FR 2126452 A1 19721006 FR 7206607 A 19720225 72 06607 1 2126452 La présente invention concerne, et comporte parmi ses objec tifs, des modes opératoires pour cultiver certaines bactéries uti les pour la production de~ "pain français" à pâte acide. D'autres buts de l'invention ressortiront à l'évidence de la description 5 suivante dans laquelle les parties et pourcentages sont en poids sauf indication contraire. Le pain français à pâte acide est un genre spécial de pain préféré par de nombreuses personnes en raison de ses propriétés remarquables, et notamment sa texture croustillante et son goût 10 acide ou acidulé attrayant. Aux Etats-Unis dAmérique, l'article véritable n'est virtuellement produit que dans la région de la baie de San-Francisco. Dans cette région, le produit est fabriqué continuellement depuis plus de cent ans et il commande un marché que l'on estime constituer 15 à 20 % de la totalité du 15 pain consommé. En outre, le produit est exporté dans d'autres régions des Etats-Unis d'Amérique et dans des pays étrangers. Virtuellement toute personne qui a eu l'occasion de visiter San-Francisco se souvient avec plaisir de sa rencontre avec le pain français à pâte acide et elle exprime le regret que ce produit 20 ne soit pas fabriqué, dans sa propre localité. L'un des buts de la présente invention est de proposer le moyen permettant de fabriquer ce produit remarquable de façon efficace, économique, et en n'importe quel endrc-it quels qu'en soient le climat et la topographie. 25 Afin de bien situer l'invention, il est nécessaire de décri re sommairement le procédé de production classique du pain français à pâte acide dans les établissements de la région de la baie de San-Francisco. Le coeur du procédé est le levain de départ ou de première, 30 comme on l'appelle couramment. Le levain n'est pas seulement la source du pouvoir de levée et d'acidulation, mais il fournit également le mécanisme permettant de perpétuer le processus. En pratique industrielle, on refait le levain en moyenne toutes les huit heures environ, ou bien au moins deux à trois fois par jour, 35 pendant les 7 jours d'une semaine. Ce mode opératoire est réalisé de cette façon depuis cent ans au moins, et l'origine du levain initial est enveloppée de mystère. Le levain précité est obtenu à partir d'un levain antérieuir, 72 06607 2 2126452 d'eau et d'une farine à teneur élevée en gluten (par exemple une farine contenant enviro n 14 % de protéines), ces ingrédients étant typiquement utilisés selon les proportions suivantes : Formulation d'un levain : 5 50 à 100 parties d'un levain antérieur ; 100 parties de farine (à teneur élevée en gluten) ; 45 à 52 parties d'eau. Après le malaxage ou pétrissage, on garde le levain (on le fait développer) durant sept à huit heures à 24° - 27° C. Le le-10 vain est alors prêt à servir pour préparer une pétrissée de pâte. Le pH du levain, au début de sa préparation, est de 4,4 - 4,5 ; le pH final est de 3,8 - 3,9. Pour préparer une pétrissée de pâte, on mélange le levain développé précité avec de la farine, de l'eau et du sel, typique-15 ment selon les proportions suivantes : Formulation d'une pâte : 15 - 20 parties de levain, 100 parties de farine (qualité courante), 60 parties d'eau , 20 2 parties de sel. Après sa préparation, on laisse la pâte reposer pendant au moins 30 minutes à 24° - 27° C. Puis on la pèse (on la divise en _ des morceaux ou pâtons de poids prédéterminé), on l'arrondit et on laisse la levée ou le pointage s'effectuer sur le dessus pen-25 dant 20 minutes environ à 32,5° C, après quoi on moule, on place sur une toile qui a d'abord été saupoudrée de farine de riz et/ou de farine de blé ou de maïs et on laisse la levée s'effectuer pendant six à huit heures environ à 29,5° - 32,5° C et à une humidité relative de70%-90%. On cuit ensuite les miches 30 de pain dans un four à sole durant 45 - 55 minutes à 190° - 199°C. On maintient humide l'atmosphère régnant dans le four en la saturant par de la vapeur d'eau, en particulier au cours de la première moitié du cycle de cuisson. De même, juste avant la cuisson, on taillade les sommets des miches avec un couteau pour évi-35 ter le fendillement et le plissement de la croûte au cours de la cuisson. Un autre aspect important de la production du pain français à pâte acide de San-Francisco réside dans le domaine microbiologique. Le produit est fabriqué depuis 100 ans au moins ; cependant, 72 06607 2126452 les facteurs microbiens n'ont pas été découverts jusqu'à présent. On sait depuis toujours, bien entendu, qu'une certaine action microbienne est en cause et qu'elle est responsable de l'action de levée ou de poussée et du développement de l'acidité ; cependant, 5 la nature du ou des micro-organismes est restée inconnue. Les re cherches des Demandeurs ont révélé que deux micro-organismes distincts sont en cause, et les Demandeurs ont isolé chacun de ces micro-organisme s. L'un des micro-organisme est une levure qui est responsable 10 de l'action de levée ou.de poussée. Les Demandeurs ont identifié cette levure comme étant la forme imparfaite (sans sporulation) de Saccharomyces exiguus, à savoir, Torulopsis holmii. L'une des propriété différenciant cette levure de la levure ordinaire de boulangerie (S. cereviseae) est qu'elle ne peut fermenter ou croî-15 tre sur du maltose ; elle peut faire fermenter du glucose, du saccharose, du raffinose et du galactose. S. cereviseae, par ailleurs, peut faire fermenter l'ensemble des cinq sucres cités. Une autre caractéristique est que T. holmii peut croître dans des milieux contenant de l'acide acétique. Cela se démontre com-20 me suit : on ajuste à 4,5, avec de l'acide acétique, le pH de suspensionsaqueusesà 10 % de farine et l'on inocule à des portions séparées de la levure de boulangerie et T. holmii. Après six heures d'incubation à 27° C, la numération des cellules viables de levure de boulangerie indique que le nombre a diminué 25 pour atteindre moins de 0,1 % du nombre d'origine, alors que T. holmii a quintuplé. On pourra observer que si T. holmii est une espèce connue de levure, on ne savait pas jusqu'à présent que cette espèse était impliquée dans la production du pain français à pâte acide. 