FR 2495636 A2 19820611 FR 8026132 A 19801209 Procédé de transformation de cellules, notamment eucaryotes,par un fragment d'ADN circulaire du virus de Il hépatite B et préparations contenant les produits d'expression desdits ADN. L'invention est relative à une préparation contenant des antigènes possédant des propriétés immunologiques, notamment antigéniques, caractéristiques des virus de diverses formes d'hépatites, telles que l'hépatite virale B ou diverses autres formes d'hépatites telles que celles qui sont connues pour se développer chez certains sujets à la suite de transfusions sanguines, par exemple les hépatites dites "non A" ou "non B". L'invention concerne plus particulièrement des préparations de ce type, qui sont caractérisées par une pureté élevée, l'absence de protéines d'origine humaine et, lorsqu'il s'agit de préparations ayant des propriétés antigéniques analogues à celles des antigènes HBs, exemptes de particules de Dane. Elle est également relative à un procédé de production d'antigènes, notamment appropriés à la fabrication des susdites préparations. En ce qui concerne plus particulièrement le virus de l'hépatite B, on sait que certaines de ses propriétés antigéniques spécifiques doivent être attribuées à un antigène appelé "Antigène HBs" ou "HBsAg", essentiellement formé par l'enveloppe du virus de l'hépatite virale du type B (HBV) ou particule de Dane. I1 a été rappelé dans le brevet principal que le génome du virus de l'hépatite B est formé d'une molécule d'ADN circulaire partiellement à simple brin, dont le brin le plus long comporte de l'ordre de 3200 nucléotides (SUtERS J. et coll. (1975), Proc. Nat. Sci. U.S.A. 72, 4597-46P1). La figure unique constitue une carte schématique de l'ADN du génome de la particule de Dane. Cet ADN comporte deux brins b et b2, le plus court d'entre eux (b2) étant normalement dépourvu de la partie représentée par une ligne en trait interrompu dais le dessin. Il est connu que cet AND ne comporte qu'un seul site EcoRI. La flèche f1 donne le sens de la numérotation des nucléotldes, dont est composé le brin le plus long b1, et la flèche f2 donne le sens de la transcription du gène S par la machinerie cellulaire des cellules envahies par le virus de l'hépatite B. Le site EcoRI peut donc être numéroté O, ou 3182 (NATURE, 1979, vol.281, p. (646-650). Le cercle concentrique intérieur e1 donne l'échelle en nombres de nucléotides Ce cercle permet e préciser les postions de certaines des parties de cet ADN. Les nombres 3', 5' et 5', 3' à la partie infé- rieure de la carte visent les extrémités terminales porteuses de mémes nombres dans les représentations conventionnelles des extrémités des chaînes d'acide nu clelque. Au surplus, il a été possible de localiser le gène codant pour la partie de la protéine de l'antigène n3sAg, qui est responsable des propriétés immunologi- ques de l'enveloppe du virus de l'hépatite B. La position de ce gène, dénommé "gène S", est schématisée par la flèche S sur la figure. Le "gène S" est essentiellement porté par le fragment du brin le plus long b1 situé entre les positions nucléotidiques 155 et 833 de la carte schématique de la figure dans le sens de la transcription du gène S. Le brin le plus court (b2) du génome de la nar- ticule de Dane peut être "réparé in vitro en présence de nucléotides précurseurs et d'une polymérase, par exemple selon la technique de T.A. LANDERS et coll., J. VIROL., 23, 1977, p. 368-376. Les génomes ainsi réparés es vIrus de l'hépatite virale (ou tout ADN sus pible de coder pour les mêmes séquences d'acides aminés) seront, ci-après, désignés par l'abréviation DNA HBV. Il a déjà été rappelé dans le brevet principal que cet antigène possède des propriétés vaccinantes à l'égard de l'hépatite virale du type B et qu'il est essentiellement obtenu à partir d'échantillons de sérum humain. On a également rappelé que son utilisation en thérapeutique préventive, n'est cependant pas dépourvue de risques sérieux, en raison de l'origine de ces