FR 2465784 A1 19810327 FR 8019925 A 19800916 -1 - La présente invention concerne un hétéro- polysaccharide dénommé hétéropolysaccharide S-114. Le produit S-84 peut être préparé par fer- mentation d'un milieu nutritif approprié avec un or- ganisme n'ayant pas été décrit jusqu'à présent, d'a- près des études taxonomiques poussées, qui est une es- pèce de Pseudomonas non-dénommée. Un dépôt permanent sans restriction de cet organisme utilisé dans la pro- duction du présent hétéropolysaccharide a été effec- tué avec l'American Type Culture Collection le 10 sep- tembre 1979 sous le numéro d'inscription ATCC 31562. Les considérations suivantes rendent la dé- finition d'une nouvelle espèce de Pseudomonas justi- fiée et nécessaire. Description de la souche A. Caractéristiques de morphologie des colonies De petites colonies jaunes apparaissent sur gélose nutritive en deux jours à 30C. Le diamètre atteint environ 1,2 - 1,8 mm après incubation pendant LO 4 jours. Les colonies sont rondes, lisses, convexes et opaques. Les propriétés gluantes ne sont pas signi- ficatives. On n'observe pas de texture membraneuse. Sur gélose YM, de petites colonies jaunes mucoldiques apparaissent en deux jours à 301C, le cubation. Les colonies sont rondes, lisses, convexes et translucides. Des formes à protubérances avec des cercles concentriques peuvent se développer en cas d'incubation prolongée. On n'observe pas de texture membraneuse. B. Caractéristiques de morphologie des cellules La souche S-84 est une bactérie Gram-négative en forme de bâtonnet. Sur gélose nutritive (culture de 2 jours), les dimensions moyennes de la cellule sont d'environ 0,5-0,6 sur 1,2-1,6,um; une extrémité de la cellule est amincie. Des cellules très longues (d'en- viron 8-10um de longueur) peuvent apparaitre et les cellules ne sont pas colorées uniformément parce que des structures du genre à vacuoles peuvent apparaître avec une incubation prolongée. Sur gélose YM (culture de 2 jours), les di- mensions moyennes des cellules sont de 0,6 sur 1,6- 2,0dm et une extrémité de lebellule est souvent amin- cie. On observe souvent des bâtonnets courbes et des structures du type à vacuoles apparaissent aussi. Par- fois, on peut observer des bâtonnets minces, très longs. On n'a pas observé d'accumulation de PHB. Une agrégation en palissades est courante sur gelose YM. Les colorations des flagelles (méthode au nitrate d'argent modifiée) montrent que la souche est flagellée de manière monotriche polaire. C. Caractéristiques physiologiques et biochimiques Résultat faible ou négatif avec la cyto- chrome-oxydase; positif avec la catalase. L'organisme est capable de développement à 530 C, mais pas à 370 C. Tolérance à 5,0 % de NaCl, mais pas à 6,5 % de NaCl. Développement à des pH compris entre 5 et 11. De l'acide, mais pas de gaz, a été produit dans des conditions aérobies à partir des hydrates de carbone suivants: L-Arabinose Mannose D-Glucose Maltose Fructose Mannitol Galactose Il n'y a pas eu d'acide produit à partir des 2465?84 hydrates de carbone suivants: D-Xylose Àdonitol L-Rhamnose Dulcitol Lactose Sorbitol Mélibiose balicine Sucrose Inuline 2réhalose Inositol Raffinose aucune réduction d'acide n'a été observée dans le lait tournesolé. mais on a observé une pepto- nisation. De l'ammonium a été produit, mais pas H2S. Les résultats avec ADH, ODC et LDC ont été négatifs; positifs avec PDA. Les résultats d'essais avec l'u- réase, l'indole, LR, VP et le citrate de Simmons ont été négatifs. Nitrate et nitrite non réduits. Les es- sais avec la phosphatase et le 3-cetolactose ont été négatifs. La gélatine, la caséine, l'amidon, Tween 80, l'esculine et le jaune d'oeuf ont été hydrolysés. Pas de survie à 60c pendant 5C minutes. L'organisme se développe sur gélose EM-B, MacConkey et lellurite, mais pas sur gélose SS ou Pseudosel. Les colorants Bleu Nil et Rouge Congo n'ont pas et_ absorbés. D. Essai de sensibilité aux antibiotiques c5 La souche S-84 est sensible aux antibiotiques suivants: Kanamycine................ Néomycine.......... ..... Chlorotétracycline.............DTD: Colistine................ Novobiocine............... Erythromycine............... Polymyxine B............... Tétracycline............... Gentamicine............... /ug /ug / ug /ug 1 5/us 300 unités / g lO7i,g -4- La souche S-84 n'est pas sensible aux anti- biotiques suivants: Pénicilline...........-.. l. 10 unités Carbénicilline. .......... 50 /g E. Caractéristiques de nutrition D-Xylose D-Arabinose D-Glucose D-ILannose D-Galactose D-Fructose Sucrose Tréhalose Laltose Cellobiose Amidon Acétate Heptanoate Pélargonate Malonate Succinate Fumarate L-Malate DL-Tartrate..DTD: DL-p-Hydroxy- butyrate Glycellate Citrate Pyruvate Mannitol n-propanol Phényl- acetate uinate L-c-Alanine L-Aspartate L-Histidine L-Proline L-Tyrosine a-céto- glutarate 2G F. Identification par système API La souche S-84 n'a pas été identifiée par les systèmes à tubes API ou OXI/FERM. Cela suggère que l'organisme ne pourrait pas être isolé à partir d'une source clinique. G. Identification La souche S-84 est un organisme Gram-négatif, en forme de bâtonnet, avec flagelles polaires. Elle est aérobie; l'action de la cytochrome-oxydase est faible ou négative et celle de la catalase est posi- tive. Selon la définition du Bergey's Manual (8ème édition), cet organisme est un membre du genre Pseudomonas. TABLEAU I. Essais biochimiques souche S-84 et autres essais divers utilisés pour la Oxydase: de Kovac Pathotech Catalase Milieu OF: oxydant fermentatif Gaz à partir de glucose Production de H2S: TSI à partir de cystine Ammonium à partir de peptone P-galactosidase (ONPG) Arginine dihydrolase Lysine décarboxylase Ornithine décarboxylase Tryptophane désaminase Phénylalanine désaminase Uréase Indole Essai MR Essai VP Réduction de nitrate Réduction de nitrite Dénitrification Fixation de N2: Développement dans milieu de Burk Hydrolyse da Gélatine Caséine Amidon Tween 80 Pectine Alginate Cellulose Chitine ADN Esculine + m + + + NT + Développement sur divert Gélose EMB Gl ose MvIacConkey Gélose SS Gélose au sel de mannit Gélose TCBS Gelose au sang et au tellurite de Tinsdale Gélose Pseudosel + + + + NT NT +/ s milieux: + tol - + Production de pigment: Milieu King A Milieu King B + I \k- I ra n Co TABLEAU I (Suite) Activité de nitrogénase Malonate (oxydation) Phosphatase Hémolyse (sang de mouton) Lait tournesol6: acide, réduction seulement Production de 3-cétolactose Survie à 600 C pend. 30 min TSI: Culture inclinée "Butte" Gaz Réaction au jaune d'oeuf NT + NT Réaction de colorants: Rouge Congo Bleu Nil pas de changement de couleur pas de changement de couleur I ut - + = positif - = négatif NT = pas essayé ra ou VIl oe Conditions de fermentation L'hétéropolysaccharide S3-e4 est produit durant la fermentation aérobie de milieux nutritifs appropries dans des conditions contrôlées par inocula- tion de l'organisme de l'espèce non-dénommée de Pseudomonas. Les milieux sont des milieux usuels, contenant une source de carbone, d'azote et des sels inorganiques. En générai, des hydrates de carbone (par exemple glucose, fructose, maltose, sucrose, xylose, mannitol, sirop de mais, amidon, etc) peuvent 8tre utilisés isolément ou en combinaison comme sources de carbone assimilable dans le milieu nutritif. La quan- tité exacte de la source ou des sources hydrate de carbone qu'on utilise dans le milieu dépend en partie des autres ingredients du milieu, mais, en gt.néral, la quantité d'hydrate de carbone varie habituellement entre 2 et 4 5x environ du poids du milieu. De préférence, on utilise 3,- de glucose. Ces sources de carbone peu- vent 6tre utilisées individuellement ou plusieurs de ces sources de carbone peuvent être combinées dans le milieu. En