FR 2482133 A1 19811113 FR 8107788 A 19810417 2482 1 33 La présente invention concerne un procédé pour la production d'acide L-glutamique par fermentation. On connaît diverses souches bactériennes sauvages productrices d'acide Lglutamique, spécialement dans le genre Brevibacterium ou Corynebacterium. Pour augmenter la productivité d'acide L-glutamique des souches sauvages connues, on leur fait- subir une mutation artificielle. Des exemples de ces mutants artificiels sont les mutants de Brevibacterium résistants à la S-(2-aminoéthyl)-cystéine (demande de brevet japonais non examinée publiée n 126877/1975), mutants de Brevibacterium et Corynebacterium résistants à l'acide fluoro- citrique, à l'acide cétomalonique, à l'acide a-amino-g-hydroxyvalé- rique, au DL-thréoninehydroxamate, à l'acide 2-amino-3-phosphopro- pionique ou à l'acide 5-aminolévulinique (demande de brevet japonais non examinée publiée n 89045/1979), mutants de Brevibacterium et Corynebacterium sensibles au lysozyme (demande de brevet japonais non examinée publiée n 122794/1979), mutants de Brevibacterium et Corynebacterium ayant une activité réduite de pyruvico-déshydrogé- nase (demande de brevet japonais non examinée publiée n 21762/1980), mutants de Brevibacterium ou Corynebacterium résistant à l'acide glu- tamique ou aux analogues de l'acide glutamique (demande de brevet japonais non examinée publiée n 21763/1980), et mutants de Brevi- bacterium résistants à lacide 2,6-pyridine-dicarboxylique (demande de brevet japonais non examinée publiée n 21764/1980). Il est cependant devenu difficile d'augmenter les rendements en acide Lglutamique par les techniques de mutation artificielle. On continue donc à avoir besoin de mettre au point de nouveaux micro-organismes capables de produire l'acide L-glutamique avec des rendements élevés. L'invention a donc pour objet un procédé pour la produc- tion d'acide L-glutamique avec des rendements élevés. Cet objet et d'autres objets de l'invention, qui appa- raîtront plus facilement ci-après, ont été obtenus par un procédé qui consiste: (a) à cultiver dans un milieu de culture un micro- organisme producteur d'acide L-glutamique qui est obtenu par incor- poration, dans une souche réceptrice du genre Brevibacterium ou Corynebacterium, d'un plasmide hybride dans lequel est inséré un fragment d'ADN qui est obtenu à partir d'une bactérie productrice d'acide Lglutamique du genre Brevibacterium et Corynebacterium, et (b) à récupérer l'acide L-glutamique accumulé dans le milieu de culture. Le donneur d'ADN utilisé pour construire le producteur d'acide Lglutamique de l'invention est une bactérie productrice d'acide L-glutamique appartenant au genre Brevibacterium ou Coryne- bacterium. Des exemples de souches sauvages de ces bactéries produc- trices d'acide L-glutamique sont les suivants: Brevibacterium divaricatum ATCC 14020 Brevibacterium flavum ATCC 13826 Brevibacterium immariophilum ATCC 14068 Brevibacterium lactofermentum ATCC 13869 Brevibacterium roseum ATCC 13825 Brevibacterium saccharolyticum ATCC 14066 Brevibacterium thiogenitalis ATCC 19240 Corynebacterium acetoacidophilum ATCC 13870 Corynebacterium acetoglutamicum ATCC 15806 Corynebacterium callunae ATCC 15991 Corynebacterium lilium ATCC 15990 Corynebacterium melassecola ATCC 17965 Corynebacterium glutamicum ATCC 13032 On peut, bien entendu, utiliser comme donneurs d'ADN des mutants artificiels dérivés des souches sauvages mentionnées ci-dessus si les mutants sont producteurs d'acide Lglutamique. On obtient les meilleurs résultats lorsque l'on utilise comme donneur d'ADN une bactérie ayant une productivité supérieure d'acide L-gluta- mique. Les