FR 2460139 A1 19810123 FR 7916851 A 19790629 l 2460139 La présente invention est relative à une fraction anti- génique vaccinante glycopeptidique, à très grande immunogénicité, isolée de cultures de germes pathogènes et à des procédés d'ex- traction de ladite fraction antigénique de cultures de germes pathogènes et de purification pour isoler le constituant actif glycopeptidique; l'invention est également relative à la pré- paration de vaccins à très grande immiunogénicité, contenant ladite fraction. Les applications médicales actuelles des fractions anti- géniques sont nombreuses: sérothérapies de toutes sortes, sérodiagnostic, détection de germes pathogènes dans les produits p a t h o l o g i q u e s l e s plu s v a r i é s, enquêtes épidémiologiques et surtout 1 e s vaccinations. Comme on le sait, la vaccination constitue souvent la seule arme et la seule prophylaxie dont on dispose contre de nombreuses maladies, d'o l'importance accordée par les Chercheurs au dé- veloppement de procédés d'obtention d'antigènes présentant une antigénicité et une spécificité élevées. Les recherches se sont tout d'abord orientées vers l'obtention d'une immunisation à l'égard des infections bactériennes, notamment entériques, induites par exemple par les bactéries du groupe des Salmonella et plus particulièrement de Salmonella thyphimurium, a l'aide d'un vaccin constitué par les bactéries entières tuées. L'uti- lisation de tels vaccins n'est cependant pas dénuée de danger, en raison de leur toxicité,due à la forte teneur en endotoxines de la membrane cellulaire desdites bactéries, toxicité qui est à l'origine de réactions allergiques parfois très graves. On a donc cherché à préparer des vaccins constitués par des fractions puri- fiées extraites des cultures bactériennes. C'est ainsi qu'ont été proposés des vaccins obtenus à partir de fractions anti- géniques de surface extraites de Brucella melitensis et de Brucella abortus, essentiellement constituées par un complexe de lipopolysaccharide-protéine /-f. DIAZ, JONES, LEONG et WILSON, Journal of Bacteriology, Oct.1968, Vol.96, n 4, p.893-901, "Surface antigens of Smooth Brucellaeo/. A noter que les Auteurs de l'Article cité rapportent que si le constituant actif de la fraction antigénique est le complexe lipopolysaccharide-protéine susdit, la fraction antigénique contient néanmoins en outre des composants protéiques associés à des antigènes internes de Brucellae, ainsi qu'un complexe polysaccharide-protéine, dépourvu 2 2460139 de lipide, dont il est dit qu'il ne jouerait apparemment pas un rôle important dans les réactions d'agglutination du fait que ses anticorps pourraient être séparés par absorption sans affec- ter le taux d'agglutination. De même, ont été proposés des vaccins polyvalents contre Pseudomonas aeruginosa obtenus à partir d'antigènes de surface présentant une immunogénicité élevée, essentiellement constitués par un complexe lipopolysaccharide- protéine très immunogène, dépourvu de constituants toxiques, extraits de cultures de bactéries sur un milieu spécial. Une autre solution proposée pour éliminer la toxicité due à l'endotoxine des membranes des cellules des bactéries, est représentée par les vaccins acellulaires, qui utilisent comme source d'antigènes les produits d'excrétion (ou "slime")de cultures bactériennes, notamment de cultures de Pseudomonas aeruginosa, préalablement débarrassés par lavage des produits toxiques également contenus dans le "slime", notamment des produits d'excrétion labiles et des impuretés du milieu de cultu- re /cf. Brevet français INSTITUT PASTEUR, n02 290 219 du 5 Novem- bre 1974 et P. BERCHE, M.VERON et R.TINELLI, Ann.Microbiol. (Institut Pasteur) 1976, 127A, p.247-2597. Toutefois, ces divers essais de purification des cultures bactériennes n'ont pas atteint leur but en ce que d'une part, ils n'ont pas permis d'identifier effectivement le constituant antigénique apte à assurer l'immunisation recherchée et, d'autre part, ils n'ont pas permis l'obtention de vaccins effectivement dépourvus de toxicité. Les recherches ont donc été poursuivies dans ces deux directions. C'est ainsi qu'a été proposée une fraction antigénique extraite par des techniques appropriées, de cultures de germes pathogènes, notamment de cultures de Salmonella thyphimurium, de Malleomyces mallei, de Pseudomonas mallei, de Vibrio cholerae, qui ne présenterait pas les réactions allergiques,des vaccins précédemment proposés; cette fraction antigénique qui a été identifiée comme étant une fraction lipido- protéinique, est caractérisée par le fait qu'elle correspond au premier pic sur le diagramme d'absorption dans l'ultra-violet à 280 nm et en ce que, opposée à un immunsérum produit chez un animal à partir de la même culture, elle donne la bande (ou le couple de bandes) la plus proche du puits d'antigène dans l'épreuve de diffusion en mi-lieu gélose et dans l'épreuve d'analyse imminoélectrophorétique Zcf. Brevet Français ANVAR, Inventeur:lIbnsieur A. DODIN, n 73 03734 du 2 FEVRIER 19737. Il s'est cependant avéré qu'aucune des tentatives d'immunisation par les fractions antigéniques purifiées proposées, n'était satisfaisante, en raison du fait que ces fractions contiennent toutes une portion lipidique à laquelle a pu être attribuée la toxicité Zcf.LUDERITZ, GALANOS, LEHMANN, NURMINEN, RIETSCHEL, ROSENFELDER, SIMON et WESTPHAL, 1973, "Lipid A: chemical structure and biological activity" in "Bacterial lipopolysaccharides", édité par KALL et WOLLF, The University of Chicago Press, Chicag27. Bien que des expérimentations aient été menées dans le but d'obtenir une immunisation chez les souris à l'égard de Pseudomonas aeruginosa, par des polysaccharides capsulaires extraits de "slime" de Pseudomonas aeruginosa Zcf. PIER, SIDBERRY & SADOFF, INFECTION and IMMUNITY, Déc.1978, Vol.22, n 3, p.908-918 et PIER et Alia, loc.cit. p. 919-9257, il