FR 2081546 A1 19711203 FR 7106703 A 19710226 71 06703 1 2081546 L'invention a pour objet un nouvel éther de lysolécithine et l'utilisation des 1-alcoxyglycérine-phosphates-O)de monocholine (alcoxy-lysolécithines) de formule générale : CH--0-R 5 I 2 CHOH i <>* CH2-0-P02-Œ2-CH2- N °(_) 10 dans laquelle R représente un radical alcoyle comportant au moins 12 atomes de carbone, de préférence 18 atomes de carbone en tant qu'agent pour l'accroissement de la résistance naturelle de l'organisme, lesdites substances ne subissant pas de transformation métabolique dans l'organisme sous l'influence de 15 la phospholipase B. La cellule vivante, qui constitue la plus petite unité de l'organisme, a été jusqu'à présent l'objet d'un très grand nombre de recherches. On connaît très bien la configuration morphologique de la cellule et, dans l'essentiel, on a des données certai-20 nés sur la signification et le mode de fonctionnement des différentes structures subcellulaires. La membrane cellulaire aussi a déjà été l'objet de recherches approfondies. On a une idée très précise de sa structure fine et d'un grand nombre de ses fonctions telles que le transport actif ou passif, la diffusion inhi-25 bée ou facilitée, les effets de contre-courant, les effets de pompage, les processus d'excitation, le traitement de signaux et d'autres mécanismes. Il est d'autant plus étonnant qu'on a accordé jusqu'à présent si peu d'attention aux propriétés interfaciales des membranes, bien qu'il soit facile de reconnaître qu'une 30 grande, sinon la majeure, partie des fonctions de la membrane est influencée d'une façon décisive par leur activité inferca-ciale. L'idée que la modification de l'activité interfaciale pourrait constituer le mécanisme central de commande et de régulation ne paraît pas tellement déraisonnable quand on considère 35 que des modifications de l'activité interfaciale n'affectent pas seulement la perméabilité des membranes, mais aussi les seuils de potentiel électrique qui s'y établissent. Lorsqu'on tient compte en outre du fait que la perméabilité de la membrane est responsable de la direction, de la quantité et de la nature des 40 substances qui la traversent, et que le potentiel de la membrane 71 06/03 2081546 jous un roltf- iœyor'tiirl; -J;sr»s 3.à v^âïïsaxssion des signaux à l'intérieur de l'organisme - sans oublier que les modifications de différences de potentiel de part et d'autre des membranes sont à attribuer en dernière analysa à des modifications de la perméa-5 bilité de celles-ci » on pourrait arriver à la conclusion qu'il devrait être possible de produire des effets biologiques arbitrairement déterminés, en agissant sur les activités interfaciales des membranes® Pourtant s tout essai de contrôler les activités interfacia-10 les à l'aide de substances surfactives ou à activité interfaciale a été considéré par les spécialistes comme déraisonnable, car il est bien connu que ces substances sont, en général, fortement toxiques. Elles réduisent, déjà à des concentrations largement inférieures au domaine des doses qui sont nécessaires pour pro-15 duire un effet biologique ou pharmacodynamique, l'activité interfaciale de la membrane de manière telle que la membrane se désintègre^ Autrement dit, les substances à activité interfaciale produisent en général un effet cytolytique, elles anéantissent la membrane et détruisent la cellule. Cet effet cytolytique sera 20 d'autant plus grand que les substances à activité interfaciale seront plus fortement résorbées, c'est-à-dire fixées sur la membrane, et que leur transformation métabolique sera plus faible et plus lentes Les lysolécithines, c'est-à-dire les esters des acides acyl-25 glvcérophosp h or i que s et de choline, présentent également des propriétés