FR 2482622 A1 19811120 FR 8109776 A 19810515 24 26 2 La présente invention concerne un procédé pour la production de L-lysine par fermentation et en particulier un procédé pour produire la L-lysine au moyen d'un micro-organisme construit par une technique de recombinaison de gènes: Jusqu'à présent, pour rendre une souche sauvage capa- ble de produire la L-lysine à partir des hydrates de carbone, il était nécessaire d'induire des mutants artificiels à partir de la souche sauvage. On connaît de nombreux mutants artificiels produc- teurs de L-lysine. La plupart des mutants producteurs de lysine sont résistants aux analogues de la lysine tels que la S-(2-aminoéthyl)- cystéine (AEC) et/ou nécessitent pour leur croissance de l'homosérine et appartiennent au genre Brevibacterium ou Corynebacterium. Ces microorganismes produisent la L-lysine avec un rendement de 40 à %. Des exemples de publications récentes concernant la production de L-lysine par fermentation sont les demandes de brevet japonais non examinées publiées n 9784/1980, 9783/1980, 955911980, 9785/1980, 86091/1978, 86090/1978, 86089/1978, 26391/1978, 20490/1978, 9394/1978 et 6486/1978. Il est devenu cependant difficile d'augmenter les rendements de L-lysine en utilisant les techniques de mutation arti- ficielle. On a donc encore besoin de développer de nouveaux microorganismes capables de produire la L-Iysine avec des rendements élevés. L'invention a donc pour objet un procédé pour produire la L-lysine avec un rendement élevé. Cet objet et d'autres objets de l'invention,qui appa- raîtront plus clairement ci-après, sont atteints par un procédé de production de la L-lysine qui consiste a) à cultiver dans un milieu de culture un micro-organisme produc- teur de L-lysine qui est construit par incorporation, dans une souche réceptrice du genre Brevibacterium ou Corynebacterium, d'un plasmide hybride dans lequel est inséré un fragment dtADN chromosomique qui est obtenu à partir d'une bactérie du genre Brevibacterium ou Corynebacterium et qui contr le la résistance à la S-(2-amino-éthyl)-cystéine et la production de L-lysine, et b) à récupérer la L-lysine accumulée dans le milieu de culture. Les souches donneurs d'ADN utilisées dans l'invention sont résistantes à la S-(2-aminoéthyl)-cystéine (ci-après dénommée AEC) et capables de produire de la L-lysine. Ces souches ont naturel- lement une région de l'ADN chromosomique qui contr6le la résistance à l'AEC et la production de la L-lysine.-On connaît diverses souches résistantes à 1'AEC et capables de produire la L-lysine, par exemple dans les demandes de brevet ci-dessus mentionnées. D'autres souches donneurs d'ADN peuvent être induites en conférant la résistance à l'AEC et la production de L-lysine spécialement à des bactéries dites 'oryne-formes productrices d'acide glutamique" du genre Brevibacterium ou Corynebacterium telles que: Brevibacterium divaricatum ATCC 14020 Brevibacterium flavum ATCC 13826 Brevibacterium immariophilum ATCC 14068 Brevibacterium lactofermentum ATCC 13869 Brevibacterium roseum ATCC 13825 Brevibacterium saccharolyticum ATCC 14066 Brevibacterium thiogenitalis ATCC 19240 Corynebacterium acetoacidophilum ATCC 13870 Corynebacterium acetoglutamicum ATCC 15806 Corynebacterium callunae ATCC 15991 Corynebacterium lilium ATCC 15990 Corynebacterium melassecola ATCC 17965 Corynebacterium glutamicum ATCC 13032 On peut obtenir de meilleurs résultats lorsque l'on utilise comme souche donneur d'ADN un producteur de L-lysine ayant une productivité plus élevée. La production de L-lysine peut être accrue par n'importe quel procédé connu,comme indiqué dans les demandes de brevet ci-dessus mentionnées. Les ADN vecteurs sont des plasmides ou phages que l'on peut obtenir à partir des souches donneurs d'ADN ci-dessus mentionnées et de leurs mutants et les dérivés des ADN plas- mides et phages. Comme souche réceptrice, bien que l'on puisse uti- liser les souches sauvages de bactéries coryne-formes productrices d'acide glutamique du gente Brevibacterium ou Corynebacterium, il 24526 2 est souhaitable d'utiliser un mutant producteur de L-lysine dérivé de la bactérie coryne-forme