FR 2497103 A1 19820702 FR 8124272 A 19811228 2497 1 La présente invention concerne un procédé de production de facteur de croissance humain, ci-après dé- signé en abrégé par FCh. Ce facteur FCh est une substance de type hor- monal, présente principalement dans le sérum humain; elle dépend de l'hormone croissance et son action s'exerce sur différents tissus; cette substance est donc classée dans le groupe des substances dites de type Somatomedine qui sont des facteurs stimulant la croissance. On sait également que FOn stimule la multiplication des cellules de différents tissus, favorise l'oxydation du glucose dans les tissus graisseux, et, administré in vivo, provo- que la réduction du taux de sucre dans le sang, ce qui est une activité de type insulinoIdeo Bien que le mode d'ac- tion de FPC ne soit pas entièrement connu à ce jour, il est clair qu'il est en rapport étroit avec des phénomènes métaboliques comme régénération et multiplication cellu- laires. La commercialisation de cette substance, en tant que médicament, est très attendue depuis de nombreuses années, mais les procédés classiques pour sa production, par exemple par récupération de FCh à partir de grandes quantités de sérum humain, à l'aide de modes opératoires très compliqués. ou par culture in vitro de tissus, ne permettent pas d'obtenir des quantités suffisantes pour l'utilisation clinique et thérapeutique. La présente invention est basée sur la consta- tation inattendue que, des cellules humaines, obtenues par multiplication de cellules humaines, capables de produire FCh à l'aide d'un animal à sang chaud, présentent une ap- titude à produire ce facteur bien supérieure à celle des cultures de tissu in vitro, la production de FCh par cel- lule étant jusqu'à 2 à 50 fois supérieure. Le nouveau procédé selon l'invention de produc- tion de FCh consiste à multiplier des cellules humaines, capables de produire FCh, par transplantation de ces cel- lules dans le corps d'un animal à sang chaud, ou en four- nissant à ces cellules, à l'aide d'un dispositif, le flui- de corporel nutritif d'un animal à sang chaud, puis à laisser les cellules, multipli4es par i7'un ou l'autre de ces procédés de multiplication, libérer FGh. Le procédé selon e'innention, ou ai sant un production su eri d3e er LC!, n' exige que ieu ou ps. de. milie;u nutritie contenran- du serum copt.e;}our la multi. plication cellulaire, et il peormet de main-Leniisr elus faci lement que dans l1 cas de la culture de iisslu i-n itro le milieu de a!tur- 8u cturs de a là!'ti!ia'ion cellu- laire. En particulier, toutes les csIl.iies bumaines. ca- pables de produire FCb- peuvent &tó%. faciltsme: multipi4es, grtce à 'utilisation de fLuide c01oroe nI:-'.if0 oe - ',F nant d'un animal h sang chaudz Dam %ranspl.anation ee cellules e.. quest'.n dans le corps de 1 an'ma!s. ou ?ar leur mise en s$s$ion dans une chambre de diffusien équipée pour Te -ceo!r- le f.l3ide corporel nut'_.ti. f ia- nimial 'tant ali ent- de maanière habituelleo 2O. Ce proc4d6é èst de plus -caractéris4 par aune ultiplica-ion des cellules plus stable et plus éleviep e pa;- u un. prc duction spieure de ?Ch par cellules Conviennent% confonrmément ià ineA nion oute les cellules humaines dans la mesure o elle; produisent FCh et se nmul.%iplie+n aisment dans le corps dn akmial à sang ch.aud: Dar exemle, les cellules humaines, (ui produisent par nature FCh, ccmrîae les cellules hépartiques humaines, celles qui sont transformées par un virus, un agent earc3nge e ou des radiations, etl des ceillles de carciniome du foie humain provenaînt d'un patient porteur d'un carcinome du foie; des cellules de carcinome du poumon humain, productrices de FCh ectopique; et des li- inées de cellules établies des cellules ci-dessus. L'uti- lisation de lignées de lymphoblastoides humains, établis, faciles à conserver, dotées de sites génetiques codant la 24971 production de FCh au moyen de techniques de recombinaison génétique utilisant des enzymes comme ADN ligase, nucléa- se et ADN polymérase, ou au moyen de fusion cellulaire, utilisant des agents tels que polyéthylène glycol ou virus de Sendal, aboutit avantageusement à une multiplication cellulaire remarquablement supérieure, lorsqu'on trans- plante les cellules dans le corps d'un animal à sang chaud, la production de FCh par cellule étant alors de 