FR 2112249 A1 19720616 FR 7124518 A 19710705 71 24518 2112249 L'invention concerne un procédé de préparation d'un vaccin vivant très atténué contre la rubéole, ce vaccin étant non seulement nouveau et efficace mais aussi plus atténué, c'est-à-dire ayant moins d'effets secondaires, que ceux connus jusqu'à mainte-5 nant. La rubéole est une maladie infectieuse qui ressemble à la rougeoie et qui est provoquée par une infection du virus de la rubéole; la maladie est .-araetérisée par une légère fièvre, des éruptions sur la peau et un§A.ymphadénopathie qui se manifestent 10 après une période d'incubation de quelques semaines. Tandis que cette maladie ne présente pas de symptômes sérieux quand il s'agit d'enfants et de nourrissons, elle est bien plus sévère pour les adultes et est accompagnée d'arthrite, arthralgie ou maladie semblable. En particulier lorsque des femmes enceintes souffrent de 15 cette maladie à un stade prépose de la grossesse, l'infection s'étend au-delà du placenta au foetus, et provoque chez le nouveau-né un syndrome congénital de la rubéole, et provoque à un degré élevé des phénomènes comme des cataractesP des défaillances du coeur congénitales, et des difficultés d'audition. C%st pour 20 cette raison que les médecins cherchent à développer des mesures de contrôle efficaces de la rubéole0 Il est inutile de dire que l'on essaye de contrôler la rubéole par tous les moyens et une possibilité de vaccination contre la rubéole a été recherchée depuis la découverte du virus de 25 la rubéole par Weller et autres et Parkman et autres en 1962. Ces recherches cnb eu peur résultat que l'on a trouvé que le virus de la rubéole peut être atténué par des passages répétés dans une culture du tissu contenant un certain nombre de cellules de mammifères ou de cellules d'embryon de volaille, jusqusà un degré de 30 virulence qui permet d'inceuler aux êtres ces virus sous forme vivante atténuée, et qu'il immunise les personnes vaccinées sans effets secondaires. Qjû a démontre par expérience clinique que lorsqu'on inocule un va ;-;-in atténué vivant de la rubéole à des nourrissons 35 et des enfants, la répense de 1'anti-corps correspondant peut être obtenue sans accompagnement de réactions cliniques fâcheuses, et aussi que ceux qui ont acquis l'anticorps peuvent être protégés contre la rubéole0 Quelquefois on prélève le virus de la rubéole de la gorge des personnes vaccinées, mais on sait qu'on n'a jamais 40 constaté l'infection par contact sur des enfants et adultes pré 71 24518 a 2112249 disposés, vivant dans l'entourage. D'autre part, toutefois, ona observé après inoculation de vaccins vivants atténués contre la rubéole connus jusqu'à maintenant;, et en particulier aux femmes étant en âge de reproduction, 5 des réactions différentes de celles du nourrisson et d'enfant, et on a souvent constaté des symptômes répondant à ceux de la rubéole tels que fièvre s malaise, éruption de la peau, arthrite, anthralgie et semblables» C'est la raison pour laquelle il reste toujours le difficile problème à résoudre concernant l'inoculation de vaccins 10 vivants atténués contre le viras de la rubéole aux adultes prédisposés. De plus on ne sait pas si le vaccin connu est entièrement dépourvu de caractère tératogène ou de toxicité foetale pour la progéniture lorsqu'il est inoculé aux femmes enceintes. 15 La demanderesse a maintenant trouvé que lorsqu'on soumet le virus de la rubéole à des passages dans une culture de tissu contenant des cellules primaires du rein du cochon d'inde, le virus de la rubécle peut être rapidement atténué avec la progression des passages. Par le procédé d'atténuation du virus de 20 la rubéole dans ladite culture du tissu, la demanderesse a fini par obtenir un vaccin contre le virus de la rubéole très atténué, qui ne présente pa3 d'effets secondaires non désirés à l'égard des adultes humains tels que mentionnés ci=dessus0 L5objet principal de la présente invention est d'of-25 frir un procédé de préparation de vaccin de virus de la rubéole vivant et très atténué, nouveau e+ efficace, et à des frais économiquement réalisables. TJn autre cbjet de la présente invention est d'obtenir un vaccin vivant contre le virus de la rubéole très atténué nouveau 30 et efficace et qui ne présente pas après la vaeeination les symptômes ressemblant à la rubéole, ni un caractère tératogène ou une toxicité foetale qu'en a trouvé difficile à Jliminer entièrement des vaccins contre le viras de la rubéole connus jusqu'à maintenant. 