FR 2467194 A2 19810417 FR 7925015 A 19791008 La présente invention se rattache à la demande de brevet N076 22279 du 21 juillet 1976 dans laquelle on décrit la bestatine et des composés apparentés répondant à la formule où R1 est un groupe choisi dans les groupes comprenant le groupe alkyle inférieur, le groupe cyanoalkyle, le groupe ényle, le groupe benzyle et le groupe benzyle substitué; R2 est un groupe choisi parmi les groupes comprenant le groupe alkyle ayant 1 à 6 atomes de carbone, le groupe hydroxyalkyle, le groupe mercaptoalkyle, le groupe carboxyamidoalkyle, le groupe alcoxyalkyle, le groupe alkylmercaptoalkyle, le groupe carboxyalkyle, le groupe aryle, le groupe aralkyle, et le groupe aralkyle substitué.Dans le cas où R1 est le groupe benzyle et R2, est le groupe isobutyle, la configuration du composé est (2S, 3R, 2'R), (2S, 3S, ou ou (2S, 3S, 2'R). Dans cette demande de brevet N 76 22279 la demanderesse a montrd que la bestatine et les composés apparentés qui y sont décrits inhibent l'aminopeptidase B, l'aminopeptidase de leucine et l'hydrolase de bléomicine et augmentent l'effet anti-tumeur de la bléomycine et l'effet antifertilité. La demanderesse a maintenant découvert que les composés de formule générale (I) dans laquelle le substituant R1 a la valeur p-hydroxybenzyle, ont des propriétés très remarquables. Ils ont une bonne activité du point de vue inhibition vis-à-vis de l'aminopeptidase B et ils possèdent une action excellente en ce qui concerne la résistance immune au cancer. La présente invention concerne donc les nouveaux composés de formule (I) dans laquelle R1 a la valeur p-hydroxybenzyle. Plus particulièrement la présente invention vise l'obtention des composés doués de propriétés physiologiques intéressantes, de formule (I) dans laquelle R1 est le groupe p-hydroxybenzyle, R2 est le groupe isobutyle et de configuration (2RS, 3RS, 2'S) et (2S,3R,2'S). Les composés selon la présente invention peuvent être préparés selon un procédé connu, en hydrolysant un dérivé nitrile de formule (II) (où R1 est tel que défini ci-dessus) ou un dérivé nitrile dont le groupe amino est protégé, avec un acide pour préparer un amino-acide de formule (III) en condensant, après avoir praégé si nécessaire les groupes fonctionnels qui ne prennent pas part à la réaction, cet amino-acide (III) avec un amino acide (IV) (où R2 a la signification précedemment donnée) selon la méthode normale de liaison des peptides et en éliminant ensuite les groupes protecteurs. Les composés de formule (I) dans laquelle R1 est hydroxybenzyle et R2 est le groupe isobutyle sont avantageusement préparés en partant comme nitrile de formule (II), du 3-amino-2-hydroxy-4-p-benzyloxyphénylbutyro- nitrile. La présente invention est illustrée par les exemples non limitatifs ci-après, dans lesquels on utilise les abréviations AHPA = acide 3-amino-2-hydroxy-4-phénylbutanoSque, précurseur de la bestatine. Z = groupe protecteur benzyloxycarbonyle Leu l: leucine OBzl.TosOH = p-toluènesulfonate d'ester benzylique DCCD = N,N'-dicyclohexylcarbodimide, utilisé lors de la condensation des deux aminoacides selon la méthode du carbodiimide. DCHA =. dicyclohexylamine EXEMPLE 1 Etapé a On dissout 22,0g de Z-(2RS,3RS)-3-amino-2-hydroxy-4-p-méthoxy-phénylbutyroni- trile huileux dans un mélange