FR 2483461 A1 19811204 FR 8011728 A 19800527 FROCEDE ET COMPOSITIONS POUR LE DIAGNOSTIC IN VITRO DES MALADIES DUES A DES DEFICIENCES LYSOZOMIALES, A DES ABERRATIONS CHiROMOSOMIQUES, A LA DYSTROPHIE MUSCULAIRE OU A LA FIBROSE KYSTIQUE. L'invention concerne un procédé de diagnostic in vitro de maladies trouvant leur origine dans des anomalies lysozomiales (ou lysozomales), la fibrose kystique, la dys- trophie musculaire et/ou les aberrations chromosomiques, un procédé dérivé du précédent permettant la détermination in vitro de la possibilité d'action de médicaments à l'étude sur ces maladies, ainsi que des réactifs susceptibles d'être mis en oeuvre dans ces Drocédés. I]. est à ce jour pratiquement établi que de nom- breuses maladies lysozomiales trouvent leur origine dans une modiiication d'origine génétique des équilibres enzymatiques au sein des cellules de l'organisme. A titre d'un premier type d'exemple de ces maladies lysozomales, on peut citer les maladies classiques dites de stockage ou d'accumulation dues à l'incapacité des cellules de l'hôte de synthétiser des enzymes déterminées aptes à mé- taboliser ou cataboliser des substrats déterminés, plus par- ticulièrement certains types d'hydrolases. Il est ainsi connu par exemple que la maladie de Pompe est due à une déficience en O-glucosidase, d'o l'impossibilité pour les cellules attein- -tes de digérer ou d'hydrolyser le substrat correspondant, le glycogène, lequel tend alors à s'accumuler dans l'organisme de l'hôte. Il en est encore de même des maladies du type gMl-gangliosidose, qui sont dues à une déficience en e-galactosidase. Les cellules de l'individu affectées ne sont alors pas aptes à hydrolyser les gM,-gangliosides. Une autre catégorie de maladies lysozomiales se, manifeste au contraire par des libérations d'hydrolases dans les espaces extracellulaires et par conséquent en des défi- ciences intracellulaires multiples en ces hydrolases. L'hypothèse a été formulée que ces libérations in- contrôlées trouvaient leur origine dans un défaut génétique affectant certains marqueurs portés par ces hydrolases, mar- queurs qui servent normalement à ancrer ces hydrolases sur des récepteurs de membranes lysozomaux spécifiques. Ces mar- queurs paraissent devoir être constitués par des oligosaccha- rides phosphorylés fixés sur les protéines enzymatiques à l'occasion d'un processus secondaire intervenant lors de leur passage'à travers les cavités du réticulum endoplas- mique. La conséquence de modifications du système lyso- zomal est là encore une accumulation dans l'organisme de différents substrats macromoléculaires non hydrolysés. Un certain nombre de mucolipidoses se rattachent à cette caté- gorie de maladies. Il semble ainsi établi que la maladie des "cellules-I"- ("I-cell disease") est due à une phospho- rylation anormale d'un groupe mannose, d'o des libérations incontrôlées d'hydrolases dans les espaces extracellulaires ou - lorsque ces cellules sont cultivées in vitro - dans le milieu de culture. A cette catégorie de maladies se rattache la fi- brose kystique (souvent visée ci-après par les initiales "CF"), également dénommée mucoviscidose, qui est une maladie génétique récessive autosomale extrêmement grave, particu- lièrement fréquente dans les populations d'origine euro- péenne. En France un nouveau-né sur 2.000 à 2.500 en est affecté. Cette maladie se manifeste en général aussitôt après la naissance. Les syndromes les plus caractéristiques consistent dans le développement d'obstructions pulmonaires chroniques, d'insuffisances pancréatiques, un défaut de mé- tabolisation des graisses et une sensibilité extrême aux infections, notamment au niveau des régions respiratoires. La mort s'ensuit habituellement au cours des toutes pre- mières années de la vie de l'enfant. Au niveau cellulaire, on constate des déficiences intracellulaires partielles multiples en hydrolases, des fuites excessives de ces mêmes hydrolases dans les fluides extracellulaires (plasma sanguin, milieux de cultures). Certaines des enzymes concernées sont encore affectées d'une thermolabilité, qui peut être mise à profit pour un diagnostic différentiel in vitro de la fi- brose kystique. A l'inverse, ce sont, dans une autre catégorie de maladies, les récepteurs lysozomiaux de membranes eux-mêmes qui peuvent être défectueux (maladie de Chediak-Higashi), -40 d'o encore la conséquence d'une libération incontrôlée d1hydrolases dans le milieu extracellulaire et la métaboli- sation insuffisante, sinon inexistante de divers substrats. De nombreuses autres maladies, plus particulière- ment celles'dues à des anomalies chromosomiques, se mani- festent par des modifications au niveau de la synthèse des enzymes qui s'avèrent pouvoir être dépistées au niveau cellulaire. Il a été par ailleurs constaté, dans le cadre dé la présente invention, qu'une maladie mettant en jeu une anomalie au niveau du chromosome X (mutation ponctuelle sur ce chromosome) et qui est particulièrement répandue - la dystrophie musculaire -, peut se manifester dans les conditions qui seront décrites plus loin par une libération dans les milieux extracellulaires d'enzymes spécifiques. Il a cependant été constaté qu'elles ne présentent pas de thermolabilité différentielle vis-à-vis des enzymes corres- pondantes produites par les cellules d'individus sains. Plus généralement, on constate que les cultures de cellules pré- sentant des anomalies chromosomiques sont susceptibles d'engendrer, dans les conditions qui seront décrites plus loin, des variations importantes vis-à-vis de la normale des quantités d'enzymes, notamment d'hydrolases, produites par rapport aux cellules normales. Ce phénomène se concré- tise par des excédents intracellulaires, extracellulaires ou les deux à la fois,d'enzymes hydrolytiques. En raison du caractère particulièrement grave de la plupart de ces maladies, il est souhaitable de pouvoir dé- pister ces anomalies génétiques aussitôt que possible. Les chances de survie d'un nouveau-né potentiellement affecté de l'une de ces maladies seront d'autant meilleures qu'il pourra sans tarder être soumis à une thérapie intensive. Il serait mieux encore de dépister cette anomalie dans la phase néonatale, éventuellement même dans la toute première phase de la grossesse, à un moment o une interruption de grossesse thérapeutique