FR 2132271 A1 19721117 FR 7211308 A 19720330 72 11308 î 2132271 La présente invention est relative à un procédé nouveau et industriellement avantageux pour la production de céphalosporineso Plus particulièrement, la présente invention concerne un procédé de production d'une céphalosporine de formule t 10 G NHo S l ^ \ CH - CONH - OH CH 0Ho Ir L W \ yyGCH2"E' C OOH dans laquelle R représente un reste hydrocarboné à noyau hexa-15 gonal ou un reste hétérocyclique à noyau pentagonal et R' représente un atome d'hydrogène ou un radical organique dont la liaison indiquée est celle qui s'étend entre l'atome de carbone du groupe méthylène et un atome d'oxygène, de soufre ou d'azote faisant partie du radical organique, ce procédé comprenant la 20 condensation (1) d'un a-amino-acide a-substitué, de formule NH0 I R - CH - C00H (II) dans laquelle R a la signification donnée ci-dessus, ou bien 25 un dérivé réactif d'un tel acide et (2) d'un dérivé de 7-amia-o-céphem de formule S H~N - CH CH ^ * I l 30 ^ K ^CCH2-R» (III ) Aooh dans laquelle R' a la signification donnée ci-dessus, ce procédé faisant appel à un microorganisme ayant un nouveau type d'activité enzymatique» 35 Jusqu'ici, la production de céphalosporines par une réaction de condensation entre des a-amino-acides a-substitués et des dérivés de 7-aminocéphem. faisait appel à des réactions chimiques. Toutefois, dans ces procédés connus, il 40 faut protéger au préalable le groupe amino des amino-acides pour 72 11308 2 2132271 éviter des réactions secondaires indésirables ou bien convertir au préalable le groupe amino en un radical tel qu'un groupe azide (N^) qui peut être reconverti en groupe amino. Après la réaction de condensation, il est donc nécessaire d'éliminer le 5 groupe protecteur du groupe amino ou bien de reconvertir ce radical en un groupe amino, et ces opérations accessoires doivent être exécutées dans des conditions modérées, de manière qu'elles ne modifient pas des groupes autres que ceux qui sont concernés dans ces réactions, spécialement de manière à ne pas 10 scinder le noyau céphem ou la liaison amide d'acide dans la chaîne latérale en position 7» Ces opérations accessoires diminuent inévitablement le rendement en céphalosporines recherchées. La demanderesse a trouvé de façon inatten-15 due que, parmi les microorganismes du genre Mycoplana, Protami-nobacter, Acetobacter (y compris les genres Gluconobacter« Acetobacter selon "Bergey's Manual of Determinative Bacterio-logy", 7e éd., 1957)» Xanthomonas« Pseudomonas, Aeromonas. Escherichia, Staphylococcus, Arthrobacter, Proteus, Coryne-20 bacterium, glav'obacterium, Clostridium Spirillum et Bacillus il existe un grand nombre de microorganismes possédant un nouveau type d'activité enzymatique, c'est-à-dire ceux qui sont capables de produire tuie céphalosporine (I) à partir d'un a-a-mino-acide a-substitué (II) ou un dérivé réactif d'un tel acide 25 et d'un dérivé de 7-smnocéphem (III), et que la céphalosporine (I) peut être produite régulièrement avec un rendement élevé en soumettant (1) les a-amino-acides a-substitués (II) ou leurs dérivés réactifs et (2) les dérivés de 7-aininocéphem (III) à l'action enzymatique de ces microorganismes. Pour autant que la de-30 manderesse le sache, une réaction de condensation faisant appel à un microbe entre un acide organique ou l'un de ses dérivés réactifs et un dérivé de 7-aminocéphem, pour produire une céphalosporine, n'est pas connue et elle a été mise au point par la demanderesse. 35 Ainsi la présente invention a pour objet un procédé de production de céphalosporines (I) à partir d'a-amino-acides a-substitués (II) ou de leurs dérivés réactifs et de dérivés de 7-amin.océphem (III) , procédé dans lequel on utilise un microbe et qui est nouveau et beaucoup plus avanta-40 geux que les procédés chimiques connus. 72 11308 3 2132271 D'autres caractéristiques et avantages de la présente invention ressortiront au cours de la description qui va suivre» En ce qui concerne la formule (I) ci-des-5 sus, le symbole R représente un reste hydrocarboné à noyau hexagonal ou tin reste hétéro cyclique à noyau pentagonal. En ce qui concerne le reste hydrocarboné à noyau hexagonal, on peut citer les radicaux phényle, cyclohexényle, (c'est-à-dire 1-cy-clohexényle, 2-cyclohexényle et 3-cyclohexényle) ,cyclohexadié-10 nyle (c'est-à-dire 1,3-cyclohexadiényle, 1,4-cyclohexadiényle, 1,5-cycloh.exadiényle et 2,5-cyclohexadiényle) et cyclohexyle» En ce qui concerne le reste hétérocyclique à noyau pentagonal, on peut citer,par exemple, les radicaux thiényle (2-thiényle ou 3-thiényle), furyle, 2-furyle ou 3-furyles etc„ Chacun de ces 15 restes hydrocarbonés et de ces restes hétérocycliques peut comporter un ou plusieurs substituants fixés sur le noyau. Les substituants peuvent être par exemple un groupe hydroxy ou un atome d'halogène (par exemple du brome et du chlore) ou encore l'un des radicaux alkyle (par exemple méthyle, éthyle, isopro-20 pyle, allyle et octyle ; alcoxy (par exemple méthoxy, éthoxy, isopropoxy, allyloxy et hexoxy) ; carbosyle, mercapto, cyano, nitro, sulfo, amino, suifamino, carboxyalkyle (par exemple car-boxyméthyle et carboxyéthyle, etc. Dans la formule (I), R' représente un atome, d'hydrogène ou on radical organique » dont 25 la liaison représentée est celle qui relie l'atome de carbone du groupe méthylène en postion 3 et un atome d'oxygène, de soufre ou d'azote faisant partie du radical organique. En ce qui concerne ce radical organique, on peut citer par exemple les radicaux alcoxy (par exemple méthoxy, éthoxy,isopropoxy, ally-30 loxy et hexoxy), alcoxycarbonyle (par exemple méthoxycarbo-nyle, éthoxycarbonyle, isopropoxycarbonyle, allyloxycarbonyle et hexoxycarbonyle), pyridyle (2-pyridyle et 3-pyridyle), pyridinium (par exemple —x + -. , \ ou -N^ZV- G0m2 } ' 35 l-oxydopyrid-2-yle, méthylthiocarboxy, diméthyldithiocarba-myle, triméthylamino, azido, benzyloxycarbonylamino, etc. En ce qui concerne la formule (II), le symbole R représente l'un des restes hydrocarbonés ou hétérocycliques susmentionnés. Mnsi, l'a-amino-acide a-substitué (II) 40 comprend, entre autres, la phénylglycine, la cyclohexadiènylgly« 72 11308 4 2132271 cine, la cyclohexénylglycine, la cyclohexylglycine, le 2-thiénylglycine, la 2-furylglycine, la p-hycb? oxyphény lgly cine, la p-mercaptophénylglycine, la p-carboxyphénylglycine, la p-sulfo-phénylglycine » la p-aminophénylglycine, la m-aminophénylglycine, 5 la p-nitrophénylglycine, la p-chlorophénylglycine, l'o-chloro-phény lgly cine, la p-bromophénylglycine, la p-méthylphénylglyci-ne, la p-éthylphénylglycine, la p-méthoxyphénylglycine, la p-cyanophénylglycine, la m-cyanophénylglycine, la p-sulfaminophé-nylglycine, etc. Des a-amino-acide3 a-substitués (II) qui por-10 tent deux substituants ou plus de deux substituants identiques ou différents sur leurs noyaux peuvent également être utilisés. En ce qui concerne les substituants fixés sur les noyaux dans ce cas, on peut choisir des combinaisons facultatives des divers substituants mentionnés ci-dessus. Bien qu'il existe quelques 15 composés nouveaux parmi ces a-amino-acides a-substitués (II), on peut facilement les préparer, par exemple, par une réaction de Strecker, à partir d'un aldéhyde comportant les groupes R correspondants. Les dérivés réactifs de ces a-amino-acides 20 a-substitués (II) peuvent être des dérivés quelconques dont la portion carboxylique donne les a-amino-acides a-substitués (II) lors de l'hydrolyse au sein d'un milieu aqueux par le microorganisme utilisé selon la présente invention. Des exemples typiques de dérivés actifs sont les alkyl esters (par exemple les 25 méthyl esters, les éthyl esters, les isopropyl esters et les octyl esters) des «-amino acides a-substitués (II), les aralkyl esters (par exemple benzyl et phénéthyl esters) de ces acides, les thioësters (par exemple thioglycol esters) de ces acides, les amides de ces acides, les dipeptides formés entre ces acides 30 et d'autres amino-acides /""comme la N-(phénylglycyl)glycine etc. Par la suite, l'a-amino-acide a-substitué (II) et ses dérivés réactifs seront tous appelés "dérivés d*a-amino-acides a-substitués^ Il existe des isomères optiques des déri-35 vés d'à-amino-acides a-substitués respectifs et on recommande, au point de vue de l'activité antibactérienne des céphalosporines résultantes (I) d'utiliser les formes D ou D1 en ce qui concerne l'atome de carbone a de ces composés. Le dérivé d'a-amino-acide a-substitué 40 peut être utilisé sous la forme libre ou sous forme de son sel, 72 11308 5 2132271 par exemple sous forme d'un chlorhydrate d'un sel de sodium ou d'un sel de potassium. Le symbole H* dans la formule (III) est un atome d'hydrogène ou bien l'un des radicaux organiques, sus--5 mentionnés. Ainsi, des exemples typiques des dérivés y-a^M-Océ-phem (III) sont l'acide 7-aminocéphalosporanique, l'acide 7-a-mino-3-désacétoxycéphalosporanique, l'acide 7-amino-3-métho-xyméthyl-3-céphem-4-carboxylique, l'acide 7-amino-3-(1-oxydo-pyrid-2-yl thiométhyl)-3-céphem-4— carboxylique, le N-(7-amino-10 3-céphem-3-ylméthyl)pyridinium 4-carboxylate, le N-(7-amino-3-céphem-3-ylméthyl)4~carboxamidopyridinium-4--carboxylate, 1 ' acide 7-amiB-o 3-méthylth.iocarboxyméthyl-3-céphem-4—carboxylique 1' acide 7-ainino-3-triméthyI--aminométhyl-3-céphem-4-carboxyli-que, l'acide 7-amino-3-diméthyldithiocarbamylméthyl-3-céphem-4-15 carboxylique, l'acide 7-ami^o-3-azidométhyl-3-céphem-A—carboxylique , l'acide 7-amino-3-benzyloxycarbonylaminométhyl-3-cé-phem-4-carboxylique, etc. Ces dérivés 7-aminocéphem sont connus et peuvent être préparés pai; des procédés également connus, comme par exemple ceux qui sont décrits dans "Advances in Applied 20 Microbiology", 1^, (1970), pages 163-236» publié par Académie Press, Inc., New York et Londres. On peut utiliser chacun de' ces dérivés 7-e™inocéphem (III) sous forme de l'acide libre ou de sel correspondant, par exemple d'un chlorhydrate, d'un zel de sodium ou d'un sel de potassium. 