FR 2462167 A1 19810213 FR 8016227 A 19800723 -1 - La présente invention concerne l'interféron de fibroblastes humains sous la forme d'une protéine homogène et un procédé pour sa production en combinant la chromatographie d'affinité et la chromatographie en phase liquide à haute pression (HPLC). Depuis sa découverte initiale par Isaacs et Lindenmann en 1957, l'interféron, que ce soit sous la forme des leucocytes ou des fibroblastes, a résisté aux tentatives des chercheurs dans les institutions de l'ensemble du monde au cours de deux décennies en vue de son isolement sous la forme d'un peptide homogène en quantités suffisantes pour permettre la caractéri- sation et l'identification de ses propriétés biolo- giques et chimiques particulières. Bien que plusieurs auteurs affirment avoir purifié des interférons de souris ou humains à un état homogène, ils n'ont donné aucune des preuves classiques d'homogénéité des ma- tières protéiques et n'ont décrit non plus aucune des propriétés des composés purs qu'ils prétendent avoir obtenus. L'utilisation de chromatographie en phase li- quide à hautes performances pour la purification de protéines est connue d'une manière générale dans la technique. Les références décrivent spécifiquement des colonnes des types à échange d'ions et à exclusion de grosseurs dans la purification de protéines (par exemple Regnier et Noel, J. Chromatog. Sci. 14, 316 [1976J et Chang et autres, Anal. Biochem. 48, 1839 [1976] et l'utilisation de Lichrosorb RP-18 (colonne de microparticules de silice liée à des groupes octa- décyle) dans une chromatographie de partage à phase -2- inverse a été employée efficacement pour purifier des peptides tels que la p-endorphine (Rubinstein et autres, Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 24, 4969 [1977]. Il est connu dans la technique d'utiliser la chromatographie d'affinité comme étape opératoire dans la purification de l'interféron de fibroblastes humains. Ainsi, Davey et autres, J. Biol. Chem. 251, 7620 (1976), décrivent l'utilisation d'une chromatographie d'affini- té Concanavalin A-Sepharose 4B pour produire de l'inter- féron de fibroblastes humains purifié. Jankowski et autres, Biochemistry 15, 5182 (1976), utilisent dans le même but un système Blue DextranSepharose. Enfin, selon le brevet des E.U.A. NO 4 172 071 (de Maeyer et autres), la purification de diverses solutions brutes d'interféron de leucocytes et de fibroblastes est ef- fectuée par chromatographie d'affinité sur une colonne de Blue DextranSepharose donnant des préparations qui ont une activité spécifique comprise entre 1 et 5 x 108 Unités Internationales d'interféron. Aucune étape de purification supplémentaire n'est décrite et les pré- parations d'interféron obtenues sont indiquées comme ayant une haute teneur en produits présentant une acti- vité du type interféron, dépouillés dans une mesure majeure des protéines polluantes. Le procédé perfectionné selon la présente in- vention utilise une combinaison d'étapes de chromato- graphie d'affinité et de chromatographie en phase li- quide à haute pression pour effectuer une purification efficace de l'interféron de fibroblastes humains. Plus particulièrement, le procédé selon la présente invention comprend les étapes suivantes en com- binaison: A. On fait passer une solution aqueuse d'inter- féron de fibroblastes humains dans un état impur à tra- vers une colonne à chromatographie d'affinité de ma- a 246216 7 nière à adsorber l'interféron sur la colonne et en- suite on élue l'interféron de la colonne et on ob- tient l'interféron dans des fractions choisies de l'é- luat dans un état de pureté accrue; et B. On fait passer les fractions choisies d'in- terféron obtenues dans l'étape A à travers une ou plu- sieurs colonnes de matrice de silice liée à des groupes d'hydrocarbure équilibrées par un tampon dans des con- ditions de chromatographie en phase liquide à haute pression, les groupes d'hydrocarbure étant choisis parmi les groupes cyclohexyle, phényle, diphényle, octyle, octadécyle et cyanopropyle, de manière à absor- ber l'interféron sur la colonne, et ensuite on élue l'interféron de cette colonne au moyen d'un gradient d'un mélange acide aqueux tamponné de solvants misci- bles avec l'eau et on obtient l'interféron sous la forme d'un pic distinct unique dans des fractions choi- sies de l'éluat à l'état d'une protéine homogène. Dans l'opération de chromatographie d'affini- té selon la présente invention, on peut utiliser un système Concanavalin A-Sepharose 4B ou Blue Dextran- Sepharose, l'utilisation de ce dernier étant préférée en raison du fait que l'on obtient avec lui des rende- ments sensiblement plus élevés qu'avec le système Concanavalin A-Sepharose 4B et on obtient aussi un pro- duit plus stable. Avec le système Concanavalin A-Sepharose 4B, on peut utiliser le mode opératoire suivant: (a) 20 à 30 volumes de colonne d'interféron de fibroblastes humains (activité spécifique environ i014 unités/mg) dans du milieu essentiel minimal d'Eagle contenant 5 % de sérum foetal de veau sont re- foulés sur une colonne de Concanavalin A-Sepharose 4B à un débit de 30 à 60 cm3/h; (b) on lave avec une solutiortaline tamponnée au -4- phosphate (PBS), pHi 7,2; (c) on lave avec PBS-O,IM a-méthyl mannoside (ac-M,); et (d) on élue avec PBS-0,1M a-IW contenant 50 % d'éthylèneglycol. L'interféron purifié résultant obtenu après l'étape (d) présente une activité spécifique d'environ 107 unités/mg avec une récupération de 10 à 50 % envi- ron. Un mode opératoire approprié pour l'utilisa- tion de Blue Dextran-Sepharose dans l'étape de chro- matographie d'affinité