FR 2466252 A2 19810410 FR 7924655 A 19791003 ta présente invention concerne de nouveaux produits ayant notamment des propriétés anticancéreuses. Dans la demande de brevet d'invention déposée le 28 septembre 1978 sous le nO 78 27838, la demanderesse a décrit des produits anticancéreux constitués par couplage d'un agent cytotoxique la channe A de la Ricine avec une immunoglobuline spécifique d'antigènes portés par des cellules cancéreuses. Ces produits désignés par le terme "conjugués" étaient préparés par formation d'un pont disulfure entre le groupe thiol libre éventuellement activé sous forme de disulfure de la channe A de la Ricine et une immunoglobuline dans laquelle on a introduit un ou plusieurs groupes thiol ou un ou plusieurs groupes disulfure activé. La présente addition a pour objet divers perfectionnements apportés à la méthode décrite dans la demande principale ainsi que la préparation de nouveaux conjugués selon cette méthod Le premier perfectionnement concerne la préparation de la channe A de la Ricine. La méthode indiquée dans la demande principale conduisait à une solution diluée de channe A de Ricine. I1 a été trouvé qu'en soumettant cette solution à une étape de concentra tion sur support C.M.Sepharose &commat; combinant les effets d'échange d'ion et d'affinité, on peut obtenir une solution présentant à la fois une concentration élevée et une très grande pureté. En outre, une telle solution laisse déposer par refroidissement la channe A sous forme cristallisée. La chaîne A ainsi préparée est dépourvue de toxicité non spécifique envers des systèmes cellulaires ou des organismes animaux et est donc utilisable pour la confection de conjugués dont la spécificité est strictement apportée par l'anticorps. Par ailleurs, la présente demande décrit la préparation de nouveaux conjugués. Ces nouveaux conjugués sont de différents types - conjugué entre la channe A de Ricine et l'anticorps anti-DNP obtenu par fixation sur l'anticorps d'un réactif de type disulfure différent de celui utilisé dans la demande principale. Dans celle-ci, le réactif utilisé était l'acide (pyridyl-2 disulfanyl)-3 propionique alors que dans la présente demande il s'agit de l'acide ((pyridyl-2 disulfanyl)-3 propîonylaminoj-6 hexanotque ; - conjugué entre la chaine A de Ricine et un fragment F (ab)'2 d'anticorps.Ces fragments d'anticorps F (ab)'2 contenant les sites de reconnaissance suffisent pour assurer la spécificité des conjugués - conjugué entre la channe A de Ricine et une immunoglobuline du type M (IgM) dont la spécificité anticorps est la reconnaissance de la forme allélique 1,2 de l'alloantigène Thy porté notamment par les cellules de certaines lignées lymphotdes cancéreuses Lture, 209, n 5022, 521 (1966)]. Les exemples suivants illustrent l'invention. EXEMPLE 1 Concentration de la channe A de Ricine. La chaine A obtenue en solution diluée selon l'exemple 2 du brevet principal est déposée sur une colonne de chromatographie de diamètre intérieur 16 mm contenant 10 ml de Carboxyméthyl Sepharose # équilibrée avec le même tampon. Dans ces conditions, la channe A se fixe ; elle est ensuite éluée avec le tampon TPE. La récupération est quantitative. Un d.Sptt de 150 mg de channe A permet d'éluer des fractions à la concentration moyenne da 10 mg/ml en channe A, représentant au total 90 % de la quantité déposée sur la colonne. La solution concentrée de -chaine A ainsi obtenue présente une pureté supérieure à celle qui résultait de l'application du protocole décrit dans la demande principale, ainsi que cela sera démontré dans le chapitre "Résultats". Obtention de cristaux