FR 2487851 A1 19820205 FR 8114523 A 19810727 La présente invention concerne un procédé amé- lioré pour la production d'insuline humaine. Les procédés classiques, connus, de production d'insuline humaine,-tels que synthèse chimique, culture de tissus in vitro, ou culture de microorganismes recombinés génétiquement, n'aboutissent qu'à de très faibles rende- ments, avec un coût élevé. C'est pourquoi on utilise for- cément de l'insuline de provenance bovine ou porcine. La présente invention permet d'éviter ces incon- vénients de l'art antérieur. Elle est basée sur la consta- tation que l'on peut obtenir de façon inattendue des cel- lules humaines, capables de produire de l'insuline humaine en quantité de 2 à 50 fois supérieure, par cellule, à celle que l'on obtient lors de la culture de tissus in vitro, grâce à la multiplication de cellules humaines, capables de produire de l'insuline humaine, réalisée au moyen d'ani- maux à sang chaud. Le nouveau procédé selon l'invention de produc- tion d'insuline humaine consiste à multiplier les cellules humaines, capables d'effectuer une telle production, en les transplantant dans le corps d'un animal à sang chaud, ou bien en les laissant se multiplier dans un dispositif, dans lequel on leur apporte le fluide corporel nutritif d' un animal à sang chaud; les cellules multipliées sont en- suite exposées, par l'un des modes opératoires précédents de multiplication, à l'action d'un inducteur d'insuline. Le procédé selon l'invention, en dehors du fait qu'il permet une production plus forte d'insuline humaine, ne nécessite pas ou très peu de milieu nutritif contenant du sérum coûteux, pour la multiplication des cellules; il facilite, bien plus que dans le cas des cultures de tissus in vitro, la conservation du milieu de culture au cours de la multiplication cellulaire. En particulier, toutes les cellules humaines, capables de produire de l'insuline hu- maine, peuvent se multiplier facilement grâce au fluide corporel nutritif, fourni par un animal à sang chaud, soit par transplantation de ces cellules à l'animal, soit par mise en suspension de ces cellules dans une chambre de diffusion conçue pour recevoir le fluide corporel nutri- tif; l'animal est nourri de manière habituelle.Ce procédé est également caractérisé par une multiplication des cel- lules plus stable etYelesvée, et par une production plus abondante d'insuline humaine, par cellule. Les cellules qui conviennent conformément à l'in- vention sont des cellules productrices d'insuline humaine, qui se multiplient facilement dans le corps d'animaux à sang chaud. On peut citer notamment les cellules humaines qui produisent par nature de l'insuline, comme les cellu- les-P intactes des ilôts de Langerhans du pancréas humain, celles qui sont transformées par le virus EB ou l'irradia- tion aux rayons-X et des cellules d'insuloma provenant de patients atteints d'insuloma; les cellules de carcinome du poumon humain, qui produisent de l'insuline humaine ecto- pique; conviennent aussi des lignées de cellules établies, des cellules ci-dessus. De même, l'utilisation de lignées de lymphoblastoîdes humains établis, facilement conserva- bles, introduites avec les gènes dominant la production d' insuline humaine, au moyen de techniques de recombinaison génétique avec utilisation d'enzymes telles que ADN-ligase, nucléase et ADN-polymérase, ou par fusion cellulaire uti- lisant des agents tels que polyéthylène glycol ou virus de Sendai, aboutit commodément à une multiplication cellulaire remarquablement supérieure, lorsque leurs cellules sont transplantées dans le corps d'animaux à sang chaud et à une production, par cellule, d'insuline humaine, 2 à 10 fois supérieure. En outre, comme la transplantation des lignées de lymphoblastoîdes humains, établis, mentionnées plus haut, au corps de l'animal, entraine la formation de tumeurs mas- sives, et que ces tumeurs massives ne sont guère contaminées par les cellules de l'hÈte animal, et sont désagrégées faci- lement, les cellules de lymphoblastoldes humains multi- pliées, vivantes, peuvent être facilement récoltées. Comme animaux, utilisables conformément à l'in- vention, conviennent tous les animaux dans lesquels les cellules