FR 2464997 A1 19810320 FR 8019399 A 19800909 L'invention fournit le gène humain isolé et purifié (cloné) codant pour la proinsuline et le gène humain codant pour la pré-proinsuline, des procédés d'isolement et de puri- fication des fènes et un procédé de transfert des gènes à, et de reproduction des gènes dans, un microorganisme. Les gènes isolés et purifiés sont exprimés par un microorganisme hâte lorsqu'ils sont fusionnés avec un gène de procaryote hôte ex- primable. Les deux gènes sont utilisables dans la production d'insuline humaine dans des buts thérapeutiques. L'insuline est une hormone produite principalement par les cellules B du pancréas. Actuellement, l'utilisation de cette hormone dans le traitement du diabète est bien con- nue. Bien que les abattoirs fournissent des pancréas de boeuf et de porc comme sources d'insuline, une pénurie de cette hor- mone se fait sentir en raison du nombre croissant de diabéti- ques dans le monde. De plus, certains diabétiques sont allet- giques à l'insuline de boeuf et de porc, avec des effets né- fastes. Une possibilité de produire de l'insuline humaine en quantités suffisantes pour satisfaire les besoins mondiaux est donc hautement désirable. L'invention fournit des gènes qui sont insérables dans des microorganismes, qui sont utili- sables dans la production d'insuline humaine. L'insuline est constitués de deux chaînes de polypep- tides connues sous le nom de chaîne A et B, reliées ensembles par des ponts disulfure. La cha ne A consiste en 21 acides aminés et la chaXne B en 30 acides aminés. Ces chaînes ne sont pas synthétisées indépendamment in vivo, mais dérivent d'un précurseur immédiat, appelé proinsuline. La proinsuline est une simple chaXne de polypeptide qui contient un peptide appelé le peptide C qui relie les chatnes A et B. Voir Stei- ner D.F. et al., Science 157, 697 (1967). Ce peptide C est excisé pendant l'emmagasinage de l'insuline dans les granules secréteurs des cellules B du pancréas avant la secrétion. Voir Tager H.S. et al., Ann. Rev. Biochem. 43, 509 (1974). On pen- se généralement que le rôle du peptide C consiste à ne fonc- tionner que pour former la structure tri-dimensionnelle de la molécule. La séquence d'acides aminés pour la proinsuline, déterminée par des techniques classiques, est indiquée dans le tableau 1 suivant. Dans ce tableau, la chaîne C comprend les acides aminés 1 à 30, le peptide C les acides aminés 31 à 65 et la chaîne A les acides aminés 66 à 86. TABLEAU 1 10 NH2Phe-Val-Asn-Gln-His-Leu-Cys-Gly-Ser-His-Leu-Val-Glu- -1 20 Ala-Leu-Tyr-Leu-Val-Cys-Gly-Glu-Arg-Gly-Phe-Phe-Try-Thr- 40 Pro-Lys-Thr-Arg-Arg-Glu-Ala-Glu-Asp-Leu-Gln-Val-Gly-Gln- - Val-Glu-Leu-Gly-Gly-Gly-Pro-Gly-Ala-Gly-Ser-Leu-Gln-Pro- 60 Leu-Ala-Leu-Glu-Gly-Ser-Leu-Gln-Lys-Arg-Gly-Ile-Val-Glu- 80 Gln-Cys-Cys-Thr-Ser-Ile-Cys-Ser-Leu-Tyr-Gln-Leu-Glu-Asn- Try-Cys-Asn -_ La synthèse chimique de cette séquence de 86 acides aminés, bien que réalisable, est difficile au moyen de techniques classiques. Dans les cellules B du pancréas, le produit de trans- lation initial n'est pas la proinsuline elle-même, mais une pré-proinsuline qui contient plus de 20 acides aminés supplé- mentaires sur la terminaison amino de la proinsuline. Voir Cahn S.J. et al., Proc. Nat. Acad. Sci. USA 73, 1964 (1976) et Lomedico P.T. et al., Nucl. Acid Res. 3, 381 (1976). L'au- tre séquence d'acides aminés est appelée le peptide "signal". Dans la pré-proinsuline humaine (voir la Fig.2 des dessins annexés) le peptide signal comporte 24 acides aminés et la -24 -20 séquence est la suivante: NH2-Met-Ala-Leu-Trp-Met-Arg-Leu- -10 Leu-Pro-Leu-Leu-Ala-Leu-Leu-Ala-Leu-Trp-Gly-Pro-Asp-Pro-Ala- -1 Ala-Ala. On pense que la séquence de 24 acides aminésserait un signal spécifique pour le transport vectorial du polypep- tide synthétisé dans le réticulum endoplasmique de la cellu- le B, et est séparée de la proinsuline pendant cette phase. Voir Blobel G. et al., J. Cell. Biol. 67, 835 (1975). On connait plusieurs cas de peptides "signal" pour des protéines d'eucaryotes à transporter à travers des bar- rières de membrane. Une enzyme de scission spécifique a été observée dans un système sans cellules qui hydrolyse la liai- son peptidique entre le peptide signal et la protéine active en même temps qu'un passage à travers une membrane cellulaire. (Voir Blobel G. et al., Proc. Nat. Acad. Sci. USA 75, 361 (1978)). De récents progrès en biochimie et dans la technolo- gie de l'ADN recombinant ont rendu possible la synthèse de protéines synthétiques dans des conditions déterminées indé- pendantes de l'organisme supérieur dont elles sont normale- ment isolées. Ces procédés de synthèse biochimiques utilisent des enzymes et des constituants sous-cellulaires du mécanisme de synthèse des protéines des cellules vivantes, soit in vi- tro,dans des systèmes sans cellules, soit in vivo, dans des microorganismes. Dans l'un ou l'autre cas, l'élément clé est la fourniture d'un acide désoxyribonucléique (ADN) de séquen- ce spécifique qui contient l'information nécessaire pour spé- cifier la séquence d'acides aminés désirée. Un tel ADN spéci- fique est appelé ici un gène. La relation codante o une sé- quence de désoxynucléotides est utilisée pour spécifier la séquence d'acides aminés d'une protéine est décrite briève- ment, ci-dessous, et fonctionne selon un ensemble fondamental de principes qui prévalent dans la totalité du domaine connu des organismes vivants. Un gène cloné peut être utilisé pour spécifier la sé- quence d'acides aminés des protéines synthétisées par des sys- tèmes in vitro. Des systèmes de synthèse des protéines à par- tir de l'ADN sont bien connus dans la technique, voir, par exemple, Zubay G., Ann. Rev. Genetics 7, 267 (1973). De plus, un ADN à simple chatne (spirale) peut être induit pour jouer le rôle d'ARN messager in vitro, fournissant une translation très fidèle de la séquence d'ADN (Salas, J. et al. J. Biol. Chem. 243, 1012 (1968). D'autres procédés bien connus dans la technique peuvent être utilisés en combinaison avec les procédés ci-dessus pour augmenter les rendements. Des développements concernant la technologie de 1' ADN recombinant ont permis l'isolement de gènes ou de por- tions de gènes spécifiques à partir d'organismes supérieurs, tels que l'homme et d'autres mammifères, et de transférer les gènes ou fragments à un microorganisme, tel qu'une bactérie ou une levure. Le gène transféré est reproduit et propagé lorsque le microorganisme transformé est reproduit. Il en ré- sulte que le microorganisme transformé peut devenir capable de produire toute protéine pour laquelle code le gène ou le fragment, que ce soit une enzyme, une hormone, un antigène ou un anticorps ou une portion de ces substances. Le micro- organisme transmet sa capacité à sa descendance, de sorte qu'en fait le transfert a pour résultat une nouvelle souche, possédant l'aptitude décrite. Voir par exemple Ullrich A. et al., Science 196, 1313 (1977) et Seeburg P.H. et al., Natu- re 270, 486 (1977). Un fait fondamental qui sert de base à l'application de cette technologie à des buts pratiques, est que l'ADN de tous les organismes vivants, des microbes à lthomme, est chimiquement le même, étant composé des quatre mêmes nucléotides. Les différences significatives résident dans les séquences de ces nucléotides dans la molécule d'ADN polymère. Les séquences de nucléotides sont utilisées pour spécifier les séquences d'acides aminés des protéines qui cons- tituent l'organisme.. Bien que la plupart des protéines de dif- férents organismes diffèrent les unes des autres, la relation codante entre une séquence de nucléotides et une séquence d'a- cides aminés est fondamentalement la même pour tous les orga- nismes. Par exemple, la même séquence de nucléotides qui code pour la séquence d'acides aminés de 1'HGH (hormone gonadotrope humaine) dans les cellules de l'hypophyse humaine, sera, une fois transférée à un microorganisme, reconnue comme codant pour la méme séquence d'acides aminés. - Les abréviations utilisées ici sont expliquées dans le Tableau 2. ADN ARN cADN mARN dATP dGTP dCTP A T G C U ATP TTP EDTA TABLEAU 2 = acide désoxyribonucléique = acide ribonucléique = ADN complémentaire (synthétisé par voie enzymatique à partir d'une séquence de mARN) = ARN messager = désoxyadénosine triphosphate = désoxyguanosine triphosphate = désoxycytidine triphosphate = adénine = thymine = guanine = cytosine = uracile = adénosine triphosphate = thymidine triphosphate = acide éthylène diamine tétraacétique Les relations codantes entre une séquence de nucléo- tides dans l'ADN et une séquence d'acides aminés dans la pro- téine sont collectivement connues sous le nom de "code géné- tique", tel qu'indiqué dans le Tableau 3. Phénylalanine(Phe) Leucine(Leu) Isoleucine(Ile) Méthionine(Met) TABLEAU 3 CODE GENETIQUE TTK xrY ATM j ATG I Histidine(His) Glutamine(Gin) Asparagine(Asn) Lysine(Lys) CAK CAJ AAK AAJ Valine(Val) GTL Acide aspartique(Asp) GAK Sérine(Ser) QRS Acide glutamique(Glu) GAJ Proline(Pro) CCL Cystéine(Cys) TGK Thréonine(Thr) ACL Tryptophane(Try) TGG Alanine(Ala) GCL Arginine(Arg) WGZ Tyrosine(Tyr) TAK Glycine(Gly) GGL Signal de ter- minaison TAJ Signal de ter- minaison TGA Explication: chaque triplet de désoxynucléotide, de 3 let- tres, correspond à un trinucléotide de mARN, ayant une ex- trémité 5, à gauche et une extrémité 3' à droite. Toutes les séquences d'ADN indiquées ici sont celles de la chalne dont la séquence correspond à la séquence de mARN, l'uracile étant remplacé par la thymine. Les lettres représentent les bases purine ou pyrimidine formant la séquence de désoxynucléotides. A = adénine J = A ou G G = guanine K = T ou C C = cytosine L = A, T, C ou G T = thymine M = A, C ou T X = T ou C si Y est A ou G X = C si Y est C ou T Y = A, G, C ou T si X est C Y = A ou G si X est T W =C ou A si Zest A ou G W =C si Zest C ou T Z = A, G, C ou T si West C Z =A ou G si West A QR =TC si S est A, G, C ou T *QR =AG si S est'T ou C S =A, G, C ou T si QR est TC S =T ou C si QR est AG Une caractéristique importante du code, pour le but de l'invention, réside dans le fait que chaque acide aminé est spécifié par une séquence de trinucléotide, également connue comme triplet de nucléotide. Les liaisons phospho- diester réunissant des triplets adjacents ne peuvent pas ê- tre chimiquement distinguées de toutes les autres liaisons internucléotides dans l'ADN. En conséquence la séquence de nucléotides ne peut pas être lue pour coder pour une séquen- ce unique d'acides