FR 2115246 A1 19720707 FR 7141365 A 19711118 71 41365 • 1 2115246 La présente invention concerne des composés nouveaux qui sont intéressants dans la conduite d'un test nouveau pour le diagnostic de l'insuffisance de-la sécrétion d'enzyme pancréatique. La séci'étion exocrine du pancréas contient plusieurs 5 enzymes qui sont importants pour la digestion ; ce sont le tryp-sinogène, le chymotrypsinogène, la lipase, l'a-amylase et la phospholipase. Cette sécrétion, qui est stimulée par les hor--mones appelées sécrétine et pancréozyxaine, s'écoule par le canal pancréatique dans l'intestin grêle où la trypsine et la chymo-10 trypsine sont libérées .de leurs précurseurs xhactifs. A ce stade, ces deux enzymes transforment les polypeptides contenus dans le chyme gastrique en peptides plus petits et aminoacides qui sont absorbables. Les troubles de la fonction exocrine du pancréas sont 15 multiples : pancréatite, tumeurs pancréatiques, kystes pancréatiques fibrose kystique et obstruction du canal pancréatique. Ces troubles peuvent conduire à des syndromes complexes de mauvaise absorption, dont le diagnostic n'est pas toujours aisé, pendant les phases préliminaires. 20 A l'heure actuelle, il n'existe aucun test simple et fiable pour la détermination d'une hyposécrétion d'enzyme pancréatique. Les tests que l'on utilise le plus fréquemment sont le test à la sécrétine et sa variante très proche, à savoir, le test à la sécrétine et à la paneréozymine. Ces tests impliquent 25 l'analyse d'échantillons prélevés par aspiration dans le duodénum, après stimulation par la sécrétine et la pancréozymine. Bien que ces tests puissent donner des renseignements utiles sur le fonctionnement du pancréas, ils sont difficiles à exécuter et prennent du temps, parce qu'ils requièrent un tubage duodénal et le pré-30 lèvement du contenu du duodénum pendanijdeux heures, une méthode fluoroscopique pour contrôler la position du tube intestinal et 1 'injection intraveineuse de protéines étrangères qui peuvent déclencher des réactions allergiques. En outre, il existe quelque incertitude relativement à ce qui constitue un test anormal. Les 35 méthodes les plu3 simples que l'on peut utiliser, telles que l'analyse des enzymes dans le sérum ou les matières fécales, sont généralement considérées comme des indicateurs imprécis d'une in- COP^ BAD ORIGINAL 71 41365 2 2115246 suffisance pancréatique et elles né permettent pas de mesurer l'étendue de cette insuffisance. Par conséquent, il serait extrêmement désirable de disposer d'un test de détermination quantitative d'une insuffisance pancréatique, qui serait non seulement fiable, mais 5 aussi simple à exécuter et à interpréter. On vient de découvrir que la sécrétion normale d'enzymes pancréatiques dans un organisme animal peut être évaluée par administration interne d'une quantité efficace d'un polypeptide qui peut être hydrolysé par l'une ou plusieurs des . 10 endopeptidases pancréatiques pour donner un résidu qui peut être absorbé par l'organisme et être restitué par ce dernier, le résidu est absorbé puis excrété dans l'urine, dont l'analyse permet de déterminer la présence ou l'absence du résidu. Chez des animaux dont la fonction pancréatique est normale, on a constaté que le 15 peptide est hydrolysé en libérant un aminoacide ou un autre résidu qui n'est pas métabolisé, qui est ensuite absorbé, excrété et détecté par.l'analyse. Chez les animaux dont la fonction pancréatique a été rendue anormale, le peptide reste sensiblement non hydrolysé, en sorte qu'il n'y a essentiellement pas de résidu 20 décelable dans l'analyse de l'urine. On peut utiliser une grande variété de polypeptides dans la pratique de l'invention, et on peut recourir à tout polypeptide qui contient trois composants essentiels. Le premier composant essentiel est une liaison aminoacide qui peut être clivée 25 par hydrolyse en présence de l'une des endopeptidases pancréatiques. Le second élément essentiel est un groupe de blocage de la fonction amino de cette liaison aminoacide. Le troisième élément essentiel est un groupe analysable, acceptable du point de vue pharmacolo-gique, qui est séparé du polypeptide par hydrolyse en présence d'ion 50 enzyme pancréatique pour produire un composé qui n'est- pas un produit naturel, qui est absorbé et éliminé dans le corps, et qui est facile à doser par des méthodes d'analyse quantitative. Les polypeptides qui satisfont à cette condition peuvent être représentés par la formule générale : 35 Q-NHQ'CO-Q" (I) (dans laquelle Q désigne le groupe de blocage de la fonction aminé, I1B3'C0 représente la liaison aminoacide hydrolysable et Q" repré- ORIGINAL 71 41365 2115246 sente le groupe analysable. On peut utiliser dans les polypeptides de l'invention toute liaison aminoacide capable d'être hydrolysée par l'une des endopeptidases du pancréas. Dans une forme de réalisation de l'in-5 vention, la liaison aminoacide que l'on choisit est une liaison hydrolysable en présence d'un représentant quelconque du groupe des -enzymes pancréatiques habituellement appelé chymotrypsine. Par exemple, la chymotrypsine provoque le clivage d'une liaison -CONH- ou -C00- interne si la fonction -GO- provient de la 1-10 phénylalanine, d'un dérivé de la L-phénylalanine, tel que la L-tyrosine, la 1-leucine, ±a L-méthionine ou le L-trypt ophane. Ainsi, on peut choisir l'un quelconque de ces aminoacides comme liaison aminoacide (HHQ'CO de la formule I) pour le polypeptide utilisé dans le test. De plus, étant donné que la présence de 15 la trypsine (enzyme pancréatique) conduit au.clivage hydroly-tique d'une liaison -CONH- ou -C00- interne si la fonction -C0-provient de la L-lysine ou de la L-arginine, l'un quelconque de ces deux aminoacides peut être choisi comme liaison aminoacide dans le polypeptide utilisé dans le test. 20 On peut utiliser une grande variété de groupes de blocage (Q danB la formule I) pour bloquer la fonction amino de la liaison aminoacide. Généralement, on choisit un groupe acyle tel qu'un groupe alkylcarbonyle, un groupe arylcarbonyle, un groupe aral-kylcarbonyle, un groupe alkarylcarbonyle, un groupe arylsulfonyle, 25 un groupe alkylsulfonyle, un groupe alkylcarbamoyle, un groupe arylcarbamoyle, -un groupe alkoxycarbonyle, un groupe aryloxycar-bonyle, etc. Le groupe analysable (Q" de la formule I) doit satisfaire à plusieurs conditions. Premièrement, il doit être accep-30 table du point de vue pharmacologique, c'est-à-dire qu'il ne doit pas produire d'effets indésirables dans l'organisme animal auquel le peptide est administré. Deuxièmement , il doit être séparé du peptide par hydrolyse en donnant une substance qui est absorbée dans le corps puis excrétée dans l'urine,de préférence d'une façon 35 relativement rapide. Troisièmement, la substance hydrolysée doit pouvoir être dosée par des méthodes d'analyse quantitative. Tout groupe qui satisfait à ces conditions peut être utilisé comme BAD ORIGfNAl/ 71 41365 4 2115246 groupe analysable. Le groupe analysable peut former ou bien un ester, ou bien un amide avec le groupe carboxyle de la liaison aminoacide. Parmi les polypeptides qu'il convient d'utiliser dans le 5 test d'hyposécrétion pancréatique, on mentionne les nouveaux peptide s qui répondent à la formule suivante : RCO-A -IIHR'CO-B -NHZ (II) n m (dans laquelle R est vin atome d'hydrogène ; un groupe phényle ; un groupe phényle substitué avec un ou plusieurs atomes d'halogè-10 nés, des groupes alkyle en à C^, des groupes hydroxy, des groupes .alkoxy en à C^, des groupes alkoxycarbonyle en à ou des substituants analogues qui ne gênent pas l'efficacité du polypeptide dans le test ; un groupe alkyle en C1 à C^2, de préférence en C.| à Cg, un groupe alkyle en à O^g substitué par un 15 ou plusieurs atomes d'halogènes» des groupes alkoxy en C, à C., 1 4 des groupes hydroxy, des groupes acyloxy, de préférence des groupes alcanoyloxy en à ou benzoyloxy, des groupes polyalkoxyalkyle, des groupes phényle ou des substituants analogues qui ne gênent pas l'efficacité du polypeptide dans le test ; un groupe alkoxy 20 en C,j à C^t ûe préférence en à Gg; un groupe aryloxy ayant jusqu'à 10 atomes de carbone ; ou un groupe alkylène divalent ayant jusqu'à 6 atomes de carbone, auquel cas la formule (£0 doit être représentée sous la forme ï R(-C0-A -ÏÏHR'CO-B -NHZ)„ (lia) n m 2 25 ou bien, lorsque le groupe de blocage dérive de l'acide oxalique, sous la forme s (C0-An-KHR'C0-Bm-NHZ)2 (Ilb) } HHR'CO est la liaison aminoacide dérivée de la L-phénylalanine, de la L-tyrosine, de la L-leucine, de la L-méthionine, du L-30 tryptophane, de la L-arginine ou de la L-lysine ; Z est un groupe de formule î y „ ÉAD ORIGINAL 71 41365 • 5 2115246 (dans laquelle R" est un groupe hydroxy,un groupe alkoxy en C-j a C^, un groupe alkoxyalkoxy en à Cj, un groupe aminoalkoxy en à Cg, un groupe amino, un groupe monoalkylamino en à C^, dialkylamino en à C^, un groupe de formule -HHCHgCOR'1 ou un 5 sel tel que le sel de sodium, potassium ou ammonium de ce groupe dans la formule duquel R" est un groupe hydroxy ; Y est un groupe de formule -GO- ou -SO^- î X est un groupe hydroxy, un groupe alkyle en à C^, un atome d'halogène, un groupe alkoxy en à ou un substituant analogue, qui ne gêne pas l'efficacité du 10 polypeptide dans l'essai ; et n' est égal à 0, 1 ou 2); A et B sont les résidus d'aminoacides de bas poids moléculaire, par exemple des résidus glycyle, alanyle, glycylglycyle, etc. ; et