FR 2462709 A1 19810213 FR 8015663 A 19800716 Les dosages ou dosages immunologiques par fixation des protéines ont fait l'objet de nombreuses recherches et commercialisations. La possibilité de déterminer spécifique- ment un médicament ou un autre composé intéressant, en parti- culier intéressant du point de vue physiologique, présent en une concentration extrêmement faible, normalement moins de quelques microgrammes par ml, a ouvert de nouvelles opportu- nités dans les laboratoires cliniques. La possibilité de sur- veiller l'administration thérapeutique d'un médicament ou l'addition d'un médicament, de déterminer rapidement et effi- cacement des états morbides et de surveiller la condition d' un patient pendant les périodes de stress, a fourni d'impor- tantes occasions d'améliorer les précautions sanitaires. Les dosages dans le laboratoire clinique requièrent souvent non seulement une sensibilité élevée, mais également une précision dans une gamme relativement étroite. On a donc développé de nouvelles techniques qui répondent à ces exigen- ces en fournissant une plus grande sensibilité, une réponse réduite à des effets non-spécifiques et des protocoles plus simples. En outre, de nombreux antigènes ne peuvent être ob- tenus que sous une forme impure ou sous une forme pure à des prix très élevés. En conséquence, les dosages doivent être adaptés au fait que l'antigène puisse être impur. Parallèle- ment à cette situation, la plupart des anticorps qui sont ob- tenus par une injection d'antigène ont moins d'environ 30 % ou souvent moins d'environ 20 % en poids de la protéine to- tale comme anticorps intéressant. Dans la préparation de réac- tifs qui impliquent des réactions avec la composition d'anti- corps, il faut donc tenir compte de la présence d'une quan- tité importante de contaminant. Lors de la mise au point d'un dosage, il faut éga- lement considérer la nécessité et le nombre des incubations, la durée requise pour l'incubation, la durée requise pour la mesure, la sensibilité de la mesure vis-à-vis de facteurs é- trangers, la stabilité des réactifs, la formulation des réac- tifs et similaires. Le brevet US 3 996 345 décrit l'utilisation d'une paire de chromophores substance fluorescente et substance extinctrice - o les éléments de la paire sont liés à diffé- rents éléments d'une paire de fixation spécifique, de sorte que la quantité de substance fluorescente et de substance ex- tinctrice qui participent à une interaction, dépend de la quantité du produit à analyser dans le milieu. Le brevet US 3 935 074 décrit un dosage immunologique dépendant de l'inap- titude de deux anticorps à se fixer simultanément sur un réac- tif ayant au moins deux sites déterminants. La demande de bre- vet US no 893 650 déposée le 5 avril 1978 concerne le concept de dosages immunologiques dans lesquels on fournit simultané- ment deux enzymes dont les substrats ou les produits sont d'une certaine manière reliés à la production d'un signal dé- tectable, o la juxtaposition des enzymes est fonction de la quantité de produit à analyser dans le milieu. La demande de brevet US n0 815 632 déposée le 4 Juillet 1977 décrit l'uti- lisation d'un agent macromoléculaire modifiant un marqueur fixé à un anticorps, o l'agent de modification est inhibé vis-à-vis du marqueur lorsque l'anticorps marqué est fixé à l'antigène. La demande de brevet US n0 815 487 déposée le 14 Juillet 1977 décrit un dosage immunologique par des enzymes o un ligand est marqué par un enzyme et un inhibiteur d'en- zyme est inhibé vis-à-vis de l'enzyme lorsqu'un anticorps est fixé au ligand. La demande de brevet US n0 964 099 déposée le 24 Novembre 1978 décrit l'utilisation de particules macro- moléculaires pour apporter une discrimination entre un mar- queur fixé à la particule et un marqueur libre dans la solu- tion, o la quantité de marqueur fixé à la particule est fonc- tion de la quantité de substance à analyser dans le milieu et le signal détectable observé dépend du partage du marqueur entre la particule et le milieu. Le brevet US 3 817 837 décrit un dosage immunologique homogène par les enzymes. On décrit un dosage par fixation des protéines impli- quant des éléments d'une paire de fixation spécifique, les éléments étant un ligand et un récepteur (antiligand). Comme premier réactif dans la méthode, un des éléments est substitué par plusieurs fonctions ionisables qui sont capables de four- nir une charge, positive ou négative, dans les conditions du dosage. Un second élément, soit le même, soit un élément ho- mologue, est marqué avec un constituant d'un système produi- sant un signal, lequel système produisant un signal est capa- ble de produire un signal détectable dans les conditions du dosage. Le signal produit par le système produisant un si- gnal est affecté par la juxtaposition du champ électrique ré- sultant du premier élément chargé. Grâce à un choix approprié des éléments selon le produit à analyser, la proximité moyenne des premier et second éléments dans le milieu de dosage peut être reliée à la quantité de produit à analyser dans le mi- lieu de dosage. C'est ainsi que le signal observé peut être rapporté à la quantité de produit à analyser dans le milieu de dosage. En utilisant des produits de comparaison appropriés, contenant des quantités connues de la substance à analyser, on peut établir une relation entre la concentration de la substance à analyser et le niveau du signal observé. - De plus,-on fournit des réactifs pour le dosage, ainsi que des combinaisons de réactifs qui assurent une opti- miisation substantielle de la sensibilité du dosage ou du taux de réponse du dosage aux variations de concentration de la substance à analyser. L'invention concerne un dosage par fixation de pro- téine, impliquant une paire de fixation spécifique, soit un ligand et un récepteur. La base de l'invention consiste à éta- blir une relation entre la proximité de deux réactifs et la quantité de substance à analyser dans le milieu de dosage. Le premier réactif est un premier élément de la paire de fi- xation spécifique qui est modifié par plusieurs charges ioni- ques de façon à créer un champ de charge dans un environnement aqueux à un pH déterminé. Un second élément est modifié par un marqueur qui est un constituant d'un système produisant un signal, à simple constituant ou à constituants multiples;_le niveau du signal observé dépend de la juxtaposition du système produisant un signal avec le champ créé par l'élément chargé. Le champ affecte le système produisant un signal en augmen- tant ou en diminuant la concentration localisée de certains ions dans le milieu de dosage, laquelle concentration ionique affecte le niveau dusignal observé. En plus de la substance à analyser et des premier et second éléments, d'autres maté- riaux peuvent être ajoutés selon la nature du système produi- sant un signal. La fixation d'éléments homologues de la paire de fixation spécifique résulte en la formation d'un complexe, lorsqu'au moins deux, et normalement au moins trois éléments sont impliqués. Etant donné la nature polyvalente des anti- corps et des antigènes, le complexe peut être développé pour créer un réseau d'anticorps et d'antigène apportant plusieurs marqueurs pour le signal et plusieurs charges ioniques à pro- ximité, o des interactions peuvent se produire. Dans la discussion de l'invention, on respectera l'ordre suivant. On considérera en premier la méthode de do- sage; puis les définitions concernant les différents termes en rapport avec les matériaux utilisés. On discutera ensuite des matériaux en ce qui concerne la substance à analyser, le système produisant un signal et l'élément chargé. Enfin, on traitera de la partie expérimentale et on démontrera l'utilité du procédé selon l'invention. METHODE DE DOSAGE Conformément à la méthode de l'invention, la subs- tance à analyser, un réactif comportant plusieurs groupes io- nisables, substantiellement ionisés dans les conditions du dosage, un réactif marqué o le marqueur est un élément d'un système produisant un signal et tous constituants supplémen- taires nécessaires sont combinés dans un milieu aqueux tam- ponné. Le signal observé peut alors être lu et comparé à un milieu de dosage contenant une quantité connue de la substan- ce à analyser. La substance à analyser est un élément d'une paire de fixation spécifique, constitué d'un ligand et de son ré- cepteur homologue, o le ligand ou le récepteur peut être la substance à analyser. Le milieu de dosage est normalement aqueux, usuellement tamponné en une quantité suffisante pour atteindre un pH modéré, généralement proche de celui assurant une sensibilité de dosage optimale. Le milieu aqueux peut être uniquement de l'eau, ou il peut comprendre de O à 40 volumes % d'un co-solvant, géné- ralement un solvant polaire, ordinairement un solvant organi- que oxygéné ayant de I à 6, de préférence de I à 4 atomes de carbone, tel que des alcools, des éthers et similaires. Le pH du milieu aqueux est normalement compris en- tre 4 et 11, de préférence entre 5 et 10, et avantageusement entre 6,5 et 9,5. Le pH est choisi de façon à maintenir un taux significatif de fixation spécifique par le récepteur, tout en optimisant la sensibilité ou la réponse du-système produisant un signal, aux variations de concentration de la substance à analyser. On peut utiliser divers tampons pour obtenir le pH désiré et maintenir ce pH pendant la détermination. Comme e- xemples de tampons, on citera les borates, phosphates, car- bonates, tris, barbital et similaires. Le tampon particulier utilisé n'est pas critique pour l'invention, mais selon les dosages on peut préférer l'un ou l'autre tampon. On utilise normalement des températures modérées pour effectuer le dosage et usuellement des températures constantes pendant la durée de la mesure, en particulier pour des déterminations de taux. Les températures dtincuba- tion sont normalement comprises entre 5 et 45 OC environ, plus usuellement entre 15 et 40 OC. Les températures pendant les mesures sont généralement comprises entre 10 et 50 0C,de préférence entre environ 15 et 40 OC. La concentration dosable de la substance à analy- ser varie généralement entre 10 et 10 1 M, plus usuelle- ment entre environ 10 et 101 M. Des considérations, tel- les que le type d'essai ou de dosage, qualitatif, semi-quanti- tatif ou quantitatif, la technique particulière de détection et la concentration de la substance à analyser, déterminant normalement les concentrations des autres réactifs. Bien que les concentrations des différents réactifs dans le milieu de dosage soient généralement déterminées par la gamme de concentration intéressant la substance à analyser, la concentration finale de chacun des réactifs est normalement déterminée empiriquement pour optimiser la sensibilité du do- sage dans la gamme intéressante. C'est-à-dire qu'une variation de la concentration de la substance à analyser, qui est signi- ficative, fournit une différence de signal mesurable avec pré- cision. Les sites de fixation totaux des éléments de la pai- re de fixation spécifique, qui sont réciproques vis-à-vis de la substance à analyser, varient beaucoup selon la nature des réactifs, c'est-à-dire selon qu'il s'agit de réactifs identi- ques à, ou différents de la substance à analyser. Par exemple, les deux réactifs peuvent être des récepteurs ou les deux ré- actifs peuvent être des ligands ou l'un des réactifs peut ê- tre un ligand et l'autre réactif un récepteur. Au moins un des réactifs doit être l'agent de fixation réciproque de la substance à analyser. Le rapport du réactif marqué à la substance à ana- lyser, basé sur les sites de fixation dans le milieu de dosa- ge est généralement d'environ 0,5 à 100 sites de fixation du réactif marqué par site de fixation de la substance à