FR 2466991 A1 19810417 FR 7924948 A 19791008 2466991 ? L'invention concerne la préparation d'allergènes, à laquelle elle apporte un perfectionnement permettant l'obten- tion de compositions allergéniques améliorées; ces dernières font également partie de l'invention. L'allergologie a pris une place importante dans la thérapeutique au cours des dernières décennies, et son rble va en s'amplifiant; non seulement décèle-t-elle le caractère allergique dans diverses affections anciennes, mais encore est-elle appelée à remédier aux atteintes de ce type, que mul- tiplie la pollution moderne. Aussi, un besoin de bons agents hyposensibilisants existe toujours, -malgré la présence sur le marché d'allergènes bien connus, extraits de différentes matières, notamment z de pollens, farines, poussières de mai- son, poils, kapok, plumes, moisissures, etc. Bien que plusieurs préparations, et en particulier des allergènes-retard adsorbés sur des supports minéraux, tels que des gels à base d'alumine par exemple, donnent d'excellents résultats, l'inocuité et la constance d'activité de certains d'entre eux laissent souvent à désirer. La durée d'utilisation de plusieurs extraits aller- géniques, disponibles à l'heure actuelle, est donc limitée dans le temps. La présente invention apporte un perfectionnement qui rend possible l'obtention d'allergènes beaucoup plus sta- bles, plus actifs, ne provoquant pas des réactions secondaires, dans l'organisme auquel on les injecte. Les allergènes perfec- tionnés, produits suivant cette invention, ont une durée d'uti- lisation considérablement prolongée et ils se prêtent particu- lièrement bien à la préparation de la forme adsorbée sur un gel minéral. L'invention résulte de la mise en lumière d'un phé- nomène qui était ignoré, dans cette technique, jusqu'à présent: la présence de diverses enzymes dans les extraits allergéniques n'était pas considérée comme défavorable, et l'on a même pro- posé de la mettre à profit pour classer ou apprécier l'activité (GLEICH G.J. et coll. "Allergy and Clinical Immunology"- Excerpta Medical, Amsterdam, 1977, pages 184 et 213); or, 1' Institut Pasteur a trouvé qu'au moins certaines de ces enzymes dégradent des protéines constitutives des allergènes. Ainsi, de façon imprévue, les demandeurs ont déterminé la cause de l1 instabilité des extraits allergéniques; ils ont trouvé égale- 2466991' ment que les enzymes, responsables de l'attaque des protéines utiles, ainsi que d'autres impuretés, gênent l'adsorption des allergènes sur des adjuvants minéraux. En outre, ces ou cer- taines de ces enzymes peuvent être la cause de la production d'anticorps, par une réaction de l'organisme contre les impu- retés qu'elles constituent dans l'allergène injecté. Le procédé perfectionné, suivant l'invention, com- prend donc l'élimination des enzymes présentes de l'extrait aqueux d'un allergène, aussitôt que possible après la prépara- tion de cet extrait. Il s'agit, en effet, de laisser le moins de temps possible à l'attaque des protéines utiles par les protéases du milieu en présence. Ainsi, le procédé suivant l'invention, qui comprend la préparation d'un extrait aqueux d'allergène, est caractérisé en ce que l'on élimine de cet extrait des substances ne pré- sentant pas l'activité allergénique voulue. Dans une forme d' exécution particulière, on laisse dans la solution seulement les substances allergéniquement actives dont les masses molé- culaires vont d'environ 10 000 à 50 000,et surtout de 14 000 à 45 000 (par précipitation). Dans la pratique de l'invention, il est d'ailleurs souhaitable d'effectuer l'opération sus-indiquée sur un extrait déjà débarrassé de différentes autres impuretés; cela se fait, comme connu, par la précipitation et redissolution des protéi- nes de l'extrait. L'élimination des fractions inactives, notamment celles dont les masses moléculaires sont inférieures à 10 000 ou à 14 000 et supérieures à 55 000 ou à 45 000, conformément à l'invention, peut être réalisée par tous moyens appropriés, bien connus dans l'art, par exemple des procédés chromatogra- phiques, précipitations fractionnées, électrophorèse, etc. La filtration sur gel rend, dans cette voie, de grands services, aussi décrit-on ciaprès, à titre d'exemple non limitatif, le fractionnement d'un extrait de pollen par tamisage moléculaire. Les méthodes-d'extraction de protéine de diverses matières, notamment en vue de la préparation de compositions allergéniques, sont connues, il n'y a donc pas lieu de les dé- crire ici. On rappelle seulement, à titre d'exemple, un mode opératoire qui convient particulièrement bien et qui a fait l'objet de publications comme celle du brevet français 3. 