FR 2182136 A1 19731207 FR 7315149 A 19730426 73 15149 2182136 lia présente invention fournit une méthode de production de désacétoxycéphalosporine c, qui consiste à cultiver dans un milieu de culture nutritif aqueux dans des conditions de fermentation aérobie en immersion un micro-organisme producteur de 5 pénicilline N appartenant aux:genres Cephalosporium, Emericellopsis, S c opu lar iops i s, Paecilontyçes ou Diheterospora jusqu'à ce qu'une quantité substantielle de désacétoxycéphalosporine C soit produite par ledit micro-organisme dans ledit milieu de culture et à isoler la désacétoxycéphalosporine C dudit milieu de culture. 10 Le dérivé de la céphalosporine qu'est la désacétoxycéphalos porine C, représenté par la formule développée suivante 0 H C00H 20 diffère de la céphalosporine C en ce que le groupement acétoxy-méthyle situé en position 3 du noyau dihydrothiazine de la céphalosporine C est remplacé par un groupement méthyle. On a désigné de manière commode cette différence de structure en faisant 25 précéder du préfixe désacétoxy le nom du dérivé de la céphalosporine décrit. Sinon, on a souvent utilisé le nom plus formel d'acide 3-méthyl-7-(5'-amino-5'-carboxyvaléramido)-3-céphem-4-carboxylique qui correspond au système de nomenclature en cépham. Par raison de commodité, le composé produit selon la méthode de cette 30 invention est désigné ici sous le nom de désacétoxycéphalosporine C. La désacétoxycéphalosporine C est un intermédiaire intéressant utile dans la préparation des antibiotiques de type céphalosporine. Par exemple, on peut la faire réagir avec le 35 chlorure de nitrosyle dans les conditions exposées dans le brevet E.U.A. N° 3.188.311, pour séparer la chaîne latérale aminoadipoyle et obtenir l'acide 7-aminodésacétoxycéphalosporanique (7-ADCA). On peut ensuite acyler le 7-ADCA avec le groupement acyle désiré pour obtenir l'antibiotique de type céphalosporine. Par exemple, 40 on peut acyler le 7-ADCA par des méthodes connues avec un ester 73 15149 2 2182136 actif, un anhydride mixte ou un autre dérivé approprié de la phénylglycine pour préparer la céphalexine antibiotique connue. La désacétoxycéphalosporine C a été préparée antérieurement par hydrogénolyse de la céphalosporine c selon la méthode décrite 5 dans le brevet E.U.A. H° 3.124.576 délivré le 10 Mars 1964. En raison de l'utilité de ce composé comme intermédiaire dans la préparation des antibiotiques du type céphalosporine,il est nécessaire de trouver d'autres voies plus économiques pour préparer ce composé. 10 On cultive les champignons producteurs de pénicilline n (céphalosporine N) du genre Cephalosporium, Emericellopsis, Scopulariopsis, Paecilomvces et Diheterospora, dans un milieu de culture nutritif aqueux contenant des sources de carbone et d'azote assimilables et des sels minéraux dans des conditions de 15 fermentation aérobie en immersion pour obtenir la désacétoxycéphalosporine c. On sépare la désacétoxycéphalosporine C des autres substances produites simultanément comme la céphalosporine C, la pénicilline N et la désacétylcéphalosporine c tout d'abord en acidifiant le bouillon total avec un acide minéral tel que l'acide 20 sulfurique de manière à l'amener à un pH d'environ 2. On agite le bouillon acidifié en le remuant à la température ambiante pendant environ 1 heure, pendant laquelle les composés acides labiles sont dégradés. Ensuite, on réajuste le pH à 6,0 en ajoutant une base appropriée telle que l'hydroxyde de sodium. On filtre le 2 5 mycélium et autres substances insolubles et on extrait le bouillon filtré par un solvant organique non miscible à l'eau pour^séparer les autres impuretés. On récupère la désacétoxycéphalosporine C du bouillon aqueux à demi purifié en effectuant une chromatographie de la manière suivante. On chromatographie initialement le 30 bouillon aqueux sur charbon actif. On lave la colonne de charbon à l'eau pour en séparer encore les impuretésr et ensuite on élue l'activité avec une solution aqueuse d'acétone à 50 % . On concentre l'éluat et on le fait passer sur une résine échangeuse d'anions, puis on en élue la désacétoxycéphalosporine C de préférence à 35 l'aide d'une solution d'acétate de sodium 0,15 N. On évapore alors les éluats jusqu'à siccité ou bien on les lyophilise pour obtenir une préparation de désacétoxycéphalosporine C brute. On purifie _ la substance brute par une autre chromatographie sur colonne de cellulose ou sur gel de silice. Les fractions actives contenant 40 la désacétoxycéphalosporine c sont soit concentrées à un petit 73 15149 2182136 volume soit: évaporées à siocité.On dissout le concentré ou le résidu solide séché dans une quantité minimale d'isopropanol et on verse la solution dans de l'éther diéthylique pour précipiter la désacétoxycéphalosporine c sous forme du sel de sodiun. 5 Selon le procédé de cette invention on cultive les champignons des genres Cephalosporium, Emericellopsis, Scopulariopsis, Paecilomyces et Diheterospora qui produisent la pénicilline N, dans des milieux nutritifs contenant des sources de carbone, d'azote assimilables et des sels minéraux pour obtenir la 10 désacétoxycéphalosporine c. Les micro-organismes utiles dans le présent procédé, à l'exception de Emericellopsis, ont été classés dans la catégorie des Fungi imperfecti du fait qu'ils ne produisent pas de spores sexuelles. Ils sont en outre classés dans l'ordre des Moniliales, 15 famille des Moniliaceae et genres Cephalosporium, Scopulariopsis, Paecilomyces et Diheterospora. Les micro-organismes de la présente méthode qui produisent des ascospores ont été classés dans le genre Emericellopsis qui est le stade sexuel parfait de Cephalosporium. Les organismes sont par conséquent classés parmi 20 les Ascomvcètes de l'ordre des Eurotiales, famille des Eurotiaceae. La classification précédente des champignons utiles dans la présente invention est basée sur leurs caractéristiques morphologiques et culturales observées. On présente dans les paragraphes qui suivent la description taxonomique d'un certain nombre de 25 champignons qui sont des illustrations des genres respectifs. Les références renvoyant à "Maerz and Paul Color Plates" concernent les planches de couleur données dans Maerz and Paul, Dictionarv of Color, McGraw-Hill Book Co., Inc., New York (1950). Cephalosporium - General Morphology. 30 Les cellules portant les spores sont des phialides (stérigmates) qui proviennent directement d'hyphes végétatives ou de faisceaux d'hyphes en cordonnets ou de corémiums. Les phialides sont hyalines, effilées, produisent au sommet des phialospores qui forment soit des boules soit des chaînes fragiles. Habituellement 35 les spores ne sont pas cloisonnées, elles ont une forme globuleuse à cylindrique courte. Les colonies varient de colonies lisses et humides sans mycélium aérien à des colonies granuleuses et ^'iveteuses avec mycélium aérien. Le mycélium est habituellement composé d'hyphes en cordonnets. La couleur des colonies va du 40 blanc au jaune à rose et gris foncé ou brun. 73 15149 2182136 Caractéristiques morphologiques et culturales Souches de Cephalosporium Dans les descriptions taxonomiques suivantes de Cephalosporium sp. les cultures produisent un stade imparfait caractéristique 5 du genre cephalosporium. Cephalosporium sp. NRRL 5445. Les cellules sporogènes apparaissent sur les stérigmates non ramifiés et qui sont disposés en alternance et proviennent directement des hyphes d'un synnéma. Les stérigmates sont 10 essentiellement uniformes du point de vue diamètre et sont légèrement effilés au sommet. Les stérigmates sont monocellulaires, mesurent 2,8yU, de diamètre à la base et de 14^$. à 25jU.à.Q longueur, avec en moyenne 21/6t . Les phialospores apparaissent communément en chaînes mais se terminent habituellement en boules de spores 15 dans les cultures âgées. Les phialospores sont hyalines mais apparaissent ocre clair à jaune rosé moyen en masse (planches de couleur 2-9A de Maerz et Paul). Les phialospores mesurent de 1,4y££ à 4,2x 2,8JtX I 4,9/i j en moyenne 2,4^t x 3,5M* . Les spores sont polysymétriques, et ovales ou à peu près ovales 20 dans leur forme globale. La croissance du champignon varie sur les différents milieux. Sur les milieux nutritifs riches tels que le jus V-8 gélosé et le milieu de lactose-glycérol-peptone gélosé, les cultures croissent rapidement, pour atteindre des diamètres supérieurs 25 à 50 mm en 10 jours. La partie correspondant au développement aérien est floconneuse, tout d'abord blanche, puis devient ocre clair dans les cultures plus âgées. Les hyphes aériennes sont principalement composées de synnémas dressés à semi-dressés avec présence de quelques hyphes en cordonnets couchées. Sur les 30 milieux synthétiques, la croissance est lente, le mycélium aérien est épars ou absent, avec une sporulation peu développée. La couleur de la partie végétative est orangé moyen (planche 10—7F de Maerz et Paul). Cephalosporium chrysogenum ATCC 14615. 35 La description taxonomique de ce champignon est donnée par ' R.S. Sukapure and M. J. Thirmalachar, Studies on Cephalosporium Specias from India I, Mycologia LV, 563-569 (1963). Cephalosporium sp. NRRL 5712 Sur toutes les géloses suivantes les colonies présentent des 40 hyphes aériennes blanches en 3 jours et des nuances de rose 73 15149 C 2182136 jaunâtre en 5 jours. Les colonies développées sur solution de Czapek gélosée présentent les hyphes abondantes allant d'une forme floconneuse à une forme en cordonnet avec des synnéma à la fois dressés et 5 couchés. Elles forment des plis dans le sens radial, elles sont rondes, ont un bord entier, non fragmenté et atteignent 38 mm au départ d'une zone de 16 mm. Aucune fructification n'apparaît sur ces colonies après 14 jours. Elles sont rose jaunâtre modéré ; la couleur de leur envers est orangé vif. 10 Les colonies développées sur pommes de terre-dextrose gélosée sont jaune grisâtre clair. Les colonies croissent pour atteindre un diamètre de 37 mm au départ d'une zone d'inoculation de 18 mm de diamètre. Les colonies sur milieu de pommes de terre-dextrose gélosée ont des hyphes dont le développement aérien est faible, 15 elles apparaissent veloutées et sont en cordonnet et ont des synnémas dressés et couchés. Les stérigmates sont abondants et naissent de synnémas, de funicules, et d'hyphes rampantes, et élaborent des conidies en chaînes et en boules humides. Ce milieu est utilisé pour étudier encore le stade conidien. 