FR 2086432 A1 19711231 FR 7115249 A 19710428 71 15249 1 2086432 l'invention a pour objet un procédé de séparation chromatogra-phique de mélanges de substances par mise en oeuvre de tamis moléculaires et, le cas échéant, d'échangeurs d'ions. Les matériaux du type tamis moléculaires fractionnent des mé-5 langes de substances de poids moléculaires différents. La structure spatiale des mailles constitutives de ces matériaux qui sont du type gel comporte des cavités dans lesquelles les molécules diffusent avec des vitesses variables qui sont fonction de leurs dimensions. Les substances à molécules de grand volume ne pénètrent pas dans 10 les pores, alors que les petites molécules diffusent dans le gel et parcourent ainsi des distances plus longues que les grandes molécules. C'est le degré de réticulation de la matrice du gel qui détermine le domaine de séparation et une séparation de mélanges de substances n'est possible que si les pores du gel sont suffisamment 15 grands. L'application de la chromatographie sur gel est donc étroitement limitée par les domaines de fractionnement des différents tamis moléculaires. Les dimensions des colonnes sont assujetties à des limitations semblables du fait que la pression hydrostatique relativement élevée qui règne dans des colonnes de dimensions relati-20 vement importantes comprime le màtériau très mou constituant les tamis moléculaires et exerce ainsi une influence négative aussi bien sur la perméabilité de la colonne que sur son effet de séparation. Au moyendee échangeurs d'ions, il n'est possible; de séparer des 25 substances que lorsqu'elles portent des charges différentes. Un mélange composé de substances à répartition de charges identique ne peut donc pas être fractionné par chromatographie sur échangeur d'ions, même si les composants présentent des poids moléculaires différents. Dans des cas de ce genre, on était donc jusqu'à présent 30 obligé de faire suivre à la chromatographie sur un échangeur d'ions une nouvelle chromatographie sur une colonne à tamis moléculaire. Il s ' ensuivait non seulement une d épense supplémentaire, mais aussi la nécessité d'au moins deux élutions entraînant une diminution indésirable de concentration à laquelle il fallait remédier par éva-35 poration et par d'autres phases opératoires supplémentaires de ce genre. L'invention a pour but de remédier à ces inconvénients. Le procédé, conforme à l'invention, de séparation chromatogra-phique de mélanges de substances au moyen de tamis moléculaires et, 40 le cas échéant, d'échangeurs d'ions consiste à disposer, immédiate 71 15249 2 2086432 ment l'un à la suite de l'autre, au moins deux matériaux différents propres au fractionnement chromatographique par tamisage moléculaire et, le cas échéant, échange d'ions, de telle manière qu'au moins un matériau échangeur d'anions cu/et de cations ou/et un matériau du 5 type tamis moléculaire soit suivi d'au moins un matériau du type à tamis moléculaire, le matériau constituant le tamis moléculaire à réticulation la plus forte précédant le matériau constituant le tamis moléculaire à la réticulation la plus faible. Les différents matériaux servant à la chromatographie selon le 10 procédé de l'invention sont disposés de telle manière que, dans la direction de l'écoulement du mélange de substances à fractionner, l'éluat sortant d'un matériau monté en amont parvienne immédiatement sur le matériau chromatographique monté à la suite. On réalise cette disposition de préférence en plaçant les différents matériaux 15 dans une seule colonne dans laquelle on sépare les différents matériaux en intercalant des tamis ou d'autres matières poreuses. Il est cependant également possible de disposer les différents matériaux dans plusieurs colonnes, montées les unes après les autres; toutefois, le volume vide compris entre deux colonnes doit alors 20 être suffisamment faible pour que la substance éluée ne subisse pas une diminution sensible de concentration. On peut réaliser un tel dispositif par exemple en reliant les colonnes par des canalisations de communication dont le volume total est, avantageusement, inférieur au volume du liquide qui traverse la colonne dans l'espa-25 ce de 5 minutes, de préférence dans l'espace de 1 minute. On obtient toutefois les meilleurs résultats en l'absence complète de tout volume vide. Selon un mode de réalisation préféré du procédé selon l'invention, on superpose dans une colonne plusieurs matériaux du type ta-30 mis moléculaires à degrés de réticulation différents en disposant les différents matériaux suivant un