FR 2481081 A1 19811030 FR 8107880 A 19810421 24810 81 La présente invention concerne un procédé de dêsesti- rification et de saccharification enzymatique de déchets cel- lulosiques de la fabrication du tabac, permettant de produi- re des sucres utilisables dans divers procé6dés de traitement du tabac. Au cours de la fabrication du tabac, ii se forme des quantités notables de déchets de matire filtrante et de pa- pier à cigarette. Ces déchets ne sont géuéazlemet pas uti- lisables dans la fabrication des cigarettes, on s en débar- rasse plut8t par combustion après séparation de constituants à base de tabac. Ltélimination de ces déhets et les pertes économiques correspondantes seraient évitees sil eistait un moyen de transformer les déchets en un produit utile pour la fabrication de prodits à base de tabac. Des sucres, en particulier le glucose2 sont utilisés dans un certain nombre de procédés de traitement du tabac. On utilise par exemple des sucres comme source de carbone dans des fermentations d tabac telles que la dénitrifica- tion. En outre, on peut utiliser des suires comme matières d'enveloppement dii tabac ou pour la production de produits aromatisants pour le tabac. L'utilisation d'enzymes, en particulier celles prove- nant de Trichoderma viride, pour hydrolyser des matières cellulosiques en sirop de sucre est connue dans la techni- que. En outre, on a proposé divers moyens pour améliorer l'hydrolyse enzymatique en sucre de déchets de cellulose. Le broyage et des prétraitements par les acides et/ou les bases rendant les matières cellulosiques plus sensibles & la dégradation enzymatique sont parmi les moyens de la tech- nique antérieure suggérés pour améliorer l1hydrolyse enzy- matique. Mais ces procédés n'ont pas été appliqués à des dé- chets cellulosiques de la fabrication du tabac. De plus, l'acétate de cellulose présent dans le tampon filtrant ré- siste à 1'hydrolyse enzymatique par la cellulase ou & la saccharification et la technique ne suggère aucun prétraite- ment de ce déchet cellulosique permettant de le recycler. La présente invention fournit un procédé d'utilisation des déchets cellulosiques formés lors de la fabrication du tabac. Le procédé consiste à transformer les déchets en su- cres utilisables pour la fabrication de produits à base de tabac. Ces déchets cellulosiques peuvent être recyclés, a) en broyant le déchet cellulosique; b) en désestérifiant l'acétate de cellulose présent dans le déchet par traitement avec une base; c) en soumettant la matière broyée et désestérifiée à une saccharification enzymatique dans des condi- tions favorisant l'hydrolyse de la cellulose en su- cres simples; d) en récupérant le sucre produit au stade c; et e) en utilisant le sucre récupéré dans un procédé de traitement du tabac. Les cellulases de Trichoderma viride conviennent parti- culièrement pour l'utilisation dans la mise en oeuvre de l'invention. L'invention concerne un procédé de recyclage des dé- chets cellulosiques produits au cours de la fabrication du tabac. Le procédé consiste à transformer les déchets cellu- losiques en sucres utilisables pour la fabrication de pro- duits à base de tabac sans purification. D'une manière générale, le procédé consiste & soumet- tre un déchet cellulosique, de préférence sous forme broyée, à une saccharification enzymatique. L'acétate de cellulose présent dans la matière est désestérifié avant la sacchari- fication. Les sucres formés sont récupérés, ils peuvent en- suite être utilisés dans des enveloppes pour le tabac, des produits aromatisants ou des processus de fermentation. Plus précisément, le