FR 2479214 A1 19811002 FR 8101332 A 19810123 L'invention a pour objet des dérivés de la vitamine D marqués par un isotope. La vitamine D est un agent bien connu de la maitrise de l'homoes- tasie du calcium et du phosphore. On sait que dans l'homme ou l'animal nor- mal ce composé stimule l'absorption intestinale du calcium et du phosphate, mobilisant les minéraux se trouvant dans les oset retenant le calcium dans les reins et il est efficace pour prévenir le rachitisme. Il est actuellement bien connu que pour être efficace la vita- mine D3 doit être transformée in vivo sous des formes hydroxylées. Par exemple, la vitamine est d'abord hydroxylée dans le foie sous la forme de -hydroxyvitamine D3 puis est ensuite hydroxylée dans les reins pour produire la 1-a,25-dihydroxy vitamine D3 ou la 24,25-dihydroxy vitamine D3. La forme 1-a-hydroxylée de la vitamine est généralement considérée comme étant la forme de la vitamine physiologiquement active ou hormonale. Essentielle pour l'établissement de ces faits était la disponi- bilité d'une variété de dérivés de vitamine D marqués radioactivement (voir par exemple Suda et al, Anal. Biochem. 43, 139 (1971), Neville et DeLuca, Biochemistry, 5, 2201 (1966), Jones et al, Biochemistry 14, 1250 (1975), Bell et Scott, J. Label, Compds. 9, 339 (1973), DeLuca et al, Arch. Biochem. Biophys. 124, 122 (1968), et Yamada et al, Anal. Biochem. , 34 (1978)). Cependant, de tels composés marqués radioactivement pré- sentaient comme inconvénients soit une activité spécifique faible (0O2 à 10,6 Ci/mmole) et/ou nécessitaient des synthèses compliquées. L'invention a pour objet des composés de vitamine D marqués par ul isotope (traceurs radioactifs) caractérisés par une activité spécifi- que très élevée, spécifiquement les dérivés marqués radioactivement en positions 26, 27 du 25-hydroxycholecalciferol (25-OH-D3)etdula,25dihydroxy- cholecalciferol (lc,25-(011H)2D3) et les analogues 24-hydroxy de ces composés ainsi qu'un procédé efficace et polyvalent pour synthétiser de tels compo- sés. Les dérivés marqués par un isotope de la vitamine D selon l'in- vention trouvent une application dans la détermination des taux de métabo- lite de vitamine D dans le sang et dans les tissus humain et animal et peuvent ainsi être d'unevaleur inestimable pour la détermination de la pré- de sence ou/l'absence de maladies telles que ostéomalacie, osteodystrophie et hyperparathyroidisme. Par exemple, de tels composés sont utiles dans des essais connus pour 25-011-D3 (Bayard et al, Europ. J. Ciin. Invest. 2,195 (1972), Belsey et al, J. Clin. Endocrinol. Metab. 33, 554 (1971), Bouillon et ai, Clin. Chem. 22, 364 (1976), Edelstein et al, Clin. Sci. Mol. Med. 46, 231 (1974), Eisman et ai, Anal. Biochem. 80, 298, (1977), Garcia- Pa6cual et ai, Clin. Chim. Acta 68, 99 (1976), Hladdad et Chyu, J. Clin. En- docrinriol, Metab. 33, 992 (1971), Iladdad et al, J. Clin. Endocrinol. Metab. 43, 86 (1976), Jones, Clin. Chem. 24, 287 (1978), et Preece et ai, Clin. Chem. Acta 54, 235 (1974), ou pour la-25-(0O])2D3 (Brumbaugh et al, Sciences 183, 1089 (1974), Eisman et al, Arch. Biochem. Biophys. 176, 235 (1976), et Clemens et al. Clin. Science Mol. Med. 54, 329 (1978)) ou pour des essais multiples à la fois pour 25-OH1-D3 et 1,25-(OH2D3) ainsi que pour d'autres métabolites (Caldas et al, J. Lab. Clin. Med. 91, 840 (1978) , Hughes et al, J. Clin. Invest. 58, 61 (1970)) ou dans les recherches continues de la fonction de vitamine D, les études concernant les protéines liant, l'iso- lation et la caractérisation de tissus cibles récepteurs, études autoradio- graphiques et d'autres recherches dans le métabolisme de la vitamine D. Les composés vitamine D marqués avec des isotopes lourds stables de carbone ou d'hydrogène ( 13C ou 2H) sont également utiles pour l'analyse de métabolite dans le sang et dans les tissus, particulièrement dans les méthodes par spectrométrie de masse comme montrées par Bjorkhem et Holm- berg, Clin. Chim. Acta 68, 215 (1976)). Les composés selon l'invention présentent la structure générale R2 i / 1"[' 01 l I-,1 ( (A) Rj 3 2479214 o R et R2 désignent chacun hydrogène, hydroxyle, 0-alkyle ou 0-acyle et R2 peut en outre désigner alkyle et chaque Q désigne un groupe méthyle tel qu'au moins quatre des six atomes d'hydrogène et/ou au moins un des deux atomes de carbone dans le dit groupe méthyle sont des isotopes lourds. Des composés préférés de l'invention sont des composés de vi- tamine D marqués radioactivement et présentant les structures générales suivantes: X 3 13 c3u3 3 110 " Il) Tl I30,,II /1-j X X.(: ].l 33- Cl i/_ fi 11-- - rv III 24?9214 o X désigne hydrogène, hydroxyle, alkyle, o-alkyle ou 0-acyle et o le substituant X peut avoir une configuration stéréochimique R ou S. Le terme"alkyle" se réfère à un groupe alkyle inférieur ayant généralement de 1 à 4 atomes de carbone tel que méthyle, éthyle, propyle, isopropyle, butyle, sec. butyle, isobutyle, tert. butyle, et le terme "acyle" signifie soit un groupe acyle inférieur ayant par exemple de 1 à 4 atomes de carbone tel que formyle, aqétyle, propionyle, butyryle ou un groupe acyle aromatique tel que benzoyle ou nitrobenzoyle. Il est aussi à noter que bien que les composés ci-dessus comprennent du tritium ou du carbone-14 comme isotope lourd, les composés o le deuterium et le carbone-13 sont substitués à la place du tritium et du carbone-14 sont également très utiles. La présence d'isotopes radio- actifs et leur nombre peuvent être déterminés à partir de leur activité spécifique. Ainsi, la présence de quatre atomes de tritium fournit une activité spécifique théorique de 120 Ci/mmole; les composés préférés selon l'invention ont une activité spécifique d'au moins 150 Ci/mmole. Le spectre de masse peut être utilisé pour les isotopes non radioactifs. Les composés marqués par un isotope sont préparés par un procé- dé qui comprend le traitement d'un ester de l'acide 24-X-26,27-dinor- vitamine D-25-carboxylique (X ayant la signification ci-dessus indiqués)ou d'un ester de l'acide 1-a- hydroxy-24-X-26,27-dinorvitamine-D-25-carboxylique avec un réactif de Grignard tel que C H3MgBr ou 14CH3MgBr, ou un autre métal alcalin tel que 3 1433 C H3Li ou CH3Li, ou réactifs analogues de Grignard marqués avec le deu- térium ou avec le 13C ou les réactifs méthyl lithium. Comme exemples de tels esters on peut citer les composés V, VI, VII et VIII ci-après o R représente un hydrocarbure, généralement un groupe alkyle et en parti- culier un groupe alkyle inférieur ayant de préférence de 1 à 4 atomes de carbone. IIIA oi0 \\ TA A UOOD g OII o Oú 11it0 T g0 0I IOOD IlA 6 247921 4 La production de composés marqués par un isotope ayant les structures 1IV comprend ainsi deux phases la synthèse des matières de départ appropriées non marquées suivie par l'introduction de l'isotope désiré en positions 26 et 27. Il est à noter que lorsque le réactif marqué par un isotope est un mélange de différentes espèces marquées par un isotope, le produit sera en général non pas un composé simple mais un produit comprenant deux ou plusieurs composés. Ainsi, l'invention a également pour objet un procédé pour préparer un composé marqué par un isotope, de formule (A) o R1 et R2 lo ont la signification ci-dessus indiquée et chacun des Q désigne un groupe méthyle tel qu'au moins un des six atomes d'hydrogène et/ou au moins un des deux atomes de carbone dars lesdits groupes méthyle est un isotope lourd, ce procédé comprenant le traitement d'un ester de la vitamine D ayant la structure -.s CAO (8) R,1 o R désigne un groupe hydrocarboné monovalent,avec un réactif de Grignard méthyl marqué par un isotope ou avec un réactif méthyl lithium marqué par un isotope et la récupération de la vitamine D marquée par un isotope en positions26, 27. Les composés V-VIII sont préparés de façon caractéristique à partir de matières de départ telles que les esters de l'acide homochole- nique ou les esters de l'acide homocholenique substitués par un hydroxyde, suivant le schéma général représenté par le procédé schématique I: X1 X1 Procédé schématique 1 COOR y1 R1( i X 1, COOR V-1: X=H1, Y=OJl VII. - Xr:Ol1, Y=H1; VIII: X=Y=OIIl, Y 2479t14 I Dans ces formules R représente un groupe protégeant un groupe- ment alcool tel qu'un groupe acyle (par exemple acétyle ou benzoyle), X et Y désignent indépendemment l'un de l'autre hydrogène ou hydroxyle et X et Y désignent indépendemment l'un de l'autre hydrogène ou 0-acyle.. La préparation des composés V-VIII comprend la transformation de l'ester de l'acide homocholenique protégé par un acyle (1) (préparé par acylation de groupes hydroxy libres, par des procédés d'acylation bien connus, par exemple traitement avec anhydride acétique/pyridine ou chlorure de benzoy- le/pyridine) en 5,7-diène correspondant (2) utilisant par exemple le procédé de déshydrogénation de Hunzicker et MUllner (Helv. Chim. Acta 61, (1958)); suivi par l'élimination des groupes acyle protecteurs par hydrolyse, en milieu alcalin doux conduisant à l'hydroxyester 3. Ce diène est transformé en vitamine D désirée par le procédé bien connu d'irradia- tion avec la lumière ultraviolette, pour obtenir la prévitamine D inter- médiaire qui est ensuite isomérisée par voie thermique en ester de vita- mine D (V à VIII). Ces transformations sont bien connues par l'homme de l'art (voir par exemple les brevets US n 3.907.843, 3.741.996 et 3.772. 