FR 2497101 A1 19820702 FR 8124269 A 19811228 24971I 41 1 La présente invention concerne un procédé pour la production d'hormone stimulant la thyrotde humaine, ci- après désignée en abrégé par HSTh. HSTh est une hormone sécrétée par les cellules basophiles, humaines, du lobe antérieur de la glande hy- pophysaire, qui stimule la croissance de la glande thy- rolde et la fixation de l'iode dans'les autres hormones hu- maines; elle active l'ATPase. A ce jour, il n'existe pas de procédé de production à l'échelle industrielle de HSTh à bas prix. La présente invention est basée sur la constata- tion inattendue, que certains lymphoblastotdes humains, capables de produire cette hormone, conviennent pour la production industrielle de HSTh, en raison de leur vites- se de multiplication, et de leur taux de production d'hor- mone par cellules, très élevés. Le nouveau procédé selon l'invention de produc- tion de HSTh consiste à multiplier des lymphoblastoldes humains, capables de produire cette hormone, par trans- plantation de ces cellules dans le corps d'un animal à sang chaud, ou en fournissant à ces cellules, à l'aide d' un dispositif, le fluide corporel nutritif d'un animal à sang chaud et à laisser les cellules humaines, ainsi mul- tipliées, par l'un ou l'autre procédé, libérer l'hormone HSTh. Le procédé selon l'invention, tout en aboutis- sant à une production supérieure en HSTh n'exige que peu ou pas de milieu nutritif contenant du sérum coûteux pour la multiplication cellulaire, et il permet de maintenir plus facilement que dans le cas de la culture de tissu in vitro, le milieu de culture au cours de la multiplication cellulaire. En particulier, tous les lymphoblastoldes hu- mains, capables de produire HSTh, peuvent être facilement multipliées, grâce à l'utilisation de fluide corporel nu- tritif, provenant d'un animal à sang chaud, par transplan- tation des cellules erAquestion dans le corps de l'animal, ou par leur mise en suspension dans une chambre de diffu- sion équipée pour recevoir le fluide corporel nutritif, l'animal étant alimenté de manière habituelle. Ce procédé est également caractérisé par une multiplication des cellules plus stable et plus levée, et par une production soerie-ur. de HSTh pa cel lule. Conviennent, conforriment à 1'invenltion, tous les ly-mphiblas.oldes humains dans la mesure o ils produi- sent ISThS e.' se multiplisnt rapidement dans le corps d2un animal a sang chaud. Leú lymphoblastodes humains, pré6 férés, sont ceux qui sonl, dotes de sites génétiques com- mandant 'a prodIuction de HSTh, des cellules humaines qui produisent par nab'ure cette hormone, ce.n..ota.ent des cellules basophiles du lobe antérieur c3 la glande hypophysaire, des cellules de tumeurs hypphysaires ou des cellules d'adénome chromophobe de la glande hypophy- saire, ou des cellules humaines, qui produ-.isent de l'HSTh ectopique colme es cellules du carcincc-e du pumn au moyen de fu.sioi ce!llulaire utilisant des Cnt tes que polyeéthvlnc glynh- ou virus de Send?, ou d;e techniques de recombinaison génétique utilisant LAD-N liase nucléase et ADN polymérase; et des lymphoblastoides humains qui produisent de iAHLPh ectopiqueo Comme la trinsplantationr au corps ae l'animal de ces lymaphoblastodes humains abou- tit à la formation de tumeurs massives,pouvant être facile- ment désagrégées, et que ces tumeurs ne sonI.: guère conta- minées par les cellules de l'h6te animal, la récolte des cellules vivantes de liphoblastoîdehnaiïns, multipliée, est facile. Conviennent comrme animaux utilisables dans le procédé selon l'invention tous ceuxz dans lesquels les lymphoblastoïdes humains peuvent se multiplier, par exem- ple des volailles comme poulet et pigeon, des mammifères comme chat, chien, singe, chèvre, porc, vache, cheval, la- pir, cobaye, hamster, souris