FR 2100930 A1 19720324 FR 7126145 A 19710716 71 26145 1 2100930 L'invention a pour objet un nouvel antibiotique, qui sera désigné par la suite sous le nom de "Proticine™, ainsi qu'un procédé permettant de le préparer, de l'isoler et de le purifier. 5 On obtient le .nouvel antibiotique par culture de Bacillus licheniformis var. mesenterieus FK-G-439 (souche conservée par American Type Culture Collection, Washington û.C., sous le tî° ATCC 21552), provenant d'un échantillon de sol isolé en Norvège. 10, On peut cultiver le bacille, ainsi que ses variantes et ses mutants, selon les procédés couramment utilisés en microbiologie, aussi bien en surface dans des tubes à gélose penchés qu'en immersion dans des erlenmeyers ou des fermenteurs en mettant en jeu des milieux nutritifs solides ou liquides 15 couramment utilisés pour la culture des micro-organismes. Ces milieux nutritifs solides ou liquides contiennent, en plus de sels minéraux et organiques, de l'amidon, du sucre de canne, de la mélasse ou du glucose, en tant que sources de carbone, et de la farine de soja, de la liqueur de macération du maïs, des 2o extraits de levure, des peptones, des nitrates ou des sels d'ammonium, en tant que sources d'azote. En dehors de ces solutions nutritives complexes, on peut aussi utiliser des solutions nutritives synthétiques, qui contiennent par exemple de la glycérine, de la glycine, du chlorure de sodium, de 1' 25 hydrogënophosphate de potassium et du sulfate de magnésium. En plus des procédés de culture qui viennent d'être indiqués, on peut également opérer en continu (cf.par exemple lîethods in Microbiology, Vol. 2, Academic Press London New-York, 1970, pages 259 - 323) . Dans les systèmes de ce genre, on peut 30 maintenir plus longtemps le bacille en équilibre hydrodynamique sans qu'il n'apparaisse de mutations spontanées ou d'autres manifestations ae dégénérescence. On isole, de la manière qui va être décrite, à partir des substances produites par Bacillus licheniformis var. mesen-35tericus, l'antibiotique désigné sous le nom de "proticine". Dans la description suivante de la bactérie, on considère à la fois les caractères morphologiques et les caractéristiques métaboliques et physiologiques. Du point de 71 26145 2 2100930 vue taxonomigue, la bactérie appartient à la famille des Bacillacées, groupe morphologique 1 du genre ûacillus ; on peut le considérer comme une variante de Bacillus licheniformis var. mesentericus. 5 Dans les tableaux 1 et 2 qui suivent sont indiquées les caractéristiques morphologiques et physiologiques du bacille ATCC 21552. Dans ces tableaux : - le signe + signifie que la substar.ee nutritive est utilisée 10 ou que le caractère est présent- - le signe - signifie que la sul3fcr.ee nutritive n'est pas utilisée ou que le caractère n'est pas présent. - le signe - signifie que l'utilisation de la substance nutritive ou la présence du caractère existent dans des conditions 15 particulières. 71 26145 3 2100930 Tableau 1 Substance nutritive Tableau 2 Caractéristiques organique + + Avec une source d'azote Fructose Arabinose Mannose Raffinose Mannitoi Amidon Glycérine Maltose Lactose Xylose Glucose Sorbitol Galactose Salicine Insuline Saccharose Rhamnose. Dulcitol Avec une source d'azote Glucose Dimensions des spores 0,5 x 1,0 Dimensions des bacille ,0 x6,0 + + Saccharose + Glycérine + Arabinose + Xylose + Mannite + Lactose + Rhamnose + Sorbitol + + Coloration du Grain + Mobilité + Formation d'un mucus - + Gëlatinase + + Protéase + + Amylase + + Lipase + + Catalase + + Urêase + Cytochromoxydase - + Phënylalanine-desaminase - + Lysinedecarboxylase + Lécithinase + + Glucose-oxjdase + Phosphatase + + Cellulase _ Hémolyse _ minérale Croissance dans une solution â 3 % de HaCl + + Croissance dans une sol ution à 9 % de NaCl Croissance à 40°C + Croissance S 50°C Réaction â 1'indole - Réaction de Voges-Proskauer+ Réaction au rouge de méthyle- Production de H2S + Réduction de NOg + Citrate comme source de carbone + Formation de pigments Croissance en anaérobiose + Besoins en vitamines Croissance dans le glucose. 