FR 2484424 A1 19811218 FR 8111924 A 19810617 La présente invention se rapporte à un nouveau composé polymérique désigné sous la référence "MF-300" qui résulte de la réaction de la ribostamycine avec le chlorure de crotonoyle dans un solvant organique aqueux en présence d'une base, suivie par le 5 fractionnement des produits de réaction selon la différence de poids moléculaire. La présente invention se rapporte par ailleurs à un procédé pour la préparation du composé MF-300 et a une com- position pharmaceutique soluble dans l'eau contenant ce composé comme composé actif et présentant une activité protectrice à 10 l'égard des infections bactériennes. Il est connu que certaines substances macromoléculaires ont pour effet de potentialiser la réponse immunologique in vivo. Ainsi il est bien connu qu'un résidu insoluble dans l'eau prove- nant de produits obtenus par autolyse ou par traitement d'une 15 protease de parois de cellules de levure,intervient dans le mécanisme de défense immunologique d'un animal vivant et présente une action protectrice à l'égard des infections bactériennes. Un exemple d'un tel résidu insoluble dans l'eau est la substance désignée sous la dénomination "Zymosan" (voir Nagy et Al., Archivo 20 Italiano di Patologia e Clinica der Tumori, XIV, Fasc. 3-4, pages 29-35 (1971) ; F.W. Fitzpatrick, F.I. Dicarlo, Ann. New York Acad. Sci., 118 (4), pages 233-262 (1964)). Au cours du 25ème Congrès Général de la Société de Chimiothérapie du Japon (voir résumé du rapport, page 157, édité le 11 Juin 1976), il a été proposé 25 d'utiliser le "Zymosan" comme substance de référence pour évaluer l'activité du Picibanil en tant que protecteur vis-à-vis d'infec- tion par certaines bactéries du type Staphylococus. Il est également fait référence aux demandes japonaises (publication préliminaire) n 70809/76 et n 29215/76 qui décri- 30 vent l'effet immunopotentialisateur d'une substance constituée d'un hydrolyzat de parois de cellules de levure. La demande japonaise n 27101/80 décrit les effets prophylactiques et théra- peutiques sur des maladies infectieuses, de la substance KS-2-A qui est produite par culture d'un mycelium. 35 Ces dernières années, il a été rapporté que la N-acétylmuramyl-L-alanyl-D-isoglutamine (demande japonaise n 41211/77) et la N-acétylmuramyl-L-alanyl-D-glutamine (demande japonaise n 44223/77) présentent un effet adjuvant élevé comme immunopoten- tialisateur soluble dans l'eau de bas poids moléculaire. Il a 40 également été constaté que l'oxyde de l'acide orthobenzoique a -2- 2484424 montré une activité protectrice à l'égard des infections bac- tériennes (Chem. Pharm. Bull., 2143 ( 1977), demandes japonaises n 41041/76 et n 12141/77) et qu'un certain dérivé d'aziridine était susceptible de fournir une augmentation du degré de résis- 5 tance aux infections bactériennes (demande japonaise n 111563/77). Comme décrit ci-dessus, il existe une grande variété de composés obtenus par voie de synthèse qui ont déjà été proposés comme agents protecteurs vis-à-vis des infections bactériennes mais tous ces composés sont de nature chimique différente du 10 nouveau composé selon l'invention. Ainsi l'oxyde de l'acide orthobenzoique est de squelette aromatique (demande japonaise n 41041/76 et n 12141/77) et le dérivé d'aziridine est de structure cyclique à trois atomes (de- mande japonaise n 111563/77). Comme exemple d'agents immunopoten- 15 tialisateurs à bas poids moléculaire déjà proposé, on peut citer la 4-imino-1,3-diazobicyclo Z ,1,07 hexan-2-one (demande japonaise n 10290/77), la N-2-(6-hydroxybenzothiazolyl)-N'-substitué