FR 2471188 A1 19810619 FR 8025464 A 19801201 La présente invention concerne une composition stable de S-adénosyl- L-méthionine (qu'on abrège ci-après SAM). Plus particulièrement, l'invention concerne une composition stable de SAM comprenant un sel de SAM et un sel hydrosoluble pharmaceutiquement acceptable d'un métal bivalent ou trivalent. L'invention concerne également un procédé de préparation d'une composition de SAM. La composition selon l'invention est une composition stable de SA! convenant à des usages pharmaceutiques. On sait que SAM se retrouve abondamment dans les organismes vivants et joue le rôle d'un donneur de méthyle dans de nombreuses transméthylations in vivo. Les effets pharmaceutiques de SAM ont été constatés dans des trou- bles divers tels que l'adipohépatite, l'hyperlipémie, l'artériosclérose, les dépressions, l'arfrite déformante, les douleurs dans certaines manifestations neurologiques et l'insomnie. Etant donné que sous sa forme simple, SAM est trop instable pour des utilisations pharmaceutiques, on a proposé de nombreux sels et compositions de SAM, par exemple, le p-toluènesulfonate de SAM (brevet RFA 2 336 401 et brevet JA 35 726/1977); un sel double de SAM avec l'acide p-toluènesulfo- nique et l'acide sulfurique (brevet RFA 2 430 999 et brevet JA 35 727/1977); le méthanesulfonate de SAM, l'éthanesulfonate de SAM, le dodécanesulfonate de SAM, le 1-octadécanesulfonate de SAM, le 2chloréthanesulfonate de SAM, le 2-bromoéthanesulfonate de SAM, le 2-oxyéthanesulfonate de SAM, le 3oxypro- panesulfonate de SAM, le d, -10-camphorsulfate de SAM, le d, Q-3-bromocam- phorsulfate de SAM, le cysténate de SAM, le benzènesulfonate de SAM, le pchlorobenzènesulfonate de SAM, le 2-mésitylbenzènesulfonate de SAM, le 4-biphénylsulfonate de SAM, le l-naphtalènesulfonate de SAM, le 2naphtalène- sulfonate de SAM, le 5-sulfosalicylate de SAM, le pacétylbenzènesulfonate de SAM, le 1,2-éthanedisulfonate de SAM, l'obenzènedisulfonate de SAM, le chondro-étain-sulfate de SAM et un sel double de SAM avec l'acide sulfurique et les acides sulfoniques cités ou bien le chondro-étain-sulfate (brevet RFA 2 530 898 et première publication de la demande de brevet JA 125 717/ 1976); le 1,5-naphtalènesulfonate de SAM et le 1-amino-8-naphtol-2,4- disulfonate de SAM (première publication de la demande de brevet JA 38614/ 1978); le citrate, tartrate, maleate et ascorbate de SAM (brevet FR 2 275 220); une composition comprenant SAM, l'acide sulfurique et le ribonucléatide 5'-monosulfate (première publication de la demande de brevet JA 169 998/1979); une composition comprenant SAM, l'acide sulfu- rique et le sulfate de nucléotide (première publication de la demande de brevet JA 154 774/1979); une composition comprenant SAM, l'acide sulfuri- que et un sulfate de monosaccharide ou d'un oligosaccharide (première pu- 24711 88 blication de la demande de brevet JA 105 700/1980); une composition compre- nant SAM, l'acide sulfurique et le cytidine 5'-monosulfate (première publication de la demande de brevet JA 28 808/1979); une composition comprenant SAM, l'acide sulfurique et l'uridine-2'(3'), 5'-disulfate (deman- de de brevet JA); et une composition comprenant SAM ou son sel et un sel de lithium (demande de brevet JA). Les compositions connues de SAM ne sont cependant pas stables à la température ambiante. D'autre part, la teneur en acide est élevée de sorte que leurs solutions aqueuses sont fortement acides et ont un pH de 1 à 2. Ainsi, lors de l'injection, on doit neutraliser les solutions aqueuses pour les amener à un pH approprié; d'autre part, leurs compositions pour voie orale peuvent exercer des effets fâcheux sur les organes digestifs. En outre, de nombreuses compositions de SAM exigent des procédés de prépa- ration