FR 2478670 A1 19810925 FR 8105731 A 19810323 La présente invention concerne la production dl hormone somatotrope bovine par des micro-organismes. Plus particulièrement elle se rapporte à de nouveaux micro-or- ganismes modifiés, adaptés à la production d'un polypep- tide qui comporte la séquence d'amino-acides de l'hormone somatotrope bovine. L'invention comprend également un procédé pour modifier des microorganismes non pathogènes, faciles à cultiver, pour les transformer en producteurs efficaces d'un polypeptide contenant l'hormone somatotro- pe bovine. L'invention concerne également la production d' hormone somatotrope bovine au moyen de micro-organismes non pathogènes faciles à cultiver. On peut synthétiser de 1'ADN capable de coder pour des polypeptides et l'épisser à de l'ADN de plasmide. Lorsque des cellules sont transformées par cet ADN re- combinant, l'ADN synthétique se réplique dans ces cellu- les. S'il est convenablement inséré en phase avec un pro- moteur bactérien approprié, l'ADN synthétique est décodé (exprimé) en le polypeptide type. On peut utiliser cette technique pour produire divers types d'hormonest d'enzymes et d'autres polypeptides. Dans chaque cas la technique doit être adaptée aux circonstances particulières. L'invention concerne de nouveaux micro-organis- mes modifiés adaptés à la production de l'hormone soma- totrope bovine. Elle comprend également un procédé de production de l'hormone somatotrope bovine, par culture de ces nouveaux microorganismes. L'invention se rapporte en outre à la production d'hormone somatotrope bovine, qui consiste à extraire de l'ARN d'hypophyses bovines, trans- crire de l'ADN bicaténaire sur ces modèles d'ARN, modifier les extrémités de l'ADN avec de l'oligo-désoxycytidine, insérer l'ADN du plasmide à extrémités modifiées, sélec- tionner les colonies bactériennes contenant les plasmides recombinants et cultiver ces colonies pour obtenir une cul- ture cellulaire contenant le polypeptide désiré et l'ex- traire de cette culture. Selon un de ses modes de réalisation préférés, l'invention concerne des souches de E. coli modifiées pour produire l'hormone somatotrope désirée. De préféren- ce la souche utilisée dérive de E. coli HB101, et un plas- mide préféré utilisé est le plasmide pBR322. On synthétise de l'ADN par voie enzymatique sur du mARN isolé d'hypophyses bovines. On épisse l'ADN au gène de la P-lactamase du plasmide pBR322 qui est couram- ment utilisé. On transforme des cellules de E. coli, de préférence de la souche HB101, ou de souches semblables, avec les plasmides recombinants et on isole les colonies contenant ces plasmides. On identifie les colonies (clones) ayant le pouvoir de coder pour l'hormone somatotrope bovine et les colonies ayant la capacité de coder pour la prolac- tine par détermipation de la séquence de l'ADN. On isole l'ADN inséré d'une colonie contenant la totalité des sé- quences de codage pour l'hormone somatotrope et on le ré- insère dans un autre plasmide dans une position adjacente au promoteur correspondant à la P-galactosidase. On isole plusieurs colonies produisant un polypeptide, que l'on ca- ractérise être l'hormone somatotrope désirée, par lélectro- phorèse sur gel et par précipitation avec un antisérum pré- paré à partir d'hormone somatotrope bovine, standard, pure. Mode opératoire utilisé pour établir la souche bactérienne capable de produire l'hormone somatotrope bovine soudée à une fraction de.