4,9 - 7,2 71 26145 4 2100930 Le procédé de préparation de l'antibiotique dénommé "proticine" ou des sels que donnent cette substance avec une base acceptable du point de vue physiologique est carctê-risé en ce que l'on cultive les germes appartenant à des 5 souches de Bacillus licheniformis var. mesentericus (ATCC 21552) produisant cet antibiotique sur une solution nutritive aqueuse contenant une source de carbone, une source d'azote, des sels nutritifs et des oligo-éléments, â une-température comprise entre 20 et 40°, jusqu'à ce que la solution nutritive contienne 10 des quantités importantes de protiœine, puis on extrait la proticine de la culture et on la met éventuellement sous la forme d'un sel à l'aide d'une base physiologiquement acceptable. Les sels nutritifs contiennent en particulier du sodium, du potassium, du magnésium, du calcium, du phosphore et du soufre. 15 Parmi les oligo-éléments, le fer et le manganèse sont particulièrement importants. Il y a avantage à effectuer la culture à grande échelle en submersion dans la solution nutritive. On préfère des températures comprises entre 28 et 30° C. Il est avantageux de réaliser la culture dans des conditions 20 d'aérobiose. Quand on opère dans des conditions d'anaérobiose, on obtient des rendements plus faibles. Au cours de la culture, le pu du milieu nutritif passe de la neutralité à une légère acidité ; en général, il n'est pas nécessaire d'ajouter une solution tampon. Il y a 25 intérêt à terminer la culture au bout de 2 à 4 jours, car à ce moment on obtient un excellent rendement. A ce moment la solution nutritive contient une quantité importante de proticine. Pour isoler la proticine, on peut extraire la culture 30 du bacille ainsi obtenue sous forme de suspension aqueuse, soit avec un solvant organique polaire non miscible à l'eau, tel que l'acétate d'éthyle, soit avec un alcool, lequel a ■ avantageusement 4 ou 5 atomes de carbone. Le solvant organique, qui contient l'antibiotique, est séparé de la suspension aqueuse, 35 par exemple par centrifugation. Néanmoins, il est également possible de soumettre d'abord la culture à une filtratton ou une centrifugation. Dans ce cas, une quantité importante de 1'antibiotique reste dans la masse cellulaire. Il y a intérêt à extraire 40 celle-ci avec un solvant miscible à l'eau, par exemple l'acétone 71 26145 5 2100930 ou avec un alcool aliphatique â bas poids moléculaire. Du liquide aqueux obtenu par filtration ou centrifugation on extrait 1'antibiotique avec les solvants polaires non miscibles à l'eau qui ont été indiqués plus haut. 5 II est également possible de précipiter l'anti biotique dans le liquide aqueux séparé? par addition d'une solution contenant les ions appropriés. A cette fin conviennent des cations ayant une valence supérieure i 1, par exemple les ions du calcium et du baryum» mais également des cations 10 monovalents, comme des cations d'argent, avec lesquels la proticine donne des précipités très peu solubles dans l'eau. On sépare le produit qui a précipité par filtration ou par centrifugation. On remet l'antibiotique en solution par fixation du cation utilisé pour la précipitation, par exemple en fixant 15 le cation sur un complexant, tel qu'un éthylëne-diaminé tétra-acétate, ou en reprécipitant avec des anions, comme l'ion sulfate, pour lesquels le cation en question présente une plus grande affinité que pour l'antibiotique. A partir d'une solution aqueuse ainsi préparée, on isole l'antibiotique 20 par extraction, de la manière décrite plus haut. On concentre les extraits organiques