FR 2464955 A1 19810320 FR 8020059 A 19800915 L'invention concerne un nouveau procédé de production d'un dérivé de la céphamycine et plus spécialement de l'a- cide 7 0- [ 2 D-2-amino-2-carboxy) éthylthioacétamidoJ -7a- méthoxy-3- [ (1-méthyl-lH-tétrazole-5-yl) thiométhyl] -3- céphem-4-carboxylique, ainsi que de ses sels et esters pharmaceutiquement acceptables qui possèdent une activité antibactérienne élevée et trouvent de nombreuses applica- tions dans le traitement chimiothérapeutique des affec- tions bactériennes. L'acide 70 [(2D-2-amino-2-carboxyl)éthylthioacétamidol- 7a-méthoxy-3- [(1-méthyl-lH-tétrazole-5-yl)thiométhyq-3-ce- phem-4-carboxylique (que l'on appelera ci-après plus sim- plement "le composé'")a été récemment synthétisé dans le la- boratoire o travaillent les inventeurs (cf demande de bre- vet japonais non examinée "Kokai" n 83791/80 publiée le 24 juin 1980, brevet belge no 880 656, demande de brevet britannique n 79 43159 et demande de brevet US SN 104 220). Toutes les méthodes de production du composé précé demment mises au point partent exclusivement de l'acide 7-amino-cé- phalosporanique comme matériau de départ et, à un certain stade, nécessitent d'effectuer certains procédés connus de méthoxylation en 7a de l'acide 7-amino-céphalosporanique. Les processus actuellement disponibles pour la méthoxyla- tion en 75 nécessitent habituellement des opérations soi- gneuses et ennuyeuses s'accompagnait inévitablement d'une méthoxylation en 70 non désirée. La présence simultanée du produit désiré de méthoxylation en 70 avec même une faible quantité du produit de méthoxylation en 7P non désiré diminue normalement fortement l'effet thérapeutique et la valeur commerciale du produit de méthoxylation en 7" et il est donc fortement recommandé d'éliminer le produit de métho- xylation en 70 du produit en 7a. On n'a pourtant pas en- core mis au point, pour cela, une méthode de purification efficace et simple, et applicable à l'échelle industrielle. Les inventeurs ont donc recherché un nouveau procédé de production du composé qui ne nécessite pas, à aucun stade, d'effectuer la méthoxylation en 7a de l'acide 7-amino-cé- phalosporanique ou d'un dériv6 de la 7-amino-c6phalosporine. La c6phamycine A ou B est le composé qui contient initiale- ment le noyau 7a-méthoxycephem quiest obtenu comme produit de fermentation dans la culture de microorganismes apparte- nant au genre Streptomyces et les inventeurs ont entrepris des recherches pouss6es pour mettre au point un proc6d6 de production du composé à partir de la c6phamycine A ou B, sans nécessiter d'étape de m6thoxylation en 7a. A la suite de ces recherches les inventeurs ont découvert que, quand la c6pha- mycine A et/ou la c6phamycine B est ou sont soumises à la suite des étapes r6actionnelles décrites ci-après, on peut produire avec un rendement élevé le composé. - L'invention a pour objet principal un proc6dé de pro- duction du compos6 en partant des c6phamycines A, B, mais sans n6cessiter l'étape de méthoxylation en 7? jusqu'ici nécessaire dans les méthodes partant de l'acide 7-amino-cé- phalosporanique. L'invention a donc pour objet un procéd6 de production de l'acide 7p- [(2D-2-amino-2-carboxy)éthylthioac6tamido]- 7a-méthoxy-3- r (1-méthyl-lH-tétrazole-5-yl)thiométhylJ-3- cephem-4-carboxylique qui consiste: a) à faire r6agir la céphamycine A et/ou la c6phamy- cine B avec le 5-mercapto-1-m6thyl-lH-tétrazole pour obte- nir le compos6 de formule: NH2 OCH 2 t 'CH2)S IOH X COOH CH3 () b) à faire r6agir le compos6 (I) avec un agent d'acy- lation pour l'introduction d'un groupe amino-protecteur pour obtenir un compos6 de formule: NHR, 3 s CH-(CH2)3-CONH N N COOH CH3 (II dans laquelle R représente un groupe amino protecteur de type acyl. c) à faire réagir le composé (II) avec un réactif d'introduction d'un groupe carboxy-protecteur pour bloquer les deux groupes carboxyles du composé (II) et obtenir le composé de formule OCH NHR 3LS CH-() N_- N I ili CH2)3-COCH COOR' I oa-NCS |.N (I)N 2 1 (II#) COOR' CH3 dans laquelle R' représente le groupe carboxy-protecteur. d) à faire réagir le composé (II') avec un halogénure d'halogéno-acétyl de formule: XCH2COX' dans laquelle X et X', qui peuvent être semblables ou différents, représentent chacun un halogène, et particu- lièrement le chlore ou le brome, en présence d'un tamis moléculaire ou d'un agent de silylation pour donner un composé de formule: 2'64955 OCH s XCH2CONH N CH2S N/N Q 2 COOR' CH 3 (III) dans laquelle X a la d6finition ci-dessus et R' repré- sente le groupe carboxy-protecteur. e)6éliminer le groupe carboxy-protecteur (R') du compos6 (III) de façon connue pour obtenir le compos6 de formule: OCH3 S. s XCH2CONH ANCN CHES N/N 2 (III') COOH CH3 dans laquelle X est tel que défini ci-avant et f) à faire réagir le composé (III') avec la D-cystéine pour produire le compos6 désiré. Le terme "cèphamycine A, B" correspond à la c6phamycine A et/ou la c6phamycine B, c'est-à-dire la c6phamycine A ou la céphamycine