FR 2113821 A1 19720630 FR 7121358 A 19710611 71 21358 1 2113821 1 La présente invention se rapporte d'une façon générale aux produits conjugués d'haptènes et de protéines et .aux dérivés fluorescents des fragments hapténiques de ces produits. Dans le présent mémoire, on entend par "haptène" une petite molécule ou 5 une portion de molécule, par exemple d'oestriol, capable de se lier avec un anticorps spécifique, mais incapable de créer des anticorps à moins d'être liée à un véhicule antigène. Plus particulièrement,- l'invention concerne des produits conjugués et des dérivés de cette nature, ainsi que des procédés pour leur prépa— 10 ration et leur utilisation afin de former des nouveaux anticorps fluorescents et de réaliser des titrages pour certains métaboli— tes du corps. L'invention concerne également des produits intermédiaires nouveaux qu'on utilise pour préparer les composés indiqués, ainsi que des procédés de préparation de ces produits in— 15 termédiaires. Ces composés sont utilisables à des fins médicales, entre autres. Un grave problème qui se pose en médecine est la détection et la caractérisation de petites quantités de substances qui sont importantes pour.le métabolisme, par exemple de stéroïdes, de 20 catéchol aminés, d'insuline et de polypeptides, dans les fluides physiologiques et dans les cellules. Les procédés ordinaires manquent de sensibilité ainsi que de spécificité pour la substance soumise au titrage. En conséquence, les résultats de tels titrages ne sont pas sûrs. 25 L'importance des procédés sûrs de titrage ressort notamment quand on les applique aux stéroïdes, à l'oestradiol et à l'oestriol, qui sont tous des éléments ayant une répercussion certaine sur les anomalies du foetus. Le foetus produit, principalement dans sa glande adrénale, 30 une molécule androgène qui joue le rôle d'un précurseur de l'oestriol et qui est la source principale de ce dernier élément dans le sérum maternel. C'est le placenta, c'est-à-dire un produit principalement foetal, qui aromatise la molécule du précurseur et effectue son hydroxylation, pour donner de l'oestriol. 35 Les niveaux d'oestriol dans le sang et dans l'urine de la mère augmentent fortement pendant la grossesse par suite des changements du métabolisme. Ce phénomène est normal. On observe une augmentation des niveaux d'oestriol d'au moins 1000 à 10.000 fois au terme de la gestation si la grossesse se déroule normalement. 40 Cependant, si le foetus est dans un état critique ou est malade, 71 21358 2 2113821 ou bien encore si le placenta n'est pas mûr ou s'il est fortement contaminé et que le foetus est en danger de mort, les niveaux d'oestriol dans le sérum maternel sont diminués. Il en est également ainsi dans le cas" d'une diminution de l'oestriol dans l'u-5 rlne de la mère (en supposant un fonctionnement normal des reins) ou dans le fluide amniotique foetal. Il résulte de ce qui précède qu'un dosage rapide et précis des niveaux d'oestriol dans ces fluides physiologiques serait utile pour pouvoir prédire la survivance du foetus et pour per-10 mettre au praticien de déterminer l'utilité éventuelle d'une césarienne ou d'un traitement d'un autre genre de la mère pour tenter de sauver le foetus. L'oestradiol est la plus active des substances oestrogènes pendant la gestation. L'action complète de l'oestradiol (et aussi 15 de l'oestrone) chez la mère demeure un facteur inconnu car on n'a jamais réussi â en effectuer une détermination précise. Pour la même raison, les niveaux d'oestrogènes individuels pendant la grossesse, au cours de la période allant de la conception jusqu'à huit semaines de gestation, ne sont pas connus 20 car les moyens dont on dispose à l'heure actuelle ne permettent pas une détermination précise. Si une telle détermination était possible dès les premiers jours qui suivent la conception, on pourrait tracer une courbe normalisée et on pourrait effectuer un test plus précoce et plus sûr de la grossesse. 25 Une façon relativement nouvelle d'abord'er les titrages bio logiques consiste à utiliser des procédés immuno—chimiques comme base du titrage. Les techniques de ce genre comportent une tentative de production d'un antigène synthétique (un antigène est une molécule qui produit des anticorps chez un hôte, par exemple 30 l'albumine du sérum bovin) qui crée des anticorps spécifiques pour le composé à titrer. On mélange une quantité connue d'un tel anticorps et un échantillon inconnu (par exemple un stéroîde) provenant de l'échantillon à titrer. En théorie, si l'anticorps était spécifique pour le stéroîde, on pourrait mesurer la quan— 35 tité de l'anticorps qui réagit avec le stéroîde. On pourrait alors déduire de la valeur obtenue la quantité du stéroîde présent dans l'échantillon, en supposant évidemment que le procédé de mesure est suffisamment sensible aux concentrations considérées. 40 .Malheureusement, aucune technique immuno-chimique capable 71 21358 3 2113821 d'effectuer un titrage précis et sûr n'a pu être réaliséaà ce jour. Un problème important des techniques immuno—chimiques connues, outre le manque de sensibilité des techniques de mesure dont on dispose, est que l'antigène synthétique ne produit pas un 5 anticorps qui est spécifique pour le stéroîde soumis à l'essai. Par exemple, un article publié dans la revue Immunochemistry _5, 55-65 (1968) décrit la synthèse de certains produits conjugués de stéroïdes et de protéines et la production d'un antisérum de lapin pour le bêta-oestradiol, en combinaison avec l'albumine de 10 sérum bovin (BSA) et 1'hémocyanine de la variété de patelles vivant sur le long des côtes des Etats-Unis et appelée "keyhole lîmpet" (KLH). Des antisérums ont été essayés contre les stéroïdes combinés avec la gamma-globuline humaine (IgG). Les titrages immunologiques utilisent des essais quantitatifs d'inhibition 15 avec la précïpitine et l'haptène. Les produits conjugués qu'on obtient par le procédé décrit dans l'article précité ne permettent pas d'obtenir des anticorps qui sont spécifiques pour l'haptène de stéroîde (c'est-à-dire le bêta-oestradiol, l'oestriol ou l'oestrone) utilisé dans le pro-20 duit conjugué. L'anticorps pour 1'oestradiol-KLH fait descendre un précipité non spécifique avec la testostérone-IgG, alors que 1'anticorps pour 1'oestriol-KLH fait descendre un précipité de façon non spécifique avec testostérone-IgG et avec oestradiol-IgG. Il est ainsi impossible d'effectuer des titrages précis en utili-25 sant les anticorps obtenus par le procédé indiqué» Comme on le verra dans la description ci-après, la présente invention a pour objet des anticorps fluorescents nouveaux, purifiés, qui sont spécifiques pour le composé soumis au titrage, et de nouveaux haptènes fluorescents. Grâce à cette remarquable 30 réalisation, on est en mesure d'effectuer des essais fluorescents et des immuno-radlo-titrages d'un caractère extrêmement sûr, pour une grande variété de substances qui sont importantes pour le métabolisme, y compris l'oestrone, l'oestradiol, l'oestriol, les catécholaminés, l'insuline et la plupart des 35 polypeptides. Selon un aspect de l'invention, cette dernière a pour objet des antigènes nouveaux, tels que les antigènes stéroïdes-protéines, les antigènes catécholamines-protéines et d'autres antigènes qui seront étudiés par la suite. Quand on injecte ces 40 antigènes à l'état pur dans un hôte produisant des anticorps, on 71 21358 4 2113821 obtient des anticorps spécifiques pour la substance métabolique-ment active correspondante (par exemple le stéroîde ou la caté-cholamine). Ces anticorps procurent des résultats précis quand on les utilise dans des titrages par fluorescence et des immuno-5 radio-titrages de telles substances. Ces anticorps et les titrages correspondants constituent également des modes de réalisation de l'invention. L'injection de ces antigènes dans un hôte est une autre technique qui fait 1'obj et de 1'invention et qui permet de disposer d'un procédé efficace pour l'immunisation de l'hôte con-10 tre la fonction physiologique des métabolites correspondants ou contre la destruction de ces métabolites chez l'hôJe. L'invention vise également à fournir des procédés nouveaux et des produits intermédiaires nouveaux pour la production des antigènes et des anticorps indiqués, ainsi, que des procédés de 15 préparation de tels produits intermédiaires -à l'état pur. En outre, l'invention englobe les haptènes fluorescents nouveaux et les dérivés antigènes qui sont utiles pour le titrage par fluorescence, ainsi d'ailleurs que des procédés pour la préparation de telles substances. Tous ces buts de l'invention ainsi 20 que d'autres ressortiront de la description détaillée qui va en être faite ci-après. Les antigènes stéroïdes—protéines, selon l'invention, sont 30 ( «y englobe les isomères alpha ou bêta) dans laquelle R représente un atome d'hydrogène ou un radical alcoyle inférieur (C^-C^); R» représente un fragment quelconque 35 capable de supporter un ion diazonium (voir par exemple P.A. Smith, "The Chemistry of Open Chain Nitrogen Compounds", Vol. 1, pp. 100-105, W.A. Benjamin, New York 1965J, tel qu'un radical arylène non substitué, de préférence tin radical phénylène ou naphtylène, contenant environ 6 à environ 14 atomes de carbone 40 ou un radical arylène substitué renfermant 1 à 3 groupes qui ne 71 21358 5 2113821 gênent pas la formation d'un ion diazonium (c'est-à-dire supporté par le fragment d'aryl-amine, -R'NH^), et de préférence les groupes choisis parmi les suivants : amino, nitro, halo (c'est-à-dire chloroj bromo, fluoro, iodo), HSO^, carboxyle ou un fragment de 5 noyau condensé tel que napthyle ou terphényle; X représente un atome d'hydrogène ou un radical hydroxy, céto, ester, -0Ro dans lequel Rq est un radical alcoyle ou cycloalcoyle, de préférence en C^-C4, aryle, de préf érence en cg-c-£o> Y compris 1 ' adamantyle un groupe amino primaire, secondaire ou tertiaire (-NH^, -NHR", 10 -NR£ ); un alcoyle inférieur; un radical halo; un radical aryle, de préférence en Cg-C10; alcényle; -N=NR"; -SC=N; —OOCR"; —NHCOR" -SR"; -SOR"; -NO et d'autres groupes analogues en positions ortho ou para; -NO^; carboxyle; -C00R"; -SO^H; -GF^; -CCl^; ~NR^ ®; -CN: -COR"; -SO^R"; -102; -R"(0H)2 et des groupes analogues en posi-15 tion méta; R" est un radical alcoyle, cycloalcoyle, aryle, alcényle, cycloalcényle ou hétérocyclique dans lequel les hétéro-atomes sont 0, S ou No De préférence, R" contient environ 1 à environ 10 atomes de carbone dans les chaînes aliphatiques et environ 4 à environ 14 atomes de noyau dans les groupes-cycliques. Y 20 peut avoir la même signification que X et peut également représenter un substituant organique ou minéral quelconque qui reste stable dans les conditions utilisées lors de la synthèse des nouveaux produits conjugués de stéroïdes et de protéines selon l'invention. Les lettres a et b désignent un nombre entier de là 3. 25 Le fragment de protéine (véhicule) peut être une protéine lourde quelconque dont le poids moléculaire est supérieur à environ 6.000. Le fragment de "protéine doit être immunogène et, de préférence, hétérologue. Parmi les protéines de ce genrè, on citera 1'hémocyanine de keyhole limpet précitée (KLH, ayant un poids 30 moléculaire d'environ 7.000.000), l'albumine de sérum bovin (BSA, poids moléculaire 7Q.OOO) et la gamma-globuline humaine (XgG, poids moléculaire 150.000). Dans l'ouvrage "Structural Concepts in Immunology and Immunochemistry" (Elvin Kabat, publié par Holt, Rinehart & Winston, 1968, pages 9-26), on décrit d'.autres proté-35 ines ou molécules que l'on peut utiliser comme véhicules dans l'invention. En outre, le fragment protéine dans la formule précédente peut être remplacé par des polysaccharides, des polypep-tides ou des glyco-prôtéines contenant des groupes carboxyle, hydroxyle ou amino pouvant être couplés avec les produits azos-40 téroïdiques intermédiaires de la présente invention. Ces substan 71 21358 2113821 ces immunogènes sont présentées dans l'ouvrage de N.E. Cremer et ses collaborateurs, "Methods Xn Immunology" 1963, W.A. Benjamin Inc., New York, pages 65—113. Dans ce cas encore, ces fragments doivent être immunogènes et avoir des poids moléculaires supé-5 rieurs à 6.000 environ. Les substances immunogènes de ce genre sont également étudiées dans 1'ouvrage précité de Kabat. L'expression "protéines" englobe dans le présent mémoire ces autres substances immunogènes- Dans la formule précédente, on préfère que X soit OH et que 10 a. soit 1. De préférence, X est substitué en position 3 du stéroîde (alpha ou bêta). En conséquence, le fragment azoïque est substitué en position 2 ou 4 du stéroîde (alpha ou bêta). De préférence R est un radical méthyle ou un atome d'hydrogène dans la forme alpha ou bêta. On préfère que Y soit OH ou céto. Quand Y 15 représente OH, b est de préférence 1 ou 2 et Y est substitué en position 16 et 17 (alpha ou bêta) du stéroîde, habituellement sous forme alpha en 16 et bêta en 17. Quand Y est un groupe céto, b est 1 et la substitution est en position 17. La protéine est de préférence KLH, IgG ou BSA, comme on l'a expliqué plus haut. 20 Dans la formule précédente, X est défini comme étant un groupe en position o, m ou- jd. Cependant X peut représenter un atome d'hydrogène. Dans de tels cas, on utilise des conditions plus rigoureuses pour la réaction. Les nouveaux composés antigènes représentés par la formule 25 précédente et ceux qu'on étudiera par la suite possèdent des propriétés pharmacologiques utiles. Plus précisément, ces composés à l'état pur se révèlent capables de créer des anticorps qui sont absolument spécifiques pour le métabolite correspondant au fragment hapténique des nouveaux produits conjugués selon l'invention. 30 Ainsi ces substances antigènes sont efficaces pour la détection et la caractérisation de quantités minimes (par exemple dans l'intervalle de lO à 20 picogrammes) de métabolites, par exemple de stéroïdes, de catéchol-aminés ou de peptides, dans les fluides physiologiques et les cellules. Les résultats des titrages qui 35 utilisent des anticorps produits par les nouvelles substances antigènes sont sûrs et précis. Lors de la préparation des anticorps -du type indiqué, on administre une dose efficace (par exemple une dose totale de 30 à ÎOO mg par animal) de l'antigène haptène-protéine sous formé pure 40 à un animal, de préférence à un lapin. On préfère administrer 71 21358 7 2113821 l'antigène un jour sur deux par voie intraveineuse pendant une semaine au total (c'est-à-dire 3 injections par semaine). Deux semaines plus tard, on administre par/voie sous-cutanée (en une seule fois) une dose efficace de l'antigène avec une quantité 5 égale de l'adjuvant complet de Preunds. Trois semaines plus tard, on saigne l'animal et on sépare par une technique usuelle l'anticorps contenu dans le sérum sanguin. Un exemple de ce procédé est l'administration de 0,5, 0,75, ou 1,0 ml d'une solution aqueuse à 1% (par rapport au poids de la protéine) du produit oestradiol— 10 KLH, administration que l'on effectue par voie intraveineuse trois fois par semaine pendant deux semaines, puis on administre 2,5 ml d'une solution à 1% dans un volume égal de l'adjuvant de Freunds par voie sous-cutanée. On peut préparer les antigènes représentés par la formule 15 précédente en utilisant la séquence de réactions I ci-après : SEQUENCE DE REACTIONS-X (^✓englobe les isomères alpha ou R bêta) 40 71 21358 8 2113821 R dans laquelle R, R', X, Y, a et b sont tels que définis plus haut R", Rr *' et R"", qui peuvent être les mêmes ou différents, repré-2q sentent chacun un groupe alcoyle, par exemple alcoyle inférieur, cycloalcoyle, par exemple en C^-Cg, aryle, par- exemple en C6-C10, alcényle, par exemple alcényle inférieur, cycloalcényle, par exemple un groupe monooléfinique en C^-Cg, ou hétérocyclique, auquel cas les hétéro-atomes sont 0, S ou N et les atomes du 35 noyau sont au nombre de 5 à 7. Dans la séquence de réactions ci-dessus, le dérivé stéroï-dique de l'acide azo-aryloïque, c'est-à-dire 1'azostéroïde (III), sous forme pure, est un composé nouveau et constitue l'un des modes de réalisation de l'invention. On le prépare à partir du 40 stéroîde (I) contenant un noyau aromatique A, par réaction avec 71 21358 9 2113821 un acide amino-aryloïque (II) dans des conditions usuelles de diazotation. En général, on utilise un excès d'acide nitreux. De préférence on utilise environ 0,75 à environ 1 équivalent de l'acide amino-aryloïque en présence d'environ 0,85 à environ 1, 2 • 5 équivalent d'acide nitreux. On effectue la diazotation dans une solution d'un acide minéral fort. On forme en général l'acide nitreux par une addition d'une solution de nitrite de sodium au mélange de l'arylamine dans un excès d'acide minéral. On maintient habituellement la réaction à une température inférieure à 5°C, de 10 préférence à 0°C. On ajoute l'acide amino-aryloïque diazoté ainsi obtenu à une concentration à peu près équivalente (par exemple 1-1,35) du stéroîde (I) et on obtient 1 »azostéroïde (III). On maintient en général le stéroîde dans une solution tamponnée dont le pH est d'environ 11. On conserve, de préférence, le stéroîde 15 dans une solution d'alcanol (par exemple de méthanol). L'estérifi-cation avec l'acide minéral, de préférence HC1, se traduit par la précipitation de 1'azostéroïde désiré (III) sous une forme brute. L'azostéroïde brut est un mélange stéréoisomère et contient d'autres sous-produits de réaction. L'isomère particulier, dont 20 la formation sera prédominante, dépend du substituant X (aussi bien en ce qui concerne son caractère que sa position) dans la séquence de réactions indiquée. Ainsi on effectue la purification de l'isomère d'azostéroïde prédominant (III) par des techniques de chromatographie. Par exemple, on peut effectuer la chromato-25 graphie de 1'azostéroïde sur une colonne de gel de silice et obtenir ainsi 1'azostéroïde désiré (III) sous une forme sensiblement pure (c'est-à-dire d'une pureté de plus de 98% environ). Le produit intermédiaire de couplage,qui est une pseudo-urée (V), est également un-" produit nouveau selon l'invention et on 30 l'obtient en faisant réagir 1'azostéroïde pur (III) avec le carbo-diimide (IV). Les températures ne sont pas critiques et sont normalement comprises entre environ -10°.C et' 25°C. On effectue la réaction dans une solution aqueuse, ' de préférence une solution aqueuse saline à 1/6. On préfère faire réagir l'azostéroïde (III) 35 avec le carbodiimide (IV) en présence de la protéine de conjugaison (par exemple KLH, IgG ou BSA)."En général, on introduit la protéine dans le mélange des autres ingrédients. De préférence on isole les pseudo-urées (V) qui sont des produits intermédiaires nouveaux, avant la conjugaison avec les 40 véhicules protéiniques, dans du méthanol à 20%, à pH élevé (10). 