FR 2459288 A1 19810109 FR 8013647 A 19800619 Procédé pour la préparation de la mildiomycine. La présente invention concerne un procédé pour la fabrication de la mildiomycine. Plus spécifiquement, la présente invention concerne un procédé pour fabriquer la mildiomycine en cultivant un micro-organisme produisant de la mildiomycine et appartenant au Actinomycetes dans un milieu de culture pour avoir la mildiomycine élaborée et accumulée dans le bouillon de culture, procédé caractérisé par le fait qu'au moins un composé N-méthyle est présent dans le milieu de culture. La mildiomycine est une substance antibiotique appelée "antibiotique B98891" et depuis qu'elle a été découverte pour la première fois, ses propriétés ont été étudiées et sa struc- ture chimique déterminée est représentée par la formule: /H 3 O- HO0 OH 2/\0 \I C HC 'À CH2*OH HOH2C-HC-C-HN H H2N 0 En même temps, l'attention des auteurs de la présente invention a été dirigée sur son activité, particulièrement ses effets comme agent pour empêcher et traiter le mildiou dans un grand nombre de plantes ou comme agent acaricide. (Brevet U.S. n 4 007 267; brevet britannique n 1 507 193 et The Journal of Antibiotics Vol. 31, n 6, pages 511-518, 519-524 (1978)). Comme résultats de ces études poussées faites en se basant sur les faits décrits ci-dessus, sur les conditions de production de ces effets afin de fournir des quantiés indus- trielles de mildiomycine à bas prix, les auteurs de la présente invention ont découvert qu'une quantité importante de mildio- mycine pouvait être produite en présence d'un composé N-méthylé dans le milieu de culture, en cultivant un Actinomycetes * capable de produire la mildiomycine et ont complété la présente invention. Donc, la présente invention concerne un procédé pour la production de mildiomycine caractérisé par le fait qu'on cultive un micro-organisme d'Actinomycetes capable de produire la mildiomycine dans un milieu de culture contenant un composé N-méthylé à raison de 3niM, pour avoir la mildio- mycine élaborée et accumulée dans le bouillon de cultuire. Les micro-organismes d'Actinomycetes capables de produire la mildiomycine utilisés dans le procédé de la présente invention, comprennent par exemple les Actinomycetes appartenant * au genre StreptoV'erticillium, en particulier au genre Srp toverticillium. rimofaciens FERM-P 2549 (IFO 13592, ATCC 31120). Cet organisme a été identifié au départ comme étant du 1l5 Streptomyces rimofaciens suivant les caractéristiques de la classification décrite dans Bergey's Manual of Determinative Bacteriology, 7th Edition britannique no 1 507 193) mais, en vue d'une modification ultérieure des caractéristiques de la classification, le 2Q micro-organisme ci-dessus a été identifié comme appartenant au genre Streptoverticillium selon les caractéristiques de la classification décrite dans Bergey's Manual1 of Determinative Bacteriology, 8th Edition (1974) (The Journal of Antibiotics, Vol. 31, N0 6, pages 511-518). LscmoéN-méthylés pouvant être utilisés dans la, présente invention sont ceux atant au moins un atome d'azote substitué par 1 à 4 groupes méthyle dans leur molécule. Parmi ces composés, ceux ayant un atome d'azote substitué par des groupes méthyle dans leur molécule sont préférés et, en particulier, les sels d'ammonium quaternaire ayant un groupe - triméthylammonio dans lequel l'atome d'azote est substitué par trois groupes méthyle, c'est-à-dire -N (CH), sont préférés. En outre, les composés ayant un groupe capable d'être converti en un groupemN-CH dans le milieu de culture, -3 par exemple le N,N-méthylènebisacrylamide, peuvent aussi être utilisés comme lesdits composés N-méthylés.Les composés N-méthylés ont généralement des poids