échantillons de sérum, puisqu'il provient en général de personnes qui ont été exposées au virus de l'hépatite virale B, de sorte que la présence dé particules de Dane dans les préparations d'antigène dlHBsAg d'origine sérique ne peut pas toujours être complètement exclue, même dans le cas de préparations extrêmement purifiées. Les particules de Dane peuvent dans certains cas encore posséder des propriétés hautement infectieuses. C'est pour remédier à ce type de diffieultés que le brevet principal s'était déjà assigné, entre autres buts, celui de l'obtention d'un procédé visant à la production de préparations contenant des antigènes présentant la même spécificité immunologique que l'HBsAg ou d'un antigène analogue de haute pureté, à partir d'un système autre que le sérum humain,à la fois reproductible et stable, au moins en ce qui concerne certains caractères déterminés susceptibles de faire l'objet d'une surveillance permanente. On rappellera que le procédé selon l'invention du brevet principal comprend notamment l'opération qui consiste à mettre une culture de cellules déterminées, de préférence eucaryotes, en contact avec un vecteur, plus particulièrement un plasmide, contenant lui-même une séquence d'insertion formée d'au moins deux ADN ou fragments d'ADN originaires du génome de l'hépatite virale B, orientés dans la même direction de transcription et dans laquelle la queue de l'un est reliée à la tête de l'autre (séquence dite "en tandem" lorsqu'elle ne comprend que deux de ces ADN ou fragments d'ADN). De préférence, on se place dans des conditions qui permettent en même temps un marquage des cellules transformées, de façon à rendre leur détection aisée, par exemple en mettant en oeuvre des cellules (ou mutants de ces cellules) rendues déficientes, à des fins de sélection, en un gène marqueur sélectionnable normalement nécessaire à leur croissance (déficience naturelle ou induite) lorsqu'elles sont placées dans certains milieux de culture déterminés, ces cellules étant néanmoins susceptibles de se déyelopper à nouveau dans l'un au moins de ces mêmes milieux de culture, après introduction dans ces cellules d'un gène ou fragment d'ADN homologue, quoique d'origine étrangère (ADN de complémentation), susceptible de compenser ou "complémenter" ladite déficience. Cette variante de proc8d consiste alors, soit à tenter de réaliser ladite transformation avec le seul vecteur contenant la séquence d'insertion d'ADN de l'hépatite B, lorsqu'il contient également dans son propre génome un tel "ADN de complémentation", soit, lorsque tel n'est pas le cas, à produire la co-transformation (ou les transformations simultanées) d'au moins certaines des cellules d'une telle culture au sein d'un tel milieu, d'une part, par ledit vecteur, d'autre part, par un vecteur, de préférence un plasmide, préalablement modifié par l'insertion dans son génome d'un tel ADN de complémentation. Il a alors été constaté que la culture des cellules transformées dans le milieu sus-défini entraîne 1'expression dudit fragment dérivé du DNA HBV et la production du polypeptide. présentant les propriétés immunologiques de l'HBsAg, qui peut en général être excrété dans le milieu de culture sous forme de particules d'HBs. Il a également déjà été indiqué dans le brevet principal que la séquence d'insertion pouvait aussi être formée d'au moins une partie d'un DNA HBV, celui-ci comprenant, de part et d'autre de son site EcoRI unique, d'une part, un sous-fragment contenant la séquence de nucléotides du gène S qui est apte à coder le polypep tide responsable des propriétés immunologiques de l'antigène HBs et, d'autre part, un sous-fragment suffisamment long pour qu'il soit susceptible d'inclure le promoteur du gène S. En d'autres termes, cette séquence d'insertion comprend notamment, si l'on se réfère à la figure unique, d'une part, le sous-fragment compris entre les positions nucléotidiques 835 à O (sens inverse de fl), lorsque ce sous-fragnent comprend le gène S dans son entier