FR 2091946 A1 19710121 FR 6944897 A 19691224 69 44897 i 2091946 La présente invention concerne un procédé de séparation de l'acide (-) (cis-1 ,2-époxypropyl)pho3piionique de mélanges énantiomères de dérivés de l'acide (cis-1,2-époxypropyl)ph.osph.o-nique. Plus particulièrement, elle concerne un procédé pour 5 hydrolyser stéréo-sélectivement des esters et amides de l'acide (-) (cis-1,2-époxypropyl)phosphonique. l'acide (-) (cis-1,2-époxypropyl)phosphonique et ses sels sont des antibiotiques précieux qui sont efficaces contre divers pathogènes gram-positifs et gram-négatifs. Bien que 10 ces antibiotiques puissent être produits par fermentation de souches convenables de Btreptomyces, par exemple en cultivant Streptomvces fradiae NEBL B-3351 dans des conditions aérobies dans des milieux de fermentation appropriés, on a trouvé d'autres méthodes permettant de préparer l'antibiotique et ses sels, 15 esters et amides par synthèse, par exemple à partir de l'acide cls-propényl-phosphonique et de ses dérivés. Un inconvénient de ces méthodes de synthèse est que le produit désiré est obtenu en mélange avec son énantiomère, généralement sous forme d'un racé-mate et il doit être séparé pour obtenir le produit sous forme 20 pure. l'invention a pour objet un procédé qui peimet d'obtenir 1*isomère (-) de l'acide (çis-1#2-époxypropyl)phosphonique à partir de mélanges d'esters et d'amides des acides (+) et (-) (cis-1,2-époxypropyl)phosphoniques. Elle a également pour objet 25 tui procédé pour hydrolyser stéréo-sélectivement les esters et amides stéréoisomères de l'acide (cis-1,2-époxypropyl)phosphoni-que pour obtenir l'acide (-) (cis-1f2-époxypropyl)phosphonique et ses sels. D'autres objets apparaîtront dans la description détaillée ci-après de la présente invention. 30 Selon la présente invention, la demanderesse a détermi né que les antipodes d'esters et d'ami des de l'acide (cis-1.2-époxypropyl)phosphonique peuvent être hydrolysés sélectivement lorsqu'on soumet de tels mélanges à l'action d'enzymes de souches hydrolysantes sélectives de microorganismes pour produire des 35 mélanges contenant l'acide (-) (cis-1,2-époxypropyl)phosphonique ou ses sels. Pour mettre en oeuvre le procédé selon l'invention, les esters ou amides peuvent être ajoutés à un milieu nutritif dans lequel on cultive le microorganisme ou être mis en contact 69 44897 2 2091946 intime avec des cellules de l'organisme dans des milieux tamponnés convenables. Ainsi, selon des modes de réalisation préférés de l'invention, quand des mélanges d'antipodes d'esters et amides de 5 formule : 0 0 ai / \ V CH^CH - OH Y 10 dans laquelle X représente OR ou HR^Rg et Y représente HR^Bg ou OH, R étant un radical alcoyle inférieur, alcényle inférieur ou alcynyle inférieur à chaîne droite ou ramifiée et R^ et Rg représentant de l'hydrogène ou des groupes hydrocarbyle éventuellement substitués, identiques ou différents,scmt soumis à 15 l'action d'enzymes de certains microorganismes, les esters ou amides de 1'acide (-) (cis-1,2-époxypropyl)phosphonique sont hydrolysés sélectivement pour produire l'acide (-) phosphonique sans hydrolyse concomitante des dérivés de l'acide (+) (oiSr 1,2-époxypropyl)phosphonique. l'acide (-) (cis-1,2-époxypropyl)-20 phosphonique ou un de ses sels peut alors être séparé des esters ou amides de 11énantiomère (+)• Selon un mode de réalisation préféré de la présente invention, des mélanges énantiomères monoesters de composés de formule : 25 0 A i>« OHjCH - OH P^ OH et de leurs sels, formule dans laquelle R est un groupe alcoyle 30 de 1 à 7 atomes de carbone, alcényle de 2 à 7 atomes de carbone, ou alcynyle de 2 à 7 atomes de carbone, à chaîne droite ou ramifiée, sont des composés de départ particulièrement avantageux car 1*énantiomère (-) peut être scindé de façon substantiellement quantitative sans hydrolyse concomitante de 1'énantiomère (+)t ce 35 qui donne un mélange d'acide (-) (cis-1 ,2-époxypropyl)phosphonique et du monoester (+) qui peut être facilement séparé pour donner l'acide (-) désiré ou un de ses sels. De même, des mélanges énantiomères d'amides de formule 69 44897 3 2091946 générale : A Vmi ** CIL OH CH Z 5 dans laquelle et Rg sont comme précédemment définis et Z représente NR^Rg ou OH ou leurs sels peuvent être hydrolysés sélectivement pour donner l1acide (-) (cis-1,2-époxypropyl)-phosphonique alors que les amides (+) restent substantiellement 10 inchangés. Ainsi, l,acide (-) (cis-1,2-époxypropyl)phosphonique dans le mélange réactionnel résultant peut être séparé de l'ami de de l'acide (+) (cis-1,2-époxypropyl)phosphonique. Dans la formule qui précède, les substituants