FR 2121499 A1 19720825 FR 7137754 A 19711012 71 37754 2121499 La présente invention concerne un procédé pour provoquer une réaction immunologique tissulaire aux antigènes et des produits qui en résultent. Fondamentalement il existe deux types de réactions immu-nologiques protégeant contre les maladies infectueuses. Elles sont connues comme "humorale" et "tissulaire". Les réactions immunologiques humorales protègent contre les maladies telles que polio, tétanos, rougeole, diphtérie etc. . Eeamoins, elles sont relativement inefficaces contre les maladies telles que variole, tuberculose, fièvre typhoide, coccidioidomycose, etc. . La protection contre ces dernières maladies se fait principalement par une réaction immunologique tissulaire. Les immunologis-tes ont plus ou moins été capables de provoquer des réactions immunologiques humorales à volonté, mais ils n'ont jamais su comment provoquer sélectivement des réactions immunologiques tissulaires sauf occasionnellement par essais et erreurs. Dans les dernières années, la méthode d'essais et erreurs a conduit à la découverte que des réactions immunologiques tissulaires peuvent être provoquées en injectant la substance immunisante dans une émulsion eau-huile. Mais de telles injections tendent également à provoquer des réactions en anticorps intenses inutiles et nuisibles. Pour cette raison et pour d'autres raisons médicales, des injections de ces émulsions dans une personne humaine sont généralement évitées. La tuberculose a été une maladie redoutable pour les hommes pendant plusieurs siècles et même avec la science médicale moderne, elle reste une maladie infectueuse importante à travers le monde. La chimiothérapie et l'éducation ont été les armes les plus efficaces contre la maladie. Des conditions de vie améliorées et la vaccination avec le vaccin BCG constituent d'importants contrôles supplémentaires de la tuberculose chez l'homme. Le caractère protecteur de la vaccination BCG- contre la tuberculose clinique a été fermement établi et par suite une telle immunisation BGG est pratiquée couramment dans beaucoup de pays. Son utilité est la plus grande parmi les populations sur lesquelles 3!in-cidence de la tuberculose est très élevée, spécialement quand l'un ou l'autre des trois autres facteurs de contrôle est absent. De telles populations sont très étendues dans les pays en voie de développement, mais peuvent également être trouvées dans des pays développés à haute densité de population et bas niveaux de 71 37754 2121499 - 2 - vie. Le rôle de la vaccination anti-tuberculeuse dans ces populations est de neutraliser l'infection primaire généralement inévitable. Ceci évite la maladie clinique et une extension ré-5 sultante de la tuberculose. Elle convertit également l'infection potentielle dangereuse en une réimmunisation naturelle. La vaccination contre la tuberculose est de préférence réalisée tôt dans la vie et une exposition ultérieure occasionnelle au bacille de la tuberculose augmente le bénéfice d'une seule vaccination à 10 travers les années. Cette perpétuation dans le milieu, de l'immunisation acquise contre la tuberculose dans des populations de haute densité avec une haute incidence à l'exposition» est absente chez les populations avec une exposition peu fréquente et des revaccinations sont à l'occasion nécessaires. 15 Deux des quatre contrôles de la tuberculose mentionnés ci- dessus, c'est - à-dire la chiomiothérapie et la vaccination BCG, donnent des résultats rapides. Mais le contrôle chimiothérapeu-tique de la tuberculose est trop coûteux pour la plupart des pays et la vaccination BCG- sensibilise un individu à la tuberculine et 20 par conséquent annule l'utilité du test à la tuberculine pour le diagnostic. A cause de ce désavantage plusieurs pays comme les E.