FR 2483748 A1 19811211 FR 8012616 A 19800606 L'invention concerne un procédé d'hydrolyse du lactose contenu dans les lactosérums à l'aide de lac- tases immobilisées. iL'hydrolyse du lactose en glucose et galactose dans un lactosérum à l'aide de réacteurs à enzymes immo- bilisés pose, à l'échelle industrielle, des problèmes difficiles liés à la stabilité de l'activité enzymatique au cours des opérations. L'activité enzymatique ne doit varier que dans des limites étroites afin d'obtenir un taux d'hydrolyse du lactose compris entre des limites spécifiées. Enfin, le procédé ne peut avoir d'intérêt du point de vue économique que si on arrive à maintenir constante cette activité pendant une durée suffisante car la charge d'enzymes immobilisés est très cotteuse. Jusqu'à présent, les efforts entrepris pour trouver un procédé satisfaisant ont surtout porté sur l'hydrolyse du lactose contenu dans un lactosérum qu'on avait préalablement déprotéinisé par ultrafiltration et déminéralisé, car on estimait que l'hydrolyse du lactose contenu dans un lactosérum non déprotéinisé n'était pas viable à l'échelle industrielle en raison de la rapide perte d'activité enzymatique observée par suite du dép8t de protéines sur le lit d'enzymes et d'une contamination microbienne de ce lit. Divers traitements de lavage et de désinfection périodiques (notamment à l'aide de solu- tions acétiques) ont bien été proposées pour remédier à ce défaut, mais ceux-ci n'ont pas permis, à la connais- sance de la Demanderesse, d'apporter une solution satis- faisante aux problèmes en question. L'invention a pour but de fournir un procédé permettant d'hydrolyser en glucose et galactose le lac- tose contenu dans du lactosérum non-déprotéinisé, donc sans avoir à effectuer au préalable une opération d'ultra- filtration, et qui permet de maintenir l'activité enzy- matique à un haut niveau pendant des périodes prolongées. Linvention concerne un procédé de traitement du lactosérum en vue d'obtenir un lactosérum dont au moins une partie du lactose a été hydrolysé en glucose et ga- lactose, selon lequel on fait passer le lactosérum à tra- vers un lit de lactase immobilisée après avoir fait subir un prétraitement au lactosérum, et on effectue des nettoya- ges et des désinfections périodiques du lit de lactase immobilise caractérisé en ce que le prétraitement com- prend un chauffage du lactosérum dans la gamme de tempé- rature allant de 45 à 900C suivi d'une centrifugation du lactosérum. La durée de chauffage du lactosérum dépend de divers facteurs tels que le taux de déminéralisation du lactosérum, le pH du lactosérum, la température de chauf- fage et l'origine du lactosérum. A titre indicatif, la durée de chauffage est d'au moins 15 secondes, de préfé- rence comprise entre 15 minutes et 1 heure. De préférence, on effectue la centrifugation du lactosérum tandis qu'il est encore chaud. Selon un mode de mise en oeuvre particulière- ment préféré, le procédé se caractérise en outre en ce qu'on effectue le nettoyage du lit de lactase par mise en contact périodique du lit de lactase immobilisée et d'une solution d'un enzyme protéolytique. l'opération de nettoyage est avantageusement suivie d'une opération de désinfection consistant à mettre en contact le lit d'enzyme avec une solution de désinfection appropriée. De préférence, les opérations de nettoyage et de désinfection du lit d'enzyme sont effectuées quotidien- nement. Le prétraitement de l'invention s'effectue sur un lactosérum ayant été préalablement déminéralisé à rai- son de 0 (sérum brut) à 90% et porté à un pH compris dans la gamme de 3,5 à 6, par exemple, par addition d'acide chlorhydrique. Le choix du pH particulier s'opère en fonc- tion du type de lactosérum, du pH optimal de travail de la lactase immobilisée utilisée et du taux de déminéra- lisation du lactosérum. De préférence, le lactosérum est clarifié, par