FR 2490496 A1 19820326 FR 8020188 A 19800919 1 2490496 La présente invention concerne de nouvelles glycoprotéines immunostimulantes extraites de Klebsiella Pneumoniae, leur procédé d'obtention, leur application comme médicaments et les compositions les renfermant. Un certain nombre de brevets français ont déjà décrit des glycoprotéines extraites de Klebsiella Pneumoniae, il en est ainsi, par exemple, des brevets français n 2.043.475, 2.088.112 et 2.171.907. La présente demande concerne des glycoprotéines plus précisément définies et a ainsi pour objet de nouvelles gly- coprotéines immunostimulantes extraites de Klebsiella Pneumoniae, caractérisées en ce qu'elles renferment de 30 % à 45 % de protéines, 30 %fi à 40 % d'oses neutres, moins de 4 % d'acide glucuronique, 2 % à 5 % d'osamines et ont un poids moléculaire d'environ 350 000 daltons. On désigne par oses neutres, notamment, des hexoses neu- tres tels que le glucose, le mannose ou le galactose. Le poids moléculaire des glycoprotéines de la présente demande a été estimé par ultra centrifugation. Les glycoprotéines de l'invention peuvent Otre extraites de différentes souches de Klebsiella Pneumoniae; on retient cependant tout particulièrement celles qui proviennent de la souche déposée à l'Institut Pasteur sous le numéro 52 145. L'étude de la structure de ces glycoprotéines à l'aide de différentes techniques chimiques, notamment, la réduction des résidus acides uroniques par le carbodiimide, la perméthylation, la dégradation uronique, l'oxydation périodi- que ou l'oxydation par l'oxyde de chrome, a permis de préciser la composition et la structure des produits de la présente demande. Les glycoprotéines selon l'invention sont formées d'une chatne protéique sur laquelle est greffée la fraction polysaccharidique. Les glycoprotéines préférées selon l'invention sont celles -pour lesquelles la fraction protéique est composée par environ 30 % d'acides aminés acides. On entend par acides aminés acides des acides aminés tels que l'acide aspartique ou l'acide glutamique. Les glycoprotéines préférées selon l'invention sont aussi celles pour lesquelles la fraction polysaccharidique -2 2490496 renferme approximativement une molécule de glucose pour quatre molécules de galactose. Parmi celles-ci, on retient tout particulièrement celles pour lesquelles la fraction polysaccharidique est essentiel- lement composée de la répétition do ltunité penta-sacchari- dique dont la structure est la suivante: 1 3 I 3 I 3 1 4ou 31 4galactose- alactose---galactose-- -galactose- 4-3-lucoseQ n L'invention a également pour objet un procédé d'obtention. des nouvelles glycoprotéines hydrosolubles telles que définies ci-dessus, ledit procédé est caractérisé en ce que l'on traite, à l'aide dtun ammonium quaternaire, une solution de glycoprotéines obtenue par diafiltration d'un extrait de l1sat de cultures de Klebsiella Pneumoniae, isole le surna- geant par élimination du précipité obtenu, traite à froid à ltaide d'un alcanol de faible poids moléculaire, le surna- geant correspondant à une solution saline des glycoprotéines, obtient ainsi ull nouveau précipité que l!on redissout dans l'eau, dialyse, lyophilise, remet en solution, filtre sur gel puis recueille la première fraction é3tée et lyophilise, si désire. On peut utiliser différentes solutions de glycoprotéines au départ du procédé, ces solutions sont obtenues par diafiltra- tion de lysats de cultures de Klebsiella Pneumoniae sur des membranes poreuses calibrées, capables de retenir les molécules dtun poids moléculaire égal ou supérieur à un poids moléculaire donné qui est une constante pour ces membranes. Les membranes utilisées sont, par exemple, les membranes vendues sous les noms de marque AMICON XM50, PM30 et UM2,. mais on préfère utiliser des membranes dont le seuil de rétention est de 100 000 daltons, telles que les membranes commercialisées sous la désignation XM 100 