FR 2501507 A1 19820917 FR 8203942 A 19820309 PREPARATION D'INSULINE STABILISEE ET PROCEDE POUR SA FABRICATION. La présente invention concerne unenouvelle pré- paration d'insuline stabilisée qui est spécialement adaptée àl'utilisation dans un équipement qui débite de l'insuline en continu. Elle concerne également un procédé pour la fabrication d'une telle préparation d'insuline stabilisée Ces dernières années, des efforts de plus en plus importants ont été consacrés au développement de dispositifs portatifs ou implantables pour l'infusion d'insuline en continu, le but principal de ces efforts étant de mettre à la disposition d'un patient diabétique un régime de traitement d'insuline qui est mieux adapté. aux variations journalières de ses besoins physiolo- giques d'insuline que le traitement d'insuline habituel. La partie mécanique d'un dispositif de débit d'insuline en continu comprend essentiellement comme éléments un réservoir d'insuline, un système de pompage et un cathéter adéquat pour débiter l'insu- line à l'endroit choisi qui est d'habitude en posi- tion.sous-cutanée, intraveineuse ou dans la cavité péritonéale. Le système de pompage peut être enclenché automatiquement et peut aussi être muni d'un réglage supplémentaire volontaire pour débiter l'insuline à des moments de besoins spécifiques. Si la solution d'insuline est administrée par une seringue, celle-ci fonctionnera également d'habitude comme un réservoir d'insuline. Des dispositifs du type à seringue sont généralement portés en dehors du corps. Cependant, des dispositifs beaucoup plus compliqués ont également été développés, dispositifs dans lesquels la partie mécanique entière est construite de façon à être implantée, d'habitude en position sous-cutanée. Le réservoir d'insuline est généralement adapté pour un rechargement percutané. La tendance de l'insuline de se séparer par précipitation des solutions obtenues dans le commerce, en obstruant ainsi les parties mécaniques et le cathéter, constitue l'inconvénient majeur pour des développements ultérieurs et une application médicale sûre d'un appareil d'infusion en continu. En outre, il y a des raisons évidentes pour essayer de diminuer les dimensions des dispositifs du type à débit en continu et il est donc nécessaire d'avoir des solutions d'insuline plus concen- trées que celles disponibles jusqu'à présent, ce qui peut encore aggraver les problèmes expliqués ci-dessus. On suppose généralement que l'explication du phé- nomène de précipitation doit être cherchée dans la tendan- ce qu'a l'insuline à former des fibrilles insolubles, particulièrement quand les solutions sont maintenues à des températures élevées pour de longues périodes. Il est également évident de montrer que tout type de mou- vement de la solution ou dans celle-ci, v compris par exemple la turbulence causée lors d'un passage de la solution à travers ou près d'une lumière ou d'un orifice, cause la fibrillation de l'insuline. Il est évident que des solutions d'insuline sont soumises à la plupart ou à toutes les actions du genre de celles exercées dans les dispositifs de débit en continu. Les inconvénients généraux, à cet égard, des préparations d'insuline de l'art antérieur sont bien mentionnés dans la littérature, par exemple-dans un article récent de W.D. Lougheed et al. (Diabetologia vol. 19 (1980) pages 1 à 9). Afin de résoudre ce Problà,e, on a prcposé d'utiliser des solutions d'insuline acides ou des formulations d'insuline neutres contenant un sucre, par exemple du glucose (D.S. Schade et al.: Satelite-Symposium to 16th European Association for the Study of Diabetes-Meeting, Grèce, 22 23 Sept., 1980, p. 107) ou un tensio-actif synthétique non-ionique (H. Thurow: demande de brevet allemand n0 P 2 952 119.5). 