FR 2461498 A1 19810206 FR 7919076 A 19790724 i La présente invention est relative à un procédé de préparation de solutions concentrées de la forme naturelle de l'amygdaline. Elle est également relative aux solutions concen- trées ainsi obtenues et à des poudres obtenues par lyophilisa- tion desdites solutions concentrées. L'amygdaline ou le mandélonitrile egentiobioside est un hétéroside (glucoside cyanogénétique) contenu dans l'amande amère et divers fruits d'amygdalacées et de pomacées. Lorsque l'amygdaline est extraite du milieu naturel dans lequel elle se trouve et que l'on a pris toutes les pré- cautions nécessaires pour qu'elle ne subisse aucune modifica- tion:physico-chimique (et notamment aucune modification du pouvoir rotatoire) au cours de l'extraction et/ou de la purification, on obtient le D ou R mandélonitrile e-gentiobioside trihydraté qui répond à la formule générale I ci-après H OH O I CH2 O I O CN OH HH 3 3 +.332O L'amygdaline constitue, comme on le sait, un cytosta- tique puissant, notamment à l'égard de cellules contenant l'enzyme $glucuronidase qui hydrolyse l'amygdaline selon le schéma II ci-après: H CH2OH 1 II Hgo H ô CN H H H HO H ! H OH H O & 2 D GLUCOSE + 1 D MANDELONITRILE Les quantités d'amygdaline qui doivent être adminis- trées aux malades sont relativement importantes et s'élèvent à environ 2025 g par jour. Comme la solubilité dans l'eau de l'amygdaline est assez faible, de l'ordre de 8 à 8,5 % (1 g d'amygdaline se dissout dans environ 12 ml d'eau), ce sont donc des volumes importants qui sont injectés aux malades. On a donc tenté, conformément à l'Art antérieur, d'augmenter la solubilité de l'amygdaline afin de pouvoir ré- duire les volumes injectés. Toutes ces tentatives, qui ont fait appel à des opérations physico -chimiques, ont donné lieu à des solutions d'amygdaline contenant une proportion élevée d'impuretés. Dans certaines de ces préparations, la teneur en amygdaline pure a meme été réduite jusqu'à 65 % par rapport à la quantité d'amygdaline pure initialement présente. C'est ainsi que 10 échantillons du commerce ont été analysés, et les résultats suivants ont été obtenus (Tableau I): TABLEAU I LOT - 25 trouvé D 1 - 3706 2 - 39 1 3 - 49 4 - 50 2 - 5603 6 - 4303 7 - 40 8 - 39 4 9 - 550 - 52 Or, la rotation optique de l'amygdaline pure est de - 35 5 (C,l,eau) pour la forme trihydratée et de - 42 (C,l,eau pour la forme anhydre. Lorsque l'amygdaline est dissoute dans l'eau, et qu'on soumet cette solution à l'action du temps, de la cha- leur, de la congélation, ou bien d'un alcali léger, ou bien encore de certains catalyseurs comme le noir animal, la forme optique initiale change brusquement, entrainant avec elle des modifications moléculaires, qui font suite à une ou plusieurs réactions chimiques d'hydrolyse donnant naissance à une ou plusieurs impuretés telles que l'amygdalinimide, le mandélo- nitrile ou encore le glucose. Le mécanisme de l'action de ces divers processus physico-chimiques résulte des transformations qui s'opèrent sur le carbone assymétrique contenant les groupements nitrile, glucoside, hydrogène, benzene, lequel, au cours de la trans- formation optique, voit un de ses groupements s'échapper de la molécule, pour venir se placer dans une position symé- trique. Au cours de cette réaction stéréo-chimique qui démarre à partir de l'épimère R pur (D mandélonitrile gentiobioside ou amygdaline de formule I), lequel se transforme pour une partie en épimère S (ou L mandélonitrile gentiobioside ou néo-amygdaline de pouvoir rotatoire 25 = _ 6105 C,l,eau), il se produit en plus, selon les conditions mises en oeuvre et selon la quantité d'épimère R