FR 2471387 A1 19810619 FR 8025953 A 19801205 2471387-. 1. La présente invention se rapporte à des dérivés de moranoline, à des procédés pour leur préparation et à leur utilisation pour abaisser le niveau de sucre dans le sang. La cyclodextrine glycosyltransférase (E.C.-2,4,1,19 cyclodextrine glycosyltransférase) est connue depuis longtemps et, depuis que cette enzyme a été découverte pour la première fois à partir du Bacillus macerans, l'enzyme est généralement appelée amylase de Bacillus maceransoComme on l'indique,par exemple,dans les demandes de brevets japonais publiées n 20373/72, n 63189/75 et n 88290/75, dans l'article de Hans Bender, Archives of Microbiology, 3, pages 27-282, 1977 et dans l'article de Agricultural and Biological Chemistry 40, page 753, 1976, on sait que cette-enzyme est produite par le Bacillus macerans, le Bacillus megaterium, le Bacillus circu- lans, le Bacillus polymyxa, le Bacillus stearothermophillus, le Klebsiella pneumoniae et le Bacillus n 38-2 (bactéries alcalophiles). La moranoline est représentée par la formule déve- loppée suivante (III): 2471387.1. 2. CH OH 2 H H (III)l H H HQ H OH et elle a été d'abord extraite et isolée à partir d'un pro- duit pharmaceutique brut provenant de la pellicule des racines de Morus alba (Yagi et collaborateurs, Journal of Japanese Association of Agricultural Chemistry, 50, page 571, 1976 et demande de brevet japonais publiée n 83951/77). La deman- deresse a préalablement mis au point un procédé pour préparer le composé ayant la formule (III) à partir d'un microorganis- me appartenant au genre Streptomyces par le procédé de fer- mentation (demande de brevet japonais publiée n 84094/79). Le dérivé N-alkylique inférieur de moranoline ayant la formule développée indiquée ci-dessus est obtenu par alkyla- tion du composé de formule (III) (demande de brevet japonais publiée n 12381/79). Les applications de la cyclodextrine glycosyltransférase sont présentées dans de nombreux brevets et de nombreuses références de la littérature. Par exemple, les techniques suivantes peuvent être mentionnées: (a) Production d'hespérétine dihydrochalcone-7- maltooligosides en tant qu'agents édulcorants (Amylase Sympo- sium, 4, page 61, 1972) (b) Production d'oligosaccharides ayant des unités de fructose liées aux parties terminales (demandes de bre- vets japonais publiées n 20373/72 et n 119092/79). (c) Production d'oligomères de nojirimycine gluco- se (demande de brevet japonais publiée n 23976/78). (d) Production de dextrines cycliques (demande de brevet japonais publiée n 88290/75). (e) Production d'a-glycosylstévioside en tant qu'agent édulcorant (demande de brevet japonais publiée n 5070/79). 2471387 i 3. Ces inventions utilisent les trois caractéristiques suivantes que poss&de la cyclodextrine glycosyltransférase: (1) Amidon---- w cyclodextrine (cyclisation) (2) Cyclodextrine + glucose - oligoglucose (couplage) (3) (glucose)n + (glucose)m -b (glucose)n+x + (glucose), (formation dghomologues) (dans l'équation indiquée ci-dessus, m, n et x sont des nombres entiers) (voir Amylase Symposium, 7, page 61, 1972) Récemment, la spécificité de substrat de la cyclodex- trine glycosyltransférase dans la réaction de couplage a été récemment expliquée (voir, par exemple Agricultural and Biolo- gical Chemistry, 42, pages 2369, 1978)o La présente invention est basée sur la nouvelle découverte selon laquelle la morano- line et une N-alkyl(inférieur)moranoline peuvent être des subs- trats de la cyclodextrine glycosyltransférase dans la réaction de couplage. On a révélé que la moranoline et ses dérivés sont de grande valeur comme produits pharmaceutiques pour contrôler l'augmentation de niveau de sucre dans le sang des animaux char- gés de sucre (demandes de brevets japonais publiées n 83951/77 n 12381/79 et n 106477/79) La demanderesse a fait des recherches en vue de met- tre au point des dérivés de moranoline ayant encore plus de valeur, et est alors arrivée à achever la présente invention. La cyclodextrine glycosyltransférase qui est utili- sée dans la présente invention peut être obtenue en cultivant un microorganisme capable de produire cette enzyme, par exem- ple, un microorganisme appartenant au genre-Bacillus ou Kleb- siella, dans un milieu nutritif contenant une source de car- bone, telle que l'amidon ou le son, une source d'azote, telle que la liqueur de mais macérée, la polypeptone, la farine de gluten de mais ou un extrait de levure, une substance minéra- le, telle.que du sulfate d'ammonium, du carbonate de calcium ou du chlorure de magnésium, ou d'autres substances convenables pour la produetion de l'enzyme, et en purifiant la cyclodex- 4. trine glycosyltransférase ainsi formée par des moyens de purification connus, tels que le relargage, la dialyse, l'ad- sorption sur de l'amidon, la désorption, la filtration sur gel ou la chromatographie à échange d'ions. Un filtrat du milieu de culture peut être utilisé comme liquide d'enzyme brute, mais, ordinairement, l'enzyme est utilisée sous la forme d'un produit enzymatique partiellement purifié, fortement purifié ou stabilisé. Si le composé ayant la formule (II) CH2OH C2 / R H N H (Il) OH H HH(I HO H OH o R représente H ou un groupe alkyle inférieur, et la cyclo- dextrine (de l'amidon ou de la dextrine peut être utilisé à la place) sont mis à réagir en présence de la cyclodextrine glycosyltransférase ainsi obtenue, le produit recherché peut être obtenu, ce produit de formule (I) étant le suivant: CH2OH CH20H 0 0 CH2OH R H OH. O _ O-0 H HH CH20H R NH H M= I 5. o n est un nombre entier de 0 à 7 et R représente H ou un groupe alkyle inférieur. Les conditions réactionnelles sont modifiées selon l'origine de la cyclodextrine glycosyl- transférase utilisée, mais, ordinairement, on obtient le pro- duit recherché en réalisant la réaction à une température d'environ 40'C et à une valeur de pH de 5,0 à 8,5 pendant un temps de réaction de 1 à 3 jours. Des procédés connus de sépa- ration et de purification peuvent être adoptés pour l'isole- ment du produit recherché à partir du mélange réactionnel liquide. Par exemple, les modes opératoires suivants peuvent être adoptés. D'abord, on fait passer le mélange réactionnel liqui- de à travers une colonne d'une résine échangeuse d'ions,for- tement acide, pour amener les substances basiques à être ad- sorbées sur la résine, l'élution est réalisée en utilisant de l'ammoniaque 0,5 N et l'éluat est concentré sous pression réduite. Le concentré est soumis au fractionnement en utili- sant une colonne du produit dit Séphadex, et les fractions nécessaires sont rassemblées et séchées par congélation pour obtenir une poudre blanche. L'identification des fractions respectives peut être réalisée, par exemple, par chromato- graphie en phase liquide à grande vitesse. Quand la chromato- graphie en phase liquide à grande vitesse est réalisée dans un chromatographe en phase liquide à grande vitesse (Modèle dit ALC GPC-244 fourni par la société dite Waters Co.) en utilisant une colonne dite uBondapak NH2 et en réalisant le développement avec de l'acétonitrile/eau (70/30) à un débit de 1,5 ml/mn, ceci étant illustré dans les exemples 2, 3 et 4 et porté sur les figures 1, 2 et 3 on trouve que les compo- sants respectifs ont les temps de rétention indiqués dans le tableau I ci-dessous. Les figures 1, 2 et 3 représentent les résultats de la chromatographie en phase liquide à grande vitesse (Modèle dit ALC-GPC-244 fourni par la société dite Waters Co.) des fractions basiques obtenues dans les exemples 2, 3 et 4, respectivenent.Une colonne dite o-Bondapak NH2 a été utilisée,le dé- veloppeioent a été conduit avec de l'acétonitrile/eau.