FR 2080620 A1 19711119 FR 7105498 A 19710218 71 05493 A La présente invention concerne un procédé d'isomérisation enzymatique . l'invention a plus particulièrement trait à l'isoméri-sation enzymatique de produits d'hydrolyse de l'amidon qui contiennent du glucose, pour former des produits contenant du lévulose. 5 L'invention a pour but d'offrir un procédé perfectionné d'iso- mérisation enzymatique destiné à fournir des produits contenant des cétoses. D'autres caractéristiques et avantages de la présente invention ressortiront de la description détaillée qui va suivre, 10 La Demanderesse vient de découvrir que l'isomérisation enzy matique d'un aldose en un cétose, et en particulier l'isomérisation enzymatique du glucose en lévulose, peut être sensiblement perfec- C 6 "u ~C © tionnée par la conduite de / isomérisation dans des conditions non oxydantes. Un mode préféré de mise en oeuvre de l'invention impli-15 que le barbotage d'azote, d'argon ou de quelque autre gaz inerte dans le mélange à isomériser de sucre et de préparation enzymatique, en même temps qu'une agitation modérée du mélange, pour exclure l'oxygène (air), tout en établissant une atmosphère inerte au-dessus du mélange soumis à l'isomérisation. 20 L'isomérisation particulière à laquelle l'invention s'adresse est l'isomérisation du glucose en lévulose. Lorsque cette isomérisation est conduite en vue de produire et d'isoler des solutions contenant du lévulose, dans lesquelles la concentration en lévulose atteint un taux important, par exemple d'environ 1 à environ 40 ou 25 plus de 40 ?£ en poids sur base sèche, la sucrosité du produit est élevée. Ceci accroît son intérêt économique pour de nombreuses applications. Au cours des dernières années, et en particulier depuis le dépôt du brevet des Etats-Unis d'Amérique ÏT° 2 950 228 qui a été 30 le premier dans ce domaine, de nombreux travaux ont été effectués sur l'isomérisation enzymatique. On a identifié plusieurs sources microbiennes différentes de préparations enzymatiques à base d'iso-mérase du glucose. Dans quelques cas, l'enzyme qui isomérise le glucose en lévulose a été appelé isomérase du xylose, par exemple 35 dans le brevet des Etats-Unis d'Amérique précité. Le procédé de la présente invention peut être mis en oeuvre, pour autant que l'on sache, avec tous les types de préparations à 71 05490 "2~ 2080620 enzymatiques à base d'isomérase du glucose. Ces préparations enzy-matiques peuvent provenir d'un grand nombre de sources microbiennes différentes. Chaque préparation d'enzyme semble avoir ses propres caractéristiques, les caractéristiques de chaque préparation 5 d'enzyme, par exemple son pH optimal, sa température optimale, les ions métalliques requis, sa constante de Michaelis et le mécanisme de formation du lévulose, semblent différer légèrement d'une préparation enzymatique à une autre. Toutefois, le procédé de la présente invention semble pouvoir être appliqué à toutes les prépara-10 tions enzymatiques connues à base d'isomérase de glucose. On peut conduire l'isomérisation en ajoutant la préparation d'enzyme, sous la forme soluble, à une solution sucrée telle qu'un contenant sirop/du glucose, par exemple. On a également tenté d'utiliser ces préparations d'enzyme sous une forme insoluble, en particulier 15 pour la mise au point de procédés continus d'isomérisation. la présente invention peut s'appliquer à tous ces procédés. l'invention est illustrée par les exemples suivants, donnés à titre non limitatif. Toutes les parties et tous les pourcentages y sont exprimés en poids, sauf indication contraire, et sont donnés 20 sur une base "brute", sauf si l'on indique qu'il s'agit d'une base sèche ou d'une autre base. EXEMPLE 1 Isomérisation d'un produit d'hydrolyse d'amidon (équivalent de dextrose 95) au moyen d'une préparation enzymatique d'isomérase de 25 glucose dérivée d'une souche de Streptomyces Cet exemple