FR 2459832 A1 19810116 FR 8014132 A 19800625 La présente invention concerne un procédé pour pro- duire de la L-histidine par fermentation. On sait que des mutants auxotrophes ou résistant aux drogues appartenant, par exemple, aux genres Brevibacterium, Corynebacterium (brevet des EtatsUnis d'Amérique n 3 716 453); Escherichia (H.S. Moyed, M. Friedman: Science 129, 968 (1959)) et Serratia (demande de brevet japonais non examinée publiée n 116 296/1973) sont utiles pour la production de L4histidine par fermentation. La demanderesse a choisi un mutant du genre Escherichia résistant à un analogue de l'histidine comme donneur d'acide désoxyribonucléique (appelé ci-après ADN) pour obtenir à partir de ce mutant un fragment d'ADN possédant une information génétique concernant la production de L-histidine et a finalement inséré le fragment d'ADN dans un vecteur obtenu a partir d'Escherichia coli. Le plasmide recombinant a été introduit avec succès dans un micro-organisme du genre Escherichia. La demanderesse a découvert que le micro-organisme de l'invention produit de la L-histidine avec un rendement bien supérieur à celui des mutants connus produc- teurs de L-histidine du genre Escherichia. Les modes de réalisation préférés de l'invention vont maintenant être décrits. Le mutant du genre Escherichia résistant a un analogue de l'histidine est connu (H.S. Moyed, F. Friedman: Science 129, 968 (1959)) et on l'obtient selon des techniques classiques de mutation artificielle. L'analogue de l'histidine que l'on utilise dans l'invention inhibe la croissance des micro-organismes du genre Escherichia, mais l'inhibition est empêchée en partie ou en tota- lité par la présence de L-histidine. On peut citer comme exemples d'analogues de l'histidine, la thiazolyl-2 alanine, la triazole- 1,2,4-alanine, la méthyl-2 histidine et l'histidine-hydroxamate. Le donneur d'ADN que l'on utilise dans l'invention peut également consister en un mutant résistant aux sulfamides, tels que la sulfaguanidine, résistant à un analogue de la purine tel que l'aza-8 guanine ou nécessitant un aminoacide tel que le tryptophane ou la iréthionine pour se développer, en même temps qu'il résiste à un analogue de l'histidine. Généralement, plus le donneur d'ADN a un pouvoir élevé de production de la L-histidine, plus on obtient des résultats favorables. On extrait l'ADN chromosomique du mutant de façon habituelle et on le traite avec une endonucléase de restriction selon le procédé habituel. On traite également I'ADN de plasmide ou de phage que l'on utilise comme vecteur avec une endonucléase de restriction selon un mode de traitement analogue à celui de l'ADN chromosomique. On peut utiliser divers types d'endonucléases de restriction pour effectuer une digestion partielle de l'ADN chromosomique. Ensuite, on soumet l'ADN chromosomique ayant subi la digestion et l'ADN vecteur clivé à une réaction de recombinaison. On peut également pour effectuer la recombinaison des fragments d'ADN, incorporer une terminaltransférase, de l'acide désoxyadénylique et de l'acide thymidylique ou de l'acide désoxy- guanylique et de l'acide désoxycytidylique au fragment d'ADN chromo- somique et & l'ADN vecteur clivé, puis soumettre le fragment d'ADN chromosomique modifié et le fragment d'ADN clivé & une recombinaison cyclique. Comme ADN vecteur, on peut utiliser un vecteur clas- sique dérivant d'un plasmide ou d'un phage tel que Col El, pSC 101, pBR 322 et R6K. On peut incorporer l'ADN hybride ainsi obtenu & un micro-organisme du genre Escherichia selon une technique classique de transformation. On sélectionne le transformant désiré avec un milieu sur lequel peut seulement se développer un clone possédant les caractéristiques de production