FR 2467402 A1 19810417 FR 8018331 A 19800821 La présente invention concerne une méthode d'essai biologique et plus précisément un procédé pour détecter et mesurer la réaction des cellules à certaines substances extra-celulaires. Il est connu depuis longtemps que l'intérieur des cellules animales et végétales est électriquement négatif par rapport à l'extérieur. La valeur de cette différence de potentiel se situe habituellement entre 5 et 90 mV, la plus grande partie du potentiel étant développée au travers de la membrane de la cellule. Les potentiels de membrane descellules changent de diverses façons avec l'état physiologique de la cellule. Etant donné que l'expédient de l'énergie métabolique est nécessaire pour maintenir les potentiels, le potentiel au travers de la membrane d'une cellule blessée ou morte diminue de valeur. Des changements spécifiques du potentiel de membrane se produisent en quelquesminutes après l'inter- action des cellules avec un grand nombre de substances o coordinats qui se lient avec une affinité relativement élevée aux récepteurs transmembraneux. En rapport avec les ligands et les récepteurs, des recherches récentes en biologie cellulaire ont démontré qu'une forme de base de communication entre les cellules de systèmesvivantsmulticellulairesest réalisée par des ligands extra-cellulaires ou messagers chimiques. Ces messa- sers chimiques proviennent à la fois des tissus spécialisés de l'organisme et de sources externes. Leurs structures chimiques et sites d'action varient grandement. Ils peu- vent avoir une zone d'influence aussi petite que quelques centaines d'angstroms (par exemple à la jonction neuromus- culaire) ou dans la totalité de l'organisme (des messagers portés par le sang tel que les hormones). Du fait de récentes recherches biochimiques dans ce domaine, il a maintenant été établi que de nombreux de ces messagers chimiques se combinent avec la cellule re- cevant le message en s'accouplant sélectivement aix récep- teursdisposèssur l'extérieur de la cellule. Apparemment, le récepteur reconnaÂt le messager chimique sur la base de sa stéréochimie et/ou la répartition spatials de ses -2- groupes chargés ou chimiquement actifs. Donc, le ligand et le récepteur sont liés de façon non convalente suivant une liaison de "clé et serrure". Du fait de cette liaison, un changement intracellulaire biochimique ou biophysique se produit qui induit la cellule à commencer ou achever un certain procédé métabolique ou physiologique. Les ligands comprennent des substances telles que l'acétyl- choline, l'épinéphrine, et la nore1nephrine (neurotrans- metteur), l'insuline, l'hormone de croissance et la thyro- tropine (hormones), l'histamine, les antigènes, les protéi- nes du système immunologique ou des protéines de celle-ci, les virus, les bactéries, certaines toxines, et le sperme. Pour beaucoup de ces substances,il existe un antagoniste naturel ou synthétique c'est-à-dire une substance qui peut inverser l'essai physiologique de sa substance correspon- dante o se lier at.récepteursempêchant ainsi la liaison de la substance naturelle. On connait également des agonistes naturels ou synthétiques. Un agoniste est une substance qui se lie au récepteur pour amorcer une réaction cellulaire physiologique similaire à celle du ligand naturel. De nombreuses drogues maintenant habitue- lement employéeedans la pratique médicale sont des agonistes ou antagonistes de ligands naturels. Dans de nombreux cas, les événements qui se produisent dans les cellules à la suite d'iune liaison du ligand avec des récepteurs spécifiques peuvent être reproduites en faisant réagir les cellules avec d'autres substances qui se lient auxrécepteurs, par exemple avec certaines lectines végétales ou avec un anticorps préparé contre les récepteurs isolés. Il est également possible d'amorcer les réactions cellulaires de ce type par addition d'agents qui changent le potentiel de membrane dans le même sens que celui obtenu après une interaction ligand-récepteur. Une méthode rapide est fiable paur détecter et mesurer l'effet intracellulaire de l'interaction ligand-récepteur aurait une utilité significative en recherche biochimique et des essais pour diagnostics. A cause de la diversité des spécificités des récepteurs parmi les populations cellulaires autrement homogènes eticause du nombre énorme -3d'agents chimiotactiques un tel essai idéalement devrait être capable de s'appliquer aux cellules individuelles. Divers procédés directs et indirects pour détecter l'interaction ligandrécepteur sont connus dans la techni- que. Dans un type de procédé,on utilise des ligands marqués par une substance radioactive ou fluorescente. Ils sont incubés avec une suspension de cellules et après lavage pour éliminer les ligands non liés, on dose la radiactivi- té ou fluorescence de la masse cellulaire. La nécessité d'employer des ligands marqués impose des limitations sévères à l'utilisation de cette technique. Dans un autre type de procédés de détection connu dans la technique,on utilise l'observation que les interactions ligand-récep- teur sont souvent accompagnéespar des augmentations de synthèse intracellulaire d'acide déCsyribonucléique (ADN). Dans certains systèmes, anrrrs la liaison des ligands au récepteur,par exemple après que les lymphocy- tes aient été stimulés par un antigène ou des mitogènes tale ue la phytohémagglutinine, on peut mesurer les quantités dle ADN et ensuite les comparer avec la quantitéde ADN d'une masse cellulaire comparable o aucune inter- action ligand- récepteur ne s'est produite. Le niveau relatif de ADN donne une mesure de l'interaction ligand- récepteur. L'utilisation de cette technique est limitée parce que la synthèse de l'ADN généralement n'est pas détectable avant de nombreuses heures ou mêmes jours après la liaison du ligand. Encore un autre type de procédés pour détecter certains types d'interaction ligand-récepteur est basé sur la "structure de la matrice cytoplasmique " détermi- née par la mesure de la polarisation de fluorescence de la fluorescéine intracellulaire. Pour pouvoir être analysées par de tels procédés, les cellules doivent être capables de produire une fluorescéine intracellulaire par hydrolyse enzymatique du diacétate de fluorescéine ou d'un composé similaire. Ces procédés sont techniquement difficiles à mettre en oeuvre et les résultats sont difficilement interprétés. En outre, le procédé exige une modification métabolique d'un réactif par les cellules 2467402i -4- à étudier. Blen qu'il ait été ' [e membrane lorsqu'elles sont stimulées par un neuro- transmetteur, il est seulement apparent depuis peu de temps qlue les changements du potentiel de membrane induits pardes stimuli physiologiquesne sont pas limités à ces cellules spécialisées. En insérant des microélectro- dles dans des cellules non excitables, des chercheurs ont établis que les changements de potentiel de membrane sont associés à leurs interactions ligand -récepteur. En fait, on a observé que les événements physiologiques qui se produisent dans des cellules non excitables % la suite d'une liaison d'un ligand à un récepteur peuvent parfois être reproduits par addition à la suspen- sion de ce]lules, d'agents qui changent le potentiel de membrane dans le même sens que celui qui se produit après une liaison ligand-récepteur. Une recherche supplé- ment-aire a développé de nouvelles techniques pour observer ces changements. Par exemple, une méthode photométrique de mesure des changements du potentiel de membrane dans une masse de cellules ensuspension a été décrite par P.J. Sims et col. (Biochemistry, Vol. 13, No. 16, 1974, :,e 3315). Selon cette méthode, la suspension de cellul.; est incubée avec une cyanine ou un autre colorant qui est chargé positivement et est capable de traverser la couche de lipide des membranes cellulaires. Le rapport () des concentrations de co lorants intracellulare à colorant extra-cellulaire change avec les changements du potentiel de membrane: lorsque les cellules deviennent hyperpolarisées, c'est-à-dire lorsque l'intérieur des cellules devient plus négatif, davantage de molécules de colorant pénètrent dans les cellules. Dans la méthode de Sims et col., ces colorants sont utilisés en con- centration