FR 2387942 A1 19781117 FR 7811581 A 19780419 1 2387942 Cette invention concerne les tétradêcapeptides de formule I Y-Gly-L-Cys-L-Lys-L-Asn-L-Phê-L-Phê-D-Trp-L-Lys-L-Thr-L-Phé-L-Thr-L-Sér-L-Cys-OH, où Y est D-Val ouD-Ala; ainsi que leurs sels d'addition d'acide pharmaceutiquement acceptables et les intermédiaires produits pendant la synthèse des tétradêcapeptides. La somatostatine (également appelée facteur inhibiteur de la libération de la somatotropine) est un tétradécapeptide de formule L-Ala-Gly-L-Cys-L-Lys-L-Asn-L-Phé-L-Phé-L-Trp-L-Lys-L-Thr-L-Phê-L-Thr-L-Sér-L-Cys-OH. Ce tétradécapeptide est isolé des extraits hypothalamiques ovins et on a trouvé.qu'il est actif dans l'inhibition de la sécrétion de l'hormone de croissance (HC) également appelée somatotropine. A cet égard, voir P. Brazeau, W. Vale, R. Burgus, N. Ling, M. Butcher, J. Rivier, et R. Guillemin, Science, 179, 77 (1973). En outre, le composé commodément désigné sous le nom de 8 D-Trp -somatostatine a précédemment été décrit par Brown et al., Endocrinology, 98,, N°2, 336-343 (1976). Les tétradêcapeptides biologiquement actifs de formule I définie précédemment comprennent leurs sels d'addition d'acide non toxiques. Leurs structures diffèrent de celles de la somatostatine par la présence d'un reste D-tryptophane en position 8 à la place d'un reste L-tryptophane et d'un restetD-valine ou D-alanine en position 1 à la place d'un reste L-alanine. Pour des raisons de commodité, les tétradêcapeptides de formule I peuvent être 18 1 désignés sous le nom de D-Val , D-Trp -somatostatine et D-Ala , 8 D-Trp -somatostatine. Ainsi, cette invention concerne un composé choisi parmi ceux de formule H-Y-Gly-L-Cys-L-Lys-L-Asn-L-Phé-L-Phê-D-Trp-L-Lys-L-Thr-L-Phé-L-Thr-L-Sér-L-àys-OH et leurs sels d'addition d'acide non toxiques pharmaceutiquement acceptables, et a titre d'intermédiaires, les composés de formule IX R-Y-Gly-L-Cys(R^-L-Lys(R2)-L-Asn-L-Phé—L-Phé-D-Trp (Rg) -L-Lys (R2) -L-Thr (R3) -L-Phé-L-Thr (r"3) rL-Sér(R^)-L-Cys(R^)-X, où : . Y est D-Val ou D-Ala ; R est un atome d'hydrogène ou un groupement protecteur des groupements ot-amino ; R^ est un atome d'hydrogène ou un groupement protecteur des groupements thio ; R2 est un atome d'hydrogène ou un groupement protecteur des groupements £-amino ; 2 2387942 10 15 20 25 30 35 R3 et R^ sont chacun un atome d'hydrogène ou un groupement protecteur des groupements hydroxy ; R5 est un atome d'hydrogène ou un groupement formyle ; et X est un groupement hydroxy ou où la résine est le polystyrène ; pourvu que, quand X est un groupement hydroxy, chacun des groupements R, R^, R2, R3 et R^ soit un atome d'hydrogène, et quand X est chacun des groupements R, R^, R2, R^ et R^ soit autre qu'un atome d'hydrogène. On prépare les nouveaux tétradêcapeptides de formule I ci-dessus en faisant réagir le tétradécapeptide à chaîne droite correspondant de formule III Y-Gly-L-Cys-L-Lys-L-Asn-L-Phé-L-Phé-D-Trp-L-Lys-L-Thr-L-Phé-L-Thr-L-Sér-L-Cys-OH, dans laquelle Y est D-Val ou D-Ala, avec un agent oxydant. Cette réaction transforme les deux groupements sulfhydryle en un pont disulfure. Les sels d'addition d'acide non toxiques pharmaceutiquement acceptables comprennent les sels d'addition d'acides organiques et minéraux, par exemple ceux préparés à partir des acides comme les acides chlorhydrique, suifurique, sulfonique, tartrique, fumarique, bromhydrique, glycolique, citrique, maléique, phospho-rique, succinique, acétique, nitrique, benzoïque, ascorbique, p-toluènesulfonique, benzènesulfonique, naphtalènesulfonique et propionique. De préférence, les sels d'addition d'acide sont ceux préparés à partir de l'acide acétique. On prépare tous les sels précédents par des procédés classiques. Sont également considérés comme faisant partie du domaine de cette invention les intermédiaires de formule II R-Y-Gly-L-Cys(R^)-L-Lys(R2)-L-Asn-L-Phé-L-Phé-D-Trp(R5)-L-Lys(R2)-L-Thr(R3)-L-Phë-L-Thr(R3)-L-Sêr(R^)-L-Cys(R^)-X dans laquelle les divers symboles sont tels que définis précédemment. Des exemples de ces intermédiaires sont : R-D-Val-Gly-L-Cys(Rx)-L-Lys(R2)-L-Asn-L-Phé-L-Phé-D-Trp(R5)-L-Lys- Résine 3 2387942 20 (R2)-L-Thr(R3)-L-Phé-L-Thr(R3)-L-Sêr(R4)-L-Cys(R1)-X ; et R-D-Ala-Gly-L-Cys (R^ -L-Lys (R2) -L-Asn-L-Phé-L-Phé-D-Trp (R5) -L-Lys-(R2)-L-Thr(R3)-L-Phê-L-Thr(R3)-L-Sér(R4)-L-Cys(RL)-X. Un intermédiaire préféré comprend l'intermédiaire suivant de 5 formule III Y-Gly-L-Cys-L-Lys-L-Asn-L-Phé-L-Phé-D-Trp-L-Lys-L-Thr-L-Phé-L- Thr-L-Ser-L-Cys-OH dans laquelle Y est tel que défini précédemment. D'autres intermédiaires préférés comprennent les composés suivants : 10 H-D-Val-Gly-L-Cys-L-Lys-L-Asn-L-Phé-L-Phé-D-Trp-L-Lys-L-Thr- L-Phé-L-Thr-L-Sêr-L-Cys-OH ; H-D-Ala-Gly-L-Cys-L-Lys—L-Asn-L-Phé-L-Phé-D-Trp—L-Lys-L-Thr-L-Phé-L-Thr-L-Sér-L-Cys-OH ; N-(BOC)-D-Val-Gly-L-(PBM)Cys-L-(CBzOC)-Lys-L-Asn-L-Phé-L-15 Phé-D-Trp-L-(CBzOC)-Lys-L-(Bzl)Thr-L-Phé-L-(Bzl)Thr-L-(Bzl)Sér- yRésine /9==m^/ L-(PMB)Cys-0-CH2 pi ; et N-(BOC)-D-Ala-Gly-L-(PMB)Cys-L-(CBzOC)-Lys-L—Asn-L-Phé-L— Phé-D—Trp-L-(CBzOC)Lys-L-(Bzl)Thr-L-Phé-L-(Bzl)Thr-L-(Bzl)Sér-L- ~ ,Résine /*— (PMB)Cys-0-CH2 y 25 Les formules précédentes définissant les intermédiaires comprennent des groupements protecteurs pour les fonctions aminé, hydroxy et thio (sulfhydryle) . I.es propriétés d'un groupement prétecteur tel que défini ici sont doubles. D'abord, le groupement protecteur empêche un groupement réactif présent sur une 30 molécule particulière de subir une réaction pendant que la molécule est soumise à des conditions qui pourraient entraîner la réaction du groupement par ailleurs actif. Ensuite, le groupement protecteur est tel qu'il peut être facilement éliminé avec restauration du groupement actif initial et dans des conditions qui ne nuisent pas 35 de façon indésirable aux autres portions de la molécule. Les groupements qui sont utiles dans de tels buts, c'est-à-dire pour protéger les groupements amino, hydroxy et thio, sont bien connus de 1'homme de l'art. En fait, des livres entiers ont 'été consacrés exclusivement à la description et la discussion de procédés 40 d'utilisation de tels groupements. Un tel livre est le traité 4 2387942 intitulé Protective Groups in Organic Chemistry, J.F.W. McOmie, Editor, Plénum Press, New York, 1973. Dans les formules précédentes définissant les intermédiaires, R représente soit un atome d'hydrogène sur un groupement o(-amino 5 soit un groupement protecteur d'un groupement ° -d ichl orobenzyloxycarbony] e , 2,4 — dichlorobenzyloxycarbonyle, o-bromobenzyloxycarbonyle, p-môthoxybenzyloxycarbonyle, D-nitrobenzyloxycarbonyle, t-15 butyloxycarbonyle (BOC), t-amyloxycarbonyïe, 2-(p-biphénylyl)- isopropyloxycarbonyle (BpOC), adamantyloxycarbonyle, isopropyloxy-carbonyle, cyclopentyloxycarbonyle, cyclohexyloxycarbonyle, cycloheptyloxycarbonyle, triphénylméthyle (trityle) et £-toluènesulfonyle. De préférence, le groupement protecteur des 20 groupements o R^ représente- soit l'atome d'hydrogène du groupementsulfhydryle de la cystêine soit un groupement protecteur du substituant sulfhydryle. Un grand nombre de tels groupements protecteurs sont -25 décrits dans McOmie, supra, Chapitre 7, de R.G. Hickey, V. R. Rao, et W.G. Rhodes. De tels groupements protecteurs aj^propriés types sont.les groupements £-méthoxybenzyle, benzyle, p-tolyle, benzhydryle, acétamidométhyle, trityle, n-nitrobenzyle, t butyle, isobutyloxyméthyle ainsi qu'un grand nombre de dérivés trityle. 