FR 2134614 A1 19721208 FR 7215099 A 19720427 72 15099 2134614 La présente invention concerne un nouvel antibiotique appelé EM-49 et son procédé de préparation ainsi que sa séparation en ses constituants. Cet antibiotique est obtenu par culture du micro-organisme Bac.illus circulans ATCC 21656 dans un milieu nutritif aqueux comprenant un hydrate de carbone 5 assimilable et une source d'azote assimilable dans des conditions aérobies submergées jusqu'à ce que le milieu acquière une activité antibiotique importante. On acidifie le bouillon de fermentation, on sépare les solides par filtration et on les lave à l'eau puis on ajoute les eaux de lavage au filtrat. 10 On extrait les eaux de lavage et le filtrat réunis à l'aide d'un^alcool non miscible à l'eau, de préférence le n-butanol. On concentre la solution alcoolique et on précipite l'antibiotique à l'aide d'un solvant organique, par exemple l'acétate d'éthyle, l'acétonitriles 1'éther ou de préférence l'acétone. On peut encore purifier le produit par distribution à contre-15 courant dans un système eau-alcool-acide organique, par exemple dans un système n-propanol-n-butanol-eau-acide acétique ou par formation de 1'hélianthate et régénération de l'antibiotique à partir de ce sel. Ces procédés permettent d'isoler l'antibiotique appelé EM-49 sous forme de sel d'acide correspondant à l'acide utilisé pour l'acidification 20 du bouillon. On peut transformer le sel en la base libre par neutralisation à l'aide d'une base telle qu ' hydroxyde d'ammonium, hydroxyde de sodium, hydroxyde de baryum ou analogues, et extraction à l'aide d'un alcool non miscible à l'eau, tel que le n-butanol. L'antibiotique EM-49 ainsi obtenu est une substance à activité anti-25 microbienne dont l'activité sera décrite ci-après. En utilisant des techniques de séparation plus élaborée^ telles que celles décrites ci-après, on peut séparer cet antibiotique en quatre fractions contenant des substances actives très proches du point de vue structural et une cinquième fraction active contenant une substance active dont la structure n'est pas aussi proche. 30 Dans les figures annexées, - la figure 1 représente le spectre infrarouge de l'antibiotique EM-49, sous forme de son chlorhydrate,dans KBr; - la figure 2 représente le'spectre de résonance^ magnétique nucléaire à 100 MHz de l'antibiotique EM-49, sous forme de son chlorhydrate dans le 35 diméthylsulfoxyde-dg; - la figure 3 représente le spectre infrarouge de l'antibiotique EM-49, dans KBr. 72 15099 2 2134614 - la figure 4 représente le spectre de résonance magnétique nucléaire à 60 MHz de l'antibiotique EM-49 dans le diméthylsulfoxyde-dg; - la figure 5 représente le spectre infrarouge de l'antibiotique EM-49 alpha dans KBr; 5 - la figure 6 représente le spectre infrarouge de l'antibiotique EM-49 bêta dans Kbr; - la figure 7 représente le spectre infrarouge de l'antibiotique EM-49 ganma dans KBr; - la figure 8 représente le spectre infrarouge de l'antibiotique 10 EM-49 delta dans KBr; et - la figure 9 représente le spectre infrarouge de l'antibiotique EM-49 SMP (fraction lente) dans KBr. L'antibiotique EM-49 et les fractions obtenues à partir de cet antibiotique sont actifs vis-à-vis des champignons et des bactéries 15 gram négatives et gram positives, par exemple Staphylocoeeus >aureus, Streptococcus pyogenes, Escherichia çoli, Pseudomonas aeruginosa et Candida albicans. On peut utiliser l'antibiotique, ou l'un de ses sels physiologl-quement acceptables, comme agent antimicrobien, soit comme désinfectant, par exemple sous forme de pulvérisation ou de poudre contenant jusqu'à 1% 20 environ de la substance dans un véhicule approprié, soit pour combattre des affections chez diverses espèces animales dues aux micro-organismes tels que ceux énumérés, par exemple par voie topique dans une crème ou onguent usuel contenant jusqu'à 1% environ de la substance ou sous forme de dosage injectable à raison de 5b-125 mg/kg/jour, La DE^q chez des souris contre une 25 infection létale systémique par Escherichia coli est par exemple d'environ 50 mg/kg. Le micro-organisme, Le micro-organisme utile pour la production du EM-49 est une souche de Bacillus circulans isolée dans le sol. On peut obtenir une sous-culture 30 de l'organisme aupces de 1'American Type Culture Collection, Rockville, Maryland, Le numéro matricule de ce micro-organisme, chez ce dépositaire, est ATCC 21.656. Les caractéristiques de Bacillus circulans ATCC 21656 sont les ' suivantes : 35 Caractéristiques microscopiflues ibacille sporifère gram variable à gram négatif. Les spores sont centrales à para-centrales, ovales; la paroi des spores est épaisse et facilement colorée; le sporangium est définitivement gonflé. Les bâtonnets ne sont pas en chaînes. Des frottis colorés avec de la Slljèhsile basique à 0,5% présentent une faible encapsulation. 72 15099 2134614 Caractéristiques macroscopiques : des colonies sur gélose nutritive-glucose sont brillantes et ont des bords unis à lobaires. Les colonies sont adhérentes, très mucilagineuses, mobiles et se répandent rapidement à la surface de la gélose, en particulier si les plaques sont humides. 5 Dans un bouillon nutritif, la turbidité est élevée et il y a une forte sédimentation. Il se forme une pellicule mucilagineuse épaisse couvrant littéralement le bouillon de culture. Caractéristiques physiologiques : l'essai de Voges-Proskauer pour la production d'acétylméthylcarbinol est négatif. L'essai de production d'indole est négatif. 