ou souris nue. Comme cette transplantation cellulaire provoque une immunoréaction ind sirable, il s'avère souhaitable d'utiliser des ani- maux nouveau-nés ou en bas âge, ou encore au stade le plus Jeune possible, comme oeuf, embryon ou foetus. Afin de réduire autant que possible l'immunoréaction, l'animal peut être traité, avant la transplantation des cellules, par irradiation aux rayons-X ou aux rayons-Y, d'environ à 600 rems, ou par injection d'antisérum ou d'agent immunodépresseur préparé selon un procédé classique. Com- me la souris nue, utilisée comme animal à sang chaud, pré- sente l'immunoréaction la plus faible, même à l'âge adul- te, on peut l'utiliser avantageusement sans prétraitement, pour y transplanter et y multiplier rapidementdes lignées de lymphoblastoides humains. Une multiplication cellulaire, stabilisée, et une augmentation de la production de HSTh peuvent être à la fois réalisées par transplantation répétée, utilisant des combinaisons de différents animaux à sang chaud: par exemple, on peut atteindre ces objectifs en implantant d'abord les cellules chez le hamster, o elles se multi- plient, puis en les réimplantant chez la souris nue. En outre, on peut effectuer la transplantation successive chez des animaux de la mème classe ou division, aussi bien que chez ceux de la même espèce ou du même genre. En ce qui concerne la localisation de l'implan- t-tion des lymphoblastoTdes humains, conviennent tous les sitesde l'animal, pourvu que ces cellules puissent s'y multiplier, par exemple la cavité allantoIque, ou les voies intrapéritonéale, intraveineuse ou sous-cutanée. A côté de cette transplantation directe des lym- phoblastoldes humains au corps de l'animal, existe la pos- sibilité de faire se multiplier aisément les lignées clas- siques de lymphoblastoldes humains capables de produire HSTh, en utilisant le fluide corporel nutritif provenant de l'animal, grâce à l'inclusion, par exemple par voie intrapéritonéale, dans le corps de l'animal d'une cham- bre de diffusion classique, de taille et de forme appro- priées, munie d'une membrane poreuse filtrante, d'un ul- tra-filtre ou de fibre creuse d'un diamètre de pore de l'ordre de 10-7 à 10t5 m, qui empêche la contamination de la chambre de diffusion par les cellules de4'hôte tout en permettant l'apport du fluide corporel nutritif de 1' animal aux cellules. Comme la chambre de diffusionteut ê- tre conçue, si nécessaire, pour être placée sur l'hôte animal et permettre au fluide corporel de ce dernier de circuler dans la chambre, les parois de celle-ci peuvent être munies de fenêtres latérales, transparentes, per- mettant l'observation de la suspension de cellules, ainsi quelle remplacement et l'échange avec une chambre fraiche: la production cellulaire par hôte est ainsi augmentée à un niveau encore supérieur, rapporté à la durée de vie de l'animal, sans sacrifice de l'hôte. En outre, lorscu'on utilise cette chambre de diffusion, comme les cellules hu- maines multipliées peuvent être facilement récoltées, et qu'il n'y a pas manifestation d'immunoréaction, du fait de l'absence de contact direct entre les lymphoblastoldes hu- - mains et les cellules de l'hôte animal, on peut utiliser comme hôte, conformément à l'invention, sans prétraitement destiné à réduire l'immunoréaction, tout animal à sang chaud. L'alimentation de l'hôte animal, auquel on a im- - planté des cellules humaines, peut s'effectuer facilement par procédé classique, même après la transplantation cel- lulaire, et elle ne nécessite pas de soins particuliers. La multiplication cellulaire maximale est attein- te environ 1 à 20 semaines, en général l à 5 semaines, a- près l'implantation des cellules. Conformément à l'inven- tion on obtient 