361). De façon alternative, le 5,7-diène intermédiaire protégé par acyle, de structure 2 peut bien entendu être directement irradié pour fournir l'ester intermédiaire de la prévitamine D acylée, qui est ensuite isomérisée par voie thermique (par exemple par chauffage à 80-90 C en présence d'une base douce telle que par exemple 10% KOHI/ méthanol) pour effectuer à la fois la transformation à la structure de vitamine 5,6-Cistriène et élimination des groupes acyle pour obtenir les produits de structure V-VIII. La préparation de l'ester de vitamine D,V peut être réalisée par application directe du schéma ci-dessus aux esters de l'acide homo- cholénique ou à leurs dérivés 3-0-acyle (par exemple la structure 1 cidessus o R désigne méthyle, R désigne benzoyle, X désigne hydrogène) qui sont des composés connus (voir par exemple Campbell et al, Steroids 13, 567-577 (1969)). Les esters de la vitamine D ayant les structures VI-vIII peu- vent être préparés de façon similaire. Un procédé commode pour préparer les esters la-hydroxyvitamine D de structure générale VI et VIII comprend l'hydroxylation directeen C-1 des composés V ou VII utilisant les procédés généraux de paaren etal. (Proc. Natl. Acad. Sci. 75, 2080 (1978)). Ce procédé est représenté dans le procédé schématique 2: Procédé schématique 2 X x1 i. C ECOOR COOR Xt,> i '/gO [ 01I a/fl'- ii /. l )OR QOR R VI: X=TI VIII: X:-01I 0I1 o0 v 1] x _ _ Dans ces formules, Z représente de façon caractéristique un radical alkyle par exemple un radical alkyle inférieur tel que méthyle ou éthyle ou propyle. Cependant les intermédiaires dans lesquels Z désigne hydrogène ou un groupe acyle (par exemple acétyle ou benzoyle) sont également utiles. Le procédé comprend la tosylation de] 'hydroxy ester V (ou VII) en composé 3-0-tosyl, suivie par solvoiyse directe du tosylate dans un solvant alcoolique (par exemple éthanol ou mfthanol) contenant un tampon approprié tel que l'acétate ou le bicarbonate de sodium pour fournir la cyclovitamine intermédiaire 4 (o Z désigne un groupe alkyle correspondant au résidu alkyle du solvant utilisé dans la réaction de solvolyse, par exemple lorsqu'on utilise du méthanol, Z = méthyle, lorsqu'on utilise un solvant aqueux z = 11, etc.). Le traitement de l'intermédiaire 4 avec du dioxide de sélénium et hydroperoxyde ou un alkyle hydroperoxyde (par exemple t.butyl- hydroperoxyde) fournit la la-hydroxy cyclovitamine D intermédiaire 5 qui est acylée en (6) par des procédés connus. La solvo- lyse du composé 6 dans l'acide formique fournit un mélange de l'ester-3- formate de l'acide 1-0-acyi-vitamine D carboxylique et le 5,6-trans-isomè- re correspondant. Le groupe formyle est éliminé par hydrolyse dans des conditions très douces qui n'hydrolysent pas les groupes ester en C-1 ou C-25 et le mélange est ensuite fractionné par chromatographie (chromato- graphie en couche mince ou chromatographie liquide à haute pression) pour pur fournir l'intermédiaire la-0-acyle /de formule générale 7. L'hydrolyse basique subséquente dans une base alcoolique élimine le groupe acyle et conduit à l'ester de la la-hydroxyvitamine D de structure VI ou VIII. Les esters ayant les structures générales VI ou VIII sont des composés nou- veaux. Parmi les composés de formule (B), les esters suivants et leurs précurseurs sont préférés: - (i) R1 et R2 désignent hydrogène et R désigne méthyle ou éthyle; (ii) R1 désigne hydroxy, R2 désigne hydrogène et R désigne méthy- le ou éthyle; (iii) R1 désigne hydrogène, R2 désigne hydroxyle et R désigne méthyle ou éthyle; ou (iv) R1 et R2 désignent hydroxyle et R désigne méthyle ou éthyle. Un procédé dé préparation alternatif des composés la-hydroxy VI ou VIII à partir des esters de l'acide homocholénique figure sur le procédé schématique 3. Ce procédé comprend l'introduction de la fonction 11. en passant la-hydroxy/par un intermédiaire la, 2a-époxy 4,6-diène-3-one stériode de (par exemple le produit 9) suivie du procédé général Barton et al (J.Am. Chem. Soc. 95, 2748 (1973)). La transformation'du composé la-hydroxy-5- ene résultant (composes 10 et 11) en 5,7-diène (par exemple composé 12) et irradiation subséquente et isomérisation thermique suivent les pratiques classiques déjà discutées par rapport au procédé schématique 1, pour fournir les composés la-hydroxy VI ou VIII. procédé schématique 3 X COOR COOR i 0 1o X X COOR ]10 0,, 1,, 1 i xl(.,,l- CI(CA 1R 1 7-- R- 0 u O 12 Jx COOR VI: X=1 I VIII: X=011 11O -) I! 12 247921 4 Pour préparer les esters de la 24-hydroxyvitamine D ayant les struc- tures générales VII et VIII,par les procédés figurant dans les procédés schématiques 1, 2 ou 3 ci-dessus, il est nécessaire de disposer comme précurseur ultime d'un ester de l'acide homocholénique 24-hydroxyvlé. De tels composés peuvent être préparés par plusieurs méthodes. Un procédé approprié pour obtenir les esters de l'acide 24-hydroxy homocholénique est illustré dans le procédé schématique4: Procédé schématique 4 ó 3 t-, {I 13 -)!. 0 13 011 011 NsJ A COOR" '.\seD " C Xi R"0O OI 0(113 1_,| 6 15 Le 22-aldéhyde 13 pouvant être obtenu à partir du stigmasterol par le procédé de Partridge et al (Helv. Chim. Acta 57, 764 (1974)), est condensé (réaction aldol) avec l'acide pyruvique pour fournir, après estérification, l'ester cétonique non saturé 14,utilisant par exemple les procédés généraux de Eyley et Williams (J. Chem. Soc. Perkin Trans. I. p. 727 et 731 (1976)). Le traitement de l'ester 14 avec NaBI4 dans la pyridine a pour résultat la réduction à la fois de la double liaison et du groupe cétonique et on obtient l'ester hydroxy 15 (voir Eyley et Williams, ci-dessus). La solvolyse du composé 15, utilisant des condi- tions bien connues (voir par exemple Partridge et al ci-dessus) fournit l'ester de l'acide 24-hydroxy homocholénique 16 o R1 désigne hydrogène ou un groupe acyle (par exemple acétyle),suivant les conditions de sol- volyse choisies. Le composé 16 peut être facilement transformé en ester 24- hydroxyvitamine D VII par le procédé figurant dans le procédé schémati- que 1. L'ester VII peut, à son tour, servir comme matière de départ pour la préparation de l'ester la, 24-dihydroxyvitamine D VII, suivant le procédé figurant dans le procédé schématique 2. De façon alternative il le composé 16 (o R1 = H) peut être transformé en la,24-dihydroxyester VIII, par le procédé montré dans le procédé schématique 3o Les esters analogues de l'acide homocholénique C-24-hydroxylé peuvent également être préparés de façon appropriée à partir du 24,25-di- hydroxycholestérol ou à partir du la,24,25-trihydroxycholestérol, ces deux composés étant des composés connus (Lam et al., Biochemistry 12, 4851 (1973); Seki et al; Chem. Pharm. Bull. (Japan) 21, 2783-2785 (1973); Ikekawa et al, Chem. pharm. Bull. (Japan) 23, 695-697 (1975)). La transformation de ces dérivés du cholestérol en esters de l'acide 24-hydroxyhomocholénique ou en esters de l'acide la,24-dihydroxy- homocholéniqtie sont représentés sur le procédé schématique 5. Procédé schématique 5 (011 1tO 1, 0 I10 Il z J - C 1]-f3 i1CÄtfIlc)( NI c.; iio- --' y C ifçlo(lhd A *! T (o COOR y COOR -J 1li / Le traitement d'une solution méthanolique de la matière de dé- part 24,25-dihydroxycholesterol (17) (o Y = hydrogène ou hydroxy) avec un excès de solution méthanolique saturée de métaperiodate de sodium, - à la température ambiante,pendant par exemple 2 heures,fournit le pro- duit de clivage attendu,le 24-aldéhyde (18). Ce produit intermédiaire (après la protection des fonctions hydroxyle sous forme d'éther silyl) peut être alkylé directement avec le 2-lithio-2-méthyl mercapto-l-3- dithiane (procédé A selon le procédé schématique 5) et le produit d'addition résultant, à savoir le 24-hydroxy 25-ortho trithioester peut être transformé directement en ester de l'acide-24-hydroxy homocholénique 19 par alcoolyse oxydante de l'ester orthothio. (Seebach, Angew. Chem. 79, 469-470 (1969); Seebach, Synthesis p. 17-36 (1969); Ellison et al, J. Org. Chem 37, 2757 (1972)). De façon alternative (procédé B, procédé schématique 5) l'inter- médiaire 24-aldéhyde 18 peut être transformé en 24-thioacétal (20), par traitement avec du 1,3-propanedithiol en solution chloroformique conte- nant comme catalyseur de l'éthérate de BF3. La réaction du composé (20) (après blocage temporaire des groupes hydroxy sous forme de fonction éther par exemple d'éther triméthylsilyl)avec du n-butyl lithium en solution dans le tétrahydrofuranne,à basse température,par exemple de -20 à - 70 C sous atmosphère d'azote ou d'argone conduit au dérivé 24-li- thio qui peut être directement carboéthoxylé par addition d'un excès de chloroformate d'alkyle (par exemple le chloroformate d'éthyle) suivant le procédé général de Corey et Seebach (Angewandte Chemie, 77, 1135-1136 (1965)) pour fournir l'ester intéermédiaire de l'acide 24-thiocétal 25- carboxylique. Le traitement de cet ester avec HigO/HgC12 dans l'acétone aqueux a pour résultat l'hydrolyse du thio-cétal avec formation de a-cé- to ester (21) qui peut être réduit directement avec NaBHI4 dans le méthanol, pour obtenir le 24-hydroxy-25-homocholénique ester de structure 19 (o Y désigne hydrogène ou hydroxyle). L'ester 19 (Y = hydrogène) après acylation appropriée des groupes hydroxyle (par exemple acétylation ou benzoylation) peut être transformé en 24-hydroxyvitamine D ester VII par le procédé figurant tandis dans le procédé schématique l,/quel'ester 19 (Y = hydroxy) fournit le lc-25-dihydroxyvitamine D3 ester VIII correspondant,par le même procédé. A partir des esters de la vitamine D de structures V à VIII on peut préparer les métabolites désirés 26, 27 de la vitamine D marqués radioactivement,de structures I-IV par un stade final unique qui comprend 16 2479Zl4 le traitement des composés V, VI, VII ou VIII avec un réactif de Grignard méthylé marqué radioactivement (par exemple le bromure de méthyl magne- sium ou le iodure de méthyl magnesium) ou un réactif méthyl lithium marqué radioactivement. Les transformations ci-après caractéristiques illustrent ce stade de réaction final et la polyvalence de ce procédé: (1l) (,. I1qNî Bt--: (,,l) ou ( 1 I (3)N' (RI.N'tir lB-llI1D. II o 1u1 1 i ou Cli I ('1) v'1 (:11,,.JA1W1 1\' (\X-- I) v,,., ou 3C1 1,1 i (t;) Vi 1 ( (:-MI) 15.......... _.....) ou (' 11- 17 2479214 3, (6) Vlll C311Mg lh U I (X:01l) (7) VIII c 13 i IV (X I) ' -'CIM 1tr I V(--011)-_ ou Cli T i 3- Les réactions de marquage radioactive. illustrées par les exemples (1) - (7) ci-dessus peuvent être conduites de façon appropriée en faisant réagir une solution éthérée de l'ester de la vitamine D appropriée (par exemple les composés V - VIII) avec une solution dans désiré ou avec l'éther du réactif de Grignar r/ le réactif de méthyl lithium marqué radioactivement,avec refroidissement dans un bain de glace si pendant le mélange des réactifs le procédé progresse trop vigoureu- sement. La réaction peut être ensuite conduite à la température ambiante pendant par exemple 1 heure et le produit marqué radioactivement peut être isolé par des procédés classiques appropriés pour les réactions du type Grignard (par exemple addition de H20 ou de NH4C1 aqueux dilué et de l'éther, séparation, lavage et séchage de la phase éthérée, suivies par l'évaporation du solvant). La purification du produit,utilisant par exemple chromatographie liquide à haute pression ou colonne de gel de silice en microparticules, complète la synthèse. Il est bien entendu essentiel que ces opérations soient conduites dans des laboratoires équi- pés pour le traitement de radionuclides ayant des activités spécifiques élevées,dans des conditions de sécurité. L'introduction d'isotopes stables de carbone et hydrogène ( 3C, 2H) peut être réalisée par le même procédé, utilisant le réactif approprié de Grignard méthylé ou le réactif de méthyl lithium marquCs sauf qu'il n'est pas nécessaire de prendre des précau- tions concernant les radiations car les isotopes stables ne présentent pas de danger de radiation. Les réactifs nécessaires marqués radioactivement sont dispo- nibles chez les fournisseurs de produits chimiques radioactifs (par exemple New England Nuclear, Boston, Mass.). Les réactifs ayant des 18 2479214 activités spécifiques très élevées sont disponibles (par -e:emple C lH3MgBr à 80 Ci/mmole). L'utilisation de tels réactifs dans le procédé décrit ci-dessus fournit par exemple les métabolites de vitamine D 26,27tritié de structure I ou II ayant une activité spécifique de 160 Ci/mmole. De tels niveaux de radioactivité n'ont pas été obtenus jusqu'à présent dans le domaine de la vitamine D et il serait impossible de préparer des composés ayant une activité spécifique si,élev.ie par les synthèses radio- chimiques iu:;lu'ici uti lisées. Les procédés de rad!osynthWse ci-dessus décrits rendent de telles préparations des préparations de routine. De façon similaire les métabolites marqués 26,27- 14C de structures III et IV avec des activités spécifiques jusqu'à 120 mCi/nTmaole peuvent être préparés par le traitement des composés V - VIII avec le réactif de Grignard 4C approprié ou avec le réactifdeméthyl lithium. Les réactifs contenant des isotopes stables constituent également des produits commerciaux, par exemple le trideutero iodure de méthyle et le 3C iodure de méthyle sont disponibles facilement et à partir de ces composés on peut préparer les composés de Grignard ou le réactif de lithium appropriés. On dispose de deux compte rendus de radiosynthèse de métabolite de vitamine D ayant une activité spécifique élevée (78 et 90 Ci/mmole) (yanada et al, Anal. Biochem. 85, 34 (1978) et Muccino et al, Steriods 31, 645 (1978). Dans les deux cas le composé a été obtenu par tritiation d'un composé intermédiaire stéroïde acétylénique utilisant il2 ayant une acti- vité spécifique élevée pour introduire le radionuclide, conditions qui ont souvent pour résultat des complications dans le marquage. Les deux syntheses sont difficiles et compliquées, nécessitent sept stades après l'introduction du marqueur, y compris transformation du stéroide en seco- stéro'ide. En outre de tels procédés ne peuvent être adaptés pour marquer le composé avec du carbone 14 et ne peuvent-pas non plus être utilisés pour la préparation des composés de vitamine D ayant une activité spéci- fique supérieure à 120 Ci/mmole. Comme avantages des procédés selon l'invention, on peut noter les avantages suivants. Ils permettent l'introduction du carbone-14, du carbone-13, du deitérium et du tritium. Ils ne conduisent pas à des compli- cations dans le marquage. Ils fournissent (dans le cas de l'incorporation de radionuclide) des composés ayant une activité spécifique très élevée. Ils fournissent des produits dans lesquels l'emplacement de l'isotope est connu sans anbiguité et dans lesquels l'isotope ne peut être perdu par 19 2479214 des procédés d'échange (dans le cas d'isotopes d'hydrogène). Ils permet- tent l'introduction du radionuclide au cours du dernier stade de synthèse et augmentent ainsi l'économie et la souplesse du procédé et dans le cas de radionuclides ces procédés permettent de réduire considérablement les risques que comportent les synthèses de produits marqués radioactivement. La souplesse du procédé permettant l'introduction appropriée de n'importe quel isotope de carbone ou l'hydrogène est particulièrement digne d'être notée. Par exemple le 26,27-hexadeutéro ou le 26,27-di l3C métabolites de vitamine D marquéssont facilement produites à partir des îO esters de la vitamine D de structure V-VIII par traitement avec le réactif appropriédeutérisé ou le réactif de Grignard C ou par le réac- tif méthyl lithium. On a ainsi la possibilité de produire à partir de chacune des matières de départ ester du type V à VIII, en un seul stade, l'un ou tous les quatre composés de vitamine D marqués par un isotope le composé 26,27- 3i, le composé 26,27-2 i, le composé 26,27- 4C et le composé 26,27- C. La préparation de tels dérivés par des procédés déjà connus auraient nécessité quatre synthèses différentes à plusieurs stades. L'introduction du marquage isotopique au dernier stade offre certains autres avantages pratiques importants, car elle évite des pertes de matière dues à une transformation avec un faible rendement. Dans la préparation des composés de vitamine D à partir de stéroides, les derniers stades, à savoir la formation du 5,7-diène et la formation subsé- quente de seco-stéroides par irradiation constituent tous deux des trans- formations à faible rendement (par exemple de 20 à 4070). Il en résulte que lorsque le marqueur est introduit au stade de stéroïde, la matière iso- topique précieuse est perdue et on gaspille un réactif coûteux. Ces pertes