FR 2495635 A1 19820611 FR 8122481 A 19811201 La présente invention concerne un procédé de production d'urokinase humaine. L'urokinase (EC 3,4,99,26) est une enzyme que l'on trouve dans l'urine des mammifères, et qui catalyse le clivage du plasminogène (ou profibrinolysine) en plas- mine (ou fibrinolysine). Comme différentes thromboses do- minent dans les statistiques annuelles de mortalité, l'u- tilité d'agents renfermant de l'urokinase croit d'année en année. Bien que l'on connaisse des procédés classiques pour la production d'urokinase humaine, comme celui qui consiste à la recueillir à partir de l'urine humaine à l'aide de floculants ou d'adsorbants, ou bien par culture continue de cellules de rein humain en présence d'un in- ducteur d'urokinase, on ne connait pas de procédé de pro- duction massive d'urokinase humaine à faible coût. La présente invention est basée sur la consta- tation inattendue que, des cellules obtenues à l'aide cdun animal à sang chaud par multiplication de cellules humai- nes, capables de produire de l'urokinase humaine, présen- tent une aptitude à produire cette urokinase bien supé- rieure à celle des cultures de tissu in vitro, la produc- tion par cellule étant jusqu'à 2 à 50 fois supérieure. Le nouveau procédé selon l'invention de produc- tion de cette enzyme consiste à multiplier des cellules humaines, capables de produire l'urokinase, par transplan- tation de ces cellules dans le corps d'un animal à sang chaud, ou en fournissant à ces cellules, à l'aide d'un dispositif, le fluide corporel nutritif d'un tel animal, puis à exposer les cellules, multipliées par l'un ou 1' autre de ces procédés de multiplication, à l'influence d' un inducteur de cette enzyme. Le procédé selon l'inven- tion, tout en aboutissant à une production supérieure en urokinase, n'exige que peu ou pas de milieu nutritif con- tenant du sérum coûteux pour la multiplication cellulaire, et il permet de maintenir plus facilement que dans le cas de la culture de tissu in vitro, le milieu de culture au cours de la multiplication cellulaire. En particulier, toutes les cellules humaines, capables de produire l'uro- kinase,peuvent être facilement multipliées, grace à l'uti- lisation de fluide corporel nutritif, provenant d'un ani- mal à sang chaud, par transplantation des cellules en question dans le corps de l'animal, ou par leur mise en suspension dans une chambre de diffusion équipée pour re- cevoir le fluide corporel nutritif, l'animal étant ali- mente de manière habituelle. Ce procédé est également caractérisé par une multiplica- tion des cellules plus stable et plus poussée, et par une production supérieure d'enzyme par cellule. Conviennent, conformément à l'invention, toutes les cellules humaines, à condition qu'elles produisent!' urokinase et se multiplient aisément dans le corps d'un animal à sang chaud: par exemple des cellules de rein normal ou des cellules fibroblastes du poumon, ces cel- lules transformées par irradiation ou par virus; des cellules de carcinome du foie, de carcinome de la vésicule de carcinome épidermolde, de carcinome du poumon; des cellules de fibrome; des cellules de rhabdomyosarcome et de sarcome du mésenchyme; ainsi que des lignées de cellu- les établies des cellules ci-dessus. L'utilisation de li- gnées de lymphoblastoldes humains, faciles à conserver, dotées de sites génétiques commandant la production d'u- rokinase au moyen de techniques de recombinaison généti- que utilisant des enzymes comme ADN ligase, nucléase et ADN polymérase, et au moyen de fusion cellulaire, utili- sant des agents tels que polyéthylène glycol ou virus de Sendal, aboutit avantageusement à une multiplication cel- lulaire remarquablement supérieure, lorsqu'on transplante les cellules dans le corps d'un animal à sang chaud, la production de l'enzyme par cellule étant alors de 2 à 10 fois, ou davantage, plus élevée. En outre, cormme la trans- plantation au corps de l'animal des lignées de lymphoblas- tondes humains, mentionnés plus haut, aboutit à la forma- tion de tumeurs massives,pouvant être facilement désagré- gées, et que ces tumeurs ne sont guère contaminées par les cellules de l'hôte animal, la récolte des cellules de lymphoblastoldes humains multipliés, vivantes, est facile. Conviennent comme animaux, utilisables dans le procédé selon l'invention, tous ceux, dans lesquels les cellules peuvent se multiplier, par exemple des volailles comme poulet