FR 2073358 A1 19711001 FR 7040685 A 19701113 70 ^0685 1 2073358 La présente invention concerne un nouveau procédé de préparation de vaccins multivalents et les vaccins nouveaux obtenus par ce procédé. Plus particulièrement, elle concerne un procédé comportant une infection multiple d'un seul système de culture de cellules avec plus d'un virus pour la production de vaccins viraux multivalents. Encore plus particulièrement, elle concerne un tel procédé pour la préparation d'un vaccin efficace pour combattre les affections respiratoires dues à un virus,et les vaccins produits . L'importance des vaccins est bien établie pour la lutte contre les affections virales. Il est également bien connu par les techniciens de la production de vaccins que le travail, les substances et le contrôle de qualité nécessités par chaque isolement de fluides infectés par des virus sont extrêmement coûteux. Comme un vaccin donné est spécifique pour une infection donnée, la prophylaxie des affections à virus a provoqué le développement d'associations de virus monovalents ou de vaccins avec les prix élevés qui en résultent et la nécessité de multiples injections pour la protection de chaque patient. Pour faciliter une partie du problème, l'industrie a développé certains vaccins multivalents qui sont simplement des mélanges de vaccins compatibles produits individuellement qui peuvent être administrés en une seule formulation d'injection et assurent la protection contre plusieurs affections virales différentes. Ces vaccins multivalents réduisent les frais de conditionnement et la nécessité d'injections multiples de chaque composant séparément mais sont sans grande influence pour réduire les frais globaux de production des composants individuels ou les frais finals pour le consommateur. La caractéristique importante de la présente invention est qu'on emploie un seul système de cellules pour le développement simultané de différents virus de sorte qu'il en résulte une seule opération d'isolement dans un vaccin multivalent à des frais substantiellement réduits. Cette réduction de prix est importante dans le cas de l'administration de vaccins multivalents contre les maladies sérieuses comme la poliomyélite, la rougeole, la rubéole, les oreillons,etc. a*ia 70 40685 2 2073358 elle est encore plus importante pour le traitement d'affections considérées comme de peu d'importance en raison du faible nombre de cas fatals, par exemple les affections respiratoires des enfants. Bien que les cas fatals soient rares, la maladie est fré-5 quente. Environ 40 fo de toutes les maladies respiratoires des enfants sont dues à ce type d'agent. Les affections respiratoires ne sont pas le résultat d'un seul agent mais sont plutôt associées à des virus différents comme le virus syncytial respiratoire, les virus de l'influenza, les virus du para-influenza, les virus des 10 rhinites, les virus du coryza, les adénovirus, les organismes du type pleuro-pneumonie etc. Il apparaît alors qu'une série de vaccins monovalents ou des vaccins multivalents sont nécessaires pour venir à bout des affections respiratoires. Toutefois, en raison du faible nombre de cas fatals et du prix élevé des vaccins monovalents ou 15 multivalents préparés par des méthodes connues, le développement d'un vaccin efficace contre les affections respiratoires ne s'est pas produit. Ainsi, le nouveau procédé de la présente invention trouve sa plus grande utilité dans la préparation d'un vaccin multivalent 20 contre les virus communément associés aux affections respiratoires. A ion certain moment on croyait communément que l'infection d'une cellule avec un type de virus empêchait l'infection de la même cellule par un virus différent. Cette théorie a été examinée et s'est montrée comme n'étant pas vraie d'une façon générale. On 25 a étudié l'infection multiple de cellules et on a trouvé qu'elle était possible avec certains virus. Le procédé de la présente invention comporte 1'inoculation d'un système de culture de cellules capable de supporter une croissance virale spécifique comme des cultures de cellules de rein de 30 singe vert d'Afrique ou des systèmes analogués connus avec deux virus compatibles ou plus comme le virus syncytial respiratoire et le virus du para-influenza types 1, 2 et 3, le virus de la bronchite infectieuse, les souches A^ , A2 et B du virus de l'influenza et des organismes comme Mycoplasma pneumoniae. 