FR 2475900 A1 19810821 FR 8003707 A 19800220 La présente invention, réalisée au Centre d'immunologie et de Biologie Pierre FABRE, concerne des complexes d'antigènes bactériens spécifiques couplés à des ARN ou à des fragments d'ARN ribosomaux provenant des mêmes bactéries ou de bactéries diffé- rentes, leur procédé de préparation et des vaccins les contenant. Pour un grand nombre de bactéries, il est connu que le pouvoir vaccinant est lié à la présence d'antigènes spécifiques. Ce sont presque toujours des antigènes de surface présents dans les parois, les membranes, les capsules, ou libérés sous forme soluble dans le milieu de culture. Leur nature est essentiellement poly- saccharidique, polypeptidique ou glycoprotéique. Ces antigènes sont bien connus et leurs méthodes de préparation ont été largement décrites dans la littérature. L'utilisation directe, en tant que vaccins, de ces antigènes spécifiques de sérotype, pour séduisante qu'elle soit, n'est pas toujours sans inconvénients. Le pouvoir antigénique de ces subs- tances est souvent modeste, ce qui conduit à l'admi- nistration de doses élevées pour obtenir une protection significative. Cependant, à de telles doses, ces antigènes ne sont pas toujours dépourvus de toxicité. Par exemple dans le cas des polysaccharides capsulaires, ceux-ci sont en général impliqués dans la pathogénicité des bactéries et l'utilisation de doses vaccinantes élevées présente de graves inconvénients. 2 2475900 Or, il a été observé cue des ARN ribcsomaux cu des fragments de ces mêmes ARN pouvaient être avantageusement utilisés cor.ne transporteurs actifs de ces antigènes spécifiques avec 'lesquels ils forment un complexe particulièrement immuncgénique à très faibles doses, dé semble-t-il à une structure spatiale directement utilisable par les cellules immmunocompétentes de l'organisme. C'est pourquoi la présente invention concerne un complexe vaccinal caractérisé en ce qu'il est constitué par des ARN ribosomaux bactériens ou des fragments d'ARN ribosomaux bactériens sur lesquels sont couplés de 1 à 5 % en poids d'un antigène spécifique de sérotype bactérien. Selon l'invention, les ARN ribosomaux et l'antigène spécifique peuvent provenir des mêmes souches bactériennes ou de souches différentes. Par "couplage" on entend de façon générale au moins une liaison entre les deux types de molécule, liaison qui est de préférence covalente par réaction des différentes fonctions des molécules en présence, mais qui peut être de nature différente. Les ARN ribosomaux utilisables peuvent, en particulier, être extraits des ribosomes des souches suivantes: - Streptococcus pneumoniae, Streptococcus pyogenes, - Staphylococcus aureus, - Klebsiella pneumoniae, - Serratia marcescens, - Escherichia coli, - Salmonella typhimurium, Corynebacterium (parvum, acnés, granulosum), - Mycobacterium (tuberculosis, Smegmatis). I Mais, il a été remarqué que l'ARN ribosomal pouvait être avantageusement remplacé par des fragments d'ARN de poids moléculaire inférieur, obtenus notamment par hydrolyse ménagée de ce même ARN ribosomal. Cette hydrolyse peut être notamment réalisée par des méthodes classiqẻs chimiques ou enzymatiques à l'aide de ribonucléases. Le poids moléculaire des fragments obtenus est compris entre 3 x 104 et 2 x 105 daltons et on utilise de préférence des poids moléculaires entre 30 000 et 50 000. Parmi les antigènes spécifiques utilisables il faut citer: - les polysaccharides capsulaires notamment de: 15. Klebsiella pneumoniae Streptococcus pneumoniae Hemophilus influenzae Escherichia coli; - les lipopolysaccharides membranaires des bactéries gram négatives, notamment: Klebsiella pneumoniae Serratia marcescens Escherichia coli Neisseria meningitidis 25. Salmonella typhimurium; - les protéines membranaires spécifiques, notamment: Escherichia coli À Serratia marcescens Salmonella typhimurium 30. Streptococcus pyogenes; - les acides teichoiques et lipoteichoiques, notamment de: * Streptocoques * Staphylocoques Lactobacilles. Selon leur nature chimique et leur localisa- tion en surface de la bactérie, ou dans le milieu de culture, de très nombreux procédés ont été décrits pour la préparation de ces antigènes spécifiques, notamment dans les documents cites qui sont inclus ci-après comme références. A - Les polysaccharides capsulaires: Les po- lysaccharides, constituants essentiels de la capsule de certaines bactéries,sont généralement libérés en abon- dance dans le milieu de culture. Leur extraction est donc possible soit à partir de la biomasse, soit direc- tement à partir de la culture. Les polysaccharides capsulaires ont une struc- ture chimique généralement simple, formée de la répéti- tion d'une molécule constituée de 2 à 4 sucres, et cette structure est caractéristique de l'espèce bactérienne considérée. Ce sont donc bien des antigènes spécifiques et les anticorps qu'ils produisent sont généralement protecteurs. Toutefois ils sont donc presque toujours impliqués dans la pathogénicité des bactéries et leur administration directe