FR 2482611 A1 19811120 FR 8010791 A 19800514 -21 _ La présente invention a pour objet de nouveaux mé- langes de polysaccharides sulfatés de poids moléculaire mo- yen en poids inférieur à celui de l'héparine, utilisables comme agents anticoagulants et antithrombotiques dans la prévention et le traitement des thromboses et comme agents hypolipémiants. L'héparine est un mélange de mucopolysaccharides sulfatés d'origine animale, largement utilisé pour ses pro- priétés anticoagulantes et antithrombotiques, notamment dans la prévention des thromboses veineuses postopératoires, et pour ses propriétés hypolipémiantes. On sait qu'elle agit dans le processus de la coagulation en activant un inhibi- teur naturel de la coagulation contenu dans le sang, l'anti- thrombine III. L'activation de cette protéine a poureffet d'inhiber l'action de deux protéases, le facteur X-activi (facteur Xa) d'une part et la thrombine d'autre part. L'activité anticoagulante in vitro de l'héparine est mesurée communément par les techniques officielles des pharmacopées, en particulier des pharmacopées américaine, anglaise ou française, en se référant à un étalon interna- tional. Mais il est maintenant possible de mesurer ses ac- tivités spécifiques in vitro, d'une part vis-à-vis du fac- teur Xa et d'autre part vis-à-vis de la thrombine (cf. par exemple A. TEIEN et al., Thrombosis Research, 11, 107, 1977). Les héparines commerciales, qui sont des mélanges de polysaccharides dont le poids moléculaire moyen en poids est supérieur à 10 000 daltons et dont la dispersion de poids moléculairesva de 4 000 à 45 000 daltons environ, présentent les activités in vitro suivantes-: - Activité anticoagulante mesurée par la méthode de la pharmacopée française, 8ème édition, monographie héparine, en se référant au 3ème étalon international (ou -2 - activité anticoagulante codex): 140 à 200 u.i./mg. - Activité anti-Xa mesurée par la méthode de TEIEN et al (déjà cité), en se référant au 3ème étalon internatio- nal: 160 à 180 u.i./mg. - Activité A.P.T.T. (Activated Partial Thrombo- plastin Time) mesurée par la méthode de TEIEN et al (déjà cité), en se référant au 3ème étalon international: 150 à u.i./mg. L'héparine est obligatoirement administrée par voie parentérale (en pratique la voie sous-cutanée) et sa durée d'action est relativement courte, d'o les deux incon- vénients majeurs suivants: nécessité d'effectuer trois ad- ministrations par jour et fréquence relativement élevée d'accidents hémorragiques postopératoires. Il est connu (cf. JOHNSON et al, Thrombos. Hae- mostas. Stuttg., 1976, 35, 586-591; LANE et al, Thrombosis Research 16, 651-662, Pergamon Press Ltd. 1979; LASKER, CHIU, Annals N.Y. Acad. Sci., 222, 1973, 971-977; LASKER, Adv. Exp. Med. Biol. 52, 1975, 119-130) que l'on peut obte- nir par fractionnement de l'héparine, par exemple par fil- tration sur gel Sephadex, des fractions de poids moléculaire moyen plus faible que celui de l'héparine et de dispersion de poids moléculaires moins large que celle de l'héparine. Ainsi que le montrent les essais effectués in vitro et in vivo, de telles fractions d'une part sont relativement plus actives sur le facteur X-activé que sur la thrombine (ctest- à-dire qu'elles présentent un rapport activité anti-Xa nettement supérieur à 1), et activité anti-thrombinique d'autre part sont plus aisément absorbées dans la circula- tion à partir d'une injection sous-cutanée que l'héparine elle-m9me, d'o une activité plasmatique plus élevée et de plus longue durée que celle de l'héparine. Il est connu également (cf. LASKER et CHIU déjà - 3 - cité; LASKER déjà cité; brevet U.S. 3 766 167; PERLIN et al, Carbohydrate Research, 18, 1971, 185-194) de préparer, par hydrolyse enzymatique de l'héparine, des produits de dé- polymérisation ayant un poids moléculaire moyen bas (prati- quement 5 300 à 4 500 daltons, déterminé par ultracentrifu- gation) et une activité anticoagulante, déterminée par la méthode U.S.P. No. XVII, d'environ 70 u.i./mg. Ces produits de dépolymérisation peuvent être fractionnés, par filtration sur gel Sephadex, en fractions dont les poids moléculaires moyens, déterminés par ultracentrifugation, vont de 3 200 à 900 daltons et les activités anticoagulantes de 45 à 95 u.i./mg (méthode U.S.P.). Ces produits de dépolymérisation et les fractions qui en sont issues sont actifs par la voie orale aussi bien que par la voie parentérale. Il est connu aussi (cf. LASKER déjà cité) de pré- parer, par dépolymérisation de l'héparine à l'aide d'acide ascorbique et d'eau oxygénée, des produits de bas poids mo- léculaire moyen. La dépolymérisation à l'aide d'acide ascor- bique et d'eau oxygénée conduit, après fractionnement à l'alcool, à des fractions ayant un poids moléculaire moyen de 4 000 à 7 100 daltons et une activité anticoagulante de 12 à 100 u.i./mg (méthode U.S.P.). Enfin, il est connu (cf. demande de brevet anglais 2 002 406 A publiée le 21.02.1979) de