FR 2065581 A1 19710730 FR 7039081 A 19701029 70 39081 2065581 La présente invention concerne un nouveau procédé de diagnostic ; et plus particulièrement un nouveau procédé pour le dosage rapide et précis du glucose. L'invention vise également de nouveaux réactifs utilisa-5 bles dans le procédé de diagnostic ci-dessus. Le glucose est un sucre présent à l'état naturel dans les fruits, les plantes et d'autres organismes vivants dont il est la source principale d'énergie. Il est souvent nécessaire de déterminer la concentration du glucose dans ces systèmes. Par exemple, pour que le méde-10 cin puisse étudier et identifier des anomalies du métabolisme des hydrates de carbone, ou des anomalies secondaires accompagnant d'autres maladies, par exemple le.diabète sucré, il est nécessaire de déterminer exactement la concentration du glucose dans des échantillons, par exemple la concentration de glucose dans le sé-15 rum. On effectue fréquemment aussi le dosage du glucose, par exemple dans des jus de fruits. On dispose d'un grand nombre de méthodes pour le dosage du glucose. La plupart d'entre elles reposent sur la réduction de certains métaux lourds, comme le cuivre, ou d'acides nitroaromatiques, par le groupe aldéhydique du gluco-20 se. On trouvera une excellènte vue d'ensemble de ces méthodes disponibles dans l'ouvrage Clinical Diagnosis for Laboratory Use, l4e édition, publié par W.B. SMJNDERS CO., 1969. La plupart de ces méthodes, cependant, présentent un inconvénient majeur en ce qu'elles manquent soit de spécificité, soit de précision. De plus, » 25 elles sont toutes très longues. On a maintenant trouvé un procédé rapide et cependant précis pour le dosage du glucose. Selon l'invention, on traite l'échantillon dans lequel la concentration du glucose doit être déterminée avec un nouveau réactif constitué par une association 30 d'hexokinase, de glucose-6-phosphate déshydrogénase, d'adénosine-5-triphosphate (ATP), de nicotinamide adénine dinucléotide phosphate (NADP), d'un accepteur d'électron chromogène, et d'un véhicule d'électron intermédiaire. Le véhicule d'électron ehromogène, qui est typiquement un sel de tétrazolium, est réduit à l'état 35 d'un formazan coloré, dont on détermine ensuite colorimétriquement la densité optique. Le nouveau réactif peut facultativement contenir une petite quantité d'ion magnésium et une petite quantité d'un agent chélatant. Le pH n'est pas critique, et la réaction s'effectue de préférence à un pH de 6,5 à 8,5-40 Le procédé de l'invention pour le dosage du glucose peut 70 39081 2. 2065581 être mis en oeuvre selon la description ci-dessus, ou en faisant incuber l'échantillon avec un nouveau réactif contenant de l'hexokinase, du nicotinamide adénine dinucléotide phosphate (NADP), de la glucose-6-phosphate déshydrogénase, et de 1'adénosine-5-tri-5 phosphate (ATP) en présence éventuellement d'ions magnésium, et contenant une petite quantité d'un agent chélatant tel que le sel de sodium de l'acide éthylène-diamine tétracétique (EDTA). L'incubation s'effectue typiquement pendant environ 2 à 3 minutes à 37°C, et l'on ajoute une petite quantité d'un révélateur 10 de coloration constitué d'un mélange de méthylsuLfate de phénazine (PMS) et de chlorure de 2-iodophényl-3-p-nitrophényl-5_phénylté-trazolium (INT) (connu aussi sous le nom de chlorure d'iodonitro-tétrazolium). Le" mélange obtenu èst mis à incuber à environ 37°C pendant environ 10 minutes. La réaction se poursuit jusqu'à son 15 achèvement. On lit ensuite l'absorbance optique du mélange obtenu au moyen d'un colorimètre, à une longueur d'onde d'environ 520 nm. Pour augmenter la stabilité du. formazan coloré, on ajoute, à la fin de la période d'incubation, de l'eau ou des acides minéraux comme l'acide chlorhydrique, l'acide sulfurique, l'acide nitrique 20 ou lèurs mélanges. L'intensité de.la couleur produite est proportionnelle à la concentration du glucose dans les échantillons essayés. La densité optique ainsi obtenue est ensuite comparée à celle produite par un témoin, c'est-à-dire par l'ensemble des réactifs moins 25 l'échantillon. La concentration du glucose peut être lue directement sur une courbe standard donnant la concentration du glucose en fonction de la densité optique. On peut se procurer dans le commerce l'hexokinase et la glucose-6-phosphate déshydrogénase utilisées dans cette invention 30 chez les fournisseurs tels que Nutritional Biochem, Calbiochem, ou Boehringer Biochem. On prépare les réactifs utilisés dans l'invention en dissolvant dans