analy- ser, normalement d'environ 1 à 50, et plus couramment d'en- - viron 1 à 20 dans la gamme de concentration de la substance à analyser. Ces nombres se rapportent aux sites disponibles à la saturation, car tous les sites ne sont pas également dis- ponibles. Il faut souligner que ces nombres ne sont donnés qutà titre d'illustration des rapports les plus intéressants. Le rapport varie en fonction du mode de mesure, l'équilibre ou non, de la constante de fixation du réactif marqué, de la concentration de la substance à analyser, de la sensibilité du système produisant un signal vis-à-vis des effets des char- ges, de la nature du ligand et de la sensibilité avec laquel- le le signal peut être détecté. Le rapport molaire de l'élément chargé à l'élément marqué peut également varier dans de grandes proportions, se- lon la nature du marqueur, la sensibilité du marqueur aux effets des charges et la nature du ligand. Normalement, le rapport molaire de l'élément chargé à l'élément marqué est d'environ 0,5-100:1, plus usuellement d'environ 1 à 20:1. Ce- lui-ci peut varier tout à fait dramatiquement, selon le pro- tocole particulier, l'ordre d'addition, la nature du marqueur, les affinités de fixation relatives et similaires. Ltordre d'addition peut varier considérablement, bien que fréquemment tous les constituants d'un système pro- duisant un signal, à constituants multiples, ne soient pas ajoutés simultanément. Normalement, l'élément marqué avec un constituant du système produisant un signal est ajouté dans le milieu du dosage avant au moins un des autres constituants du système produisant un signal. Ceci est particulièrement vrai, lorsque le marqueur est une enzyme et les autres cons- tituants sont des substrats et des co-facteurs. Les deux éléments réactifs peuvent être ajoutés simultanément ou consécutivement à la substance à analyser. De façon commode, le marqueur du système produisant un si- gnal est souvent ajouté avant l'élément chargé. *Les deux ré- actifs peuvent être fournis sous la forme d'une simple compo- sition ou de compositions séparées, selon la naturezdu pro- tocole. A titre d'illustration, on peut indiquer deux pro- tocoles particuliers. Le premier protocole implique l'addition de l'élément marqué du système produisant un signal-à la subs- tance à analyser et l'incubation pendant un temps suffisant pour que le système approche au moins de l'équilibre. On peut ensuite ajouter au mélange l'élément chargé et en même temps, ou immédiatement après, tous les constituants supplémentaires du système produisant un signal. Un autre protocole consisterait à ajouter pratique- ment simultanément l'élément marqué du système produisant un signal et l'élément chargé, puis d'incuber ou non, selon désir. Dans certains cas, il est souhaitable d'ajouter un inhibiteur de signal, c'est-à-dire un matériau qui réagit avec le mar- queur du système produisant un signal, de façon à inhiber la production d'un signal, lorsque l'élément marqué du système produisant un signal n'est pas lié à son élément homologue. La substance à analyser peut apporter en même temps l'élément chargé et l'élément marqueur du système produisant un signal ou augmenter la séparation de l'élément chargé et de l'élément marqueur du système produisant un signal. Par exemple, lorsque la substance à analyser est un antigène ou un poly(analogue de ligand) et que les deux éléments réactifs sont des anticorps, dans une gamme limitée de concentration, la substance à analyser peut servir à amener en moyenne les deux éléments réactifs plus proches l'un de l'autre que lors- que les éléments diffusent librement dans la solution. D'au- tre part, lorsque la substance à analyser est un antigène et que l'élément marqueur du système produisant un signal est un antigène, la substance à analyser et l'élément marqueur du système produisant un signal entrent en compétition pour un antigène chargé. Un ou plusieurs stades d'incubation peuvent être nécessaires pour la préparation du milieu de dosage. Par exem- ple, il peut être désirable d'incuber une substance d'antigè- ne à analyser avec un récepteur marqué. De plus, il peut être désirable de procéder à un second stade d'incubation, selon la nature des autres réactifs utilisés. Ou bien, on a re- cours à une longue incubation et la durée de l'incubation dépend en grande partie du mode de détermination - équilibre ou non - et du taux de úixatbn du récepteur sur le ligand. Normalement, la durée des stades d'incubation varie de 0,5 minute à 6 heures, plus usuellement de 5 minutes à 1 heure. Les températures d'incubation varient entre 4 et 50 OC envi- ron, plus usuellement entre 15 et 37 OC. Lorsque les réactifs ont été combinés, le signal peut alors être déterminé. La méthode de détermination est normalement l'observation d'une radiation électromagnétique, en particulier, la lumière ultraviolette et visible, plus précisément la lumière visible, soit par absorption, soit par émission. Lorsqu'une fluorescence est impliquée, il est sou- haitable que la lumière émise ait une longueur d'onde supé- rieure à 400 nm, plus avantageusement supérieure à 450 nm et de préférence supérieure à 500 nm. Lorsqu'il s'agit d'absorp- tion, l'absorption a normalement lieu entre 250 et 900 nm environ, plus usuellement entre 325 et 650 nm. La température à laquelle on observe le signal se situe généralement entre 10 et 50 OC environ, plus usuelle- ment entre 15 et 40 OC. On peut préparer des milieux à dosage de référence contenant des quantités connues de la substance à analyser. Le signal observé pour les milieux de dosage de référence (témoins) peut alors être porté sur un diagramme de façon à obtenir une relation entre la concentration et le signal. Une fois qu'on a tracé une courbe de référence, un signal peut être directement rapporté à la concentration de la substance à analyser. Le temps pour mesurer le signal dépend de ltutili- sation d'un mode d'équilibre ou non, de la sensibilité requi- se, de la nature du système produisant un signal et similai- res. Dans le cas d'un mode non-équilibré, les temps entre les lectures varient généralement entre 5 secondes et 6 heures, normalement entre 10 secondes et 1 heure. Pour un mode d'é- quilibre, après avoir obtenu un état stable, une simple lec- ture peut être suffisante ou deux lectures au besoin à un in- tervalle de temps approprié peuvent convenir. DEFINITIONS Substance à analyser (analyte) - le composé ou la composition à mesurer, qui peut être un ligand, un simple com- posé ou plusieurs composés qui fournissent au moins un site épitope ou déterminant commun, ou un récepteur. Paire de fixation spécifique - deux molécules dif- férentes, o l'une des molécules comporte une zone sur la sur- face ou dans une cavité qui se lie à un arrangement spatial et polaire particulier de l'autre molécule. Les éléments de la paire de fixation spécifique sont le ligand et le récepteur (antiligand). Ligand - tout composé organique pour lequel un ré- cepteur existe naturellement ou peut être préparé. Récepteur (-antiligand) - tout composé ou toute com- position capable de reconnattre un arrangement spatial ou po- laire particulier d'une molécule, c'est-à-dire un site déter- - minant ou épitope. Comme exemples de récepteurs naturels, on peut citer la globuline fixant la thyrosine (TBG), les anti- corps, les fragments Fab, les enzymes, les lectines et simi- laires. Analogue d'un ligand - un ligand modifié qui peut entrer en compétition avec le ligand analogue pour un récep- teur, la modification fournissant un moyen de réunir 1'analo- gue d'un ligand avec une autre molécule. Selon les fonction- nalités disponibles du ligand, l'analogue d'un ligand peut différer du ligand par plus que le remplacement d'un hydrogè- * ne par une liaison qui réunit l'analogue d'un ligand à un cen- tre (hub) ou marqueur. - Poly (analogue d'un ligand) - plusieurs analogues de ligand réunis de façon covalente, le plus souvent à un noyau centre.Ienoyau centre est un matériau polyfonctionnel, norma- il lement polymère,'comportant ordinairement plusieurs groupes fonctionnels par exemple hydroxy, amino, mercapto, éthyléni- que, etc. comme sites de fixation. Le noyau centre peut être soluble ou insoluble dans l'eau, normalement soluble dans l'eau et a normalement un poids moléculaire d'au moins 10 000 environ, usuellement un poids moléculaire d'au moins 35 000 environ et pouvant atteindre 10 millions ou plus, normalement inférieur à 600 000 et plus usuellement inférieur à 300 000. Comme noyaux centres, on peut citer des polysaccharides, des polypeptides comprenant des protéines, des acides nucléiques, des résines échangeuses d'ions, etc. Les noyaux centres inso- lubles dans lVeau peuvent comprendre des verres, des polymè- res d'addition et de condensation, réticulés et non-réticulés, des particules naturelles, ou similaires, comportant plusieurs fonctions ou capables d'acquérir plusieurs groupes fonction- nels. Système produisant un signal - le système produi- sant un signal peut avoir un ou plusieurs constituants, un constituant étant conjugué à un élément d'une paire de fixa- tion spécifique. Le système produisant un signal produit un signal mesurable qu'on peut détecter par des moyens externes, normalement la mesure d'une radiation électromagnétique. Con- formément à l'invention, le niveau du signal observé, produit par le système produisant un signal, est sensible à la proxi- mité de l'élément chargé par rapport à l'élément marqué. Dans la plupart des cas, le système produisant un signal implique des enzymes et des chromophores, o les chromophores compren- nent des colorants qui absorbent la lumière dans la région ultraviolette ou visible, des produits phosphorescents, des produits fluorescents et des produits chimiluminescents. Les enzymes impliquent normalement la formation ou la destruction d'une substance qui absorbe la lumière dans la région ultra- violette ou visible ou la production directe ou indirecte d'u- ne lumière émise par fluorescence ou chimiluminescence. Marqueur - toute molécule conjuguée à un autre mo- lécule, en particulier, la première étant un élément du sys- tème produisant un signal. Conformément à l'invention, les marqueurs sont le constituant d'un système produisant un si- gnal, fixé à un élément de la paire de fixation spécifique et appelé le marqueur du signal. Ligand marqué - le conjugat de l'élément ligand (analogue d'un ligand) de la paire de fixation spécifique avec un élément du système produisant un signal, par liaison covalente ou non-covalente, et dans le cas d'une liaison co- valente, par une liaison, un groupe de liaison ou un noyau centre. Le ligand marqué peut avoir un ou plusieurs ligands ou un ou plusieurs marqueurs ou plusieurs ligands et marqueurs, dans ce dernier cas il est appelé poly (analogue de ligand) polymarqueur. Récepteur marqué - le conjugat d'un récepteur avec un élément du système produisant un signal, o les deux sont liés de façon covalente ou non-covalente, normalement de fa- çon covalente par un groupe de liaison o il peut y avoir un ou plusieurs récepteurs liés au marqueur ou un ou plusieurs marqueurs fixés au récepteur. Elément chargé - un élément soluble de la paire de fixation spécifique, normalement le récepteur, plus usuelle- ment un anticorps, polyionique, substitué de façon covalente ou non-covalente par plusieurs groupes fonctionnels de la mê- me charge,-soit négative, soit positive, de façon à créer une densité localisée, relativement élevée d'une charge particu- lière, qui peut être un simple élément ou plusieurs éléments reliés ensemble. IMUERIAUX Les constituants utilisés dans le dosage selon ltinvention sont la substance à analyser qui est un élément d'une paire de fixation spécifique, l'élément marqué du si- gnal, tous constituants supplémentaires du système