FR 2484451 A1 19811218 FR 8026218 A 19801210 Cette invention concerne des noyaux peptidiques cycli- ques de formule générale: I et leurs sels d'addition d'acides. Les noyaux et leurs sels sont utilisables comme intermédiaires dans la préparation d'agents antifongiques semi-synthétiques. On prépare les noyaux en désacylant un antibiotique peptidique cyclique de formule générale: II i dans laquelle R est une chaîne latérale d'acide gras saturé ou insaturé et R, R R et R sont des substituants défi- nis ci-dessous. On a découvert un procédé d'enlèvement enzymatique de la chaîne latérale d'acide gras R, pour obtenir le noyau peptidique cyclique. Le procédé consiste à mettre l'anti- biotique dans un milieu aqueux en contact avec une enzyme produite par un microorganisme de la famille Actinoplanaceae jusqu'à désacylation substantielle. Un procédé préféré selon cette invention consiste à utiliser une enzyme produite par le microorganisme Actinoplanes utahensis NRRL 12052 pour couper la chaine latérale d'acides gras. La désacylation est généralement effectuée en ajoutant l'antibiotique approprié à une culture de A. utahensis et en faisant incuber la culture jusqu'a ce qu'on obtienne la désacylation. Les noyaux ainsi obtenus sont séparés du bouillon de fermentation par des procédés connus dans le domaine. Ces noyaux sont utiles en ce qu'on peut les réacyler pour obtenir de nouvelles substances anti- biotiques. En particulier, l'invention fournit un noyau peptidique cyclique de formule p.H À.H CH3 Ha.0 23 R - e X X S- H' HO H /= RHOC H -H -NX /CHs R -CH - // lqe0. H e. H oH qad"tH OHetH H e HH_ R ÀH I dans laquelle R1 est H ou OH et; quand R1 est H, R2 est H et R3 et R4 sont tous deux H I ou tous deux OH, et quand R est OH, R est H, R3 est OH ou un groupement 4 2 alkyloxy en C1-C6 et R est OH, ou bien R est un O g' 3 4 groupement -C-NH2 et R et R sont tous deux OH, et ses sels d'addition d'acides. Dans un mode de réalisation des noyaux de cette inven- i 3 4 2 tion, R, R et R sont OH et R est H. Le noyau de ce mode de réalisation est connu comme noyau de A-30912A. On prépare le noyau de A-30912A en désacylant un antibiotique peptidi- que cyclique de formule II ou R est un groupement linoléoyle, i 2 3 4 stéaroyle ou palmitoyle et R, R, R _et R sont tels que dans le noyau de A-30912A. Quand R dans l'antibiotique peptidique cyclique de formule II est un groupement linoléoyle, l'antibiotique est connu comme facteur A de A30912, quand R est un groupement stéaroyle, l'antibiotique est connu comme facteur A de A-30912-tétrahydrogéné et quand R est un groupement palmitoyle, l'antibiotique est connu comme aculéacine A. Facteur A de A30912 Le facteur A de A-30912 est un facteur du mélange A-30912 qui contient également les facteurs B, C, D, E, F et G. Le mélange A-30912 et les différents facteurs A à G sont décrits dans le brevet des E.U.A. N 4. 024.245. Le facteur A de A-30912 est identique à l'antibiotique A-22082 qui est décrit dans le brevet des E.U.A. N 4.024.246. Depuis la délivrance des brevets des E.U.S. N 4.024 245 et 4.024.246, on a trouvé que le facteur A de A-30912 est identique à l'échinocandine B antibiotique [Voir F. Benz et al., Helv. Chim. Acta 57, 2459-2477 (1974) et le brevet suisse N 568.386]. L'antibiotique SL 7810/F a également été identifié comme étant l'échinocandine B [C. Keller- Juslen, et al., Tetrahedron Letters 1976 (46), 4147-4150, et le brevet belge N 834.289]. Keller-Juslen, et al. ont proposé la structure de formule II o R est un groupement linoléoyle, R, R et R4 sont 011O et R est Il pour le facteur A de l'antibiotique A-30912. 4. Facteur A de A-30912 tétrahydrogéné Le facteur A de A-30912 tétrahydrogéné (SL 7810/F tétrahydrogéné, tétrahydroéchinocandine B), qui est décrit dans le brevet belge No 834.289 et par F. Benz et al., Helv. Chim. Acta 57, 2459-2477 (1974), a la formule II dans laquelle R est un groupement stéaroyle, R, R3 et R sont OH et R est H. Pour des raisons de commodité, cette subs- tance sera appelée ici tétrahydro-A-30912A. Aculéacine A L'aculéacine A est un composant du mélange aculéacine qui comprend un composant principal (aculéacine A) et six composants mineurs (aculéacines B, C, D, E, F et G). Les composants de l'aculéacine sont décrits dans le brevet des E.U.A. N 3.978.210. Ainsi qu'il est décrit dans le brevet belge N 859.067, l'aculéacine A a vraisemblablement la même structure peptidique cyclique que tétrahydro-A-30912A mais la chaîne latérale stéaroyle est remplacée par une chaîne palmitoyle. Noyau de A30912A Le nouveau noyau peptidique cyclique de ce mode de réalisation, c'est-à-dire le noyau du facteur A de A-30912 (échinocandine B, SL 7810/F), du facteur A de A-30912 tétra- hydrogéné, et de l'aculéacine A, a la formule I dans laquelle R1, R3 et R sont OH et R est H. Ce noyau (noyau de A-30912A) est un matériau amorphe blanc qui est soluble dans les solvants comme l'eau, le diméthylformamide, le diméthylsulfoxyde et le méthanol et qui est insoluble dans des solvants comme le chloroforme, le toluène et l'éther diéthylique. Le noyau de A-30912A a une formule brute de C34H51N7015 et un poids moléculaire de 797,83. Le spectre d'absorption infrarouge du noyau de A-30912A en pastilles de KBr est indiqué sur la Figure I. On observe les maximas d'absorption suivants: 3340 large (OH, liaison hydrogène), 2970, 2930 et 2890 (étirement de CH, aliphatiques dans les groupements CH3, CH2, CH), 1660 et 1625 (plusieurs groupements carbonyle C=O), 1510-1550, 1430-1450 (déformation "wagging" de CH), 1310-1340, 1230-1260, 1080, 835, 650 large et 550 large, cm -1 et 550 large, cm Le titrage électrométrique du noyau de A-30912A dans le diméthylformamide aqueux à 66 % indique la présence d'un groupement titrable avec un pKa d'environ 7 7,32). On peut séparer le noyau de A-30912A par chromatogra- phie liquide sous pression élevée (CLPE). Le noyau de A-30912A a un temps de rétention approximatif (k') de 11,52 minutes quand on le mesure par CLPE en utilisant les condi- tions suivantes: Colonne: 4 x 400 mm Garniture:gel de silice/C18 Solvant: mélange 1:2:97 d'acétate d'ammonium, d'acétonitrile et d'eau Débit: 3 ml/mn Pression: 172,5 bars Détecteur: UV à longueur d'onde variable à 230 nm Sensibilité: 0-0,4 A.U.F.S, Préparation du noyau de A-30912A Préparation du substrat Le noyau de A-30912A selon cette invention peut être préparé à partir du facteur A de A-30912, du facteur A de A-30912 tétrahydrogéné ou de l'aculéacine A. Ces substrats peuvent être utilisés sous forme de matériaux purifiés mais il n'est pas essentiel qu'il soit purifé. Ainsi, par-exemple, le mélange A-30912 dont le facteur A de A30912 est le composant principal, peut être utilisé comme substrat de préparation du noyau de A-30912A. Facteur A de A-30912 Le facteur A de A-30912 peut être obtenu par fermenta- tion aérobie de: 1) une souche de 2) une souche de 3) une souche de A-32204, NRRL 4) une souche de ) une souche de NRRL 11440. Quand on utilise Aspergillus Aspergillus Aspergillus 3860; Aspergillus Aspergillus rugulosus NRRL 8113; nidulans NRRL 8112; nidulans var. echinulatus rugulosus NRRL 8039; ou nidulans var. roseus, une souche de A. nidulans var. roseus NRRL 11440 pour produire le facteur A de A-30912, on obtient un mélange de facteurs que l'on appelle, pour des raisons de commodité, mélange antibiotique A-42355. Le facteur A-30912 est le facteur principal du mélange antibiotique A-42355. Les facteurs B, D et H de A-30912 sont des facteurs mineurs du mélange A42355. Tétrahydro-A-30912A On prépare tétrahydro-A-30912A à partir du facteur A de A-30912 par des techniques d'hydrogénation classiques, en effectuant la réduction jusqu'à ce que l'on ait réduit les deux doubles liaisons de la chaîne latérale linoléoyle. Aculéacine A On prépare l'aculéacine A par fermentation d'une souche de Aspergillus aculeatus NRRL 8075 comme décrit dans le brevet des E.U.A N 3.978.210 qui est incorporé ici par voie de référence. Selon un autre mode de réalisation du noyau de cette invention, R et R sont tous deux H et R3 et R sont tous deux OH. Le noyau de ce mode de réalisation est connu comme noyau de A-30912B. On prépare le noyau de A30912B en désacylant un antibiotique peptidique cyclique de formule II dans laquelle R est un groupement linoléoyle ou stéaroyle et R, R, R et R sont comme dans le noyau de A-30912B. Quand R dans l'antibiotique peptidique cyclique de formule II est un groupement linoléoyle, l'antibiotique est connu comme facteur B de A30912 et quand R est un groupement stéaroyle, l'antibiotique est connu sous le nom de facteur B de A-30912 tétrahydrogéné. Facteur B de A-30912 Le facteur B de A-30912 est un facteur du mélange A30912 qui contient également les facteurs A, C, D, E, F et G. Le mélange A-30912 est décrit dans le brevet des. E.U.A. N 4.024.245. On a trouvé que le facteur B de A-30912 est identique à l'échinocandine C antibiotique [Voir R. Traber et al., Helv. Chim. Acta 62, 1252-1267 (1979) ] et à l'antibiotique SL 7810/F-l (Brevet belge N 834.289). Traber et al. ont proposé la structure de formule II dans laquelle R et R sont tous deux H, R3 et R sont tous deux OH et R est un groupement linoléoyle pour l'échino- candine C antibiotique. Pour la tétrahydro-échinocandine C antibiotique, Traber et al. proposent la formule II dans laquelle R et R sont tous deux H, R et R4 sont tous deux OH et R est un groupement stéaroyle. Facteur B de A-30912 tétrahydrogéné Le facteur B de A-30912 tétrahydrogéné (tétrahydro-SL 7810/F-II; tétrahydroéchinocandine C),-qui est décrit dans le brevet belge N 834.289 et par R. Traber et al., Helv. Chim. Acta 62, 1252-1267 (1979), a la formule II dans laquelle R et R sont tous deux H, R et R4 sont tous deux OH et R est un groupement stéaroyle. Pour des raisons de commodité, ce matériau sera appelé tétrahydro-A-30912B. Noyau de A-30912B Le nouveau noyau peptidique cyclique de ce mode de réalisation, c'est-à-dire le noyau du facteur B de A-30912 (échinocandine C, SL 7810/F-II) et de tétrahydro-A-30912B, a la structure représentée par la formule I, dans laquelle R1 et R sont tous deux H et R et R sont tous deux OH. Le noyau de A-30912B a une formule brute de C34H51N7014 et un poids moléculaire de 781,83. Préparation du noyau de A-30912B Préparation du substrat On peut préparer le noyau de A-30912B à partir du facteur B de A-30912 ou de tétrahydro-A30912B. Comme ce facteur B n'est pas le composant principal des mélanges antibiotiques dans lesquels il est produit, il doit être purifié pour enlever les autres facteurs coproduits avant de l'utiliser comme substrat. Facteur B de A-30912 Ce facteur peut être obtenu par fermentation aérobie de: 1) une souche de Aspergillus rugulosus NRRL 8113; 2) une souche de Aspergillus nidulans var. echinulatus A-32204, NRRL 3860; 3) une souche de Aspergillus rugulosus NRRL 8039; ou 4) une souche de Aspergillus nidulans var. roseus, NRRL 11440. Quand on utilise une souche de A. nidulans var. roseus NRRL 11440 pour produire le facteur B de A-30912, on obtient un mélange de facteurs qui, pour des raisons de commodité, est appelé mélange antibiotique A-42355. Le facteur A de A-30912 est le facteur principal du mélange antibiotique A-42355. Les facteurs B, D et H de A-30912 sont des facteurs mineurs du mélange A-42355. Tétrahydro-A-30912B On prépare tétrahydro-A-30912B à partir du facteur B de A-30912 par des techniques d'hydrogénation classiques, en effectuant la réduction jusqu'à ce que l'on ait réduit les deux doubles liaisons de la chaîne latérale linoléoyle. Dans,un autre mode de réalisation des noyaux de cette invention, R, R, R et R sont tous des atomes d'hydro- gène. Le noyau de ce mode de réalisation est appelé noyau de A-30912D. On prépare le noyau de A-30912D en désacylant un antibiotique peptidique cyclique de formule II o R est un groupement linoléoyle ou stéaroyle et R, R, R et R sont comme dans le noyau de A-30912D. Quand R dans l'antibiotique peptidique cyclique de formule II est un groupement linoléoyle, l'antibiotique est appelé facteur D de A-30912 et quand R est un groupement stéaroyle, l'antibiotique est appelé facteur D de A-30912 tétrahydrogéné. Facteur D de A-30912 Le facteur D de A-30912 est un facteur du mélange A-30912 qui contient également les facteurs A, B, C, E, F et G. Le mélange A-30912 est décrit dans le brevet des E.U.A. N 4.024.245. On a trouvé que le facteur D de A-30912 est identique à l'échinocandine D antibiotique [Voir R. Traber et al., Helv. Chim. Acta 62, 1252-1267 (1979) ] et à l'antibiotique SL 7810/F-III (Brevet belge N 834.289). Traber et al. ont proposé la structure de la formule II dans laquelle R, R, R et R sont tous H et R est un groupement linoléoyle pour l'échinocandine D antibiotique. Pour la tétrahydroéchinocandine D, Traber et al. ont proposé i 2 3- 4 la structure de formule II dans laquelle R, R, R et R sont chacun H et R est un groupement stéaroyle. Pour des raisons de commodité, le facteur D de A-30912 tétrahydrogéné (tétrahydro-SL 7810/F-III; tétrahydro- échinocandine D) sera appelé tétrahydro-A-30912D. Noyau de A-30912D Le nouveau noyau peptidique cyclique de ce mode de réalisation, c'est-à-dire le noyau du facteur D de A-30912 (échinocandine D, SL 7810/F-III) et de tétrahydro-A-30912D, a la structure représentée dans la formule I dans laquelle 1 2 3 4 og R, R2, R et R sont des atomes d'hydrogène. Le noyau de A-30912D a une formule brute de C34H51N7012 et un poids moléculaire de 749,83. Préparation du noyau de-A-30912D Préparation du substrat On peut préparer le noyau de A-30912D à partir du facteur D de A-30912 ou de tétrahydro-A30912D. Comme le facteur D de A-30912 n'est pas le composant principal des mélanges antibiotiques dans lesquels il est produit, il doit être purifié pour enlever les facteurs produits simultané- ment avant de l'utiliser comme substrat. Facteur D de A-30912 Le facteur D de A-30912 peut être produit par fermen- tation aérobie en immersion de: 1) une souche de Aspergillus rugulosus NRRL 8113; 2) une souche de Aspergillus nidulans var. echinulatus A 32204, NRRL 3860; 3) une souche de Aspergillus rugulosus NRRL 8039; ou 4) une souche de Aspergillus nidulans var. roseus, NRRL 11440. Quand on utilise une souche de A. nidulans var. roseus NRRL 11440 pour obtenir le facteur D de A-30912, on obtient un mélange de facteurs que l'on appelle pour des raisons de commodité mélange antibiotique A-42355. Le facteur A de A-30912 est le facteur principal du mélange antibiotique A-42355. Les facteurs B, D et H de A-30912 sontdes facteurs mineurs du mélange A-42355. Tétrahydro-A-30912D On prépare tétrahydro-A-30912D à partir du facteur D de A-30912 par des techniques d'hydrogénation classiques en effectuant la réduction jusqu'à ce que l'on ait réduit les deux doubles liaisons de la chaîne latérale linoléoyle. Dans encore un autre mode de réalisation des noyaux de cette invention, R et R sont tous deux OH, R est H et R est un groupement alkyloxy en C1-C6. Les noyaux de ce mode de réalisation sont appelés noyaux de type A-30912H. On prépare les noyaux de type A-30912H en désacylant un anti- biotique peptidique cyclique de formule II dans laquelle R i 2 3 est un groupement linoléoyle ou stéaroule et R, R R et R sont comme dans les noyaux de type A-30912H. Quand R dans l'antibiotique peptidique cyclique de formule II est un groupement linoléoyle et R est un groupe- ment méthoxy, l'antibiotique est appelé facteur H de A-30912 et, quand R est un groupement stéaroyle et R est un groupe- ment méthoxy, l'antibiotique est appelé facteur H de A-30912 tétrahydrogéné. Quand R, dans l'antibiotique peptidique cyclique de formule II, est un groupement linoléoyle et R est un groupe- ment alkyloxy en C2-C6, les antibiotiques sont appelés homo- logues à groupement alkyloxy inférieur du facteur H de A-30912 et quand R est un groupement stéaroyle et R est un q groupement alkyloxy en C2-C6, les antibiotiques sont appelés homologues à groupement alkyloxy inférieur du facteur H de A-30912 tétrahydrogéné. Facteur H de A-30912 Le facteur H de A-30912 est un facteur du mélange A30912 qui contient également les facteurs A, B, C, D, E, F et G. Le mélange A-30912 est décrit dans le brevet des E.U.A. N 4.024.245. Le facteur H de A-30912 est un facteur de A-30912 découvert par la suite. Le facteur H de A-30912 est décrit dans la demande de brevet français N 0O 12212- Homologues du facteur H de A-30912 Apres la découverte de la structure du facteur H de A-30912, on a mis en valeur le fait que les homologues à groupement alkyloxy inférieur du facteur H de A-30912 seraient des produits utiles. Avant ce moment, les dérivés alkyloxy que l'on avait prépares n'avaient pas été