FR 2460952 A1 19810130 FR 8014984 A 19800704 La présente invention concerne de nouveaux dérivés de ptérine et un procédé de détermination radioimmunologique (ci-après dénommée "RIA") pour déterminer les ptérines, utilisant comme traceur un dérivé de ptérine contenant un reste tyramine radio-iodé. Dans les années récentes, on a trouvé que les ptérines, telles que l'acide folique,jouent un rôle de coenzyme dans le méta- bolisme des aminoacides. Cette découverte a conduit au concept que la détection des variations quantitatives des ptérines dans un organisme vivant pourrait être utile pour le diagnostic de diverses déficiences en enzymes. Récemment, la relation entre la phénylcétonurie et la bioptérine a été indiquée dans Annals of Neurology, volume 3, pages 224-230 (1978); The New England Journal of Medicine, volume 299, pages 673-679 (1978);et Clinica Chimica Acta, volume 93, pages 251-262 (1979). Ainsi donc, on a montré un grand intérêt aux variations quan- titatives des ptérines (dérivés de la 2-amino-4-hydroxyptéridine) dans l'organisme humain. On connaît un procédé de détermination biologique de la bioptérine, c'est-à-dire la 2-amino-4-hydroxy-6-(L-érythro-1,2- dihydroxypropyl)ptéridine, comme décrit dans Methods in Enzymology, volume 18 B, page 618 (1971). Cependant,ce procédé n'est pas appro- prié pour l'utilisation pratique, parce qu'il nécessite une durée relativement longue pour obtenir le résultat. Il n'a pas encore été proposé de procédé pour la détermination de la néoptérine, c'est-à- dire la 2-amino-4-hydroxy-6-(L- ou D-érythro-l1,2,3-trihydroxypropyl)- ptéridine, mais il peut devenir nécessaire dans le futur. L'invention a principalement pour objet des dérivés de ptérine de formule générale OR I N6 (I) Q-R dans laquelle R représente un groupe hydroxyphényle, hydroxyphényle radio-iodé, tyraminocarbonyle, tyraminocarbonyle radio-iodé, protéinocarbonyle ou carboxyle; Q représente un groupe alkylène à chaîne droite ou ramifiée en C1-C6; et R6 et R représentent chacun un atome d'hydrogène ou un groupe alkyle en C1-C6, ou hydroxy- alkyle en C1-C6. L'invention a également pour objet l'utilisation de certains dérivés radio-iodés de la ptéridine comme traceurs dans un procédé de détermination radioimmunologique (ou RIA). L'invention sera mieux compris à la lecture de la description qui va suivre en référence aux figures 1 et 2 ci-annexées qui représentent des courbes d'étalonnage pour la bioptérine, o "B" représente la radioactivité (comptage,en coups par minute, ci- après "cpm"), "Bo0" représente la radioactivité (cpm) en l'absence de la substance étalon (bioptérine) et '"N représente la radioacti- vité de la fixation non spécifique (cpm) en l'absence de l'antisérum et de la substance étalon (bioptérine). Pour la RIA des ptérines, on a synthétisé deux types de traceurs. Les premiers comprennent les dérivés radio-iodés de 4-hydroxy- 2-tyraminocarbonylalkylaminoptéridines et les autres les dérivés radio- iodés de la 4-hydroxy-2-tyraminoptéridine; les premiers ont un groupe tyraminocarbonyle radio-iodé et les seconds un groupe hydroxy- phényle radio-iodé, comme reste R dans la formule (I). Des exemples caractéristiques de ces traceurs sont la 2-[5-(tyraminocarbonyl)- pentylamino]-4-hydroxy-6-(L-érythro-1,2-dihydroxypropyl)ptéridine radio-iodée et la 4-hydroxy-2-[2-(4-hydroxyphényl)éthyl]-amino-6- (L-érythro-l1,2-dihydroxypropyl)ptéridine radio-iodée. On peut également préparer de nouvelles protéinocar- bonylalkylptérines telles que les bioptérinylcaproylprotéines, pour la production d'anticorps. La synthèse des composés de l'invention est illus- trée par le schéma suivant dans lequel *1 représente l'iode radio- actif. Dans ce schéma, on utilise la bioptérine, la sérumalbumine de boeuf (BSA) et le groupe pentylène comme exemples de ptérine, de protéine et de groupe alkylène dans la formule (I), respective- ment. C(eA) HOZ-ZHDZH N N NH úHDHDHYN IN IHD HI HO [, D. C'BAI). XN úHD3H)H Né HO HO HO T,i (III) ZHN y SúHD ÀZH N HO (II) -ziA). zHN N SúHD CIIA) ZS6O9M ( IA) úHD3HDHD Il HO HO çi ç OH (II) C HNN NH2 (CH2) 5CooH (VII) - OH OH OH ! { N N CHCHCH3 RN{N mN \CCH2)5CONRCR2CH2CHoR (Xa) D' t.cc.H OH OR C0Ia) A OH NH2 EN-t>N NEL2 (C 2)5,COO (VIII) B41 OH OH 0OH HN N- :(CR2)5COOA (Xa) OH OH OH CHN>CHCHCH3 H N L CCH2)5COB A CXIIa) a Dans ce schéma, les réactions indiquées par la même lettre majuscule près de la flèche sont mises en oeuvre sensiblement dans les mêmes