de 200ml d'acide chlorhydrique concentré et 200mol de dioxane. Après avoir ajouté 13,2 gd'anisole, on chauffe au reflux le mélange réactionnel pendant 12 heures. Puis on élimine le dioxane par distillation sous pression réduite, on lave la solution résultante d'acide chlorhydrique avec de l'éther et on concentre la couche aqueuse sous pression réduite et on l'évapore à sec. Ensuite, on ajoute lOoml d'eau à la substance résiduelle et on sépare la substance insoluble par filtration.Après avoir ajouté une quantité égale d'acétone, on ajuste le mélange à pH 5,5 avec de l'ammoniaque. On met le mélange à reposer au réfrigérateur. Les cristaux déposés sont séparés par filtration, on obtient6,73g de (2RS,3RS)-AHPA (p-OH) recherché. Etape b On dissout 2,11 g du (2RS,3RS)-AHPA (p-OH) obtenu dans l'étape a)dans loml d'une solution 1N d'hydroxyde de sodium. Tout en agitant vigoureusement la solution en refroidissant avec de la glace, on ajoute en trois portions pendant une période de 30 minutes 4,5ml de Z-C1. On continue alors d-'agiter encore vigoureusement le mélange réactionnel pendant une heure en refroidissant avec de la glace et pendant trois heures à température ambiante. Durant la réaction le pH est ajusté à 8-9 avec une solution d'hydroxyde de sodium 1N. Quand la réaction est complète, on ajoute de l'acide chlorhydrique 6N pour ajuster le mélange réactionnel à pH2. Comme résultat, on sépare un produit huileux qui est ensuite extrait deux fois avec lOOml d'acétate d'éthyle. On lave la couche d'acétate d'éthyle avec de l'eau et on la déshydrate jusqu'à ce qu'elle soit sèche en utilisant du sulfate de magnésium anhydre. Apres avoir séparé le sulfate de magnésium par filtration, on concentre le filtrat sous pression réduite et on cristallise le résidu dans un mélange acétate d'éthyle-éther de pétrole pour préparer 3,64 g de Z-(2RS, 3RS)-AHPA(p-OZ). Point de fusion l38-l400C. Etane c un dissout dans lOml de tétrahydrofurane 479mg de Z-(2RS,3RS)-AHPAtp-Oz) et 162mg de HOBt. Après avoir ajouté 472mg de Leu-OBzl. TosOH, on neutralise le mélange avec 0,168ml de triéthylamine et on refroidit jusqu'à -50C. Puis on ajoute 206mg de DCCD et on laisse reposer le mélange réactionnel durant une nuit pour qu'il réagisse. On élimine par distillation le tétrahydrofurane sous pression réduite et on ajoute 30ml d'acétate d'éthyle.Après avoir filtré les substances insolubles, on lave le filtrat avec, dans cet ordre, de l'acide sulfurique 1N, de l'eau, une solution de bicarbonate de sodium aqueuse à 5% et de 1 'eau, et ensuite on le déshydrate jusqu'à ce qu'il soit sec avec du sulfate de magnésium anhydre. Le résidu obtenu par concentration du filtrat sous pression réduite est solidifie dans de l'acétate d'éthyle-éther de pétrole. ta recristalli satis ans le même solvant donne 450mg de Z-(2RS,3RS)-AHPA-(p-OZ)-(S)-Leu-OBzl. Point defusion 98-99 C, gt 2 588 = -14,0 (C=0,58 ,AcOH), Etape d On dissout dans lOml de méthanol 400mg de Z-(2RS,3RS)-AHPA(p-OZ)-(S)-Leu OBzl et on l'hydrogène pendant 3heurs avec environ lOmg de noir de palladium. On élimine le catalyseur par filtration et on concentre le solvant sous pression réduite. Quand l'opération de recristallisation est effectuée avec du méthanol-acétate d'éthyle, on obtient 219mg de (2RS,3RS)-3-amino-2-hydroxy-4- p-hydroxy-phénylbutanoyl-(S)-leucine. 