FR 2496689 A1 19820625 FR 8027143 A 19801219 Procédé et substrat de fermentation. L'invention a pour objet un procédé de fermenta- tion mettant en oeuvre un substrat de fermentation qui constitue un produit industriel nouveau. Par l'expression "procédé de fermentation", on désigne tout procédé destiné à la production, par fermenta- tion, de substances telles que les enzymes, des acides or- ganiques, des antibiotiques, des polysaccharides, des aci- des aminés ou des vitamines. Dans la mise en oeuvre de ces procédés, on a re- cours à des milieux de fermentation au sein desquels on introduit des substances nutritives indispensables apparte- nant au groupe des matières glucidiques, des sels minéraux, des oligo-éléments, des vitamines. et des matières protéi- ques apportant des acides aminés, des polypeptides et des protéines. Les matières protéiques utilisées jusqu'à ce jour sont généralement constituées par des tourteaux de soja, des levures et des extraits de levure, des eaux de trempage du mais ou "corn-steep", des farines de sang, des protéines de lait, des "pharmamédia", donnant généralement satisfaction. L'invention a toutefois pour but de fournir un procédé et un substrat du genre en question conduisant à des résultats améliorés notamment du point de vue du rende- ment des fermentations et permettant de valoriser, par une grande valeur ajoutée, une matière première dont les appli- cations connues ne mettent pas à profit tous les avantages. Or, la Société Demanderesse a eu le mérite de trouver que la protéine de pomme de terre obtenue par coagulation des eaux de végétation ou "eaux rouges" -- sous- produit bien connu des féculeries survenant lors de l'ex- traction de la fécule et de la pulpe des tubercules de pomme de terre -utilisée en tant que substance nutritive protéique, permettait d'augmenter considérablement le ren- dement de certaines fermentations et procurait un certain nombre d'autres avantages dont il va être question plus loin. Le mérite de la Société Demanderesse est d'autant plus grand que tout portait à croire que la mise en oeuvre de la protéine de pomme de terre en question serait inopé- rante notamment du fait que ladite protéine se présente sous une-forme complètement insolubilisée et dénaturée et bien qu'il était déjà connu d'utiliser directement, comme source de protéines dans les fermentations, des eaux rouges plus ou moins concentrées ou même partiellement déprotéini- sées ainsi que d'ailleurs des poudres contenants sous forme soluble, les mêmes protéines, ces poudres ayant par exemple été obtenues par atomisation à partir d'eaux rouges con- centrées. Le procédé de fermentation conforme à l'invention est donc caractérisé par le fait que l'on a recours, en tant que substance nutritive protéique introduite dans le milieu de fermentation, à une quantité efficace de protéine de pomme de terre obtenue par coagulation des eaux rouges. Le substrat-de fermentation conforme à l'inven- tion est caractérisé par le fait qu'il contient, en tant que substance protéique, une quantité efficace de protéine de pomme de terre obtenue par coagulation des eaux rouges. Enfin, l'invention vise, en tant qu'application nouvelle de la protéine de pomme de terre obtenue par coa- gulation des eaux rouges, l'utilisation de celle-ci dans la constitution du substrat de fermentation. L'invention présente encore un certain nombre d'autres caractéristiques qui s'utilisent de préférence en même temps et dont il sera plus explicitement question ci- après. Elle pourra être bien comprise à l'aide du com- plément de description qui suit ainsi que des exemples, l'un et les autres étant donnés surtout en rapport avec des modes de réalisation avantageux. Se proposant donc de réaliser des fermentations, on s'y prend comme suit ou de façon équivalente, mais en ayant recours, en tant que matière protéique indispensable au bon déroulement de la fermentation, à une quantité effi- cace de protéine de pomme de terre obtenue par coagulation des eaux rouges. La coagulation de la-protéine à partir des eaux rouges peut être réalisée par voie thermique, chimique ou thermochimique. Cette protéine contient plus de 70 % de protéine comptée en N x 6,25 sur matières sèches et, plus générale- ment, de 72 à 95 % de protéines. Par coagulation thermochimique, on obtient un produit donnant satisfaction et se présentant, après sécha- ge et broyage, sous la forme d'une poudre fine, de couleur grise à verdâtre, dont une composition type est la sui- vante - Eau.......................8 à 9 % - Protéines (N x 6,25)...... 