FR 2112530 A1 19720616 FR 7139944 A 19711108 71 39944 1 2112530 Depuis longtemps déjà on a ajouté des enzymes à de nombreux médicaments digestifs (eupeptiques) dans le but de dégrader les matières alimentaires d'origine végétale. Les parois des cellules végétales sont prin-5 cipalement formées de cellulose et d'hémicelluloses. Il est déjà connu d'ajouter à des médicaments digestifs des concentrés d'enzymes enrichis et normalisés en cellulase et hémi-cellulase. On utilise en général comme substrat, pour la normalisation biochimique, la carboxymethylcellulose (cellu-10 lose soluble chimiquement substituée), ou des extraits (lichénine) de certains lichens (Cladonia rangiferir.a). La carboxyméthylcellulose, dans ses propriétés chimiques et biochimiques, diffère cependant essentiellement de la cellulose naturelle telle qu'elle existe dans les 15 parois des cellules végétales. De même, la lichénine ne se trouve pas en général dans les parois des cellules des végétaux supérieurs. Les enzymes qui se sont montrées efficaces dans le test de normalisation n'ont que peu d'effet sur une matière végétale broyée. Par ailleurs, le pH 20 optimal pour ces enzymes se trouve dans la zone acide. Pour un pH neutre, comme dans l'intestin, leur activité est fortement réduite. Il est également connu d'ajouter- à des médicaments digestifs des hydrolyses êe ^ecxtj.ne^ 0 en cri-25 c?. Xs. ci5comeo3j ^ ■*- -^3 par la putréfaction. Mais les essais ce âéco-::p~s..tior; v-:.v les hydrolases de pectines sur une matière purerer.t végétale, dans les conditions physiologiques de la digestion, n'ont pas été plus satisfaisants que les essais de décomposition 30 précédents, par les cellulases. L'activité des pectinases est habituellement examinée sur des pectines solubles. A la différence de celles-ci, les pectines insolubles présentes dans les cloisons des cellules végétales sont associées en un réseau, 35 chimiquement et physiquement, avec les autres constituants des polysaccharides, et elles diffèrent par suite dans leur comportement biochimique des pectines solubles isolées. Aussi, les hydrolases de pectines peuvent-elles âtre très -actives comme substrat vis-à-vis des pectines solubles, ji^q alors qu'elles ne dégradent que lentement les substances bad orig/nal 71 39944 2 2112530 purement végétales. , ALBERSHEIM, NEUKOM et DEUEL (Helv. Chim. Acta 1422 (1960))ont trouvé pour la première fois, dans une préparation enzymatique du commerce pour la clarification de jus de fruits, une enzyme dissociant les motifs d'acide galactu-5 ronique à liaisons hétérosidiques de la pectine, non par le mécanisme connu d'hydrolyse, mais par un mécanisme d'élimination, les restes hétérosidiques étant ainsi séparés avec formation d'une double liaison. Cette enzyme a été appelée par les auteurs "Pectine-trans-éliminase". Une enzyme à 10 action voisine, la "trans-eliminase d'acide pectique", a été découverte depuis dans des filtrats de culture de Bacillus polymyxa (NAGEL et ANDERSON, Arch. Biochem. Biophys.112, 322 (1965))- Ces auteurs n'ont porté d'intérêt qu'à la scission des acides oligo-galacturoniques et des acides 15 pectiques solubles. Comme ces substrats sont des produits de saponification artificiels, alors que les pectines naturellement incluses dans le réseau moléculaire des cloisons cellulaires végétales sont des esters méthyliques, on ne pouvait prévoir une activité dégradante de l'enzyme vis-à-vis 20 d'une matière finement végétale. La Demanderesse a découvert de façon inattendue que des enzymes provenant de filtrats de cultures de Bacillus polymyxa dégradaient de manière