FR 2488805 A1 19820226 FR 8116057 A 19810821 La présente invention concerne un procédé pour la production de gonadotrophine chorionique humaine, dé- signée ci-après après par l'abréviation hCG. L'hCG est une hormone, secrétée par les cellu- les syncytiotrophoblastiques humaines des villosités cho- riales, qui stimule la sécrétion d'androgènes et de pro- gestérone. Bien qu'on connaisse un procédé pour la produc- tion d'hCG utilisant une culture de tissu [A.S. Rabson et coll., J. Natl. Cancer Inst., Vol. 50, pp.669-674 (1973), ce procédé ne permet pas la production en masse d'hCG peu coûteuse, par suite de sa très faible multipli- cation cellulaire et de sa faible production d'hCG par cellule. La demanderesse a étudié des procédés pour la production en masse d'hCG. Ces efforts ont débouché sur la découverte inattendue que les cellules lymphoblastol- des humaines, capables de produire l'hCG, se multiplient rapidement et ont une production d'hCG par cellule gran- dement plus élevée et que ces cellules conviennent donc pour la production d'hCG. Plus précisément, l'invention concerne un pro- cédé pour la production d'hCG, caractérisé en ce qu'on multiplie des cellules lymphoblastoldes humaines, capa- bles de produire l'hCG, par transplantation de ces cel- lules dans l'organisme d'un animal à sang chaud, ou par multiplication de ces cellules dans un dispositif dans lequel elles sont alimentées en liquide nutritif de 1' organisme d'un animal à sang chaud; les cellules multi- pliées par l'un ou l'autre des modes de multiplication po r ci-dessus sont alors laisséesy1ibérer l'hCG. Le procédé de l'invention permet une production accrue d'hCG, ne nécessite pas, ou bien moins, de milieu nutritif contenant un sérum coteux, pour la multiplica- tion des cellules; il rend l'entretien du milieu de cul- ture, pendant la multiplication cellulaire, bien plus fa- cile que dans le cas d'une culture de tissu in vitro. E) particulier, on peut multiplier facilement toutes les cel- lules lymphoblastoïdes humaines, capables de produire de l'hCG, en utilisant le liquide nutritif de l'organisme d'urnnimal à sang chaud, par transplantation de ces cel- lules dans l'organisme de l'animal, ou par leur mise en suspension dans une chambre de diffusion conçue pour re- cevoir le liquide nutritif d'un tel organisme, l'animal étant alimenté de façon ordinaire. Egalement, le procédé est caractérisé par une multiplication cellulaire plus stable et plus abondante, la production d'hCG par cellule étant accrue. En ce qui concerne les cellules lymphoblastoïdes humaines, pouvant être utilisées dans l'invention, on peut employer toutes les cellules lymphoblastoïdes humai- nes, pourvu qu'elles produisent de l'hCG et se multiplient dans l'organisme d'un animal à sang chaud. Par exemple, des cellules lymphoblastoldes humaines, dans lesquelles les gènes, commandant la production d'hCG des cellules syncytiotrophoblastiques humaines des villosités choria- les, des cellules humaines de chorio-épithéliome ou des cellules humaines d'adénome chromophobe de l'hypophyse, qui produisent naturellement de l'hCG, ou des cellules hu- maines de carcinome du poumon qui produisent de 1'hCG ectopique, ont été introduits grâce à une fusion cellu- laire utilisant le polyéthylèneglycol ou le virus Sanda! ou une technique de recombinaison génétique utilisant 1' ADM-ligase, la nucléase et l'ADN-polymérase; ou des cel- lules lympho13lastoldes humaines capables de produire de l'hCG ectopique* Comme la transplantation des cellules lymphoblastoldes humaines précitées dans l'organisme d'un animal provoque la formation de tumeurs massives, se désa- grégeant facilement, et que ces tumeurs sont difficilement contaminées par les cellules de l'animal