71 21358 10 2113821 ^ ' Après séchage par congélation, on fait réagir la pseudo-urée avec les protéines dans le rapport molaire désiré (par exemple 10 à 30:1). Cette façon d'aborder le. problème offre l'avantage désiré d'empêcher la polymérisation des protéines par le carbodiimide 5 libre. La conjugaison avec les protéines se produit à des températures du même ordre que précédemment, c'est-à-dire entre environ -10°C et 25 °C, mais on peut utiliser une température aussi élevée que 60°C. On utilise des milieux aqueux pour la réaction. La 10 conjugaison se déroule par l'entremise du produit intermédiaire (VI), qui est pur et qui constitue l'un des produits nouveaux faisant l'objet de l'invention, pour former l'antigène stéroïde-protéine désiré (VII). Pour transformer l'intermédiaire azoïque (III) en protéine 15 désirée, on peut utiliser d'autres techniques de copulation, par exemple la technique décrite à la page 20 de l'article de Kabat déjà cité. C'est ainsi qu'on peut faire réagir 1'azostéroïde (III) avec un dihalothiocyânatè, par exemple un dichlorothiocya-nate ou un halogénure de thionyle, tel que le chlorure de thio-20 nyle, et on obtient ainsi des mélanges stéréoisomères de produits intermédiaires nouveaux, selon l'invention, plus précisément de 30 R dans lesquelles R, R', X, Y, _a et b^ sont tels que définis précédemment. La conjugaison du produit intermédiaire (IX) avec la protéine réactive permet d'obtenir l'antigène stéroïde-protéine 40 désiré (VII). La conjugaison du produit intermédiaire ("VIII) avec 71 21358 2113821 ' la protéine donne le nouveau produit conjugué antigène ci-après : R 10 formule dans laquelle R, R', X, Y, _a et b ont les mêmes significations que précédemment. Les exemples suivants, dans lesquels toutes les proportions sont en poids, sauf stipulation contraire, servent à illustrer 1'invention sans aucunement en limiter la portée : 15 EXEMPLE 1 Acide 4-(17'bêta-oestradiol-41-azo)benzoîque A. Préparation A 10 ml de HC1 normal on ajoute 0,75 milliéquivalent- (meq) d'acide p-amino—benzoîque et on réfrigère à 5°C. On ajoute 20 0,85 meq de nitrite de sodium. On agite dans un bain de glace pendant 20 minutes, le pH ne dépassant pas 1. On titre sur un papier d'iodure d'amidon, puis on enlève l'excès de nitrite avec de lracide sulfamique. On ajoute goutte à goutte l'acide p-amino-benzoïque diazoté à une concentration équivalente d'oestradiol 25 (0,75 meq) en dissolution dans un tampon de phosphate décinormal, à pH 11, contenant 20% de méthanol. On ajoute un supplément de méthanol pour maintenir le stéroîde à l'état soluble. On verse la solution dans un bêcher contenant 20 ml de HC1 concentré. On dilue jusqu'à 500 ml. On observe une précipitation de l'azosté-30 roïde. Après centrifugation, on dissout de nouveau dans une base (carbonate de sodium décinormal). Le stéroîde qui n'a pas réagi reste insoluble. Après centrifugation on acidifie de nouveau la solution et on 1'extrait dans du tétrahydrofuranne (séché sur LiB^) qu'on évapore rapidement sous azote. 35 B. Purification On procède à la chromatographie de 1'azo—oestradiol brut (250 mg), contenant le dérivé 4'-azoïque, une certaine quantité d'acide 4-(17'bêta-oestradiol-2'-azo)benzoîque et une très faible proportion d'acide 4-(17'bêta-oestradiol—1'-azo)benzoîque, sur 40 une colonne de 100 g de-gel de silice (Brinkmann, 0,05-0,2 mm) 71 21358 2113821 tassée sous forme d'une suspension dans un mélange d'acétate d'éthyle, de méthanol et d'eau (98,5:1:0,5). On commence par éluer la matière non acide avec 400 ml du même solvant. On poursuit l'élu-tion avec un mélange d'acétate d'éthyle, de méthanol et d'acide 5 acétique (97:2:1). On met au rebut les premiers 200 ml et on recueille 1'azo-oestradiol dans les 300 ml suivants.'L'évaporation du solvant permet d'obtenir 67 mg d'acide 4-(17'-bêta-oestradiol— 4'-azo)benzoîque, d'une pureté d'environ 98% par chromatographie. C. Préparation de 1'acide 4—(17' -bêta-oestradiol-4'—hydrazo) 10 benzoîque On dissout dans du méthanol 25 mg d'acide 4-(17' bêta-oestradiol-4 '-azo)benzoîque (0,15 mg/ml). On ajoute un excès molaire de 800% de borohydrure de sodium, sous forme d'une solution aqueuse (0,5 mg/ml de solution d'azostéroïde), le mélange étant 15 balayé avec de l'azote. On extrait le mélange de réaction (pH 11) avec de l'acétate d'éthyle et, après évaporation, on obtient du 4-amino—oestradiol. On abaisse le pH de la phase aqueuse à une valeur de 3-4 et, après extraction et évaporation, on obtient de l'acide 4—( 17'-bêta—oestradiol—4'-hydrazo)benzoîque. Une chromato— 20 graphie en couche mince permet d'obtenir les dérivés purifiés fluorescents de 4-amino-oestradiol et d'acide hydrazo-oestradiol— benzoîque. EXEMPLE 2 Acide 4-(17' bêta-oestradiol-4'-azo)benzoîque 25 A. Préparation A 10 ml de HC1 normal on ajoute 0,75 meq d'acide p—aminoben— zoïque et on réfrigère à 5°C. On ajoute 0,85 meq de nitrite de sodium. On agite dans un bain de glace pendant 20 minutes, le pH ne dépassant pas 1. On effectue un titrage avec un papier d'iodu-30 re d'amidon, puis on enlève l'excès de nitrite avec de l'acide suifamique. On aj oute goutte à goutte 1'acide p—amino—benzoîque diazoté à unê concentration équivalente de 17—bêta-oestriol (0,75 meq) en dissolution dans un tampon de phosphate décinormal, pH 11, contenant 20% de méthanol. On ajoute un supplément de mé-35. thanol pour maintenir le stéroîde à l'état soluble. On verse la solution dans un bêcher contenant 20 ml de HC1 concentré. On dilue jusqu'à 500 ml. On observe une précipitation de 1'azostéroïde. Après centrifugation on dissout de nouveau dans une base (carbonate de sodium décinormal). Le stéroîde qui n'a pas réagi 40 reste insoluble. Après centrifugation on acidifie de nouveau la 71 21358 2113821 solution et on l'extrait dans du tétrahydrofuranne (séché sur LiB^) qui est rapidement évaporé sous azote. -- -- B. Purification On soumet à une chromatographie 1'azo-oestriol brut provenant 5 du stade A (250 mg), contenant le dérivé 4'-azoïque, une certaine quantité d'acide 4-(17'-bêta-oestriol-2'-azo)benzoîque et une très faible quantité d'acide 4-(17'-bêta-oestriol—1'-azo)benzoîque sur 100 g d'une colonne de gel de silice (Brinkmann, 0,025-0,2 mm) tassée sous forme d'une suspension dans un mélange d'a-10 cétate d'éthyle, de méthanol et d'eau (98,5:1:0,5). On commence par éluer la substance non acide avec 400 ml du même solvant. On poursuit l'élution avec un mélange d'acétate d'éthyle, de méthanol et d'âcide acétique ("97:2:1). On jette les premiers 200 ml et on recueille 1'azo-oestriol dans les 300 ml suivants. L'évapora-15 tion du solvant permet d'obtenir 52 mg d'acide 4-(17'-bêta-oestriol—4'-azo)benzoîque d'une pureté de 98-99% par chromatographie . C. Préparation de l'acide 4-(17* -bêta-oestriol-4'-hydrazo) benzoîque 2q On dissout 25 mg d'acide 4-(17' -bêta-oestriol-4'-azo)ben zoîque purifié dans du méthanol (0,15 mg/ml). On ajoute un excès molaire de 800% de borohydrure de sodium sous forme d'une solution aqueuse (0,5 mg/ml de solution d'azostéroïde), le mélange étant balayé avec de l'azote. On extrait le mélange de réaction 25 (pH 11) avec de l'acétate d'éthyle et, après évaporation, on obtient du 4-amino-oestriol. On abaisse le pH de la phase aqueuse à 3-4 et, après extraction et évaporation, on obtient l'acide 4—(17' bêta-oestriol-4'-hydrazo)benzoîque; La chromatographie en couche mince permet d'obtenir les dérivés purifiés désirés, qui 30 sont le 4-amino-oestriol fluorescent et l'acide hydrazo-oestriol-benzoïque. EXEMPLE 3 Acide 4-(oestrone-4'-azo)benzoîque A. Préparation 35 A 10 ml de HC1 normal on ajoute 0,75 meq d'acide p-amino- benzoïque et on réfrigère à 5°C. On ajoute 0,85 meq de nitrite de sodium. On agite dans un bain de glace pendant 20 minutes, le pH ne dépassant pas 1. On soumet à un titrage avec un papier d'iodure d'amidon, puis on élimine l'excès de nitrite avec de 40 l'acide sulfamique. On ajoute goutte à goutte l'acide p-amino- 71 21353 14 2113821 benzoîque diazoté à une concentration équivalente (0,75 meq) de 17-bêta-oestrone en dissolution dans un tampon de phosphate déci normal (0,1 M), le pH étant de 11, contenant 20% de méthanol. On ajoute un supplément de méthanol pour maintenir le stéroîde à 5 l'état soluble. On verse la solution dans un bêcher qui contient 20 ml.de HC1 concentré. On dilue jusqu'à 500 ml. L'azostéroïde précipite. Après centrifugation ori dissout de nouveau dans une base (carbonate de sodium et hydroxyde de sodium 0,1 M). Le stéroîde qui n'a pas réagi reste insoluble. Après centrifugation on 10 acidifie de nouveau la solution et on extrait dans du tétrahydro furanne (séché sur LiB^) qui s'évapore rapidement sous azote. B. Purification On effectue la chromatographie de 1'azo-oestrone brute (250 mg) contenant des stéréoisomères 4'-,.2'- et 1'-azoïque sur 15 une colonne de ÎOO g de gel de silice (Brinkmann 0,05-0,2 mm) tassée sous forme d'une suspension dans un mélange d'acétate d'éthyle, de méthanol et d'eau (97:2,5:0,5). On commence par éluer la substance non aci-de avec 400 ml du même solvant. On poursuit l'élution avec un mélange d'acétate d'éthyle, de métha-20 nol et d'acide acétique (97:2:1). On met au rebut les 200 premiers millilitres et on recueille 1'azo-oestrone dans les 300 ml suivants. L'évaporation du solvant permet d'obtenir 40 mg d'acide 4-(oestrone-4'-azo)benzoîque d'une pureté d'environ 98% par chromatographle. 25 C. préparation de l'acide 4-(oestrone-4'-hydrazo)benzoîque On dissout 25 mg d'acide 4-(oestrdne-4'-azo)benzoîque dans du méthanol (0,15 mg/ml). On ajoute un excès molaire de 800% de borohydrure de sodium sous forme d'une solution aqueuse (0,5 mg/ml de solution d'azo-stéroïde), le mélange étant balayé avec 30 de l'azote. On extrait le mélange de réaction (pH 11) avec de l'acétate d'éthyle et, après évaporation, on "obtient la 4-aminô-oestrone. On abaisse le pH de la phase aqueuse à 3-4 et, après extraction et évaporation, on obtient de l'acide 4-(oestrone-4'-hydrazo)benzoîque. La chromatographie en couche mince permet 35 d'obtenir les dérivés purifiés désirés qui sont la 4-amino-oestrone fluorescente et l'acide hydrazo-oestrone-benzoïque. EXEMPLE 4 • Acide 4-(17'^alpha—oestradiol-4'-azo)benzoîque A. Préparation 40 A 10 ml de HC1 normal, on ajoute 0,75 meq d'acide p-amino- 71 21358 15 2113821 benzoîque et on réfrigère à 5°C. On ajoute 0,85 meq de nitrite de sodium. On agite dans un bain de glace pendant 20.minutes, le pH ne dépassant pas 1. On effectue un essai avec un papier d'iodure d'amidon, puis on élimine l'excès de nitrite avec de l'acide sul-5 famique. On ajoute goutte à goutte l'acide p-amino-benzoïque diazoté à une concentration équivalente (0, 75 meq) de ITalpha-oestradiol en dissolution dans un tampon de phosphate 0,1 M, à pH 11, contenant 20% de méthanol. On ajoute un supplément de méthanol pour que le stéroîde reste soluble. On verse la solution 10 dans un bêcher qui contient 20 ml de HC1 concentré. On dilue jusqu'à 500 ml. L'azostéroïde précipite. Après centrifugation on le redissout dans une base (carbonate de sodium O,1 M). Le stéroîde qui n'a pas réagi reste insoluble. Après centrifugation on réacidifie la solution et on extrait dans du tétrahydrofuranne 15 (séché sur LiB^) qui est rapidement évaporé sous azote. B. Purification On soumet à une chromatographie 250 mg de 1'azo-oestradiol brut contenant des stéréoisomères 4'-,2'- et 1'-azoïque sur une colonne de 100 g de gel de silice (Brinkmann 0,05 à O,2 mm) tas-20 sée sous forme d'une suspension dans un mélange d'acétate d'éthyle, de méthanol et d'eau (98,5:1:0,5). On commence par éluer la matière non acide avec 400 ml du même solvant. On poursuit 1r é-lution avec un mélange d'acétate d'éthyle, de méthanol et d'acide acétique (97:2:1). On met au rebut les premiers 200 ml et on 25 recueille 1'azo-oestradiol dans les 300 ml suivants. L'évaporation du solvant donne 64 mg d'acide 4-(17'alpha—oestradiol—4'-azo)benzoîque, d'une pureté d'environ 98-99% par chromatographie. C. Préparation de 1'acide 4-(17'alpha-oestradiol-4'—hydrazo) benzoîque 30 On dissout dans du méthanol 25 mg de l'acide 4—(17'alpha- oestradiol-4' -azo) benzoîque purifié (0,15 mg/ml). On ajoute un excès molaire de 800% de "borohydrure .de sodium sous forme d'une solution aqueuse (0,5 mg/ml de solution d'azostéroïde), le mélange étant balayé avec de l'azote. On extrait le mélange de réac-35 tion (pH 11) avec de l'acétate d'éthyle et, après évaporation, on obtient du 4-amino-oestradiol. On abaisse le pH de la phase aqueuse à 3-4 et, après extraction et évaporation, on obtient l'acide 4-(17'alpha-oestradiol-4'-hydrazo)benzoîque. La chromatographie en couche mince permet d'obtenir les dérivés purifiés 40 désirés qui sont le 4-amino-oestradiol fluorescent et l'acide 71 21358 2113821 hydrazo-oestradiol-benzoîque« EXEMPLE 5 Préparation de 4-(17'bêta-oestradiol—41-azo)benzoyl-hemocvanine de keyhole limpet (KLH) 5 On ajoute 100 mg de jnétho-p—toluène-suifonate de 1-cyclo- hexyl-3-(2-morpholinoéthyl)carbodiimide O,1 M dans une solution saline à 1% à 25 mg d'acide azobenzoyl-4-(17'bêta-oestradiol-4'-azo)benzoîque cristallin purifié. On obtient ainsi le produit intermédiaire désiré qui est la O-l,3-dicyclohexyl-2- [(4 -(3'-171 10 bêta-dihydroxoestra-1', 3 ' , 5 1-triényl-4'-azo)benzoyl]J pseudo-urée. A ce mélange on ajoute de la KLH. On agite le mélange jusqu'au moment où 1'azopseudo-urée intermédiaire est liée à KLH et on dialyse pendant 2 à 3 jours à 3°C dans du carbonate de sodium O,5 M, à pH 8,2, jusqu'à ce qu'aucune couleur n'apparaisse plus 15 dans la solution de dialyse. On effectue une dialyse finale contre du NaCl à 0,9% pendant 24 heures. Les stades précédents éliminent les molécules du stéroîde et du dérivé qui n'ont pas réagi. On élimine la protéine insoluble par centrifugation. On effectue la détermination des protéines sur la phase colorée qui 20 surnage et qui contient le produit conjugué 4-(17'bêta-oestradiol-4'-azo)benzoyl-KLH. On lyophilise la phase qui surnage après dialyse avec de 1'eau distillée trois fois. Quand on répète cet exemple 5,sauf qu'on remplace la KLH par une proportion égale d'immuno-gamma—globuline ou d'albumine de 25 sérum bovin, en qualité de protéine, on obtient respectivement la 4-171bêta-oestradiol-4'-azo-benzoyl-immuno-gamma-globuline et la 4-^.7'bêta-oestradiol-4'-azo) benzoyl-albumine de sérum bovin. Les réactions se déroulent par l'entremise des produits intermédiaires correspondants, "qui sont les pseudo-urées de protéines (VI). 30 EXEMPLE 6 Préparation de 4-(oestriol-4'-azo)benzoyl-KLH On ajoute 100 mg de métho-p-toluène suifonate de 1-cyclo-hexyl-3-(2-morpholinoéthyl)carbodiimide (0,1 M) dans une solution saline à 1% à 25 mg d'acide 4-(oestriol-4*-azo)benzoîque 35 cristallin purifié. On obtient ainsi le produit intermédiaire désiré qui est le 0-1,3 -dicyclohexyl-2-{~4-( 3 ', 16 'alpha, 17'bêta-trihydroxy-oestra-1',3',5' —triénylazo)benzoylJpseudo-urée. On ajoute 200 mg de KLH à ce mélange. On agite le mélange jusqu'à l'accouplement de 1'azo-pseudo-urée intermédiaire avec la KLH et 40 on dialyse pendant 2 à 3 jours à 3°C dans du carbonate de sodium 71 21358 2113821 ' 0,5 M, à pH 8,2 jusqu'au moment où la couleur n'apparaît■ plus dans la solution de dialyse. On effectue une dialyse finale contre NaCl à 0,9% pendant 24 heures. Les stades précédents servent à éliminer les molécules de stéroîde et du dérivé qui n'ont pas 5 réagi. On élimine la protéine insoluble.par centrifugation. On procède à la détermination des protéines sur la phase colorée qui surnage et qui contient le produit conjugué 4-(oestriol-4'-azo) benzoyl-KLH. On lyophilise la phase qui surnage après sa dialyse avec de l'eau trois fois distillée. 