FR 2495159 A1 19820604 FR 8122586 A 19811202 La présente invention concerne un complexe antibiotique et ses hémiacétals utiles comme médicaments antibiotiques et anti- tumoraux et des procédés et un micro-organisme pour leur préparation. Plus particulièrement l'invention concerne un complexe antibiotique comprenant un groupe de composés étroitement apparentés, ce complexe étant appelé arbitrairement ici antibiotique PR-1350 ou simplement PR-1350, ce complexe ayant présenté des propriétés inté- ressantes relatives à son emploi en pratique clinique humaine et vétérinaire et comme additif des aliments. L'invention concerne également un procédé pour produire le PR-1350, des préparations pharmaceutiques contenant le PR-1350 et des procédés pour produire ces préparations, les souches et leurs mutants produisant le PR-1350 et l'emploi du PR-1350 dans le traitement de l'homme et des animaux. Le complexe antibiotique PR-1350 est produit par un cham- pignon isolé d'une botte de gélose contaminée au laboratoire des anti- biotiques de Leo Pharmaceutical Products à l'occasion de l'isolement de champignons produisarúdes antibiotiques. L'organisme a été caracté- risé sur le plan taxonomique par le Centraalbureau voor Schimmel- cultures, Baarn, Pays-Bas, comme une nouvelle souche d'Oidiodendron truncatum Barron, et a été déposé sous l'appellation Oidiodendron truncatum Barron, HL-972, ZP-88 sous le n CBS 475.78. Oidiodendron fait partie des Fungi imperfecti. Selon N.F. Buchwald: Fungi imperfecti, d'après la méthode de classification de Saccardo, le genre Oidiodendron appartient à la famille des Dema- tiaceae et à l'ordre des Hyphomycetales. On cultive Oidiodendron truncatum Barron, HL-972, ZP-88 dans un milieu nutritif aqueux en conditions aérobies submergées jusqu'à ce qu'on obtienne une activité antibiotique d'importance appropriée. Il convient également de noter que pour préparer des quantités limitées, on peut effectuer des cultures en surface et employer des flacons à agitation. On cultive la souche dans un milieu nutritif contenant une source de carbone, par exemple un hydrate de carbone assimilable, et une source d'azote, par exemple un composé azoté assimilable ou une matière protéique. Les sources de carbone préférées comprennent le glucose, le saccharose, le glycérol, l'extrait de malt, la dextrine et similaires. Les sources d'azote préférées comprennent l'infusion de mais, la levure, l'autolysat de levure de bière, la farine de soja, la farine de coton, la farine de poisson, la farine de mais, le lait en poudre, le produit de digestion pan- créatique de la caséine, des résidus solubles de distillation, des infusions de peptones animales, des déchets de viande et d'os et similaires. On peut de façon avantageuse utiliser des combinaisons de ces sources de carbone et d'azote. On peut également utiliser des milieux "synthétiques" purs mais on obtient souvent des rendements plus faibles. Il n'est pas nécessaire d'ajouter au milieu de fermen- tation des traces de métaux tels que le zinc, le magnésium, le manga- nèse, le cobalt, le fer et similaires,car on utilise comme composants du milieu avant sa stérilisation de l'eau du robinet et des ingré- dients non purifiés. On peut effectuer la production du complexe de l'inven- tion à une température quelconque permettant une croissance satis- faisante du micro-organisme, par exemple entre environ 12 et 350C et mieux entre environ 14 et 30C, et de préférence entre environ 16 et 240C. On maintient le pH du milieu à des valeurs permettant une croissance satisfaisante du micro-organisme, par exemple en pH 4,0 et 8,0 et de préférence entre pH 5,0 et 7,0. Généralement on obtient la production optimale du complexe en environ 2 à 10 jours selon le milieu nutritif et les conditions de fermentation utilisées. Lorsqu'on effectue la culture dans de grands fermenteurs, il est préférable d'utiliser la forme végétative plutôt que la forme sporulée du micro-organisme lors de l'ensemencement pour éviter un délai important de la production du nouveau complexe et l'immobili- sation correspondante de l'appareillage. Par conséquent, il est souhai- table de produire un inoculum végétatif dans un bouillon de culture nutritif par ensemencement de ce bouillon de culture avec une portion d'une culture inclinée. Lorsqu'on a ainsi obtenu un inoculum végétatif actif jeune, on le transfère aseptiquement dans de grands fermenteurs. Le milieu dans lequel on produit l'inoculum végétatif peut être le même que celui utilisé pour la production des nouveaux composés ou en Etre différent, dans la limite o l'on obtient un bon développement du microorganisme. Il convient de noter que bien que le procédé microbiolo- gique décrit ici concerne Oidiodendron truncatum Barron souchie HL-972, ZP-88, CBS 475.78, il n'est pas limité à ce micro-organisme particulier. L'invention englobe également d'autres souches ou mutants dudit micro- 2 4 95 15 9 bière, la farine de soja, la farine de coton, la farine de poisson, la farine de mais, le lait en poudre, le produit de digestion pan- créatique de la caséine, des résidus solubles de distillation, des infusions de peptones animales, des déchets de viande et d'os et similaires. On peut de façon avantageuse utiliser des combinaisons de ces sources de carbone et d'azote. On peut également utiliser des milieux "synthétiques" purs mais on obtient souvent des rendements plus faibles. Il n'est pas nécessaire d'ajouter au milieu de fermen- tation des traces de métaux tels que le