FR 2497576 A1 19820709 FR 8100103 A 19810106 24975 76 Procédé de reconnaissance des femelles en vitellogénèse chez les animaux ovipares par un test dz'immunoagglutination. L'invention a pour objet un test slmple, rapide et spécifique permettant de reconnaître le sexe des animaux ovipares, sans léser ceux-ci. La reconnaissance du sexe, notamment chez les poissons, est utile aux écologistes pour déterminer le potentiel reproducteur des populations. EUe peut permettre également d'optimiser la gestion des stocks de géniteurs destinés à la production piscicole. !h dehors de la pdriode de rep.oducttm, la recerehe des critères de sexage à partir de caractères morphologiques est une opération longue et hasardeuse. Par contre, il est possible d'envisager une technique de sexage fondée -sur la reconnaissance biochimique d'une protéine spécifique de l'un des sexes. Dés 1932, SASAKI proposait de reconnaltre le sexe des poulets en utilisant comme crit-re de sexage la prfaence d*une pro- téine plasmatique précurseur des réserves vitellines de l'oeuf. Plus récemnent, une protéine équivalente (la vitellog6nine) a été mise en évidence chez les saumons et chez la truite grice à des tecmhni- ques d'électrophorèse et d'iumunodiffusion. Bien que suffisamm_ ent sensibles pour autoriser la détection de la vitellogénine au cours du cycle annuel, la difficulté de leur mise en oeuvre sur le terrain ne permet pas de considérer eee tCR "pe de u.4,b%,e de rpa m6dft ea aux utilisateurs potentiels. Le procédé de sexage selon l'invention consiste à déceler la vitellogénine présente spécifiquement dans le sang des femelles à un certain moment du cycle de reproduction, c'est-à-dire en cours de vitellogénèse, par un test d'immunoagglutination effectué sur un échantillon de sérum ou de sang de l'animal; cet échantillon est mis en présence d'un support sensibilisé par des anticorps antivitellogénine, et la formation d'un précipité (test positif) indique la présence de vitellogénine. Le test d'inmunoagglutination est basé sur la réaction entre l'antigène (vitellogénine dans le milieu à tester) et son anticorps spécifique fixé sur un support ayant une surface spécifique relativement importante tel que des hématies tannées de mouton ou des particules de latex. Le support a pour but de rendre visible la réaction antigène-anticorps. Bien que celle-ci ait toujours lieu quel que soit le rapport des concentrations antigène-anticorps, elle n'est visible que dans une plage réduite des rapports de concentration dite "zone d'équivalence". En effet, la visualisation de la réaction correspond à une précipitation du complexe a;tigène-anticorps due à la formation d'une densité suffisante de ponts entre les aati- olrps par les atibua. ta figure en nmexe illustre ee phénomène. Sur cette figure on a représenté: - en a) les différents produits eu présence: l)le support (billes de latex), 2) l'anticorps, 3) l'antigène; s b) le àppo.t susibLh ta. c'est-à-dire rev#tu de l'anticorps; - en c) le cas o -'antig.ne est en excès: il y a saturation par l'antigène des sites de liaison (anticorps) sur le support; - ean d) le cas o l'anticor est eg axcès: il n'y a que très peu de sites de liaison anticorps-antigêne sur le support. Dans les deux cas c) et d) o l'un des réactifs est en excès, la densité des ponts formés est trop faible pour former un réseau précipitant, et la réaction apparait négative à l'observa- teur. - Par contre en el qui représente ce qui se passe dans la "zone d'équivalenee", le nombre de ponts formés entre les anticorps par les antigènes est suffisant pour provoquer une précipitation (agglutination) visible: la réaction apparatt positive. Par conséquent, pour une concentration donnée d'anti- corps sur le support une réaction apparemment négative peut résulter d'une absence d'antigène, mais aussi d'une concentration d'antigène en excès dans le milieu testé. Dans ce cas, pour trancher entre ces deux possibilités (absence ou excès d'antigène) on ajoute aux réactifs déjà en présence du sérum connu, donnant une réaction positive (c'est-à-dire contenant de l'antigène): si une précipitation se produit, il y avait absence d'antigène dans le milieu testé. Dans le cas contraire, l'antigène était en excès par rapport à la concentra- tion d'anticorps choisie. Pour mettre en oeuvre le test d'agglutination il faut disposer de l'anticorps spécifique de la vitellogénine avec lequel on sensibilisera un support adéquat. Les antisérums contenant les y-globulines antivitellogénine (anti-VgP) ont été préparés par in- jection à des lapins de vitellogénine pure (VgP) isolée à partir du sang de poissons (en particulier de salmonidés) oestrogénisés. Obtention de vitellogénine pure: Chez les salmonidés, l'oestrogénisation du mâle et de la femelle: quelle que soit l'époque du cycle reproducteur, induit une synthèse hépatique de vitellogénine et une augmentation de la concentration plasmatique de cette protéine (BAILEY, 1957, TAKASHIMA and al., 1972). Cette méthode a été appliquée à des truites arc-en- ciel femelles qui ont été traitées par de l'oestradiol-17P en injec- tion intra-péritonéale pendant quatre semaines, à raison d'une injec- tion de O,5 mg/kg tous les deux jours. A la fin du traitement, les animaux ont été sacrifiés et le sang est recueilli au niveau de l'artère caudale. La purification de la vitellogénine est inspirée de la technique de HARA et HIRAI (1978): après coagulation le sérum est séparé par centrifugation et mis à dialyser trois jours contre cent volumes d'eau distillée renouvelée chaque jour. Le précipité formé est séparé par centrifugation (3000 g, 40C, une heure). Le culot est redissous dans un tampon tris 0,05 M NaCl M, pH 9,2. L'insoluble est éliminé par centrifugation. Le surnageant est déposé sur une colonne de sépharose 6B (lm x 1,6 cm). La reconnaissance de la vitellogénine dans les fractions issues de la chromatographie a été faite par électrophorèse sur gel de polyacrylamide à 5 % (14 cm de long) selon la technique de ORNSTEIN et DAVIS (1964) modifiée en réajustant le pH du tampon de migration à 9,2 par NaOH N. Des sérums de femelles en vitellogénèse et de mâles sont utilisés comme référence. Les fractions les plus riches sont réunies et dialysées contre de l'eau distillée. Le précipité est repris dans le tampon tris 0,05M NaCl M pH 9,2, puis rechromato- graphié sur sépharose 6B et dialysé dans les mêmes conditions que précédemment. La concentration de la solution finale de vitellogénine (VgP) a été déterminée par la méthode de LOWRY et al. (1951). Préparation des y-globulines antivitellogénine: On injecte à des lapins, par voie sous-cutanée, 0,5 mg de VgP en présence d'adjuvant de Freund complet, et répète cette injection tous les quinze jours pendant 3 mois. Après cette période les animaux sont saignés, et on isole les yglobulines anti-VgP à partir du sérum par précipitation au sulfate d'armonium à 33 % de saturation; le précipité est centrifugé, dialysé contre de l'eau distillée et lyophilisé. Préparation du support sensibilisé: On a utilisé des billes de latex (Difco 0,81), mais on peut utiliser tout autre support d'adsorption classique. Les y-glo- bulines anti-VgP lyophilisées sont redissoutes dans un tampon véronal (0, 05M) CaCl2 (5mM). La fixation de l'anticorps sur les billes de latex s'effectue selon la technique de MIcCARTHY (1975) dans lequel le tampon glycine-NaCl a été remplacé par un tampon véronal pH 8,2. Les essais ont été faits en sensibilisant les billes par des solutions contenant les y-globulines anti.-VgP à des concentrations 4 et 9 fois supérieures à la concentration des y-globulines dans le sérum. Test d'agglutination: Le test d'agglutination s'effectue en mettant en pré- sence, sur une lame de verre dégraissée, une goutte du milieu à tester, une goutte de tampon véronal pH 8,2 et une goutte de la suspension de billes de latex sensibilisée. Le mélange est homogé- néisé et agité lentement. La réaction positive, caractérisée par l'apparition d'aggrégats de billes, se développe en 2 à 3 minutes. Quand la réaction est négative, on ajoute du sérum positif témoin et attend encore 1 à 2 minutes, pour déterminer si on est en présence d'un excès (réponse négative) ou d'une absence de vitellogénine (réponse positive). Onn'aobservé aucune différence entre les réactions du sérum et du plasma d'un même animal. On peut également utiliser le sang entier pour effectuer le test. Cependant, le sang provoquant des coagulations qui peuvent être confondues avec l'agglutination spécifique, on élimine cette difficulté en ajoutant de l'héparine (300 Ul/ml) au tampon de réaction. Pour une même réponse, il faut utiliser une quantité de sang de 1 fois et demie à 2 fois plus grande que celle des sérums correspondants. Validation du test: La validation des réponses au test d'agglutination a été recherchée d'une part pa. irmunodiffusion sur gel d'agarose à 0,8 % en tampon véronal 0,05M, pH 8,3, et d'autre part en effectuant le test sur le plasma d'animaux préalablement