35 Après incubation à la manière habituelle, c'est-à-dire pen dant environ 6 à 25 jours à 28-38^0, on recueille le contenu des 70 40685 3 2073358 "bouteilles de culture selon des méthodes connues et les constituants viraux sont isolés par des méthodes qu'on sait être applicables pour les virus particuliers en cause et les produits résultants concentrés et purifiés sont utilisés dans des vaccins aqueux 5 ou du type adjuvant. Exemple 1 Infection simultanée de cultures primaires de cellules de rein de singe vert d'Afrique avec certains myxovirus. Des cultures primaires de cellules de rein de singe vert 10 d'Afrique sont inoculées avec diverses associations de virus syncytial respiratoire (1ml de 1 x 10^'^ particules de virus/ml), 4 7 de virus para-influenza type 1 (1 ml de 1 x 10 ' particules de virus/ml), de virus de para-influenza type 2 (1 ml de 1 x 10^'^ particules de virus/ml) et de virus de para-influenza type 3 3 7 15 (1 ml de 1 x 10 ' particules de virus/ml). Les inocula de virus sont adsorbés sur la culture de cellules pendant deux heures, puis les cultures -de cellules sont recouvertes avec le milieu 199 (sans sérum). Les cultures de cellules sont incubées à 36-C en position fixe, les virus sont recueillis 20 dix jours plus tard, inactivés par une solution de formaldéhyde (concentration finale 1:4000), adsorbés sur sulfate d'aluminium et pour de potassium (8 mg/ml) et injectés à des cobayes/évaluation antigène. Les résultats du titx-age sérologique (neutralisation du sérum ou hémagglutination-inhibition) sont présentés dans les ta-25 bleaux I et II. 70 40685 4 2073358 Tableau I Béaction anticorps d'hémagglutination-inhibition de cobayes à des virus de para-influenza types 1. 2 et 5 cultivés individuellement ou en association (MIF No.2) Agents viraux ■ Antigènes dérivés d'une infection multiple de la couche de cel CR50* Titres HI de cobayes individuels ayant reçu une injection de produit non dilué. lules l!i non 43 320** , 320, 160 160, 80 PI + P2 + P3 non 32 160, 80, 80, 40, 10 PI + P2 + P 3 oui 43 320, 80, 80, 40, 20 PI + P2 + RS non 24 160, 80, 40, 10, 10 EL + P2 + RS oui 43 40, 40, 40, 40, 40 P2 non 316 320, 320, 320, 160, 160 21 +P2 + P3 non 68 160, 160, 160, 80, 20 PI + P2 + P3 oui 6 160, 160, 20, PI + P2 + RS non 32 160, 40, 40, 20, 20 PI + P2 + RS oui 24 80, 80, 80, 40, n non 316 640, 320, 320, 320, 160 • PI + P2 + £2 non 147 160, 160, 160, 160, 160 PI + P2 + H oui 237 320, 320, 320, . 320, 160 70 40685 5 2073358 *CR^q = dilution la plus élevée d'antigènes qui stimule la production d'anticorps dans 50 fo des animaux (c'est-à-dire taux de séroconversion à 50 %). ** = Inverse des dilutions initiales de sérum 5 +HI = Hémagglut inat i on-inhib it ion Dans le Tableau I,dans la colonne intitulée "Agents viraux" sont indiqués les composants antigènes du vaccin (l'infectivité du virus a été inactivée) en injection intramusculaire à des cobayes. PI, P2 et P3 représentent les virus de para-influenza types 1, 2 10 et 3 respectivement. Dans chaque cas.l'un des agents viraux est souligné. Ceci indique l'agent viral particulier pour lequel on a examiné 1'antigénicité. Par exemple, dans chaque cas, dans la première rangée horizontale, on a observé les titres HI développés par les cobayes contre Pl. 15 La colonne 2 du tableau donne la source du vaccin multi- valent. Par exemple, ceux qui sont marqués "oui" ont été isolés d'un seul milieu de culture comme celui décrit dans l'exemple 1. Ceux qui sont marqués "non" ont été formulés à partir de 3 vaccins séparés. 20 ^50 = ^aux séroconversion à 50 i<>, c'est-à-dire dilution du vaccin qui provoque une réaction anticorps détectable dans 50 io des animaux injectés et exprimée comme l'inverse de la dilution. La dernière colonne montre les titres d'anticorps hémagglu-tination-inhibition obtenus pour les cobayes individuels. 25 On peut voir dans le Tableau I que les propriétés antigènes des agents viraux particuliers ne sont pas affectées de façon fâcheuse par la technique de l'infection multiple par comparaison avec celles des agents viraux cultivés individuellement et associés pour l'injection. 