conditions réactionnelles. Dans le schéma de réaction, on chauffe la 4-amino- 6-hydroxy-2-méthylthio-5-nitrosopyrimidine (II) avec l'acide ú-amino- caproique dans l'eau, ce qui produit la 4-amino-2-(2-carboxypentyl- amino)-6-hydroxy-5-nitrosopyrimidine (VII). Si l'aminoacide est un a-aminoacide, la réaction est mise en oeuvre de préférence en condi- tions alcalines, par exemple dans une solution aqueuse d'hydroxyde de sodium 0,25M. Lorsque le composé de formule (II) ou (VII) est réduit catalytiquement, le groupe 5-nitroso est transformé en un groupe amino en donnant le composé de formule (III) ou (VIII) respec- tivement. Pour la réduction catalytique, on peut utiliser comme cata- lyseur le charbon palladié et les analogues. Ensuite, le composé de formule (III) ou (VIII), après purification facultative, est chauffé avec la 5-désoxyarabinose-phénylhydrazone dans un solvant pour former un noyau ptéridine par condensation avec cyclisation, pour produire le composé de formule (IVa) ou (IXa). Des exemples de solvants sont les alcools aqueux et les analogues et la réaction est effectuée de préférence sous un courant de gaz inerte tel que l'azote. Lorsque le composé de formule (IVa) est traité par la tyramine de manière semblable à la réaction entre le composé (II) et l'aminoacide décrite ci-dessus, on aboutit à la synthèse de la 4-hydroxy-6-(1,2-dihydroxy- propyl)-2-[2 utilisé comme traceur. Le composé de formule (IXa) préparé ci-dessus peut ensuite être conjugué avec la tyramine ou une protéine telle que la sérumalbumine de boeuf (BAS), la sérumalbumine de lapin ou la sérum- albumine humaine par un procédé de formation de la liaison amide d'acide connu dans la technique. On peut citer, par exemple, le pro- cédé à l'anhydride mixte dans lequel on traite un acide, tel que le composé (IXa), par un ester chloroformique en présence d'une amine tertiaire, pour donner un anhydride mixte que l'on fait ensuite réagir avec la tyramine ou une protéine. Les composés tels que (Va) ou (Xa) contenant la tyramine dans la structure sont marqués par l'iode radioactif pour donner un traceur, par l'un quelconque des procédés connus, de préférence en utilisant une modification de la technique bien connue à la chloramine T (dérivé sodé du N-chloro-p-toluènesulfonamide). Dans le mode opératoire général du procédé à la chloramine T, on fait réagir le produit de conjugaison avec l'iodure de sodium radioactif en présence de chloramine T, pendant environ s à environ 5 min et on arrête la réaction par addition de méta- bisulfite de sodium. Du point de vue de leur disponibilité et de leur activité spécifique, on préfère I et 13 plus particulière- t125I ment 15I. On peut également utiliser un autre mode opératoire pour la production du traceur. La tyramine est préalablement marquée par l'iode, comme décrit ci-dessus, etensuite, conjuguée avec un dérivé de ptéridine en utilisant les mêmes réactions que décrites ci-dessus. Bien entendu, le mode opératoire illustré dans le schéma réactionnel ci-dessus peut être modifié par l'homme de l'art de manière à préparer un composé convenable en fonction du but recherché. Par exemple, dans la production d'un composé de néoptérine, on peut utiliser la D- ou L-arabinose phénylhydrazone pour la réac- tion de cyclisation dans l'étape B. D'autres exemples de réactifs que l'on peut utiliser dans cette étape sont le diacétyle et le glyoxal. On peut également préparer des composés de formule (I) contenant divers groupes alkylène; on peut citer à titre d'exemples, les groupes méthylène, éthylène, propylène, butylène et pentylène qui peuvent porter un substituant tel que méthyle, éthyle ou hydroxy- benzyle. Pour la production d'un antisérum contre la ptéridine, on peut utiliser des techniques connues d'immunisation. Par exemple, on immunise des mammifères par injection d'une ptéridine conjuguée avec une protéine sous forme d'une émulsion avec l'adjuvant de Freund complet. Des exemples de mammifères qui peuvent être conve- nablement utilisés comprennent les lapins, les chèvres, les brebis, les cobayes et les analogues. Après plusieurs injections "booster", :-............. - - 2460952 on recueille le sang, puis-on sépare les globules sanguins. On peut : utiliser l'antisérum tel quel pour le procédé de détermination, mais on peut utiliser d'abord des techniques de purification telles que relargage ou chromatographie d'affinité. Avant la RIA, on peut soumettre un échantillon