FR 2065725 A1 19710806 FR 7035697 A 19701002 70 35697 i 2065725 " La présente invention concerne un procédé de production d*acide citrique et d'acide isocitrique, ainsi que de celules microbiennes. Plus particulièrement, elle concerne un procédé de production d'acide citrique, d'acide isocitrique et de corps 5 de cellules de micro-prganismes par fermentation,, Plus particulièrement encore, l'invention concerne un tel procédé de fermentation utilisant des micro-organismes assimilant les hydrocarbures. Des tentatives en vue de l'obtention de divers produits 10 de micro-organismes en utilisant des hydrocarbures comme source principale de carbone ont fait l'objet de beaucoup d'attention récemment et il y a eu de nombreux rapports dans la documentation technique pub2 _ée concernant la production de cellules microbiennes, comprenant des corps de cellules de levures, des ami.no-15 acides, des acides nucléiques, des acides organiques, des sucres, des enzymes, des vitamines, etc... En ce qui concerne la production d'acide citrique, parmi les acides organiques, des procédés basés sur l'utilisation de bactéries, l'utilisation de moisissures et l'utilisation de 20 levures ont été mis au point dans la technique antérieure. Toutefois, ces procédés ne sont pas satisfaisants pour la production d'acide citrique parce que les rendements de production sont bas, les temps de culture sont prolongés et le produit est obtenu quelquefois sous la forme d'un mélange avec l'acide isocitrique, 25 qui est difficile à séparer de l'acide citrique*. En ce qui concerne la production de corps de cellules de micro-organismes, des procédés perfectionnés pour l'obtention de rendements élevés en cellules microbiennes à partir d'hydrocarbures ont été mis au point avec pour conséquence une réduction 30 du coût de production» Toutefois, comme la plupart des cellules microbiennes sont utilisées pour l'alimentation animale, il est nécessaire et souhaitable d'abaisser encore le coût de production. Par ailleurs, la formation de cellules microbiennes à partir d'hydrocarbures s'effectue par des réactions compliquées dans 35 le corps vivant. On a trouvé très utile de récupérer et d'utiliser les substances intéressantes dans l'étape de métabolisme dans ces réactions afin d'utiliser efficacement les ressources en matières premières» Toutefois, dans un tel cas, le but principal est de 70 35697 2 2065725 produire uniquement des corps de cellules et par conséquent il est naturel que seulement une petite quantité de sous-produits soit formée dans la liqueur de culture. De plus, comme la production des cellules microbiennes est effectuée sur une échelle 5 de production en masse, il est nécessaire de traiter une très grande quantité de bouilloni Par conséquent, la récupération des sous-produits en provenance de la liqueur de culture est limitée seulement à la récupération de produits facilement récupérable so A ce propos, l'acide citrique a une faible solubilité 10 et, s'il est présent sous la forme du sel de calcium, il est sensiblement insoluble dans l'eau chaude; Par conséquent, il est très facile de recueillir l'acide citrique de ces bouillons» lies procédés de production d'acide citrique mentionnés ci-dessus, comportant l'utilisation de bactéries, l'utilisation 15 de moisissures ou l'utilisation de levures, visent seulement à la production d'acide citrique, l'acide citrique étant formé en conduisant le développement des cellules microbiennes d'une manière appropriée, par exemple par l'addition d'un agent inhibiteur du métabolisme, limitation de la quantité d'azote ou 20 réglage d'une autre source nutritive et donc en provoquant une certaine déviation du métabolisme0 Au contraire, quand des cellules microbiennes sont produites à partir d'hydrocarbures selon les techniques normales, on utilise les sources nutritives en quantités nécessaires et suffisantes pour la formation des 25 cellules microbiennes, avec le résultat qu'une très petite quantité seulement des substances intermédiaires du métabolisme s'accumule dans la liqueur de culture et on ne détecte pas du tout ou presque pas d'acide citrique. En utilisant ces critères, la demanderesse a cherché 30 des moyens d'accumuler et de produire de l'acide citrique et de l'acide isocitrique par fermentation, tout en produisant aussi des quantités notables de cellules microbiennes» En effectuant ces études, on a découvert aussi un procédé perfectionné pour la production d'acide citrique et d'acide isocitrique par 35 fermentation. l'un des buts de la présente invention est donc de fournir un procédé perfectionné de production d'acide citrique et d'acide isocitrique qui remédie aux inconvénients et aux 70 35697 3 2065725 insuffisances des procédés de la technique antérieure Un autre but de la présente invention est de fournir un procédé pour la production de quantités considérables d'acide citrique en même temps que de cellules microbiennes par fermen-5 tation, ce procédé pouvant être mis en oeuvre d'une manière efficace et relativement simple,» Un autre but de l'invention est de fournir un procédé pour la production d'acide citrique, d'acide isocitrique et/ou de cellules microbiennes par fermentation susceptible d'être 10 mis en oeuvre avantageusement sur une échelle industrielle à peu de frais pour