teÄ que les molécules de colorant intra- cellulaire forment des agrégats non fluorescents et Id fluorescence du colorant libre dans le milieu en suspension est mesurée contre le fond plus sombre dE 2467402, -5- cellules.Cette fluorescence diminue avec l'hyperpolari- sation des cellules. Si seulement une petite fraction des cellules dans une suspension est sensible à un ligand donné, c'est seulement cette fraction qui présente un changement du potentiel de membrane. Dans ce cas, la concentration de colorant dans le milieu ne changera pas d'une manière appréciable et il n'y aura donc pas de changement détectable de fluorescence du colorant extra-cellulaire. De toute façon,cette méthode ne permet pas d'identifier les cellules individuelles sensibles au ligand. Dans la publication Journal of Me.abrane Biology Vol.33, page 141 (1977), W.N. Ross et col. ont décrit l'utilisation de la mérocyanine, de l'oxonol, et de la cyanine comme colorants pour mesurer les changements rapides du potentiel de membrane dans les cellules excita- bles telbs que les axones géants du système nerveux du calmar. On a observé que les changements de l'absorption, la de la fluosrescence, du dichroisme et de/ irefringence des colorants étaient associés aux changements du potentiel de membrane. Les colorants qui conviennent le mieux pour ces mesures sont les mérocyanines, qui sont chargées néga- tivement et donc ne pénètrent pas facilement les parois cellulairesGénéralement, les colorants ne colorent pas les membranes cellulaires autres que celles des cellules nerveuses et musculaires excitables. On a observé que les mérocyanines colorent certaines membranes cellulaires non exaitables, par exemple, les cellules sanguines immatures ou leucémiques. Cependant, on a constaté que cette coloration se produisait indépendamment des changements du potentiel de membrane cellulaire. Il est un but de l'invention de mettre en oeuvre une méthode d'essai biologique basée sur une mesure non inLrusixe des changements du potentiel de membrane des cellules individuelles. Un autre but de l'invention est de fournir une méthode rapide sensible et universelle d'essai biologique servant à détecter et à prédire la réaction cellulaire des interactions ligand-récepteur. Encore un autre but de l'invention est de détecter les interactions 2467402 i - 6 - ligand-récepteur dans des cellules individuelles non exita- bles. D'autres buts sont de fournir des nouvelles techniques pour sélectionnerdes drogues potentiellement actives, pour diagnostiquer le mauvais fonctionnement physiologique des tissus et pour tester l'allergie et l'histo-compatabilité. L'invention met en oeuvre une méthode d'essai biologique se caractérisant par les étapes de:(a) déterminer uneypropiilté caractéristique d'éléments individuels d'une ou nombreuses cellules non excitables représentative du potentiel de membrane de celle-ci Dar une méthode nonintrusive. et (b) comparer cette c/caractéristique cellulaire à une carac- téristique de référence pour détecter les différences du potentiel de membrane de ces cellules individuelles. Les modes de réalisation de l'invention constituent un procédé rapide et sensible, non intrusif pour détecter le changement du potentiel de membrane des cellules pour les cellules non excitables et pour prédire la réaction physiolo- gique des cellules non excitables à une modification par des agents physiques, pharmacologiques, biologiques ou chimi- ques. Selon un mode de réalisation le changement du potentiel est provoque par l'interaction ligand-récepteur. Dans un autre mode de réalisation le changement est non spécifique ainsi que cela se produit après un dommage causé aux cellules. Dans le premier cas, le procédé est basé sur l'observation que, bien que la réaction physiologique d'une cellule donnée à la liaison d'un ligand spécifique est souvent difficile ou impossible à détecter et souvent nes/$roduit pas avant des heures ou des jours après l'interaction, un changement du flux ionique au travers de la membrane de la cellule et le changement résultant du potentiel de membrane se produisent après peu de temps, typiquement endéans une heure. Ce mode de réalisation consiste à déterminer une caractéristique des cellules individuelles qui est représentative du potentiel de membrane de cellej-ci, comparer cette caractéristique à une caractéristique de référence pour détecter les différences du potentiel de membrane et utiliser les changements observés comme indicateur de l'interaction ligand-récepteur. Du fait du grand nombre de substances qui présentent une activité -7- comme messagtrchimique, la diversité observée des sites récepteurs sur les cellules individuelles d'une population donnée de cellules, et la diversité de la réaction physiologique des cellules individuelles à des ligands spécifiques, il est un point important que la réaction des cellules individuelles (par opposition aux suspensions de masse) à l'exposition des ligands soit détectée. Donc, on met en oeuvre des procédés: (1) pour déter- miner la présence ou absence de récepteurs spécifiques pour un ligand donné sur certaines ou la totalité des cellules d'une population de cellules;(2) pour déterminer la présence ou absence dans un mélange de substances d'un ligand spécifique connu pour réagir avec les éléments d'une population de cellules données; (3) pour étudier les effets cumulatifs des combinaisons des ligands sur les cellules, (4) pour comparer les effets de deux ou plusieurs ligands sur une population de cellules donnée, et (5) pour déterminer une indication de l'état physiologique d'une population de cellules o sous-population après exposition à une toxine suspectée ou autre substance. Etant donné que plusieurs des méthodes utilisées pour détecter les changements du potentiel de membrane ne sont pas destruc- tives, les procédés peuvent être utilisés en combinaison avec une espèce de cellule pour produire des populations de cellules riches en cellules ayant les spécificités souhaitées des récepteurs tout en préservant la viabilité des cellules. 3o) Suivant un mode de réalisation de l'invention, des cellules non excitables, typiquement en suspension, sont mises en contact avec une solution contenant ou suspecta-de contenir un ou plusieurs ligandsactifs. On incube le mélange sous les conditions o les récepteurs des cellules et ligands complémentaires se lient pour induire un changement physiologique dans les cellules o la liaison se produit. Avant, après, ou pendant l'in- cubation, une caractéristique représentative du potentiel de membrane cellulaire des cellules individuelles est 4(0 détectée. Cette caractéristique détectée est comparée -8- à une caractéristique de référence pour détecter les changements des potentiels de membrane et pour obtenir une information utile. La présence ou absence d'un ligand donné dans une solution peut être déterminée en incubant la solution avec une population de cellules comprenant au moins une sous-population connue pour contenir des récepteurs pour le ligand en question, en détectant les changements dans le potentiel de membrane cellulaire dans chacune des cellules formant la population et en comparant la réparti- tion des changements du potentiel de membrane s'il y en a, parmi lescellules aux résultats /par exempled'une carac- téristique de référence comprenant 1 résultats du même essai réalisé en parallèle avec un échantillon à tester contenant un échantillon authentique du ligand en question. Une indication de la concentration du ligand dans l'incon- nu peut également être déduite par cette technique. La présence et fréquence des cellules qui réagissent avec un ligand donné dans une population hétérogène de cellules peut être déterminée d'une manière similaire en comparant les changements du potentiel de membrane parmi les éléments de la population. En combinant cette technique avec des méthodes connues de classifications de cellules, le chercheur peut obtenir des populations de cellules rela- tivement homogènes par rapport à la sensibilité d'un ligand spécifique. Suivant un autre mode de réalisation, la réaction physiologique d'une population de cellules non-excitables s) à l'exposition de deux ou plusieurs ligands chimiquement distincts peut