FR 2458286 A1 19810102 FR 8011531 A 19800523 L'invention concerne un diluant pour le plasma, dont le constituant colloidal consiste en un pullulane raffiné ayant une répartition de poids moléculaire spécifiquement établie, comprise entre 30 000 et 90 0000 Le diluant pour la plasma selon l'invention est utilisable dans la prévention et le traitement des hémorragies. Le diluant pour le plasma selon linvention peut être administré de façon répétée par voie intraveineuse à un patient, en toute sécurité, car le pullulanse y contenu. peut,lorsqu'il est perfubé, être métabolisé et se décomposer dans le corps au point d'être excrété totalement par les reins. Récemment, l'utilité de diluants pour le plasma pour le traitement d'une blessure externe et pour les opérations chirurgicales a augmenté, dans la mesure o il y a un risque d'hépatite sérique probable causée par une transfusion sanguine et une diminution progressive dds réserves d e sang pour les transfusions. Les diluants pour le plasma.commercialisés, utilisés actuellement, consistent en des constituants colloïdaux tels que la gélatine modifiée, le dextrane et l'hydroxyéthyl amidon, appelé ci-après "HES". Les conditions auxquelles doivent répondre les substances colloldales utilisables pour un diluant pour le plasma sont les suivantes a) Ces substances doivent avoir des dimensions molécu- laires qui garantissent un effet osmotique colloldal adéquat. b) Leur solution aqueuse doit avoir une pression osmo- tique colloldale et une viscosité du même ordre de grandeur que celles du plasma. c) Elles doivent être aussi peu étrangères au corps que possible et ne pas se montrer toxiques. Elles ne doivent pas provoquer d'altérations des tissus et des organes corporels dans lesquels elles se trouvent accumulées mais doivent pouvoir s'éliminer du corps par métabolisme et/ou décomposition. d) Elles doivent rester dans le sang pendant une période de temps suffisamment longue et à une concentration adéquate - 2 - pour garantir un effet thérapeutique désiré. e) Leur solution aqueuse ne doit pas développer de réactions pyrogènes ou allergiques. Elle ne doit pas provoquer de sensibilité en raison de propriétés antigéniques. f) Elles ne doivent pas avoir tendance à causer une agglutination ou une lyse des érythrocytes ou une dégradation des leucocytes. Elles ne doivent pas interférer sérieusement avec le groupe sanguin. g) Elles doivent être métabolisées et finalement élimi- nées du corps de façon à ne pas provoquer d'interférence retard avec la fonction d'un organe quelconque, mime après des administrations répétées. On a cependant objecté que les diluants pour le plasma, connus jusqu'à présent, et commercialement disponibles, ne remplissent pas les conditions exigées ci-dessus, car non seulement ils ne montrent pas un effet de dilution du plasma tel qu'on l'attend, mais ils sont toxiques en raison de leur accumulation dans le corps pendant une période de temps prolongée, sans métabolisme. Plus précisément, les déficiences présentées par les diluants pour le plasma, connus jusqu'à présent, sont les suivantes: a) Les propriétés physiques et chimiques de la gélatine modifiée ne sont pas suffisamment mises en évidence et, étant donné que les plus grandes proportions de son contenu dans la préparation thérapeutique administrée sont excrétées par les reins en deux à trois heures, l'effet de dilution du plasma,. attendu, ne dure pas assez longtemps. b) Des risques de thrombose ont-été rapportés dans l'utilisation de préparations commerciales de dextrane comme diluant pour le plasma, telles que Dex-70, par exemple, qui contient le dextrane ayant un poids moléculaire moyen voisin de 70 000, car la préparation a tendance à provoquer l'agglu- tination des globules rouges du sang dans les vaisseaux. c) Le Dex-40, une autre préparation de dextrane, qui contient mu dextrane ayant un poids moléculaire moyen voisin de 40 000, et n'a pas beaucoup été utilisée jusqu'à présent, -3- est, en raison de la faible dimension de ses molécules, capable de filtrer rapidement à travers le glonmérule rénal, provoquant ainsi une diurbse osmotique. Ceci se traduit par un risque de néphrite osmotique lorsque cette préparation est utilisée de façon répétée. d) On rapporte que l'HES contient des constituants molé- culaires de diverses dimensions. Parmi eux, les constituants ayant les plus faibles dimensions moléculaires sont facile- ment excrétables par les reins dès la perfusion, alors que les constituants ayant des dimensions moléculaires extrgme- ment grandes peuvent demeurer tels que dans le corps et présentent en conséquence un risque d'altération des reins. Dans ces circonstances, la demanderesse s'est efforcée de trouver un nouveau diluant pour le plasma, qui possède l'effet thérapeutique désiré sans présenter d'effets secon- daires indésirables. Dans le cadre de recherches portant en particulier sur le pullulane, la demanderesse a trouvé de façon surprenante que le pullulane ayant un poids moléculaire moyen compris entre 30 000 et 90 000 se révèle très efficace comme diluant sans danger, pour le plasma. En fait, le pullulane ayant le poids moléculaire parti- culier indiqué, lorsqu'il est perfusé dans le corps sous la forme d'une préparation aqueuse en une concentration de 4 à 10 % (poids/volume), montre un remarquable effet de dilution du plasma sans preeque pas d'accumulation dans le corps. A