FR 2121723 A1 19720825 FR 7200687 A 19720110 72 00687 2 T 217 23 On recherche continuellement des procédés précis et efficaces pour l'analyse rapide de petites quantités de composés organiques. Ce besoin se fait sentir dans des domaines très différents qui requièrent le dosage de petites quantités de matières 5 organiques. La nécessité de titrer diverses substances, allant d'impuretés renfermées dans l'eau, le sol ou l'air, qui-peuvent être présentes en quantités extrêmement faibles, à des médicaments ou des substances naturelles douées d'activité physiologique, dans des liquides corporels tels que le sang, l'urée et la 10 salive, illustre la multiplicité des cas dans lesquels des dosages de faible^uantitési&e substance sont requis. Plus particulièrement, dans le secteur médical et le secteur de la répression, l'abus des stupéfiants et de la drogue nécessite un procédé pratique de détection rapide de l'usage de 15 ces drogues, soit immédiatement après l'ingestion ou l'injection, soit, fréquemment, après une période relativement prolongée. La méthode de détection doit être efficace pour le médicament, son métabolite ou les deux, individuellement ou ensemble, et doit être spécifique de la drogue recherchée,et elle ne doit pas 20 être gênée par d'autres substances qui peuvent être présentes dans le liquide corporel. En cas de trouble physiologique, il peut être important de détecter des composés ou des métabolites-particuliers, de manière à diagnostiquer le trouble en question. De même, en cas d'em-25 poisormement, une méthode pratique et rapide de détermination de la toxine pourrait être extrêmement importante pour établir l'antidote. Il existe de très nombreuses méthodes d'analyse d'un large spectre de composés organiques différents. Beaucoup de ces 30 méthodes impliquent des types différents d'intruments de détection tels que des fluorimètres, des spectrophotomètres à lumière ultraviolette, un équipement d'analyse gravimétrique , un équipement d'analyse titrimétrique , etc. D'autres méthodes sont basées sur la chromâtographie en couche mince, qui est souvent lente, 35 qui subit des interférences et qui peut ne pas être reproductible. In raison des différences notables qui existent dans ces méthodes, leur précision et la présence de substances qui inter 72 00687 2 2121723 fèrent, beaucoup d'essais diagnostiques ne peuvent pas être conduits d'une façon courante à cause des frais qu'ils entraînent et du manque d'équipement. L'utilisation de radicaux libres dans des essais 5 portant sur des substances naturelles est décrite dans les brevets des Etats-Unis d'Amérique N° 3 489 522 et ÏT° 3 453 288. Le marquage de diverses protéines de haut poids moléculaire est décrit dans le brevet des Etats-Unis d'Amérique K° 3 481 952. Voir également Hubbeinjet Collaborateurs, "Proc. Hat. Acad. Sci. 10 U.S.'' 6j[, 12 (1968). Des radicaux organiques libres ont été liés à des anticorps et ont fait l'objet d'études. Voir L. Stryer et 0. Hayes Griffith, "Proc. Fat. Acad. Sci» U.S." 1785 (1965) > et J.C. Hsia et L. H. Piette, "Arch. Biochem. and Biophys." 132. 466 (1969). Dans ce dernier article, des anti-15 corps dinitrophényliques sont marqués avec des radicaux 2,4- dinitrophényle utilisés comme traceurs à spins et on observe les variations du spectre de résonance des spins des électrons, qui résultent de l'interaction entre lea traceurs et les anticorps. Des stéroïdes ont été marqués avec des traceurs à 20 spins, par préparation de l'oxazole du 3-cétostéroïde et oxydation de l'azote en nitrosyde, ou par utilisation d'un groupe earboxy-alkyle en position 17 pour former l'amide d'un groupe tétraméthyl-(amino)pipéridino-oxyle. Voir McConnell et Collaborateurs, "Quart. Rev. of Biophys.", 91-136 (1970) ; et Hamilton et 25 Collaborateurs, "Structural Chemistry and Molecular History", V.H. Freeman & Co., San Francisco, Californie (1968), chapitre traitant des traceurs à spins. Voir également Hubbell, "Proc. ÏFatl. Acad. Sci. U.S." 6£, 16 (1963). La détection de concentrations extrêmement faibles 30 de molécules organiques ayant au moins 6 atomes de carbone et portant au moins un site polaire peut être effectuée par mise en présence d'une molécule de récepteur ayant un site dont la configuration est caractéristique d'une molécule de liaison, le groupe spécifique de liaison et son groupe analogue ayant une 35 configuration spatiale et polaire analogue à celle du groupe de liaison, mais variable par suite de la présence d'une fonction stable basée sur des radicaux libres. En déterminant la variation 72 00687 5 2121723 du spectre de résonance des spins des électrons de la combinaison du récepteur, du groupe de liaison et du groupe analogue,comparativement au spectre du récepteur et du groupe analogue seulement, on peut déterminer la concentration du groupe de liaison en uti-5 lisant des étalons connus. La méthode s'applique en particulier au cas où des composés doués d'activité biologique constituent le groupe de liaison, la fonction nitroxyde constitue le radical libre et des protéines constituent le récepteur. On peut utiliser d'autres radicaux libres et d'autres récepteurs. 10 Sur le dessin annexé : la figure 1 représente la courbe de la variation du spectre de résonance des spins des électrons avec addition de -U-e.psilon-dinitrophényl-lysine à une solution contenant un complexe d'un anticorps et de 1-oxyl-3-(2',4'—dinitrophénylamino)-15 2,2,5,5-tétraméthylpyrrolidine ; la figure 2 représente la courbe de la variation du spectre de résonance des spins des électrons avec addition de morphine et de codéine, individuellement, à une solution contenant ■2 t! un complexe d'un anticorps et de 3-[2'-(0 -morphino )acétamido]-20 2,2,5,5-tétraméthylpyrrolidine-i-oxyle. L'invention concerne le dosage quantitatif d'une substance spécifique appelée "groupe de liaison" dans une solution, par mise en présence d'une substance de haut poids moléculaire ayant un site caractéristique de la nature polaire et de la géo-25 métrie spatiale du groupe de liaison à détecter, cette substance étant appelée "récepteur", et un radical libre analogue au groupe de liaison, appelé "groupe analogue". Le spectre de résonance des spins des électrons de la fonction créée par le radical libre varie en association avec une molécule relativement petite, 30 comparativement à l'association avec une molécule sensiblement plus grande. Dans une solution ne contenant que le groupe analogue et le récepteur, à l'équilibre, les sites récepteurs sont sensiblement occupés par le groupe analogue. Par addition d'une petite quantité du groupe de liaison à la solution, ce groupe et 35 le groupe analogue entrent en compétition par suite de l'insuffisance des sites récepteurs, en affectant la position de l'équilibre et l'aspect du spectre. 3n utilisant des quantités connues 72 00687 4 2121723 du groupe de liaison, on peut aisément déterminer l'effet exercé sur l'équilibre, comme indiqué par la variation du spectre de résonance des spins des électrons. Une fois que l'étalonnage a été effectué, on peut utiliser divers dispositifs qui permettent 5 de lire directement la quantité de substance inconnue. Dans la conduite du titrage, trois réactifs basiques sont impliqués : le corps inconnu ou groupe de liaison ; le groupe analogue ou radical libre ; et le récepteur. Le groupe analogue ou radical libre et le récepteur sont avantageusement 10 préparés sous la forme de solutions de réactifs, d'autres réactifs étant éventuellement présents dans l'une et/ou l'autre des solutions. Les réactifs peuvent être transportés soit à sec, soit en solution. Des liquides conviennent pour le transfert de petites quantités de substances, parce que leur mesure est pra-15 tique. On utilise normalement des solvants polaires, notamment des solvants hydroxyliques tels que l'eau et des solutions aqueuses d'alcanols en ou Cg (méthanol et éthanol). On peut aussi utiliser d'autres solvants oxygénés tels que des éthers, des 20 esters, le diméthylformanride, le diméthylsulfoxyde, l'hexa-méthylphosphoramide, etc., habituellement en combinaison avec de l'eau en quantités de 0 à 40 et plus couramment de 1 à 30 $ en volume. Dans la conduite du titrage, le facteur de dilution 25 pour chaque réactif est habituellement de 1,5 à 10, et, plus couramment, de 1,5 à 5. Par conséquent, la concentration initiale du réactif dans sa solution permet de prévoir dans une certaine mesure la concentration finale du réactif dans le titrage. La concentration du récepteur dans la solution de 30 réactif est habituellement comprise dans la gamme de 10~^ à —3 * —7 —3 10 M, de préférence de 10 à 10 M sur la base des sites actifs. (La méthode de détermination des sites actifs sera décrite dans la partie expérimentale). Habituellement, elle varie, en gros, d'environ 10 ^ à environ 100 mg/ml, notamment —2 ^ 35 d'environ 10 à 10 mg/ml. Pour le titrage, la concentration des sites récepteurs doit être comprise entre environ 10~^ et _Q 10 I-I, notamment entre 10 et 10- K. 72 00687 5 2121723 lies gammes de concentrations molaires pour le groupe analogue sont parallèles à celles du récepteur, tant en ce qui concerne la solution de réactif qu'en ee qui concerne la concentration de titrage. le rapport du groupe analogue au récepteur 5 est habituellement compris entre 0,5 et 10, notamment entre 0,5 et 3 molécules par site récepteur, le rapport est régi par les constantes de liaison, la méthode de détermination, la concentration attendue du groupe de liaison et la spécificité du titrage. Habituellement, il est désirable que le mélange à 10 titrer soit-tamponné, de manière que son pH soit compris dans la gamme de 5,0-à 10,5» de préférence de 7,0 à 8,5. Dans ces circonstances, en raison du facteur de dilution, l'une des solutions de réactif, de préférence la solution du récepteur, est tamponnée, de manière que le pH soit compris entre 6,5 et 9,5, 15 de préférence entre 7,0 et 8,5. La concentration du tampon varie avec la nature de ce dernier, et dans la solution de réactif, elle est habituellement de 0,05 à 0,8 M, notamment de 0,2 à 0,7 M. le pH de la solution de réactif que l'on utilise est d'autant plus élevé que la solution inconnue est plus acide. 20 Dans le mélange à titrer, la concentration du tampon se situe, habituellement, entre environ 0,1 et 0,6 M. le choix du tampon varie dans une large mesure, en fonction de l'effet qu'il exerce sur les réactifs, par exemple la solubilité, l'inertie vis-à-vis des réactifs, etc. Divers 25 tampons que l'on utilise couramment comprennent la tris(hydroxy-méthyl)méthylamine (tampon tris) ; et les sels de tris, par exemple le maléate de tris ; des borates de métaux alcalins et d'ammonium, par exemple le borate de sodium, un phosphate de métal alcalin et d'ammonium, par exemple le phosphate mônosodique 30 et le phosphate disodique ; un bicarbonate et un carbonate de métal alcalin, par exemple le bicarbonate et le carbonate de sodium j l'acide éthylène-diamine tétra-acétique ; des amino-diols en combinaison avec leurs sels, par exemple le chlorhydrate de 2-amino-2-méthyl-1,3-propane-diol ; une combinaison de 35 chlorure d'ammonium et d'hydroxyde d'ammonium ; une combinaison de barbital et de son sel de métal alcalin ; des aminés hétéro-cycliques en combinaison avec leurs sels, par exemple les combinai 72 00687 6 2121723 sons de. collidine et d 'acide chlorhydrique ; de collidine, pyridine et acidê acétique ; d*éthanolamine et d'acide chlorhydrique ; de n-éthylmorphine, pyridine et acide acétique ; de glycine et d'acide chlorhydrique ; de pipérazine et de glycylglycine ; 5 etc. les tampons préférés sont le tris, une combinaison de bicarbonate et de carbonate, un phosphate et un borate. Avec les tampons minéraux, il est souvent pratique de neutraliser l'acide minéral, par exemple l'acide borique, avec une base de métal alcalin, par exemple l'hydroxyde de sodium, au pH désiré. 10 D'autres sels ou réactifs peuvent aussi être présents dans la solution de réactif, le cas échéant. Dans certains cas, un traitement préalable du substrat inconnu peut être requis. Lorsqu'on présume que le substrat inconnu contient un corps réducteur, par exemple l'acide ascorbi- t 15 que, capable de réduire le radical libre, on peut traiter le substrat inconnu avec un agent oxydant tel que le bichromate de sodium, le perborate de sodium, le periodate de sodium, l'iode, etc. Le choix de l'agent oxydant est régi par l'effet qu'il exerce sur les autres réactifs présents dans la composition à 20 titrer. Un bichromate de métal alcalin, notamment le bichromate de sodium, et l'hypo-iodite. de sodium sont des oxydants de choix. La quantité d'agent oxydant est régie par la quantité d'agent réducteur dont on suspecte la présence. Dans le cas —1 -3 de l'urine, des concentrations de 10 à 10 M sont habituelle-25 ment suffisantes. L'ordre dans lequel les réactifs sont mis en présence est relativement arbitraire, et il est régi à un certain degré par l'interaction entre le radical libre constituant le groupe analogue et le récepteur. Par conséquent, le radical libre 30 constituant le groupe analogue peut être utilisé à l'état lié au récepteur, et la solution inconnue peut être ajoutée. Ou bien, la solution inconnue et le radical libre constituant le groupe analogue peuvent être ajoutés simultanément pour se disputer les sites du récepteur. Dans quelques cas, le groupe de liaison 35 peut tout d'abord être lié au récepteur, et le groupe analogue peut être ajouté. L'un quelconque de ceprocédés peut être réglé avec précision et utilisé pour la détermination d'un groupe particulier de liaison. Par commodité, la solution peut être 72 00687 7 2121723 séparée du récepteur et la concentration du radical libre constituant le groupe analogue dans la solution peut être déterminée. Ceci peut aussi être rattaché à la concentration du groupe inconnu de liaison . 5 Les solutions sont mélangées jusqu'à ce qu'on obtienne une homogénéité raisonnable, et le cas échéant, elles sont transférées dans un porte-échantillon pour la détermination de la résonance des spins des électrons. Le porte-échantillon est ensuite introduit dans la cavité d'un spectromètre de. 10 résonance des spins des électrons. La température qui règne dans la cavité est normalement maintenue dans la gamme d'environ 15 à 40°C, et on mesure la variation du spectre. Suivant la méthode de normalisation et la méthode d'étalonnage, on peut avoir à déterminer un ou plusieurs points pour trouver la concentration 15 du groupe inconnu de liaison. On utilise des volumes extrêmement faibles pour la détermination, habituellement dans la gamme de 10 à 100 microlitres, en ce qui concerne le volume total des réactifs et du corps inconnu. La quantité de groupe inconnu de liaison qui -5 20 est requise, se situe normalement dans la gamme d'environ 10 —15 —7—13 à 10 moles, notamment de 10 à 10 moles. Une variante, qui ajoute une étape au procédé, consiste à lier le récepteur à un support. Ceci implique, normalement un système hétérogène, au lieu d'un système homogène. Dans de 25 nombreux cas, l'utilisation avantageuse du support dans un système hétérogène fait plus que compenser l'effort supplémentaire impliqué dans la liaison du récepteur au support. Il est possible d'utiliser le support pour garnir une colonne (qui serait vraisemblablement un petit tube capil-30 laire) avec le récepteur lié au support, puis de lier au récepteur le groupe analogue. La quantité de groupe analogue présente pourrait être déterminée par mesure du spectre de résonance des spins des électrons de la colonne, ou de préférence par mesure de la quantité de groupe analogue en solution avant et 35 après le passage dans la colonne. On pourrait alors faire passer des quantités relativement grandes du fluide inconnu dans la colonne, puis déterminer le spectre de la colonne ou du courant sortant. La variation du spectre serait proportionnelle à la 72 00687 8 2121723 quantité de groupe de liaison contenue dans le fluide passant sur la colonne (ainsi que la vitesse d'écoulement si l'équilibre n'est pas établi). A titre de variante, on pourrait mélanger le groupe 5 de liaison et le groupe analogue avec le récepteur lié au support dans un tube. lorsque l'équilibre a été établi, en séparant le récepteur lié au support du liquide surnageant, on pourrait mesurer la résonance du spin des électrons du support et/ou du liquide surnageant. Une autre variante consisterait à déterminer la 10 quantité résiduelle de groupe analogue lié au support, par addition de groupe de liaison au support, de manière à libérer tout groupe analogue restant et à doser ce groupe dans la solution. De plus, des supports trouvent une application 15 particulière, lorsqu'une grande molécule, de poids moléculaire habituellement supérieur à 5 000 et notamment supérieure à 10 000, constitue le groupe de liaison à rechercher. On constate que lorsque le composé à radical libre est lié à une grande molécule, de poids moléculaire sen'siblement supérieur à 20 5000, le spin s'approche de celui d'un spin immobilisé en solution. Par conséquent, une liaison supplémentaire à un récepteur ne modifie pas notablement le spin du radical libre. Il convient donc de lier le récepteur au support, d'effectuer le titrage par addition de groupe analogue et de groupe de liaison 25 au support, puis de déterminer la quantité de groupe analogue dans une solution et/ou sur le support. Dans ce cas, on ne détermine pas la variation du spectre de résonance des spins des électrons due à un passage d'un spin non mobilisé à un spin mobilisé, mais plutôt le nombre absolu de radicaux libres 30 qui sont présents. On décrit ci-après les réactifs, à savoir le groupe de liaison et le radical libre utilisé comme groupe analogue. Les groupes de liaison que l'on peut titrer sont limités principalement par l'aptitude à fournir un site récepteur de spécificité désirée. Lorsque l'interaction avec le groupe de 35 liaison et le radical libre présent comme groupe analogue est réversible, on peut utiliser soit le déplacement du radical libre du site récepteur par le groupe de liaison, soit la compétition entre le radical libre utilisé comme groupe analogue 72 00687 9 2121723 et le groupe de liaison pour occuper le site récepteur. Lorsque ce dernier réagit avec le groupe de liaison et/ou le groupe analogue à radical libre d'une façon irréversible, on ne peut utiliser que le procédé impliquant une compétition. 5 Les groupes de liaison comprennent des composés tels que des narcotiques, des hypnotiques, des sédatifs, des analgésiques, des antipyrétiques, des anesthésiques, des drogues psychogènes, des agents de relaxation musculaire, des stimulants du système nerveux, des agents anticholinestérase, des agents 10 parasympathomimétiques, des agents sympathomimétiques, des agents de blocage a-adrénergique, des agents anti-adrénergiques, des agents de stimulation et de blocage ganglionnaires, des agents de blocage neuromusculaire, des histamines, des antihistamines, la 5-hydroxytryptamine et ses antagonistes, des médicaments 15 cardiovasculaires, des médicaments antiarythmiques, des agents antihypertensifs, des médicaments vasodilatateurs, des diurétiques, des pesticides (fongicides, anthelminthiques,insecticides, ectoparasiticides, etc.), des médicaments antipaludéens, des antibiotiques, des antimétabolites, des hormones, des vitamines, 20 des sucres, la thyroïde et des médicaments antithyroïdiens, des corticostéroïdes, l'insuline et des médicaments hypoglycé-miques administrés par voie orale, ainsi que leur^éiétabolites. Parmi ces médicaments et ces agents, on mentionne des alcaloïdes, des stéroïdes, des polypeptides, des prosta-25 glandines, des catécholamines, des xanthines, des arylalkylamines, des composés hétérocycliques, par exemple des thiazines, des pipé-razines, des indoles et des thiazoles ; des amino-acides, etc. Les groupes de liaison sont pour la plupart des molécules douées d'activité biologique qui présentent au moins un 30 site polaire, notamment au moins deux sites polaires et comportent au moins 6 atomes de carbone, leurs poids moléculaires étant normalement au moins égaux à 125 environ. Les poids moléculaires ne dépassent habituellement pas 70 000, notamment 10 000, et ils sont, le plus souvent, inférieurs à 5 000. Comme indiqué pré-35 cédemment, dans le cas de groupes de liaison dont le poids moléculaire est supérieur à 5000, on utilise -une technique particulière. Le rapport des atomes de carbone aux hétéroatomes est normalement égal ou supérieur à 1:1, notamment supérieur à 2:1, 72 00687 10 2121723 et de préférence supérieur à 4:1, mais il ne dépasse pas 30:1. les diverses molécules qui constituent les groupes de liaison et qui présentent un intérêt diagnostique peuvent être subdivisées en catégories différentes. Alcaloïdes fins de la présente invention, on inclut dans cette catégorie d'alcaloïdes des composés qui sont préparés par voie de synthèse pour simuler, du point de vue physiologique,les alcaloïdes na-•jq turels. Tous les alcaloïdes naturels portent un atome d'azote d'amine comme membre hétérocyclique. les alcaloïdes de synthèse portent normalement un groupe aminé tertiaire, qui peut ou non être un membre hétérocyclique, les alcaloïdes portent diverses fonctions présentes sur la molécule, par exemple ^ éthers, hydroxyles, esters, acétals, aminés, isoxazole, oléfines, qui peuvent toutes, en fonction de leur position particulière dans la molécule, être utilisées comme sites pour la liaison à la fonction du radical libre. 