FR 2492403 A1 19820423 FR 8022401 A 19801020 -1 - La présente invention se rapporte à l'industrie ali- mentaire et, plus spécifiquement, à un procédé d'optimisation de cultures de microorganismes, notamment de levures, spéciale- ment de levures lactiques, pour la production de biomasse ou de métabolites intermédiaires de fermentation, utilisables dans l'industrie alimentaire. Un des procédés connus de culture de levures lactiques sur du lactosérum est décrit dans le brevet français n 1.128.063 de la société dite Fromageries Bel. Il se rapporte à un procédé de fabrication de levures lactiques éclatées,qui consiste à séparer par précipitation les corps fermentescibles azotés, protéines et albumines, contenus dans le sérum de fro- magerie ou de caséinerie ou dans le mélange sérum-babeurre,et à absorber et transformer par des levures les corps hydrocarbo- nés existant dans le sérum ou le mélange ainsi déprotéiné. La fermentation, menée dans des conditions de pH, d'aération et de températures précises, est effectuée par des souches de Saccha- romyces, classées ultérieurement dans l'espèce Kluyveromyces (Lodder, 1970). Depuis la date de dépôt (22 juin 1955) du brevet fran- çais n 1.128.063,ce procédé a fait l'objet de nombreuses amé- liorations, notamment en ce qui concerne l'adaptation des cul- tures aux nouvelles techniques de déprotéination du lacto- sérum,ainsi que le conditionnement et la conservation des cellu- les de levures obtenues. La déprotéination du lactose,autrefois effectuée par précipitationthermique, est maintenant réalisée par ultrafiltration et chromatographie échangeuse d'ions.De plus,le _2 - substrat carboné, autrefois constitué de lactose, est mainte- nant formé de lactose hydrolysé, tel que cela est indiqué dans la demande de brevet français no 78/30229 déposée par la so- ciété dite des Fromageries Bel, o l'on conduit la culture d'un microorganisme sur le substrat laitier renfermant du lactose hydrolysé. Actuellement, la production de levure-aliment est basée sur la culture préférentielle-de certaines souches sur certains milieux: par exemple, le Kluyveromyces fragilis est îo cultivé sur du lactosérum, le Candida lipolytica sur des alca- nes, le Candida tropicalis sur du gaz-oil et le Candida utilis sur des mélasses. Ces fermentations, conduites le plus souvent dans des conditions de nonstérilité, entraînent la présence, dans le mélange, d'autres espèces qui, le plus souvent, ne sont pas souhaitées. De ce fait, un inconvénient résultant est que la souche souhaitée peut être amenée à être éliminée du fermenteur par une souche "pirate contaminante". De plus, si l'on veut obtenir le développement d'une culture pure,il faut que le substrat carboné de croissance soit de qualité stérile constante pour maintenir une souche unique de fermentation. Or, les lactosérums provenant de la fabrica- tion de fromages à caillé lactique ou de caséine lactique (lac- tosérums acides) contiennent 4 à 10 g/l d'acide lactique, alors que les lactosérums provenant de la fabrication de fromages à caillé présure ou de caséines-présure (lactosérums doux) ne con- tiennent que 1 à 3 g/l d'acide lactique. De plus, la varia- tion de la teneur en acide lactique du substrat est due égale- ment au fait que les unités industrielles de traitement du lac- tosérum reçoivent cette matière à traiter continuellement tout le long de la journée et, en fonction de son origine, ce lacto- sérum a un rapport lactose/acide lactique qui varie tout le long de celle-ci. Pour répondre à la variation de ce rapport, il est nécessaire de concevoir un système susceptible de s'adanter à ces variations par une sélec- tion de souches présentant une spécificité d'assimilation des substrats. Une telle spécificité, compte tenu des phénomènes de diauxie existant en cultu- re continue,n'est envisageable que par la sélection de mutants qui au- - 3 - ront perdu la capacité d'assimiler l'un ou l'autre des substrats carbonés présents. On entend par diauxie, la capacité d'adapta- tion d'une souche à la consommation de différents substrats l'un après l'autre, ce qui impose le choix entre des vitesses de croissance limitée de façon à consommer toutes les sources de carbone ou des vitesses de croissance rapide et une perte de substances carbonées. L'augmentation de la vitesse de croissance d'une culture dans laquelle il y a spécificité de consommation d'une espèce vis-à-vis d'un substrat se traduit en fait par la satu- ration du métabolisme oxydatif des Kluyveromyces et une partie de la source de carbone est dégradée par voie fermentai- re, ce qui conduit à l'apparition obligatoire d'éthanol. Cet éthanol est