30 L'autre micro-organisme que les Demandeurs ont trouvé être impliqué dans le pain français à pâte acide est une espèce de bactérie, étroitement apparentée au genre Lactobacillus ou appartenant à ce genre, et cette espèce n'a été jusqu'à présent ni connue ni décrite. Cette bactérie est responsable du développe-35 ment de l'acidité du produit et, puisque les Demandeurs l'ont découverte, ils ont suggéré pour cette bactérie le nom de Lactobacillus sanfrancisco. La présente invention concerne ce micro-organisme et 4 72 06607 2126452 propose les moyens pour le cultiver. Les cultures de ce micro-organisme sont utiles dans le système à levain liquide de départ pour produire le pain français à pâte acide. On a obtenu les échantillons de levain de départ de pâte acide 5 à partir de plusieurs bactéries dans la région de la baie de San-Francisco ; et à partir de ces échantillons, les Demandeurs ont obtenu en culture pure la bactérie de la pâte acide qui n'avait pas été isolée ou décrite antérieurement. Pour cette bactérie, les Demandeurs, puisqu'ils l'ont découverte, ont suggéré 10 le nom de Lactobacillus sanfrancisco. Les efforts des Demandeurs pour isoler et cultiver ce microorganisme ont été grandement gênés et ont même été infructueux à l'origine parce que le micro-organisme a des exigences nutritives particulières et ne se cultive pas sur des milieux classiques, 15 notamment les milieux auxquels on fait particulièrement appel pour la numération des bactéries produisant de 1'acide lactique dans les farines et pâtes. Les exigences nutritives de la bactérie sont étudiées en détail dans la suite du présent exposé. En général, les Demandeurs ont trouvé que la bactérie est 20 présente dans des levains entièrement développés en des nombres 9 dont l'ordre de grandeur est d'environ 1 x 10 par gramme, ce qui représente énviron 30 à 100 fois le nombre des cellules de levure de la pâte acide. De même, en explorant les levains provenant des différentes sources, les Demandeurs ont obtenu cinq sou-25 . ches isolées différentes de L. sanfrancisco que l'on désigne dans le présent mémoire comme étant les souches B, C, L, P et T. En général, ces souches ne diffèrent que légèrement l'une de l'autre et l'on peut utiliser l'une quelconque d'entre elles dans la pratique de la présente invention. Les souches P et L sont par-30 ticulièrement similaires et peuvent être considérées comme iden tiques . Des cultures de différentes souche de Lactobacillus sanfrancisco utiles aux fins de l'invention ont été déposées à la "Stock Culture Collection" du "U.S. Department of Agriculture, Northern 35 Régional Research Laboratory, Peoria, Illinois 61604" (Collection des cultures de réserve du laboratoire de recherches de la région nord du ministère de l'agriculture des Etats-Unis d'Amérique) . On peut obtenir des échantillons de ces souches en 72 06607 5 2126452 s'adressant à ce laboratoire. En outre, puisque les Demandeurs ont caractérisé le microorganisme et en ont élucidé les exigences nutritives et autres conditions de croissance, ils ont fourni les outils permettant aux experts en microbiologie d'isoler eux-mêmsle micro-organisme à partir de ses sources comme les levains pour pâte acide et les pâtes. On trouvera immédiatement ci-après une description et des procédés pour cultiver l'espèce bactérienne constituant le sujet de la présente invention-. Les référence au bouillon de culture des bactéries pour pâte acide désignent le milieu utili-sé de façon courante par les Demandeurs pour cultiver le micrô-organis-me. Voici la composition de ce bouillon de culture : Bouillon de culture de la bactérie pour pâte acides Pour cent Maltose 2 Extrait de levure du commerce 0,3 Extrait de levure fraîche ££ 0,5 à 1,5 Dérivés polyoxyéthyléniques de mono-oléate de sorbitanne ("Tv.'een 80") 0,03 Hydrolysat de caséine ("trypticase") 0,6 Eau pour compléter à 100 On ajuste à pH 5,6 à l'aide d'acide lactique à 20 % ou de HC1 1 N à 6 N. £ On utilise le bouillon contenant les ingrédients indiqués pour effectuer des cultures en milieu liquide. Pour effectuer les cultures sur un milieu solide - par exemple des plaques ou des milieux inclinés - on ajoute une faible proportion de gélose (2 %) au bouillon. On désignera ci-après un tel milieu comme étant de la gélose pour bactéries de pâte acide . De façon courante, on fait incuber des cultures sur du bouillon pour bactéries de pâte acide ou sur de la gélose pour bactéries de pâte acide à 30° - 31° C durant 1 à 2 jours dans une atmosphère contenant CO^r ce que l'on obtient en balayant par du CO^ l'espace situé au-dessus des cultures sur le bouillon ou bien, dans le cas de cultures sur gélose, en plaçant les plaques ou les milieux inclinés dans un réceptacle d'où l'air à été enlevé et remplacé par un mélange de CO2 et d'air contenant environ 25 â 95 % en volume de 72 06607 6 2126452 ££ Préparé par chauffage en autoclave, durant 30 minutes à 1,05 bar , d'une suspension à 20 % de levure de boulangerie comprimée du commerce dans de l'eau distillée, en laissant ensuite la suspension se déposer durant seize heures environ à 1,1° -5 1,7° C, en décantant et en clarifiant encore la liqueur surna geante par une centrifugation. L'extrait préparé de cette façon contient 1,5 % de solides et, si on ne l'utilise pas dans les quelques jours qui suivent sa préparation, on le congèle ou le lyophilise immédiatement. On utilise une proportion des prépara-10 tions d'extrait de levure fraîche permettant d'obtenir de 0,5 à 1,5 % des solides (ou de l'extrait sec) de l'extrait de levure fraîche. Propriétés générales : L. sanfrancisco, au stade de début de croissance, dans le 15 levain ou en culture pure, et avant de développement de l'acidité totale, apparaît sous forme de minces tiges de longueur courte : à moyenne ou de très courtes chaînes n'ayant qu'une tendance mineure à donner des formes incurvées ou filamenteuses. Cependant, dans des conditions de nutrition médiocres ou dans des cultures 20 assez anciennes, le micro-organisme présente couramment des formes involutives ou filamenteuses présentant parfois une très grande longueur