FR 2462477 A1 19810213 FR 7919652 A 19790731 La présente invention, à la réalisation de laquelle ont participé Messieurs Bernard FOURNET et René ZALISZ, concerne de nouvelles glycoprotéines extraites de Klebsiel- la Pneumoniae, leur procédé d'obtention, leur application comme médicaments et les compositions les renfermant. Un certain nombre de brevets français ont déjà décrit des glycoprotéines extraites de Klebsiella pneumoniae, il en est ainsi, par exemple, des brevets français n 2.043.475, 2.088.112, et 2.171.907. La présente demande concerne des glycoprotéines plus précisément définies et a ainsi pour objet de nouvelles gly- coprotéines hydrosolubles extraites de Klebsiella Pneumoniae, caractérisées en ce qu'elles renferment de 10% à 20% de pro- téines, 50% à 70% d'oses neutres, 15% à 25% d'acide glucuro- nique, 1% à 2% d'osamines et ont un poids moléculaire compris entre 80.000 et 350.000 daltons. On désigne par oses neutres, notammentdes hexoses neu- tres tels que le glucose, le mannose ou le galactose. On retient de préférence les glycoprotéines telles que définies ci-dessus, caractérisées en ce que leur poids mo- léculaire estimé par ultra centrifugation est d'environ 100.000 daltons. Les glycoprotéines de l'invention peuvent être extrai- tes de différentes souches de Klebsiella pneumoniae; on retient cependant tout particulièrement cel-Les qui provien- nent de la souche déposée à l'Institut PASTEUR sous le nu- méro 52.145. L'étude de la structure de ces glycoprotéines à l'aide de différentes techniques chimiques, notamment, la réduction des résidus acides uroniques par le carbodiimide, la pexmé- thylation, la dégradation uronique, l'oxydation périodique ou l'oxydation par l'oxyde de chrome, a permis de préciser la composition et la structure des produits de la présente demande. Les glycoprotéines selon l'invention sont formées d'une chaine protéique sur laquelle est greffée la fraction polysaccharidique. Les glycoprotéines préférées selon l'invention sont celles pour lesquelles la fraction protéique est composée par environ 30% d'acides aminés acides. On entend par aci- des aminés acides des acides aminés tels que l'acide aspar- tique ou l'acide glutamique. On retient aussi de préférence les glycoprotéines selon l'invention pour lesquelles l'acide aminé N-terminal de la fraction protéique est l'acide aspartique. Les glycoprotéines préférées selon l'invention sont aussi celles pour lesquelles la fraction polysaccharidique renferme approximativement de 9,5 à 10,5 molécules de gluco- se, de 4 à 5 molécules de mannose et de 3 à 3,5 molécules d'acide glucuronique pour une molécule de galactose. Parmi celles-ci, on retient tout particulièrement celles pour lesquelles la fraction polysaccharidique est essentiellement composée de la répétition de l'unité tétra- saccharidique dont la structure est la suivante: {-.glucose 1 4 mannose 1 4 glucose q acide glucuronique Parmi les nouvelles glycoprotéines, objet de l'inven- tion, on retient également tout particulièrement, celles dont la fraction polysaccharidique est formée de deux chai- nes polysaccharidiques dont chacune de ces chaines est liée à la fraction protéique par une liaison N-glycosidique en- tre une molécule de glucosamine d'une extréelité de la chai- ne polysaccharidique et une molécule d'asparagine de la chaîne protéique. L'invention a également pour objet un procédé d'obten- tion des nouvelles glycoprotéines hydrosolubles telles que définies cidessus, ledit procédé est caractérisé en ce que l'on traite, à l'aide d'un ammonium quaternaire, une solu- tion de glycoprotéines obtenue par diafiltration d'un ex- trait de lysat de cultures de Klebsiella pneumoniae, isole puis dissout le précipité obtenu à l'aide d'une solution aqueuse de chlorure de sodium, traite à froid la solution