FR 2128362 A1 19721020 FR 7206432 A 19720225 72 06432 1 2128362 La présente invention est relative à un procédé de préparation de moût de brasserie. Lorsqu'on prépare du moût suivant le procédé habituel, on mélange du malt ou un mélange de malt et de grain non malté avec de l'eau 5 chaude, puis on filtre. Le filtrat résultant contient tout une gamme d'hydrates de carbone solubles provenant d'amidon liquéfié et de produits azotés solubles comprenant des protéines et leurs produits de dégradation; le filtrat est un milieu de fermentation approprié pour la levure, pour la préparation d'alcool. La plupart des matiè-10 res azotées du moût proviennent du malt, ayant été préformées au cours du procédé de préparation du malt. Les hydrates de carbone solubles sont produits par l'action des enzymes amylolytiques du malt sur l'amidon contenu dans le malt et l'amidon du grain non malté. C' est ainsi que tout grain non malté utilisé dans ce procédé contribue 15 principalement à, la fraction d'hydrates de carbone du moût. Il est essentiel de maintenir, dans le moût, l'équilibre approprié entre hydrates de carbone et protéines si on veut que la fermentation ait lieu de manière satisfaisante, mais, comme les hydrates de carbone provenant de produits non maltés sont moins onéreux que le 20 malt, la plupart des brasseurs adoptent le rapport maximum d'hydrates de carbone à protéines, dans le moût, compatible avec la qualité du produit. On a récemment proposé des procédés de préparation du moût qui évitent ou réduisent au minimum l'utilisation de malt, utilisant à la 25 place une (X-amylase commerciale ainsi que des enzymes protéolytiques commerciales pour dégrader les protéines et l'amidon dans le grain cru ou cuit. Une enzyme commerciale est une enzyme qui a été préparée industriellement (par exemple par fermentation), présentée sous une forme 30 appropriée permettant son utilisation dans des procédés industriels. L'enzyme peut être utilisée par elle-même, par exemple sur un support constitué par un diluant solide, ou sous forme de solution. Le traitement par 1' o 72 06432 2 2128362 L'invention a pour but de fournir un procédé perfectionné de préparation de moût. La Demanderesse a maintenant découvert, par exemple, qu'on peut avantageusement préparer du moût à l'aide d'une enzyme protéolytique 5 bactérienne commerciale thermostable, à une température supérieure à l'intervalle de température efficace normal pour les enzymes protéo-lytiques classiques, lequel intervalle de température normal est compris, par exemple, entre 50 et 55°C. On a découvert, de manière surprenante, que l'enzyme protéolyti-10 que thermostable permet une meilleure solubilisation des protéines, par comparaison avec les enzymes protéolytiques classiques. De plus, l'amidon peut être liquéfié et les protéines converties en composés azotés solubles par traitement simultané avec l'enzyme protéolytique thermostable et l'enzyme liquéfiant l'amidon, à la mê-15 me température, la température correspondant à un intervalle de température efficace pour l'enzyme liquéfiant l'amidon et supérieur à 1* intervalle normal de température efficace pour les enzymes protéolytiques classiques, ce qui permet de réduire le temps de digestion, par comparaison avec les procédés précédemment proposés dans lesquels 20 la liquéfaction de l'amidon et la conversion des protéines sont effectuées à des températures différentes. L'enzyme protéolytique thermostable a une activité optimale à une température comprise par exemple entre 65°C et 75°C, notamment d* environ 70°C. 25 Comme exemples d'enzymes protéolytiques thermostables on citerai - la Protéinase T (A.B.M. Industrial Products Limited, Voodley, Ches-hire, Angleterre) initialement préparée par Daiva Kasei K.K., Osaka, Japon sous les marques "Thermoase" ou "Thermolysin", - Astra ST1 (Lake Medel A.B., Suède), 30 - Astra 1048 (Lake Medel A.B., Suède), - Alcalase (Novo Industri A/S Danemark), - Bioprase (Nagase & Co., Ltd., Osaka, Japon), - D66/72 (A.B.M. Industrial Products Limited). La Protéinase T est préférable. 