FR 2485564 A1 19811231 FR 8112332 A 19810623 La présente invention concerne un procédé pour produire de la L-carnitine et, plus particulièrement, un procédé pour produire par voie enzymatique de la L-carnitine par réaction de la y-butyro- bétaYne'avec une enzyme de type hydroxylase. Comme on le sait, la carnitine (acide 9-hydroxy y-triméthylaminobutyrique) comporte un centre d'asymétrie et il existe donc deux stéréo-isomères, la forme D et la forme L, de la carnitine. La L-carnitine est normalement présente dans l'orga- nisme o elle joue le rôle d'un transporteur des acides gras libres activés a chatne longue a travers la membrane des mitochondries. Comme la membrane des mitochondries est imperméable aux dérivés d'acylCoA, les acides gras libres à chaîne longue ne peuvent pénétrer qu'après estérification avec la L-carnitine. La L-carnitine exerce son rôle de transporteur à la fois dans le transport des acides gras actives a cha5ne longue des sites de leur biosynthèse, par exemple les microsomes, aux mitochondries o ils sont oxydés et dans le transport de l'acêtyl-CoA à partir des-mitochondries, o ils se forment, aux sites extramitochondriaux o la synthèse des acides gras à chaîne longue se produit, par exemple dans les micro- somes o l'acétyl-CoA peut être utilisé pour la synthèse du choles- térol et des acides gras. Bien que l'isomère lévogyre (L-carnitine) constitue exclusivement la forme biologique (et,en pratique*, ce jour, la D-carnitine n'a jamais été détectée dans les tissus des mammifères), on a utilisé le racémate, la DLcarnitine, depuis de nombreuses années dans différentes indications. Par exemple, la DL-carnitine est vendue en Europe' comme stimulateur de l'appétit et on a signale que ce composé a un effet sur la vitesse de croissance des enfants; voir, par exemple, Borniche et Col., Clinic Chemica Acta, 5, 171-176, 1960, et Alexander et col., "Protides in the Biological Fluids", 6e colloque, Bruges, 1958, 306-310. Le brevet des Etats-Unis d'Amérique n 3 830 931 décrit des améliorations de la contracti- lité du myocarde et du rythme systolique dans l'insuffisance cardiaque que l'on peut souvent obtenir par administration de la DL-carnitine. Le brevet des Etats-Unis d'Amérique n 3 810 994 décrit l'emploi de la DL-carnitine dans le traitement de l'obésite. Cependant, récemment, on s'est de plus en plus intéressé à l'emploi exclusif de l'isomère lévogyre de la carnitine au moins dans certaines applications thérapeutiques. On a en pratique montré que la D-carnitine est un inhibiteur compétitif des enzymes lies à la carnitine tels que la carnitine-acétyltransférase (CAT) et la carnitine-palmityltransférase (PTC). De plus, des faits récents suggèrent que la D-carnitine peut abaisser la teneur en L-carnitine du tissu cardiaque. Par conséquent, il est essentiel d'administrer exclusivement la L-carnitine aux malades soumis à un traitement médical pour des affections cardiaques ou pour abaisser la lipidémie. On a proposé divers procédés pour produire la carnitine à l'échelle industrielle. La synthèse chimique de la carnitine conduit cependant inévitablement à un mélange racémique des isomères D et L. Par conséquent, on doit avoir recours à des procédes de dé- doublement pour obtenir les antipodes optiques sépares à partir du racemate. Un procédé typique de dédoublement dans lequel on utilise le chlorhydrate de DL-carnitinamide comme composé de départ pour le dédoublement est décrit dans le brevet belge n0 660 039. Ce procédé comprend l'emploi de l'acide D-camphorique pour produire le Dcamphorate de DL-carnitinamide. On soumet une solution alcoolique de ce composé à une cristallisation fractionnée pour obtenir l'iso- mère L comme première fraction que l'on précipite à partir de la solution. Pour former le D-camphorate de DL-carnitinamide, il est tout d'abord nécessaire de former le sel d'ammonium de l'acide D-camphorique avec de l'ammoniac; on transforme ensuite le D-cam- phorate d'ammonium ainsi formé en le D-camphorate d'argent par action du nitrate d'argent. Comme le carnitinamide est sous