valeur étalon nominale (ng/ml) O 2 1,0 1,7 1,5 2,5 5,1 5,0 ,0 6,6 5,9 10,0 11,8 10,9 ,0 20,6 20,1 Semaines & 4 C 1,3 2,8 ,7 9,9 ,4 1,5 2,5 ,7 9,8 ,3 1,2 2,2 4,7 8,9 __ 1, 0 1,9 ,0 9,1 ,9 1,1 2,3 ,5 108,1 18,4 0,8 2,0 ,7 11, 1 19,7 19,7 EXEMPLE 4: Une série d'échantillons lyophilisés conformes à ceux utilisés à l'Exemple 3 est conservée à environ 4 C, et on reconstitue les échantillons le jour de l'analyse Des mesures sont effectuées aux semaines , 6, 7 et 8 Leurs résultats sont rassemblés dans le Tableau 4 ci-après. TABLEAU 4 Fraichement reconstitué Semaines & 4 C _ 6 7 8 1,0 1,2 1,3 1,5 1,1 2,5 2,7 2,7 2,7 2,9 ,0 4,2 6,1 5,6 5,8 10 11,5 11,4 11,4 22,7 19,1 18,4 Des variantes de l'invention apparaîtront au technicien expérimenté Par exemple, d'un point de vue générique, le récepteur pourrait être non protéinique, comme par exemple une résine d'échange d'ions, une colonne de matière hydrophobe ou analogue offrant prise à la fixation de petites molécules De plus, des expériences in vitro ont montré que des particules de verre sont capables d'imiter le comportement de surfaces réceptrices protéiniques Parfois, alors que le récepteur est une protéine, la fixation s'effectue par une portion non protéinique de la protéine, telle qu'une portion moléculaire glucidique, lipidique et/ou peptidique de celle-ci. REVE-NDI Cit TIOI 75 1 Procédé pour la stabilisation d'un méta- bolite intermédiaire, caractérisé en ce qu'il comprend la complexation du métabolite intermédiaire dans un milieu liquide avec un fixateur ou récepteur complémen- taire de celui-ci, puis la lyophilisation du complexe ainsi formé pour obtenir une poudre sèche contenant le complexe stable. 2 Procédé selon la revendication 1, caracté- risé en ce que le fixateur ou récepteur est une protéine. 3 Procédé selon la revendication 2, carac- térisé en ce que le métabolite intermédiaire est dans un liquide à base aqueuse, en ce que l'on y mélange la protéine fixatrice ou réceptrice et en ce que l'on fait incuber le mélange ainsi obtenu à une température comprise entre le voisinage immédiatement supérieur de la tempéra- ture de congélation du mélange et le voisinage immédiate- ment inférieur de la température à laquelle la protéine fixatrice ou réceptrice serait détruite pendant une durée suffisante pour-former le complexe préalablement à la lyophilisation. 4 Procédé selon l'une quelconque des reven- dications 1 et 3, caractérisé en ce que le métabolite intermédiaire est un dérivé de l'acide folique ou analogue. Procédé selon la revendication 1 ou 3, caractérisé en ce que le métabolite intermédiaire est l'acide N-5-méthyltétrahydrofolique. 6 Procédé selon l'une quelconque des reven- dications 1 et 3, caractérisé en ce que le liquide con- tient au moins un ingrédient additionnel dont la présence est souhaitée lorsque le produit lyophilisé est reconsti- tué pour utilisation. 7 Procédé selon la revendication 6, caractérisé en ce que le métabolite intermédiaire est un dérivé de l'acide folique ou analogue. Z 510759 il 8 Procédé selon la revendication 6, carac- térisé en ce que le métabolite intermédiaire est l'acide N-5méthyltétrahydrofolique. 9 Complexe stable d'un métabolite intermé- diaire complexé avec un fixateur ou récepteur de celui-ci sous forme de poudre sèche lyophilisée. Complexe selon la revendication 9, carac- térisé en ce que le fixateur ou récepteur est une protéine. 11 Complexe selon la revendication 9 ou 10, caractérisé en ce qu'il est préparé par un procédé selon la revendication 1 ou 3. 12 Complexe selon la revendication 9 ou 10, caractérisé en ce que le métabolite intermédiaire est un dérivé de l'acide folique ou analogue. 13 Complexe selon la revendication 11, caractérisé en ce que le métabolite intermédiaire est un dérivé de l'acide folique ou analogue. 14 Complexe selon la revendication 9 ou 10, caractérisé en ce que le métabolite intermédiaire est l'acide N-5-méthyltétrahydrofolique. Complexe selon la revendication 11, caractérisé en ce que le métabolite intermédiaire est l'acide N-5-méthyltétrahydrofolique. 16 Utilisation du complexe de métabolite intermédiaire stabilisé selon l'une quelconque des reven- dications 9 à 15, dans un dosage par fixation compétitive. 17 Utilisation du complexe de métabolite intermédiaire stabilisé selon l'une quelconque des reven- dications 9 à 15, dans un jeu de réactifs de dosage par fixation compétitive.