FR 2123562 A1 19720908 FR 7206121 A 19720223 72 06121 1 2123562 La présente invention concerne un agent d'immunisation amélioré et un procédé pour le préparer. Plus particulièrement, elle concerne un lipopo-lysaccharide (LPS) d'endotoxine bactérienne, modifié par voie chimique afin de rehausser sa faculté de stimuler la formation d'anticorps chez les êtres 5 humains et les animaux à sang chaud, ainsi qu'un procédé pour la préparation du LPS modifié et des compositions immunisantes le renfermant. 11 est bien connu que les lipopolysaccharides de bactéries Gram-négatives renforcent la réponse des anticorps chez les êtres humains et les animaux à sang chaud, aux antigènes protéiniques relativement purs, lorsqu'on 10 injecte le LPS et la protéine, ensemble ou successivement à des intervalles appropriés. On peut administrer le LPS chez les lapins de 0-48 heures après l'antigène. Chez la souris de l'espèce Balb, on peut administrer le LPS à des intervalles compris entre 7 jours avant ou 8 jours après l'administration d'un antigène soluble en observant encore un accroissement de la formation des anti-15 corps. Un agent qui augmente la formation des anticorps lorsqu'il est associé à un antigène peut être désigné sous le nom d'"adjuvant" et on peut désigner le phénomène résultant sous 1'"effet adjuvant". Bien que l'utilisation du LPS comme adjuvant soit extrêmement souhaitable, son application était dans une certaine mesure limitée par la toxicité du LPS lorsqu'on l'administrait à une 20 dose active. On recherchait jusqu'à présent le maintien de l'activité renforcée avec une diminution conjointe de la toxicité, ou, du moins, l'augmentation de l'écart entre la dose de renforcement de l'activité et la dose toxique. L'invention a par suite pour objet une composition à base de LPS adjuvant qui assure une formation accrue des anticorps et qui est pourvue d'une 25 toxicité réduite. Selon un autre objet, on propose selon l'invention un adjuvant à base de LPS modifié par voie chimique, de toxicité réduite. L'invention concerne encore, selon un autre objet, une composition adjuvante comprenant une combinaison synergique de dérivés d'endotoxine modifiés par voie chimique qui présentent une activité rehaussée dans la formation des anticorps et une faible 30 toxicité. Un objet complémentaire de l'invention consiste en un procédé pour modifier par voie chimique le LPS et une fraction dérivée du LPS selon lequel on diminue ou on élimine sa toxicité en conservant sa faculté de rehausser la formation des anticorps. Les objets précités ainsi que d'autres objets de l'invention sont 35 atteints en partie par la découverte de la demanderesse que l'on augmente fortement l'accroissement de la formation des anticorps au moyen d'une liaison de nature covalente, par voie chimique, entre l'antigène et le LPS. La demanderesse a en outre découvert selon l'invention que l'on peut modifier par voie chimique 72 06121 ^ 2123562 le LPS lui-même en réduisant fortement sa toxicité tout en conservant inchangé ou seulement légèrement diminué son effet de renforcement de la formation d'anticorps. D'une manière supplémentaire, on a découvert dans le cadre de l'invention qu'une combinaison de dérivés de LPS modifiés par voie chimique 5 assure des effets qui sont davantage que de simples effets adjuvants supplémentaires sans toutefois ajouter à la toxicité, en produisant ainsi une augmentation inattendue du rapport entre l'activité de rehaussement de la formation des anticorps par rapport à la toxicité. Les lipopolysaccharides n'ont pas été complètement caractérisés jusqu'à présent mais il est admis qu'ils com-10 prennent un squelette formé d'unités disaccharides d'heptose reliées entre elles par des ponts phosphodiesters. Des polysaccharides et des bas polymères d'aminohexose complètement acylés sont reliés aux unités