FR 2108794 A1 19720526 FR 7035985 A 19701006 70 35935 2108794 La présente invention à la réalisation de laquelle ont participé MM. PESASSE Lucien et BARTHELEMY Pierre, a pour objet un nouveau procédé de préparation d'anâLogues de la vitamine Elle a plus précisément pour objet un procédé de préparation de cobamides com-5 portant un radical hydrocarboné lié à l'atome de cobalt. Ces composés sont désignés ici par le terme "Co-R cobamides", R représentant un radical hydrocarboné. L'a structure de la vitamine B12 est bien connue. C'est une molécule complexe comportant un atome central de cobalt, relié à dif-10 férents groupements dont un groupe cyano, par des liaisons covalentes ou semi-polaires : 70 35985 2 2108794 On connait également de nombreux analogues de la 'vitamine dans lesquels la molécule a été modifiée. Dans le fragment nucléotide, la base (5>6-diméth.yl benzimidazole dans le cas de la vitamine B^) peut par ejgipple être remplacée par une autre base hétérocyclique 5 telle que/5-h.ydry^^b^^^yidazole, le 5-méthoxy benzimidazole, le naphtimidazole,/la 2-méthyladénine, la xanthine, 11hypoxanthine, la 2-méthylhypoxanthine, la guanine. le groupe phosphate peut être lié à différents carbones du fragment ribose. Le fragment isopropylamino peut être remplacé par une autre chaîne alcoylamino. Le fragment 10 nucléotide peut être absent comme dans le cobinamide ou facteur B, ou remplacé par un groupement CN ou OH. Les groupements amides CO-HH^, peuvent être convertis en groupements carboxyliques, qui peuvent être estérifiés ou transformés en d'autres amides. Le groupe cyano peut être remplacé par un groupement tel qu'un 15 radical hydroxyle, un halogène (chloro, bromo, iodo), un groupe sulfito, nitrito,thiocyanato, cyanato, un groupement ÎJH^ ou Histidine ou un radical hydrocarboné, substitué ou non substitué, tel que méthyle ou 5'-désoxy adénosyle. L'atome de cobalt peut être également sous la forme de ses 20 divers isotopes naturels ou artificiels. Tous les composés dont il est fait état ci-dessus, sont décrits dans les ouvrages sur la vitamine B^ et ses analogues ainsi que dans divers documents accessibles au public. Dans la présente demande ces composés sont désignés par le 25 terme général wCo-Y cobamides" ou encore "cobamides Y-substitués?, étant entendu que l'une ou l'autre de ces deux expressions s'applique également dans le cas où les groupes amides de la molécule envisagée, ont été modifiés. Dans ces expressions, Y représente notamment le groupe cyano 30 ou un des groupements mentionnés ci-dessus comme pouvant se substituer à CK. Parmi les "Co-Y cobamides" on doit mentionner tout spécialement les "Co-R cobamides" où R représente un radical.hydrocarboné lié à l'atome de cobalt par une liaison carbone-cobalt. Ces composés déjà 35 décrits dans la littérature, sont doués de propriétés biologiques intéressantes. Les "Co-R cobamides, d'une façon générale et en particulier le "Co-méthyl cobamide" encore appelé méthyl cobalamine, trouvent leur emploi dans l'expérimentation et la thérapeutique 70 35935 3 2108794 liés au métabolisme de la vitamine notamment en ce qui concerne la méthyl cobalamine dans des processus anaboliques liés à la biosynthèse de la méthionine. Ces composé connus sont doués de propriétés biologiques inté-5 ressantes. Les "Co-R cobamides" étaient jusqu'à présent préparés par réduction d'un "Co-T cobamide" notamment d'un hydroxo cobamide (T = OH), puis action d'un agent alcoylant générateur de cations R+ Cette suite de réactions peut être représentée, en considérant la 10 réduction comme tin gain d'électrons (e~), selon le schéma suivant : Co® ^ f \ +2 © N - ^ Co \ R & © R X I ^ Co © ^ î \ © 15 +T § T étant notamment un radical hydroxyle. Un tel procédé est décrit dans le Brevet français n° 1 450 375 et dans le Brevet allemand n° 1 213 842. Le procédé objet de la présente invention repose sur un mécanisme entièrement différent. Alors que les procédés cités plus haut consistent à faire agir sur Tin cobamide réduit, un ion alcoyle chargé positivement, on a découvert que les "Co-R cobamides" peuvent être préparés en faisant agir directement sur le cobamide un ion 20 alcoyle chargé négativement. Ce procédé peut être représenté par le schéma suivant : r Z Cô ^ î \ & Co® î N bZp © 25 Z étant