FR 2490827 A1 19820326 FR 8117488 A 19810916 La présente invention est relative à un papier filtre témoin destiné au diagnostic de l'homocystinurie, type de trouble congénital du métabolisme des amino aci- des, et plus particulièrement à un papier filtre témoin du type mentionné ci-dessus,qui est utilisé pour diagnosti- quer l'homocystinurie, en mesurant la concentration de méthionine dans le sang et qui peut se conserver pendant longtemps sans se détériorer d'une manière décelable. Les troubles congénitaux du métabolisme des amino- acides, tels que la phénylcétonurie, l'histidinémie et l'hmocystinurie, sont des troubles dangereux conduisant à des déficiences mentales ou à la cirrhose du foie. Mais, récemment, on a pu soigner et sauver ces patients atteints de tels troubles congénitaux si on identifie ces troubles pendant la prime enfance et si les patients sont traités promptement et d'une manière appropriée, par exemple en les mettant au-régime. Pour identifier ces troubles, il est nécessaire que la concentration d'un aminoacide particulier dans le sang d'un nouveau né soit mesurée dans la semaine de sa naissance afin de déterminer si cette concentration est ou non anormalement élevée. A cet effet, on souhaite dis- poser d'une essai de dépistage simple et fiable. L'essai qui est utilisé le plus généralement pour déterminer la concentration est l'essai d'inhibition bactérien de Guthrie. Le principe de cet essai est le suivant: Quand on cultive bacillus subtilis dans un milieu de culture gélosé, si ce milieu contient une quantité dé- terminée à l'avance d'un inhibiteur de métabolisme qui agit sur un aminoacide qui est indispensable à la crois- sance bacillus subtilis, la croissance de bacillus subti- lis est inhibée par l'action de l'inhibiteur de métabo- lisme. Mais si l'on place une feuille de papier filtre imprégnée du sang échantillon sur le mi- lieu de culture gélosé mentionné ci-dessus et contenant l'inhibiteur de métabolisme et si l'on cultive bacillus subtilis, bacillus subtilis peut croître en utilisant l'aminoacide contenu dans le sang du papier filtre, de sorte qu'il se forme un cercle de croissance de bacillus subtilis dont la dimension correspond à la quantité de l'aminoacide contenu dans le sang. De même, bacillus subtilis est cultivé sur un morceau de papier filtre témoin imprégné de sang contenant une quantité connue de l'amino- acide, de manière à obtenir un cercle de croissance té- moin de bacillus subtilis. En comparant le cercle de croissance mentionné en premier au cercle de croissance témoin mentionné en second, on peut déterminer la concentration approxima- tive de l'aminoacide dans le sang échantillon. Les détails de ce processus et des conditions de mesure pour l'essai d'inhibition bactérien de Guthrie sont décrits dans Rinshobyori (Clinical Pathology) 24 (12) 962à 973, 1976. Pour obtenir des résultats de mesure très sta- bles et reproductibles, il est indispensable que la quan- tité de l'aminoacide contenu dans le papier filtre témoin ne se modifie pas en fonction du temps et le papier fil- tre témoin doit pouvoir être conservé pendant longtemps sans se détériorer d'une manière décelable. Dans un papier filtre témoin classiquedestiné à mesurer la concentration de méthionine dans le sang, la méthionine contenue dans le filtre témoin est oxydée extrêmement facilement au stockage, et en conséquence ses propriétés changent aussi au stockage. C'est ainsi par exemple que s'il est conservé à une température de -200C, il est si détérioré 4 mois a- près qu'il ne peut plus être utilisé. Il s'agit là d'un inconvénient important du papier filtre témoin classi- que. L'invention vise donc un nouveau papier filtre témoin destiné à mesurer la concentration de méthionine dans le sang, ce papier filtre témoin n'ayant pas les