75 à 82 % - Résidu à la calcination.... 1 à 3 % - Extrait aqueux............ 3 à 7 % - Extrait à l'éther sulfurique 4 à 6 % l'extrait à l'éther sulfurique étant constitué pour la plus grande partie par des acides gras. La proportion de cer- tains de ces acides gras peut être la suivante - Acide laurique.....i..... 1 % - Acide myristique......... 1 % - Acide palmitique.......... 27 % Acide stéarique............7 % - Acide oléique............. traces - Acide linoléique.......... 60 %. La répartition des différents acides aminés cons- titutifs de cette protéine, peut s'établir comme suit: % en poids de Acide l'azote aminé - Acide aspartique.12,6 - Acide gluatmique.10,2 - Alanine. 4,6 - Arginine.4,8 - Cystine.1,5 - Glycine. 4,8 - Histidine.1,8 a en poids de Acide l'azote aminé - Isoleucine.5,9 - Leucine. 10,0 - Lysine.7,5 Méthionine 2,1 - Phénylalanine 6,2 --Proline... - Sérine.5,3 Thréonine................. 5,7 - Tyrosine.5,2 - Valine.................... 7,0. Pour obtenir la susdite protéine, on peut procé- der comme suit. On amène les eaux rouges à un pH de l'ordre de 4,6 à 5,2 par addition d'un acide minéral ou organique, puis on les porte à une température suffisante, générale- ment comprise entre 90 et 1100C, pour provoquer la flocula- tion des protéines. Cette température est maintenue pendant une durée suffisante pour parfaire la floculation, c'est-à- dire pour désaérer le floculat et le débarrasser du liquide dans lequel il se trouve en suspension; en général, cette température est maintenue pendant environ 5 à 15 minutes. Le floculat obtenu est alors séparé par exemple sur une décanteuse centrifuge, puis séché sur un séchoir pneumati- que. Cette protéine représente seulement 25 à 30 % environ de la matière sèche contenue dans les "eaux rouges" et ne contient qu'une faible quantité des constituants bio- logiques essentiels initialement présents dans les eaux rouges, d'o un préjugé défavorable supplémentaire à l'en- contre de l'utilisation de cette protéine dans les procédés de fermentation. Pour mémoire, on rappelle que les eaux rouges surviennent lorsque, pour retirer de la pomme de terre la fécule et la pulpe, on désintégre, dans les féculeries, le tubercule de manière telle que ses cellules constitutives soient broyées, et que l'on sépare ensuite de la bouillie ou râpure ainsi obtenue la fécule et la pulpe. Les eaux de végétation résiduelles ou "eaux rouges" ainsi obtenues con- tiennent en solution la plus grande partie des constituants autres que la fécule et la pulpe et comportent donc, à côté des protéines présentes en quantité prépondérante, de très nombreux composés de très haute valeur biologique tels que vitamines, matières minérales, acides organiques, sucres et matières grasses. La protéine de pomme de terre, outre qu'elle per- met d'accroître de façon notable le rendement de certaines fermentations, entraîne pour ces dernières les avantages importants suivants: stérilisation du milieu de fermentation beaucoup plus facile, - viscosité du milieu de fermentation plus faible, d'o plus grande facilité d'agitation et d'aération, - purification facilitée des moûts de culture, - réduction de la pollution, qui vont être davantage détaillés ci-après. Ainsi, par exemple, des rendements supérieurs de % peuvent être obtenus pour la production d'a-amylase, par remplacement de la protéine de soja classiquement uti- lisée par la protéine de pomme de terre coagulée. La richesse en protéine vraie de la protéine utilisée selon l'invention étant approximativement le dou- ble de celle des tourteaux de soja, le même taux d'azote peut être obtenu par une mise en oeuvre deux fois moins élevée. Il s'ensuit une viscosité beaucoup plus faible du milieu ainsi qu'une plus grande facilité d'aération et d'agitation. La purification des moûts de culture est d'autre part plus facile étant donné l'absence de matières inertes comme, par exemple, les matières cellulosiques, d'o une diminution de la perte en produits nobles dans les gâteaux de filtration ou dans les boues de centrifugation. La protéine de pomme de terre ayant, après broya- ge, une granulométrie très fine, inférieure à 200 p et plus généralement inférieure