n et m sont égaux à 0, 1 ou 2 . En général, le test est facilité par une solubilité re-15 lativement grande du polypeptide dans l'organisme. Par conséquent, les polypeptides qui ont un poids moléculaire relativement faible et ceux qui portent un groupe carboxy libre ou un sel d'un groupe carboxy, sont particulièrement préférés. Des exemples de groupes RCO convenables comprennent les 20 groupes benzoyle, adipoyle, malonyle, succinoyle, formyle, acétyle, propionyle, butyryle, hexanoyle, heptanoyle, octanoyle, dodé-canoyle, acétylsalicylyle, oxalyle, éthoxycarbonyle, benzyloxy-carbonyle, chlorobenzoyle, iodobenzoyle, toluoyle, éthylbenzoyle, anisoyle, chloracétyle, éthoxypropionyle, hydroxybutyryle, phé-25 nylacétyle, etc. Des exemples de groupes -ÏÏHZ convenables comprennent ceux qui dérivent des acides p-aminobenzoxque, m-amino-benzoïque, 4~amino-3-iodobenzoïque, 4-amino-2-hydroxybenzoïque, 4-amino-3-méthylbenzoïque, 4-amino-2,6-diméthylbenzoïque, 4-30 aminohippurique, p-aminobenzènesulfonique, 4-amino-2-ethyl-benzoïque, 4-amino-2-butylbenzoïque, 4-amino-2-bromobenzoïque, 4-amino-2-éthoxybenzoîque, 3-amino-4-hydroxybenzoîque, 3-amino-4-méthylbenzoïque, 3-amino-4-chlorobenzoïque, m-aminobenzènesul-fonique, anthranilique, 4-amino-3-méthylbenzènesulfonique, 4-35 amino-3-hydroxybensènesulfonique, etc., les sels tels que les sels de sodium, potassium et ammonium de ces acides, leurs esters d'alkyle en à tels que méthyle, éthyle, n-propyle, isopropyle, BAD ORIGINAL 71 41365 6 2115246 n-butyle, isobutyle et tertiobutyle, leurs esters d'alkoxyalkyle en à C^, tels que les esters d1éthoxyéthyle et méthoxyéthyle, leurs esters d'aminoalkyle en à Cg tels que les esters N,N-diméthylaminoéthyle, morpholinoethyle, pipéridinoéthyle, pipérazi-5 noéthyle et IT,Iï-diéthylaminométhyle, les amides de ces acides et leurs alkylamides tels que les 17,11-diéthylamides. On préfère les acides libres et leurs sels, Bien que l'isomère 1 d'un polypeptide de l'invention soit seul réellement clivé en présence des enzymes pancréatiques, 10 des mélanges racémiques des composés peuvent être utilisés sans aucune interférence avec la méthode d'essai ou les résultats. Toutefois, en général, lorsqu'on utilise un mélange racémique, on doit administrer une dose double du composé. les composés de l'invention se préparent généralement ^ par blocage préalable du groupe amino de 1'aminoacide avec l'un quelconque des groupes convenables de blocage. Diverses techniques de préparation pour la conduite de cet étape de blocage sont bien connues en pratique et, peuvent être suivies dans la préparation des composés de l'invention. Un procédé intéressant implique 20 la réaction de l'aminoacide avec un chlorure d'acide du groupe de blocage, en présence d'un catalyseur basique ou d'un accepteur de base, soit en milieu aqueux, soit dans un solvant non aqueux. Le groupe analysable est ensuite attaché par amidation ou esté-rification de 1'aminoacide à groupe amino bloqué. Diverses techni-25 ques de préparation sont bien connues en pratique et peuvent être utilisées pour la préparation des amides et des esters. Un procédé nouveau et intéressant implique la réaction d'un anhydride mixte de l'aminoacide bloqué avec le groupe analysable portant la fonction amino. L'anhydride mixte peut être préparé avantageusement 30 par réaction de l'aminoacide à groupe amino bloqué avec le chloro-forraiate d'éthyle en présence d'une aminé tertiaire. Généralement, l'anhydride mixte est ensuite amené à réagir avec un ester contenant le groupe amino libre. Des exemples particuliers de procédés convenables pour la préparation des nouveaux peptides de l'invention 35 sont donnés dans les exemples qui suivent. Le test d'insuffisance pancréatique est conduit par administration interne, généralement par voie orale, d'une dose effl- BAÛ ORIGINAL ' 71 41365 7 2115246 cace de l'un des nouveaux peptides de l'invention, puis l'urine est recueillie pendant une période convenable de temps et soumise à une analyse pour déterminer la quantité du fragment peptidique approprié. Généralement, on a trouvé qu'en recueillant l'urine pendant 5 une période de temps s'étendant d'environ 4 à environ 10 heures, et de préférence d'environ 5 à environ 7 heures après l'administration du peptide, on peut conduire un test convenable. Si la sécrétion des enzymes pancréatiques est normale, la présence de ces enzymes provoque un clivage du peptide et on retrouve dans l'urine 10 une grande quantité du résidu analysable. En l'absence d'une fonction pancréatique normale, le peptide n'est pas aisément clivé, et seule une faible quantité du résidu analysable se retrouve dans l'urine. la quantité de peptide que l'on administre à l'animal 15 doit être suffisante pour produire un résidu analysable dans l'urine d'un animal normal. Généralement, une quantité'du peptide d'environ 2 à environ 50 mg par kg de poids corporel de l'animal est efficace pour la conduite du test de l'invention. Une gamme posologique préférée va d'environ 5 à environ 10 mg/kg de peptide. 20 Chez les êtres humains, une posologie d'environ 350 à environ 700 mg, par exemple environ 500 mg, est généralement efficace. On peut utiliser une grande variété de modes opératoires pour la conduite du test d'insuffisance pancréatique de l'invention. lie mode opératoire suivant est un exemple de ceux qu'on 25 peut utiliser. la substance d'essai doit être administrée le matin, après un petit déjeuner léger, exempt de matières grasses. La vessie doit être vidée avant le début du test. On fait absorber au sujet soumis au test une dose orale 30 convenable d'un peptide de l'invention, par exemple une dose orale de 0,5 g pour un sujet humain, et on recueille toute l'urine pendant les six heures qui suivent. On doit s'efforcer d'obtenir un échantillon d'urine entre la cinquième et la sixième heure. On peut administrer de l'eau ou de la caféine pendant la période 35 d'essai pour provoquer la miction, mais l'emploi d'autres diurétiques et d'autres médicaments doit généralement être évité. Des repas légers, sans matières grasses, peuvent être tolérés. BAD ORIGINAL 71 41365 2115246 On détermine le volume- total d'urine et on garde au frais ou on congèle l'échantillon entier ou une partie aliquote, jusqu'au moment de l'analyse chimique. le groupe analysable est ensuite recherché dans l'urine. 5 Par exemple, lorsque le groupe analysable est une aminé aromatique, on peut recourir à là méthode de Bratton-Marshall en utilisant l'acide p-aminobenzoïque comme étalon. Lorsque le groupe analysable est l'acide p-aminobenzoïque, des sujets chez lesquels la sécrétion pancréatique exocrine est normale éliminent géné-10 ralement au moins 25 fi de l'acide p-aminobenzoïque ingéré, soit environ 40 mg d'acide p-aminobenzoïque pendant la période d'essai de six heures, après correction pour tenir compte des aminés aromatiques urinaires constituant le fond. Celui-ci peut être déterminé sur un échantillon d'urine recueilli pendant 6 heures, la 15 veille du test, ou bien on peut admettre une valeur de 3 mg par 6 heures. La récupération d'un pourcentage anormalement faible, par exemple 5 i<> (8 mg) ou moins lorsque l'acide p-aminobenzoïque constitue le groupe analysable, de la dose administrée de poly-20 peptide en l'absence d'un défaut d'absorption, de troubles hépatiques ou rénaux, indique une nette insuffisance pancréatique exocrine. Le degré auquel l'un quelconque de ces états pathologiques extra-pancréatiques peut influencer les résultats de l'essai, peut être déterminé par une répétition du test 48 heures 25 plus tard en utilisant une dose orale de 160 mg d'acide p-aminobenzoïque. On peut utiliser toute méthode analytique permettant de doser quantitativement le groupe analysable hydrolysé (-Q" dans la formule(I)ou -NHZ dans la formule(ll) dans l'urine recueillie. 30 Lorsque le groupe analysable est le résidu d'un acide, aminobenzoï-que ou d'un acide aminobenzènesulfonique, ou de l'un quelconque de leurs dérivés, la méthode de Bratton-Marshall, décrite dans le "Journal of Biological Chemistry" 128. 537(1939) et dans "J.A.O. A.C.", £1_, 612 (1968), constitue une technique analytique con-35 venable. Le groupe analysable peut aussi contenir des atomes nar-qués. Ainsi, lorsque ce groupe contient des atomes de I ou I , lui comptage des rayons gamma peut être utilisé comme technique BAD ORIGINAL 71 41365 2115246 fùialytioue. le groupe analysable peut aussi être une substance formant un colorant et sa présence dans l'urine peut alors Être déterminée par coloi^iciétrie ou par des méthodes analytiques apparentées. 