produisant un signal, l'élément chargé et selon les cas un récepteur ou un polyanalogue de ligand. Substance à analyser Les substances de ligands à analyser selon l'inven- tion sont monoépitopes ou polyépitopes. Les substances de ligands polyépitopes à analyser sont normalement des poly- acides aminés,c'est-à-dire des polypeptides et des protéines, des polysaccharides, des acides nucléiques et leurs combinai- sons. Ces combinaisons ou assemblages comprennent des bacté- ries, des virus, des chromosones, des gènes, des mitochon- dries, des noyaux, des membranes cellulaires et similaires. Dans la plupart des cas, les substances de ligands polyépitopes à analyser, utilisées conformément à l'invention, ont un poids moléculaire d'au moins 5 000, plus usuellement d'au moins 10 000. Dans la catégorie polyacide aminé, les polyacides aminés intéressants ont généralement un poids mo- léculaire compris entre environ 5 000 et 5 000 000, plus u- suellement entre 20 000 et 1 000 000; les hormones intéres- santes ont des poids moléculaires compris normalement entre 000 et 60 000. La grande variété de protéines peut être considérée quant à la famille de protéines ayant des caractéristiques structurales similaires, de protéines ayant des fonctions biologiques particulières, de protéines se rapportant à des microorganismes spécifiques, en particulier des microorganis- mes provoquant des maladies, etc. Les suivantes sont des classes de protéines de structure similaire protamines histones albumines globulines scléroprotéines phosphoprotéines mucoprotéines chromoprotéines lipoprotéines nucléoprot6ines glycoprotéines prot6oglycanes protéines nonclassées, par exemple somatotropine, prolactine, insuline, pepsine. Un certain nombre de prot6ines trouvées dans le plasma humain sont cliniquement importantes et comprennent les prot6ines suivantes: Pré albumine Albumine " 1-Lipoprotéine oc1 -Acide glycoprotéinique l Antitrypsine o.l-Glycoprotéine Transcortine 4.6S-Postalbumine t 1glycoprot6ine pauvre en tryptophane 1 -X-Glycoprotéine Globuline fixant lathyroxine Inter-d -inhibiteur de la trypsine Gc-globuline (Gc 1-1) (Gc 2-1) (Gc 2-2) Haptoglobine (Hp 1-1) (Hp 2-1) (Hp 2-2) Céruloplasmine Cholinestérase c -Lipoprotéine(s) Myoglobine Protéine C-réactive 2Macroglobuline c-2-HS-glycoprotéine Zn- 2-glycoprotéine o 2-Neuraminoglycoprot6ine Erythropoiétine P-lipoprotéine Transferrine Hémopexine Fibrinogène Plasminogène. P2-glycoprot6ine I p2-glycoprotéine II Immunoglobuline G (IgG) ou eG-globuline Formule moléculaire: 'y2k2 ou Y2 2 Immunoglobuline A (IgA) ou y A-globuline Formule moléculante: ( 2k2)n ou (: 2 2) Immunoglobuline M (IgM) ou y M-globuline Formule moléculaire: (P2k2) ou (2 À 2) Immunoglobuline D(IgD) --ou D-Globuline ( D) VII Proconvertine VIII Globuline antihémophilique (AHG) IX Christmas factor, ou facteur Christnas (au choix) Constituant piasmatique de la thromboplastine (PTC) X Stuart-Prower factor ( ou Facteur Stuart-Prower) autoprothrombine III XI Antécédent plasmatique de la thromboplastine (PTA) XII Hagemann factor (ou Facteur d'Hagemann) XIII Facteur stabilisant la fibrine Les hormones prot6iques importantes sont les sui- vantes: Hormones peptidiques et protiques Hormone parathyroîdique (parathromone) Thyrocalcitonine Insuline Glucagon Relaxine Erythropoiétine Mélanotropine (hormone stimulant les mélanocytes; intermédine) Somatotropine (hormone de croissance) Corticotropine (Hormone adrénocorticotropique) Thyrotropine Hormone stimulant folliculostimulante Hormone luteinisante (Hormone stimulant les cellules intersticielles) Hormone lutéomammotropique (lutéotropine, prolactine) Gonadotropine (gonadotropine chorionique) Hormones tissulaires Secrétine Gastrine Angiotensine I et IIl Bradykinine Lactogène placentaire humain Hormones peptidiques de la neurohypophyse Oxytocine Vasopressine Facteurs de libération (RF) CRF, LRF, TRF, somatotropine-RF, GRF, FSH-RFn PIF, PIF Les mucopolysaccharides et polysaccharides sont d'autres matériaux polymères intéressants. Comme exemples de polysaccharides antigéniques dé- rivés de microorganismes, on citera les suivants: Espèces de microorganismes Hémosensitine trouvée dans Streptococcus pyogenes Polysaccharide Diplococcus pneumoniae Polysaccharide Neisseria meningitidis Polysaccharide Neisseria gonorrheae Polysaccharide Corynebacterium diphtheriae Polysaccharide Actinobacillus mallei; Extràt brut Actinobacillus whitemori Francisella tularensis Lipopolysac- charide Polysaccharide Pasteurella pestis Pasteurella pestis Pasteurella multocida Brucella abortus Haemophilus influenzae Haemophilus pertussis Treponema reiteri Veillonella Erysipelothrix Listeria monocytogenes Chromobacterium Mycobacterium tuberculosis Polysaccharide Antigène capsulaire Extrait brut Polysaccharide Brut Polysaccharide Lipopolysac- charide Polysaccharide Polysaccharide Lipopolysac- charide Extrait salin de myco- bactéries extraites avec % phénol et fraction de polysaccharide des cellules et tuberculine Klebsiella aerogenees Polysaccharide Klebsiella cloacae Polysaccharide Salmonella typhosa Lipopolysac- charide, Polysaccharide Salmonella typhi-murium; Polysaccharide Salmonella derby Salmonella pullorum Shigella dysenteriae Polysaccharide Shigella flexneri Shigella sonnei Brut, Polysaccharide Rickettsiae Extrait brut Candida albicans Polysaccharide Entamoeba histolytica Extrait brut Les microorganismes qui sont dosés peuvent être in- tacts, lysés, broyés ou fragmentés d'une autre façon, et la composition ou la partie résultante, par exemple par extrac- tion, est alors dosée. Les microorganismes intéressants sont les suivants: Corynebacteries Corynebacterium diphtheriae Pneumocoques Diplococcus pneumoniae Streptocoques Streptococcus pyrogenes Streptococcus salivarus Staphylocoques Staphylococcus aureus Staphylococcus albus Neisseries Neisseria meningitidis Neisseria gonorrheae Entérobactériacées Escherichia coli Aerobacter aerogenes Klebsiella pneumoniae Salmonella typhosa 1 Salmonella choleraesuis Salmonella typhimurium j Shigella Shigella Shigella Shigella Shigella Shigella dysenteriae schmitzii arabinotarda flexneri boydii Sonnei Autres bacilles ent6ricqe Proteus vulgaris Proteus mirabilis Proteus morgani Pseudomonas aeruginosa Alcaligenes faecalis Vibrio cholerae Groupe Rmophilus-Bordetella Hemiophilus influenzae, } Bacterie coliforme Salmonelles Shigelles Espèces Proteus H. ducreyi H. hemophilus H. aegypticus H. parainúfluenzae Bordetella pertussis Pasteurelles Pasteurella pestis Pasteurella tulareusis Brucelles Brucella melitensis Brucella abortus Brucella suis Bacilles aerobies formant des spores Bacillus anthracis Bacillus subtilis Bacillus megaterium Bacillus cereus - Bacilles ana6robies formant des spores Clostridium Clostridium Clostridium Clostridium Clostridium Clostridium Clostridium Clostridium Clostridium Mycobactéries botulinum tetani perfringens novyi septicum histolyticum tertium bifermentans sporogenes Mycobacterium tuberculosis hominis Mycobacterium bovis Mycobacterium avium Mycobacterium leprae ycobacterium paratuberculosis Actinomycètes (bactéries analogues à des Mycètes) Actinomyces israelli Actinomyces bovis Actinomyces naeslundii Nocardia asteroides Nocardia brasiliensis Spirochètes Treponema pallidum Treponema pertenue Spirillumni minus Streptobacillus moniliformis Treponema carateumn Borrelia recurrentis Leptospira icterohemorrhagiae Leptospira canicola Mycoplasmas Mycoplasma pneumoniae Autres pathogènes Listeria monocytogenes Erysipelothrix rhusiopathiae Streptobacillus moniliformis Donvania granulomatis Bartonella bacilliformis Rickettsies (bactéries analogues à des parasites) Rickettsia prowazekii Rickettsia mooseri Rickettsia rickettsii Rickettsia conori Rickettsia australis Rickettsia sibiricus Rickettsia akari Rickettsia tsutsugamushi Rickettsia burnetii Richettsia quintana Chlamydies (parasites bactériens/viraux inclassables) Agents de chlamydies ( appellation incertaine) Champignons Cryptococcus neoformans Blastomyces dermatidis Histoplasma capsulatum Coccidioides immitis Paracoccidioides brasiliensis Candida albicans Aspergillus fumigatus Mucor corymbifer (Absidia corymbifera) Rhizopus oryzae Rhizopus arrhizus Phycomycètes Rhizopus nigricans -246f709 Virus Adénoviru Virus du Virus Pox Sporotrichum schenkii Fonsecaea pedrosoi Fonsecaea compacta Fonsecaea dermatidis Cladosporium carrionii Phialophora verrucosa Aspergillus nidulans Madurella mycetomi Madurella grisea Allescheria boydii Phialosphora jeanselmei Microsporum gypseum Trichophyton mentagrophytes Keratinomyces ajelloi Microsporum canis Trichophyton rubrum Microsporum andouini Ls groupe Herpes Herpes simplex Varicelle Herpes zoster (Shingles) Virus B Cytomegalovirus (Virus de la vérole, syphilis) Variole Vaccine Poxvirus bovis Paravaccinia Molluscum contagiosum Picornavirus Poliovirus Coxsackievirus Echovirus Rhinovirus Myxovirus Influenza (A, B, et C) Parainfluenza (1-4) Virus des oreillons Virus de la maladie de Newcastle Virus de la rougeole Virus de la peste bovine Virus de la maladie des chiens Virus Syncytiel respiratoire Virus de la rubéole Arbovirus Virus de l'encéphalite équine orientale Virus de l'encéphalite équine occidentale Sindbis Virus Chikugunya Virus Semliki Forest Virus Mayora Virus Virus de l'encéphalite de Saint-Louis Virus de l'encéphalite de Californie Virus de la fièvre des tiques du Colorado Virus de la fièvre jaune Virus de la dengue Réovirus Réovirus Types 1-3 Hatites Virus de l'hépatite A Virus de l'hépatite B Virus tumoraux Virus de la leucémie Rauscher Virus Gross Virus de la leucémie Maloney Les substances de ligands monoépitopes à analyser ont généralement des poids moléculaires compris entre 100 et 2 000 environ, plus usuellement entre 125 et 1 000o Les subs- tances à analyser, conformément à l'invention, sont des médi- caments, des métabolites, des pesticides, des polluants et similaires. Parmi les médicaments, les plus intéressants sont les alcaloïdes. Et parmi les alcaloides, on peut citer les alcaloïdes de la classe de la morphine, tels que la morphine, la codéine, l'héroïne, le dextrométhorpan, leurs dérivés et métabolites; les alcaloïdes de la classe de la cocaine tels que la cocaïne, et la benzoyl ecgonine, leurs dérivés et mé- tabolites; les alcaloïdes de la classe de l'ergot de seigle tels que le diéthylamide de l'acide lysergique; les alca- loides de la classe des stéroldes, les alcaloïdes d'imina- zoyle; les alcaloïdes de quinazoline; les alcaloides d'iso- quinoléine; les alcaloïdes de quinoléine tels que la quini- ne et la quinidine; les alcaloïdes de diterpène; leurs dé- rivés et métabolites. Un autre groupe de médicaments comprend les sté- roades tels que les oestrogènes, les gestogènes, les andro- gènes, les stéroides adréno corticaux, les acides biliaires, les glycosides cardiotoniques et les aglycones telles que la digoxine et la digoxigénine, les saponines et les sapogéni- nes, leurs dérivés et métabolites. Ils comprennent également des substances ressemblant aux stéroides, telle que le dié- thylstilbestrol. Un autre groupe de médicaments comprend des lacta- mes ayant de 5 à 6 chaînons qui comprennent les barbiturates tels que par exemple le phénobarbital, et la sécobarbital, la diphènylhydantoïne, la primidone, l'éthosuximide et leurs métabolites. Un autre groupe de médicaments comprend des amino- alkylbenzènes, avec des alkyles avant de 2 à 3 atomes de carbone, tels que les amphétamines, les catécholamines, par exemple l'éphédrine, la L- dopa, l'épinéphrine, la narcéine, la papavérine, leurs métabolites et dérivés. Un autre groupe de médicaments comprend des benzo- h6térocycliques tels que l'oxazépam, la chlorpromazine, le tégrétol, l'imipramine, leurs dérivés et métabolites, les noyaux hétérocycliques étant des azépines, diazêpines et phé- nothiazines. Un autre