FR 2488804 A1 19820226 FR 8116056 A 19810821 i La présente invention concerne un procédé pour la production de prolactine humaine. La prolactine humaine est une hormone secrétée par les cellules des adénomes acidophiles de l'hypophyse antérieure, qui stimule le développement de la glande mam- maire, de la prostate et des vésicules séminales. Aucun procédé de production en masse de la prolactine humaine n'a été mis au point à ce jour. La demanderesse a étudié des procédés pour la production en masse de prolactine humaine peu conteuse. Ses efforts ont débouché sur la découverte inattendue que des cellules humaines, obtenues par multiplication de cel- lules humaines capables de produire la prolactine humaine, avec emploi d'un animal à sang chaud, ont une capacité de production de la prolactine humaine de beaucoup supérieu- re à celle des cultures de tissu in vitro: une produc- tion de prolactine humaine par cellule 2 à 50 fois supé- rieure. Plus précisément, l'invention concerne un procé- dé pour produire la prolactine humaine, caractérisé en ce qu'on multiplie des cellules humaines capables de produire la prolactine humaine par transplantation de ces cellules dans l'organisme d'un animal à sang chaud, ou par multipli- cation dans un dispositif les alimentant en liquide nutri- tif de l'organisme d'un animal à sang chaud; les cellu- les, multipliées par l'un ou l'autre de ces modes de mul- tiplication, sont exposées à l'action d'un inducteur de la production de prolactine humaine. Le procédé de l'invention permet une production accrue de prolactine humaine, ne nécessite pas ou bien moins de milieu nutritif contenant un sérum coûteux pour la multiplication des cellules, et rend l'entretien du mi- lieu de culture pendant la multiplication cellulaire bien plus facile que dans le cas d'une culture de tissu in vitro. En particulier, on peut multiplier facilement toutes les cellules humaines capables de produire de la prolactine humaine, en utilisant le liquide nutritif de l'organisme d'un animal à sang chaud, par transplantation de ces cel- lules dans l'organisme de l'animal ou mise en suspension de ces cellules dans une chambre de diffusion conçue pour recevoir le liquide nutritif de l'organisme, l'animal é- tant alimenté de façon ordinaire. Egalement, le procédé est caractérisé par une multiplication cellulaire plus stable et plus abondante, ainsi que par un accroissement de la production de prolactine humaine par cellule. En ce qui concerne les cellules pouvant être utilisées dans l'invention, on-peut employer toute cellu- le produisant de la prolactine humaine et se multipliant facilement dans l'organisme d'un animal à sang chaud. Par exemple, peut-on utiliser, selon l'invention, des cellu- les humaines produisant naturellement de la prolactine humaine, telles que les cellules acidophiles de l'hy;io- physe antérieure de l'homme, les cellules transformées par le virus EB ou par irradiation par les rayons X, et celle d'un adénome acidophile de l'hypophyse d'un sujet humain; des cellules de carcinome du poumon, produisant de la prolactine humaine ectopique, et des lignées cellu- laires établies des cellules ci-dessus. Egalement l'em- ploi de lignées lymphoblastoldes humaines établies, faci- les à entretenir, dans lesquelles on a introduit des gènes commandant la production de la prolactine humaine, selon des techniques de recombinaison génétique utilisant des enzymes telles que l'ADN-ligase, la nucléase et l'ADN- polymérase ou par fusion cellulaire avec des agents tels que le polyéthylèneglycol ou le virus Sendal, provoque une multiplication cellulaire remarquablement supérieure, lors- que ces cellules sont transplantées dans l'organisme d'un animal à sang chaud; la production de la prolactine hu- maine, par cellules est supérieure d'environ 2 à 10 fois ou plus. De plus, comme la transplantation des lignées lymphoblastoldes humaines, précitées, provoque la forma- tion de tumeurs massives, et que ces tumeurs sont diffi- cilement contaminées par les cellules de l'animal hôte et se désagrègent facilement, les cellules lymphoblas- tordes humaines vivantes, multipliées, peuvent être fa- cilement récoltées. En ce qui concerne les animaux pouvant être uti- lisés dans l'invention, on peut employer tout animal dans l'organisme duquel les cellules se multiplient. Par exem- ple, on peut employer, de façon avantageuse, des vQlail- les telles que poussin ou pigeon, ou des mammifères comme chien, chat, singe, chèvre, porc, vache, cheval, lapin, cobayerat, hamster, souris ou souris nue. Comme une tel- le transplantation