5 les peptides qui conviennent pci:.r la conduite du test d1 insuffisance p-cierratique de l'invention peuvent avantageusement être formulés et administrés sous diverses formes de compositions pharmaceutiques, les compositions pharmaceutiques comprennent un véhicule ou diluant non toxique acceptable du point de vue 10 pharmacologique et l'un des peptides de l'invention. On peut utiliser un véhicule solide ou liquide. Parmi les véhicules solides que l'on peut utiliser, on mentionne le lactose, la magnésie, le saccharose, le talc, la gélatine, l'amidon, la gélose, la pectine, la gomme arabique, le phosphate de calcium, le stéarate 15 de magnésium, l'acide stéarique, etc. Parmi les véhicules liquides que l'on peut utiliser, on mentionne un sirop, l'huile d'arachide, l'huile d'olive, l'huile de sésame, l'eau, etc. 3n outre, le véhicule ou diluant peut renfermer toute substance retardatrice connue en pratique, par exemple le monostéarate de glycéryle, 20 le distéarate de glycéryle, etc., seul ou en combinaison avec une . cire. D'autres substances acceptables du point de vue pharmaco-logique telles que des édulcorants, des agents.modifiant le goût, une matière colorante ou des pigments, des agents émulsifiants, des dispersifs, des agents de mise en suspension, des agents épais-25 sissants, des liants, des agents de conservation, des anti-oxydants, des diluants inertes, etc., peuvent aussi être formulés dans les compositions pharmaceutiques, le cas échéant. Bien que la plupart des substances acceptables du point de vue pharmacologique soient des substances inertes, il peut être avantageux, dans cer-30 taines circonstances,d'incorporer d'autres agents thérapeutiques dans les compositions de l'invention. Pour inhiber l'attaque des être peptides par les sucs gastriques , il peut aussi/avantageux de formuler le peptide avec un ingrédient anti-acide tel que le bicarbonate de sodium ou un ingrédient analogue. 35 las compositions pharmaceutiques ue l'invention con tiennent ordinairement environ 250 à environ 3500 mg d'un peptide conforme à l'invention. Une composition préférée contient environ 350 à environ 700 mg du peptide. le composé actif représente normalement environ 1 à 95 l/» en poids de la composition totale. Ordi- '©AD 71 41365 10 2115246 nairement, étant donné qu'on désire administrer le composé actif sous une forme assez concentrée, c'est-à-dire avec seulement la quantité de véhicule pharmaceutique nécessaire ou suffisantQpour aider à l'administration, le composé actif représente dans la plu-5 part des cas une très forte proportion de la composition totale. Les compositions de l'invention peuvent être foriauloes sous l'une quelconque de très nombreuses formes pharmaceutiques, par exemple capsules, comprimés, bols, poudre sous emballage ou suspension liquide. Par exemple, si l'on utilise un véhicule solide, 10 la préparation peut être transformée en comprimé , placée dans une capsule de gélatine dure sous la forme de poudre ou de comprimé, ou transformée en dragée ou tablette. Si l'on utilise un véhicule liquide, la préparation peut être sous la forme d'un sirop, d'une solution, d'une émulsion, d'une capsule de gélatine molle, d'une 15 ampoule ou d'une suspension liquide. Chacune de ces formulations la peut être préparée sous/forme posologique unitaire, de manière qu'une ou plusieurs unités contiennent une quantité de peptide qui convient pour la conduite du test d'insuffisance pancréatique, la valeur de la dose unitaire dépend naturellement de la taille de 20 l'animal à traiter. Des comprimés ou capsules enrobés ou non enrobés constituent des formes posologiques unitaires préférables. Toutes les préparations pharmaceutiques de la présente invention peuvent être obtenues d'après les techniques classiques de la chimie pharmaceutique, par exemple mélange, granulation 25 et compression, ou bien diverses opérations de mélange et de dissolution des ingrédients selon la forme que l'on désire donner au produit final. L'invention est illustrée par les exemples suivants, donnés à titre non limitatif. 30 Sauf indication contraire, toutes les parties sont ex primées en poids et toutes les températures sont données en degrés centigrades» Exemple 1 Préparation du N-benzoyl-L-phénylalanyl-jD-ajninoben^oate d'éthyle 35 On ajoute 5,5 ml de N-méthylmorpholine et 5 ml de chloro- formiate d'éthyle à 13,45 g de benzoyl-L-phénylalanine préparée au moyen du procédé de R. Steiger décrit dans "J. Org.Ohem." 9, 396 (1944), dissous dans 300 ml de tétrahydrofuranne anhydre, à -15°C. Au bout de 3 minutes, on ajoute une solution de 8,25 g BAD ORIGINAL 71 41365 " 11 2115246 de p-aminobenzoate d'éthyle dans 50 ml de tétrahydrofuranne, puis une solution de 0,95 g d'acide p-toluènesulfonique dans 35 ml de tétrahydrofuranne. On maintient le mélange réactionnel à 5°C, puis on effectue une chromatographie en couche mince sur gel de silice 5 en utilisant comme solvant de développement, un mélange de 70 parties de benzène, 30 parties d'acétate éthylique et une partie d'acide acétique, la mise en évidence étant effectuée avec de l'acide sulfurique à 50 c,o et en chauffant. Au bout d'une heure, l'anhydride mixte a disparu. Au bout de deux heures, on verse 10 le mélange dans 1,5 kg de glace et 1 litre d'eau, on agite pendant une demi-heure, on filtre et on lave à l'eau, avec de l'acide chlor-hydrique 0,1 N, du bicarbonate de sodium à 5 fit de l'eau, puis on. déshydrate pour obtenir 19,6 g de produit brut. Par recristallisation dans le benzène, on obtient 18,6 g de M-benzoyl-L-phényl-15 alanyl-jD-aminobenzoate d'éthyle fondant à 171-174°C, = +81,3° (1 fi dans le diméthylformamide). Analyse : C fi H fi N fi Calculé : 72,1 5,8 6,7 Trouvé : 71,9 5,7 6,5 20 En procédant d'une manière analogue, on prépare la forme DL correspondante à partir de la benzoyl-DL-phénylalaziine pour obtenir une substance solide incolore fondant à 203-204°C. Exemple 2 Préparation du N-benzoyl-L-phénylalanyl-jJ-aminohippurate de méthyle 25 On prépare l'anhydride mixte à partir de benzoyl-1- phénylalanine (0,81 g), de chloroformiate d'éthyle (0,3 ml) et de méthylmorpholine (3 ml de solution 1M dans le tétrahydrofuranne) dans 35 ml de tétrahydrofuranne à -15°G. Au bout de trois minutes, on ajoute 0,624 g de p-aminohippurate de méthyle dissous dans 30 25 ml de tétrahydrofuranne et on agite le mélange pendant 5 heures à la température ambiante. On sépare par filtration le chlorhydrate de morpholine et on ajoute 150 ml d'acide chlorhydrique 0,1N. On refroidit le mélange à 0°C pour achever la précipitation et on filtre, le produit sec, à savoir le N-benzoyl-L-phénylalanyl-jD-35 aminohippurate de méthyle, est recristallisé dans le méthanol en donnant une substance solide incolore fondant à 215-233°C, r«j? -+111,3° (1 /" dans le diméthylformamide). Analyse : G H fi N fi Calculé : 68,0 5,5 9,2 40 Trouvé : 67,6 5,6 9,0 r "î BAD ORIGINAL 71 41365 12 2115246 En jirocédant d'une manière analogue, en obtient la forme DL correspondante à partir de la benzoyl-DL-phénylalanine, sous la forme d'une substance cristalline fcjn.larrt h 2C4°C. Exemple 3 5 Préparation de 1' acide N-benzoyl-I— ^henylalanyl-p-aminobenzolque et de son sel de sodium On prépare une solution de 13,6 g de tertiobutylate de potassium dans 100 ml de .dinéthylsulfoxyde. On ajoute à cette solution une solution de 10 g de benzoyl-l-phénylalanyl-T)-amino-10 benzoate d'éthyle dans 50 ml de diméthylsulfoxyde à la température ambiante. Au bout de 5 heures, la chromatographie en couche mince montre qu'il n'y a plus d'ester,et le mélange réactionnel est alors versé dans un mélange de 140 ml d'acide chlorhydrique 1ÏT, 1 litre d'eau et 1,5 kg de glace. Au bout d'une demi-heure, on isole le 15 produit par filtration, on le lave à l'eau et on le sèche. Par recristallisation dans un mélange d'éthanol et d'eau, on obtient 7 g de l'acide N-benzoyl-L-phénylalanyl-js-aminobenzoïque libre dont l'équivalent de neutralisation est égal à 388 ; point de fusion = 245-'252°G ; a _7jp = +79° (1 dans le diméthylformamide). 20 Analyse : ' C ^ H fo N c/c Calculé : 71,1 5,15 7,2 Trouvé : 70,8 5,4 7,0 On prépare l'isomère DL d'une manière analogue à partir de benzoyl-DL-phénylalanyl-jD-aminobenzoate d'éthyle pour obtenir 25 une substance solide cristalline fondant à 248-252°C. On prépare le sel de sodium de l'acide benzoyl-L-phénylalanyl-jD-aminobenzoï-que en neutralisant exactement l'acide libre et en récupérant le sel par lyophilisation. Exemple 4 30 Préparation de l'acide N-benzoyl-L-phénylalanyl-p-aminohippurique et de son sel de sodium En suivant le mode opératoire de l'exemple 3, on prépare l'acide benzoyl-L-phénylalanyl-c-aninohippurique par hydrolyse de benzoyl-L-phénylalanyl-jj-aninohippurate de méthyle. 35 La réaction est bien plus rapide avec les esters hippu riques, et elle est terminée au bout de 35 minutes à la température ambiante. Le produit fond à 205-20:30C, con pouvoir rota-—> Pâ. toire / a _7d est de +70,5° (1 CA dans le dirn-'thylformamide) et son équivalent de neutralisation est de 4-50. On obtient la forme ÇOPt BAD ORIGINAL 71 41303 t. ±xyj Dit comme matière solide incolore fondant ?i 200-202°C, donîuuvb dos résultatn corrects à l'analyse. Là encore, la réaction est terminée en 35 minutes. Les sels de sodium des acides L et DL s'obtiennent 5 en neutralisant exactement les acides libres et en récupérant les sels par lyophilisation. faemple 5 Préparation du îT-benr.o;'l~L~phcnylalunyl{2;lycylglye3^1-;o-araino-hippurate de méthyle 10 On ajoute goutte à goutte à une solution de 24,2 g de bensoyl-L-phénylalanine dans 200 ml de tétrahydrofuranne anhydre à -10°C, d'abord 9,1 g de N-néthylmorpholinet puis en une période de 2 minutes, 9,7 g de chloroformiate d'éthyle. Au bout de 10 minutes à -10°C, on ajoute une suspension de 30,3 g de sel d'acide" 15 p-toluènesulfonique du glycinate de benzyle et 9,1 g de rnothyl-morpholine dans 275 ml de tétrahydrofuranne et on laisse le mélange s'équilibrer avec la température ambiante. Après agitation pendant environ 16 heures, on réduit le volume de liquide à 300 ml et on verse le mélange sur 1300 g d'un mélange d'eau et de glace. 