FR 2475542 A1 19810814 FR 8102716 A 19810211 Procédés de préparation de l'insuline humaine et d'esters de celle-ci, et produits obtenus. La présente invention concerne la transfor- mation d'insuline et de composés analogues à ltinsu- line en insuline humaine. Lors du traitement du diabète sucré, on a généralement utilisé des préparations d'insuline déri- vant de l'insuline porcine out bovine. Les insu- lines bovines, porcines et humaines présentent de lé- gères différences en ce qui concerne leur composition en acides aminés, la différence entre l'insuline hu- maine et l'insuline porcine étant limitée à un seul acide aminé: lacide aminé B30 de l'insuline humaine est la thréonine, tandis que celui de l'insuline por- cine est llalanine. Toutefois, on pourrait argumenter sur le fait que la préparation d'insuline idéale pour le traitement des êtres humains devrait être une irnsu- line ayant exactement la même structure chimique que celle de l'insuline humaine, Pour la production d'insuline humaine natu- relle, on ne dispose pas de la quantité nécessaire de glandes pancréatiques humaines. De l'insuline humaine de synthèse a été pré- parée à petite échelle et à grands frais (voir "Helv. Chim. Acta" s, 2617 et 60, 27). De l'insuline humai- ne semi-synthédtique a été préparée à partir d'insuline porcine en recourant à des méthodes fastidieuses (voir Hoppe-Seyler, "Z. Physiol. Chem." 356, 1631, et "Nature" 280, 412), Toutefois, la présente invention concerne un procédé pouvant être adopté à l'échelle industrielle pour la préparation d'insuline humaine. Le brevet des Etats-Unis d'Amérique n 3.276.961 vise un procédé de préparation d'insuline humaine semi-synthétique. Toutefois, le rendement en insuline humaine est médiocre du fait que ce pro- cédé est effectué dans l'eau, soit des conditions dans lesquelles la trypsine provoque une scission de la liaison ArgB22-GlyB23 (voir "J. Biol. Chem.", 236; 743). Un procédé semi-synthétique connu pour la préparation d'insuline humaine comprend les trois étapes suivantes: 1) on transforme l'insuline por- cine en des-(AlaB3O)-insuline porcine par traitement avec de la carboxypeptidase A (voir Hoppe-Seyler, "A. Physiol. Chem." M5, 799). 2) On soumet la des-(AlaB30)-insuline porcine à un couplage avec Thr-OBut en utilisant de la trypsine comme cataly- seur de façon à former l'ester ThrB30-tert-butylique d'insuline humaine. 3) On traite cet ester avec de l'acide trifluoracétique pour obtenir de ltinsuline humaine (voir "Nature" 280, 412). Toutefois} la pre- mière étape donne lieu à une élimination partielle de AsnA21 de sorte que l'on obtient la des-(AlaB30 AsnA21)-insuline. Après les deux-réactions ultérieu- res, ce dérivé donne lieu à une contamination de la des-(AsnA21)-insuline dans l'insuline humaine semi- synthétique préparée, cette contamination ne pouvant être éliminée aisément par les méthodes de prépara- tion connues. La des-(AsnA21)-insuline exerce une faible activité biologique (environ 5%) (voitr "Amere 3. Medo" 40, 750). Un objet de la présente invention est de fournir un procédé permettant de transformer une insuline non humaine en insuline humaine. Un deuxième objet de la présente invention est de fournir un procédé permettant de transformer l'insu- linê porcine et certaines impuretés qui y sont conte- nues, en insuline humaine via un ester de thréonineB30 d'insuline humaine. D'autres objets et avantages de la présente invention apparaîtront à la lecture de la description ci-après. -La présente invention est basée sur la dé- couverte selon laquelle l'acide aminé ou la chaîne peptide lié au groupe carbonyle de LysB29 du composé d'insuline peut être interchangé avec un ester de thréonine. Cet échange mutuel sera appelé ci-après "transpeptidation". 53 L'expression "composés d'insuline". utilisée dans la présente spécification, englobe les insulines et les composés analogues à l'insuline contenant la fraction de des(ThrB30)-insuline humaine, l'acide aminé B30 de l'insuline étant l'alanine (dans l'insu- line provenant, par exemple, du porc, du chien, du rorqual et du cachalot) ou la sérine (lapin). L'ex- pression "composés analogues à l'insuline", utilisée dans la présente spécification, englobe la proinsuline dérivant de l'une ou l'autre des espèces ci-dessus et des primates, conjointement avec des produits intermé- diaires provenant de la transformation de la proinsu- line en insuline. Parmi ces produits intermédiaires$ on peut mentionner, par exemple, la proinsuline de scission, les proinsulines de desdipeptides, la pro- insuline de desnonapeptides et les insulines de diar- ginine (voir R. Chance: "In Proceedings of the Se- venth Congress of IDF", Buenos Aires, 1970, 292-305, éditeurs: RR. Rodriques & J.V.-Owen, Excerpta Medica, Amsterdam. Le procédé suivant la présente invention con- siste à effectuer la transpeptidation d'un composé d'insuline ou d'un de ses sels ou complexes avec un ester de L-thréonine ou un de ses sels dans un mélange d'eau, d'un solvant organique miscible à l'eau et de trypsine, la teneur en eau du mélange réactionnel étant inférieure à environ 50% (volume/volume), tandis que la température réactionnelle est inférieure à en- viron 50 C. Bien que la trypsine soit la mieux connue pour ses propriétés protéolytiques, des techniciens ont reconnu que la trypsine était capable de cataly- ser'le couplage de la des-(Ala30)-insuline et d'un ester tert-butylique de thréonine (voir "Nature", 280, 412). Dans le procédé de la présente invention, on utilise la trypsine pour catalyser la transpepti- dation. On peut effectuer la transpeptidation en dis- solvant 1) le composé d'insuline, 2) un ester de L- thréonine et 3) de la trypsine dans un mélange d'eau et d'au moins un solvant organique miscible à l'eau, facultativement en présence d'un acide. Les solvants organiques miscibles à l'eau préférés sont les solvants polaires. Comme solvants spécifiques de ce type, on peut mentionner, par exemple, le méthanol, lféthanol, le 2-propanol, le 1s 