FR 2101198 A1 19720331 FR 7128394 A 19710803 5 10 71 28394 2101198 La présente demande concerne des amino acides fluorés et en particulier des 03 —fluoro amino acides. Encore plus particulièrement, elle concerne le groupe de composés ayant la formule structurelle suivante : XHp XH I I FC G COOH m2 D ou L ou D,L dans laquelle ï et ï sont 1 ou 2 et représentent le poids ato-15 mique de sorte que les substituants portant ces désignations sont hydrogène ou deuterium. Les symboles D et L se réfèrent aux isomères optiques, bont compris par exemple dans ce groupe de composés la 3-flu.oro-D-alanine, la 3-fluoro-L-alanine, la 2-^H-3-fluoro-D-alanine .et la 2,3,3-^H-3-fluoro-D-alanine et 20 leurs sels pharmaceutiquement acceptables. Le composé 3-fluoro-D,L-alanine est un composé déjà décrit par Lettre et coll. dans Ann. Chem. 708, 75 - 85 (1967)» Toutefois, les isomères optiques, avant cette invention n'ont pas été décrits et l'activité antibactérienne du racémate n'a 25 pas été étudiée.La 3-fluoro-D-alanine et son isomère optique selon l'invention n'ont pas été préparées par résolution du racémate connu, mais, comme on le" verra plus loin, par fluorura-tion directe des D- et L-alanines connues et accessibles dans le commerce. 30 On a découvert de façon surprenante que ce n'est que dans des procédés d'essai antibactériens spécifiques in vitro que se manifeste l'activité inhibitrice de la 3-fluoro-D-alanine. Il était possible de cette façon de montre que l'activité antibactérienne in vitro des isomères optiques est comparable.Ce-35 pendant, in vivo, les isomères diffèrent notablement. L'isomère D garde ses propriétés antibactériennes et peut servir à protéger 1.'animal infecté alors que l'isomère L paraît ne pas pouvoir protéger des animaux infectés par des bactéries et est même mortel pour ces animaux à des doses modérées. COf*f 71 28394 -2- 2101198 Les nouveaux composés selon l'invention et leurs sels sont des agents antibactériens qui peuvent être utilisés pour empêcher la croissance des bactéries pathogènes du genre aussi "bien gram-positif que gram-négatif comme Streptococcus, Eschéri-5 chia, Staphylococcus, Salmonella, Pseudomonas, Diplococcus, Klebsiella, Protêus, Mycobacterium, Yibrio, Pasteurella et Serratia aussi bien que leurs souches résistant aux antibiotiques. Des représentants de ces pathogènes sont Escherichia coli, Proteus mirabilis. Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus 10 aureus et Streptococcus pyogenes. Ainsi les nouveaux composés selon l'invention et leurs sels peuvent être utilisés comme agents antiseptiques pour éliminer les organismes des équipements pharmaceutique, dentaire et médical et peuvent aussi être utilisés en d'autres lieux susceptiblés d'être infectés 15 par ces organismes. Les isomères D des nouveaux composés et leurs sels sont de valeur particulière non seulement parce qu'ils ont l'utilité mentionnée précédemment mais parce qu'ils peuvent être utilisés dans le traitement de maladies causées par les orga-20 nismes ci-dessus chez l'homme et les animaux et peuvent être administrés dans une grande variété de dosages thérapeutiques comme, par exemple, par administration orale sous forme d'une capsule ou d'un comprimé ou d'une solution ou suspension liquide. Des formulations convenables peuvent contenir des diluants, des 25 agents de granulation ou de préservation, des liants, des parfums, et des agents de revêtement'qui sont bien connus dans cette technique particulière et le dosage des produits peut varier dans un large intervalle, la limite supérieure étant établie par le seuil autoantagoniste de l'organisme infectant par 30 rapport à la 3-fluoro-D-alanine dans le domaine immédiat de l'action antibactérienne attendue. Par exemple les dosages pourraient être d'environ 250 mg à environ 