de la L-histidine du fragment d'ADN chromosomique et/ou les caractéristiques que possède l'ADN vecteur. Conmme receveur de l'ADN hybride, on peut utiliser une souche quelconque du genre Escherichia. Pour accroître la productivité, il est souhaitable que le receveur présente des besoins nutritionnels, par exemple en L-isoleucine, Lproline, L-arginine, L-méthionine, L-tryptophane, L-leucine, L-tyrosine, L-lysine, guanine et xanthine et une résis- tance, par exemple, & la sulfaméthomidine, à l'éthionine, & l'amino-2 benzothiazole, & l'aza-8 guanine, & l'aza-8 adénine, & la diamino-2,6 purine, au méthionine-sulfoxyde, à l'amino-4 pyrazole-3,4-dipyridine, à la triazole-1,2,4-alanine, isolément ou en combinaison. Il est souhai- table d'utiliser comme receveur un mutant ayant un fort pouvoir de production de la L-histidine. & On préfère que le donneur d'ADN présente également la résistance ou le besoin nutritionnel précité. Les procédés de culture de la souche productrice de I.-histidine ainsi obtenue sont classiques et semblables aux pro- cédés de culture des micro-organismes connus producteurs de L-his- tidine. Donc, le milieu de culture est un milieu classique contenant des sources de carbone, des sources d'azote, des ions minéraux et, lorsqu'il est nécessaire, des substances nutritives organiques secon- daires, telles que des vitamines ou des aminoacides. On peut citer comme exemples de sources de carbone, le glucose, le fructose, le saccharose et le lactose et des matières brutes contenant des sources de carbone, telles que les hydrolysats d'amidon et les mélasses. On peut utiliser comme sources d'azote, l'ammoniac gazeux, l'ammoniaque aqueuse, des sels d'ammonium et d'autres sources classiques d'azote. On obtient les meilleurs résultats lorsqu'on ajoute au milieu plus de 50 mg/dl de dérivé de purine tel que l'adénine, l'adénosine, l'acide adénylique, l'hypoxanthine, l'inosine et l'acide inosinique. On effectue la culture en aérobiose en ajustant le pH et la température du milieu à des valeurs appropriées et on poursuit la culture jusqu'à ce que la formation de L-histidine cesse pratiquement. On peut récupérer de façon classique la L-histidine accumulée dans le milieu de culture. Selon l'invention, on peut produire la L-histidine avec un rendement supérieur à ceux des-procédés connus utilisant des souches d'Escherichia. De plus, la quantité d'aminoacides formés comme sous-produits est faible et, par conséquent, on peut récupérer de façon simple la L-histidine avec un rendement élevé. L'invention est illustrée par l'exemple non limitatif suivant. EXEMPLE (1) Préparation d'ADN chromosomique possédant une information géné- tique concernant la production de L-histidine On cultive & 37 C en agitant Escherichia coli R-344, mutant résistant à la thiazolyl-2 alanine (2TA) et induit à partir de la souche K-12 (ATCC 10798) dans 1 litre de milieu L contenant 1 g/dl de peptone, 0,5 g/dl d'extrait de levure, 0,1 g/dl de glucose et 0,5 g/dl de chlorure de sodium (pli ajusté à 7,2) et on recueille les cellules bactériennes de la phase de croissance exponentielle. On extrait l'ADN chromosomique selon le procédé classique au phénol et on obtient 5,3 mg d'ADN purifié. (2) Préparation de l'ADN vecteur Comme vecteur, on prépare de la façon suivante de l'ADN du plasmide pBR 322, qui contient comme marqueurs des gènes de résistance à l'ampicilline et à la tétracycline. On incube une souche d'Escherichia coli K-12 héber- geant le plasmide pBR 322, à 37 C, dans 1 litre de milieu glucose- "casaminoacid'"- sels minéraux contenant par litre 2 g de glucose, 1 g de chlorure d'ammonium, 6 g de phosphate disodique, 3 g de phos- phate monopotassique, 5 g de chlorure de sodium, 0,1 g de sulfate de