FR 2481318 A1 19811030 FR 8108105 A 19810423 La présente invention se rapporte à un procédé immunologique pour l'analyse qualitative ou quantitative d'une substance. Le procédé selon l'invention est un procédé immuno- enzymatique basé sur ce qu'on appelle le "principe sandwich". Selon ce principe, la substance à analyser, qui peut être un antigène, un anticorps ou un haptène, est mise à réagir avec deux réactifs possédant l'activité immunologique. En règle générale, l'un de ces réactifs possédant une activi- té immunologique est fixé sur un support insoluble dans l'eau et l'autre est associé à une enzyme appropriée. Dans la pratique, la substance à analyser est d'abord mise à réagir avec le réactif fixé sur un support; après sépara- tion de phases et lavage, la substance, fixée entre temps sur le support par voie immunologique, est mise à réagir avec le deuxième réactif, marqué par une enzyme. Après une nouvelle séparation de phases, la réaction enzymatique servant au dosage de la substance soumise à analyse est effectuée en phase solide ou en phase liquide. Jusqu'à maintenant on pensait que, dans les pro- cédés immuno-enzymatiques, la réaction immunologique de la substance soumise à l'analyse avec les deux réactifs possédant l'activité immunologique correspondante devait être effectuée dans deux stades de réaction successifs. Conformément à l'invention, on a maintenant trou- vé que contrairement à cette conception antérieure, on pou- vait opérer presque selon une technique "en un seul réci- pient", dans laquelle la substance soumise à l'analyse est mise à réagir simultanément avec les deux réactifs pos- sédant l'activité immunologique au cours d'une seule et unique incubation. L'invention concerne donc un procédé immuno-en- zymatique pour l'analyse qualitative ou quantitative d'une substance à l'aide d'un réactif possédant une activité immunologique et marqué par une enzyme et d'un réactif pos- sédant une activité immunologique qui est fixé ou sera fi- xé sur un support insoluble dans l'eau, par incubation de la substance soumise à l'analyse avec les réactifs possé- dant l'activité immunologique, séparation subséquente de la phase solide et de la phase liquide et mesure du degré de marquage à l'enzyme, soit dans la phase solide soit dans la phase liquide, en tant que mesure de la quantité de la substance soumise à l'analyse, ce procédé se carac- térisant en ce que, pour la réaction immunologique, la substance soumise à l'analyse et les réactifs possédant l'activité immunologique sont soumis à incubation dès le début et en commun et une seule fois. Parmi les substances soumises à l'analyse, on citera tous les constituants des liquides physiologiques, des extraits cellulaires ou tissulaires pour lesquels il existe des réactifs immunologiques ou pour lesquels on peut former des réactifs immunologiques, et qui possèdent deux ou plusieurs sites possédant l'activité immunologique. Il peut s'agir de peptides, de protéines, de lipoprotéines, de glycoprotéines, de stérols, de stéroîdes, de lipides, d'acides nucléiques, d'enzymes, d'hormones, de polysaccha- rides, d'alcaloïdes. Les substances immuno-actives préfé- rées sont les antigènes naturels tels que les hormones, les enzymes, les antigènes spécifiques d'organes, les compo- sants du tissu conjonctif, les antigènes des cellules san- guines, les protéines du plasma, les globulines pathologi- ques. Les substances particulièrement appréciées sont l'antigène carcino-embryonnaire (CEA) ainsi que la gonado- tropine chorionique humaine (HCG). Dans le procédé selon l'invention, le réactif immuno-actif marqué par une enzyme sert d'indicateur pour la réaction immunologique. Les enzymes préférées sont les phosphatages alcalines, la malate-déshydrogénase, la gluco- se-6-phosphate-déshydrogénase, la glucose-oxydase, la glu- coamylase, la galactosidase et l'acétylcholine-estérase. Un marqueur enzymatique préféré consiste en la peroxydase de raifort. 