70 40685 6 2073358 Tableau II Réactions anticorps de neutralisation de sérum de cobayes au virus RS cultivé individuellement ou en association avec les types de virus de para-influenza indiqués (MIF Ho.2). Agents viraux Infection multiple de la couche de cellules * 50 Titres du sérum (AM) ** vaccin dilution 10- 10"1 RS non 237 225 40 RS + Para 2 oui 237 56 56 RS + Para 1 + Para 2 oui 147 115 28 RS + Para 1 + Para 2 non 48 56 20 *CR^q = taux de séroconversion à 50 c'est-à-dire dilution du vaccin qui provoque une réaction anticorps détectable dans 50 io des animaux injectés. **AM = moyenne arithmétique du titre en anticorps. 5 N.B. Toutes les récoltes de virus ont été mises en suspension dans l'alun avant injection. Exemple 2 Infection simultanée de cultures primaires de cellules de rein de singe vert avec certains myxovirus (MIF No.6). 10 On réalise une infection simultané de cultures de cellules de rein de singe vert avec des virus de para-influenza types 1, 2 et 3» Des cultures de cellules infectées sont incubées à 322C en position fixe et les fluides de cultures de cellules surnageants sont récoltés deux et trois semaines après infection. Des échantil-15 Ions contenant trois virus sont neutralisés avec des antiséra appropriés pour deux des virus et titrés pour 1'infectivité du troisième virus dans les cultures primaires de cellules de rein de singe vert. Les données d'infectivité dans le Tableau III indiquent que Ha 70 40685 7 2073358 réplication de tous les trois virus s'est déroulée également bien, qu'elles soient inoculées dans les cultures de cellules individuellement ou en association. Tableau III 5 Infection simultanée de cultures primaires de cellules de singe vert d'Afrique avec les virus de para-influenza types 1. 2 et 5. Agent viral Inoculum Jour de récolte Inverse du log^Q du titre en virus/ ml. 10 1 Para 1 14 4.7 2 Para 2 14 6.7 3 Para 3 14 6.7 1 Para 1+2+3 14 4.7 2 Para 1+2+3 14 6.2 15 3 Para 1+2+3 14 7.2 1 Para 1 21 6.2 2 Para 2 21 5.7 3 Para 3 21 4.7 1 Para 1+2+3 21 5.7 20 2 Para 1+2+3 21 6.7 3 Para 1+2+3 21 6.2 Dans le tableau III, dans la colonne intitulée "agent viral" est indiqué le type de virus de l'influenza pour lequel on a étudié 1'infectivité. Dans la colonne intitulée "inoculum" est indiqué le 25 type de virus avec lequel les cultures de cellules ont été inoculées et la colonne suivante indique le nombre de jours après l'infection au virus au bout desquels on a recueilli les fluides surnageants des cultures de cellules. Exemple 3 30 Vaccin multivalent contenant le virus syncytial respiratoire et les virus de para-influenza types 1. 2 et 5 suivant l'infection multiple de cultures de cellules données. 70 40685 8 2073358 Des cultures primaires de cellules de rein de singe vert d'Afrique (âge 8 jours) sont inoculées avec 2 ml de chacun des virus suivants : virus syncytial respiratoire, virus de para-influenza type 1, virus de para-influenza type 2 et virus de para-5 influenza type 3, chaque inoculum contenant approximativement le même nombre de particules infectieuses tel que déterminé par un titrage préalable d'infectivité. Le minimum d'inoculum est dispersé de façon uniforme sur la couche de cellules et incubé à 36-G pendant deux heures en posi- 10 tion fixe. Après la phase d'adsorption du virus on ajoute à chaque bouteille 100 ml de milieu 199 ajusté à pH 7,6 avec du bicarbonate de sodium et contenant 50 à 100 unités de néomycine par ml. Les fluides nutritifs surnageant la culture de cellules contenant le virus sont récoltés 7 à 14 jours après l'inoculation, clarifiés dans 15 une centrifuge DeLaval (12 000 t/mn = 18 500 x g) à une vitesse d'écoulement de 900 ml/mn. Le tout clarifié est inactivé avec du formaldéhyde 1:4000 pendant 6 jours à 362C et passé à travers une ultracentrifugeuse Sharples et/ou zonale à la force g appropriée (approximativement 70 000 - 85 000 x g), vitesse d1écoulement ap- 20 propriée (2 litres/heure Sharples) et gradient de densité approprié (bromure de sodium ou sucrose). Le concentrât purifié est utilisé directement comme vaccin type aqueux ou est associé à un adjuvant qui augmentera la réaction anticorps aux agents en cause. Chaque 9 11 dose de vaccin résultant contient 1 x 10 à 1 x 10 particules 25 de virus par souche. En suivant