disaccharides d'heptose. Le LPS obtenu à partir de E. coli K.235 est également rattaché à des amino-acides et à 1'éthanolamine qui assurent la présence de groupes amino 15 primaires libres qui peuvent être utilisés pour former la liaison covalente entre le LPS et la protéine. La plupart des restes d'acides gras existent sous forme de liaisons esters et peuvent être éliminés par une hydrolyse alcaline très modérée. Dans un mode de mise en oeuvre de l'invention, on fait réagir les 20 groupes amino actifs et éventuellement quelques groupes hydroxy avec un halo-génure d'halogéno-acyle. Successivement, on fait réagir l'halogène du reste halogéno-acyle avec des sites actifs d'un antigène protéinique en obtenant un LPS couplé de manière covalente avec un antigène (LPS-A) par l'intermédiaire d'une liaison ester ou amide. Les réactions ont lieu aux environs de la tempé-25 rature ambiante, c'est-à-dire entre environ 20 et environ 50°C, et dans un milieu ayant un pH égal au minimum à 7, de préférence un pH maintenu à une valeur comprise entre environ 8,5 et environ 9,5. Plus particulièrement, on fait réagir les groupes amino avec le bromure de bromacétyle en solution aqueuse selon la réaction suivante : 30 0 , Il lipopolysaccharide (NH2)x+ (Br-C-CH^Br) en excès pH 9 0 35 \J/ lipopo ly s ac char ide (NH-C -CH^Br)^ 0 ii Le groupe -NH-C-CH^Br est relativement stable et on peut séparer le dérivé de lipopolysaccharide (LPS) à partir des sels et du réactif en excès 72 06121 3 2123562 par dialyse. On peut faire réagir chaque atome de brome de ce dérivé de LPS avec des groupes -SH et imidazoles de protéines à pH d'environ 7, ou avec des groupes -NH^ de protéines à pH d'environ 8 à 10 pour former les composés suivants : 0 5 LPS-NH-C-CH2-S-pro té ine CH = CH-protéine 10 N N H NH - protéine En conséquence, on peut coupler tout lipopolysaccharide ayant des groupes amino libres avec toute protéine ou toute autre macromolécule, tout 15 virus ou toute fraction cellulaire qui dispose de groupes -SH, imidazole ou dérivé de LPS ayant une teneur en lipide fortement réduite (PS) avec un halo-génure d'halogéno-acyle et un antigène protéinique, tels que définis ci-dessus, 20 en obtenant un polysaccharide-antigène couplé (PS-A) qui présente une faible toxicité et un faible effet adjuvant. On y ajoute un LPS qui a été détoxifié par réaction avec l'anhydride d'un diacide alkylique inférieur. Dans un mode de mise en oeuvre préféré, on conduit la réaction dans des conditions suffisantes pour acyler tous les groupes amino libres et environ la moitié des 25 groupes hydroxy libres. Le lipopolysaccharide acylé (AcLPS) lui-même possède un certain effet adjuvant et une très faible toxicité mais, lorsqu'il est mélangé avec le PS-A, la combinaison produit un effet qui représente davantage qu'une simple réponse adjuvante supplémentaire, et qui est accompagné d'une toxicité de loin inférieure à une toxicité supplémentaire. 30 Les anhydrides que l'on peut utiliser pour l'acylation sont ceux qui forment des semi-esters avec les groupes hydroxyle de la molécule de lipopolysaccharide sans remplacement d'un nombre notable des restes d'acides gras initialement présents. Les anhydrides convenables comprennent les composés de formule générale (I) : -NH, r Dans un autre mode de mise en oeuvre de l'invention, on traite un 35 (I) R ln R, 2 72 06121 4 2123562 dans laquelle n est un nombre entier égal à 0 ou 1, R, R^, R^ représentent chacun un atome d'hydrogène, un radical alkyle et alkyle substitué, alké-nyle et alkényle substitué, cycloalkyle et aryle et dans laquelle deux quelconques des groupes R considérés ensemble peuvent former un substituant 5 cyclique saturé ou insaturé. L'anhydride succinique, l'anhydride glutarique et l'anhydride de l'acide 1,2-cyclohexane-dicarboxylique sont préférés. On peut également utiliser les anhydrides