ou Hl P100 par la société AMICON; les membranes tout particulièrement préférées permettent de retenir les molécules dont le poids moléculaire est supérieur à 300 000 daltons; celles-ci sont avantageu- sement constituées par les membranes commercialisées sous la désignation XM300 par les sociétés AMICON et ROMICON. La diafiltration permet de sélectionner, en solution, des molécules dont le poids moléculaire est supérieur à un poids moléculaire donné, comme on l'a dit, par le choix de la membrane, en fonction du sueil de rétention désiré. Il est évident, pour l'homme de l'art, que l'utilisation d'au- tres solutions de même caractéristiques, obtenues par d'autres moyens, comme, par exemple, par chromatographie sur gel polymérisé hydrophile, est tout à fait possible. Préalablement à cette opération de sélection, le lysat peut, très avantageusement, 4tre délipidé et débarrassé de ses acides nucléiques. Dans des conditions de réalisation tout particulièrement préférées du procédé selon l'invention, la solution de glycoprotéines de départ est obtenue selon le procédé dé- crit dans le second certificat d'addition n0 2.171.907 au brevet français n0 2.043.475, dans ce certificat d'addition, le poids moléculaire des glycoprotéines a été estimé par la technique d'exclusion de gels. L'ammonium quaternaire que l'on utilise pour traiter la solution de glycoprotéines de départ peut Otre, par exemple, le chlorure de pyridyl cétyl ammonium, mais, tout particu- lièrement, le bromure de triméthyl cétyl ammonium ou cétavlon. Après traitement par l'ammonium quaternaire, le précipité obtenu peut 4tre séparé du surnageant par des procédés classiques, tels que la décantation ou la filtration, mais, on préfère le séparer par centrifugation. La solution obtenue est alors traitée à froid aux environs de + 4c, à l'aide d'un alcanol de faible poids moléculaire tel que le méthanol, l'éthanol, le n-propanol ou l'isopropanol, mais on utilise de préférence l'éthanol. Les résultats les plus intéressants sont obtenus par l'uti- lisation de six volumes d'éthanol pour un volume de solution saline, pendant une nuit à la température de + 4C. Le précipité est redissout dans l'eau et dialysé pour le purifier. La dialyse est effectuée à l'aide de cellules da type classique obturées par des membranes, par exemple, de collodion ou de cellulose. On retient notamment les cellules dont la membrane est en cellulose régénérée à diamètre moyen des pores égal à environ 24 A retenant les substances dont le poids moléculaire est supérieur à 12 à 14 000 daltons. Parmi les cellules à dialyse, on peut noter tout particulièrement les tubes VISKING. Cette dialyse permet d'éliminer de la solution de glyco- 4.2490496 protéines, les impuretés de faible poids moléculaire res- tantes, comme les traces dtalcanol. Los lyophilisations sont effectuées de façon classique, par exemple, dans des ensembles congélateur-sublimeur de taille moyenne comme les modèles SMU ou S1RfG commercialisés par la Société Usifroid, des lyophilisateurs de grande taille comme, par exemple, l'ensemble formé par un congélateur CAI et un sublimeur SMIRS tous deux commercialisés par Usifroid. Des modèles plus petits de laboratoire peuvent aussi 4tre utilisés, ainsi que ceux commercialisés par d'autres sociétés telles la société Sérail. Les étapes de lyophilisation sont facultatives mais sont toutefois préférées. La filtration sur gel peut être réalisée directement après dissolution du lyophilisat dans l!eau ou alors en utîlisant - la solution aqueuse de glycoprotéines. On préfère cependant tamponner la solution à filtrer et opérer leluitîon avec le même tampon; le tampon est avantageusement constitué de carbonate d'ammonium de telle manière que la solution de glycoprotéines à filtrer titre OIM en tampon. Les gels utilisés peuvent 8tre, par exemple, commercialisés sous le nom Sephadem X on préfère utiliser ceux commercialisés sous les noms