10 L'amidon est fortement hydrolysé ainsi que la caséine. Il ne se forme pas de gaz à partir d'hydrates de carbone, bien que l'organisme croisse et donne un acide dans des milieux inorganiques avec le glucose, la saccharose ou le xylose comme seules sources de carbone. L'organisme ne croît pas à 60-65°C. Production de l'antibiotique. 15 Le micro-organisme Bacillus circulans ATCC 21656 donne un antibiotique actif vis-à-vis des bactéries gram positives et gram négatives et des champignons comme Candida albicans. Pour former l'antibiotique, selon la méthode préférée, on cultive Bacillus circulans ATCC 21656 à 25°C environ dans des conditions aérobies submergées dans un milieu nutritif aqueux contenant un 20 hydrate de carbone assimilable et une source d'azote. On réalise la fermentation pendant environ 60 à 150 h, et de préférence 144 h environ; au bout de ce délai, l'antibiotique est formé. Après achèvement de la fermentation, on ajuste le pH du bouillon à 2 à l'aide d'un acide, tel que l'acide chlorhydrique concentré. On ajoute au 25 bouillon de fermentation acidifié un adjuvant de filtràtion et on filtre l'ensemble de la suspension. On lave les solides abondamment à l'eau et on réunit ensuite les eaux de lavage avec le filtrat. On élimine les solides lavés. On extrait le filtrat additionné des eaux de lavage à l'aide de n-butanol saturé d'eau. On concentre l'extrait butanolique sous vide, à une température infé-30 rieure à 45°C, jusqu'à obtention d'un faible volume. On dilue alors ce produit de concentratbn avec 15 volumes d'acétone. On lave le précipité ainsi obtenu à l'acétone, à l'acétate d'éthyle et à l'éther pour obtenir, après séchage, une poudre jaune-brun clair. On purifie encore cet antibiotique brut par distribution à contre-courant en utilisant un système n-propanol-n-butanol-35 eau-acide acétique (50:75:100:2 en volume). La substance obtenue par distribution à contre-courant comportant 29 transferts est utilisée pour la caractérisation de l'antibiotique. 72 15099 4 2134614 Le EM-49 est un peptide basique et forme des sels avec divers acides inorganiques et organiques. Gomme le mode opératoire préféré comporte l'acidification du bouillon de fermentation par un acide, on obtient l'antibiotique sous forme du sel d'acide. Lorsque l'on acidifie le bouillon de fermentation à l'acide chlorhydrique, on obtient le chlorhydrate. Si on utilise d'autres acides, par exemple d'autres acides minéraux, tels que l'acide bromhydrique, l'acide sulfurique, etc., on peut obtenir le sel d'acide correspondant. On peut neutraliser le sel, qui est la forme sous laquelle on obtient d'abord l'antibiotique, à l'aide d'une base telle que 1'hydroxyde de sodium, pour obtenir la base libre et, si on le désire, on peut transformer cette dernière en d'autres sels d'acidespar traitement à l'aide d'acide acétique, d'acide propionique ou de tout autre acide organique, ou d'acide phosphorique ou analogues. On peut former des sels insolubles dans l'eau, par exemple d'acides arylsulfoniques, tels que l'acide naphtalènesulfonique-2, l'orange de méthyle, l'acide p-phénylazobenzènesulfonique et analogue, par réaction d'un sel d'acide du EM-49, tel que le chlorhydrate, avec un sel de métal alcalin de l'acide arylsulfonique. Une méthode particulièrement préférée consiste à Isoler l'antibiotique EM-49 à l'aide de 1'hélianthate. On traite la poudre jaune-brun clair obtenue par précipitation à l'acétone du produit de concentration, comme il est indiqué ci-dessus, avec une solution aqueuse d'orange de méthyle, ce qui provoque la précipitation de l'hélianthate de EM-49. L'héllanthate est amorphe à ce stade et on le purifie par reprécipitation dans le diméthylformamide, dans un mélange méthanol-acétonitrile ou analogue. Par traitement à l'acide chlorhydrique, on transforme 1'hélianthate en chlorhydrate. La poudre insoluble dans l'acétone, de couleur jaune-brun clair mentionnée ci-dessus, contient l'antibiotique EM-49. On peut purifier cette substance comme il est décrit et l'utiliser sous sa forme purifiée. La poudre purifiée contient des antibiotiques consistant en peptidesde structures très proches qui, par exemple, peuvent être séparés par chromatographie par échange d'iota Tous ces composés se caractérisent par la présence de quatre groupes amino libres. Lorsque l'on fait subir à une solution aqueuse de chlorhydrate de EM-49, obtenue par l'intermédiaire de l'hélianthate, comme il est décrit ci-dessus, une chromatographie sur une colonne de carboxyméthylcellulose, forme sodium (par exemple cellulose Whatman CM-52) et que l'on élue à l'aide d'une solution de chlorure de sodium dilué, on sépare l'antibiotique en 72 15099 5 2134614 quatre fractions comme on peut le contrôler à l'aide de la tension de surface de l'effluent. Ces fractions sont respectivement appelées EM-49 alpha, EM-49 bêta, EM-49 gamma et EM-49 delta dans leur ordre d'êlution. Ces fractions peuvent se distinguer par leur composition en aminoacides et par les 5 variations de la structure des fractions d'acides gras .L'analyse "des aminoacides montre que les EM-49 alpha et bêta ne contiennent pas de phénylalanine, mais contiennent cinq restes d'acide diamino-2,4 butyrique et trois restes de leucine. Les EM-49 ganme et delta contiennent un reste de phénylalanine, deux restes de leucine et cinq restes d'acide diamino-2,4 butyrique. Les 10 EM-49 alpha et bêta diffèrent l'un de l'autre par la structure des acides gras séparés par hydrolyse acide. Les EM-49 gamma et delta diffèrent l'un de l'autre de la même façon. Une chromatographie de partage de la poudre insoluble dans l'acétone dans certains systèmes révèle la présence, en plus du EM-49, d'une fraction 15 lente (SMF) qui possède également une activité antimicrobienne à large spectre. On isole cette fraction et op la purifie par extraction au n-butanol suivie d'une chromatographie sur diéthylaminoéthylcellulose et d'une chromatographie de partage sur une colonne d'acide silicique-cellulose, l'élution se faisant à l'aide de n-butanol-acide isobutyrique-pyridine-eau, (40:9:4:10). 