ou non substitué phenylurée (demande japonaise n 59860/76) et les déri- vés de pyrrolidine (demande japonaise n 98299/76). Comme agents 20 immunopotentialisateurs de haut poids moléculaire, on peut en particulier citer les esters d'acides gras de fructose et de sucrose (demande japonaise n 29291/76), lesesters d'acides gras de glucose et de trehalose (demande japonaise n 29292/76), le 6,6'-dimycolate de trehalose (Cancer Imm. Immunother, 1, 227 25 (1976)) et la 6-mycoloyl-N-acteylmuramyl-L-alanyl-D-isoglutamine (IUPAC A.P. 602-14 (1977)). Selon l'invention on a préparé un nouveau composé polymérique dérivé de la réaction de la ribostamycine avec le chlorure de crotonoyle et constaté qu'il n'avait aucune activité anti- 30 bactérienne in vitro et n'était pas métabolisé in vivo en une substance ayant une activité anti-bactérienne mais de façon tout à fait surprenante qu'il présentait une activité protectrice in vivo à l'égard d'infections bactériennes. Selon un premier objet de l'invention on propose à titre 35 de produit industriel nouveau le composé polymérique MF-300 qui est obtenu par réaction de la ribostamycine avec le chlorure de crotonoyle, par concentration et purification du produit de réaction et récupération du composé sous forme d'une fraction ayant un domaine de poids moléculaire de 10.000 à 100.000 mesuré 40 par la méthode d'ultrafiltration et qui présente les propriétés suivantes : -3- (1) Analyse élémentaire : 5 (2) Poids moléculaire : (3) Aspect : (4) Point de décomposition (5) Pouvoir rotatoire spécifique : (6) Spectre infra-rouge : (7) Spectre ultra-violet : (8) Spectre de RMN : (9) Nature de la solution 2484424 C 48,52 + 2,16% H 7,24 + 0,24% N 8,04 + 1,02% Ck 5,05 + 0,3% 10.000 100.000 (mesuré par ultrafiltration) 15.000 - 70.000 (mesuré par ultracentrifugation) Jaune pale, poudre amorphe 170e - 200oC (a)25 + 40,4o + 7,3 (c 1,0,H20) (~D -2- 3400, 2940, 1660, 1630, 1550 cm Aucun maximum d'absorption spécifique. 1,0-1,5; 1,8-2,1; 3,2-4,2; 5,2-5,4; 5,6-6,3; 6,5-7,2 ppm aqueuse : pH 4-6 (1% en solution aqueuse) (10) Solubilité : Soluble dans l'eau et le méthanol. 20 Insoluble dans l'éthanol, le chloro- forme, l'acétone et l'éther de pétrole. (11) Réaction colorée : Positive à la réaction à l'anthrone et au réactif de Molisch. Faiblement positive aux réactions à la ninhydrine 25 . et au biuret. Négative à la réaction de Tollens. Ainsi, le composé selon la présente invention se diffé- rencie fondamentalement de par sa structure chimique à l'un quelconque des composés immunopotentialisateurs connus et mentionnés 30 ci-dessus et appartient donc à une nouvelle classe de substances susceptibles d'agir comme agent protecteur vis-à-vis des infec- tions bactériennes. Le composé polymérique MF-300 peut être préparé selon la présente invention en faisant réagir la ribostamycine avec le 35 chlorure de crotonoyle dans un solvant organique aqueux en présen- ce d'une base, en concentrant le produit de réaction et en récu- pérant une fraction ayant un domaine de poids moléculaire de 10.000-100.000 lorsqu'il est mesuré par la méthode d'ultrafiltra- tion. Selon un mode particulier du procédé selon la présente 10 15 40 -4- 2484424 invention, la ribostamycine en solvant organique aqueux est mis à réagir rapidement avec 1 à 36 moles, par mole de ribostamycine, de chlorure de crotonoyle à 0-150 C en présence d'une base. Le mélange réactionnel résultant est concentré à sec, dissous dans 5 l'eau et lavé avec de l'acétate d'éthyle ou du chloroforme pour éliminer tout excès des réactifs et du solvant utilisé. La couche