30 Pour des groupements supplémentaires, se reporter par exemple à Houben-Weyl, Méthodes der Organischen Chemie, "Synthese von Peptiden", Vols. 15/1 et 15/2, (1974), Stuttgart, Allemagne. De préférence, le groupement protecteur du groupement sulfhydryle défini par R^ est un groupement p-méthoxybenzyle. 35 R2 représente un atome d'hydrogène sur la fonction £.-amino du reste lysine ou un groupement protecteur approprié de ce groupement P-amino. Des exemples de ces groupements sont en majeure partie ceux mentionnés ci-avant comme convenant pour l'utilisation comme groupements protecteurs des groupements «*-amino. 40 Font partie do tel s groupements types les groupements 5 2387942 benzyloxycarbonyle, t-butyloxycarbonyle, t-amyloxycarbonyle, cyclopentyloxycarbonyle, adamantyloxycarbonyle, p-méthoxybenzyloxy-carbonyle, g-chlorobenzyloxycarbonyle, p-bromobenzyloxycarbon yle, o-chlorobcnzyloxycarbonyle, 2,6-dichlorobenzyloxycurbonyle, 2,4-dichlorobenzyloxycarbonyle, o-bromobenzyloxycarbonyle, p-nitrobenzyloxycarbonyle, isopropyloxycarbonyle, cyclohexyloxy -carbonylc, cycloheptyloxycarbonyle et p-toluènesulfonyle. Comme on le verra ci-après, le procédé de préparation des tétradêcapeptides de formule I comprend la coupure périodique d'un groupement protecteur du groupement 6 2387942 fonction protectrice du groupement of-amino. Dnns ce contexte, 2 R est de préférence un groupement o-chlorobenzyloxycarbonyle ou cyclopentyloxycarbonyle, et en conjonction, le groupement protecteur du groupemente Los groupes et R^ représentent I'atome d'hydrogène du groupement hydroxy ou un groupement protecteur du groupement hydroxy alcoolique do la thréonine et de la sérino respectivement. 10 Un grand nombre do tels groupements protecteurs sont décrits dans McOmie, supra, Chapitre 3 do C-.Ii. Rooso. Dos groupements protecteurs types sont par exemple les 5roup«fl»enfcS sJfcyle eu Cj-C^, comme les groupements méthyle, éthyle et fc-butyle ; be-rjzy}« ; b©nzyle substitué comme les groupements p-inéthoxybonzy l.o, p-nitrobenzyle, 15 p-chlorobenzyle et o-chlorobenzyle ; alcanoylo on C^-C^, comme les groupements formyle, acetyle et propionyle ; triphénylméthyle (trityle). De préférence, quand R et R^ sont dos groupements protecteurs, le groupement protecteur de choix dans les deux cas est le groupement benzyle. 20 Le groupement Rr représente soit un atome d'hydrogène soit un groupement formyle et définit le groupement NR,. du reste tryptophane. Le groupement formyle sort do groupement protecteur. L'utilisation d'un tel groupement protecteur est facultative et donc R^ peut être de façon appropriée un atome d'hydrogène 25 (N non protégé) ou formyle (M protégé). Le groupement X a trait à la terminaison carboxyle de la chaîne tétrapop t i d i qu>1 ; il peut. être un qroupomont hydroxy, auquel cas un groupement rarboxy libre est défini. !-)n outre, X représente le support de résine solide auquel la partie terminale 30 carboxyle du poptide est liée.pondant sa synthèse. Cette résine solide est représentée par la formule Dans tout ce qui précède , quand >: représente un groupement hydroxy, chacun des groupements R, R , R0, R^, R^ et Rj- est un atome d'hydrogène. Quand X représente le support do résine solide, chacun des groupements R, R , ï., , et est un groupement 4 0 protecteur. Pes i n e ——■ ■ c, 2 35 7 2387942 Les abréviations suivantes dont la plupart sont bien connues et couramment utilisées dans la technique, sont utilisées ici : Ala - Alanine Asn - Asparagine 5 Cys Cystéine Gly - Glycine Lys - Lysine Phé Phénylalanine Sér Serine 10 Thr Thréonine Trp - Tryptophane Val - Valine DCC - N,N'-Dicyclohexylcarbodiimide DMF - N ,N'-Diméthylformamide 15 BCfc - t-Butyloxycarbonyle PMB - £-Méthoxybenzyle CBzOC— o-Chlorobenzyloxycarbonyle CPOC - Cyclopentyloxycarbonyle Bzl - Benzyle 20 For Formyle BpOC - 2-(£-biphénylyl)-isopropyloxycarbonyle. Bien que le choix des groupements protecteurs particuliers à utiliser pour préparer lés composes de formule I reste un domaine qui fasse partie des possibilités d'un chimiste connaissant la 25 synthèse des peptides, on verra que la séquence de réaction qui doit être effectuée exige le choix de groupements protecteurs appropriés. En d'autres termes, le groupement protecteur choisi doit être un groupement qui est stable vis-à-vis des réactifs et dans les conditions utilisées dans les étapes successives de la 30 séquence réactionnelle. Par exemple, conme déjà indiqué à un certain degré ci-avant, le groupement protecteur particulier que l'on utilise doit être un groupement qui reste intact dans les conditions que l'on utilise pour couper le groupement protecteur du groupement «(-amino du reste amino-acide terminal du fragment peptidique 35 en préparation pour la copulation du fragment amino-acide suivant à la chaîne peptidique. Il est également important de choisir, comme groupement protecteur, un groupement qui restera intact pendant- la construction de la chaîne peptidique et qui sera facilement éliminé une fois la synthèse du produit têtradécapeptidique 40 désiré achevée. Tous ces sujet? font partie des connaissances 8 2387942 de l'homme du métier. Comme il est évident d'après la discussion précédente, les tétradêcapeptides de formule I peuvent être préparés par synthèse en phase solide. Cette synthèse comprend la construction séquentiel-5 le de la chaîne peptidique en commençant à l'extrémité 15 C terminal du peptide. Spécifiquement, on fixe d'abord la cystéine par sa fonction carboxy n la résine, par réaction d'une cystéine à groupement amino protégé et S protégé, avec une résine chloromêthylêe ou une résine hydroxyméthylée. La préparation d'une résine hydroxy- -10 méthylêe est décrite par Bodanszky et al. Chem. Ind. (Londres), 38 1597-98 (1966). La résine chloromêthylêe est disponible commercialement chez Lab Systems Inc., San Matoo, Californie, Etats-Unis d'Amérique. Lorsqu'on effectue la liaison de la cystéine à C terminal sur 15 la résine, on transforme d'abord la cystéine protégée en son sel de césium. On fait ensuite réagir ce sel avec la résine suivant le procédé décrit par B.F. Gisin, Ilelv. Chim. Acta, 56, 1476 (1073). Ou bien, on peut lier la cystéine à la résine par activation de la fonction carboxyle de' la molécule de cystéine en utilisant des 20 techniques connues. Par exemple, on