FR 2489150 A1 19820305 FR 8116169 A 19810824 La présente invention concerne un procédé de prépa- ration d'un concentré à forte teneur en facteur VIII (globuline antihémophilique A) avec une activité spéci- fique d'au moins 2,5 urits deglobuline antihémolytique A (GAA) et une teneur en fibrinogène inférieure à 0,25 mg/ mg de protéine de plasma humain ou animal par fractionnemst à étapes nultiples du plasma, en particulier par cryopréci- pitation et purification à l'aide d'agents de précipita- tion des protéines, comme le polyéthylène-glycol. On connaît déjà des concentrés de facteur VIII (GAA) préparés au départ rie plasma humain ou animal et manifes- tant une activité en facteur VIII supérieure en comparaison de celle du plasma natif. Les procédés connus de prépara- tion de concentrés à forte teneur en facteur VIII font appel à des méthodes de fractionnement qui se mettent en oeuvre par un traitement du plasma par de l'éthanol, de l'éther, du polyéthylène-glycol et/ou de la glycine. Il est également connu de procéder à une cryoprécipitation du plasma selon Pool (1965, ''The New England Journal of Medicine'" 273, 1443) ou à une cryoprécipitation à l'éthanol du plasma selon Johnson (Congr. Int. Soc. Blood Transf., Sydney, Australia, Abstracts of Paper, page 1109 (1966)). Il existe encore bien d'autres procédés de prépara- tion de concentrés du facteur VIII, notamment le traite- ment du plasma par des agents adsorbant4 tels que le florigel, la bentonite, des échangeurs d'ions et des agents de chromatographie à perméabilité. Selon l'état de la technique, c'est Cohn (J. Amer. Chem. Soc. 68, 459 (1946)) qui a pour la première fois décrit le traitement du plasma par de l'éthanol. Lors du traitement du plasma par de l'éthanol, on obtient la fraction appelée Cohn-I qui ne possède cependant qu'une activité de facteur VIII réduite. La méthode de Cohn a été améliorée par Blombâck (Arkiv for Kemi, 12,387 (1958)), qui purifie davantage la fraction Cohn-I par extraction à l'aide d'un tampon éthanolglycine-citrate. C'est de cette manière que naquit la fraction dite I-0. Ainsi que le décrivent Simonetti et coll. (Hemostase 1, 57 (1961)), celleci peut encore être davantage purifiée à l'aide d'acide tannique; même ces concentrés améliorés n'ont qu'une activité de facteur VIII relativement réduite. Ces concentrés ont aussi pour désavantage de comporter des teneurs élevées en protéines étrangères, c'est-à-dire des teneurs élevées en protéines thromboplastinogéno- inactives. C'est ainsi que la fraction de Cohn-I contient plus de 60 % de la protéine qu'est le fibrinogène et que la fraction de Blombâck-I-O contient plus de 80 % de fibri- nogène. Quant au fractionnement connu par cryoprécipitation, on entreprend celui-ci en surgelant du plasma de départ humain ou animal et en le décongelant ensuite. On dissout ce cryoprécipité dans une solution tampon et on le purifie éventuellement davantage à l'aide d'un agent de précipi- tation des protéines, tel que le polyéthylène-glycol et la glycine. La cryoprécipitation n'a pas permis de par- venir à une élévation importante de l'activité de facteur VIII. En comparaison du plasma de départ, l'activité de facteur VIII est environ décuplée par la cryoprécipitation, mais même les mesures prises en combinaison avec la cryo- précipitation n'ont Jusqu'à présent pas réussi à élever l'activité des produits obtenus dans la mesure souhaitable. Les brevets des Etats-Unis d'Amérique NO 3 652 530, 3 631 018, 3 682 881 et le brevet autrichien N 349 639 décrivent des procédés de fractionnement à multiples étapes en combinaison avec une premibre étape de cryoprécipitation. De tels produits sont désignés comme étant des pro- duits à ''GAA hautement purifiée" ou "'GAA de haute pureté "'. Leur activité de facteur VIII ne s'élève ce- pendant qu'à 90 à 100 fois l'activité du plasma natif, tandis que la teneur en protéine thromboplastinogéno- inactive (fibrinogène) constitue encore 35 % de la protéine globale. La présente invenion a donc pour objet d'obvier aux difficultés et inconvénients esquissés et vise plus par- ticulièrement un concentré