est le suivant: (a) 10 à 40 volumes de colonne du liquide surna- geant d'une culture (1-3 x 104 unités/cm3, 0,2-1 mg protéine/cm3) sont réglés à 1,25 M NaCl par addition d'une solution saturée de NaCl et ensuite refoulés sur la colonne à une vitesse linéaire d'écoulement de 40 cm/h; (b) on-lave la colonne avec 5-15 volumes de co- lonne de IM NaCl/0,02-0,05M phosphate et ensuite avec -15 volumes de colonne de 1M NaCl/O,02-0,05M phosphate contenant 15 % (v/v) d'éthylèneglycol (pH 7,2); et (c) on élue l'interféron avec 1M NaCl/0,02-0,05 M phosphate contenant 50 % (v/v) d'éthylène-glycol (pH 7,2). L'interféron résultant a une activité spéci- fique d'environ 3 x 106 unités/mg et peut être obtenu par cette étape avec une récupération d'environ 80 %. Le Blue Dextran-Sepharose utilisé dans l'é- tape de chromatographie d'affinité ci-dessus peut être préparé commodément par copulation de Blue Dextran (produit de couplage de Cibacron Blue F3GA et de Dextran) avec un Sepharose 4B activé par le bromure de cyanogène au piH 9,5. L'opération de copulation ci-dessus, ainsi que le lavage et le vieillissement de la résine, le mode opératoire pour la chargement de la colonne et pour 1'élution sont importants pour l'obtention du rendement maximal et du plus haut degré de pureté du produit in- terféron de fibroblastes humains. Dans les cas o l'échantillon d'interféron est récolté à partir d'un milieu exempt de sérum, la purification à un état homogène est effectuée par un seul ou deux passages à travers une colonne de Blue Sepharose-4B en éluant avec une solution aqueuse tam- ponnée à 30-50 % (v/v) d'éthylène-glycol (pH 7,2). Pour obtenir une purification supplémentaire de l'interféron produit dans l'étape de chromatogra- phie par affinité, on traite l'interféron par une ou plusieurs étapes de chromatographie en phase liquide à haute pression avec une haute résolution et un rende- ment élevé à une échelle de préparation. L'opération de chromatographie en phase liquide utilise des co- lonnes contenant une matrice de silice poreuse à la- quelle sont liés des groupes cyclohexyle, octyle, octadécyle, phényle, diphényle ou cyanopropyle. Ces colonnes, qui peuvent être utilisées successivement et dans des conditions variables de pH et de gradient de solvant organique, peuvent purifier l'interféron de fibroblastes humains jusqu'à un état homogène comme déterminé par l'obtention d'une seule bande lors d'une électrophorèse sur gel de polyacrylamide au dodécyl- sulfate de sodium (NaDodSO4), d'une activité spécifique constante et d'un seul pic en HPLC avec l'activité et les niveaux de protéine superposables. Les colonnes de microparticules de silice totalement poreuses, de forme irrégulière (grosseur des particules 10 microns environ et une grosseur de pores o de 100 A environ) ayant des groupes cyclohexyle, oc- tyle, octadécyle, phényle ou cyanopropyle liés utili- -6- sées dans la mise en oeuvre de l'invention sont des articles du commerce. Un système commode de chromatographie en phase liquide à haute pression utilisable dans les colonnes indiquées ci-dessus est décrit dans le brevet des E.U.A. n0 4 116 046 (Stanley Stein). Dans la mise en oeuvre du présent procédé, la solution d'interféron de fibroblastes humains purifiée par chromatographie d'affinité dans un tampon aqueux de pH 4-8 est passée à travers une colonne de matrice de silice. Un tampon préféré pour les buts de la pré- sente invention est un tampon pyridine/acide formique/ eau (8:8:84, v/v). Habituellement, on met en oeuvre le procédé sous pression, de préférence une pression comprise entre environ 3,4 et environ 340 atm. L'inter- féron est absorbé sur la colonne et on l'élue ensuite d'une manière sélective en utilisant un gradient d'un tampon aqueux plus des quantités variables d'un solvant miscible avec l'eau. De-s solvants miscibles avec l'eau utilisables à cet effet sont, par exemple, des alca- nols comme le n-propanol, l'isopropanol, le n-butanol, le tert-butanol, l'éthanol, le méthanol, etc. On pré- fère particulièrement pour l'élution d'interféron de fibroblastes humains un mélange de propanol et de bu- tanol. On effectue le fractionnement de l'éluat en utilisant des collecteurs de fractions d'une manière en elle-même connue avec contrôle concomitant de la teneur en protéine de chaque fraction par des contr8- leurs de peptides fonctionnant avec une grande sensi- bilité. Un système utilisable à cet effet est décrit par Bohlen et autres, Anal. Biochem. 67, 438 (1975). On notera aussi le brevet des E.U.A. no 3 876 881. Le choix des types particuliers de résines à utiliser dans les étapes de chromatographie en phase f liquide à haute pression dépend de la source et de la pureté de la matière de départ interféron de fibro- blastes humains qu'on utilise pour cette étape. Ainsi, la matière produite par chromatographie d'affinité sur une colonne de Concanavalin ASepharose est puri- fiée commodément jusqu'à un état homogène en utilisant une chromatographie en phase liquide à haute pression sur une colonne de silice à groupes cyclohexyle liés et ensuite sur une colonne de silice à groupes octyle liés. Par ailleurs, quand on utilise une colonne de Blue Dextran dans l'étape de chromatographie d'affini- té, la purification à un état homogène peut être effec- tuée par un ou plusieurs passages à travers une colonne de silice à groupes octyle liés ou en variante par pas- sage à travers la colonne de silice à groupes octyle liés suivie d'un passage à travers une colonne de silice à groupes cyanopropyle liés et ensuite, si nécessaire, à travers une colonne de silice à groupes diphényle