20 Ou encore, on peut isoler l'antibiotique EM-49 SMF et le purifier par chromatographie de la poudre insoluble dans l'acétone sur Sephadex LH20 (dextrane réticulé alkylé) l'élution se faisant au méthanol. On isole facilement la fraction SMF par formation du reineckate cristallin que l'on obtient sous forme de cristaux pourpres. 25 Les exemples suivants illustrent l'invention sans toutefois en limiter la portée. EXEMPLE 1 On ensemence des plaques inclinées de gélose aux extraits de boeuf et de levurè par des Bacillus circulans ATCC 21656. On laisse incuber pendant 30 une nuit à 37°C puis on utiliser ces plaques pour inoculer 50 ml d'un milieu aqueux de farine de soja contenu dans deâ erlenmeyersde 250 ml. La composition du milieu de germination est comme suit : Milieu Grammes Farine de soja 15,0 35 Pomme de terre écrasée déshydratée 15,0 Glucose 50,0 CoCl2,2H20 0,005 CaC03 10,0 Eau distillée, complément à 1 litre 72 15099 6 2134614 Oit stérilise ce milieu pendant 30 mn à 121°C et sous une pression de vapeur de 6,8 kg avant de l'utiliser. On laisse incuber les flacons de gërmination inoculés à 25CTC pendant 72 h dans un agitateur rotatif tournant à 280 tr/mn avec une distance de 50,8 mm. 5 On effectue un transfert à 2,5% (volume/volume) des récipients de germination dans des erlenmeyersde 500 ml contenant 100 ml d'une liqueur de macération aqueuse de maïs. La composition de ce milieu est comme suit s Milieu Grammes Liqueur de macération de maïs 6,0 10 (NH4)H2P04 3,0 Extrait de levure 2,5 Dextrose 10,0 Eau distillée, complément à 1 litre pH ajusté à 7,0 15 CaC03 2,5 , On laisse incuber les récipients de fermentation et on les agite comme les récipients de germination. On prélève des échantillons au bout de 3 et 6 jours et on les examine par chromatographie sur papier et recherche de l'activité biologique. Pour la chromatographie sur papier, on applique 20 sous forme de taches des quantités appropriées d'extrait butanolique du bouillon acidifié sur des feuilles de papier Whatman n° 1 et on développe les chromatogrammes à l'aide d'un solvant de composition suivante : n-butanol, acide acétique, eau (4:1:5 en volume). On utilise comme solvant la phase supérieure de ce système de solvants. Dans ce système, le EM-491(sous forme 25 de chlorhydrate) a une valeur de de 0,71. On décèle l'antibiotique par bioaôtographie contre Staphylococcus aureus PDA 209P et Escherichia coli ATCC 10536. Pour la recherche de l'activité biologique, on utilise ces deux organismes selon des essais de dilution dans des tubes usuels. EXEMPLE 2 30 On laisse fermenter un bain de 250 1 de Bacillus circulans ATCC 21656 dans un récipient d'acier inoxydable de 378,5 1 en opérant, avec le milieu et dans les conditions donnés ci-après*. Etape 1 Inoculum : on conserve une culture de Bacillus circulans ATCC 21656 35 par stockage dansde l'azote liquide et on laisse croître ces micro-organismes, lorsque cela est nécessaire, sur des plaques de gélose aux extraits de boeuf et de levure possédant la composition suivante : 72 15099 7 2134614 Milieu Extrait de boeuf Extrait de levure Peptone 5 Dextrose Gélose Eau distillée, complément à On stérilise ce milieu sous une pression 15 mn avant de l'utiliser. 10 On utilise ces cultures sur plaques pour germination. Milieu Farine de soja Pomme de terre écrasée déshydratée 15 Glucose CoC12,2H20 CaC03 Eau distillée, complément à stérilisé à 121°C pendant 30 mn. 20 On laisse incuber 100 ml de ce milieu dans un erlenmeyer de 500 ml pendant 72 h sur un agitateur rotatif à 25°C. L'agitateur fonctionne à 280 tr/mn avec une distance de 50,8 mn. Etape 2 Inoculum : 100 ml obtenus dans la première étape. 25 Milieu : semblable au milieu de germination de l'étape 1. On laisse incuber l'inoculum et 1.000 ml de milieu dans un erlenmeyer de 4 1 pendant 72 h à 25°C sur un agitateur rotatif. L'agitateur travaille à 280 tr/mn avec une distance de 50,8 mm. Etape 3 30 Inoculum : 3.000 ml obtenus dans l'étape 2. Milieu : Milieu Grammes Liqueur de macération de mais 6,0 (NH4)H2P04 350 35 Extrait de levure 2,5 Dextrose 10,0 Eau distillée, complément à 1.000 ml Ajusté à pH 7,0 CaC03 2,5 Grammes. 1,5 3S0 6,0 1,0 15,0 1 litre. de 6,8 kg et à 121°C pendant inoculer les récipients de Grammes 15,0 15,0 50,0 0,005 10,0 1 litre 72 15099 s 2134614 On ajoute l'inoculum à 250 1 de milieu et on laisse incuber pendant 144 h. Pendant l'incubation, on aère le bouillon à raison d'une vitesse de 2 l'air en surface de 61 cm/mn, sous 0,7 kg/cm . Pendant ce temps, on agite le bouillon à raison de 0,4 W par litre et à 155 tr/mn, EXEMPLE 3 On ajuste le pH du bouillon de fermentation, obtenu comme il est décrit dans l'exemple 2 (209 1) à 2,0 à l'aide de 1,5 1 d'acide chlorhydrique concentré. On ajoute un adjuvant de filtratlon (Hyflo,15kg) au bouillon acidifié et on filtre le mélange pour obtenir 41 kg de matière insoluble. On lave le gâteau insoluble avec 10 1 d'eau et on réunit les eaux de lavage au filtrat pour obtenir 190 1. On élimine le gâteau lavé (41 kg). EXEMPLE 4 On extrait le filtrat (190 1) obtenu dans l'exemple 3 avec trois