FR 2495938 A1 19820618 FR 8123152 A 19811211 La présente invention concerne un procédé pour la production d'hormone adrénocorticotrope humaine. Cette hormone, désignée ci-après par l'abré- viation hACTH, est une hormone sécrétée par le lobe antérieur de l'hypophyse, qui stimule la synthèse des hor- mones stéroldes et la sécrétion de l'insuline humaine. La demanderesse a étudié des procédés pour la production er"nasse de l'hACTH. Ces efforts ont conduit à la découverte inattendue que des cellules lymphoblastoides, humaines, capables de produire cette hormone, conviennent à la production massive de l'hACTH, en raison des valeurs très élevées de leur vitesse de multiplication et de leur production d'hACTH par cellule. En particulier l'invention concerne un procédé pour la production d'hACTH, qui con- siste à faire se multiplier des cellules lymphoblastoldes, humaines,capables de produire cetteormone, par la trans- plantation des cellules en question dans l'organisme d'un animal à sang chaud ou en les laissant se multiplier dans un dispositif leur fournissant un liquide nutritif de l'or- ganisme d'un animal à sang chaud; les cellules lymphoblas- toldes, humaines, ainsi multipliées, libèrent ensuite 1' hACTH que l'on recueille. Le procédé, selon l'invention, en plus d'une pro- duction accrue d'hACTH,ne nécessite pas ou nécessite bien moins de milieu nutritif contenant du sérum coûteux pour la multiplication cellulaire; il rend l'entretien de l'4- quilibre du milieu de culture, pendant la multiplication cellulaire, bien plus facile que dans le cas des cultures de tissu in vitro. En particulier, on peut faire se multi- plier facilement toute cellule lymphoblastolde, humaine, - capable de produire de l'hACTH, en utilisant un liquide nu- tritif de l'organisme d'un animal à sang chaud, par trans- plantation des cellules dans l'organismes de l'animal ou leur mise en suspension dans une chambre de diffusion clas- sique, conçue pour recevoir le liquide nutritif de l'orga- nisme, l'animal étant nourri de façon habituelle. En ou- tre, le procédé est caractérisé par une multiplication cellulaire plus stable et plus abondante, avec une pro- duction accrue d'hACTF par cellule. En ce qui concerne les cellules lymphoblastol- des, humaines, utilisables dans l'invention, on peut prendre des cellules lymphoblastoîdes quelconques, pourvu qu'elles produisent de l'hATCH et se multiplient dans 1' organisme de l'animal a sang chaud. Les cellules lympho- blastoîdes, humaines, que l'on pr'fére, sont celles dans lesquelles on a introduit les sites génétiques, comman- dant la production d'hACTH, des cellules humaines capa- bles de produire cette hormone, par exemple des cellules produisant naturellement de l'hACTH, telles que celles du lobe antérieur de l'hypophyse, des cellules de tumeur hypophysaire ou de l'adénome chromophobe, ou d'autres cel- lules humaines, qui produisent de l'hACTH ectopique, tel- les que les cellules de carcinome du pancréas atteignant les lots de Langerhans, ou de cellules de carcinome pul- monaire. L'introduction peut se faire par fusion cellulai- re, utilisant du polyéthylèneglycol ou le virus Sendal, ou bien selon une technique de recombinaison génétique avec de l'ADN!-ligase, une nucléase et l'ADN-polymérase, ou des cellules lymphoblastoldes humaines produisant de l'hACTH ectopique. Comme l'emploi des cellules lymphoblastoides, humaines, provoque la formation d'une tumeur massive, faci- le à désagréger lorsqu'on transplante les cellules dans 1' organisme d'un animal à sang chaud, et que la tumeur massi- ve est difficilement contaminée par les cellules de l'ani- mal h8te, les cellules lymphoblastoides humaines, vivantes, multipliées, peuvent être facilement récoltées. En tant qu'animaux à sang chaud, on peut utiliser tout animal si les cellules lymphoblastoîdes humaines se dé- veloppent dans son organisme. Par exemple, on peut employel