FR 2481928 A1 19811113 FR 8105380 A 19810318 2481 928 La présente invention concerne de nouveaux mu- tants bactériens, un procédé de leur production et des vaccins vivants les contenant. De façon-générale, l'in- vention concerne des vaccins à large spectre à base de nouvelles souches bactériennes mutantes et un procédé de vaccination de mammifères et de volailles avec un tel vaccin vivant. Le vaccin de l'invention est particuliè- rement utile en élevage et il provoque une immunisation prolongée contre une grande diversité de bactéries Les nouveaux mutants ne sont pas susceptibles de réversion, ils sont pratiquement non pathogènes et on peut les uti- liser pour l'immunisation efficace de mammifères et de volailles. Les bactéries à gram négatif et en particulier les bactéries appartenant à la famille-des Enterobacte- riaceae (entérobactéries) causent des inconvénients de plus en plus graves en médecine et en élevage. Les bac- téries de ce type provoquent diverses infections des vo- lailles, de l'homme et d'autres mammifères e le traite- ment des maladies et infections qu'elles provoquent de- vient difficile du fait que beaucoup de ces bactéries sont devenues résistantes à de nombreux antibiotiques ac- tuellement utilisés. Cette résistance aux antibiotiques est probablement due au fait que ces bactéries portent des plasmides de résistance aux antibiotiques. Une solutionjossible des difficultés que créent ces bactéries, en particulier dans le domaine de l'éleva- ge, notamment celui des volailles et similaires, est 1' emploi de vaccinations efficaces. Ces vaccinations doivent avoir un effet prolongé et couvrir un spectre large d'a- gents infectieux. Comme les Enterobacteriaceae appartien- nent à une grande diversité de sérotypes, il est diffici- le de préparer un vaccin couvrant un nombre suffisant d'- agents infectieux. Des expériences de laboratoire ont montré que 2481 928 l'on peut obtenir des mutants bactériens dépourvus d'an- tigène 0, c'est-à-dire des bactéries que l'on peut défi- nir comme des bactéries de type "fortement rugueux; for- tement R", et que ces bactéries ont un spectre d'immuni- sation assez étendu lorsqu'on les utilise dans des vaccins tués par la chaleur. Ces mutants bactériens, c'est-à-dire ces bactéries de type "fortement rugueux", peuvent être utilisés comme vaccins tués par la chaleur pour l'immuni- sation contre une gamme assez étendue d'Enterobacteria, mais l'immunisation par des vaccins tués par la chaleur n'est pas très efficace; plusieurs immunisations par in- jection sont nécessaires. De plus cette immunisation n'a pas un effet prolongé. L'immunisation par injection n'est pas pratique en médecine humaine et elle est pratiquement prohibitive en élevage lorsqu'on doit vacciner un grand nombre de volailles ou similaires. L'invention évite les inconvénients des vaccins classiques et des vaccins tués par la chaleur à basede bactéries de type "fortement ru- gueux". L'invention concerne de nouveaux mutants bacté- riensque l'on peut utiliser pour la vaccination efficace des volailles et des mammifères. L'invention concerne é- galement un procédé pour préparer de telles souches mu- tantes et des vaccins à base des bactéries mutantes, vi- vantes, ainsi produites. L'invention concerne également de nouveaux vaccins à base de telles bactéries vivantes et un procédé de vaccination des animaux d'élevage au moyen de tels vaccins. La préparation de mutants de type "fortement rugueux" de bactéries prédéterminées permet de produire de nouvelles souches isolées totalement dépourvues d'an- tigène 0. On peut également obtenir de telles souches pré- sentant une mutation non susceptible de réversion, por- tant sur la biosynthèse de lipopolysaccharides. Les mu- tants sont des mutants par délétion, et on peut les cul- 2481 928 tiver de façon pratique. On n'observe pas de réversion au laboratoire ou après réisolement à partir d'animaux ayant reçu l'injection. Les souches sont pratiquement non viru- lentes et non pathogènes. Un grand nombre de ces bacté- ries ont été injectées