2 2481318 L'enzyme servant d'indicateur de la réaction immunologique est dosée selon des méthodes connues dans la phase liquide ou, de préférence, dans la phase solide, et constitue une mesure de la quantité de la substance soumise à l'analyse. Lorsque -le marqueur est la peroxy- dase de raifort, la quantité d'enzyme est de préférence dosée par l'activité catalytique existante, laquelle est déterminée à l'aide d'H202 et de l'o-phénylènediamine qui sert d'indicateur rédox. Après une réaction catalyti- que de 30 mn, on mesure par photométrie l'intensité de coloration de l'indicateur rédox oxydé. Le second réactif immuno-actif sert à la sépara- tion de la substance à doser de l'échantillon soumis à l'analyse. Pour ce stade de séparation, le second réactif immuno-actif peut être fixé dès le début sur un support insoluble dans l'eau ou fixé sur un support approprié du- rant ou après la réaction immunologique. Parmi les supports insolubles dans l'eau qui con- viennent pour le duexième réactif immuno-actif, on citera des polymères organiques et minéraux (amylase, dextrannes, celluloses naturelles ou modifiées, polyacrylamide, aga- rose, magnétite, poudre de verre poreux, fluorure de poly- vinylidène (Kynar) et latex), la paroi intérieure de ré- cipients d'analyse (petits tubes à essai, plaques de ti- trage ou cuvettes en verre ou en résine synthétique) ain- si que la surface de corps colides durant ou après la réaction. L'essentiel dans le procédé selon l'invention réside en ce que la substance soumise à l'analyse possède au moins deux sites immuno-actifs (épitopes), qui puissent être reconnus par les deux réactifs immunoactifs,Y celui qui est fixé sur un support et celui qui est marqué par une enzyme, et réagir avec eux. Les réactifs immuno-ac- -tifs sont de préférence deux composants différents qui, certes, réagissent tous les deux avec la substance soumise à l'analyse mais dirigés chacun sur des sites immuno-ac- tifs différents. Les réactifs qui conviennent tout parti- culièrement pour l'analyse des antigènes sont deux anti-. corps à cet antigène, produits par deux espèces animales différentes et qui sont dirigés vers des épitopes diffé- rents de cet antigène. La combinaison d'anticorps de clo- nes différents ou d'anticorps monoclonaux et d'anticorps d'une espèce animale différente convient tout spécialement. Pour la réaction immunologique, on peut partir avec l'échantillon contenant la substance soumise à l'ana- lyse tel quel ou dilué au préalable ou soumis à un traite- ment préalable approprié. Pour le traitement préalable, on peut isoler la substance soumise à l'analyse, enrichir l'échantillon en cette substance ou le débarrasser de constituants gênants. Conformément à l'invention, la substance soumise à l'analyse est mise à réagir simultanément avec le réac- tif immuno-actif marqué par une enzyme et avec le réactif immuno-actif fixé sur un support. L'ordre de l'addition des réactifs dépend de la nature du système de support choisi. Lorsqu'on opère avec une bille de matière plas- tique sensibilisée, on place d'abord le réactif marqué par une enzyme et la substance soumise à l'analyse dans un petit tube à essai approprié puis on ajoute la bille sen- sibilisée par l'autre réactif. La réaction immunologique est effectuée dans un système tampon approprié permettant de maintenir un pH optimal, qui peut