avantageusement, dans l'invention, des volatiles tels que poulet ou pigeon et des mammifères, tels que chien, chat, singe, chèvre, porc, vache, cheval, lapin, cobaye, rat, hamster, souris ou souris nue. Comme la transplantation des cellules lymphoblastoidés humaines à l'animal provoque une réaction immunitaire indésirable, l'emploi d'un animal nouveau-né ou très jeune, de préférence au stade le plus précoce possible, par exemple d'oeuf, d'embryon ou de foetus, est souhaitable. Pour réduire autant que possible la réaction immunitaire, on peut traiter l'ani- mal, avant la transplantation cellulaire, par irradiation avec des rayons X ou t à raison d'environ 200 à 600 rems ou par injection d'un antisérum ou d'un agent immunosup- presseur préparé selon un procédé classique. Comme la souris nue,' lorsquIon l'utilise comme animal à sang chaud présente une réaction immunitaire plus faible même à l'é- tat adulte, on peut de façon pratique lui transplanter toutes lignées lymphoblastoîdes humaines pourvu qu'elles se multiplient rapidement, sans qu'un prétraitement soit nécessaire. On peut effectuer la multiplication cellulaire, stabilisée, et l'accroissement de la production d'hACTH par transplantation répétée avec une ou plusieurs combinai- sons d'animaux à sang chaud différents; on peut atteindre les objectifs visés, en implantant tout d'abord les cellu- les lymphoblastoldes humaines à des hamsters,pour qu'elles se multiplient, puis en les réimplantant à des souris nues. On peut effectuer la transplantation répétée avec des ani- maux de la même classe ou du même groupe ou de la même es- pbce ou du même genre. On peut implanter les cellules lymphoblastoldes humaines en un site quelconque de l'animal, à la seule con- dition qu'elles s'y multiplient: par exemple on peut ef- fectuer l'implantation dans la cavité allantolque ou par voie intraveineuse, intrapéritonéale ou sous-cutanée. En dehors de la transplantation cellulaire di- recte dans l'organisme d'un animal, on peut faire se mul- tiplier des lignées lymphoblastoîdes humaines, classiques, quelconques, capables de produire de l'hACTH, en utilisant le liquide nutritif fourni par l'organisme d'un animal à sang chaud, par inclusion, par exemple par voie intrapé- ritonéale, dans l'organisme de l'animal, d'une chambre de diffusion classique de forme et de taille appropriées, munie d'une membrane filtrante, poreuse, d'un ultrafiltre ou de fibres creuses ayant des pores d'environ 10-7 à 10-5 mètre de diamètre, empêchant la contamination de la cham- bre par les cellules de l'animal hôte. Comme la chambre de diffusion peut, si nécessaire, être conçue pour pouvoir être placée par exemple sur le corps de l'animal hôte et permettre la circulation du liquide de l'animal dans la chambre. permettre l'observation de la suspension cellu- laire contenue dans la chambre par une ou plusieurs feng- tres latérales, transparentes, dont sont munies une ou plu- sieurs parois de la chambre et permettre le remplacement et l'échange avec une chambre neuve, la production cellu- laire par hôte peut être accrue pendant la durée de vie de l'animal, sans qu'il soit aucunement nécessaire de sacri- fier celui-ci. De plus, lorsqu'on utilise une telle cham- bre de diffusion, comme il ne se produit pas de réaction immunitaire, grâce à l'absence de contact direct des cel- lules humaines avec les cellules de l'animal hôte, on peut employer divers animaux à sang chaud comme hôtes, sans ef- fectuer un prétraitement pour réduire leurs réactions immu- nitaires, et on peut récolter facilement les cellules lym- phoblastoldes humaines, multipliées. On peut facilement nourrir l'animal hôte, auquel on a implanté les cellules lymphoblastoïdes humaines à la manière habituelle, même après la transplantation cellulai- re, et aucun soin particulier n'est nécessaire. La multiplication des cellules atteint générale- ment un maximum en 1 à 20 semaines après