FR 2490494 A1 19820326 FR 8118140 A 19810925 î49o494 Agent pour améliorer la circulation sanguine périphérique. La présente invention concerne des médicaments qui facilitent et rétablissent la circulation sanguine périphérique dégradée, empêchent l'apparition d'une insuffisance circulatoire, sta- bilisent les cellules du plasma, empêchent la coagulation du sang et améliorent le maintien en l'état des divers dis- positifs d'assistance pour la circulation extracorporelle. Le sang des hommes et des animaux physiologiquement en bonne santé contient plus de 50% de constituants insolubles, prin- cipalement les cellules du plasma. Ces constituants du sang circulent à vitesse élevée dans les vaisseaux capillaires dont le calibre est inférieur à 5p, en dépit du fait que le diamètre des cellules du plasma, telles que les érythrocytes ou les leucocytes, est compris entre 5 à 10p et est quel- 15.quefois plus important que celui des vaisseaux capillaires. En conséquence, pour obtenir un passage régulier du sang à travers les petits vaisseaux capillaires, une distension de la paroi capillaire aussi bien qu'une déformation des cellules du plasma sont effectivement nécessaires. Les inven- teurs de la présente demande ont indiqué que le frottement entre les cellules du plasma et la paroi des vaisseaux est un des facteurs importants pour maintenir la circulation sanguine dans le réseau de microcirculation et ils ont con- sidèré que les diverses conditions pathologiques ou maladies suivantes peuvent résulter ou être aggravées par un manque de lubrification des cellules, à savoir la thrombose péri- phérique, la thrombophlébite, la thrombose cérébrale, l'is- chémie cardiaque, la sédimentation des cellules du plasma, la coagulation intravasculaire disséminée,d'autre défauts microcirculatoires, le symptôme d'agglutination des plaquettes ou le symptôme d'hémophilie provoqués par une hémolyse exces- sive chez les cancéreux sous traitement avec des agents antitumoraux. De plus, dans les dispositifs d'assistance pour une circulation extracorporelle, les tubes fins présen- tant une lubrification et une aptitude à se distendre faibles entraînent des troubles fréquents dus à l'hémolyse concomit- tante même après une utilisation de courte durée. Les inventeurs ont effectué pendant longtemps des recherches sur les méthodes ou les traitements pour empêcher l'endomma- gement des cellules sanguines durant le passage des cellules- à travers les vaisseaux capillaires, en facilitant leur passager ce qui peut conduire -à des thérapies pour les maladies concernées et ils ont déjà déposé des demandes de brevet sur un procédé de production d'une solution de protéine stable (Demande de brevet japonais- publiée NI 37. 187/78) et sur des substances pour améliorer la circulation périphérique en utilisant une glycoprotéine (Demande de brevet japonais publiée NI 15.213/81). Les inventeurs on-t maintenant trouvé qu'une gélatine ou un collagène solubilisé ont une action sur l'apparition de la coagulation, de l'agglutination et de V hémolyse des composés solides du sang tels que les erythrocytes et les leucocytes, ce qui facilite la filtration et le passage du sang dans les vaisseaux capillaires, les membranes artificielles (par exemple les membranes en nitrocellulose, les membranes en acétate de cellulose, les membranes en tétrafluoréthylène "Téflon', etc.), les tubes artificiels fins utilisés dans la circulation extracorporelle du sang,les dispositifs d'assis- tance pour une circulation extracorporelle du sang tout en empêchant ou en réduisant en même temps la stagnation du 3 2490494 sang dans les micropores aussi bien qu'en stabilisant la membrane des cellules du plasma et en facilitant la microcir- culation des constituants cellulaires du sang. La présente invention a été mise en oeuvre sur la base des découvertes ci-dessus. En conséquence, l'invention couvre des substances pour amélio- rer la circulation sanguine périphérique comprenant une gélatine ou un collagène solubilisé comme composé actif. La présente invention sera maintenant décrite avec référence aux dessins ci-annexés dans lesquels La figure 1 représente les effets de la gélatine sur les taux de filtration des érythrocytes à travers des micropores et ceux de l'hémolyse produite durant la filtration, ces effets étant comparés à ceux d'autres substances; la figure 2 représente les effets d'un collagène solubilisé sur les