FR 2103402 A1 19720414 FR 7130222 A 19710819 71 30222 1 2103402 La présente invention concerne un procédé permettant de produire un vaccin destiné S la prévention et au traitement de la nécrobacillose, en particulier chez les moutons. La nécrobacillose ovine (encore appelée mal-de-5 pied, piétin ou fourchet du mouton) est une maladie contagieuse largement répandue, affectant les tissus épidermiques du pied et causée par l'action synergique de deux bactéries ana-érobies Sram-négatiyës, Fusifqrmis nodosus et FusiFormis né-crophorus. La maladie apparaît seulement lorsque ces ger-10 mes sont tous les deux présents. On rencontre normalement F. necrophorus dans le tractus digestif ; il en est éliminé avec les excréments, de telle.sorte que ce germe se trouve généralement au vois.inage immédiat des pieds du mouton, ce qui lui.permet de participer 15 à l'infection. Par contre, F. nodosus .est incapable de survivre pendant plus de quelques jours, dans des conditions naturelles, en dehors des lésions de nécrobacillose. Le pied infecte est soïi seul habitat normal et, pat» conséquent, F. nodosus est souvent décrit comme l'agent spécifique provoquant la 20 maladie. L'élimination de F. 'nodosus d+un troupeau de moutons, que l'on peut obtenir soit en guérissant tous les cas de nécro bacillose existants, soit en détruisant sélectivement le germe, entrainerait l'éradication de la maladie, puisque F. -necrophorus rie peut provoquer la nécrobacillose en l'absence de 25 p• nodosus. Il y a quelques années, on a combattu la nécrobacillose par l'isolement des animaux infectés, suivi d'un rogna ge étendu des parties du pied atteintes et d'une application par voie externe de désinfectants ou d1-. antibiotique s. Plus ré-30 cemment, on a essayé d'enrayer la maladie chez le mouton par une vaccination contre F. nodosus et F. necrophorus, mais il-n'a pas été possible de mettre au point un procédé de culture à grande échelle de F. nodosus dans des conditions de rentabilité permettant la préparation de vaccins en vue d'une dis-35 tribution étendue. Les essais ayant pour but la culture de F. nodosus se sont heurtés â des obstacles pendant plusieurs années, et même en 1970 les chercheurs éprouvaient encore des difficultés à isoler le germe sous la forme de cultures pures (H. Marsh 40 et coll The Cornell Veterinarian, 60, p. 309-3173 avril, 71 30222 2103402 1970).. En 1941•Beveridge (Bull. Coun. sci. industr. Res. Aust. M° 140) a exposé les exigences culturales du germe, mais ses essais de culture en milieu liquide ne donnèrent pas de bons résultats. Il a décrit le germe comme étant un anaérobie 5 strict et indiqué que la croissance est favorisée dans une atmosphère contenant de 5 à 1055 d'anhydride carbonique, et que même 80% de ce- gaz n'inhibait pas la croissance. En utilisant un produit de digestion liquide de muscle et de foie de boeuf, on n'obtenait qu'une croissance très faible, ou pas de crois-1° sance du tout,"- mais l'addition de 10$ de sérum de cheval don-.nait une croissance médiocre. On a obtenu de meilleurs résultats, pour' l'isolement- et-la sub-culture de F. nodosus en milieu liquide, en utilisant un bouillon contenant des particules broyées prove-15 nant de sabots de moutons et de "la trypsine "Difco", et en utilisant une atmosphère contenant 10$ d'anhydride carbonique / J.H. Thomas, Aust. vet.J.y 3^» 411 (1958)_7. La poursuite de ces recherches a montré qu'on obtient un développement avec un milieu liquide contenant de la trypsine ou un extrait 20 pancréatique, avec addition de caséine, de protéose-peptone ou d'un hydrolysat de sabot ou de laine'. Dans cétte étude, on utilisait une atmosphère d'azote pour maintenir l'anaérobiose / J.H. Thomas, Aust. vet.J.', 39, 434 (1963)_7. Enfin,- de-S' vaccins préparés à partir de F. nodo-25 sus pour essais sur le terrain ont été obtenus en partant de germes cultivés sur gélose "au sabot" solide contenant de la corne broyée, sous atmosphère d'hydrogène contenant 10% d'anhydride carbonique, ou sur un milieu biphasique constitué de gélose au sabot recouverte d'un bouillon au sabot, dans des 30 conditions d'anaérobiose /J.R. Egerton et coll., Aust. vet. J-, 517 (Novembre 1970)_7. Parmi les essais faits pour trouver un procédé de culture â grande échelle de F. nodosus en vue de la préparation d'un vaccin, les tentatives faites pour mettre en jeu les 35 conditions et les méthodes', employées jusqu'à présent pour la culture en milieu liquide n'ont pas donné satisfaction. L'emploi de milieux solides., comme des plaques de gélose, présente plusieurs inconvénients, en plus de ceux inhérents à la culture de F. nodosus : on a bësoin d'une plus grande quanti-40 té de milieu ;.la stérilisation, l'incubation, ainsi que la 71 30222 3 2103402 récupération à partir de la culture en surface donnent lieu à des difficultés ; il faut des milliers de culture sur gélose, maintenues dans des conditions d'anaérobiose, avec la dépense de main-d'oeuvre correspondante. L'utilisation d'un mi-5 lieu biphasique solide/liquide entraîne les mêmes problèmes. La kératine de sabots broyés a été largement utilisée dans les essais faits en vue de cultiver F. nodosus avec suecès, mais on a constaté que, malheureusement, l'emploi des farines de "sabots et cornes" ("Hoof and Horn") du 10 commerce inhibe la croissance du germe. Par conséquent, l'utilisation de la kératine de sabots dans un milieu destiné à la culture des germes impliquerait qu'on réunisse des milliers de sabots de moutons, et, même alors, l'incorporation d'une poudre insoluble à un milieu liquide n'est pas souhaitable. 15 Quand on incorpore des sabots pulvérisés à un milieu gélosé solide approprié, la croissance du germe est plutôt médiocre, même après cinq jours d'incubation dans des conditions d'anaérobiose, et les germes récoltés après culture en milieu liquide, préalablement chauffé avec des sabots pulvérisés, n'ont 20 pas un pouvoir antigénique suffisant pour qu'on puisse les utiliser ultérieurement dans un vaccin.