se situer entre 4 et 9. Les tampons pré- 2 2481318 férés sont par exemple le tampon à l'acétate, le tampon au citrate, le tampon au phosphate, le tampon au Tris, le tam- pon à la triéthanolamine, le tampon au borate ou le tampon à la glycine. On peut également utiliser des mélanges de tampons. La réaction immunologique est de préférence ef- fectuée à une température de O à 55C. NoTmalement, la vitesse de la réaction immunologique augmente avec la température et dans des conditions opératoires par ailleurs identiques, l'équilibre est atteint plus rapidement. L'incubation de la substance soumise à l'analyse avec le réactif marqué par une enzyme et le réactif fixé sur support peut être poursuivie jusqu'à l'équilibre. Tou- tefois, on peut aussi arrêter la réaction immunologique plus tôt, en séparant la phase solide et la phase liquide après une durée d'incubation déterminée et en déterminant le de- gré du marquage à l'enzyme soit dans la phase liquide soit dans la phase solide. Pour la réaction immunologique, on peut prendre des mesures particulières pour stabiliser l'activité immunologi- que des réactifs, de la substance soumise à l'analyse et de l'enzyme. En outre, on peut ajouter à la solution d'incuba- tion des constituants tels que des protéines et des déter- gents, servant à éliminer des réactions non spécifiques, à amoindrir des influences inhibitrices ou à activer. Le procédé selon l'invention est extrêmement sen- sible et se distingue par sa simplicité dans les manipula- tions. Les exemples suivants illustrent l'invention sans toutefois la limiter; dans ces exemples, les indications de parties et de % s'entendent en poids sauf mention con- traire. Exeml Analyse quantitative du CEA dans des plasmas de patients à l'aide d'un anticorps monoclonal dû CEA et d'un 2 4 8 13 1 8 anticorps du CEA (chèvre) Dans le nombre nécessaire de petits tubes à essai (de 10 x 75 mm), on pipette 0,2 ml dans chaque cas de la solution pour analyse (0,2 mole/litre de NaH2P04/ Na2HP04, pH: 6,5, à 2 g/litre de sérum-albumine de bovin, % de sérum de chèvre normal et 0,2 microgramme/ml de produit de conjugaison anti-CEA de chèvre-peroxydase), on ajoute en mélangeant 0,050 ml du plasma de patient à ana- lyser ou de l'étalon de CEA (0 ng/ml de CEA, 2,5 ng/ml de CEA, 10 ng/ml de CEA et 20 ng/ml de CEA) et du sérum té- moin au CEA (5,0 ng/ml de CEA + 1,0 ng/ml),on ajoute dans chaque tube une bille de polystyrène (diamètre: 6,5 mm) sensibilisée par de l'anti-CEA monoclonal de souris et on soumet à incubation de 16 heures à 37 C. L'anti-CEA monoclonal de souris est préparé par un mode opératoire analogue à celui décrit dans Journal of Immunological Methods, 32 (1980) 297-304, en utilisant comme ligne cellulaire initiale pour la fusion la ligne du myélome Sp 2/01-AG déposée sous n CRL 8006 à l'ATCC. La fusion est effectuée avec des cellules de rate de souris immunisées par le CEA. L'immunisation des souris a été réalisée comme décrit dans le tableau I de la publication ci-dessus, les deux premières immunisations avec 50 micro- grammes de CEA à chaque fois, les immunisations 3 et 4 ont été supprimées, l'immunisation 5 avec 50 microgrammes de CEA et les immunisations 6 à 8 avec 200 microgrammes chacune de CEA. Les billes de polystyrène sont ensuite lavées à trois reprises avec 2 à 5 ml d'eau distillée à chaque fois, transférées dans 0,5 ml de tampon-substrat pour la déter- mination de l'activité de la peroxydase (0,1 mole/litre de tampon au citrate de potassium, pH 5,0, avec 6 millimoles/ litre d'H202 et 20 millimoles/litre d'o-phénylène-diamine) et soumises à incubation de 30 mn à température ambiante (22 C). Pour