FR 2499410 A1 19820813 FR 8201810 A 19820204 En 1950, on a découvert que l'avortement enzoo- tique chez les brebis était dû à une infection des animaux par une souche virale du groupe Psittacose - Lymphogranu- lome (Young et Coll., J.A.V.M.A., vol. 133 (ler. octobre 1958) p. 374) classé aujourd'hui comme Chlamydia sp. (Becerra et al, Zbl. Bakt., I. Abt. Orig. vol. 214 p. 250-258 (1970)). A une date antérieure dans la même décade, des chercheurs travaillant dans ce domaine ont trouvé que l'inoculation à des brebis, au moment de la reproduction ou aux environs de ce moment, d'un vaccin préparé à par- tir (1) de sacs vitellins infectés par le virus, ou (2) de membranes foetales d'ovius infectées par le virus, réduisait efficacement l'incidence de l'avortement enzoo- !5 tique des brebis. Les corps élémentaires de chlamydia étaient concentrés à partir d'embryons de poulets infec- tés ou de membranes foetales, ils étaient inactivés et utilisés pour préparer le vaccin. McEwen et al, Vet. Rec., Vol. 63, p. 197 (3/17/51); McEwen et al. Vet. Rec., Vol. 66, p. 393 (7/10/54); McEwen et al. Vet. Rec., Vol. 67, p. 393 (5/21/55); McEwen et al, Vet. Rec., Vol. 68, p. 686 (10/6/56); McEwen et al, Vet. Rec. Vol. 68, p. 690 (10/6/56); Hulet et al, Am. J. Vet. Res. Vol. 26, p. 1464 (1965); Frank et al, Am. J. Vet. Res., Vol. 29, p. 1441 (1968); Meinershagen et al, Am. J. Vet. Res., Vol. 32, p. 51 (1971). Des passages successifs d'un microorganisme virulent à l'extérieur de son hôte naturel sont un pro- cédé admis pour la sélection de mutants (souches atténuées) ayant une virulence réduite. Wilson, G.S., et Miles, A. Topley et Wilson, Principles of Bacteriology, Virology, and Immunity, Williams & Wilkins, 6è édition 1975 Vol. 1, p. 412-416. On a également signalé des immunisations réus- sies de brebis contre l'avortement dû au chlamydia avec des organismes chlamydiaux atténués par des passages successifs dans des embryons de poulets. Voir Mitscherlich, E., The Control of Virus Abortion of Sheep, Berl-Munch. Tierarztl, Wschr. 78, N 5: 81-100 (1965); Nejvestic, A. et Forsek, Z., Active Immunization in the Prophylaxis of Enzootic Abortion in Ewes - I. Vet. Glasnik, 23, 6: 423-427 (1969); Schoop, G., Wachendorfer, G., KrugerHansen-Schoop, U., et Berger, J., Studies on a Live Vaccine for the Control of Miyagawanella Abortion in Sheep, Zbl. Vet. Med., série B., 15, N 2: 209-223 (1968); Yilmaz, S., et Mitscherlich, E., Experiences in the Control of Ovine Enzootic Abortion with a Live Vaccine made from an Attenuated Strain of Chlamydia ovis, strain "P", Berl. Munch., Tierarztl., Wschr. 86, N 19: 361-366 (1973). D'autres rapports indiquent cependant que la virulence des organismes chlamydiaux n'est pas diminuée par des passages successifs en culture cellulaire ou dans des embryons de poulets. On consul- tera à ce sujet Becerra, V.M., Ata, F.A., et Storz, J., Studies on the Response of Ewes to Live Chlamydia Adapted to Chicken Embryos or Tissue Culture, Canad., J. Compar. Med. 40: 46-52 (1976); Becerra, V.M., et Storz, J., Tissue Culture Adaptation and Pathogenic Properties of an Ovine Chlamydial Abortion Strain, Zentbl, Vet. Med. 21: 288-299 (1974); et McKercher, D.G., Robinson, E.A., Wada, E.M., Saito, J.K. et Franti, C. E., Vaccination of Cattle against Epizootic Bovine Abortion, Cornell Vet. 59: 211-226 (1969). Le cout de production d'un vaccin utilisant un sac vitellin et/ou une membrane foetale ovine infectés est cependant prohibitif. De plus, le vaccin produit conformément aux procédés publiés est difficile à uni- formiser. Les techniqueé au sac vitellin et à la membrane foetale sont non seulement onéreuses, mais encore longues et