et, à l'occasion, des formes pléomorphes gonflées ou renflées. Sur des géloses en plaques, le micro-organisme, lorsqu'il est vigoureux, croît sous forme de colonies translucides, 25 rondes et lisses ayant un diamètre égal ou inférieur à 1 millimètre environ. • Il est gram-positif dans les premiers stades de son développement, non mobile et donne un résultat négatif â l'épreuve de la catalase, ce qu'indique le manque de formation de gaz lors-30 qu'on verse une solution à 10 % de H2O2 sur les colonies étalées sur une plaque de gélose. Dans les levains et les pâtes, environ 70 à 80 % de l'acidité organique totale produite par le micro-organisme est de l'acide lactique, le reste est de l'acide acétique. Dans des cultu-35 res pures effectuées sur du bouillon, le rapport entre l'acide lactique et l'acide acétique est variable, et ce rapport dépend de l'atmosphère à laquelle la culture est exposée. En raison de la production de l'acide acétique, les Demandeurs estiment que 72 06607 7 2126452 la bactérie est un type de lactobacille à hêtérofermentation. On peut noter que la fondation d'acide acétique est une clé qui non seulement explique la saveur remarquable du pain français à pâte acide, mais qui explique également la protection du système de 5 levain de départ de pâte acide contre la contamination, puis que 1'acide acétique exerce une influence létale sur de nombreux micro-organisires. Du gaz (C^) est produit par toutes les S'ouches en culture' pure . La croissance est inhibée par l'acide sorbique, mais non 10 par l'actidione, qui est un antibiotique produit par Streptomy- ces griseus. Le micro-organisme est mësophile et il ne présente _ aucune tolérance inhabituelle à la chaleur ou au. sel. Résistance à la chaleur et tolérance au sel : On a soumis des cultures de douze et de vingt-quatre heures 15 de trois souches différentes (B, L et T), effectuées sur du bouil mon de culture^ de la bactérie de pâte acide , à une submersion dans un bain à 60° C durant 15 minutes en opérant de façon à comprendre une période de 3 à 4 minutes de submersion totale. Les cultures de douze heures ont des dénombrements compris entre 19 7 20 et 34 x 10 cellules par ml et les cultures de vingt-quatre heu- 7 res ont des dénombrements compris entre 150 et 160 x 10 cellules par ml. On ne trouve en aucun cas de survivants viables à la plus grande dilution essayée ( Exigence, de maltose : Une caractéristique particulièrement distinctive de L. sanfrancisco est que ce micro-organisme nécessite du maltose pour 35 une croissance rapide et puissante. D'autres sucres, et notamment le: xylose. , l'arabinose , le galactose , le lactose, le saccharose, le raffinose et le rhamnose, ne sont pas utili.sés. Quelques individus isolés de la bactérie peuvent s'adapter au glucose 72 06607 8 2126452 ! mais seulement après une longue période d'attente. La préférence du micro-organisme pour le maltose est démontrée par l'exemple suivant. Exemple 1 5 On utilise les échantillons de gélose pour bactéries pour pâte acide , préparée comme décrit ci-dessus, et l'on utilise d'autres échantillons modifiés par le remplacement du maltose par la même proportion (2 % ) d'autres sucres. On forme des plaques que l'on ensemence par différentes souches de la bactérie. 10 On maintient à 31° C durant 2 jours et l'on en examine la croissance. Les résultats obtenus sont présentés au tableau I ci-après : TABLEAU I Croissance sur les hydrates de carbone essayés ste 15 Souche Xylose Arabinose Glucose Galactose Saccharose Maltose Pharnnose Raffincse B - - - - - + - P NE — - + NE NE L - - - - - + NE NE T-NE --NE+- 20 * + : indique une croissance; - : indique l'absence de croissance ; NE : n'a pas fait l'obj.et d'un essai de vérification. Exemple 2 Pour examiner l'effet de différentes "proportions de malto-25 se sur la croissance et sur la production d'acides,on cultive deux souches de la bactérie à 31° C sur du bouillon pour bactéries de pâte acide où l'on fait varier la proportion de maltose. On estime la croissance d'après le volume des cellules et la turbidité; on estime la production d'acides par la mesure du pH. 30 Les résultats obtenus sont présentés dans le tableau II ci-après: 72 06607 9 2126452 TABLEAU II Effet de la proportion de maltose sur la croissance et sur la chute de pH dans des cultures du bouillon (1,5 % d'extrait de levure fraîche dans du bouillon pour bactéries de pâte acide) Concentration Souche L - 24 heures Souche C - 41 heures de maltose, % pH Volume des Turbidi- pH Volume des Turbidi cellules té £ cellules té £ (ml/10ml de culture) (ml/lQml de culture) 0,10 4,50 0,02 0,08 5,07 0,01 0,09 0,25 4,45 0,03 0,23 4,80 0,02 0,15 0,50 4,40 0,07 0,47 4,48 0,04 0,30 1,00 4,15 0,11 0,63 4,17 0,06 0,35 1,50 4,15 0,11 0,60 4,10 0,08 0,39 2,00 4,15 0,10 0,62 4,10 0,07 0,39 _ 15 Si On mesure la densité optique à 525 millimicrons dans un appareil "Spectronic 20" de Bausch et Lomb après avoir dilué la culture avec de l'eau distillée selon un rapport 1:5. Les chiffres indiquant la turbidité sont corrigés pour tenir compte de la turbidité, en fonction du pH, dans un bouillon pour culture 20 de bactéries de pâte acide , mais qui n'a pas été inoculé. En tenant compte des données précédentes, on utilise dans la pratique de l'invention un milieu de culture contenant du maltose. En général, on fournit ce sucre S une concentration au moins égale à 0,5 %, de préférence égale â 2 % environ. On peut fournir 25 le maltose tel quel ou bien il peut être fourni, par l'un quelconque des hydrates de carbone qui le contiennent, par exemple du sirop de maïs ou des solides de sirop de maïs, de l'extrait de malt, et d'autres substances contenant du maltose et préparées par hydrolyse chimique ou enzymatique d'amidon ou de fécule pro-30 venant de riz, de blé, de pommes de terre, d'orge, d'avoine, etc. Extrait de levure fraîche : Une autre caractéristique de L. sanfrancisco est que certains extraits de levure sont nécessaires pour obtenir une bonne croissance et que ces extraits provoquent une réponse qui ne peut être 35 atteinte par des extraits de levure du commerce et par des auto-lysats, par des hydrolysats de caséine ou par de