FR 2488803 A1 19820226 FR 8116060 A 19810821 La présente invention concerne un procédé pour la production d'érythropolétine humaine. L'érythropolétine humaine est une hormone es- sentielle à la formation des érythrocytes, produite dans les cellules rénales humaines. Bien qu'on connaisse des procédés classiques pour la production d'érythropolétine humaine, tels qu'un procédé par récolte à partir de l'urine humaine (brevet US no 3 865 801) et un procédé par culture tissulaire, uti- lisant des cellules tumorales rénales, humaines (demande de brevet japonais publiée non examinée n0 55 790/79), ces deux procédés ne permettent pas la production en masse de l'érythropolétine humaine par suite de la faible teneur en érythropolétine humaine de l'urine humaine dans le pre- mier cas et de la faible production d'érythropolétine hu- maine par cellule et de la faible multiplication cellulaire dans le second. La demanderesse a recherché des procédés pour la production en masse d'érythropoiétine humaine peu coû- teuse. Ces efforts ont débouché sur la découverte inatten- due que des cellules lymphoblastoides, humaines, capables de produire l'érythropolétine humaine, se multiplient ra- pidement et ont une capacité de production par cellule de l'érythropolétine humaine supérieure et que ces cellules conviennent donc à la production d'érythropoiétine humaine. Plus précisément, l'invention concerne un procé- dé pour produire l'érythropolétine humaine, caractérisé en ce qu'on multiplie des cellules lymphoblastoides humai- nes, capables de produire l'érythropolétine humaine, par transplantation de ces cellules dans l'organisme d'un ani- mal à sang chaud, ou par multiplication de ces cellules dans un dispositif o elles sont alimentées en liquide nutritif de l'organisme d'un animal à sang chaud; on laisse ensuite les cellules, multipliées par l'un ou l'autre de ces modes de multiplication, libérer l'érythropolétine humaine. Le procédé de l'invention, permet une production accrue d'érythropolétine humaine, ne nécessite pas, ou bien moins, de milieu nutritif contenant un sérum co- teux pour la multiplication cellulaire et rend l'entretien du milieu de culture, pendant la multiplication cellulai- re, bien plus facile que dans le cas d'une culture de tis- su in vitrol. En particulier, on peut multiplier facile- ment toutes les cellules humaines capables de produire 1' érythropolétine humaine, en utilisant le liquide nutri- tif de l'organisme d'un animal à sang chaud, par trans- plantation de ces cellules dans l'organisme de l'animal ou mise en suspension de ces cellules dans une chambre de diffusion, conçue pour recevoir le liquide nutritif de t1' organisme, l'animal étant alimenté de façon habituelle. Egalement, le procédé est caractérisé par une multiplica- tion cellulaire plus stable et plus abondante et un accrots- sement de la production d'érythropo%étine humaine par cel- lule. En ce qui concerne les cellules lymphoblastol- des, humaines, pouvant être utilis4es dans l'invention, on peut employer toute cellule produisant de l'érythro- polétine humaine et se multipliant facilement dans l'orga- nisme d'un animal.à sang chaud. Par exemple, on peut uti- liser, de façon avantageuse dans l'invention, des cellu- les lymphoblastotdes humaines dans lesquelles on a intro- duit les sites génétiques commandant la production d'éry- thropoiétine humaine de cellules rénales humaines norma- les, de cellules rénales ou hépatiques humaines transfor- mées, provenant d'un patient atteint d'un carcinome du rein ou d'un carcinome du foie, ou de cellules humaines de carcinome du poumon produisant de l'érythropolétine humai- ne ectopique, par fusion cellulaire avec emploi de poly- éthylèneglycol ou du virus Sendal, ou selon une technique de recombinaison génétique utilisant l'ADN-ligase, la nu- cléase et l'ADN-polymérase; et des cellules lymphoblas- toldes humaines produisant de l'érythropolétine humaine ec- topique. Comme