FR 2472390 A1 19810703 FR 7911272 A 19790504 -1- 2472390 La présente invention a trait à un procédé de prépa- ration d'un concentré de facteur IX ou plus généralement de complexe prothrombinique, hautement purifié, ainsi qu'à des nouveaux concentrés hautement purifiés de complexe prothrom- binique qui peuvent être obtenus grâce à ce procédé. Différents essais de préparation de complexe prothrom- binique (complexe comprenant les facteurs de coagulation II,VII, IX et X), ont déjà été proposés pour le traitement de divers troubles de la coagulation, dus notamment à des déficiences en facteur IX (hémophilie B), ou encore à une insuffisance hépa- tique. Ainsi, on a déjà cherché à purifier le complexe prothrombinique en partant de plasma frais ou fraichement congelé par l'utilisation de phosphate de calcium ou d'échangeurs d'ions- DEAE. D'autres procédés ont également été utilisés tels que l'adsorption sur sulfate de baryum ou gel d'alumine. On a également déjà proposé de préparer un concentré de facteur IX à partir de la fraction III de COHN provenant du fractionnement de plasma fraîchement congelé par l'éthanol à froid. Ces différents produits se sont avérés instables parce que certains facteurs de la coagulation s'y trouvent à l'état "activé" et il s'est avéré que 11 % environ des patients traités avec ces concentrés ont développé des thromboses. Afin de remédier à ces inconvénients, M.Wickerhauser a déjà prévu d'inactiver le facteur IX activé présent dans la fraction III de COHN par l'addition, au concentré obtenu après élution, d'héparine et de son cofacteur obtenu séparément à partir de la fraction IV de COHN. Il en résulte qu'un Comité international a recommandé formellement que des préparations moins dangereuses soient développées par l'adjonction d'héparine au produit final pour éviter les effets néfastes de l'activité anti-coagulante. Dans d'autres procédés on a également prévu, une fois le produit obtenu, de le stabiliser par addition d'héparine et de son co-facteur, en utilisant par exemple un sérum complet comme source de co-facteur d'héparine. Cependant, les concentrés actuellement proposés pré- sentent une proportion notable de facteur activé malgré -2- 2472390 l'adjonction finale d'héparine. La présente invention se propose de fournir un procédé de préparation de concentré de complexe prothrombinique qui permette d'obtenir directement un concentré non "activé" c'est-à- dire stable et sans risque pour les patients. L'invention se propose également de fournir un procédé simple et peu onéreux pour obtenir un tel concentré. L'invention a pour objet un procédé de préparation de concentré de complexe prothrombinique dans lequel, partant d'une source de complexe prothrombinique, on effectue une adsorption suivie d'une élution, caractérisé par le fait que l'on met en contact une source de complexe prothrombinique et une source d'anti-thrombine III (ou AT III), avec un agent adsorbant capable d'adsorber à la fois le complexe prothrombinique et l'anti- thrombine III, que l'on opère, au moins pendant le stade d'élu- tion, en présence d'héparine, et que l'on effectue l'élution avec un agent d'élution capable d'éluer à la fois le complexe prothrom- binique, l'AT III et l'héparine. L'héparine active l'anti-thrombine III. L'anti-thrombi- ne III activé protege et stabilise le complexe prothrombinique. Dans le cas o la source de complexe prothrombinique contient de l'AT III, en quantité suffisante, les deux sources de départ sont évidemment confondues en une seule. Dans le cas o la source de complexe prothrombinique ne contient pas d'AT III ou en contient une quantité insuffisante pour stabiliser ledit complexe, il convient donc d'ajouter une quantité suffisante d'AT III avant l'élution. De préférence, on ajoute i'AT III à la source de complexe prothrombinique, avant adsorption. L'addition d'héparine est effectuée avant l'élution. Autrement dit, il est possible d'ajouter l'héparine à l'agent éluant, à la suite de quoi on effectue l'élution. Mais, de préférence, l'héparine est ajoutée à la source de complexe prothrombinique ou à la source d'AT III, avant l'adsorption. On peut aussi mettre l'héparine en contact avec l'agent adsorbant, puis mettre celui-ci en contact avec la ou les sources de départ. Lorsqu'il est nécessaire d'ajouter de l'AT III à la source de complexe prothrombinique, cette addition est effectuée, de préférence, en même temps que l'addition d'héparine. -3- 2472390 Ainsi, dans le mode d'éxécution préféré du procédé, le complexe prothrombinique se trouve protégé pendant toute la durée du procédé. Comme source de départ, on utilise de préférence la fraction obtenue à partir du plasma décongelé, après élimination du cryoprécipité, fraction dite "cryo poor plasma" ou CPP. On peut cependant également utiliser un plasma frais congelé ou non. On peut aussi utiliser comme produit de départ, la fraction III de COHN à laquelle il convient d'ajouter de l'anti- thrombine AT III, par exemple sous forme de fraction IV de COHN. On peut également utiliser comme produit de départ la fraction IV, seule, car cette fraction IV est aussi une source de complexe prothrombinique. De préférence, lorsque l'on part d'un plasma