FR 2504360 A1 19821029 FR 8207246 A 19820427 La présente invention se rapporte à un procédé pour préparer des sirops de glucose/fructose et plus particulièrement à un procédé pour préparer des sirops de glucose/fructose par traitement d'un hydrolysat d'amidon non raffiné, contenant du glucose, par de la glucose-isomérase immobilisée. On connaît déjà de nombreux procédés de préparation d'hydrolysats d'amidon contenant du glucose, procédés qu'on peut classer grossièrement en deux catégories les procédés de con- version acide-enzyme et les procédés de conversion enzyme-enzyme. En général, on préfère ces derniers procédés car ils donnent moins de produits de réversion résistant à un traitement complémentaire et qui, par conséquent, diminuent l'efficacité globale des opéra- tions. Dans le procédé du type enzyme-enzyme, on forme une dispersion aqueuse contenant d'environ 30 à 40 % d'amidon, en matière sèche, et on ajoute une enzyme qui digère l'amidon, couram- ment une a-amylase bactérienne puis on chauffe la dispersion & une température dans l'intervalle de 80 à 90 'C à laquelle il y a hydrolyse partielle ou liquéfaction de l'amidon L'a-amylase est une enzyme endoamylolytique capable de provoquer une scission statistique des liaisons a1,4-glucosidiquoede la molécule de l'amidon; elle est élaborée par un certain nombre de micro- organismes de types variés, par exemple des micro-organismes des genres Bacillus et As Dergillus, et se trouve également dans les graines de céréales maltées. Le traitement par l'a-amylase ne provoque qu'une hydrolyse partielle de la molécule de l'amidon car cette enzyme n'agit pas dans une mesure appréciable sur les liaisons a-l,6-glu- cosidiquesde la molécule Ainsi donc, l'amidon traité par l'a-amy- lase consiste principalement en oligosaccharides à poids moléculaires variés et en fragments de ces oligosaccharides qui sont plus sen- sibles que l'amidon non traité à une digestion complémentaire par des enzymes spécifiques Pour cette hydrolyse complémentaire de l'amidon conduisant à un hydrolysat qui contient une proportion importante de glucose, on traite l'amidon liquéfié par une enzyme glucogénique L'enzyme glucogénique couramment utilisée est la glucoamylase. Dans le procédé acide-enzyme, l'amidon est d'abord soumis à hydrolyse partielle ou liquéfaction par exemple en suspen- sion aqueuse contenant d'environ 35 à 40 % d'amidon à laquelle on ajoute un acide tel que l'acide chlorhydrique La suspension aci- difiée est ensuite chauffée à haute température, refroidie et traitée par la glucoamylase à une concentration appropriée et à un p H approprié pour conversion de l'amidon partiellement hydrolysé en glucose. L'utilisation de la glucose-isomérase adsorbée sur des supports ou fixée sur des supports en tant que catalyseur biologique immobilisé a largement supplanté les procédés anté- rieurs dans lesquels on utilisait des enzymes solubles ou des cellules entières de micro-organismes Comparativement à ces pro- cédés plus anciens, les enzymes immobilisées apportent un certain nombre d'avantages, en particulier dans des opérations industrielles dans lesquelles on procède à des conversions continues En raison de l'intérêt économique de ces procédés, il est d'une importance cruciale que l'enzyme immobilisée conserve sa stabilité ou son activité effective pendant une durée suffisante pour permettre 1 l conversion de grandes quantités de substrat Parmi les procddis de préparation d'une glucose-isomérase immobilisde on citera la fixation par un moyen quelconque de l'enzyme sur des supports inertes tels que des dérivés de la cellulose, des résines échan- geuses d'ions et d'autres substances polymères, l'encapsulation de l'enzyme, l'occlusion de l'enzyme dans des fibres, etc. Jusqu'à maintenant, les essais d'utilisation d'hydro- lysats d'amidon non raffinés en tant que substrats dans des procédés enzymatiques continus de préparation de sirops de glucose/fructose n'ont pas donné les résultats recherchés en raison du fait que la glucose-isomérase immobilisée est désactivée dans une mesure impor- tante après une durée d'utilisation relativement courte On pense que cette désactivation est due en grande partie à la présence dans l'hydrolysat d'amidon non raffiné de substances qui inhibent ou affectent autrement l'activité de cette enzyme. Les recherches de la demanderesse ont montré que la stabilité ou la durée de service efficace de la glucose-isomérase immobilisée était amoindrie en raison de la présence dans l'hydro- lysat d'amidon non raffiné de substances formées au cours des opé- rations servant habituellement à la liquéfaction et à la sacchari- fication de l'amidon Bien qu'on ait pas pu parfaitement caractériser ces substances, on pense que les conditions de préparation des hydrolysats d'amidon qui favorisent la formation de ces substances ont également tendance à favoriser la formation non enzymatique de sucresdu type cétoses, comme le maltulose et le fructose, ou de produits précurseurs de ces sucres La concentration totale de l'un ou l'autre de ces sucres ou des deux, lorsqu'ils ont été formés par un processus non-enzymatique dans un hydrolysat non raffiné,peut donc servir d'indice de l'aptitude de l'hydrolysat à l'isomérisation enzymatique pour ce qui concerne la prolongation de l'activité de la glucose-isomérase. Jusqu'à maintenant, une pratique générale de l'indus- trie consistait à raffiner ou à purifier profondément les hydro- lysats d'amidon contenant du glucose par des procédés connus avant d'isomériser le glucose par la glucose-isomérase Les techniques de raffinage exploitées couramment comprennent le traitement de l'hydrolysat clarifié par du carbone et des résines échangeuses d'ions qui éliminent les constituants indésirables tels que les ions métalliques et les produits de dégradation des hydrates de carbone. Les opérations de liquéfaction de l'amidon sont en général conduites à haute température afin d'assurer une gélati- nisation complète des granules d'amidon Les liquéfactions uti- lisant des préparations d'a-amylase qui exigent du calcium, par exemple celles obtenues à partir de B subtilis, peuvent exiger la présence d'une quantité d'ions calcium allant jusqu'à 200 ppm par rapport à l'amidon, en matière sèche, pour une stabilité optimale à la chaleur de l'enzyme On a fréquemment utilisé à cet effet le calcium sous forme de chaux dans des liquéfactions de l'amidon dans lesquelles la chaux sert également à régler le p H au niveau voulu Toutefois, la présence de proportions importantes d'ions calcium conduit à une forte teneur en cendres, indésirable, dans l'hydrolysat, et par ailleurs l'ion calcium est connu en tant qu'inhibiteur de l'activité de la glucose-isomérase Quoiqu'il soit probablement impossible d'éviter totalement la présence de calcium dans les hydrolysats d'amidon préparés à l'aide d''a-amylase, pour les buts de l'invention, l'hydrolysat doit contenir au maximum 100 ppm environ d'ions calcium, par rapport à l'amidon. En contrôlant avec soin les conditions dans lesquelles on pratique l'hydrolyse et en évitant les conditions qui favorisent l'apparition de cétoses formées par des processus non enzymatiques et d'une forte teneur en cendres, on peut supprimer des opérations coûteuses de raffinage ou de purification de l'hydrolysat avant l'isomérisation par la glucose-isomérase immobilisée sans amoindris- sement notable de la stabilité ou de la durée d'activité effective de l'enzyme. L'état de la technique antérieure relatif à la liqué- faction et a la saccharification enzymatique de l'amidon conduisant à des hydrolysats qui contiennent du glucose et qui conviennent pour une conversion enzymatique en sirops de glucose/fructose est décrit brièvement dans un article de N H Aschengreen et collaborateurs, dans Starke, volume 31, p 64-66 ( 1979) Cet article décrit un procédé en quatre stades pour convertir un amidon en un sirop de fructose: ( 1) la liquéfaction; ( 2) la saccharification; ( 3) la purification; et ( 4) l'isomérisation Le premier stade de préparation des hydrolysats, la liquéfaction ou fluidification de l'amidon, comprend le traitement d'une dispersion de l'amidon par l'a-amylase à une température d'environ 105 'C pendant une durée d'environ 5 min et à un p H de 6 ou au-dessus On indique également qu'une proportion substantielle d'ions calcium est souhaitable dans la dispersion au cours de la liquéfaction, ceci pour maintenir l'activité de l'a-amylase aux hautes températures observées On recommande égale- ment de manière précise