FR 2135669 A1 19721222 FR 7216268 A 19720505 10 15 20 25 72 16268 1 2135669 L'invention, due à ECKSTEIN Fritz et GOODY Roger Sydney, a pour objet de nouveaux analogues thiophosphatés des nucléoaide-di-et -triphosphates, dans lesquels un atome d'oxygène du groupe phosphate terminal de la chaîne d'anhydrides phosphoriques est remplacé par un atome de soufre, ainsi qu'un procédé de fabrication, de ces composés. On a déjà décrit des analogues de nucléotides, modifiés par remplacement d'un atome d'oxygène sur le groupe phosphate par un atome de soufre. On connaît également déjà des nucléotide-anhydri-des portant un atome de soufre sur l'atome de phosphore en position a. les composés connus, mis en oeuvre dans des réactions enzymati-ques concurremment avec des- nucléotides naturels correspondants, présentent des propriétés intéressantes % toutefois un grave inconvénient de ces composés réside dans le fait que, consécutivement à l'asymétrie de l'atome de phosphore en position oc du nucléotide, ils se présentent sous des formes diastéréo-isomères difficilement dédoublables qui peuvent agir de façons très différentes sur des enzymes particulières. Ces difficultés ne devraient pas exister dans le cas de di- et triphosphates portant lratome de soufre sur l'atome de phosphore terminal, car ces composés ne présentent pas d'asymétrie à cet endroit, ta fabrication de tels composés est donc d'un grand intérêt. L'invention a donc pour objet de nouveaux composés de formule générale 30 S -P0„ P03)n - 0 CH. B 2 0 ( N w OH X 3- (I) -> m dans laquelle B représente une base nucléique naturelle ou modifiée, X représente un atome d'hydrogène ou un groupe hydroxyle et 35 m et n représentent chacun les nombres 1 ou 2., ainsi que les sels de ces composés. 72 16268 2 2135669 Si B dans la formule générale susindiquée représente une base nucléique naturelle, il peut désigner l'adénine, la guanine, 1'hypoxanthine, la cytosine, l'uracile, la thymine, la 5-méthyl-cytosine ou la 5-hydroxyméthylcytosine. Les composés susindiqués 5 constituent, lorsque X représente un groupe hydroxyle, des dérivés de nucléotides normaux et, lorsque X représente un atome d'hydrogène, les désoxyribonucléotides correspondants. Comme exemples de composés selon l'invention, on peut citer 1*adénosine-5'-0-(2-thiodiphosphate), le guanosine-5 *-0-(2-thio-10 diphosphate), 1'inosine-5'-0-(2-thiodiphosphate), le cytidine-5'-0-(2-thiodiphosphate), l'uridine-51-0-(2-thiodiphosphate), le thymidine-5'-0-(2-thiodiphosphate), le 5-méthylcytidine-51-0-(2-thiodiphosphate), le 5-hydroxyméthylcytidine-5'-0-(2-thiodiphosphate), le disulfure d'adénosine-5'-0-(2-thiodiphosphate), le disulfure 15 de guanosine-5'-0-(2-thiodiphosphate), le disulfure d'inosine-5'-0-(2-thiodiphosphate)-, le disulfure de cytidine-5*-0-(2-thiodiphosphate), le disulfure d'uridine-5'-0-(2-thiodiphosphate), le disulfure de thymidine-5'-0-(2-thiodiphosphate), 1'adénine-5'-0-(3-thiotriphosphate), le guanosine-5'-0-(3-thiotriphosphate), 20 1'inosine-5'-0-(3-thiotriphosphate), le cytidine-5'-0-(3-thiotri-phosphate), l'uridine-5'-G-(3-thiotriphosphate), le thymidine-5'-0-(3-thiotriphosphate), le disulfure d'adénine-5'-0-(3-thiotri-phosphate), le disulfure de guanosine-5'-0-(3-thiotriphosphate), le disulfure d'inosine-5*-0-(3-thiotriphosphate), le disulfure de 25 cytidine-5■'-0-(3-thiotriphosphate), le disulfure d'uridine-5'-0-(3-thiotriphosphate) et le disulfure de thymidine-5'-0-(3-thiotriphosphate) . Lorsque B, dans la formule générale susindiquée, représente une "base nucléique modifiée, celle-ci dérive d'une "base nucléique 30 nat-urelle par remplacement d'un ou de plusieurs cubstituants du noyau. Ainsi, les noyaux purique ou pyrimidique peuvent être substitués dans les différentes positions par des atomes d'halogène, des radicaux alcoyle, par des groupes amino substitués ou par des groupes sulfhydryles. Comme exemples de composés de ce genre, on 35 peut citer les 1-méthyl-, 2-méthyl-, ou 7-méthyladénine, -guanine, -hypoxanthine, ou -xanthine, les 3-méthyl-, et N^-méthylcytosine, les 5-bromo-, 5-jodo-, 5-chlorouracile, les 8-bromo-, 8-jodo, 6 8-fluoroguan±ne, la ïï -diméthyladénine, la 1-diméthylallyladénine, 72 16268. 