remarquable les matières végétales dans les conditions physiologiques régnant dans 25 l'intestin, en particulier une pâte de légumes grossièrement broyés, et l'activité de ces enzymes se maintient pleinement même en présence de fortes concentrations en ferments pancréatiques. L'étude plus poussée des enzymes produites par Bacillus polymyxa ci montré que leur activité de décom-30 position des matières végétales était essentiellement liée à la présence de "trans-éliminase de l'acide pectique" ou TEAP. Cette forte action dégradante inattendue sur 1-s matières purement végétales est aussi nouvelle que surprenante. Pour obtenir cette enzyme, on cultive Bacillus 35 polymyxa en milieu aérobie, immergé, en utilisant de préférence des milieux nutritifs aqueux contenant comme sources de carbone des- amidens, du saccharose, de la mélasse ou du glucose et comme source d'azote de la farine de soja, "bad originat 71 39944 2112530 des liqueurs de macération de grains, des extraits de levures, des peptones, des nitrates ou des sels d'ammonium, ainsi que des sels organiques et minéraux, en particulier du carbonate de calcium. 5 L'enzyme peut en principe être aussi obtenue avec de bons rendements par culture anaérobie de Bacillus polymyxa. Cependant, la culture aérobie est en général plus facilement réalisable. La fermentation peut être effectuée soit en 10 continu, soit en discontinu, avec agitation et aération, le pH étant de préférence maintenu entre 5,2 et 7,8. Selon la grandeur des récipients, la fermentation dure en général de 2 à 4 jours. Au bout de ce délai, la concentration en enzyme ne varie pratiquement plus. L'enzyme est présente dans la 15 culture en quantités importantes, correspondant jusqu'à 30.000 unités par ml. Elle est obtenue à l'état de produit solide brut à partir du filtrat de la culture par précipitation au moyen d'un solvant miscible à l'eau, comme l'acétone ou 1'isopropanol, puis séchage du précipité. Son activité 20 est alors de 1500 à 3000 unités par mg. En utilisant des milieux nutritifs particulièrement riches, on peut élever la quantité d'enzyme jusqu'à environ 13O.OOO unités par ml; cependant, la préparation d'une poudre enzymatique sèche présente dans ce cas d'assez 25 grandes difficultés en raison de la présence d'une quantité élevée de substances qui ?$ner.t beaucoup la filtration stérile, la pré?i"^.l-.ation On obtient des rendements particulièrement 30 élevés avec la souche de Bacillus polymyxa K 890/3 (ATCC 21551)* isolée à partir d'un échantillon d'eau du lac de Constance, ou ses variantes, mutants ou révertants, La souche K 890/3 se caractérise, vis-à-vis de la souche connue ATCC 842 de Bacillus polymyxa, par les propriétés morphologiques et 35 physiologiques ci-après r (tableau I voir pages suivantes) BAD OR1G!Nal TABLEAU I Propriété B,polymyxa ATCC 21551 / ATCC 842 Propriété B.polymyxa ATCC 21551 / ATCC 842 O o ~0 • Utilisation de Fructose + G + G Arabinose + G + G Mannose + G + G Raffinose + G + G Mannitol U) C + G + G Amidon + G + G Glycérol c +> a 0) Dk + G + G Maltose + G t + G Lactose Xylose 0) 3 cr •H C ni + G + G + G + G Glycose CJ> U O + G + G Sorbitol Galactose V 4-> O N n3 + G + G + G + G Salicine Xi + G + G Inuline tV O u + G + G Saccharose a r, en + G + G Rhamnose + G + G Dulcitol + G + G Scission de t l'hémoglobine la chitine la cellulose Développement avec NaCl à 4 ;& Développement avec NaCl à 5 % Développement à + 40°C Développement à + 45°C Glucose-H20 Réaction de Vpges-Proskauer Réaction au rouge de méthyle Réaction à l'indole Formation de Réduction dés nitrates Citrate comme source de C