35 L'invention vise un procédé de préparation dé 'moût à partir d* une suspension aqueuse de matière végétale contenant de l'amidon et des protéines, suivant lequel l'amidon est liquéfié par traitement de la suspension à l'aide d'une enzyme liquéfiant l'amidon et les protéi- 72 06432 3 2128362 nés sont converties en composés azotés solubles par traitement avec une enzyme proteolytique commerciale thermostable, à une température supérieure à 55°C environ. L'invention vise également un procédé de préparation de moût à 5 partir d'une suspension aqueuse de matière végétale contenant de 1® amidon et des protéines, suivant lequel l'amidon est liquéfié et, à la même température, les protéines sont converties en composés azotés solubles par traitement simultané de la suspension à l'aide d'une enzyme liquéfiant l'amidon et d'une enzyme protéolytique commerciale 10 thermostable, à une température correspondant à un intervalle de température efficace pour l'enzyme liquéfiant l'amidon et supérieur à 1' intervalle de température normal efficace pour les enzymes protéolytiques classiques. On a découvert que l'atténuation apparente d'un moût pré— 15 paré par un procédé selon l'invention est améliorée et que la fermentation ultérieure du moût est facilitée. On a également découvert, de manière tout-à-fait inattendue, que la saveur de bière brassée à partir d'un tel moût est améliorée, si on la compare avec un échantillon témoin obtenu à l'aide d'une enzyme protéolytique classique. 20 En outre, en effectuant la protéolyse à une température plus élevée, les risques d'infection possible sont rendus minimes. Il est préférable que l'enzyme protéolytique soit obtenue à partir de Bacillus thermoproteolyticus Rokko. comme par exemple la Protéinase T précitée. 25 Selon un autre mode de mise en oeuvre de l'invention, indiqué à. titre d'exemple, la liquéfaction de l'amidon est pratiquement terminée avant la conversion des protéines, au lieu d'effectuer simultanément la liquéfaction de l'amidon et la conversion des protéines. Comme exemples de substances végétales contenant de l'amidon et 30 des protéines autres que les céréales, on citera des racines, des substances fongiques ainsi que des sous-produits de procédés de traitement de céréales. Comme exemples de substances appropriées on citera: le mil, le tapioca et le riz, ainsi que le blé, l'orge et le mais. 35 L'invention vise également le moût produit par un procédé sui vant l'invention. L'invention vise encore un procédé de brassage de la bière selon lequel du moût suivant l'invention est fermenté par de, la levure. 72 06432 4 2128362 L'invention vise aussi: - la bière préparée par un tel procédé, - un procédé de préparation d'un sirop de moût consistant à condenser un moût selon l'invention, 5 - un sirop de moût condensé lorsqu'il est préparé par un tel procédé. A titre d'enzyme liquéfiant l'amidon, il est préférable d'utiliser une o(-amylase bactérienne commerciale qui peut, par exemple, être obtenue à partir des sources suivantes: Bacillus subtilis. Ba— 10 cillus megaterium. Bacillus cereus. Bacillus amyloliquefaciens. Ba-cillus "polymyxa. Ou bien, par exemple, l'enzyme liquéfiant l'amidon peut être fournie par du malt. Il est préférable que le traitement par l'enzyme protéolytique 15 soit effectué à une température comprise entre 60 et 75°C. Lorsque la liquéfaction de l'amidon est effectuée avant la conversion des protéines, la température de protéolyse est de préférence comprise entre 60 et 70°C et, mieux, d'environ 62°C; et il est préférable que le pH soit compris entre 5 et 6 et, mieux, d'environ 20 5,5. L'invention vise aussi un procédé de préparation de moût à partir d'une suspension aqueuse contenant de l'orge non malté, consistant à liquéfier l'amidon en traitant la suspension par l'o(-amylase puis à traiteT la suspension, à une température de 60 k 70°C, par une 25 enzyme protéolytique commerciale thermostable obtenue à partir de Bacillus thermoproteolyticus Rokko. Lorsque la suspension est traitée simultanément par 1'enzyme liquéfiant l'amidon et l'enzyme protéolytique, il est préférable d'opérer à une température de 63 à 75°C, par exemple de 65 à 70°C et, mieux, 30 d'environ 65°C et il est préférable que le pH soit compris entre 5,5 et 8,5, par exemple entre 6,5 et 8,5 et, mieux, soit d'environ 7,5. L'invention vise également un procédé de préparation de moût h. partir d'une suspension aqueuse contenant de l'orge non malté, selon lequel l'amidon est liquéfié et, à la même température, les