FR 2488908 A1 19820226 FR 8115932 A 19810819 La présente invention se rapporte à un procédé de préparation de l'acrylamide à l'aide de cellules immobilisées qu'on prépare en immobilisant des micro-organismes présentant une activité nitrilasique sur un gel polymère cationique à base d'acrylamide. L'acrylamide est un composé qui possède des applications multiples par exemple en tant que produit de départ de la préparation de polymères variés utilisés eux-mêmes en tant que floculants, additifs à des huiles de base, polymères servant à la récupération du pétrole, et dans d'autres applications analogues. Parmi les procédés de préparation de l'acrylamide, on a décrit antérieurement un procédé qui consiste à faire réagir l'acrylonitrile avec l'eau en présence d'un catalyseur contenant du cuivre à l'état réduit. Toutefois, ce procédé présente des inconvé- nients variés; ainsi, par exemple, la préparation du catalyseur est compliquée; on rencontre des difficultés dans la régénération du catalyseur usé; et on rencontre également des complications dans la séparation et la purification de l'acrylamide formé. En outre, on cherche à obtenir l'acrylamide dans des conditions de réaction ménagées parce que les compo ès contenant des doubles liaisons dans la molécule, comme l'acrylamide, polymérisent facilement. On a déjà considéré comme tout à fait souhaitable la mise au point d'un procédé permettant de préparer l'acrylamide par hydrolyse de l'acrylonitrile à l'aide de micro-organismes dans des conditions ménagées. On sait depuis longtemps que les micro-organismes présentant une activité nitrilasique permettent d'hydrolyser effica- cement l'acrylonitrile en acrylamide. Parmi ces micro-organismes, on connaît déjà ceux qui appartiennent aux genres Bacillus, Bacteridium au sens de Prevot,. Micrococcus et Brevibacterium au sens de Bergey, etc. (cf. par exemple brevet des Etats-Unis d'Amérique n0 4 001 081). On a également trouvé antérieurement que les micro-organismes appar- tenant aux genres Corynebacterium et Nocardia pouvaient être utilisés pour l'hydrolyse de l'acrylonitrile (cf. par exemple brevet des Etats-Unis d'Amérique n0 4 248 968). Pour préparer l'acrylamide à partir de l'acrylonitrile à l'aide de ces micro-organismes, on met l'acrylonitrile en contact avec les microorganismes ou avec des cellules immobilisées de ces micro-organismes qu'on a préparées en immobilisant les cellules sur des gels polymères, dans un milieu aqueux tel que l'eau pure, le sérum physiologique, ou une solution de tampon phosphaté. Récemment, un procédé sur colonne, continu ou discontinu, exploitant des cellules immobilisées sur des granulés a été largement exploité, dans le but d'empêcher l'élution d'impuretés provenant des cellules, d'améliorer la séparation des cellules et de la solution de réaction, de permettre l'utilisation répétée des cellules et d'accroître la stabilité des enzymes. Ces procédés exploitant des cellules immobi- lisees sur des granulés présentent des avantages économiques. Par suite, on a proposé un procédé de préparation de l'acrylamide par réaction en continu sur une colonne dans laquelle on utilise des cellules de micro-organismes immobilisées qu'on prépare en emprison- nant les cellules dans un gel de polyacrylamide ou d'une substance analogue (cf. par exemple brevet des Etats-Unis d'Amérique n0 4 248 968). Toutefois, dans les procédés tels que proposés ci-dessus, l'utilisation d'une solution de sérum physiologique, d'une solution de tampon phosphaté ou d'une solution analogue en tant que milieu aqueux conduit à l'introduction de grandes quantités de chlorure de sodium, de phosphates ou de substances analogues dans la solution aqueuse d'acrylamide obtenuece qui présente des inconvénients à l'égard de la qualité du produit recherché. En particulier, pour la préparation de polymères à base d'acrylamide à haut poids molé- culaire, la présence de phosphates dans l'acrylamide peut conduire à des propriétés d'insolubilité dans l'eau des polymères formés. De sorte que pour éliminer ces sels, il est indispensable de procéder à des traitements subséquents tels que des traitements par échange d'ions. On perd alors les avantages attendus de la préparation d'une solution aqueuse d'acrylamide de haute qualité sans purification spéciale, ce qui constitue une caractéristique du procédé de prépa- ration de l'acrylamide par la technique aux cellules immobilisées. Ainsi donc, on perd les avantages du procédé aux cellules