taux de filtration des érythrocytes et ceux de l'hémolyse, ces effets étant comparés à ceux d'autres substances; la figure 3 repré- sente les courbes dose-réponse de la gélatine sur les taux de filtration et d'hémolyse des érythrocytes, et, la figure 4 représente les courbes dose-réponse d'un collagène solubilisé sur les taux de filtration et d'hémolyse des érythrocytes. La gélatine et le collagène qui sont les composés actifs de la présente invention sont des substances connues et dé- crites par exemple dans l'Haurowits nThe chemistry and Func- tional proteins" (La Chimie et les Fonctions des Protéines) 212-217 (1963, Academic Press, N.Y.). Ces substances peuvent être facilement obtenues à partir des tissus cutanés, des os, de la peau, etc., des animaux après solubilisation. De plus, une gélatine ou un collagène disponibles commercialement présentant une pureté adéquate peuvent être utilisés dans la présente invention. Dans le cas d'un collagène insoluble, sa solubilité peut être augmentée en soumettant le collagène à des modifications chimiques telles qu'une maléylation, une succinylation, une citraconylation, une formylation, etc, ou à une hydrolyse partielle telle qu'à un traitement en autoclave, un traitement à l'acide chlorhydrique, un traitement à l'ammoniaque, un traitement au bromure de cya- nogène, à une collagènase, à une élastase, etc. De cette manière un collagène insoluble peut être mis sous la forme d'un collagène solubilisé. Ces substances efficaces pour faciliter la circulation sanguine peuvent généralement être utilisées comme élément injectable et l'élément injectable de la présente invention peut être utilisé en combinaison avec divers éléments injectables tels qu'une solution saline physiologique, une solution nutritive, une préparation pour goutte à goutte, des matériaux pour transfu- sion sanguine, etc. Dans la présente invention, une gélatine, un collagène solubilisé ou un mélange de gélatine et de col- lagène solubilisé peut être ajouté à diverses autres solutions pour injection intraveineuse ou intra-artérielle et les effets souhaités sont habituellement obtenus sous une concentration de 0,01 à 1,0%. De plus, conformément à un autre mode d'utilisation des substances de la présente invention, elles peuvent être ajoutées au sang ou à une suspension de cellules sanguines, à du sérum, à du plasma sanguin, à des solutions nutritives artificielles, à un diluant du plasma, à une suspension de cellules et à une transfusion d'érythrocytes concentrée, etc. sous des concentrations de lpg/ml à 200 mg/ml. De plus, les substances de la présente invention peuvent être utilisées comme solution pour divers dispositifs d'assistance pour la circulation extracorporelle du sang. Les substances peuvent être administrées au système circu- latoire à titre préventif pour empêcher l'endommagement des érythrocytes et la coagulation pendant la circulation extra- corporelle du sang. Les substances de la présente invention peuvent être administrées sous des doses de 0,1 à lOg par dose à raison d'une à trois fois par jour pour des malades pesant 60 kg mais une quantité plus importante peut être administrée. Lorsque les substances de la présente invention sont administrées dans une microartère cérébrale locale, on préfère administrer les substances de la présente invention sous forme de doses unitaires de 0,01 à l,Og, une à dix fois par jour en fonction du malade. La présente invention sera détaillée ci-après. EXPERIENCE 1: Préparation d'un collagène solubilisé Procédé 1: (Succinylation du collagène): ml d'eau ou d'une solution aqueuse à 7% de bicarbonate de sodium ont été ajoutés à 1 g d'un collagène insoluble et le mélange v été mis dans un autoclave à 120WC pendant 30 à 120 minutes. Ensuite, après refroidissement du mélange réactionnel à la température ambiante, le pH a été réglé à 8,0 et lg d'anhydride succinique en poudre a été ajouté très lentement au mélange réactionnel pour permettre un temps de réaction suffisant. La réaction a été effectuée pendant 2 à 3 heures avec un contrôle du pH convenable pour maintenir un pH stationnaire. Cependant, la réaction peut être effectuée de manière semblable à un pH compris entre 7,5 et 9,5. Après achèvement de la réaction, le produit a été séparé par cen- trifugation (à 2000 tours/minute) et la partie surnageante a été dialysée avec de l'eau distillée. Le produit a été lyophilisé pour obtenir environ 