FR 2135284 A1 19721215 FR 7215877 A 19720504 72 15877 2135284 La présente invention concerne une substance antigénique particulièrement adaptée au diagnostic de la tuberculose, ainsi que son procédé de préparation,, Il est reconnu depuis de nombreuses années que l'exposi-5 tio.n d'un être humain à la maladie couramment appelée tuberculose, résultant d'une infection par Myccbacteriujn tuberculosis (Mo tb0), peut être diagnostiquée par injection intradermique d'une matière antigénique extraite des bacilles des tubercules ou de leurs produits. La matière antigénique, appelée tubercu-10 line, incite des lymphocytes sensibilisés à produire une réaction retardée d'hypersensibilité sur le site de l'injection. La turgescence qui se manifeste au site d'injection est appelée oedème ou induration et la rougeur produite dans cette région est appelée érythème. Après un laps déterminé de temps, géné-15 ralement 48 à 72 -heures, on estime le volume de l'oedème et on compare le résultat avec des étalons statistiques préala.-blement établis qui permettent d'établir une relation entre l'ampleur de la réaction après l'injection d'une dose particulière d'antigène et la probabilité et l'origine dans le temps 20 de la primo-infection par M„tbo Ceci permet d'estimer si le récepteur a une réaction "positive" ou "négative". De nombreuses substances antigéniques ou tuberculines existent ou ont été proposées, et on a utilisé de nombreux dispositifs d'injection intradermique. Le type classique d'in-25 • jecteur consiste en une aiguille et une seringuo^e l'on utilise d'après une technique universellement connue dans la littérature médicale et appelée "test de Mantoux", technique qui requiert une habileté considérable tant pour 1'administration qxie pour l'interprétation des résultats» D'autres dispositfs 30 d'injection et leurs techniques d'utilisation comprennent, dans la mesure où on les utilise encore, un test par simple éraflure, le test de "Vollmer" consistant à appliquer un timbre, les scarifications multiples effectuées à l'aide d'un instrument tel que le pistolet de Heaf (connu également sous la marque 35 déposée "Sterneedle"), ou bien la piqûre épidermique et l'injection simultanées, effectuées au moyen d'instruments tels que "Mono-Vacc" de la firme Lincoln Laboratories et "Tine Test", de la firme Lederle Laboratories» Pour des raisons qui sont sans importance poux- la présente invention, le test de Mantoux est BAD ORIGINAL 72 15877 2 2135284 admis, de façon générale}comme un test diagnostique normalisé, tandis que l'utilisation des autres instruments est généralement considérée comme un test de "dépistage", intéressant à utiliser comme premier test pour reconnaître, parmi de nombreux êtres 5 humains, ceux qui semblent avoir une réaction nettement "positive". Certains des tests mentionnés tels que le test de Vollmer, procédant par application d'un timbre, ont été rejetés pour leur manque de sûreté» le problème du "manque de sûreté" est facteur qui 10 est toujours présent même lorsqu'on utilise le test de Mantoux. Une cause majeure du facteur "manque de sûreté" provient de la nature de la matière antigène utilisée par les instruments, et les techniques de mise en oeuvre du test» les deux tuber-culines utilisées jusqu'à présent sont appelées, dans la litté-15 rature médicale, "tuberculine vieillie" (TV) et "dérivé protéinique purifié"(DPP), qui est un dérivé de TV. la littérature médicale a mentionné depuis des années , et l'existence du facteur "manque de sûrete'ya introduit l'expression "faussement positives" pour qualifier des réactions résul-20 tant de l'utilisation de TY et DPP. Ces réactions indésirables résultent principalement de la stimulation de lymphocytes déjà sensibilisés par une première exposition à d'autres bactéries ou une première infection par ces bactéries, par exemple des "mycobactéries atypiques" qui sont étroitement apparentées 25 à Matb Certains chercheurs ont admis dans ce domaine que l'isolement d'un antigène unique spécifique de M. tb. offrirait la matière antigéniqu.e idéale pour le diagnostic par cuti-réaction BAD ORIGINAL Jfr'-'-'sC ■■ 72 15877 3 2135284 de Motb., et pour des essais diagnostiques de sensibilisation à Motbo ou d'infection par M.tb., in vitro» On a effectué de nombreuses études sur le "mélange" antigénique de filtrats de culture de Motbo pour choisir et 5 isoler de façon ou d'autre un antigène permettant un diagnostic sûr et doué d'une grande spécificité? de nombreuses techniques ont été proposées pour isoler cet antigène mycobactérien» Voir par exemple "American Review of Respiratory Diseases", volume 89, 1, Janvier 1964, pages 29 et suivantes, et 10 volume 92, Décembre, partie. 