FR 2492841 A1 19820430 FR 8022721 A 19801023 La présente invention concerne un nouveau vaccin utilisable pour prémunir les salmonidés, et plus particulière- ment les truites Arc-en-ciel, contre la Septicémie Hémorragique Virale, ou SHV en abrégé. Elle concerne également sa préparation et un nouveau microorganisme qu'elle fait intervenir. On sait qu'il existe en fait plusieurs virus respon- sables de cette maladie, comme il est précisé notamment dans la demande de brevet français déposée le 8 Février 1977, sous le No. 77.03438 au nom de la Demanderesse, et son Certificat d'Addition déposé le 19 Janvier 1978, No. 78.01556. Pour prévenir la maladie, on a déjà proposé d'admi- nistrer aux poissons, à titre de vaccin, du virus inactivé par traitement chimique. On trouvera dans les demandes de brevets déjà citées tous les détails souhaitables sur un tel vaccin, sa préparation et les conditions de son efficacité. L'invention propose de remplacer la vaccination connue, qui fait appel à un virus tué, par une vaccination par un virus d'une souche nouvelle, mais vivant, et de permettre ainsi une vaccination plus sûre et plus durable. Conformément à l'invention, on utilise comme vaccin une forme mutante de virus de SHV qui est pratiquement non vi- rulente dans les conditions de vie habituelles des poissons. Ce vaccin se caractérise en ce qu'il est essentiellement cons- titué par un mutant de virus de SHV cultivé à température com- prise entre 21 et 30C. Une souche d'un tel mutant a été déposée à la Collection Nationale de Cultures de Microorganismes à l'Institut Pasteur, o elle a reçu le No. i-136. Il s'agit d'un microorganisme-nouveau obtenu à partir d'un virus de SHV exis- tant, par un procédé qui consiste essentiellement à reproduire ce virus en culture cellulaire, en effectuant une série de pas- sages à des températures progressivement croissantes depuis une température comprise entre 12'C et 15'C jusqu'à une température d'au moins 230C, et de préférence comprise entre 230C et 280C. Le virus de départ se développe bien dans la première gamme de températures, qui est voisine des températures des eaux dans lesquelles vivent les truites. Au contraire, le mutant se dé- veloppe aux températures nettement plus chaudes de la seconde gamme, mais il a perdu l'essentiel de sa virulence pour les truites. Ce qui est dit ici s'entend naturellement aussi des autres salmonidés sensibles à la SHV. Dans la mise en oeuvre du procédé, chaque passage implique avantageusement d'inoculer la culture en couche mono- cellulaire par une dose de virus d'environ 10 unité for- mant plage (UFP) par cellule, de laisser le virus se développer pendant un temps suffisant pour obtenir la destruction complète du tapis cellulaire, généralement de l'ordre de 1 à 5 jours, et et de prélever du virus dans le surnageant liquide pour consti- tuer l'inoculum pour le passage suivant. La culture cellulaire est de préférence constituée de cellules de peau de Carpe de la lignée EPC (Epithelioma Papulosum Cyprini), dont un échantil- lon a fait l'objet d'un dépôt de souche à la Collection Natio- nale de Cultures de Microorganismes (Institut Pasteur) sous le No. i-039. Le milieu de croissance est généralement du milieu de Stoker, supplémenté par du sérum d'embryon de bovins comme il a été décrit dans les demandes de brevets déjà citées. Le nombre de passages peut être très variable (géné- ralement de 20 à 150 passages), avec toutefois de préférence au moins 5 passages par gamme de 30C d'accroissement de température, à partir de 18'C, ce qui correspond par exemple à au moins 5 passages, et de préférence 10 à 50 passages, à chacun de trois paliers dans l'augmentation progressive de température, à environ 200C, 230C, et 25- 260C. C'est ainsi que l'on a obtenu le mutant dénommé F25 (21) qui a fait l'objet d'un dépôt de souche à la même Collection le l1er Octobre 1980 sous le No. i-136. Le virus mutant, ou virus "chaud", se distingue du virus d'origine par sa capacité de multiplication à des tempé- ratures relativement chaudes auxquelles les virus S1V nocifs à l'égard des truites ne sont pas