peuvent se multiplier, et avantageusement les vo- lailles comme poulet et pigeon et des mammifères comme chien, chat, singe, chèvre, cochon, vache, cheval, lapin, cobaye, rat, hamster, souris et souris nue. Comme cette transplantation cellulaire fait nattre une immunoréaction indésirable, il est souhaitable d'utiliser un animal nou- veau-né ou en bas âge, ou au stade le plus jeune possible, notamment oeuf, embryon ou foetus. Afin de réduire l'immu- noréaction, l'animal peut être traité, avant la transplan- tation cellulaire, par une irradiation aux rayons X ou Y, de l'ordre de 200 à 600 rem, ou recevoir une injection d'an- tiserum ou d'agent immunosuppressif, préparé selon le pro- cédé classique. Comme la souris nue, utilisée comme animal à sang chaud, présente une immunoréaction plus faible, mé- me à l'état adulte, on peut y transplanter commodément et laisser s'y multiplier rapidement, sans prétraitement, tou- tes les cellules humaines établies. Une multiplication cellulaire stabilisée et une augmentation de la production d'insuline humaine, peuvent être réalisées par transplantations répétées, utilisant une combinaison de différents animaux à sang chaud, autres que l'homme; par exemple, ces objectifs peuvent être atteints par implantation d'abord de cellules humaines chez un hams- ter, o elles se multiplient, puis par réimplantation chez la souris nue. En outre, la transplantation répétée peut s'effectuer avec des animaux de la même classe ou division, aussi bien qu'avec ceux de la même espèce ou genre. L'endroit, o les cellules humaines sont implan- tables, peut être tout site de l'animal o les cellules se multiplient; par exemple la cavité allantoique, ou les voies intraveineuse, intrapéritonéale ou sous-cutanée. En dehors de cette transplantation directe des cellules dans le corps d'un animal, toutes les cellules humaines établies, classiques, capables de produire de 1' insuline humaine, peuvent se multiplier grâce à l'utili- sation de fluide corporel nutritif, apporté par le corps d'un animal par inclusion, par exemple par voie intrapéri- tonéale, dans le corps de l'animal d'une chambre de dif- fusion classique, de taille et de forme variées, munie d' une membrane poreuse filtrante, d'un ultra-filtre, ou de fibre creuse dont la dimension des pores a un diamètre de l'ordre de 10a7 à 10-5 m, qui empoche la contamination par pénétration des cellules de l'hôte à l'intérieur de la chambre de diffusion, et permet l'apport du fluide corpo- rel nutritif de l'animal aux cellules. De plus, comme la chambre de diffusion peut avoir une forme appropriée, elle peut 4tre placée par exemple sur l'hôte animal, et laisser circuler le fluide corporel du corps de l'animal vers la chambre, ce qui permet l'observation de la suspension de cellules dans la chambre par une ou plusieurs fenêtres la- térales transparentes, prévues dans la paroi de cette cham- bre, ainsi que le remplacement par échange avec une chambre nouvelle; de cette façon la multiplication cellulaire aug- mente à un niveau encore supérieur par rapport à la durée de vie de l'animal, et la production de cellules par animal est augmentée, sans sacrifice de l'hôte. En outre, lorsqu' on utilise une telle chambre de diffusion, comme les cellu- les humaines multipliées peuvent être récoltées facilement et qu'aucune immunoréaction'n'est suscitée en raison de 1' absence de contact direct entre les cellules humaines et celles de l'hôte animal, tout animal b sang chaud peut ê- tre utilisé comme hôte conformément à l'invention, sans trai- tement préalable, destiné à réduire l'immunoréaction. L'alimentation de l'hôte animal implanté avec des cellules humaines peut être effectuée facilement par un procédé classique, même après la transplantation de cellu- les, et ne nécessite aucun soin particulier. La multiplication maximale des cellules est atteinte au bout de l à 20 semaines environ, après la transplantation. Lorsque les cellules humaines établies, implantées dans l'animal, sont des cellules de tumeur humaine, ou des lignées de lymphoblastoides humains, la multiplication cellulaire maximale est atteinte en 1 à semaines après la transplantation cellulaire, en raison de leurs vitesses de