liés. Quand on utilise une colonne de Blue Sepharose-4B et une préparation exempte de sérum, un seul passage à travers une colonne de silice à groupes octyle liés donnera une préparation homogène. En raison de la sensibilité de l'activité de l'interféron de fibroblastes humains en présence de solvants organiques, par exemple en présence des propa- nols, du butanol ou du 2-méthoxy-éthanol à un pH neutre, on effectue la chromatographie à un pHl acide. Comme l'interféron de fibroblastes humains a une nature plus hydrophobe que l'interféron de leucocytes et comme il y a d'autres protéines plus hydrophobes présentes dans les préparations d'interféron de fibroblastes partiel- lement purifia, on a trouvé qu'un mélange de propanol et de butanol constitue le solvant proféra pour l'élu- tion des colonnes à phase inverse, plutôt que le n-propanol. L'utilisation d'un tel solvant sert à limi- -8- ter la concentration dusolvant organique nécessaire pour l'élution complète de toutes les protéines absor- bées et réduit ainsi les produits artificiels se for- mant à une haute charge en raison de la solubilité plus faible des protéines. L'interféron de fibroblastes humains obtenu dans un état homogène selon la présente invention est dérivé d'un pic unique dans la dernière colonne de chromatographie en phase liquide à hautes performances et donne une seule bande étroite lors d'une électro- phorèse sur gel de NaDodSO4 polyacrylamide en présence de 2mercaptoéthanol. L'extraction du gel donne un seul pic d'activité antivirale coïncidant avec la bande de protéine. On peut utiliser à cet effet n'im- porte quelle détermination antivirale classique pour l'activité de l'interféron de fibroblastes humains. La masse moléculaire de l'interféron de fibro- blastes humains homogène telle que déterminée par la méthode au gel de polyamide a été de 20 500 environ. L'activité spécifique de cette matière purifiée était d'environ 4 x 108 unités/mg. La séquence partielle à l'extrémité côté azote obtenue sur un échantillon d'interféron de fibroblastes humains homogène a été Met1-Ser-Tyr-Asn-Leu5- Leu-Gly-Phe-Leu-Gln 0-Arg-Ser-Ser- Asn-Phel5-Gln-...-Gln-Iys19-.... Les interférons ont présenté une activité anti- virale, anti-tumeurs, d'inhibition de croissance et d'immunosuppression. Ces activités ont été obtenues même au niveau clinique en utilisant 1-10 x 106 unités par jour avec des préparations relativement brutes, dont moins de 1 %, était de l'interféron humain. L'inter- féron de fibroblastes humains purifié homogène selon la présente invention peut être utilisé de la même manière que les préparations brutes utilisées antérieurement avec ajustement des doses de manière à donner le niveau équivalent désiré d'unités d'interféron. -I- Les aspects procédé et produit de la présente invention sont encore illustrés par référence aux exem- ples suivants. Tous les titres des interférons sont exprimés en unités de référence par cm3 ou en unités par mg par comparaison avec un étalon de référence pour l'interféron de leucocytes humains (G023-901-527) fourni par The National Institutes of Ilealth des E.U.A. Exemple 1 Chromatographie d'affinité sur Concanavalin A Dans une colonne de polypropylène de 50 cm5 équipée d'un disque de polyéthylène fritté, on intro- duit 50 cm3 de Concanavalin A-Sepharose 4B que l'on met en équilibre avec PBS pH 7,2 contenant 0,1M a-MN. On la charge à un débit de 180 cm3/h (35,5 cm/h) de 1,25 litre d'interféron brut (2 x 107 unités) ayant une activité spécifique de 2 x 104 unités/mg. La colonne chargée est lavée avec 150 cm3 de tampon PBS et 600 cm3 de tampon PBS contenant 0,1M d'a-MM. L'inter- féron est finalement élue avec le tampon ci-dessus contenant 50 % (v/v) d'éthylène-glycol. Le rendement obtenu est de 9 % (1,8 x 106 unités) avec une activité spécifique d'environ I x 107 unités/mg. Une portion plus large comprenant des fractions supplémentaires donne un rendement de 15 % (3 x 106 unités) avec une activité spécifique de 2-4 x 106 unités/mg). HPLC Uttotal de 120 cm3 d'éluat de la colonne de Concanavalin A-Sepharose 4B (2,5 x 106 unités; environ 2-4 x 106 unités/mg) est appliqué directement à une colonne de Chromegabond 10p à groupes cyclohexyle (4,6 x 300 mm) ayant été mise en équilibre avec un système pyridine/acide formique/isopropanol/eau (8:8: :64; v/v; tampon A) à des débits compris entre 0,4 et 0,8 cm3/min, en maintenant la contre-pression maxi- male au-dessous de 306 atm. De système utilisé pour -10- les étapes de HPLC est sensiblement celui décrit par Bohlen et autres (Anal. Biochem. 67, 438 [1975]) À Le gradient suivant depuis le tampon A de mise en équilibre jusqu'à un tampon B final (pyridine/acide formiqueisopropanol/nbutanol/eau, 8:8:25:20:39, v/v) est utilisé à 0,4 cm3/min.: 0-25 % B, 32 min; 25-60 % B, 225 min; 60-100 %/ B, 63 min. On recueille des frac- tions de 2,0 cm3. On prend un ensemble comprenant les fractions 26 à 29 (2 x 106 unités) au centre du pic d'activité et on le dilue avec 4 cm3 de pyridine/acide formique. On applique cette solution au moyen de la pompe à une colonne de Chromegabond 10? à groupes octyle (4,6 x 300 mm). Les conditions d'élution sont les mêmes que pour la colonne à groupes cyclohexyle ci-dessus. L'activité spécifique dans le centre du pic d'activité est d'environ 4 x 1018 unités/mg avec une --- production totale d'interféron de fibroblastes humains purifié de 106 unités. Il-y a lieu de noter que la position d'élution de l'interféron sur les colonnes tant à groupes cyclo- hexyle qu'à groupes octyle est très proche du pic cen- tral principal quand l'interféron purifié sur Concana- valin