et, d'autre part, un sous-fragment compris entre la position 3182 et une position correspondant à un nombre suffisamment éloigné de cette position 0, dans le sens inverse de la transcription pour que le promoteur susdit soit susceptible d'y être inclus. L'ADN de complémentation préféré, dont la mise en oeuvre est préférée, consiste en un fragment d'ADN contenant le gène de la thymidine-kinase du virus Herpès simplex HSV-1, fragment qui peut être excisé du génome du virus par des enzymes de restriction spécifiques, telles que PvuII (GARAPItS et Coll., PNAS, 1979, vol. 76, p.3755-3759). A ce gène de la thymidine-kinase d'origine virale correspondent, dans de nombreux types de cellules eucaryotes, des gènes homologues propres à diriger la synthèse de la thymidine-kinase (enzyme phosphorylant la thymidine exogène fournie par le milieu de culture). La possibilité de suppléer à la fonction T se mutante par l'introduction préalable du gène entier de la thymidine-kinase du vines de l'herpès dans des cellules de souris du type L antérieurement déficientes, en raison d'une mutation induite ou provoquée affectant leur gène de la thymidine-kinase endogène, a déjà été décrite par M. WIGLER et coll. (Cell., vol. II, p. 223-232, 1977). Les cellules déficientes, dites TK sont sélectionnées en raison de leur incapacité de synthétiser la thymidine-kinase dans un milieu tel que celui connu sous le nom de "milieu HAT" (contenant de l'hypoxanthine et de l'amino-ptérine en sus de la thymidine). Ces cellules peuvent néanmoins devenir TK+, lorsqu'on incorpore, à leur patrimoine génétique transmissible, notamment le gène TK du virus de l'herpès.Bien entendu le système sélectif utilisant la Tkinasi3 pellet être remplacé par tout autre système @électif et notamment un AND de complémentation approprié par exemple 1'ADN de la dihydrofolate réductase (DHFR), ou d'une façon genérale, tout gène de complémentation dont de nombreux exemples existent dans la nature. Conformément à un mode de mise en oeuvre du pro cedé selon le brevet principal, on a recours aux mêmes vecteurs de base pour former les deux types de vecteurs modifiés utilisés pour la co-transformation. Un vecteur de base particulièrement favorable est constitué par le plasmide pBR32; > . Ainsi, on a décrit dans le brevet principal l'insertion d'un "VNA HBV tandem dans le site EccRI du plasmide pBR322 pour former l'un des vecteurs modifiés de co-transformation, qui a été dénommé pCPîO. De même, on a obtenu par l'insertion d'un gène tkHSV, dans un site Pnnj II du même plasmide pBR322, le second vecteur de co-transformation, qui a été dénommé pAGO. La réalisation desdites co-transformations qui ont été décrites dans le brevet principal, particulièrement lorsque l'on met en jeu des plasmides modifiés préférés qui ont été mentionnés dans ce qui précède, dans des fibroblastes de souris, conduit au résultat remarquable que constitue l'excrétion par les cellules cotransformées dans le milieu de culture de particules présentant des propriétés immunologiques caractéristiques des enveloppes du virus de l'hépatite B, notamment en ce qui concerne leur agglutination par des anticorps susceptibles d'agglutiner les antigènes HBsAg naturels, tels qu'isolés des sérums humains.La présence de particules excrétées agglutinables par des anticorps anti-HBsAg peut être détectée par des essais radioimmunologiques classiques, par exemple par immunofluores cence indirecte mettant en jeu des sérums anti-HBsAg et des anti-IgG fluorescents de lapins. Les quantités formées peuvent être dosées par des tests d'hémagglutination passive directe, de façon en soi connue pour les HBsAg naturels. Il est également remarquable que les particules excrétées par les fibroblastes de souris ne contiennent pas de traces d'antigènes HBcAg et HBeAg, détectables par immunofluorescence directe mettant en jeu des anticorps humains fluorescents anti-HBc et anti-HBe/1,2,3. Par mise en contact des cellules co-transformées ellesmêmes avec un sérum anti-HBsAg,des