FR 2464993 A1 19810320 FR 8005328 A 19800310 Culture thermophile anaérobie et son application à la production d'éthanol. La présente invention concerne des cultures biologique- ment pures de micro-organismes et plus particulièrement des souches d'un anaérobie thermophile producteur d'éthanol récemment décou- verte. L'invention concerne en outre la préparation de cultures pures dudit anaérobie et un nouveau procédé pour la production d'éthanol à partir desdites cultures. On a isolé et caractérisé relativement peu d'anaérobies qui poussent sur des hydrates de carbone (bactéries glycolytiques) et donnent de l'éthanol dans des conditions thermophiles et thermophiles extrêmes. Des exemples représentatifs de bactéries anaérobies glyco- lytiques bien caractérisées qui poussent dans un milieu de culture dans la gamme thermophile à thermophile extrême appartiennent au genre Clostridium et comprennent: C. thermoaceticum, C. tartarivorum, C. thermosaccharolyticum C. thermocellum, C. thermocellulaseum et C. thermohydrosulfuricum. Des souches de ces derniers organismes ont été isolées et caractérisées par J. Wiegel et L.G. Ljungdahl (voir Abstract I 75 de l'Abstract of the Annual Meeting of the American Society of Microbiology, Las Vegas, Nevada, Etats-Unis d'Amérique, 1978, et J. Bacteriology, septembre 1979, sous presse). Une souche néotype de C. thermohydrosulfuricum E 100-69 a été isolée des liqueurs d'une usine de betteraves A sucre autrichienne par F. Hollaus et U. Sleytr (voir Arch. Mikrobiol. 86, pages 129-146, 1972). Ces micro-organismes sont, bien entendu, intéressants pour la fermentation anaérobie possible de divers hydrates de carbone, tels que les saccharides, pour contribuer, en combinaison avec d'autres bactéries (cultures mixtes), à la dégradation efficace de la cellulose, et pour la production d'éthanol et d'autres produits de fermentation dans des conditions thermophiles. La fermentation du sucre par la levure (espèce Saccharomyces), comme il est bien connu, doit être effectuée à moins d'environ 37 C dans des conditions semi-aérobies pour donner de l'éthanol. En outre, les conditions doivent être soigneusement contrôlées pour éviter la contamination par des bactéries, champignons et moisissures nuisibles. Dans l'isolement de bactéries anaérobies thermophiles, en particulier d'espèces Clostridium, d'échantillons de boue des sources chaudes en divers endroits dans le Yellowstone National Park, Etats-Unis d'Amérique, la demanderesse a découvert deux souches d'une nouvelle espèce glycolytique thermophile anaérobie. Dans l'isolement, la purification et la caractérisation de cette nouvelle espèce qui n'est pas un Clostridium, la demanderesse a trouvé que la nouvelle espèce est un producteur efficace d'éthanol à partir de divers hydra- tes de carbone, en particulier des mono- et disaccharides les plus courants. Comme la demanderesse l'a indiqué dans la demande de brevet français intitulée "Culture thermophile anaérobie productrice d'étha- nol" n0 80 05 327 déposée ce jour, la nouvelle espèce décrite ici est également intéressante dans des cultures nutritives mixtes (c'est-à- dire avec certaines espèces de Clostridium) pour la production d'éthanol à partir de cellulose. L'invention a donc pour objet des cultures biologique- ment pures d'une espèce thermophile anaérobie nouvellement découverte. L'invention a également pour objet un procédé pour la production d'éthanol utilisant des cultures biologiquement pures dudit anaérobie nouvellement découvert. L'anaérobie récemment découvert est une nouvelle espèce d'un nouveau genre isolé dans des cultures biologiquement pures et dénommé Thermoanaerobacter ethanolicus. Une souche repré- sentative de ce