forme du chlorhydrate, la formation de ce sel d'argent est essentielle pour éliminer l'ion chlore. Ce procédé est donc très coûteux (car il est obligatoire d'utiliser le composé d'argent) et difficile à mettre en pratique industrielle, car on doit effectuer les divers stades à l'abri de la lumière pour éviter un noircissement important des récipients de réaction par suite de la quantité impor- tante de chlorure d'argent formé. De plus, le D-camphorate de DL- carnitinamide peut être souille par la présence des ions argent. De plus, après la cristallisation du D-camphorate de L-carnitinamide à partir de la solution alcoolique, des stades ultérieures sont nécessaires pour le transformer finalement en L-carnitine. Plus récemment, la demande de brevet français no 77 22 183 décrit un procéde enzymatique selon lequel on synthétise exclusive- ment la L-carnitine par réduction asymétrique de la déhydrocarnitine, (CH3)3N ±CH2-C-CH2-COO0, avec la carnitinedéshydrogénase, un co- O enzyme pouvant être utilisé pour la réduction par la déshydrogénase tel que le nicotinamide-adénine-dinucléotide réduit (NADH) et un agent chimique ou enzymatique convenant à la réduction de la forme oxydee du NAD en sa forme réduite NADH. On isole la carnitine- déshydrogénase d'une bactérie du genre Pseudomonas. Ce procéde ainsi que d'autres,qui visent à produire des composés pharmaceutiques, reposent sur l'emploi de bactéries et comportent divers inconvénients. 1. On doit purifier soigneusement le système enzymatique, ce qui implique des opérations malaisées de purification et des coûts élevés, en particulier lorsqu'on opère à l'échelle industrielle. 2. La L-carnitine produite nécessite une purification poussée pour la séparer des métabolites bactériens et des conta- minants qui sont susceptibles d'être toxiques et dangereux pour la santé. De plus, le NADH (qui est un compose réagissant coûteux) ne stimule pas la réaction lorsqu'on utilise des bactéries intactes car il ne pénètre pas à travers la paroi des cellules bactériennes. L'invention concerne un procédé pour la production enzymatique exclusive de L-carnitine ne reposant pas sur l'emploi de bactéries comme source du système enzymatique utilise dans le procéde. L'invention repose sur la découverte que les spores de Neurospdra crassa possèdent une enzyme de type hydrolase qui, lorsqu'elle est mise en contact avec la ybutyrobétaine dans un solvant donneur de radical hydroxy, en présence d'oxo-2 glutarate de sodium, d'ions ferreux et d'un agent réducteur, transforme sélectivement la T-butyrobêtaine exclusivement en L-carnitine pratiquement pure. La y-butyrobétaine (CH3)N-CH2-CH2-CH2-COOH est un composé connu que l'on peut facilement préparer par synthèse chimique. Par exemple, un procédé de production de la y-butyro- betaine est décrit dans Can. J. Chem. 54 (1976) 3310-3311. On sait que l'hydroxylation de la y-butyrobêtaTne en L-carnitine se produit dans les organismes vivants. En pratique, les recherches des dernières années ont montré de façon certaine que la voie de biosynthèse de la carnitine est la suivante: N, l H3N -CH2-CH2-CH2-CH2-CH-COQ (liée à une protéine) 3 2 2 2 S-adénosylmethionine lysine-méthyltransférase NH + y 3 - 6 (CH3)3N CH2 CH2 -CH2-CH2 C CO -triméthyl-lysine 11+ +,3 (CH N -CH -CH -CH -CH-CH-COQ hydroxy-3 triméthyl-lysine (CH3)3N CH2C 2 2 OH (CH3) N-CH -CH -CH -COO triméthylamino-4 butyrate (y-butyrobétaine) (CH) H±CH -CH-CH -COO carnitine 33 2carnitine OH L'hydroxylation de la ybutyrobétaIne en L-carnitine par une fraction protéique soluble partiellement purifiee,isolée du foie de rat, a également été décrite. Voir Biochemistry, vol. 6, n 5, mai 1967, 1271-1282. Cependant, on n'avait jamais précédemment indique qu'une enzyme de type ybutyrobétaIne-hydroxylase soit présente dans les spores de Neurospora crassa et que cette enzyme de type hydroxylase puisse être libérée (de façon à pouvoir être dispo- nible pour la conversion de la y-butyrobetaTne) par un traitement desspores qui induit une modification de leur structure. Le procédé de production de