l'emploi de ces cellules lymphoblastoldes humaines provoque la formation d'une tumeur massive, fa- cile à désagréger, lorsqu'on transplante ces cellules dans l'organisme d'un animal, et que cette tumeur est dif- ficilement contaminée par les cellules de l'animal hôte, on peut recueillir facilement les cellules lymphoblastol- des, humaines, vivantes, multipliées. En ce qui concerne les animaux à sang chaud, convenant à l'invention, on peut utiliser tout animal, pourvu que les cellules lymphoblastoldes, humaines, se multiplient dans son organisme. Par exemple on peut em- ployer avantageusement des volailles telles que poussin ou pigeon, ou des mammifères comme chien, chat, singe, ché- vre, porc, vache, cheval, lapin, cobaye, rat, hamster, sou- ris et souris nue. Comme la transplantation des cellules lymphoblastoTdes, humaines, dans l'organisme de l'animal provoque une réaction immunitaire indésirable, l'emploi d'un animal nouveau-né ou très/jeune ou à un stade le plus précoce possible,par exemple sous forme d'oeuf, d'embryon ou de foetus, est souhaitable. Pour réduire autant que possible la réaction immunitaire, on peut, avant la trans- plantation, traiter l'animal par irradiation avec des ra- yons X ou des rayons à raison d'environ 200 à 600 rems, ou par injection d'un antisérum ou d'un agent immunosup- presseur préparé selon un procédé classique. Comme les sou- ris nues, utilisées en tant qu'animaux à sang chaud, pré- sentent une réaction immunitaire plus faible, mAme lors- qu'elles sont adultes, on peut de façon pratique leur im- planter des cellules lymphoblastotdes, humaines, quelcon- ques, pour qu'elles se multiplient rapidement dans leur organisme sans qu'un tel prétraitement soit nécessaire. On peut effectuer une multiplication cellulaire stabilisée et accrottre la production d'érythropolétine humaine par transplantation répétée avec une ou plusieurs combinaisons d'animaux à sang chaud différents; par exem- ple peut-on tout d'abord implanter les cellules au hamster, pour qu'elles s'y multiplient, et les réimplanter à la souris nue. De plus on peut effectuer la transplantation répétée avec des animaux appartenant à la même classe ou à la môme division, ainsi qu'à la même espèce ou au même genre. On peut implanter les cellules lymphoblastoldes humaines à un site quelconque de l'animal, pourvu qu'elles s'y multiplient: par exemple on peut effectuer l'implan- tation dans la cavité allantolde ou par voie intraveineuse, intrapéritonéale ou sous-cutanée. En plus de la transplantation directe des cellu- les lymphoblastoldes humaines dans l'organisme d'un ani- mal, on peut,pour multiplier ces lignées de cellules lym- phoblastoIdes, humaines, classiques, quelconques, capa- bles de produire l'érythropo!étine humaine, utiliser le liquide nutritif de l'organisme d'un animal par introduc- tion, par exemple par voie intrapéritonéale, dane'orga- nisme de cet animal, d'une chambre de diffusion classique de forme et de taille appropriées, munie d'une membrane filtrante poreuse, d'un ultrafiltre ou de fibres creuses ayant des pores d'environ 10-7 à 10-5 m de diamètre empê- chant la contamination de la chambre de diffusion par les cellules de l'animal hôte et permettant au liquide nutri- tif dei'organisme de l'animal d'alimenter les cellules.De plus la chambre de diffusion peut être conçue, si nécessai- re, de façon à pouvoir être placée, par exemple, sur l'a- nimal hôte et permettre la circulation du liquide de l'or- ganisme de l'animal dans la chambre, ainsi que l'observa- tion de la suspension cellulaire dans la chambre par une ou plusieurs fenêtres latérales, transparentes, placées sur unq6u plusieurs parois de ia chambre, et pour pouvoir être remplacée et échangée par une chambre neuve; on ac- croit ainsi la production de cellules par hôte au cours de la période de vie de l'animal, sans avoir à sacrifier l'animal hôte. De plus, lorsqu'on utilise une telle chambre de diffusion, comme les