FR 2118134 A1 19720728 FR 7145283 A 19711216 71 45283 1 2118134 La présente invention concerne de nouveaux polypepti&es utiles en thérapeutique stimulant ou inhibant à des degrés divers la phagocytose ou la pinocytose. Les gamma-globulines du sang total des mammifères consti-5 tuent une fraction contenant les anticorps utilisés par l'organisme pour résister à l'invasion des antigènes. Plus particulièrement, les gamma-globulines du sang des mammifères constituent une fraction contenant des substances que l'organisme utilise pour lutter contre les maladies infectieuses. La production 10 d'anticorps est un mécanisme naturel de défense de l'organisme qui est stimulé par la présence des antigènes dans l'organisme. Normalement, il se produit une formation d'anticorps spécifiques qui combattent les antigènes spécifiques, et dans de nombreux cas, l'organisme conserve un certain taux d'anticorps s'opposant 15 à l'antigène spécifique ou à l'organisme infectieux, ce qui inhibe et souvent empêche la réinfection. L'utilisation de gamma-globulines de sang de mammifères comme agent thérapeutique a soulevé beaucoup d'intérêt en médecine, car l'utilisation de cette fraction du sang d'un individu 20 ayant résisté à une infection peut permettre de stimuler la résistance à cette infection chez un autre individu. Malheureusement, cette tentative prophylactique ne s'est pas révélée suffisamment fructueuse et on ne peut l'utiliser à long terme sauf dans le cas des agammaglobulinémies. Ceci tient 25 à plusieurs raisons. Premièrement, les malades rejettent souvent les gamma-globulines, en particulier, lorsque l'administration est répétée, car ils les identifient à un antigène et forment des anticorps pour les rejeter. Deuxièmement, lorsque le taux de gamma-globulines s'élève au-dessus de la normale dans le sang, 30 on risque d'obtenir des effets fâcheux semblables à ceux observés dans des hypergammaglobulinémies. De plus, même dans les cas où on peut utiliser un traitement par les gamma-globulines, il n'est pas aussi efficace qu'il est souhaitable car la majeure partie des gamma-globulines tend à demeurer dans le sang des 35 malades au lieu de diffuser dans les tissus qui constituent le site habituel de l'infection.- La demanderesse a découvert qu'un tétrapeptide, la L-thréonyl-L-lysyl-L-prolyl-L-arginine, qu'on peut isoler des gamma-globulines selon des techniques décrites ci-après mais qui 40 n'existe pas sous forme d'une molécule libre distincte dans les COPY 71 45283 2 2118134 gamma-globulines, a le pouvoir de stimuler la phagocytose et par conséquent, la destruction des "bactéries par les leucocytes à noyau polymorphe, en particulier, les leucocytes neutrophiles chez les mammifères. Il stimule également dans une mesure iden-5 tique, la pinocytose permettant aux cellules de se nourrir dans le milieu ambiant. L'invention concerne particulièrement les polypeptides dont ce tétrapeptide constitue un constituant, ainsi que les composés analogues, les dérivés et les sels convenant en pharmacologie correspondants. 10 La demanderesse a découvert une nouvelle catégorie de poly peptides utiles en thérapeutique. Les composants de cette catégorie sont utiles car ils possèdent la propriété de stimuler ou d'inhiber la phagocytose ou la pinocytose. La caractéristique principale des constituants de cette catégorie est qu'ils n'ont 15 pas de pouvoir antigénique et contiennent au moins 3 et jusqu'à environ 19 aminoacides et au moins un motif peptide dans lequel deux amlno-acides sont réunis par une ou deux molécules de proline. Le premier membre de cette série est un tripeptide dans lequel deux amino-acides basiques sont réunis par une molécule 20 de proline. Pour faciliter la description de l'invention, on utilise les abréviations classiques des divers amino-acides» Elles sont familières à l'homme de l'art, mais par souci de clarté * les abréviations principales utilisées dans l'invention figurent ci-25 dessous : Lysine - Lys Sérine - Sér Arginine - Arg Tyrosine - Tyr Ornithine - Orn Phénylalanine - Phé Histidine - His Proline - Pro 30 Œhréonine - Ihr On entend ici par amino-acides basiques les quatre premiers amino-acides figurant ci-dessus. Le motif fondamental de la catégorie des polypeptides de l'invention est un tripeptide dans lequel deux amino-acides basiques Bont réunis par la proline. 35 Les tripeptides suivants appartiennent à cette catégorie. Lys-Pro-Lys Orn-Pro-Lys Arg-Pro-Arg His-Pro-His Arg-Pro-Lye His-Pro-Lys lys-Pro-Arg Hle-Pro-Arg 71 45283 2118134 3 5 Arg-Pro-Orn Orn-Pro-Arg Orn-Pro-Orn Lys-Pro-Orn On préfère, en raison de leur activité élevée, comme stimu- His-Pro-Orn Lys-Pro-His Arg-Pro-His Orn-Pro-His lateurs ou inhibiteurs, les tétrapeptides dans lesquels un autre amino-acide, de préférence un amino-acide substitué par un radical hydroxyle est uni à l'un des tripeptides précités. On peut citer comme exemples caractéristiques de tels amino-acides, la 10 thréonine, la sérine, la tyrosine, la phénylalanine et le tryp-tophane. Les tétrapeptides suivants constituent donc des composés caractéristiques de l'invention. On préfère comme stimulateurs de la phagocytose et de la pinocytose, les composés dans lesquels les amino-acides sont 25 tous sous la forme L. Ils sont tous plus actifs que les tripeptides correspondants ou l'un quelconque des tripeptides précédemment cités. Le premier tétrapeptide cité est de beaucoup le plus actif. Les autres sont quelque peu moins actifs. On peut réduire l'activité en remplaçant au moins un des amino-acides 30 de forme L par un amino-acide de forme D. En pratique, on peut transformer les stimulateurs en inhibiteurs en utilisant ces modifications. Un inhibiteur ou antagoniste très actif est constitué par l'isomère inverse du premier tétrapeptide cité dans lequel tous 35 les amino-acides sont sous forme D0 Ce composé est la On peut obtenir plusieurs degrés d'inhibition en remplaçant un ou plusieurs des amino-acides D par des amino-acides L. Les composés suivants entrent dans le cadre de l'invention. 15 20 Thr-Lys-Pro-Arg Sér-Lys-Pro-Arg Thr-Lys-Pro-Lys !Ehr-Ar g-Pr o - Arg Chr-Arg-Pro-Lys Thr-Arg-Pro-Orn Thr-Lys-Pro-Orn Thr-Lys-Pro-Hi s S ér-Lys-Pro-Hi s D-arginyl-D-prolyl-D-lysyl-D-thréonine 71 45283 4 2118134 Arg-Pro-Lys-Sér Ly s-Pr o-Ly s-QSir Arg-Pro-Arg- Hir Lys-Pro-Arg-Thr 5 Orn-Pro-Arg-Thr Orn-Pro-Lys-Kir His-Pro-Lys-Thr His-Pro-Lys-Sér En général, les stimulateurs les plus actifs sont consti-10 tués de tétrapeptides dans lesquels tous les amino-acides sont sous forme L et le quatrième amino-acide uni au motif tripepti-dique fondamental est un amino-acide aliphatique susbtitué par un radical hydroxyle, uni par son groupe carboxyle au groupe -amino de 11amino-acide basique, dont le groupe carboxyle est 15 uni à la proline par une liaison peptidique. Les isomères en position inverse de ces composés dans lesquels tous les amino-acides sont sous forme D constituent des inhibiteurs actifs. Les pentapeptides dans lesquels un des amino-acides est répété possèdent également un pouvoir inhibiteur et on peut donc 20 les utiliser comme agents thérapeutiques. Les composés suivants entrent donc dans le cadre de l'invention : Thr-Lys-Pro-Pro-Arg Thr-Thr-Lys-Pro-Arg ÎEhr-Lys-Lys-Pro-Arg 25 Thr-Lys-Pro-Arg-Arg Sêr-Lys-Pro-Pro-Arg Ces structures peuvent également constituer le motif de polypeptides selon l'invention comportant jusqu'à environ 19 amino-acides. 