être prédite et comparée en incubant des solutions des ligands respectifs dans une pluralité d'échan- tillons cellulaires, en observant le sens, la valeur et/ou le temps cbi changement du potentiel de membrane dans les cellules individuelles dans les échantillons cellulaires respectifs, et en comparant ensuite les mesures faites dans les échantillons respectifs. Cette technique peut être utiliséepar exemple,pour détecter les suts- tances synthétiques suspectées d'être des agonistes ou -, antagonistes envers le ligand naturel et pour détecter des 2467402t -9- variations de la réaction cellulaire de ceailes similaires à des ligands fonctionnellement ou structurellement apparentés. Dans un autre mode de réalisation l'effet cumulatif de l'exposition de deux ou davantage de ligands chimique- ment distincts à une population de cellules non-excitables peut être rapidement essayé en incubant les ligands et la population de cellules, en détectant les changements du le potentiel de membrane cellulaire des cellules individuelles et en comparant les changements du potentiel détectés au:résultatsobtenu en parallèle avec les ligands individuels ou un enregistrement de la réaction cellulaire prédéterminée à un ou plusieurs des ligands individuels. De cette façon, des drogues qui se compor- tent comme agonistes ou antagonistes envers le ligand naturels et une indication de leur dose optimum peuvent être découvertes. Dans un autre mode de réalisation encore, les effets toxiques de divers agents sur les cellules sont évalués par la mesure du potentiel de membrane après exposition à ces agents. Le potentiel de membrane d'une cellule endommagée doit atteindre zéro dans la zone o la membrane est rompue. Des degrés d'endommagement moindre sont détectables par une diminution de la valeur du potentiel de membrane par comparaison aux cellules non endommagées. Diverses méthodes non-intrusives sont envisagées pour être utilisées pour détecter et mesurer le potentiel de membrane dans des cellules individuelles non-excitables. La méthode actuellement préférée consiste à utiliser soit des colorants perméables aux membranes soit des colorants liés aux membranes qui s'associent aux cellules individuelles et ont des caractéristiques optiques détec- tables qui changent en réponse à des changements de poten- tiels de membrane. Donc, des colorants ioniques perméables aux membranes cellulaires, s'ils sont incubés avec lescellules, s'équilibrent rapidement entre les côtés opposés des membranes cellulaires en fonction du potentiel de membrane. Une mesure indicative de la concentration - 10 - intracellulaire du colorant est alors faite par mesure photométrique de la fluorescence, de l'absorption ou autres propriétés optiques du colorant dans la cellule individuelle et d'autres attributs de la cellule individuelle (par exemple le volume de la cellule) qui doivent être connus dans le but de déterminer la concentration intracellulaire du colorant. Lorsque les cellules comparées sont homogènes en ce qui concerne leur volume, la mesure représentative de la quantité de colorant intracellulaire sera proportionn[le au potentiel de membrane. La mesure photométrique peut être mise en oeuvre par microphoto- métrie habituelle ou cytométrie à débit. Lorsque la propriété optique à mesurer est la fluorescence, le colo- rant est de préférence choisi parmi ceux caractérisés par une augmentation du rendement quantique de fluorescen- ce dans des solvants ou la polarité diminue et la concentration du colorant dans le milieu est choisi de façon à décourager l'inactivation intracellulaire de la fluorescence par formation de complexe de fluorescence réduite. Des colorants fluorescents préférés sont les cyanines cationiques te,--que dihexyl 3,3' oxa 2,2' carbccyanine (diO-C6- (3)). Pour que l'invention puisse être mieux comprise, référence est faite aux figures suivantes de modes de réalisation de l'invention. La description a seulement un but illustratif et ne doit pas être considérée pour limiter l'invention. Dans les dessins La figure 1 est un graphique de la répartition de l'intensité de la fluorescence cellulaire d'une premiè- re aliquote d'une suspension de cellules humaines de lymphocyte incubés avec une concentration de 5 x 10-8M de dihexyl 3,3' oxa 2,2' carbocyanine (diO-C6-(3)). Dans ce graphique et dans les graphiques suivants l'axe vertical représente le nombre de cellules ayant une intensité particulière et l'axe horizontal représente l'intensité de la fluorescence. La figure 2 est un graphique de la répartition de 'L'intensité de la fluorescence cellulaire d'une seconde 2467402. - 11 - aliquote d'une suspension de cellules incubée simultanément avec une concentration de 2 x 10 5M de gramicidine ionopho- re dépolarisante et une concentration de 5 x 10-8M de diO-C6-(3). La figure 3 est un graphique représentant la distri- bution de l'intensité de la fluorescence cellulaire d'une troisième aliquote d'une suspension de cellules incubées simultanément avec une concentration de 6 x 10-6M de valinomycine ionophore hyperpolarisante et une concentration de 5 x 10-8 M de di0-C6-(3). La figure 4 est un graphique donnant la distribution de l'intensité de la fluorescence cellulaire d'une quatrième aliquote d'une suspension de cellules incubées simultanément avec une solution de 10 pg/ml de ligand concanavaline A et une concentration de 5 x 10 8M de di0-C6- (3)). La figure 5 est un graphique représentant la distri- bution de l'intensité de la fluorescence cellulaire d'une cinquième aliquote d'une suspension cellulaire incubée simultanément avec une solution de 20 pg/ml de ligand phytohemagglutinine et une concentration de 5 x 10 8M de di0-C6-(3)). La figure 6 est un graphique de la distribution de l'intensité de la fluorescence cellulaire du nombre de cellules avec une réaction de fluorescence donnée en fonction de l'intensité de la fluorescence fait avec une aliquote de lymphocytes T équilibrée par une concentration de 5 x 10-8M de diO-C6- (3). La figure 7 est un graphique représentant la distribution de l'intensité de la fluorescence cellulaire d'une suspension de lymphocytesT de la figure 6 vingt minutes après l'addition de phytohemagglutinine pour obtenir une concentration de 20 kg/ml, montrant l'effet dépolarisant de cette lectine sur une sous-population de cellules T. La figure 8 est un graphique donnant la distribution de l'intensité de la fluorescence cellulaire d'une suspen- sion de cellules de lymphocite:;B équilibrée par une concentraton de 5 x 10-8M de di0-C6(3). 2467402, - 12 - La figure 9 est un graphique représentant l'effet ihyperpolarisant de la phytohémagglutinine sur la suspension de cellulesB de la figure 8/vingtcinq minutes après ]'addition de phytohemagglutinine à une concentration de p)g/ml. Tous ces granhiques précédents ont été réalisés de avec un cytomètre du type Cytofluorographd,e Ortho Instruments raccordé à un analyseur d'altitude des impul- sions. Le procédé consiste à utiliser des cellules non- excitables, c'est-à-dire des cellules autres que celles provenant du tissu musculaire et nerveux. Les cellules concernées dans l'analyse selon la présente invention sont isolées par des techniques habituelles etmis en suspension dans un milieu capable de supporter un métabolisme cellu- laire norma], par exemple une solution saline équilibrée, oxygénée, isotonique tamporrée à pH 7,2 -7,6 et contenant du glucose ou autres produits nutritifs et approximative- 2) ment dC, concentratior;!)hysiologiquesd'ions sodium, potassium, calcium et magnésium. De préférence, les cellules ne contiennent pas de protéines étrangères (albu- mine, etc) et autres substances ayant une forte affinité pour les colorants du type utilisé pour détecter les changements des potentiels de membrane dans la technique de détection préférée décrite ci-dessous. Ainsi qu'il est exigé pour les buts du test à mettre en oeuvre, les cellules peuvent comprendre une population relativement homogène en ce qui concerne leur fonction physiologicque (par exemples des lymphocytes T) , ou en ce cqui concerne la spécificité du-ligand (par exemple des cellules-mères sensibles au complexe allergène IgE). Si nécessaire, les cellules peuvent être divisées en un certain nombre de