FR 2510760 A1 19830204 FR 8213244 A 19820729 La carence en folates est une cause cou- rante d'anémie mégaloblastique chez l'homme Dans le corps humain, l'acide folique est métabolisé en acide tétrahydrofolique, puis en acide N-5-méthyltétrahydro- folique, lequel peut à son tour être reconverti en acide tétrahydrofolique en présence de vitamine B 12 pour rentrer dans le circuit métabolique des donneurs et accepteurs de fragments à I atome de carbone Il est important d'être à même de mesurer la quantité d'acide N-5- méthyltétrahydrofolique dans le sérum, dans le plasma et/ou dans les globules rouges. Très fréquemment, la concentration en acide N-5-méthyltétrahydrofolique, qui est le principal dérivé folate contenu dans le sang, se mesure en recourant à un dosage par fixation compétitive de protéines Comme on le verra plus amplement dans la suite, un dosage de l'acide N-5méthyltétrahydrofolique par fixation compétitive de protéine doit de préférence comporter l'utilisation d'acide N-5-méthyltétrahydrofo- lique dans les réactifs étalons Toutefois, l'acide N-5méthyltétrahydrofolique est très instable, et il nécessite de ce fait des précautions telles qu'un scellement en ampoules sous forme lyophilisée sous une atmosphère d'azote pour assurer convenablement sa conservation De telles techniques sont très incomm Bo- des dans la fabrication d'un jeu de réactifs de dosage. De plus, le scellement hermétique ne serait pas à même de prolonger la stabilité au-delà de la reconsti- tution, laquelle n'est que d'environ trois jours à 4 C pour l'acide N-5-méthyltétrahydrofolique. En raison de la relation existant entre la vitamine B 12 et l'acide folique chez l'homme, on a mis au point des dosages qui sont utilisés pour déterminer non seulement la teneur en acide N-5-méthyl- tétrahydrofolique, mais aussi la concentration en vitamine B 12 en recourant à une procédure de dosage unique à étapes multiples Se reporter au protocole exposé au brevet des E U A NI 4 146 602, qui décrit un radiodosage simultané vitamine B 12/folate En fait, les carences en vitamine B 12 et en folate étant hématologiquement et cliniquement indiscernables l'une de l'autre, il est ordinairement nécessaire de déter- miner la teneur en vitamine B 12 dans le sérum et la teneur en folate dans le sérum et dans les globules rouges du sang pour faciliter l'établissement définitif de l'étiologie de l'anémie mégaloblastique. Parmi les divers composés stabilisants pou- vant 9 tre utilisés pour stabiliser l'acide N-5-méthyl- tétrahydrofolique, l'acide ascorbique est préféré. Toutefois, il est connu que l'acide ascorbique perturbe l'analyse de la vitamine B 12 par fixation compétitive. Du fait de l'instabilité réputée de l'acide N-5-méthyl- tétrahydrofolique, de nombreux dosages de folate nécessitant un ou des folates titrés ou étalons, notamment du type faisant intervenir une technique de dosage simultané vitamine B 12/folate, faisaient auparavant appel à la substance mère, & savoir l'acide folique, en tant que folate étalon Cependant, l'acide folique ne reproduit pas toujours exactement l'activité de l'acide N-5-méthyltétrahydrofolique dans la procédure d'analyse. L'un des buts de la présente invention est de fournir un procédé de dosage par fixation compé- titive de protéine perfectionnée faisant appel à un réactif spécifique à l'acide N-5-méthyltétrahydrofolique stabilisé. Un autre but de la présente invention est de fournir un radio-dosage par fixation compétitive de protéine perfectionné permettant de déterminer simultanément les teneurs tant en acide N-5-méthyl- tétrahydrofolique qu'en vitamine B 12. Un autre but encore de la présente inven- tion est de fournir un dosage de folate par fixation compétitive de protéine qui offre une précision de détermination améliorée des teneurs en acide N-5- méthyltétrahydrofolique. D'autres buts de la présente invention apparaîtront au technicien compétent à la lecture de la description détaillée de l'invention que l'on trouvera plus loin. Selon