à effet interfacial et il est connu qu'elles produisent, à des concentrations relativement élevées, un effet cytolytique, par exemple un effet hémolytique. Malgré cela, la dose létale des lysolécithines est relativement élevée, ce qui est à 30 attribuer au fait que les lysolécithines subissent, à l'intérieur de l'organisme, une transformation métabolique extrêmement rapide par réacylation en lécithines entre autres ou par désacyla-tion en glycérylphosphorvlcholine. Le fait que des alcoxy-lysolécithines de formule I, également surfactives, sont elles 35 aussi relativement peu toxiques, n'en est que plus étonnant, car elles se distinguent des lysolécithines par la substitution d'un groupe alcoyle au groupe acyle et, par conséquent, leur transformation métabolique devrait être considérablement plus difficile, sinon impossible, Ces alcoxy-lysolécithines présentent des 40 effets pharmacodynamiques, proportionnels aux doses, qui appaBAD ORIGINAL 71 06703 3 2081546 raissent déjà dans un domaine de doses nettement supérieur à la valeur de la dose létale. En leur qualité de substances surfactives, les composés de formule I modifient également l'activité interfaciale des membranes et ils conviennent donc d'une façon 5 remarquable aux modifications et au contrôle des propriétés interfaciales de ces dernières. L'application pratique des alcoxy-lysolécithines de formule I est liée à la possibilité de les utiliser comme agents d'accroissement de la résistance naturelle de l'organisme. Cet ac-10 croissement de résistance se manifeste par une aptitude à mieux résister aux infections et aux formations de tumeurs et, de plus, par la potentialisation du pouvoir antigénique vis-à-vis de produits immunogènes faibles, autrement tolérés. En plus, on peut utiliser les composés de formule I comme adjuvants et comme 15 moyen attractif de cellules in vivo et pour la production de cellules d'une activité immunologique très élevée. La fabrication des composés de formule I a été décrite dans les publications scientifiques ; on peut la réaliser, par exemple, selon le procédé décrit par D. Arnold, H.U. Weltzien et O. West-20 phal dans Liebigs ANN. Chem. 709 (1967) 234. La synthèse s'effectue conformément au schéma de réaction ci-après à partir de 1,3-benzylidèneglycérine par transformation de celle-ci en 2-benzyloxyglycérine, alcoylation de cette dernière, réaction du diéther de glycérine résultant avec du dichlorophosphate de 25 2-bromo-éthyle et introduction de l'ion triméthylammonium avec formation de l-alcoxy-2-benzyloxy-glycérine-phosphate-(3) de mo-nocholine dont on élimine ensuite, par hydrogénolyse, le groupe benzyle de protection. ch2-o ch2-o. 30 \ CHOH CH—CgH,- > CH-O-Bz CH-CgH5 ^ / 35 ch2-o ch2-o• CH„-0H CH,—0—aie. I 2 I 2 CH-O-Bz >- CH-0-Bz ch2-oh ch2-oh * 71 06703 4 2081546 CH2-0-alc CT^-O—aie. CH-O-Bz > CH-O-Bz 5 CH2-0-P02-CH2—CH2-Br CH2-0-P.02-CH2-CH2-Br Cl OH CH2-0-alc. CH-O-Bz X (+) CH2-0-P02-CH2-CH2-N(CH3)3 15 Dans ces formules : - aie. représente un radical alcoyle comportant au moins 12 atomes de carbone, . - Bz représente le groupe benzyle (-CH2-CgH,_) . Les composés de formule I comportent un atome de carbone asymétrique ; ils peuvent donc se présenter sous deux formes 20 stéréo-isomères. On peut fabriquer les composés stéréo-isomères en modifiant de façon appropriée le schéma de réaction sus-indi-qué, c'est-à-dire en partant de composés optiquement actifs ou en dédotiblant ultérieurement le produit de réaction en ses antipodes optiques. 25 On illustre ci-dessous la fabrication des susdits composés en décrivant celle de l'octadécylaxy—lysolécithine qui n'a pas encore été décrite. Procédé de fabrication. Le 1-octadécyloxy-glycérine-phosphate-^) de monocholine. 