nouveau micro-organisme dans une sous-culture biolo- giquement pure, dénommée JW 200, a été déposée dans la collection de souches de l'American Type Culture Collection, Rockville, Maryland, Etats-Unis d'Amérique, sous le n0 ATCC 31550. La souche isolée de T. ethanolicus a été cultivée dans un milieu nutritif aqueux pour produire des quantités récupérables d'éthanol. Le nouveau procédé de l'invention est donc un procédé pour la production d'éthanol qui consiste à soumettre des hydrates de carbone à l'action de fermentation du micro-organisme nouvellement isolé T. ethanolicus dans une culture biologiquement pure pour former de l'éthanol et à récupérer ledit éthanol. Pour les buts de l'invention, le terme "thermophile" désigne une température de culture comprise entre environ 45 et 70'C et le terme "thermophile extrême" désigne des températures de culture supérieures à environ 70 C. Comme il sera évident pour l'homme de l'art d'après la description ci-après et d'après la morphologie et le schéma de fermentation uniques, en particulier l'aptitude du micro-organisme a pousser à des températures thermophiles et thermophiles extrêmes, la souche T, ethanolicus nouvellement découverte se distingue nettement des autres genres thermophiles anaérobies. Le micro-organisme de l'invention a été découvert et isolé dans des échantillons de boue de sources chaudes du Yellowstone National Park, Wyoming, Etats-Unis d'Amérique. Une souche, JW 201, a été isolée dans une source acide, la Dragon Mouth, ayant un pH d'environ 5,5, et la seconde souche, JW 200, dans une source alca- line, la White Creek, d'un pH d'environ 8,8. Les souches sont très semblables et ont été découvertes en association avec les souches Clostridia thermophiles anaérobies mentionnées ci-dessus. Bien que les nouvelles souches de micro-organismes partagent,avec les Clostridia mentionnées ci-dessus, l'aptitude à faire fermenter les hydrates de carbone à des températures thermo- philes, elles ne forment pas de spores et sont donc exclues du genre Clostridium. D'autres caractéristiques les excluent de genres carac- térisés et connus. Au vu de la morphologie et des caractéristiques de fermentation, on pense que ces souches sont un nouveau genre, l'espèce désignée ci-après Thermoanaerobacter ethanolicus, ATCC 31550 étant représentative de ces souches. L'isolement des nouvelles souches è partir des échan- tillons de boue a été effectué en utilisant la technique anaérobie selon Hungate, Bacteriol. Revo 14, pages 1-49, modifiée par Bryant et Robinson, J. Dairy Science 44, pages 1446-1456, cette technique étant familière a l'homme de l'art. Le milieu utilisé pour les cultures d'isolement et d'enrichissement et pour entretenir des souches isolées présente la composition préférée suivante: KH2PO4: 1,5 g/l; Na2HP04,12H20: 42 g/l; NH4C1:Cl 0,5 g/l; MgC12: 0,18 g/l; extrait de levure (Difco): 2,0 g/l; glucose: 8,0 g/l; et solution minérale de Wolfe: 5 ml/l. Le milieu est préparé en conditions anaérobies et doit être conservé en atmosphère de gaz inerte tel qu'azote ou argon. Le pH du milieu est de l'ordre d'environ 6,8 à 7,8, de préférence 7,3, et on l'ajuste selon le besoin avec une solution anaérobie, stérile de NaOH ou HC1. Les cultures de réserve sont entretenues sur le même milieu solidifié avec 2% de gélose et stockées à 4 C. Les cultures sur.milieu liquide peuvent être conser- vées à -18oC après addition d'un égal volume de glycérol. Bien que le glucose soit le substrat hydrocarboné préféré dans le milieu nutritif cité à titre d'exemple, on peut utiliser d'autres monosaccharides, tels que xylose, ribose, mannose, fructose et galactose, et des disaccharides, tels que saccharose, lactose, maltose et