l'eau tous les produits actifs. On peut aussi préparer séparément les enzymes et le révélateur de colora-.tion. Typiquement, la première partie contient les enzymes, et se 35. prépare en dissolvant l'hexokinase, la glucose-6-phosphate déshydrogénase, l'adénosine-5-triphosphate (ATP), et'la nicotinamide adénine dinucléotide phosphate (NADP) dans l'eau. On lui ajoute ensuite une petite quantité d'ions magnésium sous la forme d'un sel de magnésium, comme le chlorure de magnésium ou le sulfate de 40 magnésium et l'acide éthylène diamine tétracétique sous la forme 70 39081 3- 2065581 de son sel disodique. Le système final est maintenu à un pH d'environ 6,0 à 8,5, de préférence à 7,8 avec un système tampon approprié tel que le tris-hydroxy-méthylaminométhane, ou d'autres tampons capables de maintenir ce pH. Typiquement, on mélange envi-5 ron 35 à 50 unités Bûcher d'hexokinase, 8 à 10 unités Bûcher de glucose-6-phosphate déshydrogénase, 0,5 à 2 moles d'adénosine-5-triphosphate (ATP), et 0,2 à 2 moles de nicotinamide adénine dinucléotide phosphate (NADP). L'activité enzymatique des préparations commerciales est déterminée comme indiqué dans le catalogue des 10 enzymes de Boehringer. On dit qu'une unité d'activité est basée sur l'unité Bûcherlorsqu'une unité d'activité est la quantité d'enzyme dissoute dans 1 ml qui donne une variation de densité optique de 0,100 en 100 secondes à 366 nm et à 25°C, en utilisant une cuve de 1 cm, c'est-à-dire qui catalyse la réduction de 0,030 (y moles 15 de NADP par ml, ou 22,5 f*g de NADP par ml. On peut ajouter si on le désire des agents conservateurs comme le méthylparaban (raïajhy-droxybenzoate de méthyle) ou le propylparaban (para|iydroxybenzoate de propyle). La seconde partie est la solution de révélation de colo-20 ration, et se prépare en dissolvant dans l'eau un accepteur d'électron chromogène qui joue le rôle d'indicateur, comme le chlorure d'iodonitrotétrazolium (INT) ou bleu-nitro tétrazolium, et un véhicule d'électron intermédiaire, comme le méthylsulfate de phénazi-ne. 25 Pour faciliter leur stockage et leur manipulation, on peut lyophiliser les solutions ci-dessus, ou dispenser tous les produits sous la forme de capsules ou de tablettes, et les reconstituer avec de l'eau avant de les utiliser. L'accepteur d'électron chromogène servant d'indicateur 30 existe sous la forme incolore à l'état oxydé, et se colore à l'état réduit. Par exemple, l'INT devient rouge lorsqu'il est réduit. La concentration de celui-ci est d'environ 150 mg% à 400 mg% pour l'INT, et de 25 mg% à 75 mg% pour le méthylsulfate. de phénazine. Dans la réaction, on peut utiliser d'autres véhicules 35 d'électrons comme le bleu de méthylène, le 2,6-dichlorophénolindo-phénol ou la thionine. A la place de l'INT, on peut utiliser d'autres sels de tétrazolium, comme le bleu de tétrazolium (BT) (chlorure de 3,31-dianisole-bis-4,4'-3,5-diphényltétrazolium), le chlorure de néotétrazolium, le TNBT (Tétranitro BT) ou le 2,3j5-tri-40 phényltétrazolium formazan. On trouvera une description du véhicu 70 39081 i. 2065581 le d'électron intermédiaire dans l'article d'Analytical Biochemis try, 1,317-326 (i960) intitulé "le dosage de la déshydrogénase lactique avec un sel de tétrazolium", par M.M. Nachlas, S.I. Mar-gulies, J.D. Goldberg, et A.M. Seligman. 5 En variante, on peut aussi ajouter ensemble l'hexokinase la glucose-6-phosphate déshydrogenase, 1'adénosine-5-triphosphate (ATP) et le nicotinamide adénine dinucléotide phosphate (NADP), l'accepteur d'électron chromogène et le véhicule d'électron inter médiaire pour former une solution unique. Ici encore, pour facili 10 ter le stockage et la manipulation, on peut lyophiliser la solution et la reconstituer avant de l'utiliser. Typiquement, lorsqu'on désire doser le glucose dans le sang, on ajoute'20 microlitres d'échantillon à 1,0 ml de tampon tris-hydroxy-méthylaminométhane (TRIS) 0,1 M à pH 7,8, contenant 15 9 mg% d'acide éthylène diamine tétracétique (EDTA), 0,5 g% ou 500 mg$ de MgC^jôE^O 16 mg% de nicotinamide adénine dinucléotide phosphate (NADP), 50 unités Bûcher d'hexokinase, 8 unités Bûcher de glucose-6-phosphate déshydrogénase par essai, ou 50 mg% d'adé-nosine-5-triphosphate (ATP). On effectue une incubation prélimi-20 naire pendant 2 à 3 minutes, et on ajoute 0,2 ml de révélateur de coloration. On laisse incuber pendant 10 minutes, puis on ajoute pendant ce temps 5 ml d'HCl 0,1 N pour achever la réaction enzyma tique. On lit la couleur finale à 520 nm par rapport à un témoin de réactif. 