FR 2483948 A1 19811211 FR 8111072 A 19810604 1 2483948 Production de L-proline par fermentation. L'invention concerne un procédé de production de L-pro- line, par utilisation d'un microorganisme. Plus particulière- ment, elle concerne un procédé de production de L-proline, par a un genre culture d'un microorganisme, appartenant/du groupe de Coryne- bacterium, Anthrobacter, Brevibacterium, Microbacterium et Saccharomyces, capable d'accumuler la L-proline dans la liqueur d'un milieu de culture, puis de récupération de la L-proline dans ladite liqueur. On connaît déjà divers procédés de production de la L- proline par fermentation. On connait par exemple la production de Lproline par culture d'une souche naturelle, ou d'une souche nécessitant une substance nutritive, ou d'une souche résistant à un certain agent chimique, appartenant au groupe des bactéries du genre Brevibacterium, Microbacterium, Micrococcu.s, Paracolo- bacterium, Bacillus, Escherichia, Kurthia, Microbacterium et Corynebacterium, ou d'un ferment du genre Saccharomyces (voir brevets japonais numéros: 11751/68, 13679/68, 1193/69, 1198/69, 6631/69, 26911/69, 38876/73, 28431/74, 33190/76, 40158/76, 41386/79 et 105293/79. D'autre part, le procédé caractérisé par l'ajustement de la concentration des sels minéraux contenus dans le milieu, à un intervalle de valeurs spécifique, se trouve décrit dans les brevets japonais Nos. 38557/71 et 42597/71. Par ailleurs, on sait que la biosynthèse de la L-proline s'effectue par la voie de l'acide Lglutamique et que l'on peut augmenter la sécrétion de la L-proline d'un microorganisme de Escherichia coli par addition d'acide L-glutamique au milieu. Toutefois la valeur pratique d'un tel procédé est très faible car la quanti- té de la L-proline sécrétée est très basse (par exemple d'envi- ron 0,03 grammes/litre) [voir Biochimica et Biophysica Acta, vol. 104, 397 (1965)]. Il est également connu que l'on peut améliorer le rende- ment de la production de L-proline par fermentation de Kurthia catenaforma, par addition d'un agent tensio-actif et d'acide L- glutamique au milieu de culture [voir Applied Microbiology, vol. 23, 758-764 (1972)]. Cependant, il est nouveau, selon l'in- vention, d'accumuler une quantité accrue de L-proline dans la liqueur de culture, lorsqu'on effectue la fermentation en 2 2483948 utilisant un groupe de certaines bactéries (les bactéries di- tes productrices d'acide glutamique telles que celles apparte- nant aux genres de Corynebacterium, Brevibacterium, Arthrobacter, et Microbacterium), dans un milieu auquel on ajoute l'acide L- glutamique [voir "J. of the Japanese Agricultural Chem. Soc.", vol. 42, 703-710 (1968); "Amino Acids and Nucleic Acids", No. 16, 126-133 (1967)]. L'invention est basée sur la découverte qu'il est possi- ble d'améliorer le rendement de la production de L-proline sans IO addition d'aucun agent tensio-actif au milieu, si on emploie un microorganisme appartenant au groupe des bactéries des genres de Corynebacterium, Brevibacterium, Arthrobacter et Micro- bacterium et un ferment du genre Saccharomyces, dans un milieu de culture contenant au moins un membre du groupe de l'acide L- glutamique et de l'acide L-, D- ou DL-pyrrolidone carboxylique. L'invention a donc pour objet un procédé de production de L-proline par fermentation. La L-proline est largement utili- sée, par exemple dans la préparation des médicaments, des aliments, etc. Selon le procédé de l'invention de production de L- proline par fermentation, comprenant