est néanmoins admis qu'il n'est pas possible de préparer des vaccins à partir de polysaccharides, que ceux-ci soient extraits des produits d'excrétion des cultures bactériennes ou obtenus par coupure de la portion lipidique de la molécule de lipopolysaccharides (LPS),attendu que de tels vaccins présentent une très faible immunogénicité qui résulte du fait que les poly- saccharides aussi bien capsulaires qu'issus du "slime", s'ils sont responsables de la spécificité antigénique, sont dépourvus d'immunogénicité. Il a par ailleurs été proposé de réaliser l'immunisation de souris à l'égard de Bordetella pertussis, à l'aide d'un oligopeptide isolé de cette bactérie, à partir d'un groupe de ribonucléoprotéines de faible poids moléculaire Zcf. WILHELM & ROMER, Zbl. Bakt. Hyg., I Abt., Orig. B 166, p.264-271(1978)/, u n e immunisation par des complexes peptidiques d'organis- mes contenant des acides désoxyribonucléiques, lesquels complexes sont présentés comme possédant des propriétés antigènes spéci- fiques à l'égard de l'organisme à partir duquel ils sont isolés, étant également proposée par le Brevet français R. et Z. VERMOGENS- VERWALTUNGSGESELLSCHAFT GmbH, n 2 387 991 du 19 AVRIL 1978. Cependant, antérieurement à ces dernières publications, les protéines associées à l'endotoxine présente dans la membrane cellulaire des bactéries étaient considérées comme des adjuvants propres à stimuler la production d'anticorps et non comme présentant par elles-mêmes une activité antigénique Zcf.AMSTEDT et LINDHOLM, Immunology, 33, p.629-633 (1977)7. De même, un certain nombre de Brevets ont été déposés pour des vaccins dans lesquels les polysaccharides et/ou les glycopeptides entrent comme adjuvants d'immunité et de stabilisation associés a l'ARN ou aux ribosomes extraits de germes pathogènes. Une autre direction de recherche a consisté à préparer un produit de conjugaison synthétique polysaccharide-protéine utilisable en tant qu'immunogène actif à l'égard de différents germes pathogènes (notamment Pneumocoques,Salmonella), en partant du fait que la portion polysaccharide du lipopolysaccharide (LPS) membranaire des bactéries présente une spécificité antigénique dont l'importance est primordiale pour l'immunogénicité du vaccin et que si on pouvait lier ce polysaccharide en tant qu'haptêne constituant un excellent déterminant antigénique, a un support constitué par une protéine immunogène, dépourvue de toxicité, on obtiendrait un agent immunogène pour la préparation de vaccins- spécifiques /cf. PAUL, KATZ et BENACERAF, The Journal of Immuno- logy, Vol.107, n 3, Septembre 1971, p.685-688; EKBORG et Alia, Immunochemistry (1977), Vol.14, p.153-157; SVENSON et LINDBERG, FEMS Microbiology Letters 1 (1977), p.145-148; LINDBERG et Alia, INFECTION & IMMUNITY, Vol.10, n 3, Septembre 1974, p.541-545; SVF4SON et LIDBERG, The Journal of Immunology,Vol.120,N"5, Mai 1978, p. 1750- 1757; ZCE et Alia, Archives of Biochemistry and Biophysics, vol. 185, n l (1978), p.61-71; SVENUNGSSON et LINDBERG, Acta Path.Microbiol. Scand. Sect.B,86, p.35-40 (197817. Toutefois, les études compa- ratives entreprises par les différents Chercheurs ont montré que si de tels produits de conjugaison synthétiques présentent bien une activité immunogène et l'absence de toxicité que l'on atten- dait d'eux, leur activité immunogëne est toutefois très inférieu- re a celle des vaccins obtenus a partir de bactéries entières tuées. La présente invention s'est en conséquence donné pour but de pourvoir a une fraction antigénique vaccinante a très grande immunogénicité, isolée de cultures de germes pathogènes, qui présente une composition glycopeptidique déterminée, qui estcaractérisée par une image immunologique nettement définie. La présente invention a pour objet une fraction antigé- nique vaccinante à très qrande immunoqénicité, isolée d'une cul- ture de cermes oathoqènes, caractérisée en ce qu'elle est cons- tituée par une partie osidique présente dans une proportion d'environ 50 % avec une partie protéique, liées entre elles par $5 2 2460139 liaison de covalence, et en ce qu'elle présente, lorsqu'elle est opposée à un immunsérum provenant d'un animal traité par la même culture, une image immunologique comprenant essentiel- lement une ligne de précipitation "nette" près du puits de l'antigène, en immunodiffusion en gélose. Selon un mode de réalisation avantageux de ladite frac- tion antigénique vaccinante, cette dernière est caractérisée par le fait qu'elle présente en immunodiffusion en gélose, ou- tre la ligne de précipitation "nette" précitée, située près du puits de l'antigène dans laquelle a été mise en évidence par marquage à l'Iode 125 avec de la chloramine T, la présence d'acides aminés, une ligne de précipitation "floue" située dans une position variable entre les puits d'antigène et d'anticorps, et qui met en évidence la participation de polyosides à la for- mation de ce deuxième précipité. Selon une caractéristique avantageuse de la fraction antigénique vaccinante conforme à la présente invention, ladite fraction se distingue par le fait que l'image immunologique en ligne "nette" obtenue en immunodiffusion en gélose n'est pas modifiée après traitement de la fraction antigénique vaccinante conforme à l'invention, par des protéases. Selon une autre caractéristique avantageuse de la frac- tion antigénique vaccinante conforme à la présente invention, ladite fraction se distingue par le fait que son image immuno- logique de ligne "nette" obtenue en immunodiffusion en gélose, disparait après traitement de ladite fraction par de la soude. Egalement conformément à l'invention, la fraction anti- génique vaccinante se distingue en outre par le fait que l'appa- rition de la ligne de précipitation "lfloue" est inhibée, en immunodiffusion en gélose, si on ajoute des oses à la gélose dans laquelle se produit la réaction d'immunodiffusion. Cette