FR 2500477 A1 19820827 FR 8202815 A 19820219 La présente invention concerne un procédé pour la culture de micro-organismes. Comme on le sait, lorsque l'on fait cuire des matières fibreuses telles que des plantes ligneuses et non ligneuses, etc. en conditionsforternent alcalinesà température et sous pression élevées par le procédé de cuisson kraft, le procédé de cuisson à la soude, le procédé de cuisson oxygènealcali, le procédé de cuisson au sulfite alcalin ou un autre procédé de cuisson alcaline, une grande quantité du com- posant hémicellulose et une portion du composant cellulose, outre le compo- sant lignine contenu dans les matières fibreuses, sont dissoutes et décompo- sées, se dissolvant ainsi dans la lessive extraite (en début ou au cours de la cuisson) ou la lessive usée (extraite en fin de cuisson). Comme décrit dans"Iappi" volume 59, n0 9, pages 118-121 (1976), divers acides organiques comprenant les acides isosacchariniques et les acides métasacchariniques principalement dérivés d'hydrates de carbone se forment et sontdissous dans la lessive usée au cours de la cuisson alcaline. Le mécanisme de décomposition et de dissolution des hydrates de carbone dans les matières fibreuses naturelles est connu sous le nom de réaction "d'arrachage". Cependant, on n'a pas indiqué dans la technique antérieure que ces acides organiques puissent être utilisés en conditions alcalines par les micro- organismes. Le pH initial d'une lessive de cuisson alcaline est d'environ 14 en raison de la présence d'alcali caustique. Bien que l'alcali caustique contenu dans la lessive de cuisson soit partiel- lement consommé par les acides organiques formés au cours de la cuisson, la lessive extraite du système de cuisson dans les stades initial et intermédiaires et la lessive usée contiennent généralement de l'alcali résiduel à une concentration de 2 à 30 g/l, exprimée en Na20, et sont encore fortement alcalines, ayant un pH de 10 à 14. Donc, la lessive extraite ou la lessive usée dérivéesde la cuisson alcaline contiennent comme substancesorganiquesde la lignine et divers acides organiques et contiennent également une grande quantité de divers sels. Le composant insoluble riche en cellulose obtenu à partir de la cuisson alcaline est directement utilisé comme pâte dans la production du papier. Cependant, la lessive extraite restante et la lessive usée étaient jusqu'à présent brOlées après concentration. Ainsi donc, on ne récupérait que l'énergie de combus- tion des substances organiques et que des substances chimiques de cuisson à partir des substances inorganiques. En conséquence, la présente invention a pour objet d'utiliser efficacement la lessive extraite et la lessive usée ci- dessus mentionnées de manière à cultiver des micro-organismes en utilisant les substances organiques, en particulier divers acides organiques,contenus dans la lessive extraite ou la lessive usée en milieu alcalin, c'est-à-dire sans neutraliser la lessive extraite ou la lessive usée. D'autres objets et avantages de la présente invention apparaîtront clairement à la lecture de la description qui va suivre. Selon l'invention, on propose un procédé pour cultiver des microorganismes comprenant les étapes suivantes: on inocule avec les microorganismes un milieu de culture contenant comme source de carbone la lessive extraite ou la lessive usée dérivée de la cuisson alcaline; et on cultive les micro-organismes inoculés dans le milieu de culture, les acides organiques contenus dans la lessive extraite ou la lessive usée étant utilisés. La demanderesse a étudié les micro-organismes qui.peuvent être produits commercialement en conditions alcalines, avantageuse- ment à un pH de 8,0 à 12,5, en utilisant la lessive alcaline extraite ou la lessive usée contenant des sels à une concentration élevée. Par suite de la classification et de la recherche de nombreuses souches de bactéries isolées des sols naturels, on a isolé des sols naturels à Shinonome, Koto-Ku, Tokyo, au Japon, les bactéries appartenant aux genres Bacillus, Arthrobacter, Corynebacterium ou Brevibacterium, qui sont viables dans une lessive extraite alcaline ou une lessive usée. Des exemples caractéristiques des bactéries utilisables dans la présente invention sont: celles appartenant au genre Bacillus telles que Bacillus sp. FERM-P n0 5861 qui a été déposé depuis le 30 janvier 1981 au Fermentation Research Institute (FRI) au Japon (tous les numéros "FERM-P" indiqués ci-après désignent les numéros de dépOt dudit Institut) et Bacillus sp. FERM-P no 5862 déposé à la même date; celles appartenant