hôte, on peut fa- 2 4s o n, >0 5 cilement récolter les cellules lymphoblastoides humaines, vivantes, multipliées. En ce qui concerne les animaux utilisables dans l'invention, on peut prendre tout animal, pourvu que les cellules se multiplient dans son organisme. Par exemple on peut utiliser avantageusement, selon l'invention, des volailles telles que poussin ou pigeon, ou des mammifères comme chien, chat, singe, chèvre, porc, vache, cheval, lapin, cobaye, rat, hamster, souris ou souris nue. Comme une telle transplantation cellulaire provoque une réac- tion immunitaire indésirable, l'emploi d'un animal nou- veau-né ou très jeune ou à un stade le plus précoce pos- sible, par exemple sous forme d'oeuf, de foetus ou d'em- bryon, est souhaitable. Pour réduire autant que possible la réaction immunitaire, on peut, avant la transplanta- tion cellulaire, traiter l'animal par irradiation aux rayons X ou Y, à raison d'environ 200 à 600 rems, ou par injection d'un antisérum ou d'un agent immunosuppres- seur préparé selon un procédé classique. Comme les souris nues,utilisées comme animaux à sang chaud, présentent une réaction immunitaire plus faible même lorsqu'elles sont adultes, on peut de façon pratique leur implanter des cellules lymphoblastoldes humaines, quelconques, pour qu'elles se multiplient rapidement dans leur organisme, sans qu'un tel prétraitement soit nécessaire. On peut effectuer une multiplication cellulaire stabilisée et accroître la production d'hCG par transplan- tation répétée avec une ou plusieurs combinaisons d'ani- maux à sang chaud différents; par exemple on peut tout d'abord implanter les cellules lymphoblastoides humaines au hamster, pour qu'elles s'y multiplient, puis les ré- implanter à la souris nue. De plus on peut effectuer la transplantation répétée avec des animaux appartenant à la même classe ou à la même division ainsi qu'à la même espèce ou au même genre. On peut implanter les cellules lymphoblastoldes humaines en un site quelconque de l'animal, o elles se multiplient: par exemple peut-on effectuer l'implanta- tion dans la cavité allantoide ou par voie intraveineuse, intrapéritonéale ou sous-cutanée. En dehors de la transplantation directe des cel- lules lymphoblastoides humaines dans l'organisme d'un a- nimal, pour multiplier des lignées lymphoblastoldes hu- maines classiques, quelconques, capables de produire de l'hCG, il est possible d'employer le liquide nutritif de l'organisme d'un animal par introduction, par exemple par voie intrapéritonéale, dans l'organisme de cet ani- mal, d'une chambre de diffusion classique, de forme et de taille appropriée, munie d'une membrane filtrante po- reuse, d'un ultrafiltre ou de fibres creuses ayant des pores d'environ 10 7 à 10-5 m de diamètre, empêchant la contamination de la chambre de diffusion par les cellules de l'animal hôte, et permettant au liquide nutritif de l'organisme de l'animal d'alimenter les cellules. De plus, la chambre de diffusion peut être conçue, si nécessaire, de façon à pouvoir être placée par exemple sur l'animal hôte et permettre la circulation du liquide de l'organisme de l'animal dans la chambre de diffusion, ainsi que l'ob- servation de la suspension cellulaire dans la chambre par une ou plusieurs fenêtres latérales, transparentes, pla- cées sur une ou plusieurs parois de la chambre g de pré- férence cette chambre est remplaçable et échangeable par une chambre neuve; on accroit ainsi la multiplication des cellules au cours de la vie de l'animal, sans avoir à sacrifier celui-ci. Lorsqu'on utilise une telle chambre de diffusion, comme on peut facilement récolter les cel- lules lymphoblastoldes humaines multipliées et qu'il ne se produit pas de réaction immunitaire par