inhibition met en évidence la participation de polyosides à la formation de ce deuxième précipite, défini immunochimiquement par une ligne "floue". Conformément à l'invention, il a été démontré que la présence des déterminants responsables de la formation du pré- cipité de ligne "nette" est indispensable pour que la fraction antigénique conforme à l'invention entraîne une bonne protec- tion, par les expérimentations suivantes: - du polyoside capsulaire extrait de Klebsiella pneumoniae ne 24,60 139 donne, en immunodiffusion, que peu de précipité en ligne "nette" et, par contre, beaucoup de précipité en ligne "floue": son pouvoir protecteur sur souris est très faible (de l'ordre de 80 ng); - des préparations d'antigènes de surface qui ne donnent en immunodiffusion, que le précipité de ligne "nette", sont très actives en test de protection (1 ng) ; - le traitement à la soude des préparations d'antigènes de sur- face, qui fait disparaître le précipité en ligne "nette" di- minue considérablement le pouvoir protecteur de la préparation (au moins d'un facteur 100). Selon un mode de réalisation avantageux de ladite frac- tion antigénique vaccinante conforme à l'invention, cette der- nière est isolée de cultures de germes pathogènes ne sécrétant ni n'excrétant de toxines, qui contiennent un antigène protec- teur défini par une ligne de précipitation centrée sur le puits de l'antigène, en immunodiffusion en gélose, lorsqu'il est op- posé à un immunsérum provenant d'un animal traité par une cul- ture du même germe pathogène. Selon une modalité avantageuse de ce mode de réalisation, ladite fraction antigénique vaccinante est isolée de cultures de germes pathogènes pris dans le groupe qui comprend Klebsiella pneumoniae, Streptococcus pneumoniae, Pseudomonas aeruginosa, Vibrio cholerae, Hemophilus influenzae, Bordetella pertussis. Selon une caractéristique avantageuse de la fraction antigénique vaccinante conforme à la présente invention, ladite fraction se distingue par le fait que le pic obtenu par chroma- tographie sur colonne correspond (pour une absorption à 280 nm dans l'ultra-violet) à une composition de l'ordre de 25 à 25,55 % de protéines et de l'ordre de 73,40 à 73,42 % de poly- saccharides capsulaires, la teneur en phosphore ne dépassant pas 0,41 % environ, la teneur en 2-céto-3 déoxyoctanoate (KDO) spécifique du LPS étant inférieure à 0,32 % et la teneur en N-acétylglucosamine étant inférieure à 0,32 %. Une telle analyse met en évidence d'une part la composi- tion glycoprotéique de la fraction antigénique vaccinante con- forme à l'invention et, d'autre part, l'absence d'ADN ou d'ARN. La présente invention a également pour objet des procédés d'extraction et de purification d'antigènes de surface de cul- tures de germes pathogènes, pour obtenir la fraction antigénique vaccinante à immunogénicité élevée définie dans ce qui précède. Selon un procédé d'extraction et de purification d'anti- gènes de surfaces d'une culture de germes pathogènes, conforme à la présente invention, on extrait une à plusieurs fois le cu- lot bactérien sous une agitation très vigoureuse par un tampon approprié à pH voisin de 6, le surnageant obtenu contenant les constituants de surface bruts, est concentré par ultrafiltration en ne recueillant que les particules dont le poids moléculaire est supérieur à 10 000, l'ultrafiltrat obtenu est traité au désoxycholate de sodium (DOC) dans un tampon approprié à un pH voisin de 8, l'ultrafiltrat traité est précipité par l'étha- nol absolu, le précipité obtenu est repris par le même tampon de pH voisin de 8 additionné de 2 % de DOC, puis il est dialysé contre le tampon Tris-HCl pH 8, adsorbé sur DEAE-cellulose, l'antigène est élué par le même tampon utilisé à molarité crois- sante, puis concentré par ultrafiltration. Suivant un mode de réalisation avantageux du procédé ob- jet de la présente invention, le culot bactérien est extrait par un tampon composé de: - Acétate de lithium 0,2 M - EDTA 10 mM - Azide de sodium 0,02 % - Acide acétique QSP > pH 6 à raison de 50 à 70 ml du tampon par g de culot bactérien humide. Suivant un autre mode de réalisation du procédé objet de la présente invention, la solution de constituants de surface bruts est filtrée sur millipore avant de procéder à l'ultra- filtration. Suivant un autre mode de réalisation de l'objet de l'in- vention, l'ultrafiltrat ajusté à pe voisin de 8 par le tampon TRIS est traité par une solution de DOC à 5 % dans du tampon TRIS-HCl à pH 8, constituée par: TRIS-HCl 10 mM EDTA 10 mM de manière à amener la concentration de la solution des consti- tuants de surface à environ 1 % (poids/volume) de DOC. Suivant un autre mode de réalisation de l'objet de l'in- vention, l'ultrafiltrat traité est précipité par 4 à 5 fois son volume d'alcool absolu. Suivant un autre mode de réalisation de l'objet de l'in- 8 2460139 vention, le repérage des tubes contenant l'antigène après pas- sage sur colonne de DEAE-cellulose se fait par le test de pro- tection et/ou le test d'iimmunodiffusion et/ou d'immunoélectro- phorèse. Selon un autre procédé d'extraction et de purification d'antigènes de surface d'une culture de germes pathogènes, con- forme à la présente invention, on obtient une fraction antigé- nique vaccinante pure telle que définie dans ce qui précède, par purification d'une préparation contenant lesdits antigènes de surface, par chromatographie d'affinité. Suivant un mode de réalisation avantageux de ce procédé, la purification par chromatographie d'affinité est réalisée en utilisant un immunoadsorbant constitué par des anticorps spécifiques du composant qui constitue le précipité en ligne "nette", insolubilisés par tous moyens appropriés. Selon une disposition préférée de ce mode de réalisation, lesdits anticorps sont obtenus par hyperimmunisation de mammi- fères tels que le lapin, notamment, par une préparation