FR 2497100 A1 19820702 FR 8124271 A 19811228 i La présente invention concerne un procédé de production de calcitonine humaine, ci-après désignée en abrégé par CTh. CTh est une hormone sécrétée par les cellules parafolliculaires humaines de la glande thyrotde; elle supprime la libération dqualcium des os, dans le sang, et également la secrétion d'insuline. A ce jour, il n'existe pas debrocédé de production à l'échelle industrielle de CTh à bas prix. La présente invention est basée sur la constata- tion inattendue que, l'utilisation de lymphoblastoldes hu- mains, capables de produire la CTh, comme producteurs de cette hormone, aboutit à un taux de multiplication cellu- laire élevé, et également à une forte production de CTh par cellule, d'o l'intérêt de cette utilisation. Le nouveau procédé,selon l'invention,de produc- tion de CTh, consiste à multiplier des lymphoblastotdes hu- mains, capables de produire cette hormone par transplanta- tion de ces cellules dans le corps d'un animal à sang chaud, ou en fournissant à ces cellules, à l'aide d'un dispositif, le fluide corporel nutritif d'un animal à sang chaud, puis à laisser ces cellules, multipliées par l'un ou l'autre de ces procédés de multiplication, libérer CTh. Le procédé selon l'invention, tout en aboutissant à une pro- duction supérieure en CTh, n'exige que peu ou pas de milieu nutritif contenant du sérum coûteux pour la multiplication cellulaire, et il permet de maintenir plus facilement que dans le cas de la culture de tissu in vitro, le milieu de culture au cours de la multiplication cellulaire. En parti- culier, tous les lymphoblastotdes humains, capables de pro- duire CTh, peuvent être facilement multipliées, grâce à 1' utilisation de fluide corporel nutritif, provenant d'un ani- mal à sang chaud, par transplantation des cellules en ques- tion dans le corps de l'anima] ou par leur mise en suspen- sion dans une chambre de diffusion équipée pour recevoir le fluide corporel nutritif, l'animal étant alimenté de ma- nière habituelle. Ce procédé est également caractérisé par une multiplica- tion des cellules plus stable et plus élevée, et par une production supérieure de CTh par cellule. Conviennent, conformeément à invention, tous les lymphoblastoides humains dans 1la mcsure o ils produi- sent CTh et se multiplient. aisément danz le ccrps deun animal à sang c_'aud 7 par exemple, peuvent 2'Lre utiliscs les lynphoblasto!des humains, dans lesquels]es stes génétiques, codant la producticî-ie CTh, sont introduits à partir deellules humaines, oapables pa.- nature de pro- duire cette hormone, cpee tles cellules pari"olliculaires de la giande thyroïde ou les celluls o a la t--h- rode, ou dk cellules de tumeurs humaines caypables de pro- duire de la CTh ectopqueo., cornome les cellules carsinoldes ou -es cellules de tumeur du pounon, au moyen de la tech- nique de fusion cellulaire utilisant des agents come poly- éthylène glycol ou vi-rus dSBndai, ou au moyen de la tech- ninue de eco mbinaison gneétique utiisant des enz-ymes com- me ADNli gase. nutéase et ADînposrase, ainsi que des, u- phoblastofIes. humaina capables de produire de la CTh ecto- pique. En ou-tre, comme la transplantation au corps -de l'animal des,i. gnées de ly!phoblastoTdes numains, établis, mentionnés _iu$ haut aboutit à la formation de tumeurs mas- sives, pouanti 8tre facilement désagrégées, et que ces tu- mneurs ne sont guère contaminées par les cellules de l'hâte animal, la rcolte des lymphoblastoldes humains multipliés, vivants, est facile. Conviennent comme animaux utilisables dans le pro- cédé selon l'invention tous ceux, ilanz lesquels les cellu- les peuvent se multiplier, par exemple des volailles comme poulet et pigeon, des mammiferes comme chat, chien, singe, chèvre, porc, vache, cheval, lapin, cobaye, hamster, rat, souris ou souris nue. Comme cette transplantation cellu- laire provoque une immunoréaction indésirable, il s'avère souhaitable d'utiliser des animaux nouveau-nés, ou en bas âge, ou encore au stade le plus jeunepossible, comme oeuf, embryon ou foetus. Afin de réduire l'immunoréaction, 1' animal peut être traité, avant la transplantation des cel- lules, par irradiation aux rayons-X