20 Au bout d'une heure on isole les substances solides par filtration. L'ester benzylique intermédiaire, en quantité"de 33,7 g, fond à 149°0. " " L'ester benzylique, dissous dans 700 ml de tétrahydrofuranne, est agité avec 3 g de palladium à 5 % sur du charbon à 25 la température ambiante, cependant qu'on fait barboter de l'hydrogène pendant environ 16 heures. La chromatographie en couche mince montre qu'il ne reste pas d'ester. Le catalyseur est séparé par filtration et la solution est purifiée. Le résidu solide est recristallisé en donnant l'acide désiré, ayant un équivalent de 30 neutralisation de 323 (la valeur théorique est de 326). On prépare une solution de 15,8 g de tertiobutoxy-carbonylglycine, 18,7 g de ]D-aminohippurate de méthyle et 18,6 g de dicyclohexylcarbodiimide dans 1300 ml de chlorure de méthylène. Après agitation pendant environ 16 heures, on évapore le mélange 35 à environ 500 ml et on le filtre. On extrait plusieurs fois les substances solides avec 500-7C0 ml de tétrahydrofuranne, on filtre et on évapore la solution pour' obtenir 2J,7 'C de 1:-. r;ubiitonce solide solubie dans le tétrahyvirofuranne. On ajoute cette substance 1 gOP^ 71 41365 u 2115246 à 100 ml d'acide tr if luor.".cé tique. Après la .réaction exothermique, on ajoute de nouveau 50 ml d'acide brifluoracotique. Au bout d'une heure, on chasse l'acide triflucracofcique. On dissout le résidu dans 120 ml de méthanol et on ajoute 300 ml d'éther 5 à la température ambiante. Le produit cristallise lentement et on le filtre pour obtenir 25,9 g du sel désiré. Analyse : C c,o H c/o JJ "/s Calculé : 44,3 4,22 11,08 Trouvé : 44,0 4,26 11 ,04 10 On ajoute 5,1 g de N-méthylmorpholine à -10°C à une solution de 16,3 g de bensoylpliénylalanylglycine dans 300 ml de tétrahydrofuranne anhydre» Au bout de 5 minutes, on ajoute en 2-3 minutes 5,4 g de chloroformiate d'éthyle et agite le mélange pendant 10 minutes à -10°C. Entre temps, on prépare une solution 15 de 19 g du sel d'acide trifluoracétique du N-glycyl-jo-aminohippurate' de méthyle et 5,1 g de N-méthylmorpholine dans 65 ml de diméthylformamide. On ajoute ensuite cette solution au mélange réactionnel, qu'on laisse s'équilibrer avec la température ambiante. Au bout de quatre heures, on verse le mélange sur 800 g 20 ^-e Sla°e et un litre d'eau, on agite pendant une demi-heure, on filtre et on sèche. Le produit solide, qui est le N-benzoyl-L-phénylalanylglycylglycyl-n-aminohippurate de méthyle (25,5 g), fond à 245-252°C ; [_ a_7 jp = -38,5° (1 c/° dans le diméthylformamide) . Analyse : C fo H N'fZ Calculé î 62,8 5: ,4 12,2 Trouvé : 62,7 5. ,6 12,1 Exemple 6 Préparation du flT-benzoyl-L-phénylalanylglycylglycyl-30 £-aminohippurate d'ammonium On ajoute 5 ml de tertiobutylate de potassium 1N dans le diméthylsulfoxyde à une solution de 0,573 g de benzyl-l-phénylalanylglycylglycyl-_£-aininohippurate de méthyle préparé comme dans l'exemple 5, dans 5 ml de diméthylsulfoxyde. Au bout 35 de 15 minutes à la température ambiante, la chromatographie en couche mince montre qu'il ne reste pas d'ester méthylique. Au bout de 35 minutes, on verse le mélar.je réaction/nul dans 2C0 ml d'eau froide, contenant 10 ml d'acide chlorhydrique 0,5IT. Après repos pendant 30 minutes, on isole l'acide libre p-ir filtration COPY BAD ORIGINAL 71 41365 . 15 2115246 pour obtenir, après séchage, 0,55 g d'une substance solide incolor qui est le N-benzoyl-l-phénylalanylglycylglycyl-T>-aminohippurate d'ammonium ; [a _7'^ = -34,9° (1 > dans le riir::û thylforr.iai.iide). Analyse : C Jo H jô N c/o 5 Calculé : 62,3 5,19 12,5 Trouvé : 62,2 5,25 1 2,2 Un autre échantillon (9,5 g) est dissous dans 20 ml d'hydroxyde d'ar.imôniura 1ivi et 200 ml d'eau. On chasse sous vide à peu près la moitié de l'eau, en maintenant le mélange au frais 10 pour empêcher le noussage. On ajoute environ 600 ml d'acétone et on agite le ballon par secousses pour dissoudre le résidu épais, puis on ajoute'un supplément de 400 ml d'acétone. Après repos pendant environ 16 heures au réfrigérateur, on filtre le " mélange et en le sèche pour obtenir 8,5 g du sel d'atamonium ; 15 J_ a_7g^ = -41° (1 CA dans le diméthylf ornamide). Exemple 7 Préparation du xT-benzoyl-l3^ph.énylalanylglycyl-jo-aminobenzoate d'éthyle On ajoute 5,0 g de triétïiylamine puis 5,4 g de chlo-20 roformiate d'éthyle à une solution de 10,5 g de carbobenzoxygly-cine dans 100 ml de tétrahydrofuranne à -10°C. Au bout de plusieurs minutes, on ajoute goutte à goutte une solution de 8,25 g de p-aminobenzoate d'éthyle dans 25 ml de tétrahydrofuranne. On laisse reposer le mélange réactionnel pendant environ 1 6 heures 25 à la température ambiante. On le verse ensuite sur de la glace et de l'eau, on le déshydrate et on le recristallise dans du benzène pour obtenir 6,5 g de carbobenzoxyglycyl-o-aminobenzoate d'éthyle fondant à 150-152°C. Analyse : C fi H c/° N fo 30 Calculé : 64,0 5,6 7. ,9 Trouvé : 64,0 5,8 7, ,9 On fait barboter de l'hydrogène gazeux dans une suspension de 2 g de palladium à 10 ^ sur du charbon, dans une solution de 17,8 g du carbobenzoxyglycyl-r-aminobenzoate d'éthyle dans '5 1600 ml d'éthanol, pendant une période de 36 heures. On sépare le catalyseur par filtration et on évapore l'éthanol. Aiîrès recristallisation dans le cyclchexsne, le fily cy l-p-x.iinobencoe.be d'éthyle fond à c8-93°C et son équivalent de neutralisation est de 236 (la valeur théorique est de 222). COPY 8AD ORIGINAL 71 41365 16 2115246 On ajoute 8,8 g de 1'aminoester indiqué ci-desnus, à -10°C, à l'anhydride mixte obtenu à partir de 10,8 g de benzoyl-L-phénylalanine et de chloroformiate d'éthyle dans du tétrahydrofuranne anhydre, Après repos pendant 1,5 heure à la température 5 ambiante, on verse le mélange sur de la glace et on le traite comme indiqué ci-dessus. Par recristallisation dans le nuthanol, le produit donne 10 g d'une substance solide blanche, à savoir le N-benz'oyl-L-phénylalanylglycyl-^-aminobenzoate d'éthyle fondant à 223-224°C ; C ~ -34,4° (1 ï» dans le diméthylformamide). 10 Exemple 8 Préparation du N-adipoyl-bis(L-phénylalanyl-p-aminobenzoate)de sodium et d'ammonium On ajoute simultanément à une solution de 18,2 g de L-phénylalanine dans 110 ml d'hydroxyde de sodium 1ÏT, 9,15 g de 15 chlorure d'adipoyle et 100 ml d'hydroxyde de sodium 11T en deux heures a 5°0f de manière à maintenir le pH entre 11,5 et 11,8. On acidifie la solution avec 30 ml d'acide chlorhydrique 6N et on la filtre, la substance solide sèche est dissoute dans 75 ml de méthanol chaud, la solution est filtrée et on ajoute 130 ml 20 d'eau pour précipiter l'adipoyl-bis(phénylalanine) purifiée, fondant à 90°G ; = -6>9° (1 eA dans le diméthylformamide), équivalent de neutralisation = 224 (valeur théorique = 220). On prépare une solution de 8,8 g de cet acide dans 150 ml de tétrahydrofuranne anhydre. On ajoute à cette solution, 25 à -15°G, 4,9 ml de N-méthylmorpholine et 200 ml de tétrahydrofuranne. On ajoute ensuite 4,4 ml de chloroformiate d'éthyle. Au bout de 15 minutes à -15°G, on ajoute 7,26 g de p-aminobenzoate d'éthyle dans 20 ml de tétrahydrofuranne et 0,76 g d'acide p-toluènesulfonique dans 10 ml de tétrahydrofuranne. On maintient 30 le mélange réactionnel à 5°C pendant environ 16 heures, puis on le verse dans 160 ml d'acide chlorhydrique 1N additionné d'un kilogramme de glace et de 400 ml d'eau. Au bout de 30 minutes, on filtre le mélange réactionnel et on le lave. On sèche la substance solide et on la recristallise dans du méthanol pour obtenir 35 10,8 g de N-adipoyl-bis(I-phénylalanyl-jD-aminobenzoate) de dié-thyle fondant à 236-238 °C Analyse : C fô H Jo N jâ Calculé î 68,7 6,3 7,63 Trouvé s 69,1 6,45 7,44 £AD ORIGINAL j 71 4136 5 * 17 2115246 On dissout l'ester (35 g) dans 450 ml ds dinuSthylsulioxyde et on ajoute à la solution une solution de 28 £ de tertiobutylate de potassium dans 250 iâl de diu-Jthyloul£o:cyde* Après repos pendant 16 heures à la température ambiante, on verse le mélange réactionnel 5 dans 3500 ni d'eau glacée contenant 30 fjL d'acide chlorhydrique concentré . On filtre le précipité et en le sèche. On le traite ensuite avec 7U0 ml d'eau contenant 10 x.:l d1 ammoniaque, et on filtre sur "Ceiite". On acidifie le filtrat limpide et on isole par filtration l'acide libre. Par recristallisation dans le méthanol et dans l'eau, 10 on obtient le diacide solide, à savoir l'acide îï-adipoyl-bis( 1-phény 1 alany1-n-ar.inobenzoïque) fendant à 273-275°C ; équivalent de neutralisation =316. Analyse : C fi . H fi N fi Calculé : 67,3 5, ,6 8, ',3 15 Trouvé : 67,3 5j ,5 . 8. ,1 On prépare les sels de sodium et d'ammonium par neutralisation exacte et lyophilisation. Exemple 9 Préparation de l'acide/benzoyl-l-tyrosyl-p-aminobenzoïque 20 On prépare un mélange de 18,1 g (0,1 mole) de L-tyro sine, 7,0 g (0,05 mole) de chlorure de benzoyle et 200 ml de tétrahydrofuranne anhydre. Après agitation au reflux pendant deux heures, on refroidit le mélange à la température ambiante et on sépare par filtration le précipité de chlorhydrate de tyrosine 25 (11 g, 46 milliéquivalents de Cl"). On évapore le tétrahydrofuranne et on extrait le résidu au tétrachlorure de carbone (reflux, 3 portions de 100 ml qu'on jette), puis on dissout le résidu dans de l'acétate éthylique (200 ml) en filtrant les substances insolubles. On évapore la solution dans l'acétate éthylique 30 pour obtenir 13,2 g d'un produit solide fondant à 159-162°C (93 fi). On récupère la tyrosine (8 g) du chlorhydrate par neutralisation avec une base alcaline aqueuse. Un échantillon préparé D d'une façon analogue a un pouvoir rotatoire £a J2^ égal à -76° (1 fi dans le diméthylformamide). 