FR 2111707 A1 19720609 FR 7137531 A 19711019 71 37531 2111707 1 La présente invention concerne de nouveaux polysaccharides, leur procédé de préparation et l'utilisation de ces nouveaux composés. Plus particulièrement, elle concerne de nouveaux polysaccharides ayant une activité antitumorale. 5 On sait que certains polysaccharides ont une activité iftysiologique, telle qu'une activité antitumorale ou antivirale, cependant, la plupart de ces polysaccharides physiologiquement actifs sont tfop insolubles dans l'eau pour Stre administrés par injection intraveineuse et leur injection sous-cutanée, intradermique ou intramusculaire tend à provoquer divers effets secondaires. Mêmes les polysaccharides solubles dans l'eau 10 ne se dissolvent dans celle-ci qu'en quantité de 0,2% au plus, et ces polysaccharides sont en général insolubles après isolement et séchage. On utilise souvent des agents de surface ou analogues pour dissoudre diverses substances médicales, cependant, on ne peut les utiliser pour les polysaccharides physiologiquement actifs car les structures de dimensions élevées des polysaccharides peuvent varier sous l'effet des agents 15 de surface, ce qui entraîne la perfe de l'activité physiologique de ces composés. La demanderesse a découvert selon l'invention que lorsqu'on fait réagir un p-(l —*■ 3) glucane ou un a-(l —+ 6) glucane insoluble dans l'eau avec un acide gras inférieur halogéné en a, ou un de ses dérivés, 20 et que l'on traite le carboxy-alkyl inférieur-p-(l —> 3) glucane et le carboxy-alkyl inférieur-a-(l 6) glucane, pour isoler leur sel de métal alcalin, le sel de métal alcalin du carboxy-alkyl inférieur-p-(l—^ 3)glucane, et le sel de métal alcalin du carboxy-alkyl inférieur-a-(l —^ 6) glucane sont aisément solubles dans l'eau et ont une forte activité physiologique. Elle 25 a également découvert que lorsque l'on utilise un glucane physiologiquement actif comme substance de départ, l'activité physiologique de la substance de départ est fortement accrue, on obtient des glucanes physiologiquement actifs à partir de glucanes physiologiquement inactifs et la toxicité des glucanes physiologiquement actifs obtenus comme produits finals est très 30 faible. Les glucanes que l'on peut utiliser comme substances de départ selon l'invention sont les p-(l —^ 3) glucanes ou les a-(l —^ 6) glucanes, insolubles dans l'eau ou faiblement solubles dans l'eau. A titre d'exemple de glucane, on peut mentionner le lentinane qui est un glucane n'ayant que 35 des liaisons |5-(1 —> 3 glucosidiques comme liaisons glycosidiques, et qui est obtenu par extraction à l'eau chaude des sporophores de Lentinus edodes 3hg ou Flammulina veltipes Sing _£~"Saishin - Igaku" (Recent Medicine), 71 37531 2 2111707 volume 25, page 1043, 1970/,le pachymarane que l'on peut obtenir par oxydation ménagée, réduction et hydrolyse de pachymane ("Recent Medicine", vol. 25, 1043, 1970), 1'«-(!—>6) glucane que l'on obtient par extraction des sporophores de lentinus edodes Sing. On pensait que le pachymane, qui est un polysaccharide obtenu à partir de l'extrait de Poria cocos Wolf était un |J-(1 ~? 