transformée en épimère S, jusqu'à 30 % de produits secondaires (amygdalinimides et meme produits de l'hydrolyse du groupement nitrile ou de l'hydrolyse successive des groupements glucosido-glucosides). Cf. le schéma IV ci-après: CN -R1 O - c tR1 - O-C Isomère R Isomère S CH CH R1 0 + R1 O- et R1 O NS44 1 0, 4 H30H N IV \NH2 Ni2 R1 étant le reste glucosido-glueosidique. Alors que les solubilités des énantiomères sont identiques, celles des diastéréoisomères sont, d'une façon géné- rale, différentes. C'est le cas pour le mélange épimère R et épimère S qui voit sa solubilité dans l'eau augmenter de quatre fois par rapport à l'épimère R seul. Cette variation de solubilité a été mise à profit dans les préparations de l'Art antérieur, pour dissoudre de grandes quantités de produit, mais si ces diastéréoisomères ont des propriétés chimiques ou physiques différentes, leurs propriétés pharmacologiques le sont aussi. La présente invention s'est, en conséquence, donné pour but de pourvoir à des solutions concentrées d'amygdaline qui répondent mieux aux nécessités de la pratique que les so- lutions de l'Art antérieur, notamment en ce qu'elles rendent le traitement beaucoup plus supportable aux malades et ceci sans altérer en aucune manière les caractères physico-chimiques du produit naturel. La présente invention s'est donné notamment pour but de préparer des solutions concentrées de la forme natu- relle diastéréoisomère R qui répond à la formule D mandélonitri- le e-D-glucosido-6-e-glucoside,de pureté optique maximum. Au cours de. travaux portant sur l'étude de la trans- formation de l'amygdaline en isoamygdaline, la Demanderesse a constaté qu'il y:a migration de l'atome d'hydrogène du carbone assymétrique portant les groupements nitrile, benzyle et gentiobioside, avec formation d'un carbanion instable et fixation en position symétrique du proton, et ceci jusqu'à l'équilibre stable du mélange des deux diastéréoisomères R et S. Autrement dit, afin d'empêcher cette migration et la formation d'isomère S, il y a lieu de favoriser la réaction inverse, c'est-à-dire de stabiliser la liaison C-H de la forme épimère R. La Demanderesse a pu mettre en évidence que cette stabilité est en relation directe avec le pH. La présente invention a pour objet un procédé de préparation de solutions concentrées de la forme naturelle de l'amygdaline, caractérisé en ce que l'on dissout de l'amygdaline pure naturelle dans de l'eau,par chauffage rapide, à Une tempé- rature comprise entre 40 C et 115 C, ladite solution étant ajustée à un pH compris entre 3,5 et 4,5, et de préférence entre 3,7 et 3,9, après quoi on laisse refroidir la solution à la température ambiante. Ainsi, en combinant l'effet de stabilisation du diastéréoisomère R aux pH acides,avec la propriété connue de l'amygdaline de présenter une solubilité importante aux tempé- ratures élevées, on parvient à dissoudre une quantité impor- tante d'amygdaline sans modifier la pureté optique initiale de l'amygdaline. En refroidissant ensuite, la température de la solution s'abaisse au-dessous de la valeur de saturation usuelle, sans que l'on observe un dépot du produit. L'état de sursaturation ainsi obtenu peut être conservé autant de temps que l'on veut. D'autre part, cette faculté de pouvoir chauffer à des températures élevées (jusqu'à 1150C) sans produire de diastéréoismère S,permet en mxme temps de stériliser les solutions d'amygdaline sans altérer aucunement le produit. Selon un mode de réalisation avantageux du procédé objet de la présente invention, on utilise pour ajuster le pH, des acides organiques pharmaceutiquement acceptables n'ayant pas d'atome d'halogène