FR 2125334 A1 19720929 FR 7204169 A 19720208 72 04169 1 2125334 Cette invention concerne un procédé de fabrication de D-mannitol par fermentation. En particulier, elle concerne un procédé de fabrication de D-mannitol consistant à faire fermenter en aérobiose un milieu aqueux nutritif contenait 5 un hydrocarbure par une nouvelle souche de levure, candida lipolvtica, et à isoler le D-mannitol par cristallisation directe dans le bouillon de fermentation clarifié. Le D-mannitol est un polyalcool cristallin blanc, non hygroscopique, qui possède une saveur sucrée agréable qui 10 est égale à environ 65% de celle du saccharose. Il est utilisé dans les aliments comme agent Sonnant du corps et de la texture. Il est utile comme excipient dans les comprimés à mâcher tels que vitamines et aspirine. En outre, le D-mannitol est utile dans la fabrication des résines artificielles et des 15 plastifiants et comme intermédiaire dans la fabrication du vasodilatateur qu'est l'hexanitrate de D-mannitol. On l'utilise également avec l'acide borique dans la fabrication de condensateurs élecfcrolytiques secs pour les radioapplications. La majeure partie de l-'.approvisionnement du commerce en 20 D-mannitol provient du saccharose. Le saccharose est tout d'abord hydrolysé en D-glucose et D—fructose et ensuite réduit, ce qui conduit à un mélange de sorbitol et de D-mannitol dans le rapport approximatif de 3 à 1. Le coût actuel relativement élevé du D-mannitol est dû en partie aux problèmes rencontrés 25 pour séparer le D-mannitol de pureté élevée du sorbitol produit s imultanément. On sait que les souches du genre Candida produisent divers mélanges de polyalcools tels que glycérol, i-érythritol, D-arabitol et D-mannitol, habituellement à partir de substrats 30 constitués de glucides. Il existe également dans la littérature de nombreux rapports qui décrivent la culture des souches do Candida dans des milieux contenant des hydrocarbures comme source principale de carbone assimilable. Cette invention fournit un procédé de fermentation permettant 35 de produire à l'échelle industrielle, à un prix faible, du D-mannitol à partir de certains hydrocarbures largement disponibles. Le procédé utilise une nouvelle souche de Candida lipolvtica qui produit du D-mannitol comme principal polyol et à des concentrations telles qu'on peut le cristalliser direc-40 tement dans un concentré de bouillon de fermentation clarifié et 72 04169 2 212533^ désionisé. La présente invention fournit désormais un procédé de production de D-mannitol dans lequel on fait fermenter en aérobiose un milieu nutritif aqueux contenant un hydrocarbure 5 ou un mélange d'hydrocarbures comme source principale de carbone assimilable par une certaine souche nouvelle du genre candida pendant environ 8 à environ 9 jours, et on récupère le D-mannitol directement en concentrant le bouillon de fermentation filtré et désionisé. En particulier, cette invention 10 comporte ion procédé de production du D-mannitol par fermentation en aérobiose de candida lipolvtica ATCC n° 20297 dans un milieu nutritif contenant au moins un hydrocarbure qui est un n-alcane ayant de 12 à 18 atomes de carbone que l'on mélange intimement à une phase aqueuse contenant une source assimilable d'azote, 15 des produits minéraux et d'autres produits nutritifs habituels. Dans le procédé de cette invention, les concentrations en D-arabitol et i-érythritol produits simultanément sont si faibles et la concentration en D-mannitol est si élevée qu'elles permettent de récupérer le D-mannitol pur en le faisant cristalliser direc-20 teraent dans les bouillons de fermentation clarifiés et désionisés. On a désormais trouvé qu'une certaine souche de levure, la souche Candida lipolvtica, a le pouvoir particulier de produire du D-mannitol à une concentration élevée, au cours de la fermentation aérobie de milieu aqueux contenant un hydrocarbure ou un 25 mélange d'hydrocarbures comme source principale ou unique de carbone assimilable, avec production simultanée de D-arabitol et de i-érythritol à des concentrations faibles. Actuellement on ne connait que la seule souche de Candida lipolvtica qui permette de récupérer facilement du D-mannitol avec