2, 1965, pages 19 et suivantes. Toutefois, pour autant que l'on sache, il apparaît que la compréhension du mode de préparation-d'une matière antigénique douée à la fois dJune grande spécificité et d'une grande sensibilité a échappé aux recherches, malgré le fait qu'il existe 15 réellement des antigènes spécifiques de M»tb» et que l'on dispose, depuis de nombreuses années, de la littérature décrivant les méthodes de préparation et d'analyse pour la séparation et l'isolement d'antigènes de M»tb. Un antigène unique isolée M»tb», même s'il est très .pour 20 spécifique de souches de M»tb., est peu susceptible,/ae nombreuses raisons, dé donner une tuberculine satisfaisante, universellement applicable au diagnostic» Chez des êtres humains et des animaux sensibilisés à M»tb», de trop fortes doses d'un antigène unique sont requises pour obtenir des réactions même légèrement 25 positives d'hypersensiblité retardée, chez une faible proportion d'individus. On présume que des antigènes uniques ne peuvent pas provoquer la réponse d'un nombre suffisent de lymphocytes pour déclencher une inflammation suffisante. Pour cette raison, il pourrait apparaître une réaction indésirable d'hypersensi-30 bilité immédiate de la peau par l'entremise des anticorps ou d'une immunisation des individus testés,, pour une grande dose d'antigène. De plus, il est possible que certains individus ou certains animaux n'acquièrent pas l'immunité ou ne donnent pas de réponses d'immunisation à un antigène particulier ; il 35 peut en être ainsi sur une base congénitale ou une base acquise. Il n'est pas possible de trouver un antigène unique particulier dans toutes les souches de M»tb.capables d'infecter un individu ou un animal; si cet antigène n'était pas présent dans un organisme qui a infecté même un petit nombre d'individus ou d'animaux, BAD ORIGINAL 72 15877 2135284 l'intérêt et la sûreté de cet antigène unique dans le diagnostic seraient sérieusement compromis. le caractère physiochimique d'un antigène -unique peut, chez certains individus, ne pas provoquer la réponse positive 5 désirée d'hypersensibilité retaxdée, in vivo ou in vitro ; un tel antigène de M.tb. peut être un antigène de nature glu-cidique prédominante. On a montré également qu'une primo-infection ou sensibilisation par certaines mycobactéries atypiques fait disparaître la réponse d'hypersensibilité à l'antigène uni-10 que, même lorsque l'individu ou l'animal testé a été infecté ou sensibilisé assez récemment par des organismes de l'espèce M.tb. En fait, on a découvert qu'un mélange d'antigènes.multiples spécifiques de Motbo, qui ont chacun leurs caractéristiques physiques et chimiques distinctes, comme démontré par des ,et 15 techniques chromatographiques/ d'autres techniques de séparation, augmentent de façon synergique la réponse d'hypersensiblité retardée, sans réduire la spécificité, l'utilisation d'un tel mélange d'antigènes spécifiques conduit à une réponse de spécificité désirable, à des doses bien plus faibles que celles 20, qui sont nécessaires lorsqu'on n'utilise qu'un antigène unique de M. tbo Ainsi, on a découvert une nouvelle substance diagnostique antigénique qui est sensiblement dépourvue d'antigènes à réaction croisée et qui permet donc d'obtenir une réponse positive 25 d'hypersensibilité retardée à l'injection intradermique d'une quantité ou d'une masse antigénique raisonnable, de manière à faire apparaître à co\ip sûr la sensibilisation d'individus à des antigènes de M.tb. seulement. la figure unique du dessin annexé est une représentation 30 graphique des résultats d'essais de spectrophotométriè et d1immuno-diffusion, qui met en évidence le caractère de divers antigènes qui sont contenus dans un filtrat représentatif de cultures de M.tb. Avant d'entreprendre la description détaillée du pro-35 cédé de production de la nouvelle substance d'essai de l'invention, il est utile d'en donner tout d'abord un bref aperçu. Les grandes lignes du procédé sont les suivantes : I. Préparation d'un filtrat de culture ou d'un extrait bacillaire de M0tb0 bad original c0py j 72 15877 5 2135284 II. Fractionnement du filtrat de culture ou de l'extrait bacillaire et identification des antigènes contenus dans les fractions ; et 5 III. Préparation d'une substance d'essai par combinaison de plusieurs fractions qui contiennent des antigènes spécifiques de M»tb. et qui sont sensiblement exemptes d'antigènes susceptibles d'une réaction croisée» Io Préparation du filtrat de culture Plusieurs souches différentes de Motbo ont été utilisées 10 pour préparer les filtrats nécessaires de culture de M.tb. Il est facile de se procurer ces souches auprès de laboratoires des Etats-Unis d'Amérique et on peut les identifier de la façon suivante : C-3 ; C-27 ; H37 Rv et TMC-107» les cultures H37 Rv (et TMC-107) sont caractérisées par leur virulence et 15 sont fournies par le Docteur William