FR 2128669 A1 19721020 FR 7207730 A 19720306 72 07730 i 2128669 La présente invention est relative à un procédé perfectionné de production de L-tryptophane à partir d'acide anthrani1ique, avantageusement à l'aide dcun microorganisme du genre Bacillus. 5 Le L=tryptophane est un composé important qui est utile non seulement comme réactif chllque mais aussi comme amino-acide essentiel dont les aliments ordinaires sont souvent dépourvus . La mise au point d'un procédé économique de produc-10 tion de L-tryptophane présente donc une grande importance» Divers procédés ont été proposés dans la technique antérieure. L'un des procédés dont il est fait mention dans la littérature* et qui semble avoir certains avantages» est un procédé dans lequel on utilise un mutant exigeant de l'acide anthra-15 nilique pour sa croissance. Toutefois, le système enzymatique est affaibli ou même inhibé, ce qui détermine la réduction de la production de L-tryptophane, quand l'acide anthranilique est utilisé comme matière de départ en une quantité plus importante que celle qui est 20 requise pour la croissance du microorganisme utilisé, quel que soit le moment où l'acide anthranilique est ajouté, en particulier même si l'addition est effectuée après l'achèvement de la croissance et la formation du système L-tryptcphane~enzyme synthétique . 25 La présente invention a donc pour objet un procédé perfectionné de production de L-tryptophane qui peut 'être mis en oeuvre à l'échelle industrielle. L'invention vise également l'obtention d'un mutant convenant pour la production de L-tryptophane, qui exige de l'acide 30 anthranilique pour sa croissance et qui est également capable de résister à l'action inhibitrice de l'acide anthranilique sur la formation du L-tryptophane„ Conformément à l'invention, on a prévu un milieu efficace qui se prête par lui-même à la production de ii-trypt ophane. 35 D'autres caractéristiques et avantages de l'inven tion ressortiront au cours de la description détaillée qui va suivre. Pour pallier les inconvénients des procédés classiques, la demanderesse a constaté qu'un type de mutant est ex-40 traordinairement avantageux dans la production de L-tryptophane 72 07730 2 2128669 à l'échelle industrielle. Ce mutant exige de l'acide anthranilique pour sa croissance et, en même temps, il est résistant à l'acide anthranilique, et il est principalement choisi parmi les microorganismes du genre Bacillus. 5 En outre3 la demanderesse a constaté que le nouveau type de mutant peut accumuler une quantité beaucoup plus importante de L-tryptophane en présence d'acides carboxyliques spécifiques. La présente invention est l'aboutissement des découvertes qui précèdent. 10 Dans la présente invention, on utilise un microor ganisme du genre Bacillus qui exige de l'acide anthranilique pour sa croissance et qui, en même temps, est résistant à l'acide anthranilique. Pour choisir un tel microorganisme, l'un des procé-15 dés courants conçus pour la sélection de mutants autotrophes peut être d'abord appliqué à une souche de Bacillus d'origine naturelle. Parmi les mutants autotrophes résultants, on choisit une souche résistant à'l'acide anthranilique. Ainsi, les microorganismes qui ont été choisis 20 grâce à divers traitements mutagènes sont respectivement cultivés dans un milieu minimal contenant des sources de carbone et d'azote ainsi que des éléments nutritifs minéraux et d'autres éléments nutritifs qui peuvent convenir pour la culture des microorganismes Bacillus ordinaires mais qui est dépourvu d'acide an-25 thranilique, d'indole et de L-tryptophane et dans un milieu minimal similaire auquel on a ajouté de l'acide anthranilique. Les souches qui ne polissent pas dans le premier milieu mais qui se développent sélectivement dans le second sont choisies comme microorganismes exigeant de l'acide anthranilique. 