107 à 1012, ou plus, de lymphoblastoîdes humains par hôte. Autrement dit, le nombre de lymphoblastol- des humains implantés chez l'hôte animal s'accroît 102 107 fois ou plus, ou bien est d'environ 101 à 106 fois ou plus celui que l'on obtient avec un procédé de culture de tissu in vitro, utilisant un milieu nutritif, aussi ces cellules multipliées sont-elles avantageusement utilisa- bles pour la production d'HSTh. En ce qui concerne le procédé grâce auquel les lymphoblastotdes humains multipliés peuvent libérer HSTh on peut employer tout moyen permettant la libération d' HSTh par ces cellules. Par exemple, les lymphoblastotdes humains, obtenus par multiplication en ascite, en suspen- sion, etécolte à partir de cet ascite, ou par extraction de tumeur massive, formée sous la peau, et récolte après désagrégation de la tumeur, sont mis en suspension pour atteindre une concentration de 104 à lo8 cellules par ml dans un milieu nutritif, préchauffé à une température de l'ordre de 20 C à 400C, puis mis à incuber à cette tem- pérature pendant 1 à 100 heures, pour produire HSTh. L'aug- mentation de la production d'HSTh peut être réalisée par la présence d'un ou de plusieurs des composés suivants: amino-acides comme lysine, arginine, glycine, leucine ou cystéine; des sels minéraux comme chlorure de sodium, de potassium ou de calcium, et sulfate de magnésium; et des hormones comme l'hormone libératrice de thyrotropine. La production simultanée dtautres hormones hu- maines comme l'hormone stimulant les follicules (en abré- gé HSFh) et la gonadotropine chorionique, humaine (en abrégé GCh), peut être réalisée conformément à l'inven- tion. L'HSTh, ainsi obtenue, peut être recueillie facilement grâce à des techniques de purification et de séparation utilisant des modes opératoires classiques tels que relargage, dialyse, filtration, centrifugation, con- centration et lyophilisationo Quand on. souhaite un pro- duit encore plus pur, on peut obtenir une préparation de pureté supérieure par combinaison des techniques mention- nées plus haut avec d'autres modes opératoires classiques, tels qu'adsorption et désorption avec échange d'ions, fil- tration sur gel, chromatographie par afin e fractionne- ment au point isoelectrique et électrophor-se La préparation d'HSTh, ainsi obtenue, peut être avantageusementL utilisée, zeule.ou en combinaison avec un ou plusieurs aents, pour injection, axinisratio - x Lerre, interne ou de diagnostico, pour l a p. ven+tein eL, le traitement de maladies hb.a.neso Au ccu'rs de la pr-sente lzcrp n, la y dv-' tion de HSTh est dose aàr. ced1 -oëd k--. r'-ecee décrit par S3';c * R3nlny et Po' J G. e End 5k-zî!- lV.7 61, pp. 419-436 (!4:.... eo-t expr.P_-% nt-. Yn- les (UI) par paorrt ' la pr4paation t! d:HTh diso- ni.ble auaMtioenal dIs.stt 0--Angl etr re). La p:uoducti,çn simultan de ?Fh est - oe w le pnrocédé Jn. noro. z- 3, -- _' ur,oe44i=a4 R20 ( 1967) e*t es tr '-:té' ' i'ci:e r)ADe j,/ et e s-t. ' -'' t Xn8m4e, la cr'tuctin de GCih estl- pz le Srocéd4 de Pa'±%r: îZidaley J-'dci radioimmuno-aessaai dé:r-t p. e x nology, Vol. 79e Dpp ÂJ0-/8 (1966) e st e +_:-:-'im en Uni- tes Internationales (Ui" 2!5 L'invention est i1lust'ée czi-ezrrpar p!usieurl formes de réalisation non limitatives. EXEMPLE I Des cellules d'adénome basophile humain dêsagr? gé, obtenues par extraction à partir d'un oai=ent souffrant 3C d4adénome basophile du lobe anterieur de l'hypophyse, sui- vie de harhege, et une lignée de!y phb-lastoldes leucémi- ques, humains.. de Namalwa, sont mises en suspension ensem- ble dans. un -rci- ient avec une solution saline de 140 mX de NaCl, 54 mM de Cl, I mM't de IaI]PO e-t 2 M de CaC12, de manière à obtenir des concentrations cellulaires res- 24971C Dectives de l'ordre de 1 4 cellules/ml. La