Steencken, Saranac Lake, New York ; les cultures C-27 et C-3 sont détenues par le Docteur J» Bâtes, Vétérans' Administration Hospital, little Rock, Arkansaso Une série de cultures mycobactériennes atypiques est fournie par le Docteur Ernest Runyon, Sait Lake City, 20 Ut ah, ou par le "Vétérans' Administration Hospital", Little Rock, Arkansas ; on peut utiliser ces cultures pour les déterminations des réactions croisées et les préparations des antisérumso Des cultures et sous-cultures typiques sont conservées sur des milieux inclinés de Lowenstein-Jensen à 4°C. 25 -Pour la préparation des antigènes bruts, on utilise un milieu liquide de Proskauer-Beck modifié» (Pour de plus amples détails concernant ce milieu, voir "Journal of Bacteriology", 1946, volume 51, page 703). Après le traitement approprié, les milieux sont inoculés avec chacun des organismes étudiés» Après 30 l'incubation, le contenu des fioles est divisé en parties égales pour inoculer huit à dix fioles de Roux stérilisées, contenant chacune 250 itl de milieu de Proskauer-Beck. On les fait ensuite incuber pendant 8 à 12 semaines. 35 on récolte les cultures et on les stérilise par filtration sur des tampons filtrants de Seitz. On concentre ensuite la majeure partie du filtrat stérile de culture au cinquantième de son volume, par dialyse sous vide ; on ajoute du thiomérosal dans le rapport de 1:10 000 et on conserve ensuite le mélange Lorsque la croissance a atteint la densité désirée, bad original copy 72 15877 6 2135284 à -20°C jusqu'au moment de l'utilisation» II « Séparation et identification de l'antigène L'étape suivante consiste à fractionner le filtrat, de manière à séparer les antigèneso Cette opération peut être ef-5 fectuée de diverses façons. La chromatographie par échange ionique peut constituer l'un, de ces modes de séparation. On peut ainsi produire plusieurs fractions du filtrat, et on constate que certaines de ces fractions contiennent en même temps des antigènes spécifiques et des antigènes à réaction croisée de 10 Motb. On est donc obligé de séparer encore les fractions ou d'effectuer un sous-fractionnement. Une variante de la séparation chromâtographique consiste à effectuer une séparation par électrophorèseo D'autres chercheurs ont constaté que la fraction électrophorétique la 15 plus lente (appelée fraction A) contient un grand nombre d'antigènes spécifiques de Motbo ; une fraction de migration plus rapide (la fraction B) contient d'autres antigènes spécifiques ; tandis que la fraction la plus rapide (fraction C) contient beaucoup plus d'antigènes à réaction croisée que d'an-20 tigènes spécifiques. Les fractions électrophorétiques qui ont été nommées correspondent grossièrement, par leur teneur en antigènes, aux fractions chromatographiques désignées ci-après par les mêmes lettres. Dans tous les cas, chacune des fractions dominantes, 25 qu'elle ait été séparée par chromatographie par échange ionique ou par électrophorèse, contient encore un mélange d'antigènes spécifiques et à réaction croisée de Motb«, qui requièrent une autre séparation ou un autre sous-fractionnemento Cette autre séparation ou cet autre sous-fractionnement peut être effectué 30 au moyen de l'un quelconque des procédés suivants :■ Chromatographie par exclusion moléculaire ; concentration au point isoélectrique ; ou électrophorèse sur disques de gel (ou gel de polyacrylamide), notamment sa variante sur gel "discontinu". On peut séparer les divers antigènes en utilisant ces 35 techniques. Des procédés d'immuno-diffusion peuvent être utilisés pour déterminer, parmi les antigènes de toute fraction ou sous-fraction, ceux qui ont une réaction croisée et ceux qui sont spécifiques de Motbo La technique d1immuno-diffusion utilise BAD ORIGINAL 72 15877 7 2135284 des anti-sérums hyper-immunisants, relatifs à chacune des nombreuses souches de M„tb., de même qu'à des souches représentatives des groupes atypiques de mycobactéries. Une fois que les antigènes à réaction croisée ont été reconnus, les 5 fractions oxj&ous-fractions qui contiennent uniquement les antigènes spécifiques de M. tB. sont rassemblées pour former la nouvelle substance d'essai» Pour mieux expliquer les techniques utilisées dans le présent mémoire, on donnera ci-après une description d1exemples 10 spécifiques de techniques de séparation et de techniques comparatives, appliquées aux diverses fractions chromatographiques d'échange ionique. Il y a lieu de remarquer que les modes opératoires intéressants dans le cas d'une fraction peuvent aussi être utilisés pour les autres fractions. À l'heure actuelle, 15 on suppose que l'utilisation combinée de la chromatographie par échange ionique et de quelque autre forme d'électrophorèse sur gel de polyacrylamide, constitue le procédé le plus efficace . Par exemple, un