donner un rendement élevé en produit. Un autre but encore de l'invention est de fournir de l'acide citrique, de l'acide isocitrique et/ou des corps de cellules de micro-organismes» 15 D'autres buts et avantages de l'invention résulteront encore de la description ci-après et des revendications annexées. Selon la présente invention, on a trouvé que quand on essayait de produire des cellules microbiennes à partir d'hydrocarbures, une quantité considérable d'acide citrique 20 s'accumulait dans la liqueur de culture par addition d'un alcool au milieu, sans altération du rendement de production des cellules microbiennes à partir des hydrocarbures. On a découvert, de plus, que la teneur en protéines des cellules microbiennes ainsi obtenues était légèrement accrue par rapport au cas où 25 on utilisait seulement des hydrocarbures comme source de carbone. D'autres études ont montré que certains additifs au milieu nutritif ont un effet important sur l'accumulation et la production d'acide citrique et d'acide isocitrique dans la liqueur de culture0 En utilisant des additifs appropriés, l'iso-30 lement et le recueil du produit acide citrique ou acide isocitrique peuvent être rendus beaucoup plus simples. Afin de détecter les produits chimiques ayant un effet sur le développement ou l'accroissement de la productivité en acide citrique, en utilisant un micro-organisme assimilant les hydrocarbures 35 et des hydrocarbures comme source principale de carbone, la demanderesse a effectué des études poussées concernant divers agents inhibiteurs d'aconitase, des agents de chélation pour métaux, des alcools, des agents tensio-actifs, des agents 70 35697 4 2065725 désionisants, des fluorures, etc... et elle a trouvé que le ferrocyanure de potassium et l'acide monofluoro-aeétique ont un effet remarquable. Par conséquent, on a trouvé que le rendement en acide isocitrique est grandement accru par l'addition 5 de ferrocyanure de potassium au milieu, tandis que le rendement en acide citrique est considérablement accru par l'addition d'acide monofluoro-aeétique au milieu, l'addition de ces composés aux milieux non seulement a un effet sur la production et l'accumulation d'acide isocitrique et d'acide citrique, mais encore 10 a un effet considérable sur la variation du rapport de formation de ces acides organiques par l'accroissement de leurs productivités. Pour discuter plus en détail ce dernier mode de mise en oeuvre de l'invention, l'addition au milieu d'une quan-15 tité efficace allant jusqu'à environ 5 f» en poids de ferrocyanure de potassium fournit les avantages indiqués ci-dessus0 La quantité d'acide monofluoro-aeétique à ajouter au milieu est comprise entre une quantité efficace et jusqu'à environ 20 mM. Toutefois, il est difficile de donner des indications précises 20 sur la concentration à utiliser car les quantités varieront suivant le micro-organisme particulier utilisé et les conditions de fermentation. De plus, les concentrations peuvent varier en fonction du moment de l'addition<> Bien que les additifs puissent être ajoutés au milieu nutritif en une seule fois ou d'une 25 manière intermittente, le moment optimal pour l'addition se trouve durant les stades relativement initiaux de la culture, les meilleurs résultats étant obtenus habituellement entre 0 et 24 heures de culture. Le fait que la productivité en acide citrique est 30 accrue par l'addition de ferrocyanure de potassium au milieu est nouveau dans la technique et on pense qu'il constitue une façon extrêmement avantageuse de produire l'acide citrique ainsi que l'acide isocitrique, qui sont des produits intermédiaires importants de métabolisme,, 35 Bien que la formation et 11 accumulation d'acide ci trique en utilisant l'acide monofluoro-aeétique comme additif dans le milieu aient été rapportées dans la technique antérieure, on mettait en oeuvre le procédé en utilisant une matière du 70 35697 5 2065725 type saccharine comme source de carbone. On A'a pas utilisé ce procédé avec un micro-organisme assimilant les hydrocarbures. La présente invention est la première à décrire 1*addition d'acide monofluoro-acétique à un milieu nutritif pour obtenir des 5 quantités considérables d'acide citrique, rendant possible la mise en oeuvre du procédé de l'invention sur une échelle industrielle. Le plus, la technique de culture est grandement simplifiée selon l'invention par le fait que l'acide monofluoro-actique peut être ajouté au milieu dès le début de la culture. 10 En particulier, quand on utilise des hydrocarbures comme source de carbone, on pense qu'une action douce d'activité d'aconitase est nécessaire et ainsi il semble que l'effet du ferrocyanure de potassium ou ie l'acide monofluoro-aeétique soit si particulier qu'il ne peut pas être expliqué simplement 15 uniquement d'après la fonction qui a été rapportée antérieurement dans la documentation technique publiée. Pourtant, en utilisant ces additifs, la présente invention fournit un procédé de production d'acide citrique et d'acide isocitrique qui peut être mis en oeuvre industriellement. 