reconnus comme ayant une utilité et étaient préparés seulement comme outils de détermination de la structure. Les homologues à groupement alkyloxy en C2-C6 du facteur H de A-30912 sont préparés à partir du facteur A de A-30912. Le facteur H de A-30912 peut être produit par fermen- 1il tation de: 1) une souche de Aspergillus rugulosus NRRL 8113; 2) une souche de Aspergillus nidulans NRRL 8112; 3) une souche de Aspergillus nidulans var. echinulatus A-32204, NRRL 3860; 4) une souche de Aspergillus rugulosus NRRL 8039 comme décrit dans le brevet belge N 834.289; ou ) une souche de Aspergillus nidulans var. roseus, NRRL 11440. Comme chaque noyau de A-30912H contient une partie amino, ils peuvent exister sous la forme de sels. Ces sels sont également utilisables comme intermédiaires et pour des besoins de purification. Les sels pharmaceutiquement accep- tables des noyaux de A-30912H sont particulièrement utiles parce qu'ils réduiront au minimum la purification des pro- duits finals. Les sels "acceptables sur le plan pharmaceu- tique" désignent les sels dont la toxicité du produit en tant que tout vis-à-vis des animaux à sang chaud n'est pas accrue. Les sels d'addition d'acides des noyaux de A-30912H peuvent être préparés par des modes opératoires de réaction classique avec un acide minéral ou organique. Des exemples des acides minéraux et organiques comprennent les acides chlorhydrique, bromhydrique, iodhydrique, sulfurique, phosphorique, acétique, benzoique, sulfamique, tartrique, citrique, maléique, succinique, ascorbique, glycolique, lactique, fumarique, palmitique, cholique, pamoique, mucique, D-glutamique, d-camphorique, glutarique, phtalique, laurique, stéarique, salicylique, méthanesulfonique, benzènesulfonique, sorbique, picrique, cinnamique et d'autres acides appropriés. Préparation des noyaux de A-30912H Préparation du substrat On peut préparer le noyau de A-30912H, c'est-à-dire le composé de formule I dans laquelle R1 et R sont tous deux OH, R est H et R est un groupement méthoxy, à partir du facteur H de A-30912 ou de tétrahydro-A-30912H. Comme le facteur H de A-30912 n'est pas un composant principal des mélanges antibiotiques dans lesquels il est produit, il doit être purifié pour enlever les autres facteurs antibiotiques produits simultanément, avant son utilisation comme substrat. On prépare les substrats des noyaux A-30912H de formule I o R et R sont tous deux OH, R est H et R est un groupement alkyloxy en C2-C6 (homologues de A-30912H) par réaction du facteur A de A-30912 ou de tétrahydro-A- 30912A avec un alcool approprié pour préparer le dérivé à groupement alkyloxy en C2-C6 correspondant. Comme le facteur A de A-30912 est le composant principal des mélanges anti- biotiques dans lesquels il est produit, ce procédé est également une façon préférée de préparer le facteur H de A-30912 et tétrahydro-A-30912H. Facteur H de A-30912 On peut obtenir le facteur H de A-30912 par fermenta- tion aérobie en immersion d'une souche de Aspergillus rugulosus NRRL 8113 ou d'une souche de Aspergillus nidulans var. roseus NRRL 11440. Quand on utilise une souche de A. nidulans var. roseus NRRL 1140 pour produire le facteur A-30912, on obtient un mélange de facteurs que l'on appelle pour des raisons de commodité mélange antibiotique A-42355. Le facteur A de A-30912 est le facteur principal du mélange antibiotique A-42355. Les facteurs B, D et H de A-30912 sont les facteurs mineurs du mélange A-42355. Homologues de A-30912H - On prépare les homologues de A-30912H en faisant réagir le facteur A de A30912 ou tétrahydro-A-30912A avec l'alcool correspondant approprié pour former le dérivé à groupement alkyloxy désiré de formule II dans laquelle R1 et 4 2 3 R sont tous deux OH, R est H et R est un groupement alkyloxy en C2-C6. Ceci est un procédé préféré de prépara- tion du facteurH de A-30912 et de tétrahydro-A-30912H. On peut préparer les homologues de A-30912H de formule II o R est un groupement stéaroyle et R3 un groupement alkyloxy en C2-C6:a) en préparant tétrahydro-A-30912A et en le faisant réagir avec l'alcool approprié pour former le dérivé à groupement alkyloxy, ou b) en faisant réagir le facteur A de A-30912 avec l'alcool approprié pour former le dérivé à groupement alkyloxy puis en réduisant les doubles liaisons de la chaîne latérale linoléoyle. Les dérivés tétrahydrogénés On prépare tétrahydro-A-30912A, tétrahydro-A30912H, et les composés de formule II o R est un groupement alkyloxy en C2-C6 et R un groupement stéaroyle à partir des facteurs A et H de A30912 et à partir des composés de formule II o R est un groupement alkyloxy en C2-C6 et R est un groupement linoléoyle, par des techniques d'hydrogé- nation classiques, en effectuant la réduction jusqu'à ce que l'on ait réduit les deux doubles liaisons de la chaîne latérale linoléoyle. Dans encore un autre mode de réalisation des noyaux de 1 3 4 2 cette invention, R R et R sont OH et R est un groupe- ment carboxamide. Le noyau de ce mode de réalisation est connu comme noyau de S 31794/F-1. On prépare le noyau de S 31794/F-1 en désacylant un antibiotique peptidique cycli- que de formule II dans laquelle R est un groupement i 2 3 4 -ud myristoyle et R, R R et R sont comme dans le noyau de S 31794/F-1. S 31794/F-1 On obtient le noyau de S 31794/F-1 de cette invention en désacylant l'antibiotique peptidique cyclique S 31794/F-1. L'antibiotique S 31794/F-1, oui est décrit dans la demande de brevetallemande- -! publiée après examen N 2.628.965 et le brevet des E. UoA. N 4.173.629, est un composé antifongique produit par Acrophialophora limonispora nov. spec. Dreyfuss et Muller NRRL 8095. S 31794/F-1 a les caractéristiques suivantes: p.f. 168-180 C. (décomposition) (amorphe) ou 181-183 C. (décomposition) (cristallisé); [a] D = -24 (c = 0,5, méthanol) ou +37 (c = 0,5, méthanol, à l'état cristallisé); maxima d'absorption UV dans le méthanol à 194 nm (E 1%cm = 807), 225 nm (épaulement) 1% lc 1% (Em = 132), 276 nm (Elcm = 12,8), 284 nm (épaulement) lcm lc (Ecm = 10,5); Spectre de RMN du carbone 13C dans le lcm deuterométhanol (190 mg dans 1,5 ml de deuterométhanol), le tétraméthylsilane étant utilisé comme étalon interne) avec les caractéristiques suivantes (à l'état cristallisé): PPM PPM PPM 176,2 75,5 51,2 ,0 74,0 39,7 173,7 71,0 38,8 172,6 70,5 36,6 172,0 69,7. -34,8 171,8 68,0 32,8 171,7 62,2 30,6 168,6 58,3 26,7 157,7 57,0 23,5 132,5 56,2 19,7 129,0 55,4 14,3 ,9 52,9 11,1 76,6 une analyse élémentaire approximative (après séchage du matériau cristallin pendant deux heures sous vide poussé à C) comme suit: 55,5 56,5 % de carbone, 7,5 - 7,7 % d'hydrogène, 10,5 - 10,8 % d'azote et 25,5 - 26,0 % d'oxygène. S 31794/F-1 est facilement soluble dans le méthanol, l'éthanol, la pyridine et le diméthylsulfoxyde et est faiblement soluble dans l'eau, le chloroforme, l'acétate d'éthyle, l'éther diéthylique, le benzène et l'hexane et a une activité antifongique, en particulier vis-àvis de Candida Albicans. On pense que l'antibiotique S 31794/F-1 a la formule 1 3 II dans laquelle R est un groupement myristoyle, R, R et R sont OH et R est un groupement carboxamide. Noyau de S 31794/F-1 On pense que le nouveau noyau peptidique cyclique de cette invention, c'est-à-dire le noyau de l'antibiotique S 31794/F-1, a la structure représentée par la formule I dans laquelle R, R et R sont OH et R est un groupement carboxamide. Le noyau de S 31794/F-1 a une formule brute de C35H52N8016 et un poids moléculaire de 840,87. Préparation du noyau de S 31794/F-I Préparation du substrat On prépare le noyau de S 31794/F-I de cette invention à partir de l'antibiotique S 31794/F-1. i On prépare l'antibiotique S 31794/F-1 par culture aérobie en immersion d'Acrophialophora limonispora NRRL 8095. Ce microorganisme fait partie de la collection de cultures permanentes du Northern Regional Research Center, U.S. Department of Agriculture, Agricultural Research Culture Collection, North Central Region, Peoria, Illinois 61604, o il est disponible au public sous le numéro NRRL indiqué. Comme les noyaux contiennent chacun un groupement amino, ils peuvent exister sous forme de sels. Ces sels sont également utilisables comme intermédiaires et pour la purification. Les sels pharmaceutiquement acceptables des noyaux sont particulièrement utilisables car la purification des produits finals est minimisée. Les sels "pharmaceuti- quement acceptables" désignent les sels dont la toxicité du produit en tant que tout vis-à-vis des animaux à sang chaud n'est pas accrue. Les sels d'addition d'acides des noyaux peuvent être formés par des modes opératoires de réaction classique avec un acide minéral ou organique. Des acides minéraux et organiques types comprennent les acides chlorhydrique, bromhydrique, iodhydrique, sulfurique, phosphorique, acéti- que, benzoïque, sulfamique, tartrique, citrique, maléique, succinique, ascorbique, glycolique, lactique, fumarique, palmitique, cholique, pamoique, mucique, D-glutamique, d-camphorique, glutarique, phtalique, laurique, stéarique, salicylique, méthanesulfonique, benzènesulfonique, sorbique, picrique, cinnamique, et d'autres acides appropriés. La chromatographie liquide sous faible pression de caractéristiques élevées (CLFPCE) à phase inversée utilisant un absorbant gel de silice/C18 est un procédé préféré pour la purification finale des différents antibiotiques. Dans ce procédé, on place le mélange antibiotique brut dissous dans un solvant sur une colonne équilibrée avec le même solvant. Puis, on élue la colonne avec le solvant. Les fractions recueillies sont contrôlées par bioautographe par Candida albicans et/ou par UV (en se basant sur les durées de rétention relatives). On réunit les fractions contenant des facteurs antibiotiques identiques. Il est parfois nécessaire d'effectuer une séparation chromatographique supplémentaire pour obtenir les différents facteurs sous forme purifiée. On obtient le mélange antibiotique brut de A-30912 ou A-42355, par exemple, par extraction du bouillon entier ou des myceliums avec du méthanol ou du chloroforme. Le mélange 7:2:1 de méthanol, d'eau et d'acétonitrile est un système solvant préféré pour la chromatographie de ces antibiotiques. L'antibiotique S 31794/F-1 brut est obtenu par extrac- tion du bouillon entier par un mélange 4:1 d'acétate d'éthyle et d'isopropanol et chromatographie des extraits. Les différents facteurs peuvent être identifiés par chromatographie sur couche mince (CCM). Le gel de silice est un adsorbant preferé. Les Rf des facteurs A à G de A-30912, en utilisant une CCM sur gel de silice à teneur élevée en carbone, un système solvant 7:3 de benzène et de méthanol et un bioautographe Candida albicans, sont donnés dans le Tableau I TABLEAU I Facteur de A-30912 Rf A 0,35 B 0,45 C 0,54 D 0,59 E 0,27 F 0,18 G 0,13 Les Rf approximatifs des facteurs A, B, C, D et H de A-30912 dans différents systèmes solvants, en utilisant une CCM sur gel de silice riche en carbone et bioautographe par Candida albicans, sont donnés dans le Tableau II TABLEAU II Facteur de A-30912 Rf - Systèmes solvants a b c d Facteur A 0,28 0,14 0, 28 0,43 Facteur B 0,39 0,21 0,42 0,47 Facteur C 0,46 0,31 0,51 0,58 Facteur D 0,50 0,38 0,57 0,61 Facteur H 0,42 0,27 0,36 0,53 Systèmes solvants: a: acétate d'éthyle:méthanol (3:2) b: acétate d'éthyle:méthanol (7:3) c: acétonitrile:eau (95:5) d: acétate d'éthyle:éthanol:acide acétique (40:60:0,25) Les facteurs A, B, D et H de A-30912 peuvent également être identifiés par CLFPCE analytique en utilisant les conditions suivantes: Colonne: Verre, 0,8 x 15,0 cm Garniture: Nucléosil 10-C. (Macherv- Solvant: Volume d'échantillon Dimension de l'échantillon: Température de la Nagel and Company); garnissage effectué en utilisant le mode opératoire de garnissage en suspension de la préparation 11. Mélange 7:2:1 de méthanol, *d'eau et d'acétonitrile. 8 P1 8 pg colonne: ambiante Débit: 1,8 ml/minute Pression: environ 14 bars Détecteur: UV à 222 nm (Appareil.de contrôle par absorbance UV- visible à longueur d'onde variable ISCO, modèle 1800) Pompe: LDC Duplex Minipump Injection: Injection en boucle Les durées de rétention approximatives pour les facteurs A, B, D et HI de A-30912 dans ces conditions sont résumées dans le Tableau III. TABLEAU III Facteur de A-30912 Durée de rétention - (secondes) A 792 B 870 H 990 D 1.140 Préparation de l'enzyme A. Microorganisme producteur L'enzyme qui est utilisable pour la désacylation des antibiotiques de cette invention est produite par certains microorganismes de la famille Actinoplanaceae, de préférence le microorganisme Actinoplanes utahensis NRRL 12052. L'enzyme peut être la même enzyme que celle que l'on a utilisée pour désacyler les pénicillines. Ce travail a été décrit dans le brevet des E. U.A N 3.150.059. Bien qu'un procédé préféré de culture de A. utahensis NRRL 12052 pour la production de cette enzyme soit décrit dans la préparation 1, l'homme de l'art verra que d'autres procédés peuvent être utilisés. Les Actinoplanaceae sont une famille relativement récente de microorganismes de l'ordre Actinomycetales. Décrite pour la première fois par le Dr. John N. Couch, cette famille a été créée en 1955 [J. Elisha Mitchell Sci. Soc.71, 148-155 (1955)]. Les caractéristiques de la famille et de nombreux genres distincts se trouvent dans: "'Bergey's Manual of Determinative Bacteriology", 8th Ed., R.E. Buchanan and N.E. Gibbons, Eds., The Williams & Wilkins Co., Baltimore, Md., 1974, pages 706-723. Dix genres ont ainsi été distin- gués depuis: I. Actinoplanes (c'est-à-dire le genre type et de fait le genre de loin le plus commun); II. Spirillospora; III. Streptosporangium; IV. Amorphosporangium; V. Ampullariella; VI. Pilimelia; VII. Planomonospora; VIII. Planobispora; IX. Dactylosporangium ; et X. Kitasatoa. Certaines des espèces et variétés qui ont été isolées et caractérisées jusqu'à présent sont: Actinoplanes philippinensis, Actinoplanes armeniacus, Actinoplanes utahensis, et Actinoplanes missouriensis; Spirillospora albida; Streptosporangium roseum, Streptosporangium vulqare, Streptosporangium roseum var. hollandensis, Streptosporangium album, Streptosporangium viridialbum, Amorphosporangium auranticolor, Ampullariella reqularis, Amnpullariella campanulata, Ampullariella lobata, Ampullariella digitata, Pilimelia terevasa, Pilimelia anulata, Planomonospora parontospora, Planomonospora venezuelensis, Planobispora longispora, Planobispora rosea, Dactylosporangium aurantiacum, et Dactylosporangium thailandense. Le genre Actinoplanes est une source préférée de l'enzyme qui est utilisable pour cette invention. Dans le genre Actinoplanes, l'espèce Actinoplanes utahensis est une source particulièrement préférée de l'enzyme, Des cultures des espèces représentatives sont disponi- bles au public au Northern Regional Research Center, Voir ci-dessus, sous les numéros d'accès suivants: Actinoplanes utahensis NRRL 12052 Actinoplanes missouriensis NRRL 12053 Actinoplanes sp. NRRL 8122 Actinoplanes sp. NRRL 12065 Streptosporangium roseum var. hollandensis NRRL 12064 A. utahensis NRRL 12052 a été obtenu à partir d'une culture mère qui a été déposée à la American- Type Culture Collection (ATCC), 12301 Parklawn Drive, Rockville, Md. 20852 (A. utahensis ATCC 14539). La culture de A, utahensis ATCC 14539 peut également être utilisée comme source de l'enzyme. A. missouriensis NRRL 12053 a été obtenu à partir d'une culture qui est également déposée à l'ATCC (A. missouriehsis ATCC 14538) et qui est une autre source de l'enzyme. L'efficacité d'une quelconque souche donnée de micro- organisme appartenant à la famille Actinoplanaceae pour la mise en oeuvre de la désacylation de cette invention est déterminée par le mode opératoire suivant. On inocule avec le microorganisme un milieu de culture approprié. On fait incuber la culture à environ 280C pendant 2 ou 3 jours sur un agitateur rotatif. Puis on ajoute à la culture un des antibiotiques utilisés comme substrat. On maintient le pH du milieu de fermentation à environ pH 6,5. On contrôle l'activité de la culture en utilisant un dosage par Candida albicans. Ce mode opératoire est décrit dans le paragraphe E. La perte de l'activité antibiotique est une indication que le microorganisme produit l'enzyme nécessaire pour la désacylation. Ceci doit cependant être vérifié en utilisant l'un des procédés suivants: 1) Analyse par CLPE pour déterminer la présence du noyau intact; ou 2) Réacylation avec une chaîne latérale appropriée pour restaurer l'activité. B. Conditions de production de l'enzyme La production de l'enzyme s'effectue dans des condi- tions permettant la croissance d'Actinoplanaceae, c'est-à- dire à une température