FR 2501230 A1 19820910 FR 8124482 A 19811230 250123C La présente invention concerne des molécules d'ADN recombinant et des procédés de production de protéines par ces molécules. Elle concerne en particulier des molécules d'ADN recombinant qui sont synthétisées dans des bactéries de souche Bacillus et sont connues comme ayant un ADN qui code pour des exoenzymes excrétées par elles, et qui sont présentes à des dizaines d'exemplaires dans les bactéries de souche Bacillus; ainsi que des molécules d'ADN recombi- nant modifiées à partir des molécules d'ADN recombinant ci- dessus, qui sont connues pour avoir un ADN qui contient des signaux de régulation et d'excrétion du gène de l'a-amylase de B. amyloliquefaciens, auxquels signaux on peut unir un gène de n'importe quelle protéine. Comme il sera décrit ci- après, ces molécules d'ADN recombinant peuvent être utilisées par exemple pour intensifier la production d' a-amylase dans des bactéries de souche Bacillus, et leurs variantes pour produire n'importe quelle protéine dans des bactéries de souche Bacillus. Un développement récent de la biologie moléculaire a créé de nouvelles possibilités de production de protéines dans des bactéries par des techniques d'ADN recombinant. En plus de la possibilité de produire des protéines de cellu- les eukaryotes dans des bactéries par des techniques d'ADN recombinant, la synthèse des protéines des bactéries elles- mêmes peut être améliorée de façon importante en augmentant le nombre des exemplaires du gène désiré dans la cellule. Le nombre des exemplaires du gène dans une cellule de bacté- rie peut être augmenté en unissant le gène à un plasmide ou une molécule d'ADN de virus telle que celle trouvée dans la cellule à plusieurs exemplaires, habituellement 10 à 100. L'augmentation du nombre d'exemplaires du gène dans une cel- lule conduit habituellement aussi à une augmentation corres- pondante de la synthèse des protéines exprimées par le gêne. Bien que plusieurs expériences de ce type aient été effectuées en utilisant E. Coli et des molécules de plasmide ou d'ADN de virus se reproduisant dans celle-ci en tant que bactérie hôte, l'utilisation de bactéries de la souche Bacillus comme hôtes ne fait que commencer (Cryczan et al., Molecular General Genet. 177, 459-467, i979; Keggins et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 75, 19423-1427 1973; Yoneda et al., Biochem. Biophys. es Commn., 91 1556-1564, 1979). Aucun des procédés publiés jusque rresent ne concerne l'aug- mentation de la production de d o;e d'une bactàrie de souche Bacillus dans des bactêeris de souche Baci!!s d'une manière qui permettrait au codage du gêne pour l'exoenzyme d'être reproduit en l'unissant ai p. asnmide qui est présent dans la bactérie de la souche Bacillus à plusieurs exemplai- res (Partie I de l'invention), de flemm aucun des procédés publiés ne concerne la production de protéines par un procédé dans lequel les signaux de régulation et de sécrétion du gêne de l'enzyme sécrétée par les bactéries de souche Bacillus ont été unis au gêne de la protéine que l'on desire produire (Par- tie II de l'invention). Comme exemple de la première partie de l'invention, par laquelle la production d'exoenzymes d'une bactérie de souche Bacillus peut être intensifiée en augmentant le nombre des gênes de l'exoenzyme désirée dans la cellule, on citera le transfert du gêne de l'a-amylase du Bacillus. La figure 1 montre l'exécution de la première partie de l'invention. Le gênome de la bactérie entière est isolé de la bactérie de souche Bacillus produisant l'a-amylase, et coupé par un enzyme de restriction. Des séquences d'ADN de longueur désirée sont unies à la molécule de plasmide coupée par l'enzyme de restriction. Conformément a l'invention, le gênome de la bactérie peut être coupé par l'enzyme de res- triction Mbol, et pUBllO peut être utilisé comme le plasmide qui peut être coupé par l'enzyme de restriction BamHI. Il est à noter qu'une molécule d'ADN recombinant correspondante peut également être préparée en utilisant d'autres enzymes de restriction ou plasmides, et un scientifique expérimenté peut choisir entre diverses combinaisons enzyme de restriction/ 2 2501230 plasmide, tout en demeurant dans le cadre de la présente invention. Après avoir uni les séquences d'ADN aux molécules de -plasmide, les molécules d'ADN recombinant obtenues sont transférées dans la bactérie hôte, et, dans la population de bactéries hôtes, on sélectionne les cellules bactériennes qui ont reçu un codage de gêne pour l'a-amylase, uni au plasmide. La sélection est basée sur la capacité obtenue des cellules transformées de produire de l'a-amylase. La souche Bacillus subtilis est utilisée comme bactérie hôte dans l'invention. Lorsque la molécule d'ADN recombinant ci-dessus a été transférée dans la souche, le codage de gêne pour 1' a-amylase est présent dans celle-ci à environ 50 exem- plaires. Ceci augmente la production d'a-amylase de la souche d'environ 500 fois, par rapport aux souches