FR 2134658 A1 19721208 FR 7215270 A 19720428 72 15270 i 2134658 Cette invention concerne un complexe sel d'insuline-protamine et une suspension de celui-ci dans un milieu aqueux, ainsi qu'un procédé de préparation du complexe et de la suspension. L'invention fournit un complexe sel d'insuline-protaminé 5 contenant un sel de métal alcalin ou d'ammonium de l'insuline et de 0,2 mg à 1,5 mg de protamine pour 100 unités d'insuline. L'invention fournit encore une suspension constituée d'eau ou d'une solution isotonique contenant en suspension le complexe sel d'insuline-protamine. On fait une suspension d'une quantité 10 de complexe fournissant de 90 à 115 unités d'insuline pour 100 ml de suspension. On prépare le complexe sel d1insuline-protamine en combinant : A) dans un milieu aqueux 1) la protamine 15 2) un sel de métal alcalin ou d'ammonium de l'insuline B) dans des proportions telles que pour 100 unités d'insuline il y ait de 0,2 à 1,5 mg de protamine C) pour former une suspension d'un complexe insoluble. Les présentes préparations d'insuline sont habituellement 20 réparties en catégories à action brève, à action intermédiaire, ou à action prolongée en ^e qui concerne leur activité biologique. Dans de nombreux cas de diabètes, la préparation souhaitée pour une utilisation thérapeutique est une préparation dont l'action démarre rapidement et a une durée prolongée. Aucune composition 25 d'insuline disponible dans le commerce jusqu'ici n'a présenté cette double action pour une régulation efficace de l'hyperglycémie en une seule injection. Même si dans les dernières années une préparation d'insuline prémélangée ayant à la fois les activités hyp0glycémiantes 30 brève et intermédiaire désirées a été introduite sur le marché, la préparation nécessite encore des spécifications de stockage et de conservation, donc a besoin d'être améliorée. La composition prémélangée est composée d'une solution de cristaux d'insuline-zinc provenant de pancréas de porc et d'une suspension de cristaux 35 d'insuline-zinc (ce dernier en quantité élevée) provenant de boeuf. D'autres préparations préliminaires dans lesquelles des solutions de cristaux d'insuline-zinc ou d'insuline amorphe étaient mélangées avec des préparations d'insuline-protamine-zinc ou d'insuline-protamine ont rencontré des problèmes de stabilité dus 40 à la dégradation de la protamine et également à la précipitation du 72 15270 2 2134658 constituant insuline so.lubie pa„' la protamine en excès présente dans le mélange. De nombreux problèmes, tels que faible pureté, instabilité, couleur, contamination par le facteur hyperglycémiant (glucagon), et protéines antigènes de poids moléculaire élevé 5 associées aux cristaux d'insuline-zinc du commerce, ont empêché le développement de compositions ayant à la fois une action hypoglycémiants débutant rapidement et durant longtemps. Un avantage de la présente invention est qu'elle fournit une suspension d'insuline pour une injection unique et qui à l'emploi 10 donne une action à démarrage rapide et une action de durée prolongée. Un autre avantage est que le complexe d'insuline, ou la suspension, peuvent être conservés pendant de longues durées sans subir de dégradation importante. 15 Les Figures 1, 2, 3, 4 et 5 sont des graphiques représentant le taux de sucre du sang obtenu avec diverses préparations d'insuline chez des animaux après injection, la durée étant portée en abscisse et le taux du sucre du sang de l'animal ayant reçu l'injection étant porté en ordonnée. 20 La Figure 1 est un graphique comparant les effets d'injection d'insuline sodée-protamine et d'insuline isophane (NPH). La Figure 2 est un graphique comparant l'effet du complexe ou de la suspension de la présente invention avec l'effet d'un mélange d'insuline normale acide et d'insuline isophane. 25 La Figure 3 ?st un graphique qui compare trois suspensions de la présente invention, à savoir insuline de boeuf, insuline de porc, et mélange des deux. La Figure 4 est un graphique comparant les activités du complexe de l'invention après conservation. 