de-chatne A. Une solution de chaîne A de concentration égale à 10 mg/ml est abandonnée à 40C. I1 apparaît après quelques jours des cristaux dont l'analyse, après redissolution, révèle qu'ils .possèdent les memes propriétés physicochimiques (poids moléculaire, point isoélectrique) et biologiques (inhibition de protéosynthèse) que la chaîne A en solution dont ils sont issus. EXEMPLE 2 Préparation du conjugué obtenu à partir d'anticorps anti-DNP substitué par un groupe disulfure activé et de chaîne A de Ricine. a) Acide [(pyridyl-2 disulfanyl)-3 propionyl amino]-6 hexanoiSue. Cet acide s'obtient en 2 étapes à partir de l'acide (pyridyl-2 disulfanyl)-3 propionique sans purification du produit intermédiaire. 0,430 g de l'acide (pyridyl-2 disulfanyl)-3 propionique obtenu comme décrit dans l'exemple 6 a) de la demande principale est dissous dans 3 ml de pyridine. La solution est refroidie dans un bain de glace. A cette solution, sont ajoutés 0,230 g de N-hydroxysuccinimide en poudre puis 0,453 g de dicyclohexyl carbodiimide également an poudre. Le mélange est agité pendant 20 h à 40C. Le milieu réactionnel est filtré pour éliminer le précipité de dicyclohexylurée formé, le précipité est lavé å la pyridine. La solution de lavage est jointe au filtrat puis la pyridine est évaporée à siccité sous vide poussé. Le résidu obtenu est repris dans l'acétate d'éthyle un nouveau précipité de dicyclohexylurée se forme ; il est éliminé par filtration.L'acétate d'éthyle est évaporé a siccité sous vide poussé puis l'opération de lavage à l'acétate d'éthyle est reprise deux fois. On obtient ainsi 0,610 g de l'ester attendu. Le produit obtenu est dissous en totalité dans 5 ml de tetrahydrofurane. A cette solution, sont ajoutés 0,288 g d'acide amino-6 caprotque en solution dans 2,5 ml d'eau. De la triéthylamine est ajoutée en quantité stoéchiométrique par rapport b l'acide amino-6 caproîque (0,222 g) pour maintenir le pE a 7,0. ta réaction est poursuivie 20 h à 40C sous agitation. Le milieu réactionnel est évapore a siccité sous vide poussé. Le résidu est repris par 10 mi d'eau. Le milieu est acidifié jusqu'd pH 4,5 par addition d'acide acétique. Il se forme un précipité qui est récupéré par décantation puis solubilisé dans l'acétate d'éthyle. La solution est séchée par le sulfate de magnésium puis filtrée et évaporée a siccité-sous vide poussé. On obtient 0,600 g du produit à purifier. La purification est opérée par chromatographie de partage sur colonne de silice, dans des conditions définies par analyse du produit en chromatographie sur couche mince dans un mélange acétone-chloroforme-acide acétique (15-80-5). 0,410 g du produit obtenu sont déposés sur une colonne de diamètre intérieur 2 cm contenant 160 ml de gel de silice (nO 60, 60-230 mesh MERCK) équilibrée- avec le chloroforme. L'élution est opérée en gradient discontinu de méthanol dans le chloroforme le produit pur est élué avec le mélange à 2 Z de méthanol. Les solvants sont évaporés a siccité sous vide poussé. Le produit obtenu, jaune pale et de consistance p teuse, est caractérisé par son spectre de résonance magnétique nucléaire. b) Préparation d'anticorEs anti-DNP activés. A 9 ml de la solution d'anticorps anti-DNP à la concentration de 11,4 mg/ml dans le tampon TPE, sont ajoutés 9 ml d'un mélange eau/t.butanol 2/1 (v/v) contenant 5,3 mgd'éthyl-l (dimé thylamino-3 propyl > -3 carbodiimide et 13,7 ma :.