FR 2497102 A1 19820702 FR 8124270 A 19811228 La présente invention concerne un procédé pour la production d'hormone parathyroïdienne, humaine, ci- après désignée en abrégé par HPTh. HPTh est une hormone secrétée par les glandes parathyroides, qui règle la synthèse de la vitamine D3 activée, stimule la libération du calcium à partir de l'os et conduit à un accroissement du taux de calcium dans le sang. A ce jour, il n'existe pas de procédé de production à l'échelle industrielle de HPTh à bas prix. La présente invention est basée sur la consta- tation inattendue que, certains lymphoblastoides humains, capables de produire HPTh, conviennent pour la production industrielle de cette hormone, en raison de leur très fort pouvoir de multiplication et de leurroduction très élevée de HPTh par cellule. Le nouveau procédé,selon l'invention de produc- tion de H-4PTh, consiste à multiplier des lymphoblastoldes humains, capables de produire cette hormone,par transplan- tation de ces cellules dans le corps d'unMnimal à sang chaud, ou en fournissant à ces cellules, à l'aide d'un dis- positif, le fluide corporel nutritif d'un animal à sang chaud, puis à laisser ces lymphoblastoïdes humains, mul- tipliés par l'un ou l'autre de ces procédés de multipli- cation, libérer HPTho Le procédé selon l'invention, tout en aboutis- sant à une production supérieure en HPTh, n'exige que peu ou pas de milieu nutritif contenant du sérum coûteux pour la multiplication cellulaire, et il permet de maintenir plus facilement que dans le cas de la culture de tissu in vitro, le milieu de culture au cours de la multiplication cellulaire. En particulier, tous les lymphoblastoldes hu- mains, capables de produire HPTh, peuvent être facilement multipliés, grâce à l'utilisation de fluide corporel nutri- tif, provenant d'un animal à sang chaud,par transplantation des cellules en question dans le corps de l'animal, ou par leur mise en suspension dans une chambre de diffusion équipée pour recevoir le fluide corporel nutritif, l'a- nimal étant alimenté de manière habituelle. Ce procédé es-t également caractérise par une multiplica- tion des cellules plus stable et plus élevle, et par une production supérieure de HPTh par celule. Conviennent, conformOent à 1 inàention % ous les lyîiphoblastoîdes humains dans la mesure oh ils pro- duisent H-PTh, et se multiplient rapidement dans le corps d'un animwal à sang chaude Les iympholasodes hu2ains prefraes sont ceux qui sont do-tes de sites iqus commanan% iE pxl-ducion d'HPTh des.ei!uics humaines, produisant nawtu;re cette hnormonâc, core-e la c.llulle parathyr)di;nes nlo>r3ales ou transferme-s, ouS deu d. ies hurmminais qui p-roduisent de& âlPTh ectca,A--que i-e-. s celluleo duI carcinome du poumon, des tumeurs otar-iennes, du -arcinome du rein ou du fcie 7 les dits si es êtant ina ti.oduits au mi.oyen de la - usion celuiaire obtenue 1aide de rpv4!thy!Unse glycol, u par une techni.aue de recombinaisson gnCtique utilisant AEU!igase, nuc1Case et ADNpo!ymnrase a conviennent aussi d autres! hob!aoto- des humains pdoduisan% ce lH-PTh ectopiouei Com.m. la trans- plantation au corps de îl'animial de ces lymphob!astoî-des humains aboutit à la fomiartion de tumeurs massives, pou= vant 9tre facilement désagrckÂes, et que ces tumeurs ne sont guère contaminées par les cellules de lh8te animal, la reolte des cellules de lymphob!asto2es humains multi- plies, vivahtes, est facile. Conviennent comme animaux ' btilisables dans le procédé selon l'invention tous ceux, dans lesquels les cel- lules peuvent se multiplier, par exemole drs voleilles comme poulet et pigeon, des mamrnifères co-mme chat, ch.ien, singe, chèvre, porc, vache, cheval, rat., cobaye, hamstear, souris, ou souris nue., Comme cette transplantation cellu- laire provoque une immunoréaction indésirable, il s 'avère souhaitable d'utiliser des animaux nouveau-nés ou en bas âge, ou encore au stade le plus jeune possible, comme oeuf, embryon ou foetus. Afin de réduire autant que pos- sible l'immunoréaction, l'animal peut être traité, avant la transplantation des cellules, par irradiation aux ra- yons-X ou aux rayons-', d'environ 200 à 600 