FR 2489326 A1 19820305 FR 8107611 A 19810415 La présente invention concerne un composé ayant une activité vitaminoïde D qui est un dérivé de la vita- mine D3. La vitamine D3 est un agent bien connu interve- nant dans l'homéostasie du calcium et du phosphore. Chez l'homme et l'animal dans l'état normal, ce composé sti- mule, comme on le sait,le transport intestinal du cal- cium et la mobilisation du calcium osseux et est effi- cace pour prévenir le rachitisme. On sait aussi que pour être efficace, la. vitami- ne D3 doit être convertie in vivo en ses formes hydro- xylées. Par exemple, la vitamine est d'abord hydroxy- lée dans le foie en 25-hydroxyvitamine D3 et est hydro- xylée à nouveau dans les reins en la,25-dihydroxyvita-. mine D3,qui est généralement considérée comme étant la forme hormonale ou physiologiquement active de la vita- mine à l'origine des activités dites vitaminoide D comme l'augmentation de l'absorption intestinale du calcium et du phosphate, la mobilisation des minéraux osseux et la rétention du calcium par les reins, ou en 24,25-dihydro- xyvitamine D3. La Demanderesse a préparé un nouveau dérivé de la vitamine D3 faisant l'objet de l'invention qui manifeste une excellente activité vitaminoide D,comme le montrent son aptitude à stimuler le transport du calcium intesti- nal, à mobiliser le calcium osseux et a. augmenter letaux de phosphore inorganique dans le sérum, de même que son activité antirachitique mesurée par épreuve linéaire chez le rat. Ce composé peut donc remplacer la vitamine D pour le traitement de différentes affections métaboli- ques osseuses. Ce dérivé a été identifié comme étant le la- hydroxy-2p-fluorocholéca.lciférol (la-0H-2.PF-cholécalci- férol, la-OH-2PF-vitamine D3 ou la-OH-2PF-D3). Le composé de l'invention est synthétisé de la manière suivante (toutes les températures sont don- nées en OC): la, R = THP lb, R = H 4.- t.. - , 1 . _. C H0O F.. La réaction du composé la (éther 1,2a-époxy- cholest-5-èn- 3P-yl-tétrahydropyrannylique) avec le p- toluènesulfonate de pyridinium (0,1 équivalent molaire) dans un mélange 1:1 de chlorure de méthylène et de mé- thanol à 55 pendant 5 heures donne l'époxyalcool lb (ren- dément de 75%) fondant à 105-107 , dont le spectre de résonance magnétique nucléaire comprend les signaux 6 suivants: 0,72 (3H, s, 18-CH3) , 1,15 (3H, s, 19-CH3), 3,08 et 3,20 (2H, une paire de doublets, J=4 Hz, 1- et 2-H), 3,90 (1H, m, 3-H), 5,5 (1H, m, 6-H), et le spec- tre de masse comprend des signaux pour m/e à 1+00 (M+) 382, 342, 287, 269) . [Le composé de départ la s'obtient aisément comme décrit dans Chem. Pharm. Bull., 23, 3272 (1975)]. Les tentatives d'introduction du fluor en C-2 du composé lb au moyen de fluorure de tétra-éthylammo- nium ou du système KF/dicyclohexyl-18-couronne-6 se sont révélées infructueuses.Toutefois, le chauffage du composé lb avec de l'hydrogénodifluorure de potassium (KF conte- nant KHF2, de la Société Merck) dans l'éthylèneglycol à pendant 90 minutes donne la fluorhydrine 2 (rende- ment de 48%)fondant à 167-170 ,dont le spectre de réso- nance magnétique nucléaire comprend des signaux 6 à 0,68 (3H, s, 18-CH3), 1,13 (3H, s, 19-CH3), 3,7 (1H, m, 3-H), 3,96 (1H, m, 1-H), 4,78 (1H, td, JHF=50 Hz, JHH = 3 Hz, 2-H), 5,6 (1H, m, 6-H) et dont le spectre de masse comprend des signaux-pour m/e = 420 (M +), 405, 402, 400, 382, 307, 289, 265, 247). On peut se référer à ce propos à P.A. Grieco, T. Sugahara, Y. Yokoyama et E. Williams, J. Org. Chem., 44, 2189 (1979). L'orientation P de l'atome de fluor en C-2 est à prévoir d'après l'ouvertu- re diaxiale de l'époxyde et est mise en évidence par la constante de couplage (3 Hz) du triplet de doublets du composé 2 qui est compatible avec des angles dièdres O (H2-H1)=O (H2-H3) de 600. La transformation