FR 2486097 A1 19820108 FR 8107829 A 19810417 I La présente invention est relative à l'industrie microbiologique et a notamment pour objet un procédé de préparation d'une semence, en particulier pour la produc- tion d'acide citrique. On connait un procédé de préparation d'acide citrique (R.Y. Karklin, A.K. Probok "La biosynthèse des acides organiques", Riga, 1972), qui consiste à préparer la semence de la souche Aspergillus niger EU-119, à faire fermenter à l'échelle industrielle par culture des spores (conidies) de la souche indiquée sur un milieu nutritif de mélasse et à isoler l'acide citrique du liquide de fermentation. La souche Aspergillus niger EU-119 (certificat d'auteur URSS N 170898 publié le 11.05.1965) possède les propriétés morphologiques et culturales suivantes: sur le milieu de Czapek-Dox une culture âgée de 5 jours a des chapelets de conidies circulaires ou étoilés d'un diamètre de 85 à 190, les stérigmes sont bicouches; la longueur des stérigmes du premier ordre est de M1), celle du deuxième ordre étant de 7,5f; la culture a des conidies rondes de 3,4k de diamètre; la longueur des conidiophores est de 0,7 à mm. Sur le milieu de Czapek-Dox une colone géante âgée de 5 jours est ronde, de 40 mm de diamètre, le mycélium de substrat est radialement plissé, le mycélium aérien est élevé, les conidies sont de couleur brun foncé, la zone asporogène est de 7 mm. Sur le moût gélosé une colonie géante de 5 jours est ronde, duveteuse, de 73 mm de diamètre, la zone asporogène est de 11 mm. Sur un milieu de mélasse la souche Aspergillus niger EU-119 donne 70 à 75 % d'acide citrique calculé par rapport au sucre de la mélasse. Sur le milieu motgélosé le rendement en spores (conidies) est de 0,9 g par dm 2. La teneur en conidies constitue 15-20 milliards par gramme. En utilisant la souche Aspergillus niger EU-119 35. dans la production de l'acide citrique au stade de prépa- ration de la semence, on n'obtient qu'un bas rendement en spores à faible activité biochimique. Parmi les procédés connus d'obtention de la semence pour la production d'acide citrique, celui qui est décrit dans le certificat d'auteur URSS N 568677 (publié le 15.08.1977) est le plus proche du procédé faisant l'objet de la présente invention. Selon le procédé mentionné, on obtient la semence de la souche Aspergillus niger R-1 par ensemencement d'une culture pure de la souche sur un milieu nutritif de moût gélosé ayant la composition suivante (% en masse): 0 moût de bière (calculé par rapport au sucre) 6 - 8 urée 0,05 - 0,1 NaCl 1 - 2 CuS04.'5H20 0,0001 gélose 2 - 3 Le pH du milieu est maintenu au niveau de 5 à 6. On effectue la culture à une température de 30 à 32 C pendant 9 à 10 jours dans des cures de 10 à 12 dm2 de surface. On sépare-les conidies mêres à partir du mycé- lium à l'aide d'un pinceau ou d'un dispositif à vide. Le rendement en conidies par dm2 de surface de sporulation est de 1,0 à 1, 1 g. La teneur en conidies constitue 24 milliards par gramme. La souche Aspergillus niger R-1 présente les pro- priétés morphologiques et culturales suivantes: sur le milieu de Czapek Dox une culture âgée de 5 jours a des chapelets de conidies circulaires d'un diamètre de 205 à 215J, les vésicules sont de forme allongée de 27) de diamètre, les stérigmes sont monocouches de 10i de longueur, les conidies sont rondes et de 7h de diamètre en moyenne; la longueur des conidiophores est de 3 à 4 mm, leur diamètre étant de 20À. Sur le milieu de Czapek-Dox une colonie géante âgée de 5 jours est ronde, de 45 à 50 mm de diamètre, son bord est plan; la zone 35. asporogène est de mm, le mycelium de substrat est radialement plissé, la sporulation est d'une densité moyenne, les conidies sont de couleur brun foncé. Sur le moût gélosé se forme au bout de 5 jours une colonie géante d'un diamètre de 90 mm. Au centre de la colonie les sporophores