30 a) La l-octadécyloxy-2-benzyloxy-glycérine. On dissout 14 g (0,07 mole) de 2—benzyloxy—glycérine dans 500 ml de xylène absolu, on ajoute 1,62 g (0,07 mole) de sodium et on chauffe le mélange progressivement à 100°C. Au bout de 6 heures, alors qu'il s'est formé une suspension d'alcoolate de so-35 dium épaisse, on ajoute 34 g (0,09 mole) d'iodure de n-octadé-cyle et on agite le mélange durant 6 heures à 90°C. Il se forme d'abord une solution claire, mais au bout d'un certain temps, elle se trouble peu à peu par cristallisation d'iodure de sodium. Après refroidissement et addition de 500 ml d'eau, on sé-40 pare la phase organique. On élimine de cette phase par distilla 71 06703 5 2081546 tion tous les constituants qui se volatilisent sous une pression de 0,1 mm dans le domaine de température allant jusqu'à 180®C. Le résidu consiste en 29,2 g de produit brut. On le chromatogra-phie en trois portions sur chaque fois 120 g de silicagel, en 5 utilisant comme éluant un mélange éther/éther de pétrole =1 : 1. On obtient le diéther sous forme d'une substance cireuse incolore, de P.F. 45°C (R^. = 0,37), avec un rendement de 8,2 g = 19% de la théorie. Analyse : C28H50°3 (434,7) 10 Calculé : C 77,36, H 11,59 Trouvé : C 77,03, H 11,27. b) Le l-octadécyloxy-2-benzyloxy-glycérine-phosphate^3) de monocholine monohydraté. On dissout 6,8 g (0,016 mole) de l-octadécyloxy-2-benzyloxy-15 glycérine dans 60 ml de chloroforme absolu et on ajoute lentement, à la température ambiante et goutte à goutte, 4,0 g (0,017 mole) de dichlorophosphate de 2-bromo-éthyle et 3,8 g (0,065 mole) de triéthylamine dans 60 ml de chloroforme. On laisse reposer le mélange à la température ambiante durant 24 heures, puis on hy-20 drolyse la solution brun-rouge, en l'agitant énergiquement avec 8 ml d'eau durant 2 heures. Après évaporation sous vide, on sèche le résidu sur du pentoxyde de phosphore sous un vide élevé et on l'extrait ensuite avec 300 ml d'éther de pétrole absolu (60-70°C). On élimine par essorage les sels ammoniacaux non dissous, 25 on évapore lé filtrat, on dissout le résidu dans 100 ml de chloroforme, on ajoute 20 ml d'une solution aqueuse saturée d'acétate de baryum et on agite énergiquement durant 5 minutes. On purifie le sel de baryum sur 200 g de silicagel avec un mélange chloroforme/méthanol =9:2 comme éluant et on obtient le pro-30 duit principal sous forme d'une substance caoutchouteuse incolore (R^ = 0,58). Après reprécipitation avec de l'acétone absolue à partir.d'une solution dans de l'éther absolu, on obtient 6,2 g de sel de baryum pur. On agite ce sel dans 150 ml de méthanol absolu (chauffé à environ 50 - 60°C) durant 15 minutes 3 5 avec un échangeur de cations constitué par une résine à l'état H séchée à l'air, opération au cours de laquelle le mélange se transforme peu à peu en une solution. Après essorage et évaporation du solvant, on obtient 5,8 g de phosphate de bromo-éthyle libre sous la forme d'une huile incolore. On fait ensuite bouil-40 lir cette huile à reflux durant 6 heures avec 300 ml d'une solu 71 06703 2081546 tion méthanoAxque de trimétfryi&âTiine à 12,5%. Puis on agite énergiquement le bromure de lécithine solide (7,0 g), obtenu après évaporation, dans 200 ml de méthanol avec 2,8 g d'acétate d'argent durant 30 minutas à la température ambiante. Il se forme a-5 lors de la lécithine brute d'aspect cireux, de laquelle on ne peut éliminer les dernières traces d'acétate d'argent que par chroma-tographie, qu'on effectue sur 200 g de silicagel en utilisant comme éluant un mélange chloroforme/méthanol/eau = 65 : 25 ; 4 (R_^ = 0,3). Après reprécipitation avec de l'acétone à partir 10 d'une solution dans unetrès faible quantité de chloroforme, on obtient finalement le produit pur sous la forme d'une poudre incolore avec un