FR 2135345 A1 19721215 FR 7216226 A 19720505 72 16226 i 2135345 Cette invention concerne des améliorations ayant trait à un procédé d'oxydation d'hydrocarbures, d'alcools ou d'aldéhydes non ou peu solubles ou miscibles à l'eau au moyen d'un enzyme ou d'un complexe enzymatique extrait de cellules de 5 micro-organismes,, Des procédés d'oxydation d'hydrocarbures, d'al-cools ou d'aldéhydes au moyen d'enzymes extraits de cellules de micro-organismes ont déjà été proposés» Différentes méthodes permettant d'obtenir des enzymes ou des complexes enzymatiques 10 susceptibles d'être utilisés dans ces procédés d'oxydation ont été décrites dans la littérature scientifique0 Un des buts de la présente invention est de fournir un procédé d'oxydation enzymatique ayant une vitesse de réaction peu élevée» 15 Le procédé selon la présente invention pour l'o xydation enzymatique d'un hydrocarbure, d'un alccol ou d'un aldéhyde non ou peu solubles ou miscibles à l'eau, désigné ci-après "le support", consiste s à réaliser une solution du support dans un amide miscible à la fois à l'eau et au support et 20 ayant la formule EP H —_ Q __ -n 25 50 55 40 H5 dans laquelle E^, Eg ou ® représentent soit l'hydrogène, soit une fonction aliphatique ^ à 0^, à disperser la solution du support dans l'amide dans un tampon aqueux dont le pH se situe dans la fourchette 6,5 à 9,5 et en présence d'un enzyme pouvant oxyder le support et extrait d'un micro-organisme et d'un co-enzyme pour obtenir un mélange réactionnel contenant une quantité pouvant aller d'une trace 3us(3.u,à 50 % e]1 volume de la solution du support dans l'amide, et à maintenir le mélange réactionnel en présence d'oxygène à une température comprise entre 20 et 58°C afin de réaliser l'oxydation du support» Le support sera préférablement un hydrocarbure, alcool ou aldéhyde aliphatiques à au moins 6 à 20 atomes de carbone» Ceux-ci seront disposés de préférence en une chaîne linéaire. L'hydrocarbure sera de préférence saturée A titre d'exemple, nous citerons s n-décane, n-hexadécane, 1-décanol, 72 16226 2 2135345 1 tétra-décanol, 1=10 décaneiiol, 1-10 hexadécanediol , 1-décanol et tétradécanol» Préférablement, la concentration molaire du support dans le mélange réactionnel sera comprise 5 entre 0,1 et 20 x 10"^ « Les enzymes ou complexes enzymatiques utilisables dans le présent procédé peuvent être obtenus en cultivant un micro-organisme capable de croître sur hydrocarbures en tant que source de carbone assimilable, pour ex-10 traire ensuite l'enzyme ou le complexe enzymatique d'une manière connue (voir par exemple "The Archives of Microbiology, JoM. Lebeault et al0 72»140-153 1970)» Des enzymes ou complexes enzymatiques appropriés peuvent être obtenus à partir des cellules de toute bactérie, levure ou moisissure capables d'oxy-15 der, ou ayant été amenées à oxyder les hydrocarbures. Lorsque l'on souhaite effectuer une étape spécifique d'oxydation on peut n'utiliser qu'un seul enzyme» Par exemple, on peut utiliser unedéhydrogénase pour convertir un alcool en un aldéhyde par oxydation. En revanche, 20 on peut utiliser un complexe enzymatique si on veut réaliser plusieurs étapes d'oxydation» Par exemple, on utilise un complexe enzymatique pour convertir un alcane en l'acide correspondant» Les structures chimique et physique des enzymes ou complexes d'enzymes sont mal connues» Toutefois* dans le micro-25 organisme intact, il semble que ces enzymes se trouvent surtout dans les mitochondries et le cytoplasme. La quantité d'enzyme ou de complexe enzymatique contenue dans le mélange réactionnel peut varier de 0,1 à 10 grammes par litre. 30 Comme exemples de co-enzymes nous citerons , dans le cas de l'oxydation du décane, nicotinamide adénine dinucléotide (NAD ou NADH) qui peut être remplacé par nicotinamide adénine dinucléotide phosphate (NADP ou NADPH). La concentration molaire du co-35 enzyme dans le mélange réactionnel peut varier de 10"^ à 10""^ • Les amides ne doivent pas rendre inactifs l'enzyme ou le complexe enzymatique, du moins aux proportions et dans les conditions existantes dans le mélange réactionnel» La quantité /itiîisee représente générale-40 ment 10 % par rapport au volume du mélange réactionnel. 72 16226 3 2135345 Nous préférons une quantité d'amide d'environq 3 °Jo par rapport au volume du mélange réactionnel. Comme exemples d'amides appropriés, nous citerons ï N,N=diméthyl formamide, formamide, H,N-diéthyl formamide, N-éthyl formamide et ÏT-méthyl formamide. 5 Le tampon aqueux peut être du type traditionnel utilisé dans les réactions enzymatiques, par exemple un tampon d'acide trisbydrooMorique ou au phosphate. Les conditions de réaction favorables à l'oxydation sont celles, relativement douces, généralement utilisées 10 pour les réactions enzymatiques. La température peut être comprise entre 20 et 58°0 et sera de préférence de 22 à 25°C. Le pH le plus approprié se situe dans l'intervalle de 7,5 à 8,5 pour la conversion de n-alcanes en alcools ou acides et po-ar la conversion d'aldéhydes en acide s „ Mais le pH convenant le wxbwc. 