à une dose vaccinante souvent importante (50 à 200 Fg) présente de sérieux inconvé- nients. L'utilisation de doses considérablement réduites sous forme d'un complexe avec l'ARN permet dont d'élimi- ner les risques en conservant un très fort pouvoir immu- nostimulant. Les articles ci-dessous sur ces polysacchari- des capsulaires, concernent les procédés d'obtention et les activités immunogéniques, pour quelques souches bactériennes o le rl81e des polysaccharides capsulaires a été clairement établi. - Klebsiella pneumoniae - C.ERBING, L. KENNE, B. LINBERG, J.LONNGREN (1976) - Structural studies of the capsuler polysaccharide of Klebsiella pneumoniae type I (Carbohydr. Res, 50 (1976), 115-120). - W.NIMMICH. (1968) - Zur isolierung und qualitativen bausteinanalyse der K. angigen von klebsiellen (Z. med. MIKROBID. u. IMMUNOL, 154, 117,131). - C. RICHARD (1973) - Etude antigénique et biochimique de 500 souches de KLebsiella (Ann. Biol. Clin. (1973), 31, 295-303). Le polysaccharide capsulaire de Klebsiella pneumoniae type 1, est à titre d'exemple un polymère de l'unité trisaccharidique suivante: e 4)-f-D-Glc Ap- (1 -- 4)- 3)-/-D-Glcp - 2 3 CH 3 COOH Glc = glucose, Fuc = fucose, Glc Ap. acide glucuronique. - Streptococcus pneumoniae: - L'étude de 83 types capsulaires différents a été décrite par KAUFFMANN.F. and LUND E (1954) (Int. Bull.bact.Nomencl, 4, 125-128). Le pouvoir immunostimulant de ces antigènes capsulaires pneumococciques a été remarqué-dès 1920 par FELTON et approfondi par FELTON et OTTINGER (J.of.Bac- teriology (1942), 43, 94-105) - COLIN M, Mac LEOD M.D. and al. Prevention of pneumococcal pneumoniae by immunization with specific capsular polysaccharides (J.Exp.Med. (1945) 82,445-465) - La présence de ces antigènes solubles spéci- fiques dans le milieu de culture avait déjà été signalée par: DOCHEZ, A.R. and O.T. AVERY. The elaboration of specific soluble substance by pneumoccoccus during growth (1917) (J.Exp. Med. 26: 477-493) Les méthodes de préparation de ces polysaccha- rides capsulaires sont nombreuses et ont fait l'objet d'un grand nombre de publications. I1 faut citer: . 7 2475900 - WEST PHAL and LUDERITZ (Z. Naturf. (1952), 7B, 148) qui sont à l'origine de toutes les méthodes basées sur l'utilisation du phénol - GLAUDEMANS C.P.J. and H.P. TREFFERS - An improved pre- paration of the capsular polysaccharide from Diplococcus pneumoniae (carbohydr. Res. (1967), 4, 181-184) Egalement à titre d'exemples de structures chimiques connues de ces polysaccharides capsulaires il faut citer: - Polysaccharide capsulaire de Streptococcus pneumoniae type 2: L - Rhap - (1 ->3) - L - Rhap - (1 -,3) - L - Rhap -(1 ->2) - Erythritol - Polysaccharide capsulaire de Streptococcus pneumoniae type 5. ->2) - D- Glc Ap- (1 -73) - L- Fuc NAcp - (1-> D.Glc p 4 I 1 - Pnc NAcp (L. Pnc. NAcp= N acétyl - L - pneumosamine = 2.acetamido 2,6 - didéoxy -L. tolosyl) - Polysaccharide capsulaire de Streptococcus pneumoniae type 8 --4)- D- Glc A - - (1 --4)- D- Glc - A- (1 ->4) - D- Glc- (1 -> 4) - D - Gal - (1 + 30. Polysaccharide capsulaire de Streptococcus pneumoniae type 14 -6)- P-D- Glc Nacp - (1 ->3) - - D- Galp - (1 ->4)- P- D - Glcp - (1 - - Hémophilus influenzae L'antigène protecteur d'Hemophilus influenzae est également un polysaccharide capsulaire de type poly- ribosephosphate dont la formule exacte n'a pas encore été déterminée. Sa préparation, son immunogénicité et sa caractérisation sont décrits dans les publications sui- vantes: P. ANDERSON et al. (1972). Immunization of humans with polyribosephosphate, the capsular antigen of Hemophilus influenzae type b (J. of Clin. Invest. vol. 51 (1972), 39-44) P. ANDERSON et al (1977). Isolation of the capsular polysaccharide from supernatant of Hemophilus influenzae type b (Infect. and Immun (1977) 15 (2), 472-477) - Escherichia coli Comme pour les germes précédents, les antigè- nes spécifiques se trouvent pour une partie du moins être des polysaccharides capsulaires. LUDERITZ et al (1968) - Somatic and capsular antigens of gram. négative bacteria (Compr. Biochem. 26 A: 105-228) Leur pouvoir protecteur est cependant moins bien établi que pour les germes précédents. B - Les Lipopolysaccharides membranaires (LPS) Les bactéries gram négatif possèdent toutes les lipo- polysaccharides dont la structure générale est composée des parties suivantes Lipide A - KDO - Core polysaccharide- Antigène O0 L'antigène O qui se trouve à l'extrémité libre du LPS est un polysaccharide spécifique fortement antigénique. Les anticorps obtenus n'ont cependant pas toujours un pouvoir protecteur intéressant et d'autre part, la par- tie lipidique (Lipide A) du LPS est responsable de la plupart des propriétés toxiques de la bactérie. L'u- tilisation directe de tels antigènes n'est donc guère envisageable. Par contre, une association ARN - Antigè- ne O purifié est très intéressante. Parmi les espèces bactériennes dont les LPS ont été plus particulièrement étudiés il faut citer: - Klebsiella pneumoniae - Serratia marcescens - Escherichia