suite de l'absence de contact direct entre les cellules humaines et les cel- lules de l'animal hôte, on peut employer, comme animal hôte selon l'invention, un animal à sang chaud quelconque, sans aucun traitement préalable pour réduire la réaction immu- nitaire. On peut alimenter facilement, de façon classique, l'animal hôte, auquel sont implantées les cellules lympho- blastoldes, humaines, même après la transplantation des cellules, et aucun soin particulier n'est nécessaire. On obtient la multiplication maximale des cellu- les en environ 1 à 20 semaines et généralement 1 à 5 se- maines après la transplantation cellulaire. Selon l'invention, le nombre des cellules lym- phoblastoides humaines, obtenues par hôte, est compris en- tre environ 107 et 1012 ou plus. En d'autres termes, le nombre des cellules lymphoblastoldes humaines, implantées dans l'organisme de l'animal, s'accro t d'un facteur d'en- viron 102 à 107 ou plus, ce qui est supérieur d'environ 1O1 à 1 ou plus à ce qu'on obtient selon la méthode de culture tissulaire in vitro, avec un milieu nutritif, les cellules-peuvent donc être utilisées de façon appropriée pour la production d'hCG. En ce qui concerne le procédé, selon lequel on laisse les cellules humaines libérer l'hCG, on peut uti- liser un procédé quelconque pourvu qu'il permette la li- bération d'hCG par les cellules lymphoblastoldes humaines, obtenues selon le mode opératoire précité. Par exemple, les cellules lymphoblastotdes humaines, obtenues par multipli- cation en suspension dans le liquide d'ascite et récoltées dans ce liquide, ou par extraction de la tumeur massive, formée sous la peau, et récoltées après désintégration de cette tumeur massive, sont mises en suspension à une con- centration d'environ 104 à 108 cellules par millilitre dans un milieu nutritif, maintenu à une tmpérature d'envi- ron 20 à 400C; elles sont ensuite incubées à cette tem- pérature pendant encore 1 à 50 heures, pour produire 1'hCa L'incubation des cellules en présence d'un ou de plusieurs constituants d'un groupe composé d'amino-acides,tels que leucine, lysine, arginine ou cystéine; de sels minéraux, tels que chlorures de sodium, de potassium ou calcium, et sulfate de magnésium; des hormones, telles que le LHRH (luteinizing hormone-releasing hormone), font accroître encore la production d'hCG. On peut recueillir facilement l'hCG, ainsi ob- tenue, selon des techniques de purification et de sépa- ration, comprenant des opérations classiques, telles que relargage, dialyse, filtration, centrifugation, concentra- tion ou/et lyophilisation. Si on désire une préparation d'hCG plus purifiée, on peut obtenir une préparation d' hCG de pureté maximale par combinaison des techniques précitées avec d'autres opérations classiques, notamment adsorption et désorption avec échange d'ions, filtration sur gel, chromatographie d'affinité, fractionnement au point isoélectrique ou/et électrophorèse. La préparation d'hCG, ainsi obtenue, peut être utilisée de façon avantageuse seule ou en combinaison avec un ou plusieurs autres agents pour l'administration par injection, par voie externe ou interne, pour la pré- vention et le traitement de maladies humaines et pour un but de diagnostic. La production d'hCG dans le milieu de culture a été déterminée selon une méthode radio-immunologique, comme décrit par A. R. Midgley, Jr., Endocrinology, Vol. 79, pp. 10-18 (1966) et exprimée en unités internatio- nales (UI). Plusieurs modes de réalisation de l'invention, non limitatifs, sont décrits ci-après. EXEMPLE 1 On met en suspension, dans un récipient, des cel- lules humaines d'un chorio-épithéliome désagrégé, obtenues par extraction à un patient atteint de chQrio-épithéliome et hachage, et des cellules