FR 2126312 A1 19721006 FR 7205981 A 19720222 cÂ» W ^*3 I - présente inv~?it : on ast relative aux matières protéiniques unicei- laires (en abrégé : PUC); et elle concerne, plus particulièrement, un procédé permettant d'abaisser la teneur en acides nucléiques dans de telles matières PUC. 5 Un récent rapport officiel concernant le bien-être de l'hu manité comportait la prise en considération de nouveaux moyens permettant d'alimenter le nombre rapidement croissant d'individus en cause. Le problème porte aussi bien sur l'apport du nombre adéquat de calories par tête que sur l'établissement d'un régime 10 alimentaire équilibré, compte tenu du fait bien connu d'une pénurie d'aliments apportant des protéines qui sévit dans de nombreuses parties du monde. Un moyen permettant de fournir à l'humanité les protéines nécessaires consiste essentiellement à cultiver et faire croître des microorganismes unicellulaires fournissant des 15 protéines, microorganismes tels que des levures, des bactéries, des algues ; les matières PUC ainsi obtenues sont utilisables soit comme aliments, soit comme suppléments (condiments, assaisonnements , etc.) nutritifs. La production de matières PUC en grandes quantités est réa-20 lisable par mise en oeuvre de procédés de fermentation utilisant comme substrat, par exemple, des hydrates de carbone, des hydrocarbures ou des matières hydrocarburées oxygénées. Les principales exigences sont que la matière servant de substrat soit peu coûteuse et soit facilement consommable par le microorganisme 25 choisi, de façon telle que les frais de mise en oeuvre du procédé ne soient pas excessifs. Il importe également beaucoup que la matière PUC obtenue soit bien acceptée par les consommateurs et ait une bonne valeur nutritive comme aliment ou composant d'aliments. Parmi ces dernières considérations figurent des caracté-30 ristiques organoleptiques (odeur, saveur, arôme) qui rendent le produit plus ou moins facilement accepté par les consommateurs, mais aussi des facteurs relatifs au métabolisme et à la toxicité qui régissent les conditions d'acceptabilité de la matière PUC en -question et la possibilité ou l'impossibilité de l'intégrer à un 3 5 régime alimentaire pour êtres.humains. Aussi bien dans la littérature technique que dans les brevets, on trouve la description de procédés de fermentation permettant de produire des microorganismes fournissant facilement d'intéressantes matières PUC utilisables. Par exemple, on a cul-4" tivé et fait croître des levures sur les hydrates de carbone con— ■N 72 05981 £ JSDJn tenus dans la liqueur résiduaire sulfitique de la fabrication de pâte à papier, sur des composants du type alcane normal d'un combustible hydrocarbure du type fuel-oil, et sur un mélange d'hydrocarbures oxygénés. La production de bactéries a été similairement 5 décrite. Une fermentation aboutissant à la production de levures ou de bactéries comporte une opération d'oxydation dégageant de très grandes quantités de chaleur et nécessitant à la fois un transfert substantiel d'oxygène et une bonne maîtrise exercée sur la température de fermentation. Des matières préférées pour 10 constituer le substrat doivent contenir autant d'oxygène combiné que possible pour minimiser le dégagement de chaleur et les besoins en oxygène. La production d'une matière PUC de qualité alimentaire peut nécessiter aussi la mise en oeuvre d'une opération d'extraction afin de limiter la présence d'une matière résiduelle 15 indésirable provenant du substrat et telle que des hydrocarbures de hauts poids moléculaires (en abrégé : PM) ou des espèces chimiques hydrocarburées oxygénées lentement fermentées. D'un certain nombre de procédés de fermentation en projet ou couramment utilisés pour la production de matières PUC, on attend 20 principalement la fourniture de suppléments alimentaires pour animaux, ce qui revient à ne mettre qu'indirectement des sources de protéines à la disposition des consommateurs humains. Toutefois, quelques microorganismes, et notamment certaines levures appartenant aux sous-familles des Saccharomycetoideae et des 25 Cryptococcoideae, ont été approuvés par des administrations gouvernementales compétentes (telles, aux Etats-Unis d'Amérique, que la Food and Drug Administration dont la compétence s'étend aux médicaments et aux substances alimentaires) en vue de leur utilisation directe dans des substances alimentaires destinées à 30 la consommation humaine. Le système métabolique humain produit de l'acide urique notamment dans le métabolisme de l'acide ribonucléique (en abrégé : ARN). Etant donné que le corps humain ne comporte pas un système enzymatique mettant en jeu de l'uricase, l'acide urique 3 5 n'y subit pas un clivage plus poussé et se trouve excrété dans l'urine. En raison du fait que l'acide urique n'est que très faiblement soluble dans l'eau, il s'accumule dans le corps sous la forme de cristaux s'il se trouve produit en quantités plus fortes que celles que le corps est capable d'excréter. Ceci peut con-40 duire à l'apparition de troubles du genre de ceux connus sous la COPY 72 05981 3 2126312 dénomination de goutte- Il est donc recommandé par de nombreux spécialistes de la nutrition (les diététiciens) de maintenir à un bas niveau la quantité d'ARN apportée au corps humain dans les aliments consommés. 