comprise entre environ 25 et environ 300C et à un pH compris entre environ 5,0 et environ 8,0, avec agitation et aération. Le milieu de culture doit contenir: a) une source de carbone assimilable comme du saccharose, du glucose, du glycérol, etc....; b) une source d'azote comme la peptone, l'urée, le sulfate d'ammonium, etc...; c) une source de phosphate comme un phosphate soluble-; et d) des sels minéraux qui se révèlent généralement être efficaces pour l'amélioration de la croissance des micro- organismes. On obtient, en général, une quantité effective de l'enzyme en environ 40 à environ 60 heures après le début du cycle de croissance et elle persiste pendant un certain temps après que l'on a atteint la croissance effective. La quantité d'enzyme produite varie d'une espèce d'organisme à une autre et en fonction de conditions de culture diffé- rentes. Comme le verra l'homme de l'art, les microorganismes, comme Actinoplanes utahensis NRRL 12052, qui produisent l'enzyme sont sujets à variations. Par exemple,. on peut obtenir des variants et mutants artificiels de ces souches par traitement par divers mutagènes connus comme les rayons ultraviolets, les rayons X, les ondes de fréquence élevées, les rayons radioactifs, et les produits chimiques. Tous les variants et mutants naturels et artificiels que l'on obtient à partir des Actinoplanaceae et qui produisent l'enzyme peuvent être utilisés dans cette invention. C. Conditions de désacylation Le substrat est de préférence ajouté à la culture d'Actinoplanaceae une fois que la culture a incubé pendant au moins environ 48 heures. La concentration du substrat dans le milieu de transformation peut varier de façon importante. Pour une utilisation maximale de l'enzyme et pour une désacylation pratiquement complète en 24 heures, la concentration du substrat sera cependant généralement comprise entre environ 0,5 et environ 1,0 mg/ml. On peut utiliser des concentrations inférieures mais elles ne per- mettent pas d'utiliser au maximum l'enzyme; on peut égale- ment utiliser des concentrations supérieures, mais le substrat ne peut pas être totalement désacylé si l'on ne prolonge pas la durée de'fermentation. La transformation des substrats antibiotiques en noyaux correspondants de cette invention se fait pour le mieux quand le pH du milieu de fermentation est maintenu entre environ 6,0 et environ 7,0. A pH 6 ou moins, la désacylation se fait lentement; lorsque le pH monte au- dessus de 6,0, le substrat et le noyau qui se forme sont de moins en moins stables. Pour un maximum de stabilité, on préfère un pH de 6,0, mais à ce pH, la désacylation se fera moins rapidement (environ 30 à environ 36 heures). Pour une désacylation plus rapide (environ 24 heures) sans pertes importantes, on préfère un pH d'environ 6,5. Dans les fermenteurs agités, le pH peut être réglé par des appareils de détection et de commande. Quand ceci n'est pas pratique, i comme dans des fermenteurs en flacons, on peut régler le pH en ajoutant du tampon phosphate 0,1 M au milieu avant addi- tion du substrat. Après addition du substrat, il faut poursuivre l'incu- bation de la culture pendant environ 24 heures ou plus. La pureté du substrat affectera la vitesse de désacylation. Par exemple, un substrat ayant une pureté supérieure à 50 % est désacylé à un taux d'environ 0,8 à environ 1,2 mg/ml d'antibiotique en 24 heures. Quand on utilise des substrats de pureté inférieure, la désacylation se fait moins rapide- ment. Le substrat peut être introduit en plusieurs fois. Par exemple, dans de petits réservoirs, on peut introduire 0,3 à 0,5 mg/ml d'antibiotique à des intervalles de 12 heures pendant au moins cinq additions, et dans des réservoirs plus grands, on peut ajouter deux fois 0,7 mg/ml. La désacylation peut être effectuée sur un large intervalle de températures, par exemple d'environ 20 à environ 450C. Il est cependant préférable d'effectuer la désacylation à des températures d'environ 25 à environ 30'C, et une température d'environ 260C particulièrement préférée, pour une désacylation et une stabilité optimales du substrat et du noyau. D. Le substrat Il est préférable d'utiliser comme substrats des anti- biotiques purifiés. Les substrats antibiotiques ont une activité antifongique mais non antibactérienne. Ainsi, les substrats peuvent abriter des cellules bactérielles ou des spores qui pourraient se développer dans le milieu de fermen- tation de désacylation. De telles impuretés peuvent nuire à la réaction de désacylation ou à la stabilité des anti- biotiques de départ ou des noyaux obtenus. Il est donc important que les substrat soient stériles. Comme le passage à l'autoclave détruit la majeure partie des substrants anti- biotiques, il est préférable de stériliser les préparations par traitement par l'oxyde d'éthylène dans un système sous pression. E. Contrôle de la désacylation Les substances de départ sont des antibiotiques anti- fongiques qui sont particulièrement actifs vis-à-vis de Candida albicans. Pour cette raison, une analyse utilisant C. albicans est préférable pour déterminer les quantités de substrats présents. Les noyaux qui se forment sont solubles dans l'eau mais sont inactifs sur le plan biologique. Une diminution de l'activité biologique est donc un essai présomptif rapide de désacylation. D es échantillons de bouillons et des extraits alcooliques des solides de fermen- tation doivent tous deux être analysés car les substrats ne sont que légèrement solubles dans le bouillon. F. Utilisation des cellules restantes Un autre procédé de désacylation consiste à recueillir les cellules d'Actinoplanaceae du milieu de culture, à mettre à nouveau les cellules en suspension'dans une solution tampon et à effectuer la désacylation comme décrit dans le paragraphe C. Quand on utilise ce procédé, les myceliums actifs sur le plan enzymatique peuvent être réutilisés. Par exemple, les myceliums de A. utahensis NRRL 12052 conservent une activité de désacylase après conservation pendant un mois ou plus sous réfrigération (4 - 80C) ou à l'état conge- lé (-20'C). Une solution tampon préférée est le tampon phosphate 0,1 M. G. Enzymes immobilisées Un autre procédé de mise en oeuvre de la désacylation consiste à immobiliser l'enzyme par des procédés connus dans le domaine. (Voir, par exemple, "Biomedical Applications of Immobilized Enzymes and Proteins", Thomas Ming Swi Chang, Ed., Plenum Press, New York, 1977; Vol. 1). L'enzyme immo- bilisée peut ensuite être utilisée dans une colonne (ou tout autre type approprié de réacteur) pour effectuer la désacy- lation. En outre, le microorganisme peut lui-même être immobi- lisé et utilisé pour catalyser la réaction de désacylation. Utilité des noyaux Les noyaux et leurs sels d'addition d'acides sont'des- intermédiaires utilisables pour la préparation de composés antifongiques synthétiques. Les composés antifongiques uti- lisables préparés à partir de ces noyaux sont décrits dans les demandes de brevets N' déposées le même jour que la présente demande de brevet. Ces composés sont représentés par la formule suivante III dans laquelle R1., R2, R3 et R4 sont tels que définis pour la formule I et R5 a diverses définitions (Voir les demandes correspondantes mentionnées page 23, ligne 39 ci-dessus. III H On prépare les composés de formule III en acylant le noyau approprié sur le groupement a-amino de la partie ornithine du noyau par la chaîne latérale acyle appropriée en utilisant des procédés connus dans le-domaine pour former une liaison amide. L'acylation est généralement effectuée en faisant réagir le noyau avec un dérivé activé de l'acide correspondant à la chaîne latérale acyle désirée. L'expression "Dérivé activé" désigne un dérivé qui rend la fonction carboxy de l'agent d'acylation réactif à la copulation avec le groupement amino primaire pour former la liaison amide qui lie la chaîne latérale acyle au noyau approprié. Les dérivés activés appropriés, leurs procédés de préparation et leurs procédés d'utilisation comme agents d'acylation d'une amine primaire sont connus de l'homme de l'art. Les dérivés activés préférés sont (a) un halogénure d'acide (par exemple un chlorure d'acide), l (b) un anhydride d'acide (par exemple un anhydride d'acide alcoxyformique ou un anhydride aryloxyformique) ou (c) un ester activé (par exemple un ester 2,4,5- trichlorophénylique). D'autres procédés d'activation de la fonction carboxy comprennent la réaction de l'acide carboxylique avec un carbonyldiimide (par exemple le N,N'-dicyclohexylcarbodi- imide ou le N,N'-diisopropylcarbodiimide) pour obtenir un intermédiaire réactif qui, en raison de son instabilité, n'est pas isolé, la réaction avec l'amine primaire étant alors effectuée in situ. Si un amino acide particulier contient un groupement fonctionnel acylable autre que le groupement amino, il est entendu pour l'homme de l'art qu'un tel groupement doit être protégé avant la réaction de l'amino acide avec le réactif utilisé pour fixer le groupement N-alcanoyle ou N-alcénoyle. Des groupements protecteurs appropriés peuvent être un quelconque groupement connu dans le domaine comme utilisable pour la protection d'un groupement fonctionnel de chaine latérale dans la synthèse des peptides. De tels groupements sont bien connus et le choix d'un groupement protecteur par- ticulier et son procédé d'utilisation seront facilement appréciés de l'homme de l'art [Voir, par exemple, "Protective Croups In Organic Chemistry", M. McOmie, Editor, Plenum Press, N.Y., 1973]. Les composés de formule III inhibent la croissance des champignons pathogènes et sont donc utilisables pour lutter contre la croissance des champignons sur des surfaces envi- ronnementales (en tant qu'antiseptique) ou dans le traitement d'infections provoquées par des champignons. Les composés sont, en particulier, actifs vis-à-vis de Candida albicans et sont donc particulièrement utiles pour traiter la candi- dose. L'activité des composés peut être déterminée par des modes opératoires d'essais microbiologiques classiques, comme in vitro par des essais de diffusion de disques sur plaque de gélose ou des essais de diffusion sur gélose, ou in vivo dans des essais sur des souris infectées par C. albicans. Les composés sont également actifs vis-à-vis de trichophyton mentagrophytes (organisme dermatophyte), Saccharomyces pastorianus et Neurospora crassa. Certains composés (Comme indiqué dans l'Exemple de Référence 19, Tableau VIII) donnent des taux significatifs dans le sang après administration par voie orale chez les souris. Quand on administre à un chien par voie intraveineuse à une dose de 100 mg/kg par jour pendant 5 jours, le composé de formule III o R est un groupement p-(n-octyloxy)- benzoyle, onn'observe aucun signe extérieur de toxicité bien que l'on observe des taux temporairement accrus de trans- aminase glutamo-pyruvique sérique. Quand on les utilise de façon systématique, la dose de composés de formule III variera selon le composé particulier que l'on utilise, la sévérité et la nature de l'infection, et l'état physique du sujet que l'on traite. La thérapie doit être amorcée à de faibles doses, et la dose doit être accrue jusqu'à ce que l'on obtienne l'effet antifongique désiré. Les composés peuvent être administrés par voie intraveineuse ou intramusculaire par injection sous forme d'une solution ou suspension aqueuse stérile à laquelle on peut ajouter, si on le désire, des agents classiques pharmaceutiquement acceptables comme des agents de conserva- tion, des agents tampons, des agents de solubilisation ou de mise en suspension. D'autres additifs, comme la solution saline ou le glucose, peuvent être ajoutés pour rendre les solutions isotoniques. Les proportions et la nature de ces additifs seront évidentes pour l'homme de l'art. Certains composés de formule III donnent des taux dans le sang significatifs après administration par voie orale (Voir l'Exemple de référence 19, Tableau VIII) et peuvent être administrés de façon systématique par voie orale. Pour l'utilisation par voie orale, de tels composés peuvent être administrés en combinaison avec des supports ou excipients pharmaceutiquement acceptables sous forme de capsules, de comprimés ou de poudres. La nature et la proportion de ces supports ou excipients sont connus de l'homme de l'art. Quand on les utilise pour traiter des infections vaginales dues à Candida, les composés de formule III peuvent être administrés en combinaison avec des excipients classiques pharmaceutiquement acceptables convenant pour l'utilisation intravaginale. Les compositions conçues pour l'administration intravaginale sont connues de l'homme de- l'art. Pour permettre de mieux comprendre cette invention, on donne les exemples suivants: I [Préparation I FerimuLntation d'Actinoplanes utahiensis NIRRI 12052 On prépare une culture mère d'Actinoplanes utahensis NRRL 12052 et on l'entretient sur une culture inclinée cle gélose. Le milieu utilisé pour préparer la culture inclinée est choisi parmi l'un des suivants: Milieu A ngrQ_édient Quantité Farine d'avoine pour bébé 60,0 g Levure 2,5 g K2IIP()I 1,0 g Soluti.on minérale de Czapek:: 5,0 ml Gé].ose 25,0 g Eau ciésionisée q.s.p. 1 litre le pll avant passage à l'autoclave est environ 5,9; on ajuste le pli à 7,2 par addition de NaOHI; après passage à l'autoclave, le pll est d'environ 6,7. :: La solution minérale de Czapek a la composition suivante: ngnr6ó1 ió. mnt Quan tILité -FeSO4.71120 (dissous dans 2 ml d'IICI concentré) 2 g KC I MJ.- 4 ' 7112O I:au dési.onisée Milieu B igrédienlt D)extrine de pomme de terre Extlra.i. t de]c.vure IlydIrolysat enzymatique de caséine Extrait cde boeuf Dextrose Amidon cie mais Peptonie de viande MéI:;: 1;: noire MgJ;(),1 ' 111, ( CaC(), 1 00 CI g q.s.p. 1 litre QuaniLité ,0 g 0,5 g 3,0 g 0,5 g 12,5 g ,0 g ,0 g 2,5 gc 0,25 g 1,0 g 29 2484451 I;olti ioiiH dmIinc.raie de Czapeîk.,f) ml Gé1 ose 21), 0 g tk Eau t(l; ir);i.:e q.;.pl). 1 litre :: N-Z-Amine A, llumko Sheffield Chemical, Lynldhurst, New Jersey, U.S.A. On inocule la culture inclinée avecActinoplanes utahliensis NRIIL 12052, et on fait incuber l.a culture inoculée à.30 C pendant environ 8 à 10 jours. On utilise à peu près la 'moi ti6 dle la cul ture pour inoculer 50 ml d'un milieu végétatif ayant la composition suivante: I/% gré_cll. cn; LQuantité Farine d ' w)ine pour bébé 20,0) g Saccharos;e 20,0 g Levure 2,5 g Grains séchés de distillation: 5,0 g K211PO4 1,0 g Solution minérale de Czapek 5,0 ml Eau désionisée q.s.p. 1 litre ajuster à pli 7t4 avec NaOII; après passage à l'autoclave, le plil est d'environ 6,8. :: National Distillers Products Co., 99 Park Ave., New York, New York, U. S.A. On fait incuber le milieu végétatif inoculé dans un flacon lrlnicmeyer de 250 ml à large encolure à 30 C pendant environ 72 heures sur un agitateur tournant sur un arc dc 5 cmiii de diamètre à 250 tours par minute. O)n peut utiliser ce milieu véq(Ltatif incubé directement pour inoculer un milieu véqétatif de second stade. Ou bien et d(e préférence, on peut le conserver pour un usage ultérieuien maintenant la culture danis la phase vapeur de l'azotc liquide. On prépare la culture pour une telle conservation dans de nombreuses petites ampoules comme suit: dans chaque ampoule, on place 2 ml de milieu végétatif incubé et 2 ml d'une solution de glycérol et de lactose [voir W.A. Dailey eL C.I. Iligqens, "Preservation and S;tora(cje of Micro- organ.ismi; in thie as Phase of Liquid NiLrogjen, Cryobiol 10, 364-367 (1973) pour les détails]. Les suspensions ainsi préparées sont: conservées dans la phase vapeur de l'azote liquide. On utilise une suspension conserve (] ml) ainsi L préparée pou- inoculer 50 ml d'un milieu v6cjftatif de premier stade (ayant la composition décrite ci-avant) . On fait incuber colmme décrit précédemment le milieu végétatif de premier stade inoculé. Pour obtenir un plus grand volume d'inoculum, on utilise 10 mil du milieu végétatif de premier stade incubé pour inoculer 400 ml d'un milieu végétatif de sèecohd'stade ayant la même composition que le milieu véqgtatif de premier stade. On Jait: incuber le milieu de second sLade dans un flacon Er]enmeyer de 2 litres à-larce encolure à 300C pendant environ 48 heurles sur un agitateur tournant d'un arc de 5 cm de diamètre à 250 tours par minute. On utilise ie milieu végétatif cde second stade incubé (800 mi]), préparé comme décrit ci-dessus, pour inoculer 1 d'un miilieu de production stérile choisi parmi l'un des suivants: Milieu I In r.d ient Quantité (g/l) Farine d'arachide 10,0 Peptone (le viande soluble 5,0 Saccharose 20, 0 M1I2M 4 0,5 K2 1H4 1,2 MCJSO. 