la présente invention, la concentra- tion en acide N-5-méthyltétrahydrofolique d'un échan- tillon provenant d'un patient ou échantillon biolo- gique est déterminée en ajoutant séparément à l'échan- tillon biologique et à au moins un réactif étalon des quantités connues d'acide folique marqué ou de dérivé marqué de l'acide folique pour obtenir au moins deux échantillons d'examen distincts, le ou lesdits réactifs étalons comprenant un complexe lyophilisé reconstitué d'acide N-5-méthyltétrahydro- folique et de protéine se fixant aux folates, en détruisant la protéine se fixant aux folates du ou desdits réactifs étalons et en détruisant toute protéine fixatrice éventuellement présente dans l'échantillon biologique, en ajoutant une quantité connue de protéine se fixant aux folates, de préfé- rence immobilisée sur un support inerte, à chaque échantillon d'examen, et en déterminant la quantité d'acide N-5-méthyltétrahydrofolique contenue dans l'échantillon biologique par mesure de la quantité d'acide folique marqué ou de dérivé marqué de l'acide folique qui se fixe ou ne se fixe pas à la protéine fixatrice immobilisée de chaque échantillon d'examen et en comparant la mesure obtenue sur l'échantillon biologique avec la ou les mesures obtenues sur le ou lesdits réactifs étalons. lie préférence, on fait agir en batterie une série de réactifs à l'acide N-5-méthyltétrahydro- folique connus à concentrations différentes avec des échantillons biologiques à doser afin de pouvoir tracer une courbe d'étalonnage utilisable pour déterminer par interpolation la concentration en acide N-5-méthyl- tétrahydrofolique de l'échantillon biologique, comme cela est bien connu en soi. Dans une forme de mise en oeuvre préférée de la présente invention, la détermination de l'acide N-5-méthyltétrahydrofolique est effectuée de façon à faire partie d'un dosage simultané vitamine B 12/ folate. Dans une autre forme de mise en oeuvre préférée de la présente invention, il est fait appel à des marqueurs radioactifs. Dans une autre forme de mise en oeuvre préférée de l'invention, la protéine se fixant aux folates présente dans le ou les échantillons de réactif(s) étalon(s) et les protéines fixatrices endogènes éven- tuellement présentes dans l'échantillon biologique sont détruites par chauffage des échantillons d'examen après addition à ceux-ci d'acide folique marqué ou de dérivé marqué de l'acide folique à une température et pendant une durée suffisantes pour assurer la destruc- tion desdites protéines En outre, lorsqu'on le désire, les fixateurs peuvent Otre détruits avant addition au système de l'acide folique marqué ou du dérivé marqué de l'acide folique. Comme exposé sommairement plus haut, des problèmes de stabilité faisaient auparavant obstacle à l'utilisation de l'acide N-5-méthyltétrahydrofolique dans les dosages par fixation compétitive de protéine, et en particulier dans ceux du type simultané vitamine B 12/folate La présente invention fournit un dosage de folate perfectionné gràce à l'utilisation d'un complexe stable de l'acide N-5méthyltétrahydrofolique avec une protéine se fixant aux folates Ce complexe est décrit en détail dans la demande de brevet français NI et déposée ce m 9 me jour par la Demanderesse pour: "Stabilisation par complexation et lyophilisation de métabolites intermédiaires sensibles et biologique- ment actifs, complexes obtenus et leurs utilisations", à laquelle on se reportera utilement à ce sujet. La protéine fixatrice, autant que l'on sache, peut être n'importe quelle protéine se fixant aux folates, et par exemple une protéine se fixant aux folates qui est obtenue par purification à partir de lait de bovin. Le complexe est formé en mélangeant de l'acide N-5- méthyltétrahydrofolique non marqué avec la protéine fixatrice dans un milieu liquide, en laissant le complexe se former par adoption de conditions d'incubation appro- priées, puis en opérant une congélation et une déshydra- tation rapides du mélange, de préference par