compliqués et coûteux. On voit donc qu'on ne dispose pas à l'heure actuelle d'un sel ou d'une composition suffisamment stable de SAM qu'on peut préparer d'une façon économique et qui convient pour des utilisations pharmaceutiques. Les spécialistes sont à la recherche d'une telle composition de SAM. La demanderesse a entrepris différentes recherches pour obtenir une composition stable de SAM qu'on peut préparer d'une façon économique et qui convient à des usages pharmaceutiques; la présente invention a été ainsi élaborée. L'invention a pour objet une composition stable de SAM et un procédé de préparation. La composition comprend un sel de SAM et un sel hydro- soluble pharmaceutiquement acceptable d'un métal bivalent ou trivalent. Le sel de SAM dans la composition est un sel de SAM avec un acide minéral ou organique. Il peut également être un sel double de SAM avec des acides organiques ou minéraux. Comme exemple de sels de SAM, on peut mentionner ceux obtenus avec les acides chlorhydrique, sulfurique, ptoluànesulfonique, phosphorique, formique, acétique, citrique, tartrique et maléique; les sels doubles de SAM peuvent être obtenus avec ces mêmes acides. Le sel hydrosoluble pharmaceutiquement acceptable d'un métal bivalent ou trivalent dans la composition selon l'invention peut être notamment le chlorure de calcium, le chlorure ferrique, le chlorure de magnésium et le sulfate de magnésium. La composition selon l'invention peut être obtenue par mise en oeuvre d'un procédé qui consiste à dissoudre un sel de SAM du type décrit et un sel d'un métal divalent ou trivalent également du type indiqué, dans un solvant aqueux pour préparer une solution aqueuse de la composition, puis à éliminer le solvant aqueux de la solution ou ajouter un solvant organique à la solution aqueuse pour précipiter la composition. Selon l'invention, on peut préparer une composition de SAM qui reste stable pendant une longue durée, même à température ambiante, d'une façon simple et à un faible prix de revient, une telle composition étant à usage pharmaceutique. En particulier, grâce à la composition stable selon l'invention, on utilise facilement en médecine des compositions orales de SAM telles que des comprimés, des pillules et des gélules. On peut obtenir le sel de SAM dans la composition selon l'invention, par exemple, par les procédés connus ci-après: A. Préparation de SAM 1. On produit la SAM dans les cellules de microorganismes lorsqu'on cultive les microorganismes dans un milieu contenant la méthio- nine EF. Schlenk et al, J. Biol. Chem., 229, 1051 (1957); F. Schlenk et al., Enzymologia, 29, 283 (1965)]. Les microorganismes comprennent, par exemple, ceux appartenant aux genres Saccharomyces, Candida, Hansenula, Pichia, Cryptococcus, Rhodotorula, Trichosporon, Kloeckera, Torulopsis, Hanseniaspora, Sporobolomyces, Lipomyces, Tolula, Aspergillus, Penicillium, Mucor et Rhizopus. On extrait les cellules d'un microorganisme séparées du bouillon de culture à l'aide d'un acide tel que l'acide perchlorique, chlorhydrique, sulfurique, formique ou acétique et des alkylformiates pour obtenir un extrait contenant SAM. On soumet l'extrait à des stades ultérieurs de purification. 2. On synthétise également SAM par voie enzymatique à partir du triphosphate d'adénosine et de la méthionine pour obtenir une solution contenant SAM [S. Hervey Mudd et al., J. Biol. Chem., 231, 481, (1958); et brevet JA 35 727/1977). On soumet la solution contenant SAM aux procédés de purification ci-après: B. Purification de SAM Pour isoler SAM des solutions décrites la contenant et pour en effectuer la purification, on opère comme suit: on peut utiliser l'une quelconque des techniques ciaprès ou une combinaison appropriée de telles techniques. Ces techniques