FR 2070050 A1 19710910 FR 6909609 A 19690331 69 09609 -1- 2070050 L'invention concerne un procédé de préparation de mélanges de lysolécithine contenant une forte proportion d'acides gras insaturés, à partir de la phosphatidylcholine c'est-à-dire d'une lécithine d'origine végétale ou animale. 5 La lysolécithine est une lécithine rendue hydrosoluble par élimination d'un radical d'acide gras. Antérieurement, os. la préparait en hydrolysant la lécithine chimiquement pure par voie enzymatique au moyen de la pkosph©lipase A du venin de serpent. Il est connu aussi de fabriquer une jEcno-Êlêyl-lys©Xé-= 10 cithine synthétique, composé qui* l©rs des études phsrii®e©l©«= giques, s'est montré capable d'améliorer 1® e©ntrs©tilitê dm coeur. Dans l'hydrolyse enz-ymatique eonnue de la lécithine aia moyen de phospholipase A, il se sépare essentiellement 1°acide 15 gras qui se trouve en position p du radical glycérol. Etant d©m~ né que les acides gras insaturés de la lécithine se trouvent essentiellement en cette même position pss on n8obtient d©ne„ par la méthode enzymatique connue » qu'une lysolécithine relativement pauvre en acides gras insaturés. 20 Gomme on le sait, les acides gras insaturés et en parti culier polyinsaturés ont Justement une grande importance peur 1® application thérapeutique des lécitinine s et esest pourquoi ©n désire depuis longtemps préparer des lysoléeitMnes ayant un® forte teneur en acides gréa inssturés. Etant donné la fragilité 25 des acides gras polyinsaturés 9 mne synthèse m8 est pratiquement pas possible. Les essais effectués peur obtenir ée telles lygelé-cithines en hydrolysant de façon non spécifique les lêeitfeineg en milieu aqueux au moyen d'acides ou d'hydrcxydes alcalins m°©nt pas eu de succès car il se forme essentiellement de la glycéryl-30 phosphorylcholine par séparation des deux acides gras, ou mixte% il se produit une hydrolyse allant jusqu'à l'acide glycérophes-phorique par séparation du radical choline également. De façon surprenante, on a constaté maintenant que par une alcoolyse modérée on obtient des lysolécithines nouvelles 35 inconnues antérieurement dans lesquelles le pourcentage d'acides gras insaturés correspond au moins à celui de la matière première0 Suivant l'invention, le procédé de préparation de lysolécithine à forte teneur en acides gras insaturés ou de mélanges contenant principalement cette lysolécithine et aussi de la lécithine, ©m 40 de la lécithine et de la glycérylphosphorylcholine, à partir de ~BAD ORIGNAL1 69 09609 -2- 2070050 lécithine chimiquement pure par élimination d'un radical d'acide gras consiste à prendre une solution alcoolique de la lécithine, à la traiter par un alcali faible à des températures comprises entre 10°C et le point d'ébullition sous un gaz inerte protec-5 teur, à l'abri de la lumière, de l'air et de l'humidité, puis à neutraliser la solution, à séparer les esters d'acide gras formés par dialyse vis-à-vis de 1'éther de pétrole ou par extraction répété® à l'seétoa®, puis, dans le cas où l'on prépara une lysoléeitliiae por©9 à traiter le mélange par le dichloréthane 10 &u 1© dichloréthylène pour éliminer la glyc érylphosphoryl-eholine forcée et à isoler la lysolécithine de façon connue En décomposant de façon spécialement chimique la lécithine par i ma alcali faible en solution alcoolique, on obtient relativement vit® des mélanges réaetiozmels contenant une forte proportion 15 de lysolécithine9 ear par l'alcoolyse en présence d'alcali faible 9 la décomposition s'arrête au stade des lysodérivés, ou la séparation du deuxième acide gras se fait beaucoup plus lentement que celle dm premier. La formation de glycérylphosphorylcholine est entravée 20 dans œa© large mesure par le choix du milieu spécial et de 1'aies ail faible® les aeiâes gras éliminés sont sous la forme des esters formés &r@o 1°alcool qui sert à la réaction et il s'ea-smit réaction constitue une aleoolyse ou une transesté- rifieati©B,s 23 Ohose surprenante, la lysoléeithine qui est 1® produit priaeipal présente une haute teneur en acides gras' insaturés0 Le fait q«,® la lysolécithine obtenue selon l'invention contienne encore pratiquement tous les acides gras .insaturés de la phosphatidylcholine mais surtout les acides gras essentiels démontre 30 que 1sélimination hydrolytique des acides gras de la molécule de phosphatidylcholine se produit aussi en position a, où- se trouvent préférentiellement les acides gras saturés, contrairement à là décomposition enzymatique par la phospholipase A qui sépate quasi-exclusivement les aeides gras insaturés qui se trouvent en 55 position Alors que 1'attaque de la phospholipase forme exclusivement de l3a=»lysoléeithine s la lysolécithine du présent procédé contient m mélange de lysolécithines a et j3, se qui a ime grande importance pour l'action biologique. Ha^du et ses collaborateurs (J. Fharmacol, Exptl. ïherap. 120 (1957) page 99)s qui 40 ont pu déceler une action analogue à celle de la digitale sur BAD ORIGINAL 69 09609 -3- 2070050 le coeur de grenouille isolé dans le cas d'a-lysolécithines fabriquées par l'action de la phospholipase A sur la phosphatidylcholine naturelle, ont en outre pu observer, avec l'application d'un mélange de lysolécithines a et P, une augmentation du débit-5 minute du coeur par amélioration de la contractilité de celui-ci. En général, les mélanges réactionnels peuvent être utilisés immédiatement après séparation des esters d'acide gras formés. Mais si l'on désire une lysolécithine pure, il faut éliminer du mélange réactionnel la glycérylphosphorylcholine formée, ce 10 que l'on fait suivant l'invention en utilisant comme solvant le dichloréthane ou le dichloréthylène. Pour la neutralisation on peut utiliser des acides dilués quelconques et des solutions de sels acides. Ainsi l'acide chlorhydrique dilué convient, ou encore la substance dite "oxyde 15 d'aluminium acide11 utilisée fréquemment en chromatographie comme substance anionotrope, On peut utiliser comme acides ou sels des composés minéraux ou organiques, dans la mesure où ceux-ci ou leurs produits de réaction ne présentent pas une trop grande solubilité dans les systèmes liquides, sinon il faudrait prévoir 20 des étapes additionnelles de séparation et de lavage0 On peut citer à titre d'exemples d'acides, outre l'acide chlorhydrique déjà mentionné, des acides organiques comme l'acide acétique ou l'acide formique, et à titre d'exemples de sels le sulfate acide de sodium, le phosphate diacide de sodium ou le tartrate pri*> 25 maire. 69 09609 2070050 Une matière première particulièrement appropriée et contenant de la lécithine est la phosphatidylcholine du soja, obtenue selon le brevet allemand n° 1.053«299. Avec cette matière» lorsqu'on applique le procédé selon l'invention, on obtient jus-5 qu'à 80 % de lysolécithine dont la fraction d'acides gras contient plus de 70 % d'acides gras insaturés. Comme alcali faible, la magnésie et la chaux conviennent particulièrement, mais le carbonate-hydroxyde de magnésium et le carbonate de magnésium ainsi que le bicarbonate et le carbonate de sodium sont utili-10 sables aussi. L'ammoniac également, à faible concentration, joue le rôle d'un alcali faible au sens de l'invention et c'est pourquoi on peut aussi effectuer la décomposition dans une solution % aqueuse alcoolique d'ammoniac. Comme solvants, on peut utiliser le méthanol et l'éthanol; le méthanol associé à la magnésie ou 15 à la chaux activées est un mode d'exécution préférentiel. Le choix de l'agent utilisé pour la transestérification a une influence décisive sur la composition du produit final, en combinaison avec la température de réaction et le temps de