zinc, le magnésium, le manga- nèse, le cobalt, le fer et similaires,car on utilise comme composants du milieu avant sa stérilisation de l'eau du robinet et des ingré- dients non purifiés. On peut effectuer la production du complexe de l'inven- tion à une température quelconque permettant une croissance satis- faisante du micro-organisme, par exemple entre environ 12 et 350C et mieux entre environ 14 et 30C, et de préférence entre environ 16 et 240C. On maintient le pH du milieu à des valeurs permettant une croissance satisfaisante du micro-organisme, par exemple en pH 4,0 et 8,0 et de préférence entre pH 5,0 et 7,0. Généralement on obtient la production optimale du complexe en environ 2 à 10 jours selon le milieu nutritif et les conditions de fermentation utilisées. Lorsqu'on effectue la culture dans de grands fermenteurs, il est préférable d'utiliser la forme végétative plutôt que la forme sporulée du micro-organisme lors de l'ensemencement pour éviter un délai important de la production du nouveau complexe et l'immobili- sation correspondante de l'appareillage. Par conséquent, il est souhai- table de produire un inoculum. végétatif dans un bouillon de culture nutritif par ensemencement de ce bouillon de culture avec une portion d'une culture inclinée. Lorsqu'on a ainsi obtenu un inoculum végétatif actif jeune, on le transfère aseptiquement dans de grands fermenteurs. Le milieu dans lequel on produit l'inoculum végétatif peut être le même que celui utilisé pour la production des nouveaux composés ou en Etre différent, dans la limite o l'on obtient un bon développement du microorganisme. Il convient de noter que bien que le procédé microbiolo- gique décrit ici concerne Oidiodendron truncatum Barron souche HL-972, ZP-88, CBS 475.78, il n'est pas limité à ce micro-organisme particulier. L'invention englobe également d'autres souches ou mutants dudit micro- de chlore et de brome. Le pic prédominant du spectre de masse par ionisation de champ du complexe est présent à m/e 366. La spectro- métrie de masse par choc électronique haute résolution montre que ce pic est associé à la formule C20H3006. D'autres pics importants du spectre de masse par choc électronique figurent dans le tableau A ci-après. Le complexe PR-1350 est soluble dans les solvants orga- niques courants, tels que l'acétate d'éthyle, l'éther éthylique, le benzène, l'éthanol, le méthanol, le chloroforme et similaires, mais il est relativement insoluble dans l'eau et insoluble dans les solvants constitués d'hydrocarbures saturés. Une solution du complexe PR-1350 dans l'éthanol présente un maximum d'absorption dans l'ultraviolet, x a à 230 nm (E = 304). Max 1 cm Le spectre infrarouge du complexe PR-1350 (pastille de KBr) est illus- tré par la figure 1 (absorbance en ordonnées et cm-1 en abscisses), tandis que les tableaux B et C ci-après présentent certaines absorp- tions caractéristiques des spectres de RMN 1H et 13C du complexe. Les spectres de RMN ont été enregistrés avec un spectromètre JEOL FX 100 A 99, 6 mégacycles sur une solution à 10 % dans le deutérochloroforme ou la deutéroacétone. Les déplacements chimiques sont exprimés en ppm (échelle S) avec le tétraméthylsilane comme référence. La rotation optique d'une solution du complexe PR-1350 peut varier pendant les quelques premières heures qui suivent la prépa- ration de la solution, la valeur initiale dépendant du procédé d'isole- ment du complexe, tandis que la valeur finale est indépendante de ces facteurs. Les valeurs typiques de deux charges différentes du complexe figurent dans le tableau D ci-après. On peut séparer les composants du complexe PR-1350 par chromatographie sur Sephadex LH-20 avec un mélange de chloroforme, de méthanol et d'hexane (65/10/25) comme éluant, mais, après repos de la solution, les composants séparés se retransforment rapidement en le complexe comme le- montre une chromatographie répétée (voir les détails dans l'exemple 9). Lorsqu'on dissout le complexe PR-1350 dans le méthanol et qu'on laisse au réfrigérateur pendant plusieurs jours, un hémiacétal cristallin précipite. Ce composé qui fait également partie de l'inven- tion est appelé PR-1381. Il a un point de fusion de 139-141'C et présente un maximum d'absorption ultraviolette, X ma 230 nm 1% max'>30n (E1 = 310; éthanol). Le spectre infrarouge du PR-1381 (pastille 1 cm -1 de KBr) est illustré par la figure 2, (absorbance en ordonnéeset cm' en abscisses). Les spectres de masse par ionisation de champ et par choc électronique du PR-1381 sont identiques à ceux du PR-1350. Les signaux caractéristiques observés sur le spectre de RMN H enregistré immédiatement après la dissolution du PR-1381 dans le deutérochloroforme, figurent dans le tableau E ci-après. Lorsqu'on laisse la solution dans le deutérochloroforme reposer à la température ordinaire, ces signaux initiaux disparaissent rapidement tandis que la molécule libère du méthanol et finalement après 10 heures, on observe un spectre identique à celui obtenu pour le complexe PR-1350 dans le deutérochloroforme si ce n'est un signal additionnel à = 3,48 probablement dé au méthanol libéré lors de la transformation du PR-1381 en le complexe PR-1350. On voit que le PR-1381 en solution se décompose en le complexe PR-1350 avec libération de méthanol. Ceci est confirmé de plus par l'observation que l'activité antimicrobienne du PR-1381 est identique qualitativement et quantitativement à celle du complexe PR-1350 et par les valeurs de la rotation optique du PR-1381 en fonction