et R^ peuvent être des radicaux aliphatiques, cycloaliphatiques, 15 araliphatiques, aromatiques ou hétérocycliques qui peuvent, si on le désire, comporter d'autres substituants. Ainsi, par exemple, ils peuvent être aliphatiques substitués ou non comme alcoyle, alcényle ou alcynyle dont des exemples sont les radicaux alcoyle comme méthyle, propyle, isopropyle, t-butyle, 20 hexyle, octyle, décyle, dodécyle, haloalcoyle comme chloroéthyle, fluoropropyle, bromométhyle et dichloroéthyle, acylamidoalcoyle comme acétylaminométhyle et benzoylaiainoéthyle, acyloxyalcoyle comme acétoxyméthyle, propionoxyéthyle et benzoyloxyéthyle, d'autres groupes alcoyle substitués comme hydroxypropyle, pipé-25 ridinométhyle, aminométhyle et aminoéthyle, alcoylaminoalcoyle comme diméthylaminométhyle, diéthylaminopropyle, carboalcoxy-méthyle, cyanoéthyle, sulfonamidoéthyle, phtalimidométhyle et méthoxyméthylej alcényle comme allyle, méthallyle, vinylpropényle, hexényle, octadiényle, alcynyle comme propargyle, éthynyle ou 30 chloréthynyle; cycloalcoyle comme cyclohexyle, cyclohexényle ou cyclopropyle. Quand R^ et R^ sont aliphatiques ils ont de-préférence 1 à 6 atomes de carbone. Comme exemples de R^ et R^ représentant un radical araliphatique on peut citer les cas des radicaux aralcoyle comme 35 benzyle, phénéthyle, phénylpropyle, p-halobenzyle et o-, m- ou p-alcoxybenzyle, nitrobenzyle, aminophénéthyle, pyridyléthyle, furylméthyle, thiénylpropyle, etc... R,j et Rg peuvent aussi représenter un radical aryle 69 44897 4 2091946 confie phényle, naphtyle ou phényle substitué, par exemple p-cnloro-phényle, o-nitrophényle, ofp-uiiialophényle, cyanophényle, méthoxyphényle, aniinopiiény le et tolyle et ûe préférence un résidu aromatique mononucléaire. Quand ou R^ est hétéro cyclique, il peut être hétéroaromatioue com:,ie pyridyle, furyle, thiényle, thiasolylc ou ^yrazinyle; il peut aussi représenter un cycle Iiétéro hydrogéné dont des exemples sont les cycles tétra-hydrofuryle et pipérazinyle. Quand et/ou sont des radicaux acyle, ce sont de préférence des groupes alcanoyle inférieurs ou aroyle comme acétyle, propionyle, butyryle, hexanoyle, benzoyle, halobenzoyle, nitrobensoyle et analogues. Selon la présente invention, la demanderesse a détermin qu'on dispose de divers nicroorganismes .produisant des enayiùes capables d'hydrolyser sélectivement les esters et ar-ides de. l'acide (-) (cis-1 «2-6poxy;;ropyl)nnosphonique„ Ainsi, on a trouvé eue produisent tous des enzymes capables d'hydrolyser sélectivement les esters et acides de l'acide (-) (cis-1.2-époxypropyl)phosphonique, des bactéries couine celles de l'ordre des Actinoiayces, par exemple Hocardia corallina: des champignons cornue des souches convenables de Pénicillium, par exemple Pénicillium freauentans et Pénicillium verrai culatum : des souches d'Aspergillus, par exemple Asoerrillus ni.^er; des fungi Lmperfec-ti, par exemple Ashbya feossypii et Helicostulum piriforme. les microorganicnes produisant des enzymes utilisables pour mettre en oeuvre les procédés selon l'invention peuvent facilement être trouvés en cultivant soit des microorganisues connus, soit des raicroorganisiaec inconnus obtenus à partir de sources comme le sol ou analogue en présence d'un monoester ou d'un aniae de l'acide (-) (cis-1,2-époxypropyl)phosphonique et en déterrainojat apr":s . u'une borne croissance a été obtenue (2 à 5 jours cor.t en général suffisants pour cela) si oui ou non la liqueur surnageante a une activité telle que déterminée par le titrage à Proteus valgaris. in variante, on peut effectuer cette même détermination en utilisant des cellules contenant l'ensjone et en faisant incuber de telles cellules dans des milieux convenables comme, par exemple, le tampon 'fris 0,05 au pH 5,0 pendant 2-4 jours et en titraîat ensuite la portion liquide avec bad ORIGINAL 1 69 44897 5 2091946 Proteus vulgaris. Quand on effectue de tels essais, il convient d'inoculer simultanément le microorganisme d'essai dans un milieu nutritif convenable sans le monoester ni l'amide pour distinguer les organismes qui produisent l'antibiotique directe-5 ment de ceux qui sont capables d'hydrolyser sélectivement les estera ou amides. Les exemples non limitatifs qui suivent illustrent des modes de mise en oeuvre de l'invention. Exemple 1 - 10 Un milieu contenant 0,8 fo de bouillon nutritif (Difco), 0,2 1» d'extrait de levure, 3 $> de cérélose et 0,3 # d'extrait de malt dans de l'eau distillée est ajusté à pH 7« 40 ml de ce milieu sont placés dans une fiole d'Erlenmeyer de 250 ml qui est alors mise en autoclave à 1,05 kg/cm pendant 15 minutes. le 15 milieu est inoculé avec une cuillerée d'inoculum provenant d'une culture inclinée sur gélose d'Aspergillus niger HREL-67 et incubé sur un agitateur mécanique tournant à 220 t/mn avec une course de 55 mm à 28°C pendant 4 jours jusqu'à ce qu'on obtienne une bonne croissance de l'organisme. 