rendement total (correspondant aux deux étapes) de 40% de la théorie. Analyse C^Kg^G^P (617,9) (monohydrate) 15 Calculé : C 64,15, H 10,44, M 2,27, P 5,01 Trouvé : C 63,40, H 10,26, N 2,32, P 5,07. c) le *i-octadécyloxy-glycérine-phosphate-( 3) de monocho-line monohydraté» On hydrogène durant 7 heures à 40°C et sous la pression at-20 mcsphérique 1,0 g (1,52 mole) de l-octadécyloxy-2-benzyloxy-glycérine-phosphate-C3) de monocholine avec 250 mg de mousse de palladium dans 150 ml de méthanol absolu. Par chromatographie subséquente sur 100 g de silicagel avec un mélange chloroforme/ néthano1/eau dans une proportion en volume de 65 : 25 : 4, on 25 obtient 1'alcoxylysolécithine pure sous la forme d'une poudre incolore présentant une valeur R_ de 0,2. Le rendement est de X 0,54 g = 75% de la théorie. Analyse C^gH^gO^NP (527,7) (monohydrate) Calculé : C 59,17, H 11,08, N 2,65, P 5,87 30 Trouvé : C 57,69, H 11,26, N 2,48, P 5,60. On a vérifié l'accroissement de la résistance aux infections selon une méthode qui s'appuie sur le dispositif expérimental décrit par H.G„ Howard, D.R. Rowly et A.C. Wardlaw dans Nature 179 (1957) 317, en déterminant la survie de souris après 35 infection avec des germes pathogènes. Les animaux traités, antérieurement à l'infection intrapéritonéale avec E. Coli 145, avec une alcoxy-lysolécithine de formule I, appliquée par voie intrapéritonéale, présentent une survie deux à trois fois supérieure à celle des animaux témoins non-traités. On peut admettre que 40 l'accroissement de la résistance est due à une phagocytose BAD ORIGINAL 71 06703 7 2081546 accrue. Les animaux préalablement traités avec une alcoxy-lyso-lécithine présentent une absorption accrue de germes dans le cy-toplasma des phagocytes (macro- et microphages). Chez les animaux préalablement traités, le nombre des cellules phagocytantes, 5 aussi bien que le nombre des bactéries absorbées par une cellule, se trouvent multipliés. Ces résultats ont été vérifiés in vivo aussi bien que in vitro. L'augmentation de la résistance aux tumeurs a pu être vérifiée à propos de tumeurs vaccinales. La tumeur dite "tumeur-as-cite d'Ehrlich" de la souris est une tumeur provoquée par vaccination intrapéritonéale qui se développe sur toutes les souches de souris et qui conduit, au bout d'environ 10 à 14 jours, à la mort de tous les animaux vaccinés. Mais, lorsqu'on traite les animaux préalablement avec des alcoxy-lysolécithines de formule 15 i, on peut empêcher complètement la croissance de la tumeur chez 50% des animaux d'expérience, c'est-à-dire que la tumeur transmise eét détruite. Chez les autres 50% des animaux, on peut constater que la survie est doublée jusqu'à triplée. La potentialisation du pouvoir antigénique d'immunogènes 20 faibles, qui peut être considérée également comme une augmentation de la résistance naturelle, a été vérifiée de la façon suivante : 1. On a réalisé les essais en se fondant sur la méthode de Dresser (Immunology _9 (1965) 261). Le principe du dispositif ex-25 périmental consiste en l'induction d'une tolérance par une protéine soluble. Dans ce dispositif expérimental, on détermine le pouvoir des substances de renforcer la réponse immunitaire dans l'organisme vis-à-vis de la gammaglobuline bovine (GGB) extrêmement faible, de telle manière que les anticorps protecteurs 30 vis-à-vis de cette protéine soient nettement décelables. A cet effet, on applique à des souris par injection intrapéritonéale, une dose de 5 mg de GGB séparée par centrifugation de tout agrégat. A cette dose, au bout de 8 à 10 jours, aucun anticorps n'est décelable. Les animaux ne sont donc pas immunisés. Ils 35 sont, sous ces conditions, incapables de donner une réponse immunitaire vis-à-vis de la GGB. Par contre, si l'on administre la GGB en combinaison avec un adjuvant, l'établissement de la tolérance passagère est empêché et les animaux produisent maintenant des anticorps à 1'encontre de la GGB, autrement tolérogè-40 ne (immunologiquement tolérée). 