FR 2137511 A1 19721229 FR 7215336 A 19720428 72 15336 1 2137511 La présente invention concerne un procédé de production d'acide adénosine-31jS'-cyclo-monophosphorique par fermentation. L'acide adénosine-3' ,5'-cyclo-monophosphorique est un nucléotide .important au point de rue physiologique qui contrôle de nombreuses réactions hormonales dans les animaux supérieurs, et qui est un médicament important. Le produit de la présente invention peut être caractérisé par la formule suivante : nh2 Il est connu de préparer l'acide adénosine-3' »5* »-eyelo-aonophosphorique (désigné ci-après par l'abréviation eAMP) par fermentation. On sait par exemple par le brevet français 2,015 396 qu'en cultivant un microorganiqme du genre Arthrobacter. Corynebacterium ou Microbacterium capable de produire et accumuler le cAMP à partir d'adénine, adénosine, 72 15336 2 2137511 hypoxanthine, inosine, 5-amino-4-itaidazolcarboxamide, 5-amino- 4-imidazolcarboxamide-riboside, succinyladénine ou succinyla-dénosine, le cAMP s'acoumule dans le bouillon de culture à une concentration de 1 à 3 mg/ml quand on ajoute au milieu de 5 culture pendant la croissance un des précurseurs cités ci-dessus à une concentration de 1 à 3 mg/ml. Etant donnée la grande importance du cAMP comme médicament il importe de trouver un procédé qui à l'échelle industrielle produirait de plus grandes quantités de ce produit. 10 Comme résultat de nombreuses études sur la produc tion du cAMP par fermentation, les présents inventeurs ont réussi à produire des quantités considérables de cAMP en cultivant une bactérie capable de produire du cAMP, dans un milieu contenant un fluorure comme le fluorure de sodium, 15 fluorure de potassium, etc. sans ajouter de l'adénine, adéno-sine, hypoxanthine, inosine, 5-amino-4-imidazolecarboxamide, 5-amino-4-imidazolecarboxamide-riboside, succinyladénine ou succinyladénosine. les substances mentionnées ci-dessus telles que 20 l'adénine etc. sont des précurseurs indispensables dans la biosynthèse de nucléotides de purines et pour la formation de cAMP dans les êtres vivants (W. W. ïïmbreit : Metabolic Map, Yol II, p. 201 (i960) Burgess Publishing Co., Minnesota). D'autre part les fluorures tels que le fluorure de sodium ou 25 le fluorure de potassium sont généralement utilisés comme inhibiteurs d'enzymes (R. M. Hochster & J. H. Quastel : Metabolic Inhibitor, Yol. I & II (1963) Académie Press, New York). Il était donc évident que l'addition d'adénine, etc. et l'addition d'un fluorure auraient des effets physiologiques 30 très différents sur le métabolisme du microorganisme. D'autre part il a été signalé que le fluorure de sodium inhibe l'adé-nylcyclase qui prend directement part dans la biosynthèse du cAMP à partir de l'acide adénosine-triphosphorique (M. T'ao & F. Lipman ; Proc. JTatl. Acad. Sci., 6£ 86 (1969)). Il fallait 35 donc en inférer que la formation et l'accumulation de cAMP seraient inhibés par l'addition de telles substances. Au contraire les présents inventeurs ont trouvé que des quantités 72 15336 3 2137511 plus importantes de cAMP sont produites quand on ajoute le fluorure sans ajouter aucun précurseur. Bien que des quantités plus importantes de cAMP soient produites dans le milieu de culture sans addition des 5 précurseurs mentionnés, les inventeurs ont aussi trouvé que des quantités plus importantes de cAMP sont également produites dans le milieu quand un fluorure et un précurseur à la fois sont présents dans le milieu de culture. Selon la présente invention on produit de l'acide 10 adénosine-3'»5'-cyclo-monophosphorique en quantités plus importantes par fermentation dans un milieu nutritif contenant au moins un fluorure, par un microorganisme capable de produire de l'acide adénosine-3'>5'-cyclo-monophosphorique. Comme alternative le milieu nutritif peut contenir à la fois un 15 fluorure et une substance prise dans le groupe de l'adénine, adénosine, acide adénylique, hypoxanthine, inosine, acide inosique, 5-atnino-4-imidazolecarboxamide, 5-amino-4-imidazole-carboxamide-riboside, 5-amino-4-imidazolecarboxamide-ribotide, succinyladénine et succinyladénosine. 