FR 2137478 A1 19721229 FR 7211004 A 19720329 72 11004 i 2137478 La présente invention concerne un vaccin tué ayant un excellent pouvoir immunisant, qu'on a préparé en utilisant le micro-organisme Bordetella bronchiseptica utile à la prévention de la rhinite atrophique du porc, ainsi qu'un procédé de préparation d'un tel vaccin. 5 La rhinite atrophique du porc existe dans divers pays du monde, et a des répercussions économiques importantes sur l'élevage industriel du porc, car elle gêne la croissance et diminue le rendement alimentaire. L'agent causal de cette maladie est essentiellement Bordetella bronchiseptica comme l'ont vérifié expérimentalement R.F. Cross et coll. (Amer. 10 Vet. Med. Assoc., Vol. 141, 1467 (1062), J.R. Duncan et coll. (Amer. Jour. Vet. Res. Vol. 27, 457 (1966)), R.F. Ross et coll. (Vet. Med., Vol. 58, 566 (1063)), Shimizu et coll. (Jap. J. Vet. Med. Vol. 32 Supplément, 30 (1970)), et la demanderesse (Jap. J. Vet. Med., Vol. 33 Supplément (1971)). Pour empêcher cette maladie, on administre de façon 15 continue des agents chimiques, tels que des antibiotiques, des sulfamides, etc. Cependant, récemment, la suppresdon de cette maladie est devenue difficile par suite de l'apparition de micro-organismes résistant aux médicaments.. De plus, il se pose des problèmes tels que l'apparition d'une surinfection, due à l'administration continue des agents chimiques, et la 20 limitation de l'administration des antibiotiques, pour des raisons de santé publique et d'économie. C'est pourquoi, les procédés de prévention de cette maladie, utilisant dès agents chimiques, ne sont pas toujours satisfaisants et, actuellement, on recherche un procédé approprié de prévention de cette maladie. 25 En 1969, J. R. Ganaway et coll. ont annoncé que la vaccination empêchait la pneumonie du cobaye provoquée par Bordetella Bronchiseptica (Lab. Anim. Care, Vol. 15, 156 (1965)). Par suite de cela, D.L. Harris et coll. ont préparé un caccin inactivé par la formaline de ce micro-organisme, et ont tenté en vain d'empêcher la rhinite atrophique 30 du porc en utilisant ce vaccin, et ont dirigé leurs efforts vers un vaccin vivant atténué en estimant que le mécanisme immunitaire du porc est différent de celui du cobaye. (Am. J. Vet. Res., Vol. 30, 1161 (1969)). La demanderesse a réussi à provoquer la rhinite atrophique du porc par l'inoculation de Bordetella bronchiseptica et confirmé que ce 35 micro-organisme est l'agent pathogène de la rhinite atrophique du porc. La demanderesse a de plus découvert qu'un vaccin, préparé à partir d'un Bordetella bronchiseptica possédant un antigène K, a un pouvoir protecteur net, tandis qu'un vaccin, préparé à partir d'un Bordetella bronchiseptica n'ayant pas d'antigène K, ne possède pas ce pouvoir. B 4.503 Jap 72 11004 2 2137478 On prépare le vaccin tué de l'invention en utilisant comme matière de départ un Bordetella bronchiseptica en phase I isolé, par exemple, des voies respiratoires du porc ou du chien, possédant de façon suffisante un antigène K et un antigène capable de protéger la souris contre 5 l'infection intracérébrale provoquée par ce micro-organisme. L'organisme en phase I précité, décrit dans la publication de la demanderesse (Kitasato Arch. Exp. Med. Vol. 30, 57 (1957)), est un germe gram négatif qui a sur un milieu gélosé au sang une forme de coccus ou de coccobacille ayant une capsule ou une enveloppe et peu ou pas de flagelles, et qui présente une agglutination 10 forte avec un sérum anti K, mais une agglutination faible ou légère avec un sérum anti 0, qui est très virulent lorsqu'on l'injecte dans le cerveau de la souris, et provoque des nécroses toxiques importantes lorsqu'on l'injecte par voie intradermique au cobaye. Le sérum anti K est un sérum de lapin préparé en adsorbant un sérum de lapin immunisé par un organisme en phase I avec un 15 organisme en phase.