FR 2485925 A1 19820108 FR 8017656 A 19800811 i La présente invention concerne des composés nouveaux à acti- vité mucolytique topique, en particulier sur les sécrétions des voies respiratoires, composés qui ne sont pas absorbés par les tissus avec lesquels ils entrent en contact, mais parviennent éventuellement sans être modifiés dans le système gastro-intesti- nal oh ils sont métabolisés sous forme de produits non toxiques, complètement éliminables. L'invention concerne en outre le procédé pour la préparation de ces nouveaux agents mucolytiques et les compositions thérapeu- tiques à activité mucolytique, en particulier dans les affections des voies respiratoires, qui contiennent un composé nouveau sui- vant l'invention en tant que principe actif. Plus précisément, la présente invention a pour objet de nouveaux agents mucolytiques macromoléculaires, de poids molécu- laire compris entre 10 000 et 300 000, constitués par des hydrates de carbone formant la structure de base à laquelle sont liés, par l'intermédiaire de chaînes aliphatiques appropriées, des groupes sulfhydryles -SH et des enzymes à action protéolytique. On sait que, dans le domaine médical, le problème des affec- tions des voies respiratoires avec les sécrétions de mucus qui en résultent est toujours un problème de vaste portée, pour lequel on n'a pas encore trouvé de médicament résolutif (The American Journal of Medicine, vol. 49, juillet 1970, pages 1 à 4: 'The appropriate use of mucolytic agents"). En particulier, le problien s'aggrave et le mucus est plus difficile à éliminer lorsqu'il s'agit de mucus purulent. Parmi les médicaments connus jusqu'à maintenant, dotés d'ac- tivité mucolytique, tant sur le mucus purulent que sur le mucus non purulent, le plus connu est la N-acétyl-cystéine; mais cette substance présente un certain nombre d'inconvénients majeurs: elle a une odeur désagréable; elle peut provoquer des broncho- spasmes; lorsqu'elle est vaporisée en doses assez fortes, elle a un effet irritant et provoque des quintes de toux. En outre, elle a une action inhibitrice sur les antibiotiques, ce qui fait qu'elle ne peut pas être utilisée en combinaison avec ceux-ci. Plus récemment, de bons résultats ont été obtenus dans l'attaque du mucus purulent par l'emploi des enzymes protéolyti- ques comme la trypaine, la chimotrypsine et les désoxyribonucléa- ses. Parmi ces enzymes, la trypsine et la chimotrypaine agissent à la fois sur le mucus ordinaire et sur le mucus purulent,- tandis que la désoxyribonucléase n'agit que sur le mucus purulent. Tou- tefois, l'emploi de ces enzymes a été formellement déconseillé, en raison du fait qu'ils sont absorbés par les tissus des voies respiratoires, provoquant une irritation du pharynx et une action protéolytique diffuse sur le sang et dans les tissus pulmonaires, chez les sujets dotés d'une faible activité alpha-antitrypsinique. Etant donné qu'il est apparu que les malades atteints d'affection pulmonaires ont fréquemment une activité alpha-antitrypsinique déficiente, on a pratiquement abandonné l'utilisation des enzymes comme mucolytiques, à moins qu'il ne s'agisse de sujets soumis à un contrôle médical continu. Or, il a été découvert - et cela fait l'objet de la présente invention des produits mucolytiques nouveaux, tant pour le mucus purulent que pour le mucus non purulent, qui ne sont pas absorbés à travers les muqueuses des voies respiratoires et, par conséquent, ne donnent lieu à aucun effet protéolytique ou allerg- que parallèle, ni de type inflammatoire, ni de type hémolytique. En outre, les nouvea-x produits sont compatibles avec les antibio- tiques. Les nouveaux produits faisant l'objet de la présente inven- tion sont représentés par la formule générale: E- B Y -Y - SHE.J (c2-CH)= - (CE2-CH)- H (I) R. R2 dans laquelle - A - B - représente le radical d'un hydrate de carbone, avec A = B ou A À B; Y = radical capable d'unir les groupes sulfhydryle aux molécules de l'hydrate de carbone; R3 = reste de R1,R1 = groupe fonctionnel capable d'unir l'enzyme aux macromolécules de synthèse; E = radical enzymatique; R2 - groupe fonctionnel destiné à régler la solubilité du produit; n = 1 à 2000; m = 0 à 1000; w = 1 à 100; z = 0 à 10, étant enten- du que chaque unité d'hydrate de carbone peut porter un ou plusieurs radicaux enzymatiques, un ou plusieurs groupes sulfhy- dryle ou encore des radicaux différents, non essentiels auxfins de la présente invention. Le radical hydrate de carbone -A - B - est de préférence le radical d'un diholoside comme le saccharose ou le cellobiose, d'un oligoholoside contenant 3 à 6 unités d'oses, ou d'un poly- oside de bas poids moléculaire, ne dépassant généralement pas 000. Le radical enzymatique E est le radical d'un enzyme p1ot&>r lytique, de préférence la trypsine, la chimotrypsine, la désoxy- ribonucléase, la streptokinase, la neuroamidase, la bromexine,la