parties aliquotes de sorte que plusieurs déterminations du potentiel de membrane peuvent être faites en parallèle.Le potentiel de membrane des cellules dans chaque partie aliquote est alors déterminé après ex- p(sition, par exemple, à une solution de différents ligands dlitffe(rentc; concentrationsd'un seul type de ligand, ou 4J une solution sans ligand de sorte qu'une comparaison puisse 2467402; - 13 - être faite. La solution à laquelle les cellules sont exposées, en fonction des buts du test, peut comprendre un inconnu suspecté de contenir un ligand spécifique pour les cellules de l'échantillon, un échantillon authentique d'un ligand connu de concentration connue ou inconnue, une préparation impure de ligand o une solution contenant une substance suspectée d'être toxique envers les cellules o une sous-population de cellea-ci. En plus de détecter la liaison ligand-récepteur, la technique permet de vérifier les catégories suivantes d'informations: 1) la présence d'une sous-population de cellules dans la suspension ayant des récepteurs de surface de la membrane complémentaires à un ligand spécifique, 2) la présence dans une solution d'un type spécifique de ligand capable de se lier avec les récepteurs disposés sur les cellules dans la suspension o une sous-population de ces cellules, 3) l'effet cumulatif de ligands multiples qui réagissent avec une population donnée de cellules. 4) une comparaison de la réaction d'une population de cellules ou souspopulation de celles-ci à différents types de liganç4 5) l'effet sur la viabilité des cellules des diverses concentrations de substances toxiques, o 6) la stimulationr métabolisme cellulaire par diverses concentrations de produits nutritifs tels que les acides aminés ou des sucres. En ce qui concerne les systèmes impliquant des inter- actions ligand-récepteur, l'information est obtenue en incubant les cellules avec une solution de ligand pendant une période de temps suffisante et à une température convenable (par exemple la température normale descellules dans leur milieu naturel) pour permettre aux interactions ligand-récepteur de se produire et un changement résultant du flux ionique au travers des membranes cellulaires. Une caractéristique représentative du potentiel de membrane de chaque cellule dans la suspension o de chaque cellule dans une partie aliquote de la suspension est alors obtenue, 2467402. - 14 - éventuellement après des intervalles de sorte qu'un profil de changement de potentiel en fonction du temps soit obtenu. La caractéristique mesurée est alors comparée à une caractéristique de référence/d5terminer si l'inter- action ligand- récepteur a eu lieu, si le sens, la valeur, ou le temps des changements imite ou est opposé au changement induit dans les cellules après exposition à un ligand connu, soit que l'effet cumulatif sur le potentiel de membrane de deux ou plusieurs ligands diffère de celui d'un seul ligand ou d'un mélange différent de ligands. La nature de la caractéristique de référence nécessairement variera en fonction de l'information spécifique recherchée. Comme on l'a noté cidessus, elle peut comprendre les résultats d'un ou plusieurs essais réalisés en parallèle avec l'échantillon à tester. Selon une autre possibilité, elle peut prendre la forme d'un enregistrement d'un tel essai, par exemple sous forme d'un graphique du nombre des cellules présentant un potentiel donné en fonction de la valeur du potentiel Les ligands et leurs antagonistes généralement produisent des effets opposés sur le potentiel de membrane cellulaire. Par conséquent, au cours de la recherche des efforts dirigés vers la découverte de substance capable d' imiter, bloquer ou annuler l'effet de ligandsnaturels sur lcs cellules d'un tissu particulier, le sens, la valeur et/ou le temps des changements de potentiel de membrane dans un échantillon de cellules d'un tissu peuvent être déterminés Par de mesures multiples après exposition de cellules a un ligand naturel. Ensuite, diverses substances peuvent être ajoutées aux aliquotes de la même suspension de cellules. En comparant les chdngement;de potentiel de membrane indui% dans les échantillons respectifs, le chercheur peut identifier comme candidat valable pour une recherche supplémentaire des matières spécifiques ayant vraisemblaliement l'effet physiologique souhaité, et d'autres composés peuvent être éliminées de la recherche. En utilisant la présente méthode, on peut également déterminer des paramètres tel que 2467402; - 15 - la concentration de l'antagoniste nécessaire pour abolir l'effet sur le potentiel de membrane d'un type donné de cellules, d'une concentration donnée d'agoniste. De tellesmesuressont utiles pour l'évaluation des ligands et de leurs antagonistes comme agents pharmacologiques. Dans certains cas il existe divers types de récepteurs spécifiques pour un ligand donné. Par exemple, la liaison d'un ligand à des récepteurs d'une classe de cellules peut résulter en une hyper-polarisation alors que la liaison du même ligand à des récepteurs d'une seconde classe de cellules peut résulter en une dépolarisation. La méthode actuelle permet de distinguer entre ces deux types d'interaction. Des techniques connues de classifica- tion de cellules, utilisées en combinaison avec le procédé selon l'invention, permettent l'isolation de lignes de cellules ayant une spécificité de récepteur souhaits parmi des populations hétérogènes. L'utilisation de la méthode dans ce contexte fournit une sélectivité accrue par comparaison aux méthodes habituelles de classification de cellules basée sur la liaison d'un ligand marqué par fluorescence parce que l'effet physiologique aussi bien que la liaison du ligand peuvent être incorporés dans le critère de sélection. Une spécificité supplémentai- re peut être obtenue par la combinaison d'une mesure directe de la liaison du ligand marqué optiquement avec détection du changement du potentiel de membrane après la liaison du ligand. Lorsque la présence d'un type particulier de ligand dans une solution, ou la présence de cellulesayant une spécificité particulière envers le ligand est l'information intéressante, on peut lire le potentiel de membrane avant et après le mélange de ce ligand et la suspension de cellule;et les résultats sont comparés. Les parties aliquotes représentatives respectives d'une suspension de cellules peuvent être incubées avec, par exemple, 1) ume solution contenant une concentration inconnue d'un ligand donné, 2) une solution sans ligand, et 3) une solution contenant une concentration connue de ligand. Après incubation, une indication dans la concentration 2467402'. - 16 - de ligand de l'inconnu peut être obtenue par comparaison des potentiels de membrane descellules dans les échantil- lons respectifs. Etant donné que le potentiel de membrane de cellules individuelles est mesuré, il est possible d'identifier une souspopulation de cellules dans la suspension avec une spécificité choisie de ligand. La méthode peut être utilisée pour la détection et la quantification des réactions immunesdescellulespar mesure deschangemen-b de potentielchez les lymphocytes, macrophages ou autres cellules du système immunologique après expositionde substances telesque les antigènes, anticorps, haptènes, allergènes, et composants de complément. Etant donné que les lymphocytes sont typiquement une population hétérogène en ce qui concerne la réactivité envers un antigène donné, la fraction de cellules répondant à l'antigène donné donne une mesure utile de la réaction immunologique cellulaire. Des altérations du modèle habituel des changements de potentiel sur les cellulesen réaction peuvent indiquer des défauts de la fonction immunologique. Similairement, l'introduction de divers allergènes dans plusieurs échantillons d'un sérum individuel suivi par l'incubation des Cchantillons avec des cellules impliquées dans l'excrétion de l'histamine peut être utilisée comme moyen non-intrusif1de;tecter la sensibilité d'un individu à diverses matières allergènes. Etant donné, qu'avec les procédés selon l'invention l'isolation et le ma^q1iges d'espèces spécifiques de ligand n'est pas nécessaire pour la détection de substances capables de selier aux cellules avec les spécificités des