2 à 10 fois, plus élevée. En outre, comme la transplantation au corps de l'animal des lignées de lymphoblastoldes humains établis, mentionnés plus haut, aboutit à la formation de tumeurs massives, pouvant être facilement désagrégées, et que ces tumeurs ne sont guère contaminées par les cellules de l'h8te animal, la récolte des cellules de lymphoblastot- des humains multipliés, vivantes, est facile. Conviennent comme animaux utilisables dans le pro- cédé selon l'invention tous ceux, dans lesquels les cellu- les peuvent se multiplier, par exemple des volailles comme poulet et pigeon, des mammifères comme chat, chien, singe, chèvre, porc, vache, cheval, lapin, cobaye, hamster, souris ou souris nue. Comme cette transplantation cellulaire pro- voque une immunoréaction indésirable, il s'avère souhaita- ble d'utiliser des animaux nouveau-nés ou en bas âge, ou encore au stade le plus jeune possible, comme oeuf, embryon ou foetus. Afin de réduire l'immunoréaction, l'animal peut être traité, avant la transplantation des cellules, par ir- radiation aux rayons-X ou aux rayons-t, d'environ 200 à 600 rems, ou par injection d'antisérum ou d'agent immuno- dépresseur préparé selon un procédé classique. Comme la souris nue, utilisée comme animal à sang chaud, présente 1' immunoréaction la plus faible, même à l'âge adulte, on peut l'ut'l,'iser avantageusement sans prétraitement, pour y trar4planter et t multiplier rapidement des lignées de cellules humaines établies. Une multiplication cellulaire, stabilisée, et une augmentation de la production de FCh peuvent être à la fois réalisées par transplantation répétée, utilisant des combinaisons de différents animaux à sang chaud: on peut atteindre ces objectifs en implantant d'abord les cellules chez le hamster, o elles se multiplient, puis en les réimplantant chez la souris nue. En outre, on peut effectuer la transplantation successive chez des animaux de la même classe ou division, aussi bien que chez ceux de la même espèce ou du même genre. En ce qui concerne la localisation de l'implanta- tion des cellules humaines, conviennent tous les sites de l'animal, pourvu que les cellules puissent s'y multiplier, par exemple la cavité allantoIque, ou les voies intrapé- ritonéale, intraveineuse ou sous-cutanée. A côté de cette transplantation directe des cel- lules au corps de l'animal, existe la possibilité de fai- re se multiplier aisément les lignées classiques de cellu- les humaines, établies, capables de produire FCh, en uti- lisant le fluide corporel nutritif provenant de l'animal, gràce à l'inclusion, par exemple par voie intrapéritonéale, dans le corps de l'animal d'une chambre de diffusion clas- sique, de taille et de forme appropriées, munie d'une mem- brane poreuse filtrante, d'un ultra-filtre ou de fibre creuse d'un diamètre de pore de l'ordre de 10-7 à 10 5 m, qui empêche la contamination de la chambre de diffusion par les cellules de l'hôte tout en permettant l'apport du fluide corporel nutritif de l'animal aux cellules. De plus, comme la chambre de diffusion peut être conçue, si nécessaire, pour être placée sur l'hôte animal et permet- tre au fluide corporel de ce dernier de circuler dans la chambre, les parois de celle-ci peuvent être munies de fe- nêtres latérales, transparentes, permettant l'observation de la suspension de cellules, ainsi que le remplacement et l'échange avec une chambre fraiche: la multiplication -35 cellulaire est ainsi augmentée à un niveau encore supérieur, rapporté à la durée de vie de l'animal, et la production par animal est encore accrue sans sacrifice de l'hôte. En outre, lorsqu'on utilise cette chambre de diffusion, com- me les cellules humaines multipliées peuvent être facile- ment récoltées, et qu'il n'y a pas manifestation d'immu- noréaction, du fait de l'absence de contact direct entre les cellules humaines et celles de l'hôte animal, on peut utiliser comme h8te, conformément à l'invention, sans prétraitement destiné à réduire l'immunoréaction, tout a- nimal à sang chaud. L'alimentation de l'hôte animal, auquel on a implanté des cellules humaines, peut s'effectuer facile- ment par procédé classique, même apres la transplantation cellulaire, et elle ne nécessite pas de soins particuliers. La multiplication cellulaire maximale est attein- te environ 1 à 20 semainesaprèe l'implantation