groupe de médicament est constitué par les purines qui comprennent la théophylline, la caféine, leurs métabolites et dérivés. Un autre groupe de médicaments est constitué par les médicaments dérivés de la marijuana et comprend le canna- binol et le tétrahydrocannabinol. Un autre groupe de médicaments comprend les vita- mines telles que les vitamines A, B, par exemple R12, C, D, E et K, l'acide folique, la thiamine. Un autre groupe de médicaments est constitué par les prostaglandines qui diffèrent entre elles par le degré et les sites d'hydroxylation et d'insaturation. Un autre groupe de médicaments est représenté par les antibiotiques qui comprennent la pénicilline, la chloro- mycétine, l'actinomycétine, la tétracycline, la terramycine, leurs métabolites et dérivés. Un autre groupe de médicaments est constitué par les nucléosides et les nucléotides qui comprennent l'ATP, le NAD, le FMN, l'adénosine, la guanosine, la thymidine, et la cytidine avec leurs substituants sucre et phosphate appro- priés. Un autre groupe de médicaments comprend divers mé- dicaments individuels qui sont par exemple la méthadone, le méprobamate, la sérotonine, la mépéridine, l'amitriptyline, la nortriptyline, la lidocaine, la procarneamide, l'acétyl- procaine-amide, le propanolol, la griséofulvine, l'acide val- proique-amide, le propranolol, la griséofulvine, l'acide valproique, les butyrophénones, les antihistamiques, les mé- dicaments anticholinergiques tels que l'atropine, leurs mé- tabolites et dérivés. Un autre groupe de composés est représenté par les acides aminés et de petits peptides qui comprennent les po- lyiodothyronines, par exemple la thyroxine, et la triiodothy- ronine, l'oxytocine, l'ACTH, l'angiotensine, les met- et leu-encéphalines, leurs métabolites et dérivés. Les métabolites relatifs à des états morbides com- prennent la spermine, la galactose, l'acide phénylpyruvique et la porphyrine de type 1. Un autre groupe de médicaments comprend les amino- glycosides telles que la gentamycine, la kanamycine, la to- bramysine et l'amicacine. Parmi les pesticides concernés, on peut citer les biphényles polyhalogénés, les phosphates, les thiophosphates, les carbamates, les sulfènamides polyhalogénés, leurs méta- bolites et dérivés. En ce qui concerne les substances de récepteur à analyser, les poids moléculaires varient généralement entre 6 6 10 000 et 2 x 10, plus usuellement entre 10 000 et 10. Pour les immunoglobulines IgA, IgG, IgE et IgM, les poids molécu- laires varient généralement entre 160 000 et 10 environ. Les enzymes ont normalement des poids moléculaires compris entre 0o00 et 6 000 000 environ. Les récepteurs naturels ont des poids moléculaires très variables, d'au moins 25 000 en géné- ral et qui peuvent atteindre 10 ou plus; ils comprennent des matériaux tels que l'avidine, la globuline fixant la thyroxi- ne, la préalbumine fixant la thyroxine, la transcortine, etc. Analoaue de ligand L'analogue de ligand diffère du ligand par remplace- ment d'un hydrogène ou d'un groupe fonctionnel par une liai- son ou un groupe de liaison possédant une fonctionnalité pour former-une liaison covalente avec une autre molécule ayant une fonctionnalité active, telle qu'un groupe hydroxyle, amino, aryle, thio, oléfine, etc., o le composé résultant diffère du ligand par plus qu'une substitution d'un hydrogène par la molécule à laquelle il est conjugué. Le groupe de liaison a normalement de 1 à 20 atomes autres que l'hydrogène, qui peu- vent être le carbone, l'oxygène, le soufre, l'azote et un ha- logène ayant un nombre atomique de 17 à 35. Les fonctionnali- tés qui sont impliquées comprennent les fonctions carbonyle, oxo et nonoxo, halogène actif, diazo, mercapto, éthylène, en particulier éthylène activé, amino, et similaires. Le nom- bre d'hétéro-atomes est généralement compris entre 0 et 6, plus usuellement entre 1 et 6, et de préférence entre 1 et 4 environ. Des groupes de liaison utilisables sont décrits dans le brevet US 3 817 837. Pour la plupart, les groupes de liaison sont alipha- tiques, bien qu'on puisse utiliser des groupes diazo, des groupes aromatiques. De façon générale, le groupe de liaison est une chaêne divalente ayant de 1 à 10, plus usuellement en- viron de 1 à 6 atomes dans la chaXne. L'oxygène est normale- ment présent sous forme oxo ou oxy, lié à un carbone et à un hydrogènes de préférence uniquement lié à un carbone, alors que l'azote est normalement sousú forme amino, lié seulement à un carbone, ou amido, et que le sulfure est analogue à l'o- xygene. Des fonctionnalités usuelles formant la liaison co- valente entre le groupe de liaison et la molécule à conjuguer sont des fonctionnaliés alkylamine, amide, amidine, thioamide, urée, thiourée, guanidine, et diazo. Des groupes de liaison qui trouvent des applica- tions particulières pour une conjugaison aux polypeptides sont ceux impliquant des acides-carboxyliques qui peuvent être utilisés avec des diimides, ou sous forme d'anhydrides mixtes avec des monoesters de carbonate, ou sous forme d'esters car- boxyliques actifs, par exemple N-hydroxy succinimide ou p-ni- trophényle. Des analogues de l'azote peuvent être utilisés sous forme d'imido-esters. Des aldéhydes peuvent être utili- sées pour former des imines dans des conditions d'amination réductrice, par exemple en présence de borohydrures, afin de produire des alkylamines. Comme autres groupes carbonyle non- oxo qui sont utilisables, on peut citer les isocyanates et les isothiocyanates. De plus, on peut utiliser un halogénure actif tel que des groupes bromoacétyle en particulier. 2 46270.9 Dans la plupart des cas, le ligand a un ou plusieurs groupes fonctionnels qui peuvent être utilisés comme site de liaison pour le groupe de liaison. En particulier, les groupes hydroxy, amino et aryle, spécialement les groupes aryle acti- vés, sont utilisables. Des oximes peuvent également être pré- parées à partir de fonctionnalités oxo et l'hydroxyle utilisé comme site pour la réunion avec un groupe de liaison, tel que carboxyméthyle. Le choix. du groupe de liaison dépend en grande par- tie des fonctionnalités présentes dans le ligand, et dans le composé auquel le ligand doit être conjugué, de la nature et de la longueur du groupe de liaison désiré, et similaires. Système produisant un signal Le système produisant un signal est constitué d'au moins un élément et fournit un signal détectable dans le mi- lieu de dosage, lequel signal est influencé par la proximité de la molécule très chargée vis-à-vis de l'élément marqué. En plus de la sensibilité à la présence de la molécule fortement chargée, il est souhaitable que le système produisant un si- gnal fournisse plusieurs phénomènes mesurables en réponse a la fixation entre les éléments d'ule paire de fixation spé- cifique (amplification). Les systèmes produisant un signal, les plus intéres- sants, sont ceux qui impliquent un catalyseur, en particulier un catalyseur enzymatique, ou un chromophore qui absorbe ou émet de la lumière, en particulier des agents fluorescents ou des agents chimiluminescents, ainsi que des combinaisons des deux systèmes. Le premier type de système à considérer est celui comprenant des enzymes. Enzymes La première considération dans le choix d'une en- zyme selon l'invention est qu'elle peut être influencée par la proximité de la molécule fortement chargée. La molécule fortement chargée peut influencer l'enzyme en au moins une de trois façons possibles. La première façon consiste en une in- fluence de la concentration localisée en protons. La concen- tration localisée en protons (inversement la concentration en hydroxyde) affecte l'activité de l'enzyme en modifiant la conformation de l'enzyme ou le degré d'ionisation des fonction- nalités spécifiques de l'enzyme ou du substrat essentiel à la réaction, c'est-à-dire avec ou sans fixation de protons. En conséquence, on peut obtenir une augmenta-tion du taux ou une diminution du taux selon le pH de la solution, la nature de l'espèce chargée et la réponse de l'enzyme à la concentration locale en protons. Un second mode d'influence par lequel le taux d'en- zyme peut être affecté est l'attraction ou la répulsion d'un substrat chargé, en particulier d'un substrat qui comprend plusieurs molécules de substrat reliées à un centre. L'élé- ment chargé lorsqu'il est à proximité du marqueur dans le système produisant un signal, c'est-à-dire l'enzyme, peut at- tirer ou repousser le substrat, de façon à augmenter ou rédui- re le taux de "déplacement" (turnover). Une troisième technique consiste à disposer d'une substance chargée qui soit capable d'affecter la concentra- tion localisée d'un composé qui réagit avec un produit d'en- zyme. Par exemple, lorsqu'une enzyme produit une réaction chi- miluminescente, on peut fournir un accepteur d'énergie char- gé qui est attiré par l'élément chargé, et l'énergie provenant de l'agent chimiluminescent sera transférée à l'accepteur d'énergie très proche de l'agent chimiluminescent, ce qui se traduit par une émission sensibilisée de l'accepteur. Lors du choix d'une enzyme, en plus de l'effet de la particule chargée sur le taux de déplacement de l'enzyme, il faut tenir compte d'autres considérations. Ces considéra- tions sont par exemple la stabilité de l'enzyme, le désir d'avoir un taux de déplacement élevé, la sensibilité du taux aux variations dans l'environnement physique, la nature du (ou des) substrats) et du (ou des) produit(s), de préférence xna4daoo amurmoo amoxqooxq ov un a o9e gy1 :na; daooe aemoo dVfM no orM oaAe 1'9-1 fnauuop ammoo XTçnpqa doVM no aN;ns uess TfV 9 7 ana.da'ole ammoo Zô ZaAe ú*'-1 imadaooe ammxoo IOVM no VM zame 1'S*I szneuuop sap HN- adnoz6 al mns 4uessT.V S*1 mnadaome amwoo 0 oaAZ '* xna:dcaooe aumoo dIVM no (VN oaAe *t'*I sxnauuo sp sap R-HD adnoz6 al ans IuessT6V v'1 smna.daooe samxnp aaAe 66'E'1 znaedaoou amuoo ZO Aae S'S1I xnadaooe ammoo amomqoo:Xz un aaAe Z'ú'I mna4daooe ammoo daVM no oio no ap.qply adnom6 al ans.tuessT6v Z'- sana4daooe saxmline1p oaie 66'1'1 :n;:daooe ammouo Zo aAe ú'i*' mna.daooe ammoo amoxqwoo4&o un oaAe Z*g'T xna:l.daDoe ammuuoo dUVM no 1 N aAe 1 '1' sxneuuop sap HO-HD aduoz6 al mns iuessT6V 1I1 saseonpmopúxo *1 I flv'Ifv. 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Transférases 2.1 Transférant des groupes à un carbone 2.1.1 Méthyltransférases 2o1.2 Hydroxyméthyl-, formyl - transférases et apparentées, 2.1.3 Carboxyl- et carbamoyltransfúérases 2. 1.4 Amidinotransférases 2.2 Transférant des résidus aldéhydiques ou cétoniques 2.3 Acyltransférases 2.3.1 Acyltransférases 2.3.2 Aminoacyltransférases 2.4 Glycosyltransférases 2.4.1 Hexosyltransférases 2.4.-2 Pentosyltransférases 2.5 Transférant des groupes alkyle ou apparentés 2.6 Transférant des groupes azotés 2.6.1 Aminotransférases 2.6. 2 Oximinotransférases 2.7 Transférant des groupes contenant du phosphore 2.7.1 Phosphotransférases avec un groupe alcool comme accepteur 2.7.2 Phosphotransférases avec un groupe carboxyl comme accepteur - 2.7.4 Phosphotransférases avec un groupe phospho comme accepteur * 2.7.5 Phosphotransférases, apparemment intramolé- culaires 2.7.6 Pyrophosphotransférases 2.7.7 Nucléotidyltransférases 33 2. 7 8 Transférases pour d'autres groupes phospho 3O, substitués 2.8 Transférant des groupes contenant du soufre 2.8.1 Sulfurtransférases 2.8. 2 Sulfotransférases 2.8.3 CoA-t-ansférases e 3. Hydrolases 3.1 Agissant 3. 