FR 2493865 A1 19820514 FR 8120798 A 19811106 La présente invention concerne la culture d'un an- ticorps et en particulier la production d'anticorps par des cellules vivantes. La production d'anticorps spécifiques pour les déter- minants antigéniques de virus, tumeurs et agents étrangers est importante à la fois pour l'immunothérapie et pour la recherche médicale. Des anticorps monocloniques pour des déterminants antigéniques ont été produits in vitro dans des cultures de cellules de rate infectée avec un virus, ainsi que l'a illus- tré la technique Epstein-Barr. Des anticorps ont également été produits en utilisant des cellules hybrides réunies, ou hybri- domes, de cellules de rate de souris et de cellules myélomati- ques de souris; voir les brevets U.S. Nos 4 172 124 et 4 196 265. Des cellules hybrides réunies de cellules de rate de souris BALB/c et de cellules mnyélomati--ques de souris BALB/c ont également été décrites dans la littérature par Kohler et coll. dans Nature, Vol. 256, 495-497 (1975), et dans Eur. J. Immunol., Vol. 6, 511-519 (1976). Les cellules de rate utili- sées pour la production de ces hybrides furent prises à partir de souris immunisées au moyen de globules rouges de sang de mouton. D'autres articles révélant la production d'hybrides de cellules réunies de cellules de rate animales et de cellules myélomatiques animales comprennent ceux de Milstein et coll. dans Nature, Vol. 266, 550-552 (1977); Koprowski et coll. dans Proc. Nat. Acad. Sci., Vol. 74, 2985-2988, (1977) et Welsh dans Nature, Vol. 266, 495 (1977). La technologie des hybridomes s'est avérée capable de fournir des rendements satisfaisants dans la production d'anticorps. Cependant, les anticorps produits par des hybri- domes consistant en cellules somatiques hybrides de cellules de rate produisant des anticorps et de cellules myélomatiques de souris BALB/c sont nécessairement des agents étrangers lors- qu'ils sont injectés dans le corps humain. En conséquence, le système naturel de réponse immunitaire humain fabrique des anticorps pour combattre les anticorps produits par les hybri- domes après leur première introduction dans le corps humain. Des injections répétées de ces anticorps peuvent provoquer un choc. Certains chromosomes humains se perdent normalement lors de la réunion de lymphocytes humains avec des cellules myélomatiques de souris pour la formation d'hybrides souris- humains. De tels hybrides doivent conserver les deux chromoso- mes humains qui transportent les gènes réarrangés pour les chaînes humaines d'immunoglobuline légère et lourde afin de rester efficaces. En conséquence, i1 est difficile d'obtenir des hybridomes entre espèces qui puissent secréter des anti- corps humains. Il est avantageux de fourair une cellule hybridome iormée par la réunion dune cellule myélomatique humaine avec un lymphocyte humain. Une cellule hybridome de ce genre pour- rait produire des anticorps humains avec un risque réduit de chocs résultant d'injections répétées dans un être humain. Cependant, en général, les cellules myélomatiques humaines ne se réunissent pas bien avec les lymphocytes humains. La présente invention a pour but de fournir des cel- lules myélomatiques stables, qui peuvent être cultivées et sous-cultivées à l'infini, et qui soient capables d'hybrida- tion avec des lymphocytes humains et avec des lymphocytes pro- venant d'autres animaux afin de former des cellules hybrides réunies stables. En outre, la présente invention a pour but de four- nir un procédé de production d'hybridomes à partir de cellu- les myélomatiques humaines, ces hybridomes pouvant exprimer des anticorps utiles acceptables par le système de réponse immunitaire humain. La présente invention a également pour but de four- nir un procédé de production d'anticorps utilisables pour le traitement de maladies humaines, les anticorps ainsi produits étant acceptables par le système immunitaire humain. Suivant la présente invention, on fournit une compo- sition comprenant une lignée de