lyophilisation de celui-ci, afin d'obtenir une poudre sèche. Par exemple, à une solution aqueuse contenant 20 ng/ml d'acide N-5méthyltétrahydrofolique, on ajoute 66,4 microgrammes de protéine bovine se fixant aux folates Ensuite, après incubation à 4 C pendant deux heures, on effectue la lyophilisation du mélange. L'échantillon lyophilisé peut 9 tre reconstitué en ajoutant de l'eau à celui-ci comme de besoin Ce produit reconstitué présente une stabilité améliorée comparati- vement au produit dépourvu de protéine fixatrice. En plus de la protéine se fixant aux folates obtenue à partir de lait de bovin qui a été mentionnée plus haut, d'autres protéines se fixant aux folates que l'on trouve dans le commerce ou qui peuvent tre obtenues expérimentalement peuvent 9 tre substituées à celle-ci, telles par exemple qu'une protéine fixatrice obtenue à partir de lait de chèvre, des récepteurs ou fixateurs extraits de divers organes d'animaux, et en particulier de reins, de foies et de pancréas, des préparations de 3-lactoglobulines ou de sérum de dauphin. L'acide folique ou le dérivé de l'acide folique peuvent être marqués en recourant à toute techni- que de marquage appropriée, telles celles faisant appel à un marqueur radioactif, à un marqueur enzymati- que, à un marqueur fluorescent, etc On préfère utiliser un marqueur radioactif, tel que l'iode radioactif 125 I. Lorsque le dosage est un dosage à procédure de déter- mination simultanée de folate et de vitamine 312, il est commode de recourir à des marqueurs différents pour les réactifs à l'acide folique ou à-dérivé de l'acide folique et à la vitamine B 12. L'exemple ci-après illustre une forme de mise en oeuvre de la présente invention dans laquelle un m 9 me échantillon provenant d'un patient ou échantillon biologique est soumis à une recherche simultanée de la concentration en acide N-5-méthyltétrahydrofolique et de la centration en vitamine B 12 Toutefois, cet exemple ne saurait d'aucune façon être interprété comme limitatif pour la présente invention Par exemple, les durées d'incubation, la taille des échantillons, les températures et autres facteurs peuvent être modifiés, comme bien connu en soi. EXEMPLE Réactifs utilisés dans le dosage A Protéines fixatrices Les protéines fixatrices (prot Ine se fixant aux folates, purifiée à partir de lait de bovin, et facteur intrinsèque de porc purifié jouant le rôle de protéine fixatrice pour la vitamine B 12) sont liées de façon covalente à des particules de verre, qui sont placées en suspension dans un milieu salin à tampon phosphate 0,03 M de p H 7,5 ( 0,15 M en chlorure de sodium) contenant 0,0 e/o d'azoture de sodium comme stabilisant. B l 57 Colvitamine B 12 et l 125 Il-folate conjugués De la l 57 Col-vitamine B 12 et du 125 Il- folate sont dissous dans du tampon borate 0,IM à p H 9,3 contenant 0,001 % de cyanure de potassium, 2 microgrammes/ ml de rouge amarante comme colorant de pipetage et 0,2/o d'azoture de sodium comme stabilisant. C Dithiothréitol On dispose d'un flacon contenant du dithio- thréitol sous forme lyophilisée. D Etalons vitamine B 12/folate Six concentrations de vitamine B 12 et d'acide N-5-méthyltétrahydrofolique dans un milieu salin à tampon phosphate 0,1 M de p H 7,4 contenant 1 % de sérum- albumine humaine et 0,2/o d'azoture de sodium comme stabilisant, ayant été lyophilisées en présence d'un excès quintuple de protéine se fixant aux folates. E Témoins de référence vitamine B 12/folate Deux témoins de référence vitamine B 12/acide N-5-méthyltétrahydrofolique ont été préparés à partir de plasma humain défibriné, et lyophilisés en présence de protéine se fixant aux folates. Dans la préparation des réactifs D et E ci-dessus, on utilise pour constituer le "folate" de l'acide N-5-méthyltétrahydrofolique sous la forme d'un complexe avec une protéine se fixant aux folates qui est obtenue par purification à partir du lait de bovin. Les conditions de conservation, de manipula- tion et de reconstitution des réactifs sont connues