FR 2482621 A1 19811120 FR 8106417 A 19810331 La présente invention concerne un procédé perfectionné de production de l'enzyme appelé fructosyl- transférase sous l'action de la levure noire, Aureobasidium PuLLulans. Du fait que le fructose est plus sucré que le glucose ou le saccharose, on a consacré de nombreux efforts à l'étude de procédés de production de sirops dans lesquels plus de 50 % des glucides consistent en fructose. Récemment, un nouveau mode d'obtention d'un sirop de fructose à teneur en fructose supérieure à 50 % a été révélé dans le brevet britannique NI 2 000 144. Conformément à ce procédé, un substrat de saccharose est soumis à l'action enzymatique d'une fructosyl-transférase pour convertir le saccharose en un sirop intermédiaire contenant principalement des polymères de fructose et du glucose. Ce sirop, dans lequel le fructose se trouve sous la forme polymérique, peut encore être traité de manière à produire des sirops de fructose dans lesquels plus de 50 % de la matière glucidique se trouvent sous la forme de fructose. Une source économique de l'enzyme appelé fructosyl-transférase est essentielle au succès de la mise en oeuvre de ce procédé. Le brevet britannique NI 2 000 144 précité décrit un procédé de production et d'isolement de fructosyl- transférase du bouillon de fermentation d'Aureobasidium pullulans. Toutefois, la fermentation conduite conformément au procédé décrit dans ce brevet donne un bouillon visqueux de couleur noire qui renferme de grandes quantités d'un polysaccharide appelé pullulane. Un traitement intensif est nécessaire pour éliminer la couleur et le pullulane avant que la fructosyl-transférase ne puisse être isolée. De plus, la quantité d'enzyme tirée du bouillon de fermentation est relativement faible. Il est donc nécessaire de trouver un procédé perfectionné de production d'une préparation enzymatique de fructosyl-transférase. En conséquence, la présente invention propose un procédé perfectionné de production de la fructosyl- transférase. Ce procédé implique l'inoculation d'un milieu de culture avec les cellules d'une souche d'Aureobasidium 2 2482621 pullulans. Le milieu de culture contient environ 16 à environ 24 % en poids par volume (poids/volume) de saccharose, environ 1 à environ 2,4 % (poids/volume) d'extrait de levure ou de son équivalent nutritionnel, et environ 1 % (poids/volume) d'un nitrate inorganique. Le mélange est cultivé à un pH choisi entre 6 et 8 à une température de 28 à 32WC jusqu'à ce que le rendement en fructosyl-transférase ait été obtenu. La préparation enzymatique est ensuite recueillie du milieu de culture. Aux fins du présent mémoire, on donne les définitions suivantes des divers termes et expressions utilisés: 1. Préparation enzymatique L'expression "préparation enzymatique" est utilisée dans le présent mémoire pour désigner toute composition qui déploie l'activité enzymatique désirée. Cette expression est utilisée pour désigner par exemple des extraits cellulaires, des préparations raffinées et concentrées dérivées des cellules et de liqueurs de culture. La préparation enzymatique peut aussi renfermer une composition dans laquelle l'enzyme est lié à un support inerte ou adsorbé sur ce support. 2. Fructosyl-transférase Ce terme désigne au sens du présent mémoire tout enzyme qui catalyse le transfert d'un groupe fructosyle d'un donneur, par exemple le saccharose, à un accepteur. Il englobe la préparation enzymatique dérivée d'Aureobasidium pullulans, ATCC N0 9348 (synonyme de Pullularia pullulans). 