cet égard, on doit ajouter que le pullulane ayant les dimen- sions moléculaires relativement grandes, définies ci-dessus, qui est quelque peu difficile à excréter par le glomérule rénal, subit un métabolisme enzymatique dans le corps. - Le pullulane est produit de façon générale par culture d'Aureobasidium pullulans dans un milieu nutritif qui contient une substance sucrée provenant del'hydrolyse de l'amidon. Le pullulane ainsi obenu est un i-glucane de vaste dimension moléculaire, composé d'unités de maltotriose associées en position" -1,6 et en disposition tête-à-queue. Le pullulane particulier ayant l'étroite distribution de poids moléculaire définie ci-dessus, utilisé dans l'inven- -4 - tion, peut 9tre obtenu soit en réglant de façon adéquate les conditions de travail au stade de la culture d'Aureobasidium pullulans cidessus, dans le milieu nutritif contenant un sucre, selon un procédé classique tel que décrit dans le brevet japonais 42199/76, par exemple; par hydrolyse partielle d'un pullulane classique qui contient une variété de poids moléculaires dont certains sont plus élevés et d'autres plus faibles que-ceux spécifiés dans l'invention, en utilisant un acide tel que l'acide chlorhydrique, l'acide sulfurique, l'acide oxalique ou similaire; par un procédé de partage dans lequel un pullulane classique est soumis à un fractionnement en utilisant un solvant organique miscible à l'eau, tel que le méthanol, l'éthanol, l'acétone et l'iso- propanol; soit par une séparation chromatographique d'un pullulane classique au moyen d'un adsorbant; soit par ultra- filtration. A cet égard, le procédé de fractionnement d'un pullulane brut en le traitant avec le solvant organique miscible à l'eau, ett particulièrement recommandable en raison de sa simplicité par rapport à d'autres procédés. On conduit avantageusement ce procédé en ajoutant l'un des solvants organiques miscibles à l'eau mentionnés ci-dessus à une solution aqueuse à environ 5 - 20 % d'un pullulane du commerce, par exemple, ayant une répartition de poids molécu- laire plus-large que celle du pullulane raffiné spécifié dans l'invention, afin de produire un mélange aqueux qui contient approximativement de 20 à 50 % (volume/volume) du solvant organique; oen rejetant la portion inférieure de la colonne du mélange aqueux pour ne recueillir que la portion supérieure;en ajoutant de nouveau au mélange aqueux recueilli le même solvant organique que celui utilisé au stade précédent, en une quantité suffisante pour produire le mélange aqueux qui contient environ de 40 à 70 % (volume/volume du solvant orga- nique;etenrecueillant finalement dans le mélange aqueux la portion inférieure qui contient le pullulane désiré, défini dans l'invention. - 5 - En utilisant l'un des procédés mentionnés ci-dessus pour le fractionnement d'un pullulane brut, les fractions de pul- lulane ayant les poids moléculaires correspondant à la gamme des poids moléculaires définis spécifiquement ci-dessus sont sélectivement isolées et recueillies conformément à l'inven- tion. Ceci est essentiel, car un pullulane dont les poids moléculaires sont inférieurs à 30 000, ce qui correspond à la limite inférieure de la gamme définie ci-dessus, lorsqu'il est perfusé>dans le corps par voie intraveineuse, ne demeure dans le système de circulation sanguine que pendant une durée limitée, ce qui se traduit par une courte durée de l'effet de dilution du plasma; alors qu'un pullulane ayant des poids moléculaires supérieurs à 90 000, ce qui correspond à la limite supérieure de lagamme de poids moléculaires définie ci-dessus, lorsqu'il est perfusé dans le corps par voie intra- veineuse, a tendance à provoquer une charge physique indue sur le système cardiovasculaire. Aucun de ces défauts n'est rencontré lorsque les fractions de pullulane ayant les poids moléculaires spécifiés sont utilisées -sélectivement pour la perfusion. Une préparation pharmaceutique selon l'invention, uti- - lisable pour une perfusion intraveineuse, qui contient environ de 4 à 10 % (poids/volume) des fractions de pullulane spéci- fiques ci-dessus, peut être obtenue selon un procédé classique dans la technique, en dissolvant, par exemple, le pullulane dans un milieu aqueuxisotonique afin de produire une solution aqueuse contenant le pullulane à la concentration mentionnée ci-dessus, puis en stérilisant la solution. Une préparation pharmaceutique semblable peut être obte- nue en dissolvant simultanément le pullulasne spécifique dans un volume donné d'eau et d'un agent isotonique, les quantités de ces deux substances étant équivalentes à celles utilisées dans la préparation indiquée dans le paragraphe précédent; ou en dissolvant d'abord le pullulane, puis l'agent isotonique dans le volume d'eau défini, ou inversement, les deux substan- ces étant utilisées en des quantités équivalentes à celles - 6 - du premier cas. Dans les deux cas, les solutions aqueuses résultantes sont finalement stérilisées. Comme agent isotonique approprié pour le but ci-dessus, on peut citer le chlorure de sodium, des sels mixtes de type Ringer auxquels on a ajouté de l'acide acétique, le glucose, le chlorure de sodium mélangé au glucose, le sorbitol, le xylitol et similaires. Lors de la réalisation des préparations pharmaceutiques telles que mentionnées ci-dessus, il est recommandé d'élimi- net au préalable tout agent pyrogène du pullulane spécifique en