FR 2490495 A1 19820326 FR 8020187 A 19800919 La présente invention concerne de nouvelles glycc- protéines hydrosolubles immunostimulantes extraites de Elebsiella Pneumoniae, leur procédé d'obtention, leur appli- cation comme médicaments et les compositions les renrifermant. 59 Un scertain nombre de brevets français ont déjà dé- crit des glycoprotéines extraites ds Klebsiella Pneumoniae, il en est ainsi,par xemple, des brevets français No 2.043.475, 2.088.112, et 2.171t907. La présente demande concer-,e des glycoprotéines plus précisément définies et a aiinsi pour objet de nouvelles gly- coprot-ines hydrosolubles immunostimulantes ext'ai tes de Klebsiella PnelLnmoniae, caractérisées en ce qu'elles rnfe- ment de 20% à 35% de protéines, 50% à 70% d'oses neutres, 3% à 8% d'acide glucuronique et 1g5% à 3% d'osaminc-s, et ont un poids moléculaire superieur à 100.000 daltons. On désigne Dar oses neutres, notement, des hexoses neutres tels que I le glucose, le maxnose ou le galactose. Le poids moléculaire des glycoprotéines de la présente dem.ande a été stime par ultra centrifugation; on a trouvé trois fractions de poids moléculaire supérieur à 100.000 daltons. Les glycoproteines de 1 'invention peuvent $tre extrai- tes de d ifférentes souches de Klebsiella Pnemnoniae; on re- tient cependant tout particulièrement celles qui proviexnent de la souche déposée à l'Institut PASTEUR sous le numéro 52.145. L'étude de la structure de ces glycoprotéines à l'aide de différentes techniques chimiques notamment, la r- duction des résidus acides uroniques par le carbodiimide, la permé- thylation, la dégradation uronique, l'oxydation périodique ou l'oxydation par l'oxyde de chrome, a permis de préciser la composition des produits de la présente demande. Les glycoprotéines préférées selon l'invention sont celles pour lesquelles la fraction protéique est composée par environ 30% d'acides aminés acides. On entend par acides aminés acides des acides aminés tels que l'acide aspartique ou l'acide glutamique. Les glycoprotéines préférées selon l'invention sont aussi celles pour lesquelles la fraction polysaccharidique renferme approximativement pour une molécule de glucose, de 1 à 1,5 molécule de mannose, de 1 à 1,5 molécule d'acide glucuronique et de 2 à 2,5 molécules de galactose, L'invention a également pour objet un procédé d'obten- tlon des nouvelles glycoprotéines hydrosolubles telles que définies ci-d. essus; ledit procédé est oaractrisé en ce que l'on traite-, l'aide d'un aimmonium quaternaire, une solu- tion de glycoprotéines obtenue par diafiltration d'un extrait de lysat de cultures de Klebsiella Pneumxoniae, isole le sur- nageant par élimination du précipité obtenu, traite à froid à l'aide d'un alcanol de.faible poids moléculaire le surna- geant correspondant par ulesolution saline des glycoproteines, obtient ainsi un nouveau précipitD que l'on redissout dans eau, dialyse puis lyophiliseo On peut utiliser difSérentes solutions de glycopro- tines au dépat du procdé; ces solutions sont obtenues par diafltra;tion de lysats de cultures de Klebsiella Pneumoniae sur des uem branes poreuses calibrées, capables de retenir les molécules d'un p-oids moléculaire égal ou supérieur à un poids m-oléculaire Cdoî8 qui est une constante pour ces membranes Les man.s u hiiisdes sont, par E 'pl= les ge nee vendues sans ls nfi._sQ de m@axue MICON M-150 PN30 et Q2 ais on p utiliser des meb'nes dont le s.entl _ b f@Seno r.S d fe!00o0 daltons, telles e l cE:a- nf cQERo-.oilos sous la désignation ", 100 ou El pl000 ar sociéto oc iCO, Les cbranes tout par:iculliîreent pr-e=s3 rpe ete@nt da meteni!s lecus dont le poids Zluuais e us: p3suiseux à3 300000 daltaons celles-ci sont Aan=ajeuse_ ent cnstituées par lexs ml branee coerciais&es ecuF la dcsigna-tion Xk!300 par les sociétés ZUICON et ROMICCONo nf La dia2filtration pemet de sélectionner, an solution, das moilcules dont le poids moléculaire est supé5rieur à un F-oids 4molêcu!aira donné, co.me on l'a dit, par le chofiL de la membrane, en fonction du seuil de rétention désiré. I1 est évident, pour l'ho.mae de l'art, que l'utilisation d'au- tres solutions de mmes caractéristiques, obtenues par d'autres moyens, comme par exemple par chromatographie sur gel polymérisé hydzophile, est tout à fait possible. Préalablement à cette operation de sélection, le