papaine. R. et R2, semblables ou différents, sont de préférence: -CO0H, -CC0001, -CONEH2, -C000CH3, -C0-00CH2--CH-2, -C0-0CH2-CH-/H, -CN03, -CHO. 0 S La solubilité ou la dispersabilité des nouveaux produits peut être contrôlée en réglant le type et la quantité desgroupes R2 présents dans la macromolécule. Les cha nes aliphatiques Y, lorsque z est différent de zéro, sont choisies de préférence dans le groupe constitué par ,-0-,oH-%- -0H2-CH2-CH2-, -Ch2-CH- 2 -00-CH2-, -_0-CH-CH2-. OH NH2 Les radicaux enzymatiques sont dérivés de préférence sur les hydroxyle1 secondaires de l'hydrate de carbone, tandis que les groupes -SH sont fixés de préférence sur les hydroxyle. pri- maires. Les nouveaux produits faisant l'objet de la présente inven- tion sont préparés suivant un procédé en plusieurs phases, qui comprend essentiellement une réaction de copolymérisation d'un hydrate de carbone avec des monomères vinyliques, une réaction avec un enzyme protéolytique et une réaction de sulfhydrylation. Dans l'essentiel, le procédé suivant l'invention consiste A faire réagir un hydrate de carbone choisi dans le groupe cons- titué par des diholosides, des oligoholosides à 3-6 unités et des polyosides dont le poids moléculaire ne dépasse généralement pas 10 000, simples ou sulfhydrylds, avec un ou plusieurs ccmposés vinyliques de formule: C2= OH 2 C, * 2 " = CH, E, R, R2 et RE ayant les significations Rl R2 R3. données ci-dessus. Dans le cas o les monomères vinyliques ne contiennent pas de radicaux enzymatiques, le polymère obtenu de formule -- A - B - Yz - SH 7w - n (C - H (II) R "R2 est mis en réaction, directement ou par l'intermédiaire de compo- sés bifonctionnels appropriés, avec un enzyme à action protéoly- tique directe lorsque z est différent de O ou, lorsque Z = 0, il est sulfhydrylé avant ou après sa réaction, directe ou par l'in- termédiaire de composés bifonctionnels appropriés, avec un enzyme à action protéolytique directe. Chacune des phases indiquées schématiquement ci-dessus peut être réalisée suivant diverses variantes qui sont récapitulées ci-après en considérant, pour plus de clarté et de simplicitéun diholoside. 1) On fait réagir l'hydrate de carbone avec un ou plusieurs monomères vinyliques, en milieu aqueux ou aqueux-organique, en appliquant des mécanismes de déclenchement de type radicalaire, comme on en obtient par exemple en utilisant comme initiateur un sel de Ce4+ ou de V5+, ou un système oxydo-réducteur du type Fe++/H202, Na2S203/202, Na2S203/Na2S208, R-SH/H202 ou similaires; ou bien en appliquant des réactions de transfert ou de décomposi- tion de groupes fonctionnels peroxydiques, de sels de diazonium présents sur des hydrates de carbone dérivés; ou encore en appli- quant des rayonnements ionisants ou des rayonnements UTV en pré- sence de photo-sensibilisateurs. H- A -B - H + n(0H2C= CH) + m(CH2= CH) - ---- I t H 1 R2 E- A - B - (I) 0H2-..CH-(0H2-OH)1- oH-c-(0H2-CH):)m-l H dans laquelle ' et R2, qui peuvent être semblables ou diffrerents, ont les significations données précédemment. La chaîne du polymère synthétique, dans le cas o l'on utili- 4+ se un sel de Ce comme initiateur, est liée à l'oxygène bydroxy- lique du carbone en position 2 ou 3 du composant hexose et/ou pentose du diholoside (II). Avec d'autres systèmes de déclenche- ment, il est plus difficile d'établir le point d'attaque de la macromolécule synthétique. Le poids moléculaire de la composante synthétique du produit obtenu est compris entre S0 000 et 300 000. Si l'on opère en milieu aqueux, on favorise la formation de peu de chaînes poly- vinyliques de poids moléculaire relativement élevé; si l'on opère en milieu aqueux-organique, on favorise la formation d'un nombre relativement grand de chaînes polyvinyliques de poids moléculaire relativement bas. Les solvants organiques qui peuvent être utilisés sont de préférehce le méthanol, l'acétone, le tétrahydrofuranne, le dimé- thylformamide, l'acétonitrile ou similaires. Pour obtenir des composés de poids moléculaire relativement élevé, il faut opérer dans un mélange de solvants comprenant de 90 à 50 parties en poids de H20 et de 10 à 50 parties de solvant organique. L'hydrate de carbone et le composé vinylique sont mélangés dans des rapports en poids compris entre 0,3 et 3,0. Le catalyseur est utilisé avec un rapport en poids de 3 à 50 % sur laase de l'hydrate de carbone. La réaction est menée à la température am- biante et à un pH fortement acide, se situant de préférence entre 1 et 2. Le pH est réglé par addition d'un acide minéral. A titre de variante de la première phase, il est possible de ramifier l'enzyme avec un monomère vinylique du type CH2=C-R4 (R4 = EH, 3 et R1 ayant la signification donnée 1 précédemment), puis de copolymériser l'enzyme ramifié ainsiobtenu avec l'hydrate de carbone. La réaction entre enzyme et composévi- nylique est conduite dans les conditions de pH, de temps et de température propres à favoriser la réaction de liaison entre com- posé vinylique et enzyme sans réduire considérablement l'activité enzymatique de ce dernier. En général, la réaction est menée à un pH compris entre 5 et 9, avec une durée comprise entre 30nn et 24 h et à une température se situant entre 4 et 25 C0. La réaction de copolymérisation de l'enzyme ramifié avec l'hydrate de carbone est généralement conduite dans les mêmes conditions adoptées pour la réaction de copolymérisation du mono- mère vinylique avec l'hydrate de carbone. 