notamment un radical hydroxyle. Ce nouveau procédé permet en particulier de supprimer le stade de réduction du cobamide et conduit à l'obtention de Co-R cobamides avec des rendements élevés. Ce procédé se caractérise en outre par son extrême simplicité. On sait que les générateurs de carbanions R^ notamment les 7 G 35985 4 2108794 dérivés organo-métalliques, ou organo-métalloïdiques, sont très réactifs et susceptibles de réagir sur de nombreux groupes fonctionnels des molécules organiques. Or la vitamine B^^ et ses analogues sont des molécules complexes, comportant un grand nombre de centres 5 susceptibles de réagir avec les dérivés organo-métalliques et les dérivés organo-métalloïdiques. Le procédé de l'invention permet cependant l'alcoylation de l'atome de cobalt des cobamides sans altération des autres centres réactionnels de la molécule, et présente par là un caractère inatten-10 du. Il convient de noter que dans la présente demande, on entend par "alcoylation" de l'atome de cobalt, la réaction de formation d'une liaison cobalt-carbone entre un groupement hydrocarboné et l'atome de cobalt. La présente invention a pour objet un procédé de préparation de 15 cobamides substitués désignés par le terme "Co-R'cobamides", R' représentant un radical alcoyle ou un radical alcoyle substitué par un groupe aryle, un groupe hydroxyle, ou un groupe carboxyle, caractérisé en ce que l'on fait réagir un "Co- Z cobamide" dans lequel Z représente un groupe formateur d'anions, avec un réactif générateur 20 de carbanions R' ®, R' étant défini comme ci-dessus. Le substituant R' est de préférence un radical alcoyle ayant de là 10 atomes de carbone, notamment un radical méthyle, éthyle, propyle, butyle, pentyle, hexyle, heptyle, octyle ou nonyle, éventuellement substitué par un radical hydroxyle ou carboxyle, comme 25 par exemple le radical p-hydroxy éthyle ou le radical carboxyméthyle. R' peut être encore un radical alcoyle ayant de 1 à 4 atomes de carbone substitué par un radical aryle monocyclique, notamment un radical phényle (R' est par exemple un radical benzyle). cyano^10 S1"011!1® ^ est de préférence un radical hydroxyle, sulfito, 30/cyanato, thiocyanato, ou nitrito, un atome d'halogène choisi parmi le chlore, le brome ou l'iode, ou un radical du type 5'-déxoxy adénogyle. Les réactifs générateurs de carbanions R' © , sont choisis parmi ceux qui sont capables de scinder la liaison Co-T sans affec-35 ter les autres groupes fonctionnels de la molécule de cobamide. Ce sont de préférence des composés organo-métalliques ou organo-métalloïdiques, comportant le substituant R' lié à l'atome de métal ou de métalloïde, par une liaison carbone-métal ou métalloïde. Parmi 70 35935 5 2108794 ces dérivés, on peut citer notamment ceux du mercure, du gallium, du thallium, du silicium, du bore, du germanium, de l'étain, du plomb ou du bismuth. Ces dérivés organo-métalliques ou organo-métalloïdiques, peuvent 5 être notamment du type M (R')n, M étant un atome de métal ou de métalloïde, R' étant défini comme ci-dessus, n étant la valence du métal ou du métalloïde dans le composé considéré. Ces dérivés peuvent également être du type mixte, 11atome de métal ou de métalloïde étant 2Lé en outre à un ou plusieurs restes anioniques. Ils se pré-■JO sentent par exemple sous forme d1halogénures, nitrates ou sulfates d1alcoyle métal ou métalloïde. On peut également utiliser les dérivés de coordination que certains composés forment avec l'ammoniac ou avec les aminés, comme par exemple les dérivés du gallium du type (R'Ga.NH^ ou (&' 15 ffa.lî(CH^)^. Dans le cas où l'on utilise un dérivé du mercure, on emploie notamment les dérivés (R')„ Hg, les dérivés mixtes de formule R'HgX, X étant/ d- /par exemple un atome d'halogène,un anion nitrate ou un équivalent sulfate et R' étant défini comme ci-dessus; on citera par exemple 20 les iodures, bromures, ou nitrates de méthyl mercure, d'éthyl mercure, de butyl mercure, les halogénures d'alcoyl mercure dont le radical alcoyle est substitué par un groupe hydroxy, comme le bromure de P-hydroxy éthyl mercure, les halogénures d'aralcoyl mercure, comme l'iodure de benzyl mercure. 