FR 2479851 A1 19811009 FR 8100869 A 19810119 Les hormones humaines sont de plus en plus nécessaires pour la thérapie. L'hormone insuline en fait, entre autres, partie. Etant donné qu'il est impossible d'obtenir des hormones en plus grandes quantités à partir d'organes humains, on a dû dévelop- per des techniques appropriées pour produire ces hormones à partir de sources autres que l'organisme humain. La présente invention met en évidence un tel procédé. Elle concerne l'isolement de séquences de nucléotides qui contiennent le code génétique pour une protéine spécifique, la synthèse de l'ADN avec ces séquences de nucléotides spécifiques et le transfert de cet ADN dans un microorganisme choisi comme hôte, dans lequel ont lieu la réplique et l'expression de cet ADN. On sait préparer des polypeptides et des protéines par culture de bactéries qui portent des plasmides avec des gènes, qui codent pour les polypeptides ou protéines souhaités. On sait en outre qu'il est possible de construire des plasmides qui amènent leur hôte porteur à préparer des produits de gène qui, de par leur nature, ne sont pas caracté- ristiques pour lui. On sait également que des techniques de recombinaison d'ADN permettent de cloner l'information génétique de la pré-proinsuline de rat dans des bactéries. On a pu montrer que ces bactéries expriment une protéine qui possède les déterminants antigèniques de l'insuline. On sait encore que l'in- formation génétique des chaînes A et B de l'insuline humaine a été clonée séparément dans des bactéries. Ceci a pu être obtenu en synthétisant de nouveau les ADN correspondants pour les chaînes A et B. Les chaînes A et B produites par les bactéries ont pu alors être recombinées in vitro en une molécule d'insuline. Mais aucune de ces techniques n'a conduit à -2- un produit pharmaceutique utilisable en thérapie humaine. Dans le cas de proinsuline de rat le produit final, l'insuline de rat, est une protéine qui produit des réactions allergiques. Dans le cas des chaînes A et B humaines, les propriétés de la chaîne B, en raison de sa tendance à la polymérisation, et le très mauvais rendement concernant la combinaison des chaînes A et B s'opposent au but final, l'insuline humaine. La présente invention propose donc une autre voie. On sait que l'insuline de singe et l'insuline humaine possèdent une structure identique. Si on parvient à préparer la proinsuline de singe, on peut alors par scission obtenir l'insuline humaine. La présente invention concerne donc en particulier la préparation de gènes pour la proinsuline de singe, le transfert de ces gènes dans un hôte microbien, la réplique de l'hôte et du gène et l'expression du gène par l'hôte. On obtient alors des protéines qui contien- nent les séquences d'acides aminés de la proinsuline du singe. Pour atteindre le but de l'invention, on peut procéder de la manière suivante, la voie décrite étant donnée à titre d'exemple parmi plusieurs autres possibles. On obtient des cellules isolées à partir de pancréas de singe, dé préférence de singe rhésus ou de cynomolgus, par une digestion protéolytique qui doit être réglée très soigneusement pour éviter une décomposition ultérieure possible, suivie d'une centri- fugation. A partir de ces cellules, par centrifugation avec un gradient de densité, on obtient une couche riche en cellules /. Cette couche de cellules est dénaturée et l'ARN est recueilli sous forme d'un précipité après une centrifugation dans le chlorure de césium. Après une autre précipitation, le mARN(ARN messager) est séparé de cet ARN sur une colonne d'oligo-dT-dellulose. Le mARN obtenu est complété en une double chaîne ARN-ADN à l'aide de l'enzyme réverse transcriptase. Après -3- digestion de la chaîne d'ARN, la chaîne d'ADN (ADN complémentaire = cADN) est complétée en une double chaîne ADN-ADN (dsADN) au moyen de la réverse transcriptase ou de l'enzyme polymérase