3. Unité de fructosyl-transférase Au sens du présent mémoire, une unité de fructosyl-transférase est définie comme représentant la quantité d'activité enzymatique nécessaire pour produire une micromole de sucre réducteur, exprimé en glucose, par minute dans les conditions suivantes: (a) pH de 5,5, (b) température de 55WC et (c) concentration 3 2482621 en substrat de 60 g de saccharose de qualité alimentaire pour ml d'un mélange réactionnel aqueux. Le sucre réducteur (exprimé en glucose) peut être dosé au moyen d'un analyseur du type "Technicon Autoanalyzer II" (Technicon, Inc., Tarrytown, New York). L'analyse est conduite selon une méthode classique au ferricyanure alcalin, Analytical Biochemistry 45, NI 2, pages 517-524 (1972), modifiée de manière à pouvoir être appliquée à l'appareil "Autoanalyzer IV". Sauf spécification contraire, les déterminations de l'activité enzymatique sont effectuées par contrôle continu d'un mélange réactionnel de composition suivante 7,5 ml de solution aqueuse à 80 % (poids/volume) de saccharose de qualité alimentaire. 2,3 ml de tampon au citrate 0,1 M, de pH 5,5. 0,2 ml d'un échantillon d'enzyme contenant la quantité de fructosyltransférase apte à produire 5 à 15 microgrammes de sucre réducteur (exprimé en glucose) par minute par millilitre de mélange réactionnel). On peut utiliser dans le procédé de l'invention toute souche d'Aureobasidium pullulans qui est capable de produire une fructosyltransférase. Des souches convenables de cette levure comprennent les souches NRRL NO 3937, ATCC NO 12 535, NRRL N0 1673, NRRL N0 Y 2311, NRRL N0 YB 3892, ATCC NI 15 223 et NRRL NI YB 3861. La souche ATCC NI 9348 est une souche particulièrement convenable. Le procédé de l'invention utilise un appareillage et des opérations classiques de fermentation. Généralement, la culture de levure est maintenue ou préservée sur gélose inclinée, avec des transferts périodiques destinés à maintenir la viabilité. Dans le développement de l'inoculum, la culture est transférée de la gélose inclinée à un milieu liquide de culture en vue de produire une culture active en un volume suffisant pour inoculer le milieu final de production. L'étape de développement de l'inoculum peut consister en un simple transfert dans un milieu liquide ou peut comporter plusieurs transferts successifs, en quantité nécessaire pour permettre l'activation de la culture ou l'accumulation d'un volume suffisant pour l'inoculation d'un milieu final de production. C'est dans le milieu final de production que l'enzyme désiré est produit en vue de son utilisation directement ou après un autre traitement ou une purification. Les très bons rendements en fructosyl- transférase obtenus par ce procédé sont dus en partie à l'utilisation d'une solution plus concentrée de saccharose comme source de glucide pour la croissance du micro- organisme. Des rendements élevés en fructosyl-transférase sont obtenus par l'utilisation d'un milieu de culture contenant environ 16 à environ 24 % (poids/volume) de saccharose. Une plage appréciée de concentrations en saccharose va d'environ 20 à environ 24 % (poids/volume). Des concentrations plus fortes en saccharose ne parviennent pas à donner des rendements en enzyme améliorés dans une mesure appréciable. Les très bons rendements en fructosyl- transférase que l'on obtient par le procédé de l'invention sont également dus en partie à l'utilisation de concentra- tions élevées en extrait de levure dans le milieu. Des concentrations convenables en extrait de levure vont d'environ 1 à environ 2 % (poids/volume). Une concentration appréciée en extrait de levure est égale à environ 2,0 % (poids/volume). Un extrait de levure convenable est l'extrait fourni par la firme Difco Laboratories, Inc., Detroit, Michigan. D'autres préparations qui sont l'équivalent nutritionnel de l'extrait de levure peuvent remplacer cet ingrédient. Par exemple, le produit "Amber BYF 5OX", qui est une fraction autolysée pure de levure de bière fournie par la firme Amber Laboratories de Juneau, Wisconsin, peut être utilisé à une concentration d'environ 5 à environ 10 % (poids/volume) à la place de l'extrait de levure. Pour que la préparation de la fructosyl- transférase par le procédé de la présente invention réussisse de la meilleure façon, on ajoute également un nitrate inorganique hydrosoluble au milieu de culture dans lequel les 2482621 cellules