une teneur minimale de 40 ppm de Cae+ dans une dispersion à 30-35 % d'amidon en matière sèche au cours de la liquéfaction Cette proportion équivaut à 114-135 ppm par rapport- au poids d'amidon sec A la suite d'un nouveau traitement à la - chaleur, l'amidon partiellement hydrolysé est traité par une enzyme glucogénique qui donne un hydrolysat à haute teneur en glucose. L'hydrolysat enrichi en glucose est clarifié, raffiné et traité par la glucose-isomérase qui convertit une partie du glucose en fructose. Comme on le souligne dans l'article précité, une pra- tique générale de l'industrie consistait à soumettre les sirops de conversion de glucose préparés à partir des hydrolysats d'amidon à des opérations de raffinage soigné avant l'isomérisation par la glucoseisomérase, ceci afin d'éliminer les substances qui affectent la stabilité de l'enzyme ainsi que les substances qui contribuent à une coloration indésirable du sirop fini Couramment, comme on l'indique dans l'article, les hydrolysats d'amidon sont traités à la fois par le carbone et des substances échangeuses d'ions avant l'isomérisation par la glucose-isomérase. Parmi les autres publications relatives à la question on citera un article de C Bucke dans Topics in Enzyme Fermentation and Biotechnology, A Wiseman, éditeur, volume 1, chapitre 7 ( 1976) dans lequel on discute de la qualité-des matières premières à base de glucose en tant que substrats pour des conversions par la glucose- isomérase Dans Die Starke, volume 25, N O 9, p 304-308 ( 1973), Madsen et collaborateurs décrivent une préparation d'a-amylase stable à la chaleur et moins dépendante du calcium pour sa stabilité à haute température Dans le brevet des Etats-Unis d'Amérique N O 4 025 389, on décrit un procédé pour l'isomérisation enzymatique de sirops contenant du glucose en mélanges glucose/fructose dans lequel on utilise un hydrolysat d'amidon à concentrations limitées et à proportions limitées d'ions calcium et magnésium Le brevet des Etats-Unis d'Amérique n' 4 230 802 décrit un procédé dans lequel on utilise un sirop de glucose non raffiné en tant que substrat pour l'isomérisation enzymatique du glucose en fructose. Le substrat contenant la bouillie de conversion de l'amidon est isomérisé sans adjonction de sels de cobalt et/ou de magnésium. Le brevet des Etats-Unis d'Amérique N O 4 235 965 décrit un procédé de préparation d'amidon liquéfié à fortes concentrations en matière sèche à l'aide d'une a-amylase dérivée de Bacillus licheniformis. B.J Scnnyder, dans Die Starke, Volume 26, n'12, p 409-412 ( 1974) donne une description de la production industrielle des sirops de glucose/fructose Le brevet des Etats-Unis d'Amérique N O 3 909 354 constitue un exemple des nombreux brevets concernant des procédés d'isomérisation enzymatique des hydrolysats d'amidon contenant du glucose par de la glucose-isomérase immobilisée On trouvera la description de procédés de préparation d'hydrolysats d'amidon à bh ED (équivalent de dextrose) par des techniques delquéfacti endeuxstades par exemple dans les brevets des Etats-Unis d'Amérique n 3 551 293; 3 654 081; 3 663 369; 3 783 100; 3 853 706 et 3 912 590 et du brevet allemand n 2 216 854. La purification ou le raffinage d'hydrolysats d'amidon avant l'isomérisation est décrit dans les articles précités d'Aschengreen et collaborateurs et de Schnyder ainsi que dans des articles de Scallet et collaborateurs, Die Starke, volume 26, n 12, p 405-408 ( 1974) et d'Aschengreen, Process Biochemistry, mai 1975, p 17-19. Conformément à l'invention, on prépare un sirop de glucose/fructose par liquéfaction et saccharification enzymatique de l'amidon dans des conditions étroitement contr Olées conduisant à un hydrolysat contenant du glucose et qui ne contient pas plus de 100 ppm d'environ d'ions calcium, par rapport & l'amidon sec, et dans lequel le rapport molaire des sucres du type cétose forait par des processus non ensymatiques esat inférieur à 2 moles poeur 100 moles de motifs d'hexoses et on prépare un sirop de glucose/ fructose en mettant en contact l'hydrolysat non raffiné avec de la glucose-isomérase immobilisée. Pour parvenir au but recherché dans l'invention, il faut exercer un contrôle soigné des conditions dans lesquelles on prépare l'hydrolysat d'amidon. L'amidon obtenu à partir d'origines courantes, par exemple par broyage au mouillé du male, est lavé; on en prépare une dispersion aqueuse contenant 30 à 357 d'amidon sec De pré- férence, la dispersion a une faible teneur en ions, et par exemple ne contient pas plus d'environ 0,2 % de cendres sulfatées, sur les matières sèches. On peut également utiliser pour la préparation de l'hydrolysat d'autres amidons obtenus à partir de céréales ou de tubercules, y compris la pomme de terre, le tapioca, le blé, le sorgho et les amidons de mals cireux. Les hydrolysats d'amidon contenant du glucose selon l'invention peuvent être préparés par un procédé du type acide- enzyme ou par un procédé du type enzyme-enzyme Dans le procédé du type acide-enzyme, l'amidon est d'abord liquéfié par un traite- ment acide ménagé puis on utilise une enzyme pour convertir l'amidon liquéfié en glucose Dans le procédé typique enzyme-enzyme, l'amidon est liquéfié par traitement à l'aide d'une a-amylase puis on uti- lise une glucoamylase pour convertir l'amidon liquéfié en glucose. De préférence, on prépare l'hydrolysat d'amidon contenant du glucose par le procédé enzyme-enzyme. La préparation d'hydrolysats d'amidon contenant du glucose et qui n'exigent pas de raffinage avant le traitement par la glucose-isomérase immobilisée demande un contrôle soigné des conditions de réaction au cours de la liquéfaction et de la sac- charification La température, la durée et le p H doivent être tels qu'ils évitent la formation de proportions substantielles de matières affectant la stabilité de la glucose-isomérase. Il est également nécessaire de maintenir au minimum la teneur en calcium du substrat destiné à l'isomérisation Il est bien connu que certaines préparations d'a-amylase exigent la pré- sence d'ions calcium à haute concentration pour être actives à la liquéfaction Lorsque la liquéfaction est effectuée en présence de calcium à forte concentration, il faut éliminer les ions calcium de l'hydrolysat avant l'isomérisation On peut faire appel à une technique quelconque connue permettant d'éliminer les ions calcium et par exemple on peut traiter la liqueur contenant le glucose par l'acide oxalique et faire suivre d'une filtration. Durant la liquéfaction, on utilise de préférence une préparation d'aamylase qui n'exige pas la présence d'une forte concentration d'ions calcium ajoutés pour être active et stable à la chaleur On a obtenu des résultats satisfaisants en utilisant une préparation d'a-amylase obtenue à partir de Bacillus licheni- formis (a-amylase Termamyl-60 L de la firme Novo Enzyme Corp). Cette préparation se caractérise par une bonne stabilité à la chaleur et une bonne activité dans un intervalle de p H étendu, avec une dépendance réduite à l'égard de la présence du calcium. Cependant, on peut utiliser d'autres préparations d'a-amylase et par exemple les produits Taka-Therm de la firme Miles Laboratory, Elkhart, Indiana et Hi-Tempase de la firme Biocon Inc, Lexington, Kentucky. La durée et la température au cours de la gélatinisa- tion et de la liquéfaction de l'amidon sont interdépendantes Si la dispersion d'amidon est chauffée à une basse température de géla- tinisation pendant une durée trop courte, une quantité importante des granules d'amidon plus résistants à la chaleur peut rester non- gélatinisée, de sorte que l'a-amylase n'a pas l'efficacité voulue sur la diminution de la viscosité de la dispersion En général, les températures situées dans la partie inférieure de l'intervalle de gélatinisation et par exemple les températures inférieures à 800 C environ pour l'amidon de mals, ne donnent pas des résultats satisfaisants en raison de la proportion importante d'amidon qui reste non gélatinisée et par conséquent pratiquement inaccessible à l'action de l'enzyme Naturellement, du fait que la gélatinisation est réalisée en présence de l'a-amylase, les températures observdea ne doivent pas Otre élevées au point d'affecter l'activité de la préparation d'enzyme. Un point particulièrement important réside dans le maintien au cours de la liquéfaction et de la saccharification de conditions de réaction qui ne favorisent pas la formation chimique ou non enzymatique de sucres du type cétoses Plus précisément, il faut