3466991 i n0 1 604 135. Cette méthode consiste à traiter 100 g de matière, notamment de pollens, par 1 litre d'une solution de Na2HP04.121-O à 25 g/l, renfermant 1/10 000 de merthiolate. Après 24 heures d'agitation à + 41C, la solution est séparée du solide par cen- trifugation. L'extrait brut, ainsi obtenu, est purifié par pré- cipitation saline, qui consiste à ajouter 604 g de sulfate d' ammonium, cristallisé, à 1 litre de cet extrait, et à laisser en contact, sous agitation, pendant 3 h à +40C. Le précipité formé est alors séparé par centrifugation et redissous dans une solution de phosphate disodique à 25 g/l contenant 1/10 000 de merthiolate. La solution obtenue est dialysée contre une solu- tion fraiche de phosphate disodique à 25 g/l, toujours addi- tionné de merthiolate. C'est sur un extrait, c'est-à-dire une solution pré- parée comme indiqué ci-dessus, à partir du pollen de phléole, qu'ont été effectuées les opérations exposées dans la suite de la présente description. Cette solution est d'abord soumise à un fractionne- ment par tamisage moléculaire. Pour cela, on utilise une co- lonne chromatographique de 35 mm de diamètre et 560 mm de haut; elle est chargée de Sephadex G-100 dont le domaine de fraction- nement possible s'étend sur les masses moléculaires de 4 000 à 150 000. Le fractionnement est conduit avec un éluant consti- tué par une solution de phosphate disodique à 25 g de Na2HPO4. 12H20 par litre, renfermant 0,9% de NaCl et 1/10 000 de merthio- late. On opère sur des portions de 5 ml d'extrait, chacune d' elles étant suivie d'un passage du tampon d'élution. On re- cueille des fractions de 10 ml sur lesquelles on détermine: la masse moléculaire de la substance dissoute, la présence d'enzymes et la réaction sur la peau. D'autre part, un fractionnement semblable, et les déterminations sus-indiquées, sont effec- tués sur un extrait du pollen de phléole dans le phosphate di- sodique, de même concentration,mais non encore purifié par pré- cipitation au sulfate d'ammonium: cette solution est appelée extrait brut dans la suite de la description. Les résultats de ces essais sont rapportés dans les graphiques et tableaux ci-joints. Sur la figure 1, on a tracé la courbe d'élution de 2466991 1 l'extrait brut du pollen de phléole: les numéros des frac- tions de 10 ml sont portés en abscisses, tandis que les or- données indiquent l'absorbance à 280 nm. En haut du graphique, sur une ligne parallèle aux abscisses, on note les réactions sur la peau des fractions mélangées depuis la 13ème jusqu'à la ème fraction. Les lettres A à F désignent les repères de ré- férence de substances à masses moléculaires connues: A - Bleu de dextran masse mol. 2 000 000 B - Albumine " 65 000 C - Ovalbumine N 45 000 D Lysozyme N 14 600 E - Bacitracine 1450 F - DNP éthanolamine 227 La réaction de la peau est déterminée par la métho- de connue de piqure ("prick"), qui consiste à mettre une goutte de liquide sur la peau et piquer à travers cette goutte avec une aiguille; après 20 minutes environ, un sujet allergique donne une réaction positive, notée +, c'est-à-dire une papule et un érythème. Un seul + signifie que la papule s'étend sur un diamètre moyen de 5 mm; le nombre des + indique le multi- ple des 5 mm observés. Dans le cas de l'extrait brut de la figure 1, on constate une réaction de la peau pour les fractions réunies n0 16 à 29, (++), 30 à 34 (+ ) et 35 à 44 ( ): il n'y a pas de réaction avant la fraction 15, ni après la fraction 45, ce qui signifie qu'en dehors des fractions 16 à 44, il n'y a plus de produit intéressant en tant qu'allergène. Le domaine utile va donc du n0 16 au n0 44. Sur la figure 2, on voit le diagramme d'élution , analogue à celui de la figure 1, mais appliqué à l'ex- trait du pollen de phléole préalablement purifié par précipita- tions au sulfate d'ammonium et redissolution dans une solution de phosphate disodique; ce sont donc presque uniquement les protéines qui sont ainsisoumises à-la séparation par tamisage moléculaire. Sur ce graphique, la série de rectangles verti- caux représentent les seules fractions intéressantes qui don- nent des réactions + à tii sur la