et pigeon, des mammifères tels que chat, chien, singe, chèvre, porc, vache, cheval, lapin, cobaye, hamster, souris ou souris nue. Comme cette transplantation cellulaire provoque une immunoréaction indésirable, il s'avère souhaitable d'utiliser des animaux nouveau-nés ou en bas âge, ou encore au stade le plus jeune possible, comme oeuf, embryon ou foetus. Afin de réduire 1'immuno- réaction, l'animal peut être traité, avant la transplanta- tion des cellulespar irradiation aux rayons-X ou aux ra- yons- Y, d'environ 200 à 600 rems, ou par injection d'an- tisérum ou d'agent immunedépresseur préparé selon un pro- cédé classique. Comme la souris nue, utilisée comme animal à sang chaud, présente l'immunoréaction la plus faible, même à l'àge adulte, on peut l'utiliser avantageusement sans prétraitement, pour y transplanter et y multiplier rapidement des lignées de cellules humaines établies. Une multiplication cellulaire, stabilisée, et une augmentation de la production d'urokinase humaine peu- vent être à la fois réalisées par transplantation répétée, utilisant des combinaisons de différents animaux à sang chaud: on peut atteindre ces objectifs en implantant d'a- bord les cellules chez le hamster, o elles se multiplient, puis en les réimplantant chez la souris nue. En outre, on peut effectuer la transplantation successive chez des ani- maux de la même classe ou division, aussi bien que chez ceux de la même espèce ou du même genre. En ce qui concerne la localisation de l'implan- t-tion des cellules humaines, conviennent tous les sites de i'animal, pourvu que les cellules puissent s'y multi- plier, par oxemple la cavité allantoique, ou les voies. intrapéritonéale, intraveineuse ou sous-cutanée. A côté de cette transplantation directe des cel- lules au corps de l'animal, existe la possibilité de fai- re se multiplier aisément les lignées classiques de cellu- les humaines, capables de produire l'urokinase, en utili- 1C sant le fluide corporel nutritif provenant de l'animal, grace à l'inclusion, par exemple par voie intrapéritoné- ale, dans le corps de l'animal d'une chambre de diffusion classique, de taille et de forme appropriées, munie d'une membrane filtrante, d'un ultra-filtre ou de fibre creuse d'un diamètre de pore de l'ordre de 10-7 à 10-5 m, qui em- pêche la contamination de la chambre de diffusion par les cellules de l'hôte tout en permettant l'apport du fluide corporel nutritif de l'animal aux cellules. De plus, comme la chambre de diffusion peut être conçue, si nécessaire, pour être placée sur l'hôte animal et permettre au fluide corporel de ce dernier de circuler dans la chambre, les parois de celle-ci peuvent être munies de fenêtres laté- rales, transparentes,permettant l'observation de la sus- pension de cellules, ainsi que le remplacement et l'échan- ge avec une chambre fraîche: la multiplication cellulaire est ainsi augmentée à un niveau encore supérieur, rapporté à la durée de vie de l'animal, et la production par ani- mal est encore accrue sans sacrifice de l'hôte. En outre, lorsqu'on utilise cette chambre de diffusion, comme les cellules humaines multipliées peuvent être facilement ré- coltées, et qu'il n'y a pas manifestation d'immunoréaction, du fait de l'absence de contact direct entre les cellules humaines et cellesde l'hôte animal, on peut utiliser comme hôte, conformément à l'invention, sans prétraitement des- tiné à réduire l'immunoréaction, tout animal à sang chaud. L'alimentation de l'hôte animal, auquel on a implanté des cellules humaines, peut s'effectuer facile- ment par procédé classique, même après la transplantation cellulaire, et elle ne nécessite pas de soins-particuliers. La multiplication cellulaire maximale est at- teinte environ 1 à 20 semaines après l'implantation des cel- lules. Lorsque la lignée établie, implantée, est une li- gnée de cellules de tumeur humaine ou de lymphoblastotdes humains, la multiplication cellulaire maximale est attein- te en 1 à 5 semaines, après la transplantation. Conformément à l'invention on obtient 107 à 1012, ou plus, de cellules humaines par hôte. Autrement dit, le nombre de cellules humaines implantées chez l'hôte animal s'accrott 102 à 107 fois ou plus, ou bien est d'environ 101 à 106 fois ou plus celui que l'on obtient avec un pro- cédé de culture de tissu in vitro, utilisant un milieu nu- tritif, aussi ces cellules sont-elles avantageusement u- tilisables pour la production d'urokinase