à des animaux de laboratoire, sans provoquer aucun effet indésirable. Ces mutants sont des constituants actifs, efficaces, de vaccins vivants, appor- tant une protection à spectre large contre des agents pa- thogènes, l'éventail de la protection étant fonction de la nature des bactéries utilisées, Selon un de ses modes de réalisations l'inven- tion concerne des mutants par délétion d'Enterobacteria- ceae qui sont pratiquement dépourvus d'antigêne-O, c'est- d-dire que l'on peut définir comme appartenant au type "fortement rugueux"; ils sont adaptés pour produire une immunisation efficace et prolongée contre des gammes étendues de bactéries appartenant à cette famille d'Ente- robacteriaceae, Les nouveaux vaccins peuvent être utili- sés en médecine. Ils sont particulièrement utiles pour l'élevageo Un des avantages importants de ces vaccins vivants est que l'on peut les administrer sous forme dl aérosols. Des expériences ont montré que des poussins9 immunisés par exposition è un aérosol d'un tel vaccin, acquièrent une protection prolongée contre un spectre é- tendu d'agents pathogènes pour les oiseaux. Selon un mode de réalisation préféré, l'inven- tion concerne une nouvelle souche mutante d-Eschetichia coli K-12 qui est en- soi une -souche non pathogèneë et- que l'on peut utiliser pour effectuer des expériences de re- combinaison d'ADN du système EK1. Les nouveaux mutants sont pratiquement non virulentset-on peut les utiliser dans des vaccins vivants. On peut utiliser ces vaccins sous forme d'aérosols pour l'immunisation efficace de mammifères. La nouvelle souche est un mutant dépourvu d' antigène O, par suite d'une délétion non susceptible de ré- 2481 928 version. Comme ces antigènes O sont responsables des sé- rotypes spécifiques de l'espèce, un mutant n'effectuant pas la biosynthèse des antigènes O immunise contre les antigènes communs à toutes les entérobactéries, c'est-à- dire le KDO et le lipide A. Ce mutant est efficace pour produire une immunisation efficace contre une gamme éten- due d'Enterobacteriaceae. Le nouveau mutant de la souche K-12 est appelé LR-2. Il est caractérisé ci-après. La mutagénèse a été effectuée par emploi d'aci- de nitreux et par sélection de la souche mutante désirée. La souche n'est pas susceptible de réversion, le taux de réversion étant inférieur à 10-11. Après des injections répétées à l'animal, on n'a pas isolé de formes de ré- version. On peut provoquer la mutag4nèse par des rayonne- ments, des délétions induites par des phages tels que le phage p, etc. L'invention s'applique à une grande diversité de bactéries. Elle est illustrée ci-après à titre d'exem- ple par la production d'une nouvelle souche mutante spé- cifique dérivant d'Escherichia coli K-12. Préparation d'une souche mutante s On effectue une mutagénèse avec de l'adide ni- treux préparé Juste avant l'emploi par mélange de quanti- tés égales de nitrite de sodium (0,1 M) et de tampon acé- tate 0,1 M à pH 4,6 pour obtenir une concentration finale en nitrite de 0,05 M. On cultive une colonie unique d'Es- cherichia coli K-12p pendant une nuit avec agitation à 37 C dans du milieu nutritif LB contenant 10 g de Bacto Tryp- tone, 5 g d'extrait de levure et 10 g.de chlorure de so- dium par litre, on lave avec un volume égal de tampon acé- tate et on remet en suspension dans 0,3 ml d'acide nitreux (0,05 M). Après 10 minutes d'incubation à 37"C, on lave les cellules, on remet en suspension dans 10 ml de milieu LB et on incube pendant une nuit à 37 C ', On sélectionne le mutant de la façon.suivante: on dilue 2481 928 des cultures d'une nuit au 1/100 dans du milieu LB frais et on cultive à 370C avec agitation. Lorsque la culture a repris, on ajoute le bactériophage T4 avec une multipli- cité d'infection de 5 et on poursuit l'incubation jusqu'à la lyse. On place les bactéries survivantes sur des bottes de gélose LB et on sélectionne les colonies.en fonction de la sensibilité aux antibiotiques et de la résistance: aux phages. Le nouveau mutant appelé LR_2 présente les ca- ractéristiques suivantes. Substances