FR 2128560 A1 19721020 FR 7207361 A 19720303 72 07361 1 2128S60 La présente invention concerne un procédé pour la préparation à grande échelle de particules virales chez des champignons hôtes© On sait maintenant que les acides ribonucléiques à double 5 chaîne et leurs sels (dénommés ci-après conjointement ARN d.c.) sont des générateurs potentiels d'interférons et sont ainsi intéressants dans la prophylaxie à large spectre des infections virales et à un moindre degré dans le traitement de ces infections. On a démontré que"1'ARN d.c. "à la fois d'origine synthé-10 tique et naturelle possède une activité génératrice d'interférons. Parmi les sources spécifiques d'ARN d.Co naturel générateur d'interférons qui ont été citées, on peut mentionner les particules virales que l'on trouve dans certaines souches de Pénicillium chrysogenum, P.funiculosum et P.stoloniferum. Un 15 examen au microscope électronique a également révélé des virus ARN doc. dans d'autres espèces fongiques, y compris certaines souches d'Aspergillus niger et d'A„foetidus et également chez les suivantes :-HYPHOMYCETES 20 Aspergillus nidulans Botrytis allii Botrytis cinerea Cephalosporium sp. Fusarium oxysporum 25 Gliocladium roseum Gliocladium sp. Paecilomyces varioti Scopulariopsis brevicaulis Trichothecium roseum 30 Verticillium sp<> -ASCOMYCETES Daldinia concentrica Hypoxylon fragiforme LEVURES 35 Candida krusei Candida stellatoidea Kloeckera apiculata PHYCOMYCETES Choanephora sp. 40 Mucor spp» 72 07361 2 2128560 Rhizopus nigricans Syncephalastrum sp0 BASIDIOMYGE-TES Hypholoma sublateritium 5 Polyporus lucidum Lors de la culture de champignons infectés par des virus pour l'isolement ultérieur de l'ARN d.Co viral, il a jusqu'ici été nécessaire de trouver dans la nature le champignon déjà infecté par le virus, et le rendement en particules virales 10 d'ARN d.Co obtenu après la culture dépend directement de là combinaison particulière champignon hôte/virus trouvée. S'il était possible d'infecter de façon délibérée des champignons initialement libres de virus avec de tels virus suivant les besoins, la souche hôte la plus appropriée pourrait alors être 15 choisie pour donner les meilleurs résultats, par exemple les rendements les plus élevés, les préparations les plus pures, etc ..o En outre, si une espèce d'ARN d.c» viral particulière était préférée comme génératrice d'interférons, il serait possible d'infecter le champignon hôte le plus approprié et d'obtenir 20 les rendements élevés en virus désirés sans une recherche initiale longue et très incertaine d'une souche de champignon hôte déjà infectée par le virus désiré. Jusqu'ici, il n'existait pas de méthode appropriée pour infecter un champignon préalablement non infecté au moyen d'un virus ARN d.c0 25 L'invention est matérialisée dans un procédé pour la pré paration d'un champignon infecté par un virus ARN d.c., ce procédé consistant à amener en contact des protoplastes fongiques avec des particules virales d'ARN d.Co d'origine fongique, en infectant ainsi certains au moins des protoplastes de ces par-30 ticules virales, puis à cultiver les protoplastes infectés pour produire un champignon qui est infecté par des particules virales d'ARN d.Co Dans la présente description, on dénomme "protoplaste fongique" le contenu protoplasmique d'une cellule fongique, à l'ex-35 clusion de la paroi ou capsule de la cellule» Les protoplastes sont les parties activement metabolisatrices des cellules fongiques et sont formés par une matière protoplasmique délimitée par une membrane extrêmement mince» Plusieurs protoplastes peuvent provenir d'une seule cellule fongique. 40 Les parois des cellules fongiques sont constituées par des 72 07361 3 2128560 matières cellulosiques ou chitineuses, parfois conjointement à des substances formées par des lipides, des protéines et des hydrates de carbone. Ainsi, les parois des cellules.