ÏÏ.A. devancent l'utilisation du BCG et dépendent fortement de la chimiothérapie pour compenser la perte de contrôle par immunisation. D'un autre côté, les nations pauvres qui sont incapables 25 d'utiliser la chimiothérapie doivent utiliser toutes les autres solutions de contrôle possibles y compris la vaccination BCG. Le vaccin BCG a une autre caractéristique qui est à la fois bonne et mauvaise; il est constituée par une suspension de bacilles de la tuberculose atténués et vivants. Cela est bénifique parce 50 qu'ils induisent une infection autolimitative mais fortement immunogène. Théoriquement ce type d'immunisation est supérieure à tout autre. Mais cela est également préjudiciable parce qu'il y a toujours un danger d'infection avec des microorganismes atténués devenant progressivement des organismes virulents; et c'est 55 également mauvais parce que l'efficacité du vaccin varie facilement avec les proportions de bacilles vivants présents dans une fournée donnée et avec les changements dans son état d'atténuation. Cela complique sa standardisation et sa distribution. Ce qui précède indique que la vaccination contre la tuber-40 culose, pratiquée de manière prédominante avec BCG, est un con- 71 37754 - 5 - 2121499 trôle valable de la maladie. Néamoins, des améliorations significatives du vaccin sont nécessaires. De telles améliorations sont trouvées dans un immunogène qui n'est pas sensible à la tuberculose, qui est stable et qui est plus simple à standardiser 5 et à distribuer. De la disponibilité d'un tel agent immunogène résulterait une immunisation plus large et plus uniforme contre la tuberculose sans interférence avec le test de la tuberculine pour détecter la tuberculose et sans les désavantages de la vaccination BGG mentionnés ci-dessus. 10 II est un objet de la présente invention de décrire un procédé pour modifier les antigènes par une estérification chimique pour induire de préférence une réaction immunologique tissulaire en anticorps plutôt qu'une réaction immunologique humorale en anticorps. 15 Un deuxième objet de l'invention est de fournir des pré parations immunisantes solubles dans l'eau. Un troisième objet de l'invention est de préparer des antigènes estérifiés du bacille de la tuberculose qui peuvent immuniser lorsqu'ils sont appliqués en solution aqueuse ou dans des 20 émulsions eau-huile, sans sensibiliser les personnes à la tuberculine. Les objets et avantages de la présente invention cités ci-dessus et d'autres peuvent être aisément obtenus en-se référant à la description suivante. 25 En une forme spécifique, l'invention décrit la méthylation de l'antigène du bacille dé la tuberculose. Des matériaux de départ variés peuvent être utilisés. Par exemple, une tuberculopro-téine est précipitée du milieu dans lequel les bacilles de la tuberculose ont été cultivés par addition de sulfate d'ammonium. 50 Le précipité obtenu est collecté dans une centrifugueuse, lavé, redissout dans l'eau, dialysé et ensuite séché par évaporation de la glace. Un deuxième matériau de départ est l'antigène extrajb des bacilles de la tuberculose avec une enzyme telle que la tryp-sine. Un troisième produit est 1'immunogène extrait de la tryp-35 sine purifié par adsorption physique des produits contaminants. La méthylation des antigènes peut être réalisée de plusieurs manières. Une méthode simple est de catalyser la réaction du méthanol avec l'antigène en utilisant de l'acide chlorhydrique. D'autres alcools (par exemple éthanol, propanol) peuvent être 40 utilisés similairement pour produire d'autres esters d'antigènes 71 37754 2121499 - 4 - immunisants. Le résultat recherché est de transformer la molécule acide ayant un point isoélectrique bas en une molécule basique ayant un haut point isoélectrique, ce qui constitue une transformation favorisant le développement d'une réaction tis-5 sulaire en anticorps plutôt qu'une réaction humorale en anti corps dans un animal. Exemple I Le milieu de croissance d'une culture de bacilles de la tuberculose est mélangé avec suffisamment de sulfate d'ammonium pour 10 former une solution à 