sont rares, élevés; puis il y a une zone de sporophores abondants, bas, qui deviennent rares vers les bords de la colonie. En utilisant le procédé de culture en surface sur des milieux de mélasse, la souche Aspergillus niger R-1 donne 99 à 100 % d'acide citrique calculé par rapport au sucre de mélasse. L'inconvénient de l'utilisation de la souche Aspergillus niger R-1 dans la production de l'acide citrique est le bas rendement en spores (conidies) par unité de surface de sporulation et la faible teneur en spores par unité de masse, observés au stade de la préparation de la semence. On s'est donc proposé, en utilisant une nouvelle souche, d'augmenter le rendement en spores (conidies) par unité de surface de sporulation et d'améliorer la qualité de la semence. Ce problème est résolu grâce à un procédé de préparation de semence pour la production d'acide citrique par culture de spores (conidies) d'une moisissure Aspergillus niger sur un milieu nutritif, comportant des sources de carbone et d'azote et des sels minéraux, et par séparation des spores (conidies) du milieu nutritif, caractérise, suivant l'in- vention, en ce qu'on emploie en tant que moisissure la souche Aspergillus niger R-3 qui est sélectionnée par action successive, sur la souche Aspergillus niger EU-119, de l'éthylène-imine, de la N-nitrosoméiylurée et de rayons ultraviolets, et présente les propriétés morpho- logiques et culturales suivantes: sur le milieu de Czapek-Dox une culture âgée de 5 jours a des chapelets conidiens arrondis, de 200 à 220} de diamètre, les stérigmes.sont monocouches et d'une longueur de 9 à 15/, les vésicules ont une forme légèrement allongée de 34x37 35. à 46x50,, les conidies sont de couleur brun foncé, rondes, de 5 à 7J de diamètre, la longueur des conido- phores est de 1 à 3 mm; sur le milieu de Czapek-Dox une colonie géante âgée de 5 jours est circulaire, de 40 à mm de diamètre, la zone asporogène est de 4 à 8 mm; sur le moût gélosé le diamètre d'une colonie de 5 jours est de 46 à 48 mm, la zone asporogène est de 6 à 10 mm; les sporophores sont abondants, le centre de la colonie est convexe avec une sporulation pauvre de couleur brun foncé; la souche est douée d'une résistance élevée aux bactéries antagonistes qu'on trouve lors de la fermen- tation critique; le rendement en acide citrique va jusqu'à 100 % calculé par rapport au sucre de mélasse; elle ne forme pas d'acide oxalique; le rendement en spores (conidies) sur le milieu mont gélosé est de 1,3 à 1, 45 g par dm2 de surface de sporulation, la quantité de conidies dans 1 g est de 30 à 35 milliards. La souche indiquée est déposée au Musée central des micro-organismes industriels de l'Institut national de recherches sur la génétique (URSS) sous la dénomination Ugn MC 132. La nouvelle souche Aspergillus niger R-3 a été obtenue en traitant successivement la souche Aspergillus niger EU-119 par l'éthylène-imine, la N-nitrosométhylurée et les rayons ultraviolets. Les propriétés morphologiques de la nouvelle souche ont été étudiées sur le milieu de Czapek-Dox à 321C. Les propriétés culturales de cette souche ont été étudiées sur le milieux de Czapek-Dox, de moût gélosé et sur un milieu sporulant. Les caractères biochimiques de la souche ont été déterminés sur un milieu fermentatif utili- sable dans la production de l'acide citrique. Ses pro- priétés antagonistes ont été testées à l'égard des microorganismes étrangers qu'on trouve dans le processus fermentatif de préparation de l'acide citrique. La nouvelle souche possède les propriétés suivantes. 