sont notamment: chromatographie par échange ca- tionique; précipitation fractionnée avec un sel de Reinecke, l'acide pi- crique, l'acide phosphotungstique, l'acide picrolonique ou le méthyl orange; chromatographie par adsorption sur carbone active, chromatographie sur résine chélatée; précipitation fractionnée avec des solvants organiques polaires. Comme précédemment expliqué, la composition comprend un sel de SAM 247 1 88 et un sel hydrosoluble pharmaceutiquement acceptable d'un métal bivalent ou trivalent. Les exemples des sels de SAM et des sels de métaux bivalents ou trivalents ont été donnés plus haut. Avantageusement le sel de SAMI dans la composition comprend pas moins de 0,5 et de préférence 0,5 à 3 et, mieux encore, 0,5 à 1 mole du composant acide et 1 mole du composant SAM. Dans la composition, le rapport molaire du sel métallique du métal bivalent ou trivalent à la SAM n'est de préférence pas inférieur à 0,1 et de préférence de 0,3 à 10 et, mieux encore, de 2 à 6. Une solution aqueuse de la composition selon l'invention présente un pH de 0,7 à 7, de préférence de 2 à 6 et, mieux encore, de 3,5 à 5 quand la concentration de SAM dans la solution aqueuse est de 50 mg/ml. La compositim selon l'invention est stable surtout dans les formules décrites ci-dessus dans lesquelles la teneur en acide peut varier entre les limites plus larges que dans le cas des compositions connues de SAM. En d'autres termes, on remarquera que la composition selon.l'invention est stable mime quand la teneur en acide est faible ou si le pH d'une solution aqueuse de la composition est relativement élevé. Les préparations connues les plus courantes de SAM ont, lorsqu'elles sont en solutionsaqueuses, un pH d'environ 1 à 2; en conséquence, quand on les utilise pour l'injection, ces solutions doivent être neutralisées pour régler leur pH à celui des fluides physiologiques et, quand on les utilise par voie orale, elle risquent d'avoir des effets nuisibles sur les organes digestifs. Au contraire, la compsition de SANM -lon l'invention n'a pas de tels inconvénients dans ses applications médicales aussi bien par injection que par voie orale. Pour préparer la composition selon l'invention, on commence par préparer une solution aqueuse contenant le sel de SAM et le sel hydrosoluble pharmaceutiquement acceptable d'un métal bivalent ou trivalent. On dissout le sel métallique, dont des exemples ont été donnés précédemment, dans une solution aqueuse contenant le sel de SAM avec agitation pendant quelques minutes. On règle ensuite le pH de la solution, de préférence à la valeur indiquée à propos du pH d'une solution aqueuse de la composition, c'est- à-dire à une valeur de 0,7 à 7, de préférence de 2 à 6 et, mieux encore, de 3 à 5,5 quand la concentration de SAM dans la solution aqueuse est de 50 mg/ml. Pour le réglage du pH, on utilise une résine échangeuse d'anions du type OH ou un hydroxyde métallique dont le métal correspond, par exemple, 24711 88 au métal bivalent ou trivalent de la composition selon l'invention. Comme exemples d'une résine échangeuse d'anions du type OH, on peut citer "Amberlite IR-45" (marque déposée de Rohm & Haas Co.), "Dowex-l" (marque déposée de Dow Chemical Co.) et "DIAION WA 10" (marque déposée de Mitsubishi Chemical Industries Ltd). Parmi les hydroxydes métalliques, on peut citer l'hydroxyde de calcium, l'hydroxyde ferrique et l'hydroxyde de magnésium. Si nécessaire, on peut enlever par filtration ou centrifugation les éventuels précipités présents dans la solution. On soumet ensuite la solution aqueuse ainsi obtenue aux traitements suivants. Dans un premier procédé, on débarrasse la solution aqueuse du solvant aqueux, par exemple par évaporation à siccité sous pression réduite ou par lyophilisation. On