FR 2495937 A1 19820618 FR 8123151 A 19811211 La présente invention concerne un procédé pour la production du facteur de croissance épidermique, hu- main, c'est-à-dire d'urogastrone, désigné ci-après par 1' abréviation hEGF. Comme décrit par M. H. F. Friedman dans "Vita- mines and Hormones", Vol. 9, pp 312-353 (195 )3 1'hEGF est une substance à activité biologique, découverte dans l'urine humaine et classée dans la famille des "gastrones"; elle inhibe la sécrétion des sucs gastriques par le systè- me digestif. Depuis la découverte de ses puissantes acti- vités antiulcéreuse et stimulatrice de la croissance dans divers tissus, en plus de la propriété susmentionnée, la production abondante d'une quantité d'hEGF suffisante pour les applications médicales est devenue très souhaitable. Bien que les procédés classiques, tels que la récupération à partir de l'urine humaine, en des stades très compliqués, soient connus, ils ne permettent pas de disposer d'une quan- tité suffisante d'hEGF homogène, de qualité bien définie, pour les essais cliniques pratiques. La demanderesse a étudié des procédés pour la production en masse de l'hEGF, pour obtenir un produit ho- mogène et à titre élevé, utilisable dans les essais clini- ques. Ces efforts ont conduit à la découverte inattendue que l'on peut obtenir une quantité importante d'hEGF par multiplication de certaines cellules humaines, capables de produire ce facteur, en utilisant une culture tissulaire in vitro, ou un animal à sang chaud, et une culture in vitro de cellules humaines multipliées, pour produire la- dite substance. En particulier l'invention concerne un pro- cédé pour la production d'hEGF, caractérisé en ce qu'on fait se multiplier des cellules humaines, capables de pro- duire de l'hEGF, dans un milieu nutritif, on transplante ces cellules dans l'organisme d'un animal à sang chaud, ou bien on les laisse se multiplier dans un dispositif leur fournissant un liquide nutritif de l'organisme d'un animal à sang chaud; on laisse les cellules humaines, multipliées selon l'un des modes de multiplication ci- dessus, libérer de l'hEGF. Comme cellules humaines, utilisables dans l'in- vention, on peut employer toute cellule humaine produisant de l'hEGF, transplantable dans un milieu nutritif in vitro ou dans l'organisme d'un animal à sang chaud et capable de s'y multiplier. De préférence, les cellules humaines sont des cellules de glande sous-maxillaire, de la thy- roîde, de la rate, du rein, du duodénum ou du jéjunum; on peut prendre aussi de telles cellules9 transformées par un virus ou un agent carcinogène ou par des radiations, des cellules tumorales, provenant d'un malade atteint d' une tumeur des glandes sous-maxillaires, d'un carcinome pulmonaire ou d'un carcinome de la vessie; et également des lignées cellulaires établies des cellules ci-dessus. L'emploi de lignées lymphoblastoides humaines, faciles à entretenir, dans lesquelles on a introduit les sites génétiques commandant la production de lt'hEGF des cellules décrites plus haut, selon une technique de re- combinaison génétique utilisant l'ADN-ligase, une nucléea- se et l'ADN-polymérase, ou par fusion cellulaire avec du polyéthylèneglycol ou le virus Senda! permet d'obtenir une production supérieure d'environ 2 à 10 fois ou plus d'hE-GF par cellule, ainsi qu'une multiplication cellulaire extrt- mement accrue. De plus, comme l'emploi de telles lignées lymphoblastoides humaines provoque la formation d'une tu- meur massive,facile à désagréger lors de la transplanta- tion des lignées dans l'organisme d'un animal, on peut facilement récolter les-cellules lymphoblastoides humaines, vivantes, multipliées. 