250 1507 Cependant, l'insuline est chimiquement instable dans les acides, même endessous de la température du corps, et peut réagir de façon réversible ou irréversible avec des hydrates de carbone. En outre, le tensio-actif non physiologique mentionné ci-dessus peut être considéré comme indésirable dans les médicaments à usage paren- téral. Suivant l'invention, de tels inconvénients sont surmontés en fournissant une nouvelle solution d'insuline dans laquelle l'insuline a essentiellement moins tendance de précipiter sous des conditions régnant dans des dis- positifs à débit d'insuline en continu que ce n'est le cas avec les prénarations d'insuline usuelles. L'invention est basée sur la découverte que des ions de calcium ou de magnésium peuvent, à cer- taines concentrations, exercer un effet stabilisateur sur les solutions d'insuline. Ceci est surprenant puisqu'on sait que le calcium,comme beaucoup d'ions métalliques bivalents,forme des complexes légèrement solubles avec l'insuline et diminue la solubilité de l'insuline - zinc à pH neutre (J.E. Pitts et al.: Insulin, Chemistry, Structure and Function of Insulin and Related Hormones, p. 674 (Walther de Gruyter & Co. 1980); S.0. Emdin et al.: Diabetologia 19 (1980), pages 174 à 182). La présente invention fournit une préparation d'insuline comprenant de l'insuline - zinc en solution, un agent conservateur et, éventuellement, un agent régulateur de pression osmotique non ionisant et/ou un tampon de pH qui ne forme pas de complexe ou de composés légèrement solubles avec les ions de calcium ou de magnésium, cette préparation d'insuline convenant pour un usage dans des dispositifs débitant de l'insuline du fait qu'elle est physiquement stable sous les condi- tions qui y règnent, ladite préparation d'insuline étant carac- térisée en ce qu'elle comprend du calcium ou du magnésium sous 250 1507 une forme essentiellement ionisée à une concentration suffisante pour conférer la stabilité physique nécessaire à la préparation, mais insuffisante pour y provoquer la précipitation de l'insuline sous des conditions nor- males. Suivant un second aspect, la présente invention fournit également un procédé de fabrication d'une prépara- tion d'insuline qui convienne pour l'usage dans les dis- positifs débitant de l'insuline. en étant physique- ment stable sous les conditions qui v règnent, ce procédé étant caractérisé en ce qu'on met de l'insuline en solution ensemble avec du calcium ou du magnésium sous une forme essentiellement ionisable et à une concen- tration suffisante pour assurer à ladite solution la sta- bilité physique nécessaire mais insuffisante pour y provoquer la précipitation de l'insuline sous des conditions normales, en ce qu'on ajoute un agent conser- vateur et, éventuellement, un agent régulateur de pression osmotique non ionisant et/ou un tampon de pH qui ne forme pas de complexe ou de composés légèrement solubles avec les ions de calcium ou de magnésium. La présente invention sera mieux comprise au moyen de la description détaillée des modes d'exécution préférés de l'invention. Généralement, la stabilité des solutions d'insu- line (mesurée suivant la méthode décrite ci-après) augmente avec l'augmentation de la concentration de Ca++ ou Mg++ jusqu'à un point o il peut se produire une précipitation quasi instantanée de l'insuline. A température ambiante, la limite supérieure de la concentration de Ca++ ou Mg exempte de précipitation diminue d'environ 10 2 molaire jusqu'environ 3 x 10 3 molaire pour lé domaine de concentration d'insuline correspondant à 5 à 50 unités internationales (U.I.) par ml, et jusqu'à environ 2 x 10-3 molaire pour le domaine de concentration correspondant à 50 à 1000 U.I. par