d'anti- gènes de surface de germes pathogènes dont on désire obtenir l'immunisation. Selon une modalité d'obtention préférée desdits anticorps spécifiques, ceux-ci sont obtenus en utilisant comme antigènes, des préparations d'antigènes de surface purifiées par des métho- des biochimiques connues en elles-mêmes, qui sont injectées à l'animal à immuniser. Selon une autre modalité d'obtention préférée desdits anticorps spécifiques, ceux-ci sont obtenus par utilisation directe du précipité en ligne "nette" qui s'est formé dans la gélose au cours de la réaction d'immunodiffusion, lequel préci- pité est récupéré par découpage in situ dans la gélose, avanta- geusement après lavage de ladite gélose pour éliminer les anti- gènes ou les anticorps non complexés au cours de la réaction d'immunodiffusion, après quoi il est injecté à l'animal à immu- niser. Conformément à cette modalité d'obtention des anticorps spécifiques, le précipité en ligne "nette" est obtenu en utili- sant des réactifs purifiés spécifiques du déterminant; ou bien il est obtenu en utilisant des préparations d'antigènes et d'anticorps non purifiées. Conformément à ce procédé d'extraction et de purification d'antigènes de surface, les anticorps spécifiques utilisés comme immunoadsorbants dans la technique de purification des antigènes par chromatographie d'affinité, sont récupérés à la manière usuelle après avoir recueilli le sang des animaux hyperimmunisés et avoir séparé des hématies,le sérum riche en anticorps spé- cifiques. Suivant une modalité préférée de ce procédé, les anti- corps spécifiques ainsi récupérés sont insolubilisés par poly- mérisation à l'aide de glutaraldéhyde ou par fixation sur des billes de gel de dextrane, de Sépharose ou de verre, par exemple, activées par le bromure de cyanogène ou analogue. Suivant une autre modalité préférée de ce procédé, la préparation d'antigènes de surface soumise à purification par chromatographie d'affinité est constituée par une culture de bactéries ou par le surnageant d'une telle culture, ou bien par le surnageant, contenant les constituants de surface bruts, obtenu par extraction d'un culot bactérien, ou encore par l'ultrafiltrat obtenu après ultrafiltration du surnageant con- tenant les constituants de surface bruts et traitement de ce dernier par du désoxycholate de sodium (DOC). La présente invention a également pour objet l'applica- tion de la fraction antigénique vaccinante glycopeptidique à très grande immunogénicité, conforme à la présente invention, pour la préparation de vaccins, et en tant qu'agent de diag- nostic. De plus, la présente invention a également pour objet l'application des anticorps spécifiques obtenus par hyper- immunisation d'animaux appropriés,à l'aide de la fraction anti- génique vaccinante glycopeptidique conforme à la présente in- vention, en tant que réactifs pour la caractérisation de l'an- tigène protecteur, notamment par réaction de précipitation en gel, ou pour le dosage spécifique dudit antigène protecteur dans des liquides biologiques (notamrment par radioimmunoessai ou par des tests immunoenzymatiques) ou dans des préparations antigéniques. Outre les dispositions qui précèdent, l'invention com- prend encore d'autres dispositions, qui ressortiront de la description qui va suivre. La présente invention vise la fraction antigénique vac- cinante conforme aux dispositions qui précèdent, ainsi que les procédés pour son obtention, les anticorps spécifiques obtenus à l'aide de ladite fraction antigénique, les vaccins, agents de diagnostic et réactifs obtenus à l'aide de ladite fraction antigénique vaccinante, et les moyens propres à la mise en oeuvre des procédés susdits et à la préparation desdites fractions anti- géniques et desdits anticorps spécifiques. L'invention sera mieux comprise à l'aide du complément de description qui va suivre,qui comprend des exemples de prépa- ration de la fraction antigénique conforme à l'invention, des exemples de caractérisation de ladite fraction antigénique, des exemples de préparation de vaccins à l'aide de ladite fraction antigénique et des compte-rendus d'expérimentations portant sur des vaccinations effectuées sur souris à l'aide de la fraction antigénique conforme à l'invention. Il doit être bien entendu, toutefois, que ces exemples et compte-rendus sont donnés uniquement à titre d'illustration de l'objet de l'invention, dont ils ne constituent en aucune manière une limitation. EXEMPLE 1 - EXTRACTION ET PURIFICATION D'UNE FRACTION ANTIGENIQUE DE SURFACE A PARTIR D'UNE CULTURE DE KLEBSIELLA PNEUMONIAE SEROTYPE 2 1._ Extraction des bactéries Le culot bactérien d'une culture de Klebsiella pneumoniae est repris par 60 ml de tampon LEA par gramme (poids humide) de culot. Tampon LEA Acétate de lithium 0,2 M EDTA 10 mM Acide acétique QSP - pH 6 Azide de sodium 0,02 % Le mélange est soumis à agitation vigoureuse avec des billes de verre pendant 2 heures à 450C, puis centrifugé à 000 g pendant 20 minutes. On recueille un surnageant: CS1 (constituants de sur- face 1) que l'on met de côté. Le culot de centrifugation est repris dans du tampon LEA de même composition que ci-dessus et on procède à une nouvelle extraction, dans les mêmes conditions que la première extrac- tion. Par centrifugation à 25 000 g pendant 20 minutes, on nil 2460139 obtient un culot, qui est rejeté, et un surnageant CS2 (consti- tuants de surface 2) Les deux surnageants, CSl + CS2, sont filtrés sur un fil- tre Millipore 0,2 p et on recueille un filtrat constitué par des CSB ou constituants de surface bruts. 2.