20 A propos du premier mode de mise en oeuvre de l'inven tion, dans lequel on produit de l'acide et des cellules microbiennes par fermentation en utilisant un alcool comme additif dans le milieu, on a trouvé que les alcools en général peuvent' être utilisés à cet effet. Toutefois; des alcools ayant de 1 25 à 20 atomes de carbone sont particulièrement efficaces et les alcools préférés à utiliser sont des alcools saturés ayant de 1 à 20 atomes de carbone. Ces aleals eux-mêmes sont effectivement assimilés par les micro-organismes utilisés et présentent aussi une action d'inhibition. Ainsi, il peut être nécessaire 30 qu'on choisisse de façon appropriée leur concentration. Les effets de l'addition de divers alcools sur la production de cellules-microbiennes, la teneur en protéines des corps de cellules et la formation d'acide citrique sont indiqués dans le Tableau 1 ci-oaprès, quand des cellules microbiennes sont 35 produites à partir de n-paraffines en utilisant Oandida zeylanoi-des ATGC 15585» Ces résultats expérimentaux sont ceux obtenus quand on conduit la culture dans des conditions aérobies en secouant dans des ballons pendant 36 heures, la composition du milieu de culture 70 35697 6 2065725 étant la suivante : n-paraffine (G^, °16» °17* Sa5 (mélange de volumes égaux) z2hpo4 MgS04«7B20 PeS04.7H20 ZnSO^oTi^O MnS04.4H20 CuS04.5H20 liqueur de macération de maïs Chlorhydrate de thia.mi.ne CaC03 2,0 fa(volume/'volume) 2,0 fo (poids/volume) 0,1 0,1 0,1 0,002 0,004 0,001 0,001 0,1 300 r/1 0,5 i» (poids/volume) 70 35697 7 2065725 TABLEAU I Effets de l'addition de divers alcools A 1 A A A i Concen Production de Teneur brute Production ft I.COOJ, tration corps de cel en protéines d'acide fo (v/v) lules (à sec) des corps de citrique mg/ cm3 cellules mg/ cm3 (à sec) io Pas d'addi tion 0 11,9 • 62,4 0 Méthanol 0,1 12,1 62,4 0,5 0,2 12,3 62,7 0,8 0,3 12,6 63,1 1,5 0,4 12,7 62,9 2,6 0,5 13,1 63,2 5,4 Ethanol 0,2 14,6 62,8 0,4 0,4 17,2 62,6 0,6 0,6 19,1 63,3 1,2 0,8 21,4 63,9 2,0 1,0 23,2 64,5 2,5 Butanol 0,1 12,0 62,4 0,5 0,2 12,2 62,8 0,7 0,3 12,6 63,6 1,2 0,4 12,5 63,2 1,8 0,5 12,3 63,3 2,1 Alcool 0,2 14,7 63,6 0,5 Laurique 0,4 15,6 64,2 0,7 0,6 17,7 65,1 1,6 0,8 21,6 66,0 2,8 1,0 24,7 65,7 5,6 Alcool 0,2 13,1 63,1 0,5 stéarylique 0,4 15,9 63,8 0,6 0,6 18,2 64,4 1,6 0,8 21,8 65,8 2,1 1,0 23,7 65,1 5,5 Alcool 0,2 13,1 63,1 0,4 oléylique 0,4 16,1 65,2 0,8 0,6 19,2 66,0 1,9 0,8 21,1 65,3 2,6 1,0 24,3 65,7 5,8 70 35697 8 2065725 Ainsi qu'il est évident d'après le Tableau 1, il ne se forme pas du tout d'acide citrique dans la liqueur de culture quand un alcool n'est pas ajouté au milieu» Toutefois, une petite quantité d'acide citrique est formée et s'accumule quand divers 5 alcools y sont ajoutés. De plus, le micro-organisme utilisé est capable d'assimiler les alcools ayant de 10 à 20 atomes de carbone et forme des cellules microbiennes avec un rendement (par rapport au carbone) qui est presque aussi bon que celui obtenu avec des n-paraffines ou l'éthanol. De plus, ainsi qu'il est évident 10 d'après le Tableau 1, on note que la teneur en protéines est un peu accrue par l'addition d'un alcool au milieu. Les micro-organismes assimilant les hydrocarbures, comprenant des bactéries, des levures, des moisissures, etc, dans un vaste domaine, peuvent être utilisés dans la présente 15 invention. Des bactéries préférées sont celles appartenant aux genres Arthrobacter. Oorynebacterium. Brevibacterium ou CTocardia» Les levures préférées sont celles appartenant aux genres Oandida. Torulonsis. Endomvces. Michia. Hansenula. Mvcoderma ou Endomycop-sis. Des moisissures préférées sont celles du genre Aspergillus 20 ou du genre Pénicillium. On peut utiliser dans le processus de fermentation de la présente invention un milieu de culture synthétique ou un milieu nutritif naturel du moment qu'il contient les substances nutritives essentielles pour le développement de la souche de 25 micro-organismes utilisée. Ces substances nutritives sont bien connues de l'homme de l'art, et comprennent des substances comme une source de carbone, une source d'azote, des composés inorganiques et les substances du même genre qui sont utilisées par le micro-organisme employé en quantités appropriées. La fermen-30 tation à propos de la présente invention est conduite•dans un milieu nutritif aqueux contenant un hydrocarbure ou un mélange d'hydrocarbures comme source principale de carbone. Ces hydrocarbures comprennent des paraffines (alcanes) à chaîne droite ou ramifiée, en particulier celles ayant de 11 à 20 atomes de 35 carbone, comme le n-pentane, le n-octane, le n-décane, le n-dodécane, le n-hexadécane, l'isopentane, l'isooctane, etc, des cycloparaffines comme le cyclohexane et le cyclooctane, des oléfines à chaîne droite ou ramifiée comme le pentène-2, l'hexène-1 70 35697 9 2065725 l'octène-1, l'octène-2, etc, des cyclooléfines comme le cyclo-hexène, des hydrocarbures aromatiques comme le benzène, l'o-xylène, etc, et leurs mélanges et des hydrocarbures mélangés comme du kérosène, des huiles légères, des huiles lourdes, des 5 huiles de paraffines, etc... Des quantités assez petites d'autres sources de carbone comme des hydrates de carbone, par exemple le glucose, le fructose, le maltose, le saccharose, l'amidon, l'hydrolysat d'amidon, des mélasses, etc, ou n'importe quelle autre source appropriée de carbone comme le glycérol, le mannitol 10 le sorbitol, des acides organiques, etc, peuvent être utilisées dans le milieu de fermentation en même temps que l'hydrocarbure, Ges substances peuvent être utilisées soit isolément, soit sous la forme de mêla •.ges de deux ou plus d'entre elles» Comme source d'azote, on peut utiliser divers types 15 de sels ou composés inorganiques ou organiques, comme l'urée ou une solution aqueuse d'ammoniac ou des sels d'ammonium comme le chlorure d'ammonium, le sulfate d'ammonium, le nitrate d'ammonium le phosphate d'ammonium, l'acétate d'ammonium, etc, ou un ou plusieurs amino-acides mélangés en combinaison, ou des substances 20 naturelles contenant de l'azote, comme la liqueur de macération de maïs, l'extrait de levures, l'extrait de viande, la farine de poisson, la peptone, le bouillon, des hydrolysats de caséine, des substances solubles de poissons, l'extrait de sons de riz, etc..