souches réceptrices sont des souches sauvages ou des mutants du genre Brevibacterium ou Corynebacterium. Il convient spécialement d'utiliser un mutant ayant besoin d'acide L-glutamique pour sélectionner les clones hybrides transformés pour produire l'acide L-glutamique. Les souches sauvages ou mutantes ayant une productivité supérieure d'acide Lglutamique sont souhaitables comme 248 2 133 souches réceptrices. Dans le cas o l'on utilise comme souche réceptrice un mutant ayant besoin d'acide L-glutamique, le mutant est avantageusement induit à partir d'une souche mère ayant une productivité supérieure d'acide L-glutamique. En vue d'augmenter la productivité d'acide L-glutamique de la souche réceptrice ou de la souche mère du mutant ayant besoin d'acide L-glutamique, on confère par mutation à la bactérie produc- trice d'acide L-glutamique le besoin d'un agent nutritif, tel que L-lysine, L-thréonine, L-isoleucine, L-proline, L-arginine, L-méthio- nine, L-histidine, L-leucine, L-tryptophane, L-tyrosine, L-phényl- alanine, L-alanine, L-sérine, glycine, xanthine, hypoxanthine, adénine ou guanine. La productivité d'acide L-glutamique est également accrue en conférant de manière connue à la bactérie productrice d'acide L-glutamique la sensibilité aux températures élevées ou au mono- palmitate de polyoxyéthylènesorbitanne, ou la résistance à l'acide monofluoroacétique, à l'acide cétomalonique, à la guanidine, à la sulfaguanidine, à la 2-thiazolealanine ou à la fluorophénylalanine. L'ADN chromosomique est extrait du donneur d'ADN de manière bien connue et traité par une endonucléase de restriction par un procédé bien connu, voir Biochem. Biophys. Acta 383, page 457 (1975). Bien que divers types d'endonucléases de restriction soient applica- bles si la digestion est effectuée partiellement, on préfère selon l'invention,pour la digestion, Hind III, Bcl I, Xba I et Xma I. On utilise comme ADN vecteur l'ADN-plasmide ou ADN-phage extrait de la bactérie productrice d'acide L-glutamique du genre Brevibacterium ou Corynebacterium ou un dérivé du plasmide ou phage. L'ADN vecteur est également digéré avec l'endonucléase de restriction. Les endonucléases de restriction préférées sont Hind III, Bcl I, Xba I et Xrmla I. L'ADN chromosomique digéré et 1'ADN vecteur sont soumis à une réaction de "ligation" (fixation) par une ligase. La recombinaison de l'ADN pour préparer le plasmide recombinant peut être effectuée par introduction, avec la transférase terminale, d'acide désoxyadénylique et d'acide thymidylique, ou d'acide désoxyguanylique et d'acide désoxycytidylique dans le fragment d'ADN chromosomique et l'ADN vecteur scindé, et en soumet- 248 2133 tant le fragment d'ADN chromosomique modifié et l'ADN vecteur scindé à une réaction d'annellation. L'ADN hybride ainsi obtenu peut être incorporé dans le micro-organisme récepteur par des techniques classiques de trans- formation et on peut ensuite laisser pousser les micro-organismes récepteurs pendant un certain temps pour stabiliser les caractéris- tiques transformées du transformant. Le transformant désiré peut être choisi en sélectionnant un clone ayant les caractéristiques de production d'acide L-glutamique et celles possédées par le vecteur ou les unes et les autres. Les bactéries productrices d'acide L-glutamique ainsi obtenues peuvent âtre cultivées de manière classique pour les laisser produire l'acide Lglutamique, par exemple à un pH de 6 à 8 et à une température de 30 à 370C. On continue la culture jusqu'à ce que la production d'acide L-glutamique ait sensiblement cessé. Le milieu de culture utilisé est classique et contient des sources de carbone, des sources