viables, par exemple de l'ordre de 250C. La forme mutante peut être utilisée à titre de vaccin sur les alevins de truites et autres salmonidés, car elle est à la fois inoffensive mais efficace pour immuniser les poissons contre la contamination par les différents virus de SHV. L'ad- ministration peut s'effectuer par toutes voies, et notamment par voir intramusculaire sur chaque individu, à une dose de l'ordre de 10 à 104 UFP, mais on préfère en pratique diluer le virus mutant, à une concentration comprise entre 5.104 et 106 UFP/ml, dans l'eau d'un bain de vaccination dans lequel on immerge les alevins pendant un temps suffisant pour leur conférer l'immunisation, généralement de l'ordre de 15 minutes à 3 heures. La température est comprise entre 8 et 15cC, et de préférence entre 8 et 120C, ce qui correspond à la température usuelle des écloseries. Le traitement peut avoir lieu notamment sur des alevins de 1 à 5 g. On décrira maintenant plus en détails un mode de préparation du vaccin et des essais de vaccination d'alevins de Truite Arc-en-ciel en précisant les conditions d'utilisatior du vaccin et les résultats qui démontrent son innocuité et son efficacité dans la prévention de la SHV. Préparation du vaccin Le virus SHV de départ est issu de la souche danoise Fl. Ce virus a été cultivé en passages successifs sur une culture cellulaire de poisson. La culture cellulaire en mono- couche était réalisée en boîte de matière plastique et cons- tituée de cellules de Carpe de la lignée EPC, mises en culture dans du milieu de Stoker, tamponné à pH 7,4, par du tampon tris-HCl 0,16 M et supplémenté par 10 % de phosphate de tryp- tose et 10 % de sérum d'embryon de bovin. Après incubation une dizaine d'heures à 28-300C, la culture était ramenée à 14'C pour servir à la croissance du virus. A chaque passage, le tapis cellulaire était inoculé avec une dose de virus de 0,001 à 0,01 UFP par cellule, on laissait la culture se poursuivre pendant 1 à 3 jours, jusqu'à destruction complète des cellules, et le surnageant infectieux dilué (10-2 à 10 3) constituait l'inoculum du passage suivant. Pour tous les titres indiqués dans ce texte en UFP (Unités Formant Plage, ou "Plaque Forming Units"), le titrage est effectué comme il a été décrit dans les demandes de brevets déjà citées. Au cours de ces passages successifs on a acclimaté le virus à des températures progressivement croissantes. Après subcultures successives à 20C, on a prélevé un clone de la dernière pour inoculer la première d'une série de 20 autres subcultures o la croissance était réalisée chaque fois à 230C, pendant 24 heures. Puis l'on a poursuivi les opérations en portant la température à 25,50C. Au vingt et unième passage à 25,50C, on a obtenu la souche mutante qui a fait l'objet du dépôt déjà mentionné, avec la dénomination F 25 (21). Aux premiers passages à 25,50C, comme à chacun des paliers de températures, la croissance du virus devait se poursuivre pendant 3 jours, mais une fois acclimaté, sa capa- cité de multiplication à cette température est suffisante pour que le temps de croissance soit réduit à 24 heures. - Ce virus est conservé à l'état congelé à -30C ou à -700C.-Il peut aussi être lyophilisé. Le mutant se distingue des virus connus de SHV par le fait qu'il se développe en culture de cellules de poissons à température supérieure à 21'C et notamment comprise entre 210C et 250C, alors que les souches qui provoquent la maladie dans les piscicultures ne se développent pas de manière signi- ficative à ces températures. Essais de vaccination Pour servir à la vaccination des salmonidés, et plus particulièrement des truites, le virus mutant "chaud" de la souche ci-dessus est remis en culture, par exemple de la manière ci-après: On inocule la culture de cellules EPC avec un inoculum de virus de 0,01 à 0,001 UFP par cellule. Pour assurer l'adsorp- tion du virus sur les cellules, on maintient une température de C, pendant une heure, en présence de 50 pg/ml de DEAE Dextran, en s'assurant que le tapis cellulaire soit bien couvert par l'inoculum. De manière à obtenir un titre d'au moins 10 