pourrait éventuellement encore être indiquée. Certes, il existe déjà à ce jour des techniques per- mettant d'apprécier sur des prélèvements de liquide amnio- tique des anomalies chromosomiques, lorsqu'elles se mani- festent par des modifications d'ordre structurel. On con- çoit cependant la difficulté d'effectuer des caryotypes systématiques sur un grand nombre de prélèvements cellu- laires. Les techniques de dépistage s'avèrent cependant encore plus difficiles à ce jour lorsque les anomalies en question sont invisibles à l'oeil et sont l'expression d'erreurs futures de contrôle ou de régulation du métabo- lisioe cellulaire. Les procédés proposés jusqu'à ce jour pour les dépistages néonataux n'ont donc guère été déve- loppés, tant en raison des résultats ambigus auxquels ils conduisent que de la difficulté technique de leur mise en oeuvre. Il serait encore mieux de pouvoir évaluer préven- tivement les risques de transmission d'un défaut géné- tique par des parents apparemment sains à leur descendance. A titre d'exemple, on peut mentionner que certaines de ces maladies, telles que la mucoviscidose, sont des affections familiales se transmettant selon le mode autosomal réces- sif. Il semble à ce jour établi que sont susceptibles d'être affectés de la mucoviscidose les enfants dont le patrimoine génétique résultede la recombinaison chromo- somique au moment de la fécondation des patrimoines géné- tiques du père et de la mère, lorsque tous deux sont porteurs d'une mutation spécifique, sans pour autant être eux-mêmes affectés de cette maladie. Ces parents seront ci-après dits "C-F-hétérozygotes". Bien entendu, cette expression s'étend également à leurs cel- lules et, d'une façon générale, à leur patrimoine géné- tique propre. Sont donc susceptibles d'être affectés de la maladie, les enfants qui reçoivent en partage ces défauts génétiques de leurs deux parents-, eux-mêmes étant dits par la suite "CF-homozygotes". Par extension, on utilisera aussi ces expressions "hétérozygotes" et "homozygotes", à l'égard de parents et enfants respectivement porteurs d'une anomalie génétique quelconque. L'invention a pour but de remédier aux inconvé- nients susmentionnés, plus particulièrement de fournir un procédé permettant tant le dépistage global in vitro chez un individu de l'existence éventuelle- ou potentielle de l'une quelconque d'une pluralité de maladies prédéterminées du genre en question, que le diagnostic à la fois plus sûr et plus aisé qu'il n'était possible jusqu'à ce jour de l'existence éventuelle ou potentielle de l'une d'entre elles. Le procédé selon l'invention a encore pour but la réalisation du test de dépistage, non seulement chez les nouveau-nés ou d'une façon plus générale les enfants, mais aussi chez l'embryon et de préférence même dans les toutes premières semaines de la grossesse. La demande de brevet n0 79 14234 déposée le 1er juin 1979 au nom du demandeur décrivait pour la fibrose kystique l'obtention d'un procédé permettant le dépistage systématique au niveau des populations de ceux des indivi- dus éventuellement porteurs d'un défaut génétique "hétéro- zygote". Un tel test de diagnostic systématique peut, par exemple, être mis en oeuvre à l'occasion des visites médi- cales prénuptiales de plus en plus couramment prescrites par les législations nationales. La présente invention vise l'obtention d'un procé- dé permettant de tester la valeur potentielle d'un médica- ment à l'étude contre une ou plusieurs des maladies du genre en question. L'invention met à profit un certain nombre de cons- tatations et d'hypothèses qui s'appuient sur un support expérimental étendu concernant la régulation génétique. C'est ainsi que l'on peut à ce jour penser que le signal primaire susceptible d'activer les gènes qui codent pour la synthèse des différentes hydrolases nécessaires à la diges- tion intracellulaire des espèces macromoléculaires corres- pondantes est induit par ces espèces macromoléculaires elles- mêmes, telles que divers polysaccharides, le glycogène, les gangliosides, etc., lorsque celles-ci entrent dans les cel- lules. Ce signal serait normalement faible et de courte durée dans des cellules qui sont pourvues d'un équipement enzymatique normal, qui est alors capable d'hydrolyser les- dites macromolécules. Il serait cependant beaucoup plus fort et de longue durée dans des cellules qui ne sont pas capables de digérer l'une au moins desdites macromolécules. Il semble que l'acide adénylique cyclique (AMP cyclique ou c AMP) intervient dans ces processus en tant que messager hormonal secondaire, en tant qu'il coordonne l'induction des hydrolases par activation des gènes correspondants, lorsque s'accroît sa concentration cellulaire. C'est l'ensemble de ces phénomènes physiologiques qu'exploite l'invention en vue du diagnostic in vitro de l'existence éventuelle ou potentielle d'anomalies lysozo- miales, de fibrose kystique, de la dystrophie musculaire et des anomalies chromosomiques; plus particulièrement: a) des maladies génétiques du dispositif de digestion intra- cellulaire, notamment les maladies lysozomiales classiques d'accumulation, le syndrome de Chédiak-Higashi, la fi- brose cystique,la dystrophie musculaire de Duchenne, etc.. b) des maladies génétiques mettant en jeu sous l'effet de sti- muli hormonaux des réactions exces- sives accompagnées d'une induction coordonnée d'hydro- lases dans les cellules affectées d'aberrations chromo- somiques, telles que trisomies, monosomies, trisomies partielles (duplications), monosomies partielles (délé- tions), etc.. Le procédé selon l'invention est, dans l'une de ses premières variantes, caractérisé par la mise en con- tact d'une culture de cellules de l'hôte avec un "cocktail" contenant les réactifs suivants: - 1) au moins un inducteur d'au moins une enzyme, plus par- ticulièrement d'une hydrolase corrélable à une maladie déterminée et dont le comportement doit être apprécié, ou alternativement une hormone stimulant l'adénylcy- clase, ou encore les deux à la fois; - 2) un.inhibiteur des phosphodiestérases, du type de celles qui peuvent dégrader 1'AMP cyclique, tel que la théo- phylline; - 3) un inhibiteur de la synthèse des protéines; les concentrations relatives de ces constituants dans le milieu de culture étant réglées de façon à permettre un comportement nettement différencié