FR 2134632 A1 19721208 FR 7215136 A 19720427 72 15136 ' 1 2134632 la présente invention concerne le domaine des hormones humaines activant la croissance et la sécrétion lactée, par exemple l'hormone hypophysaire humaine de croissance et l'hor-mon§6horionique humaine appelée somatomammotropine. l'invention 5 a plus particulièrement trait à la production de ces hormones et de certains de leurs dérivés, par un procédé de synthèse totale, qui permet d'obtenir à la fois les conformations moléculaires correctes et les activités biologiques qui ont été déployées par les hormones naturelles extraites d'hypophyses et de placen-10 tas humains. l'isolement et la structure de l'hormone hypophysaire naturelle de croissance humaine, représentée sur la figure 1 des dessins annexés, ont déjà été publiés (voir G.H. Id et H. Papkoff, "Science", 124, 1293 (1956) ; C.H. Id, W. K. Idu 15 et J.S. Dixon, "Journal of the American Chemical Society", 88, 2050 (1966). On a constaté que la formule publiée de la figure 1 ne correspond pas à la structure de l'hormone hypophysaire humaine naturelle, mais représente au contraire un produit entièrement artificiel qui a la propriété d'activer la crois-20 sance et la sécrétion lactée, la formule correcte de l'hormone hypophysaire naturelle de croissance humaine est représentée sur la figure 2 des dessins annexés. Il s'agit d'une chaîne palypeptidique de 190 résidus d'amino-acides se succédant dans l'ordre indiqué, cette chaîne portant des résidus de phényl-25 alanine à ses extrémités libres COOH et . Il existe deux ponts disulfure qui relient les résidus de cystéine entre les positions 53 et 164 et entre les positions 181 et 188, ce -qui forme donc deux noyaux intramoléculaires contenant, respectivement, 110 et six résidus d'amino-acides (sans compter les résidus 30 de cystéine). la complexité de cette molécule est évidente. Après avoir reconnu le pouvoir d'activation de la croissance et de la sécrétion lactée de l'hormone hypophysaire humaine naturelle de croissance, on a attaché beaucoup d'intérêt à l'estimation de ses applications cliniques en médecine 35 humaine pour le traitement de troubles tels que le nanisme0 Toutefois, ces travaux de recherche ont échoué en raison du manque d'une source suffisante de l'hormone naturelle0 On ne 72 15136 2 2134632 peut extraire en moyenne qu'environ 70 mg d'hormone hypophysaire naturelle de croissance de 50 hypophyses humaines fraîches et la possibilité de prélever les hypophyses requises sur des cadavres est très limitée» Ainsi, l'existence d'une 5 source plus ample d'hormones hypophysaires humaines de croissance est restée très problématique et pour autant que l'on sache, ce problème n'a pas encore été résolu. Il est également connu que le placenta humain contient une hormone protéinique appelée somatomammotropine chorionique 10 humaine, qui est douée de propriétés biologiques analogues à celles de l'hormone hypophysaire de croissance. Toutefois, 1'évaluation clinique de cette substance chez des êtres humains a été empêchée par des problèmes de disponibilité et d'approvisionnement suffisants, c'est-à-dire les mêmes problèmes que •] 5 ceux qui ont été indiqués ci-dessus en ce qui concerne l'hormone hypophysaire de croissance. L'invention apporte une solution à certains des problèmes indiqués ci-dèssus, en créant un procédé de synthèse de l'hormone /humaine hypophysaire/de croissance (HGH) et de la somatomammotropine 20 chorionique humaine (HCS) possédant les activités biologiques des hormones naturelles, cette solution supprimant les difficultés de l'obtention desdites hormones à partir de leurs sources naturelles. l'invention est basée sur plusieurs découvertes d'im-25 portance fondamentale, que l'on peut résumer comme suit : (a) la conformation moléculaire correcte de l'hormone HGH peut être obtenue dans un produit totalement synthétique tout en reproduisant les propriétés biologiques par l'utilisation d'un ordre prescrit de synthèse ; 30 (b) la conformation moléculaire de l'hormone HCS est à un degré remarquable identique à celle de l'hormone HGH et le même procédé de synthèse peut être utilisé pour préparer l'hormone synthétique HCS douée d'activité biologique ; (c) un tiers environ de la molécule de l'hormone 35 HGH, pris séparément, n'a pas d'activité sur la croissance ou la sécrétion lactée et est inutile pour établir cette activité, en sorte que l'activité est concentrée dans les deux tiers restants de la molécule. (d) on peut préparer par le même procédé de synthèse 72 15136 3 2134632 une substance synthétique n'ayant qu'une ressemblance limitée dans l'ordre de ses résidus d1amino-acides, avec l'hormone HGH et ne portant pas tous les résidus d'amino-acides de cette hormone, et cette substance est douée d'activité favorisant la croissance 5 et la sécrétion lactée; et (e) des dérivés directs des produits indiqués ci-dessus en (a), (b) et (d) peuvent être préparés sans réduction des activités biologiques» Les structures des produits indiqués dans les paragraphes 10 (a), (b) et (d) ci-dessus sont illustrées par les figures 2, 3 et, respectivement, 1 des dessins annexés. Le procédé de synthèse que l'on a trouvé intéressant pour la préparation de toutes ces structures se résume de la façon suivante : (1) formation de la chaîne polypeptidique requise -de résidus d'amino-acides ■\ 5 attachés à un support résineux par une technique générale de synthèse des peptides en phase solide ; (2) libération de la chaîne polypeptidique de son support et élimination de tous les groupes protecteurs ou groupes de blocage, en engendrant ainsi des groupes sulfhydryle au niveau des résidus de cystéine, 20 (3) oxydation des