FR 2137769 A1 19721229 FR 7216808 A 19720510 72 16808 2137769 La présente invention est relative à un nouveau procédé de production de L-lysine et' plus particulièrement à un procédé de production de L-lysine dans lequel un microorganisme producteur de L-lysine n'exigeant pas d'amino-acide pour sa 5 croissance et qui appartient au genre Brevibacterium ou Coryne-bacterium, est cultivé en aérobie au sein d'un milieu contenant de l'acide benzoïque comme source de carbone, à former et à accumuler la L-lysine dans le milieu et à récupérer la L-lysine dans ce milieu,, 10 La présente invention a pour objet un procédé permettant de former et d'accumuler une quantité considérable de L-lysine directement à partir d'un produit pétrochimique peu coûteux utilisé à titre de source de carbone, afin de produire la L-lysine de façon avantageuse à l'échelle industrielle» 15 Jusqu'ici, pour produire de la L-lysine par fermentation, on formait et accumulait la L-lysine au sein du milieu en utilisant un mutant exigeant des amino-acides pour sa croissance, c'est-à-dire une souche d'un microorganisme producteur d'acide L-glutamique, à savoir Micrococcus glutamicus 20 exigeant de l'homosérine, ou bien à la fois de la thréonine et de la méthionine, ou encore à la fois de la thréonine et de la cystathionine, ou bien encore à la fois de la thréonine et de l'homocystéine pour sa croissance» Toutefois, selon le procédé courant, il faut utiliser des sucres comme matières premières 25 et, de ce fait, ce procédé n'est pas toujours avantageux au point de vue industriel (voir brevet japonais n° 54-99/61 et brevet américain n° 2o979»4-39)« La demanderesse a cherché à mettre au point un procédé industriellement avantageux de production de L-lysine 50 par fermentation, en utilisant des produits prétrochimiques peu coûteux comme source de carbone, et elle a ainsi trouvé qu'une souche du genre Brevibacterium. ou Corynebacterium peut produire une quantité considérable de L-lysine quand elle est cultivée dans un milieu contenant de l'acide benzoïque comme 35 source de carbone et contenant en outre une source d'azote et des sels minéraux, sans aucune exigence en ce qui concerne la présence d'un amino acide» La présente invention découle de cette découverte. Les microorganismes capables de produire la 40 L-lysine utilisés dans la présente invention sont des mutants 2 2137769 " 72 16808 n'exigeant pas ds amino-acides pour léur croissance et qui appartiennent aux genres Brevibacterj-fem ou Corynebacterium» Ces mutants n'exigeant pas d'amfcs-acides pour leur croissance peuvent être obtenus en soumettant les souches de départ à ua 5 traitement de mutation faisant appel à une irradiation par les rayons ultraviolets, par les rayons X ou par les rayons radioactifs ou à un traitement par un agent mutant-, etc„ Par exemple, les souches typiques utilisées dans la présente invention, à savoir Brevibacterium divaricatum HC-615 et Corynebacterium 10 lilium HC-BQ20 ont été obtenues par un traitement de mutation de leurs souches de départ respectives, à savoir Brevibacterium divaricatum NEEL B-2312 et Corynebacterium lilium NEEL B-224-3 avec un agent mutatif, à savoir la N-méthyl-N1 -nitro-N-nitro soguanidine 0 15 Ces mutants ,. à savoir Brevibacterium divari catum HC-615 et Corynebacterium lilium. HC-B020, ont été déposés à l'organisme de dépôt public "Fermentation Eesearch Institute, Agency of Industrial Science and Technology-®1, n° 8-1 Inage, Higashi-5-chrome, Chiba-shi, Chiba-ken (Japon) sous les numé-20 ros matricules respectifs FERM-P n° 928 et FERM-P n° 973 et également à l'organisme American Type Culture Collection,. 