FR 2468646 A1 19810508 FR 8023612 A 19801105 La présente invention se rapporte d'une façon générale à un procédé de production d'acide D(-)-p -hydroxyisobutyrique (qu'on abrège ci-après DHIBA) et elle concerne plus particulièrement un procédé avantageux de production de D-HIBA en profitant de l'aptitude spéciale des microorganismes à produire un composé optiquement actif par synthèse asymétrique. Le D-HIBA est l'un des intermédiaires intéressants pour la synthèse de substances physiologiquement actives contenant des atomes de carbone asymétri- ques, par exemple de médicaments tels que le produit hypotenseur connu: 1-(D-3-mercapto-2-méthyl propanoyl)-L-proline. En ce qui concerne les procédés de production de l'acide P-hydroxyiso- butyrique (HIBA), on connaît par exemple la synthèse chimique à partir du formaldéhyde et de l'à -bromopropionate d'éthyle par la réaction de Réformatsky (voir E.E. Blaise et I. Herman: Ann. Chim. et phys. 17,371, 1969); cependant le HIBA obtenu par ce procédé est sous la forme DL() optiquement inactive. Ce procédé n'est donc pas avantageux pour la production d'un HIBA optiquement actif car des procédés complexes de séparation chimique utilisant un réactif coûteux tel que la quinine, sont nécessaires (J. Retey et F. Lynen: Biochemische Zeitschrift, 342, 256-271, 1965). Un procédé pour obtenir le D-HIBA par une synthèse chimique sans séparation optique a été décrit par M. Sprecher et D.B. Sprinson (Journal of Biological Chemistry, 241, 868, 1966); cependant, la matière de départ dans ce procédé, à savoir l'acide thréo-3-méthyl-Laspartique, est très coûteuse et les techniques de synthèse sont excessivement compliquées. D'autre part, un procédé de production d'un HIBA optiquement actif par fermen- tation en utilisant Pseudomonas putide (Charles T. Geodhue et James R. Schaeffer: Biotechnology and Bioengineering 13, 203, 1971)a également été présenté mais le HIBA obtenu par ce procédé est sous forme L(+). On voit donc qu'il n'existe aucun procédé industriellement avantageux pour la production de D-HIBA. La demanderesse a remarqué que les procédés microbiens qui utilisent la caractéristique de catalyse stéréospécifique des microorganismes se sont révélés fréquemment plus avantageux pour la production de composés opti- quement actifs que la résolution chimique des composés racémiques. La Demanderesse a maintenant trouvé que certains microorganismes ont la capacité de convertir l'acide isobutyrique (qu'on abrégera ci-après IBA) ou l'acide méthacrylique (abrégé ci-après MA) en D-HIBA. En se basant sur cette découverte, la Demande- resse a élaboré la présente invention qui est un procédé de production par fermentation de D-HIBA à partir de IBA, MA ou d'un mélange de IBA et MA. Selon l'invention, on soumet un substrat choisi parmi IBA, MA et les mélanges de IBA et MA, qui est facilement disponible à faible prix et à des quantités importantes., à l'action d'un microorganisme capable de convertir le substrat en D-HIBA. La conversion du substrat en D-HIBA par catalyse du microorganisme est effectuée de deux façons. Selon la présente variante, on cultive le microorganisme par voie aérobie dans un milieu aqueux nutritif contenant le substrat, la propagation du microorganisme et l'exposition du substrat à l'action du microorganisme se faisant simultanément en un seul stade. Selon la seconde variante, on cultive d'abord le microorganisme dans un milieu nutritif aqueux, puis on ajoute le substrat au bouillon de culture résultant ou à la suspension de cellules provenant du premier stade et ensuite on incube le mélange par voie aérobie. Les microorganismes utilisés selon l'invention convertissent le