FR 2488619 A1 19820219 FR 8115518 A 19810811 I 2488 6 19 La présente invention se rapporte à un nouveau produit contenant de l'aminoacylase immobilisée et un pro- cédé pour sa préparation. L'aminoacylase est une enzyme connue qui hydro- lyse les acides alpha-(N-acyl)-L-aminés en les acides L- aminés correspondants; cette enzyme est donc utilisée pour la résolution optique des acides DL-aminés et dans des applications analogues. Récemment, et dans le but de parvenir à une mise en oeuvre continue d'une réaction enzymatique faisant in- tervenir l'aminoacylase, on a tenté d'immobiliser cette enzyme. Ainsi par exemple, on a décrit des procédés dans lesquels l'aminoacylase est adsorbée sur un support inso- luble dans l'eau ou conjuguée avec un support insolubleé dans l'eau par des liaisons ioniques, des liaisons cova-. lentes ou une conjugaison de gel; on obtient ainsi des produits contenant l'aminoacylase immobilisée. Parmi ces procédés, et en raison des facilités de réalisation, on a souvent étudié l'immobilisation de l'aminoacylase par des liaisons ioniques; toutefois, ce procédé présente des in- convénients: l'enzyme risque de s'échapper d'un support lorsque la concentration d'un substrat à traiter ou la force ionique d'un système de réaction est forte; par suite, le produit contenant l'enzyme immobilisée est peu stable; en outre, lorsqu'on procède à une réaction con- tinue sur une colonne garnie du produit contenant l'enzy- me immobilisée, on constate une forte perte de charge. Ainsi par exemple, on a proposé de préparer le produit contenant l'enzyme immobilisée en utilisant une résine échangeuse d'anions ou une résine échangeuse d'anions poreuse en tant que support insoluble dans l'eau (demande de brevets japonais publiées sous n0 8.835/1973 et 16954/ 1976). Ces techniques classiques sont encore loin de remédier à l'inconvénient de l'immobilisation de l'amino- acylase par des liaisons ioniques, à savoir que l'enzyme est susceptible de s'échapper du support lorsque la concen- tration d'un substrat à traiter ou la force ionique d'un système de réaction est forte. A la suite de recherches approfondies, la De- manderesse a trouvé qu'on obtenait un produit contenant l'aminoacyla*se immobilisée en fixant cette dernière sur un échangeur d'anions poreux insoluble dans l'eau (en abrégé ci-après échangeur d'anions poreux) et en traitant le produit obtenu par un agent réticulant des protéines; elle a alors constaté que le produit obtenu ne présentait pas -les inconvénients décrits ci-dessus. La présente invention vise en conséquence à la mise au point d'un nouveau produit contenant l'aminoacy- lase immobilisée et qui présente des avantages, en parti- culier l'absence pratiquement totale de fuites de l'enzyme portée par le support, même lorsqu'on traite un substrat à haute concentration ou lorsqu'on opère dans un système de réaction à grande force ionique, et en outre une faible perte de charge en cours de réaction. L'invention comprend également un procédé de préparation du produit contenant 1'aminoacylase immobilisée. D'autres buts et avantages de l'invention appa- raîtront à la lecture de la description ci-après. Ces buts et avantages ont été atteints dans un produit contenant l'aminoacylase immobilisée et qui com- prend cette enzyme et un échangeur d'anions poreux, l'ami- noacylase étant fixée à l'échangeur d'anions poreux et ré- ticulée à l'aide d'un agent réticulant des protéines. Le produit contenant l'aminoacylase immobilisée selon l'in- vention est préparé par fixation de l'enzyme sur un échan- geur d'anions poreux et traitement subséquent du produit obtenu par un agent réticulant des protéines. Dans la présente invention, l'origine de 1'amino- acylase à fixer sur l'échangeur d'anions poreux ne consti- tue pas un facteur critique et on peut utiliser