FR 2068490 A1 19710827 FR 7029718 A 19700812 70 29718 1 2068490 La présente invention concerne le nouvel antibiotique A16886I et le nouvel antibiotique A16886II et leurs sels, ayant une activité antibactérienne et anthelmintique, et leur préparation par fermentation de Streptomyces clavuligerus NRRL 3585. 5 La fermentation de Streptomyces clavuligerus produit des nou velles substances antibiotiques désignées ici sous le nom d'antibiotique A16886. On obtient facilement les sels de l'antibiotique A16886 en faisant réagir l'antibiotique A16886 avec un acide ou une une base appropriés. L'antibiotique A16886 et ses sels manifestent/ 10 activité antibactérienne et anthelmintique. L'activité antibactérienne se manifeste principalement vis-à-vis des organismes Gram-négatifs, mais une certaine activité se manifeste également contre les organismes Gram-positifs. L'antibiotique A16S86 est également efficace dans la lutte contre les maladies provoquées par les 15 bactéries pathogènes des végétaux. Plus particulièrement, cette invention concerne l'antibiotique A16886I ou un de ses sels, dont le sel monoammonique se caractérise comme étant un solide amorphe, duveteux , d'un blanc légèrement sale, se ramollissant entre 190° et 300°C avec un changement de cou-20 leur vers le brun foncé; qui est très soluble dans l'eau, légèrement solûble dans les alcanols inférieurs, et insoluble dans l'a-cétonitrile; qui est amphotère, ayant quatre groupements titrables de pK'a^ =4,1; pK'a2 = 5,2; pK'a^ = 9,3; et pK'a4 = 10,5; qui a un poids moléculaire apparent d'environ 530 tel que déterminé 25 à partir des données du titrage; qui a la composition approximative de 40,26 pour cent de carbone, 5,91 pour cent d'hydrogène, 13,98 pour cent d'azote, 33,37 pour cent d'oxygène, et 7,21 pour cent de soufre; qui a un pouvoir rotatoire spécifique optique, de + 153,6° (C = 1 pour cent pds./v. dans l'eau); et dont 30 une bouillie dans l'huile minérale a les bandes suivante^ qui peuvent être distinguées clax-s son spectre d' absorption infrarouge aux longueurs d'onde suivantes, exprimées en microns: 3,10, 5,68, 6,30, 6,60, 7,20, 7,60, 8,83, 9,35, 9,60, 9,85, 11,60, et 12,90. L'invention fournit encore l'antibiotique A16886II ou un de 35 ses sels, dont le sel d'ammonium se caractérise comme étant un solide amorphe, duveteux, d'un blanc légèrement sale, se ramolis-entre sant / 190° et 300°C avec un changement de couleur vers le brun foncé; qui est très soluble dans l'eau, légèrement soluble dans les alcanols inférieurs, et insoluble dans 1'acétonitrile; qui 40 est amphotère, ayant quatre groupements titrables de pK'a^ =4,0; 70 29718 2 2068490 pK'a^ = 5,3; et pK'^j = 9,2; et pK' a^ = 10,5; qui a un poids moléculaire apparent d'environ 528 tel que déterminé à partir des données du titrage; qui a la composition approximative de 41,01 pour cent de carbone, 5,64 pour cent d'hydrogène, 15,75 pour cent 5 d'azote, 29,28 pour cent d'oxygène, et 7,04 pour cent de soufre; 7" 25 ' qui a un pouvoir rotatoire spécifique optique, /c^_/D de + 86,2° (C = 1 pour cent, pds./v. dans l'eau); dont une bouillie dans l'huile minérale a les bandes suivantes qui peuvent être distinguées dans son spectre d'absorption infrarouge aux longueurs d'onde sui-10 vantes , exprimées en microns : 3,15, 5,70, 6,30, 7,22, 7,64, 9,05, 9,40, 9,65, et 11,60. En outre, l'invention fournit encore un procédé de production de l'antibiotique A16886I et/ou de l'antibiotique A16886II tel que défini précédemment, qui consiste à cultiver Streptomyces 15 clavuligerus NRRL 3585 dans un milieu de culture contenant les sources assimilables de carbone, d'azote, et des sels minéraux dans des conditions "d' immersion aérobies jusqu' à ce que ledit organisme ait produit une quantité substantielle de A16886I' et/ou de A16886II dans ledit milieu de culture. 20 II est également du ressort de cette invention de fournir la composition comportant (1) l'antibiotique A16886I où un cîe sës sels, tel que défini précédemment, et/ou l'antibiotique A16886II ou un de ses sels, tel que défini précédemment, et (2) un agent surfactif. \ 70 29718 2068490 L'antibiotique A16886 est un antibiotique peptidique contenant du soufre ayant une molécule amphotère. Comme c'est le cas avec de nombreuses cultures productrices d'antibiotiques, la fermentation de Streptomyces clavulicrerus NRRL 3585 résulte en la production 5 d'un certain nombre de substances antiobiotiques appelées "facteurs". L'antibiotique A16886, tel qu'il est obtenu présentement à partir du fermenteur, comporte deux substances antibiotiques majeures désignées ici sous les noms de A16886I et A16886II ou sous les noms de facteur I et facteur II. En outre, on a observé des quantités 10 mineures d'autres substances antibiotiques dans certaines fermentations, mais comme elles n'étaient présentes qu'en très petites quantités, on ne les a pas caractérisées. C'est pourquoi, le terme non modifié "antibiotique A16885" est utilisé ici pour se référer à l'antibiotique tel qu'il est obtenu à partir du fermenteur et 15 comprenant ordinairement de 1 à 99 % de facteur I et de 99 à 1 % de facteur II en plus d'autres facteurs mineurs, le pourcentage total étant de ÎOO. Par conséquent, dans les discussions ci-contre concernant l'utilité et les modes d'utilisation, le terme "antibiotique Al6886" s'applique également aux facteurs individuels 20 aussi bien qu'aux mélanges attendu que les propriétés des facteurs individuels et de leurs mélanges sont similaires. On peut utiliser l'antibiotique A16836 comme tel ou sous forme d'un sel, par exemple, d'un sel d'addition d'acide ou d'un sel avec un cation. Dans le cas d'un sel avec un cation, le sel 25 peut être soit un sel mono soit un sel di .On préfère souvent préparer les sels directement dans le procédé de purification de sorte que 1'antibiotique,tel qu'il est séparé, est sous la forme sel. De cette manière on a séparé l'antibiotique A16886 sous forme du sel monoammonique, et pour cette raison, il est caractérisé 30 ci-après en tant que sel monoammonique. Certaines caractérisations ont été effectuées sur le mélange des facteurs I et II. Par exemple, on a effectué un certain nombre d'essais chimiques qualitatifs avec un mélange du sel monoëmmonique de facteur I et du sel monoammonique de facteur II : on a obtenu 35 des tests positifs avec les réactifs ninhydrine, de Pan Dutscher, de Bénédict, de Molisch, de Fehling, chlorure de dansyle, iode, et chlorure ferrique, mais on a constaté que les tests étaient négatifs avec les réactifs du biuret et de Sakaguchi. Un mélange de sels monoammoniques des facteurs I et II séchés 40 à la température ambiante sous vide sur chlorure de calcium . 70 29718 4 2068490 anhydre pendant environ 15 heures, a présenté-un pouvoir rotatoire optique /_ a+ 110,1° (C = 1 % p" /v. dans l'eau. Un mélange des sels monoammoniques des facteurs I et II de l'antibiotique A16886 est stable à pH 3-8 à 6°C pendant 8 jours et relativement 5 stable à pH 3-8 à 25°C pendant 2 jours. L'activité biologique se perd lentement à pH 3 - 8 à une température de 25°C, la moitié étant perdue à 4 jours. En outre, on a caractérisé séparément, comme mentionné précédemment,les sels monoammoniques des facteurs I et II. Les 10 valeurs précédentes du pouvoir rotatoire.optique spécifique des sels monoammoniques de l'antibiotique A16886I et de 1*antibiotique A16886II sont basées sur les sels séchés à la température ambiante sous vide sur chlorure de calcium anhydre pendant environ 15 heures.On a effectué le titrage électrométrique avec le sel 15 monoammonique de l'antibiotique A16886I dans une solution diméthyl-formamide-eau à 66 % à un pH initial de 6,50. On a effectué les analyses élémentaires des sels monoammoniques de A16886I et de A16886II séchés sous vide à environ 80° C sur anhydride phosphorique. L'analyse du sel monoammonique de 20 1'antibiotique A16886I présente une teneur en méthoxyle de 5,02 %; la présence du groupement méthoxyle a été confirmée par un singlet à 3,53 ppm.dans le spectre RMN . Une détermination de la teneur en azote aminé du sel monoammonique de l'antibiotique A16886I, par la méthode de Van Slyke , a' donné une valeur de 5,3 % 25 Le spectre RMN de A16886I dans D2O a donné les caractéristiques suivantes : 5,19 ppm. (1H, singlet); 4,94, 4,74 ppm. (2H, AB quartet, J = 13 Hz) 4,0-4,2 ppm. ( 1H, multiplet); 3,68, 3,32 ppm. (2H, AB quartet, J = 18 Hz) 3,53 ppm. (3H, singlet); 2,6-2,4 ppm. (2H, multiplet); 2,1-1, 6 ppm. (4H, multiplet). 