FR 2479207 A1 19811002 FR 8026221 A 19801210 Cette invention concerne de nouveaux conposés anti- fongiques semi-synthétiques que l'on prépare par acylation de noyaux peptidiques cycliques obtenus par désacylation enzymatique de l'antibiotique peptidique cyclique correspondant. L'antibiotique peptidique cyclique est un composé antifongique ayant la formule générale: h /10 CH H I Ra... H H I H------ H.......0À--------------- 'HO/ RHzC/ H' --- O.. \,__,x I O=* H OH --e OH. T O H *-;- - OH H I dans laquelle R, R, R, R et R sont définis ci-dessous Dans toute cette demande, les formules des peptides cycliques, comme la formule I, supposent que les amino-acides représentés sont en configuration L. Les facteurs A, B, D et Il de A-30912 sont des antibiotiques peptidiques cycliques de formule générale I o R est le groupement linoléoyle [cis, cis C113(Cil2)4-CH=CHCH2ClH= Cil- (CII2) 7-Co-.1. Le facteur A de A-30912 a la formule I dans laquelle R1 R3 et R sont tous OH et R est H. Le facteur B de A-30912 a la formule I dans laquelle R et R sont tous deux H et R et R sont tous deux OH. Le facteur D de A-30912 a la formule I dans laquelle Rl R2 R3 et R sont tous lH. Le factour II de A-30912 a la formule I dans laquelle R et R sont tous deux OiI, R est 11 et R 't: CIl30. 3. L';antibiotique S 31794/F-1 est un,e:tide cyclique antifonqique de formule I dans laquelle k est un groupement I 3 4 myristoyle et R, R et R sont OCH et R est -CC-NL. Chaque facteur est isolé du co:.3ielxe A30912 qui contient les autres facteurs arbitieen:pes facteurs B, C, D, El, F et C. Le complexe A-30J12 et les facteurs A à G individuels:-ont décrits par M. floehn et K.:.; ichel dans l] brevet dels E.U.A. N 4.024.245. ILe facteur A:ie l'antibiotique A-30912 est identique à 1'arlLibiLique A-22802 qui est dt'criLi dains le brevet des E.U.A. N ..024.246. Il a également été trouvé que le facteur A est idenritique à l'échinocandine B antibiotique ivoir P. et-n.z ut al., llelv. Chim. Acta, 57, 2459 (1974) et brevet suisse N1 568.386] et à l'antibiotique SL 7810/F [voir C. Kellcer-.'ilsien et al. Tetrahedron 1.etters, 4147 (1976) et brevet 1hel]ci N' 834.289]. Le facteur A de l'antibiotique A-30i12 est préparé par fermentation aérobie en immersion en utilisant l'un de plusieurs organismes différents, à savoir: (a) Asperqi-llus rugulosus NR1I, 8113; (b) Aspercjillus nidulans N!RIL 8112; (c) Asper-il]lus nidulans var. echinulatus A-322iJ-1, NPRRL 3860; (d) Asperqillus rugulosus NRRLI 8039; ou (e) Aspergillus nidulans var. roseus NRRL 11410. On a également trouvé que le facteur B est identique à l'échinocandine C antibiotique [voir R. Traber et al., Helv. Chim. Acta, (t2, 1252- (1979)] et à l'antibiotique SL 7810/F-II [voir le,brv.,Jt belge N 834.289]. On prCpare le facteur B de l'antibilj)tique A-30912 par fermentation aérobie en immersion en utilisant l'un de plusieurs organismes différents, à savoir: <>) As ergillus ruqulosts NiRRL, 8113; (b) Aspergillus nidulans var. eçhinulatus A-32204, NRRL 3860; (c) Aspergillus rurulosus NRRL 8039; ou (d) Asperqillus nidulans var. roseus NRRL 1440. On a également trouvé que le facteur D est identique à l'échinocandine D antibiotique [voir R. Traber et al., Helv. Chim. Acta, 62, 1252 (1979)1 et à l'antibiotique SL 7810/F-III Ivoir le brevet belge N 834.2891. On prépare le facteur D de l'antlbiotique A-30912 par feri:iuntaiorr aérobie en immersion en utilisant l'un de 3- plusieurs orqanismes différents, à savoir: (a) Aspergillus ru__ulosus NRRtl 8113; (b) Aspercoillus nidul ans var. echinulatus A-32204, NRRL 3860; (c) A]eruillus rugulosus NRRL 80.39 (voir le brevet belge N0 834.289); ou (d) Aspergillus nidulans var. roseus NRRL 11440. Le facteur Il est un facteur de l'antibiotique A-30912 découvert plus tard, et il est décrit dans la demande de brevet français N 80]2212dont la description est incorporée ici par voie de référence. Le facteur Il de A-30912 est préparé par fermentation en utilisant l'un de plusieurs organismes différents, à savoir: (a) Aspergillus rugulosus NRRL 8113 ou (b) Aspergjillus nidulans var. roseus NRRL 11440. Une sous-culture de A. nidulans var. roseus a été déposée et fait partie de la collection de cultures permanentes du Northern Regional Research Laboratory, U.S. Department of Agriculture, Agricultural Research Service, Peoria, Illinois 61604, o elle est disponible au public sous le numéro NRRL 11440. Quand on utilise une souche de A. nidulans var. roseus NRRL 11440 pour produire l'un quelconque des facteurs A-30912, on obtient un ensemble complexe de facteurs qui pour des raisons de commodité est appelé complexe-antibiotique A-42355. Le facteur A de A- 30912 est le facteur principal du complexe antibiotique A-42355, tandis que les facteurs B, D et H sont des facteurs mineurs. Les préparations 2 à 7 suivantes illustrent la préparation du complexe A-42355 et l'isolement et la purification des différents facteurs de A-30912. Dans la molécule antibiotique de formule I, la chaine latérale linoléoyle (R) est fixée au noyau peptidique cyclique sur le groupement a-amino du reste ornithine. On a trouvé de façon surprenante que la chaîne latérale linoléoyle peut être coupée du noyau par une enzyme sans modifier l'intégrité chimiquedunoyau. L'enzyme utilisée pour effectuer la réaction de désacylation est produite par un micro-organisme de la famille ActLijulanaceae, de préférence le micro-organisme Actinop îne;. ut;aliensis NRR1L 12052 ou un de ses variants. Pour effecLuer la désacylation, on ajoute 1,- ficLeur approprié de l'antibiotique A-30912 à une culture du,icru-organisme [ et on laisse la culture incuber avec le substrat jusqu'à ce que la désacylation soit pratiquement complète. Le noyau cyclique ainsi obtenu est séparé du bouillon de fermentation par des procédés connus dans le domaine. Au contraire des facteurs A, 13, D et Il de l'antibiotique A-30912, le noyau cyclique (ne possédant pas la chaîne latérale linoléoyle) est essentiellement exempt d'activité antifongique. L'antibiotique S31794/F-1, qui est décrit dans la demande de brevet allemand publiée après examen N 2.628.965 et dans le brevet des E.U.A. N 4.173.629, esL produit par Acrophialophiura 1imonisP0ra nov. sp c. Dreyfuss et Muller NRRL 8095. S31794/F-1 a les caractéristiques suivantes: P-f. 178-1800C (avec décomposition) (amorphe) ou 181-183 C (avec décomposition) (cristallisé); lu]20 - 24 (c 0,5, CH30H) ou + 37 (c 0,5, pyridine) (cristallisé); maxima 3. % d'absorption UV dans le méthanol à 194 nm (11- = 807), %= 132), 276 nm (]]=1, 225 nm (épaulement) E cm 132), 276 nm (E cm = 12,B), 284 nm (épaulement) E1 % = 10,5); un spectre RMN du 13 1- cm carbone C dans le deuterométhanol (190 mgc dans 1, 5 ml de deuteronLéthanol, en utilisant le tétraméthylsilane comme étalon interne) ayant les caractéristiques suivantes (à l'état cristallisé): PPl- ] PPM PPM 176,2 75,5 51,2 ,U 74,0 39,7 173,7 71,0 38,8 172,6 70,5 36,6 172,0 69,7 34,8 171,8 68,0 32,8 171,7 62,2 30,6 168,6 58,3 -26,7 157,7 57,0 23,5 132,5 56,2 19,7 ]29,0 55,4 14,3 I 1,9 () 52,9 11,1 -1(,, fi 2479207- une ana]yse élémentaire approximative (a[rès schlage du matériau cristallisé pendant deux heures sous vide poussé à 'C) comme suit: 55,556,5 % de carbone, 7,5-7,7 % d'hydrogène, 10,5-10,8 % d'azote et 25,5-26, 0 % d'oxygne; il est facilement soluble dans le méthanol, l'éthanol, la pyridine, le diméthylsulfoxyde et faiblement soluble dans l'eau, le chloroforme, l'acétate d'éthyle, l'éther diéthylique, le bonzène et l'hexane; et a une activité antifongique, en particulier contre Candida albicans. On prépare l'antibiotique S31794/F-1 par culture aérobie en immersion de Acrophialophora limonispora NRRL 8095 comme décrit dans les préparations 8 et 9. Ce micro- organisme fait partie de la-collection de cultures permanentes du Northern Reqional Research Center, U.S. Department of Agriculture, Agricultural Research Culture Collection, North Central Region, Peoria, Illinois 61604, o elle est disponible au public sous le numéro d'accès NRRL indiqué. L'antibiotique S31794/F-1 a une activité anti- fongique, en particulier contre les souches Candida comme Candida albicans. Ainsi, la production et l'isolement de l'antibiotique peuvent être contrôlés par bioautographe en utilisant une espèce Candida comme Candida albicans. Dans la molécule de l'antibiotique S31794/F-l de formule], o R1, I13 at R4 sont tous des groupements hydroxy et R2 est un groupement -CO-NII2, la chaîne latérale myristoyle (R) est fixée au noyau peptidique cyclique sur le groupement fi-amino du reste dihydroxyornithine. On a trouvé de façon surprenante que la chaîne latérale myristoyle peut être coupée du noyau par une enzyme sans nuire à l'intégrité chimique du noyau. L'enzyme utilisée pour effectuer la réaction de désacylation est produite par un micro-organisme de la famille Actinoplanaceae, de préférence le micro- organisme Actinoplanes utahlensis NRRL 12052 ou un de ses variants. Pour effectuer la désacylation, on ajoute l'antibiotique S31794/F-1 à une culture dlu micro-organisme et on laisse].a culture incuber avec le subst:rat jusqu'à ce que la d(6slcylation soit pratiquement complL.t. Le noyau cyclique ainsi nbtenu est séparé du bouil ion de fermentation par des pr-ocèdôCs connus dans le domaine..Au contraire de l'antibiotique S31794/F-1, le noyau cyclique (ne présentant pas la chaîne latérale myristoyle) est essentiellement exempt d'activité antifongique. Les noyaux peptidiques cycliques fournis par les réactions de désacylations enzymatiques suslientionnées des antibiotiques de formule I sont représentés par la formule générale iJ. Ho R4 CH HO. I 2 '.,,4 H I H--'-H HO/ =0 :-:--- -. ed 0=-X HX = S. H;O o.25 H II 2e composé de formule II o R, I=. et R sont tous des groupements hydroxy et R est Il est le noyau du facteur A de A-30912 et, pour des raisons de commodRit:é, sera appelé ici "noyau (le -30912A". Le noyau de "%-3012A a une formule brute de C341151N7015 et un poids moléculaire de 797,83. OH 'T 1'O I 2 0 H ' H Le composé de formule II o R1 R e t R4 sont tous deux des grouemnts hydroxy et R sont tous deux 11 est le noyau du facteur B de A-30912 et, pour des raisons de commodité, sera appelé ici "noyau (le A-30912B". Le noyau de A-30912A a une formule empiriute de C34 l51 N7015 et un poids moléculair e de 79781,81. Le composé de formule II o R1et R2 sont tous deux Il etR3ct 14 sont toits deux Oit est le noyau dut facteur B de A-30912 eL-, pour des raisons de commodité, sera appelé ici "noyau de A-30912B". Le noyau de A- 3091213 a une formule empiriquo do C 3.1t15]5N7 014 et- un poids imo]dculaiiie de 781,81. I,e cmposéc de formule I] o R, R, R et R sont tous des aloni d'hydrouqine est le noyau du fact;eur D de A-30912 et sera appelC ici pour des raisons de commodité "noyau de A-30912D". Le noyau de A-30912D a une formule brute de C34I151N70i2 et un poids moléculaire de 749,83. 4 si 712 1 4 Le composé de formule II o R et R sont tous deux 011, IR est 11 et R3 est CII 30est le noyau du facteur H de A-30912 et, pour des raisons de commodité, sera appelé ici "noyau de A-3091211". Le composé de formule II dans laquelle R, R et R4 sont OH et R est -CONIH2 est le noyau de l'antibiotique S 31794/E?-1 et sera appelé ici "noyau de S 31794/F-1". Le noyau de S 31794/F-1 a une formule brute de C351152N8016 et un p;i.ds; moléculaire de 840,87. L'enlèvement de la chaîne latérale fournit un groupement,,-amino primaire libre dans le reste ornithine du peptide cyclique. Comme le verra l'homme de l'art, les noyaux peuvent être obtenus sous la forme de l'amine libre ou sous la forme d'un sel d'addition d'acide. Bien que l'on puisse utiliser un quelconque sel d'addition d'acide approprié, on préfère ceux qui sont non toxiques et acceptables sur le plan pharmaceutique. Le procédé de préparation de chaque noyau à partir de l'antibiotiue approprié à l'aide d'une fermentation utilisant Actinoplanes uLahensis NRRL 12052 est décrit dans la demande de brevet déposée le même jour que la présente demande de brevet sous le N 080 26 218. - Des cultures d'espèces représentatives d'Actino- pnanaceae sont mises à la disposition du public au Northern Regional Research Laboratory sous les numéros d'accès suivants: Actinoplanes utahensis NRRL 12052 Actinoplanes missouriensis NRRL 12053 Actinoplanes sp. NRRL 8122 Actinoplanes sp. NRRL 12065 S treptosporanqium roseum var. hollandensis NRRL 12064 I,',l-icacité d'une quelconqui, seiche donnée de micro-ortanIiisnes appartenant à la faiiille des Actinoplanaceae k pour la mise tin oeuvre de la désacylation de cette invention est déterminée par le mode opératoire suivant. On inocule avec le micro-organisme un milieu de culture approprié. On fait incuber la culture à environ 28 C pendant deux ou trois jours sur un agitateur rotatif. Puis on ajoute à la culture l'un des antibiotiques utilisés comme substrat. On maintient le pIf du milieu de fermentation à environ 6,5. On contrôle la culture pour son activité en utilisant une analyse par Candida albicans. La perte de l'activité antibiotique est une indication que le micro-organisme a produit l 'enzyme nécessaire pour la désacylation. Ceci doit cependant être vérifié en utilisant l'un des procédés suivants: 1) analyse par chromatographie liquide sous pression élevée pour déterminer la présence du noyau intact; ou 2) réacylation avec une chaine latérale appropriée (par exemiiple linoléoyle, stéaroyle, palmitoyle ou myristoyle) pour rétablir l'activité. on sait que d'autres substances antibiotiques possèdent le même noyau que celui de facteur A de l'antibio- tique A-30912. Ces antibiotiques diffèrent du facteur A de l'antibiotique A-30912 en ce que des groupements acyle différents sont présents à la place du groupement linoléoyle (R) de la formule I. De tels antibiotiques sont: (a) le facteur A de A-30912-tétrahydrogéné {tétrailydro-SL 7810/F; tétrahydro échinocandine B) décrit dans le brevet belge N 834.289 et par F. Benz et aI., IIelv. Chim. Acta, 57 2459 (1974), composé qui est décrit par la formule I quand R est un groupement stéaroyle; et (b) l'aculaécine A, qui est un composant du complexe d'aculaécine (préparée par fermentation en utilisant Asperqillus aculeatus NRRL 8075) et est décrit dans le brevet des E.U.A. N 3.978.210. Comme décrit dans le brevet belge N 859.067, dans l'aculaécine A, la chaîne latérale palmitoyle est présente à la place du groupement linoléoyle. Le facteur A de A-30912 tétrahydrogéné peut être prpLaré à partir d(lu facteur A de A-30912 par hydrogénation catalytique en