FR 2267117 A1 19751107 FR 7511524 A 19750414 2267117 1*infection, intra-utérine par le cytomégalovirus (GMV) est une cause importante de troubles du système nerveux chez les nouveau—nés. Bien que le virus soit très répandu dans la population, environ 40 ?£ des femmes enceintes ne renferment pas d'anti-5 corps au début de leur grossesse et sont donc susceptibles d'une infection. Chez ces femmes, une sur cent environ subit une infection primaire intra-utérine. L'inclusion cytomégalique classique est une maladie rare ; tout'efois, on remarque que dans une certaine proportion, les nourrissons infectés, y compris ceux qui 10 ne présentent pas de symptômes, sont par la suite retardés mentalement ("Lancet Jan„" 5, 1974, pages 1-5). Des estimations préliminaires basées sur 1*examen d*environ 4000 nouveau.—nés de diverses régions géographiques indiquent que le virus provoque des troubles importants du système nerveux 15 central conduisant à la débilité mentale chez au moins 10 % et peut-être même chez 25 i° des nourrissons infectés. Si 1*on suppose que chaque année, environ 1 $ des nouveau—nés excrètent le cytomégalovirus et qu'environ le quart de ces nourrissons présentent ensuite des troubles mentaux, cela signifie, aux Etats-Unis d'Amé-20 rique, qu'il naît par an environ 10 000 enfants débiles mentaux. Ce nombre est considérable, notamment si l'on tient compte de l'aptitude de ces enfants à survivre ("J. of Infect. Dis." 12g, K° 5, 555 (Mai 1971)}. Par suite de la gravité du problème, les recherches 25 axées sur l'étude d'un vaccin efficace contre le cytomégalovirus ont été encouragées au cours des dernières années. Le problème de la vaccination est de produire une immunité humorale et faisant intervenir les cellules, sans permettre au virus de se propager dans l'organisme du sujet vacciné et sans entraîner d'effets 30 morbides. Le vaccin doit être -utile pour protéger les femmes de l'infection pendant la grossesse. La vaccination des adolescentes devrait réduire l1inciàeneq&e l'infection cytomégalovirale primaire au cours de la grossesse et éliminer chez le foetus les troubles cérébraux qui peuvent en résulter. 35 L'invention concerne un vaccin qui est capable de produire l'immunité contre le cytomégalovirus et que l'on peut donc utiliser pour la protection des femmes contre une infection 2 2267117 pendant la grossesse, ce qui permet de réduire grandement les troubles du système nerveux central, y compris l'arriération mentale, chez les nouveaux-nés. Le vaccin de l'invention offre l'avantage d'éviter la propagation du virus par contagion. De 5 plus, en raison de son mode de préparation, le vaccin n'est pas capable de transmettre des virus à l'état latent aux sujets vaccinés » L'invention concerne aussi un procédé nouveau de préparation du vaccin. Le vaccin de la présente invention offre les avantages 10 indiqués ci-dessus, du fait même de son mode de préparation. Une caractéristique essentielle du procédé de préparation du vaccin réside dans les passages en série du cytomégalovirus dans des fibroblastes pulmonaires diploïdes humains, notamment des fibro-blastes ¥1-38 et MRC-5» de préférence les premiers. 15 Les fibroblastes ¥1-38 ont été produits à l'origine à partir d'un seul poumon humain ; ils sont de souche pure, en ce sens qu'ils ont été amplement caractérisés du point de vue biologique, biochimique, virologique et génétique. Les fibroblastes MB.C-5 tirent eux-mêmes leur origine d'un seul poumon humain, 20 mais d'un individu différent,et leur sélection a été faite de la même manière. Ces deux lignées cellulaires sont normalisées, en contraste avec les cellules animales primaires utilisées de façon classique. Les fibroblastes ¥1-38 ont été décrits dans "Exper. Cell Res." 2£, 585 (1961) et ont été déposés auprès de 25 l'American Type Culture Collection qui leur a attribué le numéro ATCG CCL-75. Les fibroblastes MRC-5 ont été décrits dans "Nature" 227 168 (11 Juillet 1970). Les fibroblastes ¥1-38 sont à la disposition des laboratoires et on peut se les procurer auprès de l'ATCC. L'utilisation de ces lignées cellulaires pour la 30 propagation du virus minimise la probabilit é de transmission de virus latents à un sujet vacciné, au moyen du vaccin. La souche Towne de cytomégalovirus, très avantageuse à utiliser dans la préparation du vaccin en raison de son large spectre antigénique, a été isolée de l'urine d'un nourrisson du 35 sexe mâle, âgé de deux mois, atteint"de la maladie des inclusions cytomégaliques (symptômes : troubles du système nerveux central et hépatosplénomégalie). Cette souche de cytomégalovirus a été 3 2267117 isolée par le docteur otanley A. Plotkin du Wistar Institute of Anatomy and Siology, Philadelphie, Pennsylvanie, et a été décrite dans "J. Virol." 