20 prend les alcaloïdes de la classe de la morphine et leurs dérivés synthétiques analogues à effet physiologique mimétique. Toutes ces molécules ont au moins la structure suivante : dans laquelle les valences libres sont satisfaites par une grande variété de groupes, principalement du carbone et de 25 l'hydrogène. ces composés doit avoir tin squelette de structure minimale suivante : La première catégorie comprend les alcaloïdes. Aux Un groupe particulièrement préféré d'alcaloïdes com- Le groupe analogue à radical libre de la plupart de 72 00687 n 2121723 x a 10 15 dans laquelle X est une liaison ou une fonction telle que imino azo, oxy, thio, sulfonyle, oxocarbonyle, nonoxocarbonyle ou des combinaisons de ces fonctions. L'oxygène doit être en position ortho, meta ou bêta. A est un composé hétérocyclique pentagonal ou hexagonal, dont l'un des membres cycliques est un atome d'azote ou une fonction nitroxyde, l'autre membre hétérocyclique pouvant être un atome d'oxygène, de soufre ou d'azote. L'azote ou le soufre peut ou non être lié à un atome d'oxygène. Le noyau doit présenter 0 ou 1 site d'insaturation éthylénique. Les divers radicaux libres seront décrits ci-après Le poids moléculaire des composés portant le radical libre substituant est au moins égal à environ 350 et ne dépasse pas normalement 700, et il est compris, notamment, dans la gamme d'environ 400 à 600. La morphine marquée par des radicaux libres et les dérivés analogues étroitement apparentés répondent à la formule suivante : ^ga n w dans laquelle : L'un quelconque des groupes ¥ petit être un groupe 20 -X*-A* , ou bien un atome d'hydrogène de l'un quelconque des 72 00687 12 2121723 groupes ¥ peut être remplacé par un groupe X*-A*. Le groupe X*-A* sera défini ci-après (il n'y a qu'un seul groupe X*-A* par molécule) ; est tin atome d'hydrogène ou tua groupe hydrocarboné 5 en à Cg, notamment un groupe alkyle ou aralkyle, par exemple méthyle ou P-phénéthyle ; ¥^, W5 et ¥^a désignent de l'hydrogène ; ¥^ est un atome d'hydrogène ou forme, en association •5 avec W un radical divalent en CL à C., comportant 0 à 2 atomes 3 6' 10 d'oxygène, formant un noyau carbocyclique pentagonal avec la chaîne carbonée à laquelle il sont attachés, par exemple propy-lène-1,3, 1-hydroxy-prop-2-énylène-1,3, 1-hydroxypropylène-1,3, 1-acétoxypropylène-1,3,1-acétoxyprop-2-énylène-1,3, 1-oxo- propylène-1,3, 1-oxoprop-2-énylène-1,3 ; g 15 ¥ est un atome d'hydrogène ou un groupe hydroxyle ; g ¥ est un atome d'hydrogène, un groupe hydroxyle, ou forme, en association avec ¥^ la fonction oxy (-0-) ; n ¥ est un atome d'hydrogène ou un groupe méthyle ; g ¥ est un atome d'hydrogène ou un groupe hydroxyle ; 20 et g ¥ est un atome d'hydrogène, un groupe hydroxy, acyloxy en C.j à , par exemple acétoxy (acyloxy ne désignant que carboxy), hydrocarbyloxy en à C^, par exemple méthoxy, éthoxy, 2-(îT-morpholino)éthyle, et glucuronyle. (Il y a lieu de remarquer que 25 dans toutes les formules, sauf lorsqu'on indique une structure minimale ou squelette, les valences non satisfaites sont occupées par de l'hydrogène). (Le terme "hydrocarbyle" désigne un radical organique composé d'hydrogène et de carbone seulement, qui peut être 30 saturé ou insaturé, aliphatique, alicyclique, aromatique ou mixte). Des exemples de composés qui peuvent être substitués avec des radicaux libres comprennent la morphine, l'héroïne, l'hydromorphone, 1'oxymorphone, le métopon, la codéine, 35 l'hydrocodone, la dihydrocodéine, la dihydrohydroxycodéinone, la pholcodine, le dextrométhorphan, la phénazocine et la dionine. On mentionne également les métabolites de ces composés. 72 00687 13 2121723 1 9 Dans les composés préférés, ¥ ou ¥ représente un 10 "3 4 groupe -X*-A* ou bien ¥ et ¥ s'associent pour former un groupe A*-X*-CHCH2CH2- ou un groupe A*-X*-CH-CH=CH-. Il y a lieu de remarquer que les divers groupes sont choisis de manière qu'ils concernent des composés connus d'intérêt physiologique. La principale différence entre les composés connus et les composés de l'invention réside dans le groupe de liaison et dans la présence du radical libre constituant le traceur à spin. Un autre groupe de composés doués d'activité narcotique comprend la méthadone et les composés analogues, qui répondent, pour la plupart, à la formule suivante : dans laquelle l'un quelconque des groupes ¥ peut être un groupe -X*-A* ou bien un atome d'hydrogène de l'un quelconque des 15 groupes ¥ peut être remplacé par un groupe -X*-A*. Le groupe X*-A* sera défini ci-après. (Il n'y a qu'un seul groupe -X*-A* par molécule) ; n est égal à 0 ou 1, étant habituellement le même dans les deux cas ; 20 m est égal à 2 ou 3 ; 10 W est un atome d*hydrogène ; 1112 ¥ et ¥ représentent de l'hydrogène, des groupes alkyle en à C^, par exemple méthyle, ou peuvent s'associer 72 00687 14 2121723 pour former un noyau hexagonal avec l'atome d'azote auquel ils sont attachés, par exemple pentylène-1,5 et 3-oxapentylène-1,5 ; 13 /■ ¥ est un atome d'hydrogène ou un groupe méthyle, un. seul 13 groupe ¥ étant un groupe méthyle ; 5 ¥^ est un atome d'hydrogène ; 15 ¥ est un atome d'hydrogène ou un groupe hydroxyle ; ¥1^ est un atome d'hydrogène, un groupe acyloxy en C. à C^, par exemple propionoxy, ou un groupe hydroxy (lorsque ¥'5 et ¥1^ sont chacun un groupe hydroxy, la fonction oxo est 10 désirée) ; et 17 ¥ est un atome d'hydrogène ou m groupe alkyle en C.j à Cj, par exemple éthyle. Des exemples de composés qui peuvent être marqués avec un radical libre comprennent la méthadone, le dextromoramide, 15 la dipipanone, la phénadoxone, le propoxyphène (Darvon) et 1'acétylméthadone. On préfère des composés dans lesquels ¥' est un groupe -X*-A*. Le troisième groupe de composés doués d'activité 20 narcotique comprend la mépéridine et les dérivés analogues, répondant, pour la plupart à la formule suivante : r11 n16 w17 ¥ ou ¥ w 21 dans laquelle l'un quelconque des groupes ¥ est un groupe -X*-A* ou bien un atome d'hydrogène de l'un quelconque des groupes ¥ peut être remplacé par un groupe -X*-A*. Le groupe X*-A* sera 25 défini plus loin (il n'y a qu'un groupe -X*-A* par molécule). 72 00687 15 2121723 est un atome d1hydrogéné ; 21 W est un atome d'hydrogène, un groupe alkyle en C.j à G^, par exemple méthyle, un groupe aminophénylalkyle, par exemple (3- (£-aminophényl ) éthyle, un groupe phénylaminoalkyle , 5 par exemple phénylaminopropyle (les groupes alkyle ayant 2 ou 3 atomes de carbone) ; 22 W est un groupe alkoxy en à C^, par exemple éthoxy ; H23 est un atome d'hydrogène ou un groupe méthyle. 10 Des exemples de ces composés comprennent la mépéridine, l'a-prodine, l'alvodine et l'aniléridine. Les composés préférés comprennent ceux dans lesquels .21 22 w ou ¥ est un groupe -X*-A*, ou bien un atome d'hydrogène 21 de W est remplacé par un groupe . 15 Une seconde catégorie intéressante de groupes de liaison se base sur la tryptamine et entre dans la classe des alcaloïdes du type de l'indole, notamment les alcaloïdes de l'ergot. Ces composés répondent à la formule minimale suivante : dans laquelle les valences libres sont satisfaites par divers 20 groupes, principalement du carbone et de l'hydrogène, bien que d'autres substituants puissent être présents, tels que des groupes carboxyle, hydroxyle, céto, etc. Le représentant de cette classe que l'on utilise le plus couranment est l'acide lysergique, principalement sous la forme de son diéthylamide. 25 D'autres représentants de cette classe comprennent 1'ergotamine, 1'ergotaminine, l'acide isolysergique et l'ergosine. D'autres représentants de la famille des alcaloïdes du type de l'indole que l'on peut aussi détecter comprennent le groupe de la strychnine et le groupe de l'indolopyridocoline, dont des repré-30 sentants sont l'yohimbine et la réserpine. 72 00687 16 2121723 Les alcaloïdes du type de l'indole substitués par des radicaux libres, répondent à la formule générale : x - a dans laquelle X et A ont les définitions données ci-dessus. D'autres groupes d'alcaloïdes comprennent les 5 alcaloïdes stéroïdes, les alcaloïdes du type iminazolyle, les alcaloïdes du type quinazoline, les alcaloïdes du type isoquino-léine, les alcaloïdes du type quinoléine, dont la quinine est le représentant le plus courant,et les alcaloïdes du type diterpénique. 10 La plupart des alcaloïdes liés à un radical libre ont un poids moléculaire d'environ 300 à 1500, notamment d'environ 400 à 1000. Normalement, ils sont uniquement composés de carbone, d'hydrogène, d'oxygène, d'azote et de soufre, le soufre étant présent dans les radicaux libres ; l'oxygène est présent sous 15 les formes oxy et oxo et l'azote est présent sous la forme ami.no ou amido. naturellement, avec le radical nitroxyde, un atome d'azote et un atome d'oxygène sont associés sous la forme de cette fonction. Il importe particulièrement de mentionner des 20 médicaments, qui, bien qu'ayant un usage bénéfique et approprié, sont distribués à des fins non médicales et ont fait l'objet d'abus. Des exemples de groupes entrant dans cette catégorie comprennent les amphétamines, les barbiturates et d'autres médicaments qui sont utilisés pour provoquer des stimuli émotionnels. 72 00687 17 2121723 Catécholamines Le premier groupe comprend des catécholàmines de formule : MJ31 tf5 10 dans laquelle : l'un quelconque des groupes ¥ peut être un groupe -X*-A* ou bien un atome d'hydrogène de l'un quelconque des groupes ¥ peut être remplacé par un groupe -X*-A*. Le groupe -X*-A* sera défini plus loin (il n'y a qu'un seul groupe -X*-A* par molécule) ; 30 W est un atome d'hydrogène ou un groupe alkyle en C1 à C,, par exemple méthyle ; 31 ¥ est un atome d'hydrogène ou un groupe alkyle en 32 33 ¥ et ¥ sont des atomes d'hydrogène ; 15 C1 à C,, par exemple méthyle ; i y p2 ™ 34. ¥ est un atome d'hydrogène, un groupe hydroxy, diméthoxycarboxyphénacyle ou diméthoxy-a-phtalidyle ; ¥ et ¥ sont des atomes d'hydrogène, dont l'un 31 peut s'associer avec ¥ pour former une liaison et, lorsque 31 35 32 33 • ¥ et ¥ sont associés, les groupes ¥ et ¥ et 20 les groupes ¥^ et w36 peuvent s'associer pour former une double liaison. 37 ¥ est un atome d'hydrogène ou un groupe alkoxy en C, à C,, par exemole méthoxy ; 1 3 7Q * XQ 38 39 ¥ et ¥ sont des groupes hydroxy ou alkoxy en 25 à C^, par exemple méthoxy. Des exemples de ces composés comprennent la cota'inine, la narcéine, la noscapine et la papavérine. 30 38 Les composés préférés sont ceux dans lesquels ¥ , ¥ 72 00687 t8 2121723 •50 ou ¥ représente un groupe -X*-A* , ou bien un tel groupe remplace l'un de leurs atomes d'hydrogène. Un autre groupe de catécholamines comprend les amphétamines et les composés apparentés. Ces composés répondent à la formule : W XX y43 ce— ch n w 41 40 W dans laquelle î l'un quelconque des groupes ¥ peut être un groupe -X*-A* ou bien un atome d'hydrogène de l'un quelconque des groupes ¥ peut être remplacé par un groupe -X*-A*. -X*-A* 10 sera défini plus loin (il n'y a qu'un seul groupe -X*-A* par molécule). ¥^ et ¥^ sont des atomes d'hydrogène ou des groupes alkyle en C^ à C^, par exemple méthyle et isopropyle, l'un étant de préférence un atome d'hydrogène ; 15 ¥^ est un atome d'hydrogène, un groupe alkyle en C. à C., par exemple méthyle ou éthyle et un groupe carboxy. 43 ¥ est un atome d'hydrogene ou un groupe hydroxyle et 44 45 ¥ et ¥ sont des atomes d'hydrogene, des groupes 20 hydroxyle ou des groupes alkoxyle en C^ à C^. Des exemples de composés qui peuvent être marqués par un spin comprennent l'éphédrine, 1'épinéphrine, le L-dopa, la cohéfrine, la benzidrine (amphétamine), la parédrine, la méthamphé-tamine et la noréphédrine. 25 Barbiturates Une large classe de médicaments synthétiques qui font l'objet d'un abus intense et fréquent, est la classe des 72 00687 19 2121723 barbiturates. Ces composés sont faciles à obtenir par synthèse et leur utilisation n'est que difficile à réglementer. les composés qui sont utilisés répondent à la formule suivante : O dans laquelle : 5 l'un quelconque des groupes ¥ peut être un groupe -X*-A* ou bien un atome d'hydrogène de l'un quelconque des groupes ¥ peut être remplacé par un groupe -X*-A*. le groupe X*-A* sera défini plus loin (il n'y a qu'un groupe -X*-A* par molécule). 50 10 ¥ désigne de l'hydrogène, un groupe alkyle en C1 à 0y par exemple méthyle ou un métal alcalin, par exemple sodium ; 51 52 ¥ et ¥ désignent de l'hydrogène, des groupes alkyle, alcényle, cycloalkyle, cycloalcényle ou aryle en 15 Cj à Cg, notamment en à Cg, par exemple éthyle, n-butyle, a-méthylbutyle, isoamyle, allyle, A1-cyclohexényle et phényle ; 53 ¥ est un atome d'hydrogène ou un métal alcalin, par exemple sodium ; 54 ¥ est un atome d'oxygène ou de soufre. 20 Des exemples de composés qui peuvent être marqués par un spin comprennent le véronal, le médinal, le luminal, le prominai, le sonéryl, le nembutal, l'aniytal, le dial, le phénadorn, le séconal, l'évipan, le phénobarbital et pentothal. 50 51 Dans les composés préférés, ¥ ou ¥ ou un atome ■ïO ^1 25 d'hydrogène de ¥ ou ¥ est un groupe -X*-A*. Cocaïne La cocaïne est un médicament de grande importance par 72 00687 20 2121723 la quantité utilisée. La cocaïne, ses métabolites et dérivés analogues tels que l'ecgonine, marqués par des radicaux libres, répondent, pour la plupart, à la formule suivante : ch_ ch chcqw55 2 ^N—W57 JH-OW56 / * I ch_ ch ch 2 dans laquelle l'un quelconque des groupes ¥ peut être un groupe 5 -X*-A* ou bien un atome d'hydrogène de l'un quelconque des groupes ¥ peut être remplacé par un groupe -X*-A*. Le groupe X*-A* sera défini plus loin (il n'y a qu'un groupe -X*-A* par molécule). 55 ¥ est un groupe hydroxy, méthoxy ou amino ; 56 ¥ est un atome d'hydrogène ou un groupe benzoyle j et 57 10 ¥ est un atome d'hydrogène ou un groupe alkyle en C.j à C^, par exemple méthyle. Amino-acides et polypeptides Le groupe suivant de composés comprend les amino-acides et les polypeptides. Pour la plupart, les amino-acides 15 contiennent 2 à 14 atomes de carbone et portent divers groupes fonctionnels tels que mercapto, dithio, hydroxyle, guanidyle, pyrrolidine, indole, imidazole, thioéther méthylique, iodo, éther diphénylique, phénol, etc. Naturellement, ce sont principalement les amino-acides qui ont rapport aux êtres humains, 20 d'autres amino-acides étant rencontrés dans des plantes et chez des animaux. Les polypeptides ont normalement deux à environ sept cents, principalement environ deux à cent groupes amino-acide récurrents. L'un quelconque des amino-acides mentionnés ci-25 dessus peut être utilisé pour la préparation du polypeptide. En raison de la grande variété de groupes fonctionnels qui sont présents dans les amino-acides et que l'on trouve fréquemment dans les divers polypeptides naturels, le radical libre peut être lié à toute fonction classique par le fait que le radical libre 30 porte la fonction appropriée. Habituellement, la fonction du ra 72 00687 21 2121723 dical libre peut être liée à un groupe lysine ou arginine, bien qu'on puisse utiliser la sérine, la thréonine ou tout autre ami.no-acide portant une fonction convenable, par exemple carboxy et . hydroxy. 5 La plupart des polypeptides marqués par un radical libre répondent à la formule suivante : dans laquelle X et A répondent aux définitions données ci-dessus et R est un résidu amino-acide, n étant un nombre entier égal à 1-700, notamment à 1-200 et, le plus souvent, à 2-100. 10 Des exemples d'amino-acides comprennent la glycine, l'alanine, la sérine, l'histidine, la méthionine, l'hydroxypro-line, le tryptophane, la tyrosine, la thyroxine, l'ornithine, la phénylalanine, 1'arginine et la lysine. Des polypeptides intéressants comprennent l'ACÎH, 1'oxytocine, l'hormone lutéinisante, 15 l'insuline, la protéine de Bence-Jones, la gonadotropine chorio-nique, la gonadotropine pituitaire, l'hormone de croissance, la rénine, la globuline fixant la thyroxine, la bradykinine, l'angiotensine, etc. Stéroïdes 20 Un autre groupe important de composés que l'on peut utiliser conformément à l'invention comprend les stéroïdes qui portent une large gamme de fonctions suivant le-rôle qu'ils jouent dans le corps. Outre les stéroïdes, on mentionne des substances stéroïdo-mimétiques, qui, bien qu'elles n'aient pas 25 la structure polycyclique fondamentale du stéroïde, exercent certains effets physiologiques analogues. Pour la plupart, les stéroïdes utilisés répondent à la formule suivante : 72 00687 22 2121723 z x - a dans laquelle X et A ont les définitions données ci-dessus. Habituellement, le radical libre de marquage est lié aux noyaux A ou B, en positions 2, 3 ou 6, ou en position 17 du noyau D ou sur les chaînes latérales en position 17. Les 5 noyaux peuvent porter divers substituants, notamment des groupes méthyle, hydroxyle, oxocarbonyle, éther et amino. N'importe lesquels de ces groupes peuvent être utilisés pour lier la fonction du radical libre à la structure cyclique de base. La plupart des stéroïdes intéressants portent au 10 moins une et, habituellement une à quatre fonctions oxygénées, par exemple alcool, éther,esters ou cétone. Les stéroïdes ont habituellement 18 à 27 atomes de carbone. d'insaturation, de nature éthylénique ou aromatique, et ils 15 peuvent être substitués dans d'autres positions telles que les positions 6, 7 et 11 avec des substituants oxygénés. En outre, il peut y avoir des groupes méthyle dans les positions 10 et 13. La position marquée avec un groupe Z, ou position 17, peut varier et varie effectivement dans une large mesure en 20 fonction du stéroïde particulier. Z peut être un atome d'oxygène de carbonyle, un groupe aliphatique en à Cg, y compris un groupe acétyle, un groupe hydroxyacétyle, un groupe hydroxy, un groupe carboxy ou carboxyalkyle en Cg à Cg, un groupe acétylé-nique en C2 à Cg ou des groupes alkyle halogénés ou alkyle 25 oxygénés, ou un groupe portant plus d'une fonction, habituellement une à trois fonctions.: Les noyaux présentent un ou plusieurs sites 72 00687 Ces stéroïdes sont utilisés comme hormones, hormones sexuelles mâles et femelles qui peuvent être divisées en oestrogènes, gestogènes et androgènes, hormones adrénocorticales (glucocorticoïdes), acides biliaires, glucosides cardiotoniques 5 et aglycones, ainsi que saponines et sapogénines. les substances stéroïdo-mimétiques, notamment les hormones sexuelles, sont illustrées par le diéthyl-stilboestrol. les hormones sexuelles intéressantes peuvent être divisées en deux groupes, à savoir les hormones mâles (andro-10 gènes) et lés hormones fermelles (oestrogènes). les'androgènes que l'on utilise répondent à la formule suivante î dans laquelle : 15 l'un des groupes W peut être un groupe ou un atome d'hydrogène de l'un quelconque des groupes ¥ peut être remplacé par un groupe -X*-A*. le groupe X*-A* sera, défini plus loin (il n'y a qu'un groupe -X*-A* par molécule). f> 0 ¥ est un atome d'hydrogène ou un groupe hydroxyle 20 ¥^ est un atome d'hydrogène, un groupe méthyle ou hydroxyle (lorsque deux groupes attachés au même atome de carbone sont des groupes hydroxyle, on considère qu'il s'agit de la fonction oxo); ¥^ et ¥b^ sont des atomes d'hydrogène ou des 25 groupes hydroxyle, l'un au moins de ¥^-¥^ étant un groupe hydroxyle (soit sous la forme hydroxy, soit sous la forme oxo). 2121723 72 00687 24 2121723 Des exemples de composés qui peuvent être marqués par un spin comprennent la testostérone,l'androstérone,lfisoandrosté-rone, l'étiocholanolone, la méthyltestostérone et la déhydro-isoandro stérone. 5 les oestrogènes portent un noyau aromatique A et répondent pour la plupart à la formule suivante : dans laquelle : l'un quelconque des groupes ¥ peut être un groupe 10 -X*-A* ou bien un atome d'hydrogène de l'un quelconque des groupes ¥ peut être remplacé par un groupe -X*-A*. X*-A* sera défini plus loin (il n'y a qu'un groupe -X*-A* par molécule) ; 70 ¥ est un atome d'hydrogène ou un groupe hydroxyle ; 71 ¥ est tm atome d'hydrogène, un groupe éthynyle 15 ou hydroxyle (lorsque deux groupes hydroxyle sont attachés au même atome de carbone, il&'agit de la fonction oxo) ; 72 ¥ est un atome d'hydrogène ou un groupe hydroxyle 73 et ¥ est un groupe hydroxyle ou un groupe alkoxyle en C.j à 0^. 