20 ïout microorganisme peut être ut'ilisé dans la présente invention à condition qu'il soit capable de produire de l'acide adénosiné-3'>5'-cyclo-monophosphorique, et on peut naturellement aussi utiliser un mutant d'un tel microorganisme. On peut utiliser tout test standard pour déterminer l'ap-25 titude d'un microorganisme spécifique à produire un nucléotide. On en semence le microorganisme à tester dans un milieu nutritif convenable,' stérile et on incube à la température convenable. Quand on ensemence le microorganisme, ou au cours de la fermentation, on ajoute un précurseur tel que l'adénine, 30 l'adénosine etc. et/ou un fluorure à une concentration de 1 à 20 g/1 pour, le précurseur et à 2000 mg/1 pour le fluorure. A la fin de la fermentation on compare la culture résultante avec un témoin auquel on n'a pas ajouté d'additif. On mesure la teneur en' cAMP dans le milieu par les méthodes convention-35 nelles telles que la chromatographie sur papier, absorption ultraviolette etc. On peut aussi évaluer les cultures prometteuses par un essai quantitatif du oAMP. Des microorganismes 72 15336 4 2137511 convenant spécifiquement sont : Corynebacterium muriseptioum ATCC 21 374, Arthrobacter sp. ATCC 21 375 et Microbaotérium sp. ATCC 21 376. On peut utiliser dans la présente invention un milieu naturel ou un milieu synthétique à seule condition qu'il contienne une source suffisante de carbone, d'azote minéral ou organique, d'un sel minéral et, si c'est nécessaire, de substances nutritives spécifiques. Tous genres de source de carbone et d'azote conviennent s'ils peuvent être utilisés par les microorganismes. C'est-à-dire que conviennent comme source de carbone des carbohydrates variés comme : glucose, fructose, suerose, maltose, mannitol, galactose, ribose, amidon, solutions d'amidon hydrolysé, mélasses, etc.; des acides organiques variés comme l'acide gluconique, l'aeide pyruvique, l'acide lactique, l'acide acétique, etc. ; des alcools comme la glycérine,etc. ; des hydrocarbures comme les paraffines normales, le pétrole, etc. ; des acides aminés, comme le glycocolle, l'acide glutamique, l'alanine, la gluta-mine et l'asparagine, etc. On peut utiliser comme source d'azote l'ammoniac ï des sels d'ammonium minéraux ou organiques variés comme le chlorure d'ammonium, le phosphate d'ammonium, le sulfate d'ammonium, le nitrate d'ammonium, le carbonate d'ammonium, l'acétate d'ammonium, etc. ; l'urée ; des substances organiques azotées comme : la peptone, l'hydrolysat de caséine, un extrait de viande, un extrait de levure, une liqueur de macération de maïs ; une fatine de poisson ou ses produits de digestion, et analogues. ; et d'autres substances comme le glycocolle, l'acide glutamique, l'alanine citées ci-dessus comme source de carbone. Comme sels minéraux conviennent le dihydrogénophosphate de potassium, hydrogénophosphate di-potassique, sulfate de magnésium, carbonate de calcium, etc. Quand un microorganisme exige une substance nutritive spécifique il faut naturellement l'ajouter au milieu de culture. On ajoute le fluorure au milieu nutritif à une concentration de 1 - 2000 mg/1. On peut ajouter le fluorure au milieu de fermentation quand on prépare le milieu ou on 72 15336 5 2137511 peut préparer séparément la solution du fluorure et l'ajouter ensuite au milieu soit quand on ensemence le microorganisme soit au courant de la