30 Si la forme D ou L d'un amino-acide n'est pas précisée, on doit entendre que les deux formes sont envisagées. On voit donc qu'on peut préparer et utiliser des composés appartenant à la catégorie indiquée ayant un pouvoir stimulant ou inhibiteur d'importance variable. Ceci est très important 35 car il existe des syndromes médicaux dans lesquels le malade est pratiquement incapable de réaliser une phagocytose ou une pinocytose, comme c'est le cas des sujets ayant subi une splé-nectomie, et des cas où les phagocytes sont si actifs qu'ils ingèrent des cellules apparemment normaleso Ceci s'observe chez 71 45283 5 2118134 des malades atteints de maladies du collagène, telles que la polyarthrite chronique évolutive et le lupus érythémateux. La phagocytose anormale peut provoquer chez ces malades des lésions vasculaires destructives dans les articulations et divers or-5 ganes. Le traitement par les composés inhibiteurs de l'invention est indiqué chez ces malades. Comme précédemment indiqué, on préfère comme composés les tétrapeptides. Parmi ceux-ci, le composé ayant le pouvoir de stimulation lé plus intense observé jusqu'ici est la Œhr-Lys-Pro-10 Arg dans laquelle tous les amino-acides sont sous forme L. L'inhibiteur préférentiel est 1'Arg-Pro-Lys-Thr dans laquelle tous les amino~acide3 sont sous forme D. Pour simplifier, on a appelé ce premier composé la tuftsine IV et le second rétrotuftsine IV. L'invention va maintenant être décrite plus en détail à 15 propos de la tuftsine IV. On a synthétisé chimiquement ce tétrapeptide et il s'est révélé identique à un des produits qu'on peut isoler en quantités extrêmement faibles dans les gamma-globulines selon diverses techniques difficiles impliquant son clivage de la leucokinine qui constitue une des fractions pro-20 téiques connues des gamma-globulines. La leucokinine est synthétisée ou activée dans la rate. Les individus ayant subi une splénectomie manquent donc de tuftsine IV. La tuftsine IV est présente dans le sang des mammifères dans la molécule plus grosse de leucokinine comme le montre le 25 procédé d'isolement qui nécessite le clivage de la leucokinine par une enzyme spécifique qui est la leucokininase. Elle semble stimuler la phagocytose et la pinocytose selon un mécanisme qui implique (a) la fixation de la leucokinine en un site spécifique de la membrane cellulaire, (b) le clivage de la molécule de 50 leucokinine sous l'effet de la leucokininase de la membrane constituant une partie intégrante du site de fixation, et (c) le transport sous forme d'un complexe avec l'enzyme en son site d'activité où elle est apparemment détruite et provoque un effet stimulant. Quoi qu'il en soit, on ne connaît pas de technique 35 ne nécessitant pas de clivage enzymatique permettant d'isoler ce tétrapeptide à l'état pur. En pratique, on ne connaît pas de technique permettant d'isoler des quantités utilisables de tuftsine IV d'une quantité d« sang de mammifère utilisable en pratique. 71 45283 6 2118134 la leucokinine elle-même ne convient pas comme agent thérapeutique car on ne peut l'obtenir sous forme d'une molécule autologue, mais uniquement à partir de sources hétérologues réunies. Pour cette raison et par suite de sa taille importante et de 5 différences de structures, elle déclenche une réaction antigène-anticorps chez l'hôte et est rejetée. Cependant, la tuftsine IV semble être la même pour toutes les leucokinines d'origine humaine, et comme elle constitue une petite molécule, elle ne provoque pas de formation d'anticorps. 10 De plus, comme elle constitue une petite molécule, elle est facilement transportée dans les tissus où elle provoque une phagocytose de tous les organismes ou particules par action directe sur le phagocyte et non sur les bactéries. Dans ce sens, la tuftsine IV se comporte comme un antibiotique d'action géné-15 raie, mais contrairement aux antibiotiques, ne provoque pas de réponse à un allergène ni l'apparition d'organismes résistants comme c'est souvent le cas lorsqu'on traite les infections bactériennes par des antibiotiques agissant de façon sélective sur les bactéries, ce qui provoque la survie de mutants résistants. 20 La tuftsine IV est un tétrapeptide stimulant la phagocytose et la pinocytose: atoxique, non antigénique, utile en thérapeutique qui stimule la défense naturelle de l'organisme contre l'infection provoquée par les substances étrangères. On peut obtenir la tuftsine IV et les polypeptides appa-25 rentés que sont la tuftsine I, la tuftsine II et la tuftsine III qui activent toutes la phagocytose et la pinocytose, à partir de diverses fractions de gamma-globulines séparées par chromatographie sur colonnes de phosphocellulose. La technique générale est précisée ci-après. 30 On prépare les gamma-globulines à partir des sérums d'homme, de chien ou de lapin, par précipitation au sulfate d'ammonium à 0,33 de la saturation. La technique d'isolement des tuftsines est illustrée en détail dans les exemples. On ob-' tient la tuftsine I en traitant par la trypsine ou par des enzy-35 Eies obtenues à partir des membranes des hématies et des membranes des polynucléaires neutrophiles, une fraction séparée sur une colonne de phosphocellulose (fraction PC I) On obtient les tuftsines II, III, et IV à partir de la • 71 45283 7 2118134 fraction IV séparée sur phosphocellulose (fraction PG IV) en la traitant par la trypsine ou une leucokininase préparée à partir de membranes de leucocytes neutrophiles et d'exsudats péx'itonéaux de lapin selon des techniques connues. Ces tuftsines 5 sont essentiellement des peptides et on les sépare du reste des protéines après traitement enzymatique, en précipitant ces derniers par de l'acide trichloraeétique à 5%» Le surnageant contient les tuftsines. On élimine l'acide trichloraeétique par extraction à l'éther et on lyophilise les tuftsines et on les 10 chromatographie sur des colonnes de Sephadex G-10 en équilibre avec un éluant mobile constitué d'acide acétique 0,1 ÏT saturé en chloroforme. On recueille ]'effluent par fractions de 1 ml. Les fractions 115 à 125 contiennent la tuftsine II et les fractions 135 à 158 contiennent les tuftsines III et IV. On lyophi-15 lise 1'effluent contenant les tuftsines III et IV et on le reprend dans un tampon pyridine-acétate à pH 4-. On chromatographie le mélange sur des colonnes de Dowex 50 à un pH de 4,0 à 6,0 et une concentration en pyridine de 1,2 à 2,5 M (technique à gradient linéaire). On recueille 1'effluent par fractions de 2 ml. t 20 La tuftsine III se trouve dans les fractions.'20 à 35 et la tuftsine IV dans les fractions 65 à 78. Lorsqu'on soumet la tuftsine IV à un?" chromatographie en couche mince en utilisant un mélange de pr'opanol et d'eau 2/1, on obtient une bande unique„ Après dansylation du peptide par 25 le chlorure de dansyle, on obtient une bande fluorescente unique en chromatographie en couche mince sur du gel de silice en utilisant un mélange chloroforme-méthanol-acide acétique 15/4-/1. L'hydrolyse de la tuftsine IV par de l'acide chlorhydrique 6 H à 105°0 pendant 20 heures donne de la thréonine, de la lysine, 30 de la proline et de 1'arginine dans le rapport molaire de 1,00/ 1,00/1,05/0,92. Par digestion par la carboxy-peptidase B, seule 1'arginine constituant 1'amino-acide terminal à groupe carboxy libre est libérée. Par digestion avec la leucine-aminopeptidase, seule la thréonine constituant 1'amino-acide terminal à groupe 35 amino libre est libérée. De plus, par dansylation des produits desréactions enzymatiques, on obtient uniquement comme composés dansylés libres la thréonine et 1'arginine. De plus, une réaction positive de Sakaguchi en chromatographie en couche mince sur gel de silice montre que 11arginine constitue 1'amino-acide terminal 71 45283 8 2118134 à groupe carboxy libre après réaction avec la carboxypeptidase B. L'échange par le tritium après traitement du peptide par l'anhydride acétique dans la pyridine en solution dans l'eau tritiée montre que 1'arginine constitue le seul résidu radio-5 actif. La résistance du peptide à la digestion par la trypsine prouve la présence de proline entre la lysine et 1'arginine. Après élimination de 1'arginine par la carboxypeptidase B, en chauffant à reflux le peptide restant avec de l'anhydride acétique pendant 45 minutes dans l'eau tritiée, on obtient comme 10 seul résidu radioactif, de la proline. La dansylation du peptide après élimination de la thréonine par 1'aminopeptidase forme de la didansyl-lysine ce qui montre que la lysine précède 1'amino-acide terminal à groupe amino libre» La structure de la tuftsine IV est donc Thr-Lys-Pro-Arg. Ceci est de plus confirmé par la 15 dégradation progressive d'Edman et l'identification d'un résidu thiohydant'oxne ainsi que par dansylation du résidu exposé et par la technique soustractive d'Edman. La nature de la tuftsine IV est finalement prouvée par sa synthèse à partir des amino-acides constitutifs, précisés ci-après et illustrés dans les exemples. 