FR 2133660 A1 19721201 FR 7212910 A 19720413 72 12910 2133660 La présente invention concerne un procédé de préparation de L-histidine par fermentation à l'échelle industrielle,, Plus particulièrement l'invention concerne un procédé de préparation de 1-histidine par fermentation dans lequel on cultive un. microorganisme capable de produire la L-histidine dans un milieu contenant une source de carbone, une source d'azote, des sels minéraux et d'autres éléments nutritifs et qui est caractérisé par la présence dans le milieu de culture d'un agent inhibant la prolifération» On peut produire et accumuler la 1-histidine à des concentrations élevées et avec de bons rendements, ce qui permet sa préparation industrielle d'une manière économique. La production industrielle de la L-histidine est importante car elle a diverses utilisations par exemple comme additif, dans des médicaments, des aliments pour l'homme et les animaux, etc,,.. On peut produire et accumuler des quantités importantes de 1-histidine avec de meilleurs rendements et des concentrations plus élevées en ajoutant au milieu de culture un agent inhibant la prolifération, lorsqu'on produit la L-histidine par fermentation d'un micro-organisme en produisant„ L'invention repose sur la découverte qu'on peut préparer la L-histidine avec un meilleur rendement et une concentration plus élevée en ajoutant au milieu de culture un agent inhibant la prolifération de façon à inhiber la prolifération du micro-organisme utilisé, De plus, l'addition de l'agent inhibant la prolifération constitue un avantage économique car elle permet d'empêcher la contamination par d'autres micro-organismes indésirables.» On a utilisé de façon classique un agent inhibant la prolifération dans le cadre de la préparation de l'acide 1-glutamique par fermentation, mais son emploi n'a jamais été signalé dans l'art dans le cas de la préparation de la L-histidine par fermentation. Dans le cas de la préparation par fermentation de ltacide L-glutamique, on doit utiliser l'agent inhibant la prolifération en présence d'un excès de biotine qui n'est pas-capable de former de l'acide L-glutamique, de façon, à produire de l'acide L-glutamique. Au contraire dans le cas de la préparation par fermentation de la L-histidine, la quantité de L-histidine produite augmente nettement lorsqu'on ajoute l'agent inhibant la prolifération,dans des conditions permettant la production de L-histidine. Cette différence est également très significative du point de vue biochimique. 72 12910 -2- 2133660 Selon un mode de mise en oeuvre particulier de l'invention, on ensemence avec une culture d'un micro-organisme capable de produire de la L-histidine, un milieu de culture principal contenant des quantités appropriées de source de carbone, de source d'azote, 5 de sels minéraux et, si on le désire, d'autres éléments nutritifs, et on cultive en conditions aérobies à une température de 25 à 35°0 et à un pK de 5 à 8 pendant 24 heures au plus. Ensuite, on ajoute au milieu une quantité appropriée de l'agent inhibant la prolifération et on poursuit la culture dans les mêmes conditions 10 qu'avant, si ce n'est que la durée de culture est de 48 à 72 heures, de façon à obtenir et à accumuler dans le milieu une quantité importante de L-histidine„ Les micro-organismes produisant la L-histidine qu'on peut utiliser dans l'invention sont par exemple ceux appartenant aux gen-.15 res Brevibacteriurn, Corynebacterium, Arthrobacter, Micrococcus, Bacillus, Nocardia et similaires, bien qu'on puisse utiliser toute autre souche capable de produire de la L-histidine quelle que soit sa classification taxonomique. Ces micro-organismes tels que DT-2 031 307 sont bien connus de l'homme de l'art comme produc-20 teurs de L-histidine „ Toutes les souches figurant ci-après sont déposées à 1'American Type Culture Collection et