ou aux rayons-% d'agent immunodépresseur préparé selon un procédé clas- sique. Comme la souris nue, utilisée comme animal à sang chaud, présente ltimmunoréaction la plus faible, même à l'âge adulte, on peut l'utiliser avantageusement sans pré- traitement, pour y transplanter et y multiplier rapidement des lignées de lymphoblastoides humains établies. Une multiplication cellulaire, stabilisée, et une augmentation de la production de CTh peuvent être à la fois réalisées par transplantation répétée, utilisant des combinaisons de différents animaux à sang chaud: par exemple on peut atteindre ces objectifs en implantant d'abord les lymphoblastoïdes humains chez le hamster, o ils se multiplient, puis en les réimplantant chez la souris nue. En outre, on peut effectuer la transplantation succes- sive chez des animaux de la même classe ou division,aussi bien que chez ceux de la même espèce ou du même genre. En ce qui concerne la localisation del'implanta- tion des lymphoblastoîdes humains, conviennent tous les sites de l'animal, pourvu que ces cellules puissent s'y multiplier, par exemple la cavité allantoïque, ou les voies intrapéritonéale, intraveineuse ou sous-cutanée. A côté de cette transplantation directe des lym- choblastoïdes humains au corps de l'animal, existe la pos- sibilit-' de faire se multiplier aisément les lignées clas- siques, établies de lymphoblastoldes humains, capables de produire CTh en utilisant le fluide corporel nutritif pro- venant de l'animal, grâce à l'inclusion, par exemple par voie intrapéritonéale,dans le corps de l'animal d'une chambre de diffusion classique, de taille et de forme appropriées, munie d'une membrane poreuse, filtrante, d'un ultra-filtre ou de fibre creuse d'un diamètre de pore de l'ordre de 1077 à 10-5 m, qui empêche la contami- nation de la chambre de diffusion par les cellules de 1' hôte tout en permettant l'apport du fluide corporel nu- tritif de l'animal aux lymphoblastoïdes humains. De plus, comme la chambre de diffusion peut être conçue, si né- cessaire, pour &tre placée sur l'hôte animal et permet- tre au fluide corporel de ce dernier de circuler dans la chambre, les parois de celle-ci peuvent être munies de fe- nêtres latérales, transparentes, permettant l'observation de la suspension de cellules, ainsi que le remplacement et l'échange avec une chambre fratche: la multiplication cel- lulaire est ainsi augmentée à un niveau encore supérieur, rapporté à la durée de vie de l'animal, et la production par animal est encore accrue sans sacrifice de l'hôte. En outre, lorsqu'on utilise cette chambre de diffusion, com- me les cellules humaines multipliées peuvent être facile- ment récoltées,et qu'il n'y a pas manifestation d'fmmu- noréaction, du fait de/'absence de contact direct entre les lymphoblastoldes humains et les cellules de l'hôte ani- mal, on peut utiliser comme hôte, conformément à l'inven- tion, sans prétraitement destiné à réduire l'immunoréac- tion, tout animal à sang chaud. L'alimentation de l'hôte animal, auquel ol a im- planté des lymphoblastoldes humains, peut s'effectuer faci- lement par procédé classique, même après la transplantation cellulaire, et elle ne nécessite pas de soins particuliers. La multiplication cellulaire maximale est attein- te environ 1 à 20 semaines après l'implantation des cellu- les, habituellement 1 à 5 semaines apres. Conformément à l'invention, on obtient 107 à 1012 ou plus, de lymphoblastoides humains par hôte. Autrement 249710( Fez dit, le nombre de cellules humaines implantées chez 1' hôte animal s'accroit 1o2 à 107 fois ou plus, ou bien est d'environ 101 à 106 fois ou plus celui que l'on ob- tient avec un procédé de culture de tissu in vitro, uti- lisant un milieu nutritif, aussi ces lymphoblastoldes sont-ils avantageusement utilisables pour la production de CTh. En ce qui concerne lekrocédé grace auquel les lymphoblastoïdes humains, multipliés par l'un des modes opératoires décrits plus haut, peuvent libérer CTh, on peut employer tout moyen permettant la libération de cette hormone à partir de ces cellules. Par exemple, les lympho- blastoldes humains, obtenus par multiplication en ascite, en suspension, et récolte à