FR 2497198 A1 19820702 FR 8124412 A 19811229 -1- La présente invention se rapporte à un peptide qui permet de doser l'hormone parathyroide humaine (h-PTH). Plus particulièrement, l'invention concerne un peptide de formule 53 55 60 R - Lys - Lys - Glu - Asp - Asn - Val - Leu - Val - Glu - Ser - His - Glu - Lys - Ser - Leu - Gly - 75 Glu - Ala -Asp - Lys - Ala - Asp - Val - Asp - 84 Val - Leu -Thr - Lys - Ala - Lys - Ser -Gln - OH (I) dans laquelle: 2 R représente H, un groupe H-Tyr-ou un groupe 51 52 R1-Pro-Arg-, so R1 représente H, un groupe H-Tyr- ou un groupe 46 47 48 49 5 0 R2-Ala-Gly-Ser-Gln-Arg-, et 2 4 5 R2 représente H, un groupe H-Cys- ou un groupe 2 4 5 H-Tyr-, ou un sel de ce peptide. L'hormone parathyroide humaine (h-PT-H) est une hormone peptidique consistant en 84 aminoacides, et son activité biologique est manifestée par le reste à 34 aminoacides N-terminal ZG.W.Tregear, et al., Hoppe-Seyler's Z. Physiol. Chem., 355, 415 (1974)]. La demanderesse a synthétisé le reste à 32 aminoacides C-terminal de l'hPTH (53-84), le reste à 34 aminoacides (51-84) et le reste a 39 aminoacides de l'h-PTH (46-84) et elle a injecté ces peptides à des lapins pour les sensibiliser; elle a ainsi réussi à obtenir l'anticorps spécifique du résidu du C-terminal. 2497198 ' -2- On sait que le marquage par 125I de l'h-PTH pour radioimmunotest (RIT) est très difficile. Les résidus d'h-PTH (53-84), d'h-PTH (51-84) et d'hPTH (46-84) ne contiennent pas de la tyrosine qui pourrait être marquée facilement par 125I, toutefois, (Tyr 52) h-PTH (52-84), (Tyr50) h-PTH (5084) et (Tyr45) h-PTH (45-84), peuvent facilement être marqués par une substance de marquage à radio-isotope, mais sont difficilesà absorber sur le tube de réaction immunitaire. La demanderesse a en conséquence trouvé que ces fragments d'h-PTH pouvaient être utilisés en tant que composés marqués pour le dosage de l'h-PTH, en raison d'une adsorption moins nonspécifique et d'un dosage quantitatif exact par RIT. L'h-PTH (53-84), l'h-PTH (51-84) et l'h-PTH (46-84) ne contiennent pas l'aminoacide cystéine qui peut être marqué par une enzyme fixant SH; toutefois, la demanderesse a trouvé que ces peptides pouvaient être analysés quantitativement; par EIT, en utilisant un anticorps contre le fragment C-terminal d'h-PTH, si l'on utilisait un peptide de formule R2-Al a46-Gly-Ser-Gln-Arg-Pro5l - Arg-Lys53-Lys-Gl u55-Asp-Asn-Val- Leu-Val 60-GI u-Ser-His-Gl u-Lys65- Ser-Leu-Gly-G1 u-Ala70-Asp-Lys- Al a-Asp-Val75-Asp-Val-Leu-Thr- Lys8O-Ala-Lys-Ser-Gln84-OH [Ia] 4 5 dans laquelle R2 représente H ou le groupe H-Cys-, parmi ceux qui répondent à la formule générale (I), c'est-à- dire h-PTH (46-84) et (Cys45) h-PTH (45-84). De -3- préférence, on dosera avantageusement h-PTH ou le fragment C-terminal de h-PTH en utilisant un anticorps spécifique obtenu par une réaction immunitaire de (Cys 45) hPTH (45-85) ou de son complexe avec une protéine, par exemple l'immunocomplexe de la sérum- albumine de bovins (BSA) comme antigène, et en utilisant un composé marqué par une enzyme, de formule I 535 oR--Lys - Lys - Glu - As p - As n - Val - Leu - Val - Glu - Ser -His - Glu - 70 Lys -Ser -Leu -Gly -Glu - Ala- 15. As -- LYs -- Ala -Asp --.Val -.AsP- Val - Leu - Thbr --Lys -- Ala -Lys - Ser - Gin - OH. dans laquelle: R' représente H ou un groupe RI-Pro51-Arg52-, i Rl représente H ou un groupe R'-Ala46-Gly 7- 47_ 49_ 2 -ly Ser47-Gln49-Arg5-, et _ R2 représente H ou un groupe H-Cyp , avec le peptide de formule (I), c'est-à-dire h-PTH (53-84), h-PTH (5184), h-PTH (46-84) et (Cys45) h-PTH (45-84), en tant que composé marqué par une enzyme, par EIT. La synthèse du peptide (I) selon l'invention peut être effectuée de la manière suivante: On fait réagir un aminoacide et/ou un peptide inférieur par condensation dans l'ordre de la séquence d'aminoacides de formule (I), et on libère le groupe 2497198 ' -4- protecteur du groupe réactif dans l'étape finale de la réaction. La réaction de condensation peut être effectuée selon les techniques classiques de synthèse des peptides en répétant la fixation et l'élimination des groupes protecteurs et en répétant la condensation. Les groupes protecteurs pour la synthèse des produits de départ ou produits intermédiaires sont des groupes protecteurs classiques de la synthèse des peptides qu'on élimine facilement par hydrolyse, décomposition à l'aide d'un acide, réduction, aminolyse ou hydrazi- nolyse. Ainsi par exemple, le groupe amiro peut être protégé selon une technique classique par un groupe acyle tel que formyle, trifluoracétyle, phtaloyle, p-toluènesulfonyle ou o-nitrophénylsulfonyle; un groupe benzyloxycarbonyle tel que benzyloxycarbonyle, o-bromobenzyloxycarbonyle, p-bromobenzyloxycarbonyle, o- ou p-chlorobenzyloxycarbonyle, p-nitrobenzyloxy- carbonyle ou p-méthoxybenzyloxycarbonyle; un groupe oxycarbonyle aliphatique tel que trichloréthyloxycarbonyle, t-amyloxycarbonyle, t-butyloxycarbonyle ou diisopropyl- méthoxycarbonyle, ou un groupe aralkyloxycarbonyle tel que 2-phénylisopropoxycarbonyle, 2-tolylisopropoxy- carbonyle ou 2-p-diphényl-isopropoxycarbonyle. Ces groupes amino peuvent être protégés par formation d'une énamine par réaction avec une 1,3dicétone comme la benzoylacétone ou l'acétylacétone. Le groupe carboxyle peut être protégé par formation d'amide, formation d'hydrazide ou estérification. Le groupe amide est substitué par un groupe 3,4-diméthoxy- benzyle ou bis-(p-méthoxy-phényl)-méthyle. Le groupe hydrazide est substitué par un groupe benzyloxycarbonyle, 2497198 ' -5- trichloréthyloxycarbonyle, trifluoracétyle, t-butoxy- carbonyle, trityle ou 2-p-diphényl-isopropoxycarbonyle. Le groupe ester est substitué par un alcanol tel que le méthanol, l'éthanol, le t-butanol ou l'alcool cyanométhylé; un aralcanol comme l'alcool benzylique, l'alcool p-bromobenzylique, l'alcool pchlorobenzylique, l'alcool p-méthoxybenzylique, l'alcool pnitrobenzylique, l'alcool 2,6-dichlorobenzylique, l'alcool benzhydrylique, l'alcool benzoylméthylique, l'alcool p-bromobenzoyl- méthylique, ou l'alcool p-chlorobenzoylméthylique; un phénol tel que le 2,4,6-trichlorophénol, 2,4,5- trichlorophénol, le pentachlorophénol, le p-nitrophénol ou le 2,4dinitrophénol; ou un thiophénol tel que le thiophénol ou le pnitrothiophénol. Le groupe hydroxy de la sérine ou de la tyrosine peut éventuellement être protégé par estérification ou éthérification. Un groupe protégé par estérification est par exemple un groupe acétyle, un groupe benzoyle, benzyloxycarbonyle ou éthyloxycarbonyle. Un groupe protégé par éthérification est par exemple un groupe benzyle, tétrahydropyrannyle ou t-butyle. On peut protéger le groupe hydroxy à l'aide d'un groupe 2,2,2-trifluoro-1-t-butyloxycarbonylamino- éthyle ou un groupe 2,2,2-trifluoro-1-benzyloxycarbonyl- aminoéthyle. Toutefois, il n'est pas toujours nécessaire de protéger ces groupes hydroxy. Le groupe amino du radical guanidino de l'arginine peut être protégé par un groupe nitro, toluènesulfonyle, benzyloxycarbonyle ou méthylène-2sulfonyle. Toutefois, il n'est pas toujours nécessaire de protéger le groupe guanidino. Le groupe imino de l'histidine peut être protégé par un groupe benzyle, trityle, benzyloxycarbonyle, toluènesulfonyle, 2,2,2-trifluoro-1-t-butyloxycarbonyl- aminoéthyle ou un groupe 2,2,2-trifluoro-1-benzyloxy- 2497198 ' -6- carbonylaminoéthyle, mais le groupe imino ne demande pas toujours à être protégé. Le groupe mercapto de la cystéine peut être protégé par un groupe benzyle, p-méthoxybenzyle, p-nitrobenzyle, trityle, benzylthiométhyle, éthylcarbamoyle ou acéta- midométhyle. Le peptide(I) est synthétisé par condensation d'aminoacide ou de peptide inférieur. Ainsi par exemple, on fait réagir un aminoacide ou un peptide portant un groupe alpha-amino protégé et un groupe carboxyle terminal activé avec un aminoacide ou un peptide portant un groupe alpha-amino libre et un groupe carboxyle terminal protégé. On peut aussi faire réagir un aminoacide ou un peptide portant un groupe alpha- amino activé et un groupe carboxyle terminal protégé avec un aminoacide ou un peptide portant un groupe carboxyle terminal libre et un groupe alpha-amino protégé. Le groupe carboxyle peut être activé par exemple sous la forme d'un azide, d'un anhydride, d'un imidazolide ou d'un ester actif, par exemple par conversion en ester cyanométhylique, thiophénylique, p-nitrophénylique, p-nitrothiophénylique, p-méthane- sulfonylphénylique, thiodylique, 2,4-dinitrophénylique, 2,4,5trichlorophénylique, 2,4,6-trichlorophénylique, pentachlorophénylique, en ester de N-hydroxysuccinimide, en ester N-hydroxyphtalimidique, en ester de 8-hydroxy- quinoléine ou en ester de N-hydroxypipéridine, en carbodiimide, en N,N'carbonyldiimidazole ou en sel d'isoxazolium comme le réactif de Woodward. Les réactions de condensation qu'on préfère sont les réactions au carbodiimide, à l'azide, à l'ester -7- actif et à l'anhydride. A la réaction de condensation, on doit éviter avec soin une racémisation et les procédés préférés sont les procédés à l'azide, à l'ester actif, le procédé de WUnsch Z. Naturforsch., 216, 426 (1966)i ou le procédé de Geiger L Chem. Ber., 103, 788 (1970)], spécialement lorsqu'on utilise comme agent de condensation le N-éthyl-N'-3-diméthyl- aminopropyl-carbodiimide (WSCI). Le procédé selon l'invention est précédé par une réaction de condensation dans la séquence d'aminoacides de formule (I), et il est préférable de partir pour la synthèse du carbone terminal. L'h-PTH (53-84) protégkeest de préférence synthétisée par la méthode de Geiger modifiée avec utilisation de WSCI, avec condensation du fragment à carbone terminal -84 et du fragment à azote terminal 53-54. Le fragment à carbone terminal 55-84 est de préférence synthétisé par condensation du fragment 61-84 et du fragment 57-60 par la méthode de Geiger modifiée à l'aide de WSCI, en faisant suivre de la condensation du 56ème et du 55ème aminoacide par la méthode à l'ester actif puis en condensant le fragment 51-54 par la méthode de Geiger modifiée à l'aide de WSCI. Le fragment 6184 est de préférence synthétisé par condensation en séquence du fragment 72-84 et du 7lème, 70ème et du 69ème aminoacide, et du fragment 62-68 et du 6lème aminoacide par le procédé à l'ester actif ou par le procédé de Geiger modifié à l'aide de WSCI. Le fragment 62-68 est de préférence synthétisé par le procédé à l'azide avec condensation du fragment 64-68 et du fragment 62-63. Le fragment 7284 est de préférence synthétisé par la méthode de Geiger modifiée à l'aide de WSCI avec condensation du fragment 77-84 et du 76ème, 75ème et du 74eme aminoacide et 2497198 ' -8- du fragment 72-73. Le fragment 77-84 est de préférence synthétisé par la méthode de Geiger modifiée à l'aide de WSCI avec condensation du fragment 82-84 et du fragment 77-81. L'h-PTH (51-84) protégéeest de préférence synthétisée par condensation du fragment à carbone terminal 55-84 ci-dessus, et le fragment 51-54 par la méthode de Geiger modifiée à l'aide de WSCI. L'h-PTH (46-84) protégéeest de préférence synthétisée par condensation du fragment à carbone terminal 55-84 ci-dessus et du fragment à azote terminal 46-54 par la méthode de Geiger modifiée à l'aide de WSCI. Le fragment à azote terminal 46-54 est de préférence condensé par le procédé à l'azide avec le fragment 51-54 et le fragment 46-50. La (Tyr52) h-PTH (52-84) protégée est de préférence condensée par la méthode de Geiger modifiée à l'aide de WSCI avec l'h-PTH (53-84) protégé ci-dessus et la tyrosine 52ème. La (Tyr50) h-PTH (50-84) protégée est de préférence synthétisée par condensation de l'h-PTH (50-84) protégé ci-dessus et de la tyrosine 50ème par la méthode de Geiger modifiée à l'aide de WSCI. La (Tyr45) h-PTH (45-84) protégée et la (Cys45 h-PTH (45-84) protégée sont de préférence synthétisées par condensation de l'h-PTH (46-84) protégée ci-dessus, et du 45ème aminoacide correspondant par la méthode de Geiger modifiée à l'aide de WSCI. Dans la synthèse de peptides décrite ci-dessus, le groupe carboxyle du carbone terminal n'est pas toujours à protéger. Ainsi par exemple, dans la réaction de condensation par le procédé à l'azide, ou à l'ester actif, il n'est pas nécessaire de le protéger. Le groupe carboxyle peut être protégé par 2497198 ' -9- estérification par exemple sous la forme d'ester méthylique, éthylique ou benzylique. Un groupe ester, tel que le groupe ester méthylique peut être éliminé par une solution diluée d'hydroxyde de sodium ou par conversion en hydrazide, et le groupe ester benzylique peut être éliminé par le fluorure d'hydrogène anhydre ou par hydrogénation catalytique. Le groupe alpha-amino du peptide est protégé par un groupe protecteur classique, par exemple un groupe benzyloxycarbonyle, t-butoxy- carbonyle ou t-amyloxycarbonyle. Un groupe benzyloxy- carbonyle est éliminé par hydrogénation catalytique et les groupes tbutoxycarbonyle et t-amyloxycarbonyle sont éliminés par l'acide trifluoracétique. Les groupes protecteurs préférés sont: le groupe benzyle pour les groupes hydroxyle de la sérine et de la thréonine; le groupe 2,6-dichlorobenzyle pour le groupe hydroxyle de la tyrosine; le groupe o-chloro- benzyloxycarbonyle pour le groupe ú-amino de la lysine; le groupe toluènesulfonyle pour le groupe amino du radical guadinino de l'arginine; et le groupe p-méthoxybenzyle pour le groupe mercapto de la cystéine. Ces groupes protecteurs peuvent être éliminés à l'aide du fluorure d'hydrogène anhydride. On peut utiliser le groupe acétamidométhyle comme groupe protecteur pour le groupe mercapto de la cystéine. Comme ce groupe est stable au fluorure d'hydrogène anhydride, on l'élimine à l'aide de l'acétate mercurique à pH 4 au moment o l'on élimine les autres groupes. On obtient ainsi l'h-PTH (53-84) protégée,l'h-PTH (51-84) protégée, l'hPTH (46-84) protégée, la (Tyr52) h-PTH (52-84) protégée, la (Tyr 50) hPTH (50-84) protégée, la (Tyr45) h-PTH (45-84) protégée, et la (Cys45) hPTH (45-84) protégée. Les groupes protecteurs sont de préférence éliminés par des compositions à l'acide, par exemple par élimination en une seule opération 2497198 ' -10- à l'aide du fluorure d'hydrogène anhydre et on obtient alors le composé de formule (I). Lorsque le groupe mercapto de la cystéine en position 45 est protégé par un groupe acétamidométhyle, on peut l'éliminer par l'acétate mercurique à pH 4 après avoir éliminer les autres groupes protecteurs à l'aide du fluorure d'hydrogène anhydre. Le composé (I) ci-dessus peut être purifié