récepteurs donnGs, il est possible d'utiliser la méthode pour tester l'activité du ligand d'une préparation impure de ligand, et suivre et observer l'activité du ligand dans diverses fractions de telles préparations impures résultant de procédés conçus pour purifier ou isoler le ligand spécifique souhaité. La méthode peut également être utilisée pour aider à définir la structure chimique des récepteurs de surface 4tu par démonstration doeAmpétition entre divers ligands- 2467402i - 17 - de spécificité connue envers des sites de Maison sur les surfaces des cellules. Les effets toxiques de divers agents sur les cellules peuvent être évalués par des mesures successives des potentiels de membrane des cellules après exposition à de tels agents. Il est connu que les essais pour la viabilité des cellules basés sur la pénétration de colorants normalement perméables tels que l'iodure de propidium détec-tmtseulement ces cellules *ui sont désintégrées. Pour divers buts, par exemple l'évaluation de l'effet des drogues sur la thérapeutique du cancer, il est utile de déterminer si la capacité future de reproduction de la cellule est la détruite, ou, si un dommage insuffisant pour/rupture de l'intégrité de la membrane cellulaire s'est produit. * Le potentiel d'une cellule endommagée doit atteindre zéro dans la zone o la membrane s'est rompue. Les degrés moindre de dommages sont détectables par une diminution de la valeur du potentiel de membrane par comparaison aux cellules non-endommagées. La diminution ou suppression de la réaction contre les ligands et autres substances qui normalement produisent des changements connus du potentiel peut également être détecte par une mesure des potentiels des membranes cellulaires. Etant donné que la distribution de composés ioniques perméables, par exemple des drogues au travers des membra - nes cellulaires,dépend du potentiel de membrane, la méthode peut être utilisée pour produire des différences d'absorption de drogue parmi les différents types de cellules. Le procédé peut également être utilisé pour fournir un facteur de correction basé sur les différences d'absorption de colorants prédites sur la base des diffé- rences de potentiels mesurées, ce qui permet d'utiliser une variété de colorants ioniques perméables,par exemple les acridines, comme colorants vitaux pour la quantifica- tion de divers constituants intracellulaires, par exemple les acides nucléiques et les glycosaminoglycanes. La totalité des procédés précédents exige une méthode rapide,nonintrusive et,de préférence non destructive pour détecter le potentiel de membrane o obtenir une mesure 2467402; - 18 - proportionnelle au potentiel de membrane de 103 à 106 cellules individuelles dans un échantillon typique de cellules. L'intrusion de microélectrodes dans les cellules individuelles nécessairement endommage les membranes cellulaires et ne peut être utilisée réalistiquement pour détecter le potentiel de membrane de chacune du grand nombre de cellules d'une suspension de cellules. La méthode de détection préférée consiste à utiliser des colorants de fluorescence cationiqu% perméablE à la membrane cellulaire qui, pendant l'incubation, se partaententre les deux côtés opposés des membranes cellulaires en fonction du potentiel de membrane. La concentration intracellulaire du colorant ou un paramètre proportionnel à la concentration est alors mesuré par des techniques optiques au moyen d'un microphotomètre o cuncytomètre à débit Pendant l'hyper-polarisation, l'affinité de l'intérieur de la cellule envers le colorant est accrue. au cours d'une dépolarisation,l'affinité de l'intérieur de la cellule pour le colorant diminue. Une classe de colorants convenant pour cette technique sont lescolorants cationiques dellyanine tels que les di-n-butyl 3,3' méthyl 9 et diéthyl 3, 3' thiacarbocyanines, diéthyl 3,3' oxa 2,2' carbocyanine, hexaméthyl 2,3, 3,1',3', 3' indocarbocyanine et dicarbocyanine, diéthyl 3,3' thiadicarbocyanine, et,de préférence,dihexyl 3,3' oxa 2,2' carbocyanine (di0-C6- (3)). Ces colorants sont disponibles dans le commerce,par exemple, chez Accurate Chemical Company ou Eastman Kodak. Il est avantageux que le colorant choisi présente un rendement quantique de fluorescence augmenté lorsque la polarité du solvant diminue et que le maxima de la fluorescence et de l'absorption du colorant se déplace avec les changements de la polarité dans le solvant. Ces caractéristiques portent au maximum la sélectivité de la détection du colorant associé à la membrane dans les cellules contre un fond de colorant libre en solution. Il est également avantageux d'utiliser des concentrations suffisamment faibles du colorant fluorescent choisi pour réduire au minimum l'extinction de la - 19 - fluorescence du colorant intracellulaire due à la forma- tion d'agrégats. Dans le cas du colorant préféré de cyanine (di0-C6-(3)), des concentrations égales à ou inférieures à 3 x 1.0-7M sont préférées. Le DiO-C6-(3) se caractérise par une augmentation du rendement quantique d'environ 4,5 dans du n-octanol sur des olutions aqueuses. Son maxima d'absorption et d'émission dans le n-octanol est d'environ 10 nm supé- rieur à celui en solution aqueuse. La quantité de di0-C6(3) dans les cellules individuelles est déterminée par la mesure de la fluorescence dans la région de 504 nm après excitation à environ 488 nm. Les effets souhaités du solvant sur le rendement quantique sont plus prononces dans les colorants de carbocyanine qui a la formule générale R-(CH)3-R' que dans le cas des di-et tricar- bocyanines ayant la formule générale R-(CH)5-R' et R-(CH) 7-R' respectivement. Un microfluoromètre doit être utilisé pour mesurer la fluorescence mais la mesure est accomplie le plus rapidement et avec le plus de précision en utilisant un cytomètre à débit. La méthodologie du cytomètre à débit et la classifi.catbn ds cellules est décritepar P.K. Tioran et L.L. Wheeless,, Jr. dans Science, Vol. 198, pages 149-157 (1977). Les cytomètres à débit utilisant des sources lumineuses au laser à ions argon conviennent parfaitement pour les mesures de la présente invention. De tels instruments sont vendus par différents fabriquants etsontcapables de classer automatiquement les cellules en fonction de divers critères par exemple, intensité de fluorescence, dimension des cellules, longueur d'onde de la fluorescence et longueur d'onde ou intensité d 'absorption. Si la population de cellules étudiées est relativement lhomogène en ce qui concerne la dimension de la structure interne, et si la concentration de colorant ajouté et le nombre de cellules en suspension dans un volume donné de milieu sont maintenus relativement constants, la quantité totale de colorant dans une cellule donnée, mesurée par l'intensité de la fluorescence provenant de cette 2467402. - 20- cellule, sera directement proportionnelle à la concentra- tion et par conséquent au potentiel de membrane. Cependant, lorsque des populations de cellules mélangées o diverses concentrations de cellules et/ou de colorant sont impliquées, des mesures supplémentaires peuvent être nécessaires. Etant donné que la concentration intracellu- laire de colorant est égale à une quantité totale de colorant dans la cellule divisée par le volume de la cellule, une valeur proportionnelle à la concentration de colorant dans une cellule donnée peut être obtenue en mesu- rant la quantité totale de colorant comme il a été décrit ci-dessus, et en divisant par une quantité proportionnelle au volume des cellules. Une mesure du volume des cellules peut être obtenue simultanément avec une lecture de la fluorescence intracellulaire dans des cytomètres à débit par des mesures électroniques ou optiques de la dimension des cellules, par exemple 3/2 de l'énergie de la section transversale de la cellule, mesurée par disper- sion de la lumière à des angles proches de l'axe d'illu- mination. De manière avantageuse, les techniques cyto- métriques à débit permettent d'assembler cette information, de la manipuler électroniquement et de la montrer automa- tiquement. Le cytomètre crée un signal représentatif de l'intensité de la fluorescence, un second signal représentatif du volume des cellules et ensuite détermine le rapport des signaux. Ce