FR 2466251 A1 19810410 FR 7924665 A 19791003 2466251 - La présente invention concerne le domaine des vac- cins animaux. Elle concerne plus particulièrement un vaccin permettant la prophylaxie anticolibacillaire des diarrhées des animaux nouveau.-nés, tels que les veaux. L'invention a également pour objet un procédé d'obtention d'un tel vaccin, des préparations vaccinales formulées en vue de l'administration ainsi que les applications desdites préparations. De nombreux travaux ont été effectués depuis 1960 et surtout depuis 1970, pour étudier le rôle des E. coli entéropathogènes sur les diarrhées des animaux nouveau -nés, et on a déjà proposé ou commercialisé, des vaccins correspon- dant aux divers types d'antigènes isolés dans ces bactéries. Les références bibliographiques illustrant l'art antérieur sont nombreuses. L'homme de l'art pourra par exemple se re- porter à l'article de S.D. ACRES et al "Immunization of Calves Against Enterotoxigenic Colibacillosis by Vaccinating Dams with Purified K99 Antigen and Whole Cell Bacterins dans "Infection and Immunity" July 1979 page 121-126 Vol. 25 n 1. Cet article cite un nombre important de publi- cations antérieures pertinentes, qui sont également introdui- tes à titre de référence dans la présente description. A ti- tre complémentaire, et sans que la liste ci-après présente un caractère exhaustif, on peut encore citer les références sui- vantes: J.M. RUTTER (1975) Escherichia coli infections in piglets: Pathoge- nesis, virulence and vaccination The Vet. Record. 22 February 1975 M.R. WILSON (1974) Immunity to E.coli in pigs; efficiency of a live formalized vaccine under field conditions Brit.Vet.J 130 page 599 J.L. NAGY, P.D. WALKER, B.S. BHOGAL, T. MacKENZIE Evaluation of E.coli vaccines against experimen- tal enteric colibacillosis Wellcome - Europe informations - n 6 automne 1978 Un vaccin qui empêche l'adhésion des bactéries I.0RSKOV, F.0RSKOV, H.W. SMITH, W.J. SOJKA (1975) The establishment of K99, a thermolabile transmissible E.coli K antigen, previously called "Kco" possessed by calf and lambs enteropathogenic strains. Acta.part. microbiol.scand. Sect. B 83 31-36 (1975) P A M Guinee - J. VELDKAMP - W.H. JANSEN (1977) Improved Minca medium for the detection of K99 anti- gen in calf enterotoxigenic strains of E.coli Inf. & Immunity 15,2 676678 J.A. MORRIS, A.E. STEVENS, W.J. SOJKA (1977) Préliminary characterization of cell free K99 antigen isolaied from E. coli B 41 J. of-Gen. Microbiol. 99 353-357 L.L. MYERS (1976) Vaccination of cows with an E.coli bacterin for the prevention of naturally occuring diarrheal disease in their calves Am. J. of Vet. Res 37, 7 831,834 W.J. SOJKA, C. WRAY, J.A. MORRIS (1978) Passive protection of lambs against experimental ente- ric colibacillosis by colostral transfer of antibodies from K99 vaccinated ewes J. Med. Microbiol. il 493,499 J.W. COSTERTON, G.G. GEESEY, K.J. CHENG. (1978) Comment collent les bactéries Pour la Science n 5 En particulier, le dernier article mentionné, extrait de la revue "Pour la Science" n 5 de 1978, illustre les pro- priétés d'attachement des bactéries aux épithéliums. On présentera maintenant un bref résumé des connaissan- ces acquises dans l'art antérieur dans le domaine des vaccina- tions anticolibacillaires. La bactérie porte des flagelles pré- sentant l'antigène H. Elle peut présenter également des antigè- nes protéiques particuliers du type, par exemple, K88 ou K99. L'enveloppe capsulaire porte les antigènes K. Quant à la paroi bactérienne, elle porte les antigènes O ou somatiques. Les tra- vaux de 0RSKOV,au Centre International des entérobactéries du Danemark, ont permis de mettre en évidence un antigène parti- culier K99 dont la synthèse est codée-par un 24662P51 plasmide. Cet antigène confère à E.coli des propriétés d'at- tachement à l'épithélium intestinal du porcelet. A la suite de ces travaux, on a proposé et mis sur le marché, des vac- cins applicables aux truies et contenant l'antigène K88. Ces vaccins stimulent la protection conférée par les anticorps colostraux. On a