FR 2482112 A1 19811113 FR 8010382 A 19800509 La présente invention a pour objet de nouveaux copolymères hydrophiles à base de N- [tris (hydroxyméthyl) méthyl acrylamide, utilisables sous forme de gels aqueux dans les techniques de séparation par échange d'ions des substances naturelles ou synthétiques. L'invention concerne également les procédés de préparation desdits copolymères. Il est déjà connu (cf. Tetrahedron Letters nO 6, 1975, p. 357-358; brevet français 2 378 808) des copolymnères hydrophiles de N-Etris (hydroxyméthyl) méthyl3acrylamide et d'un monomère, hydroxyl6 ou non, possédant plusieurs doubles liaisons éthyléniques polym6risables (agent réticulant). Ces copolymères sont utilisables, sous forme de gels aqueux, comme supports pour la chromatographie par perméation de gel et dans les techniques d'immobilisation des substances naturelles. Il est également connu (cf. brevet français 2 260 597) de convertir des gels de polymères hydrophiles non ioniques du type poly(hydroxyacrylate) ou poly(hydroxy- méthacrylate) en échangeurs anioniquespar remplacement d'une partie des radicaux hydroxyle desdits polymères par des radi- caux portant un groupe fonctionnel cationique, ledit remplace- ment étant effectué en faisant réagir sur les gels de polymères hydrophiles un-composé porteur d'un groupe réactif vis-à-vis des radicaux hydroxyle et d'un groupe fonctionnel cationique. Les copolyméres hydrophiles selon l'invention sont des copolymères statistiques réticulés tridimensionnels, insolubles dans l'eau, contenant sous forme copolymérisée: a) 25 % à 98 % en poids de N- tris (hydroxyméthyl)méthyl] acrylamide ou de N-[tris(hydroxyméthyl)méthyl] m6thacryl- amide, ou d'un mélange de ces deux composés, b) 2 % à 50 % en poids d'un ou plusieurs monomères possédant plusieurs doubles liaisons éthyléniques polymérisables et exempts de groupes fonctionnels anioniques ou catio- niques, c) 0,1% à. 50 % en poids d'un ou plusieurs monomères possédant une double liaison éthylénique polymérisable et un ou plusieurs groupes fonctionnels anioniques ou cationiques choisis parmi les groupes amino monosubstitué, amino disubstitué, pyrimidinyle, guanidyle et purinyle, salifiés ou non, les groupes ammonium quaternaire, et les groupes SO3H et SO3M, M désignant un métal alcalin. Les copolymères selon l'invention contiennent de préférence 0,2 % à 15 % en poids de monomères c). Comme monomères b) (monomères réticulants) on peut citer en particulier les diesters des glycols avec les acides acrylique et méthacrylique, par exemple le diacrylate d'éthy- lèneglycol et le diméthacrylate d'éthylèneglycol, les alkyli- dène-bis-acrylamides ou -méthacrylamides, et les composés de formule: (I) H2C C- (CH2) C - N - (CHX)m - N - C - (CH2)- C = CH 2- (C2)n II il 2II1 R 0 R' R' O R ou (II) H2C = C -(CH2)n - N - C (CHX)m- C -N - (CH2n - C = CH2 1 - 1 il il 1 1 R R' 0 O R' R dans lesquelles R est un atome d'hydrogène ou un groupe mé- thyle, R' est un atome d'hydrogène ou un groupe hydroxyméthyle, X est un atome d'hydrogène ou un groupe OH, n et m sont des nombres entiers de O à 6. Dans les copolymères selon l'invention, les mono- mères b) répondent de préférence à l'une des formules (I) et (II) cidessus. Comme exemples de tels monomères b) on peut citer en particulier le N,N'-méthylène-bis-acrylamide, le N,N' -éthylène-bis-méthacrylamide, 1 'hexaméthylène-bis-acryl- amide, le N,N'-diallyl-tartradiamide, le glyoxal-bis-acryla- mide (ou N,N'-dihydroxyéthylène-bis-acrylamide) et le N,N'- méthylène-bis-hydroxyméthylacrylamide. Comme monomères c) on peut citer en particulier les composés de formule * CH2 = - X1 - (CH2)p - (Z)q - (cH2)p - (Z)q - Y (III) R1 dans laquelle R1 est un atome d'hydrogène, un groupe alkyle ayant 1 à 4 atomes