maintenir des conditions conduisant à un hydrolysat ne contenant pas plus d'environ 100 ppm d'ions calcium par rapport à l'amidon sec et dans lequel le rapport molaire des cétones formées par action non-enzymatique est inférieur à 2 environ De préférence, l'hydrolysat ne contiendra pas plus d'environ 30 ppm d'ions calcium et le rapport molaire des cétoses formés pr action non enzymatique sera inférieur à 1 environ Ce "rapport molaire" est le nombre de moles de cétoses formé par action non-enzymatique pour 100 moles de motifs d'hexoses Du fait qu'il y a interdépendance entre les effets de la température, de la durée et du p H en cours de liqué- faction, ces facteurs doivent être contrôlés dans des intervalles relativement étroits. La structure polymère de l'amidon granulaire n'est pas affectée dans une mesure appréciable par l'a-amylase tant que les granules n'ont pas été gélatinisés On provoque la gélatinisa- tion en chauffant l'amidon dans l'eau dans un intervalle de tempé- ratures dans lequel les granules gonflent et les forces qui main- tiennent ensemble les molécules d'amidon sont suffisamment amoin- dries pour qu'il y ait gélatinisation En général, comme les a-amy- lases sont sensibles à la chaleur et ont tendance à être dénaturées aux températures supérieures à 100 'C, on observe des températures inférieures à 1000 C en cours de liquéfaction afin de prolonger l'efficacité de l'enzyme Du fait que les forces associant les molécules d'amidon sous forme de granules ont une intensité variable, certains granules sont gélatinisés aux températures inférieures à 'C et deviennent alors sensibles à l'action de l'a-àmylase alors que d'autres restent non gélatinisés et résistent encore à l'action de cette enzyme Par suite, il est préférable de liquéfier l'amidon par l'a-amylase en deux stades opératoires avec un stade intermé- diaire très bref de passage à l'autoclave Au cours du premier stade opératoire, l'amidon est partiellement gélatinisé et liquéfié dans une mesure limitée; on obtient un hydrolysat partiel Le but du passage à l'autoclave est de gélatiniser les granules d'amidon résistants qui n'ont pas été gélatinisés au cours du premier stade de liquéfaction L'hydrolysat d'amidon est ensuite fludifié au niveau voulu dans le second stade de liquéfaction. Dans le procédé selon l'invention, il est important de maintenir le substrat à un p H d'environ 6,0 ou au-dessous au cours de la liquéfaction Aux p H supérieurs à 6,0 environ, on peut former des produits de dégradation qui inhibent l'activité de l'iso- mérase, en particulier aux fortes températures et/ou aux degrés de réaction prolongés La liquéfaction est avantageusement réalisée en deux stades opératoires à un p H dans l'intervalle d'environ 5,0 à 6,0 et de préférence d'environ 5,2 à 5,4 et à des températures qui se situent dans l'intervalle de gélatinisation de l'amidon et qui conviennent également pour la liquéfaction enzymatique de l'amidon. Dans le cas d'amidon de mals broyé au mouillé, il est habituellement nécessaire de régler le p H vers le haut dans l'intervalle voulu pour la liquéfaction Pour ce réglage de p H en cours de liquéfaction par l'aamylase, on utilise couramment des composés du calcium, par exemple de la chaux ou du carbonate de calcium, spécialement dans les réactions dans lesquelles on utilise des préparations d'a-amylase dépendantes du calcium Mais du fait que le calcium affecte l'activité de la glucose-isomérase, il est préférable d'éviter l'addition intentionnelle d'une source d'ions calcium à l'hydrolysat Toutefois, si on ajoute des ions calcium, il sera nécessaire de les éliminer avant l'isomérisation si l'on veut parvenir au but de l'invention Quoiqu'il existe un certain nombre de substances pouvant être utilisées pour le réglage du p H au cours de la réaction de liquéfaction, on utilise avantageusement à cet effet des composés solubles du magnésium car la glucose- isomérase obtenue à partir d'un certain nombre de micro-organisame exige du magnésium pour une activité optimale. La quantité d'a-amylase incorporée dans la dispersion est fonction d'un certain nombre de facteurs mais est déterminée principalement par l'activité propre de la préparation d'enzyme, la concentration de l'amidon dans la dispersion et le taux de coe- version amylolytique recherché En général, dans une opération de liquéfaction en deux stades opératoires, la quantité (en activité) d'a-amylase introduite au deuxième stade est identique ou légère- ment inférieure à celle utilisée au premier stade Lorsqu'il y a un passage à l'autoclave entre les deux stades, l'a-amylase active restant éventuellement du premier stade est pratiquement détruite. Couramment, on fournira au premier stade d'environ 6 à 10 liqué- fons d'activité a-amylasique par gramme d'amidon sec et d'environ à 10 liquéfons d'activité a-amylasique, sur les mêmes bases, au deuxième stade opératoire. Les températures de liquéfaction observées dans les deux stades opératoires sont de préférence inférieures à 100 "C environ et se situent plus spécialement dans l'intervalle de 82 à 950 C et mieux encore dans l'intervalle d'environ 84 à 880 C Aux températures de liquéfaction situées dans ces intervalles, on a obtenu des résultats satisfaisants dans des durées de chauffage d'environ 1 à 3 heures. il Le premier stade de liquéfaction donne un hydrolysat partiel ayant un ED (équivalent de dextrose) qui se situe de pré- férence dans l'intervalle d'environ 6 à 12 Après le premier stade de liquéfaction, la dispersion peut être soumise à un traitement à l'autoclave donnant un hydrolysat partiel pratiquement exempt d'amidon non gélatinisé Une exposition prolongée de l'amidon par- tiellement liquéfié aux conditions de l'autoclave conduit à la formation de substances qui sont nocives pour la glucose-isomérase et qui doivent être éliminées avant l'isomérisation si l'on veut prolonger la stabilité de l'enzyme Par conséquent, à l'autoclave, la durée et la température ne dépasseront pas respectivement 2 minutes environ et 160 'C environ Les conditions préférées du passage'à l'autoclave sont une température d'environ 1250 C et une durée d'environ 1 minute. Du fait que l'i-amylase présente au premier stade de liquéfaction est pratiquement désactivée par le passage à l'autoclave, il faut introduire des compléments d'enzyme au second stade de liquéfaction Habituellement, la quantité d'a-amy- lase introduite est voisine de celle introduite au premier stade. Durant le second stade, les granules d'amidon qui sont maintenant pratiquement tous gélatinisés, sont facilement attaqués par l'enzyme dans les conditions observées, et on obtient un hydrolysat fludifié présentant de préférence un ED d'environ 14 à 20 et pra- tiquement exempt d'amidon brut ou rétrogradé L'hydrolysat aura couramment un ED d'environ 16. La préparation d'amidon liquéfié est ensuite traitée par une enzyme glucogénique dans des conditiorsappropriées à la conversion enzymatique de l'amidon partiellement hydrolysé en glucose L'enzyme couramment utilisée à cet effet est la gluco- amylase (qu'on appelle également amyloglucosidase, glucamylase, enzyme glucogénique, etc) La glucoamylase qui est produite par un certain nombre de micro-organismes de types variés, est une enzyme exo-amylolytique qui catalyse l'hydrolyse successive des motifs de glucose à partir des extrémités non réductrices des molécules d'amidon ou d'amylodextrine Parmi les micro-organismes producteurs de glucoamylase on citera certaines souches de mycètes appartenant au genre Aspergillus, des souches du genre Rhizopus et des souches du genre Endomyces. La saccharification de la préparation d'amidon liqué- fié est effectuée dans des conditions conduisant à un taux élevé de conversion de l'amidon en glucose De préférence, l'hydrolysat contiendra plus de 92 % de glucose et mieux encore plus de 94 % environ de glucose Par ailleurs, les conditions doivent Etre telles qu'elles ne favorisent pas une synthèse en retour des molécules de glucose libérées avec formation d'oligosaccharides, synthèse dont on sait qu'elle se produit dans les réactions de saccharification utilisant la glucoamylase. Le traitement par la glucoamylase est effectué en diluant la suspension d'amidon liquéfié lorsque c'est nécessaire à une teneur en matière sèche d'environ 30 % puis en réglant le p H de réaction à un niveau d'environ 4, 0 à 5,0 et de préférence d'environ 4,6 On ajoute une préparation de glucoamylase en quan- tité suffisante pour apporter d'environ 0,12 à 0,30 unité de glucoamylase par