une amino- acylase quelconque pour autant qu'elle soit capable d'hydro- lyser un acide N-acyl-L-aminé en l'acide L-aminé correspon- dant. Ac préférence, on utilisera une arminoacylase à haute activité enzymatique; produite par des myctes appartenant aux genres Aspergillus, Penicillium et Mucor. L'aminoacy- lase à utiliser peut être obtenue d'une telle source par une technique quelconque. L'échangeur d'anions poreux utilisé dans l'in- vention est une matière poreuse insoluble dans l'eau à di- mension de particule appropriée, présentant un grand nom- bre de pores de dimensions allant de plusieurs dizaines à plusieurs centaines de nm et une grande surface spécifique et un grand volume de pores, dans lequel on a introduit des groupes échangeurs d'anions. Il est préférable d'u- tiliser comme échangeur d'anions poreux une résine phénoli- que poreuse (par exemple un condensat phénol-formaldéhyde), une résine de styrène poreuse (par exemple un copolymère styrène-divinyl-benzène), une silice poreuse ou un verre poreux à dimension de particule moyenne d'environ 0,1 à 1,2 mm, plus spécialement 0,3 à 0,8 mm, avec une dimension de pore d'environ de 15 à 300 nm une surface spécifique d'environ 10 à 150 m2/g et un volume de pores d'environ 0,3 à I ml/g, dans lesquels on a introduit un groupe échan- geur d'anions faiblement basique tel qu'un groupe amino primaire, secondaire ou tertiaire, par exemple amino, mé- thylamino ou diméthylamino; ou bien un groupe échangeur d'anions fortement basique tel qu'un groupe ammonium qua- ternaire, par exemple triméthylammonium ou diméthylhydro- xyéthylammonium. Comme exemples d'échangeurs d'anions po- reux préférés, on citera une silice poreuse à groupes tri- méthylimmonium, à une dimension de pore d'environ 100 nm, volume de pores: environ 0,8 ml/g, surface spécifique: environ 25 m2/g et dimension de particule 100 à 200 mi- crons (produit de la firme RhUne-Poulenc Industries, de marque commerciale "Spherosil QMA"); un copolymère styrè- ne-divinylbenzène poreux contenant des groupes triméthyl- ammonium, à une dimension de pore d'environ 45 à 50 nm, volume de pores: environ 0,96 ml/g, surface spécifique: environ 30 m2 /g et dimension de particule 0,35 à 0,55 mm (produit de la firme Mitsubishi Chemical Industries Ltd., de marque commerciale "Diaion HPA-25"); un polystyrène po- reux à groupes triméthylammonium présentant une dimension de pore d'environ 25 nm, un volume de pores d'environ 0,35 ml/g, une surface spécifique d'environ 25 à 35 m2/g et une dimension de particule de 0,3 à 1,2 mm (produit de la firme Diamond Shamrock Corporation, de marque commerciale "Duo- lite A-161"); un polystyrène poreux à groupes diméthylhy- droxyéthylammonium, dimension de pore: environ 25 nm, vo- lume de pores: environ 0,35 ml/g, surface spécifique: environ 25 à 35m2/g et dimension de particule: environ 0,3 à 1,2 mm (produit de la firme Diamond Shamrock Corporation, de marque commerciale "Duolite A-162"); une résine phéno- lique poreuse à groupes hydroxy phénoliques, dimension de pore: environ 15 nm, volume de pore: environ 0,7 ml/g, surface spécifique: environ 80 à 120 m2/g et dimension de particule: environ 0,3 à 1,2 mm (produit de la firme Dia- mond Shamrock Corporation vendu sous la marque "Duolite A- 561"); un copolymère styrène-divinylbenzène poreux à grou- pes triméthylammonium présentant une dimension de pore d'en- viron 30 nm, un volume de pore d'environ 0,5 ml/g, une surface spécifique d'environ 25 m2/g et une dimension de particule de 0,3 à 0,8 mm (produit de la firme Dow Che- mical, de marque commerciale "Dowex MSA-1"); un polysty- rène poreux à groupes triméthylammonium présentant une di- mension de pore d'environ 30 à 200 nm, un volume de po- res d'environ 0,95 ml/g, une surface spécifique d'environ 42 m2/g et une dimension de particule d'environ 0,4 à 0,5 mm (produit de la firme Rohm & Haas Co., de marque commer- ciale "Amberlite IRA-904") et les produits analogues. Comme exemples d'agents réticulants des protéi- nes qu'on peut utiliser dans l'invention, on citera des dialdéhydes aliphatiques en C 2-C 6 comme le glyoxal, le di-aldéhyde malonique, le dialdéhyde succinique, l'aldé- hyde glutarique, l'aldéhyde adipique et les aldéhydes ana- logues. On préfère le glyoxal et l'aldéhyde glutarique. 