utilisant PtO2 dans l'éthanol sous une pression positive. Le facteur A de A-30912 tétrahydrogéné et l'aculaécine A peuvent tous deux être utilisés comme substrats pour la désacylation enzymatique en utilisant lesmodes opératoires décrits ici. On sait également qu'une autre substance antibiotique possède le même noyau que le facteur B de l'antibiotique A-30912. Cette substance, qui diffère du facteur B de l'antibiotique A-30912 en ce qu'un groupement aayle différent est présent à la place du Groupement linoléoyle R de la formule I, est le facteur B de A-30912 tétrahydrogéné (tétrahydro-SL 7810/F-II; tétrahydro échinocandine C) décrit par R. Traber et al., Ilelv. Chim. Acta, 62 1252 (1979). Le facteur B de A-30912 tétrahydrocgéné est décrit par la formule I quand R est un groupement stéaroyle. Le facteur B de A-30912 t6trahydrogéné peut être préparé à partir du facteur B de A30912 par hydrogénation catalytique en utilisant PtO2 dans l'éthanol sous pression positive. Le facteur B de A-30912 tétrahydrogéné peut être utilisé comme substrat à la place du facteur B de l'antibiotique A-30912 pour la désacylation enzymatique en utilisant les modes opératoires décrits ici. On sait en outre qu'une autre substance antibiotique possède le mimei noyau que le facteur 1) de A-30912. Cette substance, qui diffère du facteur D de l'antibiotique - A-30912 en ce qu'un groupement acyle différent est présent à la place du qroupement linoléoyle (R) de la formule I, est le facteur D de A-30912 tétrahydrogéné (tétralhydro-SL 7810/F-III; tétrahydro-échinocandine D) décrit par R. Traber et ai., IIelv. Chim. Acta, 62 1252 (1.979). Le facteur B de A-30912 tétrahydrogéné est décrit par La formule I quand R est un groupement stéaroyle. Le facteur D1) de A-30912 têtrahydrogéné peut être préparé à partir du facteur D de l'antibiotique A-30912 par hydrogénation catalytique en utilisant PtO2 dans l'éthanol sous pression positive. Le facteur D de A-30912 tétrahydrogéné peut être utilisé comme substrat à la place du facteur D de A-30912 antibiotique pour la désacylation enzymatique en utilisant les modes opératoires décrits ici. Danus le factLeur 11 de l'antibiot iqt.e A-30912, le groupemenL 5-hydroxy présent dans le reste dihydroxy- ornithine du noyau peptidique est iréthylé, tandis que dans le facteur A de l'antibiotique A-30912, le groupement 5- hydroxy n'est pas substitué. On verra donc que l'on peut préparer le facteur Il de façon synthétique en méthylant le facteur A selon des procédés classiques pour préparer un éther aliphlaLique à partir d'un alcool. On verra également que le facteur A peut être alkylé avec d'autilres groupements alkyle inférieur pour former des homologues à groupements alkyloxy d(le la molécule du facteur Il. Les homologues à groupements alkyloxy du facteur H que l'on peut préparer par synthèse à partir du facteur A, sont connus sous le nom d'homologues du type facteur HIl de A-30912. Les composés de formule II o R et R sont tous deux 011, R2 est H et R est un groupement alkyloxy en C2-C6 sont ici appelés comme les "noyaux du type A-30912H". On verra également que la chaîne latérale linoléoyle du facteur 11 de A30912 ou des homologues de type facteur H de A-30912-peut être hydrogénée selon des techniques classiques pour former le facteur H de A-30912 tétrahydrogéné ou le dérive tétrahydrogéné correspondant des homologues à groupements alkyloxy (R est un groupement stéaroyle). On peut également) prôparer les dérivés tétrahydroO3ndés en hydrogénant d'abord le facteur A de l'antibiotique A-30912 pour obtenir le facteur A de A-30912 tétrahydrogéné puis en formant le dérivé alkyloxy désiré. Il est entendu que le facteur 1il de l'antibiotique A-30912, le facteur Hl de A-30912 tétrahydrogéné, un homologue à groupements alkyloxy en C2- C6 du facteur H ou un dérivé téLrahydrogéné d'un homologue du facteur Il à groupement alkyloxy en C2-C6 peuvent être utilisés comme substrat pour la désacylation enzymatique en utilisant les modes opératoires décrits ici. L'invention qui fait l'objet de la présente demande de brevet comprend de nouveaux composés obtenus par acylation d'un noyau de formule II. Les composés de la présente invention ont la structure chimique décrite dans la formule générale III HO R 3R CH3 H _ Hot-tX H 0 H H H1 X5 He RHH H-y N-C-RH oe H00 / \ \ e- HO-!H2C HH. z/ ** **1N\ -:1 OH II H. I_ T OH À H III dans laquelle: quand R1, R et R sont tous OH et R est H, (A-30912A), R5 est un groupement alkyle en C6-C24 ou alcényle en C6-C24, pourvu que quand R est un groupement alkyle, R ne puisse pas être un groupement n-tridécyle, n-tétradécyle, n-penta- décyle ou n-heptadécyle; et, quand R5 est un groupement alcényle, R5 ne puisse pas être un groupement cis,cis- CH3 (CH2) 4CH=CHCH2- CH=CH(CH2)7; quand R et R sont tous deux H et R et R sont tous deux OH (A-30912B), R5 est un groupement alkyle en C6- C24 ou alcényle en C6-C24, pourvu que, quand-R est un groupement alkyle, R5 ne puisse pas être un groupement n- heptadécyle; et, quand R5 est un groupement alcényle, R5 ne puisse pas être un groupement cis, cis-CH3(CH2)4CH= CHCH2CH=CH(CH2)7-; 1 2 3 4 392)R5 quand R, R, R et R sont tous H (A-30912D), R est un groupement alkyle en C6-C24 ou alcényle en C6-C24, pourvu que, quand R est un groupement alkyle, R ne puisse pas être un groupement n-heptadécyle; et, quand R5 est un groupement alcényle, R ne puisse pas être un groupement cis, cis- CH3 (CH2)4CH=CHCH2-ClH=CH(CH2)7-; quand R et R sont tous deux OH, R2 est H et R est un groupement alkyloxy en C1-C6 (composé de type A-30912H), R est un groupement alkyle en C6-C24 ou alcnyle en C6-C24 et R est un groupement alkyloxy en C1-C6; pourvu que, quand R est un groupement alkyle et R un groupement méthoxy, R ne puisse pas être un groupement n- heptadécyle; et, quand R est un groupement alcényle et R un groupement méthoxy, R5 ne puisse pas être un groupement cis,cis- CH3(CH2)4CH=CHCH2CH=CH(CH2)7-; quand R1, R et R4 sont tous OH et R est -CO-NH2 (S31794/F-1), R5 est un groupement alkyle en C6-C24 ou alcényle en C6-C24, pourvu que, quand R est un groupement alkyle, il ne puisse pas être un groupement n-tridécyle. Par l'expression "alkyle", on désigne un radical hydrocarboné à chaîne droite ou ramifiée, saturé et monovalent. Par l'expression "alcényle", on désigne un radical hydrocarboné à chaine droite ou ramifiée,insaturé et monovalent, ne contenant pas plus de trois doubles liaisons. Les doubles liaisons de la chaîne hydrocarbonée insaturée peuvent être en configuration cis ou trans. Par "C6-C24", on désigne un hydrocarbure (à chaîne droite ou ramifiée) contenant de 6 à 24 atomes de carbone. Dans des aspects secondaires, en tenant compte des restrictions précédentes, l'invention envisage les composés préférés suivants de formule III (a) Les composés dans lesquels R est un groupement alkyle de formule CH3(CH2)n-, o n est un entier de 5 à 23. (b) Les composés dans lesquels R est un groupement alkyle de formule CH3(CH2)n-, o n est un entier de 10 à 20. (c) Les composés o R5 est un groupement alkyle CH3 de formule CH3(CH2) nCH(CH2)- o n et m sont chacun indépendamment un entier de O à 21 pourvu que la somme n + m ne soit pas inférieure à 3 et ne soit pas supérieure à 21. (d) Les composés dans lesquels R est un groupement alcényle contenant une double liaison cis ou trans. (e) Les composés dans lesquels R est un groupement alcényle cis ou trans de formule CH3 (CH2)nCH=CH(CH2)m- dans laquelle n et m sont indépendamment un entier de O à 21, pourvu que la somme n + m ne soit pas inférieure à 3 et pas supérieure à 213 (f) Les composés dans lesquels R est un groupement alcényle contenant deux doubles liaisons cis ou trans. (g) Les composés o R est un groupement alcényle cis ou trans de formule CH3 (CH2) nCH=CH(CH2) mCH=CH(CH2)p- dans laquelle n et p sont indépendamment un entier de O à 18 et m est un entier de 1 à 19, pourvu que la somme m + n + p ne soit pas inférieure à 1 et pas supérieure à 19 et que R5 ne puisse pas être un groupement linoléoyleo (h) Les composés dans lesquels R5 est: cis-CH3 (CH2) 5CH=CH(CH2) 7- trans-CH3 (CH2) 5CH=CH(CH2)7- cis-CH3 (CH2) 10cH=CH(CH2)4- trans-CH3 (CH2)10CH=CH(CH2)4- cis-CH3 (CH2) 7CH=CH(CH2)7- trans-CH3 (CH2) 7CH=CH(CH2) 7- cis-CH3(CH2)5CH=CH(CH2)9- trans-CH3 (CH2) 5CH=CH(CH2)9- cis-CH3 (CH2) 7CH=CH(CH2)9- trans-CH3 (CH2) 7CH=CH(CH2)9- cis-CH3 (CH2) 7CH=CH(CH2)11- trans-CH3 (CH2) 7CH=CH(CH2)11- trans,trans-CH3 (CH2) 4Cti=CHCH2CI=CI (Ci!2),- cis,cis-CH3 (CE 2) 4CHI=CHCHi2CHI=CHI(Ci!,)7- cis,cis,cis-CH3Cti2CH=CHCH2CH=CHCH2Cii=CH -(CH2)7-' Des groupements alkyloxy en C1-C6 types sont les groupements méthoxy, éthoxy, n-propoxy, i-propoxy, n-butoxy, t-butoxy, n-pentyloxy, n-hexvloxy, etc. En particulier, l'invention fournit un composé peptidique cyclique de formule: H Ho* R4 CH3 U. À I\ H I h-t H H /= H0 H - OH u * -----OC R OHO H R2 HzC/ dans laquelle R1 est H quand R est ou tous deux III ou OH et H, R2 est H OH, et R3 et R sont tous deuxH et quand R1est OH, R est H, R3 est OH ou un groupement alkyloxy en C -C6 et R est OH, ou R2 3 4 1 6 est -CO-NH2 et R et R sont tous deux OH, R est un groupement alkyle en C6C24 ou alcényle 1 3 4 en C6-C24 pourvu que, quand R, R et R sont tous deux OH, R est H et R un groupement alkyle, R5 ne puisse pas être un groupement n-tridécyle, et ntétradécyle, n-pentadécyle ou n-heptadécyle; 5 et quand R est un groupement alcényle, R ne puisse pas être un groupement cis,cis-CH3(CH2)4CH=CHCH2CH= CH(CH2); et quand R et R2 sont tous deux H, R et R sont tous R1 2 3 4 deux OH, ou quand R, R R et R sont tous H, ou quand R et R sont tous deux OH, R est H et R est un groupement méthoxy, et que R est un groupement alkyle, R5 ne puisse pas être un groupement n- heptadécyle et, quand R est un groupement alcényle, R ne puisse pas être un groupement cisrcis- CH3(CH2)4CH=CHCH2CH=CH(CH2)7- et quand R, R et R sont tous OH, R est un groupement -CO-NH2 et R5 un groupement alkyle, R ne puisse pas être un groupement n-tridécyle. Les composés de formule III inhibent la croissance de champignons pathogènes comme le mettent en évidence des modes opératoires d'essais biologiques classiques. Les composés sont donc utiles pour lutter contre la croissance des champignons sur des surfaces environnementales' (en tant qu'antiseptique) ou dans le traitement d'infections causées par des champignons. L'activité antifongique des composés a été démontrée vis-àvis de Candida albicans in vitro dans des essais de diffusion de disque sur plaque de gélose et des essais de dilution sur gélose, ou dans des essais in vivo sur des souris infectées par C. albicans. Les composés sont ainsi particulièrement utilisables pour le traitement d'infections provoquées par des souches de C. albicans (candidose). Les composés de formule III présentent également une activité in vitro dans les essais de diffusion sur disque sur plaque de gélose vis-à-vis de Tricophyton mentagrophytes, un organisme dermatophyte. On a également trouvé une activité dans les essais de diffusion sur disque sur plaque de gélose in vitro vis-à-vis de Saccharomyces pastorianus et Neurospora crassa. Certains composés (comme indiqué dans l'Exemple 27, TIableau V) donnent des taux dans le sang significatifs après administration par voie orale chez les souris. Quand on administre à un chien par voie intra- veineuse 100 mg/kg par jour pendant cinq jours du composé de i 2 3 2 formule III dans laquelle R, R et R sont tous OH, R est H et R est un groupement n-dodécyle (c'est-à-dire le dérivé n-tridécanoyle du noyau de A-30912A), le chien ne présente aucun signe extérieur de toxicité, bien que l'on observe des niveaux accrus de transaminase glutamo-pyruvique sérique et une certaine hémolyse. On prépare les composés de formule III en acylant le noyau approprié sur le groupement a-amino de l'ornithine par la chaîne latérale alcanoyle ou alcénoyle appropriée en utilisant des procédés connus dans le domaine pour former une liaison amide. L'acylation est effectuée en général en faisant réagir le noyau avec un dérivé activé de l'acide alcanoique ou alcénoique (R5CO2H) correspondant à la chaîne latérale acyle désirée (R CO-). Par l'expression "dérivé activé", on désigne un dérivé qui rend la fonctioncarboxy de l'agent d'acylation réactive à la copulation avec le groupement amine primaire pour former la liaison amide qui lie la chaîne latérale acyle au noyau. Les dérivés activés appropriés, leurs procédés de préparation et leurs procédés d'utilisation comme agents d'acylation d'une amine primaire sont connus de l'homme de l'art. Les dérivés activés préférés sont: (a) un halogénure d'acide (par exemple un chlorure d'acide) ; (b) un anhydride d'acide (par exemple un anhydride d'acide alcoxy- formique ou un anhydride d'acide aryloxyformique) ou (c) un ester activé (un ester 2,4,5-trichlorophénylique). D'autres procédés d'activation de la fonction carboxy comprennent la réaction de l'acide carboxylique avec un carbonyl-diimide (par exemple le N,N-dicyclohexylcarbodiimide ou le N,N'- diisopropylcarbodiimide) pour former un intermédiaire réactif qui en raison de son instabilité n'est pas isolé, la réaction avec l'amine primaire étant effectuée in situ. Un procédé préféré de préparation des composés de formule III est le procédé par l'ester actif. L'utilisation de l'ester 2,4,5trichlorophénylique de l'acide alcanoique ou alcénoique désiré, en tant qu'agent d'acylation, est nettement préférée. Dans ce procédé, on fait réagir un excès de l'ester actif avec le noyau à la température ambiante dans un solvant organique non réactif comme le diméthyl- formamide (DMP). La durée de la réaction n'est pas détermi- nante, bien que l'on préfère un temps d'environ 6 à,environ heures. A la fin de la réaction, on chasse le solvant et on purifie le résidu comme par chromatographie liquide sous pression élevée (CLPE) en phase inversée en utilisant LP-1/C18 comme phase fixe et un mélange d'eau, de méthanol et d'acétonitrile comme système solvant. Un procédé d'acylation préféré est un mode opératoire Schotten-Baumann modifié dans lequel on traite le noyau par le chlorure d'acide de l'acide alcanoique ou alcénolque désiré à un pH alcalin. Dans ce procédé, on ajoute lentement un excès du chlorure d'acide dans un solvant organique non réactif (comme l'acétone) à une solution du noyau dans un tampon [KHPO4] (pH 7,5 à 8,0) et d'acétone. On sépare le produit de réaction brut du milieu réactionnel par extraction dans un solvant organique non miscible (chloroforme et acétate d'éthyle). La purification finale