30 Le spectre d'absorption infrarouge du sel monoammonique de l'antibiotique A16886I dans une bouillie dans l'huile minérale est représenté sur la Figure 1 des dessins d'accompagnement. Le spectre d'absorption ultraviolet du sel monoammonique de l'antibiotique A16886I en solution aqueuse présente des maxima 35 d'absorption à 242 m jfi (E J = 132) et "à 264 m ^ (Eî JnT165)'* le dichroisme circulaire a été également mesuré en solution aqueuse et il présentait un effet Cotton positif à 263 m et un effet Cotton négatif à 236 m p . Une chromatographie sur papier du sel d'ammonium de l'anti-40 biotique A16886I sur papier VJhatman n° 1 a donné une valeur du 70 29718 s 2068490 r^ de 0/41 dans un système solvant de propanol, d'acétonitrile, et d'eau dans un rapport en volume de 1:1:1. On a obtenu des bioautogrammes en mettant le chromatogramme sur papier sur des plaques d'agar ensemencées avec Salmonella crallinarum comme orga-5 nisme test. Lorsque le sel monoammonique de A16886I est soumis à une chromatographie en couche mince sur plaques de gel de silice dans 1'acétonitrile aqueux à 70 %, en utilisant une pulvérisation à la ninhydrine comme révélateur, il a une valeur du d'environ 10 0,51; sur plaques de cellulose dans le mélange acétonitrile : isopropanol : eau (1:1:1), en utilisant le même mode opératoire pour révéler, il a une valeur du Rf de 0,36. L'analyse des amino acides d'un hydrolysat d'acide de l'antibiotique A16886I, réalisée par la technique de Spackman-15 Moore-Stain, a présenté deux pics réagissant à la ninhydrine, dont l'un était élué de manière identique à la glycine (0,61 ^mole /mg.), dont l'autre a été élué juste avant la glycine et a été idendifié comme étant l'acide a-aminoadipique (1,97 ^jmolë /mg.) . 20 L& titrage électrométrique du sel monoammonique dé l'antibio tique Â16886II dans une solution diméthylformamide-eau à 66 % à un pH initial de 7,7, a révélé la présence de quatre groupements titrables : pK'a^ = 4,4 ; pK1 a.^ = 5,7; pK'a^ = 9,6; pK' aA = 10,4. Dans un titrage analogue d'un échantillon ultérieur si ce n'est 25 qu'il a été effectuéà un pH initial de 6,8, les valeurs respectives étaient pK'a1 = 4,0; pK'a2 = 5,3; pK1a3 = S,2; et pK'a^ = 10,5. L'analyse du sel monoammonique de A16886II a montré qu'il n'y avait pas de groupements méthoxyle,et, à la différence du facteur I, aucun signe attribuable au groupement méthoxyle n'a été 30 vu dans le spectre RMN du sel monoammonique de A16886II. Une détermination de la teneur en azote aminé• du sel monoammonique de l'antibiotique A16836II, par la méthode de Van Slyke, a donné une valeur de 5,1 % Le spectre RMN de A16886II dans D20 a présenté les caractéris-35 tiques suivantes : 5,67 ppm. (1H, doublet, J = 5 Hz); 5,15 ppm. (1H, doublet, J = 5 Hz); 4,90, 4,68 ppm.' (2H, AB quartet, J = 13 H.z) ; 3,9-3,7 (1H, multiplet); 3,69, 3,39 (2H, AB quartet, J = 18 Hz); 2,6-2,3 (2 H, multiplet); 2,1 - 1,5 (4H, multiplet). Le spectre d'absorption infrarouge du sel monoammonique 40 de l'antibiotique A16886II dans une bouillie d'huile minérale 70 2971B 6 2068490 est représenté par la Figure 2 des dessins d'accompagnement. Le spectre d* absorption ultraviolet du sel monoammonique de l'antibiotique A16886II en solution aqueuse présente un maximum 1 °/ d'absorption à 260 m (E ^ ^ - 148) ; le dichro'isme circulaire a 5 été également mesuré en solution aqueuse et a présenté un effet Cotton positif à 258 m ji et un effet Cotton négatif à 228 m jx. La chromatographie sur papier du sel monoammonique de 1 ' antibiotique A16886II sur papier p/hatman n° 1 a donné une valeur du R^ de 0,33 dans un système solvant de propanol, d'acétonitrile, 10 et d'eau dans un rapport en volume de 1:1:1. On a obtenu des bioautogrammos en mettant le chromatogramme sur papier sur des plaques d'agar ensemencées avec Salmonella gallinarum comme organisme test. Lorsque le sel monoammonique de A16886II est soumis à une 15 chromatographie en couche mince sur plaques de gel de silice dans 1'acétonitrile aqueuxà 70% en utilisant une méthode bioautogra-phique ou une pulvérisation à la ninhydrine comme révélateur,, il a une valeur du d'environ 0,42; sur plaques de cellulose dans le mélange acétonitrile:isopropanol:eau (1:1:1), en utilisant le 20 même mode opératoire pour révéler, il a une valeur du R^ de 0,29. L'analyse des amino acides d'un hydrolysat d'acide de l'antibiotique A16886II, effectuée par la technique de Spaclcman-Moore-Stain, n'a présenté principalement qu'un seul pic réagissant à la ninhydrine ; il a été élué juste avant la glycine et comme 2F dans le cas de l'antibiotique A16886I, il a été identifié comme étant l'acide 2-aminoadipique (2,1 ^jimoles/mg ). Cependant, il existait également un pic très faible qui a été élué de manière identique à la glycine. On a analysé un autre échantillon de la même manière et on a obtenu les valeurs de 2,1 ^umoles/mg et 30 0,13 ^unole/mg, respectivement. Outre ce qui précède, chacun des facteurs I et II du sel monoammonique de l'antibiotique A16886 a été soumis à une chromatographie sur papier et à une chromatographie en couche mince dans un certain nombre d'autres systèmes solvants en donnant les 35 résultats suivants : 70 2971B 2068490 Système solvant Chromatographie sur papier Ethanol : eau (80:20) avec 1,5% 5 de chlorure de sodium, papier imprégné de sulfate de sodium IN Butanol saturé d'eau Butanol saturé d'eau plus 2% d'acide p-toluènesulfonique 10 Méthylisobutylcétone saturée d'eau Méthylisobutylcétone saturée d'eau plus_2% d'acide p-toluène sulfonique Méthylisobutylcétone saturée d1eau plus 2% de pipéridine 15 Acétonitrile Propanol:acétonitrile rméthanol: eau (4:3:2:1) Propanol:pyridine:acide acétique: eau (15:10:3:12) 20 Propanol:pyridine:acide acétique: acétonitrile:eau (45:30:9:40:36) Butanol: acide acétique:eau (3:1:1) Acétate d'éthyle:acide acétique:eau (3:1:1) 25 Propanol:eau (70:30) Acétonitrile:eau (70:30) Eau:éthanol:acide acétique (70:42:6) Chromatographie en couche mince Acétonitrile:eau (7:3) sur 30 plaques de cellulose Valeur du R, Facteur I Facteur II 0,38 immobile 0,39 immobile immobile immobile immobile immobile 0,32 0,21 0,20 0, 29 0,17 0,72 0,82 0,35 0,33 immobile 0,32 immobile immobile immobile immobile immobile 0,27 0,15 0,17 0,22 0,17 0,65 0,82 0,29 L'antibiotique A16886 et ses sels ont une action inhibitrice sur la croissance des bactéries Gram-positives et Gram-négatives. Les concentrations auxquelles l'antibiotique A16886, sous forme d1 un mélange partiellement purifié des sels monoammoniques des 35 facteurs I et il, donne une inhibition de la croissance des 70 29718 2068490 organismes illustratifs, sont indiquées dans le Tableau I . Les concentrations inhibitrices ont été déterminées par le test de dilution sur agar ou par le test de dilution sur bouillon (identifiés dans le tableau par les lettres "a.d." et "b.d.", respectivement). 5 Dans le test de dilution sur agar, on a ensemencé l'organisme test en stries sur une série de plaques d'agar contenant diverses concentrations des sels monoammoniquesdes facteurs I et II de l'antibiotique A16886 pour déterminer les concentrations minimales en mcg/ml (microgrammes par millilitre) dans le substrat agar» 10 qui inhibaient la croissance de l'organisme en l'espace de quarante huit heures (soixante douze heures dans le cas des organismes pathogènes des végétaux). Dans le test de dilution sur bouillon, on a inoculé une série de tubes contenant des concentrations variées des sels monoammoni-15 ques des facteurs I et II de l'antibiotique A16886 avec l'organisme test pour déterminer la concentration minimale en mcg/ml dans le substrat bouillon, qui inhibait la croissance de l'organisme en l'espace d'environ vingt heures. TABLEAU I 20 Concentration inhibitrice Organisme test mcg/ml Escherichia coli 0127 0,39 b.d. Proteus PR-6 0,78 a.d. Salmonella tvphimurium S-4 0,78 a.d. 25 Klebsiella sp. K-l 1,56 a.d. Pseudomonas sp. X239 >100 a.d. Salmonella tvphosa T-63 0,78 b.d. Straphvlococcus aureus 3055 25,00 a.d. Streptococcus pvogenes C203 6,25 a.d. 30 Bacillus subtilis X12.1 1,56 a.d. Staphvlococcus aureus 3150 50,00 a.d. Dans aucun des essais précédents on n'a noté d'agglomération par le sérum de cheval. Comme on peut le voir d'après le tableau 35 précédent, l'antibiotique A16886 sous forme d'un mélange des sels monoammoniques des facteurs I et II, manifeste une activité vis-à-vis des organismes bactériens Gram-positifs et Gram-négatifs. On a encore déterminé l'activité antibactérienne de l'antibiotique A16886 dans un essai utilisant la méthode de diffusion des 40 disques de Bauer-Kirby. On a effectué l'évaluation sur les sels 70 29718 2068490 monoammoniques des facteurs I et II séparément. Les résultats, exprimés par la dimension en millimètres de la zone d'inhibition à une concentration donnée d'antibiotique, ont été ceux indiqués ci-après dans le Tableau II. TABLEAU II Facteur I yug/disque Organisme 30 10 5 Escherichia coli 0127 25, 6 20,7 18, 6 Escherichia coli EC 25 19, 6 15,1 12, 5 Proteus sp. PR6 23, 2 19,0 16, 7 Proteus sp. PR7 14, 0 10,4 0 Salmonella tvphosa SA 12 27, 2 22,8 19, 9 Salmonella typhosa SA 16 24, 2 19,6 16, 2 Klebsiella aerobacter KA 14 23, 0 18, 8 15, 4 Klebsiella aerobacter KA 25 22, 1 15,8 12, 3 Pseudomonas sp. Ps 24 23, 0 18, 2 15, 7 Pseudomonas sp. Ps 30 0 0 0 Staphvlococcus aureus 3055 0 0 0 Staphvlococcus aureus- 3074 0 0 0 -x- ' Colonies satellites à 1'intérieur de la 2f5 1,0 0,5 15,9 12,7 8,4 9,1 0 0 13,6 9, 9 0 • 0 0 0 16,9 11,3 8,0 13.1 9,3 0 11,4 7,6 0 9,0 O 0 13.2 10,1 0 0 ' 0 0 0 0 0 0 0 O Facteur II /«g/disque 30 10 5 2,5 1; o 0 19; 7 15, 9 12,9 9,4 0 0 11, 9 7,7 0 0 0 0 22, 2 16,7 13,6 10,4 0 0 7*1 0 0 0 0 0 23, 8 18,7 15,6 12,3 7,5 0 19,3 13,4 11,0 7,5 0 0 20,1 13,7 10,8 0 0 0 15, 6 10, 3. 