-peuvent être éliminées en utilisant n'importe quel agent capable de dis-5 soudre sélectivement les matières cellulosiques, lipidiques et chitineuses. Un seul enzyme pourrait être utilisé, ou bien un mélange convenable d'enzymes cellulase, lipase et chitinase. Un mélange d'enzymes aisément disponible, capable_de digérer la capsule de la cellule, est l'enzyme de l'intestin d'escargot, 10 et il constitue un agent utile pour la préparation des protoplastes fongiqueso Selon une méthode utile pour la préparation des protoplastes, des spores ou fragments mycéliens d'un champignon sélecté sont inoculés dans un ballon de milieu de culture liquide selon 6 15 une concentration d'environ 10 spores/ml de milieu. On fait incuber le ballon pendant quelques heures, habituellement 24 à 48 heures, à une température convenable, habituellement de 20° à 37° C., pour permettre au développement des spores de se produire. Le mycélium résultant est ensuite récolté, par exemple 20 par filtration, et il est remis en suspension dans un milieu liquide. Le stade suivant et la dissolution des parois ou capsules des cellules pour libérer les protoplastes eux-mêmes, et étant donné que les protoplastes sont quelque peu délicats, du fait qu'ils comportent seulement une membrane mince délimitant 25 le protoplasme, le milieu liquide dans lequel la réaction se produit doit être choisi avec soin de façon à éviter l'endomma-gement des protoplastes. D'une façon générale, le milieu liquide va être de type aqueux et, en l'absence de précautions, les protoplastes vont gonfler et éclater sous l'effet de la pression 30 osmotique. Ainsi, quand on utilise un milieu aqueux, il doit contenir un stabilisant osmotique, par exemple une concentration élevée d'un sel ou d'un sucre» Afin de réduire encore le "choc" des protoplastes, le milieu de culture lui-même peut être utilisé comir.e milieu liquide "dans lequel le mycélium est remis en 35 suspension et, comme stabilisant osmotique, on constate que le chlorure d'ammonium ou le saccharose donne des résultats satisfaisants o Ainsi, après remise en suspension du mycélium récolté dans le milieu de culture plus le stabilisant osmotique, l'enzyme 40 désiré pour la dissolution des capsules des cellules fongiques 72 07361 4 2128560 est ajouté. Comme indiqué, on constate que l'enzyme de l'intestin d'escargot est utilisable à cet effet et, avec cet enzyme, la dissolution des capsules des cellules fongiques se produit lentement lorsqu'on agite doucement le mélange pendant plusieurs 5 heures, habituellement pendant 2 à 4 heures, selon la concentration en enzyme et la température. A la fin du laps de temps désiré, les protoplastes fongiques peuvent être séparés du mycélium résiduel par filtration à travers un filtre de la taille des spores, qui permet aux pro-10 toplastes de passer, mais retient le mycélium.Si désiré, les protoplastes peuvent ensuite être recueillis dans un centrifu-geur, pour donner un agglomérat de protoplastes qui est ensuite lavé dans le centrifugeur et qui peut être remis en suspension en vue d'un nouveau traitement à un moment ultérieur. Suivant 15 une variante, la suspension de protoplastes produite après filtration peut être utilisée directement au cours du stade suivant,. par exemple par contact avec les particules virales0 Le contact des protoplastes fongiques avec les particules virales d'ARN d.c. est effectué habituellement dans un milieu 20 liquide. Les mêmes critères que ceux ^ndiqués précédemment s'appliquent en ce qui concerne le choix de ce milieu liquide. Ici encore., le milieu va généralement être aqueux et il doit alors contenir un stabilisant osmotique0 Selon un mode de mise en contact considéré comme utile, les protoplastes fongiques 25 sont mis en suspension dans un milieu de culture renfermant du chlorure d'ammonium ou du saccharose, et une suspension de particules virales dans le même milieu contenant le même stabilisant osmotique ou un stabilisant différent est ajoutée. Afin d'obtenir avec certitude une grande vitesse d'infection, il est 30 préférable d'utiliser un excès de particules virales allant de 10 à lOO particules virales par protoplaste. On laisse ensuite la suspension de particules virales et de protoplastes reposer à la température ambiante pendant un laps de temps suffisant pour permettre à lrinfection de se