d'azote, des ions inorganiques et, si nécessaire, de plus faibles quantités d'agents nutritifs organiques, tels que vitamines ou aminoacides. Des exemples de sources de carbone appropriées comprennent le glucose, le saccharose, le lactose, l'hydrolysat de mais et les mélasses. On peut utiliser comme sources d'azote l'ammoniac gazeux, l'ammoniaque aqueuse, les sels d'ammonium et l'urée. Dans le procédé de l'invention, on-peut obtenir des rendements plus élevés en acide L-glutamique que par les procédés connus, et on peut, en outre, effectuer convenablement la récupération de l'acide L-glutamique parce que les sous-produits d'aminoacides dans le bouillon de culture sont rares. Les exemples suivants illustrent l'invention sans toutefois en limiter la portée. EXEMPLE 1 (1) Préparation d'ADN chromosomique possédant l'information génétique relative à la production d'acide L-glutamique Dans 1 litre de milieu CMG contenant 1 g/dl de peptone, 1 g/dl d'extrait de levure, 0,5 g/dl de glucose et 0,5 g/dl de NaCl (ajusté à pl} 7,2), on cultive à 30 C pendant 3 h, en agitant, Brevibacterium lactofermentum n 5116 (NRRL-B 12405), mutant sensible aux températures élevées et induit à partir de la souche n0 2256 (ATCC 13869), et on récolte les cellules bactériennes dans la phase de croissance exponentielle. On extrait l'ADN chromosomique par une méthode classique au phénol et on obtient 3,5 mg d'ADN purifié. (2) Préparation de 'ADN vecteur On prépare comme vecteur l'ADN du plasmide pAM 330 (P.M. 3xl06 dalton) de la manière suivante: On fait incuber à 30 C une souche Brevibacterium lacto- fermentum n 2256 recevant le plasmide pAM 330 dans 1 litre de milieu CMG. Après avoir fait incuber la souche jusqu'à la fin de la phase logarithmique, on récolte les cellules que l'on lyse ensuite par traitement par le lysozyme et le SDS (dodécylsulfate de sodium). On centrifuge le lysat à 30.000xg pendant 1 h pour obtenir la liqueur surnageante. Après concentration de la liqueur surnageante, on obtient 74 y de 1'ADN de plasmide par fractionnement en utilisant l'électro- phorèse sur gel d'agarose. (3) Insertion du fragment d'ADN chromosomique dans le vecteur On traite 10 y de l'ADN chromosomique avec l'endo- nucléase de restriction Hind III ou Bcl 1 à37 Cpendant 10, 30 et min, respectivement, pour scinder les chaînes dlADN, et on chauffe à 65 C pendant 5 min, respectivement. On traite également 10 y de l'ADN vecteur avec chacune des endonucléases de restriction Hind II et Bcl I à 37 C pendant 1 h pour scinder complètement l'ADN, et on chauffe ensuite à 65 C pendant 5 min, respectivement. On mélange la solution d'ADN chromosomique digéré et la solution d'ADN vecteur scindé et on soumet à la réaction de ligation de fragments d'ADN par une ligase de l'ADN-phage T4 en présence d'ATP et de dithiothréitol à 100C pendant 24 h. On chauffe ensuite le mélange de réaction à 65 C pendant 5 min, et on ajoute deux fois son volume d'éthanol. On récupère l'ADN recombinant précipité. (4) Transformation génétique par le plasmide hybride recevant l'information génétique relative à la production d'acide L-glutamique On cultive des souches de Brevibacterium lactofermentum ayant besoin d'acide glutamique n 3 (NRRL B-12406)et n 4(NRRL B-12407), qui proviennent de Brevibacterium lactofermentum n 5116 par muta- génèse par la N-méthyl-N'-nitro-N-nitrosoguanidine, dans 20 ml de milieu CMG à 30 C en agitant. On récolte les cellules dans la phase de croissance exponentielle et on les met en suspension dans une solution de MgC12 O,lM,puis dans une solution de CaC12 O,1M au bain de glace; on prépare ainsi des cellules "compétentes" capables d'absorber l'ADN. Dans la