FR 2081545 A1 19711203 FR 7106702 A 19710226 71 06702 i 2081545 L'invention a pour objet le 3-octadécyloxy-propanol-(l)-phosphate de monocholine, pharmacologiquement intéressant, de formule : ÇH2-°-ci8H37 CH2 (+) CH2-0-P02-CH2-CH2-N(CH3) 3 °(-> 10 ainsi que la fabrication de ce composé. On fabrique le composé de formule I selon l'invention, en alcoylant le 1,3-propanediol avec un halogénure ou avec le sulfate d'octadécyle pour former le 3-octadécyloxy-propanol-(1) de formule : 15 ÇH2-0-C18H37 I II CH, I CH2-OH en faisant réagir l'éther avec du dichlorophosphate de 2-bromo- 20 éthyle pour former 1'hydrogénophosphate de 3-octadécyloxy-propa-nol-(l)-phosphate de 2-bromo-éthyle de formule : ÇH2-°-C18H37 CH_ I 25 CH _ —0 -PQ —0 -CH„—CH--Br III 2 i 2 2 OH en soumettant le composé à une amination avec de la triméthyla-mine et en convertissant le produit résultant, par élimination des ions bromure, en le sel interne de formule I. 30 La substance selon l'invention est une poudre amorphe sans cohésion dont le comportement à la fusion n'est pas caractéristique. Pour sa caractérisation, on utilise donc la chromato-graphie en couche mince (valeur de R^) et l'analyse élémentaire. Le composé selon l'invention, qui n'est pas métabolisé dans 35 l'organisme par la phospholipase B, présente une activité interfaciale et provoque, après application parentérale dans l'organisme animal une modification de l'activité interfaciale des membranes cellulaires. Alors que des concentrations relativement é- 71 067Ô2 2 2081545 levées entraînent une cytolyse, par exemple l'hémolyse, on ob- . serve pour des doses sublytiques une modification, proportionnelle à la dose, de l'activité interfaciale des membranes. Le composé selon l'invention est utilisable avant tout,comme adjuvant 5 immunologique. La fabrication du composé selon l'invention est décrite plus en détail par l'exemple suivant : a) Le 3-octadécyloxy-propanol-(1). On dissout 2,3 g (0,1 mole) de sodium dans 38 g (0,5 mole) 10 de 1,3-propanediol anhydre, on ajoute 57 g (0,15 mole) d'iodure de n-octadécyle et on chauffe le mélange,.en agitant énergique-ment, durant 16 heures à 150°C. Après refroidissement, on ajoute 200 ml d'éther et 100 ml d'éther de pétrole (30 - 50°C), on agite énergiquement et on sépare par décantation le résidu brun vis-15 queux. Après séchage de la solution sur du sulfate de sodium, on obtient 48,7 g de produit brut. En reprenant ce produit dans de l.'éther, la majeure partie du diéther, formé comme produit secondaire, et une partie de l'iodure d'alcoyle restent insolubles. On évapore la solution éthérée surnageante et on chromatographie 20 le résidu sur 250 g de silicagel en utilisant d'abord de l'éther de pétrole pur ( 30 - 50°C) et ensuite un mélange éther de pétrole (30 - 50°C)/éther = 1 : 1, et on obtient le monoéther sous forme d'une substance incolore pure dont la valeur de R^ est de 0,35. Par recristallisation dans de l'éther de pétrole (30-50°C), 25 on obtient des cristaux incolores de P.F. 50 - 51°C. Rendement : 10,5 g = 32% de la théorie. b) Le 3-octadécyloxy-propanol-CD-phosphate de monocholine. A une solution de 4,4 g (75 mmoles) de triéthylamine et de 4,8 g (20 mmoles) de dichlorophosphate de 2-bromoéthyle dans 30 50 ml de chloroforme absolu, on ajoute lentement, goutte à goûte, et en agitant et en refroidissant avec de la glace, une solution de 6,6 g (20 mmoles) de 3-octadécyloxy-propanol-(1) dans 50 ml de chloroforme. Après échauffement du mélange jusqu'à la température ambiante, on le laisse reposer durant 24 heures. 