71.,O 0,25 Eau du robinet Cq.s.p. 1 litre Le pli dlu milieu est environ 6,9) aprls stérilisation par passaqe A l'autoclave à 121 C pendant 415 minutes sous une pression d'environ 1,1 à 1,24 bar. Milieu II Incqr.-dicnt Quan tité (g/l) Saccha-rose 30,0 eplo) Lne 5,0 K2llO4 1,0 KC1 0,5 MqS()O,4 7.1)O 0,5 Ie.>7;,11 O 0,002 4V 2 31 2484451 I':, cl,(11; ioni:i'u -.s.p1. 1 litre On ajuste le pll a 7,0) avec iC1; après paSagLe à l'autoclave, k L le pll est d ' environ 7, 0. Milieu III -Ingj..CiluL Quantité (g/l) Glucose 20,0 NiCl C1 3,0 N Na2SO(4 2,0 ZnlC.I2 0,019 MgC 1C.2. 611 (l2 0,304 FeC13. 612i0 0,062 MnCI.2 411(. t 0,035 CuC] 2' 21120 0,005 2 0,00 CaCO3 6,0 KIl 21.4 0,67 Eau du robinet q.s.p. 1 litre :: Stérilisé séparément et ajouté de façon aseptique Le pll final est d'environ 6,6. On laisse le milieu de production inoculé fermenter dans une cuve de fermentation de 165 1 à une température d'environ 30 C pendant environ 42 heures. On agite le milieu de fermentation avec des agitateurs classiques à environ 200 tours par minute et on l'aère avec de l'air stérile pour maintenir le taux d'oxygène dissous supéri.cur à 30 % à la saturation par l'air à la pression atmosphérique. Préparation 2 Pr_ép,_-aLti.onl du mé lang.e antibiotique A-1 2355 A. Fernlelli:atio _cn facon agité On prépare une culture d'AspergiiLus nidulans var. roscus NRIb, 11440 et on la maintient sur une ql(ose inclinée de 18 x 150 mil, préparée avec un milieu ayant la composition suivante: I l.rédi.el: 't Quan lité GI ulCOSe 5 g xtrait tidu].evure 2 g CaUCO3 3 g 1 Ju. le I Ct'Oumc,.; 200 ml G6 oe:::: 20 g 32 2484451 E':au (i;si:lhiSCe cq.s.p. 1 litre (pll initial 6,1) k: Jus V-8, Campbell Soup Co., Camnden, N.J., U.S.A. :::: Meer Corp. La culture inclinée est inoculée avec Aspergillus nidulans var. roseus NRRL 11440 puis on fail: incuber la culture à 25 C pendant environ sept jours. On recouvre d'eau la culture inclinée mûre et on la gratte avec une anse stérile pour libérer les spores. La suspension résultante est ensuite mise en suspension dans 10 ml d'eau désionisee stérile. On utilise 1 ml de la culture inclinée en suspension pour inoculcer 55 ml de milieu végétatif clans un flacon de 250 ml. L.e milieu végétatif a la composition suivante: InCj ré dienlt Quantité Saccharose 25 g Mélasse noire 36 g Liqueur cle- macération de mais 6 g Extrait de malt 10 g - K2lIPO4 2g 2 g0 Ilydrolysat enzymatique de caseine:: 10 g Eau du robinet] 100 ml (pll init'ia]. 6,5-6,7) ::.N-Z-Case, Ilumko Sheffield Chemical, Jyndh'lr-st, N.J., U.S.A. On fait incuber le milieu végcétatif inoculé à 25 C pendant 48 heures, à 250 tours par minuite, sur- un agitateur de type rotatif. Après 24 heures, on homocjééise le milieu pendant une minute à faible vitesse dans un mél]angeur (de type Warinqg), puis on le fait incuber à nouveau pendant les 24 heuroC; restantes. Ou bien, on peul faire incuber le milieu vegétatif inoculé pendant 48 heuires puis l'homogénéiser pendant 15 secondes à faible vitesse. Ce milieu végétatif incubé peut être utilisé pour inoculer un milieu de culture de fermentation en flacon agité ou pour inoculer un milieu végétatif de'second stade. On peut également]e- conserver pour une utilisaLion ultérieure, en' mainLenantl la culture cldans la phase vapeurde l'azote liquide. On pré.p)are la culture pour cette colnservation dans do nolmAlli(l:;.n e.; i.Les almp)oules, coImmIe n i i: On mé ilange les cultures vCUj6t:a iLVe(S volume/volume k avec une solution de suspension ayant la composition suivante: Ingréd.ieont QuanLtité Glycérol 20 ml ILactose 10 g Eau dé:siionisée q.s.p. 100 ml On répartit les suspensions préparées dans de petits tubes stéril.es à bouchon vissé (4 ml par tube). On conserve ces tubes dans la phase vapeur de l'azote liquide. On peut utiliser une suspension conservée ainsi préparée pour inoculer des cultures incl.inées ou des milieux d'ensemencement liquides. On fait incuber les cultures inclinées à 25 C à la lumière pendant 7 jours. B. Fermentation en réservoir Pour obtenir un plus grand volume d'inoculum, on utilise 10 ml de la culture végétative de premier stade incubé pour inoculer 400 ml d'un milieu de croissance végét-at.i.l de second stade ayant la même composition que celui du mil i.eu vé(étatif. Le milieu de second stade est incubé dans un flacon Erlenmnoyer à large ouverture de deux litres, à C pendant 24 heures, sur un agitateur tournant d'un arc de cm de diamitre à 250 tours par minute. le milieu cie second stade incubé(800 ml), préparé comme décerit ci-dessus, est utilisé pour inoculer 100 litres d'un milieu de production stérile choisi parmi l'un des suivants: Milieu IV I.]édcie:o.nt L!.u anLtité Zl;xi l.71120 0,00455 g/1 leLLptone de viande soluble:: 30,5 g/1 Farine de soja 15,5 g/1 D) oextrine de tapioca:::: 2,0 g/l Mé6lasse noire 10,5 g/1 1 1yi ro]ysat e; nz'ymatique de ea:;uine:::::: 8,5 g/1 Na..111'O 4, 5 g/1 4'. 7112) 5,5 g/1 Fll';o 7l2O S 34 2484451 FeSo). 1120 ( 0, c/l 4. 2 lui.l]e de coton 40,0 ml AntiimoussanLt:... 1,0 ml Eau du robinet 1000,0 ml (pll initial 6,8-7,0) :: Peptone, Amber Laboratorifes, Juneau Wisconsin, U.S.A. :::: Sladx 11, A.E. Staley Co., Decatur, Illinois, U.S.A. *::::: N-Z-Amine A, llumko Sheffield Chemical, Ljndhurst, N.J. U.S.A. :::::::: P2000, Dow Corning, Midland, Michigan, U.S.A. Milieu V nI. jrdieit - Quantité Glucose 2,5 % Amidon 1,0 % Peptone de viande soluble:: 1,0 % Mé.asse noire 1,0 % CaCO3 0,2 V. MqSO4. 71120 0,05 % llydrol ysat enzymatique de caséine:::: 0,4 % Antimoussant:::::: 0,02 % Eau du robinet q.s.p. volume :: O.M. Peptone :::: N-Z-Amine A :::::: Antifoam "A", Dow Corning On laisse [e milieu de production inoculé fermenter dans un réservoir de fermentation de 165 1 à une température de 250C pendant 7 jours. On aère le milieu de fermeint.ation avec de l'air stérile, on maintenant le niveau d'oxygène dissous supérieur U environ 50 % de la saturation on air. C. Milieu végé6tatif de troisième stadec Si l'on effectue la fermentation dans des réservoirs plus grands que ceux utilisés pour la fermentation par litres, il est recommandé d'utiliser une culture végétative d(le troisième stade pour ensemencer le réservoir plus grand. Un milieu végétatif de troisièSme stade préféré a la composition suivante Sncjrcdi. cn. (..lid ni té SaCc}clỈ(IoiC 25 g Méla:;.;1' noire 25 g [Liqueinr de macération de mais 6 g IIy10r I yo;];i t enzymatique de caseine:: l0 g Extrait de malt 10 g:u. K211PO4 2g K. lll") 2 g Eau du robinet 1000 ml ({lI initial 6,1) N-Z-Ca;. lse( Préparation 3 Séparation dumélance antibiotique A-42355 ()On aqite soigneusement le bouil].on de fermentation entier (4l27 Llitres), obtenu par le proc(lé( décrit dans l'Exiempll.e cn utilisant le milieu de production II, avec 4280 litres de méthanol pendant une heure, pu.is on filtre, en utilisant un adjuvant de filtration.(Ilyflo Supercel, une terre de diaLomwecs, Johns-Manville Products Corp.). On ajuste le pli du filtrat à 4,0 par addition d-'IICI 5 N. On.extrait le filtrat acidifié deux fois avec des volumes é6qaux de chloroforme. On réunit les extraits chloroformiques tt on les concentre sous vide jusqu'à un volume cde 20 litres. On ajoute ce concentré à 200 litres d'éther diéthylique pour faire précipiter le m(langje A-42355. On sépare le précipité par filtration et l'on obtient 2775 g du mélange A-42355 sous forme d'une poudre blanc gris. Sarionll et identification des facteurs de A-30912 Préparation 4 Saraoln. du facteur A de A-30912 On dissout I c du mélange antil)biotique A-42355, préparé commie décrit dans les Préparations 2 eL 3, dans 7 ml d'un mél1anqe 7:2:1 de méthanol, d'eau et d'acétonitriie. On filtre cetlle solution et on l'introduit dans une colonne en verre de 3,7 cm de diamètre intérieur et de 35 cm de longueur I Colonne de Chromatographie CLFPCE (chromatocjraphie liquide sous faible pression de caractéristiques é]evées) Michel- Miller, Ace Glass Incorporated, Vineland, NJ 08360] garnie de résine ? pha;se inverse de (jel de silice 11'-l/C18 (10-20 microns), qui a é Lé 'preparée conmme d(criJt ldans la Préparation 36 2484451 , par 1 illl'nemédiair:e d'une boucle à 'aideo d'un système à vannes. I.a colonne est garnie dans le syst:ème 7:2:1 de méthanol, d'eau et d'acétonitrile, à l'aide (lu mode opératoire de garnissage en suspension décrit dans la Préparation 11. Une pompe F.M.I. avec une conception de piston sans vannes (débit maximal 19,5 ml/minute) est utilisée pour déplacer le solvant dans la, colonne à un débit de 9 ml/minute à 7 bars, des fractions étant-recueillies toutes les minutes. L'élution de l'antibioticque est contrôlée à 280 nm en utilisant un appareil de contrôle UV (ISCO Model UA-5, Instrument Specialist Co., 4700 Sul)erior Ave., Lincoln, Nebraska 68504) équipé d'une unitL optique (ISCO Type 6). Préparation 5 Séparation du facteur B de A-30912 On sépare le mélange A42355 comme décrit dans la Préparation 3, mais on chromatographie]les extraits chloroformicques concentrés (285 1) sur une colonne de gel de silice (150 1 de gel de silice Grace, quatlité 62) à un débit de 2 1/minute. On lave la colonne avec 200 litres de chloroforme, on l'élue avec 500 litres d'acétonitrile, puis on l'élue continuellement avec un mélance 98:2 d'acétonitrile et d'eau. à un débit de 1 1/minute. On recueille des fractions ayant un voLume de 200 litres et on les altialyse séparément pour cléLiermnier leur activité biologique. L'analyse biologique est effectuée par une analyse sur disque de papier sur plaque de cgjélose, ensemencée par Caicil ilda al}bicans. On réunit l].es fractions 77 à 103 (1365 litres) el: on les concent:re sous vide. La solution concentré-ee (4,5 litres) contient un précipité qu'on enlève par filtraion et l'on obtiCent 119) J d(le moélanqe A-42355 enrichi. ion lacteur B. On concentre le filtrat à siccité. On redissout le résidu obtenu dans un volume approprié de méthano]. On ajoute la solution métlianolique à 10 volumes d'éther diéthyli.que pour faire précipiter le complexe antibiotique contenant le facteur B. On sépare èqalement ce précipité par filtraL:.ion et on le sèche, et l'on ob)tient 24 g supplémentairues de mélange ' A-42355 dn.lihi ie facteur 13 sous formeo ci' pooudre grise. lI, i'.l lJIq A-42355 enriclhi.en llct Iuir i ainsi obtenu 37 2484451 (1,0 1j) s:t tdiissouis clans 8 nil d'un milatn de /:2:1 de méthanol, d'eau et d'acétonitrile. On fJiltre cette solution et onl l' int.rodLuit sur une colonne de qcel de silice (Colonne Michel-Miller de 3,7 cm de diamètre intérieur x 33 cm) par l'intermédiai.re d'une boucle à l'aide d'un système à vannes. La colonne est garnie d'une résine à phlase inversée de gel de silice 1l,'-l/Cl (10-20 microns) préparée commne décrit dans la Préparation 10, à l'aide du mélancle 7:2:1 de méthanol, d'ecau etl dl'acetoLnitrile, commre décrit dans la P'réparation 11. Le solvantl: se cdéplace dans la colonne à un débit de 10 ml/. minute à environ 7 bars, en utilisant une pompe FMI à piston sans vannes. On rccueille une fraction t:outes les minutes. On contrôle (I ' lution de l'antibiotique à? 280) inll comme dans la Préparation 15. On réunit les fractions 102-1.10 et on les concentre sous vide pour obtenir une huile. On dissout l'huile dans un petit volume de t-butanol et on la lyophilise, ce qui donne 22 mgj du facteur- B13 de A-30912. 1Pr.paration 6 Isolemellt du factecur D) de A-30912 On réunit et on chromatograpjIie sur une colonne de cgel de silice (Grace, qualité 62) les extraits chloroformiques concentrés de cieux essais de fermentation (3800 1 et 4007 1) obtenus par l.e procédé décrit dans la Préparation.3. On lave la coolocne avec du chloroforme puis on élue avec de l'acéto- nitrile et un mélangJd 98:2 d'acétonitri.le etl: d'eau. On recueil.c! des fractions ayant un volume (.'environ 200 1 et on les soum,:L. îlîe. al]. Lyse biolocrique sur pli;llC: d(e lapier sur célose ensemencée avec Candida albicans. On réunit les fractions actives (850 1) et on les concentre sous vide. On ajoute la solution concenitr(e (0,7 1) à 10 volumes d'Lthier diéthylique pour faire précipiter le mélange A-42355 enrichi en facteur D. On enlève ce précipité par filtration et on le sèche, ce qui donne 32 g de mélange A-42355 enrichi en facteur D sous forme d'une plou(dre grise. On dissout le mélange A-42355 enrichi en facteur D ainsi obltenu (1t,0 g) dans 5 ml d'un mé] angje 7:2: 1 de méthanol, d'eau etl: d'acé.lonitrile. On filtre cette solution et on l'intr.odu lit Sur une colonne de qel de s.ilice (colonne Michel- Mill.(r,, 7 cm du (liaLmtre inLtérietir x 3() Cw) plar;I l'intermédi. iii-e rd'une boucle à l'aide d'un systè,me à vannes. La colonne a été carnie de résine à phase.i.nversée de gel de silice.TPI/C18 (10-20 microns) préparée cormme décrit dans la Préparation 1.0. Le garnissage a été effectué dans un mélange 7:2:1 de méthanrol, d'eau et d'acétonitrile, selon le mode opératoire de garnissage de la Préparation Il. Le solvant se déplace (lans la colonne à un débit de 8 ml/minute à environ 3,1 bars, en utilisant une pompe FMI à conception de piston sans vannes. On recueille une fraction toutles les 2 minutes. L'élution de l.'antibiotique est contrôlée à 280 nm comme décrit dans la Préparation 4. On réunit les fractions 96-108 et on les concentre sous vide pour obteni r une huile. On dissout ceCLtt(! huile dans un petit volume de tl-butanol et on lyophilise pour obtenir 89 mg du facteur D dec A-30912. Pr.paration 7 Séparation du facteur Il de A-30912 On dissout 5,0 g du mélange antibiotique A-42355, préparé commre cldécrit clans les Préparations 2 et 3, dans 35 ml du mélanqe 7:2:1 de méthanol, d'eau et d'acétonitrile, on filtre la solution résultante et on l'introduit sur une colonne de verre de 3,7 cm de diamètre int-rieur x 42 cm (colonne Micliel-Miller) par l'intermédiaire d'une boucle à 1 'aide cd 'un sys tème de vannes. La colonne es t clarnie de résine à phase inversée de gel de silice Ill'-l/Cîi3 (10-20 microns) (Préparation 1Q) dans un mélaniec 7:2:1 de nméthanol, d'eau et d'acétonitrile commne décrit dans la Piréparation 11. Le solvant se déplace dans la colonne à un dblit de 13 ml/ minute à enuviron 8, 3 bars, en utilisan t une pompe FMI à conception cde piston sans vannes, et l'on recueille une fraction toutes les deux minutes. On contrôle '1élution de l'antibiotique à 280 nm comme décrit dans la Préparation 19, paragraphe C. On réunit les fractions 112-132 avec les fractions 106-117 d'une seconde purification similaire. Les fractions reunies sont concentrées sous vide jusqu'à une huile. Ol dissout l 'huile dans un petit volum.e de t-butanol et on ly(pIi. il is;e pour obtten.i.r 173 lmg du fe t-elr Il brut de A-3091 2. 