à forte teneur en facteur VIII dont les protéines inertes, thromboplastinogéno-inactives sont en grande partie éliminées, dont la teneur en fibri- nogène est maintenue à la valeur la plus faible possible et dont lactivité de facteur VIII, rapportée à la protéine présente dans le concentré, est supérieure à celle des préparations thérapeutiques actuellement connues. La présente invention a plus particulièrement pour objet un procédé de préparation d'un concentré a haute teneur en facteur VIII (GAA) possédant une activité spé- cifique d'au moins 2,5 unités GAA et une teneur en fibri- nogène inférieure à 0,25 mg/mg de protéine, procédé que l'on peut mettre en oeuvre à l'échelle industrielle ou technique et qui assure une grande économie. Conformément à l'invention, on a résolu les problèmes posés par la mise en oeuvre d'un procédé de fractionne- ment à étapes multiples de la nature décrite dans le préambule, selon lequel on réalise une cryoprécipitation, de préférence à titre de première étape, caractérisé en ce que l'on soumet cette fraction enrichie en facteur VIII (GAA) et purifiée par cette méthode de fractionnement à une cryoprécipitation à l'alcool et en ce que l'on trans- forme le précipité obtenu en une forme conservable. Selon une forme de réalisation particulièrement pré- férée de l'invention, on ajoute un alcool mono- ou poly- hydroxylé, tel que l'alcool méthylique, l'alcool éthylique, le polyéthylène-glycol ou un polyester-glycol (Pluronic) à la fraction purifiée et enrichie en facteur VIII (GAA), à un pH de 5,9 à 6,3 et à une température de O à -3 C, on surgèle profondément le mélange et on le décongèle ensuite Jusqu'à une température de 0 à 4 C, puis on dissout le précipité contenant le concentré à haute teneur en GAA et on l'amène sous une forme conservable par surgélation profonde et lyophilisation. 2489t'50 Selon l'une de ses formes de réalisation particuliè- rement avantageuses, le procédé conforme à l'invention se caractérise par la combinaison de mesures qui suivent: - on soumet le plasma humain ou animal à une première cryoprécipitation, - on dissout le cryoprécipité dans une solution tampon aqueuse, on règle le pH à 6,15-6925 et on soumet la solution à une première précipitation de purification au polyéthylèneglycol, - on soumet le résidu obtenu après avoir écarté le préci- pité, à au moins une précipitation de purification supplémentaire et - on soumet la fraction finalement obtenue après avoir écarté les précipités, purifiée, enrichie en facteur VIII (GAA) à une cryoprécipitation alcoolique, conformément à laquelle on ajoute à cette fraction un alcool mono- ou poly-hydroxylê, tel que l'alcool méthylique, l'alcool éthylique, le polyéthylène-glycol ou un polyester-glycol (Pluronic); on surgèle profondément le mélange et on le décongèle ensuite jusqu'à une température de O à 40 C, puis on dissout le précipité contenant le concentré à haute teneur en GAA et on l'amène sous une forme conser- vable par surgélation profonde et lyophilisation. On réalise avantageusement la première précipitation au polyéthylèneglycol avec du polyéthylène-glycol à 3 % p/v et on réalise la seconde précipitation ou les préci- pitations ultérieures au polyéthylène-glycol avec du poly- éthylène-glycol à 8 % p/v. Pour la précipitation du concentré de facteur VIII, on utilise avantageusement une solution de Pluronic dtaviron % p/v. Au lieu de se servir de polyéthylène-glycol comme agent de précipitation des protéines, on peut également employer du ''Pluronic'" auquel cas la combinaison précitée se compose des caractéristiques qui suivent: - on soumet le plasma humain ou animal à une première -' cryoprécipitation, on dissout le cryoprécipité dans une solution aqueuse tampon, on en règle le pH à 6,25 et on soumet la solu- tion à une première précipitation de purification au Pluronic, - on soumet le résidu obtenu après avoir écarté le préci- pité à au moins une précipitation de purification sup- plémentaire au Pluronic et - on soumet la fraction obtenue après avoir écarté les précipités, purifiée, enrichie en facteur VIII (GAA), à la cryoprécipitation