FR 2128844 A1 19721020 FR 7208482 A 19720310 72 08482 1 2128844 La présente invention concerne l'utilisation de certains micro-organismes pour la préparation de composés marqués par un radio-isotope. l'utilisation de cellules vivantes pour transformer des 5 formes minérales d'isotopes radio-actifs ou stables en composés organiques plus intéressants n'est pas un procédé nouveau. Des plantes entières, des feuilles détachées et d'autres organes végétaux, l'algue microscopique verte appelée Chlorella, les ïhiobactériales tels que Thiobacillus thioxldans. des levures 10 et d'autres micro-organismes ont été utilisés à cette fin. Tous les organismes utilisés jusqu'a présent pour ces opérations de marquage présentent certains inconvénients, les organismes supérieurs tels que les végétaux et les animaux -supérieurs souffrent beaucoup de l'effet produit par les ra-15 diations, en sorte que (pour prendre un exemple particulier) ils ne peuvent être utilisés qu'avec l'isotope 14 du carbone à de très faibles concentrations isotopiques. Des organismes tels que les thiobactériales offrent l'avantage d'absorber. directement de l'anhydride carbonique, mais leur croissance 20 est plutôt lente et ceci accroît leur sensibilité aux dégâts causés par les radiations. Beaucoup d'autres micro-organismes présentent l'inconvénient de nécessiter un apport de carbone isotopique sous une forme organique, par exemple glucose ou acétate. Ceci est désavantageux, parce que plus coûteux à fournir 25 que de l'anhydride carbonique isotopique, et il peut être difficile d'y pourvoir à de très grandes concentrations isotopiques. Par exemple, bien que le glucose uniformément marqué puisse être utilisé comme substrat, on ne peut pas, en fait, le produire en quantités^Lsotopiques supérieures à 80 $>, 30 l'algue verte microscopique du genre Chlorella a cons titué l'organisme entier d'emploi le plus général pour la production de composés marqués, notamment de carbone 14. les avantages de l'utilisation de Chlorella sont soulignés dans divers traités (par exemple "Carbon—14 Compounds" de J.R. 35 Catch, Chapitre 4). Il est possible de cultiver des algues du genre Chl nr-el 1 a dont les concentrations isotcpiques en carbone 14 atteignent 90-95 72 08482 2 2128844 L'algue Chlorella présente à cette fin l'inconvénient d'avoir une faible teneur en acide nucléique, et une teneur particulièrement faible en acide désoxyribonucléique (DNA). Toutefois, lorsqu'on cultive l'algue Chlorella à de très fortes 5 teneurs isotopiques en carbone 14, les cellules s'accroissent considérablement et la proportion de la teneur en carbone récupérée sous la forme d'acide désoxyribonucléique est sensiblement réduite au-dessous du faible taux normal. L'algue Chlorella constitue donc une source très insuffisante d'acide 10 désoxyribonucléique marqué au carbone 14 à une forte teneur isotopique, et par conséquent de désoxyribonucléotides et de désoxyribonucléosides. L'invention concerne un procédé de préparation d'un composé marqué par un isotope, procédé qui consiste à cultiver un 15 micro-organisme du genre Anacystis dans un milieu contenant l'isotope en question sous une forme qui est absorbée par le micro-organisme. L'espèce préférée du genre Anacystis est Anacystis nidulans, algue microscopique de couleur vert-bleu, également 20 appelée Anacystis maxima, Phormidium mucicola ou Lauterbornia nidulans. L'invention couvre également l'utilisation de formes mutantes, de sources naturelles ou produites artificiellement, de la souche typique d'Anacystis nidulans. Anacystis nidulans est un micro-organisme de photosyn- 25 thèse, dont la croissance ne nécessite que de l'eau, des sels minéraux, de la lumière et de l'anhydride carbonique ou un bicarbonate comme seule source de carbone. L'invention concerne 1 4 principalement l'utilisation de C0o comme source de l'iso- C. ♦ tope. Dans les conditions convenables, le micro-organisme 30 absorbe très rapidement le ^CO^, et le carbone 14 se répartit progressivement entre les diverses molécules de l'organisme. L'invention concerne par conséquent, selon son aspect préféré, un procédé de préparation d'un composé marqué au carbone 14, notamment un composé choisi entre les nucléôsides, 35 les nucléotides et les amino-acides, procédé qui consiste à cultiver un micro-organisme de l'espèce Anacystis nidulans dans un milieu contenant