0Oeut utiliser dans l'invention deux procédés de multiplication cellulaire; l'un est le procédé de cul- ture tissulaire in vitro, dans lequel on ensemence un mi- lieu nutritif avec les cellules humaines, capables de pro- duire l'hEGF, et on les y fait se multiplier; l'autre est un procédé in vivo, dans lequel on transplante les cellules humaines dans l'organisme d'un animal à sang chaud, ou on les met en suspension dans un dispositif fournissant aux cellules un liquide nutritif de l'orga- nisme d'un animal à sang chaud et l'on fait multiplier les cellules. - Le premier procédé de multiplication in vitro est exposé en détail ci-après. Comme milieux nutritifs, utilisables, on peut choisir tout milieu dans lequel les cellules humaines se multiplient. Les milieux préférables sont ceux qui con- tiennent généralement de la L-arginine, L-histidine, L- lysine, L-tyrosine, L-méthionine, L-sérine, L-glycine, cystéine ou du Ltryptophase comme source d'azote, des hydrates de carbone tels que glucose, inositol, ribose ou désoxyribose, et des éléments minéraux essentiels à la croissance cellulaire, notamment Na++, +, Cl, Fe++' Fe+I++ Co++, Ca++' PO__ et autres. Si nécessaire, on peut addi- tionner les milieux nutritifs d'autres facteurs de crois- sance, tels qu'hormones et/ou vitamines. Egalement, peut- on utiliser divers milieux nutritifs classiques. Un de ces milieux classiques est le RPMI 1640 qui peut, de plus, ê- tre additionné de vitamines, d'éléments minéraux, d'hydra- tes de carbone, d'amino-acides, et d'environ 0,5 à 20% en volume de sérum de mammifère, avant l'emploi. Dans ce procédé, on peut appliquer tout mode de culture in vitro conduisant à la multiplication des cellu- les humaines, avec lesquelles le milieu a été ensemencé. Le récipient de culture cellulaire,convenant à cette cul- ture, est généralement une jarre de fermentation, un fla- con, un ballon ou un réservoir en acier inoxydable, auxquels si nécessaire est associé un agitateur à va-et-vient et/ou un agitateur rotatif. Les cultures en couche monocellulai- re peuvent être effectuées sur des supports inertes et in- solubles dans l'eau, tels que perles ou tiges de verre, ou des billes d'un métal tel que-titane, polymère synthé- tique, gel de dextran ou céramique, qui accroissent la surface de développement des cellules humaines, pour qu' elles forment des colonies. Dans le c as d'une culture en suspension, on doit poursuivre la culture jusqu'à l'obten- tion de la densité cellulaire maximale en conditions aé- robies et avec agitation. Toutes conditions d'inoculation et de multiplica- tion des cellules conviennent, si elles rermettent aux cel- lules humaines de se multiplier. par exemple la tempéra- ture est d'environ 20 b 40WC, de préférence d'environ 35 à 380C; l'inoculum, exprimée par le nombre de cellules par millilitre de milieu, qui permet d'obtenir la croissance cellulaire maximale en environ une semaine après l'ense- mencement par les cellules, est de préférence d'environ 104 à 16 cellules par millilitre de milieu. On doit faire se multiplier les cellules humaines, implantées dans le milieu nutritif par incubation à la tem- pérature appropriée, pendant environ 5 à 10 jours, en rem- plaçant périodiquement le milieu par du milieu frais, pour fournir suffisamment de substances nutritives aux cellules, et pour diluer et éliminer les métabolites cellulaires. Com- me, lors de la multiplication cellulaire, une petite quan- tité d'hEGF peut être libérée dans le milieu, on peut la ré- colter lors du remplacement de celui-ci. Le procédé de multiplication in vivo peut être pratiqué de la façon suivante. Comme les cellules humaines, capables de produire de l'hEGF, peuvent se multiplier facilement, en utilisant le liquide nutritif de l'organisme, fourni par un animal à sang chaud, par suite de la transplantation de ces cellules dans l'organisme d'un animal, ou de la mise en suspension de ces cellules dans une chambre de diffusion classique, conçue pour recevoir le liquide nutritif de l'organisme, tandis qu'on alimente l'animal de façon habituelle, on peut facilement obtenir une grande quantité d'hEGF, sans ou avec beaucoup moins de milieu nutritif contenant du sé- rum coûteux, pour effectuer la multiplication cellulaire, que dans le cas d'une culture tissulaire in vitro. Ce procédé est caractérisé par une multiplication cellulaire plus stable et plus abondante, une production d'hEGF par cellule accrue, ainsi qu'un maintien plus facile de l'é- quilibre du milieu de culture, pendant la multiplication cellulaire. Comme animaux à sang chaud, utilisables dans le procédé, on peut prendre tout animal, pourvu que les cel- lules humaines se développent dans son organisme. Par ex- emple, on peut employer avantageusement des volailles, telles que poulets ou pigeons, et des mammifères comme