20 Avec l'extrait de malte gélosé on obtient une colonie de 37 mm de diamètre en partant d'une zone d'inoculation de 16 mm de diamètre. Elle se présente d'un aspect .floconneux à un aspect en cordonnet et produit le plus de synnémas, mais le stade conidien est épars. La colonie est rose jaunâtre modéré et son envers est 2 5 orangé pâle. Le jus V--8 gélosé modifié donne une colonie qui a 37 mm de diamètre au départ d'une zone d'inoculation de 17 mm. Les hyphes aériennes sont légèrement plus longues que celles des colonies obtenues sur Czapek. La colonie est d'un rose jaunâtre modéré 30 et la couleur de l'envers est orangé jaunâtre brunâtre. Elle a un aspect floconneux à un aspect en cordonnet avec des synnémas pour là plupart couchés. Les stérigmates avec conidies apparaissent en nombre modéré. Les stérigmates sont hyalins, acuminés et ont une longueur 35 de 55,8^ à 92,l^ et en moyenne 66,2^/c . Ils vont en s'effilant de la base où ils mesurent 2,3/x. au sommet où ils mesurent 0f5yCt~-de large. Les conidies unicellulaires, hyalines,oblonges à elliptiques ont une longueur de 5,6jUk à 7,7//-et une largeur de 2,5 à 3,5^£(. 73 15149 2182136 Cephalosporium sp. NRRL 5716 Les colonies apparaissant sur les milieux gélosés décrits ci-dessus ne développent pas de mycéliunsaériens, libres, visiblesmacrosco-piguera^nt mais se présentait sous formede mycélium pâteux, humide, 5 plat, presque lisse qui comporte des plis radiaux légers. La solution de Czapek gélosée fournit une colonie qui,peut atteindre 32 mm de diamètre à partir d'une zone d'inoculation de 20 mm de diamètre. Les stérigmates naissent de synnémas couchés très serrés, et au hasard de la surface mycélienne. 10 Cette colonie est blanc jaunâtre pâle avec un pourtour entier, lisse. L'envers est blanc. Il y a production d'un pigment vert jaunâtre pâle soluble. Les colonies développées sur milieux de pommes de terre-dextrose gélosés ressemblent à celles développées sur Czapek du 15 point de vue taille, couleur, production de stérigmates, consistance, et pigment . Elles diffèrent en ce que les colonies développées sur milieu de pommes de terre-dextrose ont une bordure étroite, plissée radialement, laciniée. Après 14 jours, le pigment soluble devient plus intense. 20 Les colonies développées sur extrait de malt gélosé sont également identiques aux colonies développées sur solution de Czapek gélosée mais ne produisent pas de pigment soluble. Jusqu'à 7 jours cette colonie est blanche sur les deux surfaces et à 14 jours elle devient jaune verdâtre pâle sur les 2 5 deux surfaces. Le jus V-8 modifié gélosé donne une colonie qui est différente des colonies précédentes par plusieurs caractéristiques. Elle est brun clair et a des plis radiaux serrés, relativement profonds. L'envers est brun pâle et le mycélium pénètre bien dans 30 la gélose. Des touffes d'hyphes aériennes blanches, lâches, parsèment la surface. Microscopiquement, cette colonie est composée d'un feutrage d'hyphes irrégulières tissées serré dont les cellules sont gonflées et déformées. Sa vitesse de croissance est analogue à 3 5 celle des colonies obtenues sur solution de Czapek gélosée. La production de stérigmates est la plus importante sur ce milieu ? ils naissent à profusion de la surface de la colonie et des hyphes constituant les touffes. Ces stérigmates sont hyalins, monocellulaires, acuminés et sont des excroissances latérales 40 de filaments formant les hyphes. Ils mesurent de 20 j^à 46,5 lx, de 73 15149 2182136 long et de 2, 3>à4 tlyLK, de large à leurs bases, et en moyenne 39/37/t x 4/65yUL. Au sommet ils mesurent O, fï.x^de large. Les conidies sont reliées en chaîne ou en boules humides. Elles sont hyalines, monocellulaires, lisses et généralement 5 fusiformes. Quelques unes (peu) sont allantoïdes mais avec des extrémités presque effilées ? certaines sont naviculaires. Elles mesurent de 3,5i^à 7,0,^de long et de 1,4/U-à. 2,l/4^.ds large, en moyenne 5, Cephalospor ium sp . NRRL 5718 10 Le développement des colonies de mycélium aérien sur solution de Czapek gélosée est épars et incolore. Les hyphes sont irrégulières avec des cellules gonflées et déformées. Le milieu de pommes de terre-dextrose gélosé donne une colonie plate, zonée avec bandes alternées qui diffèrent par la 15 quantité de culture aérienne. La culture a un aspect en cordonnet et donne modérément des synnémas avec phialides productrices de conidies naissant de funicules, de synnémas et d'hyphes rampantes. Les conidies humides se disposent en chaînes ou en boules. Cette col nie est blanche jaunâtre pâle sur les deux 20 faces. Elle croît au départ d'une zone d'inoculation de 17 mm de diamètre pour donner une colonie qui a 40 mm de diamètre au bout de 10 jours à 26°C. Le stade conidien, la formation de zones, le développement des hyphes, la taille de la colonie sur extrait de malt gélosé sont 25 les mêmes que sur milieu de pommes de terre-dextrose gélosée. 11 existe une bordure incolore de 4 mm. La colonie sur extrait de malt est blanche grisâtre pâle et son envers est blanc jaunâtre pâle. Bien que la vitesse de croissance soit comparable à celle 30 obtenue sur les milieux précédents, les colonies obtenues sur jus V-8 modifié gélose présentent is développement le plus abondant des hyphes et des conidies. Cette colonie a un aspect qui va d'un aspect floconneux à un aspect en cordonnet, avec à la fois des synnémas dressés et couchés. Elle est entourée d'une bordure 35 presque veloutée, plate, de 3 mm de largeur, qui est légèrement ondulée. Le mycélium est rose jaunâtre pâle et légèrement blanc grisâtre sur le bord ; l'envers est havane grisâtre pâle. Le bord de la colonie est nettement contrasté par rapport à la partie principale de la colonie. 40 Les phialides sont des structures hyalines, monocellulaires, 73 15149 2182136 acuminées. Elles mesurent de 18,9//. à 29,4yU.de long et 2,8^ de large à leurs bases, en moyenne 24,6^ x 2,8^ . Les conidies sont hyalines, monocellulaires et elliptiques. Elles mesurent de 3,5\Jk à 4,2^/{ de longueur et 2,l^Z^.de largeur, 5 en moyenne 4,l/ £l . Cephalosporium sp. NRRL 5719 Le stade imparfait de cette moisissure est classé dans le genre Cephalospor ium Corda. Aucun stade parfait ne se produit. Les colonies sur solution de Czapek gélosée sont éparses, 10 incolores, et ne sporulent pas jusqu'à 10 jours à 26°C. La présence de nombreuses spores sur la surface de la gélose indique l'absence de germination sur cette gélose. Les colonies star extrait de malt gélosé ont tendance à se développer en donnant une culture relativement plate, et elles atteignent 29 mm de diamètre 15 à partir d'une zone d'inoculation de 17 mm de diamètre. La périphérie est nettement définie et légèrement festonnée. Des touffes occasionnelles d'hyphes d'aspect floconneux à aspect en cordonnet s'étendent au-dessus de la surface inférieure de l'ensemble des hyphes rampantes. Ces colonies sont blanches rosâtres 20 très pâles avec un envers blanc. Quelques phialides avec boules et chaînes terminales de conidies naissent des funicules rampants et des filaments individuels constituant les hyphes. Le milieu de pommes de terre-dextrose gélosée donne une colonie plate, crénelée qui est blanc huître sur les deux faces et qui se développe pour 25 atteindre un diamètre de 26 mm à partir de la zone d'inoculation de 18 mm de diamètre. Le mycélium aérien est constitué d'hyphes faiblement floconneuses et forme un tissage lâche avec des faisceaux d'hyphes en cordonnet d'où naissent de nombreuses phialides, dont quelques unes sont ramifiées latéralement. Les 30 conidies se forment au sommet des phialides (stérigmates) en boules humides et rarement en chaînes. Avec le vieillissement, les spores se rassemblent dans l'humidité le long des filaments des hyphes et des funicules. Le jus V-8 modifié gélosé donne le développement aérien le meilleur. Les hyphes aériennes blanches 35 deviennent beige avec de nombreuses spores. La surface est irrégulièrement floconneuse et contient à la fois des funicules et des synnémas et présente une bordure légèrement crénelée. Des phialides se développent latéralement à la fois sur les funicules et les synnémas. La sporulation a lieu sur milieu de 40 pommes de terre-dextrose gélosé . 73 15149 2182136 Les phialides sont monocellulaires, hyalines, et mesurent de 17yOuh. 26,4y6t.de long et 3large à leurs bases. Elles mesurent en moyenne 11^&-x 3^^ en s'effilant pour mesurer 1,5/^c. Les conidies sont hyalines, à parois épaisses, légèrement 5 rugueuses, et de formes globuleuses à elliptiques. Elles mesurent de 4,2/GL à 5,25/ét de long et de 2 ,1^£, à 3,5^£t&e large, et en moyenne 4,64/4. x 2,85/£(_. Cephalosporium sp. NRRL 5720 La culture sur solution de Czapek gélosée à 26°C pendant 10 jours 10 est éparse et il ne se développe pas de mycélium aérien. La colonie se développe largement sous la surface, s'étale seulement sur 3-5 mm, et a une bordure mal délimitée. Après 10 jours à 26°C le milieu de pommes de terre-dextrose gélosé produit une colonie qui s'étale jusqu'à atteindre 37 mm 15 à partir d'une zone d'inoculation de 12 mm de diamètre. Cette colonie est zonée avec des bandes alternées avec et sans mycélium aérien. Elle a un aspect qui va d'un aspect floconneux à un aspect en cordonnet et présentant des synnémas. La colonie est blanche jaunâtre et l'envers est jaune pâle. Les phialides 20 naissent de funicules, de synnémas et d'hyphes rampantes. Les colonies sur extrait de malt gélosé atteignent un diamètre de 31 mm au départ d'une zone d'inoculation de 16 mm. La colonie est zonée et limitée par une bordure étroite, non fragmentée,d'hyphes aériennes. La formation de zones, le stade 25 conidien et la couleur sont les mômes que ceux décrits pour les colonies développées sur milieu de pommes de terre-dextrose gélosé . Le jus V—8 modifié gélosé produit des colonies avec le mycélium aérien le plus développé, cette colonie se développe 30 à partir d'une zone d'inoculation ayant 13 mm de diamètre pour atteindre 37 mm de diamètre. Le mycélium aérien est dense et feutré, en cordonnet de façon accentuée, floconneux proche de laineux. La colonie est rose jaunâtre pâle ; son envers présente des anneaux alternés qui sont havane jaunâtre pâle au centre, 35 puis un anneau plus foncé, etc. Les phialides sont des structures longues, acuminées, tubulaires, hyalines dont les bases sont bulbeuses. Elles mesurent de 15,4/CL h 24,5de long, de 2,1^ à 3,5/dCde large à la base, en moyenne 19,9/i- x 2,5^ . 