FR 2461746 A1 19810206 FR 8016014 A 19800721 246 1 746 L'invention concerne un procédé de fabri- cation de la bière. Elle concerne plus particulièrement un procédé de fabrication d'une bière pauvre en calories selon lequel on introduit une enzyme extraite du riz, source traditionnelle de brasserie, dans le processus de fabrication. Elle concerne aussi un procédé d'extrac- 1;i-on de l'enzyme du riz entier ou glacé, ainsi qu'une forme de l'enzyme stable à la conservation. Dans la production de la bière, on utilise la levure pour transformer par fermentation, en étha- nol, un substrat composé d'un mélange de carbohydrates fermentescibles. Ces carbohydrates du moût, que l'on peut faire fermenter au moyen du levain de bière, sont principalement constitués de maltose, glucose, malto- triose et de traces de sucrose et fructose. On les obtient par action des enzymes du malt (a et P amylase) qui transforment les molécules d'amidon du malt et au- tres additifs, en sucres fermentescibles mentionnés ci- dessus. Ceci s'effectue au cours de l'opération du brassage, suivi de l'extraction des matières solubles, qu'on sépare ainsi des grains épuisés. On obtient un liquide clair (moût), qu'on transfère dans une bouil- loire de brasserie, o on le fait bouillir pendant une certaine durée pour désactiver toutes les enzymes du malt. On ajoute généralement du houblon au mélange de la bouilloire, puis on refroidit le moût, on l'aère, on l'ensemence de levure et on laisse fermenter. Les compositions de moût varient en fonction des caractéris- tiques des produits, du cycle de brassage employé, etc.. Cependant un moût typique contient approximativement à 80%1o de carboeydrates fermentescibles, du type men- tionné ci-dessus et environ 20 à 35% de carbohydrates non fermentescibles. Après fermentation, on obtient un breuvage qui contient généralement 3 à 5% d'alcool, avec des quantités à peu près égales de dextrine rési- 2461 746 duelle, formant la masse des solides dissous, généra- lement appelés "extrait réel". Ce résidu subsiste en raison de l'inaptitude des amylases du malt à hydrolyser les liaisons a 1-6 de l'amidon. Après fermentation du moût décrit ci-après, on obtient un produit contenant approximativement 110 calories par bouteille de 35,5 cl, lorsque la mise en bouteille se fait pour 3,3 g% d'étha- nol. Pour la production de bières, pauvres en calories, superallégées, on a tenté d'obtenir une pro- portion plus élevée d'alcool et une teneur beaucoup plus faible en dextrine résiduelle. Ceci produit une bière d'un poids spécifique plus faible, à la fin de la fermentation, que celui normalement obtenu. Les premiers produits superallégés furent obtenus par un procédé selon lequel on ajoutait une enzyme externe dans la cuve de fermentation. Cette enzyme particulière, une glucoamylase, est capable d'hydrolyser à la fois les liaisons a 1-4 et a 1-6 de l'amidon et on l'obtient gé- néralement à partir de la moisissure Aspergillus niger. Mais l'emploi de la glucoamylase présente certains in- convénients: (a) l'enzyme hydrolyse difficilement les liaisons î 1-6. Elle est beaucoup plus efficace pour l'hydrolyse des liaisons 1-4, et, (b) on peut la consi- dérer comme exogène au processus de la brasserie, c'est- à-dire qu'elle n'est pas présente, et on ne peut l'iso- ler dans les matériaux usuels à la brasserie, comme le malt, le riz, l'orge ou la levure. On a aussi suggéré d'utiliser une a 1-6 carbohydrase, ou pullulanase combinée avec une P-amyla- se d'origine microbiologique. Il existe trois classes principales d'en- zymes dégradantes: les glucoamylases, les isoamylases et les pullulanases, dont les différences sont bien connues des spécialistes. Fondamentalement, les pullu- 24617?46 lanases coupent les liaisons a 1-6 du pullulan (poly- mère a 1-6 du maltotriose isolé de la paroi d'une cellu- le de moisissure) pour donner le maltotriose. Les pul- lulanases sont spécifiques pour les liaisons 1-6 et peuvent dégrader les dextrines résiduelles dans le moût en produisant des a-1-4 polysaccharides que l'on peut convertir par diverses a 1-4 carbohydrases en sucres qui sont fermentescibles par le levain de bière. On a tenté dans le passé d'isoler une enzy- me dégradante dans les sources appropriées pour la pro- duction de la bière, comme le malt. L'enzyme dite "enzy- me R" est décrite dans la littérature, mais il semble qu'à ce jour il n'existe pas de moyen efficace pour l'i- soler. La présente invention est basée sur la dé- couverte