gramme d'amidon sec et on chauffe la suspension dans un intervalle de température d'environ 54 à 62 "C pendant une durée suffisante pour parvenir au taux de conversion voulu. Cette durée est de préférence d'environ 30 à 80 heures De pro- férence, on maintiendra la suspension d'amidon # une température d'environ 580 C pendant environ 60 heures. Pour obtenir un substrat convenant pour l'isomérisa- tion, on filtre ensuite la liqueur,ce qui permet d'éliminer les résidus étrangers à l'amidon et on évapore de préférence le filtrat jusqu'à une concentration d'environ 50 % de matière sèche On peut ajouter à la liqueur concentrée un ou plusieurs sels solubles consistant en activateursde la glucose-isomérase et on règle le p H à un niveau d'environ 7,0 à 8,5 par une solution d'hydroxyde de sodium La liqueur est ensuite chauffée par exemple à une tem- pérature d'environ 50 à 700 C pendant une durée d'environ 20 à minutes, et filtrée à nouveau pour élimination des substances solides en suspension qui peuvent s'Otre formées au p H élevé. Dans les conditions préférées, on chauffe à 60 C environ pendant minutes environ avant de refiltrer De préférence, on évitera un chauffage prolongé de la liqueur saccharifiée ou un chauffage à des températures supérieures à 700 C environ avant l'isomérisation, en particulier après le réglage du p H en milieu alcalin En milieu alcalin, un tel chauffage de la liqueur avant isomérisation peut provoquer la formation de produits de dégradation qui inhibent l'activité de la glucose-isomérase. L'isomérisation du substrat non raffiné est avanta- geusement réalisée en continu par passage du substrat, dans des conditions appropriées, sur une ou plusieurs colonnes contenant des lits de glucose-isomérase immobilisée On trouvera -la des- cription de procédés convenant pour l'isomérisation du glucose en fructose sur des lits fixes de glucose-isomérase immobilisée dans les brevets des Etats-Unis d'Amérique no 3 909 354 et 3 788 945. En plus des avantages économiques évidents résultant de la suppression du raffinage de l'hydrolysat avant l'isomérisa- tion, l'invention peut apporter d'autres avantages Ainsi, en réalisant la liquéfaction et la saccharification dans des conditions telles que les quantités de cétoses formés par action non enzymatique restent faibles, on peut parvenir à des taux de conversion élevés de l'amidon en glucose Par ailleurs, en maintenant une basse teneur en cendres dans la dispersion d'amidon initiale et au cours des opérations suivantes, il faut moins de capacité d'échange d'ion pour déminéraliser le produit final de glucose/fructose. Les exemples qui suivent illustrent l'invention sans toutefois en limiter la portée; dans ces exemples les indications de parties et de pourcentage s'entendent en poids sauf mention contraire. On donnera maintenant les définitions de termes uti- lisés dans les exemples et la description des méthodes d'analyse employées. Equivalent de dextrose L'équivalent de dextrose (ED) est défini comme la concentration des sucres réducteurs présents exprimée en dextrose et calculée en % de la matière sèche La détermination est faite par la méthode E-26 décrite dans "Standard Analytical Methode of the Member Companies of the Corn Industry Research Foundation, Inc ", 1001 Connecticut Ave, N W Washington, D C 20036. Activité de l'a-amvlase bactérienne. L'activité des préparations d'a-amylase bactérienne a été déterminée par une modification de la méthode d'essai normalisée AATCC 103-1965 "Bacterial Alpha Amylase Enzymes Used in Desizing, Assay of" publiée dans l'édition 1967 du Technical Manual of the American Association of Textile Chemists and Colorists, volume 43, p B-174 et B-175. Les modifications apportées à la méthode publiée sont les suivantes: 1) La solution tampon pour le substrat d'amidon est préparée en dissolvant 25,3 g d'hydroxyde de sodium chimiquement pur et 340 g de phosphate monopotassique chimiquement pur dans l'eau et en diluant à volume final de 2 litres. 2) On a ajouté 125 ml de la solution tampon au substrat d'amidon empâté et refroidi et on a porté le substrat à volue final de 500 ml. 3) On a déterminé le p H du substrat d'amidon et lorsque c'est néceesaire, on l'a réglé à 6,20 + 0,05. 4) On a utilisé une solution 0,025 M de chlorure de calcium pour la dilution de l'échantillon d'enzyue On a pripard. cette solution en dissolvant 11,1 g de chlorure de calcium chimaque- ment pur dans l'eau et en portant à volume final de 4 litres. ) La formule de conversion des BAU en liquéfons est BAU x 2,85 = liquéfons. Activité de la Rlucoamylase. Une unité d'activité de glucoamylase (UG) est définie comme la quantité d'enzyme qui catalyse la production de 1 g de dextrose par heure A 60 C et à p H 4,5 dans l'essai décrit ci-dessous: On pipette dans un réacteur bouché maintenu à 60 C 10 ml d'une solution à 10 % 7 d'un amidon partiellement hydrolysé (par exemple le produit du commerce Haltrin-10 de la firme Grain Proces- sing Co, Muscatine, Iowa) contenant 20 m M de tampon à l'acétate à p H 4,5 On ajoute et on mélange 1 ml d'une solution de gluco- amylase contenant 0,03 à 0,15 UG et on maintient le mélange pan- dant 1 heure à 60 C A la fin de la période d'incubation de I heure, on arrête l'action de l'enzyme en ajoutant un volume déterminé d'hydroxyde de sodium M conduisant à un p H de 8,5 à 10,5 Le mélange est ensuite refroidi à la température ambiante. On pipette 2,5 ml de l'hydrolysat ainsi obtenu dans ml de liqueur de Fehling préparée comme décrit dans le mode opératoire indiqué ci-dessus pour la détermination de l ED On porte le mélange au bouillon et on titre par une solution étalon de dextrose contenant 5 g de dextrose par litre, selon le mode opératoire indiqué ci-dessus pour la détermination de 'ED On prépare un mélange témoin qu'on titre exactement de la même manière que l'hydrolysat obtenu ci-dessus mais en ajoutant à la solution du substrat 1 ml de solution de glucoamylase après la période d'in- cubation de 1 heure et après l'addition de la solution d'hydroxyde de sodium L'activité de la glucoamylase est calculée par l'équa- tion U - UG 0,002 V 9 w( dans laquelle V représente le volume total en ml de l'hydrolysat formé dans l'essai (habituellement 11,2 'ml); C est le nombre de ml de la solution étalon de dextrose utilisée pour-le titrage du mélange témoin; A est le nombre de ml de la solution étalon de dextrose uti- lisée pour le titrage de l'hydrolysat obtenu dans l'essai; et W est le poids de l'enzyme par ml de la solution d'enzyme diluée. Activité de l'isomérase immobilisée. L'activité de l'isomérase immobilisée est déterminée de la manière suivante: On pèse un échantillon d'isomérase immobilisée conte- nant de 1400 à 2200 IGIU (unité internationale de glucose-isomérase, voir ci-après) On lave l'échantillon dans un flacon de 250 ml par ml de solution titrée de dextrose (préalablement chauffée à 650 C) et 10 ml d'une solution 0,1 M de tris-hydroxyméthylaminométhane (THAM) (p H 7,8) La solution titrée de dextrose contient 3,33 M de dextrose, 20 m M de sulfate de magnésium, 10 m Mi de sulfite de sodium, m M de THAM et 1 m M de chlorure de cobalt (p H 7,8) A 650 C, cette solution de dextrose a un p H de 7,0 On immerge le flacon dans un bain-marie à 650 C et on le secoue pendant 1 heure On filtre le mélange sous vide sur un entonnoir en verre fritté grossier de 45 mm garni d'un filtre en fibres de verre sur lequel on a appliqué au préalable une couche de 1 gramme d'agent filtrant On rince le flacon et le gateau d'enzyme par des petites fractions aliquotes de solution tampon à 100 m M de THAM (p H 7,8) représentant au total ml. Cette enzyme lavée est introduite dans un flacon de 250 ml contenant 125 ml de solution titrée de dextrose (préalable- ment équilibrée à 650 C) On lave l'enzyme quantitativement dans le flacon par 10 ml de tampon de THAM 10 m M (p H 7,8) et on secoue le flacon pendant exactement 60 minutes On ajoute ensuite 12,0 ml d'acide acétique glacial et on secoue le mélange acidifié pendant encore 15 minutes On filtre le mélange sous vide sur un entonnoir en verre fritté grossier de 45 mm garni d'un filtre en fibres de verre sur lequel on a appliqué au préalable une couche d'environ 1 g d'agent filtrant On lave le flacon et le contenu de l'enton- noir par de l'eau déminéralisée jusqu'à ce qu'on ait recueilli environ 400 ml de filtrat Après refroidissement a 25 C, le fil- trat est dilué à volume final de 500 ml On détermine la rotation de la solution à l'aide d'une cellule de 2 dm à 25 C; cette rota- *tion