FR 2480307 A1 19811016 FR 8107492 A 19810414 La présente invention concerne un procédé pour la pro- duction de L-proline par fermentation et, en particulier, un procédé pour produire la L-proline avec un micro-organisme construit par une technique de recombinaison de gènes. La plupart des souches sauvages de micro-organismes ne produisent pas de L-proline dans le milieu. Pour rendre une souche sauvage capable de produire la L-proline à partir des hydrates de carbone, il a été nécessaire d'induire des mutants artificiels à partir de la souche sauvage. Il existe de nombreux mutants artifi- ciels producteurs de méthionine connus. Les mutants connus caracté- ristiques producteurs de proline sont les suivants: Mutant de Brevibacterium flavum qui a besoin d'iso- leucine ou d'arginine (brevet des Etats-Unis d'Amérique 3 329 577), mutant de Micrococcus glutamicus qui a besoin d'isoleucine (brevet britannique n 1 172 903), mutant de Kurthia catenaforma (brevet britannique n 1 186 270), mutant de Microbacterium ammoniaphilum (publication de demande de brevet japonais examinée n' 38876/1973), mutant du genre Brevibacterium ou Corynebacterium résistant aux sulfamides (brevet des Etats-Unis d'Amérique n 3 819 483), mutant de Corynebacterium melassecola qui a besoin de tyrosine et de phényl- alanine (publication de demande de brevet japonais examinée n0 33190/1976), mutant du genre Corynebacterium qui a besoin d'homo- sérine (publication de demande de brevet japonais non examinée n0 41386/1979), et mutant du genre Brevibacterium ou Corynebacterium résistant à la 3,4-déshydroproline (publication de demande de brevet japonais non examinée n 105293/1979). On sait en outre qu'un mutant d'Escherichia coli sécrète de la L-proline, voir Biochim. Biophys. Acta, 104, page 395 (1965). Le producteur de proline le plus efficace, à la connaissance de la demanderesse, est Brevibacterium flavum FERM-P 4371, qui produit 3,6 g/dl de L-proline à partir de 10 g/dl de glucose. Il est devenu cependant difficile d'augmenter les ren- dements en L-proline en utilisant les techniquesde mutation artifi- cielles. Il existe donc constamment un besoin de mettre au point un nouveau procédé pour la production de L-proline avec des rendements élevés. L'invention a donc pour objet un procédé pour la produc- tion de L-proline avec des rendements élevés. Cet objet et d'autres objets de l'invention, qui appa- raîtront plus facilement ci-après ont été obtenus par un procédé qui consiste: à cultiver dans un milieu de culture un micro-organisme producteur de L-proline qui est obtenu par incorporation, dans une souche réceptrice du genre Escherichia, d'un plasmide hybride dans lequel est inséré un fragment d'ADN portant une information géné- tique relative à la production de L-proline, qui est dérivé d'une souche de donneur d'ADN du genre Escherichia qui est résistante à l'éthionine et à récupérer de la L-proline accumulée dans le milieu de culture. La souche de donneur d'ADN utilisée pour construire le producteur de Lproline de l'invention est un mutant du genre Escherichia résistant aux analogues de la proline et capable de produire la L-proline. On utilise de préférence comme donneur d'ADN des souches ayant une productivité supérieure de L-proline. L'analogue de L-proline de l'invention inhibe la crois- sance de souches d'Escherichia, cette inhibition étant cependant supprimée lorsque la L-proline coexiste dans le milieu. Des exemples des analogues de proline sont la 3,4- déshydroproline et l'acide azétidine-2-carboxylique. En vue d'augmenter la production de L-proline du mutant comme ci-dessus, il est efficace de