général, de nombreuses matières protéiques peuvent être utilisées comme sources d'azote dans la fermentation. Des sources d'azote utilisables sont, par exemple, des hydrolysats de levures, de la levure primaire, de la farine de soja, de la farine de graines de coton, des hydrolysats de caséine, de la liqueur de macération de mais, des résidus solubles de distilla- tion, de la pâte de tomates, etc. Les sources d'azote, isolément ou en combinaison, sont utilisées à raison de 0,05 à 0,2 %b environ du poids du milieu aqueux. Parmi les sels inorganiques nutritifs qui peuvent être incorporés dans les milieux de culture, se trouvent les sels usuels capables de donner des ions de sodium, de potassium, d'ammonium, de calcium - 2465784 et des ions phosphate, sulfate, chlorure, carbonate, etc... Sont inclus aussi des métaux présents en quan- tités de l'ordre de traces comme le cobalt, le manga- nèse, le fer et le magnésium. Il y a lieu de noter que les milieux décrits dans les exemples sont seulement illustratifs de la grande variété de milieux pouvant être utilisés, et ne doivent pas être considérés comme limitatifs. Une caractéristique importante des milieux est que quand la souche S-84 est cultivée dans des conditions de basse teneur en Ca++, c'est-à-dire dans de l'eau désionisée ou dans un système aqueux ayant moins de 200 ppm d'ions Ca++, la gomme résultante est facilement soluble dans les solutions sans gélifica- tion. La fermentation est effectuée à des tempéra- tures comprises entre 25 et 3550 environ; toutefois, pour les meilleurs résultats, il est préférable de conduire la fermentation à des températures comprises C entre 28 et 520C environ. Le pH des milieux nutritifs pour le développement de la culture de Pseudomonas et pour la production du polysaccharide S-84 peut varier entre 6 et 8 environ, de préférence entre 6,5 et 7,5. Bien que le polysaccharide S-84 soit pro- duit par culture tant en surface qu'immergée, il est préféré de conduire la fermentation à l'état immergé. On effectue commodément une fermentation à petite échelle en inoculant un milieu nutritif appro- yC, prié avec la culture et, après transfert à un milieu de production, en permettant à la fermentation de s'effectuer à une température constante de 3000 envi- ron sur une secoueuse pendant plusieurs jours. La fermentation est commencée dans un fla- con stérilisé de milieu par une ou plusieurs étapes -CI de développement de germes. Le milieu nutritif pour l'étape de développement de germes peut être une com- binaison appropriée quelconque de sources de carbone et d'azote. Le flacon de développement de germes est secoué dans une chambre à une température constante de 301C environ pendant 1 à 2 jours, ou jusqu'à ce que le développement soit satisfaisant, et on utilise un peu du développement végétatif résultant pour inoculer un deuxième étage de développement de germes ou le milieu de production. Les flacons des étages in- termédiaires de développement de germes quand on les utilise, sont développés essentiellement de la même manière; c'est-à dire qu'une partie du contenu du fla- con du dernier étage de développement de germes est utilisée pour inoculer le milieu de production. Les flacons inoculés sont secoués à une température cons- tante pendant plusieurs jours et à la fin de la pé- riode d'incubation les contenus des flacons sont re- cueillis par précipitation par un alcool approprié com- me l'isopropanol. Pour un travail à grande échelle, il est préférable de conduire la fermentation dans des réser- voirs appropriés équipés d'un agitateur et d'un moyen pour aérer le milieu de fermentation. Selon ce procé- dé, le milieu nutritif est préparé dans le réservoir et stérilisé par chauffage à des températures allant jusqu'à 121 0 environ. Après refroidissement, le mi- lieu stérilisé est inoculé avec des germes obtenus précédemment de la culture productrice et on laisse s'effectuer la fermentation pendant un laps de temps de, par exemple, 2 à 4 jours tout en agitant et/ou en aérant le milieu nutritif et en maintenant la tem- pérature à 500C environ. Ce procédé de production du S-84 convient particulièrement bien pour la prépa- ration de grandes quantités. 