procédé de l'invention consiste à soumettre des déchets cellulosiques formés au cours de la fabrication du tabac à une saccharification enzymatique dans des conditions conduisant à l'hydrolyse de la cellulose en sucres simples. Le déchet d'acétate de cellulose est en outre désestérifié avec une base avant la saccharification. De plus, les déchets sont de préférence broyés avant la saccharification. Les sucres produits lors de l'opération de saccharification sont isolés et utilisés dans des proc6- dés de traitement du tabac. Dans la présente invention, l'expression "déchets cel- lulosiques" désigne des matières telles que du papier à ci- garette, du papier à embouts et des tampons filtrants. Des déchets de tabac, tels que la poussière de tabac, peuvent aussi être traités par le procédé de l'invention. Les papiers A cigarettes et les papiers à embouts sont constitués de matières cellulosiques traitées. Par transfor- mation de cette matière en pate, on peut l'hydrolyser en si- top de sucre avec des enzymes. Au contraires le tampon fil- trant est constitué d'un acétate de cellulose qui résiste A la saccharification enzymatique. Par désestérification de lfacétate de cellulose, on peut le rendre sensible & l'hy- drolyse enzymatique. La désestérification préliminaire du tampon filtrant (acétate de cellulose) peut être effectuée par des techni- ques classiques de désestérification. Un moyen qui s'est ré- vélé particulièrement approprié aux buts de la présente in- vention est l'hydrolyse de l'acétate de cellulose par une base telle qu'un hydroxyde de métal alcalin. Comme hydroxydes appropriés, on citera les hydroxydes de sodium et de potas- sium. Une désestérification de l'acétate de cellulose suf- fisante pour permettre la saccharification enzymatique peut être réalisée dans diverses conditions. En général la vi- tesse et/ou le degré de désestérification de l'acétate de cellulose augmentent avec des facteurs tels que la concen- tration en base, le temps, la température, la pression etc... Par exemple, on a trouvé qu'une immersion de l'acétate de cellulose dans de l'hydroxyde de sodium IN pendant deux heu- res ou davantage à la température ambiante rendait l'acéta- te de cellulose du tampon filtrant sensible au traitement enzymatique. La matière désestérifiée est de préférence lavée jus- qu'à neutralité avant d'têtre soumise au traitement enzyma- tique. En outre, pour permettre une saccharification aisée, on préfère broyer et mettre en suspension dans l'eau tant la matière désestérifiée que les déchets cellulosiques. Ce broyage augmente la surface spécifique soumise au traitement enzymatique. Le broyage peut être effectué par des techni- ques classiques, parmi lesquelles un broyage avec un mélan- geur Waring, avec un broyeur à marteaux ou à boulets, avec un déchiqueteur classique pour papiers etc...Il est préféra- ble d'effectuer le broyage du tampon filtrant avant la dé- sestérification. Après le broyage et la désestérification, on soumet les matières & une saccharification enzymatique dans des conditions conduisant & la transformation de la cellulose - en sucres simples. On peut utiliser une cellulose produite par des microorganismes tels qu'Aspergillus niger, Cellulo- monas sp., Myrothecium verrucaria, Penicillium expansum, et diverses souches de Trichoderma viride telles que les souches ATCC 13631, 24449, 26920 et 26921. Les enzymes les plus communément utilisées dans ces procédés sont les cel- lulases dérivant de Trichoderma viride. Ces cellulases pos- sèdent des activités C1, C et cellobiase suffisantes pour x hydrolyser des matières