un bon 30 rendement par cristallisation directe dans le bouillon de fermentation concentré. La souche utilisable a été déposée dans une collection publique officielle, 1'American Type Culture Collection, et a reçu le nom de souche ATCC n° 20297. On peut utiliser divers n-alcanes, allant du dodécane à 35 l'octadécane, comme seul hydrocarbure dans le milieu de fermentation. On peut utiliser également des mélanges d'hydrocarbures, parmi lesquels des matières brutes et semi-raffinées, mais au moins une partie doit être constituée d'un hydrocarbure ayant une chaîne comportant d'environ 12 à 18 atomes de carbone. La 40 concentration de l'hydrocarbure doit être au moins égale à 72 04169 j 2125334 environ 5% en poids du milieu afin de donner des concentrations et des rendements importants en D-mannitol. On peut utiliser des concentrations atteignant 20% en poids si on le désire, mais la concentration préférée pour obtenir des résultats optimaux 5 est d'environ 15% en pds/pds. Le milieu de fermentation contient les sources classiques d'azote assimilable, de substances minérales et d'autres facteurs de croissance qui sont contenus dans la phase aqueuse. L'urée est la source d'azote organique préférée bien que d'autres 10 substances telles que liqueur de macération de maïs, hydrolysat de farine de soja, acides aminés et peptones puissent Bien que toute forme d'incubation aérobie donne satisfaction, il est préférable de faire une aération contrôlée, telle que 20 par exemple l'agitation du milieu avec arrivée d'air, ou bien diffusion d'air à travers le milieu. Etant donné que l'hydrocarbure n'est pas miscible à la phase aqueuse, il est souhaitable de le maintenir sous une forme finement dispersée dans un milieu aqueux pendant fe fermentation, en s'assurant ainsi qu'une grande surface 25 d'hydrocarbure vient en contact avec la phase aqueuse. Il existe de cette manière un contact optimal entre les cellules de levure, la phase aqueuse et l'hydrocarbure. Une méthode préférée pour réaliser ces objectifs est de faire une fermentation aérobie en submersion, en agitant rapidement le mélange tout en le 30 faisant simultanément traverser par de l'air, par exemple par diffusion. On peut utiliser les conditions de durée et de température usuelles d'incubation qui sont connues dans la technique concernant la culture des levures, soit environ 20 à 34°C pendant 35 environ 4 à 9 jours. Dans le procédé de fermentation de cette invention, on conduit l'étape de production finale dans les fermenteurs sous agitation pendant environ 8 à 9 jours à 24-25°C. Dans le procédé de fermentation qui fait intervenir 72 04169 4 2125334 l'utilisation de fermenteurs sous agitation, la culture des cellules initiales est effectuée en plusieurs étapes. On prépare un inoculum de base en partant d1 une suspension aqueuse de cellules provenant d'un tube de gélose inclinéede candida 5 lipolvtica ATCC N° 20297 qui est utilisé pour ensemencer un milieu nutritif aqueux contenant du glycérol, de l'extrait de boeuf, de l'extrait de levure et de la peptone. Après avoir mis à l'incubation avec agitation pendant environ 20 heures à 28°C, on utilise la culture résultante pour ensemencer des 10 flacons d'Erlenraeyer contenant un milieu nutritif aqueux plus un hydrocarbure assimilable comme le n-hexadécane. Après une incubation d'environ 48 heures à 24-28°C, on utilise des aliquotes de la liqueur résultante pour ensemencer des flacons de Fernbach contenant un milieu nutritif aqueux à base d'hydro-15 carbure. Après incubation avec agitation à 24-28°C pendant environ 72 heures, on transporte une partie de la culture dans chacun de plusieurs fermenteurs sous agitation contenant un milieu nutritif aqueux plus l'hydrocarbure assimilable désiré ou un mélange de tels hydrocarbures. On met les fermenteurs, 20 agités à raison de 650 à 1750 tpm et recevant de l'air stérile diffusé à raison de 2 à 8 litres par minute, à l'incubation à 24-25°C pendant environ 8 à 9 jours. La quantité d'inoculum utilisée dans les diverses étapes de culture dépend jusqu'à un certain point de la "densité" de la 25 culture de cellules. Généralement un inoculum d'une bonne culture de cellules correspondant à peu