inefficaces. I1 en résulte qu'il n'existe pas actuelle- ment de vaccin contre l'avortement enzootique des brebis commercialement séduisant qui soit disponible aux U.S.A. On pense que les immunisations contre l'avortement en- zootique des brebis ne sont actuellement effectuées qu'en Idaho, en utilisant des vaccins à base de sacs vitellins ou de membranes foetales fabriqués localement en discontinu. La difficulté d'uniformiser ces vaccins a cependant conduit à des résultats mélangés et impré- visibles. Compte tenu du fait que l'avortement enzootique chez la brebis est un problème grave dans l'industrie de l'élevage du mouton et qu'elle est responsable de pertes par avortement dans des troupeaux sensibles pou- vant atteindre 30 %, il existe un besoin urgent d'un vaccin économiquement viable et d'un procédé d'immuni- sation active des brebis contre l'avortement enzootique des brebis. Un des buts de l'invention est de fournir un vaccin pour l'immunisation active des brebis contre l'avortement enzootique. Un autre but de l'invention est de fournir un procédé d'immunisation des brebis contre l'avortement enzootique. Un autre but de l'invention est de fournir un procédé relativement simple, efficace et économiquement séduisant pour la préparation d'un vaccin contre l'avor- tement enzootique des brebis. Un autre but de l'invention est de fournir une composition intermédiaire facile à uniformiser, spécialement adaptée à la préparation d'un vaccin contre l'avortement enzootique des brebis. L'invention est basée sur cette découverte que l'on peut préparer un vaccin économiquement acceptable et commercialement séduisant pour l'immunisation active des brebis contre l'avortement enzootique à partir de corps élémentaires de Chlamydia sp. qui se sont multi- pliés sur une culture cellulaire et ont été isolés de celle-ci. On a trouvé que des corps élémentaires de Chlamydia sp. qui ont été cultivés sur culture cellu- laire, sont produits plus économiquement et avec un meilleur rendement que des souches provenant d'embryon de poulet ou de membrane foetale. En outre, la composi- tion produite sur culture cellulaire est plus facile à uniformiser que celles produites jusqu'à présent. L'invention concerne une suspension aqueuse de corps élémentaires chlamydiaux inactivés qui se sont multipliés sur une culture cellulaire et ont été isolés de celle-ci, à partir de laquelle on peut formuler un vaccin contre l'avortement enzootique des brebis par dilution avec un support administrable par voie paren- térale. On donnera à présent un exemple non limitatif d'un procédé de préparation de la suspension aqueuse Une souche unique de Chlamydia sp. isolée d'un foetus d'ovin infecté est utilisée pour préparer la suspension. L'organisme est mis à reproduire sur des cultures de cellules L de fibroblastes de souris (NCTC 929) soit dans des couches monocellulaires immo- biles, dans des flacons tournants, soit en culture sur microsupport ern suspension en utilisant un Minimum Essentials Medium Eagle à 10 % complété par 5 % de sérum de foetus de bovin. A une couche monocellulaire confluente (ou son équivalent dans un flacon tournant ou une culture en suspension), on inocule 1 ml de suspension de chlamy- dia contenant 1 x 108 doses léthales pour l'embryon (DLE50) / 0,5 ml. Les cultures sont mises à incuber à 37 C dans un incubateur à CO2o Des frottis sont préparés quotidiennement à partir des cellules L infectées, et colorés par la méthode de Gimenez (Clark et al, Staining Procedures used by the Biological Stain Commission, 3è Ed. Williams & Wilkins Co., Balt. Md. 1973, p. 291). Lorsqu'environ 80-90 % des cellules L sont infectées, le milieu de culture