cellulosiques hautement cristalli- nes en sirops de sucres. Une cellulase qui s'est révélée ef- ficace pour réaliser les objectifs de 1'invention est celle tirée du T. viride longibrachiatum QM 9414 (ATCC 26921),que l'on peut se procurer auprès de 1'American Type Culture Col- lection, Rockville, Maryland 20852, USA. D'autres enzymes contenant tous les constituants nécessaires pour l'hydrolyse de la cellulose insoluble en sucres simples peuvent également être utilisées. Des modes opératoires utilisés pour la prépa- ration de la cellulase sont décrits d'tune manière générale par dandels et Sternberg dans l&article "Recent Advances in Cellulase Technology", Journal of Fermentation Technology, 54(4), 1976, p.267286. Les conditions appropzi4s 3 X a cci fia de la cellulose en surzes 3olubleo sont conmes dans la technqueo L 9 optdi:mzm dactîi et a vnsy %, t&v le @s call %asez de To vi_ _id eet rst es! ae trat ede S a oC environ e un Pm d a95 oe D l a Dmise en oeu vre de leivent2ion, or a tzv& nue sacc aicaion & pH 4-8 ett 50 C enovioâ lac une rtation raonnableo en utilisant environ 9 000 à 000 rit&e actLit& des cel! lulases totaleo/l pour jusquv 25 9/1 emvifon de M&tie solides cellulosiques opérsat ue enafor&atio pra=queG me-nt compltes des dCchets cell!o siques su crec e' le dans un temps raîsonnab!e. Des ampons convenant pu' z-l p(rocesus d;cchazi fication son* un tfapon au cierate et un t::pon a leac&ta- te. On peut aussi utiliser cie taon lt actate de potas- sium formé au cours de l'opération de eéreification3 associé & de l'acide acétiqueo Le sirop de sucre résultant de la sacchariúication des déchets peut être isolé de n mporte quelle cellulose résiduelle par des techniques classiqueso On peut utiliser 25. cet effet la centrifugation llessorage ou la filtration. En général, les sirops de sucre contiennent du glucose, du cellbiose et du xylose et ntexigent aucune purification avant leur utilisation. Le cellobiose peut Ctre soumis a une réduction ultérieure en glucose en utilisant de la cel- lobiase, par des techniques connues. Ce traitement par la cellobiase peut être effectué dans le même récipient que celui dans lequel est effectué le traitement par la cellu- lase, et il peut 9tre effectue en même temps que le traite- ment par la cellulase, ou apres. Les sirops de sucres peuvent être utilisés dans ntim- porte quel procédé de traitement du tabac utilisant des su- cres. Par exemple, les sirops produits peuvent être utilisés sans purification comme source de carbone dans des procédés de fermentation du tabac, y compris la fermentation déni- trifiante. On peut aussi concentrer les sirops et les uti- liser comme matière d'enveloppement du tabac. On peut aussi les utiliser pour la production de produits aromatisants réactifs ou pour la production de glycérol. Les exemples non limitatifs suivants sont donnés à titre d'illustration de l'invention. EXEMPLE1 - On agite 5 g d'acétate de cellulose provenant d'un tampon filtrant avec 100 ml de KOH IN pendant 12 heures & la température ambiante. On sépare ensuite la matière par centrifugation et on lave le résidu à l'eau jusqu'à neutra- lité. On ajoute au résidu neutralisé 40 ml de tampon au ci- trate O,5M & pH 4,8 et 10 ml de solution de cellulase conte- nant 750 unités de cellulases totales de Trichoderma viride longibrachiatum dans une solution de tampon au citrate. On fait incuber la solution obtenue à 50 C pendant 24 heures. Puis on centrifuge la solution et on soumet le liquide sur- nageant à une analyse des sucres en utilisant le mode opéra- toire DNS. La densité optique (D.O.) de l'échantillon