10 Quand on répète l'exemple 6, sauf qu'on remplace la KLH par de 1'immuno-gamma-globuline ou de l'albumine de sérum bovin, on obtient respectivement le produit conjugué d' azobenzoyl-oestriol et d'immuno-gamma-globuline et 1'azobenzoyl-oestriol conjugué avec l'albumine de sérum bovin. Ces réactions se déroulent par 15 1'entremise des pseudo-urées protéiniques intermédiaires correspondants (VX) . EXEMPLE 7 Préparation de 4-(oestrone-4'-azo)benzoyl-KLH On ajoute 100 mg de métho-p-toluène suifonate de 1-cyclo-20 hexyl-3-(2-morpholinoéthyl)-carbodiimide 0,1 M dans une solution saline à 1% à l'acide 4-(oestrone-4'-azo)benzoîque cristallin purifié (25 mg). On obtient ainsi le produit intermédiaire désiré qui est la 0-1, 3-dicyclohexyl-2-£4-( 3 ' -hydroxy-171 -oxoestra-l',3' -5'-triénylazo)benzoyljpseudo-urée. On ajoute à ce mélange 25 200 mg de KLH. On agite le mélange jusqu'au couplage de l'azo-pseudo-urée au KLH et on dialyse pendant 2 à 3 jours à*3°C dans du carbonate de sodium O,5 M, à pH 8,2, jusqu'à ce qu'aucune couleur n'apparaisse plus dans la solution de dialyse. On effectue une dialyse finale contre NaCl à 0,9% pendant 24 heures. Ces 30 stades servent à éliminer les molécules du stéroîde et du dérivé qui n'ont pas réagi. On enlève la protéine insoluble par centrifugation. On effectue la détermination des protéines sur la phase colorée qui surnage et qui contient le produit conjugué 4-(oestrone-4'-azo)benzoyl-KLH. Après dialyse on lyophilise la 35 phase qui surnage contre de l'eau trois fois distillée. Quand on répète l'exemple 7, mais en remplaçant la KLH par une quantité analogue d'immuno-gamma-globuline ou d'albumine de sérum bovin, on obtient respectivement les produits conjugués 4-(oestrone-4-azo)benzoyl-immuno-gamma-globuline et 4-(oestrone-40 4'-azo)benzoyl-albumine de sérum bovin. Les réactions se dérou 71 21358 18 2113821 lent par 1'entremise des pseudo-urées protéiniques correspondantes (VI). EXEMPLE 8 Préparation de 4-(17'alpha-oestradiol-4'-azo)KLH 5 On ajoute 100 mg de métho-p-toluène suifonate de 1-cyclo- hexyl-3-(2-morpholinoéthyl)carbodiimide 0,1 M dans une: solution saline à 1% à 25 mg d'acide 4-( 17'alpha-roestradiol-4'-azo)benzoîque purifié cristallin. On obtient ainsi le produit intermédiaire désiré, c'est-à-dire la 0^1,3-dicyclohexyl-2-^4-(3'-17' 10 alpha-dihydroxoestra-1', 3 ', 5 '-triénylazo)benzoylJ pseudo-urée. On' ajoute la KLH à ce mélange. On agite le mélange jusqu'au couplage de.l'azopseudo—urée intermédiaire à la KLH et on dialyse pendant 2 à 3 jours à 3°C dans du carbonate de sodium 0,5 M, à pH 8,2, jusqu'à ce que la couleur n'apparaisse plus dans la solution de 15 dialyse. On effectue une dialyse finale contre NaCl à 0,9% pendant 24 heures. Les stades précédents servent à enlever les molécules du stéroîde et.du dérivé qui n'ont pas réagi. On enlève la protéine insoluble par centrifugation. On effectue la détermination des protéines sur la phase colorée qui surnage et qui con-20 tient le produit conjugué 4-(171alpha-oestradiol-4'-azo)KLH. On lyophilise cette phase qui surnage après dialyse contre de l'eau trois fois distillée. Quand on répète l'exemple 8, sauf qu'on remplace la KLH par la même quantité d'immuno-gamma-globuline ou d'albumine de sérum 25 bovin, on obtient respectivement la 4-( 17,'alpha-oestradiol-4'-azo)immuno-gamma-globuline et 4-(17'alpha-oestradiol-4'-azo) albumine de sérum bovin. Les réactions se déroulent par l'entremise des pseudo-urées protéiniques correspondantes (VI). On peut utiliser d'autres haptènes ou même des antigènes 30 protéiniques intacts (contenant de la tyrosine, du tryptophane ou de l'histidine) pour remplacer les stéroïdes (I) dans la séquence de réactions (I) selon l'invention, à la condition que l'haptène ou 1'antigène contienne un fragment aromatique (par exemple des catécholamines) ou un fragment hétérocyclique, de préférence en-35 tièrement ou partiellement insaturé, ayant 5 à 6 atomes de noyau (par exemple l'histidine ou le tryptophane). Un exemple d'un fragment aromatique correspond à la formule suivante : 71 21358 2113821 ^ dans laquelle X et ai sont les mêmes que précédemment. Parmi les haptènes ou les antigènes, on citera notamment : les catéchola-mines, le l-(3,4-dihydroxyphényl)-2-méthylamino-éthanol; la bêta-(p-hydroxyphényl)alanine; la bêta-(3,4-dihydroxyphényl)-alpha-alanine; la 3,4-dihydroxyphénéthyl-amine; le 2-amino-l-(3,4-1° dihydroxyphényl ) éthanol ; les indoleamines, telles que la bêta-3-indolylalanine; le 5-hydroxytryptophane; ou la 5-hydroxytrypta-mine. En outre, on peut utiliser des agents psychomimétiques, par exemple la mescaline, la morphine, le tétrahydrocannabinol, le démérol, les amphétamines, les .antidépressifs tricycliques tels 15 que les dibenzocycloheptènes (par exemple 1'amitriptyline et la nortriptyline), 1'imipramine, les phénothiazènes, les benzoqui-nolizines, la réserpine, les diazépoxydes (par exemple le librium et le valium), le diéthylstilbestrol, l'insuline, 1'angiotensine, la thyroxine, 1'aldostérone, l'hormone de croissance, le lacto— 20 gène, l'insuline bovine, l'hormone de stimulation de follicule, l'hormone lutéinique, la gonadotropine chorionique humaine, la pitocine, 1'adrénocorticotropine, la thyrotropine, ou un polypep-tide contenant des résidus de tryptophane, d'histidine ou de tyrosine (voir par exemple "Atlas of Protein Sequence and 25 structure" par M.O. Dayhoff, National Biomédical Research Foundation, Silver Springs, Md, 1968, par exemple pages 235-272 et Vol. 4, 1969, pages D67-D172). De plus, on peut utiliser des A. 4,5-stéroïdes conjugués, dans lesquels le noyau A répond à la formule : X 35 dans laquelle R est H ou un radical alcoyle inférieur et X est un groupe céto, -OH ou aminé, comme on l'a défini plus haut. Un exemple est la testostérone. Ainsi, A dans la séquence de réactions XI ci-après peut être un autre haptène, un polypeptide intact ou un A, 4,5-stéroïde, chacun tel que défini plus haut, 71 21358 2113821 contenant un groupe aromatique ou un noyau hétérocyclique ayant un caractère aromatique, avec substitution par un groupe en position ortho, para ou méta (comme on 1'a expliqué précédemment à propos de X) qui permet la liaison entre un ion diazonium avec A 5 par couplage direct à un atome de ce groupe aromatique. R', R'1' et R"", ainsi que la protéine, sont les mêmes que précédemment. SEQUENCE DE REACTIONS II A + HOOC—R'—NH_ 10 (III) 15 20 (V) 25 30 (VI) 35 (VII) (I) (II) diazotation A - N=N—R'—COOH R''1 —N=C=N—R"" (IV) A - R. . . I O N ^ TI - T f N=N—R*-C-O-C i NH i R" » conjugaison des protéines R. I » N t» ft A - N=N-R'-C-O-C t t ' NH » » NH R"" i protéine O " H A - N=N-R'-C-N-protéine • Dans cette séquence, le procédé utilisé peut être le même que 40 dans la séquence de réactions I. 71 21358 21 2113821 Les nouveaux anticorps développés chez les animaux par immunisation, faisant suite à l'administration des nouvelles substances antigènes selon l'invention, constituent également l'un des modes de réalisation de celle-ci. L'anticorps produit par 5 l'administration d'une dose génératrice d'anticorps de la substance antigène de stéroîde et de protéiney de la substance antigène catécholamine-protéine et de la substance de polypeptide et d'haptène-protéine, ou bien encore de la substance protéinique antigène seule, sous une forme essentiellement pure, est récupéré 10 à partir des antisérums bruts qui sont obtenus chez les animaux de la façon suivante : On expose les antisérums bruts aux immuno—adsorbants. Ces adsorbants sont décrits dans 1'ouvrage de Kabat déj à cité et dans l'article de Weliky et ses Collaborateurs, paru dans Immunochemis-15 try 1, 219 (1964). Ces produits comprennent d'une façon générale des dérivés cellulosiques ou un verre substitué par un groupe aryle-NI^ (comme on 1'expliquera par la suite), les groupes amino ou carboxyliques disponibles formant une matrice solide à laquelle on conjugue les composés antigènes selon l'invention, 20 comme il a été décrit à propos de la conjugaison avec les protéines (voir plus haut). Quand on expose les antisérums bruts à l'action des sorbants modifiés de ce type, l'anticorps spécifique désiré pour l'haptène unique est retenu sur 1'antisérum. Les autres composants du sérum ou anticorps traversent l'adsorbant mais 25 ne sont pas retenus sur celui-ci et on peut, si on le désire, les récupérer, par exemple par centrifugation ou par passage à travers "DEAE-Sephadex" (fabriqué par Pharmacia, Uppsala, Suède). L'anticorps lié à la matrice est enlevé par un mélange d'acide acétique (ou HC1) dont la normalité est comprise entre environ 30 0,5 et 1,5 et est, de préférence, de 1, avec de l'urée d'une mo-larité de 2 à 4, mais de préférence de 3 M, le pH étant de 3,4 à 3,6. La récupération représente de 90 à 98% du total théorique. L'activité immunologique est préservée (ce mélange servant à éluer l'anticorps dans un état non dérivé provenant d'un haptène 35 hydrophobe est également nouveau et on peut l'utiliser pour extraire des haptènes libres et des haptènes liés avec des protéines à partir du sérum (protéines) par traitement avec le mélange précité et un réglage convenable du pH pour effectuer 1'extraction) . Après une neutralisation immédiate avec du NaOH O,IN, 40 on isole les anticorps et ces anticorps sont exactement spécifi 71 21358 22 2113821 ques pour le dérivé approprié qui a été fixé à la matrice. On peut utiliser ce produit pour récupérer des anticorps spécifiques à partir de sérums bruts ou bien pour récupérer des anticorps non désirés provenant de réactions auxiliaires ou croisées. 5 Parmi les nouveaux anticorps selon l'invention, on mention nera ceux possédant les caractéristiques suivantes : Anticorps d'oestradiol. On le produit en administrant une dose génératrice d!anticorps de 4-(17'bêta-oestradiol-4'-azo) benzoyl-KLH (ou en remplaçant KLH par un autre véhicule tel que 10 IgG ou BSA) et on identifie l'anticorps par les caractéristiques suivantes qui indiquent sa spécificité pour l'oestradiol : 1. Essais de double diffusion sur agar-agar ou d'immuno-électrophorèse. Ces essais sont normalisés. La double diffusion dans 1'agar-agar est un essai dans lequel on verse O,6 à 3 ml 15 d'agar-agar à 1,0% sur une lame de verre. Des petits alvéoles sont formés dans 1'agar-agar (après solidification) à l'aide d'un gabarit. Les alvéoles périphériques sont équidistants de l'alvéole central. On place dans chacun des alvéoles extérieurs des produits conjugués variés d'haptènes et de protéines, en solution 20 aqueuse et on effectue ainsi un essai sur un. échantillon, d'anticorps que l'on place dans l'alvéole central. On laisse incuber la lame contenant 1'agar-agar solidifié et les alvéoles renfermant des solutions de produits conjugués d'antigènes .et d'anticorps dans une atmosphère humide pendant environ 24 heures. Une ligne 25 ou un arc de précipitine apparaît à un moment, quelconque dans l'intervalle de 3 à 48 heures si l'anticorps est spécifique, comme l'indique la réaction avec le produit conjugué haptène-protéine. On effectue 1'immuno-électrophorèse comme suit : après avoir versé 3 ml d'agar-agar sur une lame de verre ordinaire 30 pour microscope et après avoir laissé 1'agar-agar durcir, on découpe un ou plusieurs alvéoles à l'aide d'un gabarit à proximité d'une extrémité de la lame, à peu près à distance égale d'une ou plusieurs rigoles horizontales qui sont tracées par le gabarit entre les alvéoles. On laisse fonctionner une source de courant 35fpour fournir un courant d'environ 6 milliampères pour chaque lame et on effectue 1'électrophorèse pendant une durée de 45 à 60 minutes. Après cela on coupe le courant, on enlève 1'agar-agar de la rigole préalablement sectionnée, on place l'antisérum dans la rigole et on installe là lame dans une chambre humide pour une 40 incubation d'une durée de- 4 à 48 heures. Quand un anticorps est 71 21358 2113821 spécifique pour le produit conjugué d'haptène et de protéine, on observe un arc de précipitine. Cet arc apparaît en.général presque sous l'alvéole et se déplace, légèrement vers l'électrode négative. Quand on titre le produit conjugué 4-(17'bêta-oestradiol-5 4'-azo)benzoyl-IgG contre 1'antisérum 4-(17'bêta-oestradiol-4'-azo)benzoyl-KLH, une ligne de précipitine spécifique pour l'oestradiol apparaît et les deux protéines différentes ne réagissent pas mutuellement. 2. Essais quantitatifs de précipitine. Dans chacun d'une 10 série de tubes d'essai on introduit 0,5 ml d'une solution normalisée d'anticorps qui peut être du sérum ou IgG tamponné en solution, à raison d'environ 2 à 10 mg/ml. Dans chaque tube on introduit de 0,25 à 0,5 ml d'haptène en une concentration comprise entre 1 et 200 microgrammes/ml. On laisse les tubes incuber à 15 37°C pendant 2 heures et ensuite à 4°C pendant 2 jours. A la fin de ce laps de temps on soumet les tubes à une centrifugation à 6.000 tours/minute, on lave à quatre reprises avec une solution saline tamponnée, puis on dissout dans de l'hydroxyde de sodium et on exécute une détermination des protéines par le. procédé de 20 Lowry. Après avoir soustrait la quantité connue du produit conjugué des protéines qui a été introduit, on détermine par soustraction le total de protéine-anticorps précipité par le produit de conjugaison connu. L'anticorps d'oestradiol purifié ne réagit pas avec l'oestrone et seulement d'une façon très faible avec 25 l'oestriol. On récupère une protéine d'anticorps, spécifique pour l'oestradiol, à raison de 300 à 1.200 microgrammes/ml après une brève période d'immunisation (6 semaines). 3. Essais d'inhibition d'haptènes. Après avoir permis une pré-incubation de l'anticorps avec de l'acide 4-(4'-azo-oestra- 30 diol)benzoîque, de l'acide 4-(4'-azo-oestrone)benzoîque ou de l'acide 4-(4'-azo-oestriol)benzoîque, sans couplage avec les protéines, on laisse l'anticorps réagir avec des concentrations connues d'un produit conjugué haptène-protéine, comme dans l'essai précédemment décrit et ensuite on effectue ce même essai de 35 la façon décrite plus haut. L'inhibition de l'haptène affaiblit l'anticorps ou le "bloque" (c'est-à-dire forme un complexe soluble avec lui),de sorte que plus la quantité d'haptène qui a pu réagir préalablement avec 1'anticorps est élevée, plus la précipitation sera faible lors de la réaction ultérieure avec le pro-40 duit de conjugaison stéroîde-protéine. Les haptènes hétérologues 71 21358 2113821 ' n'inhibent pas quantitativement 1'anticorps de 1'oestradiol. Si un haptène n'inhibe pas une solution d'anticorps, cela veut dire que l'anticorps n'est pas spécifique pour cet haptène. Une quantité de 2 à 10 microgrammes/ml de l'acide 4-(4'-azo-oestradiol) 5 benzoîque inhibe (100%) 1 ml d'antisérum homologue spécifique à 1'haptène (c'est-à-dire l'anticorps de l'oestradiol). 4. Extinction de fluorescence de l'anticorps à l'émission, à 350 mfi (comme on le décrira par la suite). La constante moyenne d'association spécifique avec l'oestradiol est de Ko=10^. 10 5. Renforcement de la fluorescence de 1'hydrazo- et amino- oestradiol à l'émission à 420 (comme on le décrira plus loin). La constante moyenne d'association spécifique avec l'oestradiol est de Ko=10^. Anticorps de l'oestriol. On le produit en administrant une 15 quantité génératrice d'anticorps de 4-(oestriol-4'-azo)-benzoyl-KLH (ou une autre protéine comme IgG ou BSA) et on identifie par les caractéristiques suivantes qui montrent la spécificité pour l'oestriol conformément aux essais décrits plus haut au sujet de l'anticorps de l'oestradiol. 20 1. Double diffusion dans l'agar-agar ou irariuno-électropho- rèse. Quand on soumet le produit de conjugaisort 4-(oestriol-4'-azo)benzoyl-IgG contre 1'antisérum 4-(oestriol-4'—azo)benzoyl-KLH, une ligne de précipitine spécifique à l'oestriol apparaît. 2. Essais quantitatifs de précipitine. On récupère 300 à 25 1.200 microgrammes/ml de protéine d'anticorps spécifique à l'oestriol qui ne réagit pas avec les oestratriènes apparentés, après une immunisation de brève durée (4 à 6 semaines). 3. Essais d'inhibition d'haptène. Une proportion de 1 à 5 microgrammes/ml d'acide 4-(oestriol-4'-azo)benzoîque inhibe un 30 ml d'anticorps (100%). 4. Extinction de fluorescence de l'anticorps (qu'on étudiera plus en détail par la suite). La constante moyenne d'association 7 spécifique avec l'oestriol est Ko=10 . 5. Renforcement de fluorescence de 1'hydrazo- et amino-33 oestriol (qu'on étudiera plus en détail dans ce qui suit). La constante moyenne d'association spécifique avec l'oestriol est Ko=107. Comme on l'a expliqué, les nouvelles substances antigènes selon l'invention produisent des anticorps spécifiques pour le 40 composé d'essai correspondant à-l'haptène. Ainsi les titrages 71 21358 25 2113821 ' immunologiques qui utilisent ces anticprps sont sûrs et précis. Un mode de réalisation de l'invention concerne des titrages cliniques nouveaux pour des métabolites homologues naturels dans les fluides physiologiques. Pour de tels titrages, on utilise des 5 nouveaux composés fluorescents qui répondent aux formules ci-après et qui font également l'objet de l'invention. 10 xa 0 NH 15 ' NH ? Z (III) 20 Dans ces formules A, X, Y, R, a et b ont les mêmes significations que précédemment; Ra représente un atome d|hydrogène ou un radical alcoyle, alcényle ou alcynyle, contenant de préférence de cL environ 1 à environ 10 atomes de carbone. Quand R est insaturé, il peut être mono- ou poly-insaturé, bien qu'on préfère que Ra ne 25 contienne pas plus de 1 ou 2 liaisons non saturées qui sont, de préférence, sous une forme conjuguée. De plus Ra peut représenter un résidu mono- ou polycyclique qui, quand on le condense avec A sur les atomes adjacents du noyau de ce dernier, forme un fragment de noyau condensé, notamment : un groupe naphtyle, anthryle, 30 phénanthryle, indyle, isoindyle ou similaire. Ra peut également représenter un groupe aliphatique saturé ou insaturé, à chaîne droite ou ramifiée, contenant de préférence environ 1 à environ 10 atomes de carbone; on mentionnera les groupes méthyle, éthyle, propyle, isopropyle, butyle, isobutyle, t-butyle, c'est-à-dire un 35 alcoyle inférieur; éthényle et les dérivés mono- ou di-insaturés correspondants des radicaux alcoyle inférieur précités ; des groupes alcényle tels que éthynyle, propynyle et similaire; des groupes cycloaliphatiques qui contiennent de préférence environ 4 à environ 10 atomes de carbone, comme par exemple cyclobutyle, 40 cyclopentyle, cyclohexyle, cyclooctyle et leurs dérivés substitués 71 21358 26 2113821 dans lesquels les substituants sont, de préférence, des radicaux alcoyle inférieur, aryle (phényle, naphtyle, etc.) et similaire; des groupes aryle contenant environ 6 à environ 10 atomes de carbone; des groupes cyclooléfiniques contenant environ 5 à environ 5 10 atomes de carbone et, de préférence, contenant une mono-insa-turation, comme cyclopentyle, cyclohexényle, cycloheptényle, cyclooctényle et leurs dérivés substitués par des alcoyles inférieurs, ainsi que les groupes cyclooléfiniques poly-insaturés, comme cyclopentadiényle ou 1,3,5-cyclooctotriényle. 10 Z représente un fragment quelconque capable de supporter un ion diazonium (voir par exemple l'ouvrage de P.H. Hermans "Introduction to theoretical organic chemistry" édité par Reeves et publié par Elsevier, New York et Amsterdam, notamment pages 277, 279 et 280. On peut également se référer à l'ouvrage de 15 P.A.S. Smith "The Chemistry of Open Chain Nitrogen Compounds", Vol. 1, pages 100-105, 1965, W.A. Benjamin, New Yor]^ comme par exemple un groupe aryle non substitué, de préférence phényle ou naphtyle, contenant environ 6 à environ 14 atomes de carbone; ou un groupe aryle substitué contenant 1 à 3 groupes qui ne gênent 20 pas la formation d'un ion diazonium (c'est-à-dire supportés par le fragment aminé, -R'NH^), et de préférence les groupes choisis parmi les suivants : amino, nitro, halo (c'est-à-dire chloro, bromo, fluoro, iodo), HSO^, carboxyle ou un noyau condensé tel que naphtyle ou terphényle. Parmi les composés à partir desquels 25 on obtient Z, on citera : l'acide p-aminobenzoxque; l'halogénure de benzène-diazonium, et de préférence le chlorure (méta, ou di-ou tri-substitué avec NI^, NO2, halo, COOH); une aryl-amine quelconque (pouvant être en outre substituée dans les positions 1, 2 ou 3 du noyau arylique avec NO^, halo, COÔH ou alcoyle inférieur) 30 tout sel de diazonium dans lequel le growpe diazonium est fixé à un groupe aryle ou hétérocyclique d'un cé^setère aromatique, par exemple la pipéridine, le pyrazole, le triazole, le benzyrène; les chélates métalliques, par exemple tris-(acétylacétonate-chrome); un ester hyponitrite, par exemple R0-N=N-0R (danS lequel 35 R est un alcoyle inférieur); les analogues thioïques d'azobenzène par exemple RN=S=NR, R étant un alcoyle inférieur. Les dérivés hydrazo ou les dérivés amino correspondants sont obtenus par une réduction douce des composés azoxques correspondants et ils sont fortement fluorescents. Les composés hydrazo et 40 amino ainsi obtenus, en raison de leur pouvoir absorbant et de 71 21356 2113821 leurs crêtes d'excitation qui se superposent sur le spectre d'émission de l'anticorps spécifique, manifestent une capacité d'extinction (comme d'ailleurs les composés azoïques correspondants) de l'émission fluorescente des nouveaux anticorps selon 5 l'invention. Ces anticorps renforcent également la fluorescence naturelle des dérivés hydrazoïques lors d'une liaison spécifique du fait de la superposition de l'émission de l'anticorps et de l'excitation du dérivé hapténique. Ainsi les anticorps et les nouveaux dérivés hydrazoïques sont remarquablement compatibles en 10 utilisation, que ce soit pour l'extinction ou le renforcement de la fluorescence, dans les déterminations quantitatives par spec-trophotofluorométrie, par un procédé simple et direct. Pour la production des nouveaux composés fluorescents selon l'invention, qu'on réalise par réduction des intermédiaires 15 azoïques correspondants, la réaction se déroule suivant la séquence XII ci-après, dans laquelle X, Y, R, A, Ra, Z, .a et b sont les mêmes que précédemment. A l'examen de cette séquence de réactions, on constate que la réduction du composé azoïque (I) ou (II) donne un mélange de dérivés hydrazo et amino (III) et (IV) ou 20 (V) et (VI) respectivement. Les rapports entre les dérivés hydrazo et les dérivés amino dans le mélange dépendent des substituants sur les matières premières, de la nature de l'agent réducteur et des considérations cinétiques. Par exemple, lors de la réduction de l'acide 4-(4'-azo-oestriol)benzoîque en utilisant du 25 borohydrure de sodium, le rapport du dérivé hydrazo au dérivé amino est de 1:4. Les dérivés des amino-stéroïdes (IV) et (VI) sont produits en excès; on sépare ces dérivés par des techniques traditionnelles de chromatographie et d'extraction. 