20 Selon un mode opératoire semblable, on détermine la struc ture des tuftsines I, II et III qui est essentiellement poly-peptidique. On peut également isoler la tuftsine IV de la fraction II de Cohn des gamma-globulines, qui est un produit du commerce, en 25 utilisant le procédé illustré dans les exemples, mais la qualité de ce produit Interdit son utilisation en pratique. L'essai suivant prouve 1''activation de la phagocytose sous l'effet des produits de l'invention : On recueille des leucocytes séparés de sang de chien ou 30 d'homme ou d'exsudats péritonéaux de lapins ou de cobayes, on les lave trois fois avec le milieu de Krebs-Binger et on les met en suspension dans ce milieu. On introduit dans un récipient > 4 reactionnel, 0,15 ml* de ce milieu contenant 4-5 x 10 leucocytes x neutrophiles par mm .On ajoute alors dans le récipient 0,1 ml. 35 le mélange de tuftsine contenant 0,2 à 2 Y , puis 0,05 ml. de staphylocoques opsonisés dans un sérum inactivé riche en opsonine. Ceci correspond à 1,5 à 2 bactéries par neutrophile. Le volume final est de 0,3 ml. On fait tourner le mélange à 8 tours/minute à 35°C.pendant une demi-heure. On réalise des étalements qu'on 71 45283 9 2118134 colore selon la méthode de Wright» L'indice de phagocytose correspond au pourcentage de cellules comptées ayant absorbé des bactéries. L'effet stimulant de la tuftsine IV et des produits appa-5 rentés de l'invention est détruit par incubation pendant 3 heures à 30°G avec de la pronase, de la subtilisine, de la carboxypeptidase B et de la leucine-aminopeptidase en utilisant 40 jag. ie protéine par ml, dans les conditions optimales d'activité enzymatique. Cet effet est également détruit par incubation avec 10 le surnageant liquide de leucocytes éclatés et de préparation de membranes d'érythrocytes humains et de foies de rat à pH 7,0 dans le tampon phosphate. Dans tous ces milieux, la phagocytose a la même intensité que dans les témoins. La tuftsine IV n'est pas détruite par exposition à l'air en présence ou non de cystéi-15 ne, par chauffage à 80°C pendant 10 minutes dans l'éthanol à 80%, par traitement enzymatique par la trypsine, la chymotrypsine, la clostridiopeptidase B, la phosphatase, la désoxyribonucléase ou la ribonucléase. Après de tels traitements, la phagocytose est environ 2,5 fois supérieure à celle des témoins. La tuftsine IV 20 est soluble dans l'alcool à 95%> la pyridine et l'acide acétique et insoluble dans l'éther. Les produits de l'invention sont utiles comme agents thérapeutiques chez les mammifères et constituent des stimulants et des inhibiteurs à des doses extrêmement faibles. Les médecins 25 ou vétérinaires peuvent déterminer les doses convenant le mieux aux cas particuliers. Ces doses peuvent varier d'un malade à l'autre selon le poids, les conditions du traitement et d'autres facteurs facilement déterminés par l'homme de l'art. Dans l'administration continue, prolongée à des sujets présentant des 30 anomalies plus ou moins permanentes du métabolisme ou ayant subi une splénectomie, on utilise normalement des doses diverses allant d'une quantité relativement importante provoquant une concentration sanguine rapide à des doses relativement faibles maintenant une concentration efficace. Dans les traitements 35 discontinus, destinés à lutter contre des infections aiguës ou chroniques, on peut utiliser des doses variables. On peut administrer les produits à des doses très élevées pouvant atteindre 2 g»et plus par jour. Normalement, on réalise des doses unitaires contenant environ 250 mgo d'ingrédient actif dont on administre 71 45283 2118134 quotidiennement un nombre approprié au traitement. On peut administrer les produits de l'invention seuls, mais on les administre généralement en association avec des supports atoxiques convenant en pharmacie dont les proportions 5 dépendent en particulier de la nature chimique des supports4 de la voie d'administration, et des usages pharmaceutiques habi- ' tuels. Par exemple, pour lutter contre diverses infections ou maintenir des concentrations thérapeutiques dans le sang ou les tissus, on peut administrer les produits de l'invention par 10 voie orale sous forme de comprimés ou de capsules contenant des excipients tels que l'amidon, le lactose, certains types d'argile, etc. Ces formes peuvent être à délitage intestinal pour mieux résister à l'acidité et aux enzymes digestives de l'estomac. Pour l'administration intraveineuse et intramusculaire, on 15 peut les utiliser sous forme d'une solution stérile contenant d'autres composés dissous, par exemple des quantités de sel ou de glucose rendant la solution isotonique. Un des avantages particuliers des produits de l'invention est que contrairement à la plupart des produits thérapeutiques 20 comportant une liaison peptidique, ils résistent à l'hydrolyse enzymatique sous l'effet des enzymes des voies gastro-intestinales inférieures. En raison de leur nature amphotère on peut les adsorber pour l'administration orale sur des résines échangeuses d'ions non toxiques qui peuvent être anioniques ou cationiques 25 pour obtenir une libération lente dans l'estomac ou l'intestin ou les deux. De plus, l'adsorptioh sur ces résines rend les produits de l'invention plus résistants à la destruction enzymatique. TJn autre avantage de la nature amphotère des produits de l'invention est qu'on peut les utiliser sous forme de sels conve-30 nant en pharmacologie qui peuvent être des sels métalliques ou des sels résultant de l'addition d'acide. Ces sels présentent l'avantage d'être solubles dans l'eau et conviennent particulièrement à l'administration parentérale. Les sels métalliques, en particulier les sels de métaux alcalins sont relativement sta-35 bles et on les préfère pour cela aux sels résultant de l'addition d'acide. On préfère en particulier les sels de sodium en raison de la facilité de leur préparation. On peut citer comme acides convenant à la préparation de sels résultant de l'addition d'acides convenant en pharmacologie, 71 45283 n 2118134 de l'invention, les acides contenant des anions non toxiques tels que l'acide chlorhydrique, sulfurique, phosphorique, acétique, lactique, citrique, tartrique, oxalique, succinique, maléi-que, gluconique, saccharique et similaires. 5 On peut synthétiser les polypeptides de l'invention selon l'une quelconque des diverses techniques connues de synthèse de polypeptides simples et complexes et même de protéines de poids moléculaire relativement faible. En général ces techniques comportent une synthèse progressive par additions successives 10 d1 amino-acides formant des molécules de taille croissante. On unit les amino-acides par condensation entre le groupe carboxyle d'un amino-acide et le groupe amino de l'autre amino-acide pour former une liaison peptidique. Pour diriger ces réactions, il est nécessaire de bloquer le groupe amino d'un des acides et le 15 groupe carboxyle de l'autre. Bien entendu, les groupes de blocage doivent être faciles à éliminer. La série de réactions ne doit pas provoquer de racémisation des produits. Certains amino-acides comportent des groupes fonctionnels additionnels, comme par exemple le groupe hydroxyle de la tyrosine ou de la thréonine. Il est 20 généralement nécessaire de bloquer ces groupes additionnels par un agent de blocage facile à éliminer pour qu'il ne gêne pas les réactions de condensation . On connaît dans l'art un grand nombre de techniques de synthèse des polypeptides et une grande diversité d'agents 25 de blocage. La plupart de ces techniques conviennent à la synthèse de la catégorie de polypeptides de l'invention. La description de toutes ces techniques est inutile et plusieurs d'entre elles sont décrites dans les exemples. On préfère pour synthétiser les polypeptides de l'invention, 30 la technique de Merrifield et la technique à l'anhydride de ÏT-carboxy-amino-acide. Dans la première technique, on fixe tout d'abord un amino-acide sur une particule de résine, par exemple, par une liaison ester et on forme progressivement le peptide par additions successives d'amino-acides protégés à la chaîne. Dans 35 la seconde technique, on fait réagir tin anhydride de N-carboxy-amino-acide avec le groupe amino d'un second acide ou d'un peptide dans des conditions telles que seul le groupe amino présent à une concentration appréciable sous forme réactive pendant la réaction soit le groupe amino devant entrer en réaction. On 71 45283 12 2118134 obtient cette régulation en choisissant la concentration, la température, la durée et la concentration en ions hydrogène. La réaction d'enchaînement se produit normalement en conditions alcalines, généralement à un pH d'environ 8,5 à 11. On réalise 5 ensuite la décarboxylation du carbamate intermédiaire en abaissant le pH à environ 3 à 5- On peut faire réagir le produit formé avec un autre anhydride de N-carboxy-amino-acide sans isolement et pratiquement dans les mêmes conditions. Cette technique permet de préparer très rapidement des polypeptides. 