illustre une forme préférée de mise en oeuvre de la présente invention. la fermentation est conduite de la façon suivante : A. Développement de l'Inoculua 30 On inocule des spores prélevéee^ur une culture inclinée de Streptomyces olivochromogenes AÏCC 21114 dans plusieurs fioles d'Erlenmeyer de 500 ml contenant chacune 100 ml d'un milieu stérile composé des ingrédients énumérés sur le tableau I suivant : bad original -3- 208062r TABLEAU I Ingrédients Poids Xylose 5,0 g Amidon de niais 5*0 g Extrait soluble de maïs 40,0 g 5 Sulfate de magnésium (Mg304.7H20) 5,0 g Chlorure de cobalt (CoCl2.6H20) 0,24 g Eau distillée 1000 ml 10 On ajuste le pH du milieu de culture à 7,1 avec de l'hydroxyde de sodium, avant la stérilisation. Les fioles sont inoculées et mises à incuber pendant 60 heures à une température comprise dans la gamme d'environ 26 à environ 30°C, sur une secoueuse mécanique à mouvement de va-et-vient. 15 B. Production de la préparation enzymatique On prélève des portions aliquotes de 1C ml chacune, dans les fioles contenant l'inoculum. Ces portions aliquotes sont utilisées pour inoculer des fioles d'Erlenmeyer modifiées selon Hinton, de 1000 ml de capacité, contenant chacune 200 ml de milieu stérile 20 ayant la composition suivante : TABLEAU II Ingrédients Poids Xylose 10,0 g Amidon de mais 10,0 g 25 Extrait soluble de maïs 40,0 g Extrait de levure de brasserie 2,5 g Sulfate de magnésium (MgSC4.7H20) 0,5 g Chlorure de cobalt 30 (CoCl2.6H20) 0,24 g Eau distillée 1000 ml On ajuste le pH à 7,1 avec de l'hydroxyde de sodium avant la ■ stérilisation. Les fioles inoculées sont mises à incuber pendant 48 heures à une température comprise dans la gaïame d'environ 28 à 35 -environ 30°C, sur une secoueuse rotative. Dans la préparation de l'un ou l'autre des milieux décrits ci-dessus, on peut utiliser un produit d'hydrolyse du xylane à la â i 71 05493 -4- 2080620 place du xylose, les résultats étant sensiblement équivalents. Le produit d'hydrolyse est une source peu coûteuse de xylose. C. Récolte de la préparation enzymatique Après la fermentation, on rassemble les contenus des fioles. 5 On centrifuge la liqueur à 10 000 g pendant 15 minutes. On sépare ensuite la masse cellulaire et on la c&ngèle pour la conserver. Au moment de l'utilisation, la masse cellulaire ou une fraction de cette masse est ramenée à son volume initial avec de l'eau distillée, et les cellules sont remises en suspension. Lorsque la 10 suspension cellulaire a été reconstituée, on trouve, par titrage effectué de la manière décrite ci-après, qu'elle contient 1,67 unité par ml. La suspension cellulaire est ensuite ou bien utilisée telle quelle dans des démonstrations subséquentes de la présente invention, comme décrit ci-après, ou bien on lui fait prendre une forme 15 solubilisée, également comme décrit ci-après. L. Passage de la suspension cellulaire à la forme solubilisée Une portion de la suspension cellulaire, qui a été reconstituée à partir d'une fraction congelée de la masse cellulaire, est traitée avec un lysozyme cristallin ("General Biochemical", forme 20 cristallisée 3X, 4 microgrammes/ml) pendant 24 heures à environ 25°0. L'enzyme libéré est ensuite adsorbé sur de la diéthylamino-éthylcellulose (500 unités par gramme de cellulose). La diéthylaminoéthylcellulose est ensuite lavée avec une solution de chlorure de sodium 0,2 M, qui élimine très peu de l'enzyme 25 adsorbé. La cellulose est ensuite éluée avec une solution de chlorure de sodium 0,35 M, qui élue la majeure partie de l'activité d'isomérase. La préparation enzymatique résultante, à savoir une solution d'isomérase de glucose, contient 20 unités par ml. 30 E. Titrage de l'activité d'isomérase La méthode de titrage implique une détermination spectro-photométrique du cétose produit à partir d'une solution de glucose, dans un ensemble normalisé de conditions. On prépare une solution-mère contenant