ml. Suivant un mode de réalisation préféré de l'invention, la molarité des ions de calcium ou de magnésium dans la préparation ne dépasse pas ces limites respectives, et elle n'est de préférence pas inférieure à environ 0,4 x 10-3. On préfère les sels dé calcium ou de magnésium d'acides minéraux, tels que ceux de l'acide chlorhydrique, sulfurique et nitrique; les sels de calcium sont particulièrement préférés. De préférence, la concentration molaire totale des autres sels métalliques que ceux de calcium ou de magnésium, comme par exemple les sels de sodium, n'excède pas 0,01, et on évite de préférence la présence d'anions précipitant ou complexant le calcium ou le magnésium, comme par exemple du phosphate, du gluconate, du citrate ou de l'acétate. Par conséquent, si on désire l'isotonie et la capacité tampon d'une solution d'insuline, la première est, de préférence, réalisée au moyen d'un non- électrolyte, comme par exemple le glycérol, et la deuxième est réalisée au moyen d'un tampon non complexant, comme par exemple du TRIS. Un autre mode d'exécution préféréde l'invention im- plique l'utilisation d'insuline porcine, bovine ou humaine, dont la teneur en zinc ne dépasse pas 1 % en poids (calculée sur la base de cristaux d'insuline secs). La concentration d'insuline dans la solution se situe de préférence dans l'intervalle de 5 à 1500 U.I., plus particulièrement dans l'intervalle de 40 à 1000 U.I., par ml. Un mode de préparation typique pour les solutions d'insuline de l'invention comprend la dissolution d'in- suline-zinc cristalline, par exemple une qualité hautement purifiée d'insuline, telle que de l'insuline "monoconstituant" ( voir le brevet GB 1 285 023) dans l'eau en présence d'acide, par exemple de l'acide chlor- hydrique. On prépare séparément une solution d'un agent conservateur, par exemple du phénol ou un alkylphénol, 250 1507 comme du crésol, ou du parahydroxybenzoate de méthyle, con- tenant également, si on le désire, un régulateur de pression osmotique, comme du glycérol, de préférence en une quantité calculée pour rendre la solution finale isotonique. Cette solution est ensuite ajoutée à la solution d'insu- line acide et on ajoute ensuite une base, par exemple une solution d'hydroxyde de sodium, pour ajuster le pH à la neutralité. Dans cette description, il faut entendre par neutralité, une valeur de pH comprise dans l'intervalle d'environ 7 à environ 8. Les quantités calculées de sel de calcium ou de magnésium, parexemple du dihydrate de chlorure de calcium ou de l'hexahydrate de chlorure de magnésium, et le tampon (si on le désire), comme du TRIS, peuvent être ajoutés à cette étape qui est suivie d'un nouveau réglage de pH. Le sel de calcium ou de magnésium peut, en variante, être dissous dans la solution d'insuline acide avant la neutralisation de celle-ci. La solution obtenue est finalement portée au volume calculé avec de l'eau, stérilisée par filtration et ensuite transférée dans des fioles stériles. La présente invention fournit également un procédé pour l'injectionde l'insuline dans le corps humain caractérisé en ce que la préparation d'insuline utilisée à-cet effet est une préparation d'insuline comprenant de l'insuline - zinc en solution, un agent conservateur et, éventuellement, un régulateur de pression osmotique non ionisant et/ou un tampon de pH qui ne forme pas de complexe ou de composés légèrement solubles avec les ions de calcium ou de magnésium,cette préparation d'insuline convenant pour l'utilisation dans des dispositifs débitant de l'insulinedufaitqu'elleest physiquement stable sous des conditions qui y règnent,ladite préparation d'insuline étant caractérisée en ce qu'elle comprend du calcium ou du magnésium sous une forme