2) Dans le cas o le monomère vinylique n'a pas été mis préala-- blement en réaction avec l'enzyme, le copolymère résultant de la réaction entre l'hydrate de carbone et le composé vinylique est mis en réaction, directement ou par l'intermédiaire de composés bifonctionnels appropriés, avec un enzyme à action protéolytique directe. Puisque 1' enzyme réagit le plus souvent par les groupes amines libres, si R = COOH dans le composé de formule (II), on peut faire réagir ce composé directement avec l'enzyme,en solutio., en présence d'un agent de condensation approprié comme par exemple un carbodiimide, de telle sorte qu'il se forme, entre les macro- molécules et l'enzyme, des liaisons de type amidique, -C0-lE. Si E = CHO, on peut également dans ce cas faire réagir directement le composé (II) avec l'enzyme, avec laquelle il se forme des liaisons de type iminique, -OH=NH qui peuvent être réduites, avec des réducteurs appropriés, en liaisons de type -CO -NE2. Par contre, dans le cas o 1 = -CON H dans le composé (II), il sera nécessaire de le faire réagir avec un réactif bifonction- nel, comme par exemple une dialdéhyde, pour donner un composé de formule: H-A- B - H CH2- oCH - (o%- ?H)n-l-H (III) CO CO - N = CH (H2)p- CHO : = C (o)p- COHO dans laquelle n a la signification donnée précédemment, p = nombre entier de O à 5. Les groupes OHO d'extrémité ainsi introduits réagissent avec les groupes amines de l'enzyme, en formant des liaisons iminiques du type -OH = N-E. La réaction entre composé (II) et dialdéhyde est conduite dans un solvant aqueux, à une température comprise entre 20 et 4020 et avec une durée comprise entre 2 et 48 h. Après séparation des produits n'ayant pas réagi, la réaction avec l'enzyme est menée dans des conditions de pH entre 6 et 8,e température entre 4 et 2520 et de durée entre 2 et 24 h, la quan- tité d'enzyme étant en rapport avec la quantité d'enzyme que lbn veut immobiliser. A titre de variante, les groupes R = -CO-NH2 du composé(IIj peuvent être transformés en groupes azides par réaction avec l'hydrazine, puis avec l'acide nitreux selon le schéma suivant: H-A-B-H H2N-1E2 H-A-B-H 0H2-OH- -N _HNHOH ! I CO CO NH2 NH-NH2 H-A-B-H H-A-B-H H2N-E, CH2- OHCE., - CH2 - CO CO-N-E NS On mène la réaction avec l'hydrazine 6M à 5020 pendant 6 à 24 h en dialysant le produit obtenu, en dissolvant l'hydrazide dans HO1 à 0-2 0, en ajoutant goutte à goutte une solution de NaN02 et en purifiant dans l'acétone refroidie (20 C) le produit de la réaction. On fait réagir le composé azide avec l'enzyme en phase aqueuse à un pH compris entre 7 et 8, à une température de 4aQ environ, pendant 2 à 24 h. 3) Le copolymère obtenu à partir de la réaction entre l'hydrate de carbone et le composé vinylique est modifié de manière àintro- duire dans sa structure des groupes -SH libres, suivant diverses variantes. Selon la méthode choisie pour introduire les groupes -SH, la réaction de sulfhydrylation est effectuée avant ou après la réaction d'introduction des radicaux enzymatiques. 1l convient en effet de considérer qu'à un pH supérieur à 8 - 8,5 et à une température supérieure à 420, l'enzyme se désactive, même avecdes durées brèves de réaction. A) Une méthode appropriée, appliquée pour sulfhydryler les conpo- ses suivant l'invention, consiste à faire réagir les composés (II) avec l'épichlorhydrine, en milieu alcalin (a) ou acide (b),puis à faire réagir le composé obtenu avec un thiosulfate,et à réduire enfin les groupes thiosulfates en groupes -SH. Schématiquement, le déroulement de la réaction peut être représenté de lamanière suivante: a) H - A - B - HCCH2 H2 (ôH2-OH)I-( CH2 -H-H)m-- (bH -0) -?H-O) ' O' ni R2 OH H - A B -CH2 - -CH 0 *H 2 H_ O,2 Na2 2 2 3__> sel de Bunte Hi R2 b) HE - A - B - H ClC2-CH-CH2 t OCHH 0 (6s_-CH) -(CE2-c,)(-H........ H- A- B- CHE2 -CH E - Na22 Il t t Na2S203 OH Ci.. ---.