aminéséans une autre information pour dé- terminer le cadre de lecture qui est le terme utilisé pour indiquer le groupe de triplets utilisé par la cellule en dé- codant le message génétique. De nombreuses techniques dtADN recombinant utilisent deux classes de composés, les vecteurs de transfert et les enzymes de restriction, qui seront discutés successivement. Un vecteur de transfert est une molécule d'ADN qui contient, entre autres, une information génétique qui assure sa propre reproduction lorsqu'elle est transférée & une souche de mi- Qroorganisme hête. Des exemples de vecteurs de transfert com- munément utilisés dans les génétiques bactériennes sont les plasmides et 1'ADN de certains bactériophages. Bien que des plasmides aient été utilisés comme vecteurs de transfert pour le travail décrit icn9 il est évident que d'autres types de vecteurs de transfert peuvent être également utilisés. "Plas- mide" est le terme appliqué à toute unité d'ADN à reproduc- tion autonome, qui peut 9tre trouvée dans une cellule micro- bienne, autre que le génome de la cellule hâte elle-même. L'ADN plasmique existe sous forme de structures cycliques à double chaîne, généralement de leordre de quelques millions de daltons de poids moléculaire, bien que certaines aient un poids moléculaire supérieur à 10 daltons. Elles ne représen- tent normalement qu'un faible pourcentage de I'ADN total de la cellule. L'ADN du vecteur de transfert est normalement sé- parable de l'ADN de la cellule hôte grâce à la grande diffé- rence de dimension entre eux. Les vecteurs de transfert por- tent une information génétique les rendant capables de se re- produire dans la cellule hôte, dans la plupart des cas indé- pendamment de la vitesse de division de la cellule h8te. Certains plasmides ont la propriété d'avoir une vitesse de reproduction réglable par le chercheur en modifiant les con- ditions de croissance. Au moyen de techniques appropriés, le noyau de l'ADN plasmique peut Ctre ouvert, un fragment d'ADN hétérologue inséré et le noyau refermé, formant une plus grosse molécule comprenant le segment d'ADN inséré. L'ADN bactériophage peut porter un segment d'ADN hétérologue insé- ré au lieu de certains gènes provenant d'autres phages non- essentiels. Dans l'un ou l'autre cas, le vecteur de transfert sert de support ou de vecteur pour un fragment d'ADN hétéro- logue inséré. Le transfert a lieu selon un procédé connu comme é- tant une transformation. Pendant la transformation, les cel- lules bactériennes mélangées avec l'ADN plasmique incorporent des molécules entières de plasmide dans les cellules. Bien que le mécanisme du processus reste obscur, il est possible de maximaliser la proportion de cellules bactériennes capa- bles de fixer l'ADN plasmique et par conséquent de se trans- former par certains traitements déterminés par voie empirique. Une fois qu'une cellule a incorporé un plasmide, ce dernier est reproduit dans la cellule et les répliques du plasmide sont réparties dans les cellules filles lorsque la cellule se divise. Toute information génétique contenue dans la sé- quence de nucléotides de I'ADN plasmique peut, en principe, être exprimée dapsla.cellule hôte. Typiquement, une cellule hôte transformée est reconnue par son acquisition de caractères portés sur le plasmide, tels que la résistance à certains an- tibiotiques. Des plasmides différents sont reconnaissables par les aptitudes différentes ou une combinaison différente d'aptitudes qu'ils confèrent à la cellule hôte les contenant. Tout plasmide donné peut être reproduit en quantité, en dé- veloppant une culture pure de cellules contenant le plasmide et en isolant l'ADN plasmique à partir de la culture. Les endonucléases de restriction sont des enzymes hydrolytiques capables de catalyser une scission des molécu- les d'ADN en un site spécifique. Le lieu de l'action de l'en- donucléase de restriction est déterminé par l'existence d'une séquence de nucléotides spécifique. Une telle séquence est appelée le site de reconnaissance pour l'endonucléase de res- triction. Des endonucléases de restriction de sources diver- ses ont été isolées et caractérisees en termes de la séquence de nucléotides de leurs sites de reconnaissance. Certaines endonucléases de restriction hydrolysent les liaisons phospho- diester sur les deux chaînes au même point, produisant des extrémités tronquées. D'autres catalysent tl'hydrolyse de liai- sons séparées l'une de tl'autre par quelques nucléotides, pro- duisant des régions à simple chaîne libre à chaque extrémité de la molécule scindée. Ces extrémités à simple chaîne sont autocomplémentaires, donc cohésives, et peuvent être utilisées pour réunir 1'ADN hydrolysé. Etant donné que tout ADN capable d'être scindé par une telle enzyme doit contenir le même site de reconnaissance, les mêmes extrémités cohésives seront pro- duites, de sorte qu'il est possible de réunir des séquences hétérologues d'ADN qui ont été traitées avec une endonucléase de restriction à d'autres séquences ayant subi le même traite- ment. Voir Roberts R.J., Crit. Rev. Biochem., 4, 123 (1976). Les sites de restriction sont relativement rares, mais 1':uti- lité générale des endonucléases de restriction a été considé- rablement élargie par la synthèse chimique d'oligonucléotides A double chaîne portant la séquence du site de restriction. En conséquence, virtuellement tout segment d'ADN peut être ac- couplé à tout autre segment en fixant simplement l'oligonu- cléotide de restriction approprié aux extrémités de la molé- cule, et en soumettant le produit à l'action hydrolytique de l'endonucléase de restriction appropriée, d'o la production d'extrémités cohésives requises. Voir Heyneker H.L. et al. Nature 263, 748 (1976) et Scheller R.H. et al., Science 196, 177 (1977). Une caractéristique importante de la répartition des sites de reconnaissance d'une endonucléase de restric- tion est le fait qu'ils sont répartis au hasard quant au ca- dre de lecture. En conséquence, la scission par une endonu- cléase de restriction peut se produire entre deux codons adjacents ou à l'intérieur d'un codon. On dispose de procédés plus généraux de scission de l'ADN ou de modification de la séquence terminale. Un grand nombre d'endonucléases non-spécifiques peuvent être utili- sées pour scinder statistiquement l'ADN, tel que discuté ci- dessous. Les séquences terminales peuvent être modifiées par la création de queues d'oligonucléotides de dA à une extré- mité et de dT à l'autre; ou de dG et de dC, pour créer des sites de réunion sans avoir besoin de séquences de liaison spécifiques. Le terme "expression" est utilisé pour souligner le fait qu'un organisme utilise rarement pour ne pas dire jamais, la totalité de ses aptitudes génétiques à un moment donné. - Même dans des organismes relativement simples tels que des bactéries, de nombreuses protéines que la cellule est capa- ble de synthétiser, ne sont pas synthétisées alors qu'elles pourraient l'être dans des conditions ambiantes appropriées. Lorsque le produit protéinique, codé par un gène donné, est synthétisé par 1'organisme, le gène est dit "être exprimé". Si le produit protéinique n'est pas réalisé, le gène n'est pas exprimé. Normalement, l'expression des gènes dans E. coli est réglée tel que décrit généralement ci-après, de telle sorte que les protéines dont la fonction n'est pas utilisée dans un milieu donné, ne sont pas synthétisées et l'énergie métabolique est conservée. Le mécanisme selon lequel l'expression du gène est réglée dans E. coli est bien connu, grâce aux études intensi- ves de ces vingt dernières années. Voir, en général, Hayes W., The Genetics of Bacteria and Their Viruses, 2ème édition, John Wiley et Sons, New York (1968) et Watson J.D.,The Molecu- Jar Biology of the Gene, 3ème édition, Benjamin, Menlo Park, Californie (1976). Ces études ont révélé que plusieurs gènes, normalement ceux codant pour des protéines exerçant des fonc- tions apparentées dans la cellule, sont trouvés groupés en- semble dans une séquence continue. Le groupe est appelé un "opéron". Tous les gènes dans i'opéron sont transcrits dans la même direction: en commençant avec les codons codant pour l'acide aminé N-terminal de la première protéine dans la sé- quence et en continuant jusqu'à l'extrémité C-terminale de la dernière protéine dans l'opéron. Au commencement de l'opérons il existe une région de l'ADN, appelée la région de contrôle, qui comprend une variété d'éléments de contrôl81e dont l'opéra- teur, le promoteur et les séquences pour les sites de liai- son ribosomiques. Le r8le de ces sites est de permettre que, sous leur contrôle, l'expression de ces gènes réponde aux besoins de l'organismeo Par exemple, les gènes codant pour des enzymes requises exclusivement pour l'utilisation du lac- tose ne sont normalement pas beaucoup exprimés à moins que le lactose ou un de ses analogues ne soit réellement présent dans le milieu. Les fonctions de la région de contrôle néces- saires à l'expression sont l'initiation de la transcription et l'initiation de la translation. L'expression du premier gène dans la séquence est initiée par l'initiation de la trans- cription et de la translation à la position codant pour l'aci- de aminé N-terminal de la première protéine de l'opéron. L'ex- pression de chaque gène à partir de ce point est donc initiée à son tours au moins jusqueà ce quun signal de terminaison ou un autre opéron soit rencontré avec sa propre région de contrôle, accordée pour répondre à un jeu différent d'indica- tions ambiantes. Bien que les détails correspondant à ce sché- ma général puissent varier énormément, le fait important est que, pour être exprimé dans un procaryote tel que E. coli, un gène doit être convenablement situé quant à une région de con- trôle ayant le rôle d'initiateur de transcription et d'initia- teur de translation. On a démontré que des gènes ne faisant pas normale- ment partie d'un opéron donné, peuvent être insérés dans l'o- * péron et contrôlés par lui. La démonstration classique en a été faite par Jacob F., et al., J. Mol. Biol., 13, 704 (1965). Dans cette expérience, des gènes codant pour des enzymes im- pliquées dans un processus de biosynthèse de la purine, ont été transférés vers une région contr8lée par l'opéron du lac- tose. L'expression de l'enzyme biosynthétique de purine était visiblement réprimée en l'absence de lactose ou d'un analo- gue du lactose, et ne répondait pas aux indications ambiantes réglant normalement son expression. En plus de la région