nutritives nécessaires: Leucine, adénine, tryptophane, histidine, arginine, iso- leucine, valine, méthionine, thiamine. La souche ne fermente pas les sucres suivants:. Lactose, galactose, xylosemannitol, maltose. La souche résiste: Le phage T1 du colibacille, le phage T4 du colibacille, le phage T7 du colibacille, le phage P1 du colibacille. La sensibilité visà-vis d'autres phages n'a pas été étu- diée et il semble que la souche résiste aux autres phages des colibacilles. Très sensible vis:-visde: cristal violet, violet de-gentiane, bleu de méthylêne,- éosine et autres colorants; antibiotiques de poids molé- culaire élevé (hydrophobes) s novobiocine, rifampicine, érythromycine et similaires. Le micro-organisme a été déposé à la souchothè- que allemande de Gëttingen le 25.02.1981 sous le N DSM 2051. On a étudié le taux de réversion et on a Consta- té qu'il était inférieur à 10-11: aucune forme de réver- sion n'a été isolée sur des.boOtes et après des injections multiples à l'animal. Il semble vraisemblable que le mu- tant, présentant un blocage de la formation de l'antigène O, présente une délétion. On sait que la méthode de muta- génèse utilisée produit un rendement élevé de délétions. 2481 928 L'analyse chimique du lipopolysaccharide puri- fié de la souche LR-2 a montré que le mutant contenait le lipide A et le KDO: on n'a pas mis en évidence d'hydra- tes de carbone d'antigène 0. Production d'un vaccin: Pour produire le vaccin, on cultive une colonie unique de la souche LR-2 pendant une nuit sur du milieu LB et on dilue au 1/100 dans le même milieu pour obtenir des grands volumes. On recueille les cellules lorsque la concentration est d'environ 5 x 108 bactéries/ml, on lave trois fois avec centrifugation dans du chlorure de sodium à 1% et on remet en suspension dans la même solution. On peut alors lyophiliser la culture, pour obtenir un vaccin vivant très efficace. Immunisation X On injecte à des souris et à des poussins à la dose de 109 bactéries vivantes par animal. On n'observe pas de réaction indésirable et le taux de survie est de %. On injecte à des souris avec un vaccin à la dose de 107 bactéries par souris (injections intrapéritonéales) ce qui assure une protection durant plus de deux semaines contre des doses létales de K. Dneumoniae injectées par voie intrapéritonéale. On obtient un titre d'hémaglutina- tion de 1/640 aprèx six injections intrapéritonéales. Les anticorps, formés après six injections, pré- sentent une réaction croisée avec le lipopolysaccharide (LPS) de E. coli 075. K. pneumoniae et Enterobacter aero- qenes. Six injections (intrapéritonéales) de 107 bacté- ries chacune assurent une immunité efficace contre l'in- jection intraveineuse de doses létales de E. coli 075 (voir le tableau 3, page 9). - Testde virulence s Des poussins de 1, 7, 14 et 28 jours sont expo- sés à l'action de fortes doses de vaccin; on introduit 2481 928 O108 bactéries directement dans le sac aérien des poussins, ou on les injecte par voie intrapéritonéale et on n'ob- serve pas d'effet indésirableo On injecte à divers animaux de laboratoire (sou- ris, rats) un grand nombre de bactéries9 soit plus de 109 par animal, et on n'observe pas d'effet indésirableo Le vaccin vivant est s r et non pathogène et on peut l'utiliser pour la vaccination des mammifères et des volailles sans aucun effet secondaire indésirableO Immunisation de poussins, On immunise des poussins par exposition à l'ac- tion d'un aérosôl deun vaccin contenant 3 m 10 bactéries par millilitre. On disperse sous forme d'un aérosol 10 ml de vaccin dans un volute de 20 litres contenant 36 poussins que lon expose à l'action de cet aérosol pendant 10 minu- tes. Dans un autre essai, on administre le vaccin dans leau de boisson. Dans cet essai, la concentration est de 3 x 108 bactéries/ml. Dans un troisième essaie on injecte dans le sac aérien 2 x 108 bactéries par poussin0 Les résultats sont regroupés dans le tableau 1. On expose les poussins immunisés à l!action de E.coli 02 et de E. coli 078 qui sont des germes