FR 2135638 A1 19721222 FR 7215955 A 19720504 72 15955 i 2135638 L'invention,due à August WAHLEFELD,Hans MDLLERING,Er ich, BERNT, Wolfgang GRUBER et Hans Ulrich BERGMEYER,a pour objet un nouveau procédé et un réactif spécifique pour le dosage enzymatique de créatinine. 5 Au laboratoire d'analyses médicales,en particulier dans le diagnostic du fonctionnement rénal,le dosage de la créatinine joue un rôle important.Le dosage de la créatinine dans le sérum ou, dans l'essai dit de la "clearance" (élimination de l'urée), le dosage simultané dans le sérum et dans l'urine fait partie des mé-10 thodes d'analyse-type effectuées au laboratoire clinique. La méthode de dosage utilisée jusqu'à présent est basée sur la réaction colorée, découverte par M.Jaffé,de la créatinine avec de l'acide picrique en milieu alcalin.Selon cette méthode,après avoir éliminé en milieu acide les protides de l'échantillon Cpar 15 exemple au moyen d'acide trichloracétique ou d'acide picrique),on ajoute au centrifugat l'acide picrique et on alcalinise, ce qui fait apparaître une coloration qu'on mesure photométriquement. Un inconvénient essentiel de ce procédé, en lui-même très simple, réside dans le fait qu'il n'est pas spécifique pour la créatinine. 20 II est vrai qu'une série de modifications,apportées à la réaction de Jaffé en améliorent bien la précision et la mise en oeuvre^ Toutefois,elles n'en suppriment pas le susdit défaut fondamental. Par ailleurs,la méthode de Jaffé est restée sensible aux perturbations et de très faibles variations de la concentration en ions H 25 ou OH* conduisent déjà à me modification de l'intensité de coloration. Selon une autre méthode connue,on convertit la créatinine par addition d'o-nitrobenzaldéhyde en méthylguanidine qu'on dose ensuite selon la réaction de Sakaguchi.De plus, on a décrit une réaction colorée entre la créatinine et le thiocyanate de mercure et 30 de potassium.Ces deux dernières méthodes se sont cependant révélées impropres à satisfaire aux besoins du laboratoire clinique. Dubos et Miller ont décriteJ.biol.Chem.l21r457 (1937) une modification de la réaction de Jaffé,selon laquelle on effectue la dégradation de la créatinine au moyen d'un extrait brut d'une bac-35 térie déterminée dans une partie aliquote d'un échantillon, le reste de l'échantillon n'étant pas soumis à ce traitement. 0n effectue ensuite dans les deux parties de l'échantillon le dosage selon Jaffé et on détermine la teneur en créatinine suivant la différence des extinctions. Cette méthode est très spécifique, 40 mais l'exécution de l'analyse est assez compliquée et né- 72 15955 2 2135638 cessite la culture permanente de la bactérie. L«invention a donc pour but, surtout, de fournir un procédé simple, mais spécifique, de dosage de la créatinine. Pour ce faire, conformément à l'invention, on incube, à un pH compris entre environ 7,5 et 9, une solution aqueuse contenant de la créatinine avec de la créatinine-amidohydrolase et à doser, de façon en soi connue, soit la créatine formée, soit la diminution de créatinine. La créatinamidohydrolase qui sert d'enzyme dans le procédé selon l'invention ainsi qu'un procédé de production de cette enzyme sont décrits dans la demande de brevet allemand déposé ce même jour par.la demandéresse sous le titre " Procédé de préparation et de purification de créatinine-amidohydrolase "• L'enzyme créatinine-amidohydrolase qui n'a pas encore été décrite jusqu'à ce jour, catalyse la réaction: Créatinine + H.Or^inine-amidohydrolase créatine, l -7- On peut mesurer directement la créatine formée selon des méthodes connues, par exemple par phosphorylation avec de la créa-tinekinase et de l'adénosinetriphosphate (ATP) avec formation d'adénosinediphosphate (ADP) qu'on dose de façon en soi connue. Une autre possibilité consiste à mesurer la diminution de la créatinine selon Jaffé. Dans le procédé selon l'invention, on opère, de préférence à un pH compris entre 7,8 et 8,3 qu'on peut établir à l'aide d'un tampon quelconque. On a cependant à veiller à ce que le tampon choisi ne perturbe pas le dosage subséquent. Ainsi, lorsqu'on détermine par exemple subséquemment la différence de créatinine selon Jaffé, il convient d'utiliser un tampon qui ne diminue pas les valeurs de la réaction de Jaffé. Les tampons à la glycine et à la glycylglycine par exemple ne sont pas avantageux, alors que les tampons au phosphate et au pyrophosphate ne sont pas gênants. Toutefois, lorsqu'on effectue le dosage non pas selon Jaffé,mais en déterminant, au moyen de créatininekinase et d'ATP, la créatine