d'urine ou analogue à un traitement préalabl& si nécessaire,pour le procédé de RIA. Par exemple, dans la détermination de la bioptérine dans l'urine, on peut oxyder la bioptérine forme réduite, c'est-à-dire dihydrobioptérine et tétrahydrobioptérine, en utilisant un agent oxydant convenable tel que l'iode. La RIA pour la détermination des ptérines peut être mise en oeuvre de manière connue dans la technique. Par exemple, selon un mode de mise en oeuvre, on dilue l'antisérum à une concentration convenable avec une solution tampon et on l'incube avec une solution de l'échantil- lon ou une solution témoin. On fait incuber le mélange résultant avec un traceur obtenu par le procédé décrit ci-dessus à une température conve- nable, par exemple à latempérature ambiante, et ensuite on met en oeuvre un mode opératoire convenable de séparation pour séparer l'anticorps fixé et l'anticorps libre. Des exemples de ces techniques comprennent la méthode au double anticorps, la méthode au dextranne-charbon, la méthode en phase solide, etc., qui sont bien connues de l'homme de l'art. La radioactivité de chacune des substances séparées est comptée au moyen d'un compteur à scintillation du type à godet et on trace une courbe d'étalonnage d'après la valeur obtenue pour les solutions-étalons et ensuite on détermine la teneur dans l'urine à partir de la-courbe d'étalonnage. On a trouvé que la réactivité croisée de l'antisérum contre la bioptérine avec la tétrahydrobioptérine, la dihydrobioptérine, la néoptérine, la 6,7diméthylptérine, la ptérine ou l'acide folique est assez faible pour être négligée. L'anticorps contre la néoptérine ou la diméthylptérine a également une sélectivité élevée, donnant peu de réaction croisée avec les autres ptérines. La RIA utilisant le traceur et la ptérinylprotéine selon l'invention a une excellente précision et nécessite une durée plus courte, par exemple, que la méthode de détermination biologique indiquée dans Methods in Enzymology, volume 18 B, page 618 (1971). L'utilisation d'un dérivé iodé de 2-[2-(4-hydroxyphényl)-éthyl]amino- ptéridine comme traceur donne des résultats ayant en particu- lier une meilleure sensibilité que l'utilisation de l'une des 2(tyraminocarbonylalkylamino)ptéridines radio-iodées, parce que les premières présentent un groupe de pontage différent de celui de l'antigène (produit de conjugaison de la protéine). Dans la RIA d'une substance de bas poids moléculaire qui ne peut produire elle-même un anticorps (c'est-à-dire un haptène), l'immunisation est obtenue par administration aux mammi- fères d'un produit de conjugaison haptène-protéine. L'antisérum ainsi produit contient un anticorps contre le groupe de pontage ainsi que l'anticorps contre l'haptène. Dans ces circonstances, on suppose que, lorsque l'on utilise un haptène marqué (traceur) ayant le même groupe de pontage que celui contenu dans le produit de conjugaison haptène-protéine, le système de détermination a tendance à donner des liaisons non spécifiques relativement fortes et une sensibilité relativement faible. Si le traceur et l'antigène ont le même groupe de pontage, par exemple un groupe caproyle, propionyle, ou butyryle, une étape est nécessaire pour séparer l'anticorps contre le groupe de pontage. Les exemples suivants illustrent l'invention sans toute- fois en limiter la portée. Dans ces exemples, les parties, pourcen- tages et rapports s'entendent tous en poids sauf indication contraire. EXEMPLE 1-1 On dissout 18 g de 4-amino-6-hydroxy-2-méthylthio-5- nitrosopyrimidine (II) dans 500 ml d'une solution aqueuse d'hydroxyde de potassium 0,5M. On ajoute 10 g de charbon palladié à 5% et on effectue la réduction à la température ambiante sous la pression atmosphérique jusqu'à consommation de la quantité théorique d'hydro- gène. Après séparation du catalyseur par filtration, on ajuste le filtrat à pH 3-4 par l'acide formique, ce qui fait précipiter la 4,5-diamino-6hydroxy-2-méthylthiopyrimidine (III) en aiguilles incolores. Sans isolement, on ajoute les cristaux à un mélange de 32 g de 5-désoxy-Larabinosephénylhydrazone et 400 ml de méthanol et on agite le mélange résultant en atmosphère d'azote à 25 C pendant 90 min et au reflux pendant encore 30 min. On refroidit le mélange au bain de glace et on ajoute 100 g de ferricyanure de potas- sium ainsi qu'une solution aqueuse d'iodure de potassium (5 g/500 ml). On agite à pH 3-4 à 25 C pendant 20 h en introduisant de l'oxygène