de cellules saines et de cellules porteuses de l'anomalie recherchée (notamment dans le cas de cellules homozygotes), à ne pas affecter sensiblement le développement de cellules saines, mais à entraîner l'interruption du développement, voire la mort desdites cellules homozygotes ou hétérozygotes. On appréciera que ce cocktail de réactifs - qui fait également partie de l'invention en tant que tel - semble avoir pour effets combinés, d'une part, une induction d'un signal primaire renforcé et de longue durée, lorsque la cellule est affectée par fibrose kystique, dystrophie muscu- laire ou une anomalie lysozomiale, une aberration chromoso- mique, d'autre part, la stabilisation d'un signal secon- daire (par hypothèse celui de l'AMP cyclique) également renforcé du fait de l'inhibition des phosphodiestérases qui tendent normal.ement à la dégradation de l'AMP cyclique en adénosine 5'-monophosphate et, d'autre part encore,l'incapacité de la cellule de répondre à ces stimuli, faute de pouvoir synthétiser des protéines sous l'action de l'inhibiteur de - la synthèse des protéines. A titre d'exemple l'inducteur est constitué par au moins l'un de ceux qui sont propres à normalement induire la molification de la synthèse enzymatique (ans la maladie à étudier. Il o s'agit par exeule des tlmcromoleculesnaturelles que les cellules - lorsqu'elles sont affectées par la maladie en cause - ne peuvent pas cataboliser (par exemple le glycogène dans le cas de la maladie de Pompe, des gangliosides, notamment des gM1-galglidsi(es dans le cas des maladies du type gan- gliosidoses, des glycoprotéines ou mucopolysaccharides, dans le cas de celles des autres maladies qui sont attri- buées à l'incapacité des cellules de l'hôte à cataboliser ces substrats, etc.). Les inducteurs du genre en question peuvent également être différents des substrats naturels correspondant à la maladie étudiée, pour autant qu'ils soient capables d'induire des effets semblables au niveau des cellules affectées par les maladies en question. A titre d'exemple particulièrement avantageux d'inducteurs naturels, on citera le mélange héparine-immunoglobulines, celles-ci 3[ étant de préférence d'origine humaine, et notamment consti- tuées par des y-globulines humaines, ce mélange étant - conformémelnt à un aspect particulier de l'invention - propre à servir à la caractérisation de cellules affectées par l'anomalie caractéristique de la fibrose kystique (cellules hemozygotes ou hétérozygotes) ou de la dystrophie musculaire (cellules homozygotes). A titre d'exemples préférés d'hormones stimulant l'adénylcyclase, on mentionnera essentiellement les prosta- glandines, notamment les prostaglandines E1, ou mieux encore les prostaglandines E2. En ce qui concerne l'inhibiteur des phosphodiesté- rases entrant dans le cocktail de l'invention, on peut natu- rellement remplacer la théophylline par toute autre substance ayant une action semblable. On peut citer à titre d'exemple la 4-(4,3-diméthoxybenzyl)-2-imidazoline ou encore ceux men- tiolnnés dans l'article intitulé "Inhibitors and Activators of Cyclic Nucleotide Phosphodiestérases" de M. Chasin et D.N. Harris, dans le 7ème tome de l'ouvrage intitulé "Advances in Cyclic Nucléotide Research" de Greengard et Robinson, Raven Press, 1976. En ce qui concerne enfin l'inhibiteur de la syn- thèse des protéines on peut avoir recours à tout composé actif à une étape quelconque de la synthèse prctéique, par exemple d'un inhibiteur agissant au niveau de l'activation du gène, tel que l'actinomycine D,ou d'un inhibiteur direct de la synthèse des protéines, tel que l'émétine, notamment le dichlorhydrate d'émétine, ou, de préférence, le cyclo- heximide. Dans ce qui précède, on a essentiellement considéré le cas d'un cocktail pouvant ne contenir qu'un seul induc- teur caractéristique d'une anomalie recherchée, ou seulement une hormone stimulatrice de l'adénylcyclase. Il est cepen- dant particulièrement intéressant d'avoir recours à un cocktail comprenant un grand nombre de ces inducteurs et, le cas échéant en outre, l'hormone stimulante de l'adényl- cyclase, d'o la possibilité de réaliser des "dépistages globaux" de l'existence éventuelle de l'une quelconque des différentes maladies auxquelles correspondent respectivement les différents inducteurs du cocktail en question et, le cas échéant en outre, de toute aberration chromosomique ré- vélable par l'hormone stimulante de l'adénylcyclase. Dans cette dernière hypothèse, les épreuves de diagnostics pourront comporter plusieurs phases, par exemple: - - une première phase dans laquelle sera déterminée l'exis- tence ou la potentialité d'une maladie génétique détermi- née à l'aide d'un tel'"cocktail global" (celui-ci ne per- mettra cependant pas d'identifier de façon immédiate la maladie en cause); - une ou plusieurs phases supplémentaires mettant en jeu des sous-cocktails, notamment ne contenant, au titre du pre- mier (ou des premiers) des constituants définis plus haut de façon générale, que des inducteurs de maladies lysozo- miales, à l'exclusion de l'hormone stimulant l'adénylcy- clase, ou vice versa. Une réponse positive au sous-cocktail ne contenant que des inducteurs des maladies lysozomales incitera le spé- cialiste à répéter l'expérience de culture des cellules ori- ginaires du même hôte, mais avec des cocktails spécifiques, ne contenant qu'un seul inducteur, lui-même spécifique d'une ou d'un nombre réduit de maladies., quitte à achever l'iden- tification de la maladie spécifique par d'autres méthodes ana- lytiques. Au contraire, une réponse positive avec le cocktail ne contenant que l'hormone stimulatrice de l'adénylcyclase, à l'exclusion de tout inducteur de maladie lysozomiale, inci- tera le chercheur à rechercher la nature de l'anomalie chro- mosomique alors révélée elle-même dans sa globalité, par toute autre méthode connue en soi, telle qu'une technique d'ana- lyse de structure des chromosomes susceptibles d'être affectés. A titre d'exemple de "cocktail global", on peut mentionner ceux contenant, en sus de l'inhibiteur de phos- phlo:iestérases, notamment la théophylline, et de l'inhibi- teur de la synthèse de protéines, notamment le cyclohexi- mide: - une prostaglandine, notamment une prostaglandine E2, - de l'héparine, des immunoglobulines, du glycogène, les différents gangliosides mis en jeu dans