7,4 0 0 0 20, 2 15,4 12, 3* !~9,3X" "o 0 0 0 0 0 0 0 12,4 0 0 0 0 0 10,1 0 0 0 0 0 d1 inhibition.. 70 2971R ii 2068490 L'antibiotique A16886 et ses sels manifestent également une activité in vivo vis-à-vis d'un certain nombre des organismes précédents et sont donc utiles pour lutter contre les infections provoquées par ces organismes chez les animaux hôtes. La toxicité 5 pour les mammifères est faible ? la DL5Q est ^>5- grammes/kilogramme, et l'administration sous-cutanée quotidienne de 350 milligrammes/ kilogramme à un groupe de 10 rats pendant une période de quatorze jours n'a entraîné aucun cas de décès et aucun signe appréciable de toxicité. L'antibiotique A16886, sous forme d'un- mélange des 10 sels monoammoniques des facteurs I et II, présentait les valeurs suivantes pour la DEgQ chez des souris infectées par les organismes respectifs : TABLEAU III DE Organisme 50 Escherichia coli 0127 13, ,8 (l'administration a été Salmonella tvphosa T-63 15, 6 effectuée .par voie Kiebsiella K—1 10, ,2 sous-cutanée) Proteus PR- •6 7, 3 ! 20 En outre, l'antibiotique A16886 et ses sels manifestent une activité vis-à-vis des bactéries pathogènes des végétaux. Ainsi, par exemple, l'antibiotique A16886 et ses sels viennent à bout des infections dues à des bactéries pathogènes des végétaux,telles que flétrissement bactérien, tavelure bactérienne, et brunissure 25 bactérienne. La manière précise d'appliquer l'antibiotique A1688S ou un de ses sels aux végétaux n'est pas essentielle. Généralement, le contact initial de l'organisme causatif se fait avec le feuillage de la plante ; pour cette raison, on préfère souvent faire une 30 application foliaire de l'antibiotique A16886 ou d*un de ses sels. Cependant, il se fait une translocation de l'antibiotique A16886 et de ses sels ? par conséquent, on peut également faire l'application aux tiges, fleurs, graines, racines, ou aux autres parties de la plante pour obtenir un effet bactéricide dans toute la plante. 35 La présente méthode pour lutter contre les bactéries pathogènes des végétaux consiste à appliquer à une plante exposée aux bactéries une quantité efficace de l'antibiotique A16886 ou d'un de ses sels. Il n'est pas essentiel pour cette méthode que l'antibiotique soit utilisé sous forme d'un facteur unique ; oh peut utiliser chacun 40 des facteurs I et II seul et obtenir de bons résultats. Sinon, on 70 29718 12 2068490 peut utiliser un mélange des facteurs. On peut utiliser l'antibiotique A16886 ou un de ses sels sans modification, mais lorsqu'il s'agit de traiter des végétaux on préfère généralement utiliser une formulation comprenant l'antibiotique A16886 ou un de 5 ses sels et un ou plusieurs adjuvants. Dans la préparation de ces formulations, on peut modifier 1'antibiotique A16886, ou son sel, avec de l'eau ou d'autres véhicules liquides, solvants, organiques, agents surfactifs comprenant des agents,surfactifs solides, ou des solides inertes, finement divisés ou des solides inertes, 10 granulés. La concentration exacte de l'antibiotique A16886 ou d'un de ses sels dans une telle formulation n'est pas essentielle et elle variera avec le besoin particulier pour lequel la formulation est conçue..Généralement,pour une application, foliaire pour lutter contre des infections typiques dues à des bactéries 15 pathogènes des végétaux,les concentrations de l'antibiotique A16886 ou d'un de ses sels allant de ÎO ppm à 1000 ppm, ou plus, donnent de bons résultats. Dans le cas de poudres_pour application foliaire,, les concentrations d'antibiotique préférées sont 0,1-10,0 pourcent. 20 Dans la préparation de formulations liquides, on peut combiner l'antibiotique A16886 ou un de ses sels avec un liquide convenable et un agent dispersant surfactif pour produire des concentrés qu'il est possible d'émulsionner que l'on peut ensuite diluer avec de l'eau ou un autre liquide pour former des mélanges pour pulvéri-25 sation. Les agents de dispersion préférés que l'on peut utiliser dans ces compositions comprennent les émusifiants non ioniques tels que les produits de condensation des oxydes d'alcoylène avec les acides minéraux, les dérivés polyoxyéthylène des esters de sorbitan, les alcools éthers complexes, etc... Les liquides organiques appropriés que l'on peut utiliser dans la composition comprennent les huiles «t les dietillata de.pétrole, le toluène, et les huiles organiques synthétiques. On utilise habituellement les agents de dispersion surfactifs dans des compositions liquides à raison de 0,1 à 20 pour cent en poids du poids combiné de l'agent dispersant 35 et du composé actif. Dans la préparation de compositions de poudre, on peut combiner l'antibiotique A16886 ou un de ses sels avec l'un quelconque des granulés ou solides finement divisés typiquement utilisés dans les formulations chimiques pour l'agriculture. Lorsqu'on opère selon la présente invention, l'antibiotique 40 A16886 ou un de ses sels ou une composition contenant l'antibiotique 70 29713 13 2068490 A16886 ou un de ses sels,peuvent être appliqués aux organismes contre lesquels on lutte, ou à leurs habitats de n'importe quelle manière commode, par exemple, à l'aide de pulvérisateurs ou de saupoudreurs manuels. On peut effectuer commodémment les applications 5 aux parties aériennes des végétaux avec des saupoudreurs de poudre, des pulvérisateurs à barre, des pulvérisateurs haute pression, et des pulvâriaatetirsL do brouillard. Dans les applications foliaires, les compositions utilisées ne doivent contenir aucune quantité appréciable de diluants phytotoxiques. Dans les opérations à 10 grande échelle, on peut appliquer des poudres ou des brouillards de volume faible à partir d'avions. Les Exemples 1-6 suivants illustreftt ce mode de réalisation de la présente invention et permettront à l'homme de l'art de pratiquer celle-ci. Dans chacun de ces exemples, on a utilisé 15 1Tantibiotique A16886 sous forme d'un mélange du sel monoammonique du facteur I et du sel monoammonique du facteur II. Exemple 1 ERWINIA AMYLOVORA ET PSEUDOMONAS SOLANACEARUM, IN VITRO On a déterminé la valeur de l'antibiotique Alè886 in vitro 20 pour l'inhibition d'Erwinia amvlovora et de Pseudomonas solanacearum. On a incorporé chacun des organismes séparément dans un milieu nutritif gélosé classique, et on a versé le milieu gélosé résultant dans plusieurs boîtes et on l'a laissé se solidifier. On a ensuite effectué le traitement, différentes boîtes étant traitées par des 25 méthodes différentes. Dans une méthode de traitement, on a mis à la pipette 0,1 millilitre de la solution d'essai dans chacun de deux petits cylindres d'acier placés verticalement sur une surface gélosée donnée. Dans l'autre méthode, on a imprégné 0,1 millilitre de la solution d'essai sur chacun de deux disques de 30 filtre que l'on a mis sur une surface gélosée donnée. Pour les deux méthodes de traitement on a préparé la solution d'essai en dissolvant la quantité appropriée de l'antibiotique A16886 dans de l'eau distillée dans du verre. Les résultats, exprimés par le diamètre de la zone d'inhibition, étaient ceux représentés dans 35 le tableau suivant : TABLEAU IV MESURE DU DIAMETRE DE LA ZONE D'INHIBITION EN MILLIMETRES A Cylindres d'acier Disques de filtré B Traitement E. amvlovora P. solanacearum E.amvlovorc P.solanacearum A16886 - 10 ppm. A16886 - 50 ppm. A16886 -100 ppm. Témoin (eau distillée) 6-6 12-14 15-16 6-6 16-17 25-25 30-30 6-6 13-13 16-17 20-20 13-13 A - y compris la taille du cylindre-6mm aucune inhibition de la croissance ,doncf une zone de 6mm n'itidiqra B - y compris la taille au disque de papier filtre - 13mm ? donc» une zone de 13mm n'indique aucune inhibition de la croissance. 20-21 30-30 34-35 13-13 -J O K> -O -4 K> O O- co 4S» -O o 70 29711 15 2068490 Exemple 2 PSEUDOMONAS SOLANACEARUM, PULVERISATION FOLIAIRE On a également déterminé la valeur de l'antibiotique A16S86 in vivo dans la lutte contre Pseudomonas solanacearum sur des 5 plants de tomates. Dans cette évaluation, on a formulé le sel monoammonique de l'antibiotique A16386 dans diverses formulations aqueuses contenant uniformément 1 pour cent d'éthanol et 0,1 pour cent d'un agent surfactif (un dérivé polyoxyéthylé de l'ester partiel d'un acide gras de l'anhydride du sorbitol) mais 10 contenant diverses concentrations de l'antibiotique A168S6. On a utilisé,dans 1'évaluation,des plants de tomates âgés de 30 jours, 2 plants/pot/traitement. On a traité les plants dans chaque pot avec l'une des solutions traitantes, on les a séchés à l'air, et ensuite on les a ensemencés avec un milieu 15 supportant un développement actif de Pseudomonas solanacearum. On a maintenu tous les plants pendant 24 heures dans une chambre humide, ensuite on les en a retirés et on les a maintenus 7 jours dans de bonnes conditions agricoles. A la fin de cette période de sept jours, on a examiné tous les plants pour déterminer 20 la présence, et si oui le degré d'infection. On a consigné les résultats dans le tableau suivant ; on a exprimé l'importance de la maladie avec une échelle de 0 à 4, O indiquant que l'on n'a pas été maître de la maladie, 4 indiquant que l'on en a été complètement maître, et chaque plant a été évalué séparément. 