30 La Figure 5 est un graphique comparant les complexes et suspensions des exemples de la présente invention. Le complexe sel d1insuline-protamine obtenu par le procédé de cette invention est utile comme ingrédient actif dans une composition hypoglycémiante ayant à la fois une action à 35 démarrage rapide et une action de longue durée. Le sel d'insuline est sous la forme d'un sel de métal alcalin ou d'un sel d'ammonium, et la protamine est de préférence présente sous forme du sulfate en des proportions d'environ 0,2 mg à environ 1,5 mg, de préférence d'environ 0,4 à environ 0,8 mg, pour cent unités d'insuline. 40 On prépare le sel d'insuline, gui est pratiquement exempt 72 15270 3 2134658 de zinc ou d'un autre métal lourd, de préférence par cristallisation alcaline de l'insuline, à l'aide d'hydroxyde de sodium, d'un hydroxyds de métal alcalin ou d'hydroxyde d'ammonium. Après la cristallisation, on lave les cristar.x et on les sèche jusgu! à une 5 teneur en humidité inférieure à environ 10 pour cent. Le sel d'insuline est instantanément soluble dans l'eau à pH neutre et peut être conservé en solution aussi longtemps que 3 mois sans subir de dégradation importante. Selon le procédé de la présente invention, le sel d'insuline 10 décrit ci-dessus et la protamine sont combinés en milieu aqueux de manière à former un complexe du sel d'insuline et de la protamine. Le milieu aqueux est à un pH d'environ 6,5 à 8,0. On peut facilement séparer le complexe sel d*insuline-protamine du milieu liquide par filtration, ou par un procédé analogue, et 15 le sécher. Le complexe peut être conservé sous forme sèche pendant au moins un an et plus sans se dégrader. Lorsqu'on désire utiliser le complexe sel d'insuline-protamine, on reconstitue la matière sèche dans un milieu aqueux, de préférence un diluant isctonique, à un pH d'environ 6,5 à environ 8,0. Après reconstitu-20 tion, le complexeest prêt à être injecté ; chez le patient qui reçoit la préparation -reconstituée on observe à la fois un démarrage rapide de 1*action et une durée prolongée de l'activité hypoglycémiante. Une méthode typique pour préparer le complexe sel d'insuline-25 protamine consista à préparer le sel de sodium de l'insuline de manière telle que l'insuline sodée soit pratiquement exempte de zinc, c'est-à-dire en comporte moins d'environ 0,05%. Le sel de sodium est sous forme cristalline mais il est soluble dans l'eau ou dans un diluaut isotonique. On dissout alors le sel de sodium 30 dans le milieu liquide dans une proportion telle qu'il y ait de 90 unités à environ 115 unités pour 100 ml de milieu liquide. On ajoute alors au milieu liquide le sulfate de protamine en quantité convenable. Il se forme immédiatement un complexe insoluble sous forme d'un précipité très fin. Le précipité 35 finement divisé demeure raisonnablement bien en suspension dans le milieu liquide et convient pour permettre à l'utilisateur une injection facile. Si le complexe est conservé dans le milieu liquide, il demeure stable et ne présente aucune perte d'activité pendant au moins un an. 40 Si l'on reconstitue le complexe sel d'insuline-protamine séché. 72 15270 4 2134658 il est souhaitable de mélanger le complexe dans le liquide pour répartis: le précipité dans le milieu liquide pour faire une injection. La nature exacte de l'association entre le sel d'insuline et la protamine n'est pas connue ; toutefois, l'association est 5 suffisamment forte pour que le complexe insoluble soit facilement séparé du milieu liquide et soit séché pour des raisons de facilité de transport ou de très longues périodes de conservation. Le produit sous forme sèche peut être conservé indéfiniment. On a tout d'abord pensé que le démarrage rapide de l'action 10 observé avec la préparation sel d'insuline-protamine était dû à de l'insuline libre dans la liqueur mère ; cependant, l'analyse a montré que 0,015 pour cent seulement de l'activité d'insuline totale présentedans la préparation demeure sous la forme soluble. Il semble donc que l'association de l'insuline avec la