1_J_, 6, 991 (Juin 1973). Toutefois, on peut utiliser d'autres souches de cytomégalovirus» 5 le développement des fibrcblasts pulmonaires diploïdes humains peut être effectué par l'une quelconque des méthodes normalisées décrites dans la littérature. Des exemples particuliers de ces techniques de développement sont donnés dans "Exper. Cell Res." 25, 585 (1961) et dans "Virology" 16., 147 10 (1962), La méthode de culture sur tissu implique habituellement le milieu de base d'Eagle (EME) ou le miliéu essentiel minimal d'Eagle (MEM) dans la solution d'Eagle, équilibré§4n sels, additionnée de sérum de veau présélectionné, renfermant une quantité stérilisante d'un antibiotique tel que la pénicilline, la strep-15 tomycine, la chlortétracycline ou un autre antibiotique, ou des mélanges de ces antibiotiques, le système étant tamponné à un pH d'environ 6,8 à environ 8,5 à l'aide d'un tampon biologique classique tel qu'un bicarbonate, un carbonate ou un phosphate acide de métal alcalin. 20 Le cytomégalovirus est cultivé, en vue de la production du vaccin, par inoculation de fibroblastes pulmonaire diploïdes humains avec ce virus. De l'urine contenant le cytomégalovirus constitue une matière première particulièrement intéressante pour l'inoculation des fibroblastes. Les cellules infectées traitées à 25 la trypsine sont recueillies et soumises à des passages en série dans des fibroblastes pulmonaires diploïdes humains. Chaque incubation dure sept jours et elle est conduite à une température d'environ 37°C. Le nombre de passages est choisi de manière à produire tout d'abord une souche de cytomégalovirus qui libère de grandes 30 quantités de virus exempts de cellules, qui sont ensuite atténués. On utilise au total au moins environ 50 et de préférence environ 125 à 150 passages. Le virus atténué est ensuite recueilli et soumis à des tests classiques de stérilité pour déceler la présence de bactéries, de champignons, de mycoplasmes et d'autres agents 35 contaminants. L'expression "virus atténué" est utilisée dans le présent mémoire pour désigner un virus dont la virulence a été 4 2267117 modifiée par la méthode de culture, en sorte qu'il ne produit pas de symptômes graves lorsqu* il est inoculé à des êtres humains tout en conservant son antigénicité, c*est-à>-dire son aptitude à stimuler la production d*anticorps. 5 Le virus atténué est utilisé comme vaccin par filtra- tion de la matière recueillie pour éliminer les cellules ou les bactéries, et le filtrat est utilisé tel quel, congelé en vue de son utilisation ultérieure, ou encore lyophilisé puis reconstitué à l'aide d'un solvant tel que l'eau. De préférence, on utilise 10 un agent stabilisant tel que l'albumine lorsque le filtrat est lyophilisé. Le vaccin peut être administré par voie sous-cutanée. La dose qui peut être utilisée est au minimum égale à 100 DICÏ,_q de cytomégalovirus atténué et peut atteindre 10 000 DICTpjQ. Le virus atténué peut être produit en assez grandes 15 • quantités par inoculation de fibroblaste^pulmonaires diploïdes humains avec le virus et culture du virus atténué dans ces fibroblastes. Le virus atténué peut être recueilli au moment du titre maximal, par exemple au bout d'environ une semaine. . La description suivante de la préparation et de 20 l'expérimentation du vaccin anti-cytomégaloviral illustre la présente invention à titre non limitatif. le cytomégalovirus utilisé provient de l'urine d'un ' nourrisson du sexe mâle âgé de deux mois, atteint de la maladie des inclusion cytomégaliques. Cette souche est appelée souche 25 "Towne" et répond à la description donnée ci-dessus. L'urinç est inoculée sur des fibroblastes pulmonaires diploïdes humains ¥1-38. Le milieu nutritif utilisé pour la culture du virus sur tissu est le milieu essentiel minimal d'Eagle (MEM) additionné de^ 2 io de sérum de veau présélectionné. La concentration en 30 antibiotiques de chaque millilitre