les différentes gangliosidoses, les différents mucopolysaccharides mis en jeu dans les mucopolysaccharidoses, etc.. Les cocktails plus spécifiques ou sous-cocktails ne contiendront plus alors, en sus de la théophylline et du cyc]oheximide, que des groupes réduits de ces inducteurs, voire un seul de ces inducteurs. L'invention conc'erne plus particulièrement des cock- tails dans lesquels sont associés à la théophylline et au cycloheximide (ou autres composés ayant des fonctions ana- logues), d'une part, une prostaglandine, notamment une prostaglandine E1, ou de préférence une prostaglandine E2, et, d'autre part, de l'héparine et une globuline, notamment une y-globuline humaine. L'association héparine-globuline constitue elle- même un inducteur particulier conforme à l'invention, apte à permettre le diagnostic in vitro de la présence ou de la potentialité d'une fibrose kystique ou d'une dystrophie mus- culaire. Il a en effet été constaté, conformément à l'inven- tion, que la mise en présence de cellules affectées de l'ano- malie correspondant à la dystrophie musculaire avec l'asso- ciation héparine-globuline avait pour effet l'induction d'une libération d'hydrolases par lesdites cellules. Le susdit cocktail permettra donc la détection de la présence soit d'une anomalie chromosomique, soit d'une fibrose kystique, soit d'une dystrophie musculaire. Avantageusement, les proportions des divers consti- tuants dans le cocktail de l'invention seront telles qu'après mise en contact de ces cocktails avec le milieu de culture contenant les cellules à étudier, on obtienne les concentrations finales respectives suivantes (exprimées par rapport au ml de milieu de culture contenant ces consti- tuants): - de 180 pg à 1000 pg, notamment de l'ordre de 600 pg par ml pour l'héparine, - de 180 pg à 600 pg, notamment de l'ordre de 400 pg par ml pour la y-globuline, - de 0,8 pg à 10 pg, notamment de l'ordre de 1 pg par ml pour la prostaglandine E2, - de 10 5 à Io 2, notamment 10 3M de théophylline, - de 8 pg à 25 pg, notamment 10 pg par ml pour le cyclo- heximide (concentration finale). L'invention concerne également les cocktails préfé- rés eux-mêmes, tels qu'ils ont été définis ci-dessus, conte- nant les différents constituants dans des proportions il telles qu'ils puissent donner les concentrations relatives indiquées plus haut vis-à-vis de 1 ml de milieu de culture. L'invention concerne également les sous-cocKtails du genre en question dans lesquels manquent soit l'héparine et les y-globulines, soit la prostaglandine E2* Ces deux derniers cocktails permettront par conséquent une première différenciation entre les cellules atteintes d'une anoma- lie chromosomique (réponse positive au cocktail à base de prostaglandine E2) et des cellules atteintes d'une anomalie -correspondant soit à la fibrose kystique, soit à la dystro- * phie musculaire. Ces dernières cellules devront alors faire l'objet d'un essai complémentaire, notamment selon d'autres méthodes de diagnostic. Avantageusement, on mettra à profit le fait que certaines des enzymes affectées par la fibrose kystique, présentent une thermolabilité plus grande que lorsqu'elles sont originaires de cellules saines, différence qui n'existe pas dans le cas des enzymes mises en jeu dans la dystrophie musculaire. En particulier, on peut mettre à profit,pour détec- ter la présence ou la potentialité d'une fibrose kystique, le fait que fes a-mannosidases ou phosphatases acides pro- duites par les cellules concernées tendent à subir une inac- tivation beaucoup plus- rapide à 40',5Cpour les premières, à 360,5C pour les secondes, lorsqu'elles proviennent de cellules d'individus "CF-homozygotes" ou "CF-hétérozygotes" que lors- qu'elles proviennent d'individus normaux. Ce même type d'inac- io tivation totale ou partielle à ces températures n'est pas observable lorsque les cellules proviennent d'individus souf- frant de dystrophies musculaires ou menacées par cette mala- die, d'o par conséquent la possibilité de différencier les deux maladies dans un tel test final. Dans la forme de mise en oeuvre la plus accessible du procédé qui a été défini ci-dessus, la différenciation entre cellules saines et cellules malades met essentiel- lement en jeu la capacité des cellules en question à sur- vivre en présence des cocktails du genre en question, dans 20. le cas de cellules saines, et à mourir au bout d'un certain temps de culture en présence de ces cocktails, comme cela sera illustré dans l'exemple plus loin, dans le cas de cel- lules malades. Conformément à un développement supplémentaire de l'invention, ce test peut encore être mis en oeuvre pour dé- terminer la potentialité que possède un médicament déterminé d'exercer une activité favorable à l'égard de cellules ma- lades-qui ne survivent normalement pas aux conditions de mise en oeuvre du test qui vient d'être décrit. Ce dévelop- 3Y) pement consiste à réaliser une culture de cellules malades en présence du cocktail contenant soit l'inducteur spécifique (ou les inducteurs spécifiques) de la maladie dont sont at- teintes les cellules et de doses du médicament à étudier. L'action favorable du médicament est alors susceptible de permettre la survie desdites cellules malades au bout d'un temps de culture pour lequel elles auraient autrement cessé de se développer ou seraient mortes, en l'absence du médicament en question. L'invention fournit donc un premier procédé de "screening" ou recherche systématique du médicament sus- ceptible d'agir au niveau cellulaire. On décrit ci-après un exemple de mise en oeuvre pratique d'un essai mettant en jeu les cocktails et sous- cocktails préférés de l'invention, à l'égard de fibro- blastes humains (type de cellules qui n'est ici pris qu'à titre d'exemple). Les cellules à étudier, prélevées chez des pa- li nts et su:pettm de présenter soit une anomalie chromo- somique, soit Il'une des deux maladies que sont la fibrose kystique ou la dystrophie musculaire, sont mises en culture, à 37 C, dans des boites de pétri ou dans des boites Nunclon de 241 alvéoles. Le milieu de culture est du l}am F 10 supplé- rnentl, avec 15,' de sérum de veau foetal. 16 heures plus tard, on ajoute aux cultures la composition selon l'invention dans laquelle les différents réactifs sont dans les proportions adéquates permettant l'ajustement final suivant des concentrations relatives en ses constituants essentiels vis-à-vis de 1 ml de cul- 2-5 ture: - héparine................ 