30 [&alpha;]30578 - 88 (c 0,90, AcOH); Rf 0,48 et 0,51 Analyse pour C16H24N205, trouvé C 59,38 H 7,23 N 8,95, calculé C 59,24 H 7,46 N 8,64 EXEMPLE 2 Lorsqu'on traite, de la même manière que dans l'exemple 1, étape a, 30g de Z -(2RS,3R)-3-amino-2-hydroxy-4-p-hydroxyphényl-butyronitrile, on obtient 12,61g de (2RS,3R)-AHPA(p-OH) R f = 0,20 Analyse pour C10H12NO4, trouvé : C 58,63, H 5,99, N : 7,43 calculé : C 58,81 H 5,92 N : 7,82. Lorsqu'on benzyloxycarbonyle le (2RS,3R)-APHA (P-OH) en utilisant le benzyl-.s 4, 6-diméthylpyrimidine-2-ylthiocarbonate, on obtient le Z-AHPA(p-OH) sous forme du sel DCHA. On fait cristalliser 15,22g du sel CHA brut dans méthanol, acétate d'éthyle et éther de pétrole et on obtient 3,2g du sel Z (2R,3R)-AHPA (p-OH) DCHA optiquement impur comme première récolte. Lorsqu'on évapore à siccité la liqueur mère et que l'on fait précipiter le résidu trois fois à partir d'acétate d'éthyle et d'éther, on obtient 5,02g du sel Z-(2S,3R)-AHPA(p-OH)DCHA pur. Point de fusion : 121-l220C. [&alpha;]20578 = +49,9 (C = 0,87, AcOH) 578 Analyse pour C30H42N2O6 trouvé C 69,81 H 8,35 N 6,42 calculé C 69,46 H 8,16 N 6,17 Après traitement du sel Z-(2S,3R) -AHPA(p-OH) DCHA (1,05g) avec de l'acétate d'éthyle et H2 S04 dilué, on traite, de la même manière que dans l'exemple l, étape e, lé Z-(2S,3R)-AHPA (p-OH) obtenu, 866mg de (S)-Leu OBzl.TosOH, 405 mg de HOBt, 0,308 ml de triéthylamine et 412 mg de DCCD. On obtient quantitativement Z-(2S,3R) - AHPA (p-OH) - (s) - Leu - OBzl sous forme d'un produit huileux. Lorsqu'on traite Z-(2S,3R)-AHPA (p-OH)-(S)-Leu-OBzl huileux, de la même manière que dans l'exemple 1, étape d, on obtient 630mg de (2S,3R)-3-amino-2-hydroxy-4-p-hydroxyphénylbutanoyl-(S)-Leucine. 29 [&alpha;]29578 = - 19,9 (C=1,19, AcOH) R f = 0,48 Analyse pour C16H23N205 Calculé C 59,98 H 7,42 N 10,42 Trouvé C 60,55 H 7,30 N 10,08 Les activités physiologiques des composés préparés dans la présente invention, ont été déterminées comme suit A) Activité inhibitrice vis-à-vis de l'aminopeptidase B Procédé d 'essai On a modifié la méthode décrite par V.K. Hopusu, K.K. Makinen, G.G. Glenner dans Archives of biochemistry ané biophysics, 114, 557 (1966). Au mélange de 0,3ml de 1 rtf d'argine ss -naphtylamide et 1,0 ml de tampon tris chlorhydrique 0,1 M pH 7,0), 0,7 ml d'eau distillée avec ou sans produit d'essai a été ajouté et chauffé à 37 C pendant 3 minutes. La réaction a débuté lors de l'addition de 0, 2ml de solution d'aminopeptidase B qui est préparée;ar chromatographie Sephadex 5100 comme décrit par Hopusu et ses collaborateurs.Après 30 minutes à 370c on ajoute 0,6ml de tampon acétate 1,OM (pH 4,2) contenant le sel de diazonium de l'o-aminoazotoluène à 1,0 mg/ml et du Tween 20 à 1,0%. Après 15 minutes à température ambiante, on mesure au spectrophotomètre l'absorption (a) à 530 nm. Comme élément de contrôle} on mesure par des moyens similaires l'absorption (b) après la réaction en l'absence d'échantillon. Le pourcentage d'inhibition est calculé comme suit (b-a)/b x 100. On a mesuré les pourcentages d'inhibition à diverses concentrations et, à partir des pourcentages d'inhibition mesurés, on a déduit les inhibitions à 50% (ID50). On a rassemblé les résultats dans le tableau 1. TABLEAU 1 N Composé ID50 ( g/ml) 