de tissus provenant des cellules L infectées et les cellules L infectées qui ont été détachées de la surface de croissance avec une solu- tion versène-trypsine sont rassemblés pour être utilisés comme inoculum pour des cultures fraehes de cellules L. Une couche monocellulaire immobile (ou son équivalent) est utilisée comme "germe" pour 5 couches monocellulaires fraîches (ou équivalents) de taille et de volume égaux. Le progrès de l'infection par les chlamydias est à nouveau suivi comme ci-dessus. Le fluide de culture et les cellules L infectées provenant de ballons de culture immobile (ou leur équi- valent) sont récoltés lorsque 80-90 % des cellules sont infectées. Les fluides infectés et les cellules détachées sont rassemblés et centrifugés sous 16.300 G pendant minutes. Le fluide surnageant est jeté, et le culot de centrifugation est remis en suspension dans du tampon sucrose-phosphate de Bovarnick (Bovarnicks et al, J. Bact. 1950, vol. 59, p. 509-22) pour donner un volume final égal à 1/100 de la quantité récoltée. On élimine une portion de 2 ml de cette suspension pour le titrage de l'infectivité dans un embryon de poulet de 7 jours. On ajoute au reste une quantité de formol suffisante pour donner une concentration finale en formol de 0,4 %. La suspension traitée par le formol est stockée à 370C pen- dant une semaine, puis soumise à un essai de stérilité. La suspension est à nouveai séparée par centri- fugation, le liquide surnageant est jeté et le culot est remis en suspension dans du sérum physiologique tamponné au phosphate contenant 0, 2 % de formol. On ajuste le volume final (en utilisant les résultats du titrage d'infectivité) pour avoir une concentration en corps élémentaires chlamydiaux équivalente à.08,3 DLE50/ 0,25 ml. Il est clair que la souche de chlamydia peut être obtenue de n'importe quelle source convenable et mise à se multiplier sur n'importe quelle culture de cellule appropriée, par ex. des fibroblastes de poulets, de cellules de sacs vitellins, de McCoy (synoviale hu- maine), de rein de foetus d'agneau, de poumon de foetus d'agneau, de rate de foetus d'agneau, d'amnios humain, d'HEP-2 (tumeur laryngée humaine) de testicule d'agneau, de He La, de Sirc (cornée de lapin), de foie de lézard vert, etc. Il est également clair que l'on peut utiliser n'importe quel agent destructeur pour inactiver les chlamydias, par exemple le formol, l'irradiation UV, un effet thermique (560C pendant 5 minutes ou davantage), le phénol, les gels et dégels répétés, la béta-propio- lactone, l'acétone, l'éther, les mélanges acétone-éther etc.... La multiplication peut être poursuivie jus- qu'à ce qu'il y ait dans la suspension finale une quantité de corps élémentaires chlamydiaux comprise entre 10 et 10 DLE / 0,25 ml. On peut formuler un vaccin sous forme de doses unitaires convenant pour l'immunisation contre l'avorte- ment enzootique chez la brebis en diluant la suspension aqueuse ci-dessus avec un volume égal d'un support physiologiquement acceptable et pouvant être administré par voie parentérale. Par exemple, on peut ajouter à la suspension un volume égal d'un adjuvant huileux (4 par- ties d'huile minérale légère et une partie de lanoline) à la suspension préparée ci-dessus dans un mélangeur mécanique fonctionnant à faible vitesse. Lorsque l'addi- tion de l'adjuvant est terminée, on homogénéise le mélange obtenu, on le met dans des flacons et on le stocke pour l'emploi. Le vaccin est administré par injection sous- cutanée d'une dose unique de 1 ml au moment de la repro- duction ou aux environs de celle-ci, étant entendu qu'une dose appropriée est une dose contenant d'environ 2 x 106 à environ 2 x 10 0LE 