se fait par CLPE à phase inversée, comme décrit précédemment. Un procédé de préparation des dérivés de type A-30912H de formule III est le suivant: (a) désacylation du facteur A de l'antibiotique A-30912 par voie enzymatique en utilisant Actinoplanes utahensis NRRL 12052 comme décrit dans la demande de brevet N0 déposée le même jour que la présente demande de brevet dont la description est incorporée ici par voie de référence, (b) acylation du noyau de A-30912A ainsi produit avec le groupement acyle constituant la chaîne latérale appropriée en utilisant le procédé décrit ci-avant pour l'acylation du noyau de A-30912H, et (c) alkylation du dérivé acyle approprié du noyau de A-30912A pour former le dérivé alkyloxy désiré. L'alkylation (Etape C) peut être effectuée en utilisant des procédés qui sont classiques pour la préparation d'un éther aliphatique à partir d'un alcool. Par exemple, le dérivé acylé approprié du noyau de A-30912A peut être méthylé par traitement d'une solution du dérivé dans un solvant organique inerte (par exemple le diméthylformamide) par le méthanol en présence d'un acide (par exemple 3 % de HC1 dans du méthanol). Le produit peut être isolé par des procédés classiques et purifié par CLPE à phase inversée. Les acides alcanoiques et alcénoiques utilisés comme substances de départ pour la réaction d'acylation ainsi que leurs dérivés activés (en particulier les chlorures d'acide et les esters 2,4,5trichlorophényliques) sont des composés connus ou peuvent être préparés à partir de composés connus par des procédés connus. Les esters 2,4,5- trichlorophényliques sont commodément préparés en traitant le chlorure d'acide alcanoique ou alcénoique par le 2,4,5- trichlorophénol en présence de pyridine ou en traitant l'acide alcanoique ou alcénoique libre par le 2,4,5-trichlorophénol en présence de N,N'dicyclohexylcarbodiimide utilisé comme agent de copulation. Le dérivé ester 2,4,5-trichlorophénylique peut être purifié par chromatographie sur colonne de gel de silice dans le toluène. Quand on les utilise de façon systémique, la dose des composés de formule III variera selon le composé particulier que l'on utilise, la sévérité et la nature de l'infection et l'état physique du sujet que l'on traite. La thérapie doit être commencée à de faibles doses, la dose étant accrue jusqu'à ce que l'on obtienne l'effet antifongique désiré. Les composés peuvent être administrés par voie intraveineuse ou intramusculaire par injection sous forme d'une solution ou suspension aqueuse stérile à laquelle on peut ajouter, si on le désire, divers agents classiques pharmaceutiquement acceptables comme des agents de conservation, des tampons, des agents de solubilisation ou de mise en suspension. D'autres additifs, comme une solution saline ou le glucose, peuvent être ajoutés pour rendre les solutions isotoniques. Les proportions et la nature de ces additifs seront évidentes pour l'homme de l'art. Certains composés de formule III donnent des taux dans le sang significatifs après administration par voie orale (voir l'Exemple 27) et peuvent être administrés de façon systémique par voie orale. Pour l'utilisation par voie orale, de tels composés peuvent être administrés en combi- naison avec des supports ou excipients pharmaceutiquement acceptables sous forme de capsules, comprimés ou poudres. La nature et la proportion de ces supports ou excipients seront connues de l'homme de l'art. Quand on les utilise pour traiter des infections vaginales dues à Candida, les composés de formule III peuvent être administrés en combinaison avec des excipients classiques acceptables sur le plan pharmaceutique convenant pour l'utilisation intravaginale. Des compositions conçues pour l'administration intravaginale sont connues de l'homme de l'art. 1i preéparation et l'utilisatiunl des composés de la présente intw.;, i.n sont illustrées dans l]s exemples suivants: Préparation 1 Fermentation d'Actinoplanes utahensis NRIRL 12052 On prépare une culture mère d'Actinoplanes utahensis NRRLI 12052 et on l'entretient sur une culture inclinée de gélose. Le milieu utilisé pour préparer la culture inclinée est choisi parmi l'un des suivants: - Milieu A Ingrédient Quantité Farine d'avoine pour bébé 60,0 g Levure 2,5 g K.111>0],0 g Solution minérale de Czapek:: 5,0 ml Gélose 25,0 g Eau désionisée q.s.p..1 litre le pli avant passage à l'autoclave est environ 5,9; on ajuste le pHli à 7,2 par addition de NaOH; après passage à l'autoclave, le pH est d'environ 6,7. :: La solution minérale de Czapek a la composition suivante Ingrédient Quantité FeSO4.71120 (dissous dans 2 ml d'IlCl concentré) 2- g KC1. MgS04'71120 Eau désionisée g g q.sp. 1 litre Milieu B Ingrédiecnt Dextrine de pomme de terre Extrait de levure Hydrolysat enzymatique de caséine Extrait de boeuf Dextrose Amidon de mais Peptone de viande Mélasse noire MgSO4.7112) CaCO3 Quantité ,0 g 0,5 g 3,0 g 0,5 g 12,5 g ,0 g ,0 g 2,5 g 0,25 g 1,0 g Solution minérale de Czapek 2,0 ml Gélose 20,0 g Eau désionisée q.s.p. 1 litre :: N-Z-Amine A, Humko Sheffield Chemical, Lyndhurst, New Jersey, U.S.A. On inocule la culture inclinée avec Actinoplanes utahensis NRRL 12052, et on fait incuber la culture inoculée à.30 C pendant environ 8 à 10 jours. On utilisé à peu près la moitié de la culture pour inoculer 50 ml'd'un milieu végétatif ayant la composition suivante: Ingrédient Quantité Farine d'avoine pour bébé 20,0 g Saccharose 20,0 g Levure 2,5 g Grains séchés de distillation:: 5,0 g K2ttPO4 1,0 g Solution minérale de Czapek 5,0 ml Eau désionisée q.s.p. 1 litre ajuster à pH 7,4 avec NaOH; après passage à l'autoclave, le *pH est d'environ 6,8. :: National Distillers Products Co., 99 Park Ave., New York, New York, U. S.A. On fait incuber le milieu végétatif inoculé dans un flacon Erlenmeyer de 250 ml à large encolure à 30 C pendant environ 72 heures sur un agitateur tournant sur un arc de 5 cm de diamètre à 250 tours par minute. On peut utiliser ce milieu végétatif incubé directement pour inoculer un milieu végétatif de second stade. Ou bien et de préférence, on peut le conserver pour un usage ultérieur on maintenant la culture dans la phase vapeur de l'azote liquide. On prépare la culture pour une telle conservation dans de nombreuses petites ampoules comme suit: dans chaque ampoule, on place 2 ml de milieu végétatif incubé et 2 ml d'une solution de glycérol et de lactose [voir W.A. Dailey et C.E. Iliggens, "Preservation and Storage of Micro- organisms in the Gas Phase of Liquid Nitrogen, Cryobiol 10, 364-367 (]973) pour les détails]. Les suspensions ainsi préparées; ';(Ont conservées dans la phiise valpeuUI- de] 'azote liquide. On utilise une suspension conservée (1 mi) ainsi préparée pour inoculer 50 ml d'un milieu végétatif de premier stade (ayant la composition décrite ci-avant). On fait incuber comme décrit précédemment le milieu végétatif de premier stade inoculé. Pour obtenir un plus grand volume d'inoculum, on utilise 10 ml du milieu végétatif de premier stade incubé pour inoculer 400) ml d'un milieu végétatif de second stade Io ayant la mnme composition que le milieu véqgéLtatif de premier stade. On fait incuber le milieu de second stade dans un flacon Erlerimeyer de 2 litres à large encolure à 30 C pendant environ 48 heures sur un agitateur tournant d'un arc de 5 cm de diamètre à 250 tours par minute. On utilise le milieu végétatif de second stade incubé (800 ml), préparé comme décrit ci-dessus, pour inoculer 1 d'un milieu de production stérile choisi parmi l'un des suivants: Milieu I Ingredient Quantité (g/l) Farine d'arachide. 10,0 Peptone de viande soluble 5,0 Saccharose 20,0 Kit2PO4 0,5 K211PO4 1,2 MgSO4- 71i20 0,25 Eau du robinet q.s.p. 1 litre Le pli du milieu est environ 6,9 après stérilisation par passage à l'autoclave à 121 C pendant 45 minutes sous une pression d'environ 1,1 à 1,24 bar. Milieu II Ingrédient Quantité (g/l) Saccharose 30,0 Peptone 5,0 K211P04 1,0 KCI. 0,5 MgSO4.71120 0,5 FeSO4 /.7l20 0,002 Eau désionisée q.s.p. 1 litre On ajuste le pli à 7,0 avec IICI; après passage à l'autoclave, le pH est d'environ 7,0. Milieu III Ingrédient Quantité (g/l) Glucose 20,0 NIl4Cl 3,0 Na2SO4 2,0 ZnC12 0,019 MgCl2. 6H1120 0,304 FeCl3. 6H120 0,062 MnCl 2.41120O 0,035 CuC12.21120 0,005 CaCO3 6,0 KH 2Po4 0,67 Eau du robinet q.s.p. 1 litre :: Stérilisé séparément'et ajouté de façon aseptique Le pH final est d'environ 6,6. On laisse le milieu de production inoculé fermenter dans une cuve de fermentation de 165 1 à une température d'environ 30 C pendant environ 42 heures. On agite le milieu de fermentation avec des agitateurs classiques à environ 200 tours par minute et on l'aère avec de l'air stérile pour maintenir le taux d'oxygène dissous supérieur à 30 % à la saturation par l'air à la pression atmosphérique. Préparation 2 Préparation du mélange antibiotique A-42355 A. Fermentation en flacon agité On prépare une culture d'Aspergillus nidulans var. roseus NRRL 11440 et on la maintient sur une gélose inclinée de 18 x 150 ml, préparée avec un milieu ayant la composition suivante: Ingrédient Quantité Glucose 5 g Extrait de levure 2 g CaCO3 3 g Jus de légumes: 200 ml GCélose:::: 20g Eau désionisée q.s.p. 1 litre (pH initial 6,1) :: Jus V-8, Campbell Soup Co., Camden, N.J., U.S.A. ::: Meer Corp. La culture inclinée est inoculée avec Asperqillus nidulans var. roseus NRRL 11440 puis on fait incuber la culture à 25 C pendant environ sept jours. On recouvre d'eau la culture inclinée mûre et on la gratte avec une anse stérile pour libérer les spores. La suspension résultante est ensuite mise en suspension dans 10 ml d'eau désionisée stérile. On utilise 1 ml de la culture inclinée en suspension pour inoculer 55 ml de milieu végétatif dans un flacon de 250 ml. Le milieu végétatif a la composition suivante: Ingrédient Quantité Saccharose 25 g Mélasse noire 36 g Liqueur de macération de mais 6 g Extrait de malt 10 g K2IHPO4 2g 2 g Hydrolysat enzymatique de caséine:: 10 g Eau du robinet 1100 ml (pH initial 6,5-6,7) ::.N-Z-Case, Humko Sheffield Chemical, Lyndhurst, N.J., U.S.A. On fait incuber le milieu végétatif inoculé à 25 C pendant 48 heures, à 250 tours par minute, sur un agitateur de type rotatif. Apres 24 heures, on homogénéise le milieu pendant une minute à faible vitesse dans un mélangeur (de type Waring), puis on le fait incuber à nouveau pendaht'- les 24 heures restantes. Ou bien, on peut faire incuber le milieu végétatif inoculé pendant 48 heures puis l'homogénéiser pendant 15 secondes à faible vitesse. Ce milieu végétatif incubé peut être utilisé pour inoculer un milieu de culture de fermentation en flacon agité ou pour inoculer un milieu végétatif de second stade. On peut également.le conserver pour une utilisation ultérieure, en maintenant la culture dans la phase vapeur de l'azote liquide. On prépare la culture pour cette conservation dans de nombreuses petites ampoules, comme suit: On mélange les cultures végétatives volume/volume avec une solution de suspension ayant la composition suivante: Ingrédient Quantité Glycérol 20 ml Lactose 10 g Eau désionisée q.s.p. 100 ml On répartit les suspensions préparées dans de petits tubes stériles à bouchon vissé (4 ml par tube). On conserve ces tubes dans la phase vapeur de l'azote liquide. On peut utiliser une suspension conservée ainsi préparée pour inoculer des cultures inclinées ou des milieux d'ensemencement liquides. On fait incuber les cultures inclinées à 25 C à la lumière pendant 7 jours. B. Fermentation en réservoir Pour obtenir un plus grand volume d'inoculum, on utilise 10 ml de la culture végétative de premier stade incubé pour inoculer 400 ml d'un milieu de croissance végétatif de second stade ayant la même composition que celui du milieu végétatif. Le milieu de second stade est incubé dans un flacon Erlenmeyer à large ouverture de deux litres, à C pendant 24 heures, sur un agitateur tournant d'un arc de cm de diamètre à 250 tours par minute. Le milieu de second stade incubé (800 ml), préparé comme décrit ci-dessus, est utilisé pour inoculer 100 litres d'un milieu de production stérile choisi parmi l'un des suivants: Milieu IV Ingrédient Quantité ZnSO4.7H20 0,00455 g/i Peptone de viande soluble:: 30,5 g/1 Farine de soja 15,5 g/1 Dextrine de tapioca::xZ 2,0 g/1 Mél]asse noire 10,5 g/l 11ydiro]ysat enzymatique * de asine:::::: 8,5 g/1 Nil21'. 04 4,5 g/l Mcf1O4. 