FR 2489151 A1 19820305 FR 8116058 A 19810821 La présente invention concerne un procédé de production d'hormone lutéinisante, humaine, ci-après dési- gnée en abrégé par HLh. HLh est une hormone produite par le lobe anté- rieur de la glande hypophysaire, qui stimule la sécrétion de l'hormone androgène chez le mâle, et des hormones oes- trogène et progestative chez la femelle. A ce jour, il n' existe pas de procédé de4broduction à l'échelle industrielle, de HLh à bas prix. La présente invention est basée sur la constata- tion inattendue que, des cellules humaines, obtenues par multiplication de cellules humaines, capables de produire HLh à l'aide d'un animal à sang chaud, présentent une ap- titude à produire HLh bien supérieure à celle des cultu- res de tissu in vitro, la production de HLh par cellule étant jusqu'à 2 à 50 fois supérieure. Le nouveau procédé selon l'invention de produc- tion de HLh, consiste à multiplier des cellules humaines, capables de produire HLh, par transplantation de ces cel- lules dans le corps d'un animal à sang chaud, ou en four- nissant à ces cellules, à l'aide d'un dispositif, le flui- de corporel nutritif d'un animal à sang chaud, puis à ex- poser les cellules, multipliées par l'un ou l'autre de ces procédés de multiplication, à l'influence d'un inducteur d'hormone lutéinisante. Le procédé selon l'invention, tout en aboutissant à une production supérieure en HLh, n'exige que peu ou pas de milieu nutritif contenant du sérum cotteux pour la multi- plication cellulaire, et il permet de maintenir plus faci- lement que dans le cas de la culture de tissu in vitro, le milieu de culture au cours de lç*ultiplication cellu- laire. En particulier, toutes les cellules humaines, ca- pables de produire HLh, peuvent être facilement multipli- ées, grâce à l'utilisation de fluide corporel nutritif, provenant d'un animal à sang chaud, par transplantation des cellules en question dans le corps de l'animal, ou par leur mise en suspension dans une chambre de diffusion équipée pour recevoir le fluide corporel nutritif, l'a- nimal étant alimenté de manière habituelle. Ce procédé est également caractérisé par une multiplica- tion des cellules plus stable et plus élevée, et par une production supérieure de HLh par cellule. Conviennent, conformément à l'invention, toutes les cellules humaines dans la mesure o elles produisent HLh, et se multiplient aisément dans le corps d'un animal à sang chaud: par exemple, les cellules humaines, qui produisent par nature HLh, comme les cellules basophiles humaines, provenant du lobe antérieur de l'hypophyse, ces cellules transformées par le virus EB ou par irradiation aux rayons-X, ou les cellules d'adénome d'un patient souf- frant d'adénome basophile de l'hypophyse; des cellules humaines de carcinome du poumon, qui produisent de 1'HLh ectopique;e des lignées de cellules établies des cel- lules humaines ci-dessus. L'utilisation de lignées de lym- phoblastoldes humains, établis, faciles à conserver, do- tées de sites génétiques commandant la production de HLh au moyen de techniques de recombinaison génétique utili- sant des enzymes comme ADN ligase, nucléase et ADN poly- mérase, et au moyen de fusion cellulaire, utilisant des agents tels que polyéthylène glycol ou virus de Senda!, aboutit avantageusement à une multiplication cellulaire re- marquablement supérieure, lorsqu'on transplante les cel- lules dans le corps d'un animal à sang chaud, la produc- tion de HLh par cellule étant alors deçà 10 fois, ou davan- tage, plus élevée. En outre, comme la transplantation au corps de l'animal des lignées de lymphoblastoldes humains établis, mentionnés plus haut, aboutit à la formation de tumeurs massives, pouvant être facilement désagrégées, et que ces tumeurs ne sont guère contaminées par les cellules de l'hbte animal, la récolte desbellules de lymphoblastol- des humains multipliés, vivantes, est facile. Conviennent comme animaux utilisables dans le pro- cédé selon l'invention tous ceux, dans lesquels les cellu- les peuvent se multiplier, par exemple des volailles comme poulet et pigeon, des mammifères comme chat, chien, singe, chèvre, porc, vache, cheval, lapin, cobaye, hamster, souris ou souris nue. Comme cette transplantation cellulaire pro- voque une immunoréaction indésirable, il s'avère souhaita- ble d'utiliser des animaux nouveau-nés ou en bas âge, ou encore au stade le plus jeune possible, comme oeuf, embryon