les ingrédients sui-35 vants : 71 05493 -5- 2080620 tableau iii Composant Quantité MgS04.7H20 0,1 M CoCl2.6H20 0,01 M 1 ml 1 ml 0,5 ml 5 Tampon au phosphate 1 M, pH 7,5 D-glucose anhydre Eau distillée 1,44 g quantité suffisante pour ajuster le volume total à 7,5 ml 10 La préparation enzymatique à titrer est d'abord diluée de manière qu'elle contienne 1 à 6 unités d'isomérase par ml. L'isomérisation enzymatique est conduite par addition d'un millilitre de la préparation d'enzyme à 3 ml de la solution-mère, puis incubation pendant 30 minutes à 60°C. A la fin de la période 15 d'incubation, on prélève ion échantillon d'un millilitre qu'on fixe avec un volume de 9 ml d'acide perchlorique 0,5 M". L'échantillon fixé est ensuite dilué à un volume total de 250 ml. Comme témoin destiné à des fins de comparaison, on prépare également un blanc au glucose en remplaçant par 1 ml d'eau, le millilitre de prépara-20 tion d'enzyme sous la forme dissoute, au début de la période d'incubation. Le cétose est ensuite dosé par une méthode à la cystéine et à l'acide sulfurique. Aux fins de ce titrage, une unité d'isomérase est définie par la quantité d'activité enzymatique qui est re-25 quise pour produire une micromole de lévulose par minute dans les conditions décrites d'isomérisation. P. Processus d'isomérisation Pour illustrer la présente invention, on prépare un substrat normalisé qu'on utilise dans chacune des démonstrations d'isoméri-30 sation décrites ci-après. Ce substrat est préparé comme indiqué sur le tableau IV suivant : 71 05493 2080620 tableau nr Substrat normalisé Composant Quantité 5 Produit d'hydrolyse d'amidon (équivalent de dextrose 95) 60 g/100 ml sur base sèche Chlorure cobalteux Quantité suffisante pour une concentration de 0,001 M dans le substrat 10 Sulfate de magnésium Quantité suffisante pour une concentration de 0,01 M dans le substrat Ce substrat normalisé est ensuite soumis à un processus uniforme d'isomérisation dans les exemples suivants, de sorte que les 15 résultats obtenus sont comparables. la portion du substrat que l'on doit soumettre à l'isomérisation enzymatique est maintenue à 70°C dans un. récipient chemisé. On maintient le pH à environ 6,25 en effectuant des additions éventuelles de petites quantités d'une solution saturée de bicarbonate 20 de sodium. Pendant l'isomérisation, on agite le substrat dans le récipient au moyen du barreau intérieur d'un, agitateur magnétique. la dose d'activité enzymatique que l'on utilise, est de 0,6 unité/g de substance sèche dans le substrat normalisé. En raisonnant sur la préparation d'enzyme sous la forme solubilisée, on uti-25 lise 7»2 ml de cette préparation pour 400 ml du substrat normalisé . On utilise plusieurs gaz différents dans différentes réactions d'isomérisation, à des fins de comparaison. Pour chaque isomérisation, on injecte le gaz par un simple tube capillaire dans 30 le mélange/d'isomérisation. le débit d'injection est suffisant pour produire une certaine agitation du mélange et pour maintenir une atmosphère de ce gaz au-dessus du mélange. En suivant le mode opératoire qui vient d'être décrit, on conduit des réactions d'isomérisation en effectuant des injections 35 d'un gaz de déplacement qui consiste en un mélange d'air, d'azote et d'argon. A des fins de comparaison, on conduit l'isomérisation en utilisant le même équipement et le même mode opératoire, mais en cours BAD ORIGINAL 71 05*°" -7- 2080620 sans procéder à des injections de gaz. Les observations faites pendant les diverses démonstrations sont reproduites sur le tableau V suivant : TABLEAU V 5 Effet de différents gaz sur la formation d'un cétose Période d'isomérisation en heures ia d'isomérisation du produit d'hydrolyse Gaz utilisé pour (E.D. g5) les injections en cétose en lévulose 11 M 6Z èl Air 14,7 20,2 21 ,2 19,7 Azote 17,5 28,2 35,2 33,4 Argon 15,5 29,0 36,4 34,3 Néant 17,3 27,0 30,0 28,4 15 