500 mg deux ou trois fois par jour d'ingrédient actif pour un.humain adulte de 70 kg. Un animal en croissance avec une thérapie permettant la croissance 35 doit recevoir environ 100 g/tonne d'aliment complet. Alternativement les produits peuvent être admi nistrès par voie parentérale par injection dans un excipient stérile. L'activité antibactérienne in vitro uniquement, comme 71 28394 ~5~ 2101198 on le croyait jusqu'ici, était due à la propriété inhabituelle que la 3-fluoro-D-alanine est autoantagoniste à des concentrations élevées. En conséquence, dans les essais de screening antibactériens qui ont pour but de rechercher des activités de très 5 bas ordre et où, par conséquent, on emploie des concentrations relativement élevées de produit à essayer, on n'observe pas d'activité poupla 3-fluoro-D-alanine. La propriété autoantagoniste n'exclut pas l'utilité car elle n'apparaît, par exemple in vivo, qu'à des doses supé-10 rieures à environ dix fois la dose curative efficace moyenne. Alors que la 3-fiu.oro-l-alanine est métabolisée rapidement et complètement avec des conséquences toxiques, la 3-fluoro-D-alanine est sujette in vivo à une dégradation beaucoup plus lente. Un agent possible est l'enzyme de l'oxydase de l'amino 15 acide D présent abondamment chez l'homme et le rat mais à un degré beaucoup plus faible chez la souris et chez certains herbivores. Toutefois ni le taux du métabolisme, tel qu'il peut affecter les taux sanguins de la thérapeutique, ni les produits accessoires de ce métabolisme ne militent contre l'emploi du 20 composé aux dosages suggérés pour l'emploi chez l'homme et les animaux. On a trouvé- en outre comme caractéristique de l'invention que la deutération fournit des analogues deutéro nouveaux qui sont nettement moins sensibles à l'attaque par l'oxydase de 25 l'amino acide D et qui gardent l'efficacité antibactérienne du produit parent. L'activité in vivo est ainsi maintenue et conservée. Efficacité de la 3-fluoro-D-alanine en comparaison avec d'autres antibiotiques dans le traitement de la souris infectée. 30 Des souris femelles C.D.1 de poids moyen 21,0 g sont injectées par voie intrapéritonéale avec 0,5 ml d'une dilution appropriée d'un bouillon de culture de 16 heures contenant les pathogènes indiqués. (La sévérité de l'attaque infectieuse est représentée dans chaque cas sous forme du multiple de la dilution 35 du bouillon de culture qui était toxique pour seulement 50 % cLe la population non traitée, DL^q). Le produit est administré promptement. par 0,5 ml selon.l'un des modes d'administration indiqués : par voie sous-cutanée sur la surface dorsale (S.C.), 71 28394 -4— 2101190 par voie intrapéritonéale (I.P.) ou par gavage (voie orale, P.O.). Dans le cas de souris infectées par des organismes Streptococcus ou Diplococcus, une seconde dose de produit est administrée 6 heures après l'infection. Les résultats de ces essais sont ex-5 primés en la dose statistiquement interpolée nécessaire pour protéger 50 % de la population infectée pendant une période de 7 jours suivant l'attaque et le traitement (les morts par manque de traitement et parmi les contrôles non traités se produisant dans tous les cas dans les trois premiers jours). Les abréviations 10 utilisées pour les composés comparés sont : 3FDA = 3-fluoro-D-alanine; CYC = D-cyclosérine; TET = tétracycline; CLM = chloram-phénicol. ■^1 EFPIGAOITE THERAPEUTIQUE (ED^q) mg hO 00 Organisme Voie ' d* administration 3FDA CYCLO TET CLM LU -O Esch.erich.ia coli 2017 7--10 SL50 " I.P. S.C. P.O. 0,331 0,361 0,377 2,50 2,36 0,008 0,044 0,600 0,040 0,52 * 0,446 Klebsiella imeumoniae "B" -lô-3ô ÏÏL50 S.G.. P.O. 0,162 0,109 0,332 1,51 0,190 1,42 0,340 0,440 Pseudomonas aeruginosa 2616 y ^50 S.C. 0,897 — 2,4 7,66 I VJ1 I Strentococcus rarogenes 3009 § DL50 S. C..