20 Des exemples de composés qui peuvent porter un traceur à spin comprennent 1 ' équilénine, le |3-oestradiol, l'oestrone, l'oestriol et le 17-a-éthinyl-oestradiol. Une autre classe d'hormones comprent les gestogènes qui répondent à la formule suivante : 72 00687 25 2121723 dans laquelle : l'un quelconque des groupes W peut être un groupe -X*-A* ou un atome d'hydrogène de l'un quelconque des groupes 5 V peut être remplacé par un groupe -X*-A*. le groupe X*-A* sera défini ci-après (il n'y a qu'un groupe -X*-A* par molécule) ; 80 81 W et W sont des atomes d'hydrogène ou des groupes hydroxyle, l'un au moins étant un groupe hydroxyle (lorsque deux groupes hydroxyle sont attachés au même atome de carbone, 10 il s'agit d'une fonction oxo). 82 W est un atome d'hydrogène ou un groupe hydroxyle 0"Z QA W et W sont des atomes d'hydrogène ou des groupes hydroxyle, l'un au moins étant un groupe hydroxyle. Des exemples de composés qui peuvent recevoir un 15 spin traceur comprennent la progestérone, la prégnénolone, l'alloprégnane-3a:20a-diol et l'alloprégnane-3a-ol-20-one. D'autres groupes importants de stéroïdes comprennent les corticostéroïdes qui consistent en minéralocorticoïdes et glucocorticoïdes. Ces composés répondent à la formule 20 suivante : 72 00687 26 2121723 &AT 0-2 sites d'insaturation éthylénique dans laquelle : l'un des groupes W peut être un groupe -X*-A* ou un atome d'hydrogène de l'un-quelconque des groupes ¥ peut être 5 remplacé par un groupe -X*-A*. Le groupe X*-A* sera défini plus loin. (Il n'y a qu'un groupe -X*-A* par molécule) j ¥^0 est tm atome d'hydrogène ou un groupe hydroxyle ; ¥^ et ¥^2 sont des atomes d'hydrogène ou des groupes hydroxyle, l'un au moins étant un groupe hydroxyle 10 (lorsque 2 groupes hydroxyle sont liés au même atome de carbone, il s'agit de la fonction oxo); ¥^3 est un atome d'hydrogène ou un groupe hydroxyle ; ¥-^, ¥-*5, ^96 e-j. t.j97 représentent de l'hydrogène ou des groupes hydroxyle, l'un au moins de et ¥?** étant un 15 groupe hydroxyle ; et ¥^8 est un groupe méthyle ou formyle. Des exemples de composés qui peuvent recevoir tm spin traceur comprennent la 17-hydroxydioxycorticostérone (composé S), la déoxycorticostérone, la cortisone, la corticostérone, 20 la 11-dihydrocortisone (composé î1), le cortisol, la prednisolone et l'aldostérone. Une autre famille de stéroïdes comprend les sapogénines dont la digitaline est un représentant important. Le composé fondamental est la gitoxigénine, qui existe également comme glu-25 coside. Les composés intéressants répondent à la formule suivante : W 95 72 00687 27 2121723 0-1 site d1insaturation éthylénique dans laquelle : l'un quelconque des groupes ¥ peut être un groupe -X*-A* ou un atome d'hydrogène de l'un quelconque des groupes ¥ 5 peut être remplacé par un groupe -X*-A*. X*-A* sera défini plus loin (il n'y a qu'un groupe -X*-A* par molécule) ; ¥a1, ¥a2 et ¥a5 sont des atomes d'hydrogène ou des groupes hydroxyle, habituellement des groupes hydroxyle. Marijuana 10 Bien qu'il ne s'agisse pas d'un groupe de composés, le tétrahydrocannabinol (ingrédient actif de la marijuana), en raison de la facilité avec laquelle on se le procure et de son usage répandu,est un composé de grand intérêt, pour lequel une simple méthode de titrage présenterait de l'importance, 15 Les composés qui son-tyktilisés comme composés analogues répondent à la formule suivante ï ,alO al2 j 0-1 site d'insaturation éthylénique ch3 72 00687 28 2121723 dans laquelle l'un quelconque des groupes W peut être un groupe -X*-A*, ou bien un atome d'hydrogène de l'un quelconque des groupes V/ peut être remplacé par un groupe . le groupe X*-A* sera défini plus loin (il n'y a qu'un groupe -X*-A* par molécule) ; Wa^ et Wa^ sont des atomes d'hydrogène ; et a11 W est un groupe hydroxyle, Vitamines Le groupe suivant de composés comprend les vitamines. 10 Du point de vue chimique, les vitamines ne forment pas une simple classe chimique, du fait que leur structure varie dans une large mesure, mais elles sont classées comme groupe en tant que fonction. Les vitamines comprennent la vitamine A, qui est un carotène, le groupe de la vitamine B qui comprend la riboflavine, la thiamine, 15 la niacine, la pyridoxine, l'acide pantothénique, la biotine, l'acide folique et la cyanocobalaminé (vitamine B^) 5 l'acide ascorbique (vitamine C) ; les vitamines D qui sont des dérivés stéroïdes ; le tocophérol (vitamine E) et la phytyl-1,4-naphtoqui-none (vitamine E). 20 Sucres Le groupe suivant de composés comprend les sucres et les saccharides. Ces derniers sont des combinaisons de divers sucres formant des dimeres, des trimères et des polymères de haut poids moléculaire, appelés polysaccharides. 25 Pro st aglandine Un autre groupe de composés d'importance biologique comprend les prostaglandines. Ces composés, lorsqu'ils sont marqués, répondent, pour la plupart, à la formule suivante : **20 * WY 0-1 site d'insaturation éthylénique wa"23 °5H9-U C6!W'COWa2'i Wa2* wa22 00687 29 2121723 dans laquelle : l'un quelconque des groupes ¥ peut être un groupe -X*-A* ou "bien un atome d'hydrogène de l'un quelconque des groupes V peut être remplacé par un groupe -X*-A*. Le groupe X*-A* sera défini plus loin (il n'y a qu'un groupe -X*-A* par molécule); Wa20 est un atome d'hydrogène ou un grouoe hydroxyle ; ¥a21 et ¥a"^ sont des atomes d'hydrogène ou des groupes hydroxyle. (Lorsque deux groupes hydroxyle sont attachés au même atome de carbone, il s'agit de la fonction oxo). W3"^ est un atome d'hydrogène ou un groupe hydroxyle ; a.24 et W est un groupe hydroxyle, un groupe amino ou -un groupe oxy en à. Cg, par exemple alkoxy. Tranquilli sant s Plusieurs composés exercent des effets tranquillisants et; par suite de l'usage anormal ou de l'abus qui en est fait, on peut avoir l'occasion d'en effectuer le dosage. Le premier tranquillisant intéressant .est le mépro-bamate, également appelé"Ililtotm." ou "Equanil". Ce composé et les dérivés analogues apparentés répondent à la formule générale : c,h_ 0 |3 7 ç W325 toCH ~—C—CH — 0 ~ CWa26 2 | 2 CH3 être dans laquelle l'un quelconque des groupes ¥ peut/un groupe -X*-A*, ou bien un atome d'hydrogene de l'un quelconque des groupes ¥ peut être remplacé par un groupe -X*-A*. Le groupe X*-A* sera défini plus loin. (Il n'y a qu'un groupe -X*-A* par molécule) ; **25 et T.'.,a^° sont des groupes amino. Un autre groupe de tranquillisants comprend les benzodiazocycloheptanes connus sous les noms de "Librum", "Valium", "Diasépam" ou "Oxazepam". Ces composés et les dérivés analogues apparentés répondent à la formule suivante : 72 00687 30 2121723 wa31a32 wa30 V w. t.Ta33 dans laquelle : l'un quelconque des groupes ¥ peut être un groupe -X*-A*, ou bien un atome d'hydrogène de l'un quelconque des groupes ¥ peut être remplacé par . le groupe X*-A* sera défini 5 plus loin (il n'y a qu'un groupe -X*-A* par molécule) ; „a30 et sont des atomes d'hydrogène ; Ve31 est un atome d'hydrogène, tm groupe alkyle a31 inférieur en à C^, par exemple méthyle, ou bien ¥ peut former en association avec ¥^2 une double liaison entre le 10 carbone et l'azote; ¥a55 est un groupe amino ou un groupe (alkyle inférieur)- amino en C. à C„, par exemple méthylamino, ou bien il peut former a32 en association avec W tm groupe carbonyle ; ^34 est un atome d'hydrogène ou un groupe hydroxyle ; a36 15 et ¥ est une fonction oxy ou une paire non partagée d'électrons. Un autre groupe de composés comprend les phénothiàzines dont la chlorpromazine est tm représentant. Ces composés ont pour la plupart la formule suivante : a41 72 00687 31 2121723 dans laquelle : H*140 est un atome d'hydrogène, un groupe alkyle en C1 à Cg, un groupe dialkylaminoalkyle en C^ à Cg, par exemple 3-(diméthylamino)propyle ; un groupe IT-hydroxyalkyl-(alkyle en 5 Cg à C^), IT'-pipérazinoalkyle (alkyle en C^ à C^), par exemple N-hydroxyéthyl-ÎT'-pipérazinopropyle ; un groupe N-alkyl- (alkyle en C^ à C^) IT'-pipérazinoalkyle (alkyle en Cg à C^), par exemple IT-méthyl-IT'-pipérazinopropyle ; et un groupe 2-(F-alkyl)-pipéridinylalkyle, dont le groupe îT-alkyle comprend 1 à 3 atomes 10 de carbone et l'autre groupe alkyle comprend deux ou trois atomes de carbone, par exemple 2-(N"-méthyl)-pipéridinyléthyle, au moins deux atomes de carbone se trouvant entre les hétéroatomes ; Ie41 est un atome d'hydrogène, un radical chloro, un groupe trifluorométhyle, alkylmercapto en C^ à C^ par exemple 15 méthylmercapto et acyle en C^ à C^, par exemple acétyle, et et sont des atomes d'hydrogène. Divers le dernier groupe est un groupe divers quj/6omprend une variété de médicaments ou d'autres composés chimiques utilisés 20 en médecine, en médecine vétérinaire ou pour d'autres applications. Ce groupe renferme des antibiotiques tels que la pénicilline, la chloromycétine, l'actinomycétine et des acides nucléiques ou des dérivés de ces acides tels que des nucléosides et des nucléotides. 25 II est également intéressant de mentionner la séro- tonine qui est le 3-(2'-aminoéthyl)-5-hydroxyindole. le groupe -X*-A* peut être lié à l'un ou l'autre des atomes d'azote d'aminé ou au groupe hydroxyle. Naturellement, beaucoup des composés qui sont intéres-30 sants subissent des modifications métaboliques lorsqu'ils sont introduits dans l'organisme d'un vertébré, le liquide physiologique particulier qui est soumis à l'essai peut renfermer ■une quantité faible ou nulle du composé d'origine. Par conséquent, la présence initiale du composé ne pourrait être décelée qtie sous 35 la forme d'un métabolite. Dans de nombreux cas, le métabolite peut être un glucuronide du composé initial. Dans d'autres cas, le composé initial peut avoir subi une oxydation, par exemple une 32 2121723 72 00687 hydroxylation, une réduction, une acétylation, une déamination, une amination, une méthylation ou une dégradation poussée. Lorsque le métabolite conserve une partie importante de la géométrie spatiale et polaire du composé d'origine, il est 5 fréquemment possible de baser le groupe analogue soit sur. le composé d'origine, soit sur le métabolite. Lorsque ce dernier est nettement différent du composé d'origine, le groupe analogue est basé sur le métabolite. Un grand intérêt est offert par des métabolites qui 10 sont liés à -des états pathologiques. Des exemples de ces composés comprennent la spermine, le galactose, l'acide phénylpyruvique et la porphyrine du type I, que l'on suppose être à l'origine de certaines tumeurs, à savoir, respectivement la galactosémie, la phénylcétonurie et la porphyrie congénitale. 15 Deux composés intéressants qui sont des métabolites de l'épinéphrine comprennent l'acide vanillylmandélique et l'acide homovanillique. Avec ces composés, les groupes hydroxyle ou carboxyle peuvent être utilisés comme sites pour-X*-A*. Un autre composé intéressant est le gluthéthimide, dont 20 le radical libre formant le groupe analogue répond à la formule suivante : ^a50 dans laquelle : l'un quelconque des groupes ¥ peut être un groupe -X*-A*,ou bien un atome d'hydrogène de l'un quelconque des groupes 25 ¥ peut être remplacé par un groupe -X»-A*. Le groupe X*-A* sera défini plus loin (il n'y a qu'un groupe -X*-A* par molécule); a50 oCl ¥ et ¥ sont des atomes d'hydrogène ; et a52 * ¥ est un groupe alkyle inférieur en à C^, par exemple un groupe éthyle. 00687 33 2121723 Une autre catégorie générale intéressante comprend les pesticides, par exemple des insecticides, des fongicides, des bactéricides et des nématocides. Des exemples de ces composés comprennent des phosphates tels que le malathion, les DDVP, le 5 dibrom ; des carbamates tels que le produit "Sevin", etc. Etant donné que beaucoup des substances douées d'activité biologique ne sont actives que sous une forme stéréoisomère, il y a lieu de remarquer qu'on s'adresse à la forme active ou au racémate lorsque ce dernier est satisfaisant et qu'on peut 10 se le procurer aisément. Les anticorps sont spécifiques de toute forme qu'on utilise comme groupe fixateur. Groupe radical libre (A) Le groupe radical libre est un radical libre stable, ayant de préférence un spectre assez simple de résonance des 15 spins des électrons, pouvant s'attacher de façon pratique au groupe de liaison par l'intermédiaire d'un groupe de jonction. On peut utiliser divers radicaux libres stables tels que les verdazyles, des radicaux diarylamino, des radicaux aroxyle et des radicaux nitroxyde. Voir Eorrester, "Organic Chemistry 20 of Stable Free Radicals", Academic Press, New York (1968). Dans la présente invention, les composés présentant les possibilités les plus multiples sont les composés à radical nitroxyde, dont l'azote du groupe nitroxyde est un chaînon d'un, hétérocycle. Ces composés peuvent être mono- ou bi-cycliques, 25 condensés ou non condensés, et ils ont normalement 7 à 36 atomes de carbone, notamment 7 à 16 atomes de carbone, les chaînons du cycle étant normalement au nombre de 5 à 9. Les composés peuvent comporter 0 à 2 autres chaînons hétérocycliques-, notamment 0 ou 1, consistant en oxygène, azote ou soufre. L'azote et le 30 soufre peuvent être liés à de l'oxygène, l'azote pouvant être lié à un atome d'oxygène et le soufre à 0-2 atomes d'oxygène, notamment 0 ou 2. Ces composés présentent normalement 0 ou 1 site d'insaturation endo-éthylénique. Un groupe spécial de composés à radical nitroxyde 35 comprend les nitroxydes monoaryliques et diaryliques, dans lesquels les positions ortho et para sont substituées, habituellement avec des groupes alkoxy, en vue d'inhiber la réaction entre 72 00687 34 2121723 les deux composés nitroxyde.Dans le cas du composé nitroxyde monoarylique, l'autre valence de l'atome d'azote est liée à un atome tertiaire de carbone. Les composés nitroxyde qu'on utilise dans la présente 5 invention répondent à la formule suivante : 0 1 Z H: % dans laquelle : Z et Z' sont des radicaux organiques qui sont incapables de former une double liaison avec l'azote sans modification sensible de leur structure et qui sont des radicaux aryle, normalement trialkoxyaryle, alkyle tertiaire, ou peuvent s'associer avec l'atome d'azote auquel ils sont attachés pour former un noyau monocyclique ou bicyclique à 5-9 chaînons. La plupart des composés qu'on utilise répondent à la formule suivante : 10 15 O* R\ I \ dans laquelle : R. et R1 sont des groupes hydrocarbonés en à 0.^2» notamment en à Cg, et de préférence des groupes alkyle 20 en C^ à C^ ; et I est une fonction divalente ayant 3 à 27 atomes autres que de l'hydrogène, notamment 3 à 12 atomes autres que de l'hydrogène, avec un total de 0 à 2 hétéroatomes d'oxygène, d'azote ou de soufre, qui sont des chaînons du cycle ; Y forme un noyau pentagonal ou hexagonal avec les 25 atomes de carbone et d'azote auxquels.il est attaché. L'un des atomes d'hydrogène liés au carbone, habituellement un atome cyclique de carbone, est remplacé de manière à former un site de jonction ou groupe de liaison. 72 00687 35 2121723 Y est attaché à l'atome d'azote du nitroxyde par un atome de carbone, lequel est exempt d'hydrogène ou présente un empêchement stérique en sorte qu'il ne peut pas former une double liaison avec l'azote, par exemple une double liaison endo. 5 Un groupe de composés que l'on préfère pour former le radical libre répond à la formule suivante î ©• p ^ cr dans laquelle R désignent des groupes identiques ou différents, de préférence identiques, et sont des radicaux hydrocarbonés en Ci à C^2, notamment en C1 à Cg, de préférence des radicaux 10 alkyle, parmi lesquels on préfère en particulier le radical méthyle; Y^ est un radical divalent en Cg à C^q, notamment en Cg à C^, portant 0 ou 1 hétéroatome, avec 2 ou 3 atomes cycliques, habituellement de carbone ; Y^ peut présenter 0 ou 1 site d'insaturation éthylénique et forme, de préférence, 15 un noyau de pyrroline, pyrrolidine ou pipéridine. Les hétéro-atomes sont normalement des atomes d'azote, d'oxygène et de soufre. Un sous-genre du nitroxyde monocyclique est le noyau pentagonal qui porte un hétéroatome cyclique et qui ré-20 pond à la formule suivante : O* I 0-1 site d'insaturation éthylénique 72 00687 36 2121723 2-5 dans laquelle R ont les définitions données ci-dessus. Un autre sous-genre comprend les composés à noyau hexagonal qui répondent à la formule suivante : 0-1 site d1insaturation éthylénique 2—5 5 dans laquelle les groupes R ont les définitions données ci- 2 dessus et Z est un atome de carbone ou d'azote. Les noyaux pentagonaux portant deux hétéroatomes cycliques répondent pour la plupart à la formule suivante : r2 o" 3 1 I c n dans laquelle est un groupe 10 -(R4) (R5)C-1m+=C-R6- I o- -(R6)fc7)C-0-C(R4)(R5)- ou -(R4) (R5)C-1T=C-R6-C0EB-C(R4) (R5)- 2-5 les groupes R ayant les définitions données ci-dessus et les 15 groupes R et R pouvant être identiques aux groupes R ou représenter de l'hydrogène. Un groupe préféré de composés contenant un radical nitroxyde libre répond à la formule suivante : 72 00687 37 2121723 dans laquelle £ est égal à O ou à 1, de préférence à 1 ; lorsque £ est égal à 1, l'atome d'azote auquel l'oxygène est attaché 2—5 est positif, les groupes R ont les définitions données ci-dessus et R^ répond à la définition donnée ci-dessus. 5 Des exemples de noyaux comprennent les noyaux de 1-oxylpipéridine, 1-oxylpyrrolidine, 1-oxylpyrroline, 1-oxyl-imidazolidine, 1-oxyl-3-oxyimidazolidine, 1-oxylt étrahydropyri-dine et 3-oxyloxazolidine. les nitroxydes à tête de pont répondent, pour la 10 plupart,à la formule suivante : dans laquelle Y^ et Y4 sont des radicaux hydrocarbonés alipha-tiques divalents présentant 0 ou 1 site d'insaturation éthylénique et comportant 2 ou 3 atonies de carbone. le dernier nitroxyde que l'on doive considérer en 15 particulier est le nitroxyde arylique qui répond à la formule suivante : 0. 3 dans laquelle S est un 2,4,6-trialkoxybenzène, les groupes alkoxy 72 00687 38 2121723 4 „ 3 ayant 1 à 3 atomes de carbone, et Z est identique à Z ou représente un groupe alkyle tertiaire en à C^, notamment en C. à C,. 