FR 2483928 A1 19811211 FR 8111336 A 19810609 Dérivés de la N-trifluoracétyladriamycine, leur préparation et leurs utilisations thérapeutiaues. La présente invention a été faite dans le cours de travaux subventionnés par le Ministère de la Santé des Etats-Unis (Department of Health, Education and Welfare) Elle concerne de nouveaux dérivés hydrosolubles de l'adriamycine, leur préparation et leurs utilisations thérapeutiques. Les composés- selon l'invention ont une activité anti-tumeur sur les leucémies murines P 388 et I 1.210 et sont peu toxiques. L'invention comprend donc également des compositions thérapeutiques contenant ces composés avec un véhicule aqueux non toxique acceptable pour l'usage pharmaceutique et qu'on peut utiliser pour l'administration à des souris souffrant de certaines tumeurs en vue d'accroi- tre leur espérance de vie. L'adriamycine, également connue sous le nom de doxorubicine et la daunomycine, également connue sous le nom de daunorubicine ont été décrites, avec des composés apparentés tels que certains dérivés Ntrifluoracétylés, dans les brevets US no 3 590 028 et 3 803 124. Le second de ces brevets décrit également la préparation du 14-acétate de la N-trifluoracétyladriamycine (appelé 14-acétoxy-N-trifluor- acétyldaunomycine) mais il n'indique pas que ce composé possède une activité thérapeutique ou pharmacologique quelconque et il n'en suggère aucune utilisation, excepté pour la préparation de la Ntrifluoracétyladriamycine à partir de laquelle on peut préparer par voie chimique l'adriamycine. L'adriamycine diffère de la daunomycine en ce qu'elle comporte un groupe hydroxy en position 14 alors que la seconde porte, à la place, un atome d'hydrogène. La formule de la structure de l'adriamycine est la suivante: Nil, CH'uH Dans le brevet U.S. nO 4 035 566, on décrit des- 14-alcanoates de la N-trifluoracétyladriamycine dans lesquels le radical d'alcanoate est en C 2 - C 10, et également des compositions thérapeutiques qui contiennent ces composés; on indique que ces composés ont une activité anti-tumeur. Bien que la daunorubicine et l'adriamycine présentent de l'intérêt dans le traitement clinique d'un certain nombre de maladies néoplastiques, y compris des leucémies, des lymphomes et diverses tumeurs solides, spécialement des saroomes des tissus mous, leur utilisation est compromise par des effets secondaires de toxicité, spécialement une myélosuppression aiguë et une cardio- toxicité cumulative avec les doses, ces deux effets secondai- res limitant les doses. Le 14-valérate de N-trifluoracétyl_ adriamycine, l'un des composés décrits dans le brevet U.S. no 4 035 566, a fait l'objet d'études approfondies et on a trouvé qu'il était supérieur par ses propriétés thérapeuti- ques à l'adriamycine et à la daunomycine. En outre, il est en général moins toxique et en particulier nettement moins cardiotoxique que le médicament apparenté, aussi bien dans des essais cliniques sur animaux d'expérience que dans des essais cliniques sur des humains. Toutefois, ce composé est fortement 1pophile et par conséquent essentiellement insoluble dans l'eau. Pour l'utilisation clinique, le médicament doit être mis sous une forme convenant à l'administration intraveineuse dans un véhicule contenant un agent tensio-actifo La formula- tion couramment utilisée contient le composé en solution à une concentration finale de 0935 mg/ml dans un milieu à 0,5% d'Emulphor EL620 (huile de ricin polyéthoxylée), 0,5% d'éthanol et 99% de sérum physiologique. Ainsi, un patient dont la surface corporelle est de 1,0 m2 recevant une dose de 600 mg/m du médicament, à savoir la dose clinique administrée habituellement en 24 heures une fois tous les 21 jours, doit absorber cette dose dans environ 1,7 litre d'infusat. Ces volumes importants conduisent à administrer le médicament sous forme de perfusion continue pendant 24 heures. Certains patients, à la dose de 400 mg/m2 