60% précipitant les tuberculoprotéines. Ces protéines sont collectées par centrifugation ou filtration, redissouts dans un tampon physiologique de phosphate à pH 7,4 dialysé dans l'eau distillée jusqu'à ce qu'il n'y ait plus de sels et ensuite lyophilizées. Les tuberculoprotéines brutes, 15 séchées obtenues peuvent alors être utilisées avec ou sans digestion enzymatique antérieure pour produire des antigènes estérifiés. Exemple II Les bacilles de la tuberculose sont collectés de la surface d'un 20 milieu de culture synthétique, et la pâte de bacilles obtenue est lavée d'abord avec de l'eau distillée et ensuite avec de l'acétone. La pâte lavée à l'acétone est alors séchée à l'air et ces bacilles séchés sont alors remis en suspension dans une solution aqueuse de 1% de bicarbonate de soude. La suspension 25 est alors passée à l'autoclave pendant 15 minutes. La suspension passée à l'autoclave ainsi obtenue est alors digérée par addition de trypsine à la suspension et le mélange est maintenu environ 24 heures aseptiquement à 37°C. De la trypsine est ajoutée à la suspension pour obtenir une concentration finale de 0,005%. 50 Les bacilles digérés sont séparés par filtration et le liquide de tout bacille est concentré par lyophilisation partielle. Le concentré est alors dialysé contre de l'eau distillée, et l'extrait libre de tout sel est alors lyophilisé à sec. Le résultat obtenu est un produit appelé ici extrait de trypsine. (ET) . 35 Exemple III L'extrait de trypsine obtenu dans l'exemple II est purifié davantage en dissoluant approximativement 1,1 gr. d'extrait de trypsine dans 55ml d'eau distillée. Environ 9,16 ml d'une solution de 10% de chlorure d'aluminium dans l'eau distillée est 4-0 alors ajoutée au mélange en agitant constamment. Oe mélange est 71 37754 2121499 alors neutralisé par addition de 2 à 4% d'hydroxyde de sodium pour obtenir un pH = 7^0 mesuré au pïï-mètre. Ceci produit un flocculat qui est centrifugé hors du mélange. Le surnageant contenant l'antigène immunisant purifié est alors dialysé libre de tout sel contre de l'eau distillée et ensuite lyophilisé à sec. L'antigène immunisant purifié et sec sera par la suite mentionné comme "l'antigène surnageant de l'extrait de trypsine" ou pour simplification "A SET". Un antigène tel que "A SET" peut être produit similairement à partir de la tuberculoprotéine digérée par la trypsine comme décrit dans l'exemple I, ci-dessus. L'estérification des produits ci-dessus est réalisés par des procédés d'estérification ou plus ou moins courants. Généralement, il s'agit d'une réaction de l'antigène avec l'alcool en présence d'un catalyseur tel un acide minéral concentré. Néanmoins d'autres réactions d'estérification peuvent être utilisées Les exemples qui suivent sont spécifiques. Exemple IV Environ 30 mg de ASET obtenu à partir d'un bacille de la tuberculose de force H37 sont suspendus dans 3 ml de méthanol à température ambiante et 0,03 ml d'acide chlorhydrique ajoutés en agitant vigoureusement. Ce mélange est laissé une heure à température ambiante (230 c) - Environ 15 ml d'éther éthylique absolu sont ajoutés au mélange produisant un flocculat qui est centrifugé, et le flocculat obtenu est lavé deux fois à l'éther et ensuite séché à l'air à température ambiante. Ceci fournit un produit qui par la suite sera appelé "ASET méthylé" ou"ASET Me". Exemple V Environ 120 mg de tuberculoprotéine sont suspendus dans 12 ml de méthanol à température ambiante et 0,24 ml d'acide chlorhydrique sont ajoutés. Le mélange est homogénisé dans un broyeur de tissu et maintenu à température ambiante pendant des périodes variant de 30 minutes à 48 heures. Des portions sont prélevées à 30 minutes, 4 heures, 24 heures, 48 heures. Une méthylation parallèle est réalisée sur une quantité similaire de tuberculoprotéine maintenue à une température de réfrigérateur de 4°C-, Pendant la réaction à température ambiante,des portions sont prélevées du mélange réfrigéré