produire, habituellement 35 pendant 30 à 60 minutes environ, en agitant occasionnellement le mélange pendant ce laps de temps. A la fin de la période d'infection, le stade suivant au cours du processus, objet de l'invention, est la culture des protoplastes infectés. Après le stade d'infection, on peut recueillir les proto— 40 plastes par centrifugation et, si désiré, on peut les laver avec 72 07361 5 2128560 le milieu de culture plus le stabilisant osmotique, pour éliminer les particules virales libres. Les protoplastes sont ensuite cultivés par exemple sur des plaques de culture. Au cours du stade d'infection, il est extrêmement improbable que tous les 5 protoplastes soient infectés. Ainsi, si les protoplastes obtenus après infection étaient développés simplement dans une seule colonie fongique, cette colonie renfermerait à la fois des hyphes infectés et non infectés. Toute préparation à grande échelle de particules fongiques à partir d'une telle colonie serait inévi-10 tablement moins efficace que si la totalité de la colonie avait été infectée depuis le début. Par suite, de préférence, au lieu de cultiver tous les protoplastes obtenus après mise en contact des protoplastes avec les particules virales, on cultive plusieurs colonies fongiques séparées, la plupart de ces colonies 15 étant dérivées chacune d'un seul protoplaste, et une ou plusieurs des colonies résultantes, que l'on constate être infectées par des particules virales, sont encore cultivées par exemple par fermentation aérobie en immersion, pour produire la quantité désirée de champignon infecté. Le processus préféré peut être mis 20 en oeuvre en préparant tout d'abord des dilutions en série de la matière protoplastique infectée dans un milieu de régénération, par exemple dans un milieu de gélose de régénération, et en étalant chaque dilution en une plaque de culture.» Les protoplastes sont cultivés ensuite en colonie et la plaque de cultu— 25 re présentant l'espacement optimum entre les colonies peut être examinée pour déterminer celles des colonies qui sont infectées et celles qui ne le sont pas. La présence de virus peut être détectée par examen au microscope électronique ou par analyse sur des gels polyacrylamide. Les colonies infectées décelées 30 de cette manière peuvent ensuite continuer d'être cultivées et être utilisées pour inoculer des ballons de milieux de culture liquides avant une culture à l'échelle industrielle, par exemple par fermentation aérobie en immersiono Cette invention pèrmet pour la première fois d'infecter 35 judicieusement une souche de champignons préalablement non infectée avec des particules virales d'ARN d.c. d'origine fongi-queo Ainsi, par un choix convenable du champignon hôte, on peut obtenir des rendements industriels maxima en particules virales. En outre, les particules virales fongiques contenant une espèce 40 particulièrement préférée d'ARN d0c« peuvent être cultivées" 72 07361 6 2128560 dans l'hôte désiré, que cet hôte se trouve ou non dans la nature à l'état infecté avec lesdites particules virales. A titre d'exemple, des particules virales isolées à partir d'une souche de PoStoloniferum ont pu être développées dans une souche non 5 infectée de P.chrysogenum et vice et versa» Par ailleurs, des particules virales isolées à partir d'un membre de l'espèce Aspergillus ont pu être cultivées chez un membre de l'espèce Pénicillium et vice et versa. D'une façon plus précise, on a pu cultiver le virus du Pénicillium stoloniferum dans le 10 Pénicillium chrysogenum et le virus du Pénicillium chrysogenum a pu être cultivé dans le Marasmius androsaceus ou dans Mucor Liemalis ou encore dans Aspergillus Niger0 Les exemples donnés ci-après à titre non limitatif permettront de mieux comprendre comment l'invention peut être mise en 15 oeuvreo Exemple 1 Infection par un virus de Pénicillium stoloniferum On développe des cultures de la souche de Pénicillium stoloniferum désignée par ST10/28 sur des plans inclinés de 20 gélose formant un milieu complet. Cette souche est une souche mutante à conidies blanches de P.stoloniferum A.T.C.C. 10.111 et on n'a pas pu démontrer qu'elle contenait un virus quelconque,, Gelose formant un Milieu Complet 25 Peptone 10 g Extrait de levure 5 g Glucose 10 g Eau ordinaire 1 litre Agar-agar 15 g 3C On a enlevé les spores du plan incliné par lavage et on les a ajoutés à 75 ml de Milieu Minimum liquide pour obtenir g 10 spores par ml0 Milieu Minimum Glucose 10 g 35 Nitrate de sodium 6 g Ortho-phosphate monopotassique 1,52 g Chlorure de potassium 0,52 g Sulfate de magnésium 0,52 g Eau distillée 1 litre 40 On a ajusté le pH à 6,5 avec de la soude diluée. 