FR 2122405 A1 19720901 FR 7144948 A 19711214 71 44948 2122405 La présente invention concerne le traitement du lait pour en réduire la teneur en lactose. Plus particulièrement, la présente invention concerne un procédé perfectionné pour la digestion enzvmatique du lactose du lait. 5 On sait depuis un certain temps déjà que le sucre du lait, ou lactose, présent dans le lait pose un certain nombre de problèmes. Par exemple, le lactose est médiocrement soluble et tend à se séparer par cristallisation lorsqu'on augmente la teneur en poudre de lait. Ainsi, on obtient fréquemment une crème glacée 10 ou glace "sableuse" s'il y a présence de plus de 12 % de poudre de lait. La cristallisation du lactose pose également un problème majeur lors de la préparation de produits concentrés à base de lait entier. Plus récemment, il a été trouvé que de nombreuses personnes 15 souffrent d'une intolérence au lactose ou de l'inaptitude à digérer du lactose par suite d'une déficience de l'enzyme qu'est la lactase. Les symptômes sont des douleurs abdominales, de la dilatation, de la diarrhée et une gêne intestinale après l'ingestion de lait. Chung et ses collaborateurs, Gastroentêrology, Vol. 20 54, page 225 (1968) et Bayless et ses collaborateurs, Gastroentêrology, Vol. 54, page 1220 (1968) ont indiqué que l'intolérance au lactose est extrêmement répandue parmi les populations noires et les orientaux. Divers procédés ont été proposés pour le traitement du lait 25 par la lactase, enzyme hydrolytique qui scinde le lactose en glucose et galactose, ce qui diminue la teneur du lait en lactose et élimine le lactose. En général, ces procédés, dont un exemple typique est donné dans le brevet des Etats-Unis d'Amérique n° 2 681 858, impliquent l'addition de lactase sèche à du lait et la 30 digestion du lait à des températures élevées (par exemple allant jusqu'à 71° C). Ces procédés présentent plusieurs inconvénients. En premier lieu, puisque l'enzyme lactase est une protéine étrangère, qu'elle risque d'être contaminée par d'autres protéines étrangè-35 res et qu'elle risque dfaltérer le goût du lait, il serait souhaitable d'enlever du lait la totalité de la préparation d'enzyme que l'on a ajoutée. En outre, puisque la préparation de lactase représente une dépense importante, une récupération efficace 71 44948 2122405 de l'enzyme est souhaitable du point de vue économique, mais les préparations pulvérulentes d'enzymes solubles du commerce ne sont pas récupérables du lait. En dernier lieu, l'utilisation de températures élevées diminue la durée possible de conservation 5 du lait traité. Ainsi, avant la présente invention, il n'éxistait pas de procédé pratique pour diminuer la teneur du lait en lactose. Les buts de la présente invention sont de proposer : - un procédé perfectionné pour traiter du lait par la lac-10 tase ; - un procédé pour la digestion du lait par la lactase à des températures réduites ; - un procédé pour la digestion du lait par la lactase sous une forme facilitant sa récupération à partir du lait traité ; 15 - et un procédé économique pour la digestion du lait par la lactase. On parvient aux buts de la présente invention en mettant le lait en contact avec une lactase immobilisée en vrac à des températures réduites pendant une période de temps suffisante pour 20 obtenir la diminution voulue de la concentration du lactose dans le lait. Par le terme "lait", tel qu'on l'utilise ici, on entend du lait entier aussi bien que des produits à base de lait; liquide contenant du lactose comme du lait écrémé, du petit lait, etc. 25 La lactase que l'on utilise dans la pratique de la présen te invention peut s'obtenir à l'échelle commerciale ou industrielle. Une forme appropriée est la B-Galactosidase (B-D-galactosi-de-galactohydrolase) obtenue à partie de E. Coli et vendue par Worthington Biochemical Corporation sous forme d'une poudre sè-30 che ayant une activité minimale de 50 unités internationales par milligramme de poudre. Par l'expression "lactase immobilisée", on entend une préparation de lactase qui a été immobilisée sur ou dans un support qui est insoluble dans le lait à traiter. Une forme préférée de 35 lactase immobilisée est celle dans laquelle la lactase est incorporée par des techniques appropriées dans une membrane semi-permêable . Des modes opératoires" appropriés sont décrits,par exemple, dans le brevet de la République Fédérale d'Allemagne 71 44948 2122405 n° 1 227 855. Par l'expression "membrane semi-perméable", on entend une pellicule ou membrane d'un polymère linéaire,c'est-à-dire non réticulé, qui est perméable à des composés à bas poids moléculaire, mais imperméable à des composés macromolëculaires comme les protéines. En général, de telles pellicules ou membranes ont des pores dont les dimensions moyennes