du compo- sé 2 en 2p-fluoro-la-hydroxyvitamine D3 (composé 3) est effectuée suivant les techniques habituelles en chimie de la vitamine D. Par conséquent, l'acétylation du com- posé 2 par l'anhydride acétique dans la pyridine à 90 pendant 4 heures donne le diacétate conduisant,par bro- mation (chauffage avec du N-bromosuccinimide dans du té- trachlorure de carbone au reflux pendant 78 minutes), puis par déshydrobromation (chauffage avec de las-colli- dine dans du xylène au reflux pendant 15 minutes), à un mélange du 5,7diène et du 4,6-diène. Par réaction du produit brut en milieu acide (acide p-tolUènesulfonique dans l'acétone, pendant une nuit), on convertit le 4,6- diène en un composé beaucoup moins polaire permettant un isolement efficace par chromatographie du 5,7-diène re- cherché (rendement de 30%,sur base du composé 2? Xmax 2489326 ':- 262, 271, 281,5 et 293 nm). On irradie ce composé au moyen d'une lampe à vapeur de mercure sous moyenne pres- sion (Hanovia 654iA 36; 200W) dans un mélange (2:1) de benzène et d'éthanol à 0 O pendant 150 secondes, puis on le chauffe au reflux pendant 1 heure pour obtenir,après purification par chromatographie en couche mince sur gel de silice avec deux développements au moyen d'un mé- lange (14:l) de benzène et d'acétate d'éthyle,le diacé- tate de vitamine D, avec un rendement de 36%. Par sa- ponification ultérieure avec de l'hydroxyde de potas- sium à 2,5% dans un mélange (1:1) de méthanol et de té- trahydrofuranne à 15 pendant une nuit,puis purification par chromatographie liquide sous haute pression ZZorbax SiL, 15 cm x 4,1 mm, mélange chlorure de méthylène-hexa- 2- ne (i-:1), 90 kg/cmj, on obtient la 2 p-fluoro-la-hydro- xyvitamine D3 (composé 3) min 226, max 265 nm, le 3 e min >max 25nl spectre de masse comprend des signaux pour m/e = 418 (M+), 403, '00, 398, 3803 365, 305, 287, 150, 135, et le spectre de résonance magnétique comprend des signaux 6 à 0,49 (3H, s, 18-CH3), 0,82 (6H, d, J=7 Hz, 26,27- CH3), 0,87 (3H, d, J=6 Hz, 21-CH3), 43 et 14X5 (3H, une paire de multiplets, 1-, 2- et 3-H), 5,14 et 5,54 (2H, une paire de multiplets, 19H), 599 (1H, d, J=12 Hz, 7-H), 6,36 (1HS d, J=12 Hz, 6-H). Le spectre de masse du composé. ne révèle qu'un pic ionique faible dû à la rupture de la liaison C-7,8 (m/e = 170) tandis qu'au contraire, le pic pour m/e = 380 issu de M-H20-HF est prépondérant. Il convient de noter que l'atome de fluor a l'effet remarquable de faire baisser la polarité et que le temps de rétention du composé a à la chromatogra- phie liquide sous haute pression (voir supra.) est de 4i,1 minutes, tandis que les temps de rétention de la la-hydroxyvitamine D3 et de la vitamine D3 sont de 11,0 minutes et 1,5 minute, respectivement. Si on le désire, on peut saponifier le 5,7- diène acétylé obtenu par acétylation du composé 2 comsa dejà décrit en appliquant des teehniouas a ve uc t' d'hydroxyde de potassium dans le méthanol à 20 C pen- dant 15 heures) pour convertir le radical acétoxy de la position 3 en un radical hydroxyle. En outre, si la chose est désirée, le composé prévitaminique peut être recueilli,avant ou après sapo- nification du ou des radicaux acétyle,par évaporation du solvant, puis chromatographie sur du gel de silice, de la. manière habituelle,la conversion en vitamine étant effectuée ensuite. Le composé prévitaminique répond à la formule suivante: ORi F RO Il convient de noter que le composé 2 peut être acylé autrement que par l'acide acétique. En règle générale, le radical acyle est un radical acy- le aliphatique de 1 à environ 5 atomes de carbone ou le radical benzoyle. Si la saponification est omise ou mo- difiée, l'un des radicaux hydroxyle en position 1 et 3 ou les deux sont acylés dans le produit final. Le lx-hydroxy-2p-fluorocholécalciférol peut