246S784 -10- Le produit est recueilli à partir du milieu de fermentation par précipitation par un alcool appro- prié, comme l'isopropanol. Hétéropolysaccharide S-84 L'hétéropolysaccharide produit par une es- pèce non-dénommée de Pseudomonas est composé princi- palement d'hydrates de carbone avec 1-5 % de groupes acétyle comme l'ester à liaison 0-glycosidique et 2-7 % de groupes pyruvate. i0 La portion hydrate de carbone du polysaccha- ride S-84 contient 8-15 % d'acide glucuronique; -50 % de glucose; 35-45 % de mannose; 5-15 % de rhamnose; et 3-9 % d'arabinose. La teneur en groupes acétyle de 1-5 % a été déterminée en traitant une solution aqueuse à 0,2 % de gomme S-84 par un réactif alcalin, l'hydroxylamine, cela étant suivi d'un traitement par un réactif chlo- rure ferrique acide LS. Hestrin (1949) J. Biol. Chem. , pages 249-261]. Les sucres neutres du polysaccharide S-84 ont été déterminés en dissolvant 10 mg du produit dans 2 cm3 de solution 2N de H2S04 et en chauffant le mé- lange à 100 C pendant 4 heures. La solution résultante a été refroidie, neutralisée par l'hydroxyde de baryum et on a porté le pH à 5-6 au moyen d'anhydride carbo- nique solide. Le précipité résultant de sulfure de ba- ryum a été éliminé par centrifugation et le liquide surnageant a été concentre à l'état d'un sirop sous pression réduite. On a tenté d'identifier lesoucres dans l'hydrolysat par chromatographie gaz-liquide de leurs dérivés aldononitrile acétate sur un chromato- graphe modèle 5750 de Hewlett-Packard en utilisant 3 % en poids d'OV-225 sur Gas Chrom Q en particules de 0,149 à 0,177 mm à 210 C. On a identifié et déterminé quantitativement les sucres par comparaison avec des -11 étalons authentiques LJ.1. Baird,:.J. Holroyde, et D.C. Ellwood (1973) Carbohydr. Res. 27 pages 4;4-467]. Les divers sucres neutres des polysaccha- rides ont éte caractérisés aussi par utilisation de chromatographie descendante sur palier sur du papier pour chromatographie 'hatman 1 I en utilisant comme solvant la couche supérieure d'un mélange pyridine: acétate d'éthyle: eau (2:5:5). On a coloré les chro- matogrammes en utilisant une immersion dans le nitrate d'argent et un reactif pour pulvérisation phtalate d'alanine acide. Les sucres constituants ont été iden- tifiés par cochromatographie avec des étalons de su- cres et par la réactionde couleur spécifique avec le reactif phtalate d'alanine. La teneur en acide glucuronique du poly- saccharide a été déterminée par deux mé-thodes sépa- rées. Dans une méthode, l'échantillon a été decarboxylé par de l'acide chlorhydrique à 19 %o et l'anlydride carbonique libéré a été recueilli dans de l'hydroxyde 2U de sodium normal et on a effectué des déterminations par titrage en retour LB.L. Browning (1967) -Lethods of Wood Chemistry II, pages 632-633] et par la méthode colorimétrique au carbazole LT. Bitter et H.M. Muir (1962) Anal. Biochem. 4 pages 33G-334]. On a utilisé une électrophorèse sur papier pour la séparation et la tentative d'identification de l'acide glucuronique présent dans l'hydrolysat acide neutralisé décrit ci-dessus. Des portions aliquotes de ce dernier et des étalons connus d'acide glucuro- nique ont été appliqués sur du papier pour électropho- rèse Camag N 68-011 et on a effectué une électro- phorèse pendant 2,0 heures dans un tampon au pH 2,7 en utilisant un appareil d'-électrophorèse Camag modèle HVE. Les chromatogrammes ont été colorés avec le réac- tif pour immersion au nitrate d'argent afin de locali- -12 - ser les acides glucuroniques séparés. Le polysaccharide