protamine 15 puisse être très faible, et que par conséquent l'insuline puisse être facilement utilisable pour l'absorption après l'injection. Il semble également que la nature de ce complexe soit différente des insulines-protamine-zinc commerciales connues où l'insuline se dissocie du complexe beaucoup plus lentement dans lee tissus 20 et on n'observe aucun démarrage rapide de l'action. Le compEsxe sel d'insuline-protamine se forme dans un milieu liquide ayant un pH d'environ 6,5 et environ 8,0, de préférence d'environ 7,2 à environ 7,6. On obtient le sel de métal alcalin de 1*insuline à utiliser 25 en soumettant l'insuline brute à un traitement en présence d'ions de métaux alcalins pour effectuer la cristallisation de l'insuline sous forme de sel de métal alcalin. Pour des raisons d'économie et de facilité de manipulation on préfère l'hydroxyde de sodium comme source d'ions métalliques alcalins utilisés pour 30 former le sel de métal alcalin de l'insuline. On prépare le sel de sodium en soumettant l'insuline brute en solution aqueuse à un traitement par l'hydroxyde de sodium, ce dernier étant présent en quantité suffisante pour donner un pH d'environ 8-8,5. Le traitement consiste à agiter doucement la solution alcaline 35 pendant au moins 15 minutes et de préférence pendant environ une à plusieurs heures. Le sel de sodium de l'insuline précipite dans la solution et on le sépare facilement par décantation, centrifugation, filtration, etc... On peut purifier le sel de sodium de l'insuline en dissolvant ultérieurement le sel et en 40 reformant le précipité dont la forme simule des cristaux. 7.2 15270 5 2134658 L'analyse a montré.que dans le cas^du sel de sodium de l'insuline il y a environ une mole de sodium par mole d'insuline. Les cristaux d'insuline sodée peuvent provenir de boeuf.ou de porc et sont très sclubles dans l'eau et les solutions isotoniques de pH à peu près 5 neutre . Les ions de métalloïde ou de métaux alcalins appropriés avec lesquels on peut préparer le sel dfinsuline comprennent.les ions potassium, lithium, césium, sodium et ammonium. La protamine est généralement présente sous la forme de 10 sulfate de protamine ou bien peut être présente sous d'autres formes solubles dans l'eau appropriées. Si l'on utilise un diluant isotonique comme milieu liquide pour le sulfate de protamine et le sel d'insuline, on préfère que le diluant contienne un agent de conservation. Parmi les agents 15 de conservation appropriés on trouve le phénol et le p-hydroxyben-zoate de méthyle. On a déterminé l'activité biologique du complexe insuline-protamine sur des lapins par le mode opératoire suivant s , On a séparé 36 lapins en deux groupes égaux et on les a 20 fait jeûner pendant 24 heures pendant l'expérience. Eau, ainsi que nourriture, ont été supprimées pendant l'expérience. On a prélevé un échantillon de sang de la veine marginale de l'oreille pour doser le sucre sanç.iin initial. On a injecté au groupe de lapins témoin la dose prédéterminée d'insuline Hagedorn 25 protamine neutre (nph) . On a injecté a;, groupe d'essai le complexe d'insuline sodée-protamiie (psi). Dans chacun des essais une dose 3 simple était de 1,0 unitS/lapin, soit approximativement 0,01 cm de la préparation d'insuline. On a prélevé les premiers échantillons de sang sur chaque lapin après une demi-heure. On a 30 prélevé les échantillons de sang suivants 1,5, 3,0, 5,0, 7,0 et 5,0 heures après injection. Sur chaque échantillon de sang on a déterminé le taux du sucre sanguin et on a exprimé les résultats en milligrammes-pour cent de glucose. On a calculé la concentration du sucre sanguin moyenne à chaque moment de saignement pour les 35 deux groupes. Dans le cas où on a utilisé un essai "par croisement", on a injecté le complexe insuline sodé-protaminé aux lapins qui avaient reçu l'échantillon témoin, et vice versa. On a réalisé ces essais une.semaine après avoir achevé les essais initiaux. Les résultats 40 globaux sont exprimés sous forme d'une concentration du sucre sanguin 72 15270 6 2134658 moyenne en milligrammespour