FR 2073366 A1 19711001 FR 7041032 A 19701116 70 ^1032 1 2073366 La présente invention est relative à un procédé pour isoler des particules analogues à des virus (désignées aussi ci-après,particules "virales") à partir de Pénicillium nhi-vRn 5 Dans le brevet britannique N° 1170929 la Demanderesse a décrit l'isolement de nouveaux acides nucléiques antiviraux à partir du mycélium de P. chrysogenum qui est l'organisme utilisé pour la préparation d'un antibiotique, la pénicilline,et qui, en conséquence, est accessible à bon marché et en grandes quantités.La nouvelle sub-10 séance antivirale s'est révélée, d'après sa résistance à la désoxy-ribonucléase et sa lente inactivation par la ribonucléase dans des eonditions physiologiques, ainsi que par ses caractéristiques physiques, comme rapporté dans le brevet précité, être un acide ribonu-cléique à double hélice. Il semble, comme on le verra ci-après, que 15 l'on soit en présence d'acides nucléiques ayant des poids moléculaires différents, la substance ayant un poids moléculaire d'environ 200.000, ou plus, étant la plus active. Par "poids moléculaire", on entend ici le poids moléculaire tel que déterminé par exclusion,dans une solution aqueuse de chlorure de sodium 0,1M , par un gel de dex-20 trane réticulé, par exemple Sephadex G200, qui exclut les globulines à un poids moléculaire minimum de 200.000. Dans le brevet précité, on a décrit l'isolement de la nouvelle substance antivirale par rupture du mycélium et fractionnement, après élimination des débris mycéliens, du contenu cellulaire, éliminant 25 ainsi les protéines et les polysaccharides. La source de la substance antivirale, dans le mycélium, paraît être constituée par certaines particules^virales^qui peuvent être présentes soit à titre âë conta ffliOânts, soit à titre de constituants cellulaires normaux, et toutes les souches connues de P. chrysogenum se sont révélées contenir ces 30 particules, bien qu'il soit possible de traiter les spores ou le mycélium de diverses manières , de sorte que la croissance ultérieure paraisse se poursuivre en l'absence de particules virales. Ces cultures, dans lesquelles les particules^ virales''ont été inactivées, ne semblent pas produire la substance antivirale ayant une activité an-35 tivirale élevée qui est associée avec un poids moléculaire élevé. Dans le procédé antérieur, les stades opératoires utilisés pour fractionner le contenu mycélien ou bien dépouillaient les particules ^virales*de leur enveloppe protéinique, libérant la substance à base 70 41032 2 2073366 d'acide nucléique à double hélice, ou bien isolaient simplement la substance à base d'acide nucléique à double hélice des particules vi-rales"naturellement dépouillées de leur enveloppe (dites, ci-après, dépouillées). La Demanderesse a découvert qu'en rompant les cellules 5 sans dépouiller les particules^virales" on peut séparer ces dernières des acides nucléiques libres à une seule hélice, ainsi que de nombreux autres constituants cellulaires. Après cette séparation, on peut dépuuiller les particules%irales"et séparer les acides ribonu-cléiques à double hélice des protéines et, si nécessaire, des poly-10 saccharides. La présente invention a pour objet un procédé de préparation d'acides ribonucléiques antiviraux à double hélice, à partir de F. chrysogenum, comprenant les stades suivants: (a) culture d'une souche de P. chrysogenum dans ou sur un milieu nutritif approprié, 15 des particules "virales " proliférant ainsi dans ce milieu;(b) rupture des cellules de P. chrysogenum sans enlever l'enveloppe des particules "virales" et séparation de débris cellulaires; (p). séparation partielle ou complète des particules "virales"', >ët des acides nucléiques libres et autres substances dissoutès; (d) élimi-20 nation de l'enveloppe des particules "virales"jet (c )" f^àôti'on- nement pour recueillir l'es acides nucléiques antiviraux à double hélice désirés. En permettant d'éliminer les acides nucléiques indésirables, le nouveau procédé selon l'invention permet d'obtenir une substance 25 ayant une pureté et une activité antivirale accrues. La culture de P.chrysogenum est bien connue et, en fait, la présente invention a pour avantage qu'on peut utiliser, comme matière première, un mycélium usé provenant de l'industrie de la préparation de la pénicilline. Il est préférable d'utiliser une souche Thom de 30 P. chrysogenum, par exemple ÂTGC 9480, 10.238, 10.003, 10.002,11.707 ou 13.799 et, mieux, ATCC 10.002 ou un de ses mutants. La croissance de l'organisme peut s'effectuer de manière classique, par culture superficielle ou submergée, et par des modes opératoires discontinus ou continus» Le milieu nutritif contiendra une 35 source d'azote, par exemple un nitrate, une peptone, de ]' extrait de levure ou de malt, des sels d'ammonium, de la liqueur de macération de maïs, etc.. ainsi qu'une source de carbone et d'énergie, par exemple un hydrate de carbone tel que le glucose, le saccharose, le 70 41032 3 2073366 lactose, le maltose, etc.. ou l'huile de maïs» Normalement, il y aura également présence d'oligo-éléments, par exemple de potassium, de sodium, de magnésium, de fer ferreux, de chlorure ou de phosphate . Yoici des exemples de milieux de culture particulièrement utiles 5 pour culture submergée: Milieu 1 Jh- saccharose 3 nitrate de sodium 0,2 phosphate monopotassique 0,1 10 chlorure de potassium 0,05 sulfate de magnésium 0,05 extrait de levure (Difco) 0,5 sulfate ferreux 0,001 pH ajusté à 6,8 1 5 Milieu 2 maltose 4 peptone 1 extrait de malt (Oxoid) 2,4 pH ajusté à 7,0, à l'aide de NaOH. 20 On peut récolter les cultures lorsqu'elles ont entre 24 et 150 heures. On peut également faire croître l'organisme en culture continue, en utilisant un milieu approprié, par exemple: Milieu 3 tfo 25 acétate de sodium 1 sulfate d'ammonium 0,85 phosphate monopotassique 0,11 liqueur de macération de maïs pour faire 0,0025$N pH ajusté à 6,5 30 plus glucose (stérilisé séparément) 2,2fo plus huile de maïs 0,16$> Il est préférable de récolter les cellules avant rupture ou lyse, pour éviter d'avoir à séparer les éléments nutritifs du produit désiré, et on peut les laver rapidement, par exemple à l'eau 35 distillée ou à l'aide d'une solution saline diluée. On peut ensuite les extraire directement, ou bien les conserver, par exemple sous forme congelée ou sous la forme d'une poudre acétonique, c'est-à-dire d'une poudre obtenue en lavant le mycélium à l'acétone afin de le 70 41032 4 2073366 débarrasser de l'eau; ces poudres acétoniques peuvent être conservées à 4°C sans perte d'activité. La rupture des cellules peut être effectuée, par exemple : par ultra-sons; par homogénéisation mécanique, par exemple par broyage 5 dans un broyeur colloïdal ou par homogénéisation haute pression; par congélation et décongélation; par lyse, en traitant à l'aide d'un agent mouillant aqueux, par exemple un agent mouillant anionique à longue chaîne, par exemple un alcoyl sulfate à longue chaîne tel que le lauryl sulfate de sodium ; par autolyse, par exemple par traite-10 ment à l'aide de milieux aqueux de faible force ionique, par exemple l'eau distillée ou une solution de tampon faible; ou par traitement avec une enzyme lytique, par exemple la trypsine ou la pepsine. Bien V fg que posgédant une enveloppe protéinique, les particules virales sontr en fait, résistantes à l'attaque par les enzymes protéolytiques. 15 Lorsqu'on utilise un agent mouillant pour effectuer la lyse, le contenu cellulaire doit être fractionné avant que les particules^vira-les'^soient dépouillées par l'agent mouillant. Il est avantageux d' induré un agent bactériostatique, par exemple un ester d'acide p-hydroxybenzoïque. Il est préférable d'effectuer ce stade, ainsi que 20 tous les stades du procédé selon l'invention, à basse température, par exemple d'environ 4°C, pour éviter la contamination. La séparation des débris cellulaires doit être effectuée pratiquement sans adso'rption des particulesx virales''sur la substance solide présente. La Demanderesse a découvert que les particules*vira-25 les'sont très sorbables à un. pH inférieur à 5,5, d'où il découle que la séparation des débris cellulaires doit être effectuée à un pH supérieur à 6,0.et, mieux, inférieur à 9,0 (pour éviter la destruction des particules). On peut réaliser les conditions de pH requises, par exemple en 30 ajoutant un alcali ou une solution aqueuse de tampon, par exemple d' un tampon au phosphate ou au tris-(hydroxyméthyl)-amino-méthane, la gamme de pH préférée étant comprise entre 7,5 et 8,5 et, avantageusement, entre 7,8 ét 8,2, le pH préféré étant d'environ 8,0, par exemple. 