-lactamases. On extrait par le phénol l'ARN d'un mélange de plusieurs hypophyses de veau et on purifie, par chromato- phie sur de l'oligo(dT)-cellulose, l'ARN contenant le poly(A). On transcrit le poly(A)+ ARN en de l'ADN bicaté- naire par la transcriptase réverse (AMV). On traite l'ADN avec de la nucléase spécifique monocaténaire (S1) et on effectue une modification de type dC des extrémités avec de la terminal-transférase (PL Biochemicals) puis on sé- pare par électrophorèse sur un gel d'agarose. On isole la fraction de poids moléculaire élevé comportant plus de 500 paires de bases et on recombine avec de l'ADN du plasmide pBR322 coupé par de la Pst et dont les extrè- mités ont subi une modification de type dG. On expose E. coli HB101 traité par les ions Ca++ à l'action de cet- te préparation d'ADN. On isole les colonies résistant à la tétracycline et on effectue une sélection des plasmides recombinants par hybridation in situ avec du cADN marqué par le 32 produit par transcription réverse à partir de la fraction de poly(A)+ARN précitée. On isole les colonies positives et on effectue une sélection complémentaire des plasmides contenant les séquences d'ADN correspondant à la prolactine bovine et à l'hormone somatotrope de la fa- çon suivante: on prépare des plasmides à partir de cha- que colonie, on immobilise l'ADN sur des filtres de nitro- cellulose et on hybride avec un poly(A)+ARN extrait d'hy- pophyses. On analyse la capacité que présente l'ARN hybri- dé de provoquer la synthèse d'une bande spécifique corres- pondant à l'hormone somatotrope bovine dans un système de traduction dépourvu de cellules. On détermine que la plu- part des colonies contiennent les séquences d'ADN codant pour la prolactine; quelques unes sont identifiées comme contenant l'ADN codant pour l'hormone somatotrope. Ce fait est confirmé par détermination des séquences d'ADN dans un exemple de chaque groupe. On analyse la capacité de synthétiser un polypeptide correspondant à l'hormone so- matotrope selon des techniques immuhologiques de la façon suivante: on marque les cellules avec la 35S-méthionine pendant 30 minutes et on extrait les protéines puis on incube avec un antisérum dirigé contre l'hormone somato- trope bovine purifiée et on incube avec du Staphylococcus A traité par le chloroforme. Ensuite avec du dodécylsul- fate de sodium-p-mercaptoéthanol on dissocie le complexe anticorps-antigène précipité et on l'analyse par électro- phorèse sur gel. On constate que plusieurs colonies syn- thétisent un polypeptide qui réagit spécifiquement avec cet antisérum. La taille du polypeptide correspondant à l'hormone somatotrope varie z dans une souche le polypep- tide principal a une masse moléculaire d'environ 40 kilo- daltons, dans une autre souche la masse moléculaire est d'environ 25 kilodaltons. On détermine la quantité synthé- tisée dans un fermenteur de 1 litre selon la technique radioimmunologique décrite ci-après. La souche ayant le rendement maximal en polypeptide correspondant à l'hormone somatotrope bovine est appelée souche D4 déposée dans la Collection Américaine ATTC sous le n 31826. Epissage de V'ADN pour obtenir une série d'hormones soma- totropes bovines modifiées. On construit des plasmides produisant de l'hor- mone somatotrope bovine (bGH) modifiée dans les bactéries E. coli. Toutes les constructions sont à base d'un frag- ment d'ADN provenant de 1i'ADN du plasmide pBR322 et héber- geant l'ADN codant pour la bGH. On produit ce fragment par clivage du plasmide avec l'endonucléase de restriction Hae II et on l'appelle fragment I. Le fragment I comprenant 1 640 paires de bases débute par la nucléotide n 3 co- dant pour la bGH mature et il se poursuit par toutes les séquences de l'ADN de la bGH, y compris le codon de termi- naison, puis passe par les séquences d'ADN du pBR322 du nucléotide 3612 au nucléotide 2721 selon la séquence pu- bliée par Suteliffe (1978) Nucleie Acid Res 5, 2721. Donc le début du fragment I est le suivant z Phe2 Pro3 Ala4 Met5 C TTC CCA GCC ATG CGCGG AAG GGT CGG TAC... et il manque les deux nucléotides nécessaires pour coder le premier amino-acide Ala. Exemple 1: Préparation de bGH débutant par (Met)Prophe Pro, (1) On élimine les trois nucléotides terminaux faisant saillie du fragment I avec l'exonucl4ase S1 pour pro- duire le fragment II d'ADN comportant la séquence i- nitiale s C TTC CCA G AAG