(70/30), et l'ana- lyse a été réalisée en utilisant un dispositif dit 2471387.: 6. chromatopac C-RIA fabriqué par la société dite Shimadzu Seisakusho. Sur chacune des figures 1, 2 et 3, on porte la différence d'indices de réfraction en ordonnées et le temps de développement est porté en abscisses. Les chiffres sur les dessins indiquent les temps de rétention (minutes). TABLEAU I Substance Temps de réten- j ___ ____ ___ ____ ___ ___ _ 'tion (minutes) Moranoline 4,3 4-(aDglucosyl)-moranoline 5,3 4-(a-D-maltosyl)-moranoline 6,6 4-(a-Dmaltotriosyl)-moranoline 9,8 4-(a-D-maltotétraosyl)-moranoline 11,5 Nméthylmoranoline 3,5 4-(a-D-glucosyl)-N-méthylmoranoline 4,1 4-(a-Dmaltosyl)-N-méthylmoranoline 5,3 4-(a-D-maltotriosyl)-N-méthylmoranoline 6,9 4-(a-D-maltotétraosyl)-N-méthylmoranoline 9,1 4-(a-D-maltopentaosyl)N-méthylmoranoline 11,9 4-(a-D-maltohexaosyl)-N-méthylmoranoline 15,2 4(a-D-maltoheptaosyl)-N-méthylmoranoline 19,5 4-(a-D-maltooctanosyl)-Nméthylmoranoline 25,1 N-éthylmoranoline 3,3 4-(a-D-glucosyl)-Néthylmoranoline 3,9 4-(a-D-maltosyl)-N-éthylmoranoline 5,1 4-(a-Dmaltotriosyl)-N-éthylmoranoline 6,8 4-(a-D-maltotétraosyl)-Néthylmoranoline 9,0 304-(a-D-maltopentaosyl)-N-éthylmoranoline 12,1 4-3(aD-maltohexaosyl-N-éthylmoranoline 15,8 4-(a-D-maltoheptaosyl)-Néthylmoranoline 1520,2 4- (a-D-maltoheptaosyl) -N-éthylmoranoline 20,2 Npropylmoranoline 2,9 -4-(a-D-glucosyl)-N-propylmoranoline 3,5 4-aDmloy) Npoymrnln3, 4-(a-D-maltosyl)-N-propylmoranoline 3,4 4-(a-D-maltotriosyl)N-propylmoranoline 5,7 4-(a-D-maltotétraosyl)-N-propylmoranoline 7,6 7. TABLEAU I (Suite) 4-(a-D-maltopentaosyl)-N-propylmoranoline 10,1 4-(a-Dmaltohexaosyl)-N-N-propylmoranoline 13,2 4-(a-D-maltoheptaosyl)-Npropylmoranoline 17,2 4-(a-D-maltooctanosyl)-N-propylmoranoline 22,1 Les valeurs d'analyses élémentaires, les poids mo- léculaires,les pouvoirs rotatoires spécifiques (solutions aqueuses) et les points de fusion des produits recherchés sont tels que présentés cidessous. Les poids moléculaires ont été mesurés en utilisant un dispositif de mesure de poids moléculaires dit Hitachi Modèle 115. Les valeurs entre paren- thèses sont des valeurs théoriques ou indiquent les concen- trations auxquelles les pouvoirs rotatoires spécifiques ont été mesurés. 0zHZZ * NZOú H0ú;n 0 H=' O Oz H. 'Nto EEHgD E g. 6Ocg HET 0 H auT IOUaOw - (TAsopaigio;lvu-a-D) -9 GUT T -ouuaom-(TASOTaqo4UI-G-D)7- eUTTOUeaou- (TÀSO;4Tl-a-D) -t auTToueXoui- (tSODnflB-a-D) - II avasv-i r t,- N "t- O (%S'0) oi ' ú91 (%8'0) o6'T9T 6' ú171- (%0' T) o9' à I (C/L T18) k6S'6P9) OE9 SPI L8P) LC, 0EU (E9'T) 66'T 6 60' T) (POàZ) 8ZIZ (LL' Z) P6'Z (61') bO ' b 0(8'9 (16'9) S6'9 (bZ'L) 9S'L (SO'o,') L6' 1I (LL'Z) E9'1z (OT'úE) t1 ' út gaTe'2 'N| H | O | a[DK] p-nlsTOuI, (%) a-T__ueu ouisn. tg. spTod! -PT9 9sAWeue, p s2nGTPAase nonwp2oTo_____ _ a _uesqns TABLEAU II (Suite) Substance Formule molcu-C H N Poids mo-l 24 Point laire lculaire D de fu- sion ( C) 4-(a-D-glucosyl)-N- 13H25 9 41,67(%) 7,98(% 3,93(%) 351 +95,2o 124 méthylmoranoline.2H20 (41,60) (7,79) (3,73) (339,34) (1,0%) -127 2H2 4-(a-D-maltosyl)- C19H350 14N 41,67 7,66 2,73 508 +130,45 153 Nméthylmoranoline,.2!12 N-méthylmoranoline.2 1H20 (41,76) (7,38) (2,56) (501,48) (1,0%) -155 4-(a-D-maltotriosyl) C25 45 19 42,64 7,44 2,06 650 + 152,02 174 N-méthylmoranoline.2 H2 0 (42,37) (7,11)(1,98) (663,62) (1,0%) -176 4-(a-D-maltotétra- C31H55 24N 42,01 7,01 1,87 860 +155,98 190 osyl)N-méthyl- 3H 0 (42,32) (6,99) (1,59) (825,76) (1,0%) -194 moranoline 2 4(a-D-maltopenta- CH65 29ON 42,39 6,98 1,60 939 +163,14 204 osyl)-Nméthyl- 37 60 2(42,65) (6,87) (1,34) (987,91) (1,0%) -208 moranoline 3H20 4-(a-D-glucosyl)- C14H270 14N 45,44 7,94 3,93 343 +76,2 122 Néthylmoranoline.2H 0 (45,28) (7,87) (3,77) (353,37) (0,62%) -126 4-(-Dmaltosyl)- 20H370 14N 43,51 7,61 2,61 525 +116 138 N-éthylmoranoline. 2H20 (43,55) (7,49) (2,54) (515,51) (1,0%) 143 4-(a-D-glucosyl)- C15H2909N 46,86 8,19 3,81 358 +70,4 109 N-propylmoranoline 2 (46,75) (8, 11) (3,63) (367,40) (1,0%) -113 _2 0 s-J >1 -J 10. Les produits recherchés ainsi obtenus sont de nouvel- les substances qui n'ont pas été indiquées dans l'une quelcon- que des références de la littérature, et ils ont un excellent effet de contrôle de l'augmentation des niveaux de sucre dans le sang, tel que présenté ci-dessous, et sont en conséquence de grande valeur comme produits pharmaceutiques. Effet du contrôle d'augmentation des niveaux de sucre dans le sang Des rats àgés de 5 semaines, de la série dite SD, ont été divisés en groupes, chacun se composant de 4 rats, et on a administré par voie orale 2 g/kg de saccharose et 5 mg/kg du composé expérimental. Le sang est rassemblé à partir des veines de la queue par intervalles prédéterminés pendant une période de 180 minutes à partir du point d'administra- tion et les valeurs de niveau dans le sang sont mesurées. La surface (AAUC) en-dessous de la courbe d'augmentation du ni- veau dans le sang en fonction du temps est déterminée. Le rapport d'inhibition de l'augmentation du niveau dans le sang pour le composé expérimental est calculé à partir de la va- leur de base obtenue dans le groupe auquel de l'eau seule a été administrée et la valeur de contrôle obtenue dans le groupe auquel du saccharose seul a été administré, selon la formule suivante: (AAUC du groupe de contrôle) - Rapport d'inhibition = (AAUC du groupe expérimental) x 100 (AAUC du groupe de contrôle) -x10 (AAUC du groupe de base) Les résultats du calcul ci-dessus pour le rapport d'inhibition de l'augmentation de niveau dans le sang sont présentés dans le tableau suivant. 11. TABLEAU III Substance Rapport d'inhil bition de l'augmentation du niveau dans _ le sang (%) Moranoline 19 4-(a-D-glucosyl)-moranoline 44 4-(a-D-maltosyl)moranoline 35 4-(a-D-maltotriosyl)-moranoline 31 4-(a-D-maltotétraosyl)moranoline 56 4-(a-D-glucosyl)-N-méthylmoranoline 56 4-(a-D-maltosyl)-Nméthylmoranoline- 62 4-(a-D-maltotriosyl)-N-méthylmoranoline 29 4-(a-Dmaltotétraosyl)-N-méthylmoranoline 25 4-(a-D-maltopentaosyl)-Nméthylmoranoline 23 4-(a-D-glucosyl)-N-éthylmoranoline 22 4-(a-D-maltosyl) -N-éthylmoranoline 35 4-(a-D-glucosyl)-N-propylmoranoline 24 En se référant aux composés (I) o n = 0, la deman- deresse a conduit d'autres recherches et a trouvé que, par des moyens très simples consistant à faire réagir une solution mé- langée, obtenue selon le procédé indiqué ci-dessous, avec l'a-l,4-glucanglucohydrolase (E.Co-3,2,l,3 a-1,4-glucangluco- hydrolase), on peut transformer 1'oligoglucosylmoranoline ou Nalkyl(inférieur)moranoline, o n vaut 1 ou un nombre entier plus important, avec un très bon rendement, en 4-(a-D-gluco- syl)-moranoline ou en 4-(a-D-glucosyl)-N-alkyl(inférieur)mo- ranoline o n vaut zéro. Le procédé permettant d'obtenir la solution mélan- gée est un procédé pour la préparation de dérivés de moranoli- ne représentés par la formule générale suivante (I) 2471387, 12. CH 2OH CH20H 0 - H H In CHH O H H (I H H OH 'H H o R représente H ou un groupe alkyle inférieur et m est 1n nombre entier de O à 7, ce procédé consistant a famire -agir une solution aqueuse contenant des moranolines rzprseat-es par la formule générale suivante (II): H2OH R H H o R est tel que défini ci-dessus, et de la cyclodextrine - de l'amidon soluble avec de la cyclodextrine glycosylt.rans- férase pour obtenir un mélange contenant les dérivés de mmura- noline représentés par la formule générale (I), et à isoer les composants respectifs dans le mélange. L'a-l,4-glucanglucohydrolase qui est utilisée dans le procédé indiqué cidessus est principalement produit par des moisissures telles que le Rhizopus niveus, le Rhilzpus delemar, l'Aspergillus niger et l'Aspergillus awamori, et on 13. l'appelle également glucoamylase, amyloglucosidase,y-amylase ou taka-amylase B. Dans la réalisation de ce procédé, cette enzyme peut être utilisée sous la forme d'une enzyme cristalline ou d'un milieu de culture contenant cette enzyme, par exemple un li- quide d'enzyme brute obtenu en cultivant le Rhizopus niveus. En outre, une autre enzyme décomposant des hydrocarbures, telle que l'aamylase ou la y-amylase, peut être présente dans l'enzyme à utiliser dans la présente invention.L'action de l'a-l,4-glucanglucohydrolase est une action de décomposi- tion de l'amidon à partir des parties terminales non réduc- trices pour fournir des unités de glucose. Bien sûr, le mal- tose, le maltotriose, le maltotétraose et des oligosaccha- rides supérieurs à liaisons a-l,4 peuvent être décomposés de manière semblable en unités de glucose par la présente enzy- me. Ces réactions peuvent être représentées comme suit: Amidon + nH20 -n-.glucose G-G-G......-G + mH20 --- mG o n et m sont des nombres entiers, G représente le glucose, et G-G indique une liaison a-l,4. Incidemment, comme cela semblera évident aux person- nes expérimentées dans la technique, l'origine de l'enzyme qui est utilisée dans le présent procédé n'est pas limitée aux moisissures. La première caractéristique du présent procédé rési- de dans la découverte du fait, jusqu'à présent inconnu, selon lequel, alors que le maltose ayant la formule: H O CH OH OHH^, O OH H 2471387Z 14. est rapidement décomposé en glucose par l'a-l,4-glucangluco- hydrolase, la 4-(a-D-glucosyl)-moranoline et la 4-(a-D-glu- cosyl)-N-alkyl(inférieur)moranoline sont difficilement décom- posées par l'a-l,4-glucanglucohydrolase et les oligogluco- sylmoranolines et les N-alkyl(inférieur)oligoglucosylmorano- lines ayant la formule développée (I), sauf celles dans les- quelles n est séro, sont décomposées par cette enzyme à une vitesse qui n'est pas supérieure à la vitesse de décomposi- tion du maltose mais qui est suffisamment élevée en pratique. Ce point sera maintenant décrit en détail. La réaction de la présente invention est générale- ment exprimée comme suit: G-G-... -G- A G G-G-... -G-MR 1*- km R m des G (m-l) des G G.A *- > G-G-G-G-MR G-G-G-M k4- G.A G.A_ G-MR G.A +MR k3 - G-G-MR k2 - G+M o G représente le glucose, MR représente la moranoline ou la N- alkyl(inférieur)moranoline, m est un nombre entier, G. A * représente l'a-l,4-glucanglucohydrolase, chaque liaison re- présente une liaison a-l,4, et km, km-l,...k2 et kl représen- tent les constantes des vitesses de réaction des étapes res- pectives. En pratique, les réactions des étapes respectives progressent sur un mélange de composés différant par le nombre d'unités de glucose (m). En conséquence, afin d'ac- cumuler la G-Mr recherchée dans le mélange réactionnel liqui- de, il est indispensable que les constantes de vitesses km, km-l...k2 soient suffisamment élevées mais que la constante de vitesse kl soit suffisamment faible. La figure 4 explique ce point. La figure 4 représente les rapports de décomposi- tion (%) des composés respectifs obtenus quand les N-méthyl- 3 oligoglycosylmoranolines sont mises à réagir avec l'a-l,4- glucanhydrolase. Sur cette figure ----, -X-, -----1 15. -/A-, et - --représentent les résultats obtenus respec- tivement avec le maltose, la 4- (-D-glucosyl)-N-méthylmorano- line, la 4-(a-D-maltosyl)-N-méthylmoranoline, la 4-(a-D-malto- triosyl)-N-méthylmoranoline et la 4- (a-D-maltotétraosyl)-N- méthylmoranoline. La figure 4 sera maintenant expliquée en détail. Une quantité prédéterminée de N-méthyloligoglycosylmoranoli- ne est adsorbée sur 1 g du produit dit Dowex 50Wx2 (H) dans un ballon d'Erlenmeyer ayant une capacité de 125 ml, les pro- duits sont mis en suspension dans 50 ml d'eau distillée et 10 mg d'a-l,4-glucanglucohydrolase sont ajoutés à la suspension. L'incubation est réalisée à 40 C, 500 P1 du liquide sont échan- tillonnés par intervalles prédéterminés et on détermine la quantité de glucose. Quand le maltose est utilisé comme subs- trat, il est mélangé avec 1 g du produit dit Dowex 50Wx2 (H+) et, dans cet état, l'incubation est réalisée à 40 C. Détermination du glucose: 1 ml de Ba(OH)2 0,3N et 1 ml de ZnSO4 à 5 % sont ajoutés à 500 ul du mélange réactionnel liquide et la sépara- tion par centrifugation est réalisée sous une charge de 2.000 g pendant 10 minutes. 30 ml de la liqueur surnageante sont pris et 3 ml d'un produit réagissant coloré du glucose, dispo- nible dans le commerce (fabriqué par la société dite Balinger Manhime Co.; nouveau test du sucre dans le sang) sont ajoutés à la liqueur surnageante échantillonnée. Le mélange est suffi- samment agité, on le laisse reposer à la température ambiante pendant 35 minutes et on mesure la capacité d'absorption à 420 nm. Séparément, on traite de manière semblable un produit réa- gissant du glucose, de référence (9,1 mg/dl) et on mesure la capacité d'absorption à 420 nm. En se basant sur ces mesures, on détermine la quantité de glucose formée dans le liquide du mélange réactionnel. Enzyme: Environ 22 unités/mg d'a-l,4-glucanglucohydrolase (cristal) obtenue à partir de Rhizopus niveus (fournie par la société dite Seikagaku Kogyo K.K.). Z471387. 16. Activité de l'enzyme: 1 ml de la solution d'enzyme est mélangé avec 5ml d'une solution d'amidon à 1,0 % et 4 ml d'une solution tampon d'acide acétique 0,05 M, l'incubation est réalisée à 40 C, et on détermine selon le procédé de Fehling-Lehman-Schoorl la quantité de sucre réduit formé (glucose). Une unité de l'enzyme correspond à l'activité de for- mation de 10 mg de glucose pendant 30 minutes. Substrat et quantité de substrat adsorbée sur la résine: maltose 100 mg 4(a-D-glucosyl)-N-méthylmoranoline 100 mg 4-(a-D-maltosyl)-Nméthylmoranoline 50 mg 4-(a-D-maltotriosyl)-N-méthylmoranoline 50 mg 4-(aD-maltotétraosyl)-N-méthylmoranoline 50 mg Les résultats expérimentaux sont présentés sur la figure 4. Le temps de réaction est porté en abscisses et le rapport de décomposition, basé sur la décomposition complète du glucose, est porté en ordonnées. Puisque la décomposition de la N-méthylglucosylmoranoline est extrêmement faible, tel que présenté sur la figure 4, dans le cas de N-méthyloligoglu- cosylmoranolines, pour comparer la vitesse de décomposition avec celle du maltose, chaque valeur est exprimée sous forme de valeur relative calculée en supposant que la valeur obte- nue quand la décomposition va jusqu'à la glucosylmoranoline ou la N-méthylglucosylmoranoline est 100 %. Après détermina- tion de la quantité de glucose, le liquide réactionnel est fil- tré et la résine échangeuse d'ions (dite Dowex 50Wx2) est ras- semblée, lavée suffisamment avec de l'eau et éluée avec de l'ammoniaque 0,5N. L'éluat est concentré sous pression rédui- te et séché jusqu'à formation d'un solide. Le solide est dis- sous dans de l'eau distillée et soumis à une chromatographie