• Ces substances elles aussi peuvent être utilisées soit 25 isolément, soit en combinaisons de deux ou plus d'entre elles8 Des composés inorganiques qui peuvent être ajoutés au milieu de culture comprennent le sulfate de magnésium, le phosphate de sodium, le phosphate diacide de potassium, le phosphate monoacide de potassium, le sulfate de fer ou d'autres sels de fer 30 le chlorure de manganèse, le chlorure de calcium, le chlorure de sodium, etco DE plus, il peut être nécessaire aussi qu'on ajoute certaines substances nutritives essentielles au milieu de culture, suivant le micro-organisme particulier utilisé, comme des amino-acides, par exemple l'acide aspartique, la thréonine, 35 la méthionine, etc, et/ou des vitamines, par exemple la biotine, la thiamine, la cobalamine, etc... Dans certains cas, il peut être nécessaire ou souhaitable d'utiliser un alcool, un acide mono- ou dicarboxylique ou 70 35697 10 2065725 une graisse ou huile naturelle, ou un mélange de telles substances, comme source de carbone ou au moins comme partie de la source de carbone dans le milieu. L'addition d'une huile végétale, d'une huile animale et/ou d'un agent tensio-actif peut être effi-5 cace aussi pour aider à augmenter le rendement en produit. conduite dans des conditions aérobies, comme en secouant la culture dans des conditions aérobies ou par agitation et aération d'une culture immergée, à une température de par exemple 15 à 10 45°C environ et à un pH de, par exemple, 1,0 à 9,0 environ dans le cas du premier mode de mise .en oeuvre dans lequel on ajoute un alcool au milieu et à une température de, par exëmple 20 à 37°C environ et à un pH de, par exemple, 1,0 à 7,5 environ dans le cas du premier mode de mise en oeuvre dans lequel on ajoute un 15 alcool au milieu et à une température de, par exemple, 1,0 à 7,5 environ dans le cas du dernier mode de mise en oeuvre dans lequel on ajoute du ferrocyanure de potassium ou de l'acide monofluoro-aeétique au milieu. 20 comment la présente invention peut être mise en oeuvre. Sauf spécification contraire, les pourcentages sont en poids par volume d'eau. Les produits désirés sont recueillis par des méto-des classiques, comme par traitement par une résine échangeuse d'ions, extraction aux solvants, précipitation, absorption, 25 chromatographie, etc... Exemple 1 place 18,9 litres d'un milieu de fermentation ayant la composition suivante : La fermentation ou la culture des micro-organismes est Les exemples non limitatifs suivants montreront bien Dans un fermenteur d'une capacité de 30 litres, on 30 2,5 f<> (volume/volume) n-paraffines (Q12,C13,C14^ (mélange en volumes égaux) 12' 13 14 2,0 fo (poids/volume) BH.C1 0,1 * 0,1 fo 35 0,1 fo MgS04.7H20 MnS04.4H20 FeS04.7H20 ZnS04.7H20 r(„c«r\ ku c\ 0,001 i° 0,002 56 0,001 fo 0,0005 96 0,0065 f> 70 35697 n 2065725 0,0002 £ EjBO^J. 500 "X/qsP ITonion LP-20B. (agent tensio-actif) 1cm 11 Huile de soja 200 Y/1 Chlorhydrate de thiamine 0,05 f> liqueur de macération de maïs Un litre d'une liqueur d'ensemencement microbien en Torulopsis famata AICC 15586 est ajouté au milieu de fermentation 10 ci-dessus» Ensuite, on ajoute aussi 0,1 litre d'éthanol» On conduit la culture à une température de culture de 34°C avec aération à raison de 20 litres par minute et en agitant à la vitesse de 500 tours par minute» le pH est maintenu à 6,50 à l'aide d'une solution aqueuse à 18 fo d'ammoniac durant la culture. 15 Après 42 heures, la culture est terminée et la concen tration des cellules microbiennes dans la liqueur de culture atteint 20 mg/cm^o la production d'acide citrique est de 3,0 mg/cm^. A titre de comparaison, on conduit une culture de la 20 même manière dans un milieu ne contenant pas d'éthanol. la con- rz centration des corps de cellules formés est de 14 mg/cm et on n'observe pas du tout de sous -produit acide citrique» les cellules microbiennes obtenues comme résultat de l'addition d'éthanol au milieu sont lavées successivement plu-25 sieurs fois dans un séparateur centrifuge Sharples et soumises à une séparation centrifuge» Après séchage par congélation, on obtient 365 g de corps de cellules» la teneur en protéines des corps de cellules est de 61 fo. Toutefois, quand la culture est conduite dans un milieu ne 30 contenant pas d'éthanol, on obtient seulement 246 g de corps de cellules avec une teneur en protéines de 59 f>• Après avoir enlevé les cellules microbiennes de la liqueur de culture, on ajoute 200 g de chlorure de calcium et on règle le pH à 8,0 à l'aide d'une solution aqueuse d'ammoniac. 