substrat seulement en la forme D(-) de HIBA avec un rendement élevé; en conséquence, conformément à l'invention, on peut produire le D-HIBA par un procédé simple et peu onéreux. Les microorganismes utilisés selon l'invention possèdent l'aptitude de convertir IBA et/ou MA en D-HIBA et on peut les choisir facilement parmi les cultures typiques ou les souches, isolées par la nature selon les procédés ci-après: On ajoute IBA ou MA en une quantité atteignant une concentration d'environ 2 % pds/vol, à un bouillon de culture obtenu par culture d'une souche microbienne dans un milieu nutritif dans lequel la souche testée peut se développer. On incube par voie aérobie à une température de 25 à 35 C pendant une durée de là 3 jours le bouillon de culture résultant dont le pH est ajusté entre 6 et 9. Après l'incubation, on ajoute un sel hautement hydrosoluble, tel que le sulfate d'ammonium ou le sulfate de sodiumau bouillon de culture et on abaisse le pH au-dessous de 2 pour faciliter l'extraction de D-HIBA du bouillon de culture. On extrait le bouillon de culture avec un solvant non miscible à l'eau tel que l'acétate d'éthyle. On évapore le solvant et on sèche sur du sulfate de sodium anhydre, puis on mesure, dans une solution de méthanol, la rotation optique de l'extrait. On choisit les échantillons de l'extrait à rotation lévogyre et on les applique sur une plaque mince de gel de silice. Si un échantillon fait preuve de la même mobilité que HIBA, le microorganisme utilisé pour la préparation de l'échantillon fait preuve de la même mobilité que HIBA, le microorganisme utilisé pour la préparation de l'échantillon possède presque toujours la capacité de convertir HIBA ou MA en D-HIBA. Pour confirmer la production de D-HIBA, on purifie davantage l'échantillon de l'extrait par chromatographie sur colonne de gel de silice et on détermine la structure de la composition purifiée par une analyse instrumentale telle que RMN, I.R. et ainsi de suite. D'après les résultats obtenus par cette sélection des microorganismes produc- teurs de D-HIBA, la plupart des bouillons de culture dont l'extrait dans un solvant est du type à rotation lévogyre contiennent D-HIBA. En conséquence, ce procédé de sélection est simple et permet de découvrir très facilement les microorganismes capables de produire le D-HIRA à partir de IBA ou MA. On peut utiliser tous les microorganismes producteurs de D-HIBA qui ont été sélectionnés par la technique indiquée pour mettre en oeuvre l'invention; par exemple on utilise les microorganismes appartenant aux genres suivants: Candida, Torulopsis, Trygonopsis, Saccharomyces, Pichia, Debaryomyces, Wingea, Rhodosporidium, Aspergillus, Choanephora et Zygo- rhynchus. Parmi les microorganismes appartenant aux genres ci-dessus, on utilise les souches suivantes, par exemple, pour la mise en oeuvre de l'invention: Candida Rugosa IFO 0750, Candida Rugosa IFO 0591, Candida parapsilosis IFO 0708, Candida utilis IFO 0396, Torulopsis candida IFO 0380, Trygonopsis variabilis IFO 0671, Saccharomyces cerevisiae IAM 4274, Saccharomyces rouxii IFO 0493, Pichiamembranaefaciens IAM 4904, Debaryomyces hansenii IFO 0026, Wingea robertsii IFO 1277, Rhodosporidium toruloides IFO 0559, Aspergillus niger IAM 2532, Choanephora circinanus HUT 1324 et Zygorhynchus moelleri HUT 1305. Notes: IFO: Institut de Fermentation, Osaka; Juso Nishinomachi, Higashiyodogawa-ku, Osaklca,,Japon IAM Institut de Microbiologie Appliquée, Université de Tokyo; 1-chome, Yayoi, Bunkyo-ku, Tokyo, Japon HUT: Faculté d'ingénieurs, Université d'Hiroshima 3-chome, Senda-machi, Hiroshima City, Japon, Pour soumettre le substrat à l'action du microorganisme, on dispose