5 Des cellules microbiennes, ou matières protéiniques unicel lulaires (PUC), contiennent de 4% à 30% et plus d'acides nucléiques selon leurs vitesses de croissance et la phase de leur croissance. Habituellement, les teneurs en acides nucléiques dans les cellules microbiennes sont d'autant plus élevées que les 10 phases de croissance correspondent à une allure de croissance plus rapide. Si les cellules microbiennes sont destinées à servir de source de protéines pour l'alimentation humaine, les diététiciens recommandent généralement que la quantité des acides nucléiques apportée au régime alimentaire par les PUC ne dépasse 15 pas deux grammes par jour. Les teneurs calculées en ARN de quelques sources de protéines classiques sont données dans le tableau I. Elles varient de 0 à 4%. La teneur en ARN des PUC est généralement comprise entre 8 et 18% pour des cellules récoltées au cours de la phase de 20 croissance exponentielle. Dans des PUC destinées à la consommation humaine, il convient de préférence que la teneur en ARN soit abaissée jusqu'à environ 2%, cette valeur étant basée sur le poids des cellules sèches. Tableau I 25 Teneurs (calculées) en ARN de diverses sources de protéines Aliment ARN % lait 0 haricots 1,7 saumon 2,4 poulet 2,9 boeuf 3,7 porc 4,1 foie 9,3 anchois 14, 5 PUC 8 à 18 Un mode d'utilisation préféré d'une matière PUC est sous la forme de cellules entières. Par conséquent, il est nécessaire de mettre au point des moyens permettant d'éliminer ou séparer des acides nucléiques à partir de l'intérieur des cellules micro-40 biennes. Il convient que cette opération soit réalisée avec une Copy 72 05981 2126312 perte minimum de matières protéiniques à partir de 1'intérieur des cellules afin de maintenir l'intéressante valeur nutritive des matières PUC en question. Un mode d'approche permettant d'atteindre les buts sus-5 spécifiés consiste à tirer partie des systèmes enzymatiques déjà présents à l'intérieur des microorganismes unicellulaires, à activer les enzymes latents de façon telle qu'ils agissent en dégradant ou en hydrolysant sélectivement les espèces particulières d'acides nucléiques présents dans la matière PUC. 10 Dans un tel procédé, le mode opératoire consiste à ne pas fournir du magnésium au système nutritif au cours de la fermentation afin d'exalter l'activité de la ribonucléase tout en désactivant, en même temps, 1'ARN-polymérase. Les conditions préférées comprennent un chauffage de la culture microbienne jusqu'à 15 45-100°C dans des conditions alcalines, un refroidissement, puis une addition de. glucose comme "promoteur de fuite" au cours d'un stade final de fermentation. Un autre procédé a été décrit par Ohta, Maul, Sinskey et Tannenbaum dans une communication présentée à la 160ème Réunion 20 Nationale de 1'American Chemical Society tenue à Chicago, Illinois (E.U.A.), en Septembre 1970; il consiste essentiellement à chauffer une suspension aqueuse très diluée (contenant en poids moins de 1% de cellules) selon un certain programme cyclique de température, à savoir : chauffage très bref (de 3 à 17 secondes) 25 à 65-70°C pour "choquer" les cellules; puis 1 à 2 heures à 45-50°C, et finalement environ 1 heure à 55-60°C. L'opération élémentaire de "choc thermique" est revendiquée comme étant critique. L'intervalle optimum de pH s'étend de 5,0 à 6,5, contrairement aux conditions alcalines préférées dans le premier procédé 30 décrit ci-dessus. Les deux procédés décrits ci-dessus abaissent la teneur en acides nucléiques des matières cellulaires mais leurs possibilités de mise en oeuvre se trouvent limitées à des bouillons de fermentation relativement dilués. Des conditions de dégradation 35 enzymatique efficaces en vue du traitement de crèmes cellulaires concentrées, pratiquement exemptes du bouillon de fermentation initial avec ses diverses substances nutritives constituées par des sels minéraux, sont nécessaires pour permettre l'établissement de modes opératoires attrayants servant à élaborer de nou 72 05981 5 2126312 velles substances alimentaires à partir d'une matière PUC convenablement équilibrée diététiquement. La présente invention a notamment pour buts : - de réaliser un procédé nouveau et perfectionné pour abais-5 ser la teneur en acides nucléiques de matières PUC jusqu'à une valeur généralement acceptable de la part de produits alimentaires destinés à la consommation humaine; - de réaliser des produits et ingrédients alimentaires nouveaux et intéressants comprenant des matières PUC à teneur assez 10 basse en acides nucléiques. Ces buts sont atteints conformément à la présente invention par mise en oeuvre d'un procédé de dégradation enzymatique endo-cellulaire d'acides nucléiques et fuite des fragments solubles dans l'eau résultants jusque dans le milieu aqueux environnant. 