FR 2132291 A1 19721117 FR 7211362 A 19720330 72 11362 i 2132291 La présente invention se rapporte, d'une manière générale,-à des enzymes qui décomposent l'amidon et concerne plus particulièrement la préparation de /^-amylases. La décomposition de l'amidon à l'aide de /3-amylases eonver-5 tissant l'amidon en maltose, est connue. Les ^-amylases connues sont d'origine végétale : on les trouve dans le malt, l'orge et la patate douce. La demanderesse a maintenant découvert qu'on pouvait produire des /3-amylases à l'aide de bactéries. On a trouvé des microrganismes convenant à cette préparation dans des échantillons de terre recueillis 10 au voisinage d'usines de traitement de l'amidon et dans les eaux usées. On a procédé à des cultures sur plaque des échantillons de terre ou d'eaux usées sur un milieu bouillon-gélose contenant de l'amidon et on a procédé à une première sélection des microrganismes en fonction de l'aptitude des milieux à donner la réaction de l'iode-amidon après culture. Les souches 15 sélectionnées ont été transférées dans des milieux liquides respectifs contenant 1% de bouillon et 1% d'amidon et on les a fait incuber pendant 2 jours à 30°C sous agitation, après quoi- on a séparé les cellules par filtration. On a mélangé 1 ml de chaque filtrat avec un volume égal 20 d'une solution à 4 % d'amidon solubie et on a abandonné les mélanges au repos pendant une nuit à 40°C. On a ensuite soumis à chromatographie sur papier avec un système solvant butanol-pyridine-eau et du nitrate d'argent comme révélateur. Les microrganismes ci-après dont le bouillon filtré produit une tache unique de maltose dans le chromatogramme sur papier, ont 25 été sélectionnés pour étude plus approfondie. Bacillus megaterium B-8 FERM-P 936 Bacillus megaterium IFO 3003 Bacillus megaterium B-32 FERM-P 937 Bacillus circulans IFO 3529 30 Bacillus sp. B-299 Actinomycetes sp. B-45 Aspergillus sp. B-56 Deux des souches identifiées par leurs numéros d'accès à l'IFO sont connues; les autres ont les propriétés bactériologiques suivantes : 35 Bacillus megaterium B-8 FERM-P 936 1. Caractéristiques morphologiques. Cellules végétatives. GOPV 72 11362 2 2132291 Forme : bâtonnets, 1,0 à 1,5 sur 2,0 à 5,0 microns, avec extrémités arrondies, quelquefois de forme régulière avec extrémités pointues, apparaissant isolément où en chaînes courtes, quelquefois en chaînes longues. 5 Protoplasme : granulaire ou mousseux après légère coloration par le bleu de méthylène. Formes associées : pas de formes associées. Motilité : mobile. Coloration Gram : Gram-positif. 10 Bourgeonnement : bourgeons à l'extrémité sur le côté des bâtonnets. Spores et sporanges. Sporanges : pas nettement gonflés. Spores Formes : 1,0 à 1,5 microns sur 1,5 à 2,0 microns, ellipsoïdaux à cylindriques. 15 Position : centrale à subterminale. Parois : minces. Formation : grande quantité formée en milieu bouillon en 24 h. Milieu gélose. Colonies sur gélose : rondes, entières, convexes, ne s'étendant pas, chatoyante, 20 blanc crème. Gélose inclinée : Croissance abondante, irrégulière, perlée, chatoyante, translucide à opaque, non adhérente, molle, blanc crème. Gélose inclinée au glucose : croissance plus forte et plus molle que sur gélose, irrégulière, perlée, chatoyante, opaque, 25 non adhérente, blanc crème. Gélose inclinée au nitrate et glucose : croissance très forte, en relief, échinulée, jaune brunâtre, crème. Gélose inclinée à la tyrosine : croissance modérée, opaque, blanc crème à jaune, perlée. 30 Gélose inclinée au soja : croissance très forte, échinulée, blanc crème à orangé, chatoyante. Plaque à la gélose au lait : large zone d'hydrolyse de la céséine. Pomme de terre : croissance abondante, irrégulière, en relief, non chatoyante, jaune citron. 35 Gélose inclinée à la pomme de terre : croissance très forte, irrégulière, en relief, chatoyante, échinulée, crème jaunâtre. 