FR 2489838 A1 19820312 FR 8116944 A 19810907 - 1 - Endoprotéinase-Lys-C provenant de bactéries, sa préparation et son utilisation. Dans différents buts, en particulier pour le clivage dirigé des protéines et peptides, par exemple dans le ca- dre de la détermination des séquences, les endoprotéinases qui clivent à un endroit déterminé, sont intéressantes techniquement et scientifiquement. Ainsi, on connaît déjà une endoprotéinase provenant de champignons qui clive la liaison peptidique sur le carbone terminal de la lysine. Cette enzyme est cependant difficilement accessible et n'est en conséquence pas disponible en quantité souhaitée. Maintenant, on a trouvé dans des bactéries une enzyme pré- sentant la même spécificité, laquelle enzyme est caracté- risée en tant qu'endoprotéinase-Lys-C et se différencie nettement des autres protéases bactériennes par les pro- priétés. La nouvelle endoprotéinase-Lys-C provenant de bacté- ries selon l'invention est caractérisée en ce qu'elle est constituée d'une chalne de poids moléculaire 35 000 à 38 000 daltons, présente une valeur optimum de pH de 7,7 et,inhibée par l'aprotinine, n'est pas inhibée par l'apha2- macroglobuline, l'a1-antitrypsine et l'acide éthylènedia- minetétracétique. L'enzyme selon l'invention a tendance à s'agréger dans des conditions non réductrices; il se forme alors de pré- férence des tétramères avec un poids moléculaire d'environ 000 d et des octamères avec unpoids moléculaire d'envi- ron 300 000 d qui présentent une activité enzymatique. L'optimum de pH de la nouvelle enzyme est, comme déjà indiqué, de pH 7,7, déterminé à 37 C selon la méthode dite "azocoll". Dans la méthode dite d'électrofocalisation (Elektro- fokussierung), l'enzyme se clive en de nombreuses bandes qui couvrent pratiquement tout le domaine de pH. Ce compor- tement laisse penser qu'il s'agit d'une glycoprotéine; le point isoélectrique de l'enzyme n'est par conséquent pas déterminable. Comme déjà indiqué, l'alpha2-macroglobuline, - 2 - l'ao-antitrypsine et l'acide éthylènediaminetétracétique (EDTA) n'inhibent pas jusqu'à 10 M au maximum. Par contre la benzamidine inhibe à environ 50 % à 2,5 mM; on peut obtenir 70 % d'inhibition en augmentant la concentration en benzamidine. L'aprotinine donne une inhibition complète. Le tableau I montre la spécificité du substrat de la nouvelle enzyme. Son activité spécifique, mesurée avec le p-nitroanilide de la tosyl-glycyl-prolyl-lysine à 25 C est d'environ 25 U/mg ou d'environ 50 unités azocoll/mg d'enzyme à 37 C. Contrairement à la protéinase II décrite provenant de Lysobacter, l'enzyme selon l'invention ne clive pas en po- sition amino, mais en position carboxy sur la lysine. La spécificité élevée est également montrée par le faible nom- bre de bandes qui apparaissent en chromatographie sur gel des produits de clivage de la fibrine obtenus avec cette enzyme. TABLEAU I Spécificité du substrat de l'endoprotéinase-Lys-C Dégradation par l'endo- -Substrat protéinase-Lys-C Azocoll + Caséine + Fibrinogène + Hémoglobine + TLME ++ Chromozym PL (marque déposée) ++ S 2251 (marque déposée) ++ Tos-Arg-Me Chromozym TH (marque déposée) - BAEE Leu-pNA Lys-pNA ATEE Chalne B de l'insuline + - 3 - Abrévations TLME = Ester méthylique de la tosyl-lysine BAEE = Ester éthylique de la benzoyl-arginine ATEE = Ester éthylique l'arginyl- tyrosine Chromozym PL (marque déposée) = p-nitroanilide de la tosyl- glycyl-prolyl-lysine Chromozym TH (marque déposée) = p-nitroanilide de la tosyl- glycyl-prolyl-arginine S 2251 (marque déposée) = p-nitroanilide de la valyl- leucyl-lysine Le tableau II montre les différences entre l'enzyme selon l'invention et les protéases trouvées jusqu'à présent dans Lysobacter. T.BLEAU II