cellulaire provoque une réaction immu- nitaire indésirable, L'emploi d'un animal nouveau-né ou très jeune ou à un stade le plus précoce possible, par exemple sous forme d'oeuf, d'embryon ou de foetus, est souhaitable. Pour réduire la réaction immunitaire, on peut, avant la transplantation cellulaire, traiter l'ani- mal par irradiation avec des rayons X ou des rayons Y à raison d'environ 200 à 600 rems, ou par injection d'un antisérum ou d'un agent immunosuppresseur préparé selon un procédé classique. Comme les souris nues, utilisées comme animaux à sang chaud, présentent une réaction im- munitaire plus faible, même lorsqu'elles sont adultes, on peut de façon pratique leur transplanter des cellules humaines établies, pour qu'elles se multiplient rapide- ment/ians querun OefplSr raitement soit nécessaire. On peut effectuer une multiplication cellulaire stabilisée et accroltre la production de prolactine hu- maine par transplantation répétée avec une ou plusieurs combinaisons d'animaux à sang chaud différents; par exem- ple on peut tout d'abord implanter les cellules humaines au hamster, pour qu'elles s'y multiplient, puis les ré- implanter à la souris nue. De plus, on peut effectuer la transplantation répétée avec des animaux appartenant à la même classe ou à la même division ainsi qu'à la même es- pèce ou au même genre. On peut implanter les cellules humaines à un site quelconque de l'animal, du moment qu'elles s'y mul- tiplient: par exemple, on peut effectuer l'implantation dans la cavité allantoïde, ou par voie intraveineuse, intrapéritonéale ou sous-cutanée. En plus de la transplantation directe des cel- lules dans l'organisme d'un animal, pour multiplier des lignées de cellules huiaines établies, classiques, capa- blesde produire de la prolactine humaine, on peut utili- ser le liquide nutritif de l'organisme d'un animal, par introduction, par exemple par voie intrapéritonéale, dans l'organisme de cet animal, d'une chambre de diffusion classique de forme et de taille diverses, munie d'une membrane filtrante poreuse, d'un ultra-filtre ou de fi- bres creuses ayant des pores d'environ 10-7 à 10O5 m de diamètre, empêchant la contamination de la chambre de diffusion par les cellules de l'animal h8te et permet- tant au liquide nutritif de l'organisme de l'animal d'a- limenter les cellules. De plus, la chambre de diffusion peut être conçue, si nécessaire, pour pouvoir être placée par exemple sur l'animal hôte et permettre la circulation du liquide de l'organisme de l'animal dans la chambre de diffusion, ainsi que l'observation de la suspension cel- lulaire dans la chambre par une ou plusieurs fenêtres la- térales, transparentes, placées sur une ou plusieurs pa- rois de la chambre; la chambre est remplaçable et échan- geable par une chambre neuve; on accroit ainsi la multi- plication des cellules au cours de la vie de l'animal et également la production de cellules par animal sans avoir à sacrifier celui-ci. De plus, lorsqu'on utilise une tel- le chambre de diffusion, comme on peut facilement récol- ter les cellules humaines multipliées et qu'il ne se pro- 248fl04 duit pas de réaction immunitaire, par suite de l'absence de contact direct entre les cellules humaines et les cel- lules de l'animal hôte, on peut utiliser, selon l'inven- tion, un animal à sang chaud quelconque, sans aucun trai- tement préalable pour réduire la réaction immunitaire. On peut alimenter facilement, de façon classi- que,l'animal auquel on implante les cellules humaines, même après la transplantation des cellules, et aucun soin particulier n'est nécessaire. Lçfnultiplication maximale des cellules est ob- tenue environ 1 à 20 semaines après la transplantation cellulaire. Lorsque la lignée de cellules humaines éta- blies, que l'on implante à l'animal, est une lignée de cellules tumorales, humaines, ou de cellules Lymphoblas- to!des, humaines, on atteint la multiplication maximale des cellules 1 à 5 semaines après la transplantation par suite de leur vitesse de multiplication extrêmement éle- vée. Selon l'invention, le nombre de cellules hu- maines, obtenues par hôte, est compris entre environ 107 et 1012 ou plus. En d'autres termes, le nombre de cellu- les humaines, transplantées dans l'organisme de l'animal, s'accro t d'un facteur d'environ 102 ' 1 ou plus ce qui est supérieur d'environ 101 à 106 fois ou plus aux nom- bres obtenus par la méthode de culture tissulaire in vi- tro avec un milieu nutritif; les cellules peuvent donc être utilisées de façon appropriée pour la production de prolactine humaine. En ce qui concerne