aromatiques tels que l'anhydride phtalique et ses dérivés. Bien entendu, on doit éviter l'utilisation des anhydrides qui accroissent exagérément la toxicité des dérivés de LPS 10 notamment par rapport à son effet adjuvant. On peut également préparer des sels du lipopolysaccharide acylé et on préfère en particulier les sels solubles dans l'eau, tels que les sels de sodium, potassium, lithium et les sels d'amines, bien que d'autres sels soient également utiles. On conduit la réaction d'acylation à peu près à la température ambiante, d'une manière 15 désirable cependant inférieure à environ 50°C, et dans tous les cas en dessous de la température à laquelle une décomposition notable a lieu. La durée de réaction dépend de la température et elle doit être suffisante pour permettre l'acylation des groupes hydroxy d'alcools. Ce résultat exige entre environ 12 et environ 30 heures et il peut être obtenu en un ou plusieurs stades d'acy-20 lation. Les exemples suivants illustrent l'invention en détail pour en permettre une meilleure compréhension, sans nullement la limiter dans son cadre et son esprit. Exemple 1 25 Préparation du lipopolysaccharide (LPS) et du polysaccharide (PS) On fait croître des bactéries Gram-négatives, de souche E.Coli K-235, sur un milieu aéré, on centrifuge et on extrait avec du phénol aqueux. On obtient la fraction polysaccharide (PS) du LPS par hydroxyaminolyse. Les détails des modes opératoires sont exposés dans Mclntire et coll, Biochemistry, j5, 30 2363 (1967). On modifie par voie chimique le LPS et le PS ainsi obtenus comme indiqué dans les exemples suivants. Exemple 2 Préparation du Bromacétyl-LPS 35 On met en suspension 1 g de LPS dans 250 ml d'acétate de sodium demi- saturé dans un bain de glace et on règle le pH à 9 avec de l'hydroxyde de sodium. On ajoute goutte à goutte 200^,ul de bromure de bromacétyle dissous dans 10 ml de dioxanne sec, qualité pour réactif, et on ajoute simultanément 72 06121 5 2123562 du NaOH 1 N à une vitesse suffisante pour maintenir le pH en 8,5 et 9,5. Après l'addition de tout le bromure de bromacétyle, on règle le pH à environ 4,5 avec du HCl 6 à 12 N. On dialyse la préparation pendant1 5 à 7 jours à 4°C dans un tube manchonné de toile. Le produit bromacétylé est stable à bas pH 5 et on peut ou bien le conserver sous forme réfrigérée ou bien le lyophiliser. Son activité adjuvante est à peu près égale à celle du LPS formant la substance de départ. On détermine le brome disponible pour le couplage en laissant réagir la bromacétylendotoxine avec une quantité égale en poids de N-(2,4-dinitro- phényl)-éthylènediamine à pH de 9 à 12 pendant 20 heures à tempé- 10 rature ambiante en agitant constamment. On règle la solution à pH 4 et on la -4 dialyse de manière exhaustive avec HCl 10 N. On détermine la quantité de N-(2,4-dinitrophényl)-éthylènediamine par l'absorption à 340 m^u. Le brome disponible pour le couplage, déterminé comme ci-dessus, est en général de 0,l^uM par mg d'endotoxine, bien que la quantité trouvée par l'analyse élémen-15 taire soit en général plusieurs fois supérieure. On peut éliminer la plus grande quantité du brome "non disponible pour le couplage" par électrodialyse. On prépare le PS bromacétylé selon le même mode opératoire, mais en remplaçant le LPS mentionné ci-dessus par le PS de l'exemple 1. La quantité de brome disponible pour le couplage est en général d'environ 0,04 ^,uM par 20 milligramme d'endotoxine. L'exemple suivant illustre le couplage des produits bromacétylés avec un antigène protéinique dont divers types peuvent être employés. Exemple 3A Couplage de l'Antigène avec le Bromacétyl-LPS 25 On mélange 100 mg de bromacétyl-endotoxine dans 25 ml de H^O, à pH de 4,5 avec 100 mg d'antigène dans 20 ml de solvant approprié et on ajoute 5 ml de K^HPO^ 1M. L'antigène est une préparation d'albumine du