préparer, par resul- fatation de produits de dépolymérisation de l'héparine dé- nués d'activité anticoagulante, des oligopolysaccharides ayant un poids moléculaire moyen, déterminé par la méthode de Somogy, de 2 600 à 5 500 daltons, un pouvoir rotatoire spécifique mesuré en solution aqueuse à 20 C de +40 à +50 et une activité anticoagulante inférieure à 50 u.i./mg (mé- thode U.S.P.), qui seraient actifs aussi bien par voie orale que par voie parentérale pour la prévention des thromboses. Les mélanges de polysaccharides sulfatés selon l'invention sont des mélanges de polysaccharides sulfatés -4 - ayant la structure générale des polysaccharides constitutifs de l'héparine, c'est-à-dire présentant les m8mes chatnons élémentaires que les polysaccharides constitutifs de l'hépa- rine, lesdits chatnons élémentaires étant liés de la même manière que dans ces derniers. Toutefois, contrairement aux polysaccharides constitutifs de l'héparine, les polysaccha- rides constitutifs des mélanges selon l'invention comportent une double liaison éthylénique à l'une des extrémités de leur chaine. Dans les mélanges selon l'invention, les groupes acides des polysaccharides sulfatés peuvent être sous forme libre ou sous forme salifiée, en particulier sous forme de sel de sodium, de calcium ou de magnésium. Les mélanges selon l'invention présentent, à l'é- tat de sel de sodium, les caractéristiques suivantes: - pourcentage de soufre: 9 % à 13,5 % - pourcentage d'azote: 1,8 % à 2,5 % - pourcentage d'acides uroniques: 20 % à 30 % - poids moléculaire moyen en poids: 2 000 à 10 000 daltons - pouvoir rotatoire spécifique en solution aqueuse à 20 C: [î]20: +250 à +55 Les teneurs en soufre et en azote et le pouvoir rotatoire indiqués ci-dessus ont été déterminés par les mé- thodes de la pharmacopée française, 8ème édition, monogra- phie héparine. La teneur en acides uroniques a été détermi- née par la méthode de N. BLUMENKRANTZ et al. (Analytical Biochemistry, 54, 484, 1973). Le poids moléculaire moyen en poids a été déterminé par chromatographie par perméation de gel sur gel de polyacrylamide-agarose en se référant à des étalons constitués par des héparines de poids moléculaire moyen connu, selon la méthode de ANDERSSON et al. (Thrombo- sis Research, 9, 575, 1976). -5- Bien que la présente invention concerne l'ensemble des mélanges tels que définis précédemment, elle a plus particulièrement pour objet ceux de ces mélanges qui, à l'état de sel de sodium, présentent les caractéristiques additionnelles indiquées pour les catégories I, II, III dans le tableau A ci-après: T A B L E A U A Catégorie Catégorie Catégorie I II III Poids moléculaire moyen en 8 000 à 3 000 à 2 000 à poids (en daltons) 10 o000 6 000 Activité anticoagulante in vitro Codex 130 à 160 80 à 140 30 à 80 Activité in vitro anti-Xa 130 à 180 120 à 250 80 à 200 Activité in vitro A.P.T.T. 100 à 150 80 à 120 20 à 80 Rapport activité in vitro antiXa 1 à 1,5 1,4 à 3 2,5 à 10 activité in vitro A.P.T.T. L'activité anticoagulante Codex indiquée dans le tableau ci-dessus a été déterminée par la méthode de la pharmacopée française, 8ème édition, monographie héparine. Les activités anti-Xa et A.P.T.T. ont été déterminées par la méthode de TEIEN et ai. (déjà cité). Toutes les activi- tés figurant dans le tableau sont exprimées en unités in- ternationales par mg (u.i./mg), en se référant au 3ème étalon international. Les mélanges selon l'invention sont préparés par action d'une base minérale ou organique sur un ester d'hé- parine résultant de l'estérification partielle ou totale des groupes acide carboxylique de l'héparine; Dans cet -6 - ester les groupes acides de l'héparine non estérifiés (c'est- à-dire les groupes sulfate acide et éventuellement une par- tie des groupes acide carboxylique) peuvent être à l'état libre ou sous forme de sel, en particulier de sel alcalin tel que le sel de sodium, de sel alcalino-terreux tel que le sel de calcium, de sel de magnésium ou de sel d'ammonium quater- naire à longue chatne tel que le sel de benzéthonium. Dans le cas o l'ester d'héparine est soluble dans l'eau (cas par exemple o les groupes acides non estérifiés sont sous forme de sel de sodium), la réaction entre l'ester et la base est effectuée dans leau, à une température de eC à 80C, la concentration molaire de la base dans le mi- lieu étant de préférence comprise entre 0,1 et 0,6. Comme bases utilisables on peut citer les bases solubles dans l'eau et en particulier l'hydroxyde de sodium, l'hydroxyde de po- tassium, les carbonates alcalins, la triéthylamine, la tri- éthylènediamine, la quinuclidine, le diaza-1,5 bicyclo [4.3.