Urée comme source de N Coagulation de Milchagar Réduction du bleu de méthylène Besoin en vitamines pH 4,8-7,2 5,0-8,0 + + + + + + + + + + + + U> vO nO K) Ln u> o TABLEAU I (suite et fin) Propriété B.polymyxa ATCC 21d51 / ATCC 842 Propriété B.pclymyxa ATCC 21551 / ATCC 842 et; > O a 0 Utilisation de Glucose Saccharose Glycéroi Arabinose Xylose Mannitol Lactose Rhamnose Sorbitol Pectine Dimension des spores 0,7 " des bâtonnets 2,5 Dégradation de l'amidon Dégradation de l'urée Phénylalanine-désaminase Oxydase G = formation de gaz rH m u ,—N *Q) B c 3 •H •H e C O 0) S -p B o m N m CO -o -o U) i—i Q> 0) O (S) '•—* 3 O w> + G + G Développement aérobie + + + G + G Développement anaérobie + G + G + G + G Activité antibiotique + + + G ■r G Formation de pigment - - + G -f G Réaction au jaune d'oeuf + + G + G Coloration Gram + + + G -i G Mobilité + + + G + G Formation de matières mucilagineuses + + + G + G Dégradation de la gélatine + + + G + G Cytochromoxydase - - x 0,8 F 0,h x 1,0^ Activité des protéases + + x b,0 fi 2,0 x 7,f.' ^ TEAP + + + V Dégradation des graisses -t + - - Décomposition de + + - - '' Phesphatase + + - ... Lysine décarboxylase - - + ~ posi ci f ou pït'sunt - = négatif ou absent » = positif dans certaines conditions O u> sO sO ■t» ■t* CJi ho K) Ln LO O 71 39944 6 2112530 Les effets essentiels, qualitatifs et quantitatifs, de l'enzyme de Bacillus polymyxa, ont été découverts par des expériences reproduisant bien les conditions de la digestion dans l'intestin. Comme les aliments végétaux arri-5 vent en général à l'intestin sous forme mastiquée, on a effectué des essais "in vitro" sur des matières végétales homogènes, soit crues, soit cuites. Dans l'intestin, grâce à un mécanisme régulateur physiologique, le bol alimentaire est réglé à un pH voisin de la neutralité. On veille donc, 10 dans les essais in vitro, à ce que les produits végétaux soient additionnés de solutions fortement tamponnées qui stabilisent le pH stable aux environs de 7,0. Après plusieurs heures d'incubation des produits végétaux avec l'enzyme de Bacillus polymyxa à 15 une très faible concentration, on constate une forte destruction des particules de matières végétales. On adopte comme mesure de la dissolution progressive des parois cellulaires le poids de l'extrait sec de matière végétale rapporté en pourcentage à des témoins. On constate ainsi 20 des pertes de poids allant jusqu'à 60 %. On peut de même suivre quantitativement la baisse notable d'élasticité des particules des tissus. On a étudié parallèlement, à titre comparatif, une série de pectinases, de cellulases et d'hémicellulases 25 provenant d'autres micro-organismes, ainsi que des préparations d'enzymes pectinolytiques courantes. Il résulte de cette étude que l'enzyme de Bacillus polymyxa possède une activité remarquablement plus élevée que les préparations témoins. Les mélanges d'enzymes connus par la littérature 30 attaquent principalement les lamelles médianes des parois cellulaires. Après attaque par l'enzyme de Bacillus polymyxa, on observe au contraire sous le microscope une désagrégation de l'ensemble de la paroi. Ainsi s'explique la diminution d'élasticité particulièrement forte des particules. De même, 35 la perte de poids élevée des parois après, action de l'enzyme s'explique par le fait que l'attaque porte sur toute la paroi et non pas seulement sur la lamelle médiane, dont la masse est peu importante. La décomposition de l'ensemble de la paroi ®AD original 71 39944 7 2112530 est un facteur essentiel pour l'utilisation de l'enzyme selon la présente invention dans des médicaments