40 Les conidies sont généralement lisses — certaines sont 73 15149 10 2182136 verruqueuses -, hyalines et globuleuses à subglobuleuses. Elles ont un diamètre de 2,8à 4,9^/4 et en moyenne de 3,6 La culture sur Czapek gélose est éparse, non pigmentée et ne 5 sporule pas. Les colonies sur extrait de malt gélosé atteignent un diamètre de 28 mm au départ d'une zone d'inoculation de 15 mm de diamètre, en 7 jours à 26°C. Le mycélium aérien est floconneux à velouté. Microscopiquement, il a un aspect en cordonnet et présente des synnémas qui sont soit dressés soit couchés. La 10 colonie est zonée, présentant une bordure et une limite internes de nuanc® diverses. Elle est rose jaunâtre modéré entourée d'un bord qui est rose jaunâtre pâle • l'envers est vert jaunâtre pâle. Les colonies sur milieu de pommes de terre-dextrose qui se développent à partir d'une zone d'inoculation de 15 mm de diamètre 15 sont entourées d'une bordure crenelée, analogue à un voile incolore qui mesure S mm de large. La surface principale de la colonie mesure 30 mm de diamètre et est composée d'un feutrage aérien court, blanc, présentant un aspect qui va du floconneux à un aspect en cordonnet. Après 14 jours la colonie devient havane 20 pâle, l'envers est jaune orangé modéré avec une périphérie de nuances plus pâles. Les colonies sur jus V-8 modifié gélosé se développent au départ d'une zone d'inoculation de 15 mm de diamètre pour atteindre un diamètre de 38 mm y compris une bordure de 3-4 mm de large, 25 légèrement crenelée, incolore, analogue à un voile. Le corps principal de la colonie est constitué de filaments d'hyphes en cordonnet qui forment un tissage sur la surface à la manière d'une dentelle. La colonie est un peu floconneuse et présente des plis radiaux légers. Elle est brun pâle avec un envers brun 30 jaunâtre. Tous les milieux gélosés présentent des hyphes à synnémas mais cet état s'observe au mieux sur un milieu de pommes de terre-dextrose et sur un jus V-8 modifié gélosés. Les phialides hyalines, monocellulaires, lisses, naissent de synnémas et de 35 funicules rampants et se présentent sur les colonies sur milieu de pommes de terre-dextrose gélosée. 2,8/U> de large à leurs bases. Elles mesurent en moyenne 22,26/O-x 2,5/U^en s'effilant jusqu'à 0,7y£o. Les conidies sont 40 unicellulaires, lisses, hyalines et globuleuses à subglobuleuses. Cephalospor ium sp. NRRL 5721 73 15149 ii 2182136 Elles mesurent de 2,8/* à 4,9/t. de long et de 2,8/ Cephalospori\ra sp. NRRL 5722 Sur solution de Czapek gélosée la culture atteint 32 mm de 5 diamètre au départ d'une zone d'inoculation de 14 mm. Le mycélium est plat, incolore sur les deux faces, présente des courbes radiales et il n'existe pas de mycélium aérien. Les colonies sur extrait de malt gélosé se développent jusqu'à 36 mm de diamètre au départ d'une zone d'inoculation de 20 mm de diamètre. Les 10 hyphes aériennes sont en cordonnet et ont à la fois des synnémas dressés et couchés. La colonie présente des côtes radiales et est entourée d'une bordure plate, lisse, de 2 mm de large. Les phialides naissent à la fois de funicules et de synnémas avec bon développement conidien. Les colonies sur extrait de malt sont 15 havane rosâtre et la couleur de l'envers est blanc jaunâtre moyen. Les colonies développées sur milieu de pommes de terre-dextrose gélosé sont en cordonnet, ont un aspect velouté avec des filaments d'hyphes courts, dressés. Les conidies sont éparses. La culture donne une colonie blanche grisâtre avec une bordure 20 brun grisâtre moyen de 2 mm de large et l'envers est jaune moyen. Elle atteint 30 mm de diamètre au départ d'une zone d'inoculation de 16 mm de diamètre. Sur jus V-8 modifié gélosé les colonies ont des hyphes aériennes blanc grisâtre pâle qui deviennent beige à chamois avec la sporulation. L'envers est brun léger avec une, 25 bordure blanche jaunâtre de 3 mm. Une zone d'inoculation de 15 mm de diamètre se développe pour atteindre 34 mm de diamètre en 10 jours à 26°C. eette colonie présente un feutrage d'aspect relativement floconneux à un aspect en cordonnet et présente beaucoup de synnémas. 30 Le stade conidien s'observe sur tous les 3 milieux. Les phia lides sont hyalinôs, monocellulaires, effilées et acuminées. Elles mesurent de l,4^t à 3,5^de large à la base en s'effilant jusqu'à 1,4,**- et de ÎO,5/6. à 25,9^2, de longueur, en moyenne 20,2yU. x 3,15yCK>. Les conidies sont monocellulaires, hyalines, 35 elliptiques à ovales ou presque ovales, et forment soit les chaînes soit des boules mucoîdes. Elles mesurent de 2,1/^ à 2 ,8^ de large et de 3,5/ Cephalosporium sp. NllïvL 5723 Cette culture est caractérisée par son stade imparfait et est 40 du genre Cephalosporium Corda. Aucun stade parfait n'apparaît. 73 15149 2182136 Le développement est limité sur tous les milieux gélosés et se présente souvent sous forme d'une série de lobes irréguliers qui irradiënt du point d'inoculation. La solution de Czapek gélosée produit une colonie d'aspect 5 irrégulièrement crénelée à lobulaire et les lobes sont lacinés. La formation irrégulière de lobes a pour résultat des variations de diamètre, de 25 mm à 30 mm, au départ d'une zone d'inoculation de 12 mm. Les composants aériens libres sont épars et s'observent par voie microscopique. Ils sont constitués de phialides, 10 synnémas, faisceaux d'hyphes aériens parsemés. Cette colonie est incolore sur les deux faces. Les colonies sur milieu de pommes de terre-dextrose gélosé sont fortement et régulièrement lobées en ne donnant que des hyphes aériennes blanches limitées et sont entourées d'une bordure 15 lisse, de 3 mm de large. Elles mesurent de 30 mm à 35 mm de diamètre. Les synnémas à la fois dressés et couchés donnent des phialides qui engendrent des spores en chaînes ou en boules humides. Le mycélium végétatif est plat, brun grisâtre léger avec un envers brun jaunâtre pâle. 20 Les colonies sur extrait de malt sont fortement et régulière ment lobulares et ont une bordure étroite à plis radiaux. Elles sont rose brunâtre moyen avec un envers rose jaunâtre pâle. La production de phialides et de conidies ressemblent à celle des colonies obtenues sur milieu de pommes de terre-dextrôse mais 25 elle est plus importante en nombre. Le jus V-8 modifié gélosé produit une colonie dont le diamètre atteint jusqu'à 40 mm au départ d'une zone d'inoculation de 15 mm. Une bordure de 3 mm de largeur, irrégulièrement lobulée, incolore, sous la surface, entoure les colonies. Cette colonie 30 a un aspect qui va d'un aspect floconneux à un aspect en cordonnet, avec des synnémas et des hyphes aériennes apparaissant sous forme de surface plate avec développement plus dense et plus profond près de la bordure. Elle est rose brunâtre pâle et l'envers est jaune brunâtre léger. Les phialides naissent des synnémas, des 35 funicules et des hyphes rampantes. Les phialides s'observent, et sont décrites, avec des colonies développées sur milieu de pommes de terre-dextrose et sur jus V-8 modifié gélosés. Elles sont hyalines, unicellulaires, avec bases bulbeuses, et s'effilent doucement jusqu'au sommet 73 15149 13 2182136 23,0de long et de 2,1Jx à 2,8/iA-de large à leurs bases, en moyenne 19,0^ x 2 ,3/jl . Les conidies sont unicellulaires, hyalines, lisses et elliptiques à ovales. Elles mesurent de 2,8m à 5,6^/^de long et 5 de 2,1yU. à 3,5/4, de large, en moyenne 4,48/^ x.2,8yCl*. Cephalosporium sp. NRRL.5724 Les hyphes libres aériennes sont éparses sur tous les milieux décrits ci-après et se présentent sous forme de touffes floconneuses ou de faisceaux simples parsemés sur un mycélium d'aspect humide. 10 L'inoculum appliqué sur une zone de 17 mm de diamètre sur solution de Czapek gélosée, avec incuba ion à 26°C pendant 10 jours, donne une colonie de diamètre égal à 39 mm. Les points indentés d'une bordure irrégulièrement crénelée sont joints au centre de la colonie par des lignes radiales de développement 15 moindre. Des phialides parsemées naissent de la surface mycélienne plate et portent des boules humides de conidies. Le mycélium est blanc jaunâtre pâle ; l'envers est blanc. Les colonies sur extrait de malt gélosé se développent à partir d'une zone d'inoculation de 1G mm de diamètre pour atteindre 20 37 mm de diamètre. Ce type de colonie a une bordure de 4 mm de large qui est analogue à un voile et dont le bord externe est indistinct. La partie principale de la colonie est plate et lisse et présente des touffes irrégulièrement espacées placées de manière circulaire la séparant de la bordure. Des phialides parsemées 25 portant des boules humides de conidies apparaissent au hasard sur la surface havane rosâtre pâle. L'envers de la colonie est blanc jaunâtre pâle. Le milieu de pommes de terre-dextrose gélosé , ensemencé sur une zone d'inoculation de 14 mm de diamètre, donne une 30 colonie qui mesure 35 mm de diamètre. La bordure mesure 4 mm de large, est analogue à un voile et est pour la plupart immergée. Cette colonie est plate et lisse avec des touffes d'hyphes pair semées ayant un aspect qui va d'un aspect floconneux à un aspect en cordonnet. Les phialides produisent des conidies en chaînes 35 courtes ou en boules humides mais sont relativement peu nombreuses et bien éparpillées sur toute la surface. Cette colonie est jaune orangé pâle sur les deux faces mais est légèrement plus pâle sur l'envers. La partie colorée est irrégulièrement lobée. Les colonies sur jus V-8 modifié gélosé se développent à 40 partir d'une zone d'inoculation de 15 mm de diamètre pour atteindre 73 15149 14 2182136 34 mm de diamètre. Une bordure de 3-7 mm de largeur analogue à un voile entoure une zone centraie plus dense et est irrégulièrement lobée. Les composés aériens libres sont épars. La portion centrale plate, presque pâteuse, est blanc jaunâtre 5 pâle sur les deux faces. Les cellules mycéliennes sont gonflées et déformées. Il n'y a pas de production de pigment soluble. La culture, sur ce milieu gélosé, ressemble à celle de C. chrvsogenum. Les phialospores sont lisses, monocellulaires, hyalines et 10 elliptiques. Elles mesurent de 4,2^/t à 5,6/4. de long et de 2,1/t à 3,5^t de large, en moyenne 5,27^/Ox 3,58/jl . Les phialides sont hyalines, tubulaires, formées latéralement sur des hyphes rampantes. Elles mesurent de 10,5^^, à 19,6^/cde long et de 2,1/t-à 3,5^. de large à leurs bases ; en moyenne 15 15,89^-x 2,5/ju* Elles sont effilées vers le sommet où elles mesurent 1,0 de large. 73 15149 « 2182136 Cephalosporium sp. NRRL 5725 Cette culture se développe de manière épaacse sur solution de Czapek gélosée et produit un mycélium non pigmenté ».à bordure indéterminée. La culture se développe modérément bien sur milieu 5 de pommes de terre-dextrose gélosé et sur extrait de malt gélosé; le développement est abondant sur un jus V-8 modifié gélosé. Les colonies sont décrites après 10 jours à 26°C. Sur extrait de malt gélosé une zone d'inoculation de 15 mm de diamètre se développe en une colonie de 30 mm de diamètre. 10 Elle est de couleur blanc brflnatre pâle; l'envers est incolore. La partie centrale de la colonie présente nettement des synnémas dans un réseau d'hyphes d'aspect allant d'un aspect en cordonnet à un aspect floconneux. Elle aune bordure légèrement festonnée d'hyphes aériennes courtes entrelacées avec des synnémas à la 15 fois dressés et couchés. Le jus V-8 modifié gélosé produit une colonie qui est uniformément dense et marquée de rides radiales. La périphérie est faiblement festonnée. La colonie est gris-brunâtre, et légèrement plus foncée sur les rides et la périphérie. L'envers 20 est brun jaunâtre pâle. Il a d'un aspect qui va d'un aspect en cordonnet à un aspect floconneux avec des synnémas à la fois dressés et couchés. Il se produit une colonie de 32 mm de diamètre au départ d'une zone d'inoculation de 15 mm de diamètre. Sur milieu de pommes de terre-dextrose gélosé la culture 25 donne une colonie de 28 mm au départ d'une zone d'inoculation de 15 mm de diamètre. La colonie est mince, analogue à un voile, et d'aspect en cordonnet. La périphérie est doucement festonnée. Il existe des plis radiaux légers qui se relient aux indentations du feston. La colonie est incolore sur les deux faces. 