FR 2503369 A1 19821008 FR 8205671 A 19820401 La présente invention se rapporte aux techniques d'analyse chimique et concerne plus particulièrement un appareil pour analyser des substances par excitation avec ulne banlde d't ncettgie d;e rLyotlemen 1t et par le contL, trôle de la fluorescence produite par cette excitation. Les Brevets des Etats Unis d'Amérique N S 3 664 744, 3 748 044, 3 831 618, 3 811 780, 3 900 289, 3 833 304 et 3 817 425 décrivent en détail un spectro- photomètre dichromatique et un appareil associé. Il y a également lieu de se référer aux Brevets des Etats Unis d'Amérique NOS 3 811 777, 3 973 129, 4 058 732, 3 906 226, 4 117 338 et d'autres références citées dans les Brevets mentionnés ci-dessus. Un manuel d'utilisation intitulé ABBzOT VPT4 BICHROMATIC ANALYZER (1978) diffusé par Abbott Laboratories Diagnostic Division, 1921 Hurd Drive, Irving, Texas 75062, décrit en outre des analyseurs dichromatiques et les détails de leur fonctionnement. L'invention concerne un ensemble de filtres per- fectionné qui converti; ce type de spectrophotomètre dichromatique en un spectrophotomètre à fluorescence avec un niveau de sensibilité suffisant pour effectuer des mesures précises immunologiquespar fluorescence sur des solutions extrêmement diluées. Les références mention- nées ci-dessus représentent la base essentielle de l'in- vention et de son mode préféré de réalisation. Dans le but d'analyser rapidement et avec pré- cision la concentration d'une substance particulière présentedans un échantillon chimique, par exemple du sang, du serum ou de l'urine, les chimistes ont largement em- ployé les mesures photométriques en utilisant des photo- mètres à filtre et des ensembles de spectrophotomètres monochromatiques à mécanisme asservi. Le besoin croissant de sensibilité et de spéci- ficité en détection optique et l'avènement de nouvelles techniques immunologiques a porté l'intérêt sur les mesures fluorimétriques et l'instrumentation. Ainsi, des fluorimtètres à filtres spécifiques et des spectrofluori- mètres ont été développex et sont disponibles dans le commerce. Mais tous ces appareils antérieurs présentent un inconvénient sérieux, à savoir l'impossibilité de pas- ser d'un mode de mesure, par exemple photométrique, à un autre, par exemple fluorimétrique, sur le même instru- ment. Cet inconvénient empêche de couvrir une large plage de concentration des applications potentielles. Etant donné que les fluorimètres spécifiques utilisent principalement une géométrie d'illumination à angle droit et que les spectrophotomètres à absorption utilisent principalement une géométrie d'illumination rec- tiligne, le passage d'un mode de mesure à l'autre impose des changements importants de matériel, comme la mise en place de miroirs pour diriger le faisceau, ou l'utilisa- tion d'une source lumineuse auxiliaire, Ces modifications imposent des interventions et des étalonnages longs de la part de l'opérateur. A titre d'exemple d'un tel appareil antérieur d'emploi difficile, de fluoro-spectrophotométrie à fonc- tions multiples, l'article Analytical Biochemistry 42, 494-504, 1971, Britton Chance, D. blayer, et V. Legallais, décrit un spectrophotomètre et fluorimètre à double longueur d'onde utilisant des filtres à interférence qui mesurent un rapport de fluorescence/différence d'absorp- tion, en utilisant deux sources lumineuses et trois détec- teurs. Le Brevet des Etats Unis d'Amérique NO 3 811 777 décrit un appareil pour mesurer l'intensité de la fluores- cence émise par un tissu et pour la corriger ou pour effec- tuer separément des mesures de pouvoir réflecteur sur le même échantillon. Cette technique n'est pas applicable à des solutions diluées comme celles que l'on rencontre dans les mesures immunologiques, en raison de la faible péné- tration du faisceau d'excitation dans la solution et du faible niveau du signal de réflexion. En outre, elle n'est pas convertible en un mode de mesure de pouvoir d'absorp- tion comme la