rems, ou par injection d'antisérum ou d'agent immuno-dépresseur préparé selon un procédé classique. Comme la souris nue, utilisée comme animal à sang chaud, présente l'immunoré- action la plus faible, même à l'âge adulte, on peut l'u- tiliser avantageusement sans prétraitement, pour y trans- planter et y multiplier rapidement des lignées de lympho- blastoldes humains capables de produire HPTh. Une multiplication cellulaire, stabilisée, et une augmentation de la production de HPTh, peuvent être à la fois réalisées par transplantation répétée, utili- sant des combinaisons de différents animaux à sang chaud t on peut atteindre ces objectifs en implantant d'abord les cellules chez le hamster, o elles se multiplient, puis en les réimplantant chez la souris nue. En outre, on peut effectuer la transplantation successive chez des animaux de la même classe ou division, aussi bien que chez ceux de la même espèce ou du même genre. En ce qui concerne la localisation de l'implan- tation des lymphoblastoldes humains, conviennent tous les sites de l'animal, pourvu que ces cellules puissent s'y multiplier, par exemple la cavité allantotque, ou les voies intrapéritonéale, intraveineuse ou souscutanées A côté de cette transplantation directe des cel- lules au corps de l'animal, existe la possibilité de faire se multiplier aisément les lignées classiques de lympho- blastoldes humains, capables de produire HPTh, en utilisant le fluide corporel nutritif provenant de l'animal, grâce à l'inclusion, par exemple par voie intrapéritonéale, dans le corps de l'animal d'une chambre de diffusion clas- sique, de taille et de forme appropriées, munie d'une membrane poreuse filtrante, d'un ultra-filtre ou de fibre creuse d'un diamètre de pore de l'ordre de 10 à to 5 m, qui empêche la contamination de la chambre de diffusion par les cellules de l'hôte tout en permettant l'apport du fluide corporel nutritif de l'animal aux cellules. De plus, comme la chambre de diffusion peut être conçue, si nécessaire, pour être placée sur l'hÈte animale t permet- tre au fluide corporel de ce dernier de circuler dans la chambre, les parois de celle-ci peuvent être munies de fenêtres latérales, transparentes, permettant l'observa- tion de la suspension de cellules, ainsi que le remplace- ment et l'échange avec une chambre fratche: la multipli- cation cellulaire est ainsi augmentée à un niveau encore supérieur, rapporté à la durée de vie de l'animal, et la production par animal est encore accrue sans sacrifice de l'hôteo Lorsqu'on utilise cette chambre de diffusion, com- me les lymphoblastofdes humains multipliées peuvent être facilement récoltées, et qu'il n'y a pas manifestation d' immunoréaction, du fait de l'absence de contact direct entre les cellules humaines et celles de l'hôte animal, on peut utiliser comme hôte, conformément à l'invention, sans prétraitement destiné à réduire l'immunoréaction, tout animal à sang chaud. L'alimentation de l'hôte animal, auquel on a implanté des cellules humaines, peut s'effectuer facile- ment par procédé classique, même après la transplantation cellulaire, et elle ne nécessite pas de soins particuliers. La multiplication cellulaire maximale est attein- te environ 1 à 20 semaines, généralement 1 à 5 semaines, après l'implantation des cellules. - Conformément à l'invention, on obtient 107 à 12 huma i , ou plus, de lymphoblastoldes/par Iâte. Autrement dit, le nombre de cellules humaines implantées chez l'hôte ani- mal s'accroit io2 à 1 fois ou plus, ou bien est d'envi- ron 101 à 106 fois ou plus celui que l'on obtient avec un procédé de culture de tissu in vitro,utilisant un milieu nutritif, aussi ces lymphoblastotdes humains sont-ils a- vantageusement utilisables pour la production d'HPTho En ce qui concerne le procédé grâce auquel les lymphoblastoldes humains, multipliés par l'un des modes opératoires décrits plus haut, peuvent libérer HPTh, on peut employer tout moyen permettant la libération d'HPTh à partir de ces cellules. Par exemple, les lymphoblastoides humains, obtenus par multiplication en ascite, en suspen- sion et récolte à partir de cet ascite, ou par extraction de tumeur