suspension de cellules compétentes, on ajoute l'ADN obtenu à l'étape 3 qui contient l'ADN du plasmide hybride. On maintient la suspension au bain de glace pendant 30 min, puis on chauffe à 40 C pendant 2 min, et on laisse à nouveau reposer au bain de glace pendant 30 min. On inocule dans le milieu L les cellules contenant ainsi l'ADN du plasmide hybride et on agite le milieu à 37 C pendant 3 h; la réaction de transformation est ainsi terminée. On récolte les cellules, on les lave et on les remet en suspension. On étale une faible portion de la suspension de cellules sur une plaque de gélose contenant 20 g de glucose, 10 g de (NH4)2S04, 2,5 g d'urée, 1 g de KH2P04, 0,4 g de MgSO4, 7H20, 50 T debiotine, y dechlorhydrate de thiamine, 0,01 g de FeSO 47H20, 0,01 g de MnSO 4,4H20 et 20 g de gélose par litre (ajustée à pH 7,2). On fait incuber la plaque à 37 C. Après 4 jours d'incubation, on prélève, on purifie et on isole toutes les colonies qui apparaissent. Les souches devenues capables de produire l'acide L-glutamique par transformation sont prélevées comme transformants. Parmi les transformants, on choisit les producteurs d'acide L-gluta- mique les plus actifs,AJ 11561 (FERM-P 5469, NRRL B-12408) et AJ 11562 (FERM-P 5470, NRRL B-12409). AJ 11561 est obtenu à partir de la souche réceptrice n 3 en utilisant Hind III, et AJ 11562 à partir de la souche réceptrice n 4 en utilisant Bcl I. (5) Production d'acide L-glutamique par la nouvelle souche productrice d'acide glutamique préparée On essaye la production d'acide L-glutamique par AJ 11561 et AJ 11562 en comparant avec le donneur d'ADN et les souches réceptrices, de la manière suivante: Le milieu de fermentation contient 3,6 g/dl de glucose, 0,5 g/dl d'urée, 0,1 g/dl de KH2PO4, 0,1 g/dl de MgSO4,7H20, 3 ml/dl d'hydrolysat de soja ("Mieki"), 100 -y/1 de chlorhydrate de thiamine, 3 7/1 de biotine, 1 mg/dl de FeSO4,7H20 1 mg/dl de MnSO 41 4H20 et 2,5 g/dl de CaCO3 (stérilisé séparément) et on ajuste le pH à 7,0. On place 20 ml du milieu de fermentation dans un ballon inoculé au moyen d'une boucle de platine avec le micro-organisme d'essai et on effectue la culture à 31 C pendant 48 h. Les quantités d'acide L-glutamique dans la liqueur surna- geante du bouillon de fermentation sont déterminées par dosage micro- biologique dans le tableau I ci-dessous. TABLEAU I EXEMPLE 2 (1) Préparation de l'ADN chromosomique possédant l'information génétique relative à la production d'acide L-glutamique Dans 1 litre de milieu CMG contenant 1 g/dl de peptone, 1 g/dl d'extrait de levure, 0,5 g/dl de glucose et 0,5 g/dl de NaCl (ajusté à pH 7,2), on cultive à 30 C pendant 3 h, en agitant, Corynebacterium glutamicum n 5707 (NRRL B-12410), mutant résistant à l'acide cétomalonique et induit à partir de Corynebacterium Micro-organisme essayé I Acide L-glutamique accumulé (mg/dl) Brevibacterium lactofermentum n 5116 550 Brevibacterium lactofermentum n 3 O Brevibacterium lactofermentum n 4 O Brevibacterium lactofermentum AJ 11561 980 Brevibacterium lactofermentum AJ 11562 900 i __________________11562_900 2482 1 33 glutamicum AJ 11560 (FERM-P 5485, NRRL B-12415), et on récolte les cellules bactériennes dans la phase de croissance exponentielle. On extrait l'ADN chromosomique par une méthode classique au phénol et on obtient 4,0 mg d'ADN purifié. Corynebacterium glutamicum AJ 11560 a été récemment isolé comme souche appropriée pour les buts de l'invention. Cette souche AJ 11560 a été classée dans la section III du genre Corynebacterium décrit dans le Bergey's Manual of Determinative Bacteriology (8e édition, 1974). Cependant, les caractéristiques taxonomiques des espèces appartenant