cent dans la Figure 1 et dans le Tableau 1 ci-après : Tableau 1 Taux du sucre sanguin, mcf % 5 Temps (heures) O 0,5 1,5 3,0 5,0 7,0 9,0 Témoin (NPH) 83,8 64,9 4 3,3 41,3 64 , 6 67,4 69,8 PSI 80,1 51,1 36,9 36,1 51,1 60,6 70,9 Il faut noter que le complexe insuline sodée-protamine a un démarrage d'action plus rapide et une action plus prolongée 10 que le produit NPH. On a comparé le produit PSI {insuline sodée-protamine) avec un mélange de ARI (insuline normale acide) et de NPH effectué dans un rapport de 1:1 sur la base de l'activité. La concentration du sulfate de protamine était de 0,8 mg/ml. 15 On a effectué cet essai sur 36 lapins et selon le modèle "par croisement". On a injecté à chaque lapin environ 0,01 ml du produit à base d'insuline de manière à ce qu'il reçoive une unité d'insuline par injection. Les résultats sont donnés dans la Figure 2 et dans le Tableau 2 ci-après : 20 Tableau 2 Taux du sucre sanguin, mg % Temps (heures) O 0,5 1,5 3,0 5,0 7,0 9,0 ARI & NPH 88,0 45,9 34,2 43,5 71,6 84,2 88,6 PSI 87,2 59,3 47,1 45,2 51,9 58,0 64,3 25 Les résultats précédents démontrent le démarrage rapide de l'action produit par le complexe insuline-protamine ainsi que l'action de longue durée de celui-ci. On a fait une comparaison des trois types de produits du genre insuline sodée-protamine neutre en association avec 0,02 mg 30 de zinc pour 100 unités d'insuline. Chacun des produits à base d'insuline contenait 0,02 mg de zinc pour 100 unités d'insuline. Le but de l'addition du zinc était de déterminer si le zinc avait ou n'avait pas d'influence sur la rapidité du démarrage ou la prolongation de la durée d'action donnée par le complexe insuline 35 sodée-protamine. Comme on le voit ci-après, on n'a observé aucun résultat défavorable. On a comparé trois produits ; ces produits étaient l'insuline de porc, l'insuline de boeuf, et un mélange contenant 75% d'insuline de boeuf et 25% d'insuline de porc. 40 On a effectué chaque essai sur 6 lapins avec une seule 72 15270 7 2134658 injpjtdon d'environ 0,01 nû résultant en une dose approximative de une unité d'insuline. Les résultats sont illustrés par la Figure 3 et représentés dans le Tableau 3 ci-après : Tableau 3 5 Taux du sucre sanguin, mg % Temps (heures) 0 1,5 3,0 5,0 7,0 9,0 Porc 80,3 41,5 44,5 55,4 73,0 76,7 Mélange 80,2 40,5 37,6 53,1 60,7 65,6 Boeuf 85,5 42,6 35,3 38,5 53,4 63,0 10 L'insuline de porc présente un démarrage d'action rapide, bien que dans son cas la durée d'action puisse ne pas être tout à fait aussi longue que pour les autres produits à base d'insuline ; toutefois, le produit provenant du boeuf et le mélange donnent tous deux un démarrage rapide et une action de longue durée. 15 En outre, il faut noter que l'on a ajouté une quantité mineure de zinc au complexe insuline sodée-protamine. On a trouvé qu'un métal bivalent, comme le zinc, ne doit pas être présent en quantité importante pendant la formation du sel de sodium de l'insuline. Le but de l'addition du zinc au complexe insuline 20 sodée-protamine était de s'assurer que le zinc avait ou n'avait pas d'effet sur le complexe à bpse d'insuline. D'après les résultats on peut voir que le zinc n'interfère pas avec la valeur thérapeutique et ne lui apporte rien non plus. Les exemples suivants illustrent la présente invention; 25 Exemple 1 Cet exemple illustre la préparation du complexe insuline-protamine sous forme de doses. On prépare l'insuline sodée de boeuf, cristalline, de la manière suivante : 30 On extrait 1'insuline de pancréas de boeuf par un milieu alcoolique aqueux acidifié, on concentre par distillation sous vide, et on purifie partiellement par précipitation fractionnée par le chlorure de sodium et précipitation au point isoélectrique. On purifie encore l'insuline par cristallisation alcaline à pH 8,2. 