- Or, la Demanderesse a trouvé que l'incorporation de certains produits provenant du foie dans un milieu-nutr itif liquide destiné a la culture de F. nodosus, et le maintien 25 d'une concentration élevée d'anhydride carbonique disponible, sont des facteurs qui entraînent une. augmentation importante de la vitesse de croissance, d'une part, et du rendement en germes, d'autre part, dans des conditions d'anaérobiose. En outre, les germes ainsi produits ont un pouvoir antigénique 30 suffisant pour qu'on puisse les utiliser pour la vaccination. Lorsque l'on utilise des ingrédients à peu près identiques dans un milieu solide, la croissance des germes est considérablement améliorée, et on peut transférer les germes des milieux solides dans les milieux liquides et inversement, sans 35 avoir à les adapter au nouveau milieu, ce qui évite toute perte résultant de la séparation de variants non-antigéniques, ou toute baisse de l'aptitude à croître ou à-élaborer l'anti-^ gène protecteur. Des matières d'origine hépatique convenant parti-40 culièrement bien, dont on_a. constaté qu'elles étaient d'un 71 30222 2103402 10 15 grand intérêt pour la mise en oeuvre de la présente invention, sont les préparations indiquées ci-dessous, quoique d'autres préparations commerciales équivalentes de produits de digestion, d'infusions ou d'extraits du foie puissent être utilisées à leur place : "Panmede Liver Digest" (produit de digestion du foie "Panmede", de la firme Paines and Byrne Limited, Greenford, Middlesex, Angleterre). "Liver infusion" (infusion de foie produite par Oxoid Limited, Londres, S.E.I.). Pour obtenir des rendements maximums en F. nodosus et pour faciliter l'ensemble de la fabrication, il est préférable que la concentration des matières d'origine hépatique dans un milieu de culture liquide soit de l'ordre de 0,5, 1 ou 2% (en poids/volume,' le poids se rapportant au poids sec 2Q des solides d'origine hépatique), quoique l'on puisse également utiliser des proportions plus élevées, allant jusqu'à environ 3% (poids/volume), mais le rendement tend alors à diminuer . L'effet de la variation des concentrations des 2^ produits d'origine hépatique sur la croissance de F. nodosus est indiquée plus loin dans le tableau 1. Ces préparations de foie existant dans le commerce peuvent être achetées sous la forme de poudres fines, que l'on peut dissoudre dans l'eau distillée pour obtenir une solution jq convenant pour l'incorporation dans le milieu de culture liquide, à la concentration souhaitée. Il est préférable de clarifier ces solutions pour en éliminer les fractions particu-laires, par exemple par filtration, avant de les ajouter au milieu de culture. 35 Pour qu'il donne des rendements vraiment élevés, il est bon que le milieu de culture liquide contienne un produit de digestion du pancréas, en plus des matières d'origine hépatique, ainsi que des ingrédients nutritifs couramment utilisés pour les milieux de culture, comme des extraits de le-40 vures, des peptones ou des produits de digestions de muscles 71 30222 5 2103402 de cheval ou de boeuf. Il est préférable que le milieu de culture liquide contienne aussi du chlorhydrate de L-cystéine. La matière d'origine pancréatique est, de préférence, un produit d'auto-digestion du pancréas3 que l'on peut 5 préparer selon les méthodes connues, mais, plus particulièrement, par la méthode suivante. On ajoute du pancréas haché (par exemple, du pancréas de boeuf de mouton) à de l'eau, ceci à raison d'environ 0,5 à 1,5 kg par litre d'eau, puis on élève le pH, par exemple par addition d'hydroxyde de sodium, 10 jusqu'à une valeur comprise entre 8 et 9- On agite le mélange, à une température de-35 à 40°, pendant une durée allant d'une heure à deux heures et demie, temps pendant lequel le pancréas est digéré par sa propre trypsine ; on abaisse ensuite le pH à une valeur comprise entre 3 et 5, par exemple par addition 15 d'acide chlorhydrique. On porte ensuite à l'ëbullition pendant une courte dùrée et on réajuste entre 7 et .7,8 le pH, avan't de filtrer la préparation et de recueillir le filtrat. On peut remplacer, dans le milieu liquide, la matière d'origine pancréatique par des préparations à base de 20 trypsine brute (mais non par de la trypsine pure), comme la trypsine "Difco" 1 : 250), à une concentration d'environ 0,5 à 2% (en poids/volume). Il est souhaitable que la cystéine soit présente dans les milieux de culture liquides à une concentration al-25 lant de 0,005 à 0,25? (en poids/volume), de préférence inférieure à 0,1$, mais la concentration optimum varie en sens ^ inverse du volume de la culture ; elle est par exemple égaie à 0,1% (en poids/volume.) de cystéine pour un volume du milieu égal à 5 ml, et égale à 0,02% (en poids/volume) de çys-30 téine pour un volume du milieu égal à 500 ml. Il est bon que la matière d'origine pancréatique soit présente dans le miiieu à une concentration comprise entre 1,2 et 3,6$ (en poids/volume) , le poids se référant aux solides initiaux du pancréas. Les concentrations des ingrédients indiquées ci-35 dessus s'appliquent aussi bien au milieu de culture liquide final, utilisé pour la culture à grande échelle des germes, qu'aux milieux liquides utilisés pour les sous-cultures et la préparation de l'inoculât en vue de la culture à grande échelle. A l'exception de la cystéine, on peut incorporer, aux mê-40 ines concentrations, les crèmes substances à un milieu solide, 71 30222 2103402 par exemple la gélose, en vue de l'isolement- initial du germe à partir des matières infectieuses. - On prépare de préférence les milieux de culture liquides en dissolvant les ingrédients dans l'eau distillée, 5 avec stérilisation (par exemple, à l'autoclave), et en-ajoutant ensuite tout ou partie de la cystéine, car,cette substance est