par des techniques connues de purification des peptides. Ainsi par exemple, on peut le purifier par chromatographie sur une colonne de Sephadex LH-20 (produit du commerce), Sephadex G-50 ( produit du commerce), Dowex 1 (produit du commerce) ou de carboxyméthylcellulose. Le peptide (-I) peut être obtenu à l'état de base ou à l'état de sel. En général, on peut le conserver à l'état de sel d'un acide organique tel que l'acide acétique. Les peptides (I) selon l'invention, c'est-à-dire l'h-PTH (53-84), l'h-PTH (51-84}, l'h-PTH (46-84) et la (Cys 45) h-PTH (45-84) peuvent être utilisés pour la production d'anticorps et en tant que peptides marqués par une enzyme. L'h-PTH (46-84) et la (Cys45) h-PTH (45-84) présentent des avantages dans la préparation d'anticorps. Spécialement, l'h-PTH (53-84) et l'h-PTH (51-84) conviennent particulièrement à l'utilisation comme témoins pour la préparation d'anticorps. On utilise de préférence des peptides à azote terminal de tyrosine, c'est-à-dire (Tyr52) h-PTH (52-84), (Tyr50) h-PTH (50-84) et (Tyr45) h-PTH (45-84) pour des agents de marquage au RIT. Ainsi par exemple, on a ajouté (Tyr52) h-PTH (52-84) ou (Tyr50) h-PTH (50-84) et de la chloramine T à une fraction aliquote de 125I radioactive dans du tampon phosphaté 2497198 ' -11- (pH 7,4), on a agité, on a ajouté du bisulfite de sodium, on a encore ajouté une petite quantité d'iodure de potassium et de la sérum- albumine. On a recueilli les fractions marquées par 125I par chromatographie; on a ainsi obtenu le composé conjugué à 125I à reste de tyrosine, c'est-à-dire le composé marqué I-(Tyr52) h-PTH (52-84) et le composé marqué I-(Tyr50) h-PTH (50-84) qui peuvent être utilisés comme réactifs de RIT. On décrira maintenant le marquage par 125I et l'adsorption sur les matières du tube de réaction immunitaire à partir de (Tyr52) h-PTH (52-84) et (Tyr50) h-PTH (50-84) obtenues dans les exemples ci- dessus. (I) marquage par I: On ajoute une solution (10 pil) de (Tyr52) hPTH (52-84) (2 ig) ou (Tyr 50) h-PTH (50-84) (2 pg) et une solution de chloramine T (20 pg) (3,5 mg/ml) à 50 pl de tampon phosphaté 0,5 M, pH 7, 5, contenant 125I-NaI (radioactivité 2 mCi), on agite pendant 30 secondes et on arrête la réaction en ajoutant 50 pl d'une solution de bisulfite de sodium de 4,5 mlg/ml. On ajoute 0,5 ml d'une solution d'acide acétique 0, 1 N contenant 5 % de sérum-aibumine humaine et on fait passer sur une colonne (1 x 50 cm) de Sephadex G-25 pour filtration sur gel éliminant le 125I-NaI qui n'a pas réagi et donnant le composé marqué 125I-(Tyr52 h-PTH ( 52-84) et le composé marqué 125I-(Tyr50) h-PTH (50-84) (éluant: solution d'acide acétique 0,1 N contenant 0,5 % de sérum-albumine humaine). L'activité spécifique de la 125I-(Tyr52) h-PTH (52-84) et de la 125I-(Tyr 50) h-PTH (50-84) ainsi obtenues 2497198 ' -12- est respectivement de 523 et 545 pCi/pg, et les rendements sont respectivement de 75,5 % et 76,7 % Comparativement au marquage de h-PTH (1-34) ou de la PTH bovine (1-84) (produit extrait), l'activité spécifique est doublée et le rendement est multiplié par 3 à 4. (II) adsorption du composé marqué par 125I sur le tube de réaction immunitaire: On introduit dans un tube de réaction immunitaire d'une fraction aliquote (10,5 ml) de solution d'acétate d'ammonium 0,01 M (300 000 cpm) contenant 125I-(Tyr 52 h-PTH (52-84) ou 125I-(Tyr50) h-PTH (59-84) respec- tivement, on abandonne au repos pendant une durée constante, on retire le contenu, on lave avec un excès d'eau distillée et on compte la radioactivité subsistant dans le tube afin de déterminer l'adsorbance sur le tube de réaction. Les rapports d'adsorption de 125I-(Tyr52) h-PTH (52-84) sont de 33,1 % pour le tube en verre Pyrex (produit du commerce), 7,7 % pour le tube Eiken n 1 (produit du commerce), 5,0 % pour le tube Maruemu (article du commerce) et 0,5 % pour le tube Technicon (article du commerce). Les rapports d'adsorption de 125I-(Tyr50) h-PTH (50-84)sont de 30,8 % pour le tube en verre Pyrex, de 8,1 % pour le tube Eiken n l, de 5,5 % pour le tube Maruemu et 0,4 % pour le tube Technicon. Le rapport d'adsorption du témoin 125I-PTH bovine (1-84) est de 58,4 % pour le tube en verre Pyrex, de 15,7 % pour le tube Eiken n l, de 12,2 % pour le tube Maruemu et de 4,5 % pour le tube Technicon. -13- Le rapport d'adsorption est calculé à l'aide de l'équation suivante: rapport d'adsorption radioactivité restante (cpm)00 rapport d adsorpton (%) radioactivité additionnelle (cpmn) (III) stabilité: (a) on conserve 125I-(Tyr52) h-PTH (52-84) et I-(Tyr50) h-PTH (50-84) à -20 C pendant 2 jours, 18 jours, 31 jours ou 60 jours respectivement et on procède à une filtration sur gel de Sephadex G-50 (colonne: 1 x 30 cm, éluant: tampon d'acétate d'ammonium 0,1 M). On observe les radioactivités aux positions correspondant à (Tyr52) h-PTH (52-84) et (Tyr50) h-PTH (50-84) et on constate qu'elles sont tout à fait stables. (b) activités après adsorption de 125I-(Tyr52) h-PTH (52-84) et 125I(Tyr50) h-PTH (50-84) sur talc en poudre; elles sont de 92 à 98 % immédiatement après adsorption; après 2 jours, 18 jours, 31 jours et 61 jours à -20 C, on ne constate pas de diminution des activités après adsorption. La PTH humaine ou son fragment à carbone terminal peut être dosée par EIT par utilisation d'un peptide de formule (Ia) ou un peptide de formule (Ib) (ci-après en abrégé peptide (Ia) et peptide (Ib) respectivement). Les réactifs nécessaires pour doser la PTH par EIT comme l'antisérum, l'anticorps ou le composé marqué par une enzyme, sont préparés de la manière suivante: Pour obtenir un anticorps spécifique par utilisation du peptide (Ia), soit tel quel, soit conjugué avec une protéine, telle que la BSA ou la BSA traitée par un alkali ou par du laurylsulfate de sodium et du mercaptoéthanol,qui sert à couper le groupe disulfure -14- à l'intérieur de la molécule, on administre le peptide à des mammifères tels que le lapin, le rat, le cobaye, la souris pour sensibilisation. Ainsi par exemple, l'on mélange le peptide (Ia) ci-dessus ou son composé de conjugaison avec une protéine, avec de l'adjuvant complet de Freund, on administre par injection sous- cutanée 4 à 7 fois à intervalle de 2 semaines pour sensibiliser les mammifères. On recueille le sérum des animaux sensibilisés et on les traite de la manière habituelle, par exemple on centrifuge pour obtenir l'antisérum. L'antiséruin contenant de fortes concentrations de l'anticorps spécifique peut être conservé tel quel et peut être utilisé sous forme de dilutionsaliquotes. On peut également purifier l'anticorps spécifique par des techniques classiques telles que le relargage, la précipitation au point d'isoélectrique, la dialyse, la chromatographie ou la filtration sur gel. On peut obtenir le peptide (Ia) conjugué avec une protéine en utilisant des réactifs polyfonctionnels par exemple un aldéhyde, tel que l'aldéhyde succinique, l'aldéhyde glutarique ou l'aldéhyde adipique, le diisocyanate tel que l'hexaméthylène-diisocyanate ou le 2,4-toluène-diisocyanate, le 3(2'-benzothiazolyl-dithio) propionate-succinimide-ester (demande de brevet japonais publiée sous la n 55-17302), l'ester de succinimide de l'acide 6-NZ3-(2'-benzothiazolyl-dithio) propionyl] caproique et le N-/2-(2'-pyridyl-dithio) éthyl2-3-(2'- benzothiazolyl-dithio) propionamide (demandes de brevet japonais publiées sous les n 55-94367, n 55-133382, et n 55-136261), le maléimide-benzoate-succinimide- ester, le N,N'-éthylène-bis-maléimide, la bis-diazobenzi- dine et le malonimidate de diéthyle. Ces réactifs 2497198 ' -15- polyfonctionnels peuvent être choisis en tenant compte des groupes fonctionnels du peptide (Ia) ou de la protéine, par exemple des groupes amino, carboxyle ou thiol. Le composé conjugué peptide (Ia)-protéine qu'on préfère est préparé à partir de (Cys45) h-PTH (45-84) du peptide (Ia) et d'un réactif polyfonctionnel de 3-(2'-benzothiazolyl-dithio) propionate-succinimide- ester qui fixe le groupe thiol de Cys45. Les proportions préférables pour la conjugaison sont d'une mole d'une protéine telle que la BSA pour 1 à 20 moles du peptide (Ia). Dans la réaction, le peptide (Ia) est ajouté à un milieu aqueux à pd 7-8. on ajoute ensuite le réactif polyfonctionnel pour faire réagir en maintenant à température ambiante pendant 1 à 5 heures et on purifie par filtration sur gel. On ajoute de la BSA, on fait réagir à température ambiante pendant 1 à 5 heures et on purifie par une des techniques classiques de filtration sur gel et de dialyse; on obtient ainsi le peptide (Ia) conjugué avec la BSA. L'anticorps spécifique ci-dessus est fixé sur un support immobilisé, par exemple un support de protéine immobilisée telle que l'albumine ou la gélatine, un polymère semi-synthétique immobilisé comme l'agarose, la cellulose ou la dextrine traitée par l'épichlorhydrine ou un bromocyanate, un polymère ou copolymère de l'acrylonitrile, de l'acide acrylique, d'ester acrylique, de métacrylates, d'ester métacrylique, de l'alcool vinylique, de l'acétate de vinyle, de l'aminostyrène, de l'acrylamide ou de l'éthylène, au moyen du réactif polyfonctionnel ci-dessus. 2497198 ' -16- Comme exemples d'enzymes pouvant servir à la préparation du peptide (Ib) marqué par une enzyme à i'EIT, on citera des oxido-reductase, des hydrolases, des transferases, des lyases, des isomérases ou des ligases, par exemple lactate-deshydrogénase, malate deshydrogénase, une deshydrogénase de l'acide malique, une maltose deshydrogénase, une lactate oxidase, une malate oxydase, une glucose oxydase, une choline oxydase, une xanthine oxydase, une oxydase d'aminoacide, une sarcosine oxydase, une catalase, une a-amylase, une e-galactosidase, la lysozyme, une lipase, une phosphatase alcaline, une amino peptidase, la trypsine, la papa!ne, l'a-chymotrysine, une ainidase, une hexo- kinase et une glycérokinase. De préférence, on introduit au préalable dans l'enzyme un "espaceur". Ainsi par exemple, on peut utiliser un dialdéhyde comme l'aldéhyde glutarique, un dérivé réactif comme le chlorure de l'acide w-amino acétique, une diamine; ainsi on peut fixer par l'intermédiaire d'un dialdéhyde ou d'un acide dicarboxylique et d'hexaméthylènediamine ou de décaméthylènediamine, utiliser l'anhydride S-acétyl- mercapto succinique et fixer un dialdéhyde et le 2-aminoéthane-thiol. Les groupes aldéhyde, amino ou thiol peuvent être introduits à l'aide des réactifs d'intro- duction d'espaceursdécrits ci-dessus. On peut obtenir un produit de conjugaison peptide (Ib)-enzyme en conjugant le peptide (Ib) et un groupe amino, hydroxy, carboxyle ou thiol dans l'enzyme, ou en introduisant un groupe aldéhyde, amino, thiol dans l'enzyme, ou en introduisant un groupe aldéhyde, amino, thiol ou carboxyle............................ en utilisant un réactif polyfonctionnel. On décrit ci-après dans un mode de réalisation particulier la préparation du produit de conjugaison peptide (Ib)-enzyme marqué par une enzyme. Ainsi par exemple, on fait réagir le peptide (1b) avec un réactif polyfonctionnel à une température de 0 à 40'C en présence d'un solvant organique tel que le méthanol, l'éthanol, l'acétone, le dioxane, le diméthylsulfoxyde, le diméthyl- acétamide ou le tétrahydrofuranne dans un tampon (pH 6 à 8) ou directement dans le solvant organique. De préfé- rence, on utilise le peptide (Ib) et le réactif poly- fonctionnel en proportion équimoléculaire. Après la réaction, on purifie le produit de réaction, si c'est nécessaire, et on fait réagir l'enzyme avec ce produit, de préférence dans un tampon au pH de stabilité de l'en-. zyme. L'enzyme est de préférence utilisée en quantité équimoléculaire ou légèrement en excès. On obtient ainsi le produit de conjugaison peptide (Ib)-enzyme qu'on peut purifier par chromatographie d'adsorption ou filtration sur gel. Dans l'invention, on peut utiliser pour le dosage d'h-PTH des techniques variées et classiques d'EIT. On citera par exemple la méthode par compétition ou la méthode en sandwich. On décrit maintenant en détail la méthode par compétition. On soumet l'échantillon contenant l'h-PTH à doser, le peptide (Ib) marqué par une enzyme et l'anti- sérum ou l'anti-corps du peptide (Ia) à incubation dans un milieu pour réaction immunitaire telle que du tampon au phosphate ou du tampon au véronal à une température de 4 à 5 C pendant un à trois jours. On sépare ensuite la partie fixée par immunologie (fixée: B) et la partie libre, non fixée (libre: F) (séparation B-F). La sépa- ration B-F est de préférence réalisée par addition de sérum normal du même mammifère qui a servi pour la pré- paration de l'anti-sérum, et de son anti-sérum, l'incuba- tion pendant une nuit puis centrifugation à 3000 tours/mn. pendant 20 à 30 minutes pour la séparation B-F. On détermine ensuite l'activité enzymatique du composé marqué par l'enzyme qui a précipitée (B) ou celle du liquide sur- nageant (F). Dans une technique en phase solide on utilise un anti-corps immobilisé pour une réaction compétitive à la place de l'anti-sérum ou de l'anti-corps du peptide (Ia) dans la méthode par compétition ci-dessus puis après réaction on procède à la séparation B-F et on détermine l'activité enzymatique comme décrit ci-dessus. On peut appliquer, avec des réactifs appropriés, l'autre méthode classique appelée méthode en sandwich. On peut doser l'h-PTH ou son fragment à carbone terminal en utilisant l'anti-corps du peptide (Ia) et le peptide (Ib) marqués par une enzyme, avec une bonne exac- titude et dans des conditions simples. De préférence, on utilise pour le dosage de la (Cys 45)h-PTH(45-84) marquée par de la P-galactosidase. Dans le présente demande, on a utilisé des abréviations dont la signification est donnée ci-après: BOC: t-butoxycarbonyle, AOC: tamyloxycarbonyle, PAC: ester phénacylique, Z-Cl: o-chlorobenzyloxy- carbonyle, Bzl: benzyle, Tos: toluènesulfonyle, Val: L-valine, OMe: ester méthylique, OEt: ester éthylique, ONP: ester p-nitrophényle, OBzl: ester benzylique, Cys: L-cystéine, OSU: ester du N-hydroxy- succinimide, Ser: L-sérine, Asn: acide L-aspartique, Leu: L-leucine, MeOH: méthanol, Arg: L-arginine, Ala: L-alanine, Lys: L-lysine, BuOH: butanol, Tyr: L-tyrosine, TosoH: acide p-toluène- sulfonique, TFA: acide trifluoro- acétique, Thr: L-thréonine, Glu: acide L-glutamique, Pro: L-proline, Asp: acide L-aspartique, Gly: glycine, Gln: L-glutamine, His: L-histidine, EtOH: éthanol, NMP: N-méthyl-2-pyrrolidone, Et3N: triéthylamine, éther: éther diéthylique, DMF: diméthylformamide, THF: tétrahydrofuranne, TBA: tribenzylamine, NMM: N'-méthylmorpholine, HOBT: 1-hydroxybenzotriazc WSCI: N-éthyl-N'-diméthyl- aminopropyl-carbodi- imide, Les exemples qui suivent illustrent l'invention sans toutefois en limiter la portée; dans ces exemples les indications de parties et de pourcentages s'entendent en poids sauf mention contraire. D'autre part, on a utilisé à la chromatographie sur couche mince (CCM) le support et les solvants révé- lateurs ci-après: Support: gel de silice G. Révélateurs: 1. Chloroformeméthanol-acide acétique, (95:5:3) 2. - -, (85:15:5) 3. - -, (85:10:5) 4. " - " - " (80:25:2) 5. benzène-acétate d'éthyle, (1: 1) 6. " - ", (2 : 1) 1ole, 7. Chloroforme-éthanol-acétate d'éthyle, (5:2:5) 8. i _- - ", (10:1:5) Support: Cellulose Merck. Révélateurs: 9. butanol-pyridine-acide acétique-eau, (2:2:2:3) 10. t - l " -, (1:1:1:2) L'analyse des aminoacides est réalisée de la manière suivante: On hydrolyse l'échantillon dans HCl 6N (si c'est nécessaire, on ajoute de l'anisole pour un peptide protégé) à 110'C pendant 24 à 45 heures au tube scellé et on sèche le produit d'hydrolyse sous vide: Exempile 1. * h - P TH ( 5 3 - 8 4); H - Lys - Lys - Glu - Asp -Asn - Val.