Comme l'indiquent les résultats reproduits sur le tableau V, le fait d'opérer à l'abri de l'air (oxygène) a pour conséquence de permettre la formation d'une plus grande quantité de cétose avec la dose de préparation d'enzyme que l'on utilise. En outre, ces résultats démontrent également que c'est l'existence de conditions 20 non oxydantes ou, en d'autres termes, l'exclusion de l'air (oxygène), qui est la cause de l'effet observé. Il y a lieu de remarquer que l'argon et l'azote sont des composants de l'air, et ceci est l'une des raisons pour lesquelles on les a choisis pour cette démonstration particulière. 25 La quantité de lévulose présente dans le produit d'isomérisa tion se détermine par chromatographie quantitative sur papier. Comme le montrent les résultats, la quantité présente de lévulose est en général directement proportionnelle à la quantité de cétose total. A certaines fins, il suffit d'utiliser la méthode plus rapide et plus 30 simple de dosage du cétose pour obtenir une indication de la quantité produite de lévulose. Toutefois, dans certaines conditions d'isomérisation, comme dans l'exemple 4 ci-dessous,une quantité notable de psicose, autre cétohexose, est produite, en sorte que dans ces conditions, le dosage du cétose total n'est pas une indication 35 ' précise de la quantité présente de lévulose. â ~1 05^ P" -s- 2080620 G. Caractéristiques de couleur des produits d'isomérisation On a analysé les deux sirops obtenus après 67. heures d'isomérisation, en-utilisant une injection d'air et une injection d'azote respectivement, pour déceler la présence de corps colorés. 5 Pour effectuer cette analyse, on a observé les spectres complets pour chaque sirop dans la gamme visible. De 700 nm à 360 nm, la densité optique du sirop de produit d'isomérisation formé pendant l'injection d'air est à peu près 2,5 fois celle du sirop de produit d'isomérisation obtenu pendant 10 l'injection d'azote. Par conséquent, le sirop produit pendant l'injection d'air contient environ 2,5 fois autant de corps colorés qu'il y en a dans le sirop produit pendant l'injection d'azote. Bien que le degré de raffinage et le coût de cette opération pour décolorer un sirop ne soient pas strictement proportionnels 15 à la quantité présente de corps colorés, il existe une relation certaine. Ainsi, le fait de maintenir le mélange d'isomérisation à l'abri de l'air (oxygène) permet d'obtenir un sirop isomérisé dont le raffinage est plus économique. Les valeurs d'absorption des' deux sirops dilués au dixième 20 à l'eau distillée sont données sur le tableau VT suivant : TABLEAU VI Gaz injecté dans la Longueurs d'ondes en qanomètres production du sirop Absorptions de dilutions au dixième 700 650 600 550 500 450 400 360 25 If2 0,02 0,03 0,03 0,04 0,05 0,09 0,14 0,30 Air 0,04 0,05 0,07 0,10 0,15 0,29 0,45 0,80 H. Production d'acide pendant l'isomérisation Au cours des isomérisations, on observe que l'échantillon qui est isomérisé pendant l'injection d'air, requiert environ 5 fois 30 autant de solution saturée de bicarbonate de sodium, pour maintenir le pE à 6,25» que le font les échantillons isomérisés avec injection d'azote et injection d'argon. L'isomérisation qui est conduite sans aucune injection de gaz, mais par exposition ordinaire à l'atmosphère, requiert une quantité intermédiaire de solution de bicar-35 bonate de sodium pour maintenir son pH ; elle nécessite entre deux et trois fois autant de solution que les isomérisations conduites avec injection d'azote ou d'argon. La quantité de bicarbonate de â 4 71 054P3 "9~ 2080620 sodium que lIon utilise est directement proportionnelle à la quantité d'acide produite pendant l'isomérisation. L'effet pratique est que, pour une déminéralisation complète, si une isomérisation est conduite avec exposition à l'atmosphère, 5 il faut deux à cinq fois autant de capacité d'échange ionique que ce serait le cas si l'isomérisation était conduite sensiblement à l'abri de l'air (oxygène). Par conséquent, le procédé de l'invention offre encore une autre occasion de réduire le coût du raffinage . 