FR 2132452 A1 19721117 FR 7211930 A 19720405 72 11930 i 2132452 Cette invention concerne des nouveaux composés qui sont des modifications chimiques de l'hormone naturelle qu'est le glucagon, ainsi qu'un procédé pour les préparer. Précisément, les composés de la présente invention sont des dérivés nitrès du glucagon. 5 Les composés de la présente invention sont caractérisés comme étant des polypeptides ayant l'enchaînement d'aminoacides du glucagon, mais différant de ce dernier par le fait que le reste de tyrosine, ou bien les deux, contient un groupement nitro en position 3 du groupement 4-hydroxybenzyle. 10 D'une manière générale, le procédé de la présente invention est orienté vers la préparation d'un polypeptide ayant l'enchaînement des aminoacides du glucagon, mais différant de celui-ci par le fait qu'un reste de tyrosine, ou bien les deux, contient un groupement nitro en position 3 du groupement 4-hydroxybenzyle. 15 Ce procédé consiste à faire réagir le glucagon à une concentration d'environ 1 à environ 20 mg par ml d'un milieu qui est inerte vis-à-vis des réactifs et qui donne un pH d'environ 7 à environ 10 avec d'environ 2 à environ 8 moles de tétranitrométhane par mole de glucagon, à une température d'environ -10°C à environ +25°C 20 pendant d'environ 0,25 à environ 6 heures, et à récupérer le glucagon nitré résultant. La molécule de glucagon est composée d'une seule chaîne de 29 aminoacides reliés à la façon typique des peptides. C'est-à-dire que la fonction oc-aminée d'un aminoacide de l'enchaînement est 25 reliée à la fonction carboxyle de 1'aminoacide suivant, ce qui a pour résultat la formation d'une liaison amide. il en résulte la présence d"une fonction os-aminée libre à une extrémité de la chaîne ultime et d'une fonction carboxyle libre à l'autre extrémité de la chaîne. Dans ce système l'enchaînement des 30 aminoacides du glucagon est le suivant ï 1 2 3456789 10 H^N-His - Sér - Gin - Gly - Thr - Phé - Thr - Sér - Asp - Tyr - 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 Sér - Lys - Tyr - Leu — Asp - Ser - Arg - Arg - Ala - Gin - Asp -35 22 23 24 25 26 27 28 29 Phé - Val - Gin - Trp - Leu - 1-lét - Asn - Thr - COOH Dans l'enchaînement précédent, les abréviations utilisées désignent les aminoacides suivants î 72 11930 2 2132452 15 10 5 Ala - Alanine Arg - Arginine Asn - Asparagine Asp - Acide aspartique Gin - Glutamine His - Histidine Leu - Leucine Lys - Lysine Met - Méthionine Phé - Phënylalanine Sér - Sérine Thr - Thréonine Trp - Tryptophane Tyr - Tyrosine Val - Valine Il faut savoir que,dans tout enchaînement d1aminoacides tel que celui représenté ci-dessus,certains des maillons de l'enchaîne ment contiennent, outre la fonction a-aminée et la fonction carboxyle, d'autres substituants réactifs. Toute tentative de 20 modification du polypeptide doit prendre en considération les diverses fonctions réactives présentes dans la molécule ainsi que la possibilité de fragmentation du polypeptide en chacun des aminoacides et/ou en segments de peptides très petits. structure, on a découvert qu'il est possible dans les conditions précisées ici de nitrer le glucagon et de localiser le point de nitration tout en laissant intactes les autres portions de la molécule. Selon la découverte de la présente invention, il est 30 possible de nitrer la molécule de glucagon au niveau des restes de tyrosine présents dans l'enchaînement d'aminoacides aux positions 10 et/ou 13 de la molécule et de modifier ainsi la portion 4-hydroxybenzylée du reste pour mettre comme substituant un groupement nitro en position 3 du noyau aromatique. Une 35 nitration peut avoir lieu sur l'un ou l'autre des restes de tyrosine ou bien sur les deux. Le mononitroglucagon est le résultat de la nitration d'un seul des restes de tyrosine. Dans ere cas on pense que le site principal de la nitration est situé au niveau du reste de tyrosine en position 13 de l'enchaîne-40 ment d'aminoacides du glucagon. Ceci n'exclut pas la possibilité Môme eu égard à la fragilité indiquée de la structure du 25 polypeptide et de la