essentiellement ionisée à une concentration suffisante ?501507 pour conférer la stabilité physique nécessaire à la préparation,mais insuffisante pour y provoquer la pré- cipitation de l'insuline sous des conditions normales. Essai de stabilité Les solutions d'insuline ainsi préparées sont soumises à un test de stabilité sous des conditions forcées de la manière suivante: Des fioles (d'une capacité de 12,5 ml) contenant l'échantillon (10 ml) et pourvues chacune d'un bouchon en- caoutchouc sont disposées verticalement sur une plate-forme vibrante (Type 01 T623TBSHO2, vendu par HETO, Birker6d, Danemark) qui est entièrement immergée dans un bain d'eau maintenu à une température de 41 C + 0,1 C. La plate-forme est soumise à des mouvements oscillants horizontaux d'une fréquence et d'une amplitude de respectivement 100 cycles/minute et 50 mm. L'opalescence des échantillons est surveillée à des intervalles de temps réguliers sur un néphélomètre de Fischer DRT 1000 muni d'une adaptation pour fioles. Le temps de fibrillation est défini comme étant le laps de temps s'écoulant jusqu'à ce que l'échantillon dévelop- pe une turbidité de 10 unités de turbidité néphélométri- ques (NTU). Chaque essai est effectué avec des échantillons à essayer et des échantillons de contrôle sans ajout de sel de calcium ou de magnésium (4 à 5 fioles de chacun), traités l'un à côté de l'autre. Le facteur de stabilité est calculé comme étant le rapport du temps de fibrillation moyen des échantillons d'essai sur celui des échantillons de contrôle. Des détails supplémentaires pour la mise en pratique de la présente invention sont donnés dans les exemples suivants qui, cependant, n'imposent aucune limitation au domaine de l'invention. Dans les exemples, les solutions aqueuses et l'eau sont stérilisées, les premières par filtration, et les opérations ultérieures sont effectuées dans des conditions aseptiques. Exemple 1 500 U.I. d'insuline par ml dans une solution 2 x 10-3 molaire de chlorure de calcium On dissout une insuline porcine monoconstituant cristalline (7, 44 g) contenant 0,4 % de zinc et ayant une activité totale de 200.000 U.I. dans de l'eau (250 ml) contenant de l'acide chlorhydrique (6,5 ml HCl 1N) , puis on ajoute une solution aqueuse (100 ml) contenant du glycérol (6,4 g) et du phénol (0,8 g). On ajuste le pH de la solution à 7,5 au moyen d'une solution d'hydroxyde de sodium et on porte le volume total à 400 ml avec de l'eau. On ajoute 29,4 mg de dihydrate de chlorure de calcium àune partie aliquote de ladite solution (100 ml) et la solution résultante est stérilisée par filtration et puis transféréede manière aseptique dans desfioles(10 ml). Facteur de stabilité: >25. Exemple 2 500 UI. d'insuline par ml dans une solution 3 x 10-3 et 0,02 molaire respectivement de chlorure de calcium et de TRIS On dissout de l'insuline porcine monoconstituant cristalline (3,72 g) contenant 0,4 % de zinc et ayant une activité totale de 100.000 U.I. dans de l'eau (125 ml) contenant de l'acide chlorhydrique (3,25 ml HCl 1N), puis on ajoute une solution aqueuse (50 ml) contenant du glycérol (3,2 g) et du phénol (0,4 g). On règle le pH à 7,5 au moyen d'une solution d'hydroxyde de sodium. On ajoute du TRIS (0,48 g) et du chlorure de calcium (88 mg de dihydrate). Le pH est réajusté à 7,5 avec de l'acide chlorhydrique et on porte le volume à un total de 200 ml avec de l'eau. La solution obtenue est stérilisée par filtration et ensuite transférée de manière aseptique dans des fioles (10 ml). Facteur de stabilité: 5,1. Exemple 3 500 U.I. d'insuline par ml dans une solution 0,5 x 10-3 molairede chlorure de calcium On dissout de l'insuline porcine monoconstituant cristalline (5,58 g) contenant 0,4 % de zinc et ayant une