30 Les microorganismes exigeant de l'acide anthrani lique devant être utilisés selon la présente invention sont invariablement capables de pousser en présence de n'importe quelle substance qui se présente au cours de la biosynthèse de l'acide anthranilique en L-tryptophane, comme par exemple l'indole ou le 35 L-tryptophane lui-même, et ces microorganismes sont habituelle-.. ment du genre Bacillus, comme Bacillus substllis, Bacillus pumi-lus, Bacillus circulans, Bacillus licheniformis, Bacillus polymyxa, Bacillus firmus, Bacillus brevls, Bacillus spherlcus, etc. Parmi ces microorganismes, deux mutants de Bacillus substills sont dé-40 posés à l'organisme "institute for Fermentation", à Osaka, sous 72 07730 3 2128669 les numéros IPO 13219 et IFO 13220, respectivement. Bien que l'on puisse atteindre les buts de la présente invention dans une certaine mesure en utilisant des microorganismes qui exigent un précurseur d'acide anthranilique, 5 par exemple l'acide shikimique, l'augmentation du rendement de L-tryptophane qui est obtenue est beaucoup moins importante que celle qu'on peut réaliser avec des souches exigeant de l'acide anthranilique. Les souches résistant à l'acide anthranilique sont 10 des microorganismes dont la croissance est normale, même en présence d'une quantité d'acide anthranilique en excès par rapport à la concentration maximale à laquelle leurs souches d'origine peuvent pousser dans les mêmes conditions de culture. Habituellement, une telle concentration maximale peut être d'environ 15 1 mg/ml. Ainsi, les souches qui peuvent se développer dans ce milieu minimal dont le supplément est constitué par une telle concentration maximale d'acide anthranilique, par exemple 3 mg/ ml sont utilisées aux fins de la présente invention. 20 Les microorganismes en question sont cultivés dans vin milieu contenant de l'acide anthranilique, de l'indole et/ou du L-tryptophane, en plus des sources de carbone, des sources d'azote, des sels minéraux, des vitamines et d'autres sources d'éléments nutritifs qu'on utilise habituellement dans la culture 25 des microorganismes du type Bacillus. La source de carbone principale peut comprendre du glucose, de l'amidon et d'autres hydrates de carbone et hydrocarbures, et la source d'azote peut comprendre des substances organiques et minérales comme l'urée, l'ammoniac, la liqueur de 30 macération du mais, le sulfate d'ammonium, etc... L'invention peut être mise en oeuvre en utilisant de l'indole à la place de l'acide anthranilique comme matière de départ. Toutefois, le rendement pouvant être obtenu est beaucoup plus faible que lorsqu'on utilise de l'acide anthranilique. Dans 35 la présente invention, un microorganisme du genre Bacillus qui exige de l'acide anthranilique pour sa croissance et qui est résistant à l'acide anthranilique est tout d'abord cultivé en présence d'une quantité limitant la croissance d'acide anthranilique, d'indole et/ou de L-tryptophane et, lorsque le microorganisme 40 s'est complètement développé dans ces conditions, on introduit 72 07730 !( 2128669 10 15 20 25 30 35 de l'acide anthranilique dans le milieu et on cultive encore le microorganisme qu'on laisse élaborer du L-tryptophane. on entend une quantité qui n'est pas supérieure à celle qui est requise pour la croissance maximale du microorganisme choisi et, bien qu'une telle quantité puisse varier quelque peu selon la souche, les conditions de culture et d'autres facteurs, elle peut être par exemple d'environ 5 à 6of/ml pour l'acide anthranilique et d'environ 10 à 8otfVml pour l'indole ou le tryptophane, respectivement, quand on les utilise indépendamment. En plus des constituants du milieu susmentionnés l'incorporation à ce milieu d'un ou plusieurs acides mono- et/ou dicarboxyliques à bas poids moléculaire permet d'obtenir des résultats bien meilleurs selon la présente invention, ces acides carboxyliques ont jusqu'à 7 atomes de carbone, ils ne peuvent pas inhiber la croissance des microorganismes utilisés et leur formule générale est la suivante s dans laquelle R-^ est un atome d'hydrogène ou un groupe C00H, Rg et Rj sont un atome d'hydrogène ou un groupe 0H, n est un nombre entier compris entre 1 et 5 et m est égal à 0 ou 1 (np> m). Les acides carboxyliques sont par exemple l'acide acétique, l'acide propionique, l'acide butyrique, l'acide lactique, l'acide succinique, l'acide tartrique, l'acide fumarique, l'acide maléique, l'acide pimélique, l'acide pivalique, l'acide capronique, l'acide