ou foetus, Afin de réduire l'immunoréaction, l'animal peut être traité,avant la transplantation des cellules, par ir- radiation aux rayons-X ou aux rayons-'y, d'environ 200 à 600 rems, ou par injection d'antisérum ou d'agent immuno- dépresseur préparé selon un procédé classique. Comme la souris nue, utilisée comme animal à sang chaud,présente l1 immunoréaction la plus faible, même à l'âge adulte, on peut l'utiliser avantageusement sans prétraitement, pour y transplanter et y multiplier rapidement des lignées de cellules humaines établies. Une multiplication cellulaire, stabilisée, et une augmentation de la production de HLh, peuvent être à la fois réalisées par transplantation répétée, utilisant des combinaisons de différents animaux à sang chaud: on peut atteindre ces objectifs en implantant d'abord les cellules chez le hamster, o elles se multiplient, puis en les réimplantant chez la souris nue. En outre, on peut effectuer la transplantation successive chez des animaux de la même classe ou division, aussi bien que chez ceux de la même espèce otu>u même genre. En ce qui concerne la localisation de l'implanta- tion des cellules humaines, conviennent tous les sites de l'animal, pourvu que les cellules puissent s'y multiplier, par exemple la cavité allantoIque, ou les voies intrapé- ritonéale, intraveineuse ou sous-cutanée. A côté de cette transplantation directe des cel- lules au corps de l'animal, existe la possibilité de fai- re se multiplier aisément les lignées connues de cellules humaines, établies, capables de produire HLh, en utilisant le fluide corporel nutritif provenant de l'animal, grâce à l'inclusion, par exemple par voie intrapéritonéale, dans le corps de l'animal d'une chambre de diffusion classique, de taille Ut de forme appropriées, munie d'une membrane filtrante, d'un ultra-filtre ou de fibre creuse d'un dia- mètre de pore de l'ordre de ld7à 10 5 m, qui empêche la contamination-de la chambre de diffusion par les cel- lules de l'hôte tout en permettant l'apport du fluide cor- porel nutritif de l'animal aux cellules. De plus, comme la chambre de diffusion peut être conçue, si nécessaire, pour être placée sur l'hôte animal et permettre au fluide corporel de ce dernier de circuler dans la chambre, les parois de celle4ci peuvent être munies de fenêtres laté- rales, transparentes, permettant l'observation de la sus- pension de cellules, ainsi que le remplacement et l'é- change avec une chambre fra che z la multiplication cel- lulaire est ainsi augmentée à un niveau encore supérieur, rapporté à la durée de vie de l'animal, et la production par animal est encore accrue sans sacrifice de l'hôte. En outre, lorsqu'on utilise cette chambre de diffusion, com- me les cellules humaines multipliées peuvent être facile- ment récoltées, et qu'il n'y a pas manifestation d'immu- noréaction, du fait de l'absence de contact direct entre les cellules humaines et celles de l'hôte animal, on peut utiliser comme hôte, conformément à l'invention, sans prétraitement destiné à réduire l'immunoréaction, tout arit mal à sang chaud. L'alimentation de l'hôte animal, auquel on a implanté des cellules humaines, peut s'effectuer facile- ment par procédé classique, même après la transplantation cellulaire, et elle ne nécessite pas de soins particuliers. La multiplication cellulaire maximale est at- teinte environ 1 à 20 semaines après l'implantation des cellules. Lorsque la lignée établie, implantée, est une lignée de cellules de tumeur humaine ou de lymphoblastol- des humains, la multiplication cellulaire maximale est at- teinte en 1 à 5 semaines, après la transplantation, en raison des vitesses de multiplication cellulaire très éle- vées de ce type de lignée. Conformément à l'invention on obtient 107 à 1012 ou plus, de celluleshumaines par hôte. Autrement dit, le nombre de cellules humaines s'accroit 1 2 à 107 fois ou 101 à 16 fois ou plus celui cédé de culture de tissu in tritif, aussi ces cellules si lisables pour la production i En ce qui concerne on peut employer tout moyen I par les cellules humaines, i re mentionné plus haut. Par i implantées chez l'hôte animal plus, ou bien est d'environ que l'on obtient avec un pro- vitro, utilisant un milieu nu- ont-elles avantageusement uti- dtHLh. le procédé pour induire HLh, permettant la libération de HLh obtenues par le mode opératoi- exemple, les cellules humai- nes, obtenues par multiplication en ascite, en