25 Selon le procédé de la présente invention, on peut utiliser des microorganismes qui appartiennent au genre Mycoplana, Protaminobacter, Acetobacter» Xanthomonas, Pseudomo-nas, Aeromonas, Escherichia. Staphylococcus, Arthrobacter, ProteuB, Corynebacterium, fflavobacterium, Clostridium, Spiril-30 lum ou Bacillus et qui sont capables de produire une céphalosporine de formule (I) à partir d'un dérivé d'à-aminoacide a-substitué et d'un dérivé 7-ami^océphem (III). Ces microorganismes peuvent être choisis parmi les cultures connues qui sont conservées aux endroits connus de dépSts des cultures et peuvent 35 également être isolées d'un milieu naturel, comme par exemple la terre, les eaux d'égouts, l'eau de mer, les fleurs, les fruits et l'atmosphère. Pour choisir les microorganismes possédant une activité de synthèse de la céphalosporine, on peut, par 40 exemple, mettre en suspension chacun des microorganismes à 72 11308 6 2132271 examiner dans "une solution aqueuse (pH 6,0) contenant 10 mg/ml de méthyl ester de D-phénylglycine et 5 mg/ml d'acide 7-&mino-3-désacétoxycéphalosporanique, faire incuber la suspension en secouant à 37°C pendant 30 minutes et déterminer la quantité ;j d'acide 7"*(ûc~amino-D-phénylacétamido)-3- Si un microorganisme choisi comme ci-dessus donne des enzymes indésirables qui agissent sur les cépha-15 losporines recherchées (I) et les convertissent, comme le P— lactamase (II) (céphalosporinase) ou les estérases, il est possible d'obtenir des mutants qui ne produisent pas ces enzymes indésirables en soumettant lesdits microorganismes à un traitement bien connu pour la mutation des microorganismes, 20 comme une irradiation aux rayons X ou aux rayons ultraviolets ou un traitement par la moutarde azotée. Tous les mutants qui sont obtenus d'une façon classique à partir de ces microorganismes choisis et qui possèdent une activité améliorée de synthèse de la céphalospo-25 rine peuvent, bien entendu, être avantageusement utilisés dans la mise en oeuvre de la présente invention. On va donner ci-après une liste partielle des culture s connues déposée à l'organisme "Institute for Fermentation" à Osaka (Japon) et qui peuvent être utilisées 30 dans la mise en oeuvre de la présente invention. Dans-toute la description, les nombres IFO sont les numéros d'accession des microorganismes audit organisme ; Acetobacter acetosus IFO-3296ï Acetobacter albidus IF0-3251, Acetobacter aurantium IFO-324-5, IFO-3249, Acetobacter cerinus IF0-5262, Acetobacter 35 industrius IF0-3260, Acetobacter dioxyacetohicus IFO-3272 , Acetobacter gluconicus IFO-3171, Acetobacter liquefaciens IFO-12388, Acetobacter melanegenus IFO-3293 , Acetobacter oxydans IFO-3189, Acetobacter pasteurianus IFO-3223, Acetobacter suboxydans IFO-513O , Acetobacter turbidans IFO-3225 40 Acetobacter xylinum IFO-3144, IFO-3288, Xanthomonas citri 72 11308 7 2132271 IFO"5835 » IFO-3829, Xanthomonas pruni IF0-3780, Xanthomonas orygae IFO-3995, IFO-3827, IFO-3828, I]?0-3510, Pseudomonas aeruginosa IFO-3454, Pseudomonas maltophila IF0-12690, Pseudomonas melanogenum IF0-12020, Pseudomonas vendrelli 5 IPO-3899 , Aeromonas hydrophila IF0-3820, Arthrobacter simplex IF0-12069 , Arthrobacter oxydans IF0-12138, Proteus mirabilis IF0-3849, Proteus morganii IF0-3848, Corynebacterium tritici IFO-12164, Flavobacterium capsulatum IFO-12533» Glostridium butyricum IF0-3847, Clostridium acetobutyricum IF0-3346 , 10 Staphylococcus aureus IF0-3060, Spirillum metamorphum IF0-12Q12, Bacillus subtilis IFO-3035) Bacillus sphaericus IFO-3526, Bacillus firmus IFO-3330, Bacillus pumilus IF0-12090, Escheri-chia coli IFO 3543 et Escherichia coli var communior IFO-3550. Parmi les souches isolées d'un milieu na-15 turel, on peut citer par exemple les souches Mycoplana, dimorpha IFO-13213, IFO-13240, Mycoplana bullata IF0-13267, Protamino-bacter alborflavus IFO-13221 et Acetobacter sp. IF0-13209. Les microorganismes qui sont capables de produire une céphalosporine (I) à partir d'un dérivé d'a-amino-20 acide a-substitué et d'un dérivé de 7-aminocéphem (IXI) peuvent être choisis parmi les quinze genres susmentionnés» Spécialement, les microorganismes qui donnent des résultats avantageux existent en grand nombre parmi les genres Mycoplana, Protaminobacter Acetobacter, Xanthomonas, Pseudomonas et Aeromonas, ces six 25 genres faisant partie de la famille Pseudomonadaceae . Le genre Escherichia donne aussi de bons résultats. En soumettant (1) un dérivé d'a-amino-a-cide a-substitué et (2) un dérivé de 7-aminocéphem à l'action enzymatique d'un microorganisme de ce genre possédant une telle 30 activité de synthèse de la céphalosporine, il est possible de cultiver ce microorganisme dans un milieu de culture contenant (1) un dérivé d'à-ami no-acide a-substitué et (2) un dérivé de 7-aminocéphem, mais il est généralement recommandé de cultiver au préalable un tel microorganisme dans un milieu de culture or-35 dinaire et d'utiliser le bouillon de culture résultant ou une substance résultant du traitement de ce bouillon de culture. On peut cultiver les microorganismes en aérobie, tout en agitant ou en secouant, ou dans des conditions statiques. En général, la culture dans des conditions aérobies 40 est avantageuse. 72 11308 8 2132271 En ce qui concerne le milieu de culture, on peut utiliser ceux qui contiennent une substance telle qu'un extrait de viande, un extrait de levure, une peptone, un hy-drolysat de caséine, de la liqueur de macération du maïs ou 5 d'autres substances naturelles utilisées pour les cultures d'une manière générale, ou encore une combinaison de ces substances., Ces milieux peuvent facultativement contenir des suppléments tels que des sources de carbone, comme des sucres, des acides organiques, des paraffines normales, des composés 10 minéraux ou organiques contenant de l'azote sous forme aminée et/ou sous forme de nitrate, des phosphates, des sels de manganèse, du chlorure de sodium, d'autres métaux sous la forme d'ions et/ou des vitamines. On ajuste de préférence le milieu de culture à un pH de 6 à 8. Les températures avantageuses 15 pour la culture sont comprises entre 20 et 40°C, spécialement entre 28 et 57°C» Bien que la période de culture varie avec l'appareil utilisé, pour la culture, la composition du milieu, la température de culture et des facteurs analogues, il est recommandé d'arrêter la culture au moment où l'activité de syn-20 thèse de la céphalosporine atteint le maximum, entre le dernier stade de la phase de croissance logarithmique et le plus précoce de la phase stationnaire. Généralement, un temps de culture compris entre 8 et 50 heures donne de bons résultats. Les bouillons de culture ainsi obtenus ou 25 bien leurs substances traitées peuvent être utilisés en vue de la synthèse enzymatique de la céphalosporine (I) dans le procédé de la présente invention. Le terme "substances traitées des bouillons de culture" tel qu'il est utilisé dans le présent exposé et dans les revendications s'applique à toutes les 30 substances préparées en soumettant les bouillons de culture à un ou plusieurs traitements appropriés pour augmenter l'activité de synthèse des céphalosporines et pour les amener à une forme avantageuse en vue de la réaction enzymatique. Par exemple, quand cette activité de synthèse est intracellulaire, la 55 substance traitée peut être constituée par les cellules qui ont été séparées du bouillon de culture, par l'extrait exempt de cellules pouvant être obtenu en soumettant les cellules à un traitement connu, line préparation d'enzymes partiellement ou complètement purifiée , douée d'une activité de synthèse des 40 céphalosporines et qui peut être obtenue en appliquant une 72 11308 9 2132271 technique de purification bien connue dudit extrait exempt de cellules, et la substance douée d'activité de synthèse des céphalosporines qu'on peut obtenir en combinant l'enzyme partiellement ou complètement purifié avec une substance à haut poids 5 moléculaire insoluble dans l'eau par un procédé chimique ou physiqueo Quand l'activité de synthèse est extracellulaire, ce terme implique, le fluide surnageant qui peut être obtenu a-près élimination des cellules du bouillon de culture, l'enzyme totalement ou partiellement purifié doué d'une activité de syn-10 thèse des céphalosporines qu'on peut obtenir en soumettant le fluide surnageant précité à un procédé connu de purification des enzymes, et la