peau d'allergiques, déter- minées par la méthode de piqure. Les hauteurs des rectangles sont proportionnelles au diamètre des papules formées sur la peau: 25 mm de hauteur correspondent à 5 mm de diamètre de 2466991 a papule. Le domaine utile comprend les fractions n0 25 à 38, correspondant sensiblement aux masses moléculaires de 44 000 à 20 000. On retrouve donc ici les indications fournies par 1' extrait brut de la figure 1, avec cependant un resserrement du domaine utile. Conformément à l'invention, dans le cas présent, donné à titre d'exemple, on recueille seulement les fractions n0 25 à 38 pour la préparation de la composition allergénique, tandis que les autres fractions sont rejetées, contrairement ' ce qui se pratiquait antérieurement. La preuve que les fractions 25 à 38 retenues ne con- tiennent pratiquement pas d'enzymes est apportée par des déter- minations effectuées par la méthode très pratique, connue sous le nom de système "API ZYM". Cette méthode consiste à intro- duire dans une série de 20 cupules, dont le fond est constitué d'un support contenant le substrat enzymatique avec son tampon, uneketite quantité de liquide à étudier et à faire réagir, a- près incubation, ce liquide avec deux réactifs, le tris(hydro- xy-méthyl)-amino-méthane et le bleu rapide BB. La présence d' enzymes se manifeste par la coloration qui apparait dans les cupules et que lion note sur une échelle de 1 à 5, ce dernier chiffre correspondant au maximum d'intensité. A l'aide de ce système, certains auteurs ont pu trouver la présence de nom- breuses enzymes dans des extraits de pollen de graminées; ain- si, Jean Bousquet et col. ont fait des mesures (Annals of Allergy, vol. 41, sept. 1978, p.164-169) concernant toute une série d'enzymes, telles que phosphatages, estérases, lipases, leucine-amino-peptidase, valineamino-peptidase, trypsine, chymotrypsine, béta-glucose-aminidase, des glucosidases, etc. En appliquant le système API ZYM aux produits des figures 1 et 2, ci-dessus décrites, on a trouvé les résultats rapportés dans le tableau 1 qui suit. Ce tableau donne pour les 20 cupules du système API la note ( de O à 5) déterminée par comparaison de l'échelle colorée du système avec la teinte développée dans la cupule. Les lettres "tr" signifient "trace". Les essais sont bien entendu accompagnés d'un échantillon/for- mé par une solution de phosphate disodique à 25 g/l contenant du merthiolate, et un extrait chauffé de pollen. Il résulte des données du tableau 1 que l'extrait brut contient nettement des enzymes et que la teneur en celles- 2466991. ci est un peu diminuée du fait de la purification au sulfate d'ammonium. Les enzymes disparaissent pratiquement àït à fait à la suite du fractionnement par filtration sur/;il n'en reste pratiquement plus à partir de la 22ème fraction; on en trouve, par contre, dans les fractions 14 à 18 dépourvues d'ac- tivité allergénique. (Voir Tableau 1, à la page 8). On a signalé plus haut que l'élimination des compo- sants de masses moléculaires inférieures à 14 000 et supérieu- res à 45 000 améliore également l'adsorption de l'allergène par des gels minéraux. Ainsi peut-on constater que les fractions utiles, séparées suivant la figure 2, s'adsorbent mieux sur les adsorbants connus, tels que par exemple alumine, phosphate d'alumine ou phosphate de calcium. L'adsorption est particuliè- rement efficace pour le phosphate spécial dans lequel le rap- port pondéral Ca/P est compris entre 1,55 et 1,90, comme décrit dans le brevet français nc 72 12036 (publication 2 181 426 du 7.12.1973). Un tel gel est préparé notamment par mélange d'une solution de g de phosphate disodique dans 1 litre d'eau, avec 2/10 000 de merthiolate, additionnée de 20 ml de l'extrait allergénique, préparé à partir de 100 g de pollen, comme indiqué au début de la présente description. Au mélange obtenu, on ajoute 1 litre d'eau renfermant 10,2 g de CaCl2.2H20. Cette addition est ef- fectuée très rapidement sous agitation et le pH du milieu est amené à 6,8-7 au moyen de la soude normale. Dans une première série d'essais, on a déterminé, par la méthode de la piq0re mentionnée plus haut, la réaction sur la peau de 11 patients. Pour chacun d'eux, on a utilisé un extrait de phléole purifié par précipitation au sulfate d'am- monium et - d'autre part- le liquide surnageant après la pré- cipitation du phosphate de calcium spécial en présence du même extrait, comme