réaction» En outre, dans le cas de la chaux et de la magnésie, 20 l'activité de celles-ci joue un rôle important. Ainsi, on a trouvé qu'avec une magnésie commerciale qui se trouve par exemple sous forme calcinée, on obtient, après environ 3 heures d*é-bullition au reflux dans le méthanol, une teneur en lysolécithine d'environ 50 %• Si l'on désactive une telle magnésie en la lais-25 sant séjourner à l'air, il faut déjà faire bouillir le mélange 7 heures au reflux pour obtenir le même résultat. Avec une magnésie calcinée à 300-1000°C, il suffit de chauffer 30 minutes à l'ébullition ou bien on peut supprimer cçmplètement le chauffage et il suffit d'agiter environ 4 heures à la température ambiante 30 pour obtenir la même quantité de lysolécithine. On peut ramener à un minimum la formation de glycérylphosphorylcholine qui se produit toujours, si l'on conduit la réaction à des températures inférieures à +20°C (température ambiante), en allongeant en-conséquence le temps de réaction. La concentration de la phos-35 phatidylcholine dans la solution réactionnelle n'a pas d'influence notable sur le déroulement de la réaction mais il en est autrement pour la quantité de magnésie ou de chaux. Une augmentation de ces corps qui provoquent la transestérification entraîne une formation accélérée de lysolécithine mais en même 40 temps une augmentation de la glycérylphosphorylcholine indési 69 09609 -5- 2070050 rable. Une diminution de concentration ralentit la formation de lysolécithine et entraîne obligatoirement un temps de réaction plus long. Les produits obtenus par le présent procédé constituent 5 en général des mélanges de substances qui, outre la lysolécithine, contiennent encore de la phosphatidylcholine non consommée ainsi que de la glycérylphosphorylcholine et des esters d9acide gras» Par une dialyse usuelle à travers un mince tuyau de caoutchouc ou par une extraction répétée à l'acétone froide, on peut élimi-10 ner rapidement, simplement et en totalité les esters d'acide gras. Les mélanges de lysolécithine, de phosphatidylcholine et de glycérylphosphorylcholine que l'on obtient ainsi peuvent servir à l'injection intraveineuse. Pour obtenir une solution limpide à cet effet, il est à conseiller d'ajouter une petite 15 proportion d'un sel alcalin de l'acide désoxycholique ou apocho-lique. Ainsi, même la fraction résiduelle de lécithine du mélange réactionnelle, en principe insoluble dans l'eau, devient complètement soluble. S'il est désirable d'éliminer la glycérylphosphorylcho-20 line, on traite le mélange par le dichloréthane ou le dichloréthy-lène auquel on a ajouté de préférence 5 % d'éthanol pour améliorer le rendement. La phosphatidylcholine et la lysolécithine ne passent en solution tandis que la glycérylphosphorylcholine reste non dissoute, de sorte que l'on peut ensuite l'enlever pratique-25 ment en totalité par filtration. Du mélange obtenu, on peut isoler la lysolécithine à l'aide d'une distribution à contre-courant dans le système formé d'éther de pétrole et de méthanol à 98 % (2:1) ou bien par chro-matographie préparative en couche mince sur des plaques de gel 30 de silice et on peut la doser quantitativement. Une analyse type d'une lysolécithine préparée par le procédé selon l'invention à partir de la phosphatidylcholine du soja donne les chiffres suivants : phosphore total 5»95 % 35 choline 23,50 % acides gras 52,00 % rapport molaire phosphore :choline 1,01 % indice d'iode 77 L'analyse par chromatographie gazeuse des acides gras 40 de la lysolécithine donne les moyennes suivantes : 69 09609 -6- 2070050 saturés 13 jO % 0,8 " 2,5 % C^gl insaturés 7,0 % C1S2 » 72,0 % - C,85 - 5,5# Par contre, une lysolécithine que l'on a obtenue à partir de la même matière première, c3est-à-dire la phosphatidyl-choline du soja, mais par le procédé d'hydrolyse eazyaatique