à des temps équivalents. Chaque portion contient 3 ml et est mélangée, après récupération, avec environ 15 ml d'éther absolu pour la flocculation du produit 71 37754 2121499 méthylé. Le produit flocculé est enlevé par centrifugation et le flocculat récupéré est lavé deux fois avec de l'éther absolu et ensuite séché à température ambiante. L'un des aspects importants de la méthylation est que le méthanol employé doit être hautement purifié ou redistillé et que l'acide chlahydrique concentré doit être utilisé dans une proportion de 0,01 ml dans 10 ml de méthanol absolu contenant environ 10 mg d'antigène. Ces valeurs, bien sûr, peuvent varier pour réaliser les changements désirés lors de la méthylation de différentes fournées d'antigène. De préférence, la méthylation doit être effectuée depuis la température de réfrigération à la température ordinaire en une période de plusieurs heures, de préférence de l'ordre de 4 heures. Après la méthylation des produits du bacille de la tuberculose, ceux-ci sont précipités avec environ 5 volumes d'éther éthylique absolu. L'estérification des antigènes d'autres matériaux de départ peut être utilisée, produisant ainsi des antigènes modifiés de nombreux autres microorganismes chez lesquels l'immunité tissulaire en anticorps est importante pour l'immunisation. Donc les antigènes, produisant l'immunisation contre la variole et la fièvre typhoïde aussi bien que contre la tuberculose par exemple, peuvent être estérifiés pour produire un antigène induisant sélectivement une réaction immunisée tissulaire en anticorps." En transformant la forme antigène , le vaccin obtenu peut être utilisé pour des injections en milieu aqueux aussi bien que dans une émulsion eau-huile du type Ereund. L'utilisation d'antigènes estérifiés est illustrée dans les expériences suivantes. Elles montrent que la méthylation rétablit et même renforce l'effet du ASET et rend celui-ci ainsi que les antigènes semblables immunogènes en les injectant dans une solution saline ou dans l'eau distillée. La procédure en général, comprend une immunisation initiale et ensuite encore une après trois semaines. Les critères pour mesurer l'immunité lors des expériences sont le dénombrement des tubercules et le dénombrement des bacilles acide-résistants dans les poumons. Les souris sont des femelles GF-1 divisées en groupes de 10,avec une déclaration du traitement. 1. souris de contrôle non traitées 2. souris immunisées aux jours 0 et 24 avec des bacilles Erdman tués à l'acétone avec des injections sous- 71 37754 2121499 cutanées (S.G.) dans les régions inguinales de 0,25 mg dans 0,1 ml d'hexadécane constituant une émulsion eau-huile. 3. souris immunisées aux jours 0 et 24 avec 0,1 mg de 5 ASET à partir duquel le ASET Me a été préparé pour cette expérience dans 0,1 ml d'émulsion eau-huile. 4. souris immunisées aux jours 0 et 24 dans 1'intraderme (i.d.) avec 0,02 ml d'une solution saline physiologique contenant 0,1 mg de (ET). Pour ceux-ci et les groupes 10 suivants recevant l'antigène dans une solution saline, l'antigène est dissout dans l'eau distillée et ensuis du NaCl solide est ajoutée pour ajuster la concentration saline à la concentration physiologique. 5. souris immunisées aux jours 0 et 24 avec des quantités 15 de 0,1 mg de protéines (BT) injectées i.d. dans 0,02 ml de solution physiologique saline. 6. souris devant être immunisées aux jours 0 et 24 avec des quantités de 0,1 mg de ASET injectés i.d. dans 0,02 ml de solution saline. 20 7. souris devant être immunisées aux jours 0 et 24 avec 0,1 mg de E.T. Me dans 0,02 ml de solution salin i.e. 8. souris devant être immunisées aux jours 0 et 24 avec 0,1 mg de protéines BT Me en solution saline i.d. 9. souris devant être immunisées aux jours 0 et 24 avec 25 0,1 mg. ASET. Me. injectés i.d. dans 0,02 ml de solution saline. 