FR 2480760 A1 19811023 FR 8107339 A 19810413 La présente invention concerne une résine poly- aminique qui est réticulée avec des réactifs bifonction- nels pour les groupes aminiques et iminiques (en parti- culier avec des diisocyanates) et elle convient pour la séparation sélective de l'héparine à partir de solutions contenant cette dernière seule ou en mélange avec d'autres glucosaminoglycanes ainsi qu'un procédé de préparation d'une telle résine. Le problème de séparation de l'héparine (HEP) à partir d'autres glucosaminoglycanes (GAG) qu'on considère également comme des mucopolysaccharides, polyaminosaccha- rides et polysaccharides aminés, extraits des tissus d'ani- maux sous forme de mélanges, est en général résolu par un traitement avec des sels d'ammonium quaternaire en présence de sels minéraux en des concentrations convenables, ce qui provoque la précipitation fractionnée des complexes de GAG (E. J. Scott, Methods Biochem. Anal. 8, 145 (1980). Comme autre procédé possible, on peut provoquer la précipitation préférentielle de l'héparine par l'acétate de potassium (brevet GB 1 221 784). Un autre procédé pour isoler l'héparine consiste à filtrer sur des gels appropriés (par exemple un dextrane réticulé), en tirant parti de la pénétration de l'héparine dans les pores du réseau et l'adsorption qui en résulte. Une autre façon d'aborder le problème de l'isolement de l'héparine est fondée sur l'utilisation de résines échan- geuses anioniques, qui sont en général un polystyrène, un dérivé cellulosique ou un autre dérivé de polysaccharide réticulé, dans lequel des groupes fonctionnels d'ammonium quaternaire ont été introduits; l'héparine est liée de façon préférentielle par ces résines. Cependant aucun des procédés connus n'est entière- ment satisfaisant car plusieurs stades de traitement sont normalement nécessaires pour la récupération quantitative de l'héparine. Il en est principalement ainsi du fait que les procédés de ce genre tirent en général parti des réac- tions d'équilibre de telle sorte qu'en dehors du produit à isoler, on obtient également des quantités faibles mais perceptibles d'autres ingrédients qu'on peut considérer comme des impuretés. Ainsipar exemple, le mécanisme de séparation mis en oeuvre dans la technique de filtration de gel est fondé sur le fait que les molécules d'une plus faible dimension que les pores du réseau polymère pénètrent dans ces pores alors que les plus grosses molécules restent à l'extérieur. L'importance et le caractère critique des dimensions du véhicule, c'est-à-dire la détermination de sa porosité, sont donc évidents et il est non moins incon- testable que la technique d'élution utilisée dans un tel procédé entraîne de son c8té des difficultés associées avec le coefficient de séparation. Un autre fait qui rend difficile la séparation de l'héparine est le caractère compétitif des autres poly- aminosaccharides ayant une structure chimique similaire et qui interfère d'un point de vue chimico-physique dans les réactions de séparation. Le mécanisme de séparation de l'héparine au moyen des résines échangeuses anioniques usuelles peut être consi- déré comme un type particulier d'adsorption tirant parti de la plus grande probabilité du fait que les sites anioni- ques -SO3 et -COO de l'héparine sont plus nombreux que dans les autres GAG et sont attirés par les sites cationi- ques des résines. Cependant, en raison de la répartition en général irrégulière de tels sites dans les résines, ce procédé n'implique qu'un nombre limité de groupes anioni- ques présents dans des polysaccharides. On pourrait obtenir une efficacité "d'adsorption" incontestablement plus élevée si une série de groupes basi- ques de la résine était accessible pour une série complémen- taire de groupes acides appartenant à la même chaîne d'hépa- rine, en particulier si les groupes basiques de la résine étaient