saline de glycoprotéines ainsi obtenue à l'aide d'un alcanol de faible poids moléculaire, obtient ainsi un nouveau préci- pité que l'on redissout dans l'eau, dialyse puis lyophilise. On peut utiliser différentes solutions de glycoprotéines au départ du procédé, ces solutions sont obtenues par dia- filtration de lysats de cultures de Klebsiella pneumoniae sur des membranes poreuses calibrées, capables de retenir les molécules d'un poids moléculaire égal ou supérieur à un poids moléculaire donné, qui est une constante pour ces mem- branes. Les membranes utilisées sont, par exemple, les membra- nes vendues sous les noms de marque AMICON XM50, PM30 et UM2, mais on préfère utiliser des membranes dont le seuil de rétention est de 100.000 daltons, tellesque les membra- nes commercialisées sous la désignation XM 100 ou Hi P100, par la société AMICON; Les membranes tout particulièrement préférées permettent de retenir les molécules dont le poids moléculaire est supérieur à 300.000 daltons; celles-ci sont avantageusement constituées par les membranes commercialisées sous la désignation XM300 par les sociétés AMICON et ROMICON. La diafiltration permet de sélectionner, en solution, des molécules dont le poids moléculaire est supérieur à un poids moléculaire donné, comme on l'a dit, par le choix de la membrane, en fonction du seuil de rétention désiré. Il est évident, pour l'homme de l'art, que l'utilisation d'au- tres solutions de mélnes caractéristiques, obtenues par d'autres moyens, comme par exemple par chromatographie sur gel polymérisé hydrophile, est tout à fait possible. Préalablement à cette opération de sélection, le lysat peut, très avantageusement, être délipidé et débarrassé de ses acides nucléiques. Dans des conditions de réalisation tout particulière- ment préférées du procédé selon l'invention, la solution de glycoprotéines de départ est obtenue selon le procédé dé- crit dans le second certificat d'addition no 2.171.907 au brevet français n0 2.043.475, dans ce certificat d'addition, le poids moléculaire des glycoprotéines a été estimé par la technique d'exclusion de gels. L'ammonium quaternaire que l'on utilise pour traiter la solution de glycoprotéines de départ peut être, par exem- ple, le chlorure de pyridyl-cétyl-ammonium, mais tout par- ticulièrement, le bromure de triméthyl cétyl ammonium ou Cétavlon. Après traitement par l'ammonium quaternaire, le préci- pité obtenu peut être séparé du surnageant par des procédés classiques, tels que la décantation ou la filtration, mais on préfère le séparer par centrifugation. Le précipité est alors avantageusement redissout à l'aide d'une solution de chlorure de sodium 0,2M. La solution obtenue est alors traitée à froid, aux en- viron de +40C, à l'aide d'un alcanol de faible poids molé- culaire tel que le méthanol, l'éthanol, le n-propanol ou l'isopropanol, mais on utilise de préférence l'éthanol. Les résultats les plus intéressants sont obtenus par l'uti- lisation de six volumes d'éthanol pour un volume de solution saline, pendant une nuit, à la température de +40C. Le précipité est redissout dans l'eau et dialysé pour le purifier. La dialyse est effectuée à l'aide de cellules de type classique obturéespar des membranes, par exemple, de collodion ou de cellulose. On retient,notamment,les cel- lules dont la membrane est en cellulose régénérée,à diamètre moyen des pores, égal à environ 24A, retenant les substances dont le poids moléculaire est supérieur à 12 à 14 000 dal- tons. Parai les cellules à dialyse, on peut noter tout particulièrement les tubes VISKING. Cette dialyse permet d'éliminer de la solution de gly- coprotéines, les impuretés de faible poids moléculaire res- tantes, comme les traces d'alcanol. On peut évidemment obtenir les glycoprotéines de l'in- vention, un peu moins pures, en