du temps, qui figurent dans le tableau F ci-après. Le tableau montre que bien que la valeur initiale soit très différente de celle indiquée dans le tableau D pour le complexe PR-1350, les valeurs finales des deux tableaux concordent bien. On peut, pour obtenir les hémiacétals correspondant au PR-1381, faire réagir le complexe PR-1350 avec des alcools autres que le méthanol avec ou sans solvant, ces alcools répondant à la formule générale ROH, o R représente un radical alkyle droit ou ramifié ayant 1 à 8 atomes de carbone, tel que méthyle, éthyle, propyle, isopropyle, butyle, isobutyle, tert-butyle, et les isomères connus des radicaux pentyle, hexyle,-heptyle et octyle, ces radicaux alkyles étant éven- tuellement substitués par des radicaux halogéno ou hydroxy, alcoxy, aralcoxy, aryloxy, alcanoyloxy, aralcanoyloxy, aroyloxy, mercapto, alkylthio, aralkylthio, arylthio, alcanoylthio, aroylthio, azido, nitro, cyano, thiocyano, hydroxycarbonyle, alcoxycarbonyle, aryloxycarbonyle, amino, alkylamino, dialkylamino, arylamino, alcanoyl- amino, et aroylamino; R peut de plut représenter un radical alcényle ou alcynyle comportant 2 à 6 atomes de carbone, tel qu'allyle, crotyle, ou propargyle, un radical cycloalkyle comportant 3 à 7 atomes de carbone dans le cycle alicyclique, tel que cyclopropyle, cyclobutyle, cyclo- pentyle, cyclohexyle, cycloheptyle, ou leurs analogues mono- ou di- substitués par un radical halogéno, alkyle inférieur, alcoxy inférieur ou hydroxy, un radical aralkyle, hétérocycloalkyle ou aryle, tel que benzyle, phényléthyle, phényle ou furfuryle, ces radicaux étant éven- tuellement substitués par des radicaux halogéno, nitro, alkyle infé- rieur, hydroxy ou alcoxy. Comme le PR-1381, les composés obtenus selon une telle réaction ont une activité antibiotique et entrent dans le cadre de l'invention. L'activité antimicrobienne in vitro du complexe PR-1350 a été déterminée vis-à-vis de nombreux organismes d'essai, selon des méthodes standards d'essai par dilution en bouillon ou dilution sur gélose. Les concentrations minimales inhibitrices (CMI) sont regroupées dans le tableau G ci-après. Le PR-1350 ne présente pas de résistance croisée avec l'un quelconque des antibiotiques utilisés en médecine, tels que les pénicillines, les céphalosporines, les aminoglycosides, les tétra- cyclines, l'acide fusidique, le chloramphénicol, l'érythromycine, la Novobiocine ou les lincomycines. Le PR-1350 a des effets bactéricides puissants vis-à-vis de toutes les bactéries mentionnées dans le tableau G. De plus le PR-1350 s'est révélé posséder une activité antitumorale. Lorsqu'on a administré par voie intrapéritonéale du PR-1350 pendant 9 jours consécutifs (1-9) à quatue teneurs A des souris inoculées par voie intrapDéritonéale avec o106 cellules de la leucémie P-388 le jour O, on a observé pour toutes les doses une inhibition significative de la tumeur comme le montre le tableau H ci-après. Les composés de l'invention se sont révélés avoir un faible degré de toxicité chez la souris et le rat. On sait qu'un micro-organisme isolé de la culture d'une souche d'Oidiodendron truncatum Barron a une activité antibactérienne et fongicide (Marchisio, Abstracts of Mycology, [Vol. 12(5)] 4, 50697, d'Allionia 21,67,1976). L'auteur indique que cette activité est de la m&me importance modérée vis-a-vis de Staphylococcus aureus que vis-à-vis d'Escherichia coli et qu'elle est importante vis-à-vis de la levure Candida albicans. L'auteurconclut que le principe actif semble correspondre à l'antibiotique Fuscine, produit par.. Oidiodendron fuscum Robak, décrit par S.E. Michael (Biochem. J. 43,528,1948). Le spectre d'activité antibiotique du PR-1350 indiqué ci- dessus montre une activité importante contre Staphylococcus aureus, une activité 10 à 100 fois moindre contre Escherichia coli et pas d'activité du tout contre Candida albicans. Il est donc évident que le principe antibiotique décrit par Marchisio est différent du PR-1350. Un autre objet de l'invention consiste en des prépara- tions pharmaceutiques utiles pour le traitement des maladies infec- tieuses et comme agents antitumoraux en pratique humaine et vétéri- naire. Les compositions de l'invention contiennent comme compo- sant actif, le PR-1350 ou un de ses hémiacétals, par exemple le PR-1381, avec des véhicules et/ou-diluants pharmaceutiques solides ou liquides. Dans ces compositions, le rapport de la matière à acti- vité thérapeutique à la substance véhicule peut varier entre 1 7. et 7. en poids. On peut présenter les compositions sous diverses formes thérapeutiques telles que des granulés, des comprimés, des pilules, des dragées, des suppositoires, des capsules, des comprimés à libé- ration lente, des suspensions, des injections ou, dans le cas des mélanges, les conditionner dans des flacons, des tubes ou des réci- pients semblables. On peut utiliser, pour préparer des compositions contenant les composés de l'invention, des véhicules organiques ou minéraux solides ou liquides et/ou effectuer une administration locale. L'eau, la gélatine, le lactose, l'amidon, le stéarate de magnésium, le talc, les huiles et graisses végétales et animales, l'alcool benzy- lique, les gommes, le polyalkylèneglycol, la vaseline, le beurre de cacao, la lanoline, et d'autres véhicules connus des médicaments conviennent tous, tandis que l'on peut utiliser comme agents auxili- aires des agents stabilisants, des agents mouillants, des agents émul- sifiants, des sels pour modifier la pression osmotique