Î1icide ((pyrtdyl-2 disulfanyl)-3 propionylamino]-6 hexanoique. Les opérations sont ensuite menées comme décrit dans l'exemple 6 de la demande principale. Le dosage des anticorps activés indique un taux moyen de substitution de 0,6 groupement activateur par mole d'anticorps. La solution d'anticorps ainsi obtenue est concentrée par ultrafiltration jusqu'a 11,1 mg/ml. c) Conjugué 48,8 me d'anticorps modifiés sont mis en réaction avec 35,6 mg de la chaîne A de Ricine a 7 > 9 mgXml dans le tampon TPE. la préparation est menée dans les conditions dojà écrites dans l'exemple 6 de la demande principale. Le taux de couplage moyen obtenu est de 0,5 chaîne A par mole d'anticorps. La purification du conjugua par filtration est effectuée comme décrit dans l'exemple 6 du brevet principal. EXEMPLE 3 Préparation du conjugué obtenu à partir du fragment F(ab)'2 de l'anticorps anti-DNP et de la chaîne A de Ricine. a) Préparation du fragment F(ab)' da l'anticorps anti-DNP. 2 La solution d'anticorps (exemple 4 de la demande principale) est dialysée contre le tampon acétate 120 mM pH 4,7. A 45 ml da cette solution contenant 500 mg d'anticorps, on ajoute 3 ml d'une solution de pepsine à la concentration de 10 mg!ml dans le meme tampon (Pepsine E.C. 3.4.4.1. de porc, 2 fois cristallisée, à 3200 u/mg SIGMA). L'incubation est maintenue pendant 20 h à 370C ; l'avancement de l'hydrolyse est vérifié en électrophorèse en présence de dodécyl sulfate de sodium [J. Biol. Chem. 244, 4406-4412, (1969)] par disparition de la bande à 150000 dalton correspondant à l'anticorps non hydrolysé. L'hydrolyse est arrêtée par ajustement du pH du milieu réactionnel à 7,0 à l'aide d'une solution de soude 1 N puis la solution est centrifugée et l'insoluble éliminé. Le surnageant de centrifugation est déposé sur une colonne de diamètre intérieur 50 mm contenant 1800 ml de Sephadex G 1,08équilibrée avec le tampon phosphate 100 mM pH 7,0. L'élution est effectuée avec le même tampon : le premier pic obtenu est recueilli en deux fractions ; la première (200 ml) renferme 70 mg de fragment F(ab)' de l'anticorps, la deuxième (100 ml) 2 ticorps, renferme 70 mg d'un mélange de fragment F(ab)'2 et d'un fragment contaminant de poids moléculaire 50000 dalton. Le deuxième pic contient des fragments protéiques de poids moléculaire moyen 10000 dalton il est écarté. Le fragment F(ab)'2 obtenu pur dans la première fraction du premier pic est concentré par ultrafiltration (protocole décrit dans l'exemple 1 de la demande principale) jusqu'à la concentration de 16 mg/ml et conservé à - 200C. Le fragment F(ab)'2 ainsi obtenu présente les caracteris- tiques suivantes . Poids moléculaire: 95000 dalton (déterminé après étalonnage du R gel Sephadex G 150 ). . Poids isodlectrique: compris entre pH 7,7 et 8,8 (obtenu par isoélectrofocalisation sur plaque LKB). b) Préparation (ab) ' du fragment F(ab)' activé. 2 A 15 ml de la solution F(ab)'2 à la concentration de 15,6 mg/ml sont ajoutés 15,3 ml d'un mélange eau/t.butanol 2/1 (v/v) contenant 17,3 mg d'éthyl-l (diméthylamino-3 propyl)-3 carbodiimide et 50,4 mg d'acide (pyridyl-2 disulfanyl)-3 propionique. Le mélange est incubé pendant 20 h à 300C. La solution est ensuite dialysée en continu contre le tampon TPE à 40Cpendant 23 h à un débit de 500 ml/h. Le dosage spectrophotométrique à 343 nm de la pyridine thione-2 libérée par échange avec le glutathion réduit montre que l'activation du fragment F(ab)'2 a conduit au taux moyen de substitution de 1,5 groupements activateurs par mole de F(ab)'2. La solution de F(ab)'2 activé ainsi obtenue est concentrée par ultrafiltration jusqu'à 10 mg/ml. c) Conjugue. A 13,8 ml de la solution à 10 mg/ml en F(ab)' activé 2 obtenue comme décrit ci-dessus, sont ajoutés 13,8 ml de solution de chaîne A de Ricine à 8 mg/ml dans le tampon TPE. Le mélange est incubé à