10. souris devant être immunisées aux jours 0 et 24 avec des quantités de 0,1 mg de E.T. Me. dans 0,1 ml. d'une émulsion eau-huile, (injection S.C.) 30 11. souris devant être immunisées aux jours 0 et 24 avec 0,1 mg. de protéines de B.T: dans 0,1 ml d'une émulsion eau-huile (injection S.C.) 12. souris servant de contrôle "cuti réaction" auxquelles 0,1 mg de ASET.Me dans 0,02 ml de solution saline ont 35 été injectés au jour 24 sur le côté droit et la même quantité de E.T.Me ont été injectés sur le côté gauche. tous les groupes ci-dessus ont été infectés 5 semaines aprs le jour 0 en utilisant la voie aérienne et des bacilles in vivo. Les souris des groupes 4, 5> 6, 7> 8, 9i 12, ont été exa-40 minées 3*24 et 48 heures aprs leur deuxième injection au jour 24 71 37754 2121499 jour 21, jour 22, jour 23, pour détecter des réactions à l'inoculation dues au phénomène d'Arthus ou des réactions tardives sur la peau. HORAIRE jour 0, Première vaccination de tous les groupes de souris 5 l'exception des groupes 1 et 12. jour 9» inoculation du milieu K-G pour l'infection du donneur jour 19, inoculation intra-veineuse de 10 souris CF-l avec 0,5 mg K-G d'une culture de bacilles Erdman, prélevée à la surface comme donneurs pour infection par voie res-10 piratoire seconde vaccination de toutes les souris exceptées celles du groupe 1, lecture à la 3e heure pour détecter des réactions dues au phénomène d'Arthus. lecture à la 24e heure 15 jour 23, lecture à la 48e heure jour 35, infecter toutes les souris par voie respiratoire jour 54-, sacrifier les souris, examiner et évaluer les poumons à l'autopsie, traiter les poumons à la formaline. jour 68, dénombrer les tubercules sur les poumons, commencer le 20 donombrement des bacilles acido-résistants en utili sant la procédure de digestion. Certaines des inoculations initiales ont été réalisées avec des bacilles Erdman tués à l'acétone qui ont été émulsionnés dans un tampon phosphate à une concentration adéquate plusieurs 25 mois à l'avance et congelés jusqu'à ce qu'ils soient prêts à être utilisés. Les antigènes qui n'ont pas été méthylés ont été dissous dans le "Travenol" des Laboratoires Hyland. Les antigènes méthylés sont dissous dans l'eau. L'ASET méthylé se dissout aisément en formant une solution légèrement trouble. L'extrait de 30 trypsine méthylé et la tuberculoprotéine méthylée ont été dis sous dans l'eau distillés. La tuberculoprotéine méthylée est plusieurs fois remontée et descendue dans l'aiguille d'injection de la seringue avant de faire l'injection. La table suivante montre le dénombrement des unités 35 infectées des poumons des souris sacrifiées en utilisant 3 sou ris de chaque échantillon. 71 37754 . 9 . 2121499 opecimen %age du Conversion \ dénom- dénom- surface dénom-diamètre des pro- brement brement des brement 5 par rap. au point standard portions total points moyen 1-1 100 100 10 20 20 1-2 100 100 4 8 8 11.7 1-3 92 84 3 6 7 2-1 100 100 2 4 4 10 2-2 100 100 3 6 6 5.7 2-3 92 84 3 6 7 3-1 95 90 4 8 9 3-2 100 100 4 8 8 7-3 3-3 87 76 2 4 5 15 4-1 100 100 5 10 10 4-2 87 76 5 10 13 13.7 4-3 100 100 9 18 18 5-1 93 87 3 6 7 5-2 115 132 4 8 6 6.0 20 5-3 110 121 3 6 5 6-1 110 121 9 18 15 6-2 97 94 15 30 32 19-7 6-3 90 81 5 10 12 7-1 115 132 5 10 8 25 7-2 100 100 0 0 0 10.0 7-3 100 100 11 22 22 8-1 92 84 4 8 10 8-2 100 100 9 18 18 13-3 8-3 100 100 6 12 12 30 9-1 108 117 12 24 20 9-2 95 90 2 6 7 12.0 9-3 95 90 4 8 9 10-1 100 100 1 2 2 10-2 95 90 3 6 3 2.3 35 10-3 100 100 1 2 2 11-1 105 110 6 12 11 11-2 100 100 '5 10 10 9.0 11-3 130 169 5 10 6 12-1 100 100 21 42 42 40 12-2 95 90 6 12 7 19.0 71 37754 - 10 - 2 î 21499 12-3 103 106 10 20 19 12-4 115 132 5 10 8 La conversion des proportions transforme la surface des points comptés en l'équivalent à ceux estimées à une dimension 5 désignée comme 100%. Calcul : Surface du cercle = approximative p ment 0,8 d . Pour un chiffre arbitraire d'un cercle de 100% avec 10 pour "d", la surface vaut 80. Pour les points d'une autre dimension la surface sera différente; la proportion par rapport à la dimension