protéines 35 sont converties en composés azotés solubles par traitement simultané de la suspension, à une température de 65 à 70°C, à l'aide d'o La Demanderesse a découvert que si, par exemple, un produit 40 broyé courant de céréale crue ou de céréale crue et de malt nécessite normalement 0,5% d'enzyme proétolytique classique et 0,5% d' o^-amyla-se ayant chacune une activité standard , une période de 4 heures à 55°C suivie d'une période de 4 heures à 65-70®C seraient nécessaires pour liquéfier l'amidon et solubiliser les protéines? un mode de mise 72 06432 5 2128362 en oeuvre de l'invention, faisant appel simultanément à une enzyme protéolytique thermostable et à une d-amylase présentant les mêmes degrés d'activité, paraît ne nécessiter que 4 heures de digestion à une température de 65 à 70°C pour obtenir les mêmes résultats. 5 Par exemple, suivant un mode de mise en oeuvre de l'invention, du grain cru ou un mélange de grain cru plus du malt est broyé à sec ou moulu à l'état humide et mis en suspension dans de l'eau, à une température inférieure à 55°C environ, de manière à obtenir une pâte lisse, non gélatinisée, puis la température est élevée jusqu'à 65°C. 10 On ajoute ensuite à la fois 1' oc-amylase commerciale et la protéinase thermostable commerciale et on laisse la digestion se poursuivre jusqu'à obtention d'une liquéfaction appropriée de l'amidon et d'une conversion appropriée des protéines en composés azotés solubles. Si nécessaire, on élève ensuite la température jusqu'à une valeur de 15 70 à 75°C afin de mener à bonne fin la liquéfaction de l'amidon et la solubilisation des protéines. Si, à ce stade, la teneur en sucres fermentables n'est pas suffisante, on abaisse la température jusqu'à une valeur de 60 à 65°C, on ajoute une enzyme de saccharificati.on capable de libérer des sucres fermentables à partir de dextrines, et 20 on laisse la digestion se poursuivre. L'enzyme de saccharification peut être une enzyme commerciale ou peut, par exemple, être de la /3_amylase ajoutée sous forme de malt broyé. La /^-amylase commerciale peut notamment être obtenue à partir de soja. On peut utiliser d'autres enzymes de saccharification, par 25 exemple 1'amyloglucosidase. Il est préférable d'utiliser l'enzyme de saccharification à une température entre 55 et 60°C et à un pH de 4,5 à 6; mais, lorsqu'on utilise de 1'amyloglucosidase, il peut être approprié d'opérer hors de cette gamme de pH. 30 Après traitement enzymatique, on peut par exemple filtrer et/ou centrifuger le moût résultant et le faire passer directement a un traitement ultérieur normal pour préparer de la bière. Ou bien, par exemple, on filtre le moût et on l'évaporé jusqu'à obtention d'un sirop qu'on conserve en magasin et qu'on dilue ultérieurement aux fins 35 de traitement ultérieur normal; il est préférable de filtrer le moût sans le refroidir. Suivant un autre mode de mise en oeuvre de l'invention, le produit broyé initial comprend par exemple un mélange de grain non malté et de malt. On pulvérise tout d'abord sur le malt une préparation 40 aqueuse de l'o(—amylase et de la protéinase et on ajoute la préparation malt/enzyme ainsi obtenue à la céréale crue ou cuitè, à une température dé 60 à 70°C et, de préférence, de 65°C; qn' remarquera que la limite de température inférieure préférée de'60°C est plus basse que lorsqu'il s'agit de céréales non maltées pour lesquelles 72 06432 6 2128362 la limite de température inférieure préférée est de 63°C. On opère ensuite comme décrit plus haut. Selon un autre mode de mise en oeuvre de l'invention, on ajoute l'enzyme protéolytique à un mélange normal de malt de brasserie 5 ou de malt et de céréale non maltée, puis on prépare le moût de manière classique, sans faire appel à des enzymes commerciales. Comme 1' enzyme protéolytique est relativement stable dans toute la gamme de température habituellement utilisée pour réaliser le mélange (entre 55 et 75°C, la température optimale étant de 65°C), la protéine du 10 malt est encore solubilisée par l'action de l'enzyme protéolytique. De manière inattendue, la protéine de malt supplémentaire qui a été solubilisée présente l'équilibre normal de fractions de haut et bas poids moléculaire qu'on s'attend à trouver dans le moût ce qui a pour effet d'élever le rapport