de l'opérateur réglant l'initia- tion de la transcription des gènes à partir d'elle, on sait qu'il existe des codons qui agissent comme des signaux d'ar- rêt, indiquant l'extrémité C-terminale d'une protéine donnée. Voir Tableau 3. Ces codons sont connus comme des signaux de terminaison et également comme des codons extravagants car ils ne codent normalement pas pour un acide aminé quelconque. La suppression d'un signal de terminaison entre des gènes structuraux d'un opéron crée un gène fusionné qui pourrait avoir pour résultat la synthèse d'une protéine chimérique constituée de deux séquences d'acides aminées codées par des gènes adjacents, réunies par une liaison peptidique. Cette synthèse de protéines chimériques lorsque des gènes sont fu- sionnés a été démontrée par Benzer S. et Champe S.P., Proc. Nat. Acad. Sci. USA 48, 114 (1962). Dès qu'un gène a été isolé, purifié et inséré dans un vecteur de transfert, le résultat global de ce qu'on appelle "faire un clone" à partir du gène, sa disponibilité en quan- tité substantielle est assurée. Le gène ainsi cloné est trans- féré dans un microorganisme approprié o le gène se reproduit lorsque le microorganisme prolifère et à partir duquel le gène peut être de nouveau isolé par des moyens classiques. Cette technique fournit donc une source continuellement renouvelable du gène pour d'autres manipulations, modifications et transferts à d'autres vecteurs ou en d'autres lieux dans le même vecteur. L'expression est obtenue en transférant le gène cloné, dans une orientation et un cadre de lecture appropriés, dans une région de contrôle telle qu'une lecture complète à partir du gène de procaryote se traduise par la synthèse d'une pro- téine chimérique comprenant la séquence d'acides aminés co- dés par le gène cloné. De nombreuses techniques de scission spécifique d'une protéine peuvent être utilisées pour scinder la protéine chimérique en un point désiré de façon à libérer la séquence d'acides aminés recherchés qui peut alors être purifiée par des moyens classiques. Des techniques de cons- truction d'un vecteur de transfert d'expression o le gène cloné est convenablement juxtaposé avec une région de contrô- le, sont décrites par Polisky B. et al., Proc. Nat. Acad. Sci. USA 73, 3900 (1976); Itakura K. et al., Science 198, 1056 (1977); Villa-Komaroúf L. et al, Proc. Nat. Acad. Sci. USA 75, 3727 (1978); Mercereau-Puijalon 0. et al., Nature 275, 505 (1978); Chang A.C.Y. et al., Nature 275, 617 (1978) et dans la demande de brevet US no 933 035 de Rutter et al. En résumé, le procédé qui permet de produire une pro- téine de mammifère, telle qu'une pré-proinsuline ou un proin- suline humaine, en appliquant la technologie de l'ADN recom- binant, requiert d'abord l'isolement et la purification du gène de mammifère. Une fois cloné, le gène peut être produit en quantité, modifié par un moyen chimique ou enzymatique et transféré à un plasmide d'expression. Le gène cloné est éga- lement utilisable pour isoler des gènes voisins, ou si seul un fragment est cloné, pour isoler le gène entier, en utili- sant le gène cloné comme modèle d'hybridation. De plus, le gène cloné est utilisable pour prouver par hybridation l'iden- tité ou le caractère homologue des isolats indépendants de gènes identiques ou apparentés. En raison de la nature du co- de génétique, le gène cloné, lorsqu'il est transmis dans le cadre de lecture approprié, ne dirige que la production de la séquence d'acides aminés pour laquelle il code et aucune autre. L'isolement et la purification de la proinsuline du rat ont fait l'objet de divers travaux. Ullrich A. et al., voir ci-dessus, et Villa-Komaroff L. et al., voir cidessus, décrivent l'isolement et la purification du gène de la proinsuline du rat et un procédé de transfert et de reproduction de ce gène dans un microorganisme. Ullrich et al. ont recueil- li plusieurs plasmides recombinants qui contenaient la sé- quence de codage pour la proinsuline, la région non transmise 3' et une partie du pré-peptide. L'expression de l'ADN de rat contenant la séquence codant pour l'insuline a été décrite dans la demande de brevet-US n0 933 035. Villa-Komaroff.et al. ont recueilli un plasmide recombinant qui contenait la séquence codant pour les acides aminés 4 à 86 de la proinsu- line. Cette séquence de proinsuline a été séparée des acides aminés 24 à 182 de la pénicillinase ( p-lactamase) par la séquence codant pour six glycines. Cette séquence codant pour la proinsuline de pénicillinase a été exprimée pour produire une protéine fusionnée. Ces articles décrivent une partie des procédés de base utilisés dans la technologie de 1'ADN recom- binant. Cependant, ils ne décrivent ni l'isolement, ni la pu- rification du gène de la pré-proinsuline humaine ou du gde la proinsuline humaine. Crea R. et al., Proc. Nat. Acad. Sci USA 75, 5765 (1978), ont suivi une voie différente pour obtenir de l'insu- line humaine. Cette voie consiste à synthétiser chimiquement des séquences codant pour (1) la cha ne A et (2) la chaîne B de l'insuline humaine, en utilisant des codons favorisés par Eo coli. Ces deux séquences peuvent alors être insérées dans des plasmides qui peuvent être exprimés pour produire les cha nes A et B. L'insuline humaine pourrait alors être obte- nue par formation des liaisons disulfure correctes entre les deux chaînes de protéine. Le gène cloné pour la pré-proinsuline humaine est uti- lisable de diverses façons. La transposition à un vecteur de transfert d'expression permet la synthèse de la pré-proinsu- line par un microorganisme h8te transformé par le vecteur portant le gène cloné. La prolifération de l'hôte transformé se traduit par la synthèse de la pré-proinsuline comme partie d'une protéine chimérique. Si la portion de procaryote de la protéine fusionnée est la portion signal d'une protéine hôte excrétée ou sectionnée d'une autre façon en compartiments, l'excrétion ou la division en comartim nts peuvent augmenter de façon importante la stabilité et la facilité de purification de la pro- téine fusionnée de préeproinsuline. De plus, lorsque la por- tion de procaryote est courte, l'excrétion hors de l'hâte de procaryote peut 9tre facilitée par le pré-peptide lui-même, si la pré-séquence fonctionne dans l'h6te de procaryote comme elle le fait dans la cellule d'eucaryote. Le gène de la pr6- proinsuline peut égarement Atre utilisé pour obtenir le gène de la proinsuline en utilisant les techniques décrites ci- après. Le gène cloné de la pré-proinsuline peut tre utilisé dans diverses techniques pour produire la pré-proinsuline. La pré-proinsuline elle-même est utilisable en raison du fait qu'elle peut 4tre convertie en proinsuline par des techniques enzymatiques et chimiques connues. Par exemple, le prépeptide peut etre éliminé par une préparation enzymatique soluble, tel que décrit par Blobel Go et al., ci- dessus, spécifique pour l'élimination des peptides "signal". Le gène cloné de la proinsuline peut Atre utilisé dans diverses techniques pour la production de proinsulineo La proinsuline, produite à par- tir de l'un de ces gènes, est utilisable elle-même, car elle peut être convertie en insuline par des techniques enzymati- ques et chimiques connues. Voir Kemmber W. et al., J. Biol. Chem. 242, 6786 (1971). L'invention concerne un procédé de préparation d'un vecteur de transfert dfADN, utilisable pour conserver et re- produire une séquence de désoxynucléotides codant pour la pré- proinsuline humaine, caractérisé en ce qu'on fait réagir une séquence de désoxynucléotides codant pour la pré-proinsuline humaine avec une molécule d'ADN préparée par scission d'un vecteur de transfert par une enzyme de restriction. Tel que décrit ici, un cADN ayant la séquence de base codant pour la pré-proinsuline humaine et un cADN ayant la sé- quence de base codant pour la proinsuline humaine sont isolés et purifiés (clonés). La structure des cADN clonés est véri- fiée par analyse des séquences de nucléotides. La source originale du matériau génétique est l'insu- linoma humain (une tumeur produisant de l'insuline). Un ARN messager est isolé des cellules. Un ADN complémentaire à l'ARN messager isolé (cADN) est synthétisé en utilisant la transcriptase inverse, dans deux cycles de réaction pour former le cADN à double chaîne. Le cADN à double chalne, non-scindé, hétérogène, est traité pour fournir des séquences d'oligonucléotides de liaison, spécifiques, à chaque extrémité, afin de faciliter l'insertion dans un site de même spécificité de restriction sur un vec- teur de transfert. Pour l'isolement et la purification, on choisit un vecteur de transfert assurant une bonne sélection et des pro- priétés de reproduction stables. On insère le cADN traité dans un vecteur de transfert en un site prédéterminé sur le vecteur d'ADN pour former un vecteur de transfert recombinant, en utilisant des techniques courantes. Des cellules de micro- organismes h8te sont transformées par le vecteur recombinant. Des agents de transformation ou transformants sont choisis selon les critères établis pour l'insertion en le site pré- déterminé. Des colonies simples, dérivées chacune d'une seule cellule de microorganisme transformée, sont rassemblées et multipliées dans des cultures individuelles afin de permettre la reproduction des clones d'ADN du'vecteur de transfert re- combinant. On sélectionne l'ADN du vecteur de transfert pour les séquences d'insuline par un procédé d'hybridation de co- lonies modifié. Des colonies donnant un ADN de vecteur de transfert recombinant pour les séquences d'insuline sont mul- tipliées dans de plus grandes cultures individuelles pour isoler i'ADN du vecteur de transfert et le soumettre à une analyse. On choisi des clones appropriés pour une identifi- cation définitive de la séquence de nucléotides des gènes de pré-proinsuline ou de proinsuline clones, et pour le trans- fert à des plasmides d'expression appropriés. L'invention fournit en outre un procédé de prépara- tion d'une séquence de désoxynucléotides codant pour la pro- insuline humaine, utilisable dans la synthèse de l'insuline humaine, caractérisé en ce qu'on hydrolyse les extrémités 3' d'une séquence de désoxynucléotides codant pour la pré-proin-.