humaine. En ce qui concerne le procédé pour induire cette enzyme, on peut employer tout moyen permettant sa libéra- tion par les cellules humaines. Par exemple, les cellules humaines, obtenues par multiplication en ascite, en sus- pension, et récolte à partir de cet ascite,ou par extrac- tion de tumeur massive, formée sous la peau, et récolte après désagrégation de la tumeur, sont mises en suspension pour atteindre une concentration de 104 à 108 cellules par ml dans un milieu nutritif, préchauffé à une température de l'ordre de 200C à 40WC, puis soumises à cette tempéra- ture pendant plusieurs heures ou jours, à l'action d'un inducteur d'urokinase humaine. Les inducteurs préférés d'urokinase sont des amino-acides comme glycine et phénylalanine; des saccha- rides comme glucose, inositol, ribose et désoxyribose; et des hormones comme l'adrénaline. Au cours de l'induction de l'urokinase humaine, la stabilisation de l'enzyme libé- rée et l'augmentation de sa production peuvent être réa- lisées à la fois par addition d'un stabilisant et/ou d' un agent tel que pronase (EC 3.4.24.4) ou d'alcalotdes. L'urokinase humaine, ainsi obtenue, peut être recueillie facilement grâce à des techniques de purifica- tion et de séparation utilisant des modes opératoires clas- siques tels que relargage, dialyse, filtration, centrifu- gation, concentration et lyophilisation. Quand on souhaite un produit encore plus pur, on peut obtenir une prépara- tion de pureté supérieure par combinaison des techniques mentionnées plus haut avec d'autres modes opératoires clas- siques, tels qu'adsorption et désorption avec échange d' ions, filtration sur gel, chromatographie par affinité, fractionnement au point isoëlectrique et électrophorèse. La préparation d'urokinase humaine, conforme à l'invention, est immunologiquement identique à celle qui provient de l'urine humaine, et elle n'est pas contaminée avec des pyrogènes ou des virus d'hépatite. Par conse- quent, elle peut être avantageusement utilisée, seule ou en combinaison avec un ou plusieurs agents, par exemple hormone stéroide, anticoagulant ou agent anti-tumeur, pour injection, administration, pour la prévention et le trai- tement de maladies humaines. Au cours de la présente description, l'activité fibrinolytique de furokinase humaine est dosée par le pro- cédé d'essai de plaquette de fibrine, décrit par Ploug et coll. dans Biochem. Biophys. Acta, Vol. 24, page 278 (1957) et exprimée en UI (Unité Internationale). L'invention est illustrée ci-après par plusieurs réalisations non limitatives. EXEMPLE 1 A des souris adultes nues, on implante par voie sous-cu- tanée une lignée de rhabdomyosarcome humain TE-32RD, puis on nourrit ces animaux de manière habituelle pendant 4 semaines. Les tumeurs massives résultantes, formées sous la peau et pesant environ 10 g chacune, sont extraites et désagrégées par hachage et mise en suspension dans du sérum physiologique contenant de la trypsine. Après lavage des cellules avec du milieu de Earle 199 (pH 7,2), addi- tionné de 10% en volume/volume de sérum foetal de veau, les cellules sont remises en suspension, à une concentra- tion de 105 cellules/ml, environ, dans une préparation fraiche du même milieu qui contient en tent qu'inducteur d'urokinase 50 mM de L-glycine, et l'on met à incuber à 37 C pendant 10 jours pour obtenir l'urokinase humaine. Les cellules sont ensuite soumises aux ultra-sons et l'ac- tivité fibrinolytique dans la partie surnageante est do- sée. La production d'urokinase est de l'ordre de 4 000 UI/ml de suspension cellulaire. On traite de manière similaire, pour obtenir de l'uroki- nase humaine, des cellules témoins obtenues par culture in vitro de lignée de rhabdomyosarcome humain à 37 C, avec un milieu de Parker 199 (pH 7,2), additionné de 10% en volume/ volume de sérum foetal de veau. La production d'urokinase n'est que de 750 UI/ml de suspension cellulaire. EXEMPLE 2 La lignée de rhabdomyosarcome humain TE-32RD et une lignée de lymphoblastoldes leucémiques humains de Namalwa, sont mises ensemble en suspension dans un récipient avec une so- lution saline,de 140 mM de NaCl, 54 mM1 de KCl, 1 mM de NaH2PO4 et 2 mM de CaCl2, de manière à obtenir des concen- trations cellulaires respectives de l'ordre de 103 cellu- les/ml. La suspension de cellules, refroidie à la glace, est mélangée avec une préparation fratche de la même solu- tion saline, contenant du virus de Sendai préalablement inactivé par irradiation à l'ultra-violet; le tout est transféré 5 minutes après le mélange dans un incubateur à 37 C, et y est agité pendant 30 minutes pour réaliser la fusion cellulaire, introduisant l'aptitude à produire de l'urokinase humaine de la lignée du rhabdomyosarcome humain, d.