le procédé d'induction de la prolactine humaine, on peut utiliser un procédé quelcon- que, pourvu que les cellules humaines, obtenues selon le procédé indiqué plus haut, libèrent de la prolactine hu- maine. Par exemple, les cellules humaines, obtenues par multiplication en suspension dans le liquide d'ascite et récoltées dans ce liquide, ou par extraction de la tumeur massive formée sous la peau et récoltées après désinté- gration de cette tumeur, sont mises en suspension à une concentration d'environ 104 à 108 cellules par millili- tre, dans un milieu nutritif, maintenu à une température d'environ 20 à 40 C, puis soumises à l'action d'un in- ducteur de prolactine à cette température, pendant envi- ron 1 à 50 heures pour induire la production de prolac- tine humaine. Les inducteurs de prolactine, que l'on préfère, sont des composés organiques tels que la réserpine, la - phénothiazine ou la chlorpromazine; des hormones tel- les que la TRH ("thyrotropin releasing hormone') et les oestrogènes; des amino-acides tels que la lysine, l'ar- ginine et la cystéine; et-des sels minéraux comme chlo- rure de sodium, de potassium, ou de calcium, ou le sul- fate de magnésium. Dans ce cas, d'autres hormones, tel- les que l'hormone somatotrope humaine (hGH), peuvent être produites simultanément selon l'invention. On peut facilement recueillir la prolactine hu- maine, ainsi obtenue, selon des techniques de purifica- tion et de séparation utilisant des opérations classiques, notamment relargage, dialyse, filtration, centrifugation, concentration- ou/et lyophilisationo Si on désire une pré- paration de prolactine humaine plus purifiée, on peut 1' obtenir à l'état de pureté maximale par combinaison des techniques précitées avec d'autres opérations classiques, telles qu'adsorption et désorption avec échange d'ions, filtration sur gel, chromatographie d'affinités fraction- nement au point isoélectrique et électrophorèse. La préparation de prolactine humaine, ainsi ob- tenue, est identique du point de vue immunologique à la préparation de prolactine humaine standard NIH, on peut donc, de façon avantageuse, utiliser la préparation seule ou en combinaison avec un ou plusieurs agents pour l'ad- ministration par injection, par voie externe ou interne, 2 483, O4 pour la préparation et le traitement de maladies humai- nes telles que l'hypogalactie et pour un but de diagnos- tic. Dans la présente description, on détermine la production de prolactine humaine par une méthode radio- immunologique, décrite par P. Hang et coll., Proc. Nat. Acad. Sci. USA Vol. 68, pp.1902-1906 (1971) et on l'ex- prime en poids par ml de suspension cellulaire, relati- vement à la préparation de prolactine humaine standard NIH. On détermine la production simultanée de hGH par la méthode radio-immunologique, comme décrit par S.M. Glick et coll. Nature, Vol. 199, page 784 (1963), et on l'ex- prime en poids relativement à la préparation d'hormone somatotrope humaine standard NIH. Plusieurs modes, non limitatifs, de réalisation de l'invention sont décrits ci-après. EXEMPLE 1 On implante par voie sous-cutanée, à des souris nues adultes, que l'on alimente ensuite de façon habituel- le pendant trois semaines, des cellules humaines d'adéno- me acidophile désagrégé, obtenues par hachage, après ex- traction d'un patient atteint d'adénome acidophile de l' hypophyse. On extrait les tumeurs massives, obtenues, for- mées sous la peau et pesant chacune environ 10 g. et on les désagrège par hachage et mise en suspension dans une solution salée, physiologique, contenant de la trypsine. Après avoir lavé les cellules avec du milieu 199 de Earle sans glucose (pH 7,2), additionné de 10% en volume de sé- rum foetal de veau, on remet les cellules en suspension, pour obtenir une concentration d'environ 105 cellules par ml, dans une préparation fraiche du même milieu ayant une concentration de 30 mM en L-arginine comme inducteur de la prolactine,puis on incube à 370C pendant 6 heures pour induire la production de prolactinqhumaine. Ensuite on traite les cellules par des ultrasons et on détermine la prolactine humaine dans le surnageant. La production de prolactine humaine est d'environ 600 ng par ml de sus- pension cellulaire. La production simultanée de hGH est d'environ 500 ng par ml de suspension cellulaire. On traite comme ci-dessus avec l'inducteur de prolactine les cellules témoins, obtenues par culture in vitro des cellules humaines d'adénome acidophile, dans du milieu 199 de Earle (pH 7,2) additionné de 10% en volume de sé- rum foetal de veau et incubation à 