Séphaoryl S 300 ou Ultragel ACA3I, particuliè- rement ce dernier. La-filtration peut 4tre suivie à l'aide des procédés classiques, notamment par l'utilisation de la spectrophoto- métrie U.V. à 238 nm. Dans des conditions préférentielles de mise en oeuvre, le procédé cidessus décrit est caractérisé on ce-que: - l'ammonium quaternaire utilisé est le bromlre de cétyl trimé thyl ammonium; - l'on isole-le surnageant par centrifugation - l'alcanol de faible poids moléculaire est l'éthanol; - le gel utilisé est l'Ultragel ACA34. La présente demande a également pour objet les glyco- protéines telles qu'obtenues par le procédé selon l'invention. Les produits, objet de la présente invention, possèdent de très intéressantes propriétés pharmacologiques; ils sont doués notamment de remarquables propriétés immunosti- mulantes ainsi que d'une très bonne tolérance. 5. 2490496 Ces propriétés sont illustrées plus loin dans la partie expérimentale. Ces propriétés justifient l'utilisation des glycoprotéines de la présente demande à titre de médicaments. La présente demande a ainsi également pour objet l'application, à titre de médicaments, des glycoprotéines telles que définies ci-dessus. Parmi les médicaments de l'invention, on retient également ceux caractérisés en ce qu'ils sont constitués par les glycoprotéines telles qu'obtenues par le procédé de l'inven- tion. Ces médicaments trouvent, par exemple, leur emploi dans le traitement ou la prévention, chez l'homme et l'animal, des maladies infectieuses causées par les bactéries ou les virus, dans le traitement des maladies à parasites, des toxi- infections, dans le traitement des infections posthospitaliè- res et postchirurgicales. La dose usuelle, variable selon le produit utilisé, le sujet traité et l'affection en cause, peut être, par exemple, de 1 mg à 15 mg par jour, par voie orale, chez l'homme, de 1 à 15 mg par jour par voie rectale, de 0,25 à 5 mg par jour par voie parentérale. Ljinvention a enfin pour objet les compositions pharma- ceutiques qui renferment les glycoprotéines de la présente demande à titre. de principe actif. A titre de médicaments, les glycoprotéines de la présente demande peuvent 4tre administrées par les voies digestive ou parentérale ou locale. Les compositions pharmaceutiques correspondantes peu- vent 4tre, par exemple, solides ou liquides et se présenter sous les formes pharmaceutiques couramment utilisées en médecine humaine, comme, par exemple, les comprimés, simples ou dragéifiés, les gélules, les granulés, les solutions, les sirops, les suppositoires, les préparations injectables lyophilisées ou non, les ovules, les crèmes, les pommades, les lotions, les gouttes, les collyres, les aérosols; elles sont préparées selon les méthodes usuelles. Le ou les principes actifs peuvent y être incorporés à des excipients habituellement employés dans ces compositions pharmaceutiques, telles que le talc, la gomme arabique, le lactose, l'amidon, 6 2490496 le stéarate de magnésium, le bourre de cacao, les véhicules aqueux ou non, les corps gras d'origine animale ou végétale, les dérivés paraffiniques, les glycols, les divers agents mouillants, dispersants ou émulsifiants, les conservateurs. Il va 4tre donné maintenant à titre non limitatif, des exemples de mise en oeUvre de leinvention. Exemple 1: g de produit tel qu'obtenu à leexemple 1 du brevet français n 2.171o907 sont dissous dans deux litres d0eau permutée. On ajoute, lentement, environ 1,6 litre de Cetavlon à 3 %, l'ensemble est agité pendant une heure, puis centrifugé à 000 t/mn pendant 15 minutes. On élimine le précipité, ajoute ensuite au surnageant isolé 3 litres dthasaol à 95 en 15 minuntese Apres.une heure d9agitation, on csntrifuge à 10 000 t/ma pendant 15 minutes, le surnageant ainsi obtenu est éliminé et le précipité est redissout dans 1 litre d'eau puis dialysé pondant 48 heures dQns des tubes Visking contre de l'eau permutée à + 40cO Au terme de oette dialyse, la solution est lyophiliséeo On obtient 6,2 g do glyco- protéines dont on dissout 1 g dans 10 ml de carbonate d'ammonium O,tM. La solution est passée sur une colonne de 2,5 cm de diamètre renfermant 1 litre dgUltragel ACA34 (élunt: solution de carbonate dawnamouiîm 0,IM), les fractions correspondant au premier pic d'élution (détection aux U.V. à 280 nm)sont rassemblées et lyophilisées et on obtient 0,51 g de la protéine cherchés, purifiée. Exemple 2: g de produit tel qu'obtenu à l'exemple 1 du brevet français ne 2.171,907, sont dissous dans 1 litre d'eau permutée. On ajoute sous agitation 0,800 litre de Cêtavlon à 3 %. Après une heure d'agitation, on centrifuge à 000 t/mn, pendant 15 minutes. On'élimine le précipité, ajoute au surnageant isolé 1,5 litre d'éthanol à 95 e. Après une heurs deagitation, on centrifuge pendant 15 minutes à 10 000 t/mn. Le surnageant est éliminé et le précipité repris dans 0,500 litre d'eau et dialysé pendant 48 heures dans des tubes Visking contre de l'eau permutée à + 4OC. Au terme de oette dialyse, on lyophilise la solution et on obtient 6,5 g des glycoprotéines cherchées que lVon purifie 7 2490496 par passage sur Ultragel ACA34 selon la technique décrite A l'exemple 1 et obtient 3,28 g des glycoprotéines cherchées. Exemple 3 s On a préparé des comprimés répondant à la formule: - glycoprotéines obtenues à l'exemple 1............ 5 mg - excipient q.s. pour un comprimé terminé à........ 100 mg (Détail de l'excipient: lactose, amidon, talc, stéarate de magnésium). Exemple 4: On a préparé une pommade répondant à la formule: - glycoprotéines obtenues à l'exemple 2......... 200 mg - excipient q.s.p.................. ....... 100 g..DTD: ETUDE PHARMACOLOGIQUE A) Activité immunostimulante et mitogénique On administre par voie intraplantaire à des lots de souris, 40 Jg du produit à tester et 40 Fg de sérum albumine bovine par animal. On leur administre dix jours plus tard par voie intraveineuse une dose non léthale et non choquante de sérum-albumine (100 kg par animal). Des animaux témoins ne reçoivent que la sérum-albumine lors de la première injection. On mesure l'activité immunostimulante par l'augmentation de la réponse de choc anaphylactique à la sérum-albumine et l'activité mitogénique par l'augmentation du poids des ganglions drainant le point d'injection. 1) Activité immunostimulante: On relève le nombre d'animaux présentant un état de choc (dyspnée avec cyanose du museau allant jusqu'à la paralysie du train arrière, les convulsions et la mort) ainsi que la mortalité deux heures après l'inJection intraveineuse de sérum-albumine. Résultats: % d'animaux choqués Produit de l'exemple 1 60 2 100 témoins 0O 8 2490496 2) Activité mitogénique On sacrifie deux heures après ltinjection iitraveineuse de sérum albumine les survivants et on prélève les ganglions poplités drainant la patte o a eu lieu l'injection et les pèse. L'activité mitogénique est exprimée à l'aide d'un index correspondant au rapport du poids moyen des ganglions des animaux traités avec le produit à tester, et de ceux des animaux témoins n'ayant reçu que la sérum-albumine. loRésultats: Produit de l'exemple Index 1 9,1 2 7,2 Les produits des exemples 1 et 2 présentent donc de très bonne activités immunostimulante et mitogénique. B - Stimulation des défenses non spécifues: Cette stimulation a été étudiée sur le test de la "Clearance" au carbone chez la souris en s'inspirant de la technique mise au point par HALPERN, qui consiste à injec- ter dans le sinus oculaire une suspension de carbone colloi- dal à l'animal et à apprécier en fonction du temps, la ciné- 2 tique de la disparition du carbone dans le sang, en effec- tuant des mesuresde densité optique. Les produits sont administrés à l'animal par voie in- trapéritonéale, vingt-quatre et quarante-huit heures avant le test. Les résultats sont exprimés en pourcentage d'élimina- tion