35 On a obtenu la réalisation des buts précités en sou mettant les virus de la rubéole à au moins dix passages dans une culture de ti3su contenant des cellules primaires du rein du cochon d'inde jusqu'à obtenir une atténuation suffisante. Conformément au procédé de l'invention on peut utili-40 ser n'importe quelle souche de virus de la rubéole comme virus de 71 24518 3 2112249 départ. On peut citer à titre d'exemple quelques souches de virus de la rubéole telles que To-336, Yo-25, M-33, Ko-1 , Brown, No-1 et. similaires* Parmi les souches de virus de la rubéole utilisées par la demanderesse.* en peut citer avantageusement le virus de la 5 rubéole scuohe To-336, qui a été utilisé dans le présent procédé pour obtenir un vaccin très atténué contre le virus de la rubéole,, On a Isolé la souche du virus To-336 à partir d'un prélèvement de la gorge d'une fille souffrant d'une rougeole bénigne au Japon et dent une culture secondaire a été déposée à l'American 10 Type Culture Collection, Maryland U.SoA0 enregistrée sous le n° ATCC-VR-553. les cellules primaires du rein du cochon d'inde que l'on utilise dans le procédé de la présente invention peuvent être préparées de façon connue en soi. On inocule le virus de la rubéole 15 à une culture de tissu qui contient lesdites cellules dans toi milieu convenant à la culture du tissu, et on fait incuber de façon stationnaire eu rotative pendant environ 5 à 10 jours (habituellement environ une semaine)» On réalise l'intubation en pratique à une tempérai-vre allant d- 28 'C à environ 36°C, avantageusement: 20 entre 29°C et 32rC» Le virus ainsi reproduit est ensuite inoculé à une nouvelle culture de tissu contenant lesdites cellules pour le passage suivant;, +e". quel ru après dilution convenable. Si on continue à répéter de tels passages, l'atténuation du virus de la rubéole progresse rapidement. 25 On peut citer comme milieu de tissu que l'on peut utiliser, par exemple la solution de Han&s, la solution de Earle, la solution de Gey, le milieu TC 199« Ie milieu Eagle et similaire. On peut compléter ces milieux le as échéant aveô des ingrédients convenables, tels que l'hydrolysat de lactalbumine, sérum de veau inactivé 30 etc. De plus on peut ajouter à ces milieux un antibiotique ou des antibiotiques, tels que la pénicilline, la streptomycine, la dihyd;c ;st reptomyclne, la nëomycine eu la kanamyeine de façon que la culture soif proîégée contre la reproduction de micro-organismes accidentellement intrrduijs i"ar contamination,, 35 De . erte façon on s5 omet .le virus de la rubéole de façon répétée à des passages de culture jusqu'à ce qu'il soit confirmé que le virus a été suffisamment aî*.énuéy par un essai d'inoculation à un animal séronégatif ;u à us. humain prédisposé au virus de la rubéole. Bi~r, que le nombre de fois du passage requis pour une 40 atténuation suffisante varie avec la virulence du virus de la ru 71 24518 4 2112249 béole utilisés de la période d'incubation d'un passage et d'autres facteurs de ce genre, il faut habituellement au moins dix passages» Ainsi le virus de la rubéole peut être beaucoup plus rapidement atténué par des passages dans une culture de tissus contenant des 5 cellules primaires de rein de cochon d'inde comparées au procédé connu pour atténuer le virus de la rubéole (comparer l'exemple 2 donné plus loin)0 Cette atténuation du virus de la rubéole peut encore être facilitée par l'application de la méthode de dilution, dite 10 de limitation, dans les passages dans une culture de tissu contenait les cellules primaires de rein du cochon d'inde (comparez à l'essai 3 donné plus loin). Au cours de l'application de la méthode de dilution dite de limitation, on dilue le liquide de culture du passage précédent en constituant une série de liquides dilués avec des 15 facteurs de dilution allant de 2 à 10. On inocule à chacun des liquides dilués une