de l'anhydride carbonique et un 72 08482 3 2128844 bicarbonate, dans lequel le carbone 14 est présent de préférence à une concentration isotopique sensiblement égale à 100 i°, comme source, et de préférence comme seule source de carbone. les conditions dans lesquelles Anacystis nidulans peut 5 être cultivé sont connues et analogues aux conditions dans lesquelles l'algue Chlorella se développe ; ainsi, ces" conditions ne seront pas décrites en détail dans le présent mémoire. Il est possible, et il sera généralement préférable d'utiliser de l'anhydride carbonique à teneur en carbone 14 sensiblement 10 égale à 100 $, bien qu'on puisse utiliser le cas échéant de plus faibles teneurs isotopiques en carbone 14 dans l'anhydride carbonique. lorsque la croissance est terminée, ou lorsqu'elle a progressé aussi loin qu'on le désire, on récolte les algues et on peut les traiter par des procédés connus, nécessaires 15 pour récupérer le ou les composés désirés marqués par l'isotope. On peut utiliser Anacystis nidulans pour produire des composés marqués par un isotope tels qu'une protéine, des amino-acides, des nucléosides, des nucléotides, des acides nucléiques, des désoxynucléosides, des désoxynucléotides, des acides désoxy-20 nucléiques, des acides gras, des stéroïdes et d'autres lipides, et des facteurs de croissance marqués avec des isotopes stables ou radio-actifs, les avantages que l'on peut tirer de l'utilisation d'Anacystis nidulans à la place de Chlorella sont les suivants : 25 A. Yitesse de croissance On peut faire croître Anacystis nidulans avec une génération de plus courte durée (temps nécessaire pour doubler le nombre de cellules) que Chlorella et par conséquent faire croître ce micro-organisme plus rapidement. Sur de 1'"anhydride 30 carbonique non radio-actif et dans des conditions optimales, on peut faire croître A. nidulans avec une période de génération d'environ 2 heures, tandis que l'optimum pour Chlorella est de 5 à 6 heures. Rien n'oblige à faire croître A. nidulans dans les conditions optimales absolues, et on a normalisé des condi-35 tions qui donnent une période de génération de 5 à 6 heures. Sous l'effet de légères variations du pH du milieu, de la lumière, de la température, etc. on n'observe pas d'effet 72 08482 4 2128844 important sur la vitesse de croissance, en sorte que l'opération est plus sûre. L'algue Chlorella doit être cultivée dans des conditions optimales à une forte activité spécifique de carbone 14 pour que sa croissance soit convenable, et par conséquent de 5 faibles modifications du milieu peuvent exercer un effet nuisible prononcé sur la croissance. B. Résistance à la radiation Anacystis nidulans résiste mieux à la radiation que Chlorella et ceci offre les avantages suivants : 10 1. Par culture à une forte activité spécifique de carbone 14, la période de génération d'Anacystis nidulans reste constante et le développement est complet en 24 heures environ. Toutefois, l'algue Chlorella souffre de l'effet de la radiation et chacune des générations successives demande plus de temps 15 (ce qui donne une croissance à peu près exponentielle de la période de génération). Par conséquent, bien que, dans les conditions de croissance de l'invention, il y ait peu de différence entre les périodes initiales de génération des deux organismes, le développement de Chlorella demande de 48 à 72 heures pour 20 être complet (c'est-à-dire 2 à 3 fois le temps nécessaire pour Anacystis nidulans). 2. Lorsque les cellules sont cultivées en présence d'anhydride carbonique à une forte activité spécifique, l'effet nuisible de la radiation a pour effet que Chlorella produit des 25 cellules qui sont beaucoup plus grandes et plus fragiles que celles qui sont cultivées sur l'anhydride carbonique non.radioactif. Ces cellules plus grandes subissent facilement une lyse et le contenu cellulaire intéressant à l'état potentiel est perdu dans- la liqueur surnageante, de laquelle on ne peut 30 pas le récupérer aisément. Il n'y a pas de différence visible entre des cellules d'Anacystis nidulans développées en présence de de grande activité spécifique et celles qui se déve loppent sur de l'anhydride carbonique non radio-actif. Les pertes par lyse cellulaire sont plus faibles que dans le 35 cas de Chlorella et l'anhydride carbonique ^COg initial s'incorpore à environ 85 $> dans les cellules entières, contre 75-80 io pour Chlorella. 