FR 2478104 A1 19810918 FR 8005891 A 19800317 -1- La présente invention a pour objet de nouveaux dérivés de gangliosides, leur préparation et leur application, notamment dans le domaine de la chromatographie d'affinité. Le rôle des gangliosides apparaît de plus en plus important, et de mieux en mieux élucidé, dans les propriétés biologiques des membranes cellulaires. Ils servent notamment de récepteurs spécifiques vis-à-vis de différentes macromolécules biologiques (hormones, virus, interféron, toxines bactériennes etc...) et leur permettent ainsi d'exprimer leur messages respec- tifs, bénéfiques ou toxiques pour les cellules. Cette fonction biologique de récepteur spécifique permet de nombreuses appli- cations dans le domaine des médicaments et dans le domaine des purifications par chromatographie d'affinité. On sait que les gangliosides sont des glycolipides qui peuvent être isolés notamment dans le cerveau, le foie et les reins, et dont la molécule comprend, combinés chimiquement notamment des acides gras, de la -sphingosine, des oses et des acides sialiques. En particulier, les gangliosides possèdent un groupement N-acyle (acyle dérivé d'un acide gras) et au moins un groupement N-acétyle d'une galactosamine. Selon la nomenclature proposée par SVENNERHOLM, J. NEUROCHEM. 10,613 (1963), les divers gangliosides sont désignés par la lettre G suivie de l'une des quatre lettres M, D, T ou Q selon que le ganglisode est un mono-, di-, tri- ou tétra sialo- ganglioside. Ces lettres sont suivies d'indices numériques permettant de distinguer les gangliosides contenant une même quantité d'acide sialique mais ayant des mobilités chromatogra- phiques différentes. Par analogie avec la nomenclature proposée par SVENNERHOLM pour le ganglioside GM1 on désignera ci-après par "lysogangliosides" les produits obtenus par hydrolyse totale des groupements N-acétyle et N-acyle des gangliosides en groupements NH2. Les différents gangliosides, qui sont utilisés comme produits de départ dans la présente demande, peuvent être prépa- rés par exemple selon les méthodes déjà décrites par exemple par adsorption sur résine échangeuse d'anions suivie d'une élution sélective par un gradient de concentration croissante d'acétate de potassium dans le méthanol; voir FREDMAN et coll, Biochimica et Biophysica Acta (1980); voir aussi communication de FREDMAN et coll; "Structure and function of gangliosides", Congrès de Le -2- Bischenberg, Strasbourg Avril 1979, édité par Plenum Press. Si l'on parvient à fixer chimiquement un ganglioside donné à la surface d'un support chromatographique convenablement choisi, on dispose alors d'un nouveau support chromatographique doué d'une affinité spécifique visà-vis de la macromolécule biologique qui reconnaît naturellement et sélectivement ce ganglioside choisi. Il est alors possible de purifier toute une famille de macromolécules biologiques d'un grand intérêt thérapeutique. Ainsi, sur un support recouvert de ganglioside GM1, il devient possible de purifier la toxine du choléra ou les entéro- toxines thermolabiles secrétées par E. coli et d'autres entéro- bactéries. Après inactivation par le formol ou d'autres procédés connus, il serait alors possible de préparer les vaccins corres- pondants. Sur un support recouvert de ganglioside GD1b ou GT1 il devient possible de purifier la toxine tétanique pour préparer ensuite un vaccin antitétanique plus purifié et peut-être encore plus immunogène que le vaccin actuel. Sur un support recouvert de GM2 il devient possible de purifier l'interféron qui suscite actuellement beaucoup d'espoirs en thérapeutique anti-virale et anti-tumorale. Depuis quelques années, de nombreux supports chroma- tographiques et de nombreuses réactions chimiques ont été déve- loppés pour réaliser la fixation d'un ligand (molécule ou ré- cepteur doué de propriétés de reconnaissance spécifique) sur un support en vue d'une utilisation en chromatographie d'affinité. Les fonctions chimiques généralement nécessaires sur le support sont des fonctions alcool-OH, amine-NH2, acide carbo- xylique-COOH, époxy - H-CH2, aldéhyde - CH=O. Les fonctions chimiques complémentaires sur le ligand sont choisies parmi les mêmes fonctions, selon les principes connus. Ces principes sont décrits par exemple dans l'ouvrage "Affinity Chromatography, principles and methods", Pharmacia Fine Chemicals, UPSALLA, Suède (1974). Dans le cas particulier des gangliosides et des gly- colipides, deux types de fonctions chimiques réactives sont naturellement disponibles: il y a en effet de nombreuses fonc- tions alcool et souvent un ou plusieurs acides carboxyliques por- -3- tés par l'acide N-acétyl neuraminique ou d'autres acides