3) glucane, mais ce n'est pas un |3-(1 —^ 3) glucane car on a découvert récemment qu'il possédait plusieurs liaisons p-(l 6) gluco-pyranosidiques reliées à la chaîne principale par des chaînes latérales et des liaisons p-(l 6) internes dans la chaîne principale p-( 1 ~>3). Les acides gras inférieurs halogénés en a et laurs dérivés, que l'on peut utiliser selon l'invention, comprennent l'acide monochlor-acétique, l'acide monobromacétique, l'acide a-monochlorobutyrique, l'acide a-monobromobutyrique, les sels de métaux alcalins de ces acides et leurs esters d'alkyle inférieur tels que le monochloracétate de méthyle, le monochloracétate d'éthyle, le monochloracétate de propyle, le monochloracétate de butyle, ou le monobromacétate de méthyle. Selon l'invention, on met en suspension dans l'eau ou dans un dcool la substance de départ, c'est-à-dire le p~(l -^3) glucane ou l'a-(l —> 6 ) glucane, on agite la suspension puis on ajoute à la suspension, en agitant, une solution aqueuse d'un alcali. On ajoute l'acide gras inférieur halogéné en a, ou son dérivé, à la suspension de glucane alcalinisée. La quantité de base utilisée eHt en général de 1 à 2,5 moles par mole d'acide gras inférieur halogéné en a ou de son dérivé. On utilise de préférence une solution aqueuse d'alcali à 20 à 30% en quantité de 1/5 à 1/20 de fois le volume initial. La quantité d'acide gras inférieur halogéné en a, ou de son dérivé, utilisée est de 0,8 à 2,2 moles par cycle glucopyrasi-dique du glucane utilisé. On peut achever la réaction en chauffant le système réactionnel au bain-marie, à 30-60°C, pendant 2 à 10 h. On peut récupérer le produit final selon l'invention et le purifier par les procédés suivants. On isole le précipité dans le mélange réactionnel par une technique appropriée, telle que filtration ou centri-fugation, on lave dans une solution d'acide acétique-alcool de pH environ 6, et on lave avec une solution aqueuse de méthanol à plus de 70%. On peut encore purifier le précipité obtenu en le lavant par du méthanoliabsolu et/ou de 1'acétone:--t On peut également dissoudre dans l'eau le précipité isolé du mélange réactionnel, on ajuste le pH de la solution aqueuse entre 4,0 et 8,5^ de préférence entre 6,5 et 8,0, à l'aide d'un acida tel que l'acide 71 37531 3 2111707 acétique et on ajoute à la solution aqueuse un solvant organique soluble dans l'eau pour précipiter le sel de métal alcalin du carboxy-alkyl infé-rieur-p-(l —> 3) glucane ou le sel de métal alcalin du carboxy-alkyl inférieur-a-(l ~> 6) glucane. De préférence, on réalise la précipitation 5 du sel de métal alcalin du carboxy-alkyl inférieur-p-(l —^ 3) glucane, ou -oc-(l 6) glucane en présence de 1% au plus d'un sel de métal de alcalin ou d'un sel de métal alcalinoterreux. A titre d'exemples de sels de métal alcalin préférés selon l'invention, on peut citer l'acétate de sodium et le chlorure de sodium, et comme exemple de sel de métal alcalinoterreux 10 on peut citer le sulfate de calcium. La quantité de solvant organique soluble dans l'eau utilisée n'est pas inférieure à deux fois le volume initial de la solution aqueuse. Si on le désire, on peut encore purifier le précipité isolé du produit final en le lavant à 1'aide du solvant organique soluble dans l'eau. Le sel de métal alcalin du carboxy-alkyl inférieur-15 p-(l ~~> 3) glucane et le sel de métal alcalin du carboxy-alkyl inférieur-a-(l —} 6) glucane obtenus ont une activité physiologique, telle qu'une activité antitumorale. Lorsque l'on utilise un p-CL~> 3) glucane antitumoral comme substance de départ pour la réaction de carboxyalkylation selon l'invention, l'acitivité