immobilisées en tant que procédé peu coûteux de préparation de l'acrylamide. Par contre, si l'on n'utilise pas en tant que milieu aqueux une solution de sérum physiologique, une solution de tampon phosphaté ou une solution analogue, les cellules immobilisées gonflent au cours de la réaction d'hydratation et il y a perte rapide de l'activité enzymatique des cellules. En outre, dans le cas de la ré-actio sur colonne, lorsqu'on fait passer une solution aqueuse d'acrylonitrile sur une colonne garnie de cellules immobilisées. selon la technique classique dans du polyacrylamide, les cellules immobilisées dans la colonne gonflent rapidement après le démarrage de la réaction d'hydratation et il devient impossible de poursuivre des opérations efficaces. Bien qu'on ne comprenne pas parfaitement pourquoi les cellules immobilisées gonflent au cours de la réaction d'hydratation, on pense que ce phénomène est dû aux forces de répulsion produites entre les cellules chargées négativement au passage de la solution de substrat et à la différence de pression osmotique entre l'extérieur et l'intérieur des cellules immobilisées résultant de la différence des concentrations en acrylonitrile et acrylamide entre l'extérieur et l'intérieur de ces cellules, différences de concentration qui se produisent lorsque l'acrylonitrile pénètre dans les cellules immobi- lisées et est converti (hydraté) en acrylamide qui migre hors des cellules immobilisées. On pense en outre que la dégradation de l'activité enzymatique par le phénomène de gonflement est due au fait que l'enzyme est susceptible de s'échapper des cellules immobi- lisées en raison du gonflement et que l'on ne peut pas conserver la conformation stable des cellules normales dans lesquelles l'enzyme n'est pas gonflée. Par suite, on pense que, lorsqu'on effectue la réaction dans un milieu isotonique tel qu'une solution de sérum physiologique, une solution de tampon phosphaté, etc., il ne se produit pas de grande différence de pression osmotique entre l'extérieur et Pinté- rieur des cellules immobilisées, de sorte qu'on peut à la fois empêcher le gonflement des cellules immobilisées et maintenir l'enzyme en état de stabilité. A la suite de recherches approfondies visant à la prépa- ration de cellules immobilisées qui ne gonflent pas dans le cours de la réaction d'hydratation, même lorsqu'on utilise comme milieu aqueux une solution aqueuse de substrat ne contenant pas de sel, contrairement aux solutions décrites ci-dessus, et qui possèdent une excellente stabilité enzymatique, la demanderesse a trouvé qu'on pouvait obtenir de telles cellules immobilisées en utilisant un support polymère d'immobilisation rendu cationique en vue d'améliorer son affinité pour les cellules ou l'enzyme. L'invention concerne en conséquence un procédé de préparation de l'acrylamide à partir de l'acrylonitrile à l'aide de cellules de microorganismes immobilisées dans lequel les cellules immobilisées sont préparées par immobilisation d'un micro-organisme présentant l'activité nitrilasique sur un gel polymère cationique à base d'acrylamide, et l'acrylonitrile est mis en contact avec les cellules immobilisées dans un milieu aqueux ne contenant pratiquement aucun sel. On peut utiliser dans l'invention, indépendamment de leur classification taxonomique, tous les micro-organismes capables d'hydrolyser l'acrylonitrile en acrylamide. Ainsi, par exemple, on utilise de préférence la souche N-771 appartenant au genre Corne- bacterium, telle que décrite dans le brevet des Etats-Unis d'Amérique n 4 248 968 et déposée au Fermentation Research Institute, The Agency of Industrial Science and Technology, Japon sous le numéro d'admission FERM 4445, la souche N-774 appartenant au genre Corne- bacterium déposée sous le numéro d'admission FERM 4446 et la souche N-775 appartenant au genre Nocardia et déposée sous le numéro d'admission FERM 4447. On utilise également avec avantage dans l'invention les micro-organismes décrits dans le brevet des Etats- Unis d'Amérique n 4 001 081. Pour la préparation des cellules immobilisées avec ces micro-organismes, on peut utiliser ces derniers sous l'une quelconque des formes suivantes: milieu de culture contenant les cellules (bouillon de culture), cellules lavées (cellules résiduelles), cellules rompues, et sous des formes analogues. Le polymère cationique à base d'acrylamide tel qu'il est utilisé dans l'invention pour l'immobilisation est un copolymère de l'acrylamide, d'un monomère