aqueuse est ensuite concentrée à sec, conduisant au MF-300 sous forme de chlorhydrate. Le produit brut ainsi obtenu est alors dissous dans 10 l'eau et soumis à une ultrafiltration en vue de récupérer une fraction de poids moléculaire dans le domaine souhaité. Parmi les solvants organiques aqueux on peut citer les solutions aqueuses de diméthylformamide, de méthanol, d'éthanol, d'acétone, de dioxane, de tétrahydrofurane, de diglyme, de pyri- 15 dine et d'acétonitrile. La base agit comme agent de fixation d'acide et peut être une base organique par exemple une trialkylamine inférieure telle que la triméthylamine et la triéthy- lamine, ou une base inorganique par exemple un carbonate de métal alcalin tel que le carbonate de sodium ou un bicarbonate de métal 20 alcalin tel que le bicarbonate de sodium. Un type d'appareil d'uitrafiltration est par exemple un de ceux utilisant une "membrane Diaflow" (une membrane de tamis moléculaire fabriquée par Amicon Far East Limited, U.S.A.>. Le nouveau composé MF-300 selon la présente invention ne 25 passe pas à travers la membrane "Diaflow PM 10" ayant un diamètre de pores correspondant à la taille de substances de poids molé- culaire de 10.000 mais passe à travers la membrane "Diaflow XM 10OA" ayant un diamètre de pores correspondant à la taille de substances de poids moléculaire de 100.000. Ainsi le poids molé- 30 culaire estimé du nouveau composé est de 10.000-100.000. Par ailleurs, il a été observé que le composé MF-300 lorsqu'il passe à travers une membrane "Diaflow PM-30" ayant un diamètre de pores correspondant à la taille de substances de poids moléculaire de 30.000 ou une membrane "Diaflow XM-50" ayant un 35 diamètre de pores correspondantà la taille de substances de poids moléculaire de 50.000, répartit son activité entre les fractions passantes et restantes mis à part une différence de degré dans l'activité. Par conséquent, on considère que le composé MF-300 est un polymêre ayant une distribution du poids moléculaire s'étendant 40 de 10.000 à 100.000 et comprenant des parties de ribostamycine et -5- 2484424 d'acide crotonique et/ou des chaînes butyryles comme constituants. De façon à étudier la structure chimique du composé MF- 300 on a réalisé l'hydrolyse alcaline de ce composé. Du fait que le spectre de RMN du composé MF-300 indique la présence de groupes 5 crotonoyles dans la molécule ce qui laisse supposer la possibilité d'addition d'un groupe amino de ribostamycine sur la double liai- son du groupe crotonoyle durant l'hydrolyse alcaline, l'hydrolyse a été précédée par l'addition d'hydrate d'hydrazine qui est un réactif plus nucléophile ceci en vue de saturer la double liaison 10 du groupe crotonoyl. Six types de composés dans l'hydrolysat ont été obtenus parmi lesquels quatre principaux (A) - (D) se sont avérés avoir les structures suivantes CH2NHR1 NHR2 H 0 O 15 t HO H NHR3 20 (/ruu 25 CH (A) : R1 = -CH-CH2COOH, R2 CH (B) : R2 = -CH-CH2COOH, R1 CH3 (C) : R3 = -CH-CH2COOH, R1 30 =R3 =H = R3 =H =R2 =H (D) : Ri = R2 = R3 = H (ribostamycine) La détermination de la structure a été essentiellement basée sur les analyses du C-13 et H-1 du spectre de résonance 35 magnétique nucléaire et du spectre de masse L'analyse élémentaire, le pouvoir rotatoire spécifique et le point de fusion de chacun des hydrolysats (A), (B) et (C) sont les suivants : 40 -6- 2484424 (A) Analyse élémentaire (pour C21H40N4012.4/5 H20) Tr : C 45,53; H 7,61; N 9,86% Calc : C 45,45; H 7,56; N 1,10% Z-a-7 25 + 33,0o (c 1,0; H20), Pt. de F. = 134-137 C 5 (B) Analyse élémentaire (pour C21H40N4012-H20) Tr : C 