suspension de cellules, refroidie à la glace, est mélangée avec une préparation fraiche de la même solution saline, contenant du virus de Sendaî préalablement inactivé par irradiation à l'ultra-violet, le tout est transféré 5 minutes après le mélange dans un incubateur à 370C, et y est agité pen- dant 30 minutes pour réaliser la fusion cellulaire, in- troduisant l'aptitude à produire l'HSTh-des cellules d'a- dénome basophile, humain, dans la lignée des lymphoblas- toïdes leucémiques, humains. Après clonage selon un procé- dé classique de/4a souche de cellules d'hybridome,capable de produire l'HSTh, on l'implante par voie intrapéritonéale chez des souris nues adultes, qui sont ensuite nourries de manière habituelle pendant 5 semaines. Les tumeurs mas- sives, résultantes, pesant environ 15 g chacune, sont ex- traites, désagrégées par hachage et mises en contact avec de la trypsine. Après lavage des cellules avec du milieu de Earle 199 (pH 7,2), additionné de 10% en volume/volume de sérum foetal de veau, les cellules sont remises en sus- pension, à une concentration de 105 cellules/ml, dans une préparation fraiche du même milieu qui contient 30 mM de L-arginine, et l'on met à incuber à 370C pendant 35 heu- res environ pour obtenir HSTh. Les cellules sont ensuite soumises aux ultra-sons, et la quantité d'HSTh présente dans la partie surnageante est dosée. La production d'HSTh est d'environ 180 mUI/ml de suspension cellulaire. La pro- duction simultanée d'HSFh est de l'ordre de 500 mUI/ml de suspension cellulaire. Les cellules témoins, obtenues par culture in vitro de cellules d'adénome basophile, humain, à 370C, dans du mi- lieu de Earle 199 (pH 7,2), additionné de 10% en volume/ volume de sérum foetal de veau, sont traitées comme plus haut pour produire HSTh. Cette production n'est que voi- sine de 0,3 mUl/ml de suspension cellulaire. EXEMPLE 2 Des cellules d'adénome chromophobe humain, désa- grégé, obtenues par extraction à partir d'un patient souf- frant d'adénome chromophobe de l'hypophyse, suivie de ha- chage, et une lignée de lymphoblastotdes leucémiques, hu- mains, JBL, sont mises à fusionner comme dans l'exemple 1, introduisant ainsi l'aptitude à.produire de l'HSTh des cel- lules d'adénome chromophobe humain, dans la lignée des lym- phoblastotdes leucémiques, humains. Après clonage par pro- cédé classique de la souche de cellules d'hybridome capable de produire l'HSTh, on l'implante par voie sous-cutanée chez des hamsters nouveau-nés, ayant préalablement reçu de l'antisérum, préparé à partir d'un lapin, selon un pro- cédé classique, afin de réduire leur immunoréaction; ces animaux sont nourris de manière habituelle pendant 3 se- maines. Les tumeurs massives, résultantes, formées sous la peau et pesant environ 10 g chacune, sont extraites et dé- sagrégées par hachage, puis mises en suspension dans du sérum physiologique contenant de la collagénase. Apres la- vage des cellules avec du milieu minimal, essentiel de Eagle (pH 7,4), additionné de 5% vol./volo de sérum humain, ces cellules sont remises en suspension pour donner une concentration de l'ordre de 10 cellules/ml, dans une pré- paration fraîche du même milieu, contenant 20 mM de L-lysi- ne, 10 mM de sulfate de magnésium et 10 nq d'hormone libé- ratrice de thyrotropine, puis mises à incuber à 37 C pen- dant 20 heures pour produire de l'HSTh. La production de cette hormone est d'environ 220 mIU/ml de suspension cel- lulaire. La production simultanée de GCh est de l'ordre de 430 UI/ ml de suspension cellulaire. Les cellules témoins, obtenues comme dans l'exemple 1 par culture in vitro de lignée fusionnée de lymphoblastoTdes leucémiques, humains, JBL, sont traitées comme plus haut. La production de HSTh n'est que de 8 mUI/ml de suspension