- Purification de l'antigène a) Le CSB est soumis à ultrafiltration sur filtre Amicon PM 10, pour concentrer de 10 à 30 fois et obtenir un résidu puri- fié de constituants de surface CS dont on rejette les particules de poids moléculaire inférieur à 10 000, pour ne conserver que celles de poids moléculaire supérieur à 10 000. b) Traitement au désoxycholate de sodium DOC) On ajuste le pH de CS > 10 000 à 8 avec du tampon Tris. On traite par une solution de DOC à 5 % dans du tampon TE de composition: Tris HCl 10 mM EDTA 10 mM pH 8 On amène la concentration de la solution de CS > k0 000 à 1 % (poids/volume) de DOC (on doit observer une clarification de la suspension). On laisse 30 minutes à la température du laboratoire, après quoi on recueille CSoDOC. c) Précipitation à l'éthanol On précipite le CS.DOC avec 4 à 5 volumes d'éthanol absolu à 4 C. On centrifuge à 40 000 g pendant 15 minutes. On rejette le surnageant et on recueille le culot qu'on reprend dans du tampon TE additionné de 2 % de DOC. On obtient un précipité de CSoDOC dans lJéthanol. d) Passage sur DEAE-cellulose On dialyse le précipité de CS.DOC dans l'éthanol contre le tampon: Tris HCl 10 mM pH 8 qui a servi à équilibrer la cellulose, puis on élue en augmentant la molarité du tampon Tris. Par exemple, pour les préparations de Klebsiella pneumo- niae, à 0,01 M, on élue des protéines contaminantes et à 0,5 M, on élue l'antigène protecteur. e) Repoérage des tubes contenantllantiqène protecteur par: Test de protection et/ou immunodiffusion tLimmunoélectrophorèse On regroupe les tubes positifs, c'est-à-dire ceux qui donnent une ligne de précipitation "nette" et on concentre sur Amicon PM 10. La fraction de constituants de surface (CS) finalement * recueillie, CS pic DEAE, correspond au pic obtenu par chroma- tographie sur DEAE-cellulose, et sa composition est la suivante, pour Klebsiella pneumoniae sérotype 2: - protéines (dosage Folin): 800 T/ml hexoses neutres: 1 900 y/ml - acides uroniques g 400 y/ml - phosphore: 13 y/ml - N-acétylglucosamine (traces): de la fraction antigénique. 1.- Préparation de l'immunsérum On effectue une première injection de la fraction vacci- nante a des lapins par voie intradermique avec l'adjuvant de Freund complet (doses de 100 à 1000 ig de protéines par lapin). On fait des rappels par voie intramusculaire espacés de deux à trois semaines avec des doses de fraction vaccinante variant de 10 à 100 mg de protéines par lapin. On prélave du sang 10 à 15 jours après les rappels et o contrôle les sérums obtenus,par double immunodiffusion en gélose. On sacrifie les lapins quand les taux d'anticorps obtenus sont satisfaisants (après deux a quatre rappels). - 2.- Par double diffusion dans la gélose, on obtient deux préci- pités (ainsi que cela ressort de la figure 1 du dessin annexé): a) le précipité n* 1 possède les caractéristiques sui- vantes: 13 2460139 - c'est le premier précipité en partant du puits 3 de l'anti- gène; - il est sensiblement centré sur le puits de l'antigène; - il présente une ligne de contour net; - il est commun à différents sérotypes de Klebsiella pneumoniae; - il est supprimé si on a préalablement traité la préparation antigénique par la soude dans les conditions suivantes: NaOH à 0,25 N pendant 3 heures à 56 C; b) le précipité n 2 possède les caractéristiques sui- vantes: - il est plus éloigné du puits 3 de l'antigène que le précipité n 1 et sa position est variable entre les puits d'antigène et d'anticorps; ses contours sont flous - il est inhibé par des oses g si on ajoute à la gélose qui est le siège de la réaction d'limunodiffusion, de l'acide glucuro- nique Zqui est l'un des constituants du polyoside capsulaire (PC) spécifique du sérotype 2 de Klebsiella pneumoniae7 à rai- son de 50 mg/ml de gel, le précipite n0 2 n'apparait pas. Ces deux précipités peuvent être plus ou moins proches l'un de l'autre et, dans certains cas, ils peuvent être con- fondus. Les expériences suivantes menées par le Demandeur, lui ont permis de mettre en évidence que la présence dans la frac- tion antigénique, des déterminants responsables de la formation du précipité n 1 est indispensable pour que la fraction anti- génique procure une bonne protection. le pouvoir protecteur de la fraction antigénique vaccinante est essentiellement lié à la présence et à l'importance ldu précipité no 1. Expérience n 1: Une préparation isolée de cultures de Klebsiella pneumoniae par les méthodes classiques ZHEIDELBERGER et alia, J. Exp. Med. 1950, 9! pS 34!4349 pour Pneumococcus PIER et alia, Infection & Inimunity 19785 22 (3), p. 903-925, pour Pseudomonas aeruginosa7 ne permet d'obtenir, par réaction d'immunodiffusion en gélose, qu'une ligne "floue" correspondant au précipité n 2, qui est du polyoside capsulaire (PC) prati- quement dépourvu de pouvoir vaccinant (DP50 = de l'ordre de 80 ng): cf. figure 2, o on obtient au voisinage du puits d'antigène contenant du polyoside capsulaire sérotype 2, en présence de sérum anti-polyoside capsulaire type 2, une ligne de précipita- 14 2460139 tion floue n' 2' caractéristique du PC. Expérience no 2: Des préparations fraîches de polyoside capsulaire contenant environ 4 % de protéines (qui sont dans ce cas considérées comme des contaminants) montrent en immuno- diffusion, une ligne dite "nette". Après lyophilisation, on ob- tient presque exclusivement la ligne "floue" qui vaccine mal (100 ng de PC = DP50 pour la souris). Les résultats obtenus ci- après montrent que la DP50 est beaucoup plus faible avec la frac- tion antigénique vaccinante purifiée constituée de la partie polyoside capsulaire et de la partie peptidique, conforme à la présente invention. La définition in vitro de la fraction antigénique pro- tectrice selon la présente invention, est la suivante: Expérience n0 3: Dans une boîte de gélose contenant de l'acide glucuronique (un des composants du PC), on fait deux puits: l'un contient l'antigène de Klebsiella pneumoniae type 2 préparé selon le procédé mis au point par le Demandeur, et l'au- tre un immunsérum spécifique de l'antigène. On n'observe qu'une ligne de précipitation dite "ligne nette" d'intensité plus fai- ble que dans l'Expérience n0 2, près du puits de