coli - Neisseria meningitidis - Salmonella typhimurium Ainsi que quelques références bibliographiques: - C. ERBING et al (1977) - Structural studies on the Klebsiella LPS (Carbohydr. Res, 56, 377-381) - G.B. CASTOR et al. (1971) Characteristics of a Highly purified pyrogenic LPS of Klebsiella pneumo- niae (J. of Pharm. Sci, 60 (10), 1578-1580) - K. FUKUSHI (1964) Extraction and purifica- tion of endotoxin from Enterobacteriaceae: A comparison of selected methods and sources. (J. of Bacteriol 87 (2), 391-400) - GUADALUPE A. LIMJUCO. Studies on the chemi- cal composition of LPS from Neisseria meningitidis Group B. (J. of Gen. Microbiol (1978, 104, 187-191) - G.A. ADAMS (1967) - Extraction of LPS from Gram - negative bacteria with DMSO (Canad. J. Biochem., , p 422-426) - K.G. JOHNSON (1976) - Improved techniques for the preparation of bacterial LPS (Canad. J. Micro- biol. (22), 29-34) - Y.B. KIM et al (1967) - Biologically active endotoxins from Salmonella mutans (J.of.bacteriol. 94, (5), 1320-1326) C - Les protéines membranaires spécifiques Pour de nombreuses bactéries, des protéines fonctionnellement très importantes se trouvenz situées à la surface membranaire. Certaines de ces protéines sont des antigè- nes spécifiques très intéressants produisant la forma- tion d'anticorps vaccinants. I1 faut citer par exemple: - Escherichia coli: 10. STIRM S.F. et al (1967) - Episome - carried surface antigen K88 of Escherichia coli (J.Bacteriol 93 (2): 731-739) SALLY, J.BETZ et al (1977) - Chemical and biological properties of a protein rich fraction of bacterial LPS (J. of Immunol. 119 (4) 1475-1481) - Serratia marcescens: W. WOBER (1971). Studies on the protein moiety of endotoxin from gram - gegative bacteria - characteriza- tion of the protein - moietiingisolated by acetic acid hy- drolysis of endotoxin of Serratia marcescens. - Salmonella typhimurium: NORA KUUSI et al. (1979). Immunization with major outer membrane proteins in experimental salmonello- sis of mice (Infect. and Immun (1979) 25 (3), 857-862. 25. BARBER, C. et al (1972). The protective role of proteins from S. typhimurium in infection of mice with their natural pathogen (Rev. Immunol 36: 77-81) DELORD.G. (1979). Etude d'un antigène vac- cinant contenu dans le surnageant de culture de Salmo- nella typhimurium Souche M-206. Thèse médecine Lyon N 428 (1979). G.W.GOODMAN (2979) - Characterization of the chemical and phLysical properties of a novel B. Lymphocyte activator - Endotoxin protein (Infect and Immun (1979), 24 (3), 685-696) - Streptococcus pyogènes: M.K. WITTNER (1977) - Homologous and Hete- rologous protection of mice with group A Streptococcal M protein vaccine (Infect and Immun (1977), 15, (1), 104-108) D - Les acides teichoiques et lipoteichoiques Chez les bactéries gram positif, les acides teichoiques et lipoteichoiques sont grossièrement l'é- quivalent des LPS chez les gram négatifs. Ces acides teichoiques sont généralement des polyribitolphosphate ou des polyglycerolphosphate. Ce sont des antigènes spécifiques possédant souvent un pouvoir vaccinant intéressant. Ils ont été particulièrement étudiés chez Streptocoques (pyogènes, feacalis, pneumo- niae) Staphylocoques (aureus, epidermidis....) Lactobacilles. - M.M. BURGER. (1966) Teichoic acids: antigenic deter- minants, chain separation, and their location in the cell wall (Microbiology (56) p. 910-917) - K.W.KNOX (1973) Immunological properties of teichoic acids (Bacteriol. Reviews, 37 (21, 215-257) - GLENN A. MILLER (1976) Effects of a Streptococcal Li- poteichoic acid on Host Response in Mice (Infect. and Immun. (1976) 13, (5), 1408-1417) - A.J.WICKEN et al (1975) Lipoteichoic acids: a new class of bacterial antigens (Science: 187, 1161-1167). La description dans laquelle tous les ar- ticles cités sont incorporés ici par référence montre combien les antigènes spécifiques bactériens sont va- rins dans leur structure, leur distribution et leurs propriétés. Ainsi pour chaque type bactérien il est pos- sible actuellement, d'isoler et de purifier par des pro- cédés connus, un ou plusieurs antigènes spécifiques por- teurs d'un certain potentiel immunogénique. Comme cela a été dit, la plupart de ces antigènes, à la dose vacci- nante ont souvent des effets toxiques indésirables. La formation d'un complexe de très faibles quantités de ces antigènes avec des ARN ou des fragments d'ARN ribosomaux, permet en administrant des doses dé- pourvues de toute toxicité d'obtenir un haut niveau de protection spécifique et, élargit ainsi considérablement les possibilités d'application. Pour ce qui concerne les ARN ribosomaux totaux ou leurs fragments ils peuvent être préparés par des procédés connus. Un exemple de préparation d'ARN ribosomal sera donné en exemple, car il s'agit là d'une préparation semi industrielle ou industrielle des ARN ribosomaux. Ce procédé comporte essentiellement la prépa- ration des ribosomes bactériens par précipitation frac- tionnée à partir des bactéries broyées, solubilisation des protéines ribosomales par le SDS-à