72 11362 3 2132291 2. Caractéristiques physiologiques. Bouillon : turbidité uniforme avec sédiment relativement abondant. Le pH du bouillon est de 7,8 à 30°C en 15 jours. Bouillon au glucose : Turbidité uniforme avec fort sédiment. pH du bouillon 5 4,7 à 30°C en 15 jours. Lait : peptonisé. Bouillon au glucose et NaCl : croissance jusqu'à une concentration de 8%. Faible croissance aux concentrations de 9 à 10%. Liquéfaction de la gélatine. 10 Piqûre sur gélatine : liquéfaction stratiforme à 25°C. Plaque de gélose à la gélatine : large zone d'hydrolyse à 30°C. Utilisation des sucres : acide,mais pas de gaz (avec sels d'ammonium comme seule source d'azote) à partir de glucose, saccharose, mannitol, arabinose. Ni acide, ni gaz à partir de xylose (à 30°C pendant 15 7 jours) . Hydrolyse de l'amidon : hydrolysé. Acétylméthylcarbinol : pas de production à 30°C en 1 à 3 jours. Utilisation de citrate comme seule source de carbone : utilisé avec le milieu au citrate de Koser. 20 Réduction des nitrates : pas de production de nitrite à partir des nitrates à 30°C en 1 à 3 jours. Production d'indole : pas de production à 30°C en 1 à 3 jours. Réduction du bleu de méthylène : négative. Demande d'oxygène : pas de croissance à croissance rare dans bouillon au 25 glucose en culture anaérobie. Température de croissance : optimale entre 30 et 40°G, maximale entre 45 et 50°C. Catalase : positive. Bacillus megaterium B-32 FERM-P 937 30 1. Caractéristiques morphologiques. Cellules végétatives. Forme : bâtonnet^ 1,0 à 1,5 sur 2,0 à 5,0 microns, apparaissant isolément, par paire, en chaînes courtes, en chaînes longues, avec quelques chaînes latérales ou en filaments. 35 Protoplasme : granulaire ou mousseux après légère coloration au bleu de méthylène. Forme associée : pas de forme associée. ... 72 11362 4 2132291 Motilité : non mobile. Coloration Gram : Gram-positif. Bourgeonnement : bourgeons à l'extrémité ou sur le côté des bâtonnets. Spores et sporanges. .5 Sporange : pas nettement gonflé. Spores. Forme : 0,8 à 1,5 sur 1,0 à 2,0 microns, ellipsoïdale, quelquefois irrégulière, presque sphérique, réniforme et oviforme. Position : centrale à paracentrale. 10 Paro i : mince, Formation : presque formé en milieu bouillon en 24 h. Milieu gélose. Colonies : irrégulières, lobées. Gélose inclinée : croissance abondante, perlée, chatoyante, translucide à 15 opaque, non adhérente, couleur crème. Gélose inclinée au glucose : croissance plus forte et plus molle que sur gélose, irrégulière, perlée, chatoyante, opaque, non adhérente, blanc crème. Gélose inclinée au nitrate et glucose : croissance abondante, en relief, 20 blanc crème à jaune crème, échinulée, presque pas chatoyante. Gélose inclinée à la tyrosine : croissance modérée, opaque, blanc crème à jaune brunâtre, perlée. Gélose inclinée au soja : croissance très forte, échinulée, crème à blanc orangé, presque pas chatoyante. 25 Plaque de gélose au lait : large zone d'hydrolyse de la caséine. Pomme de terre : croissance abondante, en relief, régulière, chatoyante ou non, ridéey crème. Gélose inclinée à la pomme de terre : croissance très forte, irrégulière, en relief, légèrement chatoyante, échinulée, crème. 30 2. Caractéristiques physiologiques. Bouillon : turbidifcé uniforme avec sédiment relativement abondant. pH du bouillon 8,0 à 30°C en 15 jours. Bouillon au glucose : turbidité uniforme avec fort sédiment. Pas de pellicule en surface mais pellicule annulaire épaisse et fragile. 35 Lait : peptonisé. Bouillon au glucose et au chlorure de sodium : croissance jusqu'à une concentration de 87o. Faible croissance aux concentrations de 9 à 107». 