chien, chat, singe, chèvre, porc, vache, cheval, lapin, cobaye,rat, hamster, souris ou souris nue. Comme la trans- plantation des cellules humaines à l'animal provoque une réaction immunitaire indésirable, l'emploi d'un animal très jeune, nouveau-né ou au stade le plus précoce pos- sible, par exemple d'oeuf, d'embryon ou de foetus, est souhaitable. Pour réduire autant que possible la réaction immunitaire, on peut traiter l'animal, avant la transplan- tation cellulaire, par irradiation avec des rayons X ou Y' raison d'environ 200 à 600 rems/jour, ou par injection d'un antisérum ou d'un agent immunosuppresseur préparé se- lon un procédé classique. Comme la souris nue, lorsqu'on l'utilise comme animal hôte, présente une réaction immu- nitaire plus faible, même à l'état adulte, on peut de fa- çon pratique lui transplanter des lignées cellulaires hu- maines quelconques, pour qu'elles se multiplient rapide- ment, sans qu'un prétraitement soit nécessaire. On peut effectuer la multiplication cellulaire, stabilisée, et l'accroissement de la4roduction d'hEGF par transplantation répétée avec une ou plusieurs combinaisons d'animaux à sang chaud différents; on peut atteindre les objectifs visés, en implantant les cellules à des hams- ters, pour qu'elles se multiplient, puis en les réimplan- tant à des souris nues. La transplantation répétée peut avoir lieu avec des animaux de la même classe, du même groupe, de la même espèce ou du même genre. On peut implanter les cellules humaines en un site quelconque de l'animal, pourvu qu'elles s'y multi- plient: par exemple, on peut effectuer l'implantation dans la cavité allantoque, par voie intraveineuse, in- trapéritonéale ou sous-cutanée. En dehors de la transplantation cellulaire di- recte, décrite, on peut faire se multiplier facilement des lignées cellulaires humaines, classiques, quelconques, capables de produire l'hEGF, en utilisant le liquide nu- tritif fourni par l'organisme de l'animal, par inclusion, par exemple par voie intrapéritonéale, dansiorganisme de cet animal, d'une chambre de diffusion classique, de forme et de taille appropriées, munie d'une membrane fil- trante poreuse, d'un ultrafiltre ou de fibres creuses ayant des pores d'environ lO-7 à 10-5 m de diamètre empêchant la contamination de la chambre par les cellules de l'animal hôte et permettant l'apport du liquide nutritif de l'orga- nisme de l'animal aux cellules, De plus, la chambre de diffusion peut, s'il le faut, être conçue pour 0trqplacée par exemple sur le corps de l'animai htte, rendre possible la circulation du liquide de l'organisme de l'animal dans la chambre et permettre l'observatioxe la suspension cel- lulaire contenue dans la chambre par une ou plusieurs fe- nêtres latérales, transparentes, dont sont munies une ou plusieurs parois de la chambre; il est bon de prévoir é- galement le remplacement et l'échange avec une chambre neu- ve; la production cellulaire par hôte peut ainsi être ac- crue pendant la durée de vie de l'animal, sans qu'il soit nécessaire de sacrifier celui-ci. De plus, par l'utilisa- tion d'une telle chambre/de diffusion, l'absence de contact direct des cellules humaines avec les cellules de l'animal hôte a pour résultat de provoquer qu'une faible réaction immunitaire, si bien que l'on peut employer divers animaux à sang chaud, comme hôtes, sans avoir à effectuer un pré- traitement pour réduire leurs réactions immunitaires. On peut alimenter l'animal hôte de façon classi- que, même après la transplantation cellulaire, et aucun soin particulier n'est nécessaire. La multiplication des cellules atteint gér'ale- ment un maximum 1 à 20 semaines après la transplantation. Lorsque la lignée de cellules humaines, transplantées à 1' animal hôte, est une lignée de cellules tumorales ou lym- phoblastode, on peut obtenir la multiplication cellulaire maximale 1: 5 semaines après la transplantation, par sui- te de la multiplication extrêmement intense de ces cellu- les. Selon le procédé de l'invention, le nombre de cellules humaines, obtenues par hôte, est d'environ 107 à 1012 ou plus. En d'autres termes, le nombre de cellules hu- maines, transplantées à l'animal, s'accroit d'environ 102 à 107 fois ou plus: cela représente environ 10 à 106 fois plus par