-ns la lignée des lymphoblastoîdes leucémiques humains. Après clonage selon un procédé classique de la souche de cellules d'hybridome, capable de produire l'u- rokinase, on l'implante par voie intrapéritonéale chez des souris nues adultes, qui sont ensuite nourries de ma- nière habituelle pendant 5 semaines. Les tumeurs massives, résultantes, pesant environ 15 g chacune, sont extraites et traitâes comme dans l'exemple 1 pour induire l'uroki- nase humaine, à cela près que l'on remplace les 50 mMl de L-glycine par 0, 1% en poids/volume de phénylalanine et 0,1% en poids/volume de glucose. La production d'uroki- nase est d'environ 12 000 UI/ml de suspension cellulaire. L'expérimentation témoin est effectuée comme dans l'exem- ple 1, par culture in vitro de la lignée de lymphoblastot- des leucémiques, humains, fusionnées, de Namalwa, et expo- sition des cellules humaines multipliées à l'action de 1' inducteur d'urokinase. La production d'urokinase humaine n'est que de 1 000 environ UI/ml de suspension cellulaire. EXEMPLE 3 Après injection, à des hamsters nouveau-nés, d'antisérum préparé à l'aide de lapin selon un procédé classique, on implante, par voie sous-cutanée, chez ces animaux, une lignée de lymphoblastoîdes leucémiques, humains, JBL, dans laquelle l'aptitude à rroduire l'urokinase de la lignée de carcinome du poumon humain A-549, a été introduite comme dans l'exemple 2; on les nourrit de manière habituelle pendant 3 semaines. Les tumeurs massives, résultantes, formées sous la peau, et pesant environ 10 g chacune, sont extraites et traitées comme dans l'exemple 1 pour in- duire l'urokinase humaine. La production d'urokinase est voisine de 14 000 UI/ml de suspension cellulaire. L'expérimentation témoin est réalisée comme dans l'exemple 1, par culture in-vitro de la Iignée de lymphoblastoldes leucémiques, humains, fusionnées, JBL, et exposition des cellules humaines multipliées à l'action de l'inducteur d'urokinase humaine. La production d'urokinase n'est que de 900 UI/ml de suspension cellulaire. EXEMPLE 4 A des rats nouveau-nés on implante, par voie intraveineuse, une lignée de lymphoblastoTdes leucémiques humains de Na- malwa, dans laquelle l'aptitude à produire de l'urokinase humaine de la lignée du rhabdomyosarcome humain TE-32 RD a été introduite, comme dans l'exemple 2; puis onnourrit les rats de manière habituelle, pendant 4 semaines. Les tumeurs massives, résultantes, environ 40 g chacune, sont extraites et traitées comme dans l'exemple 2 pour induire l'enzyme. La production d'urokinase humaine est voisine de 12 000 IU/ml de suspension cellulaire. L'expérimentation témoin est réalisée comme dans l'exemple 1, par culture in vitro de la lignée de lymphoblastotdes leucémiques, hu- mains, fusionnés, de Namalwa, et exposition des cellules humaines multipliées à l'action de l'inducteur d'urokinase. La production d'enzyme n'est que de 600 IU/ml de suspension cellulaire. EXEMPLE 5 Après avoir subi une irradiation de 400 rems environ de rayons-X, pour la réduction de l'immunoréaction, des sou- ris adultes reçoivent par voie sous-cutanée des implants de lignée/de rhabdomyosarcome humain TE-32 RD; puis on les nourrit de manière habituelle,pendant 4 semaines. Les tu- meurs massives, résultantes, formées sous la peau et pe- sant environ 15 g chacune, sont extraites et traitées com- me dans l'exemple 1, pour induire l'urokinase. La produc- tion d'enzyme humaineest d'environ 5 000 IU/ml de suspen- sion cellulaire. L'expérimentation témoin est réalisée comme dans l'exemple 1 par culture in vitro de la lignée du rhabdomyosarcome hu- main, et exposition des cellules humaines multipliées à 1' action de l'inducteur d'urokinase. La production d'enzyme n'est que de l'ordre de 800 IU/ml de suspension cellulaire. EXEMPLE 6 Une lignée de lymphoblastoïdes leucémiques, humains, JBL, dans laquelle l'aptitude à produire de lPurokinase humaine de la lignée de carcinome du poumon humain A-549, a été introduite comme dans l'exemple 3, est mise en suspension dans du sérum physiologique, puis le tout est transféré dans une chambre de diffusion cylindrique en matière plas- tique, dont