- Leu - Val - Glu - Ser -His - Glu - Lys - Ser -Leu - Gly - Glu - Ala -Asp - Lys - Ala - Asp - Val - Asp - Val - Leu - Thr - Lys - Ala -Lys - Sec - Gin -OH (1) P(83-84): BOC-Ser(Bzl)-Gln-OBzl (1). On dissout 181,4 g (0,242 M) de BOC-Gln-OBzl dans 270 ml de TFA et on agite à température ambiante pendant 45 minutes. Après distillation du TFA sous vide on ajoute de l'éther au résidu et on recueille le préci- pité. On redissout le précipité dans 270 ml de DMF et on ajoute 32,67 g (0,242 M) d'HOBT, 67,35 g (0,242 M) de BOC-Ser(Bzl)-OH et 44,29 ml (0,242 M) de WSCI puis on agite pendant une nuit. On distille le DMF, on redissout le résidu dans 440 ml d'acétate d'éthyle, on lave par HCl N, du bicarbonate de sodium à 5 % et de l'eau. On sèche la solution sur sulfate de sodium anhydre et on filtre puis on sèche sous vide. La recristallisation dans le mélange acétate d'éthyl-hexane donne 101,43 g soit 81,7 % de la substance (1). p.f.: 12 - 123 C CCM: Rf7 = 0,75 (_)D = 14,12 (c = 1,0, DMF) D Analyse élémentaire (C27H3507N9): C% H% N% trouvé 62,98 7,03 8,01 calc. 63,14 6,87 8,18 (2) P(82 - 84): BOC-Lys(Z-C1) -Ser(Bzl)-Gln-OBzl (2): On ajoute 440 ml de TFA à 98,87 g (192,5 mM) de la substance (1) et on agite à température ambiante pendant 30 minutes. On distille le TFA sous vide. On redissout le résidu dans 330 ml de DMF. On traite 28,6 g d'HOBT, une solution dans le DMF de BOC-Lys(Z-C1)-OH [BOC-Lys(Z-Cl)-OH.TBA (103, 33 g, excès 1,1 molaire) par l'acétate d'éthyl-HC1-N. On sèche la couche d'acétate d'éthyle sur sulfate de sodium anhydre puis on évapore sous vide et on ajoute 38,72 ml (excès 1,1 molaire) de WSCI. On agite le mélange à température ambiante pendant deux jours. On distille le DMF sous vide et on ajoute de l'eau glacée au résidu puis on recueille le précipité formé. On recristallise trois fois dans le mélange éthanol-hexane. On obtient la substance (2) avec un rendement de 111,06 g soit 71,2 %. CCH: Rf = 0,32, Rf7 = 0,76 p.f.: 145 - 147 C ()27= _13,1 (c = 1,0, DMF) 2497198 ' Analyse élémentaire (C41H52010N5Cl): C% H% N% trouvé 61,02 6,65 8,74 calc. 60,77 6,47 8,65 (3) P(80 - 81): BOC-Lys(Z-C1) -Ala-OMe (3): On met en suspension 234,24 g de BOC-Lys(Z-C1)- OH.TBA dans l'acétate d'éthyle, on lave par HC1 N et de l'eau et on sèche sous sulfate de sodium anhydre. On évapore la suspension sous vide et on redissout dans 400 ml de DMF. On ajoute 67,0 g de H-Ala-OMe.HCl, 64,8 g d'HOBT et 87,84 ml de WSCI et on agite à température anbiante pendant une nuit. On distille le DMF sous vide et on redissout le résidu dans 2 litres d'acétate d'éthyle, on lave par du bicarbonate de sodium à 5 %, HC1 N et l'eau. Après séchage sur sulfate de sodium, on évapore la solution sous vide. La recristallisation dans le mélange acétate d'éthyle-hexane donne 231,8 g soit un rendement de 96,6 % de la substance (3) fondant à 58,60 C. CCM: Rf1 = 0,77 ()27 = -17,16 (c = 1,0, DMF) Analyse élémentaire (C23H3407N3Ci): C% H% N% trouvé 54,96 6,78 8,56 calc. 55,25 6,85 8,40 (4) P(79 - 81): BOC-Thr(Bzl)Lys(Z-C1)-Ala-OMe (4): On introduit 174,99 g (0,35 M) de la substance (3) dans 500 ml de TFA et on agite à température ambiante pendant 50 minutes. On distille le TFA sous vide. On redissout le résidu dans l'acétate d'éthyle et on lave par du bicarbonate de sodium à 5 % et de l'eau. On sèche la solution sur sulfate de sodium anhydre et on évapore sous vide. On redissout le résidu dans 400 ml de DMF. On ajoute 49,95 g (excès 1,05 molaire) d'HOBT, 114,33 g (excès 1,05 molaire) de BOC-Thr(Bzl)-OH et 67,7 ml (excès 1,05 molaire) de WSCI et on agite à température ambiante pendant une nuit. On élimine le DMF sous vide et on ajoute de l'eau glacée au résidu. On recueille le pré- cipité et on recristallise dans l'éthanol chaud; on obtient 99,31 g de la substance (4). On concentre les liqueurs-mères sous vide. On redissout le résidu dans le chloroforme et on lave quatre fois par du bicarbonate de sodium à 5 %, deux fois par HC1 N et deux fois à l'eau. Après séchage sur sulfate de sodium anhydre, on évapore la solution sous vide. On purifie le résidu par chromatographie sur une colonne de gel de silice (éluant, chloroformeéthanol-acide acétique, 5:1:5); on obtient 35,09 g de la substance (4). Les fractions contenant des impuretés seront utilisées dans la prochaine opération de purification par chromatogra- phie sur colonne. On introduit 22,5 g (45 mM) de la substance (3) dans 70 ml de TFA et on agite à température ambiante pendant 45 minutes. On élimine le TFA sous vide et on redissout le résidu dans 50 ml de DMF, on règle à pH 7 par addition de NMM. On ajoute 6,68 g (excès 1,1 molaire) d'HOBT, 15,31 g (excès 1,1 molaire) de BOC-Thr(Bzl)-OH et 9,06 ml (excès 1,1 molaire) de WSCI et on agite pendant une nuit. Après distillation du DMF sous vide, on re- dissout le résidu dans 200 ml de chloroforme et on lave par du bicarbonate de sodium à 5 %, HC1 N et l'eau. On sèche la solution sur sulfate de sodium anhydre et on évapore sous vide. On mélange le résidu avec les fractions précédentes contenant des impuretés et on purifie par chromatographie sur une colonne de gel de silice. On évapore la fraction appropriée sous vide, on reprécipite deux fois par le mélange chloroformne-hexane; on obtient 48,80 g soit un rendement total de 183,2 g de la substance (4) fondant à 132 - 134 C. CCM: Rf7 = 0,85 Analyse élémentaire (C34H4709N4Cl): C% H% N% trouvé 59,06 7,05 7,41 calc. 59,08 6,85 8,11 (5) P(77 - 78): BOC-Val-LeuOEt (5): On dissout 101,99 g (0,47 M) de BOC-Val-OH, 91,98 g (0,47 M) de H-Leu-OEt.HCl, 63,45 g d'HOBT et 86,01 ml (0,47M) de WSCI dans 400 ml de THF et on agite pendant une nuit. On distille le THF sous vide, on dissout dans 400 ml d'acétate d'éthyle et on lave par du bicar- bonate de sodium à 5 %, HC1 N et de l'eau. Apres séchage sur sulfate de sodium anhdyre, on évapore sous vide. La recristallisation dans le mélange acétate d'éthyle-hexane donne 153,7 g soit un rendement de 91,2 % de la substance (5) fondant à 108 - 110 C. CCM: Rf1 = 0,63 (27 = -25,78 (c = 1,0, DMF) Analyse élémentaire (C18H3405N2): C% H% N% trouvé: 60,35 9,42 8,39 calc.: 60,31 9,56 7,82 (6) P(77 - 78): BOC-ValLeu-OH (6): 134,43 g (0,375 M) de la substance (5) en solution dans 400 ml d'éthanol on ajoute 412,5 ml (excès 1,1 molaire) de NdOH N en refroidissant à la glace et on agite pendant 1,5 heure. On agite enicore 37,5 g (excès 0,1 molaire) de NaOH N et on agite pendant encore 1 heure. On règle à pH 5 à addition de 75 ml d'HCl N. On lave la solution à l'éther. On ajoute 400 ml d'HC1 N à la couche aqueuse et on extrait par l'acétate d'éthyle. Apres séchage de la couche d'acétate d'éthyle, on l'évapore et on recristallise dans le mélange acétate d'éthyle-hexane; on obtient 119,66 g soit un rendement de 96,6 % de la substance (6). CCM: Rf1 = 0,35, Rf7 = 0,58 Analyse élémentaire (C16H3005N2): C% H% N% trouvé 57,83 9,40 8,78 calc. 58,16 9,15 8,48 (7) P(77 - 81): BOC-Val-LeuThr(Bzl)-Lys(Z-C1)-Ala-OMe (7): On ajoute 182 g, 0,263 M, de la substance (4) à 500 ml de TFA et on agite à température ambiante pendant minutes. On distille le TFA et on ajoute de l'hexane au résidu. On sépare la substance huileuse qui précipite par décantation et on la redissout dans 350 ml de TMF régléeà pH 6,5 par addition de NMM. On ajoute 42,61 g (excès 1,2 molaire) d'HOBT, 104,28 g (excès 1,2 molaire) de la substance (6) et 57,8 g (excès 1,2 molaire) de WSCI et on agite à température ambiante pendant 1,5 heure. Le mélange de réaction commence à se solidifier et il est impossible d'agiter; on ajoute alors 200 ml de DMF puis on laisse reposer une nuit à température ambiante et 4 heures à C. On ajoute de l'eau glacée au mélange de réaction et on recueille le précipité; on le redissout dans 2,5 litres de chloroforme et on lave par du bicarbonate de sodium à %, HC1 N et de l'eau. On distille le chloroforme sous vide et on recristallise le résidu dans le mélange chloroforme- éther-hexane; on obtient 224,68 g soit un rendement de 94,9 % de la substance (7) fondant à 219 - 221 C. CCM: Rf1 = 0,15, Rf8 = 0,68 ()27 = -11,72 (c = 1,0, DMF) Analyse élémentaire (C45H670 11N6C1) C% H% N% trouvé: 59,80 7,56 9,83 calculé: 59,82 7,48 9,30 (8) P(77 - 81): BOC-ValLeu-Thr(Bzl)-Lys(Z-C1)-Ala-OH (8): On ajoute 800 ml d'une solution N de KOH dans l'éthanol à 90 % en refroidissant à la glace, à 72,3 g (80 =M) de la substance (7) dissoute dans 720 ml de chloroforme et on agite entre 0 et 5 C pendant 40 minutes. On ajoute 800 ml d'HC1 N en refroidissant à la glace et on extrait par 500 ml de chloroforme. On lave la couche chloroformique à l'eau, on sèche sur sulfate de sodium anhydre et on évapore sous vide. On purifie le résidu par chromatographie sur une colonne de gel de silice (éluant: chloroforme-éthanol-acétate d'éthyle, (5:1:5). On sèche la fraction appropriée sous vide et on recristallise trois fois dans le miélange chloroforme-méthanol-éther-hexane; on obtient la substance (8). Les opérations ci-dessus ont été répétées trois fois pour l'hydrolyse de 216,9 g de la substance (7); on a obtenu 156,07 g, soit un rendement de 73,1 % de la substance (8) fondant à 180-183 C. CCM: Rf3 = 0,69 327 = 7,54 (c = 1,0 DMF) Analyse élémentaire: CC44H65011N6C. H2 [C4465 i 6 2 H20]7 C% H% N% trouvé 58,94 7,67 9,64 calculé 58,82 7,40 9,35 Analyse des amninoacides (échantillon de 3,1 mg/ml HC1 6 N + 0,1 ml d'anisole, hydrolyse à 110 C pendant 45 heures): Thr 0,96 (1), Ala 1, Val 0,93 (1), Leu 0,94 (1), Lys 1,01 (1). (9) P(77-84): BOC-Val-Leu-Thr(Bzl)-Lys (Z-C1)-Ala-Lys(Z-Cl)Ser(Bzl)-Gln-OBzl (9): On introduit 104,5 g (129 mM) de la substance (2) dans 400 ml de TFA et on agite à température ambiante pendant 40 minutes. On distille le TFA sous vide et on ajoute de l'éther au résidu. On recueille le précipité et on le redissous dans 500 ml de DMF. On ajoute 20,9 g (excès 1,2 molaire) d'HOBT, 137,7 g (excès 1,2 molaire) de la substance (8) et 28,3 ml (excès 1,2 molaire) de WSCI, on règle à pH 7 par addition de NMM et on agite pendant une nuit. Le mélange de réaction gélifie; on ajoute alors 150 ml de DMF et 12,8 ml de WSCI et on agite pendant une nuit. On ajoute de l'eau glacée au mélange de réaction, on recueille le précipité et on le lave 5 fois au méthanol chaud; on obtient 185,36 g soit un rendement de 90,68 % de la substance (9): CCM: Rf2 = 0, 85 i2 D = 12,84 (c = 1,0 DMF) analyse élémentaire: C80H107018N11C12 C% H N% trouvé 60,61 7,04 10,38 calculé 60,75 6,82 9,74 Analyse des aminoacides (échantillon de 3,1 mg/ml d'HCl 6 N + 0,1 ml d'anisole, hydrolyse à 110 C pendant 45 heures): Thr 0,93 (1), Ser 0,91 (1), Glu 1,01 (1) Ala 1, Val 0,74 (1), Leu 0,75 (1), Lys 2,01(2). (10) P(76-84): BOC-Asp(OBzl)-Val-Leu-Thr(Bzl)- Lys(Z-Cl)-Ala-Lys(Z-Cl)-Ser(Bzl)- Gln-OBzl (10): On introduit 183,5 g (116 mM) de la substance (9) dans 500 ml de TFA et on agite pendant 65 minutes à température ambiante puis on distille le TFA. On ajoute de l'éther au résidu, on recueille le précipité et on le redissous dans 900 ml de DMF. On ajoute 18,8 g (excès 1,2 molaire) d'HOBT, 45,0 g (excès 1,2 molaire) de BOC-Asp(OBzl)-OH et 25,5 ml (excès 1,2 molaire) de WSCI, on règle à pH 7 par NMM, et on agite à température ambiante pendant une nuit. On distille le DMF sous vide et on ajoute de l'eau glacée au résidu. On recueille le précipité et on le lave 2 fois par le méthanol chaud. On redissout les insolubles dans le DMF chaud et on ajoute de l'éthanol. On recueille le précipité, on le met en suspension et on le filtre; on obtient 205,5 g soit un rendement de 99,14 % de la substance (10) fondant à 259-262 C. CCM: Rf2 = 0,81 ZJ27 = 13,7 (c = 1,0 DMF) Analyse élémentaire (C 91Hl18 021N112): 2 C% H% N% trouvé 61,01 6,84 9,54 calc. 61,16 6,66 9,41 (11) P (75 - 84): BOC-ValAsp(OBzl)-Val-Leu-Thr(Bzl)-Lys (Z-C1)-Ala-Lys(Z-Cl)-Ser(Bzl)-Gln-OBzl (11) : On introduit 196,55 g (0,11 M) de la substance (10) dans 500 ml de TFA, on agite à température ambiante pendant une heure puis on distille le TFA sous vide. On ajoute de l'éther au résidu, on recueille le précipité et on le dissout dans 1,3 litre de DMF. On ajoute sous agitation 19,3 g (excès 1,3 molaire) d'HOBT, 31,1 g (excès 1,3 molaire) de BOC-Val-OH et 26,2 ml (excès 1,3 molaire) de WSCI, on règle à pH 7 par NMM et on agite à température ambiante. Au bout d'une heure, le mélange gélifie; on laisse reposer une nuit. On ajoute 400 ml de NMP, 20,2 g de 2,4- dinitrophénol et 26,2 ml (excès 1,3 molaire) de WSCI. Le mélange gélifie en 10 minutes environ; on abandonne au repos pendant une nuit. On ajoute de la glace à une solution de bicarbonate de sodium à 5 %. On recueille le précipité, on lave trois fois à l'eau et quatre fois à méthanol chaud; on obtient 203,74 g soit un rendement de 98,2 % de la substance 61) fondant à 267 - 270 C. CCM: Rf3 = 0,56 analyse élémentaire (C96H127022N13C 2 H20): C% H% N% trouvé 60,25 6,78 9,82 calculé 60,55 6,83 9,56 analyse des aminoacides (échantillon de 3,1 mg/ml d'HCl 6N + 0,1 ml d'anisole, hydrolyse de 48 heures à 110 C): 2 4 97198 Asp 1,04 (1), Thr 0,83 (1), Ser 0,78 (1), Glu 1,03 (1), Ala 1,08 (1), Leu 1, Val 1,87 (2), Lys 2,19 (2). (12) P(74 - 84): BOC-Asp(OBzl)-Val-As(OBzl)-Val-Leu-Thr (Bzl)-Lys(Z-Cl)Ala-Lys(Z-Cl)-Ser(Bzl)-Gln-OBzl (12): On dissout 151,2 g (0,08 M) de la substance (11) dans 100 ml de chlorure de méthylène et on ajoute sous