filtrat de culture produit à partir d'une 20 souche de M»tb. est fractionné sur une colonne d'échange anio-nique de DEAE-cellulose. les techniques fondamentales utilisées sont décrites en détail dans les références bibliographiques précitées, et elles n'ont été que peu modifiées depuis leur description. Après avoir préparé la colonne, on la charge avec le 25 filtrat concentré» On "lave" ensuite la colonne avec le tampon initial pour éluer totalement les antigènes faiblement liés» Dans une modification plus récente, on utilise au moins 500 ml du tampon initial pour éluer totalement les antigènes faiblement liés, de manière à les empêcher de contaminer les 30 fractions subséquentes» la fraction ainsi produite est appelée "fraction de lavage", et elle gardera cette désignation dans l'exemple pratique. le tampon initial consiste en une solution de Ete^ïïPO^ 0,01 M ajusté àun pH de 8,0» On poursuit l'élution en utilisant une pompe polystaltique et un système "Varigrad" 35 de chambre à tampon qui augmente la molarité du tampon en la portant à 0,5 M, au moyen d'un gradient linéaire aplati» A mesure que l'éluat sort de la colonne, on le recueille dans une série de tubes» On analyse chacun des tubes par spectrophotométrie à 40 280 m|i poiir déterminer la présence de protéine» On se référera BAD ORIGINAL 72 15877 8 2135284 à la figure unique du dessin annexé qui est un graphique représentant la variation de la densité optique en fonction de la quantité totale d'effluent exprimée en millimètres » Les fractions principales produites sont caractérisées par les 5 maximums principaux désignés par "lavage", "A" et "BC" (ou fractions "B" et "0")o En utilisant des anti-sérums spécifiques de chacun des organismes mycobactériens étudiés dans les fractions et en les expérimentant dans l'immuno-diffusion vis-à-vis de chaque 10 fraction chromatographique, il est possible d'énumérer les antigènes contenus dans chaque fraction et de caractériser chaque antigène par sa spécificité vis-à-vis du groupe de Motbo ou sa réactivité en croix avec des mycobactéries atypiques. La figure unique du dessin annexé montre par exemple 1 5 que des antigènes contenus dans le filtrat de culture RIRV ont été identifiés dans cette expérience particulière. Les antigènes indiqués par une ligne en traits interrompus, présentant des espaces blancs verticaux^sont les antigènes communs à une ou plusieurs mycobactéries en dehors du groupe de Motbo Ils 20 portent les numéros 1, 3, 4, 6, 9, 10, 13, 14, 15, 20. En ce qui concerne la "fraction de lavage", on constate que les antigènes 1-4 sont présents ; parmi ces antigènes, seul le numéro 2 a été identifié comme étant spécifique du groupe M.tb. Dans l'ensemble, l'étape suivante consiste en un sous-fraction-25 nement ou en une élimination et une séparation des antigènes à réaction croisée pour les isoler des antigènes spécifiques de Motbo d'une fraction, et préparer ensuite la nouvelle substance d'essai à partir des sous-fractions ne contenant que les antigènes spécifiques de M.tb. Il y a lieu de 30 remarquer que les filtrats et les fractions chromatographiques varient lors d'études répétées sur un organisme quelconque. Par exemple, le filtrat de RIRV ne contient pas toujours exactement vingt antigènes et la fraction de lavage peut contenir plus de quatre antigènes, l'un au moins étant spécifique de 35 M.tb. Conformément à la présente invention, dans des expériences récentes conduites sensiblement comme dans l'exemple précédent, la fraction de lavage venant de plusieurs organismes Motbo a été soumise à une électrophorèse discontinue sur disque 40 pour séparer les antigènes qu'elle contenait» L'électrophorèse / .. « bad original 72 15877 2135284 sur disque, telle qu'on la pratique conformément à l'invention, consiste fondamentalement à faire passer un filtrat de culture ou, comme dans le cas présent, une fraction de ce filtrat, à travers une colonne composée de trois zones superposées de gel 5 de polyacrylamide ayant chacune une concentration différente en gel. Dans ces essais, la zone supérieure consiste en polyacrylamide à 5,0 la zone intermédiaire consiste en polyacrylamide à 7,0 $ et la zone inférieure consiste en polyacrylamide à 10,5 %. Pour isoler et caractériser les substances séparées par 10 électrophorèse, on découpe les colonnes de gel en de nombreux "disques"; on immerge chaque disque dans un liquide convenable, de manière à éluer lrantigène du gel. Après centrifugation, on jette les gels et on effectue des essais sur le liquide surnageant contenant les antigènes solubles. Dans une expérience, 15 effectuée en utilisant une fraction de lavage de H37R.V, on constate qu'un antigène spécifique de M.tb., identifié 10-10, est retenu sur le disque à 10,5 fo. Une autre fois, en utilisant une fraction de lavage C-3, un antigène identifié 8-10 est également retenu au même endroit dans la zone du disque à 20 10,5 comme c'était le cas de l'antigène 10-10 de H37Rv« On constate que ces deux antigènes sont identiques lorsqu'on les expérimente ultérieurement par immuno-diffusiono La fraction chromatographique A d'organismes M.tb. (d'origine humaine)a également été soumise à une séparation. 