sexés par observation des gonades. Les essais ont portés sur deux espèces: - Les truites fario (Salmo trutta) : des mâles et femelles ont été abattus mensuellement au cours de leur premier cycle reproducteur. Les femelles ont été caractérisées soit à partir des rapports gonado- somatique (RGS) soit à partir du stade précis et du diamètre des ovocytes au cours des phases finales du cycle, selon les critères dé- finis par JALABERT (1978): fin de vitellogénèse (FV), maturante, ovulée. Du plasma de chaque animal a été obtenu après prélèvement de sang avant abattage. Ce plasma est conservé congelé jusqu'au test. - Les saumons atlantique: proviennent de captures par des pécheurs sportifs pendant toute la période de pêche légale. Le sang total a été congelé sur le terrain, le sérum n'étant séparé par centri- fugation qu'après son arrivée au laboratoire. Les animaux ont été caractérisés par leur rapport gonado-somatique, et par le diamètre moyen des ovocytes calculé à partir de 48 ovocytes pris sur six lamelles ovigères différentes. Sensibilité du test: Sur le tableau I ci-après, on a porté, pour des concen- trations en vitellogénine variant de 120 à 0,05 mg/ml, les réponses obtenues d'une part avec le test d'immunoagutination selon l'inven- tion en utilisant deux concentrations de y-globulines pour sensibiliser les billes de latex, et d'autre part avec le test d'immunodiffusion. Le tableau montre qu'aux deux concentrations d'anti-VgP de sensibilisation (9 fois et 4 fois plus grande que celle de l'anti- sérum entier) correspondent deux gammes différentes de concentration en vitellogénine conduisant à des réponses positives. La sensibilité de réponse pour des milieux à faible concentration en vitellogénine est augmentée en diminuant la quantité d'anticorps sensibilisants. Des deux cotés de la plage de réponse positive, une réaction négative peut être due soit à un excès, soit à un manque de vitellogénine; d'o la nécessité dans le cas d'une réaction négative, de l'addition au milieu réactionnel d'un sérum connu positif, pour trancher entre les deux hypothèses. Le test d'agglutination selon l'invention a été appliqué à la détection de la vitellogénine au cours du cycle reproducteur des deux espèces de poisson indiquées ci-dessus. Truite fario: Les résultats obtenus sont portés dans le tableau Il ciaprès. A toute époque du cycle aucune réaction positive n'a été mise en évidence à partir des sérums mâles. Par contre, chez la femelle, l'apparition de vitellogé- nine peut être détectée chez quelques animaux à partir du 12 avril et devient générale le 26 mai, alors que la phase de croissance rapide de la gonade et des ovocytes n'a pas débuté. Durant une période d'un ou deux mois post-ovulation, aucune réponse positive n'a été obtenue. Sur un échantillon plus important le test d'immuno- diffusion a permis de confirmer que toutes les femelles possèdent de la vitellogénine circulante aux environs de la mi-mai. Saumon atlantique: Les captures se sont échelonnées de fin mars à fin juin, époque à laquelle aucun caractère sexuel secondaire ne permet de différencier les sexes. La vitellogénine est détectée chez toutes les femelles par immunoagglutination, alors que les RGS sont faibles et que les diamètres des ovocytes ne varient pas sensiblement durant la saison de pêche. Aucun des mâles n'a répondu positivement. Ainsi, l'étude réalisée sur un cycle complet chez la truite fario montre que la sensibilité du test d'immunoagglutination permet une détection qualitative de la vitellogénine dès le mois d'avril et constitue un procédé de sexage suffisamment sûr dès le mois de mai. L'utilisation du procédé selon l'invention permet donc la constitution des stocks de géniteurs femelles en pisciculture plusieurs mois avant l'apparition des caractères morphologiques utilisés généralement pour la reconnaissance des sexes. Pour le saumon atlantique, des études antérieures signa- lent la présence de vitellogénine chez les femelles à diffétents stades a la remontée, et sur frayères. L'étude réaliséeavec le test d'agglutination donne les mêmes résultats: toutes les femelles pêchées entre début mars et mi-juin répondent positivement; la vitellogénèse serait donc engagée au moment de l'entrée en eau douce. La mise en oeuvre du procédé selon l'invention au niveau des pièges de capture est donc tout indiquéepour déterminer le sexe ratio et le potentiel reproducteur d'une population de saumons. Les concentrations d'anticorps sensibilisants ont permis