de milieu est de 100 p,g de pénicilline , 10 |ig de gentamycine et 2 p.g d'amphotérycine-B. On peut utiliser d'autres antibiotiques à la place de ceux qui ont été nommés, ci-dessus. Pour obtenir le cytomégalovirus atténué, on inocule 35 la liqueur surnageante contenant la" culture et les cellules infectées par le virus,prélevées à la surface des récipients en utilisant de la trypsine à 0,25 $ dans une solution saline physiolo 5 2267117 gique, sur des fibroblastes pulmonaires diploïdes humains ¥1-38 au repos, pour déclencher l'infection de ces cellules et pour les passages subséquents, le milieu nutritif utilisé pour déclencher l'infection cellulaire et dans tous les passages subséquents est le 5 même que celui qu'on utilise pour la culture du virus sur tissu, comme indiqué ci-dessus, la température utilisée dans chaque passage est égale à 37°C. Toutefois, on peut aussi utiliser des températures un peu plus basses, par exemple des températures comprises entre environ 30 et 37 °C„ la durée de chaque passage est 10 de 7 jours, mais on peut effectuer des passages un peu plus courts ou un peu plus longs, par exemple de 5 ou 10 jours. Dans les passages initiaux, qui sont au nombre d'environ 10, la liqueur surnageante contenant des cellules infectées par le virus qui est recueillie à chaque passage précédent, est 15 amenée à passeo? sur des fibroblastes pulmonaires diploïdes humains ¥1-28 neufs. On utilise dans chaque passage environ 25 i° du liquide renfermant des cellules, qui provient d'un passage précédent, le nombre de passages est choisi de manière à obtenir une quantité notable de virus exempts de cellules, le cytomégalovirus étant 20 ordinairement associé avec des cellules. Ainsi, on peut utiliser un nombre de passages un peu plus petit, ou un peu plus grand. la liqueur surnageante du dixième passage est obtenue par décantation et elle est centrifugée à 1200tr/mn, ce qui donne un liquide contenant le virus exempt de cellules, le liquide 25 exempt de cellules contenante virus également exempt de cellules est ensuite traité par 28 passages en série sur des fibroblastes pulmonaires diploïdes humains ¥1-38 neufs, un millilitre de fluide étant utilisé pour Inoculer des récipients ayant chacun une surface utile de 75 centimètres carrés. Bien qu'on utilise 28 passa-50 ges, le nombre de passages doit simplement être suffisant pour produire la quantité désirée de cytomégalovirus exempt de cellules. Ainsi, on pourrait utiliser un nombre plus ou moins grand de passages du fluide exempt de cellules. la liqueur surnageante,"qui peut aussi contenir le virus 35 débarrassé des cellules par traitement aux ultra-sons,est recueillie d.©s puis traitée par/passages en série sur des fibroblastes ¥1-38 un nombre suffisant de fois, par exemple environ 115 fois, pour 6 2267117 atténuer le virus, le nombre total de passages que l'on utilise dans le procédé général décrit ci-dessus se situe ordinairement entre environ 50 et 150, notamment entre environ 125 et 150. La séparation de clones du virus atténué, par dilution 5 terminale, est effectuée aux passages 50, 60 et 70. Le virus destiné à la production du vaccin est recueilli à partir des liqueurs surnageantes de cultures de fibroblastes ¥1-38 Infectés au moment ou le titre en virus est maximal, généralement au bout d'environ une semaine. On obtient ainsi une plus 10 grande quantité de cytomégalovirus atténué à partir de la quantité préparée initialement. Le vaccin cytomégaloviral se développe sur des 'fibroblastes humains tels que les cellules ¥1-38. Son effet cytopatholo— gique est caractéristique du cytomégalovirus humain décrit.dans la 15 littérature.Il peut être propagé aisément sous la forme exempte de cellules par filtration de la liqueur surnageante de la culture infectée (filtre de trois microns) et inoculation sur des cellules ¥1-38 neuves. L'effet cytopathologique se manifeste en quatre à. dix jours, selon la multiplicité de l'infection. Des inclusions , 20 se forment comme décrit dans la littérature et peuvent être colorées par la méthode à l'hématoxyline et à l'éosine ou par la méthode G-iemsa. Le virus atténué forme des plaques sur une couche de gélose nutritive. Le vaccin doit être conservé à -70°G dans une solu-25 tion à 70 % de sorbitol dans l'eau distillée (un volume de virus par volume de solution de sorbitol). Le virus atténué exempt de cellules peut être séro-neutralisé avec de l'anti-sérum humain du commerce (Flow Labs., Bethesda, Maryland), dont l'absence de cellules correspond à 30 un titre de 1:16 (dilution 1:10). 