72 08482 5 2128844 3. Peut être à cause de l'augmentation de la taille des cellules de Chlorella à une forte activité spécifique de carbone 14, la teneur en DUA par cellule diminue à mesure que l'activité spécifique augmente ; ceci n'arrive pas dans le cas 5 d'Anacystis nidulans. 4. On utilise un inoculum d'environ 5 % dans la photosynthèse pour éviter à la fois une baisse de l'activité spécifique et le danger d'un marquage non uniforme des produits; la croissance doit porter sur 4 à 5 générations pour être 10 complète (c'est-à-dire l'absorption totale de ^002). Si la croissance de Chlorella prend un mauvais départ (c'est-à-dire si la première génération a une durée plus longue que la normale), par exemple à cause d'une variation du milieu qui se trouve alors en dessous des conditions optimales, elle souffre 15 trop de l'effet nuisible des radiations et elle ne peut pas s'achever, ou bien si elle parvient à être complète, il se produit pendant les derniers stades de la croissance une lyse excessive des cellules et par conséquent une perte de matière utile. 20 C. Teneur en acides nucléiques A une forte activité spécifique de carbone 14 (teneur isotopique d'environ 95 (fa), les teneurs en acides nucléiques d'Anacystis nidulans et de Chlorella sont les suivantes : Acides nu- 25 cléiques totaux TMA BEA (par différence) Anacystis nidulans 6,5 i° 1)7 i° 4,8 $ Chlorella 3,7 ^ 0,2 % 3,5 ^ 30 c'est-à-dire qu'Anacystis nidulans contient environ deux fois autant d'acide nucléique que Chlorella,(8,5 fois autant de DEÏA et 1,3 fois autant de RÏFA). D. Teneur en protéine Anacystis nidulans donne environ 10 56 de protéine de 35 plus que Chlorella. On donne ci-après une description d'un mode préféré de mise en oeuvre du procédé de l'invention. 72 08482 6 2128844 Développement d1Anacystis nidulans sur ^CO^ à une teneur isotopique d'environ 100 aJo l'organisme peut être cultivé dans un appareil du type déjà décrit pour la culture de Chlorella-Cl4. Des exemples de 5 divers types d'appareils sont décrits par J.R. Catch ("Radioisotope Conférence 1954"» "Vol. 1, p. 337» Butterworth, londres, 1954) ; R. ¥. Dutton et C.E. Dalgliesh ("J. Chem. Soc.," 1956, 3792) ; P.H. Abelson et Collaborateurs ("Studies in Biosynthesis of E. coli", Chapitre 4, Carnegie Institue, Washington, 1955) ; 10 Z. ÎTejedly, J. Eilip, D. Grunberger ("Methods of Preparing and Storing labelled Compounds", pages 527-537» Euratom, Bruxelles 1968) ; J. liebster, J. Kopoldova, J. Kozel, M. Dobiasova,("Coll. Czech. Chem. Commun." 1961, 26, 1582) ; P. D. Ellner, ("Plant Phys 1959, 34,638-40). le procédé préféré utilise un appareil renfer-15 mant un volume de liquide d'environ 5 litres et un volume de gaz d'environ 20 litres, équipé d'un agitateur et/ou d'un dispositif de circulation de gaz pour faciliter l'absorption d'anhydride carbonique de la phase gazeuse par le liquide. Un tel appareil permet d'incorporer 100 millimoles d'anhydride car-20 bonique au carbone 14, ce qui équivaut à 6,2 Curies à une teneur isotopique de 100 $. le liquide est éclairé artificiellement avec quatre rampes formées chacune de quatre tubes fluorescents "Warmlight" ou "G-ro-lux" d'environ 61 cm. On maintient la température à 37°C au moyen d'une chemise à eau équipée d'un ther-25 mostat. le milieu de croissance qu'on utilise est une modification d'un milieu minéral classique additionné de traces d'ions métalliques, habituellement utilisés pour la croissance de Chlorella et d'autres micro-organismes de photosynthèse 30 (voir "Growth of Phototropic Bacteria and Blue-Green Algae"), H. G. Carr, Methods in Microbiology, édité par J.R. ÎJorris et D. ¥. Ribbons, Academic Press, londres, et New York, Volume 3B, pages 53-57,1970). Cette modification consiste en une concentration en phosphate supérieure à la normale, pour 35 accroître l'effet de tampon et réduire ainsi les variations de pH qui ont lieu pendant la croissance, notamment dans un système clos. 72 08482 7 2128844 L'inoculum, qui équivaut à 5 $ du poids final d'Anacystis nidulans, est prélevé dans une culture d1Anacystis nidulans non radio-active, dans la phase exponentielle de croissance. Cette culture est produite par inoculation d'un prélèvement de 5 culture sur gélose inclinée d'Anacystis nidulans dans 50 ml de milieu de culture contenus dans une fiole conique de 500 ml, et