35 On effectue ensuite l'hydrolyse, en ajoutant au mélange, refroidi à nouveau jusqu'à 0°C, goutte à goutte et en agitant, 30 ml d'une solution aqueuse 0,1 N d'iodure de potassium. On laisse reposer le mélange durant 1 heure à la température ambiante, puis on ajoute 50.ml de méthanol et, après avoir ajusté 40 le pH à l'aide d'acide chlorhydrique concentré à environ 3, on se 71 06702 3 2081545 coue énergiquement durant quelques minutes et on sépare les phases dans une ampoule à décanter. Après séchage de la phase organique sur du sulfate de magnésium et évaporation, on sèche le résidu sous vide élevé sur du pentoxyde de phosphore. On reprend 5 alors l'ester bromoéthylique brut dans du benzène absolu et on é-limine par essorage les sels d'ammonium insolubles. Dans le filtrat, on isole 10,4 g d'une substance cireuse de coloration jaune-clair. On la dissout, sans purification chromatographique intermédiaire, dans 200 ml de chloroforme absolu et on agite la solu-10 tion, après addition de 15 ml de triméthylaminé, durant trois jours à la température ambiante. Après évaporation de la solution et reprécipitation du résidu avec de l'acétone à partir de la solution chloroformique, on obtient 10,4 g de bromure de 3-octa-décyloxy-propanol-(l)-phosphate de monocholine sous forme d'une 15 poudre incolore. On élimine de cette poudre les ions bromure, en la dissolvant dans 300 ml de méthanol et en agitant la solution énergiquement avec 3 g d'acétate d'argent durant 30 minutes à la température ambiante. Dans le filtrat, on isole, après évaporation 9,2 g d'ester de choline brut. On chromatographie 1,0 g de ce 20 produit sur 200 g de silicagel avec un mélange chloroforme/métha-nol/eau =65 : 25 : 4 et on obtient le produit final de R^:0,20, qui se présente, après reprécipitation à partir de sa solution chloroformique avec de l'acétone, sous forme d'une poudre blanche comme de la neige. Rendement : 70% de la théorie (compte tenu 25 des deux étapes). C*26H58°6NP (511,7) (monohydrate) Calculé : C 61,03, H 11,42, N 2,74, P 6,05, Trouvé : C 61,38, H 11,14, N 2,72, P 5,98. On a vérifié de la façon suivante les propriétés du composé 30 selon l'invention qui en font un adjuvant : 1. On a réalisé les essais en s'appuyant sur la méthode de Dresser (Immunology _9 (1965) 261). Le principe du dispositif expérimental consiste en l'introduction d'une tolérance par une protéine solubie. Dans ce dispositif expérimental, on détermine 35 le pouvoir des substances de renforcer la réponse immunitaire dans l'organisme vis-à-vis de la gammaglobuline bovine (GGB) extrêmement faible,de telle manière que les anticorps protecteurs vis-à-vis de cette protéine soient nettement décelables. A cet effet, on applique, à des souris par injection intrapéritonéale 40 une dose de 5 mg de GGB séparée par centrifugation de tout 71 06702 4 2081545 agrégat. Normalement, à cette dose, au bout de 8 à 10 jours, aucun anticorps n'est décelable. Les animaux ne sont donc pas immunisés. Ils sont, sous ces conditions, incapables de donner une réponse immunitaire vis-à-vis de la GGB. Par contre, si l'on 5 administre la GGB en combinaison avec un adjuvant, l'établissement de la tolérance passagère est empêché et les animaux produisent maintenant des anticorps à 1'encontre de la GGB, autrement tolérogène (immunologiquement tolérée). 