FR 2477416 A1 19810911 FR 8005302 A 19800310 La présente invention a pour objet l'uti- lisation de Hansenula notamment Hansenula anomala, ou d'ex- traits de Hansenula en tant que médicament. Les Hansenula sont des levures appartenant à la famille de Saccharomycetaceae et à la sous-famille des Saccharomycoideae qui comprend de nombreux genres. Ces gen- res sont définis par exemple dans "The Yeasts" (LODDER, North Holland Publishing Company, 1970, pages 405 à 554). L'es- pèce Hansenula anomala qui a été plus particulièrement étu- diée par la Demanderesse, est connue et accessible dans plu- sieurs collections de micro-organismes, par exemple dans le CENTRAALBUREAU VOOR SCHIMMEL CULTURES (DELFT, Pays-Bas) sous le N CBS 112. A la connaissance de la Demanderesse, les Hansenula n'ont jamais été étudiées en vue d'un usage thé- rapeutique. Des levures appartenant à un genre différent, tel que Saccharomyces cerevisiae, ont trouvé des applications thérapeutiques, en particulier comme protecteurs ou régéné- rateurs de la flore bactérienne intestinale. Par ailleurs, certains auteurs ont étudié des extraits de Saccharomyces cerevisiae ou leurs glucanes dans leur action sur le système réticuloendothélial (RIGGI et Di Luzio, Am. J. Physiol. (1961) 200, 2, pages 297300 ou dans leur action antitumorale (HAMURO et coll., C.A., (1978) 89, 40 704 b). Or, la Demanderesse a trouvé que les Hansenula, notamment Hansenula anomala ainsi que ses extraits, en par- ticulier les glucanes insolubles, possedent des propriétés pharmacologiques exceptionnelles justifiant leur application en tant que médicaments des maladies infectieuses: immuno- stimulation non spécifique, potentialisation de l'action des antibiotiques et augmentation de l'activité des vaccins. Les souches de Hansenula peuvent être entre- tenues et cultivées de manière connue sur des milieux d'en- tretien et de fermentation habituellement utilisés pour les levures. Les cellules obtenues peuvent être séchées à 50 sous vide ou de préférence lyophilisées. Les extraits selon l'invention, qui sont principalement des glucanes insolubles, peuvent être isolés de la paroi des cellules de Hansenula, par exemple selon la méthode indiquée par Bell et Northcote (J. Chem. Soc. (1950), pages 1944-47), éventuellement modifiée, par exem- ple selon Peat et coll. (idem, 1958a, pages 3862-3868). Le principe consiste à éliminer de la masse cellulaire obte- nue par fermentation, d'abord les protéines et les lipides et les mannanes par traitement alcalin, puis le glycogène et les glucanes solubles par traitement acide. Les exemples suivants illustrent l'obtention de ces produits. EXEMPLE 1: Procédé de fermentation de Hansenula anomala a) Préparation des pieds de cuve. On prépare le pied de cuve à partir de la culture d'entretien de la souche de Hansenula anomala. Celle-ci est obienue par incubation pendant 48 heures à 30 C de la levure sur pente gélosée contenant: Milieu (1) eau de levure............ 500 ml peptone pancréatique..... 2 g glucose massé.............. 10 g gélàse..... ............ 18g..DTD: eau ordinaire q.s.p..... re. On décolle la culture de la pent4 élosée par environ 10 ml de sérum physiologique stérilTtube. On verse la suspension ainsi obtenue de maniè.X 4 ile dans un erlenmeyer de 6 litres contenant 1,5 litre de milieu de fermentation ayant la composition: Milieu (2) glucose.................. extrait de levure........ sulfate d'ammonium....... phosphate monopotassique. sulfate de magnésium (7H20) g 2,5 g g g 0,05 g -2477416 chlorure de calcium........ 0,01 g sulfate ferreux (7H20)..... 0,01 g chlorure de potassium...... 