en phase liquide à grande vitesse (Modèle dit ALC GPC-224 fourni par la société dite Waters Co., colonne dite u-Bonda- pak NH2,- acétonitrile/eau = 70/30,1,5 cm 3/minute), et le pro- duit réactionnel est identifié par un dispositif dit chromato- pac Modèle C-RIA fourni par la société dite Shimadzu Seisa- kusho K.K. Les rapports de formation de la N-méthylmoranoline 17. sont environ 3 %, environ 2 %, environ 2 %, environ 1 % et environ 2 % respectivement dans le cas de la 4-(a-D-glucosyl)- N-méthylmoranoline, la 4-(a-D-maltosyl)-N-méthylmoranoline, la 4-(a-D-maltotriosyl)-N-méthylmoranoline et la 4-(a-D-mal- totétraosyl)-N-méthylmoranoline. Une tendance semblable est observée pour les oligoglucosylmoranolines. Dans ce cas, la vitesse de la réaction enzymatique est supérieure au cas des N-méthyloligoglucosylmoranolines, et dans les mêmes condi- tions réactionnelles que celles adoptées pour les N-méthyl- oligoglucosylmoranolines, le maltose est décomposé sensible- ment complètement en 1 heure, mais les rapports de décomposi- tions de la 4-(a-D-glucosyl)-moranoline, de la 4-(a-D-malto- syl)-moranoline et de la 4-(a-D-maltotriosyl)-moranoline sont respectivement environ 3 %, environ 53 % et environ 50 % (la signification du rapport de décomposition est la même que celle décrite ci-dessus et en ce qui concerne les N-méthyl- oligoglycosylmoranolines). Dans les expériences précédentes, le substrat est adsorbé sur une résine échangeuse d'ions, fortement acide, dite Dowex 50Wx2 (du maltose est mélangé avec la résine). La raison de l'utilisation de cette résine sera indiquée ci-après en détail. La présence d'une quantité excessive de la résine échangeuse d'ions, fortement acide, inhibe la réaction enzymatique. Cependant, aucun problème substantiel ne se présente si la quantité de résine va jus- qu'à environ 4 g dans 100 ml du liquide réactionnel. Si la résine est saturée de moranoline, de N- alkyl(inférieur)mora- noline, d'oligoglycosylmoranolines et N-alkyl(inférieur)mora- nolines, la réaction n'est pas inhibée même quand de la résine est encore ajoutée. Ordinairement, l'a-1,4-glucanglucohydrolase est uti- lisée dans une solution tampon, mais, même si la réaction est réalisée dans de l'eau distillée, bien que l'activité soit quelque peu réduite, aucun inconvénientpratique n'est pro- voqué. La seconde caractéristique du présent procédé réside dans la découverte selon laquelle, si le mélange mentionné ci-dessus est adsorbé sur un membre échangeur de cations et 18. est mis à réagir avec de l'a-l, 4-glucanglucohydrolase, la concentration du mélange dans le liquide réactionnel peut être remarquablement augmentée, la réaction n'est pas influencée par l'état du mélange et l'inhibition des produits provoquée par la moranoline ou la N-alkyl(inférieur)moranoline formée en quantité peu importante n'est pas provoquée, en fournissant de grands avantages industriels. Ce point sera maintenant ex- pliqué en détail. La moranoline, les N-alkyl(inférieur)moranolines, les oligoglycosylmoranolines et les N-alkyl(inférieur)oligo- glucosylmoranolines inhibent l'activité de l'a-l,4-glucanglu- cohydrolase. Les intensités d'inhibition de ces composés sont présentées dans le tableau IV. L'inhibition est déterminée selon le procédé suivant. Enzyme De la glucoamylase (cristal) provenant du Rhizopus niveus (fournie par la société dite Seikagaku Kogyo K.K.) est dissoute dans de l'eau distillée afin que la concentra- tion soit 50 wg/ml et l'enzyme est utilisée sous la formede la solution ainsi obtenue. Substrat: De l'amidon soluble est dissous dans une solution tampon à une température élevée, afin que la concentration soit 1,4 %, cette solution est refroidie jusqu'à la tempéra- ture ambiante et utilisée. Solution tampon: solution de tampon au phosphate 0,1M (pH = 5,7). Liquide de départ: Essai té- Essai te- Contr1e I Echantillon I moin (I) moin (II) expérimen- _________ _ tal Enzyme - - 150 P9 150 HA Substrat 250 H9A 250 HA 250 pH 250 HA Inhibiteur 100 - - 100 pi Eau dis- tillée 150 w9 250 "t 100 _ - Modes opératoires: Le liquide de départ est soumis à l'incubation à 40 C 19. pendant 10 minutes et 1 ml d'une solution de Ba(OH)2 0,3N et 1 ml d'une solution de ZnSO4 à 5 % sont ajoutés. La sé- paration par centrifugation est conduite sous une charge de 2.000 g pendant 10 minutes, 30 pl de la liqueur surnageante sont échantillonés et 3 ml d'un produit réagissant coloré du glucose (fourni par la société dite Ballinger Manhime Co; nouveau test du sucre dans le sang) ont été ajoutés à la li- queur surnageante. On a laissé le mélange reposer à la tem- pérature ambiante pendant 35 minutes et la capacité d'absorp- tion à 420 nm est mesurée. Le pourcentage d'inhibition est calculé selon la formule suivante: Pourcentage d'inhibition = (C-B)- (TO-Bg) x 100 (C-B) o C représente la capacité d'absorption du contrôle, T représente la capacité d'absorption de l'échantillon expé- rimentale, B' représente la capacité d'absorption de l'essai témoin (I) et B représente la capacité d'absorption de l'es- sai témoin (II). Le pourcentage d'inhibition est également déterminé par rapport aux dilutions, et on trouve la concentration (CI50) fournissant 50 % d'inhibition. Dans le tableau IV, le pourcentage d'inhibition obtenu pour une concentration indi- quée entre parenthèses est présenté quand l'inhibition est faible. TABLEAU IV ci m _ CI50 (ug/mZ) Moranoline 9,3 4-(a-D-glucosyl)-moranoline 15 % (>200 pg/m.) 4-(a-D-maltosyl)-moranoline 0 % (>200 pg/mt) 4-(a-D-maltotriosyl)moranoline O % (>200 pg/mt) 4-(a-D-maltotétraosyl)-moranoline 0 % (>200 pg/mQ) N-méthylmoranoline 1,6 4-(a-D-glucosyl)-N-méthylmoranoline 125 4(a-D-maltosyl)-N-méthylmoranoline 1150 4-(a-D-maltotriosyl)-N-méthylmorano- line 160 4-(a-D-maltotétraosyl)-N-méthylmo- ranoline 180 20. TABLEAU IV (Suite) 4-(a-D-maltopentaosyl)-N-méthylmorano- Uine - 120 N-éthylmoranoline 6,9 4-(a-D-glucosyl)-N-éthylmoranoline 38 % (>800 ug/mQ) N-propylmoranoline 56 Comme on le voit d'après le tableau IV, l'inhibition de la moranoline et des N-alkyl(inférieur)moranolines est très importante, et l'inhibition est ordinairement réduite par la glycosylation. En conséquence, la réaction progresse pour une faible concentration, mais, à une concentration de quel- ques douzaines jusqu'à plusieurs centaines de pg/mZ, la réac- tion est sensiblement inhibée. Comme on le voit d'après le tableau IV, cette concentration critique diffère selon le rap- port de mélange des composants respectifs dans le mélange et selon le genre du groupe alkyle inférieur.Puisque l'inhibition de la moranoline et des N-alkyl(inférieur)moranolines est plu- sieurs centaines à plusieurs milliers de fois plus élevée que celle des substances glycolysées, la concentration critique est extrêmement modifiée par les quantités de moranoline et de N-alkyl(inférieur)moranolines contenues. Cependant, dans l'opé- ration réelle, on préfère une concentration supérieure du point de vue du prix de revient de la fabrication, et la réac- tion ne doit pas être influencée par l'état du mélange. La demanderesse a réalisé des recherches tout en tenant compte de ce point, et a trouvé que, loryque l'enzyme est utilisée dans l'état o elle est adsorbée sur une résine acide échangeu- se de cations, la réaction progresse pour une concentration supérieure à plusieurs milliers de wg/mZ et la réaction n'est pas influencée par l'état du mélange. La demanderesse