on vient de l'indiquer. Dans les deux cas, la dilution de l'extrait est de 1/1000. Les résultats sont encore indiqués au moyen de + dont chacun correspond à 5 mm de pa- pule formée sur la peau du patient. (Voir tableau 2, à la page 9). On voit que l'adsorption a été très efficace, puisque la dimi- nution de la réaction sur la peau globale a été de (22-8.5)_ 61,4% 22 2466991 1 Des essais similaires ont été effectués avec le même phosphate de calcium spécial mélangé non plus avec l'ex- trait total de phléole, mais avec les fractions dépourvues d' enzymes, représentées et décrites à propos de la figure 2. Les réactions sur la peau ont été déterminées à des dilutions allant de 1/1 000 à 1/1 000 000, le tableau 3 en donne les ré- sultats comparés d'une part, pour l'extrait, c'est-à-dire les fractions elles-mêmes, et, d'autre part, sur le liquide sur- nageant après la précipitation du phosphate. Pour la dilution de 1/1 000, la réaction est déterminée par la méthode de la pi- qûre, tandis qu'elle l'est par intradermoréaction, pour les autres dilutions. (Voir tableau 3, à la page 10). On voit que l'adsorption de l'extrait de phléole fractionné est très poussée. Des résultats similaires sont obtenus avec des ex- traits obtenus à partir d'autres pollens, notamment ceux du seigle, de l'ivraie, de dactyle, etc. Echantillon Témoin Extrait brut, total (fig.l) Extrait puri- fié au sulf. dtNH total (fig.2) dO fractions 14 à 18 d fraction d fraction dO fraction d fraction d fraction d fraction d fraction Concentration 1/100 1/100 1/34,5 1/100 1/100 1/100 1/100 1/100 1/100 1/7 TABLEAU 1 Numéros des 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 tr tr v5 3 tr 4 4 3 2 41 3 1 1 tr 1 tr 0,5 tr tr tr tr tr tr tr 1 5 cupules 12 13 14 15 16 17 18 19 20 tr >5 2 3 1 5 4 2 1 1 tr 1 tr tr tr o0 ri) s% Qà Echantillon Concentration d fraction d fraction TABLEAU 1 (suite) Numéros des cupules 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 tr tr 1/100 1/100 tr tr TABLEAU 2 nO patient 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 Total extrait ++ + +++ ++ ++ + + ++++ + ++ ++ 22 surnageant + 0 + + ++ + + + 0 ++ + 8,5 ro on o. o > o Csú'85OSL'9LL' L9 % UOTI.nUTWTQ lz_E. Q 9 L. Q'' Te. ol.L O + O 0 +++ t o; i:F+ +++ E O ±+ + +z O + t 0O + + O ++ O ++ + 0 +++ +++ + 6 -o ++ + +'1, + 8 + O O + +++++ L O O O O O O 9 0 0 0 0 0 ++ + + +++ +++++++ j, -+ O 0++ + ó +.+,_ ++ i+ ou %u a'%ed Ec nValevYL 2466991 1 REVENDICATIONS 1. Allergène constitué par un extrait protéinique d'une matière organique, en particulier pollens, farines, poussière de maison, de kapok, de laine ou de moisissures, caractérisé en ce qu'il est dépourvu d'enzymes et que toutes ses frac- j5 tions sont allergéniquement actives. 2. Allergène suivant la revendication 1, caractérisé en ce qu' il contient seulement des substances de masse moléculaire se situant entre 10 000 et 55 000, surtout entre 14 000 et 000 et mieux dans les limites de 20 000 à 44 000. 3. Allergène adsorbé sur un gel aqueux minéral, en particulier sur un gel d'alumine, de4hosphate d'aluminium ou de phos- phate de calcium, caractérisé en ce qu'il présente les par- ticularités suivant la revendication 1 ou 2. 4. Allergène adsorbé sur un phosphate de calcium, dans lequel l!N le rapport pondéral Ca/P est de 1,55 à 1,90 et, de préfé- rence, 1,62 à 1,85, caractérisé en ce qu'il présente les particularités suivant la revendication 1 ou 2. 5. Procédé pour la préparation d'un extrait allergénique a- queux, caractérisé en ce que la solution aqueuse séparée 2P-0 du solide, dont on a extrait l'allergène, est fractionnée, de façon à en éliminer les substances allergéniquement inac- tives et particulièrement les enzymes. 6. Procédé suivant la revendication 5, caractérisé en ce que l'élimination porte sur les substances de masses moléculai- X5 res inférieures à 14 000 et supérieures à 45 000, initiale- ment présentes dans la solution. 7. Procédé suivant la revendication 5 ou 6, caractérisé en ce que l'élimination des substances non actives est effectuée par tamisage moléculaire. e 8. Procédé suivant la revendication 6 ou 7, caractérisé en ce que seules les substances de masses moléculaires de 20 000 à 44 000 sont retenues pour constituer l'allergène. 9. Application de l'allergène suivant une des revendications l à 4 qui consiste à utiliser ces allergènes au diagnostic des 1.4 allergies et traitement de désensibilisation des allergies.