FR 2478125 A1 19810918 FR 8105347 A 19810317 PROCEDES ET MATERIEL GENETIQUE POUR LA PRODUCTION OPTIMALE DE PROTEINES La présente invention concerne des procédés et un matériel génétique pour la production optimale de pro- téines. L'invention concerne en particulier des fusions de gènes pour produire une quantité optimale de poiypep- tides. Dans une publication de Backman et Ptashne, Cell, Vol. 13, pages 65-71 (1978), on décrit un procédé pour produire une protéine non soudée par création, en avant du gène correspondant à la protéine, d'un site hy- bride de fixation ribosomique constitué d'une séquence Shine-Dalgarno (fixée à un promoteur portable), d'au moins deux autres paires de bases et de l'ATG (site du début de traduction) du gène de la protéine, puis clonage du gène de fusion dans micro-organisme. La quantité de pro- téine produite est en partie fonction de la longueur du site hybride de fixation ribosomique, c'est-à-dire de la distance, exprimée en paires de bases, entre la séquen- ce Shine-Dalgarno et le site de début de traduction. Pour modifier cette distance, on fait varier la position du promoteur portable, comme décrit dans la demande de bre- vet précédente. Lorsque le site hybride de fixation ribosomique a une certaine longueur optimale, la production de la pro- téine est maximalisée. Un procédé pour déterminer la posi- tion du promoteur qui produit ce site de fixation ribo- somique optimal consiste à utiliser une technique classi- que de détermination radio-immunologique pour mesurer la production de protéine. Cependant, les techniques classi- ques sont malaisées dans le cas de certains polypeptides et elles n'existent pas pour d'autres. 2478 125 La limitation des procédés classiques de déter- mination des protéines peut également gêner la détermina- tion de l'efficacité d'un site naturel de fixation ribo- somique. De même ces limitations peuvent rendre difficile ou impossible la détection d'une mutation spontanée ou in- duite provoquant un accroissement de la production d'un polypeptide. La Demanderesse a découvert un nouveau procédé pour déterminer la quantité d'un polypeptide d'eucaryote ou de procaryote produit par un micro-organisme contenant un gène désiré codant pour le polypeptide (dans la pré- sente description le terme "polypeptide' englobe les pro- téines et les polypeptides plus petits). Ce procédé consis- te à effectuer la fusion (soudure) d'une région amino- terminale d'un échantillon du gène désiré, cette région codant pour un fragment du polypeptide d'eucaryote ou de procaryote à une région de gène carboxy-terminale codant pour un fragment de polypeptide différent déterminable. On clone le gène de fusion dans un micro-organisme. o il" code la production d'un polypeptide hybride déterminable ayant un fragment aminoterminal du polypeptide désiré et un fragment carboxy-terminal du polypeptide déterminable. On mesure la quantité du polypeptide hybride déterminable cette quantité est directement proportionnelle à la quan- tité du polypeptide d'eucaryote ou de procaryote. On utilise également les principes et techniques ci-dessus selon un autre aspect de l'invention qui est un procédé pour obtenir, à partir d'un gène codant pour un polypeptide d'eucaryote ou de procaryote désiré, un échan- tillon du gène ayant subi une ou plusieurs mutations fai- sant qu'il code pour une quantité plus importante du poly- peptide désiré que des échantillons du gène n'ayant pas subi de mutation. Ce procédé consiste à se procurer des échantillons d'un gène de fusion constitué d'une région de gène carboxy-terminale codant pour un fragment de polypeptide déterminable soudée à une région de gène 24 78125 amino-terminale codant pour un fragment du polypeptide désiré. On clone les gènes de fusion dans des micro- organismes o ils produisent un polypeptide hybride dé- terminable. On sélectionne un gène de fusion quelconque ayant subi une ou plusieurs mutations spontanées faisant qu'il produit plus de polypeptide hybride que les échantil- lons n'ayant pas subi de mutation puis, à partir de ce gène de fusion, on reconstitue le gène codant pour le poly- peptide désiré, selon l'un quelconque des procédés in vitro ou in vivo habituels. Ce gène est alors prêt à être cloné dans un micro-organisme o il peut diriger la production de teneurs accrues du polypeptide désiré sous une forme pure. On peut modifier ce procédé en réalisant la mu- tagénèse des micro-organismes après le stade de clonage initial. Pour