^ nonène-5 et le diaza-1,5 bicyclo [5.4.] undecène-5. Une fois la réaction terminée, on isole le produit de dépo- lymérisation formé, par exemple par précipitation par addi- tion de chlorure de sodium, puis de méthanol. Dans le cas o l'ester d'héparine n'est pas solu- ble dans l'eau (cas par exemple o les groupes acides non estérifiés sont sous forme de sel d'ammonium quaternaire à longue chaine), la réaction entre l'ester et la base est ef- fectuée dans un solvant organique inerte dudit ester, tel que par exemple le dichlorométhane, le diméthylformamide ou le tétrahydrofuranne, à une température de préférence de eC à 80eC. Comme bases utilisables on peut citer les bases solubles dans le solvant utilisé et en particulier le diaza- 1,5 bicyclo [4.3.0] nonàne-5, la quinuclidine et le diaza- 1,5 bicyclo r5.4.0] undecène-5. Une fois la réaction termi- née, on isole le produit de dépolymérisation formé, dans lequel les groupes acide carboxylique sont encore estérifiés, à l'état de sel alcalin, et l'hydrolyse par une solution - 7 - aqueuse d'hydroxyde alcalin, en particulier d'hydroxyde de sodium, au moins 1N, à basse température (O C à +5 C). Le produit final est séparé, par exemple par précipitation par addition de chlorure.de sodium, puis de méthanol. Comme esters d'héparine utilisables comme produit de départ dans les procédés selon l'invention, on peut citer en particulier les esters d'héparine décrits dans le brevet français 2 150 724 et dans le brevet anglais 1 501 095, ainsi que les esters méthylique, éthylique, éthoxycarbonylméthyli- que, cyanométhylique, benzylique et benzylique substitué (an particulier chloro-4 benzylique, nitro-4 benzylique) d'hàpa- rine. On emploie de préférence comme produit de départ les esters benzylique ou benzylique substitué d'héparine. Les esters d'héparine utilisés comme produits de départ dans les procédés selon l'invention peuvent Otre issus d'héparine de n'importe quelle origine (héparine de poumon de boeuf, hépa- rine de muqueuse de porc, héparine d'intestins de boeuf, etc...). Les esters méthylique, éthylique, éthoxycarbonyl- méthylique, cyanométhylique, benzylique et benzylique subs- titué d'héparine peuvent 8tre obtenus par exemple par action d'un sel neutre d'ammonium quaternaire ou d'amine de l'hépa- rine avec un dérivé halogéné de formule Hal - CH2 - R, dans laquelle Hal désigne un atome de chlore, de brome ou d'iode et R désigne un atome d'hydrogène ou un groupe méthyle, éthoxycarbonyl, cyano, phényle ou phényle substitué. Cette réaction est effectuée en solution ou en suspension dans un solvant inerte tel que le diméthylformamide, le chlorure de méthylène, le diméthylsulfoxyde, le tétrahydrofuranne ou l'acétone, à une température comprise entre -20OC et +600C. Les procédés selon l'invention utilisant l'action d'une base minérale ou organique sur un ester d'héparine, qui sont des procédés par p-élimination, permettent de réa- liser une dépolymérisation partielle et contrôlée de l'hé- --8-- _ 8 2_ parine sans altérer sa structure générale. Les mélanges de polysaccharides sulfatés selon l'invention possèdent des activités anticoagulante et anti- thrombotique et une activité hypolipémiante. Pour les mélan- ges de poids moléculaire moyen suffisamment faible (en pra- tique inférieur ou égal à 7 000 daltons), l'activité anti- thrombatique est supérieure à l'activité anticoagulante. Les mélanges selon l'invention sont dénués de toxicité. Les mélanges de polysaccharides sulfatés selon l'invention dans lesquels les groupes acides des polysaccha- rides sont sous forme de sels pharmaceutiquement acceptables, en particulier sous forme de sel de sodium, de calcium ou de magnésium, sont utilisables, en tant qu'agents anticoagulants et antithrombotiques, pour la prévention et le traitement des thromboses. Ils sont également utilisables pour le trai- tement de l'hyperlipgmie. Ils peuvent tre avantageusement substitués à l'héparine pour de telles applications. En ef- fet, administrés par voie sous-cutanée, ils présentent une plus longue durée d'action que l'héparine, ce qui permet de diminuer la fréquence des injections. D'autre part, ils pro- voquent moins d'effets secondaires (effets hémorragiques) que l'héparine. Ils peuvent être administrés, en mélange avec un véhicule pharmaceutiquement acceptable, par voie intravei- neuse, par voie sous-cutanée, par voie pulmonaire (inhalation), par voie rectale et, pour les mélanges de poids moléculaire moyen suffisamment bas (mélanges de la catégorie III en par- ticulier), par voie orale. Les doses administrées dépendent du mode d'administration et de l'effet recherché (effet antithrombotique ou hypolipémiant)'. Les exemples suivants illustrent l'invention sans la limiter. -9- Le sel neutre de benzéthonium d'héparine ou hépa- rinate de benzéthonium utilisé comme produit de départ dans les exemples 1 à 3, 10, 12 à 15 est issu d'une héparine d'intestin de porc ayant les caractéristiques suivantes: - poids moléculaire moyen en poids: 16 000 daltons - pouvoir rotatoire spécifique en solution aqueuse à 200C: []20: +41' L JD - activité anticoagulante Codex: 157 u.i./mg Le sel neutre de benzéthonium d'héparine ou hépa- rinate de benzéthonium utilisé comme produit de départ dans les