FR 2489152 A1 19820305 FR 8116059 A 19810821 i La présente invention concerne un procédé de pro- duction d'hormone humaine de stimulation folliculaire (ou follotropine), ci-après désignée en abrégé par HSFh. HSFh stimule la croissance de la spermatogenèse chez le mâle, et la croissance des follicules ovariens et de la croissance des oestrogènes chez la femelle. A ce jour, il n'existe pas de procédé de production à l'échelle industrielle de HSFh à bas prix. La présente invention est basée sur la constata- tion inattendue que, des cellules humaines, obtenues par multiplication de cellules humaines, capables de produire HSFh, à l'aide d'un animal à sang chaud, présentent une ap- titude à produire HSFh bien supérieure à celle des cultu- res de tissu in vitro, la production de HSFh par cellule étant jusqu'à 2 à 50 fois supérieure. Le nouveau procédé,selon l'invention de produc- tion de HSFh, consiste à multiplier des cellules humaines, capables de produire HSFh, par transplantation de ces cel- lules dans le corps d'un animal à sang chaud ou en four- nissant à ces cellules, à l'aide d'un dispositif, le flui- de corporel nutritif d'un animal à sang chaud, puis à ex- poser les cellules multipliées par l'un ou l'autre de ces procédés de multiplication, à l'influence d'un inducteur d'hormone de stimulation folliculaire. Le procédé selon l'invention, tout en aboutissant à une production supérieure in HSFh, n'exige que peu ou pas de milieu nutritif contenant du sérum coûteux pour la multi- plication cellulaire, et permet de maintenir, plus faci- lement que dans le cas de la culture de tissu in vitro, le milieu de culture au cours de la multiplication cellu- laire. En particulier, toutes les cellules humaines, ca- pables de produire HSFh,peuvent être facilement multipliées grâce à l'utilisation de fluide corporel nutritif prove- nant d'un animal à sang chaud, par transplantation des cellules dans le corps de l'animal, ou par leur mise en suspension dans une chambre de diffusion, équipée pour recevoir le fluide corporel nutritif, l'animal étant ali- menté de manière habituelle. Ce procédé est également caractérisé par une multiplica- tion des cellules plus stable et plus abondante et par une production supérieure de HSFh par cellule. Convienoent, conformément à l'invention, toutes les cellules humaines, pourvu qu'elles produisent de l' HSFh et se multiplient aisément dans le corps d'un animal à sang chaud: par exemple, les cellules humaines, qui produisent par nature de l'HSFh, comme les cellules baso- philes, humaines, provenant du lobe antérieur de l'hypo- physe, ces cellules transformées par le virus EB ou par irradiation aux rayons-X, ou les cellules d'adénome d'un patient souffrant d'adénome basophile de l'hypophyse; des cellules humaines de carcinome du poumon qui produi- sent de l'HSFh ectopique; et les lignées de cellules é- tablies des cellules humaines ci-dessus. L'utilisation de lignées de lymphoblastoldes humains, établis, facilement conservables, dotées de sites génétiques commandant la production de HSFh, au moyen de techniques de recombinai- son génétique utilisant des enzymes comme ADN ligase, nu- cléase et ADN polymérase, ou au moyen de fusion cellulai- re sous l'effet d'agents tels que polyéthylène glycol ou virus de SendaL, aboutit avantageusement à une multipli- cation cellulaire remarquablement supérieure, lorsqu'on transplante les cellules dans le corps d'un animal à sang chaud, la production de HSFh par cellule étant alors de 2 à 10 fois, ou davantage, plus élevée. En outre, comme la transplantation au corps de l'animal des lignées de lymphoblastoïdes humains, établis, mentionnés plus haut, aboutit à la formation de tumeurs massives, pouvant être facilement