des cellu- les. Lorsque la lignée établie, implantée, est une lignée de ceilules de tumeur humaine ou de lymphoblastotdes hu- mains, la multiplication cellulaire maximale est atteinte en 1 à 5 semaines, apres la transplantation, en raison des vitesses de multiplication cellulaire très élevées de ce type de lignée. Conformément à l'invention on obtient 107 à 1012 ou plus, de cellules humaines par hôte. Autrement dit, le nombre de cellules humaines implantées chez l'hôte animal s'accroit 102 à 107 fois ou plus, ou bien est d'environ 101 à 106 fois ou plus celui que l'on obtient avec un pro- cédé de culture de tissu in vitro, utilisant un milieu nu- tritif, aussi ces cellules sont-elles avantageusement uti- lisables pour la production%Ch. En ce qui concerne le procédé pour libérer FCh des cellules humaines multipliées, on peut employer tout moyen permettant la libération de FCh par les cellules humaines, obtenues par le mode opératoire mentionné plus haut. Par exemple, les cellules humaines, obtenues par mul- tiplication en ascite, en suspension, et recolte à partir de cet ascite, ou par extraction de tumeur massive, for- mée sous la peau, et récolte après désagrégation de la tumeur, sont maises en suspension pour ateindre une con- centration de 10 è 108 cellules par mI dans un milieu nutitif., maintenues 3 une température de 1 'ordre de 200 à 400;, Puis mises à incuber à cette temp,-ralure pendant environ 1 à quelques semaines pour libérer ie l Che Pendnt cette pério e d'incubation, le milieu nutritif peut 3tre éventuellement remplacé, à intervralies réguliers, par une cr,-, aration frnche du m.e milieu, afin de fournir une nourriture suffisante aux cellles,.t le FCh libéré dans le ilieu us$, peut êtr- egalement:col s' Le FCh, ainsi obtenu, peut. -tre recueiîli facilee et m rtce f des techn-iques de purificati on et deC- s4parae ion;utilîsat des modes operao.res C siE ous tels que -aeler-cege, dialyse, filtration, centifuga'ion con- centraio. n et lyophilisationo Quand on souhaite un Dro- dui% encore plus pur, on peut obtenir une préparation de pureté supéreuue par combinaison des techniques mention-n n'es plus haut avec d'autres modes opératoires classiques, -tels qu'ad.sor;tion et désorp-ion avec echange d'ions, frac- tionnemen.t par poids moléculaire, chromatographie par af- firni%é fractionne2ment au point isoélect+?ique et électro- phorCse, Comme la pre-aration de FCh, ainsi obtenue, est identique aux points de vue immunologique et physiochimi- que, à celles que l'on obtient par des proc.dês classiques, elle peut _tre avantageusement utilisée, seule ou en com- binaison avec un ou plusieurs agents, pour injection, admi- nistration externe, interne ou de diagnostic, pour la pre- vention ou le traitement de maladies humaines. La quantité de FCh, présente dans le milieu de culture, est dosée par le procédé d'essai dacrit par Norman C. Dulak et Howard M. Tennis, Journal of Cellular Physiology, Vol. 81, pp. 161-170 (1973). Une unité de FCh 24971M y est définie comme la quantité d'activité provoquant une stimulation de l'incorporation de 3H-thymidine, équiva- lente à celle qui est provoquée par 1 mg de protéine to- tale de sérum de veau. Plusieurs formes de réalisation de la présente invention sont décrites en détail ci-après. Il est bien entendu que cette description n'est donnée qu'à titre d'exemple, et ne limite aucunement la portée de l'inven- tion. EXEMPLE 1 Des cellules de carcinome de foie humain, haché et désa- grégé, obtenues par extraction à partir d'un patient souf- frant d'un carcinome du foie, sont implantées par voie sous-cutanée dans des souris nues adultes, qui sont en- suite nourries de manière habituelle pendant 4 semaines. Les tumeurs massives, résultantes, pesant environ 9 g cha- cune, sont hachées et mises tion saline contenant de la Après lavage avec du milieu (pH 7,2), ces cellules sont préparation franche du m4me sine de 10 cellules/ml, et dant 15 jours pour libérer 1 que du milieu par du milieu géré à -200C, immédiatement en suspension dans une solu- trypsine pour les désagréger. RPMI 1640 exempt de sérum remises en suspension dans une milieu à une concentration voi- l'on met à incuber à 37 C pen- FCh, avec remplacement périodi- frais. Le milieu usé est réfri- après son remplacement, et il est entreposé jusqu'à son utilisation