espacés sur le même mode que les groupes acides du polyaminosaccharides. Ce principe de complémentarité est à l'origine de la remarquable stabilité des complexes polyélectrolytiques dans lesquels l'effet d'attraction du 24$0760 polyacide par la polybase est amplifié par rapport. celui cu'on aurait obtenu si les sites basiaues et acides ne faisaient pas partie des structures macromoléculaires. En se basant sur les concepts ci-dessus, la Deman- deresse a obtenu un nouveau tyte de résine caractérise par la présence de séquences de groupes basiques régulière- ment espacés sensiblement sur le même mode que les groupes acides de l'héparine (selon les estimations des schémas moléculaires). La résine selon l'invention comprend une polyalkylène- amine réticulée avec des diisocyanates, en particulier une poly6thylène-amine (qu'on appelle également polyéthylène- imine, PEI) réticulée avec le diisocyanate d'hexaméthylène (HMDC) ayant un poids moléculaire moyen compris entre 150 et 120.000. La réticulation des chaînes de PEI se fait aussi bien pour rendre le polymère insoluble que pour obtenirgrâce aux liaisons transversales de l'agent de réticulation, des brèches qu'on peut atteindre avec le solvant et les molécules d'héparine, et aussi pour limiter convenablement les séquences de sites basiques capables de lier l'héparine. Pour réticuler les chaînes de polyéthylène-amine on utilise un diisocyanate d'alkylène avec formation de liaisons transversales du type carbamique. En particulier, la réticulation avec le diisocyanate d'hexaméthylène de la PEI sous sa forme la plus usuelle largement ramifiée a lieu selon le schéma A pour la partie ramifiée et selon le schéma B pour la partie non ramifiée. 2 t1P-ezQ76O SCHEMA A I I È' C2 C- CH2 Ch2 If - (CU)-NH +Ocl;'-('H2) '2;SH CjH22222 C H2 xC. CFH2 xCH *2 t 2 N 72 CH CFlH2 HX |CH CsH2 2 CF2 CH2 1!H2 (CH)2-H-C0-1,H-(CH2)-HC-N-C22 j 22 22 22 N N II N2 CH H12 CH N N S CHEM-A B NN I CH H 0CN-(CH -]C H-N > -CO- ZH(CH2 6H-C0-N CH? de manière à provoquer une structure tridimensionnelle qu'on peut supposer être comme suit: I 0 0 I I O |a o t | oo, I l, i B Il 1 N-C-C-NH-C-NH-(CH) -NH-C-NH-C-C-NN-C-C-NH-C-NH-(CH2) 6-NH-C-NH-C-C-N I I *2 (CH)2 CH'R[Inl R:H HR C 11 / PPI(1s3)2 H l II N-C-C 4tPPI(l"3) 2NH-,C-Nil(CH)NtH-C-j C-C-N. pPiu(,2) 1CH3 6 - i(CH2)6-uH- i[N-C-C}5 rNEC-C-i lN. NC-C-C N C-C-NH-C(CH2NH-C-N-C-C N-C-C-NH-C-NH-(CH) -NH-C-NH-C-C-N Cic NI0 C C C C C C ?4{C-C-NH-C-NH-(CH2 6NH-C-N-C-1 NNC-C-NH-C-NH- (CII2 sNH-C-N-C-C1 i' C I II C óC CDC I Ii) PEI = polyéthylene-imine; PPI: polypropylne-imine La quantité de diisocyanate d'alkylène qu'on uti- lise dans le stade de réticulation.et qu'on exprime par le rapport molaire du diisocyanate (qu'on considère comme monofonctionnel) au motif monomère qui constitue la poly- alkylène-amine, est comprise entre environ 10 et 15 milli- moles par 100 moles de polymère (en se basant sur le motif monomère). Ainsilpar exemple, si l'on ajoute 12 millimoles de diisocyanate d'hexaméthylène (qu'on considère comme monofonctionnel) à 120 moles de polyéthylène-amine (en se basant sur le motif monomère), on obtient une résine réti- culée qui est insoluble dans l'eau et dans les solvants organiques. On utilise couramment HMDC et PEI sous forme d'une solution à 5 % dans un solvant organique (de préfé- rence le chloroforme) dans des rapports volumétriques qui sont d'environ 1:5. Alors que le rapport préféré de la résine à l'agent de réticulation est tel que ci-dessus, des rapports différents entre les deux réactifs donnent pareil- lement des résines insolubles ayant un rapport différent de réticulation, les rendements correspondants étant rela- tivement faibles pour les plus bas rapports de rétieula- tion. On remarquera à cet égard que si l'on part d'une PEI ayant un poids moléculaire relativement faible (par exemple d'environ 600 ce qui correspond à un degré de