(x2) 0,023 1,25 0,02 0,71 Staphylococcus aureus 2949 3 S.C. 0,538 0,726 0,046 1,5 Diplococcus pneumoniae 1-37 17 DL50 S.G.(x2) 0,104 >'10 0,084 1,780 Salmonella schottmuelleri 3010 P.O. 0,294 2,5 1,217 0,440 J50 NJ O o CQ 71 28394 -6- 2101198 La 3-fluoro-D-alanine montre une supériorité marquée dans le traitement d'un large spectre d'infections "bactériennes. Spécialement par voie orale la fluoro-D-alanine apporte un degré d'efficacité se comparant à, ou dépassant celui des antibioti-5 ques bien connus chloramphénicol et tétracycline. Comparaison de la sécurité et de l'efficacité curative de la fluoro-L-alanine (3FLA) et de la fluoro-D-alanine chez la souris Des groupes de cinq souris CD 1 de poids moyen 21 g servent de contrôles non infectés ou de sujets pour le traitement 10 antibactérien suivant une injection intrapéritonéale de 0,5 ml d'un bouillon de culture dilué d'Escherichia coli 2017 représentant 7 DL^q cLe pathogènes bactériens. Le produit est administré aux doses indiquées dans un volume de 0,5 ml par voie orale dans tous les cas. 15 Dose mg % de survies Contrôles non infectés Souris infectées 3-KLA 3-3TDA 3-FLA 3-PDA 0 100 100 0 0 0,078 — — 0 0 0,312 100 100 0 20 1,250 100 100 0 100 5 0 100 0 80 20 — 100 — — 40 —— 100 — 25 La tolérance des souris pour 3ÏDA dépasse celle pour 31LA par un facteur d'eau moins 10. Au-dessous de la dose maximale tolérée, 3ELA est sans effet thérapeutique. Tandis que des taux modérés de 3î1DA sont pleinement protecteurs, des taux plus élevés montrent in vivo, comme in vitro, un autoantagonisme. 30 Influence sur la croissance bactérienne de gradients de concentration de 3FDA et 3FLA montrant 1'autoantagonisme La surface d'une couche d'agar nutritif de 2 mm d'épaisseur dans une boîte de Pétri est recouverte avec 10^ orga-2 nismes/cm d'une culture d'Escherichia coli 2017 puis on dépose 35 sur cette surface des disques de 7 mm de diamètre contenant les quantités indiqyées de 3FDA ou de 33?LA. Après une incubation de 16 heures à 37°C on mesure les zones circulaires exemptes de croissance bactérienne entourant les disques. Uniquement dans le 71 28394 -7- 2101198 cas de 3FDA et seulement aux dosages supérieurs de produit on observe un anneau de croissance adhérent au disque de papier puis un. anneau d'agar exempt de "bactéries. La zone de croissance « interne, précisément dans la région de haute concentration du gradient dé concentration établi par le produit qui diffuse, est indiquée comme zone d'autoantagonisme. ... Quantité par Diamètre des zones autour des disques, mm aisq-ue 3 -ï"'LÂ 3-FDA /ug Inhibition Auto- Inhibition Auto-10 antagonisme antagonisme 25 24 0 30 . O 50 28 0 33 11 100 32 0 35 13 200 34 0 38 15 15 400 37 0 41 17 Les nouveaux acides aminés fluorés selon l'invention sont préparés par un procédé dans lequel on traite le substrat avec un fluoroxyperfluoroalcane ou avec le fluoroxypentafluoro-soufre sous l'influence d'un initiateur de radicaux libres tel 20 que la lumière, ce qui comprend la lumière ultra-violet"te, les radiations ionisantes comme les rayons a ou les microondes, ou des initiateurs chimiques de chaîne comme les composés azo,par exemple l'azo-bis-isobutyronitrile ou des associations de ces initiateurs de radicaux libres. Le mode opératoire préféré con-25 siste à dissoudre le substrat dans un solvant approprié qui est inerte à la réaction de fluoruration comme l'acide fluorhydrique liquide, l'acide fluorosulfonique, l'acide trifluoroacétique ou l'acide sulfurique; à exposer la solution à l'initiateur de radicaux libres; à ajouter lentement au mélange réactionnel la quan-30 tité voulue.de réactif fluoroxy en agitant vigoureusement et maintenant la température; et à continuer l'irradiation et l'agitation jusqu'à ce que la. réaction soit terminée. En raison du bas point