massive, formée sous la peau, et récolte après désagrégation de la tumeur, sont mis en suspension pour atteindre une concentration de 104 à 10o8 cellules par ml dans un milieu nutritif, préchauffé à une température de l'ordre de 20WC à 400C, puis mis à incuber à cette tem- pérature pendant 1 à 100 heures, environ, pour donner HPTh. L'augmentation de la production d'HPTh peut être réalisée par la présence d'un ou de plusieurs des composés suivants: aminoacides comme lysine, arginine, glycine, leucine et cystéine; sels minéraux comme chlorure de so- dium, de potassium ou de calcium, et sulfate de magnésium; et hormones comme dopamine, isoprotérénol, épinéphrine et norapinéphrine. L'HPTh, ainsi obtenue, peut être recueillie fa- cilement grace à des techniques de purification et de sé- paration utilisent des modes opératoires classiques, tels que relargage, dialyse, filtration, centrifugation, con- centration et lyophilisation. Quand on souhaite un produit encore plus pur, on peut obtenir une préparation de pureté supérieure par combinaison des techniques mentionnées plus haut avec d'autres modes opératoires classiques, tels qu' adsorption et désorption avec échange d'ions, filtration sur gel, chromatographie par affinité, fractionnement au point isoélectrique et électrophorèse. La préparation dtHPTh, ainsi obtenue, peut être avantageusement utilisée, seule ou en combinaison avec un ou plusieurs agents, pour injection, administration ex- terne, interne ou de diagnostic, pour la prévention ou le traitement de maladies humlaines. Au cours de la présente description, la produc- tion d'HPTh est doséee par le procédé de blo-essal d4crit par J.A. Parsons et coll., Endocrinology, Vol. 92, ppo4:4 462 (1973) elle est exiriméa en poids paà- rapport ' la p paration 4talon de I-IPTh, 1 3C unts S pr m', étan a+tribuéz è _fct étcalon disponible aux oa t1itî institutes of Health (USA), - 'nvention est iilustre oirs p-ar plusieurs formes de réaisaion on lim a:izvós EXEMPLE 1 Des cellulCs de tueur parathyroldienne, aln dsagr:- gue, obtenues par e-xtracton à pa;tiz dlt--:r s en $ouf- frant de tumeur parathy roXienne, suivie de:ahage. e uno lignée de lymphoblestoides euce s, t-.s 7 dn = 0 Namalwa, sont mises en suspension, ense 2Se as un re pient avec unc soution saline de 't40 riet d,ú:u.I a 5l, die KCl, I r MG ds,,adi,2P04 et. 2 se de ûal2,. de maniere à obtenir des c-....entrations cellulaires r ie"-;-t'"i-JQ b 1 ordre de 1O cellules/ml. La suspension de cellules, re froidie à la glace, est mélangée avec une preparation frat- che de la même solutio. saline, contenar. du vyirus de Sen- dal préalablement 3nactivei6 par irradiation à!ultra=vioet, le tout es- trans'ér4 S mninutes apr-es le méleage dans un in- cubateur à 37eC, et y est agit- pendant 30 minrutes pour r{- aliser la fusion cellulaire, introduisant liaptitude à pro- duire!'HPlh des cellules de tumeur parathyroïdienne, hu- iaaine, dans la lignée des lymphoblastoldes leucémiques, humains. Après clonage seloni un procédé classique de la souche de cellules d'hybridome, capable de produire!'HPTh, on l'implante par voie intrapéritonéale citez des souris nues adultes, qui sont ensuite nourries de manière habi- tuelle pendant 5 semaines. Les tumeurs massives, résul- tantes, pesant environ 15 g chacune, sont extraites, dé- sagrégées par hachage, et soumises à l'action de la tryp- sine. Après lavage, avec du milieu de Earle 199 (pH 7,2), additionné de 10% en volume/volume de sérum foetal de veau, les cellules sont remises en suspension, à une con- centration de 10 cellules/ml, dans une préparation frai- che du même milieu qui contient 30 mM de L-arginine et 20 mM de CaCl2, et l'on met à incuber à 37WC pendant 40 heures environ pour obtenir HPTh. Les cellules sont en- suite soumises aux ultra-sons, et la quantité d'HPTh pré- sente dans la partie surnageante est dosée. La production d'HPTh est d'environ 830 ng/ml de suspension cellulaire. Les cellules témoins, obtenues par culture in vitro de cellules de tumeur parathyroïdienne, humaine, dans du mi- lieu de Earle 199 (pH 7,2), additionné de 10c en volume/ volume de sérum foetal de veau, sont traitées comme