FR 2134477 A1 19721208 FR 7214594 A 19720425 72 14594 1 2134477 La présente invention concerne un nouveau nécessaire pour tests, utilisable pour tester la sensibilité de micro—organismes à des antibiotiques. Le test de sensibilité aux antibiotiques de micro-organis-5 mes, en particulier de bactéries, est un processus classique en laboratoires cliniques. Les méthodes utilisées pour effectuer ce test peuvent différer selon les laboratoires, mais en principe tous les tests appartiennent à l'un ou l'autre de deux groupes. Un groupe comprend les tests qui font intervenir une dilution en 10 série du médicament et l'autre groupe comprend les tests qui sont dénommés tests par diffusion. Au cours de la description faite ci-après de la technique antérieure, on se reportera en particulier aux problèmes relatifs aux tests sur les bactéries. La méthode de dilution en série utilisée pour le test de 15 sensibilité comprend ]a préparation d'une série de concentrations d'un antibiotique dans un milieu liquide ou solide capable d'assurer le développement de la bactérie à tester. Les milieux liquides sont habituellement versés dans des tubes à essai, tandis que les milieux solides sont placés habituellement dans des boî— 20 tes de Pétri. XI est usuel, dans la pratique, de préparer la gamme de concentrations d'antibiotique sous forme d'une série par double dilution. De cette manière, la concentration en antibiotique dans chaque tube ou boîte de Pétri diffère de celle obtenue dans le récipient voisin de la série selon un facteur égal à 2. 25 Pour effectuer l'essai, on inocule dans chaque tube ou botte de Pétri la bactérie, en question et, après la période d'incubation, on observe le développement bactérien ou l'absence de développement pour chaque concentration en antibiotique. De cette manière, on détermine la concentration d'inhibition minimale de l'antibio-30 tique par la dilution la plus voisine utilisée dans la série. Ce type de test est probablement la méthode la plus satis- ' faisante pour déterminer la sensibilité aux antibiotiques d'une bactérie. Toutefois, cette méthode est longue et la plupart des laboratoires cliniques ne sont pas équipés pour pouvoir l'utili-35 ser comme processus de routine. La plupart des laboratoires utilisent pour le test de sensibilité des méthodes par diffusion et, parmi celles—ci, la méthode employant des disques de papier est la plus couramment utilisée. Au cours du test de sensibilité au moyen du disque de pa-40 pier, une couche de milieu de gélose ou d'agar convenable est 72 1459A 2 2134477 tout d'abord préparée dans une boîte de Pétri et la surface est ensuite inoculée avec la bactérie à tester. Un petit disque de papier imprégné d'antibiotique est alors placé à la surface de la gélose, et on fait incuber la bôîte de Pétri pour permettre 5 à la bactérie de se développer. Plusieurs disques de papier, contenant chacun un antibiotique différent, peuvent judicieusement être placés sur la même boîte de Pétri. Pendant la période d'incubation, l'antibiotique diffuse du papier dans la gélose et établit un gradient de concentration. A condition que la quantité 10 d'antibiotique sur le disque soit convenable, le gradient de concentration va être tel qu'en un point quelconque écarté du disque, la concentration en antibiotique dans la gélose va correspondre à la sensibilité de la bactérie testée. Après la période d'incubation, une zone d'inhibition va ainsi apparaître. A 15 l'intérieur de cette zone, la concentration en antibiotique va correspondre à un taux d'inhibition, tandis qu'à l'extérieur de ladite zone la concentration va être inférieure à ce taux d'inhibition. Par suite du gradient de concentration en antibiotique établi au cours du test, la taille de la zone d'inhibition pro-23 duite peut être utilisée comme indice de la sensibilité pour la bactérie testée î une zone large indique que la bactérie est sensible à de faibles concentrations d'antibiotique, tandis qu'une petite zone indique que l'inhibition de la bactérie n'est assurée que par des concentrations plus élevées en médicament. Toutefois, 25 la sensibilité de la bactérie n'est pas le seul facteur qui détermine la taille de la zone d'inhibition produite au cours de ce test. La