fermentation. lia présente invention concerne l'utilisation de fluorures variés tels que le fluorure de sodium» fluorure de potassium, fluorure de calcium, 5 fluorure de magnésium, fluorure de lithium, fluorure de baryum, fluorure d'ammonium, fluorure de zinc, etc. On cultive le microorganisme de préférence dans un milieu d'ensemencement avant de l'inoculer dans le milieu de culture. L'incubation est effectuée dans des conditions 10 favorables de croissance pendant un temps suffisant pour obtenir une population de mieroorganismes convenable, généralement pendant 12 à 24 heures. Le milieu de culture est alors ensemencé avec la culture d'ensemencement. Dans l'autre forme d'exécution de l'invention on 15 ajoute au milieu de culture un ou plusieurs précurseurs. Des précurseurs appropriés sont pris dans le groupe consistant en adénine, adénosine, acide adénylique, hypoxanthine, inosine, acide inosique, 5-amino-4-imidazolecarboxamide, 5-amino-4-imidazole oarboxamide-riboside, 5-amino-4-imidazolecarboxamide-20 ribotide, succinyladénine et succinyladénosine. Le précurseur est ajouté au milieu de culture à une concentration convenable, de préférence 1-20 g/1 quand le microorganisme est ensemencé ou au courant de la fermentation. On effectue la fermentation dans des conditions 25 aérobies, par exemple en secouant la culture ou en agitant par insufflation d'air dans la culture submergée, etc. La température est comprise de préférènce entre 20° et 40°C et le milieu est avantageusement maintenu à un pH de 4 - 10. La durée de la fermentation est généralement comprise entre 30 10 et 120 heures pendant lesquelles s'accumule une quantité considérable de cAMP dans le bouillon de culture. Quand la fermentation est terminée on isole le'cAMP du milieu par un traitement avec une résine échangeuse d'ions comme on le. verra dans l'exemple 1 suivant. Il est aussi 35 possible d'isoler le cAMP par tous autres traitements bien connus, avec des échangeurs d'ions par adsorption, précipi- 72 15336 6 2137511 tation, extraction, etc. les exemples suivants illustrent certaines formes spécifiques d'exécution de la présente invention. EXEMPLE 1 5 Dans cet exemple on obtient une culture d'ensemen cement en cultivant la souche Microbacterium sp. ATCC 21 376 dans un milieu contenant 1 $> de glucose, 1 de peptone, 1 $ d'extrait de viande, 1 # d'extrait de levure, et 0,3 $ de chlorure de sodium à 30aC pendant environ 12 heures. On 10 prépare un milieu de fermentation contenant 5 $ de glucose, 1 ^ de dihydrogénophosphate de potassium, 1 $ d'hydrogéno-phosphate di-potassique, 1 de sulfate de magnésium, 10 mg/1 de chlorure eobalteux, 30 /U g/1 de biotine, 100 mg/1 de fluorure de sodium, 0,5 $> de peptone et 1 $> d'urée et on ajuste 15 à pH 7,6 avant stérilisation. On charge dans un flacon conique de 250 ml 30 ml du milieu de fermentation, on stérilise sous une pression élevée à 120°C pendant 10 minutes, et on inocule ensuite avec la culture d'ensemencement à raison de 10 $ en volume. On secoue le milieu à 30°C pendant 72 heures. Il 20 s'accumule 3,3 mg/ml de cAMP dans le milieu de culture. On ajuste 1 litre du filtrat obtenu par filtration des cellules et du précipité du bouillon de culture, à un pH 3,0 avec de l'acide chlorhydrique, et on ajoute du charbon actif. On agite le filtrat ; le cAMP est adsorbé sur le ehar-25 bon actif. Après séparation du charbon actif par filtration on élue le cAMP avec une solution éthanolique ammoniacale et on concentre l'éluat sous pression réduite. On passe la solution concentrée à travers une colonne de résine Dowex 1x2 (Dow Chemical Company) sous la forme-Ci. On lave la résine avec 30 de l'eau et on élue avec une solution diluée d'acide chlorhydrique. On recueille une fraction contenant