cellobiose. La croissance a également lieu sur pyruvate, pectine et amidon. On notera que les deux souches de T. ethanolicus nécessitent pour pousser de l'extrait de levure. Sans extrait de levure, on n'obtient pas de croissance dans les sous- cultures ultérieures. Bien que la croissance soit beaucoup plus faible qu'en présence de glucose, des concentrations d'extrait de levure de plus de 0,5% peuvent servir de seule source de carbone, d'azote et d'énergie. On peut cultiver convenablement les nouvelles souches de Thermoanaerobacter ethanolicus ATCC 31550 (JW 200) en utilisant le même milieu nutritif que pour l'isolement en conditions anaérobies à des températures d'environ 36 à 780C, la température optimale de croissance étant d'environ 680C. La période de doublement à 680C est d'environ 90 min. Il est important, cependant, que l'on puisse éga- lement entretenir une excellente croissance à une température plus élevée, telle que 720C, la période de doublement à cette température étant d'environ 120 min. L'aptitude à maintenir une croissance notable dans ces conditions thermophiles extrêmes est, bien sûr, l'une des caractéristiques distinctives de T. ethanolicus. Cette croissance ne dépend pas du pH, en ce qu'elle a lieu dans la gamme de pH très large de 4,5 à 9,8. Pour la croissance optimale, le pH du milieu doit être compris entre environ 5,7 et 8,6, le pH préféré étant d'environ 7,3. Une autre caractéristique distinctive de T. ethanolicus est son aptitude, dans les conditions décrites ci-dessus, à faire fermenter une grande variété de saccharides avec un rendement notable en éthanol. Comme on le verra dans les exemples spécifiques ci-après, on obtient un rendement atteignant jusqu'à 1,8 mole d'éthanol par motif glucose de la cellulose en fermentation à une température de C et à un pH de 7,8 en conditions anaérobies. Cependant, pour maintenir un procédé de fermentation produisant de l'éthanol, lorsque les concentrations en éthanol atteignent environ 5%, l'éthanol doit Etre séparé par des techniques classiques de distillation. Cette distillation peut être effectuée en utilisant une pression réduite (vide partiel), même pendant la fermentation en présence du micro- organisme T. ethanolicus, puisque celui-ci tolère le point d'ébulli- tion de l'éthanol (78 C). Bien entendu, la croissance est plus lente à des températures supérieures aux températures préférées. Les exemples suivants illustrent l'invention sans toutefois en limiter la portée. EXEMPLE 1 Isolement de Thermoanaerobacter ethanolicus On recueille en conditions anaérobies stériles des échantillons des sources chaudes de Yellowstone National Park. On utilise 1 g d'échantillon pour faire incuber 100 ml du milieu nutritif décrit ci-dessus. Les échantillons sont incubés à 740C. Après 3 jours, on prépare des rouleaux de dilution en utilisant des tubes anaérobies selon la technique de Hungate,modifiée par Bryant et Robinson. Après 2 jours d'incubation à 74 C, on prépare des milieux agités à la gélose à partir des tubes les plus dilués présentant la croissance. Le milieu nutritif additionné de 2% de gélose est utilisé pour les cultures sur gélose. Les milieux de gélose sont laminés et incubés à 600C à une inclinaison de 30 Les cultures finales des souches sont obtenues en choisissant des colonies uniques et en répétant plusieurs fois le mode opératoire d'agitation de gélose. Deux souches d'un nouveau genre et d'une nouvelle espèce sont découvertes et isolées sous forme biologiquement pure en utilisant cette technique et désignées sous les noms de JW 200 et JW 201, respectivement. Les deux souches sont très semblables. Les souches nouvellement découvertes sont analysées en utilisant des techniques