technique décrite selon l'invention. De même que la demande de Brevet des Etats Unis d'Amérique NO 86 202 déposée le 17 Octobre 1979, l'invention concerne une technique qui élimine ce problème et permet de mesurer la fluorescence ou l'absorption d'une solution diluée sur le même trajet lumineux en utilisant la même source lumineuse et le même détecteur, réduisant ainsi au mini- mumn la complexité du matériel et les interventions de l'opérateur. Un autre problème qui apparait dans les ap- pareils antérieurs à intensité de fluorescence est la dépendance entre la densité détectée d'une part et la géométrie et la position de l'échantillon d'autre part. Ainsi, un repositionnement très précis de l'échantillon est très crucial pour obtenir une corrélation précise en- tre l'intensité de la fluorescence et la concentration. C.A. Parker, Photoluminescence of Solutions, Elsevier, Amsterdam, 1968, pages 220 à 234, explique qu'une illu- mination en ligne, à traversée rectiligne, dépend de fa- çon beaucoup moins critique de la position exacte de la cuvette contenant l'échantillon que l'illumination fron- tale, et qu'elle est préférée à l'excitation à angle droit dans une mesure précise d'intensité de fluorescence de solution contenue dans des cellules ou des cuvettes cylindriques avec des surfaces imparfaites optiquement. Il est donc souhaitable d'utiliser les avantages d'une géormétrie d'excitation en ligne. Un inconvénient de la géométrie d'excitation en ligne, à traversée rectiligne, est qu'une partie du faisceau d'excitation transmis par le système optique, entraîne une forte lacune de mesure (C.A. Parker' 19b8). La demande de Brevet précitée décrit l'utilisation de filtres existants à trois cavités, à couches multiples, de filtres à coupure brusque et de filtres de densité neutre pour obtenir une forte réjection du faisceau d'ex- citations, et pour obtenir des sensibilités équivalentes à celle de l'excitation perpendiculaire. A titre d'exemple dans cette demande de Brevet, des concentrations détecta- bles de fluorescéine de 1,48 x 1If8EM descendant jusqu'à 7,4 x 10-9Nl ont été obtenues en utilisant les techniques décrites. Bien que ce haut niveau de sensibilité puisse suffire pour de nombreuses mesures de fluorescence, au moins un autre ordre de g-andeur d'augmentation de sen- sibilité est nécessaire pour des mesures d'immunologie précise par fluorescence. A titre d'exemple, en utilisant une géométrie d'excitation à traversée rectiligne, les niveaux lumineux de fluorescence détectés sont extrêmement bas, nécessitant pour des mesures immunologiques des ni- -1) veaux de sensibilité de l'ordre de 10 M! de fluorescéine. Il s'est avéré que la sensibilité de l'appareil réalisé selon la demande de Brevet précitée était limitée en rai- son de la lumière de fond transmise.ainsi que par le couplage de lumière diffusée entre des éléments de filtre. L'invention concerne donc un spectrophotomètre à fluorescence perfectionné pour étudier les caractéristi- ques de. fluorescence d'une solution d'essai avec une sen- sibilité de détection de fluorescence nettement accrue, suffisante pour effectuer des mesures d'immunologie pré- cises en fluorescence de solutionstrès diluées. L'appareil comporte une monture de filtre montée mobile sur une base comprenant deux filtres d'essai et deux filtres de référence mntés sur la monture, cette dernière étant mobile entre une position d'essai et une position de référence. Dans une géométrie optique en ligne ou à passage rectiligne et avec la monture de filtre dans la position de référence, la lumière d'excitation provenant d'une source lumineuse à une première longueur d'oncle peut passer par l'un des filtres de référence, un récipient de solution d'essai et l'autre filtre de référence. Avec la monture de filtre en position d'essai, la lumière d'ex- citation peut passer par l'un des filtres d'essai et par le récipient de solution d'essai, l'autre filtre d'essai laissant passer la lumière fluorescente d'une