- suline humaine, conservée et reproduite selon le procédé de l'invention, par un ou plusieurs cycles de digestion exonu- cléolytique progressive, catalysée par la T4 ADN polymérase agissant en présence d'un désoxynucléotide triphosphate, puis en hydrolysant les extrémités 5'de la séquence de désoxynu- cléotides par une digestion nucléolytique catalysée par une enzyme de nucléase spécifique pour un ADN & simple chaîne ayant une extrémité 5'. L'invention fournit en outre un procédé de synthèse de la proinsuline humaine comprenant des peptides A et B séparés l'un de l'autre par un peptide C, caractérisé par l'incubation d'un microorganisme, transformé par un vecteur de transfert d'expression comprenant une séquence de désoxy- nucléotides codant pour la proinsuline humaine préparée tel que décrit ici, dans des conditions appropriées pour ltexpres- sion de la séquence codant pour la proinsuline humaine, et la purification de la proinsuline humaine à partir du lysat ou du milieu de culture du microorganisme. L'invention fournit encore un procédé de synthèse de l'insuline humaine, caractérisé en ce qu'on oxyde des groupes sulfhydryle sur les peptides A et B de la proinsuline humaine, préparée tel que décrit ici, pour former des ponts disulfure entre les peptides A et B, puis on excise le peptide C par une hydrolyse catalysée par une enzyme, spécifique pour les liai- sons réunissant le peptide C aux peptides A et B. L'invention fournit les éléments génétiques essen- tiels, nécessaires à la production d'insuline humaine par des techniques adaptables aux procédés industriels. On isole et purifie le gène structural naturel. Son expression dans un type de cellule hote approprié donne un produit protéini- que convertissable en insuline par des procédés connus. L'in- vention est fondamentalement basée sur la molécule de proin- suline et tire avantage du fait que la région du peptide C de la molécule de proinsuline permet un pliage spontané tel que les cha nes A et B sont convenablement juxtaposées.Dans cette configuration, l'appariement correct des groupes sulfhy- dryle est assuré et la formation des ponts disulfure, tels que trouvé dans la molécule d'insuline active, est facile à réa- liser. L'excision du peptide C est effectuée par l'utilisa- tion combinée de la trypsine, ou d'une enzyme ayant une spé- cificité similaire pour un substrat, et de la carboxy-pepti- dase C ou de la cathepsine C pour éliminer 1'arginine C-ter- minale sur la chaine B, tel que décrit dans la technique an- térieure. La totalité de la partie structurale codante du gène de l'insuline humaine est clonée tel que décrit ici, compre- nant une partie de la région non-transférée 5', toute la sé- quence du prépeptide, la totalité de la séquence codant pour les peptides B, C et A et la totalité de la région non-trans- férée 3'. Le choix de la cellule hôte décide des portions du gène cloné utilisées. La totalité de la séquence codant pour la pré-proinsuline sera utilisable pour transformer certaines espèces de cellules d'eucaryotes supérieurs, car la présé- quence agit comme un simple peptide pour promouvoir l'excré- tion du peptide hors de la cellule. De plus, ces lignées de cellules d'eucaryotes capables de répondre au peptide signal, catalysent l'élimination spécifique de la préséquence pendant le transport de la protéine à travers la membrane cellulaire. En outre, ces cellules peuvent être capables de transformer ultérieurement le produit d'expression par une excision de la protéine C après la formation catalytique des ponts di- sulfure appropriés. Dans les cellules h8tes de procaryotes, l'utilisation de la séquence codant pour la proinsuline est préférée selon l'invention. L'opération de conversion de la proinsuline en insuline est conduite en détail selon des procédés connus dans la technique. Deux types d'expression sont déjà connus, impliquant tous les deux lvinsertion de la séquence codant pour la proinsuline dans une région du vecteur de transfert d'ADN dont l'expression a été contr8lée par un promoteur de procaryote. Dans certains cas9 une partie du gène structural de procaryote et du contrôle du promoteur est interposée de telle sorte que le produit d'expression est une protéine fu- sionnée ayant sa portion N-terminale composée de la partie N-terminale de la protéine de procaryote et sa portion C-ter- minale est la séquence clonée, dans ce cas la proinsuline. L'expression de la proinsuline comme protéine humaine présen- te l'avantage que la protéine fusionnée peut être plus sta- ble dans la cellule hôte que la proinsuline elle-même. De plus, lorsque la protéine dveucaryote est celle qui est normalement excrétée de la cellule hôte, la protéine zusionnee peut éga- lement être excrétée, rendent le produit dexpression plus fa- cile à purifier L emptloi de proetéines fusionnees présente tl'inconvénient que ces proetéines doivent être scindées de fa- çon spécifique pour obtenir le produit désiré. Dans le cas de la proinsuline, il1 existe des techniques qui tirent partie de la séquence d'acidXs aminés de la protéine pour scinder spécifiquement une protéine fusionnée, tel que décrit dans l'exemple 2. La séquence de codage, clonée, peut également être exprimée directement dans la cellule de procaryote en insérant la séquence de façon qu'elle soit directement adjacente à un promoteur. Cette conception est avantageuse en ce qu'une scis- sion spécifique est alors inutile. Mais elle présente l'in- convénient de nécessiter une autre purification. L'expression des gènes de mammifères insérés dans E.coli a été maintenant obtenue par insertion près des promo- teurs lac, trp et)-lactamase. Le promoteur lac est utilisa- ble du fait que ses propriétés génétiques sont bien caracté- risées. Il existe deux sites d'insertion possibles, fournis- sant des conducteurs de procaryotes longs et courts pour la protéine fusionnée. On dispose d'une grande variété de va- riants génétiques, ayant des niveaux différents de r.presseur endogène, qui peuvent être induits par la chaleur, etc. Le promoteur trp a l'avantage de fournir de hauts niveaux d'ex- pression lorsqu'il est induit. Des plasmides d'expression ayant des sites d'insertion dans le promoteur trp sont dispo- nibles pour les trois cadres de lecture. Le promoteur de bê- ta-lactamase fournit ce qui revient à une protéine signal de procaryote, car la lactamase est normalement excrétée. Le produit de fusion de plactamase est également excrété ou trouvé dans l'espace périplasmique. En conséquence, il faut moins d'opérations de purification pour obtenir la proinsu- line pure. L'invention tire avantage du r8le du peptide C de la proinsuline, en fait pour faciliter le pliage spontané de la proinsuline qui amène les cha nes A et B dans une configura- tion correcte de telle sorte que les groupes sulfhydryle sont convenablement appariés et les ponts disulfure corrects sont formés, tel qu'on l'observe dans une insuline provenant de la nature. Une comparaison des séquences du peptide C de diffé- rentes espèces montre que les séquences de peptide C ne sont pas beaucoup conservées pendant l'évolution. De nombreuses substitutions de la séquence d'acides aminés sont donc possi- bles dans le peptide C. En fait, le rôle du peptide C peut consister simplement à fournir une boucle d'acides aminés de longueur appropriée pour permettre aux chaînes A et B de se replier ensemble dans la configuration convenable. En consé- quence, pratiquement toute séquence de codage pourrait être insérée à la place de la séquence du peptide C de la proin- suline humaine sans modifier substantiellement sa fonction primaire. Mais certains avantages plaident en faveur de 1'u- tilisation du peptide C naturel; par exemple la séparation du peptide des préparations d'insuline n'a pas besoin d'être complète, car le peptide C est un constituant naturel des préparations d'insuline. De plus,'il peut être avantageux de conférer la configuration appropriée sur l'insuline ou d'ef- fectuer la séparation par des enzymes. L'invention démontre en outre l'universalité du code génétique. En particulier, des codons favorisés par les cel- lules de mammifères sont correctement transférés dans E.coli. Des codons de remplacement, codant pour le même acide aminé, pourraient être substitués dans la séquence sans affecter la séquence ou la fonction de la protéine exprimée. L'invention concerne donc toute variance de codage synthétique de la sé- quence de codage de base réellement clonée ici, dans la mesu- re o une telle variance code pour la pré-proinsuline humai- ne et la proinsuline humaine. Les exemples non limitatifs suivants sont donnés & titre d'illustration de l'invention. EXEMPLE 1 Gène cloné de la pré-proinsuline humaine On clone le gène de l'insuline humaine à partir d'ARN extrait d'un insulinoma humain selon le procédé décrit par Ullrich et al., ci-dessus, pour isoler l'ARN de cellules d'i- lots. On utilise l'ARN obtenu sous forme d'un culot après centrifugation dans CsCl 5,7 M contenant 100 mM d'EDTA, sans fractionnement, comme modèle pour la synthèse du cADN en em- ployant la transcriptase inverse et la Sl nucléase, telqce décrit par Ullrich et al., ci-dessus. A partir de 130 Fg di ARN non-fractionné, on obtient environ 40 ng de cADN à double chaîne. On traite le cADN nonfractionné avec la transférase terminale en présence de dCTP pour obtenir des queues oligo-C sur les terminaisons 3' des molécules de cADN. De même, on scinde le vecteur de transfert plasmique pBR322 au moyen de l'aidonucléase de restriction Pst I et on traite par une trans- férase terminale en présence de dGTP pour produire des queues oligo-dG sur les terminaisons 3' de l'ADN plasmique linéaire. L'ADN plasmique ainsi traité ne peut pas former un ADN circu- laire, car les extrémités des chaînes simples ne sont pas conr- plémentaires. Toutefois, les extrémités oligo-dC du cADN trai- té sont complémentaires avec les extrémités oligo-dG du plas- mide et peuvent donc être utilisées pour former des plasmides circulaires dans lesquels le cADN est inséré au site Pst I. De plus, l'insertion régénère les deux extrémités de la sé- quence de reconnaissance Pst I, aux deux extrémités de l'in- sert, permettant ainsi l'excision des séquences insérées (Voir Villa-Komaroff et al., ci-dessus). On utilise le procédé de formation de queues ci-des- sus pour produire des plasmides pBR-322 ayant une population hétérogène d'inserts de cADN au site Pst I. Ces plasmides se- raient sensibles à l'ampicilline, car le site Pst I est dans le gène de la -lactamase, mais ils restent résistants à la tétracycline. On transforme E.coli, souche X17776, par l'ADN plasmique contenant les inserts. On obtient 525 transformants résistant à- la tétracycline. On procède à une reproduction sur plaque et on sélectionne les séquences d'insuline