pathogènes pour les oiseaux. TABLAU 1I Protection des oussins parvaccination avec le LR-2 contre une in ection d' reuve dans le sac a rien de E _ coli 2 On injecte 104 bactéries dans le sac aérien. Chaque groupe est constitué de 20 poussins 2481 928 Age lors de l'immunisa- tion (Jours) I. 1+7 1+7 1+7 II. 1+7 1+7 TABLEAU 1 Méthode d't immunisation pulvérisation,pulv risation pulvérisation, eau de boisson, témoin pulvérisation, pull risation témoin (suite) Age lors de 1 épreuve (jours) a- vé- Augmenta- tion du poids ,5 57,6 ,4 - -3 TABLEAU 2 Protection deeoussins par vaccination avec le LR-2 contre une injection d'épreuve de E. coli 78 L'immunisation consiste en l'exposition à un aérosol, 10 ml de vaccin à 3 X 108 bactéries/ml dans un volume de 20 litres pendant 10 minutes. On utilise des groupes de 20 poussins. Age lors de l'immunisa- tion (jours) I. 1+14 1+21 témoin II. 1+21 1+14+40 témoin Age lors de l'épreuve (jours) Augmentation du poids après 1' épreuve - 597 ,7 9,2 11,3 0,02 -6 6,9 6,1 -5 On injecte 105 bactéries d'épreuve dans le sac aérien. On immunise des souris par six vaccinations par injection intrapéritonéale de 2 x 107 bactéries vi- vantes pendant deux semaines et on administre un rappel intrapéritonéal à la troisième et à la quatrième semaine. 2481 928 On effectue une administration d'épreuve à la fin de la sixième semaine. TABLEAU 3 Survivants aDrès une administration d'péDreuve r2 x 107 bactéries par voie intraveineuse de E coli 075 Immunisation avec E. coli. 075 (tué par la chaleur) 17/18 94% LR-2 22/31 70% P. aeruqinosa (tué par la chaleur) 12/38 31% NaCl (1%), témoin 12/36 33% On peut appliquer le procédé de mutagénèse pré- cédemment décrit à diverses bactéries semblables, par exemple à d'autres Enterobacteriaceae et Pseudomonas, et l'on peut utiliser les mutants obtenus, dépourvus dt antigène O, comme vaccins vivants, pour assurer une immu- nisation à spectre large de mammifères. L'immmunisation par application d'un aérosol du vaccin constitue une voie très pratique et très efficace d'immunisation par ce type de vaccin. vaccin polvvalent Immunisation de souris protégées par le LR-2 contre une administration d'épreuve d'une gamme étendue d 'Enterobacteriaceae. Jour de 1' Organisme Jour de 1' survivants immunisation d'éoreuve éreuve_ ___ 1 K. pneumonie 7 100 1 " 14 0 1,7 " 21 90 1,7 28 20 1,7,14,21 " 42 30 témoin - O 0 1 P. Vulgaris 7 100 1 " 14 0 1,7 21 100 témoin 0 2481 928 On effectue l'immunisation et l'injection d' épreuve par voie intrapéritonéale sur des-souris C3HeB. Immunisation t 2 x 107 bactéries par souris; épreuve: 2 DL50. 248 1 928 REVENDICATIONS 1o Vaccin vivant pour la vaccination des volailles et des mammifères contre divers agents pathogènes à gram négatif, ap- partenant à la famille des Enterobacteriaceae, caractérisé en ce qu'il consiste en un mutant par délétion, bactérien, dérivant d'une souche non pathogène de E colio 2. Vaccin vivant selon la revendication 1, caractérisé en ce que le mutant bactérien est un mutant "fortement rugueux" dérivant de E. coli K-12, 3o Vaccin vivant selon la revendication 1, t caractérisé en ce que le mutant est Eo coli LR-2o 4o Vaccin vivant, selon la revendication 1, caractérisé en ce que les bactéries appartiennent à la souche mutante Eo colio LR-20 Souche mutante E. coli LR-2. 60 Vaccin suivant une des revendications 1 à 4, caractérisé en ce qu'il est sdus la forme d'un aérosolo 7o Vaccin suivant une des revendications 1 à 4, caractérisé en ce qu'il est utilise dans l'eau de boisson, de préférence a une concentration de l'ordre de 108 bactéries par ml. 8. Procédé pour obtenir une souche mutante bactérienne, uti- le dans un vaccin vivant, selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'il consiste à exposer une souche non pauthogène de Eo coli à l'action d'un agent mutagène et à sélectionner les sou- ches dépourvues d'antigènes 0, puis à les cultiver, pour obtenir les bactéries utiles dans un tel vaccin vivant. Procédé selon la revendication 4, caractérisé en ce que l'agent utilisé est l'acide nitreuxo