protéinase-a-lytique Numéro EC 3.4.21.12 protéase-e-lytique protéinase I AL-1 protéinase II AL-1 endoprotéinase- Lys-C 3.4.99.29 3.4.99.30 Poids moléculaire 000 d 19 000 d 9 000 d (filtration sur gel), 14 000 d (équilibre de sédimentation) 17 000 d 36-38 000 d (gel de disulfate de Na red.) env. 35 000 d /Sephacryl S-300 (marque déposée)7 Mécanisme de réaction sérine-protéase Zn-métallopro- téinase inconnu inconnu sérine-protéase Spécificité groupe carboxy d'aminoacides neutres, en part. alanine. groupe carboxy d'aminoacides hydrophobes, lyse les mem- branes cellulaires bacté- riennes. aminoacides hydrophobes, lyse les membranes cellu- laires bactériennes (en part. grampositives). groupe amino de la lysine groupe carboxy de la lysine Mo co co -5L'enzyme selon l'invention peut être séparée de la plupart des impuretés à partir des bouillons de culture de microorganismes qui forment cette enzyme en quantité suffi- sante, en particulier de ceux de l'ordre des Lysobactera- les, et là de préférence ceux de la famille des Lysobacte- raceae, par exemple du genre Lysobacter (également appelé Myxobacter) selon des méthodes usuelles de purification des enzymes, comme le fractionnement au sulfate d'ammonium, le fractionnement à l'acétone et la chromatographie sur tamis moléculaire. La séparation d'autres protéases a lieu selon l'invention par traitement au moyen d'un complexe alpha2-macroglobulinemétal fixé sur support. Avec cette nouvelle étape de traitement pour la purification des enzymes, onsépare les impuretés difficiles à éliminer, mais en particulier les protéases secondaires, tandis que l'en- doprotéinaseLys-C selon l'invention reste en solution et peut être isolée à partir de celle-ci. Le procédé selon l'invention pour préparer l'endopro- téinaseLys-C est par conséquent caractérisé en ce qu'on chromatographie sur du complexe alpha2-macroglobuline-métal fixé sur support, un bouillon de culture d'une souche bac- térienne appropriée, filtré ou purifié selon des méthodes connues en soi, et on récupère l'enzyme à partir du filtrat. Dans le complexe alpha2-macroglobuline-métal mention- né plus haut, le métal est constitué d'un métal bivalent du groupe constitué par Zn, Co, Ni et/ou Cu. L'utilisation de ce complexe et sa préparation sont décrites plus en dé- tail dans la demande de brevet allemand P 30 34 043.3 (no int. 2380). Comme déjà indiqué, on peut effectuer directement à partir du bouillon de culture le traitement selon l'inven- tion, au moyen de complexe alpha2-macroglobuline-métal fixé sur support. Il est cependant plus avantageux de sépa- rer au préalable les protéines des autres substances et d'effectuer un fractionnement préalable. La séparation des protéines à partir du f iltrat de culture est avantageusement effectuée par précitation par le sulfate d'ammonium, bien que l'on puisse également -6- utiliser d'autres agents de précipitation habituels des protéines qui ne nuisent pas à l'activité enzymatique des protéines actives qui y sont contenues. Lorsqu'on ajoute du sulfate d'ammonium, on le fait avantageusement jusqu'à une concentration de 2,5 à 3,5 M, de préférence de 3 à 3,2 M. Le précipité formé alors est séparé, par exemple par filtration, et renferme toute l'activité recherchée. Après dissolution par l'eau et de préférence élimination du sulfate d'ammonium restant par dialyse, on peut soumet- tre la solution ainsi obtenue soit à la chromatographie sur complexe d'alpha 2-macroglobuline-métal, soit à une autre purification préalable. Si on souhaite effectuer une autre purification préa- lable, on effectue avantageusement un fractionnement au sulfate d'ammonium selon lequel la fraction précipitant pour une concentration en sulfate d'ammonium entre 2 et 3 M