39 2484451 ()n dlissVut Je factleur Il bi:ut: dU A-30()912 (150 mJ) dans 8 ml cl'un indilanile 7:2:1 de méthanol., Id'eaut et t d'acétolilt ile; on filt.re la solution r(!suLlan(te et on la réintrodcluit sur une colonne de verre de 2,0 cm de diamiètre intérieur x 32 cm, comme décrit ci-dessus.],e solvant-se déplace daus la colonne à un débit de 8 m.l/mniliute à environ ,5 bars, et on recueille une fi-action tioutes les 3 minutes. On contrôle 1'élution de l'antibioti.cque à 280 nm. On réunit les fractionls 17 et 18 et on les conccentre sous vide pour obtenir une huile. On dissout 1'l.hui. le dans un petit volume de t-lbutanol et on lyophilisc vour obtenir 29 mcjg du facteur Il (le A-30912. Identificalioii() des facteurs de A-30912 les différents facteurs de A309)12 peuvent être i.dentii.fié. par chromatographie sur couche minice (CCM). Les Rf - des fac1,uirs A h GdeA-30912, en utilisant la C(CM sur gel de silice (Merck, Darmstadt),un système solvant 7:3-de benzène et de, méthanol et un bioautographe par Candlida albicans sont indiqués dans le Tableau VII. TABLEAU Vii Facteur de A-30912 Rf A 0,35 - B (0,45 C 0,54 I) (, 0,59 l'] i), 27 F 0, 18 (G, 0,13 Il,es Rf approximatifs des facteurs A, 13, C, D et H de A-30912 dans différents systèmes solvants, en utilisant une CCM sur jel. d(le silice (plaques de gel de silice n 60 de Merck Darmstadt, 20 x 20 cm) et un bioautographle par Candida albicans, sont donnés dans le Tableau VIII. 2484451 TABLEAU Fac:Leulr de A-30912 k t Facteur A Facteur 13 - Facteur C Facteur D Facte; ur Il VIIIÀ R St s solvantsiii R - Systè mes solvants a 0,28 0,39 0,46 0, 50 0,42 b 0,14 0,2 1 4 n, 2J -- 0,31 0,38 0,27 c 0,28 0,42 0,51 0,57 0,36 Systl.'111es; solvants a:; acetate d'éthylc:méthanol (3:2) b: acétate- d'éthyle:méthanol (7:3) c: ac6tonitrile:eau (95:5) d: acétate d'éthyle:éthanol:acide acétique (40:60:0,25) On peut également identifier les facteurs A, B, D et Il de A309)12, par chromatographie liquidce sous faible pression de caractéristiques élevéoe (CLPFCE) analytique, dans les conditions suivantes: Colonne verre, 0,8 x 15,0 cm Garnissage Nucleosil 10-C18 (Machery Nagel and Company); jar.ni en utilisant le mode opér-atoire de garnissage en suspension de la Préparation Solvant Mélange 7:2:1 de méthanol, d'eau et d'acétou.itri.]e Volume de l'échantillon Dimension de ] ' échantillon Teinpérature de la - colonne Débit Pression Détecteur 1'On11/;" 8 pl 8 pg ambiante 1,8 ml/minute environ 14 bars UV à 222 nm (ISCO Model 1800 Variable Wavel]eunq Lh UV-visible Absorbance Moni. tor) LDC Dup)Lex Mi. Li iimn d 0,43 0,47 0,58 0,61 0,53 41 2484451 Ilnj(ec Lion injectLion Sur bI)ucl. e Les durée:,; dce r.fteniti.on approximatives pour les facteurs A, t B, 1) et Il de A-30912 dans ces conditions sont résumées dans *le Tableau IX. TABLEAU IX Facteur de A-30912 Temps de rétention (s) A 792 " À 13 870 Il 990 1 1.140 Préparation 8 PréparaLion de L'antibioLitiue S31794/F-l - On produit l'antibiotique S31'794/1'-l par culture en immersion d'Acrophialoplhora limnlonispora NIRRL 8095, en agitant, remuant et/ou aérant à pHl 3-8, de préférence 5-7, et à 15-30 C, de préférence à 1827 C, pendant 48 à 360 heures, dle ipré6'rence pendant 120 à 288 heures. On isole l'antibiotique S31794/F-i par traitement du bouil.]lon de culture (90 L) avec un mélange 4:1 (90 L) d'acéltate d'éthlyle et d'isopropanol et en homogénéisant pendant 30 minutes à la température ambiante. On sépare la phase orqani.que et on l'évapore sous vide à environ 40 C' On chronLmatogrnl[liJc.l.e résidu ainsi obtenu sur environ- dix fois sa quantité l. de gJel de silice, en utiLisant des mélanges de chlorofolrme et de méthanol (95:5 à 60:40). On réunit les fractions qui ont une activité antifonqique et on les chroimatoclralhii.e sur 100 fois leur quantité de "Sephadex LII-20" avec du méthanol. Les fractions provenant de la colonne de Sephadex et qui ont une activité antifongique sont réunies et r:chromatojraphiées sur 100 loi.s..leur quantité de gjl]. de si.lice (0,05-0,2 min) avec un systmie solvant 71:25:4 de chiloroforme, de méthanol et d'eau. Les fractions éluées q(lui. ont une activité antifonqique sont réunies et évaporées sous vide pour obtenir l'antibiotique brut S31794/F-1. On dissout ce produit dans de petites quantités de mifthantlil. et. on le précipite avec de l'éther cliéthyliqud pour obtenir S3]794/F-I sous forme d'une poudre amorphe blanche, p).f. 178-.180 C (décomposition) après séchage sous 42 2484451 vicia pou;i''.i 25-30 C. La cri.stalli.satioll dans dix fois son volume (Ie m1lange 80:12:8 d'acétate d'éthyme, de méthanol et d'eau donn:e. 31794/F-I cristallisé, p.f. 181-1l3 C avec décomposition après séchage sous vide poussé à 20 C. IPréparation 9 Séparation de l'antibiotique S31794/F-1 On introduit l'antibiotique S31794/F-1 brut, obtenu comme décrit dans la Préparation 8 après chromatographie sur Sephadex, sur ine colonne de gel de silice (co].onne Michel- Miller) par l'intermédiaire d'une boucle à l'aide d'un système à vannes. On utilise le mode opératoire de qarnissage en suspension décrit dans la Préparation 11. On déplace le solvant dansi la colonne en utilisant une pompe FMI avec une conception de piston sans vannes. On contriCle] 'élution de l'antibiotique en utilisant un appareil de contrôle UV à 280 nm commre dans la Préparation 22. On réunit les fractions ayant une activité antifongique et on]les concentre sous vide pou1. o)btenir l'antibiotique S31794/F-1. -;31794/F-1 a les R suivants par chromatographie sur couchle mince de g(el de silice (Merck, (0,25 m): Sy's; I:_me solvant R Ch olo-o f.)r. ime: ll thanol: eau (71:25:4) 0,17 Chl oriofor-me: mié thano1ol: acide ;ic;t1Ji{ue concentré (70:29:1) 0, 19 ChlourouF1orme 1: éthanol (2:1) (0,27 S31794/1-1 peut égalemenit être détecté par de la vapeur d'iode. Préparation 10 Prédaration de la résine à phase inveI:sCe dc (el de silice/ C]8 Etape 1: -Hydrolys On ajoute 1000 g de gel de silice LP-1 (Quantum Corp., maintenant Whatman) à un mélange de 1650 ml d'acide sulfurique conccntré et de 1650 m] d'acide nitrique concentré dans un bl l oun à fond rond dle 5 1 et on afl i l:e our obtenir une S;l;peiu; i n alLpprolpLr.i(:'e. 01n chaLuffe le I I;ll(Je sur un bain de Vapir peilidait. ll une nuit (16 heures') av: tuin réfrigérant àrelrodi.c;:semlent d'eau fixe sur le ballon. Onl refroidit le mélange dans un bain de glace et on I le fi..Ltre soiijneusement en utilisant tiun enl.onnoir en verre fritté. On lave le gel de silice avec de.'eau désionisée jusqu'à pli neutre. Puis, on lave le gel de silice avec 4 1 d'acétone et on le sèche sous vide à 100 C pendant deux jours. Eúape 2: Pemière silylation le gel de silice sec de l'l"tape I est transféré dans un ballon à fond rond et mis en suspensi.on dans 3,5 1 de toluène. ()n chauffe le ballon au bain de vapeur pendant deux lheures pour chasser toute l'eau résiduelle par distillation azéotrope. On ajoute 321 ml d'octad-écyl- trichlorosilane (Aldrich Chemical Company), et on chauffe le mélange réactionnel à reflux pendant une nuit (16 heures) avec une lente agitation mécanique à 600'C. On prend soin d'éviter que l.'agitateur ne soit trop près d(le la partie inférieure du ballon, pour éviter un broyage des particules de gel de sil.ice. On laisse le mélancge refroidir. On recueille le gel de silice si..lanisC, on le].ave avec 3 I de ltoluène et 3 1 d'acétone, puis on le sèche à l'air pendant une nuit (16-20 heures). On met le gel de silice séché en suspension dans 3,5 1 d'un mélange 1:1. d'acétonitrile edt d'eau dans un ballon dle 5.1., on agite soigneusement à la température ambianLte pendant deux heures, on filtre, on lave avec 3 1 d'acétone et on sèche à l'air pendant une nuit. Etape 3: Deuxième silylation On répète le mode opératoire de la première silylatLion en utilisant 200 ml d'octadécyl.1. rich].orosilane. On chauffe la suspension à reflux à 60 C pendant deux heures, tout en agitant soigneusement. On recueille].e produit final par filtration, on lave avec 3 1 de toluène et 6 1 de méthanol, puis on le sèche sous vide à 50 C pendant une nuit (16-20 helures). _r_]apdration 11 Mlode ?l.(,[,I.i: de jarnissae eCn Csus)en. i( pour. le. s colonnes Miche 1-M i. 1 t'' 44 2484451 Re Il qni i!' '111vil (-'; r j' I't:; IXllx On uLi.lise ce mode opératoire pour a:arnir une k colonne de ré:6si.ne àl phase inverse de qel. de silice/C18 comme celle préparée par le procédé de la Préparation 10. Elin général, une pression inférieure à 14 bars et des débits. compris entre 5 et 40 ml/minute sont nécessaires pour cette techlnique de garnissage en suspension; ceci dépend clu volume et des dimensions de la colonne. La pression de cgarnissacge doit être supérieure à la pression utilisée pendant la séparation réelle de 2 à 3,5 bars; ceci assure qu'il lne se produit pas de tassement ultLr-ieur de l'adsorbant pendant les séparations. Une diminution soudaine de la pression peut provoquer des craquelures ou des canaux dans le matériau de garnissage, ce qui réduirait de façon importante l'efficacité de la colonne. I1 est donc important de laisser la pression descendre lentement jusqu'à zéro chaque fois que l'on arrête la pompe. Volume approximatif des colonnes (Colonnes en verre de Ace, Catégorie No., non garnies): 5795-04, 12 ml; 5795-10, 110 ml; 5795-16, 300 ml; 5795-24, 635 ml; et 5796- 34, 34 n!l.. Le temps nécessaire pour cgarnir une colonne en verre peut varier de quelques minutes à quelques heures, selon la dimension de la colonne et l'expérience cle 1 'opérateur. EtaDes: 1. Relier la colonne de verre à une col onre réservoir par un accouplement (le volume de la colonne réservoLir doit être deux foiscelui de ia colonne). Placer;les deux colonnes verticalelment avec la colonne réservoir au-dkssus. 2. Peser]le matériau de garnissage (1.00 qj pour 200 mi de colonne). 3. Ajouter environ 5 volumes de solvant au matériau de garnis- sage; utiliser un mélange de 70-80 % de méLlhanol et de 20- 30 % d'eau. 4. B.i.en aii. Lter jusqu'à ce qlue toutes les parti.cules soient mouillées, laisser reposer pendant une nuit ou plus longtemps pour as:ure, r ule imprégnation conimplLe dles particules par le 2484451 O.v i Illo. 1)P(', 1111 ('l',l I i(i tlt'i l li:; llrllali',l lll. 5. é I)1, iyeI la rés i.je avec suffisaImment d (; (1viant pour kL remp) lir a l:U.l 1-ne rCsCrvoir. Verser rdlaidelel(nlt lans le réservoir. Ia colonne doit être préremplie avec le même solvant et la colonne réservoir doit être partiellement remplie du solvant avant de verser la suspe.nsion. L'utilisation de volumes de suspension plus qr1ands peut éga!ement donner de bons résultats; cependant, ceci nécessite (a) un réservoir plus grand ou (b) plusieurs remplissages du réservoir pendant l'opération de garnissage. 6. Fermer le réservoir avec le bouchon cde 'T'eflon en-dessous de la eolollne (voir la Figure 1 du brevet: Ides I..U.A. N 4.131.5,17, bouchon N 3); relier à la pompe; et commencer immediate. ment le pompage du solvant. dans les dispositifs au débit maximum si l'on utilise une pompe Ace Cat. No. 13625-25, ou un système de distribution de solvant similaire (20 ml/minute). 7. ConLi.inuer jusqu'à ce que la colonne soit complètement rempl)ie de I. 'adsorbant. La pression ne doit pas dépasser la 2) I.o.lérance maximale de la co]lonne pendant cete? opération (1.4 bars pour les colonnes importantes et 2.1 barb,pour les colonnes analytiques). Dans la plupart des cas, des pressions inférieures aà]4 bars seront suffisantes. 8. Si. la pJression dépassait les valeurs maximales, réduire le débit C!t la pressioron diminuera. 9. Apris remplissage de la colonne par I 'adsorbant, arrêter la poqmpe;] laisser la pression tomber à zàro; débrancher le réservoir; rempl]acer le réservoir par une l)re-colonne; remplir la pré-colonne de solvant et d'une petite quantité d'adsorbiant, et pomper à la pression imaxi.imale jusqu'à ce que la colonne soit complètement garnie. Pour une information supplémentaire, voir le mode opératoire général. Toujours laisser la. pression descendre lentement après arrêt de la pompe; ceci empêchera la formation de toutes craquelures ou canaux pudalertels dans le matériau (le (arniissage. 10. tlluppl,'i llLer -ia pressioln et débrancher,iqnieusement la précolonne. Avcec une petite spatule, enilever quelques mi].l.i.lml.l: ':; ('2-,I) d. ri.;sag e au;sommet I' 1 a.l colonne; o lacer? I c u;2 il.ltI t.. au soillncLt (le Ia olo)ilicin; appuyer 46 2484451 doucemcent jiu;lqu'au s(ommet dlu matéri.au dle g, larllissage,, et placer un lbouchon cde Telefl.on au sommet de la colonne jusqu'à confirmali.Lion de]'étanchlité. Relier la cololnne à la pompe, introduire la pression (généralement moins de 14 bars) et observer par laparoi de verre au sommet de la colonne si la résine se Lasse davantage. Si le matériau de garnissage doit continuer a se déposer (ceci peut être le cas avec les colonnes de dimensions importantes), un certain espace mort apparaîtra ou bien, il se formera des canaux préférentiels et l'étape 9) doit être répétée. 47 248445 Préparation 12 Préparation de tétrahydro-A-30912A On dissout dans de l'éthanol le facteur A de A-30912. On réduit PtO2 dans de l'éthanol absolu pour former Pt que l'on utilise à son tour pour réduire le facteur A de A-30912 par voie catalytique, en utilisant une hydrogénation sous pression positive jusqu'à ce que la réaction soit terminée (environ 2 à 3 heures). On filtre le mélange réactionnel et on le concentre sous vide. On dissout le résidu dans une petite quantité de t-butanol et on le lyophilise pour obtenir tétrahydro-A-30912A. Préparation 13 Préparation de tétrahydro-A-30912B On dissout dans de l'éthanol le facteur B de A-30912. On réduit PtO2 dans de l'éthanol absolu pour former Pt que l'on utilise à son tour pour réduire le facteur B de A-30912 par voie catalytique, en utilisant une hydrogénation sous pression positive jusqu'à ce que la réaction soit terminée (environ 2 à 3 heures). On filtre le mélange réactionnel et on le concentre sous vide. On dissout le résidu dans une petite quantité de t-butanol et on le lyophilise pour obtenir tétrahydro-A-30912B. Préparation 14 Préparation de tétrahydro-A-30912D On dissout dans de l'éthanol le facteur D de A-30912. On réduit PtO2 dans de l'éthanol absolu pour former Pt que l'on-utilise à son tour pour réduire le facteur D de A-30912 par voie catalytique, en utilisant une hydrogénation sous pression positive jusqu'à ce que la réaction soit terminée (environ 2 à 3 heures). On filtre le mélange réactionnel et on le concentre sous vide. On dissout le résidu dans'une petite quantité de t-butanol et on le lyophilise pour obtenir tétrahydro-A-30912D. Préparation 15 Préparation de tétrahydro-A-30912H On dissout dans de l'éthanol le facteur H de A-30912. On réduit PtO dans de l'éthanol absolu pour former Pt que l'on utilise ensuite pour réduire le facteur HI de A-30912 par voie catalytique, en utilisant une hydrogénation sous 48 2484451 pression positive jusqu'à ce que la réaction soit terminée (environ 2 à 3 heures). On filtre le mélange réactionnel et on le concentre sous vide. On dissout le résidu dans une petite quantité de t-butanol et on le lyophilise pour obtenir tétrahydro-A-30912H. Exemple 1 A. Désacylation du facteur A de A-30912 On effectue une fermentation de A. utahensis comme décrit dans la Préparation 1, en utilisant le milieu de culture incliné A et le milieu de production I et en faisant incuber le milieu de production pendant environ 42 heures. On ajoute au milieu de fermentation le facteur A de A-30912 (340 g desubstrat brut qui contiennent environ 19,7 g de facteur A de A-30912, dissous dans 1,5 1 d'éthanol),., On contrôle la désacylation du facteur A de A-30912 par analyse avec Candida albicans. On laisse la fermentation se poursuivre jusqu'à ce que la désacylation soit;compl'te comme le montre la disparition de l'activité vis-à-vis de C. albicans. - B. Séparation du noyau de A-30912A On filtre le bouillon de fermentation entier (100 litres), obtenu comme décrit dans le paragraphe A et conte- nant le noyau d'environ 20 g de facteur A de A-30912. On rejette le gâteau mycéliéns. On fait passer le filtrat limpide ainsi obtenu (environ 93 litres) sur une colonne contenant 4,5 litres de résine HP-20 (polymère très poreux DIAION, HP-Series, Mitsubishi Chemical Industries Limited, Tokyo, Japon) à un débit de 200 ml/minute. On rejette l'effluent ainsi obtenu. Puis on lave la colonne avec jusqu'à huit volumes d'eau désionisée à pH 6,5 - 7,5 pour enlever le bouillon filtré résiduel. On rejette cette eau de lavage. Puis on élue la colonne avec une solution 7:3 d'eau et de méthanol (85 litres) à un débit de 200-300 ml/ minute. On contrôle l'élution en utilisant le mode opératoire suivant: On prélève deux parties aliquotes de chaque frac- tion éluée. On concentre l'une des parties aliquotes jusqu'à un petit volume et on la traite par un chlorure d'acide comme le chlorure de myristoyle, en utilisant un l 49 2484451 mode opératoire tel que celui décrit dans l'Exemple de Référence 1. On détermine l'activité de ce produit et de l'autre partie aliquote (non traitée) vis-à-vis de Candica albicans. Si la partie aliquote non traitée n'a pas d'acti- vité et que la partie aliquote acylée a une activité, la fraction contient le noyau de A-30912A. L'éluat contenant le noyau de A-30912A est concentré sous vide jusqu'à un petit volume et lyophilisé pour obtenir environ 97 grammes de noyau brut. C. Purification du noyau de A-30912A par chromatographie liquide en phase inversée On dissout 25 grammes du noyau de A-30912A brut, obtenu comme décrit dans le paragraphe B,dans 300 ml d'un mélange 96:2:1:1 d'eau, d'acétonitrile, d'acide acétique et de pyridine. On chromatographie cette solution sur une colonne en acier inoxydable de 4 litres (8 cm x 80 cm) garnie de Lichroprep RP-18, granulométrie 25-40 microns (MC/B Manufacturing Chemists, Inc. E/M, Cincinnati, OH). La colonne fait partie d'une unité chromatospac Prep 100 (Jobin Yvon, 16-18 rue du Canal 91160 Longjumeau, France). Le colonne fonctionne à une pression de 6,2 - 6,9 bars, en donnant un débit d'environ 60 ml/minute, en utilisant le même solvant. On contrôle la séparation à 280 nm en utili- sant un appareil de contrôle UV (ISCO Absorption Monitor Model UA-5, Instrumentation Specialties Co., 4700 Superior Av., Lincoln, Nebraska 68504) équipé d'une unité optique (ISCO Type 6). On recueille par minute des fractions ayant un volume d'environ 500 ml. En se basant sur l'absorption à 280 nm, on réunit les fractions contenant le noyau de A-30912A, on les évapore sous vide et on les lyophilise pour obtenir 2,6 grammes de noyau. La quantité de solvant nécessaire pour achever cette sépara- tion chromatographique varie de 7 à 8 litres. D. Caractéristiques du noyau de