exemple par centrifugation, avant d'effectuer la déminéralisation, si on en opère une, ou l'ajustement de pHo La déminéralisation peut être réalisée, de façon classique, par électrodialyse ou échange d'ions. Le pré- traitement de l'invention comprend uli chauffage dans la gamme de 45 à 90 C, qui opère une-pasteurisation du lacto- sérum et provoque en même temps la formation de particu- les solides colloïdales en suspension, suivi d'une centri- fugation de ce dernier, de préfeérence tandis qu'il est encore chaud, afin d'éliminer les matières solides en suspension. Les conditions de centrifugation ne sont pas très critiques. On peut utiliser, par exemple, une centri- fugeuse tournant à 8000-12000 tours/minute. Comme enzymes, on utilise préférentiellement les lactases (3galactosidases) deAspergillus Niger ou d'Aspergillus Oryzae, mais d'autres lactases seraient utilisables. Ces enzymes peuvent 8tre immobilisées sur des supports organiques ou minéraux. On préfère actuel- lement les supports minéraux, tels que la silice, Les différents types d'enzymes immobilisés et leur prépara- tion sont bien connus et ils ont été décrits dans une littérature abondlante. On pourra se référer pour plus de détails par exemple aux brevets français no 2 001 336, 2 020 527 et 2 020 661o Le nettoyage du lit de lactase immobilisée s'opère en mettant en contact le lit de lactase immobi- lisée et une solution d'un enzyme protéolytique (appelé ci-après protéase). De préférence, on emploie une solu- tion d'une protéase ayant une activité comprise entre 0,1 et 10 unités Anson/litre de solution. Comme protéa- ses utilisables, on peut citer, de façon non limitative, les suivantes: Alcalase 0,6 L (Novo) obtenue à partir de Bacillus Licheniform - leutrase 0;5 L (ITovo) obtenue à partir de Bacillus Subtilis Protéase B 500 (Rapidase) obtenue à partir de Bacillus Subtilis Les protéases sont des enzymes bien connus dis- ponibles dans le commerce et largement utilisésdans le domaine des compositions détergentes pour lessives. Il est très surprenant que ces protéases qui sont très agres- sives vis-à-vis des matières protéinées débarrassent la charge de lactase immobilisée du dépôt de protéines qui l'inhibe sans attaquer la lactase qui est elle-m&me une matière protéinée. La désinfection du lit de lactase im- mobilisée est effectuée, de préférence, comme décrit dans la demande de brevet français no 79 30 598 déposée le 13 Décembre 1979 par la Demanderesse, c'est-à-dire en mettant en contact le lit d'enzyme avec une solution de diéthylènetriamine substituée à propriétés biocides. Le butde la désinfection est d'éviter la contamination de la charge de lactase immobilisée par des micro-organismes. La mise en contact de la lactase immobilisée avec les solutions de lavage et de désinfection peut se faire de diverses manières, ainsi que cela est évident. A ce jour, on préfère faire passer la solution de lavage ou de désinfection à contre-courant dans le lit de lac- tase immobilisée, c'est-à-dire dans le sens opposé à celui dans lequel on fait passer normalement le lactosérum sou- mis à l'action des enzymes, avec un débit tel qu'il se produise une "fluidisation"l' des particules de lactase immobilisée. Une telle fluidisation s'accompagne d'une agitation desdites particules qui favorise un bon contact entre l'enzyme immobilisé et la solution de lavage ou de désinfection. En variante, on peut décharger la charge de lactase immobilisée du réacteur et la traiter par la solution de lavage, puis la solution de désinfectant, dans un récipient séparé muni de moyens d'agitation. Après l'hydrolyse qui s'opère de façon classi- que, le produit obtenu est éventuellement désacidifié ou neutralisé, puis concentré, par exemple par évaporation, en un sirop. Ce sirop, qui contient des lactoprotéines, du glucose et du galactose, et du lactose non hydrolysé résiduel, présente un