4 6 . les verdazyles répondent, pour la plupart, à la 5 formule suivante ï / 5 /x dans laquelle Z^ est un radical hydrocarboné ou acyloxy en C, à g » Cg et Z est un groupe aryle ou aryle substitué, par exemple par un groupe hydroxy ou amino, en Cg à C^. Comme on l'a déjà indiqué, le groupe radical libre 10 est attaché au groupe de liaison par l'intermédiaire d'un groupe de jonction qui est substitué sur le groupe radical libre, paiijfcemplacement de l'un des atomes d'hydrogène. En outre, on peut obtenir des spectres plus nets en remplaçant des atomes d'hydrogène par des atomes de deutérium. Par conséquent, il 15 y a lieu de remarquer que lorsqu'on fait allusion à de l'hydrogène en ce qui concerne le groupe radical libre, le deutérium peut être considéré comme un équivalent. Dans la mise en oeuvre de la présente invention, notamment lorsque le groupe de liaison n'a pas de récepteur 20 naturel ou si l'on considère qu'il est plus pratique de préparer des anticorps, le groupe de liaison est modifié par le fait qu'on prévoit un groupe qui peut être lié à une protéine. Par conséquen;, une certaine^onctionnalité réactive est introduite dans le groupe de liaison, soit par activation d'une fonction déjà présente, 25 par exemple par transformation d'un acide carboxylique en un anhydride mixte, soit par introduction d'une fonction nouvelle, par exemple par modification d'un groupe hydroxy avec un groupe carboxyméthyle. Etant donné que les anticorps qui sont formés caractérisent le groupe de liaison attaché à son groupe 30 de jonction, qui a été utilisé dans la préparation de l'antigène, 72 00687 39 2121723 on utilise normalement, pour la liaison du groupe radical libre, le même groupe de liaison, solidaire de son groupe de jonction, que celui qui a été utilisé pour préparer l'antigène. Par conséquent, le plus souvent, les substituants portés par le groupe 5 radical libre sont des substituants relativement simples tels qu'amino, hydroxy et carboxy. Des exemples de composés qu'on utilise pour la jonction du groupe de liaison comprennent la 1-oxyl-3-amino- 2,2,5,5-tétraméthylpyrrolidine, la 1-oxyl-3-hydroxy-2,2,5,5- 10 tétraméthylpyrrolidine, la 1-oxyl-3-carboxy-2,2,5,5-tétraméthyl- pyrrolidine, la 1-oxyl-3-carboxy-2,2,5,5-tétraméthylpyr-roline, la 1-oxyl-4-amino-2,2,6,6-tétraméthylpipéridine, la 1-oxyl-4-hydroxy-2,2,6,6-tétraméthylpipéridine, la 1-oxyl- 4-carboxy-2,2,6,6-tétraméthyltétrahydropyridine, la 2-méthylamino- 15 1,3-dioxy-4,4,5,5-tétraméthylimidazoline, la 2-hydroxyméthyl~1,3- dioxy-4,4,5,5-tétraméthylimidazoline et le 1-amino~7-oxyl-7- azabicycloheptane. Dans de nombreux cas, il peut être avantageux qu'un groupe réactif soit porté par le groupe radical libre et l'attache 20 au groupe de liaison. Chaque fois que cela est possible, ce groupe doit établir le même type de pont fonctionnel et, le cas échéant, le même pont fonctionnel de jonction au groupe de liaison. En fait, il pourrait simplement s'agir du caa inverse, le composé final étant le même que si le groupe de jonction avait 25 été, au contraire, porté par le groupe de liaison. Par exemple, s'il y a un groupe amino sur le groupe de liaison, il est possible de modifier ce dernier de manière à former un isocyanate. De même, s'il y a un groupe amino sur le radical libre, il est également possible de modifier ce groupe amino pour former un 30 isocyanate. Le pont est du type uréylène, quel que soit le procédé que l'on utilise. Les exemples de composés qui peuvent être utilisés pour la jonction de la fonction au radical libre au groupe de liaison comprennent les suivants : 35 1-oxy 1-2,2,5,5-tétraméthyl-3-isocyanatopyrroli ne, 1 -oxyl-2,2,5,5-tétraéthyl-3-isothiocyanatopyrrolidine, acide ÎT-(1-oxyl-2,6-diméthyl-2,6-dibenzyl-pipéridin-4-yl)-succinamique, acide N-(1-oxyl-2,2,5,5-tétraéthylpipéridin-4-yl)-maléamique, acide 72 00687 40 2121723 N-(1-oxyl-2,2,5,5-tétrabutylpyrrolidin-3-yl)-oxalamique, fumarate de mono-(1-oxyl-2,2,5,5-tétraméthylpipérid-4-yle), N-(1-oxyl-2,2,5,5-tétraméthylpipérid-4-yl)-glycine, aoide 1-oxyl-2,2,5,5-tétraméthylpyrrolid-3-ylsulfonylacétique, 5 1 -oxyl-2,2,5,5-t étraméthyl-3-hydroxypyrrolidine, acide 1-oxyl-2,2,5,5-tétraméthylpyrrolin-3-ylcarboxylique, acide N-(l-oxyl-2,2,5,5-1 étraméthyIpyrrolidin-5-y 1 ) -1 é r é pht ail ami que, malonate de 1-oxyl-2,2,5,5-pyrrolidin-3-yle, acide 1-(oxylpyrrolidin-3-yl-3,5-dispiro-(1'-cyclopentane)-carboxylique, 4,4,5,5-10 t étraméthyl-1,2,3-tri oxyimi daz oline, 4,4,5,5-tétrapropyl-2-bromométhyl-1-oxyl-3-oxyde-imidazoline, 4,4,5,5-tétrabenzyl-2-(£-aminophényl)-1-oxyl-3-oxyde-imidazoline, 4,4,5,5-tétraméthyl- 2-chlorosulfonylméthyl-1-oxyl-3-oxyde-imidazoline, 4,4,5,5-tétraméthyl-2-carboxyméthyl-1-oxy1-3-oxyde-imidazoline, 4,5- 15 diméthyl-4,5-(butylène-1,4)-2-isocyanatométhyl-1-oxyl-imidazoline, 4,4,5,5-tétraméthyl-2-carboxycarbonyl-1-oxyl-3-oxyde-imida-zoline et 2-chlorocarbonyl-1-oxyl-3-oxyde-imidazoline-4,5-dispiro(1'-cyclohexane). G-roupes de .jonction 20 le groupe -X*- varie en fonction des sites disponibles . pour la fixation sur A*. La plupart des groupes disponibles sur le groupe de liaison sont des groupes hydroxyle (-0H), amino H8 / g (-ÎT-H, R étant habituellement un atome d'hydrogène ou un 25 groupe alkyle en à. Cg) ; mercapto (-SH) ; oxo (-0=0) ; carboxy (-CO^H) ; et méthine (ECH), l'atome d'hydrogène étant habituellement lié à un atome aromatique de carbone et le noyau étant de préférence activé par des substituants oxy ou amino. La principale fonction du groupe de jonction est 30 d'attacher le radical libre au groupe de liaison, à une distance mutuelle relativement faible. Toutefois, le groupe de jonction peut aussi être utilisé pour assumer d'autres fonctions, par exemple pour modifier les propriétés de solubilité du produit final. En particulier, lorsqu'on utilise des groupes hydrophobes rela-35 tivement grands, comme dans le cas des stéroïdes, on peut introduire un groupe capable de former un sel dans le groupe de jonction. Les exemples de ces groupes comprennent des carboxylates des 72 00687 41 2121723 sulfonates, des sulfates et des sels d'ammonium quaternaire. L'ion antagoniste peut être tout ion convenable de ce type, de préférence monovalent, par exemple chlorure, fluorure, sel de métal alcalin, ammonium, etc. 5 Le groupe de jonction comprend habituellement O à 8 atomes de carbone, plus souvent O à 6 atomes de carbone et 1 à 8 hétéroatomes, notamment 1 à 6 hétéroatomesjqui sont des atomes d'oxygène, de soufre et d'azote, principalement d'oxygène et d'azote. Tout ion antagoniste à un groupe de formation d'un sel ne doit 10 pas être compté dans le nombre des hétéroatomes. Les groupes préférés sont les groupes non-oxocarbonyle ou thiocarbonyle, alkylamino ou alkoxy, en tant que fonctions de jonction. de préférence de 1 à 10 atomes, habituellement de deux à six 15 atomes, ou une longueur équivalente, lorsqu'il s'agit de structures cycliques. La longueur de chaîne des groupes de jonction est Le tableau suivant indique les divers groupes de jonction, qui varient avec les fonctions présentes sur le groupe de liaison et le radical libre. 20 Groupe de liaison [hydroxyle (-0-) ; amino -N(R^) ] Radical libre [hydroxyle (-0-) ; amino -N(R9)] 0 II -c- 25 S il -c- 30 0 II -z-c- -so -z-so 2 2 35 0 ii -C-Z-S02 -S02-Z-C 72 00687 42 2121723 -z-so; 15 20 25 -so2-z =Z«- -z- s II -ZG S II -c-z q 10 R""- atome d'hydrogène ou groupe hydrocarboné en à Cg ; Z'- groupe âlkylidényle ; Z - représente une liaison, un groupe hydrocarboné en à C.^, notamment un groupe alkylène en à Cg, alcénylène en Cg à Cg, alcynylène en Cg à Cg, cycloalkylène en C^ à C^, arylène en C6 à °10' oxalkylene en C. à C0 et azalkylène en C, à C.. 4 - o 4 o Lorsque la fonction de jonction est un groupe hydroxyle, on préfère une liaison Z ou non oxocarbonylique au groupe hydroxy, notamment Z. Lorsque la fonction de jonction est une fonction amino, on préfère un groupe non-oxocarbonyle, non-oxothiocarbonyle ou Z, notamment un groupe non-oxocarbonyle. Groupe de liaison [oxocarbonyle (C=0)] Radical libre [hydroxy(-O-) ; amino -F(R^)-] =lT-0-Z =ÏT-0-Z-C0 =n-0gczc0- =CHCH- =mh-z-c0- =MH-Z-CS- Groupe de liaison Radical libre 30 [non-oxocarbonyle (—G—)] [hydroxy(-0-) ; amino -N(R9)-] 0-Z-C0--IT(R7)-Z-C0--1Î(R7)-Z--0-Z- 35 Groupe de liaison Radical libre [méthine(=CH)] [hydroxy(-O-) ; amino -N(R^)-] -Ng-S -N2_Z"-C0- 72 00687 43 2121723 n Z et R ayant les définitions données ci-dessus et Z" étant un groupe arylène en Cg à C^ Lorsque le groupe radical libre porte une fonction carboxy non-oxocarbonyle, les groupes sont alors 5 0 0 I' Il y des groupes -c-0- ou -c-f(r )- dans lesquels l'oxygène et l'azote sont liés à l'un quelconque des groupes de jonction indiqués ci-dessus et Z ou Z" est attaché à l'oxygène ou à l'azote. 10 Lorsque le radical libre porte un groupe oxocarbonyle et que le groupe de liaison est un groupe hydroxy ou amino, il suffit d'inverser la situation, en sorte que le groupe de jonction du radical oxocarbonyle est porté par le groupe de liaison et que le groupe hydroxy ou amino est porté par le 15 radical libre. Le tableau suivant indique les groupes de jonction lorsque le radical oxocarbonyle est présent dans le radical libre et que le groupe de liaison porte autre chose qu'un groupe hydroxy ou amino. 20 Groupe de liaison Radical libre [oxocarbonyle (C=0)] [oxocarbonyle (C=0)] =K-0-Z-0-l!= =it-o2c-z-co2ît= =h-o-z-co2ît= 25 -ÏÏÏÏH-Z-HHH= [nonoxocarbonyle (C=0)] [oxocarbonyle (C=0)] -0-Z-0-K= -F(R7)-Z-0-Î!= -0-îT= 30 -0-Z-HM= -IT(R7)-ZEÏÏiT= 72 00687 44 2121723 Groupe de liaison. [méthine ( =CH-)] Radical libre [oxocarbonyle(C=0)] 5 -N -Z»-0-N= -3st2-z * -îthit= -ït2-zco2n= -n2-zg0mî= lorsque le groupe de liaison porte un radical mercapto, lâ fonction maléimide est particulièrement intéressante, 10 l'atome d'azote d'imide étant attaché, soit directement au radical libre, soit par l'intermédiaire des fonctions indiquées ci-dessus, par exemple carboxyméthyle. libres puissent être attachées dans toute position convenable 15 au groupe de liaison, soit par l'intermédiaire d'une fonction naturellement présente dans le groupe de liaison, soit par une fonction introduite par voie de synthèse, on préfère les procédés de jonction de la fonction du radical libre au groupe de liaison. Tout d'abord, il y a lieu de remarquer que le groupe de liaison 20 substitué par un radical libre n'est pas nécessairement doué d'activité biologique. Il s'agit simplement de ne pas altérer la géométrie et les sites polaires d'une partie importante de la molécule. Par conséquent, pour la commodité de la synthèse, la fonction du radical libre est normalement introduite à une 25 extrémité de la molécule. diverses molécules qui sont très semblables, par exemple des stéroïdes, mais qui diffèrent parleurs substituants en position 17, on doit choisir de marquer la molécule avec la fonction 30 du radical libre à un site distant de la fonction, ce qui permet de faire la distinction entre le composé à détecter et des composés analogues qui peuvent aussi être présents dans la composition que l'on soumet au titrage. Par exemple, lorsqu'on titre des stéroïdes, il est souvent préférable d'effec-35 tuer la liaison en position 3 plutôt qu'en position 17, parce que la portion caractéristique de la molécule se trouve normalement Bien que la plupart des fonctions des radicaux En outre, si l'on tente de détecter l'une de 72 00687 45 2121723 en position 17, la position 3 restant le plus souvent la même ou se distinguant par le fait qu'elle est Tin alcool ou une cétone. Dans le cas d'un polypeptide de faible poids moléculaire, il serait également préférable d'attacher le 5 groupe radical libre à un amino-acide qui n'est pas directement impliqué dans le site récepteur, et non avec un amino-acide qui est impliqué dans ce site. Par conséquent, une règle importante à observer est qu'on ne doit pas modifier la zone caractéristique de la molécule par liaison de la fonction du radical libre à 10 cette zone, 'en créant ainsi une géométrie qui définit la fonction du radical libre et non celle de la molécule. De même, il peut arriver qu'on obtienne une meilleure liaison avec un récepteur en attachant la fonction du radical libre à un site plutôt qu'à un autre. Ceci peut être 15 aisémenijliéterminé par la préparation de plusieurs composés de liaison modifiés par un radical libre et la détermination de leur concentration en équilibre avec le récepteur. Ceci est vrai, en particulier lorsque le groupe de liaison est un groupe fixateur. le site du groupe de liaison et, habituellement, le 20 groupe de jonction sont presque invariablement les mêmes pour la fixation du groupe de liaison à la protéine et la fixation du groupe de liaison au radical libre. Ainsi, la partie de la molécule du groupe de liaison qui part de la protéine et qui est la portion de la molécule la plus susceptible de former un 25 modèle pour les anticorps, est la portion même de la molécule qui reste non modifiée par le groupe de jonction attaché au radical libre. Une excellente description de groupes de jonction pour des stéroïdes, en vue de la conjugaison avec des protéines, 30 est donnée par Peron et Collaborateurs dans "Immunologie I-Iethods in Steroid Détermination", Appleton-Century-Crofts, ïïev York, 1970. Récepteur Dans la présente invention, la plupart des 35 récepteurs sont des macromolécules présentant des sites qui caractérisent des structures spécifiques. la caractérisation des structures spécifiques est basée sur les forces de Van der Waals, qui sont développées au maximum par un environnement 72 00687 46 2121723 spatial spécifique ; des interactiong&ipolaires, par des dipôles, soit permanents, soit engendrés ; une liaison hydrogène et ionique une liaison de covalence par coordination ; et, dans quelques cas, une liaison de covalence. Des détails des mécanismes 5 par lesquels- les récepteurs fixent des groupes de liaison sont donnés par G-oldstein et Collaborateurs dans "Principles of Drug Action", Harper and Rowe, New York, 1968. les macromolécules du plus grand intérêt sont des protéines et des acides nucléiques que l'on rencontre dans 10 les cellules, le sang et- d'autres liquides biologiques. Ces composés comprennent des enzymes, des anticorps, l'acide ribonucléique et l'acide désoxyribonucléique, des protéines de transport telles que la transcortine, la thyréoglobuline, la préalbumine de liaison de la thyroïde et les récepteurs 15 "liés" (c'est-à-dire des récepteurs liés à des membranes cellulaire^. le groupe de protéines qu'il convient le mieux d'utiliser dans la présente invention comprend les anticorps. Ces matières sont avantageusement utilisées dans l'analyse 20 de la catégorie de groupes de liaison appelés groupes fixateurs. Des anticorps sont produits par introduction d'une substance immunogénique dans le courant sanguin d'un animal vivant. La réponse à l'introduction de la substance immunogénique ou antigène consiste en la production d'anticorps qui "enrobent" l'antigène 25 et suppriment sa toxicité ou le précipitent&ans la solution. . Les anticorps forment une enveloppe de disposition géométrique telle qu'elle s'adapte à la disposition spatiale de l'antigène. Ceci peut être comparé à une serrure et une clef. L'interaction est normalement réversible, en ce que l'antigène est susceptible 30 d'un déplacement ou d'une élimination par divers moyens, sans destruction du site récepteur. Il existe de nombreuses substances qui sont des antigènes et qui produisent une réponse immunogénique par introduction dans le courant sanguin d'un mammifère.Toutefois, 35 plusieurs substances intéressantes ne sont pas des antigènes, mais de^iaptènes et, dans ce cas, une étape supplémentaire est requise dans la préparation de l'anticorps. Ce procédé de préparation d'anticorps avec des substances autres que des anti 72 00687 47 2121723 gènes est bien connu , et il a été décrit dans "I-licrobiology", Hoeber I-Iedical Division, Harper et Rowe, 1969* Voir également landsteiner, "Specificity of Serological Reactions", Dover Publications, îl. Y. 1962 ; Kabat et Collaborateurs, "Expérimental 5 Immunochemistry", Charles C. Thomas, Springfield, Illinois, 1967 ; et Williams et Collaborateurs, "I-Iethods in Immunology and Inmunochemi stry, volume I, Academic Press, îlew York 1967. la substance qui doit être titrée est liée à line protéine par tout moyen classique et la protéine modifiée 10 est introduite dans le courant sanguin. On peut utiliser le même type de groupes de jonction que ceux qu'on utilise pour fixer le radical libre au groupe de liaison. Les anticorps qui se forment comprennent des groupes d'anticorps de configuration telle qu'ils s'adaptent à la portion étrangère (haptène)liée à 15 la protéine. Par conséquent, on obtient des anticorps qui sont spécifiques du composé ou de l'haptène lié à la protéine. Par de g/technique s de séparation minutieuse, les anticorps principalement concernés avec l'haptène en question peuvent être concentrés de manière à donner une composition d'anticorps 20 qui se rattache principalement à l'haptène spécifique lié à la protéine. Pour illustrer ce procédé, on diazote l'arsonate de para-aminobenzène pour former le sel diazoïque. Par combinaison du sel diazoïque avec de la globuline de lapin, on marque cette 25 dernière avec l'arsonate de para-azobenzène. Par l'introduction de cette composition dans le courant sanguin de l'animal autre qu'un lapin, par exemple tin mouton, il peut se former des anticorps dont la disposition spatiale caractérise l'arsonate d'azobenzène. 30 En plus des anticorps, il existe de nombreux autres récepteurs naturels spécifiques des composés d'intérêt biologique. Des composés pour lesquels des récepteurs se présentent naturellement, comprennent la thyroxine, la corticostérone, la cortisone, le 11-désoxycortisol, la 11-hydro xs^progestérone, 35 l'oestrogène, l'insuline et l'angiotensine. Voir, par exemple Vonderhaar et Collaborateurs, ^"Biochem. Biophysics Acta", 176. 626 (1969). Tous ces groupes de liaison ont été étudiés et décrits dans la littérature en relation avec des études portant 72 00687 48 2121723 sur leur liaison avec des récepteurs spécifiques. le cas échéant, les anticorps peuvent être fixés à divers supports. La fixation peut être effectuée de la même manière que la fixation de la protéine à un groupe de liaison. 5 Divers supports comprennent des polyacrylamides, des copolymères d'acétate vinylique et d'acide acrylique, des esters polyvinyliques, la cellulose modifiée, l'agarose, la sépharose, etc. l'intérêt du support e3t que l'anticorps peut ainsi être aisément séparé de la solution et que la solution limpide peut être analysée. 10 Par conséquent, le spectre qui résulte de tout radical absorbé sur l'anticorps n'apparaît pas dans le titrage. Un exemple de support est le para-aminobenzamidoéthyl-"bio-G-el" P-60 vendu par la firme Bio-Rad Laboratories de Richmond, Californie. En vue de démontrer le large spectre de composés, 15 que l'on peut détecter au moyen de la présente invention, on a utilisé plusieurs haptènes différents, de structure nettement distincte et de nature polaire, et on les a fixés de diverses façons à différents composés à radicaux renfermant la fonction nitroxyde. Ces composés ne sont pas des antigènes et ils sont 20 donc liés à des protéines que l'on utilise ensuite pour la formation d'anticorps. On a illustré l'utilisation des anticorps avec et sans supports. L'invention est illustrée par les exemples suivants, donnés à titre non limitatif. Toutes les températures y sont exprimées 25 en degrés centigrades. Exemple 1 Synthèse du 3-[2'-(2",4"-dinitranilino)acétamido]-2,2,5,5-tétraméthylpyrrolidinyl-1-oxyle. On dissout, en agitant, 250 mg de glycylamido-2,2,5,5-30 tétraméthylpyrrolidiny1-1-oxyle dans 2 ml de raéthanol. On ajoute 0,5 g de bicarbonate de potassium, puis 0,5 ml de 2,4-dinitrofluorobensène. le dégagement de gaz s'arrête au bout d'une heure, et la solution est alors diluée avec 10 ml d'eau, puis extraite avec 5 portions de 15 ml de chloroforme. 35 les phases organiques rassemblées sont déshydratées sur du sulfate anhydre de magnésium, filtrées et évaporées. Le résidu huileux est chromatographié sur du gel de silice avec 500 ml de 72 00687 49 2121723 chloroforme, puis 250 ml d'un mélange de chloroforme et d'acétone à 1 : t. Par évaporaiion de la solution et recristallisâtion du résidu par addition de benzène, on obtient 370 mg (86 fo) de substance fondant à 125-127°C en se décomposant (après recristalli-5 sation dans 5 ml d'acétate éthylique). Analyse î C $ H Calculé pour C^Hggl^Og : 50,52 5,82 18,41 Trouvé : 50,45 5,89 18,17 Poids moléculaire : 380,396 10 Spectre de résonance des spins des électrons (SEE) a^ = 14,1 gauss (benzène). Exemple 2 3-[3'-(2",4"-dinitrophénylamino)propyl]carbamoyl-2,2,5,5-tétra-méthylpyrrolidinyl-1-oxyle. 15 On dissout, en agitant, 250 ml de 3-[3'-propylamino]- carbamoyl-2,2,5,5-tétraméthylpyrrolidinyl-1-oxyle dans 2 ml de méthanol et on ajoute 0,5 g de bicarbonate de potassium et 0,5 ml de 2,4-dinitrofluor.obenzène. Au bout de deux heures, on transfert le mélange dans une ampoule à décanter. On le dilue avec 15 ml 20 d'eau et on l'extrait avec 3 portions de 15 ml de chloroforme. Les phases organiques rassemblées sont déshydratées sur du sulfate anhydre de magnésium, filtrées et évaporées. Le résidu de couleur brune est chromatographié sur gel de silice avec de l'acétate éthylique. Par évaporation du solvant, on obtient une 25 huile qui cristallise par addition d'un mélange d'acétate éthylique et de tétrachlorure de carbone en donnant des cristaux jaunes ( 280 mg) fondant à 150-151,5°C. Analyse : C /o H $ IT /» Calculé pour C^gH^gîT^Og : 52,92 6,42 17,15 30 Trouvé : 52,60 6,40 16,95 Poids moléculaire : 408,4. Exemple 3 4-(2',4'-dinitranilino)-2,2,6,6-tétraméthylpipéridino-1-oxyle. On dissout, en agitant, 50 mg de 4-amino-2,2,6,6- 35 tétraméthylpipéridino-1-oxyle dans 2,ml de méthanol et on ajoute 0,5 mg de bicarbonate de potassium et 0,5 ml de 2,4-dinitrofluoro-benzène. Un précipité apparaît et, au bout de 12 minutes, on dilue 72 00687 50 2121723 le mélange réactionnel avec 15 ml d'eau, et on l'extrait avec trois portions de 15 ml de chloroforme. les extraits organiques rassemblés sont déshydratés sur du sulfate anhydre de magnésium, filtrés et évaporés. La chromatographie sur gel de silice 5 avec du chloroforme donne deux bandes jaunes. Le composant de couleur jaune-orangé qui se déplace le plus lentement est recueilli, et le résidu obtenu par évaporation du solvant est recristallisé danqéLu chloroforme en donnant des cristaux de couleur orangée, fondant à 178-179°C ; après resolidification, ils 10 fondent à 189-190°C. Analyse : C i° H $ B" % Calculé pour C^Hg^N^O^ : 53,40 6,28 1 6,61 Trouvé : 53,29 6,18 16,38 Poids moléculaire : 337,3. 15 Eàcemple 4 311 0 3-[2 *-(0 -morphino) ac ét amido]-2,2,5,5-té traméthylpyrrolidine-1- oxyle. On chauffe au reflux sous atmopshère d'azote 139 mg de 3-bromacétamido-2,2,5,5-tétraméthylpyrrolidin-1-oxyle 20 et 153 mg de morphine dans 4 ml d'éthanol, avec 22 mg d'hydroxy de de sodium pendant deux heures. On dilue le mélange réactionnel avec de l'eau et on ajoute 2 ml d'hydroxyde de potassium 2 M. Après extraction au chloroforme et réextraction des extraits avec de l'eau, on déshydrate la solution chloroformique avec du 25 sulfate de magnésium et on l'évaporé pour obtenir un résidu jaune vitreux fondant à 75-81°C. Des essais de recristallisation se traduisent par un échec, La chromatographie sur gel de silice avec vin mélange de chloroforme et de méthanol à 9 s 1 donne une fraction principale qui est le radical nitroxyde. Le radical 30 est isolé par extraction au méthanol du gel de silice, rechroma-tographié et isolé comme précédemment. Par évaporation du méthanol, redissolution dans le chloroforme et centrifugation, on élimine le gel de silice qui se dissout dans le méthanol. Par évaporation, on obtient 113 mg d'une substance vitreuse jaune. 