connu comme étant un métabolite toxique pour les cellules; de ce fait, sa présence entraîne une inhibition de la croissance des levures. On se trouve dès lors limité par la concentration de ce métabolite dans ce milieu. Il est donc indispensable,pour imposer des vitesses de croissance maxima, d'éliminer ce métabolite; or, il représente une potentialité de synthèse. Une façon judicieuse de profiter de cette poten- tialité est d'introduire une souche capable d'assimiler ce substrat et ce de façon spécifique. Il serait donc utile de remédier aux inconvénients du procédé habituel et d'apporter une solution aux problèmes décrits ci-dessus. La présente invention a pour but de permet- tre l'optimisation des conditions de culture sur un substrat lactique, en se basant sur les techniques de culture actuelle- ment connues et, notamment, sur l'opportunité d'avoir des cultures mixtes, tel que cela est décrit dans un article de Harrisson P.E. intitulé: "Cultures mixtes dans les procédés de fermentation industrielle" (Advances in Applied Microbio- logy (1978), 24, p.129-164) qui donne un exemple de cultures mixtes sur du méthane et du méthanol. L'emploi des cultures mixtes permet une augmentation des performances par utilisa- tion des différents substrats. Un objet de la présente invention est de prévoir un procédé de culture avec association de souches, dont cha- -4- cune utilisera un constituant différent du milieu, et ceci de façon exclusive, ce qui fournit une absence de compétition vis- à-vis des différents autres substrats du milieu. Un autre objet de la présente invention est de sélectionner des mutants spécifiques d'une souche pour un sub- strat afin de créer des "niches" écologiques, chaque "niche correspondant à une association de souches appartenant à la même espèce, souches qui seront dépendantes du développement global de la culture, donc des "niches" voisines. D'autres objets apparaîtront d'après la descrip- tion suivante. Ces objets sont maintenant atteints par un procé- dé de culture de-microorganismes, en particulier de levures, sur du lactosérum en tant que substrat de départ, procédé dans lequelaprès séparation des protéines contenues dans le lacto- sérum et- récupération des autres constituants, on réalise la culture sur le substrat lactique ainsi obtenu en utilisant, d'une part, une association de souches judicieusement choisies, dont chacune se développe d'une façon spécifique sur un substrat donné présent naturellement dans le milieu ou sur les métaboli- tes formés au cours du processus de fermentation et, d'autre part, des mutants spécifiques d'une souche afin de créer des "niches" écologiques correspondant à une association de souches appartenant à la même espèce. -25 Dans la présente invention, les milieux de culture sont des lactosérums provenant de différents traitements-laitiers et fromagers, c'est-à-dire des lactosérums doux ou acides, par- tiellement ou totalement déprotéinés par différents procédés connus et utilisables industriellement (précipitation par trai- tement thermique, séparation par ultrafiltration, chromatogra- phie d'exclusion et d'échange d'ions, etc.) et partiellement ou totalement hydrolysés par voix enzymatique (traitement avec une P -galactosidase) ou chimique. Quel que soit le milieu de culture d'origine, il se compose toujours, d'une part, de lactose (ou d'un mélange de glucose,, de galactose et de lactose dans le cas d'un lactose hydrolysé) et, d'autre part, d'acide lactique et d'autres acides - 5 - organiques. La proportion de ces deux catégories de substrats peut varier selon l'origine et la technologie d'obtention du milieu. Dans le procédé de la présente invention, on sélectionne judicieusement plusieurs souches à hautes performan- ces en ce qui concerne leur taux de croissance ou le rendement de leur composition en protéines et leur spécificité à croître sur un substrat, et on les associe en vue de les cultiver sur chacun des substrats carbonés présents même en faible quantité dans la matière naturelle de départ ou sur les méta- bolites formés au cours du processus de fermentation. Au bout d'un certain temps, il résulte un équilibre de flore très stable, la proportion des différentes espèces dépendant de la concentration des substrats les uns par rapport aux autres. Pour fonctionner de manière optimale, un tel sys- tème nécessite des "niches" écologiques. A l'intérieur de cha- cune d'entre elles, il existe une compétition entre les diffé- rentes souches susceptibles de croître avec les vitesses va- riables sur le seul substrat présent. Il est évident que les sélections à l'intérieur de chacune des "niches" sont