a main- tenant achevé la présente invention en se basant sur la décou- verte de ce nouveau fait. Incidemment, dans les exemples 6, 7, 8 et 10 donnés ci-après, la réaction n'a pas du tout progressé si l'enzyme était utilisée dans l'état dans lequel elle n'était pas adsorbée sur une résine fortement acide, 6changeuse de ca- tions. La présente invention sera maintenant décrite en dé- 2471 387 21. tail en se référant aux exemples suivants. EXEMPLE 1 Culture de Bacillus macerans: On a introduit dans un ballon d'Erlenmeyer ayant une capacité de 500 ml 150 ml d'un milieu de culture conte- nant 1 % de liqueur de mais macéree, 1 % d'amidon soluble, o,5 % de (NH4)2SO4 et 0,5 % de CaCO3 et ayant une valeur de pH de 7, et le milieu de culture a été chauffé et stérilisé à 120 C pendant 15 minutes. Le milieu de culture a été inocu- lé avec 3 contenus d'une cuillère (en platine) de Bacillus macerans IFO 3490, que l'on avait fait croître suffisamment sur un milieu de culture incliné contenant 1 % de peptone, 0,5 % de levure, 0,3 % de glucose, 1,5 % de glycérol, 0,3 % de NaCl et 1,5 % d'agar-agar-poudre de foie (produit de di- gestion de foie neutralisé, fabriqué sous la marque déposée "OXOID") et la culture a été conduite à 37 C pendant 3 jourso Ensuite, 300 ml du milieu de culture résultant ont été ajou- tés à 9 1 d'un milieu de culture ayant la même composition que celle décrite ci-dessus, dans un dispositif de fermen- tation en forme de grand bocal, ayant une capacité intérieu- re de 15 1. La culture a été conduite à 37 C pendant 10 jours avec une agitation et une aération suffisantes. Un li- quide d'enzyme ayant environ 130 à environ 150 unités (la définition de l'unité sera indiquée ci-après) a été ainsi ob- tenu. Unités d'activité de cyclodextrine glycosyltransfé- rase: De l'amidon soluble (produit pour des recherches bio- chimiques;fourni par la société dite Nakarai Kagaku K.K.) a été dissous à une concentration de 0,7 % dans-une solution tampon d'acétate 0,05M ayant une valeur de pH de 5,5, pour former une solution de substrat. Ensuite, 50 uP du liquide d'enzyme ont été ajoutés à 950 w9 de la solution de subs- trat et la réaction a été conduite à 40 C pendant 10 minu- tes. La réaction a été arrêtée par addition de 0,5 ml d'aci- de acétique 0,5N. Ensuite, 0,8 ml d'une solution d'iode, qui a été formée en dissolvant de l'iode dans une solution aqueu- 2471387. 22. se 0,25M de KI afin que la concentration soit 0,OlM, a été ajouté avec 3 ml d'eauà 100 PZQ du liquide réactionnel, le mé- lange a été agité et la capacité d'absorption (At) à 660 nm a été mesurée. De manière semblable, 50 POZ d'eau et 0,5 ml d'acide acétique 0,5N ont été ajoutés à 950 PZ de la solution de substrat, la solution d'iode a été ajoutée à 100 CO du li- quide résultant et la capacité d'absorption (A r) a 660 nm a été mesurée. L'unité d'activité a été calculée selon la formule suivante: A - A une unité = r tx 100 x 2 r Cette unité représente l'activité de 1 ml du liquide d'enzyme pour réduire la capacité d'absorption de 1 % pendant 1 minute. Préparation de la solution d'enzyme brute Le milieu de culture de Bacillus macerans IFO 3490 a été soumis à la séparation par centrifugation, la liqueur surnageante résultante a été séchée par congélation et le pro- duit sec a été dissous dans une petite quantité d'eau pour ob- tenir un concentré d'enzyme. A 50C, le concentré a été dialysé par rapport à de l'eau distillée, et le liquide interne, d'o les molécules à faible poids moléculaires avaient été reti- rées, a été utilisé comme liquide d'enzyme brute. EXEMPLE 2 (A) Culture de Bacillus macerans (1) On a introduit dans un ballon d'Erlenmeyer d'une capacité de 500 ml 150 ml d'un milieu de culture comprenant 1 % de liqueur de mais macérée, 1 % d'amidon soluble, 0,5 % de (NH4)2S04 et 0,5 % de CaCa3 et ayant une valeur de pH de 7, et le milieu de culture a été stérilisé à 1201C pendant 15 minutes. Ensuite, 4 contenus de cuillére (en platine) de cel- lules de Bacillus macerans, IFO 3490, qui s'étaient suffisam- ment propagées sur un milieu de culture incliné comprenant 1 % de peptone, 0,5 % d'extrait de levure, 0,3 % de glucose, 1,5 % de glycérol, 0,3 % de NaCl, 1,5 % de produit de diges- tion de foie neutralisé (connu sous la marque déposée OXOID) et 1,5 % d'agar-agar, ont été inoculés sur le milieu de cultu- 2471 387 23. re indiqué ci-dessus, et la culture a été conduite à 37 C pendant 3 jours. Ensuite, 300 ml du milieu de culture ont été inoculés sur 9 1 d'un milieu de culture ayant la même composition dans un dispositif de fermentation en forme de grand bocal. La culture a été conduite à 37 C pendant 3 jours avec aération et agitation suffisantes et, de ce fait, on a obtenu un liquide d'enzyme contenant 130 à 150 unités de l'enzyme (la définition de l'unité sera indiquée ci- après) sous la forme d'une liqueur surnageante après sépara- tion par centrifugation. (2) Un milieu de culture comprenant 4 % de son de blé, 0,5 % de liqueur de mals macérée, o,5 % d'amidon solu- ble, 0,5 % de (NH4)2S04 et 0,5 % de CaC03 et ayant une valeur de pH de 6, 7 a été stérilisé à 120 C pendant 15 minutes et 200 ml du milieu de culture stérilisé ont été introduit dans un ballon d'Erlenmeyer ayant une capacité de 500 mlo. Le mi- lieu de culture a été inoculé avec 3 contenus de cuillère (en platine) de cellules de Bacillus macerans IFO 3490, et la culture avec agitation a été conduite à 37 C pendant 4 heures pour obtenir un liquide d'enzyme contenant environ unités de l'enzyme sous la forme d'une liqueur surnagean- te après séparation par centrifugation. (B) Unité d'activité de cyclodextrine glycosyltransférase De l'amidon soluble (pour évaluation biochimique; fourni par la société dite Nakarai Kagaku KoKo) a été dissous à une concentration de 0,7 % dans une solution tampon d'acé- tate 0,05M, ayant une valeur de pH de 5,5, pour former une solution de substrat. 50 up de liquide d'enzyme ont été ajou- tés à 950 ut de la solution de substrat ainsi formée, et la réaction a été conduite à 40 C pendant 10 minutes. La réac- tion a été arrêtée par addition de 0,5 ml d'acide acétique 0,5No 100 wO de liquide réactionnel ont été pris et mélangés avec 3 ml d'eau et 0,8 ml d'une solution d'iode, formée en dissolvant de l'iode dans une solution de KI 0,25M afin que la concentration en iode soit p,01Mo Le mélange a été agité et la capacité d'absorption (At) à 660 nm a été mesurée. Séparément, 50 ut d'eau et 0,5 ml d'acide acétique Z471387 24. 