faire en sorte que le mutant ait besoin, pour sa croissance, d'un aminoacide tel qu'isoleucine, histidine, ornitine, arginine, méthionine et leucine. La production de L-proline est également augmentée lorsque l'on confère au mutant la résistance aux sulfamides tels que la sulfaguanidine. L'ADN chromosomique est extrait du donneur d'ADN de manière bien connue et traité avec une endonucléase de restriction par un procédé bien connu (Biochem. Biophys. Acta 383, page 457 (1975)). Le plasmide-ADN ou ADN-phage utilisé comme vecteur dans le procédé de synthèse est également traité de manière analogue par une endonucléase de restriction. On peut utiliser divers types d'endonucléases de restriction si la digestion de l'ADN chromoso- 24803037v mique est effectuée partiellement. Ensuite, l'ADN chromosomique digéré et l'ADN vecteur sont soumis à une réaction de "ligation" (fixation). La recombinaison de 1'ADN pour préparer le plasmide recombinant peut être effectuée par introduction, avec la transfé- rase terminale, d'acide désoxyadénylique et d'acide désoxythymidy- lique ou d'acide désoxyguanylique et d'acide désoxycytldylique dans le fragment d'ADN chromosomique et l'ADN vecteur scindé, et en soumettant le fragment d'ADN chromosomique modifié et l'ADN vecteur scindé à une réaction d'annellation. Commea ADN vecteur convenable,-on peut utiliser un vec- teur classique tel que Col El, PsC 101, pBR 322, pACYC 177, pCR 1, PR6K( ou X-phage, ou leurs dérivés. L'ADN hybride ainsi obtenu peut Atre incorporé dans un micro-organisme du genre Escherichia par des technique classiques de transformation, voir J. Bacteriol., 119, page 1072 (1974). Le transformant désiré est sélectionné en utilisant un milieu sur lequel ne peut pousser qu'un clone ayant les caractéristiques de production de L-proline provenant du fragment d'ADN chromosomique ou celles provenant de l'ADE vecteur, ou les unes et les autres. Comme micro-organisme rêcepteurde l'ADN hybride, on utilise ordinairement un auzotrophe de L-proline puisqu'il est clas- sique de distinguer le transformant producteur de proline du récep- teur. I1 est souhaitable, pour obtenir de meilleurs résultats, d'uti- liser comme récepteur un mutant possédant déjà une productivité supérieure de L-proline. Les procédés de culture des souches productrices de L-proline ainsi obtenues sont classiques et semblables aux procédés pour la culture des micro-organismes producteurs de L-proline connus. Donc, le milieu de culture utilisé est un milieu classique contenant des sources de carbone, des sources d'azote, des ions inorganiques et, si nécessaire, de plus faibles quantités d'agents nutritifs organiques, tels que vitamines ou aminoacides. Des exemples de sources de carbone appropriées comprennent le glucose, le saccha- rose, le lactose, l'hydrolysat de ma%2s et les mélasses. On peut uti- liser commie sources d'azote l'ammoniac gazeux, l'ammoniaque aqueuse et lae sels dl'muoniua et d'& tres substances azotées, La culture des micro-organismes recombinants est effec- tuée en conditions aérobies, le pH et la température du milieu étant ajustés a une valeur convenable et maintenus jusqu'à ce que la for- mation de L-proline cesse. La L-proline accumulée dans le'milieu de culture peut être récupérée par des procédés classiques. Par le procédé de la présente invention, on peut pro- duire la L-proline avec des rendements plus élevés que ceux obtenus dans les procédés connus précédemment, dans lesquels on utilise des mutants artificiels d'Escherichia. Les exemples suivants illustrent l'invention sans toute- fois en limiter la portée. EXEMPLE 1 (1) Préparation d'ADN