protéine/hydrates de carbone dans le 15 moût. En conséquence, pour ramener l'équilibre protéine/hydrates de carbone à la valeur la plus souhaitable pour le procédé de brassage particulièrement envisagé, on peut enrichir le mélange en y ajoutant un supplément de céréale non maltée , de sorte qu'on utilise une proportion plus élevée que d'habitude de substance non maltée à base 20 d'hydrates de carbone. En outre, lorsqu'on doit utiliser dans le brassage des malts ayant une teneur faible en protéine soluble disponible, par exemple lorsqu'on utilise de l'orge de qualité médiocre pour la préparation du malt, l'addition d'une protéinase thermostable lors du mélange 25 a pour résultat la solubilisation d'une quantité supplémentaire de protéine, élevant ainsi l'équilibre protéine/hydrates de carbone jusqu'à la valeur désirée. Dans les exemples non limitatifs suivants, donnés à titre d'illustration de l'invention, on utilise certaines unités pour exprimer 30 l'activité des enzymes. Ces unités sont définies comme suit: 1. Unités Xn On considère qu'une préparation de protéinase a une activité de 36 unités Xn par graimie lorsque 5 ml d'une œncentxaticaa de 2 g/litre d'enzyme agissant sur 10 ml d'une solution aqueuse de caséine'"Hammerstein" à 35 2% en poids à un pH de 6,5 tamponné au phosphate et à une température de 35°C produisent au total 4 mg d'azote soluble dans une solution d' acide trichloracétique à 4% en 30 minutes. 72 06432 2. Unités X Une préparation d' tf-amylase bactérienne a une activité de 1 unité X par gramme lorsque 250 mg de cette préparation réagissent sur 1 g (poids sec) d'amidon de farine en un volume total de 55 ml à 30®C 5 et à un pH de 6,0 (tampon à base de phosphate) de manière à atteindre la dextrinisation en 15 minutes. La "dextrinisation" est définie comme le moment où la coloration obtenue en ajoutant 1 ml de la solution réactive précitée à 5 ml d'une solution d'iode 0,0007N est égale à une coloration étalon. Cet-10 te coloration peut être vérifiée visuellement par rapport à un disque étalon No. 4/29 A.S.C.B. d'un dispositif de mesure de la coloration "Lovibond tintometer" pour l'amylase dans le malt, ou peut de préférence être relevée sur un spectrophotomètre à cellules de verre de 1 o cm à une longueur d'onde de 6175 A par rapport à de l'eau distillée, 15 lorsque la densité optique doit être de 0,800. 3. Unités Tyn Une unité Tyn est la quantité d'activité enzymatique qui, lorsqu'on la fait réagir sur 200 mg de caséine Hammerstein en un volume total de 15 ml tamponné au phosphate à pH 6,5, et à une température 20 de 35°C, produit en 30 minutes de réaction un microgramme par minute d'équivalent de tyrosine d'azote total soluble dans une solution d' acide trichloracétique à 4%. 1 K Tyn = 1000 Tyn et 1 Xn s 5860 Tyn. 4. Unités Tys 25 Une unité Tys est la quantité d'activité enzymatique qui, lors qu'on la fait réagir sur 200 mg de caséine Hammerstein en un volume total de 15 ml tamponné au phosphate à 6,5 , à une température de 35° C, produit en 30 minutes de réaction un microgramme par minute d' équivalent de tyrosine de composés aromatiques azotés solubles dans 30 une solution d'acide trichloracétique à 4$, comme déterminé en mesurant la densité optique dans des cellules de silice de 1 cm par rap- o port à un témoin de réactif à une longueur d'onde de 2750 A. 1 K Tys = 1000 Tys EXEMPLE I 35 Comparaison d'un produit de digestion de 100% d'orge utilisant iitip protéinase bactérienne classique avec celui utilisant une protéinase bactérienne thermostable Essai A Protéinase bactérienne normale 72 06432 8 2128362 A une suspension aqueuse d'orge broyé on ajoute 0,5% de Protéinase 36Xn (36 unités XN/g; fournie par A.B.M. Industrial Products Limited), plus 0,5% de Nervanase (^-amylase, 9 unités X /g; fournie par A.B.M. Industrial Products Limited), ces deux poids d'enzyme 5 étant exprimés par rapport au poids initial d'orge pur. On maintient le produit de digestion à 55°C pendant 4 heures (temps de protéolyse) et à 65°C pendant 4 heures (temps d'amylolyse). On filtre le moût résultant, qui donne les caractéristiques analytiques suivantes, après avoir été ajusté à une densité de 1,040. 