cellules myélomatiques humai- nés stable et continue qui est capable d'hybridation avec des cellules humaines et animales produisant des anticorps, cette lignée de cellules étant un mutant de cellules humaines BGM 1500 et présentant une déficience en hypoxanthine-phosphori- bosyltransférase (HPRT). Des procédés de production de cellules hybrides uti- lisant les lignées de cellules myélomatiques humaines stables, avec une déficience en HPRT, sont fournis suivant un des modes de réalisation de la présente invention. Des procédés de production des anticorps utilisant de telles cellules hybrides sont fournis suivant un autre mode de réalisation de l'invention. La présente invention fournit, entre autres, des procédés de production de nouvelles cellules qui sont généti- quement stables, qui peuvent être cultivées et sous-cultivées à l'infini et qui produisent de grandes quantités d'anticorps contre des virus, tumeurs et agents étrangers, ainsi que leurs déterminants antigéniques. Ces lignées cellulaires sont des cellules hybrides réunies de (a) une lignée stable de cellu- les humaines myélomatiques déficientes en HPRT, p. ex. une li- gnée de cellules malignes dérivées d'une tumeur primaire de la moelle osseuse, et de (b) des lymphocytes produisant des anticorps, tels que ceux de la rate ou des nodules lymphati- ques, ou des lymphocytes périphériques. Une lignée de cellules particulièrement préférée est un hybride de cellules réunies de lymphocytes humains périphériques et de cellules myéloma- tiques humaines. Ces lignées de cellules peuvent être conser- vées à peu près indéfiniment dans un milieu de culture sélec- tif tel que l'hypoxanthine-aminoptérine-thymidine (HAT), et peuvent continuer à produire indéfiniment des anticorps spéci- fiques pour des déterminants antigoniques. Les cellules myélomatiques de la présente invention ont été dérivées de la lignée de cellules humaines B de type GM 1500 qui peut être obtenue au Dépat de Cellules Humaines Mutantes Génétiques (Human Genetic Mutant Cell Repository) de l'Institut de Recherche Médicale à Camden dans le New Jersey (Institute for Mledical Research). Les cellules myélomatiques GM 1500 ont été traitées avec du méthyl sulfonate d'éthyle pour favoriser leur taux de mutation, et elles ont été sélectionn2es pour leur déficience en hypoxanthine-phosphoribbsyltransférase (HPRT) dans un mi- lieu contenant de la 6-thioguanine à une concentration d'à peu près 30 microgrammes/ml (la technique de base pour la se- lection est d4crite dans Nature, Vol. 256, 495-497 (1975)). Ce procédé tue la plupart des cellules myélomatiques; les cellules humaines B meurent normalemrnt dans un milieu conte- nant de la 6-thioguanine, En outre, mnme parmi les cellules survivantes, la plupart ne sont pas capables d'hybridation avec des lymphocytes. Deux publications ont décrit l'hybridation des cel- lules humaines B myélomatiques GM 1500 avec des cellules myé- lomatiques non-humaines Les cellules GM 1500 n'ont pas été soumises à un traitement mutagène ni a tout autre procédé de sélection avant la réunion, dans les procédés décrits par ces articles. Ces articles sont: Croce et coll. dans Proc. Nat. Acad. Sci. U.S.A., Vol. 76, 3416-3419 (1974) et Croce et coll. dans Bur. J. Imminunol., Vol. 10, 486-488 (1980). Bien que le méthyl sulfonate deéthyle puisse être utilis6 avantageusement comme agent mutagène dans le procédé décrit précédemment, il est entendu que tout autre agent muta- gène peut être utilisé pour provoquer une mutation des cel- lules humaines B GM 1500 tant que cet agent n'affecte pas nui- siblement les cellules. Le traitement à l'agent mutagène et le procédé de sé- lection ont donné deux survivants", rendant possible la pro- pagation de lignées de cellules myélomatiques modifiées, sta- bles, déficientes en HPRT. Les deux survivants ont été dési- gnés par les noms de GM 1500 6TG-Al-1 et GM 1500 6TG A1-2. Les deux survivants, qui semblent fonctionner de manière inter- changeable, forment des lignées cellulaires