- sel de Bunte ( H2-CH) -( H2-CH) -H Hi R2 Le sel de Bunte qui s'est formé peut tre réduit, soit par décomposition avec des acides minéraux, soit par traitement par des réducteurs du type NaBH4, dithioérythrol, mercaptoéthanol, etc., en composés sulfhydrylés de formule: H - à - B -C -CH - CH2 (H' OH SH (CH-CHn-(H2-CH)m H R1 R2 dans laquelle R et R2 ont les significations données précédem- ment. Il est visible qu'à la place des groupes l, le composé peut contenir les groupes -RE, R3 et E ayant les significations données précédemment. La réaction avec l'épichlorhydrine en milieu basique estmenge à une température comprise entre 25 et 80 0 pendant des durées comprises entre 4 et 24 h. La réaction avec l'épichlorhydrineen milieu acide est conduite à une température comprise entre 80et 100 0 et pendant une durée comprise entre 8 et 24 h. La réaction avec Na2S203 est effectuée dans une solution de phosphate tampon à un pH de 6,3 pendant une nuit. La réactionde réduction est menée à un pH de 6-7 en solution tampon. B) A titre de variante de la méthode précédente, la réaction de sulfhydrylation peut être conduite en faisant réagir les cofposs (II) avec l'épichlorhydrine, puis le dérivé époxy obtenu avecle chlorhydrate de cystine en milieu aqueux à un pH de 10-12 ou dans un solvant mixte eau-solvant aprotique dipolaire(dimUthyl- sulfoxyde, diméthylformamide, etc.) à un pH de 10-12 pendant 15 h à la température ambiante. Les groupes disulfure de la cystine sont ensuite réduits en groupes -SE par le borhydrure de sodium. C) La réaction de sulfhydrylation des polyosides peut être éga- ment effectuée par estérification directe du polyoside avec l'acide thioglycolique à une température égale à 8020 et en présence d'un acide minéral ou d'acides de Lewis. La nécessité d'opérer en présence de catalyseurs réduit les possibilitésd'ap- plication de la méthode aux polyosides qui ne s'hydrolysent pas dans les conditions adoptées pour la réaction d'estérification. D) Une autre méthode pour l'introduction des groupes sulfhyd'yles consiste à préparer le dérivé tosylique du polyoside,puis à faire réagir avec le sulfo-acétate de potassium et à décomposer au moyen d'hydrates alcalins, suivant le schéma de réaction: H-A -B - H -- - 0H2-CH- ( H2-OH)-- 11 1CH (aH2-OH) m-i ! il R1 R - 2,SCOCE3 H A - - 02-06H-E 4--- 6H2-?H-(, 2-),-l-e C z(, m--C- z % R2 R2 Na0H._ E H- - - A - B - S - C0H3 aO C2- H( H2-CHtE)n--l-OH- (E2 -H) m-H t I 1 _ R, R2 R2 H-A -B - $H H2-OH-(CH 2-CH)o1-C -o-(oH2-CH) -H R1 2 R2 R2 La réaction avec le chlorure tosylique est conduite dans la pyridine à 70Q0, puis en lavant avec un mélange d'eau et de pyridine et en extrayant enfin à l'acétone. La réaction avec KSCOCH3 est effectuée dans le méthanol, l'acétone ou le diméthylformamide, à une température comprise entre 50 et 7020, pendant des durées Jusqu'à 48 h. Le réaction de décomposition du radical xanthogénique est effectuée avec un hydrate alcalin à 2 % pendant 1 h. La succession des réactions de ramification du radical -A-B- - dans la formule (I) peut être également inversée par rapport aux phases l1 2, 3 décrites ci-dessus. C'est-à-dire qu'il est possible d'introduire des groupes sulfhydryles protégés dans l'hydrate de carbone, puis de copolymériser l'hydrate de carbone avec les mono- mères vinyliques; l'enzyme est greffé sur le produit. Ou bien il est également possible de greffer à part l'enzyme avec unmoncmère vinylique et de faire réagir avec ce produit l'hydrate de carbone sulfbydrylé. Quelques-unes des variantes pr6férées du procédé suivant la présente invention sont illustrées par les exemples qui suivent, mais qui n'ont en aucune manière un caractère limitatif. il Exemple 1 8 g de saccharose sont dissous dans 16 ml de EN03 0,1 et 40 ml d'alcool isopropylique. Après avoir chassé l'air en faisant passer un courant d'azote, on ajoute simultanément une solution de 0,970 g de nitrate ammonique de cérium dans 10 ml de EN03 et une solution de 10 g d'acrylamide dans 16 ml de ENO3 0,1. La réaction de copolymérisation est menée pendant une nuit à la température ambiante sous courant d'azote. L'AM n'ayant pas réagi, éventuellement présent, est éliminé par ultrafiltration, de même que les fractions de plus bas poids moléculaire du copolymère. La solution est mise en réaction avec l'épichlorhydrine pendant 1 à 4 h à 6020 C, dans un milieu de NaOH 0,1-1 M. On extrait la solution au chloroforme jusqu'à dispari- tion, dans l'extrait concentré, de l'épichlorhydrine n'ayant pas réagi. On tamponne la solution avec du phosphate de potassium à un pH de 6,3 et on ajoute du thiosulfate sodique 1-2 M. La réac- tion est menée pendant 2 à 24 h à la température ambiante. La solution est réglée à un pH de 6,5 à 8 et traitée par le glutaral- déhyde à 50 %, à 20-4020 pendant 20 à 50 h. On dialyse contre l'eau Jusqu'à disparition du glutaraldéhyde n'ayant pas réagidans les eaux de dialyse, puis on lyophilise la solution. Le copolymère obtenu est mis en réaction avec la désoxyribonucléase à 420 dans une solution tampon à un pH compris entre 6 et 8,5 pendant des durées comprises entre 2 et 24 h. On réduit enfin les groupes carbonyliques n'ayant pas réagi en groupes hydroxyles et les groupes thiosulfoniques et groupes thioliques avec le borhydrate de sodium en présence de sels de calcium afin de ne pas désactiver