600 ig/ml, - y-globuline humaine..... . 400 pg/ml, - prostaglandine E2........1 pg/ml - théophylline............ . 10 3 M, - cycloheximide............ 10 pg/ml. On laisse 3 jours à incuber à 37 C. On lave trois fois chaque boite de pétri ou chaque alvéole avec une solu- tion tamponnée et on ajoute ensuite 1 ml de méthanol à 70 % pour fixer les cellules. On laisse 5 minutes en contact. On sèche. On colore ensuite avec du giemsa, colorant qui ne peut colorer que des cellules vivantes. - Les alvéoles des boîtes Nunclon colorées, révèlent donc les cellules normales; les cellules mutées, elles, n'ont pas résisté à l'action de la composition inductrice de la synthèse d'enzymes hydrolytiques. Les alvéoles ou boîtes de pétri non colorées, dans lesquelles les cultures.cellulaires ont donc été- tuées, témoignent de ce qu'elles présentaient l'une des anomalies sus-mentionnées. Des cellules provenant des mêmes patients peuvent alors être remises en culture dans les mêmes conditions en présence de sous-cocktails, identiques au cocktail global précédent, sauf qu'ils ne contiennent pas, soit la prosta- glandine E2, soit l'héparine et la y-globuline humaine, de façon à procéder au premier type de différenciation décrit plus haut, entre anomalies chromosomiques de structure, d'une part, une fibrose kystique ou dystrophie musculaire, d'autre part. Ces deux dernières maladies pourront d'ailleurs être également ensuite différenciées entre elles, notamment en ayant recours à la méthode qui a également été rappelée plus haut mettant en jeu l'existence ou non de thermolabi- lités de certaines des enzymes impliquées dans ces maladies. Les tests qui viennent d'être décrits peuvent être aisément adaptés à l'étude d'un médicament susceptible d'agir au niveau cellulaire. Dans le cas o l'on souhaite par exemple étudier l'action d'une nouvelle substance vis- à-vis de la fibrose kystique, on prépare une gamme de doses croissantes du médicament, et on procède à une série de cul- tures des cellules connues pour être atteintes par-la mala- die, en présence, d'une part, du sous-cocktail spécifique à cette maladie et, d'autre part, de concentrations crois- santes du médicament étudié. Le même procédé est appliqué à des cultures de cellules normales servant de témoins. Les médicaments inactifs n'altéreront évidemment pas le résultat observé, à savoir la non-coloration finale des cultures étudiées. Par contre, les doses de médicaments aptes à au moins retarder l'effet nocif de la maladie pour- ront être repérées par la coloration retrouvée des cultures de cellules correspondantes par le giemsa. Il va de soi que l'on peut utiliser, pour repérer les cellules non endommagées et les cellules endommagées, toute autre procédure ou technique que la coloration avec le giemsa (ou avec un autre colorant) pour différencier des cultures cellulaires encore vivantes et des cultures ce].lulaires qui ont cessé de se développer, voire même qui sont mortes. La composition selon l'invention peut être prépa- rée au moment de l'emploi. Elle peut aussi être préparée à l'avance, notamment se présenter sous forme d'une solution contenant: - de 1.800 lig àlO.O000Jg, notamment de 6.000 pg d'héparine par ml, - de l.8O'Ipg à 6.OOOug, notamment de 11-.000 pg par ml de y-globulineshumaines, - de 8 pg à 100. iJg, notamment de 10 pg par ml de prostaglandine E2, -Il C -de 1- à a 1 notamment de 10 M ' de théophyl- line, - de E àpg à 25O0g, notamment de 100 pg par ml d'une solution à 10( % en poids de cycloheximide, notamment dans une solution tamponnée au citrate pH 5,4. Bien entendu, lInvention concerne également les sous-cocktails contenant les mêmes substances aux mêmes concentrations, à l'exception soit de l'héparine et des y-globulines humaines, 'soit de la prostaglandine E2, D'une façon générale, on pourra constituer tout autre type de cocktail inducteur, apte à permettre le dépis- tage d'autres types de maladies lysozomales selon le même principe, les inducteurs précédents étant remplacés par ceux correspondant à la maladie que l'on désire dépister. Ces derniers peuvent également venir s'ajouter aux précé- dents dans le cas o l'on souhaiterait réaliser des cock- tails permettant un dépistage global en une seule fois d'un plus grand nombre de maladies. D'une façon générale, les inducteurs, notamment les substrats que les cellules at- teintes desdites maladies ne sont pas capables de cataboli- ser, pourront être utilisés dans des gammes de concentra- tions généralement situées entre 300 pg à 2000 pg par ml de la composition. Leurs doses peuvent également être exprimées par leur titre final vis-à-vis du milieu de cul- ture des cellules soumises à l'essai, notamment de 300 pg à 2000 pg par ml de milieu de culture. Selon une seconde variante du procédé selon l'invention, on met en oeuvre, pour le diagnostic in vitro d'éventuelles maladies du genre en question, les susdits cocktails, cependant limités aux inducteurs et/ou à l'hor- lomone stimulant l'adényleyclase, plus particulièrement à l'exclusion des inhibiteurs des phosphodiestérases et de la synthèse des protéines, et on dose les niveaux d'activité enzymatique induits par lesdits cocktails dans les cellules (milieux intracellulaires) ou dans un milieu extracellulaire, tel qu'un milieu de culture. Les niveaux d'activité mesurés s'avèrent nettement plus élevés dans les cellules malades que dans les cellules saines. Ces niveaux d'activité seront glo- balement plus élevés dans le cas des cellules caractérisées par une aberration chromosomique repérable par l'hormone stimulant les adénylcyclases (en raison d'une hyper- réaction de la synthèse enzymatique de ces cellules sous l'effet de cette stimulation) ou affectées d'une ma- ladie lysozomiale ou de la fibrose kystique ou de la dystro- phie musculaire. La lecture de l'activité enzymatique de l'enzyme de référence peut être faite par fluorescence, par colori- métrie, par dosage spécifique de l'enzyme hydrolytique choisie par l'expérimentateur (parmi toutes les enzymes hydrolyti- ques, certaines conviennent mieux pour le dosage intracellu- laire et d'autres pour le dosage dans le milieu de culture). Il s'est avéré que la phosphatase alcaline, qui est l'une des enzymes