45,44; H 7,58; N 10,01% Calc : C 45,15; H 7,58; N 10,03% a 25 D + 45,3 (c 1,0; H20), Pt. de F. = 159-164 C (C) Analyse élémentaire (pour C21H40N4012 3/2 H20) 10 Tr : C 44,61; H 7,27; N 9,83% Calc : C 44,44; H 7,64; N 9,87% - 725 + 48,1 (c 1,0; H20), Pt. de F. = 190-194 C Sur la base des structures des composés dans l'hydrolysat ci-dessus mentionné, le monomère à partir duquel le composé MF-300 15 est dérivé peut être considéré comme ayant la structure suivante : CH2NRNHR NHR 0.U _[ XsNHR 20H HO 25 R :Q-CH =CHCH3 ou H 30 3 Par conséquent, on peut présumer que le composé MF-300 est un polymère dérivé de crotonoyl-ribostamycine comme monomère auquel un groupe amino libre de la molécule de crotonoyl-ribosta- mycine est ajoutée à un groupe crotonoyl de la molécule adjacente du monomère. La présence de composés (A), (B) et (C) dans l'hydro- 35 lysat montre clairement que la position à laquelle les deux molé- cules monomères sont liées ne sont pas fixes. Ainsi, la structure présumée du composé MF-300 sous forme de chlorhydrate est la suivante : 40 -7- - 5 NH \I- NR NHR La dans laquelle : O CH Il t H3 NHC-CH-CH A NHRmHCZ \ NHR-mHC Z 2484424 n A représente : 10 15 20 0 0 CH R : -e-CH=CH-CH3, -i-CH2-CH-, H ou une liaison à la molécule 25 adjacente. 0,7 térienne accroît seulement de 23 fois à un dosage de 4mg/souris de 20 Zymosan A. et 3,8 fois à un dosage de 1 mg/souris de Zymosan A. Par ailleurs, la comparaison dans les valeurs DE50 entre le MF-300 et le Zymosan A montre que pour une quantité d'inoculum de 7,2, X DL50 la valeur DE50 du MF-300 était inférieure à 1,56 pg/souris, alors que la valeur DE50 du Zymosan A était de 1,2 mg/souris et que 25 pour une quantité d'inoculum de 72 X DL50 la valeur DE50 du MF-300 était de 33 pg/souris, alors que la valeur DE50 du Zymosan A était supérieure à 4 mg/souris. 30 35 40 TABLEAU 1 om Osé testé MF - 300 Zymosan A Témoin Dos- ___ ---.___..____..___.._ (animaux non Nombre traités) Nombre de\ cellules 100\.g 25Ug 6,25ig 1,56pg 4mg lmg 0,25mg 0 bactériennes inoculées . 7,2 x 105 1/7 0/7 1/7 7,2 x 104 6/7 2/7 1/7 3/7 2/7 1/7 0/7 0/7 7,2 x 103 6/7 7/7 7/7 4/7 7/7 3/7 0/7 1/7 7,2 x 102 7/7 6/7 7/7 5/7 4/7 7,2 x 101 7/7 Nombre de souris ayant survécu/Nombre de souris testées ro) Co N1 4:s 1- o !> TABLEAU 2 Composé Doses DL50 (óellules/souris> Rapport comparé de cellule bactérienne au témoin ~~~.. . ... ..... '. . , ... 100 Pg 2,3 x 105 230,0 25 pg 4,0 x 104 40,0 MF-300 6,25 pg 2,3 x 104 ' 23,0 1,56 pg 1,1 x 104 * 11,0 ,..,,. .. . ........ ....... , ,.,,, 4 mg 2,3 x 10 23,0 Zymosan A 1 mg 3,8 x 103 3,8 0,25 mg 2,3 x 103 2,3 Contrl1e (animaux non 0 1,0 x 103 1,0 traités) * Valeur estimée I !- TABLAU 3 Quantité Composé DE50 d'inoculum .-,,,,,.,, .11 , " , _ , ................. .. ^ MF-300 33,0 (11,7 92,4) pg/souris 72 DL50 ....à Zymosan A > 4 mg/souris ...... ......,. ,. , ................ ,.-,............................... MF-300 parentéralement, par exemple par injection intra-veineuse et souscutanée. La quantité de composé à administrer dépendra bien enten- du de la voie d'administration et du nombre d'administrations mais de façon générale l'administration de 0,05-50, mg/kg peut être 40 appropriée, par exemple pour une injection sous-cutanée. -16 -16- 2484424 Dans ce but le composé MF-300 est habituellement admi- nistré sous forme d'une composition comprenant le composé comme ingrédient actif et un véhicule ou adjuvant pharmaceutiquement acceptable. 