culture de tissu contenant les cellules primaires du rein et on fait incuber afin de déterminer la dilution la plus grande permettant encore la reproduction du virus dans le passage en question. Le liquide de culture obtenu à partir du liquide 20 de virus de départ étant le plus dilué est utilisé comme virus de départ peur le passage suivant. La méthode de dilution dite de limitation peut être appliquée à chacun des passages choisis dans, les séries de passags dans une culture de tissu contenant lesdites cellules primaires de reinc 25 Le cas échéant on peut réaliser les passages du virus de la rubéole dans la culture de tissu desdites cellules en ajoutant plusieurs passages dans une culture de tissus contenant d'autres cellules animales. On peut citer comme autres cellules animale s par exemple des cellules d'embryon de la caille, du 30 canard, du poussin eu similaire. Parmi ces cellules il est préférable d'insér-er 1 passages avec des cellules d'embryon de caille dans les passages principaux avec les cellules primaires du rein du cochon d'inde. On ii.4ilise les virus de la rubéole ainsi atténués 35 comme virus de départ pour la préparation de vaccins contre le virus de la rubéole très a^éicié i* la présente invention. On inocule ledit virus dans une des cultures de tissus pour la préparation du vaccin et on le fait inouber, par exemple dans une culture contenant des cellules primaires du rein du cochon d'inde ou du lapin 40 d'une façon connue en soi. Il est recommandé de permettre au virus 71 24518 5 2112249 de 89 reproduire dans un miliau de culture contenant aucune des substances qui peuvent agi? comme antigène lorsque le vaccin résultant est inoculé au corps humain. On enlève du liquide de culture ainsi obtenu les maté-5 riaux solides tels que cellules, fragments de cellule ou semblables, par exemple par filtration ou par centrifugation et on peut utiliser le filtrat ou le liquide surnageant comme produit de la présente inventionp en tant que tel ou dilué avec un diluant convenable, tel que sérum physiologique ou eau distillée, dépendant de la teneur 10 en virus que l'on désire obtenir0 lorsque le vaccin contre le virus de la rubéole très atténué ainsi obtenu est prêt à l'usage on peut le conserver sous forme congelée, avec ou sans addition d'un ou plusieurs agents de stabilisation tels que suerose, lactose, glutamates, phosphates et 15 similaires. Il est également possible de le lyophiliser avec ou sans addition d'un ou plusieurs agents de stabilisation, tels que l'albumine du sérum humain, la gélatine ou similaire, pour le stockagej pour l'utilisation on dissout le produit lyophilisé avec un diluant convenable tel que du sérum physiologique ou de l'eau 20 distillée stérile0 Pour une vaccination efficace il est nécessaire d'inoculer au moins par personne une quantité de virus qui titre ? n 10 5 ( 50$ dose d'interférence), de préférence par voie sous-cutanée, pour toute la quantité en une fois. On préfère en 25 particulier une dose de ÎO2®^ à 10^'^ InD^^o Pour l'inoculation sous—s'itanée, une dose ayant la teneur en viras nécessaire doit être contenue dans une composition aqueuse d'environ 0,1 à environ 1,0 ml, de préférence de 0,25 à 0,5 ml. Il faut ajuster le vaccin de la présente invention avant 30 l'utilisati.cn8 de façon qu'il comprenne le virus de la rubéole 2 2 très atténué à une teneur d'au moins 10 ' InD /ml, dans un véhi- 50 cule physiologiquement convenable. lorsqu'on inocule aux enfants et aux nourrissons le vaccin contre le virus de la rubéole très atténué ainsi obtenu, 35 on observe à la suite de cette inoculation une augmentation remarquable du niveau des anticorps dans 1® sérum qui les protège contre l'infection par le virus de la rubéole, lorsque l'on applique le vaccin aux adultes, y compris aux femmes en âge de reproduction, on observe une augmentât ion tde l'anticorps du sérum dans le sang, 40 et il est à noter que l'on^observe pas les symptômes ressemblant 71 24518 6 2112249 à la rubéole, qui sont considérés comme étant des effets secondaires indésirables se produisant souvent à la suite d'une telle vaccination par des vaccins contre le virus de la rubéole connus jusqu'à maintenant» On voir ainsi que le nouveau vaccin contre le 5 virus de la rubéole très atténué de la présente invention peut être utilisé sans danger, même pour les adultes, pour obtenir une Immunisation efficace contre une infection par le virus de la rubéole. D'autres détails de la présente invention seront illustrés 10 dans les exemples ci-après. Ensuite l'innocuité du vaccin contre le virus de la rubéole très atténué de la présente invention sera encore démontré à l'aide d'exemples et d'essais. Dans la description et dans les exemples ci-après ainsi que dans les essais, l'abréviation Kt.p.m." signifie tour(s) par minute. 