exemples 4 à 9 et 11 est issu d'une héparine d'intestin de boeuf ayant les caractéristiques suivantes: - poids moléculaire moyen en poids: 11 400 daltons []2O: +370 L D - activité anticoagulante Codex: 128 u.i./mg EXEMPLE 1. A une solution de 30 g d'héparinate de benzétho- nium dans 600 ml de diméthylformamide on ajoute 30 g de chlo- rure de (chloro-4)benzyle. Après dissolution, on laisse en contact 60 heures à la température ambiante (environ 20 C), puis ajoute 600 ml d'une solution à 10 % d'acétate de sodium dans le méthanol. Le précipité formé est séparé par filtra- tion, lavé au méthanol et séché sous vide. On obtient ainsi ,75 g d'ester chloro-4 benzylique d'héparine, sous forme de sel de sodium. On met en contact, sous agitation, l'ester obtenu avec 269 ml d'une solution aqueuse 0,4N d'hydroxyde de so- die4m à 250C. Au bout de 2 heures on neutralise par addition d'une solution aqueuse 0,4N d'acide chlorhydrique et préci- - 10 - pite par addition de deux volumes (c'est-à-dire le double du volume de la phase aqueuse) de méthanol. On isole par fil- tration 8,46 g d'héparine d6polymérisée, sous forme de sel de sodium. EXEMPLE 2. A une solution de 30 g d'héparinate de benzétho- nium dans 600 ml de diméthylformamide on ajoute 30 g de chlo- rure de benzyle. Après dissolution, on laisse en contact heures à la température ambiante, puis précipite par ad- dition de 600 ml d'une solution à 10 % d'ac6tate de sodium dans le méthanol. On isole le précipité par filtration, le lave au méthanol et le sèche sous vide. On obtient ainsi 11,4 g d'ester benzylique d'héparine, sous forme de sel de sodium. On met en contact pendant deux heures, sous agita- tion, 3 g de l'ester ci-dessus avec 75 ml d'une solution aqueuse 0,4N d'hydroxyde de sodium à 20OC-25eC. Puis on neu- tralise par addition d'une solution aqueuse 0,4N d'acide' chlorhydrique et précipite par addition de 2 volumes de mé- thanol. On isole ainsi 2,23 g d'héparine d6polymérisée, sous forme de sel de sodium. EXEMPLE 3. A une solution de 10 g d'héparinate de benzétho- nium dans 250 ml de dichlorométhane on ajoute 10 g de chlo- rure de benzyle. Après dissolution, on abandonne 24 heures à la température ambiante, puis évapore le solvant sous vide. Le résidu est dissous dans 150 ml de diméthylformamide et on précipite par addition de 150 ml d'une solution d'acétate de sodium à 10 % dans le méthanol. On sépare par filtration 3, 67 g d'ester benzylique d'héparine, sous forme de sel de - 11 - sodium. On traite sous agitation, pendant 2 heures, 2 g de l'ester cidessus avec 50 ml d'une solution aqueuse 0,1N d'hydroxyde de sodium & 60 C. Apres refroidissement, on neu- tralise par addition d'une solution aqueuse 0,1N d'acide chlorhydrique, puis précipite par addition de 2 volumes de méthanol. On obtient ainsi 1, 54 g d'héparine dépolymârisée, sous forme de sel de sodium. EXEMPLE 4. A une solution de 5 g d'héparinate de benzéthonium dans 125 ml de dichlorométhane on ajoute 5 g de chloracetate d'éthyle et, après dissolution, on laisse en contact pendant 3 jours à la température ambiante. On évapore le solvant sous vide, reprend le résidu par 75 mi de dimâthylformamide et précipite par addition de 75 ml d'une solution à 10 % d'acé- tate de sodium dans le méthanol. Le précipité, séparé par - filtration, est lavé au méthanol, puis séché sous vide. On obtient ainsi 1,72 g d'ester carbéthoxyméthylique d'héparine, sous forme de sel de sodium. On traite 1,7 g de l'ester ci-dessus par 43 ml d'une solution aqueuse O, 1N d'hydroxyde de sodium à 600C, sous agitation, pendant deux heures. Après refroidissement, on neutralise par addition d'une solution aqueuse 0,1N d'a- cide chlorhydrique et précipite par addition de deux volumes de méthanol. On isole par filtration 1,33 g d'héparine dé- polymérisée, sous forme de sel de sodium. EXEMPLE 5. A une solution de 10 g d'héparinate de benzétho- nium dans 250 ml de dichlorométhane on ajoute 10 g de chlo- rure de (chloro-4)benzyle, que l'on dissout par agitation. On abandonne la solution pendant 24 heures à température am- - 12 - biante puis évapore le solvant sous vide. Le résidu est re- pris par 150 ml de diméthylformamide et on précipite par addition de 150 ml de solution à 10 % d'acétate de sodium dans le méthanol. Après filtration, lavage du précipité au méthanol et séchage sous vide, on isole 3,64 g d'ester chloro-4 benzylique d'héparine, sous forme de sel de sodium. On traite 2 g de l'ester ci-dessus par 50 ml d'une solution aqueuse O,1N d'hydroxyde de sodium à 600C, sous agitation, pendant deux heures. Après refroidissement et neu- tralisation par une solution aqueuse 0,1N d'acide chlorhy- drique, on précipite par addition de deux volumes de métha- nol. On isole le précipité par filtration, le lave au métha- nol et le sèche sous vide. On obtient ainsi 1,38 g d'héparioe dépolymérisée, sous forme de sel de sodium. EXEMPLE 6. A une solution de 5 g d'héparinate de benzéthonium dans 