0,01 g eau ordinaire q.s.p......... 1 litre. S L'incubation dure 24 heures à 27 + 1 sur agitateur rotatif à environ 115 t/minute. b) Fermentation. On ensemence le contenu de 2 erlenmeyer tel qu'obtenu ci-dessus (environ 3 litres) dans une cuve de fermentation stérile remplie de 200 litres de milieu (2) décrit ci-dessus. On effectue la fermentation pendant heures sous aération de 20 m3/heure. Ensuite on centri- fuge le contenu de la cuve afin derécolter la masse conte- nant les cellules de Hansenula. On obtient 3,35 kg de masse cellulaire (humidité 78 %). EXEMPLE 2: Obtention de cellules desséchées de Hansenula anomala En séchant ï 500C sous vide 1 kg de la masse cellulaire obtenue dans l'exemple 1, on obtient 220 g de cellules prêtes à être utilisées. Une variante, pour obtenir un produit plus facile à conserver et à utiliser, consiste à lyophiliser la masse cellulaire obtenue dans l'exemple 1; à partir de 1 kg de masse cellulaire on obtient ainsi 215 g de cellules uti- lisables. EXEMPLE 3: Obtention de glucanes de Hansenula anomala On traite 1 kg de masse cellulaire fraîche- ment centrifugée obtenue selon l'exemple 1, par 3 litres d'une solution de soude à 6 % pendant 1 heure 30 à 80 C; on recueille le résidu par centrifugation (4000 t/minute pendant 15 minutes) et on traite ensuite par 5 litres d'une solution de soude à 3 % pendant 18 heures à température am- biante; on centrifuge à nouveau et on traite le produit insoluble de nouveau par une solution de soude à 3 % pen- dant 1 heure 30 à 80 C. On centrifuge et on reprend le culot de centrifugation par 3 litres d'eau. On amène la suspen- sion ainsi obtenue à pH 4,5 par de l'acide acétique (ou chlorhydrique)-et on porte à 80 C pendant 2 heures sous agitation. On lave le résidu obtenu par centrifugation 3 fois par 1 litre d'eau bouillante et reprend par 2,5 li- tres d'une solution d'acétate de sodium 0,02 M puis pro- cède à un autoclavage à 2 bars pendant 1 heure. On lave la partie insoluble à l'eau, puis à l'éthanol, à l'acétone et on sèche sous vide à 50 C maximum. On obtient après broyage du produit obtenu 18,3 g d'une poudre crème. L'alternative consiste à lyophiliser. A partir de la mnme quantité de cellules on obtient 15,3 g d'extrait. Analyse: C = 46,14 %; H = 7,72 %; O = 45,52 % N = L'action de l'amylase d'origine pancréatique sur l'extrait ne libère que des traces de composés réduc- teurs, indiquant l'absence de glycogène. L'extrait selon l'invention est remarquable par son insolubilité dans l'eau, les solutions alcalines ou acides, et les solvants organiques usuels, tels que l'étha- nol, l'éther diéthylique, l'acétate d'éthyle, l'acétone, le chloroforme, etc... On constate toutefois une très légère solu- bilité dans le diméthylsulfoxyde (DMSO). Pouvoir rotatoire spécifique:/ -20 or'- 65 (C = 0,16; -- -- DMSO) Infrarouge: le spectre obtenu avec pastille de KBr présente une absorption caractéristique à 890 cm1. Il ressort de ces données que les extraits obtenus de la paroi de Hansenula anomala sont principale- ment des polymères ramifiés de glucoses, liés par une majo- rité de liaisons B. L'action de l'hexo-B-(1-3)-D-glucanase sur l'extrait libère des composés réducteurs confirmant ainsi l'existence de liaisons C(1-3). L'extrait selon l'invention est donc constitué essentiellement de e-(1-3)-D- glucanes qui seront appelés simplement "glucanes" dans le texte. Les levures Hansenula, en particulier Hansenula anomala ainsi que les glucanes qui en sont extraits ont été soumis à des essais pharmacologiques. - Toxicité - Aucune toxicité n'a été constatée chez la souris par voie orale, aussi bien pour Hansenula anomala que pour ses glucanes. Par voie I.P., la DL50 de ces glucanes est supérieure à 500 mg/kg. - Mise en évidence de l'Immunostimulation par les cellules entières de Hansenula et par ses glucanes - 1) par la consommation du complément L'augmentation de la consommation du complé- ment est le signe d'une stimulation immunitaire. Ce test a été effectué avec des cellules entières d'Hansenula anomala voie parentérale, les animaux utilisés sont des lapins. Ceux-ci sont répartis comme suit - 1 lot témoin de 2 lapins - i lapin recevant une injection parentérale de 5 mg/kg de Hansenula anomala - i lapin recevant une injection parentérale de 1 mg/kg. Quotidiennement, la consommation du complé- ment est dosée. Le dosage est traduit en finalité par la lecture de l'aire d'hémolyse, celle-ci étant le reflet de l'activité du complément des animaux. Cet essai a donné les résultats suivants (en aires d'hémolyse). 