font que le procédé de marquage doit être conduit sur une échelle relati- vement grande (impliquant l'utilisation de quantités importantes de réac- tif isotopique coûteux qui présente un inconvénient lorsqu'il s'agit derécupérer des quantités de produit radioactif désiré lorsque les réactifs sont dangereux). En outre, l'isolation du produit à partir des stades ayant un faible rendenent,ci-dessus mentionné,nécessite une chromatogra- phie minutieuse et difficile dont la.mise en oeuvre est d'autant plus compliquée qu'elle s'applique à des composés hautement radioactifs. Le procédé selon l'invention élimine toutes ces difficultés. Une réaction du type de Grignard pour l'introduction du marqueur est mise en oeuvre facilement (même avec des réactifs hautement radioactifs) et lorsque le marqueur est introduit au dernier stade il n'est pas nécessaire de 24 92 14 procéder à d'autres manipulations chimiques et l'isolation du produit ne nécessite habituellement qu'un seul stade chromatographique de pu- rification. Tous les schémas de procédés dans lesquels le marqueur radio- actif est introduit dans un stade initial,nécessitent la préparation du produit radio-marqué désird,en quantité calculée,pour répondre à la demande attendue concernant le produitp9ur une longue période de temps, simplement pour éviter la nécessité de répéter fréquemment un procédé difficile et dangereux. Mis à part les nombreux problèmes pratiques d'un procédé à plusieurs stades manipulant de grandes quantités de radio- nuclides, la nécessité de stocker les produits désirés pour une longue pé- riode de temps constitue, bien entendu, un autre désavantage sérieux, étant donné que tous les produits radio-marqués subissent une dégradation, soit par décomposition naturelle de l'isotope qui a pour conséquence une perte de l'activité spécifique, et/ou par radiolyse (en particulier pour les préparations marquées ayant une activité spécifique élevée), ce qui peut conduire à des mélanges très complexes de produits. Dans le procédé selon l'invention ces difficultés sont supprimées de façon efficace, étant donné que la formation de produits radio-tmarqués à partir d'un précurseur stable, préparé de façon appropriée (par e-:emple les composés V, VI, VII ou VIII, qui peuvent être stockés indéfiniment sous forme de cristaux ou dans des solutions désoxygénées dans le froid, en un seul stade, facile à répéter, offrent l'option d'adapter la quantité de pro- duit radio-narqué -ainsi que la nature de l'isotope spécifique introduit - aux exigences réelles imnsédiaEes. Le procédé constitue également la seule méthode pour la synthèse de la 25-hydroxy vitamine D3 tritiée (marquée au tritium) avec une activi- * té spécifique supérieure à 100O Ci/mmole et constitue la première méthode strictement chimique pour la synthèse de l'hormone clé],25-dihydroxy vitamine D sous forme radioactive. La production de métabolite de vita- mine D3 sous forme fortement radio-marquée, l'utilisation de nouveaux esters de vitamine D (composés V, VI, VII ou VIII) conmme supports pour le radio-marquage, ensemble avec la souplesse expérimentale, la simplicité technique, l'économie et la sécurité,constituent les caractéristiques clé du procédé. ait Bien que la présente invention été discutée par rapport aux esters de la vitamine D ayant les structures V-VIII, dans lesquelles le substituant au carboue-24 est hydrogène ou hydroxy, pour la préparation de composés de vitamine D 26,27-marqués il est évident qu'on peut égale- ment utiliser comme supports appropriés des esters analogues de vitamine D, portant au carbone C-24 des substituants tels que alkyle, 0-alkyle ou 0-acyle; ces supports fournissant par le procédé de radio-marquage selon l'invention les composés de vitamine D marqués en 26,27 correspondants ayant les structures I-IV dans lesquelles X désigne respectivement alkyle, O-alkyle et hydroxy. i Les dérivés acylés ou d'autres dérivés O-protégés (par exemple les éthers 0-silyl) d'esters de vitamine D ayant les structures V à VIII constituent bien entendu des matières de départ alternatives. De tels dérivés O-protégés sont disponibles comme composés intermédiaires dans la préparation d'esters V-VIII ou sont aisément préparés à partir des esters V-VIII par acylation ou silylation. il est également à noter que certains intermédiaires de syn- thèse d'esters de vitamine D V à VIII constituent également des supports appropriés pour l'introduction de marqueurs isotopiques et que de tels intermédiaires marqués peuvent ensuite être transformés en substances de vitamine D-marquée, I-IV. Par exemple les intermédiaires de cyclovitamine D de structures 5 et 61selon le procédé schématique 2, fournissent par traitement avec le réactif approprié de type Grignard radio-marqué le composé 26,27-marqué-la,25-dihydroxy-24-X-cyclovitamine D qui peut être aisément transformé, par les procédés de paaren et al, cités ci-dessusen 26,27-marqués-la,25-dihydroxy-24-X-vitamine D3 (composé II ou IV). Linter- médiaire 4 du procédé schématique 2, traité de façon analogue, fournit la 26,27-marqué-25-hydroxy-24-X-vitamine D3 (structure I ou III). De façon similaire les intermédiaires 5,7-diène de structures 2 ou 3 du procédé schématique 1 peuvent être transformés en stéroides 26,27-marqués-5,7- usuelle diène qui après la séquence/d'isomérisation irradiation/thermique usuelle fournissent n!importe lequel des composés I-IV désiré. Parce que l'intro- duction de tels marqueurs intermédiaires se produit à un stade plus éloi- gné du produit final, de telles modifications du procédé général ne sont en général pas préférées. Ces modifications présentent cependant une alternative attractive dans certaines circonstances. par exemple, la préparation du composé 26,27-marqué-la,25-dihydroxy cyclovitamine D à partir des intermédiaires 5 ou 6 (procédé schématique 2) peut être avan- tageuse si à la fois le 5,6-Cis et le correspondant 5,6-trans-26,27marqué- la,25-dihydroxy-24-X-vitamine D produits sont désirés, étant donné que tous les deux sont formés par solvolyse de la cyclovitamine selon le procédé de paaren et al. De façon similaire, l'introducticnl du radio- marqueur dans les intermédiaires 5,7-diène (par e:enmple les composés 3 ou 12) peut être utile si le composé 26,27-marqué prévitamine D (ou les composés 26,27-marqués tachystérol) sont désirés, étant donné que ces derniers constituent des produits immédiats pour l'irradiation de 5,7di6ne Dans les exemples suivants qui illustrent l'invention, on a pris des spectres d'absorption ultraviolette (UV) dans l'éthanol avec un spectro-photomètre enregistreur Beckmann Modèle 24 (Beckman Instruments, Fullerton, Californie) des spectres de résonance magnétique nucléaire (PR. IN) ont été obtenus dans CDC13 avec un spectrom-tre Bruker W11i-270 (Bruker Instruments, Inc., Wheaton, ILL.), des spectres de masse ont été obtenus à 100 C au-dessus de la température ambiante avec un AEI (Asso- ciated Electrical Industries) MS-9 couplés avec un data système DS-50; la chromatographie liquide à haute pression (CLPI) a été effectuée avec un chromatographe liquide Waters Associates Model ALC/GPC-204 (Waters Associates, Milford, Mass.); les irradiations ont été effectuées dans un récipient en quartz avec une lampe lianovia 8A36 de 125 wattstéqui- pée avec un filtre Corex; la radioactivité a été mesurée avec un compteur à scintillation liquide Packard!modèle 3255 (Packard Instrument Company, Inc., Downers Grove, III). Sephadex LHII-20 est un dérivé hydroxypropyl- éther de polydextrane vendu par Pharmacia Chemicals, Piscataway, New-Jer- sey; Lipidex 5000 est un produit d'hydroxyalcoxy propylation.saturé à %, de Sephadex LII-20 avec une longueur moyenne de la chaîne alcoxy de 15 atomes de carbonelvendu par Packard Instruments, Inc., Dowlners Grove, Illinois. La colonne CLI'II semi-préparative était de dimension 0,6 x 25 cm et a été chargée avec un gel de silice en microparticules (particules de microns), la chromatographie préparative en couche a été effectuée sur des plaques de'gel de silice 20 x 20 cm avec une épaisseur du lit de 0,75 ou de 0,25 cm. Les désignations structurelles dans les exemples ci-après, avec des chiffres romains ou arabes, se réfèrent aux structures ainsi identi- fiées dans la description ci-dessus et dans les procédés schématiques. EXEMPLE 1 a) Préparation du 25-hydroxy(26,27-2H) vitamine D3(composé I, X=H). Une solution de 1 mg (2,5 pmole) d'ester méthylique de l'acide 26,27dinorvitamine D3 25-carboxylique (composé V, R = méthyle) dans l'ther sec est traite avec un excs de C3gBr (80 Ci/mmole) dans l'éther sec est traitée avec un excès de C il 3MgBr (80 Ci/mnole) dans l'éther pendant 1 heure à la température