GGT... (2) On unit le fragment II à des éléments de liaison de EcoRI de structure z G GAATTCC C CTTAAGG pour obtenir le fragment III suivant: GGAATTCCCTTCCCA.............. GGAATTCC CCTTAAGGGAAGGGT.............. CCTTAAGG (3) On soumet le fragment III à une digestion avec l'endo- nucléase de restriction EcoRI pour obtenir le frag- ment IV suivant: AATTCCCTTCCCA.........,.o, GG GGGAAGGGT...............CCAATT (4) On unit le fragment IV au plasmide pBR322 clivé par EcoRI et on clone dans la souche de E. cli HB101. Ce nouveau plasmide contient un ajout de fragment IV que l'on élimine ensuite avec l'endonucl1ase de restriction EcoRI. (5) On taille le fragment IV avec l'exonucléase S1 pour produire un fragment V à extrêmité franche.compor- tant la séquence z CCC TTC CCA.... GGG AAG GGT (6) On unit le fragment V à des éléments de liaison EcoRI-ATG de structure s CATGAATTCATG GTACTTAAGTAC pour obtenir le fragment VI suivant S CATGAATTCATGCCCTTCCCA..... GTACTTAAGTACGGGAAGGGT..... CATGAATTCATG..DTD: *... GTACTTAAGTAC (7) Comme pour la préparation du fragment V, on clive le fragment VI avec EcoRI et on taille avec l'exonuclé- ase S1 comme en 1.4 et 1.5 pour obtenir le fragment VII: CCATGCCCTTCCA.........CATGG GSTACGGGAAGGT.........GTACC (8) On unit le fragment VIe l'ADN du plasmide pGL101 ou- vert avec l'endonucléase de restriction PvuII. Le plasmide pGL101 contient le promoteur lac dans une position convenant à l'obtention d'une expression d' un ADN quelconque contenant des séquences d'initia- tion ATG et précédé par deux nucléotides, lorsqu'on l'introduit dans le site de restriction de PvuII. Donc la transformation de E. coli par un plasmide hybride constitué d'un tel mélange entratne une ex- pression importante de bGH modifiée comportant la séquence de départ Met Pro Phe Pro Ala. Cette protéine diffère de la protéine mature par le fait que Met Pro remplace Ala de la protéine mature. On peut avec des bactéries éliminer Met pour obtenir une bGH modifiée débutant par la séquence d'amino- acides Pro Phe Ala Pro. La souche productrice a été appelée bGH1. ExemPle 2: Preparation de Met Arg (Dés Ala) bGH. (1) On unit le fragment I aux éléments de liaison synthé- tiques GAATTCATGCGC CTTAAGTA pour produire le fragment VIII ayant la séquence de départ suivante: GAATTCATGCCCTTC.... CTTAAGTACGGGAAG.... (2) Selon le mode opératoire utilisé pour le fragment V, on traite le fragment VII avec EcoRI et S1 pour ob- tenir le fragment IX z CATGCGCTTC..... GTACGCGAAG..... (3) On unit le fragment X avec le plasmide pGL101 ouvert sur le site de PvuII comme en 1.8 pour obtenir un plasmide qui exprime de la bGH modifiée débutant par la séquence s (Met) Arg Phe2 Pro3Ala4... la souche productrice a été appelée bGH2. Exemple 3: Produ tion de (Met) Glu Glv Phe2 Pro3-bGH (1) On unit le fragment I 4Ies éléments de liaison Hind III de structure z CCAAG GCTTC pour obtenir le fragment XI s CCAAGCTTGGCTTC.... GGTTCGAACCGAAG.... (2) On clive le fragment XI avec Hind III pour obtenir le fragment XII de structure: AGCTTGGCTTC..... ACCGAAG..... (3) On garnit partiellement le fragment XII avec de la po- lymérase I en utilisant uniquement dG et dA. Simulta- nément, on clive les deux premiers nucléotides du fragment XII. On couple le fragment XIII obtenu avec des éléments de liaison EcoRI-ATG (comme en 1.6), on clive avec EcoRI (comme en 1l4)et on taille avec S1 (comme en 1. 