35 on dissout les cristaux résultants dans l'acide acétique dilué (0,5N) et on fractionne ensuite par filtration sur gel sur Sephadex G-50 (gel fabriqué et vendu par Pharmacia Fine Chemicals, Uppsala, Suède). On neutralise l'effluent, qui est de l'acide acétique 0,5N 40 contenant l'insuline, à pH 8,2 avec de l'hydroxyde de sodium 1,0'N 72 15270 8 2134658 et on agite pendant une heure à la température ambiante. On récolte alors les cristaux d'insuline sodée dans le mélange de cristallisation en effectuant une filtration et on les lave avec une solution de chlorure de sodium à 2%. On met alors les cristaux 5 lavés par la solution saline dans un excès d'alcool absolu sous agitation vigoureuse, on les filtre et on les recueille. Après un second lavage à l'alcool absolu, on lave les cristaux à l'éther et on les sèche sous vide. L'insuline sodée de boeuf, cristalline, résultante a les 10 caractéristiques suivantes : Activité 25,08 unités/mg Azote 15,82 pour cent Humidité 8,0 pour cent Indice de coloration 0,005 pour une solution à 15 1 pour cent à 340 nj-u. On dissout une partie de l'insuline sodée séchée à raison de 3,98 g dans 990 ml d'eau apyrogène contenant 2,27 grammes de phénol liquéfié et 1,5 ml de HCl à 10%. On ajuste ensuite le pH à 7,4 avec 1,7 ml de NaOH à 10%. Les immuno-titrages réalisés 20 selon le mode opératoire de titrage normalisé de l'U.S.P. indiquent une activité d'insuline de 101,3 unités/ml. On fait subir à cette solution une filtration stérile et ensuite on la répartit dans des flacons à raison de 1,0 ml par flacon, et on soumet les flacons à une lyophilisation dans des conditions d'aseptie 25 pour obtenir de l'insuline sodée séchée dans chaque flacon. On conserve l'insuline sous cette forme jusqu'au moment de l'utilisation dans les tests. On injecte dans chaque flacon une quantité suffisante d'un diluant isotonique pour reconstituer l'insuline dans un milieu 30 aqueux de manière à ce qu'il contienne 101,3 unités d'insuline/ml de milieu liquide. Le diluant isotonique contient 0,4 mg de sulfate de protamine/ml, 1,6% de glycérine et 0,25% de phénol sur une base en poids par volume. Le pH du diluant isotonique est de 7,4. Lorsqu'on ajoute le liquide isotonique à l'insuline 35 sodée séchée contenue dans le flacon, il y a formation instantanée du complexe d'insuline sodée-protamine. ce complexe est discernable dans le flacon sous forme d'un précipité très finement divisé. Le précipité demeure sous forme d'une suspension suffisamment régulière dans le diluant aqueux pour que, lorsqu'on fait un 40 prélèvement à l'aide d'une seringue à injection, il y ait une 72 15270 2134658 quantité uniforme d'insuline dans chacune des portions prélevées. Exemple 2 Cet exemple illustre la stabilité excellente du complexe insuline-protamine. On prépare le produit PSI neutre utilisé dans 5 cet exemple selon l'Exemple 1, si ce n'est que le diluant isotonique contient 1,2 mg de protamine par ml. Chacun des tests est réalisé sur 9 lapins. La composition, c'est-à-dire le complexe insuline sodée-protamine en suspension dans le diluant isotonique, est conservé à 25°C dans 1'intervalle 10 entre chacun des tests. Comme précédemment, on injecte aux lapins 0,01 ml de produit à base d'insuline. Les résultats sont illustrés par la Figure 4 et représentés dans le Tableau 4 ci-après : Tableau 4 15 Taux du sucre sanguin, mg % Temps (heures) 0 1,5 3,0 5,0 7,0 9,0 Initialement 91,0 51,2 43,4 54,0 59,5 65,8 Après 1 semaine 84,1 49,3 43,2 48,4 52,1 61,2 7iprês 2 semaines 78,3 45,0 33,5 37,6 48,9 54,6 Après 4 semaines 95,3 40,9 29,8 36,6 45,7 55,8 Les données du Tabl -au 4 montrent clairement que même après conservation à 25°C la solution isotonique contenant en suspension le complexe insuline sod^e-protamine présente une stabilité remarquable de l'activité de l'insuline en ce qui concerne le 25 maintient à la fois du démarrage rapide de l1action et l'action de longue durée. Exemple 3 Cet exemple illustre la formation et l'emploi du complexe de protamine avec l'insuline ammoniée, l'insuline lithiée, et 30 l'insuline potassique, ainsi que l'insuline sodée de l'Exemple 1. Chacun des sels d'insuline nommé précédemment a été obtenu par le mode opératoire de l'Exemple 1, mélangé avec une solution isotonique contenant 0,4 mg de sulfate de protamine par. ml et