FR 2485019 A1 19811224 FR 8112070 A 19810618 La présente invention concerne un dérivé obtenu par une N-désulfatation sévère de l'héparine et une hémi-succinylation complète ultérieure du produit de l'hydrolyse. Le produit qu'on obtient fait preuve pratiquement d'aucune activité anticoagulante, cette dernière étant inférieure à 0,05 unité Pharmacopée U.S. par mg, mais il possède une activité hypolipémisante, qui est toujours thérapeutiquement importante et qui est d'un intérêt particulier pour le traitement des états dyslipidémiques. L'importance physiologique de plusieurs protéoglycanes et glucosaminogly- canes était bien connue depuis longtemps, malgré qu'on ne connaisse pas entièrement et même partiellement le rôle physiologique réel et le mécanisme de fonctionnement. Les termes utilisés dans la présente demande sont ceux introduits par J.F. Kennedy dans"Proteoglycans-Biological and Chemical Aspects in Human Life" - Studies in Organic Chemistry - Vol. 2 Elsevier Scientific Publishing Company Amsterdam-Oxford-N.Y.-1979. On connait également l'activité thérapeutique élevée de plusieurs glyco- saminoglycanes, naturels ou synthétiques, comme par exemple l'héparine et le sulfate de dextrane. La première a été utilisée depuis longtemps dans le trai- tement de l'hypercoagulabilité, dans la coagulation intravasculaire étendue, dans le traitement des états de pré- et de post-thromboembolie, comme décrit par exemple par L.B. Jaques dans "Heparin, an old drug with a new paradigm" - Science 206, 528, (1979): V.V. Kakkar, D.P. Thomas - "Heparin, Chemistry and Clinical Usage" - Academic Press, Londres - N.Y. 1976 - et dans le traitement de dyslipidémie, comme expliqué par J.F. Kennedy, L.B. Jaques V.V. Kakkar, loc. cit. "Lipoprotein Matabolism" Editeur S. Eisemberg Progress in Biochemical Pharmacology, vol. 15, Séries Ed. E. Paoletti, S. Karger, Bâle (1979). Dans le cas particulier des états pathologiques mentionnés en dernier lieu, l'utilisation thérapeutique de I'héparine est basée sur un traitement prolongé même si les doses sont faibles. Avec le temps, ce traitement prolongé provoque le risque d'un état dangereux d'hypocoagulabilité chez le patient. Pour cette raison, on a essayé de séparer l'activité hypolipémisante de l'héparine de lractivité qu'on considérait comme étant de nature hypocoagulante, par exemple en apportant des modifications structurales appropriées à l'héparine ou par fractionnement de l'héparine du commerce. On a maintenant admis d'une façon générale et même démontré que ces activités sont associées à la formation in vivo de complexes de glycosaminoglycane avec une enzyme spécifique. Ces complexes ont pour but soit d'activer l'enzyme comme par exemple dans le cas du complexe antithrombine III-héparine en ce qui concerne l'activité anticoagu- lante de l'héparine, soit de faciliter la catalyse pour mobiliser l'enzyme dans la circulation sanguine, enzyme qui était initialement liée aux parois des 2-4 85019 vaisseaux. C'est lecas qui est typique avec le complexe lipoprotêinolipase (LPL)- héparine (Hep) et c'est le mécanisme servant à expliquer l'activité hypolipé- misante qu'on appelle également activité de dégagement dont font preuve les glycosaminoglycanes, comme expliqué par J.F. Kennedy; L.B. Jaques, V. V. Kakkar et S. Eisemberg dans les publications précitées. De nombreux doutes existent concernant la nature de ces complexes, mais il ept admis de façon unanime que le phénomène produit est une interaction in vitro de caractère exclusivement ionique, comme expliqué par J.F. Kennedy à la page 173 et par L.B. Jaques dans les publications citées et in vivo, de caractère ionique ou au plus de caractère semi- polaire en raison de la structure polyanionique de l'héparine. En fait, dans l'héparine on trouve plusieurs groupes sulfamidiques (N-sulfate)et groupes sulfoester (O-sulfate), les premiers étant plus labiles à l'hydrolyse acide que ceux du second groupe(voir par exemple, J.F. Kennedy, page 229; I. Danishefski, H.B. Eiber, J.J. CarrArch. Biochem. Biophys. 90, 114, 1960; K.H. Meyer, D.E. Schwartz - Helv. Chim. Acta, 33, 1651, 1950). Cet accord provient d'un nombre important d'observations expérimentales parmi lesquelles la perte progressive de l'activité anti-coagulante et de dégagement par suite de l'hydrolyse acide avec les acides minéraux des groupes N-sulfate jusqu'à l'élimination complète des deux types d'activités en raison de la N-désulfatation totale et de la Odésulfatation très réduite (voir J.F. Kennedy, page 229; S.S. Stivala, L. Yuan, J. Ehrlich, P.A. LivertiArch. Biochem.Biophys. 122, 32, 1967; S.S. Stivala, P.A. Liberti-Arch. Biochem. Biophys. 122, 40, 1967; S.S. Stivala, M. Herbst, O. Kratky, I. Piltz-Arch. Biochem.Biophys. 127, 795, 1968). On a indiqué que ces activités pouvaient être régénérées lors de la régénération des groupes N-sulfate par la réaction des produits d'hydrolyse avec la pyridine-SO3 ou la triméthylamine-S03, aussi bien qualitativement que quantitativement (voir J.F. Kennedy, page 230 et L. Levy, F.J. Petracek - Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 109, 901, 1962) étant donné qu'avec une telle opération le caractère polyanionique du glycosaminoglycane est régénéré, ce qui est égale- ment vrai de la régénération de l'aptitude à former le complexe ionique enzyme- héparine (voir S.S. Stivala, op. cit. 1967; et S.S. Stivala, op. cit. 1968). Malgré ce qui précède, Levy indique que l'hydrolyse acide de l'héparine avec des acides minéraux jusqu'à un degré de N-désulfatation supérieur à 33% donne un produit ayant subi plusieurs modifications irréversibles qu'on peut attribuer à un début de dépolymérisation et/ou de 0désulfatation de sorte qu'il n'est pas possible de rétablir l'activité initiale après avoir effectué la nouvelle sulfatation. En d'autres termes, la