température ambiante pendant 24 h sous atmosphère d'azote et a l'abri de la lumière. ta solution est ensuite centrifugée à 27000 x g, à 40C pendant 10 min et le surnageant récupéré. Le dosage de la pyridine thione-2 libérée au cours de la réaction indique que le taux moyen de couplage est de 1,2 équivalent de chaîne A par mole de F(ab)'2. La solution est déposée sur une colonne de diamètre intérieur 50 mm contenant 1730 ml de Sephadex G 200# L'élution est effectuée avec le tampon TPE. Les fractions sont recueillies sous un volume de 8,4 ml et l'analyse des fractions est effectuée comme décrit dans les exemples 5 et 6 de la demande principale. Le produit de conjugaison sort en un pic. Las fractions composant le pic du conjugué sont regroupées en trois solutions qui sont respectivement - Solution f : front du pic - Solution g : partie centrale du pic ; - Solution h : queue du pic. L'analyse de la solution g par le dosage de son activité inhibitrice de la protéosynthèse (test 1) et le dosage des protéines donne les résultats suivants /ug de chaîne A Equivalent de couplée à F(ab)'2 chaîne A par par ml de solution mole de F(ab)'2 Solution g 148 1,4 d) Concentration du conjugué. En une première étape, la concentration est effectuée par ultrafiltration : 255 ml de la solution g du conjugué (à 1481ug/ml en chaîne A) sont ainsi concentrés jusqu'à 381/ug/ml. La solution est ensuite diluée 10 fois dans l'eau distillée afin d'abaisser la force ionique du milieu. La solution obtenue (400 ml à 38/ug/ml en chaîne A) est déposée sur une colonne de diamètre intérieur 9 mm contenant 5,7 ml de C. M. Sepharose(Jéquilibrée avec le tampon phosphate 10 mM pH 6,5 additionné de sel disodique de l'acide éthylènediaminotétracé tique 1 n . Le dépôt est effectué au débit de 80 ml/h. Dans ces conditions, la totalité du conjugué se fixe sur la colonne. A la fin du dépôt, on laisse passer 4,5 ml du même tampon puis l'élution du conjugué est réalisée avec le tampon TPE, au même débit. te conjugué sort en un seul pic. La queue du pic, contenant peu de protéines, est écartée ; les fractions restantes sont regroupées et la concentration en chaîne A est déterminée. Le dosage indique que l'opération de concentration sur C.M. Sepharose(B)a a permis de porter la concentration de la chaîne A du conjugué à 3,6 mg/ml. L'opération est quantitative et les fractions composant la solution à 3,6 mg/ml représentent au total 76 % de la quantité de conjugué déposé sur la colonne. EXEMPLE 4 Préparation du conjugué obtenuà partir de l'anticorps IgM anti-Thy 1.2 et de la chaîne A de Ricine. a) Préparation de l'anticorps IgM anti-Thy 1.2 L'IgM pure est préparée à partir du liquide d'ascite obtenu auprès de OLAC LTD (Thy-l.2 F7 D5 monoclonal IgM cytotoxic antibody). A 50 ml de liquide d'ascite contenant l'anticorps sont ajoutés 15 g de sulfate d'ammonium en poudre. Après dissolution, le mélange est incubé pendant 1 h à 40C puis l'ensemble est centrifugé pendant 20 min à 17000 x g. Le surnageant de centrifugation est écarté. Le culot est dissous dans 20 ml de tampon phosphate 100-mM pH 7,0 puis la solution est dialysée en continu contre 10 1 du meme tampon. La solution obtenue est déposée sur une colonne de diamètre intérieur 50 mm contenant 1800 ml de Sepharose 6B# équilibrée avec le tampon phosphate 100 mM pH 7,0. L'solution est effectuée avec le même tampon : le pre mies pic obtenu correspond à des agrégats d'IgM. Le deuxième pic obtenu est recueilli en deux fractions : la première fraction (du front jusqu'au sommet du pic) est composée d'IgM pure ; la deuxième fraction renferme un mélange de l'IgM et d'une