dans leur molécule. Selon un autre mode de réalisation avantageux du procédé objet de la présente invention, la solution d'amygda- line est stérilisée avant refroidissement, en portant la température aux environs de 1150C pendant 15 à 25 minutes. Conformément à l'invention, les solutions d'amygda- line ainsi obtenues peuvent avantageusement être mises sous forme de poudres par lyophilisation par congélation rapide et déshydratation sous vide. La poudre ainsi obtenue est constituée par de l'amygdaline pure naturelle; elle se conserve pendant de longues périodes et conserve sa bonne solubilité. Outre les dispositions qui précèdent, l'invention comprend encore d'autres dispositions qui ressortiront. de la description qui va suivre. La présente invention vise plus particulièrement le procédé de préparation de solutions concentrées stériles d'amygdaline pure naturelle, conforme aux dispositions qui précèdent, les moyens propres à la mise en oeuvre de ce pro- cédé, ainsi que les procédés d'ensemble et les chatnes de fa- brication dans lesquels est inclus le procédé conforme à la présente invention, et les solutions concentrées et les poudres obtenues par ce procédé. L'invention pourra être mieux comprise à l'aide du complément de description qui va suivre, qui se réfère à des exemples de mise en oeuvre du procédé conforme à l'invention, à l'analyse des produits obtenus, ainsi qu'à une étude des caractéristiques de l'amygdaline en fonction du pH et de la température. Il doit etre bien entendu, toutefois, que les dif- férents exemples de mise en oeuvre du procédé qui seront décrits ci-après, sont donnés uniquement à titre d'illus- tration de l'objet de l'invention, mais n'en constituent en aucune manière une limitation. I.- udede__l'obtention de_ l'égquilibre stable des diastéréo- isomrsR__S__5_ C_fio-- çion__du___ Le Tableau II ci-après résume les résultats obtenus: TABLEAU II pH solution 3,8 4 4,5 5 67 Temps de chauffage à C pour 20 h 15 h 11 h 2 h 30 min. 5 min. l'obtention de l'équilibre Il résulte très clairement de ces résultats que pour des chauffages rapides, le risque d'épimérisation est pratiquement nul pour des pH inférieurs ou égaux à 4. II.- Solubilité de l'amygdaline en fonction de la température: TABLEAU III Température 5 C 12 C 22 C 30 C 40 C 50 C 80 C Solubilité g/100 ml H20 4,5 5,5 8 14 25 36 60 Solbiit 45f i36 6 La multiplicité des groupements hydroxyle confère à l'amygdaline une très grande solubilité à chaud. En refroidissant ces solutions concentrées, on obtient des solutions sursaturées et parfaitement stables en fonction du temps, d'amygdaline pure naturelle. Ainsi, le traitement de malades se trouve considérablement amélioré (5 à fois moins de volume à injecter). Il est aisé de faire cesser cet état de sursaturation en projetant dans la solution un cristal d'amygdaline ou d'un corps isomorphe. III.- EXEMPLES DE PREPARATION EXEMPLE 1 - g d'amygdaline pure naturelle, sont dissous dans 80 cm3 d'eau bidistillée apyrogène, en chauffant à la tempé- rature moyenne de 45 C. On ajuste le pH de la solution obtenue à 3,8 à l'aide d'acide glutamique et on filtre sur micro- pore 0,20 microns, puis on place la solution filtrée dans un ou plusieurs récipients préalablement stérilisés à 180 C pen- dant quatre heures; enfin les récipients sont fermés herméti- quement et stérilisés à 115 C pendant 20 minutes. Apres refroidissement à température ambiante, on obtient une solution limpide, claire, incolore, dépourvue d'impuretés mécaniques ou de cristallisation. Cette solution placée au réfrigérateur vers 0 C, ne cristallise sas. L'état de sursaturation ainsi produit permet la bonne conser- vation