on ajoute l'héparine le plus tôt possible, et même, si possible, avant la congélation. La quantité d'héparine à ajouter est fonction de la qualité de la source de complexe prothrombinique. Cette quantité varie généralement de 0,1 à 1 U.I. environ par ml de source. L'adsorption peut être effectuée sur le gel d'alumine qui s'est avéré particulièrement convenable pour l'adsorption puis l'élution du complexe prothrombinique protégé, conformément à l'invention. On peut cependant utiliser d'autres agents adsorbants à condition qu'ils soient susceptibles d'adsorber le concentré et le co-facteur (AT III) activé par l'héparine. On effectue l'adsorption à la température qui est la plus favorable et qui dépend principalement de la nature de l'agent adsorbant. On opère généralement à température inférieure à la température ambiante, par exemple de 0 à 150C. Ainsi, pour le gel d'alumine, la température, est de préférence de 2 à 80C environ. On effectue l'élution avec tout agent capable d'éluer simultanément le complexe prothrombinique et l'AT III. On utilise généralement un tampon de force ionique convenable. Selon un mode d'exécution particulier, la source, par exemple une fraction CPP ayant reçu une adjonction d'héparine est adsorbée sur gel d'alumine à la suite de quoi on effectue l'élu- tion, entre 00C et la température ambiante. La fraction éluée peut être purifiée, à pH 7 environ, grâce à une ou plusieurs additions de polyéthylèneglycol (PEG) (5-10%) qui précipite des protéines indésirables. De préférence on effectue les précipitations au PEG à température inférieure à la température ambiante, par exemple 0-80C et notamment à 2-40C environ. Après avoir éliminé par centrifugation le précipité de protéines contaminantes, on amène le pH du surnageant à une valeur de l'ordre de 4,8 à 5,2, on ajoute du PEG, jusqu'à une 1o concentration de 12 à 20% et isole le précipité qui contient le complexe prothrombinique. Cette précipitation est également effectuée à basse température. Le complexe prothrombinique obtenu est ensuite redissous puis cette solution finale subit éven- tuellement des opérations de filtration, de répartition et de lyophilisation. L'invention a également pour objet un concentré de complexe prothrombinique, caractérisé par le fait qu'il est pratiquement exempt de complexe prothrombinique activé. Un tel concentré peut être obtenu par le procédé précité. Il se dis- tingue des produits obtenus jusqu'à présent qui comportent en général des proportions importantes ou très importantes de complexe à l'état "activé". Le concentré de complexe prothrombinique selon l'inven- tion est utilisable comme médicament notamment pour le traitement de troubles de la coagulation, en particulier de déficiences en facteur IX, mais aussi de la maladie hémorragique du nouveau-né, des dépassements de dose des médicaments coumariniques, et des maladies du foie à l'état avancé. Il est administré selon les voies et posologies usuelles. - Ce complexe possède les propriétés pharmacologiques et l'innocuité habituelles des autres concentrés de complexes prothrombiniques purifiés, mais s'en distingue notamment par l'absence ou la quasi-absence de complications thrombotiques indésirables. L'invention va maintenant être décrite plus en détail à l'aide d'un exemple de mise en oeuvre non limitatif. La source de départ est la fraction dite CPP c'est-à- dire ce qui reste d'un plasma congelé puis décongelé et dont on a alors éliminé le cryoprécipité. A cette fraction on ajoute de l'héparine de façon à avoir dans le mélange environ 0,5 unité par millilitre de plasma CPP. On effectue ensuite à une température basse, comprise entre 0 et 80C et de préférence entre 2 et 40C l'adsorption sur un gel d'alumine à raison de 10 à 20 millilitres de gel d'alumine par litre de ce plasma hépariné. On agite puis l'on centrifuge et garde le gel. On effectue ensuite l'élution du gel à l'aide d'un tampon éluant classique convenable. A titre d'exemple on peut utiliser un tampon contenant 0,25 M de phosphate de potassium, 0,17 M de citrate trisodique, 5 H20 - et 0,003 M d'EDTA. Le pH est ajusté aux alentours de 7,5 à 8,5 et l'on peut effectuer l'élution avec un volume de tampon de l'ordre du trentième du volume du plasma CPP. L'élution s'effectue de façon usuelle en mettant le gel en suspension dans le tampon d'élution et en agitant. On effectue ensuite une centrifugation et l'on garde l'éluat. On ajuste ensuite le pH de l'éluat aux environs de 7, et la température à environ 2 à 40C, à la suite de quoi l'on ajoute de 5 à 10 % en poids/volume de PEG (polyéthylèneglycol). On agite puis l'on centrifuge et l'on élimine le précipité pour garder le surnageant. On abaisse alors le pH du surnageant à une valeur relativement faible, de l'ordre de 4,8 à 5,2, on ajoute du PEG jusqu'à une teneur de 12 à 20 % de PEG, en tenant compte du PEG ajouté initialement, et de l'augmentation de volume, on agite et l'on centrifuge pour conserver le précipité. Ce stade est égale- ment effectué à basse température. Le précipité est ensuite, de préférence à température ambiante, remis en dissolution, dans une solution contenant par exemple du chlorure de sodium ou du citrate trisodique, le volume