régénération des groupes sulfates dans le produit obtenu après l'hydrolyse sévère, qui est modifié sur le plan structural et qui est de lui-même inactif,-ne permet pas de retrouver un degré d'ionicité suffisant pour créer le complexe de l'enzyme et d'héparine modifiée, avec une perte de l'activité biologique jusqu'à des valeurs peu perceptibles. Ces observations expérimentales ainsi que d'autres, comme par exemple les rapports de J.F. Kennedy et V.V. Kakkar dans les opuscules cités, sont en accord avec les observations de Levy et l'hypothèse logique de travail selon laquelle l'interaction entre les enzymes-du type coagulant et l'héparine,ainsi qu'entre L.P.L. et l'héparine, sont toutes deux des réactions basées sur l'affinité de caractère électrostatique et de type anionique; mais il existe néanmoins une certaine différence entre les deux mêmes interactions. Etant donné que l'interaction L.P.L.-héparine est d'un caractère légèrement plus lipophile par suite de la nature de l'activité de L.P.L., on peut aboutir à plusieurs conclusions: 1) L'activité lipasémique de plusieurs compositions pharmaceutiques du commerce est due à l'emploi de substances actives qui sont ou bien l'héparine, ou bien ses dérivés naturels plus ou moins désulfatés. Ces substances possèdent une activité anti-coagulante intrinsèque et toujours très élevée afin de réduire au minimum le risque dû à l'hypocoagulabilité par suite d'un traitement prolongé comme c'est le cas lors du traitement de la dyslipidémie. 2) L'étude des nouveaux dérivés des glycosaminoglycanes qui ont été modifiés par rapport aux produits naturels, mais qui sont toujours du type héparine en ce sens que ce sont encore des dérivés de l'héparine, doit être fondée sur une modification d'un degré tel qu'on préserve un'pourcentage important de l'aniqnicité du produit final. 3) Pour obtenir ces dérivés, la matière de départ ne peut être que l'héparine elle-même ayant subi un degré variable de désulfatation et dans laquelle le caractère anionique a été régénéré avec l'introduction de groupes anioniques contenant de l'azote et moins ionisés que le groupe sulfate, comme par exemple les groupes carboxyliques. Ces dérivés font preuved'une activité lipoprotéinolipasiqUe qui est encore importante, avec une activité anticoagulante réduite de sorte que ces dérivés abaissent le risque d'hypocoa- gulabilité dans le traitement chez l'homme. Cependant, pour la raison déjà indiquée, la N-désulfatation ainsi que la régénération ultérieure du groupe anionique renfermant de l'azote ne dépassent jamais 33-35 % des groupes N-sulfate initialement présents. La raison en est qu'on ne désire pas obtenir un produit final "reconstitué" possédant un caractère extrêmement lipophile, trop peu anionique et non adéquat pour former un complexe de L.P.L. Une quantité considérable de travaux a été effectuée à partir de ces observations, en particulier concernant les dérivés Nsuccinyliques de l'héparine, plus ou moins hydrolysés comme expliqué par I.B. Cushing, selon le brevet U.S. 3 118 816. La plus importante des revendications de ce brevet U.S. est celle qui décrit une substitution ne dépassant pas 35% des groupes N-sulfate-de l'héparine de départ, les groupes N-succinyliques étant en accord avec les travaux de Levy. Cette même revendication est également fondée sur l'hypothèse selon laquelle l'activité lipasémique des dérivés N-désulfatés ayant subi une succinylation ultérieure avec un degré de N-désulfatation de plus de 35 %, est trop fortement diminuée- La raison en est que ces composés font preuve d'un caractère anionique trop faible de sorte- qu'ils sont incapables de former le complexe d'activation de L.P.L. et-d'héparine modifiée. Les mêmes conditions d'hydrolyse acide avec HCI 0,086N pendant une période maximum de trois heures permettent de satis- faire à l'exigence d'obtention d'un dérivé-exclusivement N-désulfaté dans les intervalles mentionnés plus haut et en l'absence d'une 0désulfatation ou d'une N-désacétylation. Ce produit de base, qu'on pense être optimal après sa succinylation avec du chlorure de syccinyle dans le benzène et le bicarbonate de sodium, forme un complexe N-succinylehéparine qui est suffisamment ionique pour former un complexe avec L.P.L. de sorte qu'il devient soluble dans le plasma et fait preuve d'une activité de dégagement correspondante. Cependant, cette activité n'est pas suffisance pour permettre l'interaction avec l'anti- thrombine III de sorte que l'activité-inhibitrice de l'héparine dans les phénomènes de coagulation est perdue. En d'autres termes, le but du brevet U.S. 3 118 816 est de fournir un produit ayant une activité de dégagement comparable à l'activité de l'héparine mais en l'absence de I'activité coagulante élevée de l'héparine. Dans la revendication 5 de ce même brevet, on mentionne l'emploi d'un acide dilué alors que dans les exemples on décrit l'utilisation d'un acide minéral ayant une concentration ne-dépassant pas 0,086 M. La forte activité lipasémique du produit qu'on obtient démontre que la façon dont ces chercheurs abordent le problème est correcte. Cependant l'acti- vit6 anticoagulante résiduelle (8 à 10 unités Pharmacopée U.S. par mg), même si elle est réduite par rapport à l'héparine de départ, reste toujours trop élevée pour en permettre l'emploi sans risque d'hypocoagulation chez l'homme après une durée prolongée de traitement. Dans une publication récente K. Nagasawa et al. (J. Biochem. 