la transplanta- tion cellulaire. Selon l'invention, le nombre des cellu- les lymphoblastoldes humaines, obtenues par hôte, est com- pris entre environ 107 et 1012 ou plus. En d'autres ter- mes, le nombre deskellules lymphoblastoldes humaines, im- plantées dans l'organisme de l'animal, s'accroit d'environ 102 à 107 fois cu plus ou d'environ 10 à 106 fois ou plus par rapport à ce que l'on obtient par la méthode de cul- ture tissulaire in vitro, avec un milieu nutritif; donc les cellules lymphoblastoldes humaines conviennent à la production d'hACTH. Pour l'induction de l'hACTH, on peut utiliser tout procédé dans lequel les cellules lymphoblastoldes humaines, obtenues selon l'invention, libèrent cette hor- mone. Par exemple, on met en suspension les cellules lym- phoblastoldes humaines, obtenues par la multiplication en suspension dans le liquide d'ascite et la récolte dans ce liquide d'ascite, ou par l'extraction de la tumeur massive, formée sous la peau, et la récolte après désagrégation de la tumeur massive, pour obtenir une concentration cellu- laire d'environ 104 à 108 cellules par ml, dans un milieu nutritif préchauffé à une température d'environ 20 à 40 C; puis on les soumet à l'action d'un inducteur d'hormone a- drénocorticotrope à cette température, pendant environ 1 à 50 heures, pour induire la production de cette hormone. Comme inducteurs d'hormone adrénocorticotrope, utiles suivant l'invention, on peut employer tout inducteur capable d'induire la libération de cette hormone par les cellules lymphoblastoldes humaines. Les inducteurs d'hor- mone adrénocorticotrope que l'on préfère sont la vasopres- sine, le méthylnitrate d'atropine, l'insuline, le glucagon, une endotoxine bactérienne, la sérotonine et le propanolol. La demanderesse a découvert qu'après l'induction de l'hACTH, une forte quantité d'hormone humaine stimulante de mélanocyte, désignée ci-après par l'abréviation hMSH, et de lipotropine humaine (hLPH) est produite simultané- - ment. On peut facilement recueillir l'hACTH, l'hMSH et l'hLPH selon des techniques de purification et de sé- paration utilisant des opérations classiques, telles que relargage, dialyse, filtration, centrifugation, concen- tration et lyophilisation. Si une préparation plus puri- fiée est souhaitable, on peut l'obtenir en combinant les techniques précitées à d'autres opérations classiques, telles qu'adsorption et dèsorption avec échange ionique, filtration sur gel, chromatographie d'affinité, fraction- nement au point iscélectrique et électrophorèse. La préparation d'hACTH, ainsi obtenue, peut 4- tre utilisée de façon avantageuse isolément ou en combinai- son avec un ou plusieurs agents pour l'administration par injection, par voie externe, par voie interne ou dans un but de diagnostic dans la prévention et le traitement de ma- ladies humaines, telles que l'insuffisance hypophysaire. Dans la présente description, la production d' hACTH est déterminée selon une méthode radio-immunologique comme décrit par S. Mataukura et coll., dans J. Lab. Clin. Med., Vol. 77, ppo 490-500 (1971), elle est exprimée en poids par ml de suspension cellulaire. Egalement les productions de hMSH et de hLPH sont déteirminées par une méthode radio-immunologique, comme dé- crit par K. Abe et coll. dans J. Clin. Invest., Vol. 46, pp. 1906-1916 (1967). On détermine tout d'abord la quanti- té totale des hormones avec un standard de P-MSH humaine, puis on calcule le rapport pondéral des hormones à partir des quantités de p-MSH et de PLPH humaines, isolées par filtration sur gel. Des modes de réalisation non limitatifs de l'in- vention sont décrite ci-après. EXEMPLE 1 On met en suspension ensemble des cellules humai- nes de carcinome pulmonaire obtenues par extraction à un malade, atteint de carcinome pulmonaire, suivie de ha- chage, et des cellules lymphoblastoïdes leucémiques, hu- maines, de la lignée Namalwa, dans un récipient, avec