30 Des phialides divergentes naissent des funicules, des synnémas et des hyphes rampantes, ces phialides sont doucement effilées, l^alines, lisses et non ramifiées. Elles mesurent 3 p de large à la base et 0,5 p. de large au sommet. Elles mesurent de 9,5 à 35,0 ja de long et en moyenne 22 ji x 3 p. 35 Les conidies se mettent en forme de boules humides ou de chaînes au sommet des phialides. Ces conidies sont hyalines, lisses, mono-cellulaires et subglobuleuses à elliptiques. Elles mesurent de 2,1 p à 3,5 pde large et de 2,1 ji à 4,2 p de long, en moyenne 3,43 p x 2,63 p. 73 15149 « 2182136 Emericellopsis - Morphologie générale Les cléistothèces sont globuleux* glabres et mesurent de 25 à 120 microns de diamètre avec un péridium sub-hyalien. Les ascospores sont mono-cellulaires, ellipsoïdales, à paroi 5 foncée avec 3 à 6 ailes longitudinales caractéristiques. Les ascocarpes contiennent de quelques asques (moins de 5) à plusieurs asques à 8 spores qui ont des parois fragiles. Morphologie et caractéristiques culturales des souches de Emericellopsis 10 Emericellopsis sp. NRRL 5713 Cette moisissure appartient à la famille des Eurotiaceae et possède à la fois un stade conidien et un stade ascogène. La souche A16005 est classée comme étant Emercellopsis von Beyma. La solution de Czapek gélosée donne une culture aérienne 15 dense mais ni l'un ni l'autre type de spores. La colonie s'étale pour atteindre un diamètre de 37 mm à partir d'une zone d'inoculation de 18 mm de diamètre à 26°C pendant 10 jours. Les hyphes aériennes, tout d'abord blanches, deviennent rose jaunâtre modéré. L'envers est orange Vif. il se forme des synnémas et des hyphes 20 en cordonnet. L'extrait de malt gélosé produit une colonie à synnémas, d'aspect allant d'un aspect floconneux à un aspect en cordonnet; cette colonie atteint 32 mm de diamètre au départ d'une zone d'inoculation de 18 mm. Elle est jaune orangé pâle et l'envers 25 est rose jaunâtre pâle. Aucune fructification ne se forme en 14 jours. Le milieu de pommes de terre-dextrose gélosé- produit une colonie qui atteint 32 mm de diamètre à partir d'une zone d'inoculation de 18 mm de diamètre. La colonie est zonée, avec un 30 mycélium aérien épars, court,blanc sur un feutrage terne, jaune orangé pâle, dont l'envers est rose jaunâtre pâle. On note la présence de quelques périthèces épars,-- mais les conidies sont abondantes. Le jus V-8 modifié gélosé produit une colonie qui atteint 35 31 mm de diamètre au départ d'une zone d'inoculation de 18 mm de diamètre, cette colonie est plissée radialement, elle a un aspect qui va d'un aspect en cordonnet à un aspect floconneux, elle est rouge jaunâtre pâle avec un envers orangé moyen. Les phialides proviennent de synnémas, de funicules et d'hyphes 40 rampantes; cependant le stade conidien est un peu masqué par le 73 15149 i7 2182136 stade ascogène. Les clêistothèces sont noirs , glabres et globuleux à subglobuleux avec des parois épaisses de cellules pseudoparenchyma-teuses. Ils mesurent de 57,4 p à 131,7 p de diamètre et en moyenne 5 86,57 p. Un cléistothèce contient deux asques ou plus. Les asques sont hyalins, à parois épaisses, et fragiles. ïls mesurent en moyenne 28 p de diamètre. Ils contiennent 8 ascospores brunes, ovales qui sont ornementées longitudinalement de 3 à 5 ailes dentelées qui mesurent 1,5 p de large. Ces spores 10 mesurent de 6,3 p à 8,4 p de long et 4,2 p de large. Elles font en moyenne 7,4 p x 4,2 p. Les phialides sont hyalines, lisses et occasionnellement ramifiées. Elles mesurent de 35 p à 70 p de long et en moyenne 49 p. Elles mesurent 2,5 p de large à la base et s'effilent 15 doucement pour mesurer 0,5 p en leurs sommets. Les conidies sont rassemblées en boules humides aux sommets des phialides. Elles sont lisses, hyalines et elliptiques et mesurent de 2,5 p à 3,0 p de large, de 3,5 p à 8,4 p de long, en moyenne 8,0 p x 2,8 jû Les ramifications de phialides peuvent mesurer jusqu'à 54 p de 20 long et produisent également des conidies. Emericellopsis sp. NRRL 5714 Ce champignon appartient à la famille des Eiirotiaceae et présente à la fois un stade conidien et un stade ascogène et est caractérisé comme étant l'espèce Emercel1opsis von Beyma. De nombreux cléisto-25 thèces apparaissent sur jus v-8 modifié gélosé qui donne une colonie dont le centre est virtuellement noir. La partie restante de la colonie est d'ion gris rougeâtre foncé; l'envers est orangé brunâtre. Sur ce milieu gélosé les colonies sont zonées (ce qui s'observe le mieux sur la face envers), plissées radialement, 30 crénelées, et ont un aspect qui va d'un aspect floconneux à un aspect en cordonnet. En trois semaines il se produit un pigment noir soluble. La colonie se développe pour atteindre un diamètre de 37 mm en 10 jours à 26°C au départ d'une zone d'inoculation de 20 mm. Sur ce milieu gélosé il apparaît également un stade 35 conidien modérément dense. Le milieu de pommes de terre-dextrose gélosé donne une colonie qui s'étale au départ d'une zone d'inoculation de 2C mm de diamètre pour atteindre un diamètre de 38 mm en 10 jours à 26°C. Il se forme de nombreux clêistothèces immatures. Les conidies 40 sont relativement lourdes. Le mycélium est en cordonnet et 73 15149 is 2182136 développe à la fois des synnéiftas dressés et couchés. La colonie est rose jaunâtre pâle et est entourée d'une bordure de 3 mm faite d'hyphes libres, aériennes, incolores; l'envers est jaune orangé moyen. 5 Les colonies sur extrait de malt gélosé peuvent atteindre un diamètre de 37 mm au départ d'une zone d'inoculation de 20 mm de diamètre. On note la présence de conidies mais le stade ascogène ne se développe pas. La colonie est jaune-orangé pâle sur les deux faces. Elle est en cordonnet et développe à la fois 10 des synnémas dressés et couchés. Sur solution de czapek gélosée les constituants aériens se développent faiblement. La colonie est relativement plate et brillante. Elle atteint 44 mm de diamètre au départ d'une zone d'inoculation de 20 mm de diamètre. Cette colonie est verte 15 jaunâtre pâle sur les deux faces avec un bord incolore de 4 mm fait d'hyphes sous la surface. Les hyphes ont des formes irrégulières, altérées et présentent des vacuoles. Sur jus V-8 modifié gélosé les clêistothèces sont brun foncé à noir, glabres, globuleux à subglobuleux et mesurent de 28 p. à 20 85 p de diamètre, ils mesurent en moyenne 56,6 p de diamètre. Ils contiennent des asques subglobuleux qui sont incolores et fragiles. Ces asques mesurent 18,6 p de diamètre et chacun d'eux contient 8 ascospores brunes. Les spores présentent longitudinale-' ment 3 à 5 ailes et mesurent 2 p de large. La taille des ascospores 25 se situe entre 8,4 p et 11,2 p de longueur et 4,9 p et 7,0 p de — largeur; elle est en moyenne de 10,0 p x 5,6 p. On observe un stade conidien typique de Cephalosporium sur milieu de pommes de terre-dextrose gélosé . Les phialides naissent de funicules, de synnémas et d'hyphes rampantes. Elles., sont 30 unicellulaires, hyalines et doucement effilées de la base au sommet. Leurs bases mesurent 2 p de large; le sommet 0,5 p de large. Elles mesurent 20 p à 60 y de long et en moyenne 40 x 2 Les conidies qui naissent auxsommets des phialides et forment des boules humides, sont hyalines, lisses, unicellulaires et 35 elliptiques. Elles mesurent de 2,1 p à 4,2 p de large et de 3,5 p à 7,0 p de long, en moyenne 3 p x 5p. Emericellopsis sp. NRRL 5717 Ce champignon produit à la fois un stade ascogène et un stade conidien. Il est classé comme un membre de la famille des 40 Eurothiaceae. ce champignon est classé comme étant Emercellopsis von 73 15149 i9 2182136 Beyma. Ces deux stades de fructification sont décrits sur jus v-8 modifié gélosé mais apparaissent également sur milieu de pommes de terre-dextrose gélosée. Aucune fructification n*apparaît sur solution de Czapek gélosée ou sur extrait malt gélosé en 14 jours 5 à 26°C. La solution de Czapek gélosée produit une colonie de 35 mm de diamètre dont la périphérie est entière et virtuellement circulaire. Cette colonie se développe à partir d'une zone d'inoculation de 18 mm de diamètre. Les hyphes aériennes les 10 plus denses apparaissent sur ce milieu etla colonie a un aspect velouté. L'examen microscopique révèle la présence de synnémas et d'hyphes rampantes en cordonnet. La colonie est rose jaunâtre modéré et l'envers est orangé jaunâtre à orangé vif. L'extrait de malt gélosé donne une colonie qui ne présente 15 virtuellement pas de constituants aériens, qui est plate, terne, et orangé jaunâtre pâle. L'envers est blanc jaunâtre pâle. Sa vitesse de développement est voisine de celle d'une colonie sur Czapek. Les colonies sur milieu de pommes de terre -dextrose gélosé 20 se développent à partir d'une zone d'inoculation de 16 mm de diamètre pour atteindre 35 mm de diamètre. La surface de la colonie est floconneuse à laineuse. Il existe à la fois des synnémas dressés et couchés qui donnent naissance à des phialides. Cette colonie est rose jaunâtre pâle et son envers est jaune 25 orangé pâle. Le jus V-8 modifié gélosé donne une colonie qui se développe à partir d'une zone d'inoculation de 20 mm de diamètre pour atteindre 39 mm de diamètre. Le mycélium à synnémas, présentant un aspect qui va d'un aspect floconneux à un aspect en cordonnet 30 présente un stade à conidies lourdes. De nombreux clêistothèces hyalins apparaissent en 6 jours et deviennent ensuite noirs, glabres et globuleux à subglobuleux en 10 jours. Ils contiennent de nombreux asques hyalins, fragiles qui, de leur côté, contiennent 8 ascospores. Ces ascospores sont brun moyen et 35 ovale et ornementées longitudinalement de 2 à 6 ailes déchiquetées qui mesurent 0,5 }i de large. Des clêistothèces apparaissent dans les hyphes aériennes v^a bien peuvent être partiellement ou totalement immergés dans la gélose. Ils mesurent de 16 p à 116 p. de diamètre, en moyenne 40 50 ji et peuvent contenir seulement 2 asques. Les asques mesurent . 