de B. subtilis - normales. L'augmentation de 500 fois de la production d'a- amylase est dûe d'une part au fait que le signal de régulation du gêne de l'a-amylase de la souche B. amyloliquefaciens uti- lisé comme souche initiale est environ dix fois plus efficace que celui du gêne de l'amylase de B. subtilis, et d'autre part au fait que le nombre de gênes de l'a-amylase a augmenté de 50 fois. Dans les conditions du laboratoire, une souche de B. subtilis contenant une molécule d'ADN recombinant produit 3 à 5 fois plus d'a-amylase que la souche de B. amylolique- faciens utilisée dans l'isolement du gêne. La molécule d'ADN recombinant est isolée de la souche de B. subtilis et caractérisée par des enzymes de restriction et par la définition de l'ordre de base. La figure 2 montre le pKTH10 de la molécule d' ADN recombinant obtenue, les emplacements exclusifs de coupure par l'enzyme de restriction dans le gêne de l'a-amylase ou son signal de régulation, et la structure générale de la molécule de DNA recombinant. La figure 3 montre une partie de l'ordre de base du gêne de l'a-amylase en partant de l'emplacement de coupure de l'enzyme de restriction EcoRI. La molécule d'ADN recombinant dont il est question dans la présente invention, se compose des signaux de régu- lation et d'excrétion du gène de l'a-amylase de la souche Bacillus, et de molécules de plasmide, qui sont présentes dans les bactéries de la souche Bacillus à plusieurs exem- plaires, de manière à permettre au gène de n'importe quelle protéine d'être uni à l'extrémité du signal d'excrétion du gène de l'a-amylase, ce qui conduit à la production de la protéine désirée dans la bactérie de souche Bacillus. La préparation de cette molécule d'ADN recombinant est repré- sentée à la figure 4. La plus grande partie du gène de structure de l'a-amylase est d'abord éliminée par traitement par l'enzyme de restric- tion EcoRI de la molécule d'ADN recombinant contenant le gène de l'aamylase. La molécule d'ADN obtenue est coupée par l'enzyme de restriction et raccourcie par l'exonucléase III et par la nucléase Si pour éliminer le gène de structure de l'a-amylase restant, après quoi on s'assure au moyen d'une enzyme transcriptase réverse que les extrémités de la molé- cule sont à deux brins. Une molécule de lieur d'ADN contenant l'emplacement de coupure par l'EcoRI est ensuite unie à la molécule coupée et racourcie. L'emplacement de la molécule de lieur d'ADN dans la molécule d'ADN recombinant est déter- miné en définissant l'ordre de base de l'ADN à l'emplacement d'assemblage. Les derniers nucléotides dans le gène de structure de l'a-amylase sont éliminés par traitement par la l'ADN polymérase 1, et le nouveau lieur d'ADN est uni à l'extrémité du signal de sécrétion du gène de l'a-amylase. A cet emplacement de coupure par l'enzyme de restriction de la molécule de lieur d'ADN, il est possible d'unir le gène de structure de n'importe quelle autre protéine, par exemple la e-lactamase de E. Coli, ou la séquence d'ADN ou une partie de celle-ci de n'importe quel codage de l'interféron a,g ou y pour les amino-acides. La protéine codée par le gène uni sera ensuite produite dans la bactérie de souche Bacillus à l'aide des signaux de régulation et d'excrétion du gène de l'a-amylase. On expose ci-après en détail la mise en oeuvre de la première partie de l'invention. Isolement, purification et coupure du génome provenant de bactérie de souche Bacillus. Une souche B. amnyloliquefaciens est utilisée comme sou- che de bactérie. La souche est cultivée une nuit dans une solution de milieu nutritif riche, les cellules sont récoltées et lavées dans un tampon de citrate de sodium 0,0015 M et d'NaCl 0,015 M. Les cellules lavées sont mises en suspension (2 x 1011 cellules, c'est-à-dire une culture de 200 ml) dans 2 ml d'une solution à 20% en vol. de saccharose Tris - HC1 mM (pH 8,0). On ajoute 20 mg de lysozyme, 20 mg de pronase et 2 ml d!une solution de Sarkosyl à 1% en vol. et d'EDTA 0,1 M (pH 8,0) et on fait incuber la solution pendant 15 heures à 37 C. On ajoute 6,5 ml de H20 et une quantité de CsCl solide suffisante pour amener l'indice de réfraction du lysat à 1,410, et on centrifuge le lysat (rotor Beckman Ti 50, 36 000 tours/ minute, 48 heures, 10 C). On divise le lysat centrifugé en fractions, et les fractions qui sont supposées contenir le génome bactérien sur la base de leur viscosité sont recueillie et dialysées pendant 30 heures contre un tampon Tris - HC1 mM - EDTA 1 mM - NaCl 0,1 M (pH 8,0) à 4 C). On extrait trois fois la préparation de génome obtenue par du phénol, et on élimine le phénol par extraction à l'éther. On purifie 1' ADN par centrifugation dans un gradient linéaire saccharose, 15 à 30% en vol. - NaCl 0,1 M - Tris HC1 50 mM - EDTA 1 mM, lauryl sulfate de sodium 0,1% (pH 8,0); rotor Beckman SW27, 22 000 tours/minutes, pendant 16 heures à 22 C, après quoi on fractionne le gradient, on recueille les frac- tions dont les séquences d'ADN sont > 15 x 106 dalton, et