FR 2479000 A1 19811002 FR 8106076 A 19810326 La présente invention a pour objet un vaccin contre la brucellose, maladie du bétail. De récentes recrudescences de brucellose bovine ont soulevé de sérieux doutes en ce qui concerne les pos- sibilités d'éradlcation de la maladie par mise en oeuvre de techniques présentement connues. Bien que l'utilisa- tion classique d'un vaccin obtenu a partir de souche 19 vivante de Brucella abortus ait permis de diminuer énor- mément l'incidence de la maladie au cours des quelques dernières décennies, il apparait maintenant que soit des vaccins perfectionnés, soit des techniques d'épreuve perfectionnées pour l'établissement du diagnostic peuvent être nécessaires pour mener à bonne fin le processus d' éradication. On sait maintenant qu'il existe deux types d'immunité permettant de conférer une résistance à la ma- ladie. Le premier type de protection (l'immunité humora- le) est conféré par des anticorps apparus dans la circu- lation et dans des sécrétions du corps. Un second type d'immunité est conféré par l'intermédiaire de cellules entières du sang (les lymphocytes) et est donc, pour cette raison, considéré comme étant une "immunité conférée par l'intermédiaire de cellules". De récentes études ont montré que c'est ce second type d'immunité, plutôt que l'immunité humorale, oui est responsable de la résistance à la brucellose. Bon nombre des problèmes concernant l'éradica- tion de la brucellose résultent du fait que des taux d'anticorps persistants provenant du vaccin normal de la souche 19 originaire du veau interfèrent avec les techni- ques de laboratoire utilisées pour établir le diagnostic sur des animaux naturellement infectés. Des tests norma- lisés d'agglutination dans des tubes et sur des plaques, qui permettent d'enregistrer des titres d'anticorps ac- crus et qui rendent très indésirables les techniques d'im- munisation de bestiaux adultes dans des troupeaux infec- tés, ne sont pas avantageu:7 car il n'est pas facile de distinguer des animaux immunisés des animaux infectés. -l coQnvient aussi de souligner que la protection résul- tant d'une vaccinationr à partir de souche 19 n'est effi- cace qu'à 65 à 75 % seulement. Une souche 19,qui stimule aussi bien l'immunité humorale aue l'immunité conférée par l'intermédiaire de cellules (en anglais: cell-mediated immunity, que les spécialistes désignent par l'abréviation CMI), est tout particulièrement désavantageuse et son utilisation est à proscrire sur des veaux dans des zones reconnues saines, et il ne convient pas non plus pour lutter contre la bru- cellose sur des vaches dans des troupeaux fortement infec- tés, et ce en raison de titres faussement positifs. Des tests sérologiques ordinairement utilisés permettent de déceler la présence d'anticorps humoraux. Il serait donc très avantageux d'ajouter, à l'arsenal du vétérinaire, un vaccin qui stimulerait la portion CMI de la réponse d'immunisation sans stimuler aussi des anti- corps qui réagissent lors de la mise en oeuvre de tests sérologiques normalisés présentement utilisés. En sti- mulant seulement la CMI, qui est responsable de l'élimi- nation de parasites intracellulaires tels que des Brucel- la, des tests sérologiques présentement en usage indique- raient une exposition à (ou une infection par) B. abortus observable dans la nature, mais n'indiqueraient ni une souche 19, ni d'autres souches vaccinales. Un tel vaccin serait utilisable aussi sur des bestiaux adultes afin de se rendre maitre de la maladie sévissant dans des trou- peaux. Des vaccins comprenant des cellules entières, tuées, de la souche 45/20 de Brucella abortus (en abrégé BA 45/20), qui est une souche robuste, dans des huiles inertes telles que de l'huile