le cAMP et on concentre sous pression réduite. On ajoute de l'éthanol, et on obtient 1,8 g de cristaux bruts. On les recristallise. Toutes les données de l'analyse élémentaire, détermination de la base, 35 du sucre, de l'acide phosphorique, le spectre d'absorption ultraviolet, le spectre d'absorption infrarouge, la valeur du dans le chromâtogramme sur papier etc. montrent que le 72 15336 7 2137511 produit est l'acide adénosine-3'»5'-cyclo-monophosphorique. EXEMPLE 2 Dans cet exemple on a utilisé la souche Oorynebac-teriua auriseptlcua ATCC 21 374 comme microorganisme et on a 5 inoculé un milieu de fermentation contenant 5 ^ de glucose, 0.1 in de dihydrogénophosphate de potassium, 0,3 f> d'hydrogéno-phosphate di-potassique, 0,1 $ de sulfate de magnésium, 1 # de liqueur de macération de maïs, 0,3 # de casamino-acides, 200 mg/1 de fluorure de potassium, 1,5 $>' d'urée qui a été 10 ajusté à pH 7,5 avant stérilisation. On agite à 30°C pendant 60 heures eopme dans l'exemple 1. 2,3 mg/ml de cAMP se sont accumulés dans le milieu de culture. On effectue un essai témoin dans lequel on n'ajoute pas de fluorure de potassium au milieu de culture. Il ne se forme que 0,2 mg/ml de cAMP. 15 EXEMPLE 3 Dans cet exemple on utilise comme microorganisme la souche Arthrobacter sp. ATCC 21 375. La méthode de culture et la composition du milieu sont les mêmes que dans l'exemple 1, sauf qu'on ajoute du fluorure de sodiurç au milieu à une 20 concentration de 100 mg/1, 24 heures après le début de la fermentation. On fermente à 32°C pendant 96 heures et 2,1 mg/ml de cAHP.se sont accumulés dans le milieu. D'autre part dans un essai témoin dans lequel on n'a pas ajouté de fluorure de sodium il se s'est pratiquement pas formé de cAMP. 25 -ftrmvT,?. L Dans cet exemple on a effectué la fermentation pendant 72 heures avec la même souche que dans l'exemple 1 sauf que le milieu contenait 100 mg/1 de fluorure de magnésium au lieu de fluorure de sodium. 3,0 mg/ml de cAMP se sont accumu-30 lés dans le milieu. D'autre part dans le milieu témoin dans lequel on n'avait pas ajouté de fluorure de magnésium il ne s'est pratiquement pas formé de cAMP. EXEMPLE 5 Dans cet exemple on a effectué la fermentation comme 35 dans l'exemple 2 pendant 60 heures avec la même souche que dans cet exemple 2, sauf que le milieu contenant 200 mg/1 de fluorure de lithium à la place du fluorure de potassium. 2,1 mg/ml 72 15336 8 2137511 de CAMP se sont accumulés dans le milieu. D'autre part dans le milieu témoin dans lequel on n'a pas ajouté de fluorure de lithium il ne s'est formé pratiquement pas de cAMP. EXEMPLE 6 5 Dans cet exemple on a obtenu un milieu d'incubation en ensemençant la souche Microbacterium sp. ATCC 21 376 dans un milieu contenant 1 $ de glucose, 1 $ de peptone, 1 $> d'extrait de viande ; 1 $ d'extrait de levure et 0,3 # de chlorure de sodium à 30° pendant environ 12 heures. On prépare un milieu 10 de fermentation contenant 5 $ de glucose, 1 $> de dihydrogénophosphate de potassium, 1 56 d'hydrogénophosphate di-potassique, 1 # de sulfate de magnésium, 10 mg/1 de chlorure cobalteux, 30 jô. g/1 de biotine, 100 mg/1 de fluorure de sodium, 0,5 $> de pepton et 1 # d'urée. On ajuste à pH 7,6 et on charge 30 ml 15 - du milieu de fermentation dans un flacon conique de 250 ml et on stérilise sous pression élevée à 120° pendant 10 minutes. On inocule le milieu .de ferméntation ainsi préparé avec la culture d'ensemencement à raison de 10 $ en volume et on agite à 30°C pendant 72 heures. Après une période de 20 heures et 20 après une période de 40 heures après le début de la fermentation on ajoute de l'adénine au milieu de façon à atteindre une concentration de 2 mg/ml pour chaque addition. 