10 ml du bouillon de fermentation 20 résultant sont transférés aseptiquement dans un tube centrifuge et les cellules sont séparées à 25 000 x G. Les liquides surnageants sont jetés et les cellules sont remises en suspension dans 4 ml de tampon (hydroxyméthyl)-aminométhane (tampon Tris) 0,05 H, ajusté à pH 8,0. Deux ml de la suspension de cellules résultante 25 sont transférés aseptiquement dans un tube à essai de 20 x 200 mm stérile contenant 200 Y de (cis-1,2-époxypropyl)phosphonate racémique sodique de monométhyle dans 2 ml de tampon (hydroxyméthyl) -aminométhane 0,05 M au pH 8,0. Le tube est incubé pendant 48 heures à 28°G sur agitateur mécanique. Le bouillon incubé 30 résultant est centrifugé à 25 000 x & et le liquide surnageant est testé pour son activité par titrage au disque avec Proteus vulgaris MB-838 (ATCC 21100 et EEBL B-3361) et on trouve une zone d'inhibition de 26 mm, ce qui indique la présence d'un sel de l'acide (-) (cis-1,2-époxypropyl)phosphonique. 35 Des tubes témoins contenant (1) 2 ml de suspension de cellules plus 2 ml de tampon (hydroxyméthyl)-aminométhane 0,05 M au pH 8,0 et (2) 4 ml du même tampon contenant 200Y de (cis-1,2-époxypropyl)phosphonate racémique sodique de monométhyle sont 69 44897 6 2091946 Incubés de façon analogue à 28° G pendant 48 heures, Le liquide surnageant de chacun de ces tubes témoins ne donne aucune inhibition à l'essai à Proteus vulgaris» le titrage utilisant Proteus vulgaris MB-838 est 5 effectué comme suit : La culture d'essai est maintenue sous forme de culture inclinée sur gélose nutritive (Difco) plus 0,2 % d'extrait de levure (Difco). les cultures inclinées inoculées sont incubées à 37°C pendant 18-24 heures et sont conservées aux températu-10 res du réfrigérateur pendant une semaine, des cultures inclinées fraîches étant préparées chaque semaine. L'inoculum pour les plaques de titrage est préparé chaque jour en inoculant une fiole d'Erlenmeyer de 250 ml contenant 50 ml d'un bouillon nutritif (Difco) plus 0,2 15 d'extrait de levure (Difco) avec ma copeau de la culture inclinée. la fiole est incubée à 37°0 sur une machine à secousses pendant 18-24 heures. La culture est ajustée à une transmit-tance de 40 fa à une longueur d'onde de 660 mp en utilisant un • appareil Spectronic 20 de Bausch & Lomb par addition d'extrait 20 de levure en solution à 0,2 ^ à la culture. On emploie du bouillon non inoculé comme témoin dans cette détermination. On utilise 30 ml du bouillon ajusté pour inoculer 1 litre de milieu. Gomme milieu de titrage, on utilise de la gélose nutritive (Difco) plus 0,2 56 d'extrait de levure (Difco). Ce 25 milieu est préparé, stérilisé par autoclavage et refroidi à 50°C. Quand le milieu est inoculé, on en ajoute 10 ml à des boîtes de Pétri stériles et on laisse le mélange se solidifier. Des prises d'essai de liqueur surnageante à titrer sont diluées avec du tampon Tris 0,05 M à pH 8,0 à une concen-30 tration appropriée, les disques sont plongés dans la solution d'essai et placés à la surface de la plaque de titrage; deux disques pour chaque prise d'essai sont normalement placés sur une plaque en opposition l'un à l'autre. Deux disques plongés dans une solution à 0,4 unité par ml d'acide (-) (cis-1.2-époxv-35 propyl)phosphonique sont placés sur la plaque en position alternée avec les prises d'essai. Les plaques sont incubées à 37°C pendant 18 heures et on détermine le diamètre en mm des zones» La puissance de la prise d'essai est déteiminée avec un nomographe ou à 69 44897 7 2091946 partir de le. courbe standard. 1 mg d'acide (-) (cis-1 ,2-époxypropyl) phosphonique pur contient 357 unités, une unité étant la concentration du produit qui produit mie zone de 28 irm de diamètre. Exemple 2 - En suivrait le mê-ie .iode opératoire mais en remplaçant As persil lus ni.rer par Ashbya rossypii 1S21 Y 105b» le liquide surnageant dov.no une ::one d'inhibition de 18 mm dans le titrage à Proteus vulgaris. Exemple j - Wuand on suit le ::oae opératoire de l'exemple 1 en utilisant 200 Y de (çis-1 ,2-é;'.oxyv>ropyl) phosnhoiiate racémique sodique de sonoéthyle, le linui.de surnageant donne ".me -iona d'in-hi-v!.tion je 3v :.im dr>n^ le titrage à Proteus vulgaris » ixemnle 4 - lin Fuiv:int le rode opératoire de l'exemple 1 avec la même quantité le sel ao soûi.v.: :te l'ester racémique • lonoproçyli-ouo au lieu de l'ester .:on.oaé th/lique, le liquide surnageant donne une :;one d ' in'ii bition de 20 mm dans le titrage à Proteus vulgaris, ixenr>le 5 - in suivant le mode opératoire de l'exemple 1 mais avec la T::$:.;e qu.antité de sel c.e rodi-'r. ae l'ester nonoallvlique racémique au lieu de l'ester • ;onor.;étivlique le liquide surnageant aonne une sone i'inhibitien de 30 mm dans le titrage à Proteus vul/:aris. Exemple 6 - in suivant Je r.ode ot>'vratoir-2 ae l'exemple 1-, des cellules d1 Ashbyia ~ossynii --.iLxi I 1055 sont obtenues cous for.ie àe houletteso cor cvlluie^ "ont incubéoc dans le tru;.con rrir à "û avec 2 al a'une ..olntion à 2uC Y ?