ambiante (sous atmosphère d'ar- gon). On ajoute ensuite de l'eau au mélange réactionnel, on sépare la couche éthérée et on extrait la couche aqueuse deux fois avec de l'éther. Les fractions éther combinées sont lavées avec de l'eau et avec une saumure) solution saline/,on fait évaporer le solvant et on purifie le résidu par chromatographie à travers une colonne Sephadex L1-20 (2 x 50 cm) dévelop- pée avec CIICI3/hexane (1:1) et Lipidex 5,000 (1 x 50 cm) utilisant CE1C13/ hexane (1:10) pour obtenir 32 mCi de 25-hydroxy-(26,27-3H) vitamine D3 (I o X = 11). Le produit (160 Ci/mnuiole) ainsi purifié est d'une pureté d'au moins 967, déterminée par CLPII. (0,45 x 25 cm, colonne de gel de silice à microparticules, solvant d'élution 47. de 2-propanol dans l'hexa- ne). b) Préparation de la 25-hydroxy-(26,27- 116) vitamine D3 (composé I, X=H). On prépare le réactif de Grignard méthylé deutérisé en ajou- tant iodure de méthyle 2H (60 pmole) dans 0,5 ml d'éther sec et de tournures de magnesium (50 pmole). Après que le métal se soit dissout, on ajoute 2 mg (5 pmole) d'ester méthylique de l'acide 26,27-dinorvita- mine D 25-carboxylique (composé V o R = méthyle) dans 0,5 ml d'éther et on met en oeuvre la réaction à la température ambiante pendant 2 heu- res. On ajoute de l'eau et de l'éther, on sépare la phase éthérée et on extrait la phase aqueuse deux fois avec de l'éther. Les phases organiques combinées sont lavées avec H20 et avec une solution saline et séchées sur du MgSO4 et le solvant est évaporé. La chromatographie du produit à l'aide de l'appareil Sephadex LH-20 (2 x 50 cm, CHC13/hexane 1:1 comme solvant) et Lipidex 5000 (1 x 50 cm, CHC13/hexane 1:10) donne la 25-hydroxy 26,27- hexadeutéro vitamine D3. Le composé présente un maximum au 264 nm au spectre infrarouge et le pic ion moléculaire à m/e 406 confirme l'incor- poration de 6 atomes de deuterium. EXEMPLE 2 a) Préparation de la la,25-dihydroxy-(26,27- 11) vitamine D3(II, X=11). Un grand excès de iodure de méthyl-( 11) magnesium) est préparé mlé tlly 1- (3) fraîchement à partir de iodure de / 80(ci/mmole) et poudre de magnesium dans l'éther sec exempt de peroxyde est ajoutée goutte à goutte à une solution agitée de composé VI (R = méthyle) dans l'éther /sous atmosphère d'argon. Après la fin de l'addition on laisse le mélange réactionnel au repos pendant 1 heure à la température ambiante. On ajoute de l'eau avec précaution et on extrait la phase aqueuse plusieurs fois avec de l'éther. Les phases éther combinées sont lavées avec de l'eau et une solution 24 24792z14 saline. On élimine le solvant et on sèche le résidu par distillation azéotropique de l'eau avec du benzène. Le résidu est placé dans 10 ml de solvant de colonne dans la colonne Sephladex LH-20 (2 x 65 cm) et élué avec chloroforme/hexane (13:7). Le produit désiré élue entre 700 et 1100 mi. En CLPII (0,62 x 25 cma, colonne de gel de silice en microparticules) développé avec 12%/ de 2-propanol/hexane la la-25-dihy- droxy(26,27-3H)vitamine D (160 Ci/mmole) élue apprcximativement à 52 ml et est homogène. Le produit indique une absorption maximum dans l'ultra- violet à 263 nm, et présente un ion moléculaire à m/e 428 dans son o10 spectre de masse, ce qui indique l'incorporation de 6 atomes de tritium. b) Préparation de la la,25-dihiydroxy-(26,27- H6) vitamine D3. A une solution d'éther de iodure de trideutéro m.Sthyl magnesium préparée comme décrite dans l'exemple l(b) on ajoute 1 mg d'ester méthyli- que de l'acide la-hydroxy-26,27-dinorvitamine D3-25-carboxylique (composé VI, R = méthyle) dans 0,5 ml d'éther sec. Après 1 heure et demie à la température ambiante, on ajoute de l'eau au mélange réactionne] et on iso- le produit par extraction avec l'éther, lavage et séchage des phases éthérées comme décrit dans l'exemple l(b). Le produit est ensuite purifié directement par CLPIH (0,62 x 25 cm colonne de gel de silice à microparti- cules) utilisant comme solvant 10% de propanol dans l'hexane, pour four- nir le 26,27-hexadeutéro analogue de la la,25-dihydroxy vitamine D3 sous forme pure (7max 264 nm; spectre de masse m/e 422 (M+)). EXEMPLE 3 Préparation de l'ester méthylique de l'acide 26,27 dinorvitamine D3-25-carboxylique (composé V, R = méthyle). a) Methyle 3p-hydroxy-25-homno-5,7-choladi-ène-25-oate (3, o X=Y=H et R= méthyle). Méthyle 3f-hydroxy-25-hIomo-5-chlolen -25-eate 3-1-enzoaate, 1 (X =Y =11, R = méthyle, R= benzoyle)(0,5 g, 0,99 mmole), bicarbonate de sodium (0,55 g, 6,5 mmole), et 1,3-dibromo-5,5-diméthylhydantoine (O,16 g, 0,56 mmole) dans l'hexane (10 ml)sont chauffés sous atmosphLre d'azote pendant 20 minutes à 80 C. Le mélange réactionnel est ensuite refroidi et filtré. On dissout ensuite le résidu obtenu après avoir fait évaporer le solvant du filtrat, dans une solution de 2,4,6-dinméthyl pyridine (1 ml) dans le xylène (10 ml) et on chauffe au reflux sous azote pendant 1 heure et demie. On refroidit le mélange réactionnel, on dilue avec du benzène et on lave succesivement avec IIC1 N, NalICO3 dilué et eau. On élimine le solvant et on dissout le résidu dans une solution d'acide p-toluène sul- fonique (0,06 g) dans le dioxane (12 ml) et on chauffe à 70'C pendant 25. 247921 4 25. minutes, On refroidit le mélange réactionnel et on ajoute de l'eau et de l'éther. On sépare les phases, on lave la phase organique avec du bicarbonate de sodium dilué, eau et solution saline. On élimine le sol- i i vant et le résidu (composé 2 o X =Y =11, R = méthyle, et R = benzoyle) est dissout dans un mélange d'éther (3,0 ml) et hydroxyde de potassium méthanolique 0,4 M (5 ml). Après 2 heures et demine à la température ambiante on ajoute de l'eau et de l'éther et on sépare la phase orga- nique et on lave plusieurs fois avec de l'eau. On fait évaporer le solvant et on chromatographie le résidu sur une colonne de gel de silice (1 x 15cm) on élue avec 25% acétate d'éthyle/hexane pour obtenir le inéthyl 31-hydro- xy-25-homo-5,7-choladiène-25-oate (3, X=Y=11, R=Me) (0,08 g, 0,2 mmole): UV 294, 282, 272, 264 (épaule) nm: RPN 0,67 (s, 18-CH3), 1,01 (d,j=6,5 Hz, 21-CH3), 1,04 (s, 19-Cil3), 3,72 (s, -C02CH3), 5,43, 5,64 (2m, 611, 7H11). b) Méthyl 3P-hydroxy-25-homo-9,10-secochola-5,7,10(19)-triène-25-oate. (Ester méthylique de l'acide 26,27-dinorvitamine D3-25-carboxylique, composé V, R = CH3). Une solution de méthyl-3D-hydroxy-25-homo-5,7-chola- diène-25-oate (28 mg) dans 20% éthanol/benzène (155 ml) est irradié avec lumière UV sous atmosphère d'azote, refroidi dans un bain de glace, pen- dant 7,5 minutes. On fait évaporer les solvants et on purifie le résidu par CLPH (10,6 x 25 cm colonne de gel desilice en microparticules, dévelop- 2- pé avec 1,5% de/propanol/hexane) pour obtenir la matière de départ (23 mg) et l'ester prévitamine désiré (5 mg): UV> max 260, 7min 233 nlm, l x/- Min maxI min 1,5. min L'ester de prévitamine est chauffé au reflux sous azote dans. l'éthanol pendant 4 heures et demie pour effectuer l'isomérisation de la double liaison et obtenir l'ester de vitamine V correspondant (R=CH3): UV max 264, T min 228, kmax/ min 1,8; MIN 0,54 (s, 18-CH3), 0,94 (d,j = 6,2 Hz, 21-CH3), 3,67 (s, -C02 CH3), 3,94 (m, 3a-H), 4,82, 5,05 (2m, 3 2 3' 19-11's), 6,03, 6,23 (ABq, j = Hz, 6H, 711); spectre de masse m/e intensité relative) 400 (0,85, h+), 382 (0,07 M - I120), 369 (0,09 M+ OCH3), 367 + 2 3 (0,35, M -H20 -C1l3), 341 (0,10, M - CO2Cil3), 271 (0,16, M+ - chaîne la- térale), 253 (0,21, M+ - 1120 - chaîne latérale), 166 (0,31), 158 (0,76), 136 (1,00), 118 (0,91). Le composé est homogène à la CLPII. EXEMPLE 4 Préparation de l'ester de la-hvdroxyvitamine D.Vi (R = CI) par le procédé cyclovitamine. a) Ester méthylique de l'acide 6-mèthoxy-3,5-cyclo- 26,27-dinorvitamine D -25-carboxylique (4, X = il, R = Z = méthyle). L'ester méthylique de l'acide méthyl 26, 27-dinorvitamine D -25-carboxylique (V, R = méthyle) (25 mg) dans de la pyridine sèche (0,3 ml? est traité avec du chlorure de p-toluène sulfonyl (50 mrg) pendant 72 heures,dans le noir à la tempéra- ture de 5.C. On ajoute le mélange rédactionnel à 10/, de bicarbonate de sodium sur de la glace. On extrait la phase aqueuse avec de l'éther/chloro- forme 4:1) plusieurs fois. Les phases organiques combinées sont lavées avec de l'acide chlorhydrique, du bicarbonate de sodium dilué, de l'eau et du chlorure de sodium saturé et séchées sur du sulfate de magnesium. L'évaporation du solvant donne le dérivé 3-0-tosyl qui en CCM (chromato- graphie en couche mince) présente une tache (40% acétate d'éthyle/hexane, Rf 0,62). On rechauffe tout l'échantillon de tosylate à 550C, sous azote, dans un mélange de méthanol sec (0,5 mn, de bicarbonate de sodium et de dichloromiéthane (0,1 ml). On ajoute du