I. Cet ADN à double chaîne doit alors être incorporé dans un plasmide. Dans ce but, on doit prolonger l'extrémité 3' de l'ADN avec des restes dCMP (désoxycytosine monophosphate) par exemple. Le plasmide (par exemple pBR 322) est scindé avec la nucléase de restriction PstI et prolongé par exemple avec des restes dGMP (désoxyguanadine monophosphate). Il résulte de la réunion de l'ADN ainsi prolongé avec le plasmide prolongé de façon correspondante un appariement de base entre l'ADN et le plasmide. Cette molécule rendue circulaire est alors transformée dans des microorganismes (avant tout des bactéries, de préférence E. coli, tel que E. coli K 12 ou X_1776); les liaisons non encore fermées sont reliées de façon covalente par les enzymes du microorganisme. Les microorganismes transformés sont étalés sur des plaques de gélose et sélectionnés quant aux résistances aux antibiotiques, conférées par le plasmide choisi et la nucléase. de restriction utilisée. A l'aide de tests immunologiques, on cherche les clones qui expriment des protéines contenant de l'insuline. On cultive ces clones, on sépare la masse de microorganismes par centrifugation, on extrait et on détermine la teneur en insuline. Dans une série de clones, on a pu alors mesurer des valeurs en -insuline supérieures à une unité d'insuline ( =1i.I) par litre de solution de culture. Cette solution de culture sert de matériau de départ pour l'obtention de proinsuline de singe puis d'insuline humaine. Les procédés selon l'invention peuvent être mis en oeuvre de la manière suivante. 1. Procédé d'isolement de l'ARN a) L'isolement de cellules de pancréas productrices d'insuline. -4- Dans ides conditions stériles, on prélève les pancréas de primates, de préférence de singe rhésus ou de cynomolgus, et après avoir retiré la peau et les plus gros vaisseaux sanguins, on fractionne d'abord mécaniquement au moyen de ciseaux. Il faut alors veiller à ce que le tissu reste bien froid pendant le travail, pour éviter une auto-désagrégation en raison du mélange pancréatine-enzyme qu'il contient. Le tissu en petits morceaux est lavé plusieurs fois avec du sérum de mammifère refroidi, de préférence du sérum de veau, puis introduit dans de petits ballons et on y ajoute une solution chaude de collagénase à 0, 125% dans le PBS (solution saline tamponnée au phosphate). La solution de collagénase doit toujours être préparée immédiatement avant son utilisation. L'addition simultanée d'au moins 20% de sérum, de préférence du sérum de veau, au collagénase est déterminante pour le rendement en cellules de pancréas. On agite ce mélange pendant 10 minutes et on élimine d'abord la totalité du produit surnageant. On ajoute de nouveau un mélange collagénase-sérum et on agite pendant 6 à 10 minutes environ. On répète ce processus environ 10 fois et on rassemble les produits de décomposition ainsi obtenus dans un récipient froid. Dans une centrifugeuse froide, on centrifuge à 1000 -tours/minute pendant 10 minutes environ le matériau réuni avec les cellules obtenues par voie enzymatique, on élimine le produit surnageant et on remet le culot de cellules en suspension dans un milieu de Dulbecco frais avec lg/1 de glucose et % de sérum de veau. On répète cette centrifugation et on remet le culot alors obtenu en suspension dans ml de milieu de Dulbecco avec addition de 15% de sérum. On soumet ensuite ce matériau cellulaire, qui est constitué d'un mélange de cellules f, de fibroblastes et de cellules épithélioldes, à une -5séparation par gradient de densité, par exemple avec du Ficoll ou du Percoll. A cet égard, un gradient de densité au Ficoll s'avère le meilleur. On dissout à cet effet du Ficoll 400/Pharmacia dans un milieu de Dulbecco sans sérum et on règle dans un réfractomètre à une viscosité de 1,38 ou avec la broche à une densité de 1,16, on filtré dans des conditions stériles sur un filtre à membrane ayant