81, 989, 1979), soutiennent que les héparines N-désulfatées à des degrés différents même élevés de N-désulfatation, préservent de 62 à 79% de l'activité anticoagulante initiale, ce qui semble être enopposition avec Ies résultats des travaux précités de Levy et Stivala ainsi qu'avec les résultats obtenus par la Demanderesse. Il est cependant nécessaire de ne pas oublier que Nagasawa effectue la dé- sulfatation avec du diméthylsulfoxyde et du méthanol à température ambiante, c'est-à-dire dansdes conditions qui sont très différentes de celles servant à obtenir le produit selon la présente invention (acides minéraux à une concen- tration différente, températures qui sont toujours plus élevées que la tempéra- ture ambiante). L'étude qui vient d'être faite résume l'état de la technique avant la présente invention. La Demanderesse a trouvé de façon surprenante que dans des conditions d'une hydrolyse plus sévère, c'est-à-dire avec HC; 0, 33 N à une température de 100 C pendant 6 heures, c'est-à-dire des conditions plus sévères que celles préconisées dans le brevet U.S. 3 118 816 et plus sévères que celles proposées par Levy, le produit d'hydrolyse de l'héparine est biolo- giquement inactif et après une succinylation poussée avec de l'anhydride succinique et NaOH, on obtient un dérivé dans lequel l'activité anticoagulante est pratiquement inexistante, c'est-à-dire au-dessous de 0, 05 unité Pharmacopée U.S./mg, alors que l'activité de dégagement reste toujours thérapeutiquement valable. Les conditions d'hydrolyse sont telles,en ce qui concerne la concentra- tion de l'acide et la durée de la réactionqu'on obtient une Ndésulfatation totale et une O-désulfatation réduite. La succinylation sévère effectuée ensuite aboutit à la formation d'un produit qui est toujours reproductible en ce qui concerne son activité biologique et ses propriétés physicochimiques. Dans ce produit, le motif disaccharide est basé sur l'héparine, qui consiste en le '2-0-sulfate de l'acide O-L-iduronique et 1 t -D-glucosamino-2-N- sulfate-6-0-sulfate avec une liaison 1,4 ou consiste en l'acide 3 -Dglucuro- nique et 1'0 -D-glucosamino-2-N-acétyl-6-0-sulfate avec une liaison 1,4, comme expliqué par R.W. Jeanloz-"'Héparin. Structure, Function and Clinical Implica- tions", Eds.R.A. Bradshawet S. Wessler - Adv. Expl. Med. Biol. 52, 3, 1974. Dans le produit, des motifs hémi-succiniques ont été introduits jusqu'à 1, 2 par motif disaccharide. Tout au contraire, dans les produits décrits par Cushing cette valeur ne dépasse pas 0,6 lorsque l'héparine initiale est soumise à une hydrolyse pendant trois heures avec 35% de N- désulfatation ce qui correspond à la limite maximale. 35. Tous les produits sous forme de dérivés succinyliques selon l'invention font preuve d'une perte totale d'activité anticoagulante qui est inférieure à 0,05 unité Pharmacopée U.S./mg et ce facteur a été vérifié avec tous les types d'héparine utilisés comme matière de départ. En fait, ceci a été confirmé expérimentalement avec une héparine ayant une activité anticoagulante de 150 à 180 unités Pharmacopée U.S./mg. En outre, on a constaté les propriétés suivantes 1 ) Le produit a une uoxapUsition qui est constante en isoélectrofocalisa- tion qui utilise des types différents d'héparine comme matière première. En outre, le produit fait preuve d'un degré moyen d'anionicité nettement inférieur aux valeurs obtenues dans le brevet U.S. précité, valeurs qui varient en fonction de la durée de l'hydrolyse et, par voie de conséquence, en fonction du degré de N-succinylation. De même, les produits obtenus selon Cushing diffèrent de l'un à l'autre suivant la durée de l'hydrolyse et aucun de ces produits ne possède de comportement lors de l'isoélectrofocalisation similaire à celui du dérivé selon l'invention (voir figure 1). La figure l-montre qu'outre la variation du profil de la bande, l'inten- sité de couleur à dépôt égal est inférieure dans le cas du produit selon l'invention, ce qui indique une différence de structure, à savoir une moindre affinité aux agents colorants. ) Le produit préparé selon l'invention est constant en électrophorèse avec des propriétés qui seront indiquées plus loin. En outre, il fait preuve d'une plus faible acidité totale non seulement par rapport à l'héparine utilisée comme matière de départ mais aussi par rapport aux dérivés obtenus par Cushing. Les dérivés de Cushing diffèrent aussi notablement selon la durée d'hydrolyse et cette différence est plus évidente lorsque le degré d'hydrolyse est faible. ) Lorsqu'on analyse le dérivé selon l'invention spectrométriquement par résonance magnétique nucléaire protonique (R.M.N.) et lorsqu'on l'analyse avec C13 comme on-ll'expliquera plus loin, le dérivé selon l'invention montre une forte succinylation aussi bien sur l'azote que sur une partie de l'oxygène. Ce degré de succinylation est de l'ordre de 1,2 motif hémisuccinique par motif de disaccharide, comme il a été précédemment stipulé. Tout à fait au contraire, les spectres du même type provenant des produits de Cushing ayant subi un degré variable d'hydrolyse initiale font apparaître un degré maximum de succinylation de l'ordre de 0,6 motif hémisuccinique par motif de disaccharide. 4 ) Une activité antilipémique constante: - Quand on utilise comme matière de départ pour l'hydrolyse plusieurs types d'héparine d'origines différentes, on obtient toujours comme dérivé une substance possédant une activité lipasémique constante égale à environ % de l'activité de l'héparine de départ (valeur qui est acceptable comme moyenne pour divers échantillons). Cette activité correspond également à 50% 24850 19 de l'activité obtenue avec le dérivé de Cushing qui est le produit d'hydro- lyse apres une période de 2,5 à 3 heures. Cependant ce produit présente toujours une activité anticoagulante de 8 à IO unités Pharmacopée U.S./mg. On remarquera que l'activité lipasémique de l'héparine est beaucoup plus prolongée dans le temps aussi bien avec le dérivé préparé selon l'invention qu'avec le-dérivé - préparé selon Cushing. ) La toxicité aigUe est plus faible par rapportà l''héparine de départ et aussiepar rapport au produit de Cushing qu'on obtient par