B ou un m6élange des deux. En bref, dans le procédé selon l'invention, le composé peut être produit à partir de c6phamycine A, B par les six étapes suivantes de: a) réaction de la c6phamycine A, B avec le 5-mercapto- 1-m6thyl-lH-tétrazole pour introduire le groupe m6thyl-té- trzolylthiom6thyl en position 3 de la c6phamycine A,B,- b) réaction du d6rivé de céphamycine A, B obtenu dans l'6tape (a) avec un agent d'acylation pour prot6ger le 2A64955 groupe amino terminal présent dans'la chaîne lat6rale 7- acylac6tamido de la céphamycine A,B, c) protection par est6rification des deux groupes car- boxyles, le groupe carboxyl en 4 et le groupe carboxyl terminal pr6sents dans ladite chaîne lat6rale 7-acylac6- tamido, d) halogénoac6tylation sur le groupe amino en 7 avec élimination simultanée du groupe acyl ayant été initiale- ment attaché au groupe amino en 7 de la céphamycine A,B, e) élimination du groupe protecteur du groupe car- boxyl en 4 bloqué, et f) introduction du radical D-cystélne dans le groupe halogéno-acétyl s'attachant au groupe amino en 7. Si le groupe carboxy-protecteur (formateur d'ester) sur le groupe carboxyl en 4 est sépamble par hydrolyse in vivo, on peut, si on le désire,omettre l'étape (e) d'élimination du groupe carboxy-protecteur. Dans ce cas, le produit final est obtenu sous forme de 4-carboxylate (ester). On sait que le matériau de départ, la céphamycine A,B ayant la formule suivante: NH2 OCH 1 1 S CH_(CH2)3-CONH COOH O N X CH20COC CH OY GOOH OCH 3 3o dans laquelle Y est l'hydrogène pour la céphamycine A et un groupe acide sulfonique (-S03H) pour la céphamycine B peut être produit par des microorganismes de différentes espèces d'actinomycetes. Les inventeurs ont mis au point et revendiqué une mé- thode de purification de la céphamycine A,B qui est pro- duite par culture de la souche Streptomyces viridochromo- genes SF-1584 (FERM-P N 2284) (cf demande de brevet ja- ponais non examinée "Kokai" n 64489/75) ainsi qu'une mé- thode de N-acylation du groupe acylamido en 7 de la ce- phamycine A,B dans le bouillon ou le filtrat de fermenta- tion (cf demande de brevet japonais non examinée "Kokai n 64290/75). Dans la dernière méthode, l'agent d'acylation tel qu'employ6 peut être ajouté directement au bouillon de culture ou à son filtrat contenant la céphamycine A,B produite et accumulée par culture de la souche SF-1584, ou à un concentrat primaire obtenu par concentration chroma- tographique du bouillon de fermentation. La céphamycine A,B est instable et facilement hydrolysa- ble en solution aqueuse, spécialement en raison de la gran- de tendance à l'hydrolyse du substituant en 3 de la c6pha- mycine A,B. En raison de ceci, la première étape du procéd6 selon l'invention est prévue de telle sorte que la cépha- mycine A,B soit tout d'abord convertie en un d6rivé plus stable par r6action avec le 5-mercapto-1-méthyl-lH-t6tra- zole pour remplacer le substituant en 3 facilement hydro- lysable par le substituant 3-méthyltétrazolylthiom6thyl plus stable. Ceci constitue une caractéristique de l'inven- tion. On préfère, dans la première étape du présent procédé faire réagir le 5-mercapto-1-m6thyl-lH-t6trazole avec la céphamycine A,B dans la toute première étape. A cette fin on mélange de préférence le 5-mercapto-1-m6thyl-lH-tétra- zole au filtrat du bouillon de fermentation contenant la c6phamycine A,B ou au concentrat primaire dudit filtrat de bouillon de fermentation de sorte que le 5-mercapto-1- méthyl-lH-tétrazole puisse réagir avec la céphamycine A,B juste quand la céphamycine A,B subsiste encore dans le filtrat ou le concentrat primaire du bouillon de fermenta- tion, avant toute purification ou isolement de la c6pha- mycine A,B. Le concentrat primaire qui peut être utilisé dans le présent procédé peut être obtenu soit en faisant passer le filtrat du bouillon de fermentation à travers une colonne d'une r6sine adsorbante telle que l'Amberlite XAD-2 (Rohm & Haas C USA) ou le Diaion HP-20 (Mitsubishi 2t64955 Kasei C , Japon) puis en lavant à l'eau et en éluant avec l'acétone aqueux ou le méthanol aqueux, ou en extrayant le filtrat du bouillon de fermentation à un pH de 1,5 - 3,0 avec du n-butanol. Dans la première étape du présent procédé, on peut faire réagir la céphamycine A,B dans le bouillon de cul- ture, son filtrat ou son concentrat primaire avec le 5- mercapto-l-méthyl-lH-tétrazole à pH acide ou neutre. La réaction de substitution qui prend place en position 3 de la céphamycine A,B dans la première étape peut être ef- fectuée à température ambiante. La réaction peut pourtant être effectuée entre 15 et 600C, et peut être, de pré- férence, accélérée par chauffage à une température de 40 à 600C de sorte que la réaction peut être terminée en 3 à 10 heures. Une fois la réaction terminée dans la première étape du procédé, on peut concentrer, si nécessaire, la solution réactionnelle à un faible volume. Dans la deuxième étape, on fait réagir la solution réactionnelle venant directement de la