UFP/ml, on laisse le virus se multiplier pendant 24 heures à 250C. On le récolte alors par centrifugation (à 3000 g pendant 15 minutes) et on le congèle à -3O'C ou à -70'C. Pour une administration individuelle par injection, on recommande une dilution de manière à obtenir des doses de 10 à 104 UFP par poisson sous le volume final convenable à injecter vu la taille de l'animal (de 0,05 à 0,5 mi). Mais pour une vaccination facile à réaliser dans les conditions d'élevage habituelles en pisciculture, on préfère la vaccination par bain, sur des alevins de 1 à 5 grammes, au moyen d'une suspension aqueuse de virus préparée par dilu- tion de 5 ml de la préparation virale titrant 108 UFP/ml dans 1 litre d'eau. Il suffit d'y plonger les poissons pendant 30 minutes, à la température usuelle des piscicultures, soit 8 à 12oC. Deux semaines après cette vaccination, les poissons résistent aux infections de SHV et cette immunisation per- siste au moins pendant 6 mois. Ils sont alors proches de leur taille commerciale. Dans les essais qui seront rapportés ci-après, on a étudié l'influence de différentes variables, mais sauf indication contraire, les conditions appliquées pour l'admi- nistration du vaccin étaient les suivantes température du bain: 10 C concentration en virus: 5.105 UFP/ml densité des poissons dans le bain: 1 kg par litre temps de contact: 30 minutes délai de l'épreuve: 20 jours après l'immunisation compte des survivants: 4 semaines après l'épreuve Pour l'épreuve, les poissons vaccinés étaient mis en contact avec du virus SHV de la souche INRA 07-71 telle que déposée à la Collection Nationale de Cultures de Microorganismes (Institut Pasteur), sous le No. i-040, dans les mêmes conditions d'infection par bain que pour la vaccination. Le pourcentage des survivants dénombrés 4 semaines après l'épreuve est exprimé par rapport à un total de poissons qui comprend les morts intervenues aussi bien pendant la période d'immunisation que pendant la période d'épreuve. Seuls en sont éliminés les poissons accidentés pendant les manipulations. Atténuation et pouvoir protecteur On a administré par bain à des alevins Arc-en-ciel de 2,5 g, du virus mutant chaud à un premier lot d'alevins, et du virus sauvage de la souche 07-71 à un second lot. On a immergé les alevins pendant 3 heures dans un bain à 10îC à 50000 UFP/ml de virus, en proportion de 1 volume de poissons pour 10 volumes de suspension vaccinante. Un troisième lot ne recevait aucun traitement spécial. Quatre semaines après, on a constaté bien sûr une mortalité très importante pour le deuxième lot, mais une mortalité par contre très faible pour le premier lot. On a alors soumis les poissons survivants, ceux du premier et du troisième lots, à une épreuve par le virus sauvage, en leur administrant aux uns et aux autres ce virus, en bain, comme ci-dessus. La mortalité constatée après encore 4 semaines était faible pour le premier lot, correspondant aux poissons vaccinés, très forte au contraire pour le troisième lot, o les poissons n'avaient pas été traités au préalable. Dans le tableau ci-après des résultats, on a indiqué la proportion des poissons survivants après chaque traitement en pourcentage du nombre des poissons dans le lot soumis au traitement. Lot No. 1 * 2 3 : _ _: - - -t :lère infection:virus chaud:virus sauvage: % de survie * 94. 15 *après 28 jours: :Epreuve:virus sauvage: -:virus : o sauvage :% de survie: 79 :au 56e jour Durée d'immersion et concentration L'expérience a porté sur des lots d'une centaine d'alevins chacun, soumis à vaccination en bain, avec des doses variables exprimées par la concentration du bain en vaccin, variant de 5.104 à 5.105 UFP/ml. La durée du contact avec la solution vaccinante variait de 15 à 150 minutes. L'épreuve avait lieu 21 jours après la vaccination. On a obtenu les résultats du tableau ci-après. Vaccination 4 Dose UFP/ml O 2.105 5105 2.10 5.10 Durée minutes (témoin) 30 15 15 150 Total de poissons 101 97 98 99 95 Morts 2 7 7 4 2 Epreuve Total poissons 99 88 91 94 93 Morts 75 27 21 35 28 Survivants 23 61 70 59 65 Bilan:% survivants22,8 62,9 71,4 