cationique à insaturation éthylénique copolymérisable avec l'acrylamide, et d'un monomère réticulant soluble dans l'eau. Comme exemples de monomères cationiques à insaturation éthylénique copolymérisables avec l'acrylamide, on citera les acrylates de dialkylaminoalkyle, les méthacrylates de dialkylaminoalkyle, les dialkylaminoalkylacrylamides, les dialkylaminoalkylméthacrylamides et leurs sels quaternaires, et par exemple le méthacrylate de dimé- thylaminoéthyle, le méthacrylate de diéthylaminoéthyle, le diméthyl- aminopropylméthacrylamide, le diéthylaminopropylméthacrylamide et leurs sels quaternaires formes avec le sulfate de diméthyle, le chlorure de méthyle et des agents analogues. Ces monomères peuvent être utilisés seuls ou en combinaison entre eux. Comme exemples de monomères réticulants hydrosolubles, on citera le méthylènebisacrylamide, la 1,3-di-acrylamidométhyl-2 imidazolidone, la diacrylamidométhyléthylène-urée, l'éther diacrylamido éthylique, le diacrylate de l'éthylèneglycol, le diméthacrylate de 1'éthylèneglycol et les hexahydro-l,3,5-triacyl-S-triazines. Pour ce qui concerne les quantités des trois monomères mises en oeuvre, la quantité d'acrylamide représente de 50 à 95%, la quantité de monomère cationique à insaturation éthylénique de 1 A 50% et la quantité de monomère réticulant hydrosoluble représente de 0,1 à 20% du poids total des trois monomères. Les cellules immobilisées qu'on utilise dans le procédé selon l'invention sont préparées par exemple par un procédé dans lequel on mélange une suspension des cellules de micro-organismes et des trois monomères décrits ci-dessus et on polymérise en présence d'un catalyseur de polymérisation du type couramment utilisé dans les procédés classiques comme le persulfate de potassium et le diméthylaminopropionitrile, à des pH de 5 à 10, et de préférence de 6 à 8, à une température de 0 à 30 C, et de préférence de 0 a 15 C, dans une durée de 30 à 60 min; on obtient ainsi un gel dans lequel les cellules sont immobilisées et emprisonnées. La quantité des cellules de micro-organismes contenues dans le gel tel qu'obtenu ci-dessus est habituellement de 0,1 à 50%, et de preférence de 1 à 20%,du poids total du gel aqueux; toutefois, cette quantité peut varier selon le type du micro-organisme, sa forme d'utilisation et des facteurs analogues. La teneur en monomères de la solution de réaction va de 2 à 30%, et de préférence de 5 à 20%, du poids total de la solution. Cependant, pour préparer le gel contenant les cellules immobilisées et en plus du procédé ci-dessus dans lequel on ajoute un constituant cationique à l'état de monomère puis on forme le gel par copolymérisation, on peut exploiter un autre procédé dans lequel la totalité ou une partie du monomère cationique est polymérisée au préalable sous forme d'un polymère soluble dans l'eau qui peut encore être gélifié, et on mélange alors le polymère hydrosoluble avec la suspension des cellules du micro-organisme contenant les monomères; on fait réagir afin d'obtenir le gel recherché. On peut encore préparer le polymère hydrosoluble à ajouter avant la préparation du gel en copolymérisant le monomère cationique avec une partie de l'acrylamide. Les cellules immobilisées comme décrit ci-dessus sont - mises sous la forme de particules, le cas échéant après avoir été soumises à un traitement à l'aide d'un dialdéhyde hydrosoluble tel que l'aldéhyde glutarique. Dans la pratique de l'invention, les cellules immobilisées sur un support cationique comme décrit ci-dessus peuvent être broyées en particules à la dimension voulue et introduites dans un réacteur ou une colonne. En faisant passer en contact avec les cellules immo- bilisées une solution aqueuse d'acrylonitrile à une concentration en sel de 0,1% ou moins en poids, et de préférence de 0,01 en poids ou moins, c'est-à-dire une solution aqueuse d'acrylonitrile ne contenant pratiquement pas de sel, on peut préparer l'acrylamide recherché. En choisissant correctement la quantité des cellules immobilisées qu'on utilise dans la réaction, la concentration de l'acrylonitrile, le débit de la solution aqueuse de substrat et les facteurs analogues, on peut parvenir à un taux de conversion de presque 100%. Dans un tel cas, pour conserver l'activité nitrilasique des cellules immo- bilisées pendant des durées prolongées et pour empécher la formation de produits secondaires tels que l'acide acrylique, il est préférable de maintenir une concentration en acrylonitrile