heptanique, etc..., et parmi ces acides, ceux qui sont les plus efficaces sont l'acide succinique, l'acide tartrique, l'acide fumarique et l'acide maléique, suivis de l'acide acétique. Les sels de ces acides carboxyliques peuvent être des sels de métaux alcalins correspondants, par exemple de sodium ou de potassium, ou bien des sels de métaux alcalino-terreux correspondants, par exemple les sels de magnésium. milieu de façon préalable ou bien dans une variante, ils peuvent être incorporés durant la croissance du microorganisme ou bien après que le microorganisme s'est développé suffisamment. L'addition peut également être effectuée en plusieurs stades. Toute- Par l'expression "quantité limitant la croissance", Les acides ou leurs sels peuvent être ajoutés au 72 07730 2128669 fois, d'une manière générale, on obtient des résultats plus satisfaisants quand l'acide ou ses sels sont ajoutés au préalable au milieu de culture. La concentration de ces acides dans le milieu de culture varie suivant la nature des acides et les 5 autres conditions de culture, mais elle n'est de préférence pas inférieure à environ 0,3/6. De façon désirable, on exécute la culture en aérobie, par exemple en secouant ou bien en aérant et agitant. Bien que la culture puisse être exécutée dans des conditions 10 classiques qui conviennent pour la culture d'une souche du genre Bacillus, l'incubation est généralement exécutée à environ 20 à 40°C et à un pH compris entre environ 4,5 et 10,0 et de préférence entre environ 6,0 et 9,0. L'isolement du L-tryptophane contenu dans le 15 bouillon de culture et la purification de ce composé peuvent être effectués par des procédés connus, par exemple par une série d'adsorptions et d1élutions, en utilisant du charbon activé et/ou une résine échangeuse d'ions. L'expérience et les exemples qu'on décrit ci-20 après illustrent encore l'invention. Dans tout l'exposé, la relation entre les parties en poids et les parties en volume est identique à celle qui existe entre les grammes et les millilitres, les pourcentages s'entendent en poids par volume (quand ce terme s'applique au 25 pourcentage des ingrédients dans le milieu de culture) ou en poids par poids (dans les autres cas) et les numéros précédés du préfixe "IF0W qui suivent le nom des microorganismes désignent respectivement les numéros de réception du microorganisme à l'Institut de Fermentation d'Osaka, au Japon. 30 Expérience On exécute une expérience comparative relative à la production de L-tryptophane dans un milieu auquel on a ajouté du succinate de sodium ou du tartrate de sodium comme supplément, ces deux composés étant des acides mono- ou di-carboxyliques ty-35 piques, ainsi que dans un milieu ne comportant pas de tels acides ou de tels sels, en utilisant trois microorganismes comme souches d'essai, à savoir une souche non cultivée, un mutant exigeant de l'acide anthranilique et provenant de cette souche et un mutant . selon la présente invention. Les résultats sont donnés dans le 40 tableau suivant : 72 07730 6 2128669 TABLEAU 1 Rendement en L-tryptophane (mg/ml) 5 10 15 20 (Vcide carboxylique, #, Bacillus Bacillus Bacillus subti 3ous forme de sel (# subtilis subtilis lis (IFO 13219) Mutant exigeant de l'acide ant. et résistant à l'acide ant. sous forme d'acide libre) (IFO 3009) Souche non cultivée (IFO 13308) Mutant exigeant de l'acide ant. Témoin (pas d'addition) trace 0,21 2,21 Succinate de sodium 0,05 (0,022) trace 0,20 2,21 0,1 (0,044) trace 0,20 2,22 0,3 (0,131) trace 2,03 4,47 0,5 (0,219) trace 2,20 8,23 1,0 (0,437) trace 2,50 9,54 2,0 (0,874) trace 2,47 8,21 Tartrate de sodium 0,05 (0,033) trace 0,20 2,38 0,1 (0,065) trace 0,31 2,24 0,3 (0,196) trace 0,32 2,23 0,5 (0,326) trace 1,95 5,45 1,0 (0,652) trace 2,58 8,61 2,0 (1,305) trace 2,78 9,24 Acide ant. = Acide anthranilique 25 EXEMPLE 1 Dans un fermenteur d'une capacité de 50 parties en volume, on verse 20 parties en volume d'un milieu de culture d'ensemencement comprenant 2# d'"amidon soluble, 2# de liqueur de macération du mais, 0,3# de phosphate dipotassique, 0,1# de phos-50 phate monopotassique, 30 ^/ml d'acide anthranilique et 1 Y?