une solution salée 140 mM en NaCI, 54 mM en KC1, 1 mM en NaH2PO4 et 2 mM en CaC12, pour obtenir des concentrations de chaque type cellulaire d'environ 1C5 cellules par mli On mélange la suspension cellulaire glacée avec une pré- paration fra che de la même solution salée contenant du virus Sendat préalablement inactivé par irradiation par les ultraviolets; le tout est placé dans une étuve à 370C pour 5 minutes, après le mélange, puis agité pendant minutes, pour effectuer la fusion cellulaire; la capa- cité de production de l'hACTH des cellules humaines de carcinome pulmonaire est ainsi introduite dans la lignée lymphoblastoïde leucémique, humaine. Après clonage, par un procédé classique, de la souche de cellules d'hybridome capable de produire de l'hACTH, on implante cette souche à des souris nues, adultes, que l'on alimente ensuite de façon habituelle, pendant 5 semaines. On extrait les tu- meurs massives formées sous la peau, pesant chacune envi- ron 15 g, et on les désagrège par hachage et mise en sus- pension dans une solution salée physiologique, contenant de la trypsine. Après lavage des cellules avec le milieu 199 de Earle (pH 7,2) additionné de 10% en volume de sérum de veau foetal, on remet les cellules en suspension, à une concentration d'environ 106 cellules par ml, dans une pré- paration fraiche du même milieu contenant 0,1 pq de glu- cagon par ml comme inducteur, puis on incube-à 350C, pen- dant 20 heures, pour induire la production des hormones. Ensuite on soumet les cellules à un traitement par les ul- trasons et on détermine 1'hACTH, l'hMSH et l'hLPH dans le surnageant. La production d'hACTH est de 25OQug par ml de suspension cellulaire, celle de l'hMSH de 580"g par ml et celle de 1'hLPH de 40/Ug par ml. Des cellules témoins sont obtenues par implantation de cellules humaines de carcinome pulmonaire à des souris nues, adultes, alimentation des animaux de façon habituel- le pendant 5 semaines, extraction des tumeurs massives, formées sous la peau et pesant environ 5 g chacune, et dé- sagrégation de ces tumeurs. Ces cellules témoins, obtenues, sont traitées comme ci-dessus,pour induire la production d'hormones. La production de hACTH n'est alors que de 600 ng par ml de suspension cellulaire, celle de l'hMSH de 1,2 ?g par ml et celle de l'hLPH de 350 ng par ml. EXEMPLE 2 Comme dans l'exemple 1, on effectue la fusion de cellules humaines d'adénome chromophobe, obtenues par ex- traction à un malade atteint d'adénome chromophobe de l'hy- pophyse et hachage, avec des cellules lymphoblastoldes leu- cémiques, humaines, de la lign'e JBL, pour introduire la capacité de production de l'hACTH des cellules humaines d' adénome chromophobe dans la lignée lymphoblastolde leucé- mique humaine. Après clonage, par un procédé classique, de la souche de cellules d'hybridome capables de produire de l'hACTH, on implante ces cellules d'hybridome,par voie sous-cutanée, à des hamsters nouveau-nés, auxquels on a préalablement injecté un antisérum préparé sur le lapin pour réduire leurs réactions immunitaires; on alimente les animaux de façon habituelle pendant 3 semaines. On extrait les tumeurs massives, formées sous la peau et pesant envi- ron 10 g chacune, on les désagrège par hachage et mise en suspension dans une solution salée, physiologique, conte- nant de la collagénase. Après lavage des cellules avec du milieu essentiel, minimal de Eagle (pH 7,2), additionné de 5% en volume de sérum humain, on remet les cellules en suspension, à une concentration d'environ 105 cellules par ml, dans une préparation fralche du même milieu, contenant 3 U de vasopressine par ml comme inducteur; on incube à 370C pendant 15 heures, pour induire la production des hormones. La production, déterminée comme dans l'exemple 1, est pour hACTH de 3801Jg par ml de suspension cellulai- re; pour l'hMSH de 740 g par ml et pour l'hLPH de 510ug par mi. On traite de façon