hydrolytiques induites après l'action d'un inducteur, est choisie lorsqu'on veut faire une mesure de l'activité enzymatique intracellulaire. *35 Par contre, lorsque l'on veut mesurer l'activité enzymatique dans le milieu de culture, on choisit plutôt l'hexosaminidase. Avantageusement, le diagnostic de cellules nor- males ou cellules mutées est basé sur la mesure de taux de production des enzymes concernées, mettant en jeu soit des différences substantielles mesurables de niveaux d'activité enzymatique, soit des variations des propriétés de l'enzyme de référence, notamment de thermolabilité ou de cinétique d'activation ou d'inactivation de cette enzyme (par exemple cas de la fibrose kystique), selon que ces niveaux diffé- rents d'activité enzymatique ou ces propriétés différentes de l'enzyme peuvent être mis en évidence entre cellules saines et cellules atteintes de l'une des maladies recher- chées. Cés différences de propriétés prennent une impor- tance toute particulière lorsque l'on distingue non seule- ment les cellules malades ou homozygotes des cellules "normales", mais aussi - dans le cas de la fibrose kystique - les cellules homozygotes des cellules hétérozygotes prove- nant d'individus apparemment sains. Il a en effet été mis en évidence que les en- zymes telles que l'a-mannosidase ou la phosphatase acide peuvent subir, à une température supérieure à 40,5 C pour la première et à 360 ,) C pour la seconde, une inactivation plus rapide lorsqu'elles proviennent d'individus "CF- homozygotes" que lorsqu'elles proviennent d'individus "CF- hétérozygotes", la même différence s'observant à nouveau entre individus hétérozygotes et individus normaux. Ces variations de propriétés n'apparaissent pas sur les mêmes enzymes, lorsqu'elles proviennent de cellules saines ou de cellules atteintes par l'anomalie lysozomale caractéris- tique de la dystrophie musculaire, d'o la possibilité de différencier les cellules atteintes de fibrose kystique et celles atteintes de dystrophie musculaire. La mise en évidence,par exemple, de la fibrose kystique ou de la dystrophie musculaire peut donc se faire directement sur culture de cellules après induction enzyma- tique Les conditiohs expérimentales des tests sont alors avantageusement les suivantes: 1.) Pour le diagnostic de la fibrose kystique ou de la dystrophie musculaire, la composition du cocktail inducteur est ajust6e, pour obtenir des concentrations finales en héparine et y-globuline humaine, vis-à-vis de 1 ml de milieu de culture: - de 150 à 4o00, notamment 200 pg par ml de milieu de culture pour l 'hpaproin, - de 150 à lo00, notamment 200 lg par ml de milieu de culture pour la y-globuline. 2 ) Pour le diagnostic des anomalies chromoso- miques, il teneur de la composition en prostaglandine E est ajustée le fa orn à obtenir une concentration finale de 0,83 à 10, notamment 1 ig/ml. Les cellules normales soumises à ce cocktail ne présentent pas une synthèse d'enzymes hydrolytiques très sensiblement différente de celle des cellules normales témoins. Par contre, les cellules mutées présentent une augmentation du taux d'enzymes hydrolytiques que ce soit au niveau intracellulaire ou dans le milieu de culture. Généralement, le test pour le diagnostic utilise une composition regroupant les constituants définis sous 1 et 2%ci-dessus qu'en une seule opération, on peut diagnostiquer une cellule anonnale (qu'ils'agisse de la fibrose kystique, de la dystro- phie musculaire ou d'anomalie chromosomique) et en une se- conde étape on peut par exemple en utilisant le cocktail n 2 identifier la nature de la mutation des cellules mises en culture (dans ce cas, il s'agit du diagnostic des anoma- lies chromosomiques). Le cocktail global a donc la composition sui- vante: - héparine............... de 150 à 3Y. 200 pg/ml, - y-globuline humaine.... de 150-l à pg/ml, - prostaglandine E2...... de 0,8 à 1 lg/ml. o00, notamment io00, notamment , notamment A titre d'exemple, on indique ci-après un proto- cole de traitement des cultures qui peuvent être mises en oeuvre en vue de la réalisation des susdits dosages: fo) Cultiver les cellules en flacon corning 75 cm2, milieu HAM F10 (fibroblastes humains) jusqu'à ce qu'il y ait inhibition de contact. 2 ) Eliminer le milieu de culture, laver trois fois avec une solution tamponnée pH 7,4, entre chaque la- vage, laisser les cellules à 5 minutes en contact avec cette solution. ) Préparer du milieu HAM FO10 dépourvu de sérum de veau foetal mais contenant 0,01 0 d'albumine bovine (Sigma Lab.). ) E1liminer la solution de lavage. Rincer une fois avec le milieu défini sous 3 ),puis remplir avec 5 ml du même milieu. ) Incuber pendant 10-12 heures à 37 C, en agitant très doucement. 6 ) Renouveler le milieu et laisser pendant trois jours toujours à 37 C et avec agitation. 7 ) Effectuer un premier prélèvement de 100 pi de milieu de culture à la fin du troisième jour (vers 19 h environ) et un second prélèvement le lendemain matin (vers 9 h environ) Congeler immédiatement dans l'azote liquide les aliquotes prélevées. 8 ) Après le deuxième prélèvement, ajouter à la culture cellulaire 500 il lu coclktail inducteur. 9 ) A la fin de ce quatrième jour (toujours vers 19 h) et les matins suivants (cinquième jour et sixième jour, vers 9 heures), prélever chaque fois des nouvelles aliquotes de 100 pl à congeler immédiatement dans l'azote liquide. ) Faire les dosages de l'enzyme choisie dans tous les tubes en même temps (hexosaminidase) et comparer les résultats entre les tubes contenant des cultures in- duites et les tubes contenant les cultures non induites. ) Le cas échéant, faire en parallèle les opé- rations 1 ) à 10 ) sur des cellules provenant d'individus témoins sains et comparer. Dans ce qui précède les concentrations des différents constituants du cocktail inducteur sont respectivement sensi- blement égales à dix fois les concentrations finales cor- respondantes désirées dans le milieu de culture final. Les cultures de cellules qui, dans les séquences qui précèdent, répondent "positivement" à la composition induc- trice peuvent alors être suspectées de porter l'une des anomalies recherchées. Les-cultures de cellules qui répondent "positivement" sont celles pour lesquelles les dosages de l'enzyme choisie font apparaître une production de l'enzyme étudiée beaucoup plus importante sur