antitumorale initiale du |3-(1 ~f 3) glucane 20 décroît lorsque le degré de substitution croît, puis, à partir du moment où le degré de substitution est d'environ 0,4, l'activité antitumorale du carboxyalkyl-|â-(l 3) glucane augmente fortement jusqu'à ce que le degré de substitution soit de 1,5. Par conséquent, on peut considérer que l'activité antitumorale du carboxy-alkyl-|J-(l —^ 3) glucane n'est pas due 25 à l'activité de la substance de départ mais est obtenue de façon nouvelle pour des raisons qui sont encore inconnues. La demanderesse a découvert, d'après les résultats d'essais de métabolisme, que les carboxy-alkyl-glucanes n'agissert plus vis-à-vLs des tumeurs après que les groupes carboxy-alkyle aient été divisés dans les tissus vivants et on considère que les groupes carboxy-30 alkyle du glucane ont un rOle important dans son activité. Les exemples suivants illustrent l'invention sans toutefois en limiter la portée. EXEMPLE 1 On oxyde, on réduit et on hydrolyse, comme il est indiqué 35 dans le "Saishin Igakushi" (Recent Medicine); volume 25, page 1043, 1970, un pachymane que l'on a obtenu par extraction de Pcria cocos. Wolf avec une solution alcaline aqueuse et on prépare un pachymarane (la figure 1 71 37531 4 2111707 représente le spectre d'absorption infrarouge du pachymarane). On agite vigoureusement 3 g de pachymarane dans 80 ml d'alcool isopropylique à température ambiante, on ajoute à la solution obtenue 8 ml d'une solution d'hydroxyde de sodium à 30% puis on ajoute 3 g d'acide monochloracétique 5 solide. On agite la solution obtenue pendant 3 h à 40-45°C, sur bain-marie, et on refroidit à température ambiante en agitant. On filtre le mélange réactionnel en utilisant un filtre de verre, on ajoute le précipité obtenu à 100 ml de méthanol à 707» contenant 5 ml d'acide acétique cristal-lisable, on agite pendant 10 mn et on lave trois fois avec 100 ml de 10 méthanol absolu et à l'éther. On sèche sous vide le précipité résultant et on obtient 2, 2 g d'une poudre incolore de carboxyméthyl-(â-(l —> 3) glucane, désigné ci-après comme produit I-a; la figure 2 représente le spectre d'absorption infrarouge du produit I-a. 15 pachymarane, on dissout le précipité isolé du mélange réactionnel dans 100 ml d'eau contenant 2 ml d'acide acétique cristallisable, et on ajoute 300 ml d'acétone pour précipiter le carboxyméthyl-p-(l 3) glucane. On purifie le précipité par lavage au méthanol absolu; on désigne ce précipité par produit I-b. 20 On dissout 1 g du produit I-b dans 50 ml d'eau, on ajuste le pH de la solution aqueuse à 8,0 à l'aide d'une solution aqueuse de NaOH et on ajoute 0,5 ml d'une solution aqueuse à 20% d'acétate de sodium. On isole le précipité formé que l'on désigne comme produit I-c. 380tr/mn pendant 30 mn, 200 g de pachymarane et on ajoute au pachymarane; goutte à goutte, en 115 mn, 324 ml d'une solution de NaOH à 30%, puis on agite le mélange pendant 40 mn. On chauffe la solution mixte à 50°C, on ajoute 138 g d'acide monochloracétique solide et on agite à 400 tr/mn pendant 3 h. 30 On refroidit le mélange réactionnel à 17°C, on filtre sur un filtre de verre et on lave le précipité obtenu avec 300 ml d'alcool isopropylique. On ig-te le précipité dans 10 1 de méthanol à 80%, pendant 17 h à température ambiante, on isole par filtration et on lave avec 300 ml de méthanol aqueux à 80%.. On