59,i6 68,4 Essais d'innocuité Le virus vaccin, réisolé de poissons morts pendant la période d'immunisation, ne montre aucune augmentation de virulence par rapport au vaccin initial. Ainsi, sur des lots de 33 alevins de 2,5 g ayant respectivement reçu différents virus, les % de mortalité au bout de 4 semaines étaient les suivants: Virus % morts 0 3 virus pathogène 87,8 virus vaccin 6 virus vaccin réisolé 9 De même dans une autre expérience effectuée sur des animaux d'une autre origine (160 à 148 par lot) Virus % morts 0 o,6 virus vaccin 15,7 virus vaccin réisolé 13 De même encore, au cours de passages successifs de poisson à poisson, effectués à 6 jours d'intervalle par injec- tion, le virus n'a plus été réisolé à partir du 7e passage. Donc, au lieu de retrouver de la virulence, il a eu le compor- tement inverse en disparaissant. Enfin, le virus chaud cultivé de nouveau à froid (140e> sur cellules pendant 5 passages consécutifs ne montre pas d'augmentation de virulence Virus % morts o 10 virus vaccin (5 27 passages à 140C) virus vaccin normal 25 D'autre part, on s'est préoccupé de savoir si les animaux vaccinés excrétaient un virus qui pouvait être dangereux pour les poissons situés en aval. Dans une première expérience, aucune mortalité significative n'est survenue chez les sujets recevant l'eau contenant des vaccinés et les 3 morts recueillis (sur 100) ont conduit à des résultats d'examens virologiques négatifs. Donc le virus vaccin ne semble pas dangereux pour les poissons situés en aval, mais il est cependant excrété à faible dose car les survivants précédents, confrontés ensuite au virus pathogène, ont montré une résistance significative. Animaux % de mortalité Témoins non vaccinés 60,1 Témoins ayant reçu l'eau des vaccinés 40,4 vaccinés 27 La confirmation d'une légère excrétion du virus vaccin est apparue dans les essais d'innocuité par injection au cours desquels le virus a pu être réisolé de 1 sur 12 des animaux marqués et ajoutés dans l'aquarium contenant les poissons vaccinés 24 heures après l'injection à ces derniers. Mais aucune mortalité n'est survenue au cours de ces trans- missions par contact. L'innocuité a aussi été vérifiée en fonction de la température. Alors que dans la nature la contamination des truites par la SHV ne se produit guère qu'à des températures inférieures à 150C, on a réalisé la vaccination dans les conditions, pour le reste, standard, en maintenant la tempé- rature de bain à 180C. On a obtenu les résultats suivants: à 10oC à 180C Vaccination oui non oui non Total initial 101 198(+) 78 86 Morts 31 15 9 4 Disparus O 4 O O (+) en 2 aquariums Epreuve (à 10C) Total initial Morts Disparus Survivants Bilan % survivants 179 6 129 o 3 61 47 23,7 69 82 14 59 3 2 52 21 66,6 24,4 Contamination par différents virus SHV Le vaccin protège les truites contre différents types de SHV. Après vaccination par 50000 UFP/ml de virus mutant pendant 180 minutes à IOC sur des alevins de 2,5 g, l'épreuve a été réalisée 31 jours après, avec soit du virus SHV 1 de la souche 07-71, soit du virus 23-75 de la souche INRA qui a été déposée à la Collection Nationale de Cultures de Microorganismes (Institut Pasteur) sous le n0 i-039. Ce dernier virus est particulièrement virulent. Dans chaque cas la comparaison a été faite avec un lot témoin d'alevins non vaccinés. Virus d'épreuve: 07-71 Vaccination: oui non Total initial 150 149 Morts 9 3 Disparus 2 0 Epreuve: Total initial 139 146 Morts 60 106 Survivants 79 40 Bilan: % survivants 52,7 26,9 (+) Animaux tués ou tombés sur le sol au cours 23-75 oui non 150 3 2 o 147-22(+) 38,7 1,6 des manipulations Le pourcentage des survivants est calculé par rapport au total (survivants + morts en période d'immunisation et en période d'épreuve). Administration par injection Le vaccin a été injecté par voie intramusculaire, à la dose de 10-20 UFP par individu. L'épreuve a eu lieu au moyen de virus 07-71 dans les conditions standard 31 jours après la vaccination. La comparaison avec un lot témoin de poissons non vaccinés a fait apparaître les résultats ci- apres. Vaccination oui non Total initial 