FR 2474508 A1 19810731 FR 8101508 A 19810127 i La présente invention concerne un procédé pour obte- nir des héparines de bas poids moléculaire possédant des propriétés pharmacologiques et thérapeutiques remarquable- ment intéressantes à partir de l'héparine normale et le produit ainsi obtenu. L'héparine est un sel mono ou bivalent bien connu et stable de l'acide héparinique instable. C'est un polymère d'un motif disaccharidique formé d'acides hexuroniques (acide D-glucuronique et acide L-iduronique) et de glucosa- mine 60- et N-sulfatée à liaisons a-1-4-glucosidiques. Ses propriétés anticoagulantes sont bien connues de- puis de nombreuses années et elle a été découverte et iso- lée des tissus en 1917. L'héparine est présente sous diverses formes dans de nombreux tissus et de nombreuses cellules, plus ou moins fortement liée à un fragment protéique. Dans la peau et, en( partie, dans les poumons d'animaux de différentes espèces, l'héparine est présente sous une forme à poids moléculaire élevé qui est sensible à l'action de l'acide ascorbique ou de certaines enzymes que l'on pense être présentes dans la muqueuse intestinale. Après traitement par l'acide ascorbi- que ou par des homogénats de muqueuses intestinales, ces formes macromoléculaires de l'héparine pulmonaire ou cuta- née peuvent être réduites à Sa même taille moléculaire que l'héparine que l'on peut isoler de la muqueuse intestinale. L'héparine isolée de la muqueuse intestinale qui a un poids moléculaire moyen (PM) de 15 000 daltons, ou les héparines provenant d'autres sources réduites à ce même PM selon l'un des procédés classiques précédemment décrits, constituent les molécules naturelles d'héparine de taille minimale. Selon l'invention, ce type d'héparine est appelé héparine normale. En pratique, il n'existe pas dans l'orga- nisme d'enzymes pouvant fragmenter l'héparine de la muqueu- se intestinale en fractions de poids moléculaire plus fai- ble et on n'a pas mis au point à ce jour de procédé chimi- que permettant de dépolymériser la molécule d'héparine noi- male sans perte totale de l'activité biologique. 2474508 J Seules certaines enzymes microbiennes, par exemple l'héparinase de Flavobacterium heparinum, sont capables de dissocier la molécule d'héparine en motifs disaccharidiques modifiés. On a appliqué ce procédé à des études structura- les, mais il s'est révélé inapproprié pour obtenir de nou- velles molécules à activité biologique. L'invention a pour objet un procédé permettant, à partir d'héparine normale, d'obtenir des fractions d'hépa- rine de poids moléculaire plus faible ayant une activité pharmacologique importante. Le procédé de l'invention est caractérisé Dar le fait qu'il comporte les stades suivants: - a)- acidification de l'héparine normale pour obtenir l'acide héparinique, b)- dépolymérisation de cet acide héparinique par chauf- fage dans un autoclave en présence de peroxydes, pour obtenir une héparamine de bas poids moléculaire, c)- sulfatation de cette héparamine pour obtenir l'hépa- rine de bas poids moléculaire correspondante. Un schéma réactionnel du procédé de l'invention est représenté cidessous: (I) (II) COONa CH2OSO 3Na _ COOH CH20S03H -OH\/r _ - 'io z]HOH I_H ieH-S 03Na OH SO3 n COO 0 H2SONa 0OOH CH20S03H 0% 0- O_0 O OH NH-SO3Na- OHNH2 (IV) (III) o m et 7 m 22 lorsque n e'26,7, ce qui est la va- leur de correspondant à l'héparine de P:S 15 000 daltons. 2474508i On effectue le calcul de la façon suivante: = 15 000 W26,7 o 562 est le PM du motif disaccharidiaue (de formule chimi- que O12H15016NS2Na3) représenté par les formules (I) et (IV) ci-dessus. Dans le schéma réactionnel ci-dessus, la formule I re- présente le sel de sodium de l'héparine normale; pour simpli- fier,cette formule représente uniquement l'acide D-glucuro- nique et non la partie de la molécule qui contient l'acide L-iduronique. De façon semblable, on peut faire figurer d'autres cations monovalents ou divalents au lieu du cation sodium. On acidifie cette héparine I pour obtenir l'acide li- bre correspondant, l'acide héparinique de formule II, selon le stade a) précédemment indiqué. Dans le stade b), l'acide héparinique de formule II est dépolymérisé avec perte de la majorité des groupes N-sulfates et formation d'une héparamine de formule III. Finalement, on traite l'héparamine de formule III dans le stade c) par reconstitution des groupes N-sulfates pour obtenir le produit final selon l'invention, c'est-à-dire les héparines de formule IV, qui sont appelées héparines de bas poids moléculaire ou héparines dépolymérisées reconstituées. Selon une description plus détaillée du procédé de l'invention, on obtient l'acide héparinique à partir de l'héparine normale I par simple acidification ou, de préfé- rence, par traitement avec des résines échangeuses de ca- tions. L'acide héparinique II est ensuite soumis au stade b) de dépolymérisation qu'on effectue dans un autoclave