productrice d'acide glutamique pour obtenir les meilleurs résultats. Il. convient également d'utiliser comme récepteurs des auxotrophes de L-lysine dérivés des souches sauvages ou des mutants producteurs de L-lysine mentionnés ci-dessus pour sélectionner les souches transformées en producteurs de L-lysine. Dans le cas o l'on utilise comme souche réceptrice un auxotrophe de Llysine, on souhaite que l'auxotrophe soit induit à partir d'une souche mère ayant une productivité plus élevée de L-lysine. L'ADN chromosomique est extrait du donneur d'ADN de manière connue et traité avec une endonucléase de restriction par un procédé connu (Biochem. Biophys. Acta 383 page 457 (1975)). Divers types d'endonucléase de restriction sont applicables si la digestion est faite partiellement. L'ADN vecteur est digéré égale- ment avec l'endonucléase de restriction. L'ADN chromosomique et l'ADN vecteur digérés sont soumis à une réaction de ligation avec une ligase. La recombinaison de l'ADN pour préparer le plasmide recombinant peut être effectuée par incorporation par la terminal- transférase d'acide désoxyadénylique et d'acide thymidylique, ou d'acide désoxyguanylique et d'acide désoxycytidylique dans le frag-.. ment d'ADN chromosomique et l'ADN vecteur scindé et en soumettant l'ADN chromosomique modifié et L'ADN vecteur à une réaction de couplage. L'ADN hybride ainsi obtenu peut être incorporé dans le micro-organisme récepteur par des techniques connues de transfor- mation telles que la méthode à CaC12 ou la méthode au protoplaste et on laisse ensuite pousser les récepteurs pendant un instant pour stabiliser les caractéristiques transformées du transformant. Les transformants désirés sont ceux qui possèdent un plasmide dans lequel est inséré un fragment d'ADN chromosomique de l'ADN donneur, ledit fragment contrôlant la résistance à l'AEC et la production de la L-lysine. Ces transformants désirés peuvent être choisis comme ceux qui sont devenus résistants à I'AEC et capables de produire la L-lysine lorsque 1'ADN recombinant est introduit dans le récepteur par la technique de transformation ci-dessus mentionnée. 2 4 26 2 Le plasmide hybride dans le transformant désiré men- tionné ci-dessus peut être incorporé, après extraction du transfor- mant, dans une autre souche réceptrice de l'invention telle qu'un producteur de lysine résistant à l'AEC et un producteur ayant besoin d'homosérine. On peut cultiver de manière classique le transformant producteur de L-lysine ainsi obtenu pour le laisser produire la L-lysine, par exemple à un pH de 6 à 8, et à une température de 30 à 370C. La culture est continue jusqu'à ce que la production de L-lysine soit sensiblement arrêtée. Le milieu de culture utilisé est classique et contient une source de carbone, une source d'azote, des ions inorganiques et si nécessaire quelques substances nutritives organiques en plus faible quantité. Comme sourcesde carbone, on peut utiliser le glucose, le saccharose et des produits bruts contenant ces hydrates de carbone (tels qu'hydrolysat de mats et mélasse), des acides organiques tels que l'acide acétique et des alcools tels que l'éthanol. Comme sources d'azote, on peut utiliser l'ammoniac gazeux, l'ammoniaque aqueuse, les sels d'ammonium et l'urée. Dans le procédé de l'invention, on peut obtenir des rendements plus élevés en L-lysine par les souches construites selon l'invention que par le donneur ou le récepteur d'ADN utilisé. Les exemples suivants illustrent l'invention sans toutefois en limiter la portée. Exemple 1 (1) Préparation d'ADN chromosomique possédant l'information génétique relative au contrôle de la production de L-lysine. On cultive Corynebacterium Slutamicum no 22 (NRRL B-12416), mutant résistant à l'AEC et induit à partir de Corynebacterium glutamicum AJ 11560 (FERM-P 5485, NRRL B-12415), à 30C pendant 3 heures en agitant dans 1 litre de milieu CMG con- tenant 1 g/dl de peptone, 1 g/dl d'extrait de levure, 0,5 g/dl de glucose et 0,5 g/dl de NaCl (ajusté à pH 7,2), et on récolte les cellules bactériennes dans la phase de croissance exponentielle. On extrait l'ADN chromosomique par une méthode classique