désagrégées, et que ces tumeurs ne sont guère contaminées par les cellules de l'hôte animal, la récolte des cellules de lymphoblastoides humains multipliés vivan- tes est facile. Conviennent, comme animaux utilisables dans le procédé seloxg'invention, tous les animaux dans lesquels les cellules peuvent se multiplier, par exemple des vo- lailles comme poulet et pigeon, des mammifères comme chat, chien, singe, chèvre, porc, vache, cheval, lapin, cobaye, rat, hamster,souris ou souris nue. Comme cette transplantation cellulaire provoque une immunoréaction indésirable, il est souhaitable d'utiliser des animaux nouveau-nés ou en bas âge, ou encore au stade le plus jeune possible, comme oeuf, embryon ou foetus. Afin de réduire l'immunoréaction, l'animal peut être traité, avant la transplantation des-cellulespar irradiation aux rayons-X ou aux rayons-Y d'environ 200 à 600 rem, ou par injection d'antisérum ou d'agent immunodépresseur prépa- rés selon un procédé classique. Comme la souris nue, uti- lisée comme animal à sang chaud, présente l'immunoréacbion la plus faible, même à l'âge adulte, on peut l'utiliser avantageusement sans prétraitement, pour y transplanter et y multiplier rapidement des lignées de cellules humai- nes établies. Une multiplication cellulaire stabilisée et une augmentation de la production de HSFh peuvent être à la fois réalisées par transplantation répétée,utilisant des combinaisons de différents animaux à sang chaud: on peut atteindre ces objectifs en implantant d'abord les cellu- les chez le hamster, o elles se multiplient, puis en les réimplantant chez la souris nue. En outre, on peut effec- tuer la transplantation successive chez des animaux de la même classe ou division, aussi bien que chez ceux de la même espèce ou du même genre. En ce qui concerne la localisation de l'implan- tation des cellules humaines, conviennent tous les sites de l'animal dans la mesure o des cellules peuvent s'y multiplier, par exemple la cavité allantoIque, ou les voies 24891S2 intrapéritonéale, intraveineuse ou sous-cutanée. A côté de cette transplantation directe des cellules au corps de l'animal, existe la possibilité de faire se multiplier aisément les lignées connues de cel- lules humaine,>capab s de produire HSFh, en utilisant le fluide corporel nutritif provenant de l'animal, grâce à l'inclusion, par exemple par voie intrapéritonéale, dans le corps de l'animal, d'une chambre de diffusion clas- sique, de taille et de forme appropriées, munie d'une membrane filtrante, d'un ultra-filtre ou de fibre creuse ayant un diamètre de pore de l'ordre de 10-7 à 10-5 m, qui empêche la contamination de la chambre de diffusion par les cellules de l'hôte, tout en permettant l'apport du fluide corporel nutritif de l'animal aux cellules. De plus, comme la chambre de diffusion peut être conçue, si nécessaire, pour être placée dans lehôte animal et per- mettre à son fluide corporel de circuler dans la chambre, les parois de celle-ci peuvent être munies de fenêtres latérales, transparentes, permettant l'observation de la suspension de cellules, ainsi que le remplacement et l'é- change avec une chambre fràtche: la multiplication cel- lulaire est ainsi augmentée à un niveau encore supérieur, rapporté à la durée de vie de l'animal, et la production par animal est encore accrue, sans sacrifice de l'hôte. En outre, lorsqu'on utilise cette chambre de diffusion, comme les cellules humaines multiplies peuvent être fa- cilement récoltées, et qu'il n'y a pas d'immunoréaction, du fait de l'absence de contact direct entre les cellules humaines et celles de l'hôte animal, on peut utiliser comme hôte, conformément à l'invention, sans prétraite- ment destiné à réduire l'immunoréaction, tout animal à sang