être obtenu sous forme cristalline par recristallisation dans un solvant ou système solvant approprié, par exem- ple l'éthanol. L'efficacité biologique du la-OH-2PF-D3 est confirmée par des épreuves appropriées in vivo sur le rat. On donne à des rats mâles sevrés (Société Holtzman Co., Madison, Wisconsin) à volonté de l'eau et une alimentation pauvre en calcium et normale en phos- phore,mais déficiente en vitamine D,comme décrit par Suda. et al. (J. Nutrition 100, 1049, 1970) ou bien une alimentation riche en calcium et pauvre en phosphore, mais déficiente en vitamine D (alimentation provoquant le rachitisme) comme décrit par Tanaka et DeLuca (PNAS 71 1040, 1974) pendant trois semaines. Mesure du phosphore inorganique dans le sérum On répartit les rats qui ont reçu pendant trois semaines l'alimentation provoquant le rachitisme en six groupes de 5 ou 6 animaux auxquels on administre respectivement 325 pmoles de la-OH-2pF-D3 ou de l.aOHD3 en solution dans 0,05 ml d'éthanol à 95%, l'administra- tion étant effectuée par voie intrajugulaire 24 ou 96 heures avant de sacrifier les animaux. On administre le véhicule éthanolique seul de la même manière aux rats des groupes témoins. On sacrifie les animaux par décapitation aux moments indiqués après administration de l'agent ac- tif et on reueillé le sang. On centrifuge le sang immédiatement pour obte- nir le sérum. On ajoute au sérum de l'acide trichloro- acétique à 10% et on soumet le liquide surnageant col- lecté par centrifugation a l'analyse comme décrit par P.S, Chen et al. (Anal. Chem. 28, 1756, 1956). Les ré- sultats sont rassemblés au tableau I. TABLEAU I Augmentation de la concentration en phosphore inorgani- que du sérum par une dose unique de 325 pmoles de la-OH-2pF-D3 ou de laOH-D3 Composé admi- Concentration en phosphore inorganique nistré du sérum 24 heures après 96 heures après l' administration l'administration Ethanol 1,6+0,+a) 1 4+0 d) lx-OH-2pF-D3 3,3+0,4 b) 2,4+O,3 e) li-OH-D3 2, 6+0,4 c) 1,9+ 0,2 f) + Ecart type par rapport à la moyenne Significations des différences b) par rapport à a) p On répartit des rats ayant reçu pendant 3 se- maines l'alimentation pauvre en calcium et déficiente en vitamine D en quatre groupes de 5 ou 6 animaux aux- quels on administre respectivement 32,5 pmoles, 68 pmo- les ou 325 pmoles de la-OH-2pF-D3 en solution dans 0,05 ml d'éthanol à 95% par voie intrajugulaire 24 heures avant de sacrifier les animaux. On administre le véhi- cule éthanolique seul de la même façon aux rats du grou- pe témoin. On sacrifie les animaux par décapitation, puis on prélève immédiatement le duodénum pour mesurer l'activité de transport du calcium intestinal de la ma- nière décrite par Martin et DeLuca (Am. J. Physiol. 216, 1351, 1969). Les résultats sont rassemblés au tableau II dans la deuxième colonne. TABLEAU II Augmentation de la concentration en calcium du sérum et de l'activité de transport du calcium intestinal sous l'effet d'une dose unique de la-OH2pF-D3 ou de la-OH-D3 24 heures avant que- les animaux soient sacrifiés Composé administré Concentration en Transport intes- Nature Quantit calcium du sé- tinal du calcium Nature Quantité u m/lOm)+ e rum (mg/100 ml) (pmoles) Ethanol 1+,8+0,1+ a) 5,0 3) 32,5 5,6+0,3 b) 7, 2+ 1,0b) laOH-2pF- 68,0 6,5+0,3 b) 9,2+2,2b) D35b) b) 325 6,2+0,3 b) 8,8+ 1,8b) TABLEAU II (suite) Composé administré Concentration en Transport intes- Nature Quantité calcium du sé- tinal du calcium (pmoles) rum (mg/lO0 ml). 