sont à la libre disposition du public« Les agents inhibant la prolifération, qu'on peut utiliser dans 25 l'invention sont de façon générale toutes les substances ayant des propriétés antibiotiques telles que les antibiotiques,les agents tensio-actifs, ainsi que divers inhibiteurs organiques et minéraux„ Des exemples d'antibiotiques préférés sont la pénicilline,la streptomycine, la céphalqsporine, la cycloserine, le chloramphéni-30 col, l'érythromycine, la tétracycline, la bacitracine, la kana- mycine, la spiramycine, la viomycine, la novobiocine, la eolisti-ne, etc.. Des exemples d'agents tensio-actifs préférés sont des agents tensio-actif s anioniques tels que d-es sulfates d'alkyles, -, des sulfonates d!alkylaryles, des phosphates d'alkyles,- des sulfo- 35 nates d'amides, des sitlfonates d ' esters .et. des sulfates d'amides; - ; des agents 'tensio-actifs cationiques tels que des aminés et leurs sels, des sels d'ammonium quaternaire, des sels de pyridinium, e^ des sels de picolinium; des agents tensio-actifs amphotères des types bétaxne, ester d'acide sulfurique et acide sulfonique; et des agents tensio-actifs non ioniaues tels qu'un alkyléther de 40 72 12910 -3- 2133660 polyoxyéthylène, un. alkylphénoléther de polyoxyéthylène, un alkyl-ester de polyoxyéthylène, un alkylester de sorbitane, un alkylester de polyoxyéthylènesorbitane, un glycol-ester de polyoxyéthylène et un glycoléther de polyoxyéthylène, etc.., 5 Des exemples d'agents inhibiteurs organiques et minéraux pré férés sont le chlorure mercurique, l'acrinol, le résorcinol, le crésol, etc... Parmi ces agents la pénicilline et les agents tensio-actifs non ioniques sont particulièrement utiles pour la mise en oeuvre 10 de l'invention. On entend ici par "pénicilline" la pénicilline G-, l'o Les conditions dans lesquelles on fait application de l'agent 15 inhibant la prolifération selon l'invention sont très importantes et également très intéressantes du point de vue biochimique. Dans le cas' où on utilise un agent inhibant la prolifération ayant une activité importante, on a avantage à l'ajouter dans le dernier stade de la croissance logarithmique de la souche utilisée. En 20 particulier dans le cas où on utilise une souche produisant de la L-histidine qu'on a obtenue à partir d'une souche produisant de l'acide L-glutamique par mutation induite, comme illustré dans les exemples, l'addition dans un stade précoce de la croissance logarithmique se traduit par la production d'une quantité relative-25 ment importante d'acide L-glutamique tandis que lorsqu'on réalise l'addition dans un stade tardif de la croissance logarithmique de la souche utilisée, on obtient des quantités importantes de L-histidine sans production d'acide L-glutamique. La quantité ajoutée ;de l'ageht inhibant la prolifération à ac-30 tivité importante, est de préférence comprise entre 1 et 100 y/™! et de préférence entre 1 et 50 y/ml de milieu.7 Par contre, on peut ajouter les agents tensio-actifs non ioniques qui ont.m effet inhibiteur moindre, à un stade plus précoce de la croissance logarithmique de la souche utilisée, de préférence à raison de 100 35 à 2 000 y /ml de milieu. On peut recueillir la L-histidine accumulée dans le liquide de culture selon un procédé classique, par exemple par chroiûatogi-aphie sur une résine échangeuse d'ions. 72 12910 -4- 2133660 Le tableau 1 suivant montre les résultats expérimentaux obtenus avec et sans addition de sel dé potassium de pénicilline G, comme agent inhibant la prolifération. L'avantage technique de l'invention apparaît nettement» TABLEAU 1 Sel de potassium de la pénicilline G Poids des L-histidine Quantité de cellules . L-histidine sèches produite 10 Temps d'addition Quantité ajoutée heures r/mi mg/ml mg/ml mg/mg de cellules 15 5 40,9 7,14 0,175 18 10 37,4 10,62 0,284 Pas d'addition 50,1 5,70 0,114' Nota du