de carbone, en particulier un groupe méthyle, un groupe S 03H ou un groupe S03M, M désignant un métal alcalin, X1 est une liaison simple, un atome d'oxygène ou un groupe -CH2-, -C-O-, - So-, -So2ou p-phénylène, p,p', II o q et q' sont des nombres entiers de O à 4, Z et Z' sont des atomes d'oxygène ou de soufre ou des groupes -NH- C-, -C-NH-, O O Wl II -C-, -C-O-, -C-S-, -SO-, -S02-, -CH=N-, NHS02-, -CHOH-, O O R -C-C- ou - groupe SO3H ou un groupe S03M, M étant un métal alcalin. Comme exemples de groupes amino monosubstitués ou disubstitués, non salifiés ou salifiés, représentés par Y on peut mentionner en particulier les groupes de formules: _ NH -N R R3 R3 N Pl N-/H A O - N -, A( R3 H - N-R3 A R4 dans lesquelles R3 et R sont des groupes alkyle ayant 1 à 3 atomes-de carbone et A est l'anion chlorure, bromure ou iodure. Comme exemples de groupes ammonium quaternaire représentés par Y on peut mentionner en particulier les groupes de formule: )/ R3 - N -R4, A R5 dans laquelle R3, R4 et R5 sont des groupes alkyle ayant 1 à 3 atomes de carbone et AG est l'anion chlorure, bromure ou iodure. Comme exemples de composés de formule (III) on peut citer, sans que cette énumération ait un caractère limitatif, les composés suivants: - l'acide vinylsulfonique et ses sels alcalins - les méthacrylate et acrylate de diéthylaminoéthyle et leurs chlorhydrates - les méthacrylate et acrylate de diméthylaminoéthyle et leurs chlorhydrates - les N-(diéthylaminoéthyl) acrylamide et N-(diméthylamino- propyl) acrylamide et leurs chlorhydrates - le chlorure de (m'thacrylamido-3) propyltriméthylammonium - le chlorure de (méthacryloyloxy-3) propyltriméthyl- ammonium. Les copolymères hydrophiles réticulés selon l'in- vention peuvent être préparés, selon des procédés connus, par polymérisation radicalaire des monomères a), b) et c). La polymérisation peut en particulier être effectuée en solution aqueuse, à une température de 0 C à 100 C, de préférence 40 C à 60 C, et en présence des initiateurs habituellement utilisés en polymérisation radicalaire. Comme tels on peut citer, par exemple, les systèmes red-ox comme N,N,N,'N'-tétraméthyl éthylènediamine (TEMED) + persulfate alcalin ou diméthyl- aminopropionitrile + persulfate alcalin, les peroxydes orga- niques comme le peroxyde de benzoyle, et l'azo-2,2'-bis- isobutyronitrile. La concentration totale en monomères Ec'est- à-dire la concentration en monomères a) + b) + c)] des solu- tions aqueuses soumises à la polymérisation est le plus sou- vent comprise entre 20 g/l et 400 g/l. La polymérisation peut être une polymérisation en bloc ou en émulsion. Dans le cas de la polymérisation en bloc, la solution aqueuse contenant les divers monomères et l'ini- tiateur est soumise à une polymérisation en phase homogène. Le bloc de gel aqueux obtenu est ensuite fractionné en grains, par exemple par passage à travers les mailles d'un tamis. La polymérisation en émulsion, qui est le mode de préparation préféré car elle fournit directement le gel aqueux sous forme de granules sphériques de taille déterminée, peut être effectuée comme suit: La solution aqueuse contenant les divers monomères est versée lentement dans une phase liquide organique, non miscible à l'eau, maintenue en agitation et contenant éven- tuellement un agent émulsifiant. La vitesse d'agitation est réglée de façon à obtenir une émulsion de la phase aqueuse dans la phase organique ayant la taille de gouttelettes voulue. Le contr8le de cette taille, donc le réglage de l'agi- tation, est effectué par examen au microscope de prélèvements faits sur l'émulsion. Une fois réglée la vitesse d'agitation, on introduit dans l'émulsion l'initiateur, qui déclenche la polymérisation. Cette dernière est poursuivie jusqu'à son terme