35 Spectre RSE : a^ = 14,58 gauss (CECI,). 72 00687 51 2121723 Exemple 5 X II 4-[21-(O -morphino)acétamido]-2,2,6,6-tétraméthylpipéridino-1-oxyle. On dissout, sous atmosphère d'azote, 153 mg de morphine 5 dans 4 ml d'éthanol absolu et on ajoute, en agitant, 146 mg de 4-bromacétamido-2,2,6,6-tétraméthylpipéridino-1-oxyle. Après agitation de la solution pendant deux heures au reflux, on la maintient pendant environ 16 heures à la température ambiante. On dilue la solution avec de l'eau et on l'extrait au 10 chloroforme (deux fois 30 ml). les phases organiques rassemblées sont ré-extraites avec 50 ml d'eau (3 gouttes de K0H 1M) puis déshydratées sur du sulfate anhydre de magnésium. Après filtrat ion puis évaporation du solvant, i]^?este une huile de couleur brune dont la chromâtographie en couche mince montre qu'il 15 s'agit d'un seul composant principal, le produit ne peut pas être cristallisé. Exemple 6 3-(0 -morphinométhyl)-2,2,5,5-t étramethylpyrrolin-1-oxyle, A. On ajoute 71,3 mg (0,60 mmole) de chlorure de 20 thionyle à une solution sous agitation de 100 mg (0,58 mmole) de 3~hydroxyméthyl-2,2,5,5-tétraméthylpyrrolin-1-oxyle et de 11,49 mg (0,62 mmole) de tri-n-butylamine dans 15 ml d'éther absolu. On agite le mélange réactionnel à la température ambiante pendant deux heures puis on l'évaporé. L'huile résultante est 25 purifiée par chromâtographie en couche mince sur des plaques de gel de silice, avec du chloroforme, le liquide jaune obtenu est utilisé directement dans la réaction suivante. B. On dissout de l'hydrure de sodium dans de l'éthanol absolu et on procède au titrage avec de l'acide chlorhydrique 30 normal, jusqu'au point de virage à la phtaléine du phénol. On dissout 30,2 mg (0,10 mmole) de morphine dans de l'éthanol contenant 0,10 mmole d'hydrure de sodium et on agite la solution sous atmosphère d'azote, en lui ajoutant 18,8 mg (0,1 mmole) du composé indiqué ci-dessus, dissous dans 35 1 ml d'éthanol absolu, puis on chauffe la solution au reflux pendant deux heures. Le mélange réactionnel est ensuite versé 72 00687 52 2121723 par décantation et évaporé. L'huile résultante est purifiée par chromâtographie en couche mince, en utilisant des plaques de gel de silice avec un mélange de chloroforme et de méthanol à 9î1 comme éluant. Le produit est une substance vitreuse jaune 5 pesant 15 mg. Exemple 7 __ ^ O -carboxyméthylmorphine. On fait sécher 909 mg de morphine pendant 4 heures à 50°C .jq sous Tin vide de 0,01 mm de mercure. On dissout la morphine séchée dans 18 ml d'éthanol absolu et on ajoute 350 mg de chloracétate de sodium anhydre puis 125 mg d'hydroxyde de sodium. Après purge avec de l'azote, on agite la solution et on la chauffe au reflux pendant quatre heures. La solution chaude est traitée avec 3,8 ml de solution éthanolique de gaz chlorhydrique (0,85 H) puis 15 filtrée pendant qu'elle est encore chaude. Par refroidissement pendant environ 16 heures, il se forme un précipité (272 mg) qu'on recueille et qu'on recristallise dans un mélange d'éthanol et d'eau.Par addition d'éther au filtrat initial, on obtient un précipité supplémentaire qu'on recristallise également dans un 20 mélange d'éthanol et d'eau. Le rendement total est de 600 mg (55 f°). Par chauffage de ce produit à 75°C sous vidé, on constate une perte de poids correspondant à 0,48 molécule d'éthanol ou 1,15 molécule d'eau. Le composé sec se décompose à 190-220°C 25 (en fonction de la vitesse de chauffage). Analyse : C fo H fo N Calculé pour C.nHo.N0,- : 66,45 6,16 4.08 ly o Trouvé : 65,87 6,98 4,09, 4,07 Spectre de résonance magnétique des noyaux (C^D^iT) 2,44 ppm 30 (-CHj ), 5,08 ppm (-CHg-COO). Exemple 8 Conjugaison de la carboxyméthylmorphine avec la poly-L-lysine (PLL). On met en suspension 50 mg de bromhydrate de poly-L-lysine 35 (lot ÎT° LY 115A de la firme L'iles) (1,14 x 10° moles) dans 1 ml de diméthylformamide anhydre et on ajoute 0,241 ml d'hydroxyde 72 00687 53 2121723 de sodium 1N. La suspension se dissout à peu près complètement (résidu pesant 5 mg). Dans un ballon séparé, on dissout 12,4 mg (0,033 mH) de carboxyméthylmorphine dans 1 ml de diméthylformamide (une 5 quantité plus faible de diméthylformamide ne dissout pas l'acide) et on refroidit la solution à -15°C. On ajoute à cette solution 3,28 g (0,033 mmole) de chloroformiate d'éthyle. On agite la solution à -15°C pendant 20 minutes, après quoi on ajoute la solution de poly-L-lysine_,puis 2 ml de diméthylformamide utilisés 10 pour laver le ballon qui contenait la poly-l-lysine. Un précipité se forme. On agite le mélange réactionnel pendant environ 16 heures à 0°C, on le dilue avec de l'eau et on le dialyse vis-à-vis d'eau distillée (que l'on remplace six fois). Par lyophilisation, on obtient 19 mg de résidu. 72 00687 54 2121723 Détermination du degré de conjugaison On mesure le spectre ultraviolet à 280 nm dans une cellule de 1 cm ; d est égal à 0,25 lorsque la concentration est de 5 °'287 B/1 daM 1,eM- £ carboxyméthylmorphine = 1070 ! e M " °" Le degré de conjugaison peut être déterminé d'après ce résultat au moyen de la formule : à _ ( carboxyméthylmorphine + PLL)¥ XPi,1CMM + PIaELL 10 dans laquelle X est le nombre d'haptènes par molécule, ¥ est le poids de conjugué protéinique par litre et PM est le poids moléculaire, CMM désignant l'haptène et PLL étant la protéine. Etant donné que le poids moléculaire de la protéine est égal à 27 000, X = 30 haptènes/molécule. 15 EXEMPLE 9 - Conjugaison de là carboxyméthylmorphine à l'albumine du sérum de boeuf (BSA) On met en suspension 240 mg de carboxyméthylmorphine dans 8 ml de diméthylformamide anhydre et on refroidit la suspension à -15°C, puis on la traite avec 84 pi de chlorofcrmiate isobutylique. 20 On dissout la substance solide en agitant pendant 30 minutes à -15°C. On ajoute à cette solution une solution de 400 mg de BSA dans 56 ml d'eau contenant 2,6 g de bicarbonate de sodium et on maintient le mélange à 0°C pendant environ 16 heures. On le dialyse ensuite vis-à-vis d'eau distillée en changeant l'eau 25 4 fois (dialyse 1:80) et on lyophilise le produit pour obtenir 350 mg de conjugué. Concentration en haptènes sur la protéine : d = 0'59 e BSA = 41 600 = 30 PMcmi =■ 327 PMbsa = 64 400 EXEMPLE 10 - Liaison d'anticorps à un support A. On met en suspension 50 mg de Para-aminobenzamidoéthyl— 'Bio-Gel" P-60 dans 10 ml d'eau et on acidifie la suspension à un pH égal à 4,5, avec de l'acide chlorhydrique 1N. On refroidit 35 la suspension à 4°C et on ajoute en 10 minutes 6 mg de nitrite de sodium dissous dans 2 ml d'eau. On mélange une portion de —5 1 ml de solution à 10 K d'anticorps purifiés de morphine, avec 72 00687 55 2121723 la substance indiquée ci-dessus'à un pH égal à S, tout en maintenant la température. Au bout de 40 minutes, on ajoute 20 mg de résorcinol pour éliminer le composé de diazonium restant. On filtre ensuite la substance solide et on la lave avec un tampon 5 de borate à un pH égal à 8. B. On met en suspension 50 mg des anticorps de morphine fixés sur un support comme indiqué ci-dessus dans 10 ml de solution tampon au borate à un pH égal à 8, contenant 10 de ■7 () 4-[21-(0 -morphino)acétamido]-2,2,6,6-tétramé thylpipéridino-10 1-oxyle et on agite pendant 2 heures. Par filtration et lavage à l'eau, on obtient 50 mg d'une substance solide qui montre de larges signaux de résonance des spins des électrons, indiquant la fixation au récepteur de la morphine marquée avec un radical libre. 15 EXEMPLE 11 - Isolement des anticorps On introduit dans 20 ml de diméthylformamide, 400 mg de aminoéthyl-"Bio-Gel" P-60 et 300 mg de carboxyméthylmorphine (Voir exemple 7) et on ajoute 1 g de bicarbonate de sodium. Après agitation de la suspension pendant 2 jours à 4°C, on la 20 filtre, on lave le résidu avec de l'eau jusqu'à ce que les eaux de lavage soient neutres, puis on sèche le résidu sous vide. Le produit résultant est ensuite mis en suspension dans 20 ml de sérum de lapin contenant des anticorps de morphine et on agite pendant 4 heures à 4°C. On obtient par filtration un résidu 25 qu'on remet en suspension dans 5 ml de tampon au phtalate à un pH égal à 3,8 (0,1 M) et on agite pendant 2 heures. On sépare le gel par centrifugation et on dialyse la liqueur surnageante vis-à-vis d'un tampon au phosphate à un pH égal à 7,4 (0,1 M), ce qui donne une solution tamponnée d'anticorps sensiblement purs. 30 EXEMPLE 12 - Préparation de sérum de lapin et de y-glo^U-li*16 On peut obtenir des antisérums de la façon suivante : l'antigène (haptène fixé à une protéine appropriée) est préparé dans une solution saline (9 g/l) à une concentration de 2 mg/ml. Pour chaque portion introduite de 1,0 ml de la solution indiquée 35 ci-dessus» on introduit simultanément 3 cil d'adjuvant complet de Preuna sous la forme homogénéisée, au moyen d'une aiguille à deux voies. Pour des injections sous-cutanées, on injecte environ 72 00687 56 2121723 0,3 ml (antigène + solution de Freund) par site et pour des injections intrapéritonéales, on injecte environ 0,4 ml. La dose totale est d'environ 4,0 ml par lapin. Au bout de 3 à 4 semaines, on effectue une injection intra-5 musculaire de rappel, de 0,5 ml de la solution saline indiquée ci-dessus et 0,5 ml d'adjuvant complet de Freund.On laisse s'écouler une période de 5 à 7 jours et on saigne le lapin par ponction cardiaque. Lorsque la quantité désirée de sang a été recueillie, on 10 laisse le sang se coaguler et on retire le caillot. On centrifuge ensuite la solution restante à 2000 tours/ninute pendant 10 minutes. « On recueille le sérum exempt de globules rouges libres. On ajoute goutte à goutte au sérum, en agitant, à 4°C, un volume égal de solution saturée de sulfate d'ammonium. Après 15 repos pendant une heure à cette température, on centrifuge la solution à 10 000 tours/minute pendant 15 minutes et on enlève la liqueur surnageante. On met le résidu en suspension dans un volume aussi faible que possible de PBS 1X (solution saline tamponnée au phosphate, voir la définition ci-dessous), on trans-20 fère la suspension dans un sac à dialyse et on effectue la dialyse pendant environ 16 heures vis-à-vis de PBS 1X (pH 7,0). Le résidu contenu dans le sac de dialyse est ensuite isolé et congelé. (Pour préparer 1 1 de PBS 10X, on rassemble 76,5 -g de KaCl, 25 7,25 g de UagHPO^ anhydre, 2,12 g de KHgPO^ et 10,0 g de NaïT^ » on complète à 1 1 avec de l'eau distillée et on ajuste le pH à 6,5 avec de l'acide chlorhydrique 1F. On obtient PBS 11 en diluant 10 fois,le pH passant de 7,0 à 7,1 par suite de la dilution) . 30 EXEMPLE 13 - Conjugué phénobarbital-BSA On chauffe au reflux pendant 2 heures 5,08 g (0,02 mole) de sel sodium du phénobarbital, 2,16 g (0,02 mole) de chloracétate méthylique, 14 ml de méthanol et une quantité catalytique de diméthylformamide (1 ml). Pendant cette période de temps, un 35 précipité blanc se sépare. On refroidit le mélange réactionnel à la température ambiante et on le filtre. Le filtrat méthanolique est évaporé à sec en donnant environ 5 g d'une substance gommeuse 72 00687 2.121723 qui se solidifie au repos, (le précipité séparé dans la filtration indiquée ci-dessus se dissout partiellement lorsqu'on le lave de nouveau avec de l'eau distillée. la substance insoluble dans l'eau, pesant environ 50 mg, se révèle être le produit 5 dialkylé). La substance solidifiée est agitée avec 20 ml de solution d'hydroxyde de sodium 1ïT pendant 15 minutes,puis filtrée. Ceci sépare les dérivés insolubles dans la base alcaline du produit monoalkylé et du phénobarbital non combiné. Le filtrat alcalin 10 est acidifié avec de l'acide chlorhydrique concentré à un pH égal à 2, et le précipité blanc à consistance gommeuse qui se forme est repris dans du chlorure de méthylène. Par séchage sur du sulfate de magnésium puis évaporation du solvant organique, on obtient 4 g de substance gommeuse. On 15 dissout cette substance dans du benzène et on chromâtographie la solution sur une colonne de gel de silice (40 g). On effectue 1'élution avec du chloroforme et on recueille des fractions de 100 ml. (On suit la progression de la chromâtographie par chromâtographie en couche mince, parce que le produit dialkylé 20 a unSj égal à 0,9» la substance monoalkylée a un R^ égal à 0,6 et le phénobarbital a un R^ égal à 0,1 avec un mélange de chloroforme et de méthanol à 95:5). Les fractions 2 à 5 rassemblées donnent par évaporation 1,6 g d^une substance gommeuse qui se solidifie au repos. Par 25 trituration avec de 1'éther de pétrole,puis filtration, on obtient 1,5êfi'une poudre blanche dont le spectre de résonance magnétique nucléaire montre qu'il s'agit du dérivé monoalkylé désiré, à savoir le N-méthoxycarbonylméthylphénobarbital. En poursuivant 1'élution avec 500 ml de chloroformé, on 30 obtient 1,5 g d'une substance solide blanche qui se révèle être du phénobarbital n'ayant pas réagi. B. Le monoester préparé ci-dessus (1g) est chauffé au reflux avec 10 ml de solution d'acide chlorhydrique à 20 % pendant 3,5 heures. Le mélange réactionnel refroidi est dilué avec 20 ml 35 d'eau et extrait à 1'éther. Par évaporation de l'autre extrait, on obtient 0,98 g d'une gomme incolore qui se solidifie très lentement au repos. Le spectre de résonance magnétique nucléaire 72 00687 58 2121723 et la chromatographie en couche mince montre qu'une hydrolyse totale en acide s'est produite. Un échantillon pur de l'acide est obtenu par chromatographie préparative en couche mince en vue de l'analyse ultraviolette, 5 en utilisant un mélange de chloroforme et de méthanol (5î1) comme éluant. C. On refroidit à -15°C du carboxyméthylphénobarbital préparé comme ci-dessus (3 ml). On ajoute à une solution agitée au moyen d'un agitateur magnétique, 0,14 ml (1,0 millimole) de triéthyla-10 mine et 0,13- ml (1 millimole) de chloroformiate isobutylique. On agite le mélange réactionnel à -15°C pendant 10 minutes, puis à 0°C pendant 30 minutes, l'anhydride mixte préparé ci-dessus est ajouté lentement à une solution, refroidie à la glace, de sérum-albumine de boeuf, (BSA)(400 mg) dans 56 ml d'eau contenant 15 2,6 g de bicarbonate de sodium. On agite le mélange réactionnel à 0° pendant 6 heures puis on le dialyse vis-à-vis d'eau distillée en changeant l'eau 4 fois (41 d'eau à chaque fois). La solution dialysée est ensuite centrifugée et versée par décantation, et on obtient ainsi 118 ml d'une solution claire. Par lyophilisation 20 de 10 ml de cette solution, on obtient 0,0362 g de conjugué protéinique, ce qui équivaut à un rendement total de 0,427 g de conjugué. La majeure partie de la solution est dialysée vis-à-vis d'un tampon au phosphate à un pH égal à 8, avec 4 changements de la solution de tampon à des intervalles de 3, 17, 25 et 49 25 heures. Enfin, par dialyse vis-à-vis d'eau pendant 48 heures, suivie d'une lyophilisation, on obtient 0,325 g de conjugué protéinique. Une courbe d'étalonnage U.V. avec la sérum-albumine de boeuf et le carboxyméthylphénobarbital dans un tampon de H^BO^/FaOH/KCl à un pH égal à 10, permet de déterminer le nombre 30 de molécules d'haptène fixées sur la sérum-albumine de boeuf. On trouve qu'il y a 15 molécules de carboxyméthylphénobarbital par molécule de BSA. EXEMPLE 14 - Conjugué sécobarbital-BSA A. On fait passer de l'ozone à travers une solution refroidie 35 (neige carbonique/acétone) de sel de sodium de sécobarbital (2,6 g , 0,01 mole) dans 250 ml de méthanol. Lorsque l'ozonolyse est terminée (test à l'iodure de potassium positif), on fait 72 00687 59 2121723 passer de l'azote dans le mélange réactionnel pour éliminer toutes les traces d'ozone, puis on ajoute 7 ml de sulfure de diméthyle à la solution froide au moyen d'une seringue, et on laisse reposer pendant environ 16 heures à la température ambiante. Après évapora-5 tion du solvant, on dilue le résidu avec 20 ml d'eau, on l'acidifie avec de l'acide chlorhydrique concentré et on l'extrait au chloroforme (3 fois 20 ml). L'extrait chloroformique est séché (sulfate de magnésium) et évaporé en donnant 2,4 g d'une substance incolore à consistance gommeuse. Le spectre de résonance magnétique nuclé-10 aire révèle la présence d'un groupe aldéhyde à S 9»7 ppm. On utilise cette substance sans autre purification dans la réaction avec l'acide malonique. B. On chauffe au reflux pendant 6 heures un échantillon d'aldéhyde pur (0,24 g, 1 millimole), d'acide malonique (0,21 g, 15 2 millimoles), de 20 ml de pyridine et de 1 ml de pipéridine. On chasse le solvant sur un appareil d'évaporation instantanée et on dissout le résidu dans une solution à 10 $ de bicarbonate de sodium. On lave la solution de bicarbonate avec 3 fois 20 ml d'éther puis on l'acififie avec de J-'acide chlorhydrique concentré. d'ether 20 Par extraction avec 2 fois 20 ml/puis avec 2 fois 25 ml de chloroforme, suivie d'un séchage au sulfate de magnésium et d'une évaporation des phases organiques rassemblées, on obtient 0,23 g (rendement 80 fo) d'une substance solide blanche dont le spectre de résonance magnétique nucléaire montre qu'il s'agit de l'acide 25 5-(a-crotonique)-5-(1'-méthylbutyl)barbiturique désiré. Par recristallisation dans un mélange de chloroforme et de tétrachlorure de carbone, on obtient 0,16 g de substance pure. C. On ajoute 0,28 ml (2 millimoles) de triéthylamine et 0,13 ml (1 millimole) de chloroformiate d'isobutyle à une solution 30 de 0,282 g(1 millimole) d'acide 5-(«-crotonique)-5-(1 'méthylbutyl) barbiturique dans 3 ml de diméthylformamide, refroidie à -15° (bain de sel et de glace). On continue d'agiter à -15° pendant 15 minutes puis à 0° pendant 30 minutes. Le mélange réactionnel est ensuite ajouté goutte à goutte, au moyen d'une seringue, 35 à une solution refroidie de 400 mg de BSA dans 56 ml d'eau contenant 2,6 g de bicarbonate de sodium. On agite le mélange réactionnel à 0° (chambre froide) pendant 5 jours, jusqu'à ce que le trouble initial ait pratiquement disparu. On dialyse ensuite la solu 7200687 eo 2121723 tion vis-à-vis de 4 1 de tampon au phosphate (pH 8) puis d'eau distillée pour obtenir le conjugué désiré. L'anhydride peut être utilisé pour l'association avec le 4-amino-2,2,6,6-tétraméthylpipéridino-1-oxyle ou le 3-amino-2,2,-5 5,5-tétraméthylpyrrolidino-1-oxyle pour former le groupe de liaison marqué avec un radical libre. EXEMPLE 15 - Conjugaison de la mépéridine avec la sérum-albumine de boeuf (BSA) A. On chauffe au reflux sous atmosphère d'azote 142 mg de 10 chlorhydrate.de mépéridine dans 2,5 ml d'hydroxyde/potassium 4M et 5 ml de méthanol pendant 2 heures. On chasse le méthanol à l'é-vàporatëur rotatif. On neutralise la solution aqueuse à un pH égal à 8,1. Il se forme un précipité qu'on recueille et qu'on sèche. On obtient 79 mg (76 $) de substance fondant à 298«-300°. 15 B. On met en suspension'54,8 mg de la 4-carboxy-1 -méthyl-4- phénylpipéridine préparée comme indiqué ci-dessus, dans 3 ml de diméthylformamide. On refroidit la solution à -15° et on ajoute 32,8 [il de chloroformiate d'isobutyle. On maintient le mélange à -15° sous agitation. Au bout de 30 minutes, on ajoute la solu-20 tion à une solution de 161 mg de BSA dans 18 ml d'eau contenant en solution 1,1 g de bicarbonate de sodium. On maintient le mélange à la chambre froide pendant environ 16 heures. On le dialyse vis-à-vis d'eau distillée (80:1) en effectuant 3 changements pendant 36 heures. Après lyophilisation, il reste 159 mg de 25 résidu. Ce résidu contient 32 haptènes par molécule de BSA, comme indiqué par l'analyse ultraviolette. EXEMPLE 1 6 - 3[4'-(4'-phényl-1'-méthylpipéridino)carbamoyl]-2,2,5,5-tétraméthy1-1-pyrrolidinyloxyle A. On chauffe au reflux 110 mg de 4-carboxy-1-méthyl-4-30 phénylpipéridine (voir exemple 15) dans 3 ml de tétrahydrofuranne fraîchement distillés et 178 mg (110 pi) de chlorure de thionyle pendant 30 minutes. L'acide insoluble forme un précipité volumineux. Après élimination du solvant sous vide, on distille le résidu dans 3 ml de pyridine anhydre et on ajoute la solution à 35 231 mg de 3-amino-2,2,5,5-tétraméthy1-1-pyrrolidinyloxyle. Au bout de 1 heure à 0°, on dilue le mélange réactionnel avec de l'eau et ajuste le pH à 11. Deux extractions à 1'éther et deux 72 00687 61 2121723 extractions à l'acétate éthylique éliminent le radical de la phase aqueuse. Le résidu de l'extraction est séparé par chromatographie préparative en couche mince. La bande jaune de plus faible valeur de contient un amide (IR). On l'élimine du gel de silice avec 5 du méthanol et on le recristallise dans un mélange de benzène et d'hexane. Les cristaux fondent à 84-86°. EXEMPLE 17 - Conjugaison de la 4-carbéthoxy-t-carboxyméthyl^- phénylpipéridine avec la sérum-aTisaffiine de boeuf (BSA) On dissout 2,23 g de chlorhydrate de 4-cyano-4—phénylpipé-10 ridine dans 15 î£L d'eau et on ajoute à la solution 4 «OL d'hydroxyde de potassium en. solution aqueuse à 50 On extrait: H'iuiile avec 3 fois 15 ml d'éther et on sèche les phases organiques sur du sulfate anhydre de magnésium. Par filtration et évaporation de la solution, on obtient un résidu qu'on place dans une ampoule de 15 verre en présence de 3 ml de méthanol et de 1,23-ml d'hydroxyde de potassium en solution aqueuse à 50 L'ampoule scellée est chauffée à 165-170° pendant 3,5 heures et son contenu est dilué avec 50 ml d'eau. Après extraction au chloroforme, on neutralise la phase aqueuse avec le produit "DOWEX" 50-X8 (forme H+) à un 20 pH égal à 6. Par filtration et évaporation, on obtient un résidu (0,82 g) fondant au-dessus de 300°. Par recristallisation dans l'eau et déshydratation sur du pentoxyde de phosphore, on obtient un composé fondant à 285-286°. ^ ~ —- B. On chauffe au reflux 1,8 g de 4-carboxy-4-phénylpipéri-25 dine dans 50 ml de solution éthanolique de gaz chlorhydrique à 5 i» en 4 heures. Le résidu d'évaporation du solvant est dissous dans de l'acétone et la partie insoluble est séparée par filtration. Par évaporation de la solution acétonique, il reste une huile visqueuse qui cristallise au repos. Les cristaux fondent à 107-30 110°'N(1,068 g). On les utilise sans autre purification. B'. Suivant une variante, on chauffe à 145on agite pendant 45 minutes une solution de chlorhydrate de 4-cyano-4-pipéridine dans 6 ml d'acide sulfurique à 66 % . Par refroidissement à 125°, la solution devient un peu plus visqueuse. L'addition d'alcool 35 (la tige de l'entonnoir d'addition se trouvant au-dessous de la surface dix mélange réactionnel) abaisse la température à 105°. On maintient la solution à cette température pendant 4 heures. 