35 On peut séparer les débris cellulaires du surnageant, par exem ple par filtration ou centrifugation basse vitesse. On peut effectuer la filtration à travers une toile, ou un filtre Millipore, ou sur un lit filtrant, par exemple d'une terre de diatomées telle que la Céli- 70 41032 5 2073366 te ou le kieselguhro \ r ' // Très avantageusement, la séparation des particules virales des acides nucléiques libres et autres substances dissoutes tire parti des propriétés de l'enveloppe protéinique des particules. C'est ain-5 si, par exemple, qu'on peut, après séparation des débris cellulaires traiter la solution à l'aide d'un coagulant des protéines grâce auquel les particules se rassemblent en ..agrégats et peuvent être séparées de la solution, par exemple par filtration ou par centrifuga-tion basse vitesse, à un pH acide, par exemple à 2.000 ou 3.000 g, 10 ou bien, en tirant parti de la sorption élevée des particules à un pH de 4,5 à 5,5, on peut traiter la solution à ce pH à l'aide d'un adsorbant ou la soumettre à une filtration sur membrane et,avantageusement , laver l'adsorbat ou la membrane de filtration au même pH, afin d'éliminer les substances dissoutes. 15 II est préférable que le coagulant des protéines soit un poly- alcoylène glycol et, mieux, un polyéthylène glycol ayant avantageusement un poids moléculaire compris entre 4.000 et 10.000. Une concentration, dans le milieu, de 3 à 5f° pds/vol, avantageusement d'environ 4$, est préférable. La filtration permettant de recueillir les 20 particules rassemblées en agrégats peut être effectuée, par exemple, à l'aide d'un filtre Millipore, ou d'un lit de Célite ou de kieselguhr. Il est préférable d'effectuer l'agrégation en présence d'un électrolyte, par exemple un halogénure de métal alcalin et, par exemple, à une force ionique comprise entre 0,10 et 0,25M et, de îa-25 çon appropriée, de 0,2M. Le pH doit être compris entre 4,5 et 9,0; bien qu'un pH compris entre 4,5 et 5,5 ne soit pas essentiel, ces pH acides sont préférables. On peut centrifuger les agrégats de particules, avantageusement à un pH de 3,5 à 5,5 et, mieux, de 4,5 à 5,0. 30 En l'absence d'un coagulant des protéines, comme indiqué ci- dessus, le pH doit être compris entre 4,5 et 5,5. On peut obtenir ce pH par addition d'acide, par exemple d'un acide minéral tel que 1' acide chlorhydrique, phosphorique ou sulfurique, ou d'un acide organique tel que l'acide acétique ou propionique, ou par addition d'un 35 tampon approprié, par exemple d'un tampon à base de phosphate diacide. L'adsorbant peut être, par exemple, de l'hydroxyde d'aluminium ou un alumino silicate tel que l'alumino silicate de sodium, ou le kieselguhr. 70 41032 6 2073366 Comme exemple d'adsorbant préféré on citera un gel de phosphate d'aluminium. On peut le préparer par le procédé de Fantes (J. Hyg. Camb. 60, 123, 1962). Il est préférable d'utiliser l'adsorbant dans son milieu aqueux initial, sans stade intermédiaire de séchage. Une 5 concentration d'adsorbant de 0,5 à 2,0, par exemple d'environ 1,0 mg/ml est préférable. La force ionique de la solution à adsorber est avantageusement relativement basse, par exemple de moins de 0,1M. On peut déceler la séparation des particules virales de la so— 10 lution à l'aide d'un microscope électronique, ou par des techniques immunologiques, par exemple par précipitation sur gel ou fixation de complément. Lorsqu'on filtre sur membrane, une membrane filtrante à pores relativement fines, telle qu'une membrane Millipore (pores d'environ 15 0,45 ^l), peut retenir les particules par suite de leur agrégation ou de leur adsorption sur la membrane filirante. Le procédé précité, d'adsorption ou d'agrégation, sert à sépa-rer les particules virales de la plupart des acides nucléiques libres et d'une partie importante des polysaccharides cellulaires et 20 des protéines contenues dans les cellules, mais une certaine proportion des protéines cellulaires est adsorbée ou coagulée simultanément. On traite ensuite l'adsorbat, ou la membrane filtrante, ou l'agrégat séparé de particules''virales'/ afin de supprimer l'enveloppe protéinique des particules"Virales'^et on peut également effectuer 25 une séparation plus poussée des protéines et même d'autres substan- Or ces, par exemple des polysaccharides. Les particules virales séparées, préparées par le procédé précité, représentent une source précieuse de substance antivirale pouvant être obtenue à partir de cette source, par le procédé décrit ici» 30 On peut désorber les particules^virales"de l'adsorbant, ou les laver afin de les séparer de la membrane filtrante, à l'aide d'un éluant, à un pH de 7,0 à 9,0 et, mieux, de 7,5 à 8,5, par exemple de 8,0, environ. Pour éluer d'un adsorbant au phosphate d'aluminium ou autre adsorbant similaire, la force ionique de 1'éluant est de préfé-35 rence relativement élevée, par exemple de 0,05M à 1 ,0M, d'environ 0,5M, par exemple. Pour l'élution du kieselguhr et/ou la séparation dess membranes filtrantes par lavage^ on peut utiliser des forces ioniques plus basses, pouvant descendre jusqu'à 0,1M.,0n peut 70 41032 7 2073366 de façon appropriée, obtenir la force ionique élevée à l'aide du tampon ou de l'alcali utilisé pour ajuster le pH; comme exemples de tampons appropriés on citera le phosphate de sodium ou de potassium On peut également utiliser des sels de sodium, de potassium ou d'am-5 monium comme éluants, en particulier les acétates, thiocyanates ou iodures, le pH étant ensuite ajusté à l'aide d'alcali. D'une façon générale, il est préférable que 1'éluant ne précipite pas au cours de la précipitation ultérieure des acides nucléiques à l'aide d'un solvant organique miscible avec l'eau. On peut également utiliser 10 une solution aqueuse de pyridine à 20fo comme éluant. La quantité d' éluant est de préférence aussi basse que possible et, de cette manière, on peut facilement réaliser la concentration de la substance active par rapport à l'eau. D'une façon générale, l'acétate de sodium est le tampon préféri 15 pour élution du kieselguhr ou pour le lavage des membranes filtrantes. Pour 1'élution du phosphate d'aluminium, 1'éluant préféré est le thiocyanate de potassium qui a pour avantage supplémentaire, comme on l'expliquera ci-après, de faire précipiter les protéines indésirables lorsque le milieu est ensuite acidifié , avec relativement \\ // 20 peu de précipitation des particules virales. Il est également possible de dépouiller les particulesvVirales tandis qu'elles sont encore retenues par la membrane filtrante ou 1 adsorbant. Les procédés permettant de dépouiller les particules'vi-rales'sont bien connus et consistent, par exemple: à chauffer, par 25 exemple à une température de 60 à 90°C, de préférence à une force ionique relativement élevée, afin de stabiliser les acides nucléiques antiviraux; à traiter par un agent mouillant, par exemple un alcoyl sulfate à longue chaîne tel que le lauryl sulfate de sodium; ou à traiter par un solvant des protéines, par exemple un hydroxy-30 benzène tel que le phénol; une solution aqueuse de phénol à 80fo donne de particulièrement bons résultats. Après rupture de l'enveloppe il est facile de séparer les acides nucléiques de l'adsorbant ou du filtre et de les fractionner pour éliminer les protéines et autres substances. 35 Lorsqu'on utilise KCNS ou Kl comme éluants, l'acidification ul térieure, par exemple à un pH de 3,0 à 4,0, de préférence de 3,5 environ, précipite un peu de protéine indésirable et améliore l'activité spécifique des acides nucléiques, bien qu'un peu de substance 70 41032 8 2073366 active précipite simultanément. NV ff Que les particules virales soient eluées sans être dépouillées ou qu'un dépouillement ait lieu et qu'il y ait libération d'acide nucléique, il convient particulièrement d'éliminer la protéine asso-5 ciée, par exemple en traitant les solides élués en solution aqueuse par un solvant des protéines à peu près non miscible avec l'eau, par exemple un hydroxybenzène tel que le phénol. Le solvant des protéines formera une phase séparée qui sépare les protéines, laissant les acides nucléiques dépouillés dans la solution aqueuse. Si nécessai-10 re, on peut répéter plusieurs fois ce stade de séparation, en séparant les phases par centrifugation, paT exemple. Il est parfois avantageux d'ajouter un alcoyl sulfate à longue chaîne au phénol pour améliorer le dépouillement. Il est préférable que la solution aqueuse contienne un électrolyte, par exemple un acétate de métal alcalin, 15 et il est préférable que cet électrolyte ne puisse être précipité en solution aqueuse par des solvants organiques miscibles avec l'eau. Il peut être préférable de précipiter les solides élués, par exemple par addition d'un solvant organique miscible avec l'eau, tel qu'un alcanol ou une cétone, par exemple l'éthanol ou, mieux, l'alcool 20 isopropylique, et de redissoudre à une concentration plus élevée, avant de séparer. Comme procédés permettant de séparer les protéines on citera,par exemple: la protéolyse à l'aide de trypsine, de papaïne ou de prona-se; un traitement à l'aide