possibilité élevée de dégradation de la 72 11930 3 2132452 de mononitration au niveau du reste de tyrosine situé en position 10 de l'enchaînement d'aminoacides, et il n'est pas prévu de limiter la présente invention à une mononitration en position 13. Le dinitroglucagon est le résultat de la nitration des restes de 5 tyrosine présents dans les deux positions 10 et 13 de l'enchaînement d'aminoacides. La présente invention comprend donc le mononitroglucagon dans lequel un seul des deux restes de tyrosine présents dans le glucagon contient un groupement nitro en position 3 du cycle 10 benzénique ; et, précisément, le mononitroglucagon dans lequel le groupement nitro est en position 3 du groupement 4-hydroxy-benzyle du reste de tyrosine situé en position 13 de l'enchaînement d'aminoacides du glucagon ; et le mononitroglucagon dans lequel le groupement nitro est en position 3 du groupement 4-hydroxy-15 benzyle du reste de tyrosine situé en position 10 de l'enchaînement d'aminoacides du glucagon. La présente invention comprend également le dinitroglucagon dans lequel les deux restes de tyrosine contiennent un groupement nitro en position 3 de leurs groupements 4-hydroxybenzyle 20 respectifs. En outre, la présente invention comprend des mélanges contenant les deux mononitroglucagons définis ci-dessus, ainsi que les mélanges contenant les deux mononitroglucagons et le dinitroglucagon définis ci-dessus. 25 Du fait des nombreux points où une dégradation et/ou une modification de la molécule de glucagon peut avoir lieu, les conditions de nitration doivent être choisies soigneusement. Un agent nitrant relativement doux, le tétranitromëthane (TNM) , s'est révélé nitrer le reste de tyrosine du glucagon sans donner 30 de quantités excessives de sous-produits. Les conditions de réaction sont très spécifiques. Le tétranitromëthane est l'agent nitrant essentiel. La nitration peut être effectuée à un pH situé dans la gamme d'environ 7 à environ 10. Tout milieu de réaction qui conduit à un pH situé dans cette 35 gamme et qui est de plus inerte vis-à-vis de la nitration convient. En général, on utilisera un milieu de réaction contenant un agent tampon approprié pour obtenir le pH désiré. Le pH du milieu de réaction sera de préférence situé dans la gamme d'environ 8 à environ 9, et de préférence encore ce pH sera égal à environ 8. 40 La nitration sera effectuée à une température d'environ -10°C 72 11930 4 2132452 à environ +25°C. La température de réaction sera de préférence située dans la gamme d'environ 0°C à environ +5°C, et de préférence ancore,la température à laquelle la réaction est effectuée sera égale à environ 0°C. 5 La durée de réaction peut aller d'environ 15 minutes jusqu'à 6 heures. Toute fois, on préfère que la durée de réaction soit maintenue à une valeur située vers l'extrémité inférieure de cette gamme, généralement à une valeur d'environ 15 minutes à environ 45 minutes, et de préférence encore, que cette durée de 10 réaction soit d'environ 30 minutes. La concentration du glucagon dans le milieu tamponné est également un facteur de réaction important. La concentration du glucagon doit être maintenue dans la gamme d'environ 1 à environ 20 mg de glucagon par ml de milieu de réaction. La concentration 15 du glucagon sera de préférence d'environ 2 à environ 10 mg par ml, une concentration d'environ 10 mg par ml étant particulièrement préférée. La concentration du TNM par rapport au glucagon est également un facteur de réaction important. Le rapport molaire du TNM au 20 glucagon doit être maintenu dans la gamme d'environ 2 à environ 8. Cette gamme restera de préférence comprise entre environ 4 et environ 8, un rapport molaire du TNM au glucagon d'environ 4 étant particulièrement préféré. L'activité biologique du glucagon est accrue par nitration. 