hydrolyse d'une durée de-2,5 à 3 heures et dont l'activité coagulante est de 8 à 10 unités Pharmacopée U.S./mg. En fait, chez les rats la valeur DL50 par voie d'adminis- tration endoveineuse est de 3,4 g/kg alors que la toxicité aigue du sel de sodium de l'héparine de'départ est d'environ 0,9 à 1,0 g/kg et la toxicité aigQe du dérivé de Cushing est de 2,3 g/kg. Dans ce qui suit on donne un exemple de préparation et de détermination des propriétés du produit selon l'invention. Dans cet exemple, le dérivé de glycosaminoglycane obtenu selon l'invention est désigné par l'abréviation G.G.M. Préparation Dans un ballon d'une capacité de 3 litres comportant un condenseur, un agitateur mécanique et une tubulure d'entrée d'azote afin de pouvoir opérer en atmosphère inerte, on verse 2 litres d'eau distillée et 200 g de sel de sodium d'héparine. On dissout le produit à température ambiante sous agitation, puis on ajoute 400 cm3 de HC 2N. On désaère la solution limpide avec ltazote et, tout en maintenant une atmosphèred'azote, on place la solution dans un bain d'eau bouillante et on maintient dans cet état pendant 6 heures.-On refroidit la solution à température ambiante et pendant qu'on refroidit à.la glace, on élève le pH à 8,5 par addition d'une solution froide saturée de NaOH. Tout en maintenant la température dans un intervalle initial de 5 à 10 C et le pH aux alentours de 8 par addition d'une solution de NaOH, on'ajoute en plusieurs doses 400 g d'anhydride succinique. L'addition finale porte le pH à environ 7,4 - 7,5. On maintient la solution froide sous agitation pendant 30 minutes et ensuite on ajoute 3 volumes d'éthanol à 95 . On filtre par aspiration et on sèche à l'air le précipité qui est huileux lors de sa formation initiale mais qui après une certaine période au repos devient solide. On dissout-de nouveau ce précipité dans 3 litres d'eau distillée et on dialyse dans un dialyseur de seuil de coupure nominale de 600 daltons, contre de l'eau distillée jusqu'à élimination de succinate de sodium. On lyophilise ensuite la solution finale. Le produit obtenu (200 g) est sous forme aciculaire. Isoélectrofocalisation On effectue la détermination selon le procédé de P. G. Righetti et E. Gianazza, B.B.A. 532, 137 (1978). On utilise un gel de polyacrylamide T à 7%, contenant 2,5 à 4 % de L.K.B. à 1%; 3 à 5 % de L.K. B. à 1 %; et 3,5 à 10 % d'ampholine renfermant 0,1 % de L.K.B. On dissout les échantillons dans de l'urée 8M à une concentration de 20 mg/ml et on les dépose sur un papier Whatmann (3MM) en quantités égales pour tous les échantillons (250 micro- grammes). - On effectue les essais pendant 0,5 heure + 3 heures;12 W et 100 V max.; T = 9 C. Coloration: bleu de toluidine dans de l'acide acétique à 2 %. Les résultats apparaissent sur la figure 1 dont les portions 1 et 2 désignent G.G.M.,250 - microgrammes (on utilise deux préparations provenant de lots différents de sel de sodium de l'héparine, un produit disponible dans le commerce ayant une activité anticoagulante de 165 à 178 unités Pharmacopée U.S./mg) . Sur la figure, les portions 3 et 4 sont obtenues avec des dérivés provenant d'un lot de sel de sodium d'héparine ayant un pouvoir anticoagulant de 165 unités Pharmacopée U.S./mg préparé par le procédé de Cushing avec une durée d'hydrolyse de 30 minutes et de 180 minutes respectivement, à une concentration de 250 micro- grammes. La portion 5 correspond au sel de sodium d'une héparine de 165 unités Pharmacopée U.S./mg à partir de laquelle on obtient les dérivés qui correspon- dent aux portions 2, 3 et 4, à une concentration de 250 microgrammes. Electrophorèse Les données d'électrophorèse qui apparaissent sur la figure 2 ont été obtenues dans les conditions suivantes: acétate de baryum 0,1 M, pH 5,8; film d'acétate de cellulose ("Sepraphore III"- Gelman) de 5,5 x 11 cm; tension volts; durée de l'essai: 4 heures à température ambiante; dépôts de 3 microgrammes; coloration:,bleu Alcian sous forme d'une solution de 150 mg dans 100 ml d'éthanol à 95 , diluée (1:1) avec de l'acétate de sodium 0,5M, pH = 5,8. On détermine la décoloration dans l'acide acétique à 5%. On effectue la, diaphanisation en 1 minute avec-une solution de 15% d'acide acétique, de 84% de méthanol, de 0,5 % de toluène et de 0,5% d'acétone. Sur la figure 2, les points a, b et d sont obtenus avec des dérivés selon l'invention en utilisant comme matière de départ trois lots différents d'hépa- rine qu'on trouve dans le commerce. On obtient le point c avec le dérivé obtenu par le procédé de Cushing (2,5 heures d'hydrolyse), l'échantillon pré- sentant une activité anticoagulante résiduelle de 10 unités Pharmacopée U. S/mg. Les données apparaissant sur la figure 3 ont été obtenues dans les 2485o19 conditions suivantes une solution d'acide trichloracétique 0,05 M ajustée à un pH de 3 avec NaOH; un film d'acétate de cellulose ("Sepraphore III"- Gelman) de 5,5 x 11 cm; tension 45 volts; durée de l'essai: 3 heures à température ambiante; dép8ts de 3 microgrammes. La coloration est telle que décrite plus haut. La diaphanisation a été déterminée comme ci-dessus. Sur la figure 3, la portion a est obtenue avec le dérivé selon l'inven- tion en utilisant comme matière de départ une héparine ayant servi à produire la portion b, c'est-à-dire une héparine de 160 unités Pharmacopée U.S./mg. On obtient la portion c avec un produit obtenu par le procédé de Cushing, après trente minutes d'une hydrolyse acide de la même héparine et on obtient la portion d avec un autre produit de Cushing résultant d'une hydrolyse acide de 180 minutes, la matière de départ étant toujours la même héparine. 