ultérieure. Après la période d'incubation, la partie surnageante de la suspen- sion cellulaire et le milieu provenant d'un stock réfri- géré, préparé par dégel, sont centrifugés ensemble à envi- ron 8 000 tours/minute pendant 30 minutes; et la partie surnageante, ainsi obtenue, est essayée quant à sa teneur en FCh. La production de cette substance est de 7 500 uni- tés/ml de suspension cellulaire. Les cellules témoins, obtenues par culture in vitro des mêmes cellules, de carcinome de foie humain, dans du milieu de Eagle (pH 7,2), additionné de 1% en volume/volume de sérum foetal de bovidé et 20Y% en volume/volume de bouillon, et mises à incuber à 370C, sont traitées comme plus haut pour libérer FCh. La production de cette substance n'est que de 25 unités/ml de suspension. EXEMPLE 2 Des cellules de carcinome du foie, humain, haché et désa- grégé, obtenues comme dans l'exemple 1, et une lignée de lymphoblastoldes leucémiques, humains, de Namalwa, sont mises en suspension ensemble dans un récipient avec une solution saline de 140 mM de NaCl, 54 mM de KCl, 1 mM de NaH2PO4 et 2 mM de CaCl2, de manière à obtenir des concen- trations cellulaires respectives de l'ordre de 1 cellu- les/ml* La suspension de cellules, est mélangée sous re- froidissement à la glace, avec une préparation franche de la même solution saline, contenant du virus de Sendal préalablement inactivé par irradiation à l'ultra-violet; le tout est transféré 5 minutes après le mélange dans un incubateur à 370C, et y est agité pendant 30 minutes pour réaliser la fusion cellulaire, introduisant l'aptitude à produire FCh dans la lignée des lymphoblastoldes humains de Namalwa. Après clonage selon un procédé classique de la lignée de cellules d'hybridome, capable de produire FCh, on l'implante par voie intrapéritonéale chez des sou- ris nues adultes, qui sont ensuite nourries de manière ha- bituelle pendant 5 semaines. Les tumeurs massives, résul- tantes, pesant environ 14 g chacune, sont extraites et trai- tées comme dans l'exemple 1 pour libérer FCh. La production de FCh est d'environ 32 000 unités/ml de suspension cellu- laire. L'expérimentation témoin est réalisée comme dans l'exemple 1, par culture in vitro de la lignée de lympho- blastotdes, humains, fusionnés, de Namalwa, et maintien des cellules ainsi multipliées, jusqu'à ce qu'elles aient li- béré du FCh. La production de FCh n'est que de 1 100 unités /ml de suspension cellulaire. EXEMPLE 3 Après injection à des hamsters nouveau-nés d'antisérum, préparé à l'aide de lapin selon un procédé classique, afin de réduire une immunoréaction possible résultant de la transplantation cellulaire, on implante, par voie sous-cutanée, chez ces animaux, une lignée de lymphoblas- toldes leucémiques, humains, JBL, dans laquelle l'apti- tude à produire FCh a été introduite comme dans l'exemple 2, puis on les nourrit de manière habituelle pendant 3 semaines. Les tumeurs massives, résultantes, formées sous la peau, et pesant environ 11 g chacune, sont extraites et traitées comme dans l'exemple 1, pour donner FCh, à ce- ci près que l'on remplace le milieu nutritif d'incubation RPMI 1640, par du milieu de Eagle (pH 7,2) contenant 20% en volume/volume de bouillon. La production de FCh est de l'ordre de 45 000 unités/ml de suspension cellulaire. L'expérimentation témoin est réalisée comme dans l'exemple 1 par culture in vitro de la lignée de lymphoblastotdes leucémiques, humains, fusionnés, JBL, et abandon des cellu- les humaines multipliées pour qu'elles libèrent FCh. La production de FCh n'est que de l'ordre de 2 100 unités/ml de suspension cellulaire. EXEMPLE 4 A des rats nouveau-nés on implante, par voie intraveineuse, une lignée de lymphoblastotdes leucémiques humains BALL_1, dans laquelle l'aptitude à produire FCh a été introduite, comme dans l'exemple 2; puis on nourrit les rats de manière habituelle, pendant 4 semaines. Les tumeurs massives, résul- tantes, environ 38 g chacune, sont extraites et traitées comme dans l'exemple 1 pour libérer FCh. La production de FCh est voisine de 42 000 unités/ml de suspension cellulai- re. L'expérimentation témoin est réalisée par culture in vitro de laignée de lymphoblastoïdes leucémiques, humains, fusionnés, BALL-1, et abandon des cellules humaines multi- pliées pour qu'elles libèrent FCh. La production de FCh n'est 2497 