est R 2. On fait un essai a blanc exactement comme décrit ci- dessus, mais sans ajouter d'enzyme On détermine également la rota- tion optique de l'essai à blanc à 250 C; c'est R 1 Le degré d'isomé- risation est calculé b partir de la relation (R 2 R 1) a C L p dans laquelle a est la variation de rotation spécifique lorsque le fructose est entièrement converti en dextrose; Cp est la concentration en sucre de la solution ( 0,15 g/ml); et L est la longueur du tube de polarimètre ( 2 dm). On calcule les unités d'activité fixées (FAU) de l'activité de l'isomérase, par l'équation suivante FAU/g J Ckftw dans laquelle kf est une constante de vitesse ( 1,21 I h 1 FU mg de glucose); t est la durée de réaction en heures(l heure); W est le poids en grammunesde l'échantillon; C est la concentration initiale en mg pour 125 ml du mélange de réaction ( 75 000 mg de glucose); et J est défini par l'équation suivante: + + 2 Ka J = C e 1 e) dans laquelle I est le degré d'isomérisation à l'équilibre en fractions de mole e de fructose ( 0,513) I est le degré d'isomérisation en fraction de mole de fructose C est la concentration molaire initiale de glucose ( 3,33}l) Km est la constante de Michaelis pour le glucose ( 0,7 M) K est la constante de Michaelis pour le frglucose ( 1,43 M) s K est la constante de Michaelis pour le fructose ( 1,43 M) Une IGIU est égale à 15,8 FAU. IGIU C'est l'abréviation désignant l'Unité Internationale de GlucoseIsomérase: c'est la quantité d'enzyme qui convertit une micromole de glucose en fructose par minute dans une solution conte- nant à l'origine 2 moles de glucose par litre, 0,02 mole de Mg SO 4 et 0, 001 mole de Co C 12 par litre à un p H de 6,84 a 6,85 (mal 6 ate de sodium 0,2 M) et à une température de 60 "C Les déterminations de glucoseisomérase ont été effectuées selon le mode opératoire décrit par N E Lloyd et collaborateurs, Cereal Chem, 49 N O 5 p 544-553 ( 1972). Détermination des saccharides L'analyse des hydrolysats avec recherche du glucose, du fructose, du maltulose et des autres saccharides a été effectuée par chromatographie de liquide sous haute pression Le mode opéra- toire est décrit dans Standard Analytical Methods, Corn Refiner's Association, Inc, Method E-61. Degré d'isomérisation (% de fructose) On détermine le pourcentage de fructose obtenu à la suite des réactions d'isomérisation par le mode opératoire suivant: on pipette une fraction aliquote de 5 ml du substrat (hydrolysat non raffiné, avant isomérisation) dans une éprouvette graduée de 100 ml et on dilue au volume final par l'eau déminéralisée; la concentra- tion finale est d'environ 2,5 g de matière sèche pour 100 ml On dilue également àun volume final de 100 ml, par l'eau déminéralisée, une fraction aliquote de 5 ml de l'effluent d'une colonne contenant de la glucose-isomérase immobilisée et sur laquelle on a fait passer le substrat On détermine la rotation optique pour le substrat dilué (s) et pour l'effluent (i). On en tire une constante (K) définie par l'équation d x 100 L(la dl lafl) K = 59,08 dans l'équation ci-dessus d est la dilution, soit 20 L est la longueur de la cellule de polarimètre soit 0,2000 dm ladl lafl = variation de la rotation spécifique a la conversion du glucose pur en fructose pur, mesurée avec une source de lumière au mercure 169,3 degrés. Par conséquent, % de fructose, d b 59,08 (as ai)/C avec a rotation observée pour le substrat, en degrés ai rotation observée pour l'affluent, an degrés C = grammesde matière sèche par 1 ml de substrat. Détermination de la stabilité de la plucose-isomérase. Calcul de la vitesse de réaction (kf) et de la période ("demi-vie") de l'enzyme "). La stabilité ou période de la glucose-isomérase a été déterminée pour les réactions d'isomérisation faites ci-après par substitution des valeurs appropriées dans l'équation suivante Ie I kf E e'0,693 t/X II CR e dans laquelle I est le degré d'isomérisation du produit introduit dans le rdac- teur, F/(F+G), F étant la fraction en poids de fructose, par rapport aux hydrates de carbone totaux secs et G la fraction en poids de glucose, par rapport aux hydrates de carbone totaux secs I est le degré d'isomérisation de l'effluent du réacteur, F/(F/G) Ie est la valeur de I à l'équilibre, 0,514 à 65 C ou 0,505 à 60 C k est la constante de vitesse de réaction initiale, g(G+F)h IGIU f Et est l'activité de l'enzyme en IGIU C est la concentration du substrat, le glucose, en g/ml R est le débit en ml/h Y est la période de l'enzyme, en heures t est la durée de service du réacteur en heures. kf" la constante de vitesse de réaction initiale, et t'ont été calculés en modifiant l'équation ci-dessus de la manière suivante: lo JR l(Ie l = 10 log kft _ 0,30102 t/- La pente d'une courbe représentant log R ln 0) en fonction du temps est égale à -0,30102/r; par conséquent = -0,30102/pente L'intersection X O au temps O d'une telle courbe est utilisée pour résoudre l'équation Xo I es pour la vitesse de réaction initiale kf Ainsi k C x 10 o kf = E t Le produit de la constante de vitesse de réaction initiale kf et du facteur exprimant la période de l'enzyme Tdonne une indication appropriée de l'efficacité globale du procédé; plus - forte est la valeur obtenue pour kf ' meilleure est l'efficacité du procédé en matière de taux de conversion de glucose en fructose et de l'effet du procédé sur la période de l'enzyme. Exemple 1 Dans cet exemple, on décrit une mise en oeuvre du procédé selon l'invention en continu qui met en évidence la haute stabilité de la glucose-isomérase-à laquelle on parvient dans le procédé La glucoseisomérase utilisée dans cet exemple et dans les exemples qui suivent est immobilisée sur de la DEAE-cellulose comme décrit dans le brevet des Etats-Unis d'Amérique N O 3 788 945. On lave de l'amidon de mals obtenu dans une opération de broyage au mouillé du mals, par de l'eau déminéralisée et on en prépare une dispersion contenant 33 % d'amidon sec On règle le p H de la dispersion à 5,2 par Mg O et on ajoute de l'a-amylase (Termamyl-60 L) en quantité suffisante pour apporter 7 liquéfons d'activité a-amylasique par gramme d'amidon sec On fait passer la dispersion dans un serpentin en acier inoxydable de 12,7 mm de diamètre dans lequel on la maintient à une température de 860 C pen- dant une durée de 2,5 heures A la suite de ce traitement à la chaleur de premier stade, on pompe la dispersion dans un serpentin en acier inoxydable de 6,35 un de diamètre dans lequel on la main- tient à une température dans l'intervalle d'environ 115 à 130 'C et sous une pression de 3,5 à 7 bars pendant une durée d'environ 1 minute On refroidit ensuite la dispersion à une température d'environ 860 C, on ajoute une quantité d'a-amylase identique à celle introduite au premier stade de chauffage et on passe dans un troisième serpentin chauffant Dans ce serpentin qui a les Mimes caractéristiques que celui du premier stade, la dispersion est main- tenue à la température de 860 C pendant 2 heures. L'amidon liquéfié est dilué à une teneur de 307 de matière sèche par de l'eau déminéralisée et soumis à des conditions de saccharification dans un système de réacteur à cuve agité à plusieurs étages On ajoute un agent filtrant (Dicalite CP-175 de la firme GREFCO, INC) en quantité correspondant à une concentration de 1 % de cet agent filtrant sec et on règle le p H à 4,5 environ par HCI La préparation d'amidon liquéfié est introduite dans le premier réacteur du système dans lequel on ajoute une préparation de gluco- amylase (AMG-150, lot SI 3075 de la firme Novo Enzyme Corp) en quantité suffisante pour apporter 0,27 unité de glucoamylase (UG) par gramme d'amidon sec On chauffe le contenu du réacteur à 580 C puis on fait passer en série dans chacun de 7 autres réacteurs maintenus à la même température La durée de passage moyenne dans chaque réacteur est de 7,5 heures A la fin du cycle de sacchari- fication, le produit de réaction ou liqueur est passé sur un filtre revêtu d'une couche d'agent filtrant sous un vide de 25 cm de mercure afin d'éliminer les résidus étrangers présents éventuellement. Pour former un substrat convenant pour l'isomérisation parla glucoseisomérase, on concentre la liqueur à environ 50 % de matière sèche dans un évaporateur continu On chauffe d'abord la liqueur à 860 C et on la maintient à cette température pendant 4 minutes au bout desquelles on évapore à 580 C sous un vide de 73 cm de mercure On ajoute une solution de Mg(HS 503)2 en quantité correspondant A une concentration 0,002 molaire de ce sel dans la liqueur, on