granules cytoplasmiques individualisées sont révélées par immunofluorescence indirecte dans la majeure partie des cellules cotransformées. Ces cellules peuvent être également repérées après lyse des cellules. Dans la plupart des cas, les particules excrétées forment la majeure partie des particules agglutinables par des anticorps anti-HBsAg susceptibles d'être produites. Il a ainsi été possible d'obtenir des préparations d'antigènes présentant les caractéristiques immunologiques de l'antigène HBsAg, dépourvues (dans les limites des méthodes de détection disponibles) de toute particule de Dane et des autres antigènes caractéristiques contenus dans ces dernières, en l'absence de composants d'origine humaine, notamment de toute protéine sérique. L'invention du brevet principal permettait par conséquent déjà la fabrication de compositions de vaccins contenant lesdits antigènes (tels qu'ils peuvent être récupérés à partir des milieux de culture desdites cellules co-transformées ou de lysats de ces dernières), le cas échéant, associés à tout véhicule pharmaceutique approprié à la constitution de vaccin actif contre l'hépatite virale, susceptible d'être administré par voie orale ou parentérale. La présente invention a pour but de renforcer encore la certitutde de l'exclusion parmi les produits d'expression des cellules envisagées dans le brevet prinpal, plus particulièrement des fibroblastes de souris, de l'un des autres antigènes principaux caractérisant le virus de l'hépatite virale, à savoir l'antigène de noyau ("core antigen") aussi désigné par l'abréviation HBcAg. La nécessité de cette exclusion est d'autant plus importante que l'on sait qu'un autre groupe de chercheurs a réussi à transformer des cellules humaines HeLa avec un ADN cloné circularisé d'un virus de l'hépatite B, transformation qui a conduit à l'excrétion par ces cellules non seulement d'antigène HBs, mais également de particules virales complètes contenant de l'antigène HBc dans le milieu de culture (SHALOMZ. HIRSCHMAN et coll., Proc. Natl. Acad. Sci.USA, vol. 77, nO 9, p. 5507-5511, septembre 1980, "Expression of cloned hepatitis B virus DNA in human cell cultures"). L'invention a donc encore pour but de fournir des séquences d'ADN codant pour l'antigène HBs, ces séquences pouvant être insérées dans des vecteurs aptes à transformer des cellules eucaryotes, qutil s'agisse de fibroblastes de souris ou de cellules humaines, mais en l'absence de toute possibilité de production d'antigène HBc. Le perfectionnement apporté au procédé selon le brevet principal est caractérisé par la mise en contact d'une culture de cellules déterminées, dans lesquelles ltADN du virus de l'hépatite virale B est susceptible d'être exprimé, de préférence des cellules eucaryotes, avec un vecteur, plus particulièrement un plasmide, contenant lui-même une séquence d'insertion formée de l'ADN du virus de l'hépatite virale B dont a été délétée une partie suffisante du gène codant pour l'antigène HBc, pour que la production de ces derniers antigènes par les cellules infectées soit rendue impossible. En particulier, l'ADN d'insertion est avantageusement constitué par l'ADN du virus de l'hépatite virale B, dont a été délété le fragment délimité par les extréintés BglII au niveau des nucléotides 1986 et 225, si l'on se réfère à la carte schématique de la figure unique, à l'intérieur du gène C, dont la position relative vis-à-vis de 1' ADN entier a été symbolisée par la flèche C. On peut également avoir recours à des séquences d'insertion originaires du DNA HBV, dont auront été déletés des fragments plus importants. Néanmoins la séquence d'insertion doit comprendre, outre le gène S,et en amont dans le sens de la transcription, un sous-fragment suffisamment long pour que le promoteur de la transcription y soit inclus, comme il avait déjà été indiqué dans le bre vet principal. Il avère que ce sous-fragment devra norma- lement comprendre une séquence TATATM,laquelle se trouve normalement en amont du début