instable. Il est bon que le pH soit ajusté entre 7,0 et 7,8, et que la température soit comprise entre 35 et 39° • On garde, de préférence, la matière d'origine hé-10 patique séparée des autres ingrédients pendant toutes les opérations .de dissolution,- de chauffage et de clarification qui précèdent le passage à l'autoclave, lequel permet d'obtenir le milieu stérile final auquel on peut inoculer une culture d'ensemencement. Le milieu ainsi obtenu est une solution, 15 de préférence homogène, des ingrédients, pratiquement exempte de fractions insolubles en'suspension. Pendant "là culture du germe, il est indispensable d'assurer des conditions d'anaérobiose, et il y a avantage à les réaliser en utilisant une atmosphère constituée de 100$ 20 d'anhydride carbonique, ce qui peut être obtenu par simple remplacement de l'air se trouvant au-dessus du milieu de culture liquide par de l'anhydride carbonique stérile. On a constaté que la présence de ce gaz dans l'atmosphère surmontant un milieu de- culture de F. nodosus joue un rôle important dans 25 l'accélération de la vitesse dé croissance d'au moins quelques souches du germe, mais il a aussi été observé que l'effet précis varie selon la souche utilisée, le passé cultural du germe, et le rapport volumiqué entre les phases gazeuse et liquide. D'une façon générale, on a constaté que la croissance 30 de F. nodosus était d'autant plus rapide que la concentration en anhydride carbonique était plus élevée. On obtient une bonne croissance du germe en utilisant des concentrations de 60, 80, 90, 95 et 100$ d'anhydride carbonique, à la pression normale, le reste de l'atmosphère (si besoin est) étant essentiel-35 lement constitué d'un gaz chimiquement inerte, comme l'azote, l'argon ou l'hélium. Quoique 1'hydrogène ait été employé comme gaz complémentaire dans des expériences faites à petite échelle, i-1 est évidemment difficile de l'utiliser à l'échelle industrielle, .et, dans le présent texte, 1 'expression ""gaz iner-40 te" n'englobe ni l'hydrogène ni les autres gaz capables"dé 71 30222 2103402 réaction avec le milieu de culture ou pouvant être nuisibles pour les germes. Il a également été constaté que le rapport gaz/ liquide a une influence sur la vitesse de croissance des ger-5 mes lorsque l'on utilise un milieu de culture liquide, et, en général, le volume d'anhydride carbonique à la pression normale ne doit pas dépasser 30$ du volume du milieu de culture liquide, il est préférable que le volume de l'anhydride carbonique soit égal à 10$ du volume du liquide, qu'il ne dépasse 10 pas 20$ et qu'il ne soit pas inférieur à 5$. L•introduction d'anhydride carbonique .dans 1'espa-ce gazeux surmontant un milieu liquide a évidemment pour résultat la dissolution d'au moins une partie du gaz dans le milieu et l'abaissement du pH de celui-ci en dessous de sa va-15 leur initiale. Elle a aussi pour résultat .la formation.d'un vide partiel, ceci dans une mesure qui dépend des. conditions utilisées, et il se peut que le récipient. réactionnel doive être scellé hermétiquement ou muni d 'une source-de .gaz inerte pour remplacer l'anhydride carbonique passé en solution. 20 II est souhaitable que la culture finale de ger mes de P. nodosus qui doivent être transformés•en un vaccin, contienne une proportion maximum de germes vivants et sains. Ceci exige que l£ culture finale soit réalisée en un temps aussi court que possible, ce qui, a son tour, exige, l'ut il i-25 sation, pour la culture finale, d'un inoculât aussi important qu'il est possible sans trop de difficultés. De même, les germes d'ensemencement utilisés pour l'inoculât doivent comporter une proportion élevée de germes viables. Par conséquent, il est souhaitable d'augmenter progressivement le nombre des 30 germes à partir du produit d'ensemencement initial par des cultures en série. A cette fin, on peut d'abord isoler le germe en cultivant dans, des conditions d'anaérobiose un matériel infectieux approprié sur un milieu.solide contenant un produit de 35 digestion, une infusion ou un extrait de foie. On continue les sous-cultures, à partir de cette primo-culture, jusqu'à ce que le germe soit obtenu sous la forme de culture pure. Ce résultat est généralement atteint par une ou deux cultures sur un milieu solide, en utilisant des conditions, et matières ap-40 propriées., semblables à celles décrites plus haut pour la cul 71 30222 2103402 ture en milieu liquide. Il est bon que le milieu solide soit constitué de plaques de gélose comportant un produit d'autodigestion du pancréas ou de la trypsine Difco 1 : 250, de la peptone, de 5 l'extrait de levure, du chlorure de sodium et de la gélose, en plus de la matière d'origine hépatique dont il a été question plus haut, à un pH compris entre 7,0 et 7,8. C'est ainsi, par exemple, que l'on peut ensemencer les plaques de gélose avec une suspension de matériel infectieux, provenant de lë-sions de nécrobacillose ovine, dans une solution de saccharose dont la molarité va de 0,1 â 0,4, puis faire incuber les plaques, à une température comprise entre 35 et 39°, pendant plusieurs jours, sous une atmosphère d'anhydride carbonique et d'azote. *5 Une fois que l'on a obtenu, à partir de cultures sur milieux solides, une culture pure de F; nodosus, celle-ci peut être utilisée cornue inoculât pour une culture du germe en milieu liquide dans des conditions d'anaérobiose, sous une atmosphère d'anhydride carbonique, culture qui est suivi d'au-20 très sous-cultures jusqu'à ce que l'on ait obtenu suffisamment de germes pour disposer d'un inoculât final suffisant pour un lot de production, ce qui, pour des raisons d'ordre économique, implique l'utilisation d'un grand volume du milieu liquide, volume qui peut être de l'ordre de 500 litres, et dé-25 passe obligatoirement 5 litres. Les sous-cultures successives en milieux liquides sont réalisées de préférence dans les conditions décrites, plus loin pour un lot de production à grande échelle et en utilisant des milieux ayant une composition .identique. 