n'effectuant pas l'étape de dialyse. Dans des conditions préférentielles de mise en oeuvre, le procédé cidessus décrit est caractérisé en ce que: - l'ammonium quaternaire utilisé est le bromure de cétyl- triméthyl-ammonium; - l'on isole par centrifugation le premier précipité; - l'alcanol de faible poids moléculaire est l'éthanol. La présente demande a également pour objet les glyco- protéines telles qu'obtenues par le procédé selon l'inven- tion. Les produits, objet de la présente invention, possè- dent de très intéressantes propriétés pharmacologiques; ils sont doués, notamment, de remarquables propriétés anti- bactériennes, immunostimulantes ainsi que d'une très bonne tolérance. Ces propriétés sont illustrées plus loin dans la partie expérimentale. Ces propriétés justifient l'utilisation des glycoprotéi- nes de la présente demande, à titre de médicaments. La pré- sente demande a ainsi également pour objet l'application, à titre de médicaments, des glycoprotéines telles que défi- nies ci-dessus. Parmi les médicaments de l'invention, on retient égale- ment ceux caractérisés en ce qu'ils sont constitués par les glycoprotéines telles qu'obtenues par le procédé de l'inven- tion. Ces médicaments trouvent, par exemple, leur emploi dans le traitement ou la prévention, chez l'homme et l'animal, des maladies infectieuses causées par les bactéries ou les virus, dans le traitement des maladies à parasites, des toxi- infections, dans le traitement des infections posthospitaliè- res et postchirurgicales. La dose usuelle, variable selon le produit utilisé, le sujet traité et l'affection en cause, peut être, par exem- ple de 0,5 mg à 10 mg par jour, par voie orale, chez l'hom- me, de 2 à 10 mg par jour, par voie rectale, de 0,25 à 5 mg par jour, par voie parentérale. L'invention a enfin pour objet les compositions phar- maceutiques qui renferment les glycoprotéines de la présente demande, à titre de principe actif. A titre de médicaments, les glycoprotéines de la présen- te demande peuvent être administrées par les voies digesti- ve ou parentérale ou locale. Les compositions pharmaceutiques correspondantes peu- vent être, par exemple, solides ou liquides et se présenter sous les formes pharmaceutiques couramment utilisées en mé- decine humaine, comme par exemple, les comprimés, simples ou dragéifiés, les gélules, les granulés, les solutions, les sirops, les suppositoires, les préparations injectables, les ovules, les crèmes, les pommades, les lotions, les gout- tes, les collyres; elles sont préparées selon les méthodes usuelles. Le ou les principes actifs peuvent y être incor- porés à des excipients habituellement employés dans ces compositions pharmaceutiques, tels que le talc, la gomme arabique, le lactose, l'amidon, le stéarate de magnésium, le beurre de cacao, les véhicules aqueux ou non, les corps gras d'origine animale ou végétale, les dérivés paraffini- ques, les glycols, les divers agents mouillants, dispersants ou émulsifiants, les conservateurs. Il va être donné, maintenant, à titre non limitatif, des exemples de mise en oeuvre de l'invention. EXEMPLE 1: g de produit tel qu'obtenu à l'exemple nl du brevet français n 2.171.907, sont dissous dans deux litries d'eau permutée. On ajoute, lentement, environ 1,6 1 de Cetavlon à 3%, l'ensemble est agité pendant une heure, puis centrifugé à 10.000 t/mn, pendant 15 minutes. Le précipité est repris par 0,5 1 d'une solution 0,2M de chlorure de sodium. On ajoute ensuite 3 1 d'éthanol à 95 , en 15 minutes. Apres une heure d'agitation on centri- fuge à 10.000 t/mn, pendant 15 minutes, le surnageant ainsi obtenu est éliminé et le précipité est redissout dans 1 1 d'eau puis dialysé pendant 48 heures dans des tubes Visking contre de l'eau permutée à +4 C. Au terme de cette dialyse, la solution est