rapport à ce que l'on obtient par la méthode de culture in vitro utilisant un milieu nutritif. Les cellu- les humaines multipliées peuvent donc être avantageusement utilisées pour la production en masse d'hEGF. Pour laisser les cellules humaines, multipliées comme susindiqué, libérer l'hEGF, on peut appliquer tout procédé conduisant à la libération de cette substance par les cellules. Par exemple, on met en suspension des cel- lules humaines, obtenues par culture in vitro, en couche monocellulaire, ou par culture en suspension, par multipli- cation en suspension dans le liquide d'ascite et récolte dans ce liquide, ou par extraction d'une tumeur massive, formée sous la peau, puis récolte après désagrégation de la tumeur, pour obtenir une concentration cellulaire d'en- viron 104 à 108 cellules par ml, dans un milieu nutritif préchauffé à une température d'environ 20 à 40 C; on incube ensuite à cette température,pendant plusieurs heu- res ou plusieurs jours, pour produire de l'hEGF. On peut facilement recueillir l'hEGF, ainsi ob- tenu, selon des techniques de purification et de sépara- tion utilisant des opérations classiques, telles que re- largage, dialyse, filtration, centrifugation, concentra- tion et lyophilisationo Si l'on désire une préparation plus purifiée, on peut y arriver en combinant les opéra- tions précitées avec une ou plusieurs autres, telles qu' adsorption et désorption, avec échange d'ions, fraction- nement selon masses moléculaires,chromatographie d'affi- nité, fractionnement au point isoélectrique et électropho- rèse. La préparation d'hEGF, ainsi obtenue, est identi- que du point de vue immunologique à celles que l'on ob- tient à partir de l'urine humaine par desrocédés classi- ques; elle n'est pas contaminée par le virus de4'hépatite ou des pyrogènes. Donc on peut utiliser la préparation de façon avantageuse, isolément ou en combinaison avec un ou plusieurs agents, par injection, par voie externe ou in- terne, ou dans un but de diagnostic dans la prévention et le traitement de diverses maladies humaines. Dans la présente description, la production d' hEGF est déterminée par une méthode à radiorécepteur, con- me décrit par Roger L. Ladda et coll. dans Analytical Chemistry, vol. 93, ppo 286-294 (1979) et exprimée en poids. Des modes de réalisation non limitatifs de l'in- vention sont décrits ci-après. EXEMPLE 1 On ensemence des cellules humaines de tumeur de la glande sous-maxillaire désagrégée, obtenues par extrac- tion d'un malade atteint d'une tumeur de la glande sous- maxillaire. Cette extraction est effectuée après hachage, dans un milieu 199 de Earle (pH 7,4) additionné de 10% en volume de sérum de veau foetal, pour obtenir une con- centration cellulaire d'environ 1 x 105 cellules par ml. Ensuite on incube dans un récipient fermé, à 370C, pendant une semaine, en remplaçant périodiquement le milieu par du milieu frais. Après avoir atteint la confluence, on lave la couche monocellulaire avec une solution salée, phy- siologique, contenant de la trypsine et du phosphate. Les cellules trypsinées sont remises en suspension à une concentration cellulaire d'environ 1 x 105 cellules par ml, dans une préparation fratche du même milieu, la sus- pension cellulaire est incubée à 370C et à pH 7,4, pen- dant une semaine. Ensuite, on soumet les cellules à un traitemenpar les ul- trasons et on détermine l'hEGF dans le surnageant obtenu. La production d'hE F est d'environ 1,3/.q/ml de suspension cellulaire. EXEMPLE 2 On met en suspension ensemble des cellules hu- maines de tumeur de glande sous-maxillaire et des cellules de la lignée lymphoblastolde leucémique, humaine, Namalwa, dans un récipient-avec une solution salée 140 mM en NaCl, 54 mM en KC1, 1 mM en NaH 2P04 et 2 mM en CaCl2 pour obtenir une concentration de chaque type de cellules d'environ 1 x 1 cellules par ml. On mélange la suspension cellulai- re, en refroidissant par la glace, avec une préparation fratche de la même solution salée contenant du virus Sendal préalablement inactivé par irradiation par les ultravio- lets; on transfère dans une étuve à 370C pour 5 minutes, après le mélange, et on agite pendant 30 minutes, pour ef- fectuer la fusion cellulaire et introduire la capacité de production'de hESF