2ème 3ème 4ême 5ème 8ème Avant jour jour jour jour jour Témoin N 1 25,50 23,75 29,22 27,33 27,33 Témoin N 2 26,41 22,89 24,62 22,04 23,75 Hansenula 5 mg' 29,22 36,32 50,27 39,60 33,18 38,18 Hansenula 1 mg 34,21 45,36 55,42 52,81 47,78 24,62 Comme on peut le constater, 48 heures après l'injection il y a augmentation très significative de l'ac- tivité du complément (+ 70 % pour 5 mg/kg; + 61 % pour 1 mg/kg). 2) par la protection contre une infection expé- rimentale mortelle traitement préventif; voie I.P. Les animaux utilisés sont des souris SPF IFFA CREDO, femelles, de 18-20 grammes, nourries avant ex- périence durant 8 jours avec un régime dépourvu de levures mais contenant la dose de vitamines nécessaires. Ces souris sont réparties en 2 lots: - 1 lot témoin d'infection - 1 lot infecté et traité soit par Hansenula soit par ses glucanes. Les expériences ont été effectuées sur les souris infectées par voie I.V. par environ 1 x 106 Staphylo- coccus aureus pathogènes (souche Institut Pasteur 54.146) ou par environ 1 x 104 Klebsiella pneumoniae. Le traitement a été effectué par voir I.P. - pour Hansenula anomala à la dose de 50 mg/kg - pour les glucanes de Hansenula à 10 mg/kg. Le schéma opératoire est le suivant: Lot témoin Lot traité Jour - 7 Injection I.P. de Injection I.P. de 0,2 ml de sérum 0,2 ml de suspen- physiologique par sion de Hansenula souris ou de glucanes Jour - 4 2ème injection 2ème injection idem idem Jour - O Infection bactérienne Le nombre de souris mortes dans chaque lot est noté chaque jour. Les tableaux suivants indiquent le nombre d'animaux survivants. A) - Avec levures entières de Hansenula anomala Lot témoin Lot traité Infection par Klebsiella pneumoniae 1/10 7/9 % de survie 10 % 77 % Infection par Staphy- lococcus aureus 0/10 7/10 % de survie 0 % 70 % B) - Avec les glucanes d'Hansenula Infection par Staphylococcus Lot témoin Lot traité 1er essai 0/10 8/10 2ème essai 0/10 6/10 3ème essai 2/10 7/10 4ème essai 2/10 5/10 ème essai 2/10 7/10 % de survie 12 % 66 % Comme on peut le constater, le nombre de souris mortes est inférieur dans les lots traités au nom- bre de souris mortes dans les lots témoins, que ce soit avec les cellules entières de Hansenula anomala ou avec ses glucanes. Etant donné la virulence du germe injecté, la protection conférée par l'injection I.P. de Hansenula ou de ses glucanes est très importante. Cette protection est attribuable à une immunostimulation non spécifique. Mise en évidence de l'IMMUNOSTIMULATION par Hansenula anomala et par ses glucanes après injection préalable d'antigène. Les animaux utilisés sont des souris SPF IFFA CREDO,femelles, de 18-20 grammes, nourries avant l'expérimentation durant une semaine avec un régime ne comportant aucune levure mais contenant la dose nécessaire de vitamines. Ces souris sont réparties en 5 lots: - lot 1: témoin d'infection - lot 2: témoin antigène ("vaccin") - lot 3: recevant l'antigène + l'infection lot 4: comme lot 3, avec en supplément un traitement par Hansenula anomala - lot 5: comme lot 3, avec en supplément un traitement par glucanes de Hansenula. L'antigène est ici constitué d'une culture de staphylococcus aureus (Institut Pasteur 54.146) à dose non mortelle. La culture de 16 heures en bouillon nutritif est diluée au moment de la vaccination à 1 x 10-4, repré- sentant environ 1 x 104 germes/ml. Les souris des lots 1, 3 à 5 sont infectées par la souche très pathogène de staphylococcus aureus (Institut Pasteur 54.146) réactivée. Une culture en bouillon nutritif, incubée durant 16 heures à 37 est injectée par la voie I.V. pour infecter les