--- '-1 de sel de sc-dar: ,:u (çis-1,2-épox^/pro >yl) phos; honate de mono-ittliyle racé.-i-•;ue .vi utilisant les •:oâo.": o.-Jr-ito^res :.o l'e.-cemle 1 , le liquide surnageai;^ •/. "r" s ine"' itio-i ao 4 ixorr-le 7 - su suivait les rodes? opératoires o.e l'exemple o nais « avec le sol sodiun .du nonoailyl ester racémiaue au lieu de l'ester ucnc 'thylique, le bouillon incubé résultat donne une bad original ' 69 44897 8 2091946 zone d'inhibition de 24 mm dans le titrage à Proteus vulgaris» Exemple 8 - En suivant les modes opératoires de l'exemple 1, on obtient des cellules de Ho cardia corallina ATCC 4273 sous forme 5 de boulettes. Quand ces cellules sont incubées avec le sel de sodium de l'ester monométhylique de l'acide (cis—1,2-époxypropyl)-phosphonique racémique, selon les procédés décrits dans l'exemple 1, le bouillon incubé résultant donne une zone d'inhibition de 12 mm dans le titrage à Proteus vulgaris. 10 Exemple 9 - En suivant le mode opératoire de l'exemple 8 avec la même quantité du sel de sodium de l'ester monoéthylique au lieu de l'ester monométhylique, le bouillon incubé résultant donne une zone d'inhibition de 13 mm par titrage à Proteus vulgaris. 15 Exemple 10 - En suivant les modes opératoires de l'exemple 8 avec la même quantité du sel de sodium de l'ester monopropylique racémique au lieu de l'ester monomé thylique, le bouillon incubé résultant donne une zone d'inhibition de 11 mm par titrage à Proteus 20 vulgaris. Exemple 11 - En suivant les modes opératoires de l'exemple 8 avec la même quantité du sel de sodium de l'ester monoallylique racémique au lieu de l'ester monomé thylique, le bouillon incubé résultant 25 dorme une zone d'inhibition de 19 mm par titrage à Proteus vulgaris. Exemple 12 - En suivant les modes opératoires de l'exemple 1, on cultive Pénicillium frequentans JJRB1 1915 et les cellules résul-30 tantes sont obtenues sous forme de boulettes. Les cellules sont alors incubées avec le sel de sodium du monométhyl,ester de l'acide (cis-1,2-époxypropyl)phosphonique racémique et la solution liquide résultante est titrée par le procédé à Proteus vulgaris. L'essai nontre que le produit a une zone d'inhibition de 21 mm. 35 Exemple 15 - A 40 ml d'un milieu stérile consistant en 0,8 # de bouillon nutritif, 0,2 $ d'extrait de levure, 3 $ de cérélose et 0,3 1» d'extrait de malt dans l'eau distillée ajusté à pH 7,0 flymn 69 44897 9 2091946 une fiole Erlenmeyer de 250 ml, on ajoute un inoculum d'JLspergillus niger NRRI 67 venant d'une culture inclinée sur gélose, la-fiole inoculée est incubée sur un agitateur mécanique tournant à 220 t/mn avec une course de 55 mm à 28°C pendant 4 jours. 10 ml 5 du"bouillon de fermentation résultant sont alors transférés aseptiquement dans une centrifugeuse et les cellules sont mises en boulettes à 25 000 x G. le liquide surnageant est jeté et les cellules en boulettes sont remises en suspension dans 4 ml de tampon Tris 0,05 à-pH 8. 2 ml de la suspension dé cellules résul-10 tante sont transférés aseptiquement dans un tube à essai 20 x 200 mm stérile contenant 200 y de N,N'-tétraéthyl (cis-1.2-époxypropyl)phosphamide racémique dans 2 ml de tampon Tris 0,05 M à pH 8,0, Le tube est incubé pendant 48 heures à 28°C dans un agitateur mécanique tournant à 220 t/mn avec une course de 55 mm. 15 Après incubation, les cellules sont séparées par céntrifugation et le liquide surnageant est titré pour son activité biologique avec Proteus vulgaris MB-838» La solution a une zone d*inhibition de 38 mm. Exemple 14 - 20 En suivant les modes opératoires décrits dans 1*exemple 13, on cultive Hellcostylum piriforme AT0C 8992 et les cellules résultantes sont incubées avec le 1T, N1-tétraméthyl (cis-1,2-époxypropyl)phosphamide racémique pendant 2 jours à 28°C. Le liquide surnageant du bouillon'incubé résultant donne une zone 25 d'inhibition de 35 mm par titrage à Proteus vulgaris MB-838. Exemple 15 - En suivant le mode opératoire décrit à l'exemple 13, des cellules de pénicillium frequentans NBEL 1915 sont incubées avec du NjN'-tétraméthyl (cis-1,2-époxypropyl}phôsphamidé racémi-30 que et la portion liquide incubée résultante donne -une zone d'inhibition de 39 mm par titrage à Proteus vulgaris « Exemple 16 - Quand, dans le mode opératoire de l'exemple 13; on utilise Aspergillus fumigatus NREL 165 au lieu d'Aspergillus niger. 