1.3 Spectre RMN 3C de G.G.M. Les données sont obtenues avec 25,2 MHz dans dioxane-D20; standard interne: dioxane (p.p.m. 67,4); les données sont exprimées en p.p.m. Le procédé utilisé est décrit par G. Gatti, B. Casu. G.K. Hamer et A.S. Perlin, Macromolecules 12, 1001 (1979). Ce spectre comparé au spectre de sel de sodium de l'héparine, qu'on détermine dans les mêmes conditions, indique les signaux et les différences ci-après: 1) On constate un nouveau signal à 181,8 qu'on peut attribuer au groupe COO- du résidu succinique. 2) On constate un nouveau signal à 177 qu'on peut attribuer au groupe -CONH du résidu succinique. 3) On constate un signal à 176,7 qu'on peut attribuer au groupe COOH du résidu iduronique, identique à celui de l'héparine. 4) On constate un faible signal à 102 qu'on peut attribuer à C1 de petites quantités du résidu de l'acide glucuronique, identique à celui de l'héparine. 5) On constate un signal à 100 qu'on peut attribuer à C du résidu iduronique, identique à celui de l'héparine. 6) On constate un. nouveau signal à 95,3 qu'on peut attribuer à C1 du motif N-succinyl-glucosamine. De façon similaire, on constate la disparition du signal à 97,7 qu'on peut attribuer à C du résidu N-sulfate de glucosamine caractéristique de l'héparine de départ. Quoique la sensibilité en RMN ne soit pas absolue, la disparition de ce signal montre de manière certaine que le nombre de groupes N-sulfate est égal à moins de 10 % du nombre de groupes dans l'héparine de départ. 7) On constate une nouvelle série de signaux entre 72 et 76 qu'on peut attribuer à C2 et C4 du résidu N-succinylglucosaminique et à C2 du résidu iduronique; ces signaux dans le spectre de l'héparine sont groupés en un seul signal intense à 76. 24850Q19 8) On constate deux signaux à 70 et 7I qu'on peut attribuer à C3 et C5 du résidu N-succinylglucosaminique et à C et C durésidu iduronique, identi- 3 5 ques aux signaux des mêmes atomes de l'héparine. 9) On constate un signal à 67 qu'on peut attribuer à C6 du résidu Nsuccinylglucosaminique, identique au signal de C du résidu N-sulfonylique de l'héparine. 0l) On constate un nouveau signal en 54,5 qu'on peut attribuer à C du résidu N-succinylglucosaminique. En même temps, on constate la disparition du signal à 58,8 qui est dû à C2 du résidu N- sulfonylglucosaminique dans le spectre d'héparine. ll) On constate deux nouveaux signaux en 33,0 et 33,5 qu'on peut attribuer aux groupes-CH2COO et -CH2-CO-NH- du résidu succinique dans la N-succinyl- héparine. 13. Spectre R.M.N. 13C du dérivé obtenu par le procédé de Cushing après minutes d'hydrolyse acide Le spectre 13C du produit montre des signaux qui ont été décrits ci-dessus aux paragraphes 1 à 5, 9 et 11 à propos du composé selon l'invention. Pour ce qui est du signal dû à C du résidu glucosaminique, qui a été décrit dans le pagraphe 6 ci-dessus, on constate l'apparition du pic dû à la N-succinylglucosamine, alors qu'on remarque toujours le pic dû à C1 du résidu N-sulfonylglucosaminique. Ceci prouve que dans cet échantillon la N-désulfatation est incomplète et qu'il existe toujours un mélange de groupes N-sulfate et N-succinyle. Les signaux dus à C3, C4 et C du résidu N-sulfonyle ou du résidu 34 5 N-succinylglucosaminique et à C2, C3, C4 et C du résidu iduronique appa- raissent sous forme d'une série de pics qu'on peut grouper en deux groupes principaux aux alentours de 70 et 76. Ainsi la situation est intermédiaire entre celle de l'héparine et celle du dérivé selon l'invention (paragraphes 7 et 8 ci-dessus). On remarque l'apparition d'un nouveau pic à 54,5 qui correspond au picdécrit au paragraphe 10 au sujet du dérivé faisant l'objet de l'invention. Cependant le signal.à 58,8 qui indique la présence de carbone C2 du résidu N-sulfonylglucosaminique de l'héparine est toujours présent. 8248 5 0 1 9 -l Spectre R.M.N.13C du dérivé obtenu par le procédé de Cushing après 30 minutes d'hydrolyse acide. - Ce spectre est similaire à celui de l'échantillon obtenu après 180 minutes de l'hydrolyse acide et indique un faible degré de succinylation. En fait, tous les pics décrits pour le produit obtenu après 180 minutes d'hydrolyse sont encore présents dans ce cas. Plus particulièrement, Ies pics décrits aux paragraphes 1 et 2 sont beaucoup moins intenses que le pic décrit-au para- graphe 3 à propos du spectre du composé G.G.M. et du composé après 180 minutes d'hydrolyse, ce qui indique un plus faible degré de succinylation. Les pics étudiés aux paragraphes 3, 4, 5, 9 et il sont les mêmes que pour le produit d'hydrolyse après 180 minutes. Le signal de C1 (N-sulfonylglucosamine du résidu à 97,7 est présent mais plus intense au voisinage du signal de *C de la N-succinylhéparine 95,3 montrant une fois encore un faible degré J1. de succinylation (voir paragraphe 6). Les signaux dus à C3 C4et C5 du résidu N-sulfonyl-ou N-succinyl-glucosaminique et dus à 2 C2, C3, C4 et C5du résidu iduronique (paragraphes 7 et 8) apparaissent sous une forme intermé- diaire entre les signaux du produit après 180 minutes d'hydrolyse et les signaux obtenus avec l'héparine de départ. - Le pic net à 54,5 de C2 du résidu N-succinylglucosaminique est proche du pic à 58,8 dû au résidu N-sulfonylglucosaminique, le premier étant moins intense que le second (paragraphe 10 ci-dessus). Spectre R.M.N. 1 H enregistré avec "Varian XL-l00" à 100 MHz On utilise les spectres R.M.N. 1H pour déterminer le degré de succinylation en établissant un rapport entre le signal d'hydrogène en C1, deux atomes d'hydrogène pour un motif disaccharide, c'est-à-dire pour le motif iduronique et un pour le motif glucosaminique et le signal des atomes d'hydrogène de l'acide succinique, à savoir.un total de quatre atomes d'hydrogène par résidu d'acide succinique. On obtient-les données suivantes: 1 ) Dérivé-préparé selon l'invention: 1,2 motif d'acide succinique par motif de disaccharide. 2 ) Dérivé obtenu selon Cushing après 30 minutes d'hydrolyse acide 0,20 motif d'acide succinique /motif de disaccharide. 