première étape, ou ayant été concentrée et qui contient le composé de for- mule I, c'est-à-dire l'acide 7-(5-amino-5-carboxyvalérylamido) 3- U(1-méthyl-lH-tétrazole-5-yl)thiométhylj -3-céphem-4- carboxylique avec un excès d'un agent d'acylation connu comme réactif d'introduction d'un groupe amino protecteur afin de protéger le groupe 5-amino terminal dans le subs- tituant 7-acylamino du dérivé de cèphamycine de formule (I). Cet agent d'acylation peut se présenter par exemple sous la forme d'un anhydride ou d'un halogénure d'acide ou d'un dérivé halogène d'un alkylester d'acide carbonique, d'un halogénure d'alcoxycarbonyl ou d'aralkyloxycarbonyl et peut être de préférence, le chlorure de méthoxycarbonyl, le chlorure de t-butoxycarbonyl, le chlorure de trichloro- éthoxycarbonyl ou le chlorure de benzyloxycarbonyl. Dans la deuxième 6tape du procédé, la réaction peut être effectuée en milieu aqueux quand les réactifs sont solubles dans l'eau. Quand l'agent d'acylation est peu soluble dans l'eau comme c'est le cas avec l'halogénure de benzyloxycarbonyl la réaction, dans la deuxième étape du procédé, est ef- fectuée en présence additionnelle d'un solvant organique miscible à l'eau tel que l'acétone, le méthanol ou simi- laire. L'acylation pour la protection du groupe amino terminal peut généralement être effectuée à température ambiante ou sous refroidissement et de préférence en pré- sence d'un agent fixateur d'acide tel qu'une alkylamine tertiaire, par exemple la triéthylamine et un carbonate d'un m6tal alcalin. La durée de réaction de cette deu- xième étape varie habituellement de 1 heure à quelques heures. Une fois la N-acylation de la deuxième étape terminée, la solution réactionnelle obtenue peut être concentr6e par évaporation du solvant organique présent ou peut être diluée avec de l'eau puis extraite en conditions acides avec un solvant organique convenable (par exemple l'acé- tate d'6thyl) et lavée à l'eau, puis on extrait en retour dans une solution aqueuse faiblement alcaline, telle qu'une solution aqueuse à 5 % de bicarbonate de sodium. Cette technique de purification permet d'obtenir le d6riv6 S- acylé d% 5-mercapto-1-m6thyl-lH-tétrazole à partir de e l'excès/5mercapto-1-m6thyl-lH-t6trazole et l'excès du r6actif d'acylation n'ayant pas réagi peut être facilement éliminé du mélange réactionnel. Un traitement ult6rieur peut être effectué en faisant passer les extraits d'ex- traction en retour à travers une résine adsorbante telle que le Diaion HP-20 (résine adsorbante non -ionique mi- croporeuse, copolymère styrène-vinylbenzène de Mitsubishi Kasei C , Japon) ou l'Amberlite XAD-2 (r6sine adsorbante non ionique microporeuse, copolymère styrène-vinylbenzéne de Rohm & Haas C , USA), permettant ainsi une séparation facile du 5-mercapto-1-méthyl-1H-t6trazole n'ayant pas réagi et des produits de dégradation acide de l'agent d'a- cylation en excès. Le produit N-prot6gé de formule (II) obtenu dans la deuxième 6tape peut être élu6 de la r6sine adsorbante à l'aide d'acétone aqueux ou de méthanol aqueux. On obtient ainsi le dérivé N-protégé de formule (II) qui est stable et facile à purifier, ce que l'on peut faire si nécessaire par des techniques chromatographiques en utilisant un échangeur d'ion basique ou du gel de si- lice. Naturellement l'utilisation de céphamycine A,B dans la première étape conduit à la production du même composé (II) que l'on ait utilisé comme matériau de départ la cépha- mycine A ou la céphamycine B ou un mélange de ces composés. La caractéristique significative des première et deuxième étapes est qu'un mélange de céphamycines A et B, relati- vement instables, est transformé dans une étape de début du procédé en composé unique (II), bien stable et facile à purifier. Dans la troisième étape du procédé, les deux groupes carboxyles libres du composé (II) sont bloqués avec un groupe carboxy-protecteur pour empêcher toute réaction annexe indésirable au cours de la quatrième étape. Ce groupe protecteur peut, de préférence, être un groupe for- mateur d'ester et est généralement un de ceux bien connus dans le domaine des céphalosporines synthétiques pourvu qu'il soit facilement éliminable dans des conditions mo- dérées sans exercer d'effet sur les autres sites du noyau céphem. C'est ainsi par exemple que l'introduction du groupe carboxy-protecteur dans le composé (II) peut être effectuée par réaction de ce dernier avec un réactif d'in- troduction du groupe carboxy-protecteur, par exemple par réaction avec le diphényldiazomèthane dans un solvant organique inerte pour former le déphénylméthyl ester, par réaction avec l'isobutène en présence d'un catalyseur acide pour former le t-butyl ester ou par réaction avec le chlorure de trichloréthyl, le chlorure de méthoxy- éthoxy méthyl ou un bromure de benzyl substitué tel que le bromure de pnitrobenzyl en présence d'une base telle qu'un agent fixant l'acide pour former le trichloréthyl ester, le méthoxyéthoxyméthyl ester ou le benzylester