25 TABLEAU V Evaluation de la maladie due à Pseudomonas solanacearum Témoin (1 % EtOH + 0,1 % d'agent surfactif) O O 30 A16886 - 400 ppm. 2+ 3+ A16886 — 200 ppm. 2+ 2+ Les plants témoins ont présenté une infection par Pseudomonas solanacearum étendue. Exemple 3 35 PSEUDOMONAS GLYCINIA, MACERATION DES RACINES DENUDEES On a déterminé la valeur dé l'antibiotique A16886 dans la lutte contre Pseudomonas crlvcinia en faisant macérer' des racines dénudées dans des solutions contenant A16S86. On avait deux solutions de macération, l'une contenant 200 parties par million 40 d'antibiotique A16806, l'autre contenant 400 parties par million 70 2971B 16 2068490 d'antibiotique A16886. On a inoculé des plants de soja.âgés de dix jours avec Pseudomonas crlycinia, et on a maintenu les racines de tous les plants dans des solutions aqueuses tout au long de l'évaluation. Initialement, on a mis les plants inoculés 5 dans 50,millilitres de solution, un groupe de plants dans la solution à 200 ppm, un second groupe de plants dans la solution à 400 ppm, un troisième groupe de plants dans 1'eau pour servir de témoin. On a fait macérer les racines pendant 24 heures, en aérant pendant ce temps. Ensuite on a mis les plants, avec 10 les racines toujours dans les diverses solutions, à incuber pendant 24 heures. On a ensuite retiré les plants de la chambre d'incubation et on les a maintenus pendant une période d'une semaine. En commençant approximativement avec la période d'incubation et en continuant pendant toute la semaine, on a 15 ajouté aux racines une solution contenant des éléments nutritifs autant qu'il était nécessaire pour maintenir les plants dans un état viable. A la fin de la durée d'une semaine, on a examiné les plants pour déterminer l'importance du développement de Pseudomonas glycinia ; on a évalué la maladie avec 20 une échelle de 0 à 4, 0 indiquant que l'on n'a pas été maître de la maladie, 4 indiquant que l'on a été complètement maître de la maladie. Les résultats ont été ceux exposés dans le tableau suivant : TABLEAU VI 25 Evaluation de la maladie due à Pseudomonas crlvcinia Témoin 0 A16886 — 200 ppm. 3+ A16886 - 400 ppm. 2+ 30 Exemple 4 XAMTHOMOMAS PHASEOLI VAR. SOJENSIS, PULVERISATION FOLIAIRE Dans une première évaluation, on a inoculé des plants de soja âgés de dix jours en faisant légèrement tremper la surface foliaire inférieure des feuilles primaires dans une suspension 35 aqueuse de Xanthomonas phaseoli var. soiensis. Deux heures plus tard, on a pulvérisé le feuillage avec une solution de pulvérisation, un groupe de plants inoculés étant traité par une solution contenant 100 parties par million de l'antibiotique A16886 un second groupe, par une solution contenant 500 parties par 40 million de l'antibiotique A16886. On a formulé l'antibiotique 70 2971?» m 2068490 A16886 dr.ns do l'eau avec • * 353 parties par million d'un mélange de sulfonates émulsifiants liquides non ioniques. Dans une seconde évaluation/ on a pulvérisé le feuillage 5 de plants de soja âgés de dix jours avec une solution de pulvérisation contenant soit 100 soit 500 parties de l'antibiotique A16S86, et7 deux heures plus tard, on les a inoculés par le même mode opératoire que celui utilisé dans la première évaluation. La formulation de l'antibiotique A16886 était la 10 même que dans la première évaluation. On a maintenu les plants dans de bonnes conditions agricoles pendant une période d'environ 11 jours et ensuite on a regardé s'il y avait présence ou absence de Xanthomonas phaseoli var. sciensis. Les résultats ont été réunis dans le tableau 15 suivant, avec une échelle de 0 à 4 ayant la même signification que dans les exemples précédents. TABLEAU VII Valeur moyenne pour la maladie par groupe de plants traité. 2o Xanthomonas phaseoli var. soiensis Pulvérisation Inoculation puis puis inocula-pulvérisation tion Témoin (eau seule) 0 O 25 Témoin (eau + mélange d'émulsifiants) O 0 Â16886 - 100 ppm. 2 4 A16836 - 500 ppm. 3 + 4 Exemple 5 30 PSEUDOMONAS PHASEOLICOLA, PULVERISATION FOLIAIRE On a pulvérisé toutes les surfaces de plants de haricots d'Espagne rouges âgés de vingt jours avec une formulation aqueuse contenant 400 parties par million d'antibiotique A168C6, et 0,1 pour cent d'un agent surfactif (un dérivé polyoxyéthylé d'un 35 ester partiel d'acide gras de l'anhydride du sorbitol). On a laissé sécher les plants pulvérisés et ensuite on les a inoculés avec Pseudomonas phaseolicola ; on a effectué l'inoculation en faisant tremper la surface foliaire inférieur d'une foliole de chacune des première et seconde feuilles trifoliées dans une 40 suspension bactérienne aqueuse (30 pour cent de transmission de la lumière avec un appareil Bausch and Lomb Spectronic 20), 70 2971 P. 18 2068490 On a ensuite maintenu les plants dans une chambre humide pendant vingt quatre heures, puis on les a retirés et maintenus dans de bonnes conditions agricoles pendant 14 jours. A la fin de cette période, on a examiné toutes les plantes, dans le 5 groupe de plantes traité, on était modérément maître de Pseudomonas phaseocicola, tandis que dans le groupe témoin, il y avait un développement important de la maladie. Exemple 6 PSEUDOMONAS SOLANACEARUM, PULVERISATION SEPAREE DES FEUILLES 10 OU DES TIGES On a formulé l'antibiotique A16886 dans de l'eau avec un mélange de deux émulsifiants liquides non ioniques qui étaient des sulfonates, pour obtenir de-ox solutions traitantes, l'une contenant 100 parties par million de A16886, l'autre contenant 15 400 parties par million.de l'antibiotique A16886, et chacune contenant 353 parties par million du mélange émulsifiant. On a utilisé des groupes de plants de tomates âgés de 28 jours, ; dans une série d'évaluations,on a appliqué la solution aux tiges seulement, et dans la seconde série d'évaluations,on a appliqué la solution 20 seulement aux feuilles. Deux heures après le traitement selon l'une ou l'autre méthode, on a inoculé les plants en enfonçant un cure dents trempé dans une culture de Pseudomonas solanacearum en bouillon dans la tige au niveau des cotylédons. On a maintenu les plantes dans de bonnes conditions agricoles pendant 10 jours 25 et ensuite on les a examinées pour voir où en était la maladie. Les résultats avec une échelle de 0-4, avec 0 indiquant qu'il n'y a pas eu jugulation et 4 indiquant qu'il y a eu jugulation complète de la maladie, ont été les suivants î TABLEAU VIII 30 Evaluation de la maladie due à Pseudomonas solanacearum Traitement des feuilles Traitement des seulement tiges seulement Témoin (eau +353 ppm» de mélange d'émulsi-35 fiants) O 10 1 A16886 - 100 ppm. 3 4 . 3 4 A16886 - 400 ppm. 4 4 4 4 Comme il a été noté ci-dessus, l'antibiotique A16886 et ses sels présentent une activité anthelmintique en plus d'une 40 activité antibactérienne. On peut donc administrer l'antibiotique 70 2971H 19 •2068490 A16886 ou un de ses sels à des animaux à sang chaud pour lutter contre divers parasites internes, en particulier les vers stomachaux et intestinaux tels que Ascaris lumbricoides var. suum. Nematospiroides dubius, Aspiculuris tetraptera. 5 Syphacia obvelata, etc. Comme c'est le cas pour l'activité bactéricide, chaque facteur majeur manifeste une activité anthelmintique ; on obtient donc l'activité anthelmintique lorsqu'on utilise l'un ou l'autre facteur séparément, ou lorsqu'on utilise un mélange des facteurs. 10 On administre l'antibiotique A16886 ou un de ses sels de préférence par voie orale, par exemple, en incorporant l'antibiotique A16886 ou un de ses sels à l'alimentation animale, en administrant des comprimés, des breuvages, etc. En général, des doses de 1 à 500 milligrammes par kilogramme, 15 ou plus, de poids corporel de l'animal sont efficaces lorsqu'elles sont administrées en une seule dose. Lorsque l'antibiotique A16886 ou un de ses sels est fourni sous forme de constituant d'une alimentation régulière, des concentrations de 0,0001 à 0,05 pour cent, ou plus, donnent de bons résultats. Une gamme 20 de concentration préférée de l'antibiotique A16S86 ou d'un de ses sels dans les aliments est de 0,01 à 0,05 pour cent. L'activité anthelmintique de l'antibiotique A16886 est illustrée par les Exemples 7-9 suivants, dans chacun desquels on a utilisé l'antibiotique A16886 sous forme d'un mélange du 25 sel monoammonique du facteur I et du sel monoammonique du facteur II. Exemple 7 Dans une première évaluation, on a administré l'antibiotique A16886 en une seule dose en le donnant par gavage à chacune de 30 deux souris infectées par Aspiculuris tetraptera et Syphacia obvelata (oxyures vermiculaires). La dose était de 500 milligrammes d'antibiotique A16386 par kilogramme de poids corporel de chaque animal, administrée en une suspension de solution saline physiologique contenant 0,125 pour cent de méthylcellulose 35 comme agent de mise en suspension. On a utilisé, dans l'évaluation, un groupe témoin de six souris infectées par Aspiculuris tetraptera et Syphacia obvelata. On a maintenu les deux groupes dans des conditions normales de laboratoire pendant quarante huit heures après avoir administré la dose au groupe traité. 