3 ) Dérivé selon Cushing après 180 minutes d'hydrolyse acide: 0,6 motif d'acide succinique par motif de disaccharide. En conclusion, les tests indiquent que le dérivé selon l'invention est le résultat d'un degré plus élevé de désulfatation et de' succinylation par comparaison avec le dérivé de Cushing et aussi que le produit selon l'inven- tion a subi une hydrolyse acide dans des conditions plus sévères que celles utilisées par Cushing, à savoir une hydrolyse pendant 180 minutes. Toxicité On a étudié la toxité de G.G.M. qu'on présentera dans les exemples ci-après, exemples qui illustrent l'activité lipasémique et de dégagement, sur deux espèces d'animaux, à savoir sur des souris par voie endoveineuse et sur des rats par voie endoveineuse en plus de la voie i.p. et-la voie orale. Le véhicule utilisé était une solution physiologique. On a obtenu les valeurs suivantes de DL50 en mg/kg: Espèce: souris mâles albinos Swiss ayant un poids moyen de 22 1 g. Administration endoveineuse: DL50 = 3 414 mg/kg (2927,6 - 3826,2). Espèce: rats mâles albinos Wistar pesant en moyenne 180 - 10 g. Administration endoveineuse: DL50= 2400,2 mg/kg(2100,2 - 2782,6). - Administration endopéritonéale: DL50:> 3500 mg/kg; Administration orale: DL50 > 5000 mg/kg. La valeur DL50 par voie endoveineuse chez les souris avec le dérivé de Cushing est d'environ 2300 mg/kg. - Activité sur l'hypercholestérolémie et l'hypertriglycéridémie provoquée par "Triton" - On a déterminé l'activité d'hypocholestérolémisation et hypotriglycéridique par le test d'hypocholestérolémie et d'hypertriglycéridémie au moyen de "Triton" (WR-1339) comme décrit par Garattini S., Morpurgo P., Paoletti, R. Arzn. Forsch, 9, 206 (1959); E. Marmo, E. Lampa, et al: Archivo per le Scienze Mediche 132, (3), (83), (1975). On a effectué les essais avec des rats mâles adultes, albinos Wistar pesant de 190 à 210 g et choisis au hasard. - On a divisé les animaux en groupes de 10; un groupe n'a reçu que le véhicule du produit étudié, c'est-à-dire la solution physiologique, alors que les autres groupes ont été traités (1) par "Triton" et (2) par "Triton" avec la substance étudiée selon la voie d'administration et les dosages figurant dans le tableau I. Dans chaque cas,- on a administré 200 mg/kg de "Triton" par la voie endo- veineuse aux rats qui ont jeiné pendant douze heures, avec seulement un libre accès à l'eau. On a administré les substances servant d'antagonistes par voie endopéri- tonéale ou par voie orale deux heures avant le "Triton" et deux heures après. Entre l'administration de "Triton" et la seconde administration du produit testé, on a nourri les animaux et ensuite on a enlevé la nourriture en ne leur permettant que l'accès à l'eau. Douze heures après l'administration de "Triton", on a prélevé un échantillon de sang par ponction cardiaque et on a effectué la détermination des triglycérides selon le test combiné Biochemia Boheringer. Il s'agit d'une détermination enzymatique des triglycérides après saponification avec l'hydrogène de potassium éthanolique (KOH) selon Eggstein M.: Klin. Wschz. 44, 1966, 262. On a également testé l'échantillon de sang pour le cholestérol selon le test combiné de Roschlav P., et al: Z. Klin Chem. Klin. Biochem. 12, 1974, 403, par le procédé de catalyse, c'est-à-dire par le test enzymatique colorimétrique. Les résultats apparaissent dans le tableau I. Dans les tableaux II et III on a fait figurer les résultats expéri- mentaux obtenus après l'induction de l'hyperlipémie au moyen de "Triton", résultats obtenus par administration par voie orale à des rats par les procédés décrits plus haut de la substance active G.G.M. dans deux véhicules différents, substance qui possède un caractère lipophile. TABLEAU I Dosage des triglycérides et du cholestérol chez les rats Wistar pesant environ 200 g et ayant subi un traitement après induction de l'hyperlipémie au moyen de "Triton" (200 mg/kg intra-veineux) Dose Voie Triglycérides Cholestérol Composé (mg/kg) d'administration (mg%) (mg%) Témoins Solution i.p. et orale 111,62 + 3 71,82 + 2 physiolo- gique 2 ml/kg "Triton" 200 i.v. 479,78 + 7 198,12 + 5 G.G.M. + 20 i.p. 190,18 + 6 151,00 + 6 "Triton" (200 mg/kg) G.G.M. + 40 i.p. 139,64 + 6 116,50 + 5 "Triton" (200 mg/kg) G.G.M. + 100 orale 320,70 + 8 171,30 + 7 "Triton" (200 mg/kg) G.G.M. + 200 orale 280,75 + 7 162,47 + 6 "Triton" (200 mg/kg) TABLEAU II Dosage des triglycérides et du cholestérol chez les rats Wistar pesant 10 g et ayant subi un traitement après induction de l'hYperlipémie au moyen de "Triton" (200 mg/kg intra-veineux). On administre le produit en cours d'examen dans un véhicule à base de "Tween"- Dose Voie Triglyc rides Cholestérol Compos (mg/kg) d'administration (mg%) mg%) Témoins Solution orale 111,62 + 3 71,81 + 2 physiologique (2 ml/kg) "Triton" 200 i.v. 479,78 + 7 198,12 + 5 G.G.M. + 50 orale 355,82 + 10 179, 31 + 7 "Triton" (200 mg/kg) G.M. + 100 orale 210,37 + 9 130,92 + 9 "Triton" (200 mg/kg) TABLEAU III Dosage des triglycérides et du cholestérol chez les rats Wistar pesant 10 g et ayant subi un traitement après induction de l'hyperlipémie au moyen de "Triton" (200 mg/kg intraveineux). On administre le produit en cours d'examen dans un véhicule à base de "Tween". Composé Dose Voie Triglycérides Cholestérol (mg/kg) d'administration (mg%) (mg%) Témoins Solution orale 111,62 + 3 71,81 + 2 physiologique - (2 ml/kg) "Triton" 200 i.v. 179,78 + 7 193,78 + 7 G.G.M. + 50 orale 347, 82 + 9 172,36 + 9 "Triton" (200mg/kg) G.G.M. + 100 orale 202,23 + 6 116, 75 + 9 "Triton" (200 mg/kg 24850 19 Activité lipoprotéinolipasique (Test d'Ediol) On a examiné les effets de dégagement par Ie-produit selon l'invention sur des rats mâles albinos Wistar pesant en moyenne 190 - lOg selonBianchini (P. Bianchini, G. Guidi, B. Osima: "Blood Levels of the Clearing Factor