au phénol et on obtient 4,0 mg d'ADN purifié. Corynebacterium glutamicum AJ 11560 a été fraîchement isolé comme souche convenable pour les buts de l'invention. Cette souche AJ 11560 a été classée dans la section III du genre Corynebacterium décrit dans le-Bergey's Manual of Determina- tive Bacteriology (8e édition, 1974). Cependant, les caractéristiques taxonomiques de l'espèce appartenant à la section III ne sont pas décrites dans le Manual, mais seulement les noms des espèces appar- tenant à la section III. Donc, on se reportera à tous les articles originaux mentionnés dans le Manual à la section III. La souche AJ 11560 a été identifiée avec Corynebacteriumglutamicum décrit dans Bull. Agr. Chem. Soc. Japan, 22 pages 176-185 (1958) et dans J. Gen. Appl. Microbiol., 13 pages 279-301 (1967). (2) Préparation de l'ADN vecteuro On prépare comme vecteur l'ADN du plasmide pAM 286 (PM 3.106 dalton) de la manière suivante: on incube à 30 C dans 1 litre de milieu de CMG une souche de Corynebacterium glutamicum AJ 11560 recevant le plasmide pAM 286. Après incubation de la souche jusqu'à la fin de la phase logarithmique, on recueille les cellules et ensuite on les lyse par traitement avec le lysozyme et le SDS 6odécylsulfanate de sodium). On centrifuge le lysat a 30 000 Xg pendant minutes pour obtenir une liqueur surnageante. Après concentration de la liqueur surnageante, on obtient 60 y de l'ADN plasmide par fractionnement en utilisant lélectrophorèse sur gel d'agarose. (3) Insertion du fragment d'ADN chromosomique dans le vecteur. On traite 10 y de l'ADN chromosomique avec l'endonu- cléase de restriction XbaI à 37 C pendant 10, 30 ou 60 minutes, respec- tivement, pour scinder les chaînes d'ADN,et ensuite on chauffe à 65 C pendant 5 minutes. On traite également5 y de l'ADN vecteur avec l'endonuclêase de restriction XbaI à 37 C pendant 1 heure pour scin- der complètement l'ADN,et ensuite on chauffe à 65 C pendant 5 minutes. On mélange 1'ADN chromosomique etl 'ADN vecteur digérés et on les soumet à la réaction de ligation par l'ADN-ligase T4 en présence d'ATP et de dithiothréitol à 10 C pendant 24 heures. On chauffe ensuite le mélange de réaction à 65 C pendant 5 minutes, et on ajoute 2 fois son volume d'éthanol. On récupère l'ADN recombinant qui précipite. (4) Transformation génétique avec le plasmide hybride contenant l'in- formation génétique de contr6le de la production de lysine. On cultive en agitant dans 20 ml de milieu CMG à 30 C une souche qui a besoin de L-lysine, Corynebacterium glutamicum n" 97 (NRRL B-12417), qui est dérivée de Corynebacterium glutamicum n 22 par mutagénèse par la Nméthyl-N'-nitro-N-nitrosoguanidine. On récolte les cellules dans la phase de croissance exponentielle et on prépare par traitement par CaC12 les cellules "compétentes" capables d'absorber l'ADN. Dans la suspension de cellules compétentes, on ajoute i'ADN obtenu dans l'étape (3) et on incorpore l'ADN dans la cellule. Apres la réaction de transformation, on étale la suspension de cel- lules sur une plaque de gélose contenant, par litre, 20 g de glucose, g de (NH4)2S04,2,5 g d'urée, 1 g de KH2PO4, 0,4 g de MgSO4.7H20, 5 Y de biotine, 200 y de chlorhydrate de thiamine, 0,01 g de FeSO4.7H20, 0,01 g de MnSO 4.4H20, 3,0 g d'AEC,HCl et 20 g de gélose (ajustée à pH 7,0). On incube la plaque à 30 C. Après 4 jours d'in- cubation, on prélève toutes les colonies qui sont apparues et ont acquis la productivité de L-lysine et la résistance à I'AEC, on les purifie et on les isole. On obtient ainsi AJ 11575 (FERM-P 5501, NRRL B-12418). (5) Production de L-lysine par la souche productrice de lysine pré- - parée. On cultive les transformants obtenus-dans l'étape (4) pour déterminer leur productivité de L-lysine. On cultive de la même manière,à titre comparatif, la souche n 22 donneur d'ADN et la souche réceptrice n 97. Le milieu de culture contient 10 g/dl de glucose, 0,5 g/dl d'urée, 4,5 g/dl de (NH4)2S04, 0,1 g/dl de KRH2P04, 0,04 g/dl de MgSO4.7H20, 10 mg/dl d'adénine, 10 mg/dl de glutamate de sodium, 0,1 mg/1 de thiamine.HCl, 0,5 mg/l de biotine, 1 mg/dl de FeSO4.7H20, mg/dl de MnSO4.4H20 et 5 g/dl de CaCO3 (stérilisé séparément) et on l'ajuste à pH 8,0. On place des lots de 20 ml du milieu de fermentation dans des fioles de 500 ml, on inocule au moyen d'une boucle de pla- tine avec l'inoculum du micro-organisme d'essai et on cultive à 31 C pendant 70 heures. 