agitation 450 ml de TFA; on agite à température ambiante pendant 40 minutes puis on élimine le TFA sous vide. On ajoute de l'éther au résidu. On redissout le précipité par addition de 500 ml de DMF et 1 litre de NMP. On ajoute de la glace et du bicarbonate de sodium à 5 %. On recueille le précipité qui s'est formé, on le lave à l'eau et on le sèche. On redissout la matière dans un mélange de 500 ml de DMF et 1 litre de NMP et on ajoute 44,0 g (excès 1,3 molaire) de BOC-Asp(OBzl)-OSU, 1,4 g (excès 0,13 molaire) d'HOBT et 11,4 ml (excès 1,3 molaire) de NMM puis on agite à température aoibiante pendant une nuit. On coule le mélange de réaction dans l'eau glacée, on recueille le précipité qui s'est formé, on ajoute du méthanol et on traite à chaud. On répète cette opération deux fois; on obtient 157,6 g de la substance (12) soit un rendement de 94,2 %. CCM: Rf3 = 0,56 Analyse élémentaire (C107H 135025N14 C2) C% H% N% trouvé 61,35 6,66 9,90 calc. 61,45 6,65 9,38 Analyse des aminoacides (HC1 6N/anisole, 110 C, 48 heures): Asp 1,86 (2), Thr 0,87 (1), Ser 0,71 (1), Glu 1,01 (1), Ala 1,00 (1), Val 1,91 (2), Leu 1, Lys 2,01 (2). (13) P(72 - 73): BOC-Lys(Z-Cl)-Ala-OH (13): On ajoute à 0 C 9115,2 ml (excès 1,2 molaire) de NaOH N à 48,0 g (96 ml) de la substance (3) dissoute dans 100 ml d'éthanol et on agite pendant 50 minutes. On règle à pH 6 par 19 ml d'HC1 N et on distille l'éthanol à 35 C. On extrait le résidu par l'acétate d'éthyle, de l'eau glacée et 96 ml d'HC1 N. On lave la couche d'acétate d'éthyle à l'eau, on sèche sur sulfate de sodium anhydre et on évapore sous vide. La recristallisation du résidu dans le mélange acetate d'éthyle-hexane donne 45,90 g soit un rendement de 98,4 % de la substance (13) fondant à 116 - 119 C. CCM: Rf7 = 0,44 analyse élémentaire (C22H3207N3C1): C% H% N% trouvé 54,57 6,91 8,95 calculé 54,37 6,64 8,65 (14) P(72 - 84): BOC-Lys(Z-Cl)-Ala-Asp(OBzl)-Val-Asp(OBzl)- Val-Leu-Thr(Bzl) -Lys(ZC1)-Ala-Lyz(Z-Cl)-Ser-Bzl)-Gln-OBzl (14): On ajoute 60 ml de chlorure de méthylène et 360 ml de TFA à 125,46 g (60 mM) de la substance (12), on agite à température ambiante pendant 55 minutes puis on distille le TFA. On ajoute de l'éther au résidu et on recueille le précipité. On redissout par addition de 600 ml de DMF et 600 ml de NMP. On ajoute de la glace et du bicarbonate de sodium à 5 %. On recueille la substance qui est précipitée, on la lave trois fois à l'eau puis au méthanol et à l'éther et on sèche. On redissout la matière par 1200 ml de NMP et 600 ml de DMF. On ajoute 10,56 g (excès 1,3 molaire) d'HOBT, 37,92 g (excès 1,3 molaire) de la substance (13) et 14,28 g (excès 1,3 molaire) de WSCI et on agite à température ambiante pendant trois jours. On coule le mélange de réaction dans l'eau glacée, on recueille le précipité, on lave trois fois à l'eau puis deux fois au méthanol chaud. On lave à nouveau par l'éther et on sèche; on obtient 142,74 g soit un rendement de 96,7 % de la substance (14). Analyse élémentaire (C124H161 029N27 C3 C% H% N% trouvé 60,30 6,79 9,70 calc. 60,54 6,60 9,68 analyse des aminoacides (HC1 6N/anisole, 110 C, 48 heures): Asp 1,86 (z), Tbr 0,85 (1), Ser 0,67 (1), Glu 1,02 (1), Ala 1,90 (2), Val 1,93 (2), Leu 1, Lys 2,93 (3). (15) P(71 - 84): BOC-Asp(OBzl)-Lys(Z-Cl)-Ala-Asp(OBzl)-Val- Asp(OBzl)-Val-Leu-Thr(Bzl)-Lys(Z-Cl)-Ala-Lys(Z-C1) -Ser (Bzl)-Gln-OBzl (15): On introduit la substance (14) dans 420 ml de TFA, on agite à température ambiante pendant 55 minutes et on distille le TFA sous vide. On ajoute de l'éther au résidu, on recueille le précipité puis on redissout par 720 ml de NMP et 720 ml de DMF. On coule le mélange sur glace et sur une solution de bicarbonate de sodium à 5 %, on recueille le précipité, on lave trois fois à l'eau puis une fois au méthanol et à l'éther. On redissout la matière par 840 ml dé NMP et 840 ml de DMF. On ajoute 0,732 g (excès 0,14 molaire) d'HOBT, 11,93 g (excès 1,2 molaire) de 2,4-dinitrophénole,3,18 g (excès 1,2 molaire) de BOC-Asp(Bzl)-OSU et 5,94 ml (excès 1,4 molaire) de NMM et on agite à température ambiante pendant deux jours. On redissout la matière en ajoutant au mélange de réaction 120 ml de NMP et 60 ml de DMF. On ajoute 4,56 g (excès 0, 2 molaire) de BOC-Asp(OBzl)-OSU et 1,19 ml (excès 0,2 molaire) de NMM et on agite à température ambiante pendant deux jours. On coule le mélange de réaction dans l'eau glacée, on recueille le précipité et on lave à l'eau puis au méthanol chaud. Après refroidissement, on filtre le précipité. On répète l'opération trois fois; on obtient 136,72 g soit un rendement de 95,0 % de la substance (15). Analyse élémentaire (C135H1720 32N18c3) C% H% N% trouvé 60,33 6,55 9,76 calculé 60,83 6,51 9,46 Analyse des aminoacides (HC1 6N/anisole, 110 C, 48 heures): Asp 2,60 (3), Thr 0,83 (1), Ser 0,65 (1), Glu 1,00 (1), Ala 1,81 (2), Val 1,92 (2), Leu 1, Lys 2,85 (3). (16) P(70 - 84): BOC-Ala-Asp(OBzl)-Lys(Z-Ci)-Ala-Asp (OBzl)-Val-Asp(OBzl)Val-Leu-Thr(Bzl)-Lys(Z-Cl)-Ala-Lys (Z-C1)-Ser(Bzl)-Gln-OBzl (16): On introduit la substance (15) dans 325 ml de TFA, on agite à température ambiante pendant 70 minutes puis on distille le TFA sous vide. On ajoute de l'éther à résidu. On recueille le précipité et on le redissout dans 600 ml de NMP et 600 ml de DMF puis on ajoute du bicarbone de sodium à 5 %. On recueille le précipité et on lave trois fois à l'eau et une fois au méthanol. On redissout le précipité dans 720 ml de NMP et 720 ml de DMF. On ajoute 9,0 g de 2,4-dinitrophénol, 0,55 g (excès 0,1 molaire) d'HOBT, 17,52 g (excès 1,5 molaire) de BOC-Ala-OSU et 6,72 ml (excès 1,5 molaire) de NMM et on agite à température ambiante pendant une nuit. On ajoute encore 2, 34 g de BOC-Ala-OSU et 0,9 ml de NMM et on agite à température ambiante pendant cinq jours. On coule le mélange de réaction dans l'eau glacée, on recueille le précipité, on lave trois fois à l'eau et deux fois au méthanol; on obtient 109,78 g soit un rendement de 98,3 % de la substance (16) fondant ' plus de 280 C (décomposition). Analyse des aminoacides (HC1 6N/anisole, 110 C, 48 heures): Asp 2,57 (3), Thr 0,84 (1), Ser 0,67 (1), Glu 1,00 (1), Ala 2,53 (3), Val 1,98 (2), Leu 1, Lys 2,79 (3). (17) P(69 - 84): BOC-Glu(OBzl)-Ala-Asp(OBzl)-Lys(Z-C1)-Ala- Asp(OBzl)-Val-Asp(OBzl) -Val-Leu-Thr(Bzl)-Lys(Z-C1)-Ala-Lys (Z-C1)Ser(Bsl)-GlnooBzl (17): On introduit 85,38 g (31,2 mM) de la substance (16) dans 280 ml de TFA, on agite à température ambiante pendant une heure puis on distille le TFA. On ajoute de l'éther au résidu, on recueille le précipité, on le redissout par addition de 540 ml de DMF et 540 ml de NMP et on ajoute la solution à un mélange de bicarbonate de sodium à 5 % et de glace. On lave le précipité trois fois à l'eau et une fois au méthanol. On le redissout dans 600 ml de DMF et 780 ml de NMP. On ajoute 6,89 g (excès 1,2 molaire) de 2,4-dinitrophénol, 0,59 g (excès 0, 14 molaire) d'HOBT, 18,97 g (excès 1,4 molaire) de BOC-Glu (OBzl)-OSU et 4,8 ml (excès 1,4 molaire) de NLM et on agite à température ambiante pendant trois jours. On ajoute 2,71 g (excès 0,2 molaire) de BOC-Glu(OBzl) -OSU en solution dans 60 ml de DMF et 50 ml de NMP, et 0,64 ml (excès 1,4 molaire) de NMM et on agite encore trois jours à température ambiante. On ajoute les mêmes quantités de BOC-Glu(OBzl)-OSU et NMM et on agite à température ambiante pendant une nuit. On coule le mélange de réaction dans l'eau glacée, on recueille le précipité qui s'est formé et on le lave trois fois à l'eau. On met le préci- pité en suspension dans du méthanol chaud, on refroidit et on filtre. On répète cette opération trois fois et on obtient 88,97 g soit un rendement de 96,5 % de la substance (17). Analyse des aminoacides (HC1 6N/anisole, 110 C, 24 heures): Asp 2,66 (3), Thr 0,91 (1), Ser 0,78 (1), Glu 1,76 (2), Ala 2,65 (3), Val 1,97 (2), Leu 1, Lys 2,88 (3). (18) P(66 - 68): BOC-Ser(Bzl)-Leu-Gly-OBzl (18): On ajoute goutte à goutte 33,69 ml de WSCI à 45,64 g de BOC-Leu-OH.H20, 61,87 g de H-Gly- OBzl.TosOH et 24,87 g d'HOBT en solution dans 200 ml de THF, en refroidissant, et on agite à température ambiante pendant une nuit. On concentre le mélange de réaction sous vide; on obtient une substance huileuse qu'on redissout dans 600 ml d'acétate d'éthyle; on lave trois fois avec du bicarbonate de sodium à 5 %, trois fois avec HC1 N et trois fois à l'eau. On sèche la couche organique sur sulfate de sodium anhydre et on évapore sous vide; on obtient 69,0 g soit un rendement de 99 % d'une substance huileuse qu'on redissout dans 10 ml de chlorure de méthylène; on ajoute 250 ml de TFA à 5 C et on agite à température ambiante pendant 20 minutes. On distille le TFA sous vide, on ajoute 200 ml de DMF au résidu et on neutralise par addition de NMM à 0 C. On ajoute 20,7 g (O,19 M) d'HOBT, 56 g (0,19 M) de BOC-Ser(Bzl)-OH et 34,8 ml (0,19 M) de WSCI et on agite à température ambiante pendant une nuit. On élimine le DMF sous vide, on ajoute de l'acétate d'éthyle au résidu puis on lave avec du bicar- bonate de sodium à 5 %, HC1 N et de l'eau. Après séchage sur sulfate de sodium anhydre, on concentre le mélange sous vide. On ajoute de l'hexane au résidu et on filtre le précipité. La recristallisation dans le mélange acétate d'éthyle-hexane et le mélange acétate d'éthyle- éther-hexane donne 72,47 g (rendement 72,0 %) de la substance (18) fondant à 112 - 113 C. CCM: Rf5 = 0,55 Analyse élémentaire (C30Hi4107N3): C% H% N% trouvé 65,06 7,75 7,36 calc. 64,84 7,44 7,56 (19) P(65 - 68): BOC-Lys(ZCl)-Ser(Bzl)-Leu-Gly-OBzl (19): On ajoute 250 ml de TFA à 5 C à 72,47 g (0,13 M) de la substance (18) en solution dans 20 ml de chlorure de méthylène et on agite à température ambiante pendant 20 minutes. On élimine le TFA sous vide et on ajoute de l'éther au résidu. On recueille le précipité et on ajoute du DMF. On neutralise la solution à 5 C par addition de NMM. On ajoute 200 ml d'acétate d'éthyle à g (0,143 M) de BOC-Lys(Z-C1)-OH.TBA et on lave deux fois avec HC1 N et avec de l'eau. On sèche la couche d'acétate d'éthyle sur sulfate de magnésium anhydre et on concentre sous vide. A la substance huileuse obtenue on ajoute 100 ml de DMF; on obtient ainsi une solution de BOC-Lys(Z-Cl)-OH dans le DMF. A cette solution neutralisée dans le DMF on ajoute 19,3 g d'HOBT, la solution de BOC-Lys(Z-Cl)-OH dans le DMF et 26,2 ml (0,143 M) de WSCI et on agite à température ambiante pendant une nuit. On distille le DMF sous vide, on ajoute 400 ml d'acétate d'éthyle au résidu et on lave trois fois avec du bicarbonate de sodium à 5 %, deux fois avec HC1 N et deux fois à l'eau. On sèche la couche organique sur sulfate de magnésium anhydre et on concentre sous vide. On ajoute au résidu de l'éther et de l'hexane, on recueille le précipité et on le recristallise dans le mélange acétate d'éthyle- méthanol-hexane; on obtient 104 g soit un rendement de 2497 1 98 94,6 % de la substance (19) fondant à 128 - 130 C. CCM: Rf1 = 0,51, Rf2 = 0,88 analyse élémentaire (C44H58010N5Cl): C% H% N% trouvé 61,96 7,02 7,91 calc. 62,00 6,86 8,22 Analyse des aminoacides ( 1 "M/HC1 6N 0,3 ml, 105 C, heures): Ser 0,92 (1), Gly 0,98 (1), Leu 1, Lys 0,99 (1). (20) P(65 - 68): BOC-Lys(Z-C1)-Ser(Bzl)-Leu-Gly-OY (20): On ajoute 600 ml de méthanol à 85,3 g de la substance (19), on introduit sous agitation à 5 C 120 ml de NaOH N puis on agite à température ambiante pendant 3 heures. Apres addition de 20 ml d'HC1 N à 5 C, on distille le méthanol sous vide. A la solution aqueuse du résidu on ajoute à 5 C 100 ml d'HCl N et on extrait par 500 ml de chloroforme. On lave la couche chloroformique à l'eau, on sèche sur sulfate de sodium anhydre et on concentre sous vide. On ajoute de l'hexane au résidu, on recueille le précipité et on recristallise dans l'acétate d'éthyle; on obtient 66,21 g soit un rendement de 87 % de la substance (20) fondant à 156 - 158 C. CCM: Rf2 = 0,63 Analyse élémentaire (C37H52010N5Cl): C% H% N% trouvé: 58,49 6,95 9,09 calc.: 58,30 6,88 9,19 Analyse des aminoacides (1, uM/0,3 ml d'HCl 6N, 105 C, heures): Ser 0,92 (1), Gly 0,97 (1), Leu 1, Lys 0,99 (1). (21) P(64 - 68): BOC-Glu(OBzl)-Lys(Z-Cl)-Ser(Bzl)-Leu-Gly- OH (21): On ajoute 300 ml de chlorure de méthylène à 66,2 g (87 mM) de la substance (20), on ajoute 250 ml de TFA à 5 C et on agite à température ambiante pendant heures. On distille le TFA sous vide et on ajoute de l'éther au résidu. On recueille le précipité et on le rédissout dans 100 ml de DMF en neutralisant par addition de NMM à 5 C. En raison de la formation d'un précipité, on ajoute encore 500 ml de DMF. On ajoute 50 g (113 mM) de BOC-Glu(OBzl)-OSU et 1,53 g (11,3 ml) d'HOBT, on neutralise par NMM- et on agite a température ambiante pendant une nuit. On élimine le DMF sous vide et on coule le résidu dans l'eau. On lave le précipité à l'eau et on sèche. On recristallise deux fois dans l'acétone-mréthanol; on obtient63,85 g soit un rendement de 73,5 % de la substance (21) fondant à 165 - 167 C (décomposition). CCM: Rf4 = 0,72 Analyse élémentaire (C49H65014N6Cl): C% H% N% trouvé: 59,61 6,76 8,31 calc.: 59,00 6,57 8,42 Analyse des aminoacides (0, 927 mg/0,3 ml d'HCl 6N, 105 C, 24 heures): Ser 0,92 (1), Glu 0,99 (1), Gly 0,97 (1), Leu 1, Lys 0,99 (1). (22) P(62 - 63): BOC-Ser(Bzl)-His- NHNH2 (22): On ajoute 150 ml de THF, 31,5 g (0,13 M) de H-His-Oe.2HCl et 17,6 g (0,13 M) d'HOBT à 37 g (0,125 M) de BOC-Ser(Bzl)-OH. On ajoute encore 23,8 ml (0,13 M) de WSCI puis 150 ml de DMF et on agite à température ambiante pendant une nuit. On ajoute encore 4,4 g d'HOBT et 6 ml de WSCI et on agite à température ambiante pendant une nuit. On distille les solvants sous vide. On redissout la substance huileuse résiduelle dans l'acétate d'éthyle et on lave trois fois par une solution de bicarbonate de sodium à 5 % puis à l'eau. Après séchage sur sulfate de magnésium anhydre, on concentre. On ajoute de l'hexane au résidu, on recueille le précipité et on recristallise dans un mélange acétate d'éthyle-éther-hexane; on obtient 46,1 g de BOC-Ser(Bzl)-His-OMe brut (CCM:Rf3 = 0,56). On dissout 44,6 g de ce produit dans 300 ml de DMF. On ajoute 100 ml d'hydrate d'hydrazine à 100 % et on agite à température ambiante pendant une nuit. On élimine le DMF sous vide. On extrait le résidu huit fois par l'acétate d'éthyle et on lave les extraits par une petite quantité d'eau puis on sèche sur sulfate de magnésium anhydre. On concentre la solution sous vide, on ajoute de l'hexane au résidu et on recueille le précipité qu'on purifie par chromatographie sur gel de silice (éluant: chloroformeméthanol-acétate