9,7 mg/ml de cAMP se sont accumulés dans le milieu de culture. Un essai témoin a été effectué dans un milieu de fermentation ne conte-25 nant pas de fluorure de sodium. Seulement 2,1 mg/ml de cAMP se sont accumulés. EXEMPLE 7 Dans cet exemple on a utilisé comme microorganisme la souche Microbacterium sp. ATCC 21 376 et on a effectué la 30 fermentation dans le même milieu et dans les mêmes conditions que dans l'exemple 6. A titre de contrôle on a effectué une fermentation sans addition de fluorure de sodium. Comme précurseur on a ajouté chaque substance du tableau 1 dans les quantités et au moment indiqué dans le tableau. Après 72 heures de 35 fermentation à 30°C on a obtenu les résultats ci-dessous. 72 15336 9 2137511 TABLEAU I ; Précurseur Quantité ajoutée après cAMP 0 heure 20 heures NaP ajouté sans ïfaP adénosine 0 mg/ml 4 mg/ml 4,7 mg/ml 2,3 mg/ml hypoxanthine 3 0 7,1 2,4 inosine 0 5 5,8 2,2 A ICA* 3 0 6,4 1,8 AICAR** 0 4 5,1 2,4 * 5-amino-4-imidazolecarboxamide ** 5-amino-4-imidazolecarboxamide-riboside. EXEMPLE 8 Dans cet exemple on a utilisé la souche Arthrobacter 5 sp. ATCC 21 375 pour préparer la culture d'ensemencement, et le milieu de fermentation avait la composition suivante : 5 fi de glucose ; 0,1 fi de dihydrogénophosphate de potassium, 0,3 fi d'hydrogénophosphate di-potassique, 0,1 fi de sulfate de magnésium, 1 ^ de liqueur de macération de maïs, 0,5 fi de 10 casamino-acides, 1,5 fi d'urée. On a ajusté à pH 7,5 avant stérilisation. On aeffectué la fermentation par la même méthode que dans l'exemple 6 sauf qu'on a ajouté du fluorure de potassium à une concentration de 200 mg/1. Au moment de l'inoculation à titre de contrôle on a fait fermenter un milieu 15 qui ne contenait pas de fluorure de potassium. On a ajouté les précurseurs indiqués dans le tableau 2 en quantités et au moment indiqués dans le tableau. La fermentation a été effectuée à 30°C pendant 60 heures. La quantité de cAMP accumulée est indiquée dans le tableau 2. 72 15336 10 2137511 TABLEAU 2 1 Précurseur 0 heure 20 heures cAMP KF ajouté sans EF hypoxanthine adénosine succinyladénine succinyladéno-sine 3 mg/ml 0 2 2 3 mg/ml 4 2 2 5.2 mg/ml 4,8 5,7 4.3 1,8 mg/ml 1.6 2,2 1.7 EXEMPLE 9 Dans cet exemple on a utilisé la souche Cor.vnebac-terium murisepticum ATCC 21 374 comme microorganisme et on a opéré comme dans l'exemple 6 sauf qu'on a ajouté au milieu 5 de fermentation du fluorure de sodium à la concentration de 100 mg/1 20 heures après le début de la fermentation, conjointement avec les précurseurs indiqués dans le tableau 3. Après fermentation à 30°C pendant 90 heures on a obtenu les résultats suivants : TABLEAU 3 Précurseur Quantité ajoutée cAMP NaF ajouté sans NaF adénine 3 mg/ml 5,3' mg/ml 2,2 mg/ml adénosine 4 4,7 2,1 hypoxanthine 3 5,5 1,8 inosine 4 4,3 2,1 A ICA 3 4,3 1,9 10 EXEMPLE 10 Dans cet exemple on a utilisé la souche Microbacterium sp. 21 376 comme microorganisme, et on a fermenté comme 72 15336 11 2137511 dans l'exemple 6 mais en utilisant les précurseurs indiqués dans le tableau 4 ajoutés dans le milieu de fermentation 20 heures après le début de la fermentation et on opéré à 30°C pendant 72 heures. Les résultats sont rassemblés dans le tableau 4. TABLEAU 4 Précurseur cAMP NaF ajouté sans KaF acide 5'-inosinique acide 5'-adénylique AICARP* 2,3 mg/ml 1,8 1.7 0,4 mg/ml 0,6 0,5 * 5,amino-4-i®idazolecarboxamide-ribotide EXEMPLE 11 Dans cet exemple on fermente comme dans l'exemple 6 sauf qu'on ajoute 100 mg/1 de florure de magnésium au lieu de fluorure de sodium. 9»5 mg/ml de cAMP se sont accumulés dans le bouillon de culture. Dans un milieu témoin sans fluorure de magnésium ils ne se sont accumulés que 2,4 mg/ml de cAMP. EXEMPLE 12 Dans cet exemple on a effectué la fermentation pendant 72 heures comme dans l'exemple 6 sauf qu'on a ajouté 100 mg/sl de fluorure de lithium au lieu de fluorure de sodium. 