activité totale de 150.000 U.I. dans de l'eau (150 ml) contenant de l'acide chlorhydrique (4,9 ml HC1 1N) et du chlorure de calcium (22 mg de dihydrate), puis on ajoute une solution aqueuse (100 ml) contenant du glycérol (4,8 g) et du phénol (0,6 g). On règle le pH de la solution à 7,5 au moyen d'une solution d'hydroxyde de sodium et on porte le volume total à 300 ml avec de l'eau. La solution résul- tante est stérilisée par filtration et on la transfère ensuite de manière aseptique dans des fioles (10 ml). Facteur de stabilité: 2,3. Exemple 4 500 U.I. d'insuline par ml dans une solution 2 x 10-3 molaire de chlorure de calcium La méthode est analogue à celle de l'exemple 3, sauf que l'on ajoute 88 mg de dihydrate de chlorure de calcium fournissant donc une solution contenant 0,002 M de chlorure de calcium. Facteur de stabilité: >25 Exemple 5 U.I. d'insuline par ml dans une solution 2 x 10-3 molaire de chlorure de calcium On dilue 300 ml d'une solution d'insuline préparée suivant l'exemple 4 par 450 ml d'une solution aqueuse neutre contenant du glycérol (7,2 g), du phénol (0,9 g) et du chlorure de calcium (132 mg de dihydrate). La solution d'insuline obtenue contenant U.I./ml est stérilisée par filtration et transférée de manière aseptique dans des fioles (10 ml). Facteur de stabilité: 12 Exemple 6 U.I. d'insuline par ml dans une solution 2 x 10-3 molaire de chlorure de calcium On dissout de l'insuline porcine monoconstituant cristalline contenant 0,4 % de zinc et ayant une activité totale de 40.000 U.I. dans 120 ml d'eau contenant de - l'acide chlorhydrique (1280 pl HC1 1N), puis on ajoute une solution aqueuse (730 ml) de phénol (2 g) et de glycérol (16 g). On ajoute une solution aqueuse (40 ml) contenant de l'hydroxyde de sodium (2000 pl NaOH 1N), puis on ajoute une solution aqueuse (15 ml) contenant du chlorure de calcium (220 mg de dihydrate). On règle finalement le pH à 7,4 au moyen d'une solution d'hydroxyde de sodium et on porte le volume total à 1000 ml avec de l'eau. La solution est stérilisée par filtration et elle est ensuite transférée de manière aseptique dans des fioles (10 ml). Facteur de stabilité: 3 Exemple 7 500 U.I. d'insuline par ml dans une solution 2 x 10 3 molaire de chlorure de magnésium On dissout de l'insuline porcine monoconstituant cristalline (3,72 g) contenant 0,4 % de zinc et ayant une activité totale de 100.000 U.I.dans de l'eau (125 ml) contenant de l'acide chlorhydrique (3,25 ml HCl 1N), puis on ajoute une solution aqueuse (50 ml) contenant du glycérol (3,2 g) et du phénol (0,4 g). On règle le pH à 7,5 au moyen d'une solution d'hydroxyde de sodium. On ajoute du chlorure de magnésium (81 mg d'hexahydrate), on règle de nouveau le pH à 7,5 avec de l'hydroxyde de sodium et on porte le volume total à 200 ml avec de l'eau. La solution obtenue est stéri- lisée par filtration et elle est ensuite transférée de manière aseptique dans des fioles (10 ml). Facteur de stabilité: 6 Exemple 8 U.I. d'insuline par ml dans une solution 2 x 10- 3 molaire de chlorure de magnésium On dissout de l'insuline porcine monoconstituant cristalline (3, 72 g) contenant 0,4 % de zinc et ayant une activité totale de 100.000 U.I. dans de l'eau (125 ml) contenant de l'acide chlorhydrique (3,25 ml HCl 1N), puis on ajoute une solution aqueuse (800 ml) contenant du glycérol (16 g) et du phénol (2 g). On règle le pH à 7,5 au moyen d'une solution d'hydroxyde de sodium. On ajoute du chlorure de magnésium (407 mg d' hexahydrate), on règle de nouveau le pH à 7,5 et on porte le volume total à 1000 ml avec de l'eau. La solution obtenue est stérilisée par filtration et est ensuite transférée de manière aseptique dans des fioles (10 ml). Facteur de stabilité: 4 Exemple 9 