seconde longueur d'onde provenant de la solution d'essai. Un pré- filtre laissant passer la lumière d'excitation et bloquant la lumière fluorescente est intercalé entre la source lu- mineuse d'excitation et les filtres. Cela réduit au mini- mum la lumière de fond transmise et la lumière fluorescente dans des trajets d'optique indésirables, pour réduire le couplage optique entre les éléments de filtre. Un écran pour la lumière ou un dispositif déflecteur est prévu pour éviter le couplage indésirable de lumière diffusée ou de lumière réfléchie entre les éléments de filtre, ac- croissant ainsi de façon notable la sensibilité de l'ap- pareil. Des premières pièces de déflexion sur la sur- face supérieure de la monture de filtre forment un com- partiment cloisonné séparément pour chaque filtre afin d'éviter que la lumière diffusée n'établisse un couplage optique entre les filtres, le long du dessus de la monture de filtre. Des secondes pièces de déflexion sur la sur- face inférieure de la monture de filtre évitent que la lumière diffusée ne produise un couplage optique entre les filtres, le long de. la surface inférieure de la mon- ture. Avec une réalisation selon l'invention, une sen- sibilité détectée de 1,9 x 10 10>1 de fluorescéine a été obtenue. Ainsi, l'appareil selon l'invention permet d'ac- cro;tre la sensibilité de deux ordres de grandeur par rap- port au mode de réalisation décrit dans la demande de Brevet précitée. D'autres caractéristiques et avantages de l'in- vention seront mieux compris à la lecture de la descrip- tion qui va suivre d'un exemple de réalisation et en se référant aux dessins annexés sur lesquels: La Figure I représente schématiquement un spectro- photomètre! à fluorescer:ce, avec une coupe d'un ensemble de filtre comprenant un pré-filtre et un écran à lumière ou un dispositif déflecteur selon l'invention, la Figure 2 est une vue de dessous d'un disque à filtre de l'ensemble de filtre, la Figure 3 est une vue de dessus du disque à filtre de l'ensemble de filtre et la Figure 4 est une vue de dessus d'un chariot ou d'une base avec le disque à filtre en pointillés. Les Figures montrent donc une source lumineuse 1 et un ensemble de filtre 3 comportant un disque à fil- tre 9 sur lequel sont montés des filtres 5, 6, 7 et 8. L'arbre 15 du disque à filtre, monté de manière à pou- voir tourner dans un chariot ou une base 16, est sur- moulé dans le disque à filtre 9 et il est utilisé pour accoupler ce dernier avec un moteur d'entraînement. Un récipient 4 à solution d'essai et un détecteur tel qu'un photomultiplicateur 13 fournissent des informations de sortie de détecteur à un processeur de données 14. Un pré-filtre 17 est monté dans une cavité 18 formée sur le chariot 16, pour réduire au minimum la lu- mière ambiante transmise.Une série de nervures continues l9,(voir Fig. 3) en saillie sur la surface supérieure du disque à filtre 9 forment des compartiments cloisonnés qui entourent respectivement chacun des filtres 5, 6, 7, 8 pour bloquer la lumière diffusée et l'empêcher de pro- duire un couplage optique entre les filtres à la surface supérieure du disque. De même, des nervures annulaires 20, 21 font saillie sur la surface, inférieure du filtre 9 (voir Fig. 1 et 2) pour bloquer la lumière diffusée au- dessous du disque à filtre et éviter un couplage optique entre les filtres.Cette lumière diffusée peut être d'une part de la lumière d'excitation réfléchie par de nombreu- ses surfaces au-dessous du disque à filtre. Les nervures , 21 s'ajustent dans des rainures annulaires 22, 23 cor- respondantes, prévues dans le chariot 16. En fonctionnement, dans la position d'essai, la lumière provenant de la source lumineuse 1 est diri- gée par le prisme 2 vers les filtres 17 et 5, consistant chacun en un filtre à interférence à bande étroite de 500 nm, servant à laisser passer la lumière d'une lon- gueur d'onde d'excitation vers le prisme Il qui dirige cette lumière d'excitation vers l'échantillon en essai 4. La