moléculaires compris entre environ 50 et environ 1000, de préférence entre 70 et , mieux entre 90 et 130. Les composés N-méthyles peuvent être solubles ou insolubles dans l'eau, mais les composés N-méthylés solubles dans l'eau peuvent être avantageusement utilisés. Comme exemples de ces composés N-méthylés on peut citer les amides N-méthylés, les composés N-méthylamino, les N- méthylamines, les composés de N-méthylammonium, les polyméthylènediamines, le N,N-méthylènebisacrylamide, etc. Les amides N-méthylés tels que par exemple le N,N-diméthyla- cétamide, le N-méthylacrylamide, et analogues; les composés N-méthylamino tels que par exemple la N-méthylurée, la 1,1,3,3-tétraméthylurée, le 2diméthylamino-éthanol et produits analogues; les N-méthylamines tellesque par exemple la triméthylamine, la diméthylamine et produits analogues;les composés de N-méthylammonium tels que par exemple lécithine, chloline, bétaine, tétraméthylammonium, chlorure d'éthylène- bis(triméthylammonium) et produits analogues, et les poly- méthylènediamines telles que par exemple l'éthylènediamine, la tétraméthylènediamine, l'hexaméthylènediamine et produits analogues, peuvent être utilisés avantageusement. Un résultat satisfaisant peut être obtenu avec les composés de N-méthylam- monium, particulièrement avec la choline, la bétaine ou le tétraméthylammmonium. Ces composés N-méthyléspeuvent être utilisés seuls ou en mélange de deux, ou davantage de produits. La présente invention concerne également dans son cadre un procédé comprenant l'addition d'une grande quantité d'une substance contenant le composé N-méthylé, par exemple les mélasses de betterave contenant de la bétaine, la farine de soja contenant de la lécithine ou les oeufs de poules contenant à la fois de la choline et de la lécithine, etc. à un milieu de culture afin de fournir plus de 3mM de composés N-méthylés au milieu. La concentration du composé N-méthylé dans le milieu de culture peut être choisie convenablement dans une gamme de valeurs qui n'empêchent pas la croissance du micro- organisme utilisé et qui est réglée à plus de 3mM.La concen- tration est de préférence comprise entre 4mM et 200 mM, mieux entre 7 et 50 mM, et à une concentration supérieure à 200 mM, l'effet dû à l'addition de composés N-méthylés tend à ne pas être aussi remarquable que lorsque la concentration est inférieure à 200 imM. La quantité de substances d'origine naturelle contenant des composés N-méthylés peut être choisie de façon à obtenir la concentration en composés N-méthylés spécifiée ci-dessus, mais cette concentration exige une quantité de substances d'origine naturelle supérieure à celle convenablement utilisée, ce qui fait que la croissance du micro-organisme peut être affectée d'une façon nocive par les composants des substances d'origine naturelle différents des composés N-méthylés empêchant ainsi la production de mildio- mycine. Dans de tels cas,on préfère utiliser les composés N-méthylés en combinaison avec les substances d'origine naturelle. Le moment o le composé N-méthylé est incorporé dans le milieu de culture se situe de préférence avant que le milieu de culture soit inoculé avec le microorganisme, eut égard à la facilité de l'opération et à l'efficacité, mais le composé N-méthylé peut être aussi ajouté à un moment ap- 7. 