ou des tampons pour assurer un pH approprié à la composition. De plus, la composition peut contenir d'autres composants à activité pharmaceutique que l'on peut administrer de façon appro- priée avec le PR-1350 ou un de ses hémiacétals pour traiter des mala- dies infectieuses ou comme agents antitumoraux, tels que d'autres antibiotiques ou agents antitumoraux appropriés, en particulier de tels agents susceptibles d'accroître l'activité et/ou d'empocher l'apparition d'une résistance. D'autres composés que l'on peut de façon avantageuse combiner aux composés de l'invention, en particulier dans les préparations locales, comprennent des corticostéroides, tels que l'hydrocortisone, le triamcinolone ou le fluocinolone. Dans le cas des granulés, des comprimés, des capsules ou des dragées, la composition pharmaceutique de l'invention contient de façon appropriée 25 % à 95 % des composés de l'invention et, dans les suspensions orales, la quantité correspondante est de façon appropriée de 2 à 25 %. Pour la voie parentérale, on administre de préférence les composés de l'invention par injection de compositions pharmaceutiques contenant 1 à 20 % d'ingrédient actif. Comme précédemment indiqué, on peut incorporer les compo- sés de l'invention à des formes pharmaceutiques telles que des sus- pensions, des poudres, des pommades et des crèmes. Une préparation pharmaceutique pour le traitement oral peut &tre sous forme d'une suspension contenant les composés à raison de 20 à 100 mg par litre de véhicule. Une préparation pharmaceutique pour le traitement local peut Etre sous forme d'une poudre, d'une pommade, d'une crème ou d'une lotion contenant les composés de l'invention à raison de 0,5 à 10 g pour 100 g de préparation. L'invention a également pour objet le choix d'une dose des composés de l'invention que l'on peut administrer pour obtenir l'activité désirée sans effetssecondaires simultanés. En thérapeu- tique humaine, on administre de façon appropriée les composés de l'invention (à des adultes) sous forme de doses unitaires n'en conte- nant pas moins de 50 mg et pas plus de 1000 mg, de préférence de 250 à 750 mg. On entend par dose unitaire, une dose unique que l'on peut administrer à un malade et qu'il est facile de manipuler et de conditionner, qui demeure sous forme d'une dose unitaire physiquement stable et contient soit les composés tels quels, soit un mélange de ces composés avec des diluants ou véhicules pharmaceutiques solides ou liquides. Sous forme d'une dose unitaire, on peut administrer les composés en une ou plusieurs prises journalières à des intervalles appropriés-selon, bien entendu, l'état du malade et la prescription du praticien. Dans le traitement par voie générale, la dose journa- lière est comprise entre 0,25 et 4 g par jour, de préférence entre 0,5 et 3 g. Dans le traitement par voie locale, on entend par dose unitaire, une dose unique que l'on peut administrer localement au malade et appliquer à la zone infectée du malade à raison de 0,1 mg à mg, de préférence de 0,2 mg à 1 mg des composés de l'invention par centimètre carré. Si la composition doit atre injectée, elle peut être sous forme d'une ampoule scellée, d'un flacon ou d'un récipient semblable contenant une solution ou dispersion aqueuse ou huileuse injectable, convenant à la voie parentérale, de l'agent actif sous forme d'une dose unitaire. Les préparations parentérales sont particulièrement utiles pour le traitement des états dans lesquels une réponse rapide au traitement est souhaitable. Dans le traitement continu de malades atteints de maladies infectieuses, les comprimés ou les capsules peuvent constituer la forme appropriée de préparation pharmaceutique par suite de l'effet prolongé que l'on obtient lorsqu'on administre le médicament par voie orale en particulier sous forme de comprimés à libération lente. Dans le traitement des maladies infectieuses ou dans la lutte contre les tumeurs, ces comprimés peuvent de façon avantageuse contenir d'autres composants actifs comme précédemment indiqué. L'invention a également pour objet un procédé pour traiter des malades atteints de maladies infectieuses ou de tumeurs, le procédé consistant à administrer à des malades de 0,25 à 4 g par jour, de préférence de 0,5 g à 3 g par jour d'agent actif. De préfé- rence on administre l'agent actif sous forme des doses unitaires précitées. L'invention est illustrée par les exemples non limitatifs suivants. Exemple 1 Pour obtenir une culture végétative, on transfère des spores d'Oidiodendron truncatum Barron, souche HL-972, ZP-88 d'une gélose inclinée de 8 jours dans des erlenmeyers de 500 ml contenant 100 ml de bouillon stérile ayant la composition suivante: Infusion de mais 20 g/litre KH2PO 42 H20 10 g/litre MgS04, 7 H20 0,5 g/litre Saccharose 50 g/litre Eau du robinet q.s. 1000 ml (pH 6,7) et on cultive en aérobiose à 28 C pendant 3 jours sur un agitateur à va-et-vient, On transfère la matière d'ensemencement ainsi obtenue dans des flacons à agitation de 2 litres contenant 250 ml d'un milieu nutritif ayant la composition cidessous, avec une concentration de l'inoculum de 8 %: Extrait de malt 20 g/litre Saccharose 20 g/litre Farine de soja 7,5 g/litre Farine de viande et d'os 7,5 g/litre K2HPO4 1 g/litre Eau du robinet q.s. 1000 ml (pH 6,2) On effectue la fermentation sur une table d'agitation par va-et-vient (112 oscillations par minute) à 28 C et à un pH du milieu nutritif d'environ 6,0. On détermine l'activité antibiotique pendant la fermentation