1,2-éthane-diol, l'acétone, le dioxanne, le tétrahy- drofuranne, le NIN-diméthylformamide, le formamide, le N,Ndiméthylacétamide, la N-méthylpyrrolidone, lthexaméthylphosphorotriamide et lT'acétonitrile. En fonction du solvant organique miscible l'eau utilisé, de la température réactionnelle choi- sie et de la présence d'un acide dans le mélange réac- t-ionnel, la teneur en eau de ce dernier doit être in- férieure à environ 50% (volume/volume), de préférence, inférieure à environ 40% (volume/volume), et supérieu- re à environ 10% (volume/volume). Un avantage qu'offre la réduction de la quan- tité d'eau dans le mélange réactionnel, réside dans le fait que l'on atténue ainsi la formation de sous- produits. De même, en augmentant la quantité d'acide dans le mélange réactionnel, on peut réduire la forma- tion de sous-produits. L'accroissement du rendement est en corrélation positive avec un haut pourcentage de solvant organique. Le type de trypsine importe peu pour la mise en oeuvre de la présente invention. La trypsine est une enzyme bien caractérisée qui est disponible dans le tommerce à un haut degré de pureté et qui est notam- ment d'origine bovine ou porcine. De plus, on peut uti- liser la trypsine d'origine microbienne. En outre, la forme sous laquelle se présente la trypsine (par exem- ple, la trypsine cristalline (forme soluble), la tryp- sine immobilisée ou même les dérivés de la trypsine (pour autant que l'activité de la trypsine soit main- tenue)) importe peu pour la mise en oeuvre de la pré- sente invention. Il est entendu que l'expression "trypsine" utilisée dans la présente spécification en- globe les trypsines de toutes originesde même que toutes les formes de trypsine conservant une activité de transpeptidation, y compris les protéases dlune spé- cificité analogue à celle de la trypsine, par exemple, la protéase Acromobacter lyticus (voir "Agric. Biol. Chem." 4, 1443). Parmi les dérivés actifs de trypsine, on peut mentionner, par exemple, les dérivés de la trypsine a- cétyléee de la trypsine succinyléede la trypsine trai- tée au giutaraldéhyde et de la trypsine immobilisée. Si on utilise une trypsine immobilisée, on la met en suspension dans le milieu. Afin d'obtenir un système tampon approprié, on peut ajouter des acides organiques ou inorganiques tels que leacide chlorhydrique,l'acide formique,l'aci- de acétique, l'acide propionique et l'acide butyrique, ou encore des bases telles que la pyridine, le TRIS, la Nl-méthylmorpholine et la N-éthylmorpholine. Les a- cidês organiques sont préférés. Toutefois, la réaction peut être effectuée sans procéder à ces additions. La quantité d'acide ajouté est habituellement inférieure à environ 10 équivalents par équivalent de l'ester de L-thréonine. De préférence, la quantité d'acide se si- tue entre 0,5 et 5 équivalents par équivalent de l'es- ter de L-thréonine. On peut ajouter des ions stabilisant la trypsine, par exemple, des ions calcium. On peut effectuer le procédé à une tempéra- ture se situant entre 5O C et le point de congélation du mélange réactionnel. On effectue habituellement S des réactions enzymatiques avec la trypsine à une température d'environ 37 C afin d'assurer une vitesse réactionnelle suffisante. Toutefois, afin d'éviter l'inactivation de la trypsine, il est avantageux d'effectuer le procédé suivant la présente invention à une température inférieure à la température ambian- te. Dans la pratique, des températures réactionnelles supérieures à environ 0 C sont préférées. Le temps de la réaction se situe habituelle- ment entre quelques heures et quelques jours suivant la température réactionnelle, la quantité de trypsine ajoutée et d'autres conditions réactionnelleso Le rapport pondérai entre la trypsine et le composé d'insuline dans le mélange réactionnel est normalement supérieur à environ 1:200, de préférence, supérieur à environ 1:50 et inférieur à environ 1:!, Les esters de L-thréonine envisagés pour la mise en oeuvre de la présente invention peuvent &tre représentés par la formule générale: Thr(R5)-0R4 II dans laquelle R4 représente un groupe protecteur d'un- groupe carboxy et R5 représente un atome d'hydrogène ou un groupe protecteur d'un groupe hydroxy, ou en- core^;un sel de ce composé. Les esters de thréonineB30 de l'insuline humaine résultant de la transpeptidation peuvent être représentés par la formule générale: (Thr(R5)-OR4)B30-h-In III dans laquelle h-In représente la fraction de des- (ThrB30)insuline humaine, tandis que R4 et R5 ont les significations définies ci-dessus. Les esters de L-thréonine de formule II que l'on peut utiliser, sont ceux dans lesquels R4 est un groupe protecteur d'un groupe carboxy, qui peut être éliminé de l'ester de thréonineB30 de l'insuline hu- maine (formule III) dans des conditions ne donnant pas lieu à une forte altération irréversible de la molécule d'insuline. Parmi ces groupes protecteurs de groupes carboxy, on peut mentionner, par exemple, les groupes alkyle inférieurs, par exemple, le groupe méthyle, le groupe éthyle et le groupe tert-butyle, les groupes benzyle substitués tels que le groupe p-méthoxybenzyle et le groupe 2,4,6-triméthylbenzyle, de même que le groupe diphénylméthyle et les groupes de formule générale Cl2CII2S02R6 dans laquelle R6 représente un groupe alkyle inférieur tel qu'un grou- pe méthyle, un groupe éthyle, un groupe propyle et un groupe n-butyle. Les groupes appropriés R5 protégeant un troupe hydroxy sont ceux pouvant être éliminés de l'ester de thréonineB30 de l'insuline humaine (for- mule III) dans des conditions ne provoquant pas une forte altération irréversible de la molécule d1insu- line. Comme groupe (R5) de ce type, on peut mention- ner, par exemple, le groupe tert-butyle. Les groupes alkyle inférieurs contiennent moins de 7 atomes de carbone, de préférence, moins de atomes de carbone. D'autres groupes protecteurs habituellement utilisés sont décrits par WUnch: "Methoden der Orga- nischen Chemie" (Ilouben-Weyl), volume XV/1, éditeur: Eugen Miller, Georg