d'es- sai à 500 mi est égale à 1,26x20 (facteur de dilution). De son c8té, la densité optique d'un étalon de glucose de 0,3 mg est de 0,25. La teneur en sucres de l'échantillon d'essai se calcule donc comme suit: - 1,26 X 20 X 0,3 = 30,2 mg de glucose/ml 0,25 Le pourcentage de conversion des 5000 mg d'acétate de cellulose initiaux en sucres est donc de 30.2 X 50 X 100 = 30,2% EXEMPLE 2 On soumet un tampon filtrant au traitement de désest6- rification et au lavage décrits A l'exemple 1. On combine quatre échantillons d'essai désestérifiés de.1,25 g avec ml de tampon au citrate 0,5M A pH 4,8 et une quantité de cellulase suffisante pour donner la concentration d'enzyme indiquée dans le tableau ci-dessous. On ajoute à ce témoin ml du tampon et 5 ml de la solution de cellulase. On vé- rifie la densité optique de chaque échantillon au bout de 16, 24, 48 et 72 heures. On calcule ensuite la teneur en su- cres et le pourcentage de conversion pour chaque échantillon. Les résultats sont-donnés dans le tableau suivant: TABLEAU 1 Unités Temps Sucre Taux de d'enzyme/ produit conversion % 55 ml (mg/ml) _ 24 heures 13,92 55,7 48 heures 17,52 70,1 300 24 heures 19,4 77,6 48 heures 23,5 84,0 450 24 heures 21,6 86,4 48 heures 23,5 94,0 750 24 heures 23,5 -94,0 48 heures 23,5 94,0O Ces résultats indiquent une conversion pratiquement complète en sucres réducteurs avec des concentrations en en- zyme de 900 unités d'enzyme/55 ml, ou davantage. EXEMPLE 3 Pour évaluer l'effet de la teneur en solides sur le degré d'hydrolyse, on soumet des échantillons d'essai conte- nant des quantités croissantes d'acétate de cellulose pro- venant d'un tampon filtrant traité comme à l'exemple 1 A une saccharification de la cellulose. Chaque échantillon contient les quantités indiquées de matière filtrante,50 ml de tampon au citrate 0,5 M et 5 ml de composition de cellu- lase (750 unités). Le tableau 2 donne les résultats obtenus. l TABLEAU 2 Teneur en Temps - Sucres pro- Taux de solides (heures) duits (mg/ml) conversion % 1,25 6 16,6 66,2 12 23,5 94,0 24 26,4 100,0 2,50 12 26,6 53,2 24 35,5 71,0 48 39,36 78,7 3,75 12 30,7 41,0 24 37,9 50,5 48 45,6 60,8 Il est évident que des teneurs en cellulose d'environ 1,25 g/50 ml (c'est-à-dire 25 g/1) conduisent & une conver- sion en sucres pratiquement complète en 12 A 24 heures. Au dessus de cette concentration, on observe'une réduction des taux de conversion, mais les concentrations en sucres aug- mentent. EXEMPLE 4 Pour déterminer lteffet du temps de désestérification de l'acétate de cellulose sur la transformation de l'acétate de cellulose en sucres, on plonge des échantillons de 1,25g d'acétate de cellulose provenant d'un tampon filtrant dans ml de NaCH IN & la température ambiante pendant les temps indiqués dans le tableau 3. On filtre ensuite chaque échan- tillon, on le lave jusqu'à neutralité et on le sèche. On met en suspension la matière désestérifiée dans 50 ml de tampon au citrate 0,5M à pH 4,8 et on ajoute 5 ml de solu- tion d'enzyme (750 unités). On fait incuber le mélange à 50 C pendant 6 et-12 heures. Le tableau 3 donne les résul- tats de ces expériences. 