cellulaire. EXEMPLE 3 A des rats nouveau-nés on implante, par voie intraveineuse, une lignée de lymphoblastodes leucémiques, humains, de BALL-1, dans laquelle l'aptitude à produire de l'HSTh de cellules d'adénome basophile humain a été in- troduite, comme dans l'exemple 1t; puis on nourrit les rats de manière habituelle, pendant 4 semaines. Les tumeurs mas- sives, résultantes, environ 30 g chacune, sont extraites et traitées comme dans l'exemple 1, pour produire HSTh. La production d'HSTh est voisine de 160 mUI/ml de suspen- sion cellulaire. La production simultanée d'HSFh est d'environ 900 mUI/ml de suspension cellulaireo Les cellules t4moins, obtenues comme dans l'exemple 1 par culture in vitro de lignée fusionnée de lymphoblastoldes leucémiques humains BALL-1, sont traitées comme plus haut. La production d'HSTh n'est que de 5 mUI/ml de suspension cellulaire. EXEMPLE 4 Après avoir subi une irradiation de 400 rems en- viron de rayon-X, pour la réduction de l'immunoréaction, -des souris adultes reçoivent par voie sous-cutanée des implants de lignée de lymphoblastoïdes leucémiques, hu- mains, NALL_1, dans laquelle l'aptitude à produire l'HSTh des cellules d'adénome chromophobe humain a été introduite comme dans l'exemple 1; puis on nourrit les souris de ma- nière habituelle pendant 3 semaines. Les tumeurs massives, résultantes, formées sous la peau et pesant environ 15 g chacune, sont extraites et traitées comme dans l'exemple 2 pour produire l'HSTh. La production de cette hormone est d'environ 210 mUI/ml de suspension cellulaire. La production simultanée de GCh est de l'ordre de 480 UI/ml de suspension cellulaireo Les cellules témoins, obtenues comme dans l'exemple 1 par *: culture in vitro de/iignée fusionnée de lymphoblastotdes leucémiques, humains NALL-1, sont traitées comme plus haut. La production de HSTh n'est que de 7 mU'I/ml de sus- - pension cellulaire, environo EXEMPLE 5 Unre lignee de lymphoblastodes le uc 'iques hu- mains, TALL_-', dens laquelle l'aptitude ' poroduire de 1- HSTh des ceillules d'adénome basophile huain, a é-té intro- duite cormne dans l'exemple 1, est mise en suspensipon dans du sérum pyilogique, ps le tou. est t-ra-.ns-éré dans une chambre de diffusion cylindrique-en.atière plastique, dont le volumia lnfÉgieu? est de i-ordr de 10 mi l munie d'une membrane filtran't; ayant une dins-e.ion dio.e voi- sine de 0,5 v, Apes -nc.rus on par oie intrapété n ale, de cette chamb-re dans un rat. adu!ie on _eurri% c-!u1i-i de manière habituelle pendant 4 semaines. puis on enl-e la chambre. La densité en cellules humaines dans la cham- bre, atteint.e au cours de l'opération ci-essusest d'eln- viron 7 x 10 cellules/ml, ce qui est. env.iron 102 fois su- périeur, ou mFme plus, à ce qu'on atteint avec une culture in vitro à l':ide d'un incuba%-eur à C02. Lee ysIphoblas- to'des humains, ain$i obtenus, sont iraits comme dans i'exemple 2, pour produire HSTho Cet-te production est de l'ordre de 170 mU'l/ml de suspension cellulaire. La production simultanée de GCh est voisine de 720 UI/ml de suspension cellulaire. Les cellules teréonso obtenues par mise en suspension dans du sérum chyrsiologique de cellules d'adénome basophile humain, transfert- de la suspension de cellules résultante dans la chambre de diffusionl inclusion par voie intrapé- ritonéaie de la chambre dans un rat, alimentation de ce dernier de manaire habituelle oendant 4 semaines, et ré- coite des cellules de lymphoblastoldes hl!mains multipliées (densité environ 8 x 106 cellules/ml), sont craitées comme plus haut. La production en HSTh n'est que de 0,lmUI/ml de 249710' suspension cellulaire. EXEMPLE 6 Une lignée de lymphoblastoides leucémiques, hu- mains, JBL, dans laquelle l'aptitude à produire de ltHSTh des cellules de