32,5 5,5+0,1 b) l"OH-D3 68,0 6,0+0,4 b) 325 6,2+0,1 b) -_ 4 Ecart type par rapport à la moyenne a+ 45 Ca du sérum/45 Ca. des muqueuses Significations b) par rapport à a) b) par rapport à a) des différences p rats ayant reçu pendant 3 semaines l'a.limenta.tion provo- quant le rachitisme. On répartit les rats en cinq grou- pes de 5 ou 6 animaux auxquels on administre respective- ment 6,5 pmoles par jour ou 65 pmoles par jour,soit de la-OH-2pF-D3,soit de la-OH-D3, en solution dans 0,05 ml d'un mélange de 5% d'éthanol et de 95% de propylèneglycol, l'administration étant effectuée quotidiennement par voie sous-cutanée pendant sept jours. Q sacrifie les animaux par décapi- tation 24 heures après la dernière administration d'agent actif et on recueille le sang pour la mesure de la. corr centration en phosphore inorganique du sérum. On prélè- ve le duodénum pour la mesure de l'activité du transport du calcium intestinal, comme décrit précédemment. Les résultats sont rassemblés à la première colonne du ta- blean III. L'augmentation de la concentration en phos- phore du sérum sous l'effet d'une dose quotidienne du composé est précisée à la seconde colonne du tableau III. Activité antirachitique On répartit des rats ayant reçu l'alimentation provoquant le rachitisme en cinq groupes de 5 ou 6 ani- maux auxquels on administre 6,5 pmo]les par jour ou 65 pmoles par jour, soit de lo-0H-2pF-D3, soit de 1.--0i1--D3 en solution dans 0,05 ml d'un mélange de 5% d'étha.n ett de 95 de propylëneglycol, l'administration étant pour- suivie pendant 7 jours comme ci-dessus. On administre le véhicule seul de la même façon aux rats du groupe témoin. Après 1 semaine, on sacrifie les rats et on prélève le duodénum pour la mesure de l'activité de transport du calcium intestinal, tandis qu'on recueille le sang pour doser le phosphore inorganique du sérum comme déjà indiqué, les ré- sultats étant donnésrespectivement à la première colonne et à la. seconde du tableau III. On prélève le radius et le cubitus pour l'évaluation suivant l'épreuve linéaire du rat (pharmacopée des Etats-Unis d'Amérique, 15e édition, Mack Publishing Co., Easton, Pa. 1955, page 889). Les résultats sont rassemblés à la troisième colonne du ta- bleau III. TABLEAU III Transport du calcium intestinal et augmentation de la. concentration en phosphore inor- ganique du sérum sous l'effet d'une dose quotidienne de la-OH-2pF-D3 ou de la-OH-D3 et activité antirachitique de cette même dose Composé administré Transport intestinal Phosphore inorgani- Activité antirachi- Nature Quantité du calcium +C que du sérum tique (unités) (pmoles (mg/l00 ml) par jour) Ethanol 2,7 +0, a) 2,6+0,5 f) O0 6, 5 6,1+1,2b) 3,4+1",0g) 1 la-OH-2pF-D365 13,9 _3,4c) 5,1+'0,7)5 +_0 >5 6,5 1+,8+0,9d) 3,0+0 g) 1 li-OH-D3 65 9,2+0,8e),5+0 7i) 4--5 * Ecart type par rapport à la. moyenne ++ 45 Ca du sérum/45 Ca des muqueuses. Significations des différences d) par rapport à a) p g) par rapport à f) N.S. h), i) par rapport à f) p h) par rapport à i) N.S. O O ro Co %O ru Ch ll / Mobilisation du calcium osseux On répartit des rats ayant reçu pendant 3 se- maines l'alimentation pauvre en calcium et déficiente en vitamine D de Suda et al. en sept groupes de 5 ou 6 animaux auxquels on administre respectivement 32,5 pmo- les, 68,0 pmoles ou 325 pmoles,soit de la-OH-20FD3, soit de la-OH-D3, en solution dans 0,05 ml d'éthanol à 95%, l'administration étant effectuée par voie intrajugulaire 24 heures avant que les animaux soient sacrifiés. On ad- ministre le véhicule éthanolique de même aux rats du groupe témoin. On sacrifie les rats par décapitation et et on recueille le sang. On centrifuge le sang pour ob- tenir le sérum. On mélange 0,1 ml de sérum avec 1,9 ml d'une solution de chlorure de lanthane à 0,1% et on me- sure la concentration en calcium au spectrophotomètre en absorption atomique (appareil Perkin-Elmer modèle 214). Du fait que l'apport de calcium par l'alimenta- tion est négligeablement faible, une augmentation de la concentration en calcium du sérum sous l'effet del la-OH- 2 F-D3 est présumée traduire l'aptitude