FR 2478646 A2 19810925 FR 8006282 A 19800320 Composition mucopolysaccharidigue avant une activité régula- trice de la coagulation, médicament la contenant et procédé pour l'obtenir. L'invention est relative à des fractions mucopoly- saccharidiques douées de propriétés biologiques leur permettant notamment de jouer un rôle régulateur vis-à- vis de la coagulation sanguine. L'invention représente un développement de celle qui fait l'objet de la demande de brevet FRANCE NO 78 31357 déposée le 6 novembre 1978. Dans cette demande de brevet principal, on a décrit des fractions mucopolysaccharidiques exerçant un effet régulateur à l'égard de la coagulation, notamment dans le sens d'un retard à la coagulation, mais par la mise en jeu d'actions inhibitrices plus sélectives que celles de l'héparine, à l'égard d'un nombre plus réduit de fac- teurs de coagulation, plus particulièrement à l'égard du facteur X activité (Xa). De telles fractions mucopolysaccharidiques peuvent être obtenues à partir de l'héparine ou de fractions com- portant des constituants hépariniques tels qu'obtenus par extraction à partir de tissus ou d'organes d'animaux, en particulier de mammifères. Le terme héparine sera utili- sé dans la suite du texte dans son sens le plus général pour désigner indifféremment une héparine-commerciale qualité pharmaceutique ou une héparine brute telle qu'ob- tenue par extraction. Comme matière première héparinique, on a plus parti- culièrement recours à de l'héparine comportant des chai- nes de poids moléculaire s'étageant notamment d'envi- ron 2000 à 50000. Les fractions, selon la demande de brevet principal, sont caractérisées notamment par les propriétés suivantes: elles sont solubles dans un milieu hydro-alcoolique (eau- éthanol) ayant un titre de 55-610 GL; elles tendent à l'insolubilité dans un milieu eau-éthanol ayant une teneur en alcool plus élevée; elles sont insolubles dans l'al- cool pur; et elles présentent un titre Yin-Wessler (Y & W) et un titre USP qui sont respectivement dans un rapport au moins égal à 2, notamment d'au moins 3, de préférence supérieur à 6. Ces fractions mucopolysaccharidiques donnent lieu à des fractionnements supplémentaires, permettant l'obten- tion de fractions mucopolysaccharidiques de haute activi- té spécifique, au niveau du titre Yin-Wessler et présen- tant des rapports du titre Yin-Wessler au titre USP dépas- sant 10. On rappelle que le titre Yin-Wessler traduit plus spécifiquement la capacité des fractions actives à poten- tialiser l'inhibition du facteur Xa du sang par l'anti- thrombine III dans le test correspondant, mesuré selon la technique de ces auteurs qui est décrite dans "J. Lab. Clin. Med", 1976, 81,298-300. Le titre USP qui permet de mesurer une intensité de coagulation globale dans des conditions bien déterminées est également bien connu. On le détermine comme décrit dans la Pharmacopée des Etats-Unis XIX, pp 229-230 (voir aussi le Second Supplément USP-NF, p. 62, et le Quatrième Supplément USP-NF, page 90, respectivement intitulés "Drug Substances and Dosage Forms" (substances médicamen- teuses et modes de dosage)). L'invention de la demande de brevet principal fournit donc un principe actif particulièrement intéressant par la capacité qu'il a d'inhiber le facteur Xa de façon qui peut être très sélective, capacité qui contraste avec son ac- tivité sur la coagulation globale, laquelle peut être maintenue à un niveau très faible. Ces fractions mucopolysaccharidiques constituent un principe actif de médicament anticoagulant particuliè- rement avantageux dans la mesure o l'on peut à ce jour admettre que l'inhibition préférentielle d'un facteur activé, intervenant à un stade précédant la thrombinofor- mation, et situé à l'aval de l'intersection des voies in- trinsèque et extrinsèque, est susceptible d'assurer une protection contre les risques d'hypercoagulabilité, équivalente à celle procurée par l'héparine couramment utilisée en thérapeutique, sans cependant, en raison de cette sélectivité d'action, entraîner les mêmes risques hémorragiques que ceux de l'héparine classique. Celle-ci est, en effet, apte à inhiber non seulement le facteur Xa, mais également d'autres facteurs intervenant tant en amont qu'en aval de celui-ci, à d'autres stades des voies de coagulation, par exemple le facteur lia. On conçoit que le rééquilibrage in vivo du système de coagu- lation et de fibrinolyse, lorsque celui-ci tend à se dé- séquilibrer sous l'effet d'une cause pathologique ou d'une intervention extérieure, par exemple chirurgicale, soit plus facile à réaliser avec un médicament agissant sélec- tivement sur un facteur spécifique, plus particulièrement au niveau de l'inhibition du facteur Xa, qu'avec un médi- cament susceptible d'agir de façon non différenciée sur -plusieurs facteurs de coagulation à la fois.. Dans la demande de brevet principal, on décrit égale- ment un procédé pour obtenir les fractions mucopolysaccha- ridiques en question. Ce procédé est caractérisé par: - la mise en suspension dans un milieu hydro-alcoolique du type eau-éthanol, ayant un titre compris entre environ 55 et environ 610 GL, de préférence de l'ordre de 580 GL, d'une matière à base d'héparine ou de constituants hépari- niques dont les poids moléculaires s'étagent notamment de 2.000 à 50.000, cette matière ayant une teneur réduite en sels minéraux, de préférence inférieure à -1% en poids, - la séparation de la fraction insoluble et la récupération de la solution contenant la fraction mucopolysaccharidique dissoute, dont elle peut à son tour être séparée, notam- ment par précipitation alcoolique, à partir du susdit mi- lieu hydro-alcoolique. La matière première, à partir de laquelle le mucopo- lysaccharide peut être extraitpeut être constituée par une héparine de qualité pharmaceutique classique, injectable, ou par une héparine brute telle qu'elle est obtenue à l'issue des opérations d'extraction de ce principe actif à partir de tissus ou d'organes de mammifères, notamment de mucus d'intestins ou de poumons, par exemple de porc ou de boeuf. Elle peut encore être constituée par les frac- tions qui sont normalement écartées (produits de rejet) lors de la purification d'une telle héparine