1 5 Exemple 1 On prélève sur des cochons d'inde en bon état de santé de façon aseptique les reins. 0n lave ces reins (auxquels on se réfère ci-après par la désignation "RCI™) avec -une solution de sel équilibrée selon Hanks et on les hache. La solution de sel équili-20 brée selon Hanks est composée de ; NaCl 8*0 g EC1 0,4 g CaCl2 0,2 g MgS04.7H20 0,2 g Na2HP04 « 2H20 0,06 g KH2PO4' 0,06 g NaHCO^ 0,25 g d-G-lucose 1 ,0 g rouge de phénol 0,02 g 30 Eau distillée (triple-distillée), q.s.p. 1 litre. On met le tissu haché dans un volume 50 fois plus grand d'une solution de Hanks, complétée de 0,25 $ de trypsine, et on le fait digérer sous agitation. Les cellules libres qu'on obtient sont réunies par centrifugation à 1*000 t.p.m. pendant 5 mn et on dilue 35 avec une quantité de solution de lactalbumine selon Hanks à laquelle on a qjou+é 5% de sérum de veau inactivé, de façon telle que la suspension des cellules résistantes contien^fenviron 5 ï 10^ cellules/ml. (La solution de lactalbumine selon Hanks est préparée par dissolution de 5 g de laetalbramine dans la solution de sel équili-40 brée de Hanks, pour obtenir un volume total de 1.000 ml). On fait 71 24518 f-' I 2112249 incuber la suspension de façon stationnaire dans des flacons de 50 ml à 36°C, Après 7 jourss quand les cellules se sont répandues sur la paroi inférieure des flacons, on lave les cellules 3 fois avec le milieu TC "199 afin de préparer une culture de cellules pri-5 maires de RCI, fie milieu TC 199 est une solution aqueuse stérile dont le pH est por+-é à 7,2. e+ qui contient des aminoacides, des bases de turine, des bases de pyrimidine, des vitamines, des sucres, des nucléctides, des sels organiques, et?, la composition détaillée est décrite dans Morgan, J.Fo e,a," Proc. Soc. Expo Biol. Med.,72, 10 pp. 1 à 8 (1950)? On inocule 0,2 ml du liquide dix fois dilué d'une souche de virus de rubéole qui a été isolée d'un malade de la rubéole, et qui a fait 13 passages dans des cellules primaires de reins du singe vert africain (auquel on se réfère ci-après par la désigna-15 tion "SVA"}, à un milieu de culture de cellules RCI, et le garde pendant 90 mn à 37°» On écarte le liquide et on lave les cellules 5 fois avec le milieu TC 199. Ensuite on ajoute 40 ml du milieu TC 199 litres de sérum et faifc incuber à 32°C pendant 7 jours. Enfin, on ajoute dans le flacon 5 ml du milieu TC 199, auquel on 20 a ajouté 2% de sérum de veau inactivé, et on fait incuber à 32°C pendant 7 jours. On soumet le liquide de culture à une centrifuga-tion à 3000 t.p.m. pendant 5 mn pour séparer le liquide surnageant que l'on utilise comme virus de départ pour le passage suivant, après l'avoir dilué 10 fois par addition du milieu TC 199. 25 De cette façon on répète le passage dans la culture de tissu RCI 45 fois, puis on soumet le liquide de culture de la 45ième culture à une centrifugation afin d*obtenir un virus de départ très atténué pour la préparation du vaccin contre le virus de la rubéole. 