5 Un autre -objet de la présente invention est donc une - composition pharmaceutique utilisable pour protéger les mammifères vis-à-vis des infections bactériennes comprenant comme ingrédient actif une quantité effective du composé mF-300 telle que défini ci-dessus en association avec un véhicule ou adjuvant pharmaceutiquement acceptable. Selon un-mode de réalisation préféré, la présente inven- tion a pour objet une composition pharmaceutique soluble-dans l'eau utilisable pour protéger les mammifères vis-à-vis des in- fections bactériennes provoquées par Pseudomonas aeruginosa com- 15 prenant le composé MF-300 et un véhicule ou adjuvant soluble dans l eau pharmaceutiquement acceptable. La composition selon la présente invention peut contenir des quantités variables de l'ingrédient actif mais de préférence environ de 10-80% en poids. 20 La composition pharmaceutique selon l'invention peut se présenter sous forme de capsules, de tablettes, de tablettes revê- tues de sucre, d'ampoules, de sirops, de dispersions, de supposi- toires, etc... et peut être préparée par toute technique de for- mulation conventionnelle. 25 Dans les dessins ci-joints annexes La figure I représente une courbe du spectre d'absorp- tion infra-rouge du MF-300, La figure 2 représente une courbe du spectre de réso- nance magnétique nucléaire du MF-300. 30 Les exemples suivants illustrent par ailleurs la prepa- ration du composé MF-300. EXEMPLE I 20 g de ribostamycine sous forme de base libre est dissous dans une solution aqueuse à 50% de diméthylformamide (132. 35 m)} à laquelle on ajoute de la triéthylamine (13,2 mZ) sous agitation. Le chlorure de crotonoyle (8,3 mú) est ensuite ajouté en une seule fois à la solution et le mélange est agité à la tem- pérature ordinaire pendant une nuit. Le mélange réactionnel est 40 ensuite concentré à sec sous vide et l'on ajoute de l'eau (240 m.) -17- 2484424 pour dissoudre le résidu. La solution est lavée une fois avec de l'acétate d'éthyle (100 mR) et la couche aqueuse isolée est con- centrée à sec sous vide. La poudre brute ainsi obtenue est à nouveau dissoute dans l'eau (340 mR) et soumise à une ultra- 5 filtration utilisant une membrane "Diaflow PM 10". La fraction résiduelle sur la membrane est ensuite soumise à une ultra-filtration utilisant une membrane "Diaflow XM 100 A". Le filtrat provenant de la membrane XM 100 A est concentré à sec sous vide pour donner le produit recherché MF-300 (122 mg). 10 Analyse élémentaire : C 47,76; H 7,21; N 8,30; Cú 5,02% Température de décomposition : 195 - 200 C - - 25 +3 ( ,;H0 Pouvoir rotatoire spécifique :/ a 25 + 38,2 (c 1,0; H20) Spectre infra-rouge : tel que représenté à la figure 1. Spectre de RMN : tel que représenté à la figure 2. 15 EXEMPLE 2 2 g de ribostamycine sous forme de base libre sont dissous dans une solution aqueuse à 50% de diméthylformamide (13,2 mR) et l'on ajoute de la triéthylamine (10,56 mt) sous agitation. Du chlorure de crotonoyle (6,64 mR) est ensuite ajouté 20 en une seule fois à la solution et le mélange résultant est agité à température ambiante pendant une nuit. Le produit de réaction est ensuite concentré à sec sous vide et l'on ajoute de l'eau (25 mR) pour dissoudre le résidu. La solution est lavée une fois avec de l'acétate d'éthyle (10 mi) et 25 la couche aqueuse isolée est alors concentrée à sec sous vide. La poudre brute ainsi obtenue est à nouveau dissoute dans l'eau (120 mi) et la solution est soumise à une ultra-filtration utilisant une membrane "Diaflow PM 30". La fraction résiduelle sur la mem- brane est concentrée à sec sous vide pour donner le composé 30 recherché MF-300 (182 mg). Analyse élémentaire : C 50,48; H 7,15; N 7,53; CZ 5,35% Température de décomposition : 195 - 198 C Pouvoir rotatoire spécifique : -a_7 25 + 45,60 (c 1,0; H) D H20 Les spectres IR et RMN de ce produit sont les mêmes que 35 ceux du produit de l'exemple 1. EXEMPLE 3 2 g de ribostamycine sous forme de base libre sont dissous dans une solution aqueuse à 50% de dioxane (13,2 mi) à laquelle on ajoute de la triéthylamine (1,32 mi) sous agitation. 