brute, en vue de l'obtention d'une héparine de qualité injectable et d'activité spécifique plus élevée, à condition, bien entendu, que les produits de rejet de moindre activité spécifique contiennent encore des constituants héparini- ques. Il est alors possible, à partir de matières premières de ce type, sensiblement exemptes de protéines, d'acides nucléiques et de sels minéraux, de préférence lorsque des teneurs pondérales de ces derniers sont inférieures à 1%, d'obtenir par extraction à l'alcool 55-610 GL une fraction mucopolysaccharidique contenant des consti- tuants de faibles poids moléculaires, dont les titres Yin-Wessler et USP sont dans un rapport d'environ 2 à environ 5, notamment de 3 à 5. La demande de brevet principal a également déjà défini des variantes de procédé supplémentaires permettant un enrichissement supplémentaire des fractions traitées en un "produit de fractionnement", dont les titres Yin- Wessler et USP sont dans un rapport encore plus élevé. Selon l'une de ces variantes, on procède à des frac- tionnements supplémentaires de la fraction mucopoly- saccharidique obtenue à l'issue du procédé sus-décrit, par diverses techniques, telles que gel-filtration ou encore précipitation sélective dans un milieu hydro-alcoo- lique de titre déterminé, en présence de proportions éga- lement déterminées d'un sel minéral, tel que le chlorure de sodium. Un fractionnement supplémentaire peut être obtenu par une étape supplémentaire appliquée à ladite fraction mucopolysaccharidique, préalablement remise en solution dans l'eau, étape qui consiste à ajouter à cette solution aqueuse de 1 à 2 volumes d'éthanol et de 10 à 100 g/l de chlorure de sodium et à recueillir, d'une part, le précipité formé également actif et, d'autre part, le contenu restant dissous dans le surnageant, notamment par une nouvelle précipitation alcoolique, et qui consti- tue un produit de fractionnement dont les titres Yin- Wessler et USP respectivement sont dans un rapport encore plus élevé que celui relatif à la fraction initiale, notam- ment passent d'une valeur de l'ordre de 3 à une valeur de l'ordre de 6 à 8. Selon une autre de ces variantes du procédé, on a obtenu des fractions mucopolysaccharidiques ayant un rapport de titres Yin-Wessler/USP plus élevé par gel- filtration à partir des fractions de première extrac- tion par le milieu hydro-alcoolique 55-610GL, après remise en solution préalable dans un solvant aqueux, telle qu'une solution NaCl 0,5 M; tris-HCL 0,1 M; pH 7,5. Une telle solution peut être passée sur un gel de polya- crylamide et d'agarose, sous forme dé perles, sous la désignation commerciale ULTROGEL AcA 44, dont la zone de fractionnement effectif se situe entre des poids mo- léculaires effectifs de 4.000 à 60.000 (pour les molécu- les linéaires). Des fractions mucopolysaccharidiques selon l'inven- tion de la demande de brevet principal, qui ont un rapport de titres YinWessler/USP plus élevé, sont donc encore celles qui passent après élution d'un volume de 2,5 litres, volume mort non compris (le volume mort étant le volume de liquide que peut contenir la colonne de gel, notamment dans les espaces interstitiels entre grains de gel), lorsque la gel-filtration est conduite, sous un débit de 200 ml/heure, dans une colonne ayant un diamètre de 100 mm et une hauteur de 1 m et lorsque la concentration en mucopolysaccharide et le volume de la solution placée sur la colonne ont été respectivement de 50 mg/ml et 37,5 ml. Les fractions les plus actives sont alors contenues dans les 1,5 litres qui passent ensuite. Le contenu des premiers 2,5 litres est en grande partie formé d'héparane-sulfates ou héparitine-sulfates, produits de poids moléculaires élevés et de forte visco- sité, qui n'ont pas d'activité anticoagulante. Le passage d'une colonne à une autre colonne de même longueur mais de section différente suppose la modification du volume de solution (de même concentration) à placer sur l'autre colonne, vis-à-vis du volume placé sur la précé- dente colonne, dans un rapport égal au carré de celui des sections (ou diamètres) de ces colonnes, pour que les mêmes fractions soient obtenues dans un volume d'élution de l'autre colonne se trouvant lui aussi dans un rapport avec le volume d'élution correspondant.de la précédente colon- ne sensiblement égal au carré du rapport desdites sec- tions. Enfin, comme on l'a également encore décrit dans la demande de brevet principal, il est possible d'obtenir à partir des fractions ayant des rapports de titres Yin- Wessler/USP de l'ordre de 6 à 8, par des fractionnements supplémentaires, notamment par gel-filtration ou analogue, des fractions mucopolysaccharidiques caractérisées par des rapports de titres YinWessler/USP excédant 10,notamment de l'ordre de 13-16, et ayant des titres Yin-Wessler supé- rieurs à 130, notamment de 135-160 unités/mg. La poursuite des travaux dans ce domaine a amené la demanderesse à étudier des fractions répondant davantage encore aux buts qu'elle s'était assignée dans la demande de brevet principal, à savoir de fournir des principes actifs de médicaments (et les médicaments eux-mêmes) per- mettant de remédier au moins en partie à ces difficultés, notamment qui soient capables de permettre un rééquilibrage éventuel et/ou un contrôle plus aisé, au prix d'une moindre surveillance clinique du système coagulation-fibrinolyse chez des patients affectés d'une pathologie de la coagula- tion ou ayant subi un traitement, tel qu'une intervention chirurgicale, qui les expose à des risques d'hypercoagu- labilité. Ces travaux ont abouti à la mise au point de l'inven- tion faisant l'objet de la demande de premier certificat d'addition NO 79 18873 à la demande de brevet principal n0 78 31357. Dans cette demande de premier certificat d'addition, on a décrit des fractions mucopolysaccharidiques (ci-après désignées par la référence MPS) exerçant un effet régula- teur à l'égard de la coagulation, notamment dans le sens d'un retard à la coagulation, par la mise en jeu d'actions inhibitrices plus sélectives encore que celles des MPS définies dans la demande de brevet principal, s'exerçant tout particulièrement à l'égard du facteur X activé. Il s'agit de fractions de MPS