sia- liques. Cependant l'expérience a montré qu'une fixation par l'intermédiaire de ces fonctions détruisait ou rendait inutili- sables les propriétés d'affinité spécifique attendues d'un tel support. Le problème est donc de faire apparaître d'autres fonctions chimiques sur ces gangliosides ou glycolipides sans détruire leur activité biologique. Plusieurs méthodes développées par UEMURA et al (1976) et WIEGANDT et al (1970) consistent à oxyder la portion terminale de la sphingosine au niveau de la double liaison pour faire apparaître une fonction réactive de type époxy ou-aldéhyde. Ces méthodes n'ont cependant donné que des résultats peu exploitables. Une autre méthode, développée en 1963 par TAKETOMI et al, J of BIOCHEM. 54,5,444 (1963), consiste à transformer les gangliosides en lysogangliosides. Les fonctions N-acétyl et N- acyl sont totalement hydrolysées en fonctions aminées -NH2 par chauffage à 1200 C à reflux pendant 2 heures dans un mélange de butanol-potasse 10 N (90:10). Après extraction dans une phase aqueuse, et concentration par évaporation, le lysoganglioside ainsi obtenu peut être facilement couplé sur différentes ma- trices. C'est ainsi que du lysoganglioside GM, peut être couplé à différents supports polysaccharidiques pour purifier la toxine cholérique (voir demande de brevet français 77 28163). Cependant en voulant appliquer la même méthode pour fixer les gangliosides GDlb ou GTl récepteurs de la toxine tétanique, il n'a pas été possible de réaliser un support doué d'affinité pour la toxine tétanique, contrairement à ce qui était normalement attendu. Il a maintenant été découvert qu'il est possible de transformer les gangliosides par hydrolyse ménagée, en de nou- veaux dérivés de ganglioside "activés" qui ne présentent pas ces inconvénients. Ces nouveaux dérivés possèdent des groupements réactifs permettant de les fixer sur différents supports, de diverses manières, sans perte de leurs propriétés de ligands doués d'affinité spécifique vis-à-vis de macromolécules bio- logiques. Cette méthode est applicable, plus généralement à tous les gangliosides possédant plusieurs groupements N-acyle. Il -4- convient de préciser que, par convention, dans la présente demande, l'expression "ganglioside" englobe ces divers glyco- lipides. L'utilisation de ces supports en chromatographie d'affinité a permis, dans le cas du dérivé du ganglioside GDIb ou GTl de purifier la toxine tétanique en une seule étape, montrant que les conditions nouvelles d'activation chimique des ganglio- sides respectaient leur propriétés biologiques. Une purification de cette nature, aussi simple et aussi rapide, n'avait jamais été décrite à notre connaissance. Ce procédé d'activation ménagée des gangliosides a également été appliqué avec succès au ganglioside GMi et à divers autres gangliosides purs ou en mélanges. La présente invention a pour objet de nouveaux dérivés de gangliosides, caractérisés par le fait qu'ils sont des pro- duits de désacylation partielle des gangliosides, qu'ils pré- sentent des groupements amine libre pouvant être mis en évidence par une réaction positive dans le test à la ninhydrine, qu'ils sont mobiles en chromatographie sur couche mince de gel de silice dans le système chloroforme - méthanol-eau (60:32:7), et qu'ils présentent les propriétés d'affinité spécifique des gangliosides dont ils dérivent, lesdits dérivés pouvant être couplés à des supports solides, par l'intermédiaire des groupements amine apparus lors de la désacylation partielle, sans perte desdites propriétés d'affinité spécifique. L'invention a également pour objet un procédé de prépa- ration des nouveaux dérivés activés de gangliosides. Selon ce procédé pour activer chimiquement les ganglio- sides tout en conservant l'essentiel de leurs propriétés biolo- giques, il suffit de traiter ceux-ci avec une solution aqueuse basique à une température comprise entre O et 1200C, ladite température étant d'autant plus basse que le milieu est plus basique. Pour une solution finale d'alcalinité comparable à la potasse ou la soude normale, il importe de ne pas dépasser 100'C. Pour une alcalinité comparable à la potasse ou la soude décinor- male, il importe de ne pas dépasser 1200C. Le plus souvent on choisit les conditions qui permettent d'opérer entre 40 et 1000C. Le temps de réaction doit être suffisant pour qu'appa- raissent des groupements amine libre, mais il faut en outre arré- ter la réaction avant désacylation totale. Le temps de réaction -5- peut être déterminé facilement dans chaque cas par une expérimen- tation simple, en utilisant par exemple le test à la ninhydrine, ou le text de SANGER au dinitrofluorobenzène, en recherchant une