portions de 56 1 de n-butanol saturé en eau. On réunit les couches butanolique (194 1) et on les concentre sous vide à une température inférieure à 45°C, jusqu'à obtention d'un faible volume (2,3 1). EXEMPLE 5 On dilue une fraction de 50 ml du produit de concentration obtenu dans l'exemple 4 avec 750 ml d'acétone et on centrifuge le précipité résultant On lave le précipité à l'acétone (60 ml) en le mettant en suspension dans le solvant et en le centrifugeant. On répète cette opération en utilisant de l'acétate d'éthyle (trois fractions de 60 ml) et finalement de l'éther, (trois fractions de 60 ml). On sèche le précipité à l'air, on le réduit en poudre et on le sèche sous vide, ce qui permet d'obtenir 1,4 g d'une poudre jaune-brun clair. EXEMPLE 6 On purifie encore un échantillon de 1,4 g de la poudre insoluble dans l'acétone obtenue dans l'exemple 5 en la soumettant à une distribution à contre-courant en utilisant un système n-propanol-n-butanol-eau-acide acétique (50:75:100:2 en volume). On réalise 29 transferts en utilisant 40 ml de chaque phase par tube. L'activité maximale, que l'on détermine par un essai de diffusion sur gélose sur disque de papier, est localisée dans le tube 11. On réunit les contenus des tubes 8-14 et on élimine les solvants sous vide. On dissout le résidu dans un peu de méthanol et on précipite l'antibiotique par addition d'acétone et d'éther. On lave soigneusement le précipité à l'éther, on le sèche à l'air et ensuite sous vide, ce qui permet d'obtenir 0,466 g d'une poudre jaune-brun clair. Cette substance est 72 15099 2134614 constituée essentiellement de peptide basique antibiotique EM-49 sous forme de son chlorhydrate. On ne décèle pas de circuline dans les bouillons produits dans ces conditions. Analyse 00 Rotation optique c=l,0 dans l'eau 5 C, 45,58 589 nm -42+ 3° H, 7,31 578 -44 N, 14,42 546 -50 Cl, 11,86 (ionique ) 436 -91 Le spectre infrarouge, sous forse du chlorhydrate, dans KBr est 10 représenté dans la figure 1, Le spectre de résonance magnétique nucléaire à 100 MHz, sous forme du chlorhydrate, dans le diméthylsulfoxyde-dg, est représenté dans la figure 2. On utilise,pour détecter l'antibiotique, la chromatographie sur papier filtre Whatman n° 1 en utilisant la bioautographie contre E. Coli 15 ATCC 10536. Systèmes de solvants (en volume) R^ n-butanol-acide acétique-eau (4:1:5) 0,71 n-propanol-n-butanol-eau (2:3:4) 0,57 chloroforme-méthanol-eau (5:4:2) 0,38 20 chloroforme-méthanol-acide acétique à 1% (5:4:2) 0,35 chloroforme~méthano1-NH^OH 0,5N (5:4:2) 0,91 Le chlorhydrate de l'antibiotique EM-49 fond à 180"207t'C (avec décomposition) sous vide. Il est soluble dans l'eau, le méthanol, l'éthanol, 25 le diméthylsulfoxyde et l'acide acétique et est insoluble dans l'acétone, l'acétate d'éthyle, l'éther et l'acétonitrile. Un hydrolysat d'un échantillon (2,30 mg) du chlorhydrate d'antibiotique EM-49, préparé selon le mode opératoire donné ci-dessus, obtenu par chauffage de cet échantillon dans HC1 6N à 110°C pendant 16 h et analysé 30 par la méthode de Stein-Moore usuelle, révèle la présence de leucine (3,95 micromoles) et d'acide diamino-2,4 butyrique (7,35 micromoles). On décèle également dans l'hydrolysat la présence de phénylalanine (0,86 micro-moles). On ne décèle que des traces d'autres aminoacides. On ne trouve pas de quantités décelables dethréonine, ce qui distingue l'antibiotique EM-49 35 d'autres antibiotiques du type peptide, tels que la circuline, les poly- myxines et polypeptines. On obtient, à partir de l'hydrolysat, par extraction à l'éther, un acide gras encore non identifié, ce qui indique la présence 72 15099 2134614 d'environ 10% en poids de cet acide dans l'antibiotique. Le spectre ultraviolet du chlorhydrate pris dans HC1 0,05 N présente un faible maximum à l7o 248 nm (E °=25) et une absorption finale. L'intensité de l'absorption à 248 nm est probablement élevée en raison des impuretés colorées qui donnent 5 lieu à une absorption dans la région visible. Ce pic et l'absorption finale sont dus, au moins en partie, à la phénylalanine. EXEMPLE 7 On transforme le chlorhydrate de l'antibiotique EM-49 en la base libre par distribution à contre-courant en utilisant un système n-butanol-10 NH^OH 0.5 N. On traite 1,01 g du chlorhydrate de EM-49 préparé comme il est indiqué dans l'exemple 6, par distribution à contre-courant comportant 29 transferts en utilisant 40 ml de chacune des phases supérieure et inférieure par tube. On réunit les contenus des tubes 25-29 et on sépare la phase supérieure puis on l'amène à sec sous vide. On dissout alors le résidu dans du 15 méthanol chaud (environ 50 ml). On ajoute de l'acétate d'éthyle (50 ml), du benzène (50 ml) et du cyclohexane (50 ml). Par élimination de ce mélange de solvants sous vide, on obtient 0,75 g d'une poudre presque blanche qui constitue la base libre de l'antibiotique EM-49. Cette substance fond à 245-248°C dans un capillaire dans lequel on a fait le vide. 20 Analyse : C 56,64; H 8,65; N 16,50; Cl 0,0%. Le poids moléculaire de la base libre déterminée dans l'éthanol par ultracentrifugation est d'environ 1080'. Le poids équivalent pair titrage à l'acide perchlorique est de 272. La formule empirique de l'antibiotique EM-49 sous forme de base libre correspond approximativement à 3^13^2' 25 Le spectre ultraviolet dans le méthanol présente, en plus d'une absorption finale intense, les pics suivants : ^ max . ■ E Epaulement à 247,5 5,8 Epaulement à 252 4,5 Epaulement à 258 4,1 Epaulement à 265 3,4 Epaulement à 268 3,2 Le spectre infrarouge dans KBr est représenté dans la figure 3. 