peut faire réagir la cystéine avec la résine en présence d'un composé d'activation du groupement carboxy, comme le N,N'-dicyclohexylcarbodiimide (DCC). Une fois que la cystéine à groupement carboxy libre a été liée de façon appropriée au support de résine, le reste de la séquence 25 de construction du peptide comprend l'addition par étapes.de chaque amino-acide à la portion à N terminal de la chaîne peptidique. Nécessairement donc, la séquence particulière que l'on considère comprend une coupure du groupement protecteur du groupement^-amino de 1'amino-acide qui représente la portion à N terminal du fragment 30 peptidique, puis la copulation du reste amino- acide suivant 3 1'amino-acide à N terminal maintenant libre et réactif. La coupure du groupement protecteur du groupement K-nmino peut être effectuée en présence d'un acide comme l'acide bromhydrique, l'acide chlor-hydrique, l'acide trifluoroacétique, l'acide p-toluènesulfonique, 35 l'acide benzènesulfonique, l'acide naphtalènesulfonique et l'acide acétique, avec formation du sel d'addition d'acide correspondant. Une autre méthode dont on dispose pour effectuer la coupure du groupement protecteur du groupement amino comprend l'utilisation de trifluorure de bore. Par exemple, le complexe trifluorure de bore-40 éther dicthylique dans l'acide acétique glacial transformera 9 2387942 le fragment peptidique à groupement amino protégé en un complexe avec BF^ que l'on transforme ensuite en fragment peptitique débloqué par traitement par une base comme le bicarbonate de sodium aqueux. On peut utiliser l'une quelconque de ces méthodes 5 pour autant que l'on tienne du fait que la méthode de choix doit être celle qui permet la coupure du groupement protecteur du groupement e la coupure sera effectuée à une température allant d'environ 0°C à environ la température ambiante. Une fois que la coupure a été effectuée sur le N terminal, le produit qui résulte sera normalement sous forme du sel d'addition 15 de l'acide que l'on a utilisé pour effectuer la coupure du groupement protecteur. On peut alors transformer le produit en composé à groupement amino terminal libre par traitement par une base modérée, par exemple une aminé tertiaire comme la pyridine ou la triëthylamine. 20 La chaîne peptidique est alors prête pour la réaction avec 1'amino-acide suivant. Ceci peut être effectué en utilisant l'une quelconque de plusieurs techniques connues. Pour effectuer la copulation de 1'amino-acide suivant à la chaîne peptidique à N terminal, on utilise un amino-acide qui a un groupement carboxy 25 libre et qui est protég.é de façon appropriée à sa fonction ° et le chlorure de pivaloyle. . . Une autre méthode d'activation de la fonction carboxy de l1amino-acide pour effectuer la copulation comprend la transformation de 1'amino-acide en son dérivé esfer actif. Des exemples de tels esters 10 2387942 actifs sont par exemple les esters 2,4,5-trichlorophénylique pentachlorophénylique, p-nitrophénylique, les esters formés à partir du 1-hydroxybenzotriazole, ou à partir du N-hydroxysuccini-mide. Une autre méthode pour effectuer la copulation de l'amino-5 acide à C terminal sur le fragment peptidique, consiste à effectuer la réaction de copulation en présence d'au moins une quantité équimolair.e de N , N ' — d i cyclohexvl carbod i irni do (HCC). Cette dernière méthode est préférée pour préparer le tétradécapeptide de formule /• os i r. e .»—•-/ 10 II où X est un groupement y* • - ~ '•=» Une fois que la séquence désirée d'nmino-acide.s a été préparée, on peut enlever le peptide résultant du support de résine. Ceci est: effectué en traitant le tétradécapeptide sur support de résine protégé par 1'acide fjuorhydrique. Le traitement par l'acide 15 fluorhydrique coupe le peptide de la résine ; en outre, cependant, il coupe tous les groupements protecteurs restants présents sur les groupements réactifs de la chaîne peptidique, ainsi que le groupement protecteur du groupement-amino de 1'amino-acide à N terminal. Quand on utilise l'acide fluorhydrique pour effectuer la coupure 20 du peptide de la résine ainsi que pour éliminer li-s groupements protecteurs, on préfère que la réaction soit effectuée en présence d',anisole. On a trouvé que la présence d'an isole inhibe 1 ' alkylation potentielle de certains restes an.iino- acides présents dans la chaîne peptidique. En outre on préfère que la coupure soit effectuée en 25 présence d'éthylmercaptan. L1éthylmercaptan sert à protéger le cycle indole du reste trvptophane, et facilite en outre la transformation ries cystéines bloquées en leurs formes thiols. Egalement, quand Rj- est un groupement formyle, la présence d'éthyl-mercaptan facilite la coupure du groupement formyle par l'acide 30 f lurohydri'que. Une fois que la réaction de coupure a été effectuée, le produit que l'on obtient est un peptide à chaîne droite contenant 14 restes amino-^cides. Pour obtenir le produit final de formule I, il est nécessaire de traiter le tétradécapeptide à chaîne droite 35 dans des conditions qui effectueront son oxydation en transformant les deux groupements sulfhydryle présents dans la molécule, un à chaque groupement cystéinyle, en un pont disulfure. Ceci peut être effectué en traitant une solution diluée du tétradécapeptide linéaire par l'un quelconque de divers agents oxydants comprenant, 40 par exemple, l'iode et le ferricyanure de potassium. L'air peut 11 2387942 également être utilisé comme agent oxydant, le pli du mélange étant généralement d'environ 2,5 à environ 9,0, et de préférence d'environ 7,0 à environ 7,6. Quand on utilise de l'air comme agent oxydant, la concentration de la solution de peptide n'est généralement pas supérieure à environ 0,4 mg de peptide par ml de solution, et est souvent d'environ 50 microgrammes/millilitre. 12 2387942 Les composés de formule I peuvent être administrés aux mammifères à sang chaud à l'homme, et sont particulièrement utiles pour relaxer les muscles lisses. En particulier, l'appareil gastrointestinal peut être relaxé par administration parentérale 5 de petites quantités de ces composés, et de préférence de D-Val"'', 8 D-Trp -somatostatine. Cette action, résultant en la réduction de la mobilité de l'intestin, est particulièrement désirable pour la radiographie gastrointestinale hypotonique. Ces composés sont en outre utiles dans le traitement du colon spastique, du spasme du 10 pylore, et d'autres états spastiques de l'appareil gastro- intestinal, ainsi que pour les coliques urétérales et hépatiques. Normalement, pour effectuer la relaxation des muscles lisses, on administre ces composés à une dose d'environ 0,1 pg à environ 3 pg/kg de poids corporel et de préférence d'environ 0,3 y g à 15 environ 1,5 pg/kg de poids corporel. L'administration se fait par voie parentérale et elle peut se faire par voie intramusculaire, souscutanëe ou intraveineuse ; de préférence, les composés sont administrés par voie intraveineuse ou intramusculaire. Pour l'administration parentérale, les formes posologiques 20 unitaires fluides sont généralement préparées en utilisant le composé en association avec un support pharmaceutique, comme par exemple la solution saline isotonique, la glycine isotonique, le lactose, le mannitol, l'acide acétique dilué, l'eau bactério-statique, par exemple de l'eau contenant 1 % d'alcool benzylique, 25 et les solutions tamponnées de phosphate, ainsi que les combinaisons appropriées de supports classiques quelconques. Le support, par rapport au composé actif, est généralement présent dans un rapport pondéral d'environ 25:1 à environ 1000:1. Selon le support et la concentration utilisés, le composé 30 peut être en suspension ou dissous dans un véhicule stérile approprié, l'eau étant préférée. Dans la préparation des solutions, on peut dissoudre le composé et le support dans le véhicule choisi, filtrer la solution et l'ajouter dans une ampoule ou un flacon approprié, et fermer hermétiquement l'ampoule ou le flacon. Avanta-35 geusement, on peut dissoudre dans le véhicule des adjuvants comme un anesthésiquelocal, un agent de conservation ou un agent tampon. Pour améliorer la stabilité, on peut dissoudre dans l'eau le composé en association avec le support, et placer la solution aqueuse dans un flacon puis lyophiliser le tout. Le solide 40 lyophilisé sec est ensuite enfermé hermétiquement dans le flacon 13 2387942 et un flacon annexe de véhicule est fourni pour reconstituer la composition avant son utilisation. On peut préparer des suspensions parentérales pratiquement de la même manière, sauf que 1'on met le composé en suspension dans le support au lieu de le dissoudre. 5 Les composés de formule I sont également actifs, bien que pas nécessairement à un degré équivalent dans l'inhibition de la libération de l'hormone de croissance. Cet effet inhibiteur est bénéfique dans les cas où le patient nécessite un traitement thérapeutique pour une sécrétion excessive de somatotropine, cette 10 sécrétion étant associée à des troubles comme le diabète juvénile et l'acromégalie. Ces composés présentent également d'autres effets physiologiques, comprenant l'inhibition de la sécrétion d'acide gastrique, utile dans le traitement des ulcères ; l'inhibition de la sécrétion exocrine du pancréas, potentiellement utile dans 15 le traitement de la pancréatite ; et l'inhibition de la sécrétion de l'insuline et du glucagon. Les composés peuvent être administrés par l'une quelconque de plusieurs voies, comprenant les voies orale , sublinguale , souscutanée , intramusculaire et intraveineuse . De préférence, l'intervalle de dose pour une administra-20 tion sublinguale ou orale est d'environ 1 mg à 100 rag/kg de poids corporel. En général, l'intervalle de dose pour l'administration intraveineuse, souscutanée ou intramusculaire est d'environ 1 pg à environ 1 mg/kg de poids corporel, et est de préférence d'environ 50 pg à environ 100 pg/kg de poids corporel. Il est 25 évident que l'intervalle de dose peut varier largement selon l'état particulier à traiter ainsi que selon la sévérité de cet état. Les composés de formule peuvent être administrés par voie orale ou sublinguale en association avec un support pharmaceutique, 30 par exemple sous forme de comprimés ou de capsules. On peut utiliser des diluants ou des supports inertes, par exemple le carbonate de magnésium ou le lactose, ainsi que des agents de. délitement classiques par exemple l'amidon de maïs et l'acide alginique, et des agents lubrifiants, par exemple le stéarate de 35 magnésium. Typiquement, la quantité de-support ou diluant sera comprise entre environ 5 et environ 95 % de la composition finale et de préférence entre environ 50 et environ 85 % de la composition finale. Des agents aromatisants appropriés peuvent être utilisés dans la préparation finale pour la rendre plus agréable pour l'administration. 40 14 2387942 Quand les composés de formule I doivent être administrés par voie parentérale, on peut utiliser des supports appropriés, comme ceux décrits précédemment par exemple pour l'utilisation de ces composés pour la relaxation des muscles lisses. 5 Les exemples suivants illustrent la préparation des composés de formule I et de leurs intermédiaires. Exemple 1 N-t-BUTYLOXYCARBONYL-L-CYSTEINYL(S-£-METHOXYBENZYL)-RESINE DE POLYSTYRENE METHYLE a 100 0 ml de N,N-diméthylformamide (DMF) contenant le sel de-césium de la N-t-butyloxycarbonyl-(S-p-méthoxybenzyl)cystéine " (préparé à partir de 17,5 g de l'acide libre), on ajoute 100 g de résine de polystyrène chlorométhylé (Lab Systems, Inc., 0,75 mmole de Cl/g). On agite le mélange à la température ambiante pendant 5 jours. Puis on filtre la résine et on la lave alternativement trois fois avec un mélange de 85 % de DMF et 15 % d'eau et avec du DMF, puis deux fois avec du DMF. A la résine en suspension dans 10 ml de DMF, on ajoute une solution de 16 g (83,4 mmoles) d'acétate de césium. On agite le mélange pendant 9 jours à la temperature ambiante. Puis on filtre la résine et on la lave alternativement trois fois avec un mélange de 85 % de DMF et de 15 % d'eau et avec du DMF. On lave la résine avec du chloroforme puis on la met en suspension quatre fois dans du chloroforme dans une ampoule à décanter, en soutirant le liquide à chaque fois pour 25 enlever les fines. On filtre la résine, on la lave avec de l'éthanol à 95 % puis alternativement trois fois avec du benzène et avec de l'éthanol à 95 °. Puis on sèche la résine sous vide à 30°C et l'on obtient 115,3 g du composé cité en titre. L'analyse des amino-acides indique 0,254 mmole de Cys/g de résine. On 30 détermine la cystéine sous forme d'acide cystéique par hydrolyse acide effectuée en utilisant un mélange 1:1 de dioxanne et d'acide chlorhydrique concentré, auquel on a ajouté une petite quantité de diméthylsulfoxyde. Exemple 2 35 N-t-BUTYLOXYCARBONYL-D-VALYL-GLYCYL-L—(S-p-METHOXYBENZYL)- CYSTEINYL-L-(NÉ-o-CHLOROBENZYLOXYCARBONYL)-LYSYL-L-ASPARAGINYL-L-PHENYLALANYL-L-PHENYLALANYL-D-TRYPTOPHYL-L-(NÊ-o-CHLOROBENZYLOXY-CARBONYL)LYSYL-L-(0-BENZYL)THREONYL-L-PHENYLALANYL-L-(O-BENZYL)-THREONYL-L-(O-BENZYL)SERYL-L-(S-p-METHOXYBENZYL)CYSTEINYL-RESINE 40 DE POLYSTYRENE METHYLE 15 2387942 On place 5,0 g du produit de l'Exemple 1 dans le récipient de réaction d'un appareil de synthèse de peptides automatique Beckman 990 et l'on ajoute 12 des 13 aminoacides restants en utilisant l'appareil de synthèse automatique. On sépare en deux portions égales l'ensemble tridécapeptide-résine protégé résultant et l'on introduit le reste final sur l'une des portions. Les aminoacides que l'on utilise ainsi que leur ordre d'utilisation sont les suivants : Cl) N-t-butyloxycarbonyl-(O-benzyl)-L-sérine ; (2) N-t-butyloxycarbonyl-(O-benzyl)-L-thréonine r (3) N-t-butyl-oxycarbonyl-L-phénylalanine ; (4) N -t-butyloxycarbonyl-(O-benzy1)- Q/ Ç L-thréonine ; (5) N -t-butyloxycarbony1-NC-o-chlorobenzyloxy-carbonyl-L-lysine ; (6) N^-t-butyloxycarbonyl-D-tryptophane ; (7) N-t-butyloxycarbonyl-L-phénylalanine ; (8) N-t-butyloxycarbonyl-L-phénylalanine ; (9) ester p-nitrophénylique de la N-t-butyloxy-carbonyl-L-asparagine ; (10) N°^-t-butyloxycarbonyl-N^-o-chlorobenzy loxycarbony 1-L-lysine ; (11) N-t-butyloxycarbonyl-(S-£-méthoxybenzyl)-L-cystéine ; (12) N-t-butyloxycarbonyl-glycine ; et (13) N-t-butyloxycarbonyl-D-valine. La séquence de déprotection, neutralisation, copulation et recopulation, pour l'introduction de chaque aminoacide dans le peptide est la suivante : (1) trois lavages (10 ml/g de résine) de trois minutes chaque avec du chloroforme ; (2) élimination du groupement BOC par traitement deux fois pendant 20 minutes chaque par 10 ml/g de résine d'un mélange de 29 % d'acide trifluoroacétique, de 48 % de chloroforme, de 6 % de triéthylsilane et de 17 % de chlorure de méthylène ; (3) deux lavages (10 ml/g de résine) de 3 mn chaque avec du chloroforme ; (4) un lavage (10 ml/g de résine) de 3 mn avec du chlorure de méthylène ; (5) trois lavages(10 ml/g de résine) de 3 mn chaque avec un mélange de 90 % d'alcool t—butylique et de 10 % d'alcool t-amylique ; (6) trois lavages (10 ml/g de résine) de 3 mn chaque avec du chlorure de méthylène ; (7) neutralisation par trois traitements de trois minutes chaque par 10 ml/g_ de résine de 3 % de triéthylamine dans du chlorure de méthylène ; (8).trois lavages (10 ml/g de résine) de 3 mn chaque avec du chlorure de méthylène ; (9) trois lavages (10 ml/g de résine) de 3' mn chaque avec un mélange de 90 % d'alcool t-butylique et de 10 % d'alcool t-amyli-que ; (10) trois lavages (10 ml/g de résine) de 3 mn chaque, avec du chlorure de méthylène ; (11) addition de 1,0 mmole/g de résine de l'aminoacide protégé et de. 1,0 mmole/g de résine de N,N'-dicyclohexylcarbodiimide (DCC) dans 10 ml/g de résine de chlorure 16 2387942 de méthylène, puis mélange pendant 120 mn ; (12) trois lavages (10 ml/g de résine) de 3 mn chaque avec du chlorure de méthylène ; (13) trois lavages (10 ml/g de résine) de 3 mn chaque avec un mélange de 90 % d'alcool t-b'utylique et 10 % d'alcool t-amylique ; 5 (14) trois lavages (10 ml/g de résine) de 3 mn chaque avec du chlorure de méthylène ; (15) neutralisation par trois traitements^ de 3 mn chaque par 10 ml/g de résine de 3 % de triéthylamine dans du chlorure de méthylène ; (16) trois lavages (10 ml/g de résine) de 3 mn chaque avec du chlorure de méthylènej(17) trois lavages 10 (10 ml/g de résine) de 3 mn chaque avec un mélange de 90 % d'alcool t-butylique et de 10 % d'alcool t-amylique ; (18)' trois lavages (10 ml/g de résine) de 3 mn chaque avec du chlorure de méthylène ; (19) trois lavages (10 ml/g de résine) de 3 mn chaque avec du DMF ; (20) addition de 1,0 mmole/g de résine de l'amino-15 acide protégé et de~1,0 mmole/g de résine de N,N'-dicyclohexylcarbodiimide (DCC) dans 10 ml/g de résine d'un mélange 1:1 de DMF et de chlorure de méthylène, puis mélange pendant 120 mn ; (21) trois lavages (10 ml/g de résine) de 3 mn chaque avec du-DMF ; (22) trois lavages (10 ml/g de résine) de 3 mn chaque avec du 20 chlorure de méthylène ; (23) trois lavages (10 ml/g de résine) de 3 mn chaque avec un mélange de 9 0 % d'alcool t.-butylique et de 10 % d'alcool t-amylique (24) trois lavages (10 ml/g de résine) de 3 mn chaque avec du chlorure de méthylène ; (25) neutralisation par trois traitements de 3 mn chaque par 10 ml/g de résine de 25 3 % de triéthylamine dans du chlorure de méthylène ; (26) trois lavages (10 ml/g de résine) de 3 mn chaque avec du chlorure de méthylène ; (27) trois lavages (10 ml/g de résine) de 3 mn chaque avec un mélange de 90 % d'alcool t-butylique et de 10 % d'alcool t-amylique ; et (28) trois lavages (10 ml/g de résine) de 3 mn chaque avec du chlorure de méthylène. On utilise la séquence de traitement précédent pour l'addition de chacun des aminoacides à l'exception des restes glycine et asparagine. On effectue l'addition de la glycine en utilisant seulement les étapes 1 à 18. On introduit le*reste asparagine par l'intermédiaire de son ester actif g-nitrophénylique. Pour effectuer ceci, on modifie l'étape (11) précédente en la remplaçant par la séquence de trois étapes suivantes : (a) trois lavages (10 ml/g de résine) de 3 mn chaque avec du DMF ; (b) addition de 1,0 mmole/g de résine de l'ester £-nitrophénylique de la N-t-butyl-oxycarbonyl-L-asparagine dans 10 ml/g de résine d'un mélange 1:3 30 35 40 17 2387942 de DMF et de chlorure de méthylène, puis mélange pendant 720 mn ; et (c) trois lavages (10 ml/g de résine) de 3 mn chaque avec du DMF. On modifie également l'étape (20) précédente pour utiliser l'ester £-nitrophénylique de la N-t-butyloxycarbonyl-L-asparagine 5 dans un mélange 3:1 de DMF et de chlorure de méthylène puis en mélangeant pendant 720 mn. - On sèche sous vide le complexe peptide-résine terminé. On hydrolyse le produit en le chauffante à reflux pendant 72 heures dans un mélange 1:1 d'acide chlorhydrique concentré et de dioxanne. 10 L'analyse des aminoacides du produit résultant donne les résultats suivants, la lysine étant utilisée comme référence : Asn, 1,00 ; 2Thr, 2,18 ? Sér, 0,95 ; Gly, 1,00 ; Val, 0,99 ; 3Phë, 3,45 ; 2Lys, 2,00. Exemple 3 15 D-VALYL-GLYCYL-L-CYSTEINYL-L-LY SYL-L-ASPARAGINYL-L-PHENYLALANYL-L-PHENYL-ALANYL-D-TRYPTOPHYL-L-LYSYL-L-THREONYL-L-PHENYLALANYL-L-THREONYL-L-SERYL—L-CYSTEINE A un mélangé de 7,2 ml d'anisole et de 7,2 ml d'éthylmercaptan, on ajoute 3,914 g (à un taux dé substitution de 20 0,155 mmole/g) de l'ensemble tétradécapeptide-résine protégé de l'Exemple 2. On refroidit le mélange dans de l'azote liquide et on ajoute par distillation 80 ml de gaz fluorhydrique liquéfié. On laisse le mélange résultant se réchauffer jusqu'à. 0°C et on l'agite pendant 2 heures. Puis on chasse le gaz fluorhydrique par 25 distillation. On ajoute de l'éther au mélange résultant et on le refroidit à 0°C. On recueille par filtration le solide résultant et on le lave avec de l'éther. On sèche le produit et on extrait le tétradécapeptide déprotégé du mélange de résine en utilisant de l'acide acétique 1M et de l'acide acétique à 50 %. Puis on 30 lyophilise immédiatement la solution d'acide acétique à siccité à l'obscurité. Le solide légèrement jaune résultant est mis en suspension dans un mélange de 10 ml d'acide acétique 0,2M dégazé et de 4 ml d'acide acétique glacial. On chauffe la solution résultante doucement avec 6 ml d'acide acétique à 50 % jusqu'à 35 obtention d'une solution jaune limpide et l'on dépose la solution sur une colonne de Sephadex G-25 F. Les conditions chromatographi-ques sont les suivants : solvant, acide acétique 0,2M dégazé ; dimension de la colonne, 7,5 x 150 cm ; température, 26°C ; débit, 1670 