coloration intermédiaire d'intensité inférieure à celle obtenue après désacylation complète. Généralement, le temps de réaction varie de 30 minutes à 24 heures. Le solvant de réaction est soit l'eau, soit un mélange d'eau et de solvants organiques. Parmi les solvants organiques on citera des alcools tels que le butanol. Parmi les bases utilisables dans le procédé de l'inven- tion, on citera celles qui sont capables de donner dans l'eau un pH de 9 à 14, et en particulier les hydroxydes de métal alcalin comme la soude ou la potasse. Le plus simple est de dissoudre le ganglioside choisi dans de la potasse ou de la soude normale et d'incuber cette solution à température de 60-1000C pendant 2 heures environ. La transformation se traduit par l'apparition d'au moins une fonction NH2 résultant de l'hydrolyse partielle des fonctions N-acétyl ou N-acyl, en nombre suffisant pour permettre une fixation par des méthodes connues, au moyen de ladite fonc- tion - NH2, mais cette transformation est assez limitée pour conserver l'essentiel des propriétés biologiques des gangliosides choisis. Il est possible de vérifier que ces conditions nou- velles d'hydrolyse basique donnent un dérivé de ganglioside très différent du lysoganglioside obtenu par hydrolyse totale dans les conditions décrites par TAKETOMI. En effet, en chromatographie en couche mince, sur gel de silice dans le système chloroforme- méthanol-eau (60-32-7), les lysogangliosides obtenus selon TAKETOMI ne migrent absolument pas, alors que les gangliosides activés selon le présent procédé donnent un Rf égal ou inférieur à celui du ganglioside natif correspondant, mais toujours déplacé par rapport au point de départ. Comme indiqué ci-dessus, l'invention a également pour objet les nouveaux dérivés de désacylation partielle de ganglio- sides couplés à des supports solides par l'intermédiaire de leurs groupements amine apparus lors de la désacylation partielle. Les supports solides sont en particulier des supports solides utilisables en chromatographie. L'invention a également pour objet un procédé d'obten- -6- tion des nouveaux dérivés de gangliosides de l'invention couplés à des supports. Ce procédé, qui comprend l'étape d'hydrolyse ménagée comme décrit précédemment, est caractérisé par le fait qu'il comprend en outre l'étape consistant à fixer sur un support solide, selon les méthodes connues, par l'intermédiaire des groupements amine apparus, le dérivé activé de ganglioside. La réaction de couplage peut être effectuée selon les méthodes connues, comme cela a été indiqué ci-dessus en présence éventuellement d'un agent de couplage intermédiaire (dérivé bifonctionnel). Parmi les supports solides utilisables on citera les supports solides poreux. Les supports solides poreux sont par exemple des oxydes métalliques tels que la silice, l'alumine, la magnésie, etc..., ou leurs dérivés synthétiques ou naturels tels que les verres, les silicates, les borosilicates, ou le kaolin, ou des polymères organiques tels que des polysaccharides, des polymères vinyliques tels que des polyacryliques, des polysty- rènes, etc... - Les supports minéraux poreux peuvent être des supports modifiés de façon à comporter des groupements réactifs capables de favoriser la fixation des nouveaux dérivés de gangliosides par l'intermédiaire de leurs groupements amine apparus lors de la désacylation partielle. Lesdits groupements réactifs peuvent être aussi des groupements capables de réagir avec une fonction d'un dérivé bifonctionnel (agent de couplage) dont l'autre fonction est susceptible de réagir avec lesdits groupements NH2. Les groupements réactifs capables de réagir avec les groupements NH2 sont bien connus; ce sont notamment les grou- pements époxy, les groupements carbonylés (notamment aldéhydes), les groupements carboxyliques en présence de carbodiimides, etc... Selon un mode de réalisation particulier, lorsque le couplage est effectué avec un support ou un agent de couplage du type époxy, le support de type époxy et les réactions d'hydrolyse ménagée et de couplage peuvent être effectuées simultanément en ajoutant le support au début ou au cours de la réaction d'hy- drolyse. Le dérivé de ganglioside peut être fixé par exemple sur des particules de polysaccharides. L'expression "polysaccharide" englobe ici les polysaccharides modifiés. Ces polysaccharides -7- sont notamment du dextran, des celluloses, de l'amidon, de l'agarose, etc... ou encore des polysaccharides modifiés, notam- ment des dialkylaminoalkyl- ou di(hydroxyalkyl) amino-alkyl- polysaccharides tels que par exemple le diéthylaminoéthyl dex- tran, la diéthylaminoéthyl cellulose, etc... On fixe le dérivé de ganglioside sur les