73 15149 2182136 29 p de diamètre. Les ascospores ont des parois relativement épaisses. Elles mesurent 5,6 p à 7,0 p de long et 2,8 p à 4,9 p de large, en moyenne 16 ^ x 3,8 p. Les phialides sont ramifiées ou non ramifiées, hyalines, 5 lisses et deviennent acuminées. Les phialides ramifiées peuvent mesurer 30 p de long. En général, les phialides mesurent de 30 p à 70 p de long et 1,5 p de large à la base. En moyenne elles mesurent 51,3 p de long. Les conidies apparaissent à l'extrémité des phialides et forment des boules humides. Les conidies sont 10 hyalines, lisses, fusiformes approchant la forme elliptique, et mesurent de 8,4 p à 14,0 p de long. La largeur est comprise entre 3,5 p et 6,3 p. Les conidies mesurent en moyenne 4,7 p x 11,5p Emericellopsis sp. NRRL 5446 Les clêistothèces se forment en abondance sur jus v-8 gélosé 15 et modérément sur milieu de pommes de terre-dextrose gélosé . La croissance est éparse sur Czapek gélosé. Les clêistothèces sont brun foncé à noir brunâtre, glabres, globuleux à subglobuleux, mesurant de 35 p à 68 p, en moyenne 50 p de diamètre. Le péridium a une épaisseur d'environ 5 p , est brun pâle et constitué 20 d'hyphes entrelacées de manière serrée. Les asques sont subglobuleux, mesurant de 14 p à 21 p de diamètre. Les asques sont à 8 spores et il y a un à plusieurs asques par ascocarpe. Les ascospores sont ellipsoïdales à ovales, mesurent 5,6 p - • 7,0 p x 8,4 p - 10,5 p, en moyenne 6,2 p - 10,1 p, sont brun 25 foncé, lisses présentent des ailes proéminentes, habituellement quatre, se projetant longitudinalement, d'environ 2 p, et équidistantes de la paroi de l'ascospore. Des indentations irrégulières apparaissent sur le bord des ailes. Autrement la surface des ascospores est lisse. 30 II se forme également un stade conidien de Cephalosporium mais il est épars sur tous les milieux. Sur le milieu de pommes de terre-dextrose gélosé , des phialides non ramifiées, hyalines, mesurant en moyenne 38 p x 1,6 p, effilées aux sommets, naissent d'hyphes en synnémas aériennes ou couchées. Les spores apparaissent 35 habituellement en chaînettes courtes de 5 à 6, se terminant en une boule humide. Les conidies sont hyalines, monocellulaires, subglobuleuses à ovales, mesurent 5,5 p -6,5 p x 10 p - 12 p, habituellement 5,8 p x 10,6 p. La culture se développe modérément sur jus V-8 gélosé et 40 sur milieu de pommes de terre-dextrose gélosé ■. Les colonies 73 15149 21 2182136 sur jus v-8 gélosé ont un aspect qui va d'un aspect floconneux à un aspect en cordonnet, le mycélium aérien est blanc à brun pâle et le mycélium du substrat a un aspect gris bleu. La couleur de l'envers est orangé brunâtre dans les cultures jeunes. 5 Emericellopsis sp. NRRL 5447 Cet organisme est un champignon à clêistothèces appartenant à la famille des Eurotiaceae. Les clêistothèces se forment en abondance en 5 jours sur jus V-8 gélosé; ils sont parsemés sur milieu de pcmmes de terre -dextrose gélosé . Le développement est très 10 faible sur Czapek gélosé. Les ascocarpes sont globuleux, glabres, brun à noir brunâtre, ont 25 p à 120 p de diamètre, habitue lieraient environ 70 p; le péridium est transparent, hyalien à brun clair, mesure 5 - 6,0 p d'épaisseur; les ascocarpes, situés au hasard dans le mycélium 15 du substrat, contiennent un ou plusieurs asques. Les asques sont globuleux à subglobuleux, irréguliers, fugitifs, mesurent 14 p à 18 p de diamètre, et contiennent chacune 8 spores. Les ascospores sont ellipsoïdales à ovales, brun foncé, monocellulaires, avec quatre ailes longitudinales brun pâle ayant des bords 20 dentés modérément et peuvent dépasser de 2,1 p. Il se forme également un stade conidien en abondance sur milieu de pommes de terre-dextrose, et épars sur jus v-8 gélosé. Les conidiophores sont des phialides provenant d'hyphes aériennes, couchées, en cordonnet. Les conidiophores sont hyaliens, non 25 ramifiés, lisses, mesurent essentiellement 3 p x 28 p, avec des cloisons basales. Les conidies sont monocellulaires, globuleuses, subglobuleuses à presque ovales, polysymétriques, mesurant 2,8 p - 8,4 p x 3,5 p- 11 p; en moyenne 7 p x 6,5 p; les conidies se groupent en têtes globuleuses, s'agglomérant avec 30 les têtes conidiennes adjacentes. Les cultures se développent modérément; la couleur de l'envers est orangé brunâtre, la surface de la culture est blanche à gris bleuâtre, avec un aspect allant d'un aspect floconneux à un aspect en cordonnet. 35 Le stade imparfait de cet organisme est une forme de Cephalosporium. 73 15149 22 2182136 Morphologie et caractéristiques culturales de Scopulariopsis Scopulariopsis sp. NRRL 5715 Les caractéristiques de cette culture correspondent à la description 5 de Scopulariopsis Bainier (1) faite par Rapeir et Thom La production de conidies à parois lisses ou à parois rugueuses provenant de phialides latérales et de phialides terminales mais non en verticiUes, ainsi que les couleurs et les descriptions des colonies indiquent que cette culture se place probablement 10 entre le groupe III de Râper et Thom qui est représenté par Scopulariopsis brevicaulis var. glabra Thom et le groupe IX qui est représenté par S,, diversispora. La croissance de/c1iampignon sur solution de Czapek gélosée est éparse et incolore. Il n'y a aucune fructification. 15 Sur milieu de pommes de terre-dextrose gélosé il se forme une colonie qui se développe à partir d'une zone d'inoculation de 22 mm de diamètre pour atteindre un diamètre de 34 mm en 10 jours à 26°C. La sporulation est rare et limitée à la zone d'inoculation qui corfc ient les éléments nutritifs entraînés dans 20 l'inoculum. Le mycélium est incolore sur les deux faces et a un bord lisse régulier. L'extrait de malt gélosé est une colonie qui se développe à partir d'une zone d'inoculation de 15 mm de diamètre pour atteindre un diamètre de 33 mm. Cette colonie est rose jaunâtre 25 pâle sur les deux faces avec un bord incolore de 4 mm de largeur plissé radialement. Des hyphes en cordonnet et des synnémas à la fois dressés et couchés produisent des phialides qui donnent naissance à des conidies généralement en chaînettes mais occasionnellement en boules humides. 30 Le jus v-8 modifié gélosé donne le meilleur développement de colonies avec constituants aériens. La colonie atteint 33 mm à partir d'une zone d'inoculation qui a un diamètre de 15 mm. Une zone marginale de 3 mm de largeur, comparablement plate, qui n'est pas aussi bien développée, est veloutée, marquée de 35 zones de sporulation radiales "en doigts". La partie centrale plus large de cette colonie est de couleur havane pâle, résultat d'une sporulation relativement dense. Cette région présenta beaucoup de synnémas. La couleur de l'envers est brun moyen, mais après lo jours cette couleur fonce pour devenir brun 40 chocolat clair. 73 15149 23 2182136 Le milieu utilisé pour décrire le stade conidien de cette culture est le milieu de pommes de terre-dextrose gélosé . Les phialides naissent de synnémas et de funicules; certaines sont des prolongements terminaux des conidiophores. Elles ont des 5 formes uniformes, sont élargies à la base et deviennent acuminées. Elles mesurent 2,1 p de large à la base et 0,5 p de large aux sommets. Les phialides ont 17 p à 34 p de longueur et mesurent en moyenne 19,4 p x 2,1 p. Les conidies ont des parois rugueuses ou bien sont lisses, 10 hyalines, non cloisonnées, globuleuses à subglobuleuses et possèdent typiquement des bases tronquées qui sont caractéristiques du genre Scopulariopsis. Les spores lisses sont elliptiques à ovales, généralement plus petites et sont probablement non mures. On observe les deux types de spores sur les colonies développées 15 sur jus V-8 modifié gélosé. Les conidies lisses mesurent de 3,5 p à 4,9 p de long et de 1,4 p à 2,1 p de large, en moyenne 4,1 p x 1,9 p. Les spores rugueuses mesurent 3,5 p à 5,6 ji de long et 2,8 p à 4,2 p de large, en moyenne 4,3 p x 3,6 p. Ces surfaces conidiennes rugueuses varient d'un aspect verruqueux 20 à un aspect échinulé et ressemblent à des spores de Pénicillium. Il n'apparaît pas de stade parfait avant 14 jours. Référence : Râper, K.B. & Thom, C. 1949. A manual of the Penicillin. The Williams and Wilkins Company, Baltimore. 697-701. ^ Morphologie et caractéristiques culturales de Paecilomyces Paecilomyces carneus NRRL 5711 A13215 est classé comme étant une souche de Paecilomyces carneus (Duché et Heim) dans l'ordre des Moniliales. Généralement les colonies sont veloutées à floconneuses, variant dans la profondeur du feutrage aérien selon le substrat. La culture sur solufeien da Czapek gélosée est relativement mince et quelque peu en cordonnet. Les colonies sont habituellement blanches, devenant légèrement colorées au fur et à mesure du 35 développement des conidies. La périphérie est parfois légèrement crénelée et sur Czapek on remarque particulièrement une bande de mycélium profondément immergée. La couleur de l'envers présente des nuances qui vont du verdâtre brillant au jaune et sur certains milieux des nuances de brun. 73 15149 24 2182136 Des conidiophores ramifiés qui ont de 100 à 30Q p de long naissent du milieu gélosé et des hyphes aériennes rampantes. Les ramifications bifurquées peuvent atteindre des longueurs de 40 p. Fréquemment, des ramifications secondaires ou des sous— 5 ramifications de 10 à 15 p apparaissent. Des stérigmates se forment selon de nombreux modèles sur les conidiophores et ses ramifications. ils peuvent apparaître aux sommets comme un seul stérigmate ou bien en verticilles en comportant jusqu'à 5. Ils peuvent être en spires le long de l'axe principal avec des entre-noeuds de 5 à 10 20 p. Généralement les stérigmates en verticilles sont largement divergents. Les mêtulas sont plus fréquentes mais se rencontrent parfois en verticilles et seul un stérigmate simple y est fixé. Des stérigmates séparés qui sont fortement divergents et souvent plus longs apparaissent le long du conidiophore et de ses 15 ramifications. La forme des stérigmates est typique de ce genre. Ils sont souvent lancéolés, virtuellement cylindriques et à partir de la base sur approximativement 75% de leur longueur et s'amincissent brusquement pour former un long tube mince d'environ 5,0 p x 0,5 20 Les conidies sont unicellulaires, subglobuleuses à elliptiques sèches et présentent de fines rugo-sités, du fait qu'elles sont échinulées à pointues. Elles sont en longues chaînes et les spores semblent maintenues ensemble par un pont de liaison, dont une partie peut se voir sur les conidies libres sous forme 25 de petites plaques de moins de 1 p de long et 1 p de large. Ces caractéristiques de surface s'observent le mieux avec un objectif à immersion dans l'huile avec éclairage à contraste de phase. En plus de ces conodies, on voit des macrospores terminales à parois épaisses (4,9 p x 3,5 p) sur certaines hyphes qui ont 30 100 p x 3 p de long et sortant librement du feutrage mycélien. Les colonies sur solution de Czapek gélosée à 26°C peuvent atteindre 32 mm de diamètre en 10 jours avec ensuite un développement faible ou restreint vers l'extérieur. Elles sont relativement plates avec une surface veloutée à floconneuse et sont modérément 35 en cordonnet.La culture en surface et sous la surface ressemble à du cuir; la culture sous la surface s'étale en éventail pour former une bordure nette à la colonie. Après 