à 50 p, elle se disperse très faci- lement dans l'eau, ce qui a pour effet de faciliter la sté- rilisation du milieu. Etant donné son procédé d'obtention par coagula- tion thermique puis séchage dans un équipement agro-alimen- taire, le produit a d'autre part un niveau de contamination bactériologique très faible, ce qui présente un grand inté- rêt dans les processus fermentaires. Les rendements de fermentation élevés obtenus grâce à l'utilisation de la protéine de pomme de terre en- traînent enfin une meilleure productivité du matériel et permettent des réductions importantes de la pollution par unité biologique produite. La mise en oeuvre de cette protéine de pomme de terre dans le procédé de fermentation conforme à l'inven- tion ou dans la constitution des substrats de fermentation, est réalisée par introduction de la protéine dans le milieu de fermentation sous agitation, toutes les autres caracté- ristiques du procédé étant équivalentes à celles des procé- dés déjà connus. Les exemples suivants se rapportent à des modes de réalisation avantageux. EXEMPLE 1 Production d'a-amylase bactérienne. Deux fermenteurs B1 et B2 de type BIOLAFITTE de 20 litres ont été garnis de milieux de fermentation conte- nant: B1 B2 Malto-dextrine 750 g 750 g NH4 NO3 60 g 60 g Protéine de pomme de terre 590 g 0 g Tourteaux de soja 0 g 1050 g La protéine de pomme de terre floculée par thermo- coagulation mise en oeuvre se présentait sous la forme d'une poudre très fine, 99 % en poids des particules ayant une dimension inférieure à 50 i; elle présentait une perte à la dessication de 6,2 % et titrait,84,9 % de protéines sur matière sèche (N x 6,25). Le résidu à la calcination de cette protéine était égal à 2,7 %, le pourcentage de lipides totaux était de 3,5 % et l'extrait aqueux était égal à 6,0 %, ces trois derniers pourcentages étant exprimés sur la matière commer- ciale telle quelle. Les tourteaux de soja utilisés dans le présent exemple titraient environ 48 % de protéines (N x 6,25). Les contenus des deux fermenteurs ont été ajustés à 15 litres; ils ont été ensemencés chacun à l'aide de 300 ml d'une préculture de 48 heures de Bacillus Subtilis cultivé sur un milieu contenant 2 % d'extraits de levure et % de malto-dextrine. Les conditions de la fermentation à l'intérieur des fermenteurs B1 et B2 étaient les suivantes Aération 1 volume d'air à la minute, soit 22 1/minute Agitation 700 tours/minute Température 350C. La production d'a-amylase a été suivie sur chacun des fermenteurs en mesurant l'activité par la méthode UBR (Unité Bactérienne RAPIDASE). Selon cette méthode, l'acti- vité dextrinifiante des amylases bactériennes est évaluée en mesurant le temps nécessaire à l'apparition d'un change- ment de couleur à l'iode du substrat, ce changement corres- pondant à la dextrinification de celui-ci. L'unité UBR est définie comme étant la quantité d'enzyme qui dextrinifie 1 mg d'amidon en 1 minute. Le tableau I ci-dessous présente les résultats obtenus. TABLEAU I Temps de Activité dans B 1 Activité dans B 2 fermentation (en UBR) (en UBR) 19 h 400 190 26 h 620 300 43 h 785 550 67 h 1300 700 Cette expérimentation a été reproduite cinq fois de suite. Les activités obtenues après un temps de 67 heu- res, au cours de ces cinq expérimentations, sont indiquées dans le tableau II. TABLEAU II Des résultats numériques réunis dans le tableau II découle une moyenne de 1250 UBR par utilisation de la protéine de pomme de terre et de-750 UBR sur soja; on en- registre donc une augmentation d'activité de 500 UBR, soit environ 66,7 %, par rapport à l'activité obtenue sur soja. Outre cette amélioration très sensible de l'acti- vité, l'utilisation de la protéine de pomme de terre pré- sente plusieurs autres avantages importants par rapport à l'utilisation de tourteaux de soja. La viscosité du milieu de fermentation est moins forte dans le fermenteur B 1, ce qui facilite l'aération. La floculation des corps bactériens ainsi que la filtration sont facilitées sur le milieu > base de protéine de pomme de terre. Ainsi, après chauffage à 500C, les deux milieux ont été filtrés, après ajustement à 15 litres, sur filtre Buchner de laboratoire. La vitesse de filtration, ramenée à 1 m2 de surface de filtration, est égale à envi- ron 250 litres par m et par heure pour le milieu à base de protéine de pomme de terre, alors qu'elle n'est que de 180 litres par m2 et par heure pour le milieu à base de soja. Le poids du gâteau humide était, d'autre part, trois fois plus important dans le cas du milieu à base de soja que dans le cas du milieu à base de protéine de pomme EActivité dans B i Activité dans B 2 Essai (en UBR) (en UBR) 1 1 300 700 2 1 150 750 3 1 220 800 4 1 380 730 1-210 770! 