2 4 8 081 TABLEAU 3 Durée de la Durée S- ucres formesTaux de con- désestérifi- d'incubation -(h) (mg/ml) version ({) cation (h),, -- 1 6 12924 48,96 12 15,36 6194 2 6 12 68 54 7 12 18,7 74, 9 4 6 14a,6 56,6 12 1795 70,0 6 6 12,7 50, 9 12 1793 6991 12 - 6 15"4 61,4 12 17,8 71,04 Ces résultats suggèrent que le traitement-du tampon filtrant par NaoH IN pendant 2 heres à la t emprature am- biante conlvient pour rendre ltac&tate de cellulose plus sen- sible a lthydrolyse par la cellulaseo Une confirmatioui de la d.tfi catio de la cellé- lose a été obtenue par la méthode de dgagemenm de gas Fr-IR, qui montre que la matière désesrtézfiée donne lieu à une formation d'acide acétique réduite de façon significative et & une formation de furfural fozrtement accrue par rapport & l'acétate de cellulose non traité. La formation de glucose et de cellobiose après le traitement par la cellulase cons- titue également un indice de la désestérification de l'acé- tate de cellulose. EXEMPLE 5 On mélange 10 g de déchets de papier & cigarette dé- chiquetés avec 500 ml dteau distillée pendant 5 minutes à la vitesse maximale dans un mélangeur Waring. On ajuste le pH de la pâte obtenue & 4,8 avec de l'acide citrique OlM. On combine 100 ml de la pâte avec chacune des solutions d'enzyme contenant les quantités d'enzyme indiquées. On fait ensuite incuber les mélanges à 50 C dans un agitateur ro- tatif à bain-marie, à une vitesse d'agitation de 100 tours/ min. Au bout des durées d'tncubation indiquées, on filtre les 248 1081 - mélanges et on détermine les quantités de sucres réducteurs formées dans les filtrats. Le tableau 4 donne les résultats de ces essais. Concentration de lIenzyme (unités/100 ml) 1500 TABLEAU 4 Temps - Sucres (h) réduits (Mg/Ml) o -0 o O o o 0,2 0,8 0,8 0,7 0 - 1,0 1, 6 2,2 ,2 2,4 3,0 7,4 7,9 7,4 11,1 7,3 o 9,8 11,8 ,1 o ,8 ,4 ,8 14,9 Taux de conversion o 1,0 3,2 3,2 2,8 3,8 6,4 8,6 ,8 9,6 12,0 29,6 31,7 29,8 44,0 31,3 o 39,4 47,0 ,5 o 43,2 61,6 63,4 59,5 24 18,2 73,0 EXEMPLE 6 On met en suspension 2,5 g d'acétate de cellulose pro- venant de tampons filtrants dans 100 ml de tampon au citra- te O,lM & pH 4,8. On ajoute ensuite & la suspension 10 ml d'une solution de cellulase comprenant 1500 unités de cellu- lases totales dans une solution tampon au citrate. On fait ensuite incuber la suspension à 50 C. On prélève des échan- tillons au bout de durées d'incubation de 24, 48 et 72 heu- res. Le tableau 5 donne les résultats obtenus. TABLEAU 5 Durée de Sucres formés Taux de l'hydrolyse (mg/ml) conversion (%) (h) 24 0 0 48 0,28 1,1 72 0,31 1,2 Ces résultats montrent que le tampon filtrant non trai- té n'est pas sensible à la saccharification par la cellulase de T. viride. EXEMPLE 7 On soumet à une analyse par chromatographie en phase gazeuse l'échantillon provenant de l'exemple 3, contenant 26,4 mg/ml de sucres réducteurs. Cette analyse indique les concentrations en sucres suivantes: TABLEAU 6 Sucres Concentration (mg/ml) Glucose 11,2 Cellobiose 12,6 Inconnu 14,2 Le pic non identifié pourrait correspondre à des po- lysaccharides intermédiaires résultant de l'hydrolyse par- tielle de la cellulose. *EXEMPLE 8 On soumet 100 ml du mélange de sucres analysé à l'exemple 7 & un autre traitement d'hydrolyse enzymatique pour évaluer le taux de conversion en glucose du cellobiose qui s'y trouve. On ajoute au mélange 150 unités de collobia- se et on fait incuber à 40 C pendant 2 heures. On soumet ensuite le mélange de sucres à une analyse chromatographi- que en phase gazeuse aux fins d'identification. Les résul- tats sont les suivants: TABLEAU 7 Sucre avant traitement après traitement àA la cellobiase Glucose, mg/ml 11,2 21,8 Cellobiose, mg/ml 12,6 2,2 Inconnu, mg/ml 14,2 16,4 Ces résultats indiquent qu'un tel traitement en deux stades optimise la quantité de glucose obtenue par hydroly- se de l'acétate de cellulose traité. EXEMPLE 9 On évalue la possibilité d'utiliser le sucre formé par hydrolyse enzymatique de l'acétate de cellulose désestérifié comme source de carbone dans la dénitrification. On dilue la solution de sucres provenant de l'exemple 8 pour obtenir lOg de glucose/l. On ajuste le pH à 7,0 avec de la poudre de K2HPO 4. On ajoute les constituants suivants à la solution 2 4 de sucres tamponnée: NH4C1 =l 1 9.1; MgSO 4.7H20 = 0,2 g/l; 4 4. 