l'enzyme. La préparation peut être facilement dispersée dans l'eau et dans le propylène-glycol et elle peut être conservée, même à la température ambiante, pendant des périodes de temps prolongées. La quantité des groupes -SH par gramme de produit varie entre 20 et 200 micromol/g en fonction des conditions de réaction. L'acti- vité enzymatique est comprise entre 10 000 et 120 000 U/g. Exemple 2 En suivant le mode opératoire décrit dans l'exemple 1, on a copolymérisé simultanément du saccharose avec de l'acrylamide et de l'acide acrylique, de façon à obtenir des produits plus solubles en phase aqueuse, qui précipitent aux alentours du pH 4 et sont complètement solubles à un pH supérieur à 7. La teneur en groupes -SH et l'activité enzymatique sontcomma- rables à celles qui ont été mentionnées dans l'exemple 1. Exemple 3 En suivant le mode opératoire décrit dans l'exemple 1, on a préparé un copolymère de saccharose-polyacrylamide qui est traité à l'hydrazine 6 M à 5020 pendant 18 à 20 h. Dans ces conditions, les groupes amides sont transformés en groupes hydrazides. On in- troduit les groupes thiosulfoniques de la manière décrite dans l'exemple 1. On traite par HOl 0,1 N à 0-220, puis on ajoute gout- te à goutte une solution de NaN02 à 13 % en maintenant latempéra- ture entre O et 2020. L'excès de HN02 est détruit avec de l'acide sulfamique, on dialyse en chambre froide à 220 et on précipite le tout dans l'acétone froide. Le copolymère azidique, ayant une teneur en groupes azides comprise entre 2 et 20 méq/g, est mise à réagir dans une solution tampon de borax à un pH de 8,5, avec différentes préparations de trypsine, à la température de 420 pendant 2 à 6 h. On procède à la réduction des groupes thiosulfoniques avec le borhydrate de sodium, de la manière décrite dans l'exemple 1. Le composé peut être dispersé dans l'eau et le propylène-glycol. L'activité enzyma- tique de la préparation est comprise entre 5 et 15 % de ceile qli a été mise en réaction. Exemple 4 De saccharose est mis en suspension dans 1' épichlorhydrine et maintenu au reflux sous agitation pendant 2 à 5 h, en présence de H01 à 37 % ou de HO104 servant de catalyseur. De produit est précipité dans l'acétone et séché. Le produit est mis en suspension dans une solution aqueuse de thiosulfate, le pH est réglé à la neutralité et la réactionest menée pendant 1 à 12 h au reflux au bain-marie. Après refroidissement, la solution est concentrée etprécipi- tée dans l'éthanol. Le traitement par le thiosulfate peut être répété Jusqu'à complète substitution des groupes Cl introduits. De produit est copolymérisé avec l'acroléine et l'acide acrylique ou la vinylpyrrolidone, en utilisant des sels de cérium comme système de déclenchement. Le copolymère est mis en réaction avec la désoxyribonucléase, au départ dans une solution tampon à un pH compris entre 6,5 et 8,5, à 4 0 pendant 4 à 24 h. Puis l'échantillon est traité par le borhydrate de sodium et lyophilisé. La teneur en groupes rSH est comprise entre 50 et 100 micromol/g de copolymère, tandis que l'activité enzymatique est comprise entre 50 000 et 250 000 U/g. Exemple 5 10 g de saccharose dans 100 ml de NaOH N sont mis en réaction avec 10 nml d'épichlorhydrine pendant 4 h à une température de 60 C. On extrait l'épichlorhydrine qui n'a pas réagi avec du chloroforme et le produit de la réaction est mis à réagir avec du chlorhydrate de cystine en excès dans un solvant aqueux ou dans un solvantmixte (eau diméthylsulfoxyde), à un pH de ll pendant 4 à 15 h à la température ambiante. Après séparation, le produit de la réaction est copolymérisé avec l'acroléLne ou avec des mélanges d'acrolél- ne et de vinyl-pyrrolidone, comme dans l'exemple 4. Après réaction avec la désoxyribonucléase I, l'échantillon est réduit avec du borbydrate de sodium, puis lyophilisé. La teneur en groupes -SH est comprise entre 100 et 400 micro- mol/g, tandis que l'activité enzymatique est comprise entre 250 000 et 500 000 U/g de copolymère. Exemple 6 En procédant de façon analogue à ce qui a été décrit dans l'exemple 4, on traite le saccharose dans des conditions acides par l'épichlorhydrine, puis par le thiosulfate. On fait réagir à part la désoxyribonucléase avec l'acroléine dans une solution tampon à un pH compris entre 6,5 et 8,5, pendant des durées variant entre 2 et 24 h, en corrigeant le pH de la réaction avec du NaOH pendant les deux premières heures. On copolymérise en présence d'acide acrylique l'enzyme * greffé sur le saccharose, en utilisant comme système d'oxydo- réduction Fe++/H202. On dialyse contre l'eau jusqu'à la dispari- tion de l'acroléine ou de l'acide acrylique n'ayant êventuellement. pas réagi dans les eaux de dialyse, on réduit avec le borhydrate de sodium et on lyophilise. La teneur en groupes -SH et l'activité enzymatique sont comparables à celles qui ont été déterminées pour le produit de l'exemple 