2488619 Pour préparer le produit contenant l'aminoacylase immobilisée selon l'invention, on fixe en premier lieu l'a- minoacylase sur l'échangeur d'anions poreux. Cette opéra- tion est de préférence réalisée par contact de l'enzyme a- vec l'échangeur d'anions poreux dans l'eau ou une solution tampon appropriée. On peut utiliser de l'aminoacylase bru- te ou purifiée. La quantité d'aminoacylase à utiliser dé- pend de l'échangeur d'anions poreux particulier qu'on met en oeuvre mais en général, on utilise de préférence d'en- viron 100 à 10.000 unités et plus spécialement de 1.000 à 5.000 unités d'aminoacylase par ml de l'échangeur. Parmi les solutions tampons qui conviennent, on citera une solu- tion tampon phosphatée et une solution tampon boratée et plus spécialement un tampon 0,05 à 0,1 M, pH: environ 7 à 9. L'échangeur d'anions poreux sur lequel on a fi- xé l'aminoaxylase est ensuite traité par l'agent réticulant des protéines. Cette opération est de préférence effec- tuée par contact de l'échangeur avec l'agent réticulant dans l'eau ou une solution tampon telle que décrite ci-des- sus. Dans cette opération, si la concentration de l'agent réticulant est trop-basse, la réticulation est insuffisante et il est alors difficile d'empêcher un échappement de l'en- zyme. Par contre, si la concentration de l'agent réticulant est trop forte, l'enzyme est désactivée. Par conséquent, la quantité d'agent réticulant doit être réglée selon la quantité d'enzyme adsorbée sur l'échangeur d'anions poreux; en général, on utilise de préférence l'agent réticulant à une concentration finale de 0,01 à 0,1% en volume par rap- port au mélange de réaction. On peut également préparer le produit contenant l'aminoacylase immobilisée en mettant en contact succes- sivement l'aminoacylase et l'agent réticulant avec l'échan- geur d'anions poreux dans l'eau ou une solution tampon tel- le que décrite ci-dessus. Ce mode opératoire est plus com- mode que la réaction en plusieurs stades décrite ci-dessus car le produit recherché contenant l'aminoacylase immobi- lisée peut être obtenu en un seul récipient et par un mode opératoire plus simple. Dans les deux opérations, il est préférable de fixer l'aminoacylase sur l'échantillon d'anions poreux et de traiter par l'agent réticulant des protéines à une température de 4 à 100C environ afin de limiter autant que possible la désactivation de l'enzyme et d'améliorer 1' efficacité d'absorption et de réticulation. La préparation du produit contenant l'aminoacy- lase immobilisée peut être réalisée en discontinu ou en continu sur une colonne. Lorsqu'on opère en discontinu,- on dissout l'aminoacylase dans l'eau ou une solution tam- pon dans laquelle on ajoute ensuite l'échangeur d'anions poreux. On agite le mélange dans les conditions appropriées pour la fixation, telles que décrites ci-dessus, et on ob- tient donc un produit contenant l'enzyme fixée sur l'échan- geur. Après avoir séparé ce produit du mélange de réac- tion par une technique connue telle que la décantation, la filtration ou la centrifugation, on introduit le pro- duit dans une solution de l'agent réticulant des protéines dans l'eau ou une solution tampon et on agite dans des conditions appropriées à la réticulation, telles que dé- crites ci-dessus; on obtient ainsi le produit recherché, contenant l'aminoacylase