40 Du chlorure de crotonoyle (0,83 mR) est ensuite ajouté en une -18- 2484424 seule fois à la solution et le mélange est agité à la température ambiante pendant une nuit. Le mélange réactionnel est concentré à sec sous vide et l'on ajoute de l'eau (25 mú) pour dissoudre le résidu. La solution est lavée une fois avec de l'acétate d'éthyle 5 (10 mZ) et la solution aqueuse isolée est concentrée à sec sous vide. La poudre brute ainsi obtenue est à nouveau dissoute dans l'eau (30 mt) et la solution est soumise à une ultra-filtration à l'aide d'une membrane "Diaflow PM 30". La fraction résiduelle sur la membrane est concentrée à sec sous vide pour donner le produit 10 attendu MF-300 (151 mg). Analyse élémentaire : C 47,32; H 7,36; N 8,28; C9, 5,10% Température de décomposition : 179 - 1800C Pouvoir rotatoire spécifique : t a7 25 + 37 REVENDICATIONS 1. Composé polymérique, MF-300, caractérisé par le fait qu'il est obtenu en faisant réagir de la ribostamycine avec du chlorure de crotonoyle, en concentrant le produit de réaction et 5 en récupérant le composé sous forme d'une fraction ayant un domaine de poids moléculaire de 10.000-100.000 mesuré par ultrafiltration et qu'ilpossède les propriétés suivantes : (I) Analyse élémentaire : C 48,52 2,16% H 7,24 - 0,24% 10 N 8,04 1,02% Ci 5,05 + 0,3% (2) Poids moléculaire : 10.000-100.000 mesuré par ultrafiltration 15.000-70.000 mesuré par 15 ultracentrifugation (3) Aspect : jaune pâle, poudre amorphe (4) Température de décomposition : 170 - 200 C (5) Pouvoir rotatoire spécifique : -a_725 + 40,4 7,3 (c 1,0; H20) 20 (6) Spectre d'absorption infra-rouge : 3400, 2940, 1660, 1630, 1550 cm 1 (7) Absorption ultra-violette : aucune absorption spécifique maximum. (8) Spectre de RMN : 1,0-1,5; 1,8-2,1; 3,2-4,2 25 5,2-5,4; 5,6-6,3; 6,5-7,2 ppm (9) Nature de la solution aqueuse : pH 4-6 (solution aqueuse à 1%) (10) Solubilité : Soluble dans l'eau et le méthanol. Insoluble dans l'éthanol, le 30 chloroforme, l'acétone et l'éther de pétrole. (11) Réaction colorée : Positive à la réaction à I'an- throne et au réactif de Molisch. Faiblement positive aux réactions 35 à la ninhydrine et au biuret. Négative à la réaction de Tollens. 2. Procédé de préparation du composé polymérique MF-300 tel que défini à la revendication 1, caractérisé par le fait qu'il 40 comprend les étapes consistant a faire réagir la ribostamycine -21- 2484424 avec du chlorure de crotonoyle dans un solvant organique aqueux en présence d'une base, à concentrer le produit de réaction et à récupérer une fraction ayant un domaine de poids moléculaire de 10.000-100.000 mesuré par la méthode d'ultra-filtration. 5 3. Procédé selon la revendication 2, caractérisé par le fait que la récupération de la fraction est réalisée par ultra- filtration. 4. Composition pharmaceutique destinée à être utilisée en vue de protéger les mammifères à l'égard des infections 10 bactériennes, caractérisée par le fait qu'elle comprend comme composé actif une quantité effective du composé MF-300 telle que définie à la revendication 1, en assocation avec un véhicule ou adjuvant pharmaceutiquement acceptable. 5. Composition selon la revendication 4, caractérisée 15 par le fait qu'elle contient de 10 à 80% en poids du composé MF-300.