selon la méthode des disques sur gélose avec plusieurs organismes d'essai comme indiqué dans le tableau I ci-après. Exemple 2 Pour obtenir une culture végétative, on transfère des spores d'Oidiodendron truncatum Barron souche HL-972, ZP-88, d'une gélose inclinée de 8 jours dans des flacons à agitation de 2 litres (première génération) contenant 250 mi d'un bouillon stérile ayant la composition suivante: Infusion de mats 20 g/litre Saccharose 50 g/litre KH2P04, 2 H2 10 g/litre MgSO4, 7 H20 0,5 g/litre Eau du robinet q.s. 1000 ml (pH 6,7) et on cultive en aérobiose à 20 C pendant 3 jours sur un agitateur à vaet-vient. On transfère la matière d'ensemencement ainsi obtenue dans plusieurs récipients de culture (deuxième génération) contenant le mtme bouillon que pour la première génération. On effectue ce stade de fermentation végétative en conditions aérobies et en agitant à une température de 20 C pendant 2 jours. Dans un récipient en acier inoxydable de 1,5 m3, on introduit 1,0 m3 d'un milieu de culture ayant la composition suivante: Extrait de malt 20 g/litre Saccharose 20 g/litre Farine de soja 7,5 g/litre Farine de viande et d'os 7,5 g/litre K2HP04 1 g/litre Eau du robinet q.s. 1000 ml dont on ajuste le pH à 6,0 avant stérilisation puis on stérilise à 120 C pendant 45 minutes et après refroidissement à 20 C, on ensemence avec le produit de deuxième génération à la concentration de 3 %. Pendant la fermentation, on fait passer de l'air stérile à travers le milieu à raison de 0,8 m3/min avec agitation (110 tr/min). On poursuit la fermentation pendant 70 heures. On limite la tendance au moussage par emploi d'un agent antimousse de type silicone. On maintient le pH à 6,0 pendant la fermentation, par addition d'acide phosphorique. On détermine l'activité antibiotique d'échantillons de culture pendant la fermentation par mesure de la zone d'inhibition observée selon la méthode des cupules sur gélose avec Staphylococcus aureus comme orga- nisme d'essai. Exemple 3 Isolement du complexe antibiotique PR-1350 On filtre le bouillon de fermentation préparé comme décrit dans l'exemple 2, avec du kieselguhr comme aide de filtration. On fait passer le filtrat (900 litres) à un débit de 2 1/min à travers une colonne préparée avec 4,4 1 de Diaion HP-20 (hauteur: 56 cm, diamètre: 10 cm; la résine a été traitée avant l'emploi avec de l'eau, de l'hydroxyde de sodium aqueux 2N, de l'eau, du méthanol, de l'acide chlorhydrique aqueux 2N, de l'eau, du méthanol et de l'eau). On lave la colonne avec 20 litres d'eau, 12 litres de méthanol aqueux à 25 %, 12 litres de méthanol aqueux à 50 % et 12 litres de méthanol aqueux à 75 % puis on élue avec du méthanol. On recueille des fractions de 2 litres. On combine les fractions 2 à 7 qui correspondent à la majorité de l'activité antibactérienne et on les évapore sous vide. On extrait le résidu avec 400 ml de méthanol et,après filtration, on évapore le méthanol. On dissout le résidu dans 50 ml de méthanol et on ajoute 800 ml d'éther à la solution agitée. On sépare par filtration le précipité formé et on concentre le filtrat sous vide pour obtenir une huile qu'on dissout dans 20 ml de méthanol et qu'on soumet à une chromatographie sur une colonne de 600 ml de Diaion HP-20 (hauteur cm, diamètre: 2,9 cm). On élue les fractions actives avec un mélange de méthanol et d'eau (95/5), on combine et on concentre sous vide pour obtenir 10,1 g d'une huile. On dissout 5,7 g de ce produit brut dans 10 ml de méthanol et on applique à une colonne de Sephadex LH-20 (hauteur cm; diamètre: 29 cm) et on élue la colonne avec du méthanol. On recueille les fractions actives (150 ml) et on les évapore à sec sous vide pour obtenir 4,2 g d'une huile que l'on dissout dans un mélange de 100 ml d'éther et 200 ml de cyclohexane. On traite la solu- tion avec 3 g de Norit, on filtre et on évapore sous vide à un volume de 50 ml. On ajoute en agitant 200 ml de çyclohexane et on sépare par filtration le précipité formé, on lave avec du cyclohexane et on sèche pour obtenir le complexe antibiotique sous forme d'une poudre amorphe incolore. Par concentration de la liqueur mère à 50 ml, et filtra- tion, on obtient une nouvelle quantité du complexe. Exemple 4 __r2rimés contenant chacun 250 - ___dePR-1350 Ingrédients PR-1350 250 g Lactose 165 g Polyvinylpyrrolidone 7 g Amidon de mais 50 g Talc 25 g Stéarate de magnésium 3 g On fait passer le PR-1350 et le lactose à travers un tamis de 0,84 mm d'ouverture de maille et on mélange pendant 15 minutes. Ensuite on humidifie le mélange pulvérulent avec une solution de poly- vinylpyrrolidone dans l'eau. On fait passer la masse humide à travers un tamis de 2,00 mm d'ouverture de maille puis on sèche à 38 C. Après évaporation de l'humidité, on divise les granules sur un tamis de 1,18 mm d'ouverture de maille et on mélange avec l'amidon de mals, le talc et le stéarate de magnésium. On comprime les granulés en comprimés pesant 0,50 g avec des poinçons et des matrices de 12,7 mm pour obtenir 1000 comprimés contenant chacun 250 mg de PR-1350. Exemple 5 Casules_ contenant chacune 250 gde PR-1381 Ingrédients: PR-1381 250 g Amidon 27 g Stéarate de magnésium 3 g On fait passer les ingrédients à travers un tamis de 0,250 mm d'ouverture de maille et on mélange pendant 15 min. On intro- duit le mélange dans des gélules avec une machine semi-automatique agitée avec un vibreur. Chaque gélule contient 280 mg du mélange, ce qui correspond à 250 mg de PR-1381. Exemple 6 Pomadecontenant 10_m_ de PR-1350_pa__rle