10 On synthétise la tuftsine IV et la rétrotuftsine IV selon ces techniques ou d'autres illustrées dans les exemples. La tuftsine IV synthétique est identique au produit isolé selon le mode opératoire précédemment décrit. Une des raisons pour lesquelles on préfère la tuftsine IV 15 et la rétrotuftsine IV est leur activité élevée. Une autre raison est qu'on peut facilement leur faire subir de légères modifications moléculaires pour obtenir des composés ayant une activité supérieure ou inférieure aux tétrapeptides d'origine, ou plus ou moins facilement adsorbés par les tissus ou convenant particuliè-20 rement à une voie d'administration déterminée. Bien que les tétrapeptides constituent les composés préférentiels, on peut décrire de façon générale les composés de l'invention comme des polypeptides convenant en thérapeutique sans caractère antigénique, comportant au moins 3 et jusqu'à 25 environ 19 amino-acides comportant un ou plusieurs motifs constitués de 3 à 5 amino-acides, chaque motif étant réuni à un motif adjacent par de la proline ou de la cystine, et chaque motif comportant deux amino-acides basiques réunis par une ou deux molécules de proline. Bien que les motifs soient générale-30 ment identiques, il n'est pas indispensable qu'ils le soient. Les sels convenant en pharmacologie et les dérivés de ces polypeptides entrent également dans le cadre de l'invention. On peut donc citer comme composants caractéristiques de l'invention: Lys-Pro-Arg 35 Lys-Pro-Arg-Pro-Lys-Pro-Arg Arg-Pro-Lys-Thr-Cys-Oys-Thr-Lys-Pro-Arg Thr-Lys-Pro-Arg-Pro-Thr-Lys-Pro-Arg-Pro-Thr-Lys-Pro-Arg- Pro-Thr-Lys-Pro-Arg. Parmi les polypeptides comportant plus de quatre amino- 71 45283 13 2118134 acides on préfère les nonapeptides car ils ne sont pas trop difficiles à préparere Ils conviennent particulièrement aux malades soumis à un traitement continu par la tuftsine car ils permettent de réduire le nombre de doses unitaires ingérées sans 5 réduire les concentrations sanguines. Le poids moléculaire d'un nonapsptide est suffisamment faible pour qu'il n'y existe pratiquement pas de risques de réponse antigénique ou allergique même chez les sujets hypersensibles. De plus, en raison de leur faible poids moléculaire, les nonapeptides diffusent rapidement 10 à travers le péritoine. Bien qu'en théorie on puisse utiliser pratiquement un amino-acide quelconque pour unir les motifs, on préfère utiliser la proline et la cystine. La raison en est que ces amino-acides forment des liaisons peptidiques qui résistent relativement bien 15 aux enzymes des voies digestives. Comme dans les traitements à long terme, on utilise normalement des produits de l'invention de poids moléculaire élevé, on préfère les administrer par voie orale. Il est donc essentiel que les agents administrés par voie orale résistent suffisamment à la digestion pour être absorbés. 20 On peut utiliser l'un quelconque des nombreux dérivés non toxiques des polypeptides de l'invention. Les sels convenant en phaimacologie ont déjà été cités. On peut également utiliser des ami des, des esters, des dérivés acylés et autres. On peut facilement, par exemple, transformer la tuftsine IV 25 en un amide. Par exemple, on peut faire réagir le tétrapeptide-avec du chlorure de thionyle pour former le chlorure d'acide et faire réagir celui-ci avec de l'ammoniac dans des conditions réduisant au minimum la racémisation pour former l'amide. Egalement, on peut former le tétrapeptide en enchaînant successive-30 ment de la proline, de la lysine et de la thréonine à un ester d'arginine et transformer l'ester de tétrapeptide obtenu en un amide par ammoniolyse. Cet ester peut, par exemple, être un ester d'un alcanol inférieur quelconque comportant jusqu'à environ six atomes de carbone. 35 L'organisme contient des enzymes qui hydrolysent les groupes amide et ester an libérant le pouvoir stimulant de l'acide. Les dérivés sous forme d'ester et d'amide constituent des agents thérapeutiques utiles car leur stabilité chimique est supérieure à celle des acides libres. Ils ont des taux 71 45283 2118134 d'absorption et de diffusion modifiés dans les tissus et leur excrétion rénale est retardée* On peut les.utiliser sous forme de sels convenant en pharmacologie» On peut réaliser d'autres dérivés utiles en modifiant les 5 groupes fonctionnels libres du squelette polypeptidique, par exemple, les groupes hydroxyle libres ou les groupes amino libres. Une catégorie particulièrement appropriée de dérivés est constituée par ceux dans lesquels un groupe hydroxyle libre, par exemple le groupe hydroxyle libre de la thréonine ou de la 10 tyrosine est estérifié par un groupe alcanoyle ou alcénoyle comportant jusqu'à 18 atomes de carbone ou plus. Egalement, on peut acyler un groupe amino, par exemple le groupe amino de la thréonine ou de la lysine par un groupe alcanoyle ou alcénoyle comportant jusqu'à 18 atomes de carbone environ. Dans les deux 15 cas, on préfère les dérivés dans lesquels les groupes formant le dérivé comportent de 11 à 18 atomes de carbone, car les chaînes hydrocarbonées longues améliorant la solubilité des molécules dans les lipides et leur passage à travers les barrières cellulaires. 20 On peut préparer ces deux types de dérivés directement à partir des polypeptides, mais on préfère les préparer en incorporant au peptide lors de la synthèse à un amino-acide comportant déjà le groupe choisi, par exemple le groupe alcanoyle. Bien que les tuftsines et les autres polypeptides de l'in-25 vention soient en un certain sens des agents thérapeutiques naturels, et puissent être utilisées seules à cet effet, on les administre souvent avec un ou plusieurs autres composés thérapeutiques actifs tels qu'un antibiotique, un antifongique, ou un agent antiviral. Une des raisons en est qu'on doit combattre les 30 infections aiguës pouvant être mortelles avec toutes les ressources disponibles. Une autre raison est qu'il est nécessaire d'évacuer les toxines en particulier les endotoxines des bactéries grain négatif et les autres débris qui s'accumulent dans les tissus et le sang par suite de la mort des micro-organismes 35 infectieux. La toxémie provoquée par cette accumulation est souvent auec-'i danger eus' sinon plus pour la santé du malade que l'infection d'origine. La présence de tuftsine IV ou d'un composé analogue aide l'organisme à éliminer les endotoxines. On peut 71 45283 15 2118134 administrer les produits de l'invention en association avec des composés tels que la tétracycline, la chlorotétracycline, la néomycine, 1 *érythromycine, la novobiocine, la pénicilline, le chloramphénicol, et la nitrofurazone. 5 On peut également combiner chimiquement les composés de l'invention avec d'autres agents tels que des antibiotiques pour que les deux composés soient apportés simultanément au même site et exercent tous deux leur effet salutaire. Par exemple, on peut utiliser le groupe carboxyle de la pénicilline pour estérifier 10 la tuftsine IV par l'intermédiaire du groupe hydroxyle de la thréonine. On peut également former line liaison amide en utilisant le groupe oC -amino de la thréonine ou le groupe £> -amino de la lysine. On peut également utiliser les peptides stimulants de 15 l'invention pour conserver les propriétés du sang total. On a constaté qu'en cours de conservation dans les conditions normales de réfrigération, le sang total perd son pouvoir phagocytaire et que les globules blancs .tendent à disparaître. L'addition de petites quantités de tuftsine IV, par exemple, inverse cette 20 tendance. D'autres caractéristiques et avantages de l'invention seront mieux compris à la lecture de la description qui va suivre de plusieurs exemples de réalisation. EXEMPLE 1 25 Préparation de tuftsines à partir de gamma-globulines par l'intermédiaire de la leucokinine. On introduit 150 mg.de gamma-globulines de la fraction II de Cohn dans 10 ml. de tampon acétate 0,05 M (pH 4,8) dans une 'colonne de 4x12cm garnie de phosphate de cellulose qu'on a préa-30 lablement équilibra avec le même tampon. On ajuste le débit à 2 ml/minute et on recueille 1'effluent par fractions de 4,0 ml. On fait passer à travers la colonne trois à quatre fois le volume retenu de tampon solvant (400 à 550 ml) pour que toute albumine contaminante éventuelle soit chassée. L'effluent ne 35 contient pas de gamma-globulines. On élue la première fraction des gamma-globulines avec du tampon acétate 0,05 M (pH 4,8) dans du chlorure de sodium 0,15 M. Cette fraction contient 51 mg-de protéines (34-%). On poursuit l'élution avec le même tampon jusqu'à ce que l'absorbance à 280 mja corresponde à celle du 71 45283 « 2118134 tampon. On poursuit de façon habituelle en recueillant les fractions jusqu'à ce que le volume de tampon éluant ayant traversé la colc-nne corresponde à 1,3 à 1,7 fois le volume retenu, c'est-à-dire jusqu'à ce qu'on ait recueilli 180 à 230 ml d'ef-5 fluent. On élue la seconde fraction contenant 37 mg de gammaglobulines (23,0 %) avec du tampon acétate 0,05 M (pH 5,0) dans le chlorure de sodium 0,15 M; et on élue la troisième fraction de 29 mg.