d'Aureobasidium ullulans se sont développées. On peut utiliser avantageusement l'un quelconque des nitrates courants tels que le nitrate de sodium0 Une concentration appréciée du sel est égale à environ 1 % (poids/volume). Le pH du milieu de culture utilisé dans le procédé de l' invention est ajusté entre 6 et 7 et le milieu est stérilisé par chauffage pendant 0ff5 à 2 heures à 120WC avant d'être inoculé avec la culture cellulaire. Le pH du milieu de culture est maintenu entre 6,60 et 8,0 au cours de la fermentatLion par l'addition d'un acide ou d'une base dilué, selon le cas. Une plage appréciée de pH pour la fermentation va d'environ 6,5 à environ 7,5. Lorsqu'on a utilisé le milieu de fermentation de l'invention, le pH de ce milieu a une tendance à croître ou à rester constant plutôt qu'à décroître comme dans le cas des fermentations du procédé de l'art antérieur. Un autre résultat inattendu lié à l'utilisation du milieu de fermentation de l'invention réside dans la disparition du pigment noir formé au cours des fermentations de l'art antérieur0 Cela évite l'inconvénient et les frais d'une étape séparée de précipitation pour éliminer ce pigment avant que l'enzyme ne puisse être isolé. Un autre avantage inattendu est offert par le procédé de l'invention. On a découvert qu'il n'y avait presque pas de production du polysaccharide visqueux appelé pullulane. Dans le procédé de l'art antérieur, une opération longue et coûteuse s'impose pour éliminer ce produit de haut poids moléculaire avant que l'enzyme ne puisse être séparé. Etant donné que l'élimination de ce produit et que la préci- pitation du pigment noir ne sont plus nécessaires, l'isolement de l'enzyme est grandement simplifié. Le procédé de fermentation de l'invention est avantageusement mis en oeuvre à une température d'environ 28 à environ 320C. Une plage appréciée de températures va d'environ 30 à environ 310C. Bien que la fermentation puisse être conduite au-dessous de 281C et au-dessus de 32WC, le rendement en fructosyl-transférase que l'on obtient lorsque la fermentation est conduite dans ces plages de températures est sensiblement plus faible que celui que l'on obtient lorsqu'on conduit la fermentation à des températures qui se situent entre 28 et 320C. Un rendement satisfaisant en fructosyl- transférase est habituellement obtenu après que la fermentation a été conduite pendant une durée d'environ 100 heures. Toutefois, la durée optimale de fermentation varie légèrement selon la température exacte que l'on utilise ainsi que selon la concentration utilisée en matières nutritionnelles. Dans ce procédé nouveau, plus de 80 % de la fructosyl-transférase sont présents dans le bouillon. Cela est en contraste avec la fermentation de l'art antérieur dans laquelle l'enzyme est presque pour moitié lié aux cellules. Du fait que la majeure partie de l'enzyme se retrouve à présent dans le bouillon, on peut le recueillir par un procédé simple. Une préparation enzymatique de fructosyl- transférase qui convient pour de nombreuses applications peut être obtenue par simple élimination des cellules de levure du mélange de fermentation. Cette séparation peut être effectuée par l'un quelconque des moyens classiques, par exemple par centrifugation ou filtration. La solution d'enzyme peut être concentrée le cas échéant par évaporation à des températures inférieures à celles qui entraînent une désactivation de l'enzyme. Cette opération est avantageusement effectuée dans un évaporateur rotatif à vide, à des températures inférieures à 500C. Si l'on désire obtenir une préparation enzymatique solide, l'enzyme peut être adsorbé sur de la terre de diatomées. On y parvient par simple addition de la terre de diatomées au bouillon de fermentation dépourvu des cellules. L'addition d'un solvant organique hydrosoluble tel que le 2propanol ou l'acétone entraîne la précipitation de l'enzyme et son adsorption sur la terre de diatomées. Le composite formé de terre de diatomées et de fructosyl- transférase est ensuite isolé par filtration ou par centrifugation. -2482621 Le procédé de l'invention est illustré par les exemples suivants, dans lesquels toutes les parties sont exprimées en poids et tous les pourcentages sont en poids par volume (poids/volume), sauf spécification contraire. EXEMPLE 1 Le milieu utilisé pour le développement de l'inoculum est le suivant 10. 