injecté comme dans l'Exemple 1 à 18 lapins. Les résultats sont 35 illustrés dans la Figure 5 et représentés dans le Tableau 5 ci-aprèsi 72 15270 10 2134658 Tableau 5 Taux du sucre sanguin, mg % Temps,(heures) 0 1,5 3,0 5,0 7,0 9,0 Ammonium 86,1 42,1 51,6 81,5 79,4 88,9 Lithium 87,1 38,6 38,6 60,2 75,9 81,1 Potassium 86,6 42,9 50,8 67,1 74,6 79,4 Sodium 80,1 36,9 36,1 51,1 60,6 70,9 Bien que l'insuline sodée présente une action de plus longue durée, chacune des autres compositions donne lieu à une 10 diminution nette des taux de sucre sanguin. Exemple 4 Cet exemple illustre la stabilité du complexe insuline sodée-protamine. On prépare le complexe comme dans l'Exemple 1 en utilisant 0,4 mg/ml de sulfate de protamine dans le diluant 15 isotonique. Après avoir préparé le complexe, on le met dans plusieurs tubes de centrifugeuse. On les soumet alors à une centrifugation et on décante le liquide surnageant. On lave le précipité séparé avec environ 15 ml d 'alcool absolu puis avec environ 15 ml d'éther. Le précipité lavé est alors séché sous vide 20 à la température ambiante. On remet la matière séchée en suspension dans un diluant isotonique neutre tel que décrit précédemment si ce n'est qu'il ne contient pas de sulfate de protamine. On détermine l'activité de la matière remise on suspension et on trouve que cette activité 25 est située dans la gamme de 88 à 95 unités/ml, ce qui indique qu'une légère perte de substance insuline est intervenue dans le lavage du complexe insuline sodée-protamine avant le séchage. On effectue les essais comme précédemment sur 9 lapins. Les données sont représentées dans le Tableau 6 ci-après ; l'essai 30 avec lyophilisation a été effectué sur la substance qui a été remise en suspension dans l'eau et ensuite lyophilisée. Tableau 6 Taux de sucre sanguin, mg, % Temps, (heures) 0 0,5 1,0 3,0 5,0 7,0 9,0 35 Séchage sous vide 82,0 52,5 57,3 67,8 76,7 74,3 77,3 Lyophilisation 85,4 44,7 45,6 53,1 78,9 80,7 80,0 Chacune des compositions à base d'insuline séchée, une fois reconstituée et injectée entraînait une diminùtion nette des taux de sucre sanguin. 72 15270 2134658 REVE N PI C A T I ONS I. Complexe sel d1insuline-protamine contenant un sel de métal alcalin ou d'ammonium de l'insuline et de 0,2 à 1,5 mg de protamine pour 100 unités d'insuline. 5 2. Le complexe de la revendication 1, caractérisé en ce que le sel d'insuline est le sel d'insuline sodée. 3. Le complexe de la revendication 1 ou 2, caractérisé en ce que le sel d'insuline est pratiquement exempt de zinc ou d'un autre métal lourd. 10 4. Le complexe de l'une des revendications 1, 2 et 3, caractérisé en ce que la teneur en humidité du complexe est inférieure à 10 pour cent. 5. Suspension constituée d'eau ou d'une solution isotonique contenant en suspension le complexe de l'une des revendications 15 1, 2, 3 et 4 en une quantité procurant de 90 à 115 unités d'insuline pour ÎOO ml de suspension. 6. La suspension de la revendication 5,caractérisée en ce que le pH est de 6,5 à 8,0. 7. Procédé pour préparer un complexe sel d'insuline-protamine 20 en combinant : A) dans un milieu aqueux 1) la protamine 2) un sel de métal alcalin ou d'ammonium d'insuline B) dans des proportions telles que pour ÎOO unités d'insuline 25 il y ait de 0,2 à 1,5 mg de protamine C) pour former une suspension d'un complexe insoluble. 8. Procédé selon la revendication 7, caractérisé en ce que le pH est de 6,5 à 8,0. 9. Procédé selon la revendication 7 ou 8, caractérisé en ce 30 que le milieu aqueux est une solution isotonique. 10. Procédé selon l'une des revendications 7 à 9, caractérisé en ce que le sel d'insuline est le sel d'insuline sodée. II. Procédé selon l'une des revendications 7 à 10, caractérisé en ce que le sel d'insuline est pratiquement exempt 35 de zinc ou d'un autre métal lourd. 12. Procédé selon l'une des revendications 7 à 11, caractérisé en ce qu'elle comporte les étapes supplémentaires consistant à séparer le complexe insoluble du milieu aqueux et à réduire la teneur en humidité du complexe à moins de 40 10 pour cent.