fort pouvoir sucrant. Ce pouvoir sucrant, combiné avec les propriétés nutritionnelles et fonctionnelles (propriétés émulsifiantes, foisonnantes, liantes, etc.) des lactoprotéines rend le produit obtenu par le procédé de l'invention très intéressant dans le domaine des industries alimentaires. Le procédé de lrinvention est économique car il évite tout recours à des opérations d'ultrafiltration et de séchage, coûteuses en énergie. Les expériences comparatives et les exemples non limitatifs suivants feront bien comprendre le procédé de l'invention et ses avantages. EXPERIENCE COMPARATIVE 1 On utilise 5 colonnes contenant un composite de lactase d'Aspergillus Niger immobilisée sur un support minéral afin de mettre en évidence les problèmes de désac- tivation de l'enzymne en présence de lactosérums. La colonne 1 est alimentée avec un lactosérum brut acidifié à pH = 3,5 avec de l'acide chlorhydrique. La colonne 2 est alimentée avec un lactosérum préalablement clarifié par centrifugation et acidifié à pH = 3,5 avec de l'acide chlorhydrique. Les colonnes 3, 4 et 5 sont alimentées avec un lactosérum préalablement clarifié par centrifugation puis partiellement déminéralisé par électrodialyse (50% de déminéralisation mesuré par le taux résiduel de cendre et contrôlé par mesure de la conductance dans des condi- tions standard) et acidifié à pH = 3,5 avec de l'acide chlorhydrique. On mesure le glucose formé à la sortie des co- lonnes, on en déduit le taux d'hydrolyse du lactose, ce qui permet d'accéder à l'activité spécifique instantanée du composite misea oeuvre (essai a). Après 6 heures de fonctionnement continu, on arrête l'expérience, on rince les colonnes à l'eau dans des conditions standard. On fluidise ensuite le composite avec une solution acétique à 1% pendant 20 minutes afin de le nettoyer. On recommence l'expérience (essai b) après le nettoyage avec la solution acétique, dans les mêmes con- ditions que ltessai a. Les résultats sont récapitulés dans les tableaux 1 et 2. L'examen des résultats obtenus montre que - la décroissance de l'activité enzymatique est rapide (comparaison E l2); - l'effet de la température est marginal: le gain en stabilité se fait au détriment de l'activité; - la désactivation n'est qu'apparente; un nettoyage per- met de restaurer pratiquement l'activité initiale (com- paraison des activités instantanées aux temps t = 2 h lors des essais a et b); - les résultats obtenus dans l'expérience comparative I ne permettent pas d'envisager un traitement à l'échelle industrielle. En particulier, le composite d'enzyme présente une période de demi-vie beaucoup trop courte (sauf à 2000, mais à cette dernière température, l'ac- tivité spécifique est faible). TABLEAU I Colonne no 2 Produit. Produit Lactosérum brut Lactosérum clarifié traité Essai a Essai b Essai a Essai b Température 500C 5000 500C 50 0C pH 3,5 5, 5 3,5 3,5 Débit (m-/h) 102 103 110 111l C omposite) 4,68 4,68 4,8 4,8 Lactose, % (lactsetrée) 4,26 a4,26 4,04 4,04 (à l'entrée) Performances à. T = 2h (2) Glucose, g/il 17 16,5 17,5 17,6 x, % (3) 78 76 85 85 E (4) 402 550 520 543 Performances à T=6h (2) Glucose, g/li 11,8 11,4 14,1 14,4 x % (3) 54 53 68 70 E6 (4) 142 133 251 269 _ rlo w -J TABLEIAU I (suite) Colonne no 3 4 5 i.... I,.,i,,i.,.i,.,,., Àhii, . i,, I,.i,i.....i.i,,.i,, l.. * Produit Lactosérum clarifié et déminéralisé par électrodialyse traité -.,Essai a Essai b Essai a Essai b Essai a Essai b Termpérature 200C 20 C 350C 350 C 500C 500C pH 3,5 3,5 3, 5 3,5 3,5 3,5 é0bit, ml/h 98 91 107 107 92 92 G domposite MS(1) 4,93 4,93 4,78 4,78 4,90 4,90 gde MS (1) Lactose, % (it l'entrée) 4,04 4,04 4,04 4, 04 4,04 4,04 Perf ormances à T=2h (2) Glucose, g/l 9,8 10,9 14,1 14,2 16 159 a.prs 3h 15,9 X, % (3) 48 53 68 69 78 77 E2E (4) 96 110 247 257.305 295 Performances à T=6h (2) Glucose, g/l 10,1 10,7 12,3 12,7 12,8 12,8 X % (3) 49 52 60 62 62 62 