substance douée d'une activité de synthèse des céphalosporines résultant de la combinaison de l'enzyme partiellement ou complètement purifié avec une substance à haut 15 poids moléculaire, insoluble dans l'eau, par des procédés physiques ou chimiques» La réaction de condensation entre (1) un dérivé d'a-amino-acide a-substitué et (2) un dérivé de 7-amino-céphem pour obtenir une céphalosporine correspondante (I) pro-20 gresse régulièrement quand les deux composés sont mis en contact avec le bouillon de culture susmentionné ou avec une de ses substances traitées, au sein d'un milieu aqueux,, Par le terme "milieu aqueux" utilisé dans le présent exposé et dans les revendications, on entend liai "milieu comprenant principale-25 ment de l'eau",, Ainsi, le milieu aqueux peut contenir un solvant organique miscible à l'eau comme un alcool inférieur (mé-thanol, éthanol ou isopropanol), l'acétone ou un solvant analogue» La concentration préférée d'un solvant organique de ce genre est inférieure à environ 40 % en volume, de préférence 30 inférieure à environ 20 % en volume, sur la base du volume total du milieu final» On recommande en général d'ajuster le pH du milieu aqueux à une valeur comprise entre environ 4 et 8, plus avantageusement entre environ 5 et 7° Bien que le temps de réaction varie avec la concentration du substrat, le degré 35 d'activité de synthèse des céphalosporines que possède le bouillon de culture ou sa substance traitée, la température ré-actionnelle et des facteurs analogues, elle est généralement comprise entre environ 10 et 300 minutes» La température de réaction peut être avantageusement choisie entre environ 5 et 4o 50°C, mieux encore entre environ 20 et 40°C» La concentration 72 11308 xo 2132271 du substrat peut être choisie principalement en fonction du degré d'activité de synthèse de la céphalosporine. En général, la concentration du dérivé de 7-aminocéphem (III), par rapport au milieu aqueux tout entier, est choisie dans tin intervalle 5 d'environ 0,3 à 10 % (poids/volume), tandis que celle du dérivé d'a-amino-acide a-substitué est choisie entre environ 0,1 et 20 % (poids/volume)„ Avantageusement, le dérivé d'a-amino-acide a-substitué est utilisé en une concentration au moins é-quimolaire, avantageusement non inférieure à 2M, par rapport 10 au dérivé de 7-aminocéphem utiliséo Quand la substance traitée d'un bouillon de culture est insoluble dans l'eau, on peut exécuter la réaction en suspension ou en faisant passer une solution aqueuse contenant le dérivé d'a-amino-acide a-substitué et le dérivé de 15 7-aminocéphem (III) à travers une colonne garnie avec la substance insoluble dans l'eau douée d'une activité de synthèse de la céphalosporine » Grâce à la réaction enzymatique susmentico.-née, la céphalosporine (I) se forme dans le mélange réactionnel. 20 Quand on utilise une forme DL comme dérivé a-amino-acide a-substitué, on observe généralement une tendance à l'introduction d'une quantité prédominante de la forme D du dérivé d'a-amino-acide a-substitué dans la céphalosporine (I). Dans la présente invention, l'indication D ou L jointe aux céphalosporines (I) 25 désigne la forme D ou la forme L en ce qui concerne l'atome de carbone en a dans la chaîne latérale en position 7 de ces composés (l)o La céphalosporine ainsi obtenue (I) peut être facilement récupérée dans un mélange réactionnel et être 30 purifiée dans des conditions modérées par des techniques bien connues, par exemple par chromatographie ou en utilisant un acide organique capable de former un sel insoluble dans l'eau avec la céphalosporine (I). Parmi les caphalosporines (I) ainsi obte-35 nues, se trouvent de nouveaux composés. Plus particulièrement, les nouveaux composés sont les céphalosporines de formule (I) dans laquelle le symbole R représente un radical cyclohexényle (1-cyclohexényle, 2-cyclohexényle ou 3-cyclohexényle), comme l'acide 7-(a-amino-l,-cyclohexénylacétamido)- 3-désacétoxy-40 céphalosporanique, l'acide 7-( 72 11308 ii 2132271 do)~céphalosporanique et l'acide 7-(a-amino=l'-cyclohexéiiyla-cétamido)-3Hniéthoxyméthyl-3-céphem-4-carboxilique. Ces céphalosporines nouvelles sont caractérisées par leur excellente activité antibactérielle et par leur stabilité excellente„ 5 Les céphalosporines (I) ont une activité antibactérienne prononcée vis-à-vis des bactéries grain-positives et gram-négatives. Elles peuvent être facilement absorbées par le petit intestin lors d'une administration par voie buœsle et, lors d'une administration par voie parentérale, 10 elles pénètrent rapidement dans les tissus et ont une affinité satisfaisante pour ces derniers» De ce fait, les céphalosporines (I) sont avantageuses comme agents antibactériens» Les céphalosporines (I) y compris leurs sels avec un acide acceptable en pharmacie (par exemple les 15 sels de sodium et de potassium) et leurs hydrates peuvent être administrées par voie orale ou parentérale, soit telles quelles soit sous une forme appropriée telle qu'une poudre, des granules, des comprimés ou des solutions pour injection, en mélange avec des adjuvants, des diluants ou des supports convenant 20 en pharmacie. On peut les utiliser pour traiter sensiblement les mêmes maladies que celles que peut traiter 1'a-aminoben-zylpénicilline ainsi que les maladies provoquées par Escherichia coli, etc. Bien que la dose des composés (I) à admi-25 nistrer varie selon la nature de ces composés, la sévérité de la maladie, etc0, cette dose est généralement comprise entre 5 et 500 mg/kg/jour, de préférence entre 10 et 200 mg/kg/jour» Les exemples qui suivent sont donnés uniquement pour illustrer des modes de réalisation actuellement 30 préférés de la présente invention et ne limitent aucunement la portée de cette dernière» L'exemple de référence illustre les procédés typiques de préparation du méthyl ester de 1-cyclohexényl-glycine, qui est un nouveau composé formant l'un des dérivés 35 d'a-amino-acides a-substitués utilisés dans les exemples» Dans la totalité du présent exposé, les pourcentages s'entendent en poids par volume, c'est-à-dire en "grammes par décilitre", sauf mention contraire, et les abréviations "IK" , "UV" et "EMN" signifient "infrarouge" , 40 "ultraviolet" et "sensibilité magnétique nucléaire"» 72 11308 la 2132271 Dans tous les exemples qui vont suivre, la bio-autographie ainsi que le titrage biologique des céphalosporines produites selon l'invention sont exécutés selon les techniques classiques dans le cas des céphalosporines, en uti-5 lisant Bacillus subtilis PCI 219, comme décrit dans "Journal of Bacteriology" ^0 , 703.-709 (1945) 5 toutefois, la détermination de l'activité enzymatique des céphalosporines obtenues selon la présente invention a été exécutée en soumettant le mélange réactionnel contenant la céphalosporine concernée à l'ac-10 tion d'un P-lactamase produit par Aerobacter cloaceae (enzyme qui scinde le cycle lactame des céphalosporines (I) mais ne peut pas scinder le cycle lactame des dérivés de 7-amin.o-céphem de départ) et en déterminant la différence d'absorption à 260 mP-avant et après le traitement par un enzyme0 15 Les milieux I à IV utilisés dans les exem ples ont respectivement les compositions suivantes s Milieu I : Bouillon bactérien nutritif, déshydraté disponible dans le commerce, distribué par 20 Difco Laboratories, E.U.A) 0,8 % Glucose 1,0 % NaCl 0,5 % pH 7»0 Milieu II ï 25 Glutamate monosodique 0,5 % Acide phénylacétique 0,3 % Urée . 0,2 % Dihydrogénophosphate de potassium 0,05 % Hydrogénophosphate dipotassique 0,05 % 30 MgS0.o7Hp0 0,1 % PH 7,3 Milieu III ; Glutamate monosodique 0,2 % Extrait de levure 0,2 % 35 Peptone 0,5 % Hydrogénophosphate dipotassique 0,2 % Chlorure de magnésium 0,1 % Fe S04o7H20 0,01 % Saccharose 2,0 % 72 11308 15 2132271 Milieu IV s Extrait de viande 1,0 % Peptone 1,0 % NaCl 0,5 % 5 pH 7,0 Exemple de référence Préparation de la DL-l-cyclohexénylKlycine : Une solution de 4,4 g de 1-cyclohexène-l-aldébyde dans 8 g de méthanol est ajoutée à une solution de 2 g 10 de cyanure de sodium et de 2,56 g de chlorure d'ammonium dans 8 ml d'eau, puis on agite le mélange à la température ambiante pendant 2 heures, après quoi on ajoute 20 ml d'eau» On extrait 1'aminonitrile résultant avec 20 ml de benzène» On extrait la couche benzénique, à trois reprises, en utilisant chaque fois 15 10 ml d'acide chlorhydrique 6N et on soumet la couche aqueuse au reflux pendant 2 heures» On élimine la substance résineuse à l'aide de charbon activé et on concentre le filtrat à environ 15 ml, après on le porte à un pH d'environ 5,0 en ajoutant une solution aqueuse concentrée d'ammoniaque (à 28 %) , ce qui 20 détermine la séparation de cristaux bruts de DL-l-cyclohexényl-glycine» On récupère les cristaux par filtration et on les dissout dans une solution aqueuse IN d'hydroxyde de sodium» On a-joute du charbon activé à la solution et on filtre le mélange» On ajoute de l'éthanol au filtrat (moitié du volume du filtrat) 25 et oi porte le mélange à ébullition, après quoi on ajuste son pH à environ 5,0 avec de l'acide chlorhydrique ce qui donne 1,1 g de DL-1-cyclohexénylglycine en paillettes incolores fondant à 242° - 245°C» Spectre IE (KBr, cm"1) ï 50 5160, 2960, 