15 proprié pendant la culture. Les sources de carbone pouvant être utilisées dans le milieu de culture pcur la culture comprennent des sucres qui peuvent être utilisés par le micro-organisme mis en oeuvre, par exemple l'amidon, la dextrine, le glucose, le lactose, le saccharose, le sorbitol ainsi que les mélasses, le sirop de mais, la gelée de millet, etc., et des acides organiques tels que l'acide acétique, l'acide succinique, et produits analogues, des graisses et des huiles. Les sources d'azote pouvant être utilisées sont les divers sels d'ammonium, les * -25 nitrates, l'urée ainsi que les substances organiques d'origine naturelle telles que l'extrait de levure, la caséine, l'extrait de viande, la farine de coton, la liqueur de macération du mals, la farine de soja et produits analogues. Le milieu peut contenir comme sel minéral, des sels de fer, de magnésium, de manganèse, de cobalt, de cuivre, de sodium, de potassium, de calcium, de zinc, etc. si nécessaire. En outre, le milieu peut contenir convenablement des agents nutritifs spécifiques tels que les acides aminés, les vitamines, les bases puriques et pyrimidiques, et produits analogues, si le micro-organisme exige de tels agents nutritifs. La culture peut être effectuée par un quelconque des procédés stationnaires, aérobie immergés, agités et autres procédés de culture, mais généralement la culture aérobie im- mergée est préférée. La température de la culture peut aller de 20'C à 40C, de préférence de 240C à 340C. Le milieu de culture est maintenu de préférence à un pH compris entre 4 et 9 et, à cet effet, la valeur du pH du milieu est réglée avec une solution aqueuse diluée d'une base alcaline caustique ou d'une solution d'ammoniaque ou d'une solution aqueuse diluée d'acide sulfurique, d'acide chlorhydrique ou produits analogues, pendant la culture. Les sels alcalins tels que le carbonate de potassium, le carbonate de sodium, etc. peuvent aussi être ajoutés au milieu. Le procédé de la présente invention peut être réalisé en continuant la culture jusqu'à ce qu'une quantité importante de mildiomycine soit élaborée et accumulée dans le bouillon de culture, et généralement la production maximum en mildiomycine peut être obtenueau bout de 4 à 12 jours. Du bouillon de culture obtenu de la façon mentionnée ci-dessus, la mildiomycine peut être isolée si nécessaire, par des procédés classiques normalement utilisés pour la récu- pération des antibiotiques basiques solubles dans l'eau. Par exemple, après avoir éliminé les cellules microbiennes et autres matières insolubles dans le bouillon de culture par un procédé tel que filtration, centrifugation ou procédé analogue, le filtrat ou le liquide surnageant sont mis en contact avec du charbon actif ou des résines adsorbantes pour adsorber la mildiomycine puis la mildiomycine peut être éluée avec un mélange d'eau et de solvant organique, une solution aqueuse saline ou acide, une solution tampon ou produits analogues. Puisque l'antibiotique produit selon la présente invention est une substance basique, il est bien adsorbé sur des résines échangeuses de cations et peut être élué avec une solution acide, alcaline ou une solution tamponJappropriées. Ces procédés peuvent être utilisés convenablement sélectivement et en combinaison puis l'éluat est concentré et cristallisé pour obtenir la mildiomycine. La mildiomycine ainsi obtenue peut être utilisée sans danger comme ingrédient actif d'un agent antibactérien et acaricide pour les plantes tel que décrit dans le brevet U.S. no 4 007 267 et le brevet britannique n 1 507 193. La présente invention est encore illustrée plus en r détail par les exemples suivants qui sont donnés à titre descriptif mais non limitatif. Dans la présente demande, les abréviations suivantes sont utilisées: millilitre = ml, litre = 1, gramme = g, pourcent (poids/volume) = %, nanomètre= nm, tours par minute = t.p.m. Les nombres indiquéspour IFO, FERM-P et ATCC sont les nombres déposés à l'Institut de la fermentation, OSAKA, Japon; au Fermentation Research Institute of the Agency of Industrial Science and Technology, Chiba, Japon; et à l'Américan Type