50/mi. Le vaccin obtenu est beaucoup moins coteaux à préparer, il est plus aisément uniformisé et donne un degré d'immunisation plus élevé contre l'avortement enzootique des brebis que les vaccins précédemment proposés provenant d'embryons de poulets (sac vitellin) et de membranes foetales d'ovins. Pour démontrer la valeur et l'efficacité du vaccin de la présente invention, on a essayé d'atténuer une souche chlamydiale par des passages successifs dans des embryons de poulets et de préparer un vaccin à par- tir de celle-ci. Le mode opératoire utilisé est le sui- vant: Une souche unique de Chlamydia psittaci (Ark 2) est utilisée dans l'expérience. L'organisme d'essai est isolé à partir d'un agneau avorté et il est cultivé par des passages successifs dans un embryon de poulet de 7 jours. On fait passer la chlamidia destinée à l'inocu- lation à des brebis du lot 2 dans un embryon de poulet 7 fois à 37 C et 10 fois à 40 C. Pour les lots 1 et 3, les inoculums ont été prépares à partir d'une chlamydia cultivée dans un embryon de poulet à 37 C avec le nombre de passages indiqué (tableau 1). Le lot 3 est un témoin dans lequel on inocule aux brebis une souche virulente de chlamydia. Le lot 4 ne reçoit pas d'inoculation et sert de témoin normal. La préparation des inoculums pour le mouton et leurs déterminations d'infectivité pour l'embryon de poulet ont été effectuées par les procédés décrits dans Reed, L.J. et Muench, H., A Simple Method of Estimating Fifty Percent Endpoints, Am. J. Hyg. 26: 493- 497 (1938); Storz, J., Chlamydia and Chlamydia-Induced Diseases, Chas. C. Thomas, 1971, p. 154; et Waldhalm, D.G., Frank, F.W. Meinershagen, W.A., Philip, R.N., et Thomas, L.A., Lamb Performance of Ewes Inoculated with Chlamydia sp. Before and After Breeding, Am. J. Vet. Rest., 32: 809-811 (1971). Les brebis ayant reçu des inoculums des lots 1 et 2 contenaient respectivement 108'48 et 10o3,46 unités de point final léthales à 50 % pour l'embryon (DLE50). Aux brebis primipares, on a inoculé par voie intramusculaire 1 ml de suspension de chlamydias aux environs du 100 jour de la gestation. Les contenus des foies et des estomacs des foetus avortés et des agneaux morts moins de 24 h après la naissance ont été cultivés avec Campylobacter (vibrio) fetus et d'autres bactéries pathogènes. Des frottis d'impression colorés (Stamp, J.T., McEwen, A.D., Watt, JoA.A., et Nisbet, D.L., Enzootic Abortion in Ewes, I, Transmission of the Disease, Vet. Rec. 62: 251 (1950)) provenant de pla- centas, d'écoulements vaginaux et de la surface de la peau de foetus avortés ont été soumis à une recherche de la présence de chlamydiaso Les résultats sont résumés dans le tableau I. Aucune bactérie pathogène n'a été isolée de foetus avortés ou d'agneaux infirmes. Les brebis du lot 3 présentaient le pourcentage le plus élevé d'avortement (67 %), mais il n'y a pas de différence statistiquement significative entre deux quelconques des lots (P > 0,5). Les résultats de la présente étude indiquent que des passages successifs de la souche Chlamydia psittaci (Ark 2) dans l'embryon de poulet, comprenant des passages à haute température d'incubation, n'affec- taient pas le pouvoir pathogène de l'organisme pour les brebis gravides. Les résultats sont en accord avec les relations d'autres essais de modification de la virulence de chlamydia, et n'établissent pas le bien- fondé des rapports sur une immunisation réussie de brebis avec des chlamydias vivantes qui ont été soumises à des passages successifs dans des embryons de poulets. TABLEAU I Pouvoir pathogène de chlamydia psittaci (souche Ark 2) dans des brebis gravides. (1) nés vivants mais morts dans les 24 heures