10 Rendement en extrait 73,6% Atténuation apparente du moût 78,1% Azote total du moût 82,6 mg/100 ml Azote C^-amino du moût 19,4 mg/100 ml Produit activité de la protéinase x temps = 15 x 36 x 8 = 1,44 Essai B Protéinase T A une suspension aqueuse d'orge broyé à 65°C on ajoute 0,5% de Protéinase T (36 unités Xn/g) plus 0,5% de Nervanase (o pendant 4 heures et on filtre le moût ainsi obtenu. Après avoir ajusté la densité du moût à une valeur de 1,040, on obtient les caractéristiques analytiques suivantes: Rendement en extrait 73,1% 25 Atténuation apparente du moût 79,0% Azote total du moût 88,7 mg/100 ml Azote Oi-amino du moût 20,1 mg/100 ml Produit activité de la protéinase x temps = foo x 36 x 4 = °*72 30 Si on compare les résultats des essais A et B, on peut voir que les moûts se ressemblent beaucoup. Toutefois, le produit activité de la protéinase x temps de l'essai B est environ la moitié de celui enregistré pour l'essai A. En conséquence, il découle de ces essais qu' en utilisant la protéinase thermostable on peut soit doubler l'uti-35 lisation de la substance végétale soit réduire de moitié l'activité de la protéinase par rapport au mode opératoire faisant appel à une protéinase normale. 72 06432 9 2128362 De même, le produit activité de 1' Dt-amylase x temps de l'essai B est la moitié de celui de l'essai A. EXEMPLE II Utilisation de protéinase thermostable "pour 5 élever la teneur en azote du moût On prépare un moût de malt en mélangeant une partie en poids de malt broyé avec 7 parties en poids d'eau, à une température de 65°C, pendant 2 heures. On recueille le moût par filtration. A titre comparatif, on prépare un mélange similaire mais, au début du mélange, 10 on ajoute 0,5% de Protéinase T (36 unités Xn/g) par rapport au poids du malt. On analyse les moûts des deux essais et on enregistre les résultats suivants: Moût normal Moût + (témoin) Protéinase T 15 Rendement % 78,5 79,1 Atténuation apparente % 81,9 82,3 Azote total mg/100 ml 78,4 90,1 Fraction Lundin A, % 24,6 25,1 Fraction Lundin B, % 10,2 10,8 20 Fraction Lundin C, % 65,4 64,1 Azote c*.-amino, mg/100 ml 20,1 23,6 On peut voir, d'après ces résultats, que l'addition de Protéinase T au mélange accroît le degré de solubilisation de l'azote tout en maintenant le spectre azoté total du moût. On remarquera que 1' 25 atténuation apparente est plus basse chez le témoin. EXEMPLE III Produit de digestion sur 100% d'orge, en utilisant de la Bioprase A une suspension aqueuse d'orge broyé, à 65°C, on ajoute 0,1i de Bioprase PN10 (100 unités Xn/g) plus 0,5% de Nervanase (o(-amylase 30 9 unités X/g), les deux poids d'enzyme étant exprimés par rapport au poids initial d'orge. On maintient le produit de digestion à 65°C pendant 4 heures et on filtre le moût ainsi obtenu. On ajuste la densité du moût à une valeur de 1,040, et on obtient les caractéristiques analytiques suivantes: 35 Rendement en extrait 74,0% Atténuation apparente du moût * 77,8% Azote total du moût 80,2 mg/100 ml Azote c^-amino du moût 17,4 mg/1 00 ml f 72 06432 10 2128362 Produit activité de la protéinase x temps x 100 x 4 = 0,75 EXEMPLE IV Produit de digestion sur IQO^d'orge obtenu avec D66/72 5 A une suspension aqueuse d'orge broyé à 65°C on ajoute 0,25% de D66/72 (72 unités Xn/g) plus 0,5% de Nervanase ( o(-amylase 9 unités X/g), les deux poids d'enzyme étant exprimés par rapport au poids initial d'orge. On maintient le produit de digestion à 65°C pendant 4 heures et on filtre le moût ainsi obtenu. On ajuste la densité du 10 moût à une valeur de 1,040 et on obtient les caractéristiques analytiques suivantes: Rendement en extrait 72,8% Atténuation apparente du moût 77,9% Azote total du moût 78,4 mg/100 ml 15 Azote oi—amino du moût 14,9 mg/100 ml Produit activité de la protéinase x temps Too5" x 72 x 4 = °»72 EXEMPLE V Schéma de fermentation de moûts préparés avec 20 une protéinase thermostable On prépare un moût témoin et un moût, contenant de la protéinase thermostable, en opérant comme décrit à l'exemple II. On prélève une portion aliquote de 22 ml de chaque moût et on ajoute 0,5 g de levure pressée. 25 On mesure la vitesse de fermentation telle qu'enregistrée par la chute de densité: 0 heure 12 heures 24 heures 36 heures 48 heures Moût normal (témoin) 1,040 1 ,035 1 ,021 1,009 1,007 30 Moût contenant la protéinase thermostable 1 ,040 1 ,032 1 ,014 1,006 1,006 Il découle de ces résultats que le moût préparé en utilisant la protéinase thermostable fermente plus vite et à un degré plus important que le témoin. 