une ouverture de pore de 0,45J4m et on conserve à +40C jusqu'à l'emploi. A partir de cette suspension de Ficoll initiale, on règle des densités avec une viscosité de 1,373, 1,370 et 1,3672 par addition de milieu de Dulbecco et on superpose les couches dans de petits tubes à centrifuger. On place au-dessus les cellules de pancréas remises en suspension et on centrifuge pendant 10 minutes à +40C et 3200 tours/minute. Après la centrifugation, on recueille avec précaution les bandes individuelles et on élimine le Ficoll résiduel par lavage avec du milieu de Dulbecco. La masse principale des cellules--l productrices d'insuline est concentrée sur les couches supérieures avec la densité la plus faible et une viscosité de 1,3672. b) Obtention de 1'ARN On fixe les cellules obtenues dans un "milieu dénaturant" (thiocyanate de guanidinium 4 M, mercaptoéthanol 1 M, acétate de sodium 0,15 M - pH 5,5) et on homogénéise pendant 1 minute à 00C avec une Ultra-Turrax. On chauffe la solution pendant 5 minutes à 800C et on place immédiatement dans un bain de glace. On la verse ensuite sur une solution ("coussin") de 5 ml de CsCl 5,7 M, tris-hydroxy- a&unométhane 10 mM (Tris), acide éthylène diamine tétraacétique (EDTA) 10 mM de pH 7,6 et on centrifuge dans un rotor Beckman-SW 27 pendant 36 heures à 200C et 22000 tours/minute. On a trouvé que, contrairement aux indications de la littérature, il faut éviter d'ajouter du CsCl au lysat pour obtenir une séparation - 6 - la plus totale possible du mARN au stade réactionnel suivant. Lorsque la centrifugation est terminée, on réfrigère les petits tubes de polyallomère dans de l'azote liquide et on découpe le fond du tube sur lequel se trouve le précipité d'ARN. On reprend le précipité dans une solution de 10 mM de tris, 10 mM d'EDTA et 1% de "Sarcosyl" (sel de sodium de la N-lauryl-sarcosine) de pH 7,6 et on sépare la suspen- sion par centrifugation à 20000 tours/minute pendant 20 minutes. On reprend encore une fois le précipité obtenu dans le même tampon, on chauffe pendant 5 minutes à 65 C et on répète la centrifugation. On ajoute de l'acétate de sodium aux produits surnageants réunis de façon à avoir une concentration 0,3 M en acetate de sodium, on ajoute 2,5 fois le volume d'éthanol et on conserve à -20 C. 2. Obtention du mARN On sépare l'ARN par centrifugation à partir de la solution éthanolique (20000 tours/minute, 30 minutes, -5 C) et on dissout dans NaCl 0,5 M et mM de tris à pH 7,5. On verse cette solution sur une colonne d'oligo-dT-cellulose (fabricant: Collaborative Research, type 3), équilibrée avec le même tampon, et on élue avec 1 mM de tris à pH 7,6 ou de l'eau distillée. On peut suivre l'élution de l'ARN contenant des polyA (mARN) par une mesure de l'extinction à 260 nm. A i'ARN ainsi obtenu on ajoute de l'acétate de sodium jusqu'à une concentration finale de 0,3 M, on ajoute 2,5 fois le volume d'éthanol et on conserve la solution à -20 C. 3. Obtention du cADN a) Obtention du cADN à simple chaîne On effectue la conversion du mARN en l'ADN correspondant (cADN) à l'aide de l'enzyme réverse transcriptase. La préparation d'incubation contient: mM de tris, pH 8,3, 10 mM de MgC12, 30 mM de 2-mercapto-éthanol, 0,5 mM au total des 4 désoxyribo- nucléoside triphosphates usuellement presents (soit - 7 les triphosphates d'adénine, de guanine, de cytosine et de thymidine), 100.t g/ml d'oligodT12_18 (fabricant: Boehringer Mannheim), environ 100 i g/ml d'ARN polyadénylé et 800 unités/ml de réverse transcriptase (fabricant: Life Science Inc., St-Petersburg, USA). Pour suivre la réaction, on peut ajouter à la préparation un désoxyribonucléoside triphosphate marqué au 32p en position (activité spécifique: 50 Ci/mmole). On incube le mélange pendant 60 minutes à 42 C, après quoi on arrête la réaction par addition de 20 mM d'EDTA. On extrait la solution avec un même volume de phénol saturé d'eau, on