en conservant les mêmes conditions d'agitation. Les perles de gel aqueux ainsi obtenues sont lavées avec un solvant ou un tensio-actif afin de les débarasser des traces de phase organique, puis avec de l'eau. Comme phase organique liquide utilisable on peut citer, par exemple, les huiles végétales (huile de soja, huile d'arachide, huile de tournesol, etc...) ou minérales (huile de paraffine, huile de silicones), les produits de distillation fractionnée du pétrole (benzène, toluène, etc...),les hydrocar- bures chlorés (tétrachlorure de carbone, chlorure de méthylène, etc...), et les mélanges de ces divers composés. La phase orga- nique liquide peut éventuellement contenir un agent émulsion- nant comme les produits connus sous la dénomination commerciale "Span", "Arlacel" ou "Tween', à la concentration de 0,1 % à 4 % en volume. Les perles de gel aqueux obtenues par le procédé de polymérisation en émulsion ont un diamètre de particules qui varie, suivant les conditions opératoires, de 1 jim à 600 pm. De préférence le diamètre des particules est compris entre jim et 80 aim. Les gels aqueux obtenus par l'un des procédés exposés ci-dessus peuvent être conservés en suspension dans de l'eau ou dans une solution tampon aqueuse, en présence de traces d'un bactériostatique comme, par exemple, l'azothydrate de sodium. Une concentration de 0,02 % en azothydrate de sodium suffit à assurer la conservation. Les gels aqueux peuvent aussi être séchés par les procédés conventionnels (lyophilisation, traitement par un solvant organique miscible à l'eau, etc...). On obtient ainsi les copolymères sous forme d'une poudre blanche, réhydratable au moment de l'emploi. La réhydratation s'effectue par simple contact avec de l'eau ou une solution tampon aqueuse. Les poudres de copolymères représentent une forme très commode de stockage car elles occupent un volume très faible et peuvent 24821 12 être conservées indéfiniment, sans addition de conservateurs et bactériostatiques. Les gels aqueux peuvent contenir 2 % à 60 % en poids de copolymère selon l'invention, le restant étant constitué par de l'eau d'hydratation. Les copolymères selon l'invention peuvent être utilisés avantageusement, à l'état de gels aqueux, comme échangeurs d'ions pour la séparation des protéines, en parti- culier des protéines du sérum, des polynucléotides et des nucléotides de synthèse. Les exemples suivants illustrent l'invention sans la limiter. EXEMPLE 1 Dans un réacteur de 700 ml, on introduit 350 ml d'huile de paraffine et 2 ml de l'agent émulsifiant connu sous la dénomination commerciale "Span 80"1 (tensio-actif non ionique constitué par des esters d'acide gras et du sorbitan). On agite mécaniquement le mélange et le chauffe à 550C. Par ailleurs on dissout dans 200 ml d'eau déminéralisée chauffée à 550C 60 g de N[tris(hydroxyméthyl)méthyglacrylamide, 8 g de N,N'-méthylène-bishydroxyméthylacrylamide et 12 9 de chlorure de (méthacrylamido-3) propyltriméthylammonium, et ajoute à cette solution 300 mg de persulfate d'ammonium. La solution ainsi obtenue est versée dans l'huile de paraffine agitée. La vi- tesse d'agitation est réglée de façon 'à obtenir une émulsion stable dont les gouttelettes ont un diamètre d'environ 80 pm. Au bout de 10 minutes d'agitation on introduit dans l'émulsion 0,32 ml de TEMED et on poursuit l'agitation pendant encore 30 minutes. On refroidit alors le milieu réactionnel par addi- tion d'eau glacée, arrête l'agitation et laisse-reposer le mélange quelques heures. La phase huileuse surnageante est éliminée par succion et les perles de gel obtenues sont récupérées par décantation. Ces perles sont lavées à l'aide d'une solution aqueuse de Triton X-100 à 0,1 %0, pour éliminer les restes d'huile, puis avec de l'eau