chaud. L'alimentation de l'hôte animal,implanté avec des cellules humaines, peut s'effectuer facilement par procédé classique, même après la transplantation cellu- laire, et elle ne nécessite pas de soins particuliers. La multiplication cellulaire maximale est at- teinte environ 1 à 20 semaines après l'implantation des cellules, Lorsque la lignée;établie, implantée, est une lignée de cellules de tumeur humaine ou de lymphoblastOl- des humains, la multiplication cellulaire maximale est atteinte en 1 à 5 semaines'après la transplantation, en raison des vitesses de multiplication cellulaire très é- levées de ce type de lignée. Conformément à l'invention on obtient 10 à 10o ou plus, de cellules humaines par hôte. Autrement dit, le nombre de cellules humaines implantées chez l'hôteanimal s'accro t 102 à 107 fois ou plus, ou bien est d'environ 101 à 106 fois, ou plus, celui que l'on obtient avec un procédé de culture de tissu in vitro utilisant un milieu nutritif, aussi ces cellules sont-elles avantageusement utilisables pour la production d'HSEh. En ce qui concerne le procédé pour induire HSFh, on peut employer tout procédé, dans la mesure o les'ceLlu- les humaines, obtenues par le mode opératoire mentionné plus haut, libèrent HSFh. Par exemple, les cellules humai- nes, obtenues par multiplication en ascite en suspension, et récoltées à partir de cet ascite, ou par extraction de tumeur massive formée sous la peau, puis récoltées après désagrégation de la tumeur, sont mises en suspension pour atteindre une concentration de le à 108 cellules par ml dans un milieu nutritif, maintenues à une température de l'ordre de 200 à 400C, puis soumises, à cette température, pendant 1 à 50 heures, à l'action d'un inducteur d'hormo- nes de stimulation folliculaire. Les inducteurs préférés d'hormone de stimulation folliculaire sont des aminoacides comme lysine, arginine, tryptophane, leucine et acide casamino; des sels minéraux comme chlorure de sodium, chlorure de potassium, chlorure de calcium et sulfate de magnésium; et des hormones comme l'hormone lutéinisante. La production simultanée d'autres hormones hu- maines comme l'hormone lutéinisante humaine (en abrégé HLh) peut être réalisée conformément à l'inventiono L'HSEh, ainsi obtenue, peut être recueillie fa- cilement, grâce à des techniques de purification et de séparation utilisant des modes opératoires classiques, tels que relargage, dialyse, filtration, centrifugation, concentration et lyophilisation. Quand on souhaite un produit encore plus pur, on peut obtenir une préparation de pureté supérieure par combinaison des techniques men- tionnées plus haut avec d'autres modes opératoires classi- ques, tels qu'adsorption et désorption avec échange d'ions, filtration sur gel, chromatographie par affinié, fraction- nement au point isoélectrique et électrophorèse. La préparation d'HSFh, ainsi obtenue, peut être avantageusement utilisée, seule ou en combinaison avec un ou plusieurs agents, pour injection, administration exter- ne, interne ou de diagnostic, pour la prévention ou le traitement de maladies humaines. Au cours de la présente description, la produc- tion de HSFh est dosée-par le procédé de radio-immuno-- essai décrit par C. Faiman, R.J. Ryan, J. Clin. Endocri- nol. Metab., Vole 27, PP. 444-447 (1967) et est exprimée en Unités Internationales (UI). La production simultanée d'HLh est dosée par le procédé de radio-immuno essai dé- crit par A.R. Midgley, Jr, Endocrinology, Vol. 79, pp. -18 (1966), et est exprimée en Unités Internationales (UI). L'invention est illustrée ciaprès par plusieurs formes de réalisation non limitatives. EXEMPLE 1 Des cellules d'adénome basophile humain désagré- gé, obtenues par extraction à partir d'un patient souffrant