0,1 ml de sérum dilué neutralise 250 doses DICT,_0. On peut aussi utiliser du sérum de pu • cobaye hyper-immùnisé contre la souche AD 169. Le tableau suivant reproduit les titres de neutralisation du sérum (NS) en l'absence et en présence du complé-35 ment. Les titres NS sont mesurés sur; des plaques microscopiques ("Linbro") : 0,025 ml de suspension de "Towne 125" à 60 DICT^^ plus 0,025 ml de sérum dilué. Au bout d'une heure, on ajoute 7 2267117 0,250 ml de milieu de base d'Eagle modifié contenant 10^" cellules Wl-38, avec 10 % de sérum de veau non chauffé. On lit les plaques microscopiques après incubation pendant 5 à 7 jours à 37°C. On utilise huit cavités pour chaque dilution. 5 Echantillon de sérum Neutralisation sans complément avec complément Lapin F 1 8 8 P 2 8 64 P 3 8 32 10 N° 4 8 64 Cobaye 20-100 100 Anti-sérum humain 40 40 Méthode d*expérimentation du vaccin 15 Chaque lot utilisé pour l'inoculation est soumis à des essais pour déeeler la présence de bactéries, de champignons et de mycoplasmes par inoculation dans des milieux artificiels appropriés. Les tests de sécurité effectués sur des. animaux consistent à Injecter des portions aliquotes de chaque 20 lot à des souris adultes (par voie intrapérltonéale et par voie intracérébrale),à de jeunes souris en période d'allaitement (voie intrapérltonéale et voie intracérébrale), à des cobayes (voie intrapéritonéale), et à des lapins (voie intradermique). L'examen des animaux à différentes périodes (espacées de plusieurs semai-25 nés) après inoculation révèle que tous les animaux restent sains. On inocule vingt singes cercopithèques avec le vaccin (0,5 ml par voie intraspinale et Intracérébrale et 1 ml par voie intramusculaire). Ils donnent tous une réaction séronégative à la neutralisation du cytomégalovirus à 100 DICT^q, tant 30 en présence qu'en l'absence de complément frais de cobaye. Les singes sont soumis aux tests de nouveau trois semaines plus tard.-Aucune séroGonversion n'apparaît chez les mêmes singes à l'examen clinique ou pathologique pendant cette période d'observation. 35 D'autres tests ont été effectués pour identifier des agents contaminants ou pour révéler leur absence dans la culture de tissu. On inocule des cellules primaires de rein de 2267117 8 callitriche, d'embryon humain et de lapin et des cellules ¥1-38 avec des portions aliquotes de virus, directement ou après neutralisation pendant une heure à 37°C avec du sérum cytomégalo-viral de lapin. Rien ne laisse entrevoir la présence de tout autre 5 agent que le vaccin anti-cytomégaloviral dans le liquide recueilli. Le titrage des lots recueillis pour déterminer la quantité de cytomégalovirus est effectué par 1*essai de dilution jusqu'à la limite sur des cellules ¥1-38.- Le vaccin a été expérimenté sur des êtres humains 10 adultes, préalablement soumis à des tests pour déceler la présence d'anticorps relatifs au cytomégalovirus et les sujets séronégatifs ont seuls été inclus dans les tests. Dix adultes séro- 3 0 négatifs ont été traités par inoculation intranasale de 10 ' DICTj-q. On n'a pas observé de s éro-inversions, ce qui démontre 15 que le virus n'était plus infectieux par la voie usuelle. Neuf autres adultes ont été traités avec la même dose inoculée par voie sous-cutanée et aucun d'eux n'a présenté une séro-inversion. Aucun symptôme n'a été observé, et le virus n'a pas été retrouvé dans les urines, dans la gorge ou dans le sang. 20 Pour obtenir les résultats indiqués ci-dessus, on inocule le virus par voie sous-cutanée," dans un volume d'un millilitre. On réalise des tampons pour prélèvement dans là gorge,que l'on déplace sur la partie postérieure du pharynx. On place immédiatement les tampons dans des tubes à capuchon vissé renfermant 25 le milieu de Hanks, contenant par millilitre 0,1 fo de gélatine, 1000 }ig de streptomycine et 400 jig de ûycostatine. On conserve les échantillons à 4°0 jusqu'à ce qu'on les inocule dans des cultures de tissus, le même jour, ou bien à -20°C jusqu'au moment des essais, dans un intervalle de deux semaines. On inocule de 30 l'urine directement sur des cellules ¥1-38. On effectue des tests de virémie en recueillant le sang additionnné d'héparine et en le laissant se sédimenter par gravité à 4°C jusqu'à ce qu'on obtienne le plasma riche en leucocytes. Après traitement aux ultra-sons pendant deux minutes, on inocule le plasma dans la culture de 35 tissu. On effectue des études des anticorps sur le sérum à partir d'échantillons de sang coagulé, en utilisant le test de ïixation du complément et le test de fluorescence. 