(III ou un organisme en phase I chauffé entre 100 et 120°C ; l'organisme en phase Illest un organisme en phase I qui a perdu sa capsule ou son enveloppe ; et le sérum anti 0 est un sérum de lapin immunisé par un organisme en phase I ou un organisme en phase III chauffé entre 100 et 120°C. Le vaccin tué de l'invention possède un excellent pouvoir 20 immunisant et est très sûr, il empêche la maladie chez le porc par injection ou inhalation, et peut conférer au porc une excellente immunité de façon précise et économique. Le vaccin de l'invention a des propriétés telles que, lorsqu'on l'injecte par voie intrapéritonéale à la souris, et qu'on injecte 10 jours après Bordetella bronchiseptica dans le cerveau de la souris à des 25 quantités égales à 10 à 100 DL^q (la DL^^ étant la quantité de micro-organisme capable de tuer 50 % des souris), les souris ne présentent pas d'infection et, également, lorsqu'on l'injecte au porc ou au lapin, ils produisent des anticorps (anticorps K) capables d'agglutiner fortement les organismes en phase I. 30 Pour préparer le vaccisi tué de l'invention, on utilise généralement comme milieu de base, un milieu gélosé au sang. Ceci est dû au fait que la présence ou l'absence d'antigène K dans Bordetella bronchiseptica est un facteur clé important qui commande le pouvoir protecteur du vaccin, consne précédemment indiqué, et le sang du milieu gélosé au sang empêche la 35 disparition de l'antigène K. Cependant, il est difficile de se procurer une quantité importante de sang pour préparer le vaccin. Par conséquent, la demanderesse a étudié les composés protégeant l'antigène K, qu'on peut utiliser à la place du sang, et a vérifié qu'une combinaison particulière 72 11004 3 2137478 d'un hydrolysat de caséine vendu par la Société Difco sous le nom de Casamino acid, d'extrait de levure et de charbon activé ou de résine échangeuse d'ions, est bien supérieure au sang, et qu'un vaccin, préparé à partir d'un micro-organisme cultivé dans un milieu contenant cette combinaison, 5 a un effet préventif excellent. Ainsi,-la demanderesse a-t-elle rendu extrêmement facile la préparation en grande quantité du vaccin de l'invention. La combinaison, qu'on peut utiliser à la place du sang, est constituée de 0,5 à 1,0 % en poids de Casamino acid, de 0,05 à 0,1 % en poids d'extrait de levure et de 0,1 à 0,5 % en poids de poudre de charbon 10 activé ou de 0,3 à 1,0 % en poids de résine échangeuse d'anions, par rapport au poids d'un milieu de base solide ou liquide, tel qu'une gélose ou un bouillon nutritifs (voir "Methods in Microbiology", pages 116-117, édité par J. R. Norris et D. W. Ribbons, Academic Press, 1970). On incorpore cette combinaison au lieu du sang au milieu de base constitué de la gélose ou du 15 bouillon nutritifs. On prépare le vaccun tué selon l'invention de telle sorte qu'on cultive un Bordetella bronchiseptica en phase I possédant un antigène K dans le bouillon au charbon ou la gélose au charbon pour retenir suffisamment de substance active et permettre la production en grande quantité, puis on 20 tue les cellules obtenues, et on inactive un lysat des cellules en chauffant entre 50 et 60°C, en utilisant un agent chimique, tel que le Thimerosal (éthylmercurithiosalicylate de sodium) ou la formaline, ou selon un procédé physique utilisant un broyeur à vibration ou une presse dite "French press" (dispositif pour désintégrer les bactéries par action d'un piston se 25 déplaçant rapidement dans un récipient cylindrique, en une fois et sans agitateur. On en connaît de nombreuses variantes, voir par exemple Hughes D. H., British Journal of Expérimental Pathology, Vol. 32, p. 97, 1951). On utilise le vaccin tué ainsi préparé tel quel ou après addition de gel d'alumine ou d'un adjuvant huileux. 