degré de réticulation décroissant, de sorte que le matériau présentant le degré de réticulation le plus faible forme la couche la plus basse de la colonne. Grâce à cette façon de procéder, il est possible de séparer en une seule 35 phase opératoire des mélanges de substances qu'on ne pouvait séparer jusqu'alors que d'une façon compliquée, en mettant en oeuvre plusieurs colonnes et en s'accommodant d'une importante, dilution des solutions des composants. Il est avantageux de séparer les différentes couches de la colonne par des couches intercalaires poreu-40 ses, par exemple par des tamis, qu'on dispose dans'la colonne de 71 15249 3 2086432 telle manière que chaque tamis absorbe le poids de la couche de gel qui repose sur lui. La colonne combinée décrite dans la demande de brevet français numéro 71 05828 convient tout particulièrement à cet effet. 5 Les matériaux constituant les tamis moléculaires sont des sub stances gélatineuses molles, de préférence à base de dextranes réticulés dont les propriétés, selon ce qui était admis jusqu'à présent, varient sensiblement en fonction de la pression hydrostatique qui leur est appliquée. Ainsi, d'après ce qui a été généralement 10 enseigné, l'augmentation de la pression hydrostatique entraînait une diminution considérable de la vitesse de passage à travers la masse. On a également admis qu'avec des colonnes d'une longueur supérieure à 1 m, on rencontre de grandes difficultés. Pour des gels d'un degré de réticulation particulièrement faible, par exemple ce-15 lui qui est connu sous la marque "Sephadex G—200", on a même prescrit de ne pas dépasser une différence de niveau de 10 à 15 cm. L'application du procédé selon l'invention permet, d'une façon surprenante, de conserver des pressions hydrostatiques d'une intensité quelconque sans que ni les difficultés appréhendées, ni une diminu-20 tion de la vitesse de passage n'apparaissent. L'expérience a montré, par exemple, que la vitesse de passage à travers un lit de gel de 100 cm de hauteur, disposé conformément à l'invention et subdivisé par de3 tamis en cinq couches de 20 cm chacune, ne subit, sous une pression d'eau de 130 cm, qu'une diminution insignifiante compara-25 tivement à un lit d'un gel de 20 cm de hauteur soumis à la même pression hydrostatique, tandis que la vitesse de passage sous une pression de 130 cm d'eau à travers une couche de gel de 100 cm de hauteur ne comportant pas de subdivisions se trouve diminuée de moitié. 30 On peut mettre en oeuvre dans le procédé selon l'invention les matériaux constituant les tamis moléculaires connus, utilisés pour la chromatographie sur gel, lesquels matériaux consistent d'une façon prépondérante en dextranes, réticulés à des degrés divers. Comme agent de réticulation, on utilise dans ce cas par exemple l'épi-35 chlorhydrine (Sephadex). On trouve dans le commerce encore d'autres dextranes réticulés appropriés, par exemple sous les dénominations "Sepharose" et "Agarose". Outre les dextranes, par exemple des po-lyacrylamides réticulés conviennent également, ainsi que d'autres substances à base de molécules à longue chaîne propres à se relier 40 par réticulation avec formation de gels mous et poreux. 71 15249 4 .2086432 Suivant un autre mode de réalisation du procédé selon l'invention, on dispose les uns derrière les autres, immédiatement et dans l'ordre indiqué, des échangeurs de cations ou/et des échangeurs d'anions et au moins un tamis moléculaire. A ce mode de réalisation 5 s'applique également ce qui a été dit plus haut au sujet de la mise . en oeuvre de tamis moléculaires différents disposés à la suite les uns des autres. On dispose les différentes couches de matériaux de préférence dans une seule colonne les unes au-dessus des autres, en les séparant uniquement par des supports constitués de minces cou-10 ches poreuses, en particulier par des plateaux en forme de tamis. Des segments de colonne qu'on peut combiner avec des segments à tamis pour former les colonnes combinées susmentionnées se sont révélés particulièrement avantageux pour ce mode de réalisation. Le matériau échangeur d'ions constituant la couche supérieure 15 de la colonne peut consister en un échangeur de cations ou un échangeur d'anions. Il est également possible de prévoir à la fois un matériau échangeur d'anions et un matériau échangeur de cations, et de mettre en oeuvre ceux-ci aussi bien sous la forme de mélanges que sous la forme de couches séparées. Enfin, il est également pos-20 sible de mettre en oeuvre différents matériaux échangeurs de cations ou anions disposés en couches, en utilisant des matériaux présentant des forces ioniques différentes. On dispose, derrière le matériau échangeur d'ions suivant la direction de l'écoulement, un matériau du type tamis moléculaire. 