35 Analyse : C fo H fi H fi Calculé î 67,4 5, ,3 4 ,9 Trouvé : 67,1 5] ,2 4; ,8 On prépare une solution de 5,7 g (20 mmoles) de ïï-bensyi- BAD ORIGINAL^ 71 41365 18 2115246 L-tyrosine et 2,04 g (20 immoles)de IJ-u.HIiyli-orpiioline dans 60 mi de tétrahydrofuranne à -15°0 et on ajoute à cette solution 2,08 g (20 mraoley)de chloroformiate d1 othyle. Au bout de 12 minutes, on ajoute 2,74 g (20 mmoles) d'acide P-ar.ûnobenzoïque dissous dans 5 25 ml de tétrahydrofuranne et 0,33 g d'acide p-toluènesulfonique (2 mmoles) et on laisse la température s'élever à 5°C. Au bout de deux heures et 40 minutes, on verse le mélange dans un litre d'acide chlorhydrique 0,1 N froid, on agite pendant une derai- heure, on filtre et on sèche pour obtenir 8,7 g de substance 10 fondant à 1S2-2230C„ On recristallise le produit dans 90 ml de méthanol et 40 ml d'eau pour obtenir 6 g (74 /•=) de produit, à savoir l'acide N-benzoyl-L-tyrosyl-jD-aminobenzoïque fondant à 240-242°C ; £~a ~ +72,3° (1 dans le diméthylformamide). Analyse : G ç/o H c/o N c/o Equivalent 15 de neutra lisation Calculé : 68,3 5,0 6,9 404 Trouvé î 68,1 5,1 6,7 413 Exemple 10 20 Préparation du N-acétyl-L-phénylalanyl-£-aminohippurate de méthyle On condense 4,16 g (20 mmoles) de £-aminohippurate de méthyle avec 4,14 g (20 mmoles) de ÏT-acétyl-L-phénylalanine par le procédé à l'anhydride mixte de l'exemple 9« Après 4,5 heures à 5°G, on verse le mélange dans 1,2 litre d'acide chlorhydrique 25 0,1N froid, on filtre le précipité et on le sèche pour obtenir 5,0 g de N-acétyl-L-phénylalanyl-£-aminohippurate de méthyle fondant à 234-238°C ; /â _7^5 = +73,8°(1 c/o dans le diméthylformamide). On précipite une quantité supplémentaire d'un gramme en chassant le tétrahydrofuranne du filtrat. Le rendement est de 30 75 °/o. Exemple 11 Préparation de l'acide N-acéty 1-L-phénylalanyl-_o-aiainohippurique On prépare un mélange du IT-acétyl-L-phénylalanyl-jo-aminohippurate de méthyle préparé comme dans l'exemple 10 (5,95 g, 35 15 mmoles) dissous dans 25 ml de diméthylsulfoxyde et de tertio-butylate de potassium (8,4 g, 75 mmoles) dissous dans 65 ml de diméthylsulfoxyde. Après repos à la température ambiante pendant 45 minutes, on verse le mélange dans une solution de '100 ml d'acide chlorhydrique 1N et 600 ml d'eau. On filtre le produit et on le BAD ORIGINAL 71 41365 . 19 2115246 sèchey puis on le dissout dans 500 ml de méthanol chaud, lorsque le produit ne précipite plus, on ajoute 200 rai d'eau et, en refroidissant à -20°G, on obtient un précipité du produit qu'on sépare par filtration et qu'on sèche pour obtenir 3,3 g d'acide lï-acétyl-5 L-phénylalanyl-ja-aminohippurique fondant à 258-260°C ; /_«■_/2^ -+74,2°. On obtient 1 g supplément aira en diluant davantage. Analyse : C L,o H c/o II c,'s Tétrahy drofuranne 10 Calculé : 62,7 5,5 11,0 383 Trouvé : 62,6 5,5 10,7 387 Exemple 12 Préparation de l'acide IT-benzoyl-L-phénylalanylanthranilique En suivant le mode opératoire de l'exemple 9 et en 15 utilisant le procédé à l'anhydride mixte, on obtient à partir d'acide anthranilique (2,74 g, 20 Eim.oles)et de benzoyl-L-phénylalanine (5,38 g, 20 mmoles) au bout de 3,5 heures à 5°C, un produit brut pesant 7,35 g (95 $ de la théorie) et fondant à 215-218°C ; £~ £L725 = +5,4°. Après recristallisation dans le méthanol, le 20 produit, à savoir l'acide ÎT-benzoyl-L-phénylalanylanthranilique (4,65 g), fond à 218°C ; 25 = +9,7° ; équivalent de neu tralisation = 392 (théorie = 388). Analyse : C fo H $ N °/o Calculé : 71,1 5,2 7,2 25 Trouvé : 71,0 5,2 7,2 Exemple 13 Préparation du N-benzoyl-L-phénylalanvlanthranilamide En suivant le mode opératoire de l'exemple 12, on obtient à partir de 2,72 g d'anthranilamide et de 5,38 g de benzoyl-30 L-phénylalanine, après une période de réaction de 4,5 heures, 7,37 g de N-benzoyl-L-phénylalanylanthrahilamide brut (96 tfo) fondait à 165-175°C qui, après recristallisation dans l'acétate d'éthyle, fond à 182°C ; /a +13°. Analyse : C c/o H fi N 35 Calculé : 71,3 5,4 10,9 Trouvé : 71,7 5,6 10,9 BAD ORIGlNAt] • " 20 _ 71 41365 2115246 Exemple 1 4 Préparât .ion du N-ben ^oyl-L-phanylnlnnylsulf anilamide En suivant le mode opératoire de l'exemple 12, on obtient à partir de 8,6 g de bensoyl-L-phénylalanine (13,45 g), après 2,5 heures de réaction selon le procédé à l'anhydride mixte, ^0 g (95 >-■) du produit, à savoir le IT-benr.oyl-L-pliényl-alanylsulfanilamide, de pureté convenable sans recristallisation, fondant à 233-235°C j [_ a_J^2^ 5 = +60,2° (1 c/° dans le diméthylformamide). 10 Analyse : C fi H fi n i S /O Calculé : 62,4 5,0 9,9 7,6 Trouvé : 62,1 5,1 9,6 7,5 Exemple 1 5 Préparation du U-benzoyl-L-tyrosylsulfanilamide 15 En suivant le mode opératoire de l'exemple 12, on . obtient à partir de 0,285 g de N-benzoyl-L-tyrosine et de 0,172 g de suif anilamide, après réaction pendant deux heures selon le procédé à l'anhydride mixte, voie substance solide qui, après recristallisation dans 10 ml de méthanol à 50 fi, fond à 188-190°G ; 20 C aJ2à, = +69>3° Exemple 16 Préparation de l'acide adipoyl~bis-(L-tyrosyl-£-aminobenzoïque) 25 On ajoute 7,24 g de L-tyrosine et 1,83 g de chlorure d'adipoyle à 75 ml de tétrahydrofuranne anhydre et on chauffe le mélange en l'agitant au reflux pendant deux heures. On isole par filtration le chlorhydrate de tyrosine et on rince avec 75 ml de • tétrahydrofuranne. On ajoute au filtrat, à -20°C, 2,02 g de ïï-30 méthylmorpholine et 2,17 g de chloroformiate d'éthyle, le tout en une seule fois. Au bout de 12 minutes, on ajoute 2,74 g d'acide p-aminobenzoïque et 0,38 g d'acide p-toluènesulfonique0 Après repos pendant 2,5 heures à 5°C, on verse le mélange réactionnel dans 600 ml d'acide chlorhydrique 0,1 N et on filtre. 35 Après recristallisation dans du méthanol et de l'eau, on obtient 3,15 g d'une substance solide blanche, à savoir l'acide adipoyl-bis-(L-tyrosyl-jD-aminobenzoïque), fondant à 262°C en se décomposant ; J_a_724 = + 72,7° (1 /- dans le diméthylformamide). BAD ORIGINAL COPY 71 41365 • 21 2115246 3■ '■ r'yr.ii3 (après corroction pour tenir coi.rote do l'eau) : C /J 11 'J N y'a C; il cul a : 64,2 5,53 7,9 Trouvé : 64,2 5,35 7,5 ■Hxonnlo 1 7 l'r.-J >;aration de 1 ' acide J'-ben::c"1-tliionvl-o-tvainobeïiz oïoug Un ajouuc ■.l,?4 ■ ' uo Jj-Hetuionino et 4,dj do c.-Llorure de benzoyle à 75 ml de tétrahydrofuranne et on chauffe le mélange au reflux pendant deux heures. On refroidit le mélange, on sépare 10 par filtration le cilorhydrate de L-méthionine insoluble et on lave avec 75 eiI de tétrahydrofuranne. On refroidit la solution à -1 5°0 et on y ajoute rapidement 3,03 g de N-méthylmorpholine et 3,24 g de chloroformiate d'éthyle. Au bout de 12 minutes, on " ajoute 4,11 g d'acide p-aminobensoïque et 0,57 g d'acide p-15 toluènesulfonique dissous dans 30 ml de tétrahydrofuranne • Après deux heures à 5°, on verse le mélange dans 1,5 litre d'acide chlorhydrique 0,1 N froid, on filtre et on recristallise dans l'acétate d'éthyle pour obtenir 6,4 g d'une substance solide blanche, l'acide F-benzoyl-l-méthionyl-jD-aminobenzoxque, fondant à 205 °C ; 20 /~a_724 = +65,7° (1 i° dans le diméthylformamide). Analyse : C jé H c/o N fi s io Calculé : 61 ,3 5,4 7,5 8,6 Trouvé : ~ 61,5 5,4' 7,3 8,7 Exenvole 18 25 Préparation de l'acide N-benzoyl-L-leucyl-jD-aminobenzoïque En suivant le mode opératoire de l'exemple 17, et en remplaçant la L-méthionine par la L-leucine dans la môme proportion moléculaire, on obtient une substance solide blanche, l'acide ÎT-benzoyl-l-leueyl-jD-aminobenzoïque, en un bory^enderaent, 30 fondant à 198-200°G ; /~a_7^4 = +95,2°. Analyse : N c/o Calculé : 7,9 Trouvé : 7,5 Exerrrole 1 9 35 Préparation de l'acide îr-benzoyl-L-tryptorhyl-p-ar.iinobenzoï'que On chauffe au reflux pendant deux heures un mélange de 20,4 g de L-tryptophane et 7,03 g de chlorure de bon^oyle dans KO ml do t ibrahydrofiirannc anhydre, on refroidit et on sépare par filtration le chlorhydrate de tryptophane» On ajoute au filtrat, BAD ORIGINAL eOPY 71 41365 22 2115246 à -1 5°C, 5,05 g de îI-mithy.L'iiorpholin.o et 5,43 s de cliloi'oformiate d'éthyle puis, en 12 minutes, 6,35 g d'acide p-aminobensoïque et 0,95 g d'acide p-toluonesuii'onique i-io^chydrato. Au beat d'une heu.ee à -15°G et de deux heures à 5°0, on verse le mélange réactionnel 5 dans 1,5 litre d'acide chlorhydrique 0,1 N froid. On isole le produit par filtration, on le lave et en le sbeho. On le dissout deux fois dans de l'acétate d'éthyle et on ajoute de l'éther de pétrole pour effectuer la recristallisation. On ajoute du charbon pour atténuer la couleur. le produit obtenu, à savoir 10 l'acide N-benzovl-L-tryptophyl-iî-aminobenzoïque, est une substance solide de couleur jaune-brun clair en quantité de 11,5 g ; jjz _]\^ ^ = +75,8°» L1 équivalent de neutralisation e st de 434 (théorie 427). Analyse : N /<> 15 Calculé : 9,8 Trouvé : 9,5 Exemple 20 Préparation de l'acide IT-acétyl-L-tyrosyl-jD-aminobensoïque On ajoute 1.5,7 g de chlorure d'acétyle à une suspension 20 de 72,4 g de L-tyrosine dans 500 ml de tétrahydrofuranne anhydre. On agite le mélange pendant 18 heures à la température ambiante et on sépare par filtration le chlorhydrate de tyrosine. On refroidit le filtrat à -15°C, en ajoute 20,2 g de Itf-méthylmorpho-line et 21,7 g de chloroformiate d'éthyle, et 15 minutés plus 25 tard on ajoute 27,4 g d'acide p-aminobenzoïque et 3,8 g d'acide p-toluène suifonique monohydraté. Au bout d'une demi-heure à -15°C, on agite le mélange à 5°C pendant 3 heures, puis on le verse dans six litres d'acide chlorhydrique 0,1 N froid, on filtre et on sèche. On recristallise le produit brut(47 g)d'abord dans de l'éthanol, 30 de l'acétate éthylique et de l'éther de pétrole, puis dans du méthanol aqueux. Le produit recristallisé final, à savoir l'acide H-acétyl-l-tyrosyl-p-aiainobenzoïque en quantité de 26 g, fond à 229-231 °C ; J_ a J 25 5 = +91>5° (1 % dans le diméthylformamide) ; équivalent de neutralisation = 367 (-théorie = 342). 