en pré- sence d'un peroxyde, par exemple H202, par chauffage à une pression de préférence comprise entre 1 et 2 bars, le trai- tement à l'autoclave pouvant être arrêté après des durées choisies (par exemple après 15, 30, 60, 120 ou 240 mn). On peut ainsi obtenir des produits finals, c'est-à-dire des héparines de bas poids moléculaire ou héparines dépolyméri- 2474508i sées reconstituées ayant des poids moléculaires moyens (PM) différents compris dans une gamme d'environ 12 000 à 4 000 daltons, à partir d'héparine normale ayant un FM de 15 000 daltons. Les rendements de ces dépolymérisations sont pra- tiquement les mêmes dans tous les cas (environ 65 % en poids). On suit la diminution du PM par titrage des grou- pes réducteurs terminaux (méthode de Somogji) ou par la diminution de la viscosité spécifique. Les produits de cette dépolymérisation sont des hépa- ramines de bas poids moléculaire III dont les poids molécu- laire peut 8tre réduit jusqu'au tiers environ, selon les du- rées choisies du traitement à l'autoclave. Comme dans ce stade de dépolymérisation, ainsi que précédemment indiqué, la majorité des groupes sulfates fixés à l'azote sont éliminés, on soumet finalement l'héparami- ne III, après refroidissement du mélange réactionnel et élé- vation du pH, à une reconstitution des groupes sulfuriques actifs pour obtenir le produit final IV selon le stade c) par des procédés connus, par exemple par réaction avec des sulfotrioxydes de bases azotées (comme le sulfotrioxyde de pyridine, le sulfotrioxyde de triméthylamine, etc.) en pré- sence de carbonates alcalins ou par réaction avec l'acide chlorosulfonique et des bases azotées. Les rendements pondéraux des produits finals par rap- port à la quantité initiale d'héparine sont dans tous les cas les mêmes quelle que soit la durée du traitement à l'autoclave. L'invention est illustrée par les exemples non limita- tifs suivants. Exemple 1 On dissout 20 g d'héparine sodique ou calcique (acti- vité anticoagulante = 150 UI/mg) dans 100 ml d'eau désioni- sée et on en charge une colonne contenant 100 ml d'Amber- liteçDIRO 120 sous la forme H+. On lave la colonne avec 100 ml d'eau désionisée et on recueille les liquides. Le pH de la solution est de 1-1,5. On ajoute 20 ml d'une solution saturée de peroxyde d'hydro- 2474508 t gène (36 %) et on chauffe le liquide à l'autoclave pendant minutes sous un bar. Après refroidissement à la tempéra- ture ordinaire, on élève le pH à 7,2 avec de l'hydroxyde de sodium 2 N; on ajoute en agitant 16 ml de pyridine et 16 g de sulfotrioxyde de pyridine. La réaction dure 12 heures avec une petite addition de pyridine pour maintenir le pH entre 5 et 6. On élève en- suite le pH à 8 avec de l'hydroxyde de sodium et on concen- tre la solution sous vide à 100 ml pour éliminer l'excès de pyridine. On élimine les sels avec une colonne échangeuse d'ions à lits mélangés, on stérilise la solution par filtra- tion et on lyophilise. On obtient avec un rendement de 65 % une poudre blan- che ayant une activité anticoagulante de 85-100 UI/mg et un PM (méthode de Somogji) égal aux deux-tiers du PM d'origine. Exemple 2 On dissout 20 g d'héparine sodique ou calcique (150 UI/mg) dans 100 ml d'eau injectable et on élimine les cations avec une résine échangeuse de cations sous la for- me eH. On ajoute à la solution (pH = 1-1,5) 20 ml d'acide peracétique (solution à 40 %), puis on traite l'ensemble à l'autoclave pendant 60 minutes sous 1 bar. Après avoir refroidi et élevé le pH à 7,2, on ajoute 20 g de sulfotrioxyde de triméthylamine et 20 g de carbona- te de sodium. On agite le mélange réactionnel pendant plu- sieurs heures à une température ne dépassant pas 6000 puis on fait passer à travers une colonne de Dovex Retardion î 11 A 8. On ajuste le pH de la solution à 6, on refroidit la solution et on ajoute trois volumes d'éthanol. On recueil- le le précipité blanc, on lave à l'éthanol (ou au méthanol ou à l'acétone) et on sèche sous vide. Le produit final a une activité anticoagulante de -50 UlI/mg et un FN (méthode de Somogji) qui est égal au tiers du PM d'origine. 2474508J Exemple 3 On opère comme indiqué dans l'exemple I mais avec un traitement à l'autoclave de 30 minutes sous 2 bars pour obtenir un produit final ayant une activité anticoagulante de 35-50 UI/mg et un PM qui est égal environ au tiers du i d'origine. On a tout d'abord établi que le produit IV a une composition chimique (teneur en sulfates, hexosamines et acides hexuroniques) et certaines propriétés physico- chimiques (pouvoir rotatoire spécifique) qui sont identi- ques à celles de l'héparine purifiée I, mais avec une va- leur différente du titrage des groupes réducteurs termi- naux (méthode de Somogji), une mobilité électrophorétique différente et un décalage des longueurs d'onde maximales d'absorption des complexes formés avec les colorants basi- ques, par exemple le bleu de. toluidine. Les héparines