les aliquotes qui ont été prélevées au terme de l'étape 90) ci-dessus que sur les aliquotes préle- vées au terme de l'étape 7 ) ci-dessus. Lorsque les mêmes opérations sont réalisées sur des cellules provenant d'indi- vidus témoins sains, une telle différence n'est pas obser- vée. Comme dans le cas de la première variante du procédé selon l'invention, on peut mettre à profit cette techniquepour 5tudier les effets de médicaments à étudier sur une maladie déterminée, en associant des gammes de doses croissantes de ce médicament à la composition induc- trice appropriée, qui est mise en contact avec la culture de cellules affectées de ladite maladie déterminée. Selon une troisième variante enfin du procédé Bselon l'invention, notamment pour effectuer le diagnostic ïn- vitro de maladies caracterisées par l'incapacité du sujet de synthétiser certaines enzymes spécifiques (par exemple une a-glucosidase dans la maladie de Pompe, une B-galactosidase dans le cas de la gM1-gangliosidose, etc.), on réalise une culture des cellules à étudier en présence d'un dérivé stabilisé de l'AMP cyclique, qui soit de plus 3tj apte à traverser facilement les membranes cellulaires, et on recherche et on dose l'enzyme spécifique éventuellement produite. T.e c- l age dee 'enzyme se fait s'ait dans le milieu intracellulaire, soit dans le milieu de culture. ?1 Il apparaît en effet que ces dérivés de l'AMP cyclique, tout comme l'AMP cyclique naturel, conduisent à une induction coordonnée de la totalité des hydrolases sus- ceptibles d'être produites par la cellule, à l'exclusion bien entendu de celles qu'elle n'est pas capable de syn- thétiser, d'o un procédé différentiel particulièrement efficace pour dépister le dernier type d'anomalies envisa- gées. De tels dérivés d'AMP cyclique "stabilisés" 1O sont disponibles dans le commerce: à titre d'exemple, on mentionne le complexe N6, D2 -dibutyryl-adénosyl 3'5'- cyclique, acide monophosphorique et le complexe 8-(4-chlo- rophénylthio)-adénosine-3',5' cyclique, monophosphate de sodium. On peut notamment procéder selon le protocole expérimental de culture susmentionné. On règle avantageuse- ment la concentration du dérivé de l'AMP cyclique à une concentration finale de 5.10 6 à 5.10- 9 M/l, par exemple de 5.108 1/l de milieu de culture, et on procède ensuite au dosage des enzymes concernées selon les méthodes, par exemple colorim6triques, déjà indiquées plus haut, en rap- port avec la seconde variante du procédé de l'invention, plus particulièrement dans son application aux diagnostics des maladies lysozomiales, de la fibrose kystique ou de la dystrophie musculaire. Cette troisième variante de procédé est avantageu- sement mise en oeuvre sur des cellules possédant une anoma- lie vraisemblable qui aura de préférence été révélée par l'application à des cultures cellulaires provenant du même individu de la première ou seconde variante de procédé sus- défini. L'anomalie spécifique sera alors plus particulière- ment révélée par l'absence de production de l'enzyme défi- ciente (par exemple de l'a-glucosidase ou de la B-galacto- sidase). Cette déficience sera d'autant plus marquée que l'on observera une production maximum de toutes les autres enzymes étudiées. Les cellules qui peuvent être mises en oeuvre dans chacun des procédés décrits dans ce qui précède peuvent être constituées par toutes cellules originaires 2. d'un malade, d'un nouveau-né ou encore d'un embryon. L'invention concerne enfin plus particulièrement le procédé d'induction visant à diagnostiquer le défaut génétique pouvant conduire-à la fibrose kystique ou à la dystrophie musculaire, ce procédé consistant à produire des cultures des cellules provenant d'individus ou d'em- bryons étudiés, en présence de la composition d'induction formées par l'association héparine-globulines, notamment y-globulines humaines, et à doser l'une au moins des en- zymes induites dont les caractéristiques sont susceptibles de donner lieu aux différences de comportement permettant la différenciation des cellules atteintes de fibrose kystique et celles atteintes de dystrophie musculaire, dans les conditions qui ont été rappelées plus haut. Comme il va de soi et comme il résulte d'ailleurs déjà de ce qui précède, l'invention ne se limite nullement à ceux de ses modes d'application et de réalisation qui ont été plus spécialement envisagés; elle en embrasse au con- traire toutes les variantes. REVENDICATIONS 1 - Procédé de diagnostic in vitro de la potentia- lité ou de l'existence de la fibrcse kystique, de la dystro- phie musculaire, d'une maladie lysozomiale ou d'une anomalie chromosomique, caractérisé par le fait que l'on met en con- tact une culture de cellules provenant d'un individu ou d'un embryon étudiés avec une composition "cocktail" contenant les réactifs suivants: - 1) au moins un inducteur d'au moins une enzyme, plus par- ticulièrement d'une hydrolase corrélable à une maladie déterminéeou une hormone stimulant l'adénylcyclase, ou encore les deux à la fois; - 2) un inhibiteur des phosphodiestérases, du type de celles qui peuvent dégrader l'AMP cyclique; - - 3) un inhibiteur de la synthèse des protéines; les concentrations relatives de ces constituants dans le milieu de culture-étant réglées de façon à ne pas affecter sensiblement le développement de cellules saines, mais à entraîner l'interruption du développement, voire la mort desdites cellules, dans le cas de l'existence ou de la poten- tialité de l'une desdites maladies ou anomalies. 2 - Procédé selon la revendication 1. caractérisé en ce que l'inhibiteur des phosphodiestérases est consti- tué par la théophylline ou la 4-(4,3-diméthoxybenzyl)-2- imidazolineet1'inhibiteur de la synthèse des protéines est constitué de tout composé actif à une étape quelconque de la synthèse protéique, notamment un inhibiteur agissant au niveau de l'activation du gène, tel que l'actinomycine D, ou d'un inhibiteur direct de la synthèse des protéines, tel que l'émétine, notamment le dichlorhydrate d'émétine, ou, de préférence, le cycloheximide. 3 - Procédé selon la revendication 2, caractérisé en ce que: l'inhibiteur de phosphodiestérases est constituée par la théophylline et - l'inhibiteur de protéines est constituée par le cyclo- heximide. 