digestifs, car cela facilite la pénétration des substances internes des cellules végétales par les enzymes eupeptiques naturelles 5 de l'intestin. Pour mettre au point et régler les conditions de préparation de l'enzyme de Bacillus polymyxa, on se limite avantageusement à une détermination de la TEAP. Le test usuel est effectué avec l'acide pectique comme substrat. Il se forme 10 par le mécanisme de scission éliminative une double liaison conjuguée au groupe carboxyle, et on observe l'augmentation corrélative d'absorption pour la longueur d'onde de 235 ni F . Le pH optimal pour l'attaque des parois des cellules végétales se situe entre 6 et 8. La stabilité de l'enzyme en 15 solution aqueuse est excellente depuis pH 4,0 jusqu'à pH 8,0. Comparée à l'action des protéases intestinales comme la. trypsine ot la chymotrypsine, la TEAP est remarquablement stable. - TEST BIOCHIMIQUE SUR LA T.E.A.P. - 20 On utilise comme substrat 0,1 $ d'acide pectique et 0,001 m de CaCl2 dans un tampon Tris/HCl 0,1 m, à pH 8,5. On mélange dans une coupelle de 10 mm, en quartz, 2 ml de substrat avec 0,1 ml de la solution convenablement diluée de l'enzyme, et on laisse incuber pendant 2 minutes 25 à 25°. On étudie l'échantillon au spectrophotoœètre enregistreur, à la longueur d r nnde de 235 m i* Lf unité d'enzyme est définie par la quantité d? enzyme qui dans les conditions de la réaction, provoque en 10 minutes une augmentation d'extinction de 0,1. Suivant la souche et les conditions de 30 la culture, on trouve dans les échantillons de 1 à 130.10 unités de TEAP par ml de filtrat de la culture. - TEST BIOCHIMIQUE SUR UNE MACERATION VEGETALE - On utilise corrige substrat le chou-rave (ou une autre matière végétale), homogéréisé à pH 7*0 avec 35 le tampon à l'imidazole 0,25 ni, de façon à obtenir une pâte épaisse, le pH étant amené à 7..0 exactement avec une lessive de soude caustique étendue. A 30 ml de substrat on ajoute 1 ml de la solution d'enzyme, et chaqtie échantillon d'enzyme est mis à incuber pendant 7 heures à 37°3 à plusieurs dilutions, W4j GhiGINM. 71 39944 8 2112530 dans des opérations séparées. Les résidus insolubles des parois des cellules sont centrifugés à environ 2000 g, puis lavés 2 fois avec chaque fois 50 ml d'eau, une fois avec 50 ml d'alcool et 2 fois avec chaque fois 50 ml d'acétone. 5 Après un simple séchage à l'air, on chauffe 4 heures à 120° et on pèse le résidu sec. Pour chaque série d'essais on fait deux ou trois essais témoins. Les pertes de poids résultant de l'action de l'enzyme sont exprimées en pourcentages par rapport aux témoins. 10 Dans le tableau II ci-après sont comparées les activités de préparations à base de pectinase, d'hémi-cellulase et de cellulase courantes, avec celles de poudres d'enzymes brutes provenant de diverses souches de Bacillus polymyxa. Le végétal d'expérience est le chou-rave et les 15 concentrations en enzyme sont respectivement de 3 mg et 0,3 mg pour 30 ml de bouillie végétale. La marge d'erreur est de + 3 % par rapport aux témoins. TABLEAU II Préparation d'enzyme Perte de poids % de la matière 20 végétale à partir de Préparation Préparation d'enzyme à 3 mg d'enzyme à 0,3 mg Aspergillus niger 7 % 4 % Aspergillus oryzae 25 Pénicillium chrysogenum 6 % 3 % Pénicillium frequentans 5 % 4 % Sclerotinia fructigena 6 % 4 % Bacillus mesentericus Préparations commerciales 30 diverses (pechinases, cellu-lases, hémicellulases) sans indicatiore de souches B. polymyxa K 890/3 58 % 30 % B. polymyxa K 890/1 53 % 26 % 35 B. polymyxa K 890/2 41 % 15 g B. polymyxa K 890/4 24 % 5 % Les résultats, de ce tableau font ressortir la nette supériorité du mélange enzymatique suivant l'invention, de Bacillus polymyxa, à pH 7,0, en ce qui concerne BA° cmimu' 71 39944 9 2112530 l'action sur les parois cellulaires de légumes, sur les préparations enzymatiques connues. L'action de l'enzyme est une fonction non pas linéaire, mais logarithmique, de la concentration en enzyme. 