cela on peut utiliser des mutagènes classi- ques, par exemple des rayons X ou des mutagènes chimiques tels que des nitrosamines. Le procédé de sélection avec mutation est parti- culièrement utile en ce qui concerne les gènes de fusion qui ne produisent pas de quantités importantes de polypep- tide quel que soit l'emplacement du promoteur. Des muta- tions successives peuvent par la suite fournir des échantil- lons permettant une production efficace de polypeptide. Les principes et les techniques ci-dessus sont également utilisés selon un autre aspect de l'invention qui est un procédé pour obtenir des gènes ayant des sites hybrides de fixation ribosomique d'efficacité maximale. Le procédé consiste à se procurer, comme décrit ci-dessus, des échantillons d'un gène de fusion comportant une région de gène codant pour un fragment du polypeptide d'eucaryote ou de procaryote désiré soudée à une région de gène codant pour un fragment de polypeptide différent déterminable. Le gène de fusion code pour un polypeptide hybride détermina- ble ayant un fragment amino-terminal du polypeptide désiré et un fragment carboxy-terminal du polypeptide détermina- ble. Un promoteur portable est placé à des distances va- riables en avant de ce gène de fusion est on sélectionne 2478 125 les gènes de fusion dans lesquels le promoteur est dans la position produisant le maximum de polypeptide hybride détermi-nable. On reconstitue ensuite le gène du polypep- tide désiré et on peut produire des teneurs élevées du polypeptide non soudé. L'inventiorn sera mieux comprise à la lecture de la description qui suit faite en regard des dessins an- nexés dans lesquels: - la figure 1 est un schéma général d'un gène de fusion de l'invention: - les figures 2 et 3 illustrent schématiquement la structure de deux gènes de fusion de l'invention; - la figure 4 illustre schématiquement la recons- titution in vitro d'un gène: et - la figure 5 illustre schématiquement la recons- titution in vivo d'un gène. On peut utiliser dans tous les aspects de l'in- vention une région de gène carboxy-terminale codant pour un fragment de polypeptide déterminable et on peut insérer la région de gène codant pour le fragment de polypeptide désiré dans la région de gène codant pour le fragment de polypeptide déterminable différent en une position quelcon- que ne détruisant pas l'aptitude à la détermination. Pour qu'on n'ait pas à se soucier si le fragment de polypeptide désiré inséré détruira ou non l'aptitude à la détermination, avant cette insertion, on peut souder un gène ou une région de gène à la région de gène codant pour le fragment de polypeptide déterminable pour que ce gène ou cette région de gène serve de site d'insertion. Comme illustré par la figure 1, un gène de fusion de l'invention facilitant l'insertion d'un gène comme dé- crit ci-dessus, comprend, de droite à gauche, une première région de gène carboxy-terminale codant pour un fragment de polypeptide déterminable soudée à une seconde région de gène amino-terminale portant un site de restriction. Dans la présente description, on utilise les termes 2 4 78 125 "gauche" et "droite" pour indiquer des positions qui sont transcrites respectivement avant puis après. Si cette ré- gion ne porte pas naturellement un tel site, on peut y insérer un élément de liaison en ADN sensible à une ou plusieurs enzymes de restriction. Le site naturel de restriction, ou l'ADN de liaison, sert de site pour l'in- sertion dans la seconde région de gène d'une troisième région de gène qui est une région amino-terminale d'un gène codant pour un fragment d'un polypeptide de proca- ryote ou d'eucaryote quelconque désiré. Cette région peut avoir son propre site de début de traduction (ATG) ou peut être dépourvue d'un tel site. Dans ce dernier cas, on peut souder un tel site à l'extrémité gauche de la région de gène désirée. En avant de la troisième région de gène se trou- ve un promoteur qui comprend un site de début de trans- cription et une séquence Shine-Dalgarno. Ce promoteur est soit un promoteur naturel soit, dans le cas o l'on fait varier la position du promoteur, un promoteur portable. Il existe toujours au moins deux paires de bases entre la séquence ShineDalgarno et le site de début de traduction. Dans le cas du procédé de détermination n'uti- lisant pas un promoteur portable, ces paires de bases font partie bien entendu du brin d'ADN naturel comprenant le gène désiré. Dans le procédé o la position du promoteur est variable, ces