72 00687 62 2121723 Pendant la première heure, on ajoute 20 ml d'alcool, et on en ajoute B kL pendant chacune dea 3 heures suivantes. On chasse les vapeurs d'alcool par distillation continue. A la fin de l'addition, on éïèv© la; température à 125° jusqu'à ce qu'il ne se forme plus de 5 condensé. La solution chaude est versée dans un mélange de 6 ml d'eau et 40 g de glace contenant 8 g d'hydroxyde de sodium. Après extraction avec 3 fois 70 ml d'éther, déshydratation sur du sulfate anhydre de sagnésium et élimination du solvant, il reste une huile qui distille à 1l2-115°/0,2 mm de mercure." Cette huile pèse 4,01 g 10 (54 %>). C. On dissout 4,01 g de 4-carbéthoxy-4-phénylpipéridine dans 13 ml d'alcool absolu et on chauffe la solution au reflux avec 2,01 g de chloracétate de sodium. Au bout de 7 heures, la chromatographie en couche mince montre qu'il n'y a plus de matière 15 première. le précipité de chlorure de sodium est séparé par filtration et lavé avec 3 ml d'éthanol. Par refroidissement du filtrat, des cristaux "blancs apparaissent. Par filtration et séchage, on obtient 2,9 g (58 $) du composé indiqué dans le titre, fondant à 148-150°C. Par évaporation de la liqueur-mère, on obtient une 20 substance vitreuse qui ne cristallise pas dans un mélange d'acétone et d'hexane. D. On refroidit à -10°C une solution de 1,76 g de 4-carbéthoxy-1-carboxyméthyl-4-phénylpxpéridine dans 6.5 ml de diméthylformamide absolu et on ajoute à cette solution 680 p.1 de chloroformiate 25 d'isobutyle. On maintient le mélange réactionnel à -10° pendant 45 minutes, en agitant, l'anhydride mixte est ajouté goutte à goutte à 3,2 g de BSA dissous dans 450 ml d'eau contenant 21g de bicarbonate de sodium. Un léger trouble apparaît après l'addition du 1/^ de la solution dans le diméthylformamide. On le 30 fait disparaître partiellement par addition d'un supplément de 250 ml d'eau. Après agitation à 4° pendant environ 16 heures et dialyse vis-à-vis d'eau distillée pendant 2 jou^-s, on centrifuge la solution pour séparer le précipité et on procède à la lyophilisation. Ii'analyse en lumière ultraviolette révèle la présence 35 d® 46 haptènes par molécule de BSA. MEMPIiE 18 - 3-[2-(4-carbéthoxy-4-phényl-pipéridino-1 )acétamido]-2,2,5,5-tétraméthyl-1-pyrrolidinyloxyle 72 00687 63 2.121723 On dissout 69,3 mg de 4-carbéthoxy-4-phénylpipéridine dans 2 ml d'éthanol et on ajoute 82,3 mg de 3-(2-bromacétamido)-2,2,5,5-tétraméthylpyrrolidinyloxyle-ljdans 2 ml d'éthanol, ainsi que 40,8 mg de carbonate de potassium. On chauffe la solution au reflux pen-5 dant 2 heures et on la dilue avec 20 ml d'eau. Par extraction à l'éther, toute la couleur jaune passe aisément dans la phase organique. Le résidu de la phase organique est recristallisé 2 fois avec un mélange de benzène et d'hexane en donnant 118 mg de cristaux jaunes fondant à 98-99°• 10 "EyRiV'PT."R 1 9 -- 4-[2-(4-carbéthoxy-4-phényl-1 -pipéridino)-acétamido]~ 2,2,6,6-tétraméthyl-1-pipéridino-oxyle On dissout 83,7 mg de 4-carbéthoxy-4-phényipipéridine dans 2 ml d'éthanol anhydre et on ajoute la solution obtenue à une solution de 104,3 mg de 4-(2-bromacétamido)-2,2,6,6-tétraméthyl-15 pipéridino-oxyle dans 2 ml d'éthanol contenant 49,8 mg de carbonate de potassium. Après chauffage du mélange réactionnel au reflux pendant 2 heures, on dilue la solution avec 20 ml d'eau. On ajuste le pE à 12 et on extrait la solution à l'éther. Toute la couleur jaune passe dans la phase organique. Par évaporation 20 de l'éther, il reste/r§sidu qu'on recristallise dans un mélange de benzène et d'hexane. Les cristaux (48 mg) fondent à 137-138°. EXEMPLE 20 - 3-carboxy-2,2,5,5~tétraméthyl-1-pyrrolidinyloxyl-(4'-carbéthoxy-4'-phényl)pipéridine On dissout 52,2 mg de 3-carboxy-2,2,5,5-tétraméthylpyrroli-25 dinyloxyle dans 2 ml de benzène anhydre avec 30 pi de pyridine. On ajoute 27 yl de chlorure de thionyle à la solution refroidie à la glace. Après agitation pendant 1 heure, on sépare les sels par filtration à l'abri de l'humidité et on les lave avec du benzène anhydre. On évapore le filtrat et on sèche le résidu sous 30 un vide de 0,1 mm de mercure pendant 1 heure (température ambiante). On dissout 77,4 tr.g de 4-carbéthoxy-4-phényipipêriaine dans 3 ml de pyridine et on ajoute la solution obtenue à la solution du chlorure d'acide indiquée ci-dessus, à 0°C. Après agitation à 0° pendant 1 heure, on dilue le mélange réactionnel avec 20 ml 35 d'acétate éthylique et on l'extrait avec 20 ml d'acide chlorhydrique 0,1 N. Le résidu de la phase organique est séparé par chromatographie préparative en couche mince (méthanol/chloroforme 1:9). 72 00687 64 2121723 Il y a une bande incolore de égal à 0,8, qui correspond au composé indiqué dans le titre. Après élution du gel de silice avec du méthanol, on obtient un composé jaune pâle qui fond après 2 recristallisations dans le cyclohexane à 114-116°. 5 EXEMPLE 21 - Préparation du conjugué d'amphétamine et de sérum-albumine de boeuf (BSA) A. On dissout 3,68 g de sulfate d'amphétamine (20 millimoles d'aminé) dans 80 ml d'hydroxyde de sodium 0,5 N. On extrait la solution alcaline avec de l'éther, on déshydrate l'éther et on 10 l'évaporé. On dissout le résidu dans 50 ml de benzène et on ajoute 3 ml de diisopropyléthylamine, puis 2,2 ml (20 millimoles) de bromacétate éthylique. On chauffe le mélange réactionnel au reflux pendant 1 heure, on le refroidit, on le filtre et on évapore le filtrat. On reprend le résidu dans de l'éther, on le lave 15 plusieurs fois à l'eau, on déshydrate l'éther et on l'évaporé. On obtient l'amino-ester pur par chromatographie sur colonne de gel de silice (hexaneréther 7*3). Rendement 3,1 g (70 $). Le spectre de résonance magnétique nucléaire et le spectre infrarouge concordent avec la structure. 20 B. On dissout l'amino-ester (2,5 g, 11,3 millimoles) dans un mélange à 1:1 de méthanol et d'hydroxyde de sodium 1ÎT (50 ml) et on laisse reposer la solution à la température ambiante pendant environ 16 heures. On évapore le mélange à un faible volume, on le lave 2 fois avec de l'éther (2 fois 25 ml) et on l'acidifie 25 à un pH égal à 6 avec de l'acide chlorhydrique concentré. Les cristaux qui se séparent sont recristallisés dans un mélange d'gther et d'acétone en donnant 2 fractions, l'une de 900 mg fondant à 222-225° (la littérature indique un point de fusion de 220-225°C, "Tetra. Letters" 1966, 4603-4607) et l'autre de 450 mg 3-0 fondant à 210-218°. On n'utilise que la première fraction pour les réactions subséquentes. ^ H2° = 257, e = 159. max. C. On met en suspension 700 mg (3,8 millimoles) d'acide amphétamine-carboxylique dans 50 ml de dioxanne anhydre à 40° et 35 on ajoute en une seule portion 12,5 % en poids de phosgène dans du benzène (20 ml). On agite le mélange réactionnel à 40-50°C 72 00687 65 2121723 pendant 3,5 heures, on l'évaporé à sec et on le redissout dans. 20 ml de dioxanne anhydre. On maintient cette solution dans de la glace pendant l'étape suivante. D. La solution indiquée ci-dessus est ajoutée en 4 portions 5 pendant une demi-heure à une solution sous agitation de 2 g de BSA dans 100 ml de solution à 2 i<> de bicarbonate de sodium, à 0°C. le mélange réactionnel est maintenu pendant 24 heures à 0°C et pendant 18 heures à la température ambiante. Il est dialysé pendant 2 jours vis-à-vis de 35 1 d'eau à 0°C, puis lyophilisé. Le 10 volume final.de la solution de dialyse est de 200 ml; 10 ml de cette solution contiennent 110 mg de substance, soit un rendement total de 2,2 g. la quantité réelle de conjugué isolé est de 1,91 g. Le degré de conjugaison (d'après le spectre ultraviolet) est estimé égal à environ 76 unités d'amphétamine/BSA. 15 EXEMPLE 22 - 3-[H-(1'-phényl-2'-propyl)-glycinamidp]-2,2,5,5-tétraméthyl-1-pyrrolidinyloxy On traite une solution de 2 millimoles d'amphétamine, préparée à partir de 368 mg du sulfate dans 20 ml de méthanol, avec 106 mg (1 millimole) de carbonate de sodium et 321 mg (1 millimoLe) 20 de 3-(2-iodacétamido)-2,2,5,5-tétraméthyl-1-pyrrolidinyloxyle. Le mélange réactionnel est agité pendant environ 16 heures à la température ambiante, évaporé à sec, et le résidu est réparti entre de l'eau et de l'éther. Le résidu obtenu par évaporation de l'éther est chromatographié sur gel de silice (8 $ de méthanol 25 dans du dichlorométhane), ce qui donne 187 mg (59 "f°) d'un mélange de couleur jaune intense d'huile et de cristaux donnant une seule tache dans la chromatographie en couche mince, dans le système indiqué ci-dessus (R^ 0,5). Spectre RSE (dans l'eau) a^ = 15,9 Gauss, 30 Spectre infrarouge : 700, 740 cm"1 - fort. EXEMPLE 23 - Conjugué d'ecgonine et de BSA 1. On chauffe au reflux 5 g de cocaïne dans 25 ml d'eau pendant 6,5 heures. L'huile qui reste après 1'évaporation de la solution est dissoute dans 5 ml d'eau chaude. Lors du refroidis-35 sement, des cristaux blancs de forme allongée se séparent (2,87 g). On obtient une autre fraction de 543 mg à partir de la liqueur-mère . 72 00687 2121723 B. On chauffe au reflux 1 g de benzoylecgonine dans 25 ml d*acide chlorhydrique 2N pendant 1 heure. Après refroidissement, on filtre la solution et on l'extrait à l'éther. On neutralise la phase aqueuse avec du bicarbonate de sodium, à un pH égal à 5 5,8. Par évaporation, il reste un résidu de couleur blanche qu'on chauffe au reflux avec 40 ml d'éthanol (95 °f°), puis on filtre et on évapore le solvant. Le résidu huileux (580 mg) cristallise par addition de 0,5 ml d'éthanol (130 mg). Il fond à 135-196° (en se décomposant). 10 C. On dissout 119 mg d'ecgonine dans 8 ml de diméthylformamide anhydre et on refroidit la solution à -10°C. Après addition de 84 pl de chloroformiate isobutylique, on agite le mélange réactionnel pendant 2 heures. D. On dissout 400 mg de BSA dans 25 ml d'eau ainsi que 2,1 g 15 de bicarbonate de sodium. L'anhydride mixte préparé ci-dessus est ajouté goutte à goutte et le mélange réactionnel est agité pendant environ 16 heures à 0°C. La solution est transférée dans un sac de dialyse et dialysée vis-à-vis de 1 1 d'eau pendant 24 heures (4 changements du dialysat, dialyse à 1:20). Par lyophilisation, 20 on obtient un composé de couleur blanche. L'analyse en lumière ultraviolette montre qu'il y a 18 haptènes par molécule de BSA. EXEMPLE 24 - Acide ÎT-2 ', 2 ', 5 ', 5 '-tétraméthylpyrrolidine-3 ' -y 1-1 '-oxyl-6-cé t o-7,7-diphényl-9-( diméthylamino )-décanoîque (a) On ajoute une solution de 32,4 g (150 millimoles) de 25 dibromure de tétraméthylène dans 150 ml d'éther anhydre à 10,9 g (450 millimoles) de magnésium dans 80 ml d'éther à une vitesse telle que l'éther soit reflué. On conduit la réaction sous atmosphère d'argon. Lorsque l'addition est terminée, on fait bouillir le mélange réactionnel pendant 1 heure. On ajoute en 30 minutes, 30 à la température ambiante; une solution de 8,4 g (30 millimoles) de 2,2-diphényl-4-diméthylaminovaléronitrile (I) (préparée comme indiqué par J. ¥. CUSIC dans "J. Am. Chem. Soc.", 71. 3546) dans 100 ml de xylène anhydre, et on agite le mélange à 55°C pendant 1 heure. On refroidit le mélange réactionnel au bain-marie glacé 35 et on fait passer de l'anhydride carbonique dans un mélange en agitant rapidement pendant 4 heures. On ajoute 200 ml d'eau et 100 ml d'acide chlorhydrique concentré, on sépare le magnésium 72 00687 6? 2121723 par filtration et on chauffe le filtrat au reflux pendant 2 heures, la solution limpide refroidie est lavée avec 3 fois 150 ni d'éther et extraite avec 3 fois 150 ml de dichlorométhane. Cet extrait est évaporé à sec et le résidu est dissous dans 0,5 1 d'hydroxyde de 5 sodium 0,5 H. On lave cette solution avec de l'éther (3 fois 100 ml), on l'acidifie avec 150 ml d'acide chlorhydrique concentré, on la sature avec du chlorure de sodium et on l'extrait avec 3 fois 200 ml de dichlorométhane. Par évaporation du solvant, on obtient une huile 10 (7,55 g» 60 fi), a savoir le chlorhydrate d'acide 6-céto-7,7-diphényl-9-(diméthylamino)décanoïque, qui se déplace en formant i une tache unique par chromatographie en couche mince (HCCl^îMeOH 8ï2 et 7:3). Spectre ultraviolet 15 x °'02 * ^s00® 293 ( e- 540) -, max. 264 ( e = 500) ; 259 ( e= 535) ï (b) le produit indiqué ci-dessus (1,170 g, 2,8 millimoles) et 423 y.1 de triéthylamine sont dissous dans du diméthylformamide 20 anhydre (5 ml), la solution est refroidie à 0°C, et elle est traitée avec 393 {il de chloroformiate d'isobutyle, sous agitation et sous atmosphère d'azote pendant 1 heure. On ajoute 450 mg de 3-amino-2,2,5,5-tétraméthylpyrrolidine-1-oxyle et on agite le mélange réactionnel à la température ambiante pendant environ 25 16 heures, on le verse dans 40 ml de carbonate de sodium à 5 et on l'extrait avec 3 fois 20 ml d'éther. la solution dans l'éther est lavée à l'eau (2 fois 10 ml) et avec une solution à 19 i° de chlorure de sodium ( 2 fois 10 ml). Par évaporation de l'éther, on obtient une huile de couleur rouge qu'on purifie par 30 chromatographie sur gel de silice (HCCl^ ^Et^O >50:50 EtgO^cétone) pour obtenir une huile qui se solidifie au repos (900 mg, 62 °/°). Analyse : C % H °/o F i<> Calculé pour ^32^46^3^3 73,80 8,90 8,06 35 Trouvé 73,27 8,86 7,98 EXEMPLE 25 - Conjugué de méthadone et de BSA On dissout l'acide décanoïque préparé dans l'exemple 24 72 00687 68 2121723 (0,63 g, 1,5 millimole) et de la triéthylamine (0,63 ml, 4,5 millimoles) dans 5 ml de diméthylformamide anhydre à -8°C. On ajoute 0,19 ml de chloroformiate d'isobutyle et on maintient le mélange à 8°C pendant une demi-heure et à 0°C pendant encore une demi-5 heure. La solution de l'anhydride mixte ainsi obtenue est ajoutée goutte à goutte à une solution de BSA (1,4 g, 1,07 milliéquivalent) dans un mélange d'eau (200 ml), de méthanol (110 ml) et de bicarbonate de sodium (9,2 g) à 0°C. On agite le mélange à 0°C pendant 18 heures, on le dialyse (18 heures, courant constant 10 d'eau-distillée) et on le lyophilise. Le rendement du conjugué est de 1,2 g (quelques pertes dues à des facteurs mécaniques). Le degré de conjugaison, déterminé d'après le spectre ultraviolet du conjugué (en utilisant une courbe d'étalonnage) est d'environ 50 fo (35 molécules de méthanol par BSA). 15 On peut utiliser du cholestérol ou d'autres stéroïdes portant la fonction 3-hydroxy et des fonctions non interfèrentes en position 17 ou des fonctions protégées dans cette même position. On peut faire réagir le cholestérol avec le bromacétate éthylique, puis effectuer une hydrolyse basique pour obtenir l'éther 3-20 carboxyméthylique. Là encore, comme décrit ci-dessus, l'anhydride mixte peut être préparé et amené à réagir avec l'une quelconque des protéines déjà indiquées et le produit résultant peut être introduit dans l'organisme d'un animal pour produire des anticorps. De même, l'anhydride mixte peut être amené à réagir avec 25 le 2,2,6,6-tétraméthyl-4-aminopipéridino-1-oxyle ou le 2,2,5,5-tétraméthyl-3-hydroxy (ou 3-amino)pyrrolidine-1-oxyle. On peut utiliser du phénobarbital dans un mode opératoire qui diffère de celui qui a été décrit ci-dessus. Le phénobarbital peut être préparé et modifié par introduction d'un groupe amino 30 dans la position para du substituant 5-phényle. Par diazotation du groupe diazo, la protéine peut être marquée avec le phénobarbital et la protéine résultante peut être introduite dans l'organisme d'un animal pour produire les anticorps désirés. Le même phénobarbital modifié par une fonction amino peut être com-35 biné avec le 4-carboxy-2,2,5,5-tétraméthylpyrrolidine-1-oxyle ou le 2,2,6,6-isocyanatopipéridino-1-oxyle. Pour illustrer le titrage appliqué à des sucres, du lactose 72 00687 69 2121723 ou (4-P-D-galactopyranosido)-D-glueopyranose peut être préparé bous la forme de l'éther para-diazophénylique en position 1, qu'on peut ensuite associer avec le 2-[1l-(3'-hydroxyphényl)]-4,4,5»5-tétraméthylimidazolinyl-1-oxyl-3-oxy. De même, le composé 5 diazoïque peut être associé avec une protéine telle que la gammaglobuline de boeuf en vue de l'utilisation dans la préparation d'anticorps. (Voir F.O. Karush, "J. Am. Chem. Soc.", 22» 3380 (1957). On peut aussi titrer de l'aspirine en utilisant l'acide 4-amino-10 2-acétoxybenzoïque, en diazotant le groupe amino de la même manière que l'aminophénol utilisé ci-dessus, puis en conjuguant le composé diazoté avec de la sérum-albumine de boeuf, le groupe amino peut aussi être amené à réagir avec le dérivé carboxy ou le dérivé isocyanato du 2,2,5,5-tétraméthyl-3-carboxy ou (3-iso-15 cyanato)-pyrrrolidine-1-oxyle ou du 2,2,6,6-tétraméthyl-4-carboxy (ou 4-isocyanato)pipéridine-1-oxyle. Pour illustrer le titrage d'une substance toxique telle qu'un pesticide, on peut modifier du malathion (2-(0,0-diéthylphosphoro-thionothioylsuccinate) de diéthyle) de manière à former le 20 chlorure hémi-acylique de 1'hémi-ester, qu'on peut ensuite utiliser pour le conjuguer avec une protéine telle que BSA, A titre de variante, l'halogénure d'acyle peut être amené à réagir avec le 3-(para-aminophényl)-1,5-diphénylverdazyle. Outre les haptènes que l'on utilise comme groupes de liaison 25 avec des anticorps récepteurs, il y a d'autres groupes de liaison qui ont naturellement des récepteurs spécifiques naturels. le tableau suivant illustre ces groupes de liaison et indique une référence bibliographique qui décrit un récepteur convenable pour c.e groupe de liaison. Ce tableau indique également des 30 radicaux libres convenables que l'on peut utiliser comme groupes analogues dans le titrage du groupe de liaison conformément à une méthode précédemment décrite. TABLEAU I Groupe de liaison Thyroxine Corticostérone Référence bibliographique concernant le récepteur pour le groupe de liaison Globuline fixant la thyroxine (TBG) Préalbumine fixant la thyroxine (TBA.) B.E.P. Murphy, C.J.J. Pattee, "J. Clin. Endocr." 24, 187 (1964) Protéine dérivée des noyaux de cellules cérébrales, B. McEwen, L. Plapinger, "Nat." 226, 263 (1970) Formule du groupe de liaisoàSC nh; X . I Thyroxine h2-ch~co6h Cj:H2OH c=o a* ob •SJ Corticostérone —j o Cortisol (R=0H,H) Cortisone (R=0) 11-désoxycortisol (R=H,H) B.E. Murphy, "J. Clin. Endocr.", 28, 343 (1968), 22, 973 (1967) Globuline fixant les corticostéroldes (transcortine) çh2oh c=o 'OH Cortisone K) KO wJk •»sl NO U> TABLEAU I (suite) *-4 K) Groupe de liaison Oestradiol Référence "bibliographique concernant le récepteur pour le groupe de liaison Site récepteur de l'oestrogène de l'utérus, BBA, 126, 626 (1969) Formule du groupe de liaison OH O O o 00 Oestradiol Insuline C.R. Morgan, W.M. Holland, III Diabetes, 1966 * Voir ci-dessous EK„ S- I 2 i •S NH, bh2 BH, * H-Gly-Ile-Val-Glu-Glu-Cys-Cys~Ala-8er-Val-Cys-Ser-Leu-Tyr-Glu-Leu-Glu-Asp-Tyr-Cys-Asp-0H S S S s H-Phe-Val-Asp-Glu-His-Leu-Cys-Gly-Ser-His-Leu-Val-Glu-Ala-Leu—Tyr—Leu—Val— Oys-Gly-Glu-Arg-Gly m2 nh2 Phe-Phe-Tyr-Thr-Pro-Lys-Ala-OH >o K> KJ UJ Groupe de liaison Angiotensine II TABLEAU I (suite) Référence bibliographique concernant le récepteur pour le groupe de liaison L.B. Page, B. Haber, A.Y. Kimura et A. Purnode, "J. Clin. End." 28. 