arrêter l'activité peroxydasique et intensi- fier la profondeur de coloration, on mélange 2,0 ml d'HCl N et on mesure par photométrie, dans un délai de 30 mn au maximul, l'extinction à la longueur d'ondes de 492 nm. On trouvera dans le tableau 1 ci-après les valeurs obte- nues dans une détermination de CEA, comparativement aux valeurs obtenues par le radio-immunotest de Roche. Tableau 1 Echantillon soumis à l'analyse LE492 n/TA/30 Min. E ha = u Je m L E492 nm/TA/30 Min. Etalon de CEA O ng/ml CEA 0,103 2,5 ng/ml CEA 0,330 ,0 ng/ml CEA 0,978 ,0 ng/ml CEA 1,850 Sérum témoin au CEA ,0 ng/ml CEA 0,540 plasmas des RIT Roche Procédé selon patients l'invention No. 7212 0,6 ng/ml 1,2 ng/ml No. 7188 2,2 ng/ml 1,0 ng/ml No. 7220 1,2 ng/ml 1,4 ng/ml No. 7218 1,2 ng/ml 1,3 ng/ml No. 7234 2,5 ng/ml 2,7 ng/ml No. 7249 2,4 ng/ml 2,0 ng/ml No. 7203 2,3 ng/ml 2,0 ng/ml No. 7223 3,0 ng/ml 3,3 ng/ml No. 7247 3,1 ng/ml 2,8 ng/ml No. 7258 4,6 ng/ml 4,3 ng/ml No. 7215 4,9 ng/ml 5,5 ng/ml No. 7219 5,0 ng/ml 5,9 ng/ml No. 8180 8,6 ng/ml 8,5 ng/ml No. 7248 11,2 ng/ml 10,7 ng/ml No. 7262 14,2 ng/ml 14,3 ng/ml No. 7201 15,6 ng/ml 15,3 ng/ml Les valeurs inférieures à 2,5 ng/ml de CEA sont normales; les valeurs supérieures à 2,5 ng/ml correspon- dent à un état pathologique. Exemple 2 Dosage du CEA dans des plasmas de patients à l'aide d'anticorps du CEA provenant de deux espèces anima- les différentes (chèvre et cobaye) Dans le nombre nécessaire de petits tubes à essai (10 x 75 mm) on pipette dans chaque cas 0,2 ml de la solution pour analyse (0,2 mole/litre de NaH2P04/Na2HP04, pH 6,5, à 2 g/litre de sérum-albumine de bovin, 20% de sérum de chèvre normal et 0,2 microgramme/litre de pro- duit de conjugaison anti-CEA de chèvre-peroxydase), on mélange 0,050 ml du plasma de patient soumis à l'analyse ou de l'étalon de CEA (0 ng/ml de CEA, 2,5 ng/ml de CEA, ng/ml, et 20 ng/ml de CEA) et du sérum témoin au CEA (5,0 ng/ml de CEA + 1,0 ng/ml), on ajoute dans chaque cas une bille de polystyrène (diamètre: 6,5 mm) sensibilisée à l'anti-CEA de cobaye et on soumet à incubation pendant 16 heures à 37 C. On lave ensuite les billes de polysty- rène à trois reprises avec 2 à 5 ml d'eau distillée à chaque fois, on les transfère chacune dans 0,5 ml de tam- pon-substrat pour la détermination de l'activité de la peroxydase (0,1 mole/litre de tampon au citrate de potas- sium, pH 5,0 avec 6 millimoles/litre d'H202 et 20 millimo- les/litre d'o-phénylène-diamine) et on soumet à incubation de 30 mn à température ambiante (22 C). Pour couper l'ac- tivité peroxydasique et intensifier la profondeur de cou- leur, on mélange 2,0 ml d'HCllN et, dans un délai maximum de 30-mn, on mesure par photométrie l'extinction à la lon- gueur d'ondes de 492 nm. On trouvera dans le tableau II ci-après les valeurs obtenues dans un dosage du CEA, com- parativement aux valeurs obtenues dans le radio-immunotest de Roche. Tableau II Echantillon soumis à l'analyse eE492 m/TA/30 Min. Etalon de CEA 0 ng/ml CEA 0,098 2,5ng/ml CEA 0,270 ,Ong/ml CEA 0,830 0, Ong/ml CEA 1,515 Sérum témoin au CEA ,0 ng/ml CEA 0,470 plasmas des RIT Roche Procédé selon p atients 1 l'invention No. 7220 1,2 ng/ml 1,3 ng/ml No. 7218 1,2 ng/ml 1,3 ng/ml No. 7234 2,5 ng/ml 2,4 ng/ml No. 7249 2,4 ng/ml 2,2 ng/ml No. 7203 2,3 ng/ml 2,2 ng/ml No. 7223 3,0 ng/ml 3,0 ng/ml No. 7247 3,1 ng/ml 3,2 ng/ml No. 7258 4,6 ng/ml 4,5 ng/ml No. 7215 4,9 ng/ml 5,3 ng/ml No. 7219 5,0 ng/ml 5,6 ng/ml No. 8180 8,6 ng/ml 8,5 ng/ml No. 7248 11,2 ng/ml 10,9 ng/ml No. 7262 14,2 ng/ml 14,2 ng/ml No. 7201 15, 6 ng/ml 15,0 ng/ml Les valeurs inférieures à 2,5 ng/ml de CEA sont normales; les valeurs supérieures à 2,5 ng/ml correspon- dent à des états pathologiques. Exemple 3 Dosage du CEA dans des plasmas de patients à l'aide d'anticorps du CEA monoclonaux provenant de deux clones différents. 