par une hy- bridation des colonies in situ, essentiellement tel que dé- crit par Gruenstein et Hogness, Proc. Nat. Acad. Sci., USA 72, 3961 (1975) . On utilise le cADN de la pré-proinsuline de rat, préalablement isolé et purifié (Ullrich et al., ci-des- sus) comme modèle d'hybridation, après avoir marqué le cADN de rat par une translation en utilisant l'ADN polymérase I. Etant donné que les séquences d'acides aminés de l'insuline de rat et de l'insuline humaine sont tout à fait semblables (insuline, 92 % d'homologie; proinsuline, 83 % d'homologie), on suppose que le cADN de rat isolé et purifié s'hybride de façon croisée avec les séquences de l'insuline humaine dans des conditions de rigueur réduite, connues dans la technique. Une autoradiographie révèle que 2 des 525 colonies s'hybri- dent avec le modèle de pré-proinsuline I de rat cloné. Ces deux colonies sont sensibles à l'ampicilline. Les plasmides isolés des colonies ont environ 250 paires de base et 500 paires de base de plus que le pBR322 lui-même. Le plasmide le plus long est désigné par l'abréviation pcHI-l. On détermine la séquence de nucléotides du fragment de cADN inséré de pcHI-1 par le procédé de Maxam et Gilbert, Proc. Nat. Acad. Sci. USA 74, 560 (1977). Une représentation schématique de ltinsert est illustrée sur la Fig. 1 des des- sins annexés. Toute la région codant pour la pré-proinsuline humaine est contenue dans l'insert, avec une partie de la région 5t non-transférée, toute la région 3' non-transférée * et une partie de la région 3'-polydAo Les sites de restzic- tion utilisés pour scinder linsert pour obtenir les séquen- ces sont également montrés sur la Fig. 1o., avec la direcUon de formation des séquences dans chaque fragment et les régions de chevauchement. La séquence du mARN dérivée de la séquence du cADN, et la séquence d'acides aminés déduite de l'un des cadres de lecture sont représentées sur la Fig. 2 des dessins annexés. La structure primaire de la proinsuline humaine déterminée de cette façon concorde de façon précise avec celle obtenue par des expériences de formation-de séquences d'acides aminés (Dayhoff M.D., Atl:as of Protein Sequence and Structure, 5, Suppl. 2, pp. 127=130 (1976) et Suppl.3, pp. 150-151 (1978). Les acides aminés de la séquence codant pour la proinsuline sont numérotés de 1 à 86, ceux de la pré-séquence sont numé- rotés de -24 à -1. La Fig. 2 montre en outre l'emplacement de certains sites de restriction utilisables pour la construc- tion du gène de la proinsuline à partir de l'insert pcHI-l. On comprendra que la séquence de cADN de la chaîne codante de l'insert pcHI-l est la même que celle représentée sur la Fig. 2 si ce n'est que la thymine (T) remplace l'uracile (U). On prépare de grandes quantités de pcHI-l et d'autres plasmides en transformant en outre E.coli HB-101. La souche HB-101 sert donc d'h8te approprié pour conserver et reprodui- re des plasmides ayant des inserts clonés, tel que décrit ici. EXEMPLE 2 Construction du vecteur de transfert de la proinsuline L'insert de cADN de pcHI-l contient toute la séquence codant pour la pré-proinsuline humaine. Pour certaines appli- cations, telles que le transfert à une autre espèce de cellu- le d'eucaryote, le processus normal et la séparation de la pré-séquence et du peptide C, et l'obtention d'une configura- tion convenablement repliée donnant une insuline active peu- vent être nécessaires. Dans d'autres cas, un transfert à une cellule de procaryote telle qu'une bactérie, peut être néces- saire pour obtenir la protéine non-traitée. Dans cette derniè- re situation, la construction d'une séquence codant pour la proinsuline est avantageuse, car la proinsuline est facilement convertie en une insuline active in vitro, en utilisant des procédés connus dans la technique. Voir Kemmler W. et al, J. Biol. Chem. 242, 6786 (1971). On décrit ici trois procédés possibles pour construire une séquence codant pour la proin- suline. Un vecteur de transfert plasmique comprenant pBR322 avec une séquence codant pour la proinsuline, insérée, est désigné par pcHP-l. A. Une séquence codant pour la chaîne B de l'insuline humaine, synthétisée par voie chimique, a été décrite par Crea R. et al. Proc. Nat. Acad. Sci. USA 75, 5765 (1978). La séquence de nucléotides, synthétique, diffère de la séquence naturelle décrite ici, car la séquence synthétique est conçue pour exploiter les attributions du codon plus favorisées par un hôte de procaryote, tel que E. coli. On incorpore donc un triplet codant pour la méthionine, juste avant l'acide aminé 1 (phe). Mais, par hasard, les deux séquences sont identiques dans la région des acides aminés 13-14, laquelle région ne contient que le site Alu I commun aux deux séquences. Les em- placements des sites Alu I sur la séquence naturelle sont indiqués sur la Fig.2. On traite lVADN de proinsuline synthétique par l'Alu I endonucléase pour obtenir deux fragments de 43 paires de base et environ 56 paires de base, respectivement. On scinde de même ltinsert de cADN de pcHI-l, obtenu de préférence par scission en Hha I tel que décrit dans l'exemple 2B, par une hydrolyse partielle catalysée par l'Alu I endonucléase pour former des fragments de 75, 90, 110, 135, 165, 200, 245, 275, 375 et 455 paires de base, respectivement; on fractionne ces fragments par électrophorèse sur gel pour obtenir le frag- ment de 375 paires de base, le résultat d'une scission en un seul site dans le codon pour l'acide aminé numéro 14. On réunit par une ligature des extrémités tronquées les fragments de scission du gène synthétique et le fragment de scission à un seul site, de 375 paires de base, de l'in- sert de cADN. Une réunion correcte du fragment synthétique à 43 paires de base avec le fragment de cADN à 375 paires de base est maximalisée en assurant un excès molaire du cADN à 375 paires de base. Les possibilités d'une réunion incorrecte sont également réduites du fait que les fragments synthétiques ont des extrémités saillantes à simple chaîne qui ne sont pas complémentaires avec celles du fragment de cADN à 375 paires de base. La molécule ainsi formée, un composite de la séquence synthétique codant pour la méthionine suivie des acides ami- nés 1 à 13, et de la séquence naturelle codant pour les aci- des aminés 14 à 86 de la proinsuline, constitue une séquence codant pour la proinsuline. La séquence codant pour la pro- insuline peut être insérée dans n'importe quel plasmide d'ex- pression choisi, par remplissage ou excision des extrémités à simple chaîne, puis fixation des oligonucléotides de liaison appropriés. L'expression donne une protéine fusionnée qui peut être scindée au résidu méthionine par traitement au bromure de cyanogène pour obtenir la proinsuline. La proinsuline est ensuite convertie en insuline par le procédé de Kemmler et al., ci-dessus. B. L'insert de cADN de pcHI-l a un site Hha I dans la séquence codant pour les acides aminés -14 à -13, tel que représenté sur la Fig. 2. De plus, le vecteur de transfert pBR322 a un site Hha I juste à 22 paires de base du site Pst I à l'extrémité 5' de l'insert. I1 est donc possible d'isoler de nouveau une séquence comprenant la totalité de la séquence codant pour la proinsuline et une région de 22 paires de base de ADN pBR322, en traitant pcHI-l par l'Hha I endonucléase. Ch préfère ce procédé à un nouvel isolement de l'insert avec la Pst I endonucléase, car l'insert contient deux sites Pst I internes et le rendement en ADN d'insert intact par un trai- tement à la Pst I endonucléase est faible. La séquence Hha I isolée est également parfaitement utilisable dans les procé- dés des exemples 2A et 2C décrits ici. Le traitement de l'un ou l'autre des isolats par l'Hha I endonucléase se traduit par une scission de la chai- ne plus entre les acides aminés -14 et -13 de la pré-séquence. (La chaine plus est définie comme la cha ne dont la séquence de nucléotides correspond à la séquence du mARN. La chaine moins est la chaine dont la séquence est complémentaire de la séquence du mARN). La pré-séquence restante peut être spé- cifiquement séparée en exploitant l'activité 3' à 5' exonu- cléase de la T4 ADN polymérase qui agit sur la chaîne moins à l'extrémité de codage de la pré-séquence et sur la chaXne plus à l'extrémité opposée. La réaction exonucléolytique peut être arrêtée à un nucléotide défini en mettant le même nu- cléotide, sous la forme triphosphate, dans le mélange réac- tionnel. Ltaction exonucléolytique est alors contrecarrée par l'activité de polymérase de l'enzyme qui remplace conti- nuellement le nucléotide spécifique, tel que décrit par En- glund P.T. dans J. Biol. Chem. 246, 3269 (1971) et dans J. Mol. Biol. 66, 209 (1972). La pré-séquence restante peut être digérée spécifi- quement jusqu'au codon de phénylalanine N-terminal de l'aci- de aminé numéro 1 par trois cycles de digestion par la T4 polymérase. Le cycle 1 est effectué en présence de TTP qui termine la digestion à l'opposé du A du codon de glycine dans l'acide aminé en position -7o Le cycle 2 est effectué en pré- sence de dCTP qui termine la digestion à l'opposé du G du codon en position -5 (Asp). Le cycle 3 est effectué en pré- sence de dATP qui termine la digestion à l'opposé du T qui est le premier nucleotide de position 1 de la proinsuline. Après chaque cycle de digestion par la T4 polymérase, le triphosphate du cycle juste complété doit être éliminé avant d'introduire le triphosphate nécessaire pour le cycle suivant. Pour séparer les triphosphates du mélange réaction- nel, on utilise des minicolonnes de Sephadex G-75 (Marque déposée. Pharmacia Inc, Uppsala, Suède). Les colonnes peuvent être équilibrées avecun tampon approprié et des échantillons recueillis dans un tampon comtenant le triphosphate du cycle suivant. De cette façon, l'enzyme migrant avec l'ADN ne di- gère pas I'ADN au-delà du prochain point d'arrêt choisie Pour eviter une telle digestion dans la partie inférieure de la colonne après la réesolution du triphosphate précédent, on effectue une chromalographie à froid (4 C) et on active l'é- lution par centzifugation0 On peut également inactiver l'en- zyme par la chaleur, à 65 C, avant l'opération de chromato- graphie. On amorce alors le cycle suivant par addition d'en- zyme active, fraiche. Les trois cycles de digestion par la T4 polymérase fournissent une digestion complète et spécifi- que de la chaîne moins d'ADN jusqu'au premier codon de la sé- quence codant pour la proinsuline. La séquence de la chaîne plus à l'extrémité opposée de