15 Les microorganismes unicellulaires sont d'abord physiologiquement conditionnés à 30°C dans des conditions de privation de nourriture, et facultativement on leur fait subir un choc par le froid à 0°C pour provoquer une activation des nucléases endogènes. On procède ensuite à une incubation (chauffage en étuve) à une tem- 20 pérature réglée à 50—55°C ët à un pH de 5,0—5,5 pendant que le processus de dégradation a lieu, de préférence en présence d'une concentration d'ion acétate d'environ 0,1 M. Pendant la totalité du traitement, on entretient une aération par injection et dispersion d'un gaz fournissant de l'oxygène. 25 Le composant alimentaire perfectionné résultant, contenant des matières PUC, n'a pratiquement pas perdu notablement des protéines qu'il contenait initialement, mais il contient finalement moins de 2% en poids (calculés sur une base sèche) d'acides nucléiques . 30 La présente invention a donc pour objet un procédé nouveau permettant d'abaisser la teneur en acides nucléiques de microorganismes unicellulaires; bien entendu, la portée de l'invention s'étend également à des produits alimentaires nouveaux et perfectionnés obtenus par mise en oeuvre du susdit procédé. 3 5 On a découvert que la majeure partie des acides nucléiques contenus dans des microorganismes unicellulaires peut en être enlevée en permettant la dégradation de l'acide ribonucléique (ARN) par des ribonucléases endodènes (RNases) dans des conditions convenablement réglées et pendant qu'on laisse fuir les 40 produits dégradés solubles jusque dans le milieu environnant. 72 05981 6 2126312 Ceci est réalisé pratiquement sans attaque des compositions pro-téinées contenues à l'intérieur des cellules. L'efficacité et le rendement du procédé dépendent d'une étroite surveillance et d'un réglage adéquats de la température et du pH; ils sont améliorés 5 par l'utilisation soit d'ions acétate, soit d'ions éthylènediami-netétraacétate, soit de ces deux espèces d'ions, dans le milieu où ils servent d'agent d'extraction. Il a donc été rendu possible, grâce à la mise en oeuvre du procédé selon l'invention, d'obtenir une matière.PUC se présentant sous la forme de cellules in-10 tactes et ayant une teneur en acides nucléiques sensiblement inférieure à 2% en poids. L'efficacité et le rendement des processus enzymatiques dépendent notablement de l'histoire antérieure des cellules, et surtout de leurs conditions de culture. L'activité des enzymes 15 endogènes capables de dégrader les acides nucléiques est liée à l'état physiologique des cellules. Quand la croissance en est limitée par des conditions ambiantes physiques ou chimiques défavorables, telles que les conditions prévalant lors de la phase du déclin de croissance lors d'une opération de fermentation discon-20 tinue, les cellules sont plus sensibles à leurs propres enzymes autolytiques capables de dégrader les acides nucléiques, et il est possible d'obtenir une efficacité de dégradation des acides nucléiques notablement supérieure. Des cellules en cours de croissance rapide et à plus haute teneur en acides nucléiques intracel-25 lulaires sont beaucoup plus résistantes à un traitement d'abaissement de la teneur en acides nucléiques (en abrégé : AN). Une modification de l'état physiologique des cellules par un ajustement du milieu de culture (par exemple, le fait de priver le substrat de substances alimentaires) peut activer les enzymes endo-30 gènes latents capables de dégrader les AN, enzymes tels que des ribonucléases ribosomales, et donc améliorer l'efficacité et le rendement de l'opération de dégradation enzymatique des AN. La présente invention a pour objet un procédé de ce genre permettant de conditionner physiologiquement des cellules microbiennes par 35 des modifications du milieu de culture, modifications telles que les nucléases endogènes s'en trouvent activées d'une manière intéressante. La mise en oeuvre de la présente invention est d'une manière générale applicable à des microorganismes de genres variés, et 40 plus particulièrement à des microorganismes