effectue la distillation ou la lyophilisation à une température inférieure à 450C, de préférence inférieure à 35 C. Si nécessaire, on peut sécher la com- position obtenue sous vide et en présence d'un agent de dissication tel que le pentoxyde de phosphore, l'hydroxyde de potassium ou le gel de silice. On peut aussi utiliser pour le séchage un piège à froid. Ainsi, on peut éliminer les traces d'humidité de la composation. Dans un autre procédé, on ajoute un solvant organique à la solution aqueuse décrite pour précipiter la composition. Ce solvant organique peut être notamment le méthanol, l'éthanol, l'isopropanol, le n-propanol, le n- butanol, le sec-butanol, le t-butanol, l'acétone, la méthyléthylcétone, le formiate d'éthyle, l'acétate de méthyle, l'acétate d'éthyle, l'éther éthylique, le 2-méthoxyéthanol et le dioxanne. On élimine par filtration le précipité résultant et on le sèche sous vide. Si nécessaire, on élimine les traces d'humidité par séchage avec un agent de dissication ou à l'aide d'un piège à froid de la même façon que précédemment. Avantageusement, on sèche la composition obtenue jusqu'à une teneur en humidité de 3 % ou moins, de préférence de 1 % ou moins. La composition selon l'invention reste stable pendant une longue période même à la température ambiante. On a comparé la stabilité de la composition selon l'invention à celle des compositions connues de SAM et plus précisément du sulfate de SAM et du sel double de SAM avec l'acide ptoluènesulfonique et l'acide sulfurique, comme on le verra dans les exemples. Les deux compositions connues ne sont stables que dans des conditions fortement acides alors que la composition selon l'inven- tion est stable à des acidités très variées, même à une faible acidité. La composition selon l'invention est plus stable que les deux compositions connues après un stockage à 400C pendant trois mois. En outre, alors qu'on doit stocker les compositions connues dans un endroit froid, on peut stocker 2471 1 88 la composition selon l'invention même à température ambiante. Les exemples suivants, dans lesquels toutes les proportions sont en poids, servent à illustrer l'invention sans aucunement en limiter la portée. EXEMPLE 1 On prépare un sulfate de SAM contenant de l'acide sulfurique et S'MI dans un rapport molaire de 2,2 moles par un procédé connu (F. Schlenk et al., J. Biol. Chem. 229, 1037 (1957) et brevet JA 13680/1971). Dans ml d'eau distillée, on dissout 10 g de sulfate de SAM et on règle le pH de la solution résultante à 6 avec de "l'Amberlite IR-45" (type OHI), on filtre et on obtient 90 ml d'une solution aqueuse de SAM. Dans la solution aqueuse de SAM, on dissout des quantités variées de chlorure de calcium, chlorure ferrique, chlorure de magnésium et sulfate de magnésium pour préparer des solutions aqueuses respectives contenant des exemples de deux composants de la composition selon l'invention, c'est-à- dire un sel de SAM et un sel d'un métal bivalent ou trivalent. On dilue chaque solution aqueuse jusqu'à obtention d'une concentration de 50 mg/ml de SAM avec de l'eau distillée et on règle le pH à 1,2; 3; 4 et 5 avec de l'acide sulfurique hexanormal. On soumet à une centrifugation à 3000 tours/minute pendant 10 minutes les solutions aqueuses dont les pH ont été réglés afin d'éliminer les précipités. A l'aide d'une pipette on introduit chaque surnageant (lml) dans une ampoule en verre de 3 ml et on lyophilise à une température de 'C ou plus faible pendant 16 heures sous une pression de 6,6 Pa pour préparer les compositions. Chaque ampoule scellée par un brûleur à gaz est stockée à une température de 40'C et à 75 % d'humidité relative pendant trois mois pour un essai de stabilité. Les résultats apparaissent dans le tableau I. Au lieu de la lyophilisation, On peut utiliser l'évaporation à sec sous pression réduite dans le procédé décrit. Pour mieux expliquer le procédé, on peut encore ajouter que lorsque la composition est préparée par élimination du solvant aqueux à partir de la solution aqueuse des composants de la composition, comme c'est le cas dans le présent exemple, on détermine la teneur des composants dans la composition quand les composants sont dissous dans une solution aqueuse. 