dans le mélange et on concentre sous vide jusqu'à un volume de 500 ml et on ajuste à pli 9-10 par l'ammoniaque. On retire par filtration un solide qui n'est pas fluorescent et on fait passer le filtrat sur une colonne (5 x 60 cm) garnie de "Florisil" et on élue par l'eau. On obtient deux fractions ayant une fluorescence bleue. On concentre la fraction principale à 150 ml et on traite à nouveau par chromato- graphie sur colonne de "Florisil" et élution. On concentre l'éluat à siccité sous vide et on extrait le résidu par 500 ml de méthanol chaud. On concentre l'extrait jusqu'à un volume de 50 ml, qui donne, par refroidissement, 5,5 g d'aiguilles incolores de 4-hydroxy-6-(L- érythro-l,2-dihydroxypropyl)-2-méthylthioptéridine (IVa). Ce produit se décompose au-dessus de 210 C (recristallisation dans l'eau). Analyse élémentaire: C(%) H(%) N(%) Calculé pour C10H12N403S32H20: 39>46 5,31 18,41 Trouvé: 40,27 4,45 18,65 De la même manière que décrit ci-dessus, mais en uti- lisant la D- ou L-arabinosephénylhydrazone au lieu de la 5-désoxy-L- arabinosephénylhydrazone, on obtient la 4-hydroxy-6-(D-érythro-1,2,3- trihydroxypropyl)-2-méthylthioptéridine (IVb) ou sa forme L (IVc), respectivement. Les deux isomères, après recristallisation dans l'eau, se décomposent à 158 C. Analyse élémentaire: C(%) H(%) N(%) Calculé pour C10oH12N404S 20 39,72 4, 68 18,54 Trouvé pour la forme D: 39,63 4,68 18,03 Trouvé pour la forme L: 39,75 4,63 18,17 EXEMPLE 1-2 On chauffe à 100-105 C pendant 6 h un mélange de 1,0 g de 4-hydroxy-6-(L-érythro-l1,2-dihydroxypropyl)-2-méthylthio- ptéridine (IVa), 3,0 g de tyramine, 0,8 g d'acide acétique et une solution aqueuse à 50% de 2-méthoxyéthanol. On ajuste le pH du mélange de réaction à 1-2 par l'acide chlorhydrique et on fait passer le mélange sur une colonne (3,5 x 40 cm) de "Florisil" et on sépare les produits de départ n'ayant pas réagi par lavage de la colonne avec 500 ml d'une solution aqueuse d'acide formique 2M, puis 500 ml d'eau, et ensuite on élue le produit avec un gradient de concentration au moyen de 1 000 ml de solutions aqueuse d'ammo- niaque ayant des concentrations de O à 2%. On concentre l'éluat jusqu'à un volume de 150 ml et on traite à nouveau sur une colonne de "Fluorisil" comme précédemment. On concentre l'éluat à siccité, on extrait avec 200 ml d'une solution aqueuse d'ammoniaque et on concentre l'extrait jusqu'à un volume de 100 ml. On ajuste le mélange à pH 3-5 par l'acide formique et on refroidit le mélange pour obtenir la 4-hydroxy-2-[2-(4-hydroxyphényl)éthyl]amino-6-(L-érythro- 1,2-dihydroxypropyl)ptéridine (Va) sous forme d'aiguilles jaunes se décomposant à 165 C (recristallisation dans l'eau). Analyse élémentaire: C(%) H(%) N(0) Calculé pour C17H19N504 H 20 54,39 5, 64 1866 17 1 5,9,6 18,62 Trouvé: 54,56 5,62 18,38 EXEMPLE 1-3 Marquage par l'iode radioactif. A 20ul d'un tampon au phosphate O0,05M (pH 7,4), on ajoute 0lpl de diméthylformamide contenant 10 y du composé (Va) obtenu comme décrit à l'exemple 1-2 et on ajoute 10/1 (1,2 mCi) de Na 125I, puis on ajoute 20 y de chloramine T dissoute dans 10P1 du même tampon. On fait réagir le mélange résultant à 25 C pendant s. On arrête la réaction par addition de 40 y de métabisulfite de sodium dissous dans 10/l du même tampon. On purifie le mélange de réaction résultant par électrophorèse sur acétate de cellulose en séparant avec un tampon au phosphate 0,05M (pH 7,6) et on extrait par un tampon au phosphate contenant 5% de BSA et on obtient la 4-hydroxy-2-[2-(4-hydroxyphényl)éthyl]amino-6-(L-érythro- 1,2-dihydroxypropyl)ptéridine marquée par I (VIa). Chromatographie sur couche mince de gel de silice. Rf 0,48; éluant: acétate d'éthyle- méthanol-solution aqueuse d'ammoniaque à 5% (1:1:0,2 en volume). EXEMPLE 1-4 Production de substances étalon. On chauffe au reflux pendant 4 h un mélange de 0,2 g de 4-hydroxy-6 (3,5 x 20 cm) garnie de "Florisil" que l'on élue ensuite par l'eau. On concentre l'éluat à siccité sous vide. On extrait le résidu par 50 ml de solution aqueuse d'ammoniaque, on concentre l'excès jusqu'à 10 ml et on refroidit pour obtenir 90 mg de bioptérine sous forme d'aiguilles ivoire, dont les propriétés physico-chimiques sont identiques à celles des échantillons authentiques. De manière semblable, on obtient la D-érythronéo- ptérine (rendement 60%) et la L-érythronéoptérine (rendement 72%) à partir des composés 2-méthylthio (IVb) et (IVc) respectivement. EXEMPLE 2 On ajoute