de paraffine ou une huile minérale, ont été utilisés hors des Etats-Unis. Ces vaccins ne sont pas complètement satisfaisants pour d'assez nombreuses raisons, et principalement parce qu' ils nécessitent deux doses initiales suivies d'une injec- tion de rappel annuelle [McDiarmid, Ann. Inst. Pasteur 102:792-800, et Hendricks et al., U.S. Department of Agriculture, Animal Health Division Staff Report, 1966]. En outre, on observe communément des réactions nuisibles, dans la région oh l'on a pratiqué l'inoculation, avec certains vaccins disponibles dans le commerce (du type émulsion eau dans l'huile). Des vaccins à base de cellules vivantes, de cellules atténuées, de cellules tuées et d'antigenes cel- lulaires sont communément utilisés ou ont été signalés. Aucun n'est complètement satisfaisant. Il existe donc un réel besoin d'un vaccin perfectionné, utilisable en toute sécurité et donnant des résultats réguliers, et qui soit dépourvu des inconvénients susmentionnés. La découverte se trouvant à la base de la pré- sente invention a permis la production de vaccins ne sou- levant pas les problèmes décrits ci-dessus Ils confè- rent la CMI et n'interfèrent donc pas avec des modes opératoires ayant recours à des tests sérologiques norma- lisés qui aboutissent à des réponses faussement positives à cause des anticorps circulants apparus à la suite de vaccinations du type de celles pratiquées sur des veaux. Les vaccins selon l'invention comprennent des cellules entières, tuées, d'une souche 45/20 de Brucella abortus (BA 45/20) accompagnées d'un adjuvant particulier et dans un véhicule immmunologiquement acceptable. BA 45/20 est une souche robusteo Le rapport en poids des cellules à l'adjuvant est de préférence compris entre 1/1 et 20/1. Les adjuvants présentement préférés sont au moins un mono- ou di-mycolate de tréhalose. Ces esters constituent une classe bien connue de composés comprenant des 6-mono- et des 6,6-di-esters d'a,a-D-tréhalose dans lesquels le radical estérifiant contient de 30 à 60 ato- mes de carbone. On peut les obtenir à partir de sources naturelles telles que des mycobacteria, des corynebacte- ria et des nocardia, ou bien on peut en réaliser la syn- thèse. Ces composés sont représentables par la formule suivante: CH2OR H OH H O H H OH H O OH OH H HO O OH H OH H CE20R1 dans laquelle R et R1 peuvent être identiques ou diffé- rents et sont choisis parmi le groupe constitué par hydrogène et R2C- qui est une portion acide mycolique %0 dans laquelle R2 contient de 30 à 90 atomes de carbone, avec cette condition que R et R1 ne peuvent pas être tous deux de l'hydrogène dans une molécule particulière donnée. Les acides mycoliquessont une classe bien connue et carac- térisée de composés qui sont des acides gras à longue chaîne B-hydroxy-a-ramifiée [Asselineau et al., Prog. Chem.Fats Other Lipids 16, 59 (1978); Asselineau et ai., Ann. Microbiol. (Paris) 129A, 49 (1978); Lederer E., Pure and Applied Chemistry 25, 135 (1971); Lederer E., Springer Semin. Immunopathol. 2, 133 (1979)]. Les esters qui sont obtenus à partir de sources naturelles,telles que celles mentionnées ci-dessus, et des souches d'Arthrobacter et de Brevibacterium sont des glycolipides et sont normalement des mélanger dans les- quels les composés sont caractérisés par des acides myco- liques différents. La nomenclature utilisée pour identi- fier ces substances naturelles est quelque peu imprécise. Généralement, les spécialistes qui connaissent le mieux ces substances admettent qu'il s'agit de mélanges natu- rels relativement impurs de dimycolates de tréhalose ob- tenus à partir des sources susmentionnées, et les dési- gnent comme étant un "facteur cord". Normalement, un facteur cord contient environ 