d'agents précipitant ou dénaturant les 25 protéines, par exemple le chloroforme; ou un traitement avec des résines échangeuses d'ions» Après traitement par le solvant des protéines, la phase aqueuse contenant les acides nucléiques antiviraux peut être traitée par un solvant organique miscible avec l'eau, par exemple un alcool tel que 30 le méthanol, l'éthanol, 1'isopropanol, le 2—méthoxyéthanol ou le 2— éthoxyéthanol, ou une cétone telle que l'acétone ou la méthyl éthyl cétone. On peut améliorer la purification par redissolution dans 1' eau et reprécipitation avec une quantité supplémentaire de solvant. Il est avantageux d'extraire le précipité une ou plusieurs fois à 1' 35 aide d'un solvant non misciblè avec l'eau, par exemple l'éther dié-thylique, pour éliminer tout phénol restant. Tout polysaccharide restant après séparation des particulesvNvi-rales''par les procédés ci—dessus peut être séparé à n'importe quel 70 41032 9 2073366 stade, par partage^ entre une solution aqueuse concentrée d'un élec— trolyte et un alcanol approprié qui formera une phase séparée, par exemple le 2-méthox3réthanol. Les polysaccharides se rassemblent dans la couche inférieure et la substance active peut être recueillie à 5 partir de la couche supérieure, par exemple par lyophilisation après dialyse. Comme précédemment indiqué, les acides ribonucléiques à double hélice isolés à partir de P. chrysogenum n'ont pas tous le même poids moléculaire et on peut continuer à fractionner afin d'obtenir 10 une séparation plus poussée. On remarquera que l'acide ribonucléique à double hélice, pur, n'est pas très stable dans l'eau distillée, et toutes les solutions aqueuses contenant la substance pure doivent contenir un électrolyte pour élever la force ionique. C'est ainsi, par exemple, que la substance antivirale isolée, 15 à base d'acides nucléiques, peut être filtrée sur gel. Lorsqu'on utilise un gel qui exclut les molécules sphériques ayant un poids molé- 6 culaire de l'ordre de 15x10 , il y a une fraction majeure qui est exclue et. qui présente un degré très élevé d'activité antivirale. La Demanderesse a découvert, en utilisant une colonne d'un tel gel, 20 qu'on peut isoler trois fractions principales. La Fraction I, qui est éluée la première, est la substance à peu près complètement exclue précitée. La Fraction II possède un poids moléculaire plus bas, mais encore très élevé, et présente également une activité antivirale très élevée lorsqu'on la soumet à des essais. La Fraction III, 25 qui est éluée la dernière, a un poids moléculaire beaucoup plus bas et est bien moins active. Le gel utilisé pour le fractionnement peut, par exemple, être un dextrane réticulé de type Sephadex ou un polyacrylamidé. La Demanderesse préfère utiliser des gels d'agarose, par exemple le Bio-30 Gel A15m fourni par la Société Biorad Laboratories Inc. Il est préférable d'effectuer le fractionnement à une force ionique de 0,015M à 2M, de façon'appropriée de 0,1 à 0,5M, par exemple d'environ 0,15 M. Le pH n'est pas critique, mais il est préférable d'effectuer 1' élution dans une gamme de pH de 6 à 8, et un tampon peut être pré-35 sent. L'électrolyte utilisé pour ajuster la force ionique est de préférence un halogénure de métal alcalin, par exemple un chlorure, ou bien un acétate ou un thiocyanate; il est préférable que l'élec-trolyte ne soit pas précipité en solution aqueuse par les solvants 70 41032 10 2073366 organiques miscibles avec l'eau, pour•faciliter la collecte finale d'acide nucléique relativement exempt d'électrolyte. Après fractionnement, on peut recueillir les acides nucléiques à partir des fractions appropriées réunies, par addition d'un sol-5 vant organique miscible avec l'eau, du type décrit ci-dessus, de préférence l'éthanol, avantageusement après concentration sous vide. Après lavage à l'éthanol, on peut dissoudre les solides précipités dans l'eau distillée, et les dialyser, si nécessaire, pour réduire la concentration en tout électrolyte restant, puis les sécher par 10 congélation. Les fractions I et II (pics I et II) précitées se sont révélées posséder les caractéristiques physiques, biochimiques et biologiques décrites ci-après dans l'exemple 11. La substance brute, à base d'acides nucléiques, après sépara-15 tion des polysaccharides et de la majeure partie de la protéine indésirable, peut être fractionnée pour donner les substances précitées du Pic I et du Pic II, sans filtrer sur gel, technique qui.est parfois difficile à mettre en oeuvre à l'échelle industrielle, par exemple par précipitation fractionnée. C'est ainsi que la substance 20 peut être dissoute dans un milieu aqueux, contenant de préférence un électrolyte pour stabiliser l'acide nucléique, par exemple du chlorure de sodium environ 2M, et qu'on peut ajouter un solvant organique miscible avec l'eau, tout d'abord pour précipiter les substances indésirables, puis, à concentration plus élevée, -pour précipiter 1' 25 acide nucléique du Pic I et,- enfin, à concentration encore plus élevée, pour précipiter l'acide nucléique du Pic II. L'agent de précipitation préféré est l'éthanol. C'est ainsi que, dans le chlorure de sodium aqueux 2M, environ 5 à 10% vol/vol d'éthanol précipitent les. substances indésirables qui peuvent être séparées, par centrifuga-30 tion par exemple. Lorsqu'on ajoute ensuite de l'éthanol jusqu'à 14 à 16%, par exemple à environ 15% vol/vol, on fait précipiter surtout la substance du Pic I et, en redissolvant dans du chlorure de sodium aqueux 2M et en reprécipitant à la même concentration en étha-nol, on peut obtenir une substance contenant environ 95% d'acide nu-35 cléique du Pic I. En ajoutant encore de l'éthanol au surnageant initial, qui contient les acides nucléiques du Pic II, ces derniers précipitent sous forme relativement pure, à une concentration en éthanol de 18 à 22% 70 41032 n 2073366 vol/vol, par exemple d'environ 20% vol/vol. En redissolvant le précipité dans du sérum physiologique et en reprécipitant à environ la même concentration en éthanol, on peut isoler les acides nucléiques du Pic II à une pureté d'environ 95%« 5 II est préférable, dans chaque cas, d'ajouter l'éthanol à tem pérature ambiante, puis de refroidir la solution à basse température, par exemple à environ 4°C, pour obtenir la précipitation. On peut séparer 1'électrolyte des précipités, par dialyse. Ces fractions sont présentes en proportions variables dans la 10 substance isolée par les divers modes opératoires indiqués ci-dessus ou dans le brevet antérieur précité . Par exemple, la nouvelle substance s'est montrée active, dans les cultures tissulaires, contre le virus Semliki Forest, le virus grippal, par exemple A2, le virus para-grippal I, le virus Coxsackie 15 A21, le poliovirus type I Brunenders, le virus de la rubéole, le virus de la fièvre aphteuse, le virus de la maladie de Carré et les Rhinovirus de types IB et 5 qui tous sont des virus de type AR5T, ainsi que contre le virus vaccinal, l'adénovirus SV17, les virus Herpes simiae (virus B) et Herpes simplex, qui sont tous des virus 20 de type ADN. Les cultures tissulaires dans lesquelles la nouvelle substance antivirale fournit, avec succès, une protection, sont des cultures de rein primaire de singe, d'embryon primaire de poussin, de souches cellulaires pulmonaires d'embryons humains, de cellules L de souris et de lignée cellulaire de rein de lapin (Glaxo Labo- 25 ratories Limited). La protection n'est pas couronnée de succès dans une lignée cellulaire de rein de bébé hamster et dans une lignée cellulaire de rein de singe. Des souris auxquelles on avait administré la substance antivirale survécurent 14 jours après agression avec 100 x DL^q de virus Semliki Forest, les animaux témoins mourant 30 le troisième ou le quatrième jour. La substance accroît le temps de survie de souris têtant encore, ayant subi une agression par le virus Coxsackie A21 ou le virus Semliki Forest ainsi que de souris en sevrage ayant subi une agression par le virus Herpes simplex ou Semliki Forest. 