dépen- dantes,en particulier pour la niche "éthanol", dont la con- centration en substrat dépend de l'activité fermentaire des souches appartenant aux deux autres "niches" (lactose et ses dérivés d'hydrolyse acide lactique et autres acides organi- ques) et, en particulier, à la niche "lactose". Les souches sélectionnées appartiennent notamment aux espèces suivantes: Kluyveromyces fragilis, Kluyveromyces lactis et Torulopsis bovina. Les Kluyveromyces fragilis se développent sur du lactose, les Kluyveromyces lactis sur l'aci- de lactique, sans possibilité d'interférences, et les Torulop- sis bovina sur l'éthanol. L'équilibre entre les souches varie selon la proportion des substrats dans le milieu et de la capa- cité du fermenteur pour la quantité d'éthanol produite. A titre d'exemple, on peut donner la rénartition suivante dans un milieu ccmposé de lactose,d'acide lactique et d'éthanol cogprenant 90-95 % de lactosérum,5-10 % d'acide lactique et 1-3 % d'éthanol: - Kluyveromyces fragilis environ 90 à 95 % - Kluyveromyces lactis environ 5 à 10 % Torulopsis bovina environ 1 à 3 % -6 - Si le milieu est du lactosérumr partiellement ou tota- lement hydrolysé, ce qui entraîne la présence de deux substrats carbonés supplémentaires, le glucose et le galactose, il peut être intéressant d'utiliser une nouvelle souche de levures tel- le que Saccharomyces cerevisae ou Candida utilis. On doit noter que le taux d'hydrolyse du lactose peut varier entre O et 100 %, la répartition du glucose et du galactose entre O et 45 % et celle du lactose entre O et 95 %. L'équilibre des souches, qui varie en fonction de la nature des substrats, est le suivant,lorsqu'il y a hydrolyse du lactose à 80-90 % et que les substrats sont constitués de 10- % de lactose,de 36-43 % de glucose, de 36-43 % de galactose, de 5-10 % d'acide lactique et de 1-3 % d'éthanol: - Kluyveromyces fragilis environ 45 à 65 % - Kluyveromyces lactis environ 5 à 10 % Candida utilis environ 35 à 45 % - Torulopsis bovina environ 1 à 3 % Les fermenteurs employes travaillent, dans des con- ditions optima, à des températures comprises entre environ 30 et 40 C, à un pH d'environ 3 à 4, avec un débit d'arrivée d'air égal à environ 1800 m3/h, avec une gamme d'environ 2 à 3 mil- liards de cellules totales par cm3, cette gamme étant la même quelle que soit la souche.On doit remarquer que, le volume d'air étant toujours fonction du volume du milieu, celui de 1800 m3/h correspond à un volume du milieu de 25 m3. En expri- mant le volume d'air non pas en m3/h mais en VVm (volume d'air/ volume du milieu/mn), les conditions optima se situent entre 1,2 et 1,5. Comme on travaille en continu, le débit est cons- tant pendant la fermentation et avant le soutirage. Le rendement en biomasse et/ou en métabolites peut être augmenté en incorporant dans le milieu de culture des substances minérales, telles que le phosphore, le cuivre, le zinc,le fer et divers autres éléments qui sont des substances nutritives pour les microorganismes (addition de H3PO4,CuSO4,ZnSO4,FeSO4). Par rapport aux procédés de cuiture existant actuelle- ment, à une seule souche primordiale et à souches secondaires parasites, le procédé de la présente invention a les avantages -7- suivants 1 ) Il est possible d'adapter le procédé aux diffé- rents rapports lactose/acide lactique existant dans les lac- tosérums, qui sont les milieux naturels de culture. 20) On utilise la totalité de chaque source de car- bone avec limitation des pertes, d'o l'obtention d'un rende- ment optimum, qui est d'environ 50 à 55 %. En l'absence de souche métabolisant l'éthanol, la perte serait au moins égale à la proportion de Torulopsis bovina, soit 2 à 3 %. 30) Il est possible de travailler avec des vitesses maxima de croissance des souches principales, du fait de la consommation par une tierce souche de métabolite intermé- diaire toxique, d'o l'obtention d'une productivité maxima de l'ensemble du dispositif (fermenteur); le gain de produc- tivité est environ 15 à 20 % par rapport au procédé normal à une seule souche primordiale. 4>) on supprime la compétitivité "interniches", tout en maintenant, d'une part, la compétitivité à l'intérieur de chaque niche et, d'autre part, la compétitivité des sou- ches entre les niches. ) Les installations ne sont pas sophistiquées en ce qui concerne l'aération et la limitation des transferts air- liquide qui constituent habituellement le facteur limitant ces installations. 