35 le liquide surnageant donne une zone d'inhibition de 44 nim par titrage à Protéus vulgaris. Exemple 17 - * En suivant "les modes opératoires de l'exemple 13, des 69 44897 10 U2093946 cellules de Pénicillium vermlculatum. culture 54 B dans la Quatermaster Collection à Natick Conn, sont .incubées avec, du N,N'-tétraméthyl (cis-1,2-époxypropyl)phosphamide racémique pendant 48 heures et le liquide surnageant résultant donne une 5 zone d'inhibition, de 32 mm par titrage à Proteus vulgaris. Exemple 18 - Une solution de 1,2 g de. EHgPO^, 2>4 g de Na^HPO^, 0,4 g de NH401, 0,002 g de ZnS04, 5 HgO, 0,004 g de PeS04 , 2 g de CaCOj et 2 g de lactate d'éthyle dans 400 ml d'eau du 10 robinet dans une fiole Erlenmeyer de 4 litres est ajustée à pH 7,0 et la fiole est stérilisée.par autoclavage à 121°C et sous 1,05 kg/cm pendant 15 minutes, lu milieu stérile résultant, on ajoute une culture végétative d'Aspergillus niger NBB1 67 et la fiole inoculée est incubée pendant 4 jours sur un agitateur 15 rotatif tournant à 220 t/mn avec "une course de 55 mm à 28°C. A ce milieu de fermentation, on ajoute alors 40 ml d'une solution aqueuse contenant 20 g de sel de sodium de (cis-1,2-époxypropyl)-phosphonate de monoéthyle racémique préalablement neutralisée à • pH 7 et stérilisée par filtration, l'incubation est poursuivie 20 pendant encore 24 heures, le milieu de fermentation résultant est filtré et le filtrat est évaporé à plusieurs reprises avec du méthanol sous vide jusqu'à ce qu'on obtienne une solution consistant en méthanol à 90 Cette solution méthanolique est filtrée pour éliminer 25 les sels minéraux précipités et le résidu est lavé avec du méthanol qu'on ajoute au filtrat, La solution méthanolique résultante est chromatographlée sur une colônne contenant 2000 g: d'alumine préalablement lavée avec du méthanol» La. colonne est développée avec du méthanol et on prend des fractions de 200 ml dé l'éluat. 30 Les fractions sont titrées à l'aide de Proteus vulgaris et les-fràctions ayant une activité antibiotique sont réunies puis le méthanol est chassé par évaporation sous pression réduite. Le résidu contenant le sel sesquisodique de l'acide (-) (cis-1,2-époxypropyl) phosphonique est reeristallisé dans du méthanol 35 aqueux.pour obtenir le sel sesquisodique-Sous formé-cristallisée •pure. Une solution à 2 $ de -ce produit dans -l'eau a un. pH de 6,8 et un £oa-°mu = -14,9». . • Les esters et amides énantiomères de l'acide (cis-1,2- 69 44897 if 2091946 épojypropyl)phosphonique utilisés dans le procédé selon l'invention sont obtenus par époxydation des dérivés correspondants de l'acide çis-propénylphosphonique. Ainsi, on prépare les monoesters en époxydant les mono-5 esters correspondants de l'acide ci s-monopropénylphosphonique ou, en variante, par hydrolyse acide du diester de l'acide (cis-1,2-époxypropyl) phosphonique. Par exemple, les monoesters peuvent être préparés à partir du phosphorochloridite de di-t-butyle comme suit : 10 Du trichlorure de phosphore (68,7 g, 0,5 mole) et 750 ml de benzène anhydre sont placés dans un ballon tricol de 2 litres équipé d'un agitateur mécanique, d'un thermomètre, d'un entonnoir à robinet et d'un tube desséchant. La solution est refroidie à 5°C et on ajoute en 20 minutes de la triéthylamine 15 (50,6 g, 0,5 mole) à 5 - 10°C. La solution benzénique est agitée pendant 20 minutes. On ajoute en agitant à 5-10°C une solution de triéthylamine (50,6 g, 0,5 mole) et de t-butanol (37,06 g, 0,5 mole) et le mélange est agité pendant 20 minutes. On ajoute en 20 minutes à 5 - 10°G une seconde portion de t-butanol (37,06 g, 20 0,5 mole) et le mélange contenant le phosphorochloridite de di-t-butyle est agité pendant 90 minutes à 5 - 10°C. Dans 40 ml de benzène anhydre, on dissout de la triéthylamine (50,6 g, 0,5 mole) et de l'alcool propargylique (28,03 g, 0,5 mole) et la solution est ajoutée au mélange réac-25 tionnel contenant le phosphorochloridite de di-t-butyle, en agitant pendant 25 minutes et en maintenant la température à 5 - 10°C par refroidissement externe, ^e mélange résultant qui contient le 2-propynylphosphite de di-t-butyle est agité à 5 -10°C pendant une heure. 