chromosomique possédant l'information géné- tique relative à la production de L-proline. Dans 1 litre de milieu L contenant 1 g/dl de peptone, 0,5 g/dl d'extrait de levure, 0,1 g/dl de glucose, 0,5 g/dl de NaCl (ajusté à pH 7,2), on cultive à 37QC pendant 3 h, en agitant, Escherichia coli EG-19 (NRLL B-12394), mutant résistant à la S-(2- aminoéthyl)-cystéine (AEC) et à la 3,4-déshydroproline et induit à partir de K-12 (ATCC 10798), et on récolte les cellules bactériennes dans la phase de croissance exponentielle. On extrait l'ADN chromo- somique par une méthode classique au phénol et on obtient 3,4 mg d'ADN purifié. (2) Préparation d'ADN vecteur. On prépare comme vecteur l'ADN du plasmide pBR 322 qui contient comme éléments constitutifs les gènes de résistance à l'ampicilline et à la tétracycline, de la manière suivante: On fait incuber à 37 C une souche d'Escherichia coli K-12 recevant le plasmide pBR 322 dans 1 litre d'un milieu glucose- "casaminoacide"-sels inorganiques contenant 2 g de glucose, 1 g de NH4Cl, 6 g de Ne2HP04, 3 g de Kil P04, 5 g de NaCl, 0,1 g de MgS04, 7H20, 0,015 g de CIC12,2H20, 20 g de "casam'inoacide" (hydrolysat de caséine et 100 7 de chlorhydrate de thiamine par litre (ajusté à pH 7,2). Apres avoir fait incuber la souche jusqu'à la fin de la phase logarithmique, on ajoute au milieu de culture 170 7/ml de chloramphénicol. Par ce procédé. iADN de plasmide s'est développé et accumulé abondamment dans les cellules bactériennes. Après 16 h d'incubation, on récolte les cellules que l'on lyse ensuite par traitement par le lysozyme et le SDS(dodécyl- sulfate de sodium). On centrifuge le lysat à 30 OOOxg pendant 1 h pour obtenir la liqueur surnageante. Après concentration de la liqueur surnageante, on obtient 480 7 de l'ADN de plasmide en uti- lisant la centrifugation dans un gradient de densité chlorure de césium-bromure d'éthidium jusqu'a l'équilibre. (3) Insertion du fragment d'ADN chromosomique dans le vecteur. On traite 10 Y de l'ADN chromosomique avec l'endonu- cléase de restriction Hind III à 37 C pend*nt 5, 10, 20, 30 ou 60 min pour scinder les chaînes d'ADN, et on chauffe ensuite à 65 C pendant min, respectivement. On traite également 10 T de l'ADN vecteur avec une endonucléase de restriction Hind III à 37 C pendant 1 h pour scinder complètement l'ADN et on chauffe ensuite à 65 C pendant 5 min, respectivement. On mélange la solution d'ADN chromosomique digéré et la solution d'ADN vecteur scindé et on soumet à la réaction de liga- tion de fragments d'ADN par une ligase de l'ADN phage T4 en présence d'ATP et de dithiothréitol à 10 C pendant 24 h. On chauffe ensuite le mélange de réaction a 65 C pendant 5 min, et on ajoute deux fois son volume d'éthanol. On récupère l'ADN recombinant précipité. (4) Transformation génétique par le plasmide hybride recevant l'in formation génétique relative à la production de proline. On cultive les souches mutantes n0 19(NRRL B-12394) et n 30 (NRRL B-12396) qui sont résistantes à la S-(2-aminoéthyl)- cystéine et à la sulfaguanidine, respectivement, qui proviennent d'Escherichia coli K-12 par mutagénèse par la N-méthyl-N'-nitro-N- nitrosoguanidine dans 10 ml de milieu L et on cultive à 37 C en agitant. On récolte les cellules dans la phase de croissance exponen- tielle et on les met en suspension dans une solution de MgC12 O,lM et, ensuite, dans une solution de CaC12 O,1M au bain de glace; on prépare ainsi les cellules "compétentes" capables de fixer l'ADN. Dans la suspension de cellules compétentes, on ajoute l'ADN obtenu à l'étape (3) qui contient l'ADN de plasmide hybride. On maintient la suspension au bain de