tableau 1 : 15 Souche : Il s'agit d'une souche de Corynebacterium glutamicum produisant de la L-histidine, déposée sous le numéro F E R M 900 (ATCC 21 604). On prépare la cul tiare d'ensemencement comme décrit " dans l'exemple 1 ci-après. . Composition du milieu : saccharose 20 ?o, phosphate monopotas-20 sique 0,2 phosphate dipotassique 0,1 fot sulfate de magnésium heptahydraté 0,05 sulfate ferreux heptahydraté 0,001 %, sulfate de manganèse tétrahydraté 0,001 fa, infusion de maïs 0,5 "A, biotine 200 y/l, sulfate d'ammonium 2,0 fo et urée 0,2 Culture principale : on conduit la culture principale comme 25 dans l'exemple 2 ci-après . Comme le montrent les résultats ci-dessus, la formation et l'accumulation de la L-liistidine augmentent nettement lorsqu'on ajoute au liquide de culture tm agent inhibant la prolifération. L'invention sera mieux comprise à la lecture de la description 30 détaillée qui suit de quelques exemples non limitatifs illustrant des modes de mise en oeuvre de l'invention» EXEMPLE 1 l) Souche : souche de Corynebacterium glutamicum produisant de la L-histidine, déposée sous le numéro ? E R M 900 ( ATCC 21 604)» 35 (II) Culture d'ensemencement : 20 ml d'un milieu constitué de 4 i° de glucose, 2 de peptone, 1 $ d'extrait de boeuf, 0,5 fa 72 12910 -5- 2133660 d'extrait de levure, 0,05 de sulfate de magnésium heptahydraté, 0,15 f de phosphate monopotassique, 0,05$ de phosphate dipotassique, 30 y/l de biotine et 0,3 f d'urée, dont on a ajusté le pH à 7,2, sont introduits dans un Erlenmeyer de 250 ml et stérilisés par chauffage. On ensemence le Milieu avec la souche et on cultive pendant 24 heures à 28°C en agitant. III) Culture principale : 40 ml d'un milieu constitué de 20fo de saccharose, 0,2 fo de phosphate monopotassique, 0,1 fo 'de phosphate dipotassique, 0,05- f> de sulfate de magnésium heptahydraté, 0,001 fa de sulfate ferreux heptahydraté, 0,001 f> de sulfate de manganèse tétrahydraté, 0,5 f° d'infusion de maïs, 200 y/l de biotine, 2 fo de sulfate d'ammonium et 0,2 fa d'urée, dont on a ajusté le pH à 7,2 ,sont introduits dans un flacon de Sakaguchi et on stérilise par chauffage, puis on ensemence avec 2 ml de la culture d'ensemencement. Après 24 heures de culture à 28°C en agitant,on ajoute à des fractions de la liqueur de culture diverses fractions d'antibiotiques et d'inhibiteurs organiques et minéraux à des concentrations diverses qu'on a préparées stérilement, et qui figurent dans le tableau 2. On cultive ensuite chaque fraction pendant 48 heures en agitant. Les quantités dé L-histidine accumulées dans les liquides de culture respectifs correspondant aux divers inhibiteurs figurent dans le tableau 2. 72 12910 -6- 2133660 TAB LEAU 2 Additifs Quantité ajoutée (y/ml) Poids de cellules sèches (mg/ml) L-histidine (mg/ml) Sel de potassium de la pénicilline G- 2,5 17,4 6,94 n 5 16,3 7,08 tt 10 15,2 7,98 Antibiotiques Cycloserine 10 20 18,7 15,9 7,01 6,82 Céphal osporine 10 16,8 7,11 20 15,7 6,63 Streptomycine 5 10 16,2 15,1 5,38 5,55 Inhibiteur Chlorure mer- numéral curique 2 14,0 4,90 Inhibiteur Acrinol 2 14,2 5,00 organique Néant 21,1 4,55 EXEMPLE 2 :- I) Souche : souche semblable à celle utilisée dans l'exemple 1. II) Culture d'ensemencement : on introduit 300 ml d'un milieu semblable à celui décrit dans l'exemple 1 dans un flacon conique de 2 litres et on stérilise par chauffage. On ensemence le milieu avec la souche et oi^ultive pendant 24 heures à 28°C en agitant. 