mis en évidence de la même manière, d'autres structures d' E.coli appelées 987 P responsables de l'attachement de E.coli à l'épithélium intestinal du porce- let. On a mis également en évidence, un antigène K com- mun (Kco) aux souchesd'E.coli entéropathogènes d'origine bovine ou ovine. Cet antigène a été caractérisé et inclus dans la nomenclature internationale sous l'appellation de K99. Sa synthèse est également codée par un plasmide. (Voir en particulier la publication de I.0RSKOV et al "The establish- ment of K99, a thermolabile, transmissible E.coli K antigen, previously called "Kco" possessed by calf and lambs entero- pathogenic strains" Acta.path.microbiol.scand. Sect. B 83 31-36 1975).On a ensuite proposé des milieux de culture spécialement appropriés pour la recherche des E.coli K99+.On a également réalisé la caractérisation biochimique de l'antigène K99. Il ressort des publications citées cidessus ainsi que d'autres, que l'antigène K99 est maintenant défini et accessible d'une manière parfaitement suffisante à l'homme de l'art. Dans le domaine des applications pratiques, en par- ticulier en vue de la prophylaxie anticolibacillaire chez les bovins, on a proposé et commercialisé de nombreux vaccins correspondant aux divers types sérologiques O (antigène de la paroi) et parfois de la capsule (antigène K). On a par exemple réalisé une vaccination à l'aide de la souche d'E.coli B 44 dont on a montré qu'elle contenait l'antigène K99. Les résul- tats d'une telle vaccination sont satisfaisants pour un cer- tain nombre de troupeaux, mais ne permettent pas une prophy- laxie complète des animaux traités. Les principales études ont porté sur la protection des veaux, mais on a également uti- lisé des vaccins à base d'antigène K99 pour la protection colostrale d'agneaux par vaccination de brebis. 246-6251 D'une manière générale on a jusqu'à présent fait appel aux antigènes K88, K99, 987 P et pratiquement à tous les "pili " d'E.coli. Il est maintenant reconnu que le fac- teur d'attachement aux épithéliums joue un rôle très impor- tant dans le développement des prophylaxies. Jusqu'à présent, cependant, il est difficile de mettre expérimentalement en évidence les propriétés d'attachement d'E.coli. Dans le cadre de ses travaux concernant la purification et la struc- ture des antigènes d'attachement K88 et K99, J.P. GIRARDEAU -10 a mis au point un modèle in vitro sur villosités intestina- les isolées faciles à préparer qui permettent de visualiser au microscope, après contact avec une suspension d' E.coli l'attachement ou non sur la villosité. Ce modèle in vitro a permis de montrer que les bactéries possédant l'antigène K99 s'attachent mais que d'autres bactéries K99possèdent aussi cette propriété. La technique de GIRARDEAU, qui n'a pas en- core fait l'objet de publication, consiste à utiliser des villosités isolées d'intestins animaux (lapins ou veaux) con- servées par congélation ou dans un tampon formolé. Ces villo- sités, mises en contact 15 minutes avec les bactéries à étu- dier,sont ensuite observées en microscopie optique à contras- te de phase. On peut distinguer facilement la bordure en brosse de la villosité et les bactéries qui s'y sont attachése L'intensité de l'attachement est apprécié par comptage des bactéries fixées au bord de la villosité. La présente invention, mettant à profit la technique proposée par GIRARDEAU pour mettre en évidence de nouveaux systèmes d'attachement d'E.coli, a tout d'abord permis d'iso- ler et de caractériser des souches sauvages d'E.coli sur des veaux atteints de diarrhée. Lesdites souches sont appelées Y+, 31A+ et 47A+. Elles sont respectivement inscrites dans la collection détenue à l'Institut Pasteur - 25 rue du Docteur Roux - Paris 15ème, o elles ont reçu un numéro d'enregistre- ment au catalogue, respectivement. Les souches nouvelles mises en oeuvre selon l'inven- tion ont été caractérisées, ainsi qu'il sera montré ci-après, par leur aptitude à fournir des antigènes spécifiques. Les autres caractéristiques des souches,connues du demandeur,sont 2466251! énumérées