immobilisée. Dans la variante, lorsque l'agent réticulant des protéines est ajouté direc- tement au mélange de réaction contenant l'échangeur d'a- nions sur lequel on a fixé l'enzyme et qu'on agite le mé- lange dans les mêmes conditions que ci-dessus, on peut par- venir au produit recherché, contenant l'aminoacylase immo- bilisée, dans un seul récipient. Le produit obtenu, con- tenant l'aminoacylase immobilisée peut être séparé facile- ment du mélange de réaction par une technique connue telle que décrite cidessus. Lorsqu'on procède à la préparation en continu sur une colonne, on fait passer de l'eau ou une solution tampon contenant l'aminoacylase sur une colonne garnie de l'échangeur d'anions poreux; on fait ensuite passer sur la colonne de l'eau ou une solution-tampon con- tenant l'agent réticulant des protéines; on obtient ainsi le produit recherché contenant l'aminoacylase immobilisée. De préférence, les deux solutions, de l'aminoacylase et de l'agent réticulant des protéines, seront passées dans la colonne à une VS d'environ 0,1 à 0,5. Lorsqu'on utilise le produit contenant l'amino- acylase immobilisée selon l'invention dans une réaction en- zymatique, l'enzyme ne s'échappe pratiquement pas de l'é- changeur d'anions poreux, même lorsque le substrat à traiter est à haute concentration et lorsque le système de réaction présente une grande force ionique; par suite, le produit contenant l'aminoacylase immobilisée reste stable-et con- serve une excellente activité enzymatique pendant des du- rées prolongées. Les exemples suivants illustrent l'invention sans toutefois la limiter; dans ces exemples, les indica- tions de parties et de % s'entendent en poids sauf mention contraire. Exemple 1 On prépare divers produits contenant l'aminoacy- lase immobilisée comme décrit ci-après. On fait réagir chacun des produits avec une solution de substrat en con- tinu et on mesure au bout d'un certain temps le rapport en- tre l'activité enzymatique résiduelle et l'activité enzyma- tique initiale. 1. Préparation des produits contenant l'amino- acylase immobilisée (i) produit contenant l'aminoacylase immobili- sée selon l'invention. On gonfle dans l'eau chacun des échangeurs d'a- nions poreux du tableau I ci-après; à 10 ml d'échangeur gonflé, on ajoute une solution d'aminoacylase brute obte- nue à partir d'Aspergillus oryzae (50 ml) Epréparée par dissolution de l'aminoacylase brute (500 mg, 15.000 micro- 24884-1 9 moles/h) dans du tampon phosphaté 0,05 M (pH 7,5, 50 ml)_7. Au mélange obtenu, on ajoute de l'aldéhyde glutarique en quantité telle que la concentration finale de ce réactif dans le mélange est de 0,05% en volume. Apres 18 heures de secousses à 10 C, on filtre le mélange de réaction et on lave le résidu à l'eau; on obtient le produit conte- nant l'aminoacylase immobilisée. ii) Produits comparatifs (1) contenant l'aminoa- cylase immobilisée. On gonfle dans l'eau chacun des échangeurs d'a- nions poreux du tableau I ci-après; à 10 ml de l'échangeur gonflé,- on ajoute une solution d'aminoacylase brute obtenue à partir d'Aspergillus oryzae (50 ml) préparée comme décrit en (i) ci-dessus. Après 18 heures de secousses à iO C, on filtre le mélange de réaction et on lave le résidu à l'eau; on obtient le produit contenant l'aminoacylase im- mobilisée. - (iii) Produit comparatif (2) contenant l'aminc- acylase immobilisée. On observe le même mode opératoire qu'en (i) ci- dessus, mais on remplace l'échangeur d'anions poreux par une résine échangeuse d'anions du type gel; on obtient ain- si un produit contenant 1 'aminoacylase immobilisée. 