classés parmi les 72 05981 7 2126312 bactéries, les levures et les mycètes ou champignons. A titre d'exemples bien entendu non limitatifs, on trouve ci-après des bactéries énumérées dans le tableau XI, des levures énumérées dans le tableau III et des mycètes énumérés dans le tableau III, 5 tous microorganismes adéquats en vue de la mise en oeuvre de la présente invention. Tableau II - Bactéries adéquates Acetobacter sp» Arthrobacter sp. 10 Bacillus subtilis Corynebacteria sp. Micrococcus sp. Pseudomonas sp. Tableau III - Levures adéquates 15 Candida curvata Candida lipolytica Candida pulcherima Candida utilis Hansenula anomala 20 Hansenula miso Oidium lactis Saccharomyces carlsberqensis Saccharomyces fraqilis Trichosporon cutaneum 25 Saccharomyces cerevisiae Candida parapsilosis Hansenula wickerhamii Pichia pastoris Pichia haplophyla 30 Tableau IV - Mycètes adéquats Asperqillus niqer Petttçillium notatum Asperqillus qlaucus Pénicillium chrysoqenum Asperqillus oryzae Pénicillium qlaucum Asperqillus terreus Pénicillium qriseofulvum 35 Asperqillus itaconicus Candida utilis, Saccharomyces cerevisiae, Saccharomyces fraqilis et Saccharomyces carlsberqensis sont des matières premières préférées en vue de la mise en oeuvre du procédé selon 72 05981 8 2126312 l'invention, toutefois, car aux E.U.A. la Food and Drug Administration les considère généralement comme utilisables en toute sécurité dans des produits alimentaires. Lors de la mise en oeuvre du procédé selon la présente inven-5 tion, on peut faire croître des cellules microbiennes adéquates par culture aérobie au cours d'une opération soit discontinue, soit continue. On peut utiliser n'importe quel substrat convenable fournissant du carbone bien que, lorsqu'on veut préparer des produits PUC utilisables dans des aliments, un substrat éthanoli-10 que soit préféré. On peut utiliser n'importe quelle combinaison classique d'éléments nutritifs minéraux. Une source adéquate d'azote est l'ammoniac que l'on peut aussi amener à l'appareil de fermentation selon les besoins en vue de maintenir le pH du bouillon de fermentation à une valeur de préférence comprise en-15 tre 3,5 et 5,5. Des cellules que l'on a fait croître à une allure rapide ont habituellement une plus forte teneur en AN, tandis que des cellules cultivées à une allure de croissance plus lente ont tendance à posséder une paroi cellulaire moins perméable. Des cellules de chacun de ces deux types, aussi bien que des cellules 20 cultivées dans des conditions limitant 1'apport d'oxygène ou limitant la quantité de substrat, peuvent être utilement traitées selon la présente invention pour aboutir à l'obtention d'aliments perfectionnés et acceptables et de composants alimentaires convenables en vue de la consommation par des êtres humains. 25 Qu'il soit préparé par fermentation discontinue ou continue, il convient que le mélange effluent de bouillon et de cellules soit séparé de façon à fournir un concentré de cellules. Ceci est réalisable en ayant recours à diverses opérations telles, par exemple, que filtration, décantation ou centrifugation. Il con-30 vient de préférence que les cellules soient lavées à l'eau puis soient concentrées (de préférence par centrif ugation) pour abou-^ tir à une crème cellulaire contenant en poids (sur une base sèche) de 5 à 15% de cellules. La crème ou suspension cellulaire est amenée à une zone de 35 conditionnement (ou à un récipient de fermentation) équipée de moyens d'agitation et qui est maintenue à environ 30°C pendant que de l'air, ou tout autre courant gazeux fournissant de l'oxygène et tel qu'un mélange d'oxygène et d'azote, est introduit par n'importe quel agencement adéquat d'injection et de dispersion. 40 II convient que le pH de la crème cellulaire soit maintenu à en 72 05981 9 2126312 viron 4,0. On ajoute de préférence une solution aqueuse d'ammoniac (convenablement sous la forme d'ammoniaque à '5%) à ladite crème selon les besoins afin d'empêcher la valeur du pH de tomber au-dessous de 4,0. Ce milieu ambiant soumet les cellules à un con-5 ditionnement physiologique en les privant d'éléments nutritifs tout en les faisant bénéficier d'une aération continue. Le déplacement du métabolisme endogène devient apparent quand le pH de la crème cellulaire aérée commence à augmenter sans aucune addition extérieure d'ammoniac ou de tout autre réactif alcalin, indiquant 10 que l'opération élémentaire est parvenue à bonne fin. L'activité des enzymes endocellulaires capables de dégrader les AN est ensuite encore accrue en transférant la crème cellulaire conditionnée, de préférence en la faisant passer dans un serpentin d'échange de chaleur, à une zone d'incubation (avanta-15 geusement constituée par une