ml/h ; volume des fractions 25,05 ml. L'absorbance à 280 mu de chaque fraction en fonction du 18 2387942 20 numéro de la fraction indique un large pic important suivi d'un épaulement. La spectroscopie UV révèle que la partie principale du pic est le produit. Les fractions que l'on combine et leur volume d'effluent sont les suivants : 5 Fractions 207-233 (5160-5837 ml, pic à 5515 ml). Cette collation des fractions ne comprend pas 1'épaulement suivant. La spectroscopie UV indique que 4 70 mg du produit sont présents (rendement 46,4 %). Un titrage Ellman d'une partie aliquote indique une teneur en groupement sulfhydryle libre de 10 95 % de la valeur théorique. Exemple 4 OXYDATION EN D-Val1, D-Trp8-SOMATOSTATINE 1 8 On dilue la solution de la D-Val , D-Trp -somatostatine réduite (677 ml) de l'Exemple 3 avec de l'eau distillée pour 15 obtenir une concentration de 50 yg/ml. On ajoute de l'hydroxyde d'ammonium concentré pour ajuster le pli du mélemge à 6,7. On agite la solution à 4°C à l'obscurité pendant 64 heures, après quoi un titrage Ellman indique que l'oxydation est complète. On concentre le mélange sous vide jusqu'à un volume de 4 5 ml et on ajoute 45 ml d'acide acétique glacial. Puis on élimine les sels du mélange sur une colonne Sephadex G-25 F. Les conditions chromatographiques sont les suivantes : solvant, acide acétique à 50 % dégazé ; dimension de la colonne, 5,0 x 215 cm ; température, 26°C ; débit, 148 ml/h ; volume des fractions, 17,3 ml. L'absorbance à 280 mp pour chaque fraction en fonction du numéro de la fraction indique deux pics importants. Le premier pic représente les formes agglomérées du produit et le second pic représente le produit monomère. On recueille la substance représentée par le second pic ^fractions 1 16-155 (2000-2685 ml)} . La spectroscopie UV indique que 279 mg de produit sont présents dans l'échantillon (rendement de 59,4 %). On lyophilise la solution à siccité à l'obscurité. On rechromatographie le solide blanc résultant en deux portions à peu près égales. On dissout la première portion dans 25 ml d'acide acétique à 50 % dégazé et on 1'adsorbe sur une colonne de Sephadex G-25 F. Les conditions chromatographiques sont les suivantes : solvant, acide acétique à 50 % dégazé ; dimension de la colonne, 5,0 x 215 cm ; température, 26°C ; débit, 14 8 ml/h ; volume des fractions, 17,3 ml. L'absorbance à 230 mp pour chaque fraction indiquée en 25 30 35 40 19 2387942 fonction du numéro de la fraction indique deux pics importants. On fait une coupe conservatrice du second pic. On réunit les fractions 119-125 (volumes d'effluent 2128-2256 ml). La spectroscopie UV indique que 65,3 mg de produit sont présents dans cet 5 échantillon. On lyophilise la solution à siccité à l'obscurité pour obtenir le produit désiré. On rechromatographie la seconde portion de la même manière que la première avec des résultats similaires. On réunit les deux bons produits, totalisant 126 mg par spectroscopie UV (récupérait) tion de 45,2 % de produit purifié). On dissout le produit réuni dans 15 ml d'acide acétique 0,2M dégazé et on le dépose sur une colonne de Sephadex G-25 F. Les conditions chromatographiques sont les suivantes : solvant, acide acétique 0,2M dégazé, dimension de la colonne, 5,0 x 150 cm ; température, 26°C ; débit, 466 ml/h ; 15 volume des fractions 16,3 ml. L'absorbance à 280 mp de chaque fraction notée en fonction du numéro de la fraction indique un pic important. La spectroscopie UV indique que la proportion principale du pic est un produit excellent. On réunit les fractions 160-180 (2592-2934 ml, pic à 20 2685 ml) et on les lyophilise â siccité à l'obscurité. Une spectroscopie UV indique la présence de 90,4 mg de produit (récupération de 71,7 %). 26 Pouvoir rotatoire = -56,1° (1 % dans l'acide acétique). Analyse.des aminoacides : Val, 1,0 ; Gly, 0,97 ; 2Cys, 1,62 ; 25 2Lys, 2,00 ; Asn, 1,01; 3Phë, 2,87 ; Trp, 1,02 ; 2Thr, 1,83 ; Sér, 0,81. Les résultats précédents sont exprimés en rapports de Lys/2 = 1,0. Toutes les valeurs sont des moyennes de deux hydrolyses de 21 heures sans agents de fixation. On détermine le tryptophane 30 par spectrocopie UV (sous forme d'un rapport à Lys/2) ; la valeur obtenue pour la sérine n'est pas corrigée des pertes au cours de 1 ' hydrolyse -. Le produit précédent contient des quantités mineures d'impuretés. Si on le désire, on peut encore purifier le produit 35 en le soumettant à une chromatographie liquide sous pression élevée préparative. 1 fi Un autre procédé dToxydation en D-Val , D-Trp°-somatostatine 1 8 de la D-Val , D-Trp -somatostatine réduite comprend le traitement par le ferricyanure de potassium. On effectue l'oxydation en ^O solution aqueuse amenée à pli 6,7 comme décrit ci-avant dans cet 20 2387942 exemple. On ajoute au mélange une solution aqueuse de ferricyanure de potassium pour obtenir une concentration finale représentant 1 8 -approximativement 3,3 fois celle de la D-Val , D-Trp -somatostatine réduite. On agite la solution à l'obscurité à la tempéra-5 ture ambiante pendant environ 2 heures. On vérifie l'achèvement total de l'oxydation à l'aide d'un titrage Ellman. Exemple 5 N—t—BUTYLOXYCARBONYL —D-ALANYL-GLYCYL-L-(S-o-METHOXYB ENZYL)-CYSTEINYL-L-(N&-O-CHL0R0BENZYL0XYCARB0NYL)LYSYL-L-AS PARAGIN YL -10 L-PHENYLALANYL-L-PHENYLALANYL-D-TRYPTOPHYL-L-(N^-o-CHLORO-BENZ-YLOXY CARBONYL)LYSYL-L-(O-BENZYL)THREONYL-L-PHENYLALANYL-L-(0-BENZYL)THREONYL-L-(O-BENZYL)-SERYL-L-(S-£-METHOXYBENZYL)-CYSTEINYL-RESINE DE POLYSTYRENE METHYLE On prépare ce composé en utilisant la seconde portion du tridécapeptide préparé dans l'Exemple 2 et en copulant de la N-t-butyloxycarbonyl-D-alanine au lieu de la N-t.-butyloxycarbonyl-D-valine. L'analyse des aminoacides du produit résultant après hydrolyse par chauffage à reflux pendant 21 heures dans un mélange 1:1 d'acide chlorhydrique concentré et de dioxanne donne les résultats suivants,, la lysine étant utilisée comme référence : Asn, 1,16 ; 2Thr, 2,14 ; Sér, 1,04 ; Gly, 1,09 ; Ala, 1,17 ; 3Phé, 2,88 ; 2Lys, 2,00. Exemple 6 25 D—ALANYL—GLYCYL—L—CYSTEINYL—L—LYSYL—L—ASPARAGINYL-L—PHENYLALANYL— L—PHENYLALANYL—D-TRYPTOPHYL—L—LYSYL—L—1THREONYL-L—PHENYLALANYL-L-THREONYL-L-SERYL-L-CYSTEINE On prépare le composé du titre selon le procédé de l'Exemple 3, en utilisant 3,77 2 g (à un taux de substitution de 0,15 6 mmole/ g) du produit de l'Exemple 5. On effectue la purification du produit par chromatographie sur une colonne de Sephadex G-25 F. Les conditions chromatographiques sont les suivantes : solvant, acide acétique 0,2M dégazé ; dimension de la colonne, 7,5 x 150 cm; température, 26°C ; débit, 1658 ml/h ; volume des fractions, 24,87 ml. L'absorbance à 280 mp de chaque fraction en fonction du numéro de la fraction indique un large pic important suivi d'un épaulement. La spectroscopie UV indique que la partie principale du pic représente le produit. Les