Thieme Verlag, Stuttgart 1974. Certains esters de L-thréonine (formule II) sont des composés connus et les autres esters de L-thréonine (formule II) peuvent être préparés en analogie avec la préparation de composés connus. Les esters de L-thréonine de formule II peu- vent être les bases libres ou leurs sels organiques ou inorganiques appropriés, de préférence, les acé- tates, les propionates, les butyrates et les halo- génhydrates tels que les chlorhydrates. Il est souhaitable d'utiliser les réactifs, c'est-à-dire le composé d'insuline et l'ester de L- thréonine (formule II), en concentrations élevées, Le rapport molaire entre l' tester de L-thréonine et le composé d'insuline est, de préférence, d'environ :1. Il est souhaitable que la concentration de l'ester de L-thréonine (formule II) dans le mélange réactionnel soit supérieue à 0,1 molaire. - L'insuline humaine peut être obtenue à par- tir des esters de thréonineB30 de l'insuline humaine (formule III) en éliminant le groupe protecteur R4 et n'importe quel groupe protecteur R5 par des méthodes connues ou des méthodes connues en soi. Lorsque R4 est un groupe méthyle, un groupe éthyle ou un groupe -CHI2CH2S02R6 dans lequel R6 a la signification défi- nie ci-dessus, ce groupe protecteur peut être éliminé dans des conditions basiques modérées et en milieu aqueux, de préférence, à un pH d'environ 812, par exemple, d'environ 9,5. Comme base, on peut utiliser l'ammoniac, la triéthylamine ou des hydroxydes de métaux alcalins tels que l'hydroxyde de sodium. Lors- que R4-est un groupe tert-butyle, un groupe benzyle substitué tel qu'un groupe p-méthoxybenzyle ou' un groupe 2,4,6-triméthylbenzyle, ou encore un groupe diphénylméthyle, ce groupe peut être éliminé par acidolyse, de préférence, avec l'acide trifluoracé- tique. L'acide trifluoracétique peut être non aqueux ou il peut contenir une certaine quantité d'eau ou encore il peut être dilué avec un solvant organique tel'que le dichlorométhane. Lorsque R5 est un groupe tert-butyle, ce groupe peut être éliminé par acidoly- se (voir ci-dessus). De préférence, les esters de thréonineB30 de l'insuline humaine de formule III sont des composés dans lesquels R5 est un atome d'hydrogène et lion prépare ces composés à partir d'esters de L-thréonine de formule II dans laquelle R5 est un atome d'hydro- gène. La transpeptidation de composés d'insuline en esters de thréonineB30 d'insuline humaine peut être décrite de manière plus détaillée en se basant sur la formule suivante attribuée aux composés d'insu- line: R1- (1 ---A7--2 21) (1--/B!---29)-R2 (I) Il 2 o -(1--fAr--21) (1--B ---29)- représente la fraction de des(ThrB30) insuline humaine dans laquelle GlyAi est relié au substituant désigné par R1, tandis que LysB29 est relié au substituant dé- signé par R2, R2 représente un acide aminé ou une chaîne peptide contenant 36 acides aminés maximum, R1 représente un atome d'hydrogène ou un groupe de formule générale R3-X- dans laquelle X représente l'arginine ou la lysine et R3 représente une chaîne peptide contenant 35 acides aminés maximum, ou encore 2 3 R ensemble avec R représente une chaîne peptide contenant 35 acides aminés maximum, à condition que le nombre d'acides aminés présents dans R plus R soit inférieur à 37. Dès lors, la transpeptidation de la présente invention transforme n'importe lequel des composés d'insuline ci-dessus en esters de thréonineB30 dinsu- line humaine (formule III) qui peuvent être ensuite débloqués pour former l'insuline humaine, Un autre avantage de la présente invention réside dans le fait que, grace à la transpeptidation, les composés analogues à l'insuline, répondant à la formule I et présents dans l'insuline brute, ainsi que dans certaines préparations commerciales d'insu- line sont transformés en esters de thréonineB30 dtin- suline humaine qui peuvent être ensuite débloqués pour former l'insuline humaine. On donnera ci-après des exemples de composés analogues à l'insuline et répondant à la formule I: ltinsuline de diarginine porcine (R1 est un atome d'hydrogène et R représente -Ala-Arg-Arg), la pro- insuline porcine (R3 ensemble avec R2 = -Ala-Arg-Arg- Glu-Ala-Glu-Asn-Pro-Gln-Ala-Gly-Ala-Val-Glu-Leu-Gly- Gly-Gly-Leu-Gly-Gly-Leu-Gln-Ala-Leu-Ala-Leu-Glu-Gly- Pro-Pro-Gln-Lys-, o le groupe alanyle terminal est relié à LysB29), la proinsuline de chien (R3 ensemble avec R2= -Ala-Arg-Arg-Asp-Val-Glu-Leu-Ala-Gly-Ala-Pro- Gly-Glu-Gly-Gly-Leu-Gln-Pro-Leu-Ala-Leu-Glu-Gly-Ala- Leu-Gln-Lys- o le groupe alanyle terminal est relié B2 9) 3 à LysB29) la proinsuline porcine de scission (R3 = Ala-Leu-Glu-Gly-Pro-Pro-Gln-Lys- et R2 = -Ala-Arg- Arg-Glu-Ala-Glu-Asn-Pro-Gln-Ala-Gly-Ala-Val-Glu-Leu- Gly-Gly-Gly-Leu-Gly-(,ly-Leu-Gln-Ala-Leu)-, laproinsuline porcine de desdipeptide (R = atome d'hydrogène et R2 = -Ala- Arg-Arg-Glu-Ala-Glu-Asn-Pro-Gln-Ala-Gly-Ala-Val-Glu- Leu-Gly-Gly-Gly-Leu-Gly-Gly-Leu-Gln-Ala-Leu-Ala-Leu- Glu-Gly-Pro-Pro-Gln), la proinsuline humaine (R3 en- semble avec R2 = -Thr-Arg-Arg-Glu-Ala-Glu-Asp-Leu- Gln-Val-Gly-Gln-Val-Glu-Leu-Gly-Gly-Gly-Pro-Gly-Ala- Gly-Ser-Leu-Gln-Pro-Leu-Ala-Leu-Glu-Gly-Ser-Leu-Gln- Lys- o le groupe thréonyle terminal est relié à LysB 9) et la proinsuline de singe (R3 ensemble avec R2 = -Thr-Arg-Arg-Glu-Ala-Glu-Asp-Pro-Gln-Val-Gly- Gln-Val-Glu-Leu-Gly-Gly-Gly-Pro-Gly-Ala-Gly-Ser-Leu- Gln-:Pro-Leu-Ala-Leu-Glu-Gly-Ser-Leu-Gln-Lys- o le groupe thréonyle terminal est relié à LysB30). Dès lors, dans toutes ces impuretés couvertes par la formule I, le substituant R désigné par R3-X- est échangé avec un atome dlhydrogène. Une forme de réalisation préférée de la pré- sente invention consiste à faire réagir de l'insuline porcine brute contenant des composes analogues à l'in- suline ou un de leurs sels ou complexes avec un ester de L-thréonine (formule II) ou un de ses sels dans les conditions spécifiées ci-dessus, après quoi on élimine le groupe protecteur R4 et éventuellement le groupe protecteur R5. Grâce à ce procédé, conjointe- ment avec les composés analogmues à