magnésium heptahydraté, 0,015 g de chlorure de calcium dihydraté, g de "casaminoacid" (hydrolysat de caséine), 0,05 g de L-trypto- phane, 0,05 g de thymine et 100,pg de chlorhydrate de thiamine (pH ajusté à 7,2). Apres incubation jusqu'à un stade avancé de la phase logarithmique,on ajoute 170 /ug/ml de chloramphénicol au milieu de culture. Ces opérations provoquent le développement et l'accumulation abondante de I'ADN de plasmide dans les cellules bactériennes. Après 16 h d'incubation, on recueille les cellules, puis on les lyse par traitement par le lysozyme et le dodécylsulfate de sodium. On centrifuge le lysat à 30 000 x g pendant 1 h pour obtenir un surnageant. Après concentration du surnageant, on obtient 580 /ug d'ADN de plasmide par fractionnement par centrifugation avec un gradient de densité à base de chlorure de césium-bromure d'éthi- dium en équilibre. (3) Insertion du fragment d'ADN chromosomique dans le vecteur On traite 10 /ug de l'ADN chromosomique avec l'une des endonucléases de restriction EcoRI, Pst I et Hind III à 37 C pendant 5, 10, 20, 30 et 60 min pour cliver les chatnes d'ADN, puis on chauffe à 65 C pendant 5 min, On traite également 10 pg de l'ADN vecteur avec l'une des endonucléases de restriction EcoRI, Pst I et Hind IIIà 37 C pendant 1 h pour cliver totalement l'ADN, puis on chauffe a 65 C pendant 5 min. On mélange la solution d'ADN chromosomique ayant subi la digestion et la solution d'ADN vecteur clivé et on effectue la réaction de recombinaison des fragments d'ADN au moyen de l'ADN- ligase de phage T4 en présence d'ATP et de dithiothréitol à 10 C pendant 24 h. On traite ensuite le mélange réactionnel à 65 C pendant min et on ajoute un volume double d'éthanol. On récupère l'ADN re- combinant précipité. (4) Transformation génétique avec le plasmide hybride hébergeant l'information génétique concernant la production de L-histidine On cultive dans 10 ml de milieu L à 37 C et en agitant une souche de Escherichia coli H-13 nécessitant de la L- histidine dérivant par mutagénèse provoquée par la N-méthyl N'- nitro N-nitrosoguanidine d'Escherichia coli K-12. On recueille les cellules dans la phase de croissance exponentielle et on les met en suspension dans une solution 0,1 M en chlorure de magnésium, puis dans une solution 0,1 M en chlorure de calcium au bain-marie glacé pour préparer ainsi des cellules "compétentes" capables de fixer l'ADN. On ajoute & la suspension de cellules compétentes l'ADN obtenu dans le stade (3) qui contient le plasmide hybride vecteur d'ADN étranger. On maintient la suspension au bain-marie glacé pendant 30 min, puis on chauffe à 42 C pendant 2 min et on laisse à nouveau reposer au bain-marie glacé pendant 30 min, puis on ensemence du milieu L avec les cellules qui ont ainsi incorporé le plasmide hybride vecteur d'ADN étranger et on agite a 37 C pendant 3 h pour achever la réaction de transformation. On recueille les cellules, on les lave et on les remet en suspension. On étale une petite portion de la suspension cellulaire sur une botte de gélose contenant par litre 2 g de glucose, 1 g de sulfate d'ammonium, 7 g de phosphate dipotassique, 2 g de phosphate monopotassique, 0,1 g de sulfate de magnésium heptahydraté, 0,5 g de citrate de sodium dihydraté et 2 g de gélose (pel ajusté à 7,2). On incube la botte a 37'C. Apres trois jours d'incubation, on prélève toutes les colonies apparues, on les purifie et on les isole. Les colonies de transformants sont celles qui résis- tent à au moins l'un des deux antibiotiques que sont l'ampicilline et la tétracycline et qui sont capables de produire de la L-histidine. On détermine la résistance à l'ampicilline (50 " g/ml) et à la tétracycline (5 p g/ml) avec le milieu gélosé L et