24813 8 Dans le nombre nécessaire de petits tubes à essai (de 10 x 75 mm) on pipette à chaque fois 0,2 ml de la solution pour analyse (0,2 mole/litre de NaH2P04/Na2HP04 pH 6,5, avec 2 g/litre de sérum-albumine de bovin, 20% de sérum de chèvre normal et 0,15 microgramme/ml de pro- duit de conjugaison anti-CEA monoclonal de souris-peroxy- dase), on ajoute et on mélange 0,050 ml du plasma de pa- tient à analyser ou de l'étalon de CEA ( O ng/ml de CEA, 2,5 ng/ml de CEA, 10 ng/ml de CEA et 20 ng/ml de CEA) et du sérum témoin au CEA (5,0 ng/ml de CEA + 1,0 ng/ml). On ajoute dans chaque cas une bille de polystyrène (diamètre: 6,5 mm) sensibilisée à l'anti-CEA monoclonal de souris et on soumet à incubation de 16 heures à 37 C. L'anti-CEA monoclonal de souris a été préparé par un mode opératoire analogue à celui décrit dans Journal of Immunological Methods, 32 (1980) 297-304, en utilisant comme ligne cellulaire initiale pour la fusion la ligne du myélome Sp 2/01-Ag déposé sous n CRL 8006 à l'ATCC. La fusion a été effectuée avec des cellules de rate de sou- ris immunisées au CEA. Les souris ont été immunisées par un mode opératoire analogue à celui illustré dans le tableau 1 de la publication ci-dessus, les deux premières immunisations avec 50 microgrammes de CEA dans chaque cas, les immunisations 3 et 4 ont été supprimées, l'immunisa- tion 5 a été effectuée avec 50 microgrammes de CEA et les immunisations 6 à 8 avec 200 microgrammes à chaque fois de CEA. On a utilisé deux anticorps monoclonaux différents et appropriés, dirigés sur des épitopes différents de l'an- tigène du CEA. Les billes de polystyrène ont ensuite été lavées à trois reprises avec 2 à 5 ml d'eau distillée à chaque fois, transférées chacune dans 0,5 ml de tampon-substrat pour détermination de l'activité de la peroxydase (0,1 mole/litre de tampon au citrate de potassium, pH 5,0, avec 6 millimoles/litre d'H202 et 20 millimoles/litre d'o-phé- nylène-diamine) et soumises à incubation pendant 30 mn à température ambiante (22 C). Pour arrêter l'activité peroxydasique et intensifier la profondeur de couleur, on a mélangé 2,0 ml d'HCllN puis on a mesuré par photomé- trie dans un délai maximum de 30 mn l'extinction à la longueur d'ondes de 492 nm. On trouvera dans le tableau III ci-après les valeurs obtenues dans une détermination du CEA, comparativement aux valeurs obtenues dans le radio-immunotest de Roche. Tableau III Les valeurs inférieures à normales; les valeurs supérieures à à des états pathologiques. 2,5 ng/ml de CEA sont 2,5 ng/ml correspondent Echantillon soumis à l'analyse E492 nm/TA/30 Min. Etalon de CEA O ng/ml CEA 0,390 2,5 ng/ml CEA 0,440 ,0 ng/ml CEA 0,620 ,0 ng/ml CEA 0,860 Sérum témoin au CEA ,0 ng/ml CEA 0,510 plasmas des RIT Roche Procédé selon patients 1' invention No. 7220 1,2 ng/ml 0,8 ng/ml No. 7234 2,5 ng/ml 3,0 ng/ml No. 7223 3,0 ng/ml 3,5 ng/ml No. 7247 3,1 ng/ml 3,2 ng/ml No. 7258 4,6 ng/ml 4,4 ng/ml No. 7215 4,9 ng/ml 5,0 ng/ml No. 7219 5,0 ng/ml 5,4 ng/ml No. 8180 8,6 ng/ml 8,6 ng /ml No. 7248 11,2 ng/ml 11,0 ng/ml No. 7262 14,2 ng/ml 14,0 ng/ml No. 7201 15,6 ng/ml 16,0 ng/ml 12 2481318 Exemple 4 Dosage de l'HCG dans sérum/plasma/urine Dans le nombre nécessaire de petits tubes à es- sai (10 x 75 mm) on pipette à chaque fois 0,2 ml de la solution pour analyse (0,1 mole/litre de NaH2P04/Na2HP04, pH 7,0, à 2 g/litre de sérumalbumine de bovin et 1,0 microgramme/ml de produit de conjugaison anti-HCG mono- clonal de souris-peroxydase) (l'anti-HCG monoclonal