formée, il n'y a pas d'inconvénient à utiliser le tampon de glycine et des tampons analogues. Le procédé selon l'invention ne nécessite pas l'élimination préalable des protides. Toutefois, une telle élimination des protides peut être avantageuse pour la détermination ultérieure de la créatine. Selon, un mode de réalisation particulier du procédé selon 72 15955 3 2135638 l'invention, on convertit, à l'aide de l'enzyme créatinase, la créatine formée eh sarcosine et urée et on dose cette dernière selon des méthodes connues. L'enzyme créatinase est décrite dansla demande de brevet sus-indiquée déposée ce même jour et peut être désignée 5 également par le terme créatinamidinohydrolase. . On effectue ce mode de réalisation du procédé selon l'invention, de préférence, en utilisant pour le dosage une préparation d'enzyme contenant un mélange de créatininase et de créatinase. . . 10 Lorsqu'on dose, de façon en soi connue, la créatine formée en utilisant de la créatinase et de l'ATP, il est avantageux d'éliminer les protides, car, de cette façon, on augmente la sensibilité de l'analyse. Cette augmentation de la.sensibilité est due au fait que, après l'élimination des protides, on peut tra-15 vailler à des concentrations plus élevées, de sorte que la différence d'extinction par rapport à une quantité déterminée de créatine se trouve augmentée. L'utilisation d'une combinaison d'enzymes contenant de la créatinineamidohydrolase et de la créatinase est avantageuse même 20 dans les cas où l'on effectue le dosage de la créatinine selon Jaffé et ceci du fait que la créatinase déplace l'équilibre en faveur de la formation de créatine. L'invention a également pour objet une nouvelle combinaison de réactifs pour le dosage spécifique de la créatinine. Cette 25 combinaison de réactifs selon l'invention est constituée de : 1. Créatinine-type, 2. acide picrique, 3.lessive de soude et 4.créatinineamidohydrolase, soit seule, soit conjointement avec 30 un tampon et, le cas échéant, de la créatinase, lesquels composants ne sont mélangés qu'au moment de leur mise en oeuvre. Une autre combinaison de réactifs selon l'invention est constituée de : 35 1. Tampon, nicotinamide-adénine-dinucléotide réduit (NADH), ATP et phospho-énolpyruvate (PEP), 2. lactate-déhydrogénase (LDH), pyruvatekinase (PK) et MgCl^,. 3. créatinekinase (CK> et 4. créatinine-amidohydrolase, 40 lesquels composants ne sont mélangés qu'au moment de leur mise en 72 15955 4 2135638 oeuvre. Le procédé selon l'invention et la combinaison de réactifs selon l'invention offrent pour la première fois la possibilité d'un dosage spécifique de la créatinine convenant aussi pour l'ap-5 plication au dosage de routine au laboratoire clinique et présentant une sensibilité suffisante pour les besoins de la pratique. Au contraire, la seule méthode de dosage spécifique connue jusqu'à présent, à savoir celle de Miller et Dubos, était inutilisable pour l'application à des examens de routine (voir R.J. Henry, 10 Clinical Chemistry, 1964, page 288). Les exemples illustratifs suivants permettent de comprendre encore mieux le procédé et la combinaison de réactifs selon l'invention et montrent l'existence d'un rapport linéaire entre les quantités en% en poids de créatinine et les coefficients 15 d'extinction en se référant aux dessins annexés, dans lesquels: La figure 1 est la représentation graphique du rapport de la créatinine en mg% au coefficient d'extinction à 546 nm conformément au mode opératoire de l'exemple 1 et la figure 2 est la représentation graphique du rapport de 20 la créatinine en mg% au coefficient d'extinction à 366 nm conformément au mode opératoire de l'exemple 2. EXEMPLE 1. Dosage avec application subséquente de la réaction de Jaffé. 2 5 On incube dans un tampon 0,050-0,2 molaire (les tampons de pyrophosphate, de phosphate, de diéthanolamine/HCl ou de glycyl-glycine/HCl conviennent tout particulièrement) durant 45-60 minutes à la température de 37°C,un échantillon de 1,0 ml contenant de la créatinine (sérum ou urine diluée) avec de la créatinine-30 amidohydrolase en une quantité d'au moins 5 unités/essai (1 unité = transformation de 1 yumole de substrat/minute) et de la créatinase en une quantité d'au moins 0,8 unité/essai. On élimine ensuite, à l'aide d'acide trichloracétique 3 molaires, les protides de l'échantillon ainsi que d'un échantillon témoin non traité aux 35 enzymes et on effectue avec les centrifugats des deux échantillons la réaction de Jaffé. La diférence des extinctions à 546 nm des deux échantillons indique, par rapport à la valeur correspondante d'une créatinine-type, la teneur en créatinine de l'échantillon. 