30 D'autres caractéristiques et avantages de l'invention seront mieux compris à la lecture de la description qui va suivre de plusieurs exemples de réalisation. Dans ces exemples, tous les pourcentages sont exprimés en poids. EXEMPLE 1 35 On ensemence avec un Bordetella bronchiseptica en phase I, possédant un antigène K, un milieu préparé en ajoutant 0,5 à 1,0 \ de Casamino acid, 0,05 à 0,1 % d'extrait de levure et 0,5 à 0,1 % de -poudre de charbon activé à de la gélose nutritive comme milieu de base, un 72 11004 4 2137478 milieu préparé en ajoutant de plus 0,5 à 1,0 % de polypeptone au milieu précité, ou un milieu de composition identique àcelle du milieu précité, si ce n'est qu'on a remplacé la poudre de charbon activé par 0,3 à 1,0 % de résine échangeuse d'anions, puis on cultive à 37°C pendant 48 h. On 5 recueille les cellules obtenues, et on les met en suspension dans une solution de tampon phosphate pour obtenir une concentration de 1 à 200 milliards de germes/ml. Ensuite, on tue les germes en chauffant la suspension entre 50 et 60°C pendant 30 mn, ou en la traitant avec 0,05 à 0,1 % de formaline ou avec 0,01 à 0,02 % de Thimerosal, puis on incorpore à la 10 suspension ainsi traitée 0,01 % de Thimerosal comme conservateur pour préparer un vaccin. EXEMPLE 2 On ensemence avec un Bordetella bronchiseptica possédant un antigène K un milieu préparé en ajoutant 0,5 à 1,0 % de Casamino acid, 15 0,05 à 0,1 % d'extrait de levure, et 0,1 à 0,5 % de poudre de charbon activé à un bouillon nutritif comme milieu de base ou à un milieu de composition identique au milieu précité, si ce n'est qu'on a remplacé la poudre de charbon activé par 0,3 à 1,0 % de résine échangeuse d'anions, puis on cultive au repos ou en agitant à 37°C pendant 48 h. Après avoir recueilli les germes 20 par centrifugation, on prépare un vaccin comme dans l'exemple 1. EXEMPLE 3 Au vaccin de l'exemple 1, on ajoute un gel d'alumine de telle sorte que la concentration en ions aluminium soit de 2 à 10 mg/ml, en obtenant ainsi un vaccin contenant un adjuvant. On peut également obtenir 25 un vaccin ayant une efficacité identique à celle du vaccin précité, en formant une émulsion avec une quantité égale d'un adjuvant huileux au lieu d'utiliser le gel d'alumine. EXEMPLE .4 Cotnme dans l'exemple 2, on prépare une liqueur de culture 30 en ensemençant et en cultivant un Bordetella bronchiseptica en phase I possédant un antigène K dans un milieu liquide, puis en tuant les germes obtenus par addition de 0,01 à 0,02 % de Thimerosal. On incorpore à la liqueur de culture 2 à 10 mg/ml de gel d'alumine, et on laisse reposer pendant une nuit à 4°C, puis on recueille le surnageant pour préparer un vaccin 35 sous forme d'un gel, auquel on acdsorbé les cellules du micro-organisme et les substances actives solubles. 72 11004 5 2137478 EXEMPLE 5 On broie les micro-organismes obtenus dans l'exemple 1 ou 2 en utilisant un broyeur à vibrations à 10 Hz ou une presse French, et on incorpore 0,01 % de Thimerosal pour préparer un vaccfcn. L'inhalation de 5 ce vaccin confère l'immunité. On dilue le vaccin de l'invention à une concentration ou une concentration équivalente de 1 à 200 milliards de germes/ml, et on •injecte 2 à 3 fois 1 à 5 ml de vaccin dilué, ou on l'administre par inhalation dans les cavités nasales à des porcelets âgés de 3 à 30 jours à intervalles 10 de 1 à 3 semaines, conférant ainsi