40 Ensuite on a sacrifié toutes les souris et on les a examinées 70 29718 20 2068490 pour déterminer la présence et les nombres d'oxyures vermiculaires, nombres qui étaient ceux indiqués dans le tableau suivant : TABLEAU XI Nombre d*oxyures par animal (moyenne) 5 * ' Aspiculuris tetraptera Syphacia obvelata Témoin 35 41 Antibiotique A16886 4,5 0,5 à 500 mg/kg. 70 2971R 2068490 Exemple 8 Dans une autre évaluation, on a mélangé l'antibiotique A16886 avec une alimentation classique pour souris afin d'obtenir diverses nourritures traitées, contenant l'antibiotique A16886 5 aux concentrations de 0,005, 0,01, et 0,05 pour cent en poids . On a utilisé les nourritures en régimes pour des groupes de souris séparés, cinq souris par groupe. Environ vingt quatre heures après le début de l'alimentation, on a infects les souris par Ascaris lunibricoides var. suum ova. On a alimenté un autre groupe 10 de cinq souris avec la nourriture ne contenant pas de médicament pour servir comme témoin mais on a infecté ce groupe de façon analogue, en même temps, par Ascaris lunibricoides var. suum. On a alimenté tous les groupes avec leur nourriture respective et on les a maintenus dans des conditions normales de laboratoire 15 pendant une période de dix jours, temps au bout duquel on a retiré la nourriture à toutes les souris. Le onzième jour, on a sacrifié toutes les souris et on a examiné les poumons pour déterminer la présence, et si oui, le nombre de lésions par Ascaris lunibricoides var. suum. 20 La concentration de 11 antibiotique A16886 dans le régime et le nombre moyen de lésions pulmonaires par animal à chaque groupe sont donnés dans le tableau suivant : TABLEAU XII Nombre moyen de lésions 25 Groupe . pulmonaires par groupe Témoin 2,0 Antibiotique A16886 à 0,005% 0,166 Antibiotique A16886 à O,01% 0,33 Antibiotique A16886 à 0,05% 0,0 30 Exemple 9 On a effectué une autre évaluation avec les modes opératoires rapportés dans l'Exemple 8, si ce n'est que l'on a modifié les concentrations. Les résultats ont été les suivants : TABLEAU XIII 35 Nombre moyen de lésions Groupe pulmonaires par groupe Témoin 2,2 Antibiotique A16886 à 0,0005 % 1,2 Antibiotique A16886 à O,001 % 0,1 40 Antibiotique A16886 à O,1 % O,2 70 29718 22 2068490 On peut préparer l'antibiotique A16886 en cultivant un organisme trouvé récemment et non décrit jusqu'ici, isolé d'échantillons de sol provenant d'Amérique du Sud. On a isolé l'organisme des échantillons de sol ci-dessus 5 en mettant des portions des échantillons de sol en suspension dans de l'eau distillée stérile, et en ensemençant les suspensions en stries sur gélose nutritive. On a mis les boîtes de gélose nutritive ensemencée .à l'incubation à environ 25-35°C pendant plusieurs jours. A la fin de la période d'incubation, on a repiqué 10 des colonies de l'organisme producteur de l'antibiotique A16886 avec une anse de platine stérile sur des tubes de gélose inclinée . Ensuite on a mis les tubes de gélose inclinée à l'incubation pour obtenir des quantités convenables d'inoculum pour la production d'antibiotique A16886. 15 II a été difficile de classer 1 ' actiiaomycète utilisée selon cette invention pour la production de l'antibiotique A16886 dans le genre Streptomycès en raison de la morphologie atypique de ses sporophores. Cependant, les données sur l'analyse de la membranne cellulaire indiquent que la culture doit être considérée comme une 20 espèce dans le genre Streptomyces. Par conséquent, on considère 1'organisme comme étant une nouvelle espèce et on lui donne le nom de Streptomyces clavuligerus. Cet organisme produit de manière caractéristique un réseau étendu d'hyphes courtes, aériennes, ramifiées en sympodes, 25 lesquelles se fragmentent éventuellement en spores. Il se forme des ramifications latérales courtes, en forme de massue qui produisent chacune habituellement de une à quatre spores.Il ne se forme p On a mis le nouvel organisme capable de produire l'antibiotique A16886 à la réserve permanente, sans restriction quant à la 40 disponibilité, avec la collection de culture de la Northern 70 2971 fi 23 2068490 Utilization Research and Development Division, Agricultural Research Service, U.S. Department of Agriculture (autrefois Northern Régional Research Laboratories), Peoria, Illinois, 61604, et le nouvel organisme est à la disposition du public 5 sous le nom de culture N° NRRL 3585. Les caractéristiques de Streptomyces clavuligerus NRRL 3585 sont données dans les tableaux suivants. On a utilisé les méthodes recommandées pour l'International Streptomyces Project (Shirling et al., "Methods for Characterization of Streptomyces Species", 10 Intern. Bull. Systemic Bacteriol. 16: 313-340, (1966))pour la caractérisation des espèces de Streptomyces, et on a également utilisé certains essais supplémentaires. On a attribué les noms de couleur selon la méthode ISCC-NBS décrite par Kelly et al. dans The ISCC-NBS Method of Designatinq Colors and a Dictionarv 15 of Color Names (U.S. Department of Commerce Cire. 553, Washington, D.C. 1955). Les lettres entre parenthèses se rapportent aux séries de couleur de Tresner et Backus (Tresner et al., "System of Color Wheels for Streptomyces Taxonomy", Appl. Microbiol.11: 335-338 /1963/) et les désiganations des- couIguîts sont 20 soulignées. Les ensembles de couleur de Maerz et Paul (Maerz et al., Dictionarv of Color (McGraw-Hill Book Co., Inc., New York, 1950) sont entre crochets. On a fait développer les cultures à 30°C pendant 14 jours sauf spécification contraire . TABLEAU XIV 25 Propriété observée Morphologie Caractéristiquesde A16886 35 30 Il se forme des sporophores sur un mycélium aérien étendu et ils consistent en ré-seaufxd'hyphes courtes, ramifiées en sympodes. Habituellement de une à quatre spores sont portées sur des ramifications latérales courtes, en forme de massues. Eventuellement les sporophores se segmentent pour former des chaînes de spores. Les spores mesurent 0,34 - O,85 yu x 0,85 x 3,3/J, en moyenne 0, 64/u x 1,5/u . La micrographie électronique révèle des spores à parois lisses. Il n'y a pas production de spores dans le mycélium du substrat. 70 2971B 24 2068490 TABLEAU XIV (SUITE) Caractéristiques cuitarales sur : ISP N°2 5 (Gélose levure-extrait de Malt) ISP N°3 (Gélose à la farine d'avoine) 10 ISP N°4 15 (Gélose sels minéraux-amidon) 20 ISP N°5 (Gélose glycérol-asparagine) 25 Gélose purée de tomate-farine d'avoine 30 Gélose d'Emerson 35 Gélose de Bennett 40 Gélose de Czapek Caractéristiques de A16886 Développement abondant, envers jaune grisâtre ^12K37;mycélium aérien abondant, gris foncé(G) 3ih / 21B1_7 ; pas de pigment soluble. Développement modéré, envers jaune pâle /Î1C17; mycélium aérien assez important, blanc (W) b /27A1/ ; pas de pigment soluble. Développement abondant, envers jaune grisâtre ^12B27; mycélium aérien modéré, gris moyen(GY) 2fe /55A17; pas de pigment soluble. Développement peu important, envers vert jaune pâle /Ï0Bl7 ; mycélium aérien peu important, blanc (W) a^ ; pas de pigment soluble. Développement abondant, envers jaune grisâtre /11E47 ; mycélium aérien modéré, légèrement olive grisâtre (GN) l-l/2ig /21Bl7 ; pas de pigment soluble. Développement abondant, envers jaune pâle /Ï1C17 ; mycélium aérien peu développé ; pas de pigment soluble. Développement abondant, envers jaune clair /11J27 ; mycélium aérien abondant, vert grisâtre foncé (GN) 24-l/2ih /23A37 ? pas de pigment soluble. Développement peu important. 70 2971R 25 206849Û TABLEAU XIV(SUITE) Caractéristiques culturales sur : Gélose glucose-asparagine Gélose à la tyrosine 10 Gélose nutritive 15 Malate de calcium 20 Action sur le lait Réduction des nitrates Liquéfaction de la gélatine 25 Réponse du développement aux variations de pH Caractéristiques de A16886 Développement modéré, envers vert jaune pâle /ÏOB17 ; mycélium aérien assez important, blanc (W) b /ïlh'y' ; pas de pigment soluble. Développement modéré, envers jaune pâle /Ï0B2/ ; mycélium aérien modéré, gris jaunâtre (GY) 2dc ^ÏOA2/; pas de pigment soluble. Développement assez important, envers vert jaune pâle /ÏOB1/; mycélium aérien épars, blanc ; pas de pigment soluble. Développement abondant, envers vert jaune pâle ^ÏOBl7 ; mycélium aérien assez important, blanc (W) a.. Pas de coagulation ; clarification en 17 jours. Négative Absente pH 5,0 - 6,0 dans la gamme optimale de développement ; développement mais pas de sporulation à partir de pH 7,5 - 8,5. 