lumière fluorescente provenant de la solution d'essai est dirigée par le prisme 12 vers un filtre 6 à coupure brusque à 530 nm laissant passer la lumière vers le dé- tecteur 13. Une rotation de 1800 de l'ensemble de disque de filtre 9 place les filtres 7 et 8 (filtres à inter- férence et de densité neutre de bande étroite de 500 nm) dans le trajet de la lumière lorsqu'elle passe de la source lumineuse au détecteur, en produisant ainsi un signal de référence* Une cartouche contenant un ensemble de filtre 3 et un chariot 16 peut être commodément introduite dans un spectrophotomètre à absorption dichromatique Abbott VlPTrpour le convertir en un spectrophotomètre à fluores- cence. Il est possible d'utiliser le principe de l'in- vention pour adapter d'autres spectrophotomètres aux me- sures de fluorescence. Le signal obtenu d'un spectrophotomètre di- chromatique courant converti en un spectrophotomètre à fluorescence au moyen de l'appareil selon l'invention est proportionnel au logarithme du rapport de l'intensité de fluorescence à l'intensité de référence. Dans le cas de solutions très diluées, le signal est linéaire avec des concentrations dépassant un ordre de grandeur par rapport à la concentration, et dans le cas de plus lar- ges plages de concentration, de signal est proportion- nel au logarithme de la concentration sur plusieurs or- dres de grandeur de variation de concentration. Les filtres à densité neutre sont choisis pour régler l'intensité de la lumière d'excitation transmise par la solution d'essai vers le détecteur dansle mode de référence et par conséquent pour régler la plage de sensiblité des mesures. Les spécialistes en optique pourront noter que toute une variété de sources lumineuses, de détecteurs et de combinaisons de filtres peuvent convenir pour at- teindre les buts de l'invention,. Différents prismes, mi- roirs, lentilles et collimateurs sont des moyens qui conviennent pour diriger la lumière de la source vers l'échantillon en essai et de cet échantillon vers le dé- tecteur. D'une façon similaire, toute une variété de techniques de traitement de données existe pour traiter les signaux électriques Résultant des faisceaux d'essai (lumière fluorescente)et de référence (lumière d'excita- tion transmise à travers l'échantillon en essai. Les filtres de l'ensemble 3 pour mesurer des substances fluorescentes sont indiqués dans le tableau I ci-après, il étant bien entendu que le filtre 17 est le même que le filtre 5 dans chaque cas. Ainsi, le,pré- filtre 17 possède des caractéristiques de transmission et de blo- cage optique correspondant à celles du filtre d'excita- tion 5 et il accroit donc les caractéristiques de blocage du filtre d'excitation à la longueur d'onde de fluores- cence. Tableau I 6..7 8 Substance fluorescente 490 nm 515 nm 490 nm 490 nm Fluorescéine 405 nm 450 nm 405 nm 405 nm Ombelliférone 340 nm 460 nm 340 nm 340 nm cdnaphtol, NADH 366 nm 470 nm 366 nm 366nm 8-anilinonaphtalène 319 nm 445 nm 319 nm 319 nm Acide homovanillique/ H202 Les spécialistes en optique reconnaîtront l'uti- lisation de filtres à bande passante étroite, de filtres de coupure et similaires pour la référence et la fluores- cence. A titre d'exemple d'application de l'invention dans des mesures immunologiques par fluorescence, un mode réel de réalisation de l'invention a été utilisé pour le dosage de théophylline dans des échantillons de sérum humain. L'ensemble de filtre 3 comportait un pré-filtre 17 à 405 nm, un filtre d'excitation 5 à 405 nm, un filtre de fluores- cence 6 à 460 nm, avec une large bande s'étendant de 440 à 470 nm et des filtres de référence 7, 8 à 405 nm. Le pré-filtre, les filtres d'excitation et de référence étaient des filtres à interférence à bande étroite. Cet ensemble de filtre a été placé dans un analyseur dichroma- tique Abbott VPT produit par Abbott Laboratories, Irving, Texas. La théophylline a été dosée en utilisant les procédés et les réactifs suivants. Les réactifs sont dif- fuses dans