10 EXEMPLE 2 Utilisation d'une autre souche de Streptomyces Une espèce du genre Streptomyces a été isolée d'un échantillon de sol. La souche en est identifiée par la désignation déposée CRY-19. Cet organisme produit un pigment rose et il est nettement 15 différencié de la souche de 3. olivochromogenes utilisée dans l'exemple 1. Cette souche a été utilisée pour la production de la préparation d'enzyme sous la forme cellulaire, d'après les techniques décrites dans l'exemple 1 . 20 La préparation d'enzyme, sous la forme cellulaire, a ensuite été utilisée dans la conduite de deux isomérisations, en suivant les modes opératoires décrits dans l'exemple 1. Dans l'une de ces isomérisations, on utilise une injection d'azote. Dans l'autre, il n'y a pas d'injection de gaz, mais le mélange en cours d'isomérisa-25 tion est exposé à l'atmosphère. Les résultats obtenus sont reproduits sur le tableau VII suivant : TABLEAU VII Durée de l'isomérisation. en heures % d'-isomérisation du produit d'hydrolyse 30 (E.D. 95) Gaz injecté en cétose 18 42 66 N2 21,3 33,5 39,7 Néant 21,9 30,9 34»1 35 Ces résultats démontrent que le fait d'empêcher l'air d'entrer en contact avec le mélange à isomériser exerce un effet général sur des préparations enzymatiques à base d'isomérase de glucose, â 10 15 20 25 71 05493 2080620 et non simplement une action sélective sur la préparation de ce type produite par S. olivochromogenes. ETRTVffLE 3 Comparaison entre une préparation enzymatique cellulaire et une préparation enzymatique sous la forme soluble - On conduit quatre isomérisations en suivant les généralités des modes opératoires décrits dans l'exemple 1 et en utilisant des préparations enzymatiques obtenues conformément à ce même exemple. Le but recherché est d'effectuer une comparaison entre une préparation enzymatique cellulaire et une préparation enzymatique sous la forme soluble. Dans chaque cas, la teneur est dosée à 0,6 unité/g de substance sèche. Les résultats sont récapitulés sur le tableau VIII suivant : TABLEAU VIII Type de la préparation d'enzyme Gaz injecté Durée d'isomérisation. heures fo d'isomérisation de l'hydrolysat (E-.D. 95) - en cétose " J_8 42 66 20 Suspension cellulaire - u2 ■19,8 30,5 38,6 40,9 Suspension cellulaire Héant 19,2 29,2 33,7 37,4 Forme solu ble N2 25,7 36,6 41,4 — Forme solu ble Néant 23,6 32,7 35,3 — 30 35 Comme l'indiquent les résultats, la préparation d'enzyme,. =ous la forme soluble, déploie une plus forte activité initiale par d >se unitaire qu'une préparation enzymatique dans laquelle des cellule ; en suspension sont utilisées comme source de l'enzyme. Toutefois, le procédé de la présente invention profite aux deux formes de la préparation enzymatique. La pratique démontre qu'il est fréquent que cette préparation enzymatique, sous la forme soluble, soit inférieure dans son comportement à la même préparation enzymatique sous la forme cellulaire, lorsque le mélange à isomériser est exposé à l'atmosphère (c'est-à-dire lorsque de l'oxygène est présent et peut entrer en contact avec l'enzyme). On a proposé d'expliquer ceci par le fait 1\ Qfj-.o** -n- 2080620 que l'enzyme contenu dans les cellulec n'est pas aussi disponible pour le glucose devant être isomérisé ou pour l'oxygène, que cela n'est le cas lorsque l'enzyme est sous la forme soluble. Les résultats donnés ci-dessus démontrent que l'effet du 5 maintien de conditions non oxydantes s'est manifesté après que l'isomérisation a progressé pendant plusieurs heures, généralement pendant environ 24 heures ou plus. EXEMPLE 4 Recherche des paramètres optimaux de pH et de température 10 On conduit trois autres isomérisations en utilisant les techniques décrites dans l'exemple 1, et en faisant agir dans chaque