sérum humain (SAH) cristallisée, reçue de la firme Pentex Incorporated. On dilue la solution à 100 ml, on l'amène à pH 10 avec du NaOH 2 à 5N, on l'agite à la température 30 ambiante pendant 2 heures et on la ramène à pH 7. Par chromatographie sur une résine connue dans le commerce sous le nom de Séphadex G-200, on obtient deux pics caractéristiques de protéines. Le pic exclu (poids moléculaire élevé) caractérise le LPS couplé au SAH et vraisemblablement une certaine quantité de LPS libre. Le pic inclus caractérise abondamment le SAH n'ayant pas 35 réagi. On détermine le degré de couplage covalent de SAH avec LPS en traitant la solution de manière à l'amener à 0,15 M avec du chlorure de sodium, en l'extrayant trois fois à 65°C avec un volume égal de phénol, en éliminant le phénol à partir de la phase aqueuse par trois extractions à l'éther, et en mesurant la 72 06121 6 2123562 protéine dans la phase aqueuse. Par ce mode opératoire, on peut séparer complètement le LPS et le SAH mélangés mais non couplés. On trouve qu'au moins 10 % et en général 25 à 30 % du SAH sont couplés au LPS à la suite du mode opératoire de cet exemple. 5 Exemple 3B On répète le mode opératoire de l'exemple 3A excepté que l'on remplace la bromacêtylendotoxine par une quantité égale de bromacétyl-polysaccha-ride préparé selon l'exemple 2. Plus d'environ 10 7» de l'antigène est couplé au polysaccharide. Les exemples suivants illustrent l'acylation d'un lipopo-10 lysaccharide. Exemple 4 Préparation du Succinyl-LPS On dissout 1 g de LPS et 10 g d'anhydride succinique dans 50 ml de formamide et 50 ml de pyridine qui a été séchêe sur des pastilles de soude 15 caustique et redistillée. On obture le flacon de réaction avec une double couche du produit connu dans le commerce sous le nom de "Parafilm", on l'agite à la température ambiante pendant 20 à 22 heures et on le verse dans 200 ml d'eau exempte de matières pyrogènes. On dialyse la solution à 4°C par rapport à 5 litres d'eau triplement distillée pendant 48 heures, du bicarbonate de 20 sodium 0,1 M pendant 48 heures, de l'eau triplement distillée pendant 48 heures, et on change l'eau toutes les 8 à 16 heures, et on agite constamment. Pour empêcher l'augmentation du volume pendant la dialyse, on place le tuyau à l'intérieur d'un manchon en toile. On concentre le dérivé sodique de succinyl-LPS et on le lyophilyse. On effectue la succinylation de ce produit, de nou-25 veau pendant 5 à 7 heures à la température ambiante avec les mêmes réactifs et proportions. Le rendement en produit final est de 1,85 à 2 g. Par filtration acido-basique, il s'élève de 50 à 55 % en poids de sodio-succinyle (NaOOCC^C^CO-), ce qui est équivalent à 8 micromoles par milligramme de LPS dans le produit. 30 On détermine l'activité adjuvante des préparations des exemples 1-4 sur des rats mâles de l'espèce Sprague Dawley, pesant environ 200 g, et des lapins mâles albinos de Nouvelle Zélande pesant environ 2 kg. Chaque rat reçoit 0,05-0,5 mg d'antigène dans 0,25 ml de solution saline. On injecte aux lapins 0,04-0,8 mg d'antigène dans 0,5 ml de solution saline. On peut 35 démontrer l'effet adjuvant du LPS lorsqu'on l'administre par voie intrapéri-tonéale, intramusculaire ou sous-cutanée. L'injection dans les pulpes des pattes n'est pas plus efficace que l'injection intramusculaire (dans le corps de la patte) ou l'injection sous-cutanée (dans la nuque). L'évaluation des 72 06121 7 2123562 anticorps est effectuée par hémoagglutination passive avec une dilution double en série. On exprime les titres en anticorps en inverse de la dilution. Chaque valeur dans les tableaux représente la moyenne géométrique des déterminations chez 8-12 rats. 5 L'exemple suivant illustre l'importance du couplage covalent entre l'antigène et le LPS lorsqu'on les injecte tous deux par voie sous-cutanée chez le rat. Exemple 