IO g de 4-amino-6-hydroxy-2-méthylthio-5- nitrosopyrimidine (II) et 20 g d'acide t-caproîque à 400 ml d'eau et on chauffe le mélange au reflux pendant 1 h. On ajuste le mélange à pH 2-3 par l'acide formique et on le refroidit et on recueille le précipité par filtration pour obtenir 8,5 g de 4-amino- 2-(5-carboxypentylamino)-6-hydroxy-5-nitrosopyrimidine (VII). Lorsqu'on dissout ce produit dans une solution aqueuse diluée d'ammoniaque chaude et on acidifie par l'acide formique, on obtient des aiguilles orange rougâtre. Par un mode opératoire semblable, on obtient d'autres composés de formule-(VII) indiqués dans le tableau I qui donne égale- ment les points de fusion et les produits de départ. TABLEAU I H OH _ _ &NiH _ _ _ _ UN "Q-R 2 Q-R F Produit de départ CH2COOH 300 C, vire au noir à280 C glycine (CH2) 2COOH 300 C -alanine (CH2)3COOH 240-241 C (décomposition) acide yaminobutyrique (CH2)5COOH 232,5-233,5 C (décomposition) acide 6aminocaproTque CH(CH3)COOH(lS) 300 C, vire au noirà245 C.L-alanine CH(CH3) COOH(1R) 300 C D-alanine CH__ COOR 300C L-tyrosine CHCH2/- 2_-. EXEMPLE 3-1 On ajoute 4,3 g de 4-amino-2-(5-carboxypentylamino)-6- hydroxy-5-nitrosopyrimidine (VII) à 60 ml d'une solution d'hydroxyde de sodium 2M et on réduit catalytiquement par l'hydrogène en présence de 2 g de charbon palladié. Lorsque l'absorption d'hydrogène a cessé, on ajoute 20 ml d'acide chlorhydrique concentré et on sépare le catalyseur par filtration. On concentre le filtrat et on sèche les cristaux résultants en utilisant le pentoxyde de phosphore comme agent desséchant,pour obtenir 9,5 g de dichlorhydrate de 4,5-diamino- 2-(5-carboxypentylamino)-6-hydroxypyrimidine monohydraté (VIII). On ajoute 5,0 g du produit ainsi obtenu et 3,7 g de 5-désoxy-L-arabinose- phénylhydrazone à 400 ml de méthanol aqueux à 50% en volume et on chauffe le mélange au reflux sous courant d'azote pendant 20 min. On ajuste le mélange de réaction à pH 5 et on introduit de l'air dans le mélange pendant 6 h. On concentre le mélange de réaction à siccité, on ajoute 100 ml d'eau et on ajuste à pH 2,0 par l'acide formique. On fait passer le mélange sur une colonne de "Florisil" (400 ml),on lave par l'acide formique 0,25M et on élue par l'eau. On concentre l'éluat à siccité, on extrait par 250 ml de méthanol et on concentre l'extrait à siccité. On cristallise le résidu dans ml d'éthanol pour obtenir 465 mg de 2-(5-carboxypentylamino)-4- hydroxy-6-(L-érythro-1,2-dihydroxypropyl)ptéridine (IXa). Analyse élémentaire: C(%) H(%) N(%) Calculé pour C15H21N505 H20 48,77 6, 28 18,96 Trouvé: 48,55 6,25 18,55 EXEMPLE 3-2 On dissout 4,3 g de dichlorhydrate de 4,5-diamino-2- (5-carboxypentylamino)-6-hydroxypyrimidine monohydraté et 2,5 g de diacétyle dans 100 ml d'eau et, après avoir ajusté à pH 2-3, on chauffe la solution au reflux pendant 1 h. Après refroidissement, on cristallise le précipité dans le méthanol à 50% en volume et on obtient 3,1 g de 2-(5-carboxypentylamino)-4-hydroxy-6,7-diméthyl- ptéridine sous forme d'aiguilles jaunes, F. 215-219 C (décomposition). EXEMPLE 4-1 On ajoute 74 mg de 2-(5-carboxypentylamino)-4-hydroxy- 6-(L-érythro-l,2-dihydroxypropyl)ptéridine et 126p1 de triéthylamine à 2 ml de diméthylformamide (DMF). On ajoute au mélange 65ul de chlotoformiate d'éthyle en refroidissant à -5 C et on agite pendant min. Après addition de 2 ml d'une solution de 52 mg de tyramine dans 2 ml de DMF, on agite le mélange à -5 C pendant 30 min et ensuite à O0 C pendant 1 h. On concentre sous vide et on ajoute au résidu 3 ml d'hydroxyde de sodium 1M et on laisse reposer le mélange à 30 C pendant 30 min. On acidifie par l'acide formique et on purifie par chromatographie sur colonne (100 ml) de "Florisil", en éluant par le mélange éthanol-eau et ensuite on recristallise le produit dans l'eau pour obtenir 66 mg du produit de conjugaison 2-(5-carboxy- pentylamino)-4-hydroxy-6-(L-érythro-1,2-dihydroxypropyl)ptéridine- tyramine (bioptérinylcaproyltyramine) (Xa) sous forme d'aiguilles incolores, F. 169-171 C (décomposition). Analyse élémentaire: C(%) H(%) N(%) Calculé pour C23H30N605,H20 56,54 6, 60 17,20 Trouvé: 56,65 6,48 17,34 EXEMPLE 4-2 On dissout 184mg de 2-(5-carboxypentylamino)-4- hydroxy-6 On concentre sous vide et on ajoute 2 ml d'hydroxyde de sodium 1MN. Après avoir laissé reposer à la température ambiante pendant 30 min, on acidifie le mélange par l'acide formique et on le purifie par chromatographie sur une colonne de "Florisil" (100 ml) en éluant par le mélange éthanol-eau pour obtenir 101 mg du produit de conjugaison 2-(5-carboxypentylamino)-4-hydroxy-6-(L-érythro-l,2,3- trihydroxypropyl)ptéridine-tyramine, qui est une néoptérinylcaproyl- tyramine, F. 192-196 C (décomposition) (recristallisation dans l'éthanol aqueux). * Analyse élémentaire: C() H(%) N(%) Calculé pour C23H30N66H0 5475 6,39 16, 66 Trouvé: 54,94 6,40 16,33 EXEMPLE 4-3 On ajoute 249 mg de 2-(5-carboxypentylamino)-4- hydroxy-6,6-diméthylptéridine et 2001pl de triéthylamine à 4 ml de DMF et on ajoute ensuite 100fl1 de chloroformiate d'éthyle à -5 C. On fait réagir le mélange à -5 C pendant 15 min. Après addi- tion de 2 ml d'une solution de 205 mg de tyramine dans le DMFP on effectue la réaction en agitant à -5 C pendant 30 min et à la température ambiante pendant 1 h. On concentre le mélange de réaction sous vide et on dissout le résidu dans l'eau. Après aci- dification par l'acide formique, on purifie le mélange par chroma- tographie sur colonne de '"Florisil", en éluant avec un gradient de concentration en utilisant 1 litre d'eau et 1 litre d'une solution aqueuse contenant 200 ml d'acétone et 4 g d'ammoniac, pour obtenir 209 mg du produit de conjugaison, 2-(5-carboxypen- tylamino)-4-hydroxy-6,7-diméthylptéridine-tyramine, F. 200 C (décomposition) (cristallisation dans l'éthanol à 50% en volume). Analyse élémentaire: C(%) H(%) N(%) Calculé pour C22 28N6 352 59,71 6,83 18,99 22 28 5,7 6,8 38,9 Trouvé: 59,77 7,35 18,76 EXEMPLE 5 Marquage par l'iode radioactif. On ajoute 10pl de DMF contenant 10 y du produit de conjugaison bioptérinylcaproyltyramine à 20p1 de tampon au phosphate O,05M (pH 7,4) et on ajoute au mélange 10pl (1,2 mCi) de Na 125I et ensuite 20 y de chloramine T dissoute dans 10/1l du même tampon. On fait réagir le mélange à 25 C pendant 30 s et on arrête la réaction par addition de 40 y de métabisulfite de sodium dissous dans 101l du mâme tampon. On purifie le produit par électrophorèse sur acétate de cellulose, on le sépare avec un tampon au phosphate 0,05M (pH 7,6) et on extrait par un tampon au phosphate contenant 0,57 de BSA pour obtenir le produit de conjugaison 2-(5-carboxypentylamino)-4-hydroxy-6-(L-érythro-1,2- dihydroxypropyl)-ptéridine-tyramine marqué par 125I. Chromato- graphie sur couche mince de gel de silice: Rf 0,50, éluant acétate d'éthyle-méthanol-ammoniaque aqueuse à 5% (1:1:0,2 en volume). EXEMPLE 6-1 Conjugaison avec la BSA On ajoute 74 mg de bioptérinylcaproyltyramine et 168p1 de triéthylamine à 1 ml de DMF et on ajoute ensuite 871l de chloroformiate d'éthyle à une température de -5 C. On agite le mélange pendant 15 min et on l'ajoute à un mélange de 114 mg de sérumalbumine de boeuf (BSA), 2 ml d'eau et 2001ul d'une solution d'hydroxyde de sodium 1M. On agite ensuite le mélange résultant à -5 C,en l'ajustant à pH 9 pendant 30 min, à 0 C pendant 1 h et à la température ambiante pendant 1 h. Après addition de 5 ml d'hydroxyde de sodium 1M, on laisse repo- ser à la température ambiante pendant 30 min, puis on dialyse contre l'eaucourante en utilisant un tube de cellulose régénérée Q'Celophane'5, On place le tube dans un bécher contenant un mélange de 1 g d'acétate de sodium et 300 ml d'eau, on ajuste à pH 4,5 et on dialyse pendant 6 h. On centrifuge la solution intérieure et on lyophilise le précipité pour obtenir 95 mg de produit de conjugaison 2-(5-carboxypentylamino)-4-hydroxy-6-(L-érythro- 1,2-dihydroxypropyl)ptéridine-BSA, ou bioptérinylcaproyl-BSA. EXEMPLE 6-2 On ajoute 73,4 mg de 2-(5-carboxypentylamino)-4- hydroxy-6-(L-érythro-l,2,3-trihydroxypropyl)ptéridine et 168 M de triéthylamine à 1 ml de DMF et on ajoute ensuite 87/il ce chloroformiate d'éthyle à une température de -5 C, puis on agite le mélange pendant 15 min. On ajoute la solution réac- tionnelle à un mélange de 114 mg de BSA, 2 ml d'eau et 200pr d'hydroxyde de sodium 1M, et on agite ensuite le mélange résul- tant en l'ajustant à pH 9, à -5 C, pendant 30 min, ensuite à 0 C pendant 1 h et à la température ambiante pendant 1 h. Apres addition d'hydroxyde de sodium 1M, on laisse reposer le mélange à la température ambiante pendant 30 min. On dialyse L, le mélange de réaction comme décrit à l'exemple 6-1, on centri- fuge et on lyophilise le précipité pour obtenir 100 mg du pro- duit de conjugaison 2-(5-carboxypentylamino)-4-hydroxy-6-(L- érythro-1,2,3-trihydroxypropyl)ptéridine-BSA, qui est une néopté- rinylcaproyl-BSA. En