des particules de carbone par rapport aux témoins ayant reçu uniquement l'injection de carbone colloïdal et corres- pondant aux 100 % du nombre de particules de carbone. ., . ,. .,.,, PRODUIT % d'activité par raDrrax témoins DE DOSES 8 minutes après L'EXEMPLE l'injection 30 minutes après 1linjection 1 0,25 mg/kg 50 % 70 % 2 0,25 mg/kg 50 % 70 % L'examen de ces résultats nous permet de noter l'intense stimulation provoquée par ces deux produits sur les défenses de l'organisme. C) Toxicité aigle 9 2490496 La dose létale 50 (DL 50) par voie intrapéritonéale, chez la souris a été déterminée par la méthode de BEHIRENS et KARBER. Elle est de 30 mg/kg pour les glycoprotéines des exemples 1 et 2. D) Tolérance L'injection sous cutanée de 0,2 ml de glycoprotéines des exemples 1 et 2 à la dose de 1000 J/kg chez la souris, ne provoque aucune intolérance locale ou générale. 11 2490496 REVrENDICATIONS 1) Nouvelles glycoprotéines imreunostmalantes extraites de Klebsiella pneumoniae, caractérisées en ce qu9elles renfer- ment de 30 % à 45 % de protéines, 30O % a 40 % deoses neutres, moins de 4 % d'acide glucuronique, 2 % à 5, deosamines et ont un poids moléculaire d. environ 350 006 daltons. 2) Nouvelles glycoprotéines selo n la rvendúeation 1, caractérisées en ce qu'elles sont extraites de la souche déposée à ltInstitut Pasteux sous le n 52 145. 3) Nouvelles glycoprotéînes selon la revoendication 1 ou 2, oaractérisées en ce que la fraction protéique est composée par environ 30 % d'acides aminés acides. 4) Nouvelles glycoprotéines selon lurne quelconque des revendications 1 à 3, caractérisées en ce que la fractio polysaccharidique renferme approxiMZtivement une molécule de glucose pour quatre molécules de galactoseo ) Nouvelles glyooprotéines selon la revendication 4, caractérisées en ce que la fraction polysaccharidique est essentiellement oomposée de la répétition de lunmité penta- saccharidique dont la structure est la suivante. 3 1 3 1 3 1 3 1 4ou3 -- aglactose - galaetose -galacrosS - galactose-iuco.e 4 6) Procédé d'obtention do nouvelles glycoprotéines telles que définies à l'une quelconque des revendications 1 à 5, caractérisé en ce que Iton traite à l'aide d'un ammonium quaternaire, une solution de glycoprotéines obtenue par diî- filtration deun extrait de lysat de cultures dc Klebsiella pneumoniae, isole le surnageant par élimination du précipité obtenu, traite à froid à ltaide d'un aleanol de faible poids moléculaire, le surnageant correspondant prune solution saline des glycoprotéines, obtient ainsi un nouveau précipité que l'on redissout dans l'eau, dialyse, lyophilise, remet en solution, filtre sur gel, puis recueille la première fraction éluée et lyophilise, si désiréo 7) Procédé selon la revendication 6, caractérisé en ce que - l1ammonium quaternaire utilisé est le bromure de cétyl trimé thyl ammonium; - lton élimine par centrifugation, le premier précipité; - ltalcanol de faible poids moléculaire est l'éthanol, il 2490496 - le gel utilisé est l'Ultragel ACA34. 8) Les nouvelles glycoprotéines telles qu'obtenues par le procédé selon la revendication 6 ou 7. 9) Médicaments, caractérisés en ce qu'ils sont constitués par les nouvelles glycoprotéines hydrosolubles telles que définies à la revendication 1 ou 2. ) Médicaments, caractérisés en ce qu'ils sont constitués par les nouvelles glycoprotéines hydrosolubles telles que définies à l'une quelconque des revendications 3 à 5. 11) Médicaments, caractérisés en ce qu'ils sont constitués par les glycoprotéines telles que définies à la revendication 8. 12) Compositions pharmaceutiques, caractérisées en ce qu'elles renferment, à titre de principe actif, l'un au moins des médicaments tels que définis à l'une des revendi- cations 9 ou 10. 13) Compositions pharmaceutiques, caractérisées en ce qu'elles renferment, à titre de principe actif, l'un au moins des médicaments tels que définis à la revendication 11.