71120 5,5 g/1 FeSO.4 711 0 0,1 g/1 liuile de coton 40, 0.ml Antiimoussant:::::::: 1,0 ml Eau du robinet 1000,0 ml (pll initial 6, 8-7,0) :: Peptone, Amber Laboratories, Juneau Wisconsin, U.S.A. :::: Stadex 11, A.E. Staley Co., Decatur, Illinois, U.S.A. :::::: N-Z-Amine A, Humko Sheffield Chemical, Lyndhurst, N.J. U.S.A. :::::::: P2000, Dow Corning, Midland, Michiqan, U.S.A. i0 Milieu V Ingrédient Quantité Glucose 2,5 % Amidon 1,0 % Peptone de viande soluble:: 1,0 % Mélasse noire 1,0 % CaCO3 0,2 % MgSO4.71120 0,05 % Hydrolysat enzymatique de caséine:::: 0,4 % Antimoussant:::::: 0,02 % Eau du robinet q.s.p. volume :: O.M. Peptone :::: N-Z-Amine A :::::: Antifoam "A", Dow Corning On laisse le milieu de production inoculé fermenter dans un réservoir de fermentation de 165 1 à une température de 25 C pendant 7 jours. On aère le milieu de fermentation avec de l'air stérile, en maintenant le niveau d'oxygène dissous supérieur à environ 50 % de la saturation en air. C. Milieu végétatif de troisième stade Si l'on effectue la fermentation dans des réservoirs plus grands que ceux utilisés pour la fermentation par litres, il est recommandé d'utiliser une culture végétative de troisième stade pour ensemencer le réservoir plus grand. Un milieu végétatif de troisième stade préféré a la composition suivante: Tr ncj' 6d}1?.Ln $Muantité Saccharî Imc^>^^^;e^ 25 g Mélasse noire 25 g Liqueur de macération de mais 6 g Hydrolysat enzymatique de caséine: 10 g ExtraiL de malt 10 q K2IIPO4 2g 2 g Eau du robinet 1000 ml (AH initial 6,1) :: NZ-Case Préparation 3 Séparation du mélange antibiotique A-42355 On agite soigneusement le bouillon de fermentation entier (4127 litres), obtenu par le procédé décrit dans l'Exemple 1 en utilisant le milieu de production II, avec 4280 litres de méthanol pendant une heure, puis on filtre, en utilisant un adjuvant de filtration (Hlyflo Supercel, une terre de diatomées, Johns-Manville Products Corp.). On ajuste le pli du filtrat à 4,0 par addition d'HICl 5 N. On extrait le filtrat acidifié deux fois avec des volumes égaux de chloroforme. On réunit les extraits chloroformiques et on les concentre sous vide jusqu'a un volume de 20 litres. On ajoute ce concentré à 200 litres d'éther diéthylique pour faire précipiter le mélange A-42355. On sépare le précipité par filtration et l'on obtient 2775 g du mélange A-42355 sous forme d'une poudre blanc gris. Séparation et identification des facteurs de A-30912 Préparation 4 Séparation du facteur A de A-30912 On dissout 1 g du mélange antibiotique A-42355, préparé comme décrit dans les Préparations 2 et 3, dans 7 ml d'un mélange 7:2:1 de méthanol, d'eau et d'acétonitrile. On filtre cette solution et on l'introduit dans une colonne en verre de 3,7 cm de diamètre intérieur et de 35 cm de longueur [Colonne de Chromatographie CLFPCE: (chromatographie liquide sous faible pression de caractéristiques élevées) Michel- Miller, Ace Glass Incorporated, Vineland, NJ 083601 garnie de résine à phase inverse de gel de silice LP-1/C18 (10-20 microns), qui a été préparée comme décrit dans la Préparation , par l'intermédiaire d'une boucle à l'aide d'un système à vannes. ILa colonne est garnie dans le syst-me 7:2:1 de t méthanol, d'eau et d'acétonitrile, à l'aide du mode opératoire de garnissage en suspension décrit dans la Préparation 11. Une pompe F.M.I. avec une conception de piston sans vannes (débit maximal 19,5 ml/minute) est utilisée pour déplacer le solvant dans la colonne à un débit de 9 ml/miinute à 7 bars, des fractions étant recueillies toutes les minutes. L'élution de l'antibiotique est contrôlée à 280 nm en utilisant un appareil de contrôle UV (ISCO Model UA-5, Instrument Specialist Co., 4700 Superior Ave., Lincoln, Nebraska 68504) équipé d'une unité optique (ISCO Type 6). Préparation 5 Séparation du facteur B de A-30912 On sépare le mélange A42355 comme décrit dans la Préparation 3, mais on chromatographie les extraits chloroformiques concentrés (285 1) sur une colonne de gel de silice (150 1 de gel de silice Grace, qualité 62) à un débit de 2 1/minute. On lave la colonne avec 200 litres de chloroforme, on l'élue avec 500 litres d'acétonitrile, puis on l'élue continuellement avec un mélange 98:2 d'acétonitrile et d'eau à un débit de 1 1/minute. On recueille des fractions ayant un volume de 200 litres et on les analyse séparément pour déterminer leur activité biologique. L'analyse biologique est effectuée par une analyse sur disque de papier sur plaque de gélose, ensemencée par Candida albicans. On réunit les fractions 77 à 103 (1365 litres) et on les concentre sous vide. La solution concentrée (4,5 litres) contient un précipité qu'on enlève par filtration et l'on obtient 119 g de mélange A-42355 enrichi en facteur B. On concentre le filtrat à siccité. On redissout le résidu obtenu dans un volume approprié de méthanol. On ajoute la solution méthanolique à 10 volumes d'éther diéthylique pour faire précipiter le complexe antibiotique contenant le facteur B. On sépare également ce précipité par filtration et on le sèche, et l'on obtient 24 g supplémentaires de mélange A-42355 enrichi de facteur B sous forme d'une poudre grise. Le mélange A-42355 enrichi en facteur B ainsi obtenu (1,0 g) est dissous dans 8 ml d'un mélange de 7:2:1 de méthanol, d'eau et d'acétonitrile. On filtre cette solution % et on l'introduit sur une colonne de gel de silice (Colonne Michel-Miller de 3,7 cm de diamètre intérieur x 33 cm) par l'intermédiaire d'une boucle à l'aide d'un système à vannes. La colonne est garnie d'une résine à phase inversée de gel de silice LP- 1/C18 (10-20 microns) préparée comme décrit dans la Préparation 10, à l'aide du mélanae 7:2:1 de méthanol, d'eau et d'acétonitrile, comme décrit dans la Préparation 11. Le solvant se déplace dans la colonne à un débit de 10 ml/ minute à environ 7 bars, en utilisant une pompe FMI à piston sans vannes. On recueille une fraction toutes les minutes. On contrôle l'élution de l'antibiotique à 280 nm comme dans la Préparation 15. On réunit les fractions 102-110 et on les concentre sous vide pour obtenir une huile. On dissout l'huile dans un petit volume de t-butanol et on la lyophilise, ce qui donne 22 mg du facteur B de A-30912. Préparation 6 Isolement du facteur D de A-30912 On réunit et on chromatographie sur une colonne de gel de silice (Grace, qualité 62) les extraits chloroformiques concentrés de deux essais de fermentation (3800 1 et 4007 1) obtenus par le procédé décrit dans la Préparation 3. On lave la colonne avec du chloroforme puis on élue avec de l'acéto- nitrile et un mélange 98:2 d'acétonitrile et d'eau. On recueille des fractions ayant un volume d'environ 200 t et on les soumet à une analyse biologique sur disque dle papier sur g!élose ensemencée avec Candida albicans. On réunit les fractions actives (850 1) et on les concentre sous vide. On ajoute la solution concentrée (0,7 1) à 10 volumes d'éther diéthylique pour faire précipiter le mélange A-42355 enrichi en facteur D. On enlève ce précipité par filtration et on le sèche, ce qui donne 32 g de mélange A-42355 enrichi en facteur D sous forme d'une poudre grise. On dissout le mélange A-42355 enrichi en facteur D ainsi obtenu (1,0 g) dans 5 ml d'un mélange 7:2:1 de méthanol, d'eau et d'acétonitrile. On filtre cette solution et on l'introduit sur une colonne de gciel de silice (colonne Michel- Miller, 3,7 cmui dc diainLtre i nLéri-url- x 3t;: 'iu l'inter;n,(.i FrL' d'une boucie à 'aive,';n svStt:.e à vannes. La colonne a été qzarnie de résine A!hase iJivursée de gel de silice LPI/C (10-20 microns) prépar,-e c-;:r. dcrit dans la Préparation 10. Le garnissage a étu eff ctue dans un mélange 7:2:1 de mnthaniol, d'eau et d'acétonitrile, seion le mode opératoire dc garnissage de la Préparation 11.,Le solvant se déplace dan.; la. colonne à un débit de O ml/:::inute à environ 3,1 bars, en utilisant une pompe FIJI ( c. rnception de piston sans vannes. On recueille une fraction toauLes les 2 minutes. L'élution de l'antibiotique est contrôlée A 28 ni3 comme décrit dlans a Préparation 4. On réunit tes fractions 96-108 et on les concentre sous vide pour obtenir un:e huile. On dissout cette huile dans un petit volume de t-butanol et on lyophilise pour obtenir 89:ng du facteur D de A-30912. Préparation 7 Séparation du facteur Il de A-30912 On dissout 5,0 g du mélange antibiotique A-42355, préparé comme décrit dans les Preparations 2 et 3, dans 35 ml du mélange 7:2:1 de méthanol, d'eau et d'acétoritrile, on filtre la solution résultante et on l'introduit sur une colonne de verre de 3,7 cm de diamètre intérieur x 42 cm (colonne Michel-Miller) par l'intermédiaire d'une boucle à l'aide d'un système de vannes. La colonne est qarnie de résine à phase inversée de gel de silice I,P-1/C18 (10-20 microns) (Préparation 10) dans un méeanre 7:2:1 de méthanol, d'eau et d'acétonitrile comme décrit dans la Préparation 11. Le solvant se dépiace dans la colonne à un débit de 13 ml/ minute à environ 8,3 bars, en utilisant une pompe FMI à conception de piston sanis vannes, et l'on recueille une fraction toutes les deux minutes. On contrôle l'élution de l'antibiotique à 280 nm comme décrit dans la Préparation 19, paragraphe C. On réunit les fractions 112-132 avec les fractions 106-] 17 d'une seconde purification similaire. Les fractions réunies sont concentrées sous vide jusqu'à une huile. on din;:;,ut l'Luile dans un petit volume: le t-butanol et on lyophiliiise pour obtenir 173 mg du f.cleur Il brut de A-30912. On dissout le facteur HI brut de A-30912 (150 mg) dans 8 ml d'un mélange 7:2:1 de méthanol, d'eau et d'acétonitrile; on filtre la solution résultante et on la réintroduit sur une colonne de verre de 2,0 cm de diamètre intérieur x 32 cm, comme décrit ci-dessus. Le solvant se déplace dans la colonne à un débit de 8 ml/minute à environ ,5 bars, et on recueille une fraction toutes les 3 minutes. On contrôle l'élution de l'antibiotique à 280 nm. On réunit les fractions 17 et 18 et on les concentre sous vide pour obtenir une huile. On dissout l'huile dans un petit volume de t-butanol et on lyophilise pour obtenir 29 mg du facteur Il de A-30912. Identification des facteurs de A-30912 Iles différents facteurs de A30912 peuvent être identifiesF par chromatographie sur couche mince (CCM). Les Rf des factuurs A àGdeA-30912, en utilisant la CCM sur gel de silice (Merck, Darmstadt),un système solvant 7:3 de benzène et de méthanol et un bioautographe par Candida albicans sont indiqués dans le Tableau VII. TABLEAU VII Facteur de A-30912 Rf A 0,35 B 0,45 C 0,54 D 0,59 E 0,27 F 0,18 G 0,13 -Les Rf approximatifs des facteurs A, B, C, p et H de A-30912 dans différents systèmes solvants, en utilisant une CCM sur gel de silice (plaques de gel de silice n 60 de Merck Darmstadt, 20 x 20 cm) et un bioautographe par Candida albicans, sont donnés dans le Tableau VIII. Facteur de A-30912 Facteur A Facteur 13 Facteur C Facteur D Facteur I1 TABLEAU VIII Rf - SystL-n;es solvants a 0,28 0,39 0, 4 6 0,50 0,42 b 0,14 0,21 0,31 0,38 0,27 c 0,28 0,42 0,51 0,57 0,36 d 0,43 0, 47 0,58 0,61 0,53 SysLLmiics solvants a: b: c: d acétate d'éthyle:méthanol (3:2) acetate d'éthyle:méthanol (7:3) acétonitrile:eau (95:5) acétate d'éthyle:éthanol:acide acétique (40:60:0,25) On peut également identifier les facteurs A, B, D et H de A-30912, par chromatographie liquide sous faible pression de caractéristiques élevées (CLPFCE) analytique, dans les conditions suivantes: Colonne verre, 0,8 x 15,0 cm Garnissage Nucleosil 10-C18 (Machery Nagel and Company); garni en utilisant le.mode opératoire de garnissage en suspension de la Préparation Solvant Mélange 7:2:1 de méthanol, d'eau et d'acétonitrile Volume de l'échantillon Dimension de l'échantillon Température de la colonne Débit- Pression Détecteur Pompel) 8 I1 8 pig ambiante 1,8 ml/minute environ 14 bars UV à 222 nm (ISCO Model 1800 Variable Wavelength UV-visible Absorbance Monitor) LDC Duplex Minil)uip Injection injection sur boucle Les durées de rétention approximatives pour les facteurs A, [ B, D et Il de A-30912 dans ces-conditions sont résumées dans le Tableau IX. TABLEAU IX Facteur de A-30912 Temps de rétention (s) A 792 13 870 I1 990 D 1.140 Préparation 8 Préparation de l'antibiotique S31794/F-1 On produitl'antibiotique S3179A/F-l par culture en immersion d'Acrophialophora limonispora NRRL 8095, en agitant, remuant et/ou aérant à pH 3-8, de préférence 5-7, et à 15-30 C, de préférence à 18-27 C, pendant 48 à 360 heures, de préférence pendant 120 à 288 heures. On isole l'antibiotique S31794/F-1 par traitement du bouillon de culture (90 L) avec un mélange 4:1 (90 L) d'acétate d'éthyle et d'isopropanol et en homogénéisant pendant 30 minutes à la température ambiante. On sépare la phase organique et on l'évapore sous vide à environ 40 C. On chromatographie le résidu ainsi obtenu sur environ dix fois sa quantité de gel de silice, en utilisant des mélanges de chloroforme et de méthanol (95:5 à 60:40). On réunit les fractions qui ont une activité antifongique et on les chromatographie sur 100 fois leur quantité de "Sephadex LH-20" avec du méthanol. Les fractions provenant de la colonne de Sephadex et qui ont une activité antifongique sont réunies et rechromatographiées sur 100 fois leur quantité de gel de silice (0,05-0,2 mm) avec un système solvant 71:25:4 de chloroforme, de méthanol et d'eau. Les fractions éluées qui ont une activité antifongique sont réunies et évaporées sous vide pour obtenir l'antibiotique brut S31794/F-1. On dissout ce produit dans de petites quantités de méthanol et on le précipite avec de l'éther diéthylique pour obtenir S31794/F-1 sous forme d'une poudre amorphe blanche, p.f.]78-180 C (décomposition) après séchagce sous vide poussé à 25-30 C. La cristallisti.-i c dans dix fois son volume de mélange 80:12:8 d'acétate ti'thyie, de méthanol et d'eau donne S31794/F-1 cristallisé, p. f. 181-183 C avec décomposition après séchage sous vide pousse A 20 C. Préparation 9 Séparation cde l'antibiotique S31794/F-1 On introduit l'antibiotique S31794/F- 1 brut, obtenu comme décrit dans la Préparation 8 après chromatographie sur Sephadex, sur une colonne de gel de silice (colonne Michel- Miller) par l'intermédiaire d'une boucle à l'aide d'un système à vannes. On utilise le mode opératoire de larnissage en suspension décrit dans la Préparation il. Orn déplace le solvant dans la colonne en utilisant une pompe FMI avec une conception de piston sans vannes. On contrôle l'élution de l'antibiotique en utilisant un appareil de contrôle UV à 280 nm comIIIe clans la Préparation 22. On réunit les fractions ayant une activité antifongique et on les concentre sous vide pour obtenir l'antibiotique S31794/F-1. S31794/F-l a les Rf suivants par chromatographie sur couche mince de gel de silice (Merck, 0,25 mm): Système solvant - F- Chloroforme:méthanol:eau (71:25:4) Chloroforme:méthanol:acide acétique concentré (70:29:1) Chloroforme:mnéthanol (2:1) S31794/F-I peut également être détecté d'iode. 0,17 0,19 0,27 par de la vapeur Préparation 10 Préparation de la résine à C]8 Etape 1: Hydrolyse On ajoute 1000 g Corp., maintenant Whatman) sulfurique concentré et de dans un ballon à fond rond une suspension appropriée. de vapeur pendant une nuit phase inverisée de gel de silice/ de gel de silice LP-1 (Quantum à un mélange de 1650 ml d'acide 1650 ml d'acide nitrique concentré de 5 1 et on agite pour obtenir On chauffe le mélange sur un bain (16 heures) avec un réfrigérant à refroidissement d'eau fixé sur le ballon. On refroidit le mélange dans un bain de glace et on le filtre soigneusement en utilisant un entonnoir en verre fritté. On lave le gel de silice avec de l'eau désionisée jusqu'à pli neutre. Puis, on lave le gel de silice avec 4 1 d'acétone et on le sèche sous vide à 100 C pendant deux jours. Etape 2: Premiere silylation Le gel de silice sec de l'Etape 1 est transféré dans un ballon à fond rond et mis en suspension dans 3,5 1 de toluene. On chauffe le ballon au bain de vapeur pendant deux heures pour chasser toute l'eau résiduelle par distillation azéotrope. On ajoute 321 ml d'octadécyl- trichlorosilane (Aldrich Chemical Company), et on chauffe le mélange réactionnel à reflux pendant une nuit (16 heures) avec une lente agitation mécanique à 60 C. On prend soin d'éviter que l'agitateur ne soit trop près de la partie inférieure du ballon, pour éviter un broyage des particules de gel de silice. On laisse le mélange refroidir. On recueille le gel de silice silanisé, on le lave avec 3 i de toluène et 3 1 d'acétone, puis on le sèche à l'air pendant une nuit (16-20 heures). On met le gel de silice séché en suspension dans 3,5 1 d'un mélange 1:1 d'acétonitrile et d'eau dans un ballon de 5 1, on agite soigneusement à La température ambiante pendant deux heures, on filtre, on lave avec 3 i d'acétone et on sèche à l'air pendant une nuit. Etape 3: Deuxième silylation - On répète le mode opératoire de la première silylation en utilisant 200 ml d'octadécyltrichliorosilane. On chauffe la suspension à reflux à 60 C pendant deux heures, tout en agitant soigneusement. On recueille le produit final par filtration, on lave avec 3 1 de toluène et 6 1 de méthanol, puis on le sèche sous vide à 50 C pendant une nuit (16-20 heures). Pr6paration il Mode Oj)l-.