polysaccha- rides à l'aide d'agents de couplage tels que des diépoxydes, des dicarbonylés, des épichlorhydrine ou le bromure de cyanogène, selon les méthodes connues. Les polysaccharides peuvent être également utilisés, non pas sous forme de particules, mais sous forme de revêtement sur des particules minérales, mais sous forme de revêtement sur des particules minérales, notamment des oxydes minéraux tels que ceux mentionnés ci-dessus. Les particules minérales poreuses revêtues de polysac- charides ou de polysaccharides modifiés peuvent être notamment celles décrites dans la demande de brevet français n 76.23176 ou celles décrites dans la demande de brevet français n 77.28163. Les particules minérales revêtues de polysaccharides, conformément à la demande de brevet français n 76.23i76 sont constituées d'un support minéral poreux, tel qu'un oxyde minéral poreux, revêtu directement sur sa surface par un polymère poly- saccharidique amine. Le support minéral poreux peut être de la silice, de l'alumine, de la magnésie, un oxyde de titane, ou leurs dérivés synthétiques ou naturels tels que verres, borosilicates, sili- cates, kaolin, etc... Le polymère polysaccharidique aminé est fixé sur le support minéral poreux par encollage. La surface interne du support minéral poreux est par exemple inférieure ou égale à 100 m2/g et si possible comprise entre 5 et 80 m2/g. Le diamètre poreux moyen est de préférence supérieur ou égal à 25nm et si possible compris entre 50 et 1000nm. Pour des surfaces plus grandes ou des diamètres poreux faibles la surface interne du support devient inaccessible au polymère polysaccharidique. Le support poreux minéral est par exemple de la silice ou de l'alumine et de préférence un support de silice poreuse à caractère anionique obtenue selon les procédés décrits dans les brevets français n 1.473.239, n 1.473.240, n 1.475.929, n 1.482.867, telles que les silices poreuses com- mercialisées par RHONE-POULENC CHIMIE FINE sous les dénominations SPHEROSIL XOB 030, XOB 015, XOB 005 et XOC 005. Le polymère polysaccharidique aminé qui sert à impré- gner et à recouvrir la surface interne du support poreux minéral doit avoir un caractère cationique prononcé et avoir de bonnes propriétés d'hydrophilie. Il doit avoir un poids moléculaire au moins égal à 104 daltons et si possible être compris entre 10 et 106. Sa formule peut être quelconque et il peut en particulier être un dérivé aminé du dextran, de l'amidon, de la cellulose, de l'agarose ou d'un polymère naturel ou synthétique de tous les oses connus. Les fonctions amines du polymère polysaccharidique peuvent être primaires, secondaires ou tertiaires ou éventuel- lement quaternaires. Le polymère polysaccharidique aminé peut notamment correspondre à la formule: R - (CH2)n- NR1 (R2) dans laquelle: R représente un reste de polysaccharide tel que par exemple un reste de dextran, d'amidon, de cellulose ou d'agarose, n est un nombre entier de 1 à 10 et de préférence de 2 à 5, R1 et R identiques ou différents représentent un radical alkyle ou hydroxyalkyle inférieur, par exemple les radicaux suivants: -CH3, -CH2, -CH3, -CH2OH, -CH2 -CH2OH ou -CH2 - CHOH-CH3, ces polymères pouvant être quaternarisés à l'aide d'un agent qua- ternarisant classique tel que les halogénures d'alkyle ou d'hy- droxyalkyle, le sulfate de diméthyle, etc... Parmi les polymères de ce type, on peut en particulier citer les composés connus sous les dénominations DEAE DEXTRAN (diéthylamino éthyl dextran) de poids moléculaire 500.000 et QAE DEXTRAN (diéthylamino éthyl dextran quaternisé) vendus par la firme PHARMACIA et le composé connu sous la dénomination DEAE amidon (diéthylamino éthyl amidon) ainsi que les amidons catio- niques tels que ceux vendus sous la dénomination commerciale CATO par la Société ROQUETTE NATIONAL. Le polymère polysaccharidique aminé peut aussi être réticulé à l'aide d'un agent réticulant par exemple un composé de carbonylés, un diépoxyde tel que le 1-4 butanedioldiglycidylé- ther, ou l'épichlorhydrine ou l'épibromhydrine. On fixe les dérivés de gangliosides sur les supports - 9- poreux ainsi revêtus, par exemple à l'aide des agents de couplage déjà mentionnés ci-dessus. Les particules minérales poreuses revêtues de poly- saccharides modifiés ou non, selon la demande de brevet français n 77. 