groupes sulfhydryle dans des conditions réglées pour former des ponts disulfure entre les résidus de cystéine et pour produire ainsi les deux noyaux intramoléculaires dans les molécules finales, comme indiqué sur les dessins. Bien que chacune des étapes générales définies ci-dessus 25 soit essentielle, en ce sens que les hormones synthétiques de l'invention ne peuvent pas être obtenues en son absence, on attribue une importance déterminante à l'étape d'oxydation par laquelle les ponts disulfure qui relient les résidus de cystéine sont formés» Comme indiqué sur les figures 2 et 3 des dessins 30 annexés, la conformation de la molécule de HGH et de la molécule de HCS comprend deux noyaux intramoléculaires contenant, respectivement,110 et 6 résidus d'amino-acides, tandis que la conformation de la molécule indiquée sur la figure 3 comprend deux noyaux intramoléculaires contenant respectivement 93 et 35 6 résidus d'amino-acides.On a découvert que ces conformations ne peuvent être obtenues qu'en conduisant l'oxydation dans des conditions réglées avec soin, après que la chaîne polypeptidique a été séparée du support solide 72 15136 4 2134632 le "bouclage" nécessaires pour réaliser la conformation cyclique requise-, par liaison des groupes sulfhydryle de la cystéine par voie d'oxydation» Par contre, une fois que la chaîne polypeptidique a été libérée de l'empêchement que constitue le support solide, 5 son oxydation doit être réglée avec soin, de manière à établir des conditions dans lesquelles la flexion et le bouclage indiqués ci-dessus peuvent avoir lieu pour que les produits synthétiques homogènes doués d'activité biologique acquièrent les conformations requises» 10 Par conséquent, en raison de la grande importance qu'elles revêtent pour le succès de la pratique de l'invention, on décrira' ci-après les conditions requises pendant l'étape d'oxydation. Tout d'abord, il est nécessaire que la vitesse d'oxydation soit réglée par la présence d'un agent réducteur séparé (c'est-à-dire 15 une substance oxydable) en mélange avec le polypeptide» De toiite évidence, cet agent réducteur retarde ou freine d'une autre façon la vitesse d'oxydation, et empêche ainsi la dégradation du polypeptide complexe fragile, et le rend à même d'acquérir la conformation requise pendant la formation des ponts de disulfure. 20 l'agent réducteur peut être tout composé organique mercapto ré-pindant à la formule E.-SH (dans laquelle E. est un radical hydrocarboné organique en à O^q), qui est inerte vis-à-vis du polypeptide HGH. Pour obtenir les meilleurs résultats, on préfère utiliser le dithiothréitol comme agent réducteur? d'autres 25 agents réducteurs que l'on peut utiliser comprennent le mercapto-éthanol et la cystéine» la proportion d'agent réducteur que l'on ajoute peut varier de 10 à 200 mg par 100 mg de polypeptide HGH ; toutefois, la proportion préférée est de 50 mg par 100 mg de polypeptide» 30 Dans l'étape d'oxydation, le polypeptide est utilisé en solution ou en suspension et la concentration du polypeptide dans ce milieu doit aussi être réglée avec soin» Ceci semble aussi être un facteur influençant la vitesse et la progression de l'oxydation pour obtenir la conformation cyclique requise, parce 35 que des concentrations s'écartant de la gamme pratique ne sont pas efficaces. Généralement, la concentration du polypeptide peut varier d'environ 0,01 à environ 0,5 mg de polypeptide par millilitre de solution ; toutefois, la concentration préférée, pour obtenir les meilleurs résultats, est de 0,25 mg par millilitre 40 de solution. 72 15136 5 2134632 Pendant l'oxydation, le pH de la solution constitue un autre facteur que l'on doit réglei^our obtenir les produits synthétiques biologiquement actifs de l'invention- le pH doit généralement être maintenu dans le/gemae d'environ 4,5 à environ 9,0 ; 5 toutefois, pour obtenir les meilleurs résultats, le pH préféré varie entre 8,0 et 8,4» Enfin, on doit régler la température à laquelle la solution de polypeptide est exposée pendant l'oxydation. Comme on l'a déjà mentionné, le polypeptide de synthèse est une molécule 10 complexe et fragile qui est susceptible d'une dégradation ou d*une altération si la température dépasse certaines limites pendant l'oxydation. Par conséquent, la température de l'ambiance où se trouve la solution doit être maintenue dans la gamme d'environ 0 à 25°C pendant l'oxydation» 15 I>a réaction d'oxydation conduite dans les conditions indiquées ci-dessus est une réaction d'auto-oxydation, c'est-à-dire qu,elle se développe par exposition de la solution de polypeptide à l'air, et ceci constitue le procédé préféré." Toutefois, à titre de variante, on peut aussi faire barboter de 20 l'air, de l'oxygène ou des mélanges d'oxygène et de gaz inerte dans la solution. On poursuit l'oxydation jusqu'à ce que les groupes suifhydryIode s résidus de cystéine aient été oxydés en liaisons disulfure. Généralement, ceci requiert un minimum de 4 à 6 heures ou davantage. Il n'existe pas de limite maximale 25 de la durée de la période d'oxydation au-delà de la mobilisation des groupes sulfhydryle. Dans les conditions réglées établies, le produit synthétique est peu susceptible d'être dégradé ou altéré, si l'oxydation est poursuivie au-delà de cette limite, lorsque l'oxydation est terminée, on traite l'hormone 30 synthétique résultante avec l'acide acétique, en vue de l'isoler et de la purifier, l'utilisation d'acide acétique à cette fin est importante pouijémpêeher l'agglutination de l'hormone et pour maintenir son pouvoir biologique, la force de l'acide acétique peut varier de 10 à 75 en solution aqueu.se ; toutefois, 35 pour obtenir les meilleurs résultats, on préfère utiliser une solution d'acide acétique à 50 fo„ la technique générale que l'on préfère pour séparer et purifier l'hormone synthétique est une chromatographie sur colonne ou sur gel, sur des résines po-lycarboxyliques oxi des gels de dextrane» 72 15136 6 213-1632 Sur les dessins annexés : la figure 1 représente la conformation moléculaire et la structure d'un produit apparenté à l'hormone hypophysaire humaine de croissance ; 5 la figure 2 représente la conformation moléculaire et la structure de l'hormone hypophysaire humaine de croissance ; et la figure 3 représente la conformation moléculaire et la structure de la somatomamicotropine chorionique humaine. 