72 07361 7 2128560 Le Milieu Minimum était contenu dans un ballon Erlenmeyer de 250 ml muni de chicanes intérieures. On a fait incuber pendant 40 heures à 27° C sur un agitateur alternatif ayant une course de 25 mm, en secouant à raison de 130 coups par minute. 5 On a recueilli le mycélium résultant sur un papier filtre Whatman n° 1 et on a dispersé ensuite le "gâteau" de mycélium dans 15 ml de milieu de "suspension" (Milieu Minimum plus concentration M de chlorure d'ammonium), auquel on a ajouté l'enzyme de l'intestin de l'escargot "Helicase" (L'Industrie Biologi-10 que Française, 35 Quai du Moulin de Cage, Gennevilliers, Paris) jusqu'à une concentration finale égale à 5 mg/ml de milieu. On a fait incuber la suspension de mycélium pendant 2 h 30 dans les mêmes conditions de secouage que celles indiquées précédemment. 15 Après le traitement par l'enzyme, on a séparé le mycélium résiduel par filtration de la suspension à travers un treillis en Nylon de 20 microns. On a lavé 2 fois le mycélium retenu avec 15 ml du milieu de suspension pour faciliter l'entraînement par lavage des protoplastes. On a centrifugé le filtrat pendant 20 10 minutes à 800 ç[ et on a remis l'agglomérat de protoplastes en suspension,puis on l'a lavé 2 fois avec-le même milieu. On a remis l'agglomérat final en suspension dans 4 ml de milieu de suspension. Ceci correspond à la suspension de protoplastes de base (Voir le tableau 1). 25 On a ajouté à une portion de la suspension de protoplastes un même volume de milieu de suspension contenant le virus' extrait de la souche de PDstoloniferum ATCC 14.586 selon une 9 concentration de 10 particules par ml. On a laissé le mélange pendant 30 minutes à la températu-30 re ambiante, en agitant de façon occasionnelle.' On a recueilli ensuite les protoplastes, de nouveau par centrifugation, et on a lavé deux fois avec le milieu de suspension, puis finalement on a remis en suspension, ici encore dans le milieu de suspension o 35 On prépare des dilutions en série à partir de la suspen sion de protoplastes dans la gélose formant milieu de régénération (Milieu Minimum + concentration M de saccharose) que l'on dépose ensuite en couche sur le même milieu en plaques de culture. On fait incuber ces plaques à 27" pour permettre aux 40 protoplastes de se développer en colonies„ 72 07361 8 2128560 A titre d'expérience témoin, on dilue en série une partie de la suspension de protoplastes et on forme des plaques sans stabilisant osmotique (saccharose). D'une façon analogue, on forme des plaques avec et sans stabilisant osmotique à l'aide 5 d'une partie de la suspension de protoplastes d'origine qui n'a pas été en contact avec le virus. Les dernières colonies apparaissant après l'étalement des protoplastes infectés sur le milieu de régénération, après incubation pendant 3-4 jours, sont reprises en cultures secondaires 10 et on les essaie pour déterminer l'infection par électro- phorèse à l'aide d'un gel de polyacrylamide, comme décrit dans Buck et coll., Nature 225,945-946, (1970). Parmi 20 colonies sè développant à partir de plaques de la suspension de protoplastes infectés, on récupère le virus 15 à partir de 12 colonieso Tableau 1 Concentration en Protoplastes dans la Suspension de base. Nombre total de Spores et fragments Protoplastes 20 cellules viables d'hyphes (b) viables (c) (a) . (cellules/ml) (cellules/ml) (cellules/ml) 8,6 x 106 0,2 x'105 8,4 x 106 25 Notes : (a) Nombre de colonies par plaque sur le Milieu Minimum avec stabilisant osmotique. 