chaud, précipi- tation de l'ARN qui est ensuite traité par la PRONASE pour éliminer les protéines résiduelles, puis lARN obtenu est à nouveau purifié par chromatographie d'é- change d'ions. L'utilisation de fragments d'ARN par réduc- tion du poids moléculaire de l'ARN ribosomal améliore sensiblement sa capacité d'augmenter le pouvoir immu- nogénique des antigènes spécifiques. De nombreuses méthodes classiques, décrites dans la littérature per- mettent d'y parvenir. Il est toutefois préférable d'utiliser une méthode enzymatique basée sur l'action de la Ribonu- cléase pancréatique qui présente l'avantage de respecter les parties en double chaîne de l'ARN ribosomal. Cette méthode consiste à incuber pendant deux heures à 37 C la solution d'ARN obtenue avec 5 Fg par ml de RNase pancréatique. L'ARN est ensuite concentré et purifié par chromatographie sur DEAE cellulose comme précédemment. Les fractions contenant l'ARN sont recueillies par pré- cipitation à l'éthanol. Une purification complémentaire, mais non indispensable peut -être obtenue en sélectionnant les fragments compris entre 5.104 et 2.105 daltons de poids moléculaire, soit par chromatographie de tami- sage moléculaire sur Séphadex G200, soit par ultra- filtration sur membrane Diaflo uM 300. Les articles ci-dessous décrivent d'autres ca- ractéristiques de la dégradation enzymatique des ARN ribosomaux. EHRESMANN, C. (1972) Biochimie 54: 901 - KAGAWA, H. (1972) J. Biochem 72: 827 - SANTER, M. (1973) J. Bact. 116: 1304 - NOMURA (1974) - Ribosomes Ed. Cold Spring Harbor Laboratory. Les préparations d'ARN ainsi obtenus peuvent être contrôlées notamment par les méthodes ci-dessous. Dosage de l'ARN: Trois méthodes sont utili- sées 1) Dosage spectrophotométrique direct à 256 nm comparativement à une préparation commerciale étalon. 2) Dosage du phosphore, sachant que l'ARN ribosomal pur renferme 8,2% de phosphore (FISKE et SUBBAROW - J. Biol Chem (1926), 66,375). 3) Chromatographie HPLC sur colonne échangeu- se d'ions après hydrolyse pour le contrôle qualitatif 14 2475900 et quantitatif de la composition en bases puriques et pyrimidiques et la recherche de la thymine caractéris- tique de l'ADN. Recherche de l'ADN: par chromatographie HPLC comme indiqué précédemment et par la réaction co- lorée à la diphénylamine (BURTON K.- Biochem. J. (1956), 62, 315-322). Recherche des protéines: par la méthode de LOWRY (J.Biol. Chem. (1951), 193, 265-275) 10. Recherche des hexoses: par dosage colori- métrique à l'anthrone d'après SCOTT T.A. (Analyt. Chem. (1953), 25, 1956-1961). Recherche des hexosamines: selon ELSON L.A. (Biochem.J. (1933), 27, 1824-1828). 15. Recherche des lipopolysaccharides: par la méthode à la carbocyanine de JANDA J. and WORK. E. (FEBS LETTERS (1971), 16, (4), 343-345). Le limulus test est également utilisé. Détermination du poids moléculaire des pré- parations 1) pour les ARN non hydrolysés, par chromato- graphie de tamisage moléculaire sur Biogel A 1,5m et par ultracentrifugation en gradient de densité. 2) pour les fragments d'ARN, par chromato- graphie de tamisage moléculaire sur Séphadex G200 et par électrophorèse sur gradient de gels d'acrylamide. Résultats analytiques moyens La détermination des poids moléculaires par les différentes méthodes indiquées donne les résultats suivants: 1) pour l'ARN non hydrolysé, les 2 molécules classiques 16S et 23S sont retrouvées avec des PM res- pectifs voisins de 5.105 et 1.106 daltons. 2475900 2) pour les fragments d'ARN, leur PM moyen se situe entre 5.104 et 2.105 daltons. * La composition physico - chimique des deux types de préparations est pratiquement la m&me: Elles contiennent au moins 95% d'ARN, moins de 0, 25% d'ADN, moins de 3% de protéines, moins de 1% d'hexoses, moins de 0,1% d'hexosamines et moins de 0,0001% de LPS. Etant donné la nature variée des antigènes spécifiques bactériens, de nombreux procédés peuvent être utilisés pour leur couplage sur les chaînes d'ARN. Il faut distinguer d'une façon plus générale deux grands groupes d'antigènes: - les antigènes peptidiques - les antigènes polysaccharidiques Les antigènes peptidiques De nombreuses techniques de couplage chimique permettent de former des liaisons covalentes entre les groupes aminés des bases nucléiques et les carboxyles ou les fonctions aminées des aminoacides terminaux des antigènes peptidiques. Ces techniques font, par exem- ple, appel à des réactifs tels que le-glutaraldéhyde, les carbodiimides. L'utilisation en particulier de carbodiimides de structure générale RN = C = NR permet de réaliser une liaison amide entre l'amine d'une des bases de 'ARN et le carboxyle d'un aminoacide. Selon le schéma suivant: NH2 - X -COOR + R'NH- Y - COOH +RN C NR R'NH - Y - CO - NH - X - COOR + H20 Le carbodiimide peut être, par exemple, le: 1-éthyle- 3-(3-diméthylamino propyl) carbodiimide hydrochloride (EDC) a,. Les conditions opératoires peuvent être les suivantes: Préparer une solution aqueuse d'ARN à 5 mg d'ARN par ml, ajuster le pH à 4,5 puis ajouter à cette solution 2 mg/ml