FR 2502009 A1 19820924 FR 8105764 A 19810323 PERFECTIONNEMENTS AUX PROCEDES DE FABRICATION D'INTERFERON L'interféron est formé d'au moins une protéine dont la synthèse par les cellules est généralement induite par une infection virale. Il est bien connu que l'interféron est capable d'inhiber le développement des virus, qu'il s'agisse de ceux ayant provoqué l'induction de la synthèse ou d'autres virus, même si l'efficacité d'inhibition de l'interféron ainsi synthétisé peut être variable d'un type de virus à un autre. L'interféron synthétisé par les cellules est normalement excrété dans le milieu extracellulàire. Il peut être absorbé par d'autres cellules et leur confé- rer ainsi une protection à l'égard d'une infection virale. L'interféron peut aussi, en particulier lorsque les cellules productrices sont cultivées in vitro au sein d'un milieu, de préfé- rence liquide, êtreEn principe récupéré à partir de celui-ci. On sait en effet que l'interféron représente un principe actif de grande valeur en thérapeutique, en raison de ses propriétés antivirales. Il peut être utilisé avec succès, par exemple pour le traitement d'infections dues au virus de l'herpès. On fonde en outre de grands espoirs sur la capacité attendue de l'interféron d'inhiber le déve- loppement de certains types de cancer. L'invention concerne donc plus particulièrement des perfectionnements apportés aux procédés de production d'in- terféron, ou plus généralement d'interférons car, comme cela est bien connu également, il existe plusieurs formes d'interféron selon le type des cellules productrices mises en oeuvre. Parmi les cellules productrices les plus couram- ment mises en oeuvre, on peut citer les leucocytes du sang, les lymphocytes, les fibroblastes, les cellules lymphoblastoMdes, des cel- lules épithéliales, par exemple des cellules de rein,ou encore des cellules HeLa, des cellules de myélome, etc. L'invention s'intéresse plus particulièrement à la production d'interférons utilisables chez l'homme, par conséquent à des interférons produits par des cellules d'origine humaine. On connait les difficultés sérieuses qui li- mitent l'efficacité des procédés connus de fabrication d'interféron. Même si l'on fait abstraction des diffi- cultés bien connues que rencontre la culture in vitro de cellules d'origine humaine, il en est une qui pré- sente une caractéristique prédominante: il s'agit des quantités extrêmement faibles d'interféron qui sont ex- crétées dans les milieux de culture, mis en oeuvre par la plupart des procédés connus de production d'inter- féron. L'invention a donc pour but de remédier au moins en partie aux difficultés rencontrées à l'occa- sion de la mise en oeuvre des procédés connus, notamment du type de ceux dans lesquels on a recours à un agent inducteur introduit dans une culture de cellules capa- bles de produire de l'interféron, dès lors qu'elles sont susceptibles de le synthétiser sous l'effet d'un tel inducteur. Le procédé selon l'invention est caractérisé par la mise en contact de ces cellules, préalablement à la réalisation de l'induction,avec un dérivé de l'acide rétinoique, du type de la vitamine A ou de l'un de ses analogues, ci-après désignés dans leur ensemble sous l'expression "dérivés rétinoiques". De préférence, le dérivé rétinoique mis en oeuvre est constitué par l'acide rétinoique (acide diméthyl-3,5 (triméthyl-2,6,6-cyclohexane-1 yl 1)-9 nonatétraène-2,4,6,8-oique) de formule: - A titre d'exemples d'autres dérivés rétino- iques susceptibles d'être mis en oeuvre dans le procédé conforme à l'invention, on citera les homologues de cet acide rétinoique, cités à la page 35 de l'article publié par Reuben Lotan dans "Biochimica et Biophysica Acta", 605 (1980) 33-91, sous le titre "Effects of vitamin A and its analogs (retinoids) on normal and neoplastic cells" (effets de la vitamine A et de ses analogues (rétinoides) sur des cellules normales et néoplasiques). Comme le montre le tableau figurant dans cet article, le groupe terminal cyclique et la chaîne polyé- nique de l'acide rétinoïque peuvent faire l'objet de nombreuses modifications ou substitutions, le groupe carboxylique pouvant lui-même être remplacé par d'autres groupes, notamment alcools, aldéhydes, hétéroxydes, méthyl, alcoyles inférieurs, etc. De préférence, on a recours à ceux des dérivés ou analogues en cause, dans lesquels la chaîne polyénique est terminée par un groupe carboxylique, à l'instar de l'acide rétinoique lui- même, dont la formule a été indiquée ci-dessus. En ce qui concerne les cellules productrices d'interféron, on pourra avoir recours à toutes lignées de cellules, de préférence d'origine humaine, suscep- tibles de produire de l'interféron. Ces cellules appar- tiennent avantageusement à l'une des lignées cellulaires déjà identifiées plus haut. Les lignées de cellules Namalva, bien connues des spécialistes, telles que celles qui sont dérivées de cellules de patients affectés par le lymphome de Burkitt sont à ce jour préférées. A titre d'exemple