cas, la préparation d'enzyme du type cellulaire obtenue conformément à l'exemple 1. On procède à une injection d'azote gazeux dans chaque cas, pour exclure l'air et pour faire régner une atmos-15 phère inerte au-dessus du mélange à isomériser. On prélève des échantillons au bout de 66 heures d'isomérisation. On détermine les teneurs en psicose et lévulose des échantillons, par chromatographie quantitative sur papier. La teneur en lévulose que l'on détermine par chromatographie 20 quantitative sur papier englobe le mannose, le sorbose et le taga-tose qui peuvent être présents, parce que la chromatographie sur papier ne peut ordinairement pas différencier ces quatre sucres. La chromatographie sur colonne est capable de séparer ces quatre composants à des fins d'analyse quantitative ,.mais la méthode impli-25 quant la chromatographie sur colonne ne convient pas pour les analyses courantes que nécessiteraient des applications pratiques industrielles. Toutefois, il existe une bonne corrélation entre la production de psicose et la production des trois hexoses, à savoir mannose, sorbose et tagatose. Par conséquent, d'une façon générale, 30 une forte teneur en psicose est l'indice d'une qualité médiocre du sirop, c'est-à-dire qu'elle reflète la présence d'hexoses qui ne sont ni glucose, ni lévulose. Les résultats obtenus dans ces trois isomérisations ressortant du tableau IX suivant : BAD ORIGINAL ~'l 0e'. -12- 208062C TABLEAU IX N° de l'essai pH Température, °C Dose de préparation d'enzyme, unités/g Cétose fo Psicose Lévulose 9-1 7,0 65 o o 39,4 4,4 ' ' 41,2 9-2 7,0 65 0,77 38,6 "> >7- 38,1 9-3 6,25 70 0,80 " 38,3 0,3 39,5 Les résultats donnés sur le tableau.IX permettent de tirer plusieurs conclusions importantes. 10 II ressort de l'essai ïï° 9-1 que le pourcentage de cétose n'est pas égal à la somme des pourcentages de psicose et de lévulose présents. Tandis que le pourcentage de cétose, déterminé au moyen de la méthode décrite dans l'exemple 1, n'est obtenu qu'avec une approximation de + 5 $ (c'est-à-dire en valeur absolue ± 2 % pour 15 un taux de cétose de 40 fo), il existe une bien plus grande différence entre les valeurs indiquées de 39,4 % pour le cétose et 45»6 % pour la somme des teneurs indiquées en lévulose et psicose. Ceci tient au fait que la chromatographie sur papier ne peut pas séparer clu lévulose certains des aldohexoses. Ceci est important, parce que 20 la technique antérieure a généralement recommandé d'utiliser un pH égal ou supérieur à 7,0 pendant l'isomérisation, en même temps qu'une-température égale ou supérieure à 65°C, parce qu'on a estimé que la préparation d'enzyme est plus active dans ces conditions. Bien que ceci soit vrai en apparence, la plus forte activité de 25 l'enzyme à la valeur élevée de pH, s'accompagne malheureusement de la formation d'une plus grande quantité de sous-produits. Dans les essais 9-2 et 9-3, on utilise à peu près la même dose de préparation d'enzyme. Ces deux essais aboutissent à la production de cétose en quantités à peu près égales, mais vu le pH 30 élevé que l'on utilise dans l'essai 9-2, la quantité de psicose (et par conséquent d'autres produits également) est notablement élevée. L'un des avantages importants que l'on acquiert par la conduite de l'isomérisation dans des conditions qui excluent la préaence 35 d'air, réside dans le fait que la préparation d'enzyme reste stable, même si le pH est dans la gamme acide, pendant une période de temps suffisamment longue pour permettre une isomérisation massive du gluBAD ORIGINAL 71 05493 -13- P08062C cose en lévulose, sans formation excessive de sous-produits. D'autres expériences conformes à l'invention indiquent que les avantages de l'utilisation d'une atmosphère inerte s'obtiennent aussi bien dans des opérations de production à l'échelle industriel-5 le que dans des expériences conduites à l'échelle du laboratoire, selon