substitué. gi 2' 64955 L'estérification pour la protection des groupes car- boxyles telle que l'on vient de la décrire sera effectuée durant des périodes allant de dix minutes à plusieurs heures. On note qu'un excès de la base présente dans le processus d'estérification comme agent fixant l'acide ne doit pas être employé afin d'éviter un transfert des doubles liaisons existantes du composé céphem. Le produit protégé (II') venant de la troisème étape, qui est déjà devenu facilement soluble dans les solvants organiques, peut être isolé du mélange réactionnel par extraction avec un solvant organique approprié suivie d'une évaporation de l'extrait à siccité. Le produit pro- tégé peut être purifié, si nécessaire, par une méthode de chromatographie ou de distribution à contre-courant. Dans la quatrième étape du procédé, on fait réagir le produit de formule (II') obtenu dans la troisème étape, qui est la forme 7P-N-monoacyl avec l'halogénure d'halo- génoacétyl de formule XCH COX' dans laquelle X et X', indépendamment représentent un atome d'halogène, spécialement un atome de chlore ou de brome, en présence d'un tamis moléculaire ou d'un agent de silylation. Dans cette quatrième étape, le composé -N-monoacyl (II') semble être converti en un composé 7P-N-diacyl à partir duquel est simultanément libéré le groupe acyl ayant été initialement attaché au groupe 7-amino de la céphamycine de départ. De toute façon, il se produit, dans cette quatrième étape, une réaction d'échange acyl telle que le groupe acyl initialement attaché au groupe 7amino de la céphamycine est remplacé par le groupe halogénoacétyl de l'halogénure d'halogèno- acétyl employé, donnant le composé de formule (III). La présence, dans cette étape, du tamis moléculaire, sert à éliminer l'acide halogéné libéré dans la réaction d'é- change acyl ci-dessus. La présence d'agent de silylation sert à activer le groupe amido en position 7 du composé (III). 2L64955 Il Comme exemple de tamis moléculaire adapté dans ce but, on peut citer une zéolite synthétique ayant un diamètre O moyen de pores de 3,4 ou 5 A disponible dans le commerce sous la marque "Molecular Sieves" 3A, 4A et 5A chez Linde C (USA). Quand le tamis moléculaire est présent, la réac- tion peut être généralement effectuée à une température de 15 à 600C ou de préférence à une température de 40 à 600C dans un solvant aprotique tel que les alcanes halo- génés ou les éthers cycliques. L'agent de silylation peut être tout agent connu or- dinairement utilisé pour la silylation de l'hydrogène ac- tif et comprend de préférence les N-silyl-amides, par exemple la N-(triméthylsilyl)acétamide, la N,N-bis(tri- méthylsilyl)acétamide et la N,N-bis(triméthylsilyl)tri- fluoracétamide. Quand la réaction est effectuée en pré- sence de l'agent de silylation, elle est de préférence conduite à une température de 40 à 600C bien qu'elle puisse être effectuée à température ambiante. Comme exemples d'halogénure d'halogénoacétyl convenant comme réactif d'acétylation, on peut citer le bromure de bromoacétyl, le chlorure de bromoacétyl, le bromure de chloroacétyl et le chlorure de chloroacétyl. La durée nécessaire pour la réaction dans la quatrième étape du procédé se situe habituellement entre plusieurs heures et 20 heures. Le dérivé 79-N-diacyl intermédiaire produit au cours de la réaction dans laquatrième étape sera ensuite spon- tanément décomposé pour donner la forme 70-N-monoacyl de formule (III) qui a subi la réaction d'échange acyl sur le groupe 7-amino. Afin d'arriver à une décomposition complète du dérivé 7P-N-diacyl dans la forme 7?-N-monoacyl, on pré- fère pourtant effectuer une opération additionnelle pour éliminer le groupe amino protecteur (R) restant sur le groupe amino terminal du dérivé 70-N-diacyl. Cette opéra- tion additionnelle peut être un traitement réducteur avec l'acide acétique et la poudre de zinc pour l'élimination du groupe trichloroéthoxycarbonyl ou benzyloxycarbonyl en 2L64955 tant que groupe R, ou peut être un traitement hydrolytique * avec un acide pour l'élimination du groupe t-butoxycarbo- nyl en tant que groupe R. On produit de cette façon le composé de formule (III) dans la quatrième étape du procédé. Le composé (III) peut être séparé du milieu réactionnel par filtration des ma- tières insolubles, lavage du filtrat à l eau et élimina- tion du solvant par distillation; il peut, si nécessaire, être purifié par chromatographie sur colonne. La cinquième étape du procédé consiste à régénérer le groupe 4-carboxyl bloqué du composé (III) en groupe 4-carboxyl libre. L'opération de déprotection à mettre en oeuvre dépendra de la nature du groupe carboxyl pro- tecteur qui a été introduit dans la troisième étape. C'est ainsi que la déprotection peut être effectuée soit par chauffage de l'ester méthoxyéthoxyméthyl (carboxylate) en même temps que le méthanol, soit par mise en contact du t-butylester avec un acide minéral dilué dans un sol- vant inerte convenable, soit par réduction du benzyl ester