ont éprouvé, aux 2/3 environ de la perfusion, un syndrome de douleur dans la poitrine, apparemment d. au véhicule. L'administration d'un stéro!de (hémisuccinate d'hydrocortisone) a supprimé dans ces cas le complexe de sympt8mes, et la prophylaxie par les stéroldes a été introduite dans la pratique; cette procédure a permis de prévenir la symptomologie de douleur de poitrine avec toutes les administrations subséquentes de médicament. On a maintenant trouvé que le 14-0-hémiglutarate et le 14-0-hémiadipate de la N-trifluoracétyladriamycine présentaient une cytotoxicité ou une activité anti-tumeur supérieure à celle de l'adriamycine et pratiquement égale à celle du 14-valérate de la N-trifluoracétyladriamycine mais étaient nettement moins toxiques que l'adriamycine ou la daunomycine, en termes de propriétés pharmacologiques, pour les souris; d'autre part, ils présentent dans l'eau, au pH physiologique dans l'intervalle de 7,2 à 7,5, une solu,- bilité très supérieure à celle du 14-valérate de la Ntrifluoracétyladriamycine dans les mêmes conditions et ils sont solubles meme en l'absence d'agents dispersants et d'alcools. En outre, malgré une solubilité très supérieure dans l'eau, l'hémiglutarate et l'hémiadipate selon l'invention présentent une excellente résistance à l'hydrolyse et sont par conséquent suffisamment stables pour pouvoir 8tre utilisés sous la forme de solutions aqueuses soumises à des transports et à des stockages pendant des durées substantielles. Par suite, les composés selon l'invention peuvent être administrés dans le véhicule couramment utilisé en clinique pour le valérate correspondant mais à des concen- trations beaucoup plus fortes, de sorte qu'une simple dose individuelle de 10 à 20 ml peut remplacer la perfusion de 24 heures. Les composés selon l'invention peuvent être préparés par des modes opératoires analogues à ceux servant à la préparation des 14-alcanoates de N-trifluoracétyl- adriamycine, tels que décrits dans le brevet U.S. 4 035 566, en remplaçant en général le sel de sodium d'acide alcanoique par le sel monosodique de l'acide glutarique ou de l'acide adipique respectivement, et ils peuvent également 8tre préparés par d'autres procédés. Les compositions thérapeutiques selon l'invention contenant les composés définis ci-dessus en tant que substances actives peuvent 9tre préparées par dispersion ou dissolution de la substance active dans un véhicule non toxique quelconque acceptable pour l'usage pharmaceuti- que et convenant pour le mode d'administration prévu, qui peut être parentéral, c'est-à-dire par injection intra- veineuse, intramulculaire, intrapéritonéale, ou un autre mode d'administration classique. De préférence, le véhicule est un milieu aqueux tamponné à l'intervalle physiologique de 7,2 à 7,5. On peut utiliser des tampons classiques appropriés tels que le Tris, les phosphates, les bicarbonates ou les citrates. Si on le désire, on peut utiliser du sérum physiologique avec pH réglé et tamponné. On peut introduire des agents émulsionnants non-ioniques tels que l'huile de ricin polyéthoxylée, le mono-oléate de sorbitanne polyéthoxylé ou une autre substance analogue en quantités allant jusqu'à 10%i en poids, ainsi que de l'éthanol, pour améliorer la solubilité des composés selon l'invention, comme dans le cas de l'administration clinique du valérate, mais en général cela est inutile car les composés sont solubles en proportions d'environ 60 mg/ml dans l'eau tamponnée à pH 7,2-7,5 sans adjonction d'agents émulsionnants ni d'alcool. On a mis en évidence les propriétés de toxicité et l'efficacité thérapeutique des composés et substances actives selon l'invention dans des essais in vitro et in vivo sur des souris. Dans les essais in vitro, on a déter- miné l'activité inhibitrice des substances sur la croissance de la ligne de cellules CCRF-CEM en culture. La ligne de cellules a été obtenue à partir du sang