FR 2128595 A1 19721020 FR 7207493 A 19720303 72 07493 i 2128595 On obtient de nouveaux antibiotiques utiles en cultivant des souches d'un microorganisme particulier dans des milieux nutritifs aqueux appropriés dans des conditions contrôlées. Généralement, avant que ces antibiotiques soient d'une valeur 5 pratique quelconque, ils doivent être obtenus dans une forme purifiée sensiblement exempte des autres matières organiques ainsi que d'un certain nombre de composés minéraux qui sont présents dans les bouillons de fermentation ou leurs concentrés. La présente invention concerne des procédés pour recueillir un tel 10 antibiotique sous une forme purifiée. L'invention concerne un procédé à plusieurs étapes pour recueillir et purifier une nouvelle substance antibiotique, l'acide 7-(3-(D-5-amino-5-carboxyvaléramido)-3-carbamoyloxyméthyl) 7-méthoxy-3-céphëm-4-carboxylique ou ses sels, à partir de solu-15 tions aqueuses contenant cet antibiotique, en mettant d'abord en contact le bouillon de fermentation dans lequel l'antibiotique a été produit avec une résine échangeuse de cations de manière à adsorber l'antibiotique sur cette résine et, en deuxième lieu, en éluant l'antibiotique de l'adsorbat avec une base faible, line 20 solution aqueuse d'une base organique ou d'une base minérale ; en troisième lieu, en mettant en contact les éluats concentrés avec une résine d'échange anionique faiblement basique pour adsorber l'antibiotique sur cette résine y en quatrième lieu, en lavant la résine avec une solution diluée d'un acide alcanoïque 25 inférieur pour éliminer les impuiebés sur la résine j et finalement, en éluant l'antibiotique sensiblement pur de l'adsorbat en utilisant une base faible ou une solution tampon. La solution tampon peut être n'importe quel tampon aqueux usuel dans l'intervalle de pH de 4,5 à 9,5. Par exemple, on peut utiliser des tam-30 pons phosphates, acétates, borates et citrates. L'ordre des étapes et les divers réactifs utilisés sont critiques pour l'obtention du rendement maximal. Chaque étape sera décrite plus en détail ci-après. L'antibiotique acide 7-P-(D-5-amino-5-carboxyvaléramido) 35 -3-(carbamoyloxyméthyl)-7-méthoxy-3-céphem-4-carboxylique et ses sels sont efficaces pour inhiber le développement de divers microorganismes gram-négatifs et gram-positifs. 72 07493 2 2128595 De l'acide 7-P-(D-5-amino-5-carboxyvaléramido)-3-(carbamoyloxyméthyl)-7-méthoxy-3-céphem-4-carboxylique ayant la Formule I ci-après est produit durant la fermentation aérobie de milieux nutritifs appropriés, dans des conditions contrôlées, 5 par une souche de Streptomyces lactamdurans capable de produire ce composé, par exemple par la souche en dépôt permanent non limité dans la collection de cultures de la Northern Utilization Research and Development Branch du Department of Agriculture des E.U.A. à Peoria, Illinois, sous le numéro HRRL 3802, et il est 10 actif pour inhiber le développement de microorganismes gram-posi-tifs et grafli-négatifs. !f2 {? OCH, 0 H0C-CH-CH2-CH2-CH2 -0-NÏÏ-,'7— Ifl h 3 / I 0 M 00H ^H20CNH£ Ce composé est amphotère avec un point isoélectrique apparent de pH 3,5 environ et est très stable en solution à un pH de 1,5 à 9,0 environ. 15 La nature amphotère de ce composé permet l'utilisation de résines échangeuses d'ions tant cationiques qu'anioniques dans la purification du composé. Toutefois, en raison de la complexité du bouillon de fermentation brut, de nombreuses autres substances acides et/ou basiques sont présentes. 