protéine contaminante de poids moléculaire évalué à environ 660000 dalton.Cette deuxième fraction est traitée à nouveau par le sulfate d'ammonium et le pré- cipité obtenu est centrifugé puis redissous dans le tampon phosphate 100 mM pH 7,0. La solution obtenue est déposée sur la colonne de Sepharose 6B(X)convenablement lavée après la première opération. L'élution par le tampon phosphate 1130 mM pH 7,0 donne lieu, comme lors de la première opération, à l'apparition de deux pics. Le deuxième pic obtenu contient l'I M pure. Chacune des deux opérations de filtration sur Sepharose 6B R a ainsi permis d'obtenir une fraction renfermant l'IgM pure. Ces deux fractions sont réunies puis l'ensemble est traité par le sulfate d'ammonium à la concentration finale de 300 mg/ml, à 40C ; la préparation est centrifugée pendant 20 min à 17000 x g puis le culot est repris dans le tampon phosphate 100 mM pH 7,4 additionné de chlorure de sodium 400 mM. L'ensemble des opérations permet de préparer 8 ml d'une solution à 6,4 mg/ml d'IgM pure. L'analyse en électrophorèse en présence de dodécylsulfate de sodium a été utilisée pour caractériser les fractions ; l'IgM pure ainsi obtenue présente à l'analyse 2 bandes très proches, d'intensités égales, correspondant aux poids moléculaires très voisins de 900000 dalton. b) Préparation de l'anticorps anti-Thy 1.2 activé. A 7,6 ml de la solution d'IgM à la concentration de 7,0 mg/ml sont ajoutés 0,46 ml d'un mélange eau/t.butanol 1/5 (v/v) contenant 2,9 mg d'éthyl-l(diméthyl3mino-3 propyl)-3 carbodiimide et 7,7 mg d'acide (pyridyl-2 disulfanyl)-3 propionique. Le mélange est incubé pendant 20 h à 300C. La solution est ensuite dialysée en continu contre le tampon phosphate 100 mM pH 7,4 additionné de chlorure de sodium 400 mM et du sel disodique de l'acide éthylènediaminotétracétique 1 mM. La dialyse est poursuivie pendant 23 h à 4 C à un débit de 500 ml/h. La solution est ensuite centrifugée à 27000 x g à 40C pendant 10 min et le surnageant récupéré.Le dosage spectrophotomé trique à 343 nm de la pyridine thione-2 libérée par échange avec le glutathion réduit montre que l'activation de l'anticorps a conduit au taux moyen de substitution de 13 groupements activateurs par mole d'IgM. c) Conjugue. La solution de chaîne A obtenue, comme décrit dans l'exemple 1, est dialysée en continu contre le tampon phosphate 100 mM pH 7,4 additionné de chlorure de sodium 400 mM et de sel disodique de l'acide éthylènediaminotétracétique 1 mM ; la dialyse est menée à un débit de 500 ml/h pendant 20 h à 40C. A 6,8 ml de la solution d'IgM activée obtenue comme décrit ci-dessus, sont ajoutés 3,9 ml de chaîne A dialysée, à la concentration de 7,4 mg/ml. Le mélange est incubé pendant 24 h à température ambiante, sous atmosphère d'azote et à l'abri de la lumière. te dosage de la pyridine thione-2 libérée au cours de la réaction indique que le taux moyen de couplage est de 9,7 équivalents de chaîne A par mole d'IgM. La solution est déposée sur une colonne de diamètre intérieur 50 mm contenant 1727 ml de Sepharose 6B(E)équilibrée avec le tampon de conjugaison. L'élution est menée avec le meme tampon. Les fractions sont recueillies sous un volume de 3,7 ml et l'analyse des fractions est effectuée comme décrit dans les exemples 5 et 6 de la demande principale. Le produit de conjugaison sort en deux pics le premier correspond au conjugué de poids moléculaire moyen supérieur à celui de l'IgM ; le second pic correspond au conjugué de poids moléculaire moyen approximativement équivalent à celui de l'IgM. La partie centrale de ce pic (solution i) est retenue. La composition du