30 Le milieu finalement constitué peut être utilisé de' la manière suivante pour la production de grandes quantités de germes en vue de la fabrication de vaccins. Il est avantageux de placer le milieu liquide, contenant les ingrédients décrits ci-dessus,' dans de grands récipients en verre 35 ou dans des réservoirs en acier inoxydable. Un inoculât (de préférence une culture en milieu liquide de F. nodosus, préparée comme décrit plus haut), représentant un volume compris entre 5 et 10$ de celui du milieu liquide, est ajouté à ce dernier. Il est préférable de remplacer en totalité l'air 4-0 surmontant le milieu par de l'anhydride carbonique stérile, 71 30222 9 2103402 puis de mettre ensuite à l'incubation le récipient scellé pendant une -durée de 12 à 30 heures, temps au bout duquel la croissance a atteint une densité suffisante pour la-produc- S 10 tion de vaccin, une densité d^environ 10 à'10 germes par 5 ml étant la plus avantageuse. En utilisant'des conditions optimales pour la culture, on peut obtenir?une récolte satisfaisante au bout de 12' heures, mais la période optimale peut naturellement varier en fonction de l'a souche du germe cultivée et des conditions de la culture. On évalue là pureté de la 10 culture par l'examen au.microscope et par ses" caractéristiques culturales»-ainsi qu'il est décrit plus loin à l'exemple-1. Si l'on désire-conserver une culture pure-de F. nodosus.,- on obtient de préférence ce résultat ■ en effectuant des sous-cultures en série sur un milieu gélosé solide, car 15 la croissance est plus .lente sur les milieux solides, et la vie du germe est par conséquent.plus longue. Une autre solution consiste à retirer les.germes d'un milieu de culture solide, à les mettre en suspension dans une solution de saccharose, à les lyophiliser et-a les mettre dans une ampoule scel-20 îée sous pression réduite. Lorsqu'il en est besoin, on reconstitue les germes lyophilisés à l'aide d'un bouillon nutritif . .quelconque et on les- remet en .culture, -dans des conditions d'anaérobiose sur un milieu solide contenant un .produit de di-.gestion, une infusion ou un extrait defoie. De cette manière, .25 on peut obtenir- une réserve de F. nodosus,' utilisable à toutes fins utiles. • - - :' Il a été constaté que les conditions •de culture décrites plus haut présentent un intérêt particulier pour la culture de deux souches de F. nodosus3 en 1'.espèce les Souches 30 183 et N° 198 du Me Master Laboratory of t'he Commonwealth Scientific Industrial Research Organisation, Sydney, Austrâlie. Des lots de germes, obtenus de la manière décrite ci-dessus, peuvent être transformés en vaccins par n'importe •quelle méthode connue.'Il est d'abord nécessaire de tuer les 35 germes, ce qui peut être réalisé par les méthodes habituelles, par exemple en utilisant de la formaline à une concentration allant de 0,5 al% (volume/volume). On peut alors combiner les germes tués avec un adjuvant*, en 'vue de favoriser la réaction immunologique aux germes'. A dette fin^ le ma-40 tériel antigénique devant fournir le vaccin peut être, soit 71 30222 10 2103402 la totalité d'une culture tuée,, soit les germes tués et récoltés. Des adjuvants appropriés ont été décrits dans le brevet britannique N° 1 lHj> 5^5 : ils peuvent aussi être utilisés comme adjuvants pour les vaccins obtenus e partir de cultures 5 de P. nodosus, préparées comme décrit dans le "présent texte. Une technique avantageuse consiste 5 mélanger la culture avec un agent émulsionnant hydrophile non-ionogene, par exemple le mono-oléate de polyoxyéthylène-sorbitanne puis a 1'émulsion-ner dans une huile minérale contenant un agent émulsionnant 10 lipôphile no'n-iônogène, comme le mono-oléate de mannide, et à stériliser le tout, de façon à obtenir une émulsiori eau-dans-l'huile des germes en dispersion dans la phase aqueuse. On préfère cependant utiliser un adjuvant contenant de 11 aluminium pour favoriser l'action immunisante des 15 antigènes, et oh a constaté 'que l'alun de "potassium convenait particulièrement bien, quoique d'autres sels d'aluminium, couramment employés dans les vaccins, puissent être utilisés. Il est souhaitable que le vaccin contienne un agent bactëriosta-tique du type généralement employé dans les' vaccins bactériejis 20 tués, et on peut, à-cette fin, incorporer 0,01# (en poids/volume) de thiomersal "(éthyl-p.ercurithio-salicylate de sodium). Il y a intérêt a administrer aux animaux les vaccins conformes -à la présente invention par voie sous-cutanée ou intra-musculâire. ' ' 25 On considère néanmoins qu'il est avantageux d'ad ministrer- uri vaccin contenant un adjuvant à l'aluminium par la voie sous-cutanée, et d'administrer un vaccin contenant comme adjuvant un agent émulsionnant, soit par voie intrapéri-tonéale, soit en un point où -la réaction locale produite par 30 l'administration par voie sous-cutanée n'a que peu d'importance pour l'éleveur. On utilise de préférence un dosage allant g 1Q de 10 à 10 germes tués par dose, et, de préférence, de 8^9 * 5 x 10 a 5 x 10' germes tués par dose, ladite dose étant la quantité totale de matériel antigénique administrée à un ani-35 mal, par exemple un mouton, dans un volume "approprié de liquide, égal par exemple à 4 ml. La dose peut être administrée à l'animal, soit sous la forme,d'une dose unique, soit sous la forme de plusieurs sous-doses ; celles-ci peuvent être adminis trées, soit à différents intervalles, soit par injections si-40 multanées des sites différents. Des méthodes adéquates, d'immu 71 30222 ii 2103.402 nisation peuvent être, soit une seule injection de la dose, soit une injection d'une sous-dose, suivie, au bout de deux semaines, d'une deuxième injection d'une sous-dose, soit deux injections, de chacune une sous-dose, effectuées simultané-5 