le traitant par un charbon actif. Les discussions suivantes concernent les essais de toxi- cité effectués sur le pullulane spécifique selon l'invention. On a perfusé plusieurs préparations obtenues selon les procédés ci-dessus, qui contiennent la fraction de pullulane spécifiquement raffinée dans une solution saline physiolo- gique à une concentration de 4 à 10 % (poids/volume), dans les veines auriculaires de lapins en des quantités de 30 ml/kg à 40 ml/kg pendant 20 à 60 minutes. Pendant l'essai, on n'a observé aucune anomalie relative aux pressions sanguines et aux rythmescardiaques des animaux. on a fract 90 OC sangu utili on a fract volun jour Dans un essai témoin analogue surdesanimaux,dans lequel utilisé une préparation pour perfusion contenant une tion de pullulane dont le poids moléculaire moyen dépasse D0, on a constaté une anomalie considérable de la pression uine des animaux examinés. Dans un autre essai sur des animaux, dans lequel on a isé deux groupes de lapins, constitués chacun de 5 animaux, perfusé chaque fois 40 ml/kg de deux préparations des tiens de pullulane à des concentrations de 6 % (poids/ ne) dans une solution saline physiologique, une fois par pendant 7 jours consécutifs,à chacun des animaux des deux groupes, l'une des préparations contenait le pullulane raffiné ayant un poids moléculaire moyen de 33 000 et l'autre conte- nait le pullulane raffiné ayant un poids moléculaire moyen de 40 000. En résultat, aucun des animaux ne montrait une di- - 71 minution d'absorptionc* nourriture et d'eau et on n'a observé aucun signe de toxicité tel qu'une perte de poids corporel. Les effets thérapeutiques désirables des préparations qui contiennent les fractions de pullulane spécifiées selon l'in- vention, sont expliqués en détail à l'aide des expériences pharmacologiques mentionnées ci-après qui se réfèrent aux figures des dessins annexés représentant respectivement: la Fig. 1-1, un diagramme montrant les variations en fonction du temps de la teneur en polysaccharide dans le sérum de lapins auxquels on a perfusé 30 ml/kg des préparations respec- tives de diluants pour le plasma, une fois par jour, pendant 7 jours consécutifs la Fig. 1-2, un diagramme montrant les variations en fonction du temps des valeurs de l'hématocrite dans le sang de lapins auxquels on a perfusé 30 ml/kg des préparations respectives de diluants pour le plasma, telles qu'indiquées sur la Fig. 1-1, une fois par jour, pendant 7 jours consécutifs; la Fig. 2, un diagramme montrant les taux pendant 7 jours consécutifs. la Fig. 3, un diagramme montrant les répartitions de poids moléculaires de trois pullulanes particuliers utilisables dans l'essai sur les animaux afin de vérifier leur dégradation molé- culaire et/ou leur décomposition dans le corps. Les pullulanes utilisés avaient les poids moléculaires moyens respectifs indiqués iciè la Fig. 4, un diagramme montrant les répartitions de poids moléculaires des polysaccharides contenus dans les urines excrétées pendant 24 heures par des lapins auxquels on a perfusé respectivement les trois préparations de pullulane spécifiées les Figs. 5-1 et 5-2, des diagrammes montrant les quantités de polysaccharides comme produits de dégradation moléculaire et de décomposition des Pul-40 et Dex-40 originaux, ayant - 8 - chacun un poids moléculaire moyen de 40 000, lorsque ces substances sont cultivées à l'aide d'un homogénéisat de rein et d'un homognénisat de poumon préparés à partir de rats. Les résultats de l'essai à blanc comme essai témoin sont égale- ment portes sur les diagrammes; les Figs. 6 et 7, des diagrammes montrant les tracés d'élution fractionnée sur des colonnes de Sephadex G-50 de 0,9 cm de diamètre et 10 cm de hauteur, des polysaccharides obtenus dans les cultures de Pul-40i de Dex-40 mentionnées ci-dessus. "d" indique la relation entre le numéro de la fraction et le poids moléculaire estimé. Les résultats des essais à blanc comme témoins sont également portés sur les diagrammes. la Fig. 8, un diagramme illustrant les variations dans le temps (en jouri des valeurs de l'hématocrite dans le sang de lapins auxquels on a perfusé 40 ml/kg des 4 préparations de diluants pour le plasma, une fois par Jeur, pendant 7 jours consécutifs. Les données de l'essai à blanc comme essai témoin sont également portées sur le diagramme, la Fig. 9, un diagramme montrant les variations dans le temps (en jourg des valeurs de glutamyl oxalo transaminase plasmatique (GOT) du sang de lapins auxquels on a perfusé les 4 préparations de diluants pour le plasma indiquées, à raison de 40 ml/kg par jour pendant 7 jours consécutifs. Les résultats de l'essai à blanc comme essai témoin, sont également portés sur le diagramme. Les détails des données rapportées sur les figures 1 à 9 ci-dessus sont établis par les expériences pharmacologiques suivantes: -a) Expérience sur l'effet des diluants pour le plasma, en raison de leur rétention dans le sang corporel On a préparé deux solutions à 5 % (poids/volume) de pullulane dans une solution saline physiologique, l'une conte- nant le pullulane raffiné ayant un poids moléculaire moyen de 000 (Pul-50) et l'autre le pullulane raffiné ayant un poids moléculaire moyen de 85 000 (Pul-85). En même temps, dans un but de comparaison, on a préparé _9- une solution à 6 % (poids/volume) de dextrans et une solution à 10 % (poids/volume) d'HES, toutes les deux dans une