à la section III ne sont pas décrites dans le Manual, mais seuls sont déQrits les noms des espèces de la section III. Donc, on se réfère à tous les rapports originaux décrits dans le Manual, dans la section III. La souche AJ 11560 a été identifiée avet Corynebacterium glutamicum décrit dans "Bull. Agr. Chem. Soc. Japon, 22, pages 176-185 (1958Y'et dans "J. Gen. Appl. Microbiol., 13, pages 279-301 (1967)"'. (2) Préparation de l'ADN vecteur On utilise comme vecteur l'ADN du plasmide pAM 286 (P.M. 3xlO6 dalton) de la manière suivante: , On fait incuber à 30 C dans 1 litre de milieu CMG une souche de Corynebacterium glutamicum AJ 11560 recevant le plasmide pAM 286. Après avoir fait incuber la souche jusqu'à la fin de la phase logarithmique, on récolte les cellules et ensuite on les lyse par traitement par le lysozyme et le SDS (dodécylsulfonate de sodium). On centrifuge le lysat à 30.OOOxg pendant 30 min pour obtenir une liqueur surnageante. Après concentration de la liqueur surnageante, on obtient 60 y de l'ADN du plasmide par fractionnement en utilisant l'électrophorèse sur gel d'agarose. (3) Insertion du fragment d'ADN chromosomique dans le vecteur On traite 10 Y de l'ADN chromosomique avec chacune des endonucléases de restriction Hind III ou Xma I à 370C pendant 10, 30 et 60 min, respectivement, pour scinder les chaines d'ADN, et on chauffe ensuite à 65 C pendant 5 min, respectivement. On traite également 10 y de l'ADN vecteur avec chacune des endonucléases de 248 2 133 restriction Hind III ou Xma I à 37 0C pendant 1 h pour scinder complètement l'ADN, et ensuite on chauffe à 65 C pendant 5 min, respectivement. On mélange la solution d'ADN chromosomique digéré et la solution d'ADN vecteur scindé et on les soumet à la réaction de ligation des fragments d'ADN par une ligase de l'ADN-phage T4 en présence d'ATP et de dithiothréitol à 10 C pendant 24 h. On chauffe ensuite le mélange de réaction à 65 C pendant 5 min, et on ajoute deux fois son volume d'éthanol. On recueille l'ADN recombinant qui précipite. (4) Transformation génétique par le plasmide hybride recevant l'information génétique relative à la producion d'acide glutamique On cultive dans 20 ml de milieu CMG a 30 C les souches de Corynebacterium glutamicum ayant besoin d'acide L-glutamique n 12 (NRRL B-12411) et n 26 (NRRL B-12412) qui proviennent de Corynebacterium glutamicium n 5707 par mutagénèse par la N-méthyl-M'-nitro-N-nitroso- guanidine. On récolte les cellules dans la phase de croissance exponentielle et on les met en suspension dans une solution de MgC12 O,lM et ensuite dans une solution de CaC12 0,lM au bain de glace; on prépare ainsi les cellules "compétentes" capables de fixer l'ADN. Dans la suspension de cellules compétentes, on ajoute l'ADN obtenu à l'étape (3), qui contient l'ADN de plasmide hybride. On maintient la suspension au bain de glace pendant 30 min, puis on chauffe à 42 C pendant 2 min, et on laisse à nouveau reposer au bain de glace pendant 30 min; les cellules dans lesquelles est ainsi incorporé l'ADN du plasmide hybride sont inoeulées dans un milieu L et on agite le milieu à 370C pendant 3 h; la réaction de transforma- tion est ainsi terminée. On récolte les cellules, on les lave et on les remet en suspension. On étale le mélange de réaction après dilution de la suspension de cellules sur une plaque de gélose contenant 20 g de glucose, 10 g de (NH4)2S04, 2,5 g d'urée, 1 g de KH2P04, 0,4 g de MgSO4,7H20, 50 y debiotine, 20 y de chlorhydrate de thiamine, 0,01 g de FeSO 4,7H20, 0, 01 g de MnS04,4H20 et 20 g de gélose par litre (ajustée à pH 7,0). On fait incuber la plaque à 37 C. Apres 4 jours d'incubation, on