cellules lymphoblastoldes, humaines, multipliées, peuvent être facilement récoltées et qu'il ne se produit pas de réaction immunitaire, par suite de l'absence de contact direct entre les cellules lymphoblas- toldes humaines et les cellules de l'animal hôte, on peut utiliser comme animal hôte, selon l'invention, un animal à sang chaud quelconque, sans aucun traitement préalable pour réduire la réaction immunitaire. On peut alimenter facilement de façon classique l'animal hôte, auquel on implante les cellules lymphoblas- toides, humaines,même après la transplantation des cellu- les, et aucun soin particulier n'est nécessaire. On obtient la multiplication maximale des cel- lules environ 1 à 20 semaines et généralement 1 à 5 se- maines après la transplantation cellulaire. Selon l'invention, le nombre des cellules lympho- blastoldes humaines obtenues par h8te est compris entre environ 107 et 1012 ou plus. En d'autres termes le nombre des cellules lymphoblastoldes, humaines, transplantées à l'animal hSte, s'accroit d'un facteur d'environ 102 à 107 ou plus, ce qui est supérieur d'environ 101 à 106 foisplus à ce qu'on obtient par la méthode de culture tissulaire in vitro avec un milieu nutritif; les cellules peuvent donc être utilisées de façon appropriée pour la production d'é- rythropoIétine humaine. En ce qui concerne le procédé, selon lequel on permet aux cellules lymphoblastoldes humaines de libérer l'érythropolétine humaine, on peut utiliser tout procédé, dans lequel les cellules lymphoblastoïdes, humaines, obte- nues selon le mode opératoire décrit plus haut, libèrent de l'érythropo!étine humaine. Par exemple les cellules lymphoblastoldes, humaines, multipliées, obtenues par mul- tiplication en suspension dans le liquide d'ascite et ré- coltées dans ce liquide, ou par extraction de la tumeur massive, formée sous la peau et récoltées après désagré- gation de cette tumeur massive, sont mises en suspension à une concentration d'environ 104 à 108 cellules par mil- lilitre dans un milieu nutritif, maintenues à une tempé- rature d'environ 20 à 400C, puis incubées à cette tempé- rature pendant encore 1 à 50 heures pour produire de l'é- rythropolétine humaine. Dans ce cas l'incubation de la suspension cellulaire sous une pression réduite d'environ 973 mbar ou moins, ou dans une atmosphère à teneur réduite en oxygène, dont 10% ou plus de l'air ont été substitués par un ou plusieurs autres gaz tels que l'azote ou le di- oxyde de carbone, accrott encore la production d'érythro- poiétine humaine. Egalement, on peut atteindre de façon efficace l'objectif visé, grâce à la présence d'une hor- mone mlle telle que la testostérone ou d'un cation métal- lique tel que Co++ ou Ni++. On peut facilement recueillir l'érythropolétine humaine, ainsi obtenue, selon des techniques de purifica- tion et de séparation comprenant des opérations classi- ques, telles que relargage, dialyse, filtration, centrifu- gation, concentration et/ou lyophilisation. Si on désire une préparation d'érythropolétine humaine plus purifiée, on peut obtenir une préparation de pureté maximale par combinaison des techniques précitées avec d'autres opéra- tions classiques, telles qu'adsorption et désorption avec échange d'ions, filtration sur gel, chromatographie d'af- finité, fractionnement au point isoélectrique et électro- phorèse z on peut ainsi obtenir facilement une préparation d'érythropolétine humaine de grande pureté, comme décrit par E. Goldwasser et coll., The Journal of Biological Chemistry, Vol.252, pp. 5558-5564 (1977). On peut de façon avantageuse utiliser la prépa- ration d'érythropoiétine humaine, seule ou en combinaison 24d83o03 avec un ou plusieurs agents pour l'administration par ih- jection, par voie externe ou interne, ou pour l'adminis- tration diagnostique, dans la prévention et le traitement de maladies humaines telles que l'anémie. La production d'érythropoiétine humaine dans le milieu de culture est déterminée selon la méthode biologi- que utilisant l'incorporation de Fe59 comme décrit par P. Marry Cotes et coll., Nature, N 4793, pp. 1065-1067 (1961) et on l'exprime en unités d'érythropo!