polymérisa- tion d'environ 14), les groupes terminaux NH2- réagissent pareillement sur un mode préféré avec HMDC; dans ces condi- tions et avec des rapports molaires d'environ 1:10 entre les groupes OCNet NH-+NH2-, on pense qu'on obtient des séquences de motifs (CH2-CH2-NH)n dans lesquelles n = 8 à 14, ayant une longueur suffisante pour exercer un effet de coopération lors de l'association avec des polyamines. Les exemples suivants servent à illustrer l'inven- tion sans aucunement en limiter la portée EXEMPLE 1 Préparation d'une polyéthylène-imine réticulée A 20 ml d'une solution à 5 c (poids/volume) de diiso- cyanate d'hexaméthylène dans le chloroforme à température ambiante, on ajoute lentement et avec agitation 100 ml 2 7z?;rfit d'une solution chloroformique à 5 % (poids/volume) de polyéthylène-imine ayant un poids moléculaire moyen dienu viron 1800. Après 15 minutes environ il se forme un pré- cipité blanc volumineux d'une résine polyéthylène-iminiqueg ayant un degré de réticulation de O,1, qu'on sépare ensuite par décantation et qu'on lave à trois reprises avec 10 mi de chloroforme à chaque fois. On lave ensuite le précipité qui contient toujours un peu de chloroforme à trois repri- ses avec 10 ml d'eau distillée à chaque fois et on conserve le produit sous l'eau. Le rendement calculé en produit sec est de 75 à 80 %o EXEMPLE 2 On procède comme dans l'exemple 1 sauf qu'on remp place la polyéthylèneimine par une polypropylèneimîine ayant un poids moléculaire moyen de 1000 à 15009 et on obtient ainsi une résine propylène-iminique ayant un degré de réticulation de 0,05, avec un rendement en produit de % en poids sec. La fig. 1 montre un spectre IR typique des résines qu'on obtient dans les exemples 1 et 20 L'examen de ce spectre IR permet, outre l'identification des résinesq une estimation semi-quantitative du rapport entre lagent de réticulation et la chaîne polyiminique ainsi qu'une véri- fication concernant la réaction bifonctionnelle de HMDC. L'expression "degré de réticulationl' utilisée dans le présent mémoire désigne le nombre de motifs monomères comprenant des groupes NH- (et/ou NE2)- participant à la réaction de réticulation en se basant sur le rapport molé- culaire entre le diisocyanate (considéré comme monofonc- tionnel) et la polyamine (considérée comme un motif mono- mère). On choisit le degré de réticulation de manière qu'au stade de réticulation ne soit impliqué qu'un maximum d'un quart des groupes aminiques de la polyalkylène=amineo Les tests de traitement d'une solution aqueuse de l'héparine et d'autres glucosaminoglycanes avec la résine réticulée ont fait ressortir que l'héparine possède une affinité remarquable à la résine. La gamme des concentrations 2 76 d de J'héparirne dans les solutions aqueuses contenant égale- ment d'autres polyamninosaccharides, dans lesquelles l'ac- tion de la résine réticulée selon l'invention permet de séparer lthéparine sur un mode quantitatif, est comprise entre 0,1 % et 1 % en poids comme il ressort des exemples suivants. L'héparine adsorbée sur la résine peut être récupé- rée et on peut aussi régénérer la résine pour réutilisation en traitant cette résine qui contient de l'héparine avec une solution saline convenable, par exemple une solution aqueuse de NaCl d'environ 1,5 à 2,5 M. EXEMPLE 3 Séparation sélective de l'héparine On met en contact 20 ml d'une solution aqueuse con- tenant 0,2 % en poids d'un mélange de glucosaminoglycanes extrait du duodénum de porc et renfermant 20 % d'héparine, % de sulfate d'héparane, 20 % de sulfate de chondroitine et de sulfate de dermatane, ainsi que 10 % d'acide hyaluro- nique avec 2 g de résine polyéthylénique ayant un degré de réticulation de 0,1 qu'on obtient selon l'exemple 1 et qu'on soumet à un préconditionnement pendant 30 minutes à pH 3,5 (en présence de HCl) et qu'on lave ensuite à deux reprises avec O10 ml