5 jours, les colonies sont blanches et deviennent blanc jaunâtre (ISCC-NBS, 92), ours polaire (Maerz & Paul, 9-B-2) au bout de 10 jours. Au fur et à 40 mesure que le nombre de conidies augmente il apparaît une nuance 73 15149 2182136 rose très pâle. La couleur de l'envers est vert jaunâtre foncé (ISCC-NBS, 137), vert civette (Maerz & Paul, 22-F-8). Après 3 semaines, l'envers est vert jaune clair (ISCc-NBS, 119), vert jonc (Maerz & Paul, 19-D-i). Les structures conidiennes 5 varient de stérigmates uniques, qui peuvent soient être au saiumet de l'axe principal du conidiophore ou de ses ramifications soient en diverger fortement, en verticilles de 2-5 stérigmates placés au sommet. Occasionnellement, on voit une ou deux spires de stérigmates entourant le conidiophore au-dessous du verticille 10 apical avec des entre-noeuds de 5-20 ji. Les stérigmates sont à parois lisses et sont lancéolés . Ils mesurent de io,5 à 16,5 p de long et en moyenne 14,35 ji x 2,1 ji, la largeur étant mesurée sur la surface la plus large. Les stérigmates divergents individuels peuvent atteindre 20 p. Les conidiophores produisent 15 des ramifications divergentes et ces ramifications peuvent produire des sous-ranifications. Les conidiophores sont à parois lisses et mesurent 2-4 ji de large. De longues chaînes de conidies hyalines, échirtulées à pointues, qui sont reliées par un pont 20 de jonction, naissent des stérigmates. En masse, ces conidies sont jaune pâle. Elles sont subglobuleuses à elliptiques et mesurent de 2,1 à 3,5 p de long et de 1,75 à 2,8 p de large en moyenne 2,3 x 3,3 p. Sur extrait de malt gélosé la colonie se développe pour 25 atteindre 30 mm en 10 jours avec peu de changement ultérieur. Le centre peut être ridé et la colonie s'étend vers l'extérieur en plis radiaux. Une bordure presque blanche, de 3 mm, veloutée - vert jaune pâle (ISCC-NBS, 121), vert écume de mer (Maetz & Paul, 18-A-l) - entoure un centre floconneux à velouté qui est 30 gris verdâtre clair (ISCC-NBS, 154), vert lichen (Maerz & Paul, 2 6-A-2). L'envers est zoné, à une couleur jaune verdâtre au centre entouré d'une zone annulaire concentrique qui ast vert jaunâtre clair (ISCC-NBS, 115), vert Tibre (Maerz & Paul, 18-E-6). Les formes et modèles de conidies, de stérigmates et de conidio-35 phores sont tels que décrits antérieurement. Les conidies mesurent 2,1-3,5 p de large et 2,8 - 4,9 p de long, en moyenne 3,3 x 4,5 ^i. Les stérigmates mesurent de 12,6 à 14,0 p de long et 2,8 à 4,9 p de large, en moyenne 13,2 x 3,6 p. Les conidiophores et ramifications sont conne sur le milieu de Czapek. En outre, des macrospores simples que l'on peut désigner sous le nom 40 d'aleurospores se développent au sommet des filaments des hyphes 73 15149 2182136 qui semblent provenir des milieux gélosés et du feutrage d'hyphes aériennes rampantes. Sur milieu de pommes de terre-dextrose gélosé la vitesse de croissance est identique. La colonie est légèrement crénelée. 5 Le centre est un feutrage quelque peu floconneux presque velouté qui est également quelque peu en cordonnet et est entouré par une périphérie en secteurs constituée d'hyphes aériennes courtes. Le centre est gris jaunâtre (ISCC-NBS, 93), cendre de bois (Maerz & Paul, 2 7-A-l) ? la périphérie est gris moyen (ISCC-NBS,265), 10 platine (Maerz & Paul, 43-A-3) . La couleur de i"'envers est vert olive grisâtre (ISCC-NBS, 127) , Vert bronze (Maerz & :%aul, 16-J-7) . On ne peut confondre A13215 avec jP. carneus, Duché et Heim comme il est décrit par A.H.S. Brôwn and G. Smith dans "The Genus Paecilomyces Banier..." Trans. Brit. Mvcol.Sac. 40 (I), 17-89 15 (1957). Les stérigmates de A13215 apparaissent vraisemblablement plus longs. Les aleurospores observées sur milieu de pommes de terre-dextrose gélosé ont été observées dans d'autres espèces de Paecilomyces comme l'indiquent Râper & Thom dans le "Manual of the Penicilli". 20 D'autres cultures productrices de pénicilline N qui ont été utilisées dans le présent procédé, en raison de leurs ressemblances taxonomiques avec Paecilomyces carneus NRRL 5711, ont été classées comme appartenant au genre Paecilomyces. Deux de ces cultures sont identifiées comme étant Paecilomyces carneus A.T.C.C. 16329 25 et P. carneus nrrl 2622. 73 15149 2182136 Caractéristiques morphologiques de Diheterospora ch3 amvdosporia Les phialides apparaissent isolément, ou en spires ou en conidiophores simples ou ramifiées. Les phialides sont légèrement 5 gonflées à la base et s'amincissent en un sommet en aiguille. Les phialospores sont ovoïdes à cylindriques courtes, lisses, hyalines, mesurent habituellement de 1,5 à 2 microns x 2 à 5 microns. Les aleurospores qui sont caractéristiques de l'espèce sont larges (15 à 30 x 10 à 20 microns), muriformes, à parois épaisses, 10 légèrement pigmentées en brun, et multicellulaires et portées par des pedicelles courts. Les colonies sont blanches à blanc .'-aie, se développent rapidement, sont densément floconneuses avec un bord régulier, abrupt. Il n'y a pas production de pigment soluble. 15 Connue il a été indiqué antérieurement les chanpignons utiles dans 1© procédé de cette invention sont tous caractérisés en outre comme étant des producteurs de pénicilline N. De plus, les champignons décrits précédemment ont la caractéristique morphologique commune de former des phialospores à partir de phialides 20 qui proviennent soit simplement d'hyphes soit de conidiophores ramifiées ou non ramifiées. Les organismes Emericellopsis de l'invention étant le stade sexuel parfait de Cephalosporium ne présentent pas cette caractéristique morphologique. Ils ne présentent pas de stade conidien (Cephalosporium) qui a cette 25 caractéristique. La majorité des souches décrites précédemment de Cephalospor ium Emericellopsis, Scopulariopsis, Paecilomyces et Diheterospora ont été déposées sans restriction quant à leur disponibilité, à la collection de culture permanente du Northern Régional Research 30 Laboratory, Agricultural Research Service, United States Department of Agriculture, peoria, Illinois 61604, où on a attribué aux cultures les numéros qui apparaissent dans la description taxonomique précédente suivant les noms de cultures respectifs. 35 Les autres cultures portant la désignation A.T.C.C., ainsi Cephalosporium chrysoqemim A.T.C.C. 14615 et Paecilomyces carneus A.T.C.C. 16339 cnt été déposés sans restriction quant à leur disponibilité à la collection de culture permanente de l'American Type Culture Collection, 12301 Parklawn Drive, Rockville, 40 Maryland 20852. 73 15149 20 2182136 Comme il a été indiqué antérieurement{ un organisme utilisant la présente invention est cultivé par la méthode de fermentation aérobie en immersion. Le milieu de culture utilisé peut être l'un quelconque d'un certain nombre de milieux différents. 5 Par exemple, on peut utiliser diverses sources de carbone telles que saccharose, glucose, amidon et sources carbonées analogues. De même, on peut choisir les sources d'azote dans une grande variété de substances telles que farine de soja, gruavKde soja, huile de coton, farine d'arachide, amino-acides, mélange d*amino-10 acide s,peptones, etc. Cependant, pour des raisons d'économie de production, de rendement maximum et de facilité d'isolement certains milieux ont la préférence, par exemple, les ci-lasses peuvent constituer une source préférée de glucides et les sources préférées d'azote sont la farine de soja et les amino-acides. 15 Les sels minéraux nutritifs/s^ont incorporés au milieu de culture peuvent comprendre les se3s usuels capables de fournir les ions sodium,potassium,ammonium, calcium, phosphate, sulfate, chlorure, bromure, nitrate, carbonate, fer ferreux et fer ferrique, magnésium, manganèse, etc. Les champignons de la 20 présente invention, comme les autres micro-organismes producteurs d'antibiotiques, ont besoin de certains oligo-éléments essentiels pour leur croissance, leur développement et leur métabolisme. Ces oligo-éléments peuvent être ajoutés au milieu de fermentation ; cependant, ils sont couramment fournis en quantités suffisantes 25 sous forme d'impuretés des autres ingrédients ajoutés au milieu de culture. Les organismes de la.présente méthode, c'est-à-dire Cephalosporium, Emericellopsis, Scopulariopsis, Paecilomyces et Diheterospora, peuvent être cultivés dans un équipement de petite 30 taille telle que des flacons d'un litre, destinés à être secoués, pour donner de petites quantités de désacétoxycéphalosporine c. Pour la production à grande échelle du composé de céphalosporine, les organismes peuvent être cultivés dans des réservoirs de fermentation de grande échelle dans des conditions de fermentation 3 5 aérobie en immersion. Lorsqu'on réalise la préparation à grande échelle de la désacétoxycéphalosporine c,on entretient l'organisme sur un tube de gélose inclinée. On utilise les spores provenant dû tube de gélose inclinée pour ensemencer un petit volume d'un milieu 40 végétatif. On met le milieu végétatif à l'incubation pour obtenir 73 15149 29 2182136 une culture du micro-organisme abondante, neuve, se développant activement. On utilise alors cette culture végétative comme inoculum pour le milieu de fermentation à grande échelle. Dans certains cas, il peut être souhaitable d'inclure encore du milieu 5 végétatif comme inoculum du milieu de fermentation. Ces milieux végétatifs de second stade, sont couramment utilisés lorsque le volume du milieu de fermentation est beaucoup ou pratiquement plus grand que le volume du premier milieu végétatif. Ainsi, on cultive les spores de l'organisme tout d'abord sur un petit 10 volume de milieu végétatif pour obtenir un inoculon destiné à un milieu végétatif de volume plus grand. Le milieu végétatif de volume plus grand fournit alor* une concentration suffisante de l'organisme pour assurer un démarrage rapide de la fermentation dans le réservoir de fermentation à grande échelle. La milieu 15 végétatif peut avoir la même composition que le milieu de fermentation ou bien il peut contenir d'autres ingrédients pour stimuler la croissance et le développement de l'organisme sur une petite échelle. On voit que les micro-organismes de la présente méthode se 20 développent et produisent de la désacétoxycéphalosporine C dans une gamme de pH d'environ 6,2 à environ 8,0. pendant la fermentation aérobie en immersion dans les réservoirs à grande échelle, le pH du milieu passe d'un pH initial d'environ 6,5 à un pH final d'environ 7,5. 