5 II en résulte comme importante conséquence pour les applications pratiques que même de très faibles concentrations en enzymes ont un effet de dégradation notable. Compte tenu de la marge d'erreur, cette action de l'enzyme sur les matières végétales peut encore être décelée pour une ooneen-10 tration de 0,005 mg par ml, alors que, pour toutes les préparations témoins étudiées, la limite est de 0,1 nrig par ail ou même plus. La différence en faveur de l'enzyme suivant l'invention est donc presque de deux ordres de grandeur. Le tube ensemencé est mis à incuber pendant 35 3 jours à 28° puis pendant encore 5 jours à la température ambiante, jusqu'à sporulation totale. Les spores sont ensuite retirés du tube par entraînement avec 10 ml d'eau 25 20 0,1 % d'extrait de levure 0,1 $ d'extrait de malt 1,0 % de limon de loess 0,1 % d'extrait de viande 2,5 % de peptone de c.. cii.e 0,01 % de trypticaso 0,5 de glucose 0,01 % d'huile de scia 0,5 % de liqueur de macération de grains 1,0 % de C0_Ca 1,0 % de saccharose 1,0 % de farine de soj a 1,0 % d'amidon 1,0 % de gélose pH : 6,0 à 6,8. 71 39944 10 2112530 distillée stérilisée ou d'une solution physiologique de NaCl et avec 5 ml de la suspension obtenue on ensemence un erlenmeyer de 300 ml contenant 100 ml d'un milieu nutritif stérilisé ayant la composition suivante : 5 2,0 % de saccharose 0,4 % d'extrait de viande 0,4 % de peptone de caséine 0,1 % d'extrait de levure 0,1 % d'extrait de foie, complétés à 10 1000 ml avec de l'eau. La fiole est agitée pendant 24 heures sur un dispositif à secousses à 200 cycles/minute, à la température de 30°, puis on place, dans des conditions stériles, des portions de 5 ml de cette préculture dans 20 erlenraeyers 15 contenant chacun 50 ml d'une solution nutritive ayant la composition suivante : 0,5 % de farine de soja 0,75 % d'amidon 0,5 % de liqueur de macération de grains 20 0,05 % de marc sec 0,005 % de trypticase 1,0 % de peptone de caséine 1,0 % de sucre d'amidon 0,25 % de NaCl, complétés à 25 1000 ml avec de l'eau ; le pH est de 7,2. Ces fioles constituent la culture principale et elles sont agitées à 200 cycles/minute sur un dispositif à- secousses, à la température de 28°, pendant 2 à 3 jours. Le 2ème et le 3ème jour on examine la concentration en TEAP. 30 Pour cela , on sépare soigneusement d'un échantillon, par centrifugation, les cellules et les matières solides du milieu nutritif, et sur le liquide on détermine au spectrophotomètre, à 235 m j_ , les doubles liaisons formées par la dissociation de l'acide pectique. Une unité d'enzyme 35 correspond à la quantité d'enzyme qui, dans les conditions de la réaction, provoque en 10 minutes un accroissement d'extinction de 0,1. La souche de Bacillus polymyxa ATCC 21551 donne dans cet essai, au bout de 3 jours de culture principale, en moyenne 1500 à 2000 unités par ml, avec un pH BAD ORIGINAL 71 39944 n 2112530 final de 7,8. EXEMPLE 2 : On opère comme dans l'exemple 1, mais en utilisant dans chaque cas 250 ml d'un milieu nutritif stérilisé 5 ayant la composition ci-après, ensemencé avec 25 ml de la suspension de germes, dans un erlenmeyer de 1 litre : 4,0 % de glucose 2,0 % de farine de soja 0,2 % de S0^(NH^)2 10 0,75 % de CO^Ca, complétés à 1 litre avec de l'eau, pH = 7^0. Après 3 jours d'agitation à 220 cycles/minute à la température de 28°, cet essai donne en moyenne 4500 unités par ml, avec un pH final de 7.» 