L-carnitine selon l'inven- tion repose sur la réaction de la y-butyrobétaine avec une enzyme de type hydroxylase et il est caractérisé en ce qu'il comprend un stade qui consiste à mettre en contact, avec une phase comprenant les produits libérés par les spores de la moisissure Neurospora crassa, une solution dans un solvant donneur de radical hydroxy, de (a) y-butyrobétaIne, (b) oxo-2 glutarate de sodium, (c) un agent réducteur et (d) une source d'ions ferreux comme catalyseur d'hydroxy- lation. On obtient la phase contenant des produits libérés par les spores soit par traitement chimico-physique des spores avec un détergent,soit par traitement mécanique des spores, par exemple avec un désintégrateur à ultrasons. De préférence, pour optimiser le rendement en L-carni- tine, la solution contient également (e) de la catalase. Solvant Le solvant, dans lequel on dissout la y-butyrobétaEne, l'oxo-2 glutarate de sodium, l'agent réducteur et le catalyseur d'hydroxylation, est choisi parmi l'eau, les solutions tampons, les alcanols inférieurs ayant 1 à 4 atomes de carbone et leurs melanges. Le solvant preféré est une solution de tampon phosphate de potassium à pH 7. Agent réducteur L'agent réducteur que l'on utilise dans le procédé de l'invention est un réducteur quelconque convenant à la réduction des ions ferriques (Fe3+) en ions ferreux (Fe 2+). Ces derniers agissent comme le catalyseur de la réaction d'hydroxylation de la y-butyrobetaïne par l'enzyme de type hydroxylase contenu dans les spores de Neurospora crassa. Par conséquent, tout ion ferrique susceptible de se former est rapidement ramené à l'etat d'oxyda- tion +2. On peut citer comme exemples non limitatifs d'agents réducteurs appropries les dithionites de métaux alcalins, l'acide ascorbique et ses sels de métaux alcalins. Source d'ions ferreux Comme source d'ions ferreux, on peut utiliser tout sel ferreux soluble dans l'eau dont l'anion n'inactive pas l'acti- vité de l'enzyme de type hydroxylase. Des ions ferreux appropriés sont FeSO4, (NH4)2Fe(S04)2 et Fe(SCN)2, parmi lesquels on préfère FeSO4. Spores Bien que l'on puisse utiliser de façon avantageuse dans le procédé de l'invention les spores d'une couche quelconque de Neurospora crassa, les souches ATCC 9279, ATCC 13 837, ATCC 15514 et ATCC 24924 se sont révélees particulièrement préférables. Les procédés de culture, d'isolement et de purifica- tion des spores de Neurospora crassa sont du domaine de la compé- tence normale d'une personne ayant l'habitude des techniques myco- logiques. Cependant, un procédé préfére est celui décrit par M. Cortat et coll. dans "Conidiation of Neurospora Crassa in Submerged Culture without Mycelial Phase", Arch. Microbiol. 95, 305-309 (1974). Oh peut conserver indéfiniment des spores ainsi cul- tivées et isolées sans aucune perte ni diminution pratiques de leur activité enzymatique. Traitement des spores On traite les spores soit avec un détergent tel que le TRITON X-100, soit avec des dispositifs mécaniques, en particulier des désintégrateurs à ultrasons. Ces traitements libèrent l'enzyme d'hydroxylation et fournissent une phase contenant l'enzyme d'hydroxylation qui peut ou non contenir le reste des spores traitées et qu'on utilise dans le procédé de l'invention. Mesure de l'activité y-butyrobêtaine-hydroxylasique On mesure l'activité butyrobétaine-hydroxylasique dans un récipient réactionnel contenant une quantité de la phase comprenant les produits de modification des spores, suffisante pour qu'on obtienne une concentration enzymatique d'environ 530 pmol/ml, 2-14 mM en y-butyrobétaYne, 0,6-2 mM n.