25 Les organismes de cette invention peuvent être cultivés à des températures comprises entre environ 20 et 35°C. La production de rendements optimaux de désacétoxycéphalosporine C semble avoir lieu à une température d'environ 26°C. La production maximale de désacétoxycéphalosporine C a lieu 30 lorsque l'organisme est cultivé dans des réservoirs à grande échelle pendant une durée comprise entre environ 4 et 7 jours. Cependant, lorsque la culture est effectuée dans un appareil à petite échelle, comme des flacons de 1 litre pour secoueuse, la croissance de l'organisme est plus rapide et il produit de la 35 désacétoxycéphalosporine C dans un temps plus court, par exemple deux à trois jours. Etant donné qu'il seable que, si le pH final du milieu de fermentation à grande échelle atteint 8,0 ou plus, le rendement en désacétoxycéphalosporine C peut subir un effet nuisible, 40 il est souhaitable de réguler le pH du milieu de fermentation 73 15149 2182136 de grande échelle de temps en tempsdans la fermentation. S'il semble que le pH va atteindre ces valeurs avant le moment où la production maximale d'antibiotiques a lieu, on peut abaisser le pH de manière commode en ajoutant un acide ou un agent tampon 5 approprié au milieu de fermentation. On peut suivre la production de désacétoxycéphalosporine c pendant la fermentation en testant des échantillons du bouillon de fermentation par chromatographie. Sinon, on peut suivre la présence de la désacétoxycéphalosporine c à l'aide de bioautographes 10 peut utilise: l'organisme pseudomonas solana ;earcum comme organisme détecteur dans les bioa.utographes. Comme avec la plupart des fermentations aérobies ^n immersion, on fait passer de l'air stérile dans le milieu de culture pour obtenir une croissance plus efficace de l'organisme et une 15 augmentation de la production des produits de fermentation. Le volume d'air introduit dans le milieu de culture est habituellement d'au moins approximativement 0,2 volume d'air par minute par volume de milieu de culture. Cependant, l'augmentation de la vitesse de passage de l'air peut souvent avoir un effet bénéfique 20 sur la production de désacétoxycéphalosporine C. La majorité des champignons utiles dans le procédé, outre le fait de produire de la désacétoxycéphalosporine C et la pénicilline N caractéristique, produisent également de la désacétylcéphaiosporine C de la céphalosporine C et occasionnel-25 lement la lactone formée avec la désacétylcéphaiosporine C ainsi que d'autres métabolites non identifiés. Etant donné que certaines des substances précédentes sont labiles aux acides, il est souhaitable au cours de la récupération de la désacétoxycéphalosporine C dans le milieu de fermentation, de traiter le bouillon 30 de fermentation total à un pH acide pendant un temps court afin de détruire certaines des impuretés produites simultanément. Dans les fermentations à petite échelle, la pénicilline N peut être détruite par l'addition d'une pénicillinase au bouillon. On récupère le produit de fermentation, la désacétoxycéphalos-35 porine c du bouillon de fermentation filtré ainsi traité et on la sépare des autres constituants du milieu de fermentation en faisant une chromatographie sur une résine échangeuse d'ions et on le purifie ultérieurement par chromatographie sur cellulose, ou gel de silice suivie d'une précipitation et d'une 40 recristallisation. 73 15149 3i 2182136 Initialement, on soumet le bouillon de fermentation filtré à une purification préliminaire qui peut comprendre une extraction initiale par un solvant organique non miscible à l'eau tel que n-butanol, acétate d'amyle, pour éliminer les impuretés. 5 On peut alors purifier encore de manière préliminaire le bouillon extrait en faisant une chromatographie sur charbon activé. On chromatographie le bouillon extrait sur une colonne garnie de charbon activé par exemple charbon Pittsburgh 12 x 40, et on lave la colonne à l'eau pour éliminer les impuretés colorées solubles 10 dans l'eau et les produits minéraux solubles dans l'eau. On élue alors les produits de fermentation du charbon avec un mélange à 50 pour cent acétone-eau. On concentre l'êluat en phase aqueuse que l'on chromatographie alors sur une résine échangeuse d'anions basique . Parmi les résines échangeuses d'anions basiques qui 15 peuvent être utilisées on trouve celles du type ammonium quaternaire-polystyrène, par exemple celles que l'on trouve dans le commerce sous le nom de Dowex 1, Dowex 2 (Dow Chemical Co., Midland, Mich.) et celles désignées sous le nom de IRA-400, IRA—45, IRA—68 (Amberlite, Rohm and Haas, Philadelphia, Pa.). La résine peut être 20 sous forme hydroxyle, acétate, formate, ou autres formes appropriées. On verse l'êluat concentré provenant de la colonne de charbon sur la résine échangeuse anionique et ensuite on lave la résine à l'eau. La désacétoxycéphalosporine C est éluée de la résine échangeuse sous forme sel par une base faible appropriée, par 25 exemple lorsqu'on utilise la colonne sous forme acétate, on utilise de préférence le solvant éluant sous forme de solution aqueuse d'acétate de sodium à une concentration environ 1 N ou moins. La concentration de la solution d'acétate de sodium n'est pas essentielle ; cependant, afin d'éviter la présence de sel 30 minéral en excès, (acétate de sodium), dans l'êluat provenant de la colonne échangeuse, la concentration souhaitable en acétate de sodium est comprise entre environ 0,1 N et 0,5 N. Une concentration particulièrement préférée pour l'élution, qui évite un excès de sel dans l'êluat est une concentration 0,15 N. Lorsque la 35 résine échangeuse utilisée est sous la forme formate ou une autre forme appropriée, le sel correspondant peut être utilisé en solution aqueuse comme solvant éluant. Par exemple, le formate d'ammonium peut être utilisé lorsque la rccine est sous la forme formate. On recueille les multiples fractions et on réunit les 40 fractions contenant la désacétoxycéphalosporine C telle que 73 15149 ,2 2182136 déterminées par bioautographe. On chromatographie ensuite les éluats réunis sur charbon activé pour éliminer les sels minéraux en excès, par exemple l'acétate de sodium qui a été utilisé dans la solution saline d'élution. On lave la colonne de charbon à 5 l'eau pour éliminer ces sels minéraux solubles dans l'eau et l'on élue alors la désacétoxycéphalosporine C de la colonne avec un mélange d'acétone et d'eau à 50 pour cent. On évapore l'êluat jusqu'à siccité ou bien, sinon, on l'évaporé pour éliminer l'acétone et ensuite on lyophilise la solution aqueuse concentrée 10 pour obtenir par l'un ou l'autre procédé la désacétoxycéphalosporine c sous forme d'un produit solide brut. On purifie ultérieurement la préparation brute de désacétoxycéphalosporine c par chromatographie sur cellulose ou sur gel de silice ou un autre adsorbant non ionique approprié. On élue 15 la désacétoxycéphalosporine c de la colonne avec un mélange 80:20 acêtonitrile:eau et on recueille les fractions multiples. On réunit les fractions contenant la désacétoxycéphalosporine C, tellesque déterminéespar chromatographie sur papier ou à l'aide de bioautographes utilisant l'organisme d'essai Pseudomonas 20 solanacearcum et on les concentre à un petit volume ou jusqu'à siccité. On dissout alors le résidu aqueux fortement concentré ou le résidu sec dans une quantité minimale d'alcool isopropylique et on verse la solution alcoolique dans un grand volume d'éther diéthylique. On obtient la désacétoxycéphalosporine C purifiée 25 sous la forme du sel correspondant à l'agent éluant aqueux utilisé dans l'élution de la résine échangeuse anionique. Par exemple, lorsqu'on utilise l'acétate de sodium comme agent éluant, on obtient la désacétoxycéphalosporine C sous forme du sel monosodique. On filtre la forme sel de la désacétoxycêphalos-30 porine c et on la sèche. Les conditions de récupération préférées de la présente méthode sont les suivantes. On acidifie le bouillon de fermentation total à pH 2 en y ajoutant de 1' acide sulfurique et on agite, en remuant, le bouillon pendant une heure à la température 35 ambiante. On ajuste ensuite le pH du bouillon à 6,0 avec de l'hydroxyde de sodium et ensuite on filtre le bouillon alcalinisê à l'aide d'un adjuvant de filtration pour séparer le mycélium et les autres insolubles. Ensuite on extrait le bouillon aqueux par le n-butanol pour éliminer les autres impuretés et on chromatogra-40 phië le bouillon extrait sur charbon activé. On lave la colonne 73 15149 2182136 de charbon à l'eau et on en élue le produit de fermentation avec un mélange acétone-eau à 50 pour cent. On concentre l'êluat en une phase aqueuse et on chromatographie la phase aqueuse sur une résine échangeuse ammonium quaternaire anionique sous forme 5 acétate, de préférence, la résine ammonium quaternaire-polystyrène que l'on peut obtenir dans le commerce et qui est désignée sous le nom de Amberlite IRA-68 (Rohm and Haas, Philadelphia, Pa). On lave tout d'abord la résine échangeuse à l'eau et on élue la désacétoxycéphalosporine C et les autres substances produites 10 simultanément avec une solution aqueuse d'acétate de sodium 0,15 N. On adsorbe les éluats actifs sur du charbon activé, et on lave la colonne à l'eau pour éliminer les sels solubles dans l'eau tels que l'acétate de sodium en excès entraînés des éluats de résine. On élue la désacétoxycéphalosporine C du charbon avec 15 un mélange acétone-eau à 50 pour cent. Ensuite on évapore l'êluat jusqu'à siccité pour obtenir la désacétoxycéphalosporine C brute sous forme de sel de sodium. On purifie la substance brute de préférence par chroiûatographie sur colonne de cellulose (Avicel pH 101). On élue la colonne de cellulose avec un mélange 20 d'acétonitrile:eau (80:20), et on recueille les fractions multiples. On réunit les fractions contenant la désacétoxycéphalosporine C, la détermination étant faite par bioautographe, et ensuite on évapore jusqu'à siccité sous vide. On dissout le résidu solide sec de désacétoxycéphalosporine c dans la quantité minimale 2:5 d'alcool isopropylique. On verse ensuite la solution alcoolique dans l'éther diéthylique pour précipiter le sel monosodique de la désacétoxycéphalosporine C. Dans une autre méthode d'isolement de la désacétoxycéphalosporine C, on concentre l'êluat provenant de la résine échangeuse 30 anionique sous forme acétate en l'évaporant et on ajoute une solution aqueuse à 20 pour cent d'acétate de sodium au concentré. On agite le concentré en le remuant et en refroidissant pour précipiter le sel monosodique de la désacétoxycéphalosporine C. On peut transformer la forme sel de la désacétoxycéphalos-3 5 porine C en acide libre par les méthodes couramment utilisées pour transformer de tels sels en acides. Par exemple, on peut faire passer le sel sur une résine échangeuse cationique pour obtenir la forme acide libre. Le système chromatographique qui est utilisé pour identifier 40 la désacétoxycéphalosporine C dans les bouillons de fermentation 73 15149 2182136 bruts ou dans les fractions d'élution de la résine est entraîné sur du papier pour chromatographie Whatman N° 1 dans le sens descendant. Le système solvant utilisé pour le développement est un mélange acétonitrile:eau (80:20 V:V) tandis que la chambre 5 est saturée des vapeurs du mélange