sépare le phénol par agitation avec de l'éther et on chasse le reste d'éther par évaporation à l'azote. Les désoxyribonucléoside triphosphates non incorporés sont séparés par chromatographie sur colonne de Sephadex G50 dans 10 mM de tris, pH 9,0, 100 mM de NaCl et 1 mM d'EDTA. On précipite le cADN par addition d'acétate de sodium jusqu'à concentration de 0,3 M et de 2,5 fois le volume d'éthanol. Après centrifugation, on reprend le précipité dans NaOH 0,1 M et on incube pendant 20 minutes à 70 C ou dans NaOH 0,3M pendant une nuit à la température ambiante. On ajuste le pH du mélange à une valeur de 7,6 avec HC1 1 M et du tris 1 M. b) Formation du cADN à double chaîne (ds-ADN) Pour synthétiser la seconde chaîne d'ADN, on peut utiliser de nouveau l'enzyme réverse transcriptase ou l'enzyme polymérase I. Formation du dsADN avec la réverse transcriptase La préparation d'incubation (pH 8,3) contient mM de tris, 10 mM de MgC12, 30 mM de 2-mercaptoéthanol, 0,5 mM des 4 désoxyribonucléoside triphosphates mentionnés ci-dessus, J)4g/ml de cADN et 800 unités par litre de réverse transcriptase. On effectue la réaction pendant 120 minutes à 42 C et on l'arrête par une addition d'EDTA jusqu'à une concentration finale de 20 mM. On extrait ensuite au phénol et on effectue une chromatographie - 8 - par perméation de gel sur Sephadex G50 tel que décrit ci-dessus. Formation du dsADN avec la polymérase I La préparation d'incubation (pH 6,9) contient 200 mM d'Hepes, 0,5 mM des 4 désoxyribonucléoside tri- phosphates mentionnés ci-dessus, 10 mM de MgC12, mM de 2-mercaptoéthanol et 70 mM de KC1. On peut suivre la réaction en ajoutant des désoxyribonucléotides marqués au 32P ( en des positions mM de tris pH 9,0, 100 mM de NaCl et 1 mM d'EDTA. On peut déterminer l'ADN par mesure de la radioactivité et on précipite par addition de 0,3 M d'acétate - 20 de sodium et de 2,5 fois le volume d'éthanol. On reprend le précipité dans l'éthanol dans une solution (pH 4, 5) de 300 mM de NaCl, 30 mM d'acétate de sodium et 3 mM de ZnC12 et on ajoute 1500 unités/ml de nucléase Sl (Boehringer Mannheim). On arrête la réaction après une heure à 37 C en ajoutant de l'EDTA jusqu'à une concentration finale de 20 mM. On extrait au phénol et on précipite à l'éthanol tel que décrit ci-dessus. c) Obtention du cADN dans un "procédé en unseul récipient D'une façon différente des réactions décrites, on peut également obtenir le dsADN à partir du mARN dans un "procédé en un seul récipient. On effectue alors la réaction avec la réverse transcriptase tel que décrit, mais on ajoute encore à la préparation d'incubation mM de KC1. Lorsque la réaction est terminée, on chauffe le mélange pendant 4 minutes à 100 C et on sépare le précipité formé par centrifugation. Au produit surnageant, on ajoute le même volume de tampon d'Hepes 0,4 M (pH 6,9), les 4 désoxyribonucléotides -9- mentionnés ci-dessus étant alors présents dans le tampon à une concentration de 0,5 mM. En ajoutant 800 unités/ml de polymérase I, on effectue la réaction à 15 C tel que décrit et on arrête la réaction- par addition de dodécyl sulfate de sodium et d'ARN. Puis on procède tel qu'indiqué en 3.b "Formation du dsADN avec la polymérase I". 4. Prolongement des extrémités 3' du cADN avec le dCTP (désoxycytosine triphosphate) - Pour l'introduction dans le plasmide, il faut prolonger l'extrémité 3' de l'ADN avec l'un des 4 désoxynucléotides mentionnés ci-dessus. On prolonge en outre les extrémités 3' du plasmide scindé avec le désoxynuCléotide complémentaire. En réunissant l'ADN et le plasmide, il se forme un appariement de base entre l'ADN et le plasmide. Cette molécule rendue de nouveau circulaire peut être utilisée pour la transformation des bactéries; les liaisons non encore fermées sont liées de façon covalente par un système d'enzyme dans la bactérie. On peut par exemple prolonger les extrémités 3' du cADN avec des