aux porcelets une immunité active. De plus, on injecte le vaccin dilué 2 à 4 fois à des truies, en réalisant l'injection de rappel pendant la gestation, ce qui confère une immunité passive aux porcelets nouveaux-nés par immunité foeto-maternelle. De plus, on peut immuniser les porcs adultes en leur injectant 2 à 3 fois, 3 à 10 ml, 15 du vaccin dilué ci-dessus, à des intervalles de 1 à 3 semaines. Les effets cliniques des vaccins tués de l'invention apparaissent dans les exemples ci-après. EXEMPLE 6 - On dilue chacun des vaccins préparés dans les exemples 20 1 à 4, à une concentration de 30 milliards de germes/ml. Ensuite, on injecte par voie intramusculaire 1 ml de vaccin dilué à 100 porcelets de 7 à 21 jours. Deux semaines après la première injection, on injecte à nouveau,par voie intramusculaire aux porcelets, 2 ml de vaccin dilué. Après 6 mois, on étudie les symptômes cliniques des porcelets et on les compare à ceux de porcelets 25 témoins qu'on n'a pas traités par le vaccin. C'est-à-dire qu'on autopsie chaque porcelet après 6 mois pour examiner l'atrophie des cornets des fosses nasales, en obtenant les résultats figurant dans le tableau I cL-apiès. Le * tableau I montre que Je vaccin de l'invention est très efficace, et qu'on peut obtenir des effets encore meilleurs lorsqu'on commence l'inoculation \ 30 du vaccin de façon précoce après la naissance. Même lorsqu'on détecte le germe, les groupes inoculés présentent peu de symptômes cliniques, et le groupe âgé de 7 jours ne présente pas d'atrophie des cornets, EXEMPLE 7 On dilue le vaccin broyé par vibration^ préparé dans 35 l'exemple 5, à une concentration de 200 milliards de germes/ml. Ensuite, on fait inhaler 5 ml du vaccin dilué par. la cavité nasale à 100 porcelets de 8 jours. Après 3 semaines, on injecte,par voie intramusculaire aux porcelets, 2mLdu vaccin au gel d'alumine, préparé dans l'exemple 3, qu'on 72 11004 6 2137478 .a dilué à la concentration de 30 milliards de germes/ml (groupe A). On injecte aux porcelets de l'autre groupe (groupe B) par voie intramusculaire, 2 fois, à trois semaines d'intervalle, 2 ml du vaccin au gel d'alumine préparé dans l'exemple 3, qu'on a dilué à une concentration de 30 milliards de germes/ml. Ensuite, on compare les symptômes cliniques des porcelets inoculés à ceux de porcelets témoins, auxquels on n'a pas inoculé le vaccin. On constate, comme le montre le tableau II ci-après que, même lorsqu'on l'administre par inhalation, le vaccin de l'invention augmente le titre en agglutinines, et est efficace, comme le prouve la diminution de l'atrophie des cornets. Même lorsqu'on détecte les germes, les groupes inoculés présentent des symptômes cliniques faibles et peu d'atrophie des cornets, comme dans le cas de l'exemple 6. EXEMPLE 8 On dilue les vaccins préparés dans les exemples 1 à 4 à une concentration de 30 milliards de germes/ml. Ensuite, on injecte, par voie intramusculaire, 3 à 10 ml de vaccin dilué, 2 à 4 fois à des truies à des intervalles de 2 à 4 semaines pour réaliser une immunité de base. Pendant la gravidité des truies, on réalise une injection de rappel 2 à 3 fois, en injectant chaque fois 3 à 10 ml du \a ccin dilué précité. Les porcelets nouveaux-nés sont fortement immunisés par immunité foeto-maternel]^ et on constate, comme le montre le tableau III ci-après, que les vaccins de l'invention sont efficaces, car ils réduisent l'atrophie des cornets des porcelets nouveaux-nés par rapport à des porcelets nés de mères-témoins non inoculées. Bien entendu, diverses modifications peuvent être apportées par l'homme de l'art aux dispositifs ou procédés qui viennent d'être décrits, uniquement à titre d'exemples non