d'eau. Après 2 heures de contact sous agitation, l'héparine ressort quantitativement et est sélectivement adsorbée par la résine, comme on peut le constater par l'analyse d'élec- trophorèse dont le diagramme est représenté sur la fig. 2. Sur ce diagramme, dont la ligne supérieure concerne la solution de glucosaminoglycanes avant le traitement et dont la ligne inférieure concerne la même solution après le traitement par la PEI réticulée, on voit que l'héparine n'apparaît absolument pas dans la solution traitée alors que les pics concernant l'acide hyaluronique (HA), le sulfate d'héparane (HS; et les sulfates de chondroitine et dermatane (ChS+DeS) sont toujours présents. EXEMPL. 4 On met en contact pendant 2 heures 20 ml d'une solution aqueuse contenant une fraction mucopolysaccha- ridique qui consiste en 85 % de sulfate d'héparane et % d'héparine avec 4 g d'une résine polyéthylène-imini- que ayant un degré de réticulation de 0,05 et ayant subi un conditionnement réglable pendant 30 minutes à pH 3,5 (avec du HC1) et ensuite deux lavages avec 10 ml d'eau. A l'achèvement du temps de contact sous agitation, l'ana- lyse par électrophorèse de la solution montre la dispari- tion complète de l'héparine. On récupère simplement le sulfate d'héparane encore dissous par évaporation de la solution avec un rendement de 95 %. EXEMPLE 5 On traite 10 ml d'une solution aqueuse d'héparine à 0,1 % (correspondant à 10 mg de mucopolysaccharide) pen- dant 2 heures avec 800 mg de PEI réticulée selon l'inven- tion. A la fin du traitement, l'héparine est quantitati- vement adsorbée par la résine, comme on peut le constater par des tests colorimétriques effectués sur le liquide restant avec du bleu de toluidine et du carbazole en pré- sence de borates. EXEMPLE 6 On traite une solution aqueuse d'tun mélange de glu- cosaminoglycanes comprenant 18 % d'héparine avec la PEI réticulée selon les conditions opératoires décrites dans l'exemple 3. L'analyse quantitative d'électrophorèse montre que l'héparine est quantitativement et sélectivement adsorbée. EXEMPLE 7 Récupération de l'héparine de la PEI réticulée On extrait 2 g de résine polyéthylène-iminiqueD contenant 8 mg d'héparine adsorbée selon l'ezemple 3, à cinq reprises par traitement pendant 30 minutes sous agi- tation en utilisant à chaque fois 20 ml de NaCl 2M. Les extraits recueillis contiennent 95 à 96 % de l'héparine initialement adsorbée par la résine comme on peut le cons- tater par l'analyse calorimétrique avec du carbazole en se 24MC760 référant à la courbe d'étalonnage dans NaCI 2M. On sépare l'héparine de la solution d'extraction par relargage effectué par dialyse ou par précipitation avec des sels d'ammonium quaternaire. Bien que l'invention ait été expliquée à l'aide de certains exemples concernant particulièrement la sépara- tion de l'héparine des mélanges qui la contiennent, on a trouvé qu'on peut faire varier l'affinité de la polyamine réticulée selon l'invention à d'autres ingrédients poly- aminosaccharidiques dans ces mélanges et on peut régler cette affinité dans chaque cas en modifiant de façon ap- propriée le degré de réticulation de la résine ainsi que le pH et la force de la solution de contact. En fait, on peut obtenir les polyamines réticulées selon l'invention avec une granulation différente et des grosseurs de pores différentes en fonction du nombre des liaisons de réticu- lation, c'est-à-dire du pourcentage de diisocyanate. Ainsi les polyamines n'ayant qu'un petit nombre de liaisons de réticulation subissent une augmentation de volume dans une solution aqueuse de nombreuses fois par rapport au volume du produit sec, alors que les polyamines ayant un degré élevé de réticulation, c'est-à-dire de nombreuses liaisons de réticulation, ne subissent qu'un faible changement de volume. Dans ces dernières, la texture est beaucoup plus rigide et ne permet donc que la pénétration