inconvénients du papier filtre classique et pouvant être conservé pendant longtemps sans détérioration décelable. L'invention repose sur le fait qu'un antioxy- dant organique soufré hydrosoluble ayant une structure de sulfure,telle que le bêta-thiodiglycol et le béta-thio- dipropanol, est capable d'empêcher l'oxydation ou la mo- dification de propriétés de la méthionine contenue dans le sang séché, sans aucun effet nuisible sur la croissan- ce de bacillus subtilis qui sert d'indicateur de la quan- tité de méthionine contenue-dans le sang. Dans la présente invention, on utilise l'un des antioxydants mentionnés ci-dessus dans le papier filtre témoin afin de réaliser l'objectif mentionné ci-dessus de l'invention. Comme antioxydant organique soufré hydrosoluble ayant une structure de sulfure, on peut utiliser suivant l'invention le bêta-thiodiglycol et le bèta-thiodipropa- nol. On prépare une feuille de papier filtre témoin suivant l'invention de la manière suivante: On dissout l'antioxydant mentionné ci-dessus dans du sang perdu de personnes en bonne santé de maniè- re à obtenir un mélange du sang et de l'antioxydant con- tenant de 30 mM à 120 mM et de préférence de 35 mM à 60 mM de l'antixoydant. On dissout de la L-méthionine dans le mélange mentionné ci-dessus pour obtenir un mélange ayant une concentration totale de 1 mg de L-méthionine par dl. On prépare de même six autres mélanges dont les concentra- tions totales de L-méthionine sont respectivement de 2 mg par dl,de 4 mg/dl, de 8 mg/dl, de 12 mg/dl, de 16 mg/dl et de 20 mg/dl. On agite doucemnt chaque mélange, puis on le laisse reposer pendant 2 heures à température ambiante, de manière à disperser l'antioxydant et la L-méthioni- ne de manière homogène dans le mélange. On étale chaque mélange sur un papier filtre du commerce destiné à effectuer le diagnostic de la phénylcétonurie (PKU) ayant un diamètre de 11 mm, puis on sèche à l'air de manière à obtenir un morceau de papier filtre témoin suivant l'invention. Comme papier filtre témoin pour l'essai d'inhibition bactérien de Guthrie, quand on doit mesurer la concentration de L- méthionine dans le sang d'un patient, on découpe un morceau de papier filtre ayant un diamètre de 3 mm dans le papier filtre mentionné cidessus, à l'aide d'une poinçonneuse à disque. A la différence du papier filtre témoin clas- sique, le papier filtre témoin suivant l'invention peut être conservé sans détérioration décelable pendant plus d'une année à -20 C ou pendant plus de 6 mois à 4 C, et quand il est conservé dans les conditions mentionnées ci-dessus, il peut donner un cercle de croissance en fonction de chaque concentration spécifiée de L-méthioni- ne, sans avoir aucun effet nuisible sur lesfacteursné- cessairespour l'essai d'inhibition bactérien de Guthrie, te]s que la croissance de bacillus subtilis et la couleur du sang. On donne au tableau I les résultats de compa- raison entre le papier filtre suivant l'invention et despapiersfiltres dans lesquels des antioxydants autres que ceux suivant l'invention sont utilisés, en ce qui concerne les effets des antioxydants sur le sang, quand chaque papier filtre est préparé,et sur la croissance de ba- cillus subtilis dans l'essai d'inhibition bactérien de Guthrie. Tableau I Antioxydant Effets sur le sang Effets sur BIA de Guthrie* Jugement Bêtathiodi- En concentrationsallant jus- En concentrationsallant jusqu'à convient glycol qu'à 120 mM, pas de coagula- 120 mM, pas de formation d'un cer- tion du sang et pas de chan- cle d'inhibition et pas de diffé- gement de la coloration du rence de croissance de bacillus sang. subtilis si on ajoute cet anti- oxydant et si on ne l'ajoute pas. Bêta-thiodi- En des concentrations allant En des concentrations allant jus- convient propanol jusqu'à 120 mM, pas de coagu- ju'à 