28163 sont constituées par un support minéral poreux revêtu par un polymère polysaccharidique, ou par un polymère polysa- ccharidique modifié, par exemple un polysaccharide aminé tel que mentionné ci-dessus, ledit revêtement polysaccharidique étant si nécessaire stabilisé par réticulation, et sur ledit revêtement polysaccharidique ou polysaccharidique modifié se trouve greffé un dérivé de ganglioside de formule schématique R"-NH2, R" étant le reste de la molécule du dérivé de ganglioside, la liaison de greffage de ladite molécule répondant à la formule R3 - CH2 -NH - R" R" étant défini comme précédemment et R3 - CH2 - représentant le reste dudit polymère polysaccharidique ou polysaccharidique modifié lorsque celui-ci a été soumis à une réaction de coupure oxydante suivie d'une réduction par exemple au borohydrure. Les supports minéraux poreux sont ceux déjà indiqués précédemment; le polymère polysaccharidique est notamment la cellulose; le polymère polysaccharidique modifié est notamment le diéthylaminoéthylcellulose; le revêtement de polymère polysa- ccharidique modifié ou non est si nécessaire stabilisé par réticulation, l'agent réticulant étant tel que ceux mentionnés ci-dessus. Le procédé de préparation de ces matériaux est carac- térisé par le fait que l'on effectue un revêtement du support minéral poreux par le polymère polysaccharidique ou par le po- lymère polysaccharidique modifié, que si désiré on transforme le revêtement polysaccharidique en revêtement polysaccharidique modifié, que l'on effectue si nécessaire une réticulation pour stabiliser le revêtement, que l'on soumet ledit revêtement polysaccharidique ou polysaccharidique modifié à une réaction de coupure oxydante selon les méthodes connues, que l'on fait réagir le porduit d'oxydation ainsi obtenu avec le dérivé activé de ganglioside tel que défini ci-dessus, de formule schématique R" - NH2, puis que l'on soumet le dérivé iminé obtenu à l'action d'un agent réducteur capable de réduire la liaison imine en liaison amine. L'invention a également pour objet l'application des -10- nouveaux produits de désacylation partielle de gangliosides à la purification de. macromolécules biologiques ou à leur élimination. Cette application est caractérisée par le fait que l'on réalise une colonne avec un support solide sur lequel est fixé un dérivé activé de ganglioside tel que défini ci-dessus, que l'on fait passer dans ladite colonne une solution contenant les macromolécules que l'on désire isoler ou purifier. Si nécessaire, on élue la macromolécule à isoler lorsqu'elle a été fixée sur le dérivé de ganglioside. Si on désire simplement éliminer une impureté par fixation de cette impureté sur le glycolipide activé, il n'est évidemment pas nécessaire d'effectuer l'élution finale. Si par contre on désire obtenir le produit qui s'est fixé sélectivement sur le glycolipide activé, il conviendra d'effectuer l'élution finale. Selon un mode d'exécution particulier de l'application de l'invention, on sépare la toxine tétanique d'une solution la contenant de la façon suivante: On réalise une colonne avec un support sur lequel est fixé du ganglioside GDib et/ou GTl activé, on fait passer sur cette-colonne une solution contenant ou susceptible de contenir de la toxine tétanique, et, si désiré, on élue ensuite la toxine dans le cas o l'on désire obtenir une toxine tétanique puri- fiée. Les exemples suivants illustrent l'invention sans toutefois la limiter. EXEMPLE 1 - Activation du ganglioside GMI micromoles de G sont dissoutes dans 1 ml de soude N et la solution est incubée à 80'C pendant 2 heures. La solution peut être ensuite diluée et ajustée pour le couplage du gan- glioside activé selon l'une quelconque des méthodes décrites plus loin. La même méthode est applicable à d'autres gangliosides tels que GDib, GTl' GM2 et d'autres glycolipides. Le produit obtenu présente une réaction positive dans le test à la ninhydrine, la coloration observée étant toutefois moins intense que celle observée avec le lysoganglioside G EXEMPLE 2 - Activation du ganglioside GMl' micromoles de GMi sont dissoutes dans 10 ml de soude N/10 et la solution est incubée à 400C pendant 15 heures. La solution est alors prête pour le couplage du ganglioside activé -11- selon l'une quelconque des méthodes décrites plus loin. Le test à la ninhydrine et le test de SANGER sont positifs. Dans le cas de couplage sur un support époxy, ce support peut avantageusement être ajouté au début du traitement alcalin. L'activation du ganglioside et sa fixation sur support se font alors dans la même étape au même pH. La même méthode est applicable aux autres gangliosides et glycolipides tels que ceux mentionnés ci-dessus. EXEMPLE 3 - Activation du ganglioside GD1b 10 micromples de GD1b sont dissoutes dans 1 ml de potasse N et la solution est incubée à 60 C pendant 2 heures. La solution obtenue, qui donne un test positif à la ninhydrine, est ensuite diluée et ajustée pour le couplage du ganglioside activé selon l'une quelconque des méthodes décrites plus loin. La même méthode est applicable