microbiologiques classiques qui permet- tent la caractérisation et l'identification de la manière suivante a) Morphologie: Les cellules ayant poussé à 60 C présentent la motilité de basculement. Les cellules plus anciennes ou ayant poussé dans un milieu liquide ou à des températures plus élevées, telles que 75 C, présentent moins de motilité, bien qu'elles soient flagellées. La flagellation est du type péritrichal retardé, avec 1 à 10 flagelles atteignant 80/u de long. Les cellules jeunes en bâtonnets présentent souvent pendant la croissance logarithmique des extrémités pointues. Ces bâtonnets ont de 4 à 8/u de long et 0,6 à 0,9/u de large. Les bâtonnets peuvent,dans la dernière phase de croissance logarithmique, pousser jusqu'à 200/u de long, et peuvent ensuite se diviser en chaînes de bactéries pendant le début de la phase de croissance stationnaire. b) Spores: Il n'y a pas de formation de spores. c) Autres caractéristiques: Les souches sont strictement anaérobies, à gram variable, donnent un test négatif à la catalase, le pyruvate est métabolisé en passant par le système pyruvate-ferré- doxine réductase. On observe la présence de deux ferrédoxines et une rubrédoxine anaérobies. d) Conditions de croissance: La croissance nécessite de l'extrait de levure (0,2%) et une source de carbone. Les ions ammonium ne sont pas nécessaires comme sources d'azote. e) Substrat: On peut utiliser le glucose, d'autres monosaccharides et des disaccharides. La croissance a également lieu sur pyruvate, pectine, amidon etdans une faible mesure, sur extrait de levure. La cellulose n'est pas dégradée. f) Produits de fermentation: Les souches font fermenter le glucose en éthanol et C02 comme principaux produits de fermenta- tion et acétate, lactate et 112 comme produits secondaires. On a déterminé que le glucose fermente en éthanol principalement selon le schéma de Embden-Mayerhof. g) Gamme de pH: 4,5-9,8. Gamme de pH optimale: 5,7-8,6. h) Gamme de températures: Température minimale = 36 C (période de doublement Td > 100 h à 37 C) Température optimale = 68 C (Td = 1 h 30 min à 68bC) Température maximale = 78 C (Td 10 h à 76 C) i) Teneur en guanosine plus cytosine (G + C) de l'acide désoxyribonucléique (DNA): Environ 38% par une méthode du type "au densitomètre flottant" ("buoyant density method") et 32% par une méthode de dénaturation thermique. j) Taxonomie: Les souches nouvellement isolées JW 200 et JW 201 ont quelques caractéristiques semblables à celles de Clostridium thermohydrosulfuricum, la seule autre bactérie glycoly- tique anaérobie thermophile extrême, Cependant, les nouvelles souches ne forment pas de spores, ce qui les exclue du genre Clostridium. D'autres propriétés indiquées dans la présente description semblent exclure les nouvelles souches de genres précédemment identifiés qui sont décrits dans la 8e édition du Bergey's Manual of Determinative Bacteriology (Williams and Wilkins Comp. Baltimore) 1974. Les nouvelles souches représentent donc un nouveau genre et la nouvelle espèce a été dénommée Thermoanaerobacter ethanolicus. EXEMPLE 2 Fermentation utilisant T. ethanolicus On fait fermenter du glucose avec T. ethanolicus ATCC 31550 dans des tubes de culture contenant 5 ml de milieu, en utilisant des techniques classiques, 72 C sous atmosphère d'argon et à un pH initial de 7,5. La-fermentation de 44 micromoles/ml de glucose donne les produits suivants: éthanol 78,4 micromoles/ml; acétate 4,5 micromoles/ml; lactate 4,0 micromoles/ml; C02 89,2 micro- moles/ml; et H2 4,3 micromoles/ml. Cet exemple montre un bilan de fermentation complète avec un rendement en éthanol de 1,76 mole d'éthanol par mole de glucose. EXEMPLE 3 Fermentation à des températures différentes