1. Propriétés morphologiques. , Milieu de Czapek-Dox. Les chapelets de conidies d'une culture âgée de 5 jours sont arrondis, de 200 à 220> de diamètre. Les stérigmes sont monocouches, leur longueur est de 9 à 15%. Les vésicules ont une forme légèrement allongée de 34x37 à 46x507. Les conidies sont de couleur brun foncé, circulaires, de 5 à 7J de diamètre. La longueur des conidiophores varie de I à 3 mm. Les caractéristiques morphologiques comparatives de la souche de départ Asperfillus niger EU-119, de la souche Aspergillus niger R-1 et de la nouvelle souche Aspergillus niger R-3 sont indiquées dans le tableau 1 cidessous. Tableau 1 N Caractéristiques Unité Souche Souche Souche de EU119 R-1 R-3 mesure 151 Diamètre des 105-115 205-215 200-220 chapelets conidiens 2 Dimension des 34x35 27x30 34x37 à vésicules 46x50 3 Longueur des stérigmes du 1er ordre 11 10 9-17 du 2nd ordre 7,5 néant néant 4 Diamètre des conidies 3-4 7 5-7 Longueur des conidiophores mm 0,7-5 3-4 13 2. Propriétés culturales. Milieu de Czapek-Dox. Une colonie géante, cultivée sur une boite de Pétri à une température de 32 C, présente au 5ème jours une forme circulaire d'un diamètre de 40 à 45 mm. La sporulation est pauvre, les conidiophores sont bas, les chapelets des conidies sont plats, brun foncé. La zone asporogène est de 4 à 8 mm. Moût géloséJ.s oonesgi âgées de 5 jours sont d'une forme circulaire, de 46 mm à 48 mm dietmèe.es sporophores 35. sont bas, abondants, brun foncé. Le centre de la colonie est convexe avec une sporulation pauvre. La zone asporogène est de 6 à 10 mm. Milieu sporulant. (Composition, % en masse): moût de bière, % en sucre 7; urée - 0,05; chlorure de sodium -2; sulfate cuivrique - O0,0001; gélose - 2,4; eau- le reste). Pendant les deux premiers jours se forme un mycélium blanc peu plissé. Le troisième jour, on a des sporophores abondants, non élevés, les chapelets conidiens sont gros, de couleur allant du brun foncé au noir. Le rendement en spores par dm2 de la surface de sporulation est de 1,3 à 1,45g par dm2. La quantité de spores dans 1 g est de 30 à 35 milliards. 3. Comportement à l'égard des sources de carbone. La nouvelle souche assimile le saccharose, le glucose, le fructose, le maltose, les hydrolysats de matières premières végétales, l'téthanol, mais n'assimile pas l'acide acétique. 4. Comportement à l'égard des sources d'azote. La souche assimile l'azote organique et minéral. 5. Propriétés antagonistes. La souche présente une résistance élevée aux bactéries formant des gaz, des acides et des nitrites et présentes dans le processus fermentatif de préparation de l'acide citrique. 6. Caractéristiques biochimiques. La nouvelle souche fait bien fermenter les solutions à mélasse. Le rendement en acide citrique atteint 100 % calculé par rapport au sucre de mélasse. La proportion de l'acide citrique calculée par rapport au total des acides synthétisés constitue 95 à 99 %. Les caractéristiques comparatives des souches Asper- 30. gillus niger EU-119, R-1 et R-3 sont indiquées dans le tableau 2 ci-dessous. 248609? Tableau 2 Souche Rendement en Rendement en Quantité de Aspergil- acide citrique spores par dm2 spores dans lus niger calculé par de surface lg, rapport au de sporulation, milliards sucre de mé- g lasse, % EU-119 70-75 0,9 15-20 R-1 jusqu'à 100 1,0-1,1 20-24 R-3 jusqu'à 100 1,3-1,45 30-35 Le procédé proposé d'obtention de la semence pour la production d'acide citrique est mis en oeuvre de la façon suivante. On prépare d'abord un milieu nutritif contenant des sources de carbone et d'azote et des sels minéraux. On utilise habituellement à titre de source de carbone du moût de bière ou un extrait de malt, dont la teneur en sucre est de 5 à 9 % en masse. Comme source d'azote, on utilise généralement l'urée, le nitrate d'ammonium ou le chlorure d'ammonium. Le milieu nutritif renferme les composants suivants (% en masse): moût de bière ou extrait de malt (% en sucre) 5-9 urée 0-0,2 NaCl 0-3 CUS04 5H20 0,0001 gélose 1,8-3 eau le reste On prépare le milieu nutritif dans un appareil chauffé muni d'un agitateur. On fait préalablement tremper la gélose, puis on la fait fondre pendant 20 à 30 min tout en