30 Le mélange réactionnel ci-dessus est alors chauffé à reflux et on continue le reflux pendant.une heure. La solution est ensuite refroidie à la température ambiante avec un bain d'eau et on ajoute par portions 185 ml d'eau. Le chlorhydrate de triéthylamine se dissout dans la couche aqueuse et la couche 35 organique est séparée de la couche aqueuse. La solution benzénique est chauffée sous la pression atmosphérique, et l'eau est éliminée par distillation azéotropique. La solution benzénique restante* contient le propadiénylphosphonate de di-t-butyle. 69 44897 12 2091946 Si ont le désire, on peut obtenir l'ester pur en chassant le solvant et en distillant l'ester sous vide poussé; l'ester pur est caractérisé par ses spectres infra-rouge et de résonance magnétique nucléaire. 5 La solution benzénique séchée de propadiénylphosphonate de di-t-butyle est hydrogénée à 20-25°C avec 5,0 g de catalyseur palladium sur noir à 5 $ jusqu'à ce que l'absorption d'hydrogène cesse. Le catalyseur est séparé par filtration et est lavé avec 2 x 50 ml de benzène. Par évaporation du solvant sous vide, on 10 obtient le cis-propénylphosphonate de di-t-butyle qu'on caractérise par les spectres infra-rouge et de résonance magnétique nucléaire. L'ester brut peut être purifié par distillation sous vide poussé. Dans 235 ml de benzène, on dissout du çis-propényl-15 phosphonate de di-t-butyle (1,0 mole) et de l'acide p-toluènesul-fonique (0,005 mole), et la solution est chauffée à reflux jusqu'à ce qu'il se forme la quantité calculée d'isobutène. On emploie un dispositif de mesure de gaz pour déceler 1'isobutène. Le mélange réactiormel est ensuite refroidi à la température 20 ambiante, le solvant est chassé sous vide et on obtient comme résidu l'acide çis-propénylphosphonique. On obtient les diesters de l'acide çis-propénylphospho-nique en transformant d'abord l'acide libre en dichlorure cis-propénylphosphonique, puis en faisant réagir ce dichlorure avec 25 deux équivalents molaires d'un alcool représenté par la formule R-OH dans laquelle R représente le reste alcool de l'ester résultant. Les monoesters sont préparés à partir des diesters en éliminant un des radicaux esters avec une base. On peut préparer un mono-ester mono-sel en faisant réagir le monoester avec un 30 équivalent d'une base. On donne ci-après des exemples types des réactions ci-dessus et il doit être entendu que d'autres esters et sels sont obtenus de la même manière à partir de matières de départ appropriées. (a) Dans un ballon tricol de 250 ml à fond rond, on ajoute 35 6,t g d'acide çis-propénylphosphonique, 60 ml de benzène sec et 9,0 ml de pyridine. On chauffe le mélange à 50°C, on cesse de chauffer et on ajoute goutte à goutte 13,2 g de chlorure de thionyle à une vitesse telle que le mélange réactionnel reste à 69~ 44897 13 2091946 50°C. Le mélange est refroidi à la température'ambiante et agité pendant 2 heures à la température ambiante. Le mélange est filtré et le filtrat est concentré sous vide à 35°C pour donner 4,5 g d'une huile trouble. Par distillation, on obtient le dichlo-5, rure çis-propénylphosphonique bouillant à 67-69°C sous 9-10 mm; njj° : 1,4885. (b) Un mélange agité de 0,1 mole du dichlorure ci-dessus et 0,2 mole de triéthylamine dans 100 ml de benzène est refroidi à 5°C. On ajoute alors au mélange 0,2 mole d'alcool méthylique à 10 une vitesse telle que la température se maintienne à 5 - 10°C. Une fois l'addition terminée, le mélange est agité à la température ambiante pendant une heure. Le chlorhydrate de triéthylamine précipité est séparé par filtration et le solvant est chassé sous pression réduite laissant le çis-propénylphosphonate de diméthyle. 15 D'autres di-esters de l'acide cis-propénylphosphonique comme les esters d*alcoyle, alcényle ou alcynyle, substitués ou non, sont préparés de la même manière en utilisant 0,2 mole de l'alcool approprié. On transforme le çis-propénylphosphonate de diméthyle en 20 sel de sodium de l'ester monométhylique en chauffant le diester dans de l'hydroxyde de sodium aqueux pendant un temps suffisant pour transformer le diester en monoester. De même, d'autres diesters de dialcoyle, dialcényle ou dialcynyle sont transformés en sel du monoester de la même manière. 