25 On à procédé à cette séparation en utilisant 1'électrophorèse en disques, comme décrit ci-dessus» Toutefois, pour expliquer une autre méthode, on a également effectué un sous-fractionnement en utilisant une concentration isoélectrique, qu'on décrira ci-après. En br$f, la concentration isoélectrique est effectuée 30 dans une colonne contenant plusieurs solutions de sucre alignées horizontalement, renfermant diverses concentrations en sucre. La colonne est conçue, à son extrémité supérieure,de manière à maintenir un pH faible ou un pH élevé et son extrémité inférieure est conçue de manière à maintenir les pH opposés. Des 35 connexions électriques sont également prévues à la partie supérieure et à la base de la colonne» La fraction à étudier est mélangée avec un support, appelé "Ampholine", marque déposée d'un réactif vendu par la firme LKB Industries, Inc» L'Ampholine et l'échantillon sont ensuite chargés en position centrale BAD ORIGINAL j 72 15877 10 I 2135284 dans la colonne. Lorsque l'on applique un courant électrique, les composants de l'ainpholine montent ou descendent pour se stabiliser à un. niveau auquel un pli particulier est établi. Les composants individuels de l'échantillon sont transportés 5 vers une zone particulière où ils se stabilisent également, et on dit alors qu'ils se concentrent» Une seconde concentration dans une gamme étroite de pH peut être effectuée de manière à permettre une autre séparation» On obtient une fraction A de filtrat concentré de cul-10 ture du bacille C-3 de la tuberculose (comme identifié ci- dessus) par chromatographie sur DEAE-cellulose, l'analyse par immuno-diffusion de cette fraction montrant qu'elle contient sept antigènes» Cette fraction est concentrée et soumise à une concentration isoélectrique dans une gamme de pH de 3 à 5, 15 en utilisant une concentration d'ampholine de 4 ^» Au bout de 48 heures, sous tension de 600 volts, on élue la colonne et on recueille l'éluat dans une série de tubes successifs» Les contenus des tubes numérotés de 11 à 20 sont rassemblés et on constate que ces tubes renferment une matière qui se con-20 centre dans la gamme de pH de 3,70 à 4,12. Le contenu des dix tubes est soumis à une seconde concentration isoélectrique et l'ampholite qui y est contenue établit un gradient linéaire dans la gamme de pH de 3,10 à 4,-15. Un test immunologique démontre que les antigènes se trouvent 25 -dans deux régions séparées. Dans la première région, ayant une gamme de pH isoélectriques de 3,2 à 3,7, se trouvent deux antigènes qui sont tous deux spécifiques de toutes les souches expérimentées de bacilles tuberculeux de l'homme et du boevif. (Les antigènes ne réagissent pas avec des anti-sérums relatifs 30 à l'une quelconque des mycobactéries atypiques). Ces deux antigènes spécifiques sont contenus dans une fraction identifiée 11-22B. Les deux autres antigènes ont des points isoélectriques supérieurs à 4,0 et réagissent en croix avec un ou plusieurs des organismes atypiques» Lorsqtx'on concentre d1une manière analogue 35 dix autres tubes successifs de l'essai à l'ampholine à 4 "/», on élue ensemble un autre antigène spécifique de M»tb» et deux antigènes à réaction croisée» Les maximums B et C ont été sous-fractionnés par électrophorèse en disques, comme indiqué ci-dessus, pour effectuer copy bad original 72 15877 n 2135284 10 35 la séparation des antigènes» les antigènes provenant de divers filtrats de culture ont été séparés par des combinaisons des procédés décrits ci-dessus et cnt été expérimentés sur des cobayes, comme décrit ci-après. Méthode de onti-r6aciion Bans une prenière série d'essais, on a utilisé des cobayes qui ont été infectés par une ou plusieurs mycobactéries pour déterminer les réactions épidermiques d'hypersensibilité retardée, vis-à-vis de certaines fractions. Des groupes de six cobayes ont été infectés avec une ou plusieurs des mycobactéries énumérées ci-après : Identifié ci-dessus M» Kansasii, espèce atypique 15 (1) H37 RV - (2) Groupe I - (3) Groupe II - (4) Groupe III - (5) Groupe IV - mycobactérium atypique, de souche Gause mycobactéries atypiques des souches Avin et Battey M» fortuitum, atypique 20 Certains cobayes ont présente deq4.nfeétions multiples, a que 1'on/énumérées dans leur ordre d'infection sur le tableau. I» TABLEAU I Mycobactéries infectantes Groupe I Groupe II Groupe III Groupe IV Première 30 Groupe de H37RV cobayes lot I Uniquement