souris après dilution au l/100e dans du sérum physiologique (soit 1 x 106 germes/ml. Le schéma opératoire est le suivant: lot 1 lot 2 lot 3 lot 4 lot 5 témoin témoin vaccin + idem 3 + -idem 3 + Jour 9 d'infc- vaccin infection Hansenula glucanes tion 0,2ml I.V. 4 de sérum 0,2 ml I.V. de 10germes/ml physiologi- (vaccin) que...... Jour - 6 à 0,2 ml I.P. de sérum physio-0,2 ml I.P 0,2 ml I.P Jour-1 logique par jour 50 mg/kg 10 mg/kg Bansenula glucanes Infection sérum Infection.séru aInfection par voie I.V. Jour O 106 germes) physlolo 0,2 ml (106 germes) 2 ml I.V.gique _ _ _ _ __ 0,2 mi I.Videm lot Le nombre de souris mortes dans chaque lot est noté chaque jour. Les survies pour chaque lot ont été les suivantes: - témoins d'inocuité du vaccin 9/9 soit 100 % de suri - souris témoins d'infection 2/10 soit 20 % " - souris vaccinées et infectées 4/9 soit 44 % - souris traitées en plus par vie Hansenula - souris traitées en plus par glucanes 9/10 soit 90 % 9/10 soit 90 % Ces résultats montrent que 80 % des animaux infectés par 106 Staphylococcus aureus sont morts. Les ani- maux, s'ils ont été vaccinés 1 fois, 9 jours avant cette infection sont en partie protégés puisque la mortalité est alors de 44 %. Comme on peut le constater ici, l'addition à la vaccination d'un traitement par Hansenula ou par ses glucanes par la voie I.P. abaisse très fortement la morta- lité à 10 %. Etant donné l'extrême virulence du germe injecté, la potentialisation conférée par les glucanes à une prévaccination spécifique a été importante. Cette potentialisation est là encore atttibuable à une immuno- stimulation. Mise en évidence de la potentialisation de l'action des antibiotiques Dans cet essai on a adjoint à un traitement antibiotique (chlorhydrate de tétracycline 4 jours à mg/kg),un traitement préventif en 2 injections par des glucanes à la dose de 10 mg/kg. Les animaux utilisés sont de la même souche qu'aux essais précédents et ont le même régime alimentaire. Les souris sont réparties en 4 lots de souris: li - lot 1: témoin d'infection - lot 2: traité par glucanes de Hansenula - lot 3: traité par 10 mg/kg par jour de tétracycline - lot 4: recevant - glucanes de Hansenula - 10 mg/kg par jour de tétracycline. L'essai a été effectué sur des souris in- fectées par voie I.V. par environ 1 x 106 Staphylococcus aureus pathogènes (Institut Pasteur 54.146) réactivés. Une culture en bouillon nutritif incubée durant 16 heures à 37 C est utilisée après dilution au 1/100e pour infecter les souris. Le schéma opératoire est le suivant: témoins dtémoins eglucanes tétracycline tétracycline d'infection + + glucanes Jour - 7à I.P.: 0,2 ml I.P.: 0,2 ml idem I.P.: 0,2 ml de sérum phy- de glucanes témoins de glucanes Jour - 4 siologique 10 mg/kg 10 mg/kg Jour O INFECTION Staphylococcique voie I.V. Jour + I à Per os: Per os: Per os: Per os: Jour + 4 0,2 ml de 0,2 ml de 0, 2 ml de sérum phy- dem tétraey- tétracycline siologique cline _ _ _ _ _ _ I. d _ _ _ Le nombre de souris mortes est relevé chaque jour. Le tableau suivant indique les survies observées pour chaque lot. (voir page suivante) Témoins glucanes seuls tétracycline glucanes + tétracycline 1/10 3/10 2/10 4/10 Comme précédemment, il y a eu protection par les glucanes de Hansenula seuls. La tétracycline, à cette dose, a faiblement protégé les animaux (2/10). L'adjonction de glucanes à cette même dose de tétracycline a potentialisé l'action antibiotique de la tétracycline (4/10). Les essais relatés ci-dessus ont mis en évidence que l'administration de Hansenula anomala ou de ses glucanes, d'une part, diminue par immunostimulation non spécifique la mortalité d'animaux infectés par un germe pathogène et, d'autre part, potentialise l'action d'anti- biotiques et celle de vaccins. Cette levure est donc sus- ceptible d'être utilisée pour renforcer la résistance de l'organisme contre les agents infectieux et pour améliorer les défenses immunitaires. Les