périphérique d'un enfant souffrant de leucémie lymphoblastique comme décrit par Foley et collaborateurs, Cancer, volume 18, pages 522 et suivantes (1965), et les essais ont été réalisés selon le mode opératoire de Foley et Lazarus, Biochem. Pharmacol., volume 16, pages 659 et suivantes (1967), les résultats étant exprimés par la dose, en micromoles par litre, nécessaire pour inhiber de 50%Fo la croissance des cultures par rapport à des cultures témoins auxquelles on n'ajoute pas le médicament (DI50). Pour les essais in vivo, on a préparé une solution à une concentration de 0,2 à 0,7% en poids de l'agent actif dans un milieu consistant en 10% en volume d'huile de ricin polyéthoxylée et 10% en volume d'éthanol dans du sérum physiologique et on a administré la dose voulue par injection intrapéritonéale. On a apprécié l'activité antitumeur sur les leucémies murine P 388 et murine L 1.210 des souris mâles BDF1 selon les modes opératoires normalisés du National Cancer Institute, tels que décrits par Geran et collaborateurs, Cancer Chemotherap. Rep. troisième partie, volume 3, pages 1 et -6 suivantes (1972), sauf que, pour conserver les produits, on a observé un programme qd 1-4 au lieu d'un programme qd 1-9. On a déterminé la dose optimale en utilisant dans les essais des doses représentant plusieurs multiples de ng/mg de poids corporel. Selon le composé particulier utilisé, on a pu observer une certaine efficacité à des dosages allant de 30 à 70 mg/kg de poids corporel. Les exemples suivants illustrent l'invention sans toutefois la limiter; dans ces exemples, les indications de parties et de % s'entendent en poids sauf mention contraire. Exemple 1 14-0-hémiglutarate de la N-trifluoracétyladriamycine. Mode opératoire 1: acétone au reflux. On introduit un mélange de 200 mg, 0,26 millimoles, de 14-iodo-N-trifluor- acétyldaunomycine et 1,2 g de sel monosodique de l'acide glutarique dans 3 ml d'eau puis on dilue par 350 ml d'acétone. On chauffe le mélange de réaction au reflux pendant 10 heures. Après refroidissement, on filtre le mélange de réaction et on lave le gàteau de filtration avec de l'acétone chaude jusqu'à ce que les lavages ne soient plus colorés. On évapore le filtrat et les lavages combinés à sec sous vide et on redissout le résidu dans 200 ml de chloroforme. On lave la solution chloroformique à trois reprises avec des portions de 150 ml d'eau, on sèche sur sulfate de sodium anhydre, on filtre et on évapore jusqu'à volume d'environ 2 à 3 ml. On chromatographie ce concentré sur une colonne d'acide silicique en utilisant le chloroforme puis du chloroforme à 0,5% de méthanol comme éluants. On triture une solution chloroformique concentrée du produit élue avec l'éther de pétrole; on obtient 152 mg (rendement: 76%) de produit fondant à 141-144 C (déc.); -a-7D + 228 (c = 0,046, CH30H); UV/VIS A maOH nm () 233 (29.700), 240 (24.800), 277 (9.900), 478 (8.540), 495 (8.350), 531 (4.270); IR (KBr) cm1 5450 large (0H,HO_9-), 1715, 1705, 1620, 1580 (C = 0 et quinone)o Analyse élémentaire C4344F3N015 calculé: 0 54,20; H 4,56; F 7,56;N 1,86 trouvé: C 54,06; H 4,65; F 7,37 N 1,86 On obtient également ce produit avec un rendement de 60% en partant de la 14bromo-N-triflauoracétyldaunomycine à la place du dérivé iodé. tyeey o On chauffe au Mode opératoire 2: dans l!'thyl'ne-eLycol. On chauffe au bain d'huile à 65-70 0C un mélange de 100 mg du sel mono- sodique de l'acide glutarique et 10 ml d'éthylène-glycol. A ce mélange, on ajoute 50 mg, 0,066 millimole, de 14-iodo-Ntrifluoracétyldaunomycine et on maintient la solution sous agitation vigoureuse à 65-700C pendant 1 heure. On verse le mélange de réaction dans l'eau glacée et on extrait le produit par le chloroforme (3 x 50 ml). On lave la solution chloroformique à l'eau (3 x 100 ml), on sèche sur sulfate de sodium anhydre pendant 2 heures et on concentre à petit volume sous vide. L'addition -d'éther de pétrole