le commerce par Ames Division, Miles Labora- tories, Elkhardt, Indiana 46515. La théophylline dans la solution a réagi avec un réactif contenant un anticorps à la théophylline et une en- la zyme,/ -galactosidase. Un dérivé de théophylline marqué avec un substrat pour cette enzyme, le conjugué -galactosyl- ombelli-férone-théophylline, a été additionné au mélange. Ce dérivé pharmaceutique n'est pas fluorescent dans les con- ditions de l'essai, cependant, l'hydrolyse catalysée par la un anticorps à la théophylline réagit avec la théophyl- line marquée, il la protège, la rendant virtuellement in- active comme substrat pour la f-galactosidase. Des réac- tions de fixation répétitives ont été menées avec une quan- tité constante de réactif marqué à la théophylline, une quantité limitée d'anticorps et l'échantillon de sérum cli- nique ou de plasma contenant de la théophylline. théophylline marquée fluorescence pro- + anticorps duite en proportion + théophylline de la teneur en is t e galactosidase théophylline dans (anticorps/théophyl- l'échantillon de line marquée) +(anti- sérum corps/théophylline) Les standards et les échantillons ont été di- lués préalablement à 1: 51 en utilisant un tampon bicine dilué à 1:20, comme spécifié par le fabricant. Un prélè- vement de 100 pl de chaque standard et échantillon préala- blement dilué a été placé dans les coupelles d'échantillons de l'ensemble à cuvettes multiples de l'analyseur dichroma- tique Abbott V.P. Le réactif enzyme/anticorps fourni par le fabricant sousune forme concentrée a été dilué à 1:30 en utilisant un tampon bicine et a été chargé dans le ré- servoir à réactif. Le réactif pharmaceutique fluorigêne fourni par Ames a été chargé dans un réservoir à réactif auxiliaire. L'analyseur dichromatique Abbott VP?"a été réglé avec un rap- port de distribution de 1:26 (10 pl d'échantillon + 250 pl de réactif). Le distributeur de réactif auxiliaire était à ,22 pl à la position 21. La température de l'eau du bain d'incubateur était 300C. La cuvette et le module de traite- ment d'échantillon ont été couverts avec des couvercles en matière plastique noire. L'instrument a été réglé pour fonctionner dans un mode de point d'extrémité après l'amor- çage des tubulures de réactif et auxiliaire Les signaux à partir du temps d'incubation au dixième tour (27 minutes) ont été tracés en fonction de la concentration standard de théophylline. La concentra- tion de théophylline dans les solutions a été déterminée àpartir de la courbe. Ces données ont été mises en corré- lation avec des données immunologiques enzymatiques obte- nues sur un spectrophotomètre dans un mode d'absorption utilisant des réactifs EMIT'Hde Syva Company. La corréla- tion des données était bonne entre les deux procédés. Il faut noter particulièrement qu'un avantage notable de l'invention réside dans le fait que, étant donné que les signaux de fluorescence et de référence sont reçus par le même détecteur, les problèmes antérieurs de transitoires et de fluctuations dé la source lumineuse sont éliminés. A la place du disque à filtre tournant décrit ci- dessus, le principe de l'invention peut s'appliquer à d'autres ensembles de filtre mobiles par exemple en en- semble de filtre coulissant, vibrant ou animé d'un mouve- ment alternatif, dans lequel les deux filtres d'essai et les deux filtres de référence peuvent être introduits successivementet répétitivement dans le trajet optique, Bien entendu, diverses modifications peuvent être apportées à l'homme de l'art au mode de réalisation dé- crit et illustré à titre d'exemple nullement limitatif sans sortir du cadre de l'invention. REVENDICATIONS 1 - Spectrophotomètre à fluorescence pour l'étude des caractéristiques de fluorescence d'une solu- tion d'essai, caractérisé en ce qu'il comporte une source de lumière(I)produisant cle la lumière d'une première lon- gueur d'onde pour exciter la solution d'essai en produi- sant ainsi de la lumière fluorescente d'une seoonde lon- gueur d'onde