ci-après au Tableau I. T A B L E AU I Sou-Antigènes Entéroto- Antibiogramme xlne Profil API xxx che Y 3A7A TSa xx A S K C T Su Thn Cen 1IA + + - - + 5144552.1 - + + + + - - (Y+) 31A - - + - - 5144572.1 - + + ++ + - - 47A - - - + - 5144552.1 + + - - + + - - x Entérotoxine thermostable a xx Profil API établi sur 24 caractères xxx Antibiogramme (- = sensible (+ = résistant A = ampicilline S = streptomycine K = kanamycine C = chloramphénicol T = tétracycline Su= sulfamide Tnp= triméthoprime Gen= gentamycine La présente invention a pour objet un vaccin anticoli- bacillaire ayant une efficacité accrue par rapport aux vaccins antérieurs, lesquels n'étaient pas capables d'immuniser les animaux traités contre les structures d'attachement d'E.coli essentiellement responsables des désordres intestinaux chez ces animaux. L'invention concerne donc un vaccin anticolibacillai- re animal essentiellement caractérisé en ce qu'il contient au moins un antigène provenant des souches d'E.coli choisies parmi les souches Y+, 31A+ et 47A+. Selon une forme de mise en oeuvre particulièrement pré- férée de l'invention, le nouveau vaccin contient en outre l'antigène K99. Ainsi, un vaccin hautement préféré selon l'invention contient les antigènes K99 et Y en association ou non avec les antigènes 31A et/ou 47A. En variante,le vaccin peut contenir les antigènes K99 et 31A, en association ou non avec les anti- gènes Y et/ou 47A. 2466251 i Les antigènes Yf 31A et 47A nité pour les villosités de veaux, alors que l'antigène K99 présentemoins de spécificité entre villosités d'origines différentes. En microscopie électronique, l'antigène Y se rapproche de l'antigène K99, bien que plus dense, avec forma- tion de gros paquets de fibres autoagglutinées. Les autres antigènes 31A et 47A ressemblent plus à des pili bien que leurs dimensions soient nettement plus faibles. En général, les souches portant ces nouvelles structures ne sont pas entérot.6ynogènes (dans le modèle du souriceau) mais leur fré- quence chez des animaux ayant des troubles digestifs est im- portante. A titre illustratif, un' sondage réalisé sur un trou- peau expérimental, a montré que sur 20 veaux atteints de diar- rhée, 13 étaient porteurs d'une souche E.coli Y+. En vue de la protection des animaux nouveau-nés, le vac- cin selon l'invention est pratiqué sur la mère. L'animal nou- veau-né se trouve alors protégé lorsqu'il absorbe le colos- trum de sa mère. L'invention a également pour objet un procédé pour l'obtention du vaccin défini précédemment. Conformément à ce procédé, on cultive séparément les souches d'E.coli portant les antigènes considérés, on récolte les bactéries ainsi res- pectivement cultivées, on mélange les cultures de bactéries respectives, on inactive le mélange de bactéries et on ob- tient le vaccin désiré après avoir éventuellement addition- né ce mélange d'un adjuvant. Dans la pratique, la souche d'E.coli portant l'antigè- ne K99 peut avantageusement être la souche B41, connue de 1' homme de l'art, et mise en évidence au Centre International des.Entérobactéries à Copenhague. Les autres souches portant les antigènes Y, 31A et 47A, sont originales et ont été défi- nies précédemment. Au cours des travaux qui ont donné naissance à la pré- sente invention, on a également trouvé un milieu de culture spécialement approprié aux souches d'E.coli mises en oeuvre, en particulier de la souche portant l'antigène K99. On a dé- couvert en effet, que la synthèse de l'antigène K99 est inhi- bée en présence de L-alanine. Un milieu de culture préféré est donc un milieu aqueux gélosé, tamponné, contenant entre autres des acides aminés, du glucose et des éléments minéraux,ledit milieu étant plus particulièrement remarquable en ce qu'il contient au plus 0,3g/litre d'alanine. Le milieu contient avantageusement, à titre complémentaire, de l'acide asparti- que. Sous une forme préférée de réalisation, le milieu de culture présente la composition suivante en g/litre: - milieu gélosé 10 à 20 g d'agar milieu tamponné à pH 7,5 (phosphates) - acide aminés (peptone) 