glace pendant 30 min, puis on chauffe a 42 C pendant 2 min, et on laisse à nouveau reposer au bain de glace pendant 30 min; les cellules contenant ainsi 1'ADN de plasmide hybride sont inoculées dans le milieu L et on agite le milieu a 37 C pendant 2 h; la réaction de transformation est ainsi terminée. On récolte les cellules, on les lave et on les remet en suspension. On étale une faible portion de la suspension de cel- lules sur une plaque de gélose contenant 2 g de glucose, 1 g de (NH4)2S04, 7 g de K2HP04, 2 g de KH2P04, O, lg de MgS04,7H20, 0,5 g de citrate de sodium,2H20, 0,5 g de S-(2aminoéthyl)-cystéine,HCl, et 2 g de gélose par litre et contenant en outre 20 7/ml d'ampicil- line par litre (ajustée à pH 7,2). On fait incuber la plaque à 37 C. Après 3 jours d'incubation, on prélère toutes les colonies apparaissant sur la plaque, on les purifie et on les isole. On obtient comme transformantsdes colonies qui sont résistantes à la fois a l'ampicilline et à la S-(2-aminoéthyl)-L- cystéine et capables de produire la L -proline. La résistance à l'ampicilline (50 7/ml et à la S-(2-aminoéthyl)-L-cystéine (500 '/ml) est essayée avec un milieu L-gélose, et on examine la production de L-proline par culture à 31 C pendant 72 h. On obtient les transformants AJ 11543 (FERM-P 5483 et NRRL B-12403) AJ 11544 (12404) a partir des souches réceptrices n 19 et 30, respectivement. (5) Production de la L-proline par la nouvelle souche productrice de Lproline. Le tableau ci-après indique les résultats expérimentaux de la production par fermentation de L-proline en utilisant les souches AJ 11543 et AJ 11544. Le milieu de fermentation contient 5 g/dl de glucose, 2,5 g/dl de sulfate d'ammonium, 0,2 g/dl de KH2P04, 0,1 g/dl de MgSO4,7H20, 0,05 g/dl d'extrait de levure, 1 mg/dl de chlorhydrate de thiamine, 1 mg/dl de FeSO4,7H20, 1 mg/dl de MnSO4,4H20 et 2,5 g/dl de CaCO3 (stérilisé séparément) et le pH est ajusté à 7,0. On place des lots de 20 ml de-milieu de fermentation dans des ballons de 500 ml inoculés chacun au moyen d'une boucle de platine avec l'inoculum du micro-organisme d'essai, et on effectue la culture à 31 C pendant 72 h. La quantité de L-proline dans la liqueur surnageante du bouillon de fermentation est déterminée par dosage microbiologique. TA7LA T A L EA U Miero-organisme essayé Quantité de L-proline accumulée (mg/dl) EG-19 08 n 19 O n 30 O AJ 11543 15,O AJ 11544t 25,0 R E V E N D I C A T I O N S 1 --Procédé pour la production de L-proline par fer- mentation, caractérisé en ce que l'on cultive dans un milieu de cul- ture un micro-organisme producteur de L-proline et on recueille la Lproline accumulée dans le milieu de culture, ledit micro-organisme étant obtenu par incorporation, dans une souche réceptrice du genre Escherichia, d'un plasmide hybride dans lequel est inséré un fragment d'ADN portant l'information génétique relative à la production de L-proline, ledit fragment étant dérivé d'une souche donneur du genre Escherichia qui est résistante à un analogue de la proline. 2 - Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que ladite souche réceptrice appartient au genre Escherichia coli. 3 - Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que ladite souche donneur appartient au genre Escherichia coli. 4 - Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que ladite souche réceptrice est Escherichia colt K-12 ou un de ses mutants. - Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que ladite souche donneur est Escherichia coli K-12 ou un de ses mutants. 6 - Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que ledit plasmide hybride est dérivé de pBR 322.