5 On injecte un antigène (albumine du sérum humain) et le LPS à des 10 rats presque simultanément dans les régions, séparées d'environ 25,4 mm, dans la nuque, en quantité de 0,19 mg d'antigène (A) dans la région 1 et 0,31 mg de LPS dans la région 2. D'autres rats reçoivent du LPS-A couplé selon le mode opératoire de l'exemple 3, en quantité de 0,5 mg. On administre également l'antigène mélangé avec le LPS immédiatement avant l'injection en quantité 15 de 0,19 mg de A mélangé avec 0,31 mg de LPS. On détermine l'importance des anticorps toutes les semaines et on l'indique dans le tableau I. TABLEAU I Réponse Immunologique relative Semaines 20 1 2 3 4 5 6 Dose LPS et A en sites séparés 0,5 mg 0 1,5 2,6 0 0 1,5 LPS plus A, en mélange 0,5 mg 3,4 2,6 7 15 10 19,5 LPS plus A couplés 0,5 mg 8,7 27" 159 115 80 72 25 Les résultats indiqués dans le tableau I montrent clairement que, dans les conditions de cette expérience, il ne se produit aucun effet adjuvant avant que le LPS soit mélangé avec l'antigène avant l'injection, et que l'effet est rehaussé par couplage des deux molécules. Lorsque, immédiatement avant l'injection, on mélange l'antigène avec le bromacétyl-LPS de l'exemple 2 à 30 pH d'environ 7 ou moins, cette condition ne favorisant pas le couplage, les résultats sont les mêmes que ceux obtenus avec un simple mélange de LPS et d'antigène. Ceci signifie que la bromacétylation du LPS, en elle-même, ne confère aucune propriété adjuvante exceptionnelle et que la supériorité du LPS-A est en fait attribuable au couplage des deux molécules. 35 L'effet adjuvant accru démontré comme ci-dessus est bien entendu un résultat hautement favorable. Dans un mode de mise en oeuvre préféré de l'invention, une réponse immunogène équivalente est une réponse qui est obtenue avec une composition de toxicité réduite. L'élimination à partir du lipopoly- 72 06121 s 2123562 saccharide essentiellement de tous les acides gras liés sous forme d'esters avec aucune modification majeure connue dans la molécule, entraîne la diminution de la pyrogénicité chez le lapin d'un facteur de 1 000 000 et la réduction de la toxicité chez la souris de plus de 6 000 fois. Cette frac-5 tion polysaccharide (PS) est capable de neutraliser presque tous les anticorps, dus au LPS dans 1'antisérum chez le lapin provoqué par les bactéries apparentées d'origine. Le lypopolysaccharide fortement succinylé (AcLPS) de l'exemple 4 est moins pyrogène que le LPS souvent d'un facteur de plus de 1 000 et moins toxique chez la souris de plus de 500 fois. Il conserve 10 pratiquement tous les restes d'acides gras du LPS mais il ne fournit aucune indication de réaction avec l'anticorps particulier employé. Ces dérivés modifiés par voie chimique, à savoir PS et AcLPS, sont chacun beaucoup moins immunogènes que le lipopolysaccharide couplé avec l'antigène. Le polysaccharide couplé avec l'antigène de l'exemple 3 fournit très 15 peu de réponse primaire, mais une réponse secondaire indique une certaine activité. On évalue d'après les résultats de déterminations comparatives séparées, que le LPS succinylé de l'exemple 4 présente environ le l/100ème de l'activité du LPS dans l'accroissement de la réponse des anticorps à A. Cepen-20 dant, sa toxicité est d'au moins 1 00Ô et, d'une manière possible, 10 000 fois inférieure à celle du LPS de sorte que le rapport entre la toxicité et l'effet adjuvant est abaissé dans le produit de l'exemple 4, selon un facteur d'au moins 10 et peut-être s'élevant jusqu'à 100. Un aspect important de l'invention réside dans la découverte qu'un 25 mélange du lipopolysaccharide acylé de l'exemple 4 avec un polysaccharide à basse teneur en lipides, préparé comme décrit à l'exemple 1, ou de préférence avec le polysaccharide couplé avec l'antigène produit selon l'exemple 3, assure un très fort effet adjuvant accompagné