de carbodiimide. Ajouter à cette préparation une solution de l'antigène peptidique au même pH dans les proportions désirées. Le mélange est agité une nuit à température ambiante. Le complexe est précipité par addition de 2 volumes d'éthanol froid en présence de CH3COONa 0,2 M puis lavé par de l'alcool à 70% contenant CH2COONa 0,2 M. Le complexe est ensuite dissous dans un tam- pon convenable, stérilisé par filtration sur membrane 0,2 u et lyophilisé. A coté de cette méthode chimique, des comple- xes peptides-ARN peuvent être également obtenus par ir- radiation ultraviolette de solution contenant l'ARN et le peptide. Dans ces conditions, des liaisons covalen- tes sont également obtenues. La longueur d'onde doit être alors comprise entre 223 et 290 nm. Les antigènes polysaccharidiques Les ARN ribosomaux possèdent une grande affi- nité pour les structures polysaccharidiques. Cette pro- priété peut être exploitée pour réaliser des complexes ARN-antigènes polysaccharidiques. Les structures secondaire et tertiaire de ARN très repliées masquent une grande partie de si- tes de couplage. Cette structure, après élimination des protéines ribosomales, reste maintenue par l'action de certains cations divalents comme le magnésium. Un procédé consiste donc à complexer l'ion magnésium à l'aide d'un agent chelatant, à mettre en présence 'ARN ainsi relaché avec l'antigène spécifique puis a ajouterensuite des ions magnésium afin d'obte- nir un complexe selon l'invention. Un mode opératoire plus détaillé sera décrit dans les exemples ci-après. Par complexe on entend dans la présente des- cription une molécule présentant une unité qui peut être caractérisée par les méthodes ci-dessous. Une des méthodes permettant le mieux de ca- ractériser les complexes ainsi préparés est l'ultracen- trifugation en gradient de densité. Sur des gradients de sucrose de 5 à 20% for- més dans les tubes d'un rotor SW de 14 ml on dépose la solution de complexe à analyser ainsi que sur les autres tubes un témoin d'ARN seul et un témoin d'antigène seul. Après stabilisation des bandes sur le gra- dient (centrifugation isopicnique) (les conditions de vitesse et de durée de la centrifugation sont adaptées pour chaque cas en fonction des poids moléculaires re- latifs de l'ARN et de l'antigène), les tubes sont re- cueillis et les gradients élués au moyen d'une pompe et d'une solution de sucrose à 35%. L'éluat est fractionné sur un collecteur de fractions et la densité optique de chaque fraction est mesurée à 260 nm. Les courbes de densité optique à 260 nm et d'indice de réfraction sont tracées graphi- quement. On peut ainsi visualiser le décalage de den- sité d'équilibre entre l'ARN témoin et l'ARN alourdi par l'antigène. De plus, la fraction contenant l'ARN couplé est recueillie et dialysée exhaustivement pour éliminer le sucrose du gradient. (la zone correspondante du tu- be témoin antigène est traitée dans les mêmes conditions pour vérifier que la zone d'équilibrage de l'antigène té- moin est différente). Après dialyse, une analyse physico-chimique est réalisée, qui permet une mesure quantitative et qua- litative de la quantité d'antigène lié à l'ARN. Deux autres méthodes peuvent également être utilisées pour caractériser ces complexes: 1 - La chromatographie de tamisage moléculaire Sur un séphadex de porosité appropriée don- nant des volumes d'élution différents pour l'ARN et l'antigène témoin, le complexe est chromatographié. La zone présentant une absorption à 260 nm est recueil- lie et analysée comme précédemment. De plus, la modi- fication du volume d'élution par rapport à l'ARN témoin caractérise l'augmentation du poids moléculaire du complexe. 2 - L'électrophorèse sur gel de polyacrylamide en gradients Sur des plaques on forme des gradients d'acry- lamide de 4 à 30% par un procédé classique, puis on dépose l'ARN témoin, l'antigène témoin et le complexe correspondant. Après une nuit de migration, l'électro- phorèse est arrêtée et révélée. Les distances de mi- gration sont alors directement proportionnelles au poids moléculaire des substances et on observe, pour le complexe, une distance de migration correspondant à un poids moléculaire supérieur à celui de l'ARN témoin. La présente invention concerne également des vaccins contenant à titre de principe actif au moins un complexe tel que défini précédemment. Les vaccins selon la présente invention peu- vent être préparés par tout procédé connu, en particu- lier sous forme de solution aqueuse, les complexes se- lon l'invention étant solubles dans l'eau. Il est possible évidemment d'utiliser d'au- tres supports ou additifs compatibles avec l'utilisa- tion en médecine. Ces vaccins peuvent être administrés également par une voie quelconque qui dépend essentiellement de l'action recherchée et de l'état du patient; ainsi les vaccins peuvent être présentés sous forme d'aérosol ou sous forme injectable en particulier par voie sous- cutanée. Les dosages journaliers et leur fréquence dépendent également beaucoup de l'affection à prévenir