solvant supplémentaire si nécessai- re pour compenser l'évaporation. Après 11 heures et demie on ajoute de 2D l'éther et de l'eau. On sépare les phases, on lave la phase organique plusieurs fois avec de l'eau et avec une solution saturée de chlorure de sodium et on sè.che sur du sulfate de magnesium. La CCM indique une tache majeure ayant un Rf de 0,42 (20% acétate d'éthvle/hexane) représen- tant l'ester cyclovitamine 4 (R = Z = Me, X = 1). b) Ester méthylique de l'acide la-hydroxy-6-méthoxy-3,5-cyclo-26,27- dinorvitamine D -25-carboxylique (5, R = Z = méthyle, X = hydrogène). A 2, 8 mg de dioxyde de selenium dans 1 ml de dichlorométhane sec, à O C, on ajoute 11 pl d'hydroperoxyde de t-butyle. On agite le mélange pendant minutes sous azote. On ajoute une portion de cyclovitamine 4 (R = Z = méthyle, X = H) dans du dichlorométhane (1,0 ml). On agite le mélange pendant 10 minutes à O"C et pendant 7 minutes à la température ambiante et on refroidit avec une solution de bicarbonate de sodium saturée. On extrait le mélange réactionnel plusieurs fois avec le dichlorométhane et on lave les phases organiques combinées avec de l'eau, avec une solution saturée de chlorure de sodium et on sèche sur du sulfate de magnesium. On purifie le résidu par chromatographie en couche (507 acétate d'éthyle/ hexane) pour obtenir le composé la-hydroxy-5 (8,5 mg, Rf 0,35) et le dérivé 1-ceto correspondant (5,8 mg/Rf 0,58). Le composé 5 (R = Z = Me, X = H) est homogène à la CCM. c) Ester méthylique.de l'acide la-acétoxy-6-méthoxy-3,5-cyclo-26,27-di- norvitamine D3-25-carboxylique (6, R = Z = méthyl, R = acétyle, X = hydrogène). la-hydroxy-cyclovitamine 5 (R-Z-Me, X=H) (8,5 mg) et de l'anhydride acétique (0,1 ml) sont chauffés dans de la pyridine sèche (0, 2 ml) à 55 C, sous azote, pendant 1 heure et demie. On verse le mélange réactionnel sur de la glace et on;ajoute du carbonate de potas- sium jusqu'à ce que le dégagement gazeux cesse. On extrait le mélange avec de l'éther, on le lave avec de l'eau et on sèche avec du sulfate de magnesium. L'évaporation du solvant donne 8,7 mg de produit l-acétoxy (407 acétate d'éthyle/hexane, Rf 0,55). d) Réduction de la 1-céto-cyclovitamine. Le 1-oxo-cyclovitamine D ester obtenu comme décrit dans l'exem- ple 4b (5,8 mg) est dissous dans le tétrahydrofurane (0,6 ml) et méthanol (0,1 ml) auquel on ajoute NaBlI4 (1 mg). Lorsque la réaction est complète (une demi-heure) on ajoute de l'eau et de l'éther et on sépare les phases. L'évaporation du solvant après traitement fournit un la-hydroxy-cyclo- vitamine D ester 5 (R=Z-le, X=u) qu'on purifie par chromatographie en couche préparative (50%, d'acétate d'éthyle /hexane, Rf 0,30). e) Ester méthylique de l'acide la-acétoxy 26,27-dinorvitamine D3-25- carboxylique (7, R=mnéthyle, R = acétyle, X = hydrogène). Une solution d'ester méthylique de l'acide la-acetoxy-6-méthoxy-3,5-cyclo-26,27-dinor- vitamine D3-25-carboxylique (préparée comme indiqué sous c ci-dessus) (8, 7 mg) dans du 1,2-diméthoxy-éthlanol sec (0,3 ml) est traitée avec de l'acide formique (0,1 ml) à 55 C sous atmosphère d'azote pendant 15 minu- tes. On verse le mrlange réactionnel sur de la glace et on ajoute du bicarbonate de sodium jusqu'à ce que l'effervescence cesse. On extrait le produit avec de l'éther, on le lave avec de l'eau jusqu'à ce que la phase aqueuse ait un pHli de 6, on le lave avec du chlorure de sodium saturé et on sèche sur du sulfate de magnesium. Ce produit (le 3-formiate- ester) dans le tétrahydrofurane (0,1 ml) et méthanol (0,3 ml) est traité avec plusieurs gouttes d'une solution saturée de bicarbonate de sodium pendant 5 minutes à la température ambiante. On ajoute de l'eau et de l'éther et on sépare les phases. On lave la phase éthérée avec de l'eau, puis avec une solution saturée de chlorure de sodium et on sèche sur du sulfate de magnésium. Le résidu obtenu après évaporation du solvant est purifié par chromatographie en couche. La bande ayant un Rf de 0,2 con- tient un mlange de 7(R=Me, Ractyle, XH) et le 5,6-trans-isolre tient un mélange de 7(R=Me, R ='acétyle, X=1) et le 5,6-trans-isomè,re correspondant. Le mélange est séparé par CLN! (2,57 2-propanol/hexane, colonne de gel de silice à microparticules) avec deux passes à travers la colonne (recyclage) pour obtenir 7 (2,0 mg) et le 5,6-trans-isomère correspondant sous forme pure. f) Ester méthylique de l'acide la-hydroxy-26,27-dinorvitamine D3 -25- carboxylique (VI, R=Ctl3). Une solution d'ester acétique 7 (R=Me, Rl=acé3. tyle, X=ll) dans l'éther (0,2 ml) est traitCeavec de l'hydroxyde de potassium 0,1 M méthanolique (0,075 ml) à la température ambiante. Après environ I heure la réaction est complète. On ajoute de l'eau et de l'éther et on sépare les phases. On extrait la phase aqueuse avec de l'éther. Les phases éthérées combinées sont lavées avec de l'eau et avec une solu- tion de chlorure de sodium saturée. L'évaporation de l'éther donne le produit désiré VI (R=Me) (1,87 mg) qui présente une tache lors de l'ana- lyse CCMi (chromatographie en couche mince) et se montre homogène lors de l'analyse CLPH (7,57 2-propanol/hexane): UV - 265, 7-. 228 nm, max min *15 max / -min 1,72; RMN O 0,54 (s, 18-CH3),0,94 (d,j=6,2 Hz, 21-CH3), 3, 63 (s,-C02C113), 4,21 (mni, 3a-H), 4,40 (m, 1D-H), 4,96, 5,28 (19 E et Z=H), ,97, 6,32 (AB quartet, j = 10,8 hlz, 6 et 7= H11); spectre de masse m/e (composition, m/e calculé, intensité relative) 41fi930(C26H114o04, 416.2927, 0,10), 398. 2812 (C263803, 398.2821, 0,09), 380.2694 (C26126), 380.2716, 0,22), 152.0840 (C911202, 152.0837, 0,29), 134.0745 (C Hil lO, 134.0732,1, 00). Le 5,6-trans isomère correspondant, l'ester méthylique de l'acide lahydro- xy-5,6-trans-26,27-dinorvitamine D3-25-carboxylique est obtenu par hydro- lyse du composé 5,6-trans-la-acétoxy dans les mêmes conditions. EXEMPLE 5 Préparation de l'ester la-hydroxyvitamine D3 VI (R=Cl3) à partir de l'ester de l'acide homocholénique. a) Néthyl-25-homo-l,4,6-cholatriène-3-one-25-oate (,, R = méthyle, X = hydrogène). On chauffe au reflux pendant 20 à 24 heures un mélange d'ester méthylique de l'acide homocholénique et de la 2,3-dichloro-5,6-dicyano-l, 4- benzoquinone (excès 3,5 molaire) dans du dioxane sec. On refroidit et on filtre le mélange réactionnel. Le résidu obtenu après l'évaporation du solvant est filtré à travers une colonne d'alumine neutre et élué avec chlorure de méthylène. Le produit obtenu est purifié par chromatographie sur du gel de silice et élué avec un mélange acétone/hexane puis utilisé tel quel pour le stade suivant. à b) Acide l-2a-oxido-25-homochola-4,6-diène-3-one-25-oic (9, X=H). Le trienone 8 obtenu selon le stade a dans éther/méthanol est 2479Z14 hydrolysé avec une solution aqueuse d'hydroxyde de potassium pour le transformer sous forme d'ester. Le mélange refroidi est dilué avec 1i20 et extrait avec de l'éther pour éliminer les matières organiques solubles. La phase aqueuse est ensuite acidifiée avec HC1 N et est extrait complète- ment avec plusieurs portions d'éther Les phases organiques combinées sont lavées avec de l'eau et avec une solution saline et séchées sur du sulfate de magnesium. Une portion du résidu obtenue après évaporation du solvant équivalant à 3,6 mmole de stéroide est dissous dans du méthanol de façon que la concentration finale dn stéroïde soit de 0,05 à 0,1 M. On ajoute 1O à cette solution de l'hydroxyde de sodium à 10% (0,45 ml) et il202 à 30% (2,5 ml)et on laisse au repos à la température amibiante pendant 16 heures le mélange résultant.Le mélange réactionnel est acidifié avec de l'acide dchlorhydrique méthaiiolique, le solvant est concentré et le précipité re- présente le dérivé lac,2a-époxy désiré, 9 (X = H) qux'on recueille et qu'on utilise pour le stade suivant. c) Méthyl la,3P-dihydroxy-25-hiomo-5-cholene-25-oate 1,3-diacétate (11, R = Me, R = acétyle, X = hydrogène). Epoxydienone 9 (X=H1) (0,25 g) 4is- sous dans du tétrahydrofurane sec à -33 C est ajouté en une portion à une solution de sodium (20 fois en excès) dans de l'ammoniaque liquide jusqu'à une concentration en stéroide final de 0,015 M. Après dix minutes on ajoute 2,5 g de chlorure d'ammonium en petites portions en l'espace de 1 heure: On laisse évaporer l'ammoniaque et on ajoute au mélange réactionnel, avec précaution, HC1 N et de l'éther. On sépare les phases et on extrait la phase aqueuse plusieurs fois avec de l'éther. On lave les phases organiques combinées avec de l'eau et avec une solution saline et on sèche sur du sulfate de magnesium. La solution est concentrée et traitée avec un excès de diazométhane dans l'éther. On fait évaporer le solvant et on purifie le résidu par chromatographie sur du gel de silice et on élue avec acétone/hexane pour obtenir l'intermédiaire la-hydroxy 10 (X=H11, R=méthyle). Ce composé la-hydroxylé est chauffé (6o0 C) avec anhydride acétique/pyridine (1:1) jusqu'à acétylation complète (environ 3 heures, contrôlée par CCM). On verse le mélange sur de la glace. On ajoute de l'éther et du carbonate de potassium jusqu'à cessation d'effervescence. On sépare les phases et on lave la phase aqueuse avec IIC1 N, du bicarbo- nate de sodium dilué, de l'eau, solution saline (saumure) et on sèche sur du sulfate de sodium. L'évaporation du solvant fournit l'ester 11 (R=mé-thyle, R = acétyle, X = il). d) Méthyl la,3a-dihydroxy-25-homo-5,7-chloladiene-25-oate 1,3-diacétate (12, R = méthyle, R1:acétyle, X hydrogene). Composé 11 (X =11) (1,2 mmole) ,hicarbonate de sodium (500 mg) et 1,3-dibromo-5,5-diméthyl hydantoine (0, 84 mmio]e) sont chauffés à 750C sous atmosphtre d'azote pendant 20 minutes. On refroidit le mélange réactionnel, on le filtre et on élimine le solvant. On dissout le résidu dans du xylène (15 ml) et dans la collidine (3,5 ml) et on chauffe au reflux sous atmosphère d'azote pendant 1 heure et demie. On ajoute du benzène et on lave les phases organiques avec IICI N, du bicarbonate de sodium dilué, la saumure et on sèche sur du sulfate de sodium. Le résidu.