0,5 % de K2HPO4 0,1 % de chlorure de sodium 0,02 % de sulfate de magnésium heptahydraté 0,06 % de nitrate d'ammonium 0,3 % d'extrait de levure (Difco Laboratories) 6 % de saccharose pH du milieu ajusté à 6,8. Les fioles d'Erlenmeyer de 500 ml utilisées pour l'ensemencement, contenant 100 ml de milieu stérile, sont inoculées à partir d'une culture inclinée de la levure noire Aureobasidium pullulans. La souche particulière de la levure que l'on utilise porte la référence ATCC NO 9348 dans le catalogue de l'American Type Culture Collection (Rockville, Maryland). Les fioles d'ensemencement, après développement sur une secoueuse rotative pendant 48 heures à 301C, sont utilisées pour inoculer des fioles d'ensemencement de second stade. 5 ml de l'inoculum d'une fiole de premier stade sont ajoutés à 100 ml du milieu stérile neuf dans une seconde fiole d'Erlenmeyer d'ensemencement, de 500 ml. On laisse le développement des secondes fioles d'ensemencement s'effectuer sur une secoueuse rotative pendant 24 heures à 301C avant d'utiliser le contenu entier d'une fiole pour inoculer 4 litres de milieu stérile contenu dans un appareil de fermentation de 7,5 litres. Le milieu utilisé pour les divers essais est indiqué sur le tableau I suivant. TABLEAU I MILIEU DE FERMENTATION Composition, % en poids/volume N de l'essai Composant 1 2 3 4 5 K2HPO4 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 MgSO4.7H20 0,05 0,05 0,05 0,05 0,05 NaNO3 1,0 1,0 1,0 1,0 1,0 Extrait de levure (Difco Labs.) 2,0 2,4 2,4 2,0 -- "Amber BYF 50X" (Amber Labs.) -.. -- 8,0 Saccharose 20 24 20 20 20 Agent anti- moussea) 0,025 0,025 0,025 0,025 0,025 a) L'agent anti-mousse consiste en polypropylèneglycol de poids moléculaire 2000. Dans chaque essai, on ajuste le pH à 6,5 avant l'inoculation à partir des fioles d'ensemencement. Les essais N 1, 2 et 3 sont conduits à 30-31 C. Les essais N 4 et 5 sont conduits à 33-34 C. Les fermentations sont conduites à une vitesse d'agitation de 580 tr/min et avec passage de 4 litres d'air par minute dans le mélange. Il a été nécessaire d'ajouter 75 ml de HC1 2N à l'essai N 4 au bout de 27 heures pour abaisser le pH de 7, 5 à 6,5. Au bout de heures, on a encore ajouté 30 ml de HCL 2N à l'essai N 4 pour réduire le pH de 7,5 à 6,5. A des intervalles périodiques, les échantillons ont été prélevés dans l'appareil de fermentation, le bouillon a été séparé des cellules par centrifugation et il a été analysé en vue de déterminer l'activité en fructosyl-transférase. Les résultats de ces analyses sont reproduits sur le tableau II. 248 2621 TABLEAU II PRODUCTION DE FRUCTOSYL-TRANSFERASE Unités/ml dans le bouillon N de l'essai Temps 1 2 3 4 5 (heures) 27 77 58 56 59 -39 42 145 126 123 79 88 178 171 158 81 106 66 238 234 221 104 144 290 355 302 144a) 159a) 114 440 438 380 -- -- a) La fermentation a été arrêtée au bout de 90 heures, le milieu étant devenu très noir. Les résultats démontrent que des fermentations conduites au-dessus de 33 C (essais N 4 et 5) sont bien moins satisfaisantes pour la production de fructosyl- transférase que les opérations conduites à 30-31 C. Ces résultats démontrent en outre que ni l'élévation de la concentration en saccharose du milieu au-dessus de 20 % (essai N 2), ni l'élévation de la concentration en extrait de levure dans le milieu au-dessus de 2 % (essais N 2 et- 3) n'améliorent la production de fructosyl-transférase dans la fermentation. Une comparaison des essais N 4 et 5 montre qu'une autre source nutritionnelle peut remplacer l'extrait de levure dans la fermentation. ESSAI COMPARATIF 