0,5N ont été ajoutés à 950 C de la solution de substrat décri- te ci-dessus, et 100 CO de la solution ainsi formée ont été pris et mélangés avec la solution d'iode, de la même manière que celle décrite cidessus. La capacité d'absorption (A)-à 660 nm a été mesurée. Une unité de l'enzyme est définie par la formule suivante: A - A 1 unité = r x 100 x 2 r Cette valeur correspond à l'activité de 1 ml de la solution d'-lenzyme pour diminuer de 1 % la capacité d'absorp- tion par la réaction à 40 C pendant 1 minute. (C) Préparation de la solution d'enzyme brute: Le milieu de culture obtenu en cultivant le Bacillus macerans IFO 3490 a été soumis à la séparation par centrifuga- tion et la liqueur surnageante a été récupérée. La liqueur surnageante a été séchée par congélation et dissoute dans une petite quantité d'eau pour obtenir un concentré d'enzyme. La dialyse a été réalisée suffisamment à 5 C en utilisant de l'eau comme liquide extérieur, d'o les molécules à faibles poids moléculaires avaient été retirées et le liquide interne a été utilisé comme solution d'enzyme brute. (D) Réaction: Dans 400 ml de la solution d'enzyme brute ayant une activité de 870 unités (348.000 unités dans l'ensemble), on a - dissous 8 g de chlorhydrate de moranoline de 8 g d'a-cyclo- dextrine, et la culture avec agitation a été conduite à 38 C et à une valeur de pH de 5,7 pendant 3 jours. Une partie du liqui- de réactionnel a été prise,les substances basiques ont été ras- semblées, et l'analyse a été conduite en utilisant un chroma- tographe en phase liquide à grande vitesse (dit ALC/GPC 244 fabriqué par la société dite Waters Co., une colonne d'analyse de saccharides (dite pBondapak CH), de l'acétonitrile/eau (70/30) et un taux de développement de 1,5 ml/mn). Les rap- ports de surfaces des fractions respectives sur le réfracto- mètre différentiel ont été déterminés en utilisant le disposi- tif dit Chromatopac C-RIA fabriqué par la société dite Shimadzu Seisakusho, ce qui a fourni les résultats suivants: 25. Moranoline n'ayant pas réagi 43 % 4-(a-glucosyl)-moranoline 16 % 4-(a-D-maltosyl)- moranoline 16 % 4-(a-D-maltotriosyl)-moranoline 12 % 4-(a-Dmaltotétraosyl)-moranoline 8 % (E) Isolement et purification: Environ 400 ml du liquide réactionnel ont été chauffés à 120 C pendant 10 minutes, 160 ml de trichloroé- thylène y ont été ajoutés et le mélange a été violemment agité. La couche inférieure a été jetée. La couche supérieu- re a été soumise à la séparation par centrifugation pour obte- nir une liqueur surnageante transparente. On a fait passer la liqueur surnageante à travers une colonne remplie de 80 ml d'une résine échangeuse d'ions, fortement acide (dite Dowex 50WX2, type H) pour amener les substances basiques à être adsorbées sur la colonne. L'élution a été réalisée en utili- sant de l'ammoniaque O,5N et l'éluat a été séché par congé- lation. La poudre obtenue a été traitée avec le produit dit Séphadex G-15 (48 mm de diamètre et 850 mm de hauteur), le produit dit Séphadex G-25 (55 mm de diamètre et 470 mm de hau- * teur) et le produit dit Séphadex G-10 (40 mm de.diamètre et 820 mm de hauteur), alors que les fractions respectives ont été identifiées par un chromatographe en phase liquide à grande vitesse (dit ALC/GPC 244 fabriqué par la société di- te Waters Co., colonne dite w-Bondapak CH, acétonitrile/eau suivant un rapport de 70/30, débit de 1,5 ml/mn) pour obtenir des oligoglycosylmoranolines recherchées. EXEMPLE 3 g de N-méthylmoranoline ont été dissous dans une petite quantité d'eau et la valeur de pH a été réglée à 5,68 par de l'acide chlorhydrique 3N (le volume de la solution était 25 ml après le réglage de la valeur de pH). g d'a-cyclodextrine ont été dissous dans 3.975 ml de la solution d'enzyme brute ayant une activité de 250 uni- tés/ml, la solution aqueuse de N-méthylmoranoline a été ajou- tée et la valeur de pH a été réajustée à 5,68. La culture avec agitation a été conduite à 391C pendant 3 jours pour ef- 2471 387. 26. fectuer la réaction. Le liquide réactionnel a été soumis à la séparation par centrifugation, et la liqueur surnageante a été passée à travers une colonne de produit dit Dowex 50W x 2 (H) (la quantité de la résine était 100 ml) pour amener les substances basiques à être adsorbées sur la résine. L'élution a été réalisée en utilisant de l'ammoniaque 0,5N et l'éluat a été concentré sous pression réduite et séché jusqu'à fournir un solide. La poudre obtenue a été dissoute dans une petite quantité d'eau, on a fait passer la solution à travers une colonne du produit dit Séphadex G-15 (48 mm de diamètre et 850 mm de longueur), et les fractions, chacune ayant un volu- me de 5 ml, ont été récupérées et identifiées par un chroma- tographe en phase liquide, Modèle dit ALC/GPC-244 en utili- sant une colonne dite p-Bondapak NH2 (acétonitrile/eau = 70/30; 1,5 ml/mn). Les fractions recherchées ont été rassem- blées, concentrées sous pression réduite et séchées par congé- lation pour obtenir l'oligoglycosyl-N-méthylmoranoline recher- chée. EXEMPLE 4 500 mg de N-éthylmoranoline ont été dissous dans une petite quantité d'eau et la valeur de pH a été réglée à 5,8 par de l'acide chlorhydrique 1N (le volume de la solution après réglage de la valeur de pH était 20 ml). Séparément, 8 g d'o-cyclodextrine ont été dissous dans 830 ml du liquide d'enzyme brute ayant une activité de 260 unités/ml. Les deux solutions ont été mélangées et la va- leur de pH a été réglée de nouveau à 5,77. La culture avec agitation a été conduite à 39 C pendant 3 jours pour effectuer la réaction. L'oligoglycosyl-N-éthylmoranoline a été récupé- rée à partir du liquide réactionnel de la même manière que celle indiquée dans l'exemple 3. 2471387, 27. EXEMPLE 5 500 ml de N-propylmoranoline ont été dissous dans une petite quantité d'eau et la valeur de pH a été réglée à 5,7 par de l'acide chlorhydrique 1N (le volume de la solu- tion était 20 ml après le réglage de la valeur de pH)o Séparément, 8 g d'a-cyclodextrine ont été dissous dans 380 ml du liquide d'enzyme brute ayant une activité de 260 unités/ml. Les deux solutions ont été mélangées et la va- leur de pH a été réglée de nouveau à 5,7. La culture avec agi- tation a été conduite à 39 C pendant 3 jours et l'oligogly- cosyl-N-propylmoranoline a été récupérée à partir du liquide réactionnel de la même manière que celle décrite dans l'exem- ple 3. EXEMPLE 6 Culture du Bacillus macerans: On a introduit dans un ballon d'Erlenmeyer ayant une capacité de 500 ml 150 ml d'un milieu de culture contenant 1 % de liqueur de mais macérée, 1 % d'amidon soluble, 0,5 % de (NH4)2S04 et 0, 5 % de CaCO3 et ayant une valeur de pH de 7, et le milieu de culture a été chauffé et stérilisé à 120 C pendant 15 minutes. Le milieu de culture a été inoculé avec le contenu de 3 cuillères (en platine) de Bacillus macerans IFO 3490, qu'on avait fait croître suffisamment sur un milieu de culture incliné contenant 1 % de peptone, 0,5 % de levure, 0,3 % de glucose, 1,5 % de glycérol, 0,3 % de NaC1 et 1,5 % d'agar-agar-poudre de foie (produit de digestion de foie neu- tralisé, fabriqué sous la marque déposée "OXOID"), et la cul- ture a été conduite à 370C pendant 3 jours. Ensuite, 300 ml du milieu de culture résultant ont été ajoutés à 9 1 d'un milieu de culture ayant la même composition que celle décrite ci-des- 2471387. 