l'insuline qui y sont contenus, l'insuline porcine est transformée en insuline humaine. Comme complexe ou sel dtun composé d'insuline (formule I), on peut mentionner, par exem- ple, un complexe ou un sel de zinc. Lorsqu'on choisit les conditions réactionnel- les selon l'exposé ci-dessus et si l'on prend en con- sidération les résultats obtenus dans les exemples ci- après, on peut obtenir un ester de thréonineB30 d'insu- line humaine avec un rendement supérieur à 60% et même supérieur à 80S et, dans certaines conditions préfé- rées, avec un rendement supérieur à 90%. En conséquence, vis-à-vis de la technique antérieure, le procédé suivant la présente invention offre les avantages suivants: a) On omet l'hydrolyse enzymatique pour éli- miner AlaB30, par exemple, avec la carboxypeptidase A. b) Il est superflu d'isoler un composé in- termédiaire tel que la des(AlaB30)-insuline porcine. c) On évite la contamination avec des déri- vés de des(AsnA21)-insuline. d) A l'intervention de l'ester de thréoni- neB30 de l'insuline humaine, la proinsuline et dlau- * treg impuretés analogues à l'insuline, qui sont pré- sentes dans l'insuline brute, sont transformées en insuline humaine par le procédé de la présente inven- tion, ce qui permet d'accroître le rendement. e) Des composés antigéniques analogues à l'insuline (voir brevet britannique n 1.285o023) sont transformés en insuline humaine. On donnera ci-après un procédé préféré pour la préparation d'insuline humaine 1) La matière de départ utilisée pour la transpeptidation est l'insuline porcine brute, par exemple, l'insuline cristalline obtenue en utilisant un tampon de citrate (voir brevet des Etats-Unis d'A- mérique n 2.626.228). 2) Si li'une ou l'autre activité de trypsine subsiste après la transpeptidation, il est préférable de l'éliminer, par exemple, dans des conditions dans lesquelles la trypsine est inactive, par exemple, dans un milieu acide d'un pHli inférieur à 3A La tryp- sine peut être éliminée par séparation suivant le poids moléculaire, par exemple. par filtration en gel sur "lSephadex G-50" ou "Bio-gel P-30"1 dans de l'acide acétique 1M1 (voir "Nature". 280, 412). 3)D'autres impuretés telles que l'insuline porcine n'ayant pas réagi, peuvent être éliminées en procédant à une chromatographie d:échange d'anions et/ou de cations (voir exemples 1 et 2). 4) Ensuite, l'ester de thréonine30 d'insu- line-humaine est débloqué et l'insuline humaine est isolée, par exemple, cristallisée, de façon connue en soi., Par ce procédé, on peut obtenir-de l'insu- line humaine d'une pureté pharmaceutique acceptable et on peut éventuellement la purifier davantage. De plus, la présente invention concerne de nouveaux esters de thréonineB30 d'insuline humaine dang lesquels le groupe ester est différent du groupe tert-butyle et du groupe méthyle. Les abréviations utilisées sont conformes à la réglementation approuvée (1974) par "IUPAC-IUB Commission on Biochemical Nomenclature", voir "Collected Tentative Rules & Recommendations of the Commission on Biochemical Nomenclature IUPAC-IUB", 2ième édition, Maryland, 1975. Essais analytiques: La transformation de l'insuline porcine et de la proinsuline porcine en esters d'insuline hu- maine peut ètre démontrée par électrophorèse de DISC PAGE dans un gel de polyacrylamide à 7,5% dans un tampon constitué de TRIS 0,375M, de IIC1 0, 06M et d'urée 8M. Le pll du tampon est de 8,7. Les esters de formule III migrent à une vitesse égale à 75% de celle de l'insuline porcine. Grâce au procédé sui- vant la présente invention, la proinsuline porcine migrant à 55$ de la vitesse de l'insuline porcine est transformée en un même produit. L'identifica- tion du produit de transformation en composés de formule III est due aux critères suivants: a) La migration électrophorétique des esters d'insuline humaine de formule III par rapport à l'in- suline porcine correspond à la perte d'une charge négative. b) La composition en acides aminés des liai- sons protéiques colorées dans le gel, représentant des composés de formule III, est identique à celle de l'insuline humaine, à savoir 3 moles de thréonine et 1 mole d'alanine par mole d'insuline, tandis que la composition d'insuline porcine est de 2 moles de thréonine et de 2 moles d'alanine par mole dlinsu- line. La technique permettant d'analyser des compo- sitions d'acides aminés de liaisons protéiques dans des gels de polyacrylamide a été décrite dans "Eur. J. giochem.", 25, 147. c) La preuve que la thréonine incorporée est placée comme acide aminé sur l'atome de carbone terminal de la chaîne B, est fournie par la sulfito- lyse oxydante des ponts S-S de l'insuline dans le chlorhydrate de guanidinium 6M, cette sulfitolyse étant suivie de la séparation des chatnes A et B par chromatographie d'échange d'ions sur "SP Sephadex". La digestion du S-sulfonate de la chaîne. B avec la carboxypeptidase A libère uniquement l'acide aminé se trouvant sur l'atome de carbone terminal. Cette technique a été décrite par Markussen dans "Procee- dings of the Symposium on Proinsulin, Insulin and C-peptide", Tokushimae 12-14 juillet 1978 (éditeur: Baba, Kaneko & Yaniahara) "IInt. Congress Series" NI 468, Excerpta Medica, Amsterdam-Oxford. L'analyse est effectuée après avoir séparé le groupe ester des composés de formule III. Ces trois analyses démontrent sans aucune ambiguïté que la transformation en insuline humaine a eu lieu. La transformation de l'insuline porcine et de la proinsuline porcine en esters d'insuline hu- maine peut être suivie quantitativement par chromato- graphie liquide sous haute pression sur phase inverse. On utilise une colonne 'I Bondapak C18" de 4 x 300 mm ("Waters Ass.") et l'on effectue l'élution avec un tampon comprenant du sulfate d'ammonium 0, 2M (réglé à unpHl de 3,5 avec de l'acide sulfurique) et conte- nant 26 à 50% d'acétonitrile. La concentration opti- male en acétonitrile dépend de l'ester de formule III que l'on désire séparer de l'insuline porcine. Lors- que R4 est un groupe méthyle et que