la vitamine Les substances que l'on utilise selon l'invention sont désignées en général comme étant de l'extrait de levure fraîche pour les 72 06607 10 2126452 ! distinguer du produit classique, et on peut les préparer de diverses façons connue expliqué ci-après. On met de la levure de boulangerie en suspension dans de l'eau et l'on chauffe la suspension en autoclave sous une pres-^ 5 sion de vapeur d'eau d'environ 0,7 - 1,75 bar . On refroidit en suite la suspension et l'on sépare la liqueur surnageante par décantation, centrifugation ou filtration. On soumet l'extrait de levure fraîche ainsi obtenue à une utilisation immédiate ou à une utilisation qui se produit au bout d'un petit nombre de 10 jours. Si l'on doit conserver cet extrait pendant une longue période, on le congèle ou le lyophilise. On utilise dans des milieux de culture les préparations d'extrait de levure fraîche en une proportion permettant de fournir au moins 0,5 % et de préférence environ 1,5 % des solides secs de l'extrait de levure fraîche. 15 Un autre procédé pour préparer de l'extrait de levure fraî che consiste à autolyser de la levure de boulangerie en maintenant une suspension 1:1 de levure dans de l'eau distillée sous du toluène (pour exclure l'air) durant trois jours à 50° - 55° C, puis en chauffant la matière jusqu'à l'ébullition et en la clari-20 fiant par centrifugation ou filtration pour séparer le liquide limpide. Les Demandeurs ont trouvé que^,si l'on n'utilise pas d'extrait de levure fraîche, la croissance de L. .sanfrancisco est très lente et elle nécessite par exemple 4 à 6 jours pour parve-25 nir à une croissance même légère. Comme antérieurement noté, des matières comme des extraits de levure du commerce et des hydrolysats de caséine du commerce ne peuvent remplacer l'extrait de levure fraîche. Cependant, on peut utiliser l'extrait et/ou les hydrolysats du commerce dans 30 la culture avec un extrait de levure fraîche pour atteindre un effet accru de stimulation sur la croissance. Des deux, les hydrolysats de caséine exercent une stimulation bien plus importante . En tenant compte des considérations précédentes, les milieux 35 de culture selon l'invention contiennent l'extrait de levure fraîche comme composant fondamental, et ces milieux contiennent également, de préférence, un extrait classique de levure en une proportion d'environ 0,3 % et de l'hydrolysat de caséine en une 72 06607 ii 2126452 proportion d'environ 0,2 à 1 %. L'utilisation de l'hydrolysat de caséine est particulièrement souhaitable. Le milieu de culture peut également contenir d'autres stimulants classiques comme de la biotine,des vitamines de la catégorie B, des hydrolysats de soja, de la liqueur d'infusion de maïs, des matières solubles de distillerie ou d'autres sources de nourriture azotée organique. Exemple 3 Pour examiner l'effet de différentes proportions d'extrait de levure fraîche sur la. croissance,on cultive deux souches de la bactérie à 31° C sur du bouillon pour culture de bactéries de pâte acide en faisant varier la quantité d'extrait de levure fraîche dans le bouillon. On estime le degré de croissance en mesurant le volume des cellules des cultures. Les résultats obtenus sont présentés dans le tableau III ci-après : TABLEAU III Effet de la proportion de levure fraîche sur la croissance des cultures en bouillon Extrait de levure Volume des cellules (ml/10 ml de culture) i fraîche, % Souche B - 24 heures Souche L -"24 heures 0,25 0,03 0,04 0,50 0,04 0,08 1,00 0,07 0,12 1,25 0,10 0,13 1,50 0,13 0,18 Acides gras insaturés : Les recherches des Demandeurs ont montré qu'un acide gras insaturé est une matière nutritive nécessaire pour la croissance de Lactobacillus sanfrancisco. Cette exigence peut être satisfaite si l'on ajoute au milieu de culture un dérivé d'un acide gras insaturé (par exemple un dérivé d'un acide oléique, linoléique, linolénique, ricinoléique, etc.) qui est soluble dans l'eau ou au moins capable d'être émulsionné dans l'eau. Ainsi, on peut utiliser les sels de sodium ou de potassium d'acides gras insa-turés ou des substances qui les contiennent,par exemple des savons de sodium ou de potassium provenant de l'huile d'olive, de l'huile de graînes de coton, de l'huile de lin, de l'huile de soja, de l'huile de carthame, de l'huile de maïs ou d'une autre 72 06607 12 2126452 : graisse ou huile qui contient des glycérides insaturés. D'autres dérivés utilisables sont des esters partiels d'acides gras insaturés et de sucres ou polyalcools, par exemple le mono-oléate de saccharose, le di-oléate 4e saccharose, le mono-oléate de glycé-5 roi, le mono-oléate d'éthylène-glycol, le monolinoléate de pen-taérythritol, le mono-oléate de mannitôl, etc. Parmi les esters de polyalcools, on préfère en particulier les esters de sorbitanne et d'acides gras insaturës comme le mono-oléate de sorbitanne les produits de la condensation de l'oxyde d'éthylène avec des 10 esters de sorbitanne et d'acides gras comme le dérivé polyoxyéthy-lénique de mono-oléate de sorbitanne ; et les produits de condensation de l'oxyde d'éthylène avec des acides gras insaturés comme le mono-oléate de polyoxyêthylène. D'autres dérivés utilisables sont les lécithines qui contiennent des fragments d'acides 15 gras insaturés comme l'acide oléique. En général, il ne faut qu'une faible proportion du dérivé d'acide gras insaturë , par exemple environ 0,01 % à environ 0,1 %. Exemple 4 Pour examiner l'effet de différentes proportions du dérivé 20 polyoxyéthylénique de l'oléate de sorbitanne (POS) sur la croissance, on cultive la souche 3 de la bactérie sur de la gélose pour bactéries pour pâte acide en faisant varier la quantité de de dérivé polyoxyéthylénique de l'oléate de sorbitanne (POS). Voi ci les résultats obtenus : 25 TABLEAU IV Concentration de POS, Dimension des colonies au bout de % deux jours à 31° C O Néant 0,0075 Très petites (non dénombrables) 30 0,02 Moyennes 0,035 Grandes 0,05 Grandes Atmosphère gazeuse : La bactérie est indifférente à l'oxygène. On peut donc la 35 cultiver dans des conditions anâërobies ou aérobies. La présence de gaz carbonique est généralement bénéfique et peut même stimuler la croissance. Par conséquent, dans une variante préférée de l'invention, on effectue la culture dans une atmosphère contenant 13 72 06607 2126452 ! ce gaz. On peut y parvenir en refoulant'., en totalité ou en partie, l'air que l'on chasse de l'espace supérieur du récipient de culture par du C02. Une exclusion totale de l'air n'est pas nécessaire et l'atmosphère située au-dessus du bouillon de culture 5 peut contenir, par exemple, environ 25 à 95 % en.volume de C02 (le reste étant de l'air). En variante, on peut faire diffuser du CO2 dans la culture ou bien y faire diffuser des mélanges d'air et de CO2 contenant 25 à 95 % en volume de CÛ2* Température : 10 Comme noté ci-dessus, les bactéries sont mésophiles ; elles croissent mieux à une température modérée d'environ. 