3 2135669 la 2-aminopUrine, la 2-cétopurine, les 2-thio- ou 4-thio-uracile, l'acide orotique, les 1-méthyl- ou 3-méthyluracile, le 5-h.ydroxy-uracile, le 5-hydrométhyluracile, des monoalcoylamino— et dialcoyl-aminopurines et des composés analogues. 5 Conformément à l'invention on fabrique les nouveaux composés de formule générale I en faisant réagir un nucléoside-5'-mono- ou --diphosphate avec du chlorure d'acide diphénylphosphorique et un composé de formule générale II ' • • 0 I! 10 R - S - P - 0 ® (II) ^ t OH 0 ^ " (-) dans laquelle R représente le groupe ^N-C-C^-CH^- ou HPO^ -S-, en éliminant ensuite le groupe R du produit de réaction et en 15 oxydant, le cas échéant, le nucléoside-5'-O-thio-di- ou -triphos- phate ainsi formé en leldisulfure correspondant. On effectue la réaction de préférence dans tin solvant organique polaire. L'ordre dans lequel on met en réaction les trois réactifs susindiqués n'est pas critique et de simples essais 20 préliminaires permettent de déterminer l'ordre de réaction le plus avantageux pour la fabrication d.'un produit désiré. Ainsi, suivant l'un, des modes de réalisation du procédé selon 1 , 2 l'invention, on commence par fabriquer le P -diphényl-P -nucléoside-51-pyrophosphate qu'on fait réagir dans le solvant organique polaire 25 avec le S-2-carbamoyléthylthiophosphate, puis on soumet le produit de réaction à une saponification alcaline et on l'oxyde, le cas échéant, en le disulfure. Suivant un autre mode de réalisation du procédé selon l'inven- f , 2 tion, on fait réagir dans le solvant polaire le P. -diphényl-P -30 nucléoside-5'-.pyrophosphate, fabriqué de la façon susindiquée, avec uh sel de l'acide dithiophosphorique, on réduit le produit de réaction à l'aide d'un composé sulfhydrylé et on l'oxyde, le cas échéant, en disulfure. . . Suivant un troisième, mode de réalisation du procédé selon 35 l'invention, on fait réagir le S-2-carbamoylthiophosphate avec le chlorure•d'acide diphénylphosphorique, puis on fait réagir le produit résultant avec le nucléoside-5'-diphosphate, on soumet le produit formé à une saponification alcaline et on l'oxyde, le cas 72 16268 4 2135669 échéant, en disulfure. Le solvant organique polaire qui s'est avéré particulièrement avantageux pour ces réactions est la pyridine ; mais d'autres solvants organiques polaires conviennent également. 5 On peut effectuer les réactions à des températures comprises entre 0 et 100°C ; on travaille de préférence à la température ambiante. On élimine du produit de réaction le groupe R, lorsqu'il constitue le radical carbamoyléthyle, de préférence par chauffage en présence d'une.solution d'un hydroxyde alcalin et, lorsqu'il 10 constitue le radical de l'acide thiophosphorique, de préférence par réduction à l'aide d'un composé sulfhydrylé ou mercapto. Un composé sulfhydrylé qui s'est avéré particulièrement avantageux est le P-mercaptoéthanol. On peut mettre en oeuvre dans le procédé selon l'invention les 15 composés initiaux renfermant des groupes acides phosphoriques sous forme d'acides libres ; on utilise dans vGe cas de préférence un solvant organique polaire approprié à la salification. Mais on peut les mettre en oeuvre également sous forme de leurs sels solubles dans des solvants organiques, en particulier leurs sels 20 avec des aminés tertiaires. On peut effectuer l'oxydation des nucléoside-thio-di- ou -tri-phosphates formés en disulfures correspondants suivant les techniques habituellement utilisées pour la conversion de groupes sulfhydryles en disulfures. On effectue l'oxydation de façon 25 préférentielle au moyen