standard varierait, par exemple pour 1-3 10 d=9»2 a= 0,8 (9,2)^ = 6?. La proportion 62. _ g^/ du standard. Ceci est la conversion des proportions. §i le chiffre 80 est p constant, faire les calculs en multipliant (d ). (0,01). Les calculs pour les bacilles acido-résistants. (BAR) par gramme de poumon sont donnés dans la Table II suivante. Le dé-15 nombrement des bacilles acido-résistants est multiplié par 714-pour donner le nombre de bacilles acido-résistants par ml. Ceci est divisé par le poids total du poumon pour obtenir le nombre de bacilles acido-résistants par gramme. Table II 20 Specimen AFB ml AFB Km Moyenne AFB / pçm 1-1 14280 15230 1-2 5712 5540 7720 1-3 4998 5060 25 2-1 2856 2574- 2-2 4284 3395 2714 2-3 3570 2164 3-1 6426 5880 3-2 5712 4840 4228 30 3-3 2856 1933 4-1 7140 6090 4-2 9282 7780 6815 4-3 9282 6540 5-1 4998 4850 35 5-2 4284 3972 4160 5-3 3570 3650 6-1 10710 7286 6-2 22848 20390 10280 6-3 6426 3175 40 7-1 5712 5820 71 37754 2121499 - ii - 10 15 7-2 0 0 4590 7-3 11424 7930 8-1 7140 6010 8-2 12852 11500 73^0 8-3 6426 4495 9-1 14280 12310 9-2 4998 3675 6590 9-3 4998 3780 10-1 1428 1190 10-2 2142 1830 1322 10-3 1428 94-6 11-1 7854- 6720 11-2 7140 5660 4-752 11-3 2856 1855 12-1 29988 24790 12-2 4998 4670 14000 12-3 13566 14760 12-4 8568 11740 Pour les expériences ci-dessus, 1'infection 20 si élevée que souhaitée. L'infection a été réalisée en utili sant la voie respiratoire et des bacilles in-vivo. Les dénombrements sont souvent variables et la signification statistique des résultats est probablement basse d'un bout à l'autre de. I1expérience. 25 Le groupe de contrôle positif 2 ayant reçu des bacilles Erdman tués à l'acétone dans une émulsion eau-huile, montre un degré d'immunité. Les groupes 3, 5» 10 et 7 et 11 montrent une immunité acquise. La meilleure immunité a été induite par l'extrait trypsine méthylée injecté dans une émulsion eau-huile, 30 suggérant que la méthylation est utile pour l'antigène, même utilisé dans des émulsions eau-huile. La méthylation augmente le caractère immunologique à la fois de l'extrait de trypsine et de ASET utilisés dans des solutions salines aussi bien que dans des émulsions eau-huile. 35 L*estérification des antigènes est de préférence réalisée à partir de températures réfrigérantes (environ de 0-10°G) jusqu'à température, ambiante (15-25°C). Les alcools utilisés pour la réaction d'estérification exposée ci-dessus sont de poids moléculaire bas, habituellement des alcools avec 1 à 4 atomes carbone. 40 L'acide pour catalyser la réaction est de préférence l'acide 71 37754 i2 2121499 chlorhydrique; néamoins d'autres acides peuvent être utilisés. D'autres réactions d'estérification, sont, aussi utilisables pour préparer les antigènes estérifiés, telles que la réaction du diazométliane pour des esters méthyliques, la réaction du sel 5 d'argent avec un halogénure d-alKyle, etc... L'estérification avec les alcools est, néamoins, la réaction choisie. Bien entendu diverses modifications peuvent être apportées par l'homme de l'art aux dispositifs ou procédés qui viennent d'être décrits uniquement à titre d'exemples non limitatifs sans 10 sortir du cadre de l'invention. 71 37754 _13_ 2121499 aECTDICAglOffS 1. Procédé pour la production de vaccins immunisants non sensibilisés à la tuberculine caractérisé par les étapes suivantes: -purifier et hydrolyser au moins partiellement des antigènes d1 une culture ; - mélanger les antigènes au moins partiellement purifiés et digérés avec un alcool à bas poids moléculaire et un catalyseur. -maintenir ce mélange à une température depuis la température de réfrigération jusqu'à la température ambiante pour une période de temps suffisante pour provoquer la réaction de formation de l'antigène estérifié, et -récuperer l'antigène estérifié obtenu. 2. Procédé selon la revendication 1,caractérisé en ce que ledit catalyseur est un acide concentré. 3. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 et 2, caractérisé en ce que l'alcool est le méthanol. 4. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1-3, caractérisé en ce que l'antigène est un antigène pour l'immunisation contre la tuberculose. 5. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1-4- pour la production d'antigènes immunisants contre la tuberculose et non sensibilisés à la tuberculine, caractérisé par les étapes suivantes : -cultiver un milieu de bacilles de la tuberculose, -traiter ce milieu avec du sulfate d'ammonium pour précipiter les tuberculoprotéines; -récupérer ce précipité de tuberculoprotéines; -digérer et purifier les tuberculoprotéines récupérées; -suspendre ces tuberculoprotéines récupérées dans le méthanol avec acide; -maintenir cette suspension à une température inférieure à la température ambiante durant une période de 30 minutes à 48 heures, et -récupérer les dérivés de la tuberculoprotéine méthylée. 6. Procédé d'aprs l'une quelconque des revendications 1-4 pour la production d'un antigène immunisant contre la tuberculose non sensibilisé à la tuberculine, caractérisé par les étapes suivantes : -cultiver les bacilles de la tuberculose dans un milieu de 71 377S4 . w.. 2121499 culture synthétique, - -récupérer les bacilles de la tuberculose obtenus; -digérer ces bacilles de la tuberculose avec de la trypsine ou de la chymotrypsine 5 -récupérer l'extrait de bacilles digéré obtenu, -mélanger cet extrait récupéré avec du méthanol et un acide; -maintenir le mélange depuis une température réfrigérante jusqu'à la température ambiante durant 30 minutes à 48 heures pour produire un extrait méthylé, et 10 -ensuite récupérer l'extrait méthylé. 7. Procédé selon la revendication 6, caractérisé en ce que ledit extrait récupéré est purifié davantage avant la méthylation en le mettant en suspension dans une solution aqueuse de chlorure d'ammonium, en neutralisant cette solution avec de l'hydroxyde 15 de sodium pour produire un flocculat, en enlevant ce flocculat et ensuite en dialysant le surnageant obtenu contre de 1'eau distillée pour enlever lès sels. 8. Un vaccin contre la tuberculose produit selon le procédé décrit dans les revendications 1-7, caractérisé en ce qu'il n'est 20 pas sensibilisé à la tuberculine et qu'il comprend au moins un composé actif partiellement purifié de bacilles de la tuberculose estérifié avec un alcool à bas poids moléculaire. 9. Un vaccin contre la tuberculose d'après la revendication 8, caractérisé en ce que l'alcool est le méthanol. 25 10. Un vaccin contre la tuberculose d'après les revendications 8-9 caractérisé en ce que le composé actif partiellement purifié des bacilles de la tuberculose est de manière prédominante la tuberculoprotéine digérée plus tard par des enzymes protéolyti-ques. 30 11. Un vaccin contre la tuberculose d'après 11 une quelconque des revendications 9-10 caractérisé en ce que le composé actif partiellement purifié des bacilles de la tuberculose est un extrait de bacilles digérés à la chymotrypsine ou à la trypsine. 12. Un vaccin de la tuberculose d'après la revendication 11, ca-35 ractérisé en ce que l'extrait de chymotrypsine ou de trypsine est purifié davantage dans des solutions de chlorure d'aluminium par adsorption avec de l'hydroxyde d'aluminium. 13. Un vaccin contre la tuberculose d'après l'une quelconque des revendications 8-12 caractérisé en ce que l'antigène est mélangé 4-0 avec une solution aqueuse non toxique à l'emploi. 71 37754 -i5- 2121499 14. Un vaccin contre la tuberculose d ' après 1 ' une quelconque des revendications 8-13 j caractérisé en ce que l'antigène est mélangé pour usage avec un tampon phosphate et n-hexadécane constituant une émulsion eau-huile du type Freund. 15- Un vaccin contre la tuberculose, non sensibilisé d'après l'une quelconque des revendications 8-14, caractérisé en ce que le composé actif du bacille de la tuberculose est le surnageant purifié des bacilles de la tuberculose digérés à la trypsine.