ainsi obtenus.Il est bon de précipiter l'antibiotique par addition d'un solvant non-polaire ; des produits convenant très bien à cette fin sont en particulier des hydrocarbures tels que 25 l'éther de pétrole ou le cyclohexane. On peut effectuer la purification du produit brut ainsi obtenu par chromatographie, en utilisant un agent d'absorption approprié, par exemple des acides saliciques polymères ou l'alumine. On élue l'antibiotique au moyen de 30 solvants polaires ou de mélanges de tels solvants, par exemple des mélanges de chloroforme et de méthanol. Quand on élue a l'aide de solvants organiques une désactivation partielle de l'adsorbant, par exemple par addition d'eau ou d'une solution tamponnée de phoaphate, peut se révéler avantageuse 35 pour éviter des pettes de substance Par contre, si l'on opère avec des mélanges de solvants contenant des composants organiques, comme des mélanges constitués d'eau et d'ammoniaque ou bien d'une aminé à bas poids moléculaires, par exemple un mélange d'isopropanol, 40 d'eau et d'ammoniaque, l'agent adsorbant retient l'antibiotique 71 26145 6 2100930 , tandis que les impuretés sont êluées. On élue ensuite l'antibiotique purifié â l'aide d'un mélange de solvants dont la polarité peut être à peu prës la même ou bien légèrement inférieure/ mais qui, par contre, ne comporte pas de fraction 5 basique, ou tout au plus une fraction extrêmement faible. On peut citer à ce sujet des mélanges d'isopropanol et d'eau. On obtient ainsi le sel de la proticine avec la base utilisée dans chaque cas. On peut aussi effectuer la purification de 10 l'antibiotique par passage sur un tarais moléculaire, mais également par chromatographie sur gel, par exemple, sur des dextrannes "Sephadex", ou bien à l'aide d'une séparation â contre-courant ou encore en utilisant des échangeurs d'ions. Si cela est nécessaire, on peut répéter ou combiner les procédés de 15 purification de la proticine qui viennent d'être décrits. Lorsqu'on utilise les procédés de séparation indiqués, l'évaluation de l'activité antibiotique se fait pas exemple au moyen d'un test Rediffusion sur gélose selon lequel on inhibe la croissance d'Escherichia coli ou de Proteus vulgaris. 20 on peut évaluer la pureté de l'antibiotique par chromatographie en couche mince sur du gel de silice avec des mélanges de solvants polaires (cf. Egon Stahl "Dûnnschicht- Chromatographie", Berlin, Heidelberg, New York, 1967, pages 7 à 23). On peut utiliser par exemple lorsqu'on emploie des plaques 25 de gel de silice G, les mélanges suivants : a) Chloroforme-méthanol-eau, dans des rapports volumiques de .65 : 25 : 4, ou b} isopropanol-eau-hydroxyde d'ammonium binormal, dans des rapports volumiques de 85 : 14 : 1 30 La proticine pure est une substance incolore soluble dans le chloroforme, le tétrahydrofuranne, l'acétone, l'acétate d'éthyle, les alcools inférieurs, la pyridine et l'eau. Elle est très peu soluble dans les solvants non-polaires, comme l'êther de pétrole, le cyclohexane ou le tétra-chlorure de 35 carbone. L'acidification fait précipiter la proticine de ses solutions aqueuses. La proticine donne des réactions colorées 71 26145 7 21.00930 avec le mélange acide chloro-sulfonique acide acétique glacial, avec la solution de Liebermann-Burchardr avec le chlorure d'antimoine (III), avec le permanganate ée potassium, et avec un mélange de molybdate d'ammonium et d'acide perchlorique, mais 5 ne donne pas de réaction colorée avec le chlorure de fer (III}, l'acide dinitrosalicylique, le chlorure de tétraphënyltétrazolium, la ninhydrine, ainsi qu'avec les réactifs de Morgan-Elson, Sakaguchi, Ehrlich, Dragendorff et Pauly. 