de ce composé à mobiliser le calcium osseux. Les résultats sont rassem- blés à la première colonne du tableau II. Il ressort de manière évidente des résultats ci-dessus que la la-OH-2 PF-D3 a une activité vitamninoï- de D marquée et se révèle aussi efficace sous ce rapport que la 1 -OH-D3 (voir brevet des Etats-Unis d'Amérique nO 3.741.996). La l-hydroxy-2P-fluorovitamine D3 peut être ad- ministrée aisément sous forme de solution stérile à usa- ge parentéral par injection intraveineuse,ou bien par voie alimentaire sous la forme de doses à usage oral ou de suppositoires. Les doses d'environ 0,1 /ug à environ 2,5 /ug par jour s'indiquent comme efficaces pour établir le bilan calcique physiologique caractéristique de l'ac- tivité vitaminofde D, la dose d'entretien étant d'environ 0,1 à 0,5 /ug. Les formes dosées du composé peuvent être pré- parées par mélange de celui-ci avec un excipient pharma- ceutiquement acceptable non toxique de manière classique. Ces excipients peuvent être des solides ou des liquides comme l'amidon de mais, le lactose, la saccharose, l'huile d'arachide, l'huile d'olive, l'huile de sésame ou l'eau. Lorsque l'excipient est solide, les formes dosées des composés de l'invention peuvent être, par exemple,des comprimés,capsules, poudres, pastilles ou ta- blettes. Lorsque l'excipient est liquide, des capsules de gélatine molle, des sirops, des suspensions liquides et des émulsions ou solutions sont des formes dosées ty- piques. Les formes dosées peuvent aussi contenir des adjuvants, comme des agents de conservation, des stabi- lisants, des agents mouillants ou émulsionnants et des agents favorisant la dissolution. Elles peuvent en ou- tre contenir d'autres substances thérapeutiquement in- téressantes. Il convient de noter qu'en dépit de l'indica- tion des intervalles de doses la dose administrée en - particulier au patient dépend de l'affection traitée et du résultat recherché,ainsi que des divers autres fac- teurs connus du spécialiste de l'application thérapeuti- que de tels médicaments. R E V E N D I C A T I O N S 1 - Composé de formule: o R et R1 représentent chacun indépendamment un atome d'hydrogène ou un radical acyle. 2 - Composé suivant la revendication 1, dans la formule duquel R et R1 représentent chacun un atome d'hy- drogène. 3 - Composé suivant la revendication 2 sous forme cristalline. - Composé de formule: OR F. R 1O o R et R1 représentent chacun indépendamment un atome d'hydrogène ou un radical acyle. - Composé suivant la revendication 4, dans la formule'duquel R et R1 représentent chacun un atome d'hydrogène. 6 - Composé de formule: OR F R 10 o R et R1 représentent chacun indépendamment un atome d'hydrogène ou un radical acyle. 7 - Composé suivant la revendication 6,dans la formule duquel R et R1 représentent chacun un atome d'hydrogène. - 8 - Composé de formule: OR F R1 o R et R1 représentent chacun indépendamment un atome d'hydrogène ou un radical acyle. 9 - Composé suivant la revendication 8, dans lafor- mule duquel Ret ireprésentert chacun un atome d'hydrogène. - Procédé de préparation d'un composé sui- vant l'une quelconque des revendications 1 à 3, carac- térisé en ce qu'on chauffe le 1,2a-époxy-3p-hydroxycho- lest-5-ène avec l'hydrogénodifluorure de potassium et on convertit la 2Pfluorhydrine résultante en le composé recherché suivant des techniques classiques en chimie de la vitamine D. 11 - Procédé suivant la revendication 10, en substance comme décrit ci-dessus. 12 - Composé suivant l'une quelconque des re- vendications 1 à 3 obtenu par un procédé suivant la revendication 10 ou 11. 13 - Composition pharmaceutique, caractérisée en ce qu'elle comprend un composé suivant l'une quelcon- que des revendications i à 3 et 12 et un excipient phar- maceutiquement acceptable.