30 0n inocule 10 mi du viras de départ, 10 fois dilués à une culture de cellules primaires de reins de lapins (auxquels on se réfère ci-après sous la désignation "BI"), dans des flacons Roux de 500 ml, que l'on prépare de la manière décrite si-dessus, et que l'on garde pendant 90 mn à 37 °C. On écarte le liquide,et 35 on lave les cellules 5 fois avec le milieu TC 199. Ensuite on ajoute 40 ml du milieu TC199 libre de sérum et on fait incuber pendant 7 jours â 32',,C, On soumet le liquide de culture obtenu à une cenfcrifugation à 3.000 t.p.m» pendant 5 minutes, pour obtenir le liquide surnageant qui est un vaccin très atténué contre le 40 virus de la rubéole, le liquide surnageant a une teneur en virus 71 24518 8 2112249 de la rubéole de 10^'^ InD^0/ml contrôlée avec le système ECHO-11 et SYA (ECHO-11 désigne le virus ECHO type 11 (souche Grégory), souche très fréquemment utilisée pour des essais d'infectiosité du virus de la rabéole. On se réfère par exemple à "New Eng. J. 5 Med.", 271, 569-574, 1966.) Pour le stockage on congèle le produit à - 70°C. Après 100 jours de stockage, on le dégèle et on le dilue avec 3 fois son volume de sérum physiologique. On inocule le vaccin dilué par voie sous-cutanée à un bras d'un être humain, pour démontrer 10 l'effet recherché d'immunisation d'adultes humains ainsi que des nourrissons et d'enfants. Exemple 2 Dans cet exemple on soumet la même souche de virus de rubéole qu'employée dans l'exemple 1, à une série de 10 passages 15 en utilisant la méthode de dilution, dite de 13jnitation0 Ainsi on dilue le liquide du virus de départ avec le milieu 2 x TC 199 en préparant une série de dilutions allant de 1 : 5 à 1 : 5 et en inocule 0,2 ml de chacun des liquides dilués à une culture de cellules RCI dans 10 flacons de 50 ml, préparés de la 20 façon de l'exemple 1 et on fait incuber 7 jours dans les conditions indiquées dans l'exemple 1. On soumet lës différents liquides de culture à une centrifugation à 3«000 t.p.m. pendant 5 minutes, afin d'obtenir des liquides surnageants qui sont ensuite gelés pour un stockage à - 70°C. 25 La dilution de limitation pour la reproduction du virus dans ledit passage est déterminée à l'aide de la méthode d'interférence suivante, utilisant un virus de stomatite vésiculaire» On inocule aux cellules, séparées des liquides comme indiqué ci-dessus, après les avoir lavés deux fois avec une solution 30 salée équilibrée selon Hanks, 100 TCID^q (50$ dose infectieuse de culture de tissus) du virus de stomatite vésiculaire et on fait incuber à 36^0 pendant 2 jours dans 5 ml de milieu TC 199, auquel on a ajouté 2"fo d'un sérum de veau inactivé. Ensuite on observe par microscope les cellules pour s'assurer des effets cytopathiques 35 causés par le virus de stomatite vésiculaire,, afin de déterminer la plus grande dilution possible polir la reproduction du virus. Parmi les liquides surnegeants stockés comme indiqué ci-dessus, on dégèle seulement ceux dont le liquide de virus de départ sont les plus dilués. On dilue les liquides dégelés avec le milieu 2 Q 40 TC199 en préparant 5 séries de dilutions de 1 s 5 à 1 ; 5 . On 71 24518 9 2112249 inocule 0,2 ml de chacun de ces liquides dilués dans une culture fraîche de cellules RCI dans des flacons de 50 al et on fait incuber dans les conditions décrites ci-dessus. On détermine à nouveau la plus grande dilution pour la reproduction de virus de la façpn 5 indiquée ci-dessus, eiybn utilise les liquides de culture obtenus à partir du liquide du virus de départ de la plus grande dilution comme virus de départ dans le passage suivant, après avoir fait une série de 5 dilutions. De cette façon on répète 10 fois le passage dans la cul-10 ture de cellules RCI en appliquant la méthode de dilution dite de limitation, et on soumet le liquide de culture de la dixième culture à une centrifugation afin d'obtenir un virus de départ très atténué pour l'introduction du vaccin du virus de la rubéole. On inocule le virus de départ à une culture de cellules 15 El dans des flacons Roux et on procède de la façon indiquée dans l'exemple 1 en utilisant un milieu TC199 libre de sérum, afin d'obtenir un vaccin de virus de la rubéole très atténué, le vaccin présente une teneur en virus de rubéole de 10^'^ InD^/ml, contrôlée par le système indiqué dans l'exemple 1, 20 On gèle le produit pour stockage de la façon indiquée dans l'exemple 1, ensuite on le dégèle et on l'utilise pour la vaccination, obtenant ainsi une immunisation satisfaisante d'adultes humains, et aussi de nourrissons et d'enfants. Exemple 5 25 On prélève de façon aseptique des embryons de caille (auxquels on se réfère ci-après par l'indication "ECM) des oeufs du cinquième jour de la couvaison et après avoir enlevé les têtes on procède de la façon indiquée dans l'exemple 1 pour préparer une culture de cellules de EC. 30 0n inocule à la culture de cellules la même souche de virus de rubéole que celle utilisée dans l'exemple 1 et on fait incuber aussi dans les conditions indiquées dans l'exemple 1. On répète le passage dans la culture de cellules EC deux fois. On soumet le liquide de la seconde culture â une centrifugation afin 35 d'obtenir le liquide surnageant. On inocule le liquide surnageant à une culture de cellules RCI dans des flacons préparés comme indiqué dans l'exemple 1. 