du gène S, à une distance correspondant à un nombre de nucléotides de l'ordre de 235. Plus particulièrement encore, la séquence d'insertion comprendra une partie supplémentaire du DNA HBV se situant en amont du site BglII qui se situe au niveau du nucléotide 2840. Conformément à une caractéristique supplémentaire de l'invention, la séquence d'insertion comprend également en outre un sous-fragment en aval du gène S dans le sens de la transcription, ce fragment s'étendant normalement dans le sens de la transcription au-delà du site BamHI, situé entre le gène S et le gène C. Une séquence d'insertion préférée comprend la totalité du gène codant pour l'ARN messager correspondant à l'antigène HBs. La position relative de cet ARN messager est représentée dans la figure par la flèche ARN , dont le début coincide sensiblement avec la position du nucléotide 2 800 , si l'on se réfère à la carte de la figure unique, et qui se termine entre les sites Bambin 1400 et BG1II 1985. Bien entendu l'ADN d'insertion peut comprendre des délétions supplémentaires, pour autant que celles-ci n'affectent ni la capacité d'expression de la séquence d'insertion, ni les phases de sa traduction. De même, l'invention s'étend à l'usage de toute séquence d'insertion équivalente, qu'il s'agisse de la séquence correspondante d'un ADN viral appartenant à un autre sous-type que celui qui a été envisagé dans le brevet principal et repris dans le présent texte, ou d'une séquence dont certaines parties auraient été modifiées sans que soit pour autant altérée la capacité des produits d'expression de réagir immunologiquement avec des anticorps contre des antigènes HBs. L'invention sera mieux comprise encore à la lecture du complément de description qui suit, qui n'est donné qu'à titre non limitatif et dans le seul but d'illustrer brièvement des principes qui sont à la base des déterminations des zones ou sous-fragments de l'ADN viral qui se sont révélés comme particulièrement utiles à la capacité de la séquence d'insertion d'être exprimée dans des cellules, notamment eucaryotes, du type de celles qui sont normalement capables d'abriter le virus de l'hépatité virale B et d'en produire des copies. La technique mise en oeuvre a consisté dans la fabrication de plusieurs vecteurs dérivés du plasmide pAGO contenant un gène de thymidine-kinase d'origine virale capable de compîémenter des cellules TK, d'une part, et contenant diverses séquences elles-mêmes dérivées de DNA BV et respectivement modifiées par insertion du plas mide pBR322 préalablement décircularisé, dans divers sites dtinsertion BglII ou BamHI de ce dernier, d'autre part. Les plasmides recombinants obtenus ont été utilisés pour transformer des cellules LTK-, dans les conditions qui ont déjà été décrites dans le brevet principal ou encore dans l'article M-F. DUBOIS et coll. intitulé "Exeretion of hepatitis B surface antigen particles from mouse cells transformed with cloned viral DNA", Proc. Natl. Acad.Sci. USA, vol. 77, n 8, p. 4549-4553, août 1980. La présence éventuelle d'antigène HBs secrété dans le milieu de culture a été testée dans le surnageant des cultures cellulaires par les tests immunologiques déjà exposés dans le brevet principal ou le dernier article cité. Les susdits plasmides recombinants ont notamment été construits comme suit, en ayant recours aux techniques également exposées dans le brevet principal et l'article susdit. 