purifiées pouvant être obtenues à partir de fractions de MPS de la demande de brevet principal. Ces fractions étant caractérisées en ce qu'elles sont solublés dans un milieu hydro-alcoolique (eau-éthanol) ayant un titre de 55-61OGL, en ce qu'elles tendent à l'insolubilité dans un milieu eau-éthanol ayant une teneur en alcool plus élevée, en ce qu'elles sont insolu- bles dans l'alcool pur et en ce qu'elles présentent des titres YW et USP dans un rapport au moins égal à 2, notamment à 3, de préférence supérieur à 6. Ces fractions de MPS peuvent être plus particulière- ment obtenues à partir de l'une ou l'autre des fractions également décrites dans la demande de brevet principal et respectivement caractérisées - en ce que, dans une opération de gel-filtration sur colonne de gel de polyacrylamide et d'agarose, sous forme de perles, du type commercialisé sous la désignation ULTROGEL AcA 44, cette fraction passe après élution d'un volume de 2,5 litres, volume mort non compris, lorsque la gel-filtration est conduite, sous un débit de 200 ml/ heure, dans une colonne ayant un diamètre de 100 mm et une hauteur de 1 m et lorsque la concentration en muco- polysaccharides et le volume de la solution placée sur la colonne ont été respectivement de 50 mg/ml et 37,5 ml, l'essentiel de cette fraction étant notamment contenu dans les 1,5 litres d'éluat qui passent ensuite; - par un temps de rétention de l'ordre de 5,7 à 7,5, notam- ment de 6,6 à 7,0 minutes dans une colonne, dans un sys- tème de gel-perméation sur colonne garnie de silice à granulométrie de 10100 microns, de 250 mm de hauteur et de 9 mm de diamètre, lorsque 50 Pl d'une solution de 1,3 mg/ml de cette fraction dans un tampon Na2S04 0,02 M, ayant été placés sur cette colonne, l'on procède ensuite à l'élution de ladite fraction sous un débit de 3 ml/mi- nute. Il résulte de ce qui précède que les fractions et les produits selon la demande de premier certificat d'addi- tion se trouvent être contenus dans les différentes fractions qui ont été définies dans la demande de brevet principal et que, à ce titre, ils en possèdent (con- jointement avec les autres constituants contenus dans ces fractions) toutes les propriétés. Ces fractions sont caractérisées plus particulière- ment encore, d'une part, par une affinité particulière à l'égard de l'antithrombine III se manifestant par leur capacité de se fixer sur cette dernière notamment dans un système comprenant la mise en contact de ces frac- tions avec une antithrombine III fixée sur un support, tel que l'agarose, du sein d'un tampon NaCl 0,2 M, tris-HCl 0,05 M pH 7,5 et, d'autre part, par des titres Yin-Wessler et USP qui sont dans un rapport (rapport YW/USP) au moins égal à 6, le titre Yin-Wessler lui-même étant au moins égal à 300 Ul/mg. L'affinité particulière des fractions en question est à la base du procédé défini dans la demande de pre- mier certificat d'addition pour l'obtention de telles fractions, notamment à partir de celles qui ont été définies dans le brevet principal, procédé qui consiste à réaliser une fixation sélective des fractions ou pro- duits de l'invention sur l'antithrombine III, notamment par la mise en contact des fractions initiales avec l'antithrombine III fixée sur un support, notamment de l'agarose, au sein d'un tampon tel que NaCl 0,2 M, tris- HCl 0,05 M, pH 7,5, puis à éluer la fraction fixée avec un tampon de force ionique plus forte, suffisante pour produire la désorption, notamment un tampon NaCl 2 M, tris-HCl 0,05 M. Dans la demande de premier certificat d'addition, on a également décrit des composés sensiblement homogènes qui paraissent constituer le principe actif essentiel des fractions ayant fait l'objet de la demande de brevet principal et que le procédé défini ci-dessus permet d'ob- tenir à un état pratiquement pur. Ces composés sont caractérisés par les spectres de résonance magnétique nucléaire (RMN) réalisés dans les conditions indiquées ci-après. Se référant plus particulièrement au sepctre de RMN des composés selon l'invention pour le proton ( H) réalisé sur des solutions de ces composés dissous dans l'eau deuté- riée à 350C avec un rayonnement de 270 mégaherz (MHz), on observe à titre d'élément caractéristique du spectre, des signaux de résonance qui, pour des déplacements chimi- ques de l'ordre de 4,8 et 5,2 ppm,sont sensiblement plus faibles que le signal de résonance qui est également obser- vé pour un déplacement chimique de l'ordre de 5,4 ppm (réfé- rence pour la mesure des déplacements: TSP (sodium 3- triméthylsilyl propionate 2,2, 3,3-d4)), ces trois si- gnaux étant pratiquement de même intensité dans le cas d'une héparine classique. Les signaux observés au niveau des déplacements chimi- ques de 5,4; 5,2 et 4,8 ppm correspondent aux signaux qui, dans le cas d'une héparine classique étudiée en RMN dans les mêmes conditions, sont respectivement caractéris- tiques: - du proton anomère, en position 1, des motifs glucosamine Nsulfatée de l'héparine; - du proton anomère, en position 1, des motifs acide iduro- nique 2-0-sulfaté, et - du proton en position 5 des motifs acide iduronique 2-0 sulfaté. Se référant plus particulièrement au spectre de RMN des composés selon la demande de premier certificat d'addition pour le carbone 13 (13C), réalisé sur des solutions de ces composés dissous dans l'eau deutériée avec un rayonnement de 20 MHz, on observe à titre d'élé- ments caractéristiques du spectre (référence pour la mesure des déplacements TMS (tétraméthyl-silane): - pratiquement l'absence de signal de résonance caracté- ristique de la présence de groupes OH sur le carbone primaire (en position 6) des motifs glucosamine contenus dans les fractions mucopolysaccharidiques de l'invention, et par rapport au spectre RMN d'une héparine classique réalisé dans les mêmes conditions, on observe: - des signaux supplémentaires, dans des régions correspon- dant à des placements chimiques de l'ordre de 100 ppm; - un signal supplémentaire près du signal du carbone 2 de la glucosamine N- sulfaté dans la région 60 ppm; - la présence d'un signal de résonance dans la région 75 ppm (les indications de déplacements chimiques susindi- qués sont appréciées vis-à-vis du CH des groupes N- acétyl