recueille toutes les colonies qui apparaissent, on les purifie et on les isole. On obtient AJ 11566 (FERM-P 5486, NRRL B-12413) à partir de la souche n 12 en utilisant Hind III et AJ 11567 (FERM-P 5487, NRRL B-12414) à partir de la souche n 26 en utilisant Xma I. (5) Production d'acide Lglutamique par la souche préparée productrice d'acide glutamique On cultive les transformants obtenus à l'étape (4) pour déterminer leur production d'acide L-glutam4que. La souche donneur d'ADN n 5707 et les souches réceptrices sont cultivées de la même manière à titre comparatif. Le milieu de culture contient 3,6 g/dl de glucose, 0,5 g/dl d'urée, 0,1 g/dl de KH2PO4, 0,1 g/dl de MgSO4,7H 20, 3 ml/dl d'hydrolysat de soja ("Mieki"), 100 y/l de chlorhydrate de thiamine, 3 y/1 de biotine, 1 mg/dl de FeSO 4,7H20, 1 mg/dl de MnSO4,4H20 et 2,5 g/dl de CaCO3 (stérilisé séparément) et on l'ajuste à pH 7,0. On place 20 ml du milieu de fermentation dans des ballons de 500 ml inoculésau moyen d'une boucle de platine avec l'inoculum du microorganisme d'essai et on effectue la culture à 31 C pendant 48 h. On détermine les quantités d'acide L-glutamique dans la liqueur surnageante du bouillon de fermentation par dosage micro- biologique dans le tableau II ci-dessous. TABLEAU II Micro-organisme essayé Acide L-glutamique accumulé (mg/dl) Corynebacterium glutamicum n 5707 600 Corynebacterium glutamicum n 12 O Corynebacterium glutamicum n 26 O Corynebacterium glutamicum AJ 11566 1010 Corynebacterium glutamicum AJ 11567 1000 R E V E N D I C A T I 0 N S 1. Procédé pour la production d'acide L-glutamique par fermentation, caractérisé en ce qu'il consiste: (a) a cultiver dans un milieu de culture un micro-orga- nisme producteur d'acide L-glutamique qui est construit par incorporation,dans une souche réceptrice du genre Brevibacterium ou Corynebacterium, d'un plasmide hybride dans lequel est inséré un fragment d'ADN portant l'information génétique relative à la produc- tion d'acide L-glutamique obtenu à partir d'un microrganisme produc- teur d'acide L-glutamique du genre Brevibaterium et CgEYebactierAmet (b) à recueillir l'acide L-glutamique accumulé dans le bouillon de culture. 2. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que ledit fragment d'ADN est obtenu par traitement de l'ADN chromo- somique avec une endonucléase de restriction choisie parmi Hind III, Bcl I, Xba I et Xma I. 3. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que ladite souche réceptrice est choisie parmi Brevibacterium diva- ricatum, Brevibacterium flavum, Brevibacterium immariophilum, Brevibacterium lactofermentum, Brevibacterium saccharolyticum, Brevibacterium thiogenitalis, Corynebacterium acetoacidophilum, Corynebacterium acetoglutamicum, Corynebacterium callunae, Coye- bacterium lilium, Corynebacterium melassecola, ou Corynebacterium glutamicum. 4. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que ladite bactérie productrice d'acide L-glutamique est choisie parmi Brevibacterium divaricatum, Brevibacterium flavum, Brevibaco terium immariophilum, Brevibacterium lactofermentum, Brevibacterium roseum, Brevibacterium saccharolyticum, Brevibacterium thiogenitalis, Corynebacterium acetoacidophilum, Corynebacterium acetoglutamicum, Corynebacterium callunae, Corynebacterium lilium, Corynebacterium melassecola, Corynebacterium glutamicum. 5. Procédé selon la revendication l, caractérisé en ce que ladite bactérie productrice d'acide L-glutamique est un mutant résistant à l'acide cétomalonique. 2482 133 6. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que ladite bactérie productrice d'acide L-glutamique est un mutant sensible aux températures élevées.