la culture d'un microorga- nisme appartenant au groupe des bactéries et des ferments, capa- bles de produire la L-proline, dans un milieu de culture, pour accumuler la L-proline dans la liqueur de culture et récupérer la L-proline dans ladite liqueur, on utilise de façon caracté- ristique un milieu de culture qui contient en outre au moins un membre du groupe de l'acide L-glutamique et de l'acide D-, L- ou DL-pyrrolidone carboxylique, en combinaison avec une source de carbone, une source d'azote et des composés minéraux. Les microorganismes convenant à l'invention comprennent les microorganismes producteurs de L-proline, appartenant aux genres de Corynebacterium, Arthrobacter, Brevibacterium, Micro- bacterium et Saccharomyces, et des exemples des souches préfé- rées sont donnés par: Corynebacterium glutamicum ATCC 21157 C. glutamicum ATCC 21158 C. glutamicum ATCC 21159 C. glutamicum ATCC 21355 3 2483948 C. acetophilum FERM-P 4045 C. acetoacidophilum FERM-P 4962 Arthrobacter citreus FERM-P 4963 Brevibacterium lactofermentum FERM-P 4964 Microbacterium ammoniaphilum FERM-P 4965 Saccharomyces cerevisiae ATCC 20169 On peut utiliser, selon l'invention, un milieu synthé- tique ou organique, lorsque ledit milieu contient une quantité convenable d'une source de carbone assimilable, d'une source d'azote assimilable, de substances minérales et des autres élé- ments nutritifs nécessaires pour la croissance du microorganisme utilisé. Des exemples de sources de carbone préférées selon l'invention sont donnés par des carbohydrates tels que les glucose, fructose, sucrose, sorbitol, glycérol, maltose, manni- tol, l'amidon hydrolysé, les mélasses, etc.; des acides organi- ques tels que les acides acétique, pyruvique, lactique, fumari- que, citrique, etc.; et des alcools tels que le méthanol, l'éthanol, etc. Parmi les sources d'azote convenant à l'inven- tion, on peut citer l'ammoniac; divers sels minéraux et organi- ques d'ammonium, comme le sulfate, le chlorure, le phosphate, l'acétate d'ammonium, etc.; divers composés azotés tels que l'urée, etc.; la peptone, l'extrait de viande, l'extrait de levure, la liqueur de macération de grain, la caséine hydroly- sée, la farine de soja hydrolysée, des corps microbiens fermen- tés et leurs produits d'hydrolyse. Des exemples de substances minérales préférées selon l'invention comprennent le phosphate monopotassique, le phosphate bipotassique, le sulfate de magné- sium, le chlorure de sodium, le sulfate ferreux, le sulfate de manganèse, le carbonate de calcium, etc. On peut en outre utili- ser, si on le désire, des éléments nutritifs en quantités de traces, tels que la biotine, la thiamine, l'acide pantothénique, etc. Dans le cas d'un microorganisme nécessitant une substance nutritive, il est nécessaire d'ajouter au milieu une quantité convenable d'une telle substance, requise pour la croissance du microorganisme. Cependant, une telle addition peut ne pas être nécessaire si la substance nutritive requise se trouve contenue de façon intrinsèque dans la substance naturelle utilisée comme source d'azote. 