on précipite l'ADN par l'éthanol. La préparation de génome de B. amyloliquefaciens ainsi isolé est coupée incomplètement par l'enzyme de restriction Mbol, et les séquences d'ADN coupées sont assorties suivant leur taille dans le gradient de saccharose ci-dessus (Rotor Beckman SW27, 22 000 tours/minute, 16 heures à 220C). Les fractions dont les séquences d'ADN sont de 1,5 à 5 x 106 dal- ton, sont récoltées et l'ADN et prëcipité par l'Vthanol1 Isolement et coupure du -,,ecteur de transfert rar l'enzyme de restriction. Le plasmide pUBiIO est utilisé comme vecteur de trans- fert. Le plasmide est isolé et purifie a partir de la souche de Bacillus subtilis SB202 comme il a été décrit précédemment (Cryczan et Coll., J. Bacteriol. I34, 318-329, 1978). La pré- paration de plasmide purifié est coupée par l'enzF.me de res- triction BamHI, qui possède un seul emplacement de coupure dans la molécule de plasmide. La linéarité de ia molécule de plasmide est-contrôlée par électrophorèse sur gel. Combinaison des brins du génome de B. amloliquefaciens au vecteur de transfert. Les brins du ginome de B. amyilLiquefaciens qui ont été coupés par l'enzyme Mbol et choisis sur la base de leur di- mension, sont mélangés au plasmide pUBIIO coupé par l'enzyme BamHI dans le tampon Tris-HCl 10 s - EDTA 1 mbl (pH 8,0) dans un rapport de concentration de I'ADN de 1:3, le volume total étant de 120 p1 et la concentration totale de 1'ADN de 180 pg/ml. On chauffe la solution pendant 5 minutes a 65 C, et on ajoute à la solution refroidie 13 p1 de tampon Tris-HCl 66 mM - MgC12 6,6 mM - dithiothreitol 100 mM - ATP 10 mM (pH 7,8) et p1 de ligase T4-ADN (20 unités Weiss). On fait incuber la solution de ligase pendant 3 heures à 23 C, et le résultat de la ligature est contrôlé par électrophorèse sur gel. Transfert de la molécule d'ADN recombinant dans la bactérie hôte. On utilise comme bactérie hôte une souche de B. subtilis 1A197 avec le génotype sacA321, metB5, aroll907, amy. La souche a été fournie par le Bacillus Genetic Stock Center (Université de l'Etat d'Ohio, USA), et la carte de son phéno- type Amy a été dressée par des procédés bactériogénétiques en tant que mutations dans le gène de structure du codage de l'enzyme pour l'aamylase. La souche a été rendue compétente, c'est-à-dire capable de recevoir l'ADN de la manière décrite précédemment (Anagnostopoulos et coll., J. Bacteriol. 81,741/ 746, 1961). Les molécules d'ADN recombinant préparées par li- gature comme il a été décrit ci-dessus, sont mélangées aux bactéries hôtes compétentes, et le mélange est maintenu pendant minutes à 370C. Le mélange est ensuite répandu sur des pla- ques de bactéries avec de la kanamycine antibiotique pour empêcher le développement de toutes les bactéries n'ayant pas reçu de plasmide. Les plaques sont maintenues à 370C pendant heures, au cours desquelles les bactéries hôtes auxquelles un plasmide ou un brin de génome de B. amyloliquefaciens a été uni, se sont développées en petites colonies. Détection des bactéries hôtes dans lesquelles le codage du gène de B. amyloliquefaciens pour l'a-amylase est uni au plasmide pUB1lO. Les colonies bactériennes décrites ci-dessus sont repro- duites sur de nouvelles plaques de milieu nutritif qui sont cultivées pendant 30 heures à 370C. Les cultures bactériennes obtenues sont traitées par une solution l-Kl en utilisant un procédé précédemment décrit (J. Bactériol. 119, 416-424, 1974), ce qui conduit à la formation d'un anneau blanc autour des colonies bactériennes qui ont reçu une molécule d'ADN recom- binant contenant un codage de gènes pour l'a-amylase. Les colonies correspondantes sont recueillies sur les boîtes de bactéries initiales et les bactéries sont soumises à plusieurs développements de purification successifs. Isolement et caractérisation de la molécule d'ADN recom- binant. On isole la molécule d'ADN recombinant et on la purifie de la bactérie hôte par un procédé qui a été décrit précédem- ment (Cryczan et Coll., J. Bacteriol. 134, 318-329, 1978). La molécule est caractérisée par diverses enzymes de restriction et l'emplacement du codage des gènes pour l'a-amylase fait l'objet d'une détermination préliminaire en suivant l'inacti- vation du gène lorsqu'on unit des séquences extra ADN en divers emplacements de la molécule d'ADN recombinant. L'ordre de base du codage des gènes pour l'a-amylase est ensuite déterminé par un procédé qui a été décrit précédemment (Maxam, A. et Gilbert, W., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74, 560-564 1977). Détermination de l'activité de l'a-amylase. La bactérie hôte B. subtilis IHO 6064 (sacA321, metEB5), modifiée, qui a un codage de gène pour l'a-amylase dans le plasmide pUB110, est cultivée dans milieu nutritif liquide (bouillon de Luria) par aération à 37 C. On prélève des échan- tillons du liquide de culture à des intervalles de 2 heures, sur lesquels on détermine l'activité de l'a-amylase au moyen de comprimés de Phadebas. On expose ci-après en détail la mise