essentiellement le mode opératoire décrit dans 1'exemple 3, mais en remplaçant les inocula viraux qui y sont employés par les groupes d'inocula indiqués dans le tableau IV, on produit les vaccins multivalents indiqués efficaces dans la préven-30 tion des affections indiquées également dans le Tableau IV. 70 40685 9 2073358 Tableau IV Exemple Inocula Affection 4 RS, Para 1, Para 2, Para 3, M. pneumoniae Croup, bronchiolite, pneumoniae 5 RS, Para 1, Para 2, M. pneumoniae Croup, bronchi-olite, pneumoniae 6 RS,Para 1, Para 2 Croup, bronchiolite, pneumoniae 7 RS, Para 1, Para 2 Bronchite infectieuse* Croup, bronchite, bronchiolite, pneumoniae 8 Para 1, Para 2, Para 3 Croup 9 Souches du virus de l'influenza (A1, A2, B) Influenza 15 * Virus du type bronchite infectieuse chez l'homme. 70 40685 10 2073358 Revendications 1. Procédé de préparation d'un vaccin multivalent caractérisé en ce qu'on cultive simultanément des agents viraux dans un seul milieu de culture de cellules et on incorpore le produit obtenu 5 dans un milieu médicalement acceptable. 2. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que les agents viraux sont ceux qui sont responsables des affections respiratoires. 3. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que les 10 agents viraux sont choisis dans le groupe formé par : (a) le virus syncytial respiratoire, (b) les virus de parainfluenza, (c) les virus de l'influenza, souches A et B, , (d) les virus du type bronchite infectieuse, et 15 (e) Mycoplasma pneumoniae. 4. Procédé selon la revendication 1? caractérisé en ce que les agents infectieux sont le virus syncytial respiratoire et le virus de l'influenza types 1, 2 et 3« 5. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que les 20 agents infectieux sont le virus syncytial respiratoire, le virus de para-influenza types 1, 2 et M. pneumoniae. 6. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que les agents infectieux sont le virus syncytial respiratoire et le virus de para-influenza types '1 et 2. 25 7. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que les agents infectieux; sont le virus syncytial respiratoire, le virus de para-influenza types 1 et 2 et le virus de la bronchite infectieuse. 8. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que les 30 agents infectieux; sont le virus de para-influenza types 1, 2 et 3. * ~ 9. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que les agents infectieux sont le virus de l'influenza souches A et B. 10.Vaccin multivalent produit par le procédé dans lequel on cultive 35 simultanément des agents infectieux dans un seul milieu de culture de cellules et on incorpore le produit obtenu dans un sup 70 40685 n 2073358 port médicalement acceptable. 11. Vaccin multivalent selon la revendication 10, caractérisé en ce que les agents infectieux sont ceux qui sont responsables des affections respiratoires. 5 12. Vaccin multivalent selon la revendication 10, caractérisé en ce que les agents infectieux sont choisis dans le groupe formé par : (a) le virus syncytial respiratoire, (b) les virus de para-influenza, 10 (c) les virus de l'influenza, souches A et B, (d) les virus du type bronchite infectieuse, et (e) Mycoplasma pneumoniae. 13. Vaccin multivalent selon la revendication 10, caractérisé en ce que les agents infectieux sont le virus syncytial respira- 15 toire et le virus de para-influenza types 1, 2 et 3. 14. Vaccin multivalent selon la revendication 10, caractérisé en ce que les agents infectieux sont le virus respiratoire syncytial, le virus de para-influenza types 1 et 2 et M. pneumoniae. 15. Vaccin multivalent selon la revendication 10, caractérisé en 20 ce que les agents infectieux sont le virus syncytial respira toire et le virus de para-influenza types 1 et 2. 16. Vaccin multivalent selon la revendication 10, caractérisé en ce que les agents infectieux sont le virus syncytial respiratoire, le virus de para-influenza types 1 et 2 et le virus de 25 la bronchite infectieuse. 17. Vaccin multivalent selon la revendication 10, caractérisé en ce que les agents infectieux sont le virus de para-influenza types 1, 2 et 3• 18. Vaccin multivalent selon la revendication 10, caractérisé en 30 ce que les agents infectieux sont le virus de l'influenza souches A et B. •1T