10 Sur les dessins, les nombres et les flèches placés à l'extérieur des motifs des résidus d'acides, aident simplement à la localisation ou à l'étude de portions de la structure totale. les abréviations des divers résidus d'amino-acides sont les abréviations normales dont la signification est reproduite 15 par commodité ci-après : Abréviation Amino-acide Ala Alanine Arg Arginine Asn Asparagine 20 Asp Acide aspartique Cys Cystéine (hémi) Glu Acide Glutamique Gin Glutaminé Gly Glycine 25 His Histidine Ile Isoleucine leu leucine lys Lysine Met Méthionine 30 Phe Phénylalanine Pro Proline Ser Serine Thr Thréonine Trp Tryptophane 35 ïyr ïyrosine Val Valine la structure moléculaire illustrée sur la figure 1 a été considérée, jusqu'à présent, comme étant la structure qui correspond à celle de l'hormone HGH naturelle, mais, comme 72 15136 7 2134632 on l'a indiqué dans ce qui précède, on a découvert que cette représentation n'est pas correcte. La structure correcte de l'hormone HGH a été établie parallèlement à la présente invention et elle est représentée sur la figure 2. Elle consiste en voie 5 chaîne polypeptidique de 190 résidus d'amino-acides, comparativement aux 188 résidus d'amino-acides de la chaîne polypeptidique illustrée sur la figure 1. La chaîne de 190 rjotifs de la figure 2 se referme par des liaisons disulfure qui pontent les résidus de cystéine dans les positions 53 et 164 et dans les positions 10 181 et 188, en formant deux noyaux intramoléculaires contenant respectivement 110 et 6 résidus amino-acides0 Dans la structure forment un représentée sur la figure 1, les liaisons disulfure/pont entre les positions 68 et 162 et entre les positions 179 et 186 et les noyaux intramoléculaires résultants contiennent, respectivement, 15 93 et 6 résidus d'amino-acideso Dans les deux structures, l'ordre des seize premiers résidus d'amino-acides, comptés à partir du groupe amino terminal, est le même. Ainsi, bien qu'il existe une similitude générale entre les conformations et les structures globales illustrées sur les figures 1 et 2, il existe des dif-20 férencesjdazis le nombre et l'ordre des résidus d'amino-acides et dans les dimensions des plus grands des deux noyaux intramoléculaires présents dans les deux structures.» Malgré ces différences, la structure illustrée sur la figure 1 a été obtenue par synthèse et des essais ont montré qu'elle est douée à la 25 fois d'activité favorisant la croissance et d'activité favorisant la sécrétion lactéeo Les découvertes récentes qui ont permis de conclure que la structure de la figure 1 n'est pas une réplique de la structure de l'hormone HGH (figure 2) permettent donc d'établir que la structure précise de l'hormone HGH'n'est 30 pas nécessaire dans un produit de synthèse pour obtenir les activités biologiques de l'hormone naturelle» Des découvertes de nature similaire ont été effectuées parallèlement à la présente invention en ce qui concerne la structure correcte de l'hormone HGH représentée sur la figure 35 2. En particulier, la portion de cette molécule, prise dans l'ordre croissant, entre la position 1 et la position 85, considérée séparément, n'a pas d'activité en faveur de la croissance ou de la sécrétion lactée» Par conséquent, ces activités sont principalement des manifestations de la portion 72 15136 8 2134632 restante de la molécule entre les positions 86 et 190, et il n'est pas nécessaire d'inclure la portion inactive d'un produit de synthèse capable de favoriser la croissance ou la sécrétion lactée» Toutefois, il est intéressant de noter qu'un produit syn-5 thétique privé de la portion inactive de la molécule totale est moins puissant que l'hormone HGH naturelle en ce qui concerne l'activité favorisant la croissance et la sécrétion lactée, mais la puissance augmente progressivement à mesure que la structure de la portion inactive est ajoutée degré par 10 degré à la portion active. les connaissances actuelles ne permettent pas d'expliquer la raison pour laquelle cette addition d'éléments structuraux inactifs à l'état individuel exalte le pouvoir de la portion active, mais on a observé l'existence de cet effet. Par con-15 séquent, un produit synthétique correspondant à la portion de la structure de la figure 2 comprise entre la position 86 et la position 1 90, avec les groupes et COOH terminaux respectifs dans ces positions, peut être préparé au moyen du procédé décrit ci-dessus, pour obtenir une substance douée d'une 20 puissante activité biologique, ayant jusqu'à environ 50 ^ de l'activité favorisant la croissance et la sécrétion lactée de l'hormone HGH naturelle. On peut accroître l'activité du produit en allongeant la chaîne polypeptidique de toute portion du segment inactif compris entre les positions 1 et 85 sur la 25 figure 2, le degré de cette augmentation d'activité étant généralement directement proportionnel à la longueur de chaîne de la portion inactive ajoutée. Par conséquent, ces molécules croissant progressivement jusqu'à la structure totale représentée