d'adénome basophile de l'hypophyse,suivie de hachage, sont implantées par voie sous cutanée dans des souris nues, a- dultes, qui sont ensuite nourries de manière habituelle pendant 4 semaines. Les tumeurs massives, résultantes formées sous la peau, pesant chacune environ 10 g, sont extraites, désagrégées par hachage et mises en suspen- sion dans du sérum physiologique, contenant de la tryp- sine. Après lavage des cellules avec du milieu de Earle 199 (pH 7,2), additionné de 10% en volume/volume de sé- rum foetal de veau, les cellules sont remises en suspen- sion, à une concentration de 105 cellules/ml, dans une préparation fraiche du même milieu, qui contient, en tant qu'inducteur d'hormone de stimulation folliculaire, mM de L-arginine, et l'on met à incuber à 37'C pendant heures environ pour obtenir HSFh. Les cellules sont ensuite soumises aux ultra-sons, et la quantité d'HSFh présente dans la partie surnageante est dosée. La produc- tion d'HSFh est d'environ 500 mUI/ml de suspension cellu- laire. La production simultanée d'HLh dans la partie sur- nageante est de l'ordre de 400 mUI/ml de suspension cel- lulaire. Les cellules témoins, obtenues par culture in vitro de cel- lules d'adénome basophile, humain, dans du milieu de Earle 199 (pH 7,2), additionné de 10% en volume/volume de sérum foetal de veau, et mis à incuber à 37"C, sont traitées com- me plus haut, pour induirela formation d'HSFh. Cette produc- tion n'est que voisine de 80 mUI/ml de suspension cellulai- re. EXEMPLE 2 Des cellules d'adénome basophile, humain, désa- grégé, obtenues comme dans l'exemple 1, et une lignée de lymphoblastoldes leucémiques, humains, de Namalwa, sont mises en suspension ensemble dans un récipient avec une so- lution saline contenant 140 mL de NaCl, 54 mM de KC1, 1 mM de NaH2PO4 et 2 mM de CaC12, de manière à obtenir des con- centrations cellulaires respectives de l'ordre de 10 cel- lules/mlo La suspension de cellules, refroidie à la glace, est mélangée avec une préparation fraîche de la même solu- tion saline contenant du virus de Senda! préalablement inactivé par irradiation à l'ultra-violet; le tout est transféré 5 minutes après le mélange dans un incubateur à 370C, et y est agité pendant 30 minutes pour réaliser le fusionnement cellulaire, introduisant l'aptitude à pro- duire l'HFSh des cellules d'adénome basophile humain dans la lignée des lymphoblastoïdes leucémiques, humains. A- près clonage selon un procédé classique de la souche de cellules d'hybridome, capable de produire l'HSFh, on i' implante par voie intrapéritonéale chez des souris nues adultes, qui sont ensuite nourries de manière habituelle pendant 5 semaines, Les tumeurs massives, résultantes, pesant environ 15 g chacune, sont extraites et traitées comme dans l'exemple 1 pour induire l'HSFh, mais on rem- place les 30 mM de L-arginine par environ 10 ng d'hormone lutéinisante. La production d'HSFh est d'environ 1600 mUI/ml de suspension cellulaire. La production simultanée d'HLh est de l'ordre de 1400 mUI/ml de suspension cellulaire. L'expérimentation témoin est réalisée comme dans l'exem- ple 1, par culture in vitro de la lignée de lymphoblastol- des leucémiques, humains, fusionnés, de Namalwat et expo- sition des cellules humaines multipliées à l'action de l'inducteur d'hormone de stimulation folliculaire. La pro- duction d'HSFh n'est que de 80 mUI/ml de suspension cellu- laire. EXEMPLE 3 Après injection à des hamsters nouveau-nés d' antisérum, préparé à l'aide de lapin selon un procédé clas- sique, on implante par voie sous-cutanée, chez ces animaux, une lignée de lymphoblastoTdes leucémiques, humains, JBL, dans laquelle l'aptitude à produire HSFh des cellules d'a- dénome basophile humain, a été introduite comme dans