l'antigène. Expérience n0 4: Les conditions sont identiques à celles de l'Expérience n0 3, mais la gélose ne contient pas d'acide glucuronique. On observe deux lignes de précipitation: l'une "nette", près du puits de l'antigène et une deuxième ligne, plus "floue", située entre les deux puits. Expérience no 5: Des marquages avec de l'iode 125, métho- de spécifique pour la mise en évidence des protéines, prouvent en immunodiffusion et en immunoélectrophorèse, que la ligne "nette" comprend une partie peptidique. Avec les résultats ob- tenus dans les Expériences 3 et 4 qui provuent la présence de polyoside capsulaire, on peut conclure à une association de type "glycopeptide" qui est responsable du pouvoir protecteur lors des immunisations chez la souris. Il résulte de ce qui précède que - il existe dans la fraction antigénique vaccinante conforme à la présente invention, du polyoside capsulaire; une autre substance est associée à ce polyoside; - le fait que dans l'Expérience n0 3, la "ligne nette" a une intensité plus faible que dans l'Expérience n0 4, signifie que des déterminants se trouvant dans la ligne "floue", sont associés à la substance précipitant sous forme de "ligne nette". Il y a lieu de préciser que le pouvoir vaccinant est lié à la "ligne nette". Cette"ligne nette" disparaît si on traite la préparation d'antigène vaccinant par la soude dans les condi- tions suivantes: NaOH à 0,25 N pendant 3 heures à 56 C; on note une diminution importante du pouvoir protecteur. Comme l'indique la composition globale de la fraction vaccinante purifiée, la présence d'une protéine ou d'un peptide est certaine. Cependant, un traitement à la "Pronase" (mélange de protéases) ne modifie pas l'aspect caractéristique de la "ligne nette" en immunodiffusion et le pouvoir protecteur sur souris est conservé. Conditions expériementales: 0,5 ml de CS pic DEAE à 1900 y/ml de protéines sont in- cubes avec 10 y de "Pronase" dans 0,3 ml de tampon Tris HC1 pH 7,8, pendant 48 heures à 56 C. B.- La caractérisation mise en évidence par immunodiffu- sion en gélose est corroborée par électrophorèse. En effet, une électrophorèse en gel de polyacrylamide mon- tre que la partie responsable du pouvoir vaccinant reste dans le tiers supérieur (borne négative) du gel normal ou du gel avec SDS 2 % + mercaptoéthanol à 5 % (tension appliquée = 7,5 mA). En immunoélectrophorèse (tampon véronal, pi- 8,6 et 5 volts/cm pendant 2 heures), on obtient l'image immunologique représentée à la figure 3 du dessin annexé o: - la référence 4 désigne le puits de 9imraunsérum antisérotype 2, - la référence 5 désigne le puits de l'immunsérum antisérotype 1, - la référence 6 désigne le puits de la fraction antigénique de surface conforme à l'invention, extraite de i'lebsiella pneumoniae type 2, - - la référence 7 désigne la ligne "nette", - la référence 8 désigne la ligne "floue", - la référence 9 désigne le PVS ou pouvoir vaccinant sur souris. Cette caractérisation montre, elle aussi, que l'activité protectrice est due à la ligne de précipitation "nette", donc à l'association peptidepolyoside capsulaire. La ligne "floue" est spécifique du sérotype. 16 2460139- EXEMPLE 2 - EXTRACTION ET PURIFICATION D'UNE FRACTION ANTIGENIQUE DE SURFACE A PARTIR DE KLEBSIELLA PNEUMONIAE 1.- Extraction des bactéries Le culot bactérien d'une culture de Klebsiella pneumo- niae est repris par 60 ml de tampon LEA par gramme (poids hu- mide) de culot. Tampon LEA: acétate de lithium 0,2 M EDTA 10 mM acide acétique QSP- - pH 6 azide de sodium 0,02 % Le mélange est soumis à agitation vigoureuse avec des billes de verre pendant 2 heures à 45 C, puis centrifugé à 000 g pendant 20 minutes. On recueille un surnageant CS1 (constituants de surface 1) que l'on met de côté. Le culot de centrifugation est repris dans du tampon LEA de même composition que ci-dessus et on procède à une nouvelle extraction dans les mêmes conditions que la première extraction. Par centrifugation à 25 000 g pendant 20 minutes, on obtient un culot, qui est rejeté et un surnageant CS2 (consti- tuants de surface 2) Les deux surnageants, CS1 + CS2, sont filtrés sur un filtre Millipore 0,2 p, et on recueille un filtrat constitué par CSB, constituants de surface bruts. 2.- Preparation de l'immunsérum Les conditions de préparation de l'immunsérum sont iden- tiques à celles décrites à l'Exemple 1 ci-dessus. En variante, la fraction antigénique utilisée pour l'im- munisation peut être constituée: - soit par des préparations d'antigènes de surfaces purifiées par des méthodes biochimiques décrites dans la Littérature, - soit par le précipité n 1 découpé dans la gélose in situ, après lavage de la gélose pour éliminer les antigènes et les anticorps non réagis. 3.- Les anticorps contenus dans l'immunsérum obtenu en 2. ci-dessus sont insolubilisés par polymérisation a u glutaral- déhyde et chargés dans une colonne dans laquelle on fait passer les constituants de surface bruts obtenus en 1. ci-dessus. L'on obtient, par chromatographie d'affinité sur ces immunoadsorbants, par purification de la fraction obtenue en 1., 17 2460139 une fraction antigénique définie par le premier pic qui sort sur colonne de DEAE-cellulose, pour une absorption à 280 nm dans l'ultra-violet, et dont la composition a été donnée plus haut. La composition, après purification sur immunoadsorbant, est sensiblement la même qu'après le passage sur colonne de DEAE. L'activité de la fraction antigénique obtenue par cette technique de purification est très bonne puisqu'elle est de 0,1 à 0,3 ng (DP 50). COMPTE-RENDUS D'EXPERIENCES DE VACCINATIONS SUR SOURIS On utilise dans les expériences dont il est rendu compte dans ce qui va suivre, la fraction antigénique purifiée extraite de cultures de Klebsiella pneumoniae, types 1 et 2, obtenue à l'Exemple 1. A.