(l9%) à pH 5>2 en utilisant des concentrations de tampon et de sel identiques. Finalement, on élue la quatrième frac-10 tion en obtenant 20 mg.de gamma-globulines (13%) en élevant le pH à 5j/t- et la concentration en chlorure de sodium à 0,2 H. L'analyse des résultats, exprimés en protéines totales récupérées dans chaque fraction correspond à une déviation standard d'environ _+ 5% pour les deux premières fractions et d'environ 15 _+ 2% pour les deux dernières. On soumet les fractions séparées à une nouvelle chromatographie. On ajuste chaque fraction à 0,60 de la saturation avec du sulfate d'ammonium solide et on laisse reposer.pendant 8 heures à 0°G. On recueille les protéines précipitées par centri-20 fugation et on les dialyse contre du tampon acétate 0,05 II à pH 4,8. Les conditions de cette seconde chromatographie sont les mêmes que ci-dessus. On utilise le procédé de préparation ci-dessus en obtenant seulement 100 mg. de fraction IV (PC IV) contenant de la leucokinine. 25 On réalise la digestion de 100 mg. de fraction PC IV avec de la leucokininase préparée à partir de membranes de leucocytes polynucléaires d'homme, de chien ou de lapin. On ajoute 5 jugode leucokininase par mg.de fraction PC IV, dans un volume final de 25 ml.de tampon phosphate 0,1 M à pH 30 6,7. On incube pendant deux heures à 37°C. On arrête la réaction en ajoutant de l'acide trichloraeétique jusqu'à obtention d'une concentration finale de 5%« On sépare le précipité. Après extraction à l'éther pour éliminer l'acide trichloraeétique, on lyophilise le produit et on le fractionne sur une colonne de 35 Dowex 10 équilibrée avec le liquide éluant qui est constitué d'acide acétique 0,1 M saturé en chloroforme; la charge de la colonne est de 295 ml; le volume de vide de 115 ml; la hauteur de 118 cm, le diamètre intérieur de 1,8 cm. On recueille des échantillons de 1 ml. dans les tubes d'un collecteur automatique 71 45283 17 2118134 de fractions. L'effluent des tubes n°H5 à 125 contient la tuftsine II et l'effluent des tubes n°.135 à 158 contient les tuftsines III et IV. On lyophilise l'effluent contenant les tuftsines III et IV et on reprend le produit lyophilisé dans 5 un tampon pyridine-acétate à pH 4, ayant une concentration en pyridine de 1,2 M. On réalise ensuite une chromatographie sur une colonne d'aminex, haute de 60 cm, ayant un diamètre intérieur de 0,6 cm, en éluant par un gradient linéaire à 60°C. le tampon de départ est ion tampon pyridine-acétate à pH 4,0 dans 10 lequel la concentration de la pyridine est de 1,2 M; et le tampon pyridine-acétate final est à pH 6,0, et la concentration de la pyridine est de 2,5 M. On recueille dans chaque tube des fractions de 2 ml. L'effluent des tubes 20 à 35 est constitué de tuftsine III. On recueille la tuftsine IV dans l'effluent des 15 tubes n° 65 à 78. Cet effluent forme un pic étroit symétrique. Par chromatographie en couche mince sur gel de silice, en utilisant line solution développante constituée de propanol et d'eau dans un rapport de 2/1, on obtient une bande unique. Par dansylation du peptide avec du chlorure de dansyle, on obtient une 20 bande unique fluorescente par chromatographie en couche mince sur gel de silice en utilisant une solution développante constituée de chloroforme, de méthanol et d'acide acétique dans le rapport de 15/4-/1. -r.Jûa composition en amino-acides après hydrolyse dans l'aci-25 de chlorhydrique 6 F à 105°C pendant 20 heures, donne les rapports molaires suivants : thréonine = 1,01; lysine = 1,00; proline = 1507; et arginine = 0,90. Tous les amino-acides sont sous la forme L. Par digestion avec la carboxypeptidase B à 80 yi>ar ml. à 20°C pendant 2 heures à pH 7*4-, seule l'arginine 30 constituant 1'amino-acide terminal à groupe carboxyle libre est libérée à une concentration de 50% du peptide. Après digestion 1 ir la leucine-aminopeptidase à 80 ^par ml. à 25°C pendant deux heures à pH 8,5 avec du chlorure de magnésium 3 x 10~^M, seule la thréonine constituant 1'amino-acide terminal à groupe amino 35 libre est libérée à 30% par rapport au peptide. Le tétrapeptide a donc pour composition Thr-Lys-Pro-Arg, et la quantité récupérée est d'environ 1 000_jig. ce qui correspond à un rendement de 1,0 jag. pour 1.000 jig. de la fraction PC IV ou de 1,0 jig. pour 10 000 jag. de gamma-globulines totales. 71 45283 2118134 EXEMPLE II Préparation de tuftsines à partir de la fraction II de Cohn„ On réalise la digestion d'un gramme de fraction II de 5 Colin de gamma-globulines avec de la trypsine, en utilisant 5 mg de trypsine pour 100 mgode gamma-globulines dans du tampon TRIS-chloruré 0,1 M ayant une concentration en calcium de 0,01 M à pH 8.1 pendant une heure à 37°C. sous un volume final de 250 ml. On sépare par précipitation dans l'acide trichloraeétique à 5% 10 la tuftsine libérée du reste des gamma-globulines et on rejette le précipité. On extrait le surnageant trois fois à l'éther et on lyophiline et on reprend dans 0,5 ml o d'acide acétique 0,1 M et on chromatographie sur colonne de Sephadex G-10 équilibrée avec de l'acide acétique 0,1 M constituant également la solution 15 éluante; le volume du garnissage de la colonne est de 295 ml» le volume de vide de 115 ml» la hauteur de 116 cm, le diamètre intérieur de 1,8 cm. On recueille des fractions de 1 ml„avec un collecteur automatique de fractions. L'effluent des tubes 115 à 125 contient la tuftsine II et l'effluent des tubes 135 20 à 158 contient les tuftsines III et IV. On lyophilise l'effluent contenant les tuftsines III et IV et on le reprend dans du tampon pyridine-acétate à pH 4, ayant une concentration en pyridine de 1,2 M. On chromatographie ensuite sur colonne d'aminex, haute de 60 cm, ayant un diamètre intérieur de 0,6 cm et on 25 élue avec un gradient linéaire à 60°C. Le tampon pyridine-acétate de départ est à pH 4,0 et a une concentration en pyridine de 1.2 M et le tampon pyi'idine-acétate final est à pH 6,0 et a une concentration en pyridine de 2,5 H. On recueille dans chaque tube des fractions de 2 ml, L'effluent recueilli dans les tubes 30 20 à 35 contient la tuftsine III. On recueille la tuftsine IV dans l'effluent des tubes 65 à 78. La tuftsine IV forme un pic étroit symétrique. Par chromatographie en couche mince sur gel de silice, en utilisant un mélange de propanol et d'eau 2/1, on obtient une bande unique. Après dansylation du peptide avec du 35 chlorure de dansyle, on obtient une bande fluorescente unique par chromatographie en couche mince avec du gel de silice en utilisant un mélange de chloroforme, de méthanol, et d'acide ac étique 15/4/1• La composition des amino-acides après hydrolyse dans 71 45283 19 2118134 l'acide chlorhydr i.que 6N à 105e0 pendant 20 heures donne les rapports molaires suivants ; thréonine = 1,03, lysine = 1,00, proline » 1,04- et arginine = 0,93. Après digestion par la carboxypeptidase B dan3 les conditions indiquées dans l'Exemple 1, 5 seule l'arginine constituant 1 ' amino-acide terminal à groupe carboxyle libre est libérée à la concentration d'environ 60% du peptide. Après digestion avec la leucine aminopeptidase comme dans l'Exemple 1, seule la thréonine constituant 1'amino-acide terminal à groupe amino libre est libérée à 35°/° du peptide. Tous 10 les amino-acides sont sous forme L. EXEMPLE III Préparation de tuftsine IV par digestion trypsique directe de gamms-globulin^s. On prépare des gamma-globulines fraîches à partir de 100 ml 15 de sérum humain ou de chien comme suit : on ajoute à 100 ml de sérum, 100 ml.de chlorure de sodium 0,15 H et 100 ml de solution de sulfate d'ammonium saturé* On laisse le précipité se former à la température ambiante pendant 2 heures. On le centrifuge et on le dissout dans 20 ml de chlorure de sodium 0,15 N. On ajoute 20 10 ml„de sulfate d'ammonium saturé. Après deux heiires de repos à la température ordinaire, on le porte à 5°C pendant une nuit. On centrifuge alors la préparation et on rejette le surnageant. On dialyse alors le précipité de gamma-globulines contre 1 1. de chlorure de sodium 0,15 N pendant 4 heures. On répète encore 25 deux fois la dialyse. On réalise ensuite la digestion de 1 g de gamma-globulines fraîchement préparées avec de la trypsine et on les traite sur des colonnes de Bowex et d'aminex, exactement comme dans l'Exemple II. Les résultats de l'analyse de la tuftsine IV sont égale-30 ment identiques : thréonine = 0,98 , lysine = 1)0, proline=1,03 et arginine = 0,87- EXEMPLE IV Préparation de tuftsine IV à partir de gamma-globulines fraîchement préparées. 