ment en différents points de l'animal. La méthode d'administration optimum varie naturellement en fonction des souches de germes utilisées comme base pour le vaccin, du nombre total de germes employés3 de la nature de l'adjuvant et de la voie d'administration. On a constaté qu'une technique prati-10 que consistait à administrer le vaccin contenant 2,5 x 10^ germes/ml, comportant un adjuvant à l'aluminium, en une seule dose de 4 ml par voie sous-cutanée, suivie d'une deuxième injection, effectuée avec le même volume et par la même voie, au bout d*un délai de 4 à 6 semaines. Si une protection pro-15 longée est nécessaire, on peut administrer des doses de rappel à des intervalles de 6 mois. En plus du matériel antigénique provenant de P. nodosus, les vaccins conformes a la présente invention peuvent également contenir du matériel antigêniaue dérivant d'autres 20 bactéries qui sont pathogènes, par exemple pour le mouton, en particulier P.. necrophorus ou des Clostridia. On préfère, entre autres, une combinaison vaccinale à plusieurs composantes, comportant une préparation d'une émulsion eau-dans-1'huile, ou une préparation ayant comme adjuvant l'alun de potassium, S 25 base d'un ou plusieurs antigènes clostridiens, décrites dans le brevet britannique n°. 1 143 5^5, en association avec une préparation antigénique à base de P. nodosus, obtenue de la manière décrite plus haut. TABLEAU I 30 Milieu Densité optique Foie % (p/v) Pancréas % ( /v ) Souche 183 Souche 198 1 2 moyenne 1 2 moyenne 0 0 ,060 ,063 ,062 ,092 ,090 ,091 0 20 ,33 ,33 ,33 ,26 ,26 ,26 1 20 ,395 ,39 ,395 ,38 ,37 ,375 1 30 ,435 . M ,435 ,41 ,415 ,415 2 20 ,39 ,395 ,395 ,43 ,455 ,44 71 30222 2103402 Le tableau (I) montre l'effet de la présence de matières d'origine hépatique sur la croissance de F. nodosus en milieu liquide. A une température de 37° et sous une atmosphère contenant 5$ de CC^ dans l'azote, on effectue deux sé-5 ries de cultures, l'une de la souche N° 183, et l'autre de la souche N° 198, dans un milieu liquide contenant 2% (en poids/volume) d'un produit de digestion de peptone et 0,3% (en poids/volume) de chlorure de sodium, en plus des teneurs en produits de digestion du foie et/ou du pancréas indiquées 10 dans le tableau. On cultive les germes jusqu'au lendemain et on mesure la densité optique du milieu 5 ce stade au moyen d'un spectrophotomètre "spectrométrique 20" (Bausch and Lomb) on obtient ainsi les valeurs de la densité optique. Les chiffres portés dans le tableau montrent clairement que l'on ob-15 tient une croissance maximum de la souche 183 avec 1% de foie et 30$ de pancréas, tandis que la croissance maximum de la souche 198 a lieu avec 2% de foie et 20%.âe pancréas. Un des objets de 1'invention est donc un procédé de culture de F. nodosus, lequel comprend la culture du germe, 20 dans des conditions d'anaérobiose, dans un récipient contenant un milieu nutritif liquide utilisable par le germe et un espace gazeux au-dessus du milieu, ledit milieu contenant en solution un extrait, un produit de digestion ou une infusion de foie, et ledit espace gazeux contenant essentielle-25 ment de l'anhydride carbonique, ou un mélange d'anhydride car bonique et d'un gaz inerte (tel que défini plus haut) contenant au moins 60% en volume d'anhydride carbonique, et le volume total de l'anhydride carbonique dans l'espace gazeux ne dépassant pas 301 du volume du milieu liquide. 30 Un autre objet de l'invention est un procédé de cultu re de F. nodosus, lequel comprend la culture du germe, dans des conditions d'anaérobiose, dans un récipient ou se trouve un milieu nutritif liquide contenant en solution de la trypsine brute ou un produit de digestion du pancréas, et conte-35 nant également en solution un produit de digestion, un extrait ou une infusion de foie. L'invention a encore pour objet un procédé de culture de F. nodosus, lequel comprend la culture du germe, dans des conditions d'anaérobiose, dans un récipient contenant un mi-40 lieu nutritif liquide surmonté d'un espace gazeux, ledit es 71 30222 13 2T03402 pace gazeux contenant essentiellement de l'anhydride carbonique ou un mélange d'anhydride carbonique et d'un gaz inerte (tel que défini plus haut), contenant au moins 60$ en volume d'anhydride carbonique, et le volume de l'anhydride cârb.oni-5 que dans l'espace gazeux ne dépassant pas 30$ du volume du milieu aqueux. L'invention a également trait à un procédé de culture de F, nodosus, lequel comprend la culture du germe, dans des conditions d'anaérobiose, dans un récipient contenant un mi-10 lieu-, nutr itif liquide utilisable par le germe et un espace gazeux au-dessus de ce milieu, ledit espace gazeux contenant au moins 80$ en volume d'anhydride carbonique, les autres gaz (s'il y en a) étant essentiellement un gaz inerte (tel que défini plus haut). 15 L'invention concerne encore un vaccin contre F. nodosus, lequel comprend une préparation stérile de germes de F. nodosus qui ont été cultivés de la manière décrite dans le présent texte ; elle concerne aussi un procédé de préparation d'un tel vaccin, ainsi qu'un procédé de prévention ou de 20 traitement de la nécrobacillose chez le mouton, lequel comprend l'immunisation des moutons à l'aide d'un vaccin à base de germes tués de F. nodosus qui ont été "cultivés de la manière décrite dans le présent texte. Les exemples qui suivent ont pour but de décrire la 25 présente invention. Sauf indication contraire expresse, les parties et pourcentages sont donnés en poids. Les tfempératu-res dont indiquées en degrés Celsius. " ' EXEMPLE 1 a) Isolement des germes : On isole, des lésions de la nécrobacillose ovine, du matériel infectieux, on le met en suspension dans une solution aqueuse 0,25 molaire de saccharose et on. 11 inocule immédiatement sur des plaques gélosées ayant la composition suivante : ^ 10$ (volume/volume) x d'un produit d'autiO-diges- . tion de pancréas de boeuf 1$ (poids/volume) de protéose-peptone 0,2$ (poids/volume) d'extrait de levure 1$ (poids/volume) d'un produit de digestion de 2l0 foie de boeuf. 