25 De façon analogue on peut utiliser les dérivés du gallium du type (R')2, GaX ou R'GaXg ou les dérivés du thallium (R')2 Ï1X et R'T1X2, les dérivés du germanium (R')^ GeX, (R')2 GeX2, R'G-eX^, les dérivés de l'étain tels que R'SnX^, (R')2SnX2, (R')^3aX , etc. R' et X étant définis comme ci-dessus. De nombreux composés de ce type 30 sont décrits dans la littérature, et leurs propriétés sont discutées, par exemple, dans l'ouvrage de ROCHOW et Coll./the chemistry of organometallic compounds, John Wiley et Sons, Inc. New York ( 1957)]. Dans le cas de dérivés du bore, on peut utiliser notamment les trialcoyl-bore. 35 Dans le cas où on utilise des dérivés du silicium, on emploie de préférence les dérivés du type R'SiFçCïïH^Jg ou R'SiPg(lIH^)^ qui peuvent être préparés selon la méthode décrite par R. MULLER et 0oll. 70 35985 6 2108794 98, 241 (196*5). Ainsi, pour préparer/ Chem. Berichte, 98« 235 (1965) et/la Co-méthyl cobalamine, on utilise notamment le méthylpentafluorosilicate d1ammonium ou le méthyl- hexafluorosilicate d'ammonium. La réaction des Co-cobamides avec les réactifs générateurs de 5 carbanions R' ^ peut être effectuée, soit en solution, soit en suspension. Les solvants des cobamides sont principalement l'eau et les alcanols inférieurs, notamment le méthanol et l'éthanol. Lorsqu'on désire opérer la sélection il est donc nécessaire de choisir un 10 réactif générateur de carbanions,soluble dans l'eau, ou dans les alcanols, et qui ne réagisse pas avec ces solvants. On peut citer comme exemple de tels réactifs les halogénures d'alcoyl mercure, les dérivés du type R'SiF^(KH^)2 ou R'SiFg(îiH^)^, les dérivés du type (R'Jg Ï1X ou R'TIX^, les dérivés du type ? 15 ^x^nX4-x étant un atome d'halogène, x étant un nombre entier ; égal à 1, 2 ou 3. Lorsqu'on désire effectuer la réaction en suspension, on opère au sein d'un solvant inerte vis-à-vis des produits réactionnels, et plus particulièrement un solvant dans lequel le réactif organo-20 métallique ou organo-métalloïdique est soluble et le cobamide n'est pas soluble, comme par exemple l'hexane, le xylène, ou le chlorure de méthylène. Lorsque le réactif organo-métallique ou organo-métalloïdique est facilement oxydable, on effectue la réaction sous atmosphère 25 d'un gaz inerte, comme l'azote. Le choix de la température de réaction dépend principalement de la réactivité du réactif générateur de carbanions et de sa stabilité thermique. On peut donc être amené selon les cas soit à refroidir, soit à chauffer le mélange réactionnel. On effectue de préférence la 30 réaction entre 0 et 100°C environ. L'isolement des Co-R' cobamides obtenus selon le procédé de l'invention est effectué selon les méthodes usuelles utilisées dans la chimie de la vitamine B^» et de ses analogues. On peut opérer par exemple par chromatographie sur des colonnes garnies de cellulose 35 ou de celluloses modifiées, telles que la carboxyméthylcellulose ou la diéthylamj.noéthylcellulose, par extraction des solutions aqueuses au moyen du phénol ou d'un mélange de phénol et d'un solvant chloré, 70 35985 7 2108794 par précipitation des solutions aqueuses au moyen de l'acétone ou d'autres solvants organiques. Par ailleurs les cobamides étant généralement altérables par la lumière, de même que certains organo-métalliques ou organo-métal-5 loïdiques, il est recommandé d'effectuer la réaction et les opérations d'extraction ou d'isolement, à l'abri de la lumière du jour, ou en lumière atténuée. Les exemples suivants il lustrent l'invention, sans toutefois la limiter. 10 Exemple I : Préparation de la méthyl eob«laminé (ou méthyl 5,6-diméthyl benzimidazole cobamide) On dissout 8 g d'hydroxo cobalamine dans 1 litre de méthanol, puis ajoute 1,4 g d'iode. On porte le mélange à 65°C pendant trois heures. 15 A la solution d'iodo cobalamine ainsi obtenue, on ajoute 50 g d'iodure de méthyl mercure. On maintient le mélange pendant trois heures à 65°C, puis évapore à sec sous pression réduite. Le résidu est lavé à l'acétone, séché, et repris par 250 cm3 d'eau. On élimine la fraction insoluble par filtration. La solution 20 aqueuse est ensuite passée à travers une colonne de diéthylaminoéthyl-cellulose, puis à travers une colonne de carboxyméthylcellulose, afin d'éliminer des impuretés et le produit de départ n'ayant pas réagi. Après lavage des colonnes à l'eau, on réunit les solutions aqueuses, les concentre jusqu'à un volume de 180 cm3 environ. On 25 ajoute 1 800 cm3 d'acétone et laisse reposer pendant une nuit à température ambiante. Le précipité formé est séparé par filtration et séché. On obtient 1,81 g de méthyl cobalamine solvatée avec de l'eau. On récupère dans la colonne de carboxyméthylcellulose 2,87 g de 30 produit de départ, sous forme d'hydroxo cobalamine. En opérant comme ci-dessus, mais en utilisant l'iodure d'éthyl mercure ou le bromure de p-hydroxy éthyl mercure, on obtient respectivement la Co-éthyl cobalamine et la Co-p-hydroxy éthyl cobalamine. 