1.1 3.1o2 3.1.3 3.1.4 3.1.5 3.1.6 3.2 Agissant 3.2.1 3.2.2 3.2.3 3.3 Agissant 3.3.1 3.4 Agissant 3.4.1 3.4.2 3.4.3 3.4.4 3.5 Agissant peptide 3.5.1 3.5.2 3.5.3 3.5.4 3.5,5 3.5.99 3.6 Agissant 3.6.1 3.7 Agissant 3.7.1 3.8 Agissant 3.8.1 3.8.2 sur les liaisons esters Carboxylique ester hydrolases Thiolester hydrolases Phosphorique monoester hydrolases Phosphorique diester hydrolases Triphosphorique monoester hydrolases Sulfurique ester hydrolases sur les composés glycosyle Gycoside hydrolases Hydrolysant les composés Nglycosyle Hydrolysant les composés S-glycosyle sur les liaisons éther Thioéther hydrolases sur les liaisons peptide (peptide hydrolases) t Aminoacyl-peptide hydrolases Peptidyl-aminoacid hydrolases Dipeptide hydrolases Peptidyl-peptide hydrolases sur des liaisons C-N autres que des liaisons Dans les amides linéaires Dans les amides cycliques Dans les amidines linéaires Dans les amidines cycliques Dans les cyanures 9 Dans d'autres composés sur les liaisons acide-anhydride Dans les anhydrides contenant un groupe phosphoryle sur les liaisons C-C Dans les substances cétoniques sur les liaisons halogénures Dans les composés C-halogénure Dans les composés P-halogénure 3.9 Agissant sur les liaisons P-N 4. Lyases 4.1 Lyases carbone-carbone 4.1o1 Carboxy-lyases 4.1.2 Aldéhydelyases 4.1.3 Cétoacide-lyases 4.2 Lyases carbone-oxygène 4.2.1 Hydrolyases 4.2.99 Autres lyases carbone-oxygène 4.3 Lyases carbone-azote 4.3. 1 Ammoniac-lyases 4.3.2 Amidine-lyases 4.4 Lyases carbone-soufre 4.5 Lyases carbone-halogénure 4.99 Autres lyases 5. Isomérases 5.1 Racémases et épimérases 5.1.1 Agissant sur les acides aminés et leurs dérivés 5.1.2 Agissant sur les hydroxy-acides et leurs dérivés 5.1.3 Agissant sur les hydrates de carbone et leurs dérivés 5.1.99 Agissant sur dtautres composés 5.2 Isomérases cis-trans 5.3 Oxydoréductases intramoléculaires 5. 3.1 interconvertissant les aldoses et cétoses 5.3.2 inconvertissant les groupes céto et énol 5.3.3 transposant les liaisons C=C 5.4 Transférases intramoléculaires 5.4.1 transférant les groupes acyle 5.4.2 transférant les groupes phosphoryle 5.4.99 transférant d'autres groupes 5.5 Lyases intramoléculaires 5.99 Autres isomérases 6. Ligases ou synthétases 6.1 Formant des liaisons C-O 6.1.1 aminoacide-ARN ligases 6.2 Formant des liaisons C-S 6.2.1 Acide-thiol ligases 6.3 Formaht des liaisons C-N 6.3.1 acide-ammoniac ligases (amide synthétases) 6.3.2 acide-ammoniac ligases (peptide synthétases) 6.3.3 cyclo-ligases 6.3.4 autres C-N ligases 6.3.5 ligases C-N avec la glutamine comme N-donneur 6.4 Formant des liaisons CC Les enzymes de la Classe 1, les oxydoréductases, et les Hydrolases de la Classe 3 sont particulièrement intéres- santes, bien que les enzymes de la Classe 2, les Transférases, les Lyases de la Classe 4 et les Isomérases de la Classe 5 puissent également présenter un intérêt dans des situations particulières. Le tableau suivant comporte des sous-classes d'en- zymes et des enzymes spécifiques dans la sous-classe qui sont particulièrement intéressantes. Parmi les Ocydoréductases, celles impliquant NAD ou NADP, l'oxygène ou le peroxyde d'hy- drogène sont particulièrement intéressantes. Parmi les Hydro- lasescelles impliquant un phosphate et des glycosides sont particulièrement intéressantes. TABLEAU 2 1. Oxydoréductase 1.1 Agissant sur le groupe CH-OH des donneurs 1.1.1ool Avec NAD ou NADP comme accepteur 1. alcohol déshydrogénase 6. glycérol déshydrogénase 27. lactate déshydrogénase 37. malate déshydrogénase 49. glucose-6-phosphate déshydrogénase 1.1.3 Avec 02 comme accepteur 4. glucose oxydase galactose oxydase 1.2 Agissant sur le groupe aldéhyde ouc6to des donneurs 1.2.1 Avec NAD ou NADP comme accepteur 12. glycéraldéhyde-3-phosphate déshydrog6nase 1.2.3 Avec 02 comme accepteur 2. xanthine oxydase luciférase 1.4 Agissant sur le groupe CH-NH2 des donneurs 1.4.3 Avec 0 conmme accepteur 2. L-amino acide oxydase 3. D- amino acide oxydase 1.6 Agissant sur NAD ou NADP réduit conmme donneur 1. 6.99 Avec d'autres accepteurs diaphorase 1.7 Agissant sur d'autres composés azot6s comme donneurs 1.7.3 AvcOcue 1.7.3 Avec 02 comme accepteur 3. uricase 1.11 Agissant sur H202 comne accepteur 1.11.1 6. catalase 7. peroxydase 2. Transférases 2.7 Transférant les groupes contenant du phosphore 2.7.1 Phosphotransférases avec CH-OH comme accepteur 1. hexokinase 2. glucokinase 15. ribokinase 28. triokinase 40. pyruvate kinase 2.7.5 1. phosphoglucomutase 3. Hydrols 3.1 Agi 3.2 Agi ases issant sur les liaisons ester 3.1.1 Carboxylique ester hydrolases 7. cholinestérase 8. pseudo cholinestérase 3.1.3 Phosphorique monoester hydrolases 1. phosphatase alcaline 2. phosphatase acide 9. glucose-6phosphatase 11. fructose diphosphatase 3.1.4 Phosphorique diester hydrolases 1. phosphodiestérase 3. phospholipase C ssant sur les composés glycosyle 3.2.1 Glycoside hydrolases 1. alpha amylase 2. béta amylase 4o cellulase muramidase 18. neuraminidase 21. béta glucosidase 23. béta galactosidase 31. béta glucuronidase 35. hyaluronidase 3.2.2 Hydrolysant les composés N-glycosyle 5. DPNase 4. Lyases 4.1 Lyases carbone-carbone 4. 1.2 Aldéhyde lyases 13. aldolyase 4.2.1 Hydro-lyases 1. carbonique anhydrase 5. Isomérases 5.4 Transférases intramoléculaires 5.4.2 transférant le groupe phosphoryle triose phosphate isomérase En dehors des enzymes comme marqueurs, on peut éga- lement utiliser des matériaux chromogènes comme marqueurs, en particulier des composés qui absorbent la lumière dans la ré- gion ultraviolette ou visible, produisent des phénomènes fluo- rescents ou chimioluminescents particulièrement fluorescents. L'élément chromogène doit fournir un signal qui peut être af- fecté par la présence de l'élément chargé. Ceci implique nor- malement l'augmentation ou la diminution d'une espèce chargée, o l'espèce chargée à l'aptitude de donner un signal renforcé ou diminué. Par exemple, si la forme ionique négative d'un a- gent fluorescent est nécessaire pour la fluorescence,: est désirable d'avoir un élément positivement chargé, adjacent à l'agent fluorescent pour stabiliser la forme négativement chargée. En tamponnant le système de façon à favoriser la for- me non-ionisée de l'agent fluorescent, la concentration de la forme ionisée de l'agent fluorescent serait renforcée par la proximité augmentée de l'agent fluorescent par rapport à l'é- lément chargé positivement. En utilisant des substances chro- mogènes qui peuvent donner ou recevoir un proton dans des mi- lieux aqueux à un pH compris entre environ 4 et 11, o les propriétés chromophoriques de la forme fixant les protons sont substantiellement différentes de celles de la forme ne fixant pas les protons, la présence de l'élément chargé peut être utilisée pour influencer le signal observé. Les agents fluorescents intéressants entrent dans diverses catégories ayant certaines fonctionnalités primordia- les. Comme exemple d'agents fluorescents avec un substituant amino, on peut citer les 1- et 2-aminonaphtalènes, les p,p'- diaminostilbènes, les 9-aminoacridines, les p,p'-diaminoben- zophénone amines, les sels de bis-3-aminopyridinium et les indoles. Comme agents fluorescents acides, normalement phéno- liques, on peut citer la 7-hydroxycoumarine, les 2,7-dihydro- xyxanthènes, le stérophénol, la tétracycline et les salicy- lates. Une autre source de lumière comme signal détectable est une source chimiluminescente. La source chimiluminescente implique un composé qui revient électroniquement excité par une réaction chimique et peuvent émettre de la lumière qui sert de signal détectable ou donne de l'énergie à un accep- teur d'énergie qui a son tour produit une fluorescence. Plusieurs familles de composés se sont avéréespro- duire une chimiluminescence dans des conditions variables. Une famille de composés est représentée par la 2,3-dihydro- 1,4-phtalazine dione dans le luminol est l'élément le plus connu. Un autre groupe de composés comprend les 2,4,5-tri- phénylimidazoles. Ces composés peuvent être utilisés individuellement, en étant affectés par l'élément chargé ou peuvent être modi- fiés pour être utilisés comme substrats d'enzyme, o l'enzy- me est affectée par l'élément chargé, de sorte que le taux de déplacement pour la transformation du substrat chromophorique est affecté à son tour. Un plus large spectre de chromophores peut alors être employé, selon la nature de l'enzyme et le groupe de liaison particulier requis pour la modification par l'enzyme. Par exemple, des hydrolysats d'enzymes peuvent être utilisés avec des esters de phénol contenant des chromogènes, o les propriétés chromogéniques de l'ester sont substantiel- lement différentes des propriétés chromogéniques du phénol. Le taux de production du chromogène hydrolysé peut être in- fluencé par la proximité de l'élément chargé. Conmme exemples de ces composés, on peut citer le diphosphate de úfluroescéine, le phosphate d'ombelliréfyle, ou similaires. Elément marqueur du signal Le marqueur du signal peut être conjugué au ligand ou au récepteur. Lorsque le ligand est un haptène ou une pe- tite molécule, normalement l'haptène est conjugué à un mar- queur d'enzyme, de sorte que l'élément chargé peut augmenter ou diminuer l'activité de l'enzyme lorsqu'elle est liée à l'haptène. Lorsque le ligand est un haptène et le marqueur du -40 signal est autre qu'une enzyme, bien qu'un simple ligand hap- ténique puisse être lié à un agent fluorescent ou chimiolumi- nescent, normalement on prépare un poly-(analogue de ligand)- marqueur de façon à avoir plusieurs sites de fixation qui peuvent alors apporter au moins un élément chargé à proximité des marqueurs. Pour les molécules antigéniques qui sont normalement polyépitopes, la situation dans laquelle le marqueur du signal est une grande molécule telle qu'une enzyme, est différente de celle o le marqueur du signal est une petite molécule telle qu'un agent fluorescent. Lorsque le marqueur du signal est une grande molécule telle qu'une enzyme, et si on dispose d'un mélange relativement impur contenant le ligand ou le récepteur, on prévoit normalement plusieurs substituants sur le marqueur du signal pour garantir que la majeure partie du marqueur du signal est fixée au ligand ou au récepteur en question. Il est souhaitable qu'au moins la moitié, plus usuellement au moins les trois quarts, et de préférence au moins environ un élé- ment de la paire de fixation spécifique soit fixé en moyenne sur le marqueur du signal. C'est ainsi qu'alors que le mar- queur du signal peut être polysubstitué, dans la plupart des cas, il est généralement monosubstitué avec un élément de la paire de fixation spécifique. Cette polysubstitution avec des mélanges impurs d'un élément de la paire de fixation spécifique a pour rôle de mi- nimiser les effets de fond. C'est-à-dire que si on utilise un mélange impur de récepteur et, par exemple si on le conjugue à une enzyme, dans le cas o on a un rapport molaire 1/1 des molécules dans le mélange impur molécules d'enzyme, une par- tie substantielle de l'enzyme sera seulement liée aux impure- tés et, si elle est active, sera capable de créer un fond substantiel. Pour s'assurer que pratiquement la totalité du marqueur du signal est capable de se fixer à l'élément homolo- gue de la paire, des mélanges impurs diun élément de la paire de fixation spécifique seront substitués de façon à assurer substantiellement qu'au moins un élément de la paire de fi- xation spécifique soit lié à l'enzyme. Lorsque le marqueur du signal est petit, la situa- tion est différente. Dans ce cas, plusieurs éléments de la paire de fixation spécifique ne peuvent pas être liés à un marqueur de signal, de sorte que lorsque le ligand ou le ré- cepteur est impur, une quantité substantielle du marqueur est fixée uniquement sur les impuretés. Dans ce cas, il est nor- malement souhaitable que, dans les conditions du dosage, le marqueur du signal fixé aux contaminants fournisse un signal minimal ou ne fournisse aucun signal, ou qu'une technique soit prévue pour que le marqueur du signal lié aux contaminants ne puisse pas fournir de signal. Le rapport du.marqueur du signal à un élément de la paire de fixation spécifique varie beaucoup en fonction du marqueur du signal, de l'élément de la paire de