25 En comparant les résultats obtenus (c'est-à-dire la lec ture correspondant à l'échantillon par rapport au témoin) à ceux produits par une concentration connue de glucose, on obtient aisé ment la concentration du glucose dans l'échantillon. 70 39081 5. 2065S81 REVENDICATIONS 1 - Un procédé pour doser le glucose dans un échantillon, caractérisé en ce qu'il comprend les stades suivants : a) incubation de cet échantillon avec une solution conte-5 nant de l'hexokinase, de la glucose-6-phosphate déshy drogénase, de l'adénosine-5-triphosphate (ATP), et du nicotinamide adénine dinucléotide phosphate (NADP), un accepteur d'électron chromogénique, et un véhicule d'électron intermédiaire ; 10 b) détermination de la densité optique de la solution ob tenue. 2 - Un procédé de dosage du glucose dans un échantillon, caractérisé en ce qu'il comprend les stades suivants : a) incubation de cet échantillon avec une solution conte-15 nant de l'hexokinase, de la glucose-6-phosphate déshy drogénase, de 1'adénosine-5_triphosphate (ATP), et du nicotinamide adénine dinucléotide phosphate (NADP) ■ b) addition d'une solution contenant un accepteur d'électron chromogène et un véhicule d'électron intermédiai-20 re. c) détermination de la densité optique de la solution obtenue. 3 - Un procédé selon la revendication 2, caractérisé en ce que le stade (a) est effectué à un pH drenviron 6,5 à environ » 25 8,5, et en présence d'une faible quantité d'ions magnésium. 4 - Un procédé selon la revendication 2, caractérisé en ce qu'on effectue le stade (a) en présence-d'un agent chélatant. 5 - Un procédé selon la revendication 4, caractérisé en ce que l'agent chélatant est le sel de sodium de l'acide ëthylène 30 diamine tétracétique (EDTA). 6 - Un procédé selon la revendication 1 ou 2, caractérisé en ce que cet échantillon est du sérum, et que la quantité utilisée est d'environ 20 microlitres. 7 - Un procédé selon la revendication 1 ou 2, caractérisé 35 en ce fait que cet accepteur drélectron chromogénique est un sel de tétrazolium. 8 - Un procédé selon la revendication 7, caractérisé en ce que le sel de tétrazolium est choisi dans le groupe constitué du chlorure d'iodonitrotétrazolium (INT) et du bleu-nitro-tétrazo- 40 lium. 70 39081 6. 2065581 9 - Un procédé de dosage du glucose dans un échantillon caractérisé en ce que : a) on ajoute 20 microlitres de cet échantillon à environ 1 ml d'une solution contenant du tris-hydroxy-méthyl-aminométhane (TRIS) 0,1 M, une petite quantité d'acide éthylène diamine tétracétique (EDTA), et une petite quantité de chlorure de magnésium, environ 35 à 50 unités Bûcher d'hexokinase, 8 à 10 unités Bûcher de glucose-6-phosphate déshydrogénase, 0,5 à 2 moles d'adénosine-5-triphosphate (ATP) et 0,2 à 2 jM/moles de nicotinamide adénine dinucléotide phosphate (NADP). b) on fait incuber le mélange ainsi formé pendant 2 à 3 . minutes à 37°C. c) on ajoute environ 0,2 ml d'une solution contenant 150 mg% à 400 mg% de chlorure d'iodonitrotétrazolium (INT) et 25 mg% à 75-mg$ de méthylsulfate de phénazine. d) on fait incuber le mélange obtenu pendant 10 minutes à 37°C. e) on ajoute 5 ml d'acide chlorhydrique 0,1 N. f) on détermine la densité optique de la solution obtenue. 10 - Un réactif utilisable pour le dosage colorimétrique du glucose, caractérisé en ce qu'il consiste en une solution d'hexokinase, de glucose-6-phosphate déshydrogénase ,d'adénosine-5~tri-phosphate (ATP), de nicotinamide adénine dinucléotide phosphate (NADP), d'un accepteur d'électron chromogène et d'un véhicule d'électron intermédiaire. 11 - Un réactif selon la revendication 10, caractérisé en ce que cette solution est lyophilisée. 12 - Un réactif selon la revendication 10, caractérisé en ce que la solution a un pH d'environ 6,5 à 8,5 et contient une petite quantité d'ions magnésium. 13 - Un réactif utilisable pour le dosage colorimétrique du glucose, caractérisé en ce qu'il consiste en une solution d'environ 35 a environ 50 unités Bûcher d'hexokinase, environ 8 à environ 10 unités Bûcher de glucose-6-phosphate déshydrogénase, environ 0,5 a environ 2 p moles d'adénosine-5~t:riphosphate (ATP), environ 2 moles de nicotinamide adénine dinucléotide phosphate (NADP), une petite quantité d'ions magnésium, environ 400 mg% de chlorure d'iodonitrotétrazolium (INT), et environ 25 mg% à environ 75 mg% de méthylsulfate de phénazine, et ayant un pH d'environ 6,5 70 39081 7' 2065581 à 8,5. lb - Un réactif selon la revendication 13, caractérisé en ce que cette solution est lyophilisée.