2. Application. On garnit une colonne de chacun des produits con- tenant l'aminoacylase immobilisée obtenue ci-dessus (10 ml). On fait passer sur la colonne à 37 C une solution aqueuse 0,6 M de Nacétyl-DL-méthionine (pH 7,0,çontenant 5 x 10' moles de Co++), provoquant ainsi une réaction enzymatique. Pour mesurer l'activité enzymatique initiale du produit, on fait passer la solution de substrat sur la colonne au débit de 80 ml/h et on détermine la quantité de L-méthioni- ne contenue dans l'éluat. L'activité est exprimée par la quantité en micromoles de L-méthionine formée par h. Après mesure de l'activité enzymatique initiale du produit, on poursuit la réaction enzymatique pendant 10 jours ei faisant passer la solution de substrat sur la colonne au débit de 6 ml/h. Au bout de 10 jours, on mesure l'activité enzyma- tique résiduelle du produit par le même mode opératoire que pour l'activité initiale. Le rapport entre l'activité résiduelle et l'activité initiale est exprimé en attribuant Une valeur arbitraire de 100 à l'activité initiale. 3. Résultats. Les résultats obtenus sont rapportés dans le ta- bleau I ci-après. L'examen de ces résultats montre claire- ment que le produit selon l'invention contenant l'aminoacy- lase immobilisée présente une activité enzymatique résiduelle très supérieure à celle des produits comparatifs et conserve sa haute activité enzymatique pendant des durées prolongées. Par contre, l'activité enzymatique du produit comparatif 1 diminue dans le temps. En outre, dans le produit compara- tif 1, on observe un support même dans le que. Dans le cas du ter que l'enzyme n'a échappement de l'enzyme d'avec le stade initial de la réaction enzymati- produit comparatif 2, on peut consta- pas été adsorbée du tout sur la résine. Tableau I Produit Echangeur Traitement Activité de l'aminoacy d'anions par agent lase immobilisée poreux* réticulant mm ilise initiale au bout de __ ____ _10 jours A 100 107 Selon B 100 88 l'inven- C oui 100 86 tion D 100 90 E 100 102 F 100 103 Compara- A 100 52 tif (1) C non 100 47 F 100 37 Contrôle G non 0 - (2) +: Les symbeLes A à G du tableau I désignent les échangeurs d'anions poreux ci-après: A. polystyrène poreux à groupes triméthy]ammo- nium, dimension de pore: environ 25 nm, volume de.pores: environ 0,35 ml/g,surface spécifique: environ 25 à 35 m2/g, dimension de particule: environ 0,3 à 1,2 mm (produit du commerce Duolite.-161 de la firme Diamond Shamrock Cor-= poration). B. résine phénolique poreuse à groupes hydroxy phénoliques, dimension de pore: environ 15 nm,volume de pores: environ 0,7 ml/g, surface spécifique: environ 80 à 120 m2/g et dimension de particule: environ 0,3 à 1,2 mm (produit de marque Duolite A-561 de la firme Diamond Shamrock Corporation). C. Copolymère styrène-divinylbenzène poreux à groupes triméthyla.mmonium, dimension de pore: environ mm, volume de pores: environ 0,5 ml/g, surface spéci- fique: environ 25 m2/g et dimension de particule: envi- ron 0,3 à 0,8 mm (produit du commerce Dowex MSA-1 de la firme Dow Chemical Co.). * D. copolymère styrène-divinylbenzène poreux à groupes triméthylammonium, dimension de pore: environ à 50 nm, volume de pores: environ 0,96 ml/g, surface spécifique: environ 30 m2/g et dimension de particule: environ 0, 35 à 0,55 mm (produit du commerce Diaion HPA-25 de la firme Mitsubishi Chemical Industries, Ltd.). E. polystyrène poreux à groupes triméthy] mmo- nium, dimension de pore: environ 30 à 200 nm, volume de pores: environ 0, 95 ml/g, surface spécifique: environ 42 m2/g et dimension de particule: environ 0,4 à 0,5 mm (produit du commerce Amberlite IRA-904 de la firme Rohm et Haas Co.). F. Silice poreuse à groupes triméthylammonium, dimension de pore: environ lo0 nm, volume de pores: envi- ron 0,8 ml/g, surface spécifique: environ 25 m2/g, dimen- sion de particule: 100 à 200 microns (produit du commerce 1i0 i1 Spherosil QOA de la firme RhOne Poulenc Industries; et G. résine de polystyrène échangeuse d'anions du type gel à groupes triméthylammonium, de type classique produit du commerce