S-P-4 donne de la viscosité à un milieu aqueux quand il est dissous dans l'eau à de faibles concentrations. Pour cette raison et aussi pour sa sensibilité au cisaillement et sa rhéologie d'ensemble, il est utile comme épaississant, agent de suspension, émulsionnant, stabilisant, lubrifiant, agent filmogène ou liant, spécialement dans des sys- tèmes aqueux. En particulier, il a des utilisations dans les applications suivantes ou les produits sui- vants: adhésifs, ciments pour joints de murs, mortiers liquides et mortiers retenant l'eau, enduits pour bou- chage de fissures, étanchéité des boites de conserve, produits pour chaudières, crémage du latex, fondants pour baguettes de soudure, pâtes à braser, vernis cera- miques et extrusions, produits de nettoyage et de bril- lantage, jouets, émulsions (latex, asphalte, silicone), récupération de l'argent, enrobages de semences, ré- glage de la pulvérisation pour pesticides ou herbicides, pesticides et herbicides fluides et concentrés émul- sionnables, liants pour tabac, encres à base d'eau, solutions pour distributeurs lithographiques, produits de finition pour cuir, hydropaillage et hydro-semis, impression et finition de tissus, additifs pour papier à ajouter dans la partie humide, adjuvant de rétention et de formation pour papier à ajouter dans la partie humide, produits antiadhésifs, agents de démoulage, résines liquides, explosifs en bouillie et emballés, boues de forage pour puits de pétrole et puits d'eau, fluides de stimulation pour pétrole, produits de beau- té, suspensions et émulsions pharmaceutiques. De plus, cette gomme est utile dans des pro- duits alimentaires tels que des gelées et d'autres pro- duits d'une haute teneur en sucre, des boissons compre- nant des boissons à base d'acide citrique, des produits -13- laitiers comprenant la crème glacée et le yaourt, des assaisonnements pour salade, des mélanges secs, des glaçages, des sirops, les gâteaux dits puddings, des aliments farineux, des aliments en boites de conserve et passés à l'autoclave et des produits de remplissage pour boulangerie. Une utilité particulièrement intéressante se trouve dans le domaine de formation de gels explosifs. On trouvera ci-après des exemples plus détaillés illus- trant cette utilisation préférée. Bien que la gomme S-84 possède une propriété générale consistant à donner de la viscosité, son pro- fil particulier de propriétés en solution est une ca- ractéristique distinctive qui permet de la distinguer des autres hétéropolysaccharides. On donne ci-après un aperçu de ces propriétés distinctives. Brièvement, la gomme présente (1) une excellente stabilité à la chaleur, à savoir une perte de viscosité de seulement 12 % quand elle est maintenue à 8000 pendant 2 heures; (2) une excellente réponse aux sels, la vis- cosité du produit augmentant en présence de KCl; (3) une bonne stabilité aux alcalis dans un essai accéléré très sévère (800C pendant 2 heures avec NaOQ à 15 %); (4) bonne capacité de suspension comme mon- tré par une valeur de WYV de 31 dynes/cm; (5) bonne formation de film. Une étude plus poussée de la stabilité à la chaleur de ce produit a montré que seulement 28 % de sa viscosité initiale était perdue par passage à l'au- toclave à 121 0 et à 1,05 kg/cm2 pendant 15 minutes. Les propriétés suivantes de la gomme: bonne viscosité dans la saumure (iCC et NaCl) et dans l'eau de mer, bonne stabilité aux alcalis et à la chaleur, 246S784 -14- viscosité constante dans l'intervalle de pH de 1,5 à 12,1 et bonne stabilité au cisaillement, la rendent spécialement utilisable pour des applications indus- trielles comme dans des compositions de gels explosifs. 1. Viscosité et cisaillement A. Brookfield 1. 1,0 % 60 tpm 800 cPo 6 tpm 4700 cPo Rotor N 2. 0,1 % (adaptateur UL)a 3 CPo 3. 