30 Production de mélanine Gélose peptone-fer et bouillon tryptone-extrait de levure Exigences de température 35 Constituants majeurs d'hydrolysats cellulaires entiers Absente Développement bon et sporulation bonne de 26 à 30° ; pas de développement à 37° ou au-dessus. Acide L, L-diaminopimélique, glycine, acide glufcamique, acide aspartique, alanine, et leucine. 70 2971 a 26 2068490 Dans le Tableau XV on donne les résultats des tests d'utilisation du carbone effectués sur l'organisme NRRL 3585. Dans ce tableau, on utilise les symboles suivants : + = développement et utilisation 5 r - = pas de développement, pas d'utilisation (+) = utilisation probable {-) = utilisation discutable. TABLEAU XV SCHEMA D'UTILISATION DU CARBONE POUR NRRL 3585 10 15 20 Composé Réponse du développement 25 Utilisation du carbone L-arabinose rhamnose fructose D-xylose mélézitose raffinose dextrose cellobiose maltose saccharose cellulose inositol mannitol glutamate de Na (-) (+). (+) 70 2971H 2068490 Comme indiqué précédemment, on peut produire l'antibiotique A16886 en cultivant NRRL 3585. Le milieu de culture utilisé lorsqu'on produit l'antibiotique A16886 en cultivant l'organisme identifié précédemment peut être l'un quelconque de plusieurs 5 milieux, bien que comme il ressort des tests d'utilisation décrits précédemment, l'organisme n'est capable que d'utiliser quelques sources de carbone dans des conditions de culture artificielles. L'homme de l'art comprendra que les organismes peuvent utiliser dans \an milieu complet des sources de carbone qui ne sont pas 10 utilisées dans ces conditions artificielles. Cependant, pour l'économie de la production, pour avoir un rendement maximal en antibiotique, et pour la facilité d'isolement de l'antibiotique, certaines sources nutritives relativement simples sont préférables. Par exemple, les milieux qui sont utiles dans la production de 15 l'antibiotique comprennent une source assimilable de carbone telle que glucose, amidon, glycérine, mélasses, dextrine, etc... Les sources de carbone préférées sont le glucose et le glycérol. De plus, les milieu;; utilisables comprennent une source d'azote assimilable telle que farine de soja, matières solides 20 de macération de maïs, levure, farine de graine de coton, extrait de boeuf, peptones (viande ou soja), caséine, mélanges d'amino-acides, etc... Les sources d'azote préférées sont les peptones, la farine de soja, les mélanges d'amino acides, etc... Parmi les sels minéraux nutritifs que l'on peut incorporer aux milieux de 25 culture se trouvent les sels habituels capables de fournir des ions sodium, potassium, ammonium, calcium, phosphate, sulfate, chlorure, carbonate, et ions analogues. On peut également incorporer au milieu de culture des éléments mineurs nécessaires à un développement et à une croissance optimals 30 de l'organisme utilisé pour la production de l'antibiotique A16886. Ces oligo-éléments interviennent habituellement sous forme d'impuretés qui se trouvent dans les autres constituants du milieu en quantités suffisantes pour répondre aux exigences de développement des actinomycètes utilisés dans cette invention. 35 On peut faire varier le pH initial du milieu de culture. Cependant, on a trouvé qu'il était souhaitable que le pH initial du milieu soit compris entre 6,5 et 7,2. Comme il a été observé avec d'autres actinomycètes, le pH du milieu augmente progressivement tout au long de la période de développement de l'organisme 40 pendant qu'il y a production de l'antibiotique, et il peut 70 2971B 28 2068490 atteindre une valeur de 6,7 à 7,5 ou plus, le pH final étant fonction au moins en partie du pH initial du milieu, des tampons présents dans le milieu, et de la durée pendant laquelle on laisse se développer l'organisme. 5 Les conditions de culture en immersion, en aérobiose, sont les conditions de choix pour la production de l'antibiotique A16886. pour la préparation de quantités relativement petites, on peut utiliser la culture en flacon agité et la culture en surface dans des bouteilles; mais pour la préparation de grandes 10 quantités, on préfère la culture immergée aérobie dans des réservoirs stériles. On peut ensemencer le milieu contenu dans le réservoir stérile avec une suspension sporulée; mais en raison du retard de développement rencontré lorsqu'on utilise une suspension sporulée comme inoculum, on préfère la forme végétative de la 15 culture. En évitant ainsi le retard de développement, on réalise une utilisation plus efficace de l'équipement de fermentation. Par conséquent, il est souhaitable de produire tout d'abord un inoculum végétatif de l'organisme en ensemençant une quantité relativement petite de milieu de culture avec la forme spore' de 20 l'organisme; et lorsqu'on a obtenu un inoculum végétatif actif, jeune, de repiquer 1'inoculum végétatif aseptiquement dans un grand réservoir. Le milieu dans lequel on produit 1'inoculum végétatif peut être soit identique soit différent du milieu utilisé pour la production de l'antibiotique A16886 à grande échelle. 25 L'organisme qui produit l'antibiotique A16886 se développe dans une large gamme de température entre 25 et 37° C. La production optimale de A16886 semble avoir lieu a des températures de 26-30° C. En général, la production maximale de l'antibiotique a lieu environ dans les 36-72 heures après l'ensemencement du 30 milieu de culture. Comme c'est l'habitude dans les procédés de culture immergée, aérobie, on insuffle de l'air stérile dans le milieu de culture. Pour avoir une croissance efficace de l'organisme et une production convenable d'antibiotique A16886, on utilise dans la 35 production de A16886 en réservoir un volume d'air de 0,2 à 0,4 volume d'air par minute par volume de milieu de culture. Le volume préféré est 0,40 volume d'air par minute par volume de milieu de culture. On peut suivre la concentration de 1'activité antibiotique 40 dans le milieu de culture pendant la période dé fermentation en 70 2971H 29 2068490 déterminant l'activité inhibitrice d'échantillons du milieu de culture vis-à-vis du développement d'organismes connus pour être inhibés par la présence de l'antibiotique A16886. On a trouvé que dans ce but les organismes E. coli, Salmonella gallinarum, et 5 Pseudomonas solanacearum étaient utiles. On peut effectuer." les essais sur les échantillons par les méthodes bien connues de turbidimétrie ou dos plaques-crapules. En général, la production maximale de A16886 a lieu dans les un à trois jours après l'inoculation du milieu de culture dans les 10 procédés de culture immergée aérobie ou de culture en flacon agité. L'activité antibiotique produite pendant la fermentation de A16886 a lieu essentiellement dans le bouillon antibiotique. Par conséquent, les techniques d'isolement utilisées dans la production de A16886 sont conçues pour permettre une récupération maximale 15 de l'antibiotique à partir du bouillon. Ainsi, par exemple, on retire le mycélium et les solides non dissous du bouillon de fermentation par des moyens classiques tels que filtration ou centrifuga-tion, et on peut récupérer l'antibiotique A16886 du bouillon filtré ou centrifugé en utilisant des techniques d'extraction ou d'adsorp-20 tion. Pour récupérer A16886 par des techniques d'adsorption, on peut utiliser divers adsorbants et résines échangeuses d'ions, par exemple, carbone, gel de silice, alumine, cellulose microcristalline, et des résines échangeuses d'ions. L'antibiotique 25 A16886, tel qu'il est obtenu à partir d'une fermentation, peut être soit sous forme amphotère soit sous forme de sel, selon les conditions de fermentation.Quelle que soit la forme obtenue, on peut l'adsorber sur un des adsorbants ci-dessus ou sur un adsorbant similaire à partir de la solution dans un solvant approprié. On 30 peut ensuite éluer l'antibiotique A16886, ou son sel, adsorbé à partir de 1'adsorbant par des techniques d'élution appropriées, telles qu'en lavant 1'adsorbant sur lequel l'antibiotique A16886 ou son sel est adsorbé par 1'adsorbant. Dans les cas où on effectue l'élution par lavage avec une solution par exemple de formate 35 d'ammonium ou d'acétate de sodium, le procédé résulte en l'élution de l'antibiotique A16886 sous forme du sel d'ammonium ou de sodium, respectivement. On retransforme facilement ces sels en antibiotique A16886 par des modes opératoires classiques. On prépare les sels de l'antibiotique A16886 autres que les 40 sels d'ammonium ou de métaux alcalins de préférence en faisant 70 29718 30 2068490 réagir de manière classique l'antibiotique A16886 sous forme amphotère non modifiée avec l'acide ou la base respectifs. Ainsi, lorsqu'on prépare les sels d'addition d'acide, on fait réagir l'antibiotique A16886 avec un acide minéral ou organique. Les 5 acides représentatifs appropriés comprennent l'acide chlorhydrique, 1'acide broirihydrique, 1'acide iodhydrique, 1'acide suifurique, 11acide phosphorique, 11acide acétique, 1'acide benzoïque, 11 acide sulfamique, l'acide tartrique, l'acide citrique, l'acide maléique, l'acide succinique, l'acide ascorbique, et l'acide glycolique. 