du clinicien expérimenté Le dithiothréitol a été reconsti- tué avec du réactif B à une teneur de 2 mg/ml afin de renforcer la fixation non spécifique et d'améliorer la stabilité de l'acide N-5méthyltétrahydrofolique et de la vitamine B 12 lors du chauffage Les témoins de référence, qui sont facultatifs, sont choisis dans cette forme de mise en oeuvre de l'invention en sorte qu'ils présentent des concentrations propres à fournir approximativement des résultats de dosage se rapprochant des gammes de carence et de normalité des patients et des gammes de vitamine B 12 normales et élevées Ces témoins peuvent servir à fournir un contr 8 le du compor- tement du dosage lorsqu'ils sont traités de la m 8 me façon que l'échantillon à doser. Dans cet exemple particulier, les six éta- lons vitamine B 12/folate sont choisis comme indiqué ci- dessus, étant entendu qu'il est loisible au technicien compétent d'en modifier le nombre, les concentrations et paramètres similaires en fonction des normes du laboratoire Les concentrations des étalons sont des concentrations par millilitre. Contenu du tube (par ml) Etalon vitamine B 12/folate, 0/0 pg/ng Etalon vitamine B 12/folate, 100/1,0 pg/ng Etalon vitamine B 12/folate, 250/2,5 pg/ng Etalon vitamine B 12/folate, 500/5,0 pg/ng Etalon vitamine B 12/folate, 1000/10,0 pg/ng Etalon vitamine B 12/folate, 2000/20,0 pg/ng. Mode opératoire du dosage On utilise en double des tubes à essai en verre Pyrex@ ou en polypropylène pour toutes les opé- rations, c'est-à-dire pour la mise en réaction des éta- lons, des témoins, et pour chaque échantillon biloogique. Dans cette forme de mise en oeuvre du dosage, on peut utiliser du sérum ou du plasma (addi- tionnés d'anticoagulant EDTA) De plus, un lysat de sang entier peut 8 tre préparé et stabilisé à l'acide ascorbique pour effectuer une analyse de la teneur en folate des globules rouges du sang. 1 Les tubes à essai sont disposés comme suit Numéro du tube Contenu du tube (par ml) 1, 2 Etalon vitamine 0/0 pg/ng 3, 4 Etalon vitamine /1,0 pg/ng , 6 Etalon vitamine 250/2,5 pg/ng 7, 8 Etalon vitamine 500/5,0 pg/ng 9, 10 Etalon vitamine 1000/10,0 pg/ng 1, 12 Etalon vitamine 2000/20, 0 pg/ng 13, 14 Témoin vitamine , 16 Témoin vitamine B 12/folate de zéro, B 12/folate, B 12/folate, B 12/folate, B 12/folate, Bl 2/folate, B 12/folate N I B 12/folate N 2 Echantillon de sérum biologique (à doser). 1 I I 17, 18 2 Ajouter 100 i/L 1 de l'étalon, du témoin ou de l'échan- tillon approprié dans le tube à essai. 3 Ajouter 1,0 ml de réactif B (vitamine B 12/folate à marqueur radioactif) dans chaque tube. 4 Bien mélanger. Faire incuber dans de l'eau bouillante pendant minutes, puis à la température ambiante pendant encore minutes. Cette opération détruit la protéine se fixant aux folates utilisée pour former le complexe d'acide N-5-méthyltétrahydrofolique, en détruisant en m 9 me temps toute protéine endogène se fixant aux folates qu'est susceptible de contenir l'échantillon biologique. 6 Ajouter 0,5 ml de réactif A (protéines se fixant aux folates et à la vitamine B 12) dans chaque tube. 7 Bien mélanger. 8 Faire incuber pendant 1 heure à la température ambiante. Au moins pendant les opérations d'incubation, les tubes sont de préférence protégés de la lumière. 9 Centrifuger tous les tubes. Décanter tous les tubes. 11 Soumettre à comptage tous les tubes à l'aide d'un compteur gamma propre à doser simultanément ou séparément 57 Co et 125 I Dans cet exemple, c'est le culot de centrifu- gation que l'on passe au compteur, mais on pourrait aussi bien passer au compteur le liquide de décantation, sous réserve de modification des calculs et de la génération des courbes d'étalonnage. De plus, le réactif à protéines fixatrices A pourrait être immobilisé sur un autre support, tel qu'un polymère organique, des particules inorganiques, etc Bien qu'il soit préféré que la protéine fixatrice soit liée au support par covalence, la liaison s'effec- tuant directement avec le support ou par la médiation