/ml de biotine (pH 7*2), après quoi on stérilise et on inocule avec une culture d'un imitant (IF0 13219) résistant à l'acide anthranilique et exigeant de l'acide anthranilique pour son développement obtenu à partir de Bacillus subtilis ÇIFO 3009). On incube le milieu inocu-55 ié à 37°C pendant 24 heures, tout en aérant et en agitant. Séparément, dans un fermenteur d'une capacité de 500 parties en volume, on verse 200 parties en volume d'un milieu de fermentation comprenant 14# de glucose, 3# de liqueur de macération du mais, 0,9# d'urée, 1# de succinate de sodium (0,0437# sous forme d'acide libre), 0,5# de phosphate dicalcique, 0,5# de 72 07733 7 2128669 phosphate tricalcique, 0,037# d'éthylènediaminé tétraaeétate di-sodique (2H20), 3# de carbonate de calcium, ly/ml de biotine et 20 tfVml d'acide anthranilique (pH 7,2), puis on stérilise. On transfère 20 parties en volume de la culture d'ensemencement pré-5 parée comme décrit ci-dessus dans le milieu de fermentation et on fait incuber le milieu inoculé à 37°C pendant 16 heures. Ensuite, on ajoute une solution neutralisée d'acide anthranilique à raison de 8 mg pour 1 ml du bouillon de culture, puis on fait encore incuber à 37°C pendant 48 heures, tout en aérant et en 10 agitant. Le bouillon de fermentation résultant contient 10,4 mg/ml de L-tryptophane. On ajuste ce bouillon (200 parties en volume) au pH 6,5 et, après ébullition à 100°C pendant 10 minutes, on sépare les cellules par centrifugation. On traite la •L5 couche surnageante avec 50 parties en poids de charbon activé, sur lequel le L-tryptophane se trouve ainsi adsorbé. Après lavage à l'eau, on élue le charbon activé avec 500 parties en volume d'é-thanol à 50# pour recueillir le L-tryptophane. On concentre le produit d'élution sous pression réduite à 200 parties en volume, on 20 ajuste le pH du produit concentré à 4,5 et on amène son volume à 300 parties. On fait passer la solution à travers 60 parties en volume d'une colonne de résine échangeuse d'ions (Dowex 50 x 8, forme sodique de Dow Chemicals) qu'on a tamponnée avec 1000 parties en volume d'un tampon au citrate 0,1 M (pH 3,4). 25 Ensuite, on verse 1500 parties en volume de tam pon au citrate 0,1 M (pH 5,0) sur la colonne, puis on élue le L-tryptophane avec 400 parties en volume d'un mélange d'éthanol et d'ammoniaque (50#-0,28#). On concentre le produit d'élution sous pression 2Q réduite jusqu'à 180 parties en volume et on ajuste le produit concentré au pH 6,0, après quoi on porte son volume à 250 parties avec de l'eau. On traite de nouveau la solution avec 20 parties en poids de charbon activé qu'on élue ensuite avec un mélange dféthanol et d'ammoniaque (50#-0,28#). On concentre le produit d'élution ^ sous pression réduite, ce qui donne 1,58 partie en poids de L-tryptophane cristallin. L'analyse de ce produit, qui est donnée ci- dessous, est en conformité avec les valeurs publiées : 40 72 07730 8 2128669 3Jji22 » 31,3 (01,0, eau) Analyse élémentaire Calculé (#) : C 64,92? H 6,07; N 13,78 Trouvé (#) : C 64,69; H 5,92; N 13,72 5 EXEMPLE 2 En partant d'un mutant (IFO 13220) résistant à l'acide anthranilique et exigeant de l'acide anthranilique pour sa croissance de Bacillus substills, on prépare une culture d'ensemencement dans des conditions par ailleurs similaires à celles 10 qui sont décrites dans l'exemple 1, on fait passer 20 parties en volume de la culture d'ensemencement dans un fermenteur principal, d'une capacité de 500 parties en volume et qui contient 200 parties en volume d'un milieu de fermentation ayant la composition suivante donnée ci-dessous. On fait incuber le milieu 15 inoculé à 37°C pendant 16 heures, tout en aérant et en agitant. 