continues qui sont déposées àl'American Type Culture Collection (ATCC), 12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland, sous les numéros d'accès CRL-8032 et CRL-8038 respectivement. Ces lignées de cellules myélomatiques possèdent la caractéristique distinctive de pou- voir être-hybridées avec des lymphocytes humains ainsi qu'avec les lymphocytes d'autres animaux. Ces cellules secrètent de l'IgG (immunoglobuline gamma-2, K) comme les cellules-parentes GM 1500, et elles sont positives à l'antigène nucléaire du vi- rus Epstein-Barr. Les cellules ont été conservées dans le mi- lieu essentiel minimum d'Eagle (MEM), le milieu RPMI (Rosewell Park Memorial Institute) 1640 pouvant aussi être utilisé, avec % de sérum de foetus bovine La croissance des cellules myé- lomatiques est inhibée par le milieu sélectif hypoxanthine-ami- noptérine-thymidine. Ce milieu est décrit dans Science, Vol. 154, 709-710 (1964). Le reste du présent mémoire se réfère aux cellules GM 1500 6TG-A1-2; la lignée cellulaire GM 1500 6TG- Al-l put aussi être utilisée. Les lymphocytes utilisés peuvent être n'importe quels lymphocytes provenant d'un être humain, trouvé comme exprimant les anticorps requis. Il est également possible de stimuler les lymphocytes humains in vitro pour obtenir les anticorps souhai- tés. Par exemple, les lymphocytes peuvent être prélevés sur un malade contaminé par un virus actif tel que la rage, la grippe, la rougeole, la rubéole, la poliomyélite, etc. Cependant, il va de soi que ceux-ci ne sont que des exemples; on peut éga- lement utiliser des lymphocytes créant des anticorps attaquant d'autres virus ou d'autres antigènes non-viraux, tels que le pollen. Il est préférable que les lymphocytes soient des lym- phocytes périphériques séparés du sang du malade ou des cel- lules de la rate. Dans l'un des modes de réalisation de l'invention, la source de lymphocytes utilisée est du plasma sanguin hé- parinisé provenant d'un malade souffrant de panencéphalite sclérosante subaigUe (SSPE), une infection du virus de la rou- geole du cerveau. Afin de vérifier la présence de lymphocytes anti-SSPE dans ce plasma sanguin, un échantillon de sérum a été dilué à 1:10.000. 000 avec une solution tampon de phosphate et on a trouvé qu'il se liait en utilisant l'essai radio-immun à des cellules cible, infectées de rougeole. Ces données, ain- si que la mise en évidence de lésions histologiques du cerveau caractéristiques de la maladie, ont confirmé le diagnostic clinique de SSPE. Un échantillon de 10 ml de plasma sanguin héparinisé a été prélevé sur ce malade et une suspension de cellules de lymphocytes purifies au Ficoll a été préparée de la manière enseignée par Gerhard et collo, Eur. J. Immunol., 5, 720-725 (1975). Les globules rouges ont été lysés par incubation de l'échantillon de sang pendant 15 minutes à 4 C dans du NH4C1 (0,83 %). La suspension de cellules résultante a été lavée par une centrifugation (800Xg) au moyen de sérum bovin inac- tivé par la chaleur et une centrifugation dans un milieu sans protéine (RPMI 1640, tamponné avec 7,5 mM, d'HEPES, pH 7,2). La production des hybrides a été réalisée par mé- lange d'environ dix millions de cellules myélomatiques sélec- tionnées déficientes en HPRT suivant la présente invention avec un à dix millions de lymphocytes. Le mélange de cellules a été centrifugé à 800Xg et les cellules ont été à nouveau mises en suspension pour la réunion dans une solution à 50 (poids-volume) de polyéthylène glycol - 1000 (PEG) dilué dans un milieu essentiel minimum (MEM) sans sérum. Suivant les pro- cédures de réunion enseignées par Davidson et coll., Somat, Cell Genet. 