20 La présente invention a donc pour but de fournir un procédé de purification qui entraînera l'isolement du produit final avec un rendement élevé, en utilisant un petit nombre d'étapes de manipulation. ïïlle a aussi pour but d'isoler le produit final dans une forme qui peut être utilisée directement 25 comme antibiotique, ou dans d'autres synthèses chimiques, sans modification chimique supplémentaire. Selon la présente invention, on a trouvé que l'acide 7-3-(D-5-amino-5-carboxyvaléramido)-3-(carbamoyloxyméthyl)-7-méthoxy-3-céphem-4-carboxylique et ses sels peuvent être purifiés 72 07493 3 2128595 par utilisation, d'un procédé de purification comportant plusieurs étapes. La matière de départ à purifier est sous la forme du bouillon de fermentation brut. Des bouillons partiellement puri-5 fiés peuvent aussi être utilisés dans ce procédé ; toutefois, l'avantage de ce procédé est que le bouillon brut n'exige pas de traitement préliminaire. Le bouillon contenant l'antibiotique est passé à travers une colonne d'échange d'ions cationique. Une résine typique est 10 du type sulfonate ayant une matrice de styrène-divinylbenzène, par exemple la résine polystyrène-acide sulfonique nucléaire Dowex 50 sur le cycle hydrogène. On préfère utiliser la résine dite Dowex 50 x 4, ce qui signifie que la résine comporte 4$ de réticulation. On peut utiliser d'autres résines d'acide sulfoni-15 que disponibles dans le commerce. Le bouillon est réglé à des pH au-dessous de 7, par exemple compris entre 1,5 et 7, avant contact avec la résine. De préférence, le pH est réglé entre 2 et 4 par addition de petites quantités d'un acide inorganique ou organique quelconque. L'acide 20 préféré est l'acide phosphorique, chlorhydrique ou sulfurique, mais évidemment ce choix n'est pas critique. L'adsorbat sur résine résultant est ensuité élue avec xine solution aqueuse d'une base faible. La concentration de l'é-luant est de 0,1-2,0 M. Le choix de la base n'est pas très cri-25 tique, et ce peut être une base organique comme la pyridine, une trialcoylamine comme la triéthylamine, une picoline, la triéthandt-amine ou une lutidine, ou une solution aqueuse d'une base organique ou inorganique comme NH^OH. L'éluant préféré est une base organique volatile, car elle peut alors être facilement éliminée. 30 La pyridine est spécialement préférée. Les éluats sont recueillis en fractions, l'importance de la fraction dépendant des dimensions de la colonne utilisée. On mesure la bioactivité des éluats au moyen d'un essai utilisant Vibrio percolans comme organisme d'essai. Les fractions contenant 35 la majeure partie de la matière active sont alors concentrées, généralement sous vide, pour élimination de toute base volatile et des solvants organiques. Cette purification utilisant la résine échangeuse de cations n'est évidemment pas limitée à des bouil- 72 07493 2128595 Ions de fermentation, mais peut être utilisée avec n'importe quelle solution impure du composé de formule I. Ce concentré est ensuite réglé à un pH de 5-7 environ et passé à travers une résine échangeuse d'anions du type faible-5 ment basique, comme une résine d'aminé tertiaire sur une matrice acrylique ou une matrice styrène-divinylbenzène. Un exemple du premier type est la résine dite IRA-68, dans le cycle chlorure, formiate ou acétate. Pour cette résine, on a trouvé que le pH optimal est compris entre 6 et 7, bien que le pH ne soit pas 10 extrêmement critique. L'adsorbat sur résine résultant est ensuite "lavé" avec une solution aqueuse diluée d'un acide alcanbïque inférieur, Par "acide alcanoïque inférieur", on désigne de préférence un acide ayant de 1 à 5 atomes de carbone. L'espèce préférée est l'acide 15 acétique. Bien qu'on ne désire pas être limité par la théorie, 1'"étape de lavage", crée une compétition pour les emplacements acides sur la résine. Les substances moins acides qui sont des impuretés sur le produit antibiotique sont enlevées par cette étape de lavage à l'acide ; mais, d'une manière surprenante, 20 l'antibiotique basique reste adsorbé sur la résine. En conséquence, cette adsorption et ce lavage en combinaison augmentent beaucoup la pureté du produit final. On a trouvé que la solution aqueuse de l'acide alcanoïque inférieur est utilisable entre 0,1 et 1,0 M, et est de préfé-25 rence à 0,5-0,75 M environ. Le volume total du liquide acide de lavage est évidemment fonction des dimensions de la colonne et peut être déterminé expérimentalement. Par exemple, on a trouvé qu'une quantité égale à 5 fois le volume de la colonne élimine 90# des impuretés, avec une perte de moins de 6# de substance 30 