R5 est un atome d'hydrogène, la séparation est effectuée avec 26% (volume/volume) d'acétonitrile. L'insuline porcine et la (Thr-OMe)B30-h-In (Me = méthyle) éluent respec- tivément après 4,5 et 5,9 volumes de colonne sous forme de pics symétriques bien séparés. Avant leur application dans la colonne de clhromatographie li- quide sous haute pression, les protéines contenues dans le mélange réactionnel sont précipitées par ad- dition de 10 volumes d'acétone. On isole le préci- pité par centrifugation, on le sèche sous vide et on le dissout dans de l'acide sulfurique 0,02M. Le procédé de préparation d'esters d'insuline humaine, ainsi que de l'insuline humaine est illustré par les exemples suivants qui n'ont toutefois aucun caractère limitatif. Ces exemples illustrent certai- nes formes de réalisation préférées du procédé sui- vant l'invention. Exemple 1 On dissout 200 mg d'insuline porcine brute, cristallisée une fois, dans 1, 8 ml d'acide acétique 3,33M. On ajoute 2 ml d'une solution 2M de Thr-OMe (Me = méthyle) dans du N,N-diméthylacétamide, ainsi que 20 mg de trypsine dissoute dans 0,2 ml d'eau. Après conservation pendant 18 hieures à 37 C, on pré- cipite les protéines par addition de 40 ml d'acétone et on isole le précipité par centrifugation. On éli- mine le produit surnageant. L'analyse du précipité par chromatographie liquide sous haute pression en utilisant de l'acétonitrile à 26% (voir "essais ana- lytiques") révèle une transformation de 60% de l'in- suline porcine en (Thr-OMe)B30-h-In. On dissout le prédipité dans 8 ml dturée 8M fraîchement désionisée, on règle le pH à 8 avec de l'ammoniac IM et on appli- que la solution ainsi obtenue dans une colonne de 2,5 x 25 cm garnie de résine "QAE A-25 Sephadex", équilibrée avec un tampon de chlorure d'ammonium 0,1M contenant 60j (volume/volume) d'éthanol et dont le pH a été réglé à 8 avec de l'ammoniac. On effectue l'élution avec le même tampon et l'on recueille des fradtions de 15 ml. On trouve de la (Thr-OMe) B30-h-In dans les fractions n 26-46 et de l'insuline porcine n'ayant pas réagi, dans].es fractions n 90-120. On rassemble les fractions n 26-46, on évapore-léthta- nol sous vide et on cristallise la (Thlr-ONle)B3 -h-In dans un tampon de citrate comenic décrit par Schlicht- krull et ai-., "Ilandbuch der inncren Medizin", 7/2A, 96, Berlin, Heidelberg, New York-1975. Le. rendement est de- 95a mg de cristaux av-ant la même- forme rhombi- que que l'insulineporcir-neie cristallisée de la même manière, On constate que la composition en acides aminés est identique à celle de l'insuline humaine. Des essais analytiques complémentaires décrits dans le paragraphe cidessus intitulé "Essais analytiques' démontrent que le produit obtenu est la (Thr-OMe)B30- h-In. Exemple 2 On dissout 100 mg dtinsuline porcine ayant la pureté requise conformément au brevet britannique n 1.285.023, dans 0,9 ml d'acide acétique 3,33M, puis on ajoute 1 ml d'une solution ZM d'ester méthylique de thréonine dans du N,N-diméthylformamide, ainsi que 12 mg de trypsine traitée à la tosylphényl-alanine- chlorométhyl-cétone, dissoute dans 0,>1 ml d'eau. Après incubation pendant 24 heures à 37 C, on arrête la réaction par addition de 4 ml d'acide phosphorique 1M. On sépare la (Thr-OMe) 30-h-Ili obtenue d'insuline por- cine..n'ayant pas réagi par chromatographie d'échange d'ions dans une colonne de 2,5 x 25 cm de résine "SP-Sephadex" avec un éluant comprenant du chlorure de sodium O,0O9M et du dihydrogéno'phosphate de sodium 0,02M (pHli du tampon: 5,5) da'ns de'l'éthanol à 60%. On recueille les fractions contenant la (Thr-0Me)B3 - h-In, on élimine liéthanol sous vide et on cristallise le produit comme décrit à l'exemple 1., Le rendement est de 50 mg de (Thr-OMe)B30-h-In. Exehple 3 On dissout 100 mg de proinsuline porcine dans 09 ml d'acide acétique 3,33M et on la transforme en (Thr-OMe)B30-h-Ini, puis on la purifie comme décrit à l'exemple I pour l'insuline porcine. Lorsqu'on sou- met le produit obtenu par précipitation clans de l'acé- tone à une analyse par chromatographie liquide sous haute pression, on constate que la transformation de la proinsuline en (Thr-OMe)B30-h-In est de 73%. Le rendement en (Thr-OMe)B30-h-In cristalline est de 54 mg. Exemple 4 On dissout 100 mg d'insuline porcine dans 0,9 ml d'acide acétique 2,77M dans de l'eau et on fait 1S réagir de la même manière que dans le procédé décrit à l'exemple 2. Au terme de la réaction, on précipite les protéines par addition de 10 volumes d'acétone. L'analyse par le procédé de "DISC PAGE" révèle une transformation de 70% en (Thr-OMe)B30-h-In. Exemple 5 On dissout 100 mg d'insuline porcine dans 0,9 ml d'acide acétique 3,33M et on ajoute 1 ml de Thr-OMe 2M dans de la N-méthylpyrrolidone. On effec- tue la réaction de la même manière que celle décrite à l'exemple 4 et la transformation en (Thr-OMe)B30-h- In est de 20%. Exemple 6 On dissout 100 mg d'insuline porcine dans 0,9-ml d'acide acétique à 2,77M dans l'eau et on ajou- te 1 ml de Thr-OMe 2M dans de 1lhexaméthylphosphoro- triamide. On effectue la réaction de la même manière que celle décrite à l'exemple 4. La transformation en (Thr-OMe)B30-h-In est de 80%. Exemple 7 On dissout 100 mg d'insuline porcine dans 0,9 ml d'acide acétique 3,33M et on ajoute 1 ml de Thr-OMe 2M dans du NN-diméthylacétamide. On effec- tue la réaction de la même manière que celle décrite à l'exemple 4. La transformation en (Thr-OMe)B30-h- In est de 80%. Exemple 8 On dissout 100 mg d'insuline porcine dans 0,9 ml d'acide acétique 3,33M et on ajoute 1 ml de Thr-OMe 2M dans du NN-dclimétiylactamidtie. Ensuite, on ajoute de la trypsine à 200 unités (activité me- surée vis-à-vis du substrat BAEEY immobilisée sur 1 g de perles de verre et, apres incubation à 37 C pendant 24 heures, on sépare, par filtration, la trypsine fixée aux perles de verre. -Au terme de la réaction, on précipite les protéines par addition de volumes d'acétone. L'analyse par le procédé "DISC PAGE" révèle une transformation de 40% en (Thr-OMe)B30_h-In. Exemple 9 On dissout 100 mg d'insuline porcine dans 0,9 ml d'acide acétique 3,33M et on ajoute 1 ml de Thr-OMe 2M dans du N,N-diméthylacétamide. Ensuite, on ajoute de la trypsine à 300 unités (activité mesu- rée avec le substrat BAEE) immobilisée sur 200 g de "Sephadex G-150" activé au CNBr. Apres incuba- tion à 37 C pendant 24 heures, par filtration, on sépare la trypsine fixée à la résine "Sephadex". Au terme de la réaction, on précipite les protéines par -addition de 10 volumes d'acétone. L'analyse par le procédé "DISC PAGE" révèle une transformation de 70% en (Thr-OMe)B30-h-In. Exemple 10 On répète le procédé décrit à l'exemple 7, avec cette exception que l'ester utilisé est le t t Thr- OBu 2M (But = tert-butyle) dans du N,N-diméthyl- acétamide. La transformation en (Thr-OB3ut)B30-h-In est de 80%;. Exemple 11 On répète le procedé décrit à l'exemple 8, avec cette exception que l'ester utilisé est le Thr- OBut 2M dans du N,N-diméthylacétamidc. La transfor- mation en hr-OBut)B30-h-In est de 30%. Exemple 12 On répète le procédé décrit à l'exemple 9, avec cette exception que l'ester utilisé est le Thr- OBut 2M dans du N,N-diméthylacétamide. La transforma- tion en (Thr-OBut)B30_h-In est de 70%. Exemple 13 On dissout 100 mg de proInsuline porcine dans 0,9 ml d'acide acétique 3, 33M et on ajoute 1 ml de Thr-OMe 2M dans du N,N-diméthylacétamide. On effectue la réaction d'une manière analogue à celle décrite à l'exemple 4. La transformation en (Thr-OMe)B30-h-In est de 80%. Exemple 14 On dissout 100 mg de proinsuline porcine dans 0,9 ml d'acide acétique 3, 33M et on ajoute 1 ml de Thr-OMe 2M dans du N,N-diinémthylacétami(lde. On traite le mélange avec de la trypsine immobilisée de la même manière que dans le procédé décrit à ltexem- ple S. La transformation en (Thr-OMe)B30-h-In est -de 40/J. Exemple 15 On dissout 100 mg de proinsuline porcine dans 0,9 ml d'acide acétique 3, 33M et on ajoute 1 ml de Thr-Oble 2.1 dans du N,N-diméthlylacétamide. On traite le mélange de la même manière que dans le pro- cédé décrit dans l'exemple 9 avec de la trypsine im- mobilisée. La transformation en (Thr-Obie)B30-h-In est de 70% $75542 Exemple 16 On dissout 100 mg de proinsuline porcine dans 0,9 ml d'acide acétique 3, 33M et on ajoute 1 ml de Thr-OBut 2M dans du NN-diméthylacétamide. On effectue la réaction d'une manière analogue à celle décrite à l'exemple 4. La transformation en (Thr- oBut)B30-h-In est de 80%. Exemple 17 On dissout. 100 mg de proinsuline porcine dans 0,9 ml d'acide acétique 3, 33M et on ajoute 1 ml de Thr-OBut 2M dans du NN-diméthylIacéttamide. On traite le mélange avec de la trypsine immobilisée sur des perles de verre de la même manière que dans le procédé décrit à l'exemple 8. La transformation en (Thr-OBut)B30-h-In est de 40/%. Exemple 18 On dissout 100 mg de proinsuline porcine dans 0,9 ml d'acide acétique 3, 33M et on ajoute 1 ml de Thr-OBut 2M dans du NN-diméthylacétamide. On traite le mélange avec de la trypsine immobilisée sur la résine "Sephadex G-150" activée au CNBr de la même manière que dans le procédé décrit à l'exemple 9. La transformation en (Thr-OBut)B30-h-In est de 70%. Exemple 19 On dissout 100 mg d'insuline porcine dans 0,5 ml d'acide acétique 6M et on ajoute 1 ml de Thr- OTmb 1M (Tmb = 2,4,6-triméthylbenzyle) dans du N,N- diméthylacétamide. En outres on ajoute 0,5 ml de NN-diméthylacétamide et 5 mg de trypsine traitée à la tosylphényl-alanine-chlorométhiyl-cétone, dans 0,1 ml d'eau. On conserve le mélange réactionnel à 32 C pendant 44 heures. Au terme de la réaction, on pré- cipite les protéines par addition de 10 volumes d'acé- tone. L'analyse par le procédé "DISC PAGE" révèle une transformation de 50% en (Thr-OTmb)B30-h-In. Exemple 20 On dissout 100 mg d'insuline porcine dans 0,9 ml d'acide acétique 3M et on ajoute 1 ml de Thr- OMe 2M dans du dioxanne. On effectue la réaction de la même manière qu'à l'exemple 4 et la transformation en (Thr-OMe)B30-h-In est de 10%. Exemple 21 On dissout 100 mg d'insuline porcine dans 0,9 ml d'acide acétique 3M et on ajoute l ml de Thr- OMe 2: dans de l'acétonitrile. On effectue la réac- n ci _d -Grïe vendications 1 et 2, caractérisé en ce que le composé d'insuline est un composé choisi parmi le groupe com- prenant l'insuline de porc, de chien, de rorqual, de cachalot et de lapin, la diarginine-insuline porcine, la proinsuline porcine de scission, la proinsuline porcine de desdipeptides, la proinsuline porcine, la proinsuline de chien, la proinsuline de singe et la proinsuline humaine, ainsi que leurs mélanges. 4. Procédé suivant l'une quelconque des re- vendications l à 3, caractérisé en ce que le composé d'insuline est d'origine porcine. 5. Procédé suivant la revendication 4, ca- ractérisé en ce que, comme composé d'insuline, on A,_14 i o 11 dnp relativement brute. =. _,_ a-, LZZZ de tétrahydrofuranne, on l'isole à nouveau par centri- fugation et on le sèche sous vide. On dissout le pré- cipité dans 10 ml d'eau et on règle le pli de la solu- tion à 2,5 avec une solution d'hydroxyde de sodium IN, On précipite l'insuline humaine par addition de 1i5 g de chlorure de sodium et on l'isole par centrifuga- tion. On dissout le précipité dans 10 ml d'eau et on précipite l'insuline humaine par addition de 0,8 g de chlorure de sodium, de 3,7 mg d'acétate de zinc à 2 molécules d'eau et de 0,14 g d'acétate de sodium à 3 molécules d'eau, après quoi on ajoutc une solution d'hydroxyde de sodium IN pour atteindre un plU dc 5,52.. Après conservation pendant 24 heures à 4 C, on isole le précipité par centrifugation, on le lave avec 0,9 ml d'eau, on l'isole à nouveau par centrifugation et on le sèche sous vide. Rendement: 90 mg d'insuline humaine. Exemple 24 On dissout 100 mg d'insuline porcine dans 0,5 ml d'acide acétique 1OM et on ajoute 1,3 ml de Thr-OMe 1,54M dans du N,N-diméthylacétamide. On re- froidit le mélange à 12 C. On ajoute 10 mg de trypsi- ne dissoute dans 0,2 ml d'acétate de calcium 0,095M. Après 48 heures à 12 CI on précipite les protéines