remuant et en chamfant peu à peu jusqu'à 800C. On ajoute 35. à la gélose fondue, sous agitation, le moût de bière ou l'extrait de malt. On dissout dans l'eau, tout en mélangeant, le chlorure de sodium, le sulfate cuivrique et l'urée et on les introduit dans l'appareil. On mélange le contenu de l'appareil et on ajoute de l'eau jusqu'à obtenir le volume requis. On verse dans des cuves le milieu nutritif ainsi pré- paré, on ferme les cuves avec une couverture en ouate et gaze et on la stérilise dans un autoclave à une température de 1200C pendant 20 à 30 min. Les cuves stérilisées sont placées dans une chambre thermique. On ensemence le milieu nutritif congelé avec les spores de la culture initiale Aspergillus niger R-3. Les spores à utiliser peuvent être pures ou mélangées avec une charge (charbon actif, talc, craie) dans des rapports de 1:1 à 1:0. L'ensemencement est réalisé à l'aide d'un appareil du type pulvérisateur. Il est également possible d'ense- mencer le milieu avec des spores sous forme de suspension. On utilise pour l'ensemencement 1 à 2 mg de spores par dm2 de milieu nutritif. La culture des spores dans la chambre thermique dure 8 à 10 jours. Le processus de culture pett être réalisé tant dans des conditions de température et d'humidité réglées qu'à des valeurs de température et d'humidité constantes. L'humidité de l'air dans la chambre thermique est réglée par sa diminution graduelle de 90 à 40 % à l'aide d'un humidificateur et d'une aération à l'air stérile. Le contrôle de la température est effectué par sa diminution successive de 33-341C à 20-251C. On recueille les spores à partir de la surface du mycélium, dans des conditions stériles, à l'aide d'un pinceau ou d'un dispositif à vide. On pèse la semence. Le rendement en spores par dm2 de surface de sporulation constitue 1,3 à 1,45 g. Le nombre de spores est déterminé dans une chambre de comptage. lg de spores en contient 30 à 35 milliards. On mélange les spores avec une charge (charbon actif, talc ou craie) dans un rapport de 1:1 à 1:2. 35. La semence obtenue est testée quant à son activité biochimique et son pouvoir germinatif. L'activité de la formation d'acides est évaluée dans des conditions de laboratoire par culture de spores sur des milieux fermentatifs à mélasse (teneur en sucre de 13 à 15 %) utilisables dans la production d'acide citrique. On effectue la culture par un procédé superficiel, la hauteur de la couche étant de 8 à 12 cm, à une température de 30 à 320C pendant 7 à 8 jours. Le pH du milieu est de 6,7 à 7,0; On soumet au titrage par la soude caustique la solution de mélasse fermentée et l'on mesure le rendement en acides synthétisés. La teneur en acide citrique est déterminée par la méthode des sels calcaires ou par la méthode spectrophotométrique ou iodométrique. La quantité d'acide citrique constitue 95 à 99 % de la somme des acides. Le rendement en acide citrique calculé par rapport au sucre de mélasse est de 95 à 100 ". La teneur en acide oxalique constitue O à 1 % par rapport au total des acides synthétisés. Le pouvoir germinatif des spores est déterminé à l'aide d'un verre porte-objets dans une goutte pendante de solution de mélasse ou de solution de moût. Le pouvoir germinatif des spores est de 95 à 98 %. Les caractéristiques comparatives des souches Asper- gillus niger EU-119, R-1 et R-3 sont données dans le tableau 3 ci-dessous. Tableau 3 Souche Rendement en acide Rendement en Quantité Aspergillus citrique calculé spires par de spores niger par rapport au dm de surface dans I g, sucre de mélasse, de sporula- milliards % tion, g EU-119 70-75 0,9 15-20 R-1 jusqu'à 100 1,0-1,1 20-24 R-3 jusqu'à 100 1,3-1,45 30-35 Le semence est conservée dans des conditions d'humidité relative de l'air ne dépassant pas 70 %. La température de ,conservation est de 20 à 250C. La durée de validité des spores est de 6 mois à partir de la date d'obtention. On donne ci-après des exemples-types concrets mais non limitatifs illustrant certains aspects de la présente invention et mettant en évidence ses particularités et avantages. Exemnple 1 Pour préparer la semence, on utilise la souche Aspergil- lus niger R-3. Le milieu nutritif comporte les constituants suivants, % en masse: moût de bière (% en suDre) 7 urée 0,05 NaC1 2 CuSO4. 