active. On peut utiliser de façon appropriée des quantités de liquide acide de lavage comprises entre 3 et 10 fois le volume de la colonne. L'adsorbat sur résine "lavé" est ensuite élué avec un certain nombre de substances d'une manière satisfaisante. On 35 utilise de préférence une base organique faible ou un sel correspondant, comme la pyridine ou le chlorhydrate de pyridine, en solution aqueuse* 72 07493 2128595 Un autre éluant est tin tampon phosphate inorganique aqueux à un pH de 8 environ. les fractions d'éluat contenant la matière active ont été identifiées par l'essai décrit ci-dessus. Généralement, la 5 majeure partie de l'activité est recueillie dans les fractions 1 à 7 de l'éluat, et un intervalle encore plus étroit est celui de 2 à 5. L'antibiotique purifié peut ensuite être séparé de 1'éluant comme par évaporation, mais il peut être encore traité 10 chimiquement pour former des dérivés chimiques possédant une activité antibiotique. Le composé antibiotique de formule I ci-dessus et ses sels présentent une résistance non seulement à la pénicillinase, mais aussi aux céphalosporinases et il présente une activité 15 accrue contre des microorganismes gram-négatifs. Contrairement à la céphalosporine C qui a une activité antibactérienne relativement basse, les produits de la présente invention présentent un notable effet gram-négatif in vivo avec une puissance qui, en général, est supérieure à celle de la céphalothine. Cette activi-20 té comprend line efficacité in vivo sur Proteus morganii et, de plus, une efficacité contre les bactéries gram-négatives suivantes : Escherichia coli, Proteu3 vulgaris. Proteus mirabilis, Salmonella schottmuelleri, Klebsie-lla pneumoniae AD, Klebsiella pneumoniae B et Paracolobactrum arizoniae. 25 Les bioessais pour cet antibiotique sont effectués par un procédé à disques et plaques en utilisant des disques en papier-filtre de 1,27 cm. On prépare les plaques d'essai en utilisant de la gélose nutritive Difco plus 2,0 g/l d'extrait de 3 levures Difco à raison de 10 cm par plaque. Une culture d'une 30 nuit de l'organisme d'essai, Vibrio percolans ATCC 8461 est diluée dans une solution saline stérile de manière à former une suspension ayant un facteur de transmission de 40# à une longueur ■2 d'orite de 660 mji. Cette suspension à 20 cm /l de milieu avant coulée des plaques. 35 Les plaques d'essai sont maintenues à 4°C jusqu'à leur utilisation (5jours au maximum). Après l'application des disques d'essai saturés d'antibiotique, les plaques sont mises en incubation à 28°C pendant une période de 8 à 24 heures. On note le 72 07493 2128595 diamètre en millimètres des zones d'inhibition. On utilise ces résultats pour déterminer les puissances relatives ou, quand on les compare à un étalon de référence purifié, la puissance en 7 jig/cm . 5 L'acide 7-P-(D-5-amino-carboxyvaléramido)-3-(carbamoyl- oxyméthyl)-7-méthoxy-3-céphem-4—carboxyli-que est produit durant la fermentation aérobie de milieux nutritifs aqueux appropriés dans des conditions contrôlées par inoculation avec l'organisme Streptomyces lactamdurans NBBL 3802. Des milieux aqueux tels que 10 ceux utilisés pour la production d'autres antibiotiques sont utilisables pour produire l'antibiotique acide 7-f3-(D-5-amino-5-carboxyvaléramido)-3-(carbamqsLoxyméthyl)-7-méthoxy-3-céphem-4-carboxylique. Ces milieux contiennent des sources de carbone et d'azote assimilables par le microorganisme et des sels inorgani-15 ques. En général, des hydrates de carbone tels que des sucres, par exemple du glucose, de l'arabinose, du maltose, du raffinose, du xylose, du mannitol, etc.., et des amidons tels que des céréales, par exemple de l'avoine, du riz, de l'amidon de maïs, de la 20 farine de maïs, etc.., peuvent être utilisés isolément ou en combinaison comme sources de carbone assimilable dans le milieu nutritif. La quantité exacte de la source ou des sources d'hydrate de carbone qu'on utilise dans le milieu dépend en partie des autres ingrédients du milieu, mais en général la quantité d'hydra-25 te de carbone varie