1605, 1490, 1400, 1545, 1274, 1145, 720» Spectre RMN (solvant : NaOD IN) % 1,5 - 2,4 (multiplet, 8 H) 5,81 (singulet, 1H,~ CH - COOH) 5,84 (multiplet, 1H , -CH « C-) 55 Préparation du méthyl ester de DL-l-eyclohexénylKlycine On met en suspension 10 g de DL-l-cyclo-hexénylglycine dans 100 ml de méthanol» Tout en refroidissant la suspension résultante à environ -15°C, on y introduit goutte à goutte 80 g de chlorure de thionyle» Après l'addition du chlo-40 rure de thionyle, on laisse le mélange à 4°C pendant 5 jours,, 72 11308 14 2132271 On concentre le mélange sous pression réduite et on cristallise le résidu résultant dans 20 ml d'un mélange de méthanol et d'éther diéthylique (mélange 1:1 en volume), ce qui donne environ 10 g de méthyl ester de DL-l-cyclohexénylglycine<> 5 BMN dans I^O) » d^(™®.p) ° 1»7 (4 protons sur les atomes de C en positions 4 et 5 du cycle), 2,05** (4 protons sur les atomes de carbone en position g 2 et 6 du cycle), 3,92 (3 protons du groupe ✓ S méthyle), 4,54 (1 proton sur le carbone a) B 10 6,21 (1 proton sur le carbone oléfinique du cycle)» Nota : S : singulet B : large Préparation du méthyl ester de P-l-cyclohexénylKlycine 15 A une solution de 10 g de chlorhydrate de méthyl ester de DL-1-cyclohexénylglycine dans 1000 ml d'eau, ajustée au pH 7»2 par addition d'hydroxyde de sodium 2N, on ajoute 1 g de chymotrypsine disponible dans le commerce ("a-chymotrypsin3S vendue par Sigma Chemical Company, Missouri, 20 E0U.A0 ; activité de chymotrypsine : 50 unités/mg). On fait incuber le mélange à 23°C pendant 2 heures tout en ajustant son pH à 7,2 par addition d'hydroxyde de sodium IN. Après avoir ajusté le pH à 8,0 par addition d'hydroxyde de sodium 5N, on extrait le mélange de réac-25 tion à sept reprises en utilisant chaque fois 1300 ml d'éther diéthylique. On fait évaporer à siccité la couche d'éther diéthylique résultante, à 25°C sous pression réduite, ce qui laisse un résidu huileux brun. On ajoute au résidu 100 ml de méthanol saturé de HC1 et on concentre le mélange sous pression 30 réduite. On introduit goutte à goutte dans le résidu ainsi obtenu 30 ml d'éther diéthylique et on concentre le mélange, ce qui donne 3s5 ml de méthyl ester de D-1-cyclohexénylglycine. PS Son pouvoir rotatoire spécifique est „ -115e, - 0,5, HC1 0,1N) . Son spectre EMN est identique à celui du 35 méthyl ester de DL-l-cyclohexénylglycine. Exemple 1 Les cultures inclinées de 3 jours des microorganismes mentionnés dans le tableau ci-dessous sont respectivement inoculées dans trois fioles contenant 30 ml de milieu 40 I chacune, et on cultive en secouant à 28°C pendant 20 heures, 72 11308 15 2132271 après quoi on récolte les cellules par centrigugation» On lave les cellules avec 30 ml d'une solution tampon au phosphate 0,05 M à pïï 6,0 et on les met en suspension dans 3 ml de cette solution tampon » On ajoute à chacune des suspensions 3 ml 5 d'une solution aqueuse 0,1N de K^HPO^ contenant 4 % de méthyl ester de phénylglycine (1) et 2 % d'acide 7-aminocéphalospho-ranique (a) ou 7-amino-3-désacétoxycéphalosporanique ("b) ou 7-amin0"3~méth0xyméthyl'- 3"Cé?hem-4-carboxylique (c) , la solution ayant été ajustée à pH 6,0 avec HC1 2N. On incube cha-10 cun des mélanges en secouant à 37°C pendant 40 minutes» la céphalosporine accumulée dans chacun des mélanges réactionnels est identifiée par bio-autographie et titrage biologique» Les résultats sont donnés dans le tableau 1 ci-dessous» 15 TABLEAU 1 Quantité de céphalospori-Microorganisme ne accumulée (mg/ml) Mycoplana dimorpha 20 Mycoplana bullata Protami nobacter alboflavus Acetobacter acetosus Acetobacter albidus Acetobacter aurantium 25 Acetobacter aurantium Acetobacter cerinus Acetobacter industrius Acetobacter dioxyacetonicus IFO-3272 Acetobacter gluconicus 30 Acetobacter liquefaciens Acetobacter melanogenus Acetobacter oxydans Acetobacter pasteurianus Acetobacter suboxydans Acetobacter turbidans Acetobacter xylinum Acetobacter xylinum Xanthomonas citri Xanthomonas pruni 40 Xanthomonas oryzae A B G IFO-13213 2,1 1,8 1,5 IFO-13267 0,6 0,1 0,2 IPO-13221 6,5 2,3 3,6 IP0-3296 1,3 0,1 1,1 IFO-3251 0,4 0,4 H O IFO-3245 6,8 0,8 . 3,5 IFO-3249 7,4 1,2 2,5 IFO-3262 0,9 0,4 0,3 IF0-3260 0,5 0,4 0,2 IPO-3272 0,6 0,4 0,2 IFO-3171 0,3 0,2 0,1 IFO-12388 0,5 0,2 0,4 IFO-3293 2,2 1,1 0,8 IFO-3189 1,0 1,1 0,5 IFO-3223 8,2 4,1 4,0 IFO-313O 1,8 1,0 0,5 110-3225 6,5 5,2 4,8 IFO-3144 8,2 4,5 2,8 IFO-3288 8,0 4,0 4,0 IFO-3835 6,8 2,9 2,2 IF0-3780 4,8 2,5 2,4 IFO-3995 8,0 8,2 3,0 72 11308 16 2132271 ' Pseudomonas aeruscinosa IFO- -3454 0,2 0,4 0,5 Pseudomonas maltophila IFO- -12690 2,0 1,0 1,2 Pseudomonas melanoerenum IFO. -12020 3,1 0,4 1,0 Pseudomonas vendrelli IFO- -3899 0,2 0,4 0,3 Aeromonas hydrophila H *1 O -3820 0,1 0,1 H * O Nota : A : Acide 7-(a-aminophénylacétamido)céphalosporanique obtenu à partir de 1 et de A : B : Acide 7-(a -aminoph.énylacétamido)-3-désacétoxycéphalos-poranique obtenu à partir de 1 et de B C : Acide 7-(c* -aminophénylacétamido)-3-méthoxyméthyl-3-céphem-4-carboxylique, obtenu à partir de 1 et de C 15 Exemple 2 A l'aide d'une anse en platine, on prélève des cultures inclinées de 3 jours des microorganismes mentionnés dans le tableau 2 ci-dessous et on les inocule dans 20 ml du milieu donné dans le tableau 2, après quoi on cultive tout en secouant à 28°C pendant 24 heures. On inocule chacune des cultures résultantes dans 20 500 ml du même milieu que ci-dessous et on cultive en secouant à 28°C pendant 20 heures, après quoi on recueille les cellules par centrifugation. On lave les cellules avec 500 ml d'une solution tampon au phosphate 0^05 M à pH 6,0 et on les met en suspension dans 50 ml de ladite solution tampon. On ajoute à chacune des sus- -25 pensions 50 ml d'une solution aqueuse 0,1N de KgHPO^ contenant 4 $ de méthyl ester de phénylglycine (l) et 2 ^ d'acide 7-aminocéphalos-poranique (a), la solution ayant été ajustée à pH 6,0 avec HC1 2N. • • On fait incuber chacun des mélanges en secouant à 37°C pendant 30 minutes. Après titrage biologique et bioautographie, on cons-30 tate que l'acide 7-(* -aminophénylacétamido)céphalosporanique (A) est accumulé dans chacun des mélanges réactionnels. Les résultats sont donnés dans le tableau 2 ci-dessous : 35 TABLEAU 2 Milieu de cul- Quantité accumu- Microorganisme ture du micro- lée de A organisme (mg/ml) Xanthomonas oryzae IFO-3995 Milieu X 8,8 Escherichia coli IFO-3543 Milieu II 3,5 copy / 72 11308 17 2132271 Escherichia coli var commuaior IEO-3550 Milieu III 4,3 Staphylococcus aureus I3T0-3060 Milieu I 1,5 5 Exemple 5 Avec une anse de platine, on prélève une culture inclinée de 3 jours d'Acetobacter pasteurianus IEO-3223 qu'on inocule dans 20 ml du milieu I et on cultive en secouant à 28°C pendant 1 jour» On inocule la culture ré-10 sultante dans 500 ml de milieu I et on cultive en secouant à 28°C pendant 20 heures. On recueille les cellules par centri-fugation et on les lave avec 500 ml d'une solution tampon au phosphate 0,05M à pH 6,0» On met les cellules lavées en suspension dans 50 ml de ladite solution tampon* On ajoute à la 15 suspension résultante 50 ml d'une solution aqueuse 0,1N de K~HP0 contenant 4 °/o d'éthyl ester de phénylglycine (2) et 2 % d'acide 7-amino-3-désacétoxycéphalosporanique (b) la solution ayant été ajustée au pH 6,0 avec HC1 2N» On fait incuber le mélange en secouant à 37°C pendant 30 minutes» 20 Après bio-autographie et titrage bio logique, on constate qu'une quantité de 6,8 mg/ml d'acide 7-(a-aminop hénylacét amido)-3-dé sac ét oxyc éphalo spor anique (B) s'est accumulée dans le mélange réactionnel» Exemple 4 25 Avec taxe anse en platine, on prélève des cultures inclinées de 3 jours d'Acetobacter turbidans I3P0-3225 et d'Acetobacter aurantium 110-3245 et on les inocule dans 20 ml de milieu I, après quoi on cultive avec secousses à 28°C pendant 1 jour» On inocule les cultures respectives dans 500 ml 30 de milieu I et on cultive en secouant à 28°C pendant 20 heures» On recueille les cellules par centrifugation et on les lave avec 500 ml d'une solution tampon au phosphate 0,05 M à pH 6,0» On met les cellules lavées en suspension dans 50 ml de ladite solution tampon» On ajoute à chacune des suspensions résultan-35 tes 50ml d'une solution aqueuse 0,1 S de K^HPO^ contenant 4 % de l'alkyl ester de phénylglycine mentionné dans le tableau 3 et 2 % d'acide 7-amino-3-désacétoxycéphalosporanique (b), la solution ayant été ajustée à pH 6,0 avec HC1.2N. On fait incuber le mélange en secouant à 37°0 pendant 50 minutes. 