de deux techniques. Selon la première, on cultive le microorganisme par voie aérobie en milieu aqueux qui contient déjà le substrat depuis le début de la culture, de sorte que D-HIBA s'accumule dans le milieu simultanément avec la propogation du microorganisme. Selon la seconde technique, le procédé comporte deux stades, à savoir la culture du microorganisme, puis l'action du microorganisme sur le substrat. Pour le premier stade de ce procédé en deux stades, on peut cultiver le microorganisme dans un milieu nutritif aqueuxo Le second stade consiste à ajouter le substrat à un bouillon de culture provenant du premier stade ou à une suspension de cellules obtenue au premier stade, opération suivie d'une incubation aérobie du mélange résultant. On prépare la suspension de cellules en séparant des cellules à partir d'un bouillon de culture du microorganisme par une technique de centrifugation ou une technique analogue, puis en mettant en suspension ces. cellules dans un milieu aqueux approprié tel qu'une solution aqueuse de tampon phosphate. Etant donné que des enzymes des microorganismes participent à la réaction dans le procédé selon l'invention, on peut également soumettre les cellules séparées à des traitements variés tels que le séchage et l'homogé- néisation, etc... avant la mise en suspension dans le milieu afin de promouvoir la réaction enzymatique. Il résulte de ce qui précède que l'invention s'étend à l'utilisation de cellules traitées de diserses façons. Pour la culture des microorganismes, on peut utiliser un milieu quel- conque dans lequel les microorganismes choisis peuvent se développer. Habi- tuellement un tel milieu contient une source de carbone, une source d'azote et, le cas échéant, une source minérale et ainsi de suite. Comme exemples de sources de carbone dans le milieu, on peut citer les hydrates de carbone tels que le glucose, le saccharose, l'amidon, les hydrolysats et les mélasses;les acides organiques tels que les acides acétique, fumarique et lactique; les alcools tels que le méthanol, l'éthanol et le propanol; et d'autres hydrocarbures liquides tels que les n-paraffines et les oléfines, les huiles et les graisses, le glycérol et ainsi de suite, qui peuvent être assimilés par les microorga- nismes utilisés. Pour ce qui est de la source d'azote dans le milieu, on peut utiliser des composés minéraux ou organiques tels que le sulfate, le chlorure ou le phosphate d'ammonium, l'eau ammoniaquée, l'urée, les aminoacides, la peptone et les hydrolysats des protéines du soja. En qualité de source minérale dans le milieu, ont peut utiliser les sels d'acides minéraux de potassium, magnésium, zinc, fer, manganèse, cuivre ou calcium. Eventuellement, on peut introduire dans le milieu un extrait de levure, un extrait de viande, une liqueur de macération du mais, des vitamines ou des substances apparentées à l'acide nucléique comme l'adénine et la guanine. Pour ce qui est des conditions de culture, aucune différence particulière n'existe entre les deux techniques indiquées. On peut effectuer la culture du microorganisme dans des conditions quelconques qui permettent le développe- ment du microorganisme, mais on préfère un pH d'environ 4,0 à 9,5 et une tempé- rature d'environ 20 à environ 40 'C. Dans le procédé indiqué en deux stades, une technique efficace pour activer la réaction au second stade consiste à induire les enzymes du microorganisme qui catalysent la conversion du substrat en D-HIBA, par addition au milieu, d'une petite quantité de substrat au cours du premier stade. l'incubation au second stade du procédé décrit en deux stades peut se faire avantageusement à un pH d'environ 6,0 à 9,5 