8. 15 EXEMPLE 3 : On opère comme clans. I ' exemple 1, «nais en utilisant pour la culture principale 10 litres d'un milieu nutritif stérilisé ayant la composition ci-après, dans un récipient de fermentation de 30 litres de capacité : 20 4,0 % de saccharose 1,0 % de farine de soja 0,5 % de sulfate d'ammonium 1,0 fo de C0_Ca 1 0 % .ic l.jve-,;..- - fï-acéraT-i'.'V-; de grains, 25 ri 1 litre avec de 1 ' eau,. pH - On stérilise ce milieu pendant une heure à 121° sous une pression absolue de 2 bars, le saccharose étant stérilisé séparément, et après refroidissement, on l'in-30 troduit dans le récipient de fermentation stérilisé. Après stérilisation, le pH doit être compris entre 6,7 et 7,0. Au besoin, on corrige le pH par addition de JîaOH 2N stérilisée . On ensemence avec 500 ml .le la préculture 35 décrite dans l'exemple 1 et on laisse fermenter pendant 50 à 70 heures à 28°, en aérant la .sol - U * * - ■ * i c*- raison de 0,85 litre d'air par minute et par litre et en l'agitant à 200 cycles/minute. bad original* 71 39944 12 2112530 On suit le cours de la fermentation en prélevant des échantillons sur lesquels on détermine l'activité en TEAP, qui s'élève en 48 heures à 30.000 unités par ml, en moyenne. La solution de culture est centrifugée et addi-5 tionnée d'acétone dans le rapport de 1 à 1,6. Le produit précipité est centrifugé et séché. On obtient une poudre sèche claire, dont l'activité est d'environ 3000 unités par mg. EXEMPLE 4 : Pour une production continue de l'enzyme, on 10 utilise une installation fondée sur le principe du système ouvert homogène simple. Le récipient de fermentation comporte des tubulures pour l'introduction du substrat et l'évacuation de la solution de culture, pour l'entrée et la sortie de l'air, l'entrée d'une solution alcaline, d'un acide et d'un 15 agent antimousse, ainsi que pour une électrode à pH, pour une sonde de température pour le prélèvement d'échantillons et pour l'ensemencement. L'agitateur fonctionne à 240 cycles par minute, la température est de 28° et le volume de liquide de 1,5 litre. On introduit par "minute 0,5 litre d'air par 20 litre de solution. La solution de culture est pompée dans des flacons refroidis de 500 ml. Le récipient de fermentation et un récipient de réserve de 10 litres sont garnis d'une solution nutritive contenant : 25 3*0 % d'amidon soluble 1,0 % de peptone de viande 1,0 % de CO^Ca 0,5 % de farine de soja 0,5 % de liqueur de macération de grains 30 0,5 % de S04(NH4)2 0,01 % de polypropylène-glycol D 3600, complétés à 1 litre avec de l'eau, pH = 7,4. Les deux récipients sont stérilisés à 120° sous une pression absolue de 2 bars puis le récipient de 35 fermentation est mis en communication par un tube souple avec le récipient de réserve et avec le récipient récepteur. Après refroidissement jusqu'à une température de 28°, qui est ensuite maintenue constante, on ensemence avec 150 ml d'une pré-culture préparée suivant l'exemple 1. 