semblable, pour induire la production d'hormones, les cellules témoins obtenues par implantation des cellules humaines d'adénome chromophobe à des hamsters nouveau-nés, alimentation des animaux de façon habituelle pendant 3 semaines, extraction des tumeurs massives, for- mées sous la peau et pesant environ 3 g chacune, et désa- grégation de ces tumeurs. La production d'hACTH par ml n' est que de 750 ng par ml; celle de l'hMSH de 560 ng et celle de l'hLPH de 430 ng. EXEMPLE 3 On implante, par voie intraveineuse, à des rats nouveau-nés des cellules lymphoblastoldes leucémiques, hu- maines, de la lignée BALL-1, auxquelles on a conféré la capacité de production de 1'hACTH de cellules humaines de carcinome humain, comme dans l'exemple 1; on alimente les rats de façon habituelle pendant 4 semaines. On extrait et désagrège les tumeurs massives, formées,pesant environ 30 g chacune. Après lavage avec du milieu RPMI 1640 (pH 7,4) additionné de 10% en volume de sérum de veau foetal, on remet les cellules en suspension, à une concentration d' environ 1 cellules par ml, dans une préparation fraiche du mnme/ailieu 6 mM en sérotonine (inducteur), puis on in- cube à 300C pendant environ 40 jours. La production d'hACTH est de 730, 4g/ml de suspension cellulaire et celle de l'hMSH de 940Oug par ml, On traite comme ci-dessus des cellules témoins obtenues par implantation de cellules humaines de carcinome pulmonaire à des rats nouveau-nés, alimentation des animaux de façon habituelle pendant 4 semaines, extraction des tumeurs mas- sives, formées, pesant enviroa 5 g chacune, et désagréga- tion de ces tumeurs. La production d'hACTH n'est alors que de 650 ng par ml de suspension cellulaire et celle de i'hMSH de 1,8/g par ml. EXEMPLE 4 Après avoir irradié des souris adultes avec un équivalent de dose de rayons X d'environ 400 rems, pour réduire leurs réactions immunitaires, on implante aux animaux, par voie sous-cutanée, des cellules lymphoblas- totdes leucémiques, humaines, de lignée NALL_1, auxquel- les on a conféré la capacité de production de l'hACTH des cellules humaines dtadénome chromophobe, comme dans l'exem- ple 2, et on les alimente de façon habituelle pendant 3 semaines. Les tumeurs massives, formées sous la peau et pesant environ 15 g chacune, sont extraites et désagrégées. On traite les cellules comme dans l'exemple 2, pour induire la production d'hormone. La production d'hACTH est de 480 pg parml de suspension cellulaire et celle de l'hLPH de 350 /Ag par ml. On traite comme ci-dessus des cellules témoins obtenues par implantation des cellules humaines d'adénome chromophobe à la souris. L'alimentation des animaux a lieu de façon habi- tuelle pendant 3 semaines, après quoi on procède à l'ex- traction des tumeurs massives, formées, pesant environ 5 g chacune,/à la désagrégation de ces tumeurs. La production d'hACTH n'est que de 520 ng par ml de suspension cellulai- re; celle de l'hLPH est de 790 ng par ml. EXEMPLE 5 On met en suspension, dans une solution salée physiologique, des cellules lymphoblastotdes leucémiques, humaines de la lignée TALL-1, auxquelles on a conféré la capacité de production de l'hACTH des cellules humaines de carcinome pulmonaire, de la même façon que dans l'exemple 1; la solution est introduite dans une chambrede diffusion cy- lindrique, en matière plastique, de volume intérieur- d'en- viron 10 ml, munie d'une membrane filtrante ayant des pores d'environ 0,5 &an. Après inclusion dela chambre dans le pé- ritoine d'un rat adulte, on alimente l'animal de façon habituelle pendant 4 semaines, puis on retire la chambre. La densité des cellules humaines dans la chambre, obtenues dans l'opération ci-dessus, est d'environ 7 x 10 cellules par ml ce qui est environ au moins 1 fois supérieur à ce que l'on obtient par culture in vitro avec un incubateur à C02. On traite les cellules humaines, ainsi obtenues, comme dans l'exemple 3, pour induire