0n fait incuber la culture inoculée dans les conditions indiquées dans l'exemple 1. On dilue le liquide surnageant, obtenu par centrifugation de la culture avec 10 fois son 40 volume et on l'inocule à une culture fraîche de cellules de RCI. 71 24518 10 2112249 On répète ainsi le passage dans une culture de cellules RCI 20 fois. Ensuite on répète deux fois le passage dans une culture de cellules EC et ensuite on effectue dix passages dans une culture de cellules RCI. 5 On inocule le virus de départ ainsi obtenu dans une culture de cellules RL dans des flacons Roux de 500 ml et on procède de la façon indiquée dans 1*exemple 1 en utilisant un milieu TC 199 libre de sérum, afin d'obtenir un vaccin de virus de rubéole très atténué. Le vaccin ainsi obtenu possède une teneur en virus contre zt c 10 la rubéole de 10^' InD^/ml contrôlée avec le système indiqué dans l'exemple 1. Comme indiqué dans l'exemple 1 on gèle le produit pour le stockage, ensuite on le dégèle et on l'utilise pour la vaccination. Les cellules EC utilisées dans cet exemple doivent être 15 négatives à l'essai COFAL (on se réfère pour ces essais par exemple à : Sarma, P.S. et al; Virology, 2^, 313 et seq. (1964)). Exemple 4 On inocule 0,2 ml d'un liquide 100 fois dilué de virus de rubéole, souche To-336 et on le fait passer 7 fois dans des cellu-20 les SVA dans une exil ture de cellules RCI dans des flacons de 50 ml, la culture ayant été préparée de la façon indiquée dans l'exemple 1. On fait incuber après inoculation dans les conditions indiquées dans l'exemple 1. Ainsi on répète le passage dans les cultures de cellules RCI dix neuf fois, et on soumet le liquide de culture de 25 la dix-neuvième cuit tire à une centrifugation, afin d'obtenir le virus de départ très atténué pour la préparation du vaccin contre le virus de la rubéole. On inocule le virus de départ à des cellules RL dans des flacons Roux de 500 ml et on procède de la façon indiquée dans 30 l'exemple 1 en utilisant le milieu TC 199 libre de sérum, afin d'obtenir un vaccin contre le virus de la rubéole très atténué. le vaccin ainsi obtenu a une teneur en virus de rubéole de 104'3 InD^/ml contrôlée avec le système indiqué dans l'exemple 1. De la façon décrite dans l'exemple 1 on gèle le produit 35 pour stockage, on le dégèle ensuite et on l'utilise pour la vaccination. Exemple 5 On inocule 0,2 ml d'un liquide 100 fois dilué d'un virus de la rubéole, souche Yo-25 ayant fait cinq passages dans des cel-40 Iules SVA, à une culture de cellules RCI dans des flacons de 50 ml, 71 24518 2112249 préparés de la fa^cn indiquée, dans l'exemple 1. On fait incuber la culture inoculée dans les mêmes conditions que celles indiquées dans l'exemple 1. Ainsi en le passage dans la culture de cel lules RCI ?4 feis et -n sc-umet le liquide de culture de la vingt-quatrième - uje jre à une centril'-jgat ion afin d'obtenir un virus de départ f res at * éu ié r.:.ur la préparat ion du vaccin contre le virus de la r^séc > . On ino:'Jûe le virus de départ à des cellules RL dans des flacons Roux de 500 ml et -pèr;- de la façon indiquée dans l'exemple 2., afin d'':XAenlr vm vancin rentre le viras de la rubéole très atténué. L A O de 10 •" InDj-Q/'ml c;ntr?lé avec le système de l'exemple 1, Dr la façon .Indiquée dans l'exemple 1 en gèle le produit peur le stcokag?, ensuite en le dégèle et on l'utilise pour la va.vcina4 ir n. On inocule 0,2 ml d'un liquide 100 fois dilué de virus de la rucé'lfe, souche To-336. ayant fait 7 passages dans des cellules SVA f à -me culture de oe.lia.les Bd. dans des flacons de 50 ml, cuitur»» préparé0 de la fay'n indiquée dans l'exemple 1. On fai» incuber la oulture :n:>:ulée dans les mêmes conditions que celles indiquées dans 1 ' exemple 1,0?