40 Comme le montrent la bio-autographie COPY 72 11308 18 2132271 10 15 carboxylique (C) accumulé dans le mélange réactionnel est identifié par bio-autographie et par titrage biologique. Les résultats sont donnés dans le tableau 3 : TABLEAU 3 Microorgani sme Sg&gïïJ' Acetobacter turbidans IF0-3225 Méthyl ester 5,8 Acetobacter aurantium IFO-3245 Ethyl ester 4,8 Exemple 5 On inocule les cultures inclinées de 3 jours des microorganismes mentionnés dans le tableau 4 ci-dessous dans trois fioles contenant 30 ml chacune de milieu I et on cultive en secouant à 28°C pendant 20 heures. On récolte les cellules par centrifugation, on les lave avec 30 ml d'une solution tampon au phosphate 0,05 M à pH 6,0 et on les met en suspension dans 3 ml de ladite solution tampon. On ajoute à chacune des suspensions 3 ml d'unoéolution aqueuse 0,UJ de K^HPO^ contenant 4 % de méthyl ester de 4-hydroxyphénylglycine (3) et 2 % d'acide 7-aminocéphalosporanique (a) ou d'acide 7-amino-3-désacétoxycéphalosporanique (b) ou d'acide 7-amino-3-méthoxymé* thyl-3-céphem-4-carboxylique (c), la solution ayant été ajustée au pH 6,0 avec HCÏ02Jf« On fait incuber chacun des mélanges tout 25 en secouant à 37°C pendant 30 minutes. La céphalosporine accumulée dans chacun des mélanges réactionnels est identifiée par bio-autographie et titrage biologique. Les résultats sont donnés dans le tableau 4 ci-dessous» TABLEAU 4 Quantité accumulée de cé-Microorganisme phalosporine (mg/ml') 20 30 35 D E F Acetobacter pasteurianus i H 1 *i 1 O 1 -3223 0,8 0,5 0 ,6 Acetobacter turbidans IFO. -3225 0,7 0,7 0 ,6 Xanthomonas citri IFO- -3835 1,2 1,4- 1 ,0 Mycoplana dimorpha H O -13240 0,9 0,5 0 ,8 Pseudomonas maltophila IFO. -12690 0,7 0,4 0 ,6 40 Nota : D = Acide 7 a- amino -a- (4-hydr oxyphény l)ac é t amido7 72 11308 19 2132271 céphalosporanique produit à partir de 3 et a, E = Acide 7"/"a-amino-a~(4-hydroxyphényl)acétamido/-3-désacétoxycéphalosporanique produit à partir de 3 et b, ^ F = Acide 7-/" a-amino«-a-(4~hydroxyphényl)acétamido7-3- méthoxy-méthyl-3-c éphem-4-c arb oxylique produit à partir de 3 et c. Exemple 6 On inocule les cultures inclinées de 3 jours de chacun des microorganismes mentionnés dans le tableau 5 ci-dessous dans trois fioles contenant chacune 30 ml de milieu I et on cultive en secouant à 28°C pendant 20 heures, après quoi on recueille les cellules par centrifugation. On lave les cellules avec 30 ml d'une solution tampon au phosphate 15 0,05M à pH 6,0 et on les met en suspension dans 3 ml de ladite solution tampon. a chacune des suspensions, on ajoute 3 ml d'une solution aqueuse 0,IN de K^HPO^ contenant 4 % de méthyl ester de 355-dichloro-4-hydroxyphéiiylglycine (4) et 2 % d'acide 7-aminocéphalosporanique (a) , 7~amino-3-désacétoxycéphalospo-20 ranique (b) ou 7-amino-3-méthoxyméthyl-3-céphem-4-carboxylique (c) , la solution ayant été ajustée à pH 6,0 avec H01 2N. On fait incuber chacun des mélanges en secouant à 37°G pendant 40 minutes. On identifie la céphalosporine accumulée dans chacun des mélanges réactionnels par bib-aatographie et par titrage 25 biologique» Les résultats sont donnés dans le tableau 5 ci-dessous. TABLEAU 3 M. Quantité accumulée de cé~ Microorganisme phalosporine (mg/ml) 30 35 G H I 0,1 0,1 1 O 1 •• I H 1 0,1 H ** O O s» H 0,2 0,1 0,2 0,1 H O 0,1 Acetobacter xylinum IïO-3144 Acetobacter aurantium II,0-3245 Xanthomonas oryzae IF0-3995 Mycoplana dimorpha IF0-13240 Nota : G : Acide 7-/"a-amino-a-(3»5- -acétamido/céphalosporanique produit à partir de 4 et a, 40 H : Acide 7-£a-amino-a-(3,5-dichloro-4-hydroxyphényl) 72 11308 20 2132271 acétamido7-3-désacétoxycéphalosporanique produit à partir de 4 et "b, I : Acide 7-Z~a -amino-a-(3,5-dichloro-4-hydroxyphényl)-acéta-mido7-3-méthoxyméthyl-3-céphem-4-carboxylique 5 produit à partir de 4 et c» Exemple 7 Les cultures inclinées de 3 jours de microorganismes mentionnés dans le tableau 6 ci-dessous sont inoculées respectivement dans trois fioles contenant chacune 30 ml 10 de milieu I et on cultive en secouant à 28°C pendant 20 heures, après quoi on recueille les cellules par centrifugation. On lavé les cellules avec 30 ml' d'une solution tampon au phosphate 0,05M à pH 6,0 et on les met en suspension dans 3 ml d'une solution aqueuse 0,M de K^HPO^ contenant 4 % de méthyl ester 15 de 1-cyclohexénylglycine (5) et 2 % d'acide 7-aminocéphalosporanique (a), 7-amino-3-désacétoxycéphalosporanique ("b) ou 7-a-mino-3-méthoxyméthyl-3-céphem-4-carboxylique (c), la solution ayant été ajustée à pH 6,0 avec HG1 2N. On fait incuber chacun des mélanges en secouant à 37°C pendant 30 minutes. On i-20 dentifie la céphalosporine accumulée dans chacun des mélanges réactionnels par bio-autographie et par titrage biologique. Les résultats sont donnés dans le tableau 6. TABLEAU 6. 25 Quantité accumulée de cé- Microorganisme phalosporine (mg/ml) J KL Acetobacter xylinum IFO- ro 00 00 1,3 1,6 0,8 Acetobacter pasteurianus IFO- -3223 6,8 4,6 5,2 Acetobacter turbidans IFO- -3225 7,2 4,4 4,0 Acetobacter aurantium IFO- -3245 2,1 0,8 1,1 Pseudomonas melanogenum IFO- -12020 2,3 2,5 1,5 Pseudomonas maltophila IFO- -12690 0,9 1,2 0,7 Xanthomonas oryzae IFO- -3995 7,5 7,2 7,0 Mycoplana dimorpha IFO- -13213 1,4 2,0 1,2 Nota : J » Acide 7-(a- amino- -1*-cyclohexénylacétamido)cépha' losporanique produit à partir de 5 et a» K = Acide 7-(a— amino-1*-cyclohexénylacétamido)-3- 12 11308 21 2132271 désacétoxycéphalosporanique produit à partir de 5 et b, L = Acide 7-Co^.-aIIlino-l, -cyclohexénylacétamido)-3-méthoxy-méthyl-3-céghem-4-carboxylique produit à partir de 5 5 et c» Exemple 8 Avec une anse de platine, on prélève une culture inclinée de 3 jours d'Acetobacter pasteurianus IFO-3223 qu'on inocule dans 20 ml de milieu I et on cultive en se-10 couant à 28°C pendant 1 jour» On inocule la culture résultante dans 500 ml de milieu I et on cultive en secouant à 28°C pendant 20 heures. On recueille lès cellules par centrifugation, on les lave avec 500 ml d'une solution tampon au phosphate 0,05 M à pH 6,0 et on les met en suspension dans 50 ml de la-15 dite solution tampon. On ajoute à la suspension résultante 50 ml d'une solution aqueuse 0,1N de E^KPO^ contenant 4 % de méthyl ester de 1-cyclohexénylglycine (5) et 2 % d'acide 7-aminocéphalosporanique (a), la solution ayant été ajustée à pH 6-,0 avec HC1 2N. On incube le mélange en secouant à 37°C pendant 20 30 minutes. La bio-autographie et le titrage biologique montrent qu'une quantité de 8,5 mg/ml d'acide 7-(a-amino-l'-cyclohexényl-acétamido)céphalosporanique (J) s'est accumulée dans le milieu réactionnel» Le produit J donne une valeur Rf de 0,83. par chro-matographie sur couche mince de gel de.silice, quand on .eff ec-25 tue le développement avec une solution aqueuse à 70 % d'éthanol. Exemple 9 A l'aide d'une anse de platine, on inocule une culture inclinée de 3 jours de Xanthomonas citri IF0-3835 dans 20ml de milieu I et on cultive à 28°C pendant 1 jour. On 30 inocule la culture résultante dans 200 ml de milieu I et on cultive à 28°C pendant 20 heures. On recueille les cellules par centrifugation, on les lave avec 200 ml d'une solution tampon au phosphate 0,05M à pH 6,0 et on les met en suspension dans 100 ml de ladite solution tampon. On ajoute à la suspen-35 sion 100 ml d'une solution aqueuse 0,1 I de K^HPO^ contenant 4- % de thioglycoi ester de 1-cyclohexénylglycine (6) et 2 % d'acide 7-aminocéphalosporanique (a), la solution ayant été ajustée à pH 6,0 avec HC1 2ÎT. On fait incuber le mélange en secouant à 37°0 pendant 30 minutes, La bio-autographie biochimi-40 que et le titrage biologique montrent qu'une quantité de 72 11308 2132271 6,6 mg/ml d'acide 7-(ot-amirLo-l'-cyclohexénylacétamido)céphalos-poranique (J) s'est accumulée dans le mélange réactionnel. Exemple 10 A l'aide d'une anse de platine, on prélève 5 des cultures inclinées de 3 jours de Pseudomonas melanogenum IF0-12020 et d'Acetobacter turbidans 110-3225 et on inocule dans 20 ml de milieu I, puis on cultive en secouant à 28°C pendant 1 jour. On inocule les cul tiare s respectives dans 500 ml de milieu I et on cultive en secouant à 28°C pendant 20 heures. 10 On recueille les cellules par centrifugation, on les lave avec 500 ml d'une solution tampon au phosphate 0,05 fî à pH 6,0 et on les met en suspension dans 50ml de ladite solution tampon. On ajoute à chacune des suspensions résultantes 50 ml d'une solution aqueuse 0,1 N de Eg-^O^ contenant 4 % d'alkyl ester de 1-15 cyclohénylglycine mentionné dans le tableau 7 ci-dessous et 2 % d'acide 7-amino-3-désacétoxycéphalosporanique (b), la solution ayant été ajustée à pH 6,0 avec HC1 2N. On fait incuber les mélanges en secouant à 37°C pendant 30 minutes. L'acide 7-(«-amino-l,~cyclohexénylacétamido)-3-désacétoxycéphalosporanique 20 (K) accumulé dans les mélanges de réaction est identifié par bio-autographie et par titrage biologique. Les résultats sont donnés dans le tableau 7 ci-dessous. TABLEAU 7 25 Alkyl ester de Quantité m- 1-cyclohexényl- accumulée Mxoroorganiame glycine de E («g/ml) Pseudomonas melanogenum IF0-12020 Ethyl ester 3,5 30 Acetobacter turbidans IFO-3325 Méthyl ester 4,2 Le produit donne une valeur Rf de 0,77 sur une couche mince de gel de silice après développement avec une 35 solution aqueuse à 70 % d'éthanol. Exemple 11 Avec une anse de platine, on prélève les cultures inclinées respectives de 3 jours d'Acetobacter aurantium IF0-3245 et de Xanthomonas oryzae IFO-3995 à l'aide d'u-40 ne anse de platine et on lés inocule dans 20 ml de milieu I, 72 11308 23 2132271 après quoi on cultive en secouant à 28°C pendant 1 jour. On inocule les cultures respectives dans 500 ml de milieu I et on cultive en secouant à 28°G pondant 20 heures. On recueille les cellules par centrifugation, on les lave avec 500 5 ml d'une solution tampon au phosphate 0,05 M à pH 6,0 et on les met en suspension dans 50 ml de ladite solution tampon. On ajoute à chacune des suspensions