[ól.ire de qarnisscgte en suspensio)n jlur les colonnes Michel-.i Il r1 Renseigjnecn Ls q;3néraux On utilise ce mode opératoire pour garnir une colonne de résine à phase inversée de cel de silice/C18 comme celle préparée par le procédé de la Préparation 10. En général, une pression inférieure à 14 bars et des débits compris entre 5 et 40 ml/minute sont nécessaires pour cette technique de garnissage en suspension; ceci dépend du volume et des dimensions de la colonne. La pression de garnissage doit être supérieure à la -pression utilisée pendant la séparation réelle de 2 à 3,5 bars; ceci assure qu'il ne se produit pas de tassement ultérieur de l'adsorbant pendant les séparations. Une diminution soudaine de la pression peut provoquer des craquelures ou des canaux dans le matériau de garnissage, ce qui réduirait de façon importante l'efficacité de la colonne. Il est donc important de laisser la pression descendre lentement jusqu'à zéro chaque fois que l'on arrête la pompe. Volume approximatif des colonnes (Colonnes en verre de Ace, Catégorie No., non garnies): 5795-04, 12 ml; 5795-10, 110 ml; 5795-16, 300 ml; 5795-24, 635 ml; et 5796- 34, 34 ml. Le temps nécessaire pour garnir une colonne en verre peut varier de quelques minutes à quelques heures, selon la dimension de la colonne et l'expérience de l'opérateur. Etapes: 1. Relier la colonne de verre à une colonne réservoir par un aôcouplement (le volume de la colonne réservoir doit être deux fois celui de la colonne). Placer les deux colonnes verticalement avec la colonne réservoir au-dessus. 2. Peser le matériau de garnissage (100 g pour 200 ml de colonne). 3. Ajouter environ 5 volumes de solvant au matériau de garnis- sage; utiliser un mélange de 70-80 %O de méthanol et de 20- 30 %O d'eau. 4. Bien aqitur jusqu'à ce que toutes les particules soient mouillées, laisser reposer pendant une nuit ou plus longtemps pour assurer une imprégnation comp1lte dcles particules par le solvantl. i)X tnterl'.la liqueur surllael(nllL,. 5. Délayer la résine avec suffisamment do solvant pour remplir la colonne réservoir. Verser rapidement dans le réservoir. La colonne doit être préremplie avec le même solvant et la colonne réservoir doit être partiellement remplie du solvant avant de verser la suspension. L'utilisation de volumes de suspension plus grands peut également donner de bons résultats; cependant, ceci nécessite (a) un réservoir plus grand ou (b) plusieurs remplissages du réservoir pendant l'opération de garnissage. 6. Fermer le réservoir avec le bouchon de Tcflon en-dessous de la colonne (voir la Figure 1 du brevet des E.U'.A. N 4.131.547, bouchon N 3); relier à la pompe; et commencer immédiatement le pompage du solvant dans les dispositifs au débit maximum si l'on utilise une pompe Ace Cat. No. 13625-25, ou un système de distribution de solvant similaire (20 ml/minute). 7. Continuer jusqu'à ce que la colonne soit complètement remplie de l'adsorbant.-La pression ne doit pas dépasser la tolérance maximale de la colonne pendant cette opération (14 bars pour les colonnes importantes et 21 bars pour les colonnes analytiques). Dans la plupart des cas, des pressions inférieures à 14 bars seront suffisantes. 8. Si la pression dépassait les valeurs maximales, réduire le débit et la pression diminuera. 9. Après remplissage de la colonne par l'adsorbant, arrêter la pompe; laisser la pression tomber à zéro; débrancher le réservoir; remplacer le réservoir par une pré-colonne; remplir la pré-colonne de solvant et d'une petite quantité d'adsorbant, et pomper à la pression maximale jusqu'à ce que la colonne soit complètement garnie. Pour une information supplémentaire, voir le mode opératoire général. Toujours laisser la pression descendre lentement après arrêt de la pompe; ceci empêchera la formation de toutes craquelures ou canaux préférentiels dans le matériau de garnissage. 10. Supprimer la pression et débrancher soigneusement la pré-colonne. Avec une petite spatule, enlever quelques n.li.. imib:-(u: (2-4) de garnissage au sommet de la colonne; placer I ou 2 Il l] les au somlmelL de l a cololline; appuyer doucement juls;u'au sommet du matériau tic; al':issage, et placer un bouchon de Telflon au somnet de la colonne jusqu'à confirmation de 'étanchéité. Relier la colonne à la pompe, introduire la pression (généralement moins de 14 bars) et observer par]a paroi de verre au sommet de la colonne si la résine se tasse davantage. Si le matériau de garnissage doit continuer à se déposer (ceci peut être le cas avec les colonnes de dimensions importantes), un certain espace mort apparaitra ou bien, il se formera des canaux préférentiels et l'étape 9 doit être répétée. Préparation 12 Préparation dlu noyau de A-30912A A. Désacylation du facteur A de l'antibotiq(ie A-30912 On effectue une fermentation de A. utahensis comme décrit dans la Préparation 1, en utilisant le milieu de culture inclinée A et le milieu de production I et en faisant incuber le milieu de production pendant environ 42 heures. On ajoute au milieu de fermentation une quantité de facteur A de A-30912 (340 g de substrat brut qui contient environ 19,7 g de facteur A de A30912, dissous dans 1,5 1 d'éthanol). On contrôle la désacylation du facteur A de A- 30912 par titrage vis-à-vis de Candida albicans. On laisse la fermentation se poursuivre jusqu'à désacylation complète comme le montre la disparition de l'activité vis-à-vis de C. albicans. B. Séparation du noyau de A-30912A On filtre le bouillon de fermentation entier (100 litres), obtenu comme décrit dans le paragraphe A et contenant le noyau provenant d'environ 20 g de facteur A de A-30912. On rejette le gâteau mycénien. On fait passer le filtrat limpide ainsi obtenu (environ 93 1) sur une colonne contenant 4,5 1 de résine HP (polymère très poreux DIAION, HP-Series, Mitsubishi Chemical Industries Limited, Tokyo, Japon) à un débit de 200 ml/minute. On rejette l'effluent ainsi obtenu. Puis on lave la colonne avec jusqu'à huit volumes (volume de colonne) d'eau désionisée à pli 6,5-7,5 pour enlever le bouillon filtré résiduel. On rejette cette eau de lavage. Puis on, lu- 1-i colonne avec une S;olut ion 7:3 d'eau et de méthanol (85 1) à un débit de 200-300 ml/minute. On contrôle l'élution en utilisant le mode k opératoire suivant: on prélève deux parties aliquotes de chaque fraction éluée. On concentre l'une de ces parties jusqu'à un petit volume et on la traite par un chlorure d'acide comme le chlorure de myristoyle. Ce produit et l'autre partie non traitée sont testes pour déterminer leur adtivité vis-à-vis de Candida albicans. Si la partie aliquote non traitée n'a pas d'activité et que la partie aliquote acylée a une activité, la fraction contient le noyau de A-30912A. On concentre l'éluat contenant le noyau de A-30912A, sous vide jusqu'à un petit volume, et on lyophilise pour obtenir environ 97 g du noyau brut. C. Purification du noyau de A-30912A par chromatographie liquide sur phase inversée On dissout 25 g du noyau de A-30912A brut, obtenu comme décrit dans le paragraphe C, dans 300 ml d'un mélange 96:2:1:1 d'eau, d'acétonitrile, d'acide acétique et de pyridine. On chromatographie cette solution sur une colonne d'acier inoxydable de 4 1 (8 cm x 80 cm) remplie de Lichroprep RP-18, granulométrie 25-40 microns (MC/B Manufacturing Chemists, Inc. E/M, Cincinnati, OH). La colonne fait partie d'une unité Chromatospac Prep 100 (Jobin Yvon, 16-18 rue du Canal,91160 Longjumeau, France). On fait fonctionner la colonne à une pression de 6,2-6,9 bars, donnant un débit d'environ 60 ml/minute, en utilisant le même solvant. On contrôle la séparation à 280 nm en utilisant un appareil de contrôle UV (ISCO Absorption Monitor Model UA-5, Instrumention Specialties Co., 4700 Superior Ave. Lincoln, Nebraska 68504) avec une unité optique (ISCO Type 6). On recueille par minute des fractions ayant un volume d'environ 500 ml. En se basant sur l'absorption à 280 nm, on réunit les fractions contenant le noyau de A-30912A, on les évapore sous vide et on les lyophilise, ce qui donne 2,6 g du noyau. La quantité de solvant nécessaire pour achever ce mode opératoire de séparation chromatographique varie de 7 à 8 1. D. Caractéristi ues du noyau de A-30912A (a) formule brute: C34 H51N7O15. (b) poids moléculaire: 797,83. (c) solide amorphe blanc, soluble dans l'eau, le diméthylformamide, le diméthylsulfoxyde et le méthanol; insoluble dans le chloroforme, le toluène et l'éther diéthylique. (d) Spectre d'absorption infrarouge (pastille de KBr) présente des maximas d'absorption à: 3340 large (011, liaison hydrogène); 2970, 2930 et 2890 (étirement de CII, groupements CH3, CI2, Cil aliphatiques), 1660 et 1625 (plusieurs groupements carbonyle C=O); 1510- 1550; 1430-1.450 (déformation de Cil "wacl"), 1310-1340; 1230- -] 1260; 1080; 835, 650 large et 550 large, cm (e) le titrage électrométricque dans le diméthyl- formamide aqueux à 66 % indique la présence d'un groupement titrable avec un pKa d'environ 7,35 (pH initial 7,32). (f) durée de rétention en chromatocgraphie liquide sous pression élevée (K'): 11,52 minutes dans - les conditions suivantes: Colonne: 4 x 300 mm Garniture: gel de silice/C18 Solvant: mélange 1:2:97 d'acétate d'ammonium, d'acétonitrile et d'eau Débit: 3 ml/minute Pression: 172,5 bars Détecteur: UV à longueur d'onde variable, à 230 nm Sensibilité: 0-0,4 A.U.F.S. Préparation 13 On prépare le noyau de A-30912A et on le purifie par le procédé de la Préparation 12, mais on utilise comme substrat A-30912A tétrahydrogéné. Préparation 14 On prépare le noyau de A-30912A et on le purifie par le procédé de la Préparation 12 mais en utilisant comme substrat l'acul] acine A. Préparation 15 Préparation du noyvau de A-30912B A. Désacylation du facteur B de l'antibiotique A-30912 On effectue une fermentation de A. utahensis comme décrit dans la Préparation 1, en utilisant le milieu de production I. Après incubation de la culture pendant environ 48 heures, on ajoute au milieu de fermentation le facteur B de A-30912 dissous dans une petite quantité de méthanol. On contrôle la désacylation du facteur B de A- 30912 par essai sur disque de papier vis-à-vis de Candida albicans ou de Neurospora crassa. On laisse la fermentation se poursuivre jusqu'à ce que la désacylation soit complète comme le montre la disparition de l'activité. B. Séparation du noyau de A-30912B On filtre le bouillon de fermentation ainsi obtenu comme décrit dans le paragraphe A. On rejette le gâteau mycénien. On fait passer le filtrat limpide ainsi obtenu dans une colonne contenant de la résine IIP-20 (polymère très poreux DIAION, 1iP-Series, Mitsubishi Chemical Vndustries Limited, Tokyo, Japon). On rejette l'effluent ainsi obtenu. Puis on lave la colonne avec jusqu'à huit volumes d'eau désionisée à pH 6, 5-7,5 pour enlever le bouillon filtré résiduel. On rejette cette eau de lavage. Puis on élue la colonne avec une solution 7:3 d'eau et de méthanol. On contrôle l'élution selon le mode opératoire suivant: on prélève deux parties aliquotes de chaque fraction éluée. On concentre l'une des parties aliquotes jusqu'a un petit volume et on la traite avec un chlorure d'acide comme le chlorure de myristoyle. Ce produit et l'autre partie non traitée sont titrés pour déterminer leur activité vis- à-vis de Candida albicans. Si la partie non traitée n'a pas d'activité et que la partie aliquote acylée a une activité, la fraction contient le noyau de A-30912B. On concentre l'éluat contenant le noyau de A-30912B sous.vide jusqu'à un petit volume et on le lyophilise pour obtenir le noyau brut. C. Purifiction du noyau de A-30912B13 par chromatogjraphie liquide dphase inversée Un.IlssotuL le noyau de A-309121 brut, obtenu comme a") décrit dains; l e pairaqraphe C, dans un lbIani! fait partie d'une unité Chromatospac Prep 100 (Jobin Yvon, 16- 18 rue du Canal, Loncgjumeau, France). On fait fonctionner la colonne à une pression de 6,2-6,9 bars, donnant un débit d'environ f6lu ml par minute, en utilisant le nméime solvant. On contrôle la séparation à 280 nm en utilisant un appareil de contrôle UV (ISCO Absorption Monitor Model UA-5, Instrumentation Specialties Co., 4700 Superior Ave., Lincoln, Nebraska 68504) avec une unité optique (IS.(o Type 6). En se basant sur l'absorption à 280 nm, on réunit les fractions contenant le noyau de A-30912B, on les évapore sous vide et on les lyophilise pour obtenir le noyau de A-30912B purifié. Préparation]6 On prépare le noyau de A-30912B et on le purifie par le procédé de la Préparation 15, mais on utilise comme substrat A-30912B tétrahydrogéné. Préparation 17 Préparation dunoyau de A-30912D A. Désacylation du facteur D de A-30912 On effectue une fermentation de A. utahensis comme décrit dans la Préparation 1, en utilisant le milieu de production I. Après avoir fait incuber la culture pendant environ 48 heures, on ajoute au milieu de fermentation le facteur D de A-30912 dissous dans une petite quantité de méthanol. On contrôle la désacylation du facteur D de A-30912 par essai sur disque de papier vis-à-vis de Candida albicans ou de Neurospora crassa. On laisse la fermentation se poursuivre jusqu'à ce que la désacylation soit complète comme le montre la disparition de l'activité. B. 