sur la figure 2 sont toutes des produits synthétiques intéres-30 sants pour leur activité en faveur de la croissance et de la sécrétion lactée. la figure 3 représente la conformation moléculaire et la structure de l'hormone HCS naturelle, qui a été récemment déterminée, parallèlement à la présente invention. Elle pré-35 sente une analogie remarquable avec celle de l'hormone HGH (figure 2). le nombre total de résidus d'amino-acides dans les deux molécules est identique, à savoir 190. les liaisons disiilfure, des deux molécules forment un pont entre des résidus de cystéine dans les mêmes positions, à savoir 53-164 et 181-188, 72 15136 9 2134632 en formant deux noyaux intramoléculaires dans chaque molécule, ces noyaux contenant les mêmes nombres de résidus d'amino-acides. Parmi les 190 résidus d'amino-acides contenus au total dans chaque molécule, 160 occupent les mêmes positions dans les deux 5 molécules. Les seules différences que présentent les résidus d'amino-acides et leurs positions sont indiquées sur le tableau suivant : Position des résidus HGH (figure 2) HOS (figure 3) 1-2 • Phe-Pro Val-Gin 10 4 Ile Val 12 Asn His 16 Arg Gin 20 Leu Ala 25 • Phe Ile 15 34 Ala Thr 39 Glu Asp 46-49 Gln-Asn-Pro-Gln His-Asp-Ser-Glu 52 Leu Phe 56 Glu Asp 20 64 Arg Met 73 Gin Glu 83 Gin Glu 90 Gin. Arg 95 Val Met 25 99 Ser Asn 103-104 Gly-Ala Asp-Thr 106 Asn Asp 109 Val Asp 111 Asp His 30 132 Pro Arg 138 Phe Leu 152 Asp His 178 Ile Met Le procédé de synthèse décrit ci-dessus à propos de 35 la préparation des produits correspondant aux figures 1 et 2 peut aussi être utilisé pour préparer l'hormone HCS synthétique ayant la conformation et la structure indiquées sur la figure 3. Là encore, .. l'étape d'oxydation pour former les liaisons disulfure dans l'hormone HCS synthétique a une importance capitale 72 15136 2134632 et l'oxydation doit être conduite dans des conditions réglées, pour former un produit synthétique doué d'une activité intéressante en faveur de la croissance et de la sécrétion lactée. Outre les hormones synthétiques rejjrésentées sur les dessins, , .doues 5 l'invention -concerne aussi certains de leurs derives/d'activité biologique. Ces dérivés compi'ennent des dérivés de substitution du résidu de tryptophane (position 25 de la figure 1 et position 85 des figures 2 et 3) par un groupe 2-hydroxy-5-nitrobenzyle ou un groupe 2-nitrophénylsulfényle, les dérivés obtenus étant 10 doués d'activité favorisant la croissance. On prépare un autre dérivé par réduction des résidus de cystéine (positions 68, 162, 179 et 186 de la figure 1 et positions 53, 166, 181 et 186 des figures 2 et 3) en groupes sulfhydryle puis alkylation avec l'iodacétamide pour former un dérivé tétra-S-carbamido-15 méthylique doué d'activité favorisant la croissance et la sécrétion lactée. Enfin, la nitration de six des huit résidus de thyrosine (positions 43, 50, 57, 100, 108, 140, 157 et 161 sur la figure 1 et positions 28, 35, 42, 102, 110, 142, 159 et 163 sur les figures 2 et 3) donne des dérivés hexanitrés qui 20 sont doués d'activité favorisant la croissance et la sécrétion lactée. Toutefois, la nitration des huit résidus de tyrosine entraîne une perte totale de l'activité favorisant la croissance et de l'activité favorisant la sécrétion lactée. Comme on l'a indiqué précédemment, la phase initiale 25 du procédé de l'invention implique la fixation dë phénylalanine à une résine solide de support, puis le couplage progressif, avec l'acide fixé sur son support, des autres résidus d'amino-acides des molécules d'hormones, en utilisant la technique générale de synthèse des peptides en phase solide. Cette technique 30 est décrite en détail, par exemple, par J0M0 Stewart et J.D, Young dans "Solid Phase Peptide Synthesis" (W.H. Preeman and Company, San Francisco, 1569). la séquence fondamentale implique la réaction d'un amino-acide protégé, à savoir la tertiobutyH-oxycarbonylphénylalanine, avec une résine de synthèse 35 telle qu'un copolymère styrêne-divinylbenzène chlorométhylé- , pour former une liaison ester entre les groupes carboxyliques de l'acide protégé et les sites halogénés réactifs de la résine. Le groupe protecteur est ensuite éliminé sélectivement pour engendrer le groupe amino libre du résidu de phénylalanine fixé 72 15136 n 2134632 sur la résine, en rendant ainsi ce groupe disponible pour la réaction avec le groupe carboxylique de 1!amino-acide protégé suivant, à savoir la glycineo Cette réaction subséquente attache 1'amino-acide protégé et le résidu d'acide supporté par la résine, 5 par une liaison amide, et l'élimination subséquente du groupe protecteur du second résidu d'acide pour engendrer un groupe amino libre préparera aussi la chaîne peptidique supportée, en vue de la réaction avec 1'amino-acide protégé suivant, et ainsi de suite. Après le développement de toute la chaîne poly-10 peptidique par couplage par paliers de chaque résidu d'amino-acide, comme indiqué ci-dessus, la chaîne est sép'arée de la résine de support et les groupes protecteur^portés par les chaînes latérales du polypeptide sont éliminés par réaction avec des agents de clivage et de déblocage, par exemple un milieu 15 formé de gaz fluorhydrique et de sodium dans 1'araoniac liquide, en engendrant ainsi le polypeptide libre. les divers agents de protection, de couplage,de déblocage et de clivage qui sont intéressants à utiliser dans la conduite de la synthèse en phase solide avec les types d'amino-20 acides qui sont inclus dans les molécules représentées sur les dessins ont déjà été décrits. D'une façon générale, ces agents peuvent aussi être utilisés pour former les chaînes polypeptidir-ques de 188 et 190 résidus