A-30912A (a) Formule brute: C34H51N7 015 (b) Poids moléculaire: 797,83. (c) Solide amorphe blanc, soluble dans l'eau, le diméthylformamide, le diméthylsulfoxyde et le méthanol; insoluble dans le chloroforme, le 2484451 tolèune et l'éther diéthylique. (d) Spectre d'absorption infrarouge (Pastille de KBr). Présente des maxima d'absorption à: 3340 large (OH, liaison hydrogène); 2970, 2930 et 2890 (étirement de CH, groupements CH3, CH2, CH aliphatiques), 1660 et 1624 (plusieurs groupements carbonyle C=O); 1510- 1550; 1430-1450 (déformation "wagging"); 1310-1340; -1 1230-1260; 1080; 835, 650 large, et 550 large, cm. (e) Le titrage électrométrique dans le diméthyl- formamide aqueux à 66 % indique la présence d'un groupement titrable avec un pKa d'environ 7,35 (pH initial 7,32). (f) Durée de rétention en CLPE (K'): 11,52 minutes dans les conditions suivantes: Colonne: 4 x 300 mm Garniture: Gel de silice/C18 Solvant: Mélange 1:2:97 d'acétate d'ammonium, d'acétonitrile et d'eau Débit: 3 ml/minute Pression: 172,5 bars Détecteur: UV à longueur d'onde variable à 230 nm Sensibilité: 0-0,4 A.U.F.S. Exemple 2 On prépare le noyau de A-30912A et on le purifie par le procédé de l'Exemple 1, mais on utilise comme substrat tétrahydro-A-30912A. Exemple 3 On prépare le noyau de A-30912A et on le purifie par le procédé de l'Exemple 1, mais on utilise comme substrat l'aculéacine A. Exemple 4 A. Désacylation du facteur B de A-30912 On effectue une fermentation de A. utahensis comme décrit dans la Préparation 1, en utilisant le milieu de production I. Après avoir fait incuber la culture pendant environ 48 heures,-on ajoute au milieu de fermentation le facteur B de A-30912 dissous dans une petite quantité de méthanol. On contrôle la désacylation du facteur B de A-30912 51 2484451 par analyse sur disque de papier vis-à-vis de Candica albicans ou Neurospora crassa. On laisse la fermentation se poursuivre jusqu'à ce que la désacylation soit complète comme le montre la disparition de l'activité. B. Séparation du noyau de A-30912B On filtre le bouillon de fermentation entier obtenu comme décrit dans le paragraphe A. On rejette le gâteau mycélien. On fait passer le filtrat limpide ainsi obtenu dans une colonne contenant de la résine HP 20 (Polymère très poreux DIAION, HP-Series, Mitsubishi Chemical Industries Limited, Tokyo, Japon). On rejette l'effluent ainsi obtenu. Puis on lave la colonne avec jusqu'à huit volumes d'eau désionisée à pH 6, 5 - 7,5 pour enlever le bouillon filtré résiduel. On rejette cette eau de lavage. Puis on élue la colonne avec une solution 7:3 d'eau et de méthanol. On contrôle l'élution de la façon suivante: on prélève deux parties aliquotes de chaque fraction éluéeo On concentre l'une des parties aliquotes jusqut'à un petit volume et on la traite par un chlorure d'acide comme le chlorure de myristoyle. On détermine l'activité vis-à-vis de Candida albicans de ce produit et de l'autre partie aliquote (non traitée). Si la partie aliquote non traitée n'a pas d'acti- vité et que la partie aliquote acylée a une activité, la fraction contient le noyau de A-30912B. On concentre l'éluat contenant le noyau de A-30912B sous vide jusqu'à un petit volume et on le lyophilise pour obtenir le noyau brut. C. Purification du noyau de A-30912B par chromatographie liquide en phase inversée On dissout le noyau de A-30912B brut, obtenu comme décrit dans le paragraphe B, dans un mélange 96:2:1:1 d'eau, d'acétonitrile, d'acide acétique et de pyridine. On chroma- tographie cette solution sur une colonne garnie de Lichroprep RP-18, granulométrie 25-40 microns (MC/B Manufacturing Chemists, Inc. E/M, Cincinnati, OH). La colonne fait partie d'une unité chromatospac Prep 100 (Jobin Yvon, 16-18 Rue du Canal 91160 Longjumeau, France). On fait fonctionner la colonne à une pression de 6,2 - 6,9 bars, donnant un débit d'environ 60 ml/minute, en utilisant le même solvant. On contrôle la s6paration à 280 nm en utilisant un appareil de 52 2484451 contrôle UV (ISCO Absorption Monitor Model UA-5, Instrumentation Specialties Co., 4700 Superior Ave., Lincoln, Nebraska 68504) équipé d'une unité optique (ISCO Type 6). En se basant sur l'absorption à 280 nm, on réunit les fractions contenant le noyau de A-30912B, on les évapore sous vide et on les lyophilise pour obtenir le noyau de A-30912B purifié. Exemple 5 On prépare le noyau de A-30912B et on le purifie par le procédé de l'Exemple 4 mais on utilise comme substrat tétrahydro-A-30912B. Exemple 6 A. Désacylation du facteur D de A-30912 On effectue une fermentation de A. utahensis comme décrit dans la préparation I, en utilisant le milieu de production I. Apres avoir fait incuber la culture pendant environ 48 heures, on ajoute au milieu de fermentation le facteur D de A-30912 dissous dans une petite quantité de méthanol. On contrôle la désacylation du facteur D de A-30912 par analyse sur disque de papier vis-à-vis de Candida albicans ou Neurospora crassa. On laisse la fermentation se poursuivre jusqu'à ce que la désacylation soit terminée comme le montre la disparition de l'activité. B. Séparation du noyau de A-30912D On filtre le bouillon de fermentation entier obtenu comme décrit dans le paragraphe A. On rejette le gâteau mycélien. On fait passer le filtrat limpide ainsi obtenu sur une colonne contenant de la résine HP-20 (Polymère très poreux DIAION, HP-Series, Mitsubishi Chemical Industries Limited, Tokyo, Japon). On rejette l'effluent ainsi obtenu. Puis on lave la colonne avec jusqu'à huit volumes d'eau désionisée à pH 6, 5 - 7,5 pour enlever le bouillon filtré résiduel. On rejette cette eau de lavage. On élue ensuite la colonne avec une solution 7:3 d'eau et de méthanol. On contrôle l'élution en utilisant le mode opératoire suivant: On prépare deux parties aliquotes de chaque fraction éluée. On concentre l'une des parties aliquotes jusqu'à un petit volume et on la traite par un chlorure d'acide comme le 53 2484451 chlorure de myristoyle. On détermine l'activité vis-à-vis de Candida albicans de ce produit et de l'autre partie aliquote (non traitée). Si la partie aliquote non traitée n'a pas d'activité et que la partie aliquote acylée a une activité, la fraction contient le noyau de A-30912D. On concentre sous vide jusqu'à un petit volume l'éluat conte- nant le noyau de A-30912D et on le lyophilise pour obtenir le noyau brut. C. Purification du noyau de A-30912D par chromatographie liquide en phase inversée On purifie le noyau de A-30912D brut obtenu comme décrit dans le paragraphe B, en utilisant le mode opératoire du paragraphe C de l'Exemple 4. En se basant sur l'absorption à 280 nm, on réunit les fractions contenantle noyau de A-30912D, on les évapore sous vide et on les lyophilise pour obtenir le noyau de A-30912D purifié. Exemple 7 On prépare le noyau de A-30912D et on le purifie par le procédé de l'Exemple 6 mais on utilise comme substrat tétrahydro-A-30912D. Exemple 8 A. Désacylation du facteur H de A-30912 On effectue une fermentation de A. utahensis comme décrit dans la Préparation I, en utilisant le milieu de production I. Après fait incuber la culture pendant 48 heures, on ajoute au bouillon de fermentation du facteur H de A-30912 dissous dans une petite quantité de méthanol. On contrôle la désacylation du facteur H de A-30912 par analyse sur disque de papier vis-à-vis de Candida albicans oudelqeurospora crassa. On laisse la fermentation se poursuivre jusqu'à ce que la désacylation soit terminée comme l'indique la disparition de l'activité. B. Séparation du noyau de A-30912H On filtre le bouillon de fermentation entier obtenu comme décrit dans le paragraphe A. On rejette le gâteau mycélien. On fait passer le filtrat limpide ainsi obtenu sur une colonne contenant de la résine HP-20 (Polymère très poreux DIAION, HP-Series, Mitsubishi Chemical Industries 54 2484451 Limited, Tokyo, Japon). On rejette l'effluent ainsi obtenu. Puis on lave la colonne avec jusqu'à huit volumes d'eau désionisée à pH 6, 5 - 7,5 pour enlever le bouillon filtré résiduel. On rejette cette eau de lavage. Puis on élue la colonne avec une solution 7:3 d'eau et de méthanol. On contrôle l'élution en utilisant le mode opératoire suivant On prélève deux parties aliquotes de chaque fraction éluée. On-concentre l'une des parties aliquotes jusqu'à un petit volume et on la traite par un chlorure d'acide comme le chlorure de myristoyle. On détermine l'activité de ce produit et de l'autre partie aliquote (non traitée) vis-à- vis de candida albicans. Sila partie aliquote non traitée n'a pas d'activité et #ue la partie aliquote acylee a une activité, la fraction contient le noyau de A-30912H. On concentre sous vide jusqu'à un petit volume l'éluat contenant le noyau de A-30912H et on le lyophilise pour obtenir le noyau brut. C. Purification du noyau de A-30912H par chromatographie liquide en phase inversée On purifie le noyau de A-30912H brut, obtenu comme décrit dans le paragraphe B, selon le procédé du paragraphe C de l'Exemple 4. En se basant sur l'absorption à 280 nm, on combine les fractions contenant le noyau de A-30912H, on les évapore sous vide et on les lyophilise pour obtenir le noyau de A-30912H purifié. Exemple 9 On prépare le noyau de A-30912H et on le purifie par le procédé de l'Exemple 8, mais on utilise comme substrat tétrahydro-A-30912H. Exemple 10 On prépare et on purifie le noyau de A-30912H par le procédé de l'Exemple 8, mais on prépare le facteur H de A-30912 à partir du facteur A-de A-30912 selon le mode opéra- toire suivant: On dissout 19,6 mg de facteur A de l'antibiotique A-30912 dans 1 ml de diméthylformamide. On ajoute à cette solution du méthanol acide (3 % de HC1, 0,06 ml). On agite la solution résultante à la température ambiante pendant une 2484451 nuit puis on l'évapore à siccité sous vide. On chromatogra- phie le résidu obtenu par CLPECE comme décrit dans la Prépa- ration 7, en utilisant du gel de silice à phase inversée (LP-1/C18, préparé comme décrit dans la -Préparation 10) et un mélange 7:2:1 de méthanol, d'eau et d'acétonitrile comme solvant d'élution et l'on obtient 1,4 mg du facteur H de A-30912 (le composé de formule II o R1 et R4 sont tous deux 2 3 OH, R est l'hydrogène, R est un groupement méthoxy et R est un groupement linoléoyle). Exemple 11 On prépare et on purifie par le procédé de l'Exemple 8 le noyau de type A-30912H de formule I o R est un groupe- ment éthoxy, mais on utilise comme substrat le composé de formule II o R est un groupement méthoxy et R est un grou- pement linoléo}L. On prépare le substrat par le mode opéra- toire utilisé dans l'Exemple 10. Exemple 12 On prépare et on purifie par le procédé de l'Exemple 8 le noyau de type A30912H ayant la formule I o R3 est un groupement n-propoxy, mais on utilise comme substrat le composé de formule II o R est un groupement npropoxy et R est un groupement linoléoyle. On prépare le substrat comme décrit dans l'Exemple 10. Exemple 13 On prépare et on purifie par le procédé de l'Exemple 8 le noyau de A-30912H ayant la formule I o R est un groupe- ment isobutoxy, mais on uitlise comme substrat le composé de formule II o R est un groupement isobutoxy et R est un groupement linoléoyle. Exemple 14 On prépare et on purifie par le procédé de l'Exemple 8 le noyau de A-30912H de formule I o R est un groupement n-pentyloxy, mais on utilise comme substrat le composé de formule II o R est un groupement n-pentyloxy et R un grou- pement linoléoyle. Exemple 15 On prépare et on purifie par le procédé de l'Exemple 8 le noyau de type A-3091211 de formule I o R est un groupe- ment n-hexyloxy, mais on utilise comme substrat le composé 56 2484451 de formule II o R est un groupement n-hexyloxy et R un groupement linoléoyle. Exemple 16 On prépare et on purifie par le procédé de l'Exemple 8 le noyau de type A30912H de formule I o R est un groupe- ment éthoxy, mais on utilise comme substrat le composé de formule II o R est un groupement éthoxy et R un groupement stéaroyle. Exemple 17 On prépare et on purifie par le procédé de l'Exemple 8 le noyau de type A-30912H de formule I o R est un groupe- ment 2-éthyl-1-butoxy, mais on utilise comme substrat le composé de formule II-o R3 est un groupement 2-éthyl-1- butoxy et R un groupement linoléoyle. Exemple 18 On prépare et on purifie par le procédé de l'Exemple 8 le noyau de type A-30912H ayant la formule I o R est un groupement 3-méthyl1-butoxy, mais on utilise comme substrat le composé de formule II o R est un groupement 3-méthyl-1- butoxy et R un groupement linoléoyle. Exemple 19 A. Désacylation de l'antibiotique S 31794/F-1 On effectue la fermentation de A. utahensis comme décrit dans la Préparation], en utilisant le milieu de pro- duction I. Après avoir fait incuber la culture pendant environ 48 heures, on ajoute au milieu de fermentation l'antibiotique S 31794/F-1, dissous dans une petite quantité de méthanol. On contrôle la désacylation de S 31794/F-1 par analyse sur disque de papier vis-à-vis de Candida albicans. On laisse la fermentation se poursuivre jusqu'à ce que la désacylation * soit terminée comme le montre la disparition de l'activité. B. Séparation du noyau de S 31794/F-1 On filtre le bouillon de fermentation entier obtenu comme décrit dans le paragraphe A. On rejette le gâteau mydêIien. On fait passer le filtrat limpide obtenu sur une colonne contenant une résine HP- O20 (Polymère très poreux DIAION, HPSeries, Mitsubishi Chemical Industries Limited, Tokyo, Japon). On rejette l'effluent ainsi obtenu. Puis on i 57 2484451 lave la colonne avec jusqu'à huit volumes d'eau désionisée à pH 6,5 - 7,5 pour enlever le bouillon filtré résiduel. On rejette cette eau de lavage. Puis on élue la colonne avec une solution 7:3 d'eau et de méthanol. On contrôle l'élu- tion en utilisant le mode opératoire suivant: On prélève deux parties aliquotes de chaque fraction éluéeo On concen- tre à un petitvolume l'une des parties aliquotes et on la traite par un chlorure d'acide comme le chlorure de myristoyle. Ce produit et l'autre partie aliquote non traitée sont analysés pour leur activité vis-à-visde Candida albicans. Si la partie aliquote non traitée n'a pas d'acti- vité et que la partie aliquote acylée a une activité, la fraction contient le noyau de S-31704/F-1. On concentre sous vide jusqu'à un petit volume l'éluat contenant le noyau de S 31794/F-1 et on le lyophilise pour obtenir le noyau brut. C. Purification du noyau de S 31794/F-1 par chromatographie liquide en phase inversée On purifie selon le mode opératoire du paragraphe C de l'Exemple 4 le noyau de S 31704/F-1 brut obtenu comme décrit dans le paragraphe B ci-dessus. En se basant sur l'absorption à 280 nm, on réunit les fractions contenant le noyau de S 31794/F-1, on les évapore sous vide et on les lyophilise pour obtenir le noyau de S 31794/F-1 purifié. Préparation d'un premier groupe de dérivés Le mode opératoire suivant illustre la préparation de composés de formule III par la méthode utilisant un "ester actif". Les composés particuliers préparés par ce mode opératoire sont les composés de formule III o R5 est un groupement CH3(CH2)11-, et R 1, R2 R et R sont tels que définis dans les noyaux correspondants. Préparation de Référence I Préparation du tridécanoate de 2,4,5trichlorophényle On agite à la température ambiante pendant 16 heures une solution de 12,5 g d'acide n-tridécanoique (Sigma Chemical Co), de 11,5 g de 2,4,5-trichlorophénol et de 12,0 g de N,N'-dicyclohexylcarbodiimide dans 650 ml de chlorure de méthylène. Puis on filtre le mélange réactionnel et on le sèche sous vide pour obtenir 22 g de tridécanoate de 2,4,5- 58 2484451 trichlorophényle. On purifie ce matériau par chromatogra- phie sur colonne de gel de silice (Woelm) en utilisant du toluène comme éluant. On contrôle les fractions par CCM en utilisant une lumière ultraviolette à courte longueur d'ondes pour la détection. On réunit les fractions conte- nant le produit purifé et on les concentre sous vide à siccité. Exemple de Référence 1 Acylation du noyau de A-30912A par le ntridécanoate de 2,4,5-trichlorophényle On agite à la température ambiante pendant 16 heures une solution de 6,0 g de tridécanoate de 2,4,5-trichloro- phényle et de 4,5 g de noyau de A-30912A dans 600 ml de diméthylformamide (DMF). L'élimination du solvant sous vide laisse un résidu (12 g). On délaie le résidu avec 500 ml de chlorure de méthylène pendant 45 minutes et on filtre le mélange. On rejette le filtrat. On extrait les solides résultants avec 500 ml de méthanol. On filtre l'extrait méthanolique et on le concentre sous vide pour obtenir un produit brut (5,0 g). On purifie le produit brut par CILPE à phase inversée comme suit: On injecte un échantillon du