-obtenu après évaporation du solvant est dissout dans le dioxane (14 ml) auquel on ajoute 65 mg d'acide p-toluéne sulfonique et on chauffe à 70 C sous atmosphère d'azote pendant 35 minutes. On ajoute de l'éther et on lave la phase organique avec une solution diluée de bicarbonate de sodium, de l'eau, une solution saturée de chlorure de sodium et on sèche sur du sulfate de sodium. Le résidu obtenu après évaporation du solvant est purifié par chromatogra- phie en couche mince sur gel de silice, élué deux fois avec 107 acétone/ hexane pour obtenir le produit 12 (R = Mle, R = acétyle, X = R). e) Ester méthylique de l'acide la-hydroxy-26,27-dinorvitamine D3-25-car- boxylique (VI)(R=le). Une solution de 5,7-diène diacétate 12 (RI = acétyle, X =11H, R = Ci3) (30 mg) dans 20% éthanol/benzène (150 ml) sous azote, à O'C est irradiée pendant 20 minutes dans un récipient en quartz avec une lampe Ilanovia 8A36 de 125 watts équipée avec un filtre Corex. Le solvant est évaporé et le produit récupéré est dissous dans l'éthanol et chauffé au reflux sous atmosphère d'azote pendant 5 heures. Le solvant est élimi- né et le résidu est dissous dans l'éther et dans l'hydroxyde de potassium méthanolique 0,1 M (2:1) et on le laisse au repos à la température ambian- te jusqu'à hydrolyse complète (contrôlée par CCM). On ajoute de l'eau et de l'éther et on sépare les phases. La phase aqueuse est extraite avec de l'éther. Les extraits éthérés combinés sont lavés avec de l'eau et avec de la saumure. L'évaporation du solvant fournit un mélange de produits duquel on sépare l'ester de vitamine D désiré VI (R=C113) par chromatogra- phie CLPHl (colonne de gel de silice à microparticules 0,6 x 25 cm) utili. sant 7% 2-propanol dans l'hexane comme solvant d'élution. EXEMPLE 6 Préparation de l'ester 24-hydroxyvitamine D VII (R=méthyle). a) Condensation d'aldol en céto-ester (14 (R = méthyle). A 20 ml de di- isopropylamiile dans 14 ml de Létrahydrofurane sec, refroidi à 0 C on 2479Z14 ajoute 8,9 ml de n-butyl lithium (1,6 M dans l'hexane); On ajoute ensuite goutte à goutte 0,5 ml d'acide pyruvique dans le tétrahydrofurane (1,0 ml) et on agite la solution à 0 C pendant 1 heure. On refroidit le mélange à -78 C et on ajoute 2,0 g de 22-aldéhyde (13) dissous dans 10 ml de tétra- hydrofurane sec. Après 1 heure on laisse rechauffer la solution à 0 C et on l'agite pendant 3 heures encore. On fixe la réaction avec 1 ml d'acide acétique glacial, on dilue avec de l'éther et Il 20 et on sépare les couches. On lave la phase organique avec HIC1 N, de l'eau et une solution saturée de NaCl dans l'eau. On sèche la couche organique sur du Na2SO4 anhydre et on le concentre sous vide. On reprend le résidu dans l'éther et on le traite avec du diazométhane éthéré pour transformer l'acide dans ses esters méthyliques. L'huile résultante est chromatogra- phiée sur du gel de silice (74 à 147 microns) avec 5/ acétate d'éthyle dans l'hexane comme éluant pour obtenir le céto-ester 14 ( R = méthyle). b) Réduction du composé 14 en a-hydroxy ester 15 (R = méthyle). A une solution de 1 g de enone (14) dans 30 ml de pyridine sèche, on ajoute 178 mg de NaBlI4 et on agite le mélange à la température ambiante pendant 48 heures environ. On verse le mélange dans l'eau et on l'extrait avec de l'éther. On lave les extraits combinés avec IIC1 N, NaHCO3 N, une solution saturée de NaCI dans l'eau et on sèche sur du Na2SO4 anhydre. On concen- tre la couche organique sous vide, on la transforme en une huile, on la chromatographie sur du gel de silice (74-147 microns) utilisant 5% d'acétate d'éthyle dans l'hexane comme éluant et 800 mg de a-hydroxy ester 15 est obtenu. c) Solvolyse du 15 en ester 24-hydroxy-homocholénique 16 (R = méthyle, Rl=acétyle). Une solution de 648 mg de composé 15 dans 30 ml d'acide acéti- lue glacial est rechauffé à 70 C pendant 16 heures. On refroidit la solu- tion et on la neutralise avec du NaOll solution aqueuse à 10% (glacée). La solution est ensuite extraite avec de l'éther. On lave les extraits combinés avec 1IC1 N, NaHlICO3 N, solution aqueuse saturée de NaCI et on sèche sur Na2S04 anhydre et on le concentre sou/vide. Le produit brut est chromatographié sur gel de silice (74-147 microns) avec 5%. d'acétate d'éthyle/hexane comme éluant, on obtient le méthyl 3f, 24-dihydroxy-25- homo-5-eholene-25-oate 3-acétate (16, ot R = méthyle, R = acétyle),avec un rendement d'environ 80/%. d) Transformation de l'ester 16 en 24-hydroxyvitamine D ester VII (R=mé- thyle). Une solution de 500 mg d'ester 16 (R = acétyle, R = méthyle) dans 3 ml de pyridine est traitée avec 1 ml d'anhydride acétique, à la température ambiante, pendant la nuit et on obtient après le traitement usuel le 3,24-diacétate correspondant. Ce produit (510 mg) est trans- formé en méthyl -3 -24-dilhydroxy-25-homo-5 7-choladiene-25-oate 3,24- diacétate utilisant le procédé décrit dans l'exemple 3 a). L'hydrolyse de ce diacétate(suivant l'exemple 3 a)conduit au méthyl-3-D-24-dihydroxy- -homo-5,7-choladiene-25-oate (100 mg) qu'on purifie sur une courte colonne de gel de silice (1 x 20 cm, 74-147 microns), flué avec de l'acé- tate d'éthyle/hlexane (1:4), ou par chromatographie en couche rince (0,75 cm sur plaque gel de silice, acétate d'éthyle/hexane). En soumettant cet intermédiaire 5,7-diène à une procédure d'irradiation de l'exemple 3 b on obtient l'ester 24-hydroxyprévitamine D correspondant qu'on purifie par CLPII (0,6 x 25 cm, colonne de gel de silice, 52 2-propanol/hexane commle solvant) et on transforme par-chauffage comme décrit dans l'exemple 3b en ester 24-hydroxyvitamine D désiré VII (R = méthyle). On contrôle la pureté par CLPI et si nécessaire on purifie le produit par CLPII uti- lisant les conditions indiquées pour la purification de la prévitamine. EXEMPLE 7 Préparation de l'éthyl 3P, 24-dihydroxy-25-homr:-9,1,-seco-5,7,,lo (19)-cholatriène-25-oate(ester éthylique de l'acide (24-hydroxy-26;27-di- norvitamine D3 25-carboVylique)(composé VII, R=éthyle) à partir du 24,25- dihydroxy-cholesterol: (méthode A). a) 30-hydroxychol-5-ene-24--al(l18, Y H). A une solution de méthanol (10 ml) de 1,5 g de 24,25-dihydrocholesterol (17, Y = 11) (préparée comme décrite par Lam et ai, Biochemistry 12, 4851 (1973)) on ajoute une solu- tion méthanolique saturée de métaperiodate de sodium. AprZ's 2 heures à la température ambiante, on dilue le mélange réactionnel avec de l'eau et on extrait avec du chloroforme. On lave les extraits organiques avec de l'eau et avec de la saumure, on sèche sur du carbonate de potassium et on fait évaporer pour obtenir environ 1 g de 24-aldéhyde désiré (18, Y = i). * Le 24-aldéhyde est transformé en son dérivé 3-0-si-lyl éther, de façon habituelle: réaction de l'aldéhyde en solution de tétrahydrofu- rane/pyridine (1:1) avec hexaméthyldisilazane (1,5 ml) et trimréthychloro- silane (l ml) à la température ambiante pendant une demi heure et on obtient le 3-0-trimtthylsilyl qui dissout dans le tétrahydrofurane est séché rigoureusement avec K2CO3 puis on l'utilise comme solution en tétra- hydrofurane pour le stade suivant. b) Ethyl 30, 24-dihydroxy-25-homochol-5-en -25-oate (19, Y = H, R = Et). A une solution du sel de lithium du 2-mercapto-l,3-dithiane dans le tétrahydrofuranne (préparé comme décrit par Seebach, Angew. Chem. 79, 469470 (1967); Ellison et al, J. Org, Chem. 37, 2757 (1972)) maintenue à 78 sous une atmosphère d'argon, on ajoute, goutte