35 la liqueur résultante est chauffée à 100°C pendant 5 minutes, on filtre les cristaux de citrate de calcium obtenus et on ajoute 2 litres d'eau aux cristaux. On règle le pH à 2,0 à l'aide d'acidë chlorhydrique, dissolvant ainsi le citrate de 70 35697 12 2065725 calcium» Ensuite, par répétition de cette opération, on obtient 65 g de cristaux de citrate de calcium» Exemple 2 3 On ajoute 300 cm d'une solution d'ensemencement micro-5 bien en Uocardia paraffinica ATCC 21198 à 3 litres d'un milieu de fermentation contenus dans fermenteur de 5 litres et ayant la composition suivante : 3»5 f<> (volume/volume) 0,1 f« (poids/volume) 0,1 fo 0,05 * 0,0005 f> 0,05 fo 2,5 % 0,01 fo n-paraffines (C^» °IV °14 (mélange en volumes égaux KH2Ï04 lîa2HP04.12^0 Mg804.7H^0 ZnS04.7H20 Liqueur de macération de maïs (™4>2S°4 Cad, On ajoute 15 cm de méthanol au milieu de fermentation ci-dessus» On conduit ensuite la culture à 28°C avec aération à raison de 3 litres par minute et en agitant à la cadence de 650 tours par minute. Le pH est maintenu à 7,0 à l'aide d'une 25 solution aqueuse à 18 fo d'ammoniac durant la culture, La culture est terminée après 40 heures, La concentration des corps de cellules formés est de 21,0 mg/cm^ et la production d'acide citrique est de 2,0 mg/cm « Quand on conduit la culture sans l'addition de méthanol, la concentration des 30 corps de cellules formés est de 20,8 mg/cm^f mais on n'observe pas du tout de formation d'acide nitrique. En soumettant la liqueur de culture aux mêmes traitements que décrit dans l'Exemple 1, on obtient des cellules microbiennes et des cristaux de citrate de calcium0 Les quantités 35 obtenues sont de 53 g de corps de cellules (à sec) et 6,1 g de citrate de calciunf. Quand on conduit la culture dans le milieu ne contenant pas de méthanol, on obtient 52 g de corps de cellules (à sec), La teneur en protéines des cellules microbiennes 70 35697 13 2065725 obtenues selon l'invention est de 57» 1 fo, tandis que la, teneur en protéines des cellules microbiennes obtenues par culture dama le milieu ne contenant pas de méthanol est de 56, 3 fo„ Exemple 3 Dans un fermenteur de 5 litres, on place 3 litres d'un milieu de fermentation ayant la composition suivante : 4 f> (volume/volume) 2,0 fo (poids/volume) 0,1 * 0,05 * 0,05 fo 0,0001 fo 0,002 f> 0,0005 fo 0,001 fo 200 r/cm5 1 cm"V1 1 mg/1 0,5 fo (volume/volume) Ensuite, on ajoute comme micro-organisme d'ensemencement 3 300 cm d'une solution de culture de Pénicillium ianthinellum ATCC 13154» la culture est conduite à 26°C avec aération à raison de 3 litres par minute et avec agitation à 650 tours par minute pendant 3 jours» De pH initial est de 6,0. La concentration des corps de cellules formés atteint 30-mg/cm^, avec en même temps une production d'acide citrique de 1,8 mg/cm^» Quand on conduit la culture dans un milieu ne contenant pas d'alcool laurique, la concentration des corps de cellules formés est de 24 mg/cm et il n'y a pas du tout d'acide citrique formé» En soumettant la liqueur de culture au même traitement que décrit dans l'exemple 1, on obtient 85 g de corps de cellules et n-paraffines (C12» (mélange en volumes égaux) mh4M)3 *2^4 MgSO^.THgO MhSO^HgO EeS04o7ïï20 CuSO^HgO ZnSO^oTHgO IJbnion OT-221 (agent tensio- actif) Huile de soja Chlorhydrate de thiamine Alcool laurique 70 35697 14 2065725 5,6 g de cristaux de citrate de calcium» La teneur en protéines des corps des cellules est de 36 fo. Quand la culture est conduite dans un milieu ne contenant pas d'alcool laurique, on obtient 69 g de corps de cellules ayant une teneur en protéines de 31 f>o Exemple 4 Dans un fermenteur de 5 litres, on place 3 litres d'un milieu de fermentation comprenant ï 3,0 fo (Volume/volume) 0,1 f° (Volume/volume) 0,1 fo 0,3 f» 0,1 fo 0,005 fo 0,001 fo 0,001 $> 0,02 fo 2,5 fo 0,3 fo 100 T/l 12' °13' "H5 n-paraffine s (C (mélange en volumes égaux) EHgîO^ IL>ffi?04 KC1 MgS04;7H20 EeSO^ TH^O ZnSO^THgO MnS04i4H20 Liqueur de macération de maïs (SH4)2SO4 Ca012 Chlorhydrate de thiamine On ajoute au milieu ci-dessus 300 cm d'une solution d'ensemencement microbien en Arthrobacter paraffineus ATCC 15591. On conduit ensuite la culture à 30°C avec aération à raison de 3 litres par minute et en agitant à la cadence de 800 tours par 30 minute, tout en maintenant le pH à 6,80 à l'aide d'une solution aqueuse à 28 fo d'ammoniac. Ensuite, 6 heures après le début de la 3 culture, on ajoute 15 cm d'alcool n-amyliques. La production de cellules microbiennes atteint un maximum après 24 heures de •7 culture, leur concentration étant de 18,5 mg/cm o La production 35 d'acide citrique est de 1,3 mg/cm 0 Une culture conduite à titre de comparaison dans le même milieu mais ne contenant pas d 'alcool n-amylique donne une concentration de cellules microbiennes de 18,0 mg/cm et pas du tout de formation d'acide citrique. 