partir de cet ascite, ou par extraction de tumeur massive, formée sous la peau, et ré- colte après désagrégation de la tumeur, sont mises en suspension pour atteindre une concentration de 104 à 108 cellules par ml dans un milieu nutritif, maintenues à une température de l'ordre de 20 C à 40 C, puis mises à incu- ber à cette température pendant 1 à 100 heures, pour li- bérer CTh. Afin d'augmenter la production de CTh à partir des lymphoblastoldes humains, on peut ajouter, au milieu nutritif mentionné plus haut, un inducteur de CTh, par exemple un aminoacide comme lysine, arginine, glycine, cystéine et leucine; des sels minéraux comme chlorure de sodium, de potassium ou de calcium, et sulfate de magné- sium; et des hormones comme AMP dibutylcyclique et prosta- glandine E. CTh, ainsi obtenue, peut 4tre recueillie facile- ment grâce aux techniques de purification et de séparation utilisant des modes opératoires classiques, tels que relar- gage, dialyse, filtration, centrifugation, concentration et lyophilisation. Quand on souhaite un produit encore plus pur, on peut obtenir une préparation de CTh de pureté su- périeure par-combinaison des techniques mentionnéesplus haut avec d'autres modes opératoires classiques, tels qu'adsorption et désorption avec échange dlions, filtra- tion sur gel, chromatographie par affinité, fractionne- mnient au point isoélectrique et électoph'orèse' La Oréparation de CTh, ainsi obtenue, peut être avantageusement' utilisée, seule.ou en corb. naison avec un ou plusieurs agents, pour injection, administration exter- ne, interne ou de diagnostic9 pour la pr.vention ou ie traitement de maladies humaines. Au cours de la présente deswrip-cion, la CTh dans ilieu de culture est dosée par,l' pGroccié de radio-iaiu- no essai d4cri% par N.A0 Sam.an et, coi Jo Lab. Clin M;e., Vols,; 81, pp 671-681 (1973), et s exprmue en poids déetermlne psar rappoz-r L ia courbe dse-erponsu ob- tenue avec une préparation de calcitcnine de.réf6rence, disoonible à 2!'Crganisatiîn Mondiale de êl Saenté LJ invention est ilustrée ciOrs par plustieurs formes de réaisation non.imitati.vesO EXMPLE 1 Des cellules de thyrophyma humain haché et désagrégé, et une lignêe de lyimphobiastoîdes eucé1i",- s humains, de Namalwa, sont misse en suspension enseable dans un récipient avec une -o-lutïon saline con4tenana t i a 1'Cl, 54,iM de F1,, ni d Na4Hî2PO4 et 2 1 de -'eSC, rii3re -à obtenir des concentrations cellulaires respectivo de lcrdre de? cel.lules/ir!l. La suspenaion de cellules, refroidie a la glace, est mélangee avec une préparation fra.che de la mirg.e solution saline, cointenant du virus de Sendai préalableî-aent inactivé oar irradiation a lJultra-vioiet, le tout est -trans- féré 5 minut-es après le mélange dans un incubateur a 370C, et y est mis _ incuber sous agitation pendant 30 minutes pou!ir-éaliser la fusion cellulaire, introduisant l'aptitude à produire CTh dans la lignée des lymphoblastoides humains de Namalwa. Après clonage selon un procédé classique de la lignée de cellules d'hybridome, capable de produire CTh, on l'implante par voie intrapéritonéale chez des souris nues adultes, qui sont ensuite nourries de manière habi- tuelle pendant 5 semaines. Les tumeurs massives, résul- e Xtraites, tantes, pesant environ 15 g chacune,sont/desagrégées par hachage et mises en suspension dans du sérum physiologi- que contenant de la trypsine. Après lavage des cellules avec du milieu de Earle 199 (pH 7,2), additionné de 10% en volume/volume de sérum foetal de bovidé, les cellules sont remises en suspension, à une concentration de 105 cellules/ml, dans une préparation fratche du m4me milieu qui contient 20 mM de CaCl2 et 30 mM de L-arginine, et l'on met à incuber à 37 C pendant 40 heures environ pour obtenir CTh. Les cellules sont ensuite soumises aux ul- tra-sons, et la quantité de CTh présente dans la partie surnageante est dosée. La production de CTh est d'envi- ron 4,4 A/ml de suspension. Les cellules témoins, obte- nues par culture in vitro de cellules de thyrophyma humain, dans du milieu de Earle 199 (pH 7,2), additionné de 10% en volume/volume de sérum foetal de bovidé, et mises à in- cuber à 37 C, sont traitées comme