qu'on peut utiliser une matière bien connue et traditionnelle en brasserie, comme source d'une enzyme dégradante, pour produire une bière superallégée. L'invention a pour objet, en général, l'utilisation du riz comme source d'enzyme dégradante dans la préparation d'une bière pauvre en calories. Elle concerne aussi un procédé d'isolation de l'enzyme dé- gradante, dans le riz. On a traditionnellement utilisé le riz dans l'industrie de la brasserie, généralement comme auxiliaire, ou source additionnelle de carbohydrates, comme le gruau ou le sirop d'orge. On utilise générale- ment dans ce but un riz de qualité alimentaire, c'est- à-dire du riz qui a été séché de façon conventionnelle, puis moulu à sec. Les brasseurs utilisent en général les grains brisés provenant de l'opération de glaçage. Traditionnellement, on utilise le riz dans le cuiseur de céréales, en ajoutant en général du malt, en même temps que suffisamment d'eau afin d'obtenir une certai- ne conversion de l'amidon de riz dans le cuiseur. On fait cuire ce mélange pendant un certain temps et on l'ajoute au brassin o les enzymes du malt convertis- sent l'amidon du malt et du riz en carbohydrates fer- mentescibles. Le riz auxiliaire ainsi utilisé ne pré- sente aucune activité enzymatique, ayant été totalement inactivé dans le cuiseur de céréales. Le procédé tra- ditionnel n'utilise donc pas le riz comme source d'en- zyme. L'invention est basée sur la découverte que l'emploi d'une enzyme dégradante, qui se trouve na- turellement dans le riz, résulte, lorsqu'on l'utilise en brasserie, en une bière pauvre en calories. L'enzyme dégradante du riz se trouve dans un ingrédient traditionnel du brassage, et semble plus efficace que la glucoamylase dans la réduction de la fraction de dextrine de haut poids moléculaire, forte- ment réticulée. - Le procédé de l'invention constitue une amélioration de lz méthode de production d'une bière superallégée par fermentation du moût de bière par la le- vure; il consiste à ajouter une pullulanase du riz en une quantité efficace pour réduire la quantité de dextri- nes résiduelles dans l'extrait réel; par coupure des liaisons a 1-6 des dextrines, pour former cc 1-4 dextri- nes, qui sont converties par les 1-4 carbohydrases en sucres fermentescibles, que l'on fait fermenter par la levure pour les transformer en alcool. On peut intro- duire l'enzyme à différentes phases du processus. Selon un mode de mise en oeuvre préféré du procédé, on ajoute soit le riz, soit l'enzyme dégradante extraite du riz, au moût qui contient l'amylase de grain provenant d'une source convenable, c'est-à-dire le malt, dans la cuve de fermentation. L'enzyme de riz dégradante hydrolyse les liaisons 1-6 résiduelles des dextrines finales et l'amy- lase de grain coupe les a 1-4 polysaccharides linéaires qui en résultent, en sucres fermentescibles qui sont convertis en éthanol par la levure. Selon un autre mode de mise en oeuvre du procédé de l'invention, on ajoute les enzymes dégra- dantes extraites du riz, au brassin, pour favoriser la coupure des liaisons 1-6 des dextrines finales, qui se formeraient autrement. Les enzymes naturelles du malt kyirolysent les liaisons 1-4, produisant ainsi des te- neurs plus élevées en sucres fermentescibles. On peut produire des bières d'un goût agréable selon chacun des modes de réalisation décrits ci-dessus. Dans chaque cas, on constate que le produit final contient une proportion plus grande d'alcool vis- à-vis de l'extrait réel et moins de calories par unité de volume, lorsque conditionné à alcool constant, qu'une bière témoin produite sans addition d'enzyme. L;enzyme qui convient, selon l'invention, à la préparation d'une bière pauvre en calories ou superalléfée, est une enzyme dégradante de l'amidon, qui se trouve naturellement dans le riz. L'enzyme ap- partient à la classe de la pullulanase, car elle hydro- lyse les liaisons a 1-6 du substrat de pullulan servant à 1 ' identifier. Selon le procédé d'extraction de l'inven- tion, on extrait l'enzyme du riz entier ou glacé du commerce, avec un système tampon aqueux d'un pH d'envi- ron 6 à des températures comprises dans l'intervalle de 000 C à 6000 C. Des conditions préférables consistent à former une bouillie du riz glacé dans un tampon de phos- phate de potassium OIM et de NaC1 0,2M de pH 6,0, à en- viron 500 C, pendant environ 5 h. Le liquide surnageant contenant la pullula- nase, provenant de l'extraction, peut 8tre encore puri- fié par: (1) acidification de l'extrait brut; et (2) précipitation de l'enzyme du riz par (HI4)2S0$. Ces processus sont illustrés dans les exemples qui sui- vent. On peut conserver l'enzyme sous forme li- quide, ou sous forme lyophilisée ou de poudre séchée par pulvérisation. On obtient la poudre lyophilisée par diafiltration de l'extrait, tamponné à pH 6, contenant l'enzyme, contre une solution 0,IM de bicarbonate d'ammonium. Le bicarbonate d'ammonium est un sel vola- til qui se sublime à la lyophilisation, en donnant une poudre d'enzyme dénuée de sel. On peut aussi utiliser, si on le désire, d'autres sels sublimables qui n'inter- fèrent pas avec le procédé ou ne nuisent pas à l'activi- té enzymatique. La quantité de riz ou d'enzyme extraite devant être ajoutée dans la brasserie dépend d'un grand nombre de facteurs comme la concentration enzyma- tique du riz, l'activité de l'enzyme, la phase du pro- cessus de brassage à laquelle on l'introduit, et les conditions du brassage, comme le pH, la température et la durée. En général, la quantité de riz ou d'extrait ajoutée est une quantité efficace pourréduire la quan- tité de dextrines résiduelles dans l'extrait réel d'en- viron 30 à 80/0.o On ajoute normalement, pour la précon- version des dextrines avant la fermentation, une sour- ce d'enzyme, sous forme d'extrait ou de riz, contenant environ de 100 à 300 unités d'activité de pullulanase par litre au moût, ou environ 300 à 700 unités par li- tre au brassin. De plus petites quantités contenant environ 2 à 75 unités d'activité pullulanase par litre sont efficaces si on les ajoute au moût dans l'opéra- tion de fermentation. On peut, si on le désire, utili- ser des quantités plus grandes que celles normalement employées. Il est évident que des essais sont nécessaires pour déterminer les quantités précises devant être uti- lisées, de tels essais étant à la portée du technicien spécialisée Selon un mode de mise en oeuvre du procé- dé, on ajoute l'enzyme dégradante dans l'opération de fermentation, avec une carbohydrate, telbqu'une diastase de grain. Une telle combinaison est nécessaire car l'enzyme de riz, dégradante, coupe les a 1-6 dextrines finales, hautement réticulées, et la carbohydrate ajou- tée coupe les a 1-4 dextrines qui en résultent, en su- cres utilisables par la levure. Les quantités efficaces de chaque enzyme à ajouter dépendent de la teneur en dextrines finales normalement présentes dans le produit de la fermentation et du taux désiré de réduction des calories. Normalement l'enzyme dégradante est présente en une quantité d'environ 2 à 60 unité d'activité pullu- lanase par litre de moût et la carbohydrase ou diastase de grain est présente en une quantité d'environ 20 à unités d'activité d'amylase par litre de moût. Selon un autre mode de mise en oeuvre de l'invention, l'addition de l'enzyme dégradante de riz, dans la fermentation, est accompagnée de l'addition d'une glucoamylase, telle que celle provenant d'Asper- gillus niger, qui est active vis-à-vis des liaisons a 1-6 et a 1-4, à la fois. L'introduction de la combi- naison de ces deux enzymes dans l'opération de fermen- tation, réduit de façon notable le temps normalement requis pour préparer une bière superallégée, par exempie de 12 à 7 jours. Bien que les deux enzymes présentent une activité dégradante, l'enzyme du riz est plus puis- sante que la glucoamylase, ce qui a pour effet de di- minuer la durée de la fermentation. La concentration de l'enzyme du riz dans un tel mélange peut être infé- rieure à celle normalement employée, par exemple de 2 à 4 unités de pullulanase et la glucoamylase est présente à raison d'environ 2 à 10 unités de glucoamylase par litre. Z461746 On utilise les méthodes analytiques sui- vantes dans les exemples décrits ci-après. On mesure les protéines selon la méthode de Lowry, modifiée par Miller (1). On mesure l'activité de pullulanase par hydrolyse de 0,5% en poids/volume de pullulanase, à pH 5, 0 et 5000 C. On mesure l'activité d'amylase par hydrolyse d'un amidon Linter soluble de 0,5% en poids/ volume, à pH 5,0 et 50 C. L'apparition de sucres-réduc- teurs est contrôlée selon la méthode à l'acide dinitro- salicylique de Bernfield (2). Dans les deux essais, l'unité d'activité est définie par l'apparition de I mg de sucre réducteur (sous forme maltose)/mn. Les activi- tés spécifiques sont exprimées en unités/mg de protéi- ne. On mesure l'activité de glucoamylase selon la méthode de Pazur (3) modifiée, en utilisant le