10 L'antibiotique A16886 forme également des sels avec les cations par réaction de A16886 sous forme amphotère non modifiée avec des bases minérales et organiques et des sels minéraux et organiques. Comme exemples de ces sels se trouvent les sels d'ammonium et d'ammonium substitué; les sels des métaux alcalins tels 15 que sodium, potassium, lihtium, césium et rubidium; et les sels des métaux alcalino-terreux tels que calcium, strontium et baryum; les sels de cuivre, 'de zinc, de magnésium et d'argent. Dans le cas des bases organiques, l'identité de la base n'est pas essentiel, bien que l'on préfère généralement une base ayant un pH numérique 20 de 3,0 ou plus dans l'eau. Les bases organiques représentatives appropriées comprennent la benzylamine, la méthylamine, la diéthy-lamine, la triéthylamine, la procaîne, la diisopropylamine, 1'éthanolamine, la cyclohexylamine, la dicyclohexylamine, la diphénylamine, la di-n-butylamine, la quinoléine et la 25 pyridylamine. Pour les applications pharmaceutiques on préfère généralement les sels de l'antibiotique A16886 qui sont pharmaceutiquement acceptables. Cependant, tous les sels sont utiles comme intermédiaires dans la production, la séparation et la purification de 30 l'antibiotique A16886. Pour les besoins thérapeutiques, les sels pharmaceutiquement acceptables sont généralement équivalents à l'antibiotique A16886; cependant, on préfère à l'occasion des sels particuliers en raison d'une propriété favorable telle que solubilité, conférée par la partie génératrice du sel. 35 Afin d'illustrer plus complètement l'opération de l'invention, on fournit les exemples supplémentaires suivants à l'aide de l'illustration. Exemple lo PRODUCTION DE L'ANTIBIOTIQUE A168S6 EN FLACON AGITE 40 On a produit une culture sporulée de Streptomyces 70 29713 31 2068490 clavuligerus NRRL 3585 en cultivant l'organisme sur un tube de gélose nutritive inclinée ayant la composition suivante : Dextrine Extrait de levure 10,00 g 1,00 g 5 Caséine hydrolysée ("N-Z Aminé-Type A", Sheffield Chemical Company) Extrait de boeuf Agar de mer (lavé trois fois) 2,00 g 1,00 g 20,00 g 1 litre 10 Eau désionisée On a ajusté le pH du milieu à 7,0 en ajoutant de l'hydroxyde de sodium. On a inoculé le tube de gélose inclinéeavec des spores de Streptomyces clavuligerus NRRL 3505 et on l'a mis à l'incubation 15 pendant 4-6 jours à 30°C. On a ensuite recouvert la gélose inclinée d'eau distillée stérile et on l'a grattée doucement pour en détacher les spores et les cellules sous forme d'une suspension aqueuse. On a utilisé 1 ml de la suspension résultante pour ensemencer chaque portion de 100 ml d'un milieu végétatif ayant la 20 composition suivante : Glucose 15,00 g Farine de soja 15,00 g Solides de macération de maïs 5,00 g Carbonate de calcium 2,00 g 25 Chlorure de sodium 5,00 g Eau désionisée 1 litre On a ajusté le pH du milieu végétatif à 6,7 en ajoutant de l'hydroxyde de sodium. 30 sur une secoueuse à mouvement de va-et-vient décrivant un arc de 5 cm à 108 tpm. On a ensuite utilisé 1'inoculum ainsi préparé dans la production de l'antibiotique A16806 de la manière qui suit. On a agité 1'inoculum végétatif pendant 24-48 heures à 30°C On a préparé un milieu de production ayant la composition 35 suivante : Farine de soja Caséine Nitrate de sodium Sirop de glucose (50 % de 15,00 g 1,00 g 3,00 g 40 glucose) Eau du robinet 20,00 g 1 litre 70 2971n 32 2068490 On a mis des portions de 100 millilitres du milieu de production dans des flacons d'Erlenmeyer de 500 millilitres que l'on a stérilisés à 120° C pendant 30 minutes. Lorsqu'ils ont été refroidis, on a ensemencé chaque flacon avec vin inoculum végétatif 5 à 5 %. On a agité le milieu de fermentation pendant 48-72 heures à 25-30° C sur une secoueuse rotative opérant à 250 tpm. Pendant la fermentation, on a aéré le milieu avec de l'air stérile à raison de 0,4 v/v/mn. On a effectué l'isolement essentiellement comme il est rapporté ci-après dans l'Exemple 13. . : \ \ \ \ 70 297m 33 2068490 Exemple 11 On a produit l'antibiotique A16886 selon le procédé de l'Exemple 10, mais en utilisant un milieu de production ayant la composition suivante : 5 Solubles de distillerie (Nadrisol) 5,00 g Farine de soja (Nutrisoy 200D) 5,00 g Farine de cacahuètes 5,00 g Mélasses noires et épaisses 5,00 g Farine d'avoine O O m g 10 Glycérol 10,00 g Eau du robinet 1 litre et en utilisant, à la place d'une secoueuse rotativeune secoueuse à mouvement de va-et-vient opérant à 108 coups par minute. Exemple 12 15 On a produit l'antibiotique A16886 selon le procédé de l'Exemple 10, mais en utilisant un milieu de production ayant la composition suivante : Farine d'avoine 20,00 g Glycérol 10,00 g 20 Eau du robinet 1 litre Exemple 13 On a produit l'antibiotique AI68S6 selon le procédé de l'Exemple 10, mais en utilisant un milieu de production ayant la composition suivante ï 25 Farine de graine de coton 20,00 g Glycérol 10,00 g Glucose 5,00 g Eau du robinet 1 litre Exemple 14 30 On a produit l'antibiotique A16886 selon le procédé de l'Exemple 10, mais en utilisant un milieu de production ayant la composition suivante : Glucose 20,00 g Amidon soluble , 10,00 g 35 Peptone (Wilson 159) 30,00 g Caséine hydrolysée ("N-Z-amine-type A" vendue par la Sheffield Chemical Company) 4,00 g Sulfate de magnésium heptahydraté 5,00 g Mélasses noires et épaisses 5,00 g 70 297in 34 2068490 Carbonate de calcium 2,00 g Eau du robinet 1100 ml Exemple 15 On a produit l'antibiotique A16886 selon le procédé de 5 l'Exemplë 10, mais en utilisant un milieu de production ayant la composition suivante : Glycérol 20,00 g Peptone de soja 5,00 g Nitrate de calcium 2,00 g 10 Chlorure de sodium 0,50 g Nadrisol 3,00 g Eau du robinet 1 litre Exemple 16 On a effectué une autre culture sporulée de Streptomyces 15 clavuligerus NRRL 3585 en cultivant l'organisme sur un tube de gélose nutritive .inclinée. Dans ce cas la gélose inclinée avait la composition suivante : Dextrine 10,00 g Extrait de levure 1,00 g 20 Caséine hydrolysée ("N-Z-amine-type A") (Sheffield Chemical Company) 2,00 g Extrait de boeuf 1,00 g Chlorure de calcium heptahydraté 0,01 g 25 Agar de mer 20,00 g Eau désionisée 1 litre On a ajusté le pH du milieu à 7,0 en ajoutant de l'hydroxyde de sodium. On a inoculé le tube de gélose inclinas avec des spores 30 de Streptomyces clavuligerus NRRL 3585 et on l'a mis à l'incubation 7-10 jours à 30°C. On a ensuite gratté la gélose inclinée pour en détacher les spores auxquelles on a ajouté 2,0 ml de sérum de boeuf stérile. On a ensuite transféré 0,1 ml de la suspension résultante de spores dans le sérum dans un tube 35 séché stérile et on l'a lyophilysée sous la forme de pastilles. On a utilisé les pastilles ainsi obtenues pour ensemencer un milieu végétatif ayant la composition suivante : Glycérol 10,00 g Saccharose 20,00 g 40 Gruaux de Nutrisoy 15,00 g 70 29718 35 2068490 Ambre BÏF 300 5,00 g Tryptone 5,00 g Phosphate monopotassique 0,20 g Eau du robinet 1 litre 5 Le pH du milieu était de 6,2 et on l'a ajusté à 6,5 avec de l'hydroxyde de sodium. Exemple 17 PRODUCTION DE L'ANTIBIOTIQUE A16836 EN INSTALLATION PILOTE A un fermenteur de 40 litres, en acier inoxydable, on a 10 ajouté 24 litres d'un milieu ayant la composition suivante : Anti-mousse A (agent anti-moussant vendu par la Dow Corning Company) 5,00 g Amidon 112 5,00 g Nadrisol 125,00 g 15 Gruaux de farine de soja 500,00 g Glycérol 187,50 g N-Z aminé A 125,00 g Sulfate ferreux heptahydraté 2,50 g Eau froide du robinet q.s.p. 24 litres 20 Le pH initial était de 5,9 et on l'a ajusté à 6,5 avec approximativement 20 ml d'hydroxyde de sodium 5N. On a stérilisé le milieu pendant 30 minutes à 120°C et 2-2,4 atm., on l'a refroidi, et ensuite on l'a ensemencé avec un inoculum végétatif à cinq pour cent obtenu comme dans l'Exemple 16. On a effectué la 25 fermentation à 30°C pendant 66 heures, on a aéré avec de l'air stérile à raison de 0,35 v/v/min, et on a agité avec un agitateur mécanique fonctionnant à 420 tours par minute. Le pH final était 6,3. On a récupéré l'antibiotique A16386 du bouillon en suivant 30 le mode opératoire d'isolement exposé dans l'Exemple 18. Exemple 18 ISOLEMENT DE L'ANTIBIOTIQUE A16886 BRUT SOUS FORME DE SEL MONOAMMONIQUE On a filtré approximativement 75 litres de bouillon obtenu 35 comme il est rapporté dans l'Exemple 17, en s'aidant de Hyflo Super-Cel (une terre à diatomées vendue par Johns-Manville Products), 5 grammes pour 100 millilitres. On a fait passer le filtrat de bouillon sur une colonne de 9,5 cm x 130 cm garnie de 8 litres de carbone (Pittsburgh 12 x 40), à raison de 60 ml 40 par minute. On a lavé la colonne avec 10 litres d'eau désionisée 70 2971H 36 2068490 (pH 5,2) et on a séparé l'activité adsorbée sur le carbone en faisant passer de l'acétone aqueuse à 50 pour cent sur la colonne. On a réuni les fractions contenant l'activité, on a