12301 Parklawn Drive, Rockville à Maryland (E»U,,A») sous les numéros matricules respectifs ATCC n° 21792 et 21793° En cherchant à élucider le phénomène d'aceumula-25 tion de la L-lysine par des mutants, exigeant des amino-acides, de microorgaaismes producteurs d'acide L-glutamique, on a constaté que la thréonine -et la lysine se conjuguent pour s'opposer à la formation du P=aspartokinase, qui est le premier enzyme important dans les modes de biosynthèse de la lysine» A ce sujet, 30 on a pu constater que l'inhibition se produit difficilement quand l'un quelconque de ces amino-acides est présent en quantité insuffisante» En d'autres termes, quand ladite souche exigeant des amino-acides est cultivée avec un contrôle de la quantité de L-thréonine et qu'il se produit alors un manque de thréonine dans 35 les cellules, l'inhibition relative à la P-aspartokinase peut être supprimée et on constate une production très importante de L-lysine» Toutefois, la souche Brevibacterium divaricatum HC-615 (FERM-P n° 928, ATCC n° 2192) qui est un mutant de 40 Brevibacterium divaricatum NEEL B-2312 et la souche Corynebacte- 72 16808 2137769 10 15 25 30 rium lilium HC-B020 (FERM-P n° 973 i ATCC n° 21793), qui est un mutant de Corynebacterium lilium NRRL B-2243, et qui sont utilisées dans la présente invention, n'ont aucune de ces exigences, concernant les amino-acides pour accumuler la L-lysine. En outre,, ces mutants peuvent accumuler une quantité considérable de L-lysine même quand on les cultive dans un milieu contenant une grande quantité de L-thréonine ou d'autres amino-acides. Les résultats d'une étude faite sur la relation entre des changements dans la concentration de L-thréonine ajoutée et le rendement en L-lysine par les mutants utilisés dans la présente invention sont donnés dans le tableau 1. TABLEAU 1 Relation entre la concentration de la L-thréonine ajoutée et le rendement en L-lysine 20 Quantité de L-thréonine ajoutée (mg/ml) 0 0,1 0,2 0,4 0,5 1,0 2,5 5,0 10,0 Rendement en L-lysine (monochlorhydrate) mg/ml Brevibacterium diva- Corynebacterium lilium ricatum HC-615 (FERM-P n° 928 s ATTC n° 21 792) 20,3 22,1 20,6 21.3 20,8 19.4 20,1 20,3 HC-B020 (FERM-P n° 973 : ATCC n° 21 793) 15,4 15,9 14,8 m 16,7 16,0 15,3 15,7 35 40 Nota : Les résultats apparaissant dans le tableau 1 ont été obtenus de la façon suivante : on a ajouté de la L-thréonine à un milieu ayant la composition donnée ci-dessous, de manière que les concentrations respectives en L-thréonine soient celles qui apparaissent dans le tableau 1, et on a introduit le milieu dans plusieurs flacons à secousses ayant une capacité de 500 ml, àraism de 20 ml par flacon, après quoi on a stérilisé de la manière ordinaire. Ensuite, à l'aide d'une anse en platine, on a inoculé Brevibacterium divaricatum HC-615 (FERM-P n° 928 ; ATCC n° 21 792) ou de Corynebacterium lilium HC-B020 (FERM-P n° 973 î ATCC n° 21 793) dans ce milieu et on a fait incuber à 72 16808 2137769 30°C pendant 72 heures, tout en secouant. Le "bouillon de culture résultant a été soumis à un dosage microbiologique. Composition du milieu : Benzoate d'ammonium (calculé sous 5 forme d'acide benzoïque): 10,0 % (Initialement 1,0 % et, par fractions successives de 1,0 %) KgHPO^ 0,1 % MgS04.7H20 0,05 % 10 :FeS04.7H20 0,0005 % MnS04.4H20 0,0005 % d-biotine 100 Hg/1 Chlorhydrate de thiamine 100 ^g/l 15 Dans le milieu utilisé dans la présente in vention, la source de carbone peut être un acide organique tel que l'acide benzoïque, l'acide acétique, l'acide citrique, etc., ou un hydrate de carbone, mais la L-lysine peut être obtenue avec un rendement élevé quand on utilise de l'acide 20 benzoïque. La source d'azote est constituée par exemple par des composés minéraux ou organiques contenant de l'azote, comme le sulfate d'ammonium, l'urée, le nitrate d'ammonium, le chlorure d'ammonium, l'ammoniaque liquide, etc. En outre, il est désirable, po-yr accumuler une quantité considérable de L-lysine, 25 d'ajouter une quantité appropriée de protéines organiques telles qu'une peptone, un extrait de viande, un extrait de levure, de la liqueur de macération du maïs, un hydrolysat de farine de soja, etc., parce que les souches de la présente invention peuvent accumuler une grande quantité de L-lysine, quelle que soit 30 la concentration en L-thréonine ajoutée. En outre, du phosphate de potassium, des sels de magnésium, des sels de fer et des sels de manganèse sont utilisés en des quantités appropriées à titre de sels minéraux. On exécute la culture dans des conditions 35 aérobies selon les procédés ordinaires dë eilture avec secousses, avec aération - agitation, etc. La température de culture est comprise entre environ 20 et 37°C. Pendant la culture, le pïï est ajusté à environ 5 à 9. Le temps de culture est d'environ 48 à 96 heures et une quantité considérable, de L-lysine est 40 accumulée dans le milieu. 