lot II Deuxième et dernière lot III Troisième et dernière lot IV Troisième et dernière lot V Troisième me Première et deuxième et dernière 40 Première Deuxième On a choisi certaines sous-fractions concentrées au point isoélectrique, préparées à partir des fractions A de chromatographie par échange ionique, po\xr la réaction épider-mique d'hypersensibilité retardée chez les cobayes, comme indiqiié ci-après : bad original C°py 72 15877 12 2135284 TABLEAU II Bacille tuber- Sous-fraction Antigènes (par immuno- culeux diffusion) C-27 4~7A 2, spécifiques do M0tb. 5 C-3 11-22B 2, spécifiques de M0 tb- H-37RV 1-3B 3j à réaction croisée avec des mycobactéries atypiques C-3 2-4B 3, à réaction croisée avec 10 des mycobactéries aty- piques On a effectué des essais comparatifs dans lesquels les cobayes de chaque lot du tableau I ont été inoculés avec chacune des sous-fractions du tableau II. 15 A titre de témoin, les cobayes ont été inoculés également avec le dérivé protéinique purifié (DPP), à savoir une tuberculine brute. Toutes les doses ont été de 0,0001 mg (protéine) ce qui est la dose "intermédiaire" normale de DPP0 les cobayes ont été examinés au bout de 48 heures et 78 heures pour déter-20 miner l'apparition de toute réaction épidermique; en cas de réaction positive, on a mesuré le diamètre de l'induration, qu'on a exprimé en millimètres, TABLEAU III Cobayes Induration épidermique moyenne pour l'inoculum 2.5 DPP 4-7 A 11-22B 1-3B 2-4B Lot I 7-15 mm S.R.* SoRo 11-14 mm 8-17 mm Lot II 14 mm S„R. SoRo SoRo 1 4 mm Lot III 13 mm S.R. SoRo 5 mm 12 mm Lot IV 14 mm S.Ro S.R. S.R. S.R. 30 Lot V 1 0 mm S.R. SoRo SoR. S.R. * = Sans réaction Il ressort de ces essais que les fractions (4-7A et 11-22B) contenant des antigènes spécifiques ne produisent pa.s de réaction chez les cobayes infectés, bien qu'il y ait eu 35 des réactions avec des anti-sérums in vitro (Voir tableau II), tandis que les tests démontrent que des antigènes à réaction en croix donnent manifestement une réaction identique à celle qui a lieu lorsqu'on utilise DPP„ Ces antigènes particuliers à réaction croisée peuvent être plus puissants que ccux qui 40 ne produisent pas de réaction, ou bien ils peut y avoir eu présence d'une plus grande quantité d'antigènes lorsque la bad original copyJ 72 15877 13 2135284 réaction a été effectuée, comparativement au ca£?6ù il n'y a pas eu de réaction. Il y a lieu de remarquer que des infections antérieures avec des mycobactéries atypiques telles que des organismes du groupe III, ont pour effet que des cobayes 5 ultérieurement infectés avec M»tb. ont une réponse négative aux fractions purifiées à réaction croisée et non vis-à-vis du produit DPP brut (voir lots II,IV et V). On a effectué d'autres essais en utilisant les sous-fractions identifiées sur le tableau IV, de manière à déterminer 10 l'effet qu'aurait eu, éventuellement, une dose plus forte» TABLEAU IV Bacille tuberculeux Fraction Antigène C-3 (voir tableau II) 11-22B 2, spécifiques de M.tb» TMC-107 14-31B 1, spécifiques de M.tb. 15 C-3 11-20Z 4, spécifiques de M»tb. 11-20A Toutes les fractions identifiées sur le tableau IV ont été préparées par séparation chromatographique de filtrats de culture et par concentration au point isoélectrique de la 20 fraction chromatographique A. Des tests utilisant ces fractions ont été effectués sur des cobayes infectés avec des souches M.tb» humaine (H37RV) et de boeuf, et trois soiiches de mycobatéries atypiques» La dose injectée de chaque antigène est de 0,001 mg, soit une dose dix 25 fois plus forte que la dose usuelle de DPP» Aucune réaction n'est apparue chez les cobayes infectés avec des mycobactéries atypiques. A ces taux de doses, la fraction 14-31B réagit positivement à raison de trois animaux sur cinq (souche humaine seulement) et la fraction 11-20Z réagit à raison de quatre 30 animaux sur cinq (souche humaine) et de deux animaux sur cinq dans le cas dqia souche bovine. Les fractions 11-22B et 11-20A ne réagissent en aucun cas» (Il y a lieu de rappeler que dans les tests précédents, aux doses de 0,0001 mg, la fraction 11-22B n'a en aucun cas produit, de réaction chez des animaux 35 sensibilisés à la souche H37RV). Bien que les tests portant sur plusieurs antigènes spécifiques de Motbo aient été positifs, la dose accrue n'a pas entraîné de réponse d'hypersensibilité retardée à un degré acceptable. fcÔPY bAD ORIGINAL 1 72 15877 h 2135284 D'autres essais ont été effectués avec ces fractions, et d'autres,contenant des antigènes spécifiques de M.tb. pour déterminer si des augmentations encore plus fortes de la dose pouvaient produire une réaction cutanée satisfaisante. Ces autres 5 fractions sont identifiées corone suit : TABLEAU V Bacille tuberculeux Fraction Antigène H37RV 1-3A 2-3, spécifiques de Motb. C-3 8-10 1, spécifiques