mal- tose comme substrat, & pH 5,0 et 25 C. L'apparition de glucose est contrôlée par l'utilisation couplée de la réaction peroxydase-oxydase du glucose, avec 1'o- dansidine comme colorant indicateur (3). Une unité d'ac- tivité est définie par l'hydrolyse de I micromole de maltose/mn dans ces conditions. On contrôle les fermentations d'après la diminution du poids spécifique, en utilisant le densi- mètre calculateur de Mettler DMA-45. Quand on juge que la fermentation des bières est terminée, on mesure les indices de réfraction avec un réfractomètre à immersion de Zeiss. On utilise ces mesures pour calculer la te- neur en alcool (4,5,6) et l'extrait réel (5,6) des biè- res. On calcule la teneur en calories d'un conteneur standard de 35,5 cl, à 3,3 g% d'éthanol, comme décrit par Helbert (7). On obtient des profils de carbohydrates par chromatographie en phase liquide, sous pression élevée, sur une résine "Bio Rad Q 155" décrite par le Z461746 Comité ASBC sur les sucres et sirops de brasserie (8) et par Scobell (9). Sauf mention du contraire, on ef- fectue toutes les diafiltrations sur l'appareil vendu sous la dénomination commerciale de "Amicon DC-2" muni d'une cartouche H-1P-10 (sépare poids moléculaire = 10.000) par la Société dite Amicon Corporation. L'invention sera mieux comprise à la lec- ture des exemples non limitatifs qui suivent, de divers modes de réalisation suivant l'invention. Les exemples 1 à 5 décrivent la séparation et certaines propriétés de la pullulanase du riz. - EXEMPLE 1 - Séparation de la pullulanase du riz entier. On mélange 500 g de riz, de qualité de grain dite Lablle, avec un tampon de phosphate de potas- sium 0,1M-NaCl 0,2M, à pH 6,0, dans un mélangeur de Waring. On transLère le mélange dans un récipient placé dans un bain maintenu à 5000 C et on agite, sous 2 1 du tampon pendant 5 h. On élimine le grain épuisés, par fil- tration à travers une mousseline à fromage et on clari- fie le filtrat par centrifugation On peut clarifier davantage en réduisant le pH de l'extrait à 5,0. On élimine par centrifugation le précipité qui en résulte et on réajuste le pH du liquide surnageant à 6,0. On purifie l'extrait et on le concentre par fractionnement a (NH4)2S04. On ajoute ce sel au liquide surnageant, de pH ajusté, à la vitesse de 40 g de sel solide par 100 ml de solution. On agite la suspen- sion pendant I h à température ambiante et ons pare le précipité par centrifugation. On dissout le précipité dans, et on le diafiltre contre, le tampon d'extraction. - EXELPLE 2 - Localisation de la pullulanase à l'inté- rieur du rainde riz. Le riz Labelle de l'Exemple 1 est perlé et on isole les fractions suivantes: (1) riz non dé- cortiqué; (2) riz brun ou décortiqué; (3) son du riz; et (4) riz blanc glacé. On extrait chaque fraction et on clarifie comme dans l'Exemple I pour le riz entier. L'analyse de ces extraits montre que la plus grande partie de l'activité de pullulanase est localisée dans l'endosperme (riz glacé). De plus, l'activité spécifi- que de cette préparation est beaucoup plus grande que celle des préparations obtenues à partir soit du riz entier, soit du riz brun. Le riz glacé constitue donc la source préférée d'enzyme. - EXELTLE 3 - Extraction de la pullulanase du riz glacé. On broie 2 kg de riz glacé du commerce à 0,508 mm dans un broyeur pour orge. On forme une pâte du riz avec 4 1 d'un tampon d'extraction à pH 6 et on agite la suspension pendant 3 h à 50 C. On ajuste le pH de l'extrait à 5,0 et on clarifie le liquide surnageant par centrifugation. On réajuste le pH du liquide surnageant à 6,0. En vue d'une conservation de longue durée, il est désirable d'obtenir la préparation sous forme d'une poudre dénuée de sel. Pour cela on diafiltre le liquide surnageant, après ajustement du pH, contre NH4HC03 0,IM. On choisit ce sel car (2) la préparation nécessite un sel pour demeurer en solution, et (2) NH4HC03 se sublime et est évacué par lyophilisation ul- térieure. Après diafiltration contre 4 volumes de NH4-HC03 0,1M, le rétentat est lyophilisé. 