2 FeCl3 = 2,0 mg/i; et KNO3 = 10 g/l. On stérilise 250 ml du mélange par filtration sur fil- tre Millipore et on les place dans un ballon stérile de 1 1. On inocule au mélange présent dans le ballon 20 ml de Para- coccus denitrificans ATCC 19367 à un stade de croissance exponentielle. On fait ensuite incuber à 35 C le mélange inoculé dans un agitateur à bain-marie de la New Brunswick Scientific Company. Au bout de 12 heures, on détermine la teneur en azote de nitrate au moyen d'une électrode à ion 248 1081 nitrate Orion modèle 93-07. Les résultats sont les suivants: avec 10 g avec 10 g Pas de de glucose/1 de glucose glucose à partir de 1 aceta- te de cellulose N de N0 initial (ppm) N de NO final (ppm) (12 h) (Ppm.) (:12 h) O O Les rzesultats indiquent clairement que du glucose est nécessaire pour la d&nitrification et que le glucose produit pax hydrolyse ena5yatique de leacétate de cellulose dlsesté- rifié, ainsi que du papier à cigarettes récupéré fonctionne aussi bien qu'un glucose de qualiteé chmique dns un procédé de fermentation denitrifianteo REVEND ICAT IONS 1 - Procédé de réutilisation de déchets cellulosiques produits au cours de la fabrication du tabac, caractérisé en ce que a) on soumet le déchet cellulosique à une saccharification enzymatique dand des conditions favorisant l'hydrolyse de la cellulose en sucres simples; b) on récupère le sucre produit au stade (a); et c) on utilise le sucre recueilli dans un procédé de traitement du tabac. 2 - Procédé de transformation des déchets cellulosi- ques formés au cours de la fabrication de produits à base de tabac en sucres utilisables dans la fabrication de pro- duits à base de tabac, caractérisé en ce que: a) on broie le déchet cellulosique; b) on soumet le déchet broyé à'une saccha- rification enzymatique dans des conditions favorisant 1'hy- drolyse de la cellulose en sucres simple; et c) on récupère le sucre produit au stade (b). 3 - Procédé suivant la revendication 1, caractérisé en ce qu'on broye le déchet avant la saccharification. 4 - Procédé suivant la revendication 1 ou 2, carac- térisé en ce qu'on désestérifie l'acétate de cellulose pré- sent dans le déchet par traitement par une base avant la saccharification. - Procédé suivant la revendication 4, caractérisé en ce qu'on broye l'acétate de cellulose avant la désestéri- fication. 6 - Procédé suivant la revendication 4, caractérisé en ce que la base est un hydroxyle de métal alcalin. 7 - Procédé suivant la revendication 1, caractérisé en ce qu'on utilise une enzyme ayant des activités C1, Cx et cellobiase. 8 - Procédé suivant la revendication 1 ou 2, caracté- risé en ce qu'on utilise une cellulase de Trichoderma viride pour effectuer la saccharification enzymatique. 9 - Procédé suivant la revendication 8,. caractérisé en ce qu'on effectue la saccharification à 25-50 C environ et à un pH de 4,0-5,0 environ. - Procédé suivant la revendication 8, caractérisé en ce qu'on effectue la saccharification à pH 4,8 environ et à 50 C environ. 11 - Procédé suivant la revendication 8, caractérisé en ce qu'on utilise environ 9000 à 15 000 unités d'activité des cellulases totales/1 pour jusqu'A 25 g/1 environ de d6- chet cellulosique solide. 12 - Procédé suivant la revendication 2, caractérisé en ce qu'on utilise le sucre récupéré du stade (c) comme source de carbone pour un procédé de dénitrification micro- bienne.