incubation du milieu ensemencé (dans une atmosphère de 5 i° d'anhydride carbonique dans l'air) dans une secoueuse à, mouvement planétaire, éclairée par deux tubes fluorescents du 10 type "lumière du jour" de 40 watts placés à une distance de 28 cm, pour produire l'inoculum pour 500 ml de milieu contenu dans un récipient de culture de forme cylindrique d'un litre de capacité (40 cm x 7 cm) maintenu à 37°C au moyen d'une chemise à eau reliée à un thermostat, éclairé par six tubes 15 fluorescents du type "lumière du jour" de 40 watts disposés à une distance de 20 cm, et aéré à un débit de 1,0 à 1,5 l/mn avec de l'air stérile contenant 2 à 5 i° d'anhydride carbonique. Ceci produit, en 24 à 36 heures, une culture se développant rapidement, avec laquelle on inocule le milieu de croissance 20 de 5 1 destiné à la préparation. Après stérilisation par autoclavage , on transvase environ 5 1 du milieu de croissance dans des conditions aseptiques dans un récipient stérilisé, au moyen d'un tube d'échantillonnage, et le milieu est inoculé pendant le transfert. 25 lorsque le transfert et 1'.inoculation sont terminés, on réduit la pression d'air dans le récipient de culture à environ 0,5 bar, on engendre 100 millimoles d'anhydride carbonique au carbone 14 (6,2 curies à une teneur isotopique de 100 $) par addition d'acide perchlorique dilué à 100 millimoles de carbonate de baryum 30 au carbone 14 dans un simple récipient de dégagement du type normalement utilisé pour les travaux de synthèse impliquant l'utilisation d'anhydride carbonique au carbone 14. l'anhydride carbonique au carbone 14 est envoyé dans le récipient de culture par un courant d'air de balayage jusqu'à ce que la pression 35 à l'intérieur du récipient se trouve à environ 8 cm de mercure au-dessous de la pression atmosphérique, de manière que toute fuite pendant la croissance ait lieu par pénétration d'air dans 72 08482 8 2128844 le récipient plutôt que par passage d'anhydride carbonique au carbone 14 à l'extérieur du récipient. On prélève un échantillon immédiatement après le dégagement d'anhydride carbonique au carbone 14, et on mesure 5 son pH pour s'assurer qu'il est correct (pli 7,4). On prélève ensuite des échantillons par intervalles et on contrôle l'état . de la croissance en mesurant le pH de l'échantillon, la densité optique à 380 nm, la radio-activité totale (anhydride carbonique au carbone 14 dissous, cellules et produits marqués 10 excrétés dans le milieu), la radio-activité après acidification (cellules et produits marqués excrétés dans le milieu) et la radio-activité retenue par un filtre à membrane "Millipore" (cellules ). Au bout d'environ 14 heures, lorsque la croissance 15 a progressé d'environ 50 le pH commence à s'élever et on ajoute un acide par intervalles pour s'assurer que le pH ne dépasse pas 8,5. A mesure que la croissance s'approche de la fin, le pH cesse d'augmenter et des déterminations d'activité montrent qu'il reste en solution moins de 5 i° de l'anhydride 20 carbone -eau-C14 initial. Les cellules sont alors récoltées. La petite quantité d'anhydride carbonique au-C14 non absorbéejest récupérée par circulation d'air dans le récipient et passage dans un piège alcalin contenant 100 ml. d'hydroxyde de potassium 4N. Les cellules (qui contiennent environ 85 i° de 25 radio-activité totale) sont ensuite séparées de la liqueur surnageante (qui contient environ 10 % de la radio-activité totale) par centrifugation dans une centrifugeuse réfrigérée (environ 4°C) équipée d'un rotor à écoulement. On les traite ensuite rapidement pour réduire les pertes éventuelles d'acides 30 nucléiques de haut poids moléculaire par dégradation sous l'effet de la radiation. Traitement des cellules marquées d'Anacystis nidulans Les lipides, qui représentent environ 15 % de l'activité totale des cellules, sont isolés des cellules centrifugées 35 par extraction au solvant, à savoir deux fois avec de l'éthanol absolu et finalement avec un mélange d'éthanol et de chloroforme à 9:1. Le solvant est éliminé dans un courant d'azote et 72 08482 9 2128844 les lipides résiduels sont dissous dans du benzène et la solution est conservée sous atmosphère d'azote dans des ampoules de verre en vue du traitement subséquent par les procédés classiques, 5 le résidu obtenu après l'extraction des lipides est mis en suspension dans un faible volume (environ 