35 EXEMPLE VI Utilisation d'une enzyme protéolytique thermostable pour digérer un mélange broyé d'orge et de malt 72 06432 11 2128362 Essai A Protéinase classique A une suspension aqueuse de 50$ d'orge broyé et de 50$ de malt broyé on ajoute 1,0$ de Protéinase 36 Xn (36 unités Xn/g) plus 1,0$ de Nervanase ( Rendement en extrait 76,9$ 10 Atténuation apparente du moût 81,7$ Azote total du moût 70,6 mg/100 ml Azote ^ -amino du moût 13,7 mg/100 ml Essai B Protéinase thermostable A une suspension aqueuse de 50$ d'orge broyé et de 50$ de malt 15 broyé on ajoute 1,0$ de Protéinase T 36 (36 unités Xn/g) plus 1,0$ de Nervanase («^-amylase 9 unités X/g), les deux poids d'enzyme étant exprimés par rapport au poids d'orge. On maintient le produit de digestion à 65°C pendant 2 heures, on filtre le moût ainsi obtenu et on ajuste sa densité à une valeur de 1,040. Le moût présente les ca-20 ractéristiques analytiques suivantes: Rendement en extrait 77,3$ Atténuation apparente du moût 82,9$ Azote total du moût 81,6 mg/100 ml Azote «X-amino du moût 20,4 mg/100 ml 25 Le remplacement de la protéinase normale par un équivalent d' activité d'enzyme protéolytique thermostable provoque une décomposition plus complète de la protéine dans le produit broyé. EXEMPLE YII Comparaison entre un produit de digestion broyé à l'état humide de 30 95$ d'orge et 5$ de malt utilisant une protéinase classique et celui obtenu en utilisant une protéinase thermostable Essai A Protéinase bactérienne classique On broje l'orge à l'état humide et on le met en suspension dans de l'eau, à une température de 53°C. On ajoute une of-amylase (Ner-35 vanase 10X) et une enzyme protéolytique (Protéinase 36Xn), chacune à une concentration de 1$ en poids, par rapport au poids de l'orge. On maintient le mélange à 53°C pendant 30 minutes (temps de protéolyse) puis on élève la température jusqu'à 72°C et on la maintient à cette 72 06432 12 2128362 valeur pendant 40 minutes (temps d'amylolyse). On refroidit le mélange à 62°C et on ajoute 5$ de malt broyé. Au bout d'une heure on élève la température jusqu'à 75°C, on la maintient à cette valeur pendant 15 minutes, puis on recueille le moût par filtration. Le temps 5 de traitement global pendant lequel les enzymes réagissent sur le grain, y compris le temps nécessaire pour atteindre les diverses températures, est de 175 minutes. Le moût présente les caractéristiques analytiques suivantes: Rendement en extrait 73,4$ 10 Atténuation apparente du moût 73,8$ Azote total 113,6 mg/100 ml Azote o/-amino 19,9 mg/100 ml Produit activité de la protéinase x temps = 1.0 115 . m 100 * 36 x 60 ~ 1»05 15 Essai B Protéinase thermostable On broie l'orge à l'état humide et on le met en suspension dans de l'eau. On ajoute une c(-amylase (Nervanase 10X) à une concentration de 1,0$ (par rapport au poids d'orge) et on ajoute une protéinase thermostable (Proteinase T 36) à une concentration de 0,5$ (par rap-20 port au poids d'orge). On élève rapidement la température jusqu'à 65°C, et on la maintient à cette valeur pendant 60 minutes. On élève ensuite la température du mélange jusqu'à 72°C, on la maintient à cette valeur pendant 10 minutes, puis on refroidit à 62°C. On ajoute le malt broyé et, au bout d'une heure, on élève la température jusqu* 25 à 75°C. On recueille ensuite le moût par filtration. Le temps global de traitement est à nouveau de 175 minutes. Le moût présente les caractéristiques analytiques suivantes: • Rendement en extrait 74,7$ Atténuation apparente du moût 72,9$ 30 Azote total 168 mg/100 ml Azote o(-amino 23,9 mg/100 ml Produit activité de la protéinase x temps = 0*1 x 26 175 100 x 1 x 60 ~ Une comparaison des essais A et B indique que le produit activi-35 té de la protéinase x temps est réduit et que la digestion des protéines est améliorée par l'utilisation de l'enzyme thermostable. 