solution saline physiologique, la première contenant le dextrane ayant un poids moléculaire moyen de 40 000 (Dex-40) et la seconde contenant l'HES ayant un poids moléculaire moyen de 200 000 (HES-200). On a perfusé séparément les 4 préparations décrites di- dessus à 4 groupes de lapins, constitués chacuncd 3 animaux mâles pesant en moyenne 2,7 kg. On a effectué les perfusions avec 75 ml de chacune des préparations pendant 20 minutes par les veines auriculaires des animaux. Lorsque toutes les perfusions étaient terminées, on a prélevé périodiquement du sang chez les animaux et on a déterminé les teneurs en polysaccharide et les valeurs de l'hématocrite dans le sérum des animaux. On a déterminé les teneurs en polysaccharide selon le procédé de précipitation connu, dans lequel on emploie l'éthanol comme agent de précipitation. On a porté sur la figure 1-1 des dessins annexés les données concernant les variations des teneurs (%) en poly- sacRharide en fonction du temps (en heures), en prenant comme valeur de référence *1m00 %" la valeur obtenue immédiatement après la fin de la perfusion de 20 minutes. En comparant les diagrammes, on peut noter que les courbes des variations relatives aux perfusions des préparations à 5 % de Pul-SO et de Pul-85 sont très voisines de celles relatives aux perfusions des préparations à 6 % de Dex-40 et à 10 % d'HES- 200. D'autre part, sur la figure 1-2 des dessins annexés, on a porté les données relatives aux variations des valeurs de lthématacrite en fonction du temps (en heures), les valeurs étant mesurées à la fin des perfusions de 20 minutes des 4 préparations respectives. Une diminution de la valeur de l'hématocrite qui se pros duit lorsqu',il y a une rétention de polysaccharide dans le sang due par exemple à une perfusion d'un diluant pour le - 10 - plasma, indique, on le sait, une augmentation de la quantité de plasma dans le sang. A partir des données rapportées sur la Fig. 1-2 des dessins annexés, relatives aux valeurs de l'hématocrite mesurées, tel que mentionné cidessus, il est évident que les effets de dilution du plasma dûs aux préparations à 5 % de pullulane, de m me que ceux dûs aux préparations de Dex-40 et d'HES-20D à 10 %, durent pendant 6 heures après la fin des perfusions, avec une augmentation correspondant à une dilution d'environ 7 % du plasma (augmentation de volume) par rapport aux valeurs de plasma correspondant à celles mesurées avant les perfusions. b) Expériences sur les possibilités d'excrétion des diluants pour le plasma, à partir du corps perfusé On a confirmé que l'excrétion par le glomérule rénal de la substance colloïdale perfusée comme diluant pour le plasma, qui a lieu un certain temps après la perfusion, dépend principalement de la grandeur du poids moléculaire de la substance colla!dale. A cet égard, on a effectué l'expérience suivante afin de vérifier les circonstances d'une excrétion,à partir du corps, des diluants pour le plasma perfusés, comprenant deux préparations de pullulane qui contenaient respectivement le Pul-33 et le Pul-40 et deux autres préparations témoins, qui contenaient respectivement le Dex-40 et l'HES- 200. Les pullulanes contenus dans les premières préparations avaient des répartitions de poids moléculaire plus étroites que celle de l'HE5-200 en particulier. On a dissous séparément le Pul-33 ayant un poids molécu- laire moyen de 33 000 et le Pul-40 ayant un poids moléculaire moyen de 40 000 dans une solution saline physiologique afin d'obtenir les préparations à 6 % de Pul-33 et à 6 % de Pul-40. De la même façon que ci-dessus, on a obtenu une prépara- tion à 10 % de Dex-40 et une préparation à 6 % d'HES-200, dans une solution saline physiologique. Le Dex-40 utilisé avait un poids moléculaire moyen de 40 000 et l'HES avait un poids - il - moléculaire moyen de 200 000. On a réparti 20 lapins mâles dans 4 groupes consistant chacun en 5 animaux dont le poids corporel moyen était de 2,6 kg. Dans chaque groupe, on a perfusé les animaux par voie intraveineuse avec, dans chaque, cas, l'une des 4 préparations mentionnées ci-dessus à une dose de 40 ml/kg une fois par jour pendant 7 jours consécutifs. Pendant et après la durée de la perfusion, on a prélevé périodiquement du sang des animaux et on a déterminé les teneurs en polysaccharide dans les sérums sanguins par le procédd de précipitation avec addition d'éthanol. On a calculé les résultats des mesures en terme de taux (%) de diminution ou de consommation par rapport aux quantités initiales de polysaccharides dans les sérums, correspondant à celles des ingrédients essentiels contenus respectivement dans les préparations perfusées. Les valeurs des diminutions calculées sont rapportées graphique- ment sur la figure 2 des dessins annexés. Sur la figure 2, on peut observer 24 heures après la fin des perfusions une diminution d'environ 95 % pour le Pul-33 et une diminution d'environ 85 % pour le Pul-40. Des taux de diminution semblables sont constatés au cours des perfusions, et de plus on observe des diminutions de 100 % au 8ème jour après les perfusions, dans le cas des deux pullulanes. En contradiction avec les considérations ci-dessus, on voit sur la figure 2 que des diminutions de 65 à 67 % des quan- tités perfusées de Dex-40 se produisent au cours des perfusions, et même pendant les 15 jours qui suivent la fin des perfusions on ne constate qiLune diminution de 60 % environ. On