30 14 71 30222 2103402 0,5% (poids/volume) de chlorure-de sodium 1,5$ (poids/volume) de gélose. ( : équivalent à environ 1,2% (en poids/volume) des matières solides contenues initialement dans le pancréas). Le pH du milieu nutritif solide est égal 7,4. On fait incuber les plaques à 37°, pendant 4 jours, sous une atmosphère d'azote contenant 5% d'anhydride carbonique. Une fois l'incubation terminée, on constate que les plaques de gélose portent des colonies petites, plates 10 et étalées, typiques de P. nodosus. Dans les frottis effectués à partir des colonies et examinés au microscope, on trouve un bacille Gram-négatif ayant la .forme en haltère caractéristique de F. nodosus. On transfère du matériel, cultivé sur les plaques 1 R de gélose, sur d'autres plaques de gélose ayant la même composition, qu'on fait ensuite incuber, dans les mêmes conditions, pendant trois jours, avant dë les examiner. On examine ensuite les traits caractéristiques des bactéries qui ont cul tivé sur les plaques, éri vue de déterminer le type du germe : 20 l'aspect des colonies, la coloration des germes dans des frot tis teints au Gram, et. aussi l'odeur, semblable à celle du sperme des mammifères, sont tous caractéristiques de F. nodosus. L'identité du germe avec F. nodosus est ensuite confirmée par son incapacité à se développer sur gélose dans des pc conditions d'aêrobiose ou sur une gélose nutritive ordinaire, son aptitude à se développer sur une gélose contenant de 5 à 10% de sang de cheval, mais pas de sang de mouton, et aussi son aptitude à provoquer la nécrobacillose lorsqu'on l'applique sur la peau des espaces .interdigitaux de moutons dont les pieds ont subi une macération et ont été exposés .à une contamination alvine par F. necrosphorus. On conserve le germe par sous-cultures répétées sur gélose, comme décrit plus haut On retire du milieu gélosê les germes provenant de la deuxième sous-culture, on les met en suspension dans 35 une solution de saccharose 0,25 molaire, puis on les lyophili se et on les met dans des ampoules scellées, sous pression ré duite. On met en réserve le matériel d'ensemencement jusqu'à ce que l'on en ait besoin pour., la production de vaccin. b) Sous-cultures des germes et préparation d'un 40 inoculât en milieux liquides : 71 30222 2103.402 Pour faire démarrer la culture de P. nodosus en vue de préparer un vaccin, on reconstitue les germes, lyophilisés de la manière décrite plus haut, dans une solution aqueuse de saccharose 0,25 molaire, on les ensemence sur gé-5 lose, puis on transfère la culture ainsi obtenue sur un milieu aqueux présentant la composition suivante : 1% (poids/volume) d'un produit de digestion de foie de boeuf dp 10$ (volume/volume) d'un produit, d'autodigestion 10 de pancréas de boeuf. 1% (poids/volume) de protéose-peptone 0,2$ (poids/volume) d'extrait de levure 0,5$ (poids/volume) de chlorure de sodium 0,05$ (poids/volume) de chlorhydrate de L-cystëine 15 (ajoutée sous la forme d'une solution stérile S 10$ après passage du milieu à l'autoclave) eau distillée : Q.S.P. ( : équivalent à environ 1,2$ (en poids/volume) des matières solides contenues initialement dans le pancréas). 20 Le pH du milieu avant le passage a l'autoclave est égal â 7,4. On fait incuber les germes dans un faible volume du milieu, pendant 24 heures à 37° i on introduit ensuite la culture ainsi obtenue dans un volume plus important du milieu liquide, par exemple, à titre expérimental, dans 500 25 ml du même milieu / sauf que la concentration de la cystéine est de 0,02$ (èn poids/volume) et celle du produit d'auto-digestion du pancréas de 20$ (en volume/volume), c'est-à-dire environ 2,4$ (en poids/volume) des solides pancréatiques initiaux_7, contenu dans un flacon de verre d'une capacité d'environ 1/2 litre. On réalise une incubation supplémentaire dans les mêmes conditions ; dans chaque cas on introduit de l'anhydride carbonique dans l'espace gazeux situé au dessus du milieu au travers d'un bouchon stérile de laine de coton, jusqu'à ce 35 que la plus grande partie de l'air soit chassée. Par exemple quand on utilise le flacon ayant une capacité d'environ 1/2 litre, avec un espace gazeux d'environ 50 ml, on introduit de l'anhydride carbonique gazeux pendant environ 15 secondes, à travers une pipette de 2 ml stérile, garnie de laine de co- 40 ton. On vérifie au microscope la pureté de la culture, c'est- 71 30222 16 2103402 à-dire l'absence de micro-organismesautres que P. nodosus, c) Culture du germe à grande échelle On verse ensuite le contenu de deux Îlacons d'enté viron 1/2 litre dans 12,5 litres d'un milieu liquide ayant la même composition /"à cette exception près que la concentration de la cystéine est de 0,01$ (en poids/volume) et que celle du produit d'auto-digestion du pancréas est là encore de 2,4$ (en poids/volume), autrement dit 20% en volume/volume_7 conte-10 nus dans un récipient de verre d'une capacité de 15 litres. On remplace entièrement l'air contenu dans le récipient par de l'anhydride carbonique, introduit par un filtre linéaire stérile, puis on ferme hermétiquement le récipient et on fait incuber pendant 20 heures à 37°. Après ce laps de temps,, la culture est suffisamment dense : elle con- • Q tient à peu près 10 germes/ml. On prélève des échantillons de la culture et on en vérifie la pureté en les examinant au microscope et en étudiant les caractéristiques culturales des germes, de la manière décrite plus haut pour la détermination 2o de la pureté des cultures de germes faites sur plaques de gélose. EXEMPLE 2 Préparation d'un vaccin contre F. nodosus 25 On effectue une culture en milieu liquide de P. nodosus selon la méthode à grande échelle décrite à l'exemple 1 (c). On évalué le pouvoir antigénique