et à une température d'environ 20 à 40 C. Pour isoler le D-HIBA du bouillon de culture ou du mélange de réaction, on peut utiliser les procédés usuels d'extraction et de purification d'un acide organique, par exemple l'extraction par un solvant et l'échange d'ions. Un exemple d'un procédé efficace de récupération par extraction par un solvant est décrit ci-après: on acidifie le bouillon de culture ou le mélange de réaction par un acide minéral tel que l'acide sulfurique ou chlorhydrique, on ajoute un sel minéral tel que le sulfate d'ammonium ou le sulfate de sodium, si nécessaire, pour augmenter la force ionique du bouillon ou du mélange et on extrait avec un solvant non miscible à l'eau tel que le butanol, la méthyl- isobutylcétone, ou l'acétate d'éthyle. On obtient le D-HIBA brut par évapora- tion à siccité de la couche du solvant. On peut encore purifier le D-HIBA ainsi obtenu pa une chromatographie sur colonne de gel de silice, etc... pour obtenir un D-HIBA de haute pureté. Les exemples suivants servent à illustrer l'invention sans aucunement en limiter la portée: EXEMPLE 1 On inocule séparément chacun des organismes suivants: Candida rugosa IFO 750, Candida rugosa IFO 0591, Candida parapsilosis IFO 0708,Candida utilis IFO 0396, Torulopsis candida IFO 0380, Trygonopsis variabilis IFO 0671, Saccharomyces cerevisiae IAM4 4274, Saccharomyces rouxii IFO 0493, Pichia membranaefaciens IAM 4904, Debaryomyces hansenii IFO 0026, Wingea robertsii IFO 1277, Rhodosporodium toruloides IFO 0559, Aspergillus niger IAM 2532, Choanephora circinanus HUT 1324, et Zygorhynchus moelleri HUT 1305, dans un milieu comprenant 40 g de glucose, 5 g d'extrait de levure, 3 g de peptone, 1 g d'extrait de viande et 20 g deIBA ou 20 g de MA ou un mélange de 20 g contenant des proportions pondérales égales de IBA et MA. On cultive chaque microorganisme dans une cuve de fermentation d'une capacité de 3 litres, à C, à pH 7,5, avec agitation de 500 tours/minute et aération de 1 vol/l vol pendant 24 heures. On élève ensuite le pH à 8,5 et on poursuit la culture pen- dant 48 heures de plus. On acidifie le bouillon de culture ainsi obtenu avec de l'acide sulfurique pour lui donner un pH de 2,0, on sature avec du sulfate d'ammlonium et on extrait avec de l'acétate d'éthyle en une quantité égale en volume à celle du bouillon de culture. On sèche l'extrait avec du sulfate de sodium anhydre et on concentre sous pression réduite. On dépose la substance huileuse concentrée dissoute dans une petite quantité & benzène sur une colonne garnie de gel de silice. On effectue l'élution d'abord avec un mélange de benzène et d'acétone (9:1 en volume) pour éliminer IBA ou MA n'ayant pas réagi et ensuite avec un mélange de benzène et d'acétone (3:1 en volume) pour éluer le D-HIBA. On combine les fractions contenant le D-HIBA et on concentre sous pression réduite pour obtenir un liquide visqueux. On identifie le liquide ainsi obtenu comme étant le HIBA, aussi bien par chromatographie gazeuse, que par chromatographie en couche mince sur gel de silice, examen du spectre RMN, etc... On mesure la rotation optique de chaque produit et on obtient le résultat suivant: [25]D 13-18 (C=3, méthanol), ce qui démontre que le HIBA obtenu à l'aidcde chaque microorga- nisme est sous la forme D(-). Les rendements en D-HIBA préparés par le procé- dé décrit ci-dessus sont indiqués dans le tableau I ci-après. 