After Administration of a Natural Glucuronoglucosaminoglycan' - Biochem. Expl. Biol. - X (n.3), 1972). On a choisi les animaux au hasard et on les a divisés en groupes de 6, l'alimentation des animaux se faisant de manière usuelle. (a) Réponse à une dose unique en fonction du temps On a injecté par voie endoveineuse à raison de 10 mg/kg et en un volume de 5 ml/kg dans une solution physiologique les compositions pharmaceutiques, c'est-à-dire le dérivé selon l'invention et le dérivé selon Cushing ayant une activité anticoagulante de 10 unités Pharmacopée U.S./mg. Après des laps de temps prédéterminés, qui sont de 5, 10, 20, 40, 60 et 90 minutes, on a soumis les animaux à une-anesthésie à l'éther et un échan- tillon de 5 ml de sang est prélevé par ponction cardiaque en utilisantune seringue sèche préalablement traitée aux silicones. On a.versé rapidement le sang dans des tubes gradués pour centrifugation contenant 0, 28 ml d'une solution à 20 % de citrate de sodium. On'a centrifugé la matière à une vitesse de 4000 tours/minute pendant 15 minutes, puis on a séparé le plasma limpide. On a préparé des tubes à essai contenant 1 ml d'une solution à 0,18 % d'un émulsion de lipides qui a'été stabilisée en "lipostrate" (Ediol-Calbiochem), émulsion qui a été préalablement filtrée. On a placé dans chaque tube à essai un échantillon du plasma à étudier à raison de 2 ml. On a pris soin de-laisser passer une minute lors de la préparation de tous les échantillons de sorte qu'on pouvait obtenir une lecture correcte -exactement après trente secondes dans chaque cas et des lectures ultérieures 15 minutes après l'incubation du plasma selon Ediol à 25 C. On a effectué les lectures spectrophotométriques de la-densité optique du mélange à 600 nm. Pour la détermination de l'activité de dégagement, on- a réglé la lecture de la densité optique à 100, la lecture- de la densité optique étant effectuée après trente.secondeset étant normalement d'environ o 0,700 A. L'activité de dégagement est exprimée en pourcentage de la valeur obtenue et les lectures ultérieures sont exprimées en (=A%). * Les résultats démontrent qu'avec une dose de 10 mg/kg, la valeur %I atteint un maximum de -27% 5 minutes après l'administration, alors que le dérivé préparé selon Cushing ayant une activité anticoagulante résiduelle de 10 unités Pharmacopée U.S./mg atteint une valeur maximale de -50% dix 16 - minutes après l'administration. - Dans les deux cas, l'activité de dégagement disparaît 40 minutes après l'administration. - (b) Réponse aux rapports dose/effet On a effectué une autre série d'essais par le même procédé que ci-dessus, selon lequel on a administré toujours. à des rats par voie intraveineuse des doses croissantes de G.G. M. et plus précisément des doses de 0,2, 0,3, 0,6, 0,8, 1,z2, 3 etSmg/rat. Cinq minutes après l'administration, on a sacrifié les animaux et. par les procédés déjà décrits, on a établi la courbe dose/effet.- Cette courbe a permis de déterminer la valeur DE50 qui se révèle comme étant égale à 2,3 mg/rat, c'est-à-dire 11,5 mg/kg. La dose efficace minimale est de 0,75 mg/rat et elle est de 3,75 mg/kg avec une diminution linéaire pouvant aller jusqu'à 2,5 mg/rat.: Des essais indiqués ci-dessus, on a pu déduire que l'indice thérapeutique- du produit selon l'invention est compris entre 550 et 1700, alors que l'indice --- thérapeutique du dérivé selon Cushing est 700 à 2300. - Par la comparaison de l'activité de dégagement de G.G.M. et du produit- de Cushing, on a pu arriver à la conclusion que l'activité de dégagement du produit selon l'invention représente la moitié-de celle de ce dernier. --Cushing stipule en fait que la dose thérapeutique est comprise entre 0, 5 et mg/kg et que la dose optimale est de 1 à 3 mg/kg, ce qui correspond à un intervalle de 70 à 210 mg selon le poids du corps du patient. Pour obtenir l'activité de dégagement en thérapie par la voie parenté- rale, la dose optimale dans le cas de G.G.M. est de 2 à 10 mg/kg, c'est-à- dire de 140 à 700 mg selon le poids du corps. Cette conclusion découle également des résultats obtenus dans les essais concernant la dyslipidémie induite par "Triton" chez les rats.. La comparaison des deux compositions en ce qui concernela dose optimale en fonction du poids du corps et en considérant que l'activité anticoagulante du dérivé de Cushing est de 10 U.I./mz alors que celle de G.G.M. est de 0,05 U.I./ mg déterminée par la méthode Pharmacopée USpermet d'aboutir à la conclusion que le traitement par ce dernier- composé donne une activité anticoagulante comprise entre 7 et 35 unités Pharmacopée U.S./poids du corps/administration, alors que la thérapie par le dérivé de Cushing donne une activité anti- coagulantede 700 à 2100 unités Pharmacopée U.S./poids du corps/administration. L'avantage découlant du plus faible risque d'hypocoagulabiIité est évident à l'examen des données ci-dessus, particulièrement quand on considère qu'avec le prolongement du traitement, l'hypocoagulabilité peut se produire et ce risque est plus faible quand on emploie le produit selon l'invention. 