de 5% en poids ou moins, d'observer une température de réaction aussi basse que possible dans un intervalle dans lequel la solution aqueuse de substrat ne gèle pas, c'està-dire d'opérer dans un intervalle allant d'un point juste supérieur au point de congélation jusqu'à 100C environ, avec un pli de 7,0 à 8,5. Conformément à l'invention, la réaction peut être poursuivie sans gonflement des cellules immobilisées dans le cours de la réaction, bien qu'on n'utilise pas de solution de sérum physio- logique ou de tampon phosphaté ou de solution analogue en tant que solution aqueuse de substrat et ceci, en outre, en conservant l'activité enzymatique stable pendant des durées prolongées. En particulier, dans le cas d'une réaction continue sur colonne, le procédé selon l'invention, en plus des avantages décrits ci-dessus, apporte un autre avantage: on peut éviter toute polymérisation de l'acrylamide formé (qui aurait tendance à se produire dans le cours de la réaction) et on peut stabiliser les opérations. On peut donc obtenir en effluent de réaction une solution aqueuse transparente et incolore d'acrylamide. Du fait que cette solution ne contient pratiquement pas de sel et presque pas d'impu- retés gênantes pour la polymérisation de l'acrylamide, on peut l'utiliser telle quelle ou après concentration en tant que matière première de la préparation de polymères d'acrylamide destinés eux- mêmes à être utilisés comme agents floculants, additifs a des huiles de base, et dans des applications analogues. Les exemples qui suivent illustrent l'invention sans toutefois en limiter la portée; dans ces exemples, les indications de parties et de pourcentages s'entendent en poids, sauf indication contraire. Les concentrations en acrylonitrile, en acrylamide et en acide acrylique ont été déterminées par chromatographie en phase gazeuse, EXEMPLE 1 et EXEMPLE COMPARATIF 1 On mélange 50 parties de cellules lavées (teneur en cellules sèches 20%) de la souche N-774 soumise à culture aérobie dans un milieu de culture (à pH 7,2) contenant 1% de glucose, 0,5% de peptone, 0, 3% d'extrait de levure et 0,3% d'extrait de malt avec 4,2 parties d'acrylamide, 0,4 partie du sel quaternaire du méthacry- late de diméthylaminoéthyle et du chlorure de méthyle, 0,4 partie de méthylènebis-acrylamide et 30 parties de tampon phosphaté 0,05 M (pH 7,5; tous les tampons phosphatés décrits ci-après sont au même pH); on forme ainsi unesuspension homogène. A cette suspension, on ajoute 5 parties d'une solution aqueuse à 5% de diméthylaminopropio- nitrile et 10 parties d'une solution aqueuse à 2,5% de persulfate depotassium et on polymérise en maintenant une température de 10 C ou moins pendant 1 h; on obtient un gel contenant les cellules. On met ce gel volumineux contenant les cellules à l'état de fines particules à l'aide d'un mélangeur (modèle VA-IOP de la Firme Hitachi Ltd.) et on mélange avec 300 parties de tampon phosphaté 0,05 M et 0,5 partie d'une solution aqueuse à 50% d'aldéhyde glutarique; on traite par l'aldéhyde glutarique à 10 C ou moins pendant 30 min sous agitation. On lave les cellules immobilisées a l'eau et on les utilise pour la préparation de l'acrylamide à partir de l'acry- lonitrile comme décrit ci-après. On melange 10 parties de l'échantillon de cellules immobilisées et 90 parties d'eau. Au mélange obtenu, on ajoute goutte a goutte par intermittence l'acrylonitrile au débit de 2 parties à l'heure en maintenant le pH à 7,5 sous agitation; on fait réagir avec formation d'acrylamide à 10 C pendant 6 h. La réaction est presque quantitative et on obtient 110 parties d'une solution aqueuse à 14,6% d'acrylamide. Après avoir répété l'opération, on détermine l'activité résiduelle des cellules immobilisées. A titre de comparaison, on prépare des cellules immo- bilisees en faisant appel à un polyacrylamide du type classique, c'est-àdire que les cellules immobilisées comparatives sont préparées comme décrit ci-dessus, mais avec 4,6 parties d'acrylamide et 0,4 partie de méthylènebis-acrylamide. On utilise ces cellules immobilisées pour la même réaction de formation de l'acrylamide. Lorsque la réaction est terminée, on détermine l'activité résiduelle des cellules immobilisées. Les résultats obtenus sont rapportés dans le tableau I ci-après. L'activité résiduelle des cellules immobilisées a été déterminée de la manière suivante: L'échantillon de cellules immobilisées est broyé en totalité au mortier puis dilue par du tampon phosphaté 0,1 