72 12910 -7- 2133660 10 15 III) Culture principale : on introduit 3 litres d'-un milieu semblable à celui décrit dans l'exemple 1 dans une jarre de fermentation de 5 litres et on stérilise par chauffage. On ensemence avec 300 ml du milieu de culture d'ensemencement et on cultive à 28°C à pH 6,8 en agitant à 650 trs/mn et en aérant» Ensuite, on ajoute à des fractions de culture principale, à divers stades'de" culture comme indiqué dans le tableau 3, 10 y/ml de sel de potassium de la pénicilline G- qu'on a préparée séparément, de façon stérile. On cultive à nouveau chaque fraction pendant 48 à 72 heures dans les mêmes conditions que ci-dessus en agitant e|t en aérant. Les quantités de L-histidine et d'acide L-glutamique accumulées dans les cultures respectives figurent dans le tableau 3» T A BLE A U Addition de sel de potassium de pénicilline G Temps d'addition (heures) Quantité ajoutée (y/ml) Poids des cellules sèches (mg/ml) L-histi- dine (mg/ml) Acide L- glutamique (mg/ml) 20 9 10 20,2 4,6 27,5 1 5 . 10 24,3 6,2 ■ 23,2 20 10 42,1 9,3 0,5 néant 52,2 6,0 0 •RTOdPLE 3 î- On réalise un traitement semblable à celui dé-2 5 crit dans l'exemple 1, si ce n'est qu'on utilise comme souche Brevibacterium fiavum F E El 901 (ATCC 21605) et que les divers agents tensio-actifs figurant dans le tableau 4 sont ajoutés _ aux fractions 'de milieu de culture pour réaliser l'inhibition» Les quantités de L-histidine ainsi obtenues dans ces fractions 30 figurent dans le tableau 4. 72 12910 -8- 2133660 ÏABLEAÏÏ 4 Agents tensio- Quantité Poids des L-histi- * actifs ajoutée cellules sèches dine (y/ml) ( mg/ml) (mg/ml Nimine S-215 100 13,4 5,2 Catio- Cation Mg-lOO 100 11,9 . 5,7 nique Cation AB 100 12,1 5,1 Anio- Diapon T 10 10,5 5,0 nique Ampho- Anon BF 100 11,5 5,3 tère ■ Non OP-85-R 1000 21,0 7,1 ionique Néant 22,1 4,!. Nota du tableau 4 : 15 s fabriqués par Nippon Yushi Kabushiki Kaisha Nimine S-215 : Polyoxyéthylènealkylamine. Cation M^-lOO : Chlorure d1alkyldiméthylbenzylammonium Cation AB : Halogénure d'alkyltriméthylammonium Diapon T : Sulfonate de l'amide oléylique 20 Anon BP : Alkylbétaïne 0P-85-R : Trioléate de sorbitane EXMPLE_4 : G3n conduit un traitement similaire à celui décrit dans l'exemple 1 si ce n'est qu'on utilise diverses souches produisant 25 de la L-histidine figurant dans le tableau 5 et qu'on ajoute 10 y/txlL de sel de potassium de la pénicilline G. Les quantités de L-histidine accumulées figurent dans le tableau 5- 72 12910 -9- 2133660 T_A_B_L_ J_A_U 5 L-histidine mg/ml Avec addition de pénicilline Sans addition de pénicilline Souche utilisée Corynebacterium glutamicum FEBM 902 (ATCC 21607) 7,13 4j60 Brevibacterium flavum FEEM 901 (ATCC 21605) 6,61 4,51 Arthrobacter citreus FERM 898 (ATCC 21600)- 2,41 1,53 Bacillus megaterium FEBM 899 (ATCC 21603) 3,20 2,05 Comme le montrent les exemples ci-dessus, l'addition d'agents inhibant la prolifération augmente nettement le rendement en L-histidine0 15 Bien entendu, l'invention n'est nullement limitée aux exemples décrits et représentés; elle est susceptible de nombreuses variantes accessibles à l'homme de l'art suivant les applications envisagées et sans qu'on s'écarte pour cela de l'esprit de l'invention. / 72 12910 -10- 2133660 - REVENDICATIONS - 1.- Procédé de préparation de la L-histidine par fermentation à partir d'un micro-organisme capable de produire de la L-histidine, en cultivant le micro-organisme dans un milieu contenant des sources de carbone et d'azote et des sels minéraux, caractérisé 5 en ce qu'on ajoute une quantité efficace d'un agent inhibant la prolifération de façon à augmenter le rendement en L-histidine» 2o- Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'on choisit le micro-organisme parmi les genres Brevibacterium, Corynebacterium, Arthrobacter, Bacillus, Micrococcus et Nocardia. 10 3»- Procédé selon la revendication 2, caractérisé en ce qu'on choisit le micro-organisme parmi les genres Brevibacterium flavum Corynebacterium glutamicum, Arthrobacter citreus et Bacillus megaterium. 4o- Procédé selon la revendication 3, caractérisé en ce qu'on 15 choisit le micro-organisme parmi Brevibacterium flavum ATCC 21605» Corynebacterium glutamicum ATCC 21604 et ATCC 21607, Arthrobacter citreus ATCC 21600 et Bacillus megaterium ATCC 21603» 5.- Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 4, caractérisé en ce qu'on conduit la culture en conditions aérobies 20 à une température comprise entre 25 et 35°C et à un pH de 5 à 8 pendant 48 à 96 heures. 6.- Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 5, caractérisé en ce qu'on ajoute au milieu l'agent inhibant la prolifération dans les 24 heures qui suivent le début de la culture. 25 7o- Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 6, caractérisé en ce qu'on choisit l'agent inhibant la prolifération parmi les antibiotiques, les agents tensio-actifs et les inhibiteurs organiques et minéraux. 8.- Procédé selon la revendication 7, caractérisé en ce que 30 l'agent inhibant la prolifération est un antibiotique choisi parmi la pénicilline ,1a streptomycine, la céphalosporine, la cycloséri-ne, le chloramphénicol, l'érythromycine, la tétracycline, la bacitracine, la Icanamycine, la spiramycine, la viomycine, la novo-biocine et la colistine. 35 9»- Procédé selon la revendication 7, caractérisé en ce que l'agent inhibant la prolifération est un agent tensio-actif choisi parmi le groupe constitué par les sulfates d'alkyles, les sulfona-tes d'alkylaryles, les phosphates d'alkyles, les sulionates d'ami- 72 12910 2133660 des, les sulfonateu d'esters ,les sulfates d'amides, les aminés et leurs sels, les sels d'ammonium quaternaire, les sels de pyri-dinium, les sels de picolinium, les agents tensio-actifs amphotè-res de type bétaïne, de type ester sulfurique et de type acide 5 sulfonique, les agents tensio-actifs de type alkyléther de polyoxyéthylène, alkylphénoléther de polyoxyéthylène, alkylester de polyoxyéthylène, alkylester de sorbitane, alkylester de polyoxy-éthylène-sorbitane, glycolester de polyoxyéthylène et glycoléther de polyoxyéthylène. 10 10.- Procédé selon la revendication 7, caractérisé'en ce que l'agent inhibant la prolifération est un agent organique ou minéral choisi parmi le chlorure mercurique, l'acrinol,'le résorcinol et le crésol. 11.- Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que 15 l'agent inhibant la prolifération est présent dans le milieu à une concentration ne dépassant pas 2000 y/ml. 12.- Procédé de préparation de la L-histidine par fermentation utilisant lin micro-organisme choisi parmi Brevibacterium flavum ATCC 21605, Corynebacterium glutamicum ATCC 21604 et ATCC 21607, 20 Arthrobacter citreus ATCC 21600 et Bacillus megaterium ATCC 21603 dans lequel on cultive le micro-organisme dans un milieu contenant des sources de carbone, des sources d'azote et des sels minéraux en conditions aérobies, à une température de 25 a 35°C et à un pH de 5 à 8 pendant 48 à 96 heures, caractérisé en ce qu'il consiste 2 5 à ajouter au milieu un agent inhibant la prolifération, à une concentration au plus égale à 2 000 y/ml de milieu, dans les 24 heures suivant le début de la culture, cet agent étant choisi parmi la pénicilline, la streptomycine, la céphalosporine, la cycloséri-ne, le chloramphénicol, l'érythromycine, la tétracycline, la 30 bacitracine, la kanamycine, la spiramycine, la vlomyclne, la novo-biocine, la colistine, les sulfates d'alkyles, les sulfonates d'alkylaryles, les phosphates d'alkyles, les sulfates d'amides,les aminés-et leurs sels, les sels d'ammonium quaternaire, les sels de pyrldinium, les sels de picolinium, les agents tensio-actifs 35 amphotères de type bétaïne, de type ester sulfurique et de type acide sulfonique, les composés de type alkyléther de polyoxyéthylène, alkylphénoléther de polyoxyéthylène, alkylester de polyoxy- 72 12910 12 2133660 éthylène, alkylester de sorbitane, alkylester de polyoxyéthylène-sorbitane, glycolester de polyoxyétliylène ,glycoléther de polyoxyéthylène, le chlorure mercurique, l'acrinol, le résorcinol et le crésol de façon à augmenter le rendement en L-histidine.