cuve ou par un réservoir) dans laquelle la crème est maintenue à une température comprise entre 50 et 55°C pendant un laps de temps d'une durée comprise entre environ 1 et environ 3 heures. Le pH de la crème cellulaire continue à augmenter quand elle entre dans la zone d'incubation et 20 il convient de lui permettre de s'élever jusqu'à une valeur d'au moins 5,0 mais n'excédant pas environ 5,5. La valeur du pH est ensuite maintenue entre 5,0 et 5,5, de préférence à environ 5,2, par addition d'acide chlorhydrique ou d'acide acétique selon les besoins, pendant le séjour de ladite crème dans cette zone d'in-25 cubation. La dégradation des acides nucléiques (AN) dans ces conditions d'incubation s'effectue à une allure maximum et tombe rapidement lorsque les valeurs du pH sont aussi bien plus élevées ou plus basses que les limites extrêmes sus-spécifiées. On poursuit l'aération pendant toute la durée de la période d'incubation. 30 II convient de n'avoir recours qu'avec précaution à l'utili sation d'acides autres que les acides chlorhydrique et acétique pour régler la valeur du pH. Quelques acides communément disponibles, tels par exemple que l'acide phosphorique, inhibent la dégradation autolytique. Il convient généralement d'accorder la 35 préférence à l'acide acétique bien que l'acide chlorhydrique soit le plus souvent utilisé à cause de son bas prix. Le réglage du pH est simplifié par l'addition d'un réactif du type tampon à la crème cellulaire lors de son entrée dans la zone d'incubation. Une solution-tampon à l'ion acétate (pH 5 à 40 5,5, et de préférence égal à environ 5,2) est efficace à une mo- 72 05981 2126312 larité quelconque comprise entre 0,05 et 1,0, bien que l'on utilise de préférence une concentration d'ion acétate comprise entre 0,05 et 0,25 M, la concentration la plus avantageuse étant d'environ 0,10 M. On a encore observé qu'une élimination étonnamment 5 plus efficace de produits (solubles dans l'eau) résultant d'une dégradation des acides nucléiques (AN) à partir des cellules en direction de la phase aqueuse s'observe en présence d'un tampon à l'ion acétate. On a aussi constaté avec surprise que l'ion éthylènediaminetétraacétate (EDTA) est similairement efficace à 10 de basses concentrations telles d'environ 0,01 M. L'utilisation simultanée d'ions acétate et d'ions EDTA, par exemple à des concentrations respectivement égales à 0,1 M et 0,01 M, est même plus efficace que l'utilisation de l'un ou de l'autre de ces réactifs utilisé seul. 15 Lorsque la période d'incubation d'une durée convenable, comprise entre environ une heure et environ trois heures, est complètement terminée, les cellules traitées par la chaleur sont séparées de la phase aqueuse surnageante par mise en oeuvre de tous moyens appropriés (tels qu'une centrifugation), puis sont 20 lavées à l'eau. On peut, si on le désire, charger la totalité ou une partie de la phase aqueuse surnageante dans un appareil de fermentation primaire afin de fournit des composants des substances nutritives et d'un substrat utilisables pour assurer la croissance d'organismes microbiens unicellulaires additionnels. 25 Les cellules recueillies contiennent encore pratiquement la totalité de leur matière protéinique initiale et peuvent être sé-chées pour fournir un produit alimentaire ou un ingrédient alimentaire adéquat. L'opération de séchage est réalisable par tous moyens classiques, tels que séchage sous vide ou séchage par ato-30 misation, en veillant soigneusement à ne pas chauffer à des températures excessivement élevées le produit PUC perfectionné. XI est considéré comme préférable de sécher la matière PUC à environ 70°C. Facultativement, les cellules lavées à l'eau, traitées par 3 5 la chaleur, peuvent être extraites avec une solution aqueuse modérément chaude d'hydroxyde de sodium, à un pH compris entre 7,0 et 8,0, à une température comprise entre 60°C et 70°C afin d'éliminer plus complètement les fragments moléculaires solubilisés résultant d'une dégradation des AN. Les cellules sont finalement 40 séparées, lavées à l'eau, puis séchées. 