av. moyen du venin de Orotalus adamanteus, présente une répartition, 10 nettement différente des acides gras s CLjg saturés 26,7 % 018 " ,4,5 % C^gl insaturés 6,7 % C1g2 » 57)3 % 15 C183 m 4,8 % Si l'on part de la phosphatidylcholine animale, par exemple tirée de la lécithine d'oeuf, qui contient en principe moins d'acides gras insaturés, le présent procédé donne de façon, surprenante une lysolécithine qui contient environ 41 % d'acides 20 gras insaturés, alors que de façon connue, par hydrolyse enzyma-tique au moyen de venin de serment, on obtient une lysolécithine qui contient 95 % d8acides gras saturés, donc un produit qui a® contisiit qu'une faible proportion, environ 5 %» d'acides gras insaturés. 25 EXKWiPLS 1 En agitant sous gaz inerte, on dissout dans 4,5 litres de méthanol 300 g de phosphatidylcholine chimiquement pur© obtenue à partir du mélange de phosphatides du soja et on agit© pendant ,2 heures à 1S°G a^ec 30 g de magnésie que 1 ' on a activée 0 en la calcinant pendant 1s5 heure à 850°0 à l'abri de l'air et de l'humidité. Après avoir séparé la magnésie, avantageusament à l'aide d'une cartouche filtrante, on agite la solution pendant 20-30 minutes avec45 g d'alumine acide pour la neutraliser9 puis on filtre. Après évaporation du méthanol sous vide avec 35 gaz protecteur, on amèa® le résidu huileux consistant dans un tuyau de caoutchouc appropriés au moyen d'éther de pétrole et on dialyse pendant 8 heures vis-à-vis d'éther de pétrole (point d'ébullition 30-50°0) dans un appareil Soxhlet. Une fois qu'on a chassé le solvant sous vide en présence d'azote, il reste dans 40 le produit de dialyse les esters méthyliques d'acides gras (renm? BAD ORIGINAL 69 09609 -7- 2070050 dement 102 g soit 34- %), dans le produit retenu, une substance pâteuse presque incolore formée d'un mélange de lécithine, de lysolécithine et de glycérylphosphorylcholine. Pour séparer celle-ci, on reprend le mélange par 1,8 litre d'un mélange 95:5 5 dichloréthane et d'éthanol, on sépare par filtration la matière insoluble et oiylébarrasse de solvant la solution limpide en la distillant sous vide en présence d'azote. On obtient 155 S (52%) d'une substance pâteuse presque incolore; après séparation par chromatographie en couche mince et dosage du phosphore, on trou-10 ve qu'elle comprend 52,5 % lysolécithine et 47,5 % de lécithine . Le mélange de substances donne, à l'analyse, les chiffres suivants : indice d'iode 89 15 phosphore 4,75 % choline 18,9 % acides gras 61,5 % rapport molaire phosphore :choline 1,01 La détermination des acides gras par chromatographie 20 gazeuse donne les moyennes suivantes s acide palmitique 10,8 % " stéarique 2,5 % " oléique 6,5 % " linoléique 74-» 8 % 25 " linolénique 5,4- % EXEMPLE 2 De la façon décrite ci-dessus, on dissout 300 g de phosphatidylcholine dans 6 litres de méthanol et on agite 1 heure à la température ambiante avec 30 g de chaux vive en poudre/4ue 30 l'on a activée en la chauffant 2 heures à 450°C. On élimine l'oxyde par filtration puis on neutralise la solution méthanoli-que en ajoutant 5 ml d'acide chlorhydrique méthanolique à 5 Après avoir chassé le solvant sous vide en présence d'azote, on extrait à,plusieurs reprises le résidu par l'acétone froide afin 35 de séparer l'ester méthylique d'acide gras, on élimine l'acétone par distillation sous vide puis on reprend le mélange par environ 2 litres d'un mélange dichloréthane-éthanol (95=5)* Après filtration, on débarrasse de solvant sous vide la solution limpide, en présence d'azote. On obtient 195 S (65 %) d'une subs-40 tance pâteuse presque incolore, qui, après analyse par chromato- 69 09609 -8- 2070050 graphie en couche mince ou en colonne, comprend 55 % de lysolécithine et 45 % de lécithine. EXEMPLE 5 En agitant sous un gaz inerte protecteur, on dissout 200 5 g de phosphatidylcholine