étine humai- ne, une unité correspondant au dixième de l'érythropolé- tine humaine contenue dans uâ flacon du standard inter- national distribué par la World Health Organization. Plusieurs modes de réalisation non limitative de l'invention sont décrits ci-après. EXEMPLE 1 On met ensemble en suspension des cellules hu- maines de tumeur rénale désagrégée, obtenues par extrac- tion à un patient atteint d'une tumeur du rein, et hacha- ge, et des cellules lymphoblastoldes leucémiques, humaines, de lignée Namalwa, dans un récipient avec une solution sa- lée de concentration 140 mM en NaCl, 54 mM en KCl, 1 mM en NaH2P04 et 2 mM en CaC12, pour obtenir des concentrations de chaque type cellulaire d'environ 103 cellules par mil- lilitre. On mélange la suspension cellulaire glacée avec une préparation fra che du même milieu contenant du virus Senda! préalablement inactivé par irradiation par les ul- traviolets; on transfère dans une étuye à 37 C environ 5 minutes après le mélange, et on agite dans l'étuve pendant minutes, pour effectuer la fusion cellulaire et intro- duire la capacité de production d'érythropolétine humaine des cellules humaines de tumeur rénale dans la lignée lym- phoblastoide leucémique, humaine. Après clonage par le pro- cédé classique de la souche de cellules d'hybridome capa- ble de produire l'érythropolétine humaine, on implante les cellules de cette souche d'hybridome, par voie intrapéri- tonéale, à des souris nues, adultes, que l'on alimente de façon habituelle pendant 5 semaines. On extrait les tumeurs massives, produites, pesant environ 15 g chacune et on les désagrège par hachage et mise en suspension dans une'solu- tion salée, physiologique, contenant de la trypsine. Après lavage des cellules avec le milieu 199 de Earle (pH 7,2), additionné de 10% en volume de sérum de veau foetal, on remet les cellules en suspension dans une préparation fraîche du même milieu, pour obtenir une concentration cellulaire d'environ 106 cellules par ml, et-l'on incube à 370C pendant 20 heures sous une pression réduite de 933 mbar pour produire l'érythropoïétine humaine. On trai- te ensuite les cellules par les ultrasons et on détermine l'érythropolétine humaine dans le surnageant. La produc- tion d'érythropolétine humaine est d'environ 170 unités par ml de suspension cellulaire. On traite comme ci-dessus des cellules témoins obtenues par implantation des cellules humaines de tumeur rénale à des souris nues, alimentation des animaux de façon ha- bituelle pendant 5 semaines, extraction des tumeurs mas- sives, formées sous la peau, pesant environ 5 g chacune et désagrégation de ces tumeurs. La production d'érythro- polétine humaine n'est que d'environ 6 unités par ml de suspension cellulaire. EXEMPLE 2 Après injection d'antisérum, préparé avec un la- pin, selon un procédé classique, à des hamsters nouveau- nés, pour réduire leur réaction immunitaire, on implante aux animaux par voie sous-cutanée la lignée lymphoblastol- de leucémique, humaine, JBL, à laquelle on a conféré la capacité de produire l'érythropolétine humaine de cellu- les humaines de tumeur rénale comme dans l'exemple 1, puis on les alimente de façon habituelle pendant 5 semaines. On extrait les tumeurs massives, sous-cutanées, formées, pe- sant environ 10 g chacune, on les désagrège par hachage, 2 48C'O103 et on les met en suspension dans une solution salée, phy- siologique, contenant de la collagénase. Après avoir lavé les cellules avec du milieu essentiel minimum dqagle (pH 7,2) additionné de 5% en volume de sérum humain, on remet les cellules en suspension dans une préparation fraiche du m4me milieu, pour obtenir une concentration cellulaire d'environ 105 cellules par ml, et on incube à 354C per- dant 15 heures sous une atmosphère, dont on a remplacé 20% de l'air par du dioxyde de carbone, pour laisser les cellu- les libérer l'érythropo!