suivantes. les embryons ont été mis à incuber à 37 C saf i ndications contraires. * non dtmn. non détenuiné. Traiten de Infectivité Brebis avec Brebis avec agneaux Nombre de Brebis avec Lot N 'Nmbre de de l'inoculum agneaux infirmes (1) ou avor- placentas placentas brebis1inoulum (DLE50) vivants tement examinés infectés 1 12 110 passages 10o8,48 5 7 6 6 sur erbtr mn de poulet () 2 13 7 passages sur 10o8,46 9 4 11 8 embryon de pou- let à 37 C + 10 passages sur embryon de pou- let à 40 C 3 12 8 passages sur ND (**) 4 8 11 10 embryon de pou- let 4 14 aucun (témoin - 14 O 2 O normal) ru hWo %0 On a effectué un essai dans lequel le vaccin mis à multiplier sur culture cellulaire est comparé à un vaccin mis à multiplier sur embryon de poulet. Les deux vaccins contiennent des quantités égales d'organis- mes de chlamydias inactivés et sont semblables à tous égards excepté le mode de multiplication. Quatre vingt-trois brebis d'un an ont été choisies dans un troupeau commercial pour leurs faibles taux d'anticorps contre l'antigène des chlamydias. Les taux d'anticorps ont été déterminés par dosage au moyen d'un immunosorbant lié à une enzyme. Les brebis ont été marquées à l'oreille pour leur identification et mainte- nues dans un groupe unique jusqu'au moment de l'inocu- lation de provocation. Deux jours avant le début de la reproduction, brebis choisies au hasard ont été vaccinées: 25 d'entre elles ont reçu un vaccin provenant d'une cul- ture cellulaire et 25 autres un vaccin provenant d'un embryon de poulet. Les vaccins ont été administrés par voie sous-cutanée à des doses de lml. Les autres brebis n'ont pas été vaccinées. Des échantillons de sang ont été recueillies pour la sérologie au moment de la vaccination et aux 14è, 28è, 100è, 107è et 114è jours après la vaccination. Les concentrations en anticorps ont été déterminées par dosage au moyen d'un immunosorbant lié à une enzyme. Au 100è jour après la vaccination, les brebis ont été réparties en groupes séparés comme le montre le tableau 2. Chacune des brebis des groupes vaccinés et 25 brebis non vaccinées ont reçu une inoculation orale de 5ml d'une suspension de chlamydia psittaci vivantes, virulentes, contenant 10 8,3 DLE5Q/0,5 ml dans du tampon sucrose phosphate. TABLEAU 2 Comparaison de vaccins préparés à partir de chlamydias cultivés soit dans des embryons de poulets, soit dans des couches monocellulaires de cellules L. Nrmbre delnoculum de Group e de Traitement Lxcuum de brebis provocation 1 25 Vaccin provenant d'une Chlamydia psittaci culture cellulaire virulente 2 25 Vaccin provenant d'emni- bryons de poulets 3 25 aucun - (téroin infecté) 4 25 aucun aucun (témoin normal) Les foetus avortés et les membranes associées ont été examinés au microscope et par culture bactério- logique pour déterminer la cause de l'avortement. Dans tous les cas, on a déterminé qu'il était dû à chlamydia psittaci. Les efficacités relatives des deux vaccins peuvent être appréciées à partir des performances d'agne- lage des divers groupes (Tableau 3) et à partir des réactions des anticorps (exprimées en termes d'absorban- ce) présentées par les deux préparations (tableau 4) TABLEAU 3 Performances d'agnelage. * agneau infirme = mort dans les 48 heures ou moins, a, b, les valeurs entre traitements ayant des exposants différents diffèrent significativement (P > 0,03). Les deux vaccins apportaient une protection significative contre l'avortement et les agneaux infirmes, et donnaient lieu tous deux à une réponse des anticorps supérieure aux témoins de façon mesurable. Ces résultats montrent en outre, en ce qui concerne à la fois la pro- tection contre la mortalité des agneaux et la réponse des