au genre Arthrobacter telles qu'Arthrobacter sp. FERM-P n 5863 déposé à la même date et Arthrobacter sp. FERM-BP n 88 qui a été déposé le 2 Février 1982 au Fermentation Research Institute (FRI) (c'est-à-dire l'autorité internationale de dépôt selon le Traité de Budapest) -à Tsukuba au Japon; Corynebacterium sp. FERM-BP n 89 et 90 déposés le 2 Février 1982 au FRI selon le Traité de Budapest; et Brevibacterium FERM-BP n 91 et 92 déposés le 2 Février 1982 au FRI selon le Traité de Budapest. Tous les dépOts ont été effectués par l'un des inventeurs, Monsieur Yukio Kita. Les caractéristiques morphologiques de ces bactéries sont indiquées ci-dessous. Les méthodes d'essais de ces caractéris- tiques morphologiques et la classification des bactéries ont été mises en oeuvre selon les descriptions de N.R. Smith, R.E. Gordon e F.E. Clark dans "Aerobic Sporeforming Bacteria (United States Department of Agriculture, novembre 1952)" et dans le '"Bergey's Manual of Determinative Bacteriology (8e édition, 1974)". CARACTERISTIQUES MORPHOLOGIQUES, DE CULTURE ET BIOCHIMIQUES DE BACILLUS FERM-P n 5861 (a) Caractéristiques morphologiques O forme et dimensions des cellules bâtonnets, 0,7-0,- pléomorphisme cellulaire non pléomorphe Q motilité doué de mouvement sporulation Essai Gram Résistance aux acides péritriche formation d'endospores, sporanges non effectivement gonflés, spores 0,6-O,9xl,O-1, 5/u, ovales, centraux positif non résistant aux acides )xl,8-3,0/u P (b) Caractérisation de culture Culture de caractérisation Milieux Plaque de gélose nutritive CGélose nutritive inclinée G Bouillon nutritif Piqûre sur gélatine OLait de tournesol pH 7,0 croissance faible croissance faible croissance faible croissance faible pas de chan- gement pH des milieux de culture DH 10.0 * bonne croissance, circulaire, plate à dressée, filamenteuse, couleur crème, opaque, lisse, brillante bonne croissance, étalement moyennement trouble, pas de' croissance superficielle, sédiment croissance superficielle, liquéfaction, cratériforme pas de changement * Addition de Na2CO3 (1%) aux milieux. (c) Caractéristiques biochimiques * Q)Réduction des nitrates en nitrites Respiration dans un milieu au nitrate ( Essai au rouge de méthyle Essai de Voges-Proskauer ( Production d'indole Production de H2S tHydrolyse de l'amidon Utilisation des citrates gélose au citrate de Koser gélose au citrate de Christensen Utilisation des sources d'azote inorganiques Production de pigment O Essai à l'uréase Essai à l'oxydase + on ne peut changement à cause du alcalin observer le de couleur milieu. + + + utilise les nitrates et les sels d'ammonium non + Q Essai à la catalase O pH et température de croissance pH de croissance température de croissance Q Rapport avec l'oxygène Q Essai O-F (milieu de Hugh et Leifson) Q Utilisation des hydrates de carbone (1) L-arabinose (2) D- xylose (3) D-glucose (4) D-mannose (5) D-fructose (6) D-galactose (7) Maltose (8) Saccharose (9) Lactose (10) Tréhalose (11) D-sorbitol (12) D- mannitol (13) Inositol (14) Glycérol (15) Amidon Autre caractéristique bonne croissance dans le bouillon nutritif à 7% de NaCl Addition de Na2CO3 (1%) aux milieux. Symboles: + positif, - négatif. + 7,5-11,5,pH optimal environ 10 jusqu'à 50 C,température optimale environ 40 C aérobie oxydant (formation d'acides) + + + + + + + + + + + + + CARACTERISTIQUES MORPHOLOGIQUES, DE CULTURE ET BIOCHIMIQUES DE BACILLUS FERM-P n 5862 (a) Caractéristiques morphologiques O Forme et dimensions des cellules bâtonnets, O,7-O,8x2,O3,5/u In Pléomorphisme cellulaire non pléomorphe O Motilité doué de mouvement, péritriche GI Sporulation Q Essai Gram ORésistance aux acides formation d'endospores, sporanges non effectivement gonflés, spores 0,6-0, 9xl,0-1,5/u, ovales, centraux positif non résistant aux acides (b) Caractérisation de culture Culture de caractérisation Milieux Plaque de gélose nutritive Gélose-nutritive inclinée Bouillon nutritif ( PiqOre sur gélatine Lait de tournesol pH 7,0 croissance très faible croissance très faible croissance très faible croissance très faible pas de chan- gement pH des milieux de culture pH 10,0 * bonne croissance, circulaire, plate à dressée, filamenteuse, couleur crème, opaque, lisse, brillante bonne croissance, étalement moyennement trouble, pas de croissance superficielle, sédiment croissance superficielle, liquéfaction, cratériforme pas de changement * Addition de Na2CO3 (1%) aux milieux. (c) Caractéristiques biochimiques * QRéduction des nitrates en nitrites Respiration dans un milieu au nitrate GEssai au rouge de méthyle Essai de Voges-Proskauer