120 mM, pas de formation d'un lation du sang et pas de chan- cercle d'inhibition et pas de dif- gement de la coloration du férence de croissance de bacillus sang. subtilis si on ajoute cet anti- oxydant et si on ne l'ajoute pas. Acide thio- Au-dessus de 15 mM, coagula- Croissance excessive de bacillus ne con- glycolique tion immédiate du sang dont subtilis ne correspondant pas à vient la coloration devient brun la croissance d'un aminoacideo pas sombre. Acide bêta, Au-dessus de 10 mM, coagula- bêta-thiodi- tion immédiate du sang dont propionique la coloration devient brun sombre. Dithiothréi- Au-dessus de 45 mM, coagula- Au-dessus de 15 mM, formation tol tion du sang en 2 h, dont la nette d'un cercle d'inhibition. coloration devient brun sombre. Alcool 2-mer- Au-dessus de 45 mM, coagulaAu-dessus de 15 mM, formation captoéthyli- tion du sang en 2 h, dont la nette d'un cercle d'inhibition lque coloration devient brun sombre. Note: * Essai d'inhibition bactérienne ru o o$ M o ru Antioxydant Effets sur le sang Effets sur BIA de Guthrie Jugement Thiosulfate La coloration du sang devient Au-dessus de 30 mM, formation ne convient de sodium celle du sang frais. d'un cercle d'inhibition pas Hydrosulfite Au-dessus de 10 mM, la colo- de sodium ration du sang devient pour-.. pre sombre. Hydroxy-ani- Pratiquement insoluble dans Forme le même cercle de crois- sole buthy- l'eau et difficile à mani- sance quelle que soit la con- lé puler. centration de méthionine Hydroxy to- Pratiquement insoluble dans Forme le même cercle de crois- luène buty- l'eau et difficile à mani- sance quelle que soit la con- lé pulero centration de méthionine EDTA, 2Na Au-dessus de 0,1 mM, l'inhibi- tion de la croissance de ba- cillus subtilis est nette. Tableau II Quantité de Antioxdant Durée de l'essai de stabilité à 370C (jours) méthionine Nature Quantité ajoutée ajoutée 2 7 14 22 37 Pas d'addi- 3,6 mg/dl 2,84 2,64 2,56 2,44 L-méthio- tion à ti- 0 (90%) (71 (66) (64) (61) nine tre de com- 4 mg/dl paraison Béta-thiodi- 50 mm 3,96 mg/dl 3,76 3,60 3,44 3,32 glycol (99%) (94) (90) (86) (83) Bêta-thiodi- 50 3,97 mg/dl 3,80 3,62 3,40 3,29 propanol (99%) (97) (91) (85) (82) ========== =========== ========= ============= -========= ========== ===== -------------- Pas d'addi- L-méthio- tion à ti O 10,8 mg/dl 9,6 9,48 9,36 8,78 nine tre de com- (90) (80) (79) (78) (73) 12 mg/dl paraison Béta-thiodi- 11,76 mg/dl 11,52 11, 16 10,92 10,80 glycol 50 mM (98%) (96) (93) (91) (90) Bèta-thiodi- il,8 gd Bta-thiodi- 50 mM 11,81 mg/dl 11,59 11,20 10,88 10,82 propanol (98%) (97) (93) (91) (90) Notes: Les chiffres du tableau indiquent la concentration trouvée de méthionine résiduelle (Les chiffres entre parenthèses indiquent le rapport de la méthionine résiduelle à la quantité de méthionine ajoutée). ri N O Co ru En se reportant au tableau I, les antioxydants qui provoquent la coagulation du sang ne conviennent pas aux fins de l'invention puisque,si la coagulation a lieu, le sang n'est pas absorbé d'une manière homogène dans le papier filtre. En outre, les antioxydants qui modi- fient la coloration du sang placé sur le papier filtre témoin au point que la couleur soit tout à fait diffé- rente de la couleur du sang à essayer, ou les antioxy- dants qui forment des cercles d'inhibition inhibant la croissance de bacillus subtilis, ne conviennent pas aux fins de l'inventio4 puisqu'ils peuvent provoquer des jugements erronés dans les observations comparatives de la croissance de bacillus subtilis dans l'essai d'inhibition bactérien de Guthrie. En fait, les antioxydants qui inhibent la crois- sance de bacillus subtilis ou qui favorisent la croissan- ce de celui-ci d'une manière telle qu'elle ne dépend pas de la concentration de méthionine contenue dans le sang, ne peuvent pas non plus être utilisés