200 (1969) -^1 NO O O Formule du groupe de liaison o- * Voir ci-dessous 00 -"J * Asp-Arg-Val-Tyr-Ileu-His-Pro-Phe -j tu hO K) ■^Jl K) UJ 72 00687 73 2121723 Outre les récepteurs naturels mentionnés sur le tableau précédent, on peut aussi utiliser des enzymes comme récepteurs.Le tableau suivant indique plusieurs exemples d'enzymes et de groupes de liaison avec lesquels ils sont capables d'une interaction. 5 De même, des radicaux libres convenables sont prévus comme groupes analogues. Les références indiquent des publications qui traitent de l'interaction spécifique entre le groupe de liaison et.l'enzyme. TABLEAU ÏI Enzyme récepteur Cholinestérase (Goldstein, p. 9-10) Thymidyla te-aynthé ta se (Baker, p. 113-114) Dihydrofolate-reductase * (Goldstein, p. 426, 531) (Baker, p. 197 et suiv.) Monoaminô-oxydase néostigmine W aoide 5-fluorodéoxyuridyllque h2n n n CH2^N\"^0~ ceu v COOH cooh méthotréxate conhnhch (chj) 2 iproniazids TABLEAU II (suite) Enzvme récepteur phos phor ib o syla d énos ine triphosphate-pyrophosphorylase (Goldstein, p. 541-543)' Groupe de liaison hoocchch. nh. -P* *-4 K) O O O-00 histicline "Principles of Drug Action", A. Goldstein, L. Aronow et S, M. Kalman, Harper & Row Publishers, New York, 1970. "Design of Active-Site-Directed Irréversible Enzyme Inhibitors", B. R. Baker, John Wiley and Sons, Inc., New York, 1967. —5 U1 KJ k) -■J Ni «JO 72 00687 76 2121723 Dans le choix des enzymes comme récepteurs, il est préférable de choisir les enzymes qui ne catalysent pas les réactions des groupes de liaison à tester, pour éviter la destruction du groupe de liaison recherché avant que l'information analytique n'ait été 5 obtenue. Des inhibiteurs d'enzymes constituent donc les meilleurs choix en ce qui concerne les récepteurs. Par ailleurs, il peut être désirable d'omettre une substance nécessaire comme réactif dans la réaction catalytique, par exemple un co-enzyme. Etant donné que beaucoup de médicaments sont des inhibiteurs d'enzymes, l'uti-10 lisation d'enzymes comme récepteurs pour des groupes de liaison qui sont des médicaments peut constituer un choix correct dans la pratique du procédé de l'invention. Des enzymes peuvent être des récepteurs intéressants pour la détection d'agents chimiques pesticides. Par exemple, la choli-15 nestérase est capable d'une interaction et constitue un récepteur pour des phosphates organiques qui sont utilisés comme insecticides. Par exemple, l'insecticide appelé parathion, de formule : s peut être détecté en utilisant le groupe analogue de formule : %C2° et la cholinestérase comme récepteur. 20 Pour illustrer l'analyse de groupes de liaison par le procédé de l'invention, l'haptène marqué, à savoir le 3-(2'#4'-dinitro- r phénylamino)-2,2,5,5-tétraméthylpipéridine-1-oxyle, est ajouté aux anticorpsfdinitrophényliques en solution aqueuse. (Les anticorps sont préparés conformément à Eisen et Collaborateurs, 72 00687 77 2.121723 nJACSM, j[£, 4583 (1953) et l'haptène marqué est préparé conformément à Hsia et Collaborateurs, "Archives of Biochemistry and Biphysics" 132. 466 (1969). On utilise le mode opératoire suivant les quantités des deux composés sont choisies par addition de 5 petites portions des haptènes à la solution d'anticorps jusqu'à ce que l'intensité du signal de résonance des spins des électrons commence à s'élever nettement, lorsque chaque portion est ajoutée. A ce stade, tous les sites de fixation sur les anticorps sont occupés par le traceur et l'addition est arrêtée. Des quantités 10 croissantes'de N-epsilon-dinitrophényllysine sont ensuite ajoutées à la solution, lorsqu'on ajoute des quantités croissantes de N-epsilon-dinitrophényllysine au complexe des anticorps et de l'fcaptène marqué, on observe une augmentation du signal de résonance des spins des électrons, les résultats de cette expérience 15 sont illustrés sur la figure 1 du dessin annexé. la solution d'anticorps a une concentration d'environ 2 mg/ml, —5 ce qui équivaut à environ 1-2x10 M de site de fixation. l'haptène marqué est dissous dans du méthanol en solution aqueuse —5 à 20 $ à une concentration d'environ 1-2x10 M. On combine 20 environ 10 pl de la solution d'anticorps et 10-20 |il de la solution d'haptène marqué et on ajoute des quantités variables de —5 solution à 10 M de U- e-dinitrophényllysine dans l'eau, le maximum étant de 14 ni. En utilisant des étalons appropriés, on peut établir une rela-25 tion entre l'intensité du signal de résonance des spins des électrons (portée en abscisses sur le graphique de la figure_1) et la concentration de la U-epsilon-DKPlysine en solution (concentration en p,l en abscisses sur la figure 1). Par conséquent, en choisissant une solution inconnue que l'on suspecte de renfer-30 mer un tel haptène, et en introduisant une quantité normalisée du complexe d'anticorps et d'haptène,'on peut rapidement déterminer la concentration de la ÎT-epsilon-DNP -lysine en solution. Pour illustrer davantage le procédé de l'invention en relation avec plusieurs haptènes plus intéressants, on utilise un grand 35 nombre de médicaments de structure et .d'activité physiologique différentes, là plupart de ces médicaments ont fait l'objet d'abus " ou sont utilisés pour le traitement de toxicomanes, par exemple 72 00687 78 2121723 la méthadone. Sans chaque cas, le produit de conjugaison avec une protéine, préparé comme décrit dans l'exemple précédent, est injecté dans l'organisme d'un animal, par exemple un lapin, une chèvre, etc., conformément à des modes opératoires connus et le 5 sérum est récolté de manière à recueillir l'anticorps après l'intervalle approprié de temps. On donne ci-après une description des divers titrages qui ont été effectués, en indiquant le composé particulier utilisé dans la préparation des anticorps et les autres composés pour lesquels l'anticorps pourrait être utilisé 10 dans un titrage. Des anticorps de morphine sont combinés avec la morphine marquée par un spin, préparée au moyen du procédé de l'exemple 4. les quantités des deux composants sont choisies par un titrage analogue à celui qui est décrit pour la fixation de l'haptène marqué 15 aux anticorps dinitrophényliques. On ajoute à une solution aqueuse de la morphine marquée et de l'anticorps de morphine combinés, des quantités croissantes de morphine et on observe la variation de l'intensité du signal de résonance des spins des électrons, les résultats sont reproduits sur la figure 2 du dessin annexé. s 20 On recherche également la codéine par le même mode opératoire, parce que sa structure est très apparentée à celle de la morphine. D'autres composés étroitement apparentés tels que la nalorphine 3 et le morphine-0 -glucuronide peuvent aussi être détectés, tandis que la détection est insensible aux dérivés analogues apparentés 25 de moins près, tels que la méthadone et les composés non apparentés tels que les amphétamines. Comme mentionné, une application préférée de l'invention réside dans la détection d'un médicament dans un liquide biologique. Comme autre exemple, de l'urine de sujets asservis à la drogue 30 a été soumise à un test conformément au procédé décrit ci-dessus. 3 le 0 -glucuronide de morphine représente le principal produit de morphine et d'héroïne excrété chez les êtres humains. Environ 80 io de la. quantité totale de morphine ingérée apparaît comme glucuronide dans l'urine. Etant donné que la morphine marquée par 35 un spin indiquée ci-dessus,en combinaison avec des anticorps de morphine, peut être utilisée pour déceler ce métabolite et la morphine, la détection est particulièrement efficace. 72 00687 79 2121723 Détection de la morphine et de son métabolite dans l'urine On ajoute les urines à des solutions contenant de la morphine marquée par un spin (exemple 4) liée à un anticorps de morphine dans une solution tamponnée à un pH d'environ 7,9 et on enregistre 5 le degré d'augmentation du signal de résonance des spins des électrons. L'augmentation est enregistrée sous forme d'un pourcentage de l'augmentation maximale du signal que l'on pourrait obtenir en présence de fortes concentrations de morphine. La morphine marquée est tout d'abord dissoute dans quelques 10 gouttes d'éthanol puis dans de l'eau, pour former une solution -5 ayant une concentration de 2 x 10 M. La concentration de l'anti- -5 corps dans l'eau est d'environ 1-2 x 10 M sur la base des sites de fixation. La solution d'anticorps contient environ 0,4 M de tris ou 0,6 H de borate de sodium, ce qui donne un pH 15 de 7,5 dans le premier cas et de 7,9 dans l'autre cas. Le pH baisse par suite de la dilution et de la présence d'acide dans l'urine. On ajoute à 20 jjI d'urine une quantité suffisante de —2 dichromate de sodium pour ajuster la concentration à 2 x 10 M, de manière à détruire toutes substances réductrices qui interfèrent. 20 L'échantillon d'urine est ensuite additionné de 10 jil d'un mélange à volumes égaux de la solution d'anticorps et de la solution de morphine marquée. Les résultats indiqués pour les échantillons d'urine 1-5 sur le tableau III sont les pourcentages d'augmentation que l'on 25 obtient pour un groupe d'échantillons d'urine recueillis au hasard sur des sujets qui n'ont pas absorbé de narcotiques depuis au moins une semaine. Les échantillons d'urine 6-10, sur le tableau III, proviennent de sujets connus asservis à l'héroïne et de patients auxquels la codéine est prescrite. Les forts pourcentages 30 d'augmentation pour ce dernier groupe démontrent l'efficacité de la technique de détection. 72 00687 80 2121723 TABLEAU III Témoins N° de l'échantillon d'urine Augmentation de l'intensité du signal.# 1) 6 | 6) 2) 3 7) 3) 5 8) 10 4) 7 9) 5) ' 4 10) Pour démontrer la sensibilité du procédé, on a comparé les résultats de la technique de détection du groupe de liaison avec ceux de l'essai de chromatographie en couche mince auquel on 15 a recours à l'heure actuelle. Dans l'essai de chromatographie en couche mince, de la morphine est extraite de l'urine par extraction par un solvant et, après évaporation des extraits, le résidu est analysé par chromatographie en couche mince. Etant donné que le glucuronide de morphine n'est pas extrait avec le 20 benzène, seule la morphine est détectée, et l'essai est relativement insensible. Sur le tableau IV, les résultats des deux méthodes de détection sont comparés pour l'urine recueillie sur un seul sujet absorbant de l'héroïne, qui a reconnu avoir absorbé le médicament le second et le cinquième jour . Il ressort des 25 résultats que la technique de détection du groupe de liaison permet de détecter le médicament même trois jours après son absorption. Cette conclusion a été confirmée par comparaison des résultats avec ceux que l'on a obtenus sur les mêmes échantillons d'urine, dans une technique perfectionnée de chromatographie 30 en couche mince dans laquelle le glucuronide de morphine est tout d'abord hydrolysé avec un acide pour former de la morphine libre. Ces résultats sont inclus à titre de comparaison dans le tableau IV. Bien que la technique perfectionnée de chromatographie en couche mince soit loin d'être aussi sensible que la technique 35 de détection d'un haptène, les résultats confirment que la technique utilisant un groupe marqué de liaison donne des résultats corrects. Groupe expérimental N0 de l'échan- Augmenta- Medica- tillon d'urine tion de l'intensite du signal.^ 58 81 100 75 62 ment absorbé héroïne héroïne héroïne codéine codéine 72 00687 81 2121723 TABLEAU IV Augmentation Résultats de Résultats de de l'intensité la chromato- la technique du signal, % graphie en perfectionnée 5 Jour couche mince de chromatographie en couche mince 1 17 - + 2 57 + + 3 32 - + 10 4 26 - + 5 . 47 + + 6 .26 - + 7 16 8 8 -- 15 9 40 + . + Détection de barbiturate Séconal On prépare un anticorps (y-globuline) en utilisant le conjugué de sécobarbital et de sérum-albumine de boeuf obtenu comme décrit 20 dans l'exemple 14. Le traceur à spin est l'acide U-2,2,5,5- tétraméthylpyrrolidino-1-oxyl-3-yl-5-(alpha~crotonamide)-5-(1'- méthylbutyl)barbiturique. La y-globuline a une constante de 7 liaison de 2,2 x 10 . Dans la conduite de la détection, on prépare deux solutions. 25 La première, ou solution A, utilise 1000 (J-l de y-globuline (7,35 x 10-5 ^ans ies Sites de fixation), 725 pi de solution de phosphate de potassium 1,5 M ajustée à un pH égal à 7, et 87,5 p.1 d'eau. La seconde solution, ou solution B, utilise 1175 Ri de séconal (traceur à spin) (5 x 10~^ k) et 637^5'ni d'eau. 30 La méthode de détection est.la même que celle qui est décrite pour le phénobarbital ci-après. En utilisant le phénobarbital comme anticorps, on peut détecter les concentrations minimales suivantes d'autres barbitals : pentobarbital, 2 ng/ml ; amobarbital, 2,5 ng/ml ; sel de sodium 35 du thiopental,3,5 ng/ml ; heptabarbital, 7ng/ml ; et sel de sodium du phénobarbital, 40 |ag/ml. ' . Pour éprouver la méthode de détection avec des échantillons d'urine de sujets qui nient avoir absorbé des barbituriques, 72 00687 82 2121723 an effectue des essais sur un total de 110 échantillons. 106 échantillons donnent des résultats inférieurs à environ 1 pg/ml, ce qui indique l'absence sensible de tous barbituriques détectés par l'anticorps du sécobarbital. Trois échantillons donnent des 5 résultats compris entre 1,1 et 1,4 pg/ml, qui sont négatifs après un nouvel essai. On suppose que les premiers résultats sont dus à des erreurs de manipulation. Un échantillon, qui donne un résultat compris entre 12 et 13 pg/ml, est contrôlé par chromatographie en phasesjfeazeuse et liquide et on constate la présence 10 de séconal." En modifiant le mode opératoire pour la détection du séconal, on choisit une charge (sites de liaison aux anticorps/molécules marquées par un spin) égale à 1,25, ce qui constitue un système dont la charge est légèrement en dessous de la normale, le pH 15 préféré est égal à 7, son passage à 8 ou à 6 n'entraînant pas de modification notable. Le fait d'accroître la concentration du tampon exerce peu d'effet. On constate que l'ordre d'addition selon lequel on ajoute d'abord l'échantillon inconnu et l'anticorps, puis le traceur à spin, donne un meilleur résultat que 20 l'ordre d'addition selon lequel on combine le traceur à spin et l'anticorps, puis on ajoute l'échantillon inconnu. Phénobarbital l'anticorps du phénobarbital (y -globuline) est préparé au moyen du conjugué de phénobarbital et de sérum-albumine de boeuf 25 obtenu comme décrit dans l'exemple 13. le groupe analogue utilisé comme traceur à spin est le îî-2',2',51,5'-tétraméthylpyrrolidine-1'-oxyl-3'-yl-5-éthyl-5-phénylbarbituryl-1-acétamide. la C Y-globuline a une constante de liaison de 9,4 x 10 . Dans la conduite de la détection, on prépare deux solutions. 30 la première, ou solution A, contient 1000 pi de y-globuline _ JT (5,96 x 10 M dans les sites de fixation) et 475 pl de phosphate de potassium 1,5 M, le pH étant ajusté à 7. La seconde solution ou solution B contient 404 pl du groupe marqueur à spin du phénobarbital (1,18 x 10"^ L), 956 pl d'eau et Ii5.pl de tampon 35 au phosphate de potassium 1,5 M. r :s ; On utilise deux coupelles en matière plastique :■ l'une- contient 5 pl de bichromate de sodium 0,2 H ; l'autre contient 5 pl de 72 00687 83 2121723 solution A. On mesure une partie aliquote de 50 (il de l'échantillon à expérimenter au moyen d'un tube capillaire Drummond, et on l'ajoute au dichromate contenu dans la première coupelle, puis on prélève exactement 20 [il de la solution résultante 5 au moyen du même tube capillaire et on les ajoute à la seconde coupelle. On ajoute ensuite à l'échantillon contenu dans la seconde coupelle 5 ni de la solution B. On fait ensuite monter une partie aliquote de la solution dans un tube capillaire, destiné à la mesure du spectre de résonance des spins des électrons et 10 on enregistre le spectre. Pour éprouver la méthode de détection sur des échantillons d'urine de sujets qui nient avoir absorbé tous barbituriques, on titre un total de 100 échantillons. Tous les échantillons se situent au-dessous d'une mobilisation de 15 15 En utilisant l'anticorps du phénobarbital, on peut détecter la concentration minimale suivante (mobilisation de 15 f°) d'autres barbituriques : méphobarbital, 0,9-1,0 jig/ml, heptabarbital, 2,9-3 ng/ml î amobarbital, 3,1-3,2 ng/ml ; thiopental et butisol, 7,2-7,3 ng/ml ; et séconal, 7,3-7,4 ng/ml. 20 Dans une autre mise à l'épreuve de la méthode de détection, on recueille 27 échantillons d'urine de divers sujets qui reconnaissent avoir absorbé des barbituriques. Sur les 27 échantillons soumis à l'essai, 22 se révèlent positifs. En ce qui concerne les 5 échantillons donnant des résultats négatifs, l'un d'eux 25 donne un résultat positif dans la recherche du séconal, deux sujets ayant absorbé le barbiturique longtemps avant que les échantillons soient recueillis, et les résultats négatifs des deux échantillons restants sont difficiles à expliquer. En modifiant les modes opératoires pour la détection du phéno-30 barbital, on constate que des rapports des sites de fixation de l'anticorps au marqueur -à spin plus grands que ceux qui ont été utilisés ci-dessus sont moins satisfaisants, la variation du pH par rapport à la valeur 7 n'offre aucun avantage, la concentration finale optimale du tampon est trouvée égale à 35 environ 0,1 M. Détection de l'amphétamine On prépare l'anticorps de l'amphétamine en utilisant le conjugué 72 00687 84 2121723 d'amphétamine et de sérum-albumine de boeuf obtenu conformément à l'exemple 21. Le marqueur à spin est préparé conformément à l'exemple 22 et consiste en 3-j(N-1 '-phényl-2'-propyl)-glycinamido)J-2,2,5,5-tétraméthy1-1-pyrrolidinyloxyle. La constante de liaison 5 pour la y -globuline est égale à 4,5 x 10^. Dans la conduite de la détection, on prépare deux solutions ï la solution A contient 22 ni de y-globuline (2,18 z 10 ^ M dans les sites de liaison) ; 144 ni de tampon de borate 2M (pH 8), et 99 de solution saline ; la solution B contient 160 ni d'une 10 solution à 2,8 x lo"*^ m élu marqueur à spin et 105 ni d'eau. On utilise deux coupelles en matière plastique. L'une contient 2,5 ni de dichromate de sodium 0,2 M. L'autre coupelle contient 5,0 ni de la solution d'anticorps. On transfère l'échantillon en utilisant un échantillonneur Oxford de 25 ni e"fc on l'introduit 15 dans la coupelle contenant le dichromate. On agite la solution contenant le dichromate et l'échantillon, on la fait monter dans le tube échantillonneur et on 1'introduit dans la coupelle contenant l'anticorps, sans toucher à ce dernier. On ajoute ensuite à la solution résultante 5 ni de traceur à spin, on agite ensuite 20 l'échantillon avec un tube capillaire RSE, on laisse monter l'échantillon dans le tube capillaire et on enregistre le spectre. A l'examen de 100 échantillons d'urine, on constate que la plupart de ces échantillons donnent une mobilisation égale ou inférieure à 10 #, c'est-à-dire la valeur de fond. Quatre échan-25 tillons d'urine "normale" se situent entre 10 et 14 $ de mobilisation. Pour 6 échantillons qui donnent des résultats supérieurs à 14 #, tous les individus affirment qu'ils ont absorbé des substances connues pour leur interférence, par exemple le phénéthyl-biguanide(DBI), des agents de décongestion contenant de la 30 phénylpropanolamine, de l'amphétamine et de la psuedophédrine ; et la mescaline qui est souvent diluée avec de l'amphétamine. Quatre échantillons d'urine renfermant de l'amphétamine d'après les résultats obtenus dans une clinique privée, donnent des résultats positifs dans l'essai de détection, dans la gamme de 35 0,7 à 1,5 ng/ml. Le rapport de charge du traceur à spin aux sites de fixation de l'anticorps est égal à 0,95, ce qui donne un rapport maximal 72 00687 85 2121723 égal à 5 (amphétamine 10"^ të/solution saline). Des rapports de charge un peu plus grands donnent des rapports d'intensités maximales un peu plus faibles. Méthadone 5 L'essai immunologique avec marquage par des spins est effectué de la même manière que les essais précédents. On utilise deux coupelles en matière plastique dont l'une contient 5 ni de dichromate de sodium 0,2 M et l'autre contient 5 ni d'anticorps tamponné au borate, à un pH égal à 8. La quantité de tampon présente 10 dans la solution d'anticorps est suffisante pour que la concentration finale soit égale à 0,18 M. On ajoute au dichromate 50 |il d'échantillon, et on transfère une partie aliquote de 20 p.1 de la première coupelle dans la seconde contenant la solution d'anticorps. On ajoute ensuite à la solution résultante 10 ^1 d'une 15 solution du marqueur à spin à une concentration de 3 x 10~^ M. Cinquante cinq échantillons d'urine sont testés conformément à la méthode décrite ci-dessus. On recueille les urines de patients absorbant de la méthadone. Un seul échantillon d'urine pour lequel la chromatographie en couche mince donne un résultat 20 positif en ce qui concerne la méthadone, donne un résultat négatif dans l'essai de détection. Des échantillons pour lesquels on trouve une faible concentration de méthadone sont soumis à l'essai de détection de la morphine, "de manière à s'assurer que de fortes concentrations de morphine ne risquent pas de donner 25 un résultat positif erroné. Pour un échantillon d'urine, on.obtient un résultat positif dans l'essai de recherche de la méthadone, qui revient à une valeur normale de fond au bout de 3 minutes. Dans ce cas, on suppose que le sujet est à la limite diabétique et absorbe du BDI, dont un métabolite peut avoir été oxydé dans 30 les conditions de la réaction en donnant un radical instable. Les résultats démontrent clairement l'excellente corrélation 'qui existe entre la méthode de détection de l'invention et la chromatographie en couche mince. Dans des variantes de la méthode, on constate qu'.un facteur 35 approprié de charge est égal à 1,15:1 (marqueur à spin/sites de liaison de l'anticorps). Si l'on s'écarte de ce rapport, il en résulte une réduction de la sensibilité. La dilution de la 72 00687 86 2121723 concentration du marqueur à spin requiert un examen réduit, pour obtenir les mêmes résultats. le procédé de l'invention, utilisant des composés de l'invention en combinaison avec des anticorps préparés conformément à 5 l'invention, constitue une méthode rapide et pratique de détermination précise d'une grande variété de substances intéressantes du point de vue biologique. De plus, en contraste avec les procédés antérieurs, le procédé de l'invention offre un plus haut degré de précision et d'indépendance par rapport à d'autres matières 10 susceptibles d'interférer. Etant donné que le radical utilisé comme groupe analogue peut être préparé dans des conditions d'interférence minimale avec la géométrie spatiale et les caractéristiques polaires saillantes de la molécule, et qu'il n'y a aucun rapport avec la rétention de l'activité physiologique de 15 la molécule à détecter, le procédé a une très grande souplesse d'utilisation. En outre, des réactifs peuvent être préparés et conservés pendant de longues périodes de temps sans modification notable de leur activité, ou bien ils peuvent être aisément étalonnés, et des déterminâtiongfceuvent être effectuées rapidement 20 sans manipulations multiples ou sans longues périodes d'attente. Il n'est généralement pas nécessaire d'isoler ou de séparer sensiblement des autres groupes la substance à détecter. On évite l'utilisation de radio-isotopes qui sont souvent dangereux et qui présentent des difficultés de manipulation. De même, le 25 procédé ne présente pas les inconvénients des techniques colori-métriques, qui ne s'appliquent pas à des solutions opaques ou troubles. 