substitué dans un solvant inerte convenable en pré- sence d'un catalyseur palladium, soit par interaction du diphénylméthylester avec l'acide trifluoracétique/anisole ou acide formique dans un solvant organique inerte convena- ble, soit par traitement du trichloroéthylester avec du zinc/acide acétique. Le composé (III) portant un groupe carboxy-protecteur (R') tel que le groupe pivaloyloxyméthyl, qui est bien stable du point de vue chimique mais est facilement sé- parable par hydrolyse in vivo, peut être utilisé direc- tement dans l'étape suivante d'introduction du radical D-cystéine sans qu'il soit nécessaire d'effectuer la cin- quième étape ci-dessus pour enlever le groupe carboxy- protecteur. Une fois terminée la réaction de déprotection dans la cinquième étape, le produit déprotégé (III') peut être récupéré du mélange réactionnel par un processus classi- que, par exemple par filtration des éventuelles matières insolubles, élimination du solvant et de l'excès de réactif du filtrat par distillation sous pression réduite, dissolution du résidu dans un solvant convenable, lavage de la solution dans l'eau et élimination du solvant par distillation. La sixième et dernière étape du procédé selon l'in- vention consiste à faire réagir le dérivé halogéno-acétyl de formule (III') avec la D-cystéine de formite HOOC- CH(NH2)CH2SH pour donner le produit final de formule (IV) donnée ci-après dans laquelle R"' est un atome d'hydrogène. Cette réaction de condensation peut s'effectuer en condi- tions neutres dans un solvant mixte, de préférence l'eau ou un solvant organique aqueux. La réaction est générale- ment effectuée à température ambiante ou réduite pendant 1 à 5 heures. Pour isoler et purifier le composé final (IV) la so- lution réactionnelle obtenue peut être concentrée à un faible volume et soumise à un traitement avec un agent de filtration sur gel tel que le Sephadex G-10, LH-20 (Pharmacia Chemical CI, Suède) ou à une chromatographie sur résine adsorbante telle que l'Amberlite XAD-2 (Rohm & Haas C USA) et le Diaion HP-20 (Mitsubishi Kasei Co, Japon). Si désiré ou nécessaire, le composé obtenu dans la sixième étape peut être converti, de manière classique, soit en son sel pharmaceutiquement acceptable avec un cation pharmaceutiquement acceptable, par exemple un mé- tal alcalin ou alcalino-terreux, un acide aminé basique ou une amine, ou même en son ester actif in-vivo par exemple l'ester acyloxyalkyl, alcoxycarbonyloxyalkyl ou alcoxy. Le procédé selon l'invention permet donc d'obtenir un composé de formule NH OCH 1 21 3 S CHCH2SCH2CONH N N I Il COOH >N CH S N/N o_..2 1 (IV) COOR" CH3 dans laquelle R" représente un atome d'hydrogène, un ca- tion pharmaceutiquement acceptable ou un groupe formateur d'ester pharmaceutiquement acceptable qui est facilement séparable par hydrolyse in-vivo. Comme indiqué précédemment, quand le groupe carboxyl en 4 du composé de formule (III) de la quatrième étape du procédé selon l'invention a été protégé avec un groupe carboxy-protecteur qui est un groupe formateur d'ester pharmaceutiquement acceptable facilement séparable in-vivo, il n'est pas nécessaire d'entreprendre la cin- quième étape d'élimination du groupe carboxy-protecteur et le composé (III) de ce type peut être directement soumis à l'étape finale de réaction avec la D-cystéine pour introduction du radical D-cystéine dans le groupe 7?-ha- logénoacétylamido du composé (III). Selon un autre aspect, l'invention concerne donc un procédé de production d'un ester pharmaceutiquement acceptable de l'acide 79- [(2D-2- amino-2-carboxy) éthylthioacétamido]-7a-méthoxy-3-L(1-mé- thyl-IH-tétrazole-5-yl)thiométhyl]3-céphem-4-carboxylique qui comporte les étapes suivantes: a) réaction de la céphamycine A et/ou de la cèphamy- cine B avec le 5-mercapto-1-méthyl-lH-tétrazole pour ob- tenir le composé de formule: C2 CH-(CH2)3 COOH COOH CH3 CH 3 (I) b) réaction du composé (I) avec un agent d'acylation pour introduction d'un groupe amino-protecteur pour ob- tenir un composé de formule: NHR I 9CH CH-(CH) 3CONH COOH N ocCOOH COOH N N II CH2S NA (II) dans laquelle R représente un groupe amino-protecteur du type acyl. c') réaction du composé (II) avec un réactif d'in- troduction d'un groupe formateur d'ester qui sert de groupe carboxy-portecteur, et est pharmaceutiquement ac- ceptable et séparable par hydrolyse in-vivo, pour esté- rifier les deux groupes carboxyles du composé (II) et produire le composé de formule: 3o NHR OCH I z 3 S CH-(CH2)3-CONH ' COOR"' ' CN CCH S'NH3 C O O R " ' C H 3 (II") dans laquelle R"' est un groupe formateur d'ester phar- maceutiquement acceptable séparable par hydrolyse in-vivo et est de préférence choisi parmi les groupes acyloxy- alkyl, alcoxycarbonyloxyalkyl et alcoxy, spécialement pivaloyloxyméthyl, d') réaction du composé (II") avec un halogénure d'halogèno-acétyl de formule XCH2COX,' dans laquelle X et X', qui peuvent être semblables ou différents, représentetchacun un halogène, particulière- ment un chlore ou un brome, en présence d'un tamis molé- culaire ou d'un agent de silylation pour donner un com- posé de formule: OCH. XCH2CONH 2 N-N NCHE2S _ \ yNNI COOR"' CH3 (III") dans laquelle X a la définition ci-dessus et R"' repré- sente comme ci-dessus le groupe formateur d'ester et f') réaction du composé (III") avec la D-cysté!ne pour donner l'ester de formule: NH2 ?OCH3 s CHCH2SCH2Co N N COOH t 0 2 CH2 S COOR"' CH3 dans laquelle R"' est le groupe formateur d'ester défini ci-avant. 