Ingrédients: PR-1350 10 g Cholestérol 30 g Alcool stéarylique 30 g Butylhydroxyanisole 0,1 g Cire blanche 80 g Vaseline blanche 850 g On fond ensemble au bain-marie bouillant l'alcool stéary- lique, la cire blanche et la vaseline blanche. Ensuite on ajoute le cholestérol et le butylhydroxyanisole et on les dissout dans le mélange fondu que l'on agite jusqu'à refroidissement. On fait passer le PR-1350 à travers un tamis de 0,177 mm d'ouverture de maille et on le triture progressivement avec la base pour pommade. Exemple 7 Isolement du complexe antibio tigue PR-1350 On filtre avec du kieselguhr comme aide de filtration, un bouillon de fermentation préparé comme décrit dans l'exemple 1. On extrait le filtrat (4 litres) avec deux portions d'éther éthylique (2 x 1 litre). On lave les phases organiques combinées avec de l'eau, on sèche et on évapore sous vide pour obtenir un produit brut qu'on soumet à une purification complémentaire par chromatographie sur du Diaion HP-20 avec un mélange de méthanol et d'eau conmme éluant puis on chromatographie sur du Sephadex LH-20 avec du méthanol comme éluant et finalement on précipite dans un mélange d'éther et de cyclohexane comme décrit en détail dans l'exemple 3. Exemple 8 Préparation du PR-1381 On laisse séjourner à 5 0C une solution de 100 mg du complexe PR-1350 préparé comme décrit dans l'exemple 3 dans 0,3 ml de méthanol. En 72 heures, des cristaux précipitent lentement dans la solution. On ajoute ensuite 5 ml d'éther diisopropylique et on recueil- le les cristaux par filtration, on les lave à l'éther diisopropylique et on les sèche pour obtenir le PR-1381; F. 139-141 C. Exemple 9 s2aration..descom2osants du complexe PR-1350 A. On soumet 300 mg du complexe PR-1350 préparé comme décrit dans l'exemple 3, à une chromatographie sur une colonne de Sephadex LH-20 (hauteur 90 cm; diamètre 2,9 cm) avec un mélange de chloroforme, de méthanol et d'hexane (65/10/25) comme éluant. On recueille tout d'abord une portion de 280 ml de l'éluat puis on recueille des fractions de 15 ml. On dilue des portions de 10/ul de chaque fraction avec 1 ml de méthanol et on détermine l'activité vis-à-vis de Staphy- lococcus aureus selon la méthode des cupules sur gélose. Les résultats figurent dans le tableau. Numéro des fractions Zone d'inhibition À,, il 32; 5 31,5 o o i i B. On regroupe les fractions n 4 à 6 obtenues en A du présent exemple et on les évapore sous vide pour obtenir 100 mg d'un résidu huileux qu'on applique à nouveau à la colonne de Sephadex LH-20 utilisée en A et on élue la colonne avec un mélange de chloroforme, de méthanol et d'hexane (65/10/25). Après avoir recueilli les 300 premiers ml de l'éluat en une seule portion, on recueille des fractions de 12 ml. On détermine l'activité antistaphylococcique des fractions selon la méthode décrite en A du présent exemple. Les résultats figurent dans le tableau. Numéro des fractions Zone d'inhibition 1 22 2 28 3 31,.5 4 30 29 6 27,5 7 21 8 24 *9 26 22 11 21 12 21 13 19 14 18 20 16 24 17 29 18 21 19 16 C. On regroupe les fractions n 11 à 15 de A. du présent exemple et on les évapore sous vide pour obtenir 175 mg d'un résidu huileux qu'on applique à la colonne de Sephadex LH-20 utilisée en A et B du présent exemple et on élue la colonne avec un mélange de chloro- forme, de méthanol et d'hexane (65/10/25). Après avoir recueilli les 285 premiers ml de l'éluat en une seule portion, on recueille des frac- tions de 13 ml. On analyse l'activité antistaphylococcique des frac- tions comme décrit en A. du présent exemple. Les résultats figurent dans le tableau. Numéro des fractions Zone d'inhibition 1 15 2 - 20 3 29 4 30 26 6 24 7 20 8 20 9 20 22 11 22,5 12 31, 5 13 29,5 14 30 30,5 16 30 17 25 18 18 19 17 o Les résultats de cet exemple montrent quebien que les composants du complexe PR-1350 puissent Etre au moins partiellement séparés, les composants isolés sont rapidement transformés en le complexe PR-1350 d'origine. Bien entendu, diverses modifications peuvent être appor- tées par l'homme de l'art aux dispositifs ou procédés qui viennent d'être décrits uniquement à titre d'exemples non limitatifs sans sortir du cadre de l'invention. TABLEAU A Pics caractéristiques du spectre de masse par choc électronique du complexe PR-1350. m/e Formule C20H3006 C14H210 C14H200 C14H21 et C13H17 TABLEAU A (suite) m/e TABLEAU B Signaux caractéristiques du spectre de RMN H du complexe antibiotique PR1350 (dans la deutéroacétone). Déplacement Multiplicité Intensité chimique relative 9,28 s 1 6,63*) t large 1 2,41 m 2 1,77 m 1,21 s 0,96 s *)Ce signal apparalt à 6,54 ppm lorsqu'on détermine le spectre sur une solution du complexe PR-1350 dans le deutérochloroforme. TABLEAU C Signaux caractéristiques du spectre de RMN 13C du complexe antibiotique PR-1350 (dans le deutérochloroforme). i Déplacement I chimique Multiplicité _ _ __ ' _ m_ À! 193,8 d 151,9 s 151,5 d 44,1 37,6 36,3 29.3 28,6 ,9 21,6 17,8! ,8 l TABLEAU D Rotation spécifique du complexe PR-1350 (c = 1; éthanol) Temps écoulé après la prépa- ration de la solution (heures) a ii.f . ... mi i charge a 0 +82,1 1 +85,6 2 +86,5 3 +86,6 4 +86,6 charge b 0 +72,0 1 +80,0 2 +85,0 3 +85,5 4 +85,6 TABLEAU E Signaux caractéristiques du spectre de RMN 1Hdu PR-1381 enregistré immédiatement après la préparation d'une solution dans le deutéro- chloroforme. Déplacement Multiplicité Intensité relative chimique 9,28 s 1 6,54 t 1 ,31 s large 1 4,58 t 1 3,40 s 3 3,25 d (J=4,5) 1 2,82 d (J=4,5) 1 2,35 m 2 1,77 m 1,21 s 3 1,00 d (J=6) 3 0,90 s 3 2 4 9 5 159 TABLEAU F Rotation spécifique du PR-1381 (c = 0,2; éthanol) Temps écoulé après la préparation de 18 solution (heures) [a]D 0 +102,8 1/2 + 97,2 1 '+ 94,0 2 + 91,6 + 89,6 TABLEAU G Activité antibactérienne in vitro du complexe antibiotique PR-1350 CMI Organisme Souche) g/ml ii. Staphylococcus aureus CJ 0O1 Staphylococcus aureus CJ85 0,1 Staphylococcus aureus (résistant d Pen, Strep.) CJ9 01 Staphylococcus aureus (résistant à Pen. Strep. Tetrac. CJllO 0,1 Eryt. Methic.) Diplococcus pneumonia EA 03 I. ____________________________________________________ ___________________O. TABLEAU G (suite 1) Organisme Souche *) Cg/ml So..e.