35 D'une façon générale, la nouvelle substance antivirale est très efficace en traitement prophylactique, bien que, dans les infections oculaires par Herpes, le traitement post-infectieux se soit avéré particulièrement couronné de succès, et la nouvelle substance est 70 41032 12 2073366 particulièrement intéressante en ophtalmologie. La nouvelle substance antivirale peut être présentée pour l'administration, si on le désire, en association avec un ou plusieurs véhicules ou excipients pharmaceutiques ou autres-agents médicamen-5 teux appropriés, par exemple, pour l'administration par voie orale, topique, rectale, intravaginale ou parentérale. On peut l'utiliser en même temps que d'autres agents médicamenteux, par exemple des agents anti-inflammatoires tels que des stéroïdes, par exemple le 21-phosphate de bêtaméthasone, ou des antibiotiques tels que la té-10 tracycline. Les compositions sont présentées, de façon appropriée, sous forme de doses unitaires, et chaque dose unitaire contient de préférence au moins 1 mg, avantageusement au moins 10 mg, par exemple au moins 50 mg et de préférence pas plus de 500 mg, avantageusement pas plus de 250 mg, par exemple pas plus de 100 mg de substance 15 active. Le véhicule ou l'excipient est, de façon générale, un véhicule ou un excipient solide, un liquide stérile ou un liquide contenant un ou plusieurs agents stabilisants, aromatisants, de mise en suspension, édulcorants, émulsionnants ou conservateurs. Les préparations solides pour la consommation orale sont, habi-20 tuellement présentées sous forme de doses unitaires, par exemple de comprimés, gélules, pastilles, gomme à mâcher et bonbons médicamenteux. Les véhicules classiques, pour ces préparations, peuvent être des sucres, des amidons, des alcools de sucres, la gélatine, la gomme de chiclé, le beurre de cacao, etc.. ainsi que d'autres agents 25 nécessaires dans les mélanges, par exemple des liants, des lubrifiants, des stabilisants, des agents d'enrobage, des agents aromatisants et des colorants. Les compositions peuvent également prendre la forme de préparations orales liquides à ingérer, par exemple de solutions, de suspensions, de sirops, d'élixirs, d'émulsions, de gra-30 nulés pour reconstitution avant utilisation, etc.- qui peuvent contenir des agents de mise en suspension émulsionnants, stabilisants et conservateurs et qui peuvent également contenir des agents édulco-rants, aromatisants' ou colorants acceptables. Les composés peuvent être préparés aux fins d'application locale sur les muqueuses du nez 35 et de la gorge et peuvent prendre la forme de pulvérisations liquides ou d'insufflations pulvérulentes, de gouttes ou pommades pour le nez, de badigeons pour la gorge, de gargarismes ou de préparations similaires. On peut préparer des compositions topiques, pour le trai 70 41032 13 2073366 tement des yeux et des oreilles et pour applications externes, dans des milieux huileux, aqueux ou pulvérulents, sous la forme de préparations ophtalmiques classiques et de collyres, de badigeons pour la peau, de lotions, de crèmes, de pommades, de poudres à saupoudrer, 5 de pansements médicamenteux, de gouttes et lotions pour les yeux, etc.. Les formes aérosol des préparations, pour application locale, peuvent également être avantageuses. Les suppositoires et pessaires peuvent contenir une base classique, par exemple de l'huile de théo-broma, des polyglycols, des bases glyco-gélatineuses, ainsi que des 10 agents tensio-actifs, si nécessaire. Les préparations injectables peuvent prendre la forme de solutions, d'émulsions ou de suspensions aqueuses ou huileuses, ou de solides pour reconstitution a-Vant utilisation. Les véhicules appropriés sont, par exemple :l'eau stérile apyrogène, les huiles, esters huileux ou autres milieux non 15 aqueux, par exemple le propylène glucol, acceptables par voie paren-térales, contenant éventuellement des agents de mise en suspension, dispersants, stabilisants, conservateurs, solubilisants, émulsionnants ou tampon. Les compositions pharmaceutiques selon l'invention contiennent 20 de préférence la substance active à une concentration de 0,1 à 95%, en poids, avantageusement à une concentration de 0,5 à 40%. Les exemples non limitatifs suivants sont donnés à titre d'illustration de l'invention. Toutes les températures sont en degrés Centigrade.Le mycélium de Pénicillium chrysogenum Thom est préparé 25 comme décrit dans le brevet britannique précité. Exemple 1 On broie, entre des meules rotatives en carborundum, un mycélium de Pénicillium chrysogenum, Thom (poids humide: 15 kg), en suspension dans de l'eau alcaline (pH 8)(ou dans un tampon au phosphate 30 dilué)(30 litres). On clarifie le mélange par filtration sur un lit de kieselguhr. On ajoute au filtrat un gel de phosphate d'aluminium (AlPO^) (pour la préparation: voir Fantes, 70 41032 14 2073366 On siphone la majeure partie du surnageant (qui ne contient pas de s1* O \ particules virales observables), on centrifuge le reste de boues d' AlPO^ et on jette le fluide surnageant. On lave le résidu par remise en suspension dans 1,5 litre de sérum physiologique, en agitant, et 5 on sédimente à nouveau par centrifugation. On élue les particules xVirales"de l'adsorbat en mettant le résidu en suspension dans 4,2 litres de thiocyanate de potassium 0,5M, en ajustant le pH à une valeur de 7,5 à 8,0 ( à l'aide de NaOH) et en agitant pendant une heure, ou plus, à température ambiante. 10 On sépare le1 résidu usé d'AlPO^ par c entr if ugation. On divise l'éluat de KSCN en deux parties égales (A et B). (A) On ajoute, à cette solution (2,1 litres), à 4°C, 2,5 volumes d' isopropanol froid, et on recueille le précipité résultant au bout de quelques heures à 4°C. On le met en suspension dans 160 ml d'acétate 15 de Na 0,1M, et on l'extrait en secouant pendant 0,5 heure avec 80 ml de solution aqueuse de phénol à 80%. On sépare les deux phases par centrifugation, on extrait la couche aqueuse encore deux fois par des portions de 80mLde solution aqueuse de phénol à 80%. On la débarrasse ensuite d'un peu de substance insoluble et on ajoute 2,5 volu-20 mes d'éthanol, et on lave le précipité résultant, plusieurs fois, à l'alcool absolu, puis à l'éther; on élimine 1'éther dans un dessic-cateur sous vide. On obtient 163 mg de solide blanchâtre, correspondant à 118 mg d'ARN (acide ribonucléique) (en admettant 25^E^J = 200), soit 15,8 mg d'ARN par kg de mycélium humide. 25 (B) On acidifie l'autre moitié de l-'éluat. (2,1 litres, KSGN 0,5 M), à 4°C, jusqu'à pH 3,5 (avec HCl), ce qui provoque un certain degré de précipitation. On maintient le mélange à 4°C pendant trente minutes, puis on sépare le précipité par centrifugation. On ajuste le pH du fluide surnageant à 7,8 (à l'aide de NaOH), 30 puis on.traite exactement comme (A). On obtient 127 mg de solide blanc, correspondant à 100 mg d'ARN, soit 13,4 mg d'ARN par kg de mycélium humide. On met le précipité à pH 3,5 en suspension dans de l'acétate de Na 0,1M (80 ml) et on ajuste le pH du mélange à 7,8; on ajoute 200 35 ml d'isopropanol et on recueille le précipité résultant, au bout de quelques heures à 4°C. On le remet en suspension dans 120 ml d'acétate de sodium 0,1M et on l'extrait par 3 x 60 ml de phénol aqueux à 80%, comme décrit ci-dessus. On traite à nouveau la phase aqueuse 70 41032 15 2073366 par l'éthanol, et on obtient 40 mg d'un solide foncé, correspondant à 27 mg d'ARN, soit 3,6 mg d'ARN par kg de mycélium humide. 2*57 1 Sur la base de E^ = 200 , les"puretés" de l'ARN obtenu à partir de (A) ainsi qu'à partir du surnageant à pH 3,5 et du préci-5 pi'té à pH 3,5 sont, respectivement, de 73%, 79% et 68%. Il faut se Tendre compte, toutefois, que les substances n'ont pas été séchées de façon très poussée et que les "puretés" réelles sont plus élevées. L'acidification de l'éluat dans KSCN fait précipiter la protéine, les pigments,ainsi qu'une petite proportion de l'ARN. L'ARN ob-^ tenu à partir du surnageant à pH 3,5 a la couleur la plus claire et a la "pureté" la plus élevée. L'ARN provenant du surnageant à pH 3,5 contient la proportion la plus élevée d'ARN à haut poids moléculaire, et celui provenant du précipité à pH 3,5 contient la proportion la plus faible. Dans les deux premières de ces préparations, la pro-15 portion d'ARN de poids moléculaire élevé est bien plus élevée que celle obtenue par le procédé décrit dans le brevet britannique antérieur précité. Ces substances sont également beaucoup plus actives contre le virus Semliki Forest chez la souris. Exemple 2 20 On prépare des adsorbats d'AlPO^ comme à l'exemple 1, adsorbant, à pH5, des portions de 200 ml d'extrait mycélien (=100 g de mycélium humide) sur 20C mg d'AlPO^, et jetant les fluides surnageants. On élue avec succès chacun des adsorbats, considéré isolément, (comme le montre la protection des souris contre le virus Semliki 25 Forest), en opérant comme suit: a) en secouant dans 20 ml de phosphate 0,5M, pH 7,5 b) en secouant dans 20 ml d'acétate de Na 0,1M/ 20 ml de phénol à80% c) en secouant dans 20 ml de pyridine à 20% d) en secouant dans 20 ml de thiocyanate de K 0,5M} pH 8 30 e) en chauffant pendant \ heure à 60° dans l'acétate de Na 0,25Mo On traite ensuite les extraits par dialyse (lorsque c'est nécessaire^ par précipitation à l'alcool, extraction au phénol (sauf (b)), etc.. afin d'obtenir des solutions d'acide nucléique libre pour les essais chez la souris. 35 Dans les échantillons b) et (e), il est vraisemblable que de 1' ARN libre, plutôt que des particules Virales', sont élués des adsorbats . 