10 La proticine est constituée de carbone, d'hydrogène d'oxygène et de phosphore. On admet, comme formule brute du sel sodique, CgjH^O^PNa, ce qui correspond à 63,9 % deC, 7,6 % de H 19,2 % d'O, 5,4 % de P et à 3,9 % de Na. A l'analyse, on trouve 63,8 % de C, 7,8 % de H, 19,8 % d'O, 4,4 % de P et 3,2 % de Na. 15 Un fait qu'il convient de noter est l'abscence d'asote, de soufre et d'halogènes. Jusqu'à présent, on ne connaissait pas d'antibiotique contenant du phosphore mais ne contenant pas d'azote, en dehors de la phosphonomycine (D. Hendlin et Coll., Science 166, (1969), 122 - 123*. La.proticine se différencie 20 de la phosphonomycine, entre autres, par son spectre dans l'ultraviolet. La proticine absorbe fortement la lumière ultraviolette ; la courbe d'absorption est représentée par la figure 1. Des maximums caractéristiques de la proticine se 25 trouvent à 284, 272,5, 264 (peu marqué) et 235 nanomètres. Le spectre dans 1'infra-rouge est représenté par la figure 2, il présente des bandes d'absorption à 3400, 3080 2920, 2820 1725, 1640, 1445, 1370, 1160, 985, 890 et 750 cm""1 Le Rf mesuré par chromatographie en couche mince 30 sur du gel de silice G, avec un mélange de chloroforme et de méthanol dans un rapport 3:2 est égal â 0,38. Le pouvoir rotatoire est égal à -78° (concen tration = 0,35 dans de l'éthanol). Dans l'électrophorèse sous haute tension, la proticine migre comme un acide. On trait caractéristique de la proticine est l'élimination d'acide phosphorique, laquelle se produit même dans des conditions de faible acidité. Le reste de la molécule est instable et peut subir des transformations même lors de la récupération. Les produits de dégradation organiques 40 peuvent être utilisés pour caractériser l'antibiotique. Tous 71 26145 a 2100930 les produits de dégradation présentent en commun certaines propriétés physiques : les spectres dans l'ultra-violet montrent des maximums d'absorption à 235, 264, 272,5 et 284 n^nomètres, tandis que la spectrographie de masse indique une forte 5 densité d'ions pour les masses suivantes s 41, 43, 55, 67, 79, 81, 91, 93, 105, 107, 125, 231, 365, 444 et 462. La proticine inhibe la croissance de divers 10 germes Gram positifs et Gram négatifs ; ainsi que de myco-bactéries. Dans le tableau suivant sont rassemblées quelques concentrations inhibitrices minimums, déterminées par des épreuves de dilution en série : Proteus mirabilis 0,4 ug/ml 15 Escherichia coli 12 ug/ml Salmonella typhimurium 3 vg/ml Shigella flexneri 3 yg/ml Streptococcus haemolyticus 0,4 yg/ml Staphylococcus aureus P 209 50 yg/ml 20 Mycobacterium tuberculosis vi g/ml H 37 RV 5 5 ug/ml La proticine est peu toxique. Des souris supportent sans dommages visibles une injection de 100 mg/kg par voie intraveineuse ou de 1000 mg/kg par voie sous-cutanée. • I Culture du bacille Exemple 1 30 On ensemence Bacillus licheniformis var. mesente- ricus FH-G-439 (ATCC 21552) sur dès tubes de gélose en couche penchée. Le milieu nutritif présente la composition suivante : 8 % d ' aihidon 35 0,5 % d'éthanol 1 % de citrate dé sodium 0,5 % de glucose traces de MgS04 71 26145 9 2100930 traces de CaCl2 0,01 % de FeSO^ 1,0 % de (NH^HPOjj 1,8 % de gélose 5 pH : avant stérilisation : 7 après stérilisation : 6,8 On maintient pendant 3 à 1 jours, à une température de 28 °, les tubes ensemencés. On met ensuite les corps bactériens en suspension dans 10 ml d'un soluté physiologique . 10 de NaCl. On repique la suspension de corps cellulaires contenus dans 5 de ces tubes dans un erlenmeyer d'une capacité de 1000 ml lequel contient 250 ml de la solution nutritive suivante : 0,75 % d *amidon soluble 0,5 % de gruau de soja 15 0,5 % de liqueur de macération du maïs 0,05 % de résidus de distillation secs 0,005 % de trypticase 1,0 % de peptone de caséine 1,0 % d 'amidon 20 0,25 % de NaCl On agite mécaniquement cet erlenmeyer à raison de 220 t/mn pendant 1 jour, à 28 °. On ensemence ensuite 5 autres erlenmeyers, contenant la même solution nutritive en quantité