'Spratioi du noyau de A-30912D On filtre le bouillon de fermentation entier obtenu comme cdécrit tilis le paralraphe A. On re j.,t.e le q. 1iteau mycélien. On fait passer le filtrat limpide ainsi obtenu sur une colonne contenant de la résine IIP-20 (polymère très k poreux DIAION, iPSeries, Mitsubishi Chemical Industries Limited, Tokyo, Japon). On rejette l'effluent ainsi obtenu. Puis on lave la colonne avec jusqu'à huit volumes d'eau désionisée à pli 6,5-7,5 pour enLever le bouillon filtré résiduel. On rejette cette eau de lavage. Puis on élue la colonne avec une solution 7:3 d'eau et de méthanol. On contrôle l'élution en utilisant le mode opératoire suivant: on prélève deux parties aliquotes de chaque fraction éluée. On concentre l'une des parties aliquotes jusqu'à un petit volume et on la traite par un chlorure d'acide comme le chlorure de myristoyle. On titre ce produit et l'autre partie non traitée pour déterminer leur activité vis-à-vis de Candida albicans. Si la partie non traitée n'a pas d'activité et que la partie aliquote acylée a une activité, la fraction contient le noyau de A-30912D. L'éluat contenant le noyau de A-30912D est concentré sous vide jusqu'à un petit volume et lyophilisé pour obtenir le noyau brut. C. Purification du noyau de A-30912D par chromatographie liquide en phase inversée On dissout dans un mélange 96:2:1:1 d'eau, d'acétonitrile, d'acide acétique et de pyridine le noyau de A-30912D brut obtenu comme décrit dans le paragraphe C. On chromatographie cette solution sur une colonne garnie de Lichroprep RP-18, granulométrie 25-40 microns (MC/B Manufacturing Chemists, Inc. E/M, Cincinnati, 011). La colonne fait partie d'une unité Chromatospac Prep 100 (Jobin Yvon, 16-18 rue du Canal, 91160 Longjumeau, France). On fait fonctionner la colonne à une pression de 6,2-6,9 bars, ce qui donne un débit d'environ 60 ml/minute, en utilisant le même solvant. On contrôle la séparation à 280 nm en utilisant un appareil de contrôle UV (ISCO Absorption Monitor Model UA-5, Instrumentation Specialties Co., 4700 Superior Ave., Lincoln, Nebraska 68504) avec une unité optique (ISCO Type 6). IEn se basant sur l'absorption à 280 nm, on combine les fracltions; contenant le noyau de A-309121), on les évapore sous vide et on les] yophilise pour obtlelnir l e noyau de A-30912D pirifié. Préparation 18 on prépare le noyau de A-3.)912! c et on le purifie par le procédé de la Préparation 17, mais on utilise comame substrat A-30912D tétrahydrogéné. Préparation 19 Préparation (lu noyau de A-3091211 A: Désacy-lation du facteur Il de l'anti'biotique A-30912 On effectue une fermentation 1e A. utahensis comme décrit dans la Préparation 1, en utilisant le milieu de production [. Après avoir fait incuber la culture pendant environ 48 heures, on ajoute au milieu de fermentation le facteur 11 de A-30912 dissous dans une petite quantité de méthanol. On contrôle la désacylation du facteur Il de A-30912 par une analyse sur disque de papier vis-à-vis de Candida al1_icans ou Neurospora crassa. On laisse la fermentation se poursuivre jusqu'à ce que la désacylation soit complète commne le montre la disparition de l'activité. B. SéparaLion du noyau de A-3091211 On filtre le bouillon de fermentation entier obtenu comme décrit dans le paragraphe A. On rejette le gâteau mycénien. On fait passer le filtrat limpide ainsi obtenu dans une colonne contenant de la résine HP-20 (polymère très poreux DIAION, IIP-Series, Mitsubishi Chemical Industries Limited, Tokyo, Japon). On rejette l'effluent ainsi obtenu. Puis on lave la colonne avec jusqu'à huit volumes d'eau désionisée à pli 6,5-7,5 pour enlever le bouillon filtré résiduel. On rejette cette eau de lavage. Puis on élue la colonne avec une solution 7:3 d'eau et de méthanol. On contrôle l'élution en utilisant le mode opératoire suivant: on prélève deux parties aliquotes de chaque fraction éluée. On concentre l'une des parties aliquotes jusqu'à un petit volume et on la traite avec un chlorure d'acide comme le chlorure de myristoyle. On détermine l'activité de ce produit et de l'autre partie aliquote non traitée vis-à-vis de Candida albicans. Si la partie aliquote non traitée n'a pas d'activité et que la partie aliquote acylée a une activité, la fraction contient le noyau de A-3091211. On concentre l'éluat contenant le noyau de A-3091211 sous vide jusqu'à un petit volume et on le lyophilise pour obtenir le noyau brut. C. Purification du noyau de A- 30912H par chromatographie liquide en phase inversée On dissout le noyau de A-30912I1 brut, obtenu comme décrit dans le paragraphe C, dans un mélange 96:2:1:1 d'eau, d'acétonitrile, d'acide acétique et de pyridine. On chromatoqraphie cette solution sur une colonne garnie de Lichroprep RP18, granulométrie 25-40 microns (MC/B Manufacturing Chemists, Inc. E/M, Cincinnati, 011). La colonne fait partie d'une unité Chromatospac Prep 100 (Jobin Yvon, 16-18 rue du Canal 91160 Longjumeau, France). On fait fonctionner la colonne à une pression de 6,2-6,9 bars, donnant un débit d'environ 60 ml/minute, en utilisant le même solvant. On contrôle la séparation à 280 nm en utilisant un appareil de contrôle UV (ISCO Absorption Monitor Model UA-5, Instrumentation Specialties Co., 4700 Superior Ave., Lincoln, Nebraska 68504) équipé d'une unité optique (ISCO Type 6). Préparation 20 On prépare le noyau de A-3091211 et on le purifie par le procédé de la Préparation 19 mais on utilise comme * substrat A-3091211 tétrahydrogéné. Préparation 21 Préparation du noyau S31794/F-1 A. Désacylation de l'antibiotique S31794/F-1 On effectue une fermentation de A. utahensis comme décrit dans la Préparation 1, en utilisant le milieu de production I. Après avoir fait incuber la culture pendant environ 48 heures, on ajoute au milieu de fermentation l'antibiotique S31794/F-1 dissous dans une petite quantité de méthanol. On contrôle la désacylation de S31794/F-1 par analyse avec disque de papier vis-à-vis de Candida albicans. On laisse la fermentation se poursuivre jusqu'à ce que la désacylation suit complète comme le montre la disparition Instrumnientiat ion Specialties Co., 4700 SuA:riol- Ave., Lincoln,.Ncbr:;ka 68504) équipé d'une uniL, optique (ISCO Type 6). En se basant sur l'absorption à 280 nm, on réunit les fractions contenant le noyau de S31794'.F-1, on les évapore sous vide et on les lyophilise pour obtenir le noyau de S31794/F-1 purifié. Préparation 22 Préparation dle A-3(0912A tétrahydroc6né On dissout le facteur A de A-30912 dans l'éthanol. On réduit lPtO2 dans l'éthanol absolu pour former Pt que l'on utilise à son tour pour réduire par voie catalytique le facteur A de A-30912, par hydrogénation sous pression positive jusqu'à ce que la réaction soit termiinée (environ 2 à 3 heures). On filtre le mélange réactionnel et on le concentre sous vide. On dissout le résidu dans une petite quantité de t-butanol et on le lyophilise pour obtenir A-30912A tétrahydrogéné. Préparation 23 Préparation de A-30912B tétrahydrogéné On dissout dans l'éthanol le facteur B de A-30912. On réduit PtO2 dans de l'éthanol absolu pour former du platine que l.'on utilise à son tour pour réduire par voie catalyticlue le facteur B de A30912 par hydrogenation sous pression p,:itive jusqu'à ce que la réaction soit terminée (environ 2 à 3 heures). On filtre le mélange réactionnel et on le concentre sous vide. On dissout le résidu dans une petite quantité de t-butanol et on le lyophilise pour obtenir A-30912B tétrahydrogéné. Préparation 24 Préparation de A-30912D tétrahydroqgné o)n dissout dans de l'éthanol le facteur D de A-30912. On réduit PtO2 dans l'éthanol absolu pour former Pt que l'on utilise à son tour pour réduire par voie catalytique le facteur D de A-30912, par hydroqénation sous pression positive jusqu'à ce que la réaction soit terminée (environ 2 à 3 heures). On filtre le mélanej réactionnel et de l'activité. B. Séparation du noyau de S31794/1-] On filtre le bouillon de fermentation entier obtenu comme décrit dans le paragraphe A. On rejette le gâteau mycénien, on fait passer le filtrat limpide ainsi obtenu dans une colonne contenant de la résine I{P-20 (polymère très poreux DIAION, HIP-Series, Mitsubishi Chemical Industries Limited, Tlokyo, Japon). On rejette l'effluent ainsi obtenu. On lave ensuite la colonne avec jusqu'à huit volumes d'eau désionisée à pli 6,5-7,5 pour chasser le bouillon filtré résiduel. On rejette cette eaude lavage. Puis on élue la colonne avec une solution 7:3 d'eau et de méthanol. On contrôle l'élution en utilisant le mode opératoire suivant: on prélève deux parties aliquotes à partir de chaque fraction éluée. On concentre l'une des parties aliquotes jusqu'à un petit volume et on la traite par un chlorure d'acide comme le chlorure de myristoyle. On titre ce produit et l'autre partie aliquote non traitée pour déterminer leur activité vis-à-vis de Candida albicans. Si la partie aliquote non traitée n'a pas d'activité et que la partie aliquote acylée a une activité, la fraction contient le noyau de S31794/F-1. On concentre l'éluat contenant le noyau de S31794/F-1, sous vide jusqu'à un petit volume, et on le lyophilise pour obtenir le noyau brut. C. Purification du noyau de S31794/F-1 par chromatographie liquide en phase inversée On dissout dans un mélange 96:2:1:1 d'eau, d'acétonitrile, d'acide acétique et de pyridine le noyau de S31794/F-1 brut obtenu comme décrit dans le paragraphe B. On chromatographie cette solution sur une colonne garnie de Lichroprep RP-18, granulométrie 25-40 microns (MC/B Manufacturinq Chemists, Inc. E/M, Cincinnati, O1l). La colonne fait partie d'une unité Chromatospac Prep 100 (Jobin Yvon, 16-18 rue du Canal 91160 Longjumeau, France). On fait fonctionner la colonne à une pression de 6,2-6,9 bars, donnant un débit d'environ 60 ml/minute, en utilisant le même solvant. On contrôle la séparation à 280 nm en utilisant un appareil de conltLrle UV (I1.;CO AbsorpLion Monitor Modo] UA-5, on le concentre sous vide. On dissout le résidu dans une petite qu;antité de t-butanol et on] lu l]op!. llis; pour obtenir A-30912D tCtrahydrogéné. Préparation 25 Préparation de A-3091211 tétrahydroqéné Un dissout le facteur Il de A-312 dans de l'éthanol. on réduit PtO2 dans l'éthanol absolu pour former Pt que l'on utilise à son tour pour réduire par voie catalytique le facteur il de A-30912, par hydrocédnation sous pression positive jusqu'à ce que la réaction soit terminée (environ 2 t 3 heures). On filtre le m-lan',e réactionnel et on le concentre sous vide. On dissout le résidu dans une petite quantité de t-butanol et on le lyophilise pour obtenir A-3091211 tétrahydrogéné. EXEMPLES On effectue la préparation de divers dérivés à groupements alcanoyle et alcénoyle par acylation du noyau approprié, soit par la réaction modifiée de Schotten-Bauman en utilisant un chlorure d'acide comme agent d'acylation (Procédé A) soit par le procédé aux esters actifs utilisant l'ester 2,4,5-trichlorophénylique comme agent d'acylation (Procédé B). Les modes opératoires généraux de mise en oeuvre des réactions d'acylation par le Procédé A ou le Procédé B sont indiqués ci-dessous: Procédé A (Réaction modifiée de Schotten-Bauman). Ce procédé comprend la réaction du noyau approprié avec le chlorure d'acide alcanolque ou alcénoique qui correspond à la chaîne latérale acyle désirée. On dissout le noyau dans un mélange de tampon KHPO4 0,1 M, pH 7,5 (5 à 10 ml) et d'acétone ou de méthanol (5 à 10 ml). A la solution du noyau, refroidie par un bain de glace ou à la température ambiante, on ajoute lentement (en plus d'environ 30 minutes) une solution du chlorure d'acide alcanolque ou alcénoique dans l'acétone (2 à 20 ml). Si on le désire, on peut ajuster le pH du mélange réactionnel à 7,5-8,0 après chaque addition du chlorure d'acide; cependant, cette étape n'est pas essentielle. On agite le mélange réactionnel à la température du bain de glace ou à la température ambiante pendant 1,5 à 3,0 heures. Pendant que la réaction se fait, il se forme un précipité qui est composé principalement de l'acide alcanoique ou alcénoique libre. A la fin de la période de réaction, on centrifuge le mélange réactionnel pour enlever le précipité. Le précipité recueilli et la liqueur surnageante sont ensuite traités selon'l'un des modes opératoires de purification suivants. Mode opératoire (a) On lave le précipité une, deux ou trois fois avec 2 à 3 volumes de méthanol ou d'un mélange 1:1 de méthanol et d'eau. On centrifuge les produits de lavage au méthanol ou au méthanol-eau et on réunit les liqueurs surnageantes méthanoliques avec la liqueur surnageante obtenue après la centrifugation initiale du mélange réactionnel. Puis on concentre sous vide les liqueurs surnageantes réunies pour chasser le solvant organique. On combine ensuite le concentré aqueux avec un volume égal de méthanol et on extrait la solution résultante successivement avec du chloroforme et de l'acétate d'éthyle comme décrit ci-dessus dans le Procédé (a). Mode opératoire (b) On rejette immédiatement le précipité et on extrait la liqueur surnageante à pHl 5,0-7,0 une ou deux fois avec de l'éther diéthylique (à volume égal) pour enlever l'acide alcanoique ou alcénoique n'ayant pas réagi. On rejette l'extrait d'éther diéthylique. On concentre la liqueur surnageante extraite sous vide pour chasser le solvant organique. Puis on combine le concentré aqueux avec un volume égal de méthanol et on extrait la solution résultante successivement avec du chloroforme et de l'acétate d'éthyle comme décrit précédemment dans le Procédé (a). Après l'étape d'extraction par du chloroforme suivie par de l'acétate d'éthyle dans le mode opératoire (a) ou (b) précédent, toutes les phases d'extrait de solvant sont réunies et concentrées à siccité pour obtenir le dérivé à groupement alcanoyle ou alcénoyle brut du noyau de A-30912A. On purifie le dérivé brut par CLPE à phase inversée comme suit: l'échantillon, dissous dans 5 à 6 ml de méthanol, est injecté dans une colonne en acier inoxydable de 1,6 cm x 81 cm garnie de résine LP-1/C18 (voir Préparation ) et on élue la colonne avec un système solvant comprenant de l'eau, du méthanol et de l'acétonitrile. On effectue l'élution-à une pression de 69-103,5 bars avec un débit de à 12 ml par heure en utilisant une pompe duplex LD-C (Milton-Roy). On contrôle l'effluent avec un détecteur ISCO- UA-5 à 280 nm. On réunit les fractions contenant le produit désiré et on les concentre à siccité sous vide pour obtenir le dérivé alcanoylé ou alcénoylé purifié du noyau correspondant. Le produit purifié est analysé par chromatographie sur couche mince (CCM) en utilisant des plaques C18 à phase inversée (Whatman KC18) et un système solvant consistant en un mélange 1:2:2 d'eau, de méthanol et d'acétonitrile. Apres développement, on observe les plaques sous lumière UV pour détecter le produit. Les produits sont également analysés par spectrométrie de masse à désorption de champ. Procédé B (Procédé par l'ester actif) On agite à la température ambiante pendant 6 à 18 heures une solution du noyau approprié et de l'alcanoate ou alcénoate de 2,4,5-trichlorophényle approprié dans le diméthylformamide (DMF) (10-20 ml). On concentre le mélange réactionnel sous vide à siccité pour obtenir le dérivé alcanoylé ou alcénoylé brut du noyau correspondant. On purifie le produit brut par CLPE à phase inversée comme décrit ci-dessus dans le procédé A. Le produit purifié est également analysé par les procédés utilisés dans le Procédé A. EXEMPLES 1-16 La préparation de divers dérivés alcanoylés et alcénoylés, obtenue par acylation du noyau de A-30912A, représentatif des composés de formule III, est donnée dans le Tableau I ci-dessous. Les dérivés du Tableau I sont préparés soit par la réaction modifiée de Schotten-Bauman utilisant un chlorure d'acide comme agent d'acylation (Procédé A) soit par le procédé aux esters actifs utilisant l'ester 2,4,5-trichlorophénylique comme agent d'acylation (Procédé B) décrits ci-dessus. rt-_ VZ160E-V 1 ú O0 LE 'O isz TII P801 Sú 0 L91 -- Eú '0 99Z úú01 ZS 1O 801 úú0I OS àO bLZ ú66 Z9 ' O L 6L6 zL O 98 Z: '[: Z EZ::Z NDEHD:HO EHD:OZH (A:A:A) d'ID ap 4Uunls q 91 q Z ELZ 0 0 1 ', 00ú OSGZ 4 81 09Z 00ú qt 81 O9Z 00E q 5 I 0001 00ú L 81 00ú 0VE qt 81 09T 051Osi LT 8T OL 051 *:eal (TD") spTocI (Du) spFoc ap ' I;se neAol eaanG quabv (a-.ns) I nvaTqeJ a1 _L (ZHD) HD=HD _L (ZHD) CHD-sUma - (zHD) HD=HD (S) (p) -L (ZHO) úHH-ST. El p (ZH:)) HD=H _01 (ZHD) úHD-S-. ST (ZHD) úHD V _'L (ZHD) HD)=HD (B)j (o;))_-S ( ZH) H-'; 5s -/'_ (griD} HD=-H; _S ( HD) úHD-STUq _11 (ZHD) úHD _01 (ZHiD) HD À * I2Se, p S N pppooDoc r-. C%I c'3 Ln *1' N aidluraxg 6801 ZZ 0 19Z 4 91 V6Z 6 (ZHD) HD;=HD _L (ZHD) úH1D-STo 1601 ú1J0 LLOI LT 0 v8 4 G9T 0001". 