de molécules d'un poids relativement faible, tandis que l'échange ioni- que est-beaucoup plus lent par suite de la plus forte résistance au mouvement des contre-ions hydratés provenant de la résine. Des pores plus grands facilitent ltaccessi- bilité de la polyamine selon l'invention pour les molécules de plus grandes dimensions, qu'on peut donc séparer des molécules plus petites. Outre les effets décrits, le degré de réticulation fixe le nombre de groupes successifs NH-tet NH 2-) qui sont disponibles pour l'interaction complémentaire avec le polyanion ayant pénétré dans le réseau tridimensionnel. D'autre part, en profitant du pH et de la résistance L.0-, 7 6 0 ionique, le nombre de tels groupes NH-(et NH2) étant le même, on obtient un rapport modifié entre les groupes ayant réellement une charge positive et qui peuvent donc aug- menter la résistance à l'adsorption par suite de la for- mation de liaisons ioniques avec les groupes anioniques du polysaccharide et les groupes ne comportant pas de charge. On peut ainsi utiliser la polyamine réticulée selon l'invention aussi bien pour séparer le GAG désiré sur- tout l'héparine9que pour éliminer à partir d'un mélange de GAG en dissolution le composant indésirable, par exem- ple l'héparine lorsqu'on désire une composition n9ayant pas de propriétés anticoagulantes. Bien que l'invention ait été décrite à propos de certains exemples préférés, concernant surtout lehéparine9 les spécialistes comprendront aisément qu9on peut appor- ter diverses modifications aux exemples choisis sans sortir du cadre de l'inventiono Comme agents de réticula- tion, on peut utiliser d'autres réactifs bifonctionnels tels que les diisocyanates d'arylène ou les dialdéhydes et aussi des composés hétérocycliques tels que la trichloro- thiazine et dans ce cas on peut utiliser de lgeau. comme solvant surtout lorsqu'on utilise des dialdéhydeso _REVEXDICATIONS 1 - Procédé de réticulation de polyalkylène-amines, caractérisé en ce qu'on fait réagir les polyalkylène- amines en présence d'un solvant organique avec un agent de réticulation du type diisocyanique. 2 - Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que la polyalkylène-amine est la polyéthylène-amine. 3 - Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que l'agent de réticulation est le diisocyanate d'hexaméthylène et le solvant est le chloroforme. 4 - Polyalkylène-amine réticulée, caractérisée en ce qu'elle a été réticulée à l'aide d'un diisocyanate et en ce que le degré de réticulationbasé sur le rapport molaire entre le diisocyanate (considéré comme monofonc- tionnel) et la polyalkylène-amine (considérée comme un motif monomère), est compris entre 0,1 et 1,0. - Procédé d'adsorption sélective d'un sel muco- polysaccharidique unique à partir d'un mélange de gluco- saminoglycanes dans une solution aqueuse, caractérisé en ce qu'on met en contact la solution sous agitation avec une polyalkylène-amine réticulée selon la revendication 4. 6 - Procédé selon la revendication 5, caractérisé en ce que la structure et la polarité des chaines entre les points de réticulation de la polyalkylène-amine réti- culée sont sensiblement complémentaires à celles des por- tions polaires du composé mucopolysaccharidique devant être adsorbé. 7 - Procédé suivant la revendication 6, caractéri- sé en ce que pour séparer un composé mucopolysaccharidique sélectivement adsorbé par une polyalkylène-amine réticulée, - cette po]yalkylène-amine réticulée contenant du glucosamino- glycane est récupérée sous sa forme initiale par un trai- tement réitéré avec une solution 1,5 à 2,5 M de NaCl, puis on isole de façon connue le glucosaminoglycane présent dans la solution obtenue en utilisant une dialyse ou la précipitation par des sels d'ammonium quaternaire. 8 - Procédé selon la revendication 6, caractérisé en ce que le composé mucopolysaccharidique est l'héparine.