25 (c) Dans un ballon tricol de 50 ml à fond rond équipé d'un agitateur, d'un thermomètre et d'un entonnoir à robinet, on place 1,5 g (0,01 mole) du sel de sodium du çis-propénylphosphonate de monométhyle dans 30 ml de méthanol. Le pH est ajusté à 4,5 avec de l'hydroxyde de sodium 2,5 N. On ajoute du tungstate de sodium 30 dihydraté (0,06 g) et on chauffe le mélange à 55°0. On ajoute goutte à goutte de l'eau oxygénée à 30 % (3 ml) en 15 minutes à 55 - 60°C. L'eau oxygénée est ajoutée en quantité suffisante pour maintenir une réaction amidon-iodure positive. On ajoute au mélange une.solution saturée de sulfite de sodium jusqu'à une 35 réaction amidon-iodurè négative. Les solides minéraux sont séparés par filtration, la solution est évaporée à la moitié de son volume et refroidie. Le sel de sodium du (+) (cis-1,2-époxypropyl) phosphonate monométhylique est séparé par filtration, lavé à 69 44897 2091946 l'éthanol et séché* On obtient- le môme résultat en remplaçant le tungstate de sodium utilisé coome catalyseur par le vanadate de zinc ou le sélénomolybdotungstate de sodium. Quand une quantité équimùlaire de n-butyl-cis-propényl-5 phosphonate de sodium, d'éthyl-çis-propénylphosphonate de sodium, de monovinyl-çis-propénylphosphonate de sodium, de monoallyl-propénylphosphonate de potassium ou de propargyl-cis-propénylpho s-phonate de potassium est époxydée comme décrit ci-dessus, on obtient le sel de sodium des esters mono-n-butylique, éthylique, 10 vinylique, allylique et propargylique de l'acide (cia—1,2-époxypropyl) phosphonique racémique. Les phosphono-amides et diamides utilisés comme matières de départ sont obtenus en faisant réagir le dichlorure ois-pro-pénylphosphonique avec une aminé primaire ou secondaire. Quand on 15 emploie une mole d*aminé, l'un des chlorures est déplacé pour donner un amide ci s-prop énylpho sphono chloridiq ue. On obtient les diamides à partir du dichlorure cis-propénylphosphonique selon les procédés ci-dessus en utilisant • 2 moles d'aminé primaire ou secondaire. Les mono- ou diamides 20 de l'acide cis-propénylphosphonique ainsi obtenus peuvent réagir avec l'eau oxygénée pour produire les amides correspondants de l'acide (cis-1,2-époxypropyl)phosphonique. Par exemple, le N,N'-dibenzoyl-(çis-1,2-époxypropyl)phosphonodiamide racémique est préparé comme suit : 25 A un mélange de 3,25 g de '-dibenzoyl-cis-propényl- phosphonodiamide dans 15 ml de méthanol, on ajoute 0,06 g de tungstate de sodium dihydraté et on chauffe le mélange à 55°C. On ajoute lentement en 15 minutes, 3 ml d'eau oxygénée à 30 & et on agite le mélange résultant pendant une heure à 55°C. Pendant 30 ce temps on ajoute autant d'eau oxygénée qu'il est nécessaire pour maintenir une réaction positive amidon-iodure. Après cette heure, on ajoute une solution aqueuse saturée de sulfite de sodium pour décomposer du peroxyde qui resterait, on filtre le mélange et on l'évaporé à sec sous pression réduite pour obtenir 35 le ITjH'-dibenzoyl (i) (cis-1,2-époxypropyl)phosphonodiamide. On prépare les sels minéraux en extrayant le phosphonodiamide avec • du méthanol. Quand on époxyde avec ce mode opératoire le H,N-diéthyl-çis-propéhylphosphonoamide et le H",N'-1étraméthyl-cis-propénylphosphonodiamide, on obtient respectivement le N,N- 69 44897 15 2091946 diniéthyl(çis-1,2-époxypropyl)phosphonamide racémique et le N,H-N'.N'-tétraméthyl-(cis-1 ,2-époxypropyl)phosphonodiamide racémique.. L'acide (-) (cis-1,2-époxypropyl)phosphonique et ses sels sont des agents antimicrobiens utiles qui sont actifs pour 5 empêcher la croissance des bactéries gram-positrves et négatives. Cet antibiotique et particulièrement ses sels sont actifs contre les pathogènes Bacillus. Staphylocoques. Eschérichia. Salmonella et Proteus et leurs souches résistant aux antibiotiques. Des types de ces mathogènes sont Bacillus subtilis. Eschérichia coli. 10 Salmonella schottmuelleri. Salmonella gallinarum. Salmonella pulloram. Proteus vulgaris. Proteus mirabilis. Proteus morganii. Staphvlococcus aureus et Staphylococcus pyogenes. Ainsi, l'acide (-) (ciB-1,2-époxypropyl)phosphonique et ses sels peuvent être employés comme agents antiseptiques pour éliminer les organismes 15 nuisibles des appareils pharmaceutiques, dentaires et médicaux et autres lieux sujets à l'infection par ces organismes. De même, ils peuvent être utilisés pour séparer certains microorganismes de mélanges de microorganismes, ^es sels de l'acide (-) (cis-1,2-époxypropyl)phosphonique sont également utiles pour traiter 20 les maladies causées par des infections bactériennes chez l'homme et les animaux et ils sont particulièrement précieux dans ce domaine car ils sont efficaces contre des souches résistantes de pathogènes» Ces sels sont particulièrement précieux car ils sont actifs quand ils sont administrés par voie orale, bien 25 qu'ils puissent aussi être administrés par voie parentérale. Comme l'antibiotique et ses sels sont très actifs pour empêcher la croissance de diverses espèces de Salmonella, ils peuvent être employés comme désinfectants pour laver les oeufs et les lieux sujets à l'infection par Salmonella. Les sels de 30 l'acide (-) (çis-1,2-époxypropyl)phosphonique sont également utiles comme bactéricides dans diverses applications industrielles comme par exemple pour empêcher les croissances indésirables dans l'eau blanche des papeteries et dans les peintures comme la peinture au latex d'acétate de polyvinyle. 