25 Ge matériau peut consister en une couche unique, mais il peut être constitué également de plusieurs couches à degrés de réticulation différents qu'on dispose alors, comme on l'a déjà indiqué plus haut, les unes derrière les autres, suivant des degrés de réticulation décroissants. 30 Lorsqu'on a recours à ce mode de réalisation du procédé selon l'invention, il est possible de séparer dans le matériau échangeur d'ions des substances de forces ioniques différentes. Les substances de force ionique identique qui ne sont pas séparées dans le matériau échangeur d'ions subissent alors, à l'élution, également une 35 séparation dans le tamis moléculaire disposé à la suite de 1'échangeur d'ions, de sorte qu'on peut résoudre maintenant d'une façon très simple, et à un point considéré jusqu'à présent comme irréalisable, des problèmes de séparation même très compliqués sans avoir besoin de manipulations astreignantes ou d'appareillages encom-40 brants. 71 15249 5 2086432 Oïl peut effectuer l'élution dans le procédé selon l'invention aussi bien suivant la technique du gradient d'élution que suivant celle de l'élution discontinue. Ges techniques d'élution sont en elles-mêmes connues. 5 les facteurs qui jouent un rôle essentiel dans le procédé se lon l'invention sont l'ordre sus-indiqué des différents matériaux chromatographiques et la suppression de volumes vides entre les différentes couches, lorsqu'on s'écarte de l'ordre indiqué des matériaux ou lorsqu'il se trouve entre les différentes couches de ma-10 tériaux des volumes vides d'une certaine importance, les avantages de l'invention ne sont plus réalisables et les résultats des séparations deviennent nettement plus mauvais. Au contraire, en travaillant conformément à l'invention, on augmente le nombre de plateaux théorique, on réduit la dimension des colonnes, on évite les dilu-15 tions et on fait 11 économie d «une chromatographie supplémentaire. Grâce au mode opératoire selon 1'invention, on élargit donc considérablement le domaine d'application de la séparation chromatographique des mélanges de substances. l'invention sera bien comprise à l'aide des exemples illustra-20 tifs suivantso Exemple 1 Dans une colonne garnie d'un matériau à tamis moléculaire à base de dextrane, on introduit un mélange, comprenant 20 mg de chacune des substances suivantes : 25 bleu de dextrane, catalase, hémoglobine, chymotrypsinogène, cytochrome C, 30 acide dinitrophénylaspartique ce mélange étant dissous dans 1,2 ml de tampon au phosphate 0,05 molaire de pH 7,5. Avec cette.colonne, on effectue les essais suivants, dans chacun desquels on utilise un lit de gel de la dimension 2 x 150 cm. Les résultats de ces essais apparaissent sur 35 les fig. 1 à 5 dans lesquelles on a représenté pour chaque essai la concentration des substances en fonction du volume élué. Sur les courbes, les six susdites substances sont désignées respectivement par Â, B, C, D, E, F. 1) Le lit de gel est constitué d'une seule couche ("Sephadex 40 G - 100"). La longueur du lit de gel utilisée est à considérer 71 15249 6 2086432 comme maximum et ne peut pratiquement pas être augmentée. Malgré cette longueur maximum, une séparation du bleu de dextrane d'avec la catalase n'est pas réalisable, comme on peut le voir sur la fig. 1. On a effectué l'élution avec un tampon au phosphate 0,05 5 molaire de pH 7,5. 2) On utilise la même colonne, mais avec un tamis moléculaire à base de dextrane présentant un degré de réticulation plus faible que dans le cas précédent ("Sephadex G - 200"). Dans ces conditions, on sépare le bleu de dextrane d'avec la catalase, 10 mais une séparation satisfaisante de l'hémoglobine, du chymotryp-sinogène et du cytochrome C n'est pas réalisable (voir fig. 2). 3) On utilise une colonne qui contient une couche supérieure de 100 cm de "Sephadex G - 100" à laquelle fait directement suite une couche inférieure de 50 cm de "Sephadex G - 200", la 15 couche de "Sephadex G - 200" étant plus faiblement réticulée que la couche de "Sephadex G-100". Comme le montre la fig. 3, on réalise dans ce cas une séparation de toutes les substances contenues dans le mélange utilisé pour l'essai. On a utilisé pour cet essai la colonne combinée décrite 20 dans la demande de brevet français numéro 71 05828 et dans laquelle est vissé un tamis. 