de cellules Namalva susceptibles d'être uti- lisées, on citera celles dénommées Namalva/WRL qui sont disponibles à l'Amerioan Type Culture Collection (A.T.C.C; CRL 1432). En ce qui concerne l'inducteur, on peut avoir recours également à tout type d'inducteur classiquement utilisé, à savoir des virus tels que le virus Sendai ou le virus NQV (Newcastle Disease Virus) qui peuvent éventuellement être inactivés, ou encore des polynucléo- tides ou polyribonueléotides, par exemple l'acide poly- inosinique: polycytidylique (poly I - poly C). La découverte que la mise en contact des cellules productrices d'interféron avec un dérivé de la famille rétinoique ou leur incubation en présence de ce dérivé, préalablement à leur mise en contact avec un inducteur, pouvait conduire à un net accroissement de la quantité d'interféron susceptible d'être produite et excrétée par lesdites cellules dans un milieu de culture approprié, était d'autant plus inattendue qu'était connue la proprié- té que possède la vitamine A d'inhiber la production d'in- terféron par des cellules productrices, lorsqu'elle est mise en contact avec celles-ci, préalablement ou simulta- nément à la mise en contact avec un inducteur du type de ceux déjà mentionnés, comme cela a été décrit par plusieurs auteurs, notamment par J.E. Blalock et G.E. Gifford dans un article intitulé "Inhibition of interferon action by vitamin A" (inhibition de l'action de l'interféron par la vitamine A), paru dans "J. Gen. Virol." (1975), 29, 315-324 ou dans l'article de J.E. Blalock et G.E. Gifford intitulé "Suppression of interferon production by vitamin A" (Suppression de la production de l'interféron par la vitamine A), paru dans "J. Gen. Virol." (1976), 32, 143- 147. Cette capacité de la vitamine A d'inhiber la pro- duction de l'interféron de cellules, préalablement ou si- multanément mises en contact avec un inducteur, est d'ailleurs considérée comme une connaissance acquise de l'état de la technique, comme en témoigne la publication extrêmement complète déjà identifiée plus haut de Reuben Lotan. Avantageusement, la mise en contact est réalisée avec le milieu de culture des cellules productrices d'in- terféron, lorsque le niveau de développement de la culture a atteint le stade désiré. En effet, on aura recours à une concentration du dérivé de l'acide rétino1que aussi élevée que possible, compatible avec la viabilité de la structure cellu- laire, de préférence néanmoins proche de la concentration cytostatique. A cet égard, on remarquera que l'on peut naturellement avoir recours à des concentrations plus faibles de dérivés rétinoiques.La concentration finale de l'interféron produit dans le milieu en sera cependant amoindrie. Lorsque les cellules mises en oeuvre appartien- nent à la lignée Namalva et lorsque le dérivé réti- no;que utilisé est constitué par l'acide rétinoique, les concentrations de ce dernier seront avantageusement ajus- tées de 1.10- 6 à 1.10 4M. Il ne s'agit cependant là que d'un intervalle indiqué à titre d'exemple. Il appartient en fait à l'homme de l'art de déterminer les doses les plus efficaces, notamment en ayant recours à une série d'essais avec des doses croissantes permettant d'explo- rer celles qui permettront, compte tenu du type de dérivé rétinoique utilisé et du type de cellules produdrices d'interféron mises en oeuvre, d'établir la zone de con- centration la plus efficace. En particulier, on recherchera les doses relatives de l'agent rétinoique utilisé,susceptiblesde conduire à une quasi-interruption de la croissance cellulaire, sans pour autant porter atteinte à la viabilité d'une propor- tion majeure des cellules alors présentes dans la cul- ture. De même, les durées de contact entre le dérivé rétinoique et la culture peuvent être déterminées par l'expérience. De préférence, ces durées de contact sont d'au moins 24 heures, de préférence de l'ordre de 48 heures. Les cellules ainsi traitées, préalablement débar- rassées du dérivé rétinoique, notamment par lavage ou tout autre mode de séparation, peuvent alors être mises en contact avec l'inducteur. On peut avoir recours pour la mise en oeuvre du procédé selon l'invention, à tout milieu de culture classique considéré comme approprié pour le développement des cellules productrices d'interféron. D'autres caractéristiques de l'invention apparaî- tront encore au cours d'un exemple de mise en oeuvre préférée de l'invention, qui n'pst cependant donné ci- après qu'à titre d'illustration complémentaire non limi- tative du procédé perfectionné faisant l'objet de cette invention. 1 ) Conditions de culture: Les cellules Namalva sont cultivées en suspension non agitée (sauf si autrement indiqué) dans le milieu de culture RPMI 16. 