équivalente, à l'aide de 50 ml provenant de 25 la culture obtenue dans le premier erlenmeyer. Ces 5 erlenmeyers contiennent la culture principale. On les agite 2 à 3 jours, sur une secoueuse à raison, de 200 t/mn, à la température de 28 °. Chaque jour, on prélève un échantillon dans des 30 conditions de stérilité et on évalue l'activité antibiotique de la solution de culture contre divers micro-organismes par l'épreuve de diffusion en gélose. A cette fin, on utilise les épreuvesde la lamelle et des perforations. On emploie comme germes d1épreuveEscherichia coli et Proteus vulgaris. 35 Des zones d'inhibition qui sont de 25 mm contre Escherichia coli et de 37 mm contre Proteus montrent les activités antibiotiques maximales, ce qui correspond â une concentration de 98 mg de substance pure par litre. Lorsque, dans cette épreuve, on a mesuré ces activités maximales, on arrête HO la culture (d'une façon générale, au bout de 50 à 60 heures), 71 26145 10 2100930 puis on opère de la façon décrite ci-dessous : Exemple 2 On ensemence Bacillus licheniformis var. mesente-5 ricus (ATCC 21552) sur des tubes de gélose en couche penchée contenant le milieu nutritif suivant : 0,1 % d'extrait de levure 0,1 % d'extrait de malt 1>0 % de loess 10 0,1 % d'extrait de viande 2,5 % de peptonè de caséine 0,01 % de trypticase 0,5 % de glucose 1,8 % de gélose 15 0,01 % d'huile de soja 0,5 % de liqueur de macération de mais 1,0 % de CaCOg 1,0 % de sucre de canne 1,0 % de farine de soja 20 1,0 % d'amidon On complète avec de l'eau à 1000 ml le pH est égal à 6,8. On maintient ces tubes pendant 3 jours à la tempé- rature de 28 °. On les conserve ensuite pendant 5 jours à la 25 température ambiante, de sorte que la plus grande partie des bactéries se sont mises sous la forme de latence (spores). On met ces spores en suspension dans 10 ml d'un soluté physiologique de HaCl. On repique la suspension de spores dans un récipient d'une capacité de 1000 ml, contenant 250 ml du milieu nutritif 30 indiqué plus haut, mais qui ne contient pas de gélose. Pour 2 récipients on utilise 5 tubes, ce qui correspond donc pour chaque récipient â 50 ml de suspension de spores. On agite mécaniquement les primo-cultures ainsi obtenues à raison de 220t/mn pendant 2 jours à la température de 28°.On introduit ensuite dans un 35 fermenteUr * d'une capacité de 30 litres muni d'un agitateur, d'un tube d'amenée d'air et d'accessoires pour le prélèvement d'échantillons, avec addition d'agents anti-mousses, 10 litres de la solution nutritive suivante : 4 % d'amidon 0,4 % de liqueur de macération du maïs H0 1,0 % de glucose . 0,8 % de (NH4)2HP0^ 71 26145 2100930 0,4 % de farine de so3a 1,0 % de peptone de caséine eau distillée jusqu'à 10 litres pH : 7,2 3 7,4 on stérilise pendant 45 minutes, à la température 5 de 121° et sous une pression de 1 atomosphère relative. On a ajouté au contenu du fermenteur 0,1 % de polypropylène-glycol, à titre d'agent anti-mousse. Comme produits bactériens on utilise 500 ml de la primo-culture décrite plus'haut. On fait fermenter pendant 48 heures, à la température de 10 20 °, en faisant passer 500 litres d'air/heure. On suit le déroulement de la fermentation par prélèvement d'échantillons, dans des conditions de stérilité, et on détermine l'activité antibiotique de la manière décrite à l'exemple 1. Une fois la fermentation tetminée, la concentration de l'antibiotique 15 est de 111 mg/litre ; le pH est compris entre 6,7 et 7,0. Exemple 3 On cultive la souche B. licheniformis var. mesente-ricus (ATCC 21552) dans un tube de gélose en couche penchée, 20 dont le milieu a la même composition qu'à l'exemple 2. On transfère, dans des conditions de stérilité, la suspension de spores ainsi obtenue dans 5 erlenmeyers d'une capacité de 1000ml, contenant chacun 250 ml de la solution nutritive qui a été indiquée à l'exemple 2 pour la culture principale. 