lysat peut, très avantageusement, être délipidê et débarrassé de ses acides nucléiques. Dans des conditions de réalisation tout particulière- ment préférées du procédé selon l'invention, la solution de glycoprotéines de départ est obtenue selon le procédé dé- crxlt dans le seccnd certificat d'addition no 2.171.907 au brevet français no 2.043.475,-dans ce certificat d'addition, le poids moléculaire des glycoprotéines a été estimé par la technique d'exclusion de gels. L'ammonium quaternaire que l'on utilise pour traiter la solution de glycoprotéines de départ peut être, par exem- ple, le chlorure de pyridyl-cétyl-ammonium, mais tout par- ticulièrement, le bromure de triméthyl cétyl ammonium ou Cétavlon. Après traitement par l'ammonium quaternaire, le préci- pité obtenu peut être séparé du surnageant par des procédés classiques, tels que la décantation ou la filtration, mais on préfère le. séparer par centrifugation. La solution correspondant au surnageant est alors traitée à froid, aux environsde + 40C, à l'aide d'un alcanol de faible poids moléculaire tel que le méthanol, l'éthanol, le n-propanol ou l'isopropanol, mais on utilise de préféren- ce l'éthanol. Les résultats les plus intéressants sont obte- nus par l'utilisation de six volumes d'éthanol pour un volume de solution saline, pendant une nuit, à la température de + 40C. Le précipité est redissout dans l'eau et dialysé pour le purifier. La dialyse est effectiée à l'aide de cellules de type classique obturées par des membranes, par exemple, de collodion ou de cellulose. On retient, notamment, les cellules dont la membrane est en cellulose régénérée, à diamètre moyen des pores égal à environ 24 A, retenant les substances dont le poids moléculaire est supérieur à 12 à 14 000 daltons. Parmi les cellules à dialyse, on peut noter tout particulière- ment les tubes VISKING. Cette dialyse permet d'éliminer de la solution de gly- coprotéines, les impuretés de faible poids moléculaire res- tantes, comme les traces d'alcanol. On peut évidemment obtenir les glycoprotéines de l'in- vention, un peu moins pures, en n'effectuant pas l'étape de dialyse. La lyophilisation est effectuée de façon classique, par exemple dans des ensembles congélateur-sublimeur de tail- le moyenne comme les modèles SMU ou SIRG commercialisés par la Société Usifroid, des lyophilisateurs de grande taille comme par exemple, l'ensemble formé par un congélateur CA1 et un sublimeur SMIRS, tous deux commercialisés par Usifroid. Des modèles plus petits, de laboratoire, peuvent aussi être utilisés, ainsi que ceux commercialisés par d'autres sociétés, telle la société Sérail. Dans des conditions préférentielles de mise en oeuvre, le procédé cidessus décrit est caractérisé en ce que: - l'ammonium quaternaire utilisé est le bromure de cétyltri- méthyl-ammonium; - l'on isole par centrifugation le surnageant; - l'alcanol de faible poids moléculaire est l'éthanol. La présente demande a également pour objet les glyco- protéines telles qu'obtenues par le procédé selon l'invention. Les produits, objet de la présente invention, possè- dent de très intéressantes propriétés pharmacologiques; ils sont doués, notamment, de remarquables propriétés, immuno- stimulantes ainsi que d'une très bonne tolérance. Ces propriétés sont illustrées plus loin dans la partie expérimentale. Ces propriétés Justifient l'utilisation des glycopro- téines de la présente demande, à titre de médicaments. La presentce demande a ainsi également pour objet l'application, à titre de médicaments, des glycoprotéines telles que définies ci-dessus. Parmi les médicaments de l'invention, on retient éga- lement ceux,caractérisés en ce qu'ils sont constitués par les glycoprotéines telles qu'obtenues par le procédé de l'inven- tion. Les médicaments de l'invention trouvent, par exemple, leur emploi dans le traitement ou la prévention, chez l'homme et l'animal, des maladies infectieuses causées par les bac- téries ou les virus, dans le traitement des maladies à para- sites, des toxi-infections, dans le traitement des infections pasthospitalières et postchirurgicales. La dose usuelle, variable selon le produit utilisé, le sujet traité et l'affection en cause, peut-être par exem- ple de 1 mg à 15 mg par jour, par voie orale, chez l'homme, de 1 mg à 15 mg par jour, par voie rectale, de 0,25 mg