500 mg de l'échantillon (1) de collagène succinylé. (Rendement: environ 50% (poids/ poids". Procédé II (Hydrolyse partielle et succinylation du collagène): A 2 g d'un collagène insoluble ont été ajoutés 20 ml d'acide 2'490494 chlorhydrique 6 M et le mélange a été traité pendant 2 à 3 heures à la température ambiante. Ensuite, le mélange a été refroidi et neutralisé par addition d'une solution aqueuse de soude à 50%. Le produit a été séparé par centrifugation (à 2000 tours/minute) et la partie surnageante a été dialysée avec de l'eau distillée. Durant la dialyse, des précipités se sont formés mais seule la partie surnageante a été lyophi- lisée, ce qui a donné un rendement d'environ 330 mg de l'échan- tillon (2). Les précipités formés durant la dialyse ont été traités conformément au procédé I et succinylés. Environ 440 mg d'un échantillon (3) ont été obtenus. Lorsque de l'acide chlorhydrique concentré ou de l'acide sulfurique ont été utilisés à la place d'acide chlorhydrique 6 M dans les procédés ci-dessus, des résultats semblables - ont-été obtenus en un temps plus court que dans les procédés mentionnés ci-dessus. EXPERIENCE II: Action facilitant le passage des érythrocytes à travers des filtres à membrane. i) Effets de la gélatine: Un mélange d'une partie de sang humain et d'une partie (vol/vol) d'une solution préservatrice (du glucose contenant un tampon de citrate de sodium) a été lavé 4 à 5 fois avec une solution saline physiologique et ensuite 2% (en volume) d'une solution d'érythrocytes a été préparée dans une solution saline physiolo- gique. Dans l'étape suivante, des solutions salines physiologi- ques contenant 0,05% de gélatine, 0,1% d'acide a1-glycoprotéi- nique, 0,1% de polyéthylène glycol, 0,1% de y-globuline,0,%l d'ovomucolde, 0,1% de dextrane, 0,1% de sulfate de dextrane, 0,1% de sulfate de chondroitine ou la solution saline physio- logique seule ont été mélangées avec un volume égal d'une suspension d'érythrocytes, et ensuite chaque mélange a été secoué doucement pendant 30 min à 370C' Ensuite 1 ml de chaque mélange a été soumis à une filtration à travers un filtre- à membrane en nitrocellulose (13 mm de diamètre et 50 pm comme dimension moyenne des micropores, fabriqué par Sartorius Co.) à 37 C sous une pression de 10,7 kpa. Le filtrat a été soumis immédiatement à une centrifugation pendant 2 min.à 1500 tours/minute et à partir de la partie surnageante, le taux d'hémolyse durant la filtration a été calculé sur la base de l'absorbance à 420nm. En ce qui concerne les érythro- cytes restés sur le filtre, 5ml d'eau désionisée ont été ajoutés aux érythrocytes sur le filtre à membrane en les plaçant dans un tube à essai et l'hémolyse résultante due à l'hypotonicité a permis de mesurer l'absorbance à 420nm pour calculer le taux des érythrocytes ayant filtré à travers la membrane. Les résultats sont donnés dans la figure 1. Comme cela est évident à partir des résultats, dans le témoin (solution saline physiologique seule) , aucun érythrocyte n'est passé à travers le filtre. D'autre part, dans la solution saline contenant 0,05% de gélatine, le taux de passage des érythro- cytes augmente remarquablement et le taux d'hémolyse est réduit. Dans les expériences effectuées avec d'autres substan- ces, les cellules du sang ont passé difficilement à travers la membrane. Seul l'acide al-glycoproteinique qui a déjà été mentionné par les inventeurs, présente une activité semblable d'accélération du passage des érythrocytes à travers des micro-pores (voir, Maeda, Nishi & Mori; "Science de la vie", Vol. 27 N 2, pages 157-161, 1980). Une expérience sur l'hémolyse par la méthode de filtration ci-dessus a montré qu'environ 25 à 30% des érythrocytes sont hémolysés dans le cas d'une solution saline physiologique seule. Dans le cas de y-globuline humaine et de sulfate de dextrane la proportion est de 25 à 30%. Lorsqu'une gélatine et un acide al-glycoproteinique sont essayés, l'hémolyse se-produit seulement à raison de 5 à 7%. 