Culture Collection U.S.A. respectivement. Exemple 1 (1) A 25 ml d'un milieu de culture comprenant 10% de glucose, 3% de farine de coton (marque déposée "Proflo", Trader Oil Mill -15 Co., U.S.A.) , 1% de liqueur de macération du mais, 0,5% de / chlorure de sodium, 0, 001% de sulfate ferreux et 0,5% de i carbonate de calcium, on ajoute de la choline à une concen- tration mentionnée dans le tableau 1 ci-après, et on ajoute goutte à goutte une solution aqueuse à 20% d'hydroxyde de i 20 sodium au mélange pour régler le pH à 7. Le milieu est ensuite stérilisé puis inoculé avec le contenu d'une boucle de ., platine d'une culture inclinée de steptowerticillium rimofaciens FERM-P 2549 (IFO 13592, ATCC 31120), suivi d'une culture sur un i;' secoueur rotatif tournant à 200 tpm et à 28 C pendant 120 heures. Les dosages de la mildiomycine dans le bouillon de culture réalisés selon le procédé connu rapporté dans The Journal of Antibiotics, Vol. 31, n 6, pages 511 à 518 et q 519 à 524 (1978) donnent les résultats indiqués dans le ili tableau 1. Tableau 1 Quantité de choline Titre relatif de mildiomycine ajoutée (mM) (taux en poids) o 100 0,35 113 1,40 133 3,5 180 14,0 193 ,0 200 ,0 200 (2) 1 litre du bouillon de culture obtenu dans (1) ci-dessus utilisant le milieu de culture auquel la choline a été ajoutée à une concentration de 14 mM, est recueilli et centrifugé pour obtenir un liquide surnageant qui est ensuite passé à travers une colonne remplie avec 500 ml d'une résine échangeuse d'ions "Amberlite IRC-50" (forme H) (Rohm & Haas Co., U.S.A.). La colonne est lavée à l'eau puis l'élution est effectuée en utilisant 500 ml d'ammoniaque à 0,5%. Les fractions actives sont adsorbées en les faisant traverser: une colonne remplie avec 50 ml de charbon actif pour chromatographie (fabriqué par Takeda Chemical Industries Ltd. Japon). Les fractions actives éluées avec 250 ml d'un mélange solvant acétone: eau (3:7) sont recueillies et concentrêes, et de l'acétone est ajoutée goutte à goutte au concentré pour précipiter la mildiomycine brute. La poudre brute (1,3 g) ainsi obtenue est dissoute dans l'eau et la solution est passée à travers une colonne de 25 ml d'"Amberlite CG-50" (forme H+) (Rohm & Haas Co. U.S.A.). La colonne est lavée avec 10 ml d'eau et l'élution est alors ef- fectuée avec 250 ml d'ammoniaque à 0,5%. Les fractions actives sont recueillies et adsorbées en les faisant traverser une colonne de 50 ml de charbon actif. L'élution par fractions est effectuée en utilisant 250 ml d'un mélange acétone: acide formique 0,1 N (2:8) et les fractions actives sont concentrées. Du méthanol est ajouté au concentré pour précipiter la mildiQ- vmycine. Le précipité résultant est séché sous pression réduite . pour obtenir 1,1 g de formiate de mildiomycine. Parmi ses propriétés chimiques et physiques, le point de fusion, le pouvoir rotatoire (D 4 à c, 1,0 dans H20 et c, 1,0 dans HC1 0,lN) et l'indice d'absorbante dans les ultraviolets à 271 nm t; et 280 nm sont trouvés être fortement en rapport avec ceux :. indiqués dans la littérature (The Journal of Antibiotics Vol. ' 31, n 6, page 523, 1978) - À' Exemple 2 La culture du micro-organisme produisant la mildiomycine est effectuée de la même façon que décrite dans l'exemple 1, sauf que chacun des composés N-méthylés indiqués dans le tableau 2 ci-dessous est ajouté au milieu de culture à une concentration de 7 mM, à la place des 14 mM de choline. Les résultats obtenus par dosage de la mildiomycine sont indiqués dans le tableau 2. !!, - -Tableau 2 Titre relatif de mildiomycine Additif (7 raM) Additif Exemple 3 "'; 35La culture est effectuée de la même façon que décrite dans l'exemple 1 sauf que la bétaine est ajoutée au milieu de culture à la