1G TABLEAU I Rendement en D-HIBA (g) Substrat IBA MA j IBA±MA Microorganisme - Candida rugosa IFO 0750 8r2 779 78! Candida rugosa IFO 0591 6t5 7r8 84 4 Candida parapsiZosis IFO 0708 5,5 6,2 5t5 Candida utiLis IFO 0396 5t4 8r8 5r3 ToruZopsis candida IFO 0380 2r1 171 3,6 Trygonopsis variabilZis IFO 0671 5t8 2?5 2t9 Saccharomyces cerevisiae IAM 4274 3T2 lr7 3T3 Saccharomyces rouxii IFO 0493 4,6 2,0 470 Pichia membranaefaciens IAM 4904 - 7r0 1,3 179 Debaryomyces hansenii IFO 0026 9r2 413 7r0 Winaea roberteii IFO 1277 1T9 078 1,1 Rhodosporidium toruZoides IFO 0559 2r5 4T0 2t2 AspergiZZus niger IAM 2532 2t3 2T3 3T5 Choanephora circinanus HUT 1324 1r8 15 0,6 Zygorhynchus moelZeri HUT 1305 1T3 1,1 1,5 EXEMPLE 2 On utilise les mêmesa souches que dans l'exemple 1 et on les inocule chacune séparément dans 1 litre d'un milieu comprenant 20 g de glucose, 5 g d'extrait de levure, 1 g de IBA ou 1 g de MA ou 1 g d'un mélange de quantités pondérales égales de IBA et MA. On cultive chaque microorganisme dans une cuve de fermentation de 3 litres à 30 C, à pH 6,0, avec agitation à 500 tours/ minute et aération de 1 vol/l vol pendant 20 heures. On ajoute ensuite 30 g de IBA, MA ou d'un mélange de quantités pondérales égales de IBA et MA au - bouillon de culture résultant. On règle le pH du bouillon de culture à 8, 5, puis on incube pendant 72 heures. Après incubation, on traite le mélange comme décrit dans l'exemple 1 pour obtenir du D-HIBA. La rotation optique de D-HIBA ainsi obtenu est la même qu'avec le produit de l'exemple 1. Les rende- ments en D-HIBA sont indiqués dans le tableau II ci-après. TABLEAU II R deent en D-HIBA (g) I Rendement en D-HIBA(g) SubstratIBA MA IBA+MA Microorganism e Candida rugosa IFO 0750 8,3 10,2 778 Candida rugosa IFO 0591 6,1 974 8,5 Candida parapsiZosis IFO 0708 7,7 10T5 9y7 Candida utiZis IFO 0396 5,7 671 4,7 ToruZopsis eandida IFO 0380 1,9 1V6 3 3 Trygonopsis variabiZis IFO 0671 5,0 4,3 3,6 Sacoharomyces cerevisiae IAM 4274 372 195 3,8 Saccharomyees roouxii IFO 0493 4,4 1,8 2 0 Pichia membranaefaciens IAM 4904 4,5 17 1;8 Debaryomyces hansenii IFO 0026 8P5 5?9 8,6 Wingea robertsii IFO 1277 2,2 0,6 3v1 Rhodosporidium-t toruZoides IFO 0559 2,4 078 275 AspergiZZus niger IAM 2532 2,3 1,0 172 Choanephora circinanus HUT 1324 0,9 0,7 0,5 Zygorhynchus moelZeri HUT 1305 1?8 0 9 2?2 EXEMPLE 3 On utilise les mêmes souches que dans l'exemple 1 et on les inocule chacune séparément dans 1 litre d'un milieu comprenant 20 g de glucose, 5 g d'extrait de levure, 3 g de peptone, 3 g d'extrait de viande, 1 g de IBA ou de MA ou d'un mélange de parties pondérales égales de IBA et MA. On cultive chaque microorganisme dans une cuve de fermentation de 3 litres, à 30 C, à pH 6,0 avec une agitation de 500 tours/minute et une aération de 1 vol/l vol pendant 24 heures. On récolte les cellules par centrifugation à partir du bouillon de culture ainsi obtenu, on lave à deux reprises avec une solution saline à 0,9% et on met en suspension dans un tampon phosphate (1/15 M) à pH 8,5. A la suspension cellulaire, on ajoute 30 g de IBA, MA ou d'un mélange de IBA et MA (IBA: MA = 1: 1 en poids) et 30 g de glucose. On incube ce mélange à pH 8,5 pendant 48 heures. Après incubation, on traite le mélange comme décrit dans l'exemple 1 pour obtenir le D-HIBA. La rotation optique de D-HIBA ainsi obtenue est la même que dans l'exemple 1. Les rendements en D-HIBA sont donnés dans le tableau III ci-après. TABLEAU III Rendement en D-HIBA (g) Substrat Microorgan sme- - IBA MA IBA+MA Microorganisme - Candida rugosa IFO 0750 9,4 9 2 8,8 Candida rugosa IFO 0591 8,3 7?7 9r5 Candida parapsilosis IFO 0708 11,0 9T9 9,3 Candida utiZis IFO 0396 6?2 5r9 4?4 Torulopsis candida IFO 0380 271 1,5 2,0 Trygonopsis variabilis IFO 0671 4,4 5r0 4,6 Saccharomyces cerevisiae IAM 4274 2r5 271 1l 8 Saccharomyces rouxii IFO 0493 3,6 3r3 4,2 Pichia membranaefaciens IAM 4904 714 8T5 8,8 Debaryomyces hansenii IFO 0026 6 2 4,7 5rl Wingea robertsii IFO 1277 115 1i r6 17 3 Rhodosporidium toruZoides IFO 0559 2r0 1T5 117 AspergiZlus niger IAM 2532 0 r 7 172 1l4 Choanephora circinanus HUT 1324 1rl 118 2,2 Zygorhynchus moelZZeri HUT 1305 1f6 2T2 1 6 REVENDICATIONS 1.