M, pour formation d'une suspension à une teneur en cellules de 0,1%. A 5 ml de la suspension, on ajoute 5 ml d'une solution aqueuse à 5% TABLEAU I Activité résiduelle, % Nombre de répétitions de la réaction Exemple 1 Exemple comparatif 1 0 àa 5 N co Co %0 t Co TABLEAU II Exemple 3 4 5 6 7 8 Exemple comparatif Composition du polymère pour immobilisation des cellules. % Acrylamide Méthacrylate de diméthyl- aminoethyle Méthylènebis-acrylamide Activité résiduelle, Y. Nombre de répétitions de la réaction: fi Il *l 94 90 85 80 70 50 1 5 10 15 25 45 5 5 5 5 5 100 100 100 100 100 95 95 95 95 80 85 85 85 80 65 80 80 80 76 60 o F. ru so o Co N0 O> TABLEAU III Exemple comparatif 9 10 il 12 13 14 Composition du polymère pour immobilisation des cellules, 7. Acrylamide Sel quaternaire du méthacrylate de diméthyléthyle et du chlorure de méthyle Diméthylaminopropylméthacrylamide Méthylènebisacrylamide 1,3-Di-acrylamidométhyl-2-imidazolidone Polymère du sel quaternaire du chlorure de méthyle et du méthacrylate de diméthylaminoéthyle (Mw environ 500.000) Polymère du méthacrylate de diméthyl- aminoéthyle (Mw environ 1.000.000) Copolymère de l'acrylamide et du sel quaternaire du chlorure de méthyle et du méthacrylate de diméthylaminoéthyle (Mw environ 500.000) Copolymère de l'acrylamide et du méthacrylate de diméthylaminoéthyle (Mw environ 2.000.000) Activité résiduelle, % Nombre de répétitions de la réaction O "i 1 It 3 "I 5 82 75 75 75 75 O 10 - - - 5 5 5 R - - - - - -- 20 - - - -- 20 Exemple j- pu Co Co c, w R E V E N D I C A T I 0 N S REVENDICATIONS 1. Procédé de préparation de l'acrylamide à partir de l'acrylonitrile dans un milieu aqueux ne contenant pratiquement pas de sels par action d'un micro-organisme présentant une activité nitrilasique, caractérisé en ce que le micro-organisme est immobilisé dans un gel polymère cationique à base d'acrylamide. 2. Procéde selon la revendication 1, caractérisé en ce que les cellules de micro-organismes sont immobilisées par polyméri- sation d'un mélange d'acrylamide, d'un monomère cationique à insatu- ration éthylenique copolymérisable avec l'acrylamide, et d'un monomère réticulant hydrosoluble dans une suspension aqueuse des micro-organismes possédant l'activité nitrilasique. 3. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que les cellules de micro-organismes sont immobilisées par polymérisa- tion d'un mélange de l'acrylamide et d'un monomère réticulant hydro- soluble ou d'un mélange d'acrylamide, d'un monomère cationique à insaturation éthylénique copolymérisable avec l'acrylamide et d'un monomère réticulant hydrosoluble dans une suspension aqueuse du microorganisme possédant l'activité nitrilasique en présence d'un polymère cationique hydrosoluble. 4. Procédé selon la revendication 2 ou 3, caractérisé en ce que le monomère cationique a insaturation éthylenique copolymérisable avec l'acrylamide consiste en au moins un monomère choisi dans le groupe formé par le méthacrylate de diméthylaminoéthyle, le méthacry- late de diéthylaminoethyle, le diméthylaminopropylmêthacrylamide, le diéthylaminopropylméthacrylamide et leurs sels quaternaires. 5. Procédé selon la revendication 3, caractérisé en ce que le polymère cationique hydrosoluble consiste en au moins un polymère choisi dans le groupe formé par les homopolymères du métha- crylate de diméthylaminoethyle, du méthacrylate de diéthylaminoéthyle, du diméthylaminopropylméthacrylamide, du diêthylaminopropylméthacryl- amide et de leurs sels quaternaires et les copolymères d'un ou plusieurs de ces monomères et de l'acrylamide. 6. Procédé selon la revendication 2 ou 3, caractérisé en ce que le gel polymère contenant les micro-organismes immobilisés contient de 50 à 95% en poids d'acrylamide, de 1 à 50% en poids du monomère cationique et de 0, 1 à 20% en poids du monomère réticulant par rapport au poids total des trois monomères. 7. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, caractérisé en ce que la teneur en micro-organismes du gel contenant les micro-organismes immobilisés est de 0,1 à 50% en poids. 8. Procédé selon la revendication 7, caractérisé en ce que la teneur en micro-organismes du gel contenant les micro-organismes immobilisés est de 1 à 20% en poids. 9. Procédé selon la revendication 2 ou 3, caractérisé en ce que l'on opère à un pH de 5 à 10 et à une température de 0 à 30 C. 10. Procédé selon la revendication 2 ou 3, caractérisé en ce que l'on opère à un pH de 6 à 8 et à une température de O à 15 C.