sont intermédiaires entre les dimensions moléculaires des composés à bas poids moléculaire et les dimensions des composés macromoléculaires. La dimension exacte des pores n'est pas fondamentale pour la présente invention. Au contraire, c'est le rapport entre la dimension des pores de la membrane et la dimension efficace des molécules de lactase et de lactose qui est importante. C'est-à-dire que la dimension des pores doit être inférieure à la dimension efficace de la molécule de lactase pour garantir la rétention de la lactase dans la membrane. Par ailleurs, la dimension du pore doit être suffisante pour permettre le passage du lait contenant le lactose sur lequel agit la lactase. En général, on a trouvé utiles des membranes ayant des dimensions de pores comprises entre environ 20 et environ 60 unités Angstrom. Une caractéristique importante du polymère constituant la membrane est qu'il doit être soluble dans un solvant relativement volatil dans des conditions où la lactase est stable, mais insoluble dans le lait à traiter- En outre, le polymère doit être inerte,c'est-à-dire qu'il ne doit pas réagir avec la lactase, avec le lactose ou avec le lait. On connaît dans la pratique des polymères utiles et qui ont servi pour constituer des membranes de dialyse. Parmi ces polymères, il y a les dérivés cellulosiques comme la "Cellophane", la cellulose régénérée, et des esters comme l'acétate de cellulose et le coton partiellement nitré connu sous le nom de pyroxyline, ainsi que du celluloïd et du collodion ; des protéines comme le collagène ; des polymères vinyliques, en particulier des esters'vinyliques comme du poly(méthacrylate de méthy-le), etc. On préfère le collodion. On enferme la lactase dans la membrane semi-perméable elle-même en dispersant ou dissolvant la lactase dans une solution du polymère filmogène. Le solvant du polymère n'est pas fondamental pour la présente invention pourvu qu'il soit inerte, 71 44948 4 2122405 c'est-à-dire qu'il ne réagisse pas avec le polymère ou avec la lactase, et qu'il soit relativement volatil, c'est-à-dire qu'on puisse l'évaporer dans des conditions où la lactase est stable, de préférence à la température et à la pression ambiantes. Le 5 solvant particulier choisi va, bien évidemment, dépendre du po lymère particulier, mais des éthers volatils, par exemple l'é-ther diéthylique, des cétones, comme par exemple l'acétone, des hydrocarbures chlorés comme par exemple le 1,2-dichloréthane, etc, ainsi que leurs mélanges, conviennent en général.Le solvant 10 peut également être un solvant de la lactase, mais cela n'est pas nécessaire. La concentration du polymère dans la solution n'est pas fondamentale, pourvu que la solution ne soit pas visqueuse au point d'éviter une distribution uniforme de la lactase dans tout le po-15 lymère ou bien au point d'empêcher le mode particulier d'application et pourvu, en outre, qu'il y ait suffisamment de solvant pour dissoudre la lactase si on le désire. On préfère, cependant, n'utiliser pas plus de solvant que nécessaire pour réduire à son minimum la durée du séchage. En général, on a trouvé utiles des 20 solutions contenant environ 10 à environ 50 % de polymère. De façon similaire, le rapport entre la lactase et le polymère n'est pas étroitement fondamental, pourvu qu'il y ait suffisamment de lactose pour fournir une membrane ou une pellicule ayant une activité utile et qu'il y ait suffisamment de polymère 25 pour former une gangue autour de la lactase. En général, on préfère que la membranne contienne au moins environ 0,3 million à environ 1 million d'unités de lactase par gramme de polymère générateur de la membrane. On applique la suspension ou solution de lactase, de poly-30 mère et de solvant à n'importe quelle surface appropriée pour former une pellicule ayant l'épaisseur voulue, laquelle se situe normalement entre environ 10 microns et environ 1 mm, et l'on fait évaporer le solvant. Si l'on doit utiliser la pellicule sous une forme ne comportant pas de support,on coule sur un support 35 non adhérent, comme du verre, et l'on enlève par pelage, lorsque . la pellicule est sèche. En variante, on peut extruder la solution de polymère contenant la lactase à travers, une filière dans un bain de coagulation, en utilisant des techniques connues. 