et de l'état du patient, mais si un surdosage n'apporte souvent aucun avantage supplémentaire il ne présente aucun risque compte tenu de la très faible toxicité de ces vaccins. A titre indicatif et non limitatit on donne ci-après un certain nombre d'exemples de vaccins compre- nant des antigènes spécifiques complexés à des ARN ou à des fragments d'ARN ribosomaux. Exemple 1: Complexe ARN Antigène capsulaire d'Hémophi- lus influenzae comprenant: ARN ribosomal de Klebsiella pneumoniae: 10 pg Polysaccharide capsulaire d'Hémophilus influenzae b.............. 0,5 pg Exemple 2: Vaccin pneumococcique Streptococcus pneumoniae Streptococcus pneumoniae Streptococcus pneumoniae composé des complexes suivants: type I... 5 pg d'ARN et 0,2 pg de PS capsulaire type II.. 5 pg d'ARN et 0,2 pg de PS capsulaire type III. 5 pg d'ARN et 0,2 pg de PS capsulaire Exemple 3: Vaccin bronchique: Klebsiella pneumoniae type I...... Streptococcus pneumoniae type I... eg d'ARN et 0,2 Mg de PS capsulaire pg d'ARN et 092 ug de PS capsulaire J r, 2475900 Streptococcus pyogèn AR type 12.. 5 Fg d'ARN et 0,2 Fg d 'acide teichoique Hémophilus influenzae type a.... 5 Fg d'ARN et 0,2 pg de PS capsulaire Exemple 4: Vaccin intestinal: Salmonella typhimurium... 3 lug d'ARN et 0,1 pg de protéines - de membrane Escherichia coli......... 3 Fg d'ARN et 0,1 ug de protéi- nes K Shigella dysenteriae..... 3 Fg d'ARN et 0,1Fg d'antigène 0 Staphylococcus auréus.... 3 fug d'ARN et 0,1 pg d'acide teichoique. Afin de préciser certaines caractéristiques et avantages de la présente invention les exemples suivants décrivent en détail la préparation de la composition selon l'exemple 2. Exemple 5: Séparation des capsules et du contenu cellulaire La biomasse bactérienne de Streptococcus pneumo- niae I utilisée pour la préparation de l'ARN ribosomal et des PS capsulaires est obtenue par un procédé classique de fermentation industrielle. La seule particularité des fermentations destinées à la préparation des ARN riboso- maux réside dans la centrifugation des cultures alors qu'elles sont en pleine phase de croissance exponentielle et à basse température, afin de conserver aux cellules une activité maximale de synthèse ribosomale. Le concentrat bactérien est lavé par remise en suspension dans du sérum physiologique et centrifuga- tion. La biomasse est soumise à un contrôle de qualité bactériologique, puis stockée congelée à basse tempé- rature. Pour obtenir les polysaccharides capsulaires, les cellules lavées sont dispersées dans un tampon tris- HC1 0,01 M, pH 7, contenant NaCl 0,10 M et MgC12 0,01 M. La température de la suspension est portée à 400C et les capsules sont séparées par homogénéisation quelques minutes dans un warring blendor à cette température. Après refroidissement, les cellules décap- sulées sont séparées par une centrifugation de 30 mi- nutes à 30.000 g et 4OC. Le culot est séparé pour la préparation des ribosomes et de l'ARN ribosomal. Le surnageant conte- nant les capsules est recueilli; son traitement sera décrit dans l'exemple. Afin de recueillir le contenu intracellu- laire, le culot est remis en suspension dans du tampon tris- H Cl pH 7,2 contenant Mg C12 et Na Ci puis la suspension est soumise à une désintégration cellulaire sur un appareil DYNO-MILL à micro billes de verre, réfrigéré. Exemple 6 Préparation de la fraction ribosomale Les cellules non broyées et les débris cellu- laires sont éliminés par deux centrifugations successi- ves à 10.000 puis à 30.000 g à + 40C. Le surnageant clair obtenu est traité une heure à 370C par 5 >g/ml de D Nase puis acidifié à pH5. Le précipité de protéines formé à ce pH est é- liminé par centrifugation à 30.000 g et + 40C. Les ribosomes sont précipités du surnageant par acidification à pH 4 et recueillis par centrifuga- tion à 10.000 g et + 40C. Les protéines non ribosomales absorbées sont donc éliminées par un lavage des ribosomes 30 minutes à 250C dans une solution de SDS à 0,25% (Sodium dodécyl sulfate) dans du tampon tris H Cl pH 7,5 contenant Mg C12 et Na CI. Les ribosomes lavés sont précipités de cette solution par l'addition de 0, 7 volume d'alcool éthylique glacé. Le précipité de ribosomes est recueilli par cen- trifugation puis repris dans du tampon tris-HCl pH 7,2 contenant Na Cl. La solution est clarifiée par centrifugation à 30.000 g et le surnageant contenant les ribosomes est conservé pour la préparation de l'ARN. Exemple 7 Préparation de l'ARN ribosomal La plus grande partie des protéines ribosomales est éliminée de lARN au moyen d'un traitement par le SDS à chaud. A la suspension de ribosomes précédentes, on ajoute du SDS pour avoir une concentration finale de 1%. La solution est alors portée rapidement à 800C et maintenue5 minutes à cette température avec une agita- tion énergique. Après un refroidissement rapide, l'ARN est précipité par acidification à pH 4 avec H Cl dilué, dans ces conditions lARN 5S n'est par précipité, seuls les ARN 16 S et 23 S précipitent. Le précipité d'ARN est recueilli par centrifugation, puis lavé