d'une très basse toxicité. La combinaison de PS et de AcLPS n'entraîne pas une pyrogénécité plus grande que 30 AcLPS seul. La valeur élevée de l'effet adjuvant obtenu est illustrée à l'exemple 6. Exemple 6 Ainsi qu'on a procédé dans l'expérience de l'exemple 5, on injecte à chaque rat, parmi un groupe de 8 à 12 rats, une composition d'essai et on 35 détermine la teneur en anticorps par une technique d'hémoagglutination passive. Les résultats sont présentés dans le tableau II ci-annexé. Les substances utilisées pour l'injection sont choisies de manière à assurer une quantité constante , à savoir 0,25 mg d'antigène, et elles sont les suivantes : 72 06121 2123562 numéro de l'essai Injection - en solution saline 20 0,5 mg du mélange réactionnel de l'exemple 3A dans lequel on a couplé environ 25-30 % de l'antigène au lipopolysaccharide de manière à conserver 0,25 mg de 5 l'antigène en tant que témoin. 21 Une fraction chromatographique du mélange réactionnel de l'exemple 3B suffisante pour assurer 0,25 mg d'antigène et 0,45 mg de polysaccharide, avec environ 30 "L de l;antigène couplé au saccharidej mélangée avec 2,5 mg 10 de lipopolysaccharide acylé, préparé selon le mode opé ratoire de l'exemple 4. 22 Un mélange de 0,25 mg d'antigène, 0.25 mg de polysaccharide et 2,5 mg du lipopolysaccharide acylé de l'exemple 4. 15 23 Un mélange de 0,25 mg d'antigène et 2,5 mg du lipopoly saccharide acylé de l'exemple 4. 24 Une fraction chromatographique provenant d'une certaine quantité du mélange réactionnel de l'exemple 3B suffisante pour assurer 0,25 mg d'antigène et 0,45 mg de 20 polysaccharide, avec environ 30 % de l'antigène couplé au polysaccharide. L'analyse statistique indique que le résultat des essais n° 20 et 21 ne diffère pas d'une manière significative. Les essais n° 23 et 24 montrent la valeur de la réponse adjuvante 25 produite individuellement par chacun des dérivés de lipopolysaccharide modifiés par voie chimique. L'essai n" 21 montre la réponse élevée d'une manière surprenante présentée par un mélange des dérivés. Cette réponse immunologique est statistiquement équivalente à celle du lipopolysaccharide couplé avec l'antigène (LPS-A) mais elle est associée à une toxicité (pyrogénicité) au 30 moins 1 000 fois moindre. 72 06121 2123562 R_E_V E N_D I C A_T IONS 1. Composition immunisante, caractérisée en ce qu'elle renferme a) un dérivé d'endotoxine bactérienne de toxicité réduite, comprenant un lipopolysaccharide comportant des groupes semi-ester de diacide et leurs sels én une quantité égale à 8 micromoles de semi-ester par milligramme de lipopoly- 5 saccharide et b) un polysaccharide d'endotoxine bactérienne pratiquement exempt de 1ip ide. 2. Composition selon la revendication 1, caractérisée en ce que le polysaccharide est un polysaccharide d'endotoxine bactérienne pratiquement exempt de lipide, lié d'une manière covalente à un antigène. 10 3. Composition selon la revendication 2, caractérisée en ce que le dérivé de lipopolysaccharide constitue une plus grande - fraction de la composition que le polysaccharide d'endotoxine. 4. Formes d'administration comprenant un lipopolysaccharide d'endotoxine bactérienne acylé et un polysaccharide d'endotoxine bactérienne couplé d'une 15 manière covalente à un antigène protéinique en quantité suffisante pour provoquer la formation d'anticorps et provoquant une réponse immunologique. 5. Composition pharmaceutique d'un agent immunisant sous forme de dose unitaire comprenant un lipopolysaccharide d'endotoxine bactérienne acylé et un polysaccharide d'endotoxine bactérienne couplé d'une manière covalente à un 20 antigène protéinique dans un véhicule salin inerte. 6. Composition selon la revendication 5, caractérisée en ce que le lipopolysaccharide acylé est présent en une quantité supérieure à la quantité de polysaccharide et d'antigène couplé.