35 Analyse : N c/o Calculé î 8,2 Trouvé : 7,7 sad original 1 ,C0PY 23 ■ _ - ■ 71 41365 - 2115246 b'foy^le -J1 Préparation de l'acide N-propionyl-L-tyrosyl-p-aminobenzoïque jJn suivant le mode opératoire do l'e:ccmple 20 et en remplaçant le chlorure d'acétyle par 18,5 g de chlorure de^ropio-5 nyle, on obtient 46 g de produit brut. Après deux recristallisations, comme dans l'exemple 20, le produit, à savoir l'acide K-propionyl-l-tyrosyl-£-aminobenr;oïfiue,fond à 241-242°G ; J_ a ^ = +89,6° (1 -ï<> dans le diméthylformamide) ; équivalent de neutralisation = 372 (théorie = 256). 10 Analyse ; C i= H °,o F $ Calculé : 64,1 5,5 7,9 Trouvé : 63,7 5,9 7,6 Exemple 22 Préparation de l'acide N-butyryl-L-tyrosyl-j3-aninoben£oïque 15 En suivant le mode opératoire de l'exemple 20 et en remplaçant le chlorure d'acétyle par 20,6-ml de chlorure de butyryle, i on obtient 49,1 g de produit brut qu'on recristallise deux fois ; de la manière déjà indiquée. Le produit obtenu, Ravoir l'acide N-butyryl-L-tyrosyl-]3~aminobenzoïque, fond à 223-226°C 20 + 78,4 (1 /» dans le diméthylformamide) ; équivalent de neutralisation = 383 (théorie = 370). Analyse : C c/o H * H i Calculé : 64,9 6, 0 7,6 Trouvé : 64,5 6, 2 7,4 25 Exemple 23 Préparation de l'acide N-éthoxycarbonyl-L-tyrosyl-p-aminobenzoïque On chauffe au reflux pendant 24 heures un mélange de 36,2 g de L-tyrosine et de 10,9 g de chloroformiate d'éthyle dans 200 ml de tétrahydrofuranne. Après séparation du chlorhydrate 30 de tyrosine par filtration, on refroidit la solution à -15°C et on lui ajoute 10,1 g de II-méthylmorpholine et 10,9 g de chlorof ormiate d'éthyle, et, 15 minutes plus tard, 13,7 g d'acide p-aminobenzoïque et 1,9 g de monohydrate d'acide p-toluènesuifonique. Après une demi-heure à -15°C, on laisse reposer le mélange pendant 35 24 heures à 5°C. On le verse ensuite dans de l'eau acidifiée et on extrait le précipité à consistance gommeuse dans un litre d'acétate éthylique. On déshydrate l'extrait sur du sulfate anhydre de magnésium et on concentre à environ 100 ml, volume pour lequel ' BÂD ORIGINAL CO^i 7141365 34 2115246 la substance solide précipite. On- chauffe la solution pour diaooudre la substance solide, puis on la refroidit à -20°C pour précipiter 20 g du produit brut. On recristallise ce produit dans 100 ml d'acétate éthylique, on refroidit à -20°C et on obtient 16 g d'acide 5 N-éthoxycarbonyl-l-tyrosyl-p-arainobenzoïque purifié, de pouvoir rotatoire £" ^ égal à +84,3° (1 ï* dans le dinéthylformamide) ; équivalent de neutralisation = 379 (théorie = 372). Analyse : C L,o H ÎT je Calculé : 61,3 5,4 7,5 10 Trouvé : 61 ,8 5,7 7,3 Exemple 24 Préparation de l'acide N-benzoyl-l-tyrosylanthranilique On prépare une solution de benzoy1-1-tyrosine dans le tétrahydrofuranne en chauffant au reflux un mélange de 26,1 g 15 de chlorure de benzoyle et de 72,4 g de l-tyrosine dans 400 ml de tétrahydrofuranne pendant deux heures, en refroidissant, en filtrant puis en lavant le précipité de chlorhydrate de l-tyrosine avec 150 ml de tétrahydrofuranne. On divise le filtrat (540 ml) en deux moitiés, une partie étant utilisée dans cet exemple et 20 l'autre étant utilisée dans l'exemple suivant. On refroidit une moitié du filtrat (270 ml) à -20°C# on ajoute 10,1 g de N-méthylmorpholine et 10,9 g de chloroformiate d'éthyle, et on agite le mélange réactionnel à -15°C pendant 10 minutes. Ensuite, on ajoute 13,7 g d'acide anthranilique 25 et 1 ,9 g d'acide p-toluènesuifonique. Au bout d'une demi-heure à -15°C, on laisse reposer le mélange réactionnel à C°G pendant deux heures, puis on le verse dans quatre litres d'acide chlorhydrique 0,1 N froid. On isole le produit brut par filtration et on le sèche. On le recristallise dans du méthanol et de l'eau et 30 on obtient 31,8 g d'acide N-benzoyl-l-tyrosylanthranilique fondant à 204-208°C ; 5 = +1,5° (1 dans le diméthylformamide). Analyse ï G ^ H 5Ô •N i Calculé : 68,3 5,0 6,9 Trouvé : 68,3 5,2 6,8 35 Exemple 25 Préparation de l'acide N-benzoyl-1-tyrosyl-m-aminobenzoïque iîn suivant le mode opératoire de l'exemple 24 et en remplaçant l'acide anthranilique par l'acide m-aninobenzoïque, on obtient 30,9 g de l'isomère meta fondant à 249-253°C ; ORîGfNAL " copY 71 41365 * 2115246 CaJ% 5 = +56,8° (1 >j dans le dimétliylformamide ). /•nalyno : C ji H N io Calculé : 68,3 5,0 6,9 Trouvé : 68,2 5,0 6,8 E.remnlo 26 lYoca.r'ition ci-i l'acido TT-b ftr ~ o"l— t "'rc • r o—3—io On dissout 14,3 g de benzoyl-L-tyrosine dans 200 ml de tétrahydrofuranne, on refroidit à -20°C et on transforme en anhydride mixte par addition simultanée de 5,05 g de IT-méthyl-10 morpholine et 5,43 g de chlorof ormiate d'éthyle. Au "bout de .10 minutes à -15°C, on ajoute 13,2 g d'acide 4-amino -4 - io d ob enr; o ïque et 0,95 g d1acide p-toluène suifonique monohydraté. On agite le mélange réactionnel pendant une demi-heure à -15°C puis on le laisse reposer pendant environ 16 heures à 0-5°G. On verse le 15 mélange dans 3 litres d'acide chlorhydrique 0,1 N froid, on verse la phase aqueuse par décantation pour la séparer d'une phase huileuse visqueuse, et on sèche la phase huileuse jusqu'à ce qu'on obtienne une substance solide poisseuse. Cette substance solide, à savoir l'acide N-benzoyl-L-tyrosyl-4-amino-3-iodobenzoïque (18 g), 20 est recristallisée dans /méthanol en donnant 4 g d'une substance solide d'un blanc sale fondant à 228-230°C ; £~«_725,6 = -25,6° (1 i dans le diméthylformamide). Analyse : îl c/o I c/a Calculé : 5,3 23,96 25 Trouvé : 5,0 23,12 Exemple 27 Préparation de l'acide K-benzoyl-L-tyrosyl-4-afflino-2-hydroxy-benzoïqne On refroidit à -20°C une solution de 28,5 g de benzoyl-30 L-tyrosine dans 270 ml de tétrahydrofuranne et on transforme ce composé en anhydride mixte, comme indiqué ci-dessus. On ajoute 19,0 g d'acide para-aminosalicylique et 1,9 g d'acide p-toluène-sulfonique monohydraté, on agite le mélange pendant une demi-heure à -15°C et on le laisse reposer pendant environ 16 heures 35 à 0°C. On le verse ensuite dans deux litres d'acide chlorhydrique 0,117, on le filtre et on sèche le précipité. Après recristalli-satien dans le méthanol et l'eau, le produit obtenu, à savoir l'acide IT-benzoyl-L-tyrosyl-4-amino-2-hydroxybenzoïque, fond en se décomposant à 185-1 S5°C, il a un pouvoir rotatoire 71 41365 2115246 +77° (1 /-> dans le diméthylfor::ia::;ide) et un équivalant de neutralisation de 422 (théorie = 420). Analyse : Galculé : 5 Trouvé : E;-:ciP.'ola 23 Préparation de l'acide N-ber.r,o:.rl-L-tyro37l-4-gjaino-5~r.vithyl-bensoïque En suivant le mode opératoire de l'exemple 27, on iO prépare le composé à partir de l'anhydride nixte dérivé de 8,55 g de benzoyl-L-tyrosine, par réaction avec l'acide 4-aaino-3-méthylbenzoïque (4,53 g) et l'acide p-toluènesulfonique (0,57 g) « Après recristallisation dans un mélange de méthanol et d'eau, puis séchage, on obtient un produit blanc, à savoir l'acide 15 U-benzoyl-L-tyrosyl-4-amino-3-méthylbenzoïque (8,7 g) fondant à 242-244°C. Cette substance a un équivalent de neutralisation de 403 (théorie = 418). Analyse : C fo H fo N fo Calculé : .68,9 5,3 6,7 20 Trouvé î 68,8 5,4 6,6 Exemple 29 Préparation de l'acide N-benzo,yl-L-tyrosyl-4-amino-3«5~diméthyl-benzolque On dissout 4,27 g de benzoyl-L-tyrosine dans 100 ml 25 de tétràhydrofuranne et on refroidit la solution à -20°G. On ajoute simultanément 1,52 g de N-méthylmorpholine et 1,65 g de chloro-formiate d'éthyle et on agite le mélange pendant 10 minutes à -15°G. On ajoute 2,48 g d'acide 4-amino-3,5-diméthylbenzoïque et 0,28 g d'acide p-toluènesulfonique. Au bout de 48 heures à 30 0°C, on verse le mélange réactionnel dans 1,5 litre d'acide chlorhydrique 0,1 H froid, on sépare par filtration le précipité solide et on le recristallise dans un mélange de méthanol et d'eau pour obtenir 4,77 g d'acide H-benzoyl-L-tyrosyl-4-amino-3,5-diméthylbenzoïque fondant à 244-248°C ; = -36,9° ; 35 équivalent de neutralisation = 426 (théorie = 432). Dans chacun des exemples précédents, on peut remplacer l'acide p-toluènesulfonique par une solution de gaz chlorhydrique. Par exemple, dans un essai portant sur une mole (137 g) d'acide 2-aciinobenzoïque, 6 g d'une solution à 10 ^ de gaz chlorhydrique G ■; H I-T i o5,7 4,8 6,7 66,0 • 4,5 6,5 BAD ORIGINAL 71 41365 • 27 2115246 dans le tétrahydrofuranne (0,0165 mole) ont pour effet que la réaction avec l'anhydride mixte dérivé de benzoyltyrosine et de chloroforciiate d'éthyle est achevée en 3 heures environ à 0-50Co De même, de faibles quantités de gaz bromhydrique, d'acide 5 méthanesuifonique et d'acide sulfurique donnent de plus grandes vitesses de réaction. Exemple 30 Pr'éparation de l'acide ÎT-bensoyl-1-tyrosyl-D-I'T-méthylaninobenzoïque On prépare une solution 0,36 îl de benzoyl-L-tyrosine 10 dans le tétrahydrofuranne par réaction de chlorure de benzoyle \ avec la L-tyrozine, comme décrit ci-dessus. Oh refroidit cette solution (140 ml) à -15°C et on lui ajoute 5,5 ml de N-méthyl- ^ . morpholine et 5 ml de chloroformiate d'éthyle. Après une période de réaction de 12 minutes, on ajoute 7,.55 g d'acide ÎT-méthyl-ja- 15 aminobenzoïque et 0,95 g d'acide ^-toluènesuifonique. Après agi tation pendant trois heures entre -5 et -10°G, on verse le mélange dans deux litres, de solution froide d'acide chlorhydrique 0,t 1T, on filtre, on lave et on sèche, et on obtient 19,6 g de produit brut. On recristallise ce produit dans du méthanol et de l'eau 20 pour obtenir l'acide N-benzoyl-L-tyrosyl-ja-N-méthylaminobenzoxque fondant à 234-236°C ; =.