30 (b) Nombre de colonies par plaque sur le Milieu Minimum sans stabilisant osmotique. Dans ces conditions, les protoplastes sont détruitso (c) Différence entre (a) et (b). Les dénombrements de protoplastes décelés sous le microscope à l'aide d'un hémocytomè- 35 tre donnent des valeurs voisines de 10 fois les nombres par plaque précités, c'est-à-dire qu'environ 10% seulement des protoplastes produits par la méthode particulière employée sont viables. Exemple 2 40 On procède comme décrit dans l'exemple 1 en utilisant une 72 07361 9 2128560 souche de Pénicillium stoloniferum désignée par ST91/14. Cette souche est une souche mutante à conidies fauves de la souche IMI 910966 et on n'a pas pu déceler la présence de virus quelconque* 5 Parmi 20 colonies développées sur des plaques de suspen sion de protoplastes infectés, on a récupéré du virus à partir de 15 colonieso Exemple 3 Infection de Pénicillium chrysogenum ne contenant pas de virus 10 avec le virus ARN d.c. provenant de Pénicillium chrysogenumo On sait que des particules virales d'ARN d.cD sont présentes dans P.chrysogenum adt,0C.C. 10002 mais, parmi les colonies provenant de spores distinctes de cultures de ce champignon, certaines ne contiennent pas de virus. Dans cet exemple, la cul-15 ture à infecter était une souche non virale isolée de P.chrysogenum A.T.C.Co 10002o On a développé des cultures sur des plans inclinés de gélose Glycérol/Mélasses pour obtenir une source de spores» Gélose Glycérol/Mélasses 20 Glycérol 7,5 g. Mélasses (Mélasse de l'Inde Occidentale de Fowler) ' 7,5 g. Extrait de levure (Poudre) (Oxoid Ltd) 5,0 g. Chlorure de sodium (NaCl) 10,0 g0 25 Sulfate de magnésium (MgSO^^^O) 0,005 g. Ortho-phosphate monopotassique (KH^PO^) 0,006 g„ Sulfate d'ammonium ferrique (Fe2(S04)g (NH4)2S04.24H20) 0,0016 g0 Sulfate de calcium (CaSO^) 0,25 g. 30 Sulfate cuprique (CuSO^.SH^O) 0,0001 g0 Gélose n° 3 (Oxoid Ltd.) ~ 25,0 g. Eau distillée 1 litre On élimine les spores du plan incliné par lavage et on ajoute à 150 ml. du milieu complet liquide pour obtenir 10 6 de 35 spores par ml. Le milieu complet liquide est contenu dans un flacon conique de 500 ml. muni de pointes intérieures. On le fait incuber pendant 48 heures à 25°C. sur un agitateur orbital avec une orbite de 32 mm de diamètre et on fait tourner à 240 tours/minute<> 40 Milieu complet liquide 72 07361 10 2128560 Peptone bactériologique (Oxoid Ltd.) 8g. Extrait de levure (Poudre)(Oxoid Ltd.) 4 g. Hydrolysat de caséine (Acide)(Oxoid Ltd.) 6 g. Dextrose 40 g. 5 Nitrate de sodium (NaNO^) 6,0 g» Chlorure de potassium (KC1) 0,52 g. Ortho-phosphate monopotassique (KF^PO^) 1,52 g. Sulfate de magnésium (MgSO^.VH^O) 0,52 g. Eau distillée 1 litre 10 pH ajusté à 6,5 On recueille le mycélium provenant de 50 ml. du bouillon de culture entier sur un filtre en verre fritté n° 3 et on effectue l'homogénéisation pendant 1 minute dans 50 ml. de Milieu Minimum (ayant la composition indiquée dans l'exemple 1). On inocule 15 ensuite 5 ml. du produit homogénéisé à 150 ml» de milieu complet dans un ballon conique de 500 ml. muni de pointes intérieures et on fait incuber comme précédemment pendant 24 heures. On recueille le mycélium résultant sur un filtre en verre fritté n° 3. On en disperse ensuite 1 g. dans 11,5 ml. de 20 "milieu de suspension" (constitué par le Milieu Minimum + une concentration M de chlorure d'ammonium comme stabilisant osmotique) dans un flacon conique de 100 ml» On ajoute 1 ml. d'enzyme de l'intestin d'escargot (produit par l'Industrie Biologique Française, 35 Quai du Moulin de Cage, Gennevilliers, Paris sous 25 la dénomination "Suc Hélix pomatia Spécial" pour l'hydrolyse des membranes cellulaires). On fait incuber le mélange à 25°C. sur un agitateur alternatif avec une course de 50 mm. et on secoue à raison de 75 coups par minute pendant 2 h.30. On ajoute ensuite 25 ml. du milieu de suspension et on sépare le mycélium résiduel 30 par filtration de la suspension à travers un filtre en verre fritté n° 3, le mycélium retenu étant lavé avec 12,5 ml. de milieu de suspension pour faciliter l'entraînement par lavage des protoplastes. On soumet le filtrat à une centrifugation pendant 