suspension, et récolte à partir de cet ascite, ou par extraction de tumeur massive, formée sous la peau, et récolte après dé- sagrégation de la tumeur, sont mises en suspension pour atteindre une concentration de 104 à108 cellules par ml dans un milieu nutritif, maintenues à une température de l'ordre de 20 C à 400C, puis soumises à cette température pendant 1 à 50 heures, à l'action d'un inducteur d'hormone lutéinisante. Les inducteurs préférés d'hormone lutéinisante sont des aminoacides comme lysine, arginine, tryptophane, leucine et acide casamino; des sels minéraux comme chlo- rure de sodium, de potassium ou de calcium, et sulfate de magnésium; et des hormones comme l'hormone libératrice de l'hormone lutéinisante. La production simultanée d'autres hormones hu- maines comme l'hormone stimulant les follicules (en abré- gé HSFh), peut être réalisée conformément à l'invrwention. L'HLh, ainsi obtenue, peut &tre recueillie faci- lement grâce à des techniques de purification et de sépa- ration utilisant des modes opératoires classiques tels que relargage, dialyse, filtration, centrifugation, con- centration et lyophilisation. Quand on souhaite un pro- duit encore plus pur, on peut obtenir une préparation de pureté supérieure par combinaison des techniques mention- nées plus haut avec d'autres modes opératoires classiques, tels qu'adsorption et désorption avec échange d'ions, filtration sur gel, chromatographie par affinité, frae- tionnement au point isoélectrique et électrophorèse. La préparation d'HLh, ainsi obtenue,peut être avantageusement utilisée, seule ou en combinaison avec un ou plusieurs agents, pour injection, administration externe, interne ou de diagnostic, pour la prévention ou le traitement de maladies humaines. Au cours de la présente description, la produc- tion d'HLh est dosée par le procédé de radio-immuno essai décrit par AoR. Midgley, Jr, Endocrinology, Vol. 79, pp. -18 (1966), et est exprimée en Unité Internationale (UI). La production simultanée de HSFh est dosée par le procédé de radio-immunoessai décrit par C. Faiman, R.J* Ryan, J. Clin. Endocrinol. Metabo, Vol. 27, PPo 444-447 (1967) et est exprimée en Unité Internationale (UI). L'invention est illustrée ci-après par plusieurs formes de réalisation non limitatives. EXEMPLE 1 Des cellules d'adénome basophile humain désagré- gé, obtenues par extraction à partir d'un patient souffrant d'adénome basophile de l'hypophyse, suivie de hachage, sont implantées par voie sous-cutanée dans des souris nues adul- tes, qui sont ensuite nourries de manière habituelle pendant 4 semaines. Les tumeurs massives, résultantes, formées sous la peau et pesant chacune environ 10 g, sont extrai- tes, désagrégées par hachage et mises en suspension dans du sérum physiologique contenant de la trypsine. Après la- vage des cellules avec du milieu de Earle 199 (pH 7,2), additionné de 10% en volume/volume de sérum foetal de veau, les cellules sont remises en suspension, à une concentra- tion de 105 cellules/ml, dans une préparation franche du même milieu qui contient en tant qu'inducteur d'hormone lutéinisante 30 mM de L-arginine, et l'on met à incuber à 37 C pendant 15 heures environ pour obtenir HLh. Les cellules sont ensuite soumises aux ultra-sons, et la quan- tité d'HLh présente dans la partie surnageante est dosée. La production d'HLh est d'environ 400 mUI/ml de suspen- sion cellulaire. La production simultanée d'HSFh dans la partie surnageante est de l'ordre de 500 mUI/ml de sus- pension cellulaire. Les cellules témoins, obtenues par culture ieitro de cel- lules d'adénome basophile, humain, dans du milieu de Earle 199 (pH 7,2), additionné de 10% en volume/volume de sérum foetal de veau, et mises à incuber à 37 0Csont traitées comme plus haut pour induirela formation d'HLh. Cette pro- duction n'est que voisine de 70 mUI/ml de suspension cel- lulaire. EXEMIPLE 2 Des cellules d'adénome basophile humain désagré- gé, obtenues comme dans l'exemple 1, et une lignée de lym- phoblastoIdes leucémiques, humains, de Namalwa, sont mises en suspension ensemble dans un récipient avec une solution saline de 140 mM de NaCl, 54 mM de KC1,-1 mM de NaH2PO4 et 2 mM de CaCl2, de manière à obtenir des concentrations cel- lulaires respectives de l'ordre de 103 cellules/ml. La sus- pension de cellules, refroidie à la glace, est mélangée avec une préparation franche de la même solution saline, contenant du virus de Sendal