près à 5% est satisfaisant pour chaque étape de production. On estime les concentrations en D-mannitol, D-arabitol et i-érythritol dans le bouillon de fermentation et les étapes de 30 récupération en combinant la colorimétrie et la chromatographie en couche mince, on détermine la teneur totale en polyolspar une variante de la méthode colorimétrique de Bailey décrite dans J. Lab. Clin. Med., 54_, 158 (1959). On a évalué approximativement à l'oeil les concentrations en i-érythritol et D-arabitol 35 après une chromatographie en couche mince utilisant la cellulose F comme adsorbant, un mélange acétone:eau (85:15) comme système s olvant de développement et la p-anisidine suivie de periodate comme réactifs de pulvérisation pour la visualisation. On récupère le D-mannitol du bouillon total de fermentation 40 en faisant passer le bouillon à travers un séparateur à disque 72 04169 s 2125334 centrifuge pour séparer tout d'abord les cellules de levure et ensuite l'hydrocarbure résiduel de la phase aqueuse.On disperse la phase aqueuse trouble par filtration et ensuite on le désionisé en la faisant passer successivement sur des échangeurs 5 anioniques faibles, cafcioniques forts et anioniquesfaibles. Ensuite on concentre le bouillon clarifié, désionisé, sous pression réduite pour obtenir une solution à 25% en pds/v, et on laisse cristalliser sous réfrigération. On sépare le D-mannitol cristallin par filtration ou centrifugation, et 10 l'on obtient d'autres récoltes de cristaux en concentrant encore les liqueurs aères. Il est bien entendu que le procédé de cette invention englobe également 1'emploi de mutants ou de variants de la souche candida lipolvtica tels qu'on les obtient par des 15 procédés chimiques et physiques divers. On obtient ces mutants à l'aide des rayons X, par irradiation UV, traitement par les moutardes à l'azote ou les peroxydes organiques et d'autres techniques similaires bien connues de l'homme de l'art. En réalisant le procédé de la présente invention on envisage en 20 outre l'utilisation de sub-cultures, de mutants naturels, de variants, et::. Las exemples suivants sont donnés pour illustrer la présente invention, mais non pour en limiter le cadre. Entretien de la culture 25 a. On conserve candida lipolvtica ATCC N® 20297 en lyophi lisant les cellules dans un mélange de lait écrémé et de sérum de seing de boeuf. b. On prépare des cultures de réserve utiles en faisant des repiquages périodiques sur gélose inclinée (tubes de 25 x 150 m& 30 contenant 17 ml de gélose) en utilisant comme milieu 0,5% de glucose, 0,3% d'extrait de bo^uf, 0,5% d'extrait de levure, 3,0% de peptone et 2% de gélose. Préparation de 1'inoculum de base On lave une culture de candida lipolvtica ATCC N° 20297 35 sur gélose inclinée avec 20 ml d'eau distillée. On utilise une portion de 0,2 ml de la suspension de cellules résultante pour ensemencer 10 ml d'un milieu "A" (1% de glycérol, 0,3% d'extrait de boeuf, 0,3% d'extrait de levure et 0,5% de peptone). On met les tubes (25 x 150 mm) contenant 10 ml de milieu et 40 1'inoculum à l'incubation sous agitation pendant 20 heures 72 04169 6 2125334 à 28°C. La culture résultante est désignée sous le nom d'inoculum de base. Milieu de base de production "B" Ce milieu a la formule et contient par litre s 5 2,0 g d'urée, 1,0 g de (nh4)2S04, 1,0 g de caS04.2H20, 0,5 g de (NH4)2S04, 0,5 g de I^SO^ 0,25 g de MgS04.7H20, 2,5 mg de PeS04-7I^0, 10 mg de MnSO^ .H^O, 500 pg de chlorhydrate de thiamine et 1,0 ml de solution d'oligo-éléments minéraux. L'ensemble du milieu est ajusté à pH 3,5 et stérilisé par 10 autoclavage (l'urée est stérilisée et ajoutée séparément). La solution d'oligo-éléments (1,0 ml) fournit 1,0 mg de caci2.2H20 et 100 ^ig de chacun des composés CuSO^SHjO, C0C12.6H20, anS04.7H20, (NH4) Mo?024.4H20 et Na2B40?.IO&jO. EXEMPLE I 15 On lave deux fois à l'eau les cellules contenues dans 1'inoculum de base et on les remet en suspension dans de l'eau de manière à ce que la concentration finale en cellules soit approximativement égale à 10 mg/ml. On ensemence les flacons contenant 20 ml de milieu "B" et 4 mi de n-hexadécane (qualité 20 ASTM) avec 1,0 ml de la suspension de cellules précédente. On