de M.tb. 10 H37RV 10-10 1, spécifiques de M.tb. L'antigène 8-10 est isolé par séparation électrophorétique discontinue sur gel de la fraction de lavage, dans laquelle l'antigène spécifique est trouvé dans le disque de gel à 10,5 foo La fraction 10-10 est jjréparée de la même manière 15 que la fraction 8-10» Des cobayes infectés seulement avec la souche RIRV de M»tbo ont été utilisés dans ces autres tests pour déterminer l'effet de la dose pour des antigènes ou des fractions individuels o Le tableau VI donné ci-après reproduit - les résviltats 20 de ces tests, et comme dans les tableaux précédents, il compare les antigènes expérimentés à une dose de référence de DPP» Excepté dans le cas de DPP, les doses utilisées ont été de 0,01, 0,001 et/ou 0,0001 mg. On a mesuré et exprimé en millimètres la longueur, la largeur et la hauteur des indurations. BAD ORfGIN 00 PY Cobayes PPD T-ABIEAÏÏ VI Dose en railligraïnmes (protéine) 11-22B 4-7A 11-20Z 14-31B 0,0001 0,01 0,01 0,01 0,001 0,0001 0,01 0,001 14x 15x 1 1 6x 18x 3,5 13 x 13 x 1 SR SE. SR SR SR SR 5x 5x 0,5 SR SR SR SR SR SR SR SR SR 11x 12x 1 SR SR SR 16x 13x 2 15x 14x SR 2 SR SR = pas de réaction P = réaction présumée positive, parce qu'une dose dix fois plus faible donne une réaction positive - = non testé. TABLEAU VI (suite) Dose en milligrammes (protéine) Cobayes 1 -5 A 8-10 10-10 VJ1 0,01 0,001 0,0001 0,01 0,001 0,0001 0,01 0,001 0,0001 1 4x SR SR SR SR SR SR SR SR 0,5 9x SR SR 8x SR SR SR SR SR 1 3 SR SR SR SR SR SR _ a-y 4 SR SR SR SR SR SR 03 O 13x 8x 8x O 5 P 11x 8x P 8x SR - SR SR S 0,5 1x 1 x PO O 2 oj ui ro P = Réaction présumée positive, parce qu'une dose dix fois plus faible donne une réaction CO SR = pas de réaction positive § - = Non testé "D - 4> 72 15877 17 2135284 Il y g&ieu de remarquer qu'une concentrât ion de 0,01 mg (protéine) représente 100 fois la dose normale de DPP. Même à ces taux élevés de doses, il n'y a que cinq réponses positives dans le cas des antigènes purifiés sur 14 essais 5 effectués à une dose de 0,01 mg» Toutefois, on doit remarquer également que des doses très élevées produisent une réponse positive, contrairement à des doses plus faibles» Pour déterminer l'effet exercé par des sous-fractions mixtes ou par plusieurs antigènes, on prépare trois mélanges 10 contenant chacun des quantités égales de trois sous-fractions, comme indiqué ci-après : dose contienne 0,002 mg de protéine, soit environ vingt fois plus que la dose normale de DPP. (Chaque composant de chaque mélange a donc une concentration d'environ 0,0007 mg)» Des doses contenues dans un volume de 0,1 ml sont injectées à des cobayes 20 qui ont été'préalablement infectés avec la souche RIRV de M.tb. Comme dans les autres essais, on effectue des inoculations témoins de DPP en plus des injections des mélanges, les résultats du test sont récapitulés sur le tableau VII, les dimensions des indurations cutanées étant exprimées en millimètres 25 comme ci-dessus» 15 Mélange I 11-22B + 10-10 + 8-10 Mélange II 11-22B + 10-10 + 11-20Z Mélange III 4-7A - + *0-10 + 11-20Z On prépare ces trois mélanges de manière que chaque BAD ORIGINAL copy TABLEAU VII • Cobayes DPP Mélange I 8-10 Mélange II 0,0001 mg 0,002 mg 0,002 mg 0,002 mg 1 12x1 5x2 SR SR 10x7x1 2 1 5x1 5x2 SR ' SR . 12x12x0,5 3 7x5x1 SR . SR 12x10x0,5 4 17x16x2 5x4x0,5 5x5x0,5 12x13x1,5 5 10x11 x2 8x8x1 5x5x0,5 22x21x3 •VI ro Ul 00 11-22B Mélange III 4-7A vj 0,002 mg , 0,002 mg 0,002 mg ^ 10x8x1 13x11x1 6x6x0,5 5x5x0 13x13x1 SE SR - - 10x10x10 16x14x2 - œ IV) V*l vu IV) OD 72 15877 19 2135284 Les réactions produites par le mélange II qui contient un total d'au moins cinq antigènes différents spécifiques de M.tb., sont manifestement très semblables aux résultats produits par DPP. Comparativement à la réaction produite par la sous-5 fraction 11-22B utilisée seule (voir tableau VI), il est clair que le mélange exerce un certain résultat synergique. Ceci est fondé sur l'observation du fait que dans les tests récapitulés sur le tableau VI, la fraction 10-10 ne réagit nullement et la réaction 11-20Z ne réagit que chez cinq animaux, à une 10 dose de 0,001 mg. Ainsi, les réactions produites par le mélange II sont plus prononcées, c'est-à-dire favorisées par effet synergique, par rapport au résultat que l'on doit attendre de 11-22B ou de tout autre composant individuel utilisé seul. ' Des résultats synergiques similaires sont observés dans le 15 cas du mélang^/EII, comparativement à l'un de ses composants, à savoir la fraction 4-7A. Ces essais démontrent clairement que les tuberculines qui sont exemptes d'antigènes , à réaction croisée et qui comprennent plusieurs antigènes spécifiques de M.tb. peuvent 20 donner des réactions qui équivalent à celles qui sont produites par DPP. Il y/ê. lieu de remarquer qu'une fois qu'on a