étine humaine. La production d'é- rythropotétine humaine est d'environ 100 unités par ml de suspension cellulaire. On traite comme ci-dessus des cellules témoins obtenues par implantation des cellules humaines de tumeur rénale à des hamsters nouveau-nés, alimentation des animaux de façon habituelle pendant 5 semaines, et extraction des tumeurs massives, produitessous la peau, pesant environ 3 g cha- cune. La production d'érythropo%étine humaine n'est que d' environ 5 unités par ml de suspension cellulaire. EXEMPLE 3 On implante par voie intraveineuse à des rats nouveau-nés la lignée lymphoblastolde leucémique humaine BALL-1, à laquelle on a conféré, comme dans l'exemple 1, la capacité de produire l'érythropolétine humaine des cel- lules humaines de tumeur rénale, puis on les alimente de façon habituelle pendant 4 semaines. On extrait les tu- meurs massives, formées,pesant environ 30 g chacune et on les désagrège. Après avoir lavé les cellules avec le mi- lieu RPMI 1640 (pH 7,4) additionné de 10% en volume de sé- rum foetal de veau, on remet les cellules en suspension, pour obtenir une concentration cellulaire d'environ 107 cellules par ml dans une préparation fratche du même mi- lieu, puis on incube à 30 C pendant 40 heures dans une at- mosphère dont on a remplacé 30% de l'air par de l'azote pour laisser les cellules libérer l'érythropolétine hu- 248HI03 maine. La production d'érythropolétine humaine est d'envi- ron 340 unités par ml de suspension cellulaire. On traite comme ci-dessus des cellules témoins obtenues par implantation des cellules humaines de tumeur rénale à des rats nouveau-nés, alimentation des animaux de fa- çon habituelle pendant 4 semaines, extraction des tu- meurs massives, produites, pesant chacune environ 5 g, et désagrégation des tumeurs. La production d'érythro- polétine humaine n'est que d'environ 9 unités par ml de suspension cellulaire. EXEMPLE 4 On irradie des souris adultes avec environ 400- rens de rayons X, pour réduire leur réaction immunitaire et on leur implante, par voie sous-cutanée, la lignée lym- phoblastolde leucémique, humaine, NALL-1, à laquelle on a conféré, comme dans l'exemple 1, la capacité de produc- * tion d'érythropotétine humaine des cellules humaines de tumeur rénale, puis on les alimente de façon habituelle pendant 3 semaines. On extrait les tumeurs massives, for- mées sous la peau, pesant environ 15 g chacune, et on les traite comme dans l'exemple 1 pour obtenir une suspension cellulaire qu'on incube à 35 C pendant 20 heures dans un incubateur à dioxyde de carbone, en vue de la production de l'érythropoîétine humaine. Cette production est d'en- viron 60 unités par ml de suspension cellulaire. On traite comme ci-dessus des cellules témoins obtenues par implantation des cellules humaines de tumeur rénale à la souris, alimentation des animaux de façon habituelle pendant 3 semaines, extraction des tumeurs massives, pe- sant environ 5 g chacune, et désagrégation des tumeurs massives* La production d'érythropolétine humaine n'est que d'environ 3 unités par ml de suspension cellulaire. EXEAPLE 5 On met en suspension, dans une solution salée, physiologique, des cellules de la lignée lymphoblstolde 248O03 leucémique, humaine, TALL-1, auxquelles on a conféré, com- me dans l'exemple 1, la capacité de production d'érythro- potétine humaine des cellules humaines de tumeur rénale et on les transfère dans une chambre de diffusion cylindrique en matière plastique de volume intérieur d'environ 10 ml, munie d'une membrane filtrante ayant des pores d'environ 0,5 pm de diamètre. Après insertion de la chambre dans le péritoine d'un rat adulte, on alimente l'animal de façon habituelle pendant 4 semaines, et on retire la chambre. On obtient une densité des cellules humaines dans la chambre d'environ 7 x l08 cellules par ml, ce qui est supérieur d'environ 