de ferricyanure de potassium ou d'eau oxygénée diluée. Les nouveaux composés selon l'invention sont, du fait de leur parenté structurale avec les nucléotides, d'un grand intérêt scientifique et thérapeutique. On peut les utiliser pour le 30 marquage d'affinités ("affinity labelling") pour les protéines dont le centre actif comporte des groupes -8H ou -S3, ainsi que pour la détermination chromâtographique des affinités d'enzymes pour les nucléotide-coenzymes dont elles dépendent. Dans le domaine de la pharmacologie, ils se distinguent par leur résistance 35 aux phosphatases et leuçètabilité élevée qui en résulte. Ils peuvent donc concurrencer les nucléotides naturels dans le métabolisme et on peut les mettre en oeuvre dans toutes les réactions où des nucléotides et des polynucléotides participent au métabolisme. r Copy 72 16268 5 2135669 Les exemples non limitatifs suivants décrivent l'invention d'une façon plus détaillée : Exemple 1 On ajoute à 347 mg (1 mmole) d'adénosine-5'-phosphate sous 5 forme de l'acide libre 5 ml de méthanol anhydre et 0,43 ml (1 mmole) de tri-n-octylamine et on chauffe le mélange légèrement jusqu'à dissolution complète. On évapore ensuite le solvant sous pression réduite et on sèche le résidu par addition, plusieurs fois répétée, de portions de 5 ml de diméthylformamide anhydre, 10 suivie chaque fois d'évaporation jusqu'à siccité. On ajoute ensuite 7 ml de dioxanne anhydre et, lorsque la dissolution ne se produit pas immédiatement, 1 ml de diméthylformamide anhydre. Puis on ajoute 0,3 ml de chlorure d'acide diphénylph sphorique et ensuite 0,3 ml de tri-n-butylamine.. Il se forme un précipité blanc qu'on 15 redissout en agitant. On laisse reposer la solution durant 3 heures, puis on évapore le solvant et on ajoute au résidu 50 ml d'éther 1 x anhydre. On laisse reposer le mélange à la température de 4°C durant 30 minutes, puis on décante l'éther. On ajoute au résidu 5 ml de dioxanne anhydre et on évapore la suspension formée jusqu'à 20 siccité. On ajoute ensuite une solution de 2 mmoles de S-2-carba- moyléthylthiophosphate de tri-n-butylammonium dans 6 ml de pyridine anhydre. On laisse reposer le mélange à la température ambiante durant 3 heures au cours desquelles il se forme un précipité. On évapore ensuite la pyridine sous pression réduite, on ajoute au 25 résidu 80 ml de FaOH 0,2 N et on chauffe la solution trouble formée durant 10 minutes à 100°C. Après refroidissement, on neutralise le mélange et on convertit la substance en sel de pyridinium au moyen de l'échangeur d'ions Merck I en forme pyridine, on le traite avec 0,5 ml de P-mercaptoéthanol, on filtre et on chromatographie sur 30 de la cellulose DEAE en utilisant un tampon de bicarbonate de triéthylammonium de pH 7,5 avec un gradient linéaire entre 0,05 et 0,3 molaire. L'élution du produit a lieu à la molarité d'environ 0,22. Le rendement est d'environ 35$ par rapport à 1'adénosine-5'- phosphate mis en oeuvre. Le composé présente le spectre d'adénosine 35 X ^2^ 259 microns (£ 15.000). ' max Adénosine J P = j : 2,07. COPY 72 16268 6 2135669 Exemple 2.- On convertit 302 mg (1 mmole) de dihydrogénodithiophosphate dipotassique en sel de pyridinium en le faisant passer sur un échangeur d'ions Merck I sous forme pyridine. On ajoute au sel de 5 pyridinium 2 mmole de tri-n-butylamine et on sèche le mélange sous vide. On reprend le produit résultant dans 4 ml de pyridine anhydre et on l'utilise, au lieu du S-2-carbamoyléthylthiophosphate, dans le procédé décrit dans l'exemple 1 en le faisant réagir avec du 1 ? f P -diphényl-P -nucléoside fabriqué à partir de 0,5 mmole d'adéno-10 sine-5'-phosphate. Après avoir laissé reposer le mélange durant 16 heures à la température ambiante, on évapore le solvant sous vide, on dissout le résidu dans 20 ml d'eau, on traite la solution avec 2 ml de P-mercaptoéthanol et on purifie le produit, comme dans l'exemple 1, au moyen de cellulose DEAE. On obtient ainsi un 15 produit identique à celui de l'exemple 1 avec un rendement de 26$ par rapport à 1'adénosine-5'-phosphate mis en oeuvre. Exemple 5.