glucosamine contenus dans les MPS selon l'invention). Les composés homogènes selon la demande de premier certificat d'addition, à l'état pratiquement purifié qui présentent toutes les caractéristiques qui ont déjà été définies plus haut, pour ce qui est de leurs activités USP et Yin-Wessler et leurs affinités spécifiques vis-à- vis de l'antithrombine III, sont encore caractérisés en ce qu'ils sont formés par un oligosaccharide homogène présentant encore les caractéristiques supplémentaires suivantes: - il comprend de 8 à 12, notanmment 10 motifs mono-saccha- ridiques - sensiblement, toutes les positions primaires des motifs glucosamine de cet oligosaccharide sont sulfatées; - cet oligosaccharide comporte une unité N-acétyl-glucosa- mine pour deux unités acide idronique 2-0-sulfate et pour deux unités Nsulfate-glucosamine, les autres mono-saccharides étant constitués par des acides L-iduro- niques et des acides D-glucoroniques sulfatés ou non. Compte tenu de l'intérêt des fractions de MPS du type évoqué ci-dessus,la demanderesse a recherché de nouvelles voies d'accès de mise en oeuvre plus aisée et à rendements élevés permettant de faciliter une exploita- tion à l'échelle industrielle. Les travaux effectués pour la mise au point d'un tel procédé ont conduit la demanderesse à étudier plus spé- cialement la dépolymérisation de l'héparine par voie chimique. Ces études ont montré l'importance de la con- duite de la réaction de dépolymérisation. Il est plus particulièrement apparu qu'en dépolymé- risant l'héparine dans des conditions ménagées, il est possible d'obtenir une dépolymérisation partielle condui- sant à des fractions dérivées de celles selon la deman- de de brevet principal, conservant avantageusement leurs propriétés, et ce, avec des rendements pratiquement quan- titatifs', ce qui est d'un intérêt primordial. L'invention a donc pour but de fournir des nouvelles fractions de MPS dérivées de celles selon la demande de brevet principal, à activité antiXa élevée et présentant à l'égard du facteur Xa une sélectivité remarquable dans le cadre des réactions enzymatiques successives qui ca- ractérisent le processus de coagulation. Elle vise également à fournir un nouveau procédé de dépolymérisation par voie chimique de l'héparine conduisant selon une mise en oeuvre aisée et avec des rendements élevés à l'obtention des fractions de MPS du type en question. L'invention a en outre pour but de fournir des prin- cipes actifs de médicaments et les médicaments eux-mêmes capables notamment d'inhiber le facteur Xa selon un de- gré de sélectivité élevé alors que leur activité sur la coagulation globale peut être maintenue à un niveau très faible. L'invention concerne des fractions de MPS exerçant un effet régulateur à l'égard de la coagulation, notamment dans le sens d'un retard à la coagulation, par la mise en jeu d'actions inhibitrices hautement sélectives s'exer- çant tout particulièrement à l'égard du facteur Xa. Les fractions selon l'invention sont susceptibles d'être obtenues à partir de l'héparine ou de fractions comportant des constituants hépariniques de poids molé- culaires s'étageant notamment d'environ 2.000 à 50.000 tels qu'obtenus par extraction à partir de tissus de mam- mifères. Ces fractions sont caractérisées notamment par les points suivants: elles sont solubles dans un milieu hydro- alcoolique (eau-éthanol) ayant un titre de 55-610 GL, elles tendent vers l'insolubilité dans un milieu eau-éthanol ayant une teneur en alcool plus élevée; elles sont inso- lubles dans l'alcool pur; elles présentent des titres Y-W et USP respectivement dans un rapport égal au moins à 2, notamment d'au moins 3, de préférence supérieur à 6. Les fractions, selon la présente invention, sont plus particulièrement caractérisées encore par le fait qu'elles comportent des oligosaccharides à motifs terminaux possé- dant la structure de base 2,5-anhydro-D-manno dont la fonction alcool primaire en 6 est substituée ou non par un *groupe -SQ3. Ce motif terminal est avantageusement caractérisé par Ja formule générale suivante CH OR -0 R 1 o R2 représente un atome d'hydrogène ou un groupe SQ3- et R1 un groupement fonctionnel choisi notamment parmi des groupements aldéhyde, alcool ou acide carboxylique ou leurs dérivés, notamment les acétals, amides, éthers, esters ou sels correspondants. Dans un aspect avantageux de l'invention, R1 est constitué par un groupe aldéhyde, acide carboxylique ou al- cool. Des fractions préférées selon l'invention sont carac- térisées par des rapports YW/USP de l'ordre de 10 ou supérieurs, avec une activité Yin-Wessler supérieure à 200 UI/mg, de préférence supérieure à 250 UI/mg. De préférence encore, les fractions selon l'invention sont constituées par une majeure partie d'espèces de poids moléculaire de 3.000 à 6.000 daltons environ, ce qui cor- respond à des structures ayant de 12 à 30 entités sacchari- diques. Ces fractions peuvent être obtenues par dépolymérisa- tion de l'héparine selon le procédé défini ci-après. A cet effet, on soumet de l'héparine ayant un poids moléculaire de l'ordre de 2.000 à 50.000 à l'action ménagée d'un agent de dépolymérisation susceptible d'agir au niveau Io des motifs N-sulfate- glucosamine de l'héparine et de les transformer en groupements de structure 2,5-anhydro-D-manno. Conformément à l'invention, les conditions de la réac- tion, en particulier de concentration en réactifs, de température, de durée et de pH sont alors ajustées les unes en fonction des autres, de manière à permettre l'obten- tion d'une dépolymérisation partielle du matériau de départ conduisant à des fractions formées en majeure partie de produits ayant des titres Y-W et USP, dans un rapport supérieur à 2, notamment d'au moins 3, de préférence supé- rieur à 6, comportant des groupes réducteurs terminaux de structure 2,5anhydro-D-mannose CH2OH -0 CHO Lorsque le degré de dépolymérisation souhaité est atteint, on sépare les fractions qui sont précipitables par un solvant alcoolique et on les récupère. La mise en oeuvre de ces dispositions permet d'obte- nir de manière avantageuse des fractions de MPS à titre YW, largement supérieur à leur titre USP, et ce selon un rendement pratiquement