d'obtenir des limites de détection, compatibles avec les taux de vitellogénine circulante chez la plupart des animaux entrant en vi- tellogénèse. Une sensibilité plus importante du test pourrait être obtenue en diminuant la quantité d'anticorps fixéssur les billes. Ces conditions devraient permettre d'étendre les plages de réponses positives vers les faibles concentrations en vitellogénine, et d'accroltre les pourcentages de sexage en début de cycle. Il faut cependant préciser que plus le test est sensible plus les temps de réponse augmentent et moins nette est la lecture. Ainsi la définition des rapports optimaux, anticorps sensibilisants/support doit être déterminé dans chaque cas particulier. TABLEAU I Gcnmie de réponse des tests d'ixmnunoagglutination et d'immunodiffusion contre de la vitellogénine. Vitel logénine en mg/nil Frests ", 120 60 30 15 8 4 2 1 0,5 0,25 0,1 0,05 lmmunoa gglut inot ion X 9t - - + + + + x 4 - - (+) + + + + + (+) - - co immunodif fus ion sérum entier + + + + + + + + (+) + réaction positive - réaction négative (+) limite de détection X 9, X 4: solution de billes de latex sensibilisée avec une concentration de y-globuline 9 et 4 fois plus importante que celle de l'antisérum entier. NO cr% TABLEAU II Présence de la vitellogénine au cours du cycle annuel de la truite fario femelle Concentration de l'anticorps (AVgP) i......... ' X9 X4 Nombre Date RGS 0 W X 4________ Nombre{ Date RGS 0 W. sérum dilué sérum sérum addition de sérum d'animaux (X - t) ( +) Stade au 1/5 entier entier positif de femeile 02.11.1976 14,54 + 1,34 4,27 + 0,12 F.V. + (1) + (4) 16.11.1976 15,04 + 2,02 4,40 + 0,14 F.V. + (5) 6 30.11.1976 17,16 + 2,26 4,90 + 0,15 - F.V. + (6) 13.12.1976 16,36 + 3,19 4,43 + 0,11 maturante + (5) 13.01.1977 1,61 + 0, 23 18.03.1977 0,85 + 0,15 12.04.1977 0,85 _ +0,15 12.05.1977 0 56 + 0,40 26.05.1977 1,02 + 0,28 17.06.1977 1,17 + 0,26 1,25 +_ 0, 1 + (5) 20.07.1977 2,56 +_ 0,45 2,06 + 0,33 + (5) 18.08.1977 3,81 + 1,29 2,64 + 0,4 + (2) + (3) 14.09.1977 10,46 + 2,45 3,89 + 0,4 + (3) + (2) 4 13.10.1977 14,21 + 2,70 4,43 + 0,1 F.V. + (3) - (1) + (1) 4 25.10.1977 17,39 + 3,40 4,45 + 0,2 F.V. + (4) - Les chiffres entre parenthèsescorrespondent au nombre de réponses - RGS: rapport gonado-somatique - 0 W: diamètre des ovocytes - F.V.: fin de la vitellogénèse os -'J un Cr% R E V E N D I C A T I 0 N S 1. Procédé de reconnaissance des femelles en vitellogénèse chez les animaux ovipares Consistant à déceler la vitellogénine présente spécifiquement dans le sang de celles-ci, caractérisé en ce qu'on effectue un test d'immunoagglutination sur un échantillon de sang ou de sérum de l'animal, que l'on met en présence d'un support sensibilisé par des gamn:a-globulines antivitellogénines, la formation d'un précipité dans l'échantillon testé indiquant la présence de vitellogénine. 2. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que, lorsque le test est négatif, l'addition ultérieure à l'échantillon testé de sérum connu contenant de la vitellogénine permet de trancher entre une absence de vitellogénine (formation d'un précipité) et un excès de vitellogénine (absence de précipité) dans l'échantillon initial. 3. Procédé selon l'une des revendications 1 et 2, caractérisé en ce que, lorsqu'on effectue le test sur un échantillon de sang, on ajoute de l'héparine au tampon de réaction. 4. Procédé selon l'une des revendications i à 3, caractérisé en ce que le support est sensibilisé, par un procédé connu en soi, à l'aide de solutions de gamma-globulines anti-vitellogénine de concentrations variables, la sensibilité du test étant d'autant plus grande pour les milieux pauvres en vitellogénine que cette concen- tration est plus faible. 5. Procédé selon la revendication 4, caractérisé en ce que la concentration des anticorps sensibilisants est de 4 à 9 fois plus grande que celle des anticorps dans l'antisérum entier. ii6. Procédé selon!'une des revendications 3 à 5, caractérisé en ce qu'on détecte les femelles en vitellogénèse chez les poissons et en particulier chez les salmonidés. 7. Procédé selon l'une des revendications I à 6, caractérisé en ce que les gamma-globulines utilisées pour la sensibilisation du support sont obtenues de façon classique à partir d'un antisérum 1 1 de lapins ayant reçu des injections de vitellogénine. 8. Procédé selon l'une des revendications I à 7, caractérisé en ce que la vitellogénine injectée aux lapins est extraite du sang de salmonidés oestrogénisés, et purifiée par chromatographie.