72 06432 13 2128362 EXEMPLE VIII Comparaison de bières typiques obtenues à partir de moûts préparés à l'aide d'une protéinase classique et à l'aide d'une protéinase thermostable 5 On prépare 60 litres de moût en opérant comme décrit à l'exemple I, Essais A et B, et on fait bouillir chaque moût avec du houblon afin de lui conférer une amertume de 40 ppm d'isohumulone. On refroidit les moûts à 16°C et on ajoute à chacun 3,5 g/litre de levure pressée. On laisse le brassin fermenter pendant une durée totale de 10 5 jours, puis on sépare la bière de la levure par filtration et on 1'analyse. Analyse des bières Protéinase Protéinase normale thermostable 15 Densité initiale 1,040 1,040 Densité finale 1,007 1,006 Azote total, mg/100 ml 46,8 53,9 Coloration, degrés E.B.C. 11,0 12,5 pH 4,0 3,9 20 Rétention de la mousse £ secondes 110 108 Isohumulone, p.p.m. 28,5 28,0 Note donnée à la saveur 6 8 Là encore on remarquera les valeurs de densité finale. De manière inattendue, la saveur de la bière résultant de l'uti-25 lisation de la protéinase thermostable est significativement meilleure que celle brassée par le mode opératoire normal. La différence est notable en ce que la post-amertume astringente, qu'on rencontre souvent avec les bières brassées avec une protéinase normale, est absen— « te. 30 EXEMPLE IX Comparaison d'enzymes protéolytiques thermostables avec une protéinase classique sur la dégradation des protéines dans des céréales prégélifiées On mélange individuellement quatre échantillons de 50 g d'orge 35 finement broyé avec 150 ml d'eau et 1$ (par rapport au poids d'orge) de Nervanase 10X ( -amylase liquéfiant l'amidon). On élève rapidement la température jusqu'à 70°C, pendant 1 heure, puis on traite une heure à 80°C. On refroidit à 55°C le mélange auquel on ajoute la 72 06432 2128362 protéinase normale (Protéinase 36Xn), et on refroidit à 62°C les autres mélanges auxquels on ajoute les enzymes thermostables. On ajoute à tous les mélanges une concentration d'enzyme protéolytique équivalant à îfo de Protéinase 36Xn (par rapport au poids de l'orge). On 5 laisse les digestions se poursuivre pendant 6 heures et on prélève sur chaque essai un échantillon permettant de doser la teneur en azote soluble total et en azote ctf-amino. Les résultats obtenus sont présentés dans le tableau ci-dessous. Degré de solubilisation des protéines dans de 10 l'orge gélifié obtenu en utilisant diverses enzymes protéolytiques Enzymes Au bout de 6 heures Azote solu- Azote ble total o^-amino 15 Proteinase 36Xn 47 7,9 Bioprase PN10 58 10,7 A.B.M.I.P. D66/72 51 8,8 Proteinase T 36 55 11,9 Les valeurs sont exprimées en mg de ^/lOO ml de produit de 20 digestion. Ces résultats montrent l'amélioration de la solubilisation des protéines lorsqu'on utilise les enzymes thermostables, bien que toute les enzymes aient été utilisées à des degrés d'activité équivalents et dans des conditions optimales de pH et de température. On remarque-25 ra également les résultats remarquables obtenus avec la Proteinase T, par comparaison avec les autres enzymes thermostables. En outre, en utilisant une enzyme thermostable et en faisant digérer à une température plus élevée, le système est biologiquement plus stable. Par exemple, au bout de 6 heures de digestion à 55°C, le 30 pH du mélange réactionnel est tombé de 6,8 à 4,9 tandis qu'à 62°C le pH est tombé de 5,8 à 5,6. EXEMPLE X Caractérisation de la Proteinase T (Thermoase ou Thermolysin de MMrs. Daiva Kasei) 35 Description La Protéinase T est une enzyme protéolytique obtenue à partir de Bacillus thermoproteolyticus Rokko ayant une excellente thermostabilité et une excellente spécificité vis-à-vis du substrat. 72 06432 15 2128362 Propriétés enzvmatiques (a) Masse moléculaire : 37.500, environ (b) pH optimum - Tys standard à 35°C pH s 5,5 6,5 8,5 10,2 5 K Tys : 10,Q 20,0 21,2 4,8 (c) Température optimale - Tys standard à pH 6,5 K Tvs 25°C 10,0 35°C 20,0 10 55°C 48,9 60°C 60,2 70°C 81,2 80°C 66,0 (d) Thermostabilité - solution d'enzyme chauffée à pH 5,5 pendant 15 30 minutes avant essai à pH 6,5 , 35°C. • Température de chauffage Activité résiduelle 55°C 1i 60°C 100$ 65°C 1i 20 70°C 98$ 75°C 94$ 80°C 49$ 85°C nulle (e) Rapport = 33 25 (f) Inhibiteurs: phosphate, E.D.T.A. (g) Activateur : calcium Pour une caractérisation plus complète on peut se référer aux ouvrages suivants: (a) Matsubara, H., Singer, A., Sasaki, R., et Jukes, T.H., Biochem. 