habituellement entre 1 et 6# environ du poids du milieu. Ces sources de carbone peuvent être utilisées individuellement ou plusieurs de ces sources de carbone peuvent être combinées dans le milieu. En général, n'importe quelle matière du type protéique peut être utilisée comme source d'azote dans 30 le procédé de fermentation. Les sources d'azote utilisables comprennent, par exemple, des hydrolysats de levures, la levure dite "amber yeast", la farine de soja, des hydrolysats ou de la caséine, la liqueur de macération de maïs, des produits solubles de distillerie, de la pâte de tomate, etc. Les sources d'azote, 35 isolément ou en combinaison, sont utilisées à raison de 0,2 à 6# environ du poids du milieu aqueux. La fermentation est conduite à des températures comprises entre 20 et 37°C environ ; toutefois, pour les meilleurs résul 72 07493 7 2128595 tats, il est préférable de conduire la fermentation à des températures comprises entre 24 et 32°C environ, le pH des milieux nutritifs utilisables pour la culture des Streptomyces lactamdu— rans et pour la production de l'antibiotique doit être compris 5 entre 6,0 et 8, 0 environ. les exemples non limitatifs suivants montreront bien comment l'invention peut être mise en oeuvre. exemple 1. Etape A : Fermentation 10 On utilise un tube lyophilisé de culture de Streptomy- ces lactamdurans (lîEEL 3802) pour inoculer 50 cm^ de Milieu I __ __________ stérile dans une fiole d'Erlenmeyer de 200 cm pourvue de chicanes. Milieu I 15 Autolysat de levures (ardamine) 10,0 g Glucose 10,0 g 3 Tampon phosphate 2,0 cm MgS02.7H20 0,05 g Eau distillée, pH 6,5 1000,0 cm^ 20 Tampon phosphate : kh2po4 91,0 g Na2HP04 95,0 g Eau distillée 1000,0 cm^ La fiole inoculée est ensuite placée sur un appareil 25 rotatif à secousses tournant à 220 tours par minute et mise en incubation pendant 72 heures à 28°C. Des portions de 5 cm (inoculum à 10#) de cette culture, sont ensuite transférées, en utilisant des pipettes stériles, dans quatre fioles d'ensemencement du deuxième étage ayant les 30 mêmes dimensions et contenant le même milieu que décrit ci-dessus et ces fioles sont ensuite secouées de la manière indiquées ci-dessus. Les contenus des fioles d'ensemencement du deuxième étage sont ensuite combinés dans un seul flacon et utilisées pour inoculer 11 fioles d'Erlenmeyer de 2 litres pourvus de chi- *2. 35 canes, contenant chacune 350 cm de Milieu II avec 2-3# d'inoculum en utilisant des pipettes stériles. Le Milieu II a la composition suivante : 72 07493 2128595 Milieu II Amber Ifeast 300 10,0 g Produits solubles de distillerie 20,0 g Dextrose 10,0 g 5 Eau distillée 1000,0 cm' pH 7,0 Les fioles de production sont ensuite secouées à 28°C sur un appareil à secousses tournant à 145 tours par minute avec une course de 5 cm environ pendant 4 jours. A la fin de la 10 période d'incubation, les contenus de 20 de ces fioles sont combinés et on centrifuge un échantillon pour éliminer le mycélium. Etape B : Adsorption sur une résine échangeuse de cations Une colonne de résine Dowex 50-X-4 (résine échangeuse de cations fortement acide du type sulfonate ayant une matrice 15 de styrène-divinylbenzène) sur le cycle hydrogène, de 103 cm de hauteur et de 12,44 cm de diamètre (contenant 480 cm' de résine) est soumise à un lavage par inversion de courant pour détacher et enlever les particules fines. Le bouillon préparé dans l'Etape A est filtré. L'activi-20 té des matières solides est de 60 à 100 unités par mg. Cinq, litres (environ 10 volumes de colonne) du bouillon filtré réglé au pH 2,5 sont refoulés à travers la colonne de résine à environ 60 cm /min et on recueille le bouillon épuisé. Après lavage avec un litre d'eau, la colonne est prête pour 25 élution. Etape C : Elution L'éluant est line solution 0,5 M de pyridine dans l'eau. La solution de pyridine est passée à travers la colonne à raison 3 de 40 cm par minute et on recueille des échantillons de 100 cm . 