anticorps mesurée, que le vaccin obtenu à partir d'une culture cellulaire donne une meilleure réaction que le produit qui s'est développé sur embryon de poulet. Ceci ressort de façon particulièrement claire des absor- bances moyennes supérieures que présente le groupe 1 à partir du 28è jour après la vaccination jusqu'à la fin de l'étude au 114è jour. Nomre de Nobre de bre- Nombre de Groue Traiteent brebis bis avec avor- placentas infec- Groupe Traitement brebis "nouts-Nbr tement ou tés - Nombre grvds agneaux infirmes* examiné 1 Vaccin de 22 1a 0/12a culture cellulaire 2 Vaccin 25 a 0/13a d'embryon de poulet 3 "provoqué", 23 8b 6/12b non vacciné 4 Témoin nor- 8 0a 0/7a Imal TABLEAU 4 Absorbances moyennes dans le dosage par immunosorbant lié à une enzyme [X E.T. (écart type)] W- w Jour de la provocation rO CD Jours après la vaccination Groupe Traitement 0 14 28 100* 107 114 1 Vaccin de culture 0, 15 + 0,11 0,28 0,15 0,50 0,24 0,48 0,17 0,44 0,21 0,55 0,18 cellulaire 2 Vaccin d'embryon + + + + de poulet 0,16 - 0,14 0,31- 0,24 0, 43 - 0,19 0,34 - 0,17 0,33 - 0,14 0,40 - 0,13 3 Non vacciné, 0,14 0,09 0, 16 - 0,12 0,16 - 0,12 0,14 - 0,10 0,15 - 0,09 0,44 - 0,19 provoqué 4 Tàminnormal 0,17 0,14 0,17 0,10 0,20 0,11 0,14 0,09 0,14 0,10 0,13 0,10 REVENDICATIONS 1. Composition spécialement adaptée à la for- mulation d'un vaccin sous forme de dose unitaire pour l'immunisation contre l'avortement enzootique des brebis, caractérisé en ce qu'elle comprend une suspension aqueuse de corps élémentaires chlamydiaux inactivés qui se sont multipliés sur culture cellulaire. 2. Composition suivant la revendicaticl 1, caractérisée en ce que la concentration en corps élémen- taires chlamydiaux est dans l'intervalle de 106 à 109 DLE50 / 0,25 ml. 3. Composition suivant la revendication 1, caractérisée en ce qu'elle comprend une suspension aqueuse de corps Slémentaires chlamydiaux inactivés par le formol, qui se sont développés sur des fibroblas- tes. 4. Vaccin sous forme de dose unitaire pour l'immunisation contre l'avortement enzootique des brebis, caractérisé en ce qu'il comprend une quantité immunisante de corps élémentaires chlamydiaux qui se sont multipliés sur culture cellulaire et un support liquide administra- ble par voie parentérale pour ceux-ci. 5. Vaccin suivant la revendication 4, carac- térisé en ce que la concentration des corps élémentaires chlamydiaux est dans l'intervalle de 106 à 109 DLE50 / 0,25 ml. 6. Vaccin suivant la revendication 5, caracté- risé en ce qu'il comprend un mélange d'une suspension aqueuse de corps élémentaires chlamydiaux inactivés par le formol mis à reproduire sur culture cellulaire et un volume égal d'adjuvant huileux. 7. Vaccin suivant la revendication 6, carac- térisé en ce que cet adjuvant huileux comprend un mélan- ge d'huile minérale légère et de lanoline. 8. Procédé de préparation d'une composition de vaccin pour l'immunisation contre l'avortement enzoo- tique chez des brebis, caractérisé en ce qu'on fait reproduire des corps élémentaires chlamydiaux sur cultu- re de cellules, en ce qu'on inactive ces corps chlamy- diaux élémentaires et en ce qu'on combine ces corps élémentaires chlamydiaux inactivés avec un support ad- ministrable par voie parentérale pour ceux-ci. 9. Procédé suivant la revendication 8, carac- térisé en ce qu'on fait multiplier chlamydia sp. en culture cellulaire, en ce qu'on inactive cette chlamydia sp. multipliée par le formol pour donner une suspension aqueuse des corps élémentaires chlamydiaux inactivés à une concentration de 10 à 10 DLE50 / 0,25 ml, et en ce qu'on mélange cette suspension aqueuse à une quantité égale d'un support administrable par voie parentérale.