le volume intérieur est de l'ordre de 10 ml, munie d'une membrane filtrante ayant une dimension de pore voisine de 0,5/-.Après inclusion, par voie intrapéritonéa- le, de cette chambre dans un rat adulte, on nourrit celui- ci de manière habituelle pendant 4 semaines, puis on enl!'ve la chambre. La densité en cellules humaines dansia chambre, atteinte au cours de 'topération ci-dessus, est d'environ 2x109 cellules/ml, ce cui est environ I53 fois supérieur, ou même plus, à ce qu'on atteint avec une culture in vitro à l'aide d'un incubateur à C02. Les cellules humaines, ain- si obtenues, sont traitées comme dans liexeiple 2, pour in- duire l'urokinase. La production en urokinase humaine est de l'ordre de 21 000 IU/ml de suspension cellulaire. L'expérimentation témoin est réalisée comme dans lJexemple 1,par culture in vitro d'une lignée de lymrphoblastoIdes leucémiques humains, fusionnés, JBL, et exposition des cel- lules humaines multipliées à l'action de l'inducteur d'uro- kinase humaine. La production d'enzyme n'est que de l'or- dre de 900 IU/ml de suspension cellulaire. EXEMPLE 7 Une lignée de lymphoblastoides leucémiques humains JBL, dans laquelle l'aptitude à produire de l'urokinase humaine de la lignée de carcinome du poumon humain A-549 a été in- troduite comme dans l'exemple 3, est implantée dans la ca- vité allantoIque d'oeufs embryonnés, préalablement mis à incuber à 370C pendant 5 jours. Après incubation des oeufs embryonnés à cette température, pendant 1 semaine supplé- mentaire,les cellules humaines,multipliées, sont récoltées et traitées comme dans l'exemple 2 pour induire l'enzyme. La production d'urokinase est voisine de 8500 IU/ml de suspension cellulaire. L'expérimentation témoin est réalisée comme dtns l'exemple 1, par culture in vitro de la lignée de lymphoblastoîdes leucémiques humains, fusionnés, JBL, et exposition des cellules humaines, multipliées, à l'action de l'inducteur d'urokinase. La production d'enzyme n'est que d'environ 900 IU/ml de suspension cellulaire. Revendications 1. Procédé pour la production d'urokinase humaine, par multiplication de cellules humaines, capables de pro- duire cette enzyme et exposition des cellules multipliées à l'action d'un inducteur d'urokinase humaine, caractérisé en ce qu'on utilise, pour la multiplication cellulaire, un animal à sang chaud. 2. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que la multiplication cellulaire est réalisée par im- plantation des cellules humaines dans le corps d'un animal à sang chaud. 3. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que la multiplication cellulaire est réalisée à l'aide d'un dispositif, dans lequel-le fluide corporel nutritif d'un animal à sang chaud est fourni aux cellules humaines. 4. Procédé selon la revendication 3, caractérisé en ce que le dispositif est une chambre de diffusion équipée de manière à ce que les cellules de l'hôte animal ne la contaminent pas. 5. Procédé selon une des revendications 1 à 4, ca- ractérisé en ce que les cellules humaines, capables de pro- duire l'enzyme, sont des cellules d'hybridome obtenues par fusion cellulaire d'une lignée de lymphoblastoides humains, avec une souche de cellules humaines capables de produire de l'urokinase humaine. 6. Procédé selon la revendication 5, caractérisé en ce que la souche de cellules humaines, capables de produire l' urokinase, est une lignée du rhabdomyosarcome humain. 7. Procédé selon la revendication 5, caractérisé en ce que la souche de cellules humaines, capable de produire l'urokinase, est une lignée du carcinome du poumon humain. 8. Procédé selon l'une des revendications 5 à 7, ca- ractérisé en ce que la lignée de lymphoblastoïdes humains est une lignée de lymphoblastoldes leucémiques, humains. Procédé selon l'une des revendications 5 à 8, ca- ractérisé en ce que la lignée de lymphoblastoîdes humains est une lignée de Namalwa ou JBL. 10. Procédé selon une des revendications précédentes, caractérisé en ce que l'inducteur d'urokinase humaine est un amino-acide comme glycine ou phénylalanine, un saccha- ride comme glucose, inositol, ribose ou désoxyribose ou une hormone comme adrénaline. 11. Procédé selon une des revendications 1 à 10, ca- ractérisé en ce que l'animal à sang chaud est une volaille, en particulier poulet ou pigeon, ou un mammifère, notam- ment chien, chat, singe, chèvre, porc, vache, cheval, la- pin, rat, cobaye, hamster, souris ou souris nue.