1 (Procédé de l'art antérieur) Le développement de l'inoculum est conduit comme dans l'exemple 1. Le contenu entier d'une fiole d'ensemence- ment de second stade est utilisé pour inoculer 4 litres de milieu stérile dans un appareil de fermentation de 7,5 litres. Le milieu utilisé a la composition suivante: 0,5 % 0,1 % 0,02 % 0,06 % 0,3 % 12 % 0,025 % de K2HPO4 de chlorure de sodium de sulfate de magnésium heptahydraté de nitrate d'ammonium d'extrait de levure (Difco Laboratories) de saccharose de propylèneglycol de poids moléculaire 2000 Le pH du milieu est ajusté à 6,8 avant l'inoculation à partir des fioles d'ensemencement. La fermentation est conduite à 30 C à une vitesse d'agitation de 500 tr/min et avec passage de 4 litres d'air par minute dans le mélange. Le pH du mélange s'abaisse à 4,2 au bout de 32,5 heures et reste à la valeur de 4, 2 + 0,1 pendant tout le reste de la réaction. Périodiquement, des échantillons sont prélevés dans l'appareil de fermentation, le bouillon est séparé des cellules par centrifugation et il est analysé en vue de déterminer l'activité en fructosyl-transférase. Les résultats de ces analyses sont donnés ci-après. PRODUCTION DE FRUCTOSYL-TRANSFERASE Temps (heures) ,5 Unités/ml dans le bouillon 19,5 26,2 31,7 ,6 47,6 49,7 53,4 Le mélange réactionnel est très noir. Cet essai comparatif illustre les rendements relativement faibles en enzyme et la forte pigmentation des mélanges réactionnels que l'on obtient par le procédé de l'art antérieur. REVENDICATIONS 1. Procédé perfectionné de production d'une préparation enzymatique de fructosyl-transférase, caractérisé en ce qu'il consiste à inoculer un milieu de culture avec des cellules provenant d'une source d'Aureobasidium pullulans, le milieu de culture comprenant environ 16 à environ 24 % (poids/volume) de saccharose, environ 1 à environ 2,4 % (poids/volume) d'extrait de levure et environ 1 % (poids/volume) d'un nitrate inorganique, et à cultiver le mélange à 28-320C à un pH compris entre 6 et 8 jusqu'à ce qu'un rendement en fructosyl-transférase ait été obtenu, la préparation enzymatique étant recueillie en des rendements élevés à partir du milieu de culture sans que soit nécessaire l'élimination de pigment noir ou de polysaccharide visqueux quelconque. 2. Procédé suivant la revendication 1, caractérisé en ce que la concentration en saccharose a une valeur de 20-24 % (poids/volume). 3. Procédé suivant la revendication 1, caractérisé en ce que l'extrait de levure est présent en proportion d'environ 2 % (poids/volume). 4. Procédé suivant la revendication 1, caractérisé en ce que le pH du milieu de culture est maintenu entre 6,5 et 7,5. 5. Procédé suivant la revendication 1, caractérisé en ce que le milieu de culture est maintenu à une température comprise entre 30 et 31WC. 6. Procédé suivant la revendication 1, caractérisé en ce que la concentration en saccharose dans le milieu de culture est d'environ 20 % (poids/volume), la concentration en extrait de levure est d'environ 2 % (poids/volume), le pH du mélange est maintenu entre 6,5 et 7,5 et la température du milieu de culture est maintenue à -310C. 7. Procédé suivant la revendication 1, caractérisé en ce qu'une proportion d'environ 5 à environ % (poids/volume) de produit "Amber BYF 5OX" est utilisée à la place de l'extrait de levure. 8. Procédé suivant la revendication 1, caractérisé en outre en ce que le milieu de culture est débarrassé des cellules par centrifugation avant qu'une portion du liquide ne soit évaporée pour donner une préparation enzymatique de fructosyl-transférase concentrée. 9. Procédé suivant la revendication 1, caractérisé en ce qu'il consiste en outre à centrifuger le milieu de culture pour éliminer les cellules de levure, à ajouter de la terre de diatomées au liquide débarrassé des cellules, à précipiter l'enzyme sur de la terre de diatomées par l'addition d'un solvant organique hydrosoluble et à séparer la matière solide contenant l'enzyme.