70 41032 16 2073366 Exemple 3 On centrifuge des extraits mycéliens clarifiés (pH V\ // ^ ^ des particules virales sédimentent; lorsqu'on opère en présence de 6% ou 8% de polyéthylène glycol, toutes les particules sédimentent. La répartition des particules^virales^est déterminée au micros-10 cope électronique. L'ARN de la levure (40 pg/ml) n'est pas sédimenté (10.000 g, 5 minutes) à partir de NaCl 0,2M, en présence de 0,25% à 4% de polyéthylène glycol (comme en témoigne l'absorption UT), montrant que la centrifugation, dans ces conditions, sépare les particules* virales'' 15 des ARN de type ARN de la levure. Exemple 4 On filtre trois échantillons de 10 ml d'extraits mycéliens clarifiés, ajustés à pH 8, pH6 et jjH 5, sur des membranes Millipore (0,45 p.). Les filtrats à pH 6 et pH 8 contiennent, apparemment, tou-20 tes les particules*virales*initiales, et le filtrat à pH 5 pratiquement aucune. L'ARN de la levure, à pH 5, n'est pas retenu par les membranes. Exemple 5 On filtre 50 ml d'extrait mycélien clarifié, ajusté à pH 5 à 1' 25 aide d'acide acétique, sur une membrane Millipore (0,45fO• Il y a // très peu de particules virales dans le filtrat. Le passage ultérieur de 5 ml- de tampon au phosphate ou d'acétate de sodium (0,1M, pH 8) sur la membrane permet de recueillir la totalité des particules%-irales" dans le filtrat (déterminé au mi-30 croscope électronique). Exemple 6 On centrifuge pendant 20 minutes, à 3000 tours/min., des extraits mycéliens clarifiés (portions de 25 ml) contenant du NaCl 0,2 M et 4% de polyéthylène glycol 6000, à pH 7,5 et pH 5. A pH 5, la 35 plupart des particules^Virales^sédimentent; à pH 7,5, seulement quelques—unes, comme estimé au microscope électronique. Exemple 7 On prépare un lit de kieselguhr (5 cm de diamètre x 0,6 cm d' 70 41032 17 2073366 épaisseur), et on le lave avec 250 ml d'acétate de Na 0,01M à pH 5. On fait passer lentement, à travers le lit, des portions de 200 ml d'extrait mycélien clarifié, ajusté à pH 5. Les filtrats ne contiennent pas de particules^virales" 5 Le passage de 2 x 20 ml d'acétate de Na 0,5M (pH 7,8) ou de 6 x 20 ml de phosphate 0,1M (pH 8) élue toutes les particules^virales'/ d'après une estimation faite au microscope électronique. De même, les élutions effectuées à pH 8 à l'aide de tampons à la tris-(hydroxyméthyl)-méthylamine 0,5M, au citrate 0,5M, à 10 l'acétate de Na 0,5M, au phosphate 0,5M ou au phosphate 0,IM sont toutes efficaces. On lave quelques-uns des lits à l'eau, et une certaine proportion de particulesvVirales//est éluée de cette manière. Au contraire, un lavage à l'acétate de Na 0,5M à t>H 5 n'élue pas de particules 15 ^virales* Exemple 8 On filtre des portions de 50 ml d'extraits mycéliens, contenant du NaCl 0,2M 4% de polyéthylène glycol 6000, (à pH 7,5), sur membranes Millipore (0,45 ^i). Dans ces conditions, la plupart des par-20 ticules*virales//sont retenues. Des élutions effectuées avec des portions de 2 x 5 ml de phosphate 0,IM (PH8)ou d'acétate de Na 0,05M donnent apparemment une récupération totale; l'acétate de Na 0,1M paraît moins efficace comme éluant. 25 D'autre part, l'ARN de la levure (40 |Ag/ml^ dans le NaCl 0,2M à pH 5 , avec et sans 4% de polyéthylène glycol 6000, n'est pas retenu par les membranes Millipore (0,45fO, montrant que la filtration sur Millipore, dans les conditions ci-dessus, sépare les par-ticules^virales^des ARN libres de type ARN de la levureô 30. Exemple 9 On met 15 kg de mycélium de Pénicillium chrysogenum, Thom, en suspension dans 36 litres d'eau distillée, et on amène à pH 8,0 à 1' aide d'une solution de NaOH 4N. On ajoute 3,9 litres de tampon au phosphate 0,5M à pH 8,0 et 20 g de Nipastat (mélange d'esters méthy-35 lique, éthylique, propylique et butylique d'acide p-hydroxybenzoï-que) et, après avoir soigneusement mélangé, on traite la suspension dans un broyeur colloïdal, deux fois, à 8000 tours/minute. On'mélange l'extrait avec 0,5 kg de kieselguhr et on filtre sous vide,sur 70 41032 18 2073366 un lit de kieselguhr de 12,7 mm, dans un filtre de 60,96 cm. L'extrait clarifié (42 litres) est rendu 0,2M en chlorure de sodium (500 g). On précipite les particules'Virales^en ajoutant 1,68 kg de polyéthylène glycol 6000, en mélangeant soigneusement pendant 20 mi-5 nutes et en laissant reposer pendant 60 minutes avant d'abaisser le pH à 5,0 à l'aide d'acide acétique cristallisable, puis en laissant reposer pendant encore 60 minutes. On recueille le précipité de par-ticules^Virales^dans une centrifugeuse à 3500 g, et on remet en suspension dans 2,1 litres de solution d'acétate de sodium 0,1M, à pH 10 7,0. On sépare la protéine des particules^virales^en agitant la suspension avec un volume égal (2,1 litres) de phénol, pendant 30 minutes. On sépare les deux phases liquides par centrifugation à 21.00 g pendant 60 minutes, on sépare la phase aqueuse supérieure et on la mélange avec deux volumes d'alcool dénaturé. Après conservation a 15 4°C pendant une nuit, on recueille le précipité d'acide nucléique par centrifugation à 2100 g, pendant 10 minutes. On dissout le solide dans l'eau distillée, on dialyse contre 2 x 100 litres d'eau distillée et, enfin, on lyophilise. Le rendement en produit solide est de 930 mg, dont 593 mg sont de l'acide nucléique (sur la base d'un 20 E^j de 200). Les autres propriétés sont: e| à 258 mjt = 128, à 280 m|a = 73, E^f^ = 2,25, protéine 2,9%, hydrate de carbone 14%. Filtration analytique sur gel On dissout des échantillons de 3 à 5 mg (sur la base d'acide •J nucléique = E^ 200) dans un tampon à l'acétate (2% d'acétate de so— 25 dium trihydraté, 0,2% d'acétate de magnésium tétrahydraté) (0,5 ml). On introduit la solution dans une colonne de 500 ml (650 x 32 mm) de BioG-el Bio~ Rad (A 15m, granulométrie de 0,295 à 0,152 mm) qui a. été mis en équilibre avec un tampon à l'acétate et dégazé. On lave 1' échantillon avec 0,5 ml de tampon et on développe le chromatogramme 30 avec 500 ml de tampon, en 18 à.24 heures. On recueille des fractions de 10 ml de l'effluent de la colonne, et on analyse la teneur en absorption UV à 260 mj Les résultats sont exprimés en pourcentage basé sur l'absorption UV 260 dans le pic divisée par l'absorption UV 260 totale.. 35 Le Pic I est le premier pic majeur UV apparaissant dans l'ef fluent, le Pic II est le deuxième, tandis que le restant est appelé Pic III. Les résultats indiquent 51,3% de Pic I, 27,5% de Pic II et 21,2 70 41032 19 2073366 % de Pic III. Exemple 10. 5 kg de mycélium de Pénicillium chrysogenum, Thom, sont mis en suspension dans 12 litres d'eau distillée et amenés à pH 8,0 à l'ai-5 de d'une solution de NaOH 4N. On mélange la suspension avec 1,3 litre de tampon au phosphate 0,5 M à pH 8,0 et 6,5 g de Nipastat (mélanges d'esters méthylique, éthylique, propylique et butylique d'acide p-hydroxybenzoïque), puis on homogénéise trois fois à 562 kg/cm2 dans un homogéniseur. On mélange l'extrait arec 250 g de kieselguhr 10 et on filtre sous yide sut un lit de kieselguhr de 12,7 mm dans un filtre de 60,96 cm. L'extrait clarifié (12 litres) est rendu 0,2M en chlorure de sodium (144 g). On précipite les particules^vi- rales^en ajoutant 480 g de polyéthylène glycol 6000, en agitant pendant 20 minutes et en laissant reposer pendant 60 minutes avant d' 15 abaisser le pH à 5,0 à l'aide d'acide acétique cristallisable, et en laissant reposer pendant encore 60 minutes. On recueille les parti-culesxvirales''précipitées dans une centrifugeuse à 3500 g, et on les-remet en suspension dans un litre de solution d'acétate de sodium 0,1M à pH 7,0. On sépare la protéine des particulesN>Virales//en agi-20 tant la suspension avec un volume égal de phénol (un litre) pendant 30 minutes. On sépare les deux phases liquides par centrifugation à 2100 g pendant 60 minutes, et on sépare la phase aqueuse supérieure qu'on mélange avec deux volumes d'alcool dénaturé. Après conservation à 4°C pendant une nuit, on recueille le précipité d'acide nu-25 cléique à 4°, par centrifugation à 2100 g, pendant 10 minutes. On dissout le solide dans l'eau distillée, on dialyse contre 2 x 100 litres d'eau distillée et, enfin, on lyophilise. Le rendement en solide est de 1,79 g dont 314 mg sont de l'acide nucléique (sur la ba- 1 1 % 1 •> se de E.j = 200). Les autres propriétés sont: E^ à 258 mp. = 35, E^ à 30 280 mp, = 18, = 2,0, protéine 4%, hydrate de carbone 40%. La filtration sur.gel, comme s. l'exemple 9, indique 51% de Pic I, 47-8% de Pic II et 1,2% de Pie III., Exemple 11 Filtration sur gel d'agarose 35 (1) Un échantillon (100 unités de densité optique à 260 mju ) d' acides nucléiques extraits comme à l'exemple 1(A) est dissous dans 5 ml d'acétate de sodium 0,15M et appliqué sur une colonne d'environ 800 cm3 de perles sphériques d'agarose (Bio-Grel A15m) à 4% entassées 70 41032 20 2073366 dans de l'acétate de sodium 0,15M. On développe la colonne par écoulement ascendant, en utilisant la même solution de sel comme éluant, et on recueille des fractions de 10 ml. On règle l'effluent