par une solution à 70% d'éthanol contenant 0,2 M d'acétate de sodium à pH 7,8 pour éliminer le SDS résiduel. L'ARN ainsi lavé et transformé en sel de sodium est repris dans du tampon tris - HC1 pH 7,8 et contenant Na Cl. A ce stade, 5 à 10% de protéines peuvent en- core contaminer lARN. Leur élimination est obtenue par un traitement de 1 heure à 370C avec de la pronase. L'ARN est précipité de cette solution par addition lente d'un demi volume d'une solution aqueuse à 5% de Cétavlon. (Bromure de Cétyltriméthylamonnium et recueilli aussitôt par centrifugation. Le précipité est ensuite lavé plusieurs fois par dispersion et centrifugation dans une solution à % d'éthanol contenant 0,2 M d'acétate de sodium à pH 7,8 ce qui élimine le cétavlon résiduel0 Le résidu d'ARN est repris dans du tampon tris- HCl 0,05 M pH 7,2 puis soumis à une dernière purifica- tion par chromatographie d'échange d'ions sur une colonne de DEAE cellulose. L'ARN retenu sur cette colonne est élue après lavage par un gradient de Na Cl (0 -70,5 M) dans le même tampon. La fraction contenant 'ARN purifié est recueillie, puis précipitée par addition de 2 volumes d'éthanol glacé. L'ARN est recueilli par centrifuga- tion et repris dans un volume minimum de tampon Tris - H Cl 0,01 M pH 7,5. Exemple 8 Le surnageant contenant les capsules obtenu dans l'exem- ple 5 est traité de la façon suivante. Les polysaccharides capsulaires sont tout d'a- bord précipités à partir du surnageant par une addition lente d'une solution aqueuse de chlorure de cétylpyridi- nium à 2%, jusqu'en fin de floculation. Après une heu- re de repos à 40C, le précipité de polysaccharide est recueilli par centrifugation et le surnageant écarté. Le complexe polysaccharide-chlorure de cétyl- pyridinium précipité est dissocié dans du chlorure de sodium 2 M, dans ces conditions le polysaccharide passe en solution alors que le chlorure de cétylpyridinium est éliminé par centrifugation et le surnageant conservé. Trois volumes d'alcool éthylique froid sont ajoutés au surnageant pour précipiter le polysaccha- ride qui est recueilli par centrifugation après une heure de repos à 40C. Le polysaccharide précipité est lavé par dis- persion dans un mélange eau-éthanol (30:70 v/v) conte- nant CH3COO Na 0,1 M, pendant 30 minutes à température ambiante. La solution de lavage est éliminée par cen- trifugation et le culot est repris dans une solution aqueuse 0,1 M de CH3COO Na. Afin d'éliminer les protéines pouvant encore contaminer la préparation à ce stade, il est procédé à une extraction 10 minutes à 650C par un volume de phénol à 90% dans 1 acétate de sodium 1 M. Après agitation vive, 10 minutes à 650C, le mélange est re- froidi rapidement dans un bain de glace et les deux phases sont séparées par centrifugation 5 minutes à 10.000 g et 0C. La phase aqueuse supérieure est pré- levée délicatement. Trois volumes d'alcool éthylique froid sont ajoutés à la phase aqueuse et le polysaccha- ride est laissé en précipitation 1 heure à 40C. Le précipité est recueilli par centrifugation puis dispersé dans un mélange eau-éthanol (30:70 v/V) contenant CH3COO Na 0,1 M pendant 30 minutes à tempéra- ture ambiante. Le précipité lavé est recueilli par centrifugation et repris dans l'eau distillée puis sté- rilisé par filtration sur membrane 0,22 y. et lyophilisé. Exemple 9 Préparation du complexe On ajoute à une solution aqueuse à 5 mg d'ARN/ ml préparé par le procédé de l'exemple 7 une solution 0,001 M d'acide éthylène diamine-tétraacétique (EDTA) qui complexe les ions magnésium qui sont ensuite élimi- nés par dialyse. La structure de l'ARN se trouve ainsi "re- lâchée" démasquant un nombre maximum de sites de cou- plage. L'antigène polysaccharidique obtenu à l'exem- ple 8 est alors dissous à 0,2 mg/ml dans la solution d'ARN et le mélange est agité pendant une nuit à 40C. Après ce temps d'agitation, du chlorure de magnésium est alors ajouté à la solution pour avoir une molarité finale de 0,01 M et l'agitation est poursuivie p endant deux heures. Le complexe est alors précipité en présen- ce de CH3COONa 0,2 M par addition de 2 volumes d'é- thanol froid. Le précipité est lavé par l'éthanol à 70% contenant CH3COONa 0,2 M puis repris dans un tam- pon convenable, stérilisé par filtration sur membrane 0,2 et lyophilisé. On prépare de la même façon le complexe cor- respondant à S. pneumoniae type II et S. pneumoniae type III Exemple 10 Etude de la protection de la souris par la formulation n 2, contre un challenge par la souche virulente de Streptococcus pneumoniae type I. Animaux utilisés souris Balb/c Formule no 2 Streptococcus pneumoniae Type I: 5 pg d'ARN + 0,2 rg de PS Streptococcus pneumoniae Type II: 5 pg d'ARN + 0,2 ig de PS Streptococcus pneumoniae type III 5 pg d'ARN + 0,2 pg de PS Méthodologie: A- 20 souris traitées 2 fois par 1,25 gg de mélange en jours, par voie sous-cutanée. A'- 20 souris témoins traitées 2 fois par 0,2 ml d'eau salée en 15 jours par voie sous-cutanée. B- 20 souris traitées 2 fois par 0,6 pg du mélange en 8 jours, par voie