la molécule qui a également une extrémité 3', est telle que seuls quelques nucléotides sont éliminés par les cycles de digestion ci-dessus. La chaîne plus à l'extrémité de la pré-séquence est alors spécifiquement digérée avecla Si exonucléase qui agit sur les extrémités à simple chaîne pour donner une molécule aux extrémités tronquées. Des précautions doivent être pri- ses pour éviter une digestion partielle par la Sl nucléase au-delà du début du premier codon. Une telle digestion par- tielle peut avoir lieu en raison d'une "respiration" de l'hé- lice, un non-appariement partiel et provisoire des cha nes d'ADN. La "respiration" a lieu dans toute la molécule, mais le plus fréquemment dans les régions riches en A-T et aux ex- trémités des molécules d'ADN. Un non-appariement provisoire au codon numéro 1, riche en A-T, pourrait permettre une ac- tion S1 nucléolytique au-delà du point d'arrêt fixé. Cet in- convénient peut être évité en effectuant la digestion S1 dans des conditions d'intégrité maximale de l'hélice; faible tem- pérature (température ambiante ou plus basse) et haute teneur en sel normalement utilisé dans le tampon pour une réaction S1. Des échantillons d'ADN obtenus aux stades successifs de la digestion par la S1 nucléase sont isolés et purifiés da.ns un vecteur de transfert approprié selon des procédés connus dans la technique. On procède à une analyse de la sé- quence du plus petit fragment Alu I de ces clones pour sélec- tionner les clones codant pour la proinsuline, dont la pré- séquence a été totalement séparée. Un procédé attrayant pour isoler et purifier le cADN codant pour la proinsuline implique l'incorporation de queues oligo-A, en utilisant une transférase terminale, sur les ex- trémités 3' du cADN. Les queues oligo-T sont formées sur l'ex- trémité 3' en un site approprié sur un vecteur de transfert d'expression, tel que le site EcoRl dans le gêne de P-galac- tosidase sur le plasmide pTS-l (Ullrich A. et 41.) (Voir éga- lement la demande de brevet US no 933 035). L'insertion du cADN codant pour la proinsuline par le procédé ci-dessus four- nit uninsert correctement orienté, en phase quant au cadre de lecture avec le gène de la P-galactidase du plasmide selon une probabilité de 1/6. L'expression des queues oligo-A se traduit par l'incorporation des résidus de lysine juste avant le début de la séquence de proinsuline. Une digestion modérée de la protéine fusionnée par la trypsine fournit la proinsu- line qui est convertie en insuline active tel que décrit pré- cédemment. Selon un autre procédé, la protéine fusionnée est traitée par une combinaison de trypsine et de carboxypeptida- se B (ou de cathépsine B) pour donner une insuline active à partir de la protéine fusionnée en une seule réaction. C. On construit une séquence codant pour la proinsu- line par scission sélective à un site interne dans la région codant pour la proinsuline, puis on fixe une séquence synthé- tisée par voie chimique, codant pour cette partie de la ré- gion codant pour la proinsuline éliminée par la scission pré- cédente. Comme source de région codant pour la proinsuline, on utilise le plasmide pcHI-l qui est sélectivement excisé par traitement avec la Pst I endonucléase ou de préférence par traitement avec la Hha I endonucléase, tel que décrit dans l texemple 2B. Chaque fragment, après isolement, est traité par une phosphatase alcaline pour éliminer les groupes phosphate 5' terminaux, puis on scinde par traitement avec une endonucléase de restriction ayant un point de scission unique dans la sé- quence codant pour la proinsuline. Le site de restriction est de préférence proche d'une des extrémités de la séquence co- dant pour la proinsuline. Le site Alu I dans la région des acides aminés 13-14 fournit un point de scission approprié, (voir.Fig.2). Le fragment Hha I de pcHI-l est partiellement scindé par l'Alu I endonucléase pour fournir deux fragments d'environ 76 paires de base et 375 paires de base, respective- ment. Les fragments Alu I sont fractionnés par électrophorèse sur gel, tel que décrit dans l'exemple 2A, et le fragment à 375 paires de base est recueilli. On applique le procédé au phosphotriester (Itakura K. et al., J. Biol. Chem. 250, 4592 (1975) et Itakura K. et al., J. Am. Chem. Soc. 97- 7327 (1975)) pour synthétiser une sé- quence de nucléotides codant pour les 13 premiers acides ami- nés de la proinsuline avec un G terminal 5' (sur la chaine plus), pour compléter le codon pour l'alanine en position 14. La chaine plus de 1'ADN synthétique a la séquence 3'-TTTGTGAA- CCAACACCTGTGCGGCTCACACCTGGTGGAAG-5' correspondant à la sé- quence naturelle. Cependant, il est possible de synthétiser d'autres séquences codant pour les mêmes acides aminés. De façon générale, la séquence est: 3'-TTKGTLAAKCAJCAKXTYTGKG- GLQRSCAKXTYGTLCAJG-5'. La séquence obtenue est réunie par ses extrémités tronquées au fragment d'environ 375 paires de base du fragment Hha I de pcHI-l. Etant donné que ce dernier a un phosphate 5' uniquement à l'extrémité à réunir, les deux fragments sont réunis dans un ordre correct. Le fragment syn- thétique est correctement réuni au plus grand fragment dans environ 50 % des réactions. L'ADN traité par une ligase est alors cloné et inséré dans un plasmide d'expression approprié, soit en formant une queue oligo-A, tel que décrit dans l'exemple 2B, soit en fi- xant des agents de liaison et en insérant dans des plasmides de cadres de lecture connus. Dans le cas d'inserts à queue oligo-A, on observe l'expression de la proinsuline dans envi- ron 1/12 des clones. Dans le cas d'une insertion directe, lorsque le cadre de lecture est correct, la fréquence d'ex- pression des clones est d'environ 50 %. EXEMPLE 3 Expression de la pré-proinsuline et de la proinsuline humaines Les inserts isolés et purifiés codant pour la pré- proinsuline (exemple 1) ou la proinsuline (exemple 2) sont insérés dans un vecteur de transfert d'expression. Lorsque l'insertion a lieu dans l'orientation correcte eu égard à l'i- nitiation du transfert au site d'insertion, et que l'insert est en phase du cadre de lecture avec le promoteur et le site de fixation du ribosome, le produit protéinique du gène cloné est synthétisé par les cellules hôtes de grande activité mé- tabolique, transformées par le vecteur de transfert. Le pro- duit protéinique est une protéine fusionnée si le vecteur de transfert d'expression contient une partie du gène de proca- ryote entre le promoteur et le site d'insertion. Mais l'inser- tion peut être immédiatement adjacente à un site de promoteur. Dans de tels cas, la protéine codée par l'insert est synthé- tisée directement. Les deux techniques présentent des avan- tages et des inconvénients. Les protéines fusionnées ont l'a- vantage d'avoir tendance A stabiliser la protéine étrangère codée par le gène inséré. Des propriétés fonctionnelles dési- rables, telles que l'excrétion de la cellule hôte, sont éga- lement conférées par la fusion avec certaines protéines h8tes telles que la p-lactamaseo D'autre part, la séquence codée par l'insert est difficile a purifier, étant donné le désir général d'éliminer spécifiquement la portion hôte de la pro- téine fusionnée. Cette élimination se fait par des techniques connues telles que décrites dans les exemples 2A et 2Bo La synthèse directe de la protéine désirée supprime la nécessité d'une scission specifque, mais élimine la possibilité d'ex- crétion hors de la cellule h8te. On a développe des plasmides d'expression dans les- quels l'expression est réglée par le promoteur lac (Italura et al., Science 198, 1056 (1977) Ullrich A. et al.o Excerpta Medica (1979)), par le promoteur tr (Martial et al., Scien- ce 205, 602 (1979))ô et par le promoteur de P-lactamase, (demande de brevet US n 44 647). L'expression est décelée par la mesure d'un produit capable de s'associer par voie immunochimique avec un anti- corps anti-insuline ou un anticorps anti-proinsuline. On a recours à un dosage radioimmunologique dans lequel l'anticorps est marqué de façon radioactive et des paires antigène-anti- corps sont précipitées par une préparation de Staphyloccoccus aureus tués par la chaleur. (Voir Morgan et Lazarow, Diabetes, 12, 115 (1963) et Kessler S.W., J. Immunolo 115, 1617 (1975)). Pour déceler l'expression dans des colonies de bactéries, on utilise le test de sélection radioimmun, tel que décrit par Erlich H.A. et al., Cell 10, 681 (1978) ou par Broome S. et Gilbert W., Proc. Nat. Acad. Sci. USA 75, 2746 (1978). On décèle des protéines fusionnées indicatrices de l'expression en comparant les poids moléculaires de la pro- téine hôte contribuant à la partie N-terminale de la protéi- ne fusionnée, dans les cellules hôtes transformées par des plasmides d'expression avec et sans insert. Une variante pré- férée consiste à utiliser comme hôte E. coli, souche P678-54, produisant des minicellules. Des acides aminés marqués par un radioisotope sont incorporés dans des protéines à minicel- lules, en comparant les souches transformées avec des vecteurs de transfert d'expression avec et sans insertion de la séquen- ce codant pour la proinsuline. Les protéines sont fraction- nées par électrophorèse sur gel de SDS-acrylamide et les po- sitions des protéines décelées par autoradiographie. L'expres- sion de la proinsuline est indiquée par la présence d'une bande de protéine marquée, trouvée uniquement dans les mini- cellules transformées par le plasmide d'expression de la pro- insuline. La position de la bande d'électrophorèse fournit une mesure du poids moléculaire de la protéine exprimée et est conforme à la longueur connue du gène inséré et de la portion N-terminale du procaryote. L'élimination de la portion de procaryote et la con- version de la proinsuline en insuline, in vitro, sont effec- tuées par des procédés connus, tel que décrit en détail ci- dessus. R E V E N D I C A T I 0 N S 1 - Vecteur de transfert d'ADN comprenant une sé- quence de désoxynucléotides codant pour la pré-proinsuline humaine. 2 Vecteur de transfert d'ADN comprenant une séquen- ce de désoxynucléotidescodant pour la proinsuline humaine. 3 - Microorganisme transformé par le vecteur de transfert suivant la revendication 1 ou 2. 