103 que de 1 900 unités/ml de suspension cellulaire. EXEMPLE 5 Après avoir subi une irradiation de 400 rems environ de rayons-X, pour la réduction de!immunoréactionr des sou ris adultes reçoivent par voie souscutanée des implant_ de cellul2s d'hépatoma humain, obtenues Éoi le dans 1-e;:m- pie 1 puis on nourrit les souCis de ri.r re habi-uell*zE pendant 4 szmaines. Les tumneurs massivaes, suItantean formées sous la peau et pesant environ. g cMhacune, scn extraits et trîtées dme dans 1exp,io $- rr -. ra pro-du.i.on de Fh est d nvirn- 9 65_ units/ mi de suspensa 3>n ci;E lai. Lant. toi o5 réalis.e par cu'Ure in ' eitro es cc-1.ilels da e' du foie humaT inen *....d.. &.. c el...le2 pliées afin lu-i2.!l1'br ent: ard.d ion d. ' n'est que de d 9-o3re de d 80 urni';;s/ 1d susensios? n e e- lulaire. EXEMPLE 6: Une lignée de i phobloa'.:,a-s!eucer.ieam u-ai-ns, JBL - dans laquelle a-ptitude rduie F.-h te roduite. cornmmIe dans l'x.-'2-.oTM $e est m 3 ise '--;tpe-ni3 an dau-s4. rum physiologiquepus le tIout et u nansf-3ue chE= bre de Jif-fuion ?lindrique n: at-i.re pi'i-ru, dont we voJXlur;-;4 l. euzrest de l9 rvoisine de Ap inclusion, pa c intrap4ri to- nrale, de cette chambrr;2 3daas un rat adui' óon hourrit celui- ci de manièere habituelle pendant 4 semaines, puis on enlève la chambre. La d-ensitî an cellules humaines dans la chambre, atteinte au coursc de l'opération cidessues, est d'environ 2x109 cellules/m! l ce qui est envir*r 0, lois supérieur, ou même plus, h ce qu'on atteint avec une cul; ure in v:'tro l'aide d'un incubiateur C2. Les cellules humaines ain- si obtenues, sont traitées comme dans l'exemple 3, pour li- bérer FCh. La production du FCh est de l'ordre de 57 00 249710O unités/ml de suspension cellulaire. EXEMPLE 7 Une lignée de lymphoblastoides leucémiques humains BALL-1, dans laquelle l'aptitude à produire FCh a été introduite comme dans l'exemple 4, est implantée dans la cavité al- lantotque d'oeufs embryonnés, préalablement mis à incu- ber à 37 C pendant 5 jours. Après incubation des oeufs embryonnés à cette température, pendant 1 semaine sup- plémentaire, les cellules humaines, multipliées, sont ré- colt4es ettraitées comme dans l'exemple 1 pour libérer FCh. La production de FCh est voisine de 35 000 unités/ml de suspension cellulaire. Revendications 1. Procédé pour la production du facteur de croissan- ce humain (FCh), par multiplication de cellules humaines, capables de produire cette substance, et maintien des cellules ainsi multipliées jusqu'à ce qu'elles libèrent FCh, caractérisé en ce qu'on utilise, pour lfnultiplication cellulaire, un animal à sang chaud. 2. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que la multiplication cellulaire est réalisée par im- plantation des cellules humaines dans le corps d'un animal à sang chaud. 3. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que la multiplication cellulaire est réalisée à l'aide d'un dispositif, dans lequel le fluide corporel nutritif d'un animal à sang chaud est fourni aux cellules humaines. 4. Procédé selon la revendication 3, caractérisé en ce que le dispositif est une chambre de diffusion équipée de manière à ce que les cellules de l'hôte animal ne la contaminent pas. 5. Procédé selon une des revendication 1 à 4, carac- térisé en ce que les cellules humaines, capables dero- duire FCh, sont des cellules obtenues par fusion cellulai- re d'une lignée de lymphoblastoldes humains, avec des cel- lules humaines,capable de produire FCh. 6. Procédé selon la revendication 5, caractérisé en ce que les cellules humaines, fusionnées avec la lignée de lymphoblastoides, proviennent de carcinome-du foie humain. 7. Procédé selon une des revendications 5 ou 6, carac- térisé en ce que la lignée de lymphoblastoldes humains est une lignée leucémique, en particulier de Namalwa, BALL-1 ou JBL. 8. Procédé selon une des revendications 1 a 7, carac- térisé en ce que, au cours du stade de libération de FCh, le milieu nutritif est renouvelé à intervalles réguliers, les milieux usés étant mis de c8té pour en extraire le FCh. 9. Procédé selon une des revendications 1 à 8, ca- ractérisé en ce que l'animal à sang chaud est une volail- le, en particulier poulet ou pigeon, ou un mammifère, no- tamment chien, chat, singe, chèvre, porc, vache, cheval, lapin, rat, cobaye, hamster, souris ou souris nue.