1 1 1 de terre. Le volume de filtrat récupéré était, quant à lui, de 14 litres pour le premier milieu et de 12 litres pour le second milieu. EXEMPLE 2 Production d'a-amylase thermo-résistante. Dans le but de produire une a-amylase thermo-résis- tante, une souche de Bacillus Licheniformis ATCC 6598 a été cultivée dans trois milieux différents contenus dans trois fermenteurs distincts et contenant du sirop de maltose com- me source de carbone ainsi que: - de la farine de soja, ou - de la protéine de pomme de terre thermocoagulée, ou - des solubles de mais et de la protéine de pomme de terre, comme source d'azote. La culture du microorganisme a été effectuée dans tous les cas à 43 C et l'activité de l'a-amylase produite a été déterminée selon la méthode SKB, telle que décrite dans "Cereal Chemistry", 16, 172 (1939). Premier fermenteur La souche de Bacillus Licheniformis a été culti- vée dans des erlenmeyers de 2 litres, placés sur secoueuse rotative fonctionnant à 220 tours/minute, ces erlenmeyers contenant 400 ml d'un milieu ayant la composition suivante: - Sirop de maltose........... 100 g/l - Farine de soja............. 30 g/1l - Na2HPO4 12 H20............ 5 g/l - KH2PO4........ 1 g/l - Huile de lard.............. 0,5 ml/l. Après 30 heures de préculture, les 400 ml ont été introduits dans un fermenteur de production de 20 litres, contenant un milieu de composition analogue à celui de préculture. Les conditions de culture ont été les suivantes: - Agitation: 1200 tours/minute - Aération: 0,8 volume/minute Température: 43 C - Temps: 120 heures - pH de départ égal à 6,7, puis stabilisation à pH 7. L'activité finale mesurée a été de: 4 140 SKB à 37 C 15 525 SKB à 85 C. Deuxième fermenteur Le même processus que précédemment a été appliqué, hormis le fait que les milieux de préculture et de produc- tion avaient la composition suivante: - Sirop de maltose................ 110 g/1 - Protéine de pomme de terre (identique à celle de l'exemple 1) 15 g/1 - Na2HPO4 12 H20................. 5 g/ KH2P014.I g/i - KH2 PO4..... ................... g/i..DTD: - Huile de lard................... 5 ml/1. Les conditions de culture étaient identiques à celles choisies pour le premier fermenteur. L'activité finale mesurée a été de: 000 SKB à 37 C 18 735 SKB à 85 C, soit une augmentation d'activité d'environ 20 %, obtenue par simple remplacement de la farine de soja par la pro- téine de pomme de terre. Troisième fermenteur Le processus opératoire ainsi que les conditions de culture ont été les mêmes que pour les deux fermenteurs précédents. Le milieu de culture avait ici la composition suivante: - Sirop de maltose... ........... 110 g/1 - Protéine de pomme-de terre (identique à celle de l'exemple 1) 15 g/1 - Eaux de trempage du mais (Corn steep liquide à 50 % de matière sèche)................. 5 g/1 -Na2HPO4......................... 5 g/..DTD: - Huile de lard................... 5 ml/1. L'activité finale mesurée a été de: 000 SKB à 37 C 19 000 SKB à 85 C, il soit une activité à peu près équivalente à celle obtenue dans le second fermenteur. EXEMPLE 3 Production d'une protéase bactérienne neutre de Bacillus Subtilis. Cet exemple établit une comparaison entre les rendements obtenus dans la production d'une protéase bac- térienne neutre de Bacillus Subtilis, d'une part, sur un milieu contenant de la protéine de pomme de terre et, d'au- tre part, sur un milieu contenant un isolat de soja. Deux fermenteurs de 20 litres, contenant environ litres de milieu identifié ci-après, ont ainsi été pré- parés; les compositions des deux milieux de production étaient les suivantes: Fermenteur N 1 Fermenteur N 2 Malto-dextrine de DE = 17 3 750 g 3 750 g H3P04 62,5 ml 62,5 ml Protéine de soja 525 g - (N x 6,25 = 92 %) Levure sèche 37,5 g 37,5 g (N x 6,25 = 45 %) Corn steep liquide 125 g 100 g (à 50 % de matières sèches) Protéine de pomme de terre thermo-- 615 g coagulée (79,2 % N x 6,25) (NH4)2 HPO4 125 g 125 g MgSO4 7 H20 12,5 g 12,5 g Zn S04 0,5 g 0,5 g. Deux précultures de 50 ml, soit environ 0,33 % d'ensemencement, établies sur des milieux de préculture de compositions respectivement identiques à celles des mi- lieux de production, ont servi à ensemencer les deux fer- menteurs. Pour la préparation de ces inoculumns et pour la réalisation du processus de production, lés mêmes paramè- tres de culture ont été utilisés, à savoir: - pH: 6,9 à 7,2 - Température: 37 C - Aération: 1 d'air/l de milieu/minute - Agitation: 180 t/minute. Des échantillons ont été prélevés sur les deux fermenteurs à partir de la 16ème heure afin de vérifier l'activité enzymatique, ceci jusqu'à obtention d'une acti- vité constante pendant deux à trois heures. La méthode de dosage de l'activité enzymatique repose sur le principe suivant lequel l'enzyme agissant sur la caséine libère des produits d'hydrolyse non précipi- tables par l'acide trichloroacétique, ce qui donne avec le réactif de FOLIN une coloration bleue, que l'on mesure au spectrophotomètre à 660 mp. Cette méthode constitue une mo- dification de la méthode dite d'ANSON (J. Gen. Physiol. 22, 79 (1938)), la caséine étant utilisée comme substrat à la place de l'hémoglobine. Les résultats obtenus sur les deux fermenteurs ont été les suivants: durée de - titre à Fermenteur N 1 Fermenteur N 2 fermentation 19 h 18 h l'arrêt 27 500 unités 31 000 unités d'activité/ml d'activité/ml (pouvoir caséi- (pouvoir caséi- nolytique) nolytique) L'activité enzymatique obtenue sur le milieu con- tenant de la protéine de pomme de terre est donc supérieure * d'environ 10 % à celle obtenue sur le milieu à base d'iso- lat de soja. EXEMPLE 4 Production de bacitracine. Le microorganisme utilisé pour la production de bacitracine est le Bacillus Licheniformis déposé à l'ATCC (American Type Culture Collection) sous le NO 10.716. Cette souche est conservée au réfrigérateur sous forme d'une suspension de spores en milieu tryptone sel, additionné de 15 % de glycérine, ou sur milieu gélosé tryp- ticase soja. Afin de produire la bacitracine dans un fer- menteur de 20 litres, une préculture du milieu suivant a été inoculée par une suspension de spores, dans un erlen- meyer de 500 ml contenant 60 ml d'un milieu liquide à: - 1 % peptone - 1 % extrait de-levure - 1 % malto-dextrine de DE égal à 21-23. Cet erlenmeyer a été placé sur secoueuse à 37 C pendant 18 à 24 heures. Une subculture a ensuite été effectuée dans le même bouillon peptoné qu'indiqué précédemment (erlenmeyer de 5 1 contenant 500 ml), dans des conditions identiques, pendant 6 heures. Deux fermenteurs de 20 litres, comportant des milieux dont la composition est indiquée ci-dessous, ont alors été ensemencés avec 200 ml de cette subculture. Fermenteur 1 Fermenteur 2 - 4 % de farine de soja - 2,5 % protéine de pomme de terre (identique à celle de l'exemple 1) - 0,5 % CaCO3 - 0,5 % CaCO3 - 0,5 % amidon - 0,5 % amidon Les conditions appliquées aux deux fermenteurs ont été rigoureusement identiques, c'est-à-dire: Température: 37 C - Aération: i volume/volume/minute - Agitation: 500 t/minute. Le temps de fermentation a été de 24 heures dans les deux cas. Une unité de bacitracine est définie par la quan- tité d'antibiotique qui, en dilution de 1: 1024 dans un bouillon de culture (connu sous l'appellation "beef infusia broth"), inhibe la croissance de Streptococcus hemolyticus du groupe A, dans les conditions définies dans le Bioche- mical Engineering (R. Steel, ed.) p. 185 - Mac Millan New York. Les résultats obtenus dans le cas de deux essais successifs ont été les suivants: Fermenteur 1 Fermenteur 2 Premier essai: 328 unités/ml 385 unités/ml Deuxième essai: 312 unités/ml 374 unités/ml. De la comparaison de ces chiffres, il apparaît que l'utilisation de protéine de pomme de terre améliore donc, là encore, très nettement les rendements de produc- tion. 1 4 REVENDICATIONS 1. Procédé de fermentation caractérisé par le fait que l'on a recours, en tant que substrance nutritive protéique introduite dans le milieu de fermentation, à une quantité efficace de protéine de pomme de terre obtenue par coagulation des eaux rouges. 2. Substrat de fermentation caractérisé par le fait qu'il contient, en tant que substrance nutritive pro- téique, de la protéine de pomme de terre obtenue par coagu- lation des eaux rouges. 3. Application de la protéine de pomme de terre obtenue par coagulation des eaux rouges, à la constitution d'un substrat de fermentation.