en oeuvre de la deuxième partie de l'invention. Elimination du fragment EcoRI du plasmide pKTH1O. On coupe le plasmide pKTH10 à l'emplacement de coupure EcoRI (Fig. 2). Les séquences d'ADN obtenues (environ 1 pg) sont à nouveau liées ensemble dans un tampon Tris - HC1 66 mM MgCl2 6,6 mM - dithiothreitol 100 mS - ATP 10 mM (pH 7,8), et on ajoute 0,5 pl de ligase T4-ADN (2 unités Weiss). La solu- tion de ligature est mise à incuber pendant 3 heures à 23 C, après quoi la souche de B. subtilis IHO 6064 compétente est transformée par elle de la manière décrite ci-dessus. Les cellules sont répandues sur les boites de bactéries contenant de la kanamycine et cultivées pendant une nuit à 37 C. On sélectionne une colonie a-amylase-négative des transformants obtenus par la méthode I-KI en utilisant des plaques d'amidon et on isole un plasmide de la colonie de la manière décrite antérieurement (Cryczan et Coll., J. Bacteriol. 134, 318-329, 1978). Le fragment EcoRI - KpnI HindIII - EcoRI manquant dans la préparation de plasmide obtenu pKTH29 est contrôlé par électrophorèse sur gel. Raccourcissement du plasmide pKTH29 par traitement à l'exonucléase. On coupe le plasmide pKTH29 (100 pl, 500 pg/ml) au moyen de l'enzyme de restriction EcoRI. Apres ce traitement, on ajoute à la solution 0,5 p1 de dithiothreitol 1 M et 10 p1 d'exonucl6ase III (0,25 unités, Biolabs). On fait incuber la solution pendant 1 à 3 minutes à 37 C, et on stoppe la réac- tion dans un bain-marie à 70 C. On précipite l'ADN de la so- lution avec de l'éthanol et on le dissout dans un tampon NaCl 0,3 M acétate de sodium 0,03 M - ZnC12 3 mM (pH 4,5). On ajoute 10 p1 de Slnucléase (25 unités/ml, Boehringer Mannheim) et on fait incuber la solution pendant 30 minutes à 37 C et pendant 10 minutes à 4 C. Apres les incubations, on extrait la préparation avec du phénol, on élimine le phénol par extrac- tion à l'éther et on précipite l'ADN par l'éthanol. On dissout l'ADN desséché dans 40 pl de tampon Tris - HC1 10 mM - EDTA 1 mM (pH 8,0), et on ajoute 10 p1 de tampon Tris 150 mM - KC1 mM - MgC12 40 mM - dithiothreitol 3,0 mM (pH 8,3), et 5 p1 d'un mélange de dNTP dans lequel à chaque nucléotide-tri- phosphate on mélange 10 mM de la solution dans un rapport équimolaire, et on ajoute 2 p1 d'enzyme transcriptase réverse (Beard, 13 unités/pl). On fait incuber la solution pendant minutes à 37 C et on stoppe la réaction par incubation à C pendant 7 minutes. On purifie l'ADN par électrophorèse sur agarose préparative (LTG, Low Gelling Temperature), et on découpe dans le gel les zones de plasmide qui ont été teintes par du bromure d'éthidium. On extrait l'ADN de l'agarose par le phénol à 65 C, on répète l'extraction par le phénol à 20 C et on élimine le phénol par l'extraction à l'éther. On préci- pite l'ADN par l'éthanol, on lave le précipité par de l'éthanol à 70 C et on le sèche. Phosphorylation de la molécule de lieur EcoRI et sa com- binaison au plasmide. A 10 p1 de solution de molécule de lieur EcoRI (EcoRI linker, Collaborative Research, 50 pg/ml), on ajoute 5 41 de 32Py ATP (10 mCi/ml, 3000 Ci/mol), 1,7 p1 de tampon Tris-Cl 600 mM - MgCl2 66 mM dithiothreitol 10 m4 (pli 8,0) et 0,5 pi de T4-polynucléotidekinase. On fait incuber la solution pen- dant 30 minutes à 37 C, après quoi on ajoute 5 p1 d'ATP 19 "M et on poursuit l'incubation pendant 30 minutes à 37 C. La préparation de pKTH29 desséchée qui a été traitée par l'exonucl6ase est dissoute dans 5 ul de la solution contenant de la molécule de lieur EcoRI phosphorylé décrite ci-dessus. On ajoute à la solution 0,5 pi d'ATP 10 mM, 0,5 p1 de spermi- dine 1 mM et 0,5 p1 de T4- ADN-ligase (2 unités Weiss). On fait incuber la solution pendant 3 heures à 23 C, après quoi on la dilue à 20 p1 dans du tampon Tris - HC1 40 mM - NaCl mM - MgC12 10 mM (pH 7,6). On ajoute 15 unités d'enzyme EcoRI (Biolabs), et on fait incuber la solution pendant 12 heures à 37 C. On stoppe la réaction par incubation à 65 C pendant 10 minutes. La préparation traitée par EcoRI est fixée sur gel a travers une colonne de 1 ml de Sépharose 4B. On utilise comme tampon d'élution dans la filtration, du Tris- HCl 2 mM - EDTA 0,1 m (pH 7,5). On recueille le filtrat par fractions de 35 pi, et on identifie les fractions contenant un plasmide par leur radioactivité, on les recueille et on les sèche. On dissout l'ADN séché dans 20 pi de tampon Tris- HC1 66 mM - MgCl2 6,6 mM - dithiothreitol 10 mM (pH 8,0), et on ajoute 1,5 p1 d'ATP 10 mMi et 0,3 p1 de T4 - ADN-ligase. On fait incuber la solution pendant 3 heures à 23 C, après quoi la souche de B. subtilis IHO 6064 compétente est trans- formée par la préparation de plasmide, et les cellules sont cultivées sur des boites à bactéries contenant de la kanamy- cine. On isole les plasmides des transformants par un procédé décrit précédemment (Cryczan et Coll., J. Bacteriol. 