quantitatif. Selon une disposition supplémentaire, avantageuse- ment mise en oeuvre afin de disposer de fractions de MPS possédant des groupements terminaux de plus grande stabilité, on soumet les fractions précédemment obtenues à un traitement permettant la transformation du groupe aldéhyde en un groupement fonctionnel plus stable, notam- ment en un groupement acide ou alcool. Dans un mode préféré de réalisation de l'invention, on met avantageusement en oeuvre comme matière première une héparine possédant un poids moléculaire de 2.000 à 50.000 environ. Il peut s'agir d'une héparine de qualité pharmaceu- tique classique, injectable, ou d'une héparine brute telle qu'elle est obtenue à l'issue des opérations d'extraction de ce principe actif à partir de tissus ou d'organes de mammifères,.notamment de mucus d'intes- tins ou de poumons, par exemple de porc ou de boeuf. Elle peut encore être constituée par les fractions qui sont normalement écartées lors de la purification d'une hépa- rine en vue de l'obtention d'une héparine de qualité injectable et d'activité spécifique plus élevée. L'héparine mise en oeuvre est soumise, dans des conditions ménagées, à l'action d'un agent de dépolymé- risation, susceptible d'-agir au niveau des motifs N- sulfate-glucosamine de l'héparine et de les transformer en groupements de structure 2,5-anhydro-D-mannose. On a plus spécialement recours à l'acide nitreux HNO2. Cet acide peut être ajouté à l'héparine ou formé in situ par addition selon des quantités contrôlées d'un acide à un dérivé de l'acide nitreux, en particulier un sel ou un éther-sel. Dans un mode de réalisation avantageux de l'inven- tion, on utilise un sel de l'acide nitreux, plus parti- culièrement le nitrite de sodium NaNO2. Pour engendrer in situ l'acide nitreux, on ajoute des quantités contrô- lées d'un acide tel que l'acide chlorhydrique. L'action de l'acide nitreux sur l'héparine est avan- tageusement effectuée dans un solvant dans lequel les réac- tifs sont solubles et notamment en milieu aqueux. Les divers paramètres qui interviennent lors d'une réaction chimique, en particulier les concentrations en réactifs, la durée, la température et le pH, sont ajustés les uns aux autres afin d'obtenir les fractions désirées dans des conditions expérimentales les plus satisfaisantes. On sait, à cet égard, combien ces différents para- mètres sont généralement étroitement liés. Il est clair que la modification d'un de ces facteurs peut entraîner un ajustement d'un-ou de plusieurs autres facteurs en conséquence. L'étude de ces conditions expérimentales par la deman- deresse a montré qu'il est avantageux de mettre en oeuvre les réactifs selon des quantités conduisant à une concentra- tion finale en héparine de l'ordre de 1 à 10 g de préfé- rence, de 1,5 à 5 g, notamment voisine de 2 g pour 100 ml de milieu réactionnel, la concentration finale en nitrite de sodium pouvant varier de 0,02 M à 0,1 M environ et étant de préférence de l'ordre de 0,05 M. L'acide chlorhydrique est utilisé en quantité suffisante pour l'obtention d'un pH du milieu réactionnel de l'ordre de 2 à 3, avantageuse- ment de 2,2 à 2,7, de préférence de 2,5. En opérant à une température de l'ordre de O à 100C, de préférence de l'ordre de 40C, on laisse réagir pendant une durée suffisante pour l'obtention du degré de dépoly- mérisation souhaité. A titre indicatif, une incubation de 10 mn environ est apparue suffisante quand on opère à 4 C. On interrompt alors l'opération de dépolymérisation. A cet effet, on a recours avantageusement à une augmentation du pH du milieu. L'addition d'un agent alcalin, par exemple, de soude, en quantité suffisante pour obtenir un pH au moins neutre ou légèrement alcalin, permet l'interruption souhaitée de la réaction de dépolymérisation. On sépare ensuite celles des fractions mucopoly- saccharidiques qui précipitent avec un solvant alcoolique. L'utilisation d'éthanol absolu, à raison d'environ 5 volumes, permet d'obtenir la séparation souhaitée. Le précipité est récupéré et, en vue de son utilisa- tion, lavé et séché. Par mise en oeuvre des dispositions indiquées ci- dessus, on isole des fractions possédant des titres YW/USP dans un rapport de l'ordre-de 10/1, avec un titre en activité YW supérieur à 200 UI/mg, et ce, à partir d'héparines de départ ayant des rapports YW/USP de l'or- dre de 1. Selon une disposition supplémentaire on transforme les fonctions aldéhydes des groupes terminaux réducteurs en groupements fonctionnels plus stables tels que des groupements alcools ou acides, ce qui conduit à des chaînes d'oligosaccharides terminées pour la plupart par des motifs de structure 2,5-anhydro-D-mannitol ou acide 2,5-anhydro-D-mannonique. Pour transformer les groupes terminaux 2,5-anhydro-D- mannose en groupes 2,5 anhydro-D-mannitol,on soumet les fractions précédemment recueillies du précipité à l'ac- tion d'un agent réducteur en mettant en oeuvre les condi- tions permettant d'obtenir au moins en partie la trans- formation souhaitée. L'agent réducteur est choisi parmi ceux utilisés habituellement pour la transformation des groupes al- déhydes en groupes alcool. Parmi ces agents, il apparaît avantageux de mettre en oeuvre un borohydrure métallique. On réalise avantageusement la réaction en milieu aqueux en présence de borohydrure de sodium ou de potas- sium durant plusieurs heures. En opérant à température ambiante, de préférence sous agitation, il apparaît suffisant de laisser le mélange réagir durant environ 4 heures. On observe une augmentation du pH du milieu réactionnel. Ce pH peut atteindre une valeur de l'ordre de 10 dans le cas de l'utilisation de Na BH4 o l'on observe une libération de soude. Afin de détruire le'borohydrure qui n'a pas réagi, on abaisse le pH par addition d'acide. Dans le cas particulier considéré, il apparaît avantageux d'abaisser le pH à 4 par addition, par exemple, d'acide acétique. On réajuste ensuite le pH à une valeur voisine de la neutralité, en particulier de l'ordre de 7,5 par addition d'un agent alcalin, par exemple de soude. On récupère du milieu réactionnel celles des frac- tions qui peuvent être précipitées par de l'alcool et l'on récupère le précipité formé qui renferme les pro- duits