pour une absorption à 254 mu , et on décèle, de cette manière, trois bandes 5 de substance absorbant l'ultraviolet. Le premier pic (Pic I) élué de la colonne, dans les fractions 30 à 36, est constitué par une substance complètement exclue par le gel; il représente environ 50% de la densité optique totale. Le deuxième pic, (Pic II), se trouve dans les fractions 53 à 61 10 et représente environ 20% de la densité optique. j (2) On dissout 16 mg d'acide nucléique (E^ 164), isolé des particule sNvirales^de Pénicillium chrysogenum , comme décrit à l'exemple 1 (A), et on amène à 10 ml dans Tin système acétate de sodium 0,2M - sel disodique d'acide éthylène diamine tétracétique 0,001M.0n 15 charge l'échantillon sur environ 800 cm3 de Bio-Gel A15M, tassé et traité dans la même solution saline à 20-25°C; on recueille des fractions de 10 ml. On réunit les fractions suivantes; Fractions 30 à 40 116 unités de densité optique = 43% " 41 à 50 22 " " " " = 8% 20 " 51 à 59 87 " " " " = 32% " 60 a 81 46 " " " " = 17% On réunit les fractions 30 à 40 du "Pic I", on les concentre envi-viron au dixième de leur volume initial, on précite avec deux volumes d'éthanol, et on conserve à 5°C; et on ajoute d'autres fractions simi-25 làires, au fur et à mesure qu'on traite d'autres colonnes. De façon similaire, on concentre les fractions 51 à 59 et on les conserve comme source de Pic.II. Préparation de l'échantillon du Pic I On réunit les fractions 30 à 40 de douze préparations similai-30 res, et on les soumet à un fractionnement plus poussé. On charge entre 200 et 300 unités de densité optique, en fractions de 10 ml, sur une colonne d'environ 800 cm3 de Bio-Gel A50m, tassée et traitée dans l'acétate de sodium 0,15$ à 20-25°C. On recueille des fractions de 10 ml, puis on réunit les dix fractions qui sui-35 vent la première élévation de densité optique (fra.ctions 30 à 39), on les concentre et les reprécipite à l'aide de deux volumes d'éthanol. On réunit les fractions 30 a 39 de cinq séparations similaires. On lève le précipité flottant qui se trouve à la surface, à l'aide 70 41032 21 2073366 d'une baguette de Terre, et on le dissout dans un petit "volume d'eau distillée. On le dialyse pendant 18 heures contre 5 litres d'eaudis-tillée contenant 0,5 g d'acétate de sodium trihydraté, on centrifuge à 39.000 x g pendant 60 minutes à 5°C pour clarifier, et on lyophi-5 lise le produit surnageant. Rendement: 45,8 mg , E^J 148. S^q 12,0 £>20 étant la constante de sédimentation, en unités Svedberg, déterminée dans un tampon au phosphate 0,01M (pH7) à très basse concentration en acide nucléique, corrigée à sa valeur dans un solvant 10 ayant la densité et la viscosité de l'eau à 20°C. Une unité de densité optique, telle qu'on l'entend ici, est la quantité d'acide nucléique qui, dissoute dans 1 ml d'acétate de sodium 0,15M, donne une absorbance de 1,0 dans une cellule de 1 cm. Préparation de l'échantillon du Pic II 15 On réunit les fractions précipitées 51 à 59 de neuf séparations similaires sur Bio-Gel A15m, comme décrit sous (2), ron les redissout dans l'acétate de sodium 0,15M, et on utilise la solution ainsi obtenue comme matière première pour quatre séparations sur une colonne de 800 cm3 de Bio-Gel A 1,5m 20 On tasse et traite la colonne dans l'acétate de sodium 0,15M, à 20-25°C, et on recueille des fractions de 10 ml. La densité optique se répartit comme suit: Fractions 32 à 38 14 unités de densité optique " 39 à 46 150 " " " " 25 " 47 à 54 8 " " " " On réunit les fractions 39 à 46, on les concentre et les reprécipite avec deux volumes d'éthanol. On réunit les précipités des quatre colonnes et on les redissout dans un petit volume d'eau distillée, et on les dialyse pendant 18 heures contre 5 litres d'eau dis-30 tillée contenant 0,5 g d'acétate de sodium trihydraté. Puis on centrifuge la solution à 39.000 x g pendant 60 minutes, à 5°C, et on lyophilise la solution surnageante. Rendement: 34 mg. E^j 152. S^q w 7,0 Propriétés des substances du Pic I et du Pic II 35 On prépare les échantillons des acides nucléiques fractionnés comme décrit ci-dessus, et on les soumet aux essais suivants: 1. Résistance à la ribonucléase On dissout les acides nucléiques dans une solution saline nor 70 41032 22 2073366 malisée de citrate (SSC* chlorure de sodium 0,15M, citrate de sodiun 0,15M* pH 7,0) à une concentration donnant une densité optique d'environ 1,0 à 260 mj^ , et on traite avec 0,2 mcg/ml de ribonucléase pancréatique (Boehringer Corporation: qualité pour analyses) à 25°C, 5 pendant une heure» Ni la substance du Pic I, ni la substance du Pic II ne donnent d'accroissement de la densité optique dans ces conditions» Lorsqu'on dilue la solution saline à un dans dix (0,1 x SSC), les conditions étant par ailleurs identiques, l'absorbance optique 10. de l'échantillon du Pic II s'élève rapidement en présence de ribonucléase, et s'élève de plus de 15% en une heure. Dans ces conditions, l'échantillon du Pic I présente également une certain accroissement de densité optique, mais 1'hyperchromie observée dans ce cas n'est que de 9% en une heure. 15 2. Activité biologique des Pics I et II chez la souris Le dosage du taux d'interféron sanguin chez de jeunes souris adultes, à des temps variables après.injection intrapéritonéale des substances des Pics I et II. dans du sérum physiologique, montre des différences entre les temps de titre maximum en interféron, comme 20 indiqué ci-dessous: Pic I: maximum d'interféron sérique 6 à 18 heures après injection (1 mg/kg) Pic II:maximum d'interféron sérique \ à 6 heures après injection (1 mg/kg) 25 On détermine également le temps optimal pour l'injection intra péritonéale des substances du Pic I et du Pic II chez de jeunes souris adultes pour conférer une protection contre le virus Semliki Forest, comme indiqué ci-dessous: Pic I : temps optimal pour l'administration: 12 à 18 heures avant 30 agression par le virus. Pic II : temps optimal pour l'administration: 4 a 6 heures avant agression par le virus. 3. Dénaturation thermique L'effet de la chaleur sur l'absorption ultraviolette d'un acide 35 nucléique, en solution dans des concentrations définies de sel, est caractéristique de l'acide nucléique et déterminé par le degré d'ordre de sa structure secondaire. Lorsqu'on le chauffe dans 1,0 x SSC, 0,1 x SSC ou 0,01 x SSC (défini comme ci-dessus), le Pic I ne présente aucune élévation de 70 kl032 23 2073366 l'absorption au-dessous de 60°C. Dans 0,01 x SSC, la Tm (température requise pour donner la moitié de l'hyperchromie maximale à 259 mp. ) est d'environ 79°C. L'échantillon du Pic II, chauffé dans 0,01 x SSC, ne présente 5 pas d'élévation d'absorbance au-dessous de 50°C et, dans cette solution, la Tm est de 69°C. 4. Comportement à 1'électrophorèse dans un gel de polyacrylamide Les solutions suivantes sont nécessaires pour préparer les gels de polyacrylamide: 10 (a) 10$ d'acrylamide recristallisé et 0,5$ de méthylène bisacrylami-de recristallisé, dans l'eau. (b) Solution tampon: tris(hydroxyméthy])aminométhane 0,2M, acétate de sodium 0,1M, éthylène diamine tétra acétate de sodium 10mM, ajustée à pH 7,8 à l'aide d'acide acétique» 15 (c) N,N,N',N'—tétraméthyléthylènediamine, diluée 1 à 3 vol/vol dans l'eau distillée. (d) Solution aqueuse de persulfate d'ammonium à 1$ pds/vol. Préparation de gels de polyacrylamide à 5$. On mélange et dégaze 10 ml de la solution d'acrylamide, 4 ml de 20 tampon et 4,3 ml d'eau distillée; puis on incorpore 0,1 ml de la solution de tétraméthyléthylènediamine et 1,6 ml de la solution de persulfate d'ammonium, et on transfère rapidement la solution dans des tubes de silice préalablement préparés, de 8 mm de diamètre et 8 cm de long, temporairement scellés à une extrémité. On remplit les 25 tubes jusqu'à une hauteur de 6 cm et on laisse leur contenu polymé-riser après avoir doucement déposé quelques gouttes d'eau sur la surface. Il est préférable de mettre les gels de côté pendant une nuit avant de les utiliser, puis de les pré-traiter pendant deux heures à 5 milliampères par tube. Le tampon de traitement utilisé 30 pour remplir les réservoirs est le même que celui utilisé pour la préparation des gels, mais dilué 1 dans 5 (vol/vol). Après pré-traitement, on vide le tampon qui remplit les tubes et on sèche la surface supérieure des gels avec des bandes de papier filtre. On place des échantillons d'acide nucléique dans une solu-35 tion de saccharose à 20$, de préférence sous la forme d'une goutte unique contenant 25 à 100 mcg d'acide nucléique. On dépose doucement le tampon de traitement sur l'échantillon, et on utilise du tampon frais pour les deux réservoirs. Au bout de 180 minutes de traite 70 41032 24 2073366 ment à 5 milliampères par tube (100 volts) à 25°C, on retire les tubes et on enregistre l'absorption ultraviolette des bandes d'acide nucléique à l'aide d'un appareil