2 5 on note un accroissement de l'effet hyperglycémique des nitro-glucagons comparativement à une concentration équivalente de glucagon lui-même. En outre, le degré de nitration joue un rôle dans l'intensité de l'effet hyperglycémique. C'est-à-dire que,en concentrations équivalentes de mononitroglucagon et de dinitro-30 glucagon, le dinitroglucagon manifeste un effet hyperglycémique plus intense. L'isolement et la récupération du nitroglucagon du mélange de réaction seront réalisés par des méthodes généralement reconnues dans la technique. Dans leurs grandes lignes, l'isolement et la 35 purification du nitroglucagon du mélange de réaction vont consister à abaisser le pH auquel a été effectué la réaction pour être sûr d'avoir une précipitation totale du produit brut du mélange de réaction. Le produit brut sera alors séparé du mélange de réaction par centrifugation, filtration, ou tout autre 40 méthode bien connue dans la technique. 72 11930 5 2132452 Le glucagon nitré brut résultant va alors être soumis à un traitement de purification. Cette purification consiste généralement à soumettre tout d'abord le glucagon nitré brut à une filtration sur gel sur une colonne chromatographique. Les gels appropriés 5 qui peuvent être utilisés sont par exemple la cellulose, les acides alginiques, les polyacrylamides et les dextranes. Les dextranes modifiés, disponibles sous la marque commerciale Sephadex, conviennent particulièrement. La filtration chromatographique à l'aide d'un adsorbant qui est un gel réalise généra-1° lement une séparation des constituants du glucagon nitré brut en fonction de leur poids moléculaire. Lorsqu'on utilise la technique d'isolement décrite ici, on sépare alors ensuite la portion du glucagon nitré brut séparée par filtration sur gel et correspondant généralement au poids 15 moléculaire du glucagon lui-même, par une technique d'échange d'ions. L'échangeur d'ions qui est généralement utilisé peut être un milieu échangeur d'anions approprié quelconque. Les substances échangeuses d'ions spécifiques qui peuvent être utilisées de manière appropriée sont la diéthylaminoéthyl cellulose et le 20 diéthylaminoéthyl Sephadex. L'échantillon que l'on fait passer sur l'échangeur d'ions et qui a déjà été isolé par filtration sur gel de manière à contenir des substances de poids moléculaires analogues, subit ensuite une séparation en fonction des caractéristiques de charges diverses des constituants présents dans le 25 mélange. Il est donc possible de séparer un mélange contenant par exemple du glucagon, du mononitroglucagon et du dinitroglucagon en ses divers constituants, grâce aux différences de charges électriques des trois structures même en dépit du fait que ces trois structures ont des poids moléculaires relativement 30 similaires. Le procédé précédent est une illustration de celui dont on dispose pour séparer les glucagons nitrés du glucagon constituant la matière de départ et également les uns des autres, et pour les purifier. Toutefois il n'est pas prévu par cette discussion de 35 limiter la présente invention à une quelconque méthode particulière d'isolement et de purification des nitroglucagons. Les structures des nitroglucagons de la présente invention peuvent être déterminées par n'importe quelle technique reconnue pour analyser les peptides et/ou les aminoacides. Typiquement, 40 le peptide est tout d'abord digéré par hydrolyse enzymatique ou 72 11930 6 2132452 acide, et chacun des aminoacides ou fragments peptidiques résultants est alors analysé. Les techniques particulières mises en jeu sont bien admises dans la technique et ne font pas partie de ce qu'enseigne la présente invention. 5 Les exemples suivants sont destinés à illustrer la préparation, l'isolement, l'analyse et l'activité biologique des nitroglucagons qui constituent une partie de la présente invention. Nitration du glucagon On a mis du glucagon à raison de 2,0 grammes en suspension 10 dans 200 ml d'une solution 0,15 M d'un tampon de Tris-HCl de pH 8,0 à 0°C. Le terme "tris" désigne le trishydroxyméthylamino méthane. La concentration résultante était équivalente à environ 2,9 micromoles de glucagon par millilitre de la solution tampon. On a ajouté du TNM (0,275 ml de solution à 2,30 millimoles) dissous 15 dans 2,0 ml d'éthanol, et on a laissé la réaction se faire sous