10 à 12 jours après l'administration de la protéine immunologiquement tolérée, on 10 injecte aux animaux une nouvelle dose de GGB marquée avec de l'iode-125. Si les animaux sont tolérants, l'antigène marqué se dégrade lentement comme la gammaglobuline propre. Si, au contraire, les animaux sont immunisés, il se produit un phénomène dit "élimination consécutive à l'immunisation", c'est-à-dire une 15 disparition beaucoup plus rapide du circuit sanguin. On mesure donc les anticorps formés par la vitesse de disparition de la GGB marquée avec l'iode-125. Les essais avec le composé selon l'invention ont montré que les animaux traités avec GGB et le 3-octadécyloxy-propanol-(l>-20 phosphate de monocholine font disparaître du circuit sanguin la protéine traceuse dix à cent fois plus vite que ceux d'un groupe de contrôle traité par une injection préalable d'un liquide consistant uniquement en une solution de chlorure de sodium. 2. Une autre méthode immunologique pour l'évacuation d'anti-25 corps, à l'aide de laquelle on peut déterminer la potentialisa-tion de l'effet antigénique de produits faiblement immunogènes, consiste à accoupler l'antigène (GGB) à des érythrocytes et à incuber les cellules ainsi préparées avec le sérum dans une série à dilution progressive durant 20 heures à 4°C. Lorsque le sérum 30 contient des anticorps, les érythrocytes sont agglutinés. On désigne par "titre en anticorps d'un sérum" la dilution maxima à laquelle ce phénomène est encore perceptible. Même par cette méthode, nettement moins précise, on peut é-tablir d'une façon indiscutable que le composé selon l'invention 35 est un adjuvant d'une grande efficacité. On peut appliquer les composés de formule I suivant les modes habituels. L'application par injection intrapéritonéale est particulièrement préférée. On peut faire varier la dose entre de larges limites. On peut, selon le degré désiré de la poten-40 tialisation de la réponse immunitaire, administrer des doses de 71 06702 5 2081545 0,5 à 10 mg/kg. Les exemples suivants décrivent quelques modes de préparation pharmaceutique. Exemple I.- Dragées contenant 100 mg de 3-octadécyloxy-propanol-(l)-phosphate de monocholine monohydraté. 10 1 noyau de dragée contient : substance active 100,0 mg phosphate dicalcique anhydre 73,0 mg amidon de maïs 55,0 mg polyvinylpyrrolidone 5,0 mg carboxyméthylcellulose 5,0 mg stéarate de magnésium 2,0 mq 240,0 mg 15 Procédé de fabrication : On humecte d'une solution alcoolique de la polyvinylpyrro-lidone à 10% le mélange constitué de la substance active, du phosphate dicalcique et de l'amidon de maïs et on fait passer la masse à travers un tamis de 1,5 mm d'ouverture de maille, 20 puis on sèche à 45°C. On fait passer le granulé sec de nouveau à travers le même tamis et on le mélange avec la carboxyméthyl-cellulose et le stéarate de magnésium. On transforme le mélange résultant en noyaux de dragées par compression. Poids d'un noyau : 240 mg ; poinçon : 9 mm de diamètre. 25 On recouvre, selon les techniques connues, les noyaux ainsi fabriqués d'un enrobage consistant essentiellement en sucre et talc et on polit les dragées finies à l'aide de cire d'abeilles. Poids d'une dragée : 450 mg. Exemple II.- 30 Tablettes contenant 200 mg de 3-octadécyloxy-propanol-(L)-phospha~ te de monocholine monohydraté. 1 tablette contient : substance active 200,0 mg lactose 100,0 mg 35 amidon de maïs 80,0 mg polyvinylpyrrolidone 12,0 mg cellulose microcristalline 54,0 mg stéarate de magnésium 4,0 mg 450,0 mg 71 06702 6 2081545 Procédé de fabrication : A partir de la substance active, du lactose, de l'amidon de maïs et de la polyvinylpyrrolidone, on prépare un mélange qu'on humecte d'eau. On fait passer la masse humide à travers un tamis 5 de 1,5 mm d'ouverture de maille, on la sèche à 45°C et on la fait passer de nouveau à travers le même tamis. On mélange le granulé avec la cellulose microcristalline et le stéarate de magnésium, et on transforme le mélange en tablettes par compression. Poids d'une tablette : 450 mg ; poinçon : 11 mm de diamètre. 