- Protocole expérimental - souris SWISS âgées de 4 semaines, immunisation sous-cutanée de 0,5 ml de produit à des dilutions croissantes avec du sérum physiologique apyrogène, - 14 jours après l'immunisation, épreuve avec 100 DL50 de la souche virulente par voie intrapéritonéale. Des épreuves par voie intraveineuse ou par aérosol don- nent les mêmes résultats qu'avec la voie intrapéritonéale: - le calcul de la dose protectrice 50 % (= DP 50) est effectué selon la méthode Reed & Muench (Amer. J. Hyg. 1938, 27, p. 493-497). La DP 50 est la dose protégeant 50 % des souris. B. - Résultats: Il résulte de la description qui précède que, quels que soient les modes de mise en oeuvre, de réalisation et d'applica- tion adoptés, l'on obtient une fraction antigénique glycopeptidique vaccinante à très grande immunogénicité isolée de cultures de ger- mes pathogènes, qui présente par rapport aux fractions antigéniques obtenues conformément à l'Art antérieur des propriétés et des avan- tages importants dont certains ont été mentionnés dans ce qui pré- cède et dont d'autres propriétés et avantages ressortiront de l'uti- lisation de ladite fraction antigénique. Ainsi que cela ressort de ce qui précède, l'invention ne se limite nullement à ceux de ses modes de mise en oeuvre, de réali- sation et d'application qui viennent d'être décrits de façon plus explicite; elle en embrasse au contraire toutes les variantes qui peuvent venir à l'esprit du technicien en la matière, sans s'écar- ter du cadre, ni de la portée, de la présente invention. Fraction vaccinante DP 50 Klebsiella antigène de surface brut 10 ng de protéines pneuinoniae (= CSB) Type 2 CS pic DEAE (fraction antigénique 1 ng de protéines conforme à l'invention- Klebsiella pneumoniae CBS 100 nq de protéines Type 1 CS pic DEAE non fait Streptococcus CBS 1,5 de protéines pneum oniae --------------------------------------------------- Type 1 CBS traité au désoxycholate éthanol 0,4 ng de protéines Streptococcus CBS 400 ng de protéines pneumoniae _ --------------------------_______________________ Types 2 et 3 CBS traité au désoxycholate éthanol non fait 19 2460139 REVENDICATIONS 1 - Fraction antigénique vaccinante à très grande immuno- génicité, isolée d'une culture de germes pathogènes, caracté- risée en ce qu'elle est constituée par une partie osidique pré- sente dans une proportion d'environ 50 % avec une partie pro- téique, liées entre elles par liaison de covalence, et en ce qu'elle présente, lorsqu'elle est opposée à un immunsérum pro- venant d'un animal traité par une culture des mêmes germes patho- gènes, une image immunologique comprenant essentiellement une ligne de précipitation "nette" près du puits de l'antigène, en immunodiffusion en gélose. 2 - Fraction antigénique vaccinante selon la Revendica- tion 1, caractérisée en ce qu'elle présente,en immunodiffusion en gélose, outre la ligne de précipitation "nette" précitée, située près du puits de l'antigène, dans laquelle a été mis en évidence par marquage à l'iode 125 avec de la chloramine T, la présence d'acides aminés, une ligne de précipitation "floue" située dans une position variable entre les puits d'antigène et d'anticorps, et qui met en évidence la participation de poly- osides à la formation de ce deuxième précipité. 3 - Fraction antigénique vaccinante selon la Revendica- tion 1, caractérisée en ce que l'image immunologique en ligne "nette"obtenue en immunodiffusion en gélose n'est pas modifiée après traitement de ladite fraction par des protéases. 4 - Fraction antigénique vaccinante selon la Revendica- tion 1, caractérisée en ce que son image immunologique de ligne "nette" obtenue en immunodiffusion en gélose, disparaît après traitement de ladite fraction par de la soude. - Fraction antigénique vaccinante selon la Revendica- tion 2, caractérisée en ce que l'apparition de la ligne de préci- pitation "floue" est inhibée, en inamunodiffusion en gélose, si on ajoute des oses à la gélose dans laquelle se produit la réaction d'immunodiffusion. 6 - Fraction antigénique vaccinante selon l'une quelcon- que des Revendications 1 à 5, caractérisée en ce qu'elle est iso- lée de cultures de germes pathogènes ne secrétant ni n'excrétant de toxines, qui contiennent un antigène protecteur défini par une ligne de précipitation centrée sur le puits de l'antigène, en immunodiffusion en gélose, lorsqu'il est opposé à un immun- sérum provenant d'un animal traité par une culture du même germe 2460139 pathogène. 7 - Fraction antigénique vaccinante selon la Revendica- tion 6, caractérisée en ce qu'elle est isolée de cultures de germes pathogènes pris dans le groupe qui comprend Klebsiella pneumoniae, Streptococcus pneumoniae, Pseudomonas aeruginosa, Vibrio cholerae, Hemophilus influenzae, Bordetella pertussis. 8 - Fraction antigénique vaccinante selon l'une quelcon- que des Revendications 1 à 7, caractérisée en ce qu'elle se distingue par le fait que le pic obtenu par chromatographie sur colonne correspond (pour une absorption à 280 nm dans l'ultra- violet) à une composition de l'ordre de 25 à 25,55 % de protéi- nes et de l'ordre de 73,40 à 73,42 % de polysaccharides capsu- laires, la teneur en phosphore ne dépassant pas 0,41 % envi- ron, la teneur en 2-céto-3 déoxyoctanoate (KDO) spécifique du 15.LPS étant inférieure à 0,32 % et la teneur en N-acétylglucosamine étant inférieure à 0,32 %. 