71 44948 5 2122405 On utilise de façon souhaitable la pellicule sur un support et l'on peut déposer directement sur le support la solution contenant la lactase. Par exemple, on peut appliquer la solution sur un filtre de matière1 inerte. , comme du"Nylôn" , et sé-5 cher.D* autres formes encore de support apparaîtront aux experts ayant une connaissance moyenne dans ce domaine. Les supports préférés, cependant, sont ceux qui, comme desfiltres , rendent maximale la surface spécifique de contact de la membrane exposée par unité de poids de la membrane. L'article résultant est 10 une membrane dans laquelle se trouve le filtre. On connaît d'autres formes encore d'enzymes immobilisées, mais elles sont moins préférées pour servir dans la présente invention. Par exemple, on peut adsorber la lactase sur un support poreux comme le kaolin, mais la lactase peut être éliminée du 15 support par lessivage. On peut également utiliser une lactase qui est chimiquement liée à un substrat, mais de telles formes de lactase sont en général considérées comme ayant une activité réduite. On peut également utiliser une lactase microencap-sulée ; cependant, l'utilisation de microcapsules nécessite un 20 lit fixe et des techniques plus compliquées que celles nécessaires -lorsqu'on utilise une membrane sur un support. La quantité de lactase immobilisée que l'on utilise ne présente pas une importance étroitement fondamentale pourvu que l'on obtienne une vitesse acceptable de transformation du lac-25 tose, cette vitesse augmentant avec l'augmentation des quantités d'enzyme par unité, de volume du lait. D'ordinaire, on conduit de façon souhaitable la réaction à une vitesse telle que le lactose soit complètement hydrolysé en 12 heures. Ainsi, la concentration en lactase dépend de la concentration en lactose dans le 30 lait que l'on traite, du procédé par lequel on traite le lait, et de la forme de la lactase immobilisée. Il faut de moindres quantitésde lactase pour traiter un lait à faible teneur en lactose dans la même période de temps qu'un lait à teneur élevée en lactose, lorsqu'on effectue la mise en contact dans des conai-35 tions de plus forte agitation ou bien lorsque la membranne contenant la lactase présente une surface spécifique élevée de contact par unité de volume, ce qui expose plus de lactase à des contacts avec le lait. En général, on obtient des résultats 71 44948 6 2122405 intéressants lorsqu'on utilise au moins environ 0,5 million, et de préférence environ 1 million à 3 millions d'unités de lactase par litre de lait. Dans un mode préféré de réalisation, on mélange 20 à 40 g 5 de lactase, ayant une activité de 50 à 80 unités par milligramme, avec 90 à 100 millilitres d'une solution de 0,3 à 0,5 g de collodion dans l'éther éthylique. On applique le mélange résul- 2 tant à environ 1290 cm d'un filtre en matière inerte, comme du "nylon", puis l'on sèche. On immerge ensuite le filtre dans 1 litre 10 de lait. Après 12 heures environ d'agitation à 3°-5° C, le lactose est complètement hydrolysé. On peut réutiliser de façon similaire la membrane contenant la lactase pendant plusieurs mois avec seulement une faible diminution de son efficacité. On peut également conduire le procédé de façon continue ou 15 semi-continue. Par exemple, un récipient tubulaire peut avoir ses parois intérieures revêtues de la membrane contenant la lactase et l'on peut faire passer le lait dans le tube pour effectuer la digestion du lactose. Comme noté ci-dessus, une caractéristique de la présente 2 0 invention est que l'on peut effectuer le procédé à froid, c'est-à-dire à des température inférieures à 20 ° C et de préférence à des températures inférieures à 10° C. Par suite, la durée possible de conservation du lait ne subit pas d'influences nuisibles. 25 II a été trouvé souhaitable dans certains cas d'incluredans la préparation de lactase l'enzyme lysozyme. Il a été trouvé que si l'on effectue le traitement dans des conditions non stériles, la membrane contenant la lactase risque de subir une infection bactérienne pouvant faire aigrir le lait traité. On peut 30 combattre cependant une telle contamination bactérienne en incorporant du lysozyme dans la membrane. La concentration de lysozyme dans la membrane n'est pas fondamentale pourvu qu'elle soit efficace pour éviter une contamination bactérienne. D'ordinaire, des quantités d'au, moins 1 million environ, et de pré-35 fërence comprises entre environ 5 millions et environ 10 millions d'unités de lysozyme par gramme de polymère formant la membrane sont efficaces. Les exemples non limitatifs suivants sont présentés afin 71 44948 7 2122405 d'illustrer l'invention. Exemple 1 On reconstitue avec de l'éther éthylique du collodion du commerce, du type Codex, après avoir d'abord fait évaporer le 5 solvant d'origine dans un bain-marie chaud, et l'on met 200 mg de lactase séchée en suspension uniforme dans 10 ml du collodion reconstitué. Après l'addition de 10 ml d'éther supplémentaire, on fait passer la suspension dans une seringue (sans aiguille) et l'on éjecte dans un tube sec de dialyse ayant 1,2 m 10 à 1,8 m de longueur (épaisseur à plat : 2 mm). On étale uniformément la suspension sur toute la longueur du tube, puis l'on soumet à un courant d'air comprimé à faible pression que l'on insuffle