28. sus, dans un dispositif de fermentation en forme de grand bo- cal ayant une capacité interne de 15 1. La culture a été con- duite à 37 C pendant 10 jours avec une agitation et une aération suffisantes. Un liquide d'enzyme ayant environ 130 à environ 150 unités (la définition de l'unité sera indiquée ci-après) est obtenu. Unités d'activité de cyclodextrine glycosyltransférase: De l'amidon soluble (produit pour des recherches biochimiques; fourni par la société dite Nakarai Kagaku K.K$, a été dissous à une concentration de 0,7 % dans une solution de tampon en acetate 0,05M, ayant une valeur de pH de 5,5 pour former une solution de substrat. Ensuite 50 pi du liqui- de d'enzyme ont été ajoutés à 950 CO de la solution de subs- trat et la réaction a été conduite à 40 C pendant 10 minutes. La réaction a été arrêtée par addition de 0,5 ml d'acide acé- tique 0,5N. Ensuite, 0,8 ml d'une solution d'iode, qui a été formée en dissolvant de l'iode dans une solution aqueuse 0,25M de KI afin que la concentration soit 0,01M, a été ajou- té avec 3 ml d'eau à 100 PQ du liquide réactionnel, le mélan- ge a été agité et la capacité d'absorption (At) à 660 nm a été mesurée. De manière semblable, 50 CO d'eau et 0,5 ml d'aci- de acétique 0,5N ont été ajoutés à 950 CO de la solution de substrat, la solution d'iode a été ajoutée à 100 CO du liqui- de résultant et la capacité d'absorption (Ar) à 660 nm a été mesurée. L'unité d'activité a été calculée selon la formule suivante: Ar - At Une unité = r t x 100 x 2 A r Cette unité représente l'activité de 1 ml du liquide d'enzyme pour réduire de 1% la capacité d'absorption pendant 1 minute. Préparation de la solution d'enzyme brute: Le milieu de culture de Bacillus macerans IF0 3490 a été soumis à la séparation par centrifugation, la liqueur surnageante résultante a été séchée par congélation et le pro- duit sec a été dissous dans une petite quantité d'eau pour ob- tenir un concentré d'enzyme. A 5 C, le concentré a été dialy- 29. sé par rapport à de l'eau distillée, et le liquide interne, d'o les molécules à faibles poids moléculaires avaient été retirées, a été utilisé comme liquide d'enzyme brut. Ensui- te, 6,5 g de moranoline ont été dissous dans une petite quan- tité d'eau et la valeur de pH a été réglée à 5,7 par de l'aci- de chlorhydrique 3N (le volume de la solution était de 32,5 ml après réglage de la valeur de pH). 26 g d'a-cyclodextrine ont été dissous dans 1.300 ml de la solution d'enzyme brute de cyclodextrine glycosyl- transférase ayant une activité de 460 unités/ml, la solution aqueuse de moranoline a été ajoutée et la valeur de pH a été réglée de nouveau à 5, 67. Le mélange réactionnel était agité à 39 C pendant 3 jours. Le liquide réactionnel a été soumis à la sépara- tion par centrifugation, et la liqueur surnageante a été pas- sée à travers une colonne du produit dit Dowex 50W x 2 (H +) (la quantité de résine était 50 ml) pour amener les substances basiques à être adsorbées sur la résine. L'élution d'une par- tie (environ 2 ml) de la résine lavée suffisamment avec de l'eau a été réalisée en utilisant de l'ammoniaque 0,5N, l'éluat a été concentré sous pression réduite et séché pour fournir un solide. La poudre obtenue a été dissoute dans une petite quantité d'eau, et la solution a été analysée par un dispositif dit chromatopac (Modèle dit C-IRA fabriqué par la so- ciété dite Shimadzu Seisakusho oK.K) après la chromatogra- phie enchase liquide à grande vitesse, en utilisant un chroma- tographe dit Modèle ALC/GPC-244 fourni par la société dite Waters Co. (colonne dite p-Bondapak NH2, acétonitrile/eau = /30, 1,5 ml/mn) (la composition du mélange avant la réac- tion avec l'a-1,l4-glucanglucohydrolase a été ainsi détermi- née). Ensuite, environ 48 ml de la résine restante ont été mis en suspension dans 1.200 ml d'eau et 120 mg (environ 22 unités/mg) d'a-l,4glucanglucohydrolase provenant de Rhizopus niveus ont été ajoutés. L'incubation a été réalisée à 40 C, le mélange réactionnel a été échantillonné par inter- valles prédéterminés, et la quantité de glucose formée dans le mélange réactionnel a été déterminée pour trouver l'état de 30. la progression de la réaction. La quantité de glucose a été augmentée brusquement après le démarrage de la réaction, et le rapport de réaction s'est élevé jusqu'à 89 % en 5 heu- res. La réaction a été encore conduite et a été arrêtée à un point correspondant à 25 heures à partir du commencement de la réaction. La résine a été récupérée par filtration, lavée suffisamment avec de l'eau et éluée avec de l'ammoniaque 0,5N, l'éluat a été concentré sous pression réduite et séché jusqu'à fournir un solide. Lapoudre obtenue a été soumise à une chromatographie en phase liquide à grande vitesse, de la même manière que celle décrite ci-dessus, et le mélange après la réaction a été analysé par le dispositif dit chromatopac. Les résultats obtenus sont tels que présentés ci-dessous. f Avant la Après réaction la ré 1. actio Moranoline 25,1% 31,7 % 4-(a-Dglucosyl)-moranoline 31,0 % 68,3 % 4-(a-D-maltosyl)-moranoline 17,2 % 0 % 4-(a-D-maltotriosyl)-moranoline 11,2 % 0 % 4-(a-D-maltotétraosyl)moranoline 7,8 % O % 4-(a-D-maltopentaosyl)-moranoline 4,9 % O % 4-(a-Dmaltohexaosyl)-moranoline 2,0 % O % 4-(a-D-maltoheptaosyl)-moranoline 0,5 % 0 % 4-(a-D-maltooctanosyl)-moranoline 0,3 % O % EXEMPLE 7 2 g d'un mélange représenté sur la figure 5 ont été adsorbés sur 10 ml de produit dit Dowex 50Wx2 (H), la rési- ne a été mise en suspension dans 500 ml d'eau, et 50 mg (en- viron 22 unités/mg) d'a-l,4-glucanglucohydrolase ont été ajoutés à la suspension. La réaction a été conduite à 40 C pendant 17 heures, et le liquide réactionnel a été filtré pour rassembler la résine. La résine a été éluée avec de l'ammo- niaque 0,5N, et l'éluat a été concentré sous pression rédui- te et séché jusqu'à fournir un solide. Le solide récupéré a été soumis à une chromatographie en phase liquide à grande vitesse en utilisant un chromatographe en phase liquide, Modè- 2471 387 31. le dit ALC/GPC-244 (fourni par la société dite Waters Co.) et a été analysé par un dispositif dit chromatopac (Modèle *dit C-RIA fourni par la société dite Shimadzu Seisakusho K.K.) pour obtenir les résultats présentés sur la figure 6. Les rapports de mélange des composants respectifs dans les figures 5 et 6 étaient tels que présentés ci-dessous. Les figures 5 et 6 montrent les résultats de la chromatographie en phase liquide à grande vitesse (Modèle dit ALC/GPC-224 fourni par la société dite Waters Co.) avant et après réaction avec l'a-1,4-glucanhydrolase dans l'exem- ple 7, o la colonne dite P-Bondapak NH2 a été utilisée, l'acétonitrile/eau (70/30) envoyé suivant un débit de 1,5 ml/mn a été utilisé pour le développement et un dispositif dit chromatopac (Modèle dit C-RIA fourni par la société dite Shimadzu Seisakusho K.K.) a été utilisé pour l'analyse. Sur les figures 5 et 6, la différence d indice dé réfraction est portée en ordonnées, le temps de développement est porté en abscisses, les références chiffrées indiquent les temps de rétention (minutes), et A, B, C, D, E, FP, G, H, et-I re- présentent les N-méthyloligoglycosylmoranolines. Symbo- Avant Après le sur la ré- la ré- les action action dessins (figu- (figu- _ __ re 5) re 6) Moranoline A 4,6 % 5,3 % 4-(a-D-glucosyl)-moranoline B 13,2 % 91,5 % 4-(a-D-maltosyl)-moranoline C 14,0 % 3,0 % 4-(a-Dmaltotriosyl)-moranoline D 14,9 % O % 4-(a-D-maltotétraosyl)-moranoline E 13,2 % O % 4-(a-D-maltopentaosyl)-moranoline F 13,5 % O % 4-(a-Dmaltohexaosyl)-moranoline G 11,0-% O % 4-(a-D-maltoheptaosyl)-moranoline H 9,0 % O % 4-(a-D-maltooctanosyl)-moranoline I 4,0 % O % EXEMPLE S Dans les mêmes conditions que celles décrites dans l'exemple 7, la réaction a été réalisée à 400C pendant 26 heures. On a obtenu un mélange de 5,8 % de moranoline et de 32. 