à goutte, une solution dans le tétrahydrofurane de 24-aldéhyde-3-O-silyl éther (préparé comme indiqué sous a ci-dessus) (environ 0,8 mole d'aldéhyde par mole de réactif orthothioester de lithium). Après l'addition de l'aldéhyde, on laisse réchauffer le mélange à la température ambiante et on le traite par addi- tion d'eau et extraction du produit par CHC13 On lave la solution chloro- formique avec une solution de KOH diluée puis avec de l'eau et on sèche sur Na2SO4. Le 24-hydroxy-25-orthothioester intermédiaire obtenu de cette façon est ajouté ensuite à un mélange de HgCl2 (3,5 équivalents) et UgO (2,0 équivalents) dans de l'éthanol à 95% pour réaliser l'éthanolyse de l'orthothioester en 25-ester carboxylique (Ellison et ai ci-dessus), On élève la température à 500 C et on agite le mélange pendant la nuit sous atmosphère d'argon. Les solides précipités sont filtrés et lavés avec CH2C12 et on dilue le filtrat avec de l'eau, on l'extrait avec CH2C12' on lave avec du chlorure d'ammonium, bicarbonate de sodium, eau et saumure, et on sèche la solution sur Na2SO4 et on évapore le solvant pour obtenir le produit d'hydrolyse désiré, à savoir éthyl 35,24-dihydroxy-25-homochol- -ene-25-oa te. c) Transformation de l'éthyl 3t,24-dihydroxy-25-homochol-5ene-25-oate en ester éthylique de l'acide 24-hydroxy-26,27-dinorvitamine D3-25-oic (VIII, R = éthyle) est réalisée en soumettant l'ester 19 (Y = H, R = éthyle) à la séquence de stadesdécrite dans l'exemple 6d, dans les conditions décrites dans ledit exemple. EXIEMPLE 8 Préparation de l'éthyl 35-24-dihydroxy-25-homochol-5-ene-25-oate (19, Y = H, R = éthyle) à partir du 24,25-dihydroxycholestérol (Méthode B) . a) Préparation du 24-thioacétal (20), Y = H). A une solution chloroformi- que du 24-aldéhyde 18 (Y = H) (1 g) préparé comme décrit dans l'exemple 7a on ajoute un excès de 1,3-dithiopropane (2 ml) et on agite le mélange à la température ambiante. Après environ 30 minutes, on refroidit le mélange dans un bain de glace et on ajoute 1 ml d'éthérate de BF3 et on laisse la solution résultante au repos pendant la nuit au froid. On lave la solution froide avec une solution aqueuse de KOHI à 57, puis avec de l'eau et on sèche sur K2C03. L'évaporation du solvant fournit le dérivé 24,24- dithioacétal désiré 20 (Y = H11). Ce produit est transformé en son dérivé 3-0-triméthyl silyléther comme décrit dans l'exemple 7a. b) Ethyl 3,-hydroxy-24-oxo-homochol-5-en -25-oate (21, Y = 11, R = éthyle) . Une solution (0,1 M)de dérivé 3-0-silyl thioacétal obtenue comme décrit ci-dessus dans du tétrahiydkofurane sec est maintenue à -25 C sous atmosphère d'argon et traitée avec 1,5 équivalent de n-butyl lithium dans l'hexane (solution 1,5 M) et on agite le mélange pendant 3 heures et demie pour obtenir le dérivé 24-lithio désiré. On baisse la température à -70'C et on ajoute lentement un grand excès de chlorofor- miate d'éthyle (cICOOEt) sous forme de solution dans du tétrahydrofurane sec et on agite pendant 7 heures. On laisse ensuite se réchauffer à la température ambiante. On ajoute de l'eau et on extrait le mélange avec CIIC13. On lave l'extrait chloroformique avec du KOOH dilué et 1120 et on sèche puis on évapore pour obtenir le dérivé 25-carboéthoxy-24,24- thiocétal. Le thiocétal est hydrolysé directement par addition d'un actLonitrile de solution du produit ci-dessus (1 rmmole) à une solution en excès de N-chloro- succinimide (5 mmole) et AgNO3 (4 mmole) dans l'actonitrile/110 (5:1). Après 1 heure à 50'C on ajoute une solution saturée de NaCI, on élimine le précipité par filtration et on lave le filtrat après dilution avec Ci 2C12 avec du bisulfite de sodium, avec une solution de bicarbonate de sodium suivie d'eau et de saumure. Après séchage et évaporation du solvant, le 24-céto-25-éthylester désiré (21, Y = 11, R = Et) est obtenu. c) Ethyl 3D,24-dihydroxy-25-homochlol-5-en -25-oate (19, Y = H, R = Et). Une solution méthanolique (10 ml du dérivé 24-céto (100 mg) ob- tenue comme indiqué sous b ci-dessus est traitée avec un excès de NaBH4 à la température ambiante pendant 45 minutes. L'addition d'acide acéti- que aqueux diluée et extraction avec chlorure de méthylène fournit après chromatographie sur gel de silice développé avec acétate d'éthyl/hexane mtg de produit 24-hydroxy-25-ester désiré (19, Y = 11, R = Et). EXEMPLE 9 Préparation de l'ester éthylique de l'acide la,24-dihydroxy 26,27-dinorvitamine D3-25-carboxylique (VIII, R = Et). (Ethyl la,3P,24- trihydroxy-25-homo-9,10-seco-5,7,l10 (19)-cholatriene-25-oate) à partir de la la,24,25-trihydroxy-cholesterol. Une solution méthanolique de la,24,25-trihydroxy cholesterol est soumise à une coupure par periodate comme dans l'exemple 7a pour obtenir l'intermédiaire la-hydroxy-24-aldéhyde (18, Y = 011O). Cet aldéhyde est transformé en son 1,3-ditriméthylsilyléther utilisant les conditions indiquées dans l'exemple 7a. Le silyléther est ensuite traité avec du 2lithio-2-méthyl mercapto-l,3-dithiane exactement comme indiqué dans l'exemple 7d et le 24-hydroxy-25-orthothioester résultant est soumis à l'éthanolyse en utilisant lesiconditions indiquées dans l'exemple 7b pour obtenir l'éthyl-la,3P,24-trihydroxy-25-homochol-5-en- -oate (19, R = éthyle, Y = 011O). Après l'acylation de ce triolester o10 avec un excès d'anhydride acétique dans la pyridine à 80 C pendant 4 heures, le 1,3,24-triacétate est soumis au traitement indiqué dans les exemples 5d et 5e pour obtenir le produit désiré, c'est-à-dire l'ester éthylique de l'acide la,24-dihydroxy-26,27-dinorvitamine D3-25-carboxy- lique (VIII, R = éthyle) la seule différence étant que le produit final est purifié par CLPH (colonne de gel de silice de 0,6-x 25 cm) avec 10% de 2-propanol dans l'hexaie comme éluant. EXEMPLE 10 Préparation de l'ester éthylique de l'acide la,24-dihydroxy- 26,27-dinorvitamine D3-25-carboxylique (VIII, R = éthyle) en passant par les intermédiaires cyclovitamine. L'ester éthylique de l'acide 24-hydroxy-26,27-dinorvitamine D3- -carboxylique (VII, R = éthyle) obtenu par l'une quelconque des synthèses des exemples 7 ou 8 est tosylé en position C3 puis solvolysé dans MleOl/NaOAc exactement comme décrit dans l'exemple 4a pour fournir (environ 40%) d'ester éthyli.ue de l'acide 24-hydroxy-6-méthoxy 3,5- cyclo-26,27-dinorvitamine D3-24-carboxylique (composé 4, R = Et, X = OH, Z = Me). L'oxydation de ce produit avec SeO2 en présence d'hydroperoxyde de t-butylcomme indiqué en détail dans l'exemple 4b,fournit le dérivé lahydroxy correspondant (R = Et, X = OH, Z = Me) avec un rendement d'environ 50%. L'acétylation de ce produit, comme dans l'exemple 4c, donne l'intermédiaire 1,24-diacétate qui est solvolysé dans l'acide formique exactement comme décrit dans l'exemple 4e pour fournir un mélange de 5,6-cis et 5,6-trans 3-0-formyl vitamine D esters. Les groupes formyle sont enlevés directement par une rapide hydrolyse basique exactement comme dans l'exemple 4e et on obtient un mélange d'ester éthylique de l'acide la-24-diacétoxy-26,27-dinorvitamine D3-25-carboxylique et l'iso- mère 5,6-trans correspondant. Les isomères 5,6-cis et trans sont séparés sur des plaques de gel de silice (acétate d'éthyle/hexane) et CLPH (colonne de gel de silice, 0,6 x 25 cm; 3,5"Z 2-propanol/hexane) et l'iso- mère 5,6-cis (composé 7, R = Et, R = X = acétyle) est hydrolysé dans un alcali dilué,exactement comme dans l'exemple 4f,pour fournir le pro- duit désiré, à savoir l'ester éthylique de l'acide la-24-dihydroxy-26,27- dinorvitamine D3-25-carboxylique (VIII, R = éthyle) sous forme pure. 3. (De petites quantités d'impuretés, si présentes, sont éliminées par hlh, atugraphie CLPII sur gel de silice (cplonne 0,6 x 25 cim) utilisant IO7o de 2-propanol/hexane comme solvant). L'hydrolyse du composé 5,6-trans lrxacétoxy dans des conditions identiques fournit l'ester méthylique de o10 l'acide la-24-dihydroxy 5,6-trans 26,27-dinorvitamnine D3-25carboxylique. REVENDICATIONS 1. Composé ayant la formule COOR )OR ou R1 HO o chacun de R1 et R2 désigne hydrogène ou hydroxy et R dési- gneun alkyl inférieur ou un dérivé protégé de ce dernier. - 2. Composé ayant la structure: K COOR R R40 o chacun de R1 et R2 désigne hydrogène, hydroxy ou 0-acyle avec la condition que R1 et R2 ne peuvent tous deux désigner hydrogène, R désigne un alkyle inférieur et R4 désigne hydrogène ou acyle. 3. Composé ayant la structure CO'OR R4 O o R, R1, R2 et R4 sont comme définis comme dans la revendi- cation 2. 4. Composé ayant la structure générale R, R40 ', 'IV' o R, R1, R2 et R4 sont comme définis dans la revendication s 5. Composé ayant la structure R2 COOR ZO ,' R1 o R1 et R2 sont comme définis dans la revendication Z et Z désigne hydrogène ou alkyle inférieur.