72 11362 5 2132291 Liquéfaction de la gélatine. Piqûre sur gélatine : lente liquéfaction stratiforme à 25°C. Plaque de gélose à la gélatine : large zone de liquéfaction à 30°C. Utilisation des sucres : acide mais pas de gaz (avec sel d'ammonium comme 5 seule source d'azote) à partir de glucose, saccharose^ mannitol, arabinose, xylose. Hydrolyse de l'amidon : hydrolysé. Acétylméthylcarbinol : pas de production à 30°C en 1 à 3 jours. Utilisation du citrate (comme seule source de carbone) : utilisée avec 10 le milieu au citrate de Koser. Réduction des nitrates : production de nitrite à partir des nitrates. Production d'indole : pas de production à 30°C en 1 à 3 jours. Réduction du bleu de méthylène : négative. Demande d'oxygène : aérobie, pas de croissance à croissance rare dans bouillon 15 au glucose en culture anaréobie. Température de croissance : optimale, de 30 à 40°C, maximale, de 45 à 50°C. Catalase : positive. Bacillus sp. B-299 20 Provisoirement identifié au microscope comme Bacillus du fait qu'il s'agit de bactéries en forme de bâtonnets formant des spores apparaissant isolément, par paires ou en chaînes. Actinomycetes sp. B-45 Identification provisoire par examen microscopique. 25 Aspergillus sp. B-56 Identification provisoire par examen microscopique. Toutes ces souches ont pu être cultivées dans des cultures liquides sous secousse, en culture statique ou en culture solide, et après 2 à 3 jours à la température de 30 à 37°C, on a observé une accumulation de (3-amylase 30 dans le milieu de culture. On a déterminé l'activité enzymatique des bouillons débarrassés des cellules et des autres liquides aqueux mentionnés ci-après, par mélange de 1 ml de liquide avec 9 ml de solution d'amidon à 0,5%, en faisant suivre d'une incubation du mélange au pH optimal pour l'amylase utilisée, pendant 35 30 mn à 40°C; on a alos déterminé quantitativement le maltose formé par la méthode de Fehling-Lenmann-Schoorl. L'activité enzymatique donnant 10 mg de maltose dans les conditions indiquées est considérée comme l'unité. 72 11362 6 2132291 Les (#-amylases produites par les différentes souches nouvelles décrites ci-dessus, diffèrent légèrement par leur intervalle optimal de pH et leur intervalle de pH stable. Ces intervalles de pH sont indiqués ci-après : 5 Souche : B-32 B-8 B-299 B-45 B-56 pH optimal : 6,5 6,0 6,5-6,6 6,0 5,8 pH stable : 4,2-8,0 4,5-7,0 4,2-7,0 4,5-7,0 4,0-7,5 10 La jS-amylase produite par la souche B-32 ci-dessus agit sur 1'amidon avec formation de maltose et de dextrines ^-limitées. Elle est désactivée par le p-chloro-mercuribenzoate (PCMB) et réactivée par la cystéine. C'est me protéine présentant un poids moléculaire d'environ 50.000, mais qu'on n'a pas pu isoler sous la forme cristalline. L'électrophorèse avec focalisation dans un ampholyte a 15 fait apparaître un point isoélectrique de 9,14. La température de réaction optimale est de 50 à 65°C, et elle est entièrement désactivée à 40°C en 2 h à un pH inférieur à 3,4 ou supérieur à 9,5 ainsi que par un traitement à la chaleur à 70°C pendant 15 mn à pH 6,0. Lorsqu'on étudie ces amylases par la méthode à la carte des 20 oligosaccharides, on constate qu'elles agissent sur les résidus terminaux non réducteurs des oligosaccharides en les coupant en motifsde maltose, comme les/3-amylases typiques, par scission des liaisons oi-1,4-glucosidiques. Elles sont également efficaces sur l'amylose, 1'amylopectine, les dextrines, et les oligosaccharides. 25 Les exemples suivants illustrent l'invention sans toutefois la limiter : dans ces exemples, les indications de parties et de % s'entendent en poids sauf mention contraire. EXEMPLE 1 On stérilise dans un fermenteur à cuve un milieu contenant 30 5% de caséine de lait, 2% de liqueur de macération de maïs, 10% d'amidon soluble et la quantité d'eau nécessaire pour compléter un volume final de 15 1, on règle à pH 7,0-7,2 et on inocule par B. megaterium B-32. L'incubation dure 2 jours à 30°C sous agitation; à ce moment, le bouillon présente une activité enzymatique de 25,5 unités par millilitre. 