l'e- xemple 2, puis on les nourrit de manière habituelle, pen- dant 3 semaines Les tumeurs massives, résultantes, for- mées sous la peau, et pesant environ 10 g chacune, sont extraites et traitées comme dans l'exemple 1 pour induire HSFh. La production d'HSFh est de l'ordre de 1500 mUI/ml de suspension cellulaire. La production simultanée d'HLh est de l'ordre de 1300 mUI/ml de suspension cellulaire. L'expérimentation témoin est réalisée comme dans l'exem- ple 1 par culture in vitro de la lignée de lymphoblastot- des leucémiques, humains, fusionnés, JBL, et exposition des cellules humaines multipliées à l'action de l'induc- teur d'hormone de stimulation folliculaire. La produc- tion d'HSFh n'est qu'environ 110 mUI/ml de suspension cellulaire. EXEMPLE 4 A des rats nouveau-nés sont implantés, par voie intraveineuse, des cellules d'une lignée de lymphoblastôot- des leucémiques, humains, de Namalwa, dans laquelle l'ap- titude à produire de l'HSFh de cellules d'adénome baso- phile humain a été introduite comme dans l'exemple 2; puis les rats sont nourris de manière habituelle, pendant 4 semaines. Les tumeurs massives, résultantes,environ 40 g chacune, sont extraites et traitées comme dans l'exemple 2 pour induire l'HSFh. La production d'HSFh es/voisine de 1200 mUI/ml de suspension cellulaire. L'expérimentation témoin est réalisée comme dans l'exem- ple 1, par culture in vitro de la lignée de lymphoblastol- des leucémiques humains fusionnés de Namalwa, et exposi- tion des cellules humaines multipliées à l'action de l'in- ducteur d'hormone de stimulation folliculaire. La produc- tion deSFh n'est que de 80 mUI/ml de suspension cellulai- re. EXEMPLE 5 Après avoir subi une irradiation de 400 rem. en- viron de rayons-X, afin de réduire leur immunoréaction, des souris adultes reçoivent des implants, par voie sous- cutanée, de cellules d'adénome basophile humain, obtenues comme dans l'exemple 1; on nourrit les souris de manière habituelle, pendant 4 semaines, Les tumeurs massives, ré- sultantes, formées sous la peau et pesant environ 15 g chacune, sont extraites et traitées comme dans l'exemple 2 pour induire l'HSFh. La production d'HSFh est d'environ 500 mUI/ml de suspension cellulaire. L'expérimentation témoin est réalisée, comme dans l'exem- pie 1, par culture in vitro des cellules d'adénome baso- phile humain, et exposition des cellules humaines multi- pliées, à l'action de l'inducteur d'hormone de stimula- tion folliculaire. La production d'HSFh n'est que de l'or- dre de 80 mUI/ml de suspension cellulaire. EXEMPLE 6 Une lignée de lymphoblastotdes leucémiques, hu- mains, JBL, dans laquelle l'aptitude à produire de l'HSFh des cellules d'adénome basophile, humain, a été intro- duite-comme dans l'exemple 3, est mise en suspension dans du sérum physiologique, puis le tout est transféré dans une chambre de diffusion cylindrique, en matière plastique, dont le volume intérieur est de l'ordre de 10 ml munie dl une membrane filtrante dont les pores ont une dimension voi- sine de 0,57u. Après inclusion, par voie intrapéritonéa- le, de cette chambre dans un rat adulte, on nourrit celui- ci de manière habituelle, pendant 4 semaines, puis on en- lève la chambre. La densité en cellules humaines dans la chambre, atteinte au cours de l'opération ci-dessus, est d'environ 2 x 109 cellules/ml, ce qui est environ 103 fois supérieur, ou même plus, à ce qu'on atteint avec une cul- ture in vitro à l'aide d'un incubateur à C02. Les cellules humaines, ainsi obtenues, sont traitées comme dans l'exem- ple 2 pour induire l'HSFh. La production d'HSFh est de 1' ordre de 1300 mUI/ml de suspension cellulaire. La production simultanée de HLh est voisine de 1600 mUI/ml de suspension cellulaire. L'expérimentation témoin est