fractions que l'on réunit et leurs volumes d'effluent 30 35 40 21 2387942 sont les suivants : Fractions 206 à 230 (5098-5720 ml) . Cette collation des fractions ne comprend pas 1 ' épauleir.ent. La spectroscopie uv indique une quantité théorique de 403,9 mg (rendement de 41,9 %) présents dans l'échantillon. Un titrage "Ellman d'une partie aliquote indique une teneur en groupement sulfhydryle libre de 93 % de la valeur théorique. Exemple" 7 OXYDATION EN D-Ala1, D-Trp8-SOMATOSTATINE 1 8 On traite la D-Ala , D-Trp -somatostatine réduite de l'Exemple 6 selon le procédé de l'Exemple 4. On dilue la solution (622 ml, théoriquement 403,9 mg) avec de l'eau distillée pour obtenir une concentration de 50 yg/ml puis on ajuste a pH 6,7 avec de 1'hydroxyde d'ammonium concentré. On agite le mélange à la température ambiante à l'obscurité pendant 41 heures. On concentre le mélange sous vide à environ 40. ml puis on le dilue avec 40 ml d'acide acétique glacial. Puis on absorbe le mélange sur une colonne de Sephadex G-25 F. Les conditions chromatogra-phiques sont les suivantes : solvant, acide acétique à 50 % dégazé ; dimension de la colonne, 5,0 x 215 cm ; température, 26°C ; débit, 151 ml/h ; volume des fractions, 17,61 ml. L'absorbance à 280 mp pour chaque fraction en fonction du numérô de la fraction indique deux larges pics importants. Le premier pic représente les formes agglomérées du produit et le second pic représente un bon produit monomère. On recueille le produit représenté par le second pic [[fractions 113-155 (1971-2728 ml)J et on le lyophilise à siccité à l'obscurité. On rechromatographie le solide résultant en approximativement deux portions égales. On dissout la première portion dans 22 ml d'acide acétique à 50 % dégazé et on applique la solution sur une colonne de Sephadex G-25 F. Les conditions chromatographiques sont les suivantes : solvant, acide acétique à 50 % dégazé ; dimension de- la colonne, 5,0 x 215 cm ; température, 26°C ; débit, 153 ml/h ; volume des fractions, 17,85 ml. L'absorbance à 280 mp de chaque fraction en fonction du numéro de la fraction indique deux pics importants. On fait une coupe conservatrice du second pic en combinant les fractions 121-127 (volumes effluents de 2142 à 2167 ml). La • spectroscopie UV indique la présence de 56,7 mg de produit dans cet échantillon. On lyophilise la solution à siccité à l'obscurité pour obtenir le 22 2387942 produit désiré. On rechromatographie la seconde portion do la même manière que la première. On réunit les produits (126,3 mg/spectroscopie UV rendement de 31,3 % par rapport à la forme réduite). On dissout le produit dans 21 ml d'acide acétique 0,2M dégazé et on l'applique sur une colonne de Sephadex G-25 F. Les conditions chromatographiques sont les suivantes : solvant, acide acétique 0,2M dégazé ; dimension de la colonne, 5,0 x 150 cm ; température, 26°C ; débit, 449 ml/h ; volume des fractions, 15,71 ml. L'absorbance à 280 mp de chaque fraction en fonction du numéro de la fraction indique un pic important. La spectroscopie UV indique que la portion principale du pic est le produit. On réunit les fractions 169-188 (2640-2953 ml, pic à 2705 ml) et on les lyophilise à siccité à l'obscurité. La spectroscopie UV indique la présence de 85,2 mg de produit (récupération de 67,5 %) Pouvoir rotatoire DO 26 = _54f9 % (11 dans l'acide acétique) Analyse des aminoacides : Ala, 1,0 5 ; Gly, 1,0 ; 2Cys, 1,58 ; 2Lys, 2,0 ; Asn, 1,10 ; 3Phé, 2,92 ; Trp, 1,02 ; 2Thr, 1,98 ; Sér, 0,88. Les résultats précédents sont exprimés par rapport à Lys/2 = 1,0. Toutes les valeurs sont des moyennes de deux hydrolyses de 21 heures sans agents de fixation. On détermine le tryptophane par spectroscopie UV (par rapport à Lys/2) ; la teneur en sérine n'est pas corrigée des pertes pendant l'hydrolyse. g On teste la D-Vall, D-Trp -somatostatine pour déterminer son inhibition in vivo de la sécrétion d'acide gastrique. Sur six chiens possédant une fistule chronique et une poche Heidenhain, on induit la sécrétion d'IlCl gastrique par infusion du tétradécapeptide à C-terminal de la gastrine à raison do 0,5 pg/kg.h. Chaque chien constitue son propre témoin. Au bout d'une heure de sécrétion à l'équilibre d'IICl, on fait une perfusion de D-Val1, O D-Trp -somatostatine à raison de 0,15 pg/kg.h pendant une heure. On poursuit le recueil des échantillons d'acide gastrique pendant une heure et demie supplémentaire à des intervalles de 15 mn. On titre les échantillons à pli 7 avec un appareil de titrage automatique. On extrapole l'effet inhibiteur maximal de la D-Val1, O D-Trp -somatostatine par rapport à la courbe dose-réponse de la somatostatine, et on exprime la puissance relative de l'homologue par rapport à celle de la somatostatine en pourcentage d'activité. 1 8 La D-Val , D-Trp -somatostatine inhibe la sécrétion d'acide à 23 2387942 l'équilibre induite par le tétrapeptide à C-terminal de la gastrine de 48,22 + 6,45 % (erreur type de moyenne). Cet effet est équivalent à celui de 0,175 pg/kg.h de somatostatine. Son activité relative par rapport à la somatostatine est donc de i 8 116 %. Un échantillon encore plus purifie de D-Val , D-Trp - somatostatine, administré à des doses de 0,200, 0,166 et 0,138 fJg/ kg.h, inhibe la sécrétion d'acide à l'équilibre, induite par le tétrapeptide à C-terminal de la gastrine, respectivement de 77,63, 71,57 et 67,8 %. Cette activité par rapport à celle de la somatostatine est 302-325 %. 1 / 8 La D-Ala , D-Trp -somatostatine, testée à 0,20 pg/kg.h dans les mêmes conditions inhibe la sécrétion d'acide à l'équilibre induite par le tétrapeptide à C-terminal de la gastrine de 73,61 + 3,66 % (erreur type de moyenne). Cet effet est équivalent à celui de 0,550 pg/kg.h de somatostatine. Son activité par rapport à celle de la somatostatine est donc de 275 %. 1 8 On teste également l'activité de la D-Val , D-Trp - 1 8 " ' somatostatine et de la D-Ala , D-Trp -somatostatine pour déterminer leur action sur la mobilité des intestins chez les chiens conscients. On utilise, trois chiens ayant des cathéters placés dans les lumières de l'antre, du duodénum et du pylore. On utilise des changements de pression de la lumière de l'intestin sur un appareil d'enregistrement Visicorder, en utilisant des jauges de contrainte et des galvanomètres à faisceau lumineux miniature. Après avoir établi un témoin à l'équilibre, on fait une perfusion intraveineuse du composé d'essai pendant 10 mn. Le composé d'essai augmente initialement la pression de la lumière dans le pylore puis la diminue alors que la pression dans le duodénum et l'antre reste déprimée pendant tout l'essai. La dose efficace minimale nécessaire pour augmenter la pression dans le pylore et pour diminuer la pression du duodénum et de l'antre est 1 8 d'environ 0,05 ug/kg.10 mn pour la D-Val , D-Trp -somatostatine 18 et d'environ 0,1 pg/kg.10 mn pour la D-Ala , D-Trp -somatostatine. Ceci se compare à une valeur de la somatostatine elle-même de 0,125 à 0,25 pg/kg.10 mn. 1*8 On teste également l'activité de la D-Val , D-Trp"- 1 8 somatostatine et de la D-Ala , D-Trp -somatostatine par rapport à la libération de l'hormone de croissance. Le mode opératoire que l'on utilise est effectué en utilisant des rats mâles Sprague-Dawley normaux, pesant 100-120 g (Laboratory Supply 24 2387942 10 Company, Indianapolis, Indiana, E.O.A.). L'essai est une modification de la méthode de P. Brazeau, W. Vale et R. Guilleman, Endocrinology, 94 184 (1974). Dans cet essai, on utilise un total de cinq groupes de huit rats chacun pour l'essai de chaque composé. On administre du pentobarbital sodique par voie intrapéritonéale à tous les rats pour stimuler la sécrétion de l'hormone de croissance. Un groupe sert de témoin et reçoit seulement la solution saline. Deux des groupes.reçoivent la somatostatine, un groupe à raison de 2 pg/rat par voie souscutanée et l'autre groupe à raison de 50 pg/rat par voie souscutanée. Les deux autres groupes reçoivent le composé d'essai, l'un à 10 pg/rat par voie souscutanée et l'autre à 0,4 pg/rat par voie souscutanée. On mesure la concentration dans le sérum de l'hormone de croissance 20 mn après l'administration simultanée du pentobarbital sodique 15 du composé d'essai. On détermine ensuite par rapport au groupe témoin le degré d'inhibition de la concentration de l'hormone de croissance dans le sérum et on compare les activités relatives du composé d'essai et de la somatostatine elle-même. "" 1 8 A des doses de 0,4 yg/rat et 10 pg/rat, la D-Val , D-Trp - 20 somatostatine inhibe l'augmentation de la sécrétion d'hormone de croissance de 14 % et de 42 % par rapport au témoin respectivement. La somatostatine à une dose de 2 pg/rat n'a pas d'effet sur l'augmentation de la sécrétion de l'hormone de croissance alors qu'à 50 pg/rat elle inhibe l'augmentation de la sécrétion de 25 l'hormone de croissance de 56 % par rapport au témoin. i 8 A des doses de 0,4 pg/rat et 10 pg/rat, la D-Ala , D-Trp -somatostatine inhibe l'augmentation de la sécrétion d'hormone de croissance de 54 % et de 91 % par rapport au témoin respectivement. La somatostatine, à des doses de 2 pg/rat et 50 pg/rat, inhibe l'augmentation de la sécrétion d'hormone de croissance de 30 40 % et de 87 % par rapport au témoin respectivement. 1 8 On teste l'activité in vivo de la D-Val , D-Trp -somatosta- 1 8 tine et de la D-Ala , D-Trp -somatostatine à inhiber la sécrétion de glucagon et d'insuline après stimulation par la L-alanine. 35 on fait jeûner pendant une nuit des chiens bâtards normaux des deux sexes. On obtient des échantillons de sang témoins puis on commence une perfusion intraveineuse de solution saline, de somatostatine ou du composé d'essai. Au bout de 30 mn, on administre en outre par voie intraveineuse de la L-alanine pendant 15 mn. On poursuit la perfusion de solution saline, de 40 25 2387942 somatostatine ou de composé d'essai pendant 15 mn une fois terminée la perfusion de L-alanine. La perfusion de L-alanine provoque une augmentation brutale de la"concentration dans le sérum de gluçagon et d'insuline qui revient à la concentration 5 témoin une fois terminée la perfusion de L-alanine. D'après ce qui précède, on détermine que la dose minimale de D-Val1, 8 ' D-Trp -somatostatine pour 1'inhibition de-la sécrétion de glucagon est de 0,04 à 0,llpg/kg/mn et pour l'inhibition de la sécrétion d'insuline elle est inférieure à 0,004 pg/kg/mn. La 10 dose minimale de D-Ala1, D-Trp8-somatostatine pour l'inhibition de la sécrétion de glucagon et d'insuline est inférieure à 0,03 pg/kg/mn. 26 Z38794Z REVENDICATIONS 1. Composé de formule générale Y-Gly-L-Cys-L-Lys-L-Asn-L-Phé-L-Phê-D-Trp-L-Lys-L-Thr-L-Phé-L-Thr-L-Sër-L-Cys-OH, où Y est D-Val ou D-Ala ; 5 et ses sels d'addition d'acide non toxiques pharmaceutiquement acceptables. 2. Composé selon la revendication 1, de formule H-D-Val-Gly-L-Cys-L-Lys-L-Asn-L-Phô-L-Phé-D-Trp-L-Lys-L-Thr-L-Phé-L-Thr-L-Sér-L-Cys-OH et ses sels d'addition d'acide non toxiques pharmaceuti-- 10 quement acceptables. 3. Composé selon la revendication 1, de formule H-D-Ala-Gly-L-Cys-L-Lys-L-Asn-L-Phé-L-Phé-D-Trp-L-Lys-L-Thr-L-Phé-L-Thr-L-Sér-L-Cys-OH et ses sels d'addition d'acide non toxiques pharmaceutiquement acceptables. 15 4. Procédé de préparation d'un composé de formule I selon la revendication 1, qui consiste à faire réagir avec un agent oxydant le tétradécapeptide à chaîne droite correspondant de formule III, Y-Gly-L-Cys-L-Lys-L-Asn-L-Phé-L-Phé-D-Trp-L-Lys-L-Thr-L-Phé-L-Thr-L-Sér-L-Cys-OH, 20 où Y est D-Val ou D-Ala. 5. A titre d'intermédiaire, un composé de formule générale II, R-Y-Gly-L-Cys(R^-L-Lys(R2)-L-Asn-L-Phé-L-Phé-D-Trp(R5)-L-Lys(R^J-L-Thr(R^)-L-Phé-L-Thr(R^)-L-Sér(R^)-L-Cys(R^)-X, où Y est D-Val ou D-Ala ; 25 r est un atome d'hydrogène ou un groupement protecteur des groupements o(-amino ; R^ est un atome d'hydrogène ou un groupement protecteur des groupements thio ; R2 est un atome d'hydrogène ou un groupement protecteur des groupements €-amino ; R^ et R^ sont des atomes d'hydrogène ou des groupements protecteurs du groupement hydroxy ; R,- est un atome d'hydrogène ou un groupement formyle ; et X est un groupement hydroxy ou Résine 30 35 40 dans laquelle la résine est le polystyrène ; pourvu que, quand X est un groupement hydroxy, chacun de R, R^, R2/ R^r R4 et R^ 27 2387942 soit un atome d'hydrogène, et quand X est Résine -O-CH 5 • •' chacun de R, , R2, R^ et R^ soit autre qu'un atome d'hydrogène. 6. A titre d'intermédiaire, un'composé selon la revendication 5 de formule R-D-Val-Gly-L-Cys(R^)-L-Lys(R2)-L-Asn-L-Phé-L-Phé-D-Trp(R5)-L-Lys-(R2)-L-Thr(R3)-L-Phé-L-Tr(R3)-L-Sér(R4)-L- 10 Cys(R1)-X. 7. A titre d'intermédiaire, un composé selon la revendication 6 où X est un groupement hydroxy; 8. A titre d'intermédiaire, un composé selon la revendication 6, où X est 9. A titre d'intermédiaire, un composé selon la revendication 8 de formule N-(BOC)-D-Val-Gly-L-(PBM)Cys-L-(CBzOC)-Lys-L-Asn-L-Phé-L-Phé-D-TrprL-(CBzOC)-Lys-L-(Bzl)Thr-L-Phé-L-(Bzl)Thr- 10. A titre d'intermédiaire, un composé selon la revendication 5 de formule R-D-Ala-Gly-L-Cys(R^)-L-Lys(R2)-L-Asn-L-Phé-L-Phé-D-Trp (R5)-L-Lys-(R2)-L-Thr(R3)-L-Phé-L-Thr(R3)-L-Sér(R4)-L-Cys(R1)-X. 11. A titre d'intermédiaire, un composé selon la revendication 10, où X est un groupement hydroxy. 12. A titre d'intermédiaire, un composé selon la revendication 10, où X est 15 Résine Résine 35 • •' 28 2387942 13. A titre d'intermédiaire, un composé selon la revendica tion 12 de formule N-(BOC)-D-Ala-Gly-L-(PMB)Cys-L-(CBzOC)-Lys-L Asn-L-Phé-L-Phé-D-Trp-L-(CBzOC)Lys-L-(Bzl)Thr-L-Phé-L-(Bzl)Thr- •==•, Résine 5 L-(Bzl)Sér—L-(PMB)Cys-0-CH2— y* . • 14. Composition thérapéutiquement active comportant comme 10 ingrédient actif un composé selon la revendication 1.