des cellules humaines de tumeur de glande sous-maxillaire dans les cellules de la lignée lymphoblas- tonde leucémique, humaine. Après clonage par procédé classique de la souche de cel- lules d'hybridome capable de produire l'hEGF, on fait se multiplier la souche de cellules d'hybridome comme-dans l'exemple 1, et on traite les cellules d'hybridome muiti- pliées, comme dans ce mêmeexemple, pour produire de 1' hEGF. Cette production est d'environ 5,8 //ml de suspen- sion cellulaire. EXEMPLE 3 On implante sous la peau de souris nues adultes 1C des cellules humaines de tumeur de la glande sous-maxil- laire obtenues comme dans l'exemple 1 et on alimente les animaux de façon habituelle pendant 4 semaines. On extrait les tumeurs massives formées sous la peau et pesant envi- ron 10 g chacune et on les désagrège par hachage et mise en suspension dans une solution salée, physiologique, con- tenant de la trypsine. Apres lavage des cellules trypsinées avec du milieu 199 de Earle (pH 7,4) additionné de 10% en volume de sérum de veau foetal, on remet les cellules en suspension pour obtenir une concentration cellulaire d'en- vironl x 105 cellules/ml dans une préparation franche du même milieu, puis on incube à 37 C pendant 7 jours, pour produire de l'hEGF* Ensuite, on traite les cellules par les ultrasons et on détermine l'hEGF dans le surnageant obtenu. La production d'hEGF est d'environ 23/ g/ml de suspension cellulaire. EXEMPLE 4 On implante par voie intrapéritonéale à des sou- ris nues, adultes, des cellules de la lignée lymphoblastol- de leucémique, humaine,Namalwa, auxquelles on a conféré, comme dans l'exemple 2, la capacité de production de l'hEGF des cellules humaines de tumeur de la glande sous-maxillai- re, puis on alimente les animaux de façon habituelle pen- dant 5 semaines. On traite comme dans l'exemple 3 les tu- meurs massives, obtenues, pesant environ 15 g chacune, pour produire de l'hEGF. La production d'hEGF est d'envi- 1 1 ron 320pg/ml de suspension cellulaire. EXEMPLE 5 Après avoir injecté à des hamsters nouveau-nés u:Wantisérum préparé à partir du lapin selon un procédé classique, pour réduire leur réaction immunitaire, on implante aux animaux, par voie sous-cutanée,des cellules de la lignée lymphoblastoNde leucémique, humaine, Namalwa, auxquelles on a conféré, comme dans l'exemple 2, la ca- pacité de production de l'hEGF de la lignée de cellules humaines de carcinone pulmonaire A-549, puis on alimente les animaux de façon habituelle pendant 3 semaines. On extrait et on traite, comme dans l'exemple 3, les tumeurs massives, formées sous la peau et pesant environ 10 g cha- * cune, pour produire de l'hEGF. La production d'hEGF est d'environ 250Lg/ml de suspension cellulaire. EXEMPLE 6 On implante par voie intraveineuse à des rats nou- veau-nés des cellules de la lignée lymphoblastoïde leucé- mique, humaine, BALL-1, auxquelles on a conféré, comme dans l'exemple 2, la capacité de production de l'hEGF de cellu- les humaines de carcinome de la vessie, provenant d'un ma- lade atteint de carcinome de la vessie, puis on alimente les animaux de façon habituelle pendant 4 semaines. Pour produire de l'hEGF, on extrait les tumeurs massives pesant environ 30 g chacune et on les traite comme dans l'exemple 3, si ce n'est que l'on remplace le milieu 199 de Earle par du milieu RPMI 1640. La production de hEGF est d'envi- ron 170/-g/ml de suspension cellulaire. EXEMPLE 7 Après avoir irradié des souris adultes avec un équivalent de dose de rayons X d'environ 400 rems pour réduire leurs réactions immunitaires, on implante aux ani- maux par voie sous-cutanée, des cellules humaines de tu- meur de glande sous-maxillaire obtenues comme dans/'exem- ple 1, puis on alimente les animaux de façon habituelle pendant 4 semaines. On extrait les tumeurs massives, for- mées sous la peau, pesant environ 15 g chacune, et on les traite comme dans l'exemple 3 pour produire de l'hEGF. La production d'hEGF est d'environ 35 eg/ml de suspension / cellulaire. EXEMPLE 8 On met en suspension dans une solution salée, physiologique, des cellules de la lignée lymphoblastoide leucémique, humaine, BALL-1, auxquelles on a conféré la capacité de production de l'hEGF de cellules humaines de carcinome de la vessie