125 ml de dichlorométhane on ajoute 5 g de chlorure de (nitro-4)benzyle, que l'on dissout par agitation. La solu- tion est ensuite abandonnée pendant 3 jours à la température ambiante, puis on évapore le solvant sous vide et dissout le résidu dans 75 ml de diméthylformamide. On précipite l'ester formé par addition de 75 ml de solution à 10 % d'acétate de sodium dans le méthanol. Le précipité est recueilli par fil- tration, lavé au méthanol et séché sous vide. On obtient ainsi 1,89 g d'ester nitro-4 benzylique d'héparine, sous forme de sel de sodium. On traite 1,85 g de l'ester ci-dessus par 46 ml d'une solution aqueuse 0, 1N d'hydroxyde de sodium à 60 C, pendant deux heures, sous agitation. Après refroidissement, on neutralise par addition d'une solution aqueuse 0,1N d'a- cide chlorhydrique, puis précipite par addition de deux vo- lumes de méthanol. Le précipité est isolé par filtration, lavé au méthanol et séché sous vide. On obtient ainsi 1,13 g *- 13 - d'héparine dépolymérisée, sous forme de sel de sodium. EXEMPLE 7. A une solution de 30 g d'héparinate de benzétho- nium dans 500 ml de dichlorométhane on ajoute 30 g de chlo- rure de benzyle, que l'on dissout par agitation. La solution est ensuite abandonnée à température ambiante pendant 24 heu- res, puis on évapore le solvant sous vide et reprend le-ré- sidu par 400 ml d'éther. L'insoluble est sépare par filtra- tion. On obtient ainsi 30 g d'ester benzylique d'héparine, sous forme de sel de benzéthonium. Cet ester est dissous dans 200 ml de dichlorométhane contenant 8 ml de diaza-1,5 bicyclo [4.3.0] nonne-5. On porte à reflux pendant 3h30, puis évapore le solvant sous vide. Le résidu est dissous dans 450 ml de diméthylformamide et on ajoute un égal volume d'une solution à 10 % d'acétate de sodium dans le méthanol. Le précipité est recueilli par filtration et lavé au métha- nol. Puis on le traite à O0 C pendant une heure par une solu- tion aqueuse iN d'hydroxyde de sodium. Après neutralisation, on précipite par addition de deux volumes de méthanol. Le précipité est isolé par filtration, lavé au méthanol et sé- ché sous vide. On obtient 6,6 g d'héparine dépolymérisée, sous forme de sel de sodium.' EXEMPLE 8. A une solution de 10 g d'héparinate de benzétho- nium dans 250 ml de dichlorométhane on ajoute 10 g de chlo- rure de (chloro-4)benzyle, que l'on dissout par agitation. La solution est abandonnée à température ambiante pendant 24 heures, puis on évapore le solvant sous vide. On reprend le résidu par 200 ml d'éther et isole par filtration le précipité formé. On obtient ainsi 10 g d'ester chloro-4 ben- zylique d'héparine, sous forme de sel de benzéthonium. - 14- On dissout 5 g de ce produit dans 100 ml de dichlo- rométhane contenant 1,5 ml de diaza-1,5 bicyclo [4.3.03 nonène-5 et porte à reflux pendant 4 heures. Puis on évapore le solvant sous vide, reprend le résidu par 30 ml de dimé- thylformamide et ajoute 100 ml d'une solution à 10 % d'acé- tate de sodium dans le méthanol. Le précipité formé est isolé par filtration, lavé au méthanol, puis traité par 24 ml d'une solution aqueuse 1N d'hydroxyde de sodium pendant une heure à OOC. On neutralise par addition d'une solution aqueuse 1N d'acide chlorhydrique et précipite par addition de deux vo- lumes de méthanol. On sépare le précipité par filtration. Après lavage au méthanol et séchage sous vide, on obtient 1 g d'héparine dépolymérisée, sous forme de sel de sodium. EXEMPLE 9. A une solution de 30 g d'héparinate de benzêtho- nium dans 600 ml de diméthylformamide on ajoute 30 g de chlo- rure de benzyle. Après dissolution, on laisse en contact pendant 60 heures à la température ambiante, puis on préci- pite l'ester formé par addition de 1 200 ml d'une solution à 10 % d'acétate de sodium dans le méthanol. Le précipité est isolé par filtration, lavé au méthanol et séché sous vide. On obtient ainsi 11,4 g d'ester benzylique d'héparine, sous forme de sel de sodium. On traite 10 g de l'ester ci-dessus par 250 ml d'une solution aqueuse 0, 1N d'hydroxyde de sodium à 600C, pendant deux heures sous agitation. Apres refroidissement, on neutralise par une solution aqueuse 0,1N d'acide chlorhy- drique et précipite par addition de deux volumes de méthanol. Le précipité est filtré, lavé au méthanol et séché sous vide. On obtient ainsi 6,65 g d'héparine dépolymérisée, sous forme de sel de sodium. EXEMPLE 10. A une solution de 120 g d'héparinate de benzétho- - 15 - nium dans 2,4 1 de diméthylformamide on ajoute 120 g de chlo- rure de (chloro-4)benzyle, que l'on dissout par agitation. La solution est ensuite abandonnée à température ambiante pendant 60 heures, puis on ajoute 2,4 1 d'une solution à 10 % d'acétate de sodium dans du méthanol. Le précipité for- mé est séparé par filtration, lavé au méthanol et séché sous vide. On obtient ainsi 46 g d'ester chloro-4 benzylique dthéparine, sous forme de sel de sodium. On traite 20 g de l'ester ci-dessus par 500 mi