utilisant un mode opératoire semblable à celui décrit ci-dessus, on obtient les produits de conjugaison de la BSA suivants. EXEMPLE 6-3 Produit de conjugaison 2-(5-carboxypentyl)amino- 4-hydroxy-6,7-diméthylptéridine-BSA (83 mg) à partir de 61 mg de 2-(5-carboxypentylamino)-4-hydroxy-6,7-diméthylptéridine. Taux de substitution de la ptérine: 82%, calculé à partir de A e350 (pH 7,o). EXEMPLE 6-4 Produit de conjugaison 2-carboxyméthylamino-4- hydroxy-6-(L-érythro-l,2,3-trihydroxypropyl)ptéridine-BSA (44 mg),à partir de 31 mg du composé 2-carboxyméthylamino cor- respondant. EXEMPE 6-5 Produit de conjugaison 2-carboxyméthylamino-4- hydroxy-6,7-diméthyl-ptéridine-BSA (32 mg),à partir de 25 mg du composé 2-carboxyméthylamino correspondant. Le tableau II ci-après indique les substances de formule (I) obtenues comme dans les exemples 1-2 à 6-5 ou par un mode opératoire semblable. Dans ce tableau, les abréviations ontla signification suivante: DHP = Lérythro-1,2-dihydroxypropyle THP = L-érythro-1,2,3-trihydroxypropyle THP(D) = D-érythro-l1,2,3-trihydroxypropyle et le Rf est la valeur obtenue sur couche mince de gel de silice développée avec un mélange acétate d'éthyle-méthanol-ammoniaque aqueuse à 5% (1:1:0,2 an volume). TABLEAU II Q-R CH2CH2 OH 1! i2S I CH2CH2/ OH CH2COOH (CH2) 2 COOH ' CCH2) 3COOH CCH2) 5COOH CH CCH3) COOH ClS) CCH2) 5COOH CH2COOH CCH2) 5COOH CCH2) 5CO-tyramine i i' CCH2] 5CO-BSA CH2CO - BSA t CCH2) 5C0-tyramine-125I tl tt R6 DHP THP CD) THP DHP Me t, fi- t, DHP TfP t il CH3 THP DHP Me THP DHP Me THP Me THP DHP R7 F. ( C) ou Rf H 165 (d) " 180-182 (d) 182-184 (d) " Rf 0,48 Me 206- 210 (déc.) " 275 (vire au noir) " 238-240 (déc.) " 215-219 (déc.) " 193194 (déc.) H 216-218 (déc.) " 177-180 (déc.) " 186-190 Cdéc.) CH3 200 (déc.) Hl 192-196 (déc.) " 169-171 (déc.) Me H Me H Me H I' Rf 0,58 Rf 0, 36 Rf 0>50 EXEMPLE 7 Production de l'anticorps. On injecte par voie intradermique le produit de conjugaison 2-(5-carboxypentylamino)-4-hydroxy-6-(L-érythro-l1,2- dihydroxypropyl)ptéridine-BSA avec l'adjuvant de Freund complet à des lapins blancs de Nouvelle Zélande à raison de 1 mg par lapin. Après 1 mois, on effectue une immunisation supplémentaire (0,4 mg par lapin) de la même manière et on effectue au total quatre fois l'immunisation supplémentaire à des intervalles d'une semaine. Dix jours après l'immunisation finale, on recueille le sang des lapins et on obtient l'antisérum. EXEMPLE 8-1 (a) Prétraitement d'un échantillon d'urine. A 5,0 ml d'urine humaine fraîche, on ajoute 500/1 d'acide chlorhydrique 5M et 1 ml d'une solution à 0,2% d'iode et 0,4%7 de KI et on laisse reposer le mélange résultant à la tempéra- ture ambiante pendant 1 h. On effectue ensuite le même traitement sauf qu'on utilise de l'hydroxyde de sodium 0,5% au lieu de l'acide chlorhydrique. On arrête la réaction d'oxydation par addition de 0,5 ml d'acide ascorbique à 2% et on centrifuge le mélange réac- tionnel à 7 000 tr/min pendant 15 min. On chromatographie la liqueur surnageante sur une colonne (0,9 x 2 cm) garnie de "Dowex-50" (H+). Apres lavage de la colonne avec 20 ml d'eau, on élue la bioptérine avec 5 ml de solution aqueuse d'ammoniaque 1M. On ajuste l'éluat à pH 7,0 et à un volume de 6,0 ml par 250/pl d'un tampon au phos- phate 0,5M (pH 7,0) et par l'acide chlorhydrique 5M, et on l'uti- lise ensuite par la détermination. (b) RIA de la bioptérine. Dans le mode opératoire de détermination, on utilise un tampon au phosphate 0,0175M contenant 0,1% de BSA. Pour éliminer l'anticorps contre le reste acide caprolque, on fait incuber à 37 C pendant 30 min deux séries du mélange de 10 y de 2-(5-carboxypentylamino)-4-hydroxy-6-(L-érythro- 1,2-dihydroxypropyl)ptéridine et 100l d'antisérum dilué 800 fois. A une série de la solution résultante, on ajoute 1001pl du tampon contenant des quantités étalonnées de bioptérine (0 à 710 picomoles) et à l'autre série de la solution on ajoute 100P1 de l'échan- tillon d'urine dilué (dilution 4, 8, 16 et 32 x) et on fait incuber les mélanges à 37 C pendant 30 min. On ajoute à chacun pl de produit de conjugaison 2-(5-carboxypentylamino)-4-hydroxy- 6-(L-érythro-l,2-dihydroxypropyl)ptéridine-tyramine radio-iodé marqué par 125I (20 000 cpm) et on laisse reposer le mélange à la température ambiante pendant 30 min. On ajoute ensuite 100l 1 d'anti-IgG de lapin, comme second anticorps, puis on laisse reposer à la température ambiante pendant 15 min. Après addition de 