peut être préparé par l'un des modes opératoires décrits dans Journal of Immunological Methods 32 (1980) 297-304), on ajoute dans chaque cas une bille de polystyrène (diamè- tre: 6,5 mm) sensibilisée par de l'anti-HCG de lapin et on soumet à incubation de 16 heures à température ambiante en atmosphère saturée d'humidité. On lave ensuite les billes de polystyrène à trois reprises avec 2 à 5 ml d'eau distillée à chaque fois, on les transfère chacune dans 0,5 ml de tampon-substrat pour détermination de l'activi- té de la peroxydase (0,1 mole/litre de tampon au citrate de potassium, pH 5,0, avec 6 millimoles/litre d'H202 et 20 millimoles/litre d'o-phénylènediamine) et on soumet à incubation de 30 mn à température ambiante (16 à 30 C). Pour arrêter l'activité peroxydasique et intensifier la profondeur de coloration, on mélange 2,0 ml d'HC1 N et on mesure par photométrie dans un délai maximum de 30 mn l'extinction à la longueur d'ondes de 492 nm. On trou- vera dans le tableau ci-après les valeurs obtenues lors d'une détermination de l'HCG dans le sérum et dans l'urine. Détermination de l'HCG dans le sérum et dans l'urine 1. Courbes étalons A E 492 nm/30 mn/ TA mUI d'HCG/ml sérum urine O 0,185 0,385 - 0,385 0,525 0,530 0,720 - 0,830 1 1,05 250 1.185 1 1.59 2. Echantillons provenant de patients Calcul: 1 ng d'HCG pure correspond à environ 10 mUI dHCG Exemple 5 Dosage de 1'HCG dans le sérum à l'aide d'anti- corps monoclonaux de l'HCG provenant de deux clones diffé- rents Dans le nombre nécessaire de petits tubes à essai (de 10 x 75 mm) on pipette à chaque fois 0,2 ml de la solution pour analyse (0,1 mole/litre de NaH2P04/Na2HP04, pH 7,0 à 2 g/litre de sérum-albumine de bovin et 1,0 micro- gramme/ml de produit de conjugaison anti-HCG monoclonal de sourisperoxydase)(l'anticorps monoclonal d'HCG de souris est préparé par les modes opératoires décrits dans Journal of Immunological Méthods, 32 (1980) 297-304. On a utilisé deux anticorps monoclonaux appropriés différents dirigés vers des épitopes différents de l'antigène de l'HCG), on mé- lange 0,050 ml du plasma de patient à analyser ou de l'éta- lon d'HCG (0,25,50,100 et 200 mUI/ml d'HCG), on ajoute dans chaque tube une bille de polystyrène de diamètre 6,5 mm sensibilisée par de l'anti-HCG monoclonal de sou- ris et on soumet à incubation à 37 C par exemple pendant 2 heures. On lave ensuite les billes de polystyrène à trois reprises par 2 à 5 ml d'eau distillée à chaque fois, on les transfère chacune dans 0,5 ml de tampon-substrat pour détermination de l'activité de la peroxydase (0,1 mole/litre de tampon au citrate de potassium, pH 5,0, avec 6 millimoles/litre d'H202 et 20 millimoles/litre d'o-phé- nylène-diamine) et on soumet à incubation de 30 mn à tempé- rature ambiante (16 à 30 C). Pour arrêter l'activité per- oxydasique et intensifier la profondeur de couleur, on mé- lange 1,0 ml d'HCl 2 N et on mesure par photométrie dans un délai maximum de 30 mn l'extinction à la longueur d'on- des de 492 nm. On trouvera dans le tableau ci-après les valeurs obtenues dans des déterminations de l'HCG dans le sérum. Dosage de l'HCG dans le sérum humain (valeurs mo- yennes dans des mesures effectuées en double) 1. Courbes étalons mUI/ml d'HCG 1) sérum AE 492 inm/30 mn/TA 2) plasma 3)urine 4)tampon 0 0,038 0,054 0,158 0,180 0,226 - - - 0,475 0,544 0,557 0,716 0,905 0,955 0,970 1,40 1,75 1,55 1,90 2,44 Les valeurs d'HCG trouvées dans les sérums de pa- tients énumérés ci-après ont été relevées sur la courbe é- talon 1). Les courbes d'étalonnage 2), 3) et 4) ont été dressées plus tard avec de nouveaux étalons d'HCG. 2. Sérums de patients 6E 492/30 mn/TA mUI/ml d'HCG Sérum mesuré pris sur la courbe 1, Mélange 091080. 