d'éthyle, :0 a 1:5). On recueille les fractions correspondantes, on sèche sous vide et on recristallise dans une petite quantité de benzène-hexane. Après repos à la glacière, on recristallise les cristaux à deux reprises dans un mélange acétate d'éthyle-méthanolhexane; on obtient la substance (22) fondant à 125 - 129 C. CCM: Rf4 = 0,70, Rf7 = 0,14 analyse élémentaire (C21H3005N6): C% H% N% trouvé: 56,30 6,98 18,54 calculé: 56,49 6,57 8,42 (23) P(62 - 68): BOCSer(Bzl)-His-Glu(OBzl)-Lys(Z-Cl)-Ser (Bzl)-Leu-Gly-OH (23): On ajoute 52 ml d'une solution d'HCl 4,32 N dans le dioxane et 20 ml d'isoamylnitrile à 33,. g de la substance (22) en solution dans 200 ml de DMF à -50 C et on agite pendant 10 minutes à -20 C. On ajoute 31,6 ml d'Et3N à -50 C. On ajoute 20 ml de chlorure de méthylène à 63,85 g (64 mM) de la substance (21). On ajoute encore à 5 C 200 ml de TFA et on agite à température ambiante pendant 50 minutes. On distille le TFA sous vide, on ajoute de l'éther à la substance huileuse résiduelle et on recueille le précipité qui s'est formé; on le redissout dans 200 ml de DMF et on neutralise par NMM à 5 C. On ajoute la solution dans le DMF neutralise à la solution traitée cidessus par la triéthylamine et on agite à la glacière pendant une nuit puis à température ambiante pendant une nuit. On élimine le DMF sous vide et on redissout le résidu dans le méthanol. On coule la solution dans l'eau, on lave le précipité à l'eau et on le sèche. On recristallise dans le mélange DMF-éther, on lave deux fois au méthanol; on obtient 59,16 g soit un rendement de 60,1 % de la substance (23) fondant à 209 - 213 C (décomposition). CCM: Rf4 = 0,66 analyse élémentaire (C65H83017N10Cl): C% H% N% trouvé: 59,43 6,58 10,67 calc.: 59,51 6,38 10,68 Analyse des aminoacides (1,549 mg/0,5 ml d'HCl 6N, 105 C, 21 heures): Ser 1,82 (2), Glu 1,01 (1), Gly 0,98 (1), Leu 1, Lys 1,01 (1), His 0,94 (1). (24) P(62 - 84): BOC-Ser(Bzl)-His-Glu(OBzl)-Lys(Z-Cl)-Ser (Bzl) -Leu-Gly-Glu(OBzl)-Ala-Asp(OBzl)-Lys(Z-Cl)-Ala-Asp(OBzl)- Val-Asp(OBzl)-Val-Leu-Thr(Bzl)-Lys(Z-Cl)-Ala-Lys(Z-Cl)-Ser (Bzl)-Gln-OBzl (24): On ajoute 250 ml de TFA à 75,35 g (25,5 mM) de la substance (17) et on agite à température ambiante pen- dant une heure. On élimine le TFA sous vide et on ajoute de l'éther au résidu. On recueille le précipité et on le redissout dans 500 ml de NMP et 500 ml de DMF. On coule le mélange de réaction dans un mélange glacebicarbonate de sodium à 5 %, on recueille le précipité et on le lave à l'eau et au méthanol. On redissout le précipité dans 1 litre de NMP et 1 litre de DMF, on ajoute 5,61 g (excès 1,2 molaire) de 2,4-dinitrophénol, 4,08 g (excès 1,2 molaire) d'HOBT, 40,16 g (excès 1,2 molaire) de la substance (23) et 5,6 ml (excès 1,2 molaire) de WSCI et on agite à température ambiante pendant 4 jours. On coule le mélange de réaction dans un mélange bicarbonate de sodium à 5 % - glace et on recueille le précipité qu'on làve à l'eau, au méthanol chaud puis deux fois au méthanol; on obtient 93,53 g soit un rendement de 88,4 % de la substance (24). Analyse des aminoacides: Asp 2,6 7 (3), Thlr0,S 1 (1), Ser 1,3 7 (3),Glu 2,5 9 (3),Gly 0,7 6 (1), Ala 2,6 8 (3),Val 2,Leu 1,7 4 (2), Lys 3, 66 (4), His 0, 6 6 (1) ( 2 5) P ( f 1 - 8 4); B O C- Glu(OBzi) - Ser(Bzl) - His - Glu(OBzl) - Lys (Z-C.) - Scr (Bzl) - Leu - Gly - Glu(OBz1i) - Ala - Asp(OBzl) - Iys (Z-Ct) - A,1e -Asp(OBzl) - Val - Asp(OBzl) - Val - Leu - Tlir(Bzil) - Lys(Z-Ct) - Ala - Lys(Z-Ct) - Ser (Bzl) - Gin - OBzl C25) On ajoute 150 ml de TFA à 41,5 g (10 mM) de la substance (24), on agite à température ambiante pendant 1 heure et on élimine le TFA. On ajoute de l'éther au résidu, on recueille le précipité qu'on redissout dans 300 ml de DMF et 500 ml de NMP. On coule la solution dans un mélange bicarbonate de sodium à 5 % - glace, on recueille le précipité, on le lave à l'eau et au méthanol. On le redissout dans 700 ml de DMF et 600 ml de NMP. On ajoute 2,2 g (excès 1,2 molaire) de 2,4-dinitrophénol, 6,08 g (excès 1, 4 molaire) de BOC-Glu(OBzl)-OSU, 0,23 g (excès 0,14 molaire) d'HOBT et 1, 52 ml (excès 1,4 molaire) de NMM et on agite à température ambiante pendant une nuit. On ajoute 0,87 g (excès 9,2 molaire) de BOC-Glu(OBzl)- OSU et 0,22 ml (excès 0,2 molaire) de NMM et on agite encore pendant une nuit. On coule le mélange de réaction dans un mélange glace-bicarbonate de sodium à 5 %, on recueille le précipité, on lave à l'eau puis au méthanol. On redissout le précipité dans 700 ml de DMF et 600 ml de NMP. On ajoute 2,2 g (excès 1,2 molaire) de 2,4- dinitrophénol, 6,08 g (excès 1,4 molaire) de BOC-Glu(OBzl)- OSU et 0,23 g (excès 0,14 molaire) d'HOBT et 1,52 ml (excès 1,4 molaire) de NMM et on agite à température ambiante pendant une nuit. On ajoute encore au mélange de réaction 0,87 g (excès 0,2 molaire) de BOC-Glu(OBzl)- OSU et 0,22 ml (excès 0,2 molaire) de NMM et on agite pendant une nuit. On coule le mélange de réaction sur un mélange glace-bicarbonate de sodium à 5 %, on recueille le précipité, on le lave avec soin à l'eau puis à trois reprises avec du méthanol chaud; on obtient 40,7 g soit un rendement de 93,2 % de la substance (25). Analyse des aminoacides (HC1 6N/anisole, 110 C, 48 heures): 2 4 97198 Asp 2,66 (3), Thr 0,85 (1), Ser 1,56 (3), Glu 3,14 (4), Gly 0,71 (1), Ala 2,65 (3), Val 2, Leu 1,73 (2), Lys 3,67 (4), His 0,63 (1). (26) p(59 - 60): BOC-Leu-Val-OBzl (26): On ajoute 100 ml d'acétate d'éthyle à 17,8 g (47 mM) de H-Val-OBzl.TosDH, on lave avec du bicarbonate de sodium à 5 % et de l'eau, on sèche sur sulfate de sodium anhydre et on élimine l'acétate d'éthyle. On redissout le résidu dans 100 ml de DMF, on ajoute 11,7 g (56,4 mM) de BOC-Leu-OH.H20, 9,3 g (excès 1,2 molaire) d'HOBT et 10,3 ml (excès 1,3 molaire) de WSCI et on agite à température ambiante pendant une nuit. On élimine le DMF, on redissout le résidu dans 300 ml d'acétate d'éthyle et on lave avec du bicarbonate de sodium à 5 %, HC1 N et de l'eau. Après séchage sur sulfate de sodium anhydre, on évapore la solution sous vide. On recristallise le résidu dans le mélange acétate d'éthyle- hexane; on obtient 17,55 g soit un rendement de 88,8 % de la substance (26). CCM: Rf = 0,85 (27) P(58 - 60): BOC-Val-Leu-Val-OBzl (27): On ajoute 50 ml de TFA à 17,2 g (41 mM) de la substance (26), on agite à température ambiante et on élimine le TFA. On ajoute de l'éther au résidu, on recueille le précipité qu'on redissout dans 60 ml de DMF. On ajoute 7,7 g (excès 1,2 molaire) d'HOBT, 1,07 g (excès 1,2 molaire) de BOC-Val-OH et 9, 0 ml (excès 1,2 molaire) de WSCI, on règle à pH 7 par addition de NMM puis on agite à température ambiante pendant une nuit. On élimine le DMF, on redissout le résidu dans 300 ml d'acétate d'éthyle et on lave par du bicarbonate de sodium à 5 %, HCl N et de l'eau. On sèche la solution sur sulfate de sodium anhydre et on évapore sous vide. On recristallise le résidu à deux reprises dans le mélange acétate d'éthyle-hexane; on obtient 17,38 g soit un rendement de 81,6 % de la substance (27) fondant à 149 - 152 C. CCM: Rf5 = 0,82 (2)2 = -32,36 (c = 1,0, DMF) analyse élémentaire (C28H4506N3): C% H% N% trouvé: 64,80 8,81 8,20 calc.: 64,71 8,73 8,09 (28) P(57 - 60): BOC-AsnVal-Leu-Val-OBzl (28): On ajoute 50 ml de TFA à 17,15 g (33 mM) de la substance (27), on agite à température ambiante pen- dant 25 minutes et on élimine le TFA. On ajoute de l'éther au résidu, on recueille le précipité et on le redissout dans 100 ml de DMF. On ajoute 0, 62 g (excès 0,14 molaire) d'HOBT et 16,32 g (excès 1,4 molaire) de BOCAsn-ONP, on règle à pH 7 par addition de NMM puis on agite à température ambiante pendant deux jours. On élimine le DMF sous vide et on coule le résidu dans un mélange bicarbonate de sodium à 5 % - glace. On redissout le précipité dans le chloroforme et on lave par du bicarbonate de sodium à 5 % et de l'eau. On sèche la solution sur sulfate de sodium anhydre et on évapore sous vide. On recristallise le résidu deux fois dans un mélange éthanol-éther; on obtient 13,82 g soit un rendement de 79,5 % de la substance (28). CCM = Rf2 = 0,70 analyse élémentaire (C32H5108N5): C% H% N% trouvé: 60,83 8,19 11,09 calc.: 60,64 8,11 11,05 (29) P(57 - 60): BOC-AsnVal-Leu-Val-OH (29): On dissout 13,2 g (25 mM) de la substance (28) dans 50 ml d'éthanol et 60 ml de DMF. On ajoute 1 g de palladium à 5 % sur carbone et on hydrogène pendant 3 heures. On filtre le catalyseur et on concentre le filtrat sous vide. On recristallise le résidu deux fois dans un mélange éthanol-éther; on obtient 9,70 g soit un rendement de 71,4 % de la substance (29). * CCM: Rf2 = 0,56 Analyse des aminoacides: Asp 1,02 (1), Val 1,95 (2), Leu 1 (1). Analyse élémentaire (C25H4508N5): C% H% N% trouvé: 55,02 8,13 13,06 calc.: 55,23 8,34 12,88 (30) P(57 - 84): BOC-Asn-Val-Leu-Val-Glu(OBzl)-Ser(Bzl)-His- Glu(OBzl)-Lys(Z-Cl)-Ser(Bzl)-Leu-Gly-Glu(OBzl)-Ala-Asp(OBzl)- Lys(Z-Cl)-Ala-Asp(OBzl)-Val-Asp(OBzl)-Val-Leu-Thr(Bzl)- Lys(Z-Cl)-Ala-Lys(Z-Cl)-Ser(Bzl)-Gln-OBzl (30): On ajoute 150 ml de TFA à 39,75 g (9,1 mM) de la substance (25) et on agite à température ambiante pen- dant 60 minutes. On élimine le TFA et on ajoute de l'éther au résidu; on recueille le précipité qu'on redissout dans 600 ml de DMF et 600 ml de NMP. On coule la solution dans un mélange glace-bicarbonate de sodium à 5 %, on filtre le précipité et on le lave trois fois à l'eau et une fois au méthanol. On le redissout dans 1,2 litre de NMP et 1,2 litre de DMF. On ajoute 1,60 g (excès 1,3 molaire) d'HOBT, 2,18 g (excès 1,3 molaire) de 2, 4-dinitrophénol, 6,43 g (excès 1,3 molaire) de la substance (29) et 4,32 ml (excès 2,6 molaires) de WSCI et on agite à température ambiante pendant deux jours. On ajoute encore 0,99 g (excès 0,2 molaire) de la substance (29) en solution dans 100 ml de DMF et on agite à température ambiante pendant une nuit. On coule le mélange de réaction dans un mélange bicarbonate de sodium à 5 % - glace, on recueille le précipité, on le met en suspension dans 100 ml de DMF et on chauffe. Après refroidissement du mélange, on filtre les insolubles. - On traite ensuite ces insolubles par du méthanol et de l'éthanol à chaud comme décrit ci-dessus; on obtient 42,25 g soit un rendement de 97,2 % de la substance 30). Analyse des aminoacides: Asp 3,34 (4), Thr 0,93 (1), Ser 1,60 (3), Glu 3, 24 (4), Gly 0,85 (1), Ala 3, Val 3,39 (4), Leu 2,58 (3), Lys 4,24 (4), His 0,79 (1). (31) P(56 - 84): B O G - Asp(0OBzl)- Asn - Val - Leu - Val - Glu(OBzl)- Ser(Bzl) - His - Glu(C)Bzl) - Lys (Z-Ct) - Ser(Bzl)- Leu Gy - Gl-Glu (OBz1) - Ala -Asp(OBzI) - Lys(Z-- Cú)-Ala - Asp(UBzl) - Val -Asp( OBzl) - Val - Leu-Thr (Bzl)-Lyvs (Z- Cú) - Ala -Lys (Z--C)-Se r (Bz 1) -G4, In - OLBZIC313 On ajoute 150 ml de TFA à 28,7 g (6mM) de la substance (30) et on agite à température ambiante pendant 50 minutes. On élimine le TFA et on ajoute de l'éther au résidu. On recueille le précipité et on sèche sur NaOH pendant une nuit. On redissout le préci- pité dans 300 ml de DMF et 500 ml d'HMP. On ajoute 0,16 g (excès 0,2 molaire) d'HOBT et 5,4 g (excès 2 molaires)de BOC-Asp(OBzl)-OSU, on règle à pH 7,0 par addition de NMM et on agite à température ambiante pendant une nuit. On ajoute encore 2,50 g (quantité équimoléculaire) de BOC-Asp(OBzl)-OSU et on agite pendant une nuit. On coule le mélange de réaction dans l'eau glacée, on recueille le précipité, on lave à l'eau puis on ajoute du méthanol et on traite à chaud. Après refroidissement, on filtre l'insoluble. On répète ces chauffages trois fois; on obtient 27,75 g soit un rendement de 92,5 % de la substance (31). Analyse des aminoacides: Asp 4,00 (5), Thr 0,92 (1), Ser 1,69 (3), Glu Gly 0,81 (1), Ala Leu 2,62 (3), Lys 0,62 (1). 3,57 (4), 3, Val 3,22 (4), 4,12 (4), His (32) 1'1 M P ( 5 5 - 8 '1) C - (f u ((Iz I 5 -- Asp (013 z I)-As - Va - Leu -V; I -- Glu(OBzl) - Ser(13zl) - Ilis - Gtiu(O Bzl) - Lys(Z-Ce) - Ser (Bzl) - Ieut - Gly - Gu (OBzl) - Ala - Asp(OBzl) - Lys (Z-C-O) - Ala - Asp(OBz I)-N'Va --Asp(O Bzl) - Val - Leu - Thr(Bz I) Lys (Z-C.)- Ala - Lys(Z-C_) - Se r (Bz l) - Gin - OBz 1 C32 On ajoute 150 ml de TFA à 27,50 g (5,5 mM) de la substance (31) et on agite à température ambiante pendant 55 minutes. On élimine le TFA, on ajoute de l'éther au résidu, on recueille le précipité et on sèche sur NaOH pendant 2 jours. On redissout le précipité dans 300 ml de DMF et 500 ml de NMP. On ajoute 1,01 g (quantité équimoléculaire) de 2,4-dinitrophénol, 0,11 g d'HOBT (excès 0,15 molaire) et 3,10 g (excès 1,3 molaire) de BOC-Glu(OBzl)-OSU et on agite à température ambiante pen- dant une nuit. On ajoute encore 3,10 g (excès 1,3 molaire) de BOCGlu(OBzl)-OSU et on agite pendant 2 jours. On coule le mélange de réaction dans un mélange glace - bicarbonate de sodium à 5 %. On lave le précipité à deux reprises avec du bicarbonate de sodium à 5 % et à trois reprises à l'eau. On ajoute du méthanol au précipité, au chauffe, on laisse refroidir et on filtre les insolubles. On répète ce traitement à la chaleur trois fois; on obtient 26,77 g soit un rendement de 93,3 % de la substance (32). Analyse des aminoacides: Asp 4,11 (5), Thr 0,92 (1), Ser - 1,59 (3), Glu 3,99 (5), Gly 0,83 (1), Ala 3, Val 3,28 (4), Leu 2,49 (3), Lys 4,08 (4), His 0,71 (1). (33) P(53 - 54): BOC-Lys(Z-Cl)-Lys(Z-Cl)-PAC (33): On met en suspension 36,6 g (75 nmM) de BOC- Lys(Z-Cl)-OH.TBA dans 300 ml d'acétate d'éthyle, on lave avec un mélange glace - HC1 N puis avec de l'eau. On sèche la couche d'acétate d'éthyle sur sulfate de sodium anhydre, on évapore sous vide et on redissout dans 50 ml de DMF On ajoute 19,40 g de bromure de phénacyle et 13,60 ml (excès 1,3 molaire) d'Et3N et on agite à température ambiante pendant 4 heures. On ajoute au mélange de réaction 3,68 g (excès 0,5 molaire) d'acétate de sodium en solu- tion dans 500 ml d'acétate d'éthyle puis on lave trois fois avec du bicarbonate de sodium à 5 % de l'HCl N et de l'eau respectivement. On sèche la couche d'acétate d'éthyle sur sulfate de sodium anhydre et on évapore sous vide. On purifie le résidu par chromatographie sur une colonne de gel de silice (éluant: benzène-acétate d'éthyle, 2:1) en recueillant les fractions présentant une valeur de Rf1 = 0,77 à la CCM qu'on évapore sous vide. On recristallise le résidu dans le mélange étherhexane, on obtient 23,46 g soit un rendement de 60,5 %, de BOC-Lys(Z-Cl)-PAC fondant à 52 - 54 C. CCM: Rf1 = 0,86 On ajoute 60 ml de TFA à 20,68 g (40 mM) de ce produit et on agite à température ambiante pendant minutes. On