500/il de dextranne T-70 (Société Pharmacia) à 4%, on mélange vigoureusement et on centrifuge à 2 000 tr/min à 4 C pendant min. On compte ensuite la radioactivité de chaque précipité. On trace une courbe d'étalonnage (figure 1) en reportant la valeur B-N/Bo-N obtenue sur des solutions étalons, puis on détermine sur la courbe les teneurs en bioptérine dans les échantillons d'urine, qui pont représen- tées dans le tableau III ci-après en comparaison avec les valeurs obtenues par la détermination biologique décrite précédemment. TABLEAU III Bioptérine (moles/ml d'urine) n de l'échantillon RIA Détermination -RIA biologique 1 5,75 5,4 2 15,1 16,0 3 8,0 7,2 4 10,7 8,9 9,7 8,9 EXEMPLE 8-2 (a) Prétraitement d'un échantillon d'urine. A 500 ml d'urine humaine fraîche, on ajoute 50/l d'acide chlorhydrique 2M et 50/il d'une solution à 2% d'iode et à 4%7. de KI et on laisse reposer le mélange à la température ambiante et à l'obscurité pendant 1 h. On arrête ensuite l'oxydation en ajou- tant au mélange 50/1l d'une solution d'acide ascorbique à 2%. On lyophilise le mélange de réaction pour éliminer l'acide chlorhydrique et on dissout le résidu dans un tampon au phosphate O,02M (pH 7,5) contenant 0,3% de BSA et on l'utilise pour la détermination. (b) RIA de la bioptérine. Dans le mode opératoire de la détermination, on utilise un tampon au phosphate 0,02% (pH 7,4) contenant 0,1% de BSA. A un mélange de 100P1 du tampon et 100P1 d'anti- sérum (dilution environ 4 000-5 000 x), on ajoute 100p1 de solution étalonnée de bioptérine (0-300 picomoles) dans le tampon ou 1001l de l'échantillon d'urine (dilution 50-100 x). On fait incuber le mélange à 37 C pendant 30 min. On ajoute chaque fois lO100l de 4-hydroxy-2-r2-(4-hydroxyphényl)éthylamino-6-(L-érythro-l1,2-dihydroxy- propyl)ptéridine radio-iodée marquée par 125I (10 000-20 000 cpm) et on laisse reposer le mélange résultant à 4 C pendant 1 à 2 h. On ajoute au mélange de réaction 100pl d'anti-IgG de lapin comme second anticorps. On laisse reposer le mélange à la température ambiante pendant 10 min et on y ajoute 100,il de dextranne T-70 (Société Pharmacia) à 4%. On mélange vigoureusement et on centrifuge à 2 500 tr/min à 4 C pendant 15 min puis on déter- mine la radioactivité du précipité. En reportant les valeurs B-N/Bo-N ainsi obtenues, on trace la courbe d'étalonnage A représentée à la figure 2, comparée avec la courbe B obtenue en utilisant le même traceur qu'à l'exemple 8-1. Comme on le voit dans la figure, les courbes expriment la réponse aigué à la dose, appropriée pour la RIA et, en particulier, la sensibilité est plus grande en utilisant le traceur ayant un groupe de pontage différent de celui de l'antigène dans le cas du même groupe de pontage. I1 est entendu que l'invention n'est pas limitée aux modes de réalisation préférés décrits ci-dessus à titre d'illustra- tion et que l'homme de l'art peut y apporter diverses modifications et divers changements sans toutefois s'écarter du cadre et de l'esprit de l'invention. R E V E N D I C A T IONS 1 - Nouveaux dérivés de ptérine, caractérisés en ce qu'ils répondent è la formule générale OH ,-% N +R " N HN R7 Q-R dans laquelle R représente un groupe hydroxyphényle, hydroxyphényle. radio-iodé, tyraminocarbonyle, tyraminocarbonyle radio-iodé, pro- téinocarbonyle ou carboxy; Q représente un groupe alkylène à chaîne droite ou ramifiée en C1-C6; et R6 et 7 représentent chacun un atome d'hydrogène ou un groupe alkyle en C1-C6, ou hydroxyalkyle en C1-C6. 2 - Composé selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'il consiste en 4-hydroxy-2-[2-(4-hydroxyphényl)éthyl]amino-6- (L-érythro-1,2-dihydroxypropyl)ptéridine radio-iodée. 3 - Composé selon la revendication 1, caractérisé-en ce qu'il consiste en 2-[5-(tyraminocarbonyl)pentylamino]-4-hydroxy-6- (L-érythro-l,2-dihydroxypropyl)ptéridine radio-iodée. 4 - Composé selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'il consiste en produit de conjugaison 2-(5-carboxypentylamino)-4- hydroxy-6-(L-érythro-1,2-dihydroxypropyl)ptéridine-BSA. - Composé selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'il consiste en 2-(5-carboxypentylamino)-4-hydroxy-6-(L-érythro-1,2- dihydroxypropyl)ptéridine. 6 - Procédé de détermination radio-immunologique des ptérines, caractérisé en ce qu'on utilise comme traceur un composé radio-iodé selon la revendication 1 dans lequel R est un groupe hydroxyphényle radio-iodé ou tyraminocarbonyle radio-iodé.