Duolite A-101D de la firme Diamond Shamrock (Corporation). **: l'activité est exprimée par rapport à l'activité ini- tiale comptée-pour 100. Exemple 2 En opérant comme décrit dans l'exemple 1 (i) et -(ii), on prépare le produit contenant l'aminoacylase immo- bilisée selon l'invention et le produit comparatif en utili- sant de la silice poreuse à groupes triméthylammonium, di- mension de pore: environ 100 nm, volume de pores: envi- ron 0,8B ml/g,.surface spécifique: environ 25 m2/g, dimen- sion de particule: environ 1.000 à 2.000 microns (produit du commerce Spherosil OMA de la firme Rhone Poulenc Indus- tries). Chacun des produits contenant l'aminoacylase immo- bilisée est soumis à des réactions enzymatiques continues sur la N-acétylDl-phénylalanine (pH 7, contenant 5 x 1074 moles de Co++) et la N-acétylDL-méthtonine (pH 7, contenant x 10 -4 moles de Co++) en tant que substrats respectifs. Les résultats obtenus sont rapportés dans le tableau II ci- après. L'examen de ces résultats montre clairement que l'activité enzymatique du produit contenant l'aminoacylase immobilisée, selon l'invention reste stable pendant des du- rées prolongées. Dans le produit comparatif, du fait que l'enzyme -s'est échappée du système de réaction même dans les stades initiaux de la réaction en raison de la forte concentration du substrat, l'activité enzymatique du pro- duit est faible et diminue encore avec le progrès de la réaction. Il est donc clair que le produit contenant l'amino. acylase immobilisée selon l'invention 'est capable de mani- fester une efficacité supérieure même avec un substrat à 12 2488619 haute concentration. Tableau II *: l'activité est exprimée en micromoles d'acide L-aminé formées par h et pour 10 ml du produit contenant l'a- minoacylase immobilisée (l'éptivité sera exprimée de la même manière ci-après). Exemple 3 On immobilise l'aminoacylase sur le même échan- geur d'anions poreux que dans l'exemple 2, en ajoutant à cet échangeurune solution d'aminoacylase brute obtenue à partir d'Aspergillus oryzae (50 ml) -préparée par disso- lution d'aminoacylase brute (500 mg, 15.000 micromoles/h) dans une solution de tampon phosphaté 0,05 M, pH 7,5_7 puis en ajoutant de l'aldéhyde glutarique à la concentra- tion indiquée dans le tableau III et en terminant comme dé- crit dans l'exemple 1. Les divers produits obtenus, contenant l'amino- acylase immobilisée mais traités par des concentrations dif- férentes en aldéhyde glutarique, sont soumis à la réaction enzymatique continue avec, comme substrat, la N-acétyl-DL- méthionine à 0,6 mole/litre, en vue de comparer leurs sta- bilités. Les résultats obtenus sont rapportés dans le tableau III ci-après. Produit Substrat Concentra- Activité de l'amino- tion du acylase immobilisée* substrat, moles/1 initiale Au bout de ______ ____ _ _ __ 20 jours Selon N-acétyl-DL- Selon N-acétyh DLe 0,6 6.500 6.900 méthionine 1,in- ven- N-acétyl-DL- tion phényl-ala- 0,4 5.600 5.400 nine N-acétyl-DL- com- méthionine 0,6 4.300 1.600 com- para- N-acétyl-DL- tif phényl-ala- 0,4 3.700 1.400 nine L'examen des résultats rapportés dans ce tableau montre que lorsque la concentration en aldéhyde glutarlque est faible, l'enzyme s'échappe du système de réaction dans un stade initial de celle-ci en raison d'une réticulation insuffisante. Par contre, lorsque la concentration en aldéhyde glutarique est forte, l'activité enzymatique est diminuée. Il en résulte une diminution indésirable de l'ac- tivité du produit. Tableau 3 Produit Concentration en Activité de l'aminoacy- aldéhude glutarique, lase immobilisée % en volume initiale Au bout de jours 0,005 5.400 4.300 Selon 0,01 8.700 8.500 l'inven- 0,05 6.500 6.900 tion 0,1 5.900 6.900 Compara- - 4.300 1.600 tif Exemple 4 On gonfle dans l'eau de la silice poreuse à groupes triméthylammonium, dimension de