2, 175-176, le polyéthylène glycol a été d'abord dilué dans le MEM sans sérum, puis dans du MEM avec sérum avant que les cellules ne soient ensemencées dans des puits de plaques Linbro dans un milieu sélectif hypoxanthine-amino- ptérine-thymidine. Les cultures ont été incubées à 37 C dans une atmosphère de 95 % d'air/5 % C02 et, tous les 7 à 10 jours, le milieu de culture a été partiellement remplaçé par un mi- lieu frais (HAT) (de 1/2 à 1/3). La croissance des cellules a été observée dans 20 des 24 puits 15 à 21 jours après incubation des cultures pro- duites par la réunion des lymphocytes avec les cellules myélo- matiques. Toute croissance dans un milieu HAT est une indica- tion d'hybridation couronnée de succès entre les lymphocytes et les cellules myélomatiques. Ces cellules ont été reproduites continuellement dans un milieu HAT et ont été clonées en mi- croplaques (Linbro) par limitation de la dilution. Chaque clo- ne indépendant (dérivé d'un puit indépendant) a ensuite été testé pour l'obtention de chaTnes d'immunoglobulines humaines et pour la capacité d'immunoprécipitation des protéines du vi- rus de la rougeole. Onr a trouvé que les hybridomes secrétaient des IgM spécifiques pour les nucléocapsides du virus de la rougeole, ainsi qu'il est décrit ci-dessous. La spécificité des anticorps pour le virus de la rougeole a été déterminée par des techniques d'immuno-précipi- tation et d'électrophorèse avec gel de polyacrylamide-SDS à 10 %, bien connues dans la technique. (SDS est une abréviation pour le dodécyl sulfate de sodium). Généralement, les cultures de cellules ont été marquées avec 100 microcuries de 3H-leu- cine (70 curies par millimole) par millilitre de solution par exposition pendant 12 heures. Les chaTnes d'immuno-globulines humaines furent ensuite immuno-précipitées avec des antisé- rums d'immuno-globuline de lapin anti-humaine selon des procé- dures établies. Les chaînes marquées d'immunoglobulines humai- nes immuno-précipitées-ont été ensuite séparées par électro- phorèse conventionnelle sur gel de polyacrylamide-SDS à 10 %. Une comparaison fut faite entre (1) des immunopré cipités de l'immunoglobuline produite par les cellules GM 1500 6TG-A1-2 à la suite d'une réaction avec un antisérum gamma antihumain; (2) des immunoprécipités de chaênes d'im- munoglobulines secrétées par des hybridomes humain-humain (ob- tenus par le procédé de réunion décrit précédemment) à la sui- te d'une réaction avec un antisérum mu antihumain; et (3) des immunoprécipités de cha nes d'immunoglobulines secrétées avec un hybridome humain-humain à la suite d'une réaction avec des antisérums de cha nes spécifiques mu et gamma antihumain, en utilisant les techniques électrophoreétiques de séparation expliquées précédemment. Le but de cette comparaison était de démontrer que les hybridomes humain-humain produits selon la présente invention exprimaient les deux chaînes d'immunoglobu- line humaines mu et gamma. Six échantillons de clones de cellules hybrides ont été testées par imn2unoprécipitation des immunoglobulines se- crétées par les hybrides avec un antisérum de lapin anti-mu (IgG1l. Tous les hybrides ont exprimé la cha ne de l'immuno- globuline mu humaine, Certains de ces hybridomes ont exprimé également une chaine légère d'ixmunoglobuline migrant diffé- remment de la chaîne légère exprimée par le clone myélomati- que GM 1500 6TG-Al-2. L'un de ces clones hybridomes n'était pas capable de produire la chatne légère d'immunoglobuline exprimée par les cellules GM 1500 6TG-A1-2. Le liquide de cul- ture des hybridomes qui avaient été immunoprécipités avec les antisérums de lapin de la cha ne mu et gamma antihumaine ont exprimé deux chatnes lourdes d'immunoglobuline, la cha ne gam- ma de la cellule parente GM 1500 6TG-A1-2 et la chaîne mu de la cellule parente B du SSPE humain (Panencéphalite sclérosan- te subaigUe). Une autre comparaison a été faite par électrophorè- se au gel de polyacrylamide pour déterminer la spécificité des anticorps exprimés par les hybridomes de l'invention pour l'antigène du virus de la rougeole. Deux échantillons de mi- lieux de culture des hybridomes ont été comparés avec deux témoins. Les témoins étaient (a) du sérum prélevé d'un malade se remettant d'une infection de rougeole atypique et (2) du liquide de culture de la lignée de cellules humaines GM 1500 6TG-A1-2. Le sérum provenant