30 Biophys. Res. Commun., 21_ 242 (1965 (b) Endo, S., J. Fermentation Tech., 40 346 (1962) (c) Ohta, T., Ogura, T., et Vada, A., J. Biol. Chem., 241 5919(1966) (d) Biotechnology and Bioengineering vol.12 No.2 1970. EXEMPLE XI 35 Caractérisation d'Astra ST1 Description Astra ST1 est une enzyme protéolytique thermostable obtenue à 72 06432 16 2128362 partir de Streptomyces griseus« (a) pH optimum - Tys standard à 35°C pH : 5,5 6,5 8,5 10,0 K Tys : 9,0 20,0 35,0 28,6 5 (b) Température optimale - Tys standard à pH 6,5. Température K Tys 25°C 9,5 35°C 20,0 50°C 45,0 60°C 34,4 70°C 36,2 80°C 27,6 85°C 23,0 90°C 9,6 15 (e) Rapport Tyn = 30 Tys (d) Inhibiteurs : phosphate, E.D.T.A. EXEMPLE XII Caractérisation d'Astra 1048 Description 20 Astra 1048 est une enzyme bactérienne protéolytique thermostable. Propriétés enzymatiques (a) pH optimum - Tys standard à 35°C pH s 5,5 6,5 8,5 10,2 K Tys î 10,0 20,0 35,8 23,6 25 (b) Température optimale - Tys standard à pH 6,5. Température K Tys 25°C 9,0 35°C 20,0 45°C 43,8 30 50°C 56,2 55°C 64,6 65°C 113,6 70°C 115,0 75°C 126,0 35 80°C 55,0 (c) Thermostabilité - solution d'enzyme chauffée à pH 5,5 pendant 30 minutes avant essai à pH 6,5, 35°C. 72 06432 17 2128362 Température de chauffage Activité résiduelle 55°C 64$ 60°C 45$ 65°C 38$ 5 70°C 20$ 75°C nulle (d) Rapport = 49,4 (e) Inhibiteurs : phosphate, E.D.T.A. (f) Activateur : calcium 10 EXEMPLE XIII Caractérisation de l'Alcalase. de la Bioprase et du D66/72 Description L'Alcalase et le D66/72 sont des enzymes protéolytiques thenno-stables obtenues à partir de Bacillus subtilis. La Bioprase est une 15 enzyme protéolytique thermostable obtenue à partir de Bacillus liche-ni formis. Les autres caractéristiques des trois enzymes sont sensiblement identiques. Propriétés enzymatiques (a) Masse moléculaire : de 27.000 à 30.000 20 (b) pH optimum - Tys standard à 35°C pH : 5,5 6,5 8,5 10,2 K Tys : 7,0 20,0 31,8 44,0 (c) Température optimale - Tys standard à pH 6,5 Température K Tys 25 25°C 10,0 35°C 20,0 55°C 93,0 65°C 144,6 70°C 118,4 30 (d) Thermostabilité -solution d'enzyme chauffée à pH 5,5 pendant 30 minutes avant essai à pH 6,5, 35°C Température de chauffage Activité résiduelle 55°C 92$ 60°C 77$ 35 65°C 74$ 70°C 26$ (e) Rapport =58 (f) Activateur s calcium 72 06432 18 2128362 REVENDICATIONS 1. Un procédé de préparation de moût à partir d'une suspension aqueuse de substance végétale contenant de l'amidon et des protéines, notamment d'orge, suivant lequel on liquéfie l'amidon par traitement de la suspension à l'aide d'une enzyme liquéfiant 5 l'amidon, notamment d'une o 10 2. Un procédé suivant la revendication 1, caractérisé en ce que l'on effectue le traitement à l'aide de l'enzyme protéolytique thermostable à une température de 60 à 75°C. 3. Un procédé suivant la revendication 1 ou la revendication 2, caractérisé en ce que^L'enzyme protéolytique est obtenue à 15 partir de Bacillus thermoproteolyticus Rokko. 4. Un procédé suivant la revendication 1 ou la revendication 2, caractérisé en ce que l'enzyme protéolytique est obtenue à partir de Streptomyces griseus. 5. Un procédé suivant la revendication 1 ou la revendication 20 2, caractérisé en ce que l'enzyme protéolytique est obtenue à partir de Bacillus subtilis ou de Bacillus licheniforrais. 6. Un procédé suivant l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que l'amidon est liquéfié et les protéines sont converties à la même température en composés azotés 25 solubles par traitement simultané de la suspension à l'aide de l'enzyme liquéfiant 1'amidon et 1'enzyme protéolytique. 7. Un procédé suivant l'une quelconque des revendications 1 à 5, caractérisé en ce que la liquéfaction de l'amidon est à peu près terminée préalablement à la conversion des protéines. 30 8. Un procédé suivant l'une quelconque des revendications 1 à 6, caractérisé en ce que l'enzyme liquéfiant l'amidon est une enzyme commerciale, qu'on utilise également du malt et qu'on pulvérise sur le malt une préparation aqueuse de l'enzyme commerciale liquéfiant l'amidon et de l'enzyme protéolytique. 35 9. Un procédé suivant l'une quelconque des revendications 1 à 7, caractérisé en ce que la suspension aqueuse est constituée par un mélange normal de brasserie comprenant du malt et auquel on a ajouté l'enzyme protéolytique commercial, le malt fournissant 1'enzyme liquéfiant 1'amidon. 72 06432 19 2128362 10 • Un procédé suivant la revendication 9, caractérisé en ce la suspension aqueuse est enrichie par addition de céréale non maltée.