+190° (1 fo dans le diméthylforma mide) ; équivalent de neutralisation =416. Analyse : N # Galculé : 6,7 25 Trouvé : 6,4 Exemple 31 Titrage enzymatique in vitro Le composé à expérimenter est dissous dans le tampon tris (pH 7,8), à une concentration d'environ 0,08 M dans ce tampon 30 (trihydroxyméthylaminométhane) pour préparer" une solution à environ 5 x 10~4 M. Si le composé n'est pas soluble, on le dissout dans du méthylcellosolve et on le mélange avec le tampon, de manière que la concentration en méthylcellosolve atteigne, si nécessaire, un maximum de 30 c/a dans le tampon, la solution aqueuse est mé- 35 langée avec la solution-mère d'enzyme (1 mg par ml dans l'acide chlorhydrique 0,001 1T) dans des proportions telles que le rapport molaire du substrat à l'enzyme soit d'environ 700:1, ou bien qu'il soit d'environ 30:1 si l'on utilise le méthylcellosolveo ' COPY 3AD ORIGINAL j- 2115246 Au bout de 24 heures, on prélève une partie aliquote convenable et on l'analyse au moyen de la méthode de Bratton-I-iarshall, ou au moyen d'autres te clinique s appropriées, pour doser le produit d'hydrolyse. Une hydrolyse sensible s'est produite pen-5 dant cette période de temps avec les matières actives. Des études in vitro à eu cov.ipooes des exemples 1 à 30 montrent qu'il convient d'utiliser ces composés dans le test d'insuffisance pancréatique de l'invention. Exemple 32 10 Evaluation du test d'insuffisance •pancréatique in vivo Une insuffisance pancréatique exocrine peut être produite chez les animaux par ablation chirurgicale du pancréas, altération chimique du pancréas ou ligature et sectionnement des canaux pancréatiques, pour empêcher l'entrée de la sécrétion 15 exocrine dans le duodénum. On choisit ce dernier mode opératoire parce qu'il est reproductible et qu'il traumatise moins l'animal" que les autres procédés. La stéatorrhée et l'azotorrhée prononcées qui se manifestent chez ces animaux après l'intervention chirurgicale confirment que l'insuffisance pancréatique exocrine 20 est effectivement réalisée. Le rat, le chien et le cochon nain de Guinée africaine sont des animaux qui conviennent bien pour cet essaioLes canaux biliaires du porc et du chien débouchent• dans le duodénum indépendamment des conduits pancréatiques et la ligature du conduit pancréatique cliez ces animaux n'affecte 25 pas l'écotilement de la bile.le porc et le chien dont le conduit pancréatique a été ligaturé et sectionné seront appelés dans ce qui suit, animaux CPLS. Chez le rat, le canal biliaire se confond avec le conduit pancréatique à sa sortie du pancréas. Par conséquent, la ligature et le sectionnement du conduit pancréati-30 que empêchent également la bile d'entrer dans l'intestin. Ces rats seront appelés rats B-CP1S, Un autre type de rat, appelé CB1S, -est celui dont le canal biliaire est ligaturé et sectionné en un point situé au—dessus du pancréas, ce rat présentant, ■ par conséquent, une insuffisance biliaire, mais non une insuf— 35 fisance pancréatique„ Des études préliminaires sont effectuées pour établir une dose du peptide capable de donner des taux mesurables de matière analysable dans l'urine. On a trouvé qu'une dose de 10 mg d'acide jo-^ino'keuzoïque dans 4 ml d'eau/kg de poids corporel 40 augmente les taux urinaires d'aminé aromatique chez les rats bien au-dessus du taux existant normalement. Par conséquent, une dose de peptide équivalant à 10 mg d'acide para—aminobenzoïque par kilogramme est utilisée pour les rats d'un bout à l'autre des 71 41365 BA0 0eUGlNAL COPY' 29 . 71 41365 * 2115246 essais statistiques. Dans le cas des porcs et des chiens, on constate qu'une dose équivalente de 5 mg d'acide js-aminobenzoxque est suffisante. On recueille l'urine tondant une période de 6 heures. On utilise la méthode expérimentale suivante : 5 On fait jeûner les aninaux pendant environ 16 heures, mais on leur laisse absorber de l'eau à volonté jusqu'au début de l'essai. Pour la conduite de l'essai, on place les animaux ayaiit jéuné dans des cages individuelles équipées de dispositifs permettant de recueillir l'urine, le.peptide de l'invention est, 10 ou bien en suspension, ou bien en solution dans 4 ml d'eau (pour les rats) ou 50 ml d'eau (pour les chiens et les porcs), la substance d'essai est placée dans une seringue équipée d'un tube doseur (en acier inoxydable pour les rats, en caoutchouc pour les chiens et les porcs). On fait passer le tube doseur par voie orale 15 dans l'estomac, tandis qu'on immobilise l'animal, et on chasse le contenu de la seringue (substance d'essai) dans l'estomac, la seringue est ensuite remplie d'un millilitre d'air pour les rats et 10 ml pour les chiens et les porcs, et l'air est chassé dans le tube doseur pour enlever dans ce tube tout résidu de la 20 substance d'essai, l'animal regagne ensuite sa cage, sans pouvoir accéder à l'eau. On recueille l'urine pendant les six heures suivantes, et on la conserve à l'état congelé après en avoir noté le volume total» l'urine est ensuite décongelée à la température ambiante, de manière à permettre sa dilution et son analyse. 25 les tableaux I à IY récapitulent les résultats des essais in vivo effectués sur les peptides de la présente invention Sur le tableau II, le peptide est administré en même temps que du bicarbonate de sodium, de manière à déterminer toute interférence possible des sucs gastriques sur le peptide avant son 30 interaction avec les enzymes pancréatiques. les peptides des tableaux I à IY sont représentés par des lettres qui désignent les composés suivants : (A) ÎT-benzoyl-Dl-phénylalanyl-p-aminobenzoate d'éthyle ; (B) K-benzoy1-1-phénylalanylglycyl-£-aminobenzoate d'éthyle ; 35 (C) l^b enz oyl-l-phénylalanyl-jg-amino hippurate de méthyle ; (D) îT-benzoyl-Dl-phénylalanyl-ri-cminohippurate de méthyle ; (E ) IT-benzoy 1-1-phény lalany lglycylslycyl-B-aminohippurat e de méthyle ; (F) î7-benzoyl-I-phénylalanyl-TC-aminobenzoate d'éthyle ; BAD ORIGINAL 71 41365 2115246 (G) U-benzoyl-L-phénylalariylt."lycyl^lycyl.-j_)-;.ijiiino}iirpurate d1 ammonium ; (II) Acide IT-bonsoyl-DL-::honylalcuiyl-j_-n;..incbon^oxque ; (I) Acide IT-benzoyl-l-phfmy lalany l-jo-amiaobenzoïque ; 5 (J) Acide IT-b enz oy 1-DL- pliény lalany l-jn-aminohippuri que ; (K) Acide K-benzoyl-l-pliénylalanyl-p-aninoliippurique ; (I) Adipoyl-bis (L-phénylalanyl-j:-ar.iinobenzoate) de diammonium ; (II) II-benzoyl-l-phénylalanyl-]j-aninobenzos.te de sodium ; (II) N-benzoyl-l-phénylalanyl-ja-aninohippirrate de ooditim ; 10 (0) Adipoyl-bis (l-phdnylalanyl-jD-aminobenzoate) disodiaue ; (P) IT-acé ty 1-L-phénylalany l-£-aminohippurate de sodium ; (Q) N-benzoyl-l-phénylalanyl-p-aminobenzènesulfonamide ; (R) IT-benz oyl-1-tyr o sy 1-_d-aminob enz o at e de sodium ; (S) Adipoyl-bis(l-tyrosyl-£-aminobenzoate) disodique ; 15 (T) IT-acétyl-l-tyrosyl-D-aminobenzoate de sodium ; (U) lî-propionyl-L-tyrosyl-p-aminobenzoate de sodium ; (V) IT-butyryl-L-tyrosyl-jj-aminob enzoate de sodium j (¥) IT-benzoyl-l-tryptophyl-jD-aminobenzoate de sodium ; (X) IT-éthoxy carbony1-L-tyro sy l-£- aminob enzo at e de sodium ; 20 (Y) 11-b enzoyl-L-tyr o sy l-o-aminob enzo at e de sodium j (Z) U-benzoyl-1-tyrosyl-m-aminobenzoate de sodium ; (AA) IT-benzoyl-l-tyrosyl-4-amino-3-méthylbenzoate de sodium ; (BB) F-b enz oyl-1-leucyl-£-aminob enzo at e de sodium ; (CC) H-benzoyl-l-méthionyl-£-axainobenzoate de sodium. .'** oriqin 71 41365 2115246 TABLEAU I Evaluation de peptides contenant de l'acide para-aminobenzoîqua de en vue/leur utilisation dans l'exploration de la fonction pancréatique exocrine chez les rats £1 -Peptide Pourcentage de récupération des aminés aromatiques dans l'urine en six heures P-CBLS c Normale £_aminobenzoate • de sodium (témoin) 69,8 (39,8-85,9) 66,8 (56,4-72,6) A 0,4 2,8 B 0,8 6,8 C 0,5 5,2 D 0,5 . 