4. Exemple 7 Une solution de saccharose dans la pyridine/H20 (3: 1) est distillée jusqu'à élimination complète de l'eau en tant qu'azéo- trope (93-942C). Lorsque la température atteint 113-1142C, la distillation est interrompue et le mélange est refroidi. On ajoute du chlorure de tosyle et on laisse la réaction se poursuivre pendant une nuit à la température ambiante. On précipite dans un mélange d'éthanol/H20, on filtre et on ajoute une solution à 2,5 % de sulfoacétate de potassium dans le diméthylformamide. La réaction est menée pendant 75 h à 70 0. Après refroidissement, le produit est précipité dans l'alcool éthylique et séché. Le produit est traité par NaOH à 2 % à la température ambiante pendant 1 hl, neutralisé avec HO1 1N etpréci- pité avec de l'éthanol. En procédant de façon analogue à l'exemple 6, on greffe la désozyribonucléase avec du méthacrylate de glycidyle à un pH compris entre 6 et 8, dans une solution tampon, pendant une durée comprise entre 2 et 24 h. L'enzyme greffé est copolymérisé avec le saccharose en présence d'acide acrylique, en utilisant un système d'oxydo-réduction Fe++/k02. On dialyse contre l'eau jusqu'à la disparition du méthacry- late de glycidyle n'ayant éventuellement pas réagi. On réduitavec le borhydrate de sodium. Le composé peut être difficilement dispersé en phase aqueuse. La teneur en groupes -SH est comprise entre 50 et 150 micromol/g, 248S925 l'activité enzymatique se situe entre 10 000 et 30 000 U:g. Les composés préparés suivant la présente invention ont été éprouvés quant à leur activité mucolytique, tant "in vitro" que "in vivo". Après s'être assuré,.par un essai éliminatoire préliminaire, que tous lescomposés obtenus dans les exemples qui précèdent avaient une activité mucolytique, l'étude a été approfondie avec deux de ces composés: le produit de l'exemple 1 = ET 1014 et le produit de l'exemple 5 = ET 1015, en les confrontant avec la N-acétyl-cystéine et avec la désoxyribonucléase. L'activité mucolytique a été déterminée, tant sur expectora- tion mucopurulente que sur expectoration purulente de malades atteints de bronchite chronique et/ou de bronchectasie. La méthode appliquée a été celle décrite par Lieberman (Amer.Rev.Resp.Dis.97, 662,.1968) qui prévoit l'emploi d'un microviscosimètre Brockfield du type à c ne-plaque, à différentes vitesses (de 0,5 à 0ltr/nm), maintenu à 37 C, avec bain circulant, équipé d'un enregistreur de type pneumatique Foxboro et d'un compresseur produisant de l'air comprimé sous 15 atm. La mesure de l'activité mucolytique a été effectuée à 5, 10 et 20 minutes du début de l'essai et elle a été exprimée par la diminution de la viscosité initiale en %. Chaque valeur est la moyenne de 20 mesures effectuées en double sur l'expectoration de malades et elle est exprimée en pourcentage de l'ensemble des valeurs de base, aux différentes vitesses de rotation utilisées. Tous les produits testés ont été mis en solution et/ou en solususpension dans le même volume de solution physiologique. Dans le tableau 1 qui suit sont présentés les résultats obtenus sur une expectoration mucopurulente, tandis que le tab2eau 2 contient les résultats obtenus sur l'expectoration purulente. Des valeurs réunies dans les tableaux, il ressort manifeste- ment que les composés ET 1014 et ET 1015 sont constamment et nettement plus actifs que la N-acétyl-cystéine ou que la désoxy- ribonucléase utilisées séparément. En ce qui concerne les résultats obtenus avec la désoxyribunucléase + N-acétyl-cystéine, la faible activité du mélange est probablement à imputer à l'inhibition de l'enzyme par la N-acétyl-cystéine. Les composés selon l'invention atteignent déjà pratiquement le maximum de leur activité au bout de 5 mn et à des concentra- tions de 5 %. TABIJEAU 1 Pourcentage de réduction de la viscosité initiale à différents instants (en mn) Produit _ mn 10 mn 20 mn N-acétyl-cystéine conc. 20 % 60,4 + 13,2 62,1 + 10,8 60,5 + 7,2 " 10 % 54,9 + 9,5 59,7 + 7,5 57,2 + 5,9 " 5 % 42,6 + 11,7 48,3 + 5,4 51,6 + 7,6 ET 1014 conc. 20 % 86,8 + 8,3 85,9 + 8,2 87,5 + 7,7 " 10 % 82,5 + 7,9 83,1 + 8,4 82,3 + 8,3 " 5 % 79,7 + 8,5 80,4 + 7,9 81,2 + 6,8 ET 1015 conc. 20 % 93,8 + 6,8 92,2 + 7,1 93,1 + 7,0 " 10 % 94,2 + 7,2 93,8 + E,6 99,4 + 6,3 " 5 % 90,5 + 6,3 91,6 + 6,5 90,8 + 6,9 Désoxvribinucléase 000 unités 39,2 + 2,9 40,5 + 3,6 43,4 + 3,4 000 " 37,4 + 3,5 41,2 + 3,1 41,6 + 2,8 000 " 35,6 + 4,1 39,8 + 2,7 40,9 + 3,7 Dèsoxribonucléase (150 000 unités) + N-a cétyl-csté ine (conc. 5 %) ,2 ± 4P5 49,6 + 4712 ± 396 TAB1EAU 2 Pourcentage de réduction de la viscosité initiale à différents instants (en mn) Produit 5 mn 10 mn 20 mn N-acétyl-cvaystéine conc. Z0 % 51,6 + 7, 2 52,9 + 6,9 53,2 + 6,1 " 10 % 43,5 + 6,8 42,3 + 6,4 44,6 + 6,6 % 37,2 + 6,1 40,5 + 5,3 41,9 + 4,8 ET 1014 conc. 20 % 92,1 + 6,9 90,8 + 7,3 91,6 + 5,9 % 89,4 + 5,2 87,3 + 6,2 86,5 + 8,2 " 5 % 87,5 + 6,4 85,4 + 7,0 