25° - 35° C bien que leur croissance s'effectue dans toute la gamme comprise entre environ 15° et environ 40° C. On n'observe pas de croissance S 45° C. 15 Exemple 5 Pour examiner l'effet de la température, on cultive la souche L à diverses températures sur de la gélose ou du bouillon pour la culture de la bactérie de pâte acide . Les résultats obtenus sont résumés dans le tableau V ci-après : 20 TABLEAU V Effet de la température sur la croissance £ Croissance sur de la gélose BPA 3B£ Température, jours 0 C. 25 13 - - +1 24 +2 +3 +4 31 +3 +4 +4 37 — +1 +2 £ Les données présentées concernent la souche L. On obtient 30 des résultats similaires pour les souches B et T, à l'exception , possible d'une croissance légèrement plus faible à 13° C. SX B P A : Bactéries pour pâte acide Explication des symboles : - : Pas de croissance ; 35 - • Très faible croissance ; + 1 : Très légère croissance ; + 2 : Légère croissance ; + 3 : Croissance modérée ; + 4 : Forte croissance. 72 06607 14 2126452 TABLEAU VI Effet de la température sur la croissance fc 10 15 20 25 30 Température Croissance dans du bouillon pour B P A (0,5 % d'extrait de levure fraîche) Volume des cellules (ml/10 ml de culture) pH Temps ( jours ) 1 , 2 3 6 ■ Temps ( jours ) 1 - 2 3 ' 6 13° C 31° C 45° C 0 0,03 0,04 0,07 0,09 0,14 0,15 0,14 0 0 0 0 5,2 4,5 4,2 3,9 4,2 3,9 3,6 3,7 5,1 5,2 5,2 5,3 * Les données présentées concernent la souche L. On obtient des résultats similaires avec les souches B et T à l'exception possible d'une croissance légèrement plus faible à 13° C. Effet du PH : Une autre caractéristique particulièrement distinctive de Lactobacillus sanfrancisco est que cette bactérie croît mieux dans un milieu nettement acide, c'est-à-dire un milieu ayant un pH inférieur à 6. A cet égard, le micro-organisme contraste fortement avec les espèces connues de lactobacilles. Puisque le micro-organisme produit de l'acide, le milieu va devenir acide même s'il ne l'était pas à l'origine. Cependant, on atteint un meilleur taux de croissance lorsque le milieu est acidifié quand la culture débute. Par conséquent, dans le mode préféré de réalisation de l'invention, lorsqu'on prépare le milieu, on l'acidifie jusqu'à un pH d'environ 5 - 6. A cette fin, on peut utiliser l'acide lactique, l'acide acétique, l'acide chlorhydrique ou bien un autre acide non toxique. En général, on préfère les acides chlorhydrique et acétique. Exemple 6 Pour vérifier l'effet de différents pH de départ, on ajuste à divers pH, à l'aide de HC1, des échantillons de bouillon pour culture de bactérie de pâte acide (B P A), contenant 0,5 % d'extrait de levure fraîche (E L F), et l'on cultive diverses souches de la bactérie sur des échantillons à 31° C. Voici les résultats obtenus : 72 06607 15 2126452 ' TABLEAU VII Effet du pH initial sur la croissance + Souche' T Souche L * Volume des pH Volume des pH pH initial cellules (ml/lOml cellules (ml/lOml de culture) de culture) 24 H. 48 H. 24 H. 48 H. 24 H. 48 H. 24 H. 48 H. 6,5 (non 0,01 0,04 5,6 4,2 0,00 0,10 5,9 4,1 ajusté) 6,0 0,02 0,05 4,3 3,8 0,07 0,12 4,3 3,8 5,5 0,03 0,08 4,1 3,8 0,15 0,13 4,2 3,8 .5,0 0,07 0,19 4,1 3,7 0,19 0,17 4,1 3,7 * On ajuste initialement le pH du bouillon pour la culture des bactéries de pâte acide (0,5 % d'extrait de levure fraîche) 15 â l'aide de HC1. On obtient des résultats similaires avec des souches B et C. Production d'acides : Comme noté ci-dessus, les bactéries produisent de l'acide lactique et de l'acide acétique, avec une plus forte proportion 20 d'acide lactique. Cette propriété de Lactobacillus sanfrancisco est démontrée dans l'exemple suivant. Exemple 7 On cultive la souche B sur du bouillon pour culture de bactéries de pâte acide (1,5 % d'extrait de levure fraîche) à 25 31° C durant deux jours, et l'on effectue une analyse pour déterminer la quantité et le genre d'acides produits. Les résultats obtenus sont présentés au tableau 8 ci-après : TABLEAU VIII Production d'acide lactique et d'acide acétique dans du 30 bouillon de culture de bactéries pour pâte acide * Acidité totale, micromoles/ml 67,8 Acide lactique, pourcentage de la totalité de l'acide produit 75 Acide acétique, pourcentage de la totalité 35 de l'acide produit 25 •k Ces chiffres sont corrigés pour tenir compte de l'acide lactique et de l'acide acétique présents dans le milieu non inoculé . 72 06607 16 2126452 En tenant compte des divers facteurs mis en lumière ci-des-sus, on donne ci-après à titre illustratif des formulations ou compositions de milieux de culture selon l'invention : Ingrédient " Quantité 5 Maltose (ou un autre hydrate de Au moins 0,5 %, de préférence carbone contenant du maltose) 2 % environ (de maltose) Dérivés d'acides gras insaturës Environ 0,01 à 0,1 l,de préférence 0,03 % environ Extrait de levure fraîche Au moins 0,5 %, de préférence 10 1,5 % environ Hydrolysat de caséine (facultatif) Environ 0,2 â 1 % Extrait classique de levure (facultatif) 0 à 1 % 15 Eau Pour compléter à 100 % On ajuste le pH à une valeur comprise entre 5 et 6. Avant son utilisation, on stérilise le milieu par traitement à l'autoclave, par exemple à la pression de 1,05 bar; durant 15 minutes. 