15# de glucose, 3# de liqueur de macération du mais, 0,9# d'urée, 1# de tartratè de sodium (0,652# sous forme d'acide libre), 0,3# de phosphate monopotassique, 0,3# de phosphate dipotassique, 0,2# de sulfate de magnésium, 3# de carbo-20 nate de calcium, 0,5îf/ml de biotine et 30#Vml d'acide anthranilique (pH 7»2). Ensuite, on ajoute une solution neutralisée d'acide anthranilique à une concentration de 10 mg par ml du milieu de fermentation et on fait encore incuber le milieu à 37°C pen-25 dant 48 heures tout en aérant et en agitant. Le bouillon de fermentation résultant contient 11,7 mg/ml de L-tryptophane. EXEMPLE 3 Dans un fermenteur d'une capacité de 200 parties en volume, on verse 20 parties en volume d'un milieu de culture 30 d'ensemencement comprenant 2# d'amidon soluble, 2# de liqueur de macération du mais, 0,3# de phosphate dipotassique, 0,1# de phosphate monopotassique, 30 V/ml d'acide anthranilique et 3îf/ml de vitamine B^ (pH 7»2), puis on stérilise et on Inocule avec line culture d'un mutant (IFO 13219) exigeant de l'acide an-35 thranilique et résistant à l'acide anthranilique provenant de Bacillus substilis (IFO 3009). On fait incuber le milieu inoculé à 37°C pendant 16 heures tout en aérant et en agitant. Ensuite, on fait passer le bouillon de culture dans un fermenteur principal d'une capacité de 500 parties en volume, qui contient 200 40 parties en volume d'un milieu de fermentation ayant la composi 72 07730 9 2128669 tion ci-dessous. On fait incuber le milieu inoculé à 37°C pendant 16 heures, tout en aérant et en agitant, et on ajoute une solution neutralisée d'acide anthranilique à raison de 8 mg pour 1 ml de bouillon de culture, après quoi on fait encore incuber pendant 48 heures à 37°C tout en aérant et en agitant. Milieu : Glucose 15# Proflo (Oil Mill Company, E.U.A) 2,0# Urée 0,9# 10 KH2P04 0,3# K2HP04 0,3# Acide anthranilique 10 tf/ml Vitamine B 3 mg/l Acides carboxyliques divers Les résultats sont donnés dans le tableau suivant TABLEAU 2 Rendement en L-tryptophane (mg/ml) 20 25 30 Acide carboxylique # sous forme d'acide libre 0 0,1 0,3 0,5 1,0 2,0 3,0 Acide succinique 2,34 2,75 8,52 9,23 10,59 9,78 4,20 Acide acétique 2,20 4,50 5,55 4,11 Acide fumarique 2,10 6,5 4 7,56 6,33 Acide lactique 2,56 2,47 4,58 6,47 5,7-2 5,20 Acide propionique 2,54 6,70 7,58 6,67 Acide pivalique 3,23 4,78 5,70 3,90 Acide tartrique 2,34 2,74 7,32 8,15 4,63 Acide maléique 2,51 6,18 7,64 7,22 3,91 Acide pimélique 2,40 2,50 4,20 5,15 3,12 72 07730 10 2128669 REVENDICATIONS 1. Procédé de production de L-tryptophane caractérisé par le fait qu'il consiste à cultiver, en aérobie et en culture submergée, un microorganisme du genre Bacillus qui exige de l'acide 5 anthranilique pour sa croissance et qui est résistant à l'acide anthranilique, au sein d'un milieu contenant une quantité limitant la croissance d'acide anthranilique, d'indole et/ou de L-trypto-phane, après quoi on ajoute au bouillon de culture une quantité d'acide anthranilique en excès par rapport à celle qui est requise 10 pour la croissance bactérienne, ce qui amène le microorganisme à élaborer du L-tryptophane, et à récupérer le L-tryptophane dans ce bouillon de culture. 2. Procédé selon la revendication 1, caractérisé par le fait que le microorganisme est Bacillus subtilis. 15 3. Procédé de production de L-tryptophane, caracté risé par le fait qu'il consiste à cultiver, en aérobie et en culture submergée, un microorganisme du genre Bacillus qui exige de l'acide anthranilique pour sa croissance et qui est résistant à l'acide anthranilique, au sein d'un milieu contenant une quan-20 tité limitant la croissance d'acide anthranilique, d'indole et/ou de L-tryptophane, après quoi on ajoute au bouillon de culture une quantité d'acide anthranilique en excès par rapport à celle qui est requise pour la croissance bactérienne ainsi qu'un ou plusieurs acides mono- et dicarboxyliques connus de formule B2Hl 7-C00H dans laquelle R^ est un atome d'hydrogène ou un radical C00H, R2 et R^ sont un atome d'hydrogène ou un radical OH, n est un nombre entier compris entre 1 et 5 et m est égal à 0 ou 1 (n>m), ce qui fait que le microorganisme est capable d'élaborer du L-tryptophane qu'on recueille dans le bouillon de culture. 4. Procédé selon la revendication 3, caractérisé par le fait que l'acide carboxylique est l'acide fumarique. 35 5* Procédé selon la revendication 3, caractérisé par le fait que l'acide carboxylique est l'acide maléique. 6. Procédé selon la revendication 3, caractérisé par le fait que l'acide carboxylique est l'acide tartrique. 7. Procédé selon la revendication 3, caractérisé par le fait que l'acide carboxylique est l'acide succinique. 30