parla solution d'essai, un dispositif détec- teur (13) pour détecter la lumière des première et secon- de longueur d'ondes, un récipient (4) à solution d'essai transparent à la lumière des première et seconde longueurs d'ondes, un ensemble de filtre (3) comprenant une monture (9) sur laquelle sont montés plusieurs éléments de filtre (5, 6, 7, 8), ledit ensemble de filtre étant mobile entre une position d'essai et une position de référence, de ma- nière que dans position d'essai un élément de filtre per- mette le passa,,e de la lumière de la première longueur d'onde depuis la source lumineuse vers la solution d'essai et qu'un élément de filtre permette le passage de la lu- mière de la seconde longueur d'onde depuis la solution d'essai vers le dispositif détecteur, tandis qu'en posi- tion de référence, un élément de filtre permet le passage de la lumière de la première longueur d'onde transmise par la solution d'essai vers le dispositif détecteur, le- dit ensemble de filtre comprenant un dispositif faisant écran à la lumière (19, 20, 21) pour empêcher le couplage entre lesdits éléments de filtre par la lumière diffusée, un dispositif (I1) qui dirige la lumière de la source de lumière vers la solution d'essai et un dispositif (12) qui dirige la lumière depuis la solution d'essai vers le détecteur et un dispositif (15) pour déplacer l'ensemble de filtre entre les positions d'essai et de référence, as- sociées en fonctionnement avec l'ensemble de filtre. 2 - Ensemble de filtre, caractérisé en ce qu'il com- porte une monture(9)sur laquelle sont montés deux filtres d'essai (5, 6) et deux filtres de référence (7, 8) les éléments des deux filtres d'essai étant disposés sur une ligne circulaire, à 1800 l'un de l'autre, un élément (5) permettant le passage de la lumière d'une première longueur d'onde pour l'excitation d'une solution d'essai et un élément (6) permettant le passage de la lumière fluorescente d'une seconde longueur d'onde, les éléments (7, 8) des deux filtres cae référence étant disposés sur une ligne circulaire, à 1800 l'un de l'autre entre les éléments des deux filtres d'essai, chaque élément des deux filtres de référence permettant le passage de la lumière de la première longueur d'onde, et un écran à la lumière (19, 20, 21) étant prévu pour empêcher le cou- plage entre lesdits éléments de filtre par la lumière dif- fuséee. 3 - Spectrophotomètre à fluorescence selon la revendication 1 ou 2, caractérisé en ce que ledit écran à lumière (19, 20, 21) comporte des compartiments cloison- nés formant un compartiment cloisonné respectif au-dessus de ladite monture pour chacun desdits filtres afin de blo- quer la lumière diffusé et d'éviter le couplage entre les éléments de filtre. 4 - Spectrophotomètre selon la revendication 3, caractérisé en ce que lesdits compartiments cloisonnés comprennent une paroi continue (19) audessus de ladite monture et entourant respectivement chacun desdits élé- ments de filtre. 5 - Spectrophotomètre selon la revendication 3, caractérisé en ce que ledit écran à lumière comporte en outre au moins une nervure continue (20, 21) en saillie au-dessous de ladite monture pour bloquer la lumière dif- fusée et l'empêcher de produire un couplage entre les éléments de filtre. 6 - Spectrophotomètre selon la revendication 5, caractérisé en ce que ledit ensemble de filtre comporte un pré-filtre (17) monté entre la source lumineuse (I) et lesdits éléments de filtre (5, 6, 7, 8) et permettant le passage de la lumière à la première longueur d'onde tout en bloquant pratiquement le passage de la lumière à la seconde longueur d'onde. 2503365S 7 - Spectrophotomètre selon la revendication 1 ou 2, caractérisé en ce que ledit ensemble de filtre (3) comporte un pré-filtre (17) monté entre la source de lumière (1) et lesdits éléments de filtre (5, 6, 7, 8) et permettant le passage de la lumière de la première longueur d'onde tout en bloquant pratiquement le passage de la lumière de la seconde longueur d'onde.