conjugué de la solution i correspond aux caractéristiques suivantes /ug de chaine A Equivalents de couplée a 1'IgM chaîne A par ml de solution par mole d'IgM Solution i Les conjugués selon l'invention ainsi que les composés utilisés dans l'élaboration desdits conjugués ont été étudiés en ce qui concerne leurs propriétés biologiques et particulièrement leur action anticancéreuse. Les différents tests utilisés sont indiqués ci-après. TESTS IN VITRE 1 - Inhibition de la protéosynthèse en modèle acellulaire; Test décrit dans la demande principale. 2 - Inhibition de la protéosynthèse en modèle cellulaire Dans le cas de conjugué à spécificité anti-DNP, ce test a été décrit dans la demande principale. Pour le conjugué à spécificité anti-Thy 1.2., les cellules utilisées sont: de la lignée WEHI-7 (lymphome de souris Balb/C) obtenue auprès du SALK INSTITUTE - SAN DIEGO (Californie). Ces cellules ne subissent aucune étape de marquage car elles portent naturellement l'antigène Thy 1.2. à leur surface. L'incubation avec le conjugué puis la mesure du taux de protéosynthèse se déroulent comme décrit précédemment. RESULTATS Chaîne A : La La solution concentrée de chaîne A dans le tampon TPE, préparée comme décrit dans l'exemple 1, est soumise au dosage de son activité d'inhibition de protéosynthèse sur système acellulaire (test 1) et sur système cellulaire (test 2). L'activité de la chaîne A dans le test 1 est identique à celle mesurée sur la préparation de chaîne A décrite dans la demande principale, ce qui indique que la propriété biologique intrinsèque de la chaîne A n'est pas changée par l'étape de concentration sur C.M. Sepharose Les résultats des dosages selon le test 2 sont présentés dans le tableau ci-dessous Expression Rapport d'acti de Ricine Chaîne A vité Ricine/ l'activité chaîne A Chaîne A préparée comme décrit dans la 8 demande principale 5.10 1250 (rappel) CI50 en 4.10'11 mole/litre Chaîne A ayant subi -8 la concentration sur 68,6.10 17150 C. M. Sepharose Ces résultats indiquent que l'étape de concentration sur C.M. Sepharose permet d'abaisser encore la toxicité non spécifique de la chaîne A par une augmentation notable de la pureté de la préparation. La chaîne A purissime ainsi produite est dépourvue de toxicité non pacifique envers un système cellulaire ; ceci est clairement montré par le rapport d'activité entre la Ricine et la chaîne A dans ce test, qui est supérieur a 10000. Des essais d'absorption exhaustive de la chaîne A ont été menés en utilisant successivement des excès de cellules Hela et d'hématies mises en contact de la chaîne A et en mesurant la toxicité cellulaire de la chaîne A dans le surnageant- d'absorption (test 2) - la toxicité cellulaire de la solution de chaîne A préparée, comme décrit dans la demande principale, est abaissée par absorption et ramenée ainsi au niveau de la toxicité de la solution de chaîne A concentrée sur C.14. Sepharose et non absorbée ; - au contraire, la toxicité de la préparation concentrée sur C.M. Sepharose n'est plus diminuée par les essais d'absorption, ce qui confirme l'absence totale d'affinité de la chaîne A ainsi préparée envers les membranes plasmiques des cellules et, par voie de conséquence, le degré extreme de pureté obtenu. Conjugués : La toxicité spécifique des conjugués a été dosée dans le test 2 et les résultats portés sur les figures 1 et 2. Ces figures représentent respectivement - pour la figure 1 l'inhibition de l'incorporation de C-leucine dans les cellules Hela et Hela-TNP ; en 14 ordonnée on a porté l'incorporation de C-leucine en pour cent et en abscisse les concentrations (nM) de chaîne A ; les diverses courbes représentent les ré sultats obtenus pour 11 . la Ricine : CI50 (en chaîne A) 5,5.1O M. (1) . la chaîne A : CI50 (en chaîne A) 9.10 7 M. (2) . conjugué (solution g) sur Hela : CI50 (en chaîne A) non déterminable(3) (supérieure à 10-5 M) sur Hela-TNP :CI50 (en chaîne A) 4,5.10 -9 M. (4) - pour la figure 2 l'inhibition de l'incorporation de 14C-leucine dans les cellules wEHI-7 ; en ordonnée on 14 a porté l'incorporation de C-leucine en pour cent et en abscisse les concentrations (nM) de chaîne A ; les diverses courbes représentent les résultats obtenus pour -11 . la Ricine : CI50 (en chaîne A) 2,4.10 M. (1) la chaîne A : CI50 (en chaîne A) 8,1.10'7 M. (2) . IgM pure (les concentrations d > IgM sont reportées à la même échelle que les concentrations de chaîne A) non déterminable. (3) Conjugué -11 (solution i) : CI50 (en chaîne A) 5,2.10 M. Le conjugué formé à partir de la chaîne A de Ricine et du fragment F(ab)'2 d'IgG anti-DNP présente une forte toxicité envers les cellules llela-TNP (figure 1). Cette toxicité est assortie de la spécificité d'action puisque le rapport des activités envers cellules Hela portant et ne portant pas le TNP est supérieur à 2000. L'utilisation des fragments d'anticorps portant les sites de liaison à l'antigène permet donc d'assurer l'efficacité et la spécificité des conjugués qui en sont issus. Le conjugué formé à pâtir de la chaîne A de Ricine et de l'IgG anti-DNP, en utilisant comme activateur de l'IgG l'acide (pyridyî-2 disulfanyl)-3 propionylamino]-6 hexanoîque, a une toxicité et une spécificité identiques à celles du conjugué préparé dans l'exemple 6 de la demande principale. L'établissement du pont disulfure entre l'IgG et la chaîne A par l'intermédiaire de ce type de molécule activatrice aboutit donc à des conjugués efficaces et spécifiques. Le conjugué formé à partir de la chaîne A et de ltIgM srfti-Thy 1.2 présente une très haute toxicité envers les cellules cancéreuses portant cet antigène (figure 2). La spécificité d'action est très grande (rappor-t supérieur à 10000 entre l'activité du conjugué et celle de la chaîne A). I1 est ainsi démontré que l'établissement du pont disulfure entre la chaîne A et un anticorps spécifique d'un antigène naturellement porté par des cellules cancéreuses permet la destruction des cellules cancéreuses avec une très grande efficacité et une spécificité d'action importante. TEST IN VIVO Le conjugué préparé dans l'exemple 4 a été testé pour son activité anticancéreuse in vivo. Les cellules cancéreuses utilisées sont de la lignée WEHI 22.1 (obtenue aupres du SALK INSTITUTE-SAN DIEGO - Californie) provenant d'un lymphome de souris Balb/C. Elles sont injectées à des souris Balb/C obtenues auprès de B051OLTGAARD (Danemark) et maintenues depuis leur naissance et pendant la durée du test en zone indemne d'organismes pathogènes spécifiques (SPF). Dans le test, les cellules WEHI 22.1 maintenues en culture continue sont collectées au troisième jour après repiquage de la culture, lavées par centrifugation et resuspendues dans un tampon phosphate isotonique (PBS) à la concentration de 12.106 cellules/ml. 0,2 ml de la suspension est injecté par voie intrapéritonale aux souris au préalable réparties au hasard dans leurs cages et repérées individuellement par marquage des pattes. Chez les souris non traitées par le conjugué, l'injection intrapéritonéale de cellules wEHI 22.1 est suivie du développement de ces cellules en tumeurs dispersées dans le péritoine avec formation d'un ascite. Le développement des cellules s'accompagne d'une augmentation du poids corporel. L'ascite est détecté