134, 318- 329, 1978), et on caractérise d'abord les plasmides par élec- trophorèse sur gel, après quoi on détermine leur séquence de base d'ADN aux deux extrémités de la molécule de liant EcoRI. De cette façon, on obtient le plasmide pKTH 38 à partir du plasmide pKTK29. Dans le plasmide pKTH 38, la molécule de lieur est située 90 paires de nucléotides après l'emplacement de coupure du signal d'excrétion dans la région du gène de la structure de l'a-amylase. Pour unir la molécule de lieur à l'emplacement de liaision du signal d'excrétion ou à sa proxi- mité immédiate, on coupe le plasmide pKTH 38 avec de l'EcoRI. On met en suspension trois portions de 10 pg du plasmide coupé dans 115 pl de tampon Tris 20 mM, NaCl 600 mM, MgC12 12 mM, CuC12 12 mM, EDTA 1 mM (pH 8,1). On ajoute à chaque portion de plasmide 10 lil1 d'enzyme BAL-31 (Bethesda Research Labora- tories, BRL, 40 U/ml) et on fait incuber les tubes pendant , 6 et 7 minutes dans un bain-marie à 30 C. On stoppe la réaction par addition de EDTA 0,5 M, pH 8,0 de façon à obtenir une concentration finale de 12 mM. On rassemble les portions d'ADN traitées par le BAL-31, on les extrait deux fois par du phénol et on les précipite par l'éthanol. Le précipité par l'éthanol est mis en suspension dans 75 p1 de tampon Tris 63 mM, MgCl2 6,3 mM (pH 8,0), et on ajoute à la solution 5 pil de dATP 1 mM, dGTP 1 mM, dCTP 1 mM et dTTP 1 mM, et finalement 5 pil de T4 polymérase (PL-Biochemicals, 5 U/pi). On fait incu- ber la solution pendant 80 minutes à 11 C. On stoppe la réac- tion en ajoutant du EDTA 0,5 M comme ci-dessus, et on extrait la solution par du phénol, puis on précipite l'ADN par l'étha- nol. Le précipité par l'éthanol est dissout dans 250 pl de tampon Tris 10 mM, EDTA 1 mM (pH 8,0). A 55 pl de cette solu- tion, on ajoute 50 p1 de molécules de lieur Hind III phospho- rylé (BRL, 75 pmole), 5 p1 de Tris 660 mM, MgCl2 100 mM, dithiothreitol 50 mM (pH 7,5) et 10 p1 de T4 ADN ligase (BRL, 2U/pl). On fait incuber le mélange pendant 15 heures à 15 C et pendant 10 minutes à 65 C. On précipite l'ADN en ajoutant de l'isopropanol, on lave le précipité d'ADN avec de l'éthanol à 70% et, après séchage sous vide, on le met en suspension dans 100 p1 de tampon Tris 10 mM, NaCl 50 mM, MgC125 mM, dithiothreitol 5 mM (pH 8,0). On ajoute à la suspension 3 pl d'enzyme de restriction Hind III (BRL, 10 U/pl) et on fait incuber la solution pendant 4 heures à 37 C et pendant 10 mi- nutes à 65 C, on purifie l'ADN par électrophorèse, sur gel d'agarose LGT à 0,8% (Marine Colloids Inc.), 30 V, 15 heures. On découpe du gel la zone des plasmides linéaires, on extrait l'ADN à 65 C avec du phénol et on le précipite par l'éthanol. Le précipité par l'éthanol est dissout dans 35 pl de tampon Tris 66 mM, MgC1210 mM, dithiothreitol 5 mM (pH 7,5) auquel on a ajouté 1,5 pl de rATP 10 mM et 1, 5 pl de T4 ADN ligase (BRL, 2 U/ipl). On fait incuber le mélange pendant 3 heures à 22 C et on le transforme en B. subtilis compétent, souche IHO 6135, et on cultive les cellules sur des boîtes de milieux nutritifs contenant de la kanamycine. On isole les plasmides à partir des transformants été décrite précédemment, e molécule de lieur Hind III de l'ADN. De cette façon, dans lesquels la molécule diatement après le signal tions après l'emplacement dans la région du gène de conformément à une méthode qui a et on détermine l'emplacement de la dans les plasmides par séquencement on obtient une série de plasmides de lieur Hind III est située immé- d'excrétion ou dans diverses posi- de coupure du signal d'excrétion structure de l'a-amylase. Le codage de la séquence d'ADN pour les amino-acides de n'importe quelle protéine désirée peut être uni aux emplace- ments de coupures formés par ces molécules de lieur Hind III, - de telle sorte que, comme il ressort des exemples ci-dessus, une bactérie de la souche Bacillus produira et excrètera cette protéine sur son substrat. c> oL Dao ODY.LVú DOL WOD.li,Lv. ova DLS DJa oDVo IYvr 3 volvv ----------My liv DIX wnId 5. Daa3 O DY &Y IDOr YVD l&. LV& sov DOV oDa DDV aD, YJ DID DSD YDY -- V.I. Y-V j[,-v6 DTV S ixLd îpoDl'DD-YVVX O.LJJ IYL Dva l DJ. O. DDV oDo J.VV veo boo vol.?. ---------- YD I.V DIV L s HIlid D) ILDWDO& V sDV&s oYa V Dai DDV oDDO Ivv V VD 3aDDV V. V..--------------WY.DSY 9SH/,Xd D DDV DUO I1W VID, ZDDD Vo.? VDV --V-------1-L D.V ç mixd e.5JV DDV Doi.lvv VID a00 Val VDV -------- vv IlV DIV >S mLimd o DDOg ass VD DOD val DY --------------- YVD l.V DIV s HixId LDXssPa:lXa DV agSsw YD laD Va; VDV ------------- WaDli olîDS ZS jHsd n. I LDD Y VZ YDV -------------- WD LV DIV I 15 yd Do Vol YDa--------------- Va..i V DIVos HsXd DWV 0Da DDV LVI Do9 VVD.L Lv.!V DS DDLa DYV 0s w3 VYD IDDs V3, vDV -------------vo. SLv oo H.id agv OJ4 stq iRd5i nTg qLd il ulo leW noq juI AloD UV XeA 101V z0S 14I UID 04d lait 1.11- c-. l - t Exemple 1. Production de l'enzyme e-lactamase de E. Coli à partir de la souche Bacillus substitus. Le plasmide pKTH est ouvert par l'enzyme Hind III et, à l'emplacement de la coupure, on assemble un codage de gènes pour la $-lactamase de E. Coli, dont les régions des signaux promoteurs et d'excrétion