15 à la conversion d'alcools en aldéhydes se situe dans la fcrcœ-> chette de 8,5 à 9,5» L'oxygène peut être présent sous forme d'os^gè^ ne libre, l'oxygène de l'air par exemple. Mais on peut -atilissx-de l'oxygène lié, tel que l'oxygène présent dans la fonctioa tey» 20 droxyle ou dans l'eau. Le procédé selon la présente invention peut ê-tre utilisé pour l'oxydation des diols en acides oméga-oxhy-driles : par exemple : le décanediol peut être oxydé en acide hydroxy décanoïçfae. Les hydrocarbures peuvent être convertis 25 soit en alcool, soit en acide. Les alcools peuvent être convertis soit en aldéhyde, soit en acide et les aldéhydes peuvent être convertis en acide. Les exemples ci-dessous sont, donnés à titre d'illustration du présent procédé. 30 Exemple 1 70 milligrammes de décane furent dissous dans 1 millilitre de diméthyl formamide. 0,1 millilitre de cette solution fut mélangé à 5 millilitres d'un tampon aqueux à l'acide trishydrochlorique contenant un mélange enzymatique ca-35 pable d'oxyder le décane ainsi qu'un co-enzyme. Le pH du tampoa était de 8 et le décane avait une concentration molaire de 18,0 x 10"5 . L'enzyme capable d'oxyder le décane avait été obtenu en cultivant la levure, Candida îropicalis, sur du n-40 tétradécane en tant que source de carbone» Le bouillon de cul® 72 16226 4 2135345 titre fut centrifugé pour récupérer* une crème contenant des cellules de levure « Les cellules furent levées avec une solution isotonique de chlorure de sodium et mises en suspension dans un tampon d'acide tris-hydrochlorique ayant un pH de 7,8. 5 La suspension de cellules fut passée dans une cellule de pres-sionsion French et le produit centrifugé à 4000 g pendant 20 minutes. Le liquide surnageant contenait de 10 à 20 mg de protéine par millilitre. Un mg du liquide surnageant (contenant le mélange enzymatique capable d'oxyder le décane) fut 10 ajouté au mélange décrit ci-dessus. Le co-enzyme, nicotinamide adénine dinucléotide phosphate (NADPH) fut ajouté au mélange pour obtenir une mola-rité de 17 x 10"5 . Le mélange fut incubé pendant 50 minutes à 25°C 15 en présence d'oxygène atmosphérique» L'analyse du mélange démontra alors que 85 % en poids du décane avaient été transformés par oxydation en un mélange du décanol et d'acide décanoïque. Les proportions de décanol et d'acide décanoïque étaient respectivement de 20 % et 65 % en poids. 20 Exemple 2 Ceci est un èxemple d'oxydation de 1-10-décane-diol en acide 10-hydroxy décanoïque» Le mode opératoire fut celui déjà décrit dans l'exemple 1, à ceci près que le décane fut remplacé par une quantité similaire de 1-10 décanediol. Le ren-25 dement en 10-hydroxy décanoïque obtenu correspondant à 70-80% en poids. Ceci est un exemple d'oxydation de décanol en acide décanoïque» Le mode opératoire fut celui utilisé pour jq l'exemple l,à ceci près que le décane fuir remplacé par du déca-nol.Le rendement en acide décanoïque obtenu était de 95 à 98 %• Expérience comparative A des fins de comparaison, du décane fut oxydé en décanol et acide décanoïque par le procédé décrit dans l'ex-emple 1, sauf une différence essentielle, résidant en l'absence de diméthyl formamide et le fait que le mélange fut agité afin de stimuler la réaction» L'analyse de mélange démontra que 10 % seulement en poids du décane avaient été oxydés en un mélange de décanol et d'acide décanoïque» La proportion de décanol était 40 de 20 % en poids et celle d'acide décanoïque de 65 %. 72 16226 5 2135345 REVENDICATIONS lo Procédé d'oxydation enzymatique des hydrocarbures, d'alcools ou d'aldéhydes effectivement non ou peu miscibles ou solubles à l'eau, désignés ci—après le "support"j caractérise par le fait qu'on réalise une solution du "support" dans un amide miscible à la fois à l'eau et au "support" et ayant la formule : 10 dans laquelle E-^, E£ ou E^ représentent soit l'hydrogène, soit une fonction aliphatique C-^ à C^ ; qu'on disperse ensuite la solution du "support" dans l'amide dans un tampon aqueux dont le pïï se situe dans la fourchette 6,5 à 9*5 et en présence d'un enzyme pouvant oxyder le "support" et extrait d'un microorganisme et d'un co-enzyme , de façon à obtenir un mélange réactionnel contenant une quantité pouvant aller d'une trace à 50 % en volume de la solution du "support" dans l'amide ; et 20 qu'on maintient enfin le mélange réactionnel ainsi obtenu en présence d'oxygène à une température comprise entre 20 et 38°C afin de réaliser l'oxydation du "support"» 2» Procédé selon la revendication 1, caractérisé en outre par.le fait qu'on utilise un support ayant une 25 concentration molaire dans le mélange réactionnel comprise entre 0,1 et 20 x 10"^ „ 3® Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 et 2 caractérisé par le fait qu'on utilise "-comme enzyme capable d'oxyder le "support" un mélange capable de réa-30 liser plusieurs étapes d'oxydation» #«, Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 3 caractérisé par le fait qu'on utilise comme "support" un hydrocarbure aliphatique contenant au moins 6 à 20 atomes de carbone» 5» Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 4, caractérisé par le fait qu'on utilise comme amide du diméthyl formamide» 6o Un hydrocarbure, un alcool ou un. aldéhyde oxydé obtenu par la mise en oeuvre du-procédé selon l'une quel-40 conque des revendications 1 à 5. .