30 SEQUENCE DE REACTIONS III R 35 N N (I) pu Ra—A - N = N - Z Z 40 (II) 71 21358 2113821 10 NH réduction et 15 20 (XII) (IV) - Z (V) et R - A - NH, (VI) 25 EXEMPLE 9 A. Préparation de l'acide 4-(insuline-azo)benzoîque On dissout 300 mg d'acide p-amino—benzoîque et on les agite dans 10 ml de HCl normal dans un bêcher d'une contenance de 20 ml entouré de glace. On maintient la température au-dessous de 5°C. 30 On dissout 150 mg de nitrate de sodium dans 5 ml d'eau et on introduit cette solution lentement au-dessous de la surface de la solution de l'acide p-amino—benzoîque. On maintient la température au-dessous de 5°C et le pH à 1. On agite pendant 20 minutes le mélange de réaction. On enlève l'excès de nitrate de sodium 35 par traitement avec 10 mg d'acide sulfamique après 20 minutes. On dissout 50 mg d'insuline bovine dans un tampon de phosphate O,1 M à pH 11. On ajoute goutte-à-goutte l'acide p-amino-benzoïque diazoté à cette solution. On maintient le pH à 11 à l'aide d'hy-droxyde de sodium binormal et on agite le mélange pendant 10 mi-40 nutes. On dialyse ensuite l'acide 4-(azo-insuline)benzoîque con 71 21358 2113821 tre des charges répétées d'eau. On empêche l'oxydation par une dialyse finale à pH 5,5 (acétate ou 1^0) et une lyophilisation sous vide. B. Préparation d'acide 4-(hydrazo-insuline)benzoîque et 5 d'amino-insuline On. réduit une partie aliquote de 1 ml contenant environ 1 mg de 1'insuline diazotée du stade A avec du borohydrure de sodium (excès molaire de 8) jusqu'à-ce qu'une très faible coloration seulement demeure. On neutralise avec de l'acide acétique normal 10 la solution contenant 1'amino-insuline et le dérivé d'acide 4-(hydrazo-insuline)benzoîque (rapport amino:hydrazo = 9:1) (dans lequel une moyenne de 2,5 résidus tyrosyliques et 1,5 résidu hystadylique des chaînes d'insuline sont substitués). On isole le produit de la façon décrite précédemment. 15 Préparation d'acide 4-(17'bêta-oestradiol—4'—hydrazo)benzoîque On dissout dans du méthanol (0,15 mg/ml) 25 mg d'acide (oestradiol—4-17*bêta-4'—azo)benzoîque purifié, préparé par le procédé de l'exemple 1". On ajoute un excès molaire de 800% de 'borohydrure de sodium sous forme d'une solution aqueuse (O,5 mg/ml 20 de solution d'azo—stéroîde), le mélange étant balayé avec de l'azote. On extrait le mélange de réaction avec de l'acétate d'éthyle et, après évaporation, on obtient du 4-amino-oestradiol. On abaisse ensuite le pH de la phase aqueuse à 3-4 et, après extraction et évaporation, on obtient de l'acide 4-(17'bêta-oestradiol-25 4'-hydrazo)benzoîque. lia chromatographie en couche mince donne les dérivés fluorescents désirés d'amino-oestradiol et d'hydrazo— oestradiol purifiés. On agite une partie aliquote de 1 mg d'acide 4—(hydrazo-insuline )benzoîque produit au stade B et purifié par chromato-30 graphie, avec 14 mg de cyclohexylcarbodiimide soluble. On. condense le dérivé d'insuline avec 0,4 mg d'insuline normale. £e produit conjugué résultant consiste en insuline de sérum bovin et en chaînes fluorescentes A et B réduites de l'insuline, c'est-à-dire l'acide 4-(hydrazo-insuline)benzoîque (défini au stade B). 35 On calcule les rapports molaires des chaînes réduites liées à l'insuline (2:1), après s'être assure de la quantité des dérivés hydrazo et amino normaux de tyrosine et d'histidine, par analyse de 1'amino-acide pour laquelle on utilise comme normes de référence les amino-acides connus (pour l'insuline) et leurs dérivés 40 amino et hydrazo. 71 21358 30 2113821 La réduction par 1'hydrosuifite de sodium (excès molaire de 6),au lieu de borohydrure de sodium (comme dans le procédé indiqué précédemment dans cet exemple 9),donne un excès de 90% de dérivé d*hydrazo—insuline. On empêche l'oxydation par acidifica— 5 tion, un traitement par un anti-oxydant (2,6-di-t—butyl-p—crésol) et la lyophilisation. On prépare pareillement l'acide 4-(hydrazophénpl)benzoîque (isomères 2' et 4.' ) et les o— et p—aminophénols, par diazotation d'acide p-amino-benzoîque, suivie d'une réduction avec un excès lO de borohydrure de sodium. On effectue la séparation des aminophénols résultants (90%) et des acides 4-(hydrazophénol)benzoîque s (10%), les rapports étant inversés par 1 * hydrosulfite de sodium, par extraction dans de l'acétate d'éthyle, suivie d'enlèvement du restant d*hydrazophénol de la .phase aqueuse (pH 2) à 15 l'aide d'un solvant organique et de chromatographie. On prépare l'acide 4—(hydrazo—épinephrine)benzoîque et 1'amino—épinephrine par le même, procédé que celui donné précédemment dans cet exemple 9, sauf qu'on utilise 1*épinephrine et non l'insuline bovine comme matière première pour la préparation. 20 Pour empêcher 1'oxydation, on effectue la réaction sous en utilisant un excès de borohydrure ou d'hydrosuifite de sodium, ou bien on acidifie, ou encore on utilise un anti—oxydant et la lyophilisation sous vide, comme on l'a expliqué plus haut. EXEMPLE 1Q 25 Préparation de dérivés phénolazoîques du verre On agite environ 100 mg de perles de verra aminé dans 5 ml de HCl normal refroidi à 5°C à l'aide d'un bain de glace- Le verre utilisé est un verre poreux contenant 96% de silice et O o ayant des pores de diamètre égal à 40 A + 20 A et fabriqué par 30 Corning Glass Works- On traite ce verre sous reflux dans une solution de gamma—aminopropyl—triéthoxy-silane d'ans le toluène- On fait réagir ce mélange avec de l'acide p-nitrobenzoîque et on le réduit avec du tétrachlorométhane,de sorte qu'on obtient le verre aryl—aminé désiré (voir Weetall, Biochem. J. (1970) 117, 35 257—2C1). On dissout environ 15O mg de nitrite de sodium dans 5 ml d'eau et on introduit cette solution goutte à goutte au-dessous de la surface de la solution contenant le dérivé de verre. On ajoute goutte à goutte 150 mg de phénol au cours de 5 minutes . On agite le mélange de réaction pendant 20 minutes à une 40 température maintenue au-dessous de 5°C. Après lavage avec trois 71 21358 2113821 portions d'eau distillée, on place les perles de verre phénolazoï-que (dérivés o et p) dans 10 ml d'eau nouvellement distillée. On ajoute successivement plusieurs gouttes d'acide acétique 1M et 100 mg de borohydrure de sodium. Après neutralisation avec l'aci-5 de acétique on sépare la phase qui surnage des perles par centrifugation. On lave les perles dans trois doses d'eau distillée. Sous une source de rayons ultra-violets (brûleur au mercure de Zeiss), aussi bien la phase qui surnage et qui contient les ami-nophénols o et p solubles que le verre phénolhydrazoïque insolu-10 ble (dérivés o et p) sont fortement fluorescents. La première phase est d'une couleur bleu clair alors que la seconde phase est d'un rouge vif. Le verre aminé et d'autres matrices insolubles produisent de la même manière, à partir du composé azoïque homologue corres-15 pondant, de 1'aminoinsuline soluble, de 1Taminoépinéphrine, de 1'amino-oestradiol, de 1'amino-oestriol, de 11amino-oestrone et leurs dérivés hydrazoïques insolubles correspondants. Dans chaque cas le dérivé hydrazoïque insoluble est fluorescent et il en est de même de la phase qui surnage et qui contient le dérivé aminé. 20 On utilise les dérivés azoïques, hydrazoïques et aminés aussi bien solubles qu'insolubles pour des titrages extrêmement efficaces, comportant ou bien un renforcement ou bien une extinction de la fluorescence, ainsi que pour des techniques d'immuno-radio-titrages, afin de déterminer les concentrations quantltati-25 ves des homologues non dérivés. En utilisant les mêmes rapports molaires que dans les exemples 9 et 10, on prépare les mêmes dérivés amino solubles, hydrazoïques et verre-hydrazoïques insolubles du facteur de libération d'angiotensine thyrotropique (TRF) (un tripeptide contenant de 30 l'histidine), du lactogène, de la pitocine et l'hormone de croissance. Le verre aminé et sa préparation sont bien connus, et on peut consulter notamment J. Biochem. 117: 257-61 (1970); Biochem. Biophys. Acta, 185:464 (1969); Science 166:615 (1969); Nature 35 223:959 (1969). Ainsi on peut traiter sous reflux le verre poreux dans une solution d'amino-propyltriéthoxysilane dans du toluène, ou on peut préparer un dérivé isothiocyanate en soumettant au reflux un verre alcoyl-aminé pendant la nuit dans une solution à 10% de thiophosgène dans du chloroforme. On lave ensuite le verre 40 dans le chloroforme, on sèche et on le lie à 1'haptène dans un 71 21358 32 2113821 tampon de carbonate. On peut également préparer des dérivés de verre aryl-aminé en faisant réagir un verre d'alcoyl-amino-silane avec du chlorure de p-nitrobenzoyle dans du chloroforme contenant 5% de triéthylaminé. On réduit les groupes nitro avec 5 du dithionite de sodium (^820^) . Le tétrachlorométhane convient également dans ce même but. On procède ensuite à la diazotation du verre arylaminé et à sa liaison avec un haptène (ou un antigène), comme on l'a décrit précédemment. Ainsi un mode de réalisation de l'invention concerne les 10 combinaisons d'haptène et d.e verre azoïque ou des combinaisons conjuguées d'haptène, de protéine et de verre azoïque, ainsi que les dérivés hydrazoïques et aminés fluorescents correspondants répondant aux formules suivantes (outre le verre, on peut utiliser d'autres matrices insolubles, et c'esttpourquoi on utilise le 15 symbole M dans les formules ci-après) : 20 25 30 35 M NH t M R -A—N=N-M (II) (III) H H Ra—A—N—N—M (IV) 71 21358 2113821 R 5 X Y, b NH. 2 Ra —A—NH, 2 (V) (VI) 10 Dans ces formules R, X, Y, A, a et b ont les mêmes significations que précédemment et M désigne une matrice minérale insoluble contenant du NH^ réactif (par exemple un dérivé de verre aminé du type précédemment défini) ou une matrice organique insoluble contenant des groupes réactifs N^, OH ou COOH (par exemple 15 "Sephadex" ou des dérivés cellulosiques). On peut se référer à l'ouvrage de Weliky et ses Collaborateurs, Xmmunochemistry, 1, 219 (1964)» On remarquera que l'on peut utiliser une matière solide insoluble quelconque qui n'intervient pas dans les immuno-titrages décrits ci-après, en attirant non spécifiquement le com-20 posé soumis au titrage. dessus, on peut utiliser par exemple le dérivé insoluble de la matrice solide pour une liaison covalente directe à 1*haptène ou à l'antigène par l'entremise du fragment de noyau de 1*haptène 25 ou de l'antigène, notamment par diazotation, comme il a été indiqué dans les procédés de la présente invention. Les dérivés insolubles formant la matrice solide, qu'on utilise pour la liaison, sont des composés bien connus qui ont été décrits lors de la définition de M. On réduit le produit azoïque couplé (I et IX) 30 dans des conditions douces et on obtient ainsi les dérivés hydrazoïques (III et IV) et aminés (V et VI) correspondants. Le couplage de 1*haptène ou de l'antigène à une matrice solide, par exemple à un verre aminé, offre la possibilité d'une séparation facile entre les dérivés aminés solubles (V et VI) et 35 les dérivés hydrazoïques insolubles (III et IV). Dans de tels cas on effectue la séparation par un simple lavage suivi d'une filtration ou d'une centrifugation. L'exemple 11 ci-après décrit la préparation des nouveaux anticorps selon l'invention. Comme on l'a déjà .dit, ces anticorps Pour préparer les composés selon les formules I à IV ci— 71 21358 2113821 sont utiles pour des titrages immuno—chimiques, qu'on étudiera par la suite, en raison de leur spécificité et des caractéristiques d'émission fluorescente-EXEMPLE 11 5 On administre une dose totale de 30 à 100 mg par animal de l'antigène (sous forme pure) en solution aqueuse à 1% (par rapport au poids de l'antigène), dans une solution saline normale, les animaux étant des lapins blancs de Nouvelle Zélande pesant 5 kg (on utilise des mâles pour préparer des anticorps aux oestrogènes, ÎO mais dans tous les autres cas le sexe de l'animal est sans importance) . On administre le produit antigène par voie intraveineuse un jour sur deux pendant une semaine (c'est-à-dire trois fois par semaine). Deux semaines plus tard on administre une seule fois par voie sous—cutanée une dose totale égale de l'anti— 15 gène en émulsion dans un volume égal d'adjuvant complet de Freunds- Trois semaines plus tard on prélève 50 ml de sang. On sépare le sérum par centrifugation. On le fait passer à travers une matrice solide qui est à base de diéthylaminoéthylcellulose — produit "Sephadex A—50" (fabriqué par Pharmacia, à Uppsala en 20 Suède) et on isole la IgG. On purifie l'anticorps avec de la p— aminobenzylcellulose couplée à 1'haptène (par exemple la p—amino— benzyl—cellulose d'oestradiol)- On élue l'anticorps spécifique lié à la matrice cellulosique solide (après plusieurs lavages avec de l'eau) au moyen d'un mélange d'acide acétique 1 M et 25 d'urée désionisée nouvellement préparée 3 M, le pH étant de 3,2. Dans le tableau X ci—après, on présente les anticorps spécifiques de l'invention, ainsi que les antigènes servant à leur préparation par la technique indiquée. TART.KAU X 30 Antigène -Dose Anticorps spécifique pour: Oes tradiolazobenzoyl-KLH de l'exemple 5 30 mg oestradiol {170) Oestriolazobenzoyl—KLH 35 de l'exemple 6 30 mg oestriol Oestroneazobenzoyl—KLH de 1'exemple 7 20 mg oestrone Acide insulinazobenzoïque de 1'exemple 9 50 mg insuline 71 21358 2113821 TABLÈAU I (suite) 10 Dose Anticorps spécifique pour: 0 - " H N=N-c N KLH) 20 mg tétrahydrocannabinol Tetrahydrocannabinol azobenzoyl-KLH* O 15 . r H H » f 0^NJ-C-N-Q-C-NJ H 0 H tfc=M=uS^-C ( 11—KLH) 10 mg hormone libérant la thyrotropine 20 (L-Pyroglutamyl-L-histidyl—L-prolinéamide) azobenzoyl-KLH* * Préparé par le procédé de l'exemple 5, en remplaçant l'oestradiol par une proportion équimolaire de THC ou TRH. 25 Les nouveaux produits conjugués, les anticorps et les dérivés fluorescents, faisant l'objet de l'invention, conviennent particulièrement pour les nouveaux procédés de titrage qui, eux aussi, constituent des modes de réalisation de l'invention-30 Un procédé d*immuno-fluorescence pour le titrage quantitatif de composés (X) figurant dans la séquence de réactions I et des composés (I) figurant dans la séquence de réactions II, procédé qui constitue un mode de mise en oeuvre de 1'invèntion, consiste à préparer un mélange approprié pour un titrage fluorométrique 35 de (1) un échantillon à analyser, provenant habituellement d'un fluide physiologique (bien qu'il puisse provenir d'une source quelconque) et contenant le composé devant être titré, (2) une quantité connue d'un anticorps qui est immunologi-40 quement spécifique pour le composé à titrer, et 71 21358 2113821 (3) une quantité connue d'un dérivé haptène ou dérivé d'antigène ayant un spectre d'absorption (345 jhlO iyi) correspondant au spectre d'émission de l'anticorps et qui est un homologue à ce compose de titrage (c1 est—à—dire ayant la même spécificité immuno— 5 chimique) de manière à obtenir une liaison compétitive avec l'anticorps ; et ensuite à analyser ce mélange pour déterminer l'extinction de la fluorescence de l'anticorps. Parmi les composés que l'on peut titrer de la façon indi-10 quée, on mentionnera les suivants : cédemment ; 20 (2) les agents psychomimétiques, tels que les amphétamines, la mépéridine, la mescaline ou le tétrahydrocannabinol, c'est-à-dire l'ingrédient actif de la marihuana (hashish); (3) une catécholamine, telle que définie précédemment; (4) un polypeptide, tel que défini précédemment; 25 (5) le diéthylstibestrol; (6) un &,4,5-stéroïde,tel que défini plus haut; et (7) la chlo'rotétracycline, la tétracycline et le chloram-phénicol- Les dérivés hapténiques ou antigéniques que l'on peut utili-30 ser pour l'extinction de la fluorescence de l'anticorps sont notamment les produits représentés par les formules XIX et V, VI et VII (dans la séquence de réactions I), par les formules VIII et IX et par la formule X dans la première partie de la présente description; ainsi que les composés représentés par les formules 35 III, V, VX et VII (dans la séquence de réactions II); les formules I à III concernant les composés fluorescents, les formules IV et V (séquence de réactions III); les formules I et II concernant les verres azoïques selon 1'invention et enfin les formules IV et V concernant également les structures comportant une matrice M. 40 Le titrage par extinction de fluorescence se fait comme 71 21358 37 2113821 suit ; A. Etablissement d'une courbe normalisée pour l'échantillon a titrer On introduit dans chaque tube d'essai, faisant partie d'une —10 5 serie de 30 tubes, 1 ml de l'anticorps (1 x 10 mole/ml). On introduit également dans chague tube 1 ml contenant diverses concentrations du dérivé d'haptène ou du dérivé d'antigène, en dé— ' —10 butant avee une concentration