alcoolique, au cours de laquelle on aJoute à cette fraction un alcool mono- ou poly- hydroxylé, tel que l'alcool méthylique, l'alcool éthylique, le polyéthylène-glycol ou un polyester- glycol (Pluronic); on surgèle profondément le mélange et on le décongèle ensuite Jusqu'à une température de O à 40C, puis on dissout le précipité contenant le concentré à haute teneur en GAA et on l'amène sous une forme conservable par surgélation profonde et lyophi- lisation. Les exemples qui suivent illustrent davantage le procédé conforme A l'invention. EXEMPLE 1 On décongèle Jusqu'à O à +4C, 460 1 de plasma fraichement surgelé. On sépare le cryoprécipité formé par centrifugation et on le dissout dans 9, 6 1 de citrate trisodique à 37 C. On règle le pH de la solution à 6,2 et on y ajoute du polyéthylène-glycol 2000 à 3 % p/v. Ce faisant, il se forme un précipité que l'on sépare par centrifugation et que l'on écarte. On élève la force ionique du résidu qui contient le facteur VIII (GAA), par addition de citrate trisodique. On précipite les protéines indésirables résiduelles pat élévation de la concentration en polyéthylène-glycol 2000 jusqu'à 8 % p/v et on les écarte après centrifugation. On précipite le concentré de facteur VIII par ad- dition d'éthanol à 8 % p/v, à -2C et à un pH de 6,1, on congèle la suspension et après décongélation à +4eC, on dissout le cryoprécipité alcoolique contenant le facteur VIII dans un tampon physiologique, on le stéri- lise par filtration, on le répartit dans les récipients et on le lyophilise. EXEMPLE 2 On décongèle Jusqu'à O à +4 C9 600 ml de plasma franchement surgelé. On dissout le ỳoprécipité centri- fugé dans 240 ml de citrate trisodique à 37 C. On règle le pH de la solution à 6,2 et on y ajoute du polyéthy- lène-glycol 2000 à 3 % p/v. On sépare le précipité obtenu et on l'écarte. On élève la force ionique par addition de citrate trisodique, on précipite les protéines indésirables par addition de polyéthylène-glycol 2000 supplémentaire jus- qu'à une concentration de 8 % p/v, on sépare ces protéines et on les écarte. On précipite le concentré de facteur VIII à un pH de 6,0 et à une température qui varie de -2 à -3eC, à l'aide de méthanol à 10 % p/v, on surgèle la suspension et après sa décongélation, on dissout le cryoprécipité alcoolique dans un tampon isotonique, on le stérilise par filtration, on le répartit dans des récipients et on le lyophilise. EXEMPLE 3 On répète le mode opératoire décrit à l'exemple 2, en utilisant cependant du polyéthylène-glycol à 12 % au lieu de méthanol à 10 % p/v pour procéder à la précipi- tation du concentré de facteur VIII. EXEMPLE 4 On répète le mode opératoire décrit à l'exemple 2, en utilisant cependant du "Pluronic'" à 10 % p/v au lieu de méthanol à 10 % p/v pour procéder à la précipi- tation du concentré de facteur VIII. EXEMPLE 5 2489150. On décongèle Jusqu'à O à +4 C, 10,4 1 de plasma fraîchement surgelé. On dissout le cryoprécipité dans 250 ml d'un tampon au citrate trisodique. On règle le pH de la solution à 6,3 et on y aJoute du PluronicR à 2,5 % p/v. On écarte le précipité. Après élévation de la force ionique, on élève la concentration du Pluronic Jusqu'à 7 % p/v et on écarte de nouveau le précipité obtenu. On traite le résidu à un pH de 6,0 et à une tempéra- ture de -20C par de l'éthanol à 8 % p/v, de façon à pré- cipiter un concentré de facteur VIII. On surgèle la sus- pension et, après décongélation à +4 C, on sépare le cryo- préciplté alcoolique. Le tableau I montre, en comparaison des concentrés de GAA connus, disponibles dans le commerce, l'activité spécifique nettement augmentée des concentrés obtenus par mise en oeuvre du procédé conforme à-la présente inven- tion, ainsi que l'enrichissement de leur teneur en GAA supérieure à plus de 200 fois celle du plasma de départ. TABLEAU I Spécifité Pureté en com- unités/mg paraison du plasma Plasma 0,017 1 Cryoprécipité 0,145 9 GAA de haute pureté 1,667 98 Concentré fort préparé selon l'invention 3,500 206 La plus faible teneur du concentré fort conforme à l'invention en fibrinogène par rapport aux concentrés connus ressort