par l'observation de l'augmentation du volume abdominal. Une heure après injection des cellules, les animaux traités par le conjugué reçoivent intrapéritonéalement 1 ml de solution du conjugué (solution i, 23,7/ugjml en chaîne A) préalablement dialysée extensivement contre le tampon PBS puis stérilisée par filtration. Les lots d'animaux témoins reçoivent 1 ml de tampon PBS ne contenant pas de conjugué. Au septième jour apres inoculation des cellules, les animaux traités reçoivent une deuxième injection de conjugué dans les mêmes conditions et les animaux témoins une deuxième injection de tampon PBS. Les résultats du test apparaissent sur les figures 3 et 4. La figure 3 décrit la chronologie de l'apparition des ascites chez les animaux traités et non traités ; on a porté en ordonnée le pourcentage des animaux présentant un ascite et en abscisse le nombre du jours après l'inoculation des cellules WEHI 22.1. La courbe en trait plein représente les résultats obtenus sur animaux traités et la courbe en traits discontinus les résultats obtenus sur animaux non traités. La figure 4 montre l'augmentation moyenne de poids (en g) corporel (la ligne de base correspond au poids des animaux avant l'inoculation) en fonction du nombre da jours après l'inoculation des cellules WEHI 22.1. Cette évolution du poids est exprimée par rapport au poids de ces mêmes animaux 3 jours avant l'inoculation des cellules. La courbe en trait plein correspond aux résultats obtenus sur des animaux traités et la courbe en trait discontinu les résultats obtenus avec des animaux non traités. L'ajustement linéaire est fait selon la méthode des moindres carrés. L'interprétation des résultats est donnée dans le tableau suivant Coefficient Pente Ecart type Animaux de témoins Pente 0,54 type Animaux traités t 0 > 89 0.64 0 > 04 La figure 3 fait état d'une inhibition de la formation des ascites chez les animaux traités par le conjugué ; cette inhibition se traduit par un décalage dans l'apparition des ascites. Sur la figure 4, on cons ta te également une inhibition de l'augmentation de poids corporel chez les animaux traités par le conjugué par rapport aux animaux témoins. Ces observations sont validées par l'analyse statistique des résultats - l'inhibition par le conjugué de la formation des ascites est significative au seuil de confiance de 1 % (test X2) - l'inhibition par le conjugué de l'augmentation pondérale est significative au seuil de confiance 5 % (test de comparaison des pentes des ajustements linéaires), Le test in vivo permet de démontrer l'activité anticancéreuse du conjugué formé à partir de la chaîne A de Ricine et de l'îgM anti-Thy 1.2. Cette activité est révélée par l'inhibition du d, veloppen)ent de cellules cancéreuses WERI 22.1 injectées à la souris Balb/C. REVENDICATIONS 1 - Procédé de préparation de produits cytotoxiques en provoquant la formation d'une liaison covalente au moyen d'un pont disulfure entre un composé cytotoxique, la chaîne A de la Ricine, et un anticorps, une immunoglobuline ou une fraction d'immunoglobuline spécifique d'un antigène donné, porté par les cellules que l'on veut détruire, caractérisé en ce que l'on purifie la chaîne A de la Ricine par chromatographie jusqu'à l'obtention, après refroidisserment, de chaîne A cristallisée. 2 - Produits cytotoxiques nouveaux constitués de composés conjugués dans lesquels la chaîne A de la Ricine est couplée par un pont disulfure a une structure protéinique convenable notamment un anticorps, caractérisés en ce que ledit anticorps est choisi parmi: - le fragment F(ab)'2 de l'anticorps anti-DNP ; - l'IgM anti-Thy 1.2.