72 16808 5 2137769 Lorsque la culture est achevée, on sépare les cellules du "bouillon de culture résultant par centrifugation et on fait passer le filtrat à travers une colonne d'une résine échangeuse de cations fortement basique sous la forme NH^+ , 5 à savoir le produit Amberlite IR120 (marque de fabrique déposée par Rohm. & Haas Co., EUA) en vue de 1* adsorption. On lave ensuite la résine avec de l'eau et on l'élue avec une solution ammoniacale aqueuse diluée» On recueille une fraction contenant de la L-lysine, on la concentre sous pression réduite pour en 10 éliminer l'ammoniaque et on l'amène au pH 4,0 avec de l'acide chlorhydrique, puis on la concentre de nouveau sous pression réduite, ce qui détermine le dépôt du monochlorhydrate de L-lysine « On comprendra mieux la présente invention à 15 la lecture des exemples non limitatifs qui vont suivre. Exemple 1 On utilise un milieu composé de 1,0 % de benzoate d'ammonium, ' 0,1 % de K^HPO^-» 0,05 % de MgSO^^HgO, 0,0005 % de FeSO^^O, 0,0005 % de MnS04„4H20, 100 Kg/1 20 de d-biotine, 100 Kg/1 de thiamine monochlorhydrate et 0,5 % de liqueur de macération du maïs et on ajuste ce milieu à un pH de 7,0 à 7,5 avec une solution aqueuse d'ammoniaque, puis on introduit ce milieu dans des flacons à secousses ayant une capacité de 500 ml, à raison de 20 ml par flacon, après quoi on stéri-25 lise à 121°C pendant 10 minutes. On inocule le milieu contenu dans les flacons avec 5 % du bouillon de préculture de Corynebacterium lilium HC-B020 (FERM-P n° 973 ; ATCC n° 21 793) obtenu grâce à une culture avec secousses à 30°C, pendant 24 heures, et on le cultive en le secouant à l'aide d'un agitateur 30 animé de 120 mouvements de va-et-vient par minute. On ajoute à ce milieu de l'acide benzoïque à titre de source de carbone, sous la forme de sel d'ammonium, par fractions successives de 1 %, la quantité de cet acide ajoutée 60 heures après le début de la culture étant de 10 % au total (poids/volume). La cultu-35 re est alors terminée. La détermination par dosage microbiologique de la quantité de L-lysine accumulée dans le bouillon de culture lorsque la fermentation est achevée, montre qu'il s'est formé 40,6 g/1 de monochlorhydrate de L-lysine. Lorsque les cellules ont été éliminées du bouillon de culture par centrifu-40 gation, on recueille les cristaux par passage sur une résine 72 16808 6 2137769 échangeuse d'ions, ce qui donne 37,3 g/1 de monochlorhydrate de L-lysine » Exemple 2 Dans un fermenteur d'une capacité de 10 1, 5 on introduit 5 1 d'un milieu ayant la même composition que dans l'exemple 1 et on stérilise par le procédé ordinaire» Ensuite, on inocule le milieu contenu dans le fermenteur avec 5 % d'une solution de préculture de Corynebacterium lilium HC-B020 (îERM-P n° 973 | ATCC n° 21 793 et on cultive à 30°C, tout en agitant 10 à une vitesse de 400 tours par minute et en aérant à une cadence de 0,5 volume par minute» Tout en ajustant le pH à une valeur de 7jO à 8,5? on y ajoute de l'acide benzoïque par fractions successives de 1 % (poids/volume) sous forme de sel d'ammonium, la quantité totale de cet acide ajoutée 48 heures après 15 le début de la culture, étant de 10 % (poids/vol'urne). La culture est alors terminée» On détermine la quantité de L-lysine accumulée dans le bouillon de culture résultant par filtrage mi-crobiologique qui montre qu'on a obtenu 38,8 g/1 de monochlorhydrate de L-lysine» 20 Après avoir retiré les cellules du bouillon de culture par centrifugation, une fraction donnant une réaction positive à la ninhydrine est recueillie par la méthode ordinaire utilisant une résine échangeuse d'ions, on concentre cette fraction sous pression réduite ; et on recueille les cris-25 taux ainsi formés, ce qui donne 35 »4 g/1 de monochlorhydrate de L-lysine» Exemple 3 On prépare un milieu composé de 1,0 °/o de benzoate d'ammonium de 0,1 % de K^HPO^, de 0,05 % de MgSO^. 