de dissolution étant d'environ 1/2 ou 1/3 du volume de l'éluat. Après dissolution on ajuste le pH jusqu'à obtenir une solution claire, manifestant une dissolution complète, ce qui se produit aux alentours d'un pH de 7. Il reste ensuite à effectuer une filtration de préfé- rence sur membrane, la filtration finale au moins étant effectuée de façon stérile. -6- 2472390 On répartit ensuite stérilement le produit obtenu en parties aliquotes désirées puis on lyophilise et ceci immédia- tement après congélation. On obtient ainsi un concentré de facteur IX prati- quement dépourvu d'activité indésirable. L'exemple qui vient d'être décrit n'est evidemment nullement limitatif. L'administration du concentré lyophilisé s'effectue par voie parentérale. Le concentré n'est pas toxique aux doses actives habituelles. L'invention a également pour objet un procédé de traitement des troubles de la coagulation, caractérisé par le fait que l'on administre à une personne souffrant desdits trou- bles une quantité efficace d'un concentré de complexe prothrom- binique tel que défini dans la présente demande. REVENDICATIONS - 1. Procédé de préparation de concentré de complexe prothrombinique dans lequel, partant d'une source de complexe prothrombinique, on effectue une adsorption suivie d'une élution, caractérisé par le fait que l'on met en contact une source de complexe prothrombinique et une source d'antithrombine III ( ou AT III), avec un agent adsorbant capable d'adsorber à la fois le complexe prothrombinique et l'anti-thrombine III, que l'on opère, au moins pendant le stade d'élution, en présence d'héparine, et que l'on effectue l'élution avec un agent d'élution capable d'éluer à la fois le complexe prothrombinique, l'AT III et l'héparine. 2. Procédé selon la revendication 1, caractérisé par le fait que l'on ajoute l'héparine à la source de complexe prothrom- binique ou à la source d'AT III avant l'adsorption. 3. Procédé selon la revendication 1, caractérisé par le fait que l'on met en contact l'agent adsorbant avec l'héparine avant de le mettre en contact avec la ou les sources de départ. 4. Procédé selon la revendication 1, caractérisé par le fait qu'avant l'élution, on mélange l'héparine et l'agent éluant. 5. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 4, caractérisé par le fait que la teneur en héparine est comprise entre environ 0,1 et 1 U.I par ml de source. 6. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 5, caractérisé par le fait que l'on utilise comme source de complexe prothrombinique une fraction de plasma obtenue après élimination du cryo-précipité. 7. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 5, caractérisé par le fait que l'on utilise comme source de départ du plasma frais. 8. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 5, caractérisé par le fait que l'on utilise comme source de complexe prothrombinique la fraction III de COHN. 9. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé par le fait que l'on utilise comme source de complexe prothrombinique et/ou comme source d'AT III la fraction IV de COHN. 10. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 8, caractérisé par le fait que l'on utilise comme produit de -8 - départ une source contenant à la fois le complexe prothrombinique et V'AT III. 11. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé par le fait que l'on effectue l'adsorp- tion à température inférieure à la température ambiante. 12. Procédé selon la revendication 11, caractérisé par le fait que l'on effectue l'adsorption à une température de 0 à OC. 13. Procédé selon la revendication 11, caractérisé par le fait que l'on effectue l'adsorption à température comprise entre 2 et 8VC environ. 14. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé par le fait que l'on utilise comme adsorbant un gel d'alumine. 15. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé par le fait que-l'on effectue l'élution à température comprise entre 00C et la température ambiante. 16. Procédé selon la revendication 15, caractérisé par le fait que l'on effectue l'élution à la température ambiante. 17. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé par le fait qu'après élution, on purifie l'éluat par traitement avec le polyéthylèneglycol, à pH 7 environ, à température inférieure à la température ambiante, pour préci- piter les protéines indésirables. 18. Procédé selon la revendication 17, caractérisé par le fait qu'après élimination du précipité de protéines, on amène le pH du surnageant à une valeur de l'ordre de 4,8 à 5,2, puis l'on ajoute du PEG pour précipiter le complexe prothrombinique. 19. Concentré de complexe prothrombinique, caractérisé par le fait qu'il est pratiquement exempt- de complexe prothrom- binique activé. 20. Concentré de complexe prothrombinique selon la revendication 19, caractérisé par le fait qu'il est obtenu selon le procédé de l'une quelconque des revendications 1 à 18. 21. Procédé de traitement des troubles de la coagula- tion, caractérisé par le fait que l'on administre à une personne souffrant desdits troubles une quantité efficace d'un concentré de complexe prothrombinique tel que défini dans l'une quelconque des revendications 19 et 20. \1;