*, Streptococcus pyogenes NCTC8198 EC 0,1 Streptococcus faecalis ATCC8043 EI3 0,3 Corynebacterium xerosis NCTC9755 FF 0.03 Listeria monocytogenes NCTC7973 FT 0.1 Erysipelothrix insidiosa NCTC8163 FU 0.1 Bacillus subtilis KA2 0.1 Pseudomonas aeruginosa BA2 10 Pseudomonas aeruginosa (Psl8s) BA14 30 Pseudomonas aeruginosa (mcPhillip) BAI5 10 Pseudomonas stutzeri BC 3 Vibrio comma NCTC8367 BQ 0.03 Alcaligenes faecalis GA 1 Escherichia coli HA 3 Escherichia coli HA2 10 Escherichia coli HAll 10 Escherichia coli B AS19 HA47 0.3 Escherichia coli W 3110 R HA58 3 Klebsiella pneumoniae HE 3 Klebsiella pneumoniae ATCC10031 HE4 0.3 Klebsiella pneumoniae ATCC10273 HE7 10 TABLEAU G (suite 2) Organisme Souche*) CMI Souche _...g m Klebsiella aerogenes 1082E HC7 10 Enterobacter cloacae P99 HC8 10 Serratia marcescens ATCC14756 HG4 10 Proteus vulgaris ATCC13315 HJ 3 Proteus mirabilis HJ3 10 Salmonella paratyphi A NCTC8002 HK 30 Salmonella schotmuelleri NCTC5704 HL 30 Salmonella typhimurium NCTC5710 HL2 10 Salmonella abortus-equi NCTC5727 HL3 3 Salmonella hirschfeldii NCTC5733 HM 1 Salmonella cholerae-suis NCTC5735 HM2 10 Salmonella typhosa NCTC5760 HN 3 Salmonella enteritidis NCTC3045 HN2 10 Shigella dysenteriae NCTC8217I HR 10 Shigella flexneri NCTC 8192 HT 3 Yersenia enterocolitica HY 3 Bacteroides fragilis JA2 1 Chromobacterium violaceum NCTC9371 LQ 0.3 Neisseria gonorrhoeae DA2 1 (résistant à Sullathiaz.) J Z495159 TABLEAU G (suite 3) O!gani sme J Souche > ig/rn1 ) CMI Organisme Souche J g/ml . Neisseria gonorrhoeae Neisseria gonorrhoeae (résistant à Pen.) Neisseria gonorrhoeae (résistant à Pen.) Neisseria meningitidis Haeminophilus influenzae Haemophilus influenzae Haemophilus influenzae NCTC8365 NCTC 6489 ATCC9007 Haemophilus influenzae (Résistant a l'ampicilline) Haemophilus influenzae (résistant a l'ampicilline) Haemophilus parahaemolyticus Bordetella pertussis Propionibacterium acnes NCTC737 Mycobacterium paratuberculosis NCTC 6926 Mycobacterium phlei Candida albicans ATCCI0231 DA3 DA9 DA40 DB IX3 IX5 IX12 IX23 IX29 IX7 IY3 FN MD MO ZA i L o.3 0.3 0.3 0.1 0.1 3.2 1.0 >100 I I IlU TABLEAU G (suite 4) Organisme f Souche *) CMI _gei/mi Candida albicans ZA2 >100 Candida parakrusei ZA3 >100 Candida guilliermondii CBS566 ZA6 >100 Candida pseudotropicalis CBS607 ZAil >100 Candida tropicalis CBS 94 ZA13 >100 Saccharomyces ellipsoideus ZZ >100 Aspergillus fumigatus CBS ZM 2100 Trichophyton mentagrophytes CBS ZO >100 Trichophyton mentagrophytes var. Z02 >100 interdigitale CBS Trichophyton rubrum ATCC10272 Z07 >100 Trichophyton schônleini Z010 >100 Tetrahymena pyriformis CU-1630/1-W 10 ) Les numéros correspondent & la collection de cultures de Leo Pha-maceutical Products. TABLEAU H Activité du PR-1350 contre la leucémie lymphocytaire P-388 chez la souris. Dose (mg/kg) T/t *) 250 200 164 62,5 160 31,25 163 ) T/t est le rapport de la durée moyenne de survie des souris trai- tées (6 souris par dose) à celle des témoins non traités exprimés en pourcentage. L'activité correspond à des valeurs de T/t > 125. TABLEAU I Organisme d'essai Zone d'inhibition (mm) Organisme d'essai 2 jours 6 jours Streptococcus pyogenes 28 33 Staphylococcus aureus 32 36 Corynebacterium xerosis 33 37 Escherichia coli trace (16) Klebsiella pneumoniae 17 20 Pseudomonas aeruginosa 17 20 Neisseria gonorrhoeae 35 39 Candida albicans O O Tricophyton mentagrophytes O O Aspergillus clavatus O O RE V E N D I CATI ONS 1. Complexe de composés étroitement apparentés, ce complexe étant appelé PR-1350, et ses hémiacétals formés avec des alcools répondant à la formule générale ROH, o R représente un radical alkyle droit ou ramifié ayant 1 A 8 atomes de carbone, tel que méthyle, éthyle, propyle, isopropyle, butyle, isobutyle, tert- butyle, les isomères connus des radicaux pentyle, hexyle, heptyle et octyle, ces radicaux alkyles étant éventuellement substitués par des radicaux halogéno ou hydroxy, alcoxy, aralcoxy, aryloxy, alcanoyloxy, aralcanoyloxy, aroyloxy, mercapto, alkylthio, aralkyl- thio, arylthio, alcanoylthio, aroylthio, azido, nitro, cyano, thiocyano, hydroxycarbonyle, alcoxycarbonyle, aryloxycarbonyle, amino, alkylamino, dialkylamino, arylamino, alcanoylamino, et aroylamino; R pouvant de plus représenter un radical alcényle ou alcynyle ayant 2 à 6 atomes de carbone, tel qu'allyle, crotyle ou propargyle, un radical cycloalkyle ayant 3 à 7 atomes de carbone dans le cycle alicyclique,tel que cyclopropyle, cyclobutyle, cyclo- pentyle, cyclohexyle, cycloheptyle ou des analogues mono- ou disubstitués par un radical halogéno, alkyle inférieur, alcoxy inférieur ou hydroxy, un radical aralkyle, hétérocycloalkyle ou aryle, tel que benzyle, phényléthyle, phényle ou furfuryle, ces radicaux étant éventuellement substitués par des radicaux halogéno, nitro, alkyle inférieur, hydroxy ou alcoxy, le complexe PR-1350 étant