9 2267117 Dans un essai subséquent, on administre à neuf au- *5 0 très adultes séronégatifs la même dose (10 ' DICT^) par voie sous-cutanée. On n1observe pas de symptômes systémiques et les neuf sujets développent des anticorps relatifs au cytomégalovirus . 10 2267117 REVENDICATIONS 1. Procédé pour atténuer le cytomégalovirus, caractérisé par le fait qu'il consiste à faire passer en série un cytomégalovirus virulent dans des fibroblastes pulmonaires diploï-5 des humains, un nombre suffisant de fois pour que le virus, lorsqu'il est administré à des êtres humains, produise l'immunité sans produire de symptômes graves ou davantage qu'une excrétion minimale de virus et sans propagation par contagion. 2. Procédé suivant la revendication 1, caractérisé par 10 le fait que les fibroblastes pulmonaires diploïdes humains consistent en une lignée cellulaire ATCC CC1-75. 3. Procédé suivant la revendication 1, caractérisé par le fait que le nombre total de passages est d'environ 50 à 1 50. 15 4.Procédé suivant la revendication 3» caractérisé par le fait que les passages sont effectués à une température de 30 à 37°0 pendant cinq à dix jours. 5. Procédé suivant la revendication 4, caractérisé par le fait que le nombre total de passages est d'environ 125 à 20 150. 6. Procédé suivant la revendication 5» caractérisé par le fait que des cellules traitées à la trypsine infectées avec le cytomégalovirus sont traitéee^par 10 passages sur des fibroblastes pulmonaires diploïdes humains vierges, cette opération 25 étant suivie du passage de virus exempt de cellules sur des fibroblastes pulmonaires diploïdes humains vierges, 7. Nouveau vaccin cytomégaloviral, caractérisé par le fait qu'il renferme le cytomégalovirus atténué préparé par le procédé suivant la Revendication 1. 30 ' 8. Procédé pour atténuer le cytomégalovirus, carac térisé par le fait qu'il consiste à inoculer des fibroblastes pulmonaires diploïdes humains avec de l'urine humaine infectée par le cytomégalovirus, à recueillir la liqueur surnageante contenant des cellules traitées à la trypsine infectées par le 35 cytomégalovirus, à faire passer en série ce liquide dans des fibroblastes pulmonaires diploïdes humains pour obtenir une souche de cytomégalovirus qui produit un cytomégalovirus exempt de 2267117 il cellules et à faire passer en série ce cytomégalovirus exempt de cellules dans des fibroblastes pulmonaires diploïdes humains, un nombre suffisant de fols pour que le virus , lorsqu'il est administré à des êtres humains, produise 1*immunité sans produire 5 de symptômes graves ou davantage qu'une excrétion minimale de virus et sans propagation par contagion. 9. Procédé selon la revendication 8, caractérisé par le fait que les fibroblastes pulmonaires diploïdes humains consistent en une lignée cellulaire ATCC CCIr" 75 • 10 10. Erocédé suivant/la revendication 8, caractérisé par le fait que le liquide surnageant contenant des cellules traitées à la trypsine et infectées est soumis à dix passages, 11. Procédé suivant la revendication 9» caractérisé par le fait que le liquide surnageant contenant la souche de 15 virus exempte de cellules est soumise à environ 115 passages pour atténuer ledit virus. 12. Procédé suivant la revendication 8, caractérisé par le fait que chacun des passages est effectué à une température d'environ 37°" pendant une semaine. 20 13- Procédé de préparation d'un vaccin contenant le cytomégalovirus atténué, caractérisé par le fait qu'il consiste à cultiver un cytomégalovirus atténué dans des fi— broblates pulmonaires diploïdes humains pendant une période suffisante pour produire une assez grande quantité de virus atténué 25 que l'on recueille ensuite. 14. Nouveau vaccin contre le cytomégalovirus, caractérisé par le fait quril renferme le cytomégalovirus atténué préparé par un procédé suivant l'une quelconque des revendications 2, 4, 5, 11 et 13.