2461&46 - EXEMPLE 4 - PH optimum de la pullulanase du riz. On détermine l'intervalle optimum de pH sur la pullulanase du riz isolée selon le processus de l'Exemple 3. On utilise les systèmes tampons suivants: (1) pH 4,0 à 5,5, acide acétique 0,1 M ajusté au pH ap- proprié par NaOH; (2) pH 6 à 7, KH2P04 O,IM ajusté au pH approprié par NaOH. On dilue un pullulan de réserve (10%o en poids/volume dans l'eau) à 1% en poids/volume dans le tampon approprié. On essaie ensuite la pullula- nase du riz sur l'intervalle de pH 4 à 7, dans des con- ditions LJormalisées. Les résultats montrent que l'on obtient une activité optimale dans l'intervalle de pH de 5 à 6,5. - EXEMPLE 5 - Température optimale de la pullulanase du riz. (A) En l'absence de substrat. La pullulanase du riz préparée comme décrit à l'Exemple 5 est amenée à une concentration finale de 2 mg/ml dans un tampon d'a- cétate 0,1M, à pH 5,0. On fait incuber des portions ali- quotes de ce mélange dans l'intervalle de températures à 70 0, pendant des durées de 10 à 60 mn. On retire des portions aliquotes incubées, qu'on refroidit et soumet à l'essai normalisé de pullulanase. Les résul- tats montrent que l'enzyme est rapidement désactivée aux températures supérieures à 40 0. Une désactivation com- plète se produit à 60 0 après 10 mno. (B) Présence de substrat. De la pullulana- se de riz, préparée comme dans l'Exemple 3, est amenée à une concentration de I mg/ml dans un tampon d'acétate 0,1M, à pH 5,0. On introduit des aliquotes de cette préparation (suffisantes pour fournir une concentration finale de 0,2 mg/ml) dans des tubes contenant du pullu- * lan et un tampon d'acétate 0,1M, à pH 5,0, qui a été équilibré à la température désirée. A chaque tempéra- ture (dans l'intervalle de 40 C -70 C) on retire des aliquotes de 1 ml après 10, 20 et 30 mn d'incubation et on désactive par introduction dans une solution d'acide dinitrosalicylique, utilisé pour le développe- ment de la couleur. On mesure les sucres réducteurs selon l'essai normalisé. D'après les résultats de ces essais, on voit que l'enzyme est stable en présence de substrat, jusqu'à 60 C pendant 30 mn. Ceci est en contraste avec la stabilité à la température, de l'enzyme seule, comme décrit en 5-A. Les exemples 6 à 15 décrivent l'applica- tion de l'enzyme dégradante de riz (pullulanase) dans la brasserie. Les exemples 7 à 12 décrivent l'emploi de l'enzyme en combinaison avec diverses a 1,4 carbohydra- ses, dans la fermentation de la bière, tandis que les exemples 13 et 14 décrivent son emploi avant la fermen- tation. Dans tous les cas, le moût utilisé est brassé comme un moût tout au malt et il est ajusté à environ 12 à 15 P avec un sirop de grains, modifié, du commer- ce, avant la fermentation. Dans les exemples qui suivent, le poids spécifique original est constant. Les moûts sont ensemencés avec une culture demeserve, pour la biè- re, de S. uvarum, à une concentration finale de 1 x 107 cellules/ml et on effectue leur fermentation à 15 00. - EXFIPLE 6 - Préparation de diastases de grain pour l'emploi avec la pullulanase du riz. (A) Diastase de malt. On broie du malt de distillation, dans un broyeur pour orge. On forme une pâte avec la poudre (150 g) et 1,5 1 de tampon d'acétate 0,1M, de pH 5,0. On agite la bouillie pendant 2 h à 0C, et on recueille le liquide surnageant, comme dé- crit à l'Exemple 1, pour l'extrait brut de riz. On purifie encore l'enzyme par addition de (NH4)2S04 jusqu'à une concentration finale de 40 g/ ml. On sépare le précipité par centrifugation et on le remet en suspension dans un tampon d'acétate 0,1M à pH 5,0. On clarifie la suspension par diafiltration contre le même tampon, puis on concentre et conserve à 4 C. (B) Préparation de la P-amylase du malt. La diastaee de malt préparée comme décrit à l'Exemple 6-A contient à la fois l'a et la P-amylase, l'a-amylase étant la plus concentrée. On peut désacti- ver sélectivement l'a-amylase, à pH acide (9). On ajus- te le pH d'une portion de la diastase de malt, préparée comme à l'Exemple 6-A, à 3,6 et on fait incuber à 35 C pendant 2 h. On clarifie la solution par centrifugation et on réajuste le pH du liquide surnageant à 5,0. (C) Préparation de la diastase de soja. On broie des grains entiers de soja dans un broyeur de Wiley, jusqu'au tamis de maille 20. On agite 10 g de la poudre dans 100 ml de tampon d'acétate 0,OIM à pH 5,2 et 55O C pendant I ho On clarifie la solution par centrifugation, suivie de filtration à l'aide d'un adjuvant de filtration. On dilue 4 fois le liquide surnageant, on le diafiltre contre H20 et on concentre au volume original. On conserve le concentrat à 4 0. (D) S ration de la diastase du blé. On sépare la diastase du blé dur d'hiver, perlé, broyé comme décrit à l'Exemple 6-B pour la diastase de soja. On forme une pâte avec la poudre (50 g) et 100 ml de tampon au phosphate 0,1M-NaCl O,IM, à pH 6,0 et on agite la solution