ont été éliminées. On transforme le plasmide hybride obtenu en la souche B. subtilis IHO 6140 compétente, en choisissant des cellules qui avaient reçu le plasmide, sur la base de la résistance à la kanamycine, et on cultive les cellules sur des boites de milieux nutritifs contenant de la kanamycine. On sélectionne les transformants sous l'angle du rendement en mettant en suspension chaque co- lonie dans 100 pi1 d'une solution de nitroséphine 01 mM, phosphate de K -O,1 M (pH 7,0). On prépare des cultures liqui- des des colonies qui donnent un résultat positif aux tests à la nitroséphine (la couleur de la solution vire au rouge) pour la détermination de l'activité de l'enzyme 0-lactamase pro- duite. La souche de B. subtilis IHO 6140 qui a été transformée par le plasmide pXTH 50 est utilisée comme témoin. On cultive les souches dans une solution SMS (Spizizen minimal salts) à laquelle on a ajouté 0,5 % de glycérol, 1 % d'amidon soluble, et 5 pg/ml de kanamycine. On fait développer les cultures à 37 C en agitant. Environ 5 heures après une période de crois- sance logarithmique (Klett67 250), on centrifuge les cultures à 10.000 g pendant 5 minutes et on recueille le liquide sur- nageant. On met en suspension les cellules dans un tampon phosphate de potassium 0,1 M (pH 7,0) à leur volume de déve- loppement initial. On détermine l'activité de la e-lactamase dans la cellule et les fractions surnageantes en suivant spectrophotométriquement la désintégration de la céphalotine. Les résultats suivants sont obtenus à partir de la détermina- tion Activité de la e-lactamase (U/ml)* Cellules liquide surnageant B. subtilis IHO 6140/pKTH 50 e-lactamase 60 3000 B. subtilis IHO 6140/pKTH 50 une minute à 37 C. Exemple 2. Production d'interféron de leucocytes dans la souche de Bacillus subtilis. On coupe le plasmide pKTH 53 avec l'enzyme Hind III, et on unit à l'emplacement de la coupure le codage de séquence d'ADN pour l'interféron de leucocytes (a-2) dont on a élimi- né la partie codage pour le signal d'excrétion. Le plasmide hybride obtenu est transformé en la souche de B. subtilis IHO 6140 compétente en choisissant les cellules qui ont reçu le plasmide, sur la base de la résistance à la kanamycine. On sélectionne les transformants par une méthode d'hybridisation des colonies (Gr nstein, M. et Hogness, D.S., Proc. Natl. Acad. Sci. (US) 72, 3961-3965, 1975) en utilisant comme sys- tème de sondage le codage d'ADN pour l'interféron, marqué à 1'125I. On cultive les colonies de bactéries contenant de l'ADN-interféron dans du bouillon de Luria auquel on a ajouté 2 % d'amidon soluble et 5 pg/ml de kanamycine, tout en agi- tant à 37 C. On centrifuge la culture pendant 4 heures après la période de développement logarithmique (Klett67 300) 10.000 g, 5 minutes. On recueille le liquide surnageant et on met les cellules en suspension dans leur volume de dévelop- pement initial dans une solution de NaCl à 0,9%. On détermine l'activité de l'interféron dans la cellule et les fractions surnageantes. La souche de B. subtilis IHO 6140/pKTH 53 est utilisée comme témoin dans les déterminations. Les détermi- nations donnent les résultats suivants: Activité de l'interféron (t.U./ml) B. subtilis IHO 6140/ pKTH 53/IF B. subtilis IHlO 6140/ pKTH 53 Cellules REVENDICATIONS 1. Procédé d'amélioration de la production de protéines dans des bactéries de souche Bacillus, caractérisé en ce que le gène de la protéine excrétante d'une bactérie de la souche Bacillus est uni par des techniques d'ADN recombinant à une molécule de plasmide présente dans des bactéries de souche Bacillus à plusieurs exemplaires, en ce que la bactérie hôte de la souche Bacillus est transférée avec la molécule d'ADN recombinant obtenue et en ce que les bactéries transformées sont cultivées pour produire la protéine excrétante. 2. Procédé suivant la revendication 1, caractérisé en ce que le gène de la protéine excrétante uni au plasmide est un gène d'c-amylase. 3. Procédé suivant la revendication 1 caractérisé en ce que le gène de la protéine excrétante uni au plasmide est le gène de l'a-amylase de Bacillus amyloliquefaciens. 4. Procédé suivant l'une quelconque des revendications 1 à 3, caractérisé en ce que le plasmide est pUB1l10. 5. Procédé suivant l'une quelconque des revendications 1 à 4, caractérisé en ce que la bactérie hôte est le Bacillus subtilis. 6. Molécule d'ADN recombinant, caractérisée en ce que le gène de l'enzyme excrétante de la souche Bacillus ou une partie de celui-ci est uni à une molécule de plasmide pré- sente dans la bactérie de souche Bacillus à plusieurs exem- plaires. 7. Molécule d'ADN recombinant suivant la revendication 6, caractérisée en ce que le gène pour le codage de l'a-amylase isolé d'une bactérie de souche Bacillus ou une partie de celui- ci est uni à une molécule de plasmide présente dans la bactérie de souche Bacillus. 