dissout le précipité lavé dans 6 1 d'eau, on élimine les matières solides 35 par filtration et on ajuste le pH du filtrat à 8,7 avec de l'acide acétique. On ajoute au filtrat,dont le pH a été ajusté, 400 ml d'une solution d'acétate On recommence la réaction ci-dessus en utilisant 1 g de EXEMPLE 2 25 On agite, dans 5,3 1 d'alcool isopropylique, à raison de 71 37531 5 2111707 de soldium aqueuse à 207», on ajoute 10 1 d'acétone et on agite le mélange pendant 30 mn. On isole par filtration le précipité formé, on l'agite dans 2 1 de méthanol aqueux à 80% pendant 30 mn puis dans 2 1 de méthanol absolu pendant 30 mn. On isole le précipité par filtration, on le sèche à 40°C 5 sous vide pendant 24 h et on obtient 257 g de sel de sodium de carboxyméthyl-pachymarane (produit II). EXEMPLE 3 On dissout dans 10 ml d'une solution IN de NaOH, 1 g du produit I-a et on ajoute à la solution 50 ml de méthanol. On récupère par 10 filtration le précipité formé, on le lave avec du raethanol aqueux à 707=, du méthanol aqueux à 907o, du méthanol absolu puis de l'acétone et pn le sèche pour obtenir 0,8 g de carboxyméthyl-|3-(l —^ 3) glucane entièrement sous forme de son sel de sodium, que l'on désigne comme produit III. La figure 3 représente le spectre d'absorption infrarouge du produit III. 15 EXEMPLE 4 On fait réagir 3 g de pachymarane avec 3,6 g de monochloracétate de méthyle pendant 2 h, comme dans l'exemple 1. On neutralise le précipité obtenu dans une solution acide acétique-méthanol, on le lave comme dans l'exemple 1 et on le sèche pour obtenir 3,5 g d'une poudre incolore 20 de carboxyméthyl-p-(1~^ 3) glucane (produit IV). On trouve que ce composé est totalement salifié en sel de sodium, en examinant son spectre d'absorption infrarouge représenté dans la figure 4 et d'après les résultats de titrage. EXEMPLE 5 On traite 1 g de pachymarane et 1,2 g de monochloracétate 25 de butyle de la même façon que dans l'exemple 4 et on obtient 1,24 g d'une poudre incolore de sel de sodium de car.boxyméthyl-p-(l ^ 3)glucane (produit V). Le spectre d'absorption infearouge du produit V est représenté dans la figure 5. EXEMPLE 6 On agite 2 g de pachymarane dans 60 ml d'alcool isoamylique, 30 on ajoute à la solution obtenue 6 ml d'une solution de NaOH à 207o et on agite le mélange à température ambiante pendant 3 h. On ajoute au mélange 2 g d'acide a-bromobutyrique e't o n agite pendant 2 h au bain-marie à 50°C. On traite comme dans l'exemple 1 le précipité formé et on 35 obtient 1,6 g d'une poudre incolore d !a-éthylcarb§xyniéthyl-p-(l —^ 3) glucane (produit VI). 71 37531 2111707 EXEMPLE 7 On agite dans 30 ml d'alcool isopropylique, pendant 30 mn à température ambiante, 1 g de p-(l ~^ 3) glucane que l'on a préparé par extraction à l'eau chaude des sporophores de Lentinus edodes Sing, 5 fractionnement et purification (lentinane). On ajoute, goutte à goutte, au lentinane, 3 ml d'une solution de NaOH à 25% puis 3 ml d'alcool isopropylique contenant 1,2 g d.'acide monochloracétique, et on agite le mélange résultant pendant 150 mn à 50°C, au bain-marie. On isole du mélange réactionnel, par filtration, le précipité formé, on 10 l'ajoute à 35 ml de méthanol aqueux à 80% contenant 2 ml d'acide acétique cristallisable et on agite pendant 10 mn. On récupère le précipité par filtration, on le lave trois fois avec 40 ml de méthanol absolu et on le sèche pour obtenir 0,8 g d'une poudre incolore de carboxyméthyl-p-(l —> 3) glucane (produit VII). 