pore: environ nm, volume de pores: environ 0,8 ml/g, surface spé- cifique: environ 25.m2/g, dimension de particule: envi- ron 100 à 200 microns (produit du commerce Spherosil QMA de la firme Rhone Poulenc Industries). A 10 ml de la sili- ce poreuse gonflée, on ajoute une solution d'aminoacylase brute obtenue à partir d'Aspergillus oryzae (50 ml) _pré- parée par dissolution d'aminoacylase brute (500 mg, 1.500 micromoles/h) dans une solution de tampon phosphate 0,05M, pH 7,57. Au mélange obtenu, on ajoute de l'aldéhyde gluta- rique en quantité correspondant à une concentration finale de 0,05% en volume dans le mélange. Après 18 heures de secousses à 10 C, on filtre le mélange de réaction, on lave le résidu à l'eau; on obtientj10 ml du produit con- tenant l'aminoacylase immobilisée. Ce produit présente une activité aminoacylasi- que de 6.500 micromoles/h. Exemple 5 En opérant comme décrit dans l'exemple 4, on obtient un produit contenant l'aminoacylase immobilisée à partir du copolymère styrène-divinylbenzène poreux con- tenant des groupes triméthyla.mmonium,.dimension de pore: environ 45 à 50 nm, volume de pores: environ 0,96 ml/g, surface spécifique: environ 30 m2/g et dimension de par- ticule: environ 0,35 à 0,55 mm (produit du commerce Diaion HPA-25 de la firme Mitsubishi Chemical Industries Ltd). On obtient 10 ml d'un produit contenant l'amino- acylase immobilisée et qui présente une activité aminocyla- sique de 5.300 micromoles/h. Exemple 6 En opérant comme décrit dans l'exemple 4, on obtient un produit contenant l'aminoacylase immobilisée à partir du polystyrène poreux à groupes triméthylammonium présentant une dimension de pore d'environ 25 nm,un volu- me de pores d'environ 0,35 ml/g, une surface spécifique d'environ 25 à 35 m2/g et une dimension de particule d'en- viron 0,3 à 1,2 mm (produit du commerce Duolite A-161 de la firme Shamrock Corporation). On obtient 10 ml d'un produit contenant l'amino- acylase immobilisée et qui présente une activité aminocyla- sique de 2.600 micromoles/h. Exemple 7 En suivant le mode opératoire de l'exemple 4, on obtient un produit contenant l'aminoacylase immobilisée à partir d'un copolymère styrènedivinylbenzène poreux à groupes triméthyla.mmonium, dimension de pore: environ nm, volume de pores: environ 0,5 ml/g, surface spé- cifique: environ 25 m2/g et dimension de particule: envi- ron 0,3 à 0,8 mm (produit du commerce Dowex MSA-1 de la firme Dow Chemical Co.). On obtient 10 ml d'un produit contenant l'amino- acylase immobilisée et dont l'activité aminoacylasique est de 2.200 micromoles/h. Exemple 8 En suivant le mode opératoire de l'exemple 4, on prépare un produitcontenant l'aminoacylase immobilisée à partir d'un copolymère styrènedivinylbenzène poreux à groupes triméthylammonium, dimension de pore: environ à 200 nm, volume de pores: environ 0,95 ml/g, sur- face spécifique: environ 42 m2/g et dimension de particu- le: environ 0,4 à 0,5 mm (produit du commerce Amberlite IRA-904 de la firme Rhom & Haas Co.). On obtient 10 ml d'un produit contenant l'amino- acylase immobilisée et dont l'activité aminoacylasique est de 4.600 micromoles/h. RE:ENDICATIONS 1) Un produit contenant de l'aminoacylase immobi- lisée, consistant en aminoacylase et un échangeur d'anions poreux insoluble dans l'eau, caractérisé en ce que l'amino- acylase est fixée à l'échangeur d'anions poreux et réticulés par un agent réticulant des protéines. 2) Produit selon la revendication 1, caractérisé en ce que l'échangeur d'anions poreux insoluble dans l'eau présente une dimension de pore d'environ 15 à 300 nm, 10. un volume de pores d'environ 0,5 à 1,0 ml/g, une surface spécifique d'environ 10 à 150 m2/g et une dimension de particule d'environ 0,1 à 1,2 mm. 3) Produit selon la revendication 1 ou 2, caracté- risé en ce que l'échangeur d'anions poreux insoluble dans l'eau est choisi dans le groupe formé par une résine phéno- lique poreuse, une résine de styrène poreuse, une silice poreuse et un verre poreux portant tous un groupe échan- geur d'anions. 