à 5 mg par Jour par voie parentérale. L'invention a enfin pour objet les compositions phar- maceutiques qui renferment les glycoprotéines de la présente demande, à titre de principe actif. A titre de médicaments, les glycoprotéines de la pré- sente demande peuvent être administrées par les voies diges- tive ou parentérale ou locale. Les compositions pharmaceutiques correspondantes peu- vent être, par exemple, solides ou liquides et se présenter sous les formes pharmaceutiques couramment utilisées en mé- decine humaine, comme par exemple, les comprimés, simples ou dragéifiés, les gélules, les granulés, les solutions, les sirops, les suppositoires, les préparations injectables lyo- philisées ou non, les ovules, les crèmes, les pommades, les lotions, les gouttes, les collyres, les aérosols, elles sont préparées selon les méthodes usuelles. Le ou les principes actifs peuvent y être incorporés à des excipients habituel- lement employés dans ces compositions pharmaceutiques, tels que le talc, la gomme arabique, le lactose, l'amidon, le stéarate de magnésium, le beurre de cacao, les véhicules aqueux ou non, les corps gras d'origine animale ou végétale, les dérivés paraffiniques, les glycols, les divers agents mouillants, dispersants ou émulsifiants, les conservateurs. Il va être donné maintenant, à titre non limitatif, des exemples de mise en oeuvre de l'invention. Exemple I: g de produit tel qu'obtenu à l'exemple n 1 du brevet français n 2.171. 907, sont dissous dans deux litres d'eau permutée. On ajoute, lentement, environ 1,6 1 de Cetavlon à 3%, l'ensemble est agité pendant une heure, puis centrifugé à 10.000 t/mn, pendant 15 minutes. On élimine le précipité, ajoute ensuite au surnageant isolé 3 1 d'éthanol à 95 , en 3515 minutes. Après une heure d'agitation, on centrifuge à 10.000 t/mn, pendant 15 minutes, le surnageant ainsi obtenu est éliminé et le précipité est redissout dans 11 d'eau puis dialysé pendant 48 heures dans des tubes Visking contre de l'eau permutée à + 4 C. Au terme de cette dialyse, la solution 'est lyophilisée. On obtient 7,12 g des glycoprotéines cherchées. 2'490495 Exemlple-2 g de produit tel qu'obtenu à l'exemple i du brevet français n 2.171.907, sont dissous dans 1 i d eau permutée. On ajoute sous agitation 0,800 1 de Cétavlon à 35% Après une heure d'agitation, on centrifuge à 10O000 t/mn, pendant 15 minutes. On élimine le précipités on ajoute au surnageant isolé, 1,5 1 d'éthanol à 95o Apres une heure d'agitation, on centrifuge pendant 15 minutes à 10O000 t/mno Le surnageant est éliminé et le précipité repris dans 09500 i d'eau et dialysé pendant 48 heures dans des tubes Visking contre de l'eau Dermutée à + 4QC. Au terme de cette dialyse, on lyophilise 1a solution et on obtient 6 g des glycoprotéines chercheeso Exem:3 le 3. On a préparé des comprpimês répondant à la formule - glycoprotéines obtenues à l'exemple I............ 5 mg excipient qoso pour un comprimé terminé à....... 100 mng (Détail de l1excipient - lactose, amidon, talc, stéarate de magnésium) Zxemole 4 On a préparé une pommade répondant à la formule - g!ycoprot6ines obtenues à l'exemple 2............. 200 mg - excipient qo os p 0....0...........................! 100 g ETUDE PHARMACOLOGIQUE A) =Activité immunostîmulante et mitogénique. On administre par voie intraplantaire, à des lots de souris, 40 tg du produit à tester et 40 pg, de Serum-al= buimine bovive par animal0 On leur administre dix jours plus tard par voie intraveineuse une dose non léthale et non cho- quante de sérumn-albutminè (100 gg par animal). Des animaux témoins ne recoivent que la sérum=albumine lors de la première injection. On mesure l'activité immunostimulante par l'augmenta- tion de la réponse de choc anaphylactique à la Sérum=albumine, et l'activité mitogénique par l'augmentation du poids des ganglions drainant le point d'injection. 