sous-cutanée. B'- 20 souris témoins traitées 2 fois par 0,2 ml d'eau salée en 8 jours par voie sous-cutanée. Le challenge a lieu le 6ème jour après le dernier traitement avec la souche virulente de Strep- tococcus pneumoniae Type I. Résultats Groupe de souris A/A' 1. Challente par 50 bactéries (Streptococcus pneumoniae I) par voie intrapéritonéale. Protection ++ très significative, 20 jours après le challenge ( groupe A 20 animaux survivants ( groupe A' témoins - 12 animaux survivants 2. Challenge par 5 bactéries (Streptococcus pneumoniae I) par voie intrapéritonéale. -Protection ++ très significative, 20 jours après le challenge ( groupe A - 20 animaux survivants ( groupe A' témoins - 12 animaux survivants 3. Challenge par 1 bactérie (Streptococcus pneumoniae I) par voie intrapéritonéale. -Pas d'infection chez les animaux traités ou vaccinés. Groupe de souris B/B' 1. Challenge par 100 bactéries (Streptococcus pneumo- niae I) par voie intrapéritonéale. Protection ++ très significative, 2 jours après le challenge ( groupe B 20 animaux survivants ( groupe B' témoins - 0 animal, survivant 2. Challenge par 10 bactéries (Streptococcus pneumo- niae I) par voie intrapéritonéale. -Protection ++ très significative, 2 jours apres le challenge (groupe B 20 animaux survivants (groube B' témoins - 0 animal survivant. 27 2475900 Pour les deux challenges, tous les animaux traités survivent 20 jours après l'administration de germes virulents alors que les animaux témoins sont tous morts 2 jours après. RECHERCHE DES ANTICORPS SPECIFIQUES PAR IMMUNOELECTRODIFFUSION DIRIGES CONTRE LES TROIS ANTIGENES DONT SONT ISSUS LES A.R.N. et les P. S. CAPSULAIRES Souris Streptococcus pneumoniae Streptococcus pneumoniae Streptococcus femelles OF Type I Type II pneumoniae (Hauteur des "Rockets" en mm) (Hauteur des "Rockets" e Type III mm) SHauteur des Rockets" en mm Avant APrès Avant Après Avant Après traitement traitement traitement traitement raite- traite- ment ment 1 10 20 9 13 8 15 2 8 20 8 15 10 15 3 8 18 O 16 10 14 *4 6 18 O 15 6 12 4 17 4 16 5 16 6 10 20 12 20 12 18 7 10 19 O 16 7 14 8 10 16 7 12 7 16 9 8 17 7 16 O 12 10 15 7 12 8 16 Protocole de vaccination avec la formulation de l'exemple no 2 injections en 2 semaines. 1/4 de dose par injection, soit 1,25 "g d'A.R.N.+ 0,05 >g de P.S. de chaque animal. type par ro %O O REVENDICATIONS 1) Complexe vaccinal caractérisé en ce qu'il est constitué par des ARN ribosomaux bactériens ou des fragments d'ARN ribosomaux bactériens sur lesquels sont couplés de 1 à 5 % en poids d'un antigène spécifique de sérotype bactérien. 2) Complexe selon la revendication 1, caractérisé en ce que les ARN et l'antigène spécifique proviennent des mêmes souches bactériennes. 3) Complexe selon la revendication 1, caractérisé en ce que les ARN et l'antigène spécifique proviennent de souches bactériennes différentes. 4) Complexe selon l'une des revendications 1 à 3, caractérisé en ce que l'antigène spécifique est choisi parmi: - les polysaccharides capsulaires, - les lipopolysaccharides membranaires des bactéries gram négatives, - les protéines membranaires spécifiques, - les acides teichoiques et lipoteichoiques des bactéries gram négatives. ) Complexe selon la revendication 4, caractérisé en ce que l'antigène spécifique est choisi parmi les polysaccharides capsulaires de: Klebsiella pneumoniae, - Streptococcus pneumoniae, - Hemophilus influenzae, - Escherichia coli. 6) Complexe selon la revendication 4, caractérisé en ce que l'antigène spécifique est choisi parmi les lipopolysaccharides membranaires de: Klebsiella pneumoniae, - Serratia marcescens, - Escherichia coli, Neisseria meningitidis, - Salmonella typhimurium. 7) Complexe selon la revendication 4, caractérisé en ce que l'antigène spécifique est choisi parmi les protéines membranaires spécifiques de: Escherichia coli, - Serratia marcescens, - Salmonella typhimurium, - Streptococcus pyogenes. 8) Complexe selon la revendication 4, caractérisé en ce que l'antigène spécifique est choisi parmi les acides teichoiques et lipoteicholques de: -.Streptocoques, - Staphylocoques, - Lactobacilles. 9) Complexe selon l'une des revendications 1 et 3 à 8, caractérisé en ce que les ARN ribosomaux sont extraits des ribosomes de: - Streptococcus pneumoniae, - Streptococcus pyogenes, Staphylococcus aureus, - Klebsiella pneumoniae, - Serratia marcescens, Escherichia coli, - Salmonella typhimurium, - Corynebacterium, Mycobacterium. ) Complexe selon l'une des revendications 1 à 9, caractérisé en ce que les fragments d'ARN ribosomaux bactériens ont un poids moléculaire compris entre 3 x 104 et 2 x 105 daltons. 11) Complexe selon la revendication 10, caractérisé en ce que les fragments d'ARN ribosomaux bactériens ont un poids moléculaire compris entre 000 et 50 000. 12) Complexe selon l'une des revendications 1 à 11, caractérisé en ce que le couplage est réalisé par des liaisons covalentes. 13) Vaccin caractérisé en ce qu'il comporte à titre de principe actif un complexe selon l'une des revendications 1 à 12.