A est soumis à une HPLC sur l'une ou l'autre co- lonne. Si la première étape de HPLC est conduite sur une colonne à groupes octyle, l'interféron est élué juste avant le pic central principal, tandis qu'il est élue immédiatement après ce pic dans les mêmes condi- tions de chromatographie sur la colonne à groupes cy- clohexyle. Des échantillons d'interféron de fibroblaste humain purifié par HPLC sont passés sur des gels de polyacrylamide à 12,5 ou à 15 % de NaDodSO4 dans un tampon Tris/glycine avec 11g de protéine pour l'essai. Après électrophorèse, on obtient une seule bande par coloration au bleu de Coomassie. Un échantillon de la -11- m9me matière est passé dans un gel en parallèle et on coupe le eel en tranches pour des déterrinations anti- virales. Le maximum de l'activité antivirale colncide avec le centre de la bande colorée. Cn détermine une masse moléculaire d'environ 20 500 en utilisant de l'al- bumine de sérum bovin, de la chymotrypsine, du cyto- chrome C et de la ribonucléase comme étalons. La mobi- lité relative de l'interféron de fibroblastes humains est la m9me qu'il y ait du mercaptoéthanol dans l'é- chantillon ou qu'il n'y en ait pas. Exemple 2 Préparation de la résine Blue Dextran-Sepharose 4B grammes de Sepharose 'B dans un état tassé sont lavés avec I litre d'eau et remis en suspension dans 50 cm3 d'eau distillée. On ajoute 15 grammes de bromure de cyanogène finement divisé à la solution agitée lentement et le pH est immédiatement réglé et maintenu à 11 t 0,2 par addition goutte à goutte de 1ON NaOH. On maintient la température à 20! 50C par de petites additions de glace pilée. Quand la réaction se calme (15-20 min) on ajoute environ I volume d'eau glacée, on transfère la solution dans un entonnoir de Buchner et on la lave de nouveau avec 5 volumes de oO1N HCl. La résine activée est immédiatement mise en suspension dans 50 cm3 de tampon carbonate de sodium 0,4M (pH 9,5) contenant 1,00 g de Blue Dextran dissous et on la fait tourner toute une nuit dans un ballon à fond rond. On lave ensuite la résine avec 10 volumes de IM NaCl, 2 volumes de 1Hg NaCl et 0,05M phosphate de sodium contenant 50 e- d'éthylène-glycol (PH 7, 2), on la laisse toute une nuit dans l'êthylène-glycol à %, on la lave avec I volume d'6thylène-glycol à 80 f:' et 5 volumes de milieu essentiel minimal Gibco n? 11 contenant 5 0 On mélange 1,5 litre d'interféron de fibro- blaste brut (2 x 104 unités/cm3; I mg protéine/cm3; activité spécifique 2 x 104 unités/mg protéine) avec 0,27 volume de solution saturée de NaCl (environ 6,3M). On refoule cette solution à travers 35 cmp de Blue Dextran-Sepharose tassés dans une colonne de poly- propylène de 50 cm3 équipée au fond d'un disque de polyéthylène poreux, à un débit de 100 cm3/(20 cm3/h). La résine chargée est lavée successivement avec 200 cm3 de solution IM de NaCl contenant du tampon phosphate de sodium 0,05M (pH 7,2); 500 cm3 de solution IM de NaCl contenant du phosphate de sodium 0,05M (piH 7,2) et 75 cm3 d'éthylène-glycol et finalement est éluée avec 500 cm3 de solution IM de NaCl contenant du phos- phate de sodium O,C5M (pH 7,2) et 250 cm3 d'éthylène- glycol. Environ 90 % de l'interféron descend dans un pic avec le front de l'éthylène-glycol à 50 %. L'acti- vité spécifique dans le maximum du pic, o se trouve plus de 50 % de l'interféron total élue, est de I x 107 unités/mg. HPLC (A) Un total de 125 cm3 d'interféron accumulé élué de la colonne de Blue Dextran-Sepharose 4B (3 x 107 unités; 1 x 107 unités/mg) est refoulé sur une colonne de 4,6 x 300 mm de Chromegabond 1Cu à groupes octyle qui a été préalablement mise en équilibre avec une solution 1M. de NaCl contenant 50 % d'éthylène-gly- col. Immédiatement après l'application de l'échantillon, -13- on refoule sur la colonne du tampon A (pyridine/acide formiaue/isopropanol/nbutanol/eau, 8:8:20:3,3:60,7, v/v). On passe d'une manière échelonnée au tampon B (pyridine/acide formique/isopropanol/n-butanol/eau, 8:8:25:20:39, v/v), selon le programme suivant; à un débit de 0,45 cm3/min: 0-25 % B, 30 min; 25-55 % B, min; 55-100 % B, 20 min; 100 % B, 60 min. On trouve que l'activité d'interféron coincide essentiellement avec un seul pic de protéine présent dans les fractions 18 à 23 (chaque fraction contient 1,5 cm3 d'éluant). (B) Quand on applique à la même colonne envi- ron un quart de la charge de l'essai (A) ci-dessus et on utilise les conditions d'élution utilisées pour la colonne à groupes cyclohexyle dans l'exemple 1, on trouve que l'activité d'interféron coincide avec un pic de protéine présent dans les fractions 24 à 26. (C) En utilisant la m9me charge, le même pro- gramme échelonné et la même vitesse linéaire d'écoule- ment que dans (A) et en utilisant les tampons A et B utilisés dans (B) avec une colonne de 9,6 x 500 mm de Chromagabond à groupes octyle, ce qui donne donc environ 1/9ème de la charge par volume de colonne, on obtient une meilleure qualité de la séparation. (D) La matière présentant la plus hauteàctivi- té spécifique (4 x 1018 unités/mg) obtenue dans l'es- sai (A) ci-dessus est rechromatographiée sur une co- lonne à groupes cyanopropyle en utilisant un système pyridine/acide formique/eau (8:8:84, v/v) et un gra- dient de 0-40 % (v/v) de n-propanol en I heure, à 0,3 cm3/min, pour donner un pic principal symétrique. Electrophorèse sur el _de polyacrylamide à NaDodSO, L'électrophorèse effectuée comme décrit dans l'exemple I avec des échantillons des produits des opé- rations (A), (B) et (C) ci-dessus présente comme bande majeure la bande de 20 500 LJ, qui quand les gels sont -14- coupés en tranches et soumis à la