E6 (4) 97 103 175 186 160 160 g co Co w c4 TABLEAU I (suite) (1) Quantité de composite enzymatique mis en oeuvre en grammes de matière sèche. (2) Performances du réacteur après 2 heures de fonction- nement (T = 2 h) ou après 6 h de fonctionnement (T = 6 h). (3) X = taux de conversion du lactose. (4) E2g, E6g = activité spécifique calculée après 2 h ou 6 h de fonctionnement et exprimée en unités/g (en abrégé u/g) Sérum TABLEAU 2 Caractéristiques de désactivation du composite d'enzyme avec divers lactosérums pH= 3,5 (essais a et b) Activité au bout Vitesse de Demi-a de 2 h désactivation appari Température u / /h (heurE brut 50 C 350-400 5465 3 Sérum clarifié Sérum clarifié et démina- ralisé il 500C C 350C 500C 520-540 96-110 247-257 295-305- 67-68 1,75 54-48 vie ente eLs3_ 3-4 EXPERIENCE COMPARATIVE 2 Cette expérience a pour but de déterminer lé- volution des performances du composite d'enzyme dans le traitement de lactosérums bruts en fonction du nombre de cycles production/nettoyage. Chaque phase de produc- tion dure 18 heures et on effectue 6 cycles. Les condi- tions de production et de nettoyage sont les suivantes Production Alimentation: Iactosérum brut acidifié à pH = 3,5 Température: 320C Masse d'enzyme: 4,2 g (matière sèche) Nettoyage Rinçage à l'eau: 45 minutes Nettoyage en fluidisation: acide acétique à 1% pen- dant 20 minutes. Rinçage final à l'eau: 3 minutes Les résultats obtenus sont récapitulés dans le Tableau 3. Tableau D Cycle no Performances moyennes en phase de CYcle -roduction* Débit X E ml/h Uni:és/g 1 114 49,3 144 2 98 56 149 3 99 46 98 4 94 40 71 96 42,6 83 6 94 35 55 * Moyenne calculée sur 15h30 de production (les premiè- res 2h30 de production ne sont pas prises en compte) L'examen des résultats obtenus montrent que: - la demi-vie du système enzymatique est très faible (environ 4 jours); - le nettoyage ne permet pas de garantir une stabilité suffisante de l'activité enzymatique au cours des cy- cles consécutifs de production; 1 1 les résultats obtenus dans l'expérience comparative 2 ne permettent pas d'envisager une application à l'échel- le industrielle, en raison de la rapide perte d'acti- vité du composite d'enzyme. EXAMPLE 1 Cet exemple est à comparer avec l'expérience comparative 1 et cet exemple a pour but de mettre en évi- dence l'effet d'un traitement thermique du lactosérum suivi d'une centrifugation sur la stabilité des perfor- mances du composite d'enzyme. Le lactosérum traité est un lactosérum clarifié déminéralisé à 50% par électrodialyse et acidifié à pH = 3,5 avec de lHO1. Sa température initiale est de 2 à 40C. Il est chauffé à 8000 en 1 heure environ sous agitation et centrifugé à chaud (8000-12000 tours/mn) à l'aide d'un séparateur Alpha-Laval (IAPX 202) à décharge de solides en marche. Le produit recueilli est ensuite refroidi et stocké avant d'effectuer l'hydrolyse. On effectue l'hydrolyse du produit à diverses températures (20, 35 et 50oC) afin de déterminer la sta- bilité du composite d'enzyme. 'On mesure le glucose formé en sortie du réacteur, ce qui permet de déduire le taux de conversion du lactose et l'tactivité enzymatique du composite. Les conditions opératoires et les résultats sont récapitulés dans le Tableau 4- On observe une excellente stabilité à 20 et 0C. Après plus de 20 heures de fonctionnement continu, on n'observe pas de perte par rapport à l'activité ini- tiale. A 50 C, la stabilité est très bonne, la légère per- te d'activité mesurée correspond à une variation de l'or- dre de 1% sur le taux d'hydrolyse. La comparaison des résultats de l'exemple 1 et de l'expérience comparative 1 permet de démontrer l'Va:vtage déterminant obtenu grâace au prétraitement du lactclosriu brut Ainsi, le traitement thermique et la centrifu- gation permettent dans l'intervalle de 35-50Co d'amélio- rer par un facteur de 20 à 50 la stabilité du composite d'enzyme mesurée en