recherchés dans lesquels la terminaison de struc- ture 2,5-anhydro-D-mannose a été transformée en structure 2,5-anhydro-Dmannitol. La précipitation en question peut être effectuée par addition d'alcool éthylique absolu,avantageusement, à raison de 5 volumes. Pour isoler les produits réduits recherchés, on procède avantageusement à une centrifugation et l'on recueille le culot de centrifugation qui est ensuite, si souhaité, lavé et séché. L'étude de ces fractions de MPS ainsi obtenues montre qu'elles possèdent des titres YW/USP dans un rapport de l'ordre de 10 ou supérieur, avec des titres en activité YW supérieurs à 200 UI/mg, avantageusement supérieurs à 250 UI/mg. Selon une variante, on transforme les groupes 2,5-anhydro-D-mannose en groupes acide 2,5-anhydro-D- mannonique. On fait réagir dans les conditions nécessaires pour obtenir la transformation souhaitée les fractions compor- tant les groupes terminaux 2,5-anhydro-D-mannose avec un agent oxydant choisi parmi ceux habituellement utilisés pour la transformation des groupes aldéhyde en groupes acide carboxylique, en particulier les permanganates. La réaction est avantageusement réalisée en milieu aqueux à un pH supérieur à la neutralité. L'oxydation des groupements aldéhydes en groupements acides entraîne une chute du pH qu'il est avantageux d'ajuster constamment au cours de la réaction. En opérant à température ambiante, on obtient au bout de 15 heures environ l'oxydation souhaitée. on récupère du mélange réactionnel les produits qui préci- pwitent avec un solvant alcoolique. 247864à Le précipité est ensuite avantageusement lavé et séché. Il est entendu que les indications de poids molécu- laires qui précèdent (et qui suivent, notamment dans les exemples) découlent des mesures de temps de rétention de solutions ayant une teneur déterminée de matière étudiée, dans des expériences de gel-perméation à travers une colonne de gel, dans des conditions d'élution également dé- terminées, les logarithmes de ces indications de poids moléculaire étant dans la même relation de proportionna- lité vis-à-vis des temps de rétention mesurés susdits, que le sont ceux des poids moléculaires de 4.000, 6.500, 16.000 et 31.000 respectivement, de polystyrène-sulfona- tes de sodium étalons, notamment ceux commercialisés par la société dite CHROMPACK (Orsay-les-Ulis, France), vis- à-vis de leurs temps de rétention respectifs, mesurés dans un système et sous des conditions de gel-perméa- tion identiques. Dans la mesure o les fractions traitées, quel que soit le degré de purification atteint, se trouvent à l'état de sels d'un métal physiologiquement acceptable, tel que le sodium, elles peuvent ensuite être transfor- mées en des sels mixtes ou simples contenant un autre métal physiologiquement acceptable, tel que le calcium, par tout procédé applicable aux sels d'héparine. Avan- tageusement, on pourra avoir recours au procédé décrit dans le brevet français n0 73 13580 déposé le 13 avril 1973 au nom de la demanderesse. On rappelle que ce pro- cédé consiste essentiellement, partant par exemple d'un sel de sodium d'héparine, à mettre celui-ci en contact avec un sel différent d'un autre métal physiologiquement acceptable, par exemple le chlorure de calcium, au sein d'une solution, à procéder ensuite à la séparation des ions métalliques non liés à l'héparine (par exemple par précipitation alcoolique ou dialyse) et, dans la mesure o le taux de substitution atteint n'est pas suffisant, à remettre en contact, au sein d'une solution, le sel mixte d'héparine obtenu au terme du premier contact, avec une nouvelle dose de l'autre sel, notamment du chlorure de calcium, selon le taux de substitution final désiré. D'autres caractéristiques et avantages de l'invention apparaltront dans la description des exemples qui suivent. EXEMPLE I - Dépolymérisation partielle de l'héparine et obtention d'oligosaccharides possédant des groupes réduc- teurs terminaux ayant la structure du 2,5-anhydro-D-mannose, à savoir: CH OH OH -o CH O' le groupe hydroxyle primaire en 6 pouvant être diversement substitué notamment par un groupe S03. On soumet avantageusement une matière première hépa- rinique à l'action ménagée de HNO2 en procédant comme suit. On dissout 50 g d'héparine commerciale ayant un rap- port YW/USP voisin de i et un titre USP de 160 UI/mg dans 3 1 d'eau distillée à + 4 C. On ajoute du nitrite de sodium NaNO2 en quantité suffi- sante pour avoir une solution O,0O5M, soit 10,35 g puis, on ajuste le pH à 2,5 à l'aide d'acide chlorhydrique pur et on agite à + 40C pendant 10 mn. On ajuste alors le pH à 7,5 à l'aide de soude 5N. Par addition de 5 volumes d'éthanol pur (soit 15 500 ml), on précipite les produits de la réaction. On récupère par centrifugation le précipité formé. On le lave avec de l'éthanol et on le sèche à 600C sous vide profond. On re- cueille 60 g de produit présentant les caractéristiques suivantes: titre USP: 17 uI/mg titre YW: 240 uI/mg titre AP TT = 12 uI+mg d abréviation des termes anglais "activated partial thromboplastin time". Dans un autre essai, on procède comme indiqué ci- dessus mais on utilise comme matière de départ un autre lot d'héparine titrant 165 UI/mg en unités USP et présen- tant un rapport YW/USP de l'ordre de 1. On en dissout 3 g dans 150 ml d'eau distillée, à +4 C,517 mg de NaNO2 étant ensuite ajoutés au milieu réac- tionnel. A l'issue du traitement réalisé comme précédemment dé- crit, on récupère 2,8 g de produit ayant un titre USP de 24 uI/mg et un titre en activité Y & W de 250 uI/mg. Selon encore un autre essai, réalisé dans les condi- tions définies plus haut, on met en oeuvre 50 g d'héparine de titre USP 158 UI/mg avec un rapport YW/USP voisin de 1. On les dissout dans 2500 ml d'eau distillée et à + 4 C on ajoute 8,625 g de NaNO2. A l'issue du traitement, on ré- cupère 46 g de produit possédant les caractéristiques suivan- tes: titre USP: 13 uI/mg titre en activité Y & W: 270 uI/mg titre APTT = 7 uI/mg/ EXEMPLE II - dépolymérisation partielle de l'héparine et obtention d'oligosaccharides possédant des groupes terminaux ayant la structure du 2,5 anhydro-D-mannitol, à savoir: CH2 OH o [OH CHIOH l'alcool primaire en 6 pouvant être substitué comme évoqué