contient l'activité recherchée. Il est alors avanta- geux d'ajouter, dans une première étape, le sulfate d'am- monium jusqu'à une concentration de 0,7 à 1,3 M, de sépa- rer le précipité et d'augmenter ensuite la concentration en sulfate d'ammonium jusqu'à 3 M, de préférence 2,25 à 2,32 M, et de séparer le précipitéactif alors obten,demaniè- re habituelle et de purifier en éliminant le sulfate d'ammonium restant par dialyse. Si la solution ainsi obtenue n'est pas soumise au traitement par le complexe alpha2-macroglobuline-métal, on peut également effectuer encore au préalable un frac- tionnement à l'acétone et une chromatographie sur tamis moléculaire. Dans le cas d'un fractionnement à l'acétone, on fait précipiter par addition de 0,3 à 1,5 volume, de préférence 0,5 à 1,2 volume d'acétone, on sépare le pré- cipité et ajoute encore 1,2 volume d'acétone, on sépare le précipité et le dissout dans du tampon à pH 7,5 à 9. La concentration en tampon est avantageusement comprise entre 0,01 et 0,05 M. Après dialyse pour éliminer l'acé- tone restante et concentration éventuelle de la solution obtenue, on peut chromatographier sur un tamis moléculaire, par exemple du dextranne réticulé, tel que le produit - 7 - vendu sous la marque Sephadex-G-100; l'activité recher- chée est alors éluée au début à partir de l'acide, tandis que la protéinase I AL-1 connue n'est éluée que vers la fin. L'éluat est, éventuellement après concentration, chro- matographié sur du complexe alpha2-macroglobuline-métal fixé sur support; l'endoprotéinase-Lys-C recherchée passe alors. L'élution a de préférence lieu dans le domaine de pH de 7,0 à 8,5, avec une concentration en tampon de 0,03 à 0,08 M. Les substances tampon habituelles actives dans ce domaine sont appropriées, le tampon tris, le tampon à l'hepes et le tampon au phosphate étant préférés. De bons résultats sont obtenus à pH 6, 5 à 9 et avec une teneur en tampon de 0,01 à O, 1M. L'1éluat contient de l'endoprotéinase- Lys-C et du tampon purs et peut être lyophilisé directement. La nouvelle enzyme selon l'invention peut en particu- lier être utilisée pour la détermination des séquences des protéines et peptides. En raison de son activité clivante très spécifique, elle peut également être utilisée en thérapeutique, par exemple dans les cas de troubles de la coagulation, ou respectivement d'autres maladies selon lesquelles le clivage de chaine protéiques est souhaité. Les exemples suivants, non limitatifs, expliquent l'obtention de l'enzyme selon l'invention et son dosage. Exemple i Obtention de l'endoprotéinase-Lys-C à partir de Lysobacter enzymogenes sous-espèce enzymogenes DSM 1895 (ATCC 27796) Matière de départ: 206 litres de filtrat de culture de Lysobacter On fait précipiter lentement 206 litres de filtrat de culture de Lysobacter au moyen de sulfate d'ammonium porté à 3 à 3,2 M. Le faible précipité floconneux est séparé par filtration. Le précipité sur le filtre est dissous avec un peu d'eau distillée et précipité par le sulfate d'ammo- nium solide porté à 0,9 M (1,3 à 3 M) et centifugé. On fait alors précipiter encore le surnageant par le sulfate d'am- monium porté à 2,25 à 2,32 M, et on filtre ou centrifuge 2?U9838 - 8 - le précipité, on le dissout avec environ 400 ml d'eau dis- tillée et on dialyse contre de l'eau courante du robinet. On ajoute au dialysat 0,5 à 1,2 vol. d'acétone refroi- die à -20 C et on centrifuge. On ajoute encore au surna- geant (limpide) 1,2 vol. (calculé par rapport au volume de départ) d'acétone, on sépare le précipité par centrifu- gation et on le dissout aussi concentré que possible avec du tris 0,025 M, pH 9 et on dialyse contre 10 1 du même tampon. Le dialysat est amené sur une colonne de Sephadex-G- présentant les dimensions suivantes: 0' 5 cm, longueur 150 cm, volume de la colonneenv. 