90 % d'ester du type dimy- colate et 10 % d'ester du type monomycolate avec une pe- tite proportion de substance étrangère. Des substances du type "facteur cord" isolées à partir de Mycobacteria sp telles que M. tuberculosis, M. bovis ou M. avium et purifiées chromatographiquement par mise en oeuvre de la méthode de Ribi et al., J. Nat. Cancer Inst.o 52, 95 (1974) et Cell Immunol., 16, i11 (1975), sont désignées sous la dénomination P3. Cette catégorie de substances purifiées contient de 95 % à 99 % de dimycolates. Un P3 particulier dont l'utilisation est pré- sentement plus particulièrement préférée en vue de la mise en oeuvre de l'invention est isolé chromatographi- quement à partir de parois cellulaires de Mycobacteria sp. et correspond au troisième pic des lipides libres chromatographiés, Ribi et al., Aninual of N.Y. Acad. of Sci. 277, 228 (1976). On peut se procurer cette substan- ce en s'adressant au Rocky Mountain Laboratory à Hamilton (Montana), Etats-Unis d'Amérique. Les initiales TDM sont à peu près universelle- ment utilisées comme référence générique pour désigner des dimycolates de tréhalose. Il a été montré qu'un facteur cord provenant de diverses sources manifeste une certaine variété d'activi- tés physiologiques. Toutefois, antérieurement à la pré- sente invention, le facteur cord n'a été ni connu, ni suggéré comme adjuvant dans des vaccins entiers tués. Des tentatives en vue d'utiliser des antigènes solubles provenant de BA 45/20 se sont soldées par des échecs. Au cours des recherches qui ont abouti à la mise au point de la présente invention, des cobayes femelles Hartley pesant entre 550 g et 750 g ont été divisés au hasard en groupes principaux et en groupes témoins de cinq animaux chacun. Des cellules entières de BA 45/20 ont été inactivées par la chaleur à 8000 pendant une heure, et on a rompu ces cellules entières par application d'ultra-sons dans de l'eau. On sépare, par centrifugation, et on élimine les débris cellulaires et des matières insolubles, et on fait précipiter la substance antigène en établissant une concentrat-on finale de 10 % d'acide trichloroacétique. On soumet le précipité à une dialyse avec de l'eau distillée, puis on le lyophilise. On prépare des vaccins contenant 300 Mg de substance antigène conjointement avec 150 mg de P3 dans 0,1 ml d'émulsions à 1 % du type huile dans l'eau. On inocule les animaux d'essais par voie intra- dermique dans le cou. Huit semaines plus tard, on injec- te à tous les animaux, par voie intramusculaire, des do- ses unitaires de B. abortus 2308 capables de former 1,04 x 104 colonies; deux semaines après une telle injection, on sacrifie tous les animaux et on réalise des cultures de Brucella à partir de leurs rates. Pour cela, on pèse les rates homogénéisées, puis on en prépare une dilution au 1:5 (poids/volume) avec une solution à 1 % de peptone dans du sérum salin à 0, 5 %. On prépare des dilutions en série de chaque rate sur des plaques _ _ _ _-- couées à l'agar de soja/trypticase., On incube les pla- ques dans une atmosphère à 10 % de C02 à 370C pendant cinq jours avant de compter les colonies de Brucella. On constate que quatre des animaux d'essais sur cinq sont infectés et que tous les animaux-témoins sont in- fectés. On observe aussi, par comparaison avec les animaux-témoins non vaccinés, qu'aucune des préparations antigènes n'est capable de diminuer l'infection d'une manière significative. Par contre, avec les vaccins selon l'invention, on observe une diminution significative de l'infection. Au cours de ces dernières expériences on utilise des cobayes femelles Hartley (350 g - 550 g). On fait croître une souche BA 45/20 pendant cinq jours à 370C dans un bouillon de soja/trypticase, et