fait incuber les flacons 9 jours à 24-25°C sur une ^ secoueuse rotative. On sépare la portion aqueuse du bouillon, des callulas et de l'hydrocarbure résiduel par centrifugation. La colorimétrie et la chromatographie en aouche mince montrent 25 que la solution aqueuse contient 34 mg/ml de D-mannitol, moins de 1 mg/ml de D-arabitol et 3 mg/ml de i-érythritol. EXEMPLE II 1er Stade de développement - On ensemence des flacons d'Erlenmeyer de 300 ml contenant chacun 8 ml de milieu "A", 12 ml de milieu 30 "B* et 4 ml de n-hexadécane avec des portions de 1,0 ml de 1'inoculum de base et on met % l'incubation à 24°C sur une secoueuse rotative pendant 48 heures. 2ème Stade de croissance - On ensemence des flacons de Fernbach contenant 20 ml de milieu "A", 380 ml de milieu "B" et 80 ml 35 de paraffines mélangées (8% de n-C^H^Q# 72% de n-C^H^/ 15% de n-C^H^) avec des portions de 20 ml de la culture du premier stade et on fait incuber à 24°C sur une secoueuse rotative pendant 72 heures. Stade de la production - On ensemence des fermenteurs de 4 litres, 40 sous agitation, contenant 2000 ml de milieu "B" et 400 ml de 72 04169 7 2125334 paraffines mélangées (comme précédemment) avec 100 ml de culture de 2ème stade et on met à l'incubation à 24°C-25°C pendant 212 heures. On agite chaque fermenteur à 1750 tpm et l'on y fait diffuser 2 litres d'air stérile par minute. 5 Récupération - On fait passer l'ensemble de tout le bouillon dans un séparateur à disque centrifuge pour séparer les cellules de levure et l'hydrocarbure résiduel. On disperse la phase aqueuse trouble par filtration et ensuite on la désionisé par passages successifs sur échangeurs anioniques 10 faibles, cationiques forts et anioniques faibles. On concentre sous pression réduite 16 litres de bouillon clarifié, désionisé, contenant 12,5 mg/ml de D-mannitol jusqu'à obtention d'une solution à 25% pds/v et on laisse cristalliser sous réfrigération. La première récolte de D-mannitol cristallin pèse 15 41 grammes. Lorsqu'on les recristallise dans l'eau ces cristaux ont un point de fusion de 168°C (corrigé), qui ne s'abaisse pas lorsqu'on mélange les cristaux £vec un échantillon authentique de D-mannitol. On obtient d'autres récoltes de cristaux de D-mannitol en concentrant les liqueurs mères. 20 EXEMPLE III On répète le mode opératoire de l'Exemple II en remplaçant le mélange de n-paraffines dans le milieu de fermentation final par un mélange du même poids (comportant des portions égales) des hydrocarbures suivants : n-dodécane, n-tridécane, n-pentadécane, 25 n-hexadécane et n-octadécane, et on obtient des résultats comparables. EXEMPLE IV On prépare un inoculum de base, une culture de premier stade et une culture de second stade comme il est décrit dans 30 l'Exemple II si ce n'est que toutes les températures d'incubation sont égales à 28°C. On utilise un inoculum de 480 ml de culture de 2ème stade pour ensemencer chacun des fermenteurs New Brunswick de 14 litres, contenant chacun 7 litres de milieu "B" plus 1400 ml de paraffines mélangées (comme il est décrit 35 dans l'Exemple II). On maintient les fermenteurs à 25°C en refroidissant extérieurement, on y fait diffuser 8 litres d'air par minute et on agite à 650 tpm. Après 212 heures d'incubation, le bouillon contient 12 mg/ml de D-mannitol que l'on récupère par la méthode de l'Exemple II. 72 04169 8 2125334 REVENDICATIONS 1. Procédé de production de D-mannitol caractérisé en ce que l'on fait fermenter Candida lipolvtica ATCC N° 20297 dans un milieu nutritif aqueux contenant au moins une paraffine normale 5 ayant d'environ 12 à 18 atomes de carbone comme principale source de carbone assimilable. 2. Le procédé selon la revendication 1, caractérisé par le fait que la fermentation est conduite pendant une durée comprise entre 8 et 9 jours. 10 3. Le procédé selon la revendication 1 ou 2, caractérisé par le fait que l'on prépare 1'inoculum initial en cultivant Candida lipolvtica ATCC N° 20297 dans un milieu nutritif aqueux pendant environ 20 heures à 28°C. 4. Le procédé selon la revendication 1, 2 ou 3, caractérisé 15 par le fait que l'on récupère ledit D-mannitol directement à partir du bouillon de fermentation clarifié et désionisé.