9,3 mg/ml de cAMP se sont accumulés dans le milieu. Quand on n'ajoute pas de fluorure de lithium il se forme seulement 2,2 mg/ml de cAMP. 15336 12 2137511 REVENDICATIONS Procédé de production de l'acide adénosine-3',5'-cyclo-monophosphorique caractérisé en ce qu'on cultive un microorganisme qui est capable de produire l'acide adénosine-31,5'-cyclo-monophosphorique, dans un milieu nutritif contenant au moins un fluorure et qu'on laisse s'accumuler et qu'on isole ledit acide adénosine-3'»5'-cyclo-monophosphorique. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que le fluorure est pris dans le groupe comprenant : le fluorure de sodium, le fluorure de potassium, le fluorure de calcium, le fluorure de magnésium, le fluorure de lithium, le fluorure de baryum, le fluorure d'ammonium et le fluorure de zinc. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que le microorganisme est la souche Cor.vnebacterium murisep-ticum ATCC 21 374. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que le microorganisme est la souche Arthrobacter sp. ATCC 21 375. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que le microorganisme est la souche Microbacterium sp. ATCC 21 376. Procédé de production de l'acide adénosine-3',5'-cyclo-monophosphorique, caractérisé en ce qu'on cultive un microorganisme capable de produire l'acide adénosine-3',5'-cyclo-monophosphorique dans un milieu nutritif contenant au moins un fluorure et au moins un précurseur dudit acide adénosine-3',5'-cyclo-monophosphorique, en ce qu'on laisse s'accumuler et qu'on isole l'acide adénosine-3',5'-cyclo-monophosphorique . Procédé selon la revendication 6, caractérisé en ce que le fluorure est pris dans le groupe consistant en fluorure de sodium, fluorure de potassium, fluorure de calcium, fluorure de magnésium, fluorure de lithium, fluorure de baryum, fluorure d'ammonium et fluorure de zinc. 72 15336 13 2137511 8. Procédé selon la revendication 6, caractérisé en ce qu'on choisit le précurseur dans le groupe consistant en l'adénine, l'adénosine, l'acide adénylique, 1'hypoxanthine, 1'inosine, l'acide inosinique, le 5-amino-4-imidazole-5 carboxamide, le 5-amino-4-imidazole-car'boxamide-riboside, le 5-amino-4-imidazolêcarboxamiâe-ribotide, la succinyladénine et la succinyladénosine. 9. Procédé selon la revendication 6, caractérisé en ce que le mioroorganisme est la souche Corynebacterium mûrisep- 10 ticum ATCC 21 374. 10. Procédé selon la revendication 6, caractérisé en ce que le microorganisme est la souche Arthrobacter sp. ATCC 21 375. 11. Procédé selon la revendication 6, caractérisé en ce que 15 le microorganisme est la souche Microbacterium sp. ATCC 21 376. 12. Procédé de production d'acide adénosine-31^'-cyclo-monophosphorique , caractérisé en ce qu'on cultive un microorganisme pris dans le groupe consistant en les 20 souches Corynebacterium murisenticum ATCC 21 374, Arthro- baoter sp. ATCC 21 375 et Microbacterium sp. ATCC 21 376 dans un milieu nutritif contenant de 1 à 2000 mg/1 d'au moins un fluorure pris dans le groupe comprenant le fluorure de sodium, le fluorure de potassium, le fluorure 25 de calcium, le fluorure de magnésium, le fluorure de lithium, le fluorure de baryum, le fluorure d'ammonium et le fluorure de zinc et de 1 à 20 g/1 d'au moins un précurseur pris dans le groupe consistant en l'adénine, l'adénosine, l'acide adénylique, 1'hypoxanthine, 1'inosine, 30 l'acide inosinique, le 5-amino-4-imidazolecarboxamide, le 5-amino-4-imidazolecarboxamide-riboside, le 5-amino-4-imidazolecarboxamide-ribotide, la succinyladénine et la succinyladénosine, en ce qu'on laisse s'accumuler et qu'on isole l'acide adénosine-3',5'-cyclo-monophosphori-35 que.