quantité d'antibiotique présente sur le disque lui-même va bien entendu avoir une influence sur la taille de cette zone. D'autres facteurs encore ont une influence sur la taille 30 de la zone, y compris l'épaisseur de la gélose et les vitesses relatives auxquelles l'antibiotique diffuse et la bactérie se développe. Si le nombre des bactéries utilisées pour inoculer la plaque est faible et si la vitesse de développement de la bactérie est lente, il va s'écouler un laps de temps d'autant plus 35 long pendant lequel la diffusion de l'antibiotique vers l'extérieur peut se produire. On peut alors atteindre des taux d'inhibition de l'antibiotique en des points plus éloignés du disque que cela ne serait autrement le cas, et des zones d'inhibition de dimensions relativement grandes en résultent. Inversement, 40 les facteurs qui favorisent un développement rapide de la bacté 72 14594 3 2134477 rie testée vont avoir pour conséquence la formation de zones d'inhibition relativement petites étant donné que, dans ces conditions, un moindre laps de temps va s'être écoulé pour permettre la diffusion du médicament vers l'extérieur. 5 Lors de la mise en oeuvre du test de sensibilité au moyen de disques, l'importance de la standardisation ou normalisation du processus a été soulignée par de nombreux auteurs. Certains chercheurs ont recommandé des processus de normalisation à la fois pour effectuer les tests et pour interpréter les résultats. X) Suivant ces recommandations, une bactérie est considérée comme sensible à un antibiotique particulier à condition que le diamètre de la zone d'inhibition dépasse une certaine taille. Des diamètres de zones sont également définis, qui indiquent une serv-sibilité ou une résistance intermédiaire. Malgré ceci et les au-15 très tentatives faites pour normaliser le test de sensibilité au disque, la position demeure d'une façon générale non satisfaisante. On ne sait pas nettement si cela est dû au caractère inadéquat de la normalisation ou au fait que de nombreux laboratoires ne tiennent pas compte de cette normalisation. De toute fa-20 çon, la situation n'est pas satisfaisante. En 1960, un groupe de techniciens de Birmingham a effectué une étude de test de sensibilité aux antibiotiques au cours de laquelle six cultures bactériennes ont été envoyées à un certain nombre de laboratoires d'hôpitaux en vue d'un test par la méthode classique de chaque 25 laboratoire. Les résultats ont révélé une absence très nette d'uniformité entre les laboratoires. Par exemple, dans le cas d'une culture, 15 laboratoires ont indiqué que la culture était sensible à la streptomycine, tandis que 13 l'ont considérée comme résistante. De même, dans le cas d'une autre culture, 11 la-30 boratoires ont indiqué qu'elle était sensible à la pénicilline, tandis que 19 laboratoires ont répondu qu'elle était résistante. En 1965, un rapport a été publié sur les résultats d'une campagne portant sur le test de sensibilité aux antibiotiques organisée par le Bacteriology Committee of the Association of Clinical 35 Pathologists, à laquelle ont participé 150 laboratoires. Quatre cultures bactériennes ont été adressées à chaque laboratoire en vue d'un test par la méthode courante dans ce laboratoire. Le rapport a conclu que "les résultats obtenus justifient les reproches des cliniciens, selon lesquels les tests de laboratoire, 40 tels qu'ils sont effectués à présent, ne sont pas sûrs". 72 14594 4 2134477 Plus récemment, un rapport a été publié à propos d'une étude portant sur le test de sensibilité aux antibiotiques selon laquelle deux cultures bactériennes ont été envoyées à 73 laboratoires australiens en vue d'un test aux antibiotiques courant. 