pendant 3 h à 5000 C. On clarifie la suspen- sion comme décrit à l'Exemple 1, pour l'enzyme de riz. On dialyse le liquide surnageant contre un tampon de phosphate 0,02M-NaCl 0,2M, puis de l'eau. La glucoamylase utilisée dans les essais décrits ci-après est vendue sous la dénomination com- merciale de "Novo 150" par la Société dite Novo Indus- tries. - EXEMPLE 7 - Super allègement d'une bière pendant la fermentation en utilisant la pullulanase de riz et la diastase de malt. On fait fermenter un moût préparé comme plcédemment décrit, dans les conditions suivantes: (1) sans addition d'enzyme (bière N 1) pour déterminer la limite d'allègement; (2) avec addition de glucoamylase (8,1 U/l bière N 2) pour établir la limite de super- allègement; et (3) avec addition de pullulanase de riz (15,3 U/l) et de diastase de malt (140 U/l bière N 3). Dans tous les cas, on ensemence les moûts et on les aère, comme précédemment décrit, après quoi on ajoute les enzymes appropriées. On fait fermenter les bières à 15 C. La bière témoin, dénuée d'enzyme, contient 0,5-0,6 g% de moins d'alcool que les bières N 2 et 3, respectivement superallégées avec la glucoamylase, et les pullulanase de riz et diastase de malt. Lorsque conditionné à 353% d'éthanol, l'extrait réel de la bière N 3 est réduit d'environ 1,0 g% par rapport à la bière N 1 et il est presque identique à celui obtenu lors- qu'on utilise la glucoamylase (bière N 2). A cette con- centration d'alcool, les bières N 2 et 3 contiennent 92-93 cal/35,5 cl, comparativement à 108 cal/35,5 cl pour la bière N 1. Les profils des carbohydrates montrent que les bières N 2 et 3 ont des compositions presque iden- tiques en carbohydrates, à la fin de la fermentation, et qu'à la fois dans les bières N 2 et 3, les sucres non fermentescibles (supérieurs à DO-3) sont notablement réduits, comparativement à ceux de la bière N 1. - EXEMPLE 8 - Superallègement d'une bière pendant la fermentation en utilisant la pullulanase de riz et la diastase de soja. On ajoute la pullulanase de riz 15,3 U/l) et la diastase de soja (140 U/l) . On fait fermenter la bière comme décrit à l'Exemple 7. En fin de fermentation, la bière contenant ,3 U/l de pullulanase de riz et 140 U/l de diastase de soja (bière NO 4) est superallégée à peu près au même taux que le témoin à la glucoamylase (bière N 2), en donnant une bière à 93,4 cal/35,5 cl, lorsque con- ditionnée à 3,3 g% d'éthanol. Après 12 jourz de fermen- tation, le profil des carbohydrates montre que la frac- tion non fermentescible est presque identique à celle du témoin à la glucoamylase (bière IN 2). - EXEMPLE 9 - Sperallegement d'une bière pendant la fermentation en utilisant la pullulanase de riz et la diastase de blé. On aère et ensemence le moât comme décrit à l'Exemple 7. On ajoute la pullulanase de riz (15,3 U/l) et la diastase de blé (140 U/l). On fait fermenter la bière à 1500 C comme décrit à l'Exemple 7. Cette bière (bière N 5) est superallégée au même taux que le t6moen à la glucoamylase (bière N 2). Lorsque conditionnée à une concentration d'alcool de 3,3 g% d'éthanol9 la bière contient 92,5 cal/35 cl. La composition des carbohydrates montre que la fraction non fermentescible est presque égale à celle de la bière NO 2. - EXELE 10 - Superallègement de la bière pendant la fermentation en utilisant la pullulanase de riz et la P-amylase de malt. On aère le moût et on l'ensemence comme décrit à l'Exemple 7. On ajoute la pullulanase de riz (15,3 U/l) et la P-amylase de malt (140 U/l) et on fait fermenter la bière à 15 C, de façon usuelle. Les résultats montrent que la fermentation de cette bière (N 6) se termine en 8 jours, ce qui est plus rapide que celle du témoin à la glucoamylase (biè- re N 2) et que celle d'aucune des bières contenant la pullulanase du riz, combinée avec d'autres diastases de grain. Ici encore, la composition en carbohydrates est semblable à celle du témoin. Une 3-amylase semble supérieure à toutes les diastases (contenant à la fois a- et P-amylases) utilisées dans les exemples précé- dents. - EXEMPLE 11 - Superallègement d'une bière pendant la fermentation en utilisant des farines de riz et de malt. On broie du riz glacé pour brasserie N 4 et du malt pour distillerie dans un broyeur de Viley, jusqu'au tamis 20. On les ajoute au moût aéré et ense- mencé comme précédemment décrit. Un des moûts (bière N 7) contient 5,2 g de farine de riz et 0,12 g/l de farine de malt, tandis que l'autre(bière N 8) contient deux