00E v q 91 (j) (a) 00ú _81 (ZHD) EHD _Li (ZHD) úH SL'9 0or q '91 0001 OIZ V L ( HO) HD=HzDHO () (D) -HZ=HD ZHHD=HDZ H -úHD-o @ STDo STD q 9T 6S01 It 0 O 1 8c 0 4 9 ELZ 00E 00ú El - L (ZH3) HD=H -ZHDHD=H3D (ZHD) - HC-SuV ' sue a _6 (Z H))H:) - -5 (ZH3) tHD-ST3 NDeHD: HO HD: OgH (A: A: A) adlD ap quenTa (6w) spTod uaoe qua.6v (6u) sp.Tod 'IADep neXoN pppooad (a; 4ns) I nwqTel r- o' N O r Cr% -4-I clu (9) 8S0 E ui 00E 1'1 El ZI (clq).+ (e);-J (6Lu) sptOd qTnpOId *I1 0t oN aîdumax Tableau I (suite) Agent Dr( Eluant de CLPE Exemple5 Procédé Noyau acyl. du (v:v:v) Produit Exeiple?5 H O2CH OH:CH CN Poids (mg) Rf(a)M+ -- R d'acyl. (poids (mg) Poids (mg) ry.cPt.2 3 3M( (d) (f) 15. CTI3(CH2)20- A 300 X1000 1.5 h 1:4:6 55 0,00 1119 16. cis-CH3 (CH2) - CH=CHI(CI2)11-B 228 300 16 h 1:2:7 228 012 117 (a) Rf par CCM sur phase inversée sur des plaques Whatman KC18, indicateur fluorescent, L système solvant 1:2:2 d'eau, de méthanol et d'acétonitrile. U (b) M+ obtenu par spectre de masse à désorption de champ. Le composé "absorbe" Na+ qui est déterminé par l'ion masse parent. Les résultats sont donnés pour M+ + Na+. (c) A 4-10 C; dans tampon/acétone. (d) A la température ambiante; dans tampon/acétone. (e) A la température ambiante; dans tampon/méthanol. (f) Procédé de purification a. (g) Procédé de purification b. (h) Erroné d'une unité de mniasse. r'. -'J Do EXEMPLE 17 Dérivé n-tridécanoylé du noyau de A-30912A Le mode opératoire suivant illustre la préparation à plus grande échelle des composés de formule III par le procédé aux esters actifs. Le composé particulier préparé par le mode opératoire donné ci-dessous est le composé de formule III o R est CH3(CH2)11-. A. Préparation du n-tridécanoate de 2,4,5-trichlorophényle. On agite à la température ambiante pendant 16 heures une solution de 12,5 g d'acide n-tridécanoique (Sigma Chemical Co.), de 11,5 g de 2,4,5trichlorophénol et de 12,0 g de N,N-dicyclohexylcarbodiimide dans 650 ml de chlorure de méthylène. Puis on filtre le mélange réactionnel et on le sèche sous vide pour obtenir le n-tridécanoate de 2,4,5-trichlorophényle (22 g). On purifie le matériau par chromatographie sur colonne de gel de silice (Woelm) en utilisant du toluène comme éluant. On contrôle les fractions par CCM en utilisant une lumière UV à courte longueur d'onde pour la détection. On réunit les fractions contenant le produit désiré et on les concentre sous vide à siccité. B. Acylation du noyau de A-30912A par le n-tridécanoate de 2,4,5trichlorophényle On agite à la température ambiante pendant 16 heures une solution de 6,0 g de n-tridécanoate de 2,4,5- trichlorophényle et de 4,5 g du noyau de A-30912A dans 600 ml de diméthylformamide (DMF). L'élimination du solvant sous vide fournit un résidu (12 g). On délaie le résidu avec 500 ml de chlorure de méthylène pendant 45 minutes puis on filtre le mélange. On rejette le filtrat. On extrait les solides restants avec 500 ml de méthanol et on filtre l'extrait méthanolique et on le concentre sous vide pour obtenir un produit brut (5,0 g). On purifie le produit brut par CLPE à phase inversée comme suit: On injecte un échantillon du produit brut (1 g) dissous dans 5 ml de méthanol, dans une colonne en acier inoxydable de 2,5 x 81 cm garnie de résine LP-1/C18 (voir la Préparation 10). On élue la colonne avec un système solvant comprenant un mélange 3:3:4 d'eau, de méthanol et d'acétonitrile. On effectue l'élution à une pression de 69-103,5 bars avec un débit de 11-12 ml par minute en utilisant une pompe duplex LDC (Milton-Roy). On contrôle l'effluent avec un détecteur ultra-violet (ISCOUA-5) à 280 nm. On réunit les fractions contenant le produit désiré et on les sèche sous vide. On obtient 550 mg de produit. On répète la chromatographie décrite précédemment quatre fois avec des échantillons de 1 g de produit brut pour obtenir d'autres échantillons purifiés comme suit: 620 mg, 520 mg, 670 mg et 490 mg. Poids total de produit du titre purifié: 2,8 g. Selon les modes opératoires précédents, on fait réagir 4, 0 g du noyau de A-30912A avec le n-tridécanoate de 2,4,5-trichlorophényle pour obtenir 2,6 g du produit cité en titre purifié. On réunit les matériaux des deux préparations (5,4 g). Ion masse par spectrométrie de masse à désorption de champ: (M + Na+): 1016 (Théorique: M + Na = 1016). Une CLPE analytique (C18 Micro Bondapak, Waters Co.) avec comme système éluant un mélange 2:1:2 d'eau, de méthanol et d'acétonitrile, ne présente qu'un pic. EXEMPLE 18 Dérivé n-tridécanoylé du noyau de A-30912B On agite à la température ambiante pendant 16 heures une solution du n-tridécanoate de 2,4,5-trichloro- phényle (préparé comme dans l'Exemple 17, Etape A) (3,3 mmoles) et d'une mole du noyau'de A-30912B (voir les Préparations 15 et 16) dans 200 ml de DMF. L'élimination du solvant sous vide fournit un résidu. On délaie le résidu avec 300 ml de chlorure de méthylène pendant 45 minutes et on filtre le mélange. On rejette le filtrat, on extrait les solides résultants avec 300 ml de méthanol et on filtre l'extrait méthanolique qu'on concentre sous vide pour obtenir un produit brut. - On purifie le produit brut par CLPE à phase inversée comme suit. On injecte un échantillon du produit brut (1 g), dissous dans 5 ml de méthanol, dans une colonne en acier inoxydable de 2,5 x 81 cm garnie de résine LP-I/C18 (voir la Préparation 11). On élue la colonne avec un système solvant comprenant un mélange 3:3:4 d'eau, de méthanol et d'acétonitrile. On effectue l'élution à une pression de 69- 103,5 bars avec un débit de 11-12 ml/minute en utilisant une pompe duplex LDC (Milton-Roy). On contrôle l'effluent par un détecteur ultra-violet (ISCO-UA 5) à 280 nm. On recueille les fractions toutes les deux minutes (21-24 ml). On réunit les fractions contenant le produit désiré et on les sèche sous vide pour obtenir le produit cité en titre. On analyse le produit purifié par chromatographie sur couche mince en utilisant des plaques C18 à phase inversée (Whatman KC18) et un système solvant consistant en un mélange 1:2:2 volume/volume d'eau, de méthanol et d'acétonitrile. Apres développement, on observe les plaques sous la lumière UV pour détecter le produit. EXEMPLE 19 En utilisant le procédé de l'Exemple 18 mais en utilisant l'acide alcanoique ou alcénolque approprié dans l'Etape A et l'ester 2,4,5trichlorophénylique d'acide alcanoique ou alcénoique approprié dans l'Etape B, on obtient les dérivés du noyau de A-30912B indiqué cidessous: Dérivés alcanoylés et alcénoylés du noyau de A-30912B A ZO 6 Z Z à R5 CH3 (CH2)10- CH3 (CH2)12- CH3 (CH2)13- CH3 (CH2) 14- CH3 (CH2)15- CH3 (CH2)17- CH3 (CH2)18- CH3 (CH2) 19- Cii3(CH2) CH3 (CH2) 20 cis-CH3 (CH2) 5CH=CH(CH2)7- trans-CH3 (CH2)5-CH=CH (CH2)7 - cis-CH3(CH2)10CH=CH(CH2) 4 trans-CH3 (CH2) 10CH=CH(CH2)4 *cis-CH3 (CH2) 7CH=CH(CH2)7- trans-CH3 (CH2) 7CH=CH(CH2)7- cis-CH3 (CH2) 5CH=CH(CH2)9- trans-CH3 (CH2) 5CH=CH(CH2) 9 cis-CH3 (CH2) 7CH=CH(CH2) 9- trans-CH3 (CH2) 7CH=CH(CH2)9- cis-CH3 (CH2) 7CH=CH(CH2) 11- trans-CH3 (CH2) 7CH=CH (CH2)11- trans,trans-CH3 (CH2) 4CH=CHCH2CH=CH(CH2)7- cisciscis-CH3CH2CH=CHCH2CH=C CH=CHH=CH(CH2)7- a EXEMPLE 20 Dérivé n-tridécanoylé du noyau de A-30912D On agite à la température ambiante pendant 16 heures une solution de 3,3 mmoles de n-tridécanoate de 2,4,5-trichlorophényle (préparé comme dans l'Exemple 17, Etape A) et de 1 mmole du noyau de A-30912D (voir Préparations 17 et 18) dans 200 ml de DMF. L'élimination du solvant sous vide donne un résidu. On délaie le résidu avec 300 ml de chlorure de méthylène pendant 45 minutes et on filtre le mélange. On rejette le filtrat. On extrait les solides résultants avec 300 ml de méthanol et on filtre l'extrait'méthanolique qu'on concentre sous vide pour obtenir un produit brut. On purifie le produit brut par CLPE à phase inversée comme décrit dans l'Exemple 18. EXEMPLE 21 En utilisant le procédé de l'Exemple 20 mais en utilisant l'acide alcanoique ou l'acide alcénoique approprié dans l'Etape A et l'ester 2,4, 5-trichlorophénylique de l'acide alcanoique ou alcénoique approprié dans l'Etape B, on obtient les dérivés du noyau de A-30912D indiqué cidessous: Dérivés alcanoylés et alcénoylés du noyau de A-30912D H H 0 Ho.HHO.-, e NsX H- HOu H. *0/= H/OH I " * \__ H '/ 'OH H sd-0-N S-H 0 H IlDNeH I H.:N \OH _ T VI R5 CH3 (CH2) 10- CH3 (CH2)12 CH3 (CH2) 13- CH3 (CH2) 14 CH3 (CH2)15 CH3 (CH2)17 CH3 (CH2)18 CH3(CH2)19- CH3 (CH2)20 cis-CH3 (CH2) 5CH=CH(CH2)7- trans-CH3 (CH2) 5-CH=CH(CH2) 7- cis-CH3 (CH2) 10CH=CH(CH2)4 trans-CH3 (CH2) 10CH=cH(CH2) 4 cis-CH3(CH2)7CH=CH(CH2)7- trans-CH3 (CH2) 7CH=CH (CH2) 7 cis-CH3 (CH2) 5CH=CH(CH2)9- trans-CH3 (CH2) 5CH=CH(CH2)9- cis-CH3 (CH2) 7CH=CH(CH2)9- trans-CH3 (CH2) 7CH=CH(CH2)9- cis-CH3 (CH2) 7CH=CH(CH2) 11- trans-CH3 (CH2) 7CH=CH(CH2) 1l- trans,trans-CH3 (CH2) 4CH=CHCH2CH=CH(CH2)7- cis,cis,cis-CHCH3HCHCH2CHCHCH2CH=CHCH2CH=CH(CH2)7- EXEMPLE 22 Dérivé n-tridécanoylé du noyau de A-30912H On agite à la température ambiante pendant 16 heures une solution de 31,3 mmoles de n-tridécanoate de 2,4,5-trichlorophényle (préparé comme dans l'Exemple 17, Etape A) et de 1 mmole du noyau de A-30912H (voir les Préparations 19-20) dans 200 ml de diméthylformamide. L'élimination du solvant sous vide donne un résidu. On délaie le résidu avec 300 ml de chlorure de méthylène pendant 45 minutes puis on filtre le mélange. On rejette le filtrat. On extrait les solides résultants avec 300 ml de méthanol et on filtre l'extrait méthanolique qu'on concentre sous vide pour obtenir un produit brut. Le produit brut est purifié par CLPE en phase inversée comme décrit dans l'Exemple 18. EXEMPLE 23 En utilisant le procédé de l'Exemple 22 mais en utilisant l'acide alcanoique ou alcénoique approprié dans l'Etape A et l'ester 2,4,5trichlorophénylique d'acide alcanoique ou alcénoique approprié dans l'Etape B, on obtient les dérivés du noyau de A-30912H indiqué cidessous: Dérivés alcanoylés et alcénoylés du noyau de A-30912H CH3 HO CH30,OH 3H ! X /--- OH H O v H I H--N-C-Rs HN *=' H * *m-. 0=0- H. CI -H // - Ho @ H H-S CH3 H _\ H3C- H -H, H--//x- \ /-H CH\ H O*OH H, ? e VII O R5 CH3 (CH2)10- CH3 (CH2)12- CH3 (CH2)13- CH3 (CH2)14 CH3 (CH2)15- CH3 (CH2)17- CH3 (CH2)18- CH3 (CH2)19- CH3(CH2)20- cis-CH3 (CH2) 5CH=CH(CH2)7- trans-CH3 (CH2)5-CH=CH(CH2)7- *cis-CH3 (CH2) 10CH=CH(CH2) 4 trans-CH3 (CH2)10CH=CH(CH2)4- cis-CH3 (CH2) 7CH=CH(CH2) 7- trans-CH3 (CH2) 7CH=CH (CH2)7- cis-CH3 (CH2) 5CH=CH(CH2)9- trans-CH3 (CH2) 5CH=CH(CH2)9- cis-CH3 (CH2) 7CH=CH(CH2)9- trans-CH3 (CH2) 7CH-CH(CH2) 9- cis-CH3 (CH2) 7CH=CH(CH2)11- trans-CH3 (CH2) 7CH=CH(CH2) 1- trans,trans-CH3 (CH2) 4CH=CHCH2CH=CH(CH2)7- cis,cis,cis-CH3CH2CH=CHCH2CH=CHCH2CH=CH(CH2) 7- EXEMPLE 24 Le mode opératoire suivant illustre la préparation du dérivé N-ntridécanoylé du noyau de A-30912H à partir du noyau de A-30912A. On traite le noyau de A-30912A par le n-tridécanoate de 2,4,5trichlorophényle selon le mode opératoire de l'Exemple 17. On méthyle le dérivé ainsi- obtenu en traitant un échantillon (20 mg) par 0,06 ml de 3 % d'HCl dans du méthanol dans le diméthylformamide. On laisse la solution reposer sous agitation pendant 16 heures, après quoi on chasse le solvant sous pression réduite et on obtient un résidu. On purifie le résidu par CLPE à phase inversée en utilisant une résine de gel de silice/C18. EXEMPLE 25 Dérivé n-tridécanoylé du noyau de S31794/F-1 On agite à la température ambiante pendant 16 heures une solution de 3,3 mmoles de n-tridécanoate de 2,4,5- trichlorophényle (préparé comme dans l'Exemple 17, Etape A) et de 1 mmole de noyau de S31794/F-1 (voir la Préparation 21) dans 200 ml de DMF. L'élimination du solvant sous vide laisse un résidu. On délaie le résidu avec 300 ml de chlorure de méthylène pendant 45 minutes et on filtre le mélange. On rejette le filtrat. On extrait les solides restants avec 300 ml de méthanol et on filtre l'extrait méthanolique et on le concentre sous vide pour obtenir un produit brut. Le produit brut est purifié par CLPE à phase inversée comme décrit dans l'Exemple 18. EXEMPLE 26 En utilisant le procédé de l'Exemple 25 mais en substituant l'acide alcanoique ou alcénoique approprié dans l'Etape A et l'ester 2,4,5trichlorophénylique de l'acide alcanoique ou alcénoique approprié dans l'Etape B, on obtient les dérivés du noyau de S31794/F-1 indiqué cidessous: IIIA T HO NO' À e--- HÀ NOH HO, H..0 I -- gHÈ XN--H 9 bH 0=*/ / \ s 8-n-2\ --4 H XZ O D-ONZH g/ ?9- --H oH Il I *. /\ ' "i OH _ HO OH, OH. l-J/t6LTEs aP neAOU np s91AouDile qa SGI OUPDOe SaATIaG iQZ6ZLZ R5 CH3 (CH2)10- CH3(CH2)13- CH3(CH2)14- CH3 (CH2) 15- CH3 (CH2) 16- CH3 (C2)17 CH3 (CH2) 18- CH3 (CH2)19 CH3(CH2) 20- cls-CH3 (CH2) 5CH=CH (CH2) 7 trans-CH3 (CH2) 5-CH=CH (CH2)- clS-CH3(CH2) 10CH=CH(CH2) 4- trans-CH3 (CH2) 10CH=CH(CH2) 4- cis-CH3 (CH2) 7CH=CH(CH2) 7- trans-CH3 (CH2) 7CH=CH (CH2) 7- cis-CH3 (CH2)75CH=CH(CH2) 9- trans-CH3 (CH2) 5CH=CH(CH2) 9- cls-CH3 (CH2)7CH=CH (CH2) 9- trans-CH3 (CH2) 7CH=CH(CH2)9- cis-CH3(CH2) 7CH=CH(CH2) l- trans-CH3 (CH2) 7CH=CH(CH2) ll- trans, trans-CH3 (CH2) 4CH=CHCH2CH=CH(CH2)7 cis,cis-CH3 (CH2) 4CH=CHCH2CH=CH(CH2)7- cis,cis,cis-CH3CH2CH=CHCH2CH=CHCH2CH=CH(CH2)7- EXEMPLE 