Production d'indole OProduction de H2S + on ne peut observer le chan- gement de couleur à cause du milieu alcalin + Hydrolyse de l'amidon Utilisation des citrates gélose au citrate de Koser gélose au citrate de Christensen G Utilisation des sources d'azote inorganiques O Production de pigment O Essai à l'uréase O Essai à l'oxydase O Essai à la catalase O pH et température de croissance pH de croissance température de croissance O Rapport avec l'oxygène Essai 0-F (milieu de Hugh et Leifson) O Utilisation des hydrates de carbone (1) L-arabinose (2) D-xylose (3) D- glucose (4) D-mannose (5) D-fructose (6) D-galactose (7) Maltose (8) Saccharose (9) Lactose (10) Tréhalose (11) D-sorbitol (12) D-mannitol (13) Inositol (14) Glycérol (15) Amidon Autre caractéristique bonne croissance dans le bouillon nutritif à 7% de NaCI * Addition de Na2CO3 (1%) aux milieux. Symboles: + positif, - négatif. + + + utilise les et les sels non nitrates d'ammonium + + 7,5-12,0O,pH optimal environ 10 jusqu'à 50 C, température optimale environ 40C aérobie oxydant + + + + + + + + + + + + CARACTERISTIQUES MORPHOLOGIQUES, DE CULTURE ET BIOCHIMIQUES D'ARTHROBACTER FERM-P n 5863 (a) Caractéristiques morphologiques O Forme et dimensions des cellules OE Pléomorphisme cellulaire G Motilité Sporulation O Essai Gram Q Résistance aux acides bâtonnets, 0,4-0,6x1,O-2,0/u pléomorphe, présente la division en V non doué de mouvement pas de sporulation positif non résistant aux acides (b) Caractérisation de culture Milieux Caractérisation de culture pH des milieux de culture pn { du ___ ___ __ ___ __ ___ __ ___ _, _ p li I,U Q Plaque de gélose croissance nutritive très faible O Gélose nutritive croissance inclinée très faible Bouillon nutritif croissance très faible Piqûre sur gélatine croissance très faible Lait de tournesol pas de chan- gement pu iUrU X bonne croissance, circulaire, plate à convexe, entière, couleur crème, opaque, lisse, brillante bonne croissance, filiforme moyennement trouble, pas de croissance superficielle, sédiment croissance superficielle, liquéfaction, cratériforme pas de changement * Addition de Na2CO3 (1%) aux milieux. (c) Caractéristiques biochimiques û D Réduction des nitrates en nitrites Q Respiration dans un milieu au nitrate Q Essai au rouge de méthyle on ne peut observer le chan- gement de couleur & cause du milieu alcalin G Essai de Voges-Proskauer O Production d'indole ( Production de H2S O Hydrolyse de l'amidon G Utilisation des citrates gélose au citrate de Koser gélose au citrate de Christensen Utilisation des sources d'azote inorganiques Production de pigment Essai à l'uréase Essai à l'oxydase O Essai à la catalase pH et température de croissance pH de croissance température de croissance Rapport avec l'oxygène G Essai 0-F (milieu de Hugh et Leifson) O Utilisation des hydrates de carbone (1) L-arabinose (2) D-xylose (3) Dglucose (4) D-mannose ) D-fructose (6) D-galactose (7) Maltose (8) Saccharose (9) Lactose (10) Tréhalose (11l) D-sorbitol (12) D-mannitol (13) Inositol (14) Glycérol (15) Amidon + + utilise les citrates et les sels d'ammonium non + 7,5-12,0,pH optimal environ 10 jusqu'à 42 C, température optimale environ 37 C aérobie croissance aérobie + + + + + + + + + + + + + + + Autres caractéristiques (1) Les parois cellulaires ne contiennent pas d'acide meso-diamino- pimélique (méso-DAP). (2) La cellulose n'est pas attaquée. Addition de Na2Co03 (1%) aux milieux. Symboles: + positif, - négatif. CARACTERISTIQUES MORPHOLOGIQUES, DE CULTURE ET BIOCHIMIQUES D'ARTHROBACTER FERNI-BP n 88 (a) Caractéristiques morphologiques D Forme et dimensions des cellules bâtonnets, 0,4-0,63 Pléomorphisme cellulaire pléomorphe, présent G Motilité O Sporulation G Essai Gram G Résistance aux acides x1,0-2,0 u te la division en v non doué de mouvement pas de sporulation positif non résistant aux acides (b) Caractérisation de culture Milieux c Plaque de géloae nutritive Gélose nutritive inclinée Bouillon nutritif Piqre sur gélatine Lait de tournesol c Caractérisation de culture pH des milieux de culture 7,0 10,0 croissance bonne croissance, circu- très faible laire, plate, entière, couleur crème, opaque, lisse, brillante Croissance bonne croissance, filiforme très faible croissance très faible croissance très faible coagulé, partiellement peptonisé moyennement trouble, pas de croissance superficielle, sédiment pas de liquéfaction pas de changement * Addition de Na2C0O3 (1%) aux milieux. O 0 (c) Caractéristiques biochimiques * ( Réduction des nitrates en nitrites O Respiration dans un milieu au nitrate O Essai au rouge de