réalisée comme dans l'exem- ple 1, par culture in vitro d'une lignée de lymphoblastol- des leucémiques, humains, fusionnés, JBL, et exposition des cellules humaines multipliées à l'action de l'induc- teur d'hormone de stimulation folliculaire. La production d'HSFh n'est que de l'ordre de 110 mUI/ml de suspension cellulaire. EXEMPLE-7 Une lignée de lymphoblastoîdes leucémiques, hu- mains, JBL, dans laquelle l'aptitude à produire de l'HSFh des cellules d'adénome basophile humain a été introduite comme dans l'exemple 3, est implantée dans la cavité allan- toTque d'oeufs embryonnés, préalablement mis à incuber à 37C pendant 5 jours. Après incubation des oeufs embryon- nés, à cette température, pendant 1 semaine supplémentai- re, les cellules humaines, multipliées, sont récoltées et traitées comme dans l'exemple 1 pour induire l'HSFh. La production d'HSFh est voisine de 1300 mUI/ml de suspen- sion cellulaire. L'expérimentation témoin est réalisée comme dans l'exem- ple 1, par culture in vitro de la lignée de lymphoblastot- des leucémiques humains, fusionnés, JBL, et exposition des cellules humaines multipliées à l'action de l'inducteur d' hormone de stimulation folliculaire. La production d'HSFh n'est que d'environ 110 mUI/ml de suspension cellulaire. Revendications 1. Procédé pour la production d'hormone de stimula- tion folliculaire (HSFh) par multiplication de cellules humaines, capables de produire HSFh, et exposition des cellules multipliées à l'action d'un inducteur d'hormone de stimulation folliculaire, caractérisé er6e qu'on uti- lise un animal à sang chaud pour la multiplication cel- lulaire. 2. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que la multiplication cellulaire est réalisée par im- plantation des cellules humaines dans le corps de l'animal à sang chaud. 3. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que la multiplication cellulaire est réalisée dans un dispositif, à l'aide duquel le fluide corporel nutritif de l'animal à sang chaud est fourni aux cellules numaines. 4. Procédé selon la revendication 3, caractérisé en ce que le dispositif est une chambre de diffusion, équipée de manière à ce que les cellules de l'hôte animal ne la contaminent pas. 5. Procédé selon une des revendications 1 à 4, carac- térisé en ce que les cellules humaines, capables de pro- duire HSFh, sont des cellules d'hybridome obtenues par fusion cellulaire d'une lignée de lymphoblastoldes humains, établis, avec des cellules humaines capables de produire HFSh. 6. Procédé selon la revendication 5, caractérisé en ce que l'on fait fusionner, avec la lignée de lymphoblas- toldes humains établis, des cellules d'adénome basophile humain. 7. Procédé selon la revendication 5, caractérisé en ce que la lignée de lymphoblastoïdes humains est une li- gnée de lymphoblastoides leucémiques, humains. 8. Procédé selon une des revendications 5 à 7, carac- térisé en ce que la lignée de lymphoblastotdes humains est une lignée de Namalwa ou JBL. 9. Procédé selon une des revendications 5 à 8, carac- térisé en ce que la fusion cellulaire est réalisé à l'aide de virus de Sendal. 10. Procédé selon une des revendications 1 à 9, ca- ractérisé en ce que l'inducteur d'hormone de stimulation folliculaire est un amino acide, notamment lysine, argi- nine, tryptophane, leucine ou acide casamino; un sel minéral, en particulier chlorure de sodium, de potassium ou de calcium, ou bien sulfate de magnésium; ou une hor- mone, comme hormone lutéinisante. 11. Procédé selon une des revendications 1 à 9, ca- ractérisé en ce que l'animal à sang chaud est une volail- le comme poulet ou pigeon, ou un mammifère, notamment chien, chat, singe, chèvre, porc, vache, cheval, lapin, rat, cobaye, hamster, souris ou souris nue.