35 Le spectre de résonance magnétique nucléaire à 60 MHz dans le diméthylsulfoxyde-dg est représenté dans la figure 4. On traite des solution de chlorhydrate d'antibiotique EM-49 dans de l'eau (0,1 à 10 mg/ml) à l'aide de solutions de sels de sodium et de potassium 72 15099 2134614 (0,5 M). On n'obtient pas de précipité avec les sels des anions suivants. OAc , H^PO^ , I , ClO^ , C2®4 3 Br ' B4°7 5 *°3 * ^es ani°ns suivants donnent des précipités, dans l'ordre des solubilités décroissantes : S04=, Mo04=, HP04=, Cr04=, FetèN),.4", Fe(CN)63~, Cr^", WÛ4=. 5 EXEMPLE 8 On peut également précipiter l'antibiotique EM-49 à partir d'une solution aqueuse sous forme de sel de divers acides ary1sulfoniques par traitement avec l'acide ou un sel de l'acide. On donne, dans ce qui suit un exemple à titre d'illustration. 10 On dissout, dans 50 ml d'eau,1,00 g de chlorhydrate de EM-49 et on ajoute une solution de 1,25 g d'acide p-phénylazobenzènesulfonique dans 20 ml d'eau. On agite le mélange pendant 30 mn et on laisse reposer. On décante la couche surnageante et on lave le précipité deux fois par décantation à l'aide de fractions de 30 ml d'eau et une troisième fois par filtration. 15 On sèche le précipité sous vide, ce qui donne 1,43 g d'un solide amorphe. Ce sel d'acide p-phénylbenzènesulfonique solide cristallise lorsqu'on le mélange à du méthanol. On recristallise un échantillon quatre fois dans un mélange méthanol-acétonitrile (2:1), ce qui donne une substance qui se décompose à 267°C environ lorsqu'on la chauffe rapidement sous vide. Après avoir été 20 séchée pendant plusieurs heures sous 0,02 mmHg et à 100°C, cette substance présente un gain de poids de 4,17% lorsqu'on la laisse s'équilibrer avec 1'humidité atmosphérique. Analyse : valeur trouvée : C 53,29; H 6,42; N 13,10; 0 21,33 par différence; S 5,867». 25 Pour un poids moléculaire de 2103 (calculé sur la base de 4 atomes de soufre dans la formule) l'analyse correspond à la formule C97H130N21°24S4* EXEMPLE 9 On agite, à température ambiante, pendant 1 h 40 mn, un mélange 30 de 30,8 mg de chlorhydrate de EM-49, 1 ml de n-butanol, 1 ml de méthyléthyl-cétone, 0,2 ml d'une solution 1 M de dinitro-2,4 fluorobenzène et 2 ml d'une solution d'hydrogénocarbonate de sodium à 10%, On sépare la phase supérieure et on lave la phase inférieure plusieurs fois à l'acétate d'éthyle. On élimine les solvants sous vide de la phase supérieure et des produits 35 de lavage réunis. On dissout le résidu le plus possible dans de la méthyl-éthylcétone et on sépare la substance insoluble par centrifugation puis on l'élimine. On amène la couche surnageante à sec dans un courant d'azote. 72 15099 2134614 On dissout le résidu dans un peu d'acétone et on précipite le produit par addition de benzène. On lave plusieurs fois au benzène le dérivé dinitro-2,4 phénylé solide et on le sèche sous vide, ce qui donne 35,1 mg d'une poudre jaune. Par chromatographie sur couche mince, sur gel de silice(l'élution 5 se faisant avec du méthanol-chloroforme (1:9) on obtient une seule tache nette (Rf 0,51). On purifie cette substance par chromatographie préparative sur couche mince en utilisant le même système. On recueille une bande jaune de R^ 0,52-0,68. On enlève le produit du gel de silice à l'aide d'acétone-méthanol 10 (1:1) et on transforme ce produit en une poudre (30,4 mg), par précipitation dans une solution d'acétone avec du benzène. Spectre ultraviolet dans la méthyl-éthylcétone : Âmax nm' E^° = 398. On sèche un échantillon à i00°C sous 0,02 mm Hg et on le laisse revenir en équilibre avec l'humidité atmosphérique. Analyse : valeur trouvée : ^0, 1,04%; C 52,02; H 6,13; N 16,61; 0 25,24% 15 par différence. Pour un poids moléculaire de 1744, on a la formule empirique : C76H105R21°2T EXEMPLE 10 On dissout le plus possible dans 10 ml d'eau, 1,00 g de la poudre insoluble dans l'acétone obtenue comme il est décrit dans l'exemple 5. On 20 élimine par centrifugation la substance insoluble, on lave avec 10 ml d'eau et on réunit les couches surnageantes. On met en suspension 1,00 g d'orange de méthyle dans 15 ml d'eau. On ajoute 5 ml de diméthylformamide et on chauffe le mélange jusqu'à ce que l'orange de méthyle soit juste dissous. On ajoute cette solution chaude à 25 la solution de EM-49. On refroidit le mélange à température ambiante et on isole le solide par centrifugation, on le lave avec 3 fractions de 35 ml d'eau et on le sèche sous vide. On dissout le plus possible 1'hélianthate brut dans 3 ml de diméthylformamide et on élimine par centrifugation la substance insoluble, en la 30 lavant avec deux fractions de 3 ml de diméthylformamide. On mélange les trois solutions de diméthylformamide avec 90 ml d'eau, on sépare le précipité par centrifugation et on le lave avec trois fractions de 30 ml d'eau. L'hélianthate de EM-49 est amorphe mais on le purifie par reprécipitation dans du méthanol-acétonitrile (2:1). On sèche cette substance 35 à 100°C pendant h sous 0,02 mmHg puis on la laisse s'équilibrer avec l'humidité atmosphérique. F . (bloc Kof1er): 242-244°C (avec décomposition). t Analyse, valeurs trouvées : C' 53,01; H 6,74; N 14,19; S 5,44 (eau 5,05%). Pour un moids moléculaire de 2238, l'analyse élémentaire correspond à la formule empirique 0^^11^^132^0248^. 