limitatifs, sans sortir du cadre de l'invention. TABLEAU I J Groupe Moment de l'injection Pourcentage d'infection par B. bronchiseptica v Pourcentage d'atrophie des cornets N° 1 N° 2 N° 3 N° 4 N° 1 N° 2 Sf ° 3 N° 4 groupe âgé de 7 jours 7e et 21è jour après la naissance 29 18 23 17 0 0 \ 0 0 groupe âgé de 21 jours 21e et 35e jour après la naissance 29 20 21 20 7 8 9 4 groupe témoin - 87 78 84 69 46 52 63 47 Nota : Les colonnes 1 à 4 correspondent respectivement aux vaccins des exemples 1 à 4. TABLEAU II •^1 K> Groupe Mode d'inoculation Titre des agglutinines Pourcentage d'in Pourcentage d'atrophie des cornets au 6è mois Avant la seconde inoculation 4 semaines après la seconde inoculation fection par B. bronchiseptica entre le 3fe et le 6è mois A Inhalation + injection , 22,4 50,2 33 0 B Injection + injection 22,5 113,0 17 6,3 Témoin - 80 76,2 O O 00 hO 0L> "—4 •£» co T A B L E A V lll Truies Porcelets Groupe N° Dose l'injection (ml) Nombre d'injections Titre dea agglutinines une semaina avant la mise bas Nombre Titre des agglutinines une semaine après la naissance Proportion d'atrophie des cornets à un mois 1 3 4 6400 8 800 - 3200 3/8 2 3 4 12800 9 800 - 6400 4/9 A 3 3 4 6400 10 800 - 6400 4/10 4 3 4 3200 8 800 - 1600 5/8 1 10 3 25600 9 6400 - 12800 2/9 B 2 10 3 12800 10 6400 - 12800 3/10 3 10 3 25600 11 12800 - 25600 2/11 4 10 3 12800 10 6400 - 12800 1/10 Témoin - ~ 8 8/8 ^4 KO O O Nota : les numéros des colonnes correspondent aux vaccins des exemples 1 à 4 OU ^4 -^1 00 72 11004 10 2137478 REVENDICATIONS 1. Vaccin tué contre la rhinite atrophique porcine, caractérisé en ce qu'on l'a préparé à partir d'un Bordetella bronchiseptica en phase I, 5 qui est un germe gram négatif, possédant un antigène K et un antigène capable de protéger la souris contre l'infection intracérébrale, et qui a sur milieu gélosé au sang une forme de coccus ou de coccobacille entouré de capsules ou d'enveloppes, et peu ou pas de flagelles, et qui présente une agglutination importante avec le sérum anti K, mais peu ou pas 10 d'agglutination avec le sérum anti 0, très virulent lorsqu'on l'injecte dans le cerveau de la souris, et provoquant une nécrose toxique importante par injection intradermique aux cobayes. 2. Vaccin tué selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'on lui a de plus incorporé un gel d'alumine ou un adjuvanf huileux. 15 3. Procédé de préparation d'un vaccin tué contre la rhinite atrophique infectieuse porcine, caractérisé en ce qu'on cultive le Bordetella bronchiseptica en phase I selon la revendication 1, dans un milieu de culture solide ou liquide, et en ce qu'on tue les germes obtenus ou qu'on inactive un lysat de ces germes. 20 4. Procédé selon la revendication 3, caractérisé en ce que le milieu solide est un milieu gélosé au sang. 5. Procédé selon la revendication 3, caractérisé en ce qu'on incorpore au milieu de base solide ou liquide 0,5 à 1,0 % en poids de Casamino acid, 0,05 à 0,1 % en poids d'extrait de levure, et 0,1 à 0,5 % en poids de 25 poudre de charbon activé. 6. Procédé selon la revendication 3, caractérisé en ce qu'on incorpore au milieu de base solide ou liquide 0,5 à 1,0 % en poids de Casamino aci^d, 0,05 à 0,1 % en poids d'extrait de levure et 0,3 à 1,0 % en poids de résine échangeuse d'anions. 30 7. Procédé selon la revendication 3, caractérisé en ce qu'on tue ou inactive les germes par chauffage entre 50 et 60°C. 8. Procédé selon la revendication 3, caractérisé en ce qu'on tue ou inactive les germes en utilisant du Thimerosal ou de la formaline. 9. Procédé selon la revendication 3, caractérisé en ce qu 'on tue ou 35 " inactive les germes en utilisant un broyeur vibrant ou une presse French.