des germes en mélangeant, sur une lame, une goutte de la culture avec une goutte d'un anti-sérum agissant sur P. nodosus élevé sur le la-30 pin. L'agglutination des germes se produit immédiatement ; leur pouvoir antigénique est donc suffisamment élevé pour qu'ils puissent servir à la fabrication de vaccins. On ajoute 0,8$ (en volume/volume) de formaline à la culture totale, puis on laisse séjourner le tout pendant 3 jours à la température 35 ambiante et on y ajoute du.thiomersal (0,01$ en poids/volume). On transforme ensuite le matériel inactivé en un vaccin : on dissout du mono-oléate de sorbitanne dans la culture jusqu'à une concentration de 5$ en volume/volume, et on met en émul-sion 3 parties en volume de la suspension ainsi obtenue dans 40 7 parties d'un mélange huileux constitué de 10$ (en volume/vo 71 30222 2103.402 lume) de mono-oléate de mannide dans l'huile de par.affine légère "Bayol F" (non de marque déposé). On introduit le vaccin dans des récipients appropriés, dans des conditions de stérilité, puis on scelle les récipients. On conserve le produit 5 jusqu'à utilisation. On évalue le pouvoir du vaccin en injectant deux doses de chacune 1 ml du vaccin non dilué à 4 lapins, à un intervalle de 2 semaines. On saigne les lapins 2 semaines après l'administration de la deuxième dose et on éprouve leurs sé-10 rums à des dilutions de 2 500, 5 000, 10 000, etc, jusqu'à 320 000 ; chaque échantillon de sérum est soumis S une épreuve, d'agglutination avec une suspension de F, nodosus, dans une solution à 0,85$ (en poids/volume) de chlorure de sodium, pour une densité équivalant au tube 1 dans l'échelle d'opaci-15 té-de Brown (Burroughs, Wellcome & Go.). Le vaccin produit un. taux moyen d'agglutinés égal à 48 000 ; il est suffisamment puissant pour pouvoir être utilisé ultérieurement pour la vaccination des moutons. ! EXEMPLE 3 20 Préparation d'un vaccin contre F. nodosus De la manière décrite à l'exemple 1 (c), on cultive les souches 183 et 198 de F. nodosus, puis on inactive les germes â l'aide de formaline comme décrit & l'exemple 2. On 25 mélange des -volumes égaux de l'anaculture de chaque souche, puis on ajoute des solutions aqueuses de sulfate'd'aluminium et de potassium ainsi que de Thiomersal, de façon obtenir des concentrations respectives de 2% (ën poids/volume) et de 0,01$.(en poids/volume). On stérilise le vaccin obtenu et on 30 l'introduit dans des flacons"dont chacun contient 4 ml de vaccin comportant 2,5 x 10^ germes/ml. Ce vaccin' convient pour l'immunisation des moutons : la vaccination s'effectue en administrant, par voie sous-cutanée, d'abord 4 ml en sn seul point, puis en"injectant la même dose par la même voie 4 à 8 35 semaines plus tard. 71 30222 2103402 -REVENDICATIONS 1Procédé de culture de Fusiformis-nodosus, lequel comprend la culture du germe, dans des conditions d'anaéro-5 biose, dans un récipient contenant un milieu nutritif liquide et un espace; gazeux surmontant le milieu; ledit milieu * contenant en solution un extrait, un produit de digestion ou une infusion de foie,ceci en une"proportion pouvant aller de 0,5 à 2% en poids/volume, et, de préférence, de 1 à 2% en poids/ 10 volume (le poids.étant évalué en prenant comme base la composante d'origine hépatique sous forme solide), et l'espace gazeux contenant essentiellement de 1' anhydride carbonique ou un mélange d'anhydride carbonique et d'un gaz inerte, tel que l'azote, contenant au moins 60% en volume d'anhydride carbonique, et le volume de l'anhydride carbonique dans l'espace gazeux ne dépassant pas 30% du volume du milieu liquide, et pouvant être -compris entre 5 et 30 %, et de préférence, entre 10 et 20%, par rapport au volume du milieu .liquide. 2.- Procédé selon la revendication 1., caractérisé en 20 ce que l'espace gazeux contient au moins 80% en volume d1anhydride carbonique, le reste du gaz, si tant est qu'il y 1 en ait, étant constitué essentiellement d'un gaz inerte, tel que l'azote. 3.- Procédé selon la revendication 1., caractérisé en 25 ce que le milieu liquide contient en solution de la trypsine brute du"un produit de digestion du pancréas. 4.- Procédé de culture de Fusiformisnodosus, caractérisé en ce que l'on cultive le germe dans des conditions d'anaérobiose, dans un récipient contenant un milieu nutritif 30 liquide, surmonté d'ion espace gazeux, ledit milieu contenant en solution de la trypsine brute ou un produit de digestion du pancréas, et contenant aussi éventuellement un produit de digestion, un extrait ou une infusion de foie, celui-ci par exemple à une concentration de 0,5 à 2%, ou mieux, de 1 à 2%, 35 en poids/volume du milieu, le poids étant rapporté aux éléments . solides du foie. Procédé selon la revendication 4., caractérisé en ce que l'espace gazeux est constitué essentiellement d'anhydride carbonique ou d'un mélange d'anhydride carbonique et d'un gaz 4-0 inerte tel que l'azote» 71 30222 19 2103402 6.- Procédé selon la revendication 5» caractérisé en ce que l'espace gazeux contient au moins 60%,ou au moins 80%, en volumè"d'anhydride carbonique, le reste du gaz étant constitué essentiellement d'un gaz inerte tel que l*azote. 5 7«- Procédé selon l'une des revendications 5 et 6, . caractérisé- en ce que le volume de l'anhydride carbonique dans l'espace gazeux ne dépasse pas 30% du volume du milieu liquide, et est de préférence compris entre 5 et 30% plus particulièrement entre 10 et 20%, de ce volume. 10 8.- Procédé de culture de Fusiformis'-nodosus, caracté risé en ce que l'on cultive le germe, dans des conditions d'anaérobiose, dans un récipient contenant un milieu nutritif liquide surmonté d'un espace gazeux, ledit espace contenant essentiellement de l'anhydride carbonique ou un mélange 15 d'anhydride carbonique avec un gaz inerte, par exemple l'azote contenant au moins 60% en volume d'anhydride carbonique, et le volume de l'anhydride carbonique dans l'espace gazeux ne dépassant pas 30% du milieu liquide, et étant compris notamment entre 5 et 30%, et, de préférence entre 10 et 20%, par 20 rapport au volume du milieu liquide. 