5) pour obtenir le fragment XIV. La souche productrice a été appelée bGH3. (4) On introduit le fragment XIV dans le plasmide pGL101 (comme en 1.8) pour exprimer de la bGH modifiée com- portant la séquence initiale: (Met) Glu Gly Phe Pro.... ExemDle 4: Production de dés (Ala1Phe% ro3Ala4) bGH, c'est-à-dire de bGH débutant par Met5. On traite le fragment I avec l'exonucléase S1, l'exonu- cléase III et à nouveau l'exonucléase S1' Ces traitements produisent divers fragments à extrémités franches qui lorsqu'on les unit au promoteur sur le site PvuII du plasmide pGL101 permettent d'obtenir la bGH modifiée. Le traitement ultérieur du fragment I par les exonucléases I et S1 produit l'expression de dés (Ala1 Phe2 Pro3 Ala4) bGH, c'est-à-dire d'une bGH débutant par Met5. La souche productrice a été appelée bGH4. Exemple 5 s Production de polypeptides semblables à l'hor- mone somatotrope bovine par des bactéries. On dilue 10 ml d'une culture d'une nuit d'un clone produc- teur dans 1 litre d'un milieu stérile contenant 10 g de Bacto-Tryptone (Difco), 5 g d'extrait de levure (Difco), g de chlorure de sodium et 10 g de glucose. On cultive à 37 C en agitant et en aérant énergiquement puis on re- cueille les cellules au milieu de la phase logarithmique (A600 1,5) après refroidissement rapide, par centrifuga, tion à 7 000 tr/min (Sorvall) pendant 10 minutes. Lorsqu' on recueille les cellules au début de la phase stationnai- re, la quantité d'hormone par culture (et par cellule) di- minue fortement. On lave le culot cellulaire et on le met en suspension dans un petit volume d'une solution conte- nant 20% de saccharose et 2 mM en EDTA après 5 minutes sur de la glace; on ajoute 10 mg de lysozyme et on laisse incuber pendant encore 30 minutes. On obtient ainsi des protoplastes. On ajoute aux protoplastes 1 g de tampon barbital-Tris à pH 8,8 (Gelman) puis du Triton et du Na- Sarkosyl (concentration finale 0,1%). On soumet le lysat visqueux à un traitement par les ultrasons (1 minute z puissance utile 50%, Branson) pour réduire la viscosité. On centrifuge l'extrait à 15 000 tr/min (Sorvall) pendant minutes et on centrifuge le surnageant à 40 000 tr/min (Spinco R40) pendant 60 minutes pour éliminer les ribo- somes. La majeure partie de l'activité est présente dans le surnageant. Cette culture produit 150pug de polypepti- de de type hormone somatotrope bovine hybride à activité immunologique. On peut précipiter'la majeure partie de 1' hormone par du sulfate d'ammonium à 30% de la saturation. On mesure la quantité d'hormone produite par détermination radio-immunologique, c'est-à-dire par compé- tition avec de l'hormone somatotrope bovine pure marquée au 125I dans une réaction immunologique avec un antisérum de lapin dirigé contre l'hormone somatotrope bovine pure. Les nouveaux micro-organismes ont été déposés à l'American Type Culture Collection des Etats-Unis d'A- mérique, à Rockvillie Maryland sous les numéros respectifs ci-dessous: souche BGH I - ATTC N03184O correspondant à l'exemple 1 # BGH 2 - " 31841 correspondant à l'exemple 2 " BGH 3 - " " 31842 correspondant à l'exemple 3 " BGH 4 - " " 31843 correspondant à l'exemple 4, Revendications 1. Souches de E. coli adaptées à la production de 1' hormone somatotrope bovine, caractérisées en ce qu'elles résultent de l'extraction d'ARN d'hypophyses bovines, transcription d'ADN sur ces modèles d'ARN, épissage de 1' ADN dans des plasmides, insertion de l'ADN épissé dans des micro-organismes puis sélection et isolement des co- lonies de ces micro-organismes produisant l'hormone soma- totrope hybride ou modifiée désirée. 2. Souche modifiée de E. coli adaptée à la produc- tion d'une hormone somatotrope modifiée selon la revendi- cation 1, caractérisée en ce que la molécule d'hormone somatotrope bovine est soudée à une partie d'une molécule de P-lactamase. 3. Souche modifiée de E. coli selon la revendication 1, caractérisée en ce que la molécule de dés (Ala)-hormone somatotrope bovine est soudée à de la proline, à de l'ar- ginine, à de la glutamyl-glycine ou en ce qu'il manque à la molécule modifiée les quatre premiers amino-acides de l'hormone somatotrope bovine. 4. Hormone somatotrope bovine modifiée, caractérisée en ce qu'elle consiste ên le produit de la culture d'une souche modifiée de E. coli selon l'une des revendications 2 ou 3, et de la séparation et de la purification de l'hor- mone somatotrope modifiée contenue dans ce produit de cul- ture.