par addition de 20 ml d'acétone. La chromatographie liquide sous haute pression révèle que la transforma- tion d'insuline porcine en (Thr-OMe)B30-h-In est de 97%% Exemple 25 On dissout 20 mg d'insuline porcine dans un - mélange de 0,08 ml d'acide acétique 10M et de 0,14 ml d'eau. On ajoute 0,2 ml de Thr-OMe 2M dans du N,N- diméthylacétamide et on refroidit le mélange à -100 C. On ajoute 2 mg de trypsine dissoute dans 0,025 ml d'acétate de calcium O, 05M. Apres 72 heures à -10 C, on précipite les protéines par addition de 5 ml d'acé- tonè. La chromatographie liquide sous haute pression révèle que la transformation d'insuline porcine en (Thr-OMe)B30-h-In est de 64%. Exemple 26 On disperse 20 mg dlinsuline porcine dans 0,1 ml dl'eau. Par addition die 0,6 ml de Thr-OMe 2M dans du N,N-diméthylacétamide, ltinsuline entre en solution. On refroidit le mélange à 7 C. On ajoute 2 mg de trypsine dissoute dans 0,025 ml d'acétate de calcium 0,051. Après 24 heures i 7 C, on précipite les protéines par addition de 5 ml d'acétone. La chromatographie liquide sous haute pression révèle que la transformation d'insuline porcine en (Thr- OMle)B30-h-In est de 62%. Exemple 27 On dissout 20 mg d'insuline porcine dans 0,135 ml d'acide propionique 4, 45M. On ajoute 0,24 ml de Thr-OMe 1,67M dans du NN-diméthylacétamide. On ajoute 2 mg de trypsine dans 0,025 ml d'acétate de calcium O,05M et on maintient le mélange à 37 C pen- dant 24 heures. On précipite les protéines par addi- tion de 10 volumes de 2-propanol. La chromatographie * liquide sous haute pression révèle que la transforma- tion d'insuline porcine en (Thr-OMe)B30-h-In estde75%. Exemple 28 On disperse 20 mg d'insuline porcine dans 0,1 ml d'eau. On ajoute 0,4 ml de Thr-OMbe 2M dans du NN- dimethylacétamidepuis 0,04 ml d'acide chlorhydrique 1ON 't ainsi, ltinsuline entre en solution. On ajoute 2 mg de trypsine dissoute dans 0, 025 ml d'acétate de calcium 0,05M1 et on -75-42 maintient le mélange à 37 C pendant 4 heures. Lana- lyse par chromatographie liquide sous haute pression révèle une transformation de 46% d'tinsuline porcine en (Thr-OMe) B30-h-In. Exemple 29 On dissout 20 mg d'insuline -porcine dans 0,175 ml d'acide acétique 0,57M. On ajoute 0,2 ml de Thr-OMe 2M dans du N,N-diméthlylacétamide, puis on ajoute 0,025 ml d'acétate de calcium 0,05M. On ajoute 10 mg d'une preparation brute de protéase d'Acromo- bacter lvticus et on maiitient le mélange à 37 C pen- dant 22 heures, On précipite les protéines par addi- tion de 10 volumes d'acétone. La chromatographie li- quide sous haute pression révèle que la transforma- -tion d'insuline porcine en (Thr-OMe)B30-h-In est de 1 2 50 12%. Exemple 30 On disperse 20 mg d'insuline porcine dans 0,1 ml d'acide acétique 0,51M. On dissout l'insuline en ajoutant 0,2 ml de Thr-OMe 0,1M dans du NN-diméthyl- acétamide. On refroidit le mélange à 12 C et on ajoute 2 mg de trypsine dans 0,025 ml d'acétate de calcium 0,05M. Après 24 heures à 12 C, l'analyse effectuée par chromatographie liquide sous haute pression ré- vèle une transformation de 42% d'insuline porcine en (Thr-0Me)B30-h-In. Exemple 31 On dissout 2 mg d'insuline de lapin dans 0,135 ml d'acide acétique 4,4551. On ajoute 0,24 ml de Thr-OMe 1:67M dans du NN-diméthylacétamidc, puis on ajoute 1,25 mg de trypsine dans 0,025 ml d'acétate de calcium 0,05. On maintient le mélange à 37 C pen- dant 4 heures. L'analyse par chromatographie liquide sous haute pression révèle une transformation de 88% O d'insuline de lapin en (Thr-OMbe)B30-hIn. L'insuline de lapin est éluée de la colonne de chromatographie liquide sous haute pression avant l'insuline porcine, le rapport entre les volumes d'élution d'insuline de lapin et de (Thr-OMe)B30-h-In étant de 0,72. Exemple 32 On dissout 2 mg de diarginine-insuline por- cine (ArgB31-ArgB32-insuline) dans 0,135 ml d'acide acétique 4,45M1. On ajoute 0,24 ml de Thr-OMe 1,67M dans du N,N-diméthylacétamide, puis on ajoute 1,25 mg de trypsine dans 0, 025 ml d'acétate de calcium O,05M. On maintient le mélange à 370C pendant 4 heu- res. L'analyse par chromatographie liquide sous hau- te pression révèle une transformation de 91% de diar- ginine-insuline en (Thr-OMe)B30-h-In. La diarginine- insuline est éluée de la colonne de chromatographie liquide sous haute pression avant l'insuline porcine, le rapport entre les volumes d'élution de diarginine- insuline et de (Thlr-OMe)B30-h-In étant de 0,50. Exemple 33 On fait réagir 2 mg de produits intermédiai- res d'insuline porcine (c'est-à-dire un mélange de proinsuline de desdipeptides (Lys62-Arg63) et de pro- insuline de desdipeptides (Arg31-Arg32) de la même manière que dans la réaction décrite à l'exemple 32. L'analyse par chromatographie liquide sous haute pression révèle une transformation de 88% en (Thr- 0Me)B3O-lh-In. ExemPle 34 On dissout 20 mg d'insuline porcine dans 0,1 ml d'acide acétique 21M. On ajoute 0,2 ml de Thr-OMe 2M dans du N,N-diméthylacétamide et on re- froidit le mélange à -18"C. On ajoute 2 mg de tryp- sine dissoute dans 0,025 ml d'acétate de calcium 0,OSM et on maintient le mélange à -18 C pendant 120 heures. L'analyse par chromatographie liquide sous haute pression révèle que la transformation en (Thr- OMe)B3O-h-In est de 83%. Exefple 35 On répète le procédé décrit à l'exemple 34, avec cette exception que l'on effectue la réaction à une température de 50 OC pendant 4 heures, Ltanaly- se par chromatographie liquide sous haute pression révèle que la transformation en (Thr-OMe)B30-h-In est de 23%. Exemple 36 On dissout 20 mg d'insuline porcine dans Os1 ml d'acide acétique 3M1. On ajoute 03 ml de-Thr- O(CH2)2-S02-CH3$ CH3COOH (ester 2-(méthylsulfonyl)- éthylique de thréonine, hydroacétate) O,33Mdans du N,N- diméthylacétamide. On refroidit le mélange à 12 C et on ajoute 2 mg de trypsine dans 0,025 ml d'acétate de calcium 0,05M. Après 24 heures à 12 C, la chromato- graphie liquide sous haute pression révèle une trans- formation de 77% en (Thr-O(CH2)2-SO2-CH)B3-h-In,. Le produit élue à peu