d'un radical chimique intermédiaire comme connu en soi, on pourrait faire appel à d'autres types de technique de liaison chimique et/ou physique, telles que l'utilisa- tion de liaisons ioniques, de forces de Van der Waals, etc Dans ce dosage, la protéine de fixation est liée par covalence à des particules de verre poreuses par silane de couplage et glutaraldéhyde comme bien connu en soi (voir par exemple le brevet des E U A Nt 3 669 841). La détermination de la concentration du ou des corps à titrer dans l'échantillon biologique peut ttre effectuée en recourant à l'une quelconque d'entre de nombreuses méthodes de calcul de réduction de données connues du technicien expérimenté Par exemple, le taux de fixation relative afférent à la vitamine B 12 marquée et au folate marqué pour l'étalon, les témoins et le ou les échantillons à titrer peut être calculé en utilisant la formule suivante: Taux de moy coups/min de l'échantillon fixation relative x 100 coups/min de l'étalon 0/0 A la suite de ceci, on peut tracer des courbes d'étalonnage sur du papier millimétré semi- logarithmique (à 3 périodes) en portant le taux de fixa- tion relative suivant l'axe linéaire et les concentrations des étalons suivant l'axe logarithmique On obtient par interpolation les titres en vitamine B 12 et en folate pour les échantillons à titrer, et aussi, en tant que contrôle, pour les témoins. D'une façon similaire, on peut déterminer la concentration en folate dans le lysat de globules rouges du sang, comme sait le faire le technicien expé- rimenté. Comme bien connu en soi, la détermination quantitative de la concentration d'acide N-5-méthyltétra- hydrofolique dans un échantillon nécessite l'emploi d'au moins deux étalons présentant des concentrations suffi- samment différentes pour permettre de définir une courbe d'étalonnage C'est à ce mode opératoire que l'on a recouru dans l'exemple qui précède Il sera cependant évident pour le technicien de compétence moyenne qu'il est possible de n'utiliser qu'un seul étalon si l'on ne se propose que de déterminer si la concentration de l'échantillon en acide N-5-méthyltétrahydrofolique diffère par valeur supérieure ou inférieure d'une quelconque valeur donnée. Certains paramètres dont le technicien expérimenté sait qu'ils interviennent dans le type de dosages de folate et/ou de vitamine B 12/folate ci- dessus décrit n'ont pas été discutés ici, quant au fait par exemple que le dosage sera ordinairement *effectué à un p H voisin de 9,2, etc Vu que la présente invention, grace à l'utilisation d'une protéine fixa- trice immobilisée et du complexe d'acide N-5-méthyl- tétrahydrofolique, procure des améliorations importantes par rapport aux dosages de folate et de folate/vitamine B 12 par fixation compétitive de protéines de l'art antérieur, les paramètres, conditions, réactifs, etc, susceptibles d'être adoptés comme décrit dans l'art antérieur ne font pas partie des caractéristiques de la présente invention et n'ont donc pas besoin d'gtre décrits du tout ni décrits de façon très détaillée ici. L'invention admet des variantes qui seront évidentes pour le technicien expérimenté. REVENDICATIONS 1 Procédé pour la détermination de la concentration en acide N-5méthyltétrahydrofolique d'un échantillon biologique à concentration en acide N-5- méthyltétrahydrofolique inconnue, caractérisé en ce qu'il comprend les opérations consistant à ajouter séparément à ltéchantillonbiologique et à au moins un réactif étalon des quantités connues d'acide folique marqué ou de dérivé marqué de l'acide folique pour obtenir au moins deux échantillons d'examen distincts, le ou les réactifs étalons comprenant un complexe lyophi- lisé reconstitué d'acide N-5-méthyltétrahydrofolique et de protéine se fixant aux folates, à détruire la protéine se fixant aux folates du ou desdits réactifs étalons et à détruire toute protéine fixatrice suscep- tible d'être présente dans l'échantillon biologique, à ajouter une quantité connue de protéine se fixant aux folates à chaque échantillon d'examen, à mesurer la quantité d'acide folique marqué ou de dérivé marqué de l'acide folique qui se fixe ou ne se fixe pas à la protéine de fixation ajoutée dans chaque échantillon d'examen et, à partir des mesures ainsi obtenues, à déterminer la concentration en acide N-5-méthyltétrahydro- folique de l'échantillon biologique. 