35 Exemple II : Préparation de la méthyl cobalamine On dissout 5 g d'hydroxo cobalamine hydratée (correspondant à 3,9 g de produit anhydre) dans 250 cm3 d'eau et ajoute 5 g de méthylhexafluorosilicate d'ammonium. 4 8 2108794 70 35985 On maintient le mélange pendant deux heures à 50°C, en agitant, puis refroidit à température ambiante. On extrait par 300 cm3 d'un mélange phéno 1-dichloroét hane (1/3). On ajoute alors lentement, en agitant, 625 cm3 d'acétone, puis 5 22 cm3 d'eau. On poursuit l'agitation pendant une heure puis isole le précipité par filtration, et le sèche sous pression réduite. On obtient 4 g de méthyl cobalamine brute. On dissout 3,5 g de produit brut dans 200 cm3 d'un mélange eau-acétone (1/1) puis ajoute lentement 900 cm3 d'acétone, on laisse 10 reposer pendant une nuit à température ambiante, puis isole par filtration le précipité cristallin obtenu et le sèche sous pression réduite. On obtient 3,43 g de méthyl cobalamine hydratée à 3,3 soit 3»32 g de produit anhydre. Exemple III 15 On dissout 100 mg de 5'-désoxy adénosyle 5,6-diméthyl benzimidazole cobamide dans 5 cm3 d'eau et ajoute 100 mg de méthyl-hexafluoro silicate d'ammonium. On maintient le mélange pendant deux heures à 50°C en agitant puis refroidit à température ambiante. 20 On obtient une solution de méthyl cobalamine, qu'on purifie par chromatographie (Cf exemple 1). 70 35985 2108794 REVENDICATIONS 1) Procédé de préparation de cobamides substitués désignés par le terme "Co-R1 cobamidesyR' représentant un radical alcoyle ou un radical alcoyle substitué par un groupe aryle, un groupe 5 hydroxyle ou un groupe carboxyle, caractérisé en ce que l'on fait réagir un "Co-Z cobamide" dans lequel Z représente un groupe formateur d'anions, avec un dérivé organo métallique ou organo mé-talloi'dique générateur de carbanions R' ® , R' étant défini comme ci-dessus, ledit dérivé étant choisi dans le groupe constitué par 10 les dérivés du mercure, du gallium, du thallium, du silicium, du bore, du germanium, de l'étain, du plomb et du bismuth. 2) Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que Z représente un radical hydroxyle, sulfito, cyano, cyanato, thiocyanato, ou nitrito, un atome d'halogène choisi parmi le chlore, 15 le brome ou l'iode ou un radical du type 5'-désoxy adénosyle. 3) Procédé selon la revendication 1 ou la revendication 2, caractérisé en ce que le composé organo-métallique ou organo-métalloïdique est un dérivé du mercure, du silicium ou du bore. 4) Procédé selon la revendication 3, caractérisé en ce que le 20 dérivé organo-métallique est un dérivé du mercure de formule S' Hg X, X représentant un atome d'halogène et R' étant défini comme dans la revendication 1. 5) Procédé selon la revendication 3, caractérisé en ce que le dérivé organo-métalloïdique est un dérivé du silicium de formule 25 R' SiP^ (ïIH^g» ou 1111 dérivé du silicium de formule R' SiPg (NH^)^, R' étant défini comme dans la revendication 1. 6) Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 5, pour la préparation d'un "Co-méthyl cobamide", caractérisé en ce que R' représente le radical méthyle. 30 7) Procédé de préparation de la méthyl cobalamine, caractérisé en ce que l'on fait réagir l'iodo-cobalamine ou l'hydroxo cobalamine avec l'iodure de méthyl mercure. 8) Procédé selon la revendication 7, caractérisé en ce que la réaction est effectuée en solution dans le méthanol. 35 9) Procédé de préparation de la méthyl cobalamine, caractérisé en ce que l'on fait réagir l'hydroxo■cobalamine ou le 5'-désoxy adénosyle 5,6-diméthyl benzimidazole cobamide avec le méthylhexa-fluorosilicate d'ammonium. ? /s 2108794 70 35985 10) Procédé selon la revendication 9» caractérisé en ce que la réaction est effectuée en solution dans l'eau.