0,5 % WellsBrookfield à 9,6 s- 24 cPo B. Cisaillementb 1. n à 1,92 s-1 4480 cPo 1050 cPo 2. n à 9,6 s 1050 cPo 3. n à 76,8 s 176 cPo 4. n à 384 s-I 48 cPo 5. n à 3842 s-1 48cPo 6. n à 9,6 s- 22973 cPo C. Stockage à 4,4 C 920 cPo, rotor N 3 à 60 tpm; gélatineux; écoulement discontinu, très saccadé; accroissement de viscosité de 15 % au-dessus de la viscosité à la tempé- rature ambiante. 2. Stabilité aux acides, aux bases et à la chaleur A. Stabilité 1. Acide acétique plus chaleur -- a. valeur initiale de n: 900 cPo b. valeur finale de n: 50 cPo c. % de changement: -40 % 2. HC1 à 10 % plus chaleur -- a. valeur initiale de n: 845 cPo b. valeur finale de n: perte totale cPo c. % de changement: perte totale % i -15- 3. NaCH à 15 % plus chaleur -- a. valeur initiale de n b. valeur finale de n c., de chaangement 4. Chaleur seulement -- a. valeur initiale de n b. valeur finale de n c. % de changement Effet du pH 1. Acide acétique à 5,% 2..E4OH à 5 > 1 : 998 cPo : 61 cPo : -31 % : CPo : 885 cPo : -12 % pH 2,96 pH 11,23 885 cPoc 247 cPoc 53. Compatibilité des sels et des colorants A. Sels 1. CaC12 (saturé) Compatible 2. Polyphosphate d'ammonium Précipité 3. Iqi#4NC3 à 60 % Compatible 4. 1 A1tl2(SG4)3.18H20 Compatible 5. 1 % CaC12. 2H20 Compatible 6. I % KCl Compatible 7. 0,1 % KC1 998 cPOc 8. 2,5 % ECl.1560 cPoc - B. Colorants 1. Vert "Elilling" Compatible 2. Bleu de méthylène Précipité 4. Propriétés texture/écoulement Gomme de viscosité moyenne; écoulement légè- rement saccadé; gélatineux; pas gommeux au toucher. 5. Synergie et enzymesc n à 1 %, n à 0 heure n après 2 heures Guar H.P. Guar CMC HEC 1797 cPo 1754 cPo 832 cPo 550 cPo i050 cPo du mélange 217 cPo 1126 cPo 89 cPo 410 cPo du mé1ange 1254 cPo 909 cPo 269 cPo 760 cPo B. B. C. D. E. - iw- Viscosité - prévisible Éynergie A. Guar 1375 cPo Néant B. -.P. Guar 150 cPo éant C. CeC ICo10 cPo l éant D. HEC 760 ceFo Néant 6. Réactivité avec le lait A. Dispersion: excellente B. Séparation du petitlait: 1er jour 1G C. autres observations: 7. Formation de film Formation d'un excellent film; plastique; bonne résistance à la traction; film très clair. aViscosité mesurée sur un viscosimètre Brookfield modèle LVF à 6 tpm avec le rotor I 1 et un adapta- *teur UL. broutes mesures effectuées sur un micro-viscosimètre -t ells-Brookfield modèle TVT-c/p CViscosité mesurée sur un micro-viscosimètre bells- 2c Brookfield modèle RV2-c/p à 9,6 s-1. Exemple 1 Procédé de fermentation pour production d'hétéropol- saccharide S-84 Entretien de la culture -5 L'organisme Pseudomonas nondénommé, ATCC 31562, pousse très bien sur un milieu de gélose E-1, avec une bonne morphologie des colonies. Le milieu E-1 est le suivant (on ajoute au milieu solide 1,5 % de gélose): K2HP04. ............... 0,5 % I'h4NG3........ 09 % Promosoy................. 0,05 % Mg504.7H20. ........ .... 0,01 % Eau du robinet >5 source de carbone (3 % d'amidon hydrolysé) -17- La température d'incubation est de 30 C, et pendant..DTD: 72 heures. B. Préparation de germes Des germes en ballons sont préparés dans du bouillon YM mis à incuber à 3'CQ pendant 24 heures, puis utilisés comme germes pour du milieu E-1, qui est mis à incuber à 30 0 pendant 72 heures. On effectue aussi une fermentation à petite échelle sur E-1 conte- nant 3 % de glucose au lieu d'amidon, donnant un pro- duit d'une viscosité légèrement plus forte. C. Milieu dans le fermenteur final La matière isolée a été développée dans des fermenteurs de trois capacités (14 litres, 20 litres et 70 litres) et les résultats sont présentés dans le Tableau 2. Dans chaque cas, le milieu du fermenteur final était E-1 plus 1 ppm de Fe+ et 3 > de glucose comme source de carbone. On a fait démarrer des germes dans du bouillon YM et on les a laissés incuber pen- dant 48 heures à 300C sur une secoueuse rotative. Pour les fermenteurs de 14 litres, on a utilisé de tels germes YM pour ensemencer cinq flacons contenant le milieu E-1 et on a utilisé ces derniers