on inactive les bactéries par chauffage à 800C pendant une heure. On recueille les cellules entières (CE) par centrifugation, on les lave deux fois dans du sérum physiologique (solu- tion saline), on les dialyse contre de l'eau et on les lyophilise. On prépare des vaccins comprenant des émul- sions huileuses de CE et le P3 préféré décrit ci-dessus (CE-P3) dans une solution saline contenant du "Tween" et 1 % d'huile, de façon telle que ces vaccins contiennent 3007 g de CE et 150g de P3 par dose de 0,2 ml. On prépare aussi des suspensions, dans une solution saline, de CE exemptes de P3, à la même concentration. On inocule, dans le cou, les animaux apparte- nant à deux groupes de cinq cobayes, respectivement avec du vaccin aux CE et avec du vaccin aux CE-P3. Un autre groupe de cinq animaux sert de témoin. Six semaines après ces inoculations de vaccins, on injecte à tous les animaux, par voie intramusculaire, des doses unitaires de B. abortus 2308 capables de former 5880 colonies deux semaines après, on sacrifie tous les animaux et on réalise, à partir de leurs rates, des cultures en opérant de la manière décrite ci-dessus. On obtient ainsi les résultats présentés dans le Tableau 1 ci-dessous: Tableau 1 Cacité immunog&ne de cellules entières de BA 45/20 dans divers adjuvants Nombre Nombre moyen Taux de Vaccin d'animaux de Brucella diminution infectés p ar rate % CE dans une so- 5/5 2,8 x 103 52,5 lution saline CEP3 dans de 3/5 3,60 x 10 * 95,1 l'huile Témoins 5/5 5,89 x 103 - * P 4 0,05 Bien que ces données prouvent qu'il se produit une notable diminution de l'infection avec des CE dans ume solution saline, on constate que le taux de diminu- tion est beaucoup plus élevé quand on utilise une émul- sion huileuse de CE-P3. Le Tableau 2 ci-après montre les résultats d'une expérience similaire au cours de laquelle on a utilisé diverses doses d'adjuvant. Le résultat indiqué pour une dose d'adjuvant de 300,g est dû bien évidemment à une erreur d'expérimentation. Il est cependant donné pour que le compte-rendu soit complet. Le résultat pour 1000 ig est lui aussi quelque peu anomal. Il convient de noter que l'infection est d'un ordre de grandeur assez bas. Tableau 2 Comparaison de la protection conférée par des vaccins à base de B. abortus 45/20, avec différentes doses d'adjuvant, sur des cobayes * Dose Poids moyen Nombre moyen d'adju- de rate de 3rucella Animaux Vaccin vant par rate infectés (pAg) (grammes) CE/P3 ** 50 1,33 8,25 x 103 1/5 1,55 0 0/4 300 2,87 8,83 x 105 5/5 500 1,87 0 0/5 1000 1,25 2,41 x 103 3/5 (témoine) 9,54 1,8 x 106 20/20 * Ayant reçu, par voie intramusculaire, une injection de 3,0 x 104 B. abortus 2308 sept semaines avant d'être sacrifiés. À* Dans de l'huile. 3B-en que les agents d'addition utilisés lors de la mise en oeuvre de l'invention soient, pour plus de commodité, désignés par le terme général de "adjuvants", il apparait qu'ils exercent un effet d'immunostimulation bien supérieur ? celui constaté lorsqu'on utilise des adjuvants normalisés tels que des huiles minérales ou huiles de paraffine aui sont réputées "immunologiquement inertes". Le mode de réalisation présentement préféré de l'invention comprend des vaccins aoui contiennent depuis 0,1 mg/ml jusqu'à 5 mg/ml, et de préférence depuis 0,1 mg/ml jusqu'à 1 mg/ml, de cellules entières tuées de BA /20 tuée et un P3 selon un rapport en poids compris entre 1:1 et 20:1, de préférence entre 1,0:1 et 2,25:1, dans une émulsion d'eau et d'huile contenant en poids jusqu'à 2 % d'une huile inerte dans de l'eau. Il existe plusieurs mono- et di-esters d'acides mycoliques et de tréhalose, et des mélanges de telles substances, qui sont aussi utilisables. On peut administrer le vaccin sous la forme