lyophilisée. On obtient 8,16 g des glyco- protéines cherchées. EXEMPLE 2: g de produit tel qu'obtenu à l'exemple 1 du brevet français N 2.171.907, sont dissous dans 1 1 d'eau permu- tée. On ajoute sous agitation 0,800 1 de Cétavlon à 3%. Apres une heure d'agitation, on centrifuge à 10.000 t/mn, pendant 15 minutes. Le précipité ainsi obtenu est redissout dans 0,250 1 d'une solution 0,2M de chlorure de sodium. Sous agitation, on ajoute 1,5 1 d'éthanol à 95 . Apres une heure d'agita- tion, on centrifuge pendant 15 minutes à 10.000 t/mn. Le surnageant est éliminé et le précipité repris dans 0,500 1 d'eau et dialysé pendant 48 heures dans des tubes Visking contre de l'eau permutée à +4 C. Au terme de cette dialyse, on lyophilise la solution et on obtient 9,4 g des glycoprotéines cherchées. EXEMPLE 3: On a préparé des comprimés répondant à la formule: - glycoprotéines obtenues à l'exemple 1....... 5 mg - excipient q.s.pour un comprimé terminé à.... 100 mg (Détail de l'excipient: lactose, amidon, talc, stéarate de magnésium). EXEMPLE 4: On a préparé une pommade répondant à la formule: - glycoprotéines obtenues à l'exemple 2..... 200 mg - excipient q.s.p...................... .... 100 g..DTD: ETUDE PHARMACOLOGIQUE A - Activité antibactérienne des_-lycoprotéines obtenues selon le mode d'exécution de la présente demande. Les glycoprotéines de l'invention déclenchent une pro- tection antibactérienne intense et durable à des doses très faibles. Cette action est polyvalente et s'exerce aussi bien sur les germes Gram + que sur les germes Gram -. L'action est plus préventive que curative. Le produit est administré à des souris avant l'injec- tion des germes. A la dose de 10/kg, les "glycoprotéines" des exemples 1 et 2 assurent un pourcentage de protection de 100% contre une infection correspondant à 500 DL 50 de Klebsiella pneu- moniae. A la meme dose et pour les memes produits, la pro- tection est de 85% contre une infection correspondant à 12 500 DL 50 de Klebsiella pneumoniae. A la dose de 100/kg elle est de 100% contre 12 500 DL 50 de ce même micro-orga- nisme. L'activité antibactérienne vis à vis de Klebsiella pneu- moniae varie en fonction du moment de l'administration des glycoprotéines, selon qu'elles sont administrées quarante- huit ou quatre-vingt-seize heures avant l'infection, les pourcentages de protection sont respectivement de 30% et %; les glycoprotéines selon l'invention possèdent donc une action antibactérienne à titre préventif très nette. B - Stimulation des défenses non spécifigues: Cette stimulation a été étudiée sur le test de la "clearance" au carbone chez la souris en s'inspirant de la technique mise au point par HALPERN, qui consiste à injec- ter dans le sinus oculaire une suspension de carbone collol- dal à l'animal et à apprécier en fonction du temps, la ciné- tique de la disparition du carbone dans le sang, en effec- tuant des mesures de densité optique. Les produits sont administrés à l'animal par voie in- trapéritonéale, vingt-quatre et quarante-huit heures avant le test et les résultats sont exprimés en pourcentage d'ac- tivité par rapport à des témoins ayant reçu, uniquement, l'injection de carbone colloïdal. % d'activité Témoins PRODUIT DOSES de 8 minutes 30 minutes l'exemple: après l'injection après l'inject. 08,25 mIg/kg 42% 65% 1 0,25 mg/kg 42% 65% 2 0,25 mg/kg 43% 65% L'examen de ces résultats nous permet de noter l'inten- se stimulation provoquée par ces deux produits, sur les dé- fenses de l'organisme. C - Toxicité ai 'e La dose létale 50 (DL 50) par voie intrapéritonéale, chez la souris, a été déterminée par la méthode de BEHRENS et KARBER. Elle est de 100 mg/kg pour les glycoprotéines des exemples 1 et 2. D - Tolérance L'injection sous cutanée de 0,2 ml de glycoprotéines des. exemples 1 et 2,, à la dose de 1000y /kg,chez la souris, ne provoque aucune intolérance locale ou générale. REVENDICATIONS 1.