35 On fractionne sur une colonne de phosphocellulose, comme dans l'Exemple 1, des gamma-globulines fraîchement préparées 3omme dans l'Exemple III. On traite alors 100 mg»de la fraction IV avec de la leucokinase et on fractionne sur des colonnes de Dowex 10 et d'aminex comme dans l'Exemple I. La tuftsine IV 40 isolée donne des résidus identiques et des concentrations 71 45283 2118134 semblables à celles des Exemples I, II et III : thréonine = 0,92, lysine = 1,00, proline = 1,04 et arginine = 0,97- EXEMPLE V Synthèse de la tuftsine IV p 5 On fait réagir 13,8 mmoles de tBOC-N -nitroarginine avec 10 g de résine chlorométhylée (résine de polystyrène-divinylbenzène chlorométhylée contenant 2,2 mmoles de chlorure par gramme de résine) dans un mélange à 12,4 mmoles de tri-éthylamine et 30 ml d'éthanol pendant 24 heures à 80°C sous 10 agitation magnétique constante. On lave soigneusement la résine à l'acide acétique, puis à l'éthanol absolu, avec de l'eau ayant une concentration croissante en éthanol, finalement avec de l'éthanol absolu puis du méthanol et du chlorure de méthylène. On sèche la résine sous vide à poids constant. On hydro-15 lyse 30 xag.de la résine avec de l'acide chlorhydrique 6 N dans le dioxanne pendant 24 heures. On sèche le filtrat sous vide et on le dissout dans du tampon citrate 0,2 M à pH 2,2. On analyse une fraction appropriée avec un analyseur d'amino-acides. On détermine l'ornithine, 1'arginine et la nitroarginine. Les deux 20 premiers constituants sont des sous-produits de l'hydrolyse acide de la nitroarginine-résine. La somme des trois constituants correspond à la quantité de t-BOC-nitroarginine estérifiée qui correspond à 0,3 mmole par gramme de résine. On place 1,5 g de résine correspondant à 0,45 mmole de 25 t-BOC-nitroarginine dans un flacon pour réaction de Merrifield dont il constitue la phase solide, fixé par une pince à l'arbre d'un moteur à rotation alternative de 180°. Toutes les manipulations qui suivent sont réalisées à la température ordinaire avec une agitation alternative de 180° si bien que la résine 30 est constamment agitée. On clive le groupe t-BOC protecteur avec 15 ml d'acide trifluoroacétique dans le chlorure de méthylène pendant une durée réactionnelle de 30 minutes. On lave alors la résine au chlorure de méthylène puis par 3 portions de 15 ml de chloroforme. On ajoute 1 ml de triméthylaminé et 9 ml.de chlo-35 roforme à la résine et on agite pendant 10 minutes pour neutraliser le chlorhydrate. On lave ensuite au chloroforme et au chlorure de méthylène comme précédemment. On couple alors le N de la nitroarginine avec 1,35 mmole de t-BOC proline dans 15 ml de chlorure de méthylène, en utilisant 1,35 mmole de dicyclo^ 71 45283 ai 2118134 hexylcarbodiimide pendant deux heures en agitant de façon continue. On lave la résine à l'éthanol, au chloroforme et au chlorure de méthylène, en utilisant chaque fois 3 portions de 15 ml- On élimine le groupe t-BOC de la proline avec de l'acide trifluoro-5 acétique à 50% dans le chlorure de méthylène, on lave et on neutralise à la triéthylamine comme précédemment. De façon semblable, on combine 1,35mmole de t-BOC carbobenzoxylysine (carbo- benzoxy » CBZ) à la proline, on élimine le groupe protecteur, oC on neutralise et on combine au ¥ de la lysine dont on a éliminé 10 le groupe protecteur, 1,35 mmole de N^-t-BOC-O-benzyl thréonine. On répète pour chaque reste d'amino-acide, de façon identique, les stades d'élimination du groupe protecteur (clivage du groupe t-BOC seul) à l'acide trichloraeétique de lavage, de neutralisation par la triéthylamine, de lavage et de combinaison avec le 15 dicyclohexylcarbodiimide. On hydrolyse 30 mg de tétrapeptide-résine avec de l'acide chlorhydrique 6 N dans le dioxanne pendant 18 heures et on analyse le produit avec un analyseur d'amino-acides. On obtient les rapports suivants: Eir = 0,9; Lys = 1,0; Pro = 1,08; Arg » 1,0. 20 La quantité de dérivé d*arginine correspond à la somme de l'arginine, de l'ornithine et de la nitroarginine. On sépare le tétrapeptide de la résine en utilisant de 1'.acide bromhydrique dans l'acide trifluoroacétique à la température ambiante pendant 1,5 heure. On sèche ensuite sous vide, on lave deux fois 25 à l'eau et on lyophilise. Le tétrapeptide pèse 176 mg ce qui correspond à un rendement de 78% par rapport à 1'arginine estéri-fiée . On le reprend dans 10 ml de méthanol contenant 10% d'acide acétique. Puis on le soumet à une hydrogénation cataly-tique avec deux fois son poids, soit 350 mg de palladium sur 30 sulfate de baryum sous une pression d'hydrogène de 4,1 bars en agitant de façon continue pendant 24 heures, durée après laquelle on n'observe pas de pic d'absorption de la nitroarginine à 271 mja. On analyse, à nouveau une portion hydrolysée par de l'acide chlorhydrique 6 F en solution aqueuse. On obtient des 35 valeurs semblables : Thr = 0,92, Lys= 1,0; Pro = 1,05; Arg=0,98 On chromatographie alors ce produit sur une colonne d'aminex avec un gradient linéaire de pH de 4 à 6 et de la pyridine 1,2 M à 2,5 M à un débit de 8 ml. par heure. Le pic principal correspondant au tétrapeptide apparaît exactement à l'emplacement 71 45283 22 2118134 du pic de la tuftsine IV préparée à partir de la fraction CP IV des gamma-globulines, c'est-à-dire entre 138 et 150 ml centré à 144 ml.d1effluent. On sèche sous vide le produit recueilli, on le lave deux fois avec de l'acide acétique 0,1 molaire, on le 5 reprend dans l'acide acétique 0,1 molaire, et on le lyophilise. L'analyse des amino-acides donne les rapports suivants : Thr = 0,96; Lys = 1,0; Pro = 1,03; Arg = 1,0. Tous les amino-acides sont sous la forme L. On transforme le tétrapeptide qui est sous forme de di-10 acétate en sel de sodium en ajoutant trois équivalents d'hydro-xyde de sodium. Le rendement final par rapport à la nitroarginine estéri-fiée avec la résine est d'environ 65%. On reprend le mode opératoire pour former le même tétra-15 peptide dont tous les amino-acides sont sous forme D. On reprend deux fois le mode opératoire en remplaçant la thréonine par la sérine et en réalisant la forme où tous les amino-acides sont sous forme L et celle où tous les amino-acides sont sous forme D. EXEMPLE VI 20 Synthèse de la tuftsine IV On estérifie de la t-BOC nitroarginine sur la résine chlorométhylée, on élimine le groupe protecteur, on neutralise et on lave comme dans l'Exemple I, en réalisant un lavage supplémentaire avec du diméthylformamide. On utilise comme matière de 25 départ 1,2 g de produit contenant 0,25 mmole d'arginine. On ajoute à la résine dans le diméthylformamide 1,0 mmole d'ester succinimidique de t-BOC proline et on laisse réagir pendant 24 heures en agitant à la température ambiante. On élimine le groupe protecteur, on neutralise et on lave comme dans l'Exemple V, en 30 réalisant un lavage final au diméthylformamide, en opérant de même pour les enchaînements successifs avec 1 mmole d'esters N-hydroxysuccinimi cliques de IT0^" t-BOC CBZ lysine et t-BOC-O-benzyl thréonine. Le clivage de la résine, l'hydrogénation catalytique et la purification sur colonne sont exactement 35 les mêmes que dans l'Exemple V. Les fractions éluées de la colonne d'aminex montrent, comme dans l'Exemple V un pic principal correspondant à la position de la tuftsine IV. Le rendement par rapport à 1'arginine estérifiée est de 34-%. Après clivage de la résine, les rapports des acides aminés sont les suivants : 71 45283 23 2118134 Thr= 0,85; Lys « 1,0 ; Pro - 0,95; Arg = 1,08. Après purification sur aminex, ces rapports sont de : Thr = 0,93; Lys =..1,0; Pro = 1,05; Arg « 0,98. On sèche le tétrapeptide sous vide, on le lave deux fois à l'acide acétique 0,1 M et on le lyophilise finalement 5 dans de l'acide acétique 0,1 M et on le transforme en sel de sodium comme dans l'Exemple V. On prépare de même les tripeptides Lys-Pro-Arg dans lesquels tous les amino-acides sont sous forme D ou L en supprimant la réaction avec la thréonine protégée. 10 EXEMPLE VII dC G- On estérifie de la N t-BOC H nitroarginine sur la résine comme dans l'Exemple V, on élimine le groupe protecteur on lave et on neutralise comme dans l'Exemple V. On fait réagir-1,2 g de produit contenant 0,32 imiole d'arginine avec 1,28 15 mmole d'ester-p-nitrophénylique de t-BOC proline dans 10 ml de diméthylformamide en agitant pendant 18 heures à la température ambiante. Lorsque la réaction est achevée, on clive le groupe t-BOC, on neutralise la résine et on lave comme dans l'Exemple VI. On réalise les enchaînements suivants avec l'ester p-nitro-20 phénylique de la H"t-BOC N ^ CBZ lysine puis l'ester p-nitro-phénylique de la t-BOC-O-benzyl thréonine. On élimine les groupes protecteurs des groupes oC -amxno, on lave et on neutralise, on clive la résine et on procède à une hydrogénation catalytique comme dans l'Exemple VI. On réalise une chromâto-25 graphie sur colonne d'aminex, comme dans l'Exemple V, pour isoler la tuftsine IV pure. L'analyse du produit correspondant au pic principal donne les rapports suivants: Thr = 0,90; Lys = 1,0; Pro = 1,03; Arg » 1,03. On obtient un rendement final de 65% par rapport à l'arginine estérifiée. 