4) On utilise une colonne identique à celle de l'essai 3 mais en intervertissant les deux tamis moléculaires. Comme on peut le voir sur la fig. 4, le volume de l'échantillon subit 25 alors une forte dilution et le fractionnement dans le domaine des substances à faible poids moléculaire est de nouveau supprimé (hémoglobine, chymotrypsinogène et cytochrome C mélangés. 5) On utilise une colonne qui contient quatre tamis moléculaires présentant des degrés de réticulation décroissant du haut 30 vers le bas. Les différentes couches présentent les hauteurs suivantes : 20 cm ("Sephadex G - 25") 30 cm ("Sephadex G - 50") 50 cm ("Sephadex G - 100") 35 50 cm ("Sephadex G - 200") Il ressort de la fig. 5 qu'on réalise une très bonne séparation qui est telle que, dans l'intervalle entre le cytochrome C et la phénylalanine, on pourrait séparer encore trois à.quatre autres substances. De même, la séparation de la catalase et de 40 l'hémoglobine est d'une qualité telle que, ou bien une autre 71 ,15249 7 2086432 substance pourrait encore trouver place entre les deux dites substances, ou bien un lit de gel d'une dimension nettement plus petite serait suffisant pour la séparation complète des substances. 5 Exemple 2 On introduit un mélange de substances, composé de 40 mg de catalase et de 40 mg d*ovalbumine, dissous dans 0,2 mg de tampon "tris" (hydrométhylaminométhane) 0,2 molaire de pH 7,6, dans une colonne remplie d'un échangeur d'ions (2 x 20 cm; "DEÀE-Sephadex 10 H 25" - DEAE = diéthylaminoéthanol) et on effectue l'élution avec un gradient du même tampon. Une séparation des deux substances n'a pas pu être obtenue dans ces conditions, comme il résulte de la fig. 6 sur laquelle on a représenté la concentration des substances en fonction du volume élué, les deux substances étant 15 identifiées sur la figure respectivement par les chiffres 1 et 2. On recommence l'essai précédent, mais en utilisant une colonne combinée dans laquelle 1*échangeur d'ions est suivi immédiatement d'un, tamis moléculaire (130 cm de "Sephadex G - 200"). On sépare le matériau échangeur d'ions du matériau à tamis molécu-20 laire, sans laisser de volume vide entre les deux, par un tamis disposé à l'intérieur de la colonne et fixé sur la paroi de la colonne. Comme le montre la fig. 7 (concentration des substances en fonction du volume élué), on réalise de cette façon une séparation complète des deux substances. 25 Comme il va de soi et comme il résulte d'ailleurs déjà de ce qui précède, l'invention ne se limite nullement à ceux des modes d'application, non plus qu'à ceux des modes de réalisation de ses diverses parties, ayant été plus spécialement envisagés; elle en embrasse, au contraire, toutes les variantes. 71 15249 s 2086432 REVENDICATIONS 1 - Procédé de séparation chromatographique de mélanges de substances par mise en oeuvre de tamis moléculaires et, le cas échéant, d'échangeurs d'ions, éluables d'une façon discontinue 5 ou par gradients, lequel procédé est caractérisé par le fait qu'on dispose immédiatement l'un à la suite de l'autre au moins deux matériaux différents appropriés au fractionnement chromatographique par tamisage moléculaire et, le cas échéant, par échange d'ions, de telle manière qu'au moins un matériau échangeur 10 d'anions ou/et un matériau échangeur de cations ou/et un matériau du type tamis moléculaire soit suivi d'au moins un matériau du type tarais moléculaire et que le matériau constituant le tamis moléculaire au degré de réticulation le plus fort précède le matériau constituant le tamis moléculaire au degré de réticulation 15 le plus faible. 2 - Procédé selon la revendication 1, caractérisé par le fait qu'on utilise une colonne dans laquelle le matériau échangeur d'ions est superposé au tamis moléculaire. 3 - Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 et 20 2, caractérisé par le fait qu'on utilise plusieurs tamis moléculaires présentant des degrés de réticulation différents. 4 - Procédé selon l'une quelconque des revendications 2 et 3, caractérisé par le fait qu'on sépare les différentes couches à l'intérieur de la colonne par de minces couches poreuses. 25 5 - Procédé selon la revendication 4, caractérisé par le fait qu'on utilise, en tant que couche poreuse, un tamis fixé sur la paroi de la colonne. 6 - Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé par le fait que les différentes couches de 30 matériaux sont disposées à l'intérieur de la colonne sensiblement sans volume vide intermédiaire. 7 — Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé par le fait qu'on utilise conjointement des échangeurs de cations et des échangeurs d'anions.