plus haut pour produire HPThO Cette production n'est que voi- sine de 4 ng/ml de suspension cellulaire. EXEMPLE 2 Des cellules de carcinome du rein humain, désagrégé, ob- tenues par extraction à partir d'un patient souffrant de carcinome du rein, suivie de hachage, et une lignée de lymphoblastoldes leucémiques humains, JBL, sont fusion- nées comme dans l'exemple 1; on a introduit ainsi l'ap- titude à produire de l'HPTh des cellules du carcinome du rein humain, dans la lignée de lymphoblastotdes leucémi- ques, humains. Après clonage, selon un procédé classique, de la souche de cellules d'hybridome, capable de produire HPTh, on l'implante par voie sous-cutanée chez des hamsters nouveau-nés, ayant préalablement reçu par injection de 1' antisérum préparé à partir d'un lapin par le procédé clas- sique, pour réduire leur immuno-réaction; puis les ani- maux sont nourris de manière habituelle pendant 3 semaines. Les tumeurs massives, résultantes, formées sous la peau, et pesant environ 10 g chacune, sont extraites et désagré- gées par hachage, et mises en suspension dans du sérum physiologique contenant de la collagénase. Après lavage avec du milieu de Eagle (nH 7,4) , additionné de 5%0' volume/ volume de sérum humain, les cellules sont remises en sus- pension à la concentration de l'ordre de 1 cellules/ml dans une préparation fraîche du même milieu, contenant ml de CaCl2 et 20 mM de dopamine; on met alors à in- cuber à 37 C pendant 20 heures pour produire l'HPTh. La production de cette hormone est de l'ordre de 1,3, /g/ml de suspension cellulaire. Les cellules témoins, obtenues comme dans l'exemple 1 par culture in vitro de lignée fusionnée de lymphoblastotdes leucémiques humains, JBL, sont traitées comme plushaut. La production d'HPTh n'est que de 16 ng/ml de suspension cel- lulaire. EXEMPLE 3 A des rats nouveau-nés on implante, par voie intraveineuse, une lignée de lymphoblastoides leucémiques humains, BALL-1, dans laquelle l'aptitude à produire de l'HPTh de cellules de tumeur ovarienne humaine a été introduite, comme dans l'exemple 1; puis on nourrit les rats de manière habituel- le, pendant 4 semaines. Les tumeurs massives, résultantes, environ 30 g chacune, sont extraites et traitées comme dans l'exemple 1 pour produire HPTh. La production est voisine de 900 ng/ml de suspension cellulaire. L'expéri- mentation témoin est réalisée comme dans l'exemple 1. par culture in vitro de la lignée de lymphoblastoïdes leucémi- ques, humains, fusionnés, BALL-1, et traitement des cellu- les comme plus haut. La production d'HPTh n'est que de 10 ng/ml de suspension cellulaire. EXEMPLE 4 Après avoir subi une irradiation de 400 rems environ de rayons-X, pour la réduction de l'immuno-réaction, des sou- ris adultes reçoivent par voie sous-cutanée des implants d'une lignée de lymphoblastoldes leucémiques humains, NALL_1, dans laquelle l'aptitude à produire HPTh des cel- lules de carcinome du poumon, humain, a été introduite comme dans l'exemple 1; puis on nourrit les animaux de manière habituelle pendant 3 semaines. Les tumeurs mas- sives, résultantes, formées sous la peau et pesant envi- ron 15 g chacune, sont extraites ettraitées comme dans l'exemple 2 pour produire de liHPTh. La production est de l'ordre de 1,2.g/ml de suspension cellulaire. Les cellules témoins, obtenues comme dans l'exemple 1 par culture in vitro de lignée fusionnée de lymphoblastotdes leucémiques, humains, NALL- 1, sont traitées comme plus haut. La production d'HPTh n'est que de 20 ng/ml de sus- pension cellulaire, environ. EXEMPLE 5 Une lignée de lymphoblastoïdes leucémiques, humains, TALL- 1,dans laquelle l'aptitude à produire de l'HPTh des cel- lules de tumeur parathyroidienne humaine, a été introdui- te comme dans l'exemple/,lest mise en suspension dans du sérum physiologique, puis le tout est transféré dans une chambre de diffusion cylindrique en matière plastique, dont le volume intérieur est de l'ordre de 10 ml, munie d'une membrane filtrante ayant une dimension de pore de diamè- tre voisin de 0,5,o Après inclusion, par voie intrapéri- tonéale, de cette chambre dans un rat adulte, on nourrit celui-ci de manière habituelle pendant 4 semaines, puis on enlève la chambre. La densité en lymphoblastoldes hu- mains dans la chambre, atteinte au cours de l'opération ci-dessus, est d'environ 6 x 108 cellules/ml, ce qui est environ 10 fois supérieur, ou même plus, à ce qu'on at- teint avec une culture in vitro à l'aide d'un incubateur à C02. Les lymphoblastoldes humains, ainsi obtenus, sont traités comme dans l'exemple 2, pour produire l'HPTho La production est de l'ordre de 1,1 tg/ml de suspension cel- oTnTT UO o-e2DT FldWnuî ap sed aAi>sqou uo asuuoLqEc 51sgn^zp anbo%2.ueT!