30 EXEMPLE VIII Synthèse de la tuftsine IV On fait réagir 0,2 mmole d'arginine (monochlorhydrate) dans 2 ml d'eau contenant 0,13 ml de triéthylamine avec 0,6 nmole d'ester N-hydroxysuccinimidique (Osu) de N t-BOC proline 35 dana 5 ml de tétrahydrofuranne en agitant de façon continue à la température ambiante pendant 24 heures. On sèche ensuite sous vide et on reprend le résidu dans de l'acide acétique 0,1 M et on le lyophilise. On dissout alors le produit dans l'eau et on le chromatographie avec un gradient linéaire de pyridine-acétate 71 45283 24 2118134 ; sur une colonne d'aminex de 0,6 cm de diamètre et de 60 cm. de hauteur à 60°G à un pH de 3)1 à 5S6, la concentration en pyridine allant de 0,2 K à 4 M, et on recueille dans chaque tube des fractions de 2 ml. à un débit de 8 ml à l'heure. Dans ces condi- cKj 5 tions, le N t-BOC Pro-Osu et l'acide libre ne se fixent pas sur la colonne et sont élués au début. On isole la fraction principale correspondant à une réaction de Sakaguchi positive et correspondant au dipeptide et on la lyophilise, on la reprend par l'eau et on la lyophilise à nouveau jusqu'à poids constant. 10 On place alors le dipeptide protégé (60 mg.) dans un bain glacé et on ajoute 1,0 ml.d'acide trifluoroacétique glacé. On maintient le peptide dissous dans le bain glacé pendant 15 minutes. On dilue ensuite par 40 ml d'esu glacée, on extrait deux fois avec 80 ml d'éther glacé. On extrait les couches éthérées combinées 15 par deux fois 20 ml.d'eau glacée et on lyophilise l'ensemble des phases aqueuses. On reprend le dipeptide dans 2 ml.d'eau, on ajoute 0,12 ml de triéthylamine et on fait réagir avec 0,58 of ç ranolâ d'ester K-hydroxysuccinimddique de H t-BOC N ^ CBZ lysine dans 5 ml.de tétrahydrofuranne à la température ordinaire, pen-20 dant 24 heures, en agitant. On sèche à nouveau le produit sous vide, on le reprend par de l'acide acétique 0,1 M et ofi*Jle lyophilise. On le dissout ensuite dans l'eau et on le chromatographie sur la même colonne d'aminex, si ce n'est que le gradient de 1'éluant constitué de pyridine-acétate a'un pH allant de 4 à 25 6 et une concentration en pyridine comprise entre 1,2 M et 2,5 H. La lysine-Osu protégée n'ayant pas réagi ne se fixe pas. Le pic principal est constitué du tripeptide, Lys-Pro-Ax*g correspondant à un rapport des amino-acides respectifs de 1,0, 1,08, 0,97» On sèche ce tripeptide et on le lyophilise sous forme 30 d'une solution aqueuse, on élimine le groupe protecteur par l'acide trifluoroacétique et on extrait par l'éther dans les mêmes conditions que pour le dipeptide. Le rendement est de 93 mg. oC Finalement, on fait réagir 0,58 mmole de N t-BOC-O-benzyl-thréonine-Osu, dans 5 ml-de tétrahydrofuranne avec le 35 tripeptide dans 2 ml.d'eau et 0,13ml. de triéthylamine et on traite en utilisant le même gradient de pyridine-acétate sur une colonne d'aminex. Le pic principal correspond au tétrapeptide protégé t-BOC-Thr-O-benzyl-ET ^ CBZ-Lys-Pro-Arg. On lyophilise comme précédemment à poids constant en obtenant 118 mg. 71 45283 25 2118134 de produit et on élimine le groupe protecteur avec de l'acide fluorhydrique. On isole le peptide libre sur une colonne d'aminex comme dans l'Exemple V. L'analyse fournit les rapports suivants : Thr = 0,95; Lys = 1,0; Pro = 0,98; Arg =1,03 5 EXEMPLE IX Synthèse de la tuftsine IV On reprend les divers stades de la synthèse du premier dipeptide en utilisant l1arginine et l'ester p-nitrophénylique {/L de la N t-BOC proline, pratiquement selon la technique de 10 l'Exemple VIII. La durée de réaction est de 18 heures. On fractionne sur colonne d'aminex, on élimine les groupes protecteurs oC et on combine avec l'ester p-nitrophénylique de la N t-BOO N £ CBZ lysine, comme dans l'Exemple VIII. On purifie de même sur aminex, on élimine le groupe protecteur et on fait réagir oC. 15 avec l'ester 2,4-dinitrophénylique de la N t-BOC-O-benzyl-thréonine puis on purifie et on isole le tétrapeptide et on élimine le groupe protecteur par l'acide fluorhydrique et on réalise la chromatographie habituelle sur aminex. On reprend pratiquement les stades utilisés avec l'ester IT-hydroxysuccini-20 midique de l'Exemple VIII. Le rendement et la pureté sont semblables à ceux des exemples précédents et les rapports des amino-acides dans le tétrapeptide sont : Thr = 0,98; Lys = 1,0; Pro « 1,03; Arg « 0,95« EXEMPLE X 25 Synthèse de la tuftsine IV On dissout 0,5 mmole d'arginine libre dans 2,5 ml.de tampon borate à 0,5 M à pH 10,5 refroidi à 0°C en mélangeant rapidement à 0°C dans un bain glacé. On ajoute 0,55 mmole de K-carboxy anhydride de proline en deux parties égales à 1 minute 30 d'intervalle en maintenant le pH par addition d'hydroxyde de sodium 10 N. Une minute après addition on porte le pH à 4,8 en ajoutant de l'acide sulfurique concentré. On fait barboter de l'azote dans la solution pour chasser l'anhydride carbonique formé à partir du carbamate de peptide obtenu. On élève le pH 35 à 10,2 et on ajoute 0,55 mmole de N-carboxy anhydride de N ^CBZ lysine et on laisse la réaction se poursuivre pendant 2 minutes en maintenant le pH à 10,0 avec de la soude 10 N à 0°C. On ajoute alors de l'acide sulfurique pour abaisser le pH à 5,0 en faisant barboter de l'azote. On fait alors passer la prépara-40 tion à travers une colonne de Sephadex G-10 équilibrée en acide 71 45283 26 2118134 acétique 0,1 M et on isole le peptide, on le lyophilise" et on le reprend dans 5 ml de tétrahydrofuranne contenant 0,13ml de triéthylamine et 1,5 raaole de N t-BOC-O-benzyl thréonine. On ajoute l'ester succinimidique et on agite à la température 5 ambiante pendant 24 heures. On évapore ensuite sous vide on reprend par de l'eau et on lyophilise à poids constant. On élimine ensuite le groupe protecteur avec de l'acide trifluoroacétique à 0°C pendant 20 minutes et on évapore sous vide le solvant. On lyophilise ensuite en solution aqueuse et on chromatographie 10 sur aminex comme dans l'Exemple I. Le rendement final est de 28 % par rapport à 1'arginine de départ. La composition du produit est la suivante : Ihr = 0,86; Lys = 1,0; Pro = 1,03; Arg = 0,96. On prépare de façon similaire la rétrotuftsine IV. On prépare de même le dérivé analogue de la tuftsine IV dans lequel la 15 tyrosine remplace la thréonine. On protège le groupe hydroxyle de la tyrosine pendant la synthèse en utilisant l'éther tétra-hydropyramylique selon le procédé décrit dans le brevet des Etats-Unis d'Amérique n° 3 467 667. On reprend le procédé de cet exemple pour préparer des 20 composés similaires,si ce n'est que les N-carboxyanhydrides des amino-acides basiques sont protégés sous forme de sels N-chloro-mercuriques comme décrit dans le brevet des Etats-Unis d'Amérique n° 3 459 760. Les rendements sont nettement améliorés. 25 EXEMPLE XI Préparation de tuftsine IV acylée On enchaîne 0,45 mmole d'ester de résine d'O-benzyl- P G- thréonyl-H -CBZ-lysyl-propyl-N nitro-arginine sur 1,3g de résine avec 1,5 mmole d'acide stéarique en utilisant 1,5 mmole 30 de dicyclohexylcarbodiimide dans un mélange de chloroforme et de "liméthylformamide 1/1. On réalise le clivage de la résine avec de l'acide bromhydrique dans l'acide trifluoroacétique, l'élimination des groupes protecteurs de la thréonine et de la lysine et l'hydrogénation catalytique de la nitroarginine en 35 arginine et en ammoniac comme dans les exemples précédents. Le rendement final en F stéaryl-tuftsine est de 63% à 71%* On obtient des résultats semblables avec d'autres acides gras avec un rendement compris entre 37% et 67%. Ces acides sont l'acide 71 45283 27 2118134 acétique, propioiiique, butyrique, laurique, myristique, palmi-tique, oléique, linoléique et linolénique. Dans le cas des trois derniers acides insaturés on ne peut réaliser l'hydrogénation directe car on réduirait 1'insaturation oléfinique. On traite 5 le polypeptide-résine par l'acide fluorhydrique en condition anhydre pour éliminer la totalité des groupes protecteurs et on obtient le dérivé acylé correspondant du fluorhydrate de tuftsine. Le rendement en lipoyl-tuftsines obtenues avec les acides gras insaturés est au minimum de 48 à 55%. 