24711 88 TABLEAU I Tests de stabilité de la composition selon la présente invention et des compositions SAM connues Composition selon la présente invention Sel Rapports pH réglé au moment de la préparation métallique molaires des sels métal- liques à la 1,2 3 4 5 SAM dans la composition A B A B A B A B (%) (%) (%) () Clorure de calcium 2 88,3 2,4 86,3 1,1 94,2 0,8 94,5 0,6 4 93,1 2,4 90,8 1,1 97,6 0,8 94,8 0,6 6 92,8 2,4 88,4 1,1 98,5 0,8 97,3 0,6 Chlorure ferrique 1 87,5 2,1 88,7 0,9 93,1 0,6 90,5 0,5 2 90,0 2,0 89,4 0,9 94,9 0,5 91,1 0,5 4 91,6 1,9 90,7 0,8 93,4 0,5 91,4 0,4 Chlorure de magnésium 2 92,0 2,3 94,6 1,0 97,8 0,75 98,2 0,6 4 94,5 2,3 97,1 1,0 98,3 0,75 98,0 0,6 6 93,7 2,3 95,5 1,0 98,0 0,75 97,4 0,6 Sulfate de magnésium 2 90,4 2,4 90,6 1,1 94,4 0,8 96,4 0,6 4 93,9 2,4 96,3 1,1 97,6 0,8 97,2 0,6 6 93,1 2,4 96,7 1,1 98,1 0,8 98,8 0,6 Composition SAM connue i i lI Sulfate de SAM 36,1 2,3 17,5 1,0 11,2 0,75 10,5 0,6 Sel double de SAM avec i l'acide p-toluènesulfo- nique et l'acide ptl87,4 2,5 37,0 1,2 34,5 1,0 33,4 0,8 sulfurique.;i. (note) A: SAM restant B: Rapport molaire du composant acide à SAM dans la composition. 8 2471 1 88 Comme cela ressort du tableau T, la composition selon l'invention est plus stable que le sulfate de SAM connu et le sel douhle de SAM avec l'acide p-toluènesulfonique et l'acide sulfurique également connu. Cette différence est particulièrement marquée à -un pH de 3 à 5. EXEMPLE 2 On prépare du chlorure de SAM de la même manière que dans l'exemple 1 sauf qu'on utilise de l'acide chlorhydrique au lieu d'acide sulfurique. Dans 60 ml d'eau distillée, on dissout 6 g de chlorure de SAM. On dissout 3 g de chlorure de calcium, de chlorure ferrique, de chlorure de magnésium et de sulfate de magnésium dans- 15 ml de la solution aqueuse contenant SAM. On filtre les solutions aqueuses résultantes contenant deux composants de la composition selon l'invention pour éliminer les matières insolubles. On ajoute à chaque filtrat 30 mi d'acétone pour précipiter chaque composition. On triture les précipités résultants avec de l'acétone et on sèche pendant 16 heures sur de l'anhydride phosphorique pour obtenir les compositions selon l'invention. On place les compositions dans des fioles en verre de 10 ml et on ferme hermétiquement les fioles avec des bouchons en caoutchouc. On stocke les fioles à 40'C et 75 % d'humidité relative pendant trois mois pour un test de stabilité. Les résultats de ce test apparaissent dans le tableau II. Pour mieux expliquer le procédé, on peut ajouter que lorsque la composition est préparée par addition d'un solvant organique à une solution aqueuse des composants, le rapport entre les composants est variable selon la quantité du solvant organique ajouté. L'addition d'un minimum de solvant organique à la solution aqueuse donne une composition dans laquelle le rapport molaire du sel métallique et du compo- sant acide à la SAM est élevé. D'autre part, quand on ajoute des quantités plus importantes d'un solvant organique à la solution aqueuse, le rapport des composants à la SAM dans la composition résultante est faible. 