- répète le passage dans la culture de cellules RCI 20 feis en appliquant la méthode de dilution dite de limitation, de la fa;-n décrite dans l'exemple 5, entre le 5ème et 1- .18 ème passag-, le de dépar- tï'es atténué ainsi obtenu peut âtre vendu adaptatif à la culture des cellules RL par deux passa ges dans cette culture, et ^tisui+t?. .n l'inocule à des cellules RL dans des *: acmis E'-u* de 50Q ml et n «père de la façon décrite dans l'exemple 1, afir. d'etten.".:v \..n vaccin de virus de rubéole très atterri, X 4 rvbé'.le de 104"" 1rPk ^/cil . r;^i'Aléç avec le système de l'exemple 1, De la faç -n indiquée dans l'exemple 1 en gèle le produit peur le stockage y ensul 'e "U le dégèle et on l'utilise pr-ur la vaccinai: le. Essài 1 Os a sqmjbIs les va : cins -contre le virus de la rubéole très att , prépai es selcn les exemples 1 à 6 à des essais réalisés de la fayon décrite dans Secti,n 73»114 cf Publia Health Servi3e Regal&ticns, Title 42, Part 73, TJ.S.A# pour- les essais de 71 24518 12 2112249 sécurité des vaccins de la poliomyélite vivants et administrés par voie orale et de la façon décrite dans la section 73*73 du même règlement pour les essais de stérilité. Les résultats des essais d'inoculation à des animaux 5 différents (tels que lapins, souris adultes, souris nourries par la m&re et cochons dtinde), les essais de culture de tissu avec différentes cellules primaires (telles que des reins de singe, de l'amnion humain, du rein humain et du rein de lapin), ainsi que des essais négatifs d'agents accidentellement présent^ ont confirmé que 10 les vaccins soumis à ces essais satisfont à toutes les exigences des règlements cités ci-dessus. Essai 2 Dans cet essai on a comparé l'atténuation du virus de la rubéole obtenu par des passages dans la culture des cellules 15 RCI avec celles obtenues par des passages dans une culture de cellules EL cette dernière ayant été utilisée comme représentative pour les cultures de cellules connues jusqu'à maintenant pour l'atténuation du virus de la rubéole. On a fait 7 fois un passage du virus de la rubéole de 20 la souche Tc-336 dans des cellules SVA, et avec la souche de virus Yo-25 on a fait 5 passages dans des cellules SYA, suivis par 30 passages dans des cellules RCI, dans les conditions de l'exemple 1. Tout comme les séries de contrôle , on a soumis les deux souches 30 fois à des passages dans des cellules EL dans les mêmes condi-25 tions que citées ci-dessus. L'abaissement de la virulence des virus de la rubéole au cours des passages a été déterminé selon les différents systèmes de passage de la façon suivantes On a inoculé les liquides de virus respectifs de la 30 1ère, 5ème, lOème, 15ème, 20ème, 25ème et 30ème cultures, par voie sous-cutanée à des singes rhésus, des lapins et des cochons d'inde dans des doses de 5 x 10 TCID^q par animal. On a déterminé la réaction clinique, la teneur en anticorps du virus de la rubéole des sérums des animaux et l'isolation du virus de la rubéole des 35 prélèvements de la gorge en fonction des animaux inoculés. Réaction clinique j on a observé des efflorescences et autres symptômes attribués à l'inoculation pendant trois semaines immédiatement après 1'inoculâtion0 La teneur en anticorps du virus de la rubéole ; on a 40 prélevé des échantillons de sérum des animaux 21 jours après l'ino- 71 24518 13 2112249 collation et le titre d1inhibition à i'hémv-âggiutinatioa (IHà) a été déterminé peur chaetia -des é:-iiantill'>ns par- la méthode de Steward et autres, décrite dans i ;sIïew Bsg. J*Med,K, 226*. 554-557 1967. 5 L'isolation du virus de la vibécle des prélèvement de la g..cg* î On a fait pendant 17 3ouï-a à partir du cinquième jour après 1*inoculation, des prélèvements de la gorge de tous les animaux et on les a examinés selon la méthode de Parkman et autres, 10 décrite dans '-New Eng. J.Med.% 275. 