Joyce-Loebl Chromoscan. Ou biex^ on extrude les gels des tubes, on les plonge pendant une heure dans 5 de l'acide acétique cristallisable à 7$ (vol/vol), on colore pendant une nuit dans le bleu de méthylène à 0,2% (pds/vol) (tampon à l'acétate 0,4M, pH 4,7), et on décolore en lavant de façon répétée. Dans ces conditions, l'échantillon du Pic I donne line bande apparemment multiple, qui s'est déplacée de 5 à 6 mm à partir de l'ori-10 gine. L'échantillon du pic II présente une bande unique bien définie qui s'est déplacée de 37 à 39 mm à partir de l'origine. Les deux échantillons ne présentent qu'une légère coloration diffuse, à part les bandes principales décrites. Lorsqu'on traite l'échantillon du Pic I dans le même système, 15 mais à 2,5 milliampères par tube pendant 16 heures, à 5°C, la coloration du gel par le bleu de méthylène révèle une forte double bande à 15-16 mm de l'origine, ainsi qu'une bande unique plus faible, en retard d'environ 1 mmi. 5. Caractéristiques du Pic I et du Pic II à la filtration sur gel Gel utilisé comme milieu de filtration Solution saline Température °C Volume nécessaire pour éluer la fraction (en pourcentage par rapport au volume total de la colonne) Pic I Pic II Bio-Gel A 1,5m Acétate de sodium 20 à 25 Exclu 48 à 58 0,15 M Bio-Gel A5m Acétate de sodium 0,2M 20 à 25 40 à 52 56 à 67 -EDTA 0,001M . Bio-Gel A15m Acétate de sodium 0,2M 20 à 25 39 à 50 62 à 75 -EDTA 0,001M Bio-Gel A15m Acétate de sodium 0,1 5M 20 à 25 38 à 49 61 à 72 Bio-Gel A50m Acétate de sodium 0,15M 20 à 25 41 à 54 Les caractéristiques d'élution rapportées sont celles obtenues 40 par la Demanderesse en utilisant divers milieux de filtration sous 70 41032 25, 2073366 forme de gels,accessibles dans le commerce» Comme des différences notables peuvent se produire entre des lots différents de ces substances, les volumes d'élution donnés dans le tableau doivent être considérés comme indicatifs du degré de retard à prévoir, plutôt 5 que comme des propriétés absolues reproductibles. D'une façon générale, plus la force ionique est élevée plus le degré de retard est élevé, mais cet effet est moins net avec les acides nucléiques à double hélice qu'avec les acides nucléiques à une seule hélice. 10 Le Bio-Gel A est un gel d'agarose, le nombre en suffixe indi quant le poids moléculaire minimum de globuline exclu par lui en unités 10^. C'est ainsi, par exemple, que le Bio-Gel A15m exclut une g globuline ayant un poids moléculaire de 15 x 10 . 6. Analyse des bases 15 Les analyses des bases, après hydrolyse suivant le procédé de Smith et Markham (Bio. J. 1950, 46, 509), et la chromâtographie sur papier suivant ¥yatt (Bio.J. 1951, 48, 584), se présentent comme suit: Pic I : Guanine-25,0 +1,0 (26,2) Adénine 25,0 + 1,0 (24,2) 20 Cytosine 25,0 + 1,0 (24,8) Uracile 25,0 + 1,0 (24,9) Pic II: Guanine 18,0 +1,0 (18,7) Adénine 32,0 +1,0 (31,4) Cytosine 18,0 + 1,0 (17,7) Uracile 32,0 + 1,0 (32,3) Les valeurs entre parenthèses sont celles pour une seule estimation et ne sont pas corrigées pour les pertes en cours d'hydroly-25 se, les résultats étant exprimés en moles de base pour 100 moles recueillies » 7. Constantes de sédimentation Les valeurs de ^q.^. , qui sont une indication du poids moléculaire des acides nucléiques, varient dans les gammes suivantes, dé-30 pendant, en partie, du degré auquel de petites quantités d'acides nucléiques dégradés sont présentes: Pic I 11,7 à 12,3 ; Pic II 6,7 à 7,3 Exemple 12 Libération de particules^virales^à partir de mycélium de Pénicillium chrysogenum, Thom 35 (a) On traite par les ultra-sons, pendant 8 minutes, 15 g de mycélium en suspension dans 45 ml d'eau à pff 8,0. On filtre la suspension sur un lit de kieselguhr de 6,35 mm et on dose la teneur en particules*virales^du surnageant. Résultat: 25,6 unités/ml. 70 41032 26 2073366 (b) On broie un échantillon de mycélium pendant 10 minutes, à l'aide d'un broyeur verre/verre, avec trois volumes d'eau à pH 8,0. Après filtration sur un lit de kieselguhr de 6,35 mm on titre la teneur en particulesvVirales''du surnageant. Résultat: 25,6 unités/ml. 5 (c) On met 1,0 kg de mycélium en suspension dans 2 litres d'eau à pH 8,0 et on rend 0,05M en un tampon-au 'phosphate;:.à "pH/6,0. ,0ri. traite la suspension dans un homogéniseur pendant 5 minutes avec une tête coupante, et pendant 25 minutes avec une tête à écoulement axial. On filtre la suspension sur un lit de kieselguhr de 6,35 mm et on 10 dose la teneur en particules^virales* Résultat: 4,8 unités/ml. (d) On lave 2,0 kg de mycélium avec 4,0 litres d'eau, pendant une heure. On filtre la suspension sur un lit de kieselguhr, et on dose la teneur en particules^virales? Résultat: 0,3 unité/ml. (e) On met 1,0 kg de mycélium en suspension dans 2,0 litres d'eau et 15 on rend 0,05fi en: un tampon au phosphate à pH 8,0. On traite lasus- pension dans un broyeur colloïdal de 7,62 cm pendant 30 minutes, puis on filtre sur kieselguhr et on dose la teneur en particules'" viral esdu surnageant. Résultat: 12,8 unités/ml. (f) On traite, dans un homogéniseur à pression, à 562 kg/cm2, 5 kg 20 de mycélium en suspension dans 13 litres dé tampon au phosphate 0,05 M à pH 8,0. On filtre la suspension sur un lit de kieselguhr et on dose la teneur en particules*virales^du surnageant. Résultat: 12,8 unités/ml. Par "unités" on entend, dans cet exemple, le nombre de fois 25 que l'échantillon peut être dilué de manière à pouvoir tout juste ê-tre distingué sous la forme d'une.ligne de précipitine dans un essai de diffusion sur gel. On utilise des lots différents de mycélium dans les différents procédés et, en conséquence, les rendements indiqués en particules^virales^ne peuvent être comparés entre eux. 30 Exemple 13 On dissout, dans 80 ml d'eau distillée, 1,39 g d'acide nucléi-*| que mycophage brut (E^ à 259 nm 64), obtenu comme décrit à l'exemple 10, mais contenant environ 450 mg d'acide nucléique, et on ajoute, à la solution, 80 ml de phosphate dipotassique 2,5M, 80 ml de 2-mé-35 thoxyéthanol et 4 ml d'acide phosphorique à 33$ vol/vol. Après avoir soigneusement secoué, on centrifuge le mélange à 25°C pendant 20 minutes, à 2100 g, et on sépare la phase supérieure à la fois de la phase inférieure et du précipité à 1'interphase. On ajoute 120 ml d' 70 41032 27 2073366 éthanol à la phase supérieure séparée et, après avoir mélangé, on sépare les acides nucléiques précipités (à 1'interphase) en centrifugeant pendant 20 minutes à 2100 g. On sépare les phases supérieure et inférieure du précipité qu'on dissout ensuite dans l'eau distil-5 lée et qu'on dialyse contre de l'eau distillée jusqu'à ce qu'il soit exempt d'une contamination trop importante par les sels. Rendement: 0,40 g. E^ 170 à 259 nm Exemple 14 On dissout, dans 300 ml d'eau distillée, 1,8 g d'acide nucléi— 10 que (E^ 172 et dont on estime qu'il contient 52$ de Pic I et 36$ de Pic II) obtenu par le procédé décrit à l'exemple 13. Toutes les solutions étant à environ 25°C, on ajoute 300 ml de solution de chlorure de sodium 4M, puis 60 ml d'éthanol, et on mélange bien la solution qu'on conserve à 4°C pendant 18 heures, avant de centrifuger 15 (35.000 g) pendant une heure à 5°C. On jette la petite pastille. On laisse le surnageant décanté atteindre la température ambiante (environ 25°C) avant d'ajouter encore 45 ml d'éthanol. Il ne se produit pas de précipitation permanente à 25°C, mais, en refroidissant à 5° pendant 18 heures, il se forme un lourd précipité semblable à un gel 20 qu'on sépare par centrifugation pendant une heure à 35.000 g et 5°. La substance précipitée est principalement constituée par de l'acide nucléique du Pic I. En redissolvant le précipité dans l'eau distillée, en chassant toutes traces d'éthanol sous vide et en ajustant à 2M de chlorure de sodium avant d'ajouter 17,5$ de son volume d' 25 éthanol, le précipité, séparé comme précédemment, contient 95$ de Pic I, comme déterminé par filtration sur gel. On dissout le précipité dans l'eau distillée et on le dialyse, afin qu'il n'y ait pas trop forte contamination par Ies„sèls. Rendement: 0,80 g. E^j 167 à 259 nm. 30 On recueille les acides nucléiques provenant des surnageants des précipités enrichis du Pic I, par précipitation avec un volume égal d'éthanol. On dissout le précipité dans l'éthanol, on chasse toute trace d'éthanol sous vide, et on ajuste le volume à 100 ml. Après avoir ajouté 100 ml de solution de chlorure de sodium 4M, la 35 solution étant à température ambiante, on ajoute 35 ml d'éthanol, on centrifuge le précipité qui se sépare au bout de 18 heures de repos à 4° (35.000 g, une heure, 5°), et on le jette. On chauffe la solution surnageante jusqu'à 25° et on ajoute encore 15 ml d'étha- 70 41032 28 2073366 nol. Au bou"t de plus de 18 heures de repos à 4°C, on centrifuge le précipité (35.000 g, une heure, 5°), on dissout les pastilles dans l'eau distillée et on les dialyse jusqu'à ce qu'elles soient à peu près exemptes de contamination par le sel. On estime, par filtra- 5 tion sur gel, que le produit contient 96% de Pic II. Il contient moins de 1% de substance du Pic I. 1 , Rendement: 0,37 g. 173 a 259 nm. 70 41032 29 2073366 REVENDICATIONS 1- Procédé de préparation d'acides ribonucléiques anti-viraux, à double hélice, à partir de P. chrysogenum, caractérisé en ce que (a) on cultive une souche de P. chrysogenum dans ou sur un milieu nutritif approprié, des particules analogues à des virus prolifé- 5 rant ainsi dans celui-ci, (b) on rompt les cellules de P.chrysogenum sans séparer l'enveloppe des particules analogues à des virus et on élimine les débris cellulaires, (c) on sépare partiellement ou complètement les particules analogues à des virus des acides nucléiques libres et autres substances dissoutes, (d) on dépouille les 10 particules analogues à des virus de leur enveloppe et (e) on fractionne afin de recueillir les acides ribonucléiques antiviraux à double hélice désirés. 