multiplication très supérieures. Conformément à l'invention, le nombre de cellu- les humaines obtenues par hôte s'étage entre 107et 1012 ou plus. Autrement dit, le nombre de cellules humaines, trans- plantées dans le corps de l'animal, est multiplié par 102 à 107 ou plus, ou est environ égal à 10 à 106 fois ou plus, celui qui est atteint par le procédé de culture in vitro de tissu, utilisant un milieu nutritif, il en ressort bien que ces cellules peuvent être utilisées pour la production d'insuline humaine. En ce qui concerne l'induction de l'insuline, on peut utiliser tout procédé dans lequel les cellules humai- nes, obtenues par le mode opératoire mentionné plus haut, y libèrent de l'insuline humaine. Par exemple, les cellu- les humaines multipliées, obtenues par multiplication en ascite, en suspension et récolte, à partir de cet ascite, ou par extraction de tumeur massive, formée sous la peau et récolte après désagrégation de ladite tumeur, sont mi- ses en suspension à une concentration de l'ordre de 1 à 108 cellules/ml dans un milieu nutritif, maintenues à une température voisine de 200 à 400C, puis sont soumises à cette température à l'action d'un inducteur d'insuline pendant 1 à 20 heures, pour produire l'insuline humaine. Les inducteurs d'insuline préférés sont des saccharides comme glucose, mannose, fructose, ribose et xylitol; des amino-acides comme arginine, lysine et leucine; des hor- mones peptidiques comme glucagon et hormone adrénocortico- trope (ACTH); des cations métalliques conme K et Ca++. L'insuline humaine, ainsi obtenue, peut être re- cueillie facilement par des techniques de purification et séparation utilisant des modes opératoires classiques, tels que relargage, dialyse, filtration, centrifugation, concen- tration et lyophilisation. Lorsque l'onsouhaite disposer d' une préparation d'insuline humaine encore plus purifiée, on peut l'obtenir par une combinaison des techniques men- tionnées plus haut, avec des techniques classiques comme adsorption et désorption avec échange d'ion, filtration sur gel, chromatographie par affinité, fractionnement au point isoélectrique et électrophorèse. La préparation d'insuline humaine, ainsi obtenue, peut être utilisée seule ou en combinaison avec un ou plu- sieurs agents, pour injection, administration interne ou externe, ou de diagnostic, en vue de la prévention et du traitement de maladies humaines. L'insuline humaine est dosée dans le milieu de culture par le procédé d'immunoessai d'enzyme décrit par K.Kato et coll., J. Biochem. Vol. 78, pp. 235-237 (1975) et sa quantité est exprimée en Unités Internationales d' Insuline Humaine (UI), 1 UI d'insuline humaine étant défi- nie comme la quantité d'insuline qui diminue le taux de su- cre sanguin du lapin à 64 mg/dl en 1 heures ou à 45 mg/dl, 2 heures après son injection par voie sous-cutanée. Les exemples suivants constituent une illustra- tion non limitative de formes de réalisation du procédé se- lon l'invention. EXEMPLE 1 Des cellules désagrégées d'insuloma humain, obte- nues par extraction à partir d'un malade à insuloma, et ha- chage, sont implantées par voie sous-cutanée à des souris nues adultes, qui sont ensuite nourries de manière habituel- le, pendant 3 semaines. Les tumeurs massives, résultantes, qui se forment sous la peau et pèsent environ 10 g chacune, sont désagrégées par extraction, hachage et mise en sus- pension dans une solution saline, physiologique, contenant de la collagénase. Après lavage avec du milieu de Earle 199 (pH 7,2), additionné de 10% en volume/volume de sérum foe- tal de bovidé, les cellules sont remises en suspension, de façon à obtenir une concentration de l'ordre de 105 cellu- les par ml de préparation fraiche du même milieu contenant mM de Dglucose en tant qu'inducteur d'insuline; elles sont ensuite mises à incuber à 37'C pendant 4 heures, pour donner de l'insuline humaine. Puis les cellules sont sou- mises aux ultra-sons, et la quantité d'insuline humaine pré- sente dans la partie surnageante est dosée. La production est voisine de 1000 / UI/cellule. Les cellules témoins, ob- tenues par culture in vitro de cellules d'insuloma humain dans du milieu de Earle 199 (pH 7,2), additionné de 10% en