- Procédé de production d'acide D (-)-( -hydroxyisobutyrique, caractérisé en ce qu'il consiste à soumettre un substrat choisi parmi l'acide isobutyrique, l'acide méthacrylique et un mélange d'acides isobutyrique et méthacrylique à l'action d'un microorganisme possédant l'aptitude à convertir le substrat en acide D (-)-p -hydroxyisobutyrique dans un milieu aqueux et à récupérer l'acide D (-)-p-hydroxyisobutyrique de ce milieu. 2.- Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que le microorganisme est du genre choisi parmi les suivants: Candida, Torulopsis, Trygonopsis, Saccharomyces, Pichia, Debaryomyces, Wingea, Rhodosporidium, Aspergillus, Choanephora et Zygorhynchus. 3.- Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que le microorganisme appartient à une espèce choisie parmi: Candida rugosa, Candida parapsilosis, Candida utilis, Torulopsis candida, Trygonopsis variabilis, Saccharomyces cerevisiae, Saccharomyces rouxii, Pichia membranaefaciens, Debaryomyces hansenii, Wingea robertsii, Rhodosporidium toruloides, Aspergillus niger, Choanephora circinanus et Zygorhynchus moelleri. 4.- Procédé selon la revendication 1, 2 ou 3, caractérisé en ce qu'on cultive le microorganisme par voie aérobie dans un milieu aqueux contenant le substrat. 5.- Procédé selon la revendication 4, caractérisé en ce qu'on effectue la culture à un pH d'environ 4 à 9,5 et à une température d'envirj à 40 C. 6.- Procédé selon la revendication 1, 2 ou 3, caractérisé en ce qu'on ajoute le substrat à un bouillon de culture obtenu en cultivant le microorganisme dans un milieu aqueux et en ce qu'on incube ensuite le mélange résultant par voie aérobie. 7.- Procédé selon la revendication 6, caractérisé en ce qu'on ajoute une petite quantité d'acide isobutyrique, d'acide méthacrylique ou d'un mélange d'acides isobutyrique et méthacrylique au milieu aqueux pendant la culture du microorganisme pour induire le développement d'enzymes dans le microorganisme. 8.- Procédé selon la-revendication 6, caractérisé en ce qu'on cul- tive le microorganisme à un pH d'environ 4,0 à 9,5 et à une température d'environ 20 à 40 C et incube le mélange à un pH d'environ 6,0 à 9,5 et à une température d'environ 20 à 40 C. 9.- Procédé selon la revendication 1, 2 ou 3, caractérisé en ce qu'on introduit le substrat dans une suspension cellulaire préparée en séparant les cellules d'un bouillon de culture provenant de la culture du microorganisme dans un milieu aqueux et en mettant en suspension ces cellules dans un milieu aqueux, et en ce qu'on incube le mélange résultant par voie aérobie. 10.- Procédé selon la revendication 9, caractérisé en ce qu'on ajoute une petite quantité d'acide isobutyrique, d'acide méthacrylique ou d'un mélange des deux au milieu aqueux pendant la culture du microorganisme pour provoquer le développement des-enzymes du microorganisme. 11.- Procédé selon la revendication 9, caractérisé en ce qu'on cultive le microorganisma à un pH d'environ 4,0 à 9,5 et à une température d'environ 20 à 40 C et incube le mélange à un pH d'environ 6,0 à 9,5 et à une température d'environ 20 à 40 C. 12.- Procédé selon la revendication 1, 2 ou 3, caractérisé en ce qu'on isole l'acide D(-)- p-hydroxyisobutyrique du milieu aqueux par extraction avec un solvant non miscible à l'eau. 13.- Procédé selon la revendication 12, caractérisé en ce que le solvant non miscible à l'eau est le butanol, la méthylisobutylcétone ou l'acétate d'éthyle.