paires de bases sont soit fixées à l'o- rigine à la séquence Shine-Dalgarno du promoteur soit au gène désiré soit en partie à l'un et en partie à l'autre. Si la séquence des bases de la région de gène codant pour le fragment de polypeptide désiré est connue au point que le cadre de lecture correct pour cette ré- gion de gène est connu, on place un ADN de liaison, s'il est nécessaire, de telle sorte que la région de gène dé- sirée. après l'insertion, soit en phase avec la première région de gène. Si la séquence n'est pas connue de façon appropriée, on peut insérer la région de gène désirée 2 478125 dans trois gènes de fusion différents ayant des éléments de liaison placés différemment. Les éléments de liaison peuvent être placés n'importe o sur la seconde région de gène mais seules trois positions sont nécessaires pour couvrir les trois cadres de lecture possibles. La position de l'élément de liaison qui permet que la traduction de la région de gène particulière désirée se poursuive dans le cadre de la première région de gène est celle à utili- ser avec cette région de gène. Pour obtenir des gènes de fusion dans lesquels le promoteur est dans la position optimale, on fixe un pro- moteur portable à des échantillons des gènes de fusion précédemment décrits à diverses distances de l'emplacement du site de départ de la traduction. On clone dans des micro-organismes les échantillons des gènes de fusion unis aux promoteurs. On identifie et on sélectionne les gènes de fusion portant le fragment promoteur à la distance op- timale du site de départ de la traduction en fonction de la production de la quantité maximale du polypeptide hy- bride déterminab.le. On reconstitue ensuite le gène codant pour le polypeptide d'eucaryote ou de procaryote dans le- quel le promoteur est à l'emplacement optimal. On peut ef- fectuer la reconstitution sur l'échantillon de gène de fusion que l'on a utilisé pour la détermination du poly- peptide ou l'effectuer sur un échantillon de ce gène de fusion que l'on a réservé avant d'effectuer la détermina- tion du polypeptide. Egalement, comme après la détermina- tion du polypeptide on connaît la distance optimale du promoteur, on peut insérer un promoteur portable à la dis- tance optimale sur un autre échantillon du gène de fusion et effectuer ensuite la reconstitution sur ce gène de fu- sion. Après la reconstitution, le gène est prêt à la pro- duction directe, dans un micro-organisme, d'une quantité maximale du polypeptide désiré sous une forme pure. L'invention est illustrée par l'exemple non li- mitatif suivant. 2478 125 EXEMPLE On construit trois plasmides pLG 200, pLG 300 et pLG 400. Chacun a un site, vulnérable à une enzyme de res- triction, dans une phase de lecture et de traduction décalées sur une région du gène lacI. Chacun des trois plasmides contient également une région du gène lacZ qui code pour un fragment déterminable du polypeptide e-galactosidase. Les plasmides pLG 300 et pLG 400 ont été construits à partir du plasmide pLG 200, lui-même construit de la fa- çon suivante comme illustré par la figure 2. Tout d'abord on construit de la façon suivante le plasmide pLG 2, contenant un gène de fusion lacI-lacP- lacZ intact. On unit un fragment de Eco RI de pMC4 conte- nant le gène lacI intact, le promoteur lac et la région amino-terminale de lacZ à un fragment à terminaison vis-à-vis de Eco RI (provenant de À112, décrit par Ptashne dans The Operon, Miller et coll. eds., (Cold Spring Harbor Laboratory, New York 1978) contenant la région carboxy- terminale de lacZ pour créer un fragment avec la région lacI-lacP-lacZ intacte. On insère ce fragment dans un sque- lette contenant l'ADN de pBR 322 à partir du site RI jus- qu'au site PvuII pour obtenir le plasmide pLG2. Ensuite on croise un gène de fusion lacI-laoZ sur pLG 2 par recombinaison in vivo pour obtenir le plas- mide pLG 5. On soumet ensuite ce plasmide à une digestion partielle avec PvuII et on remplace la région amino- terminale de la région lacI par un élément de liaison Hin d III pour obtenir le plasmide pLG 200 que l'on ouvre sur le site Hin d III, pour obtenir uredes trois phases de lecture et de traduction décalées possibles. On construit le plasmide pLG 300 capable de four- nir un second cadre de lecture à partir du plasmide pLG 200 de la façon suivante. On coupe pLG 200 avec Hin d III, on garnit les extrémités d'ADNpolymérase et on place un lien Bam pour obtenir pLG 300. Pour obtenir le troisième cadre de