1 à 5 g glucose l à 5 g - Acide aspartique O à 4 g - Désoxycholate de Na O à 2 g Extraits de levures O à 1 g - Eléments minéraux (MgCO4, MnCl2, FeCl2, CaCl2) de 0,01 à 0,0001 g Si désiré, le milieu de culture considéré peut être autoclavé à 120 C. La culture des bactéries E.coli est effectuée à la surface de la gélose, avec ou sans film aqueux (lmm d'épais- seur). Après incubation, à une température voisine de 37 C, les bactéries sont récoltées à la surface de la gélose,et ame- nées par exemple à une concentration de 109 à 1010 /mI. Les cultures se font de la manière indiquée ci-dessus séparément pour chaque souche contenant l'antigène utilisé dans le vaccin selon l'invention. Après récolte des bactéries respectives, celles-ci sont mélangées pour fournir la prépa- ration vaccinale contenant la combinaison d'antigènes prévue selon l'invention. L'étape consécutive du procédé consiste à inactiver les bactéries E.coli. A cet effet on utilise les moyens d'ina- tivation connus dans le domaine des vaccins, c'est-à-dire soit des moyens chimiques, soit des moyens physiques. En ce qui con- cerne les moyens chimiques, on utilise avantageusement le formaldéhyde. De préférence, on utilise la solution commercia- le (à 30% de formaldehyde), à raison de 0,5 % de ladite solu- tion par rapport au volume total du milieu à traiter, auquel cas la durée d'inactivation à 37 C est d'environ 24 heures, Les moyens physiques peuvent consister en une irradiation par des rayons gamma. La dose de rayonnement dépendra de la concentration bactérienne de la préparation. Lorsque celle- ci est de l'ordre de 109 à 10 1/ml, la dose de rayons gamma peut être de 0,1 à 1 Mrad. L'irradiation à l'aide de rayons gamma a donné les meilleurs résultats. Il est souvent avantageaux d'ajouter à la prépara- tion vaccinale contenant les bactéries inactivées, un adju- vant du type connu dans cette technique, par exemple de 1' hydroxyde d'aluminium. On peut par exemple ajouter de l'hy- droxyde d'aluminium colloïdal à raison de 1 à 3 mg/ml par rapport à la préparation liquide finale. Complémentairement, on peut ajouter aussi de la saponine, auquel cas la concen- tration de saponine sera de 0,5 à 3 mg pour 2 à 5ml de la préparation totale. Dans la préparation vaccinale finale, les proportions des bactéries inactivées portant les antigènes respectifs K99 Y, 31A et 47A, ne sont pas critiques. D'ailleurs, certaines bactéries E.coli portant l'antigène K99 peuvent également por- ter l'antigène Y. En règle générale,cependant, on préfère que les divers antigènes soient présents en proportions sensible- ment égales dans la préparation vaccinale. La préparation vaccinale de l'invention s'utilise en injection sous-cutanée. L'invention concerne aussi l'application du vaccin et de la préparation vaccinale définies précédemment, en vue de la prophylaxie anticolibacillaire des diarrhées de l'animal nouveau-né, en particulier du veau nouveau-né. Bien que les ré- sultats les plus intéressants aient été obtenus chez lé veau, l'invention est également applicable au traitement des porce- lets et des agneaux. En vue de son application, la préparation vaccinale est injectée, notamment par voie sous-cutanée, aux mères gestantes, à une période se situant entre 15 et 90 jours de préférence entre 20 et 40 jours avant la mise bas, dans le cas de la prophylaxie des veaux. Sur le terrain, 2 à 5 ml de la préparation vaccinale contenant 5 x 109 à 5 x 1010 bacté- ries au total sont injectés aux mères gestantes. Les résultats des essais de vaccination effectués sur le terrain montrent l'effet protecteur des colostrums de va- ches vaccinées sur des veaux nouveau-nés. On a constaté que la préparation vaccinale était bien tolérée par les mères et permettait d'obtenir des titres élevés d'anticorps dans le colostrum. On n'a pas relevé de chocs anaphylactiques chez les vaches immunisées. L'invention sera maintenant illustrée sans être aucu- nement limitée, à l'aide des exemples ci-après. Les exemples 1 à 4 concernent l'obtention respectivement des vaccins de types A,B,C,D, qui