élimine le TFA, on ajoute de l'éther au résidu, on recueille le précipité et on le redissout dans ml de DMF (ci-après "solution A dans le DMF"). On met en suspension 23,42 g (excès 1,2 molaire) de BOC-Lys(Z-Cl)-OH.TBA dans 200 ml d'acétate d'éthyle, on lave par 200 ml d'un mélange glace-HCl 1 N et 100 ml d'eau. Après séchage de la couche d'acétate d'éthyle sur sulfate de sodium anhydre, on évapore sous vide. On redissout la substance huileuse dans 50 ml de DMF (ci-après "solution B dans le DMF"). On ajoute la solution B dans le DMF, 6,48 g (excès 1,2 molaire) d'HOBT et 8,78 ml (excès 1,2 molaire) de WSCI à la solution A dans le DMF, on règle à pH 7 par addition de N1iM et on agite à température ambiante pendant une nuit. On élimine le DMF sous vide, on redissout le résidu dans 500 ml d'éther et on lave trois fois par du bicarbonate de sodium à 5 %. On ajoute à la couche éthérée 300 ml d'acétate d'éthyle, on lave deux fois par HC1 N et trois fois à l'eau. On sèche la couche organique sur sulfate de sodium anhydre et on concentre sous vide. La recristallisation du résidu à trois reprises dans l'éther donne 18,73 g soit un rendement de 57,5 % de la substance (33) fondant à 72-75 C. Analyse élémentaire (C41H50 ioN4Cl,) C% H% N% trouvé: 59,22 5,98 6,81 calculé: 59,35 6,07 6,75 (34) P(53 - 54): BOCLys(Z-Cl)-Lys(Z-Cl)-OH (34): On dissout 4,07 g (5 mM) de la substance (33) dans 30 ml d'acide acétique, on ajoute 20 g de poudre de zinc et 30 ml d'acide acétique et on agite à température ambiante pendant 1,5 heure. On sépare la poudre de zinc et on concentre le filtrat afin d'éliminer l'acide acétique. On redissout le résidu dans 100 ml d'éther et on extrait trois fois par 70 ml de bicarbonate de sodium à 5 %. On règle la couche aqueuse à pH 2 par addition d'HCl N enrefmidissant à la glace puis on extrait par l'acétate d'éthyle. On lave la couche d'acétate d'éthyle à l'eau, on sèche sur sulfate de sodium anhydre et on concentre sous vide. La recristallisation du résidu dans le mélange éther-hexane donne 3,08 g soit en rendement de 85,8 % de la substance (34) fondant à 59-62 C. CCM: Rf2 = 0,45 Analyse élémentaire (C33H4409N4C12) C% H% N% trouvé: 55,58 6,40 7,58 calculé: 55,69 6,23 7,87 (35) P(53 - 84): B O C - Lys (Z-Ct)- Lys(Z-Ct) - Glu(OBzl) - Asp(OBzl)- Asn- Val - Lcu - Val - Glu(OBzl)- Ser(B13zl) - -is - Glu(O013zl) - Lys( Z-Ct) - Ser (Bzl) - Lcu - (Iy - (lu (013 z I) - A la1 - Asp (OI Z) -Lys (Z-St) - A! a - Asp(Oizl) - Val -1Asp()Z I)- -\'a - lC l - Th r (Bz) - Ly s(Z-Ce) - Al a - lys(Z-Ct) - S r (lz) --Gin 13z l [3.5J On ajoute 50 ml de TFA à 7,83 g (1,5 mM) de la substance (32) et on agite à température ambiante pendant 55 minutes. On élimine le TFA, on ajoute de l'éther au résidu, on recueille le précipité et on le redissout dans 150 ml de DMF et 150 ml de NMP. On ajoute 0,41 g (excès 2, 0 molaire) d'HOBT, 2,13 g (excès 2,0 molaire) de la substance (34) et 0, 55 ml (excès 2,0 molaire) de WSCI et on agite à 5-100C pendant trois jours. On coule le mélange de réaction dans de l'eau glacée, on recueille le précipité, on lave à l'eau et on chauffe avec du méthanol. Apres refroidisse- ment, on filtre les insolubles. On répète ce traitement à la chaleur 3 fois; on obtient 8,31 g soit un rendement de 95,3 % de la substance (35). Analyse des amino-acides: Thr 0,92 (1),Ser 1,60 (3) Glu 4,06 (5), Gly 0, 85 (1), Ala 3,00 (3), Val 3,33 (4), Leu 2,48 (3), Lys 5,41 (6), His 0,70 (1). (36) h-PTH (53 - 84): a) On ajoute 3,49 g (0,6 mM) de la substance (35) et 3 ml d'anisole à 25 ml de HF anhydre à 0 C et on agite pendant 75 minutes. Après la réaction, on élimine HF sous vide et on ajoute de l'éther au résidu. On recueille le précipité qui s'est formé, on le redissout dans 50 ml d'acide acétique 0,1 N et on fait passer sur une colonne de 2,7 x 35 cm de Dowex Xl. La lyophilisation de l'éluat donne 2,18 g du produit brut qu'on redissout dans 50 ml d'une solution 8M d'urée; on règle à pH 9,5 par addition d'ammoniaque et on laisse reposer pendant 50 minutes. On jette la solution sur une colonne de 4,4 x 12 cm de cellulose-CM imprégnée d'une solution 8M d'urée, on élue par de l'acétate d'ammonium 0,01 M (pH 4,5, environ 100 ml) puis on procède à une élution par gradient linéaire avec 700 ml d'acétate d'ammonium 0,01 M, pH 4,5, et 700 ml d'acétate d'ammonium 0,1 M, pH 4,5; finalement on élue par l'acétate d'ammonium 0,2 M, pH 4,5 (300 ml). L'éluat est divisé en fractions de 13,5 ml chacune. On contrôle chacune des fractions par la méthode de Folin-Lowry (500 nm). On obtient les fractions n 30 à 50 (fraction C1), les fractions n 56 à 119 (fraction C2) et les fractions n 120 à 150 (fraction C3). On élimine les sels minéraux de toutes les fractions en les faisant passer sur une colonne de Sephadex LH-20. On divise l'éluat en fractions de 8,5 ml chacune et on contr1ôle les activités comme décrit ci-dessus. On fait passer la fraction C1 sur une colonne de 3,4 x 113 cm; on obtient les fractions n 31 à 40 (fraction L1), les fractions n 41 à 44 (fraction L2) et les fractions n 45 à 54 (fraction L3). On fait passer la fraction C2 sur une colonne de 3,4 x 120 cm; on obtient les fractions n 35 à 45 (fraction L1), les fractions n 46 à 52 (fraction L2) et les fractions no 53 à 60 (fraction L3). On fait passer la fraction C3 sur une colonne de 3,4 x 120 cm; on obtient les fractions n 31 à 44 (fraction L1) et les fractions n 45 à 52 (fraction L2). La lyophilisation de chacune des fractions donne les composants indiqués dans le tableau ci-après. b) Purification de C2L2: On dissout 565 mg de C2L2 dans 5 ml d'acide acétique 0,1 N et on charge sur une colonne de 4,4 x 70 cm de celluloseCM et on procède à une élution par gradient Composants Analyse des aminoacides frac- Rendt As p 'Thlr Ser Gl u (JIy Ala Val l]u Lys Ils tions (mg) ( 5) ( 1)(3) (5) (1) (3) (.I) (3) (63 (l) C, L 1 182 3,P81 1, 12 2, 1I;0,6 3'321 0;63 3 30,1 2/15.1.I)1 0 46 0c 1,.. 3533 79 1;0 1 2,07 3,71 0>79 3 3,09 2,35 405 0OJ,6 COL3 30 4 3 31 1 i0 1 / 7,70 2,94 0,)553 2,74 1,96 4,11 0>13 C2Lt 166 4,i i 28 4 4-1 0,98 3 3,57 '2,80 5,7 0,87 C2L2 568 4/76 0, 7 2,33 4,80 0U98 3 3,88 2,93 5,89[ 0,87 C2L3 1 20 4 19 1 04T 2,03 4,02 0,82 3 3,41 2,56 4,97 0,66i C31.t 170 4t55 1,02. 2,29 4-65I;.03 3 3,82 2)95 6>00 083 1 57_____ I I -2 _ _1_ _. _ _ _ _9_ _9 CI,2 157 4, 58 0,96 2,36 4,69 1109 3 3 f 3,Oo 6,49 0,95 __, ___j1 ___ 3,0 __ _ ou 0- r..T i'M LW linéaire avec une solution d'acétate d'ammonium 0, 01 M (pH 4,5, 500 ml) et une solution d'acétate d'ammonium 0,1 M (pH 4,5, 500 ml). L'éluat est divisé en fractions de 6,0 ml et chacune des fractions est contrôlée par la méthode de Folin-Lowry; on obtient les fractions n 113 à 136 (fraction C2L2-C1), les fractions n 137 à 151 (fraction C2L2-C2) et les fractions n 152 à 190 (fraction C2L2-C3). On élimine les sels minéraux dans toutes les fractions en les faisant passer sur Sephadex-LH-20. L'éluat est divisé en fractions de 5,2 ml et chacune des fractions est contrôlée par la même méthode qae ci-dessus. On fait passer la fraction C2L2-C1 sur une colonne de 3,4 x 120 cm; on obtient les fractions n 55 à 72 (fraction C2L2-C1L1) et les fractions n 73 à 80 (fraction C2L2-C1L2). On fait passer la fraction C2L2-C2 sur une colonne de 3,4 x 110 cm; on obtient les fractions n 50 à 59 (fraction C2L2-C2L1) et les fractions n 60 à 67 (fraction C2L2-C2L2). On fait passer la fraction C2L2-C3 sur une colonne de 3,4 x 110 cm; on obtient les fractions n 45 à 60 (fraction C2L2-C3L1) et les fractions n 61 à 72 (fraction C2L2-C3L2). Toutes les fractions sont lyophilisées; on obtient les composants ci-après: I -CC t O 8 7 mn C2 L2 -C L2 959m 02 L2 02 L 5 3, 6q 02 L2 -02 L2 4 4 l 0C2 L2 -03 Lt 9 7!ri 9 5. 1 C2 L2 -03 L2 c) Purification de C2L2-C1L1: On charge la fraction C2L2-C1L1 en solution dans l'acide acétique 0,1 N sur une colonne de 2,0 x 15 cm de celluloseCM et on procède à une élution par gradient linéaire à l'aide d'acétate d'ammonium 0,01 M (pH 4,5, 300 ml) et d'acétate d'ammonium 0,1 M (pH 4,5, 300 ml). On divise les éluats en fractions de 7,4 ml chacune et on contrôle chacune des fractions par la méthode de Folin-Lowry (500 nm); on obtient les fractions n 46 à 56 (fraction C2L2-C1LI-C). On concentre cette fraction sous vide et la charge sur une colonne de 3,C x 90 cm de Sephadex LH-20 qu'on élue par l'acide acétique 0,1 N. L'éluat est divisé en fractions de 6,0 ml chacune. Les fractions sont contrôlées par la même méthode que ci-dessus; on obtient les fractions n 25 à 35 (fraction C2L2ClLi-CL) qu'on lyophilise; la lyophilisation donne 90,0 mg d'h-PTH (53 - 84). CCM: Rf = 0,76 (une tache). Analyse des amino-acides: Asp 4,45 (5), Thr 0,92 (1), Ser 2,16 (3), Glu 4, 94 (5), Gly 0,96 (1), Ala 3, Val 3 96 (4), Leu 2,92 (3), Lys 6,22 (6), His 1,01 (1). Exemple 2 h - Il] 11 ( 5 1 - S 4); l - Pro - rg -- Lys - Lys -Ij1 u - Asp - Asn - V al - Leu - Va 1 - Glu -Ser - lis - Giut Lys - Ser - [,ieu - (; Iy - Glu - Ala - Asp -Lys - Ala - Asp - 'al - Asp - Val - Leu - Thr - Lys - Ala - Lys - Ser - (Gin - O IH - As p (013z 1) - Asn - Val - Leu - Va - G 1 u (OBz I) - Se r (3z 1) -1li s - (glu (013z l) _- G I1v - Lys (Z-CL) Ser (13zl) - Ley- Ilu(O Bz l) - Ala - As p (OBzI) - Lys (Z-Ct) - Ala - Asp(OBzl) - Val - Asp(OBzl) - Val - Leu - Thr (Bzl) - Lys (Z-Ct) Ala - Lys (Z-Ct) - Ser(Bzl)- Gin - OBzl [39) On ajoute 50 ml de TFA à 7, 82 g (1,5 mM) de la substance (32) obtenue dans l'exemple 1 et on agite à température ambiante pendant 1 heure. On élimine le TFA et on ajoute de l'éther au résidu. On recueille le précipité et on le redissout dans 120 ml de DMF et 120 ml de NMP. On ajoute 0,30 g (excès 1,5 molaire) d'HOBT, 2,52 g (excès 1,5 molaire) de la substance (38) de formule: BOC-ProArg(Tos)-Lys(Z-Cl)-Lyz(Z-Cl)-OH et 0,41 ml (excès 1,5 molaire) de WSCI puis on agite à la température ambiante pendant 2 jours. On coule le mélange de réaction dans un mélange eau-glace. On lave le précipité à l'eau puis au méthanol et on ajoute au précipité qui a été traité à chaud. Après refroidisse- ment, on recueille les insolubles. On répète deux fois ces opérations de chauffage et on lave à l'éther; on obtient 8,20 g soit un rendement de 87, 9 % de la substance (39). Analyse des amino-acides: Asp 4,09 (5), Thr 1,05 (1), Ser 2,30 (3), Glu 4, 08 (5), Pro 0,52 (1), Gly 0,83 (1?, Ala 3, Val 3,42 (4), Leu 2,53 (3), Lys 5,11 (6), His 0,69 (1), Arg 0,51 (1). (2) h-PTH (51 - 84): On ajoute 3,73 g (0,6 mM) de la substance (39) et 4 ml d'anisole à 40 ml de HF à O C et on agite pendant 60 minutes. On distille HF' sous vide et on ajoute de l'éther au résidu. On recueille le précipité et on fait passer sur une colonne de Dowex Xl (forme acétate 2, 7 x 33 cm) après dissolution dans ml d'acide acétique. La lyophiiisation de l'éluat donne 2,41 g du produit brut. On le redissout dans 50 ml d'urée 8 M, on règle à pH 10,0 par addition d'ammoniaque et on laisse reposer pendant 30 minutes. On charge la solution sur une colonne de 4,2 x 11,5 cm de cellulose-CM imprégnée d'urée aqueuse 8 M, on élimine l'urée par addition d'acétate d'ammonium 0, 01 N (pH 4,5) puis on procède à une élution par gradient linéaire à l'aide d'acétate d'ammonium 0,01 M (pH 4,5, 700 ml) et d'acétate d'ammonium 0,1 M (pH 4,5, 700 ml) et on élue finalement par acétate d'ammonium 0,2 M (pH 4,5, 250 ml). On divise l'éluat en fractions de 8,5 ml chacune et on contrôle chacune des fractions par la méthode de Folin- Lowry (500 nm); on obtient les fractions n 30 à 63 (fraction C1), les fractions n 105 à 150 (fraction C2) et les fractions n 151 à 195 (fraction C3). On élimine les sels des fractions C2 et C3 en les faisant passer sur Sephadex LH-20. On divise l'éluat en fractions de 5,2 ml chacune. On fait passer la fraction C2 sur une colonne de 3,4 x 110 cm; on obtient les fractions n 51 à 63 (fraction C2L1) et les fractions n 64 à 80 (fraction C2L2). On fait passer la fraction C3 sur une colonne de 3,4 x 120 cm; on obtient les fractions n 50 à 69 ( fraction C3L1) et les fractions n 70 à 78 ( fraction C3L2). Chacune des fractions est lyophilisée; on obtient les composants indiqués dans le tableau ci-après. On dissout la fraction C2L2 ci-dessus (375 mg) dans 4 ml d'acide acétique 0,1 N et on charge sur une colonne de 2, 0 x 31 cm de cellulose-CM; on procède à une élution par gradient linéaire à l'aide d'acétate d'ammonium 0,01 M (pH 4,5, 500 ml) et d'acétate d'ammonium 0,2 M (pH 4,5, 500 ml). On divise l'éluat en fractions de 7,5 ml chacune; on obtient les fractions N 85 à 103 (fraction C2L2-C). On fait passer cette fraction sur une colonne de 3,0 x 123 cm de Sephadex LH-20 pour élimination des sels minéraux. On divise l'éluat en fractions de 6 ml chacune; on obtient les fractions n 34 à 42 (fraction C2L2-CL1) et les fractions n 43 à 50 (fraction C2L2-CL2). Chacune des fractions est lyophilisée; on obtient les produits suivants: C2L2-CL1 80,0 mg Analyse des amino-acides: Asp 4, 95 (5), Thr 0,98 (1), Ser 2,47 (3), Glu 5,14 (5), Gly 1,01 (1), Ala 3 (3), Val 4,05 (4), Leu 3,02 (3), Lys 6,16 (6) His 0,96 (1), Arg 0,97 (1), Pro 1,06 (1). C2L2-CL2: 197,6 mg Analyse des amino-acides: Asp 5,00 (5), Thr 0,93 (1), Ser 2,30 (3), Glu 5,17 (5), Gly 1,01 (1), Ala 3 (3), I Val 4,03 (4), Leu 3,00 (3), Lys 6,15 (6), His 0,95 (1), Arg 1,01 (1), Pro 1,04 (1). 