rapport, qui est proportionnel au potentiel au membrane peut alors être utilisé comme critère de classification des cellules et/ou montré. Lorsque la population des cellules à tester est notablement hétérogène en ce qui concerne le volume cellu- laire ou la quantité de colorant liant, une mesure propor- tionnelle du potentiel de membrane peut être obtenue en utilisant deux colorants avec des affinités différentes pour les constituants intracellulaires.Dans ce cas, la fluorescence intracellulaire des 2 colorants peut être mesu- rée. L'augmentation ou diminution du rapport des teneurs en colorants intracellulaires est alors proportionnelle au changement du potentiel de membrane et est indépendante du volume des cellules et des variations de la teneur en 2467402i - 21 - matière colorante liante dans les cellules. Bien que les principes établis en chimie permettent le calcul des effets des variations dans les cellules et des concentrations de colorant dans le milieu sur la concen- tration intracellulaire de colorant, il est plus simple en pratique d'ajuster les dilutions de sorte que les con- centrations des cellules et de colorant scent approximati- vement les mêmes dans tous les échantillons comparés. Une interférence avec les mesures photométriques du potentiel peut être provoquée par une coloration non spécifique du cytoplasme des cellules mortes o l'inté- grité de la membrane a été perdue. Si une petite quantité de colorant normalement imperméable tel que le bromure d'éthidium ou 1 iodure de propidium est ajoutéeau milieu le noyau de ces cellules à membrane endommageesera coloré alors que le colorant ne pénétrera pas dans les cellules viables. Si le colorant perméable utilisé pour les mesures du potentiel et le colorant imperméable utilisé pour détec- ter les dommages à la membrane ont des propriétés optiques différentes, il est possible de faire des mesures corréla- tives d'une ou plusieurs propriétés optiques de chaque colorant dans chaque cellule et d'éliminer les cellules endommagées ainsi détectées des analyses ultérieures. Si le colorant perméable utilisé est le diO-C6(3) préféré, et si le colorant imperméable est l'iodure de propidium, les noyaux des cellules endommagées émettront une fluores- cence rouge dans la région 610 nm après excitation à 488 nim. Cette fluorescence peut aisément être distinguée par l'observateur o par des méthodes photométriques de la fluorescence verte du diO-C6-(3). Des mesures photométriques du potentiel de membrane peuvent être combinées avec d'autres mesures des mêmes cellules pour augmenter le pouvoir analytique de la méthode. Par exemple, la réaction des cellules au cours des différentes phases du cycle de la cellule avec un ligand donné peut être détermindepar une coloration simultanée avec du diO-C6(3) et avec du fluorochrome de ADN tel que le composé No. 33342 de Hoechst. Il est possible de mesurer des propriétés optiques 2467402. - 22 - autres que la fluorescence, par exemple l'absorption pour obtenir-une indication de la quantité de colorant dans les cellules individuelles. Dans ce cas, on préfère utiliser des colorants sous forme d ' agrégats intra- cellulairesavec un maximum d'adsorption à des longueurs d'ondes différentes de celles du colorant libre et d'utiliser ces colorants en concentrations suffisamment élevéesde sorte qu'une fraction relativement importante existe dans les cellules sous forme d'agrégats. Ceci augmente au maximum la sélectivité de la détection de colorant intracellulaire contre un fond de colorant libre en solution. Les colorants de thiacarbocyanine tel que diéthyl 3,3' et dipropyl 3,3' thiadicarbocyanine peuvent présenter cette propriété sous certaines condi- tions. Lié à des cellules sanguines rouges, le premier colorant est connu comme présentant un nouveau pic d'absorption à environ 590 nm, probablement du à une complexation du colorant intracellulaire avec l'hémoglo- bine. L'absorption des cellubs à cette longueur d'onde peut être mesurée pour déterminer la quantité de colorant dans les cellules individuelles. Bien qu'une mesure photométrique de l'absorption des colorants cationiques est la méthode préférée de mesures dq;changements du potentiel de membrane, d'autres techni- ques peuvent être mises en oeuvre. Par exemple, même si l'intérieur des cellules non excitables est négatif par rapport à l'intérieur, des colorants anioniques qui ont une affinité pour les solvants à polarité décrcssante peuvent être utilisés. Dans ce cas, le colorant aura une affinité pour les constituants intracellulaires malgré sa charge et sera absorbe par la cellule. Sa concentra- tion diminuera lors de l'hyperpolarisation de la cellule et augmentera avec la dépolarisation. Il est également envisagé que les méthodes non - photométriques de détection du potentiel de membrane puio-:.ntêtre employées. De ce point de vue, des changements du potentiel de membrane peuvent être déterminés de manière connue en utilisant un cation marqué à la radio- activités tel que le carbone 14 ou des sels d'ammonium 2467402. - 23 - quaternaire ou de phosphonium marqué au tritium. Des - détails de ce procédé sont décrits dans Methods of Enzymology, H.R. Kaback, Academic Press, 1974 (page 698). Voir également, "Changes in Membrane Potential of Human Granulocytes Antecede the Metabolic Response to Surface Stimulation, Proc. Natl, Acad. Sci., Vol. 75, No. 8, pages 3818-3822, août 1978 (H. M. Korchak et col.) et Biochemistry 14:25, 1975 (Schuldiner et col.).L'absorption de ces cations, comme celle des colorants cationiques est une fonction du potentiel de membrane cellulaire. La radioactivité intracellulaire peut être testée après lavage des cellules en étalant une couche monocellulaire de cellules sur une lame et en exposant la lame à une émulsion photographique. Des comparaisons sont fai- tes, par exempleen soumettant un échantillon de contrôle au même procédé et en comparant les autoradiographies résultantes. Bien que cette méthode de mesure du change- ment de potentiel de membrane soit opérationnelle, elle n'est pas préférée étant donné que des périodes de temps relativement longues sont nécessaires pour exposer l'émulsion photographique utilisée et la viabilité des cellules n'est pas préservée. Une autre méthode non-photométrique de mesure du poten- tiel de membrane implique une modification de techniques utilisées dans les cori#eurs électroniques habituels des cellules. Dans ces appareils, on fait passer les cellubs individuelles en suspension enmilieu salin au travers d'un orifice intercalé entre une paire d'élec- trodes qui maintiennent un courant dans la solution en suspension. Le passage d'une cellule au travers de l'orifice fait varier la conductivité de la solution ce qui résulte en une impulsion de tension détectable. La hauteur de l'impulsion est une indication du volume de la cellule. Etant donné que les membranes des cellules avec des potenties de membrane différents typiquement ont des conductivités ioniques différentes, des signaux con- tenant une information indicative des variations de la conductivité ionique des membranes des cellules indivi- duelles passant au travers de l'orifice peuvent être 2467402- - 24 - obtenus en utilisant le courant alternatif. Ils peuvent être utilisés pour comparer les potentiels de membrane des cellules individuelles, par exemple à l'aide d'un analyseur d'altitude des impulsions. Exemple 1 Des l'mnhocytes de sang périphérique sont obtenus d'un sang de donneur et isolés par centrifugation sur des gradients de densités de Hypaque-Ficoll. Des estimations grossières du pourcentage d'érythrocytes, monocytes et granulocytes dans les préparations de lymphocytes sont obtenuespar analyse cytographique des signaux fluorescents rouge et vert des cellules dans des parties aliquotes colorées à l'acridine orange. Les dénombrements des celullules sont obtenus et la viabilité des cellules est établie par exclusion du trypane bleu. Des solutions de travail de di0-C6-(3) peuvent être préparées à partir de solutions stock de 10-3 M ou 5 x -4M dans de l'éthanol. Les concentrations des solutions de travail doivent être ajustées pour obtenir une concen- tration finale en colorant entre 10 8M et 5 x 10 7M pour que 10 ml d'une dolution