0,041 0 No. 2801 0,025 0 No. 3881 0,450 47 No. 2673 1,13 127 No. 1167 2,12 (1:2) 470 No. 4891 0,975 (1:50) 51450 No. 3240 1,06 (1:20) 2'280 No. 4418 1,475 (1:1000)167'000 248, 2 REVENDICATIONS 1) Procédé immunologique pour l'analyse qualitati- ve ou quantitative d'une substance à l'aide d'un réactif immuno-actif marqué par une enzyme et d'un réactif immuno- - actif fixé sur un support insoluble dans l'eau ou qui sera fixé sur un support-insoluble dans l'eau, par incubation de la substance soumise à l'analyse avec les réactifs immu- no-actifs, séparation subséquente de la phase solide et de la phase liquide et mesure du degré de marquage à l'enzyme soit dans la phase solide soit dans la-phase liquide, le- quel constitue une mesure de la quantité de substance sou- mise à l'analyse, caractérisé en ce que, pour la réaction immunologique, la substance soumise à l'analyse et les réac- tifs immuno-actifs sont soumis à incubation dès le début ensemble et une seule fois. 2) Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que la substance soumise à l'analyse est un antigène. 3) Procédé selon la revendication 1 ou 2, caracté- risé en ce que les réactifs immuno-actifs sont des anti- corps différents dirigés vers le même antigène mais vers des épitopes différents de cet antigène. 4) Procédé selon la revendication 3, caractérisé en ce que les deux réactifs sont deux anticorps monoclonaux différents. 5) Procédé selon la revendication 1 ou 2, caracté- risé en ce que la substance soumise à ?'analyse est l'an- tigène carcino-embryonnaire (CEA). 6) Procédé selon la revendication 5, caractérisé en ce que le réactif immuno-actif fixé sur un support insolu- ble dans l'eau est un anti-CEA monoclonal de souris. 7) Procédé selon la revendication 5 ou 6, caracté- risé en ce que le réactif immuno-actif marqué est un autre anti-CEA monoclonal de souris marqué par une enzyme. 8) Procédé selon la revendication 5-ou 6, caracté- risé en ce que le réactif immuno-actif marque est un anti- CEA de chèvre marque par une enzyme. 17 2481318 9) Procédé selon la revendication 6 ou 7, caractérisé en ce que l'enzyme est la peroxydase. ) Procédé selon la revendication I ou 2, caracté- risé en ce que l'antigène est la gonadotropine chorionique humaine (HCG). 11) Procédé selon la revendication 10, caractérisé en ce que le réactif immuno-actif fixé sur un support insoluble est de l'anti-HCG de lapin. 12) Procédé selon la revendication 10 ou 11, carac- térisé en ce que le réactif immuno-actif marqué est un anti-HCG monoclonal de souris marqué par une enzyme. 13) Procédé selon la revendication 12, caractérisé en ce que l'enzyme est la peroxydase. 14) Procédé eimunologique pour l'analyse qualitati- ve ou quantitative d'une substance à l'aide d'un réactif irmiuno-actif marqué et d'un réactif irimuno-actif fixé sur un support insoluble dant l'eau ou qui sera fixé sur un support insoluble dans l'eau, par incubation de la subs-. tance soumise à l'analyse avec les réactifs imm.uno-actifs, séparation subséquente de la phase solide et de la phase liquide et mesure du degré de marquage soit dans la phase solide soit dans la phase liquide., lequel constitue une mesure de la quantité de substance soumise à l'analyse, caractérisé en ce que, pour la réaction iîmunologique, la substance soumise à l'analyse et les réactifs imuno-actifs sont soumis à incubation dès le début ensemble et une seule fois, et en ce que la substance soumise à l'analyse est un antigène et en ce que les réactifs immuno- actifs sont des anticorps de clones différents, dirigés vers des épitopes différents de cet antigène.