préalablement inactivé par irradiation à l'ultra-violet, le tout est transféré 5 mi- nutes après le mélange dans un incubateur à 370C, et y est agité pendant 30 minutes pour réaliser la fusion cel- lulaire, introduisant l'aptitude à produire l'HLh des cel- lules d'adénome basophile, humain, dans la lignée des lym- phoblastoldes leucémiques, humains. Après clonage selon un procédé classique de la souche de cellules d'hybridome, capable de produire l'HLh, on l'implante par voie intra- péritonéale chez des souris nues adultes, qui sont ensuite nourries de manière habituelle pendant 5 semaines. Les tu- meurs massives, résultantes, pesant environ 15 g chacune, sont extraites et traitées comme dans l'exemple 1 pour in- duire l'HLh, à cela près que l'on remplace les 30 mM de L-arginine par environ 10 mg d'hormone libératrice d'hor- mone lutéinisante. Laroduction d'HLh est d'environ 1400 mUI/ml de suspension cellulaire. La production simultanée d'HSFh est de l'ordre de 1600 mUI/ml de suspension cellulaire. L'expérimentation témoin est réalisée comme dans l'exem- ple 1, par culture in vitro de la lignée de lymphoblas- toldeslleucémiques, humains, fusionnées, de Namalwa, et exposition des celules humaines multipliées à l'action de l'inducteur d'hormone lutéinisante. La production d'HLh n'est que de 90 mUI/ml de suspension cellulaire. EXEMPLE 3 Après injection à des hamsters nouveau-nés d' antisérum, préparé à l'aide de lapin selon un procédé clas- sique, on implante, par voie sous-cutanée, chez ces animaux, une lignée de lymphoblastoïdes leucémiques, humains, JBL, dans laquelle l'aptitude à produire HLh des cellules d'a- dénome basophile humain, a été introduite comme dans 1' exemple 2, puis on les nourrit de manière habituelle pen- dant 3 semaines. Les tumeurs massives, résultantes, for- mées sous la peau, et pesant environ 10 g chacune, sont ex- traites et traitées comme dans l'exemple 1 pour induire HLh. 248915-1 La production d'HLh est de l'ordre de 1300 mUI/ml de sus- pension cellulaire. La production simultanée d'HSFh est de l'ordre de 1500 mUI/ml de suspension cellulaire. L'expérimentation témoin est réalisée comme dans l'exem- ple 1 par culture in vitro de la lignée de lymphoblas- toldes leucémiques, humains, fusionnés, JBL, et exposi- tion des cellules humaines multipliées à l'action de 1' inducteur d'hormone lutéinisante. La production d'HLh n'est que de l'ordre de 80 mUI/ml de suspensior"ellulai- re. EXEMPLE 4 A des rats nouveau-nés on implante, par voie in- traveineuse, une lignée de lymphoblastoldes leucémiques humains de Hamalwa, dans laquelle l'aptitude à produire de l'HLh de cellules d'adénome basophile humain a été introduite, comme dans l'exemple 2; puis on nourrit les rats de manière habituelle, pendant 4 semaines, Les tumeurs massives, résultantes, environ 40 g chacune, sont extrai- tes et traitées comme dans l'exemple 2 pour induire l'HLh. La production d'HLh est voisine de 1000 mUI/ml de suspen- sion cellulaire. L'expérimentation témoin est réalisée comme dans l'exemple 1, par culture in vitro de la lignée de lymphoblastotdes leucémiques, humains, fusionnés, de Namalwa, et exposition des cellules humaines multipliées à l'action de l'inducteur d'hormone lutéinisante. La produc- tion d'HLh n'est que de 70 mUI/ml de suspension cellulai- re. EXEMPLE 5 Après avoir subi une irradiation de 400 rems environ de rayons-X, pour la réduction de l'immunoréac- tion, des souris adultes reçoivent par voie sous-cutanée des implants de cellules d'adénome basophile humain, obte- nues comme dans l'exemple 1; puis on nourrit les souris de manière habituelle, pendant 4 semaines. Les tumeurs mas- sives, résultantesformées sous la peau et pesant envi- ron 15 g chacune, sont extraites et traitées comme dans l'exemple 2, pour induire l'HLh. La production dtHLh est d'environ 500 mUI/ml de suspension cellulaire. L'expérimentation témoin est réalisée comme dans l'exem- ple 1 par culture in vitro des cellules d'adénome baso- phile humain, et exposition des cellules humaines multi- pliées à l'action de l'inducteur d'hormone lutéinisante. La production d'HLh n'est que de l'ordre de 50 mUI/ml de suspension cellulaire. EXEMPLE 6 Une lignée de lymphoblasto!des leucémiques, hu- mains, JBL, dans laquelle l'aptitude à produire de l'HLh des cellules d'adénome basophile humain, a été introduite comme dans l'exemple 3, est mise en suspension dans di6é- rum physiologique, puis