10 minutes à 800 ç[ et on remet l'agglomérat de protoplastes ré-35 sultant en suspension, puis on le lave deux fois avec le même milieu. On remet l'agglomérat final en suspension dans 1 ml de milieu de suspension. Pour l'infection, on ajoute 1 ml. du milieu de suspension contenant du virus extrait de Pénicillium chrysogenum A.T.C.C. 40 10002 à une concentration élevée (non mesurée mais d'environ 10^ 72 07361 2128560 particules par ml) à 1 ml. de la suspension de protoplastes» On laisse le mélange d'infection pendant une heure à la température ambiante, en agitant de façon occasionnelle. On effectue des dilutions en série à partir du mélange d'in-5 fection dans de la gélose à titre de milieu de régénération (gélose du milieu complet dilué + concentration M de saccharose comme stabilisant osmotique) qu'on dépose ensuite en couche sur le même milieu dans des boites de Pétri. Gélose de milieu complet dilué 10 Peptone bactériologique (Oxoid Ltd) 0,8 g Extrait de levure (Poudre)(Oxoid Ltd») 0,4 g Hydrolysat de caséine (Acid)(Oxoid Ltd) 0,6 g Dextrose 10,0 g Nitrate de sodium (NaNO^) 6,0 g 15 Chlorure de potassium (KC1) 0,5 g Ortho-phosphate monopotassique (KI^PO^) 1,5 g Sulfate de magnésium (MgSO^oVï^O) 0,5 g 'Gélose Ion" n° 2 (Oxoid Ltd) 10,0 g Eau distillée 1 litre 20 pH ajusté à 6,5 A titre de témoin, on dilue en série une partie du mélange d'infection et on l'étalé en plaques sans le stabilisant osmotique (saccharose)o On fait incuber toutes les boîtes de Pétri à 25° C pour permettre aux protoplastes de se développer 25 en colonies (régénération)o Des colonies apparaissent sur le milieu de régénération simplement 3 à 5 jours après la formation de plaques (aucune colonie n'apparaît sur les fractions témoins). Certaines sont reprises en cultures secondaires et sont utilisées pour inoculer 30 des flacons coniques de 500 rnl contenant 100 ml de milieu de culture liquide, que l'on fait incuber sur l'agitateur orbital pendant 4 jours» Milieu de culture liquide Glycérol 5,0 g 35 Dextrose 5,0 g Tryptone (Oxoid Ltd) 2,5 g Peptone bactériologique (Oxoid Ltd) 2,5 g "Yeatex" (English Grain Co. Ltd) 1,25 g Liqueur de macération de grain (Garton Ltd) 12,5 g 40 Chlorure de sodium (NaCl) 5,0 g 72 07361 12 2128560 Ortho-phosphate dipotassiaue (K„HP04) 1,0 g Eau distillée . 1 litre pH ajusté à 7,0. On soumet la totalité du bouillon de culture de chaque 5 flacon à une désintégration par ultrasons pendant lO minutes dans un désintégrateur fonctionnant sous 100 watts et ayant une sonde vibrante au titane ayant un diamètre à son extrémité de 10 mm environ. On soumet ensuite à une centrifugation dans un rotor coudé fixe, avec une vitesse à la pointe du tube de 10 5.700 g pendant 20 minutes, la couche supérieure résultante étant soumise à une centrifugation dans un rotor coudé fixe avec une vitesse à la pointe du tube de 195.000 g pendant 90 minutes. Les deux centrifugations sont effectuées dans un appareil ultracentrifuge Beckman L2-65B0 On remet l'agglomérat 15 final en suspension dans 2 ml d'une solution à 0,1% d'azothydru-re de sodium et on examine au microscope électronique pour détecter la présence de virus. Parmi 33 colonies en cultures secondaires provenant de protoplastes régénérés, on observe du virus dans 10 colonies0 20 Exemple 4 Infection par un virus de Pénicillium chrysogenum. avec du virus provenant de Pénicillium stoloniferum. On procède comme décrit dans l'exemple 3 en utilisant la même souche de Pénicillium chrysogenum pour préparer les proto-25 plastes et le Pénicillium stoloniferum A.T.C.C. 14.586 pour préparer le virus utilisé pour l'infection. Parmi 12 colonies choisies à partir de protoplastes régénérés, on observe du "virus dans trois colonies. Exemple 5 30 Infection par un virus de Marasmius androsaceus, avec le virus provenant de Pénicillium chrysogenum. On développe une culture de Marasmius androsaceusBRL F168 sur une gélose d'extrait de malt (produite par la Société Oxoid Ltd) dans des boîtes de Pétri pendant une à deux semaines, 35 après quoi le mycélium fongique s'est développé sur la totalité du milieu de gélose. On fait