plus haut pourkroduire CTh. Cette production n'est que voisine de 10 ng/ml de sus- pension0 EXEMPLE 2 Des cellules carcinoldes, humaines, hachées et désagrégé, obtenues par extraction à partir d'un patient souffrant d'argentaffinoma des bronches, et une lignée de lymphoblas- toTdes leucémiques humains, JBL, sont fusionnées comme dans l'exemple 1, introduisant ainsi l'aptitude à produire dela CTh, dans la lignée de lymphoblstoïdes humains, JBL. Après clonage, selon un procédé classique, de la lignée de cel- lules d'hybridome, capable de produire CTh, on l'implante par voie souscutanée chez des hamsters nouveau-nés, ayant préalablement reçu par injection de l'antisérum préparé à l'aide de lapin selon un procédé classique; puis les animaux sont nourris de manière habituelle pendant 3 se- maines. Les tumeurs massives, résultantes, formées sous la peau, et pesant environ 10 g chacune, sont extraites, hachées et mises en suspension dans du sérum physiologique con- tenant de la collagénase pour les désagréger. Après la- vage avec du milieu de Eagle (pH 7,4) minimal, essentiel, additioné de 5% volume/volume de sérum humain, les cellu- les d'hybridome sont remises en suspension, de manière à obtenir une concentration del'ordre de 10o6 cellules/ml, dans une préparation fraiche du même milieu, contenant mM de CaC12, 40 mMn de SO^Mg et 0,1 mM de dibutylcycli- que AMP, on met alors à incuber à 37 C pendant 30 heures, pour produire la CTh. La production de cette hormone est de l'ordre de 3,7/ g/ml de suspension. L'expérimentation témoin est réalisée comme dans l'exemple 1 par culture in vitro de la lignée de lymphoblastoïdes, humains, fusion- nés, JBL, dans laquelle a été introduite l'aptitude à pro- duire CTh, et abandon des cellules multipliées pour libé- rer CTh. La production de cette hormone n'est que d'envi- ron 60 ng/ml de suspension. EXEMPLE 3 A des rats nouveau-nés on implante, par voie intraveineuse, une lignée de lymphoblastoides leucémiques humains, BALL_1, dans laquelle l'aptitude à produire de la CTh de cellules de thyrophyma humain a été introduite, comme dans l'exem- ple 1; puis on nourrit les rats de manière habituelle, pendant 4 semaines. Les tumeurs massives, résultantes, en- viron 30 g chacune, sont extraites et traitées comme dans l'exemple 1 pour libérer CTh. La production de cette hor- mone est voisine de 4,1 Lg/ml de suspension. L'expérimenta- tion témoin est réalisée comme dans l'exemple 1, par cul- ture in vitro de la lignée de lymphoblastoides leucémiques, humains, fusionnés, BALL-1, dans laquelle est introduite l'aptitude à produire CTh, et abandon de la liqnée de cel- lules multipliées pour laisser se libérer CTh. La produc- tion de cette hormone h'est que d'environ 85 ng/ml de sus- pension. EXEMPLE 4 Après avoir subi une irradiation de 400 rems environ de rayons-X, pour la réduction de l'immuno-réaction, des sou- ris adultes reçoivent par voie sous-cutanée des implants d'une lignée de lymphoblastoldes leucémiques humains, NALL -1, dans laquelle l'aptitude à produire CTh des cellules de tumeur du poumon, humain, a été introduite comme dans l'exemple 2; puis on nourrit les animaux de manière ha- bituelle pendant 3_semaines. Les tumeurs massives, résul- tantes, formées sous la peau et pesant environ 15 g cha- cune, sont extraites et traitées comme dans l'exemple 2, pour libérer CTh. La production est de l'ordre de 5,2kg/ml de suspension. L'expérimentation témoin est réalisée comme dan.'exemple 2 par culture in vitro de la lignée de lymIphoblastodes hu- mains, NALL-1,dans laquelle est introduite l'aptitude à produire CTh, et traitement des cellules multipliées pour libérer cette hormone. La production n'est que de l'ordre de 90 ng/ml de suspension. EXEMPLE 5 Une lignée de lymphoblastoldes leucémiques, humains, TALL_1, dans laquelle l'aptitude à produire de la CTh des cellules de thyrophyma a été introduite comme dans l'exemple 1, est mise en suspension dans du sérum physiologique, puis le tout est transféré dans une chambre de diffusion cylindri- que en matière plastique, dont le volume intérieur est de l'ordre de 10 ml, munie d'une membrane filtrante ayant une dimension de diamètre de pore voisine