10 à 12 jours après l'adminis 71 06703 8 2081546 tration de la protéine immunologiquement tolérée, on injecte aux animaux une nouvelle dose de GGB marquée avec de l'iode-125. Si les animaux sont tolérants, l'antigène marqué se dégrade lentement comme la gammaglobuline propre. Si, au contraire, les ani-5 maux sont immunisés, il se produit un phénomène dit "élimination consécutive à l'immunisation", c'est-à-dire une disparition du circuit sanguin beaucoup plus rapide. On mesure donc les anticorps formés par la vitesse de disparition de la GGB marqué avec l'iode—125. 10 Les essais avec 1'octadécyloxy-lysolécithine ont montré que les animaux traités avec GGB et alcoxy-lysolécithine font disparaître du circuit sanguin la protéine traceuse dix à cent fois plus vite que ceux d'un groupe de contrôle traités par une injection préalable d'un liquide consistant uniquement en une solu-15 tion de chlorure de sodium. 2. Une autre méthode immunologique pour l'évaluation d'anticorps, à l'aide de laquelle on peut déterminer la potentialisa-tion de l'effet antigénique de produits faiblement immunogènes, consiste à accoupler l'antigène (GGB) à des érythrocytes et à 20 incuber les cellules ainsi préparées avec le sérum dans une série à dilution progressive durant 20 heures à 4°C. Lorsque le sérum contient des anticorps, les érythrocytes sont agglutinés. On désigne par "titre en anticorps d'un sérum" la dilution maxima à laquelle ce phénomène est encore perceptible. 25 Même par cette méthode, nettement moins précise, on peut établir d'une façon indiscutable que les alcoxy-lysolécithines sont des adjuvants d'une grande efficacité. On peut appliquer les composés de formule X suivant les procédés habituels. L'application par injection intrapéritonéale 30 est particulièrement préférée. On peut faire varier la dose entre de larges limites, et on peut administrer environ 0,5 à 10 mg/kg. Les exemples suivants décriront quelques modes de fabrication de préparations pharmaceutiques. Exemple I.- 35 Dragées contenant 100 mg de 1-octadécyloxy-glycérine-phosphate-(3) de monocholine monohydraté. 1 noyau de dragée contient : 71 06703 9 2081546 substance active 100,0 mg phosphate dicalcique anhydre 73,0 mg amidon de maïs 55,0 mg polyvinylpyrrolidone 5,0 mg 5 carboxyméthylcellulose 5,0 mg stéarate de magnésium 2,0 mg 240,0 mg Procédé de fabrication : On humecte le mélange constitué de la substance active, du 10 phosphate de calcium et de l'amidon de mais avec une solution alcoolique de la polyvinylpyrrolidone à 10 %, on fait passer la masse à travers un tamis de 1,5 mm d'ouverture de maille et on sèche à 45°C. On fait passer le granulé sec de nouveau à travers le même tamis et on le mélange ensuite avec la carboxyméthylcel-15 lulose et le stéarate de magnésium et on forme, à partir de ce mélange des noyaux de dragées par compression. Poids d'un noyau : 240 mg ; poinçon : 9 mm de diamètre. On recouvre,selon les techniques connues, les noyaux ainsi fabriqués d'un enrobage consistant essentiellement en sucre et 20 talc, puis on polit les dragées finies à l'aide de cire d'abeilles. Poids d'une dragée : 450 mg. Exemple XI.- Tablettes contenant 200 mg de 1-octadécyloxy-glycérine-phosphate 25 -(3) de monocholine monohydraté. 