constate en outre que dans le cas de l'HES-200, la consommation est plus faible, soit une diminution de 50 à 55 % environ au cours des perfusions et seulement une diminution de % même 36 jours après la fin des perfusions. Pour compléter l'expérience ci-dessus, on a prouvé que la quantité de polysaccharide récupérée dans l'urine excrétée par chaque lapin au cours des perfusions ci-dessus avec la: - 12 - préparation d'HES-200 n'atteignait que 50 % environ de la quantité de polysaccharide qui était respectivement récupérée dans les urines au cours des perfusions ci-dessus dans le cas de lapins auxquels on avait perfusé séparément les préparations de Pul-33 et de Pul-40 et la préparation de Dex-40. Les faits mentionnés ci-dessus mettent donc en évidence la capacité supérieure d'excrétion du pullulane raffiné tel que le Pul-33 et le Pul-40, par rapport à celle des diluants pour le plasma connus tels que le Dex-40 et l'HES-200. c) Dégradation moléculaire et décomposition-du pullulane I) Expérience sur la dégradation moléculaire et la décomposition du pullulane perfusé à des lapins On a perfusé pendant 20 minutes à des lapins pesant chacun 3 kg en moyenne 100 ml de l'une des 3 préparations à 5 % (poids/volume) qui contenaient respectivement les fractions de pullulane raffiné ayant des poids moléculaires moyens de 33 000, 50 000 et 85 000, dans une solution saline physiolo- gique. On a recueilli séparément les urines excrétées pendant 24 heures après les perfusions des animaux. On a séparé les protéines des urines et on a précipité les polysaccharides présents par addition à chaque urine respective de 5 volumes d'acétone et on a recueilli. Les répartitions des poids moléculaires des trois fractions de pullulane contenues dans les préparations de pullulane sont rapportées sur la figure 3 des dessins annexés, alors que les répartitions des poids moléculaires des poly- saccharides recueillis dans les urines sont rapportées sur la figure 4 des dessins annexés. Comme on peut le voir sur la figure 4, les tracés des courbes établies sont très semblables entre eux, indépendam- ment des grandeurs des poids moléculaires moyens des fractions de pullulane de base contenues dans les préparations, et de plus la plupart des polysaccharides possède des poids molé- culaires inférieurs à 60 000. Les observations ci-dessus prouvent que les fractions de pullulane raffinées telles que celles dont il est question - 13 - ci-dessus, sont peu à peu dégradées dans le corps en poly- saccharides ayant des poids moléculaires relativement faibles, capables de traverser facilement le glomérule rénal jusque dans les urines. II) Expérience sur le métabolisme et la décomposition du pullulane raffiné à l'aide de tissus isolés à partir d'organes corporels Le métabolisme et la décomposition du pullulane raffiné, provoqués par les tissus isolés des organes corporels ont été étudiés en utilisant le pullulane raffiné en poudre ayant un poids moléculaire moyen de 40 000 (Pul-40) et le Dex-40 en poudre pour comparaison. On a mélangé séparément les deux substances en poudre avec d'une part un homogénéisai de rein à 50 % (poids/volume) et d'autre part avec un homogénéisat de poumon à 50 % (poids/volumeL Ces homogénéisais étaient pré- parés à partir des organes de rat. On a maintenu les 4 mélan- ges résultants dans des conditions d'incubation à 370C pendant 24 heures. Vers la fin de l'incubation, la concentration en polysaccharide dans les mélanges d'incubation atteignait U,5 % (poids/volume). On a alors séparé les protéines des mélanges incubés et on a divisé les 4 couches surnageantes limpides ainsi obtenues en 5 parties aliquotes chacune. A 4 parties aliquotes des 5 ci-dessus, on a ajouté dans l'ordre 1 ml des mélanges éthanol:eau ayant les proportions suivantes (volume/volume) 45:55, 55:45, 65:35 et 75:25. Ces parties aliquotes étaient préparées à partir d'une des 4 couches surnageantes limpides ci-dessus. La couche surna- geante choisie était celle provenant de l'incubation de Pul-40 à l'aide de l'homogénéisat de rein. A la partie aliquote restante, on a ajouté néanmoins 2 ml d'éthanol absolu au lieu de l'un quelconque des mélanges éthanol:eau ci-dessus. Les précipités ainsi formés respectivement dans les 5 parties aliquotes, les polysaccharides contenus dans les précipités étant différents les uns des autres, étaient recueillis séparément par centrifugation. Lors de cette centri- fugation, la liqueur-mère de la partie aliquote à laquelle - 14 - on avait ajouté 2 ml d'éthanol absolu, était prélevée et évaporée à sec afin de récupérer le résidu qui pouvait contenir un autre polysaccharide. Le résidu obtenu était alors incorporé dans le précipité principal séparépar centrifugation de la partie aliquote spécifique. La quantité de polysaccharide dans le précipité respectif était déterminée par le procédé à l'anthrone - acide sulfu- rique. On a procédé de même avec les 5 autres parties aliquotes de la couche surnageante qui provenait de l'incubation du Pul-40 à l'aide de l'homogénéisat de poumon. Les résultats de cet essai ainsi qe ceux obtenus pour l'incubation de Pul40 à l'aide" de l'homogénéisat de rein sont rapportés graphiquement sur la figure 5-1 des dessins annexes. On a répété le même procédé pour les deux séries des 5 parties aliquotes obtenues en divisant séparément les deux couches surnageantes, dont l'une provenait de l'incubation