provoque la précipitation d'une substance solide rouge qu'on sépare par filtration, qu'on lave à l'éther de pétrole et qu'on sèche. Le produit (45 mg, rendement: 90%o) est purifié par cristallisation dans le mélange chloroforme-éther éthylique- éther de pétrole; on obtient une substance identique par toutes les propriétés spectrales et chromatographiques à celle obtenue par le- mode opératoire 1 ci-dessus. Mode opératoire 3: dans le diméth lformamide. (DMF) o On dissout 40 mg du sel monosodique de l'acide glutarique dans 10 ml de DMF en chauffant 10 mn à 12000C On refroidit la solution à 70 0 et on ajoute sous agitation 25 mg, O,033 millimole, de 14-iodo-N-trifluoracétyldaunomycine. On maintient le mélange de réaction à 65-700 pendant 1 heure, on refroidit et on élimine le DMF sous vide. L'isolement et la purification effectués comme dans le mode opératoire 2 ci-dessus donnent 23 mg de l'hémiglutarate recherché (rendement: 92 %). EXEMPLE 2 14-0-hémiadipate de la N-trifluoracétyladriamycine. Mode opératoire 1: dans l'acétone au reflux. On introduit un mélange de 150 mg, 0,2 millimole, de 14-iodo-N-trifluor- acétyldaunomycine et 1,0 g de sel monosodique de l'acide adipique dans 300 ml d'acétone contenant 2 ml d'eau. On chauffe le mélange de réaction au reflux pendant 12 heures. En terminant comme pour l'hémiglutarate, mode opératoire 1, on obtient 133 mg (rendement: 85 %) d'une substance solide rouge fondant à 135-1400 (déc. ); -_7 + 201 (c = 0,016, CH30H); IR (EBr) cm 3460 large I (OH, HO-C-), 1720, 1710, 1680, 1650, (0=0 et quinone); CHLoH m na (i) 223 (33,200), 241 (23.800), 276 (9.020) 478 (9.780), 497 (9.590), 532 (4.990). Analyse élémentaire: 035H36F3N015 Calculé: O 54,76; H 4,72; F 7,46; N 1, 82 Trouvé: 0 54,59; H 4,49; F 7,22; N 1,77 Lorsqu'on remplace le produit de départ iodé par la 14-bromo-N-trifluoracétyl-daunomycine, on obtient l'hémiadipate avec un rendement de 64 %. Mode opératoire 2: dans l'éthvlène-glycol. Le traitement de 100 mg de sel monosodique de l'acide adipique et 40 mg, 0,053 millimole, de 14-iodo-Ntrifluoracétyldaunomycine dans 15 ml d'éthylène-glycol dans les conditions de réaction et d'isolement décrites pour l'hémiglutarate, mode opératoire 2, donne 38 mg (rendement: 93 %) d'hémiadipate identique au produit obtenu par le mode opératoire 1 ci-dessus par toutes ses caractéristiques chimiques et physiques. Mode opératoire 3: dans le diméthylformamide. La réaction de 200 mg de sel monosodique de l'acide adipique et 200 mg, 0,26 millimole, de 14-iodoN-trifluoracétyldaunomycine edans le DMF comme décrit pour l'hémiglutarate, mode opératoire 3, donne 182 mg de l'hémiadipate recherché (rendement: 89 %). La solubilité dans l'eau (tamponnée à pH 7,40 par du phosphate de potassium monobasique et de l'hydroxyde de sodium certifiés Fisher) du 140-hémiglutarate de la N-trifluoracétyladriamycine est de 65 mg/ml à 220C; celle de l'hémiadipate est de 60 mg/ml alors que celle du valérate représente quelques microgrammes. On a déterminé la stabilité de l'hémiglutarate et de l'hémiadipate en dissolvant des quantités connues de chacun d'eux dans des tampons aqueux à des pH déterminés. On a conservé des échantillons de chaque solution pendant 24 heures à l'obscurité à 40C et 270C respectivement puis on a appliqué sur des plaques de gel de silice G pour chromatographie sur couche mince, sur support de verre (couche de 250 microns d'épaisseur) et on a développé les plaques dans un mélange solvant chloroforme/méthanol, 95:5 en volume en observant les taches par fluorescence à la lumière de 350 nm de longueur d'onde. On a déterminé la quantité du produit d'hydrolyse, la N- trifluoracétyladriamycine (Rf: 0,58) par comparaison avec un échantillon authentique dans un essai simultané. Les résultats obtenus sont les suivants: Tableau I % hydrolysé Rf 40C 270C 14-0-hémiglutarate pH 7,40 0, 26 0 1 pH 9,00 ' 0,5 3 14-0-hémiadipate pH 7,40 0,31 0 0,5 