volume/volume de sérum foetal de bovidé, et mise en incuba- tion à 37eC, sont traitées comme précédemment avec l'induc- teur d'insuline. La production d'insuline humaine n'est que de 200/LUI/cellule. EXEMPLE 2 Des cellules désagrégées d'insuloma humain, ob- comme tenues/dans l'exemple 1, et une lignée de cellules lympho- blastoides, leucémiqueshumaines, de Namalwa, sont mises ensemble en suspension dans un récipient de solution sali- ne contenant 140 M de NaCl, 54 mM de KCl, 1 mM de NaH2PO4 et 2 mM de CaCl2, pour donner des concentrations respecti- ves voisines de 103 cellules/ml. La suspension de cellules, refroidie à la glace, est mélangée avec une préparation de la même solution saline contenant du virus de Sendai préin- activé, transférée environ 5 minutes après le mélange dans un incubateur à 370C, et y est agitée pendant 30 minutes environ pour réaliser le fusionnement des cellules, intro- duisant l'aptitude à la production d'insuline humaine des cellules d'insuloma humain dans la lignée de lymphoblastot- des leucémiques humains. Après clonage selon un procédé classique de la souche de cellules d'hybridoma capable de produire de l'insuline humaine, on implante cetteouche par voie intrapéritonéale à des souris nues adultes, qui sont nourries ensuite de manière habituelle pendant 5 se- maines. Les tumeurs massives résultantes, de 15 g chacu- ne, sont extraites et traitées comme dans l'exemple 1 pour induire l'insuline humaine, mais en remplaçant les 20 mM de D-glucose par 30 mM de L-arginine.-La production d'in- suline humaine est de l'ordre de 3200.O-UI/cellule. comme L'expérimentation témoin est réalisée/dans l'exemple 1, par culture in vitro de lignée de Namalwa de lymphoblastoides fu- sionnés, humains, et exposition des cellules multipliées à l'inducteur d'insuline. La production d'insuline humaine n' est que de 100 O/UI /cellule environ. EXEMPLE 3 Après injection d'antisérum, préparé à partir de lapins selon un procédé classique, à des hamsters nouveau- nés afin de réduire leur immunoréaction possible résultant de la transplantation de cellules, on implante à ces ani- maux par voie sous-cutanée une lignée de lymphoblastoïdes leucémiques, humains JBL, dans laquelle l'aptitude à la production d'insuline des cellules d'insuloma humain, est introduite comme indiqué dans l'exemple 2, puis on les nour- rit de manière habituelle pendant 3 semaines. Les tumeurs massives résultantes, formées sous la peau et pesant envi- ron 10 g chacune, sont extraites et traitées comme dans 1' exemple 1 pour produire de l'insuline humaine. Cette pro- duction est de l'ordre de 2 300y>-UI/cellules. L'expérimentation témoin est réalisée comme dans l'exem- ple 1, par culture in vitro de lignée de lymphoblastotdes leucémiques humains fusionnés JBL, et exposition des cel- lules multipliées à un inducteur d'insuline. La production d'insuline humaine n'est que de l'ordre de 200/LUI/cellule. EXEMPLE 4 Des rats nouveau-nés sont implantés par voie in- traveineuse, avec une lignée de lymphoblastoïdes leucé- miques humains de Namalwa, dans laquelle l'aptitude à produire de l'insuline humaine des cellules d'insuloma humain, est introduite comme dans l'exemple 2, puis ils sont nourris de manière habituelle pendant 4 semaines. Les tumeurs massives résultantes, environ 40 g chacune, sont extraites et traitées comme dans l'exemple 1, pour produire de l'insuline humaine. Cette production est de l'ordre de 2600 A&UI/cellule. L'expérimentation témoin est réalisée comme dans l'exem- ple 3. La production d'insuline humaine n'est que de 100 ).'-UI/cellule. EXEMPLE 5 Des souris adultes sont irradiées avec 400 rem de rayon-X afin de réduire leur immunoréaction, implantées par voie sous-cutanée avec des cellules d'insuloma humain, obtenues comme dans l'exemple 2, et nourries de manière habituelle pendant 3 semaines. Les tumeurs massives résul- tantes, formées sous la peau et pesant 15 g chacune, sont extraites et traitées comme dans l'exemple 1 pour produire de l'insuline humaine. La production de cette insuline est de l'ordre de 1 000 xLUI/cellule. L'expérimentation témoin est réalisée comme dans l'exemple 1, par culture in vitro de cellules d'insuloma humain, et exposition des