concentré sous vide pour éliminer l'acétone, et on a appliqué 5 à une colonne de 9,5 cm x 140 cm garnie de Dowex 1-X1 (une résine échangeuse d'anions fortement basique, vendue £>ar The Dow Chemical Co.), sous la forme formate. On a lavé la colonne avec 10 litres d'eau désionisée, et on a séparé l'activité avec du formate d'ammonium 0,1M. On a réuni les 10 fractions actives, et on les a passées sur une colonne de 9,5 cm x 100 cm garnie de carbone (Pittsburgh 12 x 40),à raison de 60 ml par minute. On a lavé la colonne à l'eau ; et ensuite on a élué 1'activité avec un mélange 1:4 d'acétonejeau à 60 ml par minute, ce qui a donné 15 fractions de deux litres, et ensuite 15 avec un mélange 1:1 d1acétone:eau, ce qui a donné 18 fractions de un litre. On a réuni les fractions actives, on les a concentrées sous vide pour éliminer l'acétone, et on les a lyophilysées. On a extrait quarante grammes des préparations lyophilysées réunies, chaque préparation étant celle dont il a été question 20 précédemment, par 4 litres de méthanol en faisant une agitation magnétique pendant 16 heures ; on a séparé les insolubles dans le méthanol par filtration et on a précipité la portion soluble dans le méthanol par 5 volumes d'acétone. On a sépare le précipité par filtration et on l'a séché. Le rendement était 25 20,6 grammes. On a dissous cette préparation dans un minimum d'eau et on l*a passée sur une colonne de 5,8 cm x 120 cm garnie de dextrane (Sephadex G-25) à raison de 1 ml par minute. On a séparé l'activité par élution par de l'eau désionisée, et on a 30 réuni les fractions actives et on les a lyophilysées. On a dissous 10 grammes de la substance obtenue comme il a été décrit dans 256 ml de mélange acétonitrile:eau (55:45) et on a appliqué à une colonne de 5,5 cm x 85 cm garnie de gel de silice préparé dans un solvant acétonitrile:eau (7:3). 35 L'application a été faite à raison de 3 ml par minute. Après application de l'échantillon, on a élué la colonne par un mélange acétonitrile:eau (7:3) à raison de 5 ml par minute. On a réuni les fractions les plus actives, on les a concentrées à sec sous vide, et lyophilysées. 40 La matière ainsi obtenue était un mélange des sels 70 2971H 37 2068490 monoammoniques des facteurs I et II ; on l'a utilisée dans les déterminations de l'activité antibactérienne et anthelmintique exposées précédemment, ainsi que dans les modes opératoires de séparation et de purification exposés ci-après. 5 Exemple 19 SEPARATION DES FACTEURS I ET II DU SEL MONOAMMONIQUE DE L'ANTIBIOTIQUE A16886 On a dissous 10 grammes d'une préparation préparée comme il est décrit dans l'Exemple 18 dans 197 millilitres de 10 mélange acétonitrile:eau (55:45) et on a appliqué à une colonne de 4,0 cm x 130 cm garnie de 1,6 litre de cellulose microcristalline (Avicel) dans un mélange acétonitrile:eau (7:3). On a chargé la colonne à raison de 1 ml par minute, et on l'a éluée à raison de 2 ml par minute par un mélange acétonitrile:èau (7:3). 15 On a suivi l'élution par titrage et chromatographie sur papier. Comme résultat de l'élution on a obtenu plusieurs fractions contenant chacune une prédominance d'un facteur. On a rassemblé les fractions des facteurs respectifs et on les a lyophilysées. Exemple 20 20 PREPARATION DU CHLORHYDRATE DE L'ANTIBIOTIQUE. A16886I On a dissous le sel monoammonique de l'antibiotique A16886I, préparé et séparé selon les exemples précédents (200 milligrammes), dans 2 ml d'eau. Le pH de la solution était initialement 5,30 ; on a ajusté la solution à pH 2,0 par HC1 IN et ensuite on l'a 25 concentrés sous pression réduite, presque à sec. On a ajouté de l'eau (0,5 ml) et du méthanol (1,5 ml)» et on a précipité le sel chlorhydrate désiré en ajoutant dix volumes d'acétone. On a séparé par filtration le chlorhydrate de l'antibiotique A16886I précipité, on l'a lavé à l'acétone, et séché. L'analyse 30 a donné 4,50 pour cent de chlore. Le titrage électrométrique du produit dans une solution diméthylformamide-eau à 66 pour cent à un pH initial de 5,0 a révélé la présence de trois groupements titrables : pK'a^ =3,6 ; pK'a2 = 5,2 ; et pK'a^ = 10,8. 3 5 Exemple 21 PREPARATION DU SEL DISODIQUE DE L'ANTIBIOTIQUE A16886I On a dissous dans 2 ml d'eau le sel monoammonique de l'antibiotique A 168861 (200 mg), préparé et séparé selon les exemples précédents. Le pH initial était 5,30. On a ensuite 40 ajusté la solution à pH 10,50 par NaOH 2,5 N et on l'a concentrée 70 2971B 38 2068490 presque à sec, sous pression réduite. On a ajouté du méthanol (1,5 ml) et on a précipité le sel par dix volumes d1acétone. On a séparé par filtration le sel disodique de l'antibiotique A16886I précipité, et on l'a lavé à l'acétone, et séché. 5 L'analyse a donné 6,79 pour cent de sodium. Exemple 22 PREPARATION DE L'ANTIBIOTIQUE A168G6 SOUS FORME D'ACIDE On a dissous dans 40 millilitres d'eau deux cents milligrammes d'un mélange du sel monoammonique de l'antibiotique A16886I et 10 du sel monoammonique de l'antibiotique A16886II, et on a ajouté 6 millilitres de résine (H+) Dowex 50W-X12 (vendue par la Dow Chemical Co.). On a agité le mélange pendant trente minutes et on l'a filtré en utilisant ur. entonnoir de verre fritté moyen, et on a lyophilysé le filtrat (pH 2,65). 15 Un titrage électrométrique dans une solution de diméthyl- formamide et d'eau à 66 pour cent à un pH initial de 4,30 a révélé la présence de trois groupements titrables : pK'a^ = 4,2 ? pK*a2 =5,6 ; et pK'a^ =10,4. _ 70 29718 39 2068490 REVENDICATIONS 1. L'antibiotique A168861, l'antibiotique A16886II, et/ou un de leurs sels, le sel monoammonique de chaque antibiotique étant caractérisé comme un solide amorphe, duveteux, d'un blanc 5 légèrement sale, se ramolissant entre 190° et 300°C. avec un changement de couleur vers le brun foncé; qui est très soluble dans l'eau, légèrement soluble dans les alcanols inférieurs, et insoluble dans 1'acétonitrile; et qui est amphotère; et le sel monoammonique de A16886I étant encore caractérisé en ce qu'il a quatre 10 groupements titrables de pK'a^ =4,1; pK'a£ = 5,2; pK*a^ = 9,3; et pK'a^ = 10,5; ua poids moléculaire apparent d'environ 530 tel que déterminé à partir des données du titrage; la composition approximative de 40,26 pour cent de carbone, 5,91 pour cent d'hydrogène, 13,98 pour cent d'azote, 33,37 pour cent d'oxygène, cent 15 et 7,21 pour/de soufre; pouvoir rotatoire spécifique optique, —'25 de + 153,6° (C = 1 pour cent pds./v. dans l'eau); et ayant, dans une bouillie d'huile minérale, les bandes suivantes qui peuvent être distinguées dans son spectre d'absorption infrarouge aux longueurs d'onde suivantes, exprimées en microns : 20 3,10, 5,68, 6,30, 6,60, 7,20, 7,60, 8,83, 9,35, 9,60, 9,85, 11,60, et 12,90; et le sel monoammonique de A16886II étant encore caractérisé en ce qu'il a quatre groupements titrables de pK'a^ = 4,0; pK'a^ = 5,3, et pK'a^ = 9,2; et pK'a^ =10,5; un poids moléculaire apparent d'environ 528 tel que déterminé à 25 partir des données du titrage; la composition approximative de 41,01 pour cent de carbone, 5,64 pour cent d'hydrogène, 15,75 pour cent d'azote, 29,28 pour cent d'oxygène, et 7,04%de soufre; 25 un pouvoir rotatoire spécifique optique, /a/d de + 86,2° (C = 1 pour cent, pds./v. dans l'eau); et ayant, dans une bouillie 30 d'huile minérale, les bandes suivantes qui peuvent être distinguées dans son spectre d'absorption infrarouge aux longueurs d'onde suivantes, exprimées en microns- 3,15, 5,70, 6,30, 7,22, 7,64, 9,05, 9,40, 9,65, et 11,60. 2. Procédé de production de l'antibiotique A16886I et/ou 35 A16886II tel que défini par la revendication 1, lequel procédé est caractérisé par le fait que l'on cultive Streptomyces clavuligerus NRRL 3585 dans un milieu de culture contenant des sources assimilables de carbone, d'azote, et des sels minéraux dans des conditions d'immersion aérobies jusqu'à ce que ledit organisme 40 ait produit une quantité substantielle de A16886I et/ou de A16886II 70 29718 40 2068490 dans ledit milieu de culture. 3. Le procédé de la revendication 2, caractérisé en ce que l'on maintient le milieu de culture à une température d'approximativement 25°C à approximativement 37°C, et en ce que on laisse 5 le développement de l'organisme se poursuivre pour une durée d'approximativement 36 à 72 heures. 4. Le procédé de la revendication 2 où 3, qui est encore caractérisé par le fait que l'on récupère l'antibiotique A16886I et/ou A16886II dudit milieu de culture. 10 5. Méthode de lutte contre une bactérie pathogène des végé taux, qui est caractérisée par le fait que l'on applique à une plante exposée à la bactérie une quantité efficace d'antibiotique A16886I ou d'un de ses sels, ou d'antibiotique AÏ6886II ou d'un de ses sels tels qu'ils sont définis par la revendication 1. 15 6. Une composition horticole caractérisée en ce. qu'elle comporte (1) l'antibiotique A16886I ou un de ses sels, et/ou l'antibiotique A16886II ou un de ses sels, tels qu'ils sont définis par la revendication 1, et (2) un agent surfactif.