d'amino-acides indiquées sur" les dessins, et les diverses variantes particulières que l'on peut 25 mettre en oeuvre peuvent être imaginées sans difficulté par les spécialistes en ce domaine, d'après la description des formes préférées de mise en oeuvre du procédé de l'invention que l'on donne ci-après. L'invention est illustrée par les exemples suivants, 30 donnés à titre non limitatif : 72 15136 2134632 Exemple 1 On commence la synthèse de la chaîne polypeptidique de 188 amino-acides de structure indiquée sur la figure 1, par estérification de 0,52 mmoles de phénylalanine protégée 5 par un groupe tertiobutyloxycarbonyle avec 2,5 g de résine polystyrène-divinylbenzène chlorométhylée, réticulée à 1 fi (vendue par la firme Bio-Rad Laboratories, Eichmond, Californie). On élimine ensuite le groupe tertiobutyloxycarbonyle (Boc) protecteur, par réaction de l'ester formé entre la phénylala-10 nine protégée et la résine pendant 15 minutes avec de l'acide trifluoracétique à 50 $ (volume/volume) dans le chlorure de méthylène. Ensuite, on couple de la glycine protégée par un groupe Boc avec le résidu de phénylalanine fixé sur la résine en utilisant le dicyclohexylcarbodiimide comme agent 15 de couplage, la réaction étant conduite pendant 5 heures avec quatre équivalents de glycine protégée et d'agent de couplage par équivalent de résidu de phénylalanine attaché à la résine de support. Après l'élimination du groupe Boc protecteur du 20 résidu de glycine avec le même agent de déblocage, à savoir l'acide trifluoracétique, le groupe amino libre résultant peut être couplé avec 1'amino-acide protégé suivant, à savoir la cystéine. Le couplage par degrés des résidus successifs d'amino-25 acides, en suivant l'ordre de la molécule d'hormone HG-H,est poursuivi en utilisant la technique décrite ci-dessus. Le groupe Boc est utilisé pour protéger le groupe alpha-amino de tous les amino-acides. Certains des amino-acides sont utilisés soucia forme de dérivés, et le groupe protecteur Boc 30 est utilisé de même pour protéger le groupe alpha-amino de ces dérivés. Ces dérivés sont l'ester bêta-benzylique de l'acide aspartique, l'éther bêta-benzylique de la thréonine, l'éther bêta-benzylique de la sérine, l'ester gamma-benzylique de l'acide glutamique, le thioéther bêta-benzylique de la 35 cystéine, l'éther benzylique de la thyrosine, l'epsilon-carbo-foenaoxylysine, et la N-nitro-arginine. Pour l'introduction du résidu histidîna, on utilise la Ua-Boc (im-Boc)-L-histidine. 72 15136 " 2134632 On conduit les réactions de couplage avec le dicyclo-hexylcarbodiimide, de la manière décrite ci-dessus, à la différence que l'asparagine et la glutaminé sont couplées au moyen de leurs esters nitrophényliques. De même, pour le couplage des 5 résidus de valine, d'isoleucine et de nitro-arginine, on utilise six équivalents de l'acide protégé et de l'agent de couplage par équivalent de résidu de phénylalanine initialement attaché à la résine de support. les esters nitro-phényliques de l'asparagine et de 10 l^lutaminé sont couplés par réaction de dix équivalents de l'ester par équivalent de résidu de phénylalanine pendant 5 heures, cette réaction étant suivie d'une autre réaction d'une durée de 5 heures en présence de 5 équivalents d'imidazole. Après que le résidu de trvptophane a été incorporé 15 dans la position 25, on ajoute 0,08 mole de dithiothréitol à l'acide trifluoracétique utilisé comme agent de déblocage et on utilise cette combinaison dans toutes les éliminations subséquentes du groupe protecteur Boc pour débloquer et protéger le résidu de tryptophane. 20 lies opérations décrites ci-dessus donnent un poly peptide synthétique protégé non ponté, formé de 188 résidus d'acides, dans l'ordre représenté sur la figure 1 des dessins annexés, le résidu phényl! alanine terminé par un groupe COOH étant attaché à la résine de support. Pour éliminer tous 25 les groupes protecteurs du polypeptide synthétique et pour le libérer de la résine de support, on le fait réagir avec le gaz fluorhydrique puis avec le sodium dans l'ammoniac liquide. Le polypeptide synthétique libéré est ensuite traité avec du gaz fluorhydrique liquide en présence d'anisole pendant 15 minutes 30 à 0°C et pendant environ 15 minutes à 0-20°C. Le polypeptide suivant est purifié dans l'acide acétique h 50 % puis traité en quatre lots avec du sodium dans l'ammoniac liquide. La quantité totale de polypeptide est de 330 mg et chaque lot (environ 80 mg) est agité près du point d'ébullition pendant deux heures dans 35 350 ml d'ammoniac liquide fraîchement distillé sur du sodium, puis traité au point d'ébullition avec du sodium jusqu'à, ce qu'une couleur bleu clair persiste pendant environ une heure. 72 15136 2134632 les traitements précédents éliminent tous les groupes de blocage et engendrent des groupes sulfhydryle au niveau des résidus de cystéine dans la chaîne polypeptidique libérée. Ensuite, le polypeptide synthétique débloqué et purifié est 5 auto-oxydé dans l'air, dans les conditions réglées indiquées ci-après, dont on a fait ressortir l'importance déterminante dans ce qui précède, la concentration du polypeptide est d'environ 0,25 mg par ml de solution./"^solution contient environ 0,5 mg de dithiothréitol par mg de polypeptide. le pH est maintenu 10 à 8,4 et l'oxydation est effectuée pendant 4_5 heures à 25°C. Cette opération entraîne la formation de liaisons disulfure entre les résidus de cystéine dans les positions 68 et 162 et dans les positions 179 et 186, pour former les deux noyaux intramoléculaires illustrées sur la figure 1. 