ont été utilisés pour des essais de vacci- nation anticolibacillaire dans un troupeau de vaches allai- tantes, les veaux étant infectés à la naissance, dans les conditions rapportées à l'exemple 5. EXEMPLE 1 - Obtention de la préparation vaccinale A Cet exemple concerne l'obtention d'une préparation vaccinale contenant des bactéries E.coli inactivées par irra- diation et l'alumine comme adjuvant. On a utilisé la souche B41 (connue) portant l'antigène K99 et deux des souches originales selon l'invention,portant respectivement les antigènes Y et 31A. On a d'abord effectué une culture séparée des trois souches pour produire les cellu- les bactériennes. Dans chaque cas le milieu de culture utili- sé avait la composition ci-après (rapportée à un litre) - milieu gélosé 20 g d'agar - milieu tamponné à pH 7,5 (phosphates) - acides aminés (peptone) 1 g - glucose 1 g - Acide aspartique O à 2 g - Extraits de levures 1 g Elements minéraux (MgCO4, MnCl2, FeC12, CaC12) 0,01 à 0, 0001 g Les cultures sont séparément effectuées à la surface de la gélose sans film aqueux. Après incubation à 370C, les bactéries des cultures respectives sont récoltées à la surfa- ce de la gélose et amenées à une concentration de 5.i09 pour chacune des souches. Les bactéries récoltées sont ensuite mélangées et inac- tivées par irradiation gamma, à la dose de 0,6 Mrad. La con- centration bactérienne était de 5.10 9/ml. On ajoute enfin à la solution finale 2 mg/ml d'alumine colloïdale. On obtient ainsi le vaccin A. EXEMPLE 2 - Obtention de la préparation vaccinale B On opère comme dans l'exemple 1 ci-dessus, sauf que pour obtenir le vaccin final, on ajoute complémentaire- ment de la saponine à titre d'adjuvant, à raison de 2 mg par rapport à la préparation finale ajustée- à un volume de 5mli On obtient ainsi le vaccin B. EXEMPLE 3 - Obtention de la préparation vaccinale C On opère comme dans l'exemple 1 ci-dessus, mais au lieu d'inactiver les bactéries par irradiation gamma, on traite le mélange bactérien récolté par 0,5 % de formol - pendant 24 heures à 370C. Après inactivation des bactéries, on introduit à titre d'adjuvant de l'alumine col- loidale à raison de 2 mg/ml de la solution finale. EXEMPLE 4 - Obtention de la préparation vaccinale D On opère comme dans l'exemple 3 ci-dessus, sauf qu'on ajoute complémentairement à la préparation contenant de l'alumine, de la saponine à titre d'adjuvant à raison de 2 mg par rapport à la solution finale (volume total: 5 ml) EXEMPLE 5 - Immunisation des vaches gestantes Les vaccins AB,C,D, préparés respectivement aux exemples 1 à 4 ci-dessus, ont été utilisés pour des expérien- ces sur le terrain. A titre de témoin on a utilisé une prépa- ration contenant seulement un mélange d'alumine et de saponine. En vue de la vaccination on injecte par voie sous-cutanée aux mères gestantes 5 ml de chacune des préparations pré- cédemment définies. La période choisie avant la mise bas se situe. entre 15 et 90 jours. RESULTATS a/ Inoeuité Quel que soit le type de préparation, les vaches n'ont présenté aucun symptôme anormal. Une perte d'appétit lé- gère et passagère est apparue quelques heures après l'injec- tion chez certaines d'entre elles. Dans les lots A et Bi aucune anomalie au cours de la gestation ou de la naissance n'a été observée. Dans le lot D, l'un des veaux a présenté il une occlusion intestinale à la naissance. Dans le lot C, une vache n'avait pas de lait (césarienne), un veau est mort à la naissance et un veau est né anorexique. Dans le lot "témoin", une vache a avorté à 8 mois environ et un veau est mort à la naissance. b/ Pouvoir immunisant Les anticorps ont été recherchésdans le sérum et le colostrum des vaches témoins ou vaccinées. Chez deux vaches témoins ayant mis bas tardivement, on a trouvé des anti- corps anti K99 etanti Y à la mise bas dans le sérum et dans le clos- Ceci peut être lié soit à une contamination par les E.coli entéropathogènes présents dans l'étable expérimentale, soit à * une immunisation naturelle antérieure. Les autres vaches té- moins ne présentaient pas d'anticorps