méthyle on ne peut observer le changement de couleur à cause du milieu alcalin Essai de Voges-Proskauer Production d'indole Production de H2S Hydrolyse de l'amidon Utilisation des citrates gélose au citrate de Koser gélose au citrate de Christensen ( Utilisation des sources d'azote inorganiques 0 Production de pigment GO Essai à l'uréase Essai à l'oxydase Essai à la catalase ) pH et température de croissance pH de croissance température de croissance Rapport avec l'oxygène Essai 0-F (milieu de Hugh et Leifson) Utilisation des hydrates de carbone (1) L- arabinose (2) D-xylose (3) D-glucose (4) D-mannose (5) D-fructose (6) D- galactose (7) Maltose (8) Saccharose + utilise les nitrates et les sels d'ammonium non + 7,5-12,O,pH optimal envirîn 10 jusqu à 47"C, température optimale environ 40 C aérobie croissance aérobie ou anaérobie, pas de forma- tion d'acides + + + + + + + Q lo 0 ( + (9) Lactose + (10) Tréhalose + (11) D-sorbitol + (12) D-mannitol + (13) Inositol + (14) Glycérol + (15) Amidon + Autres caractéristiques (1) Les parois cellulaires ne contiennent pas de méso-DAP. (2) La cellulose n'est pas attaquée. * Addition de Na2CO3 (1%) aux milieux. Symboles: + positif, - négatif. CARACTERISTIQUES MORPHOLOGIQUES, DE CULTURE ET BIOCHIMIQUES DE CORYNEBACTERIUM FERM-BP n 89 (a) Caractéristiques morphologiques Forme et dimensions des cellules O Pléomorphisme cellulaire Q Motilité - Q@ Sporulation G Essai Gram O Résistance aux acides bâtonnets, 0,4-0,6xO, 8-1,2/u pléomorphe, présente la division en V non doué de mouvement pas de sporulation positif non résistant aux acides (b)-Caractérisation de culture Milieux O Plaque de gélose nutritive Caractérisation de culture pH des milieux de culture pH 7,0 pH 10,0 * croissance bonne croissance, circulaire, moyenne plate, entière, couleur crème, opaque, lisse, brillante O Gélose nutritive inclinée O Bouillon nutritif croissance très faible - Piqre sur gélatine croissance moyenne Lait de tournesol acide coagulé, partiellement peptonisé * Addition de Na2CO3 (1%) aux milieux. bonne croissance, filiforme croissance très faible croissance superficielle, liquéfaction, cratériforme pas de changement (c) Caractéristiques biochimiques * G Réduction des nitrates en nitrites G Respiration dans un milieu au nitrate O Essai au rouge de méthyle Essai de Voges-Proskauer Production d'indole Production de H2S Hydrolyse de l'amidon Utilisation des citrates gélose au citrate de Koser gélose au citrate de Christensen Utilisation des sources d'azote inorganiques Production de pigment Essai à l'uréase Essai & l'oxydase Essai à la catalase pH et température de croissance pH de croissance température de croissance G o OE O OE o @ G c Rapport avec l'oxygène Essai 0-F (milieu de Hugh et Leifson) Utilisation des hydrates de carbone (1) Larabinose (2) D-xylose (3) D-glucose (4) D-mannose (5) D-fructose (6) Dgalactose (7) Maltose (8) Saccharose (9) Lactose (10) Tréhalose on ne peut observer le changement de couleur à cause du milieu alcalin + utilise les nitrates et les sels d'ammonium non + 6,5-12,0,pH optimal environ 10 jusqu'à 47 C, température optimale environ 40'C aérobie croissance à la fois aérobie et anaérobie + + + + + + + + + + (11) D- sorbitol (12) D-mannitol (13) Inositol (14) Glycérol (15) Amidon O Autres caractéristiques + + + + (1) Les parois cellulaires ne contiennent pas de méso-DAP. (2) La cellulose n'est pas attaquée. * Addition de Na2CO3 (1%) aux milieux. Symboles: + positif, - négatif. CARACTERISTIQUES MORPHOLOGIQUES, DE CULTURE ET BIOCHIMIQUES DE CORYNEBACTERIUM FERM-BP n 90 (a) Caractéristiques morphologiques Q Forme et dimensions des cellules bâtonnets, 0,4-0,5 O Pléomorphisme cellulaire pléomorphe, présen Q Motilité G Sporulation O Essai Gram Q Résistance aux acides 0,5-1,0/u te la division en V non doué de mouvement pas de sporulation positif non résistant aux acides (b) Caractérisation de culture Caractérisation de culture Milieux DH des milieux de culture Q o Plaque de gélose nutritive Gélose nutritive inclinée Bouillon nutritif pH 7,0 croissance moyenne croissance moyenne croissance moyenne PiqOre sur gélatine croissance moyenne ( Lait de tournesol pas de chan- gement ,0 * bonne croissance, circulaire, plate, entière, couleur crème, opaque, lisse, brillante bonne croissance, filiforme moyennement trouble, pas de croissance superficielle, sédiment moyen - croissance superficielle, liquéfaction cratériforme pas de changement * Addition de Na2CO3 (1%7.) aux milieux. (c) Caractéristiques biochimiques * O Réduction des nitrates en nitrites Respiration dans un milieu