- On convertit, de la façon décrite dans l'exemple 2, 0,5 mmole de S-2-carbamoyléthylthiophosphate de lithium au moyen d'un échan-20 geur d'ions en sel de pyridinium et ensuite, à l'aide de 0,22 ml (0,5 mmole) de tri-n-octylamine en sel de mono-(tri-n-octylammonium). On dissout le produit formé dans 3,5 ml de dioxanne anhydre et on ajoute 0,15 ml de chlorure d'acide diphénylphosphorique et ensuite 0,23 ml de tri-n-butylamine. On laisse reposer la solution durant 25 2 heures à la température ambiante, puis on l'évaporé sous pression réduite. On ajoute au résidu 10 ml d'éther, puis, après brève agitation, 20 ml d'éther de pétrole (40-60°C) et on laisse reposer le mélange durant 30 minutes à la température de 4°C. On décante ensuite le liquide, on dissout le résidu dans 3 sil 30 de dioxanne anhydre et on évapore la solution sous vide. Au résidu de consistance sirupeuse on ajoute 0,25 mmole d'adénosine-5 diphosphate de / mono-(tri-n-octylammonium)-mono-(fcri-n-butylam-monium)_7 dissous dans 3 ml de pyridine anhydre et on laisse reposer la solution durant 2 heures à la teupérature ambiante. On 35 évapore ensuite le solvant sous pression réduite, on ajoute au résidu 20 ml de ÏTaOH 2 N et on chauffe le mélange durant 10 minutes à 100°C. Après refroidissement, on neutralise la solution au moyen d'une résine éehangeuse d'ions, on ajoute 0,5 ml de 72 16268 7 2135669 p-mercaptoéthanol et on purifie le produit par chromâtographie sur de la cellulose en utilisant un tampon de bicarbonate de triéthylammonium de pH 7,5 vec un gradient linéaire entre 0,15 et 0,4 uolaire. On élue 11 adénosine-5 '-0-( '5-thiotriphosphate) 5 dés.iré à la molarité d'environ 0,28. En répétant la chromatogra- phie sur du oephadex DEAE avec des concentrations de tampon entre 0,35 et G,o molaires, on purifie le produit qui se trouve dans la fraction environ 0,5 molaire, le composé présente le spectre d'adénosineX ®^0 259 microns ( £. 15000). max 10 Adénosine | P = I : 2,94. Exemple 4.- A une solution aqueuse de 1 mmole de 1'adénosine-5'—0—(2-thiodiphosphate) obtenu selon l'exemple 1, on ajoute une solution aqueuse de ferricyanure de potassium et on laisse reposer le 15 mélange durant 5 minutes à la température ambiante. On transfère la solution sur du papier pour chromâtographie et on effectue la séparation à un pH de 7,5 par électrophorèse sous une tension de 2200 volts. On élue le disulfate d'adénosine-5'-0-(2-thiodiphos-phate) au moyen d'un mélange méthanol/eau à parties égales. 20 Rendement : 60$. Le composé présente le spectre d'adénosine A ^2^ 259 microns (2 30000). max Exemple 5.- On traite 6 umoles d'adénosine-5'-0-(2-thiodiphosphate), 25 dissous dans 0,8 ml d'eau, avec 0,1 ml d'une solution d'eau oxygénée à 3$ et on évapore le mélange immédiatement jusqu'à siccité. On ajoute au résidu 1 ail d'eau et on évapore ; on répète cette opération 3 fois pour éliminer le reste d'eau oxygénée. La conversion en disulfure est quantitative. 30 Exemple 6.- On oxyde, de la façon décrite dans l'exemple 4, l'adénosine-5'-0-(3-thiotriphosphate) en disulfure d'adénosine-5'-0-(3-thiotriphosphate ). Le rendement est de 50$. La substance présente le -N H 0 spectre d'adénosine À 2 259 microns 30000). 35 max Exemple 7.