4 2483948 Parmi les sources d'acide L-glutamique et d'acide L-, D- ou DLpyrrolidone carboxylique convenant à l'invention, comme additions au milieu de culture, on peut citer l'acide L- glutamique isolé et le glutamate de sodium et l'acide L-, D- ou LD-pyrrolidone carboxylique; la liqueur de fermentation de l'acide Lglutamique, comme les bouillons de fermentation de l'acide glutamique, le filtrat obtenu par élimination des cellu- les microbiennes des bouillons de fermentation, la liqueur-mère obtenue par séparation de l'acide glutamique de la liqueur de fermentation de l'acide glutamique, la liqueur-mère obtenue par séparation du glutamate de sodium, les mélasses de betteraves et leurs solutions résiduaires contenant une grande quantité d'acide glutamique ou d'acide pyrrolidone carboxylique, ainsi que d'autres substances contenant de l'acide glutamique ou de l'acide pyrrolidone carboxylique. La quantité d'acide glutamique ou d'acide pyrrolidone carboxylique contenue dans le milieu varie en fonction des types de microorganismes utilisés et du moment de l'addition de l'acide, ainsi que de la nature différente dela composition du milieu, cette quantité étant généralement supérieure à 3 gram- mes/litre du milieu. La limite supérieure peut ne pas être cri- tique mais, cependant, aux concentrations supérieures à 150 grammes/litre, on constate des effets négatifs du sel utilisé pour ajuster le pH, ainsi que de la viscosité. On peut ajouter l'acide au milieu en une seule fois ou de façon intermittente, après l'inoculation jusqu'à ce que la croissance des microorga- nismes soit stationnaire. Les conditions de la fermentation de la proline varient en fonction du microorganisme utilisé, la température étant de préférence comprise dans un intervalle de 25 à 400C. Pendant la fermentation, le pH du milieu est ajusté de préférence à 6-9, en utilisant par exemple une substance minérale ou organique de pH acide ou alcalin, de l'urée, du car- bonate de calcium, etc. Dans ces conditions, on effectue une fermentation aérobie, de façon à accumuler la plus grande quan- tité possible de L-proline, de préférence pendant environ 24 à heures. On récupère la L-proline dans les bouillons de fermentation selon les méthodes usuelles, par exemple par l'em- ploi d'une résine échangeuse d'ions, par cristallisation dans 2483948 le méthanol ou autres substances semblables, ou par la combinai- son de ces méthodes. L'invention sera mieux comprise à la lecture de la des- cription détaillée qui va suivre et à l'examen des dessins annexés qui représentent, à titre d'exemples non limitatifs, plusieurs modes de réalisation de l'invention. Dans ces exemples, on mesure la quantité de proline selon la méthode décrite dans J. Biol. Chem., 199, 91-95 (1952). EXEMPLE 1 On place un milieu d'ensemencement (30 ml), ayant la composition indiquée ci-dessous, dans un flacon d'Erlenmeyer de 250 ml, on le stérilise et on l'inocule avec Corynebacterium acetophilum FERM-P 4045. On effectue la fermentation à 28 C pen- dant 24 heures, tout en secouant (220 tours/minute): Extrait de viande: 10 g/l; peptone: 10 g/l; extrait de levure: 3 g/1; chlorure de sodium: 3 g/1 (pH: 7,2). Le milieu principal a la composition suivante: Mélasses résiduaires: 170 g/1 (sous forme glucose); farine de soja hydrolysée: 20 g/1; KH2PO4... 0, 6 g/1; MgSO4.7H20... 0,6 g/1; (NH4)2S04... 23,4 g/1; FeSO4.7H20... 0,012 g/1; chlorhydrate de thiamine: 100 pg/l; CaCO3: 30 g/1 (pH: 7,4). On ajoute au milieu principal une quantité prédéterminée de L-glutamate de sodium ou d'acide DL-pyrrolidone carboxylique, comme indiqué au tableau 1, et on transfère chaque milieu (300 ml) dans un flacon d'Erlenmeyer de 2 litres, muni d'un défecteur. Après stérilisation, on inocule chaque milieu principal avec une portion de 30 ml de la culture d'ensemencement, puis on effectue la culture à 28 C pendant 4 jours tout en secouant (220 tours/minute). Le tableau 1 