de 1 x 10 mole/ml d'haptene ou d'antigène dans le premier tube et en allant jusqu'à une concen- —10 10 tration de 30 x 10 mole/ml dans le dernier tube. On fait réa- —10 gir un mélange optimal (par exemple 1 x 10 mole/ml) d'anti— —10 corps et 6 x 10 mole/ml du dérivé d'haptène ou d'antigène avec 1 ml de 1'haptène non dérivé, c'est-à-dire du composé soumis au titrage, en compétition, en des concentrations croissantes (par 15 exemple 1 à 10 x 10 mole/ml). On laisse incuber ce mélange pendant une durée de 10 minutes à 12 heures à la température ambiante et on relève les indications d'un spectrophotofluoromètre pour déterminer l'extinction de la fluorescence» Les ,tubes normalisés contiennent une concentration équivalente de 1'anticorps ou 20 d'haptène en dilution dans un agent tampon, dans la même concentration que lorsque l'anticorps et 1'haptène sont mélangés ensemble. On règle l'excitation à 280 iyX et on lit 1 Rémission à 350 n^t. . On additionne les émissions de fluorescence pour 1'haptène seul à une concentration donnée et pour l'anticorps seul à 25 la concentration donnée et on obtient ainsi un total. Ce total est égal à 100% de fluorescence. L'intensité réelle de fluorescence observée lors de la réaction entre 1'anticorps et le dérivé d'haptène représente moins de 100%. car l'extinction est inévitable à la suite de la liaison du dérivé avec l'anticorps. Quand on 30 augmente la concentration du dérivé d'haptène, la fluorescence observée diminue jusqu'au moment où la réaction entre 1'haptène et l'anticorps (ou la liaison) est terminée. La différence entre la' fluorescence du mélange haptène-anticorps après sa réaction complète et la somme des fluorescences de 1'haptène et de l'an-35 ticorps séparément constitue le pourcentage d'extinction. Ce pourcentage d'extinction est proportionnel à la concentration du dérivé d'haptène. Lors du titrage d'un échantillon d'haptène ou d'antigène non dérivé, on choisit un rapport optimal normalisé pour l'hap-40 tène et l'anticorps dérivés (par exemple 5-10:1) pour utiliser 71 21358 38 2113821 cette norme dans l'essai de l'échantillon non dérivé. Ce dernier (qui peut être par exemple l'oestradiol), dans des concentrations croissantes par ml, entre en compétition avec le dérivé d'haptène ou d'antigène pour se lier avec une quantité donnée d1 anticorps 5 et inhibe ainsi le phénomène d'extinction pour permettre la fluorescence par l'anticorps qui y est lié. Le pourcentage de l'augmentation de la fluorescence de l'anticorps, sous l'effet de sa liaison avec 1'-échantillon non dérivé, d'haptène ou d' antigène, est directement proportionnel à la concentration de 1'haptène ou ÎO antigène non dérivé. Ce rapport est rendu linéaire. Plus la quantité d'haptène ou d'antigène non altéré est importante dans la solution, plus 1'extinction de la fluorescence provoquée par 1'haptène ou 1'antigène•sous forme d'un dérivé sera faible. Ainsi, on peut tracer une courbe normalisée pour une solution inconnue. 15 B. Titrage d'un échantillon non dérivé d'haptène ou d'anti- qene La solution qui contient l'échantillon (c'est-à-dire 1'haptène ou l'antigène non dérivé comme expliqué plus haut) peut être une solution aqueuse neutre ou un fluide physiologique (sérum, 20 urine, fluide amniotique ou extrait tissulaire). Pour établir la concentration de l'ingrédient inconnu dans le fluide physiologique, on compare l'intensité de fluorescence de l'échantillon mixte (contenant l'anticorps, le dérivé d'haptène ou d'antigène et le composé inconnu) avec la courbe normali-25 sée précitée. Le produit témoin pour un tel titrage est un fluide physiologique connu qui ne contient aucun haptène ou antigène sous forme non dérivée. Ainsi pour la mise en oeuvre du titrage, on prélève un é— chantillon du fluide physiologique, on élimine les matières soli-30 des par centrifugation et on l'introduit en dilution dans un mélange normalisé de l'anticorps et de 1'haptène ou antigène homologue sous forme d'un dérivé, ce dernier ingrédient étant présent en un excès molaire (compris de préférence entre 5 et 10:1). On laisse incuber la solution résultante à la température ambiante 35 pendant une durée de 15 minutes à 12 heures. On détermine ensuite la fluorescence du mélange résultant, habituellement à l'aide d'un spectrophotofluoromètre. La valeur relevée sur cet instrument (pour une émission à 350 ) est comparée avec la courbe normalisée du composé soumis au titrage et le résultat est tra-40 duit en une concentration du composé présent dans l'échantillon 71 21358 39 2113821 (exprimée en ng/ml). L'exemple 12 décrit le titrage par extinction.de fluorescence selon l'invention, servant à la détermination quantitative de divers haptènes ou antigènes non dérivés. 5 EXEMPLE 12 On prélève^ une partie aliquote de sang (là 10 ml ) chez un patient. On élimine les matières solides par centrifugation. On ajoute le sérum limpide à un mélange normalisé d'anticorps et d'un dérivé homologue d'haptène ou d'antigène (rapport molaire de 10 1'anticorps -à 1'haptène 1:6). On incube le mélange résultant à la température ambiante pendant 15 minutes environ.' On mesure la fluorescence du mélange résultant sur un spectrophotofluoromètre Aminco-Bowman (en effectuant des corrections pour compenser l'a contribution du produit tampon et des ingrédients non spécifiques 15 du sérum établis par les témoins). On compare l'intensité mesurée de la fluorescence à la courbe normalisée du composé soumis au titrage et on traduit le résultat en une concentration du composé dans l'échantillon. Le tableau XI ci-après indique les constituants servant dans 20 chaque titrage pour l'échantillon indiqué conformément au procédé de cet exemple. TABLEAU II 25 30 Echantillon à titrer Oestradiol (17p) Oestriol Oestrône Insuline* Tétrahydrocannabinol (THC) Hormone libérant la .35 thyrotropine (TRH) Extinction des dérivés d'haptène ou d'antigène Acide oestradiol-azoben-zoïque de 1'exemple 1 Acide oestriol-azoben— zoïque de 1'exemple 2 Acide oestrone-azoben-zoïque de 1'exemple 3 Acide insuline-azoben-zoïque de 1'exemple 9 Acide THC-azobenzoïque de l'exemple 11 Acide TRH-azobenzoïque de l'exemple 11 Anticorps fluorescent Oestradiol (17p) Oestriol Oestrône Insuline THC TRH ♦Le rapport molaire de 1'anticorps au dérivé d'antigène est de 1:25 au lieu de 1:6. 71 21358 2113821 Un autre titrage immuno-fluorescent, qui constitue également un mode de réalisation de l'invention, comporte le renforcement de la fluorescence d'un dérivé fluorescent d'haptène ou d'antigène selon l'invention. 5 Ce titrage par renforcement de la fluorescence est constitué par un procédé d1immuno-fluorescence permettant le titrage quantitatif de composés qui ont été désignés par les formules (I) dans les séquences de réactions (I) et (II); ce procédé consiste à préparer un mélange approprié pour un titrage fluorométrique 10 et contenant (1) un échantillon à analyser, habituellement provenant d'un fluide physiologique (bien qu'il puisse provenir d'une autre source) et contenant le composé dont le titrage est désiré, (2) une quantité connue d'un anticorps qui est spécifique 15 pour le composé à titrer, et (3) une quantité connue d'un dérivé d'haptène ou d'antigène (fluorescent) possédant un spectre d'absorption (345 _+10 ) qui correspond au spectre d'émission de l'anticorps et qui est un homologue du composé titré (c'est-à-dire possède la même spécifi- 20 cité immuno-chimique ), de sorte que la liaison avec .1 ' anticorps sera compétitive; après quoi on analyse ce mélange pour déterminer le renforcement de la fluorescence du dérivé d'haptène ou d'antigène. ' Parmi les composés que l'on peut titrer, on citera les 25 suivants : R X, Y, R, a et b étant les mêmes que précédemment; (2) les agents psychomimétiques tels que des amphétamines, la mépéridine, la mescaline ou le tétrahydrocannabinol, c'est-à- 35 dire l'ingrédient actif de la marihuana (hashish); (3) une catécholamine, telle que définie précédemment; (4) un polypeptide, tel que défini précédemment; (5) le diéthylstibestrol; (6) un&4,5-stéroïde, tel que défini précédemment; et 40 (7) la chlorotétracycline, la tétracycline et le chloramphé- 71 21358 2113821 nicol. Les dérivés d'haptène ou d'antigène dont on peut améliorer la fluorescence par l'anticorps sont notamment les composés représentés par les formules XXI, V, VI et VII (séquence de réac-5 tions I), les formules VIII, IX et X concernant les produits intermédiaires, les formules III, V, VI et VII (séquence de réactions II), les formules I à III concernant les composés fluorescents selon l'invention, les formules I à VI (séquence de réactions III) et les formules III à VI concernant les composés con-10 tenant une matrice M. De tous ces produits on préfère ceux des formules I à III concernant les composés fluorescents, les formules III, IV et V (séquence de réactions III) et enfin les formules III à V concernant les produits avec matrice M, en raison de la fluorescence très élevée de ces composés et aussi du fait que 15 leurs spectres d'excitation se superposent de façon optimale au spectre d'émission de l'anticorps. Le titrage d'augmentation de la fluorescence se fait comme suit : A. Etablissement d'une courbe normalisée pour l'échantillon 20 a titrer Dans chacun d'une série de 30 tubes d'essai, on place 1 ml N —11 d'un dérivé fluorescent d'haptène ou d'antigene (1 x 10 mole/ ml). Dans chaque tube on introduit également 1 ml contenant des concentrations d'un anticorps purifié, en commençant avec une —11 25 concentration de 1 x 10' . mole/ml d'anticorps dans le premier -11 tube jusqu'à une concentration de 30 x 10 mole/ml d'anticorps dans le dernier tube. Ainsi on fait réagir un mélange optimal — 11 r -r •>. X (par exemple 1 x 10 mole/ml) de dérivé d'haptène ou d'antigene —w * et 6 x 10 mole/ml d'anticorps avec 1 ml d'haptène compétitif 30 non dérivé, c'est-à-dire du composé qu'on désire titrer en des —11 concentrations croissantes (par exemple 1 à 10 x 10 mole/ml). On laisse ce mélange incuber pendant une durée de 10 minutes à 12 heures à la température ambiante et on relève les données du spectrophotofluoromètre pour déterminer le renforcement de la 35 fluorescence. Des tubes normalisés contiennent une concentration équivalente soit d'un anticorps, soit d'un dérivé d'haptène en dilution dans un produit tampon et dans les mêmes concentrations que lors du mélange entre l'anticorps et le dérivé de 1'haptène. On règle l'excitation à 280 rr^ ou à 340 ixji et on contrôle l'émission à 420 +10 mi( . On ajoute la valeur de l'émission fluorescente 71 21358 2113821 de 1'haptène seul à une concentration donnée et de l'anticorps seul à une concentration donnée. Cette somme est égale à une fluorescence de 100%. La valeur réelle de l'intensité de la fluorescence qu'on constate après la réaction entre l'anticorps 5 et le dérivé de 1'haptène sera supérieure à 100% par suite du renforcement de la fluorescence du fait de la liaison entre le dérivé d'haptène ou d'antigène avec l'anticorps. A mesure qu'on élève la concentration de l'anticorps, on constate une augmentation de la fluorescence réelle jusqu'à l'achèvement de la réac-10 tion (ou liaison) entre 1'haptène et l'anticorps. La différence entre la fluorescence du mélange d'haptène et d'anticorps après la réaction complète et la somme des fluorescences pour 1'haptène et pour 1'anticorps séparément constitue le pourcentage de renforcement. Ce pourcentage de renforcement est proportionnel à la 15 concentration relative du dérivé d'haptène et de l'anticorps. Lors du titrage d'un échantillon d'haptène ou d'antigène non dérivé, on choisit un rapport normalisé optimal entre le dérivé d'haptène et l'anticorps (par exemple 1:5 à 10) pour servir dans l'essai de l'échantillon non dérivé. Ce dernier (par exemple 20 l'oestradiol) en des concentrations croissantes par ml entre en compétition avec le dérivé fluorescent d'haptène ou d'antigène pour se lier avec une proportion donnée d'anticorps, et on empêche ainsi le phénomène de renforcement de la fluorescence par la liaison avec 1'anticorps. Le pourcentage de diminution du renfor-25 cernent de la fluorescence du dérivé d'haptène ou d'antigène, du fait de la liaison de l'anticorps avec l'échantillon d'haptène ou d'antigène non dérivé, est directement proportionnel à la concentration de 1'haptène ou de l'antigène non dérivé. Ce rapport est linéaire. Plus la quantité d'haptène ou d'an-30 tigène non altéré, en compétition, est importante dans la solution, moins la fluorescence sera renforcée par l'anticorps. Ainsi on peut tracer une courbe normalisée pour une solution inconnue. B. Titrage d'un échantillon non dérivé d'haptène ou d'antigene 35 La solution qui contient l'échantillon (c'est-à-dire 1'hap tène ou l'antigène non dérivé comme expliqué plus haut) peut être une solution aqueuse neutre ou un fluide physiologique (sérum, urine, fluide amniotique ou extrait tissulaire). Pour établir la concentration de 1'ingrédient inconnu dans 40 le fluide physiologique, on compare l'intensité de fluorescence 71 21358 43 2113821 de l'échantillon mixte (contenant l'anticorps, le dérivé d'haptène ou d'antigène et le composé inconnu) avec la courbe normalisée précitée. Le produit témoin pour un tel titrage est un fluide physiologique connu qui ne contient aucun haptène ou antigène 5 sous forme non dérivée. Ainsi pour la mise en oeuvre du titrage, on prélève un é-chantillon du fluide physiologique, on élimine les matières solides par centrifugation et on l'introduit en dilution dans un mélange normalisé de l'anticorps et de 1'haptène ou antigène homo-10 logue sous forme d'un dérivé, ce dernier ingrédient étant présent en un (léger) excès molaire (par exemple 5:1). On laisse incuber la solution résultante à la température ambiante pendant environ 15 minutes à 12 heures. On détermine la fluorescence du mélange résultant, habituellement à l'aide d'un spectrophotofluoromètre. 15 On compare la valeur indiquée par cet instrument avec la courbe normalisée pour le composé soumis au titrage et on traduit ce résultat en une concentration du composé dans l'échantillon (mg/ml). L'exemple 13 décrit le titrage par renforcement de fluorescence selon l'invention, sërvant à la détermination quantita-20 tive de divers dérivés d'haptènes ou d'antigènes. EXEMPLE 13 On prélève une partie aliquote de sang (1 à 10 ml) chez un patient. On élimine les matières solides par centrifugation. On ajoute le sérum limpide à un mélange normalisé d'anticorps et 25 d'un dérivé homologue d'haptène ou d'antigène (rapport molaire de l'anticorps à-l'haptène 6:1). On incube le mélange résultant à la température ambiante pendant 15 minutes environ. On mesure la fluorescence de ce mélange sur un spectrophotofluoromètre Aminco-Bowman (en effectuant des corrections pour compenser la contri-30 bution du produit tampon et des ingrédients non spécifiques du sérum établis par les témoins). On compare l'intensité mesurée de la fluorescence à 340 irytl d'excitation et 420 mfl d'émission avec la courbe normalisée pour le composé considéré et on obtient ainsi la concentration du composé recherché dans l'échantillon. 35 Le tableau III ci-après indique les constituants servant dans chaque titrage pour 1'échantillon indiqué conformément au procédé de cet exemple. 71 21358 44 2113821 TABLEAU III Renforcement de la fluorescence Echantillon à titrer Dérivés d'haptène ou d'antigene a fluorescence renforcée Anticorps de renforcement de la fluorescence Oestradiol (17$) ÎO Oestriol 15 20 Oestrône 25 Insuline* 30 35 Tétrahydrocannabinol (THC) 40 Hormone libérant la thyrotropine (TRH) tt H Acide oestradiol-azo-benzoïque de 1'exemple 1B Acide oestradiol-ben-zoxque de l'exemple 1C Amino-oestradiol de 1'exemple 1C Acide oestriol—azo-•benzoxque de l'exemple 2B Acide oestriol-hydrazo-benzoxque de 1'exemple 2C Amino-oestriol de l'exemple 2C Acide oestrone-azoben— zoxque de 1'exemple 3B Acide oestrone-hydrazo— benzoxque de 1 '. exemple 3C Amino-oestrone de l'exemple 3C Acide insuline-azoben-zoxque de l'exemple 9A Acide hydrazoinsuline-benzoxque de l'exemple 9B Amino-insuline de l'exemple 9B Acide THC-azobenzoxqué de 1 * exemple 11 Acide THC-hydrazoben-zoxque Amino-THC Acide TRH-azobenzoïque de 1'exemple 11 Acide TRH-hydrazobenzoïqje Amino-TRH Oestradiol (17P) Oestriol Oestrone Insuline THC TRH tf « 45 *Le rapport molaire de 25rl au lieu de 6:1 l'anticorps au dérivé de l'antigène est de 71 21358 2113821 Un autre procédé de titrage, selon l'invention, comprend des procédés d'immuno-radio-titrage pour le titrage guantitatif de composés répondant aux formules CD de la séquence de réactions X et de la séquence de réactions II, procédé qui consiste à former 5 un mélange convenant pour un titrage par comptage d'isotopes de (1) un échantillon à analyser qui provient normalement d'un fluide physiologique (bien qu'on puisse utiliser un échantillon d'une autre source), (2) une quantité connue d'un isotope marqué d'un anticorps 125 10 (par exemple I , bien qu'il soit possible d'utiliser d'autres , , _ "131 ,-.14 _127 .,35, . , isotopes marques tels que I , C , I , S ) qui est spécifique pour le composé que l'on désire titrer, et (3) un dérivé d'haptène ou d'antigène qui est insolubilisé par liaison covalente à une matrice organique .solide (par exemple 15 un dérivé cellulosique) ou une matrice minérale (par exemple en verre aminé), la matrice étant préalablement traitée avec un produit tel que l'albumine "afin de réduire au minimum l'adsorption non spécifique. Le dérivé d'haptène ou d'antigène est un homologue du composé soumis au titrage (de sorte que la spécificité 20 immuno-chimique est la même), ce qui permet la liaison compétitive avec l'anticorps. On analyse la phase qui surnage du mélange pour déterminer la diminution du comptage par minute après incubation. Cette façon d'aborder le problème est tout à fait nouvelle et permet de réduire au minimum l'adsorption non spécifique, 25 par comparaison avec les procédés connus d'immuno-radio-titrage. Parmi les composés que l'on peut titrer, on citera R X, Y, R, ja et te étant les mêmes que précédemment; (2) des agents psychomimétiques tels que les amphétamines, la mépéridine, la mescaline ou le tétrahydrocannabinol, c'est-à-dire l'ingrédient actif de la marihuana (hashish); (3) une catécholamine, telle que définie précédemment; (4) un polypeptide, tel que défini précédemment; (5) le diéthylstibestrol; 71 21358 46 2113821 (6) un A 4,5-stéroïde, tel que défini précédemment; çt (7) la chlorotétracycline, la tétracycline.et le chloramphé-nicol. ". - _ On couple par voie covalente les dérivés d'haptène ou d'an-5 tigène à la matrice solide pour les rendre insolubles * Ces dérivés insolubles sont en compétition avec 1'haptène ou -l'antigène homologue à l'état non dérivé dans l'échantillon pour l'anticorps. La portion hapténique ou antigène de. ces dérivés couplés peut être notamment du type indiqué par les .composés précités 1 à ÎO 7. Les dérivés couplés peuvent répondre ,aux formules I à I\r dé-. crites à propos des produits contenant une matrice M. 1. L'immuno-radio-titrage en utilisant 1'haptène ou l'antigène en liaison covalente à une phase solide est effectué comme suit : 15 A. Etablissement d'une courbe normalisée Dans une série de 20 tubes préparés pour le comptage d'isotopes , on introduit 1 ml d'un anticorps radio-isotopique, c'est- 125 à-dire marqué (par exemple I ) dilué à 1:100 - 1:20.000. Le marquage des anticorps se fait notamment par le procédé à la 20 chloramine T, pendant que les sites des liaisons de l'anticorps sont protégés sur un immuno-adsorbant solide. Les comptages par 8 minute sont de 10 ou plus dans une solution concentrée à 0,20-0,50 microgramme/ml. On purifie l'anticorps par chromatographie. On introduit également dans chaque tube 1 ml contenant 25 de là 10 mg de matrice solide (par exemple des. perles de verre) en liaison covalente avec l'haptène ou l'antigène. On choisit un mélange optimal, par exemple un mélange dans lequel 40 à 50% du nombre total compté est enlevé de la phase liquide par le dérivé insolubilisé. On fait réagir ce mélange avec un haptène compéti-30 tif non dérivé, c'est-à-dire le composé de titrage, en des concentrations croissantes (par exemple 10 à lOO picogrammes/ml). On laisse incuber ce mélange pendant 8 à 12 heures.