2 Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que la quantité connue de protéine se fixant aux folates ajoutées à chaque échantillon d'examen est immobilisée sur un support inerte. 3 Procédé caractérisé en ce qu'il comprend les opérations consistant: A) à complexer de l'acide N-5-méthyltétrahydrofolique avec une protéine se fixant aux folates dans un milieu à base aqueuse; B) à lyophi- liser ledit milieu à base aqueuse contenant le complexe ainsi obtenu; et C) à effectuer un dosage de l'acide N-5-méthyltétrahydrofolique par fixation compétitive de protéine en utilisant le complexe lyophilisé sous forme reconstituée comme réactif à l'acide N-5-méthyl- tétrahydrofolique. 4 Procédé selon la revendication 2 ou 3, caractérisé en ce que le dosage effectué est un dosage simultané vitamine B 12/folate. Procédé selon la revendication 2 ou 3, caractérisé en ce que l'on fait agir enbatterie une série de réactifs à l'acide N-5méthyltétrahydrofolique lyophilisés reconstitués présentant chacun une concen- tration en acide N-5-méthyltétrahydrofolique différente, o l'acide N-5méthyltétrahydrofolique est complexé avec une protéine se fixant aux folates, en association avec l'échantillon à doser, et en ce que l'on détermine ensuite la concentration de folate à titrer en éta- blissant une courbe d'étalonnage à partir desdits réactifs à concentrations connues et en comparant ladite concentration à titrer avec ladite courbe d'étalonnage. 6 Procédé selon la revendication 4, caractérisé en ce que l'on fait agir en batterie une série de réactifs à l'acide N-5-méthyltétrahydrofolique lyophilisés reconstitués présentant chacun une concen- tration enacide N-5-méthyltétrahydrofolique différente, o l'acide N-5méthyltétrahydrofolique est complexé avec une protéine se fixant aux folates, en association avec l'échantillon à doser, et en ce que l'on détermine ensuite la concentration de folate à titrer en établis- sant une courbe d'étalonnage à partir desdits réactifs à concentrations connues eten comparant ladite concen- tration à titrer avec ladite courbe d'étalonnage. 7 Procédé selon la revendication 2 ou 3, caractérisé en ce que le marqueur est radioactif. 8 Procédé selon la revendication 4, caractérisé en ce que le marqueur est radioactif, en ce que l'on fait appel à un réactif étalon à la vitamine B 12 radioactive pour opérer un dosage de la vitamine B 12 par fixation compétitive, et en ce que le marqueur radioactif dudit réactif à la vitamine B 12 est diffé-, rent du marqueur radioactif dudit acide folique marqué ou dudit dérivé marqué de l'acide folique. 9 Jeu de réactifs pour dosage par fixation compétitive de protéine, caractérisé en ce qu'il comprend: A) de l'acide N-5méthyltétrahydrofolique complexé avec une protéine' se fixant aux folates; et B) une protéine se fixant aux folates immobilisée sur un support inerte. Jeu de réactifs de dosage selon la revendication 9 pour radiodosage, caractérisé en ce qu'il contient une multiplicité de réactifs étalons à l'acide N-5-méthyltétrahydrofolique lyophilisés présentant chacun à la reconstitution une concentration en acide N-5méthyltétrahydrofolique différente, et en ce que l'acide N-5méthyltétrahydrofolique desdits réactifs est complexé avec une protéine se fixant aux folates, pour permettre d'établir une courbe d'étalonnage de fixation aux folates à partir desdits réactifs étalons. 11 Jeu de réactifs de dosage selon la revendication 10, caractérisé en ce que le support inerte est formé par des particules de verre à modification par silane-glutaraldéhyde, et en ce que la protéine se fixant aux folates est liée à celles-ci de façon covalente.