10 La purification des produits lipoylés obtenus varie avec la longueur des chaînes. Le contaminant principal est la tuftsine non combinée. Dans le cas de l'acétyl-, prôpionyl- et de la butyryl-tuftsine on réalise la séparation sur colonne d'aminex (Dowex 50) avec un gradient linéaire de tampon pyridine-acétate 15 ayant un pH compris entre 4,0 à 6,0 et une concentration molaire en pyridine de 1,2 H à 2,5 N. Le pic principal constitué par la lipoyl-tuftsine apparaît en premier et le pic moins important de la tuftsine libre apparaît ensuite. Avec des acides gras à chaîne supérieure on peut séparer 20 les constituants par chromatographie sur Dowex 10 avec de l'acide acétique 0,1 M. La tuftsine comportant un groupe HHg libre est très basique, s'unit au Sephadex et est retardée, et apparaît sous forme d'une substance de bas poids moléculaire avec les amino-acides libres. On transforme alors le sel de pyridi-25 nium isolé en sel de sodium par échange de base. EXEMPLE XII Formation de 0(Ehr)-stéaroyl-tuftsine IV On lave soigneusement 0,5 mmole de N^t-BOC-thréonyl-îï'*' n . CBZ-lysyl-prolyl ET -nitroarginine sur 1,5 g de résine avec du 3Ct chloroforme et du chlorure de méthylène et on ajoute 1,5 mmole / d'acide stéarique dans un mélange 1/1 de diméthylformamide et de chloroforme. On ajoute ensuite dans le même mélange solvant 1,5 mmole de carbonyl-diimidazole. On agite les constituants réactionnels à la température ambiante dans le récipient utilisé 35 pour la synthèse de Merrifield du peptide pendant 2 heures. On clive alors le peptide par l'acide bromhydrique dans l'acide trifluoroacétique pendant 1,5 heure à la température ambiante. On conduit alors l'hydrogénation catalytique et on purifie le produit obtenu comme dans les exemples précédents. 71 45283 28 2118134 On prépare de façon semblable d'autres dérivés alc-anoy-liques correspondant au dérivé ÎT-acylé de l'exemple précédent. EXEMPLE XIII Formation de N -pénicillinyl tuftsine IV". 5 On combine au total 0,43 mmole de la matière première uti lisée dans l'Exemple XI à 1,3 mm.ole de pénicilline avec 1,3 nmole de dicyclohexylcarbodiimide dans un mélange de chloroforme et de diméthylformamide 1/1 à la température ordinaire pendant 2 heures. On obtient la -pénicillinyl tuftsine IV sous forme 10 de fluorhydrate après élimination des groupes protecteurs selon l'Exemple XI et clivage de la résine par l'acide fluorhydrique en condition anhydre. On purifie le produit comme dans l'Exemple XI et on le transforme en sel de sodium par échange de base. EXEMPLE XIV 15 Formation de 0(Th.r)-pénicillinyl tuftsine IV. On prépare ce produit en utilisant le mode opératoire de l'Exemple XII en faisant réagir 0,46 mmole de peptide protège -résine avec 2,5 mmoles de pénicilline en utilisant comme agent de combinaison du carbonyldiimidazole dans un mélange 1/1 de 20 chloroforme et de diméthylformamide. EXEMPLE XV Préparation de Eir-Lys-Pro-Arg-Pro-Thr-Lys--Pro~Arg. On prépare ce nonapeptide en utilisant le mode opératoire de l'Exemple V. Après formation de Pro-Arg-résine on réalise la 25 combinaison des amino-acides suivants en utilisant trois équivalents d'acide protégé par rapport à 1'arginine de départ. Lorsque chaque réaction de combinaison est terminée on lave le produit à l'éthanol, au chloroforme et au chlorure de méthylène. On élimine les groupes protecteurs dans chaque stade par de 30 l'acide trifluoroacétique et on neutralise avec de la triéthylamine. On clive le nonapeptide de la résine par de l'acide brom-hydrique dans l'acide trifluoroacétique et on réduit les restes nitro-arginine par hydrogénation catalytique avec du palladium sur du sulfate de baryum. On réalise la purification sur Sephadex 35 G-10 puis sur colonne d'aminex. EXEMPLE XVI Préparation de comprimés On mélange soigneusement 1 000 g de tuftsine IV et 2 000 g de lactose et on les tamise avec un tamis de 0,60 mm d'ouverture ♦ 71 45283 29 2118134 de mailles. On prépare séparément une pâte constituée de 80g d'amidon de maïs et de 350 ml d'eau distillée. On malaxe soigneusement le mélange ci-dessus avec la pâte 5 et on fait passer le mélange au tamis de 4,7 mm d'ouverture de mailles et on sèche les globules obtenus à 50°C pendant 15 heures. On granule ensuite les globules séchés dans une machine à granuler puis on les fait passer au tamis de 1 mm d'ouverture de mailles. On recouvre les grains d'une poudre préparée en mélan-10 géant 30g de stéarate de calcium, 200 g d'amidon de maïs et 80g de talc puis on les fait passer au tamis de 0,4 mm d'ouverture de mailles. Selon les techniques connues de l'art on prépare des comprimés contenant 250 mg de tuftsine IV à partir des granule ci-15 dessus. EXEMPLE XVII Préparation d'une solution injectable. On dissout 100g du sel de sodium de la tuftsine IV dans de l'eau distillée apyrogène préparée spécialement à cet effet en 20 obtenant un volume total de 5 litres. On rend la solution isotonique en ajoutant une quantité déterminée d'une solution aqueuse de sel physiologique et on filtre sur un filtre bactérien Millipore. EXEMPLE XVIII 25 Préparation d'une solution aqueuse pour administration orale. On ajoute un mélange constitué de : Chlorhydrate de tuftsine IV 20,0 g Sucre de canne 100,0 g Glycérine 100,0 ml 30 p-oxybenzoate d'éthyle 1,5 ml Essence d'orange artificielle 0,2 ml Huile d'orange 1,0 ml à de l'eau distillée en obtenant un volume total de 1 000 ml. Bien entendu diverses modifications peuvent être apportées 35 par l'homme de l'art aux dispositifs ou procédés qui viennent d'être décrits uniquement à titre d'exemples non limitatifs sans sortir du cadre de l'invention. 71 45283 ÎO 2118134 tlTHlItllIOlS 1. Polypeptides nos antigéniques, caractérisés en ce qu'ils comportent au moins 3 et jusqu'à environ 19 amino-acides formant un ou plusieurs motifs, chaque motif comportant trois à cinq 5 amino-acides et étant uni à ion motif adjacent par de la proline ou de la cystine, et comportant 2 amino-acides "basiques réunis par 1 ou 2 molécules de proline ainsi que leurs sels et dérivés convenant en pharmacologie» 2. Polypeptide selon la revendication 1, caractérisé en ce 10 qu'il comporte 9 amino-acides dans lesquels le motif est Ehr- Lys-Pro. 3. Polypeptide selon la revendication 2, caractérisé en ce que tous les amino-acides sont sous forme L. 4. Polypeptide selon la revendication 1, caractérisé en ce 15 qu'il comporte 9 amino-acides, et que le motif est Arg-Pro--iye- Œhr. 5. Polypeptide selon la revendication 4-, caractérisé en ce que tous les amino-acides sont sous forme D. 6. Polypeptide selon la revendication 1, caractérisé en ce 20 qu'il comporte 4 amino-acides ré-unis selon la séquence fThr-Lys- Pro-Arg. 7. Polypeptide selon la revendication 6, caractérisé en ce que tous les amino-acides sont sous forme L. 8. Polypeptide selon la revendication 1, caractérisé en 25 ce qu'il comporte 4 amino-acides réunis en formant la séquence Arg-Pro-Lys-ïhr. 9« Polypeptide selon la revendication 8, caractérisé en ce que tous les amino-acides sont sous forme D. 10. Polypeptide selon la revendication 1, caractérisé en JO ce qu'il comporte trois amino-acides réunis en formant les séquences Lys-Pro-Lys; Arg-Pro-Arg; Arg-Pro-Lys; Lys-Pro-Arg; Arg-Pro-Orn, Orn-Pro-Arg; Orn-Pro-Orn; Lys-Pro-Orn; Orn-Pro-Lyss His-Pro-His; His-Pro-Lys; Ïïis-Pro-Arg; His-Pro-Orn; Lys-Pro-ïïis; Arg-Pro-His, ou Orn-Pro-His. 35 11* Thréonyl-lysyl-prolyl-argininamide ainsi que ses esters inférieurs et ses sels résultant de l'addition d'acide convenant en pharmacologie. 12. Kiréonyl-lysyl-prolyl-arginine dans laquelle le groupe 71 45283 31 2118134 hydroxyle de la thréonine est estérifié par un groupe alcanoyle ou alcénoyle comportant jusqu'à 18 atomes de carbone et ses sels et dérivés convenant en pharmacologie. 13* ïhréonyl-lysyl-prolyl-arginine dans laquelle le groupe 5 amino-acide de la thréonine est acylé par un groupe alcanoyle ou alcénoyle comportant jusqu'à 18 atomes de carbone et ses sels et dérivés convenant en pharmacologie. 14-. Nouveaux médicaments utiles notamment pour stimuler ou inhiber la phagocytose et la pinocytose,caractérisés en ce qu'ils 10 consistent en un polypeptide non antigénique selon l'une quelconque des revendications 1 à 13- 15. Compositions thérapeutiques,caractérisées en ce qu'elles contiennent comme ingrédient actif au moins un médicament selon la revendication 14. 15 16. Formes pharmaceutiques d'administration des composi tions selon la revendication 15, caractérisées en ce qu'elles sont constituées de comprimés ou de capsules pour l'administration orale dosés à 250 mg environ d'ingrédient actif. 17» Formes pharmaceutiques d'administration des composi-20 tions selon la revendication 15» caractérisées en ce qu'elles sont sous forme d'une solution stérile pour l'administration parentérale dosée à 250 mg environ d'ingrédient actif.