obtenu les sous-fractions qui contiennent des antigènes spécifiques de M.tb. et qui sont exemptes d'antigènes à réaction croisée, 25 elles peuvent être le point de départ d'autres combinaisons que l'on peut utiliser dans une cuti-réaction. Par exemple, on a constaté qu'un antigène individuel spécifique de M.tb. peut être isolé dans la zone de gel à 10,5 f°, en utilisant la technique d'électrophorèse discontinue sur gel pour chacune 1/ // 'M| « » 30 des fractions chromatographiques lavage,A et BC, des filtrats de culture de H37RV ou C3. Un mélange de trois de ces antigènes spécifiques de M.tb., douégéhacun de caractéristiques physio-chimiques nettement différentes, doit être un mélange à réaction plus large que la combinaison de trois antigènes spécifiques 35 de M.tb. qui proviennent de la même fraction chromatographique, tous étant en relation chimique étroite. Il est vraisemblable que la tuberculine idéale, qui ne provoque une réaction d'hypersensibilité retardée indiscutablement positive que chez des BAD ORIGINAL 72 15877 2135284 individus sensibilisés à M.tb. à une dose de protéine comprise dans une gamme comparable à celle des tuberculines brutes usuelles, consiste en un mélange de trois ou plus de trois antigènes spécifiques de M.tb., provenant de deux ou plusieurs 5 fractions chromatographique s et peut-être de plusieurs organismes du type M.tb. Il va de soi que la présente invention n'a été décrite qu'à titre explicatif, mais nullement limitatif et que de nombreuses modifications peuvent y être apportées sans sortir 10 de son cadre. BAD ORIGINAL 72 15877 21 2135284 fiEVEHDICATIOMS 1 . Nouvelle substance antigénique diagnostique préparée à partir de plusieurs fractions de filtrats de culture ou d'extraits bacillaires de Mycobacterium tuberculosls 5 (M.tb.) Pour détecter la sensibilisation immunologique à M.tb. chez des êtres humains et des animaux, douée à la fois d'une grande spécificité et d'une grande sensibilité, caractérisée par le fait qu'elle est sensiblement exempte d'antigènes à réaction croisée et qu'elle est constituée essentiellement 10 par plusieurs, antigènes spécifiques de M.tb., deux au moins de ces antigènes spécifiques étant choisis dans une fraction différente. 2. Substance suivant 3a revendication 1, caractérisée par le fait que les fractions sont préparées par chromatographie 1 5 par échange ionique sur DEAS-cellulose et comprennent une fraction de lavage, une fraction A et une fraction BC. 3. Procédé de préparation d'une substance d'essai, douée d'une grande spécificité et d'une grande sensibilité pour la détection de la sensibilisation immunologique à M.tb. chez 20 des êtres humains et des animaux, procédé caractérisé par le fait qu'il consiste : (a) à préparer au moins un filtrat de culture ou un ■ extrait bacillaire de M.tb.; (b) à fractionner ce filtrat ou cet extrait par chro- 25 matographie par échange ionique, de manière à produire plusieurs fractions chromatographiques ; (c) à sous-fractionner plusieurs de ces fractions chromatographiques, de manière à produire plusieurs sous-fractions contenant chacune au moins un antigène spécifique de 30 M.tb., et sensiblement exemptes d'antigènes à réaction croisée ; et (d) à mélanger plusieurs de ces sous-fractions de manière à produire une substance d'essai sensiblement exempte d'antigènes à réaction croisée et contenant plusieurs antigènes 35 spécifiques de M.tb. 4. Procédé suivant la revendication 3, caractérisé par le fait qu'on sous-fractionne au moins une fraction chromato- BAD ORIGINAL 72 15877 22 2135284 graphique par électrophorèse sur gel de polyacrylamide. 5. Procédé suivant la revendication 3, caractérisé par le fait qu'on sous-fractionne au moins une fraction chromatographique par concentration isoélectrique. 5 6. Procédé suivant la revendication 3, caractérisé par le fait qu'on sous-fractionne au moins une fraction chromatographique par concentration isoélectrique et électrophorèse sur gel de polyacrylamide. 7. Une substance préparée, notamment,au moins d'un 10 procédé conforme à la revendication 3. 8. la substance préparée au moyen du procédé suivant la revendication 4, qui est un mélange d'au moins une sous-fraction provenant de chacune de plusieurs fractions chro- matographi^es. . notamment 15 9* la substance préparée/au moyen du procédé suivant la revendication 4, pour laquelle 1'électrophorèse sur gel utilise trois disques superposés de gel de polyacrylamide ayant •des concentrations de 5 f°, 7 et 10,5 7°, et au moins une sous-fraction est extraite du gel à 10,5 i° de chacune de 20 plusieurs fractions chromatographiques.- 10. la substance préparée notamment au moyen du procédé suivant la revendication 3, dans laquelle au moins deux sous-fractions proviennent de la même fraction chroma-' tographique. BAD ORIGINAL