35 On centrifuge la culture à 8000 tr/mn pendant 20 mn, afin d'éli miner les cellules; on mélange le liquide surnageant avec une quantité suffisante de sulfate d'ammonium solide pour précipiter une enzyme brute. 72 11362 7 2132291 On redissout dans une solution de tampon acétate M/100 et on dialyse la solution sur de l'eau courante pendant 3 jours. Les impuretés encore présentes sont précipitées par addition goutte à goutte d'une solution à 25% d'acétate de plomb. Le précipité est séparé par centrifugation. 5 L'enzyme est à nouveau insolubilisé par le sulfate d'ammonium, dissoute dans le tampon acétique M/100 à pH 6, et la solution chauffée 15 mn à 60°C. On dialyse comme ci-dessus et on adsorbe l'enzyme de la solution purifiée sur un tamis moléculaire pour chromatographie (SE-Sephadex G-25), on élue par une solution de chlorure de sodium M/2 et on filtre 10 sur Sephadex G-100. La fraction active est lyophilisée; on recueille 2000 mg de substance solide. Le prodiït présente une activité #-amylasique de 100 unités par milligramme et contient donc 50% de l'activité enzymatique du bouillon d'origine. 15 EXEMPLE 2 On stérilise des portions de 50 ml du milieu décrit dans l'exemple 1, dans des fioles de Sakaguchi et on inocule respectivement par B. megaterium B-8, Bacillus sp B-299, B. circulans IFO 3529, et B. megaterium IFO 3003, l'incubation dure 2 jours à 30°C sous agitation au bout desquels les cultures 20 sont débarrassées des cellules microbiennes par filtration. Les filtrats présentent des activités /3-amylasiques respectives de 13, 10, 15 et 3 unités par millilitre; on les traite comme décrit dans l'exemple 1 pour obtenir une enzyme solide purifiée à haute activité. On mélange des solutions d'amidon soluble avec 5 unités des 25 enzymes obtenues (pour 1 g d'amidon); on soumet les mélanges à une incubation de 10 h à 55°C et on analyse par chromatographie sur papier, comme décrit ci-dessus. On ne trouve que des taches de maltose. EXEMPLE 3 On stérilise deux portions de 300 ml d'un milieu aqueux contenant 30 31% de lactose, 5,5% de liqueur de macération de maïs et 1% de carbonate de calcium dans des flacons de 1000 ml et on inocule par des souches de B-45 et de B-46 respectivement. L'incubation dure 3 jours à 37°C sous agitation; les bouillons présentent alors des activités enzymatiques respectives de 5 et 8 unités par millilitre. On les traite comme décrit dans l'exemple 1; 35 on obtient des enzymes solides qui, par leur action sur l'amidon, se caractérisent comme des ^-amylases. 72 11362 8 2132291 Les collections de cultures dans lesquelles on peut trouver des cultures échantillons des microrganismes décrits dans la présente demande sont les suivantes : IFO : Institute for Fermentation Osaka City Japon. FERM-P : Fermentation Research Institute, Agency of Industrial Science and Technology, Chiba City Japon. 72 11362 2132291 9 REVENDICATIONS 1 - Procédé de préparation de la 'î-amylase, se caractérisant en ce que l'on cultive un microrganisme capable de produire de la /^-amylase extracellulaire dans un milieu contenant de l'amidon jusqu'à accumulation 5 d'une quantité substantielle de cette 2 - Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que, pendant la culture, l'amidon est converti uniquement en maltose. 3 - Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que 10 la ^-amylase peut agir sur une solution d'amidon et produit alors exclusivement du maltose dans le mélange de réaction. 4 - Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que le microrganisme cultivé sur un milieu de gélose au bouillon contenant de l'amidon convertit ce dernier uniquement en maltose. 15 5 - Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que le microrganisme appartient au genre Bacillus ou Actinomycetes. 6 - Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que le microrganisme est une souche de Bacillus megaterium. 7 - $-amylase bactérienne produite par le procédé selon la reven- 20 dication 1.