70 35697 15 2065725 En soumettant la liqueur de culture obtenue par addition d'alcool n-amylique au milieu au même traitement que décrit dans l'exemple 1, on obtient 49 g de cellules microbiennes (à sec) et 4f5 g de citrate de calcium. La teneur en protéines des cellules 5 microbiennes est de 51,0 A partir de la liqueur de culture de comparaison obtenue par culture sans aLcool n-amylique, on obtient 48 g de cellules microbiennes avec une teneur en protéines de 48,2 Exemple 5 10 On cultive le micro-organisme Arthrobacter paraffineus AIOC 15591 à 30°C pendant 24 heures avec secousses aérobies dans r* 20 cm d'un milieu contenant 0,25 f> d'extrait de levures, 0,5 ^ d'extrait de viande, 0,5 de peptone et 0,25 f° de chlorure de sodium à un pH de 7,0 dans un flacon conique de 250 cm à La cul- 15 ture résultante est transférée, dans une proportion de 10 fo, dans 3 20 cm d'un milieu de fermentation contenus dans des flacons de Sakaguchi et ayant la composition suivante : o,i $> ny?o4 0,1 Na2HP04.12^0 0,05 % MgS04o7H20 0,01 fo EeSO^E^O 0,002 fo MhSO^iy) 0,05 fo Liqueur de macération de maïs 2,0 f, NH4KO3 5 fo Mélange n-paraffine (mélange en volume égal d6 °12» °13' °14^ 5 f> CaC03 On conduit la culture à 30°C avec secousses par va-et-35 vient» On ajoute du monofluoro-acétate de sodium 6 heures après le début de la culture à une concentration de 0,1 foa Ensuite, on continue la culture pendant 4 jours et on trouve alors que 18,2 mg/cm^ de citrate de calcium (en acide citrique) se sont 70 35697 16 206572S accumulés dans la liqueur de culture» En utilisant le même milieu dans une expérience comparative, on obtient seulement 9,3 mg/cm^ d'acide citrique quand on n'ajoute pas de monofluoro-acétate de sodium au milieu» 5 On ajoute un volume égal de HC1 2N à la liqueur de culture après achèvement de la culture afin de dissoudre la totalité du citrate de calcium et on sépare les cellules microbiennes par centrifugation» On ajoute du NH^OH à la liqueur surnageante résultante pour régler le pH à 8,0 et, après chauffage, 10 on sépare par filtration environ 360 mg du citrate de calcium résultant. En répétant une fois encore ce traitement, on obtient 332 mg de cristaux de citrate de calcium» Exemple 6 On cultive le micro-organisme Candida zevlanoides ATCC 15 15 585 à 30°C pendant 2 jours avec secousses aérobies dans un 3 ^ flacon de Sakaguchi contenant 20 cm d'un milieu comprenant 5 f> d'un mélange de n-paraffines (volume/volume), 0,5 f° d'extrait de viande, 0,5 fo de polypeptone, 0,25 fo de chlorure de sodium et 5 fo de OaCOj à un pH de 6,0. la culture résultante est transférée, 20 dans une proportion de 10 f, dans des flacons de Sakaguchi conte-nant chacun 20 cm' d'un milieu de fermentation comprenant : 10 fo de mélange n-paraf fine (volume/volume) 0,3 f> NH^Gl 0,1 $> EHgPO^ 0,05 f> MgSO^THgO 500 Y/1 MqSO^.^O 500 T/1 CfuSO^.SHgO 500 T/1 (HH4)6Mb7024».4B20 200 T/1 EL^BO^ 200 mg/1 Uonion 0T-221 (agent tensio-actif) 5cm^/1 Huile de soja 1 mg/1 thiamine 0,01 fo monofluoro-acétate de sodium 8 fo CaC03 70 35697 17 2065725 le pH du milieu ci-dessus est de 6,0. la culture est conduite pendant 4 jours dans les mêmes conditions que décrit dans l'Exemple 5. Après achèvement de la culture, on trouve que 105 mg/cm3 de citrate de calcium (en acide 5 citrique) et 12 mg/cm3 d'isocitrate de calcium (en acide isocitrique) se sont accumulés dans la liqueur de culture résultante. Dans une expérience comparative, on conduit la culture de la même manière, mais dans un milieu exempt de l'acide monofluoro-aeétique. Dans ce cas, il se forme seulement 65 mg/cm3 de citrate de calcium 10 (en acide citrique), tandis que 63 mg/cm^ d'isocitrate de calcium (en acide isocitrique) s'accumulent dans la liqueur de culture. En traitant la liqueur de culture après la fin de la culture de la même manière que décrit dans l'Exemple 5, on obtient 2,05 g de citrate de calcium à partir du milieu cultivé selon la 15 présente invention, les cristaux obtenus contiennent 10,3 $ d'isocitrate de calcium (en acide isocitrique). Exemple 7 On cultive le micro-organisme Oandida lipolvtica ATCC 8661 pendant 2 jours avec secousses aérobies dans un flacon de 20 Sakaguchi content ît 20 cm3 d'un milieu comprenant un mélange à 5 $> de n-paraffines (volume/voulme), 0,5 % d'extrait de viande, 0,5 % de polypeptone, 0,25 % de chlorure de sodium et 5 $ de CaCÔ~ a un pH de 6,0. la culture résultante est transférée, dans une propor-~ tion de 10 # dans des flacons de Sakaguchi contenant chacun 20 cm 25 d'un milieu de fermentation ayant la composition suivante s 10 % de mélange n-paraffine (volume/volume) 0,3 * m4]sro3 0,1 £ KH2P04 30 0,05 3* MgSO^HgO 500 y/1 MnSO^HgO 500 T/1 CuSO^HgO 35 10 mg/1 FeSO^HgO 5007/1 (HH4)6MO7024.4H20 200 7/1 MO. 200 mg/1 îTonion OT-221 (agent tensio-actif) 40 5 cm3/1 huile de soja 0,1 liqueur de macération de maïs 8 % CaC03 le pïï de ce milieu est de 6,0. 45 la culture est conduite avec secousses aérobies dans les mêmes conditions que décrit dans l'Exemple 5 et on ajoute du ferrocyanure de potassium au milieu 24 heures après le début de la culture de façon à obtenir une concentration de 2,0 % en poids de ce composé dans le milieuo On continue ensuite la culture pendant 50 encore 72 heures et, comme résultat, on trouve que 4»6 mg/cm3 de citrate de calcium (en acide citrique) et 10,8 mg/cm3 d'isocitrate de calcium (en acide isocitrique) se sont accumulés dans la liqueur de culture résultante,. On recueille la liqueur de culture obtenue provenant de 55 50 flacons soumis à une culture comme décrit ci-dessus et on y ajoute du H^SO^ On filtre ensuite la liqueur de culture pour éliminer les sels de calcium et les micro-organismes. Ensuite, on ajoute à la liqueur de culture une solution saturée de Ba(0H)2 et on obtient ainsi des