40 additionné de 10 % de sérum de veau foetal (RETAHUIN, ARMOUR) et d'antibiotiques (CHLORTETRACYCLINE pg/ml, AYiPhOTERICIN B:1,5 pg/ml) dans des flacons incli- nés de façon à permettre l'oxygénation du milieu. Le vo- lume total du milieu ainsi complété est de 400 ml. 2 ) Prétraitement à l'acide rétinoique 48 heures avant l'induction, on laisse sédimenter les cellules par gravité durant 6 h à 37 C, le flacon étant redressé verticalement. On enlève ensuite les 3/4 du milieu, soit 300 ml, on compte les cellules et on ajoute du milieu frais pour avoir une concentration de O106 cellules /ml. On ajoute 5.10 5M d'acide rétinoique (SIGMA) à partir d'une solution mère dans l'éthanol à 1O-2M, pour - obtenir une concentration finalede 5.10 5M, soit 0,015 mg/ml. Les flacons sont remis en position inclinée et incubés à 37 C pendant 48 heures à l'abri de la lumière. On agite manuellement et périodiquement quelques secondes, pour remettre en suspension les cellules. 3 ) Induction: Apres 48 heures, on centrifuge les cellules pendant minutes à 1000 tours/minute à 4 C. Le surnageant est éli- miné. Le culot cellulaire est resuspendu en milieu RPMI sans sérum, mais contenant, outre les antibiotiques,O,5 % (concen- tration finale) de sérumalbumine humaine et 10 5M de e-mercapto- éthanol, de façon que la concentration cellulaire soit de 3,3.106/ml, soit une réduction de trois fois du volume de 25.02009 milieu initial: les cellules sont restées en effet à la concentration de 106/ml, leur multiplication ayant été bloquée par l'acide rétinoique. On ajoute ensuite 500 unités hémagglutinantes (unités HA) de virus de Sendai (préalablement inactivé par irradiation UV avec une lampe germicide à la dose de 300 ergs/mm2) par ml de suspension cellulaire. On incube pendant environ 17 heures à 370C en flacons Coràing de cm2, à raison de 100 ml par flacon. 40) Récolte: On centrifuge là suspension 10 minutes à 2000 tours par minute à 41C. On amène le surnageant à pH 2 par addition de HCl 1N et on laisse pendant trois à quatre jours. On ramène ensuite la solution à pH 7 par addition de NaOH 4N. Un aliquot est prélevé pour titrage: les titres vont de 0,5 à 1,2.106 unités internationales/ml (les unités internationales sont définies d'après un inter- féron leucocytaire de référence n0 6.023.901-527 du NIH). (A titre de comparaison, on indique qu'une préparation d'interféron réalisée dans des conditions identiques, sauf que les cellules mises en oeuvre n'ont pas, avant induction, été pré-incubées en présence d'acide rétinoique, conduit, au même stade de la préparation, à une solution titrant de 1,5.104 à 6.104 unités internationales/ml). Le reste du surnageant reçoit de l'acide trichlora- cétique (concentration finale 1,5 %, à partir d'une solution à 50 %), qui précipite la majorité des protéines,dont l'in- terféron. Après 60 minutes à 41C, on centrifuge le précipi- té à 10.000 tours/minute pendant 15 minutes. Le culot est redissous dans un volume minimal (environ 1/16 du volume initial de tampon phosphate PBS (Proc. Nat. Acad. Sci. 1952, 38, 747), en remontant progressivement le pH à 7 par addi- tion de NaOH 4 N. Le PBS utilisé selon l'invention ne con- tient en outre, ni calcium, ni magnésium. Un aliquot est prélevé pour titrage. On peut éventuellement dialyser contre du PBS ou un autre tampon en vue d'une étape ultérieure de purifica- tion selon une technique en soi connue. Des expériences menées dans les mêmes conditions avec du palmitate de rétinol (concentration optimale: 5.10-4M) et du rétinal (concentration optimale: 5.10 5M) ont donné des résultats identiques à ceux obtenus avec l'acide rétinoique. REVENDICATIONS 1 - Procédé de fabrication d'interféron par culture de cellules productrices d'interféron dans un milieu de culture de préférence liquide, et mise en contact de la culture avec un inducteur d'interféron, caractérisé en ce que les cellules de cette culture sont, préalablement à leur mise en contact avec l'in- ducteur, mises en contact avec un dérivé rétinoïque. 2 - Procédé selon la revendication 1, carac- térisé en ce que le dérivé rétinoique est un dérivé acide. 3 - Procédé selon la revendication 2, carac- térisé en ce que le dérivé rétinoique acide est consti- tué par l'acide rétinoique. 4 - Procédé selon l'une quelconque des re- vendications 1 à 3, caractérisé en ce que les concentra- tions relatives du milieu de culture en dérivé rétinol- que sont ajustées aux doses permettant une quasi- interruption de la croissance cellulaire, sans pour au- tant porter atteinte à la viabilité d'une proportion majeure des cellules alors présentes dans la culture. - Procédé selon la revendication 4, carac- térisé en ce que la durée de contact entre la culture et le dérivé rétinoique est d'au moins 24 heures, de préférence de l'ordre de 48 heures. 6 - Procédé selon les revendications 3, 4, 5 et 6 prises dans leur ensemble, caractérisé en ce que la concentration en acide rétinoique du milieu de culture est réglée à une valeur de 1.iO 6 à 1.10 4M. 7 - Procédé selon l'une quelconque des reven- dications 1 à 6, caractérisé en ce que les cellules pro- ductrices d'interféron mises en oeuvre appartiennent à une lignée de Namalva. 8 - L'interféron préparé selon le procédé dé- fini dans l'une quelconque des revendications 1 à 7.