(NH4)2Fe(S04)2 -14 mM en ascorbate de sodium, 1,4-3 mM en oxo-2 glutarate de sodium, et contenant 1-1,4 g/l de catalase dans du tampon phos- phate de potassium (14 mM) à pH 7. Après 30 à 60 min d'incubation à 37 C, on filtre le mélange réactionnel sur des filtres MILLIPORE ayant des pores de 0,7 p m pour éliminer les spores et on dose la L-carnitine dans le filtrat selon la méthode de David J. Pearson et col., "Methods of Enzymatic Analysis", volume 4 (2e édition), 1974, page 1758, Academic Press, Inc. On évalue l'échantillon examiné relativement à un témoin contenant les mimes composants à l'exception de la Ty-butyro- bêtaIne. Pour séparer toute y-butyrobêtaine n'ayant pas réagi de la Lcarnitine, on préfère le procéde decrit par GUran Lindstedt dans Biochemistry, vol. 6, n 5, mai 1967, pages 1271-1282. Il ressort de la description précédente que le procédé enzymatique de l'invention présente de nombreux avantages par rap- port aux procédes de l'art antérieur.. Certains de ces avantages figurent ci-après. (1) Par rapport aux procédes chimiques de l'art anté- rieur (quicomme précédemment indiqué, produisent tous des mélanges racémiques de D et de L-carnitine), le procéde de l'inven- tion présente l'avantage de produire exclusivement de la L-carni- tine pratiquement pure avec un rendement élevé (environ 80 %). On évite ainsi totalement le dédoublement du racémate en la forme lévogyre et la forme dextrogyre et la transformation ultérieure de cette dernière forme en DL-carnitine que l'on doit à nouveau soumettre à un dédoublement. (2) Par rapport au procéde enzymatique de l'art anté- rieur utilisant des bactéries comme source de l'enzyme employée dans le procéde, le procédé de l'invention présente l'avantage de ne pas nécessiter d'opérations de purification malaisées et coûteuses de l'enzyme à utiliser ou de la L-carnitine produite. Il n'est même pas nécessaire d'isoler l'enzyme de type hydroxylase de la prépa- ration de spores que l'on peut utiliser sans danger telle quelle et on récupère la L-carnitine produite sous une forme cristallisée pratiquement pure. Au contraire, dans les procédés enzymatiques utilisant des bactéries, il est nécessaire d'effectuer des purifi- 8. cations poussées de l'enzyme et surtout de la L-carnitine pour éviter une contamination par les bactéries et les métabolites bactériens. (3) On peut préparer les spores de Neurospora crassa en grande quantité et les conserver sous une forme sèche. On peut les utiliser à la demande pratiquement sans perte de l'activité enzymatique. Bien entendu, diverses modifications peuvent être apportées par l'homme de l'art aux dispositifs ou procédés qui viennent d'être décrits uniquement à titre d'exemples non limi- tatifs sans sortir du cadre de l'invention, 24'85564 REVE N D I C A T IONS ___________________________ 1. Procédé pour produire de la L-carnitine par réaction de la y-butyrobétaine avec une enzyme de type hydroxylase>.caracté- risé en ce qu'il consiste à mettre en contact avec une phase compre- nant des produits libérés des spores de la moisissure Neurospora crassa, une solution dans un solvant donneur de radical hydroxy de a) ybutyrobétaine, b) oxo-2 glutarate de sodium, c) un agent réducteur et d) une source d'ions ferreux comme catalyseur d'hydroxy- lation. 2. Procédé selon la revendication 1, caractérise en ce que ladite solution comprend également (e) de la catalase. 3. Procédé selon la revendication 1, caractérise en ce qu'on choisit le solvant parmi l'eau, les solutions tarmpons, les alcanols inférieurs ayant 1 à 4 atomes de carbone et leurs mélanges. 4. Procédé selon la revendication 1, caractérise en ce qu'on choisit l'agent réducteur parmi un dithionite de métal alca- lin> l'acide ascorbique et ses sels de métaux alcalins. 5. Procéde selon la revendication 1., caractérise en ce qu'on choisit la source d'ions ferreux parmi PeS04, (NH4)2Fe(S04)2 et Fe(SCN)2. 6. Procéde selon la revendication 1, caractérise en ce qu'on choisit comme source de Neurospora crassa les souches ATCC 13 837, ATCC 24914, ATCC 9279 et ATCC 15514. 7. Procéde selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'on obtient la phase contenant les produits libérés par les spores par traitement des spores avec un détergent. 8. Procéde selon la revendication 7, caractérisé en ce que le détergent est le TRITON X-100. 9. Procédé selon la revendication 1, caracterisé en ce qu'on obtient la phase contenant les produits libérés par les spores par traitement mécanique des spores avec un désintegra- teur à ultrasons.