25 On laisse les produits bactériens sur une secoueuse pendant 2 jours, à la température de 28 °, et'avec une vitesse de rotation de 220 t/mn, puis on les introduit dans un fermenteur, ayant un volume total de 100 litres et un volume opérationnel de 50 litres, contenant la solution nutritive indiquée à 30 l'exemple 2 pour la culture principale. On stérilise le fermenteur,sous agitation, pendant 40 minutes, à la température de 121° et sous une pression de 1 atmosphère relative,on l'ensemence avec 500 ml de produits bactériens, puis on l'agite pendant 60 heuresr à une température 35 de 30 ° et à raison de 150 t/mn. On introduit, par heure, 3000 litres d'air. A titre d'agent anti-mousse, on ajoute 0,1 % de polypropylëne-glycol. On surveille le déroulement de la fermentation en effectuant des prélèvements, et on évalue le résultat de la manière décrite à l'exemple 1. Quand on interrompt la fermentation, le pH est égal à 6,6 ? on obtient 40 104 mg de proticine/litre de liquide de culture. 71 26145 12 2100930 II Isolement de la proticine Exemple 4 On réunit les solutions obtenues par fermentation 5 conformément à l'exemple 1 (1 litre au total), et on centrifuge le tout. On sépare le surnageant aqueux, qui contient la plus grande partie de 1* antibiotique. Pour récupérer une quantité supplémentaire du produit, on verse sur la fraction restante, constituée de corps bactériens et de milieu nutritif 10 non dissous, 3 fois sa quantité de méthanol, puis on agite pendant : une heure . On centrifuge ensuite de nouveau. On rejette les composantes non-dissoutes, on élimine sous pression réduite la plus grande partie du méthanol contenu dans le surnageant méthanolique limpide, puis on ajoute 15 le concentré ainsi obtenu à la solution de culture centrifugée. On agite â deux reprises les solutions réunies avec, à chaque fois, 500 ml de butanol. On rejette la phase aqueuse, on réunit les extraits butanoliques, puis on concentre, sous pression réduite, jusqu'à un volume d'environ 10 ml. Si l'on 20 précipite avec de l'ëther de pétrole (domaine d'ébullition: 40 à 60° C), il se forme un dépôt pulvérent, de couleur brun gris. On obtient 1,6 g du produit sec, qui présente une activité égale à 56 pg de substance pure/mg. On purifie le produit par chromatographie sur 25 colonne, au moyen d'un gel de silice imprégné d'un tampon à base de phosphate. On prépare l'adsorbant en ajoutant 1 litre d'une solution tamponnée à base de phosphate (NaH2P04 et WajP04)0,4 N , ayant un pH égal à 6,7, à 1 kg de sel de silice ayant une granularitë de 0,05 S 0,2 mm. 30 On agite le mélange et on le sèche pendant 2 jours à la tempéra' -ture de 110°. On ajoute ensuite 50 ml d'eau et on secoue pendant 2 heures. On met en suspension 50 g de l'adsorbant ainsi obtenu, avec du chloroforme, dans une colonne de verre ayant un diamètre intérieur de 2,5 cm. On dissout le produit 35 de la précipitation dans 5 S 10 ml de chloroforme, éventuelle_ ment avec addition d'un peu de méthanol, et on.: l'amène dans la colonne. On élimine alors de la colonne les impuretés par lavage à trois reprises, avec â chaque fois 200 ml de mélanges de chloroforme et de méthanol dans des rapports en volume qui 40 sont respectivement de 9 :1, 3 s 2 et 7 :3, On élue ensuite 71 26145 13 2100930 l'antibiotique grâce à un mélange de chloroforme et de méthanol (6 : 4 en volume. On réunit les fractions ayant une activité contre Proteus vulgaris. Elles contiennent 341 mg de substance solide, dissoute, présentant une activité de 220yg 5 de proticine par mg de substance sèche. La purification complémentaire de l'antibiotique s'effectue par chromatographie sur gel. Pour cela, on fait gonfler 36 g de "Sephadex LH20 " dans un mélange S parties en volume égales de chloroforme et de méthanol, et