cellules multipliées à l'inducteur d'insu- line. La production d'insuline humaine n'est que de 200 UI/cellule. EXEMPLE 6 Une lignée de lymphoblastoïdes leucémiques hu- mains JBL, dans laquelle l'aptitude à produire de l'insuli- ne humaine,des cellules d'insuloma humain est introduite comme dans l'exemple 3, est mise en suspension dans du sé- rum physiologique, et le tout est transféré dans une cham- bre de diffusion ayant un volume interne de l'ordre de 10 ml, et dont la membrane filtrante a une dimension de pores de l'ordre de 0,5 gode diamètre; et cette chambre est incorporée par voie intrapéritonéale à l'intérieur d'un rat adulte. Au bout de 4 semaines pendant lesquelles le rat est nourri de manière habituelle, on enlève cette chambre. La densité en cellules humaines atteinte dans la chambre par l'opération ci-dessus, est de l'ordre de 5 x 109 cellules/ml, ce qui est 103 fois supérieur à ce que l'on obtient lors de la culture in vitro au moyen d'un incubateur à C02* Les cellules ainsi obtenues sont trai- tées comme dans l'exemple 1 pour induire de l'insuline humaine. La production de cette dernière est voisine de 2 500/-UI/cellule. L'expérimentation témoin est réalisée comme dans l'exem- ple 3. La production d'insuline humaine n'est que d'envi- ron 200,/LUI/cellule. EXEMPLE 7 Une lignée de lymphoblastoïdes leucémiques hu- mains JBL, dans laquelle l'aptitude à produire de l'insu- line humaine des cellules d'insuloma humain est introduite comme dans l'exemple 3, est implantée dans la cavité allan- totque d'oeufs embryonnés, préalablement mis à incuber à 370C pendant 5 jours. Après remise en incubation de ces oeufs à cette température pendant une semaine supplémen- taire, les cellules humaines multipliées sont récoltées. El- les sont ensuite traitées comme dans l'exemple 1 pour donner de l'insuline humaine. La production de cette insuline est de l'ordre de 2 000/LUI/cellule. L'expérimentation témoin est réalisée comme dans l'exemple 3. La production d'insuline humaine n'est que de l'ordre de 200 /LUI/cellule. Revendications 1. Procédé pour la production d'insuline humaine par multiplication de cellules humaines capables d'en produire, caractérisé en ce que, avant de les exposer à l'action d'un inducteur d'insuline, on soumet lesdites cellules à l'action in vivo d'un fluide corporel nutritif d'un animal à sang chaud. 2. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que les dites cellules sont transplantées directement dans le corps de l'animal à sang chaud. 3. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que lesdites cellules se multiplient dans un dispositif, qui leur apporte le fluide nutritif corporel de l'animal. 4. Procédé selon la revendication 3, caractérisé en ce que le dispositif est une chambre de diffusion. 5. Procédé selon une des revendications l à 4, carac- térisé en ce que les cellules humaines capables de produire l'insuline, sont des cellules-A intactes des ilôts de Lan- gerhans du pancréas humain, celles qui sont transformées par le virus EB ou l'irradiation aux rayons-X, des cellules d'insuloma de patients humains, des cellules de carcinome de poumons humains, ou des cellules de lignées établies des cellules ci-dessus. 6. Procédé selon une des revendications l à 4, caracté- risé en ce que les cellules, capables de produire l'insuline humaine, sont des cellules hybridoma obtenues par fusion cel- lulaire d'une lignée de lymphoblastoldes leucémiques humains avec l'une des cellules décrites dans la revendication 5. 7. Procédé selon une des revendications 1 à 6, caracté- risé en ce que l'inducteur d'insuline est un saccharide com- me glucose, mannose, fructose, ribose, xylitol, un amino-a- cide comme arginine, lysine, leucine; une hormone peptidi- que comme glucagon, hormone adréno-corticotrope (ACTH); un cation métallique comme K+, Ca + t ou le mélange de plusieurs d'entre eux. 8. Procédé selon l'une des revendications 1 à 7, ca- ractérisé en ce que l'animal à sang chaud est une volaille comme poulet ou pigeon, un mammifère comme chien, chat, singe, chèvre, cochon, vache, cheval, lapin, cobaye, rat, hamster, souris ou souris nue. 9. Insuline humaine obtenue par le procédé selon une des revendications 1 à 8.