1 - activité immunostimulantes. On relève le nombre danimaux présentant un état de choc (dyspnée avec cyanose du museau allant jusqu'a la para- lysie du train arrière, les convulsions et la mort), ainsi que la mortalité, deux heures après l'injection intraveineuse de Sérum-Albumine. Résultats: Produit de exemple: % d'animaux choqués: de morts :: 1 50 20 2 50 30 Témoin: O: O 2 - activité mitoénigue: On sacrifie deux heures après l'injection intraveineuse de Sérum-Albumine les survivants,et on prélève les ganglions poplités drainant la patte o à eu lieu l'injection et les pése. L'activité mitogénique est exprimée à l'aide d'un index corres- pondant au rapport id poids moyen des ganglions des animaux traités avec le produit à tester, et de ceux des animaux té- moins n'ayant reçu que le Sérum-albumine. Résultats: Produit de l'exemple: Index 1 6,2 2 5,6 Les produits des exemples 1 et 2 présentent donc de très bonnes activités immunostimulantes et mitogéniques. B) - Stimulation des défenses non spécifiques: Cette stimulation a été étudiée sur le test de la "clearance" au carbone chez la souris en s'inspirant de la technique mise au point par HALPERN, qui consiste à injecter dans le sinus oculaire une suspension de carbone colloïdal à l'animal et à apprécier en fonction du temps, la cinétique de la disparition du carbone dans le sang, en effectuant des mesures de densité optique. Les produits sont administrés à l'animal par voie intra- 2'490495 péritonéale, vingt-quatre et quarante-huit heures avant le test. Les résultats sont exprimés en pourcentage d'élimina- tion des particules de carbone par rapport à des témoins ayant reçu uniquement l'injection de carbone colloidal et correspon dant au 100% du nombre de particules de carbone. % d'activité par rapport Produit de Doses aux Témoins l'exemple:. 8 minutes 30 minutes après après l'injection l'injection 1 0,25 mg/kg 50% 70 2 0,25 mg/kg 60%' 70% L'examen de ces résultats nous permet de noter l'inten- se stimulation provoquée par ces deux produits, sur les dé- fenses de l'organisme. C) - Toxicité aigae. La dose létale 50 (DL 50) par voie intrapéritonéale, chez la souris, a été déterminée par la méthode de BEHRENS et KARBER. Elle est de 50 mg/kg pour les glycoprotéines des exemples 1 et 2. - D) - Tolérance. L'injection sous cutanée de 0,2 ml de glycoprotéines des exemples 1 et 2, à la dose de 1000 y/kg, chez la souris, ne provoque aucune intolérance locale ou générale. REVENDICATIONS 1) - Nouvelles glycoprotéines hydrosolubles immunostimulantes extraites de Klebsiella Pneumoniae, caractérisées en ce qu' elles renferment de 20% à 35% de protéines, 50% à 70% d'oses neutres, 3% à 8% d'acide glucuronique, 1,5% à 3% d'osamines et ont un poids moléculaire supérieur à 100.000 daltons. 2) - Nouvelles glycoprotéines selon la revendication 1, ca- ractérisées en ce qu'elles sont extraites de la souche dépo- sée à l'Institut PASTEUR, sous le n 52.145. 3) - Nouvelles glycoproteines, selon la revendication 1 ou 2, caractérisées en ce que la fraction protéique est composée par environ 30% d'acides aminés acides. 4) - Nouvelles glycoprotéines selon l'une quelconque des re- vendications 1 à 3, caractérisées en ce que la fraction poly- saccharidique renferme, approximativement pour 1 molécule de glucose, de 1 à 1,5 molécule de mannose et de I à 1,5 molé- cule d'acide glucuronique et 2 à 2,5 molécules de galactose. ) - Procédé d'obtention de nouvelles glycoproteines telles que définies à l'une quelconque des revendications 1 à 4, caractérisé en ce que l'on traite, à l'aide d'un ammonium qua- ternaire, une solution de glycoprotéines obtenue par dia- filtration d'un extrait de lysat de culture de Klebsiella Pneumoniae, isole le surnageant par élimination du précipité obtenu, traite à froid à l'aide d'un alcanol de faible poids moléculaire le surnageant correspondant par une sdution saline des glycoprotéines, obtient ainsi un nouveau précipité que l'on redissout dans l'eau, dialyse puis lyophilise. 6) - Procédé selon la revendication 5, caractérisé en ce que: - l'ammonium quaternaire utilisé est le bromure de cétyltri- méthyl-ammonium; - l'on élimine par centrifugation le premier précipité; - l'alcanol de faible poids moléculaire est l'éthanol. 7) - Les nouvelles glycoprotéines telles qu'obtenues par le procédé selon la revendication 5 ou 6. 8) - Médicaments, caractérisés en ce qu'ils sont constitués par les nouvelles glycoprotéines hydrosolubles telles que dé- finies à la revendication 1 ou 2. 9) - Médicaments, caractérisés en ce qu'ils sont constitués par les glycoprotéines telles que définies à la revendication 7. ) - Compositions pharmaceutiques, caractérisées en ce qui elles renferment, à titre de principe actif, l'un au moins des médicaments tels que définis à l'une des revendications 8 ou 9.