72 15099 13 2134614 On transforme 1'hélianthate de EM-49 en chlorhydrate par agitation avec 10 ml d'acide chlorhydrique 0,36 N pendant 20 mn. On sépare la substance insoluble par centrifugation et on la lave avec 2 fractions de 5 ml d'acide chlorhydrique 0,36 N. On agite alors les couches surnageantes 5 réunies avec 320 mg de charbon Darco G-60 et on filtre sur de la terre d'infusoires, ce qui permet d'obtenir une solution pratiquement incolore. On extrait le filtrat avec deux fractions de 10 ml de n-butanol. Par élimination du butanol sous vide, on obtient un solide amorphe. On transforme ce solide en une poudre fine en le dissolvant dans une petite 10 quantité de méthanol, en ajoutant de l'acétate d'éthyle jusqu'à ce que l'antibiotique précipite et en éliminant ensuite le mélange de solvants sous vide. On sèche alors la poudre à 50°C sous 0,02 mmHg pendant plusieurs heures (par exemple 5 h) et on la laisse se mettre en équilibre avec l'humidité atmosphérique pendant une nuit. 15 EXEMPLE 11 On fait subir à une solution de 500 mg du chlorhydrate de EM-49, obtenu comme il est décrit dans l'exemple 10, en solution dans 5 ml d3eau une chromatographie sur une colonne de 2,5 x 60 cm de cellulose Whatman CM-52 (carboxyméthylcellulose, forme sodium) en opérant à 5Û°C et en utilisant un 20 débit de 75 ml/h. On élue la colonne à l'aide d'une solution de chlorure de sodium 0,15 N en recueillant des fractions de 600 gouttes (environ 24 ml). On contrôle Ifeffluent grâce à la tension de surface car l'antibiotique réduit la tension de surface, de sorte que des fractions de nombre de gouttes constant contenant l'antibiotique ont un volume réduit. Un tracé graphique 25 du volume des fractions par rapport au volume d'élution total révèle la présence de 1'antibiotique'sous forme de pics inverses. On continue l'élution (environ 16 1), jusqu'à ce que l'on ait élué trois pics que l'on désigne par EM-49 alpha, EM-49 bêta et EM-49 ganana. On élue alors la colonne avec du chlorure de sodium 0,20 N (environ 2 1) pour éluer une quatrième fraction, 30 comme le montre le pic de tension de surface, que l'on désigne par EM-49 delta. On réunit les fractions contenant les pics respectifs EM-49 alpha, bêta, gamma et delta. On extrait chaque fraction avec la moitié de son volume de n-butanol. On lave les extraits butanoliques deux fois avec des volumes égaux d'acide chlorhydrique 0,36N puis on évapore à sec. 35 On dissout chaque résidu dans du méthanol, on précipite à l'acétate d'éthyle, on lave à l'acétate d'éthyle et à l'éther, on sèche à 75°Cet sous 0,02 mmHg pendant 30 mn puis on laisse le produit se mettre en équilibre avec l'humidité atmosphérique pendant une nuit. 72 15099 2134614 10 15 20 L'analyse de chacune des fractions précédentes (obtenues sous forme de chlorhydrate) donne les résultats suivants : Analyse, valeur trouvée (%) H20 C H N Cl (ionique) 30 35 EM-49 alpha 5,84 42,96 8,16 13,41 11,85 EM-49 bêta' 8,91 43,49 7,85 13,68 11,06 EM-49 gamma 8,86 43,42 6,96 12,92 10,64 EM-49 delta 7,09 44,75 7,17 13,13 10,58 Par rapport à la substance anhydre, les données précédentes permettent d'obtenir des poids moléculaires approchés et des formules empiriques (pour le-chlorhydrate) basées sur ce poids: Poids moléculaire Formule empirique EM-49 alpha 1203 C46H95N12C14°15 EM-49 bêta 1190 C.,HonN,oC1.0.., 47 89 13 4 13 EM-49 gamma 1250 C50H81N13Cl4°16 EM-49 delta 1267 C-.H.-N.Xl.O.- 51 86 13 4 15 On hydrolyse dans de l'acide chlorhydrique 6 N à 110°C pendant une nuit des échantillons de chacun des antibiotiques EM-49 alpha, bêta, ganma et delta. On extrait chaque hydrolysat à l'éther pour éliminer la fraction d'acides gras. On utilise la substance résiduelle pour l'analyse 25 des aminoacides. L'analyse des aminoacides et des fractions montre que le EM-49 alpha et le EM-49 bêta diffère du EM-49 gamma et du EM-49 delta, comme il est indiqué ci-après, en ce qui concerne les restes d'aminoacides. Nombre de restes par molécule. 2,4-Dab Leucine Phénylalanine EM-49 alpha 5 3 0 EM-49 bêta 5 3 0 EM-49 gamma 5 2 1 EM-49 delta 5 2 1 Acide diamino-2,4 butyrique. 72 15099 15 2134614 Les spectres infrarouges de chacun des produits précédents sont indiqués dans les figures 5,6,7 et 8 respectivement. Chacun des produits précédents, comme le chlorhydrate de EM-49, est soluble dans l'eau, le méthanol, l'éthanol, le diméthylsulfoxyde et l'acide acétique et insoluble 5 dans l'acétone, l'acétate d'éthyle, l'éther et l'acétonitrile. Chacun des produits précédents forme des sels comme le EM-49. Les extraits éthérés des hydrolysats contiennent des acides gras qui se sont séparés de l'antibiotique. On les traite avec du diazométhane pour former des esters méthyliques. On étudie alors les esters méthyliques 10 par chromatographie en phase gazeuse. Les acides gras du EM-49 alpha diffèrent des acides du EM-49 bêta et les acides gras du EM-49 gamma et du EM-49 delta diffèrent de la même façon. On peut différencier la paire EM-49 alpha-bêta de la paire gamma-delta par un petit pic à 696 cm dans le spectre infrarouge de la 15 dernière paire, ce pic étant caractéristique de la fraction phénylalanine. De même, le spectre ultraviolet de la paire gamma-delta possède l'absorption caractéristique de la fraction phénylalanine entre 245 et 270 nm et cette absorption est absente du spectre ultraviolet de la paire alpha-bêta. EXEMPLE 12 20 On extrait 70 g de la poudre insoluble dans l'acétone obtenue dans l'exemple 5 deux fois avec 200 ml environ de butanol et d'eau à pH 7,5. Les couches aqueuses ne possèdent pas d'activité antibiotique et sont jetées. On réunit les couches butanoliques et on les extrait quatre fois avec à chaque fois 200 ml d'eau saturée en butanol à pH 1,0. Les extraits aqueux 25 réunis contiennent la majeure partie de la substance active constituée