à une température de 5 à 37°C. Après séparation de la matière propre insolubilisée, on effectue des comptages radio-actifs des phases solides 35 (ou liquides) avec un compteur à scintillations. Des tubes témoins contiennent de la IgG inerte, une matrice solide non couplée, un haptène ou un antigène hétérologue insolubilité aux mêmes concentrations. Lors du titrage d'un échantillon d'haptène ou d'antigène non g 40 dérivé, avec un anticorps de marquage optimal (par exemple 10 71 21358 2113821 comptages par minute dans une concentration de 0,2 microgramme/ ml) purifié et dilué (par exemple 1:10.000), cet anticorps étant choisi pour l'excès de 1'échantillon non dérivé soluble (excès d'haptène ou d'antigène),. ce dernier (par exemple l'oestradiol), 5 en des concentrations croissantes par ml, entre en compétition avec le dérivé insolubilisé d'haptène ou d'antigène pour se lier avec une quantité donnée d'un anticorps soluble, et on aboutit à une diminution du nombre de comptages par minute (CPM) qu'on enlève avec 1'haptène insolubilisé et une augmentation de CPM qui 10 reste dans la phase aqueuse (par liaison avec 1!anticorps). Le pourcentage d'augmentation de CPM dans la phase aqueuse est directement proportionnel à la concentration de 1'haptène ou de l'antigène non dérivé dans l'échantillon. Le rapport est rendu linéaire. Plus la quantité d'haptène ou d'antigène non altéré 15 est importante dans la solution, plus les comptages enlevés par 1'haptène ou l'antigène insolubilisé par covalence seront faibles. On obtient ainsi une courbe pour le composé à titrer. B. Titrage d'haptène ou d'antigène sous forme non dérivée La solution contenant l'échantillon (c'est-à-dire 1'haptène 20 ou l'antigène non dérivé, comme décrit précédemment) peut être une solution aqueuse neutre d'un fluide physiologique (sérum, urine, fluide amniotique ou extrait tissulaire). On établit la concentration du.composant inconnu dans le fluide physiologique en comptant la radioactivité de la phase 25 aqueuse du mélange après compétition avec 1'haptène ou l'antigène non solubilisé, en liaison covalente avec des perles de verre, en vue d'une liaison avec un anticorps marqué. On compare la valeur CPM à la courbe normalisée. Le témoin pour ce titrage est un fluide physiologique qu'on sait contenir de 1'haptène ou de l'an-30 tigène à 1'état non dérivé. Ainsi lorsqu'on effectue le titrage on se procure un échantillon de fluide physiologique, on élimine par centrifugation les matières solides et on 1'introduit en dilution dans un mélange normalisé de l'anticorps et de 1'haptène ou antigène homologue 35 insolubilisé, ce dernier étant présent en un excès molaire. On laisse incuber la solution résultante à 5-37°C pendant 8 à 12 heures. On effectue ensuite les comptages radio-actifs dans la phase aqueuse, habituellement à l'aide d'un compteur à scintillations. On compare le comptage donné par ce compteur à la courbe 40 normalisée du composé titré et on traduit le résultat en concen 71 21358 48 2113821 tration du composé désiré dans l'échantillon (nanogrammes ou picogrammes/ml). Un autre mode de réalisation de l'invention concerne un immuno-radio-titrage en utilisant un anticorps lié d'une manière 5 covalente à la phase solide, procédé dans lequel l'isotope mar- 125 qué, par exemple I (ou un autre isotope parmi ceux qui ont été énumérés à propos du précédent mode de réalisation), est sur le fragment de la protéine porteuse dans le produit conjugué haptène-protéine, plutôt que sur le fragment haptène, comme c'é-10 tait le cas dans les titrages selon la technique antérieure. Cette technique réduit les endommagements radio-isotopiques des groupes fonctionnels et évite l'empêchement stérique. 2. Immuno-radio-titrage en utilisant une protéine porteuse marquée qui est formée d'un produit de conjugaison haptène-15 protéine. Le produit de conjugaison soluble et marqué entre en compétition avec 1'haptène ou l'antigène non dérivé dans le fluide à titrer, pour l'anticorps purifié (qui n'est pas marqué ou qui est marque avec un isotope différent), que l'on insolubilise par une 20 liaison covalente avec une matrice solide (par exemple des perles de verre). A. Choix de la dilution de l'anticorps En utilisant une dilution normalisée du produit de conju- 8 gaison haptène-protéine (total 10 CPM dans 0,2 microgramme/ml), 25 on dilue l'anticorps insolubilisé à une valeur comprise entre 1:10 et 1:10.000 dans une série de 50 tubes. On choisit l'un de ces tubes, dans lequel 40 à 60% du CPM total sont enlevés par l'action de l'anticorps insolubilisé et on considère qu'il s'agit du rapport optimal entre 1'anticorps et 1'antigène de marqua-30 ge. B. Courbe normalisée On utilise le mélange optimal, qui a été choisi selon le paragraphe A ci-dessus dans la série de tubes (par exemple 1 à 20) et dans chacun de ces tubes on introduit une quantité connue 35 d'haptène ou d'antigène sous forme non dérivée, par doses successives dont les valeurs sont de l'ordre du nanogramme ou du pico-gramme. Après 8 à 12 heures d'incubation à une température de 5 à 37°C, on détermine le CPM. Plus le nombre d'haptènes ou d'antigènes non marqués dans un tube donné est important, plus grande 40 sera la quantité de comptes retenus dans la phase aqueuse. La 71 21358 49 2113821 courbe normalisée est rendue linéaire. C. Titrage pour l'haptène ou l'antigène sous'forme non derivee La solution qui contient l'échantillon (c'est-à-dire l'hap-5 tène ou l'antigène sous forme non dérivée, comme on l'a décrit précédemment) peut être une solution aqueuse neutre ou un fluide physiologique (sérum, urine, fluide amniotique ou extrait tissu-laire). Pour établir la concentration de 1'haptène ou antigène in-10 connu dans le fluide physiologique, on compare les radio-activités de la phase aqueuse du mélange à titrer contenant 1'haptène ou 1'antigène inconnu et du produit conjugué haptène-protéine (dans lequel la protéine porteuse est marquée) après la réaction avec les anticorps purifiés qui sont couplés sur le mode covalent 15 aux perles de verre, avec la courbe normalisée précitée. Le produit témoin pour ce titrage est un liquide ou un fluide physiologique qu'on sait ne pas contenir d'haptène ou d'antigène sous forme non dérivée. Ainsi lors de la mise en oeuvre du titrage, on se procure un 20 échantillon du liquide ou du fluide physiologique, on le débarrasse des matières solides par centrifugation et on l'introduit en dilution dans un mélange normalisé de l'anticorps insolubilisé en liaison covalente avec les perles de- verre et le produit de conjugaison marqué de protéine et d'haptène. L'haptène ou l'antigène 25 est présent en un excès molaire par rapport à l'anticorps. On laisse la solution incuber pendant 8 à 12 heures à une température de 5 à 23°C. On effectue ensuite les comptages radio-actifs dans la phase aqueuse, habituellement à 1'aide d'un compteur à scintillations . On compare le résultat indiqué par cet instrument à la 30 courbe normalisée du composé soumis au titrage et on traduit cette valeur en concentration du composé (en nanogramme ou en pico-gramme/ml). L'exemple 14 ci-après décrit la préparation des nouveaux produits conjugués stéroïde-protéine selon l'invention. Dans cet 35 exemple, on soumet à une diazotation rapide l'acide p-aminoben-zoïque (PABA), en présence d'un oestrogène dont la fonction phé-nolique réactive C-3 permet son entrée dans le noyau A en position 2 ou 4 (mais non pas les deux positions à la fois) par l'intermédiaire de 1'atome d1 azote terminal. On couple 1'azostéroïde 40 résultant à une protéine par l'entremise du carboxyle de l'azo- 71 21358 2113821 benzoyle, par condensation avec un carbodiimide soluble, le métho-p-toluène suifonate de l-cyclohexyl-3-(2-morpholinoéthyl)-carbodiimide. . . EXEMPLE 14 5 On dissout 137 mg de PABA dans 10 ml de HCl normal. On re froidit le bêcher avec de la glace pilée pendant 5 minutes et on introduit 100 mg de NaNO^ à 20%, tout en agitant. On ne laisse pas la température monter au-dessus de. 5°C. Quand la totalité du nitrite a été ajoutée (léger excès), une tache bleu pâle appa-10 raît rapidement sur le papier humidifié d'iodure d'amidon» On élimine l'excès de NaîTC^ avec de l'acide sulfamique. La solution devient jaune clair. La diazotation nécessite 15 minutes, le pH ne dépassant jamais 1,0. On dissout 100 mg d'oestradiol, d'oestriol ou d'oestrone à l'état cristallisé dans 25 ml de mé-15 thanol à 90%. On ajoute goutte à goutte le PABA diazoté, en maintenant le pH entre 10 et 11. On acidifie le mélange final avec du HCl O,1 N pour enlever l'excès (soluble) de PABA et les produits secondaires de la réaction. On récupère le précipité d'azostéroïde, on le triture et on le. dissout de nouveau dans du NaOH 20 0,1 N. La centrifugation permet d'éliminer le stéroîde insoluble qui n'a pas réagi. Après une répétition du cycle de traitement par l'acide et la base, on extrait 1'azostéroïde dans un mélange de benzène et de méthanol (4:1) qu'on évapore à siccité. On introduit 25 mg de 1'azostéroïde cristallin dans une so-25 lution saline à 1% contenant 100 mg de carbodiimide O,1 M et 250 mg de KLH ou IgG. On agite le mélange jusqu'au couplage de 1'azostéroïde et on dialyse pendant 2 à 3 jours à 3°C dans du carbonate de sodium 0,5 M à pH 8,2, jusqu'au moment où aucune couleur n'apparaît dans la solution de dialyse. On effectue une 30 dialyse finale contre NaCl à 0,9% pendant 24 heures. Les stades précédents servent à enlever les molécules du stéroîde et du dérivé qui n'ont pas réagi. On utilise la centrifugation pour enlever la protéine insoluble. On effectue la détermination des protéines sur la phase colorée qui surnage et qui contient le pro-35 duit conjugué stéroïde-protéine. On règle la concentration à environ 1% par une mesure spectrale à 280 m/t . Analyse des dérivés azobenzoïiiques(c'est-à-dire l'acide stéroïde-azobenzoïque ) On examine initialement les échantillons par chromatographie 40 en couche mince (TLC). Des dépôts sont effectués sur des lames 71 2135Ô 51 2113821 de verre revêtues de silice G et on les développe avec un mélange de chloroforme, d'acétate d'éthyle et d'acide acétique (40:60:50). On chauffe les lames pendant 10 minutes à 110°C, on les pulvérise avec du I^SO^ concentré et on les observe sous la lumière ultra-5 violette tout en les calcinant. Pour réaliser des analyses spectrales quantitatives, on purifie davantage les échantillons d'immunisation à 1'aide de TLC préparative sur des plaquettes de verre de 10 x 14 cm revêtues avec de la silice G. On effectue le développement dans une direction avec un mélange d'éther, de mé-10 thanol et d'acide acétique (94:5:1). On racle de la plaquette la matière qui migre comme norme de référence et on récupère à 1'aide du solvant initial (volume décuple); la structure de 1'azo-oestradiol, de 1'azo-oestriol, de 1'azo-oestrone et des stéroïdes hydrazoïques et aminés fluorescents correspondants est confirmée 15 par la spectroscople de masse et la résonance magnétique nucléaire. Les dérivés azoïques ont été hydrolysés sous forme intacte à partir des produits protéiniques conjugués et ont fait l'objet d'une détermination quantitative, pour confirmer ainsi la structure azo-oestradiol-KLH, azo-oestriol-KLH, azo-oestrone-KLH et 20 celle des produits conjugués stéroïde-IgG correspondants. Les structures sont indiquées dans le tableau IV ci-dessous : TABLEAU IV OH 25 30 4-(17'p-oestradiol-4 *-azo)benzoyl-KLH 35 Il il acide 4-(17'p-oestradiol-4'-hydrazo)benzoîque H 40 71 21358 52 2113821 NH- 4—amino-17'p~oestradiol OH H 4-( 17' p-oestriol-4*-azo)benzoyl-KLH -OH acide 4-(17 r p-oestriol-4•-hydrazo)benzoîque HO NH, 4—amino—17'P—oestriol 71 21358 2113821 15 0 rr NH-NH -o- C-OH acide 4-(oestrone-4'-hydrazo)benzoîque 20 25 HO NH. 4-amino-oestrône On mesure les spectres d'absorption des dérivés et des produits conjugués sur un spectrophotomètre enregistreur de Cary, en utilisant des cellules rectangulaires d'un trajet lumineux de 10 mm. On obtient des spectres de différences avec des trajets de 30 cellules de 0,1 cm. Pour les mesures initiales d'excitation et d'émission, on utilise un spectrophotofluoromètre Aminco-Bowman qu'on fait fonctionner avec un montage à fente n° 5, ce qui donne une bande spectrale passante de 22 mjm. , alors que pour les relevés du renforcement de fluorescence, on utilise le montage 35 5233253 (bande passante de 11 iryf( ) . Une nouvelle diminution coupe le signal sans augmenter la résolution. L'exemple 15 explique l'utilisation des produits conjugués stéroîde-protéine qui ont été préparés selon l'exemple 14, pour l'immunisation d'un hôte. On indique également la production d'un 40 anticorps spécifique au produit conjugué stéroîde-protéineparti- 71 21358 54 2113821 culier qui a été administré. Dans l'exemple 15, on utilise le produit conjugué oestradiol-KLH. Cependant on peut utiliser de la même façon tous les autres produits conjugués de l'invention et obtenir un anticorps spécifique pour le stéroîde homologue. 5 EXEMPLE 15 • Immunisation On immunise des lapins néo-zélandais adultes avec des produits conjugués purs d'azo-oestradiol et KLH. On effectue des injections intraveineuses deux fois par semaine pendant un total 10 de deux semaines, la dose totale étant de 30 mg. On prélève du sang par ponction cardiaque 1 et 2 semaines après la dernière injection (on produit également des antisérums efficaces à l'aide d'une seule injection sous-cutanée de l'adjuvant complet de Freunds contenant 2,5 ml d'un produit conjugué stéroîde-protéine 15 pur à 1%, le prélèvement du sang se faisant de 21 à 28 jours après cette injection). Purification de l'anticorps On couple 500 mg d'aminoéthyl-cellulose par ses groupes amino {voir Weliky et ses Collaborateurs, Immunochem., 1, 219, 20 1964) à 100 mg de 1'azostéroïde homologue ou hétérologue en présence de N-N'-dicyclohexylcarbodiimide, comme on l'a décrit précédemment à propos de la synthèse des produits conjugués stéroîde-protéine. On dissocie les anticorps avec HAC-urée (en l'occurence, HAC étant l'acide acétique normal et l'urée étant 25 3M) à partir de la matrice solide sous forme d'une suspension ou dans une colonne réutilisable. On peut également utiliser comme matrice un dérivé aminé du verre. Analyse immunologique On titre les antisérums azostéroïde-KLH contre les azo-30 stéroïdes couplés à IgG humaine. On effectue des essais quantitatifs de précipitine en double. On incube des tubes qui contiennent des concentrations croissantes d'antigène avec 0,25-0,50 ml d'antisérum dilué 1:1 à 38°C pendant 1 heure et a 4°C pendant 60 heures. On lave les précipités à trois reprises avec une so-35 lution saline froide, on dissout dans NaOH 0,5 N et on détermine les protéines totales par le procédé Lo.wry (.voir Lowry et ses Collaborateurs, J. Biol. Chem., 153, 265, 1951). On effectue des essais quantitatifs d'absorption de la même façon. On utilise des concentrations croissantes de produits conjugués stérôïdes-IgG 40 pour absorber des sérUms anti-stéroïde-KLH et on "les titre- ensuite 71 21358 55 2113821 avec une concentration normalisée de produit conjugué homologue. Pour 1'immuno-électrophorèse, on recouvre des lames de verre avec 2 ml d'agar-agar à 1,0% dans un tampon de véronal O,075 M, à pH 8,6 (tampon "B2", Beckman Instruments). On envoie un courant to-5 tal de 50 milliampères sur six lames que 1'on-développe ensuite dans une chambre humide à température ambiante pendant 12 à 72 heures. Des essais de micro-immuno-diffusion se font en plaçant des gabarits carrés ayant 1,5 cm de côté sur 0,5 ml d1agar-agàr (voir Gross et ses Collaborateurs, Nature, 219, 758, 1968). On 10 détermine l'extinction de la fluorescence de l'anticorps à l'aide d'haptènes d'azostéroïdes avec une longueur d'onde d'excitation de 280 myL( et on détermine l'émission à une longueur d'onde de 350 mji . On mesure le renforcement de la fluorescence de l'hap-tène par l'anticorps à une longueur d'onde de 336 m/tl pour l'ex-15 citation et 420 ny(( pour l'émission. Spectres d'absorption Les spectres initiaux obtenus sur des azostéroïdes bruts servent à déterminer le degré de substitution dans les protéines. On effectue des mesures avant la combinaison et après l'éllmina-2-0 tion des dérivés azoïques des protéines porteuses par hydrolyse en milieu alcalin (voir Gross et ses Collaborateurs, Immunochem. 