1O)~ClonaOeaepCp9 (résultant de l'insertion du plasmide pBR322 linéarisé dans le site EcoRI de DNA HBV). Le plasmide pBR322 hydrolysé par EcoRI a été traité par la phosphatase alcaline, puis ligaturé en présence d'une quantité équimoléculaire de DNA HBV coupé par EcoRI. La flèche PCP9 symbolise,dans la figure unique, le site d'insertion de pBR322 dans le DNA HBV. 20) Construction des clones de -la série PAC (contenant des fragments DNA HBV (coupés par BglII) et PANC (contenant des fragments de DNA HBV coupés par BamHI). Le plasmide pAGO a été hydrolysé par BamHI et traité par la phosphatase alcaline. Les fragments HBV ont été obtenus à partir du plasmide PCP10 décrit dans le brevet prin apal, après coupure par HindIII et PstI (qui n'ont pas de site dans DNA HBV et plus particulièrement, à partir des fragments obtenus, purifiés par électroélution sur un gel d'agarose, et contenant un dimère - ou une séquence "tandem" - de DNA HBV. Ces fragments ont été hydrolysés partiellement, soit par l'enzyme de restriction BglII, soit par l'enzyme BamHI, dans des conditions où seulement deux coupures sont effectuées. Les hydrolysats ont été alors ligaturés en quantités équimoléculaires au plasmide pAGO préalablement coupé par BamHI'(cette ligature mettant à profit le fait que les sites BamHI et BglII sont caractérisés par des parties d'extrémités cohésives communes). Une collection de clones sensibles à la tétracy dinde a été obtenue et analysée afin d'isoier chaque possibilité d'insertion. Des clones PACi2, PAC11l, PAC16 et PANC34 ont été obtenus. Les flèches accompagnant dans la figure unique les symboles correspondants, situent les insertions du pBR322 linéarisé dans les sites BamHI ou BglII correspondancs des séquences de DNA HBV contenues dans les plasmides recombinants obtenus. Ces clones présentaient en outre les caractéristiques suivantes PAC12 : délétion du fragment BglII 1985-2840 ; PAC14 : délétion du fragment BglII 1986-2425 FAC 16 insertion du génome de pBR322 dans le site 1986 du DNA HBV PANC34: il contient le génome pBR322 dans le site BamHI 1400 du DNA HBV. Ces clones ont été utilisés pour transformer des cellules LTK dans les proportions de 2 us de plasmide pour 2.106 cellules. 4 semaines plus tard, les colonies TIC étaient arrivées à confluence. Le milieu de culture a alors été analysé pour la présence d'HBs par la mise en oeuvre des susdits tests radioimmunologiques. Les capacités ou non-capacités des divers plasmides recombinants d'exprimer le gène S,sous forme d'antigène HBs excrétés dans le milieu de culture, ont été respectivement exprimées dans la figure unique par des signes "+" et "-". L'expression du gène S dans les clones PAC14 et PACKS et le défaut d'expression dans le clone FAC12 montrent que la transcription du gène S est initiée dans l'ADN viral et plus précisément dans le fragment de restriction BglII 2425-2840. I1 existe une séquence TATATAA appelée également "TATATAA Box" située à 72 nucléotides en amont du début de la région "pré-S" qui paraît contrôler la transcription du gène S. Le fait qu'aucune expression ne soit obtenue avec le clone PANC34, dans les conditions dans lesquelles ltex- périence a été réalisée, est peut-être lié au fait que l'ADN coulant pour le mRNA s'arrête après le site BamHI. On retient en particulier le fait que le clone PAC14,qui produit l'HBs, possède une délétion dans le gène C du virus, ce qui élimine le risque de production de particules virales par la cellule transformée, quelle qu'en soit la nature, et permet son utilisation pour la production d'un vaccin. L'invention concerne également encore les séquences d'ADN d'insertion nouvelles elles-mêmes, telles qu'elles ont été définies plus haut, et les vecteurs, notamment plasmides, contenant lesdites séquences qui sont plus particulièrement caractérisées par le fait quelles contiennent le promoteur de la transcription du gène S. Ces vecteurs sont d'un intérêt tout particulier en ce qu'ils peuvent éventuellement être modifiés par insertion d'une séquence d'ADN déterminée correspondant à une protéine dont l'expression dans des cellules eucaryotes serait recherchée. En effet, ce vecteur a l'intérêt particulier de n'être pas toxique à l'égard des cellules en cause. Le promoteur n'est pas réprimé puisque ces cellules permettent l'expression du gène S. En outre, ce vecteur peut permettre l'excrétion des protéines synthétisées directement dans le milieu de culture. L'une des susdites séquences d'insertion nouvelle peuvent encore être définie comme contentant, outre le gène S, l'ADN de la région "pré-S" (lequel dans