fixation spé- cifique, de la sensibilité désirée pour le dosage, de l'apti- tude à supprimer le fond, de l'effet du marqueur du signal sur les caractéristiques de l'élément de la paire de fixation spécifique, et similaires. Pour augmenter encore la différence de niveau du signal entre le niveau du signal lorsque le marqueur du signal est très proche de l'élément chargé et le niveau du signal lorsque ces deux substances sont éloignées l'une de l'autre, l'élément marqué du signal peut être modifié pour introduire des charges opposées à l'élément chargé. En moyenne, il y a au moins environ 0,5 charge par marqueur du signal, de préfé- rence au moins environ 1 charge et usuellement pas plus de charges environ, plus normalement pas plus de 10 charges par marqueur du signal. L'élément marqué du signal peut être modifié de la même façon et avec le même type de substituants ionisables comme élément chargé. Bien qu'une certaine réduc- tion du signal maximal puisse résulter de la présence de char- ges sur l'élément marqueur du signal, on a trouvé qu'il exis- te une séparation plus grande entre les signaux observés à partir du marqueur du signal en présence et en l'absence de l'élément chargé. Elément chargé L'élément chargé est un ligand ou un récepteur, plus usuellement un récepteur, et généralement de nature protéique. Dans le cas d'un récepteur, le poids moléculaire varie d'en- viron 5 000 à 2 000 000 ou plus, mais c'est ordinairement un anticorps ayant un poids moléculaire compris entre 160 000 et 800 000 environ. Le nombre de fonctions qui sont introduites pour fournir une charge, soit du fait d'une charge permanente ou d'une aptitude à recevoir ou à donner un proton au milieu de solvant, est généralement au moins d'une par poids moléculaire de 20 000 et pas plus d'une par poids moléculaire de 500, plus usuellement d'environ 1 pour un poids moléculaire de 1 000 à 000 environ. C'est-à-dire, que le poids équivalent par charge est d'au moins environ 500, normalement de 1 000 a 000 et jamais supérieur à 20 000 environ. Diverses fonctions peuvent être utilisées pour four- nir une charge stable dans le milieu de dosage. On peut citer à cet effet des groupes azotés basiques tels que des amines, des sels d'ammonium quaternaires, des sels de phosphonium, des sels de tétrazolium, des sels d'inium, des sels d'hydra- zine, des chélates métalliques, etc. Comme fonctions négati- ves, on citera des carboxylates, des acides de soufre, tels que des sulfonates et des sulfates, des acides de phosphore, tels que des phosphonates et des phosphates, des oxydes,tels que des groupes phénoliques, des mercaptides, ou similaires. Des groupes oxy ionisables sont particulièrement intéressants, c'est-à-dire des fonctionnalités ayant un grou- pe hydroxylique ionisable comme dans les oxy acides cités ci- dessus. Les fonctionnalités sont fixées par un groupe de liaison approprié, ayant généralement de un à dix atomes de carbone, qui possède une fonctionnalité appropriée pour former une liaison covalente avec l'élément de la paire de fixation spécifique. Naturellement, on ne doit pas détruire un groupe fournissant une charge pour introduire un autre groupe four- nissant la même charge, tel que par exemple la substitution d'un groupe amino par un acide aminé pour former l'amino amide. Cependant, on pourrait utiliser une polyamine pour remplacer un simple groupe amino, comme dans le cas-ou on prépare la maléimide-d'un groupe amino et on conjugue un polyamino-mer- captan o un simple groupe amino est remplacé par plusieurs groupes amino. Le mode particulier de liaison, le choix des groupes de liaison et des fonctionnalités, et la fonctionna- lité particulière utilisée pour fournir la charge ne sont pas critiques vis-à-vis de l'invention, et une grande variété dté- léments chargés peut être utilisée. Des compositions anioniques particulièrement utili- sables sont des anticorps substitués par des di-acides ou des polyacides, en particulier des diacides ayant de 4 à 10 ato- mes de carbone, lesquels diacides peuvent être aliphatiques, alicycliques ou aromatiques. Comme diacides dibasiques utili- sables, on peut citer par exemple les acides succinique, glu- tarique, maléique, phtalique, hexahydrophtalique, etc. qui forment les acides amiques respectifs par réaction avec un anticorps. Inhibiteurs de signal Afin de minimiser le "fond", il peut être souhaita- ble d'ajouter un inhibiteur de signal au système, ou l'inhi- biteur ne peut pas réagir avec le marqueur du signal lors- qu'il est impliqué dans un immunocomplexe résultant de la fi- xation des éléments de la paire de fixation spécifique, mais réagit avec le marqueur du signal lorsque ce dernier n'est pas impliqué dans l'immuno-complexe. Normalement, ces inhibi- teurs sont des macromolécules qui sont stériquement empêchées de s'approcher du marqueur du signal lorsque le marqueur est impliqué dans la fixation d'au moins deux éléments de la pai- re de fixation spécifique. Les macromolécules significatives comprennent un anti-marqueur tel qu'une anti-enzyme et un agent anti-fluorescent, o le taux de déplacement de l'enzyme et l'efficacité de fluorescence sont respectivement substan- tiellement réduits. De plus, les inhibiteurs chimiques d'en- zymes peuvent être liés à des macromolécules pour inhiber l'enzyme, ou des agents anti-fluorescents peuvent être modi- fiés par liaison avec des agents d'extinction tels que des accepteurs d'énergie ou des atomes lourds, ou similaires. La quantité d'inhibiteur à ajouter doit être suffisante pour ré- duire substantiellement le signal produit par le fond, de fa- çon à limiter le signal observé au marqueur du signal impliqué dans le complexe formé par la fixation des éléments homologues des paires de fixation spécifiques. Constituants auxiliaires En plus des réactifs décrits ci-dessus, selon la nature du marqueur du signal, on peut ajouter des constituants supplémentaires tels que des substrats d'enzymes, des co-fac- teurs, des sels, des détergents, des stabilisants, des tam- pons ou similaires. Fréquemment, afin de maximiser les inte- ractions entre les charges, le substrat est lié à une macro- molécule fournissant plusieurs charges, soit attirées, soit repoussées par les charges de l'élément chargé. En conséquence, on peut utiliser divers substrats o le noyau centre fournit plusieurs charges, le substrat étant lui-même chargé ou non- chargé. Grâce à un choix approprié du noyau centre le noyau central peut fournir la densité de charge désirée pour réagir avec l'élément chargé. Le poids équivalent ionique peut être seulement de 100 et est ordinairement inférieur à 20 000, usuellement au plus égal à 10 000. Comme exemples de monomères qui peuvent être utili- sés pour préparer des polymères et qui fournissent des ions dans le milieu de dosage, lesquels monomères peuvent être uti- lisés par eux-mêmes ou associés à des monomères neutres, on citera l'aziridine, le N-(2'-aminoéthyl)acrylamide, l'acide acrylique, l'acide méthacrylique, l'anhydride maléique, le vinyl sulfonate, le vinyl phosphonate, l'aminométhylstyrène, et similaires. Normalement, le monomère ionique représente de 1 à 50, de préférence de 1 à 25 moles % du copolymère. On peut également utiliser des polymères de conden- sation ionique tels que la carboxyméthyl cellulose, la poly- lysine, des polypeptides contenant plusieurs acides aminés basiques, par exemple la lysine, l'arginine, et l'histidine, ou des acides aminés acides, par exemple l'acide aspartique et l'acide glutamique. Lorsque le noyau centre est neutre, on peut fixer des groupes chargés ou on peut utiliser un élément d'espace- ment chargé, avec un substrat neutre. Comme éléments d'espa- cement fournissant une charge ionique, on peut utiliser des polyamines, en particulier celles contenant des amines tertiai- res dans la chaîne, par exemple la bis-2-aminoéthylméthylamine, et la bisN,N'-2-aminoéthylpipérazine, ou des polyacides tels que l'acide 1,3,5-pentane tricarboxylique ou l'acide 3,6-di- thia-l,2,7,8-octane-tétracarboxylique. Combinaisons pour les dosages Pour améliorer la versatilité du procédé selon l'in- vention, les réactifs peuvent être fournis sous la forme de combinaisons, dans une fiole unique ou dans des fioles sépa- rées, de sorte que le rapport des réactifs permette une opti- misation substantielle de la réponse du signal aux variations de concentratbn de la substance à analyser. Composés On propose de nouveaux composés qui sont des anti- corps sur lesquels sont fixées plusieurs fonctionnalités ca- pables de fournir des charges dans les conditions du dosage, c'est-à-dire à un pH compris entre environ 4 et 11, plus fré- quemment 5 et 10, et de préférence entre environ 6,5 et 9,5. Dans la plupart des cas, les compositions répondent à la for- mule suivante: 1o Récepteur--ERX)n dans laquelle "Récepteur" est un récepteur spécifique pour une autre molécule, de nature protéique, normalement un anticorps; R est une liaison ou un groupe de liaison, ayant normalement de 1 à 10, plus usuellement de 1 à 6 atomes de carbone et pouvant avoir de 0 à 6, plus usuellement de 0 à 4 hétéro-atomes qui sont l'oxygène, l'azote, ou le soufre, o l'oxygène est présent sous une forme oxy ou oxo, l'azote est présent sous une forme amino ou amido et le soufre est présent sous une forme thio ou thiono; X est un groupe fonctionnel capable de posséder une charge à un pH de l'ordre de 4 à 11, normalement de 5 à 10 environ et de préférence de 6,5 à 9,5, et peut être un groupe amino ou un oxy acide, tel qu'une carboxy, sulfonate, sulfate, phosphonate, phosphate et phénoxy; et n est au moins 1-et est normalement dans la gamme du poids moléculaire du Récepteur divisé par 20 000 au poids moléculaire du Récepteur divisé par 500, plus usuellement dans la gamme du poids moléculaire du Récepteur divisé par 10 000 au poids moléculaire du Récepteur divisé par 1 000. Plus précisément, "Récepteur" est un anticorps, IgG, R est un loxoalkylène, le groupe oxo formant une liaison amide, et le groupe alkylène ayant de 2 à 6 atomes de carbone, usuellement de 2 à 4 atomes de carbone, et X est le groupe carboxy. Les exemples non-limitatifs suivants sont donnés à titre d'illustration de l'invention. PARTIE EXPERIMENTALE Sauf mention contraire, toutes les températures sont exprimées en degrés centigrade. Toutes les parties et les pourcentages s'entendent en poids, sauf mention contraire, à l'exception des mélanges de liquides qui sont indiqués en vo- lume. Les abréviations suivantes sont utilisées: PBS, N3, Ma - solution saline tamponnée au phosphate 0,10 mM P04, pH 7,0, 0,128 M NaCl, 5 mM azoture de sodium, 1 mM Mg sous forme d'acétate; DMF - N,N-diméthylformiamide; NHS - N-hydroxy suc- cinimide; RSA - albumine sérique du lapin (1 mg/ml); RT - température ambiante; EDCI - éthyl diméthylaminopropyl carbodiimide; ONPG - o-nitrophénylgalactoside. EXEMPLE 1 Conjugaison de la P-galactosidase à du sérum de mouton anti- IgG humaine (sérum de mouton anti-IgGH). A. On prépare la)-galactosidase de la façon sui- vante: On centrifuge une partie aliquote de 10 ml de B-ga- lactosidase (Boehringer 150797, 8,5 mg/ml) pendant 10 mn et on dissout le précipité dans 3 ml de PBS, N3, Mg. Au mélange, on ajoute 0,3 ml de dithioérythritol 100 mM et on incube le mélange pendant 1 heure à la température ambiante, puis on chromatographie sur une colonne de 2,6 x 75 cm, garnie de Biogel (0,074 - 0,037 mm) équilibrée avec du PBS, N3, Mg, jus- qu'à un volume total de 390 ml. On élue la solution A 12 ml/h et on recueille desfractions de 80 gouttes (5 ml). On rassem- ble les tubes 39 à 44 en un volume de 28,9 ml, avec une con- centration de 1,47 mg/ml. On dose l'enzyme et on trouve une activité de 477 U/mg de protéine. B. On précipite le sérum de mouton anti-IgG humaine avec un égal volume de sulfate d'ammonium saturé et on dis- sout le précipité dans un volume final, après dialyse, de 154 ml de phosphate 0,01 M, pH 6,5. On purifie ensuite la fraction d'IgG par chromatographie sur une colonne de 5 x 60 cm (1178 ml) de DEAE-Sephadex A50 équilibrée avec le même solvant de phosphate. A partir des tracés d'électrophorèse et du rendement en protéine, on établit que toute l'IgG n'a pas été éluée, de sorte qu'on élue encore la colonne avec un tampon auquel on ajoute 0,15 M de NaCl à une vitesse de 150 ml/h, en recueillant des fractions de 35 mlo On réunit les fractions 133 à 142 en un volume de 250 ml et on mesure l'absorption à 280 nm, on trouve alors une concentration de 9,96 mg/ml. On dose la protéine pour l'anticorps désiré et on trouve qu'elle est présente en une concentration de 1,78 mg/ml pour une activité spécifique de l'anticorps d'environ 18 % par rapport à la protéine totale. On précipite la protéine par un égal volume de sulfate d'ammonium et on dissout dans le PBS, N3, Mg pour obtenir une solution contenant 35 mg/ml de protéine.