20 Récolte : Dans diverses applications de l'invention, on peut utiliser directement les cultures de L. sanfrancisco. Par exemple, pour démarrer de nouvelles cultures, on peut utiliser une portion d'une culture antérieure à titre d'inoculum. Dans la plupart des cas 25 cependant, on préfère récolter les cellules bactériennes de la culture et les utiliser sous une telle forme isolée. On préfère cette technique, par exemple, pour préparer des levains liquides de départ ou de première pour produire du pain français à pâte acide . 30 On effectue de façon typique la récolte en centrifugeant le bouillon contenant la culture pour séparer les cellules. On lave ensuite, de préférence, le concentré de cellules ainsi obtenu pour enlever les matières nutritives et les produits du métabolisme. Pour ce lavage, les Demandeurs utilisent habituellement 35 une solution aqueuse diluée de NaCl. Si l'on ne doit pas utiliser le concentré de cellules peu après sa préparation, on peut le conserver en le congelant. Pour obtenir de meilleurs résultats, on incorpore dans le concentré 72 06607 17 2126452 de cellules un véhicule de stabilisation avant la congélation. Comme véhicule, on peut utiliser des substances comme le glycé-rol, le diméthyl-sulfoxyde, le lait écrémé, les protéines du lait, des hydrolysats de protéines du lait, le saccharose, du sirop de 5 glucose et notamment du sirop de maïs, etc. Une partie du véhi cule total est de préférence constituée par du milieu frais, c'est-S-dire du bouillon pour la culture de bactéries de pâte acide ou un autre milieu nutritif liquide, comme décrit ici, qui est utile pour la culture de L. sanfrancisco. Dans des cas typi-10 ques, on incorpore, à 10.0 parties du concentré, de cellules, 100 à 200 parties d'un véhicule stabilisant contenant environ 3 à 30 % de glycérol, le reste étant du milieu nutritif liquide, par exemple du bouillon pour culture de bactéries de pâte acide . Pour éviter une contamination du concentré des cellules, il con-15 vient de stériliser, avant son utilisation, le véhicule que l'on va ajouter. On soumet de préférence le concentré des cellules, comportant le véhicule ajouté, à une congélation rapide, par exemple en utilisant un agent réfrigérant surfondu comme l'azote liquide et l'on maintient ce concentré à une température inférieure à 20 0° Ç. ce qui permet â ce produit de conserver sa viabilité pendant des périodes considérables de temps. Des modes opératoires typiques pour la récolte et la conservation des préparations bactériennes sont présentés dans l'exemple illustratif suivant. 25 Exemple 8 On cultive L. sanfrancisco sur un bouillon nutritif comme précédemment décrit, et l'on récolte les cellules par centrifugation du bouillon, en utilisant de préférence une centrifugeuse réfrigérée. On lave ensuite le gâteau de centrifugation â l'aide 30 d'une solution aqueuse refroidie, contenant 1 % de sel, pour enlever les matières nutritives, les produits du métabolisme, etc. On peut ensuite utiliser les cellules ainsi lavées comme inoculum bactérien pour la préparation d'un levain liquide de départ ou de première. 35 Si l'on n'a pas besoin d'utiliser les cellules peu de temps après leur préparation, on peut les conserver comme suit : On met 100 parties des cellules lavées en suspension dans 200 parties d'un véhicule stabilisant (mélange de 60 parties de 72 06607 18 2126452 glycérol et de 140 parties de bouillon stérile pour la culture de bactéries de pâte acide ) et l'on soumet la suspension à une congélation très, rapide, en utilisant de l'azote liquide ou une bouillie de neige carbonique dans l'acétone. On maintient ensui-5 te la culture à l'état congelé (température égale ou inférieure à - 29° C) ce qui permet à la culture de conserver sa viabilité pendant 2 mois au moins. Lorsqu'on doit utiliser le produit, on le soumet à un dégel rapide jusqu'à 21° - 27° C et on l'utilise immédiatement. 10 Utilisation des préparations bactériennes : On peut utiliser les produits de l'invention, les cultures, les cellules bactériennes isolées ou les concentrés de cellules, etc., pour diverses applications comme la transformation du maltose en acide lactique et acide acétique. Une utilisation préfé-15 rêe consiste à préparer des levains liquides de départ ou de première pour la production du pain français à pâte acide . Les exemples suivants illustrent une telle utilisation du produit de l'invention. Exemple 9 20 Préparation du levain liquide de départ ou de première Dans une cuve équipée d'un agitateur, on prépare une suspension des ingrédients suivants : 100 parties de farine, 150 parties d'eau et 2 parties de sel. On ajuste le pH de la suspension à une valeur d'environ 5,5 25 à l'aide d'acide acétique ou chlorhydrique. On inocule ensuite des concentrés de cellules de levure pour pâte acide (qui peuvent ne pas comporter de matière amylacée), Torulopsfe holmii, et de cellules de bactérie de pâte acide (qui peuvent également ne pas comporter de matière amylacée ), Lactobacillus sanfran- 30 cisco, de façon à fournir environ 2 x 10^ cellules de levure par 8 gramme et environ 1 X 10 cellules de bactérie par gramme. On développe ensuite la suspension en la conservant à 27° C environ durant six à huit heures, en appliquant juste assez d'agitation pour maintenir la farine en suspension. Pendant cette pé-35 riode, la levure et la bactérie se multiplient à une vitesse rapide, en donnant un levain liquide de première ou de départ que l'on peut utiliser pour formuler une pâte afin de préparer du pain français à pâte acide . 72 06607 19 2126452 Si l'on n'a pas besoin directement après son développement du levain liquide de première ou de départ ainsi développé, on peut refroidir ce levain jusqu'à une température d'environ 10° -13° C, et le maintenir à cette température jusqu'à ce qu'on en 5 ait besoin pour préparer la pâte. Si l'on doit conserver le levain de première pendant une période prolongée de temps, il est préférable de diminuer le temps de développement, par exemple en le ramenant à environ 2 à 4 heures, puis de refroidir le levain jusqu'à une température de 10° - 13° C et de le maintenir à cette 10 température jusqu'à ce qu'on doive l'utiliser'. Exemple 10 Préparation du pain français à pâte acide On mélange 200 parties de farine (à teneur élevée en gluten), 500 parties d'eau et 4,4 parties de sel, et l'on ajuste le pH 15 de la suspension résultante à 5,2 par addition d'acide chlorhydrique. A la suspension, on inocule 1 partie d'un concentré de cellules de Torulopsis holmii et 5 parties d'un concentré de cellules de Lactobacillus sanfrancisco, puis l'on développe durant huit heures à 24° - 27° C. On utilise ensuite le levain liquide 20 de départ ou de première que l'on a ainsi obtenu pour préparer du pain comme expliqué ci-après. A partir du levain liquide de première développé, on prépare une pâte en utilisant la formulation ou composition suivante! 