en pratique. Les résultats comparatifs donnés au tableau 1 montrent que les antioxydants qui conviennent aux fins de l'invention sont le bêta-thiodiglycol et le bêta-thio- dipropanol. Le tableau 2 donne les résultats d'essais effec- tués sur la stabilité de la L-méthioniie dans des papiers filtres témoins contenant les antioxydants mentionnés ci-dessus selon l'invention,-ces essais étant effectués dans des conditions dures à 37 C. Au tableau 2, la mesure quantitative de la L-méthionine restante est effectuée par un essai biologique employant lactobacillus. On sait empiriquement que des papiers filtres té- moins,qui peuvent retenir plus de 80% de L-méthionine après un essai dur pendant 14 jours,peuvent être con- servés pendant plus d'une année à -20 C et peuvent être utilisés sans aucun problème pour l'essai d'inhibition bactérien de Guthrie. En partant de cette connaissance empirique, les résultats du tableau 2 montrent que le papier filtre témoin préparé en utilisant du sang,au- quel on a ajouté 50 mM de bôta-thiodiglycol ou de bêta- thiodipropanol,peut être conservé d'une manière sûre pendant plus d'une année à -20 Co Le tableau 3 donne les résultats d'essais des- tinés à rechercher la relation entre les quantités ajou- tées de bêta-thiodiglycol et de bêta-thiodipropanol res- pectivement et l'effet de conservation, ces essais ayant été effectués dans les mêmes conditions que ceux résumés au tableau 2. +tc7=o EÀ o +e O>. o- o + > _-i pà- O O F- p- p, C D O O C D P Fi -* |i CDi P -D *CD FCD tC.I.CJ.I C. C. CD%- i i DH h CD HC t CD C o oI I j vl'OOO IX0CD I- 'i I-j v.p -vO0) - --P,- - CD 0 00"-'s I0- 0 s (AM OD,. P, H H C> vO r_ iv a J OXD OCoSJ\ODw 5 - CD -,,.._ i, o-..O0,.- O 4: _ O_ v --...-- t j- -".0 O C' cD N--/' __"_ '-._ _o .0'.-' O)-..'-0- - (>1O'- c".'.0- N P. s_ \.m)'.M N0a O R3 -5 - -- -oO -.c-O+H. c C D Hc- O H- CDjçIF-J-CD p c C.1- f @ t g C+ Fi.5X _ C Oo o, ? c O P- (D PiDH 1IC DD H (D t.-,_a C} m 0T m (DD hi 0 C. O0 0 '-,1. C---, Qh C.. B PklO N) J1* c- |- o "'- s- 0 O'q,o 0 P t ç llA - o ci-h o _. _ _ _ -0v l' '-,'-- 0_ o P. HOD4--- - CD H0 0' tO-- CO"(> t', O 0k À -1, Ci'l. C- aO' 0D v.l-'- '---r" I'o 0, _,,=, _.._.,.,.-=CD o vo _ p FO"8 mS kô.o 2..DTD: -.5 -P, CD-(>- -0 Cy(- - Fi __ _ _ CD - '- 00 '.-i '-'>4 '(> - '.0-C P. P. t->. P-. P, o (D (D> c- P) I c- hi> t-. PJ o P. O kpi F3 p (>4 o O'> c- ro Comme il ressort du tableau 3, lorsqu'on ajoute plus de 30 mM de l'un des antioxydants, le rap- port de L-méthionine restant dans le papier filtre est supérieur à 80% et, donc, par addition de cette quanti- té de l'un des antioxydants, on peut obtenir d'une ma- nière suffisante l'effet de conservation aux fins de l'invention. Les exemples suivants illustrent l'inven- tion. Exemple 1 On centrifuge à 2000 tours par minute,pen- dant 20 minutes,6 1 de sang perdu (ayant une valeur d'hé- matocrite de 42%) de personnes en bonne santé. Du sang centrifugé, on enlève par aspiration 402 ml de la solu- tion surnageante qui est le plasma du sang, afin d'ajuster la valeur d'hématocrite de la solution de sang restante à 55%. On met 25 ml de b8ta-thiodiglycol ayant une pureté de 98% dans un flacon de 5 1 de volume. Au bêta- thiodiglycol on ajoute la solution de bang mentionnée ci- dessus pour obtenir exactement 5 1 d'une solution de sang et de b8tathiodiglycol. Dans le mélange de sang, la concentration de bêta-thiodiglycol est de 49 mM/l. La concentration de L-méthionine dans le mé- lange de sang est mesurée par un détecteur automatique d'ainnoacide. Elle est de 0,25 mg/dl. On prépare sept solutions ayant des concen- trations différentes de L-méthionine et on met un ml de chacune de ces solutions dans respectivement sept flacons de 100 ml de volume. Dans chaque flacon on verse la solution de sang mentionnée ci-dessus contenant l'antioxydant, de