l'ADN du virus de l'hépatite virale est situé immédiatement à l'amont du gène S dans le sens inversede la transcription, ce gène comportant de l'ordre de 163 nucléotides),le gène de l'AKN messager du gène S du virus de l'hépatite B, le promoteur de l'ADN du virus de l'hépatite B, notamment une séquence TATATAA (T abréviation de thymine et A abréviation de l'adénine). Elle comprend notamment encore une séquence d'ADN correspondant à une séquence localisée entre les positions nucléotidiques 2425 et 2840 de l'ADN du virus de l'hépatite B. Sont évidemment incluses dans le cadre de l'invention des séquences comportant plusieurs unités du type sus-décrit, notamment des séquences "tandem". L'invention concerne enfin l'application de ces séquences d'ADN ou de vecteurs les contenant à la production de principesactifsde vaccin essentiellement constitué par des produits d'expression des susdites séquences, tels qu'il peuvent être excrétés dans les milieux de culture de cellules notamment eucaryotes susceptibles d'être transfectées avec de tels vecteurs ou séquences d'ADN. Elle concerne encore --,ale.erlt leur application en tant qu'agent de diagnos REVENDICATIONS 1 - Procédé selon les revendications 5, 6, 7, 8 ou 9 du brevet principal, dans lequel on met en contact une culture de cellules déterminées, dans lesquelles l'ADN du virus de l'hépatite virale B est susceptible d'être exprimé, de préférence des cellules eucaryotes, avec un vecteur, plus particulièrement un plasmide, contenant lui meme une séquence d'insertion dérivée de l'ADN du virus de lthépatite virale B dont a été délétée une partie suffisante du gène codant pour l'antigène lIBc, pour que la production de ces derniers antigènes par les cellules infectées soit rendue impossible. 2 - Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que la séquence d'insertion est formée de l'ADN du virus de l'hépatite virale B, dont a été délété le fragment délimité par les extrémités BglII au niveau des nucléotides 1986 et 2495. 3 - Procédé selon la revendication 1 ou la revendication 2, caractérisé en ce que la séquence d'insertion comprend, outre le gène S, et en amont dans le sens inverse de la transcription, un sous-fragment suffisamment long pour qu'y soit incluse une séquence TATATAA, laquelle se trouve normalement en amont du début duene S, à une distance correspondant à un nombre de nucléotides de l'ordre de 235. 4 - Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, caractérisé en ce que la séquence d'insertion comprend également en outre un sous-fragment en aval du gène S dans le sens de la transcription, ce fragment s'étendant normalement dans le sens de la transcription au-delà du site BamHI, situé entre le gène S et le gène C. 5 - Procédé selon la revendication 4, caractérisé en ce que la susdite séquence d'insertion comprend la totalité du gène codant pour l'ARN messager correspondant à l'antigène HBs. 6 - Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que la séquence d'insertion contint, outre le gène S, l'ADIQ de la région "pré-S", le gène codant pour l'ARN messager de l'antigène HBs du virus de l'hépatite B, le promoteur de l'ADN de la transcription du gène S du virus de l'hépatite B, notamment une séquence TATATAA. 7 - Procédé selon la revendication 6, caractérisé en ce que la susdite séquence d'insertion contient une séquence d'ADN correspondant à celle qui, dans l'ADN du virus de l'hépatite B, est localisée entre les positions nucléotidiques 2425 et 2480. 8 - Séquence d'ADN dérivée de DNA HBV, caractérisée en ce qu'elle répond à la définition de la séquence d'insertion indiquée dans l'une quelconque des revendications 1 à 7. 9 - Vecteur selon la revendication 13 du brevet principal, caractérisé en ce qu'il répond à la définition de l'une quelconque des séquences des revendications 1 à 8. 10 - Application du procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 7 à la fabrication de principes actifs de vaccin contre lthépatite virale B ou comme agent de diagnostic.