d'ébullition des réactifs il convient, de conduire la réaction à tes températures aussi basses 35 que -80°G auquel cas la réaction se produit à la pression atmosphérique. Un appareil de réaction convenable pour la pression atmosphérique est usiné à partir d'un barreau de Kel-F ^ muni 71 28394 -8- 2101198 d'une fenêtre transparente aux IJV. Alternativement la réaction peut être conduite dans un appareil à pression comme une "bombe Hastelloy ou une "bombe d'acier chemisé de platine auquel cas on peut opérer à température plus élevée, par exemple jusqu'à 100°C. 5 Dans un tel cas, l'emploi de rayons a ou de rayons X comme initiateur de radicaux libres convient bien car ces rayons à haute énergie traversent les parois du réacteur. Le procédé décrit ci-dessus peut être appliqué en opérations séparées ou alternativement il peut être conduit de 10 façon continue dans un réacteur tubulaire avec ou sans garnissage tel qu'anneaux de Raschig, selles ou analogues à travers lequel le substrat ou sa solution et l'agent de fluoruration sont pompés, de préférence en contre-courant, tandis qu'ils sont exposés à une radiation engendrant des radicaux. 15 Une source appropriée de radiation pour la génération de radicaux est une lampe à arc mercure-xénon Hanovia N° 9778-1 avec une puissance de 1000 W. La lampe est montée dans un projecteur Schoeffel LH 15 1-N équipée d'une lentille condensateur de quartz et un filtre thermique (eau). 20 Exemple 1 3-fluor o-D-al anine Dans une solution de 1,822 g de D(-)alanine dans 45 ml de HP liquide, on fait passer en environ une heure 0,6 g de fluoroxytrifluorométhane gazeux sous agitation magnétique en re-25 froidissant dans un bain de glace sèche-acétone et en irradiant à la lumière ultraviolette. On irradie encore pendant 80 minutes et on fait passer encore 2 g de fluoroxytrifluorométhane en irradiant aux IJV" pendant une heure et demie puis pendant encore une heure. 30 On chasse le solvant en soufflant un courant d'azote. Le résidu est dissous dans l'eau glacée et un échantillon est analysé dans l'analyseur d'amino acide de Spinco-Beckman montrant un rendement de 41 % de 3-fluoro-D-alanine et de 32 % de produit de départ n'ayant pas réagi. Pour l'isolement le mélange est 35 chromatographié sur une résine échangeuse de cation Dowex 50 x 8 (forme H+) (résine d'acide polystyrène sulfonique nucléaire vendue par Dow Chemical Co., Midland, Michigan). On emploie l'acide chlorhydrique 2 N. Des fractions appropriées,-par évaporation 71 28394 -9- 2101198 sous vide, on obtient le chlorhydrate de 3-fluoro-D-alanine pur. la 3-fluoro-D-alanine est libérée du chlorhydrate dans un mélange, eau-pyridine-isopropanol, P.F. 166-168°C (déc.); [ct]p = -9,3° (HC1 1 N). 5 Exemple 2 3-fluoro-L-alanine En suivant le.mode opératoire de l'exemple 1 mais en remplaçant la D-alanine qui y est.employée par une quantité équi-. valente de L-alanine, on obtient la 3-fluoro-L-alanine fondant 10 à 176 - 168°C, + 9,1 (0, 2" dans HC1 1 ïf). Exemple 3 2-^H-3-fluoro-D-alanine On incorpore du deuterium en position a de la D-alanine en exposant la L-alanine à l'action, d'une racémase d'aïanine p ' • 15 dans H^O en employant dans ce but une préparation d'enzyme brut de Staphylococcus.aureus £E. Ito et J.L. Stromiger, J. Biol. Chern*. 23?, 2689 (1962)] qui a été dialyséede_façon exhaustive contre H^O tamponnée. Après récupération d'aïanine exempte de sel du mélange réactionnel par des méthodes d'échange d'ions, la 20 D-alanine qui s'est formée est séparée de la L-alanine par N- acétylation chimique et désacétylation enzymatique spécifique de l'isomère L avec I'Acylase rénale du porc.comme décrit par J.P. Greenstein et M, Winitz dans Chemistry of the Amino Acids, Vol. 3, p» 1831 (V/iley and Sons, New-York, 1961). La 2-^H-D- 25 alanine obtenue après hydrolyse acide du résidu acétylé est enri- 2 chie à 95 % en H spécifiquement en position 2 (comme déterminé par MMR) et contient moins de 1 % de. L-alanine comme déterminé enzymatiquement avec la L-alanine : oxoglutarate transaminase). En opérant comme dans l'exemple 1 mais en remplaçant 30 la D-alanine qui y est employée par une quantité équivalente p P de 2- H-D-alanine on obtient la 2- H-3-fluoro-D-alanxne fondant à 169°G, |XId0 (c> 2, dans HC1 1 N). Exemple 4- . . 