résultantes 50 ml d'une solution aqueuse 0,1N de KgHPO^ contenant 4 % de méthyl ester de 1-cyclohexénylglycine (5) et 2 % d'acide 7-amino-3-métho-10 xyméthyl-3-céphem-4—carboxylique (c), la solutionnant été ajustée à pH 6,0 avec HC1 2PT. On fait incuber les mélanges en secouant à 37°C pendant 30 minutes. On identifie l'acide 7-(a-amino-11-cyclohexénylacétamido)-3-méthoxyméthyl-3-céphem-4-carboxylique (L) accumulé dans les mélanges réactionnels par 15 bio-autographie et titrage biologique. les résultats sont donnés dans le tableau 8 ci-dessous. TABLEAU 8 Quantité accumu- 20 Microorganisme lée de L (mg/ml) Acetobacter aurantium IFO-3245 5,8 Xanthomonas oryzae IFO-3995 8,2 Le produit L donne une valeur Rf de 0,85 25 sur une couche mince de gel de silice après développement à l'aide d'une solution aqueuse à 70 % d'éthanol. Exemple 12 On inocule les cultures inclinées respectives de 3 jours des microorganismes mentionnés dans le tableau 50 9 ci-dessous dans trois fioles contenant chacune 50 ml de milieu I et on cultive en secouant à 28°C pendant 20 heures, après quoi on recueille les cellules par centrifugation. On lave les cellules avec 30 ml d'une solution tampon au phosphate 0,05 M à pH 6,0 et on les met en suspension dans 3 ml d'une solution 35 aqueuse 0,1 N de contenant 4 % d'éthyl ester de cyclo- hexylglycine (7) et 2 % d'acide 7-aminocéphalosporanique (a) s 7-amino-5-désacétoxycéphalosporanique _(b) . ou 7r-amino-3-r mé thoxy-mé thy1-3-c éphem-4-c arboxyii qué (c), là ' solution ayant été ajustée à pH 6,0 avec HC1 2N. On fait incuber chacun des mélanges en secouant à 57°C pendant 30 minutes. 40 On identifie la céphalosporine accumulée dans chacun des mélan 72 11308 2132271 10 15 20 25 ges réactioimels par "bio-autographie et titrage "biologique. Les résultats sont donnés dans le tableau 9 ci-dessous. TABLEAU 9 Quantité accumulée de cé-Microorganisme phalosporine (mg/ml) M N 0 Acetobacter xylinum IFO- -3144 1 ,8 0,7 1,1 Acetobacter turbidans IFO- -3225 3*5 2,2 1,5 Acetobacter pasteurianus H te) O > -3223 2 >8 2,1 1,8 Pseudomonas melanogenum o PH H -12020 0 ,9 0,8 1,0 Pseudomonas maltophila O PH H -12690 0 ,5 0,4 0,8 Xanthomonas citri O H -3835 1 ,8 0,3 o,9 Xanthomonas oryzae IFO- -3995 4 ,6 3,5 4,2 Mycoplana dimorpha l o H -13215 1 ,0 0,3 0,8 Nota s M « Acide 7-(cc-aminocyclohexylacétamido)céphalospora- nique produit à partir de 7 et a N = Acide 7-(a-aminocyclohexylacétamido)-3-désacéto-xycéphalosporanique produit à partir de 7 et b 0 = Acide 7-(a-aminocyclohexylacétamido)-3-méthoxy-méthyl-3-céphem-4-carboxylique produit à partir de 7 et c. Exemple 15 On prélève avec une anse de platine les cultures inclinées de 3 jours des microorganismes mentionnés dans le tableau 10 et on les inocule dans 20ml de milieu I, jq puis on cultive en secouant à 28°C pendant 1 jour. On inocule chacune des cultures résultantes dans 500 ml de milieu I et on cultive en secouant à 28°C pendant 20 heures.On recueille les cellules par centrifugation,on les lave avec 500 ml d'une solution tampon au phosphate 0,05 M à pH 6,0 et on les met en sus-yj pension dans 50 ml de ladite solution tampon.A chacune des suspensions résultantes, on ajoute 50 ml d'une solution aqueuse 0,1 N de K^H-PO^ contenant 4 % d'un alkyl ester de cyclohexylgly-cine mentionné dans le tableau 10 et 2% d'un dérivé de 7-amino-céphem mentionné dans le même tableau,la solution ayant été I 72 11308 2132271 10 15 ajustée à pH 6,0 avec HC1 2N. On fait incuber chacun, des mélanges en secouant à 37°C pendant 30 minutes. On identifie la céphalosporine accumulée dans chacun des mélanges réactionnels par bio-autographie et titrage biologique. Les résultats sont donnés dans le tableau 10 ci-dessous. Microorganisme Acetobacter turbidans 110-3225 Xanthomonas oryzae 110-3995 Pseudomonas melanogenum 110-12020 TABLEAU 10 Alkyl ester de cyclohexylgly-cine Dérivé de 7-aminocé-phem Céphalosporine accumulée Ethyl ester (a) Méthyl ester (b) Méthyl ester (c) 3,4 mg/ml de M 5,2 mg/ml de N 1,8 mg/ml de O 20 Nota : (a) = Acide 7-aminocéphalosporanique (b) a Acide 7-amino-3-désacétoxycéphalosporanique (c) « Acide 7-amino-3-méthoxyméthyl-3-céphem-4- carboxylique M » Acide 7-(a-aminocyclohexylacétamido)céphalos-25 poranique N » Acide 7-(cc-aminocyclohexylacétamido)-3-désa- cétoxycéphalosporanique 0 = Acide 7-(a-aminocyclohexylacétamido)-3-niêtho-xyméthy1-3-c éphem-4-c arb oxylique 30 Exemple 14 A l'aide d'une anse de platine, on prélève des cultures inclinées de 3 jours de chacun des microorganismes mentionnés dans le tableau 11 ci-dessous et on les inocule dans 35 30 ml de milieu I, puis on cultive en secouant à 28°C pendant 20 heures, recueille les cellules par centrifugation, on les lave avec 30 ml d'une solution tampon au phosphate 0,05 M à pH 6,0 et on les met en suspension dans 3ml de ladite solution tampon. On ajoute à chacune des suspensions 3 ml d'une sô-40 lution aqueuse 0,1 N de KgHPO^ contenant 0,4 % de méthyl ester 72 11308 26 2132271 10 15 20 de phénylglycine (1) et 0,2 % d'acide 7-aminocéphalosporanioue (a), la solution ayant été ajustée à pH 6,0 avec HC1 2N» On fait incuber chacun des mélanges en secouant à 37°C pendant 30 minutes. L'acide 7-(a-aminophénylacétamido)céphalosporani-que accumulé dans les mélanges réactionnels est identifié par bio-autographie et par titrage biologique. Les résultats sont donnés dans le tableau 11 ci- dessous o TABLEAU 11 Microorganisme 25 Quantité accumulée de A (mg/ml) Arthrobacter simplex IF0-12069 0,05 Arthrobacter oxydans IFO-12138 0,02 Proteus mirabilis IFO-3849 0,02 Proteus morganii IFO-3848 0,02 Corynebacterium tritici IFO-12164 0,03 Flavobacterium capsulatum IFO-I2553 0,04 Clostridium butyricum IFO-3847 0,05 Clostridium acetobutyricum IFO-3346 0,04 Spirillum metamorphum IFO-12012 0,03 Bacillus subtilis IFO-5035 0,03 Bacillus sphaericus IFO-3526 0,04 Bacillus firmus IFO-335O 0,02 Bacïillus pumilus IFO-12090 0,04 30 55 40 Exemple 15 Avec une anse de platine, on prélève les cultures inclinées respectives de 3 jours des microorganismes mentionnés dans le tableau 12 ci-dessous et on les inocule dans 30 ml de milieu I, puis on cultive en secouant à 28°C pendant 20 heures» On recueille les cellules par centrifugation» On lave les cellules avec 500 ml d'une solution tampon au phosphate 0,05 M à pH 6,0 et on les met en suspension dans 15 ml de ladite solution tampon., A chacune des suspensions, on ajoute 15 ml d'une solution aqueuse 0,1 N de K^HPO^ contenant 4 % de méthyl ester de phénylglycine (1) et 2 % d'acide 7-amino-3-(l-oxydopyrid-2-ylthiométhyl)-3-céphem-4-carboxylique (d), la solution ayant été ajustée à pH 6,0 avec HC1 2N. On fait incuber chaque mélange en secouant à 37°C,pendant 30 minutes» On identifie l'acide 7-( 72 11308 2V 2132271 xydopyrid-2-ylthiométhyl)-3-céphem-4—carboxylique (P) accumulé dans les mélanges réactionnels par bio-autographie et titrage "biochimique. Les résultats sont donnés dans 5 le tableau 12 ci-dessous» TABLEAU 12 Microorganisme ** 10 15 20 30 Acetobacter pasteurianus IF0-3223 4,4 Acetobacter turbidans IFO- -3225 3,5 Acetobacter aurantium IFO- -3245 2,4 Pseudomonas maltophila IFO- -12690 5,4 Pseudomonas melanoRenum IFO- -12020 8,8 Xanthomonas citri IFO- =3829 7,9 Xanthomonas oryzae IFO- -3827 8,6 Protaminobacter alboflavus IFO- -13221 5,5 Mycoplana dimorpha IFO- -13213 2,1 Exemple 16 À l'aide d'une anse de platine, on prélève les cultures inclinées de 3 jours de Pseudomonas melanogenum IF0-12020 et Protaminobacter alboflavus IF0-13221 et on les inocule dans 20 ml de milieu I, puis on cultive en secouant 2^ à 28°C pendant 1 jour» On inocule chacune des cultures résultantes dans 500 ml de milieu I et on les cultive en secouant à 28°0 pendant 20 heures» On recueille les cellules par centrifugation et on les lave avec 500 ml d'une solution tampon au phosphate 0,05 M à pH 6,0» Ensuite, on met les cellules desmi-croorganismes respectifs en suspension dans 50 ml de ladite solution tampon» On ajoute à chacune des solutions 150 ml d'une solution aqueuse 0,1 N de KgHPO^ contenant 2 % de méthyl ester de phénylglycine (1) et 4 % d'acide 7-amii1o-3-(l-oxydopyrid-2-ylthiométhyl)-3-céphem-4-carboxylique (d), la solution ayant yj été ajustée à pH 6,0 avec HC1 2N. On fait incuber chacun des mélanges en secouant à 37°C pendant 30 minutes. On identifie 1'acide 7-(a-aminophénylacétamido)-3-(l-oxydopyrid-2-ylthio-méthyl)-3-céphem-4-carboxylique (P) accumulé dans le mélange réactionnel par bio-autographie et titrage biologique» 40 Les résultats dont donnés dans le ta bleau 13 ci-dessous» 72 11308 28 2132271 TABLEAU 15 ma Quantité accumulée de Microorganisme * p (mg/Bl) Pseudomonas melanogenum IF0-12020 8,5 5 Protaminobacter alboflavus IÏO-13221 6,0 Exemple 17 Avec une anse de platine, on prélève une culture inclinée de 5 jours de Xanthomonas oryzae IF0-5995 10 et on inocule dans 20 ml de milieu I et on cultive en secouant à 28°C pendant 1 jour. On inocule la culture résultante dans 500 ml de milieu I et on cultive en secouant à 28°G pendant 20 heures. On recueille les cellules par centrifugation, on les lave avec 500 ml d'une solution tampon au 15 phosphate 0,05 M à pH 6,0 et on les met en suspension dans 50 ml de ladite solution