levures Hansenula anomala et les glucanes qui en sont extraits étant dépourvus de toxicité peuvent donc être utilisés dans la prévention et/ou le traitement des maladies infectieuses aiguës ou chroniques, en particulier des maladies de la sphère ORL et/ou pulmo- naire, mais aussi de toute autre maladie d'origine virale ou bactérienne. Hansenula anomala et ses glucanes peuvent être utilisés comme médicaments seuls ou en association avec un ou plusieurs antigènes ou encore en association avec un ou plusieurs antibiotiques. Les cellules entières de Hansenula peuvent être administrées par voie orale à des doses quotidiennes de 100 à 2000 mg (produit sec) par jour, de préférence dans des gélules contenant les cellules lyophilisées et éven- tuellement des excipients usuels, ou bien en ampoules buva- bles, les cellules étant en suspension dans leur milieu de culture. Exemple de composition d'une gélule: - Cellules lyophilisées de Hansenula anomala............. 50 mg - Lactose....................... - Stéarate de magnésium......... 7 mg 2 mg - Sucre glace q.s.p. une gélule de............ 150 mg. Les glucanes de Hansenula peuvent aussi être administrés par voie orale, à des doses quotidiennes de 20 à 500 mg, ou seront utilisés également sous forme de suspensions injectables, à raison de 5 à 100 mg par jour. On peut aussi envisager l'usage de ces glucanes sous forme de crèmes dermiques ou d'aérosols. Exemple de composition de suspension injectable: - Glucanes de Hansenula anomalat micronisés....................... 0,010 g - Polysorbate 80....... .......... 0,025 g - Polyvinylpyrrolidone............. 0,025 g - Phosphate monosodique............ 0,025 g - Chlorure de sodium q.s.p. isotonie..DTD: merthiolate de sodium............ - Eau distillée apyrogène q.s.p. 1 ampoule injectable de 5 ml (particules) Exemple d'aérosol: - Glucanes micronisés*.............. - Polysorbate 80................... - Glycérides oléiques polyoxy- éthylènes.................. - Phosphate monosodique............ - Chlorure de sodium q.s.p.isotonie merthiolate de sodium............ - Eau purifiée.... q.s.p............ 0,0002 g 0,050 g 0,2 g 1 g 0,1 g 0,0008 g ml. R E V E N D I C A T I 0 N S 1.- Médicament constitué de Hansenula ou d'extraits de Hansenula. 2.- Médicament constitué de Hansenula anomala ou d'extraits de Hansenula anomala. x 3.- Médicament selon la revendication 2, caractérisé par le fait qu'il est constitué de cellules entières de Hansenula anomala. 4.- Médicament selon la revendication 2, caractérisé par le fait qu'il est constitué d'extraits de paroi de Hansenula anomala obtenus par un procédé consis- tant à éliminer des cellules de Hansenula anomala, les protéines, les lipides et les mannanes par traitement al- calin, puis le glycogène et les glucanes solubles par traitement acide. 5.- Médicament à base d'extraits selon les revendications 2 ou 4, caractérisé par le fait que les extraits sont principalement constitués de glucanes inso- lubles. 6.- Médicament selon la revendication 5, caractérisé en ce que les glucanes insolubles sont essen- tiellement des s-(1-3)-D-glucanes.' 7.- Composition pharmaceutique renfermant à titre de substance active de la Hansenula anomala ou des extraits de Hansenula anomala tels que définis dans l'une quelconque des revendications 2 à 6, ainsi qu'un véhicule pharmaceutique acceptable. 8.- Composition pharmaceutique selon la revendication 7, administrable par voie orale, caractéri- sée par le fait qu'elle contient des cellules entières de Hansenula anomala ou d'extraits de Hansenula anomala. 9.- Composition pharmaceutique selon la revendication 7, administrable par voie parentérale, caractérisée par le fait qu'elle contient des glucanes insolubles de Hansenula anomala. 10.- Composition pharmaceutique selon la revendication 7, sous forme d'aérosol, caractérisée par le fait qu'elle contient des glucanes insolubles de Hansenula anomala.