indique la quantité accumulée de L-proline dans chaque cas. 6 -2483948. TABLEAU 1 Quantité accumulée de L-proline (g/1 de milieu), par addition de (A) glutamate de sodium ou de (B) acide DL-pyrrolidone carboxylique. EXEMPLE 2 On traite respectivement, Arthrobacter citreus FERM P 4963, Microbacterium ammoniaphilum FERM P 4965, Brevibacterium lactofermentum FERM P 4964 et Saccharomyces cerevisiae ATCC 20169, selon la méthode de l'exemple 1, si ce n'est pour la com- position du milieu principal, qui est la suivante: Glucose... 100 g/l; KH2PO4... 0,5 g/l; K2HPO4.. 0,5 g/l; (NH4)2S04... 30 g/l; hydrolysat de farine de soja... 20 g/l; biotine... 100 pg/l; MgS04.7H20... 0,25 g/l; FeSO4.4H20... 12 mg/1; MnSO 4.H20... 12 mg/1; ZnSO4.7H20... 10 mg/1; - chlorhydrate de thiamine... 100 pg/l; CaC03... 30 g/l (pH: 7,2). Avant l'emploi, on ajoute au milieu principal du L- glutamate de sodium (20 g/l) ou de l'acide L-pyrrolidone carbo- xylique (20 g/l), pour accumuler la L-proline, comme indiqué au tableau 2. Quantité ajoutée A B (g/l) (g/l) (g/l) 0 25,1 24,8 1 25,3 25,1 3 26,9 27,7 31,4 30,1 35,6 34,8 39,1 35,4 40,5 36,6 40,7 36,8 7 -2483948 TABLEAU 2 Quantité accumulée de L-proline, par addition de (A) glutamate de sodium ou de (B) acide L-pyrrolidone carboxylique (g/l). EXEMPLE 3 On répète le traitement décrit à l'exemple 1, en utili- sant Corynebacterium glutamicum ATCC 21355 et un milieu de com- position suivante: Glucose... 120 g/l; urée... 3 g/l; sulfate d'ammonium.. . 30 g/l; chlorure d'ammonium g/l; KH2PO4... 1,5 g/l; K2HPO4... 0,5 g/l; MgSO4.7H20... 0,5 g/1; FeSC4.7H20... 0,02 g/l; MnSO4.4H20... 0,02 g/l; biotine... 50 pg/l; chlorhydrate de thiamine... 1 mg/i ; peptone... g/l (pH: 7,2). On ajoute au milieu, 24 heures après le début de la fermentation, du paraldéhyde (40 g/l). On effectue la fermenta- tion à 28 C pendant 4 jours, tout en secouant (220 tours/minute) pour accumuler 27,0 g/l de L-proline. On effectue un traitement semblable, avec addition de 20 g/l de glutamate de sodium, pour obtenir 38,9 g/1 de L-proline accumulée. EXEMPLE 4 On place un milieu d'ensemencement (200 ml), dont la composition est donnée ci-après, dans un flacon d'Erlenmneyer de 2 litres, muni d'un déflecteur et stérilisé. On inocule ensuite le milieu avec Corynebacterium acetophilum FERM P 4045 ou C. acetoacidophilum FERM P 4962 et on effectue la culture à 28 C (1) Arthrobacter citreus FERM P 4963 (2) Brevibacterium lactofermentum FERM P 4964 (3) Microbacterium ammoniaphilum FERM P 4965 (4) Saccharomyces cerevisiae ATCC 20169 Additif (g/l) (1) (2) (3) (4) Néant - 4,3 6,8 3,2 2,1 A 20 13,1 17,4 16,1 11,3 B 20 12,9 16,2 15,3 10,5 8 2483948 pendant 24 heures, tout en secouant (220 tours/minute): Sucrose... 60 g/l; KH2PO4... 2 g/l; MgS04.7H20... 0,5 g/l; FeSO4.7H20... 0,01 g/1; MgSO4. 4H20... 0,01 g/1; liqueur de macération de grain... 5 g/l; chlorhydrate de thiamine... pg/l; biotine... 100 pg/l; hydrolysalde farine de soja... 20 g/i; urée... 3 g/1 (pH: 7,4). A un milieu principal dont la composition est donnée ci- dessous, on ajoute la liqueur-mère obtenue par cristallisation et séparation de glutamate de sodium en une quantité de 20 g/l, calculée en acide glutamique. On place chaque portion de 700 ml du mélange dans une cuve de fermentation de 2 litres, et on stérilise. Ensuite on inocule 200 ml du milieu d'ensemencement à chaque portion du mélange de milieu principal et on effectue la culture à 30 C dans des conditions aérobies. Au cours de la fermentation, on ajuste le pH à 7,0 par addition automatique d'acide acétique: Sucrose... 