solvant constitué de n-propa-nol:pyridine:acide acétique:acétonitrile:eau dans les proportions de 45:30:9:40:36 en volume par volume. Les chromatogrammes développés sont ensuite traités comme des bioautographes à l'aide de Pseudomonas solanacearcum comme 10 microorganisme détecteur . Afin de simplifier la chromatographie il est souhaitable de traiter l'échantillon expérimental par une pénicillinase avant de développer le chromatogramme. Les exemples suivants illustrent plus en détail la présente 15 invention. EXEMPLE 1 On ensemence séparément des spores de Cephalosporium sp. souche NRRL 5445, de Cephalosporium chrysogentim A.T.C.C. 14615, d'Emericellopsis sp. souche NRRL 5446 et d'Emericellopsis sp. 20 souche NRRL 5447 sur un tube incliné de gélose nutritive ayant la composition suivante : Ingrédient Pour cent (poids/volume) Lactose 1 Glycérol 1 2 5 Peptone de soja"'" 0,25 2 Solubles séchés de maïs et de malt 0,25 Sulfate de magnésium heptahydraté 0,05 Sulfate ferreux heptahydraté 0,001 Carbonate de calcium 0,2 3 30 Solution d'oligo - éléments 0,625 Gélose 2 Eau pour amener au volume 1. Produit de digestion enzymatique de la farine de soja 2. "Produlac", National Distiller Products Co. 35 3. La solution contient les sels suivants pour 100 ml d'eau désionisée : Poids Sel *0,102 g CuSO,, 5KL0 0,018 g FeSOT, 7^0 40 0,126 g MnCl~? -*H^0 0,024 g ZnSO^, 7^0 73 15149 35 2182136 On met les tubes de gélose inclinés à l'incubation pendant environ 7 jours à une température de 26°C. On recouvre les cultures inclinées mûres d'eau distillée stérile et on les gratte doucement avec une baguette stérile pour obtenir des suspensions 5 de spores. On utilise chacune des suspensions de spores ainsi obtenues pour ensemencer deux milieux de culture végétatife stériles. séparés ayant la composition suivante : Ingrédients Pour cent (poids/volume) 10 Farine d'arachide 2 Extrait de malt 2 Liqueur de macération de maïs (corn steep) O,5 Sulfate de magnésium heptahydraté 0,025 15 Phosphate monopotassique 0,1 Phosphate bipotassique 0,05 Chlorure de calcium dihydraté 0,01 Solution d'oligo- éléments"*" 0,625 Eau po'jr amener au volume 20 1. voir la note 3 précédente. On ajuste le pH des milieux végétatifs à 6,5 avant de mettre à l'autoclave. On met les milieux végétatifs ensemencés à l'incubation à une température de 26°C sur une secoueuse rotative (250 tpm) ayant une oscillation de 5 cm pendant 43 heures. 25 On utilise alors les milieux végétatifs incubés comme inoculum pour le milieu de fermentation dans une proportion de 1 pour cent de milieu végétatif par volume de milieu de fermentation. Les milieux de production stérile utilisés ont la composition suivante : 30 Ingrédients Pour cent (poids/volume) Saccharose 4 Glycérol 1 Glutamate de sodium O, 5 Farine d'arachide 2 35 Sulfate d'ammonium et de fer (II) hexahydraté 0,3 Nitrate de potassium 2,0 Carbonate de calcium 0,3 Eau pour amener au volume 40 On utilise facultativement un agent tensio-actif ou un agent 73 15149 36 2182136 " a nt~. il mous se" dans la réalisation de la fermentation à grande échelle. On ajuste le pH des milieux de fermentation à 6,5 avant la stérilisation. Ensuite on met à l'incubation les milieux de fermentation ensemencés en agitant à une température de 26°C 5 pendant cinq jours, pendant la fermentation, on fait passer de l'air stérile dans les milieux de fermentation à un débit correspondant à environ 1/2 volume d'air par volume de milieu de culture par minute. Le pH final des milieux de fermentation est de 7,5. 10 On acidifie 15 litres de chacun des bouillons totaux obtenus comme il a été décrit précédemment pour les amener à pH 2 avec l'acide sulfurique. On agite, en remuant, les bouillons totaux acidifiés pendant une heure à la température ambiante et ensuite on ajuste le pH à 6,0 avec une solution d'hydroxyde de sodium. 15 On filtre les bouillons et on extrait le filtrat aqueux par le n-butanol pour éliminer les insolubles en suspension. Ensuite on fait passer les phases aqueuses sur des colonnes garnies de charbon activé et on lave les colonnes à l'eau distillée. On rejette l'êluat provenant du lavage à l'eau. Ensuite on élue les 20 colonnes avec une solution aqueuse d'acétone à 50 pour cent. On évapore les éluats sous vide pour obtenir les phases aqueuses que l'on chromatographie alors sur des colonnes garnies de résines ammonium quaternaire-polystyrène (Amberlite IRA 68) sous forme acétate. On lave tout d'abord les colonnes à l'eau et on rejette 25 l'eau de lavage. Ensuite on élue les produits de fermentation actifs des colonnes avec une solution aqueuse d'acétate de sodium 0,15 N. On recueillie les fractions multiples et on réunit les fractions provenant de chacune des opérations et contenant la désacétoxycéphalosporine C. 30 La présence de désacétoxycéphalosporine C dans les fractions d'élution pour chaque cas est déterminé par bioautographe. Le système utilisé pour chacun est le suivant : on effectue la chromatographie initiale de façon descendante en utilisant un papier de qualité chromatographie Whatman N° 1 non traité. 35 Le solvant d'élution est un mélange acétonitrile:eau (80 pour cent:20 pour cent). On met au fond de la chambre de chromatographie une couche de mélange solvant contenant 300 ml d'une solution constituée de 37,5 pour cent de n-propanol, de 25 pour cent de pyridine, de 7,5 pour cent d'acide acétique et de 30 pour cent 40 d'eau, que l'on dilue avec 100 ml d'acétonitrile. On détermine 73 15149 37 2182136 la localisation de la désacétoxycéphalosporine C sur le chroma-tographe en réalisant un bioautographe avec le chromatogramme développé et en utilisant l'organisme Pseudomonas solanacearcum comme organisme détecteur. 5 On réunit les fractions obtenues dans lesquelles le procédé chromatographique décrit précédemment a montré qu'il se trouvait de la désacétoxycéphalosporine c. Ensuite on absorbe les fractions réunies sur une colonne garnie de charbon activé, et on lave initialement la colonne avec de l'eau distillée pour éliminer 10 les produits minéraux solubles, par exemple l'acétate de sodium. Ensuite, on élue la colonne avec une solution aqueuse d'acétone à 50 pour cent. On évapore l'êluat sous vide jusqu'à siccité pour obtenir une préparation solide brute de sel sodique de désacétoxycéphalosporine C. 15 On purifie ultérieurement la substance brute par chromato graphie sur une colonne garnie de cellulose (Avicel pH 101). On élue l'antibiotique de la colonne de cellulose à l'aide d'un mélange solvant constitué d'acétonitrile et d'eau (80:20). On recueille les fractions multiples et, en utilisant le système 20 chromatographique décrit précédement pour la détection, on réunit les fractions qui se sont révélées contenir la désacétoxycéphalosporine C. On concentre alors à siccité les fractions réunies et on dissout le résidu sec contenant la désacétoxycéphalosporine C dans la quantité minimale d'isopropanol. On verse la solution 2 5 alcoolique dans une quantité d'éther correspondant à environ 20 volumes de la solution isopropanolique. Lorsqu'on agite en remuant, il se forme le sel de sodium de la désacétoxycéphalosporine c sous forme d'un précipité. On filtre le précipité et on le sèche à l'air pour obtenir 126 mg de l'antibiotique sous 30 forme de sel de sodium. EXEMPLE 2 En suivant les procédés décrits dans l'Exemple 1, on cultive des spores de Emericellopsis sp. NRRL 5714 en passant par le stade de milieu végétatif en utilisant pratiquement le même milieu 35 végétatif. On utilise alors le milieu cultivé pour ensemencer un milieu de production ayant la composition suivante : 73 15149 2182136 Ingrédients Pour cent (poids/volume) Amidon soluble 1,0 Dextrose 4,0 Gruaux de soja 1,0 5 Carbonate de calcium 0,5 Agent anti-mousse 0,1 Eau à amener au volume On ajuste le pH du milieu de production à 6,5 avant de l'autoclaver avant ensemencement. 10 On laisse la fermentation se faire pendant cinq jours à environ 26°C et on isole la désacétoxycéphalosporine c en suivant les procédés de récupération et d'isolement décrits dans l'Exemple 1. EXEMPLE 3 15 En suivant les procédés de culture décrits dans l'Exemple 1, on fait germer des spores de Scopulariopsis sp. NRRL 5715 et on les cultive dans le milieu végétatif décrit dans l'Exemple 1. On utilise le milieu végétatif pour ensemencer un milieu de fermentation ayant la composition du milieu de fermentation décrit 20 dans l'Exemple 1. On effectue la fermentation pendant 5 jours à environ 26°C et on récupère la désacétoxycéphalosporine c du milieu de fermentation par les procédés décrits dans l'Exemple 1. EXEMPLE 4 En utilisant les milieux, les procédés de culture et les 2 5 méthodes de récupération de l'Exemple 1, on cultive Paecilomyces carneus NRRL 5711 et on le fait fermenter pour obtenir la désacétoxycéphalosporine C. EXEMPLE 5 En suivant les procédés de culture et d'isolement et en 30 utilisant les milieux décrits dans l'Exemple 1, on cultive Diheterospora chlamydosporia NRRL 5728 et on le fait fermenter pour obtenir la désacétoxycéphalosporine C. 73 15149 39 2182136 REVENDICATIONS 1. Procédé de production de la désacétoxycéphalosporine C, qui consiste à cultiver, dans un milieu de culture nutritif aqueux dans des conditions de fermentation aérobie en immersion, un 5 micro-organisme producteur de pénicilline N appartenant au genre Cephalospor ium, Emericellopsis, Scopulariopsis, Paecilomyces ou Diheterospora jusqu'à ce qu'une quantité substantielle de désacétoxycéphalosporine C soit produite par ledit micro-organisme dans ledit milieu de culture, et à isoler la désacétoxycéphalos-10 porine C dudit milieu de culture. 2. Le procédé de la revendication 1, dans lequel le microorganisme est Cephalosporium Corda NRRL 5445. 3. Le procédé de la revendication 1, dans lequel le microorganisme est Cephalospor ium chrvsoqenum ATCC 14615. 15 4. Le procédé de la revendication 1, dans lequel le microorganisme est Emericellopsis sp. NRRL 5446. 5. Le procédé de la revendication 1, dans lequel le microorganisme est Emericellopsis sp. NRRL 5447. 6. Le procédé de la revendication 1, dans lequel le micro-20 organisme est cephalosporium sp. NRRL 5711, Cephalosporium sp. NRRL 5716, Cephalosporium sp. NRRL 5718, Cephalosporium sp. NRRL 5719, Cephalosporium sp. NRRL 5720, Cephalospor ium sp. NRRL 5721, Cephalospor ium sp. NRRL 5722, Cephalosporium sp. NRRL 5723, Cephalospor ium sp. NRRL 5724 ou Cephalospor ium sp. 25 NRRL 5725. 7. Le procédé de la revendication 1, dans lequel le microorganisme est Emericellopsis sp. NRRL 5713, Emericellopsis sp. NRRL 5714 ou Emericellopsis sp. NRRL 5717. 8. Le procédé de la revendication 1, dans lequel le micro- 30 organisme est Scopulariopsis sp. NRRL 5715, Paecilomyces carneus NRRL 5711 ou Diheterospora chlantydosporia NRRL 5728. 9. La désacétoxycéphalosporine C lorsqu'elle est produite par le procédé de l'une des revendications 1 à 8.