5 Le rapport établi sur la base des résultats reçus montre, en ce qui concerne la pénicilline G par exemple, que pour l'une des cultures, 26 laboratoires ont indiqué une résistance et 34 une sensibilité, tandis que 9 la considéraient comme Intermédiaire au point de vue sensibilité. L'autre organisme a été considéré com-10 me résistant par 19 laboratoires, mais sensible par 51, tandis que 3 laboratoires lui reconnaissaient un caractère intermédiaire. La méthode de test de sensibilité la plus satisfaisante serait probablement le test par dilution en série si ce n'était le fait qu'il est considéré comme trop lent, et à cet égard le 15 but des processus de normalisation est de permettre d'établir une relation directe entre la taille de la zone d'inhibition et la concentration d'inhibition minimale de la bactérie testée. Il est par suite désirable de disposer d'un test ayant la simplicité de la méthode utilisant un disque en papier, mais fournis-20 sant le type de résultats obtenu au cours du test par dilution en série, à savoir l'inhibition ou l'absence d'inhibition du développement bactérien pour des concentrations précises d'antibiotique. Un but de l'invention est de créer un nouveau nécessaire 25 pour tests utilisable pour tester la sensibilité d'un micro-organisme à un antibiotique et permettant d'obtenir des résultats uniformes. Un autre but de l'invention est de créer un nécessaire pour tests utilisable avec des antibiotiques qui ne sont pas 30 stables au stockage dans les milieux sous forme de gel, en particulier les pénicillines. L'invention est matérialisée en conséquence dans un nécessaire pour tester la sensibilité d'un micro-organisme à un antibiotique, ce nécessaire comportant un socle muni sur une surface 35 plane d'au moins un alvéole peu profond tel que défini ci—après, contenant un milieu sous forme de gel, et une matière absorbante dont une partie au moins est imprégnée avec un antibiotique et ayant des dimensions telles que, lorsqu'elle est placée en contact avec le milieu sous forme de gel qui se trouve dans l'ai— 40 véole, cette matière absorbante imprégnée d'antibiotique vienne 72 14594 5 2134477 en contact sensiblement avec la totalité de la surface du milieu sous forme de gel. De préférence, ce nécessaire pour tests comprend un socle muni de plusieurs alvéoles oeu profonds et une matière absorban— 5 te imprégnée avec un ou plusieurs antibiotiques dans des zones distinctes correspondant chacune à la surface du milieu sous forme de gel de chaque alvéole. De préférence, le milieu sous forme de gel est formé par de la gélose ou agar—agar contenant des substances nutritives. Le plus judicieusement, le micro-organis-10 me testé est une bactérie. On entend par l'expression "alvéole peu profond" un alvéole ayant moins de 1 cm de profondeur et de préférence moins de 5 mm de profondeur, une couche préférée ayant 2 à 3 mm d'épaisseur. Avec un nécessaire pour tests dans lequel le socle comprend 15 un certain nombre d'alvéoles, les zones couvertes d'antibiotique, prévues sur la matière absorbante, peuvent contenir des antibiotiques différents, chacun selon une ou plusieurs concentrations. Quand la matière absorbante est appliquée sur le milieu sous forme de gel, l'antibiotique diffuse dans le gel pendant un laps 20 de temps raisonnable pour fournir dans l'ensemble de celui-ci une concentration uniforme et connue. Judicieusement, une période de 1 à 3 heures permet d'atteindre une concentration uniforme, selon l'antibiotique utilisé. Les concentrations en antibiotique dans les milieux sous forme de gel dépendent des critères requis 25 au cours d'un test et une normalisation des concentrations utilisées est obtenue facilement avec le dispositif suivant l'invention. Après la diffusion de l'antibiotique dans le milieu sous forme de gel, la matière absorbante est enlevée et ce milieu sous forme de gel est inoculé avec le micro-organisme. 30 La sensibilité, exprimée en pouvoir d'inhibition du déve loppement, pour certaines concentrations en antibiotique peut être déterminée directement par la méthode suivant l'invention, au lieu de la détermination indirecte faisant intervenir le diamètre d'une zone, par exemple dans la méthode classique utilisant 35 des disques de papier. On a effectué des tests avec un milieu formé de gélose pour déterminer la vitesse de diffusion de pénicilline G à travers une couche de 3 mm. On a préparé des blocs de gélose de lcm x 1cm x 3mm et on a appliqué des carrés de papier filtre de 40 lcm de côté, contenant 100 microgrammes de pénicilline G, sur la 72 14594 6 2134477 surface supérieure des blocs. A certains intervalles de temps, on a titré la concentration en pénicilline sur les surfaces supérieure et inférieure de la gélose. On a effectué cette opération en