lecture, pLG 300 est coupé avec Bam. inséré puis un élément de liaison Hin d III pour obtenir pLG 400 est introduit. Comme le montre la figure'3, on insère une ré- gion d'un gène codant pour un polypeptide désiré, la B-globine de lapin, dans le plasmide pLG 300 par liaison d'un fragment de globine PstBaminséré provenant de pLG 6 à un fragment de squelette Pst-Bam inséré provenant de pLG 300 pour obtenir pLG 302. On insère un fragment de promoteur lac à diverses distances en avant du site de début de traduction du gène de fusion selon la méthode décrite dans Ptashne et al. n 3 102. On ouvre pLG 302 avec Hin d III, on résèque avec l'exonucléase III et S1 (ou Bal 131) puis on coupe avec Pst pour pouvoir insérer un fragment de promoteur avec une extrémité Pst et une extrémité cohésive. On clone dans E. coli les plasmides portant des promoteurs à diverses distances du début du gène de fusion et on cultive sur une gélose indicatrice qui présente un degré de changement de couleur dépendant de la quantité de e-galactosidase produite par les bactéries. On choisit les colonies produisant le changement de couleur maximal comme étant celles ayant le promoteur en la position op- timale. Comme le montre la figure 4, on reconstitue le gène intact de la 8-globine in vitro de la façon suivante. A partir des plasmides sélectionnés, on prépare un frag- ment RI-Sau 3A contenant le promoteur lac et la portion codante aminoterminale du gène de la B-globine. On unit ce fragment à un fragment de Bam-Alu de pBG1 (Efstratiadis et coll. -1977- Cell, 10, 571-585) comportant la région codante carboxy-terminale du gène de la e-globine. On insère ensuite le gène reconstitué dans un squelette RI-PvuIII de pBR 322. Ce gène reconstitué, lorsqu'on le clone dans E. coli et qu'on le cultive, provoque la pro- duction de quantités maximales de la e-globine de lapin désirée. 24-8 125 Comme le montre la figure 5, dans le cas d'un autre échantillon. on peut reconstituer in vivo le gène de la 3-globine de la façon suivante. On insère le gène de fusion portant le promoteur ayant la position optimale dans un plasmide ayant un marqueur de résistance à l'am- picilline. On croise ensuite le plasmide avec un autre plasmide portant la portion manquante du gène de la 6-globine, plus une petite région de superposition pour obtenir l'homologie de la recombinaison génétique. Ce der- nier plasmide ne porte pas le promoteur lac mais il porte un marqueur de résistance à la tétracycline. La recombi- naison désirée sépare le promoteur lac du gène de la e-galactosidase; cette recombinaison peut donc être iden- tifiée parmi les autres recombinants présentant les deux résistances chimiques par son phénotype lac. Les procédés de reconstitution qui sont ici dé- crits sont les mêmes que ceux que l'on utilise après avoir mis en pratique le procédé de l'invention pour sélectionner les mutants souhaitables qui se sont formés spontanément ou dont on a induit la formation au moyen d'un mutagène. D'autres modes de réalisation sont couverts par les revendications ci-après. Par exemple la région du gène codant pour un polypeptide déterminable peut être soudée à des gènes autres que lacI; un exemple en est l'antigène t du virus Simian, exposé par Robert et coll. (1979), Proc. Nat. Acad. Sci., USA, 76, 5 596-5 600. D'autres gènes ap- propriés, par exemple Male et lamB sont décrits par Bassford et coll., dans The Operon, Millet et coll., eds., pages 245-261 (Cold Spring Harbor Laboratory, New York 1978). Egalement parmi les gènes de polypeptides dont l'ap- titude à la détermination est située dans la région carboxy-terminale que l'on peut utiliser au lieu du gène de la e-galactosidase, figurent par exemple les gènes trpC et trpD de E. coli qui codent pour deux polypeptides ayant chacun des activités enzymatiques spécifiques dans la 24Y8125 1 0 biosynthèse du tryptophane; et des gènes de levure qui codent pour des polypeptides à activité enzymatique. Par exemple un de ces gènes de levure code pour un poly- peptide présentant trois activités enzymatiques impliquées dans la biosynthèse de l'histidine. ll REVENDICATIONS 1. Gène de fusion caractérisé en ce qu'il com- prend: - une première région de gène carboxy-terminale codant pour un fragment de polypeptide déterminable; - une seconde région de gène aminoterminale soudée à ladite région de gène carboxy-terminale, cette région de gène amino-terminale ayant un site de restric- tion; - une troisième région de gène amino-terminale codant pour un fragment d'un polypeptide d'eucaryote ou de procaryote, cette troisième région de gène étant pla- cée sur le site de restriction et, en avant.de cette troisième région de gène; - un site de début de traduction et un promoteur portable ayant un site de début de transcription. 