2L64955 L'invention sera mieux comprise d'ailleturs à l'aide del'exemple suivant qui l'illustre sans la limiter.Exemple (i) On cultive la souche Streptomyces viridochromogenes SF 1584 (d6posée sous la référence FERM-P 2288) sous aé- ration et agitation à 28 C pendant 120 heures dans un milieu de culture placé dans une cuve de fermentation de litres. Le milieu de culture comprend 1,5 %o de glycé- rol, 1,5 % de dextrine, 2,0 % de farine de graines de soja, 0,15 % de carbonate de calcium, et 0,005 % de thio- sulfate de sodium. Le bouillon de culture obtenu est ré- glé à pli 3 par addition de HCl 5N et filtré pour donner 1 d'un filtrat de bouillon. Le filtrat contenant la céphamycine A,B est réglé à pH neutre par addition de NaOH 3N et on le fait passer à travers une colonne de 2 1 d'une résine adsorbante mi- croporeuse non-ionique, l'Amberlite XAD-2 (Rohm & Haas C , USA). La colonne est lavée avec 61 d 'eau puis éluée avec 8 1 d'acétone aqueux à 50 %; on ajoute ensuite immédia- tement à l'éluat une solution (pH 5,5) de 5-mercapto-1- méthyl-lH-tétrazole (15 g) dans l'eau (50 ml). Le mé- lange est agité toute une nuit à 35 C et on concentre la solution r6actionnelle par évaporation jusqu'à un volume de 500 ml. On ajoute goutte à goutte sous agitation à la solution concentrée (contenant l'acide 7?-(5-amino-5- carboxyvalérylamido)-7a-méthoxy-3- [(i-méthyl-lH-tétrazole- yl)thiom6thyl -3-céphem-4-carboxylique formé) une solution de chlorure de trichloréthoxycarbonyl (18 ml) (réactif amino-protecteur)dans l'acétone (200 ml) tout en mainte- nant le mélange réactionnel à pH 7,5-8,0 par addition d'une solution aqueuse de carbonate de sodium. Une fois l'addition terminée, le mélange est agité pendant 3 heu- res pour effectuer la réaction d'amino-protection. La solution réactionnelle est ensuite réglée à pH 6 par addition de HC1 5N, concentrée par évaporation de l'acétone, réglée à nouveau à pH 2 par addition de HCl 5N sous refroidissement puis extraite avec 2 fois 200 ml 2G64955 d'acétate d'éthyL. Les extraits combinés sont lavés avec de l'eau acidifiée avec HC1 (pH 2) puis soumis à une extraction en retour avec 200 ml d'une solution aqueuse à 5 % de bicarbonate de sodium. Cette opération est répétée une fois. L'extrait final est réglé à pH 6,0 par addition de HCl 5N puis concentré à faible volume. On fait passer le concentrat à travers une colonne de 500 ml d'une résine adsorbante microporeuse non-ionique, le Diaion HP-20 (Mitsubishi Kasei C , Japon) puis la co- lonne est lavée à l'eau et éluée avec de l'acétone aqueux à 10 %. L'éluat est concentré et on le fait passer à tra- vers une colonne d'Amberlite XAD-2 (250 ml). La colonne est soumise à une élution linéaire par gradients avec du méthanol aqueux. Les fractions actives de l'éluat sont combinées et concentrées à siccité pour donner 800 mg de 7?-(5D-5-trichloroéthoxycarbonylamino-5-carboxyvaléryla- mido)-7a-méthoxy-3-[(1-méthyl-lH-t6trazole-5-yl) thiomé- thylJ-3-c6phem-4-carboxylate de sodium. Ce produit est dissous dans 50 ml d'eau, et on ajoute 50 ml d'acétate d'éthyle puis de l'acide chlorhydrique 5N sous refroidissement à la glace pour régler le pH à 2,0. La phase acétate d'6thyle est séparée et la phase aqueuse extraite à l'acétate d'éthyle. L'extrait est combin6 à la phase ac6tate d'éthyle et la solution organique obte- nue lavée avec une solution aqueuse saturée de chlorure de sodium, séchée sur sulfate de sodium anhydre et con- centrée à siccité pour donner 700 mg d'acide 7?-(5D-5- trichloro6thoxycarbonylamino-5-carboxyvaléryl-amido)-7a- méthoxy-3- [l-m6thyl-1i-tétrazole-5-yl)thiom6thylJ-3- céphem-4-carboxylique. Ce produit, développé en chromatographie en couche mince sur gel de silice avec un solvant n-butanol/acide acétique/eau (2:1:1 en volume) donne une valeur de Rf = 0,58. (ii) On dissout 5,2 g de l'acide carboxylique obtenuen(i) dans 100 ml d'acide d'6thyle et on ajoute goutte à goutte, sous refroidissement à la glace et agitation, une solution de diphényldiazom6thane (3,9 g) (r6actif carboxy-pro- tecteur) dans 40 ml d'acétate d'6thyle. Une fois la réaction terminée, on agite le mélange encore pendant 4 heures pour effectuer la r6action de protection du carboxyl. La solu- tion r6actionnelle est alors concentrée par 6vaporation sous pression réduite, lavée avec 200 ml d'un mélange 6ther de p6trole/6ther 6thylique (1:1) et évapor6e à sic- cité pour donner 7,6 mg du diph6nylméthylester de l'acide 7?