102 fois ou plus à ce qu'on obtient par culture in vitro avec un incubateur à dioxyde de carbone. On trai- te les cellules humaines, ainsi obtenues, comme dans l'e- xemple 3, pour produire de l'érythropolétine humaine. La production d'érythropolétine humaine est d'environ 420 u- nités par ml de suspension cellulaire. On traite comme ci-dessus des cellules témoins obtenues par mise en suspension des cellules humaines de tumeur ré- nale dans du soluté salé, physiologique, transfert de la suspension cellulaire dans la chambre de diffusion, in- troduction de la chambre dans le péritoine d'un rat adul- te, alimentation de l'animal de façon habituelle pendant 4 semaines et récolte des cellules humaines multipliées (environ 107 cellules par ml). La production d'érythro- poiétine humaine n'est que d'environ 12 unités par ml de suspension cellulaire. EXEMPLE 6 On implante dans la cavité allanto!de d'oeufs embryonnés, que l'on a préincubés à 37 C pendant 5 jours, des cellules de la lignée lymphoblastotde leucémique, hu- maine, JBL, auxquelles on a conféré, comme dans l'exemple 3, la capacité de production de l'érythropotétine humaine des cellules humaines de tumeur rénale. Après incubation des oeufs à cette température pendant encore une semaine, 2483O03 on recueille les cellules lymphoblastoldes humaines multi- pliées. On traite les cellules, ainsi obtenues, comme dans l'exemple 2, pour produire de l'érythropolétine humaine; cette production est d'environ 130 unités par ml de sus- pension cellulaire. Dans l'expérience témoin, o on implante les cellules hu- maines de tumeur rénale, comme ci-dessus, dans la cavité allantoïde d'oeufs embryonnés, on n'observe pas de multi- plication cellulaire. 248S,03 Revendications 1. Procédé pour produire de l'éfythropotétine humai- ne qui consiste à multiplier des cellules capables de pro- duire de l'érythropolétine, caractérisé en ce que ces cel- lules sont des lymphoblastotdes humaines et que la multi- plication a lieu par transplantation de ces cellules dans l'organisme d'un animal à sang chaud ou dans un dispositif permettant d'alimenter ces cellules en liquide nutritif de l'organisme d'un animal à sang chaud, les cellules lym- phoblastoldes humaines, multipliées, étant ensuite laisI sées libérer l'érythropolétine humaine. 2. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que les cellules lymphoblastoides humaines, capables de produire l'érythropotétine, sont des cellules d'hybri- dome obtenues par fusion cellulaire d'une lignée lympho- blastolde humaine, établie, avec des cellules humaines, capables de produire l'érythropotétine humaine. 3. Procédé selon la revendication 2, caractérisé en ce que les cellules humaines capables de produire l'érythro- poiétine humaine sont des cellules humaines de tumeur ré- nale. 4. Procédé selon la revendication 2, caractérisé en ce que les cellules d'hybridome sont obtenues par fusion cellulaire avec emploi du virus Sendai. 5. Procédé selon la revendication 2, caractérisé en ce que lalignée lymphoblastoide humaine, établie, est une lignée lymphoblastolde leucémique, humaine. 6. Procédé selon une des revendications 1 à 5, carac- térisé en ce que l'animal à sang chaud est une volaille, en particulier poussin ou pigeon, ou un mammifère, notamment chien, chat, singe, chèvre, porc, vache, cheval, lapin, cobaye, rat, hamster, souris ou souris nue. 7. Procédé selon une des revendications 1 à 6, carac- térisé en ce qu'on laisse les cellules lymphoblastotdes 24 88P 05 humaines, multipliées libérer l'érythropolétine en pré- sence d'un ou de plusieurs constituants d'un groupe com- prenant une hormone m9le, notamment la testostérone et des ions métalliques, en particulier Co++ ou Ni++. 8. Procédé selon une des revendications 1 à 7, carac- térisé en ce qu'on laisse les cellules lymphoblastoïdes humaines, multipliées, libérer l'érythropolétine humaine sous une pression réduite ou une atmosphère à teneur ré- duite en oxygène.