370C. La production de prolactine humaine n'est que d'environ 100 ng par mi de suspension cellulaire. EXEMPLE 2 On met ensemble,en suspension,des cellules hu- maines d'adénome acidophile désagrégé, obtenues par ha- chage, après extraction d'un patient atteint dtadénome a- cidophile de l'hypophyse, avec des cellules lymphoblas- toIdes leucémiques, humaines, de lignée Namalwa, dans un récipient avec une solution salée de concentration 140 mM en NaCl, 1 mH en KCl, 1 mM en NaH2PO4 et 2 mM en CaCl2, pour obtenir des concentrations de chaque type cellulaire d'environ 10 cellules par ml. On mélange la suspension cellulaire glacée avec une préparation de la même solu- tion salée, contenant du virus Sendai préalablement inac- tivé par irradiation par les ultraviolets; on transfère dans une étuve à 37 C environ 5 minutes après le mélange, et on agite dans l'étuve pendant environ 30 minutes, pour obtenir la fusion cellulaire, avec introduction de la ca- pacité de production de la prolactine humaine des cellu- les humaines d'adénome acidophile dans la lignée de cel- lules lymphoblastoldes leucémiques, humaines. Après clo- nage, à la souris nues adultes, que l'on alimente de façon habituel- le, pendant 5 semaines. On extrait les tumeurs massives, produites, pesant environ 15 g chacune et on les traite comme dans l'exemple 1, pour induire la production de pro- lactine humaine, mais on remplace la L-arginine 30 mM par environ 10 ng de TRH et qu'on incube à 370C. La produc- tion de prolactine humaine est d'environ 3 300 ng par ml de suspension cellulaire. On effectue une expérience témoin, comme dans l'exemple 1, par culture in vitro de l'hybride de la li- gnée lymphoblastolde leucémique, humaine, Namalwa et ex- position des cellules multipliées à l'actionde l'induc- teur de prolactine. La production de prolactine humaine n'est qued'environ 200 ng par ml de suspension cellulaire. EXEMPLE 3 Après injection d'antisérum préparé avec un la- pin, selon un procédé classique, à des hamsters nouveau- nés pour réduire leur réaction immunitaire éventuelle à la transplantation de cellules, on implante aux animaux, par voie sous-cutanée, la lignée lymphoblastolde leucé- mique, humaine, JBL, à laquelle on a conféré la capacité de produire la prolactine humaine des cellules humaines d'adénome acidophile,comme dans l'exemple 2; les hamsters sont ensuite alimentés de façon habituellependant 3 se- maines. On extrait les tumeurs massives, sous-cutanées, obtenues, pesant environ 10 g chacune, et on les traite comme dans l'exemple 1, pour induire la production de pro- lactine humaine; cette production est d'environ 1 800 rug par ml de suspension cellulaire. La production simultanée de hGH est d'environ 2 000 ng par ml de suspension cel- lulaire. Une expérience témoin, comme dans l'exemple 1, est effec- tuée par culture in vitro de l'hybride de la lignée lympho- blastolde leucémique, humaine, JBL, et exposition des cel- lules multipliées à l'action de l'inducteur de prolacti- ne. La production de prolactine humaine n'est que d'en- viron 200 ng par ml de suspension. EXEMPLE 4 Par voie intraveineuse, on implante à des rats nouveau-nés, une lignée lymphoblastoïde leucémique, humai- ne, Namalwa, à laquelle on a conféré la capacité de pro- duire la prolactine humaine des cellules humaines d'adé- nome acidophile, comme dans l'exemple 2; puis on alimente les rats de façon habituelle, pendant 4 semaines. On ex- trait les tumeurs massives, produites, pesant environ 40g chacune et on les traite comme dans l'exemple 2 pour in- duire la production de prolactine humaine; cette produc- tion est d'environ 2 700 ng par ml de suspension cellu- laire. Une expérience témoin, comme dans l'exemple 1, est effec- tuée parJsulture in vitro de l'hybride de la lignée lympho- * blastolde leucémique, humaine, Namalwa, et exposition des cellules multipliées à l'action de l'inducteur de prolac- tine. La production de prolactine humaine n'est alors que d'environ 100 ng par ml de suspension cellulaire. EXEMPLE 5 On irradie des souris adultes avec environ 400 rems de rayons X pour xl4duire leur réaction immunitaire, et on leur implante, par voie souscutanée, des cellules humaines d'adénome acidophile, obtenues comme dans l'exem- ple 1; puis on alimente les souris de façon habituelle, pendant 3 semaines, On extrait les tumeurs massives, sous- cutanées, produites, pesant environ 15 g chacune, et on les traite comme dans l'exemple 2, pour induire la produc- tion de prolactine humaine; cette production est d'envi- ron 800 ng par ml de suspension cellulaire. Une expérience témoin, comme dans l'exemple 1, est condui- te par culture in vitro des cellules humaines d'adénome acidophile et exposition des cellules multipliées à l'ac- tion de l'inducteur de prolactine. La production de prolac- tine humaine nbst alors que d'environ 200 ng par ml de sus- pension cellulaire. 