72 05981 2126312 Le conditionnement physiologique de la matière PUC peut être amélioré si on met en oeuvre un traitement de choc par le froid entre la période de suppression des substances alimentaires de culture conduite à environ 30°C et la période d'incubation 5 conduite à 50-55°C. On a découvert avec surprise qu'une fuite plus importante de fragments de dégradation des AN à partir de l'intérieur des cellules s'observe au cours de l'incubation lorsque les cellules ont préalablement été réfrigérées jusqu'à environ 0°C et maintenues à cette basse température pendant environ 10 15 minutes. Le procédé compris dans la portée de la présente invention fournit d'une manière sûre et reproductible une matière PUC perfectionnée contenant en poids (sur une base sèche) moins de 2% diacides nucléiques (AN). La teneur en protéines des cellules 15 traitées est habituellement comprise entre environ 50 et 60% (en poids, sur une base sèche), ce qui correspond sensiblement à la proportion des protéines initialement présentes dans les cellules initiales. Des propriétés physiques et organoleptiques avantageuses (y compris la saveur et l'odeur) n'ont pas été dégradées par 20 mise en oeuvre du procédé selon la présente invention, et la matière alimentaire PUC résultante a été sensiblement améliorée en ce qui concerne ses caractéristiques diététiques. D'une manière surprenante, les propriétés fonctionnelles, c'est-à-dire les caractéristiques de texturisation, la rétention d'eau et d'huile, 25 la faible dispersibilité dans l'eau et d'autres propriétés analogues, sont grandement améliorées. Par conséquent, les matières alimentaires PUC également comprises dans la portée de 1'invention possèdent des possibilités d'utilisation très variées en ce qui concerne leur incorporation à des produits alimentaires clas-30 siques aussi bien que la création de nouveaux produits alimentaires . Ci-après sont donnés différents exemples, bien entendu non limitatifs, de mise en oeuvre de l'invention. Exemple X.- On fait croître des cellules de Candida utilis 3 5 (ATCC 9256) dans un appareil de fermentation continue en utilisant un milieu à base de sels minéraux contenant de l'éthanol comme substrat fournissant du carbone. On maintient la vitesse — 1 y spatiale à 0,22 heures , l'allure de croissance étant limitée par la concentration d'éthanol plutôt que par l'allure d'aéra-40 tion. Les cellules récoltées sont recueillies à partir de l'ef- 72 05981 12 2126312 flu.ent (contenant en poids 3,6% de cellules) par centrifugation et lavage de manière à obtenir une pâte contenant en poids environ 22% de substances solides. On remet ensuite quatre kilogrammes de cette pâte en suspens-ion dans quatre litres d'eau désioni-5 sée; on obtient ainsi huit litres d'une suspension contenant en poids (base sèche) 10% de cellules. On chauffe ensuite la suspension aqueuse de cellules jusqu'à 53 _+ 1°C tout en agitant continuellement (800 tours/minute) et en aérant continuellement (1 volume d'air par volume de suspension et à la minute). On maintient 10 la solution dans' ces conditions pendant trois heures tout en réglant le pH de la suspension à 5,2 _+ 0,1 par addition d'acide chlorhydrique 6N selon les besoins. La crème cellulaire est remise en suspension dans de l'eau chaude à 65°C de façon à établir une suspension à 15% en poids qui est alcalinisée par addition 15 d'hydroxyde de sodium jusqu'à pH 7,5, centrifugée, après quoi on lave les cellules à l'eau et enfin on les sèche. Tandis que les cellules récoltées initiales" contiennent en poids 10% d'acides nucléiques (calcul sur une base sèche), les cellules traitées n'en contiennent que 3,3%. Le rendement en cellules recueillies 20 est de 77,5%, et la teneur en protéines des cellules traitées est de 58,0% en poids. Les cellules traitées contiennent aussi très peu de phosphore et de cendres. La saveur initiale de levure a été éliminée, et les propriétés fonctionnelles ont été améliorées . 25 Exemple XI.- On répète le mode opératoire de l'exemple I, mais à 1 * exception du fait que 1'on utilise de 1'acide acétique glacial à la place de l'acide chlorhydrique 6N pour régler le pH du cours de la période de chauffage à 55°C. La teneur en acides nucléiques des cellules traitées n'est que de 2% en poids (base 30 sèche). Le rendement en matières cellulaires recueillies est de 78,0%; la teneur en protéines des cellules traitées est de 60,0% en poids. Exemple III.- On répète le mode opératoire de l'exemple II, mais en utilisant de la liqueur de fermentation épuisée à la pla-3 5 ce d'eau fraîche quand on prépare les suspensions de cellules. La teneur en AN des cellules traitées est de 3,6% en poids (calculés sur une base sèche). Exemple IV.- On fait croître des cellules de Candida utilis (ATCC 9256) par mise en oeuvre d'une opération de culture conti- —1 40 nue à une vitesse spatiale de 0,38 heure dans un milieu à base 72 05981 2126312 de sels minéraux utilisant de l'éthanol comme substrat fournissant du carbone, l'allure de croissance étant limitée par la concentration de l'oxygène dissous. On traite les cellules récoltées par mise en oeuvre du mode opératoire décrit dans- l'exemple XX. 5 Les cellules récoltées contiennent initialement 12,0£en poids (calculés sur une base sèche) d'acides nucléiques; la teneur en AN des cellules traitées est de 4,6% en poids. Exemple V.