- C. A 1,8 ml d'une solution de 35,3 mg/ml de l'anti- IgGH, on ajoute 60/1l (10 mg/ml dans le DMF) d'ester de NHS de l'acide mmaléimidobenzoique et on laisse le mélange au repos à la température ambiante pendant 30 minutes, puis on ajoute 0,18 ml d'une solution 1 M d'acétate de sodium, pH 5. On dialyse le mélange réactionnel contre 2 fois 500 ml d'a- cétate de sodium 20 mM (dégazé), pH 5, 0,15 M NaCl pendant 1 heure à la température ambiante. A une solution de 5 ml de)- galactosidase (1,47 mg/ml) on ajoute 0,2 ml de phosphate 0,5 M, pH 7, puis 2 ml du produit de réaction ci-dessus à une concen- tration de 31,1 mg/ml et on incube le mélange à la températu- re ambiante pendant 4 heures. On termine la réaction en ajou- * tant 0,2 ml de cystéine-HCl 10 mM et on incube pendant 0,5 heure pour obtenir un rendement final de 7,4 ml. On chromato- graphie le produit sur une colonne de Biogel ASM (2,6 x 75 cm, 398 ml) équilibrée avec du PISS, N3, Mg et on élue avec le même solvant à 12 ml/h en recueillant des fractions de 5 ml. On recueille les fractions 24 à 33 pour obtenir un volume de - 50 ml avec une densité optique à 280 nm de 0,540 et un rapport molaire anticorps/enzyme d'environ 5:1. On trouve une concen- tration en P-galactosidase de 121 pg/ml, alors que la concen- tration en IgG de mouton est de 213 ug/ml. Four doser l'en- zyme on utilise une fraction de 10 p1 dans 0,5 ml de PBS, N3, Mg, RSA combinée avec 0,1 ml de ON1G 20 mM dans -0,4 ml de tampon et on mesure le taux à 37 C à 420 nm après un inter- 33 valle de temps de 10 à 20 secondes apres l'addition du substrat. D. On répète le procédé ci-dessus avec les données suivantes A 1,8 pl d'antisérum de mouton contre l'IgG humaine (35,3 mg de protéine/ml), on ajoute 60 pl d'une solution 32 mM d'ester de NHS de l'acide mmaléimidobenzoique et on agite le mélange à la température ambiante pendant 30 minutes. Après avoir ajout6 0,18 il de NaOAc 1,0 M, pH 5,0, on dialyse la solution contre 2 fois 500 pl (dégazé) de NaOAc 20 mM, pH ,0, 0,15 M de NaCl pendant 1 heure à la température ambiante. A 5 ml de Pgalactosidase (1,47 mg/ml), on ajoute 0,2 pl de P04 0,5 M, pH 7,0, puis 3 ul de la solution ci-dessus (31,1 pg/ml) et on incube le mélange pendant 4 heures à la tempéra- ture ambiante. On termine la réaction en ajoutant 0,2 nul de cystéine HC1 10 mM, puis on incube pendant 0,5 heure. On chro- matographie le produit sur une colonne de Biogel (2,6 x 75 cm) équilibrée avec du PBS, N3, Mg, en éluant avec le même solvant à une vitesse de 12 ml/h et recueillant des fractions de 5 pl dont on rassemble les fractions 24 à 33. L'activité du conju- gat par rapport à l'activité de l'enzyme avec l'o-nitrophé- nyl galactoside (ONPG) comme substrat est de 96 %, alors que l'activité comparée à celle correspondant à I'ONGP fixé au DX 2000 (dextrane de poids moléculaire 2 000) est de 38,6 %. On effectue les dosages à 37 C, par des lectures à 420 nm en utilisant une solution de dosage de 10 jl du conjugat, 0,9 ml de PBS, N3, Mg, RSA et 0,1 ml de substrat (ONPG 20 mM). EXEMPLE 2 Préparation du dérivé succinylique de sérum de mouton anti- IgG humaine. Après avoir dialysé 5 ml de sérum de mouton anti- IgGH (35,3 mg/ml) contre 3 fois 0,5 1 de Na2HPO4 0,1 M, à la température ambiante pendant une nuit, on dilue les 5,3 ml (187,1 mg) obtenus avec 4 ml de la solution de Na2HPO4 et 250 pl d'une solution 1 M d'anhydride succinique marqué avec 4C en agitant. On maintient le pH à plus de 7,5 en ajoutant une solution 1 M d'hydroxyde de sodium, jusqu'à 400 1 au to- tal. Après 0,5 heure, on ajoute i ml d'une solution de chlo- 2.462709 rhydrate d'hydroxylamine 1 M ajustée à pH 8 avec de l'hydro- xyde de sodium et on incube à la température ambiante pendant minutes avant de dialyser contre 5 fois 0,5 1 de PBS, N3, Mg, à la température ambiante pendant une nuit. Le volume fi- nal atteint 10,7 ml avec une concentration de 17,4 mg/ml. EXEMPLE 3 Marquage à la fluorescéine de sérum de mouton anti-IgGH On dialyse 5 ml d'antisérum de mouton contre tl'IgG humaine (176,5 mg d'IgG de mouton) contre 3 fois 500 ml de tampon 0,1 M de Na2CO3, pH 9,0, pendant une nuit à la tempéra- ture ambiante. On ajoute 3,75 ml de tampon de dialyse afin d'obtenir un volume total de 8,65 mi. A 2,7 ml de la solution de protéine (54 mg, 0,33 umole), on ajoute 25 pl d'une solu- tion dans le DMP d'isothiocyanate de fluorescéine à 50 mg/ml (rapport molaire fluorescéine/protéine 9,2) et on agite le mélange à la température ambiante à l'obscurité. On filtre le produit sur un gel de Sephadex G25M avec PBS pH 6,8, N3,-Mg afin d'obtenir 7,3 ml de protéine marquée ayant un rapport F/P de 6,8. EXEMPLE 4 Dextran 40-ONPG A. 3-hydroxy-4-nitrobenzoate de méthyle (II) Dans 1250 ml de méthanol auxquels on a ajouté 25 ml de chlorure d'acétyle, on introduit 100,3 g (0,53 mole, 95 % de pureté) d'acide 3-hydroxy-4- nitrobenzoique (I). Le solide se dissout en deux jours. Après 6 jours, on filtre la solu- tion pour éliminer les impuretés non-dissoutes. On obtient l'ester brut en évaporant la solution. On prélève plusieurs récoltes de cristaux, la dernière dans un volume de 50 ml. On recristallise ces cristaux réunis dans 150 ml de méthanol. On obtient deux récoltes d'ester (II) sous forme de cristaux jaune-brun, point de fusion 89 - 91 C (98,7 g, 0,50 mole). B. 3-(2,3,4,6-tétraacétyl-p-galactosyloxy-4-nitro- benzoate de méthyle (IV) On dissout 100,1 g (0,23 mole, 95 % de pureté) d'a- cétobromogalactose (III) et 45,5 g (0,23 mole) de 3-hydroxy- 4-nitrobenzoate de méthyle (II) dans 600 ml d'acétonitrile. A la solution agitée, on ajoute 30 g (0,26 équivalent) d'oxy- de d'argent. Le solide noir devient peu à peu gris. Après 10 minutes, on ajoute encore une portion de 20 g d'oxyde d'ar- gent (0,17 équivalent). On poursuit l'agitation pendant enco- re 20 minutes. On filtre le mélange réactionnel sur un tampon de Celite pour éliminer les sels d'argent. On évapore le fil- trat et on obtient une masse cristalline brute, brune (115 g). On recristallise cette substance dans-l'éthanol (400 ml). On obtient deux récoltes de cristaux blancs légèrement teintés, point de fusion 150 - 152 C (99,6 g, 0,s19 mole, rendement 83 %). C. 3-p-galactosyloxy-4-nitrobenzoate de méthyle (V) On traite 119 g (0, 226 mole) du tétraacétate IV par 1 000 ml de méthanol. On chauffe le mélange à 60 C jus- qu'à ce que le solide soit dissous. On ajoute alors 25 ml de triéthylamine et on chauffe la solution à 60 C pendant encore 2 heures. On obtient le produit solide brut en plusieurs ré- coites par évaporation de la solution. La récolte finale pro- venant d'un volume de 20 ml. On utilise le matériau brut dans la réaction ultérieure sans autre purification. D. Acide 3-3-galactosyloxy-4-nitrobenzolque (VI) En agitant, on ajoute l'ester brut V (préparé à par- tir de 119 g du tétraacétate IV dans la réaction précédente) à 1 500 ml de NaOH 1 N. Après 15 minutes, l'ester est dissous et hydrolysé. On neutralise la solution avec HCl concentré afin d'obtenir une solution orange trouble, pH 7,5. On clari- fie la solution par filtration, puis on acidifie avec 250 ml de HCl 1 N afin d'obtenir une solution jaune pâle, pH - 3,5. On précipite l'acide VI et on le recueille par filtration. On lave avec 20 ml d'eau, et on obtient des aiguilles blanches soyeuses (34,7 g). On concentre les liqueurs mères aqueuses à un volume de 800 ml et on acidifie à pH 2. On obtient une quantité supplémentaire de l'acide brut qu'on recristallise dans 150 ml de méthanol pour obtenir 7,7 g d'aiguilles. Le rendement total en acide VI purifié atteint 42,4 g (123 moles), point de fusion 172 - 174 C. E. Ester de N-hydrosuccinimide de l'acide 3-)-ga- lactosyloxy-4-nitrobenzo5que (VII) On dissout 55,2 g (0,160 mole) d'acide 3-3-galacto- syloxy-4-nitrobenzoique, 20 g (0,174 mole) de N-hydrosuccini- mide et 35 g (0,183 mole) dans 200 ml de DMF. Après 2 heures, on complète la réaction par chromatographie en couche mince - (10 à 20 % de MeOH/CHC13) et on observe quelques impuretés mi- neures en plus du composé VII désiré. On utilise la solution sans autre traitement. F.- Dextrane T40 carboxyméthylé On dissout 101 g de Dextrane T40 (poids moléculaire environ 40 000) dans 500 ml d'une solution aqueuse de chloro- acétate de sodium 1,25 M. On ajoute 500 ml d'une solution a- queuse d'hydroxyde de sodium 2,5 M. On chauffe la solution à - 85 C pendant 3 heures. On laisse refroidir le mélange réactionnel. On ajou- te lentement 1 litre d'éthanol au mélange réactionnel agité. Le dextrane commence à précipiter après avoir ajouté 350 ml d'éthanol. On ajoute encore 2 litres d'éthanol pour garantir une précipitation complète. Le précipité se sépare sous la forme d'une gomme. On décante facilement le liquide surnageant. On purifie le dextrane par 3 autres précipitations effectuées de la façon suivante. On dissout la gomme dans 750 ml d'eau. On ajoute lentement 3 litres d'éthanol jusqu'à apparition d'un trouble permanent dans la solution, puis on termine l'addition plus rapidement. On laisse alors le précipité caoutchouteux de dextrane se séparer pendant une nuit. Le produit résultant contient environ 20 % d'unités de glucose carboxyméthylées. Go Amino-dextrane T40 (IX) On dissout du dextrane T40 carboxyméthyle (obtenu à partir de 100 g de dextrane T40) dans 250 ml d'eau. On ajou- te une solution de 400 g (2,00 moles) de N,N'-bis-(3-amino- propyl)-pipérazine dans 680 g (à 8,52 mmoles/g, soit 5,80 moles) d'acide chlorhydrique. A la solution résultante, on ajoute 201 g (1,05 mole) de EDCI dans 250 ml d'eau. On conser- ve le produit de réaction à la température ambiante pendant 22 heures. A la fin de cette période, on ajoute 3 litres d'é- thanol. Le dextrane commence à précipiter après l'addition de 1,5 litre d'éthanol. On laisse le précipité se déposer pendant une nuit. On purifie l'aminodextrane par deux précipitations supplémentaires, effectuées tel que décrit ci-dessus. La der- nière précipitation donne une suspension laiteuse, qui coa- gule et se dépose par addition d'une solution de 25 g de bro- mure de lithium dans 250 ml d'éthanol. On dilue la gomme ob- tenue à 1 litre et on trouve une teneur de 104 mM en groupes amino. H. ONPG-dextrane T40 On traite une solution de l'aminodextrane IX (1 li- tre de 104 mM, 104 mmole) par 89 g (0,5 mole) de K2HPO4 afin d'obtenir une solution tamponnée à pH 8 - 8,1. On ajoute len- tement une solution dans le DMF de l'ester de NHS VII (prépa- ré tel que décrit ci-dessus à partir de l'acide VI, 160 mmo- les). On conserve la solution résultante à la température am- biante pendant 24 heures. On précipite le dextrane par addi- tion de 3 litres d'éthanol. La précipitation commence après avoir ajouté 350 ml d'éthanol. On laisse le précipité se dé- poser pendant une nuit. On purifie