274 90494 Ainsi, les résultats montrent que la gélatine facilite le passage des érythrocytes à travers des micropores et empêche l'apparition de 1' hémolyse. ii) Effets d'un collagène solubilisé: Des érythrocytes de moutons ont été convenablement dilués dans une solution saline physiologique (pH 7,2) tamponnée avec du phosphate de sodium à 0,01 M pour obtenir un solution à 2% d'érythrocytes (vol/vol). Un filtre à membrane ayant une dimension moyenne de pore de 3pet présentant un diamètre de 13 mm a été utilisé.Une partie de la solution saline phy- siologique contenant les échantillons suivants savoir les échantillons (1) , (2), (3), de la gélatine, du dextrane, un acide a1-glycoproteinique, de l'albumine de sérum, sous une concentration finale de 0,05% respectivement, ou une solution saline seule a été mélangée avec une partie de la suspension à 2% mentionnée ci-dessus d'érythrocytes de mouton. Le mélange a été secoué pendant 30 min à 370C. Ensuite, un millilitre de chaque mélange a été filtré avec le filtre à membrane sous une pression de 10,7 kpa. 0,5ml du filtrat a été soumis à une centrifugation à 1500 tours/minute pendant 2 minutes et le taux d'hémolyse a été déterminé en mesurant l'absorbance à 420nm. La partie restante des érythrocytes pris par la membrane a été déterminée comme indiqué ci-dessus. Les résultats sont donnés dans la figure 2. Les résultats montrent que l'addition d'un collagène solubilisé à 0,05% facilite le passage des érythrocytes de mouton à travers les micropores et, de plus, réduit le taux d'hémolyse jusqu'à environ 30 à 40% du témoin. Ceci indique que le médicament de la présente invention à des actions lubrifiantes et stabi- lisantes sur la membrane cellulaire d'érythrocyte, et en conséquence facilite le passage des érythrocytes à travers les micropores et empêche la production d'hémolyse durant le passage. EXPERIENCE 3: Effets de la gélatine sur la microcirculation in vivo. 24 90494 Un lapin a été anesthésié avec de l'uréthane. Sa cavité abdo- minale a été ouverte pour mettre à nu le mésentére et l'écou- lement du sang dans les vaisseaux capillaires a été observé au microscope. L'écoulement et le passage des érythrocytes à travers les micro vaisseaux sont bons sous une pression normale du sang mais lorsque la pression du sang diminue par hémophilie ou par administration de pentobarbital, on a observé une diminu- tion du passage des érythrocytes et une stagnation d'érythrocytes pour une pression artérielle du sang de 8 à 10,7 kpa. Lorsque la pression artérielle du sang est abaissée jusqu'à 5,3 à 8 kpa, presque tous les érythrocytes stagnés dans les vaisseaux micro- capillaires et l'on a observé la formation de rouleau et la séparation du plasma à partir des constituants cellulaires du sang. Une transfusion intra-artérielle ou une injection intraveineuse continue de gélatine sous des doses de 0,1 à lg/kg empêchent la stagnation des érythrocytes, la formation de rouleau et la séparation du plasma à partir des composés des cellules dans les vaisseaux capillaires fins, ce qui avait été observé à une pression artérielle basse du sang dans la période de contrôle. Même à une pression artérielle du sang de 5,3 à 8 kpa, les érythrocytes se déplaçent régulièrement dans les vaisseaux mi- crocapillaires, quoique leur vitesse soit ralentie. D'autre part, d'autres substances telles que le sulfate de dextrane, l'immunoglobuline ou l'albumine pure n'exercent aucune action sur la microcirculation comme cela a été observé nour la gélatine. A partir des résultats décrits ci-dessus, on conclut que la gélatine possède des effets facilitant la microcirculation in vivo et pourrait parfaitement empêcher la formation de thrombus dans les petits vaisseaux sanguins. EXPERIENCE 4: Relation dose-réponse de la gélatine sur la filtration et l'hémolyse. i)En suivant des procédures semblables à celles de l'Expérience 2 avec une exception concernant les concentrations de 0 à 2,0 mg/ml de gélatine, les effets de la substance sur les taux de filtration des érythrocytes à travers le filtre à membrane et le taux d'hémolyse, ont été examinés pour diverses con- centrations de gélatine. Les résultats sont représentés dans la figure 3. Le taux de filtration atteint un palier pour une concentration de 0,5 mg/Ml. Une augmentation supplémentaire de la concentra- tion n'améliore pas le taux de filtration. ii) En suivant des procédures semblables à celles de l'Expé- rience 2 avec une exception en ce qui concerne les concen- trations de 0 à 1,0 mg/ml de collagène solubilisé, on a examiné les effets du collagène solubilisé sur la filtration des érythrocytes à travers le filtre à membrane pour diverses concentrations de la substance. Comme représenté dans la figure 4, le taux de filtration des érythrocytes atteint un pic à une concentration de 0,5 mg/ml de collagène