dtune solution aqueuse O, IN d'hydroxyde de sodium à 60 C pendant deux heures, sous agitation, Après refroidissement- et neutralisation, on précipite par addition de deux volumes de méthanol. On isole par filtration 11,7 g d'héparine dépo- lymérisée, sous forme de sel de sodium. EXEMPLE 11. A une solution de 30 g d'héparinate de benzétho- nium dans 750 ml de dichlorométhane on ajoute 30 g d'iodure de méthyle, que l'on dissout par agitation. On abandonne la solution pendant 48 heures à température ambiante, puis éva- pore le solvant sous vide. Le résidu est repris par 450 ml de diméthylformamide et on précipite par addition de 450 ml de solution à 10 % d'acétate de sodium dans le méthanol. Après filtration, le précipité est lavé au méthanol et séché sous vide. On isole ainsi 10,5 g d'ester méthylique d'hépa- rine, sous forme de sel de sodium. On traite 2 g de l'ester ci-dessus par 50 ml d'une solution aqueuse 0,1N d'hydroxyde de sodium à 600C, sous agitation, pendant deux heures. Apresrefroidissement, on amine le pH de la solution à 4,5 environ par agitation avec une résine échangeuse d'ions carboxylique sous forme H+. La résine est ensuite séparée par filtration et lavée à l'eau. Les phases aqueuses rassemblées sont neutralisées par addi- tion d'une solution aqueuse diluée d'hydroxyde de sodium, - 16 - puis on lyophilise. On obtient ainsi 2 g d'héparine dépoly- mérisée, sous forme de sel de sodium. EXEMPLE 12. On traite 3 g de l'ester chloro-4 benzylique d'hé- parine obtenu à l'exemple 10 par 120 ml d'une solution aqueu- se à 10 % de carbonate disodique à 600C, pendant deux heures, sous agitation. Après refroidissement, on neutralise par une solution aqueuse 0,4N d'acide chlorhydrique et précipite par addition de deux volumes de méthanol. On isole par filtra- tion 1,57 g d'héparine dépolymérisée, sous forme de sel de sodium. EXEMPLE 13. A une solution de 30 g d'héparinate de benzétho- nium dans 600 ml de diméthylformamide on ajoute 30 g de chloracétate d'tthyle. Après dissolution, on laisse en con- tact 60 heures à la température ambiante, puis ajoute 600 ml d'une solution à 10 % d'acétate de sodium dans du méthanol. Le précipité formé est séparé par filtration, lavé au métha- nol et séché sous vide. On obtient ainsi 10,78 g d'ester carbéthoxyméthylique d'héparine, sous forme de sel de sodium. On met en contact, sous agitation, 3 g de l'ester ci-dessus avec 100 ml d'une solution aqueuse à 3 % de tri- éthylamine à la température de 60 C. Au bout de 5 heures, on neutralise par addition d'une solution aqueuse d'acide chlorhydrique, puis précipite par addition de 2 volumes de méthanol. On isole par filtration 2,5 g d'héparine dépolymé- risée, sous forme de sel de sodium. EXEMPLE 14. A une solution de 5 g d'héparinate de benzéthonium dans 125 ml de dichlorométhane on ajoute 5 g de chloracéto- - 17- nitrile, que l'on dissout par agitation. On abandonne la solution pendant 48 heures à température ambiante, puis on évapore le solvant sous vide. Le résidu est dissous dans ml de diméthylformamide et on précipite par addition de 75 ml d'une solution à 10 % d'acétate de sodium dans le mé- thanol. Le précipité est séparé par filtration, lavé au mé- thanol et séché sous vide. On obtient ainsi 1,63 g d'ester cyanométhylique d'héparine, sous forme de sel de sodium. On traite l'ester obtenu par 40 ml d'une solution aqueuse O,IN d'hydroxyde de sodium à 60 C, sous agitation, pendant deux heures. Après refroidissement, on neutralise par addition d'une solution aqueuse 0,IN d'acide chlorhydri- que, puis précipite par addition de deux volumes de méthanoa. On isole par filtration 1,33 g d'héparine dépolymérisée, sous forme de sel de sodium. EXEMPLE 15. On dissout sous agitation 3 g de l'ester chloro-4 benzylique d'héparine obtenu à l'exemple 10 dans 120 ml d'une solution aqueuse à 10 % de carbonate disodique. Après deux heures d'agitation à une température de 200C à 250C, on amè- ne le pH de la solution à 6 par addition d'une solution aqueuse N d'acide chlorhydrique, puis ajoute un volume de méthanol égal à deux fois le volume de la solution aqueuse. On isole par filtration le précipité formé et obtient ainsi 2,1 g d'ester chloro-4 benzylique d'héparineo On traite sous agitation, pendant deux heures, 2 g de l'ester ci-dessus par 50 ml d'une solution aqueuse 0,1N d'hydroxyde de sodium à 600C. Après refroidissement, on neu- tralise par addition d'une solution aqueuse 0,1N d'acide chlorhydrique, puis précipite par addition de deux volumes de méthanol. On obtient ainsi 1,4 g d'héparine dépolymérisée, sous forme de sel de sodium. - 18 - Dans les exemples 1 à 10 et' 12 à 15 précédents, avant de précipiter le produit formé par addition des deux volumes de méthanol, on a ajusté la concentration en NaCl de la phase aqueuse à 10 % par addition de chlorure de so- dium. Le tableau B suivant donne les caractéristiques des produits (héparines dépolymérisées sous forme de sel de