on détermine la capacité de production de la L-histidine sur un milieu gélosé minimal sur lequel on a préalablement étalé la souche mutante H-13 nécessi- tant de la L-histidine. On obtient ainsi la souche AJ 11378 (FERM-P 5038, NRRL B-12116) contenant le plasmide traité par l'Hind III, la souche AJ 11385 (FERM-P 5045, NRRL B-12118) contenant le plasmide traité par l'EcoRI et la souche AJ 11386 (FERM-P 5046, NRRL B-12119) conte- nant le plasmide traité par le Pst I. (5) Production de L-histidine par les nouvelles souches productrices de L-histidine La partie A du tableau ci-après montre les résultats expérimentaux de la production par fermentation de L-histidine avec les souches AJ 11378, AJ 11385 et AJ 11386 par comparaison avec la souche donneuse d'ADN R-344. La partie B du tableau ci-après montre les résultats de la production par fermentation de L-histidine avec d'autres souches nouvelles productrices de L-histidine obtenues de la façon suivante. On extrait de la souche AJ 11378 le plasmide héber- geant l'information génétique concernant la production de L-histidine. On confère & la souche R-344 la résistance à la triazole-1,2,4-alanine pour obtenir la souche R-344-34. Pour obtenir les souches AJ 11387 (FERM-P 5047, NRRL B-12120) et AJ 11388 (FERM-P 5048, NRRL B-12121), on incorpore le plasmide hybride respectivement à la souche R-344 et à la souche R-344-34. Le milieu de fermentation utilisé contient 5 g/dl de glucose, 2,5 g/dl de sulfate d'ammonium, 0,2 g/dl de phosphate mono- potassique, 0,1 g/dl de sulfate de magnésium heptahydraté, 0,5 g/dl d'extrait de levure, 100 /ug/dl de chlorhydrate de thiamine, 1 p g/dl de sulfate ferreux heptahydraté, 1 mg/dl de sulfate de manganèse tétrahydraté et 2,5 g/dl de carbonate de calcium (stérilisé séparé- ment) et le pH est ajusté à 7,0. On introduit dans des flacons de 500 ml des por- tions de 20 ml du milieu de fermentation, on ensemence avec une anse d'inoculum des micro-organismes à étudier et on cultive & 31"C pendant 72 h. On détermine par méthode microbiologique la concen- tration en L-histidine du bouillon de fermentation surnageant. Bien entendu, diverses modifications peuvent être apportées par l'homme de l'art aux dispositifs ou procédés qui vien- nent d'être décrits uniquement à titre d'exemple non limitatif sans sortir du cadre de l'invention. TABLEAU Micro-organisme étudi L-histidine produite ! (mg/dl) i, R-344 6,0 i AJ 11378 15 A AJ 11385 25 AJ 11386 18 1 AJ 11378 10 1 B AJ 11387 42 !i AJ 11388 255 i, R E V E N D I C ATIONS 1. Procédé pour produire de la L-histidine par fermentation, caractérisé en ce qu'il consiste à cultiver dans un milieu de culture un microorganisme producteur de L-histidine formé par incorporation d'un plasmide hybride à une souche receveuse du genre Escherichia et à récupérer la Lhistidine accumulée dans le milieu de culture, ce plasmide hybride ayant reçu un fragment d'acide désoxy- ribonucldique possédant une information génétique concernant la pro- duction de L-histidine et obtenu à partir d'un mutant du genre Escherichia résistant à un analogue de l'histidine. 2. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que le microorganisme producteur de L-histidine est Escherichia coli NRRL B-12116, Escherichia coli NRRL B-12118, Escherichia coli NRRL B-12119, Escherichia coli NRRL B-12120 ou Escherichia coli NRRL B-12121. 3. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que l'analogue de l'histidine est la thiazolyl-2 alanine, la triazole-l,2,4-alanine ou l'histidine-hydroxama te. 4. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que le receveur appartient à Escherichia coli. 5. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que le mutant appartient à Escherichia coli.