ma- nière à obtenir exactement des mélanges de 100 ml, la concentration totale de L-méthionine étant de 1 mg/dl, de 2 mg/dl, de 4 mg/dl, de 8 mg/dl, de 12 mg/dl, de 16 mg/dl, et de 20 mg/dl. On agite doucement chacun des mélanges et on le laisse reposer pendant 2 heures à la température ambiante pour disperser la L-méthionine d'une manière homogène dans le mélange. On fait tomber goutte à goutte 50 yl de chacun des mélanges sur des morceaux de papier filtre destinés au diagnostic de la phénylcétonurie, fournis par la société Toyo Filter Paper Co., Ltd, de manière à ce que le mélange envoyé goutte à goutte s'étale en un cercle de Il mm de diamètre. On sèche chaque papier filtre à température ambiante pendant 2 heures environ, puis on le sèche au séchoir sous vide et finalement on le passe à la calan- dre. On conserve les papiers filtres ainsi pré- parés pendant 6 mois et pendant une année à -200C et on les compare aux papiers filtres classiques pour ce qui concerne le cercle de croissance de bacillus subti- lis dans l'essai d'inhibition bactérien de Guthrie. Les résultats obtenus sont consignés au tableau suivant (Note) (+) indique Exemple 2 la formation d'un cercle d'inhibition. On met 7,0 ml de bêta-thiodipropanol dans un flacon de 1 1 de volume et on ajoute au bêta-thiodipro- panol la solution de sang ayant la valeur d'hématocrite de 55% préparée à l'exemple 1, pour obtenir exactement 1 1 de mélange. La concentration de l'antioxydant, le bêta- thiodipropanol,est de 50 mM dans le mélange. Exactement de la même manière qu'à l'exemple 1, on ajoute à chaque solution de sang une quantité déterminée à l'avance diffé- rente de L-méthionine, pour former des mélanges de sang ayant des concentrations différentes de L-méthionine et on fait tomber,goutte à goutte,chaque mélange sur chaque mor- ceau de papier filtre mentionné ci-dessus destihné à dia- gnostiquer la phénylcétonurie. On sèche chaque papier filtre pour obtenir un papier filtre témoin. On conserve les papiers filtres ainsi pré- parés pendant 6 mois et pendant une année à -20 C et on les compare aux papiers filtres classiques pour ce qui Con- Immédia- Conser- Conser- centrationi Antioxydant tement a- vation vation de méthionine près la pendant pendant prépara- 6 mois un an I__ _ _tion Produit classi- 0 25,2 mm 23,7 (+) 20,5 (+) que 4 mg/dl Produit bêta-thio- suivant diglycol 25,5 mm 25,0 25,0 inven- 49 mM tion Produit classi- 0 35, 0 mm 32,5 30,0 (+) 2 mg/dl que _ Produit bSta-thio- suivant diglycol 35,0 mm 34,8 35,0 l'inven- 49 mM tion concerne le cercle d'inhibition de bacillus subtilis dans l'essai d'inhibition bactérien de Guthrie. Les résultats sont consignés au tableau suivant: Co n- Immédia- Conser- Conser- centraO Atioxydant tement a- vation vation tion de près la pendant pendant méthionine prépara- 6 mois un an _ I_ _tion Produit. classi- O 2590 mm 23,7mm 21,0 mm 4 mg/dl que _._ _. Produit bêta-thio- suivant dipropa- 25,0 24,8 25,0 lUiivenn nol25,0 24,8 25,0 l'inven- nol tion 50 mM Produit classi- 0O 35,0 32,5 30,0 que 2 mg/dl *Produit bata-thio- suivant dipropa- 35,0 35, 2 34,8 l'inven nol tion 50 mM (Note) Les chiffres du tableau ci-dessus indiquent le diamètre du cercle de croissance de bacillus subti- lis. REVENDICATIONS 1) Papier filtre témoin destiné à mesurer la con- centration de méthionine dans le sang, comprenant un morceau de papier filtre pour le sang imprégné d'une substance sanguine contenant une concentration connue de méthionine et d'au moins un antioxydant hydrosoluble soufré, caractérisé en ce que l'antioxydant répond à la formule: CH2(CH2)nOH s/ S CH2(CH2)nOH dans laquelle n = 1 ou 2. 2) Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que la concentration de l'antioxydant hydrosoluble sou- fré dans la substance sanguine est de 30 mM à 120 mM.