de l'amygdaline pure naturelle en solution aqueuse pendant au moins 20 mois. Analyse: L'analyse est effectuée par comparaison simultanée du produit initial, cristallisé, et de l'amygdaline en solu- tion. Aalys e de l'amydaline cristallisée I. Aspect: Poudre blanche cristalline sans odeur. Fusion kOfler: vers 125 C (ramollissement) II. Analyse spectrale: A. S2ectreIR (KBr) Pics maximum à 3300 cm (OH2), 2250 cm-1 (CN); 1650 cm(OH2), 1450 cm-1 1380 cm-1 (aryl) 1080-1020 (large) (C-OH) 760 et 705 cm-1(0). B. Rotation ôptiaue (C,1,H20) 25 = - 37 6 C. Spectre UV (C.O,1,H20) X max (nm) = 268,262,257,252 titúe obtenu par dosage UV = 105 % III. Chromatographie A. Chromatographie sur couche mince (Silicagel F254Merck) 1. Solvant de migration: Acétate d'éthyle 90 Méthyléthylcétone 54 Acide formique 18 Eau distillée 18 2. Quantité dépos2e y 200y (H20) 3. Détection - UV - Solution a-naphtol 6 % naphtol dans éthanol à 20 % Acide sulfurique au 1/2 4. Résultats On peut observer la présence d'un seul spot à Rf: 0,20 B. Chromatographie en phase gazeuse Référence: Par produit d'extraction - Somet CV 330 1. Colonne: L = 2m OV 17 3% sur Chromosorb W 100/120 2. Températures:Injecteur 300 C - Four 250 C. Détecteur 200 C 3. Gaz vecteur: Azote 1,45 kg/cm2 4. Détecteur: H2-0,8 kg/cm2 air 1,3 kg/cm2 5. Enregistreur: déroulement à 30 cm/heure 6. Quantité injectée: 0,1 pl dérivés sylilés 7. Résultats: le chromatogramme présente un seul pic à Tr - 29' correspondant à l'amygdaline épimère R pur. Résonnance magnétique nucléaire Référence: TMS Solvant D2 O Le spectre obtenu correspond à la structure avec déplacement chimique (S) groupement 3,4 - 4,4 protons glucosides ,8 singulet H - C - C - N (forme D) 7,35 singulet protons groupe phényle L'amygdaline considérée correspond à l'épimère R pur. Analyse de l'amygdaline mise en solution selon l'Exemple 1: I. Aspect: Solution limpide, incolore, sans impuretés mécani- ques ni cristallisations. Par évaporation au bain-marie à 30 C sous 2mm Hg, résidu cristallisé blanc - Point de fusion: vers 125 C II. Analyse spectrale (effectuée sur le résidu cristallisé blanc): A. Spectre IR (KBr) -1 Pics maximum à 3300 cm, 2250, 1650, 1450, 1380, 1080, -1 1020 (large) 760 et 705 cm. B. Rotation optique:(C,l,H20) r25 = - 40 6 (Dilution c=l H20 obtenue sur la base de la concentration de la solution préparée) C = 25 % C. Spectre UV (CO,1 H20) Xmax (nm): 268, 262, 257, 262 Titre obtenu par dosage UV: 110 % (Dilution pour C=0,1 sur la base de la concentration c = 25 % de la solution préparée). III. Chromatograhie A. Chromatographie sur couche mince: mêmes caractéristiques techniques. 1. Quantité déposée. 1007 200Y 2. Référence: le produit cristallise avant dissolution 3. Résultats: l'amygdaline en solution présente le même spot que l'anygdaline initiale Rf = 0,20 B. Chromatographie en phase vapeur: mêmes caractéristiques techniques. Dérivés triméthylsililés sur produit d'évaporation Référence: chromatogramme amygdaline avant conditionne- ment. Résultats: un seul pic amygdaline Tr = 29 minutes correspondant à l'épimère R pur. EXEMPLE 2 - De la même façon que dans l'Exemple 1, 16,5 grammes d'amygdaline pure naturelle, sont dissous dans 88 cm3 d'eau bidistillée apyrogène. Le pH de cette solution est ajusté à 3,8 par addition de 10 mg d'acide glutamique pur cristallisé. La solution est filtrée sur Micropore 0,20 microns, puis répartie dans divers récipients préalablement stérilisés à 180 C pendant 4 heures. La solution conditionnée dans les récipients cor- rectement fermés est autoclavée à 115'C pendant 20 minutes; on obtient après refroidissement, une solution limpide et claire, dépourvue