5H20 0,0001 gélose 2,4 eau le reste. On prépare le milieu nutritif dans un bac à cuisson (500 1) muni d'un agitateur mécanique et chauffé à la vapeur d'eau. On trempe 11,76 kg de gélose dans 220 1 d'eau et on maintient à la température normale pendant 24 heures. Puis on met en marche l'agitateur et on chauffe lentement, sous agitation, jusqu'à 80 C pendant 20 à 30 min. On ajoute à la gélose fondue 214 1 de moût de bière (teneur en sucre 16 %) et on mélange. On dissout dans 10 1 d'eau 9,8 kg de NaCl, 0,254 kg durée et 0,49 g de CuSO4. 5H20. On verse la solution obtenue dans le bac à cuisson, on remue le contenu et on ajoute de l'eau jusqu2à obtention d'un volume de 490 1. En utilisant un distributeur, on verse le milieu nutritif préparé dans des cuves (nombre de cuves = 350). La surface de chaque cuve est de 11 dm 2. Les cuves remplies et fermées avec des couvertures en ouate et gaze sont ensuite stéri- lisées dans un autoclave à une température de 120 C pendant min. On met les cuves stérilisées dans une chambre thermique. , On ensemence le milieu nutritif congelé avec des spores de la souche Aspergillus niger R-3 mélangées avec dlu charbon actif dans un rapport de 1:1. L'ensemencement est effectué il à l'aide d'un appareil du type pulvérisateur. On emploie pour ensemencement 1 mg de spores par dm2 de milieu nutritif. Le processus de culture des spores dure 9,5 jours dans des conditions de réglage de la température et de l'humidité. Pendant les premiers 4 jours de croissance de la moisissure, l'humidité de l'air dans la chambre thermique est diminuée graduellement de 80 à 60 %, et durant les 4,5 jours suivants, elle est diminuée de 60 à 40 % à l'aide d'un humidificateur et par aération à l'air stérile. Le réglage thermique se fait automatiquement. Pendant les premiers 4 jours la température est maintenue au niveau de 32+10C, les 4,5 jours suivants elle est de 30+10C, et le dernier jour, de 20 à 250C. A l'aide d'un dispositif à vide, on recueille les spores à partir de la surface du mycélium dans deux ballons en aluminium de 20 1 chaque et l'on pèse. On reçoit 5582 g de spores d'une surface de sporulation égale à 3850 dm2, ce qui constitue 1,45 g par dm 2. Le nombre de spores est calculé dans une chambre de comptage (1g de spores en comprend 35 milliards). On ajoute aux spores recueillies 5582 g de charbon actif et on mélange minutieusement. On soumet la semence ainsi préparée à un test pour évaluer son activité biochimique et son pouvoir germinatif. L'activité biochimique de la semence est déterminée en titrant avec NaOH la solution fermentée de mélasse. Le rendement en acide citrique est de 99 % par rapport au sucre de mélasse. On n'a pas décelé la présence d'acide oxalique. On détermine le pouvoir germatif dans une goutte pendante de solution de mélasse à l'aide d'un verre porte- objets. Le pouvoir germiamjf constitue 98 %. Exemple 2 La préparation et l'ensemencement du milieu nutritif par les spores de la souche Aspergillus niger R-3 sont effectués d'une façon analogue à celle décrite dans ,l'Exemple 1. On cultive les spores dans une chambre thermique en maintenant la température à 31+10C pendant 8 jours. L'humi- dité n'est pas contrôlée. Le dernier jour, on laisse les cuves à une température de 20 à 250C. La récolte des spores et la préparation de la semence sont réalisées d'une façon identique à celle de l'Exemple 1. On a recueilli 1,35 g de spores par dm de surface de sporulation, la surface entière de sporulation donnant 5197,5 g de spores. Le nombre de spores dans 1 g est de 30 milliards. L'activité biochimique correspond à 96,4 % d'acide citrique rapporté au sucre de mélasse. Le pouvoir germinatif constitue 97,5 %. Exemple 3 La culture des spores de la souche Aspergillus niger R-3 s'effectue sur un milieu nutritif de composition sui- vante, % en masse: extrait de malt (% en sucre) 8 urée 0,1 NaCl 1 CuSo4. 