27 L'activité antifongique des composés de formule III peut être démontrée et étudiée in vitro dans des essais de diffusion sur disque et de dilution sur gélose classiques ou dans des essais classiques in vivo chez des souris qui montrent l'efficacité vis-à-vis d'une infection fongique systémique. Les résultats des essais antifongiques pour des composés représentatifs de formule IV (Exemples 1 à 16) sont donnés dans les Tableaux II, III, IV et V. Les Tableaux II et III donnent les résultats de l'essai in vitro des composés des Exemples 1 à 16 par des méthodes de diffusion sur disque sur plaque de gélose. Dans le Tableau II, l'activité est mesurée par la dimension (diamètre en mm) de la zone d'inhibition du micro-organisme observée produite par le composé d'essai. Dans le Tableau III, l'activité est mesurée par la concentration inhibitrice minimale (CIM) de la substance (pg/disque) nécessaire pour inhiber la croissance de l'organisme d'essai. Le Tableau IV donne les résultats de l'essai in vitro du dérivé n- tridécanoylé du noyau de A-30912A (formule III, R5 est n-C 12H25) vis-àvis de cinq souches de Candida albicans par la méthode de dilution sur gélose. Dans le Tableau III, l'activité est mesurée par la concentration inhibitrice minimale (CIM) de la substance (pg/ml) nécessaire pour inhiber l'organisme d'essai. Les résultats d'essais in vivo destinés à évaluer l'efficacité du composé des Exemples 1 à 16 vis-à-vis d'une infection provoquée par Candida albicans A-26 chez les souris sont donnés dans le Tableau V, o l'activité est mesurée par la DE50 (c'est-à-dire la dose en mg/kg nécessaire pour guérir 50 % des animaux d'essai). Quand on n'obtient pas de DE50, l'activité est indiquée par la plus faible dose à laquelle on observe un effet antifongique significatif. Dans cet essai, on infecte par voie intraveineuse par Candida albicans A26 des groupes de souris albinos mâles (exemptes de pathogènes spécifiques) pesant de 18 à 20 g. On traite les animaux aux rayons X 24 heures avant l'infection à environ roentgens par minute pendant 4 minutes (dose totale de 400) pour réduire les réactions immunologiques à l'organisme d'infection. A 0, 4 et 24 heures après l'infection, on donne à chaque groupe de souris des doses progressives par voie sous-cutanée du composé d'essai sous forme d'une suspension dans un mélange à 33 % de polyéthylèneglycol dans l'eau. On note le jour de la mort pour chaque animal. Une comparaison statistique par l'essai "t" de Student du jour moyen de la mort est effectuée entre chaque groupe d'animaux infectéstraités à une dose particulière et un groupe de 10 animaux infectés non traités, pour déterminer si le traitement prolonge de façon significative la durée de survie. Le Tableau VI donne les résultats de l'essai des composés des Exemples 1 à 16 pour déterminer leur absorption après administration par voie orale. Dans cet essai, on gave les souris avec une dose de 416 mg/kg du composé d'essai en suspension dans un mélange à 33 % de PEG 400 dans l'eau. A des intervalles de temps, on prélève des échantillons de sang du sinus orbital et on détermine l'activité antibiotique comme suit: on place un disque de 7 mm contenant 20 -l de sang entier sur de la gélose ensemencée par Aspergillus montevidensis A35137. Après 40 heures d'incubation à 300C, on compare les zones d'inhibition provenant des échantillons de sang à une référence obtenue à partir du composé d'essai, et on calcule la quantité de composé dans l'échantillon de sang. Compos Exemple No R5 de la fc 1 Cil3 (CHi2)10- 2 Ci3 (CH2)11- 3 trans-CH. (CH-),CH= Tableau II Activité antifongique par l'essai de diffusion de disque sur plaque de g1losqe Zone d'inhibition (mm) (a) Saccharomyces Neurospora Trichophvton Candida )rmule III pastoranius X-52 crassa 846 mentagraphytes A-23 aiblcans A-26 16 40 (b) 25 21 32* 60* 30 =CH(CH.),- 19 40* 50* 24 3 Z'D /- 1 4 cis-Ci{3(Ct12)5CH=CH(CH2)7- Ci13 (Ci) 15- 6 ci sCH3 (CH2) 10CI =CH(CH2) 4- 7 cis-CH3 (Cil2) 7CCHl (C112) 7- 8 trans-CH3 (CH2) 7CHI=CI(CH2)7 - 3 2 7 CHC2)7 9 cis-CH3 (Cl2) 5CH=CH (CIl2)9- t ranstrans-Cl 3(CIl2)4 CII=CHCH2- Clt=Cl!(Cll2)7- * 34* 31* 26* -J O r%) -t' --j "O r\) c> -là Tableau Il (suite) Activité antifongique par l'essai de diffusion de disque sur plaque de gélose Composé Zone d'inhibition (u)(a) Exemle 5 Saccharomyces Neurospora Trichophyton Candida N0 R de la formule III pastoranius X-52 crassa 846 mentagraphytes A-23 albicans A-26 il cis,cis,cis-CHI3(CHi2)CHI-CciCH2- CH=CIICH2CH=CH-(CH2)7- 16 33* 36 30 12 Cil3(Cl 2)u- 17 18* 22* 19 13 CH3(C112)18- 18 13 16 16 14 cis-CH3(CH2)7CH=CH (CH2)9- 18 18 23* 22 C113(CH2)20- 19 15 20 12 16 cis-Clt3 (Cl2)7CH:CH (CHi2)l- 12 22 20* 12* (a) Les composés sont testés sous forme d'une suspension dans le iméthanol & une concentration de 1 mg/ml, en plongeant. un disque de 7 mm dans la suspension et en le plaçant sur la surface de la gélose. Incubation: 24-48 heures à 25-37 C. (b) Trop important pour la lecture. Zone d'inhibition mesurable distincte avec nouvelle croissance de l'organisme autour du disque. :N "O PO Tableau III Activité antifongique par l'essai de diffusion de disque sur plaque de g(lose CIM (wlg/disque): R de la formule III Candida albicans A-26 Trichophyton mentagrophytes 116 l CH3 (CH2)10- 2 CHi3 (CI12) 1- 3 trans-CH3 (CH2) 5CHCH (CH2) 7- 4 cis-C13 (C1H2)5CHCH(ClH2)7- CH3 (CHi) 15- 6 cis-CH3 (CH2) 0CIH=CII(CH2)4- 7 cis-Cl3 (CH2) 7CH=CH(CHII2)7- 8 trans-CH3 (CH2) 7CH=CH(CH2)7 9 cis-CiH3(CH2)5CHlCII (CHl2)9- transxtrans-ClH3(Cl2)4CH=CI{CH2CHI=CHl(CHl2)7- 11 c is, c is, cis-CH3 (CH2) CH=CHCH2CH=CHCH2CH-CH- (CH2)7- 12 Ci3 (Cl12) 17- 13 CH3 (C112)18- 14 cis-CIt 3(CHi2) 7Cl=CH(CH2)9- CH3 (Cl,) 20- 16 cis-C113(CH2)7CH=CH (Cit2) 11 1,25 0 625 0 039 0,312; 0 625 0t625 1,25; lr25 01625; 0,625 0,156 0 312 0,156 1.25 2,5t 5,0 tO 1125; ?1.5 ,0 7120; 10(0 0,039 0;039 01039; 0;156 0.039 r25; 01625 0,625; 01156 2,5; 2,5 Les cnmrosés sont en susptnssiole Wr1: une s:]outioII 0,,(i M de bor;te de sodiumt, pH 7,5. Les composes sont testts à 20 liq/di,-que au niveau suç,rtur (-t à des dubles diluti ons jusqu'à ce que l'on ahtielur les points finals. incubation: 24 heur',. 3.3i)'C. Exemple N Comnose t) r-4 No CD TABLEAU IV Activité in vitro du dérivé n-tridécanoylé du noyau de A-30912A vis-à-vis de cinq souches de Candida albicans. CIM (p/ml) A26 SBH 16 SBH 31 SBH 28 SBH 29 0,312 0,625 0,625 0,625 0,625 Tableau V Activité contre Exemple NO Composé R5 de formule III 1 Cil3 (CH2) 10- 2 CH3 (Cl 2) 11- 3 trans-C113 (Cl12) 5C1=CII (CH2) 7- 4 cis-Cl3 (Cil2) 5Cl=Cii (C112)7- CH3 (Cll) 15- 6 cis-CH3(C}1l2) 10CH=CH(CH2)4- 7 cls-Cl3 (C1i2) 7CH=CI (CH2)7- 8 trans-C113(CH2)7CIltCH (CH2)7 9 ciS-CilH3 (Cl2) 5CIl{CII (Ci2)9- trans,trans-CH3 (Cil 2)4 CllHCCH2 CH=CH(C112)7- 11 cis, cis,cis-CH3(Cl2)CH=CC H2CH=CH2 H=CH 2 (Clt2)7- 12 C113 (CH,) 17- 13 CH3 (CH2)18- 14 cis-C1I3(Cil2) 7Cl 'cl(Cil2)9- ClH3(CH2)20- 16 cis-CH3(CHi2)7CH=Cii (Ci 2) 1- Candida albicans A-26 chez -. l..... Programme DE50 de dose:: (m) :::: B 62 B 34 A 40 A >40 A 9 A 18; 20 A 32; 14; 22 A 11 A >40 A A A A A A A >40 12; 4,6 >40; 12.2 >40 >40; 18 les souris .... Dose active la plus faible >5 ; 20 ; 10; 20 >40 >5;:'5 ; >5 >40 ; 10,0 -J N r\) 4'- J r\) CD TABLEAU V (suite) Programmes de doses: A = 40, 20, 15 et 10 mg/kg; B = 80, 40, 20, 10 mg/kg. Les doses sont données 0, 4 et 24 heures après l'injection sous forme d'une suspension du composé J'essai dans un mélange à 30 % de PEG dans l'eau. Nombre de souris recevant les composés d'essai à chaque dose: 6 souris par groupe. Nombre de souris dans le groupe témoin (non traitées) 10 souris par groupe. Comme mesuré par augmentation de la durée de survie des animaux traités par rapport aux témoins, calculé par la méthode de Reed v Mueuch, American J. Hygiene, 27, 493 (1938). Ln c-j I-f Table VI Taux dans le sang après administration par voie orale chez les souris Composé Exemple N R de formule III __ Taux dans le sanag (liq/ml) l C113(C1i2)Lo 0 2 c1i3(Cl2)11- OO10 3 trans-Ci3 (CH2) 5C1{=CH (C2) - N.T. 4 cis-CtU3(CI{2)5CH=C}{(CH2)7 0 19 2 9 7 CH3(CH)15- 97 3 185 6 cis-C113(CH2)10CH=Cil (C2)4 18 7 cis-CH3 (CHi2)7CH=CH(C112)7- 0 8 transCiH3 (Cil2)7CH=CH(CH2)7 65 9 cis-CiH3(CH2)5CH=CH(CH2)9 42 transtransCH3(CIl2)4CH=CHCH2CH=Cl (Cl2)7- 0,61 il cis, cis, cis-Cll3 (CH2) CH=CHCH2CI1=CHCH2CIH=CH- (Cit2) 7- 12 CH3(CH2)17 54 13 Cil0(Cil 0 CH3 (C2) 18- 14 cis-Ci3(CHl2)7CIH=CH(CH2)9 N.T. CH3(CH2)20- ro 16 cis-CH3(Cl2) 7CIlt=CH(C2) 11- 0 Quatre heures après administration du compos N.T. = non testé. REVENDICATIONS 1. Composé de formule: H III dans laquelle R est H ou OH et quand R1 est H, R est H H ou tous deux OH, et et R et R sont tous deux quand R est OH, R est H, R est OH ou un groupement alkyloxy en C -C et R est OH, ou bien 2 3 C46 R est -CO-NH2 et R et R sont tous deux OH, et R est un groupement alkyle en C -C. ou al-nyle 1 63 o4 4 en C6-C24 pourvu que, quand R, R et R sont tous 2 5 5 OH, R est H et R un groupement alkyle, R ne puisse pas être un groupement n-tridécyle, n-tétra- décyle, n-pentadécyle ou n-heptadécyle; et, quand R5 est un groupement alcényle, R5 ne puisse pas être un groupement cis, cis-CH3(CH2) 4CH=CHCH2CH= CH(CH2)7-; et quand R1 et R2 sont tous deux H, R et R sont tous i 2 3 4 deux OH ou quand R, R2 R et R sont tous H ou quand R1 et R sont tous deux H011, R est H et R3 est un groupement méthoxy, et que Rt est un groupement alkyle, R ne puisse pas être un groupement n-heptadécyle, et que R est un groupement alcényle, R ne puisse pas être un groupement cis, cis-CH3 (CH2) 4CH=CHCH2CH=CH(CH2)7-, et quand R, R et R sont tous OH, R est -CO-NH2 r et R est un groupement alkyle, R ne puisse pas être un groupement n-tridécyle. 2. Composé selon la revendication 1, caractérisé en ce que R est un groupement alkyle en C6-C2. 3. Composé selon la revendication 2, caractérisé en ce que R est un groupement alkyle de formule CH3(CH2)n o n est un entier de 5 à 23, pourvu que n ne puisse pas être i 3 4 2 16, ou, quand R, R et R sont tous OH et R est H, n ne puisse pas être 12, 13 ou 14. 4. Composé selon la revendication 3, caractérisé e- ce que R est CH3(CH2) 10-, CH3(CHi2)11-, CH3(CH2)12-, CH3 (CH2)13-, CH3(CH2)14-, CH3(CH2)15-, CH3(CH2)17-, CH3(CH2)18-, CH3(CH2)19-, ou CH3(CH2)20-. 5. Composé selon la revendication 2, caractérisé en ce que R5 est un groupement alkyle de formule CH3 CH3(CH2)nCH(CH2)m dans laquelle n et m sont indépendamment un entier de 0 à 21, pourvu que la somme n + m ne soit pas inférieure à 3 et ne soit pas supérieure à 21. 6. Composé selon la revendication 1, caractérisé en ce que R est un groupement alcényle en C6-C24 contenant 1 6 24cotnt une double liaison cis ou trans. 7. Composé selon la revendication 6, caractérisé en ce que R est un groupement cis- ou trans- alcényle de formule CH3 (CH2) nCH=CH(CH2) m dans laquelle n et m sont indépendamment un entier de 0 à 21, pourvu que la somme n + m ne soit pas inférieure à 3 et ne soit pas supérieure à 21. 8. Composé selon la revendication 7, caractérisé en ce que R est cisCH3(CH2)5CH=CH(CH2)7-, trans-CH3(CH2)5CH= CH(CH2)7-, cis-CH3(CH2) 10CH=CH(CH2) 4-, cis-CH3(CH2)7- CH=CH(CH2)7-, trans-CH3(CH2)7CH=CH(CH2)7-', cis-CH3- (CH2)5CH=CH(CH2)9-, cis-CH3(CH2)7CH=CH(CH2)9-' ou cis-CH3 (CH2) 7CH=CH (CH2) 11- 9. Composé selon la revendication 1, caractérisé en ce que R est un groupement alcényle en C6-C24 contenant deux doubles liaisons cis ou trans. 10. Composé selon la revendication 9, caractérisé en ce que R est cis,cis ou trans,trans-CH3(CH2)4CH=CHCH2CH= CH(CH2)7-. 11. Composé selon la revendication 1, caractérisé en ce que R5 est un groupement alcényle en C6-C24 contenant trois doubles liaisons cis ou trans. 12. Composé selon la revendication 11, caractérisé en ce que R est cis,cis,cis-CH3CH2CH=CHCH2CH=CHCH2- CH=CH(CH2)7- ' 13. Procédé de préparation d'un composé de formule III, caractérisé en ce qu'il consiste à acyler avec un acide alcanoique ou alcénoique un noyau peptidique cyclique de formule HO CH3H, H ' " H2 Q H(.\R _: -H. /CH3 a.. Rn O danlauel R es H o He Ilout us. dH *H 2 3 Rlylx e H CI eR etOo* be s O H!"x H II dans laquelle R1 est H ou OH et Rl' 24 quand est H, R2 est Het R et R sont tous deux H ou tous deux OH, et i 3 quand Re est oHmest OH, Re est OH ou un groupement 4 26 4 alkyloxy en C -6et R4 est OH, ou bien R2 est O -C-NH2 et R3 et R4 sont tous deux OH. 14. Procédé selon la revendication 13, caractérisé en ce que R5 est un groupement aikyle en C6-C24 15. Procédé selon la revendication 14, caractérisé en ce que R est un groupement alkyle de formule CH3(CH2)n o n est un entier de 5 à 23, pourvu que n ne soit pas i 3 4 2 16 ou, quand R, R et R sont tous OH et R est H, n ne puisse pas être 12, 13 ou 14. 16. Procédé selon la revendication 14, caractérisé en ce que R5est CH3(CH2)10-, CH3(CH2) 11-, CH3(CH2)12-, CH3 (CH2)13-' CH3 (CH2)14-' CH3 (CH2)15-' CH3(CH2)17-' CH3(CH2)18-, CH3(CH2)19-, ou CH3(CH2)20-. 17. Procédé selon la revendication 14, caractérisé en ce que R est un groupement alkyle de formule CH CH3(CH2)nCH(CH2)m- dans laquelle n et m sont indépendamment un entier de 0 à 21, pourvu que la somme n + m ne soit pas inférieure à 3 et ne soit pas supérieure à 21. 18. Procédé selon la revendication 13, caractérisé en ce que R5 est un groupement alcényle en C6-C24 contenant une double liaison cis ou trans. 19. Procédé selon la revendication 18, caractérisé en ce que R est un groupement cis- ou trans- alcényle de formule CH3(CH2)nCH=CH(CH2)m- dans laquelle n et m sont indépendamment un entier de 0 à 21, pourvu que la somme n + m ne soit pas inférieure à 3 et ne soit pas supérieure à 21. 20. Procédé selon la revendication 19, caractérisé en ce que R est cis-CH3(CH2)5CH=CH(CH2)7-, trans- CH3(CH2)5CH=CH(CH2)7-' cis-CH3(CH2)10CH=CH(CH2)4-' cis-CH3(CH2)7CH=CH(CH2) 7-, trans-CH3(CH2)7CH=CH(CH2)7-, cis-CH3(CH2)5CH=CH(CH2)9-, cis-CH3(CH2) 7CH=CH(CH2)9-, ou cis-CH3 (CH2)7CH=CH(CH2) 11- 21. Procédé selon la revendication 13, caractérisé en ce que R est un groupement alcényle en C6-C24 contenant deux doubles liaisons cis ou trans. 22. Procédé selon la revendication 21, caractérisé en ce que R est trans,trans-CH3(CH2)4CH=CHCH2CH=CH(CH2)7-- 23. Procédé selon la revendication 13, caractérisé en ce que R est un groupement alcényle en C6-C24 contenant trois doubles liaisons cis ou trans. 24. Procédé selon la revendication 23, caractérisé en ce que R est cis,cis,cis-CH3CH2CH=CHCH2CH=CHCH2CH=CH(CH2)7-. 25. Composition antifongique contenant comme ingrédient actif un composé selon l'un quelconque des revendications 1 à 12.