terme de demi-vie, comme le montre le Tableau 5. Cette amélioration a un impact considérable sur la mise en oeuvre de l'opération d'hydrolyse avec les enzymes immobilisés au plan industriel. TABLEAU 4 Concentration en lactose à Température pH Composite g de MS l'entrée: 4, 53% C 3,5 350C 3,5 500C 3,5 4,93 4,78 4,90 Débit Débit 91 1 07 92 Au bout (ml/h) 91 107 92 de X % 44 62 80 2h Eg (u/g) 79,6 210 377 Débit Débit 92 107 93 Au bout (ml/h) de X % 44 62 81 6h Eg (u/g) 82 214 396 Débit Au bout (Débit 82 104 90 Au bout (ml/h) de 21h30 X % 47 62 79 Eg (u/g) 82 212 355 TABLEAU 5 C 50 C Lactosérum Lactosérum Lactosérum Lactosérum clarifié et clarifié, clarifié et clarifié, déminéralisé, déminéralisé, déminéralisé, déminéralisé, Expérience traité à chaud Expérience traité à chaud comparative 1 et centrifugé Comparative i et centrifugé Exemple 1 Exemple 1 Vitesse de désactivation 18 0,274 34 - 48 2,5 de 12enzyme u/g/h Demi- vie apparente 7 h 400 h 3- 4 h 83 h (heures) Nv Co w Co s_ EXEMPILE 2 Cet exemple est à comparer avec l'expérience comparative 2 et a pour but de démontrer l'amélioration des performances opérationnelles du système enzymatique lorsqu'on utilise les procédés de nettoyage/désinfection du lit enzymatique selon l'invention. On reçoit chaque semaine environ 100 litres de lactosérum de fromagerie. Dès réception, ce lactosérum est clarifié par centrifugation sur un séparateur Alpha- Laval LAPX 202 (vitesse de rotation: 11000-12000t/mn; débit: 30-35 l/h). Il est ensuite déminéralisé à 50% en- viron sur un module d'électrodialyse Stackpack (IONICS). Le lactosérum est ensuite acidifié à pH = 3,5 par addition d'acide chlorhydrique. On utilise environ 0,7 à 1 g d'HCl pur par litre de sérum pour acidifier un produit déminéralisé à 50%. Le lactosérum est ensuite stocké à froid (2 à 4 C). On reprend chaque jour environ 10 1 du produit ainsi stocké et on lui fait subir le prétraitement de l'inven- tion, à savoir un chauffage de 2 à 40C à 800C en 45 minu- tes environ. Le produit chaud est centrifugé à chaud (LAPX 202) à 11000 t/mn - 12000 t/mn, le débit étant de l'ordre de 30 1/h. Le lactosérun ainsi traité est refroidi et stocké à 4 C. Il sert ensuite à alimenter 3 colonnes d'hy- drolyse. Chaque colonne contient environ 4,7 à 5 g de composite de lactase immobilisée. Le débit en phase de production est de 100 à 110 ml/h. La température est de 35 C. Chaque phase de production dure 18 heures environ. En fin de phase de production, chaque colonne est rincée à l'eau pendant 45 mn environ. Elles sont en- suite nettoyées et/ou désinfectées comme suit: Colonne 1 - Nettoyage: on utilise une solution de protéase Alcalase 0,6 L à 6 unités Anson/l et pH 7,5. On ef- fectue avec cette solution, une fluidisation de 20 mn. - Désinfection: on utilise une solution de Tego Diocto BS à 0,1% et on effectue une fluidisation de 20 mn. Le "Tego Diocto BS" est un mélange à base de dioctyldi- éthylènetriamine et de trioctyldiéthylènetriamine con- mercialisé par la Société allemande Th. Goldschmidt A.Go. - On opère finalement un rinçage à l'eau. Colonne 2 - Nettoyage à l'aide d'une solution d'acide acétique à pH = 3 selon la technique de fluidisation (durée 20 mn). - Rinçage final à l'eau. Colonne 5 - Désinfection à l'aide d'une solution de Tego Diocto BS à 021% selon la technique de fluidisation (durée 20 mn). - Rinçage final à l'eau. Les performances des colonnes sont mesurées cha- que jour à divers moments en cours de production. Les ré- sultats sont récapitulés dans le Tableau 6. D'après ces réssuLtats, on voit que: 1. La colonne nettoyée à l'acide acétique dilué voit ses performances décroître assez rapidement, mais pas aussi rapidement que le lactosérum n8ayant pas subi le pré- traitement selon l'invention (voir expérience compa- rative 2). On observe, en particulier, une chute assez rapide de l'activité en cours de production. Cette chute d'activité est d'autant plus importante que lé nombre de jours de fonctionnement est élevé. La dimi- nutGion des performances moyennes conduit à l'arrAt des opérations au bout du 17ème jour. 2. La colonne désinfectée à l'aide de polyalkylsmines (Tego Diocto BS) est beaucoup plus performante en terme de stabilité en cours de production et de demi-vie. Le contrôle de la contamination microbienne au sein du lit permet donc d'obtenir un avantage important au plan industriel. 