fois plus de chaque farine. On fait fermenter les moûts comme précédemment décrit. Les additions de grains à la bière N 7 sont calculées pour fournir ,4 U/l de pullulanase et 140 U/l de diastase de malt, basées sur une extraction telle que décrite aux exem- ples 3 et 6-A, respectivement. Les résultats obtenus avec les bières NO 7 et 8 montrent que les deux bières sont allégées au marne taux que le témoin à la glucoamylase (bière N 2) et que les bières décrites aux exemples 7-11, o on emploie des extraits d'enzymes. - EXEMPLE 12 - Emploi de la pullulanase de riz avec la 1lucoamylase pour diminuer la durée de ferment ationo On utilise le moût pour faire 5 fermenta- tions distinctes. Tous les moûts sont aérés et ensemen- cés, après quoi on ajoute la pullulanase de riz (2,0 U3/1; 40 U/1 ou 8,1 U/1) et la glucoamylase (3,8 U/1 ou 15,3 U/1). Les résultats obrenus montrent que l'addition de pullulanase de riz diminue notablement la durée de fer- mentation, par rapport au témoin à la glucoamylase, mê- me pour les concentrations réduites de glucoamylase (bières NO 11 et 12) ou de pullulanase (bière NO 13). - EXEPNLE 13 - Conversion du moût tout au malt, avant la flermentation avec les pullulanase de riz et 0-amylase de malt. On obtient un moût tout malt, après l'ébul- lition en bouilloire. On convertit 3 échantillons de mo t avec la Pamylase de malt (1450 U/1) combinée à des concentrations décroissantes de pullulanase de riz (150 U/1; 75 'U/1 et 38 U/1). On convertit un autre échantillon de moût en utilisant la pullulanase de riz combinée avec la glycoamylase. Le processus employé est le même dans tous les cas. On équilibre les moûts à 600C en les agitant dans un bain d'eau. On laisse l'incubation se poursuivre pendant 30 mn, puis on les introduit dans un flacon placé dans un bain d'eau bouillant vigoureusement. On les y laisse pendant 2 h pour désactiver les enzymes. On refroidit alors les moûts et on centrifuge. On ajuste le rapport malt/sirop ajouté, au même taux que pour les moûts des Exemples 7 - 12. Les moûts sont alors ensemencés, aérés et on les fait fer- menter comme décrit à l'Exemple 7. Les bières sont superallégées, relative- ment au témoin dénué d'enzyme (bière N 1). Lorsqu'on les conditionne à 3,3 e6 d'éthanol, la teneur en calo- ries de ces bières est d'environ 98 cal, soit 10 cal de moins que pour la bière N 1, sans addition d'enzyme. - EXEDILE 14 - Addition d'amlases de grains des biè- res préconverties. Etant donné que les bières de l'Exemple 13 sont moins superallégées que les bières des Exemples 7-12, on ajoute diverses enzymes afin de déterminer si la limite d'allègement peut être diminuée. On sépare la levure de la bière N 14 par centrifugation et on divise la bière clarifiée en deux portions égales, désignées par 14A et 14B. On réensemence les deux bières. A la biè- re N 14A on ajoute 140 U/1 de P-amylase du malt et à la bière N 14B on ajoute 15,3 U/l de la pullulanase de riz et 140 U/1 de P-amylase de malt. On continue alors les fermentations à 15 C. Les bières N 15A et 16A ne sont pas réen- semencées. Au lieu de cela, on injecte directement les enzymes dans les bières en fermentation. A la bière N 15A on ajoute 15,3 U/1 de pullulanase de riz et à la bière N 16A on ajoute 15,3 U/l de pullulanase de riz et 140 U/l de P-amylase de malt. L'addition de la 1,4-carbohydrase, P-amyla- 2461746, se de malt ne réduit pas sensiblement le poids spécifi- que (bière N 14A) ce qui suggère que la plus grande partie des sucres non fermentescibles contient des liaisons a 1,6. Au contraire, la P- amylase de malt, combinée avec la pullulanase de riz (bières NI 14B et 16A) ou la pullulanase de riz seule (bière N 15A), superallègent les bières au même taux que le témoin à la glucoamylase (bière N 2) ou les bières décrites aux exemples 7-12. - EXEMPLE 15 - Addition de pullulanase de riz au mont au début du cycle de brassage. On ajoute de la pullulanase de riz, prépa- rée comme décrit à l'Exemple 3, à 400 ml de la première eau, à une concentration finale de 520 U/l à 4600 C. Puis on forme une pâte avec 129, 6 g de malt et on soumet le brassin au cycle suivant de brassage: (1) 4600 C pendant mn; et (2) 6000 C pendant 2 h. On cesse le brassage à 77 C, puis on sépare le grain épuisé, par filtration sur une mousseline à fromage. On clarifie le premier moût par centrifugation, on dilue et on le place dans un bain d'eau bouillante pendant 2 h. Toutes les opéra- tions suivantes sont semblables à celles décrites