50 Morts 10 - Epreuve Infectés 40 50 Morts 4 40 Survivants 36 10 % survivants 72 20 Recherche du virus chez les animaux vaccinés Sur des truitelles vaccinées de 2,2 g dans les conditions standard définies ci-dessus, on a recherché la présence du virus 3, 7, 15 et 21 jours après la vaccination. Le virus n'a jamais pu être mis en évidence sur plus de 50 % des animaux. Dans des lots de 100 poissons, il a été trouvé sur 20 % d'entre eux à 3 jours, sur 15 % à 7 jours, sur aucun à 20 jours. Essai à grande échelle En procédant dans les conditions standard définies ci-dessus (5.105 UFP/ml, 30 minutes), 5000 poissons de 2 g ont été vaccinés en laboratoire et 5000 témoins ont été traités de la même façon avec du milieu de culture cellulaire. Au bout de 14 jours, 300 vaccinés et 300 témoins ont été répartis en aquariums (75 poissons par aquarium) pour être soumis à l'épreuve virulente au laboratoire. Le reste des animaux a été transféré en piscicul- ture le même jour pour y subir l'épreuve virulente naturelle. Le 20e jour après l'immunisation, la mortalité respective enregistrée dans les deux lots était de 7 % chez les vaccinés et de 2 % chez les témoins. L'épreuve de laboratoire, effectuée le 20e jour, s'est traduite au bout de 4 semaines par une survie de 70 % des animaux vaccinés contre 20 % des témoins, Des résultats identiques ont été obtenus avec la contamination directe des poissons (virus ajouté dans l'eau) ou par contamination au là moyen de poissons précontaminés (contact). L'épreuve de pisciculture a conduit à une mortalité débutant 30 jours après l'introduction des poissons et a laissé subsister 80 % des vaccinés et 40 'I des témoins. Dans ce cas, le plus grand espace dont disposaient les poissons peut rendre compte du relatif ralentissement de la contagion. Les deux épreuves ont donc révélé l'efficacité de la protection conférée par le vaccin même administré à des effectifs 30 à 50 fois plus élevés que ceux des lots expéri- mentaux habituels. REVENDICATIONS 1. Nouveau microorganisme constitué par un virus de SHV (Septicémie Hémorragique Virale de la Truite), sous la forme du mutant déposé à la Collection Nationale de Cultures de Microorganismes à l'Institut Pasteur le ler Octobre 1980 sous le NO. i-136. 2. Vaccin pour l'immunisation des truites contre la SHV, caractérisé en ce qu'il est essentiellement constitué par une forme mutante du virus SHV cultivée à température comprise entre 21 et 301C, et de préférence de l'ordre de 250C. 3. Vaccin selon la revendication 2, caractérisé en ce que ladite forme mutante provient de la souche F 25 (21) telle que déposée à la Collection Nationale de Cultures de Microorganismes à l'Institut Pasteur le ler Octobre 1980 sous le No. i-136. 4. Vaccin selon la revendication 3, caractérisé en ce que ladite forme mutante est produite en culture cellulaire de poisson, notamment sur cellules Epithelioma Papulosum Cyprini. 5. Vaccin selon la revendication 4, caractérisé en ce que la forme mutante est produite à un titre d'au moins 10 UFP par ml. 6. Vaccin selon les revendications 2 à 5, caractérisé en ce que ladite forme mutante est contenue en concentration comprise entre 10 et 104 UFP par dose unitaire de 0,05 à 0,5 ml, dans un véhicule sous forme fluide convenant pour 9tre adminis- tré en injections. 7. Vaccin selon la revendication 2 ou 3, caractérisé en ce que ladite forme mutante est contenue en concentration comprise entre 5.10.4 et 106 UFP/ml dans un bain aqueux pour l'immersion d'alevins de truite. B. Procédé de préparation d'un vaccin pour l'immu- nisation des truites contre la SHV selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que l'on cultive du virus de SHV en milieu cellulaire en effectuant une série de passages à des températures progressivement croissantes depuis une température comprise entre 12 C nt C jusqu'à une température comprise entre 23 C et 28 C. 9. Procédé selon la revendication 8, caractérisé en ce que l'on effectue au moins 5 passages par gamme de 3 C d'accroissement de température à partir de 180C, avec de préférence au total 20 à 150 passages de 18 C à 25-26 CE.