84,3 +5,8 ET 1015 conc. 20 % 94,3 + 5,6 92,5 + 8,4 93,2 + 9,1 " 10 % 86,2 + 6,8 89,7 + 7,1 89,1 + 7,2 % 87,4 + 7,2 88,4 + 6,6 90,5 +t 6,9 Dé s oxyribonucléase 000 unités 82,6 + 6,8 80,4 + 6,6 79,4 + 6,4 000 " 80,4 + 7,5 77,1 + 7,1 78,7 +_ 5,9 25 000 " 77,9 + 5,4 74,6 + 7,2 73,9 + 7,3 Désoxvribbnucléas e (150 000 unités) + N-acétyl-cystéine (conc. 5 O 36,5 + 5,9 37,2 + 4,6 35,9 + 4,2 La DL50 des produits ET 1014 et ET 1015 a été évaluée sur des rats de la souche Sprague-Dawley et des souris de la souche Swiss, avec administration par voie orale. Dans les deux espèces de rongeurs, la DL50 s'est révélée supérieure à 3 g/kg. Les produits ET 1014 et ET 1015 ont été également adminis- trés à 10 + 10 patients atteints de maladies du domaine de l'oto- rhino:laryngologie caractérisées par une sécrétion purulenteet/ou mucopurulente et à 10 + 10 malades affectés de bronchite chronique et de broxchectasie avec forte expectoration purulente et/oumuco- purulente. La posologie a été de deux aérosols par Jour, avec chaque fois 1 g de produit dissous dans l'eau distillée, pendant une durée moyenne de 10 jours. On a constaté une réductionnotable de la viscosité des sécrétions des voies respiratoires, avec une mette amélioration de l'expectoration dans les maladies bronchi- ques et une disparition presque totale des symptômes desaffections otorhino-laryngologiques. La tolérance a été parfaite chez tous les patients, tant avec l'ET 1014 qu'avec l'ET 1015: en particulier, il n'est apparu aucune manifestation d'intolérance locale ou généralisée, suscep- tible d'être imputée aux deux produits. En conclusion, les nouveaux produits se sont révélés prati- quement dépourvus de toxicité, ils ne produisent pas d'effets secondaires ou d'intolérance, de quelque nature que ce soit, par le fait qu'ils ne sont pas absorbés par les tissus, et ils ont une très forte activité mucolytique, tant sur les sécrétions purulentes que mucopurulentes. Aucun médicament mucolytique connu jusqu'à maintenant ne possède cet ensemble de propriétés. Les nouveaux produits peuvent être utilisés par exemple par voie topique ou en aérosols dans les affections suivantes: - affections bronchiques et de l'appareil oto-rhino-laryngolo- gique avec sécrétion muqueuse - dans le traitement des plaies torpides ou dans les cas o il existe des sécrétions visqueuses à forte teneur protéique - pour les lavages de vessie dans les infections chroniques dans le traitement de l'acné pour le nettoyage des débris cellulaires pour éliminer les résidus protéiques et mucopolyosidiques sur les verres de contact. REVENDICATI ONS 1. Composés à activité mucolytique, non assimilables par les tissus, de poids moléculaire compris entre 10 000 et 300 000, répondant à la formule A - B - Yz - -JE (I) (cH2- CH)n - (CH2)m - CH) R. E R2 y 112 dans laquelle -A-B- représente le radical d'un hydrate de carbone avec A = B ou A 4 B; Y = radical capable d'unir des groupes sulfhydryle aux molécules de l'hydrate de carbone; R3= reste de R1, R1 = groupe fonctionnel capable d'unir l'enzyme à la macromolécule de synthèse; E = radical enzymatique; R2 = groupe fonctionnel destiné à régler la solubilité du produit; n = 1 à 2000; m = O à 1000; w = 1 à 100; z = O à 10, ét:ant entendu que chaque unité de l'hydrate de carbone peut porter un ou plusieurs radicaux enzymatiques et un ou plusieurs groupes sulfhydryle. 2. Composés selon la revendication 1, caractérisés en ce que -A-B- est un radical d'hydrate de carbone choisi dans le groupe constitué par des diholosides, des oligoholosides contenant 2 à 6 unités d'ose, ou des polyosides de bas poids moléculaire, ne dépassant généralement pas 10 000. 3. Composés selon la revendication 1, caractériss en ce que Y est un radical choisi dans le groupe constitué par -CH2-CH-CH, -H2-CH-CH -, -co-cE2, -CO-CH-CH2-. OH NH2 4. Composés selon la revendication 1, caractérisés en ce que R est le radical de R1 et en ce que R1 et R2, semblables ou différents l'un de l'autre, sont: -COOH, -COC1, -CONI2, -000CCH3, -COOo -CH-. -2, -COCH2-- COi3, Co. 5. Composés selon la revendication 1, caractérisés en ce que E est le radical d'un enzyme protéolytique choisi dans le groupe constitué par la trypsine, la chimotrypsine, la désoxyrfibonucléase, la streptokinase, la neuroamidase, la bromexine, la papaine. 