de doses posologiques unitaires, immunologiquement effi- caces, dont le volume est habituellement compris entre 0,1 et 5 il. Il convient normalement d'utiliser des émulsions du type huile dans l'eau, mais avec des adju- vants possédant des poids moléculaires plus bas on peut utiliser aussi, comme adjuvants, des compositions aqueu- ses isotoniques. L'huile peut être d'origine soit végé- tale, soit minérale. On peut administrer les vaccins en injections sous-cutanées, intradermiques, ou intramuscu- laires. On peut aussi les administrer par d'autres voies, par exemple oralement ou rectalement, ou sous la forme d'aérosols destinés à parvenir au contact de mem- branes muqueuses, plus spécialement les muqueuses oculai- res, nasales, respiratoires, ou vaginales. Typiquement, une dose peut conférer une immunité suffisante pour pro- téger contre l'infection. Il peut toutefois être prudent de procéder à un deuxième, voire même à un troisième traitement de rappel à des intervalles de un à douze mois. On donne ci-après différents exemples, bien entendu non limitatifs, destinés uniquement à illustrer les modalités de mise en oeuvre de la présente invention. Exemple 1 1. Préparation de cellules entières. a. On inocule un bouillon de soja/trypticase avec des bactéries de Brucella abortus 45/20. b. On incube (à 370C) pendant de 4 à 6 jours et on fait une culture pour assurer la pureté. c. On tue par la chaleur (800C pendant 1 heure) d. On recueille les bactéries par centrifuga- tion (10 000 fois g pendant 5O minutes). e. On lave deux fois dans une solution saline. f. On dialyse contre de l'eau pendant 24 heures. g. On réalise une cryodessiccation (lyophili- sation). 2. Préparation d'un vaccin du type 0E-P3. On place 1,5 mg de cellules entières séchées (approximativement 5 x 109 bactéries) dans un broyeur de tissus "Corning 7725". On ajoute 0,75 mg de P3 (dissous dans un mélange 95:5 de chloroforme:méthanol, C:M). On évapore le 0:M sous une hotte à écoulement laminaire ou dans N2 gazeux. On réchauffe le récipient jusqu'à 650C dans un bain-marie et on ajoute 10 l (0,01 ml) d'une huile minérale raffinée. On broie le mélange de CE, de P3 et d'huile pen- dant une minute en utilisant un pilon en "Teflon". On ajoute 0,99 ml d'une solution saline normale (à 0,9 % de NaCl) qui contient aussi 0,2 % de "Tween 80" (un émulsifiant). On broie pendant encore 3 autres minutes. Exemple 2 On répète le mode opératoire décrit dans l'exemple 1, à l'exception du fait que l'on remplace le P3 par le monoester de tréhalose obtenu en estérifiant du tréhalose avec un acide nocardomycolique préparé en recourant au mode opératoire décrit dans le brevet US N 4 101 536. On utilise le vaccin, ainsi obtenu, en doses posologiques unitaires de 3 ml administrées par injection intramusculaire pour immuniser des bestiaux contre des infections par Brucella abortus. Exemple 3 On répète le mode opératoire de l'exemple 1, mais en remplaçant le P3 par un dinocardomycolate de tréhalose obtenu de la manière décrite dans le susdit brevet US NO 4 101 536. REUVOE DICATIONS 1. 7accin contre la brucellose caractérisé en:e;iu'il comDrend de 0 1 mg/ml à 5 mg/ml de cellules entières tuées de Br.cella abortus 45/20 conjointement avec un mono-ou un di--ester de tréhalose, la portion est; éri-fian;e dérivant d-'un acide mycolique contenant de à 90 atomes de carbone, dans un véhicule imunologi- queernt acceptable, le rapport en poids des cellules à 1 'adjuvant étant compris entre I 1 et 20: 1 O 2. Vacc2in selon la revendication 1, caractéri- s en ce que l'adjuwvant est du P3O 3. Vaccin selon la revendication 1 ou 2, caractérisé en ce que l'ester est uvm monoester, et le radical estérifiant dérive de l'acide.nocardomycolique.