au nitrate O Essai au rouge de méthyle G Essai de Voges-Proskauer G Production d'indole Q Production de H2S O Hydrolyse de l'amidon t Utilisation des citrates gélose au citrate de Koser gélose au citrate de Christensen O Utilisation des sources d'azote inorganiques Production de pigment O Essai à l'uréase Essai à l'oxydase O Essai à la catalase 4 pH et température de croissance pH de croissance température de croissance O Rapport avec l'oxygène " Essai 0-F (milieu de Hugh et Leifson) O Utilisation des (1) L-arabinose (2) D-xylose (3) B-glucose (4) D-mannose (5) D-fructose (6) D-galactose (7) Maltose (8) Saccharose (9) Lactose (10) Tréhalose hydrates de carbone on ne peut observer le changement de couleur à cause du milieu alcalin + utilise les nitrates et les sels d'ammonium non + 6,5-12,0,pH optimal environ 10 jusqu'à 47 C, température optimale environ 40 C aérobie croissance aérobie ou anaérobie pas de forma- tion d'acides + + + + + + + + + + v (11) D-sorbitol (12) D-mannitol (13) Inositol (14) Glycérol (15) Amidon + + + + + G Autres caractéristiques (1) Les parois cellulaires ne contiennent pas de méso-DAP. (2) La cellulose n'est pas attaquée. * Addition de Na2Co3 (1%) aux milieux. Symboles: + positif, - négatif. CARACTERISTIQUES MORPHOLOGIQUES, DE CULTURE ET BIOCHIMIQUES DE BREVIBACTERIUM FERM-P no 91 (a) Caractéristiques morphologiques Forme et dimensions des cellules bâtonnets, 0,6-0,7xO,9-1, 0/u Q Pléomorphisme cellulaire non pléomorphe O Motilité non doué de mouvement D Sporulation -pas de sporulation Essai Gram positif Résistance aux acides non résistant aux acides (b) Caractérisation de culture Caractérisation de culture Milieux oH des milieux de culture O Plaque de gélose nutritive 3o 0l Gélose nutritive inclinée Bouillon nutritif pH 7,0 croissance très faible croissance très faible croissance très faible Piqûre sur gélatine croissance très faible Lait de tournesol pas de chan- gement ,0 * bonne croissance, circulaire, convexe, entière, jaune citron pafle, opaque, lisse, brillante bonne croissance, filiforme légèrement trouble;, pas de croissance superficielle, pas de sédiment croissance superficielle, pas de liquéfaction pas de changement * Addition de Na2CO3 (1%) aux milieux. (c) Caractéristiques biochimiques * O Réduction des nitrates en nitrites O Respiration dans un milieu au nitrate O Essai au rouge de méthyle Q Essai de Voges-Proskauer O Production d'indole G Production de H2S t Hydrolyse de l'amidon O Utilisation descitrates gélose au citrate de Koser gélose au citrate de Christensen O Utilisation des sources d'azote inorganiques Production de pigment Essai à l'uréase Essai à l'oxydase Essai à la catalase @ pH et température de croissance pH de croissance température de croissance Rapport avec l'oxygène Essai 0-F (milieu de Hugh et Leifson) Utilisation des hydrates de carbone (1) L-arabinose (2) D-xylose (3) D-glucose (4) D-mannose (5) D-fructose (6) D-galactose (7) Maltose (8) Saccharose (9) Lactose + on ne peut observer le changement de couleur à cause du milieu alcalin + utilise les nitrates et les sels d'ammonium jaune citron pale, ne diffuse pas dans le milieu + 7,5-12,5,pH optimal environ 10 jusqu'à 47 C, température optimale environ 40 C aérobie croissance aérobie ou anaérobie, pas de forma- tion d'acides + + + + + + + + + (10) (11) (12) (13) (14) (15) Tréhalose D-sorbitol D-mannitol Inositol Glycérol Amidon + + + + + + * Addition de Na2C03 (1%) aux milieux Symboles: + positif, - négatif CARACTERISTIQUES MORPHOLOGIQUES, DE CULTURE ET BIOCHIMIQUES DE BREVIBACTERIUM FERM-BP n 92 (a) Caractéristiques morphologiques Forme et dimensions des cellules bâtonnets, O,4-OSxO,6-1, 2/u G Pléomorphisme cellulaire non pléomorphe O Motilité non doué de mouvement Sporulation pas de sporulation Essai Gram positif G Résistance aux acides non résistant aux acides (b) Caractérisation de culture Milieux Caractérisation de culture pH des milieux de culture Plaque de gélose nutritive Gélose nutritive inclinée Bouillon nutritif pH 7,0 croissance très faible croissance très faible croissance très faible Piqûre sur gélatine croissance très faible Lait de tournesol * Addition de pas de chan- pH 10,0 * bonne croissance, circulaire, convexe, entière, jaune citron pâle, opaque, lisse, brillante bonne croissance, filiforme légèrement trouble, pas de croissance superficielle, pas de sédiment croissance superficielle, pas de liquéfaction pas de changement gement Na2CO3 (17.) aux milieux. 