sériques ou colostraux. Quel que soit le type du vaccin, la réponse im- munitaire des vaches a été généralement bonne après une seule injection. Les titres obtenus étaientcompris entre 1/80 et 1/160 pour les anti K99 etl/160 et 1/320 pour les anti Y. Dans la figure 1, on a reporté les titres obte- nus dans le colostrum contre deux antigènes utilisés en fonc- tion du délai entre vaccination et mise bas. La figure 1 est un graphique o l'on a porté en ordonnées le titre d'anticorps Ac dans le colostrum, et en abcisses le nombre de jours séparant la vaccination et la mise bas. Les titres en anti- corps colostraux sont généralement supérieurs aux titres séri- ques (concentration dans la mamelle). L'apparition des anti- corps dans le colostrum est très rapide puisque 12 jours suf- fisent à obtenir des titres appréciables après la vaccination. La période de vaccination idéale se situe entre le 20ème et le ème jour avant la mise bas. Passé ce délai, le titre dimi- nue notablement mais reste cependant important jusqu'au 80ème jour après la vaccination. c/ Persistance des anticorps dans le lait Chez 8 vaches appartenant à différents groupes, on a suivi la persistance des anticorps dans la sécrétion mam- maire plusieurs jours après la mise bas. Les résultats ont été reportés sur la Fig. 2 qui est un graphique o l'on a porté en ordonnées le titre d'anticorps Ac dans le lait et en abcisses le nombre de jours post-partum. Quel que soit le vaccin utilisé ou l'antigène, le taux d'anticorps est supérieur au 1/80ème jusqu'à 2 jours. Passé ce délai, les anticorps disparaissent très rapidèment (1/20ème à 7 jours). Ce résultat montre que si le veau boit correcte- ment, il reçoit à chaque tétée une dose d'anticorps impor- tante. Il est protégé non seulement par l'absorption des anti- corps et passage de ceux-ci dans le sang (protection contre la septicémie) mais aussi par apport continu d'anticorps au site même de l'éventuelle infection (tube digestif) pendant la période des 4 premiers jours de vie. Or, ces quatre pre- miers jours sont critiques car plus de 60 % de la morbidi- té (diarrhée) est attribuable aux E.coli entéropathogènes. d/ Efficacité des vaccins Dans le tableau II,on a rassemblé les résultats obtenus après infection expérimentale de veaux issus des va- ches vaccinées et témoins. Ces résultats indiquent que les préparations A et D sont très efficaces (test de corrigé, haute signifi- cation). Par contre, la préparation B est inefficace malgré de bons titres en anticorps colostraux. Si l'on examine le titre en anticorps sérique chez les veaux à 48 h (figure 3) dans ce lot, on constate que chez 3 veaux ayant la diarrhée le titre en anti K99 était nul et chez le 4ème égal au 1/40ème. La figure 3 est un graphique illustrant l'état clinique des veaux et leur devenir en fonction du titre en anticorps sériques. Les légendes complètent la figure. Pour l'ensemble des veaux, leur devenir est d'ailleurs dépendant du titre sérique en anticorps (figure 3). Si leur titre en anti K99 estsurérieur au 1/40ème, ils ont peu de chance d'être malades. Par contre pour l'antigène Y, les titres en anticorps sont moins liés, ce qui est normal puisque la souche infectante est'- seiement K99+. TABLEAU Il- Efficacité des vaccins testés Nombre de veaux diarrhéiques Témoins 4/4 Lot A 0/5 (x) Lot B 4/5 (xx) Lot C Lot D 1/4 (x) (x) Test de 2 corrigé hautement significatif (xx) Test de X2 corrigé non significatif. e/ Conclusion Dans des conditions expérimentales difficiles les résultats obtenus montrent l'intérêt des vaccins anti- colibacillaires essayes. Les trois vaccins A, B et D ne comportent pas de risques dé vaccination. Ces vaccins sont à injecter en une seule foisentre le 20ème et le 40ème jour avant la mise bas, donc dans la plupart des cas quand les vaches sont déjà à l'étable. La protection obtenue chez les veaux est bonne puisqu'ils sont résistants à l'infection expérimentale par un E.coli pathogène, mais à condition que le veau boive cor- rectement le colostrum. EXEMPLE 6 On a préparé de la même manière qu'aux