2471 1 8 TABLEAU II Testsde stabilité de la composition selon la présente invention-et des compositions SAM connues Composition selon la présente invention I Sel Rapports molaires Rapports molaires métallique des- sels métal- du composant SAM liques à la SAM acide à la SAM restant dans la composi- dans la compos- (%) tion tion Chlorure de calcium 3,5 1,0 98,2 Chlorure ferrique 4,0 1,0 95,4 Chlorure de magnésium 3,8 1,0 97,9 Sulfate de magnésium 4,2 1,0 97,4 Composition SAM connue Sulfate de SAM 2,5 46,3 Sel double de SAM avec l'acide p-toluènesulfonique et l'acide sulfurique 3,1 90,1 Comme cela ressort de ce tableau, la composition selon l'invention même avec une faible teneur en acide est plus stable que les compositions connues de SAM, à savoir le sulfate de SAM et le sel double de SAM avec l'acide p-toluènesulfonique et l'acide sulfurique dans l'état le plus stable, c'est-à-dire avec une forte teneur en acide. Z4711 88 REVENDICATIONS 1.- Composition stab.hle de S-adénosyl-L-méthionine, caractériqée en ce qu'elle comprend un sel de S-adénosyl-L-méthionine et un sel hydrosoluble phar- maceutiquement acceptable d'un -métal bivalent ou trivalent. 2.- Composition selon la revendication 1, caractérisée en ce que le sel du métal bivalent ou trivalent est le chlorure de calcium, le chlorure ferrique, le chlorure de magnésium ou le sulfate de magnésium. 3.- Composition selon la revendication 1, caractérisée en ce que le sel de S-adénosyl-L-méthionine est choisi parmi les sels de cette dernière avec l'acide chlorhydrique, sulfurique, p-toluènesulfonique, phosphorique, formique, acétique, citrique, tartrique et maléique, ainsi que les sels doubles de la S-adénosyl-L-méthïonïne avec ces mêmes acides. 4.- Composition selon la revendication 1, 2 ou 3, caractérisée en ce que le sel de S-adénosyl-L-méthionine comprend pas moins de 0,5 mole du composant acide et 1 mole de S-adénosyl-L-méthionine. 5.- Composition selon la revendication 4, caractérisée en ce que ledit sel comprend 0,5 à 3 moles du composant acide et 1 mole de S-adénosyl-L- méthionine. 6.- Composition selon la revendication 4, caractérisée en ce que ledit sel comprend 0,5 à 1 mole du composant acide et 1 mole de S-adénosyl-Lméthionine. 7.- Composition selon la revendication 1, 2 ou 3, caractérisée en ce que le rapport molaire du sel du métal bivalent ou trivalent à la S-adénosylL- méthionine n'est pas inférieur à 0,1. 8.- Composition selon la revendication 7, caractérisée en ce que ledit rapport est de 0,3 à 10. 9.- Composition selon la revendication 7, caractérisée en ce que ledit rapport est de 2 à 6. 10.- Composition selon la revendication 1, 2 ou 3, caractérisé en ce que la solution aqueuse présente un pH de 0,7 à 7 quand la concentration de Sadénosyl- L-méthionine dans la solution aqueuse est de 50 mg/ml. 11.- Composition selon la revendication 10, caractérisée en ce que ledit pH est de 2 à 6. 12.- Composition selon la revendication 10, caractérisée en ce que ledit pH est de 3 à 5,5. 13.- Procédé de préparation d'une composition telle que définie dans la revendication 1, 2 ou 3, caractérisé en ce qu'il consiste à dissoudre le sel de S-adénosyl-L-méthion ne et le sel d'un métal bivalent ou trivalent dans un solvant aqueux pour préparer une solution aqueuse de la composition, puis à éliminer le solvant aqueux de la solution aueuse ou à ajouter un solvant 1s l 2471188 organique à la solution aqueuse pour précipiter la composition. 14.- Procédé selon la revendication 13, caractérisé en ce qu'on élimine le solvant aqueux de la solution aqueuse par lyophilisation ou évaporation à siccité sous- pression réduite. 15.- Procédé selon la revendication 13, caractérisé en ce que le solvant organique est choisi parmi. les composés suivants: méthanol, éthanol, isopro- panol, n-propanol, n-butanol, sec.-butanol, t-butanol, acétone, méthyléthyl- cétone, formiate d'éthyle, acétate de méthyle, acétate d'éthyle, éther éthyli- que, 2-méthoxy-éthanol, d oxanne.