U.I. d'insuline humaine par ml dans une solution 2 x 103 molaire de chlorure de calcium On dissout de l'insuline humaine semi-synthétique cristalline préparée suivant la méthode décrite dans la demande de brevet GB n 2 069 502 A, (2,04 g) contenant 0,4 % de zinc et ayant une activité totale de 55.000 U.I. dans de l'eau (275 ml) contenant de l'acide chlorhydrique (1,8 ml HC1 1N). On ajoute à une partie aliquote de cette solution (25 ml) du dihydrate de. chloru- re de calcium (14,7 mg) puis on ajoute une solution aqueuse (20 ml) contenant du glycérol (0,8 g) et du - 2 501 507 phénol (0,1 g). On règle le pH de la solution à 7,4 au moyen d'une solution d'hydroxyde de sodium et on porte le volume total à 50 ml avec de l'eau. La solution obtenue est stérilisée par filtra- tion et est ensuite transférée de manière aseptique dans des fioles (10 ml). Facteur de stabilité: 7. REVENDICATIONS 1. Préparation d'insuline comprenant de l'insuline - zinc en solution, un agent conservateur et, éventuel- lement, un agent régulateur de pression osmotique non ionisant et/ou un tampon de pH qui ne forme pas de complexe ou de composés légèrement solubles avec les ions de calcium ou de magnésium, cette préparation d'insuline convenant pour un usage dans des dispositifs débitant de l'insuline du fait qu'elle est physiquement stable sous les conditions qui y règnent, ladite prépa- ration d'insuline étant'caractérisée en ce qu'elle comprend du calcium ou du magnésium sous une forme essen- tiellement ionisée à une concentration suffisante pour oxnférer la stabilité physique nécessaire à la prépara- tion, mais insuffisante pour y provoquer la précipitation de l'insuline sous des conditions normales. 2. Préparation d'insuline suivant la revendication 1, caractérisée en ce que la concentration en calcium ou en magnésium sous une forme ionisée n'excède pas les molarités approximatives de 10 2, 3 x 10 3 et 2 x 10 3 pour des concentrations en insuline correspondant à respectivement , 50 et 1000 unités internationales d'insuline par ml. 3. Préparation d'insuline suivant l'une des reven- dications 1 ou 2,caractérisée en ce que la molarité des ions de calcium ou de magnésium dans la préparation -3 n'est pas inférieure à environ 0,4 x 103 4. Préparation d'insuline suivant l'une quelconque des revendications précédentes,caractérisée en ce que le calcium ou le magnésium est fourni par un sel de l'acide chlorhydrique, sulfurique ou nitrique. 5. Préparation d'insuline suivant la revendication l,caractérisée en ce qu'elle comprend du calcium sous une forme essentiellement ionisée. 6. Préparation d'insuline suivant l'une quelconque des revendications précédentes,caractérisée en ce que la concentration en insuline se situe dans l'intervalle de 5 à 1500, de préférence de 40 à 1000 unités interna- tionales d'insuline par ml. 7.Préparation d'insuline suivant l'une quelconque des revendications précédentes,caractérisée en ce que le pH est situé dans l'intervalle de 7 à 8. 8. Procédé pour rendre une préparation d'insuline apte à l'usage dans des dispositifs débitant de l'insu- line du fait qu'elle est physiquement stable sous les conditions qui y règnent, caractérisé en ce qu'on met l'insuline en solution ensemble avec du calcium ou du magnésium sous une forme essentiellement. ionisable et à une concentration suffisante pour conférer à ladlite solution la stabilité physique néces- saire mais insuffisante pour y provoquer la précipita- tion de l'insuline sous des conditions normales, en ce qu'on ajoute un agent conservateur et, éventuellement, un agent régulateur de pression osmotique non ionisant et/ou un tampon de pH qui ne forme pas de complexe ou de composés légèrement solubles avec les ions de calcium ou de magnésium.