15 le polypeptide oxydé est isolé par lyophilisation et .sur débarrassé des sels/du gel de dextrane (vendu sous le nom de "Sephadex G—25" par la firme Pharmacia labs Inc., Piscataway, New Jersey) dans de l'acide acétique à 50 i°. On le soumet ensuite à des filtrations répétées sur gel de dextrane ("Sephadex G-100") 20 dans de l'acide acétique à 20 ^ jusqu'à ce qu'on isole une fraction qui passe sur la colonne en donnant un seul pic à un maximum comparable à la courbe de l'hormone HGH naturelle. Des mesures spectrophotométriques effectuées sur la protéine synthétique donnent un rapport tyrosine :tryptophane 25 de 7,5, que l'on peut comparer à la valeur 8 connue, l'analyse des amino-acides sur un. produit d'hydrolyse acide donne les résultats suivants : lys 12 ^ gHis1 ^ g-Argg ^ ^Asp2 ^ ^ g ^Ser^ 8&lu22,0"^0 5, 9&ly9, 9klal, 8~ Cys4 3Valg 2Met1 5Ile7 iTyr3 Ces Taleurs 30 sont comparables à celles que l'on obtient dans l'analyse de l'hormone HGH naturelle, traitée avec HP et Ua-UH^ : LyS9,9HiS2,5Ars10,0Asp23,3ïhr9,9Ser17,1G"Lu28,7Pro8,1ff"Ly9,3~ Ala7,1CyS3,1Tal7,6Met1,2Il86,7Leu24,7Tyr6,4Hle11,9- On a constaté que le produit de synthèse a une réaction 35 immunologique avec 1'anti-sérum de lapin vis-à-vis de l'hormone HGH,"d'après le test de diffusion sur gélose. lorsqu'on expérimente le produit synthétique, dans les tests portant sur le tibia du rat et le jabot du pigeon, on constate qu'il a line 72 15136 2134632 activité favorisant la croissance d'environ 10 $ et une activité favorisant la sécrétion lactée de 5 c'est-à-dire des activités comparables à celles de l'hormone HGH naturelle. Exemple 2 5 On peut faire réagir le polypeptide de synthèse obtenu comme décrit dans l'exemple 1 avec le bromure de 2-hydroxy-5-nitrobenzyle pour former un dérivé biologiquement actif au niveau du résidu de tryptophane de la molécule. Pour former le dérivé, on ajoute 10 mg de bromure de 2-hydroxy-5-nitro-10 benzyle à 1,0 ml d'une solution à 2 du polypeptide de synthèse dans l'acide acétique 0,1 M. On agite le mélange à la température ambiante pendant une heure, puis on le dilue et on le dialyse totalement vis-à-vis d'eau distillée pendant deux jours. Après lyophilisation, on dissout le produit dans de 15 l'hydroxyde d'ammonium 0,01 M et on chromatographie la solution sur une colonne de dextrane en utilisant comme éluant de l'hydroxyde d'ammonium 0,1 M pour éliminer toute portion non réactive. la fraction non retardée est récupérée par lyophilisation. 20 Exemple 5 le polypeptide synthétique obtenu comme décrit dans l'exemple 1 peut être réduit et alkylé avec l'iodacétamide pour former un autre dérivé biologiquement actif. Pour forner ce dérivé, on réduit tout d'abord les ponts de disulfure du 2 5 polypeptide avec le mercaptoéthanol dans de l'urée 8M. On dissout le polypeptide dans la solution d'urée{3M à une concentration de 20 mg de polypeptide par ml de solution, et on ajuste le pH de la solution à 8,5 avec une solution de méthylamine à 5 fo. On chasse l'air par purge à l'azote et après addition 30 de 0,001 ml de mercapto-éthanol par mg de polypeptide, on laisse la réaction se développer dans une fiole bouchée pendant 6 heures à 23°C. On ajoute de l'eau pour diluer la concentration d'urée à 2M, puis on ajoute un excès d'un facteur 10 (par rapport au mercaptoéthanol) d'iodacétamide en ajustant le pH à 8,5, par 35 addition d'une solution à 5 fo de méthylamine. On laisse reposer la solution pendant 15 minutes et à la fin de cette période, on élimine l'iodacétamide n'ayant pas réagi dans le mélange par réaction avec un excès de mercaptoéthanol. On purifie le 72 15136 16 2134632 produit réactionnel en éliminant les impuretés par chromatographie sur dextrane, en utilisant comme éluant une solution 0,01 M d'hydroxyde d'ammonium. Le produit final obtenu consiste en un dérivé tétra-S-carbamidométhylique du polypeptide synthétique 5 qui a l'activité biologique de l'hormone Synthétique dont il dérive. Exemple 4 On peut faire réagir le polypeptide synthétique obtenu comme décrit dans l'exemple 1 avec le chlorure de 2-nitrophényl-10 sulfényle pour former un autre dérivé doué d'activité biologique au niveau du résidu de tryptophane de la molécule. Pour former ce dérivé, on dissout une micromole du polypeptide synthétique dans 2 ml d'acide acétique à 25 % et on ajoute, en agitant, 20 micromoles de chlorure de 2-nitrophénylsulfényle 15 (dissous dans 1 ml d'acide acétique cristallisable). Au bout d'une heure, on sépare le produit réactionnel de l'excès non combiné de chlorure de 2-nitrophénylsulfényle par filtration sur une colonne de 2,2 x 20 cm de gel de dextrane ("Sephadex G-25"), qui a été préalablement équilibrée et éluée avec de 20 l'acide acétique 0,2 M. Après lyophilisation (ou concentration par ultra-filtration), on effectue la purification finale du produit réactionnel par filtration sur gel en utilisant une colonne de 3 x 60 cm de gel de dextrane ("Sephadex 100") qui a été aussi préalablement équilibrée et éluée avec une solu-25 tion d'acide acétique 0,2 M. Le dérivé final purifié est récupéré par lyophilisation ou ultra-filtration. Exemple 5 Le polypeptide synthétique, obtenu comme décrit dans l'exemple 1,peut être amené à réagir avec le tétra-nitrométhane 30 pour former un dérivé hexanitré^doué d'activité biologique, au niveau des résidus de la tyrosine. Pour former ce dérivé, on dissout le polypeptide dans le tampon tris (pH 8,0, 0,05M) à une concentration de 10 mg par ml et on ajoute une solution 0,85 M de tétranitrométhane dans l'éthanol à 95 $ dans un 35 rapport molaire polypeptide:tétranitrométhane de 1:54. On conduit la réaction à Ig/bempérature ambiante pendant 60 minutes dans, un récipient fermé, puis on soumet le mélange réactionnel à une filtration sur gel de dextrane ("Sephadex G-25") équilibré 72 15136 17 2134632 avec une solution de carbonate d'ammonium 0,01 M, à un pS égal à 8,4. le polypeptide nitré est concentré par ultra-filtration, re-chromatographié sur gel de dextrane ("Sephadex G-100") et lyophilisé. 