de EM-49 et de la fraction lente (SMF). On concentre les extraits aqueux sous vide jusqu'à obtention d'un sirop, et on précipite à l'acétone. La nouvelle poudre insoluble dans l'acétone pèse environ 15 g. On sépare d'abord grossièrement le EM-49 et la fraction lente 30 en dissolvant 15 g de solide dans 30 ml de méthanol et en faisant passer cette solution à travers une colonne de diéthylaminoéthylcellulose (4,5 x 60 cm) dans du méthanol. Après que la majeure partie de la fraction de couleur sombre a été éliminée de la colonne, on élue la SMF à l'aide d'acide acétique à 2% dans du méthanol. On recueille des fractions de 50 ml environ 35 jusqu'à ce qu'il ne sorte plus de substance active de la colonne, comme le montre l'essai sur disque avec des E. coli (SC2927) sur plaques de gélose. On analyse alors les fractions par chromatographie sur couche mince sur des 72 15099 u 2134614 feuilles d'acide silicique Gelman en utilisant le système de solvants suivant : butandl-acide isobutyrique-pyridine-eau (40:9:4:10) et on réalise une bioautographie sur des plaques de gélose ensemencées par E. coli. On réunit les fractions avec la fraction lente (R^ * 0,15) et on concentre 5 à sec (environ 5 g). On soumet alors ce solide à une chromatographie de partage sur un mélange acide silicique-cellulose (2:1 en poids, taille de la colonne 3 x 60 cm) en utilisant le même système de solvants que pour la chromatographie sur couche mince. Sur cette colonne, le EM-49 et la SMF se séparent bien et on les analyse par la même analyse chromatographique 10 sur couche mince. On réunit à nouveau les fractions désirées et on les amène à sec (environ 300 mg} Pour purifier encore le composé, on répète l'opération de chromatographie de partage. On dissout l'échantillon dans un solvant acétone-méthanol (1:1) et on fait passer cette solution à travers une colonne de Sephadex LH20 qui est Imbibé et placé dans le même solvant. 15 Lorsque l'on développe avec le même solvant, on peut observer des bandes séparée». La SMF sort alors avec le front de solvant. On analyse à nouveau les fractions par chromatographie sur couche mince et on réunit celles présentant une seule tache de SMF et on les amène à sec. Le rendement final est d'environ 150 mg. Ce produit est jaune pâle, a une pureté bioautographique, 20 ne fond pas jusqu'à 310°C et commence à prendre une couleur brune à partir de 270°C. On prépare un reineckate cristallin à partir de cet échantillon en dissolvant 100 mg du produit final dans 5 ml d'eau, en ajoutant de l'acide chlorhydrique dilué pour amener le pH à 2-3. Puis on ajoute goutte à goutte 25 une solution aqueuse saturée limpide de reineckate d'ammonium jusqu'à ce qu'il ne se sépare plus de précipité. On centrifuge et on lave le précipité une fois avec 5 ml d'eau. On sèche alors le précipité et on le cristallise dans de 1'acétone-hexane, ce qui permet d'obtenir 50 mg de produit. Le reineckate de SMF cristallin est une poudre pourpre insoluble dans l'eau mais 30 très soluble dans l'acétone et le méthanol. Il ne possède pas de point de fusion défini mais se décompose à 198-200°C. Les essais de couleur donnent les résultats 'suivants : ninhydrine(-), anthrone(-), hydrolysat-ninhydrine(+). L'antibiotique EM-49 SMF présente une absorption finale dans le spectre ultraviolet. Le spectre infrarouge est représenté dans la figure 9 35 annexée, Analyse : valeurs trouvées : C 50,46%; H 6,47%; N 11,69%. Equivalent de neutralisation = 584. 72 15099 17 2134614 Pour un poids moléculaire de 1200, l'analyse élémentaire correspond à une formule empirique C5oH76N10°24* Un hydrolysat préparé par hydrolyse de 2,012 mg de 1:antibiotique dans de l'acide chlorhydrique 6N à 110°C pendant 17 h et soumis à une analyse 5 des aminoacides comporte les produits suivants, présents dans les quantités indiquées : Acide dlamino-2,4 butyrique 1,74 micromoles NH4OH 1,01 Thréonine traces 10 Sérine 0,84 Acide glutamique traces Alanine 0,51 - Valine 0,82 Leucine 0,45 15 Tyrosine traces Phénylalanine 0,47 Le reineckate de EM--49 SMF cristallin a un point de fusion de 198-200°C (avec décomposition) et son spectre ultraviolet présente les caractéristiques suivantes : 20 X rnax -240 nm (E^"*450) /) max - 315nm (E =350) ce sel est insoluble dans l'eau et soluble dans l'acétone et le méthanol. EXEMPLE 13 Des essaiB de dilution en tube double réalisés avec plusieurs 25 micro-organismes donnent les résultats suivants. Le EM-49 utilisé dans cette étude est le chlorhydrate et a une pureté équivalente à celle de la poudre jaune-bruti clair décrite dans l'exemple 6. Organisme MIC ** (yug/ml) 30 Staphylococcus aureus. FDA 209 P 4,7 Streptococcus pyogenes C 203 0,6 Escherichia coli ATCC 10536 0,8 Escherichia coli SC 8294* 0,6 £ Paeudomonas aeruginosa SC 8329 2,4 35 Candida albicans SC 5314* 12'5 Candida crusei SC 2616 * 6,3 Saccharoayces cerevisiae SC 1600* 2,4 72 15099 °18 2134614 Aspergillus nlger SC 2828* 50,0 Fusarium bulbigenum SÇ 5273* 25,0 & Trichopfayton mentagrophytes SC 2637 6,3 Trichomonas vagirialis SC 8560* 37,5 5 * Organismes provenant de la Squibb Culture Collection. ^TIIC : concentration inhibitrice minimale. EXEMPLE 14 Un essai in vivo réalisé sur des souris auxquelles on a injecté par voie intrapéritonéale des doses de 100 DI^q de Streptococcus pyogenes 10 C203 montre que 50% des souris survivent lorsqu'on leur a administré une quantité totale de 120 mg/kg d'antibiotique EM-49, sous forme du chlorhydrate, par voie sous-cutanée,en deux parties, 1 h et 5 h après l'infection. Aucune souris du groupe témoin