2. Gène de fusion selon la revendication 1, ca- ractérisé en ce que: - ladite première région de gène est une région du gène codant pour la B-galactosidase de E. coli, et - ladite seconde région de gène est une région du gène codant pour le répresseur de E. coli. 3. Procédé pour déterminer la quantité d'un po- lypeptide d'eucaryote ou de procaryote produit par un micro-organisme contenant un gène désiré codant pour ce polypeptide caractérisé en ce qu'il consiste à: - souder une région amino-terminale d'un échan- tillon dudit gène désiré à une région de gène carboxy- terminale codant pour un fragment de polypeptide différent déterminable pour produire un gène de fusion codant pour un polypeptide hybride déterminable; - cloner ce gène de fusion dans un micro- organisme, et - mesurer la quantité de ce polypeptide hybride déterminable produite par ce gène de fusion dans ledit micro-organisme, cette quantité étant directement 2478 125 1 2 proportionnelle à la quantité de ladite protéine d'euca- ryote ou de procaryote. 4. Procédé pour obtenir, pour un gène de fusion codant pour un polypeptide d'eucaryote ou de procaryote désiré, un échantillon de ce gène de fusion ayant son pro- moteur portable situé à une distance optimale de son site de début de traduction, caractérisé en ce qu'il comporte des étapes consistant à: - se procurer des échantillons d'un gène de fu- sion comprenant une région de gène carboxy-terminale co- dant pour un fragment de polypeptide déterminable soudée à une région de gène amino-terminale codant pour un frag- ment dudit polypeptide d'eucaryote ou de procaryote désiré, ce gène de fusion étant capable de coder pour un polypep- tide hybride déterminable; - insérer ce promoteur portable à des distances variables en avant du site de début de traduction desdits échantillons dudit gène de fusion - cloner ces échantillons dudit gène de fusion dans des micro-organismes; - déterminer ce polypeptide hybride déterminable produit par lesdits gènes de fusion-dans lesdits micro- organismes - sélectionner celui desdits gènes de fusion qui produit la quantité maximale dudit polypeptide hybride déterminable; et reconstituer, à partir de ce gène de fusion sélectionné, le gène codant pour ledit polypeptide d'eu- caryote ou de procaryote désiré. 5. Procédé pour obtenir, pour un gène codant pour un polypeptide d'eucaryote ou de procaryote désiré, un échantillon de ce gène ayant subi une ou plusieurs mutations faisant qu'il code pour une quantité accrue dudit polypeptide désiré par rapport à des échantillons dudit gène n'ayant pas subi de mutation, caractérisé en ce qu'il comporte des stades qui consistent à: - se procurer des échantillons d'un gène de 2 4 7 8 1 2 5 fusion comprenant une région de gène carboxy-terminale codant pour un fragment de polypeptide déterminable soudée à une région de gène amino-terminale codant pour un frag- ment dudit polypeptide d'eucaryote ou de procaryote dési- ré, ce gène de fusion étant capable de coder pour un poly- peptide hybride déterminable; - cloner ces échantillons dudit gène de fusion dans des micro-organismes; - déterminer ledit polypeptide hybride détermi- nable produit par lesdits gènes de fusion dans lesdits micro-organismes; sélectionner le gène de fusion ayant muté produisant une quantité accrue, par rapport aux échantil- lons n'ayant pas muté dudit gène de fusion, dudit poly- peptide hybride déterminable et; - reconstituer à partir de ce gène de fusion sé- lectionné le gène codant pour ledit polypeptide d'eucaryote ou de procaryote désiré. 6. Procédé selon la revendication 5, caractéri- sé en ce qu'il comprend de plus, après ledit stade de clonage du gène de fusion dans lesdits micro-organismes, le stade dans lequel on provoque la-mutation desdits micro- organismes. 7. Procédé selon la revendication 4, caractérisé en ce que ladite région de gène codant pour le fragment de polypeptide déterminable est une région du gène de E. coli codant pour la e-galactosidase. B. Procédé selon l'une des revendications 5 ou 6, caractérisé en ce que ladite région de gène codant pour ledit fragment de polypeptide déterminable est une région du gène de E. coli codant pour la e-galactosidase.