5o9-574s 1966. Les résultats sont donnés dans les tableaux 1 et 2. TABLEAU 1 (Souche To-336) \Animal a A 11 T A Singe Rhésus Lapin Cochon d'Inde —' inocuie Réaction Titre IHA Isolation Réaction Titre IHA Isola Réaction Titre Isolatfcr K: Série^^^ clinique du virus de clinique tion du clinique IHA du virus -b* le passagers. prélèvement virus cte de pré- w de la gorge prélèvoiEnt lèveraen t —« cfe 3a garre cte ïi pprpf oc REI - 1 - 1 s 512 + - 1: 256 - 1s256 - REI - 5 - 1 s 256 + - ls 32 - ls 32 - REI - 10 - 1 s 128 - - - - - REI - 15 - 1 : 16 - - - - Cl: 8 - REI - 20 - - - - Os 8 - REI - 25 - - - - - - REI - 30 - - - - _ Cl s 8 - t- PRL - 1 - 1;1024 + - ls512 - - 1:128 - PRL - 5 - 1; 256 + - 1 s 128 - - 1 s 128 - PRL -10 - ls 128 + - ls 64 - - ls 64 - PRL -15 - 1: 64 - - ls 16 - - ls 32 - PRL -20 - ls ' 16 - - - - - PRL -25 - ls 8 - - - - - PRL -30 - ls 8 - - - - - ho —1 SJ IsJ ■fc» «CS TABLEAU g (Souche Yo-25) Animal \ inoculé \ Sériée de passages \ Singe Rhésus Lapin Cochon d'Inde Réaction clinique Titre IHA Isolation du virus de prélèvement de la gorge Réaction clinique Titre IHA Isola-tkn au vlrue de p?élèvema± cte ]a gergp Réaction clinique Titre I IsolafcScr dj virus de prélèvement de la Korge REI - 1 REI - 5 : 1:512 1:256 + -t- ». 1:256 1:128 - - 1:256 1:256 - REI -10 - 1:256 + - 1: 32 - - 1: 16 - REI -15 - 1: 64 - - ls 16 - - 1; 16 - REI -20 - ls 8 - - - - - REI -25 - l! 8 - - (1: 8 - - - REI -30 - 1: 8 - - (1: 8 - - - PRL -1 _ 1:512 + - 1:256 - - 1:128 - PRL -5 - 1:512 + - 1:128 - - 1:256 - PRL-10 - 1:128 + - 1:128 - - 1:128 - PRL-15 - 1:256 - - 1:128 - - 1: 64 - PRL-20 - 1:128 - - ls 64 - - 1:128 - PRL-25 - 1:128 - - 1: 32 - - 1: 64 - PRL-30 - ls 64 - - 1; 8 - - 1: 64 - NO JE* en CD ui NO NJ hJ -fc* «X5 71 24518 16 2112249 Essai 5 On a soumis, le virus de la rubéole, souche To-336, à 7 passages dans des cellules SVA et 20 passages dans une culture de cellules RCI en appliquant la méthode de dilution dite de limitation 5 pour le 3ème, le 6ème et le 9ème passage, de la façon décrite dans l'exemple 6. L'abaissement de la virulence du virus de la rubéole au cours des passages a été déterminé de la façon décrite dans ltessai 2. 10 On trouve les résultats dans le tableau 3. / TABLEAU 3 ..Animal inoculé Sérîhs. de x. passages1 \ Singe Rhésus Lapin Cochon d Inde Réaction clinique Titre IHA Isolation du virus de prélèvement de la gorge Réaction clinique Titre IHA Isolation du virus de prélèvement de la gorge Réaction clinique Titre IHA Isolation du virus de prélèvement de la gorge REI-1 . .! : 512 -f _ 1:^56 _ 1:256 - REI-5 - 1- 64 - - - - _ REI-10 - - - - - ~ REI-15 - - - - _ REI-20 - - - - - CL: 8 ~ NO 42» Cn QO "-3 t-o K> K> 42» -O 71 24518 18 2112249 REVENDICATIONS 1. Procédé de préparation d'un virus de la rubéole très atténué dans lequel le virus de la rubéole est soumis à un nombre de passages dans une culture de tissus suffisant pour atteindre 5 1'atténuation désirée, caractérisé par le fait que l'on effectue les passages du virus de la rubéole dans une culture de tissus contenant des cellules primaires du rein du cochon d'inde et que l'on effectue au moins dix passages. 2. Procédé selon la revendication 1 clans lequel on ef-10 fectue les passages à une température comprise entre environ 28°C et environ 36°C. 3. Procédé selon la revendication 1 dans lequel on effectue les passages en appliquant au moins une fois la méthode de dilution dite de limitation. 15 4. Procédé selon la revendication 1 caractérisé par le fait que l'on effectue les passages en intercalant 1 à 5 passages dans une culture de tissus contenant des cellules de l'embryon de la caille» 5. Procédé selon la revendication 1 caractérisé par le 20 fait que le virus de la rubéole provient de la souche To-336. 6. Vaccin contre la rubéole caractérisé par le fait qu'il contient le virus très atténué selon l'une quelconque des revendications 1 à 6. 7. Vaccin selon la revendication 6 caractérisé par le 25 fait qu'il comprend le virus vivani^de la rubéole, ayant effectué au moins 10 passages dans une culture de tissus contenant des cellules primaires du rein du cochon d'inde et un véhicule physiologique convenable potir ce virus, la teneur en virus de la rubéole 2 0 étant au moins 10 ' InD^/millilitre quand le vaccin se trouve 30 sous forme diluée inoculable. 8. Le vaccin selon la revendication 6 dans lequel la 2 5 teneur en virus de la rubéole est comprise entre 10 ' et 104'5 InD^/millilitre.