71 39944 13 2112530 Après 24 heures d'incubation, la culture est envoyée par une pompe dans une culture à incubation continue. Les débits sont maintenus en équilibre constant et ils sont réglés de façon que le contenu du récipient soit entièrement renouvelé toutes les 36 heures (D = 0,0296). La teneur en TEAP est mesurée toutes les 24 heures sur des prélèvements. Les résultats sont groupés dans le Tableau III TABLEAU III Heures Unités/ml 20 2Û00 24 3900 48 9000 72 17000 96 16200 120 18000 144 18000 168 17400 192 167 00 216 1790c 240 16300 10 Heures Unités/ml pH 6.3 6.4 f, fi ^ 15 96 16200 6,5 6,65 6,7 6,6 6.5 20 216 1790C 5,55 Après 2&0 heures de «nùT-or-e, ••.r. ir- e* renier l'alimentation en solution et on tre? 1= r-é lr le culture. Son activité moyenne est 15.000 r..;-r ~:f 25 Obtention d'une préparation enzymat-ique l'-mte. L'isolement de la préparation enzymatique dans des opérations industrielles se fait par les procédés usuels. Les plus intéressants sont la précipitation avec des solvants organiques comme le méthanol, l'éthanol, l'isopropancl, 30 l'acétone etc... Les rendements en produit actif se situent entre 65 et 90 %. On obtient de 5 à 15 g environ d'une poudre claire, non hygroscopique et soluble dans l'eau, par lïtoe du filtrat de culture. EXEMPLE : 35 30 litres de culture à 28.000 unités de TEAP par ml sont centrifugés pour en séparer la majeure partie w— bad original 71 39944 n 2112530 des constituants insolubles. Après une filtration stérile, les 26,2 litres recueillis sont ajustés à pH 6,5 et refroidis à 5°. Par addition de 50 litres d'acétone à 22°, il se forme un précipité floconneux qui est isolé, lavé deux fois 5 à l'acétone et séché à la température ambiante. Le rendement est de 77 soit 308 g d'un produit à 2100 unités de TEAP par mg. Purification par le sulfate d'ammonium. EXEMPLE : 10 10 grammes du produit sont dissous dans 500 ml d'eau. Après saturation avec du sulfate d'ammonium on amène le pH à 4,5 et au bout d'une heure on sépare le précipité par centrifugation et on le reprend dans 50 ml d'eau. Après dialyse contre de l'eau pendant environ 15 heures puis 15 lyophilisation, on obtient une poudre claire, soluble dans l'eau. Le rendement est de 57 %. On recueille 630 mg d'un produit à 19.000 unités de TEAP/mg. Autre purification. En utilisant les procédés connus de chromato-20 graphie sur colonne (par exemple avec le produit Sephadex, échangeur d'ions et 1'hydroxyl-apatite), le produit précipité par le sulfate d'ammonium peut encore êtrec purifié d'un facteur de 14, de sorte que la purification totale atteint un facteur d'environ 125. &4b ORJG/jsiAL 71 39944 15 2112530 REVE N D ICATIONS 1.- Procédé de préparation d'un produit enzymatique facilitant la digestion, caractérisé en ce que l'on forme la trans-éliminase de l'acide pectique par 5 une culture de Bacillus polymyxa dans un milieu nutritif contenant des substances carbonées et azotées, et on isole cette enzyme du milieu de culture. 2.- Procédé suivant la revendication 1, caractérisé en ce que l'enzyme est obtenue par culture aérobie 10 de Bacillus polymyxa K 890/3, ATCC 21551, ou de ses variantes, mutants ou rêvertants. 3.- Procédé suivant la revendication 1 ou 2, caractérisé en ce que l'on effectue la culture dans un milieu nutritif liquide contenant comme source de carbone 15 de l'amidon, du saccharose, de la mélasse ou du glucose, et comme source d'azote de la farine de soja, une liqueur de macération de grains, des extraits de levures, des peptones, des nitrates ou des sels d'aramonium, ainsi que du carbonate de calcium, et dont le pH est compris entre 5*2 et 7»8. 20 4.- Procédé suivant l'une quelconque des revendications 1 à 3* caractérisé en ce que l'on précipite l'enzyme de la solution de culture avec un solvant organique miscible à l'eau. 5.- Produit à base d'enzyme, facilitant 25 la digestion, caractérisé er. ce qu'il contient la crans- éliminase de l'acide pectique. 6.- Produit selon la revendication o, caractérisé en ce que l'enzyme est ootenue par un procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 4. bad original