93,2 % de 4-(a-D-glucosyl)-moranoline. La présence d'autres composants n'a pas été détectée. EXEMPLE 9 mg du mélange représenté sur la figure 5 ont été dissous dans 4 litres d'eau, la valeur'de pH a été réglée à 5,7 par HC1 0,5 N et 200 mg (environ 22 unités/mg) d'a-l,4- glucanglucohydrolase ont été ajoutés à la solution. La réac- tion a été réalisée à 40 C pendant 41 heures, et on a fait passer le liquide réactionnel à travers une colonne de 10 ml de produit dit Dowex 50W x 2 (H+). La résine a été lavée avec de l'eau suffisamment et éluée avec de l'ammoniaque 0,5N. L'éluat a été concentré sous pression réduite et séché jusqu'à fournir un solide. La poudre obtenue a été dissoute dans une petite quantité d'eau et la chromatographie en phase liquide à grande vitesse a été réalisée, dans les mêmes conditions que celles décrites dans l'exemple 1. On a trouvé que le pro- duit était un mélange de 6 % de moranoline et de 93,4 % de 4-(a-Dglucosyl)-moranoline. La présence d'autres composants n'a pas été détectée. EXEMPLE 10 1 g de N-méthylmoranoline a été dissous dans une pe- tite quantité d'eau, et la valeur de pH a été réglée à 5,7 par de l'acide chlorhydrique 1N (le volume après le réglage de la valeur de pH était 10 ml). Séparément, 16 g d'a-cyclo- dextrine ont été ajoutés à 790 ml d'un liquide d'enzyme brute de cyclodextrine glycosyltransférase (336 unités/ml). Les deux liquides ont été mélangés, et la valeur de pH a été réglée de nouveau à 5,6. La réaction a été réalisée à 39 C pendant 2 jours avec agitation. Le liquide réactionnel a été soumis à une séparation par centrifugation, et la liqueur surnagean- te a été passée à travers une colonne de produit dit Dowex CWx2 (H) (la quantité de la résine était 8 ml) pour amener les substances basiques à être adsorbées sur la résine. La résine a été lavée avec de l'eau suffisamment, et une partie (environ 2 ml) de la résine a été échantillonnée et concentrée sous pression réduite, puis séchée jusqu'à fournir un solide; dans les mêmes conditions que celles décrites dans l'exemple 33. 6, la poudre obtenue a été soumise à la chromatographie en phase liquide et analysée par le dispositif dit chromatopac (la composition du mélange avant la réaction avec l'a-l,4- glu=nglucohydrolase a été ainsi déterminée). Environ 6 ml de la résine restante ont été mis en suspension dans 150 ml d'eau, mg (environ 22 unités/mg) d'a-1,4-glucanglucohydrolase ont été ajoutés à la suspension et la réaction a été réalisée à C pendant 48 heures. Le liquide réactionnel a été filtré pour rassembler la résine, et la résine a été lavée avec de l'eau suffisamment et éluée avec de l'ammoniaque 0,5N. L'éluat a été concentré sous pression réduite et séché jus- qu'à fournir un solide. La poudre obtenue a été soumise à la chromatographie en phase liquide et analysée par un dispositif dit chromatopac. Les résultats ainsi obtenus étaient tels que pré- sentés ci-dessous. EXEMPLE 11 1 g de N-propylmoranoline a été dissous dans une petite quantité d'eau, et la valeur de pH a été réglée à 5,7 par de l'acide chlorhydrique 1N (le volume après le réglage de la valeur de pH était 20 ml). Séparément, 16 g d'a-cyclo- dextrine ont été ajoutés à 790 ml d'un liquide d'enzyme bru- te de cyclodextrine glucosyltransférase (260 unités/ml). Les deux liquides ont été mélangés, et la valeur de pH a été ré- glée de nouveau à 5,7. La réaction a été réalisée à 39 C pen- dant 2 jours en agitant. Le liquide réactionnel a été soumis Avant Après la ré- la ré- action action N-méthylmoranoline 19,0 % 21,3 % 4-(a-D-glucosyl)-Nméthylmoranoline 11,9 % 61,7 % 4-(a-D-maltosyl)-N-méthylmoranoline 13t3 % 15,4 % 4-(a-D-maltotriosyl)-N-méthylmoranoline 13,1 % 1,6 % 4-(a-Dmaltotétraosyl)-N-méthylmoranoline 11,9 % 0 % 4-(a-D)maltopentaosyl)-Nméthylmoranoline 10,9 % O % 4-(a-D-maltohexaosyl)-N-méthylmoranoline 10,4 % O % 4-(a-D-maltoheptaosyl)-N-méthylmoranoline 8,1 % O % 34. à une séparation par centrifugation,et la liqueur surnagean- te a été passée à travers une colonne de produit dit Dowex Wx2 (H) (la quantité de résine était 8 ml) pour amener les substances basiques à être adsorbées sur la résine. La -5 résine a été lavée suffisamment avec de l'eau, une partie (environ 2 ml) de la résine a été échantillonnée et concen- trée sous pressionréduite et puis séchée jusqu'à fournir un solide, et, dans les mêmes conditions que celles décrites dans l'exemple 6, la poudre obtenue a été soumise à la chro- matographie en phase liquide et analysée par le dispositif dit chromatopac (la composition du mélange avant la réaction avec l'a-l,4-glucanglucohydrolase a été ainsi déterminée). Environ 6 ml de la résine restante ont été mis en suspension dans 150 ml d'eau, et 15 mg (environ 22 unités/mg) d'a-l,4- glucanglucohydrolase ont été ajoutés à la suspension et la réaction a été réalisée à 40 C pendant 26 heures. Le liquide réactionnel a été filtré pour rassembler la résine, et la ré- sine a été lavée avec de l'eau suffisamment et éluée avec de l'ammoniaque 0,5N. L'éluat a été concentré sous pression ré- duite et séché jusqu'à fournir un solide. La poudre obtenue a été soumise à la chromatographie en phase liquide et analy- sée par le dispositif dit chromatopac. Les résultats obtenus étaient.tels que présentés ci-dessous f Avant Après la ré- la ré- action action N-propylmoranoline 19,5 % 24,2 % 4-(a-D-glucosyl)-Npropylmoranoline 16,7 % 75,1 % 4-(a-D-maltosyl)-N-propylmoranoline 10,2 % O % 4-(a-D-maltotriosyl)-N-propylmoranoline 10,0 % 0 % 4-(a-Dmaltotétraosyl)-N-propylmoranoline 10,3 % O % 4-(a-D-maltopentaosyl)-Npropylmoranoline 9,8 % O % 4-(a-D-maltohexaosyl)-N-propylmoranoline 8,3 % 0 % 4-(a-D'maltoheptaosyl)-N-propylmoranoline 7,8 % 0 % à- (-D-mnl-tnnl -nvl--N-rnoDvlmnrRnnli n q. r n. - - - _- 1 , 1 2471 387 35. La présente invention n'est pas limitée aux exem- ples de réalisation qui viennent d'être décrits, elle est - au contraire susceptible de variantes et de modifications qui apparaîtront à l'homme de l'art. 36. REVENDICATIONS 1 - Dérivés de moranoline, caractérisés en ce qu'ils sont représentés par la formule générale suivante: HO (I) o n est un nombre entier de O à 7, et R représente H ou un groupe alkyle inférieur. 2 - Procédé de préparation de dérivés de moranoline représentés par la formule générale suivante (I): CH20H 0 X HO H OH H (I) H Hy OH 37. o R représente H ou un groupe alkyle inférieur, et n est un nombre entier de O à 7, caractérisé en ce qu'il consiste à faire réagir une solution aqueuse contenant des moranolines représentées par la formule générale suivante (II): CH OH IH/ R N H OH (I) HO H H H- o R est tel que défini ci-dessus, et de la cyclodextrine ou de l'amidon soluble avec de la cyclodextrine glycosyltransfé- rase pour obtenir un mélange contenant des dérivés de morano- line représentés par la formule générale ci-dessus (I), et à isoler les composants respectifs dans le mélange. 3 - Procédé de préparation de dérivés de glucosyl- moranoline représentés par la formule générale suivante CH 2OH CH2 R HD N HOH H H HO 0 OH o R représente un atome d'hydrogène ou un groupe alkyle infé- rieur, caractérisé en ce qu'il consiste à faire réagir une solution d'un mélange contenant un composé représenté par la formule générale suivante (I): CH2OH CH2OH CH2OH H -0 À0 0 HO H HO H OH (I) 38. o R est tel que de O à 20, et un suivante (IV): défini ci-dessus et n est un nombre entier composé représenté par la formule générale CH 2OH (iv) OH o R est tel que défini ci-dessus, en prévoyant que le cas o un composé de formule générale (I) o n vaut zéro est uti- lisé seul en tant que composé de formule générale (I) est ex- clu, avec de l'a-l,4-glucanglucohydrolase directement ou après addition d'un membre échangeur de cations, si cela est nécessaire. 4 - Composition pharmaceutique à activité de con- trôle de l'augmentation des niveaux de sucre dans le sang, ca- ractérisée en ce qu'elle renferme, en tant qu'ingrédient ac- tif, au moins un des dérivés de moranoline indiqués dans la revendication 1.