592 parties de farine (pour pain normal) ; 25 226 parties de levain liquide de première ; 238 parties d'eau ; 10,8 parties de sel ; 23,1 parties de solution aqueuse à 0,1 % de KB-rO^ ; 9,9 parties d'une solution aqueuse à 0,1 % de KIO^. 30 On malaxe la pâte durant 5 minutes environ dans un pétrin classique pour pâte , puis on laisse reposer durant 30 minutes. On pèse ensuite la pâte (on la divise en morceaux ou pâtons selon le poids) et l'on fait lever la partie supérieure durant 20 minutes à 32,5° C. On moule ensuite les pains ou les miches, on 35 les place sur une toile, et l'on fait lever durant six heures et demie environ à 29,5° - 32,5° C. Finalement, on taillade les miches et on les fait cuire dans un four saturé de vapeur d'eau. Sauf la formulation différente de la pâte, on effectue toutes 72 06607 2126452 les opérations depuis le pétrissage de la pâte jusqu'à la cuisson en opérant de façon classique pour la préparation du pain français à pâte acide par le procédé usuel de pâte sur levain. Le pain ainsi produit à une excellente saveur, une excellen-5 te texture et un bon volume. En particulier, le volume est de 1 685 ml pour un pain ou une miche de 425 g. Pour développer une structure appropriée dans le pain, on ajoute à la pâte un oxydant traditionnel. En général, les Demandeurs ajoutent environ 50 parties par million d'un oxydant comme 10 le bromate ou l'iodate de potassium ou l'acide ascorbique ou l'azo-dicarbamide. Un oxydant préféré est constitué de 35 parties par million de KBrO^ et 15 parties par million de KIO^. On incorpore de préférence dans la pâte l'oxydant sous forme d'une solution aqueuse diluée, en tenant compte de cette eau pour le calcul du 15 rapport total entre l'eau et la farine dans la pâte. En variante, on peut ajouter l'oxydant sous forme de pastilles ou comprimés. Exemple 11 Isolement de Lactobacillus sanfrancisco Cet exemple montre comment l'on peut isoler Lactobacillus 20 sanfrancisco à partir d'une source comme un levain de première ou de départ pour pâte acide ou à partir d'une pâte pour pain préparée à partir de ce levain. On mélange intimément une faible quantité de la matière de source de départ, par exemple 1 g, avec de l'eau stérile ou avec 25 une solution aqueuse stérile de peptone (1 %). On enlève une portion de la suspension résultante et l'on mélange avec une quantité supplémentaire d'eau stérile ou une solution stérile de peptone. On répète un certain nombre de fois ce processus de dilution jusqu'à avoir dilué la matière de source ou de départ selon 0 30 le rapport approximatif de 1:10 . On utilise ensuite 0,1 à 1 ml du liquide dilué pour inoculer une plaque de gélose pour culture de bactéries de pâte acide (comme décrite ci-dessus) et l'on fait incuber la plaque à 31° C durant un à deux jours. La bactérie voulue va apparaître 35 sous forme de nombreuses colonies incolores, translucides et sphériques ayant un diamètre égal ou inférieur à I mm environ. S'il y a sur la plaque croissance d'une levure pour pâte acide (qui est un constituant de la source d'origine), on peut facilement distinguer cette levure de la bactérie en opérant de la 72 06607 21 2126452 façon suivante : Les colonies de levure pour pâte acide vont être présentes en petit nombre - environ 1/50 â 1/100 du nombre des colonies des bactéries ; ces colonies de levure vont avoir un diamètre bien plus grand (égal ou supérieur à 5 mm environ) ; et elles vont avoir un aspect opaque qui contraste avec l'aspect translucide des colonies bactériennes. En utilisant une aiguille stérile, on prélève une colonie de bactéries de la plaque, on la transfère sur une gélose inclinée pour culture de bactéries de pâte acide , on fait incuber à 31°C durant un à deux jours,, puis l'on refroidit jusqu'à 7° - 10° C et l'on maintient à cette température. Ce produit est la culture pure voulue de L. san«-francisco. En transférant une portion de la culture toutes les 4 à 6 semaines sur une gélose inclinée fraîche pour culture de bactéries de pâte acide , en faisant incuber à nouveau et en maintenant à 7° - 10° C, on peut maintenir indéfiniment le micro-organisme à. 1 'état viable. 06607 22 2126452 REVENDICATIONS 1 - Procédé de culture de l'espèce bactérienne pour pâte acide , T.actobacillus sanfrancisco. caractérisé en ce qu'on prépare un milieu nutritif contenant du maltose, on inocule ce milieu à l'aide de cellules viables de cette espèce bactérienne et l'on provoque la croissance et la prolifération de l'espèce en cause dans ce milieu. 2 - Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que le milieu nutritif contient un dérivé d'acide, gras insaturë, qui est notamment un ester d'acide oléique ou linoléique soluble ou émulsionnable dans l'eau et en particulier un polyalcool partiellement estérifié par l'acide oléique ou un dérivé polyoxyéthylénique de mono-oléate de sorbitanne. 3 - Procédé selon la revendication 1 ou la revendication 2, caractérisé en ce que le milieu nutritif contient également de l'extrait de levure fraîche. 4 - Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, caractérisé en ce que le milieu nutritif ne comporte essentiellement pas de matière amylacée. 5 - Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 4, caractérisé en ce qu'on ajuste initialement le pH du milieu nutritif à une valeur égale ou inférieure S 6. 6 - Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce qu'on opère à une température comprise entre environ 25° et 35" C. 7 - Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce qu'on opère dans une atmosphère contenant environ 25 à 95 % en volume de CO 8 - Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que l'espèce de bactérie. , Lactobacillus sanfrancisco, est le seul micro-organisme servant d'inoculum. 