-[5D-5-(trichloro6thoxycarbonylamino)-5-(diphénylméthyloxy- carbonyl)-valéryl-amido]-7a-méthoxy-3- [(l-m6thyl-lH-tétra- zole-5-yl)thiométhylj-3-c6phem-4-carboxylique. Ce produit, développé en chromatographie en couche mince sur gel de silice avec benzène/acétone (1:1) a un Rf = 0,47. (iii) On dissout 3 g du produit pr6par6 en (ii) dans ml de dichlorom6thane auquel on ajoute alors 6 g de "Molecular Sieves" 4A et 2,4 g de bromure de bromoacétyl. Le mélange est agité à 400C pendant 10h puis on y ajoute encore 6 g de "Molecular Sieves" 4A et on agite à 400C pendant encore 10 heures. Le mélange réactionnel obtenu est refroidi et filtré pour éliminer les matières insolubles. Le filtrat est con- centr6 par évaporation sous pression réduite, lavé à l'hexane et concentré à siccit6. Le r6sidu est repris dans 20 ml d'acétate d'éthyle et la solution mélangée à 20 ml d'acide acétique aqueux 90 % et 2 g de poussière de zinc. On maintient le mélange à 0-5 C pendant 5 heures pour éli- miner le groupe trichloro6thoxycarbonyl du groupe amino terminal. La solution r6actionnelle est ensuite filtrée pour éliminer les matières insolubles et l'acétate d'é- thyle est ajout6 au filtrat à un volume total de 150 ml. La solution est lavée avec une solution aqueuse à 5 % de bicarbonate de sodium puis avec une solution aqueuse sa- turée de chlorure de sodium, s6ch6e sur sulfate de sodium anhydre et 6vaporée à siccit6 pour donner 1,95 g d'un produit brut. Ce produit brut est purifié par chromato- graphie en colonne sur Sephadex LH-20 (agent de filtration 2L'64955 sur gel de Pharmacia Chemical C , Suède), développé avec un mélange acétate d'éthyle/méthanol (50:1) pour donner 1,1 g du diphénylméthylester de l'acide 7?-bromo-acétamide- 7a-méthoxy-3- [(1-méthyl-lH-tétrazole-5-yl)thiométhylj-3- céphem-4-carboxylique. Ce produit, développé en chromatographie en couche mince sur gel de silice avec un solvant toluène/acétate d'éthyle (5:4) a un Rf = 0,5. (iv) En alternative au processus (iii) ci-dessus, on dissout 1,5 g du produit obtenu dans l'étape (ii) ci- avant dans 30 ml de dichlorométhane, auquel on ajoute alors 2 ml de N,Nbis (triméthylsilyl)-trifluoroacétamide (comme agent de silylation). Le mélange est agité à 400C pendant 2 heures puis on y ajoute 1,2 g de bromure de bromoacétyl et on continue à agiter le mélange pendant 48 heures supplémentaires. Une fois la réaction terminée, on évapore la solution réactionnelle sous pression réduite, puis on lave à l'hexane et on concentre à siccité. Le résidu est repris dans 7 ml d'acétate d'éthyle et la solution mélangée à 7 ml d'une solution aqueuse à 90 % d'acide acétique et 2,5 g de poussière de zinc. On maintient le mélange à température ambiante pendant 4 heures pour effectuer la réaction de N-dSprotection sur le groupe amino-terminal. La solution réactionnelle est filtrée et lavée à l'acétate d'éthy]. 100 ml du filtrat sont lavés avec une solution aqueuse à 5 % de bicarbonate de sodium et de l'eau, séchés sur sulfate de sodium anhydre et concentrés à siccité pour donner 0,98 g d'un produit brut. Le produit brut est purifié par chromatographie sur colonne de Sephadex LH-20 avec, comme solvant de dévelop- pement l'acétate d'éthyl/méthanol (50:1) pour donner 450 mg du diphénylméthylester de l'acide 79-bromo-acéta- mide-7a-méthoxy-3-[(1-méthyl-lH-tétrazole-5-yl)thiométhyg -3-céphem-4-carboxylique. (v) On dissout 1,2 g du produit préparé en (iii) ou (iv) ci-avant dans 10 ml d'anisole et on ajoute à la so- 2L64955 lution 12,5 ml d'acide trifluoracétique sous refroidisse- ment à la glace et agitation. Une fois effectuée en 30 minutes la réaction d'élimination du groupe diph6nylmé- thyl carboxy protecteur, la solution réactionnelle est éva- por6e sous pression réduite sans chauffage. Le résidu est repris dans 100 ml d'ac6tate d'6thyle et la solution ex- traite avec 150 ml d'une solution aqueuse à 10 % de phos- phate dipotassique. L'extrait est lavé à l'acétate d'éthyle et mélang6 à 100 ml d'acétate d'éthyl, puis on ajoute de l'acide chlor- hydrique 5N sous agitation et refroidissement. On règle le pH de la couche aqueuse résultante à 2,0 par addition de HCl 5N avant séparation de la couche d'ac6tate d'éthyl puis on extrait à nouveau à l'acétate d'éthyl. La couche organique combinée est lav6e avec une solution aqueuse saturée de chlorure de sodium, séchée sur sulfate de magnésium anhydre et concentrée à siccité pour donner 560 mg d'acide.7f-bromo-acétamide-7G-méthoxy- 3- f(1-m6thyl-1H-tétrazole-5-yl)thiométhyl]-3-céphem-4- carboxylique. Ce produit,développé en chromatographie en couche mince sur gel de silice avec un mélange n-butanol/acide acétique/eau (2:1:1) a un Rf = 0,68. (vi) On met en suspension dans 10 ml d'eau 480 mg du produit obtenu en (v) , puis on y ajoute une solution aqueuse saturée de bicarbonate de sodium pour régler le pH de la suspension à 7,0, formant ainsi une solution. On ajoute à la solution 210 g de chlorhydrate de D-cys- téine et on maintient le mélange à température ambiante pendant une heure, en maintenant le pH à 7,0-7,5 par addition accasionnelle d'une solution aqueuse de NaHCO3. On règle à 6 par addition de HC1 5N le pH du mélange réactionnel contenant l'acide 7?