détermination, coin- cide avec le centre du pic d'activité. La bande la plus forte ensuite (10 500 MW/20-50 % de la matière -totale comme estimé d'après l'intensité de coloration) varie d'un échantillon à un autre et n'a pas d'activité antivirale. Si les échantillons ne sont pas traités au mercaptoéthanol, on peut observer une bande à 40 000 MX, qui a une activité marginale. L'analyse des amino-acides des bandes 20 000 MX et 40 000 MV donne des résultats qui ne sont pas distinguables, tandis que l'analyse de la bande 10 000 MWi est très nettement différente. L'électrophorèse d'un échantillon obtenu en (D) ci-dessus donne une seule bande qui a une masse moléculaire d'environ 20 500 et une activité spécifique de 4 x 108 unités/mg. Une analyse des amino-acides de ce peptide homogène effectuée sur un h; 24 heures dans une solution 6N de HC1l tats suivants par rapport à la leucine ment comme 25,0: Asx 15,4 + 0, 2 Ala 11,8 +t 0,4 Thr* 7,8 + 0,3 Cys n.d. Ser* 7,7 + 0,2 Val 6,9 + 0,1 Glx - 24,1 + 0,4 Met 2,8 + 0,4 Pro 2,8 + 0,4 Ile 8,7 + 0,1 Gly 4,9 + 0,3 Leu 25,0 * valeur non corrigée n.d. = pas déterminé Exemple 3 ChromatooraDhie d'affinité sur Blue De: ydrolysat de donne les résul- prise arbitraire- *Tyr Phe His Lys Arg Trp 9,6 t 0,2 7,3 + 0,1 4,5 + 0,1 11,6 + 0,4 8,8 +t 0,4 n.d. xtran-SeDharose DCo (a) Cinq litres du liquide surnageant d'une culture contenant 19 400 unités/cm3 d'interféron de fibroblastes sont filtrés à travers un filtre à 0,3 et ensuite appliqués à une colonne contenant un volume de lit de 275 cm3 de Blue Dextran-Sepharose. On règle le liquide surnageant à 1,25M NaCl par l'addition de -15- 1550 cm3 d'une solution saturée de NaCl (6,3M) et on le refoule sur la colonne à un débit de 560 cm3/h. Environ 4-6 % de l'interféron passe à travers la co- lonne dans la fraction passant directement qui n'est pas retenue par la colonne. (b) On lave ensuite la colonne avec 1300 cm3 d'une solution aqueuse contenant 15 % (v/v) d'éthylène- glycol, IM NaCl et 0,02M phosphate de sodium (pH 7,2) à un débit de 420 cm3/h. Environ 1 % de l'interféron appliqué à la colonne est élué. (c) On élue ensuite l'interféron avec une so- lution aqueuse contenant 50 % (v/v) d'éthylène-glycol, 1M NaCl et 0,02M phosphate de sodium (pH 7,2) à un dé- bit de 420 cm3/h. Peu d'interféron est élué avec les 200 cm5 initiaux de l'éluant. La majeure partie de l'interféron appliqué à la colonne est éluée avec les 500 cm3 suivants d'éluant, comme montré dans le ta- bleau suivant: Fraction Volume Protéine Titre de Activité n de la ( g/c3 l'interféron spécifique fraction m(units/mg) (cm3) (unités/cm3) (unités/mg) I 200 n.d. 122 - 2 50 43 5,8 x 105 9,02 x 106 3 50 82 11,64x 105 1,42 x 107 4 50 65 7,72x 105 1,25 x 107 50 62 1,94x 105 3,13 x 106 6 50 49 9,7 x 10 1,97x 106 7 50 41 5,64x 104 8,87 x 105 Le rendement total en interféron recueilli est calculé comme étant de 114 % (en raison de la va- riabilité de la détermination). HPLC Les fractions 2 à 6 de la colonne d'affinité -16- de Blue DextranSepharose (250 cm3; 13 x 107 unités; activité spécifique 8,12 x 106 unités/mg) sont refou- lées sur une colonne de 9,5 x 500 mm de matrice de silice à groupes octyle liés à un débit de 4 cm3/min. Du tampon A (pyridine/acide formique/2-propanol/ n-butanol/eau, 8/8/20/2, 5/61,5, v/v) est refoule à travers la colonne à un débit de 2 cm3/min pendant 12 minutes. Ensuite, on applique un gradient d'élution comme suit pour arriver au tampon B (pyridine/acide formique/2-proparol/nbutanol/eau, 8/8/25/25/34, v/v) à un débit de 1,25 cmJ/min: 0-20 % B, 18 minutes; -29 % B, 57 minutes; 29 % B isocratique pendant 27 minutes; 29-30 % B, 3 minutes; 30-100 % B, 36 mi- nutes; 100 e% B, 54 minutes. L'activité d'interféron sort dans la région isocratique du gradient et est éluée en même temps qu'un pic détecté avec un système de contrôle à la fluorescamine. On recueille 45 x 106 unités d'interfé- ron (rendement 55 %) et une activité spécifique de 2 x 108 unités/mg est obtenue pour l'ensemble (50 cm5). Après deux mois de stockage à -20 C dans des flacons de polypropylène bouchés, l'activité tombe à 10 % de la valeur après l'étape HPLC. Il n'y a pas du tout de protéine perdue. Le total des 50 cm3 provenant de la colonne de HPLC précédente (activité spécifique environ 0,2 x 108 unités/mg) est mélangé avec 1 cm3 de thiodiglycol et cm3 de n-propanol. On trouve un total de 4.,26 x 106 unités dans la détermination pour ce mélange. On y ajoute 100 cmp de 0,1 % Triton X-100/0,3 % thiodiglycol. On trouve dans ce mélange 5,1 x 106 unités au total et on le refoule sur une colonne de 4,6 x L50 mm de 5/ o A Spherisorb CN oui a été préalablement mise en équi- libre avec un mélange de pyridine/acide formique/eau (8:8:84, v/v, tampon A), à un débit de 1,5 cm3/h pendant -17- minutes. On applique le gradient suivant pour passer au tampon B, pyridine/acide formique/n-propanol/eau (8:8:50:34, v/v), à un débit de 0,5 cm3/min: 0-25 % B, minutes; 25-50 % B, 210 minutes. L'activité d'inter- féron émerge en même temps que le seul pic observé. On recueille 4,2 x 106 unités (82,%) en trois fractions de I cm3. L'ensemble ci-dessus représentant 69 % de la protéine totale appliquée sur la première colonne à groupes cyano est mélangé avec 2 cm3 de Triton X-100 à 0,1 % et le mélange est refoulé sur la même colonne à groupes cyano qu'utilisée ci-dessus. On applique le même gradient que ci-dessus avec une durée totale ré- duite de moitié. Toute l'activité (11,75 x 106 unités; récupération 280 %) est éluée en même temps que le seul pic. Le volume total de liquide contenant l'acti- vité d'interféron provenant de la deuxième