sodium) préparés dans les exemples 1 à 15. Les pourcentages de soufre, d'azote et d'acides uroniques, les pouvoirs rota- toires spécifiques en solution aqueuse à 20 C, les poids moléculaires moyens en poids et les activités indiqués dans ce tableau ont été déterminés par les méthodes signalées précédemment. Dans la colonne dispersion de poids moléculai- res figurent les valeurs extremes approximatives des poids moléculaires des polysaccharides constitutifs des mélanges, telles que déterminées par chromatographie par perméation de gel sur gel de polyacrylamide-agarose. Dans la colonne vis- cosité figurent les viscosités à 25 C des solutions aqueuses à10 % des produits. Dans la colonne absorption UV figurent les absorptions à 230 nm et sous une épaisseur de 1 cm de solutions à 1 % des produits dans HCl 0,01N. - 19 - T A B L E A U B % 0o Poids Dispersion Exem- acides % S % N mo1éculaire de poids pie uroniques Lu-D moyen moléculaires (en daltons) 1 v - i, ___ 1'0 23,0 26,0 ,4 23,9 22,8 24,5 ,2 23,7 26,0 ,2 23,8 23,9 24,3 ,6 ,3 11,5 11,6 12,0 ,9 12,2 ,8 11,3 11,1 11,8 ,9 11,0 11,5 11,8B 12,0 11,8 2,1 2,0 2,2 2,1 2,2 2, 3 2,0 2,2 2,2 2,1 2,3 2,0 2,2 2,1 2,3 + 4411 + 440 + 440 + 350 + 390 + 330 + 33'0 + 350 + 38 + 41 + 270 + 40 + 45 + 440 + 450 7 300 6 500 6 400 500 000 4 200 4 100 4 500 4 000 3 800 2 800 4 000 9 000 8 500 4 000 1 600 1 800 3 000 2 200 2 000 1 000 1 700 1 000 2 000 1 000 I 000 2 000 3 000 3 000 2 000 - 12 000 - 13 000 -11 000 -13 000 -13 000 - 10 000 = 10 000 - 10 00 - 10 000 - 9 000 - 8 000 - 9 000 - 20 000 - 20 000 - 20 000 - 20 - TABLEAU B (suite) Activité Activité Activité Exem- Viscosité Absorption anticoagu- anti-Xa A.P.T.T. pie (en centi- UV lante Codex in vitro in vitro poises) in vitro (u.i./mg) (u.i./mg) (u.i./mg) 1 2,37 7,5 127 1 80 105 2 2,25 7,8 116 148 100 3 2,08 7,9 112 163 89 4 1,93 8,2 83 130 52 1,91 9,7 75 118 43 6 1,74 12,5 60 140 33 7 1,64 15,0 50 130 30 8 1,61 16,4 54 110 33 9 1,62 14,0 80 159 45 1,57 15,4 62 159 40 11 1,50 22,8 40 90 20 12 1,60 14,4 75 140 35 13 2,60 5,9 135 140 130 14 2,50 6,1 138 130 130 1,65 10,64 110 170 86 i - 21 - EXEMPLE 16. Le produit de l'exemple 1 d'une part et une hépa- rine-commerciale d'autre part ont été administrés, à des époques différentes, par voie sous-cutanée, à cinq volontai- res sains, à la dose de 5 000 u.i. Codex. Sur des prélève- ments sanguins effectués 1 heure, 3 heures, 5 heures et 7 heures après l'administration, on a mesuré leactivité anti- coagulante plasmatique au moyen des tests anti-Xa et A.P.T.T. d6finis précédemment. Les résultats obtenus ont été exprimés en unités internationales par ml de plasma en se 6référant à une courbe d'étalonnage tracée à partir d'essais effectués sur un plasma témoin auquel on a ajouté des quantités connues d'héparine de référence (3ème étalon international). Les résultats moyens obtenus sont rassemblés dans le tableau C suivant: T A B L E A U C Temps écoulé entre l'adminis- tration et le prélèvement Activité anti-Xa Activité A.P.T.T. Produit de Héparine Produit de l'exemple 1 commerciale l'exemplei Héparine commerciale 1 heure 0,20 0,04 0,04 0,05 3 heures 0,27 0,08 0,05 0,04 heures 0,28 0,06 0,03 0,02 7 heures 0,22 0,05 0,02 0,01 L.,.! .,,_ On voit que le produit de l'exemple 1 exerce un ef- fet anti-Xa beaucoup plus intense que celui de lthéparine commerciale. - - 22 - R E V E N D I CAT I 0 N S 1/ Mélanges de polysaccharides sulfatés ayant la structu- re générale des polysaccharides constitutifs de l'héparine et dont les groupes acides sont sous forme libre ou salifiée, caractérisés en ce que les polysaccharides constitutifs des- dits. mélanges possèdent une double liaison éthylénique à l'une des extrémités de leur chaîne et en ce que les mélan- ges présentent, à l'état de sel de sodium, les caractéristi- ques suivantes: o - pourcentage de soufre: 9 % à 13,5 % - pourcentage d'azote: 1,8 % à 2,5 % - pourcentage d'acides uroniques: 20 % à 30 % poids moléculaire moyen en poids: 2 000 à 000 daltons - pouvoir rotatoire spécifique en solution aqueuse C: [îj20: + 25 à + 55= 2/ Mélanges selon la revendication qu'ils présentent, à l'état de sel de ristiques suivantes: poids moléculaire moyen en daltons - activité anticoagulante in u.i./mg activité in vitro anti-Xa - activité in vitro A.P.T.T. - rapport activité in vitro activité in vitro 3/ Mélanges selon la revendication qu'ils présentent, à l'état de sel de ristiques suivantes: 1, caractérisés en ce sodium, les caracté- poids: 8 000 à 10 000 vitro Codex: 130 à : 130 à 180 u.i./mg : 100 à 150 u.i./mg anti-Xa: 1 à 1,5 A.P.T.T. 1, caractérisés en ce sodium, les caracté- - poids moléculaire moyen en poids: 3 000 à 8 000 daltons - 23 - - activité anticoagulante in vitro Codex: 80 à 140 u.i./mg - activité in vitro anti-Xa: 120 à 250 u.i./mg - activité in vitro A.P.ToT,: 80 à 120 u. i./mg - rapport activité in vitro anti-Xa: 1,4 à 3 activité in vitro A.P.T.T. 4/ Mélanges selon la revendication