d'impuretés mécaniques ou de cristallisation. La solution étant stérile, elle peut se conserver pendant au moins 20 mois. Analyse: Résultats L'analyse effectuée comparativement avec le produit initial cristallisé montre que l'amygdaline en solution a gardé son identité structurale et sa qualité optique. Cette analyse est effectuée successivement par l'analyse spectrale (IR UV E2D) et l'analyse chromatographique (CCM,CPV). EXEMPLE 3 - grammes d'amygdaline pure naturelle sont dissous à la température de 30 C dans 90 grammes d'eau bidistillée apyrogène. Le pH de la solution obtenue est ramené au voisinage de 3,8 par addition de 15 mg d'acide glutamique, puis filtrée sur Micropore 0,20 p et répartie par fractions de 10 ml dans des flacons de 20 ml. Chaque flacon est bouché partiellement par un tampon biologique, puis est soumis à un autoclavage de 115 C pendant 10 minutes. Après refroidissement, la solution est soumise à une rapide congélation vers 45 C; -50 C, puis déshydratée par le vide. Le lyophilisat obtenu correspond à de l'amygdaline pure naturelle. Analyse I. Aspect: Poudre blanche hygroscopique Fusion kfler: 120 C avec ramollissement II. Analyse spectrale: A. - Spectre IR: conforme à la structure B. - Rotation optique: 25 = 38 C. - Spectre UV: X (max) = 268, 262,257, nm 252, titre obtenu par dosage UV = 102 % III. ChromLatographie A- sur couche mince (Silicagel) 1 seul spot identique au produit initial Rf = 0,20 B- En phase vapeur 1 seul pic à Tr = 29 minutes conforme à l'épimère R pur Il résulte de la description qui précède que, quels que soient les modes de mise en oeuvre, de réalisation et d'application adoptés, l'on obtient des solutions concentrées, de toutes concentrations désirées et contrôlées, d'amygdaline naturelle pure, dépourvue d'impuretés et stérile, lesquelles solutions concentrées peuvent, si on le désire, être stockées (telles quelles ou à l'état lyophilisé) pendant de longs mois. Ainsi que- cela ressort de ce qui précède, l'in- vention ne se limite nullement à ceux de ses modes de mise en oeuvre, de réalisation et d'application qui viennent d'être décrits de façon plus explicite; elle en embrasse, au contraire, toutes les variantes qui peuvent venir à l'esprit du technicien en la matière, sans s'écarter du cadre, ni de la portée, de la présente invention. REVENDICATIONS 1. Procédé de préparation de solutions concentrées de la forme naturelle de l'amygdaline, caractérisé en ce que l'on dissout de l'amygdaline pure naturelle dans de l'eau, par chauffage rapide, à une température comprise entre 400C et 1150C, ladite solution étant ajustée à un pH compris entre 3,5 et 4,5, et de préférence entre 3,7 et 3,9, après quoi on laisse refroidir la solution à la température ambiante. 2. Procédé selon la Revendication 1, caractérisé en ce que l'on stérilise les solutions concentrées d'amygda- line par chauffage à des températures comprises entre 115 et 'C pendant 15 à 30 minutes. 3. Procédé selon l'une quelconque des Revendications 1 et 2, caractérisé en ce-que l'on utilise, pour ajuster le pH, des acides organiques pharmaceutiquement acceptables n'ayant pas d'atome d'halogène dans leur molécule. 4. Procédé selon la Revendication 3, caractérisé en ce que l'acide utilisé est de l'acide glutamique. 5. Procédé selon l'une quelconque des Revendications 1 à 4, caractérisé en ce que l'on lyophilise les solutions d'amygdaline par congélation rapide et déshydratation sous vide. 6. Solutions aqueuses concentrées obtenues en mettant en oeuvre le procédé selon l'une quelconque des Revendications 1 à 4. 7. Poudre lyophilisée obtenue en mettant en oeuvre le procédé selon la Revendication 5.