de la lignée lymphoblastolde leucémique, humaine, Namalwa, avec une solution salée de concentration 140 mM en NaCl, 54 mU en KCl, 1 mM en NaH2PO4 et 2 mM en CaCl2, pour-obtenir des concentrations de chaque type cellulaire d'environ 104 cellules par mil- lilitre. On mélange la suspension cellulaire, glacée, avec une préparation de la même solution salée, contenant du virus Sendal préalablement inactivé par irradiation aux ultraviolets; on transfère dans une étuve à 370C en- viron 5 minutes après le mélange et on agite dans l'étu- ve pendant 30 minutes, pour obtenir la fusion cellulaire avec introduction de la capacité de production d'hCG des cellules humaines de chorio-épithéliome dans la lignée de cellules lymphoblastotdes leucémiques, humaines. Après clonage, selon le procédé classique, de la souche de cel- lules d'hybridome, capables de produire de l'hCG, on im- plante la souche de cellules d'hybridome, par voie intra- péritonéale, à des souris nues adultes, que l'on alimen- te de façon habituelle pendant 5 semaines. On extrait les tumeurs massives, produites, pesant environ 15 g cha- cune et on les désagrège par h1achage et mise en suspen- sion dans une solution salée physiologique, contenant de la trypsine. Après lavage des cellules, avec le milieu 199 de Earle (pH 7,2) additionné de 10% en volume de sé- rum de veau foetal, on remet les cellules en suspension, pour obtenir une concentration d'environ 10 cellules par millilitre dans une préparation fraîche du même milieu ayant une concentration en L-arginine de 30 mM, puis on incube à 35 C pendant 20 heures pour produire de 1'hCG. Ensuite, on soumet les cellules à un traitement par les ultrasons, et l'on détermine l'hCG dans le surnageant. La production d'hCG est d'environ 230 UI par ml de suspen- sion cellulaire. Pour produire de l'hCG, on traite comme ci-dessus, des cellules témoins obtenues par implantation des cel- lules humaines de chorio-épithéliome à des souris nues, alimentation des animaux pendant 5 semaines, extraction des tumeurs massives, produites, pesant chacune environ g, et désagrégation de ces tumeurs. La production d' hCG n'est que d'environ 20 UI par mi de suspension cel- lulaire. EXEMPLE 2 Comme dans l'exemple 1, on effectue la fusion de cellules humaines d'adénome-chromophobe désagrégé, obte- nues par extraction d'un patient atteint d'adénome chro- mophobe de l'hypophyse, et hachage, avec la lignée lym- phoblastoldeleucémique, humaine, JBL, ce qui introduit la capacité de production de l'hCG des cellules humaines d'adénome chromophobe dans la lignée lymphobiastoide leu- cémique humaine. Après clonage, par le procédé classique, de la souche de cellules d'hybridome capable de produire de l'hCG, on implante la souche de cellules d'hybridome, par voie sous cutanée, à des hamsters nouveau-nés, aux- quels on a préalablement injectéS, pour réduire leur ré- action immunitaire, un antisérum préparé à partir du la- pin selon le procédé classique; on alimente les animaux de façon habituelle pendant 3 semaines. On extrait les tumeurs massives, formées sous la peau et pesant environ g chacune, et on les désagrège par hachage et mise en suspension dans une solution salée, physiologique, conte- nant de la collagénase. Apres lavage des cellules avec le milieu essentiel minimum de Eagle (pH 7,2) additionné de 5% en volume de sérum humain, on remet les cellules en suspension pour obtenir une concentration cellulaire d'environ 105 cellules par ml dans une préparation frai- che du même milieu de concentration 20 mM en L-lysine et mM en sulfate de magnésium, et on incube à 37 C peh- dant 15 heures, pour produire de l'hCG. La production d' hCG est d'environ 450 UI par ml de suspension cellulaire. On traite