règle ensuite un p H 7,8 (mesure à 250 C) par une solution de Na OH La liqueur contenant le substrat est ensuite pompée dans un serpentin de mélange puis au travers d'un filtre garni de papier filtre Whatman N O 3, le serpentin et le filtre étant maintenus à une température de 580 C. L'isomérisation est effectuée en pompant le substrat filtré directement dans quatre réacteurs à lit fixe disposés en série et maintenus à une température de 60 C Les réacteurs consis- tent en colonnes de verre de 25 mm de diamètre et 15 cm de longueur chargées de quantités variées de glucose-isomérase immobilisée. L'activité de glucose-isomérase chargée dans chaque réacteur va de 2300 à 5000 IGIU Les réacteurs opèrent dans des conditions simulant un système dans lequel les réacteurs usés sont retirés de la position de tête et des réacteurs frais ajoutés dans la position de queue L'isomérisation est effectuée à un débit d'in- troduction de 2,4 ml de substrat par minute,Ade manière à conduire à une concentration enfructose de 42 à 46 % dans l'effluent final. A la fin de chacun des séjours dans chaque réacteur, on prélève un échantillon de l'effluent sur lequel on procède aux détermina- tions nécessaires Les résultats obtenus à l'isomérisation de l'hydrolysat non raffinés sont rapportés dans le tableau I ci-après. L'analyse périodique de la liqueur isomérisée donne les valeurs moyennes suivantes par rapport au poids de matière sèche fructose, % 44,3 glucose, % 51,6 DP 2 +, 4,1 * 2 +>J calcium, ppm 30 cendres sulfatées, % 0,28 matière sèche, % 48,6 * y compris les disaccharides et saccharides supérieures. Les résultats rapportés ci-dessus et dans le tableau I indiquent qu'on peut préparer un sirop de glucose/fructose a forte proportion de fructose en soumettant un hydrolysat d'amidon non raffiné, obtenu dans les conditions spécifiées, à isomérisation par la glucose-isomérase immobilisée Les chiffres montrent également que dans ces conditions, l'enzyme possède une bonne stabilité ou période>Met on atteint une haute efficacité enzymatique (kf'). Exemple 2 Dans cet exemple, on décrit les effets de conditions variés à la liquéfaction et saccharification de l'amidon sur la formation de cétoses produits par action non enzymatique dana le substrat contenant le glucose et sur la stabilité de la glucose- isomérase utilisée pour l'isomérisation du glucose en fructose. On liquéfie de l'amidon dans des essais séparés en utilisant dans l'un de ces essais une préparation d'a-amylase obtenue à partir de B licheniformis et dans l'autre une préparation d'a-amy- lase plus dépendante du calcium, obtenue A partir de B subtilis. La liquéfaction est effectuée en deux stades de traitement enzymatique avec passage intermédiaire à l'autoclave donnant des hydrolysats partiels pratiquement exempts d'amidon granulaire ou non gélatinisé. On prépare deux dispersions d'amidon identiques conte- nant chacune 33 % de matière sèche L'une des dispersions, le substrat A, est traitée par l'a-amylase de B licheniformis dans les conditions de liquéfaction selon l'invention L'autre dispersion, le substrat B, est traitée par une préparation d'a-amylase obtenue à partir de B subtilis (Dex-Lo-HC de la firme Wallerstein Co) et soumiseaux conditions couramment utilisées de préférence pour la liquéfaction de l'amidon avec cette préparation d'enzyme. Les conditions dans lesquelles on procède aux liqué- factions séparées sont rapportées dans le tableau II ci-après. Les préparations d'amidon liquéfié ont été chacune diluées à 307 de matière sèche, réglées à p H 4,3 et additionnées de 0,41 UG g 1 de matière sèche de glucoamylase La saccharifica- tion est effectuée à 580 C pendant 32 heures pour le substrat A et heures pour le substrat B Les liqueurs saccharifiées sont filtrées et évaporées à 50 % de matière sèche sous vide à 350 C. On prépare trois substrats pour isomérisation par la glucose-isomérase immobilisée Dans le substrat A on introduit 0,0025 M de Mg(HSO 3)2 et on règle le p H à 7,8 par une solution de Na OH Le substrat B est d'abord traité par la quantité stoéchiomé- trique d'acide oxalique à p H 4,8 La teneur en calcium du substrat est abaissée à 30 ppm par rapport à la matière sèche La liqueur est ensuite refiltrée et le filtrat additionné de 0,0025 M de Mg(H 503)2 Finalement, on règle le p H du substrat à 6,0 par Mg O puis à 7,8 par Na OH Le substrat C est préparé en dissolvant dans l'eau déminéralisée du dextrose cristallisé en quantité suffisante pour donner une solution à 50 % de dextrose sec La solution est rendue 0,0025 M en Mg(H 503)2 et réglée à p H 6,0 par Mg O puis à p H 7,8 par Na OH. Les substrats sont ensuite soumis aux conditions d'iso- mérisation: on les fait passer dans des colonnes de verre à double enveloppe (de 25 mm x 30 cm) maintenues à une température de 650 C et contenant chacune environ 800 IGIU de glucose-isomérase immobi- lisée Les substrats sont envoyés dans les colonnes en courant des- cendant au débit de 0,3 ml/min Les isomérisations sont effectuées en continu pendant 17 jours Tous les jours, on prélève des échan- tillons des substrats et des effluents de colonne afin de déterminer les concentrations en fructose et glucose dans les substrats et on calcule les paramètres cinétiques des réactions d'isomérisation. Aucun des substrats A et B n'a été soumis à une opération de raf- finage avant isomérisation Les résultats obtenus sont rapportés dans le tableau III ci-après. Les résultats rapportés dans ce tableau montrent qu'on observe la meilleure stabilité de l'enzyme et la meilleure efficacité de conversion lorsque le substrat d'isomérisation non raffiné contient peu de maltulose On observe des valeurs nettement infé- rieures pour la stabilité et l'efficacité lorsqu'on utilise un substrat non raffiné (B) qui contient une forte proportion de maltulose et a été prtparé à haut p H et a haute température d'auto- clave, ces conditions étant normalement observées lorsqu'on utilise l'a-amylase de B subtilis Les résultats de la réaction d'isomé- risation effectuée sur le dextrose cristallisé servant de substrat indiquent que ce produit n'est pas entièrement exempt de consti- tuants qui inhibent l'activité de la glucose-isomérase, ce qui confère une nouvelle importance aux conditions dans lesquelles on prépare le substrat non raffiné. Exemple 3 Dans cet exemple, on décrit les effets du p H et de la température d'autoclavation à la liquéfaction de l'amidon sur la stabilité de l'enzyme isomérisante et sur l'efficacité de la réaction de conversion. On liquéfie 5 échantillons identiques d'amidon de maïs (à 33 % 7 de matière sèche) à l'aide de l'a-amylase Termamyl-60 L dans une opération en deux stades dans des conditions varides de p H et de température d'autoclavation rapportúe dans le tableau V ci-après. Les échantillons ont été liquéfiés dans les conditions de durée, de température et de dosage d'enzyme indiquées dans le tableau IV ci-après. On saccharifie 20 litres de chacun des échantillons d'amidon liquéfié à l'aide d'une préparation de glucoamylase (AMG-150, lot SN 3068 de la firme Novo Enzyme Corp) à une dose -1 de 0,41 UG g de matière sèche Les échantillons sont réglés à p H 4,3 et chauffés a 58 C pendant 32 heures Les liqueurs saccha- rifiées sont filtrées et évaporées à 50 % de matière sèche puis réglées à p H 6,5 par Mg O On rend chaque échantillon 0,0025 M en Mg(H 503)2 et finalement on règle à p H 7,8 (mesure à 25 C) par Na OH Dans les liqueurs, on dose le glucose et le maltulose, et on détermine le rapport molaire des cétoses. Les liqueurs non raffinées ont été isomérisées par passage sur des colonnes de verre de 25 mm de diamètre maintenues à 60 'C et contenant de la glucose-isomérase immobilisée au débit de 0,3 ml min L'activité totale de l'enzyme dans chaque colonne est de 800 IGIU Les résultats des isomérisations sont rapportés dans le tableau V ci-après. Il est clair que la teneur en maltulose des substrats est affectée à la fois par le p H de liquéfaction et par la tempéra- ture d'autoclavation Les résultats rapportés dans le tableau V montrent que la teneur -en maltulose est une fonction inverse de la période de l'isomérase, ce qui indique que les conditions de liquéfaction favorisant la formation non enzymatique de précur- seurs du maltulose affectent également la stabilité de l'enzyme. Les résultats montrent également que la quantité de glucose formée au cours de la saccharification est en relation inverse avec la concentration de maltulose. Exemple 4 Dans cet exemple, on décrit les effets