Exemples 1 à 4 des vaccins A',B',C',D' correspondant respectivement aux vac- cins A,B,C,D, précédents en utilisant la souche B41 et les trois souches de l'invention Y, 31A et 47A. On a ainsi obtenu des vaccins contenant les quatre antigènes respectifs. Des es- sais de protection des veaux nouveau-nés ont montré que les vaccins anticolibacillaires correspondants étaient efficaces. Le vaccin A' s'est avéré le plus intéressant. R E V E N D'I C A T I 0 N S 1/ Vaccin anticolibacillaire animal caractérisé en ce qu'il contient au moins un antigène provenant des souches d'E.coli choisies parmi les souches Y+, 31A+ et 47A+. 2/ Vaccin selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'il contient en outre l'antigène K99. 3/ Vaccin selon l'une des revendications 1 ou 2, ca- ractérisé en ce qu'il contient les antigènes K99 et Y et/ou 31A. 4/ Vaccin selon la revendication 3, caractérisé en ce qu'il contient en outre l'antigène 47A. / Procédé pour l'obtention d'un vaccin selon l'une quelconque des revendications 1 à 4, caractérisé en ce qu'on cultive séparément les souches d'E.coli portant les antigènes considérés, on récolte les bactéries ainsi respectivement cul- tivées, on mélange les cultures de bactéries respectives, on inactive le mélange de bactéries et on l'additionne éventuel- lement d'un adjuvant, ce qui conduit à la préparation vaccinle désirée. 6/ Procédé selon la revendication 4, dans lequel le milieu de culture des souches d'E.coli, en particulier de la souche B41 portant l'antigène K99, est un milieu aqueux gélosé tamponné contenant entre autres, des acides aminés, du glucose et des éléments minéraux, caractérisé en ce que ledit milieu de culture contient au plus 0,3 g/l de L-alanine. 7/ Procédé selon la revendication 6, caractérisé en ce - que le milieu de culture contient en outre de l'acide asparti- que. 8/ Procédé selon l'une des revendications 6 ou 7, ca- ractérisé en ce que le milieu de culture présente la composi- tion suivante (en g/l): - milieu gélosé 10 à 20 g d'agar - milieu tamponné à pH 7,5 (phosphates) - acides aminés (peptone) 1 à 5 g - glucose 1 à 5 g - - Acide aspartique O à 4 g - Désoxycholate de Na 0 à 2 g - Extraits de levures 0 à 1 g - Eléments minéraux (MgC04, MnC12, FeC12, CaC12) de 0,01 à 0,0001 g 2466251 ' 9/ Procédé selon l'une quelconque des revendications à 8, caractérisé en ce qu'on inactive les bactéries par le formol ou de préférence par irradiation à l'aide de rayons gamma. 10/ Procédé selon l'une quelconque des revendications à 9, caractérisé en ce qu!à la préparation vaccinale conte- nant les bactéries inactivées, on ajoute, à titre d'adjuvant, de l'alumine colloidale à raison de 1 3mg/ml par rapport à la solution finale. 11/ Procédé selon la revendication 10, caractérisé en ce qu'on ajoute complémentairement de la saponine, à raison de 0,5 à 3 mg pour un volume total de solution finale de 2 à ml. 12/ Procédé selon l'une quelconque des revendications 5 à 11, caractérisé en ce qu'on utilise les bactéries E.coli respectives pour fournir une préparation vaccinale contenant les antigènes K99 et Y, et/ou 31A et/ou 47A, en proportions sensiblement égales. 13/ Procédé selon la revendication 12, caractérisé en ce que la préparation vaccinale contient 109 à 1010 bactéries par ml. 14/ Préparation vaccinale obtenue par le procédé selon l'une quelconque des revendications 5 à 13. / Préparation vaccinale contenant 109 à 1010 bacté- ries E.coli inactivées portant les antigènes K99 et Y, et/ou 31A et/ou 47A, ceux-ci étant présents en proportions sensi- blement égales dans la préparation. 16/ Préparation vaccinale selon la revendication 15, caractérisée en ce qu'elle est administrée par injection sous- cutanée. 17/ Vaccin anticolibacillaire selon l'une quelconque des revendications 1 à 4 et préparation vaccinale selon l'une quel- conque des revendications 14 à 16,appliqués au bovins. 18/ Vaccin anticolibacillaire selon l'une quelconque des revendications 1 à 4 et préparation vaccinale selon l'une quel- conque des revendications 14 à 16, appliqués aux vaches gestantes.