à 24 heures pour inoculer un fermenteur de 14 litres. Pour les plus grands fermenteurs, on a utilisé des germes dans du bouillon YLI vieux de 48 heures pour inoculer un fermenteur de 3,785 litres contenant le milieu du fer- menteur final. On a laissé la fermentation s'effectuer dans ces fermenteurs de 3,785 litres pendant 48 à 72 heures avant de les utiliser pour inoculer les plus 3G grands fermenteurs. On a fait fonctionner les fermenteurs à 300C. Les débits d'air et vitesses d'agitation pour chaque fermenteur étaient initialement les suivants: -18- (1) 14L 3L/M, 400 tpm (2) 20L 10L/M, 300 tpm (3) 70L 2OT/M, 3CO tpm Le débit d'aération est resté constant durant toute la période de fermentation. On a augmenté l'agitation durant la fermentation suivantle besoin pour obtenir un bon mélange. La quantité de phosphate dans le milieu pour les fermenteurs de 14, 20 et 70 litres a été ré- duite à 0,05 % et le pH a été réglé à 6,5-7,5 par l'ad- dition automatique de KOH à 25 %. Les résultats de ces productions & plus grande échelle sont présentés dans le tableau suivant: CARAC'ERISTk'XT. UEb DE PRODUCTIOi' A PLUS GRU-CDE ECHELLE DE S-84 Fermenteur 14L L L ge (heures) j9 Viscosit6 de la bière (cPo) RCS ND 1,36 I,06 0,53 0,17 n,47 1, 65 0,80 0,10 2,50 ND 1,10 0,10 Rendement (%) 0,20 0,78 0,99 I,08 I,11 0, 59 0,98 I,48 I,92 0,17 0,27 0,88 1,59 Viscosité à 1 I (cPo) I -s1 %.O I ru CI ui J' ú0 -20- D. Recueil Le recueil a été effectué par précipitation par 2-3 volumes d'isopropanol à 99 %a. Lors d'une pas- teurisation, les conditions sont un chauffage à 750 C pendant 10 à 15 minutes avant le recueil. E. béchage Le produit peut être recueilli après séchage à 50-55 C pendant environ une heure dans un séchoir à plateaux à air forcé. Le produit préparé dans cet exemple donne à l'analyse les résultats suivants: 10,4 % d'acide glucuronique par décarboxylation; 13,1 %O d'acide glu- curonique par analyse colorimétrique; 3,5 % de groupes pyruvate; 2,9 %, de groupes acétyle; 45 % de glucose; 39 % de mannose; 10 % de rhamnose; 6 % d'arabinose; et 7,2 % de protéine. Il est encore caractérisé comme étant une gomme anionique de viscosité moyenne (800 cPo). La viscosité augmente de 15 % par réfrigération toute une nuit. Il a une bonne stabilité, pendant seulement 12 % de viscosité à 80 C pendant deux heures. D'autres es- sais ont indiqué une perte de viscosité de 28 % par passage à l'autoclave à 121 C pendant 15 minutes. Il est très réactif avec ECl car sa viscosité augmente de 25 % en présence de 2,5 % KC01. Il forme un film plas- tique d'une bonne résistance à la traction. Il a un seuil d'écoulement de 31,5 (solution à 1 % dans l'eau DI). Exemple 2 nO S-84 d'une basse teneur en calcium Du S-84 d'une basse teneur encalcium peut être préparé comme dans 1'exemple 1, à ceci près qu'on utilise de l'eau désionisée, I ppm de Fe++ et 2 ppm de Ca++. Pour un bon développement, on peut ajouter de petites quantités d'oligo-éléments comme des vita- -21- mines ou des métaux. Le produit d'une basse teneur en calcium a une excellente stabilité à la chaleur. Exemple 3 Compositions Les bouillies explosives aqueuses sont géné- ralement composées de sels oxydants choisis parmi di- vers nitrates et perchlorates d'ammonium et de métaux alcalins et peuvent contenir aussi des combustibles insolubles, des sensibilisateurs, des épaississants et des agents de réticulation. La gomme de guar est habituellement l'épaississant principal en raison de son coû.t, de sa solubilité et d'autres considérations; toutefois, laéomme de guar n'est pas stable dans les solutions oxydantes chaudes utilisées et il en résulte de sérieuses pertes de viscosité et une moins bonne résistance à l'eau des bouillies explosives réticulées. Le brevet des E.U.A. No 3 728 173 enseigne l'utilisa- tion de gomme de guar plus gomme de xanthane pour l'ob- tention d'une stabilité de