à l'Exemple 11. A la fin de la fermentation de cette bière, son poids spécifique final est de 1,0019 (0,490P), com- parativement à 1,0029 (0,75 P) pour la bière témoin N 1, sans enzyme, décrite à l'Exemple 7. On voit que l'incorporation de la pullulanase de riz au brassin ré- duit la limite d'allègement de 0,26 P. Le riz utilisé comme source de l'enzyme de l'invention est un riz de qualité alimentaire, traité dans des conditions assez douces pour préserver l'acti- vité enzymatique. On peut utiliser soit du riz d'ense- mencement, soit du riz glacé broyé à sec. On peut extrai- 2 461746 re l'enzyme d'une grande variété de riz, comprenant les riz Labelle, Le Bonnet, Nato, Starbonnet ou Brazos. Cependant, le riz glacé commercial de brasserie, broyé sec est préféré. Si l'enzyme est extraite du riz avant son emploi dans le procédé de l'invention, on peut utiliser le riz épuisé, dont l'enzyme a été extraite, comme source d'amidon dans le brassage ou pour des composi- tions de sirop auxiliaire, ce qui rend l'emploi de l'enzyme de riz plus économique. - Bien que l'enzyme dégradante de riz soit appliquée, comme décrit cidessus, à la préparation d'une bière pauvre en calories ou superallégée, d'au- tres applications sont possibles. On peut, par exemple, avantageusement utiliser un mélange de l'enzyme dégra- dante du riz avec une disstase de grain pour préparer un produit de conversion de l'amidon, d'une teneur élevée en maltose. En raison de son origine naturelle, l'enzy- me dégradante de riz convient sans aucun doute pour son emploi dans les produits alimentaires. Bien entendu l'invention n'est nullement limitée aux exemples cités. Elle est susceptible de nombreuses variantes suivant les applications envisagées, sans qu'on s'écarte pour cela de son cadre. 24 61 7 46 Liste des références 1. LIiller, G. Anal. %hem. 31, 964, 1959. 2. Bernfield, P. "Advances in Enzymology XII" (Nord, F., ed.) 379 Intersciences Publishers, New York, 1951. 3. Pazur, J. "Methods in Enzymology" XXVIII, Ginsberg, V. (ed.) 931, Academic Press, 1975. 4. Kneen, E. (ed.). "Alcohol Determined Refracto- metrically"l in Methods of Analysis of the American Society of Brewing Chemists, 7th Revised edition, published by the Society, 1976. 5. Olshausen, J. Brewers Digest 27, 45, 1952. 6. Olshausen, J. Brewers Digest 27, 53, 1952. 7. Helbert, J. R. J. Amer. Soc. Brew. Chem, 8. Martinelli, L. (Chairman) ASBC Journal 35, p. 104, 1978. 9. Scobell, H., Brobst, K. et Steele, F, Cereal Chem. 54, p. 905, 1975. REVEIDICATIONS 1) Procédé amélioré de fabrication d'une bière superallégée par fermentation d'un moût de bras- sage avec de la levure, caractérisé en ce qu'on ajoute une pullulanase de riz en une quantité efficace pour réduire la quantité des dextrines résiduelles dans l'extrait réel, par coupure des liaisons a 1,6 des dextrines finales pour former des dextrines 1,4, qui sont converties par des 1,4 carbohydrases en sucres fermen- tescibles, qui sont fermentés par la levure en alcool. 2) Procédé selon la revendication 1, ca- ractérisé en ce qu'on ajoute la pullulanase de riz en une quantité efficace au moût. 3) Procédé selon la revendication 2, ca- ractérisé en ce qu'on ajoute la pullulanase de riz au moût avant la fermentation. 4) Procédé selon la revendication 2, caractérisé en ce qu'on ajoute la pullulanase de riz au moût pendant la fermentation. 5) Procédé selon la revendication 2, ca- ractérisé en ce qu'on ajoute la pullulanase de riz au moût, par addition de riz contenant la pullulanase, au moût. 6) Procédé selon la revendication 2, ca- ractérisé en ce qu'on ajoute la pullulanase de riz au moût sous forme d'une enzyme purifiée extraite du riz. 7) Procédé selon la revendication 2, ca- ractérisé en ce que la quantité de pullulanase de riz ajoutée est d'environ 15 à 60 unités de pullulanase par litre de moût. 8) Procédé selon la revendication 2, *46iT46 caractérisé en ce qu'on ajoute la pullulanase de riz en une quantité efficace pour réduire la quantité de dextrines résiduelles dans l'extrait réel, d'environ à 80%. 9) Procédé selon la revendication 2, ca- ractérisé en ce qu'on ajoute la pullulanase de riz en une quantité d'environ 2 à 60 unités d'activité pul- lulanase par litre de moût. ) Procédé selon la revendication 2, ca- ractérisé en ce qu'on ajoute une 1,4 carbohydrase au moût pour convertir les î 1,4 dextrines formées par la pullulanase de riz en sucres fermentescibles, que l'on peut faire fermenter par la levure en alcool.