9.- Procédé selon la revendication 8, caractérisé en ce que l'espace gazeux contient au moins 80% en volume d'anhydride carbonique. 10.- Procédé selon l'une des revendications 8 et 9» 25 caractérisé en ce que le milieu liquide contient en solution un extrait, une infusion ou un produit de digestion du foie, avec, éventuellement, en supplément, en solution, de la trypsine brute ou un produit de digestion du pancréas,'la teneur en constituants d'origine hépatique pouvant aller de 30 0,5 à 2%, plus spécialement de 1 à 2%, en poids/volume du milieu, le poids étant rapporté à la matière solide du foie. 11.- Procédé de culture de Pusiformisï-nodosus - caractérisé en ce que l'on cultive le germe, dans des conditions d'anaérobiose, dans un récipient contenant un milieu nutritif 35 liquide surmonté d'un espace gazeux, ledit espace gazeux contenant au moins 80% en volume d'anhydride carbonique; et le reste du gaz, si tant est qu'il y en ait, étant constitué essentiellement d'un gaz inerte, par exemple l'azote. 10 71 30222 20 2103402 12.- Procédé selon la revendication 11, caractérisé en ce que le volume de l'anhydride carbonique dans l'espace gazeux ne dépasse pas 30% du volume du milieu liquide, et est compris par exemple, entre 5 et 30%, et, de préférence, entre 10 et 20% en volume, la proportion étant rapportée au volume du milieu liquide. 13«- Procédé selon l'une des revendications 11 et 12, caractérisé en ce que le milieu nutritif liquide contient un extrait, un produit de digestion ou une infusion de foie, la teneur en constituants d'origine hépatique pouvant aller de 0,5 à 2%, plus spécialement de 1 à 2%, en poids/volume du milieu, le poids étant rapporté à la matière solide du foie. 14.- Procédé selon l'une des revendications 11 et/ 12, caractérisé en ce que le milieu nutritif liquide contient de 15 ^ la trypsine brute ou un produit de digestion du pancréas. 15»- Procédé selon l'une quelconque des revendications 1, 4, 8 et 11, caractérisé en ce que l'espace gazeux contient au moins 95% en volume d'anhydride carbonique, le reste du gaz, si tant est qu'il y en ait, étant constitué essentuelle-ment d'un gaz inerte, par exemple l'azote. 16.- Procédé selon lequel l'une quelconque des revend-cations 1 à 15» dans lequel le volume du liquide est égal ou supérieur à 5 litres. 25 17»- Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 16, dans lequel le milieu liquide est pratiquement exempt de matières particulaires, à l'exception de Fusiformis-nodosus 18.— Procédé selon l'une quelconque des revendications 3,4, 10 et 14, caractérisé en ce que le produit de digestion du pancréas est présent en une teneur comprise entre 1,2 et 3,6 % en poids par rapport au volume du milieu, le poids se rapportant aux éléments solides du pancréas. 19.- Procédé selon la revendication 18, caractérisé en ce que le produit de digestion pancréatique dérive du pancréas de boeuf ou de mouton. 20.- Procédé selon l'une quelconque des revendications 3, 4, 10 et 14, caractérisé en ce que la trypsine brute est présente en une proportion comprise entre 0,5 et 2% en poids/ volume de milieu liquide. 20 30 35 71 30222 21 2103.402 21.- Procédé selon l'une quelconque- des revendications 1 à 20;. caractérisé en ce que le milieu liquide contient en solution un ou plusieurs ingrédients tels que le chlorure de sodium, la protéose-peptone, des produits d'autodigestion demus- 5 cles de mammifères,, des extraits de levures et la cystéine. 22.- Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 21, caractérisé en ce qu'au début de la mise en culture, le pH du milieu est compris entre 7,0 et 7,8. 23.- Procédé selon l'une quelconque des revendications 10 1 à 22, caractérisé en ce que la culture est effectuée à une température d'environ 37°. 24.- Procédé de préparation d'un vaccin contre Fusi-formis nodosus, caractérisé en ce que l'on cultive Fusiformis-nodosus selon l'une quelconque des revendications 1 à 23, on 15 tue les germes et on introduit les germes tués dans un récipient en vue d'obtenir une préparation vaccinale contenant, par exemple de 2,5 x 10^ à 2,5 x 10^ germes tués par ml de préparation. 25.- Procédé selon la revendication 24, caractérisé en 20 ce que l'on sépare les germes du milieu de culture avant de . les tuer, opération qui s'effectue par.exemple à l'aide de formaline. 26.- Procédé selon l'une des revendications 24 et 25> caractérisé en ce que l'on amène les germes tués dans la 25 phase aqueuse d'une émulsion H.L. (eau dans l'huile) laquelle peut contenir éventuellement un 30 27.- Procédé selon l'une des revendications 24 et 25, caractérisé en ce que l'on ajoute à la préparation vaccinale un adjuvant comportant de l'aluminium, par exemple le sulfate de potassium et d'aluminium. 28.- Un vaccin contre Fusiformis-nodosus, comprenant une préparation stérile de Fusiformis-nodosus tué, cultivé selon l'une quelconque des revendications 1 à 23, et contenant 7 Q par exemple, de 2,5 x 10 a 2,5 x 10 , ou, plus particulière- O Q ment, d'environ 1,25 x 10 à 1,25 x 10y germes par ml de préparation vaccinale. 71 30222 2103402 29.- Vaccin selon la revendication 28'. caractérisé en ce que les germes ont été tués à l'aide de formaline. 30.- Vaccin selon l'une des revendications 28 et 29* caractérisé en ce qu'il comporte un adjuvant,, par exemple un adjuvant à base d'aluminium, et, entre autres, du sulfate de potassium et d'aluminium. 31.- Vaccin selon la revendication 30, caractérisé en ce que les germes tués sont en dispersion dans la phase aqueuse d'une émulsion H.L. (eau dans l'huile), l'huile étant, par exemple une huile minérale et l'émulsion contenant par exemple un émulsionnant lipophile non-ionogène et un émulsionnant hydrophile non-ionogène;