enlevant le papier contenant l'antibiotique et en appli-5 quant un carré de papier filtre de lcm de côté sur les faces supérieure et inférieure des blocs. Un volume fixe de liquide est ainsi prélevé par le papier aux surfaces de la gélose et la concentration peut être titrée relativement à des références-étalons préparées à partir de gélose contenant des concentrations connues 10 d'antibiotique. L'antibiotique restant dans le papier d'origine a été également titré par rapport à des références étalonnées appropriées. Les résultats obtenus sont indiqués sur la fig. 1 du dessin annexé, sur laquelle on a porté en abscisses les temps en 15 heures, en ordonnées à gauche, la concentration de la gélose en ^g/ml, et à droite la quantité de pénicilline qui demeure dans le papier en /\lg. Cette fig. 1 confirme qu'une distribution uniforme de l'antibiotique est rapidement obtenue. Les résultats d'autres essais sont illustrés dans le ta-20 bleau I, les signes 0 - © et 0-0 se rapportent aux concentrations en pénicilline dans les surfaces supérieure et inférieure de la gélose respectivement, et a — □ concerne la pénicilline restant dans le papier filtre. TABLEAU X = = = =: = s = SBS«ssss23ssss'=:ssatBass:s = «SBSssasssssxs::s8Ss = = = ssss = = = sssss An t ib io t iqu e Quantité ( /ug) 1 Temps de diffusion (minutes) Pénicilline G 1,0 110 10 110 100 110 Ampicilline 100 120 Tétracycline 10 230 100 230 Streptomycine 100 160 Erythromycine 100 220 Gentamicine 100 190 ;ssssrssssEssssssasx8SX 1-Temps mis par la concentration en antibiotique sur la face inférieure de la gélose pour atteindre 95% de la concentration sur 40 la face supérieure d'une couche de gélose de 3mm d'épaisseur. 72 14594 7 2134477 N.B. Les quantités d'antibiotique appliquées ont été choisies pour la facilité du titrage et ne sont pas celles qui seraient nécessairement utilisées dans la pratique. Les temps de diffusion semblent indépendants de la quantité d'antibiotique utilisée. 5 Des essais comparatifs ont été effectués pour comparer le procédé suivant l'invention et la méthode classique de dilution en série. Les résultats obtenus sont indiqués dans le tableau IX. TABLEAU II Comparaison des résultats de l'essai de diffusion avec la •30 concentration d'inhibition minimale déterminée par la méthode de dilution en série classique dans la gélose. On utilise des cultures en bouillon d'une nuit non diluées et on emploie le même inoculum pour l'inoculation au cours des deux tests. Au cours de l'essai par diffusion, on enlève les papiers imprégnés d'antibio-15 tique de la surface de la gélose après diffusion pendant trois heures. Lors du test de diffusion, on inocule les plaques employées avec un tampon, et on inocule les plaques de détermination de la concentration d'inhibition minimale avec une goutte, en utilisant un dispositif automatique distribuant environ 0,003 ml 20 de substance. 25 Concentration finale en antibiotique lors du test de diffusion (/Ug/ml)et développement* de l'organisme testé C.I.M par I dilution en l série dans I la gélose I ( /Ug/ml) | Benzylpénicilline 0,2 • 0,1 0,05 Staph.aureus Oxford - - - 0,02 I Staph.aureus T113 - + + 0,25 • 30 Staph.aureus T137 - + + 0,125 \ Ampici1line 0,5 0,25 0,12 Staph.aureus Oxford - - - 0,05 | Staph.aureus T113 - - - 0,25 • Staph.aureus T137 - + + 0,25 I 35 10 5 2,5 E.coli 10418 - - + 2,5 ; E.coli 37 + + + 25 i E.coli JT49 - - + 5 i E.coli JT50 - + + 5 i 43 E.coli JT52 - - + 5 : 72 14594 8 2134477 SUITE DU TABLEAU II P.mirabilis WM77 — — + : 5 Salm.typhimurium CT - - + : 2,5 Shigella sonnei II - - + : 2,5 Carbénicilline 100 50 25 : Ps.aeruginosa A - - + : 50 Ps.aeruginosa R59 - - + : 12,5 Ps.aeruginosa RI - - + : 25 Ps.aeruginosa R62 - - + : 25 Ps.aeruginosa R139 - - + : 50 10 5 2,5 ï E.coli 10418 - - + : 1,25 E.coli 100 - - - : 1,25 E.coli 101 - + + : 5,0 Enterobacter cloacae 1000 5 - - + : 5,0 P.mirabilis H - + + : 5,0 P.rettgeri C - - + : 5,0 PoVulgaris B - - + : 1,25 P.morganii G - - - : 1,25 Tétracycline 5 2,5 1,25 : E.coli 10418 - + + : 5,0 E.coli 37 + + + : 5,0 E.coli JT49 - + + : 5,0 E.coli JT50 - + + : 5,0 E.coli JT52 + + + : 5,0 P.vulgaris A - - 2,5 P.morganii A + - + + • 2,5 Shigella sonnei II - + + : 10 Erythromycine 0,5 0,25 0,12 : Staph.aureus Oxford - - - : 0,12 Staph.aureus T112 - - : 0,12 Staph.aureus T137 - - - : 0,5 Staph»aureus Smith — — + : • • 0,25 sssssxsssssBaïaissxsBsmsBSSsaiKxssKsitxssxsBsssssîHaxaeatxmKKSSSKXsMBssKB: * + « développement + « inhibition partielle du développement — m pas de développement Un mode de réalisation particulier de l'invention sera dé-40 crit ci-après à titre d'exemple en regard de la fig. 2 annexée, 72 14594 9 2134477 sur laquelle le socle A est formé par un plateau en matière plastique transparente mince. Ce plateau comprend six rangées de char-cune trois alvéoles B, chaque alvéole étant circulaire et ayant 3 mm de profondeur et 18 mm de diamètre. Un alvéole indépendant 5 C est également prévu pour un test de contrôle, c'est-à-dire que le milieu sous forme de gel ne renferme pas d'antibiotique. Chaque alvéole est rempli de gélose jusqu'à l'affleurement de la surface du plateau. Le nécessaire pour tests est complété par une feuille de 10 papier-filtre D Imprégnée par zones E avec six antibiotiques, chacun selon trois concentrations. Les zones E sont réparties sur le papier-filtre D de telle sorte que, lorsque ce papier-filtre est appliqué sur le plateau, chaque zone de gélose soit en contact avec une surface correspondante de papier—filtre im-15 prégné d'antibiotique. Un autre mode de réalisation particulier de l'invention sera décrit en regard de la fig. 3, dans laquelle le socle F est formé par un plateau en matière plastique transparente mince. Ce plateau comprend quatre rangées de huit alvéoles G, chaque 20 alvéole ayant une profondeur de 3mm et 10 x 15mm. La distance entre des alvéoles voisins, mesurée selon leur grand côté, est égale à 4mm, et selon leur petit côté à 3mm. Les dimensions du plateau considéré dans son ensemble sont telles qu'il s'adapte juste dans un couvercle ayant 82,5 x 124,5 mm. Des bandes de 25 papier-filtre ayant 10 mm de largeur et imprégnées de façon uniforme avec un antibiotique sont judicieusement placées de façon à couvrir quatre alvéoles à la fois, de sorte qu'avec des papiers-filtres renfermant diverses concentrations en antibiotique on peut tester quatre échantillons cliniques selon sept concen-30 trations en antibiotiques, plus un échantillon témoin. Des modifications peuvent être apportées aux modes de réalisation décrits, dans le domaine des équivalences techniques, sans s'écarter de l'invention. 72 14594 10 2134477 REVENDICATIONS 1.— Nécessaire pour tester la sensibilité d'un micro-organisme à un antibiotique, caractérisé en ce qu'il comprend un socle muni sur une surface plane d'au moins un alvéole de faible 5 profondeur contenant un milieu sous forme de gel, et une matière absorbante dont une partie au moins est imprégnée avec un antibiotique et ayant des dimensions telles que, lorsqu'elle est placée en contact avec le milieu sous forme de gel qui se trouve dans l'alvéole, la matière absorbante imprégnée d'antibiotique 10 soit en contact sensiblement avec la totalité de la surface de ce milieu sous forme de gel. 2.- Nécessaire pour tests suivant la revendication,1, caractérisé en ce que le socle comprend un certain nombre d'alvéoles peu profonds contenant chacun un milieu sous forme de gel, et 15 comportant une matière absorbante imprégnée avec un ou plusieurs antibiotiques dans des zones distinctes correspondant chacune à la surface du milieu sous forme de gel qui se trouve dans l'alvéole. 3.- Nécessaire pour tests suivant la revendication 1, ca- 20 ractérisé en ce que le socle comprend un certain nombre d'alvéoles peu profonds contenant chacun un milieu sous forme de gel, et comportant une ou plusieurs matières absorbantes imprégnées chacune avec un antibiotique et ayant des dimensions telles que les matières puissent être mises en contact avec le milieu sous 25 forme de gel d'un ou plusieurs alvéoles d'une manière telle qu'elles viennent en contact sensiblement avec la totalité de la surface du gel. 4.- Nécessaire pour tests suivant l'une quelconque des revendications 1 à 3, caractérisé en ce que le milieu sous forme 30 de gel est formé par de la gélose renfermant des substances nutritives. 5.- Nécessaire pour tests suivant l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que l'antibiotique est une pénicilline.