de la tempéra- ture à laquelle on chauffe le substrat non raffiné avant l'isomé- risation sur la stabilité de la glucose-isomérase et l'efficacité de la réaction d'isomérisation. On liquéfie l'amidon dans les conditions de l'exemple 1 et on-le saccharifie dans les conditions de l'exemple 3 On filtre la liqueur saccharifiée sur agent filtrant Dicalite et on évapore le filtrat à 50 % de matière sèche A la liqueur concentrée, on ajoute une solution de Mg(HSO 3)2 à 5 % en quantité suffisante pour rendre le substrat 0,0025 M en ce sel et on règle le p H à 7,8 à 250 C par Na OH. On pompe des portions du substrat sur une colonne à double enveloppe de 25 ml maintenue à l'une des températures indiquées dans le tableau VI Après une durée de passage de 30 min dans une colonne maintenue à l'une des températures spécifiées, on refroidit les substrats, on filtre et on dose le glucose et les cétoses On procède à des analyses identiques sur une portion du substrat alcalin qui n'a pas été chauffée. On isomérise individuellement les diverses portions de substrat, sans raffinage préalable, par passage sur des colonnes en verre à double enveloppe maintenues à 650 C et contenant chacune un lit de glucose-isomérase immobilisée avec une activité de 800 IGIU. Les isomérisations sont effectuées pendant une durée de 500 heures à un débit de substrat dans les colonnes de 0,3 ml/min Les rdsultats obtenus sont rapportés dans le tableau VI ci-après. Ces résultats indiquent que les hautes températures de traitement favorisent la formation de cétoses par action non enzymatique, en particulier de fructose, dans les substrats pré- parés dans les conditions préférées de liquéfaction et de sacchari- ficatiton En correspondance, la concentration du glucose dans lesubstrat est diminuée. Exemple 5 Dans cet exemple, on décrit les effets de l'isomé- risation d'un hydrolysat d'amidon non raffiné préparé par un procédé reconnu de la technique antérieure sur la stabilité de la glucose- isomérase et sur l'efficacité de conversion. Un procédé de préparation d'hydrolysat d'amidon est décrit dans l'article d'Aschengreen cité ci-dessus (Proces Bioche- mistry, mai 1975); dans cet article on indique qu'il faut un raf- finage soigné du substrat servant à en éliminer les substances qui inhibent l'activité de la glucose-isomdrase. On disperse de l'amidon obtenu dans une opdration de broyage du mals au mouillé dans de l'eau déminéralisée à la con- centration de 33 % de matière sèche On règle le p H de la dispersion à 6, 5 par Mg O et on ajoute une préparation d'e-amylaae obtenue & partir de B licheniformis (Termamyl-60 L) en quantité suffisante pour apporter dans la dispersion 20 liquéfons g 1 de matière sèche. La liquéfaction est effectuée en pompant la dispersion au débit de 12 ml/min dans des serpentins d'acier inoxydable dans lesquels elle est maintenue à une température de 105 à 107 C pendant 7 minutes. La dispersion est ensuite ramenée à 95 C et maintenue à cette tempé- rature pendant 1,5 heure dans un second serpentin L'hydrolysat partiel (à 33 % de matière sache), qui a un ED de 18,6 et est exempt d'amidon cru (essai à l'iode) est maintenu à 60 C avant saccharifi- cation. L'amidon liquéfié est dilué à 30 % de matière sèche; on règle le p H à 4,5 et on ajoute une préparation de glucoamylase (Novo AMG-150) en quantité correspondant a 0,25 UG par gramme de matière sèche On chauffe le mélange de digestion pendant 48 heures à 600 C en maintenant le p H ci-dessus. On filtre ensuite la liqueur saccharifiée sur agent filtrant Dicalite CP175 et on concentre le filtrat à 49,6 % de matière sèche dans un évaporateur à vide à une température de 430 C. L'analyse de la liqueur indique une teneur en glucose d'environ 95 % et une teneur en maltulose d'environ 0,2 %. Pour la préparation d'un substrat pour l'isomérisation, on rend la liqueur 0,002 M en Mg(HSO 3)2 et on règle le p H à 7,9 par une solution de Na OH On maintient la liqueur à 650 C pendant minutes puis on filtre. On soumet le substrat à l'isomérisation par de la glucose-isomérase immobilisée sans traitement préalable de raffinage ou de purification L'isomérisation est effectuée en passant le substrat à un débit d'entrée d'environ 0,4 ml/min sur une colonne de 25 mm de diamètre maintenue à 650 C et contenant un lit de glucose- isomérase immobilisé à une activité de 1000 IGIU L'isomérisation est poursuivie pendant 570 heures A titre de comparaison, on iso- mérise une solution de dextrose cristallisé dans les mêmes condi- tions Les résultats obtenus sont rapportés dans le tableau VII ci-après. Ces résultats montrent qu'un substrat à faible teneur en calcium et en cétoses produits par action non enzymatique n'exige pas de raffinage approfondi avant l'isomérisation Cette conclusion est tout à fait contraire aux conceptions acceptées de la technique antérieure. Exemple 6 Dans cet exemple, on décrit l'isomérisation d'un hydro- lysat d'amidon non raffiné préparé par un procédé de conversion acide-enzyme. On disperse de l'amidon obtenu dans une opération de broyage du mals au mouillé dans de l'eau déminéralisée à 33 % de matière sèche On règle la dispersion à p H 2,2 par l'acide chlorhy- drique concentré On procède à la liquéfaction en pompant la dis- persion sous pression dans un serpentin d'acier inoxydable au débit de 22 ml/min; dans le serpentin, la dispersion est maintenue à une température de 135 à 1400 C pendant une durée d'environ 4 minutes puis détendue à pression atmosphérique On règle le p H dans l'inter- valle de 4,0 à 4,4 par addition continue d'une solution d'hydroxyde de sodium et on abaisse la température à 600 C L'ED moyen de l'ami- don liquéfié est de 18. On saccharifie environ 70 litres de l'amidon liquéfié, on filtre et on concentre comme décrit dans l'exemple 5 mais à p H 4,4 avec une durée totale de saccharification d'environ 72 heures. La liqueur saccharifiée, à 50,3 % de matière sèche, est réglée à p H 5,8 par Mg O; on ajoute Mg(HSO 3)2 en quantité correspondant à une concentration 0,002 molaire et on règle à nouveau le p H à 7,8 par l'hydroxyde de sodium La liqueur saccharifiée est ensuite traitée à la chaleur, filtrée et isomérisée dans les con- ditions de l'exemple 5 L'isomérisation est poursuivie pendant 667 heures. Les résultats rapportés dans le tableau VIII ci-après sont ceux obtenus avec le substrat non raffiné du traitement acide- enzyme et, comparativement, avec un substrat de dextrose cristallise. Ces résultats montrent qu'un hydrolysat d'amidon obtenu par le procédé acide-enzyme et à faible teneur en cdtoues formiez par action nonenzymatique peut Otre isoodrial efficacement sans raffinage préalable. Exemple 7 Dans cet exemple, on décrit l'utilisation d'une glucose- isomérase obtenue à partir du micro-organisme Bacillus coagulans dans l'isomdrisation du glucose en fructose conformément à l'in- vention. On prépare deux hydrolysats d'amidon dans les condi- tions de l'exemple 3 sauf pour le p H de liquéfaction et la tempé- rature de l'autoclave Les conditions correspondantes, pour chacune des préparations A et B,sont indiquées ci-dessous. Préparation A Préparation B p H de liquéfaction 5,2 6,7 Température de l'autoclave,0 C 125 150-160 L'analyse de la teneur en maltulose des hydrolysats d'amidon indique une teneur inférieure à 0,1/ pour le produit A et une moyenne de 1,10 % pour le produit B. Chacune des préparations est filtrée et concentrée à % de matière sèche sous vide; on introduit ensuite Mg(H 503)2 en quantité correspondant à une concentration 0,0025 M et on règle le p H à 7,9 par une solution d'hydroxyde de sodium Chacune des préparations d'hydrolysat d'amidon non raffiné est ensuite passée en continu dans un serpentin chauffé à 60 C au débit de 0,4 ml/min, avec une durée de passage de 20 minutes, puis filtrée et soumise à isomérisation par passage dans une colonne de verre à double enve- loppe maintenue à 65 C au débit de 0,4 ml/min Chacune des colonnes contient un lit de glucose-isomérase immobilisée (Sweetzyme-Type S, lot n 70122, de la firme Novo Industrie, Danemark) à une activité totale de 800 IGIU. Les résultats obtenus sont rapportés ci-dessous. Pré Durée Maltulose, Rapport Constante Période Effica- paration d'opéra % d b molaire de vi de l'en cité tion, h des cé tesse zyme, enzyma- toses ( 1) kf( 2), h tique kf ( 3) A 871 B 660 1,10 0,55 0,0262 551 14,4 ( 1) moles de cétoses pour 100 moles d'anhydrohexose ( 2) g(G+F)h IGIU 1 ( 3) g(G+F)IGIU 1 Les résultats rapportés ci-dessus mettent en évidence l'importance du maintien des conditions