on introduit 10 le tout dans une colonne de verre longue de 30 cm et ayant un diamètre intérieur de 2, 5 cm. On dissout ensuite 320 mg de la substance indiquée plus haut dans un mélange de chloroforme et de méthanol, on la fait passer sur la colonne et on l'élue. On utilise comme éluant' un mélange à parties 15 égales de chloroforme et de méthanol. On évalue l'activité antibiotique des diverses fractions (10 ml chacune), puis on réunit et concentre celles qui sont actives. On obtient 98 mg d'un antibiotique brut ayant une activité spécifique de 694-Kg/mg« On répète la chromatographie sur gel avec une 20 colonne longue de 2 m et ayant une capacité de 1 litre. Après avoir garni la colonne avec 95 mg d'antibiotique brut, on recueille des fractions de 10 ml chacune. La plus grande partie de la proticine se trouve dans les fractions 193 à 206. A partir des tubes 198 à 206, on obtient 28 mg de proticine pure, ayant 25 un pouvoir rotatoire /a /de - 78°. Exemple 5 : A la solution de fermentation obtenue de la manière décrite à l'exemple 2 (9,1 1 ayant une teneur de 106 mg de substance pure par litre) on ajoute 3 1 de butanol et 3 1 30 d'acétate d'éthyle, puis on agite le tout pendant 30 mn. Ensuite on centrifuge, on sépare la phase organique et on concentre jusqu'à 20 ml sous pression réduite. On rejette la phase aqueuse et 3a boue. A l'aide de 0,2ld'ether de pétrole, on précipite l'antibiotique brut contenu dans le concentré de la phase 35 organique. On obtient 12 g d'une poudre contenant 66 ug de substance pure par mg. On met 500 g de gel de silice (granu-laiité : de 0,05 à 0,2 mm) en suspension dans un mélange d'isopropanol, d ' eau et d'ammoniaque 2 N( parties en volume 90: S:1*) et on introduit le .tout dans une colonne de verre 40 (diamètre intérieur : 5 cm, longueur : 50 cm). 71 26145 îu 2100930 On dissout la poudre qui a précipité dans 50ml du même mélange de solvants et on la fait passer sur la colonne. On lave la colonne avec un jnélange d'isopropanol, d'eau et d'ammoniaque 2N (parties en volume 90:6:4) jusqu'à ce que 5 l'éluat soit à peu près incolore pour cela il faut environ 6 1. du mélange de solvants ; on rejette les solutions de lavage ainsi obtenues. On élue ensuite l'antibiotique avec un mélange d'isopropanol et d'eau (parties en volume 9:1) ; on recueille l'éluat en fractions de 100 ml chacune 10 dont on évalue l'activité antibiotique. On réunit les fractions contenant plus de 0,1 mg d'antibiotique par ml et on et élimine le solvant sous pression réduite. La fraction restante, amorphe, de couleur jaune clair, contient le sel d'ammonium de la proticine. Le rendement est de 1,1 g , avec 15 une activité spécifique de 443 pg /mg. Une purification complémentaire sur "Sephadex LH20", effectuée de la manière décrite à l'exemple 4, fournit l'antibiotique pur sous la forme de son sel d'ammonium. Exemple 6 20 Conformément à l'exemple 4 ou 5 , on extrait, concentre et précipite 441 de la solution de fermentation obtenue conformément à l'exemple 3. On fait couler 1, 5 1 d'eau sur la poudre ainsi obtenue (58 g ; 63 pg de substance pure par mg), puis on neutralise avec précaution à l'aide de NaOH 2N. Il se forme une solution limpide, de couleur brun, sombre à laquelle on ajoute, tout en agitant, 100 ml d'une solution • binormale de chlorure de baryum. Au bout de 15 minutes on centrifuge. L'antibiotique se retrouve dans le précipité sous la forme de son sel de baryum. On rejette le surnageant de 30 couleur sombre. On met en suspension le produit qui a précipité â l'aide d'eau à laquelle ona.ajouté un peu de chlorure de baryum et on centrifuge de nouveau. On sépare par décantation l'eau de lavage et on agite le précipité dans 400 ml d'une solution à 5 % de sulfate de sodium. Le précipité volumineux 35 passe alors progressivement en solution, tandis qu'il