de colorant soient ajoutés à 1,0 ml de cellules diluées dans du milieu 199 (Gibco). On dissout de la valinomycine (Sigma Chemical Company), un ionophore connu capable d'hyperpolariser les lymphocytes dans de l'éthanol à une concentration de 0,66 mg/ml. De la gramicidine (ICN), un ionophore connu capable de dépolariser les lymphocytes est également dissout dans de l'éthanol (0,4 mg/ml). On dissout de la phytohémagglutirine ("PHIA", Difco, 2 mg/ml) et deaConcanavaline A ("Con-A", Sigma, 1 mg/ml) dans une solution saline tamponne au phosphate. PHA et Con-A sont des lectines (ligands) connus comme étant capables de se lier aux lymphocytes périphériques de l'homme. Avant que tout autre expérience/n2oit réalisée, on contrôle les cinétiques de l'absorption descolorants par les cellules. On ajoute 20 ml d'une solution de colorant à deux ml d'une suspension diluée de cellules contenant 1-2 x 10-5 cellules par ml. La fluorescence des cellules est alors mesurée au moyen d'un cytomètre à débit. Le - 25 - pic de la distribution de la fluorescence est localisé et sa position est notée avec des intervalles d'une minute jusqu'à ce qu'il devienne stable. Ceci se produit typiquement endéans les 12 minutes lorsque diO-C6-(3) est utilisé comme indicateur de colorant. Des expériences ultérieures sont alors conçues pour maintenir constant l'intervalle entre l'addition de colorant et Iectine ou ionophore et la mesure de la fluorescence lequel intervalle estde préférence légèrement plus long que celui observé au moment de l'équilibre. Une période de 15 ou 20 minutes est convenable pour diO-C6(3) aux concentrations utilisées ici. Dans une expérience, les distributions de la fluorescence de 5 parties aliquotes de suspension de cellules ont été comparées. Au moment de l'addition du colorant (10 pl de sdution de travail de diO-C6(3)/ml de cellules), on ajoute également respectivement: a. rien (échantillon de contrôle) b. PHA (10 ml de solution de travail, concentration finale 20 pg/ml) c. Con A (10 ml de solution de travail, concentration finale 10 pg/ml) d. Valinomycine (10 ml de solution de travail, concentra- tion finale 6 x 106M) et e. Gramicidine (10 ml de solution de travail, concentra- tion finale 2 x 105M). Des échantillons sont préparés à des intervalles de3 à 6 minutes pour permettre le temps de nettoyage du système de circulation du cytomètre à débit entre les échantillons. Des mesures de la fluorescence de tous les échantillons sont réaliséesen utilisant la même puissance du laser et le même facteur d'amplification. Des nombres approximati- vement égaux de cellu'bs sont mesurés dans chaque échan- tillon et la distribution de la fluorescence de tous les échantillons est donnée sur la même échelle d'un analyseur d'altitude d'impulsions. Les résultats de l'expérience sont illustrés dans les figures 1 à 5. Cesgraphiques sont obtenus lorsque la réponse fluorescente des cellules est mesurée 15 minutes - 26- après l'addition du colorant et des lectines ou iono- phores. On a utilisé le Di0-C6(3) à une concentration finale de 5 x 10-8M. Dans la figure 1, (échantillon de contrôle) on peut voir qu'il y a une distribution de la concentration intracellulaire du colorant de cyanine parmi les cellules de la population, indiquée par la distribution de l'intensité de la réponse fluorescente (axe des x). Donc, le potentiel de membrane observé des éléments individuels de la population de cellules varie avant la stimulation. Cependant, les potentiels de membrane sont distribués autour d'un pic indiqué par la ligne A, représentant une souspopulation importante de cellules ayant une valeur intermédiaire de potentiels de membrane. Dans la figure 2, l'effet de l'addition de l'ionophore dépolarisant gramicidine est montré. Comme on peut le voir, le nombre de cellules présentant une réduction de l'intensité de la fluorescence (induite par l'effet dépolarisant de la gramicidine) est significativement accru et il s'est produit un décalage du pic vers le point indiqué en B. Par opposition, les cellules auxquelles on a ajouté l'ionophore hyperpolarisant valinomycine (fig. 3) présentertuneaugmentation de la fréquence des cellules d'intensité?luorescence supérieure, indiquée en C. Les distributions de l'intensité de la fluorescence des échantillons traités à la gramicidine et à la valinomycine par comparaison à l'échantillon de contrôle, donnent une indication de la variation des signaux fluorescents espérés après une dépolarisation et hyperpolarisation maximum. Cet exemple montre que le colorant cationique de cyanine est collecté dans le volume intracellaire des cellules individuelles comme une fonction du potentiel de membrane. Exemple 2: L'effet de l'addition de Con A auxlymphocytes humains est représenté dans la figure 4. Comme on peut le voir, la suspension de lymphocytesest hétérogène en ce qui concerne sa réponse à cette lectine. Elle contient une - 27 - sous-population de cellules qui par liaison avec Con A est hyperpolarisée et une autre qui est dépolarisée. Les cellules hyperpolarisées présentent une augmentation de l'intensité de la fluorescence,comme il est montrée en D. les cellules dépolarisées présentent une diminuation de l'intensité de la fluorescence montrée par un pic faible mais distinct en D'. La dimension de la population plus hyperpolarisée est significativement/importante que celle de la population dépolarisée. L'addition de PHA aux cellules résulte en une résolution de deux groupes de cellules. La distribution large, bimodale illustrée dans la figure 5 indique qu'une sous- population de cellules semblent se dépolariser par liaison jusq' a avec PHA un point tel qu'une réponse fluorescente des cellules individuelles diminue jusqu'à un point indiqué en E. Une seconde sous-population de cellules présente une dépolarisation, plus sévère indiquée par une réponse fluorescente également plus basse indiquée en E'. Exemple 3_ Une solution stccke de PHA et diO-C6-(3) est ajoutée à une suspension de cellules lymphocytaires préparée selon l'exemple 1. Un cytomètre à débit est alors réglé pour séparer les cellules ayant une intensité de fluorescence correspondant aux intensités indiquées en E et E' dans la figure 3. Après une incubation de 15 minu- tes on mesure la suspension dans le cytomètre à débit et elle est séparée en trois suspensions cellulaires dont deux sont riches en cellules homogènes par rapport à leur réponse physiologique lors de la liaison avec PHA. Exemple 4 cellules cellules Les nopulations de lymphocytes enrichies en/3 et enrichies çellules en/T (de pureté environ 85%) sont obtenues en refaisant les essais pour leur sensibilité à PHA. La figure 6 montre la distribution de la réponse de fluorescence des cellules T dans la suspension avant l'addition de la lectine; la figure 7 montre la distribution de la réponse fluorescente de la même suspension de cellules 20 minutes après l'expo- sition à PHA dans la solution stock de l'exemple 1. 2467402, - 28 - Comme il est montré, l'addition de cette lectine résulte en une dépolarisation uniforme de lymphocytes T. Par opposition comme il est montré-dans la figure 8 (contrôle) et dans la figure 9 (25 minutes après addition de PHA) les cellules B subissent une hyperpolarisation uniforme résultant des interactions PHA-récepteurs. Ces résultats démontrent que le procédé selon l'invention peut être utilisé pour comparer la réponse physiologique de différents types de cellules envers un ligand donné. Il démontre également que différentes types de cellules peuvent être distinguer en fonction de leur réponse physio- logique à un ligand. - 29 - Revendications: 1. Méthode d'essai biologique caractérisée par les étapes de: pron rîôt dans le potentiel de membrane de ces cellules individuelles. 2. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que l'étape (a) consiste à: (1) incuber les cellules avec un colorant qui s'associe aux cellules individuelles, et (2) mesurer une propriété optique du colorant associé aux cellules individuelles, cette propriété optique mesurée étant indicative du potentiel de membrane de cellule des cellules individuelles. 