2,9 1. La colonne est équilibrée avec du tris 0,025 M, pH 9,0 et, après le chargement, lavée à fond avec le même tampon. La Lysobacter-protéase est éluée au début. Les éluats sont précipités par du sulfate d'ammonium solide à 3,2 M et centrifugés. Le précipité concentré repris est dialysé contre du tris 0,05 M, pH 8,0. Le complexe alpha2-macroglobuline-Zn, lié de façon covalente à l'agarose, est utilisé pour la purification ultérieuia.110 ml de cette matière support sont introduits dans une colonne de 3 cm de diamètre et de 17,5 cm de long et lavés avec du tris 0,05 M, pH 8,0, jusqu'à ce qu'il n'y ait plus de protéine dans le produit en circulation. Le dialysat est alors chargé et lavé à fond avec du tris 0,05 M, pH 8,0. La protéinase-Lys-C élue. L'éluat est dialysé contre de la glycine 0,05 M, pH 8,0 et dilué à 0,4 mg/ml avec le même tampon et lyophilisé. Rendement global: env. 50 à 140 mg de protéine 6 à 23 U/mg de protéinase- Lys-C activité au Chromozym TH Exemple 2 Dosaqe de l'endoprotéinase-Lys-C Préparation des solutions: 1. Tris 0,025 M, EDTA 0,001 M, pH 7,7 0,303 g de tris, 37,2 mg d'EDTA sont dissous dans -- 9 -- env. 80 ml d'eau bidistillée et le pH est réglé à 7,7 avec HCL 2 N et on complète à 100 ml. 2. Chromozym-PL (14 eM/ml) Dissoudre 9 mg de Chromozym-PL dans 1 ml d'eau bidistil- lée. 3. Solution d'endoprotéinase-Lys-C Dissoudre 10 mg de lyophilisat dans 1 ml d'eau bidistil- lée.Diluer à 1:100 avec la solution 1 avant l'emploi. Mise en oeuvre: 405 nm semi-microcuvettes de 1 cm C volume d'essai 1,07 ml Introduire à la pipette dans les cuvettes: Solution 1 1 ml Solution 2 0,05 ml Mélanger, thermostater env. 2 min. à 25 C Solution d'échantillon 3 0,02 ml Mélanger, calculer LE/mn à partir de la phase linéaire après env. 5 mn Calcul: AE/mn. x 1,07 = U/ml d'endoprotéinase-Lys-C ,4 x 0,02 - 10 - REVENDICATIONS 1. Endoprotéinase-Lys-C provenant de bactéries, cara- térisée en ce qu'elle est constitutée d"une chalne de poids moléculaire 35 000 à 38 000 daltons, présente un optimum de pH à pH 7,7 et, inhibée par l'aprotinine, n'est pas inhibée par l'alpha2-macroglobuline, l'a1antitrypsine et l'acide éthylène-diaminetétracétique. 2. Procédé pour l'obtention dë l'endoprotéinase-Lys-C selon la revendication 1, caractérisé en oe qu'on chromato- graphie sur un complexe alpha2-macroglobuline-métal fixé sur un support un bouillon de culture d'une souche bacté- rienne appropriéefiltré ou prépurifié selon des méthodes usuelles et on récupère l'enzyme à partir du filtrat. 3. Procédé selon la revendication 2, caractérisé en ce qu'on chromatographie dans du tampon 0,01 à 0,1 M, à pH 6,5 à 9. 4. Procédé selon la revendication 2 ou 3, caractérisé en ce qu'on utilise du bouillon de culture provenant de la culture de Lysobacterales. 5. Procédé selon l'une des revendications 2 à 4, carac- térisé en ce qu'on fait précipiter la protéine par le sul- fate d'ammonium à partir du bouillon de culture filtré, on fractionne le précipité,après nouvelle dissolution, à une concentration en sulfate d'ammonium comprise entre 1,3 et 3 M et on dissout dans l'eau la fraction insoluble dans ce domaine et, après dialyse, on fractionne à l'acétone entre 1,2 et 2,4 vol. d'acétone. 6. Procédé selon la revendication 5, caractérisé en ce-qu'on chromatographie sur un tamis moléculaire, après dissolution, le précipité du fractionnement à l'acétone et on soumet la fraction protéique éluée au début de la chromatographie à la chromatographie sur le complexe alpha2macroglobuline-métal. 7. Utilisation de l'endoprotéinase-Lys-C selon la re- vendication 1 pour la détermination des séquences de pro- téines et de peptides.