- On répète le mode opératoire de l'exemple XV, à l'exception du fait que, avant le chauffage jusqu'à 55°C, on agi— 10 te la suspension cellulaire et on l'aère à environ 30°C tout en en maintenant le pH à une valeur ne tombant pas au-dessous de 4,0 par addition d'une solution aqueuse à 5% d'hydroxyde d'ammonium selon les besoins. Ce traitement de conditionnement, ou de privation de substances alimentaires, est poursuivi pendant 30 mi-15 nutes, quand alors on observe que la valeur du pH augmente d'el-le-même (sans addition d'hydroxyde d'ammonium). A la suite d'un traitement ultérieur identique à celui décrit dans l'exemple XX, on obtient des cellules traitées ne contenant en poids que i,8% d'acides nucléiques (concentration calculée sur une base sèche). 20 Exemple VX.- Une suspension aqueuse contenant en poids (base sèche) 5% de cellules de levure Torula est soumise au mode opératoire de traitement décrit dans 1'exemple I, à 1'exception du fait que 1'on maintient cette suspension pendant cinq heures à 55°C, des échantillons de la phase aqueuse étant périodiquement 25 prélevés pour en mesurer la concentration de matières du type nucléotides solubilisées. De telles matières manifestent un maximum d'absorption à une longueur d'onde proche de 260 millimi-crons. Une deuxième suspension est traitée de la même manière après avoir été réfrigérée jusqu'à 0°C et maintenue à cette tem-30 pérature pendant 15 minutes avant qu'on la chauffe jusqu'à 55°C. Des mesures spectrophotométriques révèlent une amélioration de la solubilisation des matières du type nucléotides quand les cel- . Iules ont été exposées à un traitement préliminaire de choc par le froid. 35 Durée du laps de Nucléotides solubles (absorption 260) temps de chauffage à 55°C Choc par le froid pas de choc par le froid 1 heure 33 10 3 heures 43 18 40 5 heures 51 26 72 05981 14 2126312 Exemple VII.- On répète le mode opératoire de l'exemple VI, mais avec addition de : (a) une solution-tampon à l'ion acétate pour établir une concentration de 0,1 M tout en maintenant le pH à 5,2; (b) acide éthylènediamine-tétraacétique (AEDTA) pour éta-5 blir une concentration de 0,01 M ou (c) de ces deux réactifs, quand la suspension a été amenée jusqu'à 55°C. Après deux heures à 55°C, on mesure la densité optique (ou 1'absorbance) à 260 millimicrons (A260^ "'"a P^ase aqueuse, ce qui donne une indication au sujet du degré de solubilisation des matières du type 10 nucléotide. Les ions acétate aussi bien que les ions éthylène-diaminetétraacétate sont efficaces pour éliminer des acides nucléiques à partir des cellules et, quand on les utilise conjointement, leur association est encore plus efficace. Agent d'addition A260 néant 3 2 acétate 0,1 M 83 EDTA 0,01 M 68 acétate 0,1 M" O 97 20 EDTA 0,01 M_ Exemple VIII.- On fait croître des cellules de levure Torula à 30°C et à pH 4,0 dans un appareil pour fermentation discontinue en utilisant une solution nutritive à base de sels minéraux et de l'éthanol comme substrat fournissant du carbone. La 25 suspension-de cellules fraîches est ensuite amenée d'une manière continue à un récipient de fermentation à une vitesse spatiale —1 * de O,3 heure , en maintenant les memes conditions de température et de pH qu'au cours de l'opération de production discontinue, tout en aérant avec de 11 air de manière à maintenir une concen-30 tration d'oxygène dissous non inférieure à 85% de la saturation. Il n'y a pas d'ion acétate présent. On récolte d'une manière continue la suspension de cellules ayant subi le traitement, et on sépare les cellules à partir de la phase aqueuse. Par des analyses périodiques, on détermine la valeur d'absorption A260 "1"a 3 5 phase aqueuse surnageante : on la trouve égale à 319 ± 9. La teneur en poids en acides nucléiques des cellules traitées et sé-chées est de 3,2 _+ 0,3%. On recueille les cellules avec un rendement de 77,0 _+ 3,0% en poids. Comme il va de soi, et comme il résulte d'ailleurs déjà de 40 ce qui précède, l'invention ne se limite nullement à ceux de ses 72 05981 2126312 modes d'application et de réalisation qui ont été plus spécialement envisagés; elle en embrasse, au contraire, toutes les variantes . 