restes de dCMP (restes de désoxycytosine monophosphate) et le plasmide avec des restes de dGMP (restes de désoxyguanidine monophosphate). En utilisant ces désoxynucléotides selon le procédé décrit et en ouvrant le plasmide par l'enzyme de restriction Pst I, après incorporation d'ADN étranger il se forme de nouveau un site de scission de Pst I sur chaque site d'insertion, de sorte qu'après multiplication du plasmide, l'ADN inséré peut être de nouveau "découpé" facilement avec l'enzyme de restriction Pst I pour une autre étude. On dissout le précipité résultant de la pré- cipitation par un alcool après dégradation par la nucléase S1 dans une solution aqueuse (pH 6,7) contenant 30 mM de tris, 1 mM de CoC12, 140 mM de cacodylate de potassium, 150 AM de dCTP, 100 ÀMg d'hydrolysat de gélatine autoclavé et 0,1 M de dithioérythrite. Pour - 10 - suivre la réaction, on peut utiliser un dCTP marqué au P. La réaction est déclenchée par addition de désoxynucléotidyle transférase terminale et effectuée pendant 10 minutes à 370C. Lorsque la réaction est ter-minée, on place l'échantillon dans la glace et on détermine le nombre de restes de dCMP incorporés, par mesure de la radioactivité dans le précipité obtenu par addition d'acide trichloracétique. Au cours de la réaction, on devrait ajouter environ 10% des nucléotides initialement présents; si tel n'est pas le cas, la réaction est poursuivie en ajoutant une autre quantité d'enzyme. Si un trop grand nombre de restes de dCMP ont été incorporés, la chaîne formée peut être raccourcie à l'aide de l'enzyme nucléase S 1. 5. Procédé d'intégration d'ADN dans un plasmide On scinde un plasmide circulaire approprié, par exemple le pBR 322, avec une endonucléase de restriction qui ne reconnaît qu'une séquence sur le plasmide. Il est avantageux que ce site de scission se trouve derrière un promoteur puissant ou inductible et/ou soit localisé de façon à influencer une résistance aux antibiotiques. Ce plasmide ainsi linéarisé est alors prolongé par un des 4 désoxynucléotides aux extrémités 3'. - Ceci a lieu par exemple de la manière suivante: on incube 30 _ig de plasmide avec 50 unités *d'endonucléase de restriction Pst I en présence de mM de NaCl, 6 mM de tris, 6 mM de MgCl2, 6 mM de 2-mercaptoéthanol et 0,1 mg/ml de gélatine pendant 40 minutes à 370C et à une valeur de pH de 7,5. On extrait ensuite au phénol et à l'éther tel que décrit ci-dessus et on précipite le plasmide scindé par l'éthanol en présence de 0,3 M d'acétate de sodium. Le prolongement des extrémités 3' du plasmide avec le dGTP (désoxyguanidine triphosphate) se fait selon le procédé de prolongement du cADN avec le dCTP, décrit ci-dessus. On mélange l'ADN plasmique prolongé dans une - 11 - solution (pH 8,0) contenant 0,1 M de NaCl, 10 mM de tris, et 1 mM d'EDTA, avec le ds cADN prolongé, on chauffe pendant 2 minutes à 56 C, on incube pendant 2 heures à 42 C, puis on refroidit lentement à la température ambiante. L'ADN hybride ainsi obtenu est alors utilisé pour la transformation de E. coli. 6. Clonage du plasmide hybride dans E. coli On laisse proliférer les bactéries, par exemple E. coliX..1776 à 37 C dans 50 ml d'un milieu nutritif usuel jusqu'à une densité optique de A600 = 0,5 - 0,6, on sédimente, on lave une fois avec du tris 10 mM pH 7,5, puis on remet en suspension dans ml d'une solution contenant 75 mM de CaC12, 5 mM de MgC12 et 5 mM de tris de pH 8,0 et on incube dans la glace pendant 20 minutes. On sédimente ensuite les cellules et on remet en suspension dans 2 ml d'une solution contenant 75 mM de CaC12, 5 mM de MgC12 et mM de tris pH 8, 0. On mélange 0,2 ml de cette suspension de bactéries avec 0,1 ml de la solution d'ADN hybride et on incube sur de la glace pendant 45 minutes. On chauffe pendant 90 secondes à 42 C et on mélange avec 0,2 ml d'un milieu nutritif. On étale 50 à 75l1 de cette suspension sur des plaques de gélose contenant de la tétracycline et de l'ampicilline et on sélectionne quant à la résistance aux antibiotiques. 