5H20 0,0001 gélose 2 eau le reste. Le milieu nutritif, qu'on prépare selon le procédé décrit dans l'Exemple 1, a le même volume que celui de l'Exemple 1. La température et l'humidité de l'air, sont réglées de la manière décrite dans l'Exemple 1. 5005 g de spores ont été recueillies de la surface de sporulation égale à 3850 dm2, c'est-à-dire qu'on obtient 1,30 g par dm2. L'activité biochimique de la semence correspond à 95,2 % d'acide citrique calculé par rapport au sucre de mélasse. Le pouvoir germinatif est de 97 9. Le procédé proposé pour l'obtention de la semence présente un intérêt particulier dans la production d'acide , citrique en grandes quantités, lorsqu'il est avantageux d'organiser la préparation d'une semence pouvant être longtemps conservée dans des conditions normales et transportée sur de longues distances. Le procédé en question permet d'obtenir un haut rende- ment en spores, qui dépasse de 30 % le niveau existant actuellement. La qualité de la semence obtenue d'après le procédé faisant l'objet de l'invention assure un rendement élevé en acide citrique (jusqu'à 100 % par rapport au sucre de mélasse). Bien entendu, l'invention n'est nullement limitée au mode de réalisation décrit qui n'a été donné qu'à titre d'exemple. En particulier, elle comprend tous les moyens constituant des équivalents techniques des moyens décrits, ainsi que leurs combinaisons, si celles-ci sont exécutées suivant son esprit et mises en oeuvre dans le cadre de , la protection comme revendiquée. R E V E N D ICAT I 0 NS 1. Procédé de préparation de semence pour la production notamment d'acide citrique par culture de spores (conidies) d'une moisissure Aspergillus niger sur un milieu nutritif comprenant des sources de carbone et d'azote et des sels minéraux, suivie d'une séparation des spores (conidies) du milieu nutritif, caractérisé en ce qu'on utilise, à titre de moisissure, la souche Aspergillus niger R-3 sélectionnée en faisant agir successivement sur la souche Aspergillus niger EU-119 l'éthylène-imine, la N-nitrosométhylurée et des rayons ultraviolets, et possédant les propriétés morphologiques et culturales suivantes: sur le milieu de Czapek-Dox, une culture âgée de 5 jours a des chapelets de conidies arrondis, de 200 à 220J4de diamètre, les stérigmes sont monocouches et de 9 à 15, de longueur, les vésicules ont une forme légèrement allongée de 34x37 à 46x50M, les conidies sont de couleur brun foncé, rondes, de 5 à 7) de diamètre, la longueur des conidiophores est de 1 à 3 mm; une colonie géante de 5 jours formée sur le milieu de Czapek-Dox est ronde, d'un diamètre de 40 à 45 mm, la zone asporogène est de 4 à 8 mm; une colonie âgée de 5 jours sur le moût gélosé est de 46 à 48 mm de diamètre, la zone asporogène est de 6 à 10 mm; les sporophores sont abondants, le centre de la colonie est convexe avec des sporophores rares brun foncé; ladite souche possède une résistance élevée aux bactéries antagonistes présentes dans le processus de fermentation citrique; le rendement en acide citrique atteint 100 %, calculé par rapport au sucre de mélasse; sur un milieu de mont gélosé, le rendement en spores (conidies) est de 1,3 à 1, 45 g par dm2 30. de surface de sporulation, le nombre de conidies dans 1 g est de 30 à 35 milliards. 2. Semence pour la production notamment d'acide citrique, caractérisée en ce qu'elle est obtenue par le procédé faisant l'objet de la revendicationi.