5 le mode opératoire décrit ci-dessus donne un dérivé dans lequel six des huit résidus de tyrosine du polypeptide sont nitrés, cependant que l'activité de croissance et de sécrétion lactée est maintenue. On a déterminé que ces six résidus se distinguent des deux résidus restants, du fait 10 que les premiers peuvent être aisément nitrés par le procédé décrit ci-dessus, ce qui n'est pas le cas des derniers, les deux derniers résidus de tyrosine ne peuvent être nitrés qu'en présence de chlorhydrate de guanidine 5M et ils peuvent donc être moins accessibles (voir même inertes) au réactif de 15 nitration en l'absence de chlorhydrate de guanidine. l'essentiel est que la nitration au tétranitrométhane seul ne produise la substitution par des groupes nitro que sur les six mêmes résidus de tyrosine, bien qu'on ne connaisse pas spécifiquement ceux dont il s'agit ; toutefois, le dérivé 20 entièrement nitré que l'on ne peut obtenir qu'en utilisant le chlorhydrate de guanidine est dénué d'activité favorisant la croissance ou la sécrétion lactée. les détails des modes opératoires décrits ci-dessus en ce qui concerne la préparation d'une hormone synthétique cor-25 respondant à la figure 1 des dessins annexés et de ses dérivés sont intéressants de la même façon pour préparer les hormones HGH et HCS synthétiques douées d'activité biologique, correspondant aux structures représentées sur les figures 2 et 3, de même que leurs dérivés correspondants, la nature déterminante 30 des conditions requises pendant l'oxydation pour former les liaisons disulfure de pontâge de la cystéine de manière à obtenir les conformations cycliques requises a la même importance primordiale pour les trois structures primaires. le pouvoir et l'activité biologiques des polypeptides 35 synthétiques obtenus conformément à l'invention ont été déterminés par des tests normalisés utilisés en pratique pour estimer ces propriétés. Ainsi, la réaction immunologique avec 1'anti-sérum de lapin vis-à-vis de l'hormone HGH a été déterminée 72 15136 18 2134632 dans le test de diffusion sur gélose décrit par 0. Ouchterlony dans "Acta Pathol. Microbiol. Scand.", 26, 507 (1949) ; 32, 231 (1953). L'activité de croissance du polypeptide synthétique a été évaluée par le test portant sur le tibia du rat, décrit 5 par I.I. Geschwind et O.H. Li dans "The Hypophyse al G-rowth Hormone, Nature and Actions", R.W. Smith, Jr., O.H. Gaebler et C.N.H. Long, Ed., Blakiston, New York, N.Y., 1955, page 28. L'activité exercée sur la sécrétion lactée par le polypeptide synthétique a été expérimentée par le test portant sur le jabot du pigeon, 10 décrit par W.R. Lyons dans "Proc. Soc. Exptl. Biol." , 35, 645 (1937) î C.S. Nicoll, "Endocrinology", 80, 641 (1967). L'activité de croissance et de sécrétion lactée de l'hormone synthétique produite conformément à l'exemple 1 a été comparée aux activités correspondantes de l'hormone HGH 15 naturelle et de cette hormone réduite et oxydée par les mêmes traitements au sodium dans l'ammoniac liquide et dans l'air, en présence de dithiothréitol, que ceux qui ont été utilisés dans ledit exemple pour produire la matière synthétique. Les résultats de ces comparaisons sont indiqués sur le tableau 20 suivant : Test du tibia du rat Test du .jabot du pigeon 25 Préparation Dose taie to-l^g Largeur du tibia V- Dose totale tig Poids sec de substance muqueuse* mg Hormone HGH naturelle 20 60 211 + 4(12) 269 ± 5(11) 2 8 13,5 ± 18,2 + 3(6) 5(5) 30 Hormone HGH naturelle réduite et oxydée 50 200 212 + 26(4) 270 + 17(4) 5 40 12,2 + 20,2 + 3(4) 4(4) Hormone HGH synthétique 50 200 184 + 10(4) 223 ± 17(3) 50 200 12,5 + 20 ,"5 + 3(4) 3(3) 35 Solution de chlorure de sodium 0 168 + 2(12) 0 8,0 + 2(6) 72 15136 19 2134632 * Erreur statistique moyenne (les nombres indiqués entre parenthèses sont les nombres de rats ou de jabots de pigeon). Comme l'indiquent les résultats du tableau précédent, l'invention produit des hormones synthétiques HGH et HCS qui 5 ont la conformation des hormones naturelles et qui en ont également les activités 'biologiques. Les produits de synthèse sont intéressants à utiliser pour activer la croissance et la lactation chez des animaux et leur efficacité clinique aux mêmes fins chez les êtres humains est nettement indiquée 10 par ces résultats. Il va de soi que la présente invention n'a été décrite qu'à titre explicatif, mais nullement limitatif, et que de nombreuses modifications peuvent y être apportées sans sortir de son cadre. 72 15136 20 2134632 REVENDICATIONS 1. Procédé de synthèse d'hormones hypophysaires humaines de croissance, caractérisé par le fait qu'il consiste : (a) à former une chaîne polypeptidique non pontée 5 de résidus d'amino-acides, dans un ordre analogue à celui de l'hormone de croissance hypophysaire humaine naturelle ; (b) à produire des groupes sulfhydryle sur les résidus de cystéine de ladite chaîne polypeptidique ; et (c) à oxyder les groupes sulfhydryle dans des conditions 10 propres à former des ponts disulfure entre ces résidus de cystéine, de manière à engendrer deux noyaux intramoléculaires dans la chaîne polypeptidique. 2. Procédé de synthèse de somatomammotropine chorionique humaine, caractérisé par le fait qu'il consiste : , . v non pontée 15 (a) a former une chaîne polypeptidique/de résidus d'amino-acides dans l'ordre de la somatomammotropine chorionique humaine naturelle ; (b) à engendrer des groupes sulfhydryle sur les résidus de cystéine de ladite chaîne polypeptidique ; et 20 (c) à oxyder les groupes sulfhydryle dans des conditions propres à former des ponts disulfure entre les résidus de cystéine, de manière à engendrer deux noyaux intramoléculaires dans la chaîne polypeptidique. 