250Q @ (c) Caractéristiques biochimiques * O Réduction des nitrates en nitrites O Respiration dans un milieu au nitrate O Essai au rouge de méthyle O Essai de Voges-Proskauer O Production d'indole O Production de H2S t Hydrolyse de l'amidon O Utilisation des citrates gélose au citrate de Koser gélose au citrate de Christensen O Utilisation des sources d'azote inorganiques Production de pigment O Essai à l'uréase @ Essai & l'oxydase O Essai à la catalase O pH et température de croissance pH de croissance temnérature de croissance Rapport avec l'oxygène G Essai O-F (milieu de Hugh et Leifson) O Utilisation des hydrates de carbone (1) Larabinose (2) D-xylose (3).D-glucose (4) D-mannose (5) D-fructose (6) Dgalactose (7) Maltose on ne peut observer le changement de couleur à cause du milieu alcalin + utilise les nitrates et les sels d'ammonium jaune citron pâle, ne diffuse pas dans le milieu + 7,5-12,5,pH optimal environ 10 jusqu'à 47 C, température optimale environ 40 C aérobie croissance aérobie ou anaérobie, pas de forma- tion d'acides + + + + + + + 250047? (8) Saccharose + (9) Lactose + (10) Tréhalose + (11) D-sorbitol + (12) Dmannitol + (13) Inositol + (14) Glycérol + (15) Amidon + * Addition de Na2CO3 (1%) aux milieux. Symboles: + positif, - négatif. Les deux souches FERM-P n 5861 et 5862 sont des bactéries aérobies, à gram positif, formant des spores, douées de mouvement, en forme de bâtonnets avec flagelles péritricheux. Il est clair que ces deux souches doivent appartenir au genre Bacillus. Le point i5 caractéristique de ces bactéries est qu'elles poussent bien dans les milieux alcalins,plutôt que dans les milieux neutres comme le bouillon nutritif, le pH optimal de croissance étant d'environ 10. Les propriétés microbiologiques de ces souches sont semblables à celles de Bacillus subtilis. Les deux souches isolées, cependant, se distinguent de la souche caractéristique B. subtilis par le pH de croissance; Bacillus FERM-P n 5861 et 5862 poussent mieux dans les milieux alcalins que dans les milieux neutres; et, dans l'essai de Voges -Proskauer, les deux souches isolées donnent un résultat négatif, mais la souche caractéristique B. subtilis donne un résultat positif. La souche FERM-P n 5861 se distingue de la souche FERM- P n 5862 par la dimension des cellules, la production de H2S et la production d'acides à partir des hydrates de carbone. Il est donc clair que ces deux souches ne sont pas les mêmes. Les souches FERM-P n 5863 et FERM-BP n 88 sont des bâtonnets aérobies, à gram positif, ne formant pas de spores, non résistants aux acides et. présentant la division en V. En outre, ces deux bactéries n'attaquent pas la cellulose et les parois cellulaires ne contiennent pas de méso-DAP. Il est clair que ces deux souches doivent appartenir au genre Arthrobacter. La souche FERM-P n 5863 se distingue de la souche FERM-BP n 88 par la carac- térisation de culture dans la piqûre sur gélatine et dans le lait de tournesol. Il est donc clair que ces deux souches ne sont pas les mêmes. Les souches FERM-BP n 89 et 90 sont des bâtonnets aérobies ne formant pas de spores, à gram positif, non résitants aux acides, pléomorphes et présentant la division en V. En outre, ces deux bactéries n'attaquent pas la cellulose et les parois cellu- laires contiennent du méso-DAP. Il est clair que ces deux souches doivent appartenir au genre Corynebacterium. La souche FERM-BP n 89 se distingue de la souche FERM-BP n 90 par la caractérisation de culture dans le bouillon nutritif et le lait de tournesol. Il est donc clair que ces deux souches ne sont pas les mêmes. Les souches FERM-BP n 91 et 92 sont des bâtonnets courts aérobies ne formant pas de spores,à gram positif, non résistants aux acides, non pléomorphes, sans ramification ou fragmentation. Il est clair que ces deux souches doivent appartenir au genre Brevibacterium. La souche FERM-BP n 91 se distingue de la souche FERM-BP n 92 par la dimension des cellules et la réduction des nitrates en nitrites. Il est donc clair que ces deux souches ne sont pas les mêmes. - Les caractéristiques taxonomiques des souches FERM-P n 5861, 5862 et 5863 et FERM-BP n 88, 89, 90, 91 et 92 ont été étudiées selon la méthode décrite dans "Bergey's Manual of Determinative Bacteriology". Ces souchesisolées sont partiellement différentes des souches caractéristiques par certaines de leurs propriétés. Le point caractéristique de ces souches isolées est qu'elles poussent bien en milieu alcalin,plutôt qu'en milieu neutre comme le bouillon nutritif, le pH optimal de croissance étant d'environ 10. La condition importante de culture de ces bactéries est le pH du milieu de culture. Autrement dit, lorsque l'on cultive ces