4 - Vecteur de transfert d'ADN, caractérisé en ce qu'il comprend une séquence de désoxynucléot ides pour la pré- proinsuline humaine comportant une cha ne plus ayant la sé- quence: '-TCCTTCTGCCATG_24GCL_23X_22TY_22TGG-21ATG-20W-19GZ-19X-18TY-18 TXTYY X_ 1 TY 1?CCL_ 16X3 TY 15X- 4TY-14GCL-13X-12T-12X-11T-tl GCL_ 10X-9TY -9TGG_8GGL_7CCL_-6GAK-5CCL 4GCL 3GCL-2GCL1 TTK GTL2AAK3CAJ4CAK5X6TY6TGK7GGL8QR9S9CAK 10Xl TY l GTL12GAJ13 GCL14 X15TY 15TAK16Xl7TY17GTL18TGK19GCL20GAJ21w22GZ22GCL23 TTK24TTK25TAK26ACL27CCL 28 AAJ29 ACL30 31 31 32 GZ32 GAJ33 GCL34 GAJ35 AK36X37 TY37CAJ38GTL39GGL40CAJ41GTL42GAJ 43X44 TY44GGL45GGL46GGL47CCL48GGL49GCL50GGL51lQR52S52X53 TY53CAJ54 CCL 55X56TY 56GCL57X58TY58GAJ59GGL60 QR61S61X 62TY 62CAJ63 AAJ64 W65GZ65 GGL66ATM 67 68 69 CAJ70 K71 72ACL 73QR74 74 ATM75TGK76QR 77 77 78TY78TAK79CAJ80X 81 TY81 GAJ82AAK83TAK84 TGK 85AAK86TAGACGCAGCCCGCAGGCAGCCCCCCACCCGCCGCCTCCTGCACCG AGAGAGATGGAATAAAGCCCTTGAACCAGC poly A-3' o: A est le radical désoxyadényle, G est le radical désoxy-guanyle, C est le radical désoxycytosyle, T est le radical thymidyle, J est A ou G; K est T ou C; L est A, T, C ou G; M est A, C ou T; Xnest T ou C siY est A ou G, et C si Y est C ou T; Yn est A, G, C ou T si X est C, et A ou G si Xn est T; n Jqil n n -Wn est C ou A si Z n est G ou A, et C si Z n est C ou T; Zn est A, G, C ou T si Wn est C, et A ou G si Wn est A; QRn estTCsi Sn estA, G C ou T etAGsiSn est T ou C; n nn Sn est A, G, C ouT si QRn est TC et T ou C si QR est AG; et les indices n indiquent la position dans la séquence d'a- cides aminés de la pré-proinsuline humaine, à laquelle cor- respond chaque triplet dans la séquence de nucléotides, se- lon le code génétique, les positions des acides aminés étant numérotées à partir de l'extrémité aminoo - Vecteur de transfert d'ADN, caractérisé en ce qu'il comprend une séquence de désoxynucléotides codant pour la proinsuline humaine comportant une chaîne plus ayant la séquence: 'TTKlGTL2AAK3CAJ4CAK5x6TY6TGK7GGL8QR9S9CAK10XllTYllGTL12GAJ 13 GCLXTY TAK X TY GTL TGK GCL GAJ W GZ -C GCL14X15 TY15TAK 16X 17TY 17GT 18TGK 19G L20 21 22 22GCL23 TTK TTK TAK ACL CCL AAJ ACL W GZ W GZ GAJ 24 25 TAK26ACL27CCL28AAJ29ACL30 31 31 32 32 33 GCL34GA 35GAK36X37TY37CAJ38GTL39GGL40CAJ41GTL42GAJ43X44 TY 44GGL45 GGL46GGL47CCL48GGL49GCL50 GGL51QR 52 52X53 TY53 CAJ54 CCL 55X56TY 56GCL 57X58TY58GAJ59 GGL60QR61S61X62TY 62CAJ 63AAJ64 W GZ GGL ATM GTL GAJ CAJ TGK TGK ACLQ GZ65 GGL66ATM67GTL68GAJ69CAJ70 TGK71 72 CL73QR74S74 ATM75 TGK76QR77S77X78TY78TAK79CAJ80X81 TY81 GAJ82AAK83TAK84 TGK85AAK86TAG-3' ou: A est le radical dé-soxyadényle, G est le radical désoxyguanyle, C est le radical désoxycytosyle, T est le radical thymidyle, J est A ou G; K est T ou C; L est A, T, C, ou G M est A, C ou T; X est T ou C si Y est A ou G et C si Y est C ou T; Yn est A, G, C ou T si X est C, et A ou G si X est T n n n W est C ou A si Z est G ou A, et C si Z est C ou T; n n n Z est A, G, C ou T si Wn est C, et A ou G si Wn est A; nn QRn est TC si Sn est A, G, C ou T, et AG si Sn est T ouC; S est A, G C ou T si QR est TC, et T ou C est QRn est AG nnn et les indices n indiquent la position dans la séquence d'ah cides aminés de la proinsuline humaine, à laquelle correspond chaque triplet dans la séquence de nucléotides, selon le co- de génétique, les positions des acides aminés étant numéro- tées à partir de l'etrémité aminoo 6 - Microorganisse transformé par le vecteur de trans- fert selon la revendication 4 ou 5. 7 - Plasmide pcHItle 8 - Plasmide pcHP-1o 9 - Microorganisme transformé par le plasmide selon la revendication 7 ou 80 - Microorganisme selon la revendication 9, carac- térisé en ce que l'organisme est Escherichia coli. 11 - Microorganisme selon la revendication 10, carac- térisé en ce que l'organisme est Escherichia coli HB-101. 12 - Protéine fusionnée, caractérisée en ce qu'elle comprend la séquence d'acides aminés de la pré-proinsuline humaine comme séquence C-terminale et une portion d'une pro- téine de procaryote comme séquence N-terminale. 246499? 13 - Protéine fusionnée, caractérisée en ce qu'elle comprend la séquence d'acides aminés de la proinsuline hu- maine comme séquence C-terminale et une portion d'une protéi- ne de procaryote comme séquence N-terminale. 14 - Procédé de préparation d'une séquence de déso- xynucléotides codant pour la proinsuline humaine, caracté- risé en ce que (1) on traite un fragment de cADN comprenant une séquence de nucléotides codant pour la pré-proinsuline humaine avec une endonucléase de restriction ayant un site de restriction dans la région codant pour le pré-peptide de la pré-proinsuline; (2) on traite la séquence de désoxynucléotides du stade (1) contenant la séquence codant pour la proinsuli- ne avec la T4 ADN polymérase en présence d'un désoxynucléo- tide triphosphate, de telle sorte que la digestion exonucléo- lytique à partir des extrémités 3' ait lieu jusqu'à un point d'arrêt défini par le désoxynucléotide triphosphate; (3) on remplace le désoxynucléotide triphos- phate par un désoxynucléotide triphosphate différent, de tel- le sorte que la digestion procède jusqu'à un second point d'arrêt défini; (4) on renouvelle l'opération du stade (3), si nécessaire, pour effectuer la digestion de l'extrémité 3' jusqu'au premier nucléotide de la séquence codant pour la proinsuline, la digestion finale étant conduite en présence de dATP; et (5) on traite le produit de désoxynucléotide obtenu au stade (4), par la S1 nucléase pour digérer l'extré- mité 5' jusqu'au premier nucléotide de la séquence codant pour la proinsuline. - Procédé selon la revendication 14, caractérisé en ce que l'endonucléase de restriction est Hha Io 16 - Procédé de préparation de la séquence de déso- xynucléotides codant pour la proinsuline humaine, caractéri- sé en ce que: (1) on scinde en deux fragments une séquence de désoxynucléotides codant pour la chaine B de l'insuline humaine et ayant au moins un site de restriction en commun avec le cADN de la proinsuline humaine, la scission étant effectuée par une hydrolyse catalysée par une endonucléase de restriction reconnaissant le site de restriction commun; (2) on scinde un cADN codant pour la pré-pro- insuline humaine en deux fragments, la scission étant effec- tuée par une hydrolyse catalysée par la même endonucléase de restriction que celle utilisée au stade (1); et (3) on réunit par une liaison des extrémités - tronquées les fragments obtenus aux stades (1) et (2), qui contiennent ensemble la séquence codant pour la proinsuline humaine. 17 - Procédé selon la revendication 16, caractérisé en ce que ltendonucléase de restriction est Alu I. 18 - Procédé de préparation de la séquence de désoxy- nucléotides codant pour la proinsuline humaine, caractérisé en ce que: (1) on élimine une partie de la séquence de dé- soxynucléotides codant pour la proinsuline humaine, en trai- tant un cADN codant pour la pré-proinsuline humaine par une endonucléase de restriction ayant un site de reconnaissance dans la séquence codant pour la proinsuline; (2) on synthétise une séquence de désoxynucléo- tides capable de remplacer la partie éliminée et codant pour les mêmes acides aminés codés par la partie éliminée; et (3) on réunit les séquences de désoxynucléoti- des obtenues aux stades (1) et (2) en liant les extrémités tronquées. 19 Procédé selon la revendication 18, caractérisé en ce que l'endonucléase de restriction utilisée au stade (1) est Alu I. - Procédé de préparation d'insuline, caractérisé en ce que: (1) on construit un microorganisme ayant une séquence codant pour un peptide comprenant: (a) une séquen- ce de désoxynucléotides (NaNbNc)j ayant une extrémité 5' et une extrémité 3', dans laquelle Na, Nb et Nc peuvent être A, T, G ou C et jest un nombre entier de 0 à 100, N NbN n' étant pas TGA, TAA ou TAG, (b.) une séquence de désoxynucléo- tides codant pour la chaîne B de l'insuline humaine fixée à l'extré- mité 5' de (N NbNc)j; et (c) une séquence de désoxynucléo- tides codant pour la chatne A de l'insuline humaine fixée à l'extrémité 3' de (NaNbNcj; (2) on fait proliférer le microorganisme dans des conditions appropriées pour l'expression d'une séquence de désoxynucléotides codant pour le dit peptide, afin de pro- duire le peptide ayant la chaXne B de l'insuline humaine fi- xée à sa terminaison N et la chaîne A de l'insuline humaine fixée à sa terminaison C; (3) on purifie le peptide avec les chaînes A et B fixées; (4) on traite le peptide purifié pour former des ponts disulfure, tel que trouvés dans l'insuline, entre les cha nes A et B; (5) on traite le peptide purifié réticulé avec une préparation d'enzyme capable d'exciser les chatnes A et B du peptide, les chaines A et B excisées ayant les ponts di- sulfure, formant ainsi l'insuline; et (6) on purifie l'insuline produite au stade (5). 21 - Procédé selon la revendication 20, caractérisé en ce que la séquence de désoxynucléotides codant pour la cha&ne B de l'insuline humaine comprend une chaXne plus ayant la séquence: 5'TTK1GTL2AAK3CAJ4CAK5X6TY6TGK7GGL8QR9S9 CAK X11TY11GTL12 GAJ13 GCL 4X15TY15 TAK 16X 17 TY17 GTL18 TG19 GCL20 GAJ21 22G 22GCL23TTK24TTK25TAK26ACL 27CCL 28AAJ29ACL30-3 et la séquence de désoxynucl6otides codant pour la cha ne A de tl'insuline humaine comprend une chaXne "plus" ayant la séquence: 5'-GGL 66ATM67GTL68GAJ69 CAJ7oTGK71TGK72ACL 73QR74 74T GKQ TV TAKC CAJ X TY CAJ AAK 74ATM75TGK76QR77 77X 78TY78 79CAJ80 81 81 82 83 TAK84TGK85AAK86-3' o: A est le radical désoxyadényle, G est le radical désoxyguanyle, C est le radical désoxyCytosyle, T est le radical thymidyle, J est A ou G; K est T ou C; L est A, T, C ou G M est A, C ou T Xn est T ou C si Yn est A ou G, et C si Yn est C ou T Yn est A. G, C ou T si Xnest C, et A ou G si Xn est T; Wnest C ou A si Z est G ou A, et C si Z est C ou T; n n n Z est A, G, C ou T si W est C, et A ou G si W est A; n n n QRn estTCsi Sn est A, G, Cou T et AG si Sn est T ou C; S est A, G. C ou T si QRnest TC, et T ou C si QR est AG; et les indices n indiquent la position dans la séquence d'a- cides aminés de la proinsuline humaine, A laquelle correspond chaque triplet dans la séquence de nucléotides, selon le co- de génétique, les positions des acides aminés étant numérotés A partir de l'extrémité amino. 22 - Procédé de préparation deun vecteur de trans- fert d'ADN utilisable pour conserver et reproduire une séquen- ce de désoxynucléotides codant pour la pré-proinsuline humaine caractérisé en ce qu'on fait réagir une séquence de désoxy- nucléotides codant pour la pré-proinsuline humaine avec une molécule d'ADN préparée en scindant un vecteur de transfert par une enzyme de restriction. 