7. Isolement de souches qui produisent des protéines contenant de l'insuline. A l'aide d'un système d'essai-élaboré par Broome et Gilbert (Broome S. et Gilbert E., PNAS 75, 2746, 1978), on étudie les clones quant à l'expression des protéines contenant de l'insuline. Les clones qui expriment des protéines contenant de l'insuline, sont reconnaissables par fixation d'anticorps radioactifs sur ces protéines et autoradiographie ultérieure, par le fait que le film Rdntgen est noirci en ces sites. - 12 - Dans ce but, on laisse se développer jusqu'à 50 clones par filtre de nitrocellulose pendant 2 jours à 370C. Puis on place les filtres sur un bloc de gélose qui contient 1 mg/ml de lysozyme; sur la colonie de bactéries, on applique une feuille de chlorure de polyvinyle (PVC) enduite d'anticorps opposés à l'insuline, pu!s on incube pendant 2 à 3 heures à 40C. On incube ensuite la feuille de PVC pendant.15 heures à 4WC dans une solution d'anticorps opposés à l'insuline marqués à 132I. L'activité spécifique de la solution est d'environ 1 x 10 cpm/ml. Après lavage et séchage de la feuille, on procède à l'autoradiographie. Dans un milieu nutritif usuel, on cultive les clones à réaction immunologique insulinique sur la plaque, on sépare les bactéries par centrifugation, on extrait et on détermine la teneur en insuline par un dosage radioimmunologique. Un certain nombre de clones montrent alors des valeurs en insuline supérieures à 1 UI par litre de solution de culture. - 13 - - REVENDICATIONS - 1. Polypeptide préparé par voie microbiolo- gique, caractérisé en ce qu'il contient totalement ou partiellement la séquence d'acides aminés de la proinsuline de primates. 2. Polypeptide préparé par voie microbio- logique selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'il contient totalement ou partiellement la séquence d'acides aminés du peptide C de la proinsuline de primates. i 3. cADN codant pour les séquences d'acides aminés de la proinsuline selon la revendication 1 ou 2, caractérisé en ce qu'il est préparé au moyen de mARN de primates. 4. Plasmide codant pour les séquences d'acides aminés selon la revendication 1 ou 2, caracté- risé en ce qu'il est préparé à partir du cADN selon la revendication 3 et d'un plasmide, de préférence le plasmide pBR 322. 5. Microorganisme, en particulier E. coli, avec l'information génétique pour la biosynthèse du polypeptide selon la revendication 1 ou 2. 6. Procédé de préparation du polypeptide selon la revendication 1 ou 2, caractérisé en ce qu'il consiste à obtenir l'information génétique pour la biosynthèse du polypeptide au moyen de mARN de primates, à incorporer le gène obtenu, d'une manière connue en soi, dans des microorganismes et à sélectionner et cultiver d'une manière connue en soi les microorganismes qui produisent ce polypeptide. 7. Procédé de préparation de cADN selon la revendication 3, caractérisé en ce qu'il consiste à obtenir l'ARN à partir du pancréas de primates, a isoler le mARN et, au moyen de ce dernier, à préparer le cADN d'une manière connue en soi. 8. Procédé selon la revendication 7, caractérisé en ce que, lors de l'obtention de cellules - 14 - isolées à partir du pancréas de primates, on utilise un sérum de mammifère, de préférence du sérum de veau, en une quantité de préférence au moins égale à 20% du volume global et on produit l'ARN à partir des cellules isolées ainsi obtenues. 9. Procédé de préparation d'un microorganisme selon la revendication 5, caractérisé en ce qu'on transforme un microorganisme, de préférence E. coli, avec un plasmide selon la revendication 4. 10. Procédé d'obtention d'ARN, caractérisé en ce qu'on dépose un lysat exempt de chlorure de césium sur une solution aqueuse et concentrée de chlorure de césium, on centrifuge et on obtient l'ARN.