bactéries, la croissance de Bacillus sp. FERM-P n 5861 et FERM-P n 5862, Arthrobacter sp. FERM-P n 5863 et FERM-BP n 88, Coryne- bacterium FERM-BP n 89 et 90 et Brevibacterium FERM-BP n 91 et 92 est fortement influencée par le pH du milieu de culture. Le pH souhaité du milieu de culture est dans l'intervalle de 8,0 à 12,5. Ceci est très avantageux dans le cas o les micro-organismes ci-dessus mentionnés poussent bien dans la lessive extraite alcaline ou la lessive usée obtenue à partir de la cuisson alcaline. Selon l'invention, bien que la liqueur extraite alcaline ou la liqueur usée soit utilisée comme principale source de carbone, on doit noter que l'on peut également utiliser avec la lessive extraite ou la lessive usée d'autres sources qui peuvent être utilisées comme sources de carbone par les micro-organismes. Dans la culture en conditionsréellesselon l'invention, on peut utiliser comme sources d'azote des composés inorganiques d'azote,tels que sels d'ammonium et nitrates, et des substances orga- niques azotées,telles qu'urée et caséine. En outre, on peut avanta- geusement ajouter au milieu de culture des sels inorganiques tels que sels de calcium, sels de magnésium, sels de potassium, phosphates, sels de manganèse, sels de zinc, sels de fer et sels de cuivre et, facultativement, des substances nécessaires pour faire pousser les microorganismes ou agents facilitant la croissancetels que vitamines, aminoacides, liqueur de trempage de maïs et extrait de levure. La culture selon l'invention peut être effectuée par exemple en inoculant le milieu de culture mentionné ci-dessus avec des bactéries capables de pousser dans la lessive extraite alcaline ou la lessive usée obtenue à partir de la cuisson alcaline, puis en mettant en oeuvre la culture aérobie, par exemple à une température d'environ 40'C pendant 48 h. Ainsi, les acides organiques contenus dans le milieu de culture peuvent être utilisés. Ensuite, on soumet le produit cultivé à une opération de centrifugation à 5000 à 8000 tr/min pendant 5 à 15 min, ce qui sépare facilement les corps ou cellules microbiens cultivés. On récolte les cellules séparées et on les sèche de manière classique pour former les cellules séchées. Pour faciliter encore l'opération de culture et l'opéra- tion de séparation et récupération des bactéries cultivées selon l'invention, on peut avantageusement mettre en oeuvre avant la culture un prétraitement empêchant le dépôt ou la précipitation du composant lignine pendant la culture, tel que l'élimination ou oxydation préalable du composant lignine dans la lessive extraite alcaline ou la lessive usée. La demanderesse a déterminé que ces cellules cultivées obtenues à partir de la culture dans la lessive extraite alcaline ou la lessive usée contiennent une grande quantité de protéines brutes. En conséquence, on peut utiliser de manière satisfaisante les cellules obtenues par la culture selon l'invention, par exemple, comme sources d'aminoacides de protéines dans un aliment pour animaux, ou un aliment pour poisson. Les exemples suivants illustrent l'invention sans toutefois en limiter la portée. Dans ces exemples, tous les pourcentages sont exprimés en poids, sauf indication contraire. EXEMPLE 1 On ajuste à pH 10-,0 par le dioxyde de carbone la lessive usée provenant d'un procédé de cuisson à la soude et contenant environ 2,0% d'acides organiques, y compris l'acide isosaccharinique et l'acide métasaccharinique. On filtre sur papier filtre les précipités formés par l'addition de dioxyde de carbone pour obtenir une lessive usée ne contenant pas de quantité notable de solides en suspension. On ajoute à la lessive usée résultante 0,2% d'extrait de levure, 0,15% de K2HP04, 0,05% de MgS0437H20 et 0,5% de KNO3. On ajuste à nouveau le pH à 10,0 par le carbonate de sodium. On place dans des fioles de 300 ml des portions de 50 ml du milieu de culture préparé ci-dessus et on stérilise à une tempéra- ture de 120C pendant 15 min. On inocule séparément le milieu de culture avec Bacillus sp. FERM-P n0 5861 et 5862 et Arthrobacter FERM-P n0 5863. On soumet les souches bactériennes à la culture agitée à une température de 40'C pendant 48 h. On centrifuge les cellules à 5000 tr/min pendant 15 min et on les sèche à une température de 1000C pendant 24 h. Les quantités de cellules séchées sont les suivantes. Quantité de cellules récoltées Souche (mg/ml de milieu de culture) FERM-P né 5861 7,5 FERM-P n' 5862 635 FERM-P n' 5863 8,0 Le pH de chaque milieu de culture après la culture de la bactérie est de 9,5 à 10,0. Les quantités d'acides organiques contenues