carcinome de poumon, humain,a été intro- duite comme dans l'exemple 1, est implantée dans la cavité allantoique d'oeufs embryonnés, préalablement mis à incu- ber à 370C pendant 5 jours. Après incubation des oeufs em- bryonnés à cette température, pendant 1 semaine supplémen- taire, les lymphoblastotdes humains, multipliés, sont ré- coltés et traités comme dans l'exemple 1 pour produire HSTh. Cette production est voisine de 140 mUI/ml de sus- pension cellulaire. Lors de l'expérimentation témoin, au cours de laquelle dLÉs cellules de carcinome du poumon humain sont implantées dans les cavités allantolques d'oeufs embryonnés, on n'observe pas de multiplication cellulaire. Revendications t. Procédé pour la production d'hormone stimulante de la thyroïde humaine (HSTh), par multiplication de lym- phoblastoides humains, capables de produire HSTh et libé- ration de cette hormone par des cellules multipliées, ca- ractérisé en ce qu'on utilise, pour la multiplication cel- lulaire, un animal à sang chaud. 2. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que la multiplication cellulaire est réalisée par im- plantation des cellules humaines dans le corps d'un animal à sang chaud. 3. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que la multiplication cellulaire est réalisée à l'aide d'un dispositif,dans lequel le fluide corporel nutritif d'un animal à sang chaud eseourni aux cellules humaines. 4. Procédé selon la revendication 3, caractérisé en ce que le dispositif est une chambre de diffusion équipée de manière à ce que les cellules de l'hôte animal ne la contaminent pas. 5. Procédé selon une des revendications 1 à 4, ca- ractérisé en ce que les lymphoblastoïdes humains, capables de produire HSTh, sont des cellules d'hybridome obtenues par fusion cellulaire d'une lignée de lymphoblastoides hu- mains, avec des cellules humaines capables de produire HSTh. 6. Procédé selon la revendication 5, caractérisé en ce que les cellules d'hybridome sont obtenues par fusion cellulaire d'une lignée de lymphoblastoïdes humains avec des cellules de carcinome du poumon humain. 7. Procédé selon la revendication 5, caractérisé en ce quefles cellules d'hybridome sont obtenues par fusion cellulaire d'une lignée de lymphoblastotdes humains avec des cellules d'adénome chromophobe humain. 8. Procédé selon la revendication 5, caractérisé en ce que les cellules d'hybridome sont obtenues par fusion cellulaire d'une lignée de lymphoblastotdes humains avec des cellules d'adénome basophile humain. 9. Procédé selon une des revendications 1 à 8, carac- térisé en ce que la lignée de lymphoblastoides humains est une lignée leucémique. 10. Procédé selon la revendication 9, caractérisé en ce que la lignée de lymphoblastoldes leucémiques, humains, est une lignée de Namalwa, de NALL1, de BALL-1, de TALL-1 ou JBL. 11. Procédé selon une des revendications 1 à 10, ca- ractérisé par la production simultanée d'hormone gonado- tropique, chorionique, humaine (GCh). 12. Procédé selon une des revendications 1 à 11, ca- ractérisé par la production simultanée d'hormone de sti- mulation des follicules humains (HSFh). 13. Procédé selon une des revendications 1 à 12, ca- ractérisé en ce qu'on laisse les lymphoblastoides humains multipliés, libérer l'HSTh, en présence d'un ou de plu- sieurs des produits suivants: leucine, glycine, lysine, arginine, cystéine, chlorure de sodium, chlorure de po- tacsium, chlorure de calcium, sulfate de mdgnésium et hormone libératrice de thyrotropine. 14. Procédé selon une des revendications 1 à 13, ca- ractérisé en ce que l'animal à sang chaud est une volaille, en particulier poulet ou pigeon, ou un mammifère, notam- ment chien, chat, singe, chèvre, porc, vache, cheval, la- pin, rat, cobaye, hamster, souris ou souris nue.