10 Exemple III.- Gouttes buvables contenant 10 mg de 3-octadécyloxy-propanol- (i) -phosphate de monocholine monohydraté par ml. 100 ml de la solution pour gouttes buvables contiennent : substance active 1,0 g 15 p-oxybenzoate de méthyle 0,035 g p-oxybenzoate de propyle 0,015 g propylèneglycol 45,0 g essence d'anis 0,05 g menthol 0,05 g 20 saccharinate de sodium 1,0 g éthanol 1,0 g eau distillée q.s.p.f. 100,0 ml Procédé de fabrication : On prépare un mélange de 45 g de propylèneglycol et de 45 g 25 d'eau, dans lequel on dissout la substance active. On dissout les esters benzoïques, le menthol et l'essence d'anis dans l'é-thanol. On réunit les deux solutions et on ajoute de l'eau jusqu'à un volume de 100 ml, après avoir additionné la solution du saccharinate de sodium. 30 Exemple IV.- Ampoules contenant 50 mg de 3-octadécyloxy-propanol-(l)-phosphate de monocholine monohydraté. 1 ampoule contient : substance active 50,0 mg 35 polypropylèneglycol 2500,0 mg acide tartrique 15,0 mg eau distillée q.s.p.f. 5,0 ml Procédé de fabrication : On chauffe 200 g d'eau distillée à environ 50°C et on ajou-40 te la quantité nécessaire de propylèneglycol. On dissout dans ce 71 06702 7 2081545 mélange la substance active et l'acide tartrique et on ajoute de l'eau jusqu'au volume indiqué. On filtre la solution sous des conditions stériles et on la conditionne dans des ampoules de 5 ml. 5 Exemple V.- Ampoules contenant 20 mg de 3-octadécyloxypropanol-(l)-phosphate de monocholine monohydraté. 1 ampoule contient : substance active 20,0 mg 10 polypropylèneglycol 1000,0 mg acide tartrique 6,0 mg eau distillée q.s.p.f. 2,0 ml Procédé de fabrication : On procède de la même façon que dans l'exemple IV. 15 Comme il va de soi, et comme il résulte d'ailleurs déjà de ce qui précède, l'invention ne se limite nullement à ceux de ses modes d'application, non plus qu'à ceux des modes de réalisation de ses diverses parties, ayant été plus spécialement envisagés ; elle en embrasse, au contraire, toutes les variantes. 71 06702 8 2081545 REVENDICATIONS 1. Le 3-octadécyloxy-propanol-Çl3-phosphate de monocholine de formule : CH.,-0-0^ CH2 (+) CH2-0-P02-CH2-CH2-N(CH3)3 °(") 10 2. Procédé de fabrication du 3-octadécyloxy-propanol^(l)- phosphate de monocholine, caractérisé par le fait qu'on alcoyle du 1,3-propanediol avec un halogénure ou avec le sulfate d'octa-décyle pour former le 3-octadécyloxy-propanol-(1) de formule : ?H2-°-C18H37 15 I CH_ I 2 CH2-OH II qu'on fait réagir l'éther de formule II avec du dichlorophosphate de 2-bromo-éthyle pour former le 3-octadécyloxy-propanol-l-20 phosphate de 2-bromo-éthyle de formule : Ch2-0-c18H37 9H2 25 CH2-0-P0-0-CH2-CH2-Br III OH qu'on aminé le composé de formule III à l'aide de triméthylamine et qu'on convertit le composé résultant par élimination des ions bromure en le sel de formule I. 30 3. Utilisation du 3-octadécyloxy-propanol-(l)-phosphate de nonocholine de formule I comme adjuvant immunologique. 4. Adjuvant immunologique caractérisé par le fait qu'il contient en tant que substance active une quantité efficace du composé selon la revendication 1. 35 5. Adjuvant immunologique selon la revendication 4, carac térisé par le fait que la dose posologique unitaire est de 0,5 à 10 mg/kg de poids du corps du patient.