30 7H20, de 0,0005 % de FeSO^^O, de 0,0005 % de MnS0^»4H20 de 100 Kg/1 de d-biotine , de 100 Kg/1 de monochlorhydrate de thiamine et de 0,5 % de liqueur de macération du maïs et on l'ajuste au pH 7*0 à 7,5 avec une solution aqueuse d'ammoniaque» On introduit le milieu dans des flacons d'une capacité de 500 35 ml, à raison de 20 ml par flacon et on stérilise à 120°C pendant 10 minutes» On inocule le milieu dans les flacons avec 5% d'un bouillon de préculture de Brevibacterium devarieatum HC-615 (FEHM-P n° 928 5 TACC n° 21»792) obtenu par culture avec se-40 cousses à 30°C pendant 24 heures et on cultive en secouant à une 72 16808 7 2137769 vitesse de l'agitateur de 120 tours par minute» On ajoute de l'acide benzoïque à titre de source de carbone, par fractions successives de 1 % (poids/volume) sous la forme d'un sel d'ammonium, la quantité totale de 5 cet acide ajoutée 60 heures après le début de la culture étant de 10 % (poids/volume)o Ensuite, la culture est terminée. La détermination de la quantité de L-lysine accumulée dans le bouillon de culture résultant par dosage microbiologiquë montre qu'une quantité de 45,8 g/1 de chlorhydrate de L-lysine s'est 10 formée. Après avoir séparé les cellules du bouillon de culture résultant par centrifugation, on recueille les cristaux par la méthode ordinaire faisant appel à une résine échangeuse d'ions, ce qui donne 40,3 g de chlorhydrate de L-lysine à partir d'un litre du bouillon de culture» 15 Exemple 4 Dans un fermenteur d'une capacité de 10 1, on introduit 5 1 d'un milieu ayant la même composition que dans l'exemple 3 et on stérilise par le procédé ordinaire.On inocule le milieu avec 5 % d'une solution de préculture de Brevibacte-20 rium divaricatum HC-615 (FEKM-P n° 928 ; ATCC n° 21.,792) et on cultive à 30°C en agitant à une vitesse de 400 tours/minute et en aérant à une cadence de 0,5 volume 9 Tout en ajustant le pH à une valeur de 7,0 à 8,5 on ajoute de l'acide benzoïque sous la forme du sel d'ammonium par fractions successives de 3# 25 (poids/volume) en ajoutant au total 8 % (poids/volume) d'acide benzoïque 48 heures après le début de culture. Ensuite, la culture est terminée. La détermination de la quantité de L-lysine accumulée dans le bouillon de culture résultant par dosage microbiologique montre qu'on a obtenu 42,3 g/1 de monochlorhy-30 drate de L-lysine. Après avoir séparé les cellules du bouillon de culture par centrifugation, on recueille une fraction donnant une réaction positive à la ninhydrine par la méthode ordinaire faisant appel à une résine échangeuse d'ions et on con-35 centre sous pression réduite, ce qui donne des cristaux que l'on recueille, grâce à quoi on obtient 38,0 g/1 de monochlorhydrate de L-lysine. Comme décrit ci-dessus, un produit pétro 72 16808 t 2137769 chimique peu. coûteux, à savoir l'acide "benzoïque, est utilisé dans la présente invention en remplacement des sucres constituant des sources classiques de carbone et, de ce fait, il n'existe pas d'effet défavorable dû à une contamination par des substances étrangères, contrairement à ce qui se passe lorsqu'on utilise des sucres comme sources de carbone et la i-lysine peut être produite à peu de frais et avantageusement à l'échelle industrielle» 72 16808 2137769 REVENDICATIONS lo Procédé de production de L-lysine, caractérisé par le fait qu'il consiste à cultiver en aérobie, un microorganisme producteur de L-lysine, n'exigeant pas d'amino-5 acides pour sa croissance et appartenant au genre Br evib ac t eriua ou Corynebacterium, au sein d'un milieu contenant de l'acide benzoïque comme source de carbone, à former et accumuler la L-lysine dans le milieu et à récuperer la L-lysine dans ce milieu. 10 2. Procédé selon la revendication 1, carac térisé par le fait qu'on utilise un microorganisme du genre Brevibacterium divaricatum ou C oryneb act erium lilium. Procédé selon la revendication 2, caractérisé par le fait que le microorganisme est une souche du 15 genre Brevibacterium divaricatum HC-615 (FERM-P n° 928 ; ATCC n° 21792) ou Corynebacterium lilium HC-B020 (FERM-P n° 973 > ATCC n° 21793). 4. Procédé selon la revendication 1, caractérisé par le fait qu'on utilise l'acide benzoïque sous 20 forme d'un sel d'ammonium. 5« Procédé selon la revendication 1', caractérisé par le fait que le milieu contient 10 % (poids/vol'urne) d'acide benzoïque sous forme de benzoate d'ammonium. 6. Procédé selon la revendication 1, ca-25 ractérisé par le fait que la culture est exécutée à une température de 20 à 37°G et à un pH de 5 à 9 pendant 48 à 96 heures.