solu- bilisé. EXPERIENCE 5: Toxicité de la gélatine et du collagène solubilisé. Les résultats de la toxicité aiguë de la gélatine et du collagène solubilisé sont résumés dans' les Tableaux 1, 2 et 3. Les résultats montrent que la toxicité aiguë de ces substances est très modérée et de ce fait elles apparaissent comme étant très sûres pour le médicament utilisé dans les buts mentionnés ci-dessus. La gélatine ne présente en elle- même aucune activité antigénique. Tableau 1 (DL50 de la gélatine)- Animal DL50 (mg/ml) Méthode d'administration Rat >1.000 intraveineuse, intrapéri- tonéale, sous-cutanée. Mouton > 1.000 intraveineuse, intrapéri- tonéale, sous-cutanée. il Tableau 2 (DL50 du collagène solubilisé) DL50 (mg/ml) Méthode d'administration intrapéritonéale, sous- cutanée. intrapéritonéale, sous- cutanée intrapéritonéale, sous- cutanée Tableau 3 (Toxicité de la gélatine sur une culture de cellules) Toxicité (inhibition à % du développement) Hela S3 Fibroblasts du poumon de l'embrion humain Cellules lymphoblastoides P3HR-1 transformées par le virus EB > 100 V g/ml > 100 il g/ml > 100 i g/ml Les Exemples suivants sont donnés pour illustrer certaines procédures de la présente invention, mais la présente inven- tion n'est pas limitée auxdits Exemples. EXEMPLE 1: (injection) Une préparation pour injection intra-artérielle a été préparée en dissolvant 10mg de collagène solubilisé dans 10 ml d'une solution physiologique contenant 5% de maltose. EXEMPLE 2: (injection) Animal Souris Rat Lapin > 1.000 > 1.000 > 1.000 Cellule 2'490494 Une préparation pour injection intraveineuse a été préparée en dissolvant lOOmg de collagène solubilisé dans 50ml d'une solution aqueuseà 0,1% de bicarbonate de sodium contenant % de glucose. EXEMPLE 3: (injection) Une préparation pour injection intraveineuse pour goutte à goutte a été préparée en dissolvant lOg de collagène so- lubilisé dans 500ml d'une solution de Ringer à 5% de maltose. EXEMPLE 4: (solution pour goutte à goutte) Une solution pour transfusion sanguine a été préparée en dissolvant 0,lg de collagène solubilisé dans 200ml du volume de l'ensemble de la transfusion sanguine. EXEMPLE 5: (solution pour goutte à goutte) Une solution pour transfusion sanguine a été préparée en dissolvant l,Og de collagène solubilisé dans l0Oml d'une solution pour transfusion d'érythrocytes sour forme concentrée. EXEMPLE 6: (agent d'entretien pour dispositif d'assistance) Une solution de Ringer contenant 5 à 20 g par litre de col- lagène solubilisé peut être utilisée comme solution de pré- con.ditionnement à utiliser avant la mise en service d'un appareil de circulation extracorporelle ou d'un dispositif d'assistance. EXEMPLE 7: (agent d'entretien pour dispositif d'assistance) Une solution aqueuse à 10% de collagène solubilisé peut être utilisée comme un agent de lubrification et pour protéger la membrane des cellules sanguines. Elle peut être introduite par un robinet à trois voies de l'appareil de circulation extracorporelle ou du dispositif d'assistance. EXEMPLES 8 à 14: Des agents ont été préparés de la même manière que dans les Exemples 1 à 7 ci-dessus en utilisant de la gélatine à la place du collagène solubilisé. Revendications 1. Un agent pour améliorer la circulation sanguine, caractérisé en ce qu'il comporte comme composé actif de la gélatine et/ou un collagène solubilisé 2. Un agent pour améliorer la circulation sanguine selon la revendication 1, caractérisé en ce que l'agent est une-solution pour injec- tion. 3. Un agent pour améliorer la circulation du sang selon la revendication 1, caractérisé en ce que l"agent est un agent de précondition- nement, un agent d'entretien ou un agent pour protéger la membrane des cellules durant le fonctionnement de divers appareils d'assistance pour circulation sanguine extracor- porelle. 4. Un agent pour améliorer la circulation sanguine, caractérisé en ce qu'il est constitué par une composition contenant de la gélatine et/ou un collagène solubilisé comme composé actif et un support acceptable pharmaceutiquement. 5. Un agent selon la revendication 4, caractérisé en ce qu'il est administrjable par injection. 6. Un agent selon la revendication 4, caractérisé en ce qu'il est utilisable comme agent de précondi- tionnement, agent d'entretien ou agent pour la protection de la membrane des cellules durant le fonctionnement de divers appareils d'assistance pour circulation sanguine extracorpo- relle.