de O,5/f. Après in- clusion, par voie intrapéritonéale, de cette chambre dans un rat adulte, on nourrit celui-ci de manière habituelle pendant 4 semaines, puis on enlève la chambre. La densité en cellules humaines dans la chambre, atteinte au cours de l'opération ci-dessus, est d'environ 7x108 cellules/ml, ce qui est environ 102 fois supérieur, ou m4me plus, à ce qu'on atteint avec une culture in vitro a l'aide d'un in- cubateur à CO2. Les cellules humaines, ainsi obtenues, sont traitées comme dans l'exemiple 2, pourA.brere CTh. La production de cette hormone est de l'ordre de 35,I/g/Ml de suspension. L'expérimentation ténoin est réalisée comme plusehaut, par mise en suspension des cellules de thyrophTna humain dans une chambre ds diffusion. qui 9st ensuip:e. inClU Dar voie intrapéritonéale dans un rat adu.lte qeue u nourrit de maiiere habi-ueille pendant A semaines. La rc sit de cl- lides humaines, ainsi obtenues au cours de óe% essai, est de l'ordre de 6 x 10 ce!uis/m! Ces c.!lih s sont S ai- tées comme dans lexemple 2 pour libèrer Oh La production de cette hormone n'esst ue d'environ 15 ng/ma de suspen- s ion. EXEMPLE 6 Une lignée de -l aphoblastodez leucémiques humnsi - _âsBL_ 2C dons laquele l'aptitude à oduire d l CTh des cellules arino"':"Mes humaines a ete in+roduCt e C.-... dans l'exemi p!e 1, est impiantéee dans la cai.té ala1tosque dtoeufs embrynn'"s, pr4alablemrent mis % incube2 37eC perdanAt 5 iours. A Drès incubation de2 oeufs emb onn e cette %tem. pérature, pendant Ia semaine suppli -ten t le as cllues humainas, mult npées, sont coltées e iéeGs m csme dans l'exemple 1 pour libCre Th. La p ton e cette hor- mone est voisine de 2.6/3g/ml de suspension Bien que lVessai téeoin ait été réalise comme plusIaut, par implantation de cellules carcino4ldes3 humiaines, dans les cavités aliantolques d'oeufs embY1yonnés, on n'y observe aucune multi-plication cellulaireo Revendications 1. Procédé pour la production de calcitonine, hu- maine (CTh), par multiplication de cellules humaines, ca- pables de produire cette hormone et libération de la cal- cétonine par les cellules multipliées, caractérisé en ce qu'on utilise, pour la multiplication cellulaire, un ani- mal à sang chaud. 2. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que la multiplication cellulaire est réalisée par im- plantation des cellules humaines dans le corps d'un animal à sang chaud. 3. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que la multiplication cellulaire est réalisée à l'aide d'un dispositif, dans lequel le fluide corporel nutritif d'un animal à sang chaud est fourni aux cellules humaines. 4. Procédé selon la revendication 3, caractérisé en ce que le dispositif est une chambre de diffusion équipée de manière à ceAue les cellules de l'hôte animal ne la contaminent paso * Procédé selon une des revendications 1 à 4, carac- térisé en ce que les cellules humaines, capables de pro- duire CTh, sont des cellules d'hybridome obtenues par fu- sion cellulaire d'une lignée de lymphoblastotdes humains, avec des cellules humaines, capables de produire CTh. 6. Procédé selon la revendication 5, caractérisé en ce que les cellules humaines, capables de produire la CTh, sont des cellules de thyrophyma ou des cellules carcinot- des. 7. Procédé selon une des revendication 5 ou 6, carac- térisé en ce que la lignée de lymphoblastoldes humains est une lignée leucémique. 8. Procédé selon la revendication 7, caractérisé en ce que la lignée de lymphoblastoïdes leucémiques, humains, est une lignée de Namalwa, BALL-1, NALL-1, TALL-1 ou JBL. 9. Procédé selon une des revendications 1 à 8, ca- ractérisé en ce qu'on laisse les lymphoblastoldes humains, multipliés, libérer la CTh, en présence d'un ou de plu- sieurs des produits suivants: glycine, leucine, lysine, arginine, cystéine, chlorure de sodium, de potassium ou de calcium, sulfate de magnésium, AMP dibutyL cyclique, et prostaglandine E. 10. Procédé selon une des revendications 1 à 9, carac- térisé en ce que l'animal à sang chaud est une volaille, en particulier poulet ou pigeon, ou un mammifère, notam- ment chien, chat, singe, chèvre, porc, vache, cheval, rat, cobaye, hamster, souris ou souris nue.