/ %!eo eT suep safueTdWT- %mos 6uTemnqu uomtnod np sGouiDzeD Op $snITO sap OiTanb c? -ET sueP 6miowa 'IV.urni.-rdx 'pszTn- W - eD Uots2ud2n2 Gp Um/bu OOL uoz p $a o. np ozd * ELl qIdH ^i-cnpzGzd oE c a axoy suep:no-raoo sG %ez-:;-uos 'snuu% -qo 7su7 C sGC-, 7f 7%YTnW-;suTPEn sspzoe yitd *I| seT @a 0; -- uoDLqme sineo óp uo%,; u $9. -sunoú c %uepuad DCLS e I@0MDUIT E F i@çae- 3itu 4ssi-umo-,m^qîL s;nz;o,pt anb =O%4ueITTe S %:.T tiuep ea;ue/d. l e% 4 idTaXq.T suep mao- p:Tnpour uWfmnlq uom nod runp seouIGTDap sPT g /aD satp: Vp e "-npoid Ppn%!de,-TlanbeT suep ú s1 ux>u3Te.ffnzbn@ s-ap; oloUtOdm/t ap eg'ufIT @iN u,9 O q4uXP À 3lW-lylTED Fuoisuodns ae Tu/bu E oILu Gp onb 7sesu qildH P uo-Dfnpodd e7 -ne- enrTd a9Uwoo s9 CF - % %luos S /yw/slnTleao 90C x S uozrtue -D ie'rnla ass -uap) STT;.di-L SUEuifewl aq sep a;TOo9i;a ssaaTesupfj t %uEpuad e;nq.e'q aZTU!U ep aeTuZIp as Op uo7%e%:uale 'o%'r[-fnîpe ge un suep azqw-z, e, %%0 ep aTeau -o%79ade2%ui uLoL zed uGTISnTOUT 'xqmegDtj! IT sueP Olue'TnlS -a1 eyiTTLnTz uotsuadsns eT ap %I3asue% uTevunq auuaTp -jogAqe-ed irnamn app saTn Tao ap anbT6o01oTsqd mnaas np suep uoTsuedsnt ua asTu aed sanua$qo 'suTouls saTnlTao sae alZTTnT OL ZOL069Z 2497io02 1 1 Revendications 1. Procédé pour la production d'hormone parathyrol- dienne, humaine (HPTh), par multiplication de lymphoblas- to!des humains, capables de produire cette hormone et li- bération de celle-ci par les cellules multipliées, carac- térisé en ce qu'on utilise, pour la multiplication cellu- laire, un animal à sang chaudo 2. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que la multiplication cellulaire est réalisée par im- plantation des cellules humaines dans le corps d'un animal à sang chaud. 3. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que la multiplication cellulaire est réalisée à l'aide d'un dispositif, dans lequel le fluide corporel nutritif d'un animal à sang chaud est fourni aux cellules humaines. 4. Procédé selon la revendication 3, caractérisé en ce que le dispositif est une chambre de diffusion équipée de manière à ce que les cellules de l'hôte animal ne la contaminent paso o Procédé selon une des revendications 1 à 4, carac- térisé en ce que les lymphoblastotdes humains, capables de produire HPTh, sont des cellules d'hybridome obtenues par fusion cellulaire d'une lignée de lymphoblastoldes humains, avec des cellules humaines capable de produire HPTh 6o Procédé selon la revendication 5, caractérisé en ce que les cellules humaines capables de produire HPTh, sont des cellules de tumeur parathyroidienne, de tumeur rénale, de tumeur ovariennes, ou de carcinome du poumon. 7. Procédé selon une des revendications 5 ou 6, ca- ractérisé en ce que la lignée de lymphoblastotdes humains est une lignée de lymphoblastoldes leucémiques humainso 8. Procédé selon la revendication 7, caractérisé en ce que les lymphoblastotdes leucémiques, humains, sont de la lignée de Namalwa, BALL-1, NALL-1, TALL-1 ou JBLo 9o Procédé selon une des revendications 1 à 8, carac- térisé en ce qu'on laisse les lymphoblastoides humains multipliés libérer HPTh, en présence d'un ou de plusieurs des produits suivants: glycine, leucine, lysine, argi- nine, cystéine, chlorure de sodium, de potassium ou de calcium, sulfate de magnésium, dopamine, isoproterenol, épinéphrine et norépinéphrine. 10. Procédé selon une des revendications I à 9, ca- ractérisé en ce que l'animal à sang chaud est une volaille, en particulier poulet ou pigeon, ou un mammifère, notam- ment chien, chat, singe, chèvre, porc, vache, cheval, rat, cobaye, hamster, souris ou souris nue.