caractérisé par les propriétés physicochimiques suivantes: 1. spectre infrarouge du PR-1350: comme illustré par la figure 1 2. rotation optique du PR-1350 mesuree 4 h après la préparation de la solution: [a]20 = + 85-90 (c=l, éthanol) 3. spectre de masse par choc électronique (m/e): 366, 205, 204, 189, 187, 175, 161, 159, 149, 147, 145, 135, 133, 131, 121, 119, 109, 107, 105, 95, 93, 91, 81, 79, 77, 69, 67, 55, 44, 41 4. spectre de RMN 1H (solution à 10% dans la deutéroacétone): 9,28 (s), 6, 63 (t large), 2,41 (m), 1,77 (m), 1,21 (s), 0,96 (s) 5. spectre de RMN 3C (solution à 10% dans le deutérochloroforme): 193,8 (d), 151,9 (s), 151,5 (d), 44,1, 37,6, 36,3, 29,3, 28,6, ,9, 21,6, 17,8, 15,8 1% 6. maximum d'absorption ultraviolette à 230 nm (E1 = 304) en (E cm solution dans l'éthanol 7. solubilité: soluble dans les solvants organiques courants, tels que l'acétate d'éthyle, l'éther éthylique, le benzène, l'éthanol, le méthanol et le chloroforme; relativement insoluble dans l'eau; et insoluble dans les solvants de typeshydrocarbures saturés. 2. Substance selon la revendication 1, caractérisée en ce qu'elle consiste en un hémiacétal du PR-1350 et du méthanol, cette substance étant appelée PR-1381 et présentant les caractéris- tiques physico-chimiques suivantes: 1. analyse élémentaire: C = 66,307, H = 8,50%7 2. point de fusion: 139-141 C 3. spectre infrarouge comme illustré sur la figure 2 4. rotation spécifique (c=0,2, éthanol) O h après la préparation: [a]D20 =+ 102,8 5. rotation spécifique (c=0,2, éthanol) 10 h après la préparation: [a]20 = + 89, 6 D 6. spectre de masse par choc électronique (m/e): identique au spectre du PR-1350 selon la revendication 1 7. spectre de RMN 1H enregistré immédiatement après la préparation d'une solution à 10% dans le deutérochloroforme: 9,28 (s), 6, 54 (t), 5,31 (s large), 4,58 (t), 3,40 (s), 3,25 (d, J=4,5), 2,82 (d, J=4, 5), 2,35 (m), 1,77 (m), 1,21 (s), 1,00 (d, J=6), 0,90 (s) 8. maximum d'absorption ultraviolette à 230 nm (E1% = 310) en 1 cm solution dans l'éthanol. 3. Substance selon l'une des revendications 1 ou 2, caractérisée en ce qu'elle est sous une forme pratiquement pure. 4. Procédé pour préparer un composé selon la revendica- tion 1, caractérisé en ce qu'il consiste a cultiver une souche d'Oidiodendron truncatum Barron dans un milieu de culture pour accumuler ladite substance dans le bouillon de culture eta en récupérer ladite substance. 5. Procédé selon la revendication 4, caractérisé en ce qu'on utilise Oidiodendron truncatum Barron, HL-972, ZP-88 (CBS 475.78). 6. Procédé selon la revendication 4, caractérisé en ce qu'on utilise une autre souche d'Oidiodendron truncatum Barron choisie parmi le groupe constitué par les souches déposées au Centraalbureau voor Schimmelcultures, Baarn, Pays-Bas sous les numéros CBS 629.70, CBS 222.65, CBS 115.65 et CBS 114.65. 7. Procédé selon la revendication 4, caractérisé en ce qu'on utilise un mutant d'une des souches citées dans les revendica- tions 5 et 6, ledit mutant étant produit selon des procédés connus de l'homme de l'art. 8. Procédé selon la revendication 4, pour purifier la substance accumulée dans le bouillon de culture, caractérisé en ce qu'il consiste à extraire le complexe PR-1350 du milieu de fermen- tation, & concentrer l'extrait puis à purifier le produit brut. 9. Procédé selon la revendication 8, caractérisé en ce qu'on récupère le complexe PR-1350 dans le milieu de fermentation par extraction avec un solvant organique et concentration de l'extrait ou par absorption du complexe PR-1350 présent dans le milieu de fermentation sur une résine macroréticulaire telle que l'Amberlite XAD-2 ou le Diaion HP-20, à un pH compris entre 2 et 10 puis élution avec un solvant organique tel que le méthanol et évaporation du solvant sous vide, puis purification du produit brut ainsi obtenu par chromatographie sur une résine macroréticulaire, par exemple de Diaion HP-20, avec des mélanges de méthanol et d'eau comme éluants, ou sur du Sephadex LH-20 avec du méthanol ou des mélanges de chloroforme, de méthanol et d'hexane comme éluants. 10. Procédé pour produire un hémiacétal selon la revendi- cation 1, caractérisé en ce qu'il consiste à mélanger le complexe PR-1350 et un alcool de formule ROH comme défini dans la revendica- tion 1. 11. Procédé pour préparer un hémiacétal de PR-1381 selon la revendication 2, caractérisé en ce qu'il consiste a dissoudre le complexe PR-1350 dans le méthanol et à isoler le produit cristallin par filtration. 12. Procédé pour préparer le compieze PR-1350 selon la revendication 1, caractérisé en ce que l'on dissout un hémiacétal du PR-1350 dans un solvant organique différent de ROH comme défini dans la revendication 1, on abandonne la solution pendant un temps approprié puis on précipite le complexe de PR-1350 ainsi formé. 13. Nouveaux médicaments utiles notamment comme anti- biotiques et agents antitumoraux, caractérisés en ce qu'ils contiennent comme produit actif au moins un des composés selon l'une des revendications 1 ou 2. 14. Médicaments selon la revendication 13, caractérisés en ce qu'ils sont conditionnes en vue de l'administration de quantités correspondant à environ 50 a 1000 mg du produit actif par voie orale, parentérale ou locale. 15. Produit pour la mise en oeuvre du procédé selon la revendication 4, caractérisé en ce qu'il consiste en Oidiodendron truncatum Barron, HL-972, ZP-88 (CBS 475.78). 16. Produit selon la revendication 15, caractérisé en ce qu'il est dans ou sur un milieu stérile.