agitation modérée à 0°C pendant 30 minutes. La suspension a pris une coloration jaune brillante en trois minutes. A la fin de la durée de réaction de 30 minutes, on a transvasé la suspension dans un bol de centrifugeuse et on a ajusté le pH à environ 5,0 avec 20 HCl 6N. On a ensuite laissé reposer le mélange résultant pendant trois heures à 0°C, puis on l'a centrifugé à 2000 tpm pendant 30 minutes. On a lavé le culot résultant trois fois avec de l'éthanol absolu, on l'a remis en suspension dans l'eau et lyophilisé. Le produit brut recueilli, soit le nitroglucagon, 25 pesait 1,837 gramme. Isolement et purification du nitroglucagon On a dissous l'échantillon entier de nitroglucagon brut dans 100 ml de solution d'hydroxyde de sodium de pH 10,5. On a ajusté rapidement le pH à environ 3 en ajoutant de l'acide acétique 30 glacial. Ensuite on a fait passer l'échantillon de nitroglucagon brut résultant sur une colonne de Sephadex G-50F de 5 x 150 cm et on a éluë avec de l'acide acétique 1M. La filtration sur gel Sephadex a eu pour résultat la séparation d'une substance ou d'un groupe de substances ayant un poids moléculaire analogue à celui 35 du glucagon d'un groupe de substances ayant un poids moléculaire plus élevé. La substance ou le groupe de substances correspondant généralement aux poids moléculaires du glucagon, du mononitroglucagon et du dinitroglucagon prédominait et correspondait à approximativement 1,44 g de l'échantillon total introduit dans la 40 colonne de filtration sur gel. 72 11930 7 2132452 Ensuite on a lyopliilisé la portion de 1* échantillon purifié par filtration sur gel et correspondant généralement au poids moléculaire du glucagon et on l'a dissoute dans 40 ml d'urée 7M contenant un mélange HCl-Tris 0,01M et du Versène 0,001m, le 5 mélange résultant ayant un pH de 8,5. On a alors introduit cet échantillon sur une colonne de DEAE (diéthylaminoéthyl) cellulose de 3,7 x 120 cm et on a élué avec une solution de chlorure de sodium avec gradient croissant linéairement, faite avec 4 litres de la même solution-tampon et 4 litres de solution de chlorure 10 de sodium 0,1M. On a désionisé les fractions résultantes sur Sephadex Gr-2 5C à l'aide d'acidô acétique 1M et ensuite on les a lyophilisées. L'analyse selon le mode opératoire précédent a mis en évidence cinq substances, dont deux d'entre elles présentes 15 en quantités majeures. Les deux constituants principaux du mélange ont été soumis à une analyse de détermination des aminoacides et présentaient les compositions données dans le Tableau X suivant. 72 11930 8 2132452 TABLEAU I Composition en aminoacides du glucagon, du mononitroglucagon, et du dinitroglucagon (Restes par mole) 5 Aminoacides Glucacron"'' Mononitroglucagon D initroglucagon Acide aspartique 4 3,94 4,10 Thréonine^ 3 2,85 2,86 Sérine^ 4 3,70 3,72 Acide glutamique 3 2,86 2,92 10 Proline 0 0 0 Glycine 1 1,00 1,06 Alanine 1 1,04 1,02 Valine 1 1,00 0,99 Méthionine 1 0,98 0,96 15 Leucine 2 2,04 1,99 Isoleucine 0 0 0 Tyrosine 2 1,06 0,18 Phé nylalanine 2 2,03 1,99 Tryptophane 1 0,94 1,03 20 Lysine 1 1,05 0,95 Histidine 1 0,95 0,92 Arginine 2 2,00 2,00 3—Nitrotyros ine 0 1,06 1,84 Sulfoxyde d® 25 méthionine 0 0 0 Total 29 29 29 ^"Bromer et al., J. Am. Chem. Soc. 79, 2807 (1957). 2 Pas de correction pour la destruction au cours de l'hydrolyse acide. 30 Un examen du mononitroglucagon récupéré à raison d'environ 1,09 gramme, révèle la présence de 1,06 reste de tyrosine et de 1,06 reste de 3-nitrotyrosine par mole de glucagon. Ceci démontre que la nitration se fait sur l'un des restes de tyrosine de la molécule de glucagon et que l'autre reste de tyrosine demeure. 35 intact. L'analyse de l'autre constituant majeur, soit le dinitroglucagon, présent en une quantité d'environ 0,15 gramme, indique d'après le Tableau I la présence d'environ 0,18 reste de tyrosine et d'environ 1,84 reste de 3-nitrotyrosine par mole de glucagon. 