24826 2 Les quantités de L-lysine dans la liqueur surnageante du bouillon de fermentation sont déterminées par voie microbiologique. T A B L E A U I, Exemple 2 (1) Préparation d'ADN chromosomique possédant l'informationEÉnétique relative à la production de L-lysine. Par la méthode indiquée dans l'étape (1) de l'exemple 1, on obtient 3,5 mg d'ADN chromosomique à partir de Brevibacterium lactofermentum n 27 (NRRL B-12419),dérivé d'ATCC 13869 et résistant à l'AEC. (2) Préparation de l'ADN vecteur. Par la méthode indiquée à l'étape (2) de l'exemple 1, on obtient comme vecteur 74 y d'un plasmide pAM 330 à partir de Brevibacterium lactofermentum ATCC 13869. (3) Insertion du fragment d'ADN chromosomique dans le vecteur. On fait digérer 10 y d'ADN chromosomique obtenuà l'étape (1) par la méthode indiquée à l'étape (3) de l'exemple 1. L'ADN vecteur indiqué dans l'étape (2) est également mis à digérer par la méthode indiquée à l'étape (3) de l'exemple 1. L'ADN chromosomique et l'ADN vecteur digérés sont soumis à une réac- tion de ligation par la méthode indiquée dans l'étape (3) de l'exemple 1. (4) Transformation par le plasmide possédantl'information génétique relative à la production de lysine. On utilise comme récepteur Brevibacteriumlactofermentum no 28 (NRRL B12420), dérivé de Brevibacterium lactofermentum ATCC 13869 et ayant besoin pour sa croissance de L-lysine, de L-méthio- nine et de L-thréonineet on obtient par la méthode indiquée dans l'étape (4) de l'exemple 1 un transformant producteur de L-lysine AJ 11590 (FERM-P 5518, NRRL B-12421). Quantité de L-lysine Micro-organismes essayés acmée ( l) accumulée (mg/dl) Corynebacterium glutamicum n 22 120 Corynebacterium glutamicum n 97 12 Corynebacterium glutamicun AJ 11575 235 24826 _2 (5) Production de L-lysine par le nouveau producteur de L-lysine. On détermine la productivité de L-lysine par le trans- formant AJ 11590 obtenu dans l'étape (4), par la méthode indiquée dans l'étape (5) de l'exemple 1. Les résultats obtenus sont indiqués dans le tableau II ci-après. T A B L E A U I I Micro-organismes essayés Quantité de L-lysine Micro-organismes essayesacule(m/) accumulée (mg/dl) Brevibacterium lactofermentum n. 27 140 Brevibacterium lactofermentum n 28 8 Brevibacterium lactofermentum AJ 11590 189 R E V E N D I CA T I O N S 1. Procédé pour la production de L-lysine par fermenta- tion, caractérisé en ce que: a) on cultive dans un milieu de culture un micro'organisme producteur de L-lysine qui est construit par incorporation, dans une souche réceptrice du genre Brevibacterium ou Corynebacterium, d'un plas- mide hybride dans lequel est inséré un fragment d'ADN qui est obtenu à partir d'une bactérie du genre Brevibacterium ou Corynebacterium et qui contrôle la résistance à la S-(2-amino- éthyl)-cystéine et la productivitd de L-lysine, et b) on recueille la L-lysine accumulée dans le milieu de culture. 2. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que ladite souche réceptrice appartient auxgenres: Brevibacterium divaricatum Brevibacterium flavum Brevibacterium immariophilum, Brevibacterium lactofermentum, Brevibacterium saccharolyticum, Brevibacterium thiogenitalis, Brevibacterium roseum, Corynebacterium acetoacidophilum, Corynebacteriun acetoglutamicum, Corynebacterium callunae,- Corynebacterium lilium, Corynebacterium melassecola, ou Corynebacterium glutamicum. 3. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que ledit fragment d'ADN est obtenu à partir d'une bactérie apparte- nant au genres: Brevibacterium divaricatum. Brevibacterium flavum Brevibacterium immariophilum, Brevibacterium lactofermentum Brevibacterium roseum Brevibacterium saccharolyticum, Brevibacterium thiogenitalis, Corynebacterium acetoacidophilum, Corynebacterium acetoglutamicum, Corynebacterium callunae, Corynebacterium lilium, Corynebacterium melassecola, Corynebacterium glutamicum.