9 - Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que, après l'inoculation et la croissance, on centrifuge la culture pour séparer les cellules bactériennes que l'on soumet éventuellement à un lavage par une solution aqueuse diluée ayant une concentration de soluté équivalant à 0,5 - 1,0 % de NaCl. 10 - Procédé selon la revendication 9, caractérisé en ce 72 06607 23 2126452 qu'on met les cellules, après leur lavage, en suspension dans un véhicule stabilisant, et l'on congèle la suspension résultante que l'on conserve à l'état congelé. 11 - Composition bactérienne, caractérisée en ce qu'elle 5 comprend un mélange de cellules viables'de Lactobacillus sanfran cisco et d'un véhicule stabilisant contenant notamment du gly-cérol ou du diméthyl-sulfoxyde, et éventuellement aussi d'un milieu nutritif. 12 - Composition bactérienne selon la revendication 11, ca-10 ractërisée en ce qu'elle ne contient pas d'âutieraicro-organisme que Lactobacillus sanfrancisco. 13 - Composition bactérienne selon la revendication 11 ou 12, caractérisée en ce qu'elle ne comporte pas de matière amylacée. 15 14 - Procédé pour préparer un levain liquide de départ ou de première pour produire du pain français à pâte acide, caractérisé en ce qu'on forme une suspension d'eau et de farine selon une proportion d'environ 150 à environ 300 parties d'eau pour 100 parties de farine ; on inocule à cette suspension des cellu-20 les viables de la levure de pâte acide, Torulopsis holmii, et de la bactérie de pâte acide , Lactobacillus sanfrancisco ; et l'on développe la suspension ainsi inoculée à une température d'environ 13° - 27° C pour provoquer la prolifération des micro-orga-nismes ainsi ajoutés, le développement s'effectuant notamment à 25 une température initiale d'environ 24° C et une température finale d'environ 27° C. 15 - Procédé selon la revendication 14, caractérisé eh ce que la suspension contient, â titre d'ingrédient supplémentaire , une proportion de sel comprise entre environ 1 et 3 parties pour 30 100 parties de farine. 16 - Procédé selon la revendication 14 ou la revendication 15, caractérisé en ce qu'on acidifie la suspension au départ, jusqu'à un pH d'environ 5, par addition d'un acide non toxique. 17 - Procédé selon l'une quelconque des revendications 14 à 35 16, caractérisé en ce qu'on effectue l'inoculation à l'aide d'une portion d'un levain liquide de départ ou de première provenant d'une pétrissée antérieure. 18 - Procédé selon l'une quelconque des revendications 14 à 72 06607 24 2126452 17, caractérisé en ce qu'on effectue l'inoculation à l'aide de cellules des micro-organismes indiqués ne comportant pas de matière, amylacée . 19 - Procédé selon l'une quelconque des revendications 14 à 5 18, caractérisé en ce qu'on effectue l'inoculation à l'aide de cultures pures des micro-organismes indiqués. 20 - Procédé selon l'une quelconque des revendications 14 à 19, caractérisé en ce que l'inoculation fournit une concentration de cellules de levure de pâte acide d'environ 1 à 5 millions 10 par gramme et une concentration de cellules de bactérie de pâte acide représentant environ 30 à 100 fois la concentration des cellules de levure. 21 - Procédé selon l'une quelconque des revendication 14 à 20, caractérisé en ce que, après le développement de la suspen-15 sion inoculée, on refroidit cette suspension jusqu'à une température d'environ 10° à 13° C et l'on maintient la suspension à cette température en vue d'une utilisation future. 22 - Levain liquide de départ ou de première destiné notamment à la production de pain français à pâte acide , caractérisé 20 en ce qu'il comprend de l'eau et de la farine en une proportion d'environ 150 à environ 300 parties d'eau pour 100 parties de farine, d'une part, et des cellules viables de la levure de pâte acide , Torulopsis holmii, et de la bactérie de pâte acide, Lactobacillus sanfrancisco , d'autre part. 25 23 - Levain liquide selon la revendication 22, caractérisé en ce qu'il contient en outre une proportion de sel d'environ 1 à 3 parties pour 100 parties de farine. 24 - Levain liquide de première, utile notamment pour la production de pain français à pâte acide, caractérisé en ce que 30 ce levain est le produit préparé par le développement d'une suspension de farine, d'eau, en une proportion d'environ 150 à 3 00 parties d'eau pour 100 parties de farine, de sel en une proportion d'environ 1 à 3 parties de sel pour 100 parties de farine, et de cellules viables de la levure de pâte acide Torulopsis 35 holmii, et de la bactérie de pâte acide, Lactobacillus sanfrancisco, cette suspension contenant, après son développement, une concentration d'environ 10 à 50 millions de cellules de levure par gramme et une concentration de bactérie, représentant environ 30 à 100 fois la concentration de la levure. 72 06607 25 2126452 1 25 - Procédé perfectionné pour préparer du pain français à pâte acide , selon lequel on formule une pâte avec un levain de première pour assurer l'action nécessaire de levée et d'acidula-tion/ et l'on soumet la pâte S une série de stades comprenant 5 une division, une levée et une cuisson, caractérisé en ce qu'on formule la pâte avec un levain liquide de première préparé par le développement d'une suspension de farine,d'eau en une proportion d'environ 150 à 300 parties d'eau pour 100 parties de farine, de sel en une proportion d'environ 1 à 3 parties de sel pour 10 100 parties de farine, et de cellules viables de la levure de pâte acide de ^orulopsis holmii et de la bactérie de pâte acide , Lactobacillus sanfrancisco. cette suspension contenant après le développement une concentration d'environ 10 à 50 millions de cellules de levure par gramme et une concentration de bactérie 15 représentant environ 30 à 100 fois la concentration de cette levure. 26 - Procédé selon la revendication 25, caractérisé en ce qu'on incorpore dans la composition ou formulation de pâte du pain un oxydant qui est notamment choisi parmi un mélange de KBrOg 20 et de KIO^, d'une part^et l'acide ascorbique ou 1'azodicarbamide, d'autre part.