- Nouvelles glycoproteines hydrosolubles extraites de Klebsiella pneumoniae, caractérisées en ce qu'elles renfer- ment de 10% à 20% de protéines, 50% à 70% d'oses neutres, 15% à 25% d'acide glucuronique, 1% à 2% d'osamines et ont un poids moléculaire compris entre 80.000 et 350.000 daltons. 2.- Nouvelles glycoprotéines selon la revendication 1, ca- ractérisées en ce que leur poids moléculaire est d'environ 100.000 daltons. 3.- Nouvelles glycoproteines selon la revendication 1 ou 2, caractérisées en ce qu'elles sont extraites de la souche déposée à l'Institut PASTEUR, sous le n 52.145. 4.- Nouvelles glycoprotéines, selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, caractérisées en ce que la fraction protéique est composée par environ 30% d'acides aminés aci- des. 5.- Nouvelles glycoprotéines selon l'une quelconque des revendications 1 à 4, caractérisées en ce que l'acide aminé N-terminal de la fraction protéique est l'acide aspartique. 6.- Nouvelles glycoprotéines selon l'une quelconque des revendications 1 à 5, caractérisées en ce que la fraction polysaccharidique renferme, approximativement, de 9,5 à ,5 molécules de glucose, de 4 à 5 molécules de mannose et de 3 à 3,5 molécules d'acide glucuronique, pour une molécule de galactose. 7.- Nouvelles glycoprotéines, selon la revendication 6, caractérisées en ce que la fraction polysaccharidique est essentiellement composée de la répétition de l'unité tétra- saccharidique dont la structure est la suivante: --gl c oe4 mannose 1 4glcs. acide glucuronique 8.- Nouvelles glycoprotéines, selon l'une quelconque des revendications 1 à 7, caractérisées en ce que la fraction polysaccharidique est formée de deux chaines polysacchari- diques dont chacune de ces chaines est liée à la fraction protéique par une liaison N-glycosidique entre une molécule 2462477 de glucosamine d'une extrémité de la chaine polysaccharidi- que et une molécule d'asparagine de la chaine protéique. 9.- Procédé d'obtention-de nouvelles glycoprotéines telles que définies à l'une quelconque des revendications 1 à 8, caractérisé en ce que l'on traite, à l'aide d'un ammonium quaternaire, une solution de glycoprotéines obtenue par dia- filtration d'un extrait de lysat de cultures de Klebsiella pneumoniae, isole puis dissout le précipité obtenu à l'aide d'une solution aqueuse de chlorure de sodium, traite à froid la solution saline de glycoprotéines ainsi obtenue, à l'aide d'un alcanol de faible poids moléculaire, obtient ainsi un nouveau précipité que l'on redissout dans l'eau, dialyse puis lyophilise. 10.- Procédé selon la revendication 9, caractérisé en ce que - l'ammonium quaternaire utilisé est le bromure de cétyl- triméthyl-ammonium; - l'on isole par centrifugation le premier précipité; - l'alcanol de faible poids moléculaire est l'éthanol. 11.- Les nouvelles glycoprotéines telles qu'obtenues par le procédé selon la revendication 9 ou 10. 12.- Médicaments, caractérisés en ce qu'ils sont constitués par les nouvelles glycoprotéines hydrosolubles telles que définies à la revendication 1 ou 2. 13.- Médicaments, caractérisés en ce qu'ils sont constitués par les nouvelles glycoprotéines hydrosolubles telles que définies à l'une quelconque des revendications 3 à 8. 14.- Médicaments, caractérisés en ce qu'ils sont constitués par les glycoprotéines telles que définies à la revendica- tion 11, 15.- Compositions phanmaceutiques, caractérisées en ce qu'elles renferment, à titre de principe actif, l'un au moins des médicaments tels que définis à l'une des revendi- cations 12 ou 13. 16.- Compositions pharmaceutiques, caractérisées en ce qu'elles renferment, à titre de principe actif, l'un au moins des médicaments tels que définis à la revendication 14.