- On oxyde, de la façon décrite dans l'exemple 5, l'àdénosine-5* —0—(3-thiotriphosphate) en disulfure d'adénosine-5'—0—(3-thiotri- 72 16268 8 2135669 phosphate). Le rendement est de 90 %. On répète les procédés des exemples 1 à 7, mais en remplaçant dans le composé initial 1'adénosine respectivement par la guanosine, l'inosine, la cytidine, l'uridine, la thymidine, la 5 5-méthyl-cytosine ou la 5-hydroxyméthylcytosine. On utilise de la même façon les désoxy ribonucléotides correspondants. Dans tous les cas, la réaction se produit d'une façon analogue à celles décrites plus haut et conduit à des rendements comparables. Ceux des composés conformes à l'invention qui se rattachent 10 à 1'adénosine ont été soumis aux méthodes d'essais mises au point par B.R. Jewell et J.C. Riiegg et décrites à la page 428 du volume 164 (.1960) des "Proceedings of the Royal Society" (Londres). Les résultats des essais ainsi effectués ont permis de montrer que lesdits composés provoquent un relâchement muscu-15 laire lorsque lesdits composés sont mis en oeuvre sous la forme d'une solution aqueuse M/1000. Leur activité est donc du type spasmolytique ou du type curare. Ces composés, qui ne provoquent aucune contraction musculaire, sont donc applicables en tant qu'agents thérapeutiques à activité spasmolytique et de type 20 curare. Comme il va de soi et comme il résulte d'ailleurs déjà de ce qui précède, l'invention ne se limite nullement à celui de ses modes d'application, non plus qu'à ceux des modes de réalisation, de ses diverses parties, ayant été plus particulièrement 25 envisagés ; elle en embrasse, au contraire, toutes les variantes. 72 16268 2135669 REVENDICATIONS 1. Nouveaux composés de formule générale 3 -P02 (- - 0 - GH2 B 10 3- (I) m 15 20 25 30 35 dans laquelle B représente une base nucléique naturelle ou modifiée, X représente un atome d'hydrogène ou un groupe hydroxyle et m et n représentent chacun les nombres 1 ou 2 , ainsi que les sels de ces composés. 2. Procédé de fabrication de composés de formule générale I selon la revendication 1, caractérisé par le fait qu'on fait réagir un nucléoside-5r-mono- ou -diphosphate avec du chlorure d'acide diphénylphosphorique et un composé de formule générale II 0 R _ S _ P _ 0 f OH e (n) 0 ©_ dans laquelle R représente le groupe ^N-C-CH^-C^- ou HPO^^—^-S- , qu'on élimine ensuite le groupe R du produit de réaction et qu'on oxyde, le cas échéant, le nucléoside-5'-0-thio-di ou -triphosphate ainsi formé en disulfure correspondant. 3. Procédé selon la revendication 2, caractérisé par le fait qu'on fabrique des composés de formule générale I, dans laquelle n représente le nombre 1t en faisant réagir le nucléoside-5'- monophosphate avec le chlorure d'acide diphénylphosphorique et qu'on 1 2 fait réagir ensuite le P -diphényl-P -nucléoside-5'-pyrophosphate ainsi formé avec le composé de formule II. 4. Procédé selon la revendication 2, caractérisé par le fait qu'on fabrique des composés de formule générale I, dans laquelle n représente le nombre 2, eh faisant réagir le composé de formule 72 16268 10 2135669 II avec le chlorure d'acide diphénylphosphorique et qu'on fait réagir ensuite le produit résultant avec le nucléoside-51-diphosphate. 5• Procédé selon l'une quelconque des revendications 2 à 4, 5 caractérisé par le fait qu'on travaille dans un solvant organique polaire. 6. Procédé selon l'une quelconque des revendications 2 à 5, caractérisé par le fait qu'on effectue les réactions à la température ambiante. 10 T. Procédé selon .l'une quelconque des revendications 2 à 6, caractérisé par le fait qu'on élimine le groupe R, lorsqu'il constitue un radical carbamoyléthylet par chauffage en présence d'une solution diluée d'un hydroxyde alcalin. 8. Procédé selon l'une quelconque des revendications 2 à 6, 15 caractérisé par le fait qu'on élimin.e le groupe R, lorsqu'il constitue un radical de thiophosphate,: par' addition d'un composé sulfhydrylé. 9. Procédé selon la revendication 8, caractérisé par le fait que le composé sulfhydrylé est le P-mercaptoéthanol. 20 10. Procédé selon l'une quelconque des revendications 2 à 9» caractérisé par le fait qu'on effectue l'oxydation en le disulfure par addition de ferricyanure de potassium ou d'eau oxygénée. 11. Utilisation d'un composé selon la revendication 1 en tant que composé présentant de l'affinité pour les protéines.