1,1 E 0,2 0,9 P 6,7 (4,9-7,3) 20,6 (19,0-22,3) G 1,6 (1,4-1,9) 3,1 (3,0-3,2) H ' 3,3 (2,0-4,4) 10,3 (6,7-14,6) I 20,0 (14,8-23,1) 56,6 (53,0-63,0) J 2,1 (1,4-3,0) 3,6 (3,1-4,6) K 4,4 (2,4-6,7) 7,3 (7,0-7,8) R 1,1 (0-4,7) 26,3 (25,3-27,4) BB 7,8 (3,5-15,4) 16,4 (9,6-26,2) CC 8,5 (3,6-13,3) 22,4 (12,0-37,4) a. Pour l'identité chimique, voir la liste des composés expérimentés. Dose équivalente de 10 mg d'acide para-aminobenzoïque par kg dans 4 ml d'eau. b. Valeurs moyennes, les extrêmes étant indiqués entre parenthèses. Lorsque les extrêmes ne sont pas indiqués, les résultats sont obtenus sur les urines rassemblées c. Conduit pancréato-biliaire ligaturé et sectionné. j i rBAD ORtG^ ' COPV 71 41365 32 2115246 TABLEAU II- Effets du bicarbonate de sodium sur l'évaluation des peptide3 contenant l'acide para-aminobenzoïque en vue de leur utilisation dans l'exploration de la fonction pancréatique exocrine chez les rats Peptide Pourcentage de récupération des aminés aromatiques dans l'urine en six heures P-CBLS 0 Normale M 27,1(23,4-31,7) 74,7(66,2-80,6) 10 R 11,9 (9,8-15,8) 55,2 (44,2-66,2) T 23,4 (19,9-25,3) 77,9 (73,6-81,1) U 29,5 (18,9-36,8) 68,8 (65,5-72,1) V 11,0 (9,6-12,3) 67,3 (59,9-72,1) W 12,7 (7,1-18,1) 33,0 (24,1-34,7) 15 2 6,9 (5,7-9,1) 64,9 (49,3-67,2) Y 2,4 (1,9-2,9) 7,4 (3,7-9,8) Z 1,6 (0,7-2,6) 43,0 (33,4-50,7) AA 1,3 (1,0-1,8) 18,2 (12,8-20,3) a. Pour l'identité des composés expérimentés, voir la liste donnée 20 ci-dessus. Dose équivalente de 10 mg d'acide para-aminobenzoïque par kg avec 4 ml de bicarbonate de sodium à 0,5 $. • b. ValeurMoyennes,avec les extrêmes entre parenthèses. c. Conduit pancréato-biliaire ligaturé et sectionné. BAD ORIGINAL 71 41365 • 2115246 TABLEAU III Evaluation de peptides contenant de l'acide para-aminobenzoïque en vue de leur utilisation dans l'exploration de la fonction pancréatique exocrine chez les cochons nains de Guinée africaine Si 5 Peptide Pourcentage de récupération des aminés aromatiques dans l'urine en 6 heures CPLSc Normale £-aminobenzoate de sodium (té- 10 moin) 48,5 (39,4-62,4) 64,0 (44,5-81,2) G 2,6 6,8 H 1,8 (0,8-2,7) 4,8 I 0,9 (0-2,3) 9,2 (7,2-10,8). J 0,5 3,0 (1,7-4,3) 15 E 0,3 (0,2-0,7) 3,8 (0,8-7,4) i . 1,3 5,3 M 3,4 (3,0-4,0) 20,5 (10,7-34,7) N 1,1 (0,2-2,0) 3,8 (2,4-6,6) 20 0 3,6(0,5-10,0) 29,9 ( 0,5-66,9) P 2,2 (0,6-3,5) 4,9 (3,6-9,4) Q 0,7 (0-2,6) 4,0 (0,8-9,8) H 0,8(0-4,3) 20,7(4,0-41,0) S 11,7 (3,4-23,6) 18,5 (7,0-25,5) 25 S 4,1 (2,8-3,5) 44,4 ( 20,3 - 58,0) U 2,4 (1,2-3,3) 46,3 (36,8-57,6) V 2,9 (1,7-5,0) 47,1 (41,6-57,2) W 3,0 (1,7-4,0) 23,1 (16,9-23,2) X 2,2 (1,3-2,9) 39,1 (36,9-41,3) 30 a. Pour l'identité des composés expérimentés, voir la liste donnée ci-dessus. Dose équivalente de 5 mg d'acide £-aminobenzoïque par. kg dans 50 ml d'eau. b. Valeurs moyennes avec les extrêmes entre parenthèses. Lorsque les extrêmes ne sont pas indiqués, l'essai ne porte que sur un 35 animal. c. Conduit pancréatique ligaturé et sectionné. 71 41365 34 2115246 TABLEAU IV Evaluation de peptides contenant l'acide para-aminobenzoïque en vue de leur utilisation dans l'exploration de la fonction pancréatique exocrine chez des chiens Peptide a Pourcentage récupéré d1aminés aromatiques dans l'urine en six heures ^ CPLS c normale M 54,8 (49,6-80,0) R 3,9 (1,6-5,8) 65,8 (16,2-66,0) T 66,2 (61,4-72,6) • U 64,6 (61,4-66,8) V 66,9 (52,2-75,1) W 52,3 (29,8-68,0) X 66,0 (62,6-69,5) 15 a. Pour l'identité des composés expérimentés, voir la liste donnée-ci-dessus. Dose équivalente de 5 mg d'acide ^-aminobenzoïque par kg dans 50 ml d'eau. b. Valeur Moyenne s avec .les extrêmes entre parenthèses. c. Conduit pancréatique ligaturé et sectionné. BAD ORIGINAL COPV î 71 41365 35 2115246 Les résultats des tableaux I à IV démontrent l'intérêt des peptides de l'invention dans la détermination de l'insuffisance pancréatique chez les animaux. Exemple 35 5 Formulations Pharmaceutiques On donne ci-après quelques exemples de formulations de compositions pharmaceutiques contenant un peptide de l'invention. Dans chaque formulation, les quantités des ingrédients énumérés sont indiquées en proportions en poids„ 10 C0HPRIK3S Ingrédients Parties en poids N-benzoyl-L-phénylalanyl-£-aminobenzoate de sodium 500 Amidon de maïs 100 15 Ethylcellulose 20 Stéarate de calcium 30 ci-dessus, on prépare des comprimés par un procédé classique, de manière que les comprimés contiennent, chacun, 500 mg de pep- Les ingrédients indiqués ci-dessus sont agités dans une mesure suffisante pour donner une poudre uniforme qui est ensuite utilisée pour remplir des capsules de gélatine, du typé à enveloppe 30 dure et du type à enveloppe élastique molle. On doit choisir des capsules de dimensions telles qu'elles puissent recevoir une quantité suffisante de substance pour que chaque unité contienne 500 mg de peptide. Naturellement, il est facile d'utiliser,en cas de nécessité, des capsules plus grandes ou 35 plus petites pour différentes concentrations en substance active. Après avoir mélangé intimement les ingrédients mentionnés Ingrédients K-b enz oyl-L-1yro syl-£-aminobenz o at e de sodium Parties en poids 500 50 50 25 Amidon de maïs Talc r if-APY SAD ORIGINAL 71 41365 2115246 Exemple 54 Préparation de l'acide a-benzoyl-L-lysyl-n-aminobenzoïque On dissout 14,0 g d'epsilon-carbobenzoxy-L-lysine dans 24,5 ml d'hydroxyde de sodium 2,05 N et 70 ml d'eau à 0°C. On ajoute goutte 5 à goutte 7 g de chlorure de benzoyle à la solution sous agitation, en même temps qu'on ajoute un supplément de 24,5 ml de base en une période de 30 minutes. Au bout de 20 minutes, on acidifie la solution à un pH égal à 3 avec de l'acide chlorhydrique 6ïï. On filtre le précipité et on le sèche, la substance solide, à savoir l'a-10 benzoyl-epsilon-carbobenzoxy-L-lysine, qui fond à 105-112° et qui a un équivalent de neutralisation de 597, est obtenue en quantité de 15,4 g. On dissout cette substance dans 200 ml de tétrahydrofuranne et on refroidit la solution à -15°C. On ajoute 4,4 ml de N-méthylmorpholine et 4 ml de chloroformiate d'éthyle, et, au 15 bout de 10 minutes à -15°C, on ajoute 5»5 g d'acide £-aminobenzoï-que et 0,76 g d'acide p-toluènesulfonique. Au bout d'une demi-heure à -10°Cet de 16 heures à 0°C, on verse le mélange dans 2,5 litres d'acide chlorhydrique 0,1 N froid et on filtre. Après séchage, on obtient 19,2 g de précipité dont l'équivalent de neu-20 tralisation est égal à 495 et qui fond à 187-190°C ; ^5,5= . +44,8 (1 io dans le diméthylformamide). On dissout 2 g de cette substance solide, à savoir l'acide a-benzoyl-epsilon-carbobenzoxy-L-lysyl-£-aminobenzoïque, dans 200 ml de méthanol et on réduit cet acide avec de l'hydrogène en présence d'un gramme de palladium 25 à 5 i° fixé sur du charbon, pendant une période de 70 heures à la pression atmosphérique et à la température ambiante. On sépare le. catalyseur par filtration et on chasse le solvant sous vide. On lave le résidu avec un peu de tétrahydrofuranne et on le sèche sous vide. Par titrage de la fonction e-amino à l'acide perchlorique 50 dans l'acide acétique cristallisable, on trouve un équivalent de neutralisation de 584 (la valeur calculée pour l'acide cc-benzoyl-L-lysyl-jo-aminobenzoïque est de 569). le produit est rapidement hydrolysé en présence de trypsine, mais non en présence de chymotrypsine» 35 11 va de soi que la présente invention n'a été décrite qu'à titre explicatif, mais non limitatif, et qu'elle est susceptible de diverses variantes sans sortir de son cadre. 71 41365 • >7 2115246 RiygriDiCAgioiîS 1, Nouveau composé caractérisé par le l'ait qu'il répond à la formule RCO-A -ÎTHR'CO-B -KHZ n m 5 [dans laquelle S est un atome d'hydrogène ; un groupe phényle ; un groupe phényle substitué avec un ou plusieurs atomes d'halogènes groupes alkyle en à C^, groupes hydroxy, groupes alkoxy en C1 à O^y groupes alcanoyloxy en à ou groupes alkoxycarbonyle en à ; un groupe alkyle en à » un groupe alkyle en 10 à C.J2 substitué avec tin ou plusieurs atomes d'halogènes,groupes alkoxy en à C^, groupes hydroxy, groupes alcanoyloxy en à C^, groupes polyalkoxyalkyle ou groupes phényle ; un groupe alkoxy en à Cj2 ; un groupe aralkoxy ayant jusqu'à 10 atomes de carbone ou un groupe alkylène divalent ayant jusqu'à 6 atomes de carbone j 15 lïHR'CO est une liaison aminoacide dérivée de la L-phénylalanine, la L-tyrosine, la L-leucine ; la L-méthionine, le L-tryptophane, la L-arginine ou la L-lysine ; Z est un groupe de formule : (dans laquelle R" est un groupe hydroxy, un groupe alkoxy en 0^ à C^, un groupe alkoxyalkoxy en à C^, un groupe dialkylamino-20 alkoxy en à Cg, un groupe amino, un groupe monoalkylamino en à C^, un groupe dialkylamino en à C^, un groupe de formule -MCH^COR" ou un sel de ce groupe, dans lequel R" est un radical hydroxy ; Y est un groupe de formule -C0- ou -SO2- 5 X est un groupe hydroxy, un groupe alkyle en à C^, un atome d'halogène 25 ou un groupe alkoxy en à ; et n' est égal à 0, 1 ou 2); BAD OHlGlNAt^ 71 41365 33 2115246 A et B sont les résidus d'amino-aeides de bas poids moléculaire et m et n sont égaux à 0, 1 ou 2], 2. Composé suivant la revendication 1, caractérisé par le fait que Z est un groupe 4-^carboxyphényle, le sel de sodium du groupe 5 4-carboxyphényle pu le sel d'ammonium du groupe 4-carboxyphényle. 3. Composé suivant la revendication 1, caractérisé par le fait qu'il est l'acide N-benzoyl-L-phénylalanyl-]>-aminobenzoïque, son sel de sodium ou son sel djammonium ; l'acide IT-benzoyl-Ii-tyrosyl-£-aminobenzoïque, son sel de sodium ou son sel d'ammonium ; 10 l'acide N-acétyl-3j-tyrosyl-£-aminobenzoïque, son sel de sodium ou son sel d'ammonium j l'acide U-propionyl-L-tyrosyl-£-aminobenzoïque, son sel de sodium ou son sel d'ammonium ; ou l'acide N-butyryl-l-tyrosyl-£~aminobenzoïque, son sel de sodium ou son sel d'ammonium. 4. Médicament intéressant en particulier pour l'évaluation 15 quantitative de la sécrétion d'enzymes pancréatiques dans Tin organisme animal, caractérisé par le fait qu'il comprend un peptide de formule : Q-IŒQ'CO-Q'', dans laquelle Q est un groupe de blocage de la fonction aminé, 20 NHQ'CO est une liaison amino-açide pouvant être éliminée du peptide par clivage hydrolytique en présence d'une endopeptidase pancréatique, et Q" est un groupe analysable, acceptable du point de vue pharmacologique, pouvant être éliminé du peptide par clivage hydrolytique en présence d'une endopeptidase pancréatique, pour 25 donner un composAnalysable qui peut être absorbé par l'animal et restitué par ce dernier. BAD ORiGJNAi,