la formation d'hormo- nes. La production d'hACTH est de 280,mg par ml de suspen- sion cellulaire; celle de l'hMSH de 770/,g par ml; et cel- le de lhLPH de 16Oag par ml. On traite comme ci-dessus des cellules témoins obtenues par mise en suspension de cellules humaines de car- cinome pulmonaire dans une solution salée, physiologique, transfert de la suspension cellulaire obtenue dans une cham- bre de diffusion cylindrique en matière plastique ayant un volume intérieur d'environ 10 ml et munie d'une membrane filtrante ayant des pores d'environ 0,5,pm, inclusion de la chambre dans le péritoine d'un rat adulte, alimentation de l'animal de façon habituelle pendant 4 semaines et ré- colte des cellules humaines,multipliées, soit environ 107 cellules par ml. La production d'hACTH n'est que de 480 ng par ml de suspension cellulaire; celle de l'hMSH de 2,3 hg par ml et celle de l'hLPH de 250 ng par mi. EXEMPLE 6 On implante dans les cavités allantolques d'oeufs embryonnés, préincubés à 370C pendant 5 jours, des cellules lymphoblastoïdes leucémiques, humaines, de la lignée JBL, auxquelles on a conféré, comme dans l'exemple 1, la capacité de production de l'hACTH des cellules humaines de carcinome pulmonaire. Après incubation des oeufs à cette température, pendant encore 1 semaine, on recueille les cellules lympho- blastoides humaines, multipliées. On traite ces cellules comme dans l'exemple 2, pour induire la production d'hACTH. La production d'hACTH est de 520,ug par ml de suspension cellulaire. Dans une expérience témoin, o l'on implante les cellules humaines de carcinome pulmonaire dans les cavités allantolques d'oeufs embryonn6s, on n'observe pas de multiplication cellulaire. Revendications 1. Procédé pour la production de l'hormone adrénocor- ticotrope humaine, hACTH, caractérisé en ce qu'il consiste à faire se multiplier des cellules lymphoblastotdes humai- nes, capables de produire cette hormone, dans un liquide nutritif de l'organisme d'un animal à sang chaud, par transplantation de ces cellules dans l'organisme lui-même de l'animal, ou dans un dispositif recevant le liquide nutritif de cet animal, et à laisser ensuite les cellules multipliées libérer l'hormone. 2. Procédé suivant la revendication 1, caractérisé en ce que l'hormone produite est accompagnée de l'hormone sti- mulante de mélanocyte, hMSH, et/ou de lipotropine, hLPH. 3. Procédé selon l'une des revendications 1 ou 2, caractérisé en ce que les cellules lymphoblastotdes humai- nes sont des cellules d'hybridome obtenues par fusion cel- lulaire d'une lignée lymphoblastolde humaine avec des cel- lules humaines, capables de produire l'hACTH. 4. Procédé selon la revendication 3, caractérisé en ce que les cellules d'hybridome sont obtenues par fusion cellulaire d'une lignée lymphoblastolde humaine avec des cellules humaines d'adénome chromophobe. 5. Procédé selon la revendication 3, caractérisé en ce que lesdites cellules d'hybridome sont obtenues par fusion cellulaire d'une lignée lymphoblastolde humaine avec des cellules humaines de carcinome pulmonaire. 6. Procédé selon la revendication 3, caractérisé en ce que ladite lignée lymphoblastotde est une lignée lym- phoblastoide leucémique, humaine. 7. Procédé selon la revendication 3, caractérisé en ce que la lignée lymphoblastoTde humaine est une des li- gnées Namalwa, BALL-1, TALL-1, NALL-1 et JBL. 8. Procédé selon l'une des revendications précédentes, caractérisé en ce qu'on induit la libération d'hACTH dans les cellules lymphoblastoldes humaines, multipliées, au moyen dtune ou dqplusieurs substances: vasopressine, méthylnitrate d'atropine, insuline, glucagon, une endoto- xine bactérienne, sérotonine, propanolol. 9. Procédé selon l'une des revendications précéden- tes, caractérisé en ce que l'animal à sang chaud est un poulet, pigeon, chien, chat, singe, chèvre, porc, vache, cheval, lapin, cobaye, rate hamster, souris ou souris nue.