tampon» On ajoute 50 ml d'une solution aqueuse 0,1 H de K^HPO^ contenant 2 % de méthyl ester de 2-thiénylglycine (8) et 4- % d'acide 7-aminocéphalosporanique (a), la solution ayant été ajustée au pH 6,0 avec HC1 2N. On 20 fait incuber le mélange en secouant à 57°C pendant 30 minutes. Comme déterminé par bio-autographie et par titrage "biologique, il s'est accumulé une quantité de 6,2 mg/ml d'acide 7-/~a-amino (2-thiényl)~acétamido7céphalosporanique (Q) dans le mélange réactionnel» 25 Exemple 18 Avec une anse de platine, on prélève une culture inclinée de 3 jours d'Acetobacter turbidans IF0-3225 qu'on inocule dans 50 ml de milieu I, après quoi on cultive en secouant à 28°C pendant 20 heures» On recueille les cellules 30 par centrifugation, on les lave avec 30 ml d'une solution tampon au phosphate 0,05 M à pH 6,0 et on les met en suspension dans 3 ml de ladite solution tampon. On ajoute à la suspension résultante 3 ml d'une solution aqueuse 0,1 N de K^HPO^ contenant 2 % de méthyl ester de 2-thiénylglycine (8) et 4 % d'acide 35 7~amino-3-désacétoxycéphalosporanique (b), la solution ayant été ajustée à pH 6,0 avec HC1 2N. On fait incuber le mélange en secouant à 37°0 pendant 50 minutes» La biô-autographie et le titrage biologique montrent qu'une quantité de 5>6 mg/ml d'acide 7~Zra-amino-(2-thiényl)acétamido7=3-désacétoxycêphalos-40 poranique s'est accumulée dans le mélange réactionnel. 72 11308 2132271 Exemple 19 Avec une anse de platine, on prélève des cultures inclinées de 3 jours de Xanthomonas oryzae Ii'0-3288 et d'Acetobacter pasteurianus IFO-3223 qu'on inocule dans 30 ml 5 de milieu I et qu'on cultive en secouant à 28°C pendant 20 heures» On recueille les cellules par centrifugation, on les lave avec 30 ml d'une solution tampon au phosphate 0,05 M à pH 6,0 et on les met en suspension dans 3 ml de ladite solution tampon. On ajoute à chacune des suspensions résultantes 3 ml d'une solu-10 tion aqueuse 0,1 îï de KgHPO^ contenant 4 % de méthyl ester de phénylglycine (1) et 2 % d'un dérivé de 7-aminocéphem décrit dans le tableau 14ci-dessous, la solution ayant été ajustée à pH 6,0^avec HG1 2N» On fait incuber chacun des mélanges en secouant /37°C pendant 30 minutes» La céphalosporine accumulée 15 dans chacun des mélanges réactionnels est identifiée par bio-autographie/par titrage "biologique» Les résultats sont donnés dans le tableau 14 ci-dessous» TABLEAU 14 20 Dérivé de Céphalosporine Microorganisme 7-aminocé- accumulée phem 25 Xanthomonas oryzae IFO-3288 (e) 6,8mg/ml de T Acetobacter pasteurianus IFO--3223 (f) 5,6 mg/ml de U Nota : e = N-(7-amino-3-céphem-3-ylméthyl)pyridinium-4-carboxylate f = N-(7-amino-3-céphem-3-ylméthyl)4-carboxamido-pyridinium-4-carboxylate 30 T = N-^"7-(a-aminophénylacétamido)-3-céphem-3-yl- méthyl7pyridinium-4-carboxylate U = 7-(a-aminophénylacétamido)-3-céphem-3-ylméth^/ 4-carboxamidopyridinium-4-carboxylate» 35 Exemple 20 Avec une anse de platine, on prélève les cultures inclinées de 3 jours d'Acetobacter xylinum Iï,0-3144 et de Xanthomonas citri IFO-3835 et on les inocule dans 30 ml de milieu I qu'on cultive en secouant à 28°C pendant 20 heu-40 res» On recueille les cellules par centrifugation, on les lave 72 11308 30 2132271 avec 30 ml d'une solution tampon au phosphate 0,05 M à pH 6,0 et on les met en suspension dans 3 ml de ladite solution tampon dans le cas d'Acetobacter xylinum ou dans 75 ml de ladite solution tampon dans le cas de Xanthomonas citri» On ajoute à 5 chacune des suspensions résultantes le mSme volume d'une solution aqueuse 0,1 N de KgHPO^ contenant 0,4 % de phénylglycine (9) et 0,2 % d'acide 7-amiE.océphalosporanique (a), la solution ayant été ajustée à pH 6,0 avec HC1 2N» On fait incuber chacun des mélanges en secouant à 37°C pendant 30 minutes» L'acide 7-10 (a-aminophénylacétamido)céphalosporanique (A) accumulé dans les mélanges de réaction est identifié par bio-autographie et par titrage biologique» Les résultats sont donnés dans le tableau 15 ci-dessous» 3-5 TABLEAU 15 Quantité accumulée de Microorganisme A (mg/ml) 20 25 30 35 Acetobacter xylinum 110-3144 0,04 Xanthomonas citri 110-3835 0,06 Exemple 21 Avec une anse de platine, on prélève une culture inclinée de 1 jour de Xanthomonas citri 110-3835 et on l'inocule dans 30 ml de milieu III, puis on cultive en secouant à 28°G pendant 24 heures» On inocule la culture résultante dans 500 ml de milieu III et on cultive en secouant à 28°0 pendant 24 heures» On recueille les cellules par centrifugation et on les met en suspension dans 20 ml d'une solution tampon au tris-maléate 0,2 M à pH 6,5» On ajoute à la suspension résultante 20 ml de ladite solution tampon à laquelle on a ajouté 500 mg de méthyl ester de phénylglycine (1) ainsi que 250 mg d'acide 7-amino-3-désacétoxycéphalosporanique (b) et 10 ml d'acétone» On fait incuber le mélange en secouant à 25°C pendant 30 minutes» Après identification par bio-autographie et titrage biologique, on constate que 270 mg d'acide 7-(«-ami-nophénylacétamido)-3-désacétoxycéphalosporanique se sont accumulés dans le milieu de réaction. Exemple 22 On inocule Acetobacter sp. 110-13209 dans 72 11308 51 2132271 200 ml de milieu IV et on cultive en secouant à 28°C pendant 22 heures» On recueille les cellules par centrifugation et on les met en suspension dans 20 ml d'une solution tampon au phosphate 0,1 M à pH 6s0o On divise la suspension en 8 portions à 5 chacune desquelles on ajoute 2,5 ml d'une solution tampon au phosphate 0,2 M à pH 6,0 contenant 75 mg d'un dérivé de phénylglycine donné dans le tableau 16 ci-dessous et 25 mg d'acide 7-amino~3-désacétoxycéphalosporanique ("b)» On fait incuber les mélanges respectifs en secouant à 57°C pendant 1 heure» L'acide 10 7-(ot-aminophénylacétamido)-3-désacétoxycéphalosporanique (B) accumulé dans les mélanges réactionnels respectifs est identifié par bio-autographie et par titrage biologique» Les résultats sont donnés dans le tableau 16 ci-après. 15 TABLEAU 16 Dérivé de phénylglycine utilisé Qu^titégaccumuiée de 20 25 30 35 40 Méthyl ester 6,0 Ethyl ester 6,0 n-propyl ester 4,6 Isopropyl ester 2,2 Tertio-butyl ester 0,2 Benzyl ester 4,2 Phénylglycine amide 0,2 ÎT-(phénylglycyl) glycine 0,2 Exemple 25 Avec une anse de platine, on prélève une culture inclinée de 1 jour de Xanthomonas oryzae IFO-5510 qu'on inocule dans 50 ml de milieu III et qu'on cultive en secouant à 28°C pendant 1 jour» On inocule la culture résultante dans 550 ml de milieu III et on cultive en secouant à 28°C pendant 1 jour. On recueille les cellules par centrifugation dans 800 ml de bouillon de culture obtenu de la manière indiquée ci-dessus et on les met en suspension dans 200 ml d'une solution tampon au phosphate 0,2 M à pH 6,0. On ajoute à la suspension 200 ml d'une solution tampon au phosphate 0,2 M à pH 6,0 à laquelle on a ajouté 3 g de méthyl ester de DL-1-cyclohexénylglycine et 1 g d'acide 7-amino-3-désacétoxycéphalos-poranique. On fait incuber le mélange en secouant à 57°C 72 11308 2132271 pendant 1 heure» Le titrage de l'enzyme montre qu'il s'est accumulé 1,35 S d'acide 7~(a-amino-l,~cyclohexénylacétamido)-3-désacétoxycéphalosporanique dans le mélange réactionnel» On élimine les cellules du mélange ré-5 actionnel par centrifugation et on fait passer le fluide surnageant résultant à travers une colonne garnie avec 800 ml d'un absorbant constitué par un polystyrène disponible daas le commerce ("Amberlite XAD-2" vendu par Rhom & Haas Co», E«.U»A«). On lave la colonne tout d'abord avec 2600 ml d'eau et ensuite 10 avec 1400 ml d'un mélange d'eau ^t de méthanol (5 : 1 en volume)» Ensuite, on élue la colonne avec 2500ml d'une solution aqueuse à 50 % de méthanol» On fait évaporer à siccité, sous pression réduite et à environ 35o0» la première portion de 800 ml du 15 produit obtenu par élution avec du méthanol à 50 ce qui donne 135 mg d'acide 7-Z~a~ami:ii0(L--l,-cyclohexéiiyl)acétamido7-" 3-désacétoxycêphalosporanique sous forme de cristaux. Absorption UV j E*^ à 260 mP- = 205 lcm Rotation spécifique : ^ » + 137° (C =0,5 dans ^0) On fait évaporer à siccité et sous pression réduite, à environ 35°C, la fraction suivante de 700 ml du produit d'élution ce qui donne 850 mg d'acide 7—j/~*tx--a.m±n.0—(D—1* -cyclohexényl)acétamido7-3-désacétoxycéphalosporanique sous 25 forme de cristaux» Absorption U V : E^m à 260 mP- = 215 Rotation spécifique : /~a_7 jp = + 86,2° (C = 0,5, dans H^O) RMN (valeur Cf dans D^O à pH 3) s 1,66 (large, 4H), 2,10 (lar- 30 ge, 4H), 2,20 (singulet, 3H), 3*54 (AB, quartet, 2H), 4,63 (singulet, 1H), 5*19 (doublet, 1H), 5»72 (doublet, 1H), 6,18 (large, 1H)» Activité antibactérienne s voir Tableau 17 : TABLEAU 17 55 Mcroorganismes d'essai STiSfcS/Slf11""11" 40 Stapbylococcus aureus 209P 0,5 Staphylococcus aureus N° 87 2 Bacillus subtilis PCI 219 0,2 72 11308 2132271 35 Tableau 17 (suite) Microorganismes d'essai Concentration inhibi- trice min. (Mg/ml) Sartina lutea PCI 1001 0,02 5 Escherichia coli NIHJ 50 Elebsiella pneumoniae Kbl 50 Proteus vulgaris Eb51 50 Proteus morganii Eb53 7 100 Proteus morganii Eb54 rp-100 10 Proteus mirabilis Eb59 100 Pseudomonas aeruginosa Pdl -p»-100 Pseudomonas aeruginosa 10490 -^>-100 Exemple 24 15 Avec une anse en platine, on