23 - Procédé selon la revendication 22, caractérisé en ce que la séquence de désoxynucléotides codant pour la pré- proinsuline humaine comprend une cha ne plus ayant la sé- quence: 5'-ATG-24GCL-23X-22TY-22TGG-21ATG-20 W-19G- 19X-19TY-18 xTY CCL X TY X TY GCL X TY X TY X17TY 17 -16 -15TY -_15 -14TY -14G CL-13 -12TY -12 -11TY-11 GCL_10X_9TY_9TGG 8GGL_7CCL6GAK_ 5 CCL4GCL-3GCL 2GCL_1TTK_1 GTL2AAK3CA3 4 CAK5 6TY6TGK7GGL8QR9S9CAK 10 XllTYllGTL12GAJ13 GCL X TY15TAK16X17TY17GTL18TGKGCL2GAJ W 22GZ22GCL23 TTK24TTK25TAK26ACL27CCL28AAJ29ACL30w31GZ 31W32GZ 32 GAJ33 GCL34 GAJ35 GAK36X37TY37CAJ38GTL39GGL40 CAJ41GTL42GAJ43X44 TY44GGL45 GGL46GGL4 7CCLÀ8GGL4 GCL5 GGL5QR52S52X3TY 53 54 CCL X TY 56GCL57X58TY58GAJ59GGL60QR6 61X62 TY62CAJ 63 AAJ64 W GZ65GGL 66ATM6 7GTL6 GAJ68CAJ7 TGK7 TGK72 ACL73 QR74 S74 ATM75 TGK76 QR77S77 X78TY78TAK79CAJ8QX81TY8GAJ82AAK8 TAK8 TGK 5AAKX6TAG-3' o A est le radical désoxyadényle,, G est le radical désoxyguanyle, C est le radical désoxycytosyle, T est le radical thymidyle J est A ou G; K est T ou C; L est A, T, C ou G; M est A, C ou T; X est T ou C si Y est A ou G, et C si Y est C ou T; n n n Yn est A, G, C ou T si X est C, et A ou G si X est T; n n n W est C ou A si Z est G ou A, et C si X est C ou T; n n n Z est A, G, C ou T si W est C et A ou G si W est A; n n n QRn est TC si Sn est A, G, C ou T, et AG si S est T ou C; Sn est AG uTs R s C tTo iQnetA n S est A, G, C ou T si QRnest TC, et T ou C si QRn est AG; n et les indices n indiquent la position dans la séquence d'a- cides aminés de la proinsuline humaine, à laquelle correspond chaque triplet dans la séquence de nucléotides, selon le co- de génétique, les positions des acides aminés étant numéro- tées à partir de l'extrémité amino. 24 - Procédé de préparation d'une séquence de déso- xynucléotides codant pour la proinsuline humaine, utilisable dans la synthèse de l'insuline humaine, caractérisé en ce qu'on hydrolyse les extrémités 3' d'une séquence de désoxynu- cléotides codant pour la pré-proinsuline humaine, conservée et reproduite selon le procédé de la revendication 22, par un ou plusieurs cycles d'une digestion exonucléolytique progres- sive, catalysée par la T4 ADN polymérase agissant en présence d'un désoxynucléotide triphosphate, puis on hydrolyse les ex- trémités 5' de la séquence de désoxynucléotides par une diges- tion nucléolytique catalysée par une enzyme du nucléase, spé- cifique pour 1'ADN à une seule chaîne ayant une extrémité 5'. - Procédé selon la revendication 24, caractérisé en ce que la séquence codant pour la préproinsuline humaine est hydrolysée en un site spécifique dans une réaction cata- lysée par la HhaI endonucléase avant la digestion par la T4 ADN polymérase. 26 - Procédé de préparation d'une séquence de désoxy- nucléotides codant pour la proinsuline humaine, utilisable dans la synthèse de l'insuline humaine, caractérisée en ce qu'on fait réagir un fragment de cADN codant pour une partie de la proinsuline humaine, préparée par scission d'un cADN codant pour la préproinsuline humaine, conservé et reproduit selon le procédé de la revendication 22, avec une endonucléa- se de restriction ayant un site de reconnaissance unique dans sa séquence de désoxynucléotides, avec un ADN synthétisé par voie chimique dont la séquence de désoxynucléotides code pour la partie de la proinsuline humaine non-codée par le fragment de cADN, dans une réaction de liaison des extrémités tronquées, catalysée par 1'ADN ligase. 27 - Procéd6 selon la revendication 26, caract6risé en ce que l'endonucléase de restriction est Alu I. 28 - Procédé selon l'une quelconque des revendica- tions 24 à 27, caractérisé en ce que la séquence de désoxy- nucléotides codant pour la proinsuline humaine comprend une chaîne "plus" ayant la séquence: '-TTK 1GTL2 AAK3 CAJ4 CAK5 X6TY6 TGK7 GGLQR X9 CAK10 Xl TY 1GTL12 GAJ13 ST1G 2 3 J4 5 6 6 7 8Q9 9 10 11 il 12 13 GCL14 X TY15 TAK16 X17 TY17 GTL TGK19GCL20 GAJ21W22 G 22 GCL23 TTK24 TTK25TAK26ACL CCL28AAJ2 ACL3 W3 GZ 3W32 GZ32 GAJ33 TT24T 25 26 27 28 29 30 31 31 32 32 33 GCL34 GAJ GAK36 X37TY37CAJ38 GTL39 GGL4 CAJ4 GTL42GAJ X 34 35 36 37 37.38 39 40 41 42 43 44 TY44 GGL45 GGL46 GGL47 CCL47 GGL49 GCL50 GGL51QR52 S52X53 TY 53CAJ54 CCL X TY GCL X TY GAJ GGL QR S X TY CAJ AAJ C55 56 56 57 58 58GAJ59 GGL60 QR61 S61 X62TY62CAJ63 AA64 W65 Z65 GGL 6 ATM GTL68GAJ CAJ7 TGK TGK72ACL73QR SC 65 66 67 68 69 70 71 72 L73QR74S74 AT75 TGK76 QR77S77X78TY78TAK79CAJ 80X81 TY81 GAJ82 AAK83TAK84 TGK85AAK86TAG-3' o: A est le radical désoxyadényle, G est le radical d6soxyguanyle, C est le radical désoxycytosyle, T est le radical thymidyle, Jest A ou G; K est T ou C; L est A, T, C ou G; M est A, C ou T; Xn est T ou C si Y est A ou G, et C si Y est C ou T; n n - n n Y est A, G, C ou T si X est C, et A ou G si X est T; n Wn est C ou A si Z est G ou A, et C si Z est C ou T; n n n Z est A, G, C ou T si W est C, et A ou G si W est A; n n n QR est TC si S est A, G, C ou T, et AG si S est T ou C; n n n G. C S est A, G, C ou T si QR nest TC, et T ou C si QRn est AG nnn et les indices n indiquent la position dans la séquence d'a- cides aminés de la proinsuline humaine, à laquelle corres- pond chaque triplet dans la séquence de nucléotides, selon le code génétique, les positions des acides aminés étant nu- mérotées à partir de l'extrémité amino. 29 - Procédé de préparation du plasmide pcHI-1, se- lon l'une quelconque des revendications 22 ou 23, caractérisé en ce que la molécule dtADN préparée par scission d'un vec- teur de transfert avec une enzyme de restriction est pBR322 et l'enzyme de restriction est la Pst I endonucléase. - Procédé de préparation d'un vecteur de transfert dtADN, utilisable pour conserver et reproduire une séquence de désoxynucléotides codant pour la proinsuline humaine, ca- ractérisé en ce qu'on fait réagir une séquence de désoxynu- cléotides codant pour la proinsuline humaine, préparée selon l'une quelconque des revendications 24 à 28, avec une molé- cule dADN préparée en scindant un vecteur de transfert par une enzyme de restriction. 31 - Procédé selon la revendication 30 pour la pré- paration du plasmide pcHP-l, caracterisé en ce que la molécu- le d'ADN préparée par scission d'un vecteur de transfert par une enzyme de restriction est pBR322 et l'enzyme de restric- tion est la Pst I endonucléase. 32 - Procédé de préparation deun vecteur de transfert d'expression selon la revendication 22 ou 30, utilisable dans l'expression d'une séquence de désoxynucléotides codant pour la pré-proinsuline humaine ou la proinsuline humaine, carac- térisé en ce que la molecule d'ADN préparée par scission d'un vecteur de transfert par une enzyme de restriction est scindée en un point situé dans la région de contrôle de l'expression. 33 - Procédé de préparation d'une protéine fusionnée, comprenant la séquence d'acides aminés de la pré-proinsuline humaine comme séquence C-terminale et une partie d'une protéi- ne de procaryote comme séquence N-terminale, caractérisé en ce qu'on incube un microorganisme transformé par un vecteur de transfert d'expression comprenant une séquence de désoxynu- cléotides pour la pré-proinsuline humaine, préparé par le procédé selon la revendication 22 ou 23. 34 - Procédé de préparation d'une protéine fusionnée comprenant la séquence d'acides aminés de la proinsuline hu- maine comme séquence Cterminale et une partie d'une protéine de procaryote comme séquence Nterminale, caractérisé en ce qu'on incube un microorganisme transformé par un vecteur de transfert d'expression comprenant une séquence de désoxynu- cléotides codant pour la proinsuline humaine, préparé par le procédé selon la revendication 30. - Procédé de synthèse de la proinsuline humaine comprenant des peptides A et B séparés l'un de l'autre par un peptide C, caractérisé en ce qu'on incube un microorganis- me, transformé par un vecteur de transfert d'expression com- prenant une séquence de désoxynucléotides codant pour la pro- insuline humaine, préparé selon l'une quelconque des revendi- cations 24 à 28, dans des conditions appropriées pour l'ex- pression de la séquence codant pour la proinsuline humaine, et on purifie la proinsuline humaine à partir du lysat ou du milieu de culture du microorganisme. 36 - Procédé selon la revendication 35, caractérisé en ce que la séquence de désoxynucléotides codant pour la cha ne B de 1' insuline humaine comprend une chaîne plus ayant la séquence: 5'TTK1GTL2AAK3CAJ4CAK5X6TY6TGK7GGL 8QR9S9 CAK Xll TY1 GTL 2GAJ 13GCL14X15TY15TAK16X17 Ty17 GTL18 TGK19 GCL GAJ 2W GZ22GCL23 TTK24TTK2 TAK26ACL 27CCL 28AAJ ACL -3' 21 22 22 23 24 25 26 27 28 29 30 et la séquence de désoxynucléotides codant pour la cha ne A comprend une chafne plus ayant la séquence: 5'-GGL66ATM67 GTL GAJ CA.J TGK TGK ACL QR S ATM TGK PR S X TY GTL68 GAJ69A 70 oTGK71 TGK72A L73QR74S74AT 75 76 77 77 78 78 TAK79 CAJ80X 8TY81 CAJ82AAK83TAK84TGK85 AAK86-3' ou: A est le radical désoxyadényle, G est le radical désoxyguanyle, C est le radical désoxycytosyle, T est le radical thymidyle, J est A ou G; K est T ou C; L est A, T, C ou G; M est A, C ou T; Xnest T ou C si Y est A ou G, et C si Yn est C ou T; Yn est A, G, C ou T si X est C, et A ou G si X est T; n n n W est C ou A si Z est G ou A, et C si Z est C ou T; n n n Zn estA, G Cou T si W estC, etA ou G si W est A; QRnest TC si Sn est A, G, C ou T, et AG si S est T ou C; nn Sn est A, G, C ou T si QR est TC, et T ou C si QR est AG; et les indices n indiquent la position dans la séquence d'a- cides aminés de la proinsuline humaine, à laquelle correspond chaque triplet dans la séquence de nucléotides, selon le co- de génétique, les positions des acides aminés étant numéro- tées à partir de l'extrémité amino. 37 - Procédé selon la revendication 35, caractérisé en ce que la séquence de désoxynucléotides codant pour la proinsuline humaine comprend une chaSne plus ayant (a) la sé- quence de désoxynucléotides (NaNbNc)j ayant une extrémité 5' et une extrémité 3', o Na Nb et Nc peuvent être A, T, G ou C et j est un nombre entier de O à 100, NaNbNC n'étant pas TGA, TAA ou TAG; (b) une séquence de désoxynucléotides codant pour la chaîne B de l'insuline humaine fixée à l'extrémité 5' de (NaNbNc)j; et (c) une séquence de désoxynucléotides codant abcj pour la chaîne A de l'insuline humaine fixée à l'extrémité 3' de (NaNbNc)j 38 - Procédé de synthèse de l'insuline humaine, ca- ractérisé en ce qu'on oxyde des groupes sulfhydryle sur les peptides A et B de la proinsuline humaine, préparée selon l'une quelconque des revendications 35 à 37, pour former des ponts disulfures entre les peptides A et B, puis on excise - le peptide C par une hydrolyse catalysée par une enzyme, spé- cifique pour les liaisons reliant le peptide C aux peptides A et B.