dans le tube jusqu'à évaporation de la totalité de l'éther. Oh aplatit.le tube, on le noue à une extrémité et on le 15 place sur une bande de filtre inerte et souple ayant une longueur approximativement égale à celle de la tubulure. On enroule ensuite l'ensemble résultant, tube-filtre, en commençant par l'extrémité nouée, on ferme bien l'extrémité extérieure du tube de dialyse après cet enroulement pour enlever l'excès d'air et l'on 20 fixe l'enroulement par une bande élastique. On met l'enroulement en suspension dans 100 ml de lait écrémé frais disposé sur un barreau d'agitation magnétique à 5° C. En 24 heures, il y a environ 100 % d'hydrolyse -du- lactose du lait. On peut traiter de façon similaire les jours suivants une 25 seconde et une troisième portions de lait, mais on obtient moins de 100 % d'hydrolyse au bout de 3 jours. Exemple 2 On applique de la lactase en solution concentrée (lg/lOml de H2O) sur du papier filtre absorbant (à savoir, du papier 30 "Eaton-Dikeman n° 617") oû l'on effectue une lyophilisation. Après séchage -, on enlève tout l'excès de1 poudre d'enzyme, lâche et l'on recouvre le papier saturé d'enzyme par une solution formant une membrane semi-perméable (collodion, métha-crylate de méthyle, etc). Après séchage , l'enzyme n'est pas 35 enfermée dans le polymère lui-même, qui agit seulement à titre de membrane semi-perméable. Lorsqu'on opère de façon similaire à celle décrite dans l'exemple 1, il n'y a pas d'échappement d'enzyme dans le substrat environnant. 71 44948 8 2122405 Exemple 3 On étale 500 ml de poudre sèche de lactase dans une section de 45 cm d'une tubulure de dialyse en cellulose régénérée et l'on ferme les extrémités de la tubulure avec un adhésif "Dow 5 Corning Glass Ceramic". Après séchage .on enroule le tube dans un filtre d'acier inoxydable comme décrit dans l'exemple 1. On peut insérer l'assemblage ainsi obtenu dans un récipient de lait pour obtenir la digestion de 60 à 80 % du sucre de lait à 7° C. Ce niveau d'activité est conservé pendant une période d'au 10 moins 10 jours. Exemple 4 On mélange 30 g de lactase ayant une activité de 50 à 80 unités par milligramme, avec 3 g de lysozyme sans sel ., ayant une activité de 9 000 unités par milligramme. On verse le mélan-15 ge résultant dans 90 ml d'une solution contenant environ 0,4 g de collodion dans de l'ester éthylique ayant la qualité des réactifs de chimie. Après un mélange poussé, on étale la solution résultante sur un filtre de "nylon" de 9.0 cm x 13, 7 cm. On place le filtre imprégné entre deux morceaux de même dimensions de "filtre 20 non traité et l'on enroule de façon lâche les 3 feuilles autour d'une baguette en verre pour l'agitation avec un T à une extrémité. On utilise une bande élastique pour éviter le déroulement. Après exposition à un courant d'air dans une pièce froide durant 13 heures environ pour enlever toutes les traces d'éther, on im-25 merge le produit résultant dans un litre de lait écrémé frais à 3°-5° C et l'on fait tourner à 60 tours par minute. Au bout de 8 heures, il J a eu entre 75 et 96 % d'hydrolyse du lactose, et une hydrolyse complète se produit en douze heures. 71 44948 9 2122405 REVENDICATIONS 1 - Procédé perfectionné pour diminuer la teneur en lactose d'un produit liquide à base de lait par mise en contact de ce produit laitier avec du lactose, caractérisé en ce qu'on met ce 5 produit laitier en contact avec la lactase sous forme immobilisée (dans ou sur un support insoluble dans le lait à traiter), à une température inférieure à 20° C environ pendant une période de temps suffisante pour obtenir un taux voulu la diminution de la teneur en lactose. 10 2 - Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'on disperse la lactase dans une membrane semi-perméable. 3 - Procédé selon la revendication 2, caractérisé en ce que la membrane semi-perméable comprend du lysozyme en une quantité suffisante pour inhiber une contamination bactérienne. 15 4 - Procédé selon la revendication 2, caractérisé en ce que la membrasse contient au moins 0,1 million environ d'unités de de lactase par gramme de membrane. 5 - Procédé selon la revendication 3, caractérisé en ce que la membrane contient environ 0,3 million à environ 1 million d'u- 20 nités de lactase et environ 5 millions à environ 10 millions d'unités de lysozyme par gramme de membrane. 6 - Procédé selon la revendication 4, caractérisé en ce qu'on utilise au moins 0,5 million d'unités de lactase par litre de lait. 25 7 - Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que le produit à base de lait est du lait entier. 8 - Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que le produit à base de lait est du lait écrémé. 9 - Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que 30 le produit â base de lait est du petit-lait.