248S304 EXEMPLE 6 On met en suspension, dans de la solution salée, physiologique, des cellules de la lignée lymphoblastoide leucémique, humaine JBL, auxquelles on a conféré la capa- cité de produire de la prolactine humaine des cellules humaines d'adénome acidophile, comme dans l'exemple 3; les cellules sont ensuite transférées dans une chambre de diffusion cylindrique, en matière plastique, d'un volume intérieur d'environ 10 ml, munie d'une membrane filtrante ayant des pores d'environ O,5pm de diamètre; on insère la chambre dans le péritoine d'un rat adulte. Après avoir alimenté le rat pendant 4 semaines de façon habituelle, on retire la chambre. La densité des cellules humaines dans la chambre est d'environ 2 x 109 cellules par ml, ce qui est supérieur d'environ 103 fois ou plus à ce qu'on ob- tient par culture in vitro avec un incubateur à dioxyde de carbone. On traite les cellules, ainsi obtenues, comme dangtlexemple 1, pour induire la production de prolactine humaine z celle-ci est d'environ 1 900 ng par ml de sus- pension cellulaire. La production simultanée d'hGH est d' environ 2 200 ng par ml de suspension cellulaire. Une expérience témoin, comme dans l'exemple 1, est réali- sée par culture in vitro de cellules hybrides de laîignée lymphoblastolde leucémique, humaine, JBL, puis exposition des cellules multipliées à l'action d'un inducteur de pro- lactine. La production de prolactine humaine n'est que d' environ 200 ng par ml de suspension cellulaire. EXEMPLE 7 Dans la cavité allantolde d'oeufs embryonnés, que l'on a préincubés à 37eC pendant 5 jours, on implante des cellules de la lignée lymphoblastolde leucémique, hu- maine, JBL, auxquelles on Econféré la capacité de produire la prolactine humaine des cellules humaines d'adénome aci- dophile, comme dans l'exemple 3. Après incubation des oeufs à cette température, pendant encore une semaines on 248O84 recueille les cellules humaines multipliées. On traite les cellules comme dans l'exemple 2, pour induire la pro- duction de prolactine humaine; cette production est dt environ 1 700 rg par ml de suspension cellulaire, Dans une expérience témoin, comme dans l'exemple 1, par culture in vitro de cellules hybrides de la lignée lympho- blastolde leucémique, humaine, JBL, et exposition des cel- lules multipliées à l'action de l'inducteur de prolactine, on obtient seulement environ 200 ng de prolactine humaine par ml de suspension cellulaire. Revendications 1. Procédé pour produire de la prolactine humaine, qui consiste à faire multiplier des cellules humaines, ca- pables de produire de la prolactine et exposer les cel- lules multipliées à l'action d'un inducteur de prolactire pour induire la production de prolactine humaine, carac- térisé en ce que la multiplication a lieu par transplan- tation dans l'organisme d'un animal à sang chaud ou dans un dispositif permettant d'alimenter ces cellules en li- quide nutritif de l'organisme d'un animal à sang chaud. - 2. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que les cellules; humaines sont des cellules acidophi- les, intactes, de l'hypophyse antérieure, de telles cel- lules transformées par le virus EB ou par irradiation par les rayons X, des cellules humaines d'adénome acido- phile de l'hypophyse, des cellules de carcinome du pou- mon ou des lignées cellulaires établies de telles cellu- les. 3. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que les cellules humaines sont des cellules hybrides, obtenues par fusion cellulaire d'une lignée lymphoblas- torde, humaine, et d'une des cellules selon la revendica- tion 2. 4. Procédé selon une des revendications 1 à 3, carac- térisé en ce que l'inducteur de prolactine est la réser- pinet la phénothiazine, la chlorpromazine, une hormone du type TRH (thyrotropin releasing hormone) oestrogènes, un amino-acide, notamment lysine, arginine ou/et cysté- ine, un sel minéral, en particulier chlorures de sodium, potassium ou calcium, sulfate de magnésium, ou plusieurs de telles substances. 5. Procédé selon une des revendications 1 à 4, carac- térisé en ce que l'animal à sang chaud est une volaille, en particulier poussin ou pigeon, ou un mammifère, notam- ment chien, chat, singe, chèvre, porc, vache, cheval, la- pin, cobaye, rat, hamsters souris ou souris nue.