colonne à groupes cyano (4 cm3) est refoulé sur une colonne de 4,6 x 250 mm de matrice de silice à groupes diphényle liés, soumise au préalable à un gradient linéaire de 2 heures du tampon A au tampon B (même tampons que pour la colonne à groupes cyano) et mise en équilibre avec le tampon A, à un débit de 1,5 cm3/min. On effectue l'élution à gradient suivante à 0,5 cm3 min: 0,25 % B, 22 minutes; 25-50 %, 98 minutes. Le deuxième pic, qui est élué tandis que l'instrument du gradient indique 33 % de tampon B, coincide avec la courbe d'activité d'interféron. Un total de 2,6 x 106 unités (22 %) et de 40Sng de protéine est élué avec ce pic. La colonne de matrice de silice à groupes di- phényle liés est préparée comme suit: Un support de silice (10/u, pores de 10 nm) est trempé dans 6N HCl (10:1, volume/poids) pendant -18- 24 heures tandis qu'on secoue de temps à autre. On lave le support sur un filtre en verre fritté d'abord avec de l'eau jusqu'à ce que l'eau de lavage soit neutre et ensuite on le lave à l'acétone et au méthanol pour éliminer l'eau. Après séchage sous vide toute une nuit, le support (10 g) est chauffé au reflux dans du toluène anhydre (100 cmJ) contenant 10 cm3 de dichlorodiphényl- silane pendant 6 heures. Le support lié est séparé de la solution au toluène au moyen d'un filtre en verre fritté et lavé avec 200 cm3 de toluène. Ensuite, le support lié est traité dans un extracteur Soxhlet suc- cessivement avec 250 cm3 de toluène, d'acétone et de méthanol pendant 8 heures chaque fois et est traité en- suite au triméthylchlorosilane par les m8mes modes opératoires que décrit ci-dessus. Le support lié est tassé dans des colonnes en acier inoxydable de 4,6 x 250 mm à 340 atm en utilisant un mélange de chloroforme (10,7 cm5) et de n-butanol (2,3 cmp) pour mettre en suspension 3 g de support. Les colonnes sont ensuite lavées à l'éthanol (75 cm5). Un échantillon de la fraction centrale du pic d'interféron résultant est analysé en ce qui concerne la composition des amino-acides dans diverses condi- tions d'hydrolyse. Les résultats sont résumés ci-après: Toutes les hydrolyses dans 5,71-T H01 dans des tubes en verre sous vide lavés à l'acide. On a soustrait les résultats obtenus dans les essais à blanc avec le tampon et HCl. -19- Asx Thr* Ser* Glx Pro Gly Ala Cys Val Met Ile Leu Tyr Phe His Lys Arg Trp ,4 7,8 7,7 24,1 2,8 4,9 11,8 n.d. 6,9 2,8 8,7 ,0* * 9,6 7,5 4,5 11,6 8,8 n.d. 24h. TGA 17,6 8,6 8,5 21,1 n.d. 6,9 ,7 ,96 7,84 4,5 8,6 ** , 3 9,5 7,5 12,3 11,25 n.d. 24 h. TGA 17,95 8,4 9,1 21,4 n.d. 6,6 ,7 ,4 8,2 4,5 8,9 ** 9,0 9,8 6,9 11,8 ,6 nu..d, 48 h. TGA ,2 ' 7,5 9,9 n.d. ,56 7,4 9,9 n.d. 6,9 ,7 7,8 ** 8,1 9,0 6,1 11,25 8,8 2,93 24 h. TGA TGA acide thioglycolique * valeurs non corrigées ** valeur arbitraire n.d. pas déterminé L'analyse des hexosamines après hydrolyse de l'interféron avec 5,7E HC1l contenant C,02 % d'acide thioglycolique à 1100C pendant 6, 14 et 24 heures, en utilisant l'éluant provenant de la fraction du pic central de la colonne à groupes diphényle indique que l'interféron de fibroblastes contient environ 5 rési- dus de glucosamine. On ne trouve pas de galactosamine ni de mannosamine. La détermination des groupes terminaux est effectuée avec un échantillon de 90 pmoles de la frac- tion centrale du pic d'interféron de fibroblaste de 246216 7 la colonne a groupes diphényle et entraine la détec- tion de -et comme groupe terminal sur l'azote. Des échantillons de 150 pmoles chacun d'inter- féron de fibroblastes et d'interféron de leucocytes sont soumis à une digestion tryptique. On chromatogra- phie les produits de digestion et on ne trouve aucun fragment de peptide commun aux deux interférons. La détermination de séquence d'une quantité de 1,25 nmole d'interféron de fibroblastes confirme iet comme termi- naison du côté azote et confirme aussi la séquence 3-10 rapportée par Hunkapillar et Hood, Biochemistry 17, 2124 (1978), qui est Tyr3-Asn-Leu-Leu-Gly-Phe-Leu- Gln10. Les résultats d'une autre analyse de séquence de 5,9 nmoles d'interféron de fibroblastes indiquent la séquence suivante à terminaison IH_: HI2N-Met1 -Ser-Tyr-Asn-Leu5-Leu-Gly-Phe-Leu-Gln1 0-Arg- Ser-Ser-Asn-Phe15-Gln-...-Gln-Lys9-... Exemple 4 On-prépare de l'interféron brut à partir de _0 fibroblastes humains (ligne de cellules GM 2504A). La matière brute est mise à la concentration 1M dans du chlorure de sodium par addition d'une solution saturée de chlorure de sodium. On fait passer cette matière à travers une colonne de Blue Sepharose-4B (volume de lit 20-25 cm3 diamètre 2,5 cm, 2,5 cm3/min). La matière brute est maintenue sur de la glace durant le chargement. Après le chargement, on lave la colonne avec 25C cm9 de la solution suivante (2,5 cm3/min): 0c éthylène-glycol, IM NaC1, 50 m' Na2HP04 (pH 7,2). Finalement, l'interféron est élué à un débit de L,5 cm3/min avec 250 cm3 de la solution suivante: % >thylène-glycol, IM NaCl, 50 mle Na2HPO4 (pH 7, 2) Résultats de détermination typiques: Y d'activité dans le liquide sortant directement 10 % d'activité dans le liquide du lavage à 30 % 24M2167 -21- % d'activité dans le liquide du lavage à 50 % Les fractions du pic de la première colonne de Blue Sepharose sont combinées et diluées à 10 % d'éthylène-glycol avec la solution suivante: 2M NaCl, 50 mN Na2IPO4 (pH 7, 2). On charge cette matière sur une colonne de Blue Sepharose (volume de lit 20-25 cm3, 2,5 cm de diamètre, débit 2,5 cm3/min). On la lave avec 250 cm3 d'une solution contenant 2M NaCl, 50 mM Na2HP04 (pH 7,2) et 30 % d'éthylène-glycol et on l'élue avec une solution contenant 2M NaCl, 50 mM Na2HP04 (pH 7,2) et 50 % d'éthylène-glycol. Résultats de déterminations typiques: % d'activité dans le liquide sortant directement 30 % d'activité dans le liquide du lavage à 30 % % d'activité dans le liquide du lavage à 50%. HPLC Echantillon: Le premier échantillon utilisé est la fraction à 50 % d'éthylène-glycol provenant de la colonne de Blue Sepharose. Les autres échantillons sont des échantillons ayant passé deux fois à travers la colonne de Blue Sepharose, auquel cas on a pu uti- liser l'interféron dans le liquide à 30 % ou dans ce- lui à 50 % d'éthylène-glycol. On utilise une colonne de 25 x 0,46 cm de Lichrosorb RP-8. On lave la colonne d'abord avec de l'eau et ensuite on refoule sur elle l'éluat de la colonne de Blue Sepharose. On utilise avant la pompe une chambre de mélange de 5 cm3. On établit dans la colonne de HPLC un débit de 22 cm3/h avec le gradient échelonné suivant de n-propanol, à un pH constant de 4,2, maintenu avec une solution 1M acide formique/0,8M pyridine. -22- npropanol (%) o temps (min) 2. 30 40 3. 32 40 On lave ensuite la colonne avec 60 % de n-propanol et on la remet en équilibre avec 0 % pour l'essai suivant. L'interféron est élué à la fin de l'étape à 32 % (entre 80 et 90 minutes). Cette matière est homo- gène, comme déterminé par électrophorèse sur gel d'acrylamide à NaDodSO4, en colorant avec Coomassie Blue ou en marquant préalablement l'échantillon avec Fluram. On effectue des analyses des amino-acides (hydrolyse pendant 24 heures, 0,2 % TGA, 5,7N HC1) sur neuf échantillons séparés comprenant quatre prépa- rations séparées. La composition moyenne des amino- acides est indiquée ci-aprèsavec les valeurs par rap- port à la leucine prise arbitrairement comme 22,0. Des résultats sont les suivants: Résidus | Résidus Asx 15,1 t 0,7 Thr* 7,0 - 0,5 Ser* 7,5 + 0,5 Gly 22,2 t 0,5 Pro pas déterminé Cys 3,0 t 0,3 Gly 6,9 t 0,7 Ala 7,4 + 1, 0 Val 5,7 + 0,5 * valeur non corrigée Met Ile Leu Tyr Phe Ris Lys Arg Trp 4,5 t 0,7 9,4 + 0,1 22,0 8,8 t 0,2 8,0 t 0,3 4,5 + 0,1 11,0 + 0,6 11,9 t 0,7 pas déterminé D'après les divers échantillons préparés par des procédés différents et analysés à différents mo- ments comme décrit ci-dessus dans le présent exemple 1. et dans les exemples précédents, une analyse représen- tative des amino-acides ( 15 d,') pour l'interféron de fibroblastes homogène en utilisant un hydrolysat de 24 heures dans 6NT HCl avec 0,2 % d'acide thioglyco- ligue est la suivante: Asx 15,1 Gly 6,9 Tyr 8,8 Thr* 7,0 Ala 7,4 Phe 8,0 Ser* 7,5 Val 5,7 His 4,5 Glx 22,2 Met 4,5 Lys 11,0 Pro 3,0 Ile 9,4 Arg 11, 9 Cys 3,0 Leu** 22,0 Trp 3,0 * valeur non corrigée ** valeur arbitraire Exemple 5 Forme de dosage parentérale avec l'interféron de fibro- blastes humains On dissout un total de 1,5 mg d'interféron de fibroblastes humains homogène ayant une activité spéci- fique de 4 x 108 unités/mg dans 25 cm3 d'albumine de sérum humain normale à 5 %. La solution est passée à travers un filtre bactériologique et ensuite subdivisée aseptiquement dans 100 flacons. Chaque flacon contient 6 x 10O6 unités de l'interf6ron pur utilisable pour ad- ministration parentérale. Les flacons sont de préfé- rence conservés & froid (-20 C) avant utilisation. -74- - R-EVEIvICATIONS - I - Interféron de fibroblastes humains sous la forme d'une protéine homogène caractérisé par (a) une activité spécifique d'environ 4 x 108 unités/mg; (b) une masse moléculaire apparente d'environ 500 par électrophorèse sur gel de polyacry-lamide au dodécylsulfate de sodium; (c) la composition suivante en amino-acides (t 15 %) basée sur une hydrolyse 6,ON HC1 contenant 0,2 % d'acide Asx 15,1 Gly 6,9 Thr* 7,0 Ala 7,4 Ser* 7, 5 Val 5,7 Glx 22,2 Met 4,5 Pro 3,0 Ile 9,4 Cys 5,0 Leu** 22,0 * valeur non corrigée ** valeur arbitraire de 24 heures dans thioglycolique: Tyr 8, 8 Phe 8,0 His 4,5 Lys 11,0 Arg 11,9 Trp 3,0 (d) la séquence partielle suivante d'amino- acides H2N-4et1-Ser-Tyr-Asn-Leu5-Leu-Gly-Phe-Leu-Gln10- Arg-Ser-Ser-Asn-Phe1 5-Gln-...-Gln-Lys19-...et (e) un maximum de 3 résidus de glucosamine et pas de rJsidus de galactosamine ou mannosamine par mo- lécule. 2 - Interféron de fibroblastes humains tel que défini dans la revendication I pour le traitement de maladies virales et néoplastiques. 3 - Un procédé pour la production d'interféron 3C de fibroblastes humains sous la forage d'une protéine homogène, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes en combinaison: A. on fait passer une solution aqueuse d'inter- f;,ron de fibroblastes humains dans un état impur à tra- vers une colonne de chromatograpl!ie d'affinit- de ma- - - 5 - nière à absorber l'interféron sur la colonne et ensuite on élue l'interféron de la colonne et on obtient cet interféron dans des fractions choisies de l'éluat dans un état de plus grande pureté; et B. On fait passer les fractions choisies de l'interféron obtenues dans l'étape A à travers une ou plusieurs colonnes de matrice de silice liée à des groupes d'hydrocarbure mises en équilibre au moyen d'un tampon, dans des conditions de chromatographie en phase liquide à haute pression, les groupes d'hydrocarbure étant choisis parmi des groupes cyclohexyle, phényle, diphényle, octyle, octadécyle et cyanopropyle, de ma- nière à absorber l'interféron sur la colonne et ensuite on élue cet interféron de la colonne avec un gradient d'un mélange acide aqueux tamponné de solvants misci- bles avec l'eau et on obtient l'interféron sous la forme d'un pic distinct unique dans des fractions choisies de l'éluat dans l'état d'une protéine homogène. 