0n effectue la réaction colorée de Jaffé par addition 40 d'acide picrique et de NaOH, abandon du mélange durant 15 minutes 72 15955 5 2135.638 à la température ambiante et mesure à 546 nm dans une cuvette de 2 cm(épaisseur de la couche). Dosage de la créatine à l'aide de créatinekinase- 1-e principe de ce mode de réalisation consiste à hydroly-5 ser, à l'aide de créatininase, la créatinine en créatine, à phos-phoryler, selon K.L. Tanzer (J.of Bjol.Chem.234, page 3201 (1959)) à l'aide de créatinekinase et d'ATF, la créatine formée, à convertir, à l'aide de PEP et de PK, l'ADP formé en ATP et à réduire,à l'aide de NADH et de lactatedéhydrogénase, le pyruvate,formé au 10 cours de cette conversion, en lactate avec formation de NAD. La transformation de 1 mole de NADH (mesure à 334, 340 ou 366 nm) correspond à la présence de 1 mole de créatinine. Pour effectuer ce dosage, on réunit un mélange de réactifs contenant du NADH, du ATP, du PEP et du MgC]^ dans un tampon 0,11 15 molaire à pH 9,0 avec de la lactatedéhydrogénase (LDH) et de la pyruvatekinase (PK) et on amène la température de ce mélange à 25°C. On ajoute ensuite du sérum et de la créatinekinase et on incube à la température susindiquée durant au plus 30 minutes. On amorce la réaction par addition d'au moins 5 unités de créatini-20 nase. On enregistre la diminution d'extinction. La durée de la réaction varie,selon la teneur en créatinine, entre 40 et 90 minutes. Gri calcule 3a teneur en créatinine directement d'après le coefficient d'extinction molaire de NADH. Les avantages de ce mode opératoire résident dans le fait qu'on peut travailler avec une quantité d'échantillon réduite, 2 5 par rapport a la méthode de Jaffé, dans la proportion de 1 à 10, qu'il n'est pas nécessaire de déterminer, par un essai à blanc, la valeur du sérum et qu'on peut se dispenser de l'élimination des protides et de la centrifugation. Comme il va de soi et comme il résulte d'ailleurs déjà de 30 ce qui précède, l'invention ne se limite nullement à ceux de ses modes d'application et de réalisation qui ont été plus spécialement envisagés; elle en embrasse, au contraire, toutes les variantes • 72 15955 2135638 —REVENDICATIONS— 1.- Procédé de dosage spécifique de créatinine, caractérisé par le fait qu'on incube, à un pH compris entre environ 7,5 et 9, une solution aqueuse contenant de la créatinine avec de la créatinine 5 -amidohydrolase et qu'on dose ensuite, de façon en soi connue,soit la créatine formée, soit la diminution en créatinine. 2.- Procédé selon la revendication 1, caractérisé par le fait qu'on utilise un tampon au phosphate ou au pyrophosphate et qu'on détermine la différence en créatinine par mesure de la coloration 10 formée par addition d'acide picrique et d'hydroxyde de sodium. 3.- Procédé selon la revendication 1, caractérisé par le fait qu'on dose la- créatine formée de façon en soi connue par phospho-rylation a l'aide de créatinekinase et d*adénosinetriphosphate et par mesure de 1'adénosinediphosphate formé. 15 4.- Procédé selon la revendication 1, caractérisé parle fait qu'on décompose, en présence de créatinase, la créatine formée avec formation d'urée et qu'on dose, selon des méthodes en soi connues, l'urée formée. 5.- Procédé selon l*une quelconque des revendications précéden-20 tes, caractérisé par le fait qu'on effectue la réaction avec de la créatinase à un pH compris entre 7,8 et 8,3. 6.— Procédé selon la revendication 3, caractérisé par le fait que, avant de doser la créatine en présence de créatinekinase, on élimine les protides de l'échantillon à analyser. 25 7.- Procédé selon la revendication 2, caractérisé par le fait qu'on ajoute simultanément de la créatinine-amidohydrolase et de la créatinase. .. 8.- Combinaison de réactifs pour le dosage spécifique de créatinine, caractérisée par le fait qu'elle est constituée de : 30 1. Créatinine-standard, 2. acide picrique, 3. hydroxyde de sodium et 4. créatinine-amidohydrolase, soit seule, soit conjointement avec un tampon et, le cas échéant, de la créatinasef 35 lesquels composants ne sont mélangés qu'au moment de leur mise en oeuvre• 9.- Combinaison de réactifs pour le dosage spécifique de créatinine, caractérisée par le fait qu'elle est constituée de: 1. Tampon,NADH,ATP et phospho-énolpyruvate, 40 2. lactatedéhydrogénase, pyruvatekinase et KgCl^, COPY 72 15955 7 2135638 3. créatinekinase et 4. créatinine-amidohydrolaser lesquels composants ne sont mélangés qu'au moment de leur mise en oeuvre.