le dextrane par deux autres précipita- tions selon le procédé déjà décrit. On dissout la gomme finale dans 1 litre d'eau. On clarifie la solution par filtration d'abord sur une frite de verre de porosité moyenne, puis sur un filtre Millipore 0,8 pm. On dilue la solution résultante à 2 litres. On di- lue un échantillon dans le rapport 1:12m et on a A32o01 15. Par rapport à E320 = 2700, on obtient une concentration de 52 mM en groupe ONPG. On préserve la solution par addition de 0,65 g de NaN3. On lyophilise environ la moitié du matériau. Le résidu se reconstitue de façon satisfaisante. Afin de démontrer le procédé de l'invention, on ef- fectue les dosages suivants. Dans le premier dosage, le tam- pon est le PBS, N3, Mg, RSA et les solutions utilisées sont la solution d'enzyme de l'exemple lC à 10 pg/ml dans le tam- pon, l'IgG humaine à 0,2 mg/ml et le dérivé succinylique de l'anticorps à 17,4 mg/ml le nombre moyen de groupes succini- que étant de 48 par molécule de protéine. Le substrat est un éther onitrophénylgalactosidylique lié au dextrane (poids moléculaire 40 000) par un agent d'espacement de di-(3-amino- propyl)pipérazine, o le dextrane a été préalablement modifié par du chloroacétate de sodium. Le substrat est utilisé à une concentration de 4 mM de ONPG dans le PBS, N3, Mg. Le protocole indique de combiner 0,05 ml du conju- gat enzyme-anticorps et 0,10 ml de tampon avec 0,05 ml de la concentration appropriée en IgG humaine et 0,10 ml de tampon, et d'incuber le mélange pendant 3 heures à la température am- biante. Au mélange, on ajoute alors 0,1 ml du dérivé succi- nylique de l'anticorps et 0,25 ml de tampon, puis immédiate- ment (15 secondes) 0,10 ml de la solution du substrat plus 0,25 ml de tampon. On fait les mesures 10 et 40 secondes a- près l'addition du substrat, à 37 C, avec des lectures à 420 nm. Le tableau suivant rapporte les résultats obtenus avec une variété de dilutions d'IgG humaine et de dilutions du dérivé succinylique de l'anticorps, o la dilution du dé- rivé succinylique de l'anticorps est d'un volume de la solu- tion d'anticorps à un volume final donné dans le tampon com- me indiqué. Dilution Ex. de l'IgGH TABLEAU 3 Dilution du dérivé succinylique de l'anticorps 40 20 10 (Taux mn 1) 0,268 0,260 0,292 0,326 0,404 0,442 0,454 0,266 0,276 0,308 0,362 0,462 0,506 0,542 0,272 0,286 0,290 0,326 0,406 0,514 - 0,552 0,610 D'après le tableau ci-dessus, il est évident qu'en augmentant les concentrations du dérivé succinylique de l'an- ticorps, on obtient une augmentation substantielle du taux d'hydrolyse observé pour une concentration donnée de l'IgG humaine et que le changement de taux suit le changement de concentration en IgG humaine, des concentrations accrues d' IgG humaine entraînant des taux croissants. Dans un -autre dosage, on utilise la fluorescéine comme source de charge négative pour l'élément chargé. On ef- fectue le dosage en combinant 50 ul du conjugat d'enzyme de l'exemple 1D avec 50ul d'IgG humaine dans 0,2 ml de tampon (PBS, N3, Mg, RSA) et en incubant le mélange pendant 1 heure a la température ambianteo Au mélange, on ajoute alors 100 p1 de l'IgG anti-H marquée à la fluorescéine et 0,25 1 de tam- pon, on incube le mélange pendant 15 secondes à la températu- re ambiante, puis 100 ï1 d'ONPG 4 mM conjugué avec le dextra- ne (poids moléculaire 40 000) dans PBS, N3, Mg + 0,25 pl de tampon, et on effectue les mesures à 37 C, à 420 nm, avec des lectures faites 10 secondes après l'addition du substrat, qu'on soustrait des lectures faites à 40 secondes. Les résul- tats sont rapportés dans le tableau suivant. 6 2048, - 0,264 0,280 0,304 0,356 0,382 0,366 TABLEAU 4 Dilution Taux de l'IgG humaine -1 (0,2 'ug/ml) (mn) 0,398 4096 0,418 1024 0,448 256 0,502 64 0,582 16 0,624 4 0,726 1 0,828 Les résultats ci-dessus montrent une double augmen- tation du taux pour la gamme de concentration utilisée. La fluorescéine chargée, portant deux charges négatives, est capable de moduler le taux, en augmentant le taux de dépla- cement observé pour la p-galactosidase lorsqu'elle est amenée à proximité de l'enzyme par fixation avec l'antigène IgG hu- maine. - Dans les deux dosages suivants, on utilise une an- ti-enzyme comme inhibiteur de l'enzyme qui demeure non-liée à 1'antigène. On prépare un mélange de 1,5 ml du conjugat enzyme-anticorps décrit préalablement et de 1,5 ml du dérivé succinylique de l'anticorps dilué dans le rapport 1:16. A 0,05 ml de la solution d'IgG humaine appropriée, on ajoute 0,10 ml du mélange ci-dessus et soit (1) 0,05 ml de l'anti- enzyme ajouté en quelques minutes, soit (2) le mélange incubé, puis 0,05 ml de l'anti-enzyme. Dans chaque cas, on incube en- suite les mélanges pendant 1 heure à la température ambiante, puis on ajoute 0,10 ml de conjugat d'ONPG-dextrane 40 4mM et 0,7 ml de.tampon et on fait les lectures à 420 nm, 10 et 40 secondes plus tard. Les résultats observés sont rapportés dans le tableau ci-dessous. On utilise l'antienzyme dans un tampon à une concentration suffisante pour saturer pratique- ment la totalité Dilution de 1'IgG Humaine 5 10 14 19 des sites de fixation de l'enzyme TABLEAU 5 Taux % du taux Protocole (m-1 pour 0 HigG _Protocole(am-1_ humaine 1 0,80 0,82 100 0,80 99 0,78 96 0,82 101 0,86 106 0,102 126 0,122 151 0,158 195. 0,208 257 0,240 296 0,206 254 0,76 0,80 0,74 0,82 0,96 0,104 0,130 0,176 0,222 0,268 0,220 D'après les résultats ci-dessus, il est évident que pour une gamme 6tendue de changements de concentration de l'IgG humaine, on constate un changement substantiel du taux observé, déterminé pendant une très courte période de temps, c'est-à-dire 30 secondes. C'est ainsi qu'après avoir permis la réaction entre les anticorps et l'antigène, on peut rapidement déterminer l'antigène, l'IgG humaine, par une simple technique - ---- - spectrophotométrique. De plus, on peut améliorer la précision du dosage en éliminant substantiellement le fond du conjugat d'enzyme qui ne participe pas à la fixation avec l'antigène. De cette façon, les résultats observés sont moins sensibles aux effets et aux variations non- spécifiques dans les résultats dûs à l'enzyme conjuguée à un élément différent de l'anticorps homo- logue de la substance à analyser. L'invention fournit une technique grâce à laquelle un anticorps impur peut être marqué et utilisé dans un dosage sensible pour la déteriination de quantités extrêmement fai- bles de la substance à analyser. Le procédé implique la fixa- tion ensemble de plusieurs anticorps, de façon à garantir qu'il y a une proportion majeure du marqueur associée avec l'anti- corps au ligand intéressant. Le signal obtenu à partir d'un marqueur du signal à proximité de l'élément chargé est subs- tantiellement différent du signal obtenu à partir d'un marqueur du signal non-influencé par l'élément chargé. C'est ainsi qu'on peut établir une distinction substantielle entre le marqueur fixé, directement ou indirectement, à ltantiligand intéressant et le marqueur fixé à d'autres protéines présentes dans les antisérums. Conformément à l'invention, on fournit un simple do- sage rapide et sensible pour la détermination d'une grande va- riété de substances à analyser. La technique permet d'utiliser une vaste gamme de différents marqueurs, o le marqueur peut être influencé par la présence d'un champ électrique dans un milieu aqueux. Le champ est fourni en modifiant un élément d'u- ne paire de fixation spécifique avec plusieurs substituants qui sont ionisés dans les conditions du milieu de dosage afin d'assurer un environnement de charge relativement concentré. Bien que le procédé ait été démontré en utilisant comme réactifs des anticorps contre la substance à analyser, il est évident qu'on peut utiliser également des anticorps contre des anticorps comme réactifs universels et modifier l'an- ticorps pour fournir des charges et des marqueurs. De cette façon, on peut considérablement augmenter ou multiplier le nombre de marqueurs et de charges amenés ensemble par une substance à analyser. Cette technique peut être utilisée plus efficacement lorsqu'on dispose d'un anti- anticorps relativement pur. REVENDICATIONS R E, V E N D I C A T I 0 N S 1 - Procédé de détermination d'une substance à ana- lyser dans un échantillon susceptible de contenir ladite subs- tance, la substance à analyser étant un élément d'une paire de fixation spécifique consistant en un ligand et en un anti- iigand, dans lequel on obtient un signal détectable, en rap- port avec la quantité de substance à analyser, en utilisant un système produisant un signal comprenant un élément marqué dans lequel le marqueur est un constituant du système produi- sant un signal, et un élément chargé polyi-onique, o le signal détectable est fonction de la proximité moyenne entre l'élé- ment chargé et l'élément marqué; le procédé consistant à com- biner dans un milieu de dosage aqueux: (1) l'échantillon, (2) l'élément chargé, (3) l'élément marqué du signal, (4) tous constituants supplémentaires du système produisant un signal; dans lequel il y a au moins un ligand et un antili- gand parmi (1), (2) ou (3); et à déterminer le signal détectable produit par le système pro- duisant un signal, qu'on compare au signal produit dans un milieu de dosage contenant une quantité connue de la substance à analyser. 2 - Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que le milieu est à un pH compris entre environ 4 et 11, et l'élément chargé possède plusieurs atomes d'oxygène néga- tivement chargés. 3 - Procédé selon l'une quelconque des revendica- tions 1 et 2, caractérisé en ce que le marqueur est une enzyme. 4 - Procédé selon la revendication 3, caractérisé en ce que le système produisant un signal comprend un substrat macromoléculaire chargé. - Procédé selon l'une quelconcue des revendica- tions 1 et 2, caractérisé en ce que le marqueur est un agent fluorescent. 6 - Procédé de détermination de la présence d'une substance à analyser dans un échantillon susceptible de con- tenir la substance, la substance à analyser étant un élément d'une paire de fixation spécifique consistant en un ligand et en un antiligand, dans lequel on obtient un signal détec- table en rapport avec la quantité de substance à analyser en utilisant un système produisant un signal comprenant un élé- ment marqué dans lequel le marqueur est une enzyme, et un élément chargé polyionique, o le niveau du signal détectable est fonction de la proximité moyenne entre l'élément chargé et l'enzyme, le procédé consistant à combiner dans un milieu de dosage aqueux: (1) l'échantillon, (2) l'élément chargé, (3) l'élément marqué du signal, (4) des substrats et des co-facteurs pour l'enzyme, dans lequel il y a au moins un ligand et un anti- ligand parmi (1), (2) ou (3); et à déterminer le signal détectable produit par l'enzyme, qu'on compare avec le signal produit dans un milieu de dosage con- tenant une quantité connue de la substance à analyser. 7 - Procédé selon la revendication 6, caractérisé en ce que le substrat est un substrat macromoléculaire chargé. 8 - Composition utilisable dans des dosages immuno- logiques, caractérisée en ce qu'elle comprend des éléments modifiés d'une paire de fixation spécifique consistant en un ligand et en un antiligand, o les éléments modifiés compren- nent un élément marqué d'un signal, le marqueur du signal é- tant un constituant d'un système produisant un signal qui est influencé par la proximité d'une concentration élevée de char- ges, et un élément chargé qui est un élément substitué par plusieurs groupes fonctionnels chargés dans les conditions du dosage, les quantités relatives de l'élément chargé et de l'é- lément marqué du signal étant reliées à l'optimisation subs- tantielle de la réponse du système produisant un signal à la variation de concentration de la substance à analyser dans le dosage.