72 00687 87 2121723 IffiVEITDICATIOHS î. Procédé de détection de la présence d'un groupe de liaison dans un milieu, caractérisé par le fait qu'il consiste à combiner le milieu susceptible de renfermer le groupe de . 5 liaison avec (1) le groupe analogue et (2) un récepteur, le groupe analogue consistant en un radical présentant une analogie avec au moins une partie de l'organisation spatiale et polaire du groupe de liaison, de manière à .pouvoir entrer en compétition avec ce groupe pour les sites du récepteur, en liaison avec un 10 radical libre présentant un spectre de résonance des spins des électrons, et le récepteur étant capable de se combiner avec le groupe de liaison et le groupe analogue, puis à déterminer au moins un point du spectre du groupe analogue, comparativement au spectre de ce groupe analogue traité de la même manière, 15 excepté que le groupe de liaison est absent. 2. Procédé suivant la revendication 1, caractérisé par le fait que le groupe analogue est initialement lié de façon réversible au récepteur, puis on ajoute le milieu susceptible de renfermer le groupe de liaison. 20 3. Procédé suivant la revendication 1, caractérisé par le fait que le récepteur est un anticorps. 4. Procédé suivant la revendication 1, caractérisé par le fait que le groupe analogue est le groupe de liaison attaché par un groupe de jonction à un composé hétérocyclique à radical 25 nitroxyde libre ayant un noyau pentagonal ou hexagonal, l'atome d'azote du groupe nitroxyde représentant un chaînon de l'hétérocy-cle. 5. Procédé suivant la revendication 4, caractérisé par le fait que le groupe de liaison est me hormone stéroïde, une 30 hormone polypeptidique, un narcotique, en particulier la morphine ou la codéine, une amphétamine, un bartiturate, une ecgonine, la cocaïne, la méthadone, le glutéthimide ou le propoxyphène. 6. Procédé de détection de la présence d'un groupe de liaison dans un milieu, dans lequel le groupe de liaison a 35 au moins un groupe polaire et son poids moléculaire est compris dans la gamme d'environ 125 à 5000, procédé caractérisé par le fait qu'il consiste à combiner (1) un groupe analogue avec (2) un anticorps, le groupe analogue consistant en un radical pré- 72 00687 88 2121723 sentant une analogie avec au moins une partie de l'organisation spatiale et polaire du groupe de liaison, de manière à pouvoir entrer en compétition avec le groupe de liaison vis-à-vis de l'anticorps, et lié à un groupe à radical nitroxyde libre présentant vin spectre 5 de résonance des spins des électrons, l'anticorps étant capable de se combiner avec le groupe de liaison et son analogue, à mélanger le milieu susceptible de renfermer le groupe de liaison avec la combinaison du groupe analogue et de l'anticorps, de manière à déplacer, par compétition, au moins une partie du groupe analogue 10 dudit anticorps, puis à détecter la variation, due au déplacement, d'au moins un point du spectre de résonance des spins des électrons. 7. Procédé de détection de la présence d'un groupe de liaison dans un milieu, le groupe de liaison ayant au moins un site polaire et son poids moléculaire étant compris dans la gamme 15 d'environ 125 à 5000, procédé caractérisé par le fait qu'il consiste à combiner (1) le milieu susceptible de renfermer un groupe de liaison avec (2) un anticorps, à adjoindre un groupe analogue à la combinaison du milieu et de l'anticorps, le groupe analogue consistant en un radical présentant une analogie avec au moins 20 une partie de l'organisation spatiale et polaire du groupe de liaison, de manière à pouvoir entrer en compétition avec - ce dernier vis-à-vis de l'anticorps, et lié à un groupe à radical nitroxyde libre présentant un spectre de résonance des spins des électrons, l'anticorps étant capable de se combiner avec le groupe 25 de liaison et son groupe analogue, puis à déterminer au moins un point du spectre du groupe analogue, comparativement au spectre de ce même groupe, traité de la même manière, excepté l'absence du groupe de liaison. 8. Procédé de détection de la présence d'un groupe de 30 liaison dans un milieu, dans lequel le groupe de liaison a au moins un site polaire et a un poids moléculaire compris dans la gamme d'environ 125 à 5000, caractérisé par le fait qu'il consiste à combiner (1) le milieu susceptible de renfermer le groupe de liaison avec (2) le groupe analogue et à adjoindre un anticorps à la 35 combinaison du milieu et du groupe analogue, le groupe analogue consistant en un radical présentant une analogie avec au moins une partie de l'organisation spatiale et polaire du groupe de liaison, de manière à pouvoir entrer en compétition avec ce dernier vis-à-vis de l'anticorps, et lié à un groupe à radical nitroxydelibre 72 00687 89 2121723 présentant un spectre de résonance des spins des électrons, l'anticorps étant capable d'entrer en combinaison avec le groupe de liaison et son groupe analogue, puis à déterminer au moins un point du spectre du groupe analogue comparativement au spectre 5 de ce groupe traité de la même manière, excepté l'absence du groupe de liaison. 9. Procédé suivant la revendication 4, caractérisé par le fait que le nitroxyde hétérocyclique est le 2,2,5,5-tétraméthyl-1-pyrrolidino-oxyle ou le 2,2,6,6-tétraméthyl-1-pipéridino-10 oxyle. 10. Morphine ou composé analogue à la morphine, marqué par un radical libre, utile notamment dans le procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 4, caractérisé par le fait que son squelette a une structure minimale répondant à 15 la formule : dans laquelle X est un groupe de jonction et A est un groupe hétérocyclique pentagonal ou hexagonal contenant un radical nitroxyde libre stable, l'un des chaînons de l'hétérocycle étant l'azote de la fonction nitroxyde, le poids moléculaire étant com-20 pris entre environ 350 et 700 et la structure minimale du squelette présentant une analogie avec les caractéristiques spatiales et polaires d'au moins une partie de la morphine,de la codéine ou d'un dérivé analogue à la morphine, doué d'activité physiologique. 25 11. Morphine ou dérivé analogue à la morphine marqué par un radical libre suivant la revendication 10, caractérisé par le fait qu'il répond à la formule : 72 00687 90 2121723 dans laquelle ¥ est un atome d'hydrogène ou un groupe hydrocarboné 2 3 en C.j à Cg ; ¥ est tm atome d'hydrogène ; W est -un atome d'hydrogène ; est un atome d'hydrogène ou forme, en 3 association avec W , un radical divalent comprenant 5 3 à 6 atomes de carbone et 0 à 2 atomes d'oxygène, et formant un noyau carbocyclique hexagonal avec la chaîne carbonée à laquelle 5 ils sont attachés ; ¥ est un atome d'hydrogène ou un groupe g hydroxyle ; ¥ est un atome d'hydrogène, un groupe hydroxyle > 5 7 ou, en association avec ¥ , une fonction oxy ; V/ est un atome g 10 d'hydrogène ou un groupe méthyle ; ¥ est un atome d'hydrogène g ou un groupe hydroxyle ; ¥ est un atome d'hydrogène, un groupe hydroxy, acyloxy en C^ à C^, hydrocarbyloxy en C^ à C^, 2-(ïT- morpholino)-éthyle ou glucuronyle ; à condition que l'un des 1 9 groupes ¥ à ¥ soit un groupe -X*-A* ou qu'un atome d'hydrogène 1 9 15 de l'un des groupes ¥ à ¥ soit remplacé par tm groupe -X*-A*, X* étant une liaison ou un groupe stable de jonction en C^ à C^q, constitué uniquement par du carbone, de l'hydrogène, de l'azote, de l'oxygène, du phosphore et du soufre, et A* étant un radical nitroxyde libre dont l'atome d'azote est un chaînon hétérocyclique 20 d'un hétérocycle pentagonal ou hexagonal. 12. Méthadone ou dérivé analogue à la méthadone, marqué par un radical libre, utile notamment dans le procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 4, caractérisé par le fait qu'il répond à la formule : 72 00687 91 2121723 10 dans laquelle n est égal à O ou 1, m est égal à 2 ou 3 î W est 11 12 ~~ tm atome d'hydrogène j ¥ - et ¥ représentent de l'hydrogène, des groupes alkyle en à C^, ou peuvent s'associer pour former un noyau hexagonal avec l'atome d'azote auquel, ils s'ont attachés; 13 5 les groupes ¥ représentent de l'hydrogène ou des groupes méthyle un seul étant un groupe méthyle ; ¥^ est un atome d'hydrogène ; 15 W est un atome d'hydrogène ou un groupe hydroxyle ; 16 * ¥ est un atome d'hydrogène, un groupe acyloxy en C1 à C„ ou 17 ^ hydroxy ; et ¥ est un atome d'hydrogène ou un groupe alkyle 10 17 10 en à C^, à condition que l'un, des groupes ¥ à ¥ soit un groupe -X*-A* ou qu'un atome d'hydrogène de l'un des groupes ¥^ à W1 ^ soit remplacé par un groupe X* étant une liaison ou un groupe stable de jonction en à constitué uniquement par du carbone, de l'hydrogène, de l'azote, de l'oxygèn 15 du phosphore et du soufre, et A* étant un groupe contenant-un radical nitroxyde libre stable. 13. Amphétamines et composés apparentés substitués par un radical libre, utiles notamment dans le procédé selon . l'une quelconque des revendications 1 à 4, caractérisés-par-le 20 fait qu'ils répondent à la formule : W*3 WV2 » t « ch ■ XJ ■n w"0 72 00687 92 2121723 dans laquelle et sont des atomes d'hydrogène ou des AO groupes alkyle en C. à C, ; W est un atome d'hydrogène, un 43 groupe alkyle en C. a C„ ou un groupe carboxy ; W est un 1 ■> 44 45 atome d'hydrogene ou un groupe hydroxyle ; W et ¥ sont des 5 groupes hydroxyle ou alkoxy en à C^, à condition que l'un des groupes ¥^° à ¥^ soit un groupe ou qu'un atoXe/'0^^116 des groupes ¥^ à ¥^ soit remplacé par un groupe -X*-A*, X* étant une liaison ou Tin groupe stable de jonction en à constitué uniquement par du carbone, de l'hydrogène, de l'azote, 10 de l'oxygène", du phosphore ou du soufre, et A* étant un groupe contenant un radical nitroxyde libre stable. 14. Barbiturates et dérivés analogues substitués par un radical libre, utiles notamment dans le procédé selon 1 à l'une quelconque des revendications/4, caractérisés par le fait 15 qu'ils répondent à la formule : 50 dans laquelle ¥ est un atome d'hydrogène, un groupe alkyle en Cj CO C.j à ou un métal alcalin ; ¥ et ¥ représentent de l'hydrogène, des groupes alkyle, alcényle, cycloalkyle, cyclo- alcényle ou aryle n'ayant pas plus de 8 atomes de carbone ; 20 est un atome d'hydrogène ou un métal alcalin ; est un atome d'oxygène ou de soufre, à condition que l'un des groupes 50 > 54 ¥ a W soit un groupe -X*-A* ou qu'un atome d'hydrogène des 50 , 54 groupes ¥ à ¥ soit remplacé par un groupe -X*—A*, X* étant une liaison ou un groupe stable de jonction en à C^Q, constitué 25 uniquement par du carbone, de l'hydrogène, de l'azote, de l'oxygène, du phosphore et du soufre, et A* étant un groupe contenant un radical nitroxyde libre stable,, 72 00687 93 2121723 15. Cocaïne et composés apparentés marqués par un radical libre, utiles notamment dans le procédé selon l'une quelconque des revendications là 4, caractérisés&ar le fait qu'ils répondent à la formule î Vïj5 s 10 ci cii chcow* \ f n-w57 ch-ov7 5 6 / l ch2 ch ch, 55 dans laquelle ¥ est un groupe hydroxy, méthoxy ou amino ; 56 57 W est un atome d'hydrogène ou un groupe benzoyle ; et ¥ est un atome d'hydrogène ou un groupe alkyle en C, à C, ; l'un des 55 57 x groupes ¥ à ¥ étant un groupe -X*-A* ou un atome d'hydrogène 55 57 ~ des groupes ¥ a ¥ étant remplace par un groupe -X*-A*, X* étant une liaison ou un groupe stable de jonction en C.j à constitué uniquement par du carbone, de l'hydrogène, de l'azote, de l'oxygène, du phosphore et du soufre et A* étant un groupe contenant tin radical nitroxyde libre stable. 16. Stéroïdes marqués par un radical libre, comportant 15 18 à 27 atomes de carbone et présentant une à six fonctions renfermant de l'oxygène, utiles notamment dans le procédé,selon l'une quelconque des revendications 1 à 4, caractérisés par le fait que leur squelette a une structure minimale -'.de formule 72 00687 94 2121723 dans laquelle X est une liaison ou. un groupe stable de jonction et A est un. groupe contenant tm radical nitroxyde libre stable autre qu.run oxazole, et Z est un groupe hydroxy, oxo ou aliphatique en h Cg, ou tm groupe aliphatique oxygéné ayant 1 à 3 atomes d'oxygène et 1 à S atomes de carbone, au très qu'un groupe carboxy-alkyle. 17. Carmabinol marqué par des radicaux libres, utile notamment dans le procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 4, caractérisé par le fait qu'il répond à la formule talO 0-1 site d1insaturation éthylénique 10 dans laquelle Wa"'® et Wa^ désignent de l'hydrogène et Wa^ est un groupe hydroxyle, à condition que l'un des groupes al O a 1 ? W à V/ soit tm groupe -X*-A*, X* étant une liaison ou un groupe stable de jonction en à C^Q, constitué uniquement par du carbone, de l'hydrogène, de l'azote, de l'oxygène, du phosphore 15 et du soufre, et A* étant un groupe contenant un radical nitroxyde libre stable.. 18. Prostaglandine marquée par un radical libre, utile notamment dans le procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 4, caractérisée par le fait qu'elle répond 20 à la formule : wa20 0-1 site d*insaturation éthylénique \jài23 C5H9-11 V?a22 C6H1Q-12~C0W ,,a24 72 00687 2121723 dans laquelle à désignent de l'hydrogène ou des groupes hydroxyle, l'un au moins étant un groupe hydroxyle ; ,je24 est un groupe hydroxyle, amino, ou un groupe oxy en C^ à Cg, à condition que l'un des groupes ,.(32° à ¥a^ soit un groupe a20 5 -X*-A* ou qu'un atome d'hydrogene de l'un des groupes ¥ à a24 . ¥ soit remplacé par un groupe -X*-A*, X* étant une liaison ou un groupe de jonction en C^ à C^q, constitué uniquement par du carbone, de l'hydrogène, de l'azote, de l'oxygène, du phosphore et du soufre, et A* étant un groupe contenant un radical 10 nitroxyde libre stable. 19. Méprobamate marqué par un radical libre, utile notamment dans le procédé suivant l'une quelconque des revendications 1 à 4, caractérisé par le fait qu'il répond à la formule î O C3H7 O w^-coch — c—or—0—c—w326 ^ | 2 CH 3 a2R 326 x dans laquelle ¥ et ¥ sont des groupes amino, a condition 15 que l'un des groupes ¥a^ et ¥a^" soit un groupe -X*-A* ou qu'un atome d'hydrogène de l'un de ces deux groupes soit remplacé par un groupe -X*-A*, X* étant une liaison ou un groupe de jonction ayant 1 à 30 atomes de carbone, composé uniquement d'atomes de carbone, d'hydrogène, d'azote, d'oxygène, de 20 phosphore et de soufre et A* étant un groupe à radical nitroxyde libre stable. 20. Benzodiazacycloheptane marqué par un radical libre, utile notamment dans un procédé conforme à l'une quelconque des revendications 1 à 4, caractérisé par le fait qu'il répond à 25 la formule : 72 00687 ' .-v i . 96 2121723 dans laquelle w330 et TC3^ sont des atomes d'hydrogène ; W3^ est un atome d'hydrogène, un groupe alkyle inférieur en à ou peut s'associer avec ^32 pour former une double liaison ; ^33 est un groupe amino, (alkyle inférieur)-amino en à C^; 5 ou peut former en association avec W^^-un groupe carbonyle; W3^ est un atome d'hydrogène ou un groupe hydroxyle et W3^ est un groupe oxy ou une paire non partagée d'électrons, à condition que l'un des groupes W3"^ à W3^ soit tm groupe -X*-A* ou qu'un atome d'hydrogène de l'un des groupes à W3^-' soit 10 remplacé par un groupe -X*-A*, X* étant une liaison ou un groupe de jonction en à C^q constitué uniquement par du carbone, de l'hydrogène, de l'azote,de l'oxygène, du phosphore et du soufre et A* étant un groupe contenant un radical nitroxyde libre stable. 15 21. Phénothiazine marquée par un radical libre, utile notamment dans un procédé conforme à l'une quelconque des revendications 1 à 4, caractérisée par le fait qu'elle répond à la formule : 72 00687 97 2121723 dans laquelle ïïa^est un atome d'hydrogène ; un groupe alkyle en à Cg ; un groupe dialkylaminoalkyle en C^ à Cg ; tm groupe N-hydroxyalkyl - !!' -pipérazinoalkyle, les groupes alkyle ayant 2 ou 3 atomes de carbone ; U-alkyl-N1-pipérazinoalkyle, le 5 groupe îT-alkyle ayant 1 à 3 atomes de carbone et le second groupe alkyle ayant 2 ou 3 atomes de carbone ; ou 2-(lï-alkyl)-pipéridinoalkyle, le groupe îl-alkyle ayant 1 à 3 atomes de carbone et le second groupe alkyle ayant 2 ou 3 atomes de carbone ; les hétéroatomes étant séparés par au moins deux atomes 10 de carbone Wa41 est un atome d'hydrogène, un radical chloro, un groupe trifluorométhyle, alkylmercapto en C^ à C^ ou alkyle en 0, à-Oj Î 'y?*1 et ^43 sont des atomes d'hydrogène, à condition 15 que l'un des groupes à Wa^ soit un groupe —X*-A* ou qu'un atome d'hydrogène de l'un des groupes ¥a^° à W3'4'5 soit remplacé par un groupe -X*-A*, 2* étant une liaison ou un groupe de jonction en C^ à C^q constitué uniquement par du carbone, de l'hydrogène, de l'azote, de l'oxygène, du phosphore 20 et du soufre, et A* étant un groupe contenant un radical nitroxyde libre stable. 22. (xlutéthimide marqué par un radical libre, utile notamment dans un procédé conforme à l'uhë quelconque des revendications 1 à 4, caractérisé par le fait qu'il répond à 25 la formule : ^50 p cjo dans laquelle W et M désignent des atomes d'hydrogène, et Va52 est un groupe alkyle inférieur en C, à C, ; à condition a51 a52 que l'un des groupes \j et W soit un groupe -X*-A* ou qu'un 98 72 00687 2121723 oÇI oÇO atone d'hydrogene de l'un des groupes W et ¥ soit remplace par un groupe —X*~A*, X* étant une liaison ou un groupe de jonction . en C, à CL„ constitué ttniauement par du carbone, de l'hydrogène, 1 yj .de l'azote, de l'oxygène, du phosphore et du soufre et À* 5 étant un groupe contenant un radical nitroxyde libre stable. 25« Iîéthadone ou dérivé analogue de méthadone marqué par un radical libre, utile notamment dans un procédé conforme à l'une quelconque des revendications 1 à 4, caractérisé par le fait qu'il répond à la formule ï H17- 11 12 10 dans laquelle ¥ et W désignent de l'hydrogène,^ des groupes méthyle, ou s'associent avec l'atome d'azote auquel ils sont attachés pour former tm noyau de morpholine ou de pipéridine ; 17 et \1 est un groupe alkyle en à ; à condition que l'un quelconque des groupes ¥ soit un groupe -X*-A* ou qu'un atome 15 d'hydrogène de l'un des groupes ¥ soit remplacé par un groupe -X*-A*, X* étant un groupe"de jonction contenant 0 à 8 atomes de carbone et un à six hétéroatomes qui sont des atomes d'oxygène et d'azote, et ayant au moins une fonction non-oxocarbonylique, et étant un groupe contenant un radical nitroxyde libre 20 stable. i