30 Les fractions contenant le composé biologiquement actif I sont combinées. On recueille 94# de l'activité biologique dans les fractions actives. L'éluat contient le sel de pyridinium d'acide 7-P-(D-5-amino-5-carboxyvaléramido)-3-(carbamoyloxyméthyl)-7-méthoxy-3-35 cépbsn-4-carboxylique. Les fractions combinées sont concentrées sur un évaporateur rotatif à 100 cm environ. Un précipité solide brun est séparé par filtration et le filtrat et les liquides de lavage sont reconcentrés à 30 cm environ. Le pH est réglé à 72 07493 9 2128595 5 une valeur comprise entre 4 et 7 environ avec 3 cm de BaOH 2,5N et le volume est porté à 100 cm'. Etape D : Adsorption sur une résine échangeuse d'anions faiblement basique 5 Une colonne de 250 cm d'IRA-68, résine d1aminé tertiai re faiblement basique sur une matrice acrylique, est transformée à sa forme acétate. Le concentré préparé à l'Etape C est passé à travers la colonne à raison de 10 cm'/min. La colonne est 3 "5 lavée avec 250 cm d'eau et ensuite avec 1250 cm d'acide acéti- 10 que 0,5 M. Etape E : Elution avec de la pyridine La colonne est ensuite lavée avec 250 cm d'eau et ensuite éluée avec de la pyridine 0,5 M. Les cinq premiers volumes de colonne contiennent environ 70# de l'activité biologique. 15 Quand on les sèche par congélation, on obtient 325 mg d'une matière solide couleur de tan clair qui est identifiée comme étant le sel de pyridine d'acide 7-f3-(D-5-amino-5-carboxyvaléramido)-3-(carbamoyloxyméthyl)-7-méthoxy-3-céphem-4-carboxylique ayant une activité de 5400 unités/mg. 20 EXEMPLE 2. On conduit les Etapes A à D de l'exemple 1 sensiblement comme décrit. L'Etape E de dernière élution utilise un éluant tampon phosphate au lieu de 1'éluant .pyridine de 1'exemple 1. On prépare le tampon phosphate en dissolvant 14,2 g de 25 Na2HP04 dans 100 cm' d'eau (a) et 13,2 g de KHgPO^ dans 100 cm' d'eau (b). Ce sont des solutions molaires. On mélange 75 cm' de «Z *Z (a) et 5 cm de (b) et on les dilue à 1600 cm pour obtenir un tampon phosphate 0,05 M environ de pH 8. La colonne d'IBA-68 est ensuite éluée avec le tampon 30 phosphate ci-dessus. Environ 73# de l'activité biologique se trouve dans 4 volumes de colonne d'éluat. Cette activité biologique est due à la présence d'acide 7-P-(D-5-amino-5-carboxyvalé-ramido)-3-(carbamoyloxyméthyl)-7-méthoxy-3-céphem-4-carboxylique. 72 07493 2128595 REVENDICATIONS 1. Un procédé pour recueillir la substance antibiotique acide 7-P- (D-5-amino-carboxyvaléramido)-3- (carbamoyloxyméthyl)-7-méthoxy-3-céphem-4-carboxylique ou un sel de ce composé à partir de solutions aqueuses impures contenant cet antibiotique 5 caractérisé en ce que (.1) on fait passer un bouillon de fermentation ou une solution contenant cet antibiotique à travers une résine échangeuse cationique acide ; (2) on élue l'adsorbat sur résine avec une base faible ; (3) on fait passer les éluats à travers une résine échangeuse d'anions faiblement basique ; (4) 10 on lave la résine adsorbée avec une solution aqueuse diluée d'un acide alcanoïque inférieur ; (5) on élue la résine adsorbée avec une solution de base faible ou d'un tampon ; et (6) on recueille les éluats, on combine les fractions actives et on élimine les solvants de manière à obtenir le produit. 15 2. Un procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que la résine échangeuse d'anions est composée de groupes d'échanges aminé tertiaire fixés sur un réseau de polymère acrylique . 20 3. Un procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que la résine échangeuse de cations est composée de groupes d'échange acide sulfonique nucléaire fixés sur un réseau de polymère styrène-divinylbenzène. 4. Un procédé selon la revendication 1, caractérisé en ^ ce que la solution d'élution base faible de l'étape (2) est de la pyridine aqueuse. 5. Un procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que l'acide alcanoïque inférieur est de l'acide acétique. 30 6. Un procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que 1'éluant base faible de l'étape (5) est de la pyridine. 7. Un procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que 1'éluant de l'étape (5) est un tampon phosphate aqueux.