aux autres gangliosides et glycolipides. EXEMPLE 4 - Activation du ganglioside GT1 micromoles de GTi sont mises en suspension dans 10 ml de mélange Butanol-Potasse 10 N (90:10) la suspension équivaut en final à de la potasse normale. Apres incubation 2 heures à C et addition d'un volume égal d'eau, la phase aqueuse conte- nant le ganglioside actité, donnant un test positif à la ninhy- drine, est prélevée et ajustée pour couplage du ganglioside activé selon l'une quelconque des méthodes décrites plus loin. La même méthode est applicable aux autres gangliosides et glycolipides. EXEMPLE 5 - Activation du ganglioside GDib micromoles de GD1b sont mises en suspension dans 10 ml de mélange Butanol-Potasse N (90:10). La suspension finale équivaut à de la potasse décinormale. Après incubation 2 heures à C (à reflux) et addition d'un volume égal d'eau distillée, la solution aqueuse contenant le ganglioside activé est prélevée et ajustée pour couplage du ganglioside activé selon l'une quel- conque des méthodes décrites plus loin. Elle présente un test positif à la ninhydrine. La même méthode est applicable aux autres gangliosides et glycolipides. EXEMPLE 6 Couplage des gangliosides ainsi activés sur une matrice polysaccharidique par l'intermédiaire d'un agent bifonctionnel -12- 2478l04 à fonctions époxy. Dans tous les cas cette méthode de couplage conduit à fixer le ganglioside par une liaison amine extrêmement stable dérivée de la fonction amine primaire apparue par hydrolyse ménagée), ce qui permet d'obtenir des supports de grande durée de vie. 6.1 - On peut utiliser par exemple un produit dérivé de l'agarose commercialisé par Pharmacia (Uppsala-Suède) sous le nom de "epoxy activated Sepharose 6 B" et réaliser la fixation selon les recommandations du fabricant. Une dose de 1 à 10 pmole/ml est recommandée. Le dosage d'acide sialique avant et après couplage permet de vérifier la bonne fixation du ligand. 6.2 - On peut utiliser d'autres polysaccharides tels que la cellulose. Le couplage à l'aide de l'agent diépoxy - par exemple le 1-4 butanedioldiglycidyléther (Aldrich)- peut se faire en incubant pendant une nuit à température ambiante 10 g de cellu- lose dans un mélange contenant 20 ml de NaOH N,20 ml de Butane- dioldiglycidyléther et 40 mg de NaBH4. Le lendemain le support est lavé par de l'alcool, de l'eau et enfin de la soude 0,1 N. Après essorage par filtration, le support est mis en contact pendant une nuit avec l'un des gangliosides précédemment activés et en solution dans de la soude 0,1 N. Une dose de 1 à 10 pmole/ml est recommandée. Une tempé- rature d'incubation de 20 à 40'C est préférable. 6.3 - Enfin, on peut utiliser également des supports minéraux poreux imprégnés de polysaccharides tels que ceux décrits an- térieurement dans la demande de brevet français 76.23176 et secondairement activés par le même réactif diépoxyde. Ce support est particulièrement recommandé pour les applications indus- trielles. *EXEMPLE 7 Couplage des gangliosides ainsi activés sur une matrice polysaccharidique oxydée par le périodate de sodium. Pour cette méthode, la cellulose ou les supports poreux imprégnés de polysaccharides tels que ceux de la demande de brevet français 76.23176 sont préférables. L'agarose est en effet peu oxydé dans les mêmes conditions. Cette méthode a déjà été appliquée (voir demande de brevet français 77. 28163) pour le couplage des lysogangliosides préparés selon la méthode de TAKETOMI. -13- 2478104 Les conditions pour fixer les gangliosides activés selon le présent procédé sont identiques. g de support (par exemple la cellulose) sont addi- tionnés de 100 ml de périodate de sodium 0,02 M pendant 2 heures à température ambiante. Le support est ensuite lavé dans une solution de carbonate de sodium 0,02 M pH 9 additionnée de NaCI 10 g/l, essoré par filtration et additionné de 15 ml d'une solution à pH 9 de gangliosides activés selon l'un quelconque des exemples 1 à 5 ci-dessus. Une dose de 1 à 10 piaole/ml de support est recom- mandée. Après incubation une nuit à température ambiante, du borohydrure de sodium NaBH4 est ajouté pendant 2 heures à 20'C (0,2 M en final) pour réduire les liaisons imines formées en liaisons amines extrêmement stables. Là encore, les supports ainsi réalisés ont une durée de vie excellente et peuvent être réutilisés plusieurs dizaines ou centaines de fois. EXEMPLE 8 Couplage des gangliosides ainsi activés sur une matrice polysaccharidique par la méthode au bromure de cyanogène. La méthode est celle décrite par PORATH et al., Nature, 215,1491 (1967). En pratique, il suffit de mélanger le Sepharose activé au bromure de cyanogène, commercialisé par Pharmacia (Uppsala-Suède), à pH 