dans les milieux de culture après séparation des cellules de FERM-P n 5861, 5862 et 5863 sont de 0,5%, 0, 6% et 0,2%, respec- tivement. Comme il est évident d'après les résultats ci-dessus, les acides organiques contenus dans la lessive usée dérivée du procédé de cuisson à la soude sont utilisés par les micro-organismes ci-dessus mentionnés en conditions alcalines, et sont ainsi trans- formés dans les cellules. Les teneurs en protéines brutes dans les cellules séchées de FERM-P n' 5861, 5862 et 5863 sont de 55%, 60% et 55%, respetri- vement. EXEMPLE 2 On ajuste à un pH de 9,5 par le dioxyde de carbone la lessive usée dérivée d'un procédé de cuisson kraft et contenant environ 3,07. d'acides organiques, y compris l'acide isosaccharinique et l'acide métasaccharinique. On filtre sur papier filtre les précipités formés par l'addition de dioxyde de carbone pour obtenir une lessive usée ne contenant pas de quantité notable de solides en suspension. On ajoute à la lessive usée résultante 0,2% d'extrait de levure, 0,15% de K2HP04, 0,05% de MgSO4,7H20 et 0,2% d'urée. On ajuste à nouveau le pH à 9,5 par le carbonate de sodium. On place dans des fioles de 300 ml des portions de 50 ml du milieu de culture préparé ci-dessus et on stérilise à une tempé- rature de 120 C pendant 15 min. On inocule séparément les milieux de culture avec Bacillus sp. FERM-P n 5861 et 5862 et Arthrobacter sp. FERM-P n 5863. Après l'inoeulation, on soumet les souches bactériennes b la culture agitée à une température de 40 C pendant 48 h. On centrifuge les cellules h 5000 tr/min pendant15 min et on les sèche à une température de 100'C pendant 24 h. Les quantités et les teneurs en protéines brutes dans les cellulesséchées sont les suivantes. * Quantité de cellules Teneur en Souche récoltées (mg/ml de protéines milieu de culture) brutes (%) FERM-P n 5861 7,5 54 FERM-P n 5862 8,0 59 FERM-P n 5863 9,5 53 Le pH de chaque milieu de culture après la culture des bactéries est de 9,5 à 10,0. Comme il est évident d'après les résultats ci-dessus, les acides organiques contenus dans la lessive usée sont efficacement utilisés par les micro-organismes ci-dessus mentionnés. EXEMPLE 3 On répète l'exemple 1, sauf que l'on utilise les souches Arthrobacter FERM-BP n0 88, Corynebacterium FERM-BP n 89 et 90 et Brevibacterium FERMBP n 91 et 92 et la teneur en acides organiques est d'environ 5%. Les résultats obtenus sont les suivants. Souche FERM-BP n 88 FERM-BP n 89 FERM-BP ne 90 FERM-BP n 91 FERM-BP no 92 Quantité de cellules récoltées (mg/ml de milieu de culture) ,5 9,5 ,0 12,0 11,5 Quantités d'acides organiques (%) dans ie milieu de culture 0,4 1,6 1,5 0,6 0,8 Teneur en protéines brutes (%) EXEMPLE 4 On répète l'exemple 2, sauf que l'on utilise les souches Arthrobacter FERM-BP n 88, Corynebacterium FERM-BP n 89 et 90 et Brevibacterium FERMBP n 91 et 92 et la teneur en acides organiques est d'environ 67. et on ajuste le pH à 10,5. Les résultats obtenus sont les suivants. Souche FERM-BP FERM-BP FERM-BP FERM-BP FERM-BP FERM-BP Quantité de cellules récoltées (mg/ml de milieu de culture) 16,5 ,0 11,0 14,5 13,5 n - 89 n 89 n 90 n 91 n 92 no 89 et 91 ,0 Les souches Bacillus sp. FERM-P n 5861 et 5862 et Arthrobacter sp. FERM-P n 5863 ont été redéposées le 5 février 1982 avec une date de dépôt effective du ler mai 1981 au Fermentation Research Institute (FRI) au Japon selon le Traitd de Budapest sous les ne FEPXM-BP n 97, 98 et 99, respectivement. - I1 est entendu que l'invention n'est pas limitée aux modes de réalisation préférés décrits ci-dessus à titre d'illustration et que l'homme de l'art pourra y apporter des modifications sans sortir du cadre de l'invention. Teneur en protéines brutes (7) R E V E N D I C A T I O N S 1. Procédé pour cultiver des micro-organismes, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes: on inocule avec les micro-organismes un milieu de culture contenant comme source de carbone la lessive extraite ou la lessive usée dérivée de la cuisson alcaline; et on cultive les micro-organismes inoculés dans le milieu de culture, les acides organiques contenus dans la lessive extraite ou la lessive usée étant utilises. 2. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que l'on effectue la culture en conditions alcalines. 3. Procédé selon la revendication 2, caractdrisé en ce que l'on récolte les cellules obtenues par culture. 4. Procédé selon l'une quelconque des revendications l à 3, caractérisé en ce que les micro-organismes sont des bactéries choisies dans les genres Bacillus, Arthrobacter, Corynebacterium et Brevi- bacterium.