d'un malade ayant eu une rougeo- le atypique a été choisi pour tester l'efficacité croisée des anticorps du virus de la rougeole. Les résultats de la compa- raison ont été obtenus en utilisant des techniques convention- nelles d'analyse. Les procédés utilisés dans 1'immunoprécipi- tation furent les suivants: (1) des lyses de cellules CV1 in- fectées par le virus de la rougeole, marquées avec de la 35 S- méthionine furent utilisées comme antigènes; des échantillons (25 microlitres) de l'antigène furent mélangés avec des échan- tillons (100 microlitres) de liquide de culture concentré et incubés à environ 37 C pendant 90 minutes et ensuite à 4 pendant 4 heures; (3) des échantillons (25 microlitres) d'an- ticorps antihumain total de lapin furent ensuite ajoutés; (4) les incubations furent répétées; (5) les polypeptides précipités furent recueillis par centrifugation dans une cen- trifugeuse Eppendorf durant 20 minutes à 10 000 tpm; (6) le culot visible récupéré a été mis a nouveau en suspension dans un tampon au phosphate et lavé trois fois; (7) le culot a été mis en suspension dans un tampon de lyse et mis à bouillir pendant trois minutes; (8) les solutions résultantes ont été soumises à une électrophorèse sur un gel de polyacrylamide- SDS à 10 % dans les conditions décrites par Hall et coll., Proc. Nat. Acad. Sci. U.S.A., Vo. 76, 2047-2051, (1979). Après fluorographie, le gel séché a été exposé à un film radiogra- phique Cronex. Les liquides des cultures des hybridomes ont préci- pité le polypeptide du virus NP et changé les proportions de ses fragments de division. Les anticorps dans les liquides de cultures sont donc spécifiques pour un polypeptide simple, NP, qui est le polypeptide structural essentiel du nucléocapside du virus, et l'antigène primaire du virus de la rougeole. Une autre comparaison fut faite en utilisant l'ana- lyse électrophorétique sur gel de polyacrylamide-SDS, entre (1) les polypeptides du virus de la rougeole précipités par le liquide de culture (non concentré) d'un sous-clone hybri- dome, obtenu en limitant la dilution, et (2) les polypeptides du virus précipités par le même sérum de rougeole atypique que celui utilisé plus haut. Les résultats confirment- la spé- cificité des anticorps dans le liquide de culture du clone hybridome, alors que le sous-clome de celui-ci précipite le polypeptide NP avec une activité comparable à celle du clone hybridome parent. La lignée cellulaire produite par la réunion de la lignée cellulaire myélomatique humaine stable déficiente en HPRT de la présente invention avec des lymphocytes produisant des anticorps humains, ainsi qu'exemplifié par les lymphocytes anti-SSPE utilisés dans le mode de réalisation précédent de l'invention, est une culture hybride montrant les caractéristi- ques à la fois des lymphocytes normaux et des cellules myélo- matiques parentes, et semble être dérivée d'un seul cas de réu- nion. Les cellules sont de nature hybride puisque: (a) la lignée cellulaire hybride a poussé pendant plusieurs mois dans un milieu sélectif HAT qui inhibe la crois- sance des cellules myélomatiques parentales mais pas celle des lymphocytes normaux qui, à leur tour, ne survivraient proba- blement pas in vitro pendant plus de 4 à 5 semaines; (b) le nombre de chromosomes dans les cellules hy- brides est proche de la somme de celui des lymphocytes nor- maux et de celui des cellules myélomatiques parentes; (c) l'hybridome produit de nouvelles cha nes d'immu- noglobulines telles que les chaînes légères et mu; et (d) l'hybride produit des anticorps spécifiques, alors que les cellules myélomatiques parentales ne produisent pas ce genre d'anticorps. En outre, le taux de production d'anticorps de ce genre est plus élevé que celui observé dans des cultures de lymphocytes non hybridisés. Des procédés similaires peuvent être mis en oeuvre par un spécialiste dans ce domaine, à l'aide d'autres lympho- cytes, y compris des lymphocytes humains qui expriment d'au- tres anticorps, et des lymphocytes