11 suivant les instructions de la notice d'emploi. Une dose de 1 à 10 pmole de ganglioside activé par ml de gel est ici encore recommandée. Il est possible d'adapter cette technique à la cellulose ou aux supports minéraux poreux précédemment décrits, sans rien changer aux conditions opéra- toires. EXEMPLE 9 Application à la fixation et à la purification de la toxine tétanique. A titre d'exemple, on décrit ci-après les résultats obtenus sur un support minéral poreux imprégné de polysaccharide suivant une méthode déjà décrite dans la demande de brevet français 76.23176. Ce support a été choisi parce qu'il présente des propriétés de résistance mécanique remarquables, le rendant très utile pour des purifications industrielles. Le support minéral poreux est de la silice telle que celle commercialisée par Rhône-Poulenc sous le nom de SPHEROSIL -14- XOC 005. Sa surface spécifique est d'environ 10 m /g, son dia- mètre Poreux moyen est d'environ 300 nm; cette silice est imprégnée d'une couche monomoléculaire de DEAE Dextran et réticulée selon le procédé déjà décrit dans la demande de brevet français 76.23176. En appliquant la méthode décrite dans l'un des exemples 6 à 8 qui précèdent, à 10 g de ce support, il est possible de fixer par exemple 50 micromoles de gangliosides GDlb ou GTI, préalablement activés selon la présente invention aux exemples 1, 2, 3, 4 ou 5 ci-dessus. Pour cela les 10 g de support sont lavés dans une solution de soude 0,1 N et montés en colonne. Ils occupent un volume d'environ 23 ml. La colonne est équilibrée dans une solution contenant du Glycocolle (20g/1) et du NaCi (lOg/1). Un filtrat de culture de "Clostridium tetani" contenant à l'état brut de la toxine tétanique titrant 500 unités Lf/ml est dialysé contre ce même tampon. 50 ml de cette solution impure de toxine tétanique sont ensuite filtrés sur la colonne. Toutes les impuretés ne reconnaissant pas le ganglioside GD1b ou GT1 tra- versent la colonne. Seule la toxine tétanique se fixe sur la colonne et peut être récupérée par élution avec de l'ammoniaque 0,1N ou un tampon pH 9 contenant du Glycocolle (20g/1) et du NaCl (60g/1). Le produit récupéré contient environ 70% de l'activité biologique présente dans la culture initiale. Avec cette seule étape, la pureté de la toxine atteint et même dépasse les normes déjà publiées (voir B. BIZZINI et al, Bull. Inst. Pasteur 72, 177, 1974. La toxine ainsi purifiée à une activité spécifique moyenne d'environ 3500 Lf/mg azote. Le rapport D.O. 280 nm D.O. 260 nm est environ égal à 2. Par immunodiffusion en gélose contre un sérum antifiltrat de culture donnant de nombreuses lignes de précipitation avec le filtrat de culture initial, on observe une seule ligne de précipitation avec la toxine tétanique ainsi purifiée. Cette ligne donne une réaction d'identité complète avec un sérum anti-toxine spécifique de référence ou avec une toxine purifiée de référence fournie par l'Institut Pasteur. Il convient de noter ici qu'un support préparé de la même manière avec un ganglioside GDlb ou GTl, hydrolysé dans les conditions moins douces décrites par TAKETOMI, article cité, ne permet aucune fixation de la toxine tétanique. Quant aux mêmes 2-2478104 gangliosides non activés, il n'est pas possible de les fixer sur un support par les méthodes décrites ci-dessus. EXEMPLE 10 Application à la fixation et à la purification de la toxine cholérique. Le support minéral poreux est de la silice telle que celle commercialisée par Rhône-Poulenc sous le nom de SPHEROSIL XOC 005. Sa surface spécifique est d'environ 10m2/g, son diamètre poreux est d'environ 300 nm; cette silice est imprégnée d'une couche monomoléculaire de DEAE Dextran et réticulée selon le procédé décrit dans la demande de brevet français 76. 23176. En appliquant la méthode décrite à l'exemple 6, 7 ou 8 de la pré- sente demande à lg de ce support, il est possible de fixer par exemple 5 pmole de ganglioside GM, préalablement activé selon les exemples 1, 2, 3, 4 ou 5 ci-dessus. Ce support est ensuite lavé par de la soude 0,1 N et monté en colonne. La colonne est équilibrée dans une solution contenant du citrate de sodium 0, 05 M à pH 7 additionnée de NaCi lOg/1. Un filtrat de culture de "Vibrio cholerae INABA 569 B" contenant à l'état brut 25 pg/ml de toxine cholérique est dialysé contre le même tampon. 