place de la choline à des concentrations variables indiquées dans le tableau 3 ci-après. Les résultats obtenus par dosage de la mildiomycine sont indiqués dans ce tableau. Tableau 3 Quantité de Bétaine Titre relatif de mildiomycine ajoutée (mM) (taux en poids) Pas d'addition 0,35 1,40 3,5 14,0 ,0 ,0 Exemple 4 La culture est effectuée de la même façon que décrite dans l'exemple 1 sauf que des combinaisons diverses de choline et de chlorhydrate de tétraméthylammonium sont ajoutés au milieu de culture à la place de la choline, à des concentrations mention- nées dans le tableau ci-dessous. Les résultats obtenus par dosage de la mildiomycine sont indiqués dans le tableau 4. Tableau 4 Quantité de Quantité de chlorhy- Titre relatif de choline ajoutée drate de tétramxthyl- mildiomycine (nt4 antonium ajoutée (nm (taux en poids) Pas d'addition Pas d'addition C100 7 0 187 6 1 187 2 185 4 3 186 3 4 188 2 5 187 1 6 188 0 7 187 Exemple 5 La culture est effectuée de la mime façon que décrite dans l'exemple 1, sauf que la 1,1,3,3-tétraméthylurée est ajoutée au milieu de culture à la place de la choline et que la durée de l'addition varie comme indiqué dans le tableau 5. Les résultats obtenus par dosage de la mildiomycine sont indiqués dans le tableau 5. Tableau 5 Mmxent o la 1,1,3,3- Titre relatif de mildionycine tétramthylurée est ajoutée (taux en poids) dans le milieu de culture (heures) 0 140 140 (pas d'addition) 100 il REVENDICATIONS 1. Procédé pour la fabrication de la mildiomycine en cultivant un micro-organisme produisant la mildiomycinetap- partenant au genre $treptoverticillium)dans un milieu de culture, caractérisé par le fait qu'on effectue la culture en présence d'un composé N-méthylé dont la quantité est égale au moins à 3mM, pour obtenir la mildiomycine élaborée et accumulée dans le bouillon de culture. 2. Procédé selon la revendication 1, caractérisé par le fait que le composé N-méthylé comporte au moins 1 atome d'azote substitué par 1 à 4 groupes méthyle dans sa molécule. 3. Procédé selon la revendication 1, caractérisé par le fait que le composé N-méthylé est choisi parmi les groupes com- prenant les amides N-méthylés, les composés N-méthylamino, les Nméthylamines, les composés de N-méthylammonium et les composés comportant un groupe capable d'être transformé en un groupe N-CH dans le milieu de culture, ledit composé N-méthylé ayant a 3 un poids moléculaire compris entre 50 et 1000. 4. Procédé selon la revendication 3, caractérisé par le fait que le composé N-méthylé a un poids moléculaire compris entre 90 et 130. 5. Procédé selon la revendication 1, caractérisé par le fait que le composé N-méthylé est choisi parmi les groupes comprenant les Nméthylamines, les composés de N- méthylammonium et des composés comportant un groupe capable d'être transformé en un groupe.N-CH3 dans le milieu de culture, ledit composé N-méthylé ayant un poids moléculaire compris entre 50 et 1000. 6. Procédé selon la revendication 5, caractérisé par le fait que le composé N-méthylé est la triméthylamine, la lécithine, la choline, la bétaine ou le tétraméthylammonium. 7. Procédé selon la revendication 1, caractérisé par le fait que le composé N-méthylé est un composé de N-méthylam- monium ayant un groupe triméthylammonino et un poids moléculaire allant de 70 à 200. 8. Procédé selon la revendication 7, caractérisé par le :. 2459288 ô- - fait que le composé de N-m&thylammonium est la choline. ", 9. Procèd& selon la revendication 1, caractérisé par le fait que la concentration du composé N-m&thyl dans le !' i bouillon de culture est de 4 à 200 raM. ,, 10. Procèd selon la revendication 1, caractérisé par le t - fait que la concentration est de 7 à 50 mM. I; .. t,, _. ?,,,', ?:, À i, "'