prélève une culture inclinée de 1 jour de Xanthomonas citri IFO-3835 et on inocule dans 50 ml de milieu III, puis on cultive en secouant à 28°C pendant 1 jour. On inocule la culture résultante dans 550 ml d'un milieu III et on cultive en secouant à 20 28°C pendant 1 jour. On recueille les cellules par centrifugation et on les met en suspension dans 100 ml d'eau distillée. On ajoute à la suspension 8 g de métKyl ester de D-phénylgly-cine et 4 g d'acide 7-amiI1o-5-désacétoxycéphalosporanique en dissolution dans 100 ml dieau distillée. On fait.incuber le 25 mélange en secouant à 57°C pendant 1 heure, tout en ajustant son pH à 6,0 par addition de NaOH 2N. Le titrage de l'enzyme montre qu'une quantité de 24,7 mg/ml d'acide 7-(a_aminophényl-acétamido)-5-désacétoxycéphalosporanique s'est accumulée dans le mélange réactionnel» 50 On soumet le mélange réactionnel au même mode d'isolement que dans l'exemple 23 ce qui donne 3,9 g d'acide 7-(tt-amino-D-phémylacétamido)-3- -\0/ Absorption UY : E à 260 mP- = 218 lcm Rotation spécifique s /"a 7 ^ + 148° (C « 0,5 dans H?0) D c Exemple 25 Avec une anse de platine, on prélève une 40 culture inclinée de Xanthomonas citri IFO-5855 qu' on inocule 72 11308 2132271 dans 50 ml de milieu III, puis on cultive en secouant à 28°C pendant 1 jour» On inocule la culture résultante dans 4^0 ml de milieu III et on cultive en secouant à 28°C pendant 1 jour. On inocule 2,5 litres de la culture de 1 jour obtenue de la 5 manière ci-dessus dans 100 litres de milieu III et on cultive en aérant et en agitant à 28°C pendant 24 heures. On récolte les cellules par centrifugation, on les met en suspension dans 5000 ml d'une solution tampon au phosphate 0,005 M à pH 6,0 et on les traite par les ultrasons 10 à 10 kilocycles/seconde pendant 20 minutes» On soumet le produit résultant à l'action d'un désoxyribonucléase, on le traite avec un gel de phosphate de calcium pour éliminer les protéines, et on le traite ensuite avec une solution saturée à 60 % de sulfate d'ammonium, ce quidonne un précipité. On dis-15 sout ce précipité dans une solution tampon au phosphate 0,01 M à pH 6,8 , on le dialyse en utilisant de l'eau courante pendant la nuit et on le traite ensuite avec de la diéthylaminoéthyl cellulose pour éliminer les protéines impures. On soumet la solution ainsi obtenue à -une lyophilisation, ce qui donne 15 g 20 d'un enzyme brut en poudre» On ajoute 3 g de l'enzyme brut en poudre à 1 litre d'une solution aqueuse contenant 20 g de méthyl ester de D-phénylglycine et 10 g d'acide 7-amino-3-désacétoxy-céphalosporanique» On fait incuber le mélange en agitant à 25 37°C pendant 1 heure tout* en ajustant son pH à 6,0 par addition de NaOH 2N» Le titrage de l'enzyme montre qu'une quantité de 11,3 g d'acide 7~(a-aminophénylacétamido)-3-désacétoxycépha-losporanique s'est accumulée dans le mélange de réaction. On soumet le mélange de réaction au même 30 procédé d'isolement que dans l'exemple 23, ce qui donne 9»2 g d'acide 7-( Absorption U V î E1 ^ à 260 mP- = 218 lcm Rotation spécifique : jp = + 148° (G = 0,5 dans HgO) Exemple 26 On soumet encore la poudre d'enzyme brut à une chromatographie sur colonnes avec de la carboxyméthyl cellulose en utilisant le tampon au phosphate à pH 6,2 conte-40 nant NaCl 0,03M comme solvant, puis on filtre sur un gel en «p 72 11308 2132271 utilisant une colonne garnie de produit "Sephadex G—75" (marque de fabrique désignant des particules de dextrane conçues pour une filtration sur -un gel et vendues par Pharmacia Co., à Uppsala, Suède), ce qui donne un enzyme purifié dont l'acti-5 vité de synthèse de la céphalosporine est environ 80 fois aussi élevée que celle de l'enzyme brut en poudre,, On ajoute 25 P-g de l'enzyme purifié à 10 ml d'une solution tampon au phosphate 0,05 M à pH 6,0 contenant 0,42 °/o d'acide 7-amino-3-désacétoxycéphalosporanique et 10 0,80 % de méthyl ester de D-, L- ou DL-phénylglycine, comme mentionné dans le tableau 18 ci-dessous. On fait incuber chacun des mélanges en secouant à 37°C pendant 30 minutes. On détermine la quantité d'acide 7-(a-aminophénylacétamido)-3-désa-cétoxycéphalosporanique accumulée par titrage de l'enzyme en 15 ce qui concerne les mélanges réactionnels respectifs» les résultats sont donnés dans le tableau 18 ci-dessous» TABLEAU 18 Quantité accumulée de 20 Méthyl ester de phénylglycine produit (mg/ml) Méthyl ester D-phénylglycine Méthyl ester DL-phénylglycine Méthyl ester L-phénylglycine 1.7 0,9 0,2 72 11308 2132271 20 25 REVENDICATIONS 10 Procédé de production d'une céphalosporine de formule nh2 r R-CH-CONH-pi-CH CH. (I) 10 dans laquelle le symbole R représente un reste hydrocarboné à noyau hexagonal ou un reste hétérocyclique à noyau pentagonal et R' représente un atome d'hydrogène ou un radical organique, dont la liaison indiquée est celle qui relie l'atome de carbone 15 du groupe méthyle à l'atome d'oxygène, de soufre et d'azote faisant partie du radical organique, ce procédé consistant à soumettre (1) un a-amino-acide a-substitué de formule nh2 E - tîH - COOH (II) dans laquelle R a la signification donnée ci-dessus, ou un dérivé réactif de cet acide, et (2) un dérivé de 7-amino-céphem de formule ch2-r» (III) 30 dans laquelle R' a la signification donnée ci-dessus, à l'action enzymatique d'un microorganisme qui est capable de produire une céphalosporine de formule (I) à partir d'un a-amino-acide a-substitué de formule (II) ou d'un dérivé réactif d'un tel acide et d'un dérivé de 7-aminocéphem de formule (III), le microorga-55 nisme appartenant au genre Mycoplana, Protaminobacter, Acetobacter , Xanthomonas, Pseudomonas, Aeromonas, Echerichia, Staphylococcus, Arthrobacter, Proteus, Corynebacterium, glavobacterium, Clostridium, Spirillum ou Bacillus 2o Procédé selon la revendication 1 40 caractérisé par le fait qu'on met en contact (1) l'a-amino- 72 11308 57 2132271 acide-a-substitué ou l'un de ses dérivés aéadbif s et (2) le dérivé de 7-aminocéphem avec un bouillon de culture du microorganisme ou avec une substance résultant du traitement de ce bouillon, au sein d'un milieu aqueux» 5 3= Procédé selon la revendication 2 caractérisé par le fait qu'on opère le contact avec le bouillon de culture à une température comprise entre environ 5 et 50°C et à un pH compris entre environ 4 et 8. 4o Procédé selon la revendication 2, 10 caractérisé par le fait que la concentration du dérivé de 7-ami-nocéphem dans le milieu aqueux est compris entre environ 0,1 et 10 % (poids/volume) et celle de 1'a-amino-acide a-substitué ou de son dérivé réactif entre environ 0,1 et 20 % (poids/volume). 5° Procédé selon la revendication 1, 15 caractérisé par le fait que le dérivé réactif est un alkyl ester , un aralkyl ester, un thioester ou un amide de l'a-amino-a-cide a-substitué, ou bien un dipeptide formé entre cet a-amino-acide et un autre amino-acide» 6o Procédé selon la revendication 1, 20 caractérisé par le fait que le radical organique désigné par E' est un radical alcoxy, alcoxycarbonyle, pyridinium, carboxa-midopyridinio ou 2-(l-oxydo)pyridyle„ 7» Procédé selon la revendication 1, caractérisé par le fait que le.symbole E* représente un atome 25 d'hydrogène,, 8o Procédé selon la revendication 6, caractérisé par le fait que le symbole R' représente un radical méthoxyo 9» Procédé selon la revendication 6, 30 caractérisé par le fait que le symbole R' représente un radical méthoxycarbonyle» 10„ Procédé selon la revendication 1 , caractérisé par le fait que le reste hétérocyclique penta-gonal est un radical thiényle» 35 11» Procédé selon la revendication 1 caractérisé par le fait que le reste hydrocarboné à noyau hexagonal comporte un radical hydroxy et/ou un atome d'halogène fixé sur son noyau» 12. Procédé selon la revendication 1, 4-0 caractérisé par le fait que le symbole R désigne un radical 72 11308 2132271 phényle» 13° Procédé selon la revendication 1, caractérisé par le fait que le symbole E désigne un radical phényle comportant un radical hydroxy et/ou un atome d'halogène 5 fixé sur son noyau0 140 Procédé selon la revendication 1, caractérisé par le fait que le symbole E désigne un radical cyclohexényleo 15o Procédé selon la revendication 1 10 caractérisé par le fait que le symbole E désigne un radical cy-clohexyle<> 16« Procédé selon la revendication 1, caractérisé par le fait que le symbole R est un radical cyclo-hexényle et que le symbole E' est un atome d'hydrogène ou bien 15 un radical méthoxy ou méthoxycarbonyle„ 17» Procédé selon la revendication 1, caractérisé par le fait que le microorganisme utilisé est l'un des suivants : Mycoplana dimorpha, Mycoplana bullata, Protaminobacter alboflavus, Acetobacter acetosus, Acetobacter albidus, 20 Acetobacter aurantium, Acetobacter cerinus, Acetobacter industrius, Acetobacter dioxyacetonicus, Acetobacter gluconicus, Acetobacter liquefaciens, Acetobacter melanogenus,Acetobacter oxydans, Acetobacter pasteurianus, Acetobacter suboxydans, Acetobacter turbidans, Acetobacter xylinum, Xanthomonas citri» 25 Xanthomonas pruni, Xanthomonas oryzae, Pseudomonas aeruginosa, Pseudomonas maltophila, Pseudomonas melanogenus, Pseudomonas vendrelli, Aeromonas hydrophila, Escherichia coli ou Escherichia coli var communior.