72 11930 9 2132452 Ceci démontre que la nitration s'est faite sur les deux restes de tyrosine pour donner des restes de 3-nitrotyrosine. Activité biologique des glucagons nitrés On a déterminé la réponse hyperglycémique du nitroglucagon 5 en administrant par voie sous-cutanée des échantillons à des lapins à une dose de 8 microgrammes par kilogramme de poids de lapin. On a mesuré la concentration du sucre dans le sang chez le lapin au moment de l'administration du nitroglucagon. On a ensuite déterminé l'augmentation du sucre dans le sang à des temps variés 10 sur une période de quatre heures suivant l'administration de l'échantillon. Les résultats de cet essai sont représentés dans le Tableau II suivant et montrent que l'activité hyperglycémique du mononitroglucagon et du dinitroglucagon est dans les deux cas supérieure à celle du glucagon. 15 TABLEAU II Augmentation du glucose sanguin après administration de glucagon, de mononitroglucagon et de dinitroglucagon mg de glucose pour 100 ml de sang + écart-type aux temps (en heures) 0,5 1 2 4 Glucagon(104)^ 124±3,5 147-4,6 55^4,5 —10—1,6 Mononitroglucagon (16) 144^8,2 179^13,3 43^11,0 -17±2,0 Dinitroglucagon (16) 153^8,4 187^11,8 57Î8,4 -13-1,7 ''"Nombre de lapins 25 Le mononitroglucagon et le dinitroglucagon manifestent en outre une activité inotrope favorable comparativement à l'activité inotrope reconnue pour le glucagon. L'activité inotrope des mono- et dinitroglucagons est au moins aussi intense que celle du glucagon normal. 72 11930 2132452 10 REVENDICATIONS 1. Polypeptide ayant l'enchaînement des aminoacides du glucagon, mais en différant en ce que l'un des restes de tyrosine, ou bien les deux, contient un groupement nitro en position 3 du 5 groupement 4-hydroxybenzyle. 2. Polypeptide selon la revendication 1, dans lequel un seul des restes de tyrosine contient un groupement nitro en position 3 du groupement 4-hydroxybenzyle. 3. Polypeptide selon la revendication 1 ou 2, dans lequel le 10 reste de tyrosine situé en position 13 de l'enchaînement d'amino- acides du glucagon contient un groupement nitro en position 3 du groupement 4-hydroxybenzyle. 4. Polypeptide selon la revendication 1 ou 2, dans lequel le reste de tyrosine situé en position 10 de l'enchaînement 15 d*aminoacides du glucagon contient un groupement nitro en position 3 du groupement 4-hydroxybenzyle. 5. Polypeptide selon la revendication 1, dans lequel les deux restes de tyrosine contiennent un groupement nitro en position 3 de leurs groupements 4-hydroxybenzyle respectifs. 20 6. Procédé de préparation d'un polypeptide selon la revendication 1, qui consiste à faire réagir le glucagon à une concentration d'environ 1 à 20 mg par ml d'un milieu qui est inerte vis-à-vis des réactifs et qui donne un pH d'environ 7 à environ 10 avec d'environ 2 à environ 8 moles de tétranitrométhane 25 par mole de glucagon, à une température d'environ -10°C à environ +2 5°C pendant environ 0,2 5 à environ 6 heures, et à récupérer le glucagon nitré résultant. 7. Procédé selon la revendication S, qui consiste à effectuer la nitration à un pH d'environ 8 à environ 9. 30 8. Procédé selon la revendication 6 ou 7, qui consiste à utiliser d'environ 4 à environ 8 moles de tétranitrométhane par mole de glucagon, 9. Procédé selon les revendications 6 à 8, qui consiste à nitrer le glucagon avec le tétranitrométhane pendant une durée 35 d'environ 15 à environ 60 minutes et à une température d'environ 0°C à environ +5°C. 10. Procédé selon les revendications 6 à 9, qui consiste à utiliser une concentration d'environ 2 à environ 10 mg de glucagon par ml de milieu de réaction. 72 11930 2132452 11. Procédé selon la revendication 6, qui consiste à introduire du glucagon dans un milieu de réaction maintenu à un pH d'environ 8 et à une température d'environ 0°C de manière à ce que la suspension résultante contienne environ 10 mg de glucagon 5 par ml/ à ajouter à ladite suspension une solution de tétranitrométhane contenant environ 4 moles de tétranitrométhane par mole de glucagon, à maintenir le mélange résultant à 0°C pendant une durée d'environ 15 minutes à environ 45 minutes, puis à ajuster le pH à environ 5 avec de l'acide dilué, et à récupérer 10 le glucagon nitré.