8. Molécule d'ADN recombinant suivant la revendication 7, caractérisée en ce que le gène pour le codage de l'a-amylase uni à la molécule de plasmide, provient d'une bactérie de l'espèce B. amyloliquefaciens. a) >1I do cl A rd1 G) - O 0 4 c: À 0, c.,. o uIn Ln o E o o u 0 E4 o o U o Jt f o s F 0 t U O CD 3 i 0 N t. 0" i^ H f 1)u Jq1 6;ç;t t:: '-, C. ' Oxt Cl ar- "F Fi CA0 -rf+Q H) U CDCD 4 C- Os f -emirlr, tr i,,,t, P te E-1r. 4 r.:El le )bS ÉF utQ OE) U IH)tz 4E C., 0 P 9' l5 E 4: t.7 t3:> t3 0 1w UU aJ;r El L'1C) en, e-ci [ -,rC U sC E E rr ?4r4 61*t E lEq fzQ Qt3 tt:,E * V'O tJ El. U O -1O4 t- O tOOUUOUtlOfSe i UO E Ott90Wt h 'OOUt u t.JLD U4.1 EEI0 udzC^ E; r:t des revendications 6 à 9, caractérisée en ce que la molécule de plasmide utilisée est pUB1lO. 11. Procédé de préparation d'une protéine choisie ou d'une partie de celle-ci en unissant un codage d'ADN pour la protéine choisie ou une partie de celui-ci à un gène de bactérie, caractérisé en ce que le gène de Bacillus amylo- liquefaciens pour l'a-amylase est coupé en un emplacement situé après le signal d'excrétion suivant la partie régula- tion ou un emplacement situé après une partie essentielle en ce qui concerne son excrétion, en ce que ce gène est uni à un plasmide présent dans des bactéries de souche Bacillus à plusieurs exemplaires, en ce que le codage de la séquence d'AWN pour la protéine choisie ou pour une partie de celle-ci essentielle à son activité biologique est uni à l'emplacement de coupure par des techniques d'ADN recombinant, en ce que les bactéries hôtes de souche Bacillus sont transformées avec la molécule d' AN recombinant obtenue et en ce que les bacté- ries hôtes transformées sont cultivées pour produire la pro- téine choisie ou une partie de celle-ci. 12. Procédé suivant la revendication 1, caractérisé en ce que la protéine choisie est l'une des protéines suivantes': A. Protéines antigènes de microbes et de protozoaires. Protéine de la capsule, de la membrane externe et de la Fimbria provenant des sources suivantes Bacteroides fragilis Fusobacterium spp. Bordetella pertussis Haemophilus influenzae Yersinia enterocolitica Yersinia pestis Branhamella catarrhalis Escherichia coli Klebsiella pneumonia Vibrio cholerae Proteus mirabilis Pseudomonas aeruginosa Serratia marcescens Legionella pneumophila Neisseria gonorrhoeae Neisseria meningitidis Salmonella typhimurium Salmonella typhi Salmonella paratyphi B Mycobacterium tyberculosis Chlamydia trachomatis Shigella spp. Toxines protéiniques produites par les bacteéries sui- vantes: Staphylococcus aureus Pseudomonas aeruginosa Clostridium spp. Escherichia coli Yersinia pestis Vibrio cholerae Bordetella pertussis Mprotéine de la bactérie Streptococcus pyogenes Enzymes excrétées de Streptococcus mutans Protéines superficielles des organismes suivants: Plasmodium spp.) Toxoplasma spp.) Leishmania spp.) toutes les phases du développement Schistosoma spp.) Trypanosoma spp.) Membranes protéiniques des microorganismes suivants: Mycoplasma pneumoniae Mycoplasma hominis Protéine contagieuse de Streptococcus spp. Protéine contagieuse de Staphylococcus aureus B. Protéines antigènes de virus. Protéines HA et NA de myxovirus (influenza A Hi - H12, influenza B, influenza C). Protéines HN et F de paramixovirus (parainfluenza 1-4, virus de la maladie de Newcastle, virus de la rougeole, virus respiratoire syncytial, virus de la parotidite, virus de la maladie de Carré). Protéine G du virus de la rage. Protéines E1 et E2 d'alphavirus (Virus Chikungunya, virus occidental, virus oriental, virus de l'encéphalite équine vénézuélienne, virus O'nyong-nyong, virus de la forêt de Semliki, virus Sindbis). Protéines V! et V3 de virus flavin (Denque 1 - 4, virus de l'encéphalite japonaise, virus de l'encéphalite des aca- riens, virus de l'encéphalite de la vallée du Murray, virus de la maladie de la forêt de Kyasanur, virus du louping ill, virus de la fièvre hémorrhagique d'Omsk). Protéines de surface de la rougeole allemande. Protéines de surface du virus de la peste porcine. Protéines de surface du virus de l'arthrite équine. Protéines G1 et G2 de virus Bunya (virus de la fièvre de la vallée du Rift, virus de la fièvre hémorragique griméenne, virus de l'encéphalite californienne, virus de la fièvre à pappataci). Protéines G1 et G2 de virus arena (virus de Lassa, virus de la chorio-méningite lymphocytaire). Protéines Vl - V4 de virus picorna (virus polio 1 - 3, virus 1 - 24 de la Coxsackie A, virus 1 - 6 de la Coxsackie B, échovirus 1 - 8, 11 - 34, virus de l'hépatite A, rhinovirus humain 1 - 113). Protéines de surface de virus rota. Protéines de surface de virus de l'herpès (HSV 1, 2, virus Cytomegalo, virus Epstein-Barr, virus de l'avortement des chevaux). Protéines VP1 - VP3 de virus papova (virus BK, virus de la verrue humaine). Protéines de virus parvo (virus de l'entérite du vison, parvo virus bovin, parvo virus félin, parvo virus porcin). Protéines de structure du virus de l'hépatite B humaine. Protéines de surface des virus Ebola et Marburg. Hexone, pentone et p (adéno virus humain 1 - 3 C. Enzymes industrie Enzymes: a-amylase