de N-trifluor- pH 8,00 0,3 1 acétyladriamycine pH 9,00 0,5 On trouvera dans le tableau ci-après les activités inhibitrices des composés selon l'invention et d'autres substances sur les cellules CCRF-CEM dans des essais in vitro effectués comme décrit ci-dessus. Tableau II Composé DI50, micromoles adriamycine 0,05 14-valérate, 0,24 hémiglutarate, 0,28 hémiadipate, 0,31 de la N-trifluoracétyladriamycine. On trouvera dans le tableau ci-après l'activité anti-tumeur in vivo des composés du tableau I sur la leucémie murine P 388,. évaluée comme décrit ci-dessus. Tous les composés ont été administrés par voie intra- péritonéale, l' adriamycine à l'état de formulation clinique (une partie d'adriamycine plus 5 parties de lactose dans du sérum physiologique à 0, 9%), les autres composés dans un milieu à 10%o d'Emulphor EL-620, 10% d'éthanol et 80% de sérum physiologique. (voir tableau III page suivante) mg/kg de poids corporel pour chaqoe dose Tableau III r Durée de survie-- Jour moyen de décès (intervalle) Nombre de survivants le 30èie le 60ème lour 'jour témoins non traités adriamycine 14-valérate 14-hémigluta- rate 14-hémiadipa- te - 11,0 (10-14) 1,0O 2,0 3,0 4,0 ,0 ,0 ,0 ,0 ,0 ,0 ,0 ,0 ,0 ,0 ,0 ,0 ,0 ,0 ,0 ,0 21,0O 31, 0 18,0 9,0 42,0 ,0 ,0 ,0 23,0 ,0 (18-27), (20-32) (23-36) ( 7-28) ( 7-27) (21-42) (21-26) (30,71) (24-95) ( 9-90) (20-35) (20-35) (20-42) (20,29) (25-36) 0/22 -19 (25) (23,45) (24,93) (61-77) 0/7 2/7 4/7 0/7 0/7 /7 4/7 6/7 /7 /7 2/7 2/7 3/7 /7 /7 6/7 6/7 6/7 7/7 de N-trifluoroacétyladriamycine. + Augmentation % de la durée de survie comparativement aux témoins non traitéso Composé 1/7 2/7 3/7 4/7 6/7 /7 /7 o/7 1/7 2/7 4/7 4/7 6/7 /7 6/7 7/7 ADV % + Par ailleurs, des essais effectués avec le 14-hémiadipate de la Ntrifluoracétyladriamycine ont mis en évidence une haute efficacité dans le prolongement de la durée de survie des souris souffrant de leucémie L 1.210, comme le montrent les résultats rapportés dans le tableau ci-après. Tous les composés ont été administrés par voie intrapéritonéale; dans les essais 1 et 2, les composés ont été administrés dans le milieu à 10% d'Emulphor EL-620, 10% d'éthanol et 80%o de sérum isotonique. Dans l'essai 3, le composé a été administré dans un tampon aqueux contenant du phosphate de potassium monobasique et de l'hydroxyde de sodium (0,05 M), pH 7,40: Tableau IV composé Dose optimale Durée de 2) Nombre de Compose mg/kg/j x 4') survie DV % survivants moyenne, le 50ème jours jour témoins non traités 9,0 0/15(3) (1) 50,0 >456 5/7 14-valérate 60,0 > 456 6/7 (2) 50,0.> 456 7/7 14-hémiadipate 60,0 456 6/7 de N-trifluor- acétyladriamycine (3) idem 50,0 Ä 456 5/7 60,0 > 456 7/7 1) Traitement intrapéritonéal une fois par jour les jours 1, 2, 3 et 4 2) Augmentation moyenne % de la durée de survie cpomparati- vement aux témoins non traités, calculée au 50eme jour 3) Tous les animaux meurent entre le jour 8 et le jour 11. REVENDICATIONS 1. Nouveaux dérivés de la N-trifluoracétyladri- amycine caractérisés en ce qu'il s'agit du 14-0-hémiglutarate et du 14-0-hémiadipate de la N-trifluoracétyladriamycine. 2. Médicament présentant notamment une activité anti-tumeur sur les leucémies murine P 388 et murine L 1.210 des souris, caractérisé en ce qu'il comprend une quantité efficace d'un composé selon la revendication 1 et un véhicule non toxique acceptable pour l'usage pharmaceutique. 3. Médicament selon la revendication 2, caractérisé en ce que le véhicule est l'eau tamponnée à pH 7,2-7,5. 4. Procédé de préparation des composés selon la revendication 1, caractérisé en ce que l'on fait réagir le dérivé mono-iodé ou mono-bromé en position 14 de la N-trifluoracétyldaunomycine avec le sel monosodique de l'acide glutarique ou de l'acide adipique respectivement. 5. procédé selon la revendication 4, caractérisé en ce que la réaction est effectuée dans l'acétone au reflux, dans l'éthylène-glycol ou dans le diméthylformamide.