2- Un procédé suivant la revendication I, caractérisé en ce que le P. chrysogenum est de la souche Thom. 15 3- Un procédé suivant la revendication I, caractérisé en ce qu'on rompt les cellules par des ultra-sons, par homogénéisation mécanique, par congélation et décongélation, par lyse en traitant avec un agent mouillant aqueux, par autolyse ou par traitement avec une enzyme protéolytique. 20 4- Un procédé suivant la revendication 3, caractérisé en ce qu'on effectue la lyse en traitant les cellules par du lauryl sulfate de sodium. 5- Un procédé suivant la revendication I, caractérisé en ce qu'on élimine les débris cellulaires à un pH supérieur à 6,0 et 25 inférieur à 9>0- 6- Un procédé suivant la revendication I, caractérisé en ce qu'on sépare les particules analogues à des virus par agrégation desdites particules, après séparation des débris cellulaires, à l'aide d'un coagulant des protéines. 30 7- Un procédé suivant la revendication 6, caractérisé en ce que le coagulant des protéines est un polyacoylène glycol. 8- Un procédé suivant la revendication 6, caractérisé en ce que l'agrégation est effectuée à un pH de 4,5 à 9,0. 9- Un procédé suivant la revendication 6, caractérisé en ce que 35 l'on effectue l'agrégation en présence d'un halogénurede métal alcalin à une force ionique comprise entre 0,10 et 0,25M. 10- Un procédé suivant la revendication 6, caractérisé en ce qu'on récolte les particules agrégées par centrifugation à faible vitesse à un pH de 3,5 à 5*5• 70 41032 30 2073366 II- Un procédé suivant la revendication 6,caractérisé en ce qu'on sépare les particules agrégées par filtration sur une membrane filtrante ou sur un lit de terre de diatomées ou de kieselguhr à un pH de 4,5 à 5,5-5 12- Un procédé suivant la renvendication I, caractérisé en ce qu'après élimination des débris cellulaires, les particules analogues à des virus sont adsorbées sur un adsorbant ou soumises à une filtration sur membranes, à un pH de 4,5 à 5.5- 13- Un procédé suivant la revendication 12, caractérisé en ce 10 que l'adsorbant est un gel de phosphate d'aluminium. 14- Un procédé suivant la revendication 12, caractérisé en ce que les particules analogues à des virus sont désorbées de l'adsor- . bant ou séparées de la membrane filtrante par lavage, à l'aide d'un éluant dans la gamme de pH de 7,0 à 9,0. 15 15- Un procédé suivant la revendication 14, caractérisé en ce que 1'éluant pour l'élution des particules analogues à des virus d'un adsorbant à l'aluminium a une force ionique de 0,05M à I,0M. 16- Un procédé suivant la revendication I, caractérisé en ce qu'on dépouille les particules analogues à des virus de leur envelop- 20 pe avant ou après séparation de la membrane filtrante ou de l'adsorbant . 17- Un procédé suivant la revendication 16, caractérisé en ce qu'on effectue le dépouillement par chauffage, par traitement avec un agent mouillant ou par traitement avec un solvant des protéines. 25 18- Un procédé suivant la renvendication 17, caractérisé en ce qu'on chauffe à 60-90°C; à une force ionique suffisante pour stabiliser les acides nucléiques. 19- Un procédé suivant la revendication 17, caractérisé en ce que l'agent mouillant est un alcoyl sulfate à longue chaîne. 30 20- Un procédé suivant la revendication 17, caractérisé en ce que le solvant des protéines est un hydrosybenzène. 21- Un procédé suivant la revendication 12, caractérisé en ce que les particules analogues à des virus sont éluées d'un adsorbant ou d'une membrane filtrante à l'aide d'une solution d'iodure ou de 35 thiocyanate et sont ensuite acidifiées à pH 3,0 à 4,0, afin de précipiter les protéines indésirables. 22- Un procédé suivant la revendication I, caractérisé en qu' après dépouillement de l'enveloppé des particules analogues à des virus la protéine associée est séparée par partage des particules en 70 41032 31 2073366 solution aqueuse à l'aide d'une phase séparée de solvant liquide des protéines. 23- Un procédé suivant la revendication I, caractérisé en ce que les substance indésirables sont séparées par précipitation frac- 5 tionnée des acides nucléiques. 24- Un procédé suivant la revendication 23, caractérisé en ce que la précipitation fractionnée est effectuée en ajoutant du métha-nol, de l'éthanol, de 1'isopropanol, du 2-méthoxyéthanol, du 2-éthoxyéthanol, de l'acétone ou de la méthyl éthyl cétone. 10 25- Un procédé suivant la revendication I, caractérisé en ce que tout polysaccharide résiduel est séparé de la substance à base d'acide nucléique par partage entre une solution aqueuse et un al-canol qui forme une phase séparée. 26- Un procédé suivant la revendication 25, caractérisé en ce 15 que l'alcanol est le 2-méthoxyéthanol. 27- Un procédé suivant la revendication I, caractérisé en ce que la substance séparée, à base d'acide nucléique, est ensuite purifiée par filtration sur gel. 28- Un procédé suivant la revendication 27, caractérisé en ce 20 que le gel est un dextrane réticulé ou un polyacrylamide. 29- Un procédé suivant la revendication 27, caractérisé en ce qu'on effectue la filtration sur gel à une force ionique comprise entre 0,0I5M et 2M. 30- Un procédé suivant l'une quelconque des revendications pré-25 cédentes, caractérisé en ce que l'on effectue un fractionnement afin d'obtenir les acides nucléiques identifiés ici comme acides nucléiques du Pic I et/ou du Pic II, ledit fractionnement étant effectué par précipitation fractionée dans une solution aqueuse, à l'aide d'un solvant organique miscible avec l'eau. 30 31- Un procédé suivant la revendication 30, caractérisé en ce que le solvant est l'éthanol. 32- Un procédé suivant la revendication 30, caractérisé en ce qu'on mélange la solution aqueuse contenant les acides nucléiques du Pic I et du Pic II avec l'éthanol, de manière à obtenir une concen- 35 tration en éthanol comprise entre 14 et 16# vol/vol afin de précipiter les acides nucléiques du Picl. 33- Un procédé suivant la revendication 32, caractérisé en ce qu'après séparation des acides nucléiques du Pic I précipités,on mélange la solution avec une quantité supplémentaire d'éthanol afin 70 41032 32 2073366 d'obtenir une concentration en éthanol de 18 à 22# vol/vol afin de précipiter les acides nucléiques du Pic II. 34- Un procédé suivant la revendication 30, caractérisé en ce qu'on ajoute l'éthanol à température ambiante et on sépare le pré- 5 cipité à basse température. 35- Un procédé suivant la revendication 30, caractérisé en ce qu'on ajoute tout d'abord l'éthanol jusqu'à obtention d'une concentration d'environ 5 à 10# vol/vol, afin de précipiter les substances indésirables qu'on sépare avant de précipiter les acides nucléiques 10 du Pic I. 36- Un acide nucléique du Pic I dérivant de Pénicillium chrysogenum et ayant les caractéristiques suivantes : S20 = 11,7 àI2,3 (constante de sédimentation en unités Svedberg). Analyse des bases: Guanine 25,0$ +1,0 Adénine 25,0# +1,0 15 et Moles % Cytosine 25,0# +1,0 Uracile 25,0# + 1,0# Structure d'acide ribonucléique à double hélice Activité antivirale chez les mammifères. 37- Un acide nucléique du Pic II dérivant de Pénicillium chrysogenum et ayant les caractéristiques suivantes : 20 S2q w= de 6,7 à 7,3(constante de sédimentation en unités Svedberg). Analyse des bases: Guanine 18,0 + 1,0 Adénine 32,0 + 1,0 Cytosine 18,0#^ 1,0 Uracile 32,0# + 1,0. Structure d'acide ribonucléique à double hélice Activité antivirale chez les mammifères. 25 38- Une composition pharmaceutique caractérisée en ce qu'elle contient des acides nucléiques du Pic I et/ou du Pic II suivant la revendication 36 ou 37, associés à un ou plusieurs véhicules ou excipients pharmaceutiques et/ou autres agents médicamenteux. 39- Une composition suivant la revendication 38, caractérisée 30 en ce que chaque dose unitaire contient de I à 500 mg d'acide nucléique du Pie I et/ou du Pic II.