de Dex-40 à l'aide de l'homogénéisat de rein et l'autre de l'incubation de Dex-40 à l'aide de l'homogénéisat de poumon, en utilisant 4 mélanges éthanol:eau ayant les proportions suivantes (volume.volume): 80:20, 85:15, 90:10 et 95:5 au lieu des mélanges éthanol:eau utilisés en premier pour les incubations de Pul-40o Dans ce cas, des mélanges éthanol:eau contenant des proportions majeures d'éthanol, contrairement aux mélanges éthanol:eau utilisés pour le traitement des incubations de Pul-40, étaient utilisés pour le traitement des incuba- tions de Dex-40 ci-dessus, car des mélanges avec une teneur supérieure en éthanol étaient nécessaires pour précipiter totalement les couches surnageantes provenant des deux mélanges d'incubation du Dex-40. Les quantités de polysaccharides finalement obtenues par des déterminations quantitatives relatives au Dex-40 sont rapportées graphiquement sur la figure 5-2 des dessins annexés. -15 - Sur la figure 5-1, on voit que, bien que la quantité de polysaccharides déterminée au début des incubations de Pul-40 coïncide avec la quantité de polysaccharide obtenue dans l'essai d'incubation à blanc comme témoin, conduit dans une solution saline physiologique avec une concentration de 0,9 % de Pul-40, les quantités de polysaccharides finalement obtenues par les 24 heures d'incubation, suivie des additions des mélanges éthanol:eau ayant des teneurs relativement fai-. bles en éthanol, sont très petites. De nouveau, sur la figure 5-1, on voit que la quantité de polysaccharide, qui a été récupérée dans le précipité obtenu par l'addition de 2 ml d'éthanol absolu à la couche surnageante de la liqueur d'incubation de Pul-40 à l'aide de l'homogénéisat de rein, montre une diminution de 10 % environ, alors que dans le cas de l'incubation de Pul-40 à l'aide de l'homogénéisat de poumon, la diminution atteint environ 40 %, toujours par rapport à la quantité de poly- saccharide obtenue dans l'essai à blanc utilisé comme témoin pour le Pul-40. Les faits mentionnés ci-dessus permettent de supposer que le pullulane spécifique défini dans l'invention est métabolisé à l'aide des enzymes des tissus et finalement décomposé englucose, puis en anhydride carbonique gazeux. Au contraire, le Dex-40, incubé dans les mêmes conditions que celles utilisées pour l'incubation du Pul-40, n'est presque pas métabolisé, ni décomposé. On ne constate pas de différence importante entre les quantités de polysaccharides récupérées avec le traitement des mélanges éthanol:eau spécifiés, dans lesquels les teneurs en éthanol dépassent toujours 80 %, et également avec l'éthanol absolu (voir la figure 5-2). Eu égard aux répartitions de poids moléculaires des polysaccharides respectivement récupérés dans les liqueurs d'incubation de Pul-40 et Dex-40 ci-dessus, lesquelles répar- titions ont été établies d'après les données de l'élution fractionnée des polysaccharides sur une colonne de Sephadex - 16 - G-50 (marque déposée), on considère que la dégradation molé- culaire se produit uniquement dans les cas d'incubations de pul-40 (comparer la figure 6 relative au Pul-40 avec la figure 7 relative au Dex-40). Les considérations ci-dessus justifient les suppositions du paragraphe précédent concernant les aspects du métabolisme et de la décomposition> dans le corps,du pullulane défini dans l'invention. On a observé des phénomènes de métabolisme et de décompo- sition semblables lorsque le pullulane était incubé avec un homogénéisat de foie et le sérum de rats. d) Etude sur les administrations chroniques du pullulane raffiné On a étudie sur des lapins males le caractère sans danger d'administrations chroniques du pullulane raffiné par rapport aux diluants pour le plasmaeconnus jusqu'A présent. Pour exécuter cette étude, on a utilisé 4 préparations comprenant deux préparations de pullulane à 6 %, soit le Pul-33 et le Pul-40, une préparation de Dex-40 a 10 % et une préparation d'HE5-200 A 6 %. Toutes ces préparations étaient les m8mes que celles utilisées dans "l'Expérience sur la capa- cité d'excrétion des diluants pour-le plasma>perfusés dans le corps" décrite dans la section b) du premier paragraphe. Mais ici, on a utilisé en outre comme témoin une solution saline physiologique qui était la même que celle utili- sée dans les préparations mentionnées ci-dessus. * Les perfusions intraveineuses des préparations décrites ci-dessus et de la solution saline utilisée comme témoin étaient faites pendant 7 jours consécutifs à une dose de 40 ml/kg/jour pendant 60 minutes A chacun des lapins divises en 5 groupes, chaque groupe étant constitué de 5 animaux dont le poids moyen atteignait 2,6 kg. Pendantet 24 heures après les perfusions, on a mesuré les valeurs de l'hématocrite des sangs prélevés chez les lapins. Les résultats sont rapportes sur la figure 8 des dessins annexés. Comme il ressort du diagramme de la figure 8, les valeurs - 17 - de l'hématocrite diminuent légèrement et de façon continue au cours des perfusions des préparations de pullulane. Mais des valeurs équivalentes à celles mesurées au début des per- fusions sont de nouveau rapidement atteintes après la fin des perfusions successives des préparations. Avec des effets sur les valeurs de l'hématocrite diffé- rents de ceux des pullulanes raffinés, les préparations de Dex-40 et d'HES-200, une fois perfusées, entraînent une diminution considérable et rapide des valeurs de