248501-9 Cet avantage augmente encore du fait que l'absorption par voie orale de G. G.M. est telle que les niveaux hématiques.les niveaux de triglycérides et ceux du cholestérol subissent une baisse importante, ce qui contribue à augmenter l'intérêt d'une thérapie par voie orale. Données de pharmacologie clinique On administre G.G.M. par voie intraveineuse, dans des conditions de jeûne, aux dosages indiqués ci-dessous, en dissolution dans 6 ml d'eau distillée apyrogène à des volontaires en bonne santé qu'on divise en quatre groupes: Groupe I: 6 sujets (3 mâles, 3 femelles) âgés de 25 à 35 ans. Dose = 90 mg, ce qui représente 1,3 à 1,6 mg/kg de poids corporel. Groupe II: 6 sujets mâles âgés de 35 à 50 ans. Dose = 100 mg, ce qui représente 1,3 à 1,5 mg/kg. Groupe III: Les mêmes 6 sujets que dans le groupe II mais 3 semaines après le premier traitement. Dose = 300 mg, ce qui représente 3,9 à 4,5 mg/kg. Groupe IV: 6 sujets (4 mâles et 2 femelles) âgés de 50 à 60 ans. Dose = 150 mg, ce qui représente 1,9 à 2,8 mg/kg. Au temps 0, on fait un prélèvement sanguin pour la détermination de base et immédiatement après on administre le produit G.G.M. On effectue en- suite des prélèvements sanguins aux temps de 5' - 10' - 30' - 60'. On effectue les déterminations partiellement sur du plasma traité au citrate, et partiellement sur le sang "in toto". La centrifugation se fait à 3000 tours/minute pendant 15 minutes. Déterminations: activité lipasémique (LPL, exprimée en t %) selon le test d'Ediol précédemment mentionné; glycérine libre (exprimée en millimoles par litre de plasma); acides gras non estérifiés (AGNE exprimés en méq/litre de plama); temps de thrombine partiel (TTP en secondes) selon les procédés cliniques normaux. RESULTATS GROUPE I Activité LPL Glycérine libre AGNE Temps (moyenne) (moyenne) (moyenne) 0 92,53 0,062 0,462 ' 61,39 0,193 0,683 ' 76,99 0,119 0,583 i 601 88,59 I 0,081 0,474 I. I Observations: 1) L'activité LPL semble atteindre son maximum déjà 5 minutes après l'administration de G.G.M. avec une réduction de 33,6 % de la turbidité de l'Ediol à 600 nm. 2) Déjà après cinq minutes on observe une augmentation de plus de % de glycérine libre; après 60 minutes l'augmentation est beaucoup plus faible mais existe toujours. 3) De nouveau après cinq minutes la teneur en AGNE augmente d'environ % par comparaison avec le temps O. GROUPE II Observations: l) Dix minutes après l'administration on observe les plus fortes augmentations de l'activité L.P.L. (24%), de glycérine libre (environ 150%) et de AGNE (environ 120 %). 2) La valeur de T.T.P. reste sensiblement égale à la valeur de base pour tous les sujets. GROUPE III Observations: 1) Au dosage de 300 mg.(toujours après lO minutes), on observe des Temps Activité LPL Glycérine libre AGNE TTP (moyenne) (moyenne) (moyenne) 0 92,82 0,084 0,408 24 ' 70,82 0,206 0,899 25 ' 78,50 0,114 0,550 25 ' 84,49 0,084 0,521 24 Temps Activité LPL Glycérine libre AGNE TTP Temps (moyenne) (moyenne) (moyenne) 0 99,49 0,104 0,159 26 ' 50,67 O,440 0,921 26 ' 50,68 0,405 0,681 25 ' 68,59 0,262 0,617 26 ;- - 19 maxima d'activité qui sont nettement plus élevés que les valeurs précédentes: 49 % pour l'activité L.P.L.; environ 300 % pour la glycérine libre; et environ 450 % pour AGNE. Ces valeurs restent très marquées après 60 minutes. 2) Les valeurs de T.T.P. sont pratiquement constantes et égales à la valeur de base. GROUPE IV Les résultats sont parallèles à ceux des groupes précédents.- Pour les groupes II, III et IV, en outre, on détermine le lipidogramme (/o-liporotéines, pré-/-lipoprotéines,- Kilomicrons) par néphélométrie; les valeurs sont exprimées en mg par 100 ml de sérum. On a remarqué: a) chez les sujets du groupe II, la valeur de A-lipoprotéines au temps O (425-450) diminue à environ 250 après 10 minutes et, de ce fait, cette valeur se situe entre 250 et 300 après 60 minutes alors que les pré-A - lipoprotéines et les Kilomicrons restent sensiblement constants (270-280 et respectivement 11,7 - 12,2). b) Groupe III la valeur de base des/3-lipoprotéines diminue dans ce cas à environ 120 aprèslO minutes et devient 150 à 220 après 60 minutes. On ne constate aucune variation notable pour les pré- A-iipoprotéines et les Kilomicrons. c) Groupe IV: La valeur des /A-lipoprotéines diminue de 190 à 220 (temps O) à 120-130 après 10 minutes, en conservant ce niveau également après 60 minutes. Les pré-/,5-lipoprotéines restent sensiblement inchangées mais-on constate unelégère diminution des Kilomicrons. - Activité LPL Glycérine AGNE TTP Temps (moyenne) libre (moyenne) (moyenne) O 99,4 0,0599 0,410 24 ' 72,78 0,10o84 0,814- 23 ' 74,63 0,0740 0,780 24- ' 81,44 0,0494 0,656 24 . Zy. REVENDICATIONS-, k. -riV ouccltylique d'héparine. désulfatée, caractérisé en ce que le nombre de groupes N-sulfate présents est égal a moins de 10 % de celui dans lrhéparine de départ - et en ce que le rêsidu.succipylique par motif de disaccharide représente. une proportion supérieure- à 0,6.. 2. Dérivé selon la revendication I, caractérisé en ce que le résidu suc:cinylique'est présent à raison d'environ 1,2 motif par motif de résidu de disaccharide.... - - 3. Dérivé selon la revendication 1 ou 2, caractérisé en ce que son activité anticoagulante est 0.05 U.I./ mg.. .. .. 4. Procédé de préparation d'un dérivé tel que défini dans- la revendication 1, caractérisé en ce qu'on hydrolyse l'héparine avec un acide fort au moins 0,1-N A une température supérieure a la température ambian.te et fait réagir le produit-d'hydrolyse avec l'anhydride succinique à un pH de plus de 7. 5. Procédé selon la revendication 4, caractérisé en ce que la température est de 70 & 100 C et. en ce qu'on-effectue l'hydrolyse pendant une durée de'plus de 3 heures-. 6. Procédé selon la. revendication 4,ou 5,'-eAractértsé en ce qu'on utilise un acide fort au moins O,SN. -. 7. Procédè selon la revendication 4, 5 ou 6, caractérise en ce que le rapport pondérai de l'anhydride succinique au produit- de ladite hydrolyse est compris entre t: 1 et 5:' I.. 8. Composition pharmaceutique pour letraitement de la dyslipidémie, caractérisée en ce qu'elle contient à titre d'ingrédient actif le dérivé succinylique d'héparine selon la revendication 1, 2 ou 3. - -.9. Compo:sition selon. la revendication 8,.caractéris'ée en ce'qu'elle est sous forme de doses unitaires appropriées pour une administration par voie parentérale. 10. Composition-'selon la revendication 8, caractérisée en ce qu'elle est sous forme de doses unitaires convenant pour une admi- nistration par voie orale. 248.5019