produit brut (1 g), dissous dans 5 ml de méthanol, dans une colonne en acier inoxydable de 2,5 x 80 cm garnie de résine LP-1/C18 (Voir Préparations 10 et 11). On élue la colonne avec un système solvant comprenant un Mélange 3:3:3 d'eau, de méthanol et d'acétonitrile. On effectue l'élution à une pression de 69 à 103,5 bars avec un débit de 11 - 12 ml/minute en utili- sant une pompe duplex LDC (Milton-Roy). On contrôle l'effluent avec un détecteur à ultraviolets (ISCO-UA-5) à 280 nm. On recueille des fractions toutes les deux minutes (21- 24 ml). On réunit les fractions contenant le produit désiré et on les sèche sous vide. On obtient 550 mg de produit. On répète la chromatographie susmentionnée quatre fois pour obtenir des échantillons purifiés supplémentaires du produit comme suit: 620 mg, 520 mg, 670 mg et 490 mg, soit un poids total de 2,8 g. En suivant le mode opératoire précédent, on fait réagir 59 2484451 g du noyau de A-30912A avec le n-tridécanoate de 2,4,5- trichlorophényle et l'on obtient 2,6 g du produit cité en titre purifié. On réunit les substances des deux prépara- tions (5,4 g). L'ion masse par SMDC (M + Na+): 1016. - (Valeur théorique: M+ + Na+ = 1016). La CLPE analytique (C18 Micro Bondapak, Waters Co.) avec comme éluant le système 2:1:2 d'eau, de méthanol et d'acétonitrile n'indique qu'un seul pic. Exemple de Référence 2 Acylation du noyau de A-30912B par le ntridécanoate de 2,4,5-trichlorophényle On agite à la température ambiante pendant 16 heures une solution de 3,3 mmoles de n-tridécanoate de 2,4,5- trichlorophényle et de 1 mmole de noyau de A-30912B dans 200 ml de DMF. L'élimination du solvant sous vide fournit un résidu. On délaie le résidu avec 300 ml de chlorure de méthylène pendant 45 minutes et on filtre le mélangeo On rejette le filtrat. On extrait les solides restants avec 300 ml de méthanol et on filtre l'extrait méthanolique qu'on concentre sous vide pour obtenir un produit brut. On purifie le produit brut par CLPE à phase inversée comme suit: On injecte un échantillon du produit brut (1 g) dissous dans 5 ml de méthanol, dans une colonne en acier inoxydable de 2,5 x 80 cm garnie de résine LP-1/C18 (Voir Préparations et 11). On élue la colonne avec un système solvant consistant en un mélange 3:3:4 d'eau, de méthanol et d'acéto- nitrile. On effectue l'élution à une pression de 69 - 103,5 bars avec un débit de 11 - 12 ml par minute en utilisant une pompe duplex LDC (MiltonRoy). On contrôle l'effluent avec un détecteur UV (ISCO-UA 5) à 280 nm. On réunit les 'frac- tions contenant le produit désiré et on les sèche sous vide pour obtenir le produit cité en titre. On analyse le produit purifié par CCM en utilisant des plaques C18 à phase inversée (Whatman KC18) et un système solvant consistant en un mélange 1:2:2 en volume d'eau, de méthanol et d'acétonitrile. Après développement, on observe les plaques sous la lumière UV pour détecter le produit. Exemple de Référence 3 Acylation du noyau de A-30912D avec le ntridécanoate de 2,4,5-trichlorophényle On agite à la température ambiante pendant 16 heures une solution de 3,3 mmoles de n-tridécanoate de 2,4,5trichlorophényleet de 1 mmole de noyau de A-30912D dans ml de DMF. L'élimination du solvant sous vide donne un résidu. On délaie le résidu avec 300 ml de chlorure de méthylène pendant 45 minutes et on filtre le mélange. On rejette le filtrat. On extrait les solides restants avec 300 ml de méthanol, on filtre l'extrait méthanolique et on le concentre sous vide pour obtenir un produit brut. On purifie le produit brut par CLPE à phase inversée comme décrit dans l'Exemple de Référence 2. Exemple de Référence 4 Acylation du noyau de A-30912H par le ntridécanoate de - 2,4,5-trichlorophényle On agite à la température ambiante pendant 16 heures une solution de 3,3 mmoles de n-tridécanoate de 2,4,5- trichlorophényle et de 1 mmole de noyau de A-30912H dans --; ml de DMF. L'élimination du solvant sous vide donne un résidu. On délaie le résidu avec 300 ml de chlorure de méthylène pendant 45 minutes et on filtre le mélange. On rejette le filtrat. On extrait les solides restants avec 300 ml de méthanol, on filtre l'extrait et on le concentre sous vide pour obtenir un produit brut. On purifie le produit brut par CLPE en phase inversée comme décrit dans l'Exemple de Référence 2. Exemple de Référence 5 On prépare le composé de formule III o R est un groupement n-propoxy et R est un groupement CH3-(CH)11-, selon le mode opératoire de l'Exemple de Référence 4, mais en utilisant comme substance de départ le composé de formule I o R est un groupement n-propoxy (préparé par le procédé de l'Exemple 12). Exemple de référence 6 Acylation du noyau de S 31794/F-1 par le ntridécanoate de 2,4,5-trichlorophényle On agite à la température ambiante pendant 16 heures une solution de 3,3 mmoles de n-tridécanoate de 2,4,5- trichlorophényle et de 1 mmole de noyau de S 31794/F-1 dans ml de DMF. L'élimination du solvant sous vide donne un résidu. On délaie le résidu avec 300 ml de chlorure de méthylène pendant 45 minutes, et on filtre le mélange. On rejette le filtrat. On extrait les solides résultants avec 300 ml de méthanol, on filtre l'extrait méthanolique et on le concentre sous vide pour obtenir un produit brut, On purifie le produit brut par CLPE en phase inversée comme décrit dans l'Exemple de Référence 2. Préparation d'un second groupe de dérivés Le mode opératoire suivant qui donne la préparation - 5 1 O----O\ des composésde formule III o R est CH3(CH2)10CONH-\ /-, 0 illustre le procédé de préparation d'un second groupe de composés de formule III. Préparation de référence 2 Préparation de l'acide N-(n-dodécanoyl)-paminobenzoigue On ajoute goutte à goutte 8,74 g (40 mmoles) de chlorure de n-dodécanoyle à une solution de 5,5 g (40 mmoles) d'acide paminobenzoique dissous dans 100 ml de pyridine. On agite le mélange pendant 3 heures et on le verse dans 3 litres d'eau. On filtre le précipité qui se forme et on le sèche sous vide et l'on obtient 11,01 g d'acide N-(n- dodécanoyl)-p-aminobenzoique. Préparation de référence 3 Préparation de l'ester 2,4,5-trichlorophénylique de l'acide N-(n-dodécanoyl)-paminobenzoique On dissout dans 250 ml de chlorure de méthylène 11,01 g (34,5 mmoles) d'acide N-(n-dodécanoyl)-p-aminobenzoïque, 7,5 g (38 mmoles) de 2,4,5-trichlorophénol et 6,94 g (34,5 mmoles) de N,N'dicyclohexylcarbodiimide. On agite le mélange à la température ambiante pendant 3 heures et demi, puis on le filtre. On évapore le filtrat sous vide pour obtenir un résidu qu'on cristallise dans un mélange acéto- nitrile/eau et l'on obtient 12,84 g de l'ester 2,4,5- trichlorophénylede l'acide N-(n-dodécanoyl)-p-aminobenzoïque. Exemple de Référence 7 Acylation du noyau de A-30912A On dissout 8,16 g (10,2 mmoles) de noyau de A-30912A et 4,72 g (10,2 mmoles) de l'ester 2,4, 5-trichlorophéhylique de l'acide N-(n-dodécanoyl)-p-aminobenzoique dans 100 ml de DMF. On agite la solution à la température ambiante pendant heures. On chasse le solvant sous vide pour obtenir un résidu qu'on lave deux fois avec de l'éther diéthylique. On rejette les liquides de lavage. On dissout le résidu lavé dans 50 ml de méthanol et on le purifie par CLPE en phase inversée à l'aide d'une unité "Prep LC/System 500" (Waters associates, Inc.) en utilisant une colonne Prep Pak-500/C18 (Waters Associates, Inc.,) comme phase fixe. On élue la colonne de façon isocratique avec un mélange 25:65:10 en volume d'eau, de méthanol et d'acétonitrile à 34,5 bars. On analyse les fractions par CCM en utilisant des plaques de gel de silice et un mélange 25:65:10 en volume d'eau, de méthanol et d'acétonitrile comme système solvant. On réunit les fractions contenant le produit désiré et on les lyophi- lise pour obtenir le dérivé N-(n-dodécanoyl)-p-amino- benzoylé du noyau de A-30912A (3,5 g). Exemple de Référence 8 Acylation du noyau de A-30912B On dissout dans 100 ml de diméthylformamide (10,2 mmoles) du noyaudeA-30912B et 10,2 mmoles d'ester 2,4,5- trichlorophénylique de l'acide N-(n-dodécanoyl)-p-amino- benzoique. On agite la solution à la température ambiante pendant 15 heures. On chasse le solvant sous vide pour obtenir un résidu qu'on lave deux fois avec de l'éther diéthylique. On rejette les liquides de lavage. On dissout le résidu lavé dans 50 ml de méthanol et on le purif4ie par CLPE en phase inversée à l'aide d'une unité "Prep LC/System 500" unit (Waters Associates, Inc.), en utilisant une colonne Prep Pak-500/C18 (Water Associates, Inc.) comme phase fixe. On élue la colonne de façon isocratique avec un mélange :65:10 en volume d'eau, de méthanol et d'acétonitrile à 34,5 bars. On analyse les fractions par CCM sur plaques de gel de silice et en utilisant comme systeme solvant un mélange 25:65:10 en volume d'eau, de méthanol et d'acéto- 63 2484451 nitrile. On réunit les fractions contenant le produit désiré et on les lyophilise pour obtenir le dérivé N-(n- dodécanoyl)-p-aminobenzoyle du noyau de A-30912B. Exemple de Référence 9 Acylation du noyau de A-30912D On dissout dans 100 ml de diméthylformamide (10,2 mmoles) du noyau de A-30912D et 10,2 mmoles d'ester 2,4,5- trichlorophénylique de l'acide N-(n-dodécanoyl)-p-amino- benzoique. On agite la solution à la température ambiante pendant 15 heures. On chasse le solvant sous vide pour obtenir un résidu qu'on lave deux fois avec de l'éther diéthylique. On rejette les liquides de lavage. On dissout le résidu lavé dans 50 ml de méthanol et on le purifie par CLPE en phase inversée à l'aide d'une unité "Prep LC/System 500' unit (Waters Associates, Inc.), en utilisantune colonne Prep Pak-500/C18 (Water associates, InC.) comme phase fixe. On élue la colonne de façon isocratique avec un mélange :65:10 en volume d'eau, de méthanol et d'acétonitrile à 34,5 bars. On analyse les fractions par CCM sur plaques de gel de silice et en utilisant comme système solvant un mélange 25:65:10 en volume d'eau, de méthanol et d'acéto- nitrile. On réunit les fractions contenant le produit désiré et on les lyophilise pour obtenir le dérivé N-(n- dodécanoyl)-p-aminobenzyle du noyau de A-30912D. Exemple de Référence 10 Acylation du noyau de A-30912H On dissout dans 100 ml de diméthylformamide, 10,2mmoles du noyau de A-30912H et 10,2 mmoles d'ester 2,4,5-trichloro- phénillque del' acide N-(n-dodécanoyl)-p-aminobenzoique. On agite la solution à la température ambiante pendant 15 heures. On chasse le solvant sous vide pour obtenir un résidu qu'on lave deux fois avec de l'éther diéthIylique. On rejette les liquides de lavage. On dissout le résidu lavé dans 50 ml de méthanol et on le purifie par CLPE en phase inversée à l'aide d'une unité "Prep LC/System 500" unit (Waters Associates, Inc.), en utilisant une colonne Prep Pak-500/C18 (Water Associates, in.), en utilisant une colonne Prep Pak-500/C18 (Water Associates, Inc.), comme phase fixe. On élue la colonne de façon isocratique avec un mélange 25:65:10 en 64 2484451 volume d'eau, de. méthanol et d'acétonitrile à 34,5 bars. On analyse les fractions par CCM sur plaques de gel de silice et en utilisant comme système solvant un mélange 25:65:10 en volume d'eau, de méthanol et d'acétonitrile. On réunit les fractions contenant le produit désiré et on les lyophi- lise-pour obtenir le dérivé N-(n-dodécanoyl)-p-aminobenzoylé du noyau de A-30912H. Exemple de Référence 11 On prépare le composé de formule III o R est un groupement isobutoxy et R est CH3(CH2)10CONH-eI 6e -, selon le mode opératoire de l'Exemple de Référence 9, mais en utilisant comme substance de départ le composé de formule I o R est un groupement isobutoxy (préparé par le procédé de l'Exemple 13). Exemple de Référence 12 Acylation du noyau de S 31794/F-1 On dissout dans 100 ml de diméthylformamide 10,2mmoles du noyau de S 31794/F-1 et 10,2 mmoles d'ester 2,4,5- trichlorophénylique de l'acide N-(n-dodécanoyl)-p-amino- benzoique. On agite la solution à la température ambiante pendant 15 heures. On chasse le solvant sous vide pour obtenir un résidu qu'on lave deux fois avec de l'éther diéthylique. On rejette les liquides de lavage. On dissout le résidu lavé dans 50 ml de méthanol et on le purifie par CLPE en phase inversée à l'aide d'une unité "Prep LC/System 500" unit (Waters Associates, Inc.) comme phase fixe. On élue la colonne de façon isocratique avec un mélange de 25:65:10 en volume d'eau, de méthanol et d'acétonitrile à 34,5 bars. On analyse les fractions par CCM sur plaques de gel de silice et en utilisant comme système. solvant un mélange 25:65:10 en volume d'eau, de méthanol et d'acéto- nitrile. On réunit les fractions contenant le produit désiré et on les lyophilise pour obtenir le dérivé N-(n-dodécanoyl)- p-aminobenzoyle du noyau de S 31794/F-1. Préparation d'un troisième groupe de dérivés Le mode opératoire suivant qui donne la préparation I des composés de formule III o R est CH3(CH2) 7O0-/ V.e illustre le procédé de préparation d'un troisième groupe de composés de formule III. Préparation de référence 4 Préparation de l'acide p-(n-octyloxv)benzolque On ajoute une solution de 19,2 g (150 mmoles) d'acide p-hydroxybenzolque dans 120 ml d'hydroxyde de sodium aqueux à 10 % à 480 ml de diméthylsulfoxyde (DMSO) préalablement chauffés à 80 C. On ajoute goutte à goutte à la solution 28,95 g (150 mmoles) de bromure de n-octyle. On agite le mélange réactionnel pendant 4 heures à la température ambiante, après quoi on le verse dans 1200 ml d'eau glacée. On ajoute 30 ml d'acide chlorhydrique concentré et on laisse le mélange reposer jusqu'à ce que la précipitation soit ter- minée. On recueille le précipité, on le sèche et on le cristallise dans un mélange acétonitrile/eau, p.f. 97-99 Co Analyse pour C15H2203: Calculée: C, 71,97; H, 8,86 Trouvée: C, 71,72; H, 9,10 Préparation de référence 5 Préparation de l'ester 2,4,5-trichlorophénylique de l'acide p(n-octyloxy)benzoique On dissout dans 200 ml de chlorure de méthylène 6, 18 g (24,7 mmoles) d'acide p-(n-octyloxy)benzoique, 5,39 g O (27,2 mmoles) de 2,4,5-trichloroph6nol et 4,94 g (24,7 mmoles) de N,N'dicyclohexylcarbodiimide. On agite le mélange à la température ambiante pendant 18 heures puis on le filtre. On évapore le filtrat pour obtenir une huile, qu'on cristallise dans un mélange d'acétonitrile et d'eau pour obtenir l'ester 2,4,5-trichlorophénylique de l'acide p-(n-octyloxy)benzoique. Analyse RMN: 4,02 (2H, t, J = 3Hz), 5 7,0 (1H, d, J= 4 Hz), 7,23 (s, 1H), 7,3 (s, 1H), 8,08 (d, 1H, J = 4 Hz). Exemple de Référence 13 Acylation du noyau de A-30912A On dissout dans 150 ml de diméthylformamide 14,2 g (17,8 mmoles) de noyau de A-30912A et 15,32 g (35,7 mmoles) d'ester 2,4,5-trichlorophénylique d'acide p-(n-octyloxy)- benzolque. On agite la solution à la température ambiante v 1 66 2484451 pendant 16 -20 heures. On chasse le solvant sous vide et on lave le résidu deux fois avec de l'éther diéthylique et deux fois avec du chlorure de méthylène. On rejette les produits de lavage. On dissout le résidu lavé dans 80 ml d'un mélange 1:3 d'acétate d'éthyle et de méthanol et on le purifie par CLPE en utilisant une unité "Prep LC/System 500" en utilisant du gel de silice comme phase fixe. On élue la colonne progressivement avec des systèmes solvants de 1:4 à 2:3 de méthanol et d'acétate d'éthyle. On analyse les fractions par CCM sur gel de silice (Merck) en utilisant comme système solvant un mélange 3:2 en volume d'acétate d'éthyle et de méthanol.