On fait fermenter trois échantillons de glucose par T. ethanolicus ATCC 31550 avec un pH initial de 7,8 sous atmosphère d'argon, dans les conditions de l'exemple 2, sauf les températures différentes. Les résultats obtenus sont indiqués dans le tableau I ci-dessous. TABLEAU I EXEMPLE 4 Reproductibilité de la fermentation On effectue trois fermentations du glucose avec T. ethanolicus ATCC 31550 à 72 C et pH 7,2 sous atmosphère d'argon. Les autres conditions sont celles indiquées à l'exemple 2. Chaque milieu de fermentation contient 45 micromoles de glucose par ml. Les résultats obtenus sont indiqués dans le tableau II ci-dessous. TABLEAU II Concentrations, micromoles/ml à 55 C à 60 C à 72 C Substrat: Glucose 24,2 26,1 23,0 Produits: Ethanol 40,0 48,0 38,0 Acétate 5,5 3,2 4,0 Isobutyrate 0,05 0,05 0,08 Isovalérate 0,075 0,05 0,08 Lactate 2,2 2,1 2,6 C 2 (non déterminé) Rendement en éthanol, moles/mole de glucose 1,65 1,83 1,65 Concentrations, micromoles/ml Produits Fermentation 1 Fermentation 2 Fermentation 3 Ethanol 78,3 77,5 80,0 Acétate 6,5 5,2 4,2 Lactate 3,5 7,2 4,9 Rendement en éthanol, moles/ml de glucose 1,74 1,72 1,77 R E V E N D I C A T I 0 N S 1. Culture biologiquement pure, caractérisée en ce qu'elle contient une souche dénommée Thermoanaerobacter ethanolicus. 2. Culture selon la revendication 1, caractérisée en ce qu'elle contient la souche Thermoanaerobacter ethanolicus ATCC 31550. 3. Utilisation de la culture biologiquemrnent pure selon la revendication 1, pour la production d'éthanol par fermentation dans un milieu nutritif aqueux. 4. Utilisation selon la revendication 3, caractérisée en ce que ledit milieu nutritif aqueux contient un substrat d'hydrate de carbone. 5. Utilisation selon la revendication 3, caractérisée en ce que ledit milieu nutritif contient un substrat d'hydrate de carbone choisi parmi les monosaccharides, les disaccharides, les pyruvates, la pectine et l'amidon. 6. Utilisation de la culture biologiquement pure selon la revendication 1,pour la production d'éthanol en quantités récupéra- bles par fermentation dans un milieu nutritif aqueux contenant un substrat d'hydrate de carbone. 7. Utilisation selon la revendication 6, caractérisée en ce que ledit hydrate de carbone est choisi parmi le glucose, le fructose, le D-ribose, le xylose, le D-mannose, le D-galatactose, le saccharose, le cellobiose, le lactose, le maltose, le pyruvate, la pectine et l'amidon. 8. Culture biologiquement pure d'anaérobie thermophile formateur d'éthanol, caractérisée en ce que ledit anaérobie est Thermoanaerobacter ethanolicus. 9. Culture anaérobie thermophile extrême, caractérisée en ce qu'elle contient Thermoanaerobacter ethanolicus. 10. Procédé de culture de Thermoanaerobacter ethanolicus caractérisé en ce que l'on cultive ledit anaérobie dans un milieu nutritif aqueux en conditions thermophiles anaérobies jusqu'à production d'une quantité récupérable d'éthanol. 11. Procédé selon la revendication 0, caractérisé en ce que ledit milieu nutritif aqueux contient un substrat d'hydrate de carbone. 12. Procédé pour la production d'éthanol, caractérisé en ce que l'on soumet un hydrate de carbone à l'action de fermentation de Thermoanaerobacter ethanolicus dans une culture biologiquement pure pour former de l'éthanol et on récupère ledit éthanol. 13. Procédé selon la revendication 12, caractérisé en ce que l'on met en oeuvre ledit procédé en conditions thermophiles anaérobies. 14. Procédé selon la revendication 12, caractérisé en ce que l'on met en oeuvre ledit procédé dans des conditions thermophiles extrêmes, anaérobies. 15. Ethanol, caractérisé en ce qu'il est produit par un procédé selon l'une quelconque des revendications 3, 6 ou 10. *