4 - Procédé selon la revendication 3, caractérisé en ce que les proportions relatives de la théophilline et du cycloheximide sont ajustées de façon telle que, après mise en contact de la composition d'induction avec le mi- lieu de culture contenant les cellules à étudier, on obtienne les concentrations finales respectives suivantes (exprimées par rapport au ml de milieu de culture): - de 105 à 10i 2, notamment 10-3 M de théophylline, - de 8 pg à 25 pg, notamment 10 pg par ml de cyclo- heximide. - Procédé selon la revendication 1, caracté- risé en ce que l'inducteur est constitué par une asso- ciation d'héparine de d'immunoglobulines, de préférence d'origine humaine. 1i5 6 - Procédé selon la revendication 5, caracté- risé en ce que les proportions relatives de l'héparine et de la yglobuline sont ajustées de façon telle qu'après mise en contact de la composition d'induction avec le milieu de culture contenant les cellules à étu- dier, on obtienne les-concentrations finales respec- tives suivantes (exprimées par rapport au ml de milieu de culture): - de 180 ig à 1.000 pg, notamment de l'ordre de 600 'Pg par ml pour l'héparine, - de 180 pg à 600 pg, notamment de l'ordre de 400 lg par ml pour la y-globuline. 7 - Procédé selon l'une quelconque des revendi- cations 1 à 6, caractérisé en ce que l'hormone stimulant l'adénylcyclase est constituée par une prostaglandine, 530 notamment prostaglandine E1 ou, de préférence, prosta- glandine E2. 8 - Procédé selon la revendication 7, caracté- risé en ce que la proportion de prostaglandine est ajus- tée de façon telle que, après mise en contact de la composition d'induction avec le milieu de culture conte- nant les cellules à étudier, on obtienne une concentra- tion finale, exprimée par rapport au ml de milieu de cul- ture, de 0,8 pg à 10 pg, notamment de l'ordre de 1 Wg par ml pour la prostaglandine. 9 - Procédé selon l'une quelconque des reven- dications 1 à 7, caractérisé en ce que la composition d'induction contient les constituants identifiés ci- après en des proportions relatives telles, qu'après mise en contact de cette composition avec le milieu de culture contenant les cellules à étudier, on obtienne les concentrations finales respectives suivantes, ex- primées par rapport au ml de milieu de culture: - de 180 pg à 1.000 pg, notamment de l'ordre de 600 vg par ml pour l'héparine, - de 180 pg à 600 pg, notamment de l'ordre de 400 pg par ml pour la y-globuline, - de 0,8 pg à 10 pg, notamment de l'ordre de 1 gg par ml pour la prostaglandine, - de 10-5 à 10-2, notamment 10-3M de théophylline, - de 8 pg à 25 pg, notamment 10 pg par ml pour le cyclo- heximide. - Procédé selon l'une quelconque des revendi- cations 2 à 9, caractérisé en ce que la composition d'in- duction contient en outre au moins l'un-des composés choi- sis dans le groupe comprenant le glycogène, les différents gangliosides mis en jeu dans les différentes gangliosi- doses et les mucopolysaccharides du type de ceux qui sont mis en jeu dans les mucopolysaccharidoses. 11 - Procédé selon l'une quelconque des reven- dications 1 à 10, caractérisé en ce que: - dans une première phase, on met en contact une culture desdites cellules avec une composition d'induction ou "cocktail global" contenant une pluralité des inducteurs ou groupes d'inducteurs en vue de détecter l'existence ou la potentialité de l'une des maladies ou anomalies comprises parmi le groupe de maladies auquel corres- pondent lesdits inducteurs ou groupe d'inducteurs et, si l'on a observé une interruption du développement, voire la mort desdites cellules, - dans une ou plusieurs phases supplémentaires, on met en contact des cultures de cellules provenant du même indi- vidu ou embryon avec des compositions ou "sous- cocktails" plus spécifiques contenant des inducteurs ou groupes d'inducteurs correspondant à des maladies ou groupes de maladies plus spécifiques, en vue de la dé- termination de ceux des inducteurs plus spécifiques qui entraînent l'interruption du développement, voire la mort desdites cellules. 12 - Procédé selon l'une quelconque des revendi- cations 1 à il étendu à l'étude des effets d'un médicament à étudier sur la maladie ou l'anomalie révélable par l'in- ducteur ou le groupe d'inducteurs contenu dans la composi- tion utilisée, caractérisé en ce que l'on procède à une série de cultures de cellules en cause en présence, d'une part,de ladite composition d'induction et, d'autre part, de concentrations croissantes du médicament étudié. 13 - Procédé selon l'une quelconque des reven- - dications 5, 6 et 9, caractérisé en ce que, lorsque l'on a observé l'interruption du développement, voire même la mort desdites cellules, lorsque celles-ci ont été mises en contact de la susdite composition, on sou- met un milieu,au contact duquel avaient antérieurement été placées ou cultivées des cellules provenant du mêmeindividu, à un traitement thermique tel que l'une des enzymes parmi celles qui sont susceptibles d'être affectées par la fi- brose kystique soit de nature à subir une cinétique d'inac- tivation plus rapide que lorsqu'elle provient de cellules saines, l'observation d'une cinétique d'inactivation plus rapide pouvant alors être corrélée à la fibrose kystique, et l'absence de cinétique d'inactivation, tout au plus une cinétique d'inactivation réduite, pouvant alors être cor- rélée à une dystrophie musculaire. 14 - Procédé selon la revendication 13, caracté- risé en ce que l'enzyme étudiée est constituée par l'a-mannosidase ou la phosphatase acide,et que la température du susdit traitement thermique est de l'ordre de 40,5 C, lorsqu'il s'agit de l'a-mannosidase et de l'ordre de 36,5 C, !lorsqu'il s'agit de la phosphatase acide. - Composition pour la mise en oeuvre du procé- dé selon l'une quelconque des revendications 1 à i14, carac- térisée en ce qu'elle consiste en une solution contenant les constituants susdits correspondants, notamment: -5 - -2 - - de 10 à 10, notamment 10 3M de théophylline, - de 8 ug à 25 pg, notamment 10 pg par ml pour le cyclo- heximide. 16 - Composition selon la revendication 15, ca- ractérisée en ce qu'elle contient en outre: - soit de 180 pg à 1.000 pg, notamment de l'ordre de 600 pg par ml pour l'héparine et de 180 pg à 600 pg, no- tamment de l'ordre de 400 pg par ml pour la y-globuline, - soit de 0,8 pg à 10 pg, notamment de l'ordre de 1 pg par ml pour la prostaglandine, - soit encore tous ces constituants à la fois.