d'autres animaux. Comme alternative à la croissance d'hybridomes in vitro, des cellu- les hybridomes peuvent être injectées dans un animal immuno- supprimé tel qu'une souris Nude pour culture in vivo. Les anticorps produits par les hybrides peuvent être récupérés par utilisation de techniques courantes et peuvent être utilisés en recherche médicale analytique pour l'identi- fication d'antigènes dans des échantillons de sang et de mi- lieux de cultures. Les anticorps sont pratiquement homogènes et sont hautement spécifiques pour l'antigène cible. Une sour- ce de différents anticorps homogènes, chacun hautement spéci- fique à un antigène particulier permet aux chercheurs de dé- terminer rapidement la spécificité d'un antigène et/ou de ca- ractériser les antigènes. En outre, les anticorps peuvent être administrés à des êtres humains malades pour assister la lutte contre la maladie. R E V E N I C A T IO N S 1 - Composition comprenant une lignée cellulaire myéloînatique humaine continue stable, capable d'hybridation avec des cellules d'âtres humains et autres animaux produisant des anticorps, ladite lignée étant une mutante de cellules hu- maines B GM 1500 déficiente en hypoxanthine-phosphoribosyl- *transférase. 2 - Composition suivant la revendication 1, carac- térisée en ce que la lignée de cellules correspond à la li- gnée cellulaire déposée à ltATCC sous le N CRL-8032. 3 - Composition suivant la revendication 1, carac- térisée en ce Vue la lignée de cellules correspond à la lignée cellulaire déposée à 1iATCC sous le N CRL-8038. 4 - Procédé de production d'une lignée de cellules hybrides par la r6union dutme cellule produisant des anticorps et d'une cellule myelomatique pour fourDnir une cellule hybri- de fusionnée produisant des anticorps, caractérisé en ce qu'on utilise une cellule myélomatique qui est une mutante déficien- te en hypoxanthine phosphoribosyl-transf:rase, de cellule hu- mnaine B GM 1500. - Procédé suivant la revendication 4, caractérisé en ce que. la cellule myélomatique est prise à partir d'une li- gnée continue de cellules produite par le traitement de cellu- les humaines B GM 1500 avec du méthylsulfonate d'éthyle pour favoriser le taux de mutation des cellules, et ensuite on sé- lectionne les cellules avec de la 6-thioguanine pour la défi- cience en hypoxanthine-phosphoribosyltransfúrase. 6 - Procédé suivant la revendication 4, caractérisé en ce que la cellule myélomatique est obtenue à partir de la lignée cellulaire continue dépos6e à 1ATCC sous le N CRL- 8032. 7 - Procédé suivant la revendication 4, caractérisé en ce que la cellule myélomatique est obtenue à partir de la lignée cellulaire continue déposée à 1'ATCC sous le N0 CRL- 8038. 8 - Procédé suivant la revendication 4, caractérisé en ce que la cellule hybride fusionnée est cultivée et les anticorps produits par la cellule hybride sont recueillis. 9 - Procédé suivant la revendication 8, caractérisé en ce que ledit hybride est cultivé in vitro. - Procédé suivant la revendication 8, caractérisé en ce que ledit hybride est cultivé in vivo. 11 - Procédé suivant la revendication 8, caractérisé en ce que ledit hybride est cultivé dans un milieu contenant de l'hypoxanthine-aminoptérine-thymidine. 12 - Procédé suivant la revendication 4, caractérisé en ce que ladite cellule produisant des anticorps est un lym- phocyte choisi parmi les cellules de zrate, les cellules de nodules lymphatiques et les lymphocytes périphériques. 13 - Frocédé suivant la revendication 12, caractérisé en ce que la cellule produisant des anticorps est un lympho- cyte périphérique. 14 - Procédé suivant la revendication 4, caractérisé en ce que la cellule produisant des anticorps est obtenue à partir d'un être humain infecté par un virus. - Procédé suivant la revendication 14, caractéri- sé en ce que le virus est un virus de la rage, de la rougeole, de la grippe, de la rubéole ou de la poliomyélite. 16 - Procédé suivant la revendication 15, caracté- risé en ce que le virus est celui de la rougeole.