sels de Ba. Après les étapes de lactonisation 70 35697 18 2065725 de méthylation, de déméthylation et de lactonisation, on obtient 1,25 g de lactone d'acide isocitrique à Quand on conduit la culture dans une expérience comparative de la même manière, mais dans un milieu ne contenant pas de 5 ferrocyanure de potassi-um, 7,5 mg/cm^ de citrate de calcium (en acide citrique) et 7,4 mg/cm^ d'iso citrate de calcium (en acide isocitrique) s'accumulent dans la liqueur de fermentation; Exemple 8 On conduit une culture de la même manière que décrit dans 10 l'Exemple 7, en utilisant le micro-organisme Candida ^evlanoidea ATCC 15585o Comme résultat, 12,1 mg/cm'' d*isocitrate de calcium (en acide isocitrique) et 5,0 mg/cm de citrate de calcium(en acide citrique) sont formés dans la liqueur de culture à la fin de la culture» En suivant le mode opératoire décrit dans l'Exemple 7, on 15 obtient 1,44 g de la lactone d'acide isocitrique; Quand, à titre de comparaison, on conduit la culture de la même manière, mais dans un milieu ne contenant pas de ferrocya-nure de potassium, 7,3 mg/cm d'isocitrate de calcium (en acide •SÇ isocitrique) et 7,5 mg/cm de citrate de calcium (en acide citrique) 20 sont formés dans la liqueur de culture à la fin de la culture; Exemple 9 On cultive le micro-organisme Pénicillium ignthl-nRii'nwi 581 ATCC 13154 à 28°C sur un milieu incliné de gélose à l'extrait de malt pendant 3 jours0 A l'aide d'une boucle de platine, on ino- 25 cule la culture d'ensemencement résultante à 20 cm d'un milieu de 3 culture de germes contenus dans un flacon de 250 cm et ayant la composition suivante (pH 6,0) : 5 96 mélange de n-paraffine ( ^ 2* ^13* ^14 (volume/volume ) 0,025 % KHgPO^ 30 0,025 # Na2HP0^; 121^0 0,02 fo 0,001 CaClg^HgO 0,001 # MnSO^HgC 0,5 mg/1 ZnSO^iTHgO 35 10 mg/1 EeSO^èTILjO 0,6 mg/1 H^BO^ 10 Y/1 ]Ja2lïoC4.2H20 10771 CoClg.ôB^C 10^/1 CuSO^HgO 70 35697 19 2065725 0,4 i<> NH4N03 0,3 % liqueur de macération de maïs 2 in Huile de soja 3 # CaC03 5 On conduit la culture avec secousses aérobies à 28°C pendant 3 jours et on transfère 2 cm de la liqueur de culture résultante dans 20 cm d'un milieu de fermentation ayant la même £~à. ceci près qu'il contient 10 # du mélange de n-paraf fines (volume/volume) et 5 % de 0a C03_7 contenus dans un flacon de 10 Sakaguchio Ensuite, on conduit la culture avec secousses aérobies à raison de 130 courses de va-et-vient par minute„ Après 24 heures de culture, on ajoute du monofluoro-acétate de sodium au milieu à une concentration de 0,01 # •Z encore 5 jours et, comme résultat, 30 mg/cm de citrate de calcium 15 (en. acide citrique) sont formés dans la liqueur de culture après la fin de la culture 0 Dans une expérience comparative, dans laquelle on n'ajoute pas de monofluoro-acétate de sodium au milieu, on trouve que seulement 12 mg/cm^ de citrate de calcium (en acide citrique) 20 s'accumulent dans la liqueur de culture résultante# D'après la description ci-dessus, on voit qu'un ferrocyanure de métal alcalin, comme le ferrocyanure de sodium ou le ferrocyanure de potassium, peut être utilisé comme additif pour l'obtention de productions accrues d'acide isocitrique,. D'une 25 manière similaire, l'addition d'acide monofluoro-aeétique ou de ses sels de métaux alcalins, comme le monofluoro-acétate de sodium ou le monofluoro-acétate de potassium, a pour effet d'augmenter la production d'acide citrique. Il est évident que l'invention n'est pas limitée aux 30 modes de mise en oeuvre décrits, et qu'on peut y apporter toutes variantes. 70 35697 20 2065725 R E Y E H D I C ATI QHS 1. Un procédé de production d'acide citrique en même temps que de cellules microbiennes par fermentation, caracté^^ en ce qu'on cultive un micro-organisme assimilant les hydrocarbures capable de produire de l'acide citrique dans des condition. 5 aérobies dans un milieu nutritif aqueux contenant au moins tin hydrocarbure comme source principale de carbone en présence d'au moins un alcool, en accumulant l'acide citrique et les cellules microbiennes résultantes dans la liqueur de culture obtei«.-s» et on recueille l'acide citrique et les cellules microbiennes 10 à partir de cette ldqieur de culture. 2. Un procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que le micro-organisme appartient à un genre choisi parmi le groupe des micro-organismes Arthrobacter, Oorynebacterium, Brevi. bacterium, flocardia, Oandida, Torulopsis, Endomyces, Pichia» Haa. 15 senula, Mycoderma, Endomycopsis. Aspergillus et Penicilliurn. 3» Un procédé selon la revendication 2, caractérisé en ce qu'on conduit la culture à une température de 15 à 45°0 envi» ron et à un pH de 1,0 à 9»0 environ. 4« Un procédé selon la revendication 1, caractérisé en 20 ce que l'alcool contient de 1 à 20 atomes de carbone. 5» Un procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que l'alcool est un alcool saturé ayant de 1 à 20 atomes de carbone. 6. Un procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce 25 qu'on ajoute de 0,1 à 1,0 ^ (volume/volume) de l'alcool au milis" 7» Un procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que l'hydrocarbure est une n-paraffine ayant de 11 à 20 atoias de carbone. 8. Un procédé selon la revendication 1, caractérisé en 30 ce que le milieu nutritif comprend aussi un agent tensio-actif. 9» Unprocédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que le micro-organisme est choisi parmi le groupe de microorganismes Torulopsis famata. Nocardia paraffinica, Pénicillium .ianthinellum et Arthrobacter temps que de cellules microbiennes par fermentation, selon leqxie on cultive un micro-organisme assimilant les hyâroQaxb'ar-es eapafc 35 10. Un procédé de production d'acide citrique en même 70 35697 21 2065725 de produire de l'acide citrique et appartenant à un genre choisi parmi les suivants : Arthrobacter, Corynebacterium, Brevibaete-rium, Nocardia, Candida, Torulopsis, Endomyces, Pichia, Hansenula. Mycoderma» Endomycopsis0 Aspergillus et Pénicillium dans des con-5 ditions aérobies à une température de 15 à 45°0 environ et à un pH de 1,0 à 9,0 environ dans un milieu nutritif aqueux contenant au moins un hydrocarbure comme source principale de carbone en présence de 0,1 à 1,0 ^ environ en poids d'au moins un alcool saturé ayant de 1 à 20 atomes de carbone, en accumulant l'acide 10 citrique et les cellules microbiennes résultantes dans la liqueur de culture obtenue, et on recueille l'acide citrique et les cellules microbiennes à parti' de cette liqueur de culture, jn. Un procédé selon la revendication 10, caractérisé en ce que l'hydrocarbure est une n-paraffine ayant de 11 à 20 15 atomes de carbone» 12. Un procédé selon la revendication 10, caractérisé en ce que le micro-organisme est choisi parmi les suivants : lorulasis famata, Nocardia paraffina. Pénicillium .janthinellum et Arthrobacter paraffineus. 20 15o Un procédé de production d'acide citrique et d'acide isocitrique par fermentation, selon lequel on cultive un microorganisme assimilant les hydrocarbures capable de produire de l'acide citrique ou de l'acide isocitrique dans des conditions aérobies dans un milieu nutritif aqueux contenant au moins un 25 hydrocarbure comme source principale de carbone en présence de (a) un ferrocyanure de métal alcalin ou (b) l'acide monofluoro-aeétique ou un sel de métal alcalin de cet acide, en accumulant l'acide citrique et/ou l'acide isocitrique dans la liqueur de culture résultante, et on recueille l'acide citrique et l'acide 50 isocitrique à partir de cette liqueur de culture» 14o Un procédé selon la revendication 15, caractérisé en ce que le micro-organisme appartient à un genre choisi parmi les suivants : Arthrobacter, Gorynebac t e r ium, Brevibacterium, Nocardia, Gandida, Torulopsis, Endomyces, Pichia, Hansenula, Myco-55 derma. Endomycopsis, Aspergillus et Pénicillium. 12- Un procédé selon la revendication 15, caractérisé en ce que la culture est conduite à une température de 20 à 57°C environ et à un pH de 1,0 à 7,5 environ. 2065725 16. Un procédé selon la revendication 13, caractérisé en ce que ferrocyanure de métal alcalin est le ferrocyanure de potassium ou de sodium. 17o Un procédé selon la revendication 13, caractérisé 5 en ce que le sel. de métal alcalin de l'acide monofluoro-aeétique est choisi parmi le monofluoro-acétate de sodium et le monofluoro-acétate de potassium. 18. Un procédé selon la revendication 16, caractérisé en ce qu'on ajoute au milieu une quantité efficace allant jusqu'à 10 environ 5 en poids du ferrocyanure. 19. Un procédé selon la revendication 13, caractérisé en ce qu'on ajoute au milieu une quantité efficace allant jusqu'à environ 20 mM d'acide monofluoro-aeétique ou du sel de sodium ou de potassium de cet acide. 15 20. Un procédé selon la revendication 13, caractérisé en ce que l'hydrocarbure est une n-paraffine ayant de 11 à 20 atomes de carbone. 21. Un procédé selon la revendication 13, caractérisé en ce que le milieu nutritif comprend aussi un agent tensio-actif. 20 22. Un procédé selon la revendication 13, caractérisé en ce que le micro-organisme est choisi parmi les suivants : Arthrobacter paraffineus. Gandida zeylanoides. Candida lipolytica et Pénicillium j anthinellum. 23. Un procédé de production d'acide citrique et d'acide 25 isocitrique par fermentation, selon lequel on cultive un microorganisme assimilant les hydrocarbures capable de produire de l'acide citrique ou de l'acide isocitrique et appartenant à un genre choisi parmi les suivants : Arthrobacter. Corvnebaeterium. Brevibacterium. Hocardia. Gandida. Torulopsis. Endomvees. Pichia. 30 Hansenula. Mycoderma. Endomycopsis. Pichia. Hansenula. Mycoderma. Endomycopsis. Aspergillus et.Pénicillium dans des conditions aérobies à une température de 20 à 37°C environ et à un pH de 1,0 à 7,5 environ dans un milieu nutritif aqueux contenant au moins un hydrocarbure comme source principale de carbone en présence de (a) 35 ferrocyanure de potassium ou de sodium ou (b) acide monofluoro-aeétique, monofluoro-acétate de sodium ou monofluoro-acétate de potassium, en accumulant l'acide citrique et/ou l'acide isocitrique dans la liqueur de culture résultante, et on recueille l'acide 70 35697 70 35697 23 2065725 citrique et l'acide isocitrique à partir de cette liqueur de culture• 24. Un procédé selon la revendication 23, caractérisé en ce que l'hydrocarbure est une n-paraffine ayant de 11 à 20 atomes de carbone. 25. Un procédé selon la revendication 23, caractérisé en ce que le micro-organisme est choisi parmi les suivants : Arthrobacter paraffineus. Candida zeylanoides. Candida lipolytica et Pénicillium lanthinellum.