déminéralisée jusqu'à élimination totale du détergent. On obtient ainsi des perles, d'un diamètre moyen de 80 Lm, d'un gel aqueux d'un copolymère N- [tris(hydroxy- méthyl)méthyl] acrylamide/N,N'-méthylène-bis-hydroxyméthyl- acrylamide/chlorure de (méthacrylamido-3)propyltriméthyl- ammonium. Ces perles possèdent une capacité d'échange d'ions de 200 peq par ml et peuvent être conservées dans de l'eau déminéralisée ou dans un tampon approprié. EXEMPLE 2 Dans un réacteur de 700 ml, on introduit 350 ml d'huile de paraffine et 2 ml de l'agent émulsifiant connu sous la dénomination commerciale "'Arlacel C" (tensio-actif non ionique constitué par des esters d'acide gras et du sorbitan). On agite mécaniquement le mélange et le chauffe à C. Par ailleurs on dissout dans 200 ml d'eau déminéralisée chauffée à 55 C 60 g de N-[tris(hydroxyméthyl)méthyl]acryla- mide, 8 g de N,N'-méthylène-bis-acrylamide et 12 g de chlor- hydrate de N-(diéthylaminoéthyl)acrylamide, et ajoute à cette solution 300 mg de persulfate d'ammonium. La solution ainsi obtenue est versée dans l'huile de paraffine agitée. La vitesse d'agitation est réglée de façon à obtenir une émulsion stable dont les gouttelettes ont un diamètre d'environ 80 pman. Au bout de 10 mfinutes d'agitation on introduit dans l'émulsion 0,32 ml de TEMED -et on poursuit l'agitation pendant environ minutes. On refroidit alors le milieu réactionnel par addi- tion d'eau glacée, arrête l'agitation et laisse reposer le mélange quelques heures. La phase huileuse surnageante est éliminée par succion et les perles de gel obtenues sont récu- pérées par décantation. Ces perles sont lavées à l'aide d'une solution aqueuse de Triton X-100 à 0,1 %S, pour éliminer les restes d'huile, puis avec de l'eau déminéralisée jusqu'à élimination totale du détergent. On obtient ainsi des perles, d'un diamètre moyen de 80 Lm, d'un gel aqueux d'un copolymère N- [tris(hydroxy- méthyl)méthyl7acrylamide/N,N'-méthylène-bis-acrylamide/ chlorhydrate de N(diéthylaminoéthyl)acrylamide. Ces perles possèdent une capacité d'échange d'ions de 300 jeq par ml et peuvent être conservées dans une solution aqueuse molaire de chlorure de sodium. EXEMPLE 3 Les perles de gel aqueux obtenues à l'exemple 2 sont placées, sur une hauteur de 9,5 cm, dans une colonne de section 2 cm2. La colonne échangeuse d'ions ainsi constituée est placée en milieu tampon aqueux tris(hydroxyméthyl)amino- méthane/HCl 0,05 M, pH 8,6, puis on introduit en haut de la colonne l'échantillon contenant les substances à séparer. Cet échantillon est constitué par 1 ml de la solution tampon précédente contenant en solution 10 mg de chacune des quatre substances suivantes: cytochrome C, hémoglobine, P-lactoglo- buline et ovalbumine. L'échantillon est fixé sur la colonne, puis on élue avec une solution tampon tris(hydroxyméthyl) aminométhane/HCl 0,05 M, pH 8,6 contenant une concentration croissante de NaCl (la concentration de NaCl croit de O à 0,5 M). On sépare ainsi les quatre substances contenues dans l'échantillon. O10 RE VEND ICAT IONS 1. Copolymères statistiques réticulés tridimensionnels, insolubles dans l'eau, contenant sous forme copolymérisée: a) 25 % à 98 % en poids de N[tris(hydroxyméthyl)méthyl] acrylamide ou de N- [tris(hydroxyméthyl) méthyl] méthacryl- amide, ou d'un mélange de ces deux composés, b) 2 % à 50 % en poids d'un ou plusieurs monomères possédant plusieurs doubles liaisons éthyléniques polymérisables et exempts de groupes fonctionnels anioniques ou cationiques, c) 0,1 % à 50 % en poids d'un ou plusieurs monomères possédant une double liaison éthylénique polymérisable et un ou plusieurs groupes fonctionnels anioniques ou cationiques choisis parmi les groupes amino monosubstitué, amino disubstitué, pyrimidinyle, guanidyle et purinyle, salifiés ou non, les groupes ammonium quaternaire, et les groupes S038 et S03M, M désignant un métal alcalin. % 2. Copolymères selon la revendication 1, caractérises en ce qu'ils contiennent sous forme copolymérisée 0,2 % à % en poids de monomères c). 