flotter un bloc carré de 20 mm de mycélium + le milieu de gélose sur 50 ml de milieu formé d'extrait de malt liquide (3% d'extrait de malt, provenant de la Société Oxoid Ltd) dans un flacon conique de 500 ml et on fait 40 incuber à la température ambiante saris agitation pendant deux 72 07361 2128560 semaines. On effectue ensuite l'homogénéisation du mycélium dans 100 ml de milieu d'extrait de malt liquide frais pendant 10 secondes, on place l'homogénéisât dans un flacon conique de 500 ml et on fait incuber à 25° C sur un agitateur orbital tel 5 que décrit dans l'exemple 3C Après 3 jours d'incubation, on homogénéise la totalité du bouillon de culture pendant 10 secondes, on en transfère 10 ml dans 100 ml de milieu d'extrait de malt liquide frais dans un flacon conique de 500 ml et on fait incuber comme précédemment pendant un jour0 10 On sépare le mycélium résultant du milieu liquide rési duel par centrifugation sous 1500 g pendant 10 minutes. On disperse environ 1,5 g du mycélium dans 11,5 ml du milieu de suspension (milieu minimum comme décrit dans l'exemple 1 + concentration égale à 0,6 M de chlorure d'ammonium) et on ajoute 1 ml 15 d'enzyme d'intestin d'escargot ("Suc Hélix Pomatia Spécial" pour l'hydrolyse des membranes cellulaires)» On fait incuber le mélange à 25° C sur l'agitateur alternatif décrit dans l'exem pie 3 pendant 2 h 30. On sépare les protoplastes du mycélium de la même manière 20 que dans l'exemple 3, mais en utilisant un filtre en verre fritté n° 1. On les infecte également de la même manière en utilisant du virus dans le milieu minimum contenant 0,6 M de saccharose. On effectue des dilutions en série à partir du mélange 25 d'infection dans de la gélose de milieu de régénération (gélose d'extrait de malt produite par Oxoid Ltd, plus concentration de 0,4 M de saccharose, le milieu étant complété en utilisant une solution tampon de Tris (hydroxyméthyl)amino-méthane 0,2 M à un pH de 5,8), et on étale ensuite ces dilutions en couche sur 30 le même milieu dans des boîtes de Pétri. Comme fraction témoin, on dilue en série une partie du mélange d'infection et on étale en plaques sans stabilisant osmotique (saccharose)» On fait incuber toutes les boites de Pétri à la température ambiante, pour permettre le développement des protoplastes en colonies» 35 Des colonies apparaissent après 5 à 7 jours d'incubation sur le milieu de régénération, et aucune n'apparaît sur le milieu ne contenant pas de saccharose. Certaines des colonies sont reprises en cultures secondaires et utilisées pour inoculer des flacons coniques contenant 100 ml de milieu liquide 40 d'extrait de malt à 3%. On examine ces cultures pour détecter 72 07361 14 2128560 la présence de virus en utilisant la méthode indiquée dans l'Exemple 3= Parmi 12 colonies choisies à partir des protoplastes régénérés, on observe du virus dans 6 colonieso 5 Exemple 6 Infection par un virus de Mucor hiemalis avec du virus provenant de Pénicillium chrysogenum. On développe des cultures de Mucor hiemalis I.M.X. 113.134 sur des plans inclinés de gélose de Sabouraud. 10 Gélose de Sabouraud Peptone bactériologique (Oxoid Ltd) 10 g Dextrose • 40 g Gelose nc 3 (Oxoid Ltd) 20 g Eau distillée 1 litre 15 On met les spores en suspension dans 10 ml d'une solution à 0,01% de Tween 80 (qualité T.B., Atlas Chemical Industries, Inco) et on filtre à travers du coton hydrophile pour éliminer tous les fragments d'hyphes. On inocule 1 ml de la suspension de spores à 100 ml d'un milieu liquide minéraux/urée/dextrose 20 dans un flacon conique de 500 ml. On fait incuber celui-ci pendant 18 heures à 25° C sur l'agitateur orbital décrit dans l'Exemple 3e Milieu liquide Minéraux/Urée/Dextrose Dextrose 40 g 25 Urée 0,6 g Ortho-phosphate dipotassique (K^HPO^) 0,3 g Ortho-phosphate monopotassique (KH2P04) 0,2 g Sulfate de magnésium (MgS04.7H20) 0,2 g Chlorure de sodium (NaCl) 0,1 g 30 Chlorure de calcium (CaCl2.2H20) 0,1 g Sulfate ferreux (FeS04.7H20) 0,015 g Chlorure de zinc (ZnCl2) 0,00025 g Eau distillée . 