15 EXEMPLE 8 On agite, dans une solution mixte de 35 ml d'alcool isopropylique et 5 ml d'eau, 1 g d'ot-(l —^ 6) glucane que l'on a préparé par extraction des sporophores de Lentinus edodes Sing, fractionnement et purification, on ajoute à la suspension 3 ml d'une solution aqueuse de 20 NaOH à 25% et on agite le mélange pendant 30 mn. On ajoute 1,2 g d'acide monochloracétique et on achève la réaction par chauffage du système réactionnel à 50°C au bafei-marie, en agitant. On isole le précipité par filtration, on l'agite dans 35 ml de méthanol aqueux à 80% pendant 30 mn puis on le lave trois fois au méthanol absolu. On sèche le précipité 25 résultant et on obtient 0,7 g d'une poudre incolore de carboxyméthyl-oc-(l —i*- 6) glucane (produit VIII). EXEMPLE 9 On prépare un glucane possédant dès liaisons p-(l -~^3) glucosidiques en chaîne principale, par extraction des sporophores de Flammulina 30 veltipes Sing, fractionnement et purification, et on fait réagir 1 g de ce glucane (désigné comme substance F) avec 1,2 g d'acide monochloracétique, comme dans l'exemple 5, et on obtient 1,0 g de carboxyméthylglucane ayant des liaisons p-(l 3)glucosidiques en chaîne principale (produit IX). On détermine pour les produits I à IX, ainsi que pour les 35 substances de départ, l'activité antitumorale, le degré de substitution par des groupes carboxyalkyle et le pourcentage (fe sel de sodium formé, ainsi que la solubilité dans l'eau; les résultats obtenus sont rassemblés dans le tableau I ci-après. TABLEAU I Echantillon Pachymarane Produit I-a Produit I-b Produit I-c Produit II Produit III Produit IV Produit V Produit VI Lentinane Produit VII ,. 6) glucane Produit VIII 'Substance F Produit IX Solubilité (mg/100 ml H20) 46,65 7500 7500 9300 9300 9400 4300 4700 5800 38,25 7700 8000 7100 230 6100 Degré de substitution (7») 0 0,815 0,829 0,822 0,808 0,815 0,618 0,628 0,701 0 0,560 0 0,723 0 0,670 t-* Sel de Na Taux d'inhibi- Régression totale formé (%) tion (7c.) ■ ^ 0 93 4/9 ^ 75 96 8/10 50 31 0/10 100 100 10/10 100 100 10/10 100 100 10/10 100 100 10/10 100 98 8/10 72 90 8/10 0 100 10/10 -i 92 100 10/10 0 -85 0/10 98 20 2/10 0 80 5/10 94 92 8/10 ro I-* O 71 37531 2111707 Note : (1) les essais de solubilité sont réalisés à 30°C. (2) on administre par injection sous-cutanée à des souris de souche "Swiss albino" 0,05 ml d'ascites de Sarcome-180 dans l'aine droite. 24 h après 5 l'injection, et journellement pendant une durée totale de 10 jours, on administre à un groupe de dix souris les échantillons d'essai par injection intrapéritonéale. Un groupe témoin ne reçoit pas d'injection d'échantillon d'essai. Au bout de cinq semaines, on sacrifie les souris, on excise les tumeurs et on les pèse et on évalue l'effet d'inhibition des échantillons 10 sur les tumeurs pour les souris traitées et non traitées, et on note le "taux d'inhibition" et la "régression totale". On détermine la dose létale pour des souris du produit I-a et du pachymarane et on trouve que cette dose est respectivement de 4 g/kg et 1,5 g/kg. 15 On détermine également l'activité antitumorale du produit I-a en utilisant d'autres tumeurs que le Sarcome-180; les résultats obtenus sont rassemblés dans le tableau II ci-après. TABLEAU II 20 Tumeur Type de souris Dose (mg/kg .jour) ^ Taux d'inhi- Régression bition (%) totale Carcinome d'Ehrlich SWM/MS Adénocarcinone MM102 C3H/Arima Adénocarcinome CCM SWM/MS 100 x 10 5 x 10 5 x 10 40,0 78,9 36,4 0/6 0/5 0/10 71 37531 2111707 REVENDICATIONS 1-Nouveaux polysaccharides, caractérisés en ce qu'ils consistent en sels de métaux alcalins de carboxy-alkyl inférieur-|5-(l —^ 3) glucanes. 