3. Copolymères selon l'une quelconque des revendica- tions 1 et 2, caractérisés en ce que le ou les monomères b) répondent à l'une des formules: (I) H 2C = C-(CH) -C-N-(CHX) - N - C - (CH) - C CH 2 2I - 2n 2 R 0 R' R' 0 R (II) H2C = C - (CH2)n- N - C - (CHX)- C - N - (CH2)n- C = CH2 I I Il il I Il R R' O 0 R' 0 l1 dans lesquelles R est un atome d'hydrogène ou un groupe méthyle, R' est un atome d'hydrogène ou un groupe hydroxy- méthyle, X est un atome d'hydrogène ou un groupe OH, n et m sont des nombres entiers de O à 6. 4. Copolymères selon l'une quelconque des revendica- tions i à 3, caractérisés en ce que le ou les monomères c) répondent à la formule: (III) CH2 = CX - (CH - (Z) - (CH2),- (Z')q - Y j - (CH2)p qf R1 jo dans laquelle R est un atome d'hydrogène, un groupe alkyle ayant 1 à 4 atomes de carbone, en particulier un groupe méthyle, un groupe SO3H ou un groupe SO3M, M désignant un métal alcalin, X1 est une liaison simple, un atome d'oxygène ou un groupe -CH2-, -C-O-, -SO-, -SO2- ou p-phénylène, p,p', I O q et q' sont des nombres entiers de O à 49 Z et Z' sont des atomes d'oxygène ou de soufre ou des groupes -NH-C-, -C-,NH-, O O -C-, -C-O-, -C-S-, -SO-, -SO2-, -CH=N-, -NHSO2-S -CHOH-, IIIIlI O O O R2 -CC- ou /, R2 désignant un atome d'hydrogène ou un groupe méthyle ou méthoxy, et Y représente un groupe amino monosubstitué, amino disubstitué, pyrimidinyle, guanidyle ou purinyle, salifié ou non, un groupe ammonium quaternaire, un groupe SO3H ou un groupe SO3M, M étant un métal alcalin. 5. Copolymères selon la revendication 4, caractérisés en ce que, dans la formule (III) des monomères c), Y repré- s un g pR3 R sente un groupe -, -N, - N-H A 3 4 R3 - N -R3 AG ou - N-R4 A, R3, R4 et R5 repré- R4 R5 sentant des groupes alkyle ayant 1 à 3 atomes de carbone et A l'anion chlorure, bromure ou iodure. 6. Copolymères selon la revendication 5, caractérisés en ce que le monomère c) est choisi parmi l'acide vinyl- sulfonique et ses sels alcalins, - les méthacrylate et acrylate de diéthylaminoéthyle et leurs chlorhydrates, - les méthacrylate et acrylate de diméthylaminoéthyle et leurs chlorhydrates, - les N-(diéthylaminoéthyl)acrylamide et N-(diméthylamino- propyl)acrylamide et leurs chlorhydrates, - le chlorure de (méthacrylamido-3)propyltriméthylammonium, - le chlorure de (méthacryloyloxy-3)propyltriméthyl- ammonium. 7. Procédé de préparation des copolymères selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'il consiste à effectuer la polymérisation radicalaire des monomères a), b) et c). 8. Procéd6 selon la revendication 7, caractérisé en ce que la polymérisation est effectuée en solution aqueuse, à une température de 0 C à 100 C, en présence d'un initiateur de polymérisation radicalaire. 9. Procédé selon la revendication 8, caractérisé en ce que la solution aqueuse est sous forme d'une émulsion au sein d'une phase liquide organique, non miscible à l'eau. 10. Gels aqueux caractérisés en ce qu'ils contiennent 2 % à 60 r en poids d'un copolymère tel que défini dans chacune des revendications 1 à 6. 24821 1 2 11. Gels aqueux selon la revendication 10, caractéris6s en ce qu'ils sont sous forme de perles ayant un diamètre de 1 jm à 600 Jm. 12. Gels aqueux selon la revendication 11, caractérisés en ce que le diamètre des perles est compris entre 40 jm et Lm. 13. Application des gels tels que définis dans chacune des revendications 10 à 12 à la séparation des substances naturelles ou synthétiques par échange d'ions.