comme ci-dessus, pour produire de l'hCG, des cellules témoins, obtenues par implantation des cellules 2488o05 humaines d'adénome chromophobe à des hamsters nouveau-nés, alimentation des animaux de façon habituelle pendant 3 semaines, extraction des tumeurs massives formées sous la peau, pesant environ 3 g chacune, et désagrégation des tumeurs. La production d'hCG n'est que d'environ UI par ml de suspension cellulaire. EXEMPLE 3 On implante par voie intraveineuse àdes rats nouveau-nés des cellules de la lignée lymphoblastolde leucémique, humaine, BALL-1, auxquelles on a conféré, comme dans l'exemple 1, la capacité de produire de l'hCG des cellules humaines de chorio-épithéliome; les ani- maux sont alimentés de façon habituelle pendant 4 se- maines. Les tumeurs massives produites, extraites, pè- sent environ 30 g chacune; on les désagrège. Les cel- lules lymphoblastoldes humaines, obtenues,sont lavées avec du milieu RPMI 1640 (pH 7,4) additionnéde 10% en volume de sérum de veau foetal; on les met en suspension, pour obtenir une concentration cellulaire d'environ 107 cellules par ml, dans une préparation franche du même mi- lieu ayant une concentration en L-arginine de 30 mM; on incube à 300C pendant environ 40 heures, pour produire d'hCG de l'hCG. La production/est d'environ 870 UI par ml de suspension cellulaire. Pour produire de 1'hCG, on traite comme ci-dessus, des cellules témoins obtenues par implantation des cellules humaines de chorio-épithéliome à des rats nouveau-nés,. alimentation des animaux de façon habituelle pendant 4 se- maines, extraction des tumeurs massives, produites, pesant environ 5 g chacune, et désagrégation des tumeurs. La pro- duction d'hCG n'est que d'environ 30 UI par ml de suspen- sion cellulaire. EXEMPLE 4 Après avoir irradié avec les rayons X des sou- ris adultes à raison d'environ 400 rems, pour réduire leur 248380 5 réaction immunitaire, on implante aux animaux, par voie sous-cutanée, des cellules de lignée lymphoblastotde leu- cémique,/kALL-1, auxquelles on a conféra, comme dans l' exemple 2, la capacité de produire de l'hCG des cellules humaines d'adénome chromophobe, puis on alimente les ani- maux de façon habituelle pendant 3 semaines. On extrait les tumeurs massives, formées sous la peau, pesant environ g chacune; on les désagrège et on les traite comme dans l'exemple 2, pour produire de l'hCG. La production d'hCG est d'environ 520 UI par ml de suspension cellulai- re. Pour produire de l'hCG, on traite comme ci-dessus, des cellules témoins obtenues par implantation à la souris de cellules humaines d'adénome chromophobe, alimentation des animaux de façon habituelle, pendant trois semaines, extraction des tumeurs massives, produites, pesant envi- ron 5 g chacune, et désagrégation des tumeurs massives. La production d'hCG n'est que d'environ 20 UI par ml de suspension cellulaire. EXEMPLE 5 Des cellules de la lignée lymphoblastolde leucé- mique, humaine, TALL-1, auxquelles on a conféré, comme dans l'exemple 1, la capacité de produire lthCG des cellu- les humaines de chorio-épithéliome, sont mises en suspen- sion dans une solution salée physiologique. Les cellules sont ensuite transférées dans une chambre de diffusion cy- lindrique en matière plastique de volume intérieur d'en- viron 10 ml, munie d'une membrane filtrante aux pores d' environ 0,5.n de diamètre. On insère la chambre dans le péritoine d'un rat adulte. On alimente l'animal de façon habituelle pendant 4 semaines et on retire la chambre. La densité des cellules humaines dans la chambre est d'envi- ron 7 x 108 cellules par ml ce qui est supérieur d'environ 102 fois ou plus à ce qu'on obtient par culture in vitro avec un incubateur à dioxyde de carbone. On traite les cel- 248U05 