2 - Composé selon la revendication 1, caractérisé en ce que le 5 p-(l —& 3) glucane est le pachymarane et le groupe alkyle est le groupe méthyle. 3 - Composé selon la revendication 1, caractérisé en ce que le p-(l 3) glucane est le lentinane, et le groupe alkyle est le groupe méthyle. 10 4 - Composés selon la revendication 1, caractérisés en ce que le p-(l ~> 3) glucane est un glucane que l'on obtient par extraction à l'eau chaude des sporophores de Flammulina veltipes Sing, fractionnement de l'extrait et pirification. 5 - Nouveaux polysaccharides, caractérisés en ce qu'ils consistent 15 en sels de métaux alcalins de carboxy-alkyl inférieur a-(l ï 6) glucane. 6 - Composés selon la revendication 5, caractérisés en ce que l'oc-(l 6) glucane est un glucane que l'on obtient par extraction à l'eau chaude des sporophores de Lentinus edodes Sing, fractionnement de l'extrait et purification. 20 7 - Procédé de préparation d'un sel de métal alcalin d'un carboxy-alkyl inférieur-jî-(l 3) glucane ou ot-(l —? 6) glucane, caractérisé en ce qu'on fait réagir un P-(l —^3) glucane ou un a-(l —^ 6)glucane, avec un acide gras inférieur halogéné en a, ou un de ses dérivés, on dissout dans l'eau le carboxy-alkyl inférieur |i-(l ~^ 3) glucane ou -a-(l —^6) glucane 25 ainsi préparé, on ajuste le pH de la solution aqueuse entre 6,5 et 8,5, on ajoute un solvant organique soluble dans l'eau en quantité au moins égale à deux volumes de la solution aqueuse dont le pH a été ajusté, afin de précipiter le sel de métal alcalin de carboxy-(alkyl inférieur)-p-(1 ~~V 3) ou -a-(l —^ 6 ) glucane et on récupère le précipité formé. 30 8 - Procédé selon la revendication 7, caractérisé en ce qu'on ajuste le pH de la solution aqueuse de carbtuy-alkyl inférieur-{i-(l ~^"3) glucane, ou-ce-(l —> 6) glucane à plus de 4,0 et on effectue la précipitation du sel de métal alcalin de carboxy-alkyl inférieur-^-(l ~> 3) glucane ou -a-(l —^ 6) glucane au moyen d'un solvant organique soluble dans l'eau en présence de 35 17c au plus d'un sel de métal alcalin ou d'un sel de métal alcalinoterreux. 9 - Procédé de préparation d'un sel de métal alcalin de carboxy-alkyl inférieur-p-(l —^ 3) glucane ou -oc-(l -V 6) glucane, caractérisé 71 37531 2111707 en ce qu'on fait réagir un p-(l —> 3) glucane ou un oc-(1 —> 6) glucane avec un acide gras inférieur halogéné en a, ou un de ses dérivés, on isole le précipité formé dans le mélange réactionnel, on lave le précipité avec du méthanol aqueux à plus de 70% et on le lave enfin au méthanol absolu. 5 10 - Nouveaux médicaments utiles notamment comme agents anti tumoraux, caractérisés en ce qu'ils consistent en sels de métaux alcalins de carboxy-alkyl inférieur-p-(l ~~> 3) glucanes ou en sels de métaux alcalins de carboxy-alkyl inférieur-a-(l 6) glucanes. 11 - Compositions thérapeutiques, caractérisées en ce qu'elles 10 contiennent comme ingrédient actif, un médicament' selon la revendication 10. 12 - Formes pharmaceutiques appropriées à l'administration des compositions selon la revendication 11.