5, 55, 1968). Les dérivés d'azostéroïdes (c'est-à-dire azo-oestradiol, azo-oestriol et azo-oestrone) présentent des maxima d'absorption à 350-364 dans le méthanol et 344 ryU dans un 25 tampon de bicarbonate ou de phosphate, à pH 8,6. Le coefficient molaire d'extinction du chromophore de l'acide oestradiol—azo-benzoïque (AED) reste inchangé lors du couplage à la protéine; une absorption accrue par le produit conjugué par rapport à la protéine non traitée à 350 mjt\ divisée par le coefficient d'ex-30 tinction permet d'obtenir la valeur de la concentration des résidus de stéroïdes. Quand on retranche cette valeur de la concentration du produit conjugué, on obtient la concentration molaire du constituant protéinique. Les rapports molaires calculés à partir des courbes spectrales sont compris entre 4 et 30 et 35 sont analogues à ceux provenant d'une TLC. Chromatographie en couche mince (TLC) L'unique différence qualitative entre les azostéroïdes bruts et purifiés, qui migrent sur TLC, est la présence d'une quantité notable de matière restant à l'origine des premiers produits, 40 alors qu'aucune matière ne demeure à 1'origine du produit purifié 71 21358 56 2113821 Dans la chromatographie des deux types de produits, une tache seule migre. Cette migration est presqu'aussi-rapide que dans le cas des stéroïdes normalisés de référence ( Rg=0,87( 8)). Les mobilités relatives de 1'azo-oestradiol et de 1'azo-oestriol sont iden-5 tiques à celles des normes d'oestradiol et d'oestriol non traités. Une fluorescence jaune vif de 1'azostéroïde, après pulvérisation avec ï^SO^, est conforme à celle d'un stéroîde normalisé et reste entièrement superposée sur la tache occupée par le dérivé azoïque en cours de migration, que l'on perçoit sous la lu-10 mière visible. La matière colorée-qui est retenue à l'origine dans la TLC d'échantillons bruts n'est pas fluorescente. La progestérone et la testostérone traitées avec du PABA diazoté migrent séparément et en précédant la tache azoïque de couleur orange (cependant on obtient également un produit couplé). On 15 effectue un sûpplément de purification par recristallisation. Un traitement des stéroïdes-protéines avec du NaOH normal à 1000C,pendant 2 heures, permet de récupérer les azostéroïdes hydrolytiques dont la migration et la fluorescence sont exactement les mêmes que celles des dérivés initiaux. Les résultats 20 n'indiquent aucune altération majeure dans le stéroîde à la suite du couplage. La TLC révèle le nombre minimum de résidus de stéroîde par molécule de la protéine porteuse (voir tableau V ci-après) . TABLEAU V 25 Rapports molaires de produits- conjugués stéroïdes-protéines représentatifs Stéroîde Protéine KLH XgG Oestradiol 29 19 30 Oestriol 25 20 Oestrone 27 5 Purification des anticorps d * azo-oestradiol A partir de 200 mg de matrice, on récupère O à 300 micro- 35 grammes (5,0 ml de sérum) d'anticorps à l'aide d'un acide dilué (HAC O,1 N ou HCl 0,1 N). La récupération moyenne est de 25%. On peut également utiliser de l'urée (3 à 8 M) pour la dissociation à pH 3,2-4,0. Une mesure de la réactivité des protéines récupérées indique une liaison spécifique à 1'haptène homologue et au 71 21358 57 : 2113821 diéthylstylbestrol. Réaction de précipitation quantitative L'azo-oest-radiol-IgG (rapport molaire 20:1) précipite 220 à 1.200 microgrammes/ml de protéine d'anticorps. Dans 1'antisérum 5 AED—KLH, provenant du groupe initial de lapins immunisés, on obtient 354 microgrammes/ml d'anticorps par 1'haptène homologue couplé à la IgG humaine. Sur la figure 1 du dessin annexé on représente un essai de précipitine quantitative dans lequel on précipite un maximum de 354 microgrammes/ml de protéine d'anticorps 10 stéroïdique à partir de antistéroxde-KLH par le mélange azo- oestradiol.- IgG (courbe a), le mélange azo-oestriol-IgG (courbe b), le mélange azo-oestrone IgG (courbe c) et l'IgG normalisée (courbe d^) . On dilue 0,25 ml de sérum (1:1) et on le soumet à un essai contre des concentrations croissantes de produits conjugués avec 15 IgG. Le volume total est 1,25 ml. On n'examine pas la phase qui surnage. On détermine les concentrations d'antigène par voie spectrale. Bien que le couplage de l'oestrone au véhicule IgG soit moins prononcé que celui" de l'oestradiol (tableau V), toutes les dilutions des produits conjugués dé l'oestrone ne réussissent 20 pas à précipiter même 50% de la quantité d'anticorps que précipite la combinaison oestradiol-IgG. L'oestriol subit modérément des réactions auxiliaires ou croisées quand on effectue des réactions avec l'anticorps brut. La norme IgG, le.produit IgG traité avec du PABA diazoté, la progestérone (ou la testostérone) et le car— 25 bodiimide sont négatifs. On obtient une absorption quantitative avec des produits conjugués apparentés, ce qui indique la spécificité du produit brut anti-oestradiol (KLH) pour 1'haptène homologue. Sur la figure 2 du dessin annexé, on a représenté un essai d'absorption quantitative, dans lequel 0,5 ml d'un anti-oestradiol-30 KLH (70C) ayant absorbé 1 ml de stéroïde-IgG, est soumis à l'essai contre 30 microgrammes/ml d'oestradiol-IgG. Le volume final est de 2,5 ml. L'absorption d'anti-oestradiol-KLH avec des concentrations variées des combinaisons différentes d'azostéroïdes-IgG, aux concentrations indiquées, est également indiquée. Les 35 courbes e, f et £ correspondent respectivement aux combinaisons azo-oestradiol-IgG, azo-oestriol-IgG et azo-oestrone-IgG. L'inhibition de 1'haptène (de l'anticorps) pour les études de précipitine est cependant quantitativement non satisfaisante, probablement pair suite de la sensibilité réduite et de la solubilité de 40 1'haptène dans une solution aqueuse neutre. 71 21358 58 2113821 Pour une sensibilité plus élevée et pour calculer les spécificités précises des réactions entre les stéroïdes et les protéines, la technique d'extinction de la fluorescence et de renforcement de la fluorescence est avantageuse en ce qu'elle n'exi-5 ge pas d'altération physique très importante de la molécule du stéroîde, et cette technique ne gêne pas les facteurs cinétiques de la liaison. Réaction d'extinction de fluorescence Les perturbations de la fluorescence de 1'anticorps ou de 10 1'haptène, à la suite de leur réaction mutuelle, constituent des indications extrêmement sensibles de l'intensité èt de la spécificité de cette réaction mutuelle. Une quantité d'énergie, qui est par ailleurs émise sous forme de fluorescence, est absorbée par la plus petite molécule au lieu d'être .simplement dissipée 15 dans le solvant. Le pourcentage d'extinction.de la fluorescence de l'anticorps est proportionnel au nombre des sites de liaison. La protéine excitée à une longueur d'onde de 280 nyftémet dans des conditions maximales à la longueur d'onde de 350 _+ 5 nytC (tryptophane). Cette valeur coïncide avec le maximum d'absorption 20 de AED, ce qui permet un transfert d'énergie, du premier au second. L'efficacité du transfert d'énergie à partir des résidus d'amino-acide aromatique protéiné à 1*haptène lié.peut être calculée par des comparaisons d'excitation et de différence des spectres d'absorption. En l'absence d'un transfert,.le spectre 25 d'excitation de 1'haptène coïncide avec celui, de 1'haptène lié. Des courbes typiques d'extinction de fluorescence, quand on utilise de 1'anticorps brut et AED, sont représentées sur la fi- . gure 3. Ces courbes sont tracées sous forme de pourcentages de fluorescence maximum qu'on observe après la réaction entre l'an-30 ticorps d'azo-oestradiol et IgG (1 x 10~ H), en utilisant des concentrations croissantes d'azostéroïde. On soustrait la fluorescence observée pour des solutions contenant la protéine et 1'azostéroïde de la valeur enregistrée pour la protéine. On effectue des corrections pour compenser les..contributions des 35 azostéroïdes, de 1'agent-tampon et de la dilution. Les courbes le, i et i correspondent respectivement à 11 azo—oestradiol, l'azo-oestriol et 1'azo-oestrone. La contribution de la liaison non spécifique de 1'azostéroïde à IgG est indiquée par la combinaison azo-oestradiol + IgG normale de'lapin (courbe h). Un sérum 40 pré-immunisé n'est pas disponible. On détermine le-maximum-d* ex 71 21358 2113821 tinction (Q max) par voie expérimentale dans un excès d'haptène. Les valeurs de Q max dans l'essai permettent de déterminer une constante d'association (K ) en accord avec la valeur obtenue o par la dialyse équilibrée (concernant le nombre de sites de liai-5 son). Cependant, les constantes déterminées par l'extinction de la fluorescence (en supposant que la valence de l'anticorps soit 2) sont utiles lorsqu'on compare des haptènes apparentés dans un système donné. Puisqu'on peut présumer que la population d'anticorps est hétérogène, on utilise commodément l'équation de Sips 10 (voir P. Karish, Adv. Immunol., 2, 1, 1962) pour déterminer la distribution ou la valeur moyenne de Kq. log (r/n-r) = a log c + a log K dans laquelle r est le rapport du nombre de moles d'haptène lié par mole de l'anticorps à ç (concentration de 1*haptène libre), 15 - n est le nombre maximum de moles d'haptene lie par mole de proteine et _a est la pente de la courbe ou indice d'hétérogénéité. On calcule alors ces valeurs pour des dérivés purifiés. Renforcement de la fluorescence Pour mesurer des petites quantités d'haptène lié (par dilu-20 tion ou par des constantes inférieures d'association, par exemple à l'aide de sous—unités IgG), le demandeur applique la technique de renforcement de fluorescence à l'aide d'un stéroîde hautement fluorescent qui joue le rôle d'un "groupe reporteur" dans l'étude des réactions entre les stéroïdes et les protéines. On provoque 25 une fluorescence naturelle intense par réduction de 1'azobenzoyle en dérivés hydrazobenzoïliques, comme on l'a expliqué précédemment. La synthèse et la caractérisation seront décrites plus loin. Les maxima de fluorescence pour 1*hydrazo-oestradiol (HED) sont de 338 nyH à l'excitation et de 420-445 rrt^ à l'émission, dans 30 un tampon de phosphate O,1 M, à pH 8,6. Quand ces petites molécules sont fortement liées à une protéine dans un environnement non polaire, elles acquièrent une énergie fluorescente accrue si le donneur (protéine) et l'accepteur (HED) répondent aux critères spectroscopiques suivants : 35 (1) leurs spectres d'absorption permettent une excitation sélective de l'un ou l'autre chromophore, (2) le spectre d'émission du donneur se superpose à l'absorption du chromophore de l'accepteur hydrazoïque, et (3) l'accepteur est suffisamment fluorescent pour la dé-40 tection du transfert d'énergie. 71 21358 2113821 La figure 4 indique les résultats d'un renforcement de l'excès d'haptène par rapport à l'excès de protéine, quand on u-tilise une combinaison brute anticorps-IgG. On produit les spectres de fluorescence à l'émission par une excitation à une 5 longueur d'onde de 336 mj\ . On remarquera les déplacements spectraux de HED réagissant avec l'anticorps et avec IgG normale. Les courbes _1, m, n et o correspondent aux combinaisons suivantes : HED + anticorps, HED + IgG normale, HED, et anticorps-IgG. La courbe pour IgG normale d'un lapin coïncide avec celle de l'anti- —8 lO corps. Les concentrations de HED (1 x lO- M) et des protéines —8 ✓ (5 x 10" M)sont constantes dans tous les échantillons, des corrections étant apportées pour compenser la dilution. Les courbes d'émission qui utilisent une longueur d'onde d'excitation de 336 myt( démontrent une descente de l'émission et du renforcement 15 de fluorescence. Des changements analogues peuvent être observés à 10~6M. L'extinction de la fluorescence de 1'anticorps par HED, mesurée sur les mêmes échantillons (à une plus faible concentration) en utilisant une longueur d'onde d'excitation de 284 m^( et 20 une intensité d'émission relevée à 350 mjK , donne des courbes analogues à celles de AED. . Les changements chimiques produits avec des dérivés d'haptène stéroïdiques existent également avec les produits conjuguas stéroîde-protéine. Une immuno-diffusion sur microgel exécutée 25 sous azote indique une identité immunologique et la spécificité des facteurs HED et AED. L'utilité potentielle de la spectrophotofluorométrie, comme un moyen physico-chimique très rapide et très simple pour le titrage des oestrogènes normaux par leur compétition avec les mo-30 lécules du dérivé, ressort à l'examen de la figure 5 qui est un schéma général d'essais compétitifs dans lesquels on effectue 1'extinction de la fluorescence par des stéroïdes azoïques ou hydrazoïques dont les spectres d'absorption se superposent à l'émission des protéines. La seconde façon d'aborder ce problème 35 consiste à renforcer la fluorescence de 1'hydrazo-stéroïde par l'anticorps. On peut également utiliser cette technique pour déterminer la nature fondamentale de la liaison entre 1'haptène et la protéine. Le marquage de 1'anticorps utilisé dans les immuno-radio-40 titrages en phase solide, selon la technique antérieure, en utl- 71 21358 « . ' 2113821 lisant un anticorps spécifique pour le composé à analyser, constitue un autre mode de réalisation nouveau de l'invention. Les titrages de la technique antérieure sont bien connus et il est donc inutile de les décrire en détail. Brièvement, les composants 5 des titrages en phase solide de ce genre, selon la technique antérieure, sont les suivants : (1) quantité connue d'un composé marqué pour titrage; ( 2 ) quantité connue d1 un anticorps*; (3) disques (polystyrène); 10 (4) échantillon contenant une dose inconnue du composé pour titrage. Par opposition à la technique antérieure, l'invention prévoit le marquage de l'anticorps au lieu de marquer le composé à titrer, le titrage étant, par ailleurs, effectué de la façon 15 usuelle. Des titrages de ce genre provoquent un endommagement plus faible du produit marqué et aucun endommagement du composé à titrer. En raison du marquage de l'anticorps, on obtient une intensité plus élevée de radio-activité et, par conséquent, une meil-20 leure sensibilité, une meilleure spécificité et une plus brève période d'incubation. On dispose ainsi d'un essai plus bref et plus précis, même quand on le compare aux titrages modernes en phase solide qui ont été immaginés justement pour simplifier et abréger le titrage effectué par la technique du double anticorps. 25 EXEMPLE 16 Acide 4-épinéphrine-azobenzoïque On introduit 0,75 meq d'acide p-aminobenzoïque dans 10 ml de HCl normal et on réfrigère à 5°C. On ajoute 0,85 meq de nitrite de sodium, on agite dans un bain de glace pendant 20 minu-30 tes, le pH ne dépassant pas 1, et on titre le mélange avec un papier d'iodure d'amidon. On élimine l'excès de nitrite avec de l'acide sulfamique. On introduit goutte à goutte l'acide p-aminobenzoïque diazoté dans, une concentration équivalente (0,75 meq) d'épinéphrine en dissolution dans un tampon de phosphate 35 0,1 molaire, le pH étant de 11, contenant 10% de méthanol. Après .. une acidification douce, on extrait 1 ' acide épinéphrine-azoben-zoïque et on le purifie par chromatographie préparative. Acide 4-épinéphrine-hydrazobenzoîque et aminoépjnéphrine On dissout (0,15 mg/ml) 25 mg d'acide^inéphrine-azobenzoï-40 que dans de l'acide acétique 0,1 M (pH 5,5) contenant 30% de 71 21358 62 2113821 méthanol. On ajoute un excès molaire de 800% de borohydrure de sodium sous forme d'une solution aqueuse, le mélange étant balayé à l'azote. On sépare 1'amino-épinéphrine et 1'hydrazo-épinéphrine par extraction et chromatographie. On traite les composés avec du 5 2,6-di-t-butyl-p-crésol (1% du poids des molécules du dérivé) et on relargue par chromatographie. 4-épinéphrine-azobenzoyl-KLH On ajoute 100. mg de métho-p-toluène suifonate de 1-cyclo-hexyl-3-(2-morpholinoéthyl)carbodiimide (0,1 molaire) dans de 10 l'eau à 25 mg d'acide 4-épinéphrine-azobenzoïque purifié. Le produit intermédiaire désiré, c'est-à-dire 0-1,3-dicyclohexyl-2-(4-épinéphrine-azobenzoyl)pseudo-urée, est ainsi obtenu. On ajoute de la KLH à ce mélange. On agite jusqu'au moment où 1'azopseudo-urée est couplée à KLH et on dialyse pendant 48 15 heures dans de l'acétate de sodium 0,1 M, à pH 5,4, jusqu'à ce que la couleur n'apparaisse plus dans la solution de dialyse. On effectue une dialyse finale contre de l'eau distillée, .puis on lyophilise le produit conjugué. Quand on répète l'exemple 16, mais en remplaçant KLH par la 20 même quantité d'immuno-gamma-globuline ou d'albumine de sérum bovin, on obtient les produits conjugués correspondants avec la globuline et l'albumine, respectivement, et les réactions se déroulent par l'entremise des pseudo-urées des protéines correspondantes, comme produits intermédiaires. 25 EXEMPLE 17 Acide 4-TRH-azobenzoïque (TRH = hormone libérant la thyro- tropine) On introduit 0,75 meq d'acide p-aminobenzoïque dans 10 ml de HCl normal et on réfrigère à 5°C. On ajoute 0,85 meq de nitrite 30 de sodium. On agite dans un bain de glace pendant 20 minutes, le pH ne dépassant pas 1. On effectue le titrage avec un papier d'iodure d'amidon. On enlève l'excès de nitrite avec de l'acide sulfamique. On ajoute goutte à goutte l'acide p-aminobenzoïque diazoté dans une concentration équivalente de TRH (0,75 meq) en 35 dissolution dans un tampon de phosphate 0,1 M, à pH 11, contenant 10% de méthanol. Après une acidification douce, on extrait l'acide TRH-azobenzoïque et on le purifie par chromatographie prépa-rative. - Acide 4—TRH—hydrazobenzoïque et amino-TRH 40 On dissout (0,15 mg/ml) 25 mg d'acide TRH-âzobenzoïque puri 71 21358 sa 2113821 fié dans de l'acide acétique 0,1 M (pH 5,5 contenant 30%' de méthanol). On ajoute un excès molaire de 800% de borohydrure de sodium sous forme d'une solution aqueuse, le mélange étant balayé avec de l'azote. On sépare l'amino-TRH et l'acide 4-TRH—hydrazo-5. benzoîque par extraction et chromatographie. On traite les composés avec du 2,6-di-t-butyl-p-crésol (1% par rapport au poids des molécules du dérivé) et on relargue par chromatographie. 4-TRH-azobenzoyl-KLH On ajoute 100 mg de métho-p-toluène suifonate de 1-cyclo-10 hexyl-3-(2-morpholinoéthyl)carbodiimide O,1 M dans de l'eau à 25 mg d'acide 4-TRH-azobenzoïque purifié. On obtient ainsi le produit intermédiaire désiré, la 0-1,3-dicyclohexyl-2-(4-TRH-azobenzoyl)-pseudo-urée. On ajoute de la KLH à ce mélange. On agite jusqu'à ce que 15 11azopseudo—urée intermédiaire soit couplée avec KLH et on dialyse pendant 48 heures dans de l'acétate de sodium O,1 M, à pH 5,4, jusqu'à ce que la couleur n'apparaisse plus dans la solution de dialyse. On effectue une dialyse finale contre de l'eau distillée et on lyophilise ensuite le produit conjugué. 