30 ml) d'eau distillée, soumis à l'action des ultra-sons pendant 10 mn et centrifugé, la liqueur surnageante est enlevée et le résidu est remis en suspension dans vin faible volume d'eau, et soumis de 10 nouveau à l'action des ultra-sons. Les deux liqueurs surnageantes, qui contiennent des composés hydrosolubles de faible poids moléculaire, sont rassemblées et le résidu insoluble, contenant principalement la protéine et les acides nucléiques, est traité de manière à séparer les acides nucléiques de la 15 protéine. On obtient une fraction riche en désoxynucléotides par traitement d'une suspension de ce résidu avec la désoxyribo-nucléase I exempte de ribonucléase, qui dégrade l'acide désoxyribonucléique (Dl'TA) insoluble dans l'eau de haut poids molécu-20 laire en donnant des oligo-désoxyribonucléotides hydrosolubles. Lorsque la réaction est terminée, la fraction d'oligo-désoxy-nucléotides est isolée par centrifugation et transformée en un mélange des quatre monophosphates de désoxyribonucléosides (5'-monophosphate de désoxycytidine, 5'-monophosphate de déso-25 xycytidine, 5'-monophosphate de désoxyguanosine et 5l~monophos-phate de thymidine) par traitement avec la phosphodiestérase de venin de serpent purifiée et exempte de phosphatase. Les quatre monophosphates de désoxyribonucléosides sont ensuite isolés sous une" formé pure de ce mélange par des procédés classiques en 30 utilisant la chromatographie sur colonne de "DEAE-Sephadex", sur papier et en couche mince. On isole ensuite une fraction riche en acide ribo-nucléique du résidu qui reste après le traitement à la désoxy-ribonucléase, par extraction avec une solution chaude à 10 ^ 35 de chlorure de sodium. L'acide ribonucléique est isolé de cet extrait au chlorure de sodium à 10 $ par précipitation à l'é-thanol, puis dégradé pour donner un mélange des quatre mono 72 08482 10 2128844 phosphates de ribonucléosides(5'-monophosphate d'adénosine, 5'-monophosphate de cytidine, 5'-monophosphate de guanosine et 5'-monophosphate d'uridine) par traitement avec une phos-phodiestérase de venin de serpent purifiée et exempte de phos-5 phatase. les monophosphates de ribonucléosides sont ensuite isolées sous une forme pure de ce mélange par des procédés classiques, en utilisant la chromatographie sur colonne de "DEAE-Sephadex", sur papier et en couche mince. Le résidu insoluble qui reste après l'extraction au 10 chlorure de sodium des acides nucléiques consiste principalement en protéine insoluble et est hydrolysé à l'acide chlorhydrique au moyen d'un procédé normal. L'hydrolysat de protéine (dont la radio-activité est à peu près 60 $ de celle des cellules récoltées) que l'on obtient de cette façon est fractionné par des pro-15 cédés classiques pour former des amino-acides purs du point de vue radiochimique. 72 08482 2128844 ?-!WB?TDICAxIOI;S 1. Procédé de préparation d'un composé marqué par un isotope, caractérisé par le fait qu'il consiste à cultiver un micro-organisme du genre Anacystis dans un milieu contenant 5 l'isotope en question sous une forme sous laquelle il est absorbé par le micro-organisme. 2. Procédé suivant la revendication 1, caractérisé par le fait que le micro-organisme est l'espèce Anacystis nidulans. 3. Procédé suivant la revendication 1 ou 2. caractérisé *1 10 par le fait que l'isotope en question est le carbone 'C. 4. Procédé de préparation d'un composé marqué au carbone 14 C, caractérisé par le fait qu'il consiste à cultiver un microorganisme de l'espèce Anacystis nidulans dans un milieu contenant de l'anhydride carbonique et du bicarbonate dans lequel le 1 4- 15 carbone C est présent comme source de carbone. 5. Procédé suivant la revendication 4, caractérisé par le 1 4 fait que le composé marqué au carbone C est choisi entre des nucléosides, des nucléotides et des amino-acides. 6. Procédé suivant l'une des revendications 4 et 5, 20 caractérisé par le fait que le milieu anhydride carbonique/carbonate contient du carbone à une teneur isotopique pratiquement égale à 100 fo. 7. Procédé suivant l'une quelconque des revendications 4 à 6, caractérisé par le fait que la seule source de carbone 25 du milieu consiste en anhydride carbonique/bicarbonate. 8. A titre de produits -industriels nouveaux, des com- 1 A ✓ posés marqués au carbone C, obtenus au moyen d'un procédé conforme à l'une quelconque des revendications précédentes.