-[(2D-2-amino-2-carboxy- éthylthioacétamidoj-7a-méthoxy-3-[(1-méthyl-lH-tétrazole- 5-yl)thiométhyl)-3-céphem-4-carboxylique et on le fait passer à travers une colonne de Diaion HP-20 (100 ml) pour adsorber le produit désiré sur la résine. La résine 2? 64955 est alors éluée à l'eau et les fractions de l'&luat con- tenant le produit désiré sont concentrées et séchées à la glace pour donner 260 mg de 7P-[(2D-2-amino-2-carboxy) &thylthioacétamido]-7a-méthoxy-3-C(i-méthyl-lH-tétrazole- 5-yl)thiométhylj-3-céphem-4-carboxylate de sodium. Le produit final, d6veloppé en chromatographie en couche mince sur gel de silice avec un mélange n-butanol/ acide ac6tique/eau (2:1:1 en volume) donne un Rf=O,41. - REVENDICATIONS- 1 - Procédé de production de l'acide 79- (2D-2-amino- 2-carboxy)éthylthioacétamido]-7a-méthoxy-3-1(l-m6thyl-lH- t6trazole-5-yl)thiométhylj-3-céphem-4-carboxylique, ca- ractérisé en ce qu'il consiste a) à faire réagir la céphamycine A et/ou la cépha- mycine B avec le 5-mercapto-1-méthyl-lH-tétrazole pour obtenir le composé de formule: H2 OCH3 CH-(CH)3-CO N N 2 3 I I COOH O-- N CS NXN H2S (I) COOH CH3 b) à faire réagir le composé (I) avec un agent d'a- cylation pour l'introduction d'un groupe amino-protecteur pour obtenir un composé de formule: NHR OCH3 s CH-(CH2)3-CO N- N HCS - N /N 2 jH(II) COOH > N t COO H3 dans laquelle R représente un groupe aminoprotecteur de type acyl c) à faire réagir le composé (II) avec un réactif d'introduction d'un groupe carboxy-protecteur pour blo- quer les deux groupes carboxyles du composé (II) et ob- tenir le composé de formule: OCH I s CH- (CH2) 3-CONH COOR' N 0COOR' COOR N-N Il il CH2S N CH3 dans laquelle R' représente le groupe carboxy-protecteur, d) & faire r6agir le composé (II') avec un halogénure d'halogéno-acétyl de formule: XCH2COX' dans laquelle X et X', qui peuvent être semblables ou diff6rents, représentent chacun un halogène, et particu- lièrement le chlore ou le brome, en pr6sence d'un tamis moléculaire ou d'un agent de silylation pour donner un composé de formule: CH3 XCH2CONH- COOR' N N I Il - 'N ACN CH (III) dans laquelle X a la d6finition ci-dessus et R' représente le groupe carboxy-protecteur, e) à 6éliminer le groupe carboxy-protecteur (R') du composé (III) de façon connue pour obtenir le composé de formule: (II') OCH3 I wS XCH2CONH N N 2 N 0 CH2SJ III') COOH CH3 C3 dans laquelle X est tel que défini ci-avant et, f) à faire réagir le composé (III') avec la D-cystélne pour produire le composé désiré. 2 - Proc6dé selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'il comporte en outre l'étape de réaction du produit obtenu avec un cation pharmaceutiquement acceptable pour produire le sel pharmaceutiquement acceptable correspon- dant. 3 - Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que l'étape (a) est effectuée en faisant réagir le 5-mercapto-1-méthyl-lH-tétrazole avec la céphamycine A et/ou la céphamycine B qui est -ou sont- présents dans le filtrat du bouillon de culture de Streptomyces virido- chromogenes SF-1584 (FERM-P N 2284) ou dans une solution concentrée dudit filtrat. 4 - Procédé selon la revendication 1 et la revendi- cation 3, caractérisé en ce que l'étape (a) est effec- tuée à une température entre 15 et 600C en milieu neutre ou acide dans une solution aqueuse contenant la céphamy- cine A et/ou la céphamycine B. 5 - Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que l'agent d'acylation pour introduction du grou- pe amino-protecteur employé dans l'étape (b) est le chlorure de trichloro6thoxycarbonyl. 6 - Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que le réactif d'introduction du groupe carboxy-pro- tecteur employé dans l'étape(c) est un agent d'estérifi- cation choisi parmi le diphényldiazométhane, l'isobuténe, le chlorure de trichloréthyl, le chlorure de méthoxy- 6thoxym6thyl ou un bromure de p-nitrobenzyl. 7 - Proc6dé selon la revendication 1, caract6ris6 en ce que l'6tape (d) de r6action de l'halogénure d'halog6- noac6tyl avec le composé (II') est effectuée dans un sol- vant organique aprotique à une température entre 15 et 600C en pr6sence d'une zéolite synthétique comme tamis moléculaire ou en pr6sence d'un agent de silylation choisi parmi la N-(triméthylsilyl)acétamide, la N,N-bis- (triméthylsilyl)ac6tamide et la N,N-bis(triméthylsilyl) trifluoroacétamide. 8 - Procéd6 selon la revendication 1, caractérisé en ce que l'étape (e) d'élimination du groupe carboxy-pro- tecteur est effectuée de façon connue par alcoolyse, hy- drolyse ou par hydrogénolyse catalytique selon la nature du groupe carboxy-protecteur à éliminer. 9 - Proc6d6 selon la revendication 1, caract6ris6 en ce que l'6tape (f) de réaction de la D-cystéine avec le compos6 (III') est effectuées une température entre 0 et 30 C dans l'eau ou dans un solvant organique aqueux, iner- te, en milieu neutre.