l'hématocrite. Et, de plus, il faut un délai de 35 jours après la fin des perfusions, pour que les valeurs de l'hématocrite redevien- nent équivalentes aux valeurs originales. Les différentes variations des valeurs de l'hématocrite causées par les perfusions des préparations décrites ci-dessus indiquent donc que les pullulanes spécifiques sont excrétés presque totalement du corps, par métabolisme et décomposition, dans les 24 heures après les perfusions, alors que le Dex-40 et l'HES-200 s'accumulent dans le sang pendant 24 heures après la fin des perfusions. On peut donc en conclure que le pullulane raffiné selon l'invention est utilisable sans aucun danger pour le traite- ment des hémorragies. Les courbzs représentées sur la figure 9 des dessins annexés représentent d'autre part les variations des valeurs de glutamyl oxalo transaminase, ditesvaleurs GOT, des animaux ayant subi les perfusions successives des préparations, tel que déctit ci-dessus.Les valeurs GOT du sérum sont généra- lement considérées comme l'une des mesures de l'indication d'une cyto-toxicité des ellules du foie. Comme on peut le voir sur le diagramme de la figure 9, on ne constate pas de variations notables dans les valeurs GOT mesurées au cours des administrations chroniques des pré- parations de Pul-33 et de Pul-40 et de la préparation d'HES- , par rapport aux valeurs obtenues pour une perfusion comparative avec la solution physiologique saline -utili- sée comme témoin, identique à celle utilisée comme milieu - 16 - aqueux dans les trois premières préparations, bien que les premières valeurs soient un peu inférieures aux valeurs témoin. Au contraire, on constate une nette augmentation des valeurs GOT dans le cas des perfusions successives de la préparation de Dex-40. A cet égard, on doit noter que le rapport albumine:glo- buline, dans le cas des perfusions de la préparation de Dex-40, est considérablement abaissé en raison d'une part de l'augmentation du taux de globuline et d'autre part de la diminution du taux d'albumine, Le symptome observé qui indique un dérangement de la fonction du foie, coTncide avec les significations établies pour l'examen pathologique des organes dans le corps, mentionnées ci-dessous. Les animaux utilisés dans les examens pathologiques ci-dessus étaient sacrifiés quelques jours aprèsàfin de procéder à d'autres examens pathologiques sur leurs organes. Les résultats des examens microscopiques sont rapportés dans le tableau ci-après, o les signes " -, -, +, ++ et +++ n sont utilisés pour indiquer le degré de changement patholo- gique observé, tels qu'une nécrose des cellules hépatiques, une vacuolisation dans les tubules rénaux et une modification fibrotique dans les muscles cardiaques. - 19 - TABLEAU Temps écoulé en jours Préparation à partir de perfusée la perfusion Solution 7 saline 15 (témoin) 22 Foie Rein Coeur Poumon Rate _m i m Pul-33 6 -. 7 i - - - 15.. .. _ 22. 29 - - - - Pul-40 7 i.. 15.. .. . 22.. 29 - + - - - 43. _ Dex-40 7 +++ ++ +++ ++ - + - - - 22 ++ - - - - 29 +++... 43 +. . HES-200 7 - - - - + 22 ++ + - 29 ++ - - 43 +++ ++ - Explication des signes: - sans changement très léger changement + léger changement ++ +++ changement assez net changement important. - 20 - Plus précisément, par rapport aux résultats d'examen sur le témoin, on n'a observé aucun changement pathologique notable dans les organes des animaux auxquels on avait perfusé les préparations de Pul-33 et de Pul-40, à l'exception d'un dépôt blanc, comme pour le témoin, à la périphérie des foies. Au contraire, on a observé plusieurs signes de toxicité dans les organes d'animaux perfusés avec la préparation de Dex-40, tels qu'une augmentation du poids, une atrophie des cellules( hépatiques et une dissémination de la fibrose myocardique, toutes dans le foie ou en rapport avec le foie; une vacuolisation des tubules rénaux; et une tumeur boursou- flée dans le poumon. On a observé également certains signes de toxicité dans les organes d'aminaux perfusés avec la préparation d'HES-200, tels qu'un changement de couleur jusqu' à noir pâle, un dépôt blanc 'foncé à la périphérie, une augmentation et un gonfle- ment trouble des cellules hépatiques, tous dans le foie. On a également constaté un dépôt de polysaccharide dans les tubules rénaux dilatés. Les exemples suivants concernent certains modes de réali- sation de l'invention, qui illustrent l'isolement des fractions de pullulane raffiné et ltobtention des préparations thérapeu- tiques contenant les fractions de pullulane raffiné. a) Isolement des fractions de pullulane raffiné EXEMPLE 1 - On prépare une solution aqueuse à 10 % (poids/volume) d'un pullulane classique qui est un produit de Hayashibara Biochemical Laboratories, Inc. , Okayama, Japon, en dissolvant g du pullulane dans l'eau. On ajuste le pH de la solution résultante à Zenv.par addition d'acide chlorhydrique. On main- tient la solution à une température de BOOC pendant 2 heures pour obtenir une hydrolyse partielle du pullulane, puis on neutralise par addition d'une solution aqueuse d'hydroxyde de sodium, et on refroidit. On mélange alors la solution avec une quantité suffisante de méthanol pour obtenir une solution ayant une concentration L. - 21 - en méthanol de 40 % (volume/volume) et provoquer la séparation de la solution en deux couches. Après élimination de la couche inférieure, on mélange de nouveau la couche supérieure avec