00I66()9 t G O(iúE úú0IZ6 tI,t t', ú6/O 0OL1 pr i Vc B,_..1 _ _., 9L 0 IL O LL 0 ú9'Y 10Jú úLú ú '0 zo 7S 1 CI 90' 1 UV'p 96G tri V0 66 O 96%) 6ig Loi â 9'iZ ú6S ú 66 O Sephadex LH-20. On fait passer la fraction C2L2-CL2-C1 sur une colonne de 3,0 x 123 cm en divisant l'éluat en fractions de 7,4 ml chacune; on obtient les fractions n 31 à 38 (fraction C2L2-CL2-ClL1) et les fractions n 39 à 43 (fraction C2L2-CL2-C1L2). La lyophilisation de la fraction C2L2-CL2-C1L1 donne 77,2 mg d'h-PTH (53 - 84). CCM: R10 = 0,89 (une tache). Exemple 3 h-PTH [46 - 84]: Ii-Ala-Gly- Ser - Gin - Arg - Pro -Arg - Lys - Is - Gl u - Asp -Asn - Va I - Leu - Val - Glu - Ser - His - Glu - Lys - Ser Leu - GIv - Glu - Ala - Asp - Lys - Ala - Asp - Val - Asp - Val - Leu Thr - Lys - Ala - Lys - Ser - GIn - O H 2497 1 98 (1) P ( 4 6 8 1); B () C - Aa 1v - Ser(Bzl) 1, zi - Arg(Tos) - Pro - A rg (Tos) -- LsZ-t) Lys (Z-Ct) - 1 UtO Bzl) - Asp(OBzl) -Ash - Val -- eu Val - Glu(Czl) - Scr (L3z) - 1 ls - (lu C)Lzi) - L vs (-Ct) - S r (13z - Lu u - Gly - (1u(0 B zl- la-Asp(OBz1 - Lys (Z-C) -Al a -Asp( (Bzl) - Val - Asp (1Bz I) - VI - Leu - Thi r (B3zl) - Lys (Z-C,) - Ala - Lys (Z-C) - Ser - l'z) - (I n - O13z 1 C 163 On ajoute 80 ml de TFA à 10,44 g (2 mM) de la substance (32) de l'exemple 1 et on agite à température ambiante pendant 1 heure. On élimine le TFA sous vide et on ajoute de l'éther au résidu; on redissout le précipité dans 160 ml de DMF et 160 ml de NMP. On ajoute 4,28 g (excès 1,15 molaire) de la substance (45) de formule: BOC-Ala-Gly-Ser(Bzl)-Gln-Arg(Tos)-Pro-Arg(Tos)- Lys(Z-Cl)-Lys(Z-Cl)-OH, 0,32 g (excès 1,2 molaire) d'HOBT et 0,44 ml (excès 1,2 molaire) de WSCI et on agite a température ambiante pendant 2 jours. On élimine le DMF sous vide. On ajoute de l'eau glacée au résidu et on filtre le précipité, après addition de 200 ml de méthanol, on chauffe. Après refroidissement, on recueille les insolubles. On répète cette opération deux fois; on obtient 12,17 g, soit un rendement de 87,4 % de la substance (46). (2) h-PTH (46 - 84) On ajoute 4, 18 g (0,6 mM) de la substance (46) et 10 ml d'anisole à 60 ml d'HF à 00C et on agite pendant 1 heure. Après la réaction, on distille HF sous vide et on ajoute de l'éther au résidu. On recueille le précipité, on redissout dans 50 ml d'acide acétique à 10 % et on fait passer sur une colonne de Dowex Xi (forme acétate, 2,5 x 24 cm). La lyophilisation de l'éluat donne 2,82 g du produit brut qu'on redissout dans 50 ml d'urée 8 M, pH 9,0; on abandonne à température ambiante pendant 1 heure. On charge la solution sur une colonne de 2,0 x 33 cm de cellulose CM garnie d'une solution 8 M d'urée et on procède à une élution par gradian linéaire avec de l'acé- tate d'ammonium 0,01 M (pH 4,5, 500 ml) et de l'acétate d'ammonium 0,3 M (pH 4,5, 500 ml). On divise l'éluat en fraction de 7,5 ml chacune qu'on contrôle par la méthode de Folin-Lowry (500 nm); on obtient les frac- tions n 1 à 22 (fraction C1), les fractions n 23 à (fraction C2), les fractions n 46 à 80 (fraction C3) et les fractions n 81 à 120 (fraction C4). On élimine les sels de toutes les fractions en les faisant passer sur une colonne de Sephadex LH-20. On fait passer la fraction C1 sur une l'éluat en fraction fractions n 28 à 42 fraction C2 sur une l'éluat en fraction fractions n 33 à 40 (fraction C2L2). On: colonne de 3,0 x 120 de 6,0 ml chacune; colonne de 3,0 x 120 cm; on divise de 7,5 ml chacune; on obtient les (fraction C1L). On fait passer la colonne (3,4 x 120 cm) en divisant de 7,6 ml chacune; on obtient les (fraction C2L1) et n 41 à 62 fait passer la fraction C3 sur une cm en divisant l'éluat en fraction on obtient les fractions n 31 à (fraction C3L1) et n 41 à 51 (fraction C3L2). On fait passer la fraction C4 sur une colonne de 3,4 x 120 cm en recueillant par fraction de 7,5 ml; on obtient les fractions n 35 à 48 (fraction C4L). Chaque partie lyophilisée; on obtient les fractions C1L (312 mg), C2L1 (142,3 mg), C2L2 (1380 mg), C3L1 (104 mg), C3L2 (510 mg) et C4L (130 mg). On redissout la fraction C2L2 ci-dessus (1380 mg) dans 13 ml d'acide acétique 0,1 N et on charge sur une colonne de 4,3 x 6,0 cm de cellulose CM puis on procède à une élution par gradian linéaire avec de l'acétate d'ammonium 0,01 M (pH 4,5, 500 ml) et de l'acétate d'ammonium 0,3 M (pH 4, 5, 500 ml). On recueille l'éluat par fraction de 7,6 ml chacune; on obtient les fractions n 40 à 50 (fraction C2L2-C1) et les fractions n 53 à 77 (fraction C2L2-C2). On élimine les sels de toutes les fractions en les faisant passer sur une colonne de Sephadex LH-20. On fait passer la fraction C2L2-C1 sur une colonne de 2,9 x 120 cm en recueillant l'éluat par fraction de 8,0 ml chacune; on obtient les fractions n 26 à 30 (fraction C2L2-C1L1) et n 31 à 39 (fraction C2L2-C1L2). On fait passer la fraction C2L2-C2 sur une colonne de 3,4 x 120 cm en recueillant par fraction de 8 ml chacune; on obtient les fractions n 34 à 44 (fraction C2L2-C2L1) et n 45 à 53 (fraction C2L2-C2L2). La lyophilisation de chacune des fractions donne les fractions C2L2-C L1 (79, 0 mg), C2L2-C1L2 (455 mg), C2L2-C2L1 (157,3 mg) et C2L2-C2L2 (551,7 mg). Analyse des aminoacides de la fraction C2L2-C2L2: Asp 4,65 (5), ThrO0,97 (1), Ser 3,47 (4), Glu 5,99 (6), Pro 0,93 (1), Gly 1,96 (2), Ala 4 (4), Val 3,97 (4), Leu 3,01 (3), Lys 6,13 (6), His 0,93 (1), Arg 1,96 (2). On charge la fraction C2L2-C2L2 dissoute dans ml d'acide acétique 0,1 N sur une colonne de 4,2 x 7,0 cm de cellulose CM et on procède à une élution par gradian linéaire avec de l'acétate d'ammonium 0,01 M (pH 4,5, 300 ml) et de l'acétate d'ammonium 0,3 M (pH 4,5, 300 ml). On recueille l'éluat par fraction de 8,0 ml chacune; on obtient les fractions n 39 à 45 (fraction C2L2-C2L2-C) qu'on fait passer sur une colonne de 2,9 x 120 cm de Sephadex LH-20 pour élimination des sels minéraux. On recueille l'éluat en fraction de 8 ml chacune; on obtient les fractions n 24 à 30 (fraction C2L2-C2L2-CL), les fractions n 31 à 35 (fraction C2L2-C2L2-CL2) et les fractions n 36 à 39 (fraction C2L-C2L2-CL3). La lyophili- sation de toutes les fractions donne la fraction C2L2- C2L2-CL2 (200 mg) et la fraction C2L2-C2L2-CL1 (h-PTH (46 - 84), 94,9 mg). CCM: Rf9 = 0,76 Analyse des aminoacides: Asp 4,86 (5), Thr 0,99 (1), Ser 3,58 (4), Glu 6,17 (6), Pro 0,96 (1), Gly 1,97 (2), Ala 4 (4), Val 4,02 (4), Leu 2,93 (3), Lys 6,05 (6), His 0,90 (1), Arg 1,87 (2). Exemple 4 C Tyr h - P T H ( 4 5 - 8 4); H-Tyr -Ala-(ly - Ser - Gin - Arg - Pro - Arg - Lys - Lys - Glu - Asp - Asn - Val - Lcu -Val - Glu - Ser - Hlis - Glu Lys - Ser - Leu - Gly - Glu - Ala - Asp - Lys - la. -Asp - Vai- Asp - Val - Leu - Thr - Lys - Ala - Lys - Ser - Gin - O H 1) P ( 4 5 -8 4); B O C - Tyr(BzI-CZ_- -Ala - Gly - Ser(Bzl) -Gln- Arg(Tos) - Pro - Arg(Tos) - Lys - Lys(Z-Ct) Glu(OBzl)- Asp(OBzl) - Asn - Val - Leu -Val- Glu(OB3zl) - Ser(13zl) - His -.sI (OBzl) - Lys(Z--CL) - Ser(Bzl)- Leu - Gly - G(lu (OBzl) - Al a - Asp(OBzl) - Lys (Z-Ct) - Al a -Asp(OBzl) -Va -l Asp(OBzl)- -Val - Leu - Thr(Bzl) - Lys(Z-t)- Ala - Lys(Z-Ct) - Ser(Bzlz) - Gin - OBzI C47] On ajoute 60 ml de TFA à 6, 7 g (0,9 ml) de la substance (46) de l'exemple 3, et on agite à tempé- rature ambiante pendant 1 heure. On élimine le TFA sous vide et on ajoute de l'éther au résidu. La filtra- tion du précipité donne 6,30 g du composé dé-BOC. On redissout 2,10 g (0, 3 mM) de ce composé dé-BOC dans 35 ml de DMF et 35 ml de NMP. On ajoute à 0 C 0,16 g (excès 1,2 molaire) de BOC-Tyr(Bzl-C12)-OH, 0,05 g (excès 1,2 molaire) d'HOBT et 0,07 ml (excès 1,2 molaire) de WSCI et on agite à température ambiante pendant une nuit. On élimine le DMF et on ajoute de l'eau glacée au résidu. La filtration du précipité donne 2,00 g de la substance (47;. (2) (Tyr 45)-h-PTH (45-84): On ajoute 2,00 g (0,27 mM) de la substance (47) et 1,0 ml d'anisole à 20 ml d'HF à 0 C et on agite pendant 1 heure. On distille HF sous vide et on ajoute de l'éther aurésidu. On recueille le précipité qui s'est formé, on le redissout dans 20 ml d'acide acétique 0,1 N et on le jette sur une colonne de Dowex Xl (formacétate, 2,5 x 15 cm). La lyophilisation de l'éluat donne 1,37 g du produit brut. On redissout ce produit dans une solution 8 M d'urée (pH 9,5, 50 ml) et on laisse reposer à température ambiante pendant 60 minutes. On charge la solution sur une colonne de 4,3 x 8,0 cm de cellulose CM garnie d'une solution 8 M d'urée et on procède à une élution par gradian linéaire à l'aide d'acétate d'ammonium 0,01 M (pH 4,5, 400 ml) et d'acétate d'ammonium 0,3 M (pH 4,5, 400 ml). On recueille l'éluat par fraction de 6, 5 ml chacune. On soumet chacune des fractions à un contrôle par la méthode de Folin-Lowry (500 nm); on obtient les fractions n 30 à 43 (fraction C1), les fractions n 51 à 68 (fraction C2), les fractions n 69 à 83 (fraction C3) et les fractions n 84 à 100 (fraction C4). On fait passer chacune des fractions sur Sephadex LH-20 pour élimination des sels. On fait passer la fraction C1 sur une colonne de 3,4 x 120 cm en recueillant l'éluat par fraction de 7,5 ml chacune; on obtient les fractions n 25 à 41 (fraction C1L). On fait passer la fraction C2 sur une colonne de 3,0 x 120 cm en recueillant l'éluat par fraction de 7,5 ml chacune; on obtient les fractions n 25 à 36 (fraction C2L). On fait passer la fraction C3 sur une colonne de 2,9 x 120 cm en recueillant i'éluat par fraction de 8,0 ml chacune; on obtient les fractions n 24 à 27 (fraction C3L1) et n 28 à 38 (frac- tion C3L2). On fait passer la fraction C4 sur une colonne de 2,9 x 95 cm en recueillant l'éluat par fraction de 7,6 ml chacune; on obtient les fractions n 20 à 25 (fraction C4L1) et n 26 à 30 (fraction C4L2). La lyophilisation de chacune des fractions donne les fractions C1L (521,6 mg) , C2L (230,2 mg), C3L1 (41,8 mg), C3L2 (222,4 mg), C4L1 (74,3 mg) et C4L2 (48,9 mg). On charge la fraction C2L ci-dessus dissoute dans 3 ml d'acide acétique 0, 1 N sur une colonne de 2,1 x 25 cm de cellulose CM et on procède à une élution par gradian linéaire à l'aide d'une solution 0,01 M d'acétate d'ammonium (pH 4,5, 300 ml) et d'une solution d'acétate d'ammonium 0,3 M (pH 4,5, 300 ml). On recueille l'éluat par fraction de 8,0 ml chacune; on obtient les fractions n 30 à 36 (fraction C2L-C) qu'on fait passer sur une colonne de 2,9 x 90 cm de Sephadex LH-20 pour élimination des sels. On recueille l'éluat par fraction de 8,0 ml chacune et on lyophilise les 2497 1 98 fractions n 20 à 29; on obtient 163,3 mg de (Tyr 45)- h-PTH (46 - 84). CCM: Rf = 0,75 Analyse des aminoacides: Asp 4,86 (5), Thr 1,02 (1), Ser 3, 51 (4), Glu 6,05 (6), Pro 0,93 (1), Gly 1,90 (2), Ala 4 (4), Val 4,00 (4), Leu 2,93 (3), Tyr 0,88 (1), Lys 6,02 (6), His 0,86 (1), Arg 1,81 (2). Exemple 5 [Cys(Acm) - -P T H ( 45 - 8 4); H - Cys(Acm) - Ala - (Gly - Ser - GIn A\rg - Pro - Arg - Lys - Lys - Glu - Asp - AsI - Val - Lcu - VTal - Glu Scr - llis - Glu - Lys - Scr - Leu - Gly - (]lu - Ala - Asp - Lys - Aa Asp - Val - Asp - Val -- lcu - Thr - Lys - Ala - Lys - Ser - (lln - O i ( I) P ( 4 5 - 8 4); O C - Cys(Acm)- - Ua -( Ily - Ser CBzl) - (lIn -:rg(Tos) -Pro - Arg(Tos) - Lys(Z-C/t) - Lys (Z-Cú)- Glu(OB1zl) - Asp(OBzlI) - Asn - Val - Lcu Val - Ilu(OBzl) - Ser(Bzl) - His - Glu(O Bzl) - Lys (Z-C) -Ser(Bzl) - Lcu 41-Gly - (Gl,u(OBzl) - Ala - Asp(OBzl) - Lys Z-Ct) - Ala - Asp(OBzl) - Val - Asp(OBzlI) - Val - Leu - Thr(Bzl) - Lys IZ-Ct) - AI a - Lys(Z- Ct) - Ser(Bzl) - Gi(n - OBzIC48] On dissout le composé dé-BOC restant de l'exemple 4 (4,20 mg, 0,6 mM) dans un mélange de 70 ml de NMP et 70 ml de NMP. On ajoute à 0 C 0,10 g (excès 1,2 molaire, d'HOBT, 0,20 g (excès 1,2 molaire) de BOC-Cys(Acm)-OH de 0,13 ml (excès 1,2 molaire) de WSCI et on agite à température ambiante pendant une nuit. On distille le DMF sous vide, on ajoute de l'eau glacée au résidu et on recueille le précipité. On met le préci- pité en suspension dans l'éthanol, on chauffe puis on refroidit et on recueille la substance insoluble par filtration. En répétant cette opération deux fois qu'on obtient 4,07 g soit un rendement de 95,0 % de la substance (48). (2) (Cys(Acm) 45) h-PTH (45 - 84) On ajoute 4,00 g (0, 57 mM) de la substance (48) et 10 ml d'anisole à 0 C à 60 ml d'HIF anhydre et on agite pendant 1 heure. On distille HF sous vide et on ajoute de l'éther au résidu. On redissout le précipité dans 40 ml d'acide acétique à 20 % et on fait passer sur une colonne de résine Dowex X1 (foxieactate, 2,8 x 35 cm). Après lyophilisation de l'éluat, on redissout dans une solution 8 M d'urée, on règle à pH 9,0 par de l'ammoniaque puis on laisse reposer pendant 30 minutes. On charge la solution sur une colonne de 3,4 x 35 cm de cellulose CM garnie d'une solution 8 M d'urée et on procède à une solution par gradian linéaire avec de l'acétate d'armmonium 0,01 M (pH 4,5, 700 ml) et de l'acétate d'ammonium 0,3 M (pH 4,5, 700 ml). On recueille l'éluat par fraction de 8 ml chacune qu'on contrôle par la méthode de Folin-Lowry (500 nm); on obtient les fractions n 25 à 35 (fraction C1), les frac- tions n 36 à 45 (fraction C2) et les fractions n 46 à 84 (fraction C3). On fait passer chacune des fractions sur Sephadex LH-20 pour élimination des sels. On fait passer la fraction C2 sur une colonne de 3,0 x 120 cm en recueillant l'éluat par fraction de 8,0 ml chacune; on obtient les fractions n 27 à 33 (fraction C2L1) et n 34 à 40 (fraction C2L2). On fait passer la fraction C3 sur une colonne de 3,4 x 120 cm en recueillant l'éluat par fraction de 8,0 ml chacune; on obtient les fractions n 35 à 47 (fraction C3L1) et les fractions n 48 à 53 (fraction C3L2). On lyophilise chacune des fractions; on obtient les fractions C2L1 (148 mg), C2L2 (620 mg), C3L1 (212 mg) et C3L2 (605 mg). On charge la fraction C2L2 ci-dessus en solution dans 6 ml d'acide acétiqua 0,1 N sur une colonne de 5,0 x 12 cm de cellulose CM et on procède à une élution par gradian linéaire à l'aide d'acétate d'ammonium 0,01 M (pH 4,5, 400 ml) et d'acétate d'ammonium 0,3 M (pH 4,5, 400 ml). On recueille l'éluat par fraction de 6,0 ml chacune; on obtient les fractions n 110 à 126 (fraction C2L2-C) qu'on fait passer sur une colonne de 4,0 x 120 cm de Sephadex LH-20 pour élimination des sels. On recueille l'éluat par fraction de 8,0 ml chacune. On lyophilise les fractions n 38 à 54 (fraction C2L2-CL); on obtient 246.8 mg de (Cys(Acm)45) h-PTH (45 - 84). CCM: Rf9 = 0,74 Analyse des aminoacides: Asp 4,91 (5), Thr 0,98 (1), Ser 3,50 (4), Glu 6,11 (6), Pro 0,98 (1), Gly 1,98 (2), Ala 4 (4), Val 4,04 (4), Cys 0,42 (0,5, Leu 2,90 (3), Lys 5,99 (6), His 0,87 (1), Arg 1,87 (2). Exemple 6 C Cys - h - P TH ( 45 - 8 4); H -Cys -Ala - Gly - Ser - Gin - Arg - Pro Arg -Lys - Lys - Glu - Asp'- -Asn - Val - Lcu -- Val - Glu - Ser - H-lis - (lu - Lys - Ser- Leu - Gly -Glu - Ala - ASp - Lys - la - Asp - Val - Asp - Val - Leu - Thr - Lys - Ala - Lys - Ser - Gin -0 H On dissout 88 ml,(0,02 mM) de (Cys(acm)45 hPTH (45 - 84) obtenus dans l'exemple 5 dans 2 ml d'acide acétique à 50 %. On ajoute 52,24 mg, (0,18 mM) d'acétate mercurique et on agite à température ambiante pendant 70 minutes. On ajoute encore 3,4 ml de ?mercaptoéthanol et on agite à température ambiante pendant 24 heures. On centrifuge le mélange de réaction et on charge la solution surnageante sur une colonne de 3,2 x 42 cm de Sephadex LH-20 en éluant par l'acide acétique 0,1 M. On recueille l'éluat par fraction de 5 ml chacune et on rassemble les fractions positives à la ninhydrine, n 9 à 14, qu'on lyophilise; on obtient 76,1 mg de (Cys 45) h- *PTH (45-84). CCM: Rf9 = 0,73 Exemple 7 [Tyr52) h - P T Hi (52 - 84); H - Tyr - Lys - Lys - Glu - Asp - Asn - Val - Leu - Val - Glu - Ser - lis - Glu - Lys - Ser - Leu - Gly - Glu - Ala - Asp - Lys - Ala - Asp - Val Asp - Val - Leu - Thr - Lys --Ala - Lys - Ser - Gln - OH (1) P (52 - 84); B OC - Tyr (BZl-Cú2) - Lys (Z-C-) - Lys (Z-CI) - Glu(OBzl) - Asp (OBzl) - Asn - Val - Leu - Val - Glu (O]3zl) - Ser (Bzl) - IHis - Glu (O J3z3) - Lys (Z -CV) - SBer (Bzl) - Leu - Gly - Glu (OBzl) -Ala - Asp (O Bzl) - Lys (Z--C).