comme dans l'exemple 6, et on trans- fère la suspension cellulaire obtenue dans unechambre de diffusion cylindrique, en matière plastique, aybant un volu- me intérieur d'environ 10 ml et munie d'une membrane fil- trante ayant des pores d'environ 0,5,Um de diammtre. Après inclusion intrapéritonéale de la chambre à un rat adulte, on alimente l'animal de façon habituelle pendant 4 semai- nes puis on retire la chambre. La densité des cellules hu- maines dans la chambre obtenue dans l'opération ci-dessus est d'environ 2 x 10 cellules par ml ce qui est environ 103 fois ou plus supérieur à ce que l'on obtient par cul- ture in vitro avec un incubateur à C02. On traite les cellules humaines multipliées comme dans 1' exemple 6 pour produire dg4'hEGF. La production d'hEGF est d'environ 220 Ug/ml de suspension cellfulaire. EXEMPLE 9 On implante dans les cavités allantoiques d'oeufs embryonnés que l'on a préincubés à 37 C pendant 5 jours, des cellules de la lignée lymphoblasto!de leucémique hu- maine JBL auxquelles on a conféré comme dans l'exemple 5 la capacité de production de l'hEGF de la lignée de cel- lules humaines de carcinome pulmonaire A-549. Après incu- bation des oeufs à cette températurkendant encore une se- maine, on récolte les cellules numaines multipliées. On traite les cellules humaines ainsi obtenues comme dans l'exemple 1 pour produire de l'hEGF. La production d'hEGF est d'environ 13O0/g/ml de suspension cellulaire. - 14 Revendications 1. Procéd' pour la production du facteur de crois- sance épidermique humain, (hEGF),caractérisé en ce que l'on multiplie des cellules humaines capables de pro- duire de i'hEGF et on laisse les cellules humaines mul- tipliées libérer l'hEGF. 2. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que l'on multiplie les dites cellules humaines par transplantation dans l'organisme d'un animal à sang chaud qui est alimenté de façon habituelle. 3. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'on multiplie les dites cellules humaines par mise en suspension dans un dispositif fournissant aux cellules un liquide nutritif de l'organisme d'un animal à sang chaud, qui est alimenté de façon habituelle. 4. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'on multiplie les dites cellules humaines par ense- mencement d'un milieu contenant les substances nutritives essentielles à la croissance cellulaire, et pax4'incubation du milieu. 5. Procédé selon une des revendication 1 à 4, carac- térisé en ce que les aites cellules humaines sont des cel- lules d'hybridome obtenuespar fusion cellulaire d'une lignée lymphoblastovde humaine et de cellules humaines, capables de produire l'hEGF. 6. Procédé selon une des revendicationsi à 4, carac- térisé en ce que les dites cellules humaines sont obtenues par fusion de cellules d'une lignée lymphoblastoïde humai- ne avec des cellules humaines de tumeur de la glande sous- maxillaire. 7. Procédé selon une des revendications 1 à 4, carac- térisé en ce que les dites cellules humaines sont obtenues par fusion de cellules d'une lignée lymphoblasto'de humai- ne avec des cellules humaines de carcinome du poumon. 8. Procédé selon une des revendications 1 à 4, ca- ractérisé en ce que les dites cellules humaines sont ob- tenues par fusiondas cellules d'une lignée lymphobbstol- de humaine et de cellules humaines de carcinome de la ves- sie. 9. Procédé selon la revendication 5, caractérisé en ce que ladite lignée lymphoblasto de humaine est une li- gnée lymphoblastoide leucémique humaine. 10. Procédé selon la revendication 5, caractérisé en ce que ladite lignée lymphobbstoide humaine est la lignée Namalwa, BALL-1 ou JBL. 11.Procédé selon l'une des revendications précédentes, caractérisé en ce que l'animal à sang chaud est un poulet, pigeon, chien, chat, singe, chèvre, porc, vache, cheval, cobaye, rat, hamster, souris ou souris nue, 12. Procédé selon la revendication 4, caractérisé en ce que le milieu nutritif est le milieu RPWI 1640 ou le milieu 199 de Earle. 13. Procédé selon la revendication 3, caractérisé en ce que ledit dispositif est une chambre de diffusion. 14. Procédé selon la revendication 5, caractérisé en ce que les dites cellules d'hybridome sont obtenues par fusion cellulaire avec le virus Sendal.