- On réunit les fractions exemptes de noyau de A-30912A et on les lyophilise pour obtenir le dérivé p-(n- octyloxy)benzoylé du noyau de A-30912A; Rendement: 7,13 g; M+ + 23: 1052 (par SMAC). Exemple de Référence 14 Acylation du noyau de A-30912B On dissout dans 150 ml de DMF 17,8 mmoles de noyau de A-30912B et 35,7 mmoles d'ester 2,4, 5-trichlorophénylique d'acide p-(n-octyloxy)benzoique. On agite la solution à la température ambiante pendant 16 -20 heures. On chasse le solvant sous vide et on lave le résidu deux fois avec de l'éther diéthylique et deux fois avec du chlorure de méthylène. On rejette les liquides de lavage. On dissout le résidu lavé dans 80 ml d'un mélange 1:3 d'acétate d'éthyle et de méthanol et on le purifie par CLPE en utilisant une unité "Prep LC/System 500" et du gel de silice comme phase fixe. On élue la colonne par étapes avec des systèmes solvants 1:4 à 2:3 de méthanol et d'acétate d'éthyle. On analyse les fractions par CCM en utilisant du gel de silice (Merck) et un mélange 3:2 en volume d'acétate d'éthyle et de méthanol comme système solvant. On réunit les fractions exemptes de noyau de A-30912B et on les lyophilise pour obtenir le dérivé p-(n-octyloxy)benzoylé du noyau de A-30912B. Exemple de Référence 15 Acylation du noyau de A-30912D On dissout dans 150 ml de diméthylformamide 17,8 mmoles de noyau de A-30912D et 35,7 mmoles de l'ester 2,4,5- trichlorophénylique de l'acide p-(n-octyloxy)benzoique. On 67 2484451 agite la solution à la température ambiante pendant 16- 20 heures. On chasse le solvant sous vide et on lave le résidu deux fois avec de l'éther diéthylique et deux fois avec du chlorure de méthylène. On rejette les liquides de lavage. On dissout le résidu lavé dans 80 ml d'un melange 1:3 d'acétate d'éthyle et de méthanol et on le purifie par CLPE en utilisant une unité "Prep LC/System 500" et du gel de silice comme phase fixe. On élue la colonne progressivement avec des systèmes solvants 1:4 à 2:3 de méthanol et d'acétate d'éthyle. On analyse les fractions par CCM en utilisant du gel de silice (Merck) et un mélange 3:2 en volume d'acétate d'éthyle et de méthanol comme système-solvatt. On réunit les fractions exemptes de noyau de A-30912D et on les lyophilise pour obtenir le dérivé p-(n-octyloxy) benzoylé du noyau de A-30912D. Exemple de Référence 16 Acylation du noyau de A-30912H - On dissout dans 150 ml de diméthylformamide 17,8 mmoles de noyau de A-30912H et 35,7 mmoles de l'ester 2,4,5- trichlorophénylique de l'acide p-(n-octyloxy)benzoique. On agite la solution à la température ambiante pendant 16 - 20 heures. On chasse le solvant sous vide et on lave le résidu deux fois avec de l'éther diéthylique et deux fois avec du chlorure de méthylène. On rejette les liquides de lavage. On dissout le résidu lavé dans 80 ml d'un mélange 1:3 d'acétate d'éthyle et de méthanol et on le purifie par CLPE en utilisant une unité "Prep LC/System 500" et du gel de silice comme phase fixe. On élue la colonne progressivement avec des systèmes solvants 1:4 à 2:3 de méthanol et d'acétate d'éthyle. On analyse les fractions par CCM en utilisant du gel de silice (Merck) et un mélange 3:2 en volume d'acétate d'éthyle et de méthanol comme système solvant. On réunit les fractions exemptes de noyau de A-30912H et on les lyophilise pour obtenir le dérivé p-(n-octyloxy) benzoylé du noyau de A-30912Ho Exemple de référence 17 _ 3 On prépare le composé de formule III o R est un groupement n-hexy]oxy et R5 est C113(Cil2)70-. %-, en 0=/ 68 2484451 utilisant le mode opératoire de l'Exemple de Référence 16, mais en utilisant comme substance de départ le composé de formule I o R3 est-un groupement n-hexyloxy (préparé par le procédé de l'Exemple 15). Exemple de Référence 18 Acylation du noyau de S 31794/F-1 On dissout dans 150 ml de diméthylformamide 17,8 mmoles de noyau de S 31794/F-1 et 35,7 mmoles de l'ester 2,4,5- - trichlorophénylique de l'acide p-(n-octyloxy)benzoique. On agite la solution à la température ambiante pendant 16 - 20 heures. On chasse le solvant sous vide et on lave le résidu deux fois avec de l'éther diéthylique et deux fois avec du chlorure de méthylène. On rejette les liquides de lavage. On dissout le résidu lavé dans 80 ml d'un mélange 1:3 d'acétate d'éthyle et de méthanol et on le purifie par CLPE en utilisant une unité "Prep LC/System 500" et du gel de silice comme phase fixe. On élue la colonne progressivement avec des systèmes solvants 1:4 à 2:3 de méthanolet d'acétate d'éthyle. On analyse les fractions par CCM en utilisant du gel de silice (Merck) et un mélange 3:2 en volume d'acétate d'éthyle et de méthanol comme système solvant. On réunit les fractions exemptes de noyau de S 31794/F-1 et on les lyophi- lise pour obtenir le dérivé p-(n-octyloxy)benzoylé du noyau de S 31794/F-1. Exemple de Référence 19 L'activité antifongique des composés de formule III peut être démontrée in vitro par des essais de diffusion de disques et des essais de dilution sur gélose et in vivo par des essais classiques sur des souris qui montrent l'effica- cité vis-à-vis d'une infection fongique systémique. Les résultats des essais antifongiques des composés types de formule III sont donnés-dans les Tableaux IV à VIII. Les Tableaux IV et V donnent les résultats de l'essai in vitro descomposés des Exemples de Référence 1, 7 et 13 par des procédés de diffusion de disques sur plaques de gélose. L'activité dans le Tableau IV est mesurée par la dimension (diamètre en mm) de la zone d'inhibition du micro- organisme observéeque produit le composé d'essai. Dans le Tableau V, l'activité est mesurée par la concentration inhibitrice minimale (CIM) de la substance (mg/disque) nécessaire pour inhiber la croissance de l'organisme d'essaiL Le Tableau VI donne les résultats de l'essai in vitro du dérivé p-(n-octyloxy)benzoylé du noyau de A-30912A contre cinq souches de Candida albicans par le procédé de dilution sur gélose. Dans le Tableau VI, l'activité est mesurée par la CIM de la substance (mg/ml) nécessaire pour inhiber l'organisme d'essai. Les résultats d'essais in vivo pour déterminer l'effi- cacité des dérivés vis-à-vis d'une infection provoquée par Candida albicans A-26 chez des souris sont donnés dans le Tableau VII. Dans ces essais, l'activité est mesurée par la DE50 (c'est-à-dire la dose en mg/kg nécessaire pour guérir % des animaux d'essai). Quand on n'obtient pas de DE50, l'activité est indiquée par la plus faible dose à laquelle on observe un effet antifongique significatif. Dans ces essais, on infecte par voie intraveineuse avec Candida albicans A-26 des groupes de souris albinos mâles (exemptes de pathogènes particuliers) pesant 18à 20 grammes. On traite les animaux par rayons X 24 heures avant l'infection à environ 50 roentgens par minute pendant 8 minutes (dose totale de 400) pour réduire les réactions immunologiques à l'organisme infectieux. A 0, 4 et 24 heures après l'infec- tion, on donne à chaque groupe de souris des doses progres- sives par voie sous-cutanée du composé d'essai sous forme d'une suspension dans 33 % de polyéthylène glycol (PEG) dans de l'eau. On note le jour de la mort de chaque animal. Une comparaison statistique par l'essai "t" de Student du jour moyen de la mort est effectuée entre chaque groupe d'animaux infectés-traités à une dose particulière et un groupe de 10 animaux infectés-non traités pour déterminer si le traitement prolonge de façon significative la durée de survie. Le Tableau VIII donne les résultats de l'essai des composés des Exemples de Référence 1, 7 et 13 pour déterminer leur absorption après administration par voie orale. Dans ces essais, on gave des souris avec une dose de 416 mg/kg de composé d'essai en suspension dans un mélange de 33 % de PEG 400 et d'eau. A des intervalles de temps, on prélève des échantillons de sang du sinus orbital et on détermine leur activité antibiotique comme suit: on place un disque de 7 mm contenant 20 ml de sang entier sur de la gélose ensemencée avec Aspergillus montevidensis A35137. Après 40 heures d'incubation à 30'C, on compare les zones d'inhibition des échantillons de sang à un témoin obtenu à partir du composé d'essau, et on calcule la quantité du composé dans l'échantillon de sang. TABLEAU VIII Dérivés du noyau de A-30912A Taux dans le sang après administration orale chez les souris Exemple de Composés de formule III Référence 5 N R = Taux dans le sang* (mg/ml) 1 CH3(CH2)11- 0,10 A/0-0\ 7 CH3(CH2)10CONH-*O /- 0,83 13 CH3 (CH2) O-.-"/ 23, 13 23,3 2 * Quatre heures après administration par gavage du composé d'essai à une dose de 416 mg/kg sous forme d'une suspension du composé dans 33 % de PEG 400 dans l'eau. Composé déterminé par analyse biologique vis-à-vis d'Aspergillus montevidensis A-35137. Li CD TABLEAU VII Dérivés du noyau de A-30912A Activité thérapeutique vis-a-vis de Candida albicans chez les souris Exemple de Composés de Formule III Programme Dose active la plus Référence 5 de DE50 (mg/kg) faible N R = dose* (mg/kg) 1 CH3(CH2)11- B 34 20 7 CH3(CH2)10CONH-_ / A 15 10 e-e 15 >5 e-. 13 CH3(CH2)70-B\ - A 13 I10' 3e2 7 \0=6/ 22,2 >12,5 * Programmes de dose: A = 40, 20, 15 et 10 mg/kg; B = 80, 40, 20 et 10 mg/kg. Les doses sont administrées 0, 4 et 24 heures après l'injection sous forme d'une suspension du composé d'essai dans 30 % de PEG dans l'eau. Nombre de souris recevant les composés d'essai pour chaque dose: 6 souris par groupe. Nombre de souris dans le groupe témoin (non traité): 10 souris. ** Mesurée par augmentation de la durée de survie des animaux traités par rapport aux témoins, calculée par la méthode de L.J. Reed et H. Muench, Amer. J. Hygiene, 27, 493-497 (1938) C Ln 73 2484451 TABLEAU VI Activité in vitro du dérivé du noyau de A-30912A o R = CH3(CH2)7O A26 SBII 16 SBII 31 SBII 28 SBII 29 0,312 0,312 0,312 0,312 0,312- TABLEAU V Dérivés du noyau de A-30912A Activité antifongique par l'essai de diffusion de disque sur plaque de gélose Composés de Formule III CIM (mg/disque) Exemple de référence N Candida * albicans R = A-26 Trichophyton mentagrophytes # 6 CH3 (CH2)11- CH3 (CH2)10CONH-Q CH3(CH2)70 0,625 0,625 1,25 -CE 0,039 > 0,039 0,678 0,156 > 0,302(0,312)** * Les composés sont en suspension dans une solution de borate de sodium 0, 01M, pH 7,5. Les composés sont essayés à 20 mg/disque au niveau supérieur et à des doubles dilutions jusqu'à ce qu'on atteigne les points finals. Incubation: 24 heures à 300 C. - Ln ** vis-à-vis de 5 isolats TABLEAU IV Dérivés du noyau de A-30912A Activité antifongique par l'essai de diffusion de disque sur plaque de gélose Exemple de Référence N Composés de Formule III = R = Saccharomyces pastorianus X-52 Zone d'inhibition (mm)a Neurospora Trichophyton crassa mentagrophytes 846 A-23 CH3 (CH2)11- CH3 (CH2)10CONH- O CH3 (CH2) 70- Q 33* * * * 56* 23* * Zone d'inhibition mesurable distincte avec nouvelle croissance de l'organisme autour du disque. Les composés sont testés sous forme de suspensions méthanoliques à une concentration de 1 mg/ml en plongeant un disque de 7 mm dans la suspension et en le plaçant sur la surface de la gélose. Incubation: 24-48 heures à 25-37 C. Candida albicans A-26 a -J Ln REVENDICATIONS 1. Noyau peptidique cyclique de formule: I dans laquelle R est H ou OH et; quand R1 est H, R est H et ou tous deux OH, et R et R sont tous deux H 1 2 3 quand R est OH, R est H, R est OH ou un groupement alkyloxy en C1-C6 et R est OH, ou bien R est Il 3 4 -C-NH2 et R et R sont tous deux OH, et ses sels d'addition d'acides. 2. Noyau de A-30912A selon la Revendication térisé en ce que R1, R3 et R4 sont OH et R2 est H. 3. Noyau de A-30912B selon la Revendication térisé en ce que, dans la formule I, R et R sont H et R et R sont tous deux OH. 4. Noyau de A-30912D selon la Revendication térisé en ce que, dans la formule I, R1, R2 R et tous H: térisé OH, R2 5. Noyau de A-30912H selon la Revendication en ce que, dans la formule I, R1 et R sont est H et R est CH30-. 1, carac- 1, carac- tous deux 1, carac- R4 R sont 1, carac- tous deux 248'4451 6. Noyau de type A-30912H selon la Revendication 1, caractérisé en ce que, dans la formule I, R et R sont tous deux OH, R est H et R est un groupement alkyloxy en C1-C6. 7. Noyau de type A-30912H selon la Revendication 6, caractérisé en ce que R3 est un groupement éthoxy, n-propoxy, isopropoxy, n-butoxy, isobutoxy, t-butoxy, n-pentyloxy, n-hexyloxy, 2-éthyl-1-butoxy ou 3-méthyl-1-butoxy. 8. Noyau de S 31704/F-1 selon la Revendication 1, caractérisé en ce que, dans la formule I, R1, R3 et R sont 0 tous deux OH et R est -C-NH2. 9. Sels d'addition d'acides des noyaux selon l'une quelconque des Revendications 2 à 8. 10. Procédé de préparation d'un noyau peptidique cyclique de formule I et de ses sels d'addition d'acides, caractérisé en ce qu'il consiste à mettre en contact dans un milieu aqueux un antibiotique peptidique cyclique de formule CH3 HO,. R.3 R4 H HO- H *=.O R- \,./ -CH HO H -H ' \w-e/H _c/ 0.. x--o H \OH /= HO *N v*.' -.NH, -. H H o. o I OH Ii dans laquelle R est H ou OH et, quand R est H, R est H et R et R sont tous deux H ou tous deux OH et R est un groupement stéaroyle ou linoléoyle, et quand R est OH, R est H et R est OH, R est OH et R 7 8 2484451 est un groupement stéaroyle, linoléoyle ou palmitoyle, ou bien R3 est un groupement alkyloxy en Cl-C et R est un groupement stéaroyle ou linoléoyle, et o 1 3 4 2 f quand R, R et R sont OH et R est -C-NH2, R est un groupement myristoyle, avec une enzyme de désacylation produite par un microorganis- me de la famille des Actinoplanaceae. 11. Procédé selon la Revendication 10 pour préparer le noyau de A-30912A, caractérisé en ce qu'il consiste à mettre i 3 4 2 les antibiotiques de formule II o R, R et R sont OH, R est H et R est un groupement linoléoyle, stéaroyle ou palmitoyle, en contact avec une enzyme de désacylation pro- duite par un microorganisme de la famille desActinoplanaceae. 12. Procédé selon la Revendication 10 pour préparer le noyau de A-30912B, caractérisé en ce qu'il consiste à mettre l'antibiotique de formule II o R et R sont tous deux H et 3 4 R et R sont tous deux OH et R est un groupement stéaroyle ou linoléoyle, en contact avec une enzyme de désacylation produite par un microorganisme de la famille des Actino- planaceae. 13. Procédé selon la Revendication 10 pour préparer le noyau de A-30912D, caractérisé en ce qu'il consiste à mettre 1 2 3 4 l'antibiotique de formule II o R, R, R et R sont H et R est un groupement stéaroyle ou linoléoyle, en contact avec une enzyme de désacylation produite par un microorganisme de la famille des Actinoplanaceae. 14. Procédé selon la Revendication 10 pour préparer le noyau de A-30912H, caractérisé en ce qu'il consiste à mettre l'antibiotique de formule II o R et R4 sont OH, R est H, R est CH30 et R est un groupement stéaroyle ou linoléoyle, en contact avec une enzyme de désacylation produite par un microorganisme de la famille des Actinoplanaceae. 15. Procédé selon la Revendication 10 pour préparer un noyau de type A30912H, caractérisé en ce qu'il consiste à mettre l'antibiotique de formule II o R et R sont OH, R est H, R est un groupement alkyloxy en C2C et R est un 2 6 groupement stéaroule ou linoléoyle, en contact avec une enzyme de désacylation produite par un microorqanisme de la 79 2484451 famille des Actinoplanaceae. 16. Procédé selon la Revendication 10 pour préparer le noyau de S 31794/F1, caractérisé en ce qu'il consiste à mettre l'antibiotique de formule II dans laquelle R1, R3 et O 4 2 t R sont OH, R est -C-NH2 et R est un groupement myristoyle, en contact avec une enzyme de désacylation produite par le microorganisme de la famille des Actinoplanaceae. 17. Procédé selon l'une quelconque des Revendications 10 à 16, caractérisé en ce que le microorganisme de la famille des Actinoplanaceae est un membre du genre Actino- planes. 18. Procédé selon l'une quelconque des Revendications à 17, caractérisé en ce que le microorganisme est Actinoplanes utahensis. 19. Procédé selon la Revendication 18, caractérisé en ce que le microorganisme est A. utahensis NRRL 12052 ou un de ses mutants producteurs de l'enzyme. 20. Procédé selon la Revendication 19, caractérisé en ce que le microorganisme est A. utahensis NRRL 12052. 21. Procédé selon la Revendication 10, caractérisé en ce que le microorganisme est Streptosporangium roseum var. hollandensis NRRL 12064, ou un de ses mutants producteurs de l'enzyme. 22. Procédé selon la Revendication 21, caractérisé en ce que le microorganisme est Streptosporangium roseum var. hollandensis NRRL 12064. 23. Procédé selon la Revendication 17, caractérisé en- ce que le microorganisme est Actinoplanes missouriensis NRRL 12053 ou un de ses mutants producteurs de l'enzyme. 24. Procédé selon la Revendication 23, caractérisé en ce que le microorganisme est Actinoplanes missouriensis NRRL 12053. 25. Procédé selon la Revendication 17, caractérisé en ce que le microorganisme est Actinoplanes sp. NRRL 12065 ou un de ses mutants producteurs de l'enzyme. 26. Procédé selon la Revendication 25, caractérisé en ce que le microorganisme est Actinoplanes sp. NRRL 12065. 2484451 27. Procédé selon la Revendication 17, caractérisé en ce que le microorganisme est Actinoplanes sp. NRRL 8122 ou un de ses mutants producteurs de l'enzyme. 28. Procédé selon la Revendication 27, caractérisé en ce que le microorganisme est Actinoplanes sp. NRRL 8122. 29. Procédé selon l'une quelconque des Revendications ou 17 à 28, caractérisé en ce que l'enzyme est présent dans une culture du microorganisme Actinoplanaceae producteur. 30. Procédé selon l'une quelconque des Revendications à 29, caractérisé en ce qu'il comprend l'étape supplémen- taire de séparation du noyau peptidique cyclique ou d'un de ses sels, à partir du milieu de fermentation. 31. Procédé selon l'une quelconque des Revendications 10 à 30, caractérisé en ce qu'il comprend l'étape supplémen- taire de purification du noyau péptidique cyclique, ou d'un de ses sels.