9 - Procédé d'extraction et de purification de la frac- tion antigénique vaccinante selon l'une quelconque des Revendi- cations 1 à 8, caractérisé en ce que l'on extrait une à plusieurs fois un culot bactérien sous une agitation très vigoureuse par un tampon approprié à pH voisin de 6, en ce que le surnageant obte- nu contenant les constituants de surface bruts est concentré par ultrafiltration en ne recueillant que les particules dont le poids moléculaire est supérieur à 10 000, en ce que l'ultra- filtrat obtenu est traité au désoxycholate de sodium (DOC) dans un tampon approprié à un pH voisin de 8, en ce que l'ultra- filtrat traité est précipité parl'éthanolabsolu, en ce que le précipité obtenu est repris par le même tampon de pH voisin de 8 additionné de 2 % de DOC, en ce qu'il est dialysé contre le tam- pon Tris-HC1 pH 8, adsorbé sur DEAE-cellulose, après quoi l'anti- gène est élué par le même tampon utilisé à molarité croissante, puis concentré par ultrafiltration. - Procédé selon la Revendication 9, caractérisé en ce que le culot bactérien est extrait par un tampon compose de: - acétate de lithium 0,2 M - EDTA 10 mM - Azide de sodium 0,02 % - Acide acétique QSP > pH 6 à raison de 50 à 70 ml de tampon par gramme de culot bactérien humide. 21 2460139 1 - Procédé selon la Revendication 9, caractérisé en ce que la solution de constituants de surface bruts est filtrée sur Millipore avant de procéder à l'ultrafiltration. 12 - Procédé selon la Revendication 9, caractérisé en ce que l'ultrafiltrat ajusté à pH voisin de 8 par le tampon Tris,est traité par une solution de DOC à 5 % dans du tampon Tris-HCl à pH 8, constituée par: - Tris-HCl 10 mM - EDTA 10 mM de manière à amener la concentration de la solution des consti- tuants de surface à environ 1 % (poids/volume) de DOC. 13 - Procédé selon la Revendication 9, -caractérisé en ce que l'ultrafiltrat traité est précipité par 4 à 5 fois son vo- lume d'alcool absolu. 14 - Procédé selon-la Revendication 9, caractérisé en ce que le repérage des tubes contenant l'antigène après passage sur colonne de DEAEcellulose est effectué par le test de protection et/ou le test d'immunodiffusion et/ou d'immunoélectrophorèse. - Procédé d'extraction et de purification de la frac- tion antigénique vaccinante selon l'une quelconque des Revendi- cations 1 à 8, caractérisé en ce que ladite fraction est obte- nue par purification d'une préparation contenant lesdits anti- gènes de surface, par chromatographie d'affinité. 16 - Procédé selon la Revendication 15, caractérisé en ce que la purification par chromatographie d'affinité est réa- lisée en utilisant un immunoadsorbant constitué par des anti- corps spécifiques du composant qui constitue le précipité en li- gne "nette", insolubilisés par tous moyens appropriés. 17 - Procédé selon la Revendication 16, caractérisé en ce que lesdits anticorps spécifiques sont obtenus par hyper- immunisation de mammifères tels que le lapin, notamment, par une préparation d'antigènes de surface de germes pathogènes dont on désire obtenir l'immunisation. 18 - Procédé selon la Revendication 17, caractérisé en ce que lesdits anticorps spécifiques sont obtenus par injection à un animal à immuniser, de préparations d'antigènes de surface purifiées par des méthodes biochLmiques connues en elles-mêmes. 19 - Procédé selon la Revendication 17, caractérisé en ce que lesdits anticorps spécifiques sont obtenus par utilisa- tion directe du précipité en ligne "nette" qui s'est formé dans 22 2460139 la gélose au cours de la réaction d'immunodiffusion, lequel pré- cipité est récupéré par découpage in situ dans la gélose, avanta- geusement après lavage de ladite gélose pour éliminer les anti- gènes ou les anticorps non complexés au cours de la réaction d'immunodiffusion, après quoi il est injecté à l'animal à immu- niser. Procédé selon la Revendication 19, caractérisé en ce que le précipité en ligne nette est obtenu en utilisant des réactifs purifiés spécifiques du déterminant. 21 - Procédé selon la Revendication 19, caractérisé en ce que le précipité en ligne nette est obtenu en utilisant des préparations d'antigènes et d'anticorps non purifiées. 22 - Procédé selon l'une quelconque des Revendications 16 à 21, caractérisé en ce que les anticorps spécifiques uti- lisés comme immunoadsorbants, dans la technique de purification des antigènes par chromatographie d'affinité, sont récupérés après avoir recueilli le sang des animaux hyperimmunisés et avoir séparé des hématies,le sérum riche en anticorps spécifi- ques. 23 - Procédé selon la Revendication 16, caractérisé en ce que les anticorps sont insolubilisés par polymérisation à l'aide de glutaraldéhyde. 24 - Procédé selon la Revendication 16, caractérisé en ce que les anticorps sont insolubilisés par fixation sur des billes de polymères appropriés ou sur des billes de verre, convenablement activées. - Procédé selon l'une quelconque des Revendications à 24, caractérisé en ce que la préparation d'antigènes de surface soumise à purification par chromatographie d'affinité est prise dans le groupe qui comprend les cultures de bactéries ou les surnageants de telles cultures, ou bien les surnageants contenant le constituant de surface brut, obtenus par extrac- tion d'un culot bactérien, ou encore par l'ultrafiltrat obtenu après ultrafiltration du surnageant contenant le constituant de surface brut et traitement de ce dernier par du désoxycholate - de sodium (DOC). 260- Utilisation de la fraction antigénique vaccinante selon l'une quelconque des Revendications 1 à 8, pour la pré- paration de vaccins à l'égard de différents germes pathogènes compris notamment dans le groupe spécifié à la Revendication 7. 23 2460139 27 - Agent de diagnostic caractérisé en ce qu'il est constitué par la fraction antigénique vaccinante selon l'une quelconque des Revendications l à 8. 28 - Anticorps spécifiques obtenus en mettant en oeuvre le procédé selon l'une quelconque des Revendications 17 à 24. 29 - Application des anticorps spécifiques selon la Revendication 28, en tant que réactifs pour la caractérisation de l'antigène protecteur, notamment par réaction de précipi- tation en gel. 30 - Application des anticorps spécifiques selon la Revendication 28 en tant que réactifs pour le dosage spécifi- que des antigènes protecteurs selon l'une quelconque des Reven- dications l à 8, dans des liquides biologiques (notamment par radioimmunoessai ou par des tests immuno-enzynatiques) ou dans des préparations antigéniques.