3 % 3,2-%-3-f luoro-D-alanine 35 _ La 3,3,3- H-D-alanine est résolue à partir du racémate de perdeutéro alanine accessible dans le commerce par ïï-acétyla-tion chimique et désacétylation enzymatique de la portion L comme décrit dans l'exemple 3o 71 28394 -10- 2101198 10 La photofluoruration de la perdeutéro-D-alanine par le ié alanine. 2 procédé décrit dans l'exemple 1 donne la 3,3,2- H-3-fluoro-D- Exemple 5 5 Capsules contenant 330 mg d'ingrédient actif par capsule Par capsule 3-fluoro-D-alanine 330 mg Lactose pour remplir une capsule n° 0 145 mg Capsule grosseur n° 0 475 mg La 3-fluoro-D-alanine est réduite à une poudre n° 60 et le lactose est passé à travers une toile à "bluter n° 60 sur la poudre et les ingrédients sont mélangés pendant 10 minutes. Quand on a obtenu un mélange uniforme, les solides sont broyés à 15 une finesse inférieure à 10 microns et chargés dans des capsules n° 0. Exemple 6 Liquide oral contenant 100 g d'ingrédient actif par litre Par 1000 ml 20 3-fluoro-D-alanine 100,0 g Sucrose 60,0 g Glucose 25,0 g Acide citrique 25,0 g Essence d'orange concentrée 0,2 ml 25 Eau purifiée U.S.P. q.s. pour 1000 ml Le sucrose et le glucose sont dissous dans environ 400 ml d'eau en chauffant. La solution est alors refroidie et on ajoute l'essence d'orange. La solution est amenée à un volume d'environ 900 ml avec de l'eau et on ajoute la 3-fluoro-D-30 alanine. La solution est filtrée et amenée à un volume de 1000 ml. 71 28394 -11- 2101198 - REVENDICATIONS - 1 - Composé de formule XH2 yH 10 FC C — COOH I hh2 D- ou L- dans lequel x est 1 ou 2 et y est 1 ou 2. 2 - 3-fluoro-D-alanine. 3 - 3-fluoro-L-alanine - 4 - 2-^H-3-fluoro-D-alanine - . ■ . 15 5 - 2,3,3-2H-3-fluoro-D-alanine. 6 - Procédé pour traiter les animaux et les humains infectés avec des bactéries pathogènes gram-positives ou gram-négatives, dans laquelle on administre une quantité efficace d'un composé de formule 2° XH2 FC — C COOH I ,HH2 • 25 £- dans laquelle x est 1 ou 2 et y est 1 ou 2. 7 - Procédé selon la revendication 6 dans laquelle les "bactéries pathogènes sont Streptococcus, Escherichia, Staphylo- 30 coccus. Salmonella, Pseudomonas, Diplococcus, Klebsiella, Pro-teus, Myçobacterium, Yibrio, Pasteurella ou Serratia. 8 - Procédé selon la revendication 6 dans laquelle le composé est la 3-fluoro-D-alanine. 9 - Procédé selon la revendication "6 dans laquelle le 35 composé est la 2-^H-3-fluoro-D-alanine. 10 - Procédé selon la revendication 6 dans laquelle le 2 composé est la 2,3»3- H-3-fluoro-D-alamne. 71 28394 -12- 2101198 11 - Procédé de traitement d'équipement contaminé par des bactéries pathogènes gram-positives ou gram-négatives dans laquelle on administre une quantité efficace d'un composé de f ormule 5 XH2 10 PC C COOH I NH2 D, L, ou D.L dans laquelle x est 1 ou 2 et y est 1 ou 2. 12 - Procédé selon la revendication 11 dans laquelle 15 les bactéries pathogènes sont Streptococcus. Escherichia. Sta-phylococcus, Salmonella, Pseudomonas, Diplococcus, Klebsiella. Proteus, Mycobacterium, Vibrio, Pasteurella ou Serratia. 15 - Procédé selon la revendication 11, dans laquelle I^éomposé est la 3-fluoro-D-alanine. 20 14 - Procédé selon la revendication 11, dans laquelle le composé est la 3-fluoro-L-alanine. 15 - Procédé selon la revendication 11, dans laquelle le composé est la 3-fluoro-D,L-alanine.