le tout est transféré dans une chambre de diffusion cylindrique en matière plastique, dont le volume intérieur est de l'ordre de 10 ml, munie d'une membrane filtrante ayant une dimension de pore voisine de 0,5. Après inclusion, par voie intrapéritonéale, de cette chambre dans un rat adulte, on nourrit celui-ci de manière habituelle pendant 4 semaines, puis on enlève la chambre. La densité en cellules humaines dans la chambre, atteinte au cours de l'opération ci- dessus, est d'environ 2x109 cellules/ml, ce qui est environ 103 fois supérieur, ou même plus, à ce qu'on atteint avec une culture in vitro à l'aide d'un incubateur à C02. Les cellules humaines, ain- si obtenues, sont traitées comme dans l'exemple 2, pour in- duire l'HLh. La production eiMLh est de l'ordre de 1600 mUI/ml de suspension cellulaire. L4roduction simultanée de HSFh est voisine de 1300 mUI/ml de suspension cellulaire. L'expérimentation témoin est réalisée comme dans l'exemple 1, par culture in vitro d'une lignée de lymphoblastoldes leucémiques humains, fusionnés, JBL, et exposition des cel- lules humaines multiplies à l'action de l'inducteur d'hor- mone lutéinisante. La production d'HLh n'est que de l'or- dre de 80 mUI/ml de suspension cellulaire. EXEMPLE 7 Une lignée de lymphoblastoldes leucémiques hu- mains JBl, dans laquelle l'aptitude à produire de l'HLh des cellules d'adénome basophile humain até introduite comme dans l'exemple 3, est implantée dans la cavité allan- torque d'oeufs embryonnés, préalablement mis à incuber à 370C pendant 5 jours. Après incubation des oeufs embryon- nés à cette température,pendant 1 semaine supplémentaire, les cellules humaines,multipliées, sont récoltées et trai- tées comme dans l'exemple 1 pour induire l'HLh. La produc- * tion d'HLh est voisine de 1200 mUI/ml de suspension cel- lulaire. L'expérimentation témoin est réalisée comme dans l'exem- ple 1, par culture in vitro de la lignée de lymphoblas- toldes leucémiques humains, fusionnés, JBL, et exposition des cellules humaines, multipliées, à l'action de l'induc- teur d'hormone lutéinisante. La production d'HLh n'est que d'environ 80 mUI/ml de suspension cellulaire. Revendications 1. Procédé pour la production d'hormone lutéinisante, humaine (HLh), par multiplication de cellules humaines, capables de produire HLh, et exposition des cellules mul- tipliées à l'action d'un inducteur d'hormone lutéinisante, caractérisé en ce qu'on utilise, pour la multiplication cellulaire, un animal à sang-chaud. 2. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que la multiplication cellulaire est réalisée par implan- tation des cellules humaines dans le corps d'un animal à sang chaud. 3. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que la multiplication cellulaire est réalisée à l'aide d'un dispositif, dans lequel le fluide corporel nutritif d'un animal à sang chaud est fourni aux cellules humaines. 4. Procédé selon la revendication 3, caractérisé en ce que le dispositif est une chambre de diffusion équipée de manière à ce que les cellules de l'hôte animal ne la contaminent pas. 5. Procédé selon une des revendications 1 à 4, carac- térisé en ce que les cellules humaines, capables de pro- duire HLh, sont des cellules d'hybridome obtenues par fusion cellulaire d'une lignée de lymphoblastoldes humains, établis, avec des cellules d'adénome basophile humain. 6. Procédé selon la revendication 5, caractérisé en ce que la lignée de lymphoblastotdes humains est une lignée de lymphoblastoldes leucémiques, humains, 7. Procédé selon la revendication 5 ou 6, caractérisé en ce que la lignée de lymphoblastoldes humains est une li- gnée de Namalwa ou JBLo 8. Procédé selon 1 des revendications 5 à 7, caracté- risé en ce que la fusion cellulaire est réalisée à l'aide de virus de Sendai. 9. Procédé selon une des revendications 1 à 8, carac- térisé en ce que l'inducteur d'hormone lutéinisante est un amino acide comme lysine, arginine, tryptophane, leu- cine ou acide casamino, un sel minéral comme chlorure de sodium, de potassium ou de calcium, ou bien sulfate de magnésium, ou une hormone comme hormone libératrice d'hor- mone lutéinisante. 10. Procédé selon une des revendications 1 à 9, carac- térisé en ce que l'animal à sang chaud est une volaille, en particulier poulet ou pigeon, ou un mammifère, notam- ment chien, chat, singe, chèvre,porc, vache, cheval, la- pin, rat, cobaye, hamster, souris ou souris nue.