3. Procédé de production d'une substance douée d'ac-25 tivité favorisant la croissance, caractérisé par le fait qu'il consiste : (a) à former une chaîne polypeptidique non pontée de résidus d'amino-acides dans un ordre correspondant aux figures 1, 2 ou 3 des dessins annexés ; 30 (b) à engendrer des groupes sulfhydryle sur les résidus de cystéine de ladite chaîne polypeptidique, et (c) à oxyder les groupes sulfhydryle dans des conditions propres à former des ponts disulfure entre les résidus de cystéine, de manière à former deux noyaux intramoléculaires dans 35 la chaîne polypeptidique. 4. Procédé suivant la revendication 3, caractérisé par 21 2134632 72 15136 le fait que l'oxydation est conduite en solution en présence d'un composé mercapto organique de formule R-SH, dans laquelle R représente un radical hydrocarboné organique en à C^q, la proportion du composé mercapto étant comprise entre environ 5 10 et environ 200 mg, par exemple égale à 50 mg par 100 mg dudit polypeptide, la concentration du polypeptide étant comprise entre environ 0,001 et environ 0,5 mg, par exemple égale à 0,25 mg de polypeptide par ml de solution, le pH de la solution étant maintenu entre environ 4,5 et environ 9,0,par exemple 10 entre environ 8,0 et environ 8,4, et la température ambiante étant maintenue entre environ 0 et environ 25 °C. 5. Procédé suivant la revendication 4, caractérisé par le fait que le composé mercapto est le dithiothréitol, le mercaptoéthanol ou la cystéine. 15 6. Procédé suivant la revendication 3, caractérisé par le fait qu'il comprend l'étape supplémentaire, succédant à l'étape (c), qui consiste à faire réagir le polypeptide avec le bromure de 2-hydroxy-5-nitrobenzyle ou le chlorure de 2-nitrophénylsulfényle pour former respectivement un dérivé 20 portant un groupe 2-hydroxy-5-nitrobenzyle ou un groupe 2-nitrophénylsulfényle substitué sur le résidu de tryptophane du polypeptide. 7. Procédé suivant la revendication 3, caractérisé par le fait qu'il comprend les étapes supplémentaires, succé-25 dant à l'étape (c), qui consistent à réduire les ponts disulfure en groupes sulfhydryle sur les résidus de cystéine du polypeptide et à faire réagir le polypeptide réduit avec l'iodacétamide pour former un dérivé portant un groupe tétra-S-carbamidométhylique substitué sur les résidus de cystéine. 30 8. Procédé suivant la revendication 3, caractérisé par le fait qu'il comprend 'l'étape supplémentaire, succédant à l'étape (c) qui consiste à faire réagir le polypeptide avec le tétranitrométhane pour former un dérivé portant des groupes nitro substitués sur six des huit résidus de tyrosine du "polypep-35 tide, à savoir ceux qui peuvent être nitrés en l'absence de chlorhydrate de guanidine. 9. Procédé de production d'une substance douée d'activité favorisant la croissance, caractérisé par le fait qu'il 72 15136 22 2134632 consiste : (a) à former une chaîne polypeptidique non pontée de résidus d'amino-acides dans un ordre correspondant (i) à la portion de la séquence de la figure 2 des dessins annexés 5 allant de la position 86 à la position 190 ou (ii) à la portion (i) combinée avec toute fraction de la portion restante entre les positions 85 et 1 ; (b) à créer des groupes sulfhydryle sur les résidus de cystéine de la chaîne polypeptidique et 10 (c) à oxyder les groupes sulfhydryle dans des conditions propres à former un pont disulfure entre les résidus de cystéine occupant les positions 181 et 188 ; et à former ainsi un noyau intramoléculaire dans la chaîne polypeptidique. 10. Composé caractérisé par le fait qu'il consiste en .de çynthèse , 15 une sub s tance/doue e dT activité biologique dont la structure correspond à l'une des figures 1,2 et 3 des dessins annexés. 11. Composé suivant la revendication 10, caractérisé par le fait qu'il est doué d'activité favorisant la croissance dans le test portant sur le tibia du rat. 20 12. Composé suivant la revendication 10, caractérisé par le fait qu'il est doué d'activité favorisant la sécrétion lactée dans le tesi^portant sur le jabot du pigeon. 13. Composé suivant la revendication 10, caractérisé par le fait qu'il a une réaction immunologique avec l'anti- 25 sérum de lapin relatif à l'hormone humaine de croissance, dans l'essai de diffusion sur gélose. 14. Composé suivant la revendication 10, caractérisé par le fait que son résidu de tryptophane est substitué avec un groupe 2-hydroxy-5-nitrobenzyle ou avec un groupe 2- 30 nitrophénylsulfényle. 15. Composé suivant la revendication 10, caractérisé par le fait qu'il ne comprend pas les ponts disulfure indiqués sur les dessins et que ces résidus de cystéine sont substitués avec des groupes tétra-S-carbamidométhyliques. 35 16. Composé suivant la revendication 10, caractérisé par le fait qu'il est substitué avec des groupes nitro sur six des huit résidus de tyrosine, à savoir ceux qui peuvent 72 15136 23 2134632 être nitrés en l'absence de chlorhydrate de guanidine. 17. Composé caractérisé par le fait qu'il consiste en se synthèse une substance/douee d'activité biologique de structure correspondant : 5 (a) à la portion de la structure de la figure 2 des dessins annexés comprise entre les positions 86 et 190, ou (b) à ladite portion (a) associée avec toute fraction de la portion restante entre les positions 85 et 1. 18. A titre de produit industriel nouveau, 10 un composé obtenu notamment au moyen d'un procédé conforme à l'une quelconque des revendications 1 à 3 et 6 à 9.