précipite des sulfate de baryum à grains fins. Au bout d'une heure on extrait à deux reprises avec 250 ml de n-butanol. On rejette le résidu aqueux, on réunit les solutions organiques, on lave avec un peu d'eau distillée et on concentre sous pression 40 réduite, à une température de 30 à 40 °. Il reste 11 g 71 26145 is 21.00930 d'une mousse visqueuse, de couleur sombre, qui a une activité de 277 y g de prot4cine/ml. A partir de celui-ci on prépare la protécine pure selon le procédé décrit à l'exemple 4 ovr 5 71 26145 16 2100930 REVENDICATIONS 1. Procédé de préparation de l'antibiotique "Protéine" ou de l'un des sels qu'il forme avec des bases acceptables du point de vue physiologique, procédé caractérisé en ce que 5 l'on cultive des germes produisant cet antibiotique et appartenant à la souche Bacillus licheniformis var. mesentericus au moyeft d'une solution nutritive aqueuse contenant une source de carbone, une source d'azote, des sels nutritifs et des oligo-éléments à une température allant de 20 à 40°C, 10 jusqu'à ce que le milieu nutritif aqueux contienne des quantités importantes de proticine, puis on extrait la proticine du milieu de culture et on la transforme éventuellement en un sel à l'aide d'une base acceptable du point de vue physiologique. 15 2. Procédé selon la revendication 1, caractérisé par le fait que la culture est effectuée dans des conditions d'aérobiose. 3.Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 et 2 caractérisé en ce que l'on cultive les germes en 20 submersion dans la solution nutritive. H. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 2, caractérisé en ce que l^on extrait la proticine de la culture à l'aide d'un solvant organique polaire non-miscible à l'eau. 25 5. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 3 caractérisé en ce que l'on extrait la proticine des produits bactériens à l'aide d'un solvant organique miscible à l'eau. 6. Procédé selon l'une quelconque des revendications 30 1 à -3, caractérisé en ce que l'on extrait la proticine de la solution nutritive à l'aide d'un solvant organique polaire non-miscible à l'eau. 7. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, caractérisé en ce que l'on purifie la proticine par 3.5 chromatographie. 8. Procédé selon 1'une quelconque des revendications 1 à 3, caractérisé en ce que l'on purifie la proticine par chromatographie sur un acide silicique, sur du gel de silice et /ou sur des dextrannes. *»0 9. L'antibiotique "Proticine" ainsi que les sels 71 26145 17 2100930 qu'il donne avec des bases acceptables du point de vue physiologique, produits caractérisés par les proptiétés suivantes formule brute du sel sodique : C31Hi+4°7PNa C % H% 0 % P % Na % 5 calculé 63,9 7,6 19,2 5,4 3,9 trouvé 63,8 7,8 19,8 4,4 3,2 - le spectre dans l'ultra-violet présente des maximums à 284, 272,5, 264 et 235 nanomètres ; - le spectre dans l'infrarouge présente des bandes d'absorp-10 tion à 34-00, 3080, 2920, 2820, 1725, 1640, 1445, 1370, 1160, 985, 890 et 750 cm"1. - réactions colorées avec un mélange d'acide chlorosulfonique et d'acide acétique glacial, avec la solution de Liebermann-Burchard, avec le chlorure d'antimoine (III), avec le 15 permanganate de potassium et avec un mélange de molybdate d'ammonium et d'acide perchlorique ; - solubilité dans le chloroforme, le tétrahydrofuranne l'acétone, l'acétate d'éthyle, les alcools à bas poids moléculaire, la pyridine et l'eau. 20 10. Agent de lutte contre les bactéries, Gram- positifs et Gram-négatifs, ainsi que contre les mycobactéries, agent caractérisé en ce qu'il contient l'antibiotique "Proticine" ou l'un des sels qu'il forme avec des bases acceptables du point de vue physiologique, tels que spécifiés dans la 25 revendication 9, en mélange avec un véhicule ou un solvant approprié du point de vue pharmaceutique.