500 ml de cette solution impure de toxine cholérique sont ensuite filtrés sur la colonne. Toutes les im- puretés ne reconnaissant pas le ganglioside G m traversent la colonne. Seule la toxine cholérique se fixe sur la colonne et , peut être récupérée par élution avec de l'acide citrique 0,05 M pH 2,8. Le produit récupéré contient environ 100% de l'activité biologique présente dans la culture initiale. La toxine cholé- rique ainsi purifiée (12,5mg) apparaît identique à celle préparée selonle procédé décrit dans la demande de brevet français 77.28163. De la même façon, on a réalisé la fixation de ganglio- side Gmî, selon la même méthode, sur d'autres supports réalisés à partir d'agarose ou de cellulose. -16- 2478104 REVENDICATIONS R E V E N D I C A T I O N S 1. Dérivés activés de gangliosides ou glycolipides à groupements N-acyle, caractérisés par le fait qu'ils sont des produits de désacylation partielle, qu'ils présentent des grou- pements amine libre pouvant être mis en évidence par une réaction positive dans le test à la ninhydrine, qu'ils sont mobiles en chromatographie sur couche mince de gel de silice dans le système chloroforme -méthanol-eau (60:32:7), et qu'ils présentent les propriétés d'affinité spécifique des gangliosides ou glycolipides O10 dont ils dérivent, lesdits dérivés pouvant être couplés à des supports solides, par l'intermédiaire des groupements amine apparus lors de la désacylation partielle, sans perte desdites propriétés d'affinité spécifique. 2. Dérivés selon la revendication 1, caractérisés par le fait que ledit ganglioside est choisi parmi les gangliosides GM1, GM2, GDlb et GTl- 3. Dérivés selon la revendication 1, caractérisés par le fait que le ganglioside est le ganglioside GM1. 4. Dérivés selon la revendication 1, caractérisés par le fait que le ganglioside est le ganglioside GM2. 5. Dérivés selon la revendication 1, caractérisés par le fait que le ganglioside est le ganglioside GD1b. 6. Dérivés selon la revendication 1, caractérisés par le fait que le ganglioside est le ganglioside GTl. 7. Dérivés selon l'une quelconque des revendications 1 à 6, caractérisés par le fait que lesdits produits de désacy- lation partielle sont fixés sur un support solide organique minéral. 8. Dérivés selon la revendication précédente, carac- térisés par le fait que ledit support est un polymère organique modifié ou non, ledit dérivé de ganglioside étant fixé sur le support par l'intermédiaire des groupements amine apparus lors de la désacylation partielle. 9. Dérivés selon la revendication 7, caractérisés par le fait que ledit support est un corps minéral poreux modifié pour faire apparaître des groupements réactifs capables de réagir avec les groupements réactifs d'un agent de couplage ou avec les groupements NH2 desdits dérivés désacylés. 10. Procédé de préparation des dérivés selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé par le -17- fait que l'on traite le glycolipide ou un mélange de glycolipides avec une solution aqueuse basique à une température comprise entre 0 et 120'C, ladite température étant d'autant plus basse que le milieu est plus basique. 11. Procédé selon la revendication 10, caractérisé par le fait que l'on choisit la base de façon à opérer à température comprise entre 40 et 1000C. 12. Procédé selon l'une quelconque des revendications et 11, caractérisé par le fait que le temps de réaction est choisi de façon à être inférieur au temps nécessaire pour obtenir la désacylation totale du glycolipide de départ. 13. Procédé selon la revendication 12, caractérisé par le fait que le temps de réaction est compris entre 30 minutes et 24 heures. 14. Procédé selon l'une quelconque des revendications à 13, caractérisé par le fait que la base est une base capable de donner dans l'eau un pH de 9 à 14. 15. Procédé selon l'une quelconque des revendications à 14, caractérisé par le fait que l'on opère avec une solution d'alcalinité comparable à la soude ou à la potasse normale à température ne dépassant 1000C. 16. Procédé selon la revendication 15, caractérisé par le fait que l'on opère à 60'C environ pendant environ 2 heures. 17. Procédé selon l'une quelconque des revendications 10 et 12 à 14, caractérisé par le fait que l'on opère avec une solution d'alcalinité comparable à la soude décinormale, à température inférieure ou égale à 120'C. 18. Application des dérivés activés selon l'une quel- conque des revendications 1 à 9, caractérisée par le fait que l'on réalise une colonne avec un support sur lequel est fixé un dérivé activé de glycolipide, que l'on fait passer dans ladite colonne une solution contenant les macromolécules que l'on désire purifier, et que, si nécessaire, on élue la macromolécule. 19. Application selon la revendication 18, caractérisée par le fait que pour séparer la toxine tétanique d'une solution la contenant ou susceptible de la contenir, on réalise une colonne avec un dérivé du ganglioside GDlb et/ou GTl fixé sur un support, on fait passer ladite solution sur ladite colonne, et, si désiré, on élue ensuite la toxine.