60) La conduite des opérations est simplifiée. Le procédé de la présente invention- permet la production de biomasse (levure-aliment) et/ou de métabolites intermédiai- res. La présente invention sera maintenant décrite à l'aide des exemples suivants qui ne sont donnés qu'à titre d'illus- tration et non pas de limitation de la présente invention. EXEMPLE 1 On part d'un lactosérum doux provenant d'une fromage- rie, que l'on déprotéine par ultrafiltration. Ce lactosérum déprotéiné est envoyé dans un fermenteur dit Airlift, travaillant dans les conditions suivantes: - 8 - - volume utile: 23 m3 débit: 7600 1/h - pH: 3 à 4 - température: 30 à 40 C - débit d'air: 1800 m3/h - addition d'une source azotée: NH4 OH Les souches sélectionnées sont les suivantes, avec l'équili- bre indiqué ci-dessous: - Kluyveromyces fragilis sur lactose: 90-96 % Kluyveromyces lactis sur acide lactique: 5-10 % - Torulopsis bovina sur éthanol: 1 à 3 % Des contr6les systématiques sur deux ans de la flore présente dans le milieu ont montré une répartition très stable entre les espèces. EXEMPLE 2 On part d'un lactosérum acide provenant d'une casei- nerie, que l'on a déprotéiné par ultrafiltration et dont on a hydrolysé partiellement (à 90 %) le lactose à l'aide d'une - galactosidase. La fermentation se fait selon les mêmes conditions que celles données dans l'exemple 1. Les souches sélectionnées sont les suivantes: - Kluyveromyces fragilis sur lactose et galactose - Kluyveromyces lactis sur acide lactique - Candida utilis sur glucose - Torulopsis bovina sur éthanol La répartition des souches est la suivante: - Kluyveromyces fragilis: 49,5-58,5 % Kluyveromyces lactis: 5-10 % - Candida utilis: 40 - 43 % - Torulopsis bovina: 1 - 3 % Des contrôles systématiques sur deux ans de la flore présente dans le milieu ont montré une répartition très stable entre les espèces. - 9 - La présente invention n'est pas limitée aux exem- ples de réalisation qui viennent d'être décrits, elle est au contraire susceptible de variantes et de modifications qui apparaîtront à l'homme de l'art. - 10 - REVENDICATIONS 1 - Procédé de culture de microorganismes, en par- ticulier de levures, sur du lactosérum en tant que substrat de départ, caractérisé en ce qu'après séparation des protéines contenues dans le lactosérum et récupération des autres const% tuants, on réalise la culture sur le substrat lactique ainsi obtenu, en utilisant, d'une part, une association de souches,dont chacune se développe d'une-façon spécifique sur un substrat donné présent naturellement dans le milieu, ou sur les métabo- lites formés au cours du processus de fermentation, et, d'autre part, des mutants spécifiques d'une souche afin de créer des "niches" écologiques correspondant à une association de souches appartenant à la même espèce. 2 - Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que l'association de souchesest constituée de Kluyveromy- ces fragilis. se développant sur du lactose, de Kluyveromyces lactis, se développant sur de l'acide lactique, de Candida uti- lis et de Saccharomyces cerevisae,se développant sur du glucose, et de Torulopsis bovina se développant sur de l'éthanol. 3 - Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que le substrat de départ est un lactosérum doux ou aci- de provenant de divers traitements laitiers et fromagers. 4 - Procédé selon la revendication 3, caractérisé en ce que le substrat de départ est partiellement ou totalement déprotéiné par précipitation à l'aide d'un traitement thermique ou acide, par séparation par ultrafiltration ou chromatographie d'exclusion etd'échange d'ions. - Procédé selon la revendication 3, caractérisé en ce que le substrat de départ est également partiellement ou totalement hydrolysé par voie enzymatique ou chimique. 6 - Procédé selon l'une quelconque des revendica- tions 1 à 5, caractérisé en ce que, quelle que soit son origi- ne, le milieu de culture est composé d'un mélange de deux (ou davantage) substrats choisis dans le groupe se composant de lac- tose, d'acide lactique, d'éthanol et, éventuellement, de galac- tose et de glucose. 7 - Procédé selon la revendication 1, caractérisé - il - en ce qu'à l'intérieur de chacune des "niches", on maintient une compétition entre les différentes souches susceptibles de croître avec le meilleur rendement sur le seul substrat pré- sent. 8 - Procédé selon la revendication 7, caractérisé en ce que les souches sélectionnées appartiennent aux espèces * Kluyveromyces fragilis, Kluyveromyces lactis, Torulopsis bovina, Saccharomyces cerevisae ou Candida utilis. 9 - Procédé selon l'une quelconque des revendica- tions 1 à 8, caractérisé en ce que les souches sélectionnées sont des microorganismes qui ont l'aptitude à croître sur le ou les substrats, présents dans le milieu, qui se forment au cours du processus de fermentation.