de bas poids moléculaire (héparines dépolymérisées reconstituées) obtenues selon l'invention ont des propriétés pharmacologiques et thérapeutiques très in- téressantec par-rapport à l'héparine normale I. La plus importante de ces propriétés est une modifica- tion durapport, in vitro ou in vivo (chez l'animal de la- boratoire et chezl'homme), entre l'activité antithromboti- que et l'activité anticoagulante totale, ce rapport étant exprimé par: test anti-Xa o test anti-Xa = test de Yin et APTT = temps APTT de céphaline activée. Les différentes héparines dépolymérisées reconstituées présentent des valeurs croissantes du rapport activité antithrombotique lorsque le PM diminue; bien activité anticoagulante totale rsqe le PM diminue bien que l'activité anticoagulante spécifique diminue lorsque le PM diminue. En tout cas, l'héparine normale ayant un fM de 15 000 a une activité anticoagulante totale > 150 UI/mg et un rap- port anti-Xa/APTT = 1, tandis que les héparines dépolyméri- sées reconstituées de l'invention ont une activité anticoa- gulante totale Z 150 UI/mg et un rapport anti-Xa/APTT '1. En particulier, le rapport du composé IV est presque double 2474508, de celui du composé I. Ceci indique que pour la même activi- té anticoagulante, l'activité antithrombotique du composé IV est double descelle de l'héparine normale I; en d'autres termes, une dose de composé IV, exprimée en activité anti- coagulante, égale ou inférieure à la moitié d'une dose d'héparine normale, a le même effet antithrombotique. Ces résultats ont été confirmés chez l'animal de labo- ratoire par mesure de l'effet protecteur contre la formation de caillots provoquée par la thrombine et la thromboplastine de l'administration intraveineuse des composés I et IV. Donc, dans la famille des héparines dépolymérisées reconstituées que l'on peut obtenir selon le procédé de l'invention, on peut choisir le produit le mieux approprié par son activité anticoagulante spécifique et son rapport activité antithrombotique activité anticoagulante pour les applications particuliè- res dans le domaine de la protection contre les thromboses. Par exemple, un malade en état thrombogène, avec un temps de coagulation très raccourci,- peut nécessiter un agent antithrombotique ayant une activité anticoagulante assez élevée tandis qu'un malade soumis à une intervention chirurgicale chez lequel existe des risques d'hémorragie et de thrombose post-opératoire peut nécessiter un agent antithrombotique ayant une activité anticoagulante faible. De plus, après l'administration sous-cutanée à l'hom- me, les composés IV demeurent dans la circulation sanguine plus longtemps que le composé I. On a utilisé pour détermi- ner le temps pendant lequel les composés IV demeurent dans la circulation, différents tests tels que le temps de re- calcification, le temps de céphaline activée (APTT), le temps de thrombine et l'activité anti-Xa. De plus, on observe une certaine absorption par voie orale du composé IV chez certaines espèces animales (rats, souris, chiens), tandis que le composé I n'est pas absorbé par voie orale. REVENDICATIONS 1. Procédé pour obtenir des héparines de bas poids moléculaire ayant des propriétés pharmacologiques importan- tes, caractérisé par le fait qu'il comporte les stades sui- vants: a)- acidification de l'héparine normale pour obtenir l'acide héparinique, b)- dépolymérisation de cet acide héparinique par chauf- fage en présence de peroxydes, pour obtenir une hé- paramine de bas poids moléculaire, et c>- sulfatation de cette héparamine pour obtenir l'hépari- ne de bas poids moléculaire correspondante. 2. Procédé selon la revendication 1, dans lequel on effectue la dépolymérisation dans un autoclave. 3. Procédé selon la revendication 1, dans lequel on effectue la sulfatation par traitement avec des sulfo- trioxydes de bases organiques azotées en présence d'une base. 4. Procédé selon la revendication 3, dans lequel la base est la base azotée libre du sulfotrioxyde. 5. Procédé selon la revendication 3, dans lequel la base est un carbonate alcalin. 6. Procédé selon la revendication 1, dans lequel on effectue la sulfatation par traitement par l'acide chloro- sulfonique et des bases organiques azotées. 7. Héparine de bas poids moléculaire obtenue selon le procédé de l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisée par le fait qu'elle présente les propriétés suivantes: hexosamines après hydrolyse: comme pour l'héparine - acides uroniques après hydrolyse: comme pour l'héparine - groupes sulfates: comme pour l'héparine - rotation optique: comme pour l'héparine 2474508: - poids moléculaire moyen (P'): 12 000 - 4 000 da]tons - activité anticoagulante totale: - anti-Xa/APTT: > 1. 8. Composition pharmaceutique pour le traitement des thromboses, caractérisée par le fait qu'elle contient comme principe actif une héparine de bas poids moléculaire selon la revendication 7.