du méthanol jusqu'à ce que la concentration finale en méthanol (volume/volume) atteigne 55 % et on recueille la couche infé- rieure nouvellement formée. Pendant ces opérations, on main- tient la température à 300C. On élimine par distillation le méthanol contenu dans la solution aqueuse recueillie. On décolore la solution de pullu- lane, aqueuse, résultante, avec du charbon actif, on désionise avec des échangeurs d'ion sous formes H et OH, et finalement on filtre sur membrane. On concentre par évapora- tion le filtrat contenant la fraction de pullulane purifié ayant un poids moléculaire moyen de 50 000. On sèche le résidu solide et on pulvérise pour obtenir environ 90 g de pullulane blanc, sans pyrogène. EXEMPLE 2 On prépare une solution aqueuse de pullulane à 20 % (poids/volume) en dissolvant 200 g d'un produit commercial de pullulane dans l'eau, et on soumet à une hydrolyse partielle selon le procédé utilisé dans l'exemple précédent. A la solu- tion aqueuse neutralisée ainsi obtenue, on ajoute une quantité suffisante d'éthanol pour obtenir une concentration en éthanol de 50 % (volume/volume) afin de séparer la solution résultante en deux couches. Après élimination de la couche inférieure, on mélange la couche supérieure avec de l'éthanol frais jus- qu'à ce que la concentration en éthanol atteigne 70 % (volume/ volume) et on recueille la couche inférieure nouvellement formée. Pendant ces opérations, on maintient la température à 40C. - On procède alors selon le mode opératoire décrit dans l'exemple 1. On obtient environ 70 g d'un pullulane en poudre, purifié, ayant un poids moléculaire moyen de 33 000 et exempt de pyrogène. EXEMPLE 3 On prépare une solution de pullulane>aqueuse,à 5 % - 22 - (poids/volume) en dissolvant 200 g d'un pullulane commercial dans l'eau, on soumet à une hydrolyse partielle et on neutra- lise la solution aqueuse hydrolysée résultante selon le procédé décrit dans l'exemple 1. A la solution, on ajoute une quantité suffisante d'acé- tone pour obtenir une concentration de 20 % (volume/volume) en acétone, grâce à quoi la solution se sépare en deux couches. Après avoir éliminé la couche inférieure, on mélange la couche supérieure restante avec de l'acétone frais pour obtenir une concentration finiale en acétone de 45 % (volume/volume) et on recueille la couche inférieure nouvellement formée. Pendant ces opérations, on maintient la température à 300C. On procède ensuite tel que décrit dans l'exemple 1. On obtient environ 80 g d'une fraction de pullulane en poudre, purifié, ayant un poids moléculaire moyen de 85 000 et exempt de pyrogène. b) Obtention de préparations thérapeutiques de pullulane EXEMPLE 1 On dissout 60 g du pullulane raffiné ayant un poids molé- culaire moyen de 40 000 dans 1 litre de solution saline physio- logique. On filtre la solution aqueuse résultante et on agite le filtrat avec 0,05 g de charbon actif. On filtre de nouveau le mélange pour éliminer le charbon actif épuisé. Puis on stérilise la solution aqueuse du pullulane. EXEMPLE 2 On dissout 50 g du pullulane purifié ayant un poids molé- culaire moyen de 60 000 dans t litre de solution saline physio- logique, et on filtre la solution aqueuse résultante. On agite le filtrat avec 0,05 g de charbon actif et on filtre de nouveau : pour éliminer le charbon actif épuisé. Puis on stérilise le filtrat. EXEMPLE 3 On introduit un mélange de 50 g du pullulane raffiné ayant un poids moléculaire moyen de 60 000, 50 g de glucose et 9 g de chlorure de sodium dans une certaine quantité d'eau distillée et on complète à un litre par addition de la quantité adéquate - 23 - d'eau distillée. On traite ensuite la solution de pullulane, aqueuse, résultante selon le procédé décrit dans l'exemple 1. - 24 - REVENDICATIONS 1, Diluant pour le plasma, caractérisé en ce que son ingrédient indispensable est un pullulane raffiné ayant un poids moléculaire moyen compris entre 30 000 et 90 000. - 2. Diluant pour le plasma selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'il contient comme ingrédient indispensa- ble de 4 à 10 % de pullulane raffiné ayant un poids molécu- laise moyen compris entre 30 000 et 90 000. 3. Diluant pour le plasma selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'il est produit par le procédé qui con- sisteà: préparer une solution aqueuse de pullulane classique, connu jusqu'â présent, ayant une répartition de poids molécu- laires moyens plus large que la gamme de 30 000 à 90 000 en dissolvant le pullulane dans l'eau; ajouter à la solution aqueuse résultante un solvant organique miscible à l'eau en une quantité suffisante pour obtenir un mélange aqueux qui contient de 20 à 50 % (volume/volume) du solvant organique, afin de séparer le mélange résultant en deux couches; recueil- lir la couche supérieure; ajouter à la couche recueillie une autre portion du solvant organique en une quantité suffisante pour obtenir un mélange aqueux qui contient de 40 à 70 % (volume/volume) du solvant organique afin de séparer le mélan- ge résultant en deux couches; recueillir la couche inférieure; isoler de la couche recueillie le pullulasne raffiné recherché, ayant un poids moléculaire moyen compris entre 30 000 et 000; dissoudre le pullulane raffiné dans une quantité d'eau isotonique suffisante pour produire une solution aqueuse qui contient de 4 à 10 % (poids/volume) du pullulane, et stérili- ser la solution aqueuse.