4 - Un procédé pour la production d'interféron de fibroblastes humains sous la forme d'une protéine homogène, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes en combinaison: A. on fait passer une solution aqueuse d'inter- féron de fibroblastes humains dans un état impur à tra- vers une colonne de chromatographie d'affinité de ma- nière à absorber l'interféron sur la colonne et ensuite on élue l'interféron de la colonne et on obtient l'in- terféron dans des portions choisies de l'éluat dans un état de plus grande pureté; et B. on fait passer les fractions choisies d'in- terféron obtenues dans l'étape A à travers une ou plu- sieurs colonnes de matrice de silice liée à des groupes d'hydrocarbure mises en équilibre au moyen d'un tampon, dans des conditions de chromatographie en phase liquide à haute pression, les groupes d'hydrocarbure étant -26- choisis parmi les groupes cyclohexyle, phényle, octyle, octadécye et cyanopropyle, de manière à absorber l'interféron sur la colonne et ensuite on élue l'inter- féron de la colonne aveqdn gradient d'un mélange acide aqueux tamponné de solvants miscibles avec l'eau et on obtient l'interféron sous la forme d'un pic-distinct unique dans des fractions choisies de '1éluat dans l'é- tat d'unerotéine homogène. - Un procédé selon la revendication 4, ca- ractérisé en ce que la colonne de chromatographie d'af- finité est une colonne de Concanavalin A-3epharose; la chromatographie en phase liquide à haute pression est conduite sur une colonne de matrice de silice liée à des groupes cyclohexyle en utilisant comme éluant une solution pyridine/acide formique/isopropanol/ n-butanol/eau avec des concentrations croissantes de n-butanol et en faisant passer ensuite les fractions actives combinées à travers une colonne de matrice de silice liéé à des groupes octyle en utilisant les mêmes conditions d'élution que pour la colonne à groupes cyclohexyle. 6 - Un procédé selon la revendication 5, ca- ractérisé en ce que la composition initiale de l'éluant dans le système de chromatographie en phase liquide à haute pression est la suivante: pyridine/acide for- mique/isopropanol/eau (8:8:20:64, v/v) et la composi- tion finale de l'éluant est la suivante: pyridine/aci- de formnique/isopropanol/n-butanol/eau (8:8:25:20:39, v/v). 7 - Un procédé selon la revendication 4, ca- ractérisé en ce que la colonne de chromatographie d'af- finité est une colonne de Blue Dextran-Sepharose; la chromatographie en phase liquide à haute pression est effectuée sur une colonne de matrice de silice liée à des groupes octyle en utilisant comme éluant une solu- tion pyridine/acide forr.ique/isopropanol/n-butanol/eau avec des concentrations croissantes de n-butamol. 8 - Un procédé selon la revendication 7, ca- ractérisé en ce que la composition initiale de l'éluant dans le système de chromatographie en phase liquide à haute pression est la suivante: pyridine/acide for- mique/isopropanol/n-butanol/eau (8:8:20:5,3:60,7, v/v) et la composition finale de l'éluant est la suivante: pyridine/acide formique/isopropanol/nbutanol/eau (8:8:25:20:39, v/v). 9 - Un procédé selon la revendication 7, ca- ractérisé en ce que les fractions actives combinées éluées de la colonne de matrice de silice liée à des groupes octyle sont rechromatographiées sur une colonne de matrice de silice lisse à des groupes cyanopropyle en utilisant comme éluant une solution pyridine/acide for- mique/n-propanol/eau avec des concentrations croissan- tes de n-propanol. - Un procédé selon la revendication 9, ca- ractérisé en ce que la composition initiale du tampon est la suivante: pyridine/acide formique/eau (8:8:84, v/v) et la composition finale du tampon est la suivante: pyridine/acide formique/n-propanol/eau (8:8:40:44, v/v). Il - Un procédé selon la revendication 7, ca- _5 racté,risé en ce que la composition initiale du tampon dans l'étape de chromatographie en phase liquide à haute pression est la suivante: pyridine/acide for- mique/isopropanol/eau (8:8:20:64, v/v) et la composi- tion finale du tampon est la suivante: pyridine/acide formique/isopropanol/n-butanol/eau (8:8:25:20:39, v/v). 12 - Un procédé selon la revendication 9, ca- ractérisé en ce que les fractions actives combinées provenant de la colonne de matrice de silice liée à des groupes cyanopropyle sont passées une deuxième fois à travers cette colonne et les fractions actives combi- -28- nées résultant de ce deuxième passage sont passées à travers une colonne de matrice de silice liée à des groupes diphényle. 13 - Un procédé selon la revendication 4, caractérisé en ce que l'interféron de fibroblastes humains est récolté à partir d'une préparation exempte de sérum, la colonne de chromatographie d'affinité est une colonne de Blue Sepharose 4B et on effectue la. chromatographie en phase liquide-à haute pression sur une matrice de silice liée à des groupes octyle en utilisant comme éluant un gradient échelonné de - n-propanol dans un mélange constant de pyridine/acide formique/eau. 14 Un procédé selon la revendication 13, caractérisé en ce que le gradient échelonné de n-propanol est constitué de 0 % pendant dix minutes, 30 % pendant minutes et 32 % pendant 40 minutes et l'interféron est élué entre 80 et 90 minutes. - Une préparation utilisable pour administration parentérale pour traitement de maladies virales et néo- plastiques, caractérisée en ce qu'elle comprend une quantité mineure efficace d'interféron de fibroblastes humains sous la forme d'une protéine homogène et une quantité majeure d'un véhicule pharmaceutique classique pour administration parentérale. 16 - L'interféron de fibroblastes humains sous la forme d'une protéine homogène préparé par un procédé selon l'une des revendications 3 à 14.