1 (2RS,3RS)-AHPA (p-OH)-(S)-Leu 0,10 2 (2S, 3R) -AHPA (p-OH)-(S)-Leu 0,007 Référence (2S, 3R) -AHPA -(S)-Leu 0,10 Bestatine Comme on peut le voir du tableau précédent le composé de l'exemple 1 a sensiblement lee mêmes effets inhibiteurs que la bestatine. Par contre, le composé de l'exemple 2 atteint le même effet en des quantités de loin inférieures à un quarantième de la bestatine. En conclusion, de ces résultats, il ressort que les nouveaux composés, spécialement le composé de l'exemple 2 qui est une forme optiquement active du composé de l'exemple 1 peuvent être des substances physiologiquement actives extrêmement utiles. B) Formation d'anticorps humoraux. Dans cet essai on étudie l'effet du composé à tester sur la formation d'anticorps relativement aux cellules de sang rouge du mouton (SRBC), chez la souris. On immunise des souris, femelles dd/Y, par injection intra veineuse de 108 SRBC. On fait aussitôt après une injection intrapéritonéale du composé à tester. Quatre jours plus tard, on détermine le nombre de cellules formant plaque dans la rate selon latechnique de la plaque hémolytique de Jerne et al, "The agar plaque technique for recognizing antibody-producing celle" (Wistar Institut Press Philadelphia 1963), pp 109-122. Les résultats sont insérés dans le tableau 2 ci-apres. TABLEAU 2 Effet du composé testé sur la formation d'anticorps humoraux relativement à SRBC chez la souris. Cellules formant anticorps Nom du composé Dose Rapport du groupe Nombre traité au groupe non traité - - 125000#9050 - (2RS.3RS)-3-amino- 1 mgl207400+8025 1,66 Selon- hydroxyphenylbuta- 100 g 261000#11700 2 > 09 L'invention noyl-(S)-leucine 10 1lg.208000+7180 1}66 1 g 175800#8200 1,41 0,1 g 141000#5700 1,13 Bestatine 1 mg 190000#7100 1,52 10 g 136250#6500 1,09 (2RS,3RS)-3-amino éférence 2-hydroxy-4-p- 1 mg 208750+8000 1,67 chlorophenyl- 10 g 133750+5600 1,07 leucine De l'étude de ce tableau, il ressort que le nombre de cellules formant anticorps chez le groupe des souris traitées par lO/ Par contre, le nombre de cellules formant anticorps chez le groupe des souris traitées par 10t g de (2RS-3RS)-3-amino-2-hydroxy-4-p hydroxyphénylbutanoyl-(S)-leucine selon l'invention est 1,66 fois plus grand que celui du groupe non traité et même avec une dose de seulement 1 g de ce composé le rapport est encore de 1,41. La (2RS,3RS)-3-amino-q-hydroxy-4-p-hydroxybutanoyl-(S)- leucine a donc un effet sur l'accroissement du nombre de cellules forint anticorps, à un degré considérable de sorte qu'elle peut être considérée comme un excellent inhibiteur immunisant du cancer. REVENDICATIONS 1. composés de formule dans laquelle R1 désigne le groupe p-hydroxy-benzyle, dont le groupe amino et/ou le groupe hydroxy qui se trouve sur le noyau phényle sont éventuellement protégés 2. Composé selon la revendication 1, caractérisé par le fait qu'il est l'acide (2RS,3RS)- 3 - amino - 2 - hydroxy - 4 - p - hydroxyphényl bu tanoXque, dont le groupe amino et/ou le groupe hydroxy qui se trouve sur le noyau phényle sont éventuellement protégés. 3. Composé selon la revendication 1, caractérisé par le fait qu'il est l'acide (2S , 3R) - 3 - amino - 2 - hydroxy - 4 - hydroxyphényl butanotque dont le groupe amino et/ou le groupe hydroxy qui se trouve sur le noyau phényle sont éventuellement protégés.