ci-dessus. On dissout 47 g du produit obtenu dans l'Exemple I dans 1200 ml d'eau distillée à température ambiante. Sous forte agitation, on ajoute 7 g de borohydrure de potassium KBH4. Cette agitation est maintenue 2 heures à température ambiante: on ajoute de l'acide acétique au milieu réactionnel afin d'abaisser le pH à 4,0 et de détruire ainsi le KBH4 qui n'a pas été consomme. On soumet le milieu à agitation pendant 30 mn, puis on ajuste le pH à 7,5 avec de la soude 5N. On ajoute 5 volumes d'alcool au milieu réactionnel. Le précipité formé est recueilli, essoré, lavé avec de l'éthanol pur et séché sous vide à 60 C. On récupère 46,5 g de produit présentant les carac- téristiques suivantes: titre USP = 17 uI/mg titre en activité Y & W = 250 uI/mg titre APTT: 11 uI/mg EXEMPLE III Dépolymérisation partielle de l'héparine et obtention d'oligosaccharides possédant des groupes terminaux ayant la structure de l'acide 2,5-anhydro-D- mannonique, à savoir: CH2H [0 OH --o COOH le groupement hydroxyle primaire en 6 pouvant être subs- titué comme déjà indiqué. On dissout 40 g du produit obtenu selon le dernier essai rapporté dans l'exemple I dans 400 ml d'eau dis- tillée, à température ambiante. On ajuste le pH à 8,5 avec de la soude 5N puis on ajoute 2 g de permanganate de potassium KMnO4 dissous dans 40 ml d'eau. On soumet le mélange réactionnel à une forte agita- tion pendant 15 heures. Durant cette agitation, on ajuste constamment le pH du mélange à 8,5 avec de la soude 5N. Au bout de 15 heures, on ajoute 0,2 volume d'alcool (90 ml) pour achever de réduire le KMnO4 qui n'a pas réagi. On laisse le mélange réactionnel au repos durant 1 heure. On élimine par centrifugation le précipité de MnO2 formé. Par précipitation avec de l'éthanol, on récu- père les produits de la réaction, on les lave et on les sèche. On recueille ainsi 35 g de produit possédant les caractéristiques suivantes: titre USP = 12 uI/mg titre en activité Y & W = 270 uI/mg titre APTT = 8 uI/mg Les fractions selon l'invention peuvent être utilisées sous toutes les formes de sels thérapeutiquement utiles, notamment de métaux physiologiquement acceptables (sels de sodium, calcium, magnésium ou sels mixtes). On passe éven- tuellement de l'un à l'autre par le procédé décrit dans la demande de brevet N 73 13580 déposée le 13 avril 1973, au nom de la demanderesse. L'étude pharmacologique des fractions oligosacchari- diques de l'invention a montré qu'elles possèdent une action nettement plus sélective, notamment au niveau de l'in- hibition du facteur Xa, que celle de l'héparine de référence. Les fractions oligosaccharidiques selon l'invention sont atoxiques. L'administration à la souris de doses aussi importantes que 3200 mg/kg n'ont pas permis de déterminer la DL50. L'invention concerne donc plus particulièrement des fractions mucopolysaccharidiques du type qui vient d'être décrit, ayant notamment une activité d'au moins 200 UI/mg (Yin-Wessler). Elle-concerne, en outre, les préparations pharmaceutiques ayant des activités semblables, exemptes de substances pyrogènes, et en association avec des exci- pients pharmaceutiques. Elle concerne en particulier des solutions concentrées de ces fractions, injectables, sté- riles, utilisables en thérapeutique pour le contr6le de la coagulation sanguine, de façon particulièrement avan- tageuse pour la prévention des thromboses ou embolies post-opératoires, ces solutions contenant de 1.000 à 100.000 UI (Yin-Wessler)/ml de la fraction mucopolysac- charidique, de préférence de 5.000 à 50.000, par exemple de 25.000 UI/ml, lorsque ces solutions sont destinées à l'injection sous-cutanée ou contenant encore par exemple de 500 à 10.000, par exemple 5.000 unités UI/ml de la fraction mucopolysaccharidique, lorsqu'elles sont desti- nées à l'injection intraveineuse ou à la perfusion. * La fraction mucopolysaccharidique selon l'invention est avantageusement sous forme de sel d'au moins un métal physiologiquement acceptable, tel que le sodium et/ou le calcium. Avantageusement, ces- proportions pharmaceutiques sont présentées sous forme de seringues à n'utiliser qu'une fois prêtes à l'emploi au moment approprié. Les compositions selon l'invention sont particulière- ment adaptées au contrôle (préventif ou curatif) de la coagulation sanguine chez l'homme ou l'animal, notamment dans ceux des cas o l'hôte est soumis à des risques d'hypercoagulabilité, plus particulièrement ceux résultant d'une perturbation de la phase extrinsèque susdite, par exemple comme conséquence d'une libération par l'orga- nisme de thromboplastine, par exemple de thromboplastine tissulaire (interventions chirurgicales, processus athéro- mateux, développement de tumeurs, perturbations des mé- canismes de la coagulation par des activateurs bactériens ou enzymatiques, etc..). Dans le seul but d'illustrer l'invention, et sans que l'on puisse y trouver de cause à limiter la protection de l'invention, on indiquera ci- après, à titre d'exemple, une posologie susceptible d'être utilisée chez l'homme: elle comprend par exemple l'admi- nistration au patient de 1.000 à 25.000 UI par voie sous- cutanée, deux à trois fois par jour, selon le niveau des risques d'hypercoagulation ou l'état thrombotique du patient, ou de 1.000 à 25. 000 UI par 24 heures par voie intraveineuse, en administration discontinue à intervalles réguliers ou de façon continue par perfusion, ou encore de 1.000 à 25.000 UI (trois fois par semaine) par voie intramusculaire (titres exprimés en UI Yin-Wessler). Les doses devront naturellement, chez chaque patient, être ajustées selon les résultats des analyses sanguines préalablement effectuées, de la nature de l'affection dont le patient souffre et, d'une façon générale, de son état de santé, comme cela est bien connu. L'invention concerne également encore l'application des mucopolysaccharides selon l'invention à la cons- titution de réactifs biologiques utilisables au labora- toire, notamment à titre de référence de comparaison pour l'étude d'autres produits dont est testée l'activité anticoagulante, notamment au niveau de l'inhibition du facteur Xa. 2^5 2478646 REVENDICATIONS 1. Fractions mucopolysaccharidiques du type de celles selon la revendication 1 de la demande de brevet prin- pical, caractérisées par le fait qu'elles comportent des oligosaccharides à motifs terminaux possédant la structure de base 2,5-anhydro-D-manno, la fonction alcool primaire en position 6 étant ou non substituée par un groupe -SO3. 