chimiquement pure dans 1 litre d'étha-nol et on agite"pendant 10 heures à 40°C, à l'abri de l'air et de l'humidité, avec 30 g de chaux vive (que l'on a activée en la chauffant 2 heures à 450°C). Après avoir éliminé l'oxyde par filtration, on agite la solution éthanolique pendant 20 minutes 10 avec 40 g d'alumine acide pour la neutraliser, puis on filtre et finalement, on chasse le solvant par distillation sous vide en présence d'azote. Pour éliminer l'éther éthylique d'acide » gras qui s'est formé, on extrait le résidu à plusieurs reprises par l'acétone froide puis on chasse l'acétone par distillation 15 sous vide en présence d'azote. Il reste 150 g (75 %) d'un mélange comprenant' 45 % de lysolécithine, 50 % de lécithine et 5 % de glycérylphosphorylcholine. •RyRMPT/R 4 On dissout 100 g de phosphatidylcholine dans 1,2 litre 20 de méthanol et on agite 1,33 heure à 20°C avec 10 g de chaux vive, activée comme dans l'exemple 3« Après avoir éliminé celle-ci, on agite encore la solution pendant 30 minutes avec 20 g d'alumine acide pour la neutraliser, puis on filtre et on chasse le méÈîianol sous vide en présenee d'un gaz inerte. On élimine 25 totalement dans tin tuyau de caoutchouc les esters méthyliques d*acide gras, par dialyse vis-à-vis de l'éther de pétrole (voir exemple 1), Après avoir chassé l'éther de pétrole sous azote, on reprend le résidu par 400 ml d'un mélange dichloréthane-éthanol (95=5)s on élimine la fraction insoluble par filtration et on 30 chasse le solvant sous vide en présence d'azote. On obtient 22 g d'un mélange comprenant 80 % de lysolécithine et 20 % de lécithine • En agitant sous gaz inerte, on dissout dans 3 litres'de méthanol 300 g de phosphatidylcholine de provenance végétale 35 et on chauffe 3,2 heures au reflux avec 37,5 g de magnésie calcinée commerciale. Après avoir refroidi le mélange à la température -ambiante, on isole selon l'exemple 1. On obtient 165 S d'un mélange comprenant 51 % de lysolécithine et 49 % de lécithine. 69 09609 -9- 2070050 - BETiiaXlXCAIIOgS - 1 - Procédé de préparation de nouveaux mélanges de lysolécithine à haute teneur en acides gras insaturés ou de mélanges contenant principalement cette lysolécithine et aussi de la lé- 5 cithine, ou de la lécithine et de la glycérylphosphorylcholine, à partir de lécithine chimiquement pure d'origxae végétale ou animale, caractérisé par le fait que l'on part d'une solution alcoolique de la lécithine, qu'on la traite par un alcali faible à des températures comprises entre 10°G et le point d'ébullition 10 sous tua gaz inerte protecteur, à l'abri de la lumière, de l'air et de l'humidité, qu'ensuite on neutralise la solution, on sépare les esters d'acide gras formés par dialyse vis-à-vis de l'éther de pétrole ou par extraction répétée avec de l'acétone froide, et qu'ensuite, dans le cas où l'on prépare une lysolé-15 cithine pure, on traite le mélange par le dichloréthane ou le dichloréthylène pour éliminer la glycérylphosphorylcholine formée et on isole alors la lysolécithine de façon connue. 2 - Procédé selon 1, caractérisé par le fait que comme alcali faible on utilise un oxyde de magnésium ou de calcium. 20 3 - Procédé selon 1, caractérisé par le fait que l'on utilise une solution méthanolique, que l'alcali faible est la magnésie ou la chaux vive activée et que la température est de 10-20°C. 4- - Procédé selon 1, caractérisé par le fait que l'on 25 utilise une solution éthanolique, que l'alcali faible est la chaux vive activée et que l'on opère à haute température. 5 - Procédé selon 1 à 4-, caractérisé par le fait que l'on neutralise le mélange réactionnel en le traitant par l'alumine acide. 30 6 - Procédé selon 1 à 5> caractérisé par le fait que pour éliminer la glycérylphosphorylcholine on utilise le dichlor éthane ou le dichloréthylène additionné de 5 °/° d ' éthanol.