1 tablette contient : substance active 200,0 mg lactose 100,0 mg amidon de maïs 80,0 mg 30 polyvinylpyrrolidone 12,0 mg cellulose microcristalline 54,0 mg stéarate de magnésium 4,0 mg 450,0 mg Procédé de fabrication : 35 On mélange la substance active, le lactose, l'amidon de maïs et la polyvinylpyrrolidone et on humecte le mélange avec de l'eau. On fait passer la masse humide à travers un tamis de 1,5 mm d'ouverture de maille, on sèche à 45°C, et on fait passer le granulé formé de nouveau à travers le même tamis. On mélange 40 ensuite le granulé avec la cellulose microcristalline et le 71 06703 10 2081546 stéarate d? magnésium et on forme dss tablettes par compression du mélange» Poids d'une tablette ; 450 mg ; poinçon : 11 mm de diamètre. Exemple III.- Gouttes buvables contenant par ml 10 mg de 1-octadécyloxy-gly-cérine-phospliate-( 3 ) de mcnocholine monohydraté. 100 ml de solution pour gouttes buvables contiennent : substance active 1,0 g p-oxybanzoate de méthyle - 0,035 g 10 p-oxybensoate de propyie 0,015 g propv1èneglyco1 45,0 g essence d'anis 0,05 g mentho1 0,05 g saccharinate de sodium 1,0 g 15 éthanoi 1,0 g eau distillée q.s.p.f. 100,0 ml Procédé de fabrication. : On prépare un mélange de 45 g de propylèneglycol et de 45 g d'eau et on y dissout la substance active. On dissout les esters 20 d'acide benzoïque, le menthol et l'essence d'anis dans 1'éthanoi. On réunit les deux solutions et on ajoute de l'eau jusqu'au volume de 100 ml3 après avoir ajouté à la solution le saccharinate de sodium. Exemple IV.- 25 Ampoules contenant 50 mg de 1-octadécyloxy-glycérine-phosphate -(3) de monocholine monohydraté. 1 ampoule contient : substance active 50,0 mg polypropylèneglycol 2500,0 mg 30 acide tartrique 15,0 mg eau distillée q.s-p.f. ■ 5,0 ml Procédé de fabrication : On chauffe 200 g d'eau distillée à environ 50°C, et on ajoute la quantité nécessaire de propylèneglycol, puis on dissout dans 35 ce mélange la substance active et l'acide tartrique et on ajoute de l'eau jusqu'au volume indiqué. On filtre la solution sous des conditions stériles et on la conditionne dans des ampoules de 5 ml. Exemple V.- 40 Ampoules contenant 20 mg de l-octadécyloxy-glycérine-phosphate BAD ORIGINAL 71 06703 ii 2081546 -(3) de monocholine monohydraté. 1 ampoule contient : substance active 20,0 mg polypropylèneglycol 1000,0 mg 5 acide tartrique 6,0 mg eau distillée q.s.p.f. 2,0 ml Procédé de fabrication : Conformément à celui des ampoules contenant 50 mg de substance active. 10 Comme il va de soi, et comme il résulte d'ailleurs déjà de ce qui précède, l'invention ne se limite nullement à ceux de ses modes d'application, non plus qu'à ceux des modes de réalisation de ses diverses parties, ayant été plus spécialement envisagés ; elle en embrasse, au contraire,toutes les variantes. 71 06703 12. 2081546 REVENDICATIONS 1. Utilisation, pour l'accroissement de la résistance naturelle de l'organisme, des l-alcoxy-glycérine-phosphates-(3) de monocholine de formule générale : 5 CH0—0—R I 2 ÇHOH (I) I (+) CH2-0-P02-CH2-CH2-N(CH3) 3 10 °(-) dans laquelle R représente un radical alcoyle comportant au moins 12 atomes de carbone. 2. Utilisation selon la revendication 1 du 1-octadécyloxy-glycérine-phosphate -(3) de monocholine. 15 3. Nouvel éther de lysolécithine, caractérisé par le fait qu'il s'agit du l-octadécyloxy-glycérine-phosphate-(3) de monocholine. 4. Procédé de fabrication de 1-octadécyloxy-glycérine-phosphate-(3) de monocholine, caractérisé en ce qu'on traite la 20 2-benzyloxy-glycérine avec de l'iodure de n-octadécyle pour former la l-octadécyloxy-2-benzyloxy-glycérine, qu'on fait réagir sur ce composé du dichlorophosphate de 2-bromoéthyle et de la triméthylaminé pour former le l-octadécyloxy-2-benzyloxy-gly-cérine-phosphate-(3) de monocholine et qu'on élimine le radical 25 benzyle du produit résultant par hydrogénolyse. 5. Préparations pharmaceutiques pour l'accroissement de la résistance naturelle, caractérisées en ce qu'elles contiennent, comme substance active, un composé de formule I.