- Ala - Asp (OBzl) -Val - Asp (O Bzl) - Val - Leu - Thr (Bzl) - Lys (Z -C,) - Ala - Lyys (Z-Cú) - Ser (13zl) - Gin -oBzl 149] On ajoute 50 ml de TFA à 5,82 g (1,0 mM) de la substance (35) obtenue dans l'exemple 1 et on agite à température ambiante pendant 50 minutes. On élimine le TFA sous vide et on ajoute de l'éther. On redissout le précipité dans 150 ml de DMF et 150 ml de NMP. On ajoute 0,27 g (excès 2 molaires) d'HOBT et 0,37 g (excès 2 molaires) de WSCI et on agite à température ambiante pendant 2 jours. On coule le mélange de réaction dans l'eau glacée, on recueille le précipité, on lave à l'eau, on met en suspension dans le méthanol, on chauffe puis on refroidit. On recueille les substances insolubles par filtration. On met le pré- cipité en suspension dans le méthanol et on chauffe. On refroidit la suspension et on recueille 5,59 g soit un rendement de 91,0 % de la substance (49). Analyse des aminoacides: Asp 409 (5), Thr 0,9 0 (1) Ser 1,65(3 Glu 4,1 0 (5) Gly 0,88 (1)-, Ala 3 (3), Val 3,4 1 (4) Leu.2,5 0 (3), Tyr 0,8 2 (1) Lys 5,4 0 (6), lis 0,71 (1) (2) (Tyr) h-PTH (52-84): On ajoute 3,68 g (0, 6 mM) de la substance(49) et 5 ml d'anisole à 50 ml d'HF anhydre à 0 C et on agite pendant 1 heure. On distille HF et on ajoute de l'éther au résidu. On recueille le précipité et on le redissout dans ml d'acide acétique 0,1 N. On fait passer la solution sur une colonne de résine Dowex Xl(forae acétate, 2 x 45 cm) en éluant par l'acide acétique 0,1 N. On lyophilise l'éluat; on obtient 2,30 g de la substance brute qu'on redissout dans 50 ml d'une solution 8 M d'urée; on règle à pH 9,5 par addition d'ammoniaque puis on laisse reposer à 0 C pendant 1 heure. On charge la solution sur une colonne de 4,4 x 12 cm de cellulose CM garnie d' une solution 8M d'urée et on élue par l'acétate d'ammonium 0,01 M (pH 4,5, environ 100 ml), on procède ensuite à une élution par gradian linéaire avec de l'acétate d'ammonium 0,01 M (pH 4,5, 700 ml) et de l'acétate d'ammoniuml 0,1 M (pH 4,5, 700 ml) puis on élue par 300 ml d'acétate d'ammonium 0,2 M. On recueille l'éluat par fraction de 13,5 ml chacune dont on contrôle l'absorbance dans l'ultraviolet à 280 nm; on recueille les fractions n 54 à 110 et on les lyophilise. On redissout le lyophilisat dans 5ml d'acide acétique 0,1 N et on jette sur une colonne de 3,4 x 120 cm de Sephadex LH-20. On recueille l'éluat par fraction de 8,5 ml chacune et on rassemble les fractions n 47 à 53 qu'on lyophilise. on obtient 510 mg de la substance recherchée qu'on redissout dans 20 ml d'acide acétique 0,1 N; on jette sur une colonne de 4,5 x 70 cm de cellulose CM et on procède à une élution par gradian linéaire avec de l'acétate d'ammonium 0,01 M (pH 4,5, 500 ml) et de l'acétate d'ammonium 0, 1 M (pH 4,5, 500 ml). On recueille l'éluat par fraction de 6,0 ml chacune. On contrôle chacune des fractions par absorbance dans l'ultraviolet à 280 nm, on recueille les fractions n 109 à 120 et on les lyophilise. On redissout le lyophilisat dans 5 ml d'acide acétique 0,1 N et on fait passer sur une colonne de 3,4 x 120 cm de Sephadex LH-20. On recueille l'éluat par fraction de 3,4 ml et la lyo- philisation des fractions N 56 - 73 donne 102 mg de (Try52) h-PTH (52- 84). CCM: Rf9 = 0,75, une tache. Analyse des amino acides: -i a4.5.5 (5), 'Lhr0 c.'3 (1), ier Z20(3)t Glu 4.98 (5), Gly 0.96 (), 6. la.3, V.l 3.98 (4) Leu.9 3 (3), ''yr 0.9 0 (1), Lyrs 6.1 0(6), 11is 1.0 0 (1). Exemple 8. Tyr50 h - P T H (50 - 84); H - Tyr -Pro Arg - Lys - Glu - Asp - Asn - Val - Leu - Val - Glu - Ser - His - Glu - Lys - Ser - Leu -- Gly - Glu - Ala - Asp - Lys - Ala Asp - Val - AsD - Val - Leu - Thr - Lys - Ala - Lys - Ser - Gln - OH (1) p (50 - 84); B O C - Tyr (3zl -- C-2) - P-ro - Arg (Tos) - Lys (Z-Ci) --Lyb (Z-CO) - Glu (013zl) - Asp (OBzl) - Asn -- Val - Leu - Val - Glu (OBzl) - Ser (lizl) - liis - Glu (OBzl) - Lys (Z - C,) - Ser (Bzl) - Leu - Gly Glu (OBzl) - Ala - Asp (OBzl) -Lys(Z-C-C) - Ala - Asp (OBzl) - Val - Asp (OBzl) - Val - Leu - Thr (Bzli) - Lys (Z-C$) - Ala - Lys (Z-C&) - Ser (Bzl) -Gln - OBzl [50] On ajoute 50 ml de TFA à la substance (39) de l'exemple 2 et on ajoute à température ambiante pendant minutes. On distille le TFA sous vide et on ajoute de l'éther. On redissout le précipité dans 160 ml de DMF et 160 ml de NMP. On ajoute pour dissoudre 0,27 grammes (excès 2 molaires) d'HOBT et 0,88 g (excès 2 molaires) de BOCTyr(Bzl-C12)-OH, on refroidit à - 20 C, on ajoute 0,37 g (excès 2 molaires) de WSCI et on agite à tempé- rature ambiante pendant trois jours. On coule le mélange de réaction dans l'eau glacée. On recueille le précipi- té, on le lave à l'eau, on le met en suspension dans le méthanol, et on je chauffe. On refroidit la suspension méthanolique et on filtre l'insoluble. On met à nouveau le précipté en suspension à chaud dans le méthanol et on refroidit pour recueillir le précipité. On répète cette opération et on lave à l'éther; on obtient 5,97 g soit un rendement de 90 % de la substance (50). Analyse des aminoacides: Asp 4.21 (5), Thr 0.95 (1), Ser 2.32 (3), Glu 4. 50 (5), Pro 0.75(1), Gly 0.88(1), Ala 3,, Val 3.4 5 (4),. Leu 2.60(3), Tyr 0.70(1),. Lys 5.21(6),. His 0.72(1), Arg 0.7 1 ( 1). (2) (Tyr) h-PTH (50 - 84): On ajoute 3,98 g (0,6 mM) de la substance (50) et 6 ml d'anisole à 60 ml d'HF anhydre à 0 C, et on agite à cette température pendant une heure. On distille HF sous vide, on ajoute de l'éther au résidu et on re- cueille le précipité. On redissout le précipité dans ml d'acide acétique o,1 N et on jette sur une colonne de résine Dowex X1 (forme acétate, 3 X 45 cm). La lyo- philisation de l'éluat donne 2,30 g de produit brut. On le redissout dans une solution 8 M d'urée, on ajuste à pH 10,0 par addition d'ammoniaque et on laisse reposer à O0 C pendant 30 minutes. On charge la solution sur une colonne de 4,2 x 11,5 cm de cellulose CM garnie d'une solution 8 M d'urée et on élue par une solution d'acéta- te d'ammonium 0,01 M, pH 4,5, pour éliminer l'urée, puis on procède à une élusion par gradiant linéaire avec de l'acétate d'ammonium 0,01 M (pH 4,5, 700 ml) et de l'a- cétate d'ammonium 0,1 M (pH 4,5, 700 ml) et on élue fi- nalement par une solution d'acétate d'ammonium 0,2 M (pH 4,5, 250 ml). On recueille l'éluat par fractions de 8,5 ml chacune dont on contrôle l'absorbance à 280 nm; on recueille les fractions N 110 à 155 et on les lyo- philise. Le lyophilisat redissous dans 6 ml d'acide acétique 0,1 M est envoyé sur une colonne de Sephadex LH-20 (3,4 x 110 cm). On recueille les fractions N 66 à 82 de 5,2 ml chacune et on lyophilise; on obtient 360 mg de lyophilisat qu'on redissout dans 10 ml d'acide acétique 0,1 M; on charge sur une colonne de 2,0 x 31cm de cellulose CM et on procède à une élusion par gradiant linéaire à l'aide d'acétate d'ammonium 0,01 M (pH 4, 5, 500 ml) et d'acétate d'ammonium 0,2 M (pH 4,5, 500 ml). On recueille l'éluat par fractiorsde 7,5 ml chacune. On recueille les fractions N 90 à 110, on lyophilise et on redissout dans 3 ml d'acide acétique 0,1 M. On fait passer la solution sur une colonne de 3,0 x 123 cm de Sephadex LH-20. On receuille l'éluat par fractions de 6 ml chacune et on recueille les fractions N 35 à 43 qu'on lyophilise; on obtient ainsi 115 mg de (Tyr50 h-PTH (50 - 84). CCM: Rf10 = 0,88 (une tache) Analyse des aminoacides: Asp 4.95(5), Thr 0. 91 (1),. Ser 2.3.2(3), Glu 5.1 0 (5), Pro 1.01 (1), Gly 0.9 9(1), Ala 3, Val 4.01 (4), Leu 2.99 (3),- Tyr 0.8 5 (1), Lys 6.03 (6), His 0.92(1), Arg 1.0 2 (1). Exemple 9. (1) Antigènes: On a utilisé comme antigènes h-PTH (53 - 84), h-PTH (51 84), h-PTH (46 - 84) et BSA-(Cys45) h-PTH (45 - 84) obtenus par le procédé décrit ci-après. On a préparé BSA-(Cys45) h-PTH (45 - 84) de la manière suivante: On ajoute 4 mg d'EDTA tétrasodique à 50 mg de BSA en solution dans 1 ml de tampon phosphaté 0,1 M, pH 8,0. On ajoute 150 Al d'une solution dans le diméthyl- formamide de 500 gg de 3-(2'-benzothiazolyl-dithio) propionate succinimide ester et on agite en refroidis- sant à la glace pendant une heure. Après réaction, on ajoute 50 mg de (Cys45) h-PTH (45 -84), on fait réagir pendant 30 minutes en refroidissant à la glace, on règle à pH 7,0 et on fait passer sur une colonne de 1 x 50 cm de Sephadex G-75 garnie de tampons phosphatés de 0, 01 M (pH 7,2) contenant NaCl 0,15 M, pour filtration sur gel. On recueille des éluats de 15 ml - 20 ml; on obtient les fractions contenant BSA-(Cys45) h-PTH (45 - 84). (En moyenne, il y a 11 moles de (Cys45) h-PTH (45 - 84) conjuguées pour une mole de BSA). (2) Anticorps: On prépare une solution à 500 gg/ml de l'anti- gène ci-dessus dans du tampon phosphaté 0,01 M, pH 7,0, contenant NaCl 0, 15 M. On mélange des portions de 2,5 ml de la solution avec 2,5 ml d'adjuvant complet de Freund et on immunise des cobayes mâles à raison de cinq par groupes, par injection sous-cutanée (injection sous- cutanée à cinq reprises à intervalles de deux semaines à chaque fois). Deux semaines après l'immunisation finale, on recueille du sang du coeur et on isole l'anti- sérum de la manière habituelle. Dans tout ce qui suit, l'antisérum d'h-PTH (53 - 84) est désigné par la notation abrégée (A); l'anti- sérum d'h-PTH (51 - 84) est désigné par (B), l'anti- sérum d'h-PTH (46 - 84) par (C) et l'antisérum de BSA - (Cys45) h-PTH (45 - 84) par (D). (3) Marquage par une enzyme: 1) On dissout 4 mg de (Cys45) h-PTH (45 - 84) dans 1 ml de tampon phosphaté O,1 M, pH 7,0. On ajoute 0,6 mg de N-(2-(2'-pyridyldithio) ethyl)-3-(2'benzo- tiazolyl-dithio) propionamide (0,6 mg) dans 0,9 ml de diméthylformamide et on ajoute à O C pendant une heure. On règle le pH à 6,0 par addition d'HCl. On fait passer la solution sur une colonne de 1 x 50 cm de Séphadex G-25 avec du tampon phosphaté 0,1 M, pH 6,0, et on re- cueille des fractions de 15 à 19 ml (660 y/ml de (Cys45 h-PTH (45 - 84)). On ajoute la fraction ci-dessus (20 l1) à 1,5 ml de tampon phosphaté 0,1 M, pH 8,0, contenant 1,2 mg de p-galactosidase,et on ajoute à O C pendant une heure. On fait passer le mélange d'incubation sur une colonne de 1 x 50 cm de Sephadex G-100 avec du tampon phosphaté O,O1 M, pH 7,2, contenant NaCl 0,15 M pour filtration sur gel; on recueille la fraction de 13 à 17 ml. Dans cette fraction, le rapport du produit de conjugaison marqué par la -galactosidase est (Cys45 h-PTH (45 - 84): -galactosidase = environ 1: 1 (ci- après lot A). 2) On dissout 2 mg d'h-PTH (53 - 84) dans 1 ml de tampon phosphaté O,1 M, pH 8,0. On ajoute 0,2 ml d'une solution dans le diméthylformamide de 3-(2'-benzothiazolyl- dithio) propionate-succinimide-ester (0,2 mg) et on agite à O C pendant une heure. Après réaction, on ajoute 20 4l de la solution à 1 ml de tampon phosphaté 0,1 M, pH 7,0, contenant 1 mg de p-galactosidase, et on fait réagir à O C pendant une heure. On fait passer le mélange de réaction sur une colonne de Sephadex G-100 (1 x 50 cm) pour filtration sur gel; on sépare la fraction de 14 à 17 aml. Le rapport du produit de conjugaison de la p-galactosidase est h-PTH (53 - 84): P-galactosidase = 1: 1 (ci-après Lot B). 4) Méthode de dosage: On soumet à incubation pendant 24 heures à 5 C 4l de la solution échantillon, 100 4l de produit de conjugaison marqué par l'enzyme, 100 il d'une fraction aliquote d'anti-sérum dilué et 100 gl de sérum normal de cobaye (dilution 100 fois). On ajoute 100 il de sérum de lapin anti-gamma-globuline de cobaye (dilué 10 fois) et on soumet à incubation de 24 heures à 5 C. On ajoute 3 ml de NaCl 0,5 M et on centrifuge à 3000 tours par minute pendant 15 minutes. On recueille le sédiment. On introduit le sédiment dans du tampon phosphaté 0,1 M (contenant O,1 % d'azote hydrate de sodium, O,1 % de BSA, 20 mM de mercaptoéthanol et 10 % d'éthanol, pH 6,7) contenant de l'o-nitrophényl-Pgalactoside (5 mg/ml) (200 1l), et on fait réagir à 37 C pendant 90 minutes. On arrête la réaction en ajoutant 2,5 ml de tampon 0,2 M à la glycine, pH 10,4, et on procède à la mesure optique à 420 nm. On utilise comtme milieu de dilution du tampon phosphaté 0,01 M (pH 7,2) contenant 0,1 % d'azote- hydrate de sodium, 0,25 % de BSA, NaCl 0,15 M et 5mM d'EDTA. 1) On utilise le Lot A comme produit de conju- gaison marqué par une enzyme. On détermine le titre en anticorps (Bo/T) de chacun des antisérums ci-dessus. Le résultat est rapporté dans le Tableau 1 ci-après. Chaque antisérum a été utilisé dilué 1000 fois. Tableau 1. antisérum Cobaye N Titre en anticorps (Bo/T) % A- 1 19 A A- 2 23 A- 3 17 B- 1 15 B B- 2 16 B- 3 16 C- 1 38 C C- 2 39 C- 3 34 D - 1 30 D D - 2 46 D- 3 42 2) On utilise le produit de conjugaison marqué par une enzyme,Lot B et on détermine le titre en anti- corps (Bo/T) les antisérums C et D ci-dessus. Les résultats sont rapportés dans le Tableau 2 ci-après. Tableau 2 Chaque antisérum a été utilisé dilué 2000 fois. 3) On a préparé des courbes d'étalonnage en utilisant les antisérums ci-dessus. Antisérums utilisés: A - 2; dilution de 600 fois, B - 2; dilution de 500 fois, C - 2; dilution de 1500 fois et D - 2; dilution de 2000 fois. Produit de conjugaison marqué par une enzyme: Lot B. On a établit la courbe d'étalonnage h-PTH (53 - 84) en utilisant ces réactifs. Les résultats cbtenus sont représentés graphi- quement dans la figure 1 pour A-2, la figure 2 pour B-2, la figure 3 pour C-2 et la figure 4 pour D-2. antisérum Cobaye N Titre en anticorps Bo/T, % C - 1 29 C C - 2 32 C-3 29 D-1 24 D D - 2 34 D-3 34 On peut constater que les antisérums obtenus par utilisation du peptide (Ia) selon l'invention donne une courbe d'étalonnage préférable et qu'on peut ainsi doser h-PTH ou ses fragments à Carbone terminal par EIT avec une bonne exactitude. 4. Brève explication des figures Les figures 1, 2, 3 et 4 sont les courbes d'étalonnage. REVENDICATION Peptide répondant R - Lys - Lys - Glu Leu - Val - Glu Lys - Ser - ILeu Asp - Lys - Ala Val - Leu - Thr Ser - Gln - OH à la formule - Asp - Asn - Ser - His - Gly - Glu -- Asp - Val - Lys - Ala 1 3 dans laquelle R représente H, un groupe H-Tyr- ou un groupe R1-Pro-Arg-,- R1 représente H, un groupe H-Tyr- ou R2-Ala-Gly-Ser-Gln-Arg-, et R2 représente H, un groupe H-Cys- ou un groupe H-Tyr-, et ses sels. - Val - -Glu - - Ala. - - Asp - - Lys -