près à la position de la (Thr- OMe)B30-h-In. Exemple 37 On dissout 20 mg d'insuline porcine dans- 0,1 ml d'acide acétique 1OM. On ajoute 0,2 ml de Thr-OEt 2M1 (Et = éthyle) dans du N,N-diméthylacétami- de et on refroidit le mélange à 12 C. On ajoute 2 mg de trypsine dans 0,025 ml d'acétate de calcium 0,05M. Après 24 heures à 12 C0 la chromatographie liquide sous haute pression révèle une transformation dé 75% en {Thr-OEt)B30-h-In. Le produit est élué dans une portion venant légèrement après celle de (Thr- 0Me)B30_h_In. Exemple 38 On dissout 20 mg d'insuline porcine dans O,l ml d'acide acétique 6M. On ajoute 0,3 ml de tt t Thr(Bu)-OBut 0,67M (But = tert-butyle) dans du NN- diméthylacétamide. On refroidit le mélange à 12 C et on ajoute 2 mg de trypsine dans 0,025 ml d'acétate de éalcium O,05M. Après 24 heures à 12 C, la trans- formation en (Thr(But)-OBut)B30-h-In est de 77%. On élue le produit de la colonne de chromatographie liquide sous haute pression en appliquant un gradient alLant de 27% à 40% dans de l'acétonitrile. Exemple 39 On dissout 20 mg d'insuline porcine dans 0,1 ml d'acide acétique 4M. On ajoute 0,2 ml de Thr-OMble 1,5M en solution dans du tétrahydrofuranne et on refroidit le mélange à 12 C. On ajoute 2 mg de trypsine dissoute dans 0,025 ml d'acétate de cal- cium O,05M. Après 4 heures à 12 C, l'analyse par chro- matographie liquide sous haute pression révèle une transformation de 75% en (Thr-OMe)B30-h-In. Exemple 40 On dissout 20 mg d'insuline porcine dans 0,1 ml d'acide acétique 4M. On ajoute 0,8 ml de Thr-OMe 2M en solution dans du 1,2-éthane-diol et on refroidit le mélange à 120C. On ajoute 2 mg de tryp- sine dissoute dans 0,025 ml d'acétate de calcium O,05M. Après 4 heures à 12 C, l'analyse par chromato- graphie liquide sous haute pression révèle une trans- formation de 48% en (Thr-OMe)B30-h-In. Exemple 41 On dissout 20 mg d'insuline porcine dans 0,1 ml d'acide acétique 4M. On ajoute 0,2 ml de Thr- OMle 21 en solution dans de l'éthanol et on refroidit le mélange à 12 C. On ajoute 2 mg de trypsine dis- soute dans 0,025 ml d'acétate de calcium 0,05M et on effectue la réaction pendant 4 heures à 12 C. Ltana- lyse par chromatographie liquide sous haute pression révèle une transformation de 46% en (Thr-OMe)B30-h-In. Exemple 42 On dissout 20 mg d'insuline porcine dans 0,1 ml d'acide acétique 4M. Onajoute 0,2 mil de Thr-C!e 2M dans de l'acétone et on refroidit le mélange à 12 C. On -475542 ajoute'2 mg de trypsine en-solution dans 0,025 ml d'acétate de calcium O, OSM. Après 4 heures à 12 C, l'analyse par chromatographie liquide sous haute pression révèle une transformation de 48% en (Thr- OMble)B30-h-In. f REVENDICATIONS 1. Procédé de préparation d'esters dce thréonineB30 d'insuline humaine ou d'un de leurs sels ou complexes, caractérisé en ce qu'on effectue la transpeptidation d'un composé d insuline ou d'un de ses sels ou complexes pouvant être transformés en ce composé, avec un ester de L-thréonine ou un tle ses sels dans un mélange d'eau, d'un solvant organique miscible l'eau et de trypsine, la teneur en eau du mélange réactionnel étant inférieure à 50% (volume/ volume), la température réactionnolle étant inférieure à 50 C, et facultativement en présence d'un acide. 2. Procédé suivant la revendication lcarac- térisé en ce que la concentration de l'ester de L-thréonine dans le mélange réactionnel est supérieure à 0,IM, la température réactionnelle est supérieure au point de congélation du mélange réactionnel et ce dernier contient 0 à 10 équivalents d'un acide par équivalent de l'ester de L-thréonine. 3. Procédé suivant l'une quelconque des re- vendications 1 et 2, caractérisé en ce que le composé d'insuline est un composé choisi parmi le groupe com- prenant l'insuline de porc, de chien, de rorqual, de cachalot et de lapin, la diarginine-insuline porcine, la proinsuline porcine de scission, la proinsuline porcine de desdipeptides, la proinsuline porcine, la proinsuline de chien, la proinsuline de singe et la proinsuline humaine, ainsi que leurs mélanges. 4. Procédé suivant l'une quelconque des re- vendications l à 3, caractérisé en ce que le composé d'insuline est d'origine porcine. 5. Procédé suivant la revendication 4, ca- ractérisé en ce que, comme composé d'insuline, on utilise de l'insuline relativement brute. - 6. Procédé suivant l'une quelconque des reven- dications 1 à 5, caractérisé en ce que la température réac- tionnelle est inférieure à 37 C, de préférence inférieure à la température ambiante et supérieure à 0 C. 7. Procédé suivant l'une quelconque des re- vendications 1 à 6, caractérisé en ce que la teneur en eau du mélange réactionnel est comprise entre 40 et 10% - (volume/volume). 8. Procédé suivant l'une quelconque des revendications 1 à 6, caractérisé en ce que le composé d'insuline est l'insuline porcine, l'ester de L-thréonine est Thr-OMe ou Thr-OBut, le solvant organique miscible à l'eau est le N,N-diméthylformamide ou le N,N-diméthylacéta- mide, la température réactionnelle est d'environ 370C, la teneur en eau du mélange réactionnel est comprise entre 41 et 43X, le rapport pondéral entre la trypsine et le composé d'insuline est d'environ 1:8, le rapport molaire entre l'ester de L-thréonine et le composé d'insuline est d'environ 1: 120 et on ajoute entre 1,2 et 1,5 équivalent d'acide acétique par équivalent d'ester de L-thréonine. 9. Esters de thréonine B30 d'insuline humaine tels que préparés par le procédé suivant l'une quelconque des revendications 1 à 8. 10. Procédé de préparation d'insuline humaine, caractérisé en ce qu'on effectue tout d'abord le procédé suivant l'une quelconque des revendications 1 à 8, puis on B30 débloque l'ester de thréonine B30 obtenu d'insuline humaine, de préférence en présence d'une base ou d'un acide. 11. Insuline humaine telle que préparée par le procédé suivant la revendication 10. 12. Esters de threonine B30 d'insuline humai- ne selon la revendication 9 o le groupe ester est diffé- rent du groupe tert-butyle et du groupe méthyle.