4) Produit selon la revendication 3, caractérisé en ce que le groupe échangeur d'anions est choisi parmi les groupes amino primaires, les groupes amino secondaires, les groupes amino tertiaires, les groupes amonnium quaternaires et les groupes hydroxy phénoliques. ) Produit selon la revendication 3 ou 4, caracté- risé en ce que la résine de styrène poreuse est un copoly- mère styrène-divinyl-benzène poreux portant un groupe é- changeur d ' anions. 6) Produit selon la revendication 3 ou 4, caracté- risé en ce que la résine phénolique poreuse est un conden-' sat phénolformaldéhyde poreux portant un groupe échangeur d'anions. 7) Produit selon la revendication 1, caractérisé en ce que l'agent réticulant des protéines est un diald6- hyde aliphatique en C2-C6. Produit selon la revendication 7, caractérisé 8) en ce que le dialdéhyde aliphatique est choisi dans le groupe formé par le g]yoxal, le dialdéhyde malonique, le dialdéhyde succinique, l'aldéhyde glutarique et l'aldéhyde adipique. 9) Produit selon la revendication 8, caractérisé en ce que le dialdéhyde aliphatique est le glyoxal ou l'aldéhy- de glutarique. -- ) Procédé de préparation du produit contenant de l'aminoacylase immobilisée selon l'une quelconque des re- vendications 1 à 9, ce procédé se caractérisant en ce que l'on fixe l'aminoacylase à un échangeur d'anions poreux in- soluble dans l'eau et on traite le produit obtenu par un agent réticulant des protéines. 11) Procédé selon la revendication 10, caractérisé en ce que l'échangeur d'anions insoluble dans l'eau pré- sente une dimension de pore d'environ 15 à 300 nm, un volume de pores d'environ 0,3 à 1,0 ml/g, une surface spé- cifique d'environ 10 à 150 m2/g et une dimension de parti- cule d'environ 0,1 à 1,2 mm. 12) Procédé selon la revendication 11, caractérisé en ce que l'échangeur d'anions poreux insolubles dans l'eau est choisi dans le groupe formé par une résine phénolique poreuse, une résine de styrène poreuse, une silice poreuse et un verre poreux portant tous un groupe échangeur d'anions. 13) Procédé selon la revendication 12, caractérisé en ce que le groupe échangeur d'anions est choisi parmi les groupes amino primaires, les groupes amino secondaires, les groupes amino tertiaires, les groupes amonnium quaternaires et les groupes hydroxy phénoliques. 14) Procédé selon la revendication 12 ou 13, caracté- risé en ce que la résine phénolique poreuse est un conden- sat phénol-formaldéhyde poreux portant un groupe échangeur d'anions. ) Procédé selon la revendication 12 ou 13, caracté- risé en ce que la résine de styrène poreuse est un copoly- 18 2488619 mère styrène-divinylbenzène poreux portant un groupe échan- geur d'anions. 16) Procédé selon la revendication 10, caractérisé en ce que l'agent réticulant des protéines est un dialdé- hyde aliphatique en C2-C6. 17) Procédé selon la revendication 16, caractérisé en ce que le dialdéhyde aliphatique est choisi dans le groupe formé par le glyoxal, le dialdéhyde malonique, le dialdéhyde àuccinique, l'aldéhyde glutarique et l'aldéhyde adipique. 18) Procédé selon la revendication 17, caractérisé en ce que le dialdéhyde aliphatique est le glyoxal ou l'al- déhyde glutarique. 19) Procédé selon la revendication 12, caractérisé en ce que, pour la fixation de l'aminoacylase à l'échangeur d'anions insoluble dans l'eau, on utilise d'environ 100 à 10.000 unités d'aminoacylase par ml de l'échangeur. ) Procédé selon la revendication 11, caractérisé en ce que, pour la réticulation, on utilise l'agent réti- culant des protéines à une concentration d'environ 0,01 à 0,1% du volume du mélange de réaction.