20 g/1; acétate d'ammonium... 7 g/1; MgSO4.7H20... 0,6 g/1; KH2PO4 *."' 4 g/l; (NH4)2S04... 40 g/1; hydrolysat de farine de soja... 20 g/1; FeSO4.7H20... 0,012 g/l; - MnSO4.4H20... 0,012 g/1; ZnSO4.7H20... 0,01 g/1; biotine... 100 pg/1; chlorhydrate de thiamine... pg/l (pH: 7,4). 72 heures après le début de la fermentation, la quanti- té consommée d'acide acétique est de 15 %, par rapport au volu- me initial du milieu, et la proline accumulée s'élève à 38,8 g/1 par FERM-P 4045 ou à 30,1 g/l par FERM-P 4962. A titre com- paratif, on effectue un traitement semblable, sans addition de la solution de l'acide glutamique, et la valeur correspondante de proline est de 25,4 g/1 pour FERM-P 4045 et de 21,3 g/1 pour FERM-P 4962. Bien entendu, l'invention n'est nullement limitée aux modes de réalisation des exemples décrits, elle est susceptible de nombreuses variantes accessibles à l'homme de l'art, suivant les applications envisagées et sans s'écarter pour cela du cadre de l'invention. 9 2483948 REVENDICATIONS 1. Procédé de production de L-proline par fermentation, caractérisé en ce que l'on cultive un microorganisme apparte- nant au groupe des bactéries et des levures capables de produi- re la L-proline, dans un milieu de culture contenant au moins un membreOdu groupe de l'acide L-glutamique et de l'acide L-, D- ou LD-pyrrolidone carboxylique, en vue d'accumuler la L- proline. dans la liqueur de culture et de l'y récupérer. 2. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que le microorganisme est du genre du Corynebacterium. 3. Procédé selon la revendication 2, caractérisé en ce que le microorganisme appartient au groupe des Corynebacterium glutamicum. 4. Procédé selon la revendication 3, caractérisé en ce que le microorganisme appartient au groupe de Corynebacterium glutamicum ATCC 21157, Corynebacterium glutamicum ATCC 21158, Corynebacterium glutamicum ATCC 21159 et Corynebacterium glutamicum ATCC 21355. 5. Procédé selon la revendication 2, caractérisé en ce que le microorganisme appartient au groupe de Corynebacterium acetophilum et Corynebacterium acetoacidophilum. 6. Procédé selon la revendication 5, caractérisé en ce que le microorganisme appartient au groupe de Corynebacterium acetophilum FERM-P 4045 et Corynebacterium acetoacidophilum FERM-P 4962. 7. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que le microorganisme appartient au groupe de Arthrobacter, Brevibacterium et Microbacterium. 8. Procédé selon la revendication 7, caractérisé en ce que le microorganisme appartient au groupe de Arthrobacter citreus, Brevibacterium lactofermentum et Microbacterium ammoniaphilum. 9. Procédé selon la revendication 8, caractérisé en ce que le microorganisme appartient au groupe de Arthrobacter citreus FERM-P 4963, Brevibacterium lactofermentum FERM-P 4964 et Microbacterium ammoniaphilum FERM-P 4965. 10. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que le microorganisme appartient au groupe des levures de Saccharomyces. 2483948 11. Procédé selon la revendication 10, caractérisé en ce que la levure est Saccharomyces cervisiae ATCC 20169. 12. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'on effectue la fermentation à une température de 25 à 40 C et à un pH de 6 à 9. 13. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que la quantité d'au moins un membre du groupe de l'acide gluta- mique et de l'acide D-, L- ou DL-pyrrolidone carboxylique est de 3 à 150 g/l du milieu.