du tableau II. TABLEAU II Fraction de Cohn-I 60 % fibrinogène Fraction de Blomback-I-O 80 % fibrinogène GAA purifiée de haute pureté 35 % fibrinogène Concentré fort préparé selon l'in- vention 10 % fibrinogène REVENDICATIONS 1. Procédé de préparation d'un concentré à forte teneur en facteur VIII (globuline antihémophilique A) avec une activité spécifique d'au moins 2, 5 unités de globuline antihémolytique A (GAA) et une teneur en fibrinogène inférieure à 0,25 mg/mg de protéine de plasma humain ou animal par fractionnement à étpes mutls du plasma, en particulier par cryoprécipitation et pu- rification à l'aide d'agents de précipitation des pro- téines, comme le polyéthylène-glycol, caractérisé en ce que l'on soumet cette fraction enrichie en facteur VIII (GAA) et purifiée par cette méthode de fraction- nement à une cryoprécipitation à l'alcool et en ce que l'on transforme le précipité obtenu en une forme conser- vable. 2. Procédé suivant la revendication 1, caractérisé en ce que l'on ajoute un alcool mono- ou poly-hydroxylé, tel que l'alcool méthylique, l'alcool éthylique, le polyéthylène-glycol ou un polyester-glycol (Pluronic) à la fraction purifiée et enrichie en facteur VIII (GAA), à un pH de 5,9 à 6,3 et à une température de O à -3eC, on surgèle profondément le mélange et on le décongèle ensuite Jusqu'à une température de O à 4 C, puis on dissout le précipité contenant le concentré à haute teneur en GAA et on l'amène sous une forme conservable par surgélation profonde et lyophilisation. 3. Procédé suivant l'une quelconque des revendica- tions 1 et 2, caractérisé par la combinaison de mesures qui suivent: - on soumet le plasma humain ou animal à une première cryoprécipitation, - on dissout le cryoprécipité dans une solution tampon aqueuse, on règle le pH à 6,15-6,25 et on soumet la solution à une première précipitation de purification au polyéthylène-glycol, - on soumet le résidu obtenu après avoir écarté le préci- pité, à au moins une précipitation de purification supplémentaire et - on soumet la fraction finalement obtenue après avoir écarté les précipités, purifiée, enrichie en facteur VIII (GAA) à une cryoprécipitation alcoolique, conformément à laquelle on aJoute à cette fraction un alcool mono- ou poly-hydroxylé, tel que l'alcool méthylique, l'alcool éthylique, le polyéthylène-glycol ou un polyester-glycol (Pluronic); on surgèle profondément le mélange et on le décongèle ensuite jusqu'à une température de 0 à 4 C, puis on dissout le précipité contenant le concentré à haute teneur en GAA et on l'amène sous une forme conser- vable par surgélation profonde et lyophilisation. 4. Procédé suivant la revendication 3, caractérisé en ce que l'on réalise la première précipitation au polyéthylène-glycol avec du polyéthylèneglycol à 3 % p/v et on réalise la seconde précipitation ou les pré- cipitations ultérieures au polyéthylène-glycoI avec du polyéthylène-glycol à 8 % p/v. 5. Procédé suivant la revendication 4, caractérisé en ce que pour la précipitation du concentré de facteur VIII, on utilise avantageusement une solution de Pluronic d'environ 10 % p/v. 6. Procédé suivant la revendication 1, caractérisé par la combinaison de mesures qui suivent: - on soumet le plasma humain ou animal à une première cryoprécipitation, - on dissout le cryoprécipité dans une solution aqueuse tampon, on en règle le pH à 6,25 et on soumet la solu- tion à une première précipitation de purification au Pluronic, - on soumet le résidu obtenu après avoir écarté le préci- pité à au moins une précipitation de purification sup- plémentaire au Pluronic et *UO^BS9Tt -TqdoLt a aepuojoid uoTIel92Jns.ed a[qe.Aasuoo amLo$ atm snos auemi Uo e VV0 ua Jneual. enq e 1 914uaouoo 01 el qrueauuoo a.TdToqJd eI %nossTp uo sTnd '0o. B O ep eaJrnq.aemae alun enbsn aTnsua eITauoo3p e[ uo %a a2uelam ael uamgpuo;oad alearns uo! (oTuoJnld) looXI -.IaX.s aiod un no tooX-aua4wtod al 'arnIT-tlqq looole,1 'enbTTA9lm looolilu anb 1e9 'g9IXxo.pXq 5 -kTod no -ouom -ToooIae un uoToe:; 4aSao 1 eno e uo ellaenbB ep s8aoo nu 'enbTlooole UoT;ul. 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