3. Méthode selon la revendication 1, caractériséeen ce que l'étape (a) consiste à: (1) incuber ces cellules avec un colorant ionique perméable à la membrane cellulaire, et (2) mesurer une propriété optique de ces cellules,cette propriété optique étant représentative de la concentration intracellulaire du colorant, et déterminer cette caracté- ristique cellulaire à partir de cette propriété optique. 4. Méthode selon l'une quelconque des revendications 2 ou 3, caractérisée en ce que ces cellules sont modifiées avant de rmesurer cette propriété optique de sorte qu'un changement du potentiel de membrane cellulaire se produit avant de mesurer cette propriété optique. 5. Méthode selon la revendication 4, caractérisée en ce que cette modification est d'ordre pharmacologique, chimique ou biologique. 6. Méthode selon la revendication 4, caractérisée en ce que cette étape de modification consiste à incuber ces cellules dans une solution de ligands sous des conditions o les récepteurs cellulaires et les ligands se lient l'un à l'autre. 2467402; - 30 - 7. Méthode selon la revendication 6, caractérisée en ce que ces ligands sont choisis parmi les neurotransmetteurs, les hormones, les agents pharmacologiques, les agonistes et antagonistes naturels ou synthétiques de ceux-ci, les antigènes, les anticorps, les haptènes, les allergènes, les composants de complément et de.combinaisons de ceux-ci. 8. Méthode selon la revendication 4, caractérisée en ce que cette modification cellulaire est d'ordre physique. 9. Méthode selon l'une quelconque des revendications 4 à 8, caractérisée en ce que cette étape de modification précède l'incubation. 10. Méthode selon l'une quelconque des revendications 4 à 8 caractérisée en ce que cette étape de modification succède à cette incubation. 11. Méthode selon l'une quelconque des revendications 2 à 10, caractérisée en ce que cette caractéristique de référence est une valeur représentative d'une concentration prédéterminée de colorant et cette étape de comparaison détermine la différence de la valeur de cette concentration de colorant mesurée et de cette concentration prédéterminée. 12. Méthode selon l'une quelconque des revendications 2 à 10, caractérisée en ce que cette caractéristique de référence est une valeur représentative d'une concentration prédétermi-7 née de colorant et cette étape de comparaison détermine le sens du changement de la différencede valeur de cette concentration de colorant mesurée et cette concentration prédéterminée. 13. Méthode selon l'une quelconque des revendications 2 à 10, caractérisée en ce que cette caractéristique de référence est une série de valeurs représentatives de cette concen- tration prédéterminée en fonction du temps et cette étape de comparaison détermine les différences des valeurs de cette concentration mesurée et cette concentration prédéterminée en fonction du temps. 14. Méthode selon l'une quelconque des revendications 2 à 13, caractérisée en ce que ce colorant étant un colorant fluorescent et en ce que cette étape de mesure du colorant comprend la mesure de la fluorescence pour une ou plusieurs cellules individuelles de ces cellules. - 31 - 15. Méthode selon l'une quelconque des revendications 2 à 13, caractérisée en ce que ce colorant est un colorant fluorescent et en ce que cette étape de mesure du colo- rant consiste à mesurer le décalage spectral de la fluorescence pour une au plusieurs cellules individuelles de ces cellules. 16. Méthode selon l'une quelconque des revendications 2 à 13, caractérisée en ce que cette étape de mesure du colorant comprend la mesure de l'absorption optique pour une ou plusieurs cellules individuelles de ces cellules. 17. Méthode selon l'une quelconque des revendications 2 à 13, caractérisée en ce que cette étape de mesure du colorant comprend la mesure du décalage spectral de l'absorption optique d'une ou plusieurs de ces cellules après agrégation de ce colorant. 18. Méthode selon l'une quelconque des revendications 14 ou 15, caractérisée en ce que ce colorant est un colorant fluorescent cationique ayant un rendement quantique de fluorescence augmentant dans les solvants ayant une polarité décroissante. 19. Méthode selon l'une quelconque des revendications 14 ou 15, caractérisée en ce que le colorant est un colorant fluorescent cationique de cyanine. 20. Méthode selon la revendication 19, caractérisée en ce que le colorant est un sel de dihexyl 3,3' oxa 2,2' carbocyanine. 21. Méthode selon l'une quelconque des revendications 14 ou 15, caractérisée en ce que la concentratbn du colorant dans la solution intracellulaire est telle qu'on minimise l'extinction de la fluorescence intracellulaire par forma- tion de complexes de fluorescence réduite. 22. Méthode selon l'une quelconque des revendications 1 à 21 pour détecter la présence d'un ligand dans une solu- tion caractérisée en ce que cette méthode comprend l'incu- bation d'uneou plusieurs cellules non excitables connues pour contenir un récepteur lié à la membrane complémentaire au ligand, cette solution étant sous des conditions o le le ligand et récepteur se lient l'un à l'autre, la présence de ce ligand dans cette solution étantindiquée par un change- 2467402. - 32 - ment du potentiel de membrane dans les cellules contenant ce récepteur. 23. Méthode selon l'une quelconque des revendications 1 à 21, pour détecter la présence de cellules ayant des récepteurs complémentaires à un ligand spécifique choisi dans une pluralité de cellules hétérogènes par rapport à la spécificité du ligand, caractérisée en ce qu'elle consisteà incuber cette pluralité de cellules avec une solution contenant ce ligand spécifique sous des conditions o les récepteurs cellulaires complémentaires et le ligand se lient l'un à l'autre, la présence de ces cellules ayant des récepteurs complémentaires à ce ligand étant indiquê:s par un changement du potentiel de membrane de ces cellules. 24. Méthode selon l'une quelconque des revendications 1 à 21 pour détecter la présence dans une population de cellules ayant des sites de récepteurs complémentaires à un ligand choisi mais une réponse physiologique différente de celui-ci, caractérisée en ce qu'elle consiste à incuber cette population de cellules avec une solution contenant ce ligand choisi pour induire des changements de potentiel de membrane dans cette cellule de valeur - distincte o de sens distinct dans ces cellules. 25. Méthode selon l'une quelconque des revendications 23 ou 24 caractérisée en ce que des cellules présentant des changements de potentiel de membrane similaires sont séparées pour produire une population de cellules riches en cellules sensibles à ce ligand choisi. 26. Méthode selon l'une quelconque des revendications 1 à 21 pour la comparaison de la réaction physiologique d'une population de cellules exposée à une pluralité de ligancs chimiquement distincts caractérisée en ce qu'elb consiste à incuber des échantillons de cette population de cellules avec les liganèb respectifr sous des conditions o les récepteurs et les ligands se lient l'un à l'autre. et observer les changements du potentiel de membrane dans les cellules individuelles des échantillons de cellules respectifs. 27. Méthode selon l'une quelconque des revendications 1 à 21 pour la détermination des effets cumulatifs en - 33 - exposant une pluralité de ligands chimiquement distincts à une population de cellules caractérisée en ce qu'elle consiste à incuber le liganc et la population de cellules sous les conditions o les récepteurs cellulaires complé- mentaires et le ligand se lient l'un à l'autre. 28. Méthode selon l'une quelconque des revendications 1 à 21, pour la détermination de la viabilité d'une population de cellules après exposition à une toxine de celules, caractérisée en ce qu'elle consiste à incuber la population de cellules avec cette toxine. 29. Méthode selon l'une quelconque des revendications 1 à 21 pour détermination de l'effet sur une population de cellules de l'exposition à un nutritif pour ces cellule caractérisée en ce qu'elle consiste à incuber cette population de cellules avec cet agent nutritif. 30. Méthode selon l'une quelconque des revendications 2 à 21 caractérisée en ce que les cellules sont incubées avec deux ou plusiurs de ces colorants et la propriété de optique est représentative de ce rapport/concentrations intracellulaires de ces colorants.