Aminofacidacylase Amyloglucosidase Bromélaine Phisine $-galactosidase e-glucanase Glucose-isomérase Glucoseoxidase Hémicellulase Invertase Catalase Collagénase Xsylanase Lactase Lipase Naringinase Pancréatine Papaîne Pectinase Penicillinamidase Penicillinase Pepsine Protéase )rotéins fibreuses d'adéno virus 3). lles (B. subtilis, malt, A. oryzae) (Bacillus spp.) (A. niger, Rhizopus sp.) (Ananas) (Figue) (A. niger) (B. subtilis, Aspergillus sp.) (L. brevis, P. notanum., Streptomyces sp.) (A. niger) (A. niger, Tri.choderma reesei, Bacillus spp. ) (S. cerevisiae) (A. niger) (Clostridium histolyticum) (A. niger, Trichoderma reesei, Bacillus spp.) (S. fragilis, S. lactis, E. coli, Aspergillus sp.) (Moisissure, levure) (A. niger) (Pancréas) (Papaya) (A. niger, Penicillium sp.) (Bacillus spp.) (Bacillus spp.) (Abdomen animal) (A. oryzae, B. subtilis) Pullulanase (Aerobacter aerogenes) Isoamylase (Escherichia intermedia, Pseudomonas sp Rennine (Estomac de veau, M. miehei, Endothia parasitica) Ribonucléase (B. subtilis, Mould, A. niger) Cellulase (A. niger, Trichoderma reesei) Streptokinase (Streptococcus hemolyticus) Trypsine (Pancréas) 13. Procédé suivant la revendication 11, caractérisé en ce que la protéine choisie est l'un quelconque des interférons a-e-, et y- ou une partie biologiquement active de ceux-ci. 14. Procédé suivant la revendication 11, caractérisé en ce que la protéine choisie est la e-lactamase de E. coli ou une partie biologiquement active de celle-ci. 15. Procédé selon l'une quelconque des revendications 11 à 14,caractérisé en ce que le gène de la protéine choisie ou une partie de celui-ci est uni en un point situé après le signal d'excrétion suivant la partie régulation du gène d'a- amylase de Bacillus amyloliquefaciens ou après une partie essentielle en ce qui concerne l'excrétion. 16. Procédé suivant la revendication 15, caractérisé en ce que le codage de la séquence ADN pour les amino-acides dans la protéine choisie ou une partie essentielle de celui-ci en ce qui concerne l'activité biologique de la protéine est uni à l'une quelconque des séquences de nucléotides du gène de l'a-amylase ci-après: CTG TTA TTT GTC AGT TTG CCG ATT ACA AAA ACA TCA GCC GAC AAT AAA CAG TCA AAC GGC TAA TGT TTT TGT AGT CGG CGT TTA TTT GTC AGT TTG CCG ATT ACA AAA ACA TCA GCC G GAC AAT AAA CAG TCA AAC GGC TAA TGT TTT TGT AGT CGG C ' CTG TTA 3' GAC AAT TTT GTC AGT TTG AAA CAG TCA PAC CCG ATT GGC TAA ACA AAA TGT TTT ACA TCA GCC GT TGT AGT CGG CA CTG TTA TTT GTC AGT TTG CCG ATT ACA GAC AAT AAA CAG TCA AAC GGC TAA TGT AAA ACA TCA GCC GTA TTT TGT AGT CGG CAT ' CTG TTA 3' GAC AAT TTT GTC AGT TTG CCG ATT ACA AAA CAG TCA AAC GGC TAA TGT A CA ACC GTA A CA CC TA A TTT TGT AGT CGG CAT T ' CTG TTA TTT GTC AGT TTG CCG ATT ACA AAA ACA TCA GCC GTA AA 3' GAC AAT AAA CAG TCA AAC GGC TAA TGT TTT TGT AGT CGG CAT TT 17. Il à 16, lis. Procédé suivant l'une quelconque des renvendications caractérisé en ce que la bactérie hôte est B. subti- 18. Molécule d'ADN recombinant, caractérisée en ce qu'elle contient un plasmide qui est capable de se multiplier dans les bactéries de souche Bacillus, la partie régulation du gène de l'a-amylase de B. amyloliquefaciens et une séquence d'ADN qui est essentielle en ce qui concerne l'excrétion et à laquelle est uni le codage de la séquence d'ADN pour les amino-acides dans la protéine choisie ou une partie essen- tielle de celle-ci en ce qui concerne l'activité biologique de cette protéine. 19. Molécule d'ADN recombinant suivant la revendication 18, caractérisée en ce qu'elle contient la séquence de nuclé- otides définie dans la revendication 9, ou une partie de celle-ci. 20. Molécule d'ADN recombinant suivant l'une quelconque ' 3' ' 3' 3' des revendications 18 ou 19, caractérisée en ce que le codage de la séquence d'ADN pour la protéine choisie ou une partie essentielle de celle-ci en ce qui concerne son activité bio- logique est uni à l'une quelconque des séquences de nucléo- tides du gène de l'a-amylase définies dans la revendication 16. 21. Molécule d'ADN recombinant suivant l'une quelconque des revendications 18 à 20, caractérisée en ce que la séquen- ce d'ADN à unir effectue un codage pour l'une quelconque des protéines mentionnées dans la revendication 12 ou pour une partie essentielle de celle-ci en ce qui concerne l'activité biologique. 22. Molécule d'ADN recombinant suivant l'une quelconque des revendications 18 à 20, caractérisée en ce que la séquence d'ADN à unir effectue un codage pour l'un quelconque des in- terférons a-, f-, ou y- ou une partie essentielle de ceux-ci en ce qui concerne l'activité biologique. 23. Molécule d'ADN recombinant suivant l'une quelconque des revendications 18 à 20, caractérisée en ce que la séquence d'ADN à unir effectue un codage pour la e-lactamase de E.coli ou une partie essentielle de celle-ci en ce qui concerne l'activité biologique. 24. Molécule d' ADN recombinant suivant l'une quelconque des revendications 18 à 23, caractérisée en ce que le plasmide est pUB1lO.