2. Fractions selon la revendication 1, carac- tériséespar le fait que le motif terminal répond à la formule CH2OR2 -_O o R1 représente un groupement fonctionnel choisi notamment parmi des groupements aldéhyde, alcool ou acide carboxylique ou leurs dérivés, notamment les acétals, amides, éthers, esters ou sels correspondants, et R2 représente un atome d'hydrogène ou un groupe-SO3 3. Fractions selon la revendication 2, caractérisées par le fait que R1 est un groupe aldéhyde, acide carboxylique ou alcool, ce qui correspond respectivement à des motifs ter- minaux ayant la structure de base du 2,5-anhydro-D-mannose,du 2,5-anhydro-D-mannitol et de l'acide 2,5-anhydro-D- mannonique. 4. Fractions selon l'une quelconque des reven- dications 1 à 3, caractérisées par &es rapports YW/USP de l'ordre de 10 ou supérieurs et une activité Yin-Wessler supérieure à 200 UI/mg, avantageusement supérieure à 250 UI/mg. 5. Fractions selon l'une quelconque des reven- dications 1 à 4, caractérisées par le fait qu'elles sont cons- tituées par une majorité d'espèces de poids moléculaire de 3000 à 6000 daltons environ, ce qui correspond à des struc- tures ayant de 12 à 30 entités saccharidiques environ. 6. Procédé de dépolymérisation de l'héparine, pour l'obtention de fractions mucopolysaccharidiques à motifs termi- naux possédant la structure 2,5-anhydro-D-mannose, caractérisé par le fait qu'on soumet de l'héparine constitué de mucopolysac- charides ayant des poids moléculaires s'étageant d'environ 2000 à 50000, à l'action ménagée d'un agent de dépolymérisation susceptible d'agir au niveau des groupements N-sulfate des motifs glucosamine de l'héparine et de conduire à des groupements de structure 2,5-anhydro-D-manno, cette réac- tion étant effectuée dans des conditions, en particulier de con- centration en réactifs, de température, de durée et de pH ajustées les unes en fonction des autres, de manière à permettre l'obtention d'une dépolymérisation partielle du matériau de départ conduisant à des fractions formées en majeure partie de produits ayant des titres Y-W et USP, dans un rapport su- périeur à 2, notamment d'au moins 3, de préférence supérieur à 6, comportant des groupes réducteurs terminaux de struc- ture 2,5-anhydro-D-mannose. CH2OH O CHO0 et, lorsque le degré de dépolymérisation souhaité est at- teint, on sépare du milieu réactionnel celles des fractions qui sont précipitables par un solvant alcoolique et on les récupère. 7. Procédé selon la revendication 6, caractérisé par le fait qu'on met en oeuvre, comme agent de dépolymérisa- tion partielle, de l'acide nitreux. 8. Procédé selon la revendication 6, caractérisé par le fait que l'acide nitreux est formé in situ par addition de quantités contrôlées d'un acide à un dérivé de l'acide nitreux, en particulier un sel ou un éther-sel, notamment du nitrite de sodium. 9. Procédé selon la revendication 8, caractérisé par le fait que l'acide nitreux est formé in situ par addition d'acide chlorhydrique. 10. Procédé selon l'une quelconque des revendications 6 à 9, caractérisé par le fait qu'on opère dans un milieu solvant dans lequel les réactifs sont solubles, en parti- culier en milieu aqueux, la concentration finale en hépa- rine étant avantageusement de 1 à 10 g, de préférence de 1,5 à 5 g, et notamment voisine de 2 g pour 100 ml de e milieu réactionnel, la concentration finale en nitrite de sodium pouvant varier de 0,02 M à 0,1 M et étant de préfé- rence de 0,05 M environ. 11. Procédé selon l'une quelconque des revendications 7 à 9, caractérisé par le fait que, pour former in situ l'acide nitreux, on ajoute de l'acide chlorhydrique, en quantité contrôlée et suffisante pour l'obtention d'un pH de l'ordre de 2 à 3, avantageusement de 2,2 à 2, 7, de préférence de 2,5. 12. Procédé selon l'une quelconque des revendications 6 à 11, caractérisé par le fait qu'on opère à une tempéra- ture de l'ordre de 0 à 100C, de préférence de 40C, pendant une durée suffisante pour l'obtention du degré de dépoly- mérisation désiré, cette durée étant d'environ 10 mn lors- qu'on opère à 40C. 13. Procédé selon l'une quelconque des revendications 6 à 12, caractérisé par le fait qu'on interrompt la dépo- lymérisation en augmentant le pH du milieu réactionnel par addition d'un agent alcalin, jusqu'à des valeurs voisines de la neutralité ou légèrement alcalines. 14. Procédé selon l'une quelconque des revendications 6 à 12, caractérisé par le fait que, pour récupérer les fractions recherchées à groupements terminaux 2,5-anhydro- D-mannose, on ajoute de l'alcool au milieu réactionnel, avantageusement à raison d'environ au moins 5 volumes par rapport au volume de ce milieu, et l'on récupère le préci- pité formé. 15. Procédé selon l'une quelconque des revendications 6 à 14, caractérisé par l'étape supplémentaire selon la- quelle on transforme les groupes terminaux de structure 2,5-anhydro-D-mannose en groupes de structure 2,5-anhydro- D-mannitol, par réduction à l'aide d'un agent réducteur choisi parmi ceux utilisés habituellement pour la trans- formation des groupes aldéhyde en groupes alcool, en par- ticulier par un borohydrure métallique, et l'on récupère les fractions réduites obtenues. 16. Procédé selon l'une quelconque des revendications 6 à 14, caractérisé par l'étape supplémentaire selon laquelle on transforme les groupes terminaux de structure 2,5-anhydro-D-mannose en groupes de structure acide 2,5- D-anhydro-mannonique en soumettant les fractions mucopoly- saccharidiques à l'action d'un agent d'oxydation choisi parmi ceux utilisés habituellement pour la transformation des groupes aldéhyde en groupes acide. 17. Fractions mucopolysaccharidiques telles qu'obte- nues par le procédé selon l'une quelconque des revendica- tions 6 à 16. 18. Médicaments caractérisés par le fait qu'ils com- prennent une quantité efficace d'une fraction selon l'une quelconque des revendications t à 5 ou 17 en association avec un véhicule pharmaceutique..