6. Procédé pour la préparation de composés à activité mucolyti- que, non assimilables par les tissus, de poids moléculaire compris entre 10 000 et 300 000, répondant à la formule L-- A - B - Y- SH - H(1) (612- CH)n - (CE2- CH)n - H RE R2 dans laquelle -A-B- représente le radical d'un hydrate de carbone, avec A = B ou A # B; Y = radical capable d'unir des groupes sul- fhydryles aux molécules de l'hydrate de carbone; R = reste de R1, R = groupe fonctionnel capable de réunir l'enzyme à la macromolécule de synthèse; E = radical enzymatique; R2 = groupe fonctionnel destiné à régler la solubilité du produit;n = à2000; m = O à 1000; w = 1 100; z = O à 10, étant entendu que chaque unité d'hydrate de carbone peut porter un ou plusieurs radicaux enzymatiques et un ou plusieurs groupes sulfhydryle, caractérisé en ce qu'un hydrate de carbone choisi dans le groupe constitué par des diholosides, des oligoholosides à 3-6 unités et des polyosides de poids moléculaire ne dépassant généralement pas 10 000, sinple ou sulfhydrylé, est mis en réaction avec un ou plusieurs composés vinyliques de formule- CH2 = CH, CH2 = CEOH, CH2 = CH, dans lesquelles R1, R2 et R. Ri R 2 Re R ont les significations données précédemment; dans le cas o les monomères vinyliques ne comprennent pas de radicaux enzymatiques, le polymère obtenu de formule - A - B - Yz - SH J (II) (CH2- CH)n - (CH2- CH)m- H R1 R2 est mis en réaction, directement ou par l'intermédiaire de conpocéss bifonctionnels appropriés, avec un enzyme à action protéolytique directe lorsque z 4 O et, lorsque z = 0, il est sulfhydrylé avant ou après sa réaction, directe ou par l'intermédiaire de composés bifonctionnels appropriés, avec un enzyme à action protéolytique directe. 7. Procédé selon la revendication 6, caractérisé en ce que la réaction entre hydrate de carbone simple ou sulfhydrylé et mono- mères vinyliques est effectuée en milieu aqueux ou aqueux-organiqu avec des rapports pondéraux hydrate de carbone/composé vinylique compris entre 0,3 et 3,0, à la température ambiante, à un pH fortement acide, en présence d'un initiateur de polymérisation. 8. Procédé selon la revendication 6, caractérisé en ce que les composés de formule (II), dans lesquels R1 = -COOH ou -CHO, sont mis directement en réaction avec un enzyme protéolytique. 9. Procédé selon la revendication 6,.caractérisé en ce que les composés de formule (II), dans lesquels R1 = -C, sont mis en réaction avec un enzyme protéolytique, après transformation des groupes -CON2 en groupes azides -00N3, par réaction successive avec l'hydrazine et l'acide nitreux. 10. Procédé selon la revendication 6, caractérisé en ce que les composés de formule (II), dans lesquels R1 = -CON H, sont mis en réaction avec un enzyme protéolytique, après réaction avec un dialdéhyde, dans un solvant aqueux, à une température comprise entre 20 et 402C, pendant des durées de 2 à 48 heures. 11. Procédé selon l'une quelconque des revendications 6, 8, 9 et , caractérisé en ce que la réaction entre les composés deformule (II) et l'enzyme est effectuée en milieu aqueux ou aqueux-organique, à un pH compris entre 7 et 8, à une température de 4 à 2520, pen- dant 2 à 24 heures. 12. Procédé selon la revendication 6, caractérisé en ce que les composés de formule (II), dans lesquels z = 0, sont sulfhydrylés, avant ou après leur réaction avec l'enzyme, par réaction avec 1' épichlorhydrine en milieu alcalin ou acide, à une température comprise entre 25 et 100o0, pendant des durées comprises entre 4 et 24 h, les produits obtenus sont mis en réaction avec un thio- sulfate alcalin et les groupes rhiosulfates sont réduits en groupes -SH par décomposition avec des acides minéraux ou par traitement avec des réducteurs. 13. Procédé selon la revendication 6, caractérisé en ce que les composés de formule (II) dans lesquels z = O sont sulfhydrylés, avant ou après leur réaction avec l'enzyme, par réaction avec l'épichlorhydrine, puis avec le chlorhydrate de cystéine, et enfin réduction par le borhydrate de sodium. 14. Procédé selon la revendication 6, caractérisé en ce que les composés de formule (II) dans lesquels z = O sont sulfhydrylés, avant ou après leur réaction avec l'enzyme, par estérification avec l'acide thioglycolique à une température de 80 20, enprésence- d'acides minéraux ou de Lewis. M. Procédé selon la revendication 6, caractérisé en ce que les composés de formule (II) dans lesquels z = 0 sont sulfhydrylés, avant ou après leur réaction avec l'enzyme, par préparation du dérivé tosylique dans la pyridine à 702C0, réaction de celui-ci avec le sulfoacétate de potassium dans un solvant organique à -70QC et décomposition des groupes -S-C0H3 avec des hydrates alcalins. 16. Compositions thérapeutiques à activité mucolytique, carac- térisées en ce qu'elles contiennent9 en tant que principe actif, un composé de formule L-A B Y - sH -7(I) (H2- CH)n -( CH)m - H RE R2 dans laquelle -A-B- représente le radical d'un hydrate de carbone, avec A = B ou A # B; Y = radical capable d'unir des groupes sulfhydryle aux molécules de l'hydrate de carbone; R3 = reste de i, R = groupe fonctionnel capable d'unir l'enzyme aux macro- molécules de synthèse; E = radical enzymatique; k = groupe fonctionnel destiné à régler la solubilité du produit; n = 1 à 2000; m = D à 1000; w = 1 à 100; z = O à 10, étant entendu que chaque unité d'hydrate de carbone peut porter un ou plusieurs radicaux enzymatiques et un ou plusieurs groupes sulfbydryle.