lules, ainsi obtenues, comme dans l'exemple 3, pour pro- duire de l'hCG. Cette production est d'environ 750 UI par ml de suspension cellulaire. On traite, comme ci-dessus, des cellules témoins obtenues par mise en suspension des cellules humaines de chorio- épithéliome dans la chambre de diffusion, implantation de la chambre dans le péritoine d'un rat adulte et alimenta- tion de l'animal pendant 4 semaines (la densité des cel- lules obtenues est d'environ 107 cellules par ml). La production d'hCG n'est que d'environ 20 UI par ml de sus- pension cellulaire. EXEMPLE 6 On implante dans la cavité allantolde d'oeufs embryonnés, que l'on a préincubés à 37eC pendant 5 Jours, des cellules de la lignée lymphoblastolde leucémique, hu- maine, JBL, auxquelles on a conféré, comme dans l'exemple 1, la capacité de produire de l'hCG des cellules syncytio- trophoblastiques humaines des villosités choriales. Après incubation des oeufs à cette température, pendant encore une semaine, on recueille les cellules lymphoblastoldes humaines multipliées. On traite les cellules comme dans l'exemple 1 pour produire de l'hCG. La production dthCG est d'environ 210 UI par ml de suspension cellulaire. Dans une expérience témoin, o on implante de façon sembla- ble, dans les cavités allanto!des d'oeufs embryonnés, des cellules syncytiotrophoblastiques humaines de villosités cheriales, on n'observe pas de multiplication cellulaire. Revendications 1. Procédé pour produire de la gonadotrophine chorio- nique (hCG) qui consiste à multiplier des cellules humai- nes, capables de produire de l'hCG, caractérisé en ce que lescellules sont de la lignée lymphoblastoîde et leur mul- tiplication est effectuée par leur transplantation dans l'organisme d'un animal à sang chaud ou dans un disposi- tif, dans lequel elles sont alimentées en liquide nutri- tif par l'organisme d'un animal à sang chaud, et que l'on laisse les cellules lymphoblastoldes humaines, multipliées, libérer de l'hCG. 2. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que les cellules lymphoblastoldes, humaines, sont des cellules d'hybridome, obtenueskar fusion cellulaire d'une lignée lymphoblastolde, humaine, et de cellules humaines, capables de produire de l'hCG. 3. Procédé selon la revendication 2, caractérisé en ce qu'on effectue la fusion de ladite lignée lymphoblas- toide humaine avec des cellules syncytiotrophoblastiques humaines de villosités choriales. 4. Procédé selon la revendication 2, caractérisé en ce qu'on effectue la fusion de ladite lignée lymphoblas- totde humaine avec des cellules humaines de chorio-épi- théliome. 5. Procédé selon la revendication 2, caractérisé en ce qu'on effectue la fusion de ladite lignée lymphoblas- toide humaine avec des cellules humaines d'adénome chro- mophobe de l'hypophyse. 6. Procédé selon une des revendications 1 à 5, ca- ractérisé en ce que l'animal à sang chaud est une volaille, en particulier poussin ou pigeon, ou un mammifère, notam- ment chien, chat, singe, chèvre, porc, vache, cheval, la- pin, cobaye, rat, hamster, souris ou souris nue. 7. Procédé selon une des revendications 1 à 6, carac- térisé en ce qu'on laisse les cellules lymphoblastoldes humaines, multipliées, libérer de l'hCG en présence d'un ou de plusieurs constituants, en particulier des amino- acides, notamment leucine, lysine, arginine ou cystéine; des sels minéraux, particulièrement chlorures de sodium, potassium ou calcium, ou sulfate de magnésium, et des hor- mones, notamment la LHRH (luteinizing hormone-releasing hormone). 8. Procédé selon une des revendications 1 à 7, carac- térisé en ce que les cellules lymphoblastoSdes humaines sont obtenues par fusion cellulaire avec emploi du virus Sendal ou de polyéthylèneglycol.