72 05981 16 2126312 REVENDICATIONS 1. Procédé pour diminuer considérablement la teneur en acides nucléiques de produits alimentaires du type matière protéini-que unicellulaire (PUC) dérivant de microorganismes unicellulai-5 res cultivés et admis à croître dans un appareil de fermentation aérobie dans un bouillon de fermentation approprié, lequel procédé est caractérisé en ce qu'il consiste essentiellement : (a) à séparer les cellules à partir d'une majeure portion du bouillon de fermentation afin d'établir une suspension cellulaire concen-10 trée; (b) à laver à l'eau le concentré de cellules en suspension; (c) à centrifuger le concentré de cellules lavé de manière à obtenir une crème cellulaire comprenant en poids de 5 à 15% de cellules; (d) à injecter et disperser, dans la susdite crème cellulaire, un courant gazeux fournissant de l'oxygène tout en 15 maintenant cette crème cellulaire à une température d'environ 30°C; (e) à régler l'acidité de la crème cellulaire pendant la susdite injection de courant gazeux de façon telle que le pH s'en trouve ajusté à environ 4,0 par addition d'une solution aqueuse à 5% d'ammoniac selon les besoins; (f) à maintenir la crème cel-20 lulaire, pendant ladite injection de courant gazeux, à environ 30°C jusqu'à ce que la valeur du pH commence à s'élever sans autre addition supplémentaire d'ammoniaque aqueuse; (g) à chauffer la crème cellulaire, tout en poursuivant ladite injection de courant gazeux, jusqu'à une température comprise entre 50°C. et 55°C; 25 (h) à tamponner la crème cellulaire, chauffée et dans laquelle on injecte ledit courant gazeux, en y ajoutant une solution-tampon aqueuse d'ion acétate en une proportion suffisante pour établir une molarité d'ion acétate comprise entre 0,05 M et 1,0 M (i) à maintenir l'acidité de la crème cellulaire, chauffée et 30 dans laquelle on injecte ledit courant gazeux, de façon telle que son pH se trouve compris entre 5,0 et 5,5 par addition d'acide chlorhydrique ou d'acide acétique selon les besoins; (j) à traiter la crème cellulaire dans les conditions sus-spécifiées d'aération, de température et d'acidité pendant un laps de temps d' 35 uns durée comprise entre une et trois heures en y ajoutant de l'acide chlorhydrique ou de 1'acide acétique selon les besoins pour maintenir le pH dans l'intervalle requis; (k) à centrifuger la crème cellulaire, ainsi traitée, de façon à établir une phase aqueuse surnageante et un concentré cellulaire traité par la cha-40 leur et dont la teneur en acides nucléiques se trouve considéra 72 05981 17 2126312 blement diminuée; (1) à laver à l'eau le concentré cellulaire ainsi traité par la chaleur et (m) à sécher le concentré cellulaire ainsi traité par la chaleur et lavé à l'eau. 2. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que 5 l'on ajoute au moins une portion de la phase aqueuse surnageante au bouillon de fermentation contenu dans l'appareil de fermentation . 3. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que l'on opère de façon telle que la crème cellulaire contienne en 10 poids environ 10% de cellules. 4_. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que l'on tamponne la crème cellulaire, chauffée et dans laquelle on injecte ledit courant gazeux, de façon à établir une valeur de pH comprise entre 5,0 et 5,5 par addition d'une solution tampon con- 15 tenant de l'ion acétate de façon à établir une molarité d'ion acétate comprise entre 0,05 et 0,25 M. 5. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que l'on réfrigère jusqu'à environ 0°C la crème cellulaire ayant subi l'injection de courant gazeux et on la maintient à cette tem— 20 pérature pendant environ 15 minutes avant de la chauffer jusqu'à une température comprise entre 50°C et 55°C. 6. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que l'on met additionnellement le concentré cellulaire, traité par la chaleur, en suspension dans de l'eau chaude à une température 25 comprise entre 60°C et 70°C et on l'amène à une valeur de pH comprise entre 7,0 et 8,0 par addition d'une solution aqueuse d'hydroxyde de sodium avant les opérations élémentaires finales de lavage et de séchage. 7. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que 30 l'on utilise, comme microorganisme unicellulaire, une bactérie ou une levure. 8. Procédé selon la revendication 7, caractérisé en ce que l'on utilise, comme microorganisme, une levure choisie parmi le groupe constitué par Saccharomyces cerevisiae, Saccharomyces 3 5 carlsberqensis, Saccharomyces fraqilis et Candida utilis. 9. Procédé selon la revendication 8, caractérisé en ce que l'on utilise, comme levure, Candida utilis. 10. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que l'on utilise, comme microorganisme, Candida utilis; on ajuste la 40 teneur en cellules de la crème cellulaire à environ 10% en poids; 72 05981 2126312 et on tamponne la crème cellulaire (chauffée et dans laquelle on injecte ledit courant gazeux) à une valeur de pH d'environ 5,2 par addition d'une solution tampon contenant environ 0,1 M d'ion acétate et additionnellement' 0,01 M d'ion éthylènediaminetétraa-5 cétate. 11. Produit alimentaire du type matière protéinique unicellu-laire, caractérisé en ce qu'il est élaboré par mise en oeuvre d'un procédé selon la revendication 1.