20 Quand on répète l'exemple 17, mais en remplaçant KLH par la même quantité d'immuno-gamma-globuline ou d'albumine de sérum bovin, on obtient les produits conjugués correspondants avec la globuline et l'albumine, respectivement, et les réactions se déroulent par l'entremise de pseudo—urées des protéines correspon-25 dantes, comme produits intermédiaires. EXEMPLE 18 Acide 4-THC-azobenzoïque (THC = tétrahydrocannabinol) On introduit 0,75 meq d'acide p-aminobenzoïque dans 10 ml de HCl normal et on réfrigère à 5°C. On ajoute 0,85 meq de nitrite 30 de sodium. On agite dans un bain de glace pendant 20 minutes, le pH ne dépassant pas 1. On effectue le titrage avec un papier d'iodure d'amidon. On élimine l'excès de nitrite avec de l'acide sulfamique. On ajoute goutte à goutte l'acide p-aminobenzoïque diazoté dans une concentration équivalente de THC (0,75 meq) en 35 dissolution dans un tampon de phosphate O,1 M à pH 11 contenant 10% de méthanol. Après une acidification douce, on extrait l'acide THC azobenzoïque et on le purifie par chromatographie prépa-rative. Acide 4-THC-hydrazobenzoïque et amino-THC 40 On dissout (0,15 mg/ml) 25 mg d'acide THC-azobenzoïque purl- 71 21358 64 2113821 fié dans de l'acide acétique O,1 M (pH 5,5) contenant 30% de méthanol. On ajoute un excès molaire de 800% de borohydrure de sodium sous forme d'une solution aqueuse, le mélange étant balayé avec de l'azote. On sépare 1'amino-THC et l'acide 4-THC hydrazo-5 benzoîque par extraction et chromatographie. On traite les composés avec du 2,6-di-t-butyl-p-crésol (1% du poids des molécules du dérivé) et on relargue par chromatographie. 4-THC-azobenzoyl-KLH On ajoute 100 mg de métho-p-toluène suifonate de 1-cyclo-10 hexyl-3-( 2-morpholinoéthyl)carbodiimide (0,1 M) dans de .l'eau à 25 mg d'acide 4-THC-azobenzoïque purifié. On obtient ainsi le produit intermédiaire désiré, la 0-1,3-dicyclohexyl-2-(4-THC-azobenzoyl) pseudo-urée. On ajoute de la KLH à ce mélange. On agite le mélange jusqu' 15 à ce que 1'azopseudo-urée soit couplée avec KLH et on dialyse pendant 48 heures dans de l'acétate de sodium O,1 M, à pH 5,4 jusqu'à ce que la couleur n'apparaisse plus dans la solution de dialyse. On effectue une dialyse finale contre de l'eau distillée et on lyophilise ensuite le produit conjugué. 20 Quand on répète l'exemple 18, mais en remplaçant KLH par la même quantité d'immuno-gamma-globuline ou d'albumine de sérum bovin, on obtient les produits conjugués correspondants avec la globuline et l'albumine, respectivement, et les réactions se déroulent par 1'entremise de pseudo-urées des protéines correspon-25 dantes, comme produits intermédiaires. Quand on répète l'un quelconque des exemples 1 à 4, sauf qu'on remplace le stéroîde utilisé dans ces exemples par l'un des stéroïdes ci-après, en une quantité équivalente, on obtient l'acide stéroïde-azobenzoïque, l'acide stéroîde hydrazo-benzoïque, 30 1'amino-stéroïde et la stéroïde-azobenzoyl-protéine correspondants : équiline (1,3,5,7-oestrotétroen-3-ol-17-one); équiline-glycol (1,3,5-oestratrien-17-one-3,7,8-triol); équilénine (1,3,5: 10,6,8-oestropentoen-3-ol-17-one); dihydro-équiline-17-a; dihy-dro-équilénine-17-a; 4-méthoxy-oestrone; 2-méthoxy—oestrone; 35 2-méthoxy-oestradiol; 16-oxo-oestrone; 16-a-hydroxy-oestrone; 16-p-hydroxy-oestrone; 18-hydroxy-oestrone; 16-oxo-oestradiol- 17-{3; 6-oxo-oestradiol-17-p; 16-épi-oestriol ( 16-{3, 17-p); 17-épi-oestriol (16-a, 17-p); 16-épi-oestriol (16-p, 17-p); 17-épi-oestriol (16-a, 17-p); propionate d'oestradiol-17-p-cyclo- 40 pentane; 16-a, 17-p-oestriol. Les acides stéroïde-azobenzoïques 71 21358 55 2113821 et les produits correspondants peuvent être utilisés en des quantités équivalentes pour préparer les acides stéroïde-azoben-zoïques des exemples 5 à 8, c'est-à-dire pour obtenir les azobenzoyl -protéines des stéroïdes respectifs. 5 De plus, si dans l'un quelconque des exemples 1 à 4 on rem place l'acide p-aminobenzoïque par une quantité équivalente des composés aryloïques suivants, on obtient le dérivé azoïque d'a-rylène correspondant : p-aminobenzène; p-nitroaminobenzène; chlorure de p—nitrophényle; chlorure de p-aminophényle; p-10 chloroaminobenzène; acide p-chloraminobenzoïque; ou les isomères méta des produits précités ; ou encore les analogues benzéniques di- ou tri-substitués de ces produits; ou enfin les analogues naphtyliques de ces produits. On peut également utiliser des acides stéroïde-azoarylaxques à la place des acides stéroïdes 15 azobenzoïques des exemples 5 à 8 et on obtient ainsi les azoaroyl-protéines des stéroïdes correspondants. Lors du stade de diazotation dans les séquences de réactions X et II précitées, on peut utiliser tout sel de diazonium ayant des groupes diazonium fixés à 1'aryle. On peut utiliser 20 d'autres systèmes qui supportent l'ion diazonium. On citera notamment les noyaux hétérocycliques ou polycycliques, comme la pyridine, la pyrazone, le triazole, le benzyrène, les chélates métalliques (par exemple tris-(acétylacétonate)chrome), l'ester hyponitrite (RO-N=N-OR); 1 » analogue soufré de 1'azoxybenzène 25 (RN-S-NR). Comme il va de soi et comme il résulte d'ailleurs déjà de ce qui précède, l'invention ne se limite nullement à ceux de ses .modes d'application, non plus qu'à ceux des modes de réalisation, de ses diverses parties, ayant été plus spécialement envisagés; 30 elle en embrasse, au contraire, toutes les variantes. 71 21358 66 .2113821 REVENDICATIONS 1. Composé sous forme sensiblement pure, caractérisé en ce qu'il répond à la formule D-R'-N=N. 10 dans laquelle R représente un atome d'hydrogène ou un radical alcoyle inférieur; R' représente un fragment qui supporte un ion diazonium; D représente un groupement protéine-NHCO-, H00C-, •R» " 15 ' ' NO !! !l C-O-C- I NH i R"", 20 ce dernier groupement comportant ou ne comportant pas de groupe protéine-NH lié à l'atome de carbone du radical céto, SCN-, ou halo-CO; X et Y, qui peuvent être les mêmes ou différents, représentent chacun un radical choisi parmi les groupes hydroxy, céto, ester, aminé primaire, aminé secondaire, aminé tertiaire, 25 alcoyle inférieur, halo, aryle, alcényle; —N==NR" -SC=N, -OOCR", —NHCOR", -SR", -SOR", -NO, -N02, carboxyle, -10^^ , -COOR", -S03H, -CF3, -CCI3, -NR3„^ -CN, -COR" et -S03R"; R", R'" et R"", qui peuvent être les mêmes ou différents et dont chacun contient un maximum de 20 atomes de carbone environ, représentent 30 chacun un radical alcoyle, cycloalcoyle, aryle, alcényle, cyclo-alcényle ou un groupe hétérocyclique dans lequel les hétéro atomes sont O, S ou N; a et b, qui peuvent être les mêmes ou différents, représentent chacun un nombre entier de 1 à 3; et le fragment protéine est une.protéine immunogène lourde dont le 35 poids.moléculaire est supérieur à 6.000 environ. 2. Composé selon la revendication 1, caractérisé en ce que D est un groupe protéine-NHCO-; R1 est un radical arylène; X est OH; a est 1; Y est un radical OH ou céto (b étant 1 ou. 2 quand Y est OH et 1 quand Y est un groupe céto); R est H ou un radical 40 méthyle; et la protéine est 1'hémocyanine de patelle-de.la varié 71 21358 67 2113821 té appelée "keyhole limpet" (KLH), l'albumine de sérum bovin (BSA) ou 1'immuno-gamma-globuline (IgG). 3. Composé selon la revendication 2, caractérisé en ce que R' est le p-phénylène; X est un groupe 3-hydroxy; Y est un groupe 5 17-hydroxy, ou 16,17-dihydroxy ou 17-céto; R est un radical mé-thyle; _a est 1; et b est 1 quand Y représente un groupe céto et 1 ou 2 quand Y représente un groupe hydroxy. 4. Composé selon la revendication 1, caractérisé en ce que D représente HOOC-; R' représente un radical arylène; X représen-10 te OH; a. est 1; Y représente un groupe OH ou céto (1) étant 1 ou 2 quand Y est OH et 1 quand Y est céto); et R représente H ou un radical méthyle. 5. Composé selon la revendication 4, caractérisé en ce que R' représente le p-phénylène; X représente un groupe 3-hydroxy; 15 Y représente un groupe 17-hydroxy, ou 16,17-dihydroxy ou 17—céto; R est un radical méthyle; a. est 1; et b est 1 quand Y est un groupe céto et 1 ou 2 quand Y est un groupe hydroxy. 6. Composé selon la revendication 5, caractérisé en ce qu'il est choisi parmi la 0-l-3-dicyclohexyl-2-^4-(3 ', 17' {3-dihydroxy- 20 oestra-1', 3', 5'- triénylazo) benzoylQpseudo-urée, la 0-1,3-dicyclohexyl-2- [4-( 3 ' 16, 17' (3-trihydroxyoestra-l', 3', 5 '-triénylazo) benzoyljpseudo-urée, la 0-1, 3-dicyclohexyl-2-jji-3 ' |3-hydroxy-17-cétoestra-l',3',5'-triénylazo) benzoylj pseudo-urée, et la 0-1, 2-dicyclohexyl-2-^4-( 3 ' {3-17 ' a-dihydroxyoestra-1', 3 *, 25 5'-triénylazo) benzoyljpseudo-urée. 7. Composé selon la revendication 1, caractérisé en ce que D répond à la formule : % 30 ^C-O-C _ R"» NH NH-protéine dans laquelle R est un radical méthyle, X et Y sont des groupes hydroxy et R' est un radical phényle. 8. Composé selon la revendication 7, caractérisé en ce que 35 le fragment protéinique est KLH, IgG ou BSA. 9. Composé selon la revendication 1, caractérisé en ce que D représente SCN- ou halo—CO; R est un groupe méthyle, X et Y sont des groupes hydroxy et R' est un radical phényle. lO. Procédé de préparation d'anticorps, caractérisé en ce 40 qu'il consiste à administrer, sous une forme sensiblement pure, 71 21358 68 2113821 une dose efficace d'ion produit conjugué de protéine, répondant à la formule : î H A-N=N-R'-C-N-proteine 5 dans laquelle A est un haptène ou un antigène contenant un groupe aromatique ou un noyau hétérocyclique ayant un caractère aromatique, substitué par l'hydrogène ou par un groupe en position ortho, para ou méta, ledit groupe permettant à l'ion diazonium de se lier à A par couplage direct à un atome dudit groupe aromati-10 que, R' est un fragment qui supporte l'ion diazonium, et le fragment protéinique est une protéine immunogène lourde dont le poids moléculaire est supérieur à 6.000 environ. 11. Procédé selon la revendication 10, caractérisé en ce que le produit conjugué répond à la formule : • dans laquelle R représente ion atome d'hydrogène ou un radical 25 alcoyle inférieur; X et Y, qui peuvent être les mêmes ou différents, représentent des radicaux choisis parmi hydroxy, céto, ester, aminé primaire, aminé secondaire, aminé tertiaire, alcoyle inférieur, halo, aryle, alcényle, -N=NR" -SC=N, -00CR", —NHCOR", -SR", SOR", -N02, -NO, carboxyle, -C00R", -S03H, -CF3, 30 -CCI3, -NR3,P, -CN, -COR", et -S03R"; R" contient jusqu'à 20 atomes de carbone environ et représente un radical alcoyle, cycloalcoyle, aryle, alcényle, cycloalcényle ou un radical hétérocyclique dans lequel les hétéroatomes sont O, S ou N; a et b>, qui peuvent être les mêmes ou différents, représentent chacun un 35 nombre entier de 1 à 3. 12. Composé, caractérisé en ce qu'il répond à la formule Ra—A—NH—E, dans laquelle E est H ou: un groupe —NHZ, dans lequel Z est un fragment capable de supporter un ion diazonium; A est un haptène ou un antigène contenant un groupe aromatique, ou un 40 noyau hétérocyclique ayant un caractère aromatique substitué par un groupe en position ortho, para ou méta, qui permet à l'ion 71 21358 69 2113821 diazonium de se lier à- A par couplage direct à un atome dudit groupe aromatique; et Ra représente H, un groupe alcoyle, alcényle, alcynyle ou des dérivés cycliques de ces derniers contenant environ 1 à 10 atomes de carbone ou un groupe aryle contenant 5 environ 6 à 10 atomes de carbone. 13. Composé selon la revendication 12, caractérisé en ce qu'il répond à la formule : 10 15 NH 20 dans laquelle R représente un atome d'hydrogène ou un radical alcoyle inférieur; X et Y, qui peuvent être les mêmes ou différents, représentent des radicaux choisis parmi les radicaux hydroxy, céto, ester, aminé primaire, aminé secondaire, aminé tertiaire, alcoyle inférieur, halo, aryle, alcényle, -N=NR^, -SC-N, 25 -OOCR", -NHCOR", -SR", -SOR", -NO, -N02, carboxyl, -XO^/ -COOR", -S03H, -CF3, -CCI3, -NR3„®, -CN, -COR", et -S0'3R" ; R" renferme jusqu'à 20 atomes de carbone environ et représente un groupe alcoyle, cycloalcoyle, aryle, alcényle, cycloalcényle ou un groupe hétérocyclique dans lequel les hétéroatomes sont O, S 30 ou N; et _a et b, qui peuvent être les mêmes ou différents, représentent des nombres entiers de 1 à 3. 14. Composé selon la revendication 12 ou 13, caractérisé en ce que Z est une matrice minérale insoluble contenant un groupe réactif NH^ ou une matrice organique insoluble contenant un 35 groupe réactif NH2, OH ou COOH. 15. Composé selon la revendication 12 ou 13,- modifié, caractérisé en ce que l'atome d'hydrogène du groupe NHest supprimé et E représente =N-verre. 16. Procédé de titrage quantitatif pour déterminer la présen-40 ce d'un haptène, d'un antigène polypeptidique intact ou d'un 71 21358 70 2113821 composé A 4, 5-stéroïdique dans un échantillon, le composé à titrer contenant un fragment aromatique ou un fragment hétérocyclique ayant un caractère aromatique, caractérisé en ce qu'il consiste à mélanger l'échantillon avec une quantité connue d'un 5 anticorps qui est immunologiquement spécifique pour le composé titré et qui contient un fragment chimique d'identification conférant à l'anticorps une propriété physique, au moyen de laquelle on peut le titrer, et avec un composé-témoin qui est. un dérivé d'haptène ou d'antigène immunologiquement homologue au composé 10 titré, pour lui permettre ainsi de se lier sur le mode compétitif avec l'anticorps, ledit dérivé possédant une caractéristique physique qui le distingue du composé titré et au moyen de laquelle on peut déterminer quantitativement le composé-témoin, ladite caractéristique étant préservée dans la combinaison du composé-15 témoin avec 1'anticorps ; à titrer quantitativement pour la combinaison du composé-témoin avec l'anticorps; et à calculer la quantité du composé de titrage présent. 17. Procédé selon la revendication 16, caractérisé en ce que le titrage est fluorométrique, la caractéristique physique du 20 composé-témoin est la fluorescence dans un spectre se superposant à celui de l'anticorps et ledit stade de titrage consiste à mesurer 1'extinction de la fluorescence ou le renforcement de cette dernière. 18. Procédé selon la revendication 16, caractérisé en ce que 25 le titrage est radiologique, la propriété physique de l'anticorps est la radioactivité, la caractéristique physique du composé-témoin est son insolubilité dans le mélange, et le stade de titrage consiste à mesurer la radioactivité du composé insoluble qui est le produit de réaction de l'anticorps avec le composé-30 témoin. 19. Procédé selon la revendication 18, caractérisé en ce que le composé-témoin répond à la. formule AN=NM ou ANH*NHM, dans laquelle A représente un haptène ou un antigène dont la structure est immunologiquement homologue à celle du composé titré et il 35 est directement fixé à l'atome d'azote du groupe azoïque par l'intermédiaire d'un atome du noyau, et M $st une matrice minérale insoluble contenant un groupe réactif NH^, OH ou COOH. 20. Procédé de purification d'un anticorps brut, caractérisé en ce qu'il consiste à le mettre en contact avec des immuno- 40 adsorbants et ensuite à éluer l'anticorps purifié avec un mélange 71 21358 71 2113821 d'acide acétique ou chlorhydrique 0,5 à 1,5 N et d'urée d'une molarité de 2 à 4. 21. Procédé selon la revendication 20, caractérisé en ce que le mélange comprend de l'acide acétique normal et de l'urée 3 5 molaire. 22. Procédé pour isoler des métabolites liés aux protéines dans les fluides physiologiques, caractérisé en ce qu'on traite le fluide physiologique avec un mélange d'acide acétique ou chlorhydrique O,5 à 1,5 N et d'urée dont la molarité est comprise 10 entre 2 et un maximum de 8, et on règle le pH pour effectuer 1'extraction. 23. Procédé selon la revendication 16, qui est un procédé immuno-fluorescent de titrage quantitatif d'un composé choisi parmi les haptènes, les antigènes poiypeptidiques intacts et les 15 4,5- stéroïdes, contenant chacun un fragment aromatique ou un fragment hétérocyclique ayant un caractère aromatique, caractérisé en ce qu'il consiste à préparer un mélange, convenant pour un titrage fluorométrique de (1) un échantillon à analyser, (2) une quantité connue d'un anticorps qui est immunologiquement 20 spécifique pour le composé à titrer et (3) une quantité connue d'un dérivé d'haptène ou d'antigène, possédant un spectre d'absorption qui correspond au spectre d'émission de l'anticorps et qui est un homologue dudit composé titré, de sorte qu'une liaison compétitive est réalisée avec ledit anticorps ; et à analyser 25 ce mélange pour déterminer l'extinction de la fluorescence de 1'anticorps. 24. Procédé selon la revendication 16, qui est un procédé immuno-fluorescent de titrage quantitatif d'un composé choisi parmi les haptènes, les antigènes poiypeptidiques intacts et 30 les & 4, 5-stéroïdes, contenant chacun un fragment aromatique ou un fragment hétérocyclique ayant un caractère aromatique, caractérisé en ce qu'on prépare un mélange convenant pour un essai fluorométrique de (1) un échantillon à analyser, (2) une quantité connue d'un anticorps qui est immunologiquement spécifique 35 pour le composé à titrer et (3) une quantité connue d'un dérivé d'haptène fluorescent ou d'un antigène fluorescent, ledit produit étant homologue au composé titré de manière à se lier de façon compétitive avec l'anticorps; et on analyse ce mélange pour déterminer le renforcement de la fluorescence de 1'haptène ou de 40 l'antigène. 71 21358 72 2113821 25. Procédé selon la revendication 16, qui est un procédé d'immuno-radio-titrage quantitatif d'un composé choisi parmi les haptènes, les antigènes poiypeptidiques intacts et les 4,5-stéroïdes, contenant chacun un fragment aromatique ou un fragment 5 hétérocyclique ayant un caractère aromatique, caractérisé en ce qu'il consiste à préparer un mélange contenant (1) un échantillon à analyser, contenant le composé qu'on désire titrer, (2) une quantité connue d'un anticorps radio-actif immunologiquement spécifique pour le composé à titrer et (3) une quantité connue 10 d'un composé insoluble de formule : H H I I A—N=N—M ou A-N-N-M dans laquelle A représente un haptène ou un antigène dont la structure est immunologiquement homologue à. la substance titrée 15 et qui est directement fixé à l'atome d'azote du groupe azoïque par l'entremise d'un atome du noyau, et M est une matrice minérale insoluble contenant un groupe réactif NH2 ou une matrice organique insoluble contenant un groupe réactif NH2, OH ou COOH; et à soumettre le composé qui surnage ou composé insoluble à un 20 comptage radio-actif. 26. Application thérapeutique des composés et des procédés selon l'une quelconque des revendications 1 à 25, consistant à effectuer des titrages de fluides physiologiques tels que le sang, l*urine, le fluide amniotique.