longue durée et le brevet des E.U. . NI 3 867 320 enseigne que l'addition de gomme de xanthane améliore la résistance à l'eau de bouillies épaissies. On utilise de préférence des agents de réti- culation avec l'agent épaississant de manière à sta- biliser encore la dispersion de combustibles et de matières insolubles en suspension, et spécialement afin de stabiliser les bouillies dans des trous de sonde contenant de l'eau, c'est-à-dire de leur donner de la résistance à l'eau. De petites quantités de chromates sont les agents de réticulation que l'on utilise le plus couramment, bien que beaucoup d'au- tres aient été utilisés pour gélifier les bouillies afin de produire les effets mentionnés ci-dessus. C'est donc une exigence concernant l'épaississant qu'il se réticule facilement ou au moins donne de la -22- résistance à l'eau en ne gênant pas la réticulation de la gomme de guar. Bien que la gomme de xanthane soit utilisée en combinaison avec la gomme de guar pour améliorer la stabilité et la résistance à l'eau, on a trouvé que le polysaccharide S-84 est plus efficace que la gomme de xanthane pour améliorer la résistance à l'eau, a une bonne solubilité dans des solutions concentrées chaudes de nitrate d'ammonium et ne gêne pas la réti- culation par les chromates. On a effectué des essais de résistance à l'eau en préparant 500 g d'une solution à 70 % de ni- trate d'ammonium dans de l'eau à 700 C et en dissolvant un mélange de 1,0 g de gomme de guar plus 0,5 g de gomme de xanthane ou de polysaccharide S84 pendant deux heures. La solution était placée dans un flacon bouché dans lequel on avait ajouté 0,25 cm3 d'une so- lution à 20 % de nitrite de sodium et 1,0 cm3 d'une solution à 50 % de dichromate de sodium. On ajoutait aussi 0,05 % de thio-urée afin de limiter la réaction de la solution de nitrite dégageant du gaz. Le mélange chaud était secoué énergiquement pendant 15 secondes, puis versé dans un litre d'eau à la température am- biante. A ce moment, la gélification commençait et des bulles de gaz commençaient à se former dans le gel. On évaluait les gels en ce qui concerne la résistance à l'eau en observant à la surface du gel à la surface du gel la présence de bandes ondulées de gel contenant du gaz faisant saillie de la surface. Une bonne résis- tance à l'eau est montrée par une surface continue avec peu de bandes ondulées parce que le gaz est em- prisonné dans la matrice du gel et ne peut pas s'é- chapper. Des observations ont été effectuées après une heure et après 24 heures avec les résultats sui- vants: -23- Spaississant Résistance à l'eau (1) 1,5 g guar ELédiocre après 24 heures (2) 1,5 g guar Bonne 0,5 g gommee de xanthane (5) 1,C g guar Bonne 0,5 g S-b4 (4) 1,C g guar Bonne 0,4 g S-84 (5) 1,25 g guar. ssez bonne. Commence à l,25 g gomme de xanthane se fragmenter légèrement après 24 heures. (6) 1,25 g guar Bonne. Surface lisse, 0,25 g S-84 plus continue qu'avec la gomme de xanthane après 24 heures. Le produit S-84 peut être utilisé pour ame- liorer la résistance à l'eau de bouillies explosives et est plus efficace que la gomme de xanthane à de plus faibles concentrations. Généralement, '-84 est plus utile dans des bouillies e:xplosives à 0,05-0,2 %, éventuellement en combinaison avec la gomme de guar à 0,05-C0,5 % (tous les poids par rapport au poids total). Les gommes peuvent être mélangées à sec et dissoutes directement dans la solution oxydante ou ajoutées sé- parément. 2465784= - REVEEDICA IONS - 1- H6téropolysaccharide S-84 contenant 8-15 % d'acide glucuronique; 40-50 % de glucose; -45 %i de mannose; 5-15 % de rhamnose; 1-5 % de groupes acétyle et 2-7 % de groupes pyruvate, préparé par fermentation dans des conditions contrô6lées d'une culture de ATCC 31562, une espèce de Pseudomonas. 2 - Produit selon la revendication 1, ca- ractérisé en ce qu'il contient moins de 200 ppm d'ions Ca++.