35 Les performances les plus intéressantes sont cependant * obtenues en combinant u0z traitement de nettoyage des- ting à éRiminer slectivement les souillures d'origine protéinique et un traitement de désinfection à l'aide de polyalkylamines. Dans ces conditions, et à partir d'un lacto- sérum prétraité selon l'invention, on obtient un gain dé- terminant en stabilité au cours de la phase de production et en durée de vie opérationnelle de la lactase immobili- - sée, comme le montre bien le Tableau 7. TABLEAU 6 Jours Colonne 1 E (2) Eg(1 7) g. 1 234 238 210 222 17 204 Colonne 2 E (2) Eg(17) 273 258 206 231 202 177 182 163 111 162 117 91 81 36 13 Arrêt au 17ème jour Colonne 3 E (2) E (17) 96,5 223 26 198 213 203 203 175 117 104 103 98 NOTA: E2 et E17 sont les activités instantanées après g g respectivement, de production continue. 2h et 17h, est l'activité moyenne sur 15 heures de production continue g 9- Co -CS -- TABLEIAU 7 Stabilité et demi-vies au cours des opérations sur lactosérum T = 35 C pH 3,5 Alimentation Lactosérum prétraité selon l'invention Protéases Nettoyage/ Acide + Désinfection acétique Polyalkylsamines Poly l i Demivie opérationnelle 9 35 55 en jours Stabilité * 60 90 95 % * La stabilité est le rapport moyen statistique de l'activité au bout de 17 heures de fonctionnement sur l'activité au bout de 2 heures de fonctionne- ment, sur l'ensemble des jours. REVEDI CA2I 0NS 1o Procédé de traitement du lactosérum en vue d'obtenir un lactosérum dont au moins une partie du lac- tose a été hydrolysé en glucose et galactose, selon le- quel on fait passer le lactosérum dans un lit de lactase immobilisée après avoir fait subir un prétraitement au lactosérum, et on effectue des nettoyages et des désin- fections périodiques du lit de lactase immobilisée, ca- ractérisé en ce que le prétraitement comprend un chauffa- ge du lactosérum dans la gamme de température allant de à 90 C suivi d'une centrifugation du lactosérum. 2. Procédé selon la revendication 1, carac- térisé en ce que la durée du chauffage du lactosérum est d'au moins 15 secondes. 3. Procédé selon la revendication 2, carac- térisé en ce que la durée du chauffage du lactosérum est comprise entre 15 minutes et 1 heure. 4. Procédé selon la revendication 1, carac- térisé en ce que la centriftugation du lactosérum est effectuée tandis qu'il est encore chaud. 5. Procédé selon l'une quelconque des reven- dications 1 à 4, caractérisé, en outre, en ce qu'on ef- fectue le nettoyage du lit de lactase par mise en contact périodique du lit de lactase immobilisée et d'une solu- tion d'un enzyme protéolytique. 6. Procédé selon la revendication 5, carac- térisé en ce que la solution d'enzyme protéolytique a une activité comprise entre 0,1 et 10 unités Anson/litre de solution. 7. Procédé selon l'une quelconque des reven- dications 1 à 6, caractérisé en ce que l'opération de nettoyage et suivie d'une opération de désinfection. 8. Procédé selon la revendication 79 carac- térisé en ce que la désinfection est effectuée à l'aide d'une solution de diéthylènetriamine substituée. 9. Procédé selon lune quelconque des reven- dications I à 8, caractérisé en ce que le prétraitement est effectué sur un lactosérum ayant été déminéralisé à raison de 0 à 90% et acidifié à un pH de 3,5 à 6. 10. Procédé selon la revendication 9, carac- térisé en ce que le lactosérum a été clarifié avant d'être déminéralisé ou acidifié.