conduisant à une basse concentration en maltulose de l'hydrolysat non raffiné. Les effets positifs sur la stabilité de la glucose- isomérase et sur l'efficacité de conversion globale résultant de l'utilisation dans des réactions d'isomérisation d'hydrolysats d'amidon préparés conformément a l'invention permettent de sup- primer le raffinage des hydrolysats avant l'isomérisation Dans les conditions étroitement contrôlées dans lesquelles on liquéfie, on saccharifie et on manipule l'amidon, on obtient des substrats dans lesquels les teneurs en substances affectant la stabilité de la glucoseisomérase sont suffisamment basses pour permettre la production économique de sirops de glucose/fructose à partir d'hy- drolysats non raffinés à l'échelle industrielle. TABLEAU I Procédé continu pour l'isomérisation enzymatique d'hydrolysats non raffinés; Effet sur la stabilité de l'enzyme Durée d'isomérisation, h moyenne pondérée: Constante de vitesse kf( 1) 0,160 0,150 0,160 0,160 0, 159 0,158 Période de 1 'enzyme t,h Efficacité enzymatique, kf ( 13,0 ,0 18,2 17,0 16,4 16,3 ( 1) g(G+F)IGIU h 1 ( 2) g(G+F)IGIU 1 ( 3) Le réacteur n 1 est retiré de la position de tête après 720 h d'opération et le réacteur n 5 est alors placé dans la position de queue. Réacteur (en série) ( 3) E (IGCIU) N vi C> 4 o TABLEAU II Source d'a-amylase Substrat A Substrat B Conditions de liquéfaction (B licheniformis) (B subtilis) p Hl 5,2 6,6 p H réglé par Mg O Ca O ler stade -1 liquéfons g de matière sèche 14 33 température, C 86 88 durée, h 1 1 Autoclavation température, C 125 150 durée, min 1 1 2 e stade -1 liquéfons g de matière sèche 10 11 température, C 86 88 durée, h 1 1 o tu Jlb TABLEAU III Effets des conditions de liquéfaction et de saccharification sur la composition des substrats saccharifiéset sur la stabilité de la glucoseisomérase Glucose, % d b. Maîtulose, % d b. Rapport molaire des cétoses Constante de vitesse, kf Période de l 'enzyme, tc p h Efficacité enzymatique, kf? 2 Substrat * 0,25 17,4 Substrat (B) 96,6 0, 0,15 0,022 1 Substrat 0,025 14,7 ( 1) g(G+F)IGIU 1 h ( 2) g I&BLZAU IV Premier stade Second stade Dosage d'enzyme, li éfons d'a-amiylase g-?de ma tière sèche 8 6 Température, Oc 86 86 Durée, h 2,5 2,0 4 Durée d'autoclavation entre les deux stades: min tu w% o' TA.BLEAU V Effets du pli de liquéfaction et de la température de l'autoclave sur la stabilité de la glucose-isomnérase et sur Inficct de conversion. Variables à la liquéfaction Substrat d'isomérisation Période de Efficacité Echan Pli Température Na Itulose, Glucose, Rapport l' enzyme enzymatique tillon d'au toclave,0 C 7 % d b 7,d b molaire des h kf Z ( 2) no cétoses 1 5 2 125 ,2 7,2 7,2 8,0 o îa 1,10 2,83 3,$ 90 ,3 94 e 9 92,7 92,0 0 o 09 0,55 1,42 1,95 11,2 7,1 6,6 ( 1) Moles de cétoses pour 100 moles d'anhydrohexoses ( 2) g(G+F)IGIU-1 Jl, > 4 TABLEAU VI Effet du traitement à la chaleur du substrat sur la stabilité de la glucose- isomdrase et sur l'efficacité de conversion Analyse Maltulosei 7 db. 0,07 o îo du substrat Fructose non enzy- matique, 7 d b. o,43 1 J 35 3,38 ,84 Rapport molaire oiîo 0,43 1,35 3,42 ,89 Période de l'enzyme Ef ficacité enzymatique k f;( 2) 11,4 8,5 4,6 2,0 M Gles de cétoses pour 100 moles d'anhydrohexoses g(G+F)IGIU 1 Glucoseà % d b. Tempe- ra ture,. oc Ambiante ,3 94,8 93,8 91,9 89 > 5 ( 1) ( 2) w ON t'> w 0 e TABLEAU VII Effets sur la stabilité de la glucose-isomérase et l'efficacité de conversion, de l'isomérisation d'un hydrolysat d'amidon de la technique antérieure sans raffinage préalable. Analyse du substrat Glucose, Maltulose, Rapport molaiye % d b % d b des cétoses) 99,8 Constante de vitesse kf( 2) 0,026 Période de l'enzyme t, h Efficacité enzymatique kf Z ( 3) 13,7 Substrat de 94,9 0,19 la technique antérieure ( 1) Moles de cétoses pour 100 moles d'anhydrohexoses ( 2) g(G+F)h -IGIU- ( 3) g(G+F)IGIU 1 Substrat Témoin 0,10 0,021 -4 11,6 Ln Do 0 o 4 c ( 9 % TABLEAU VIII Isomérisation d'un hydrolysat d'amidon acide-enzyme non raffiné Analyse du substrat Maltulose % d b. Rapport molaire des cétoses(l) Cons tante de vitesse kf( 2) Période de l'enzyme ?_, h Ef ficacité enzyma tique k' ? ( 3) f Dextrose cris 99,8 g(C+F>h-IGIU'1 ( 3) g(G+F) ICIU-1 Substrat Glucose 7 d b. s 05 0,026 0,% 023 Go 12,7 1 %> C>' REVENDICATIONS 1 Procédé de préparation d'un sirop de glucose/fructose comportant un stade opératoire dans lequel on met un hydrolysat d'amidon contenant du glucose et non raffiné-en contact avec de la glucose-isomérase immobilisée afin de convertir une partie au moins du glucose en fructose> caractérisé en ce que l'hydrolysat contenant du glucose ne contient pas plus d'environ 100 pm d'ions calcium, par rapport à l'amidon sec, et contient des sucres du type cétose formés par action non enzymatique à un rapport molaire inférieur à 2 moles environ pour 100 moles de motifs d'hexoses. 2 Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que l'hydrolysat est préparé par un procédé du type acide-enzyme comprenant la liquéfaction et la saccharification de l'amidon dans des conditions contrôlées. 3 Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que l'hydrolysat est préparé par un procédé du type enzyme-enzyme comprenant la liquéfaction et la saccharification de l'amidon dans des conditions contrblées. 4 Procédé selon la revendication 2 ou 3, caractérisé en ce que l'amidon est liquéfié à l'aide d'une a-amylase à dépen- dance réduite à l'égard des ions calcium. Procédé selon la revendication 4, caractérisé en ce que l'a-amylase a été obtenue à partir de B licheniformis - 6 Procédé selon l'une quelconque des revendications 2 à 5, caractérisé en ce que l'amidon est liquéfié en présence d'une concentration maximale d'environ 30 ppm d'ions calcium. 7 Procédé selon l'une quelconque des revendications 2 à 6, caractérisé en ce que l'amidon est liquéfié en deux stades opératoires avec passage intermédiaire à l'autoclave. 8 Procédé selon l'une quelconque des revendications 2 à 7, caractérisé en ce que l'amidon est liquéfié à un pll d'environ à 6, de préférence de 5,2 à 5,4 9 Procédé selon l'une quelconque des revendications 2 à 8, caractérisé en ce que l'amidon est liquéfié à un équivalent de dextrose d'environ 16. Procédé selon l'une quelconque des revendications 2 à 9, caractérisé en ce que l'amidon liquéfié est préparé à partir d'une dispersion d'amidon à une teneur en ions ne dépassant pas environ 0,2 % de cendres sulfatées, sur matière sèche. 11 Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à , caractérisé en ce que l'hydrolysat de glucose a une teneur en glucose supérieure à environ 927 et de préférence d'environ 94 % par rapport à l'amidon sec. 12 Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 11, caractérisé en ce que l'hydrolysat de glucose est obtenu par saccharification de l'amidon liquéfié à l'aide de glucoamylase à une température dans l'intervalle d'environ 54 à 62 C pendant une durée d'environ 30 a 80 heures. 13 Procédé selon la revendication 12, caractérisé en ce que la saccharification est effectuée à un p H d'environ 4 & 5, de préférence d'environ 4,6. 14 Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 13, caractérisé en ce que la teneur en maltulose de l'hydrolysat non raffiné est inférieure a environ 4 % par rapport à l'midon sec. 15 Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 14, caractérisé en ce que la teneur en fructose non-enzymatique de l'hydrolysat non raffiné est inférieure à environ 1 % par rap- port A l'amidon sec. 16 Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 15, caractérisé en ce que, avant contact avec la glucose-isomérase immobilisée, l'hydrolysat non raffiné est chauffé à une température dans l'intervalle de 50 à 70 C environ pendant une durée d'environ à 60 minutes. 17 Procédé selon la revendication 16, caractérisé en ce que l'hydrolyaat non raffiné est chauffé à une température d'envi- ron 60 C pendant une durée d'environ 30 minutes. 18 Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 a 17, caractérisé en ce qu'on fait passer l'hydrolysat non raffiné sur au moins un lit de glucose-isomérase immobilisée dans des conditions appropriées à l'isomérisation d'une partie au moins du glucose contenu dans l'hydrolysat en fructose. 19 Procédé selon la revendication 18, caractérisé en ce que le lit de glucose-isomérase immobilisée consiste en glucose- isomérase adsorbée ou fixée sur de la DEAE-cellulose ou une résine échangeuse d'anions. 20 Sirops de glucose/fructose préparés par un procédé selon l'une quelconque des revendications 1 A 19.