1 litre On sépare^ le mycélium du milieu liquide résiduel par cen-35 trifugation à 1500 g pendant 10 minutes. On prépare des protoplastes à partir de 2 g du mycélium en utilisant la méthode décrite dans l'exemple 3. L'isolement, l'infection, l'étalement en plaques et l'incubation des protoplastes sont effectués comme décrit dans l'exemple 3. 40 Des colonies apparaissent après 2, 3 et 4 jours d'incuba- 72 07361 15 2128560 tiono On note environ 10 fois plus de colonies sur le milieu de gélose de régénération que sur le milieu de gélose non stabilisé. Sur ce dernier milieu, la majeure partie apparaît après 2 jours. Certaines des colonies apparaissant sur le milieu de 5 gélose de régénération après 3 et 4 jours d'incubation sont reprises en cultures secondaires et utilisées pour inoculer des flacons coniques contenant 0,15 g de carbonate de calcium dans 100 ml de milieu liquide minéraux/urée/dextrose. On examine ces cultures pour détecter la présence de virus par la méthode 10 indiquée dans l'exemple 3. Parmi 12 colonies choisies à partir des couches de suspension de protoplastes infectés, on observe du virus dans une seule colonie0 Exemple 7 15 Infection d'Aspergillus foetidus avec le virus provenant de Pénicillium chrysogenum. On développe les cultures de souches mutantes exigeant de la méthionine d'Aspergillus foetidus A.T.C.C. 10.254 sur des plans inclinés de gélose de Sabouraud. Ensuite, le processus 20 utilisé est le même que celui décrit dans l'exemple 3, sauf qu'on effectue le développement du mycélium en vue de la formation de protoplastes dans des flacons coniques de 500 ml sans pointes. Par ailleurs, on laisse le stade d'enzymation pour la production des protoplastes se poursuivre pendant 4 heures. 25 Parmi 8 colonies choisies à partir de protoplastes régé nérés, on observe le virus dans 3 colonies. Des modifications peuvent être apportées aux modes de mise en oeuvre décrits, dans le domaine des équivalences techniques, sans s'écarter de l'invention. 72 07361 16 2128560 REVENDICATIONS lo- Procédé pour la préparation d'un champignon infecté par un virus formé par un acide ribonucléique à double chaîne, caractérisé en ce qu'on met en contact des protoplastes fongi-5 ques avec des particules virales d'acide ribonucléique à double chaîne d'origine fongique, en infectant ainsi certains au moins des protoplastes par les particules virales, puis on cultive les protoplastes infectés pour produire un champignon qui est infecté par des particules virales d'acide ribonucléique à 10 double chaîne. 2.- Procédé suivant la revendication 1, caractérisé en ce que, après la mise en contact des protoplastes avec les particules virales, on cultive un certain nombre de colonies fongiques séparées, la plus grande partie de ces colonies étant 15 chacune dérivée d'un seul protoplaste, et on poursuit la culture d'une ou plusieurs des colonies résultantes que l'on constate être infectées par les particules virales, pour produire la quantité désirée de champignon infecté» 3o- Procédé suivant la revendication 1 ou 2, caractérisé 20 en ce qu'on amène les protoplastes en contact avec les particules virales dans un milieu aqueux contenant un stabilisant osmotique. 4.- Procédé suivant l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce qu'on amène les particules vi- 25 raies et les protoplastes en contact selon un rapport allant de 10 à 100 particules virales par protoplaste. 5.- Procédé suivant l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce qu'on amène des protoplastes d'une souche d'espèce fongique en contact avec des particules 30 virales provenant d'une souche d'une espèce fongique différen-te0 6.- Procédé suivant l'une quelconque des revendications 1 à 5, caractérisé en ce qu'on amène, des protoplastes d'une souche d'une espèce fongique en contact avec des particules 35 virales provenant d'une souche différente de la même espèce fongiqueo 7.- Procédé suivant l'une quelconque des revendications 1 à 5, caractérisé en ce qu'on amène des protoplastes d'un 72 07361 17 2128560 membre non infecté d'une souche d'une espèce fongique en contact avec des particules virales provenant d'un membre infecté de la même souche de la même espèce fongiqueo