n'ayant pas reçu d'antibiotique ne survit. EXEMPLE 15 15 De même, lorsque l'on injecte à une souris, par voie intrapéri tonéale, des doses de 500 DL,.q d'Es'eherichia coli SC 8294 en suspension dans de la mucine gastrique de porc à 5%, 50% des souris survivent après injection sous-cutanée de 50 mg/kg d'antibiotique EM-49,sous forme du chlorhydrate, une heure après l'infection. Lorsque l'on n'administre pas 20 d'antibiotique, aucune des souris ne survit à l'infection. EXEMPLE 16 Les essais de dilution en tube double réalisés avec les microorganismes indiqués ci-après donnent les résultats suivants : Organisme MIC 25 30 Staphylococcus aureus 209P Streptococcus pyogenes C203 Escherichia coli SC2927 Escherichia coli SC8294 Pseudomonas aeruglnosa SC8329 Candida alblcans SC5314 Trichomonas vaginalis SC8560 EM-49 alpha bêta gamma delta SMF 12,5 6,3 3,1 2,4 75 1,6 0,8 0,4 0,4 3,1 0,6 0,6 0,6 0,4 1,6 0,4 0,3 0,3 0,3 12,5 0,8 0,8 0,4 1,2 £100,0 9,4 9,4 6,3 4,7 > 25,0 ^50,0 25,0 37,5 25,0 72 15099 19 2134614 REVENDICA TIO N S 1 - Procédé de production d'antibiotiques appelés EM-49, EM-49 alpha, EM-49 bêta, EM-49 gamma, EM-49 delta, EM-49 SMF et leurs sels, caractérisé en ce qu'on cultive Bacillus circulans ATCC 21656 dans un milieu nutritif 5 aqueux comprenant un hydrate de carbone assimilable et une source d'azote , assimilable dans des conditions aérobies submergées jusqu'à ce que le milieu présente une activité antibiotique importante. 2 - Nouveau composé caractérisé en ce qu'il est choisi parmi l'antibiotique EM-49 et ses sels d'acides, l'antibiotique EM-49 fondant à 10 245-248°C, ayant un poids équivalent, par titrage à l'acide perchlorique, de 272 et présentant l'analyse élémentaire approchée suivante : C 56,64%; H 8,65% et N 16,50%. 3 - Nouveau composé caractérisé en ce qu'il consiste en chlorhydrate d'antibiotique EM-49 fondant entre 180 et 207°C sous vide, soluble dans 15 l'eau, le méthanol, l'éthanol, le diméthylsulfoxyde et l'acide acétique mais insoluble dans l'acétone, l'acétate d'éthyle, l'éther et 1'acétonitrile et présentant l'analyse élémentaire approchée suivante : C 45,58%; H 7,31%; N 14,42% et Cl 11,86% (ionique). 4 - Nouveau composé caractérisé en ce qu'il consiste en hélianthate 20 de l'antibiotique selon la revendication 2. 5 - Nouveau composé caractérisé en ce qu'il est choisi parmi l'antibiotique EM-49 alpha et ses sels d'acides, l'antibiotique EM-49 possédant cinq ïesteB acide dlamino-2,4 butyrique, trois restes leucine et ne possédant pas de reste phénylalanine, étant soluble dans l'eau, le méthanol, l'éthanol 25 le diméthylsulfoxyde et l'acide acétique et insoluble dans l'acétone, l'acétate d'éthyle, l'éther et 1'acétonitrile et ayant un chlorhydrate présentant l'analyse élémentaire approchée suivante ! C 42,96%} H 8,16%; N 13,41% et Cl 11,85% (ionique). 6 - Nouveau composé caractérisé en ce qu'il est choisi parmi 30 l'antibiotique EM-49 bêta et ses sels, l'antibiotique EM-49 bêta comportant cinq restes acide diamino-2,4 butyrique, trois restes leucine et ne présentant pas de reste phénylalanine,étant soluble dans l'eau, le méthanol, l'éthanol, le diméthylsulfoxyde et l'acide acétique et insoluble dans l'acétone, l'acétate d'éthyle, l'éther et 1'acétonitrile et ayant un chlorhydrate dont l'analyse 35 élémentaire approchée est comme suit : C 43,49%; H 7,85%; N 13,68% et Cl 11,06%. 72 15099 20 2134614 7 - Nouveau composé caractérisé en ce qu'il est choisi parmi l'antibiotique EM-49 gamma et ses sels, l'antibiotique EM-49 gamma possédant cinq restes acide diamino-2,4 butyrique, deux restes leucine et ne possédant pas de reste phénylalanine, étant soluble dans l'eau, le méthanol, l'éthanol, 5 le diméthylsulfoxyde et l'acide acétique et insoluble dans l'acétone, l'acétate d'éthyle, l'éther et 1'acétonitrile, et ayant un chlorhydrate dont l'analyse élémentaire approchée est comme suit : C 43,42% : H 6,96%; N 12,92%; Cl 10,64%. 8 - Nouveau composé caractérisé en ce qu'il est choisi parmi l'antibiotique EM-49 delta et ses sels, l'antibiotique EM-49 delta possédant 10 cinq restes acide diamino-2,4 butyrique, deux restes leucine et un reste phénylalanine, étant soluble dans l'eau, le méthanol, l'éthanol, le diméthylsulfoxyde et l'acide acétique et insoluble dans l'acétone, l'acétate d'éthyle, l'éther et 1'acétonitrile, et ayant un chlorhydrate dont l'analyse élémentaire approchée est comme suit : C 44,75%; H 7,17%; N 13,13% et Cl 10,58%. 15 9 - Nouveau composé caractérisé en ce qu'il est choisi parmi l'antibiotique EM-49 SMF et ses sels, l'antibiotique EM-49 SMF ayant un équivalent de neutralisation de 584 et présentant l'analyse élémentaire approchée suivante : C 50,46%; H 6,47% et N 11,69%, le reineckate de cet antibiotique ayant un point de fusion de 198-200°C environ. 20 10 - Nouveaux médicaments utiles notamment comme antibiotiques, caractérisés en ce qu'ils consistent en composés physiologiquement acceptables selon l'une quelconque dés fcevendications 2-à 9. 11 - Compositions pharmaceutiques caractérisées en ce qu'elles contiennent comme ingrédient actif un médicament selon la revendication 10. 25 12 - Formes pharmaceutiques appropriées à l'administration des compositions selon la revendication 11, l'administration se faisant par voie topique à l'aide de crèmes ou d'onguents contenant jusqu'à 1 % environ de la substance active ou par i n j e c t ion à raison d'environ 50 à 125 mg/kg/jour. 30 13 - Nouveau désinfectant caractérisé en ce qu'il contient jusqu'à 1% environ d'un composé selon l'une quelconque des revendications 2 à 9.