35 Quand l'acide (-) (ci£-1,2-époxypropyl)phosphonique ou ses sels sont utilisés pour combattre des bactéries chez l'homme et les animaux inférieurs, ils peuvent être administrés par voie orale sous forme de capsules ou comprimés ou en solution ou 69 44897 16 2091946 suspension liquide. L1 antibiotique peut aussi être administré par voie parentérale en injection. Ces formulations peuvent être préparées en utilisant des diluants, agents de granulation, agents de préservation, liants, agents aromatisants et agents 5 d'enrobage appropriés bien connus de l'homme de l'art. L'acide (-) (çis-1,2-époxypropyl)phosphonique peut être représenté par la formule : 0 OH H . H / 0 H,C-C C P ^ \ / \ 0 OH Cette substance est un composé acide qui est appelé acide (-) (cis-1,2-époxypropyl)phosphonique en accord avec la 5 nomenclature chimique actuelle; le (-) indique que cet acide phosphonique fait tourner la lumière polarisée dans le sens inverse de celui des aiguilles d'une montre (vers la gauche pour l'observateur) quand la rotation du sel disodique est mesurée dans l'eau (concentration 5 5») à 405 mu. La désignation cis-20 utilisée dans le nom de l'acide signifie que les atomes d'hydrogène attachés aux atomes de carbone 1 et 2 de l'acide propylphos-phonique sont du même côté du cycle oxyde. La formule de structure de cette substance antibiotique a été représentée sous forme plane pour des raisons de commodité. 25 Toutefois, l'antibiotique peut aussi être représenté dans l'espace comme suit : 0 OH \ / ®3, ,K x 0 0ÏÏ OU \} c' OH / \ / \f/ / \ /I 30 CH3 0 P^ H OH OH L'énantiomère dextrogyre de l'acide (çis-1,2-époxypropyl)-phosphonique peut être transformé en acide çis-propénylphosphonique 35 par chauffage avec du thiocyanate de potassium dans du méthanol aqueux. L'acide çis-propénylphosphonique ainsi obtenu peut être utilisé comme matière de départ dans les procédés décrits dans le présent mémoire pour produire 1'énantiomère lévogyre de l'acide (çis-1,2-époxypropyl)phosphonique. 69 44897 17 2091946 10 REVENDICATIONS 1. Procédé de préparation de l'acide (-) Cois-1.2-époiypropyl)phosphonique caractérisé en ce qu'on soumet un mélange énantiomère d'esters ou d'amides de l'acide (cis-1.2-époxvpropyl)-phosphonique à l'action d'une enzyme produite par croissance d'un microorganisme capable d1hydrolyser sélectivement un ester ou ami de de l'isomère (-). 2. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que l'ester est un monoester de formule : 0 OR CH^CH - CH OH ou un de ses sels, R étant un groupe alcoyle inférieur de 1 à 7 15 atomes de carbone, un groupe alcényle inférieur de 2 à 7 atomes de carbone, ou un groupe alcynyle inférieur de 2 à 7 atomes de carbone. 3. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que l'amide correspond à la formule : jO 0 20 Z CHjCH - CH P dans laquelle Z est -HR^R^ ou OH, et R^ et Rg représentent un 25 groupe hydrocarbyle, éventuellement substitué ou de l'hydrogène, et peuvent être identiques ou différents. 4» Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que le microorganisme est un membre du groupe Fungi •im^p.-rfpc.ti de microorganismes. 30 5. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que le microorganisme est un Pénicillium. 6. Procédé selon la revendication 1 , caractérisé en ce que le microorganisme est un Asperglllus. 7. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce 35 que le microorganisme est un Actinomycetes. 8. Procédé de préparation de l'acide (-) (cis-1.2-époxypropyl)phosphonique caractérisé en ce qu'on soumet un mélange énantiomère d'esters ou amides de l'acide (cis-1,2-époxy- 69 44897 18 2091946 propyl)phosphonique à l'action d'une enzyme produite par culture d'un microorganisme capable d'hydrolyser sélectivement un ester ou un ami de de l'isomère (-) en acide (-) (çis-1,2-époxypropyl)-phosphonique et on sépare et récupère ledit acide sous la forme 5 d'un de ses sels. 9. Procédé selon la revendication 8, caractérisé en ce que le microorganisme est un Pungi imperfecti. 10. Procédé selon la revendication 8, caractérisé en ce que le microorganisme est un Pelicillium. 10 11. Procédé selon la revendication 8, caractérisé en ce que le microorganisme est un Aspergillus. 12. Procédé selon la revendication 8, caractérisé en ce que le microorganisme est un Actinomycetes.