qu'ils présentent, à l'état de sel de ristiques suivantes: - poids moléculaire moyen en daltons - activité anticoagulante in u.i./mg - activité in vitro anti-Xa - activité in vitro A.P.T.T. - rapport activité in vitro activité in vitro 1, caractérisés en ce sodium, les caracté- poids: 2 000 à 6 000 vitro Codex: 30 à 80 : 80 à 200 uoio/mg : 20 à 80 uoio/mg Xanti-Xa 2,5 à 10 A.P*.T.To / Mélange selon la revendication 4, caractérisé en ce qu'il présente, à l'état de sel de sodium, les caractéris- tiques suivantes: - poids moléculaire moyen en poids: 4 200 daltons pouvoir rotatoire []20 = + 33 - activité anticoagulante in vitro Codex: 60 u.iJmg - activité in vitro anti-Xa: 140 u.i./mg - activité in vitro A. P.T.T.: 33 u.i./mg 6/ Mélange selon la revendication 4, caractérisé en ce qu'il présente, à l'état de sel de sodium, les caractéris- tiques suivantes: - poids moléculaire moyen en poids: 4 100 daltons pouvoir rotatoire [JD0 = + 33e - activité anticoagulante in vitro Codex: 50 u.i./mg - activité in vitro anti-Xa: 130 u.iO/mg - activité in vitro A. PoT.T.: 30 u.i./mg - 24 - 7/ Mélange seIon la revendication 4, caractérisé en ce qu'il présente, à l'état de sel de sodium, les caractéris- tiques suivantes: - poids moléculaire moyen en poids: 4 500 daltons pouvoir rotatoire [cx20 = + 35o - activité anticoagulante in vitro Codex: 54 u.i./mg - activité in vitro anti-Xa: 110 u.i./mg - activité in vitro A. P.T.T.: 33 u.i./mg 8/ Mélange selon la revendication 4, caractérisé en ce qu'il présente, à l'état de sel de sodium, les caractéris- tiques suivantes: - poids moléculaire moyen en poids: 4 000 daltons pouvoir rotatoire = + 38 - activité anticoagulante in vitro Codex: 80 u.i. /mg - activité in vitro anti-Xa: 159 u.i./mg - activité in vitro A.P.T.T. : 45 uoi./mg 9/ Mélange selon la revendication 4, caractérisé en ce qu'il présente, à l'état de sel de sodium, les caractéris- tiques suivantes: - poids moléculaire moyen en poids: 3 800 daltons pouvoir rotatoire [c"-O = + 410 - activité anticoagulante in vitro Codex: 62 u.i./mg - activité-in vitro anti-Xa: 159 u.i./mg - activité in vitro A. P.T.T.: 40 u.i./mg 10/ Mélange selon la revendication 4, caractérisé en ce qu'il présente, à l'état de sel de sodium, les caractéris- tiques suivantes: - poids moléculaire moyen en poids: 2 800 daltons pouvoir rotatoire []20 = + 270 - 25 - - activité anticoagulante in vitro Codex: 40 u.i./mg - activité in vitro anti-Xa: 90 u.i./mg - activité in vitro A.PT.T.: 20 u.io/mg 11/ Mélange selon la revendication 4, caractérisé en ce qu'il présente, à iLétat de sel de sodium, les caractêris- tiques suivantes poids moléculaire moyen en poids g 4 000 daltons - pouvoir rotatoire [ 0 + 40 - activité anticoagulants in vitro Codex s 75 u iJmg - activité in vitro anti-Xa: 140 uoio/mg - activité in vitro AoPoT.T.: 35 u.i./mg 12/ M6élange selon la revendication 3, caractérisé en ce qu'il présente, à l'état d esel de sodiumq les caractris- tiques suivantes: - poids moléculaire moyen en poids z 4 000 daltons pouvoir rotatoire +î2 45@ - activiti anticoagulante in vitro Codex 110 Uoi./mg - activité in vitro anti-Xa: 170 uoiî/mg - activité in vitro AoP. ToT. 86 uoi./mg 13/ Procédé de préparation des mélanges selon la revendi- cation 1, caractérise en ce que l'on fait réagir, en milieu aqueux et à une température de 200C à 600C, un ester d"h6pa- rine, soluble dans l'eau, résultant de l'estérification par- tielle ou totale des groupes acide carboxylique de l'hépari- ne avec une base minérale ou organique soluble dans l'eau et isole le produit de dépolymérisation ainsi formé. 14/ Procédé selon la revendication 13, caractérise en ce que la concentration molaire de la base dans le milieu est 0,1 à 0,6. _ 26 - / Procédé de préparation des mélanges selon la revendi- cation 1, caractérisé en ce que l'on fait réagir un ester d'héparine, insoluble dans l'eau, résultant de l'estérifica- tion partielle ou totale des groupes acide carboxylique de l'héparine avec une base, au sein d'un solvant organique inerte dudit ester, isole le produit de dépolymérisation ainsi formé à l'état de sel alcalin et l'hydrolyse par une solution aqueuse d'hydroxyde de sodium au moins 0,1N à basse température. 16/ Procédé selon la revendication 14, caractérisé en ce que la réaction de l'ester d'héparine avec la base est ef- fectuée à une température de 200C à 800C. 17/ Médicament, utilisable en particulier pour la préven- tion et le traitement des thromboses et pour le traitement de l'hyperlipémie, caractérisé en ce qu'il contient comme ingrédient actif un mélange de polysaccharides sulfatés tel que défini dans chacune des revendications 1 à 12, les grou- * pes acides desdits polysaccharides étant sous forme de sels pharmaceutiquement acceptables. 18/ Médicament selon la revendication 17, caractérisé en ce que les groupes acides des polysaccharides sulfatés sont sous forme de sel de sodium, de sel de calcium ou de sel de magnésium.