l'invention, et dont la description est donnée dans les exemples précédents. En outre, d'autres expériences de l'invention démontrent que l'utilisation d'une atmosphère inerte est efficace pendant l'isomé-10 risation de solutions de dextrose cristallisé pur, en sorte que l'effet de protection n'est pas limité à l'isomérisation de sirops résultant de l'hydrolyse de l'amidon. Bien qu'on ait précisé,dans ce qui précède, l'utilisation d'azote et d'argon comme gaz qui conviennent pour établir et main-15 tenir des conditions non oxydantes, on peut aussi recourir à d'autres gaz tels que, par exemple, le xénon, l'hydrogène, le chlorure de méthyle, les "Fréons", l'oxyde de carbone, l'hélium, le krypton, le butane, le propane, le méthane, l'éthane, l'hydrogène sulfuré, le protoxyde d'azote et l'éthylène. On peut aussi utiliser l'anhy-20 dride carbonique, mais il engendre un problème de stabilisation du pH. Par ailleurs, le chlore et les autres halogènes gazeux doivent ordinairement être évités, parce qu'ils réagissent avec l'enzyme. les avantages offerts par la mise en oeuvre de la présente invention ont une grande importance du point de vue industriel. 25 Ordinairement, lorsqu'on conduit une isomérisation, par exemple l'isomérisation d'un hydrolysat dont l'équivalent de dextrose est égal à 95, pour produire un mélange isomérisé contenant 40 à 45 % de lévulose, on peut observer une perte notable de l'activité enzymatique. Toutefois, lorsque l'air (oxygène) est éliminé,par exemple 30 par barbotage d'azote gazeux dans le mélange à isomériser, la perte d'activité enzymatique est réduite. la réduction de la perte d'activité enzymatique permet de produire une quantité désirée de lévulose en utilisant une plus faible dose d'une préparation donnée d'enzyme, que cela ne serait 35" possible si l'air n'était pas éliminé. En outre, l'intérêt de l'utilisation d'une préparation d'enzyme sous la forme soluble s'accentue du fait de la réduction de la perte d'activité enzymatique. De plus, BAD ORIGINAL 71 05* -14- 2080620 la technique d'élimination de l'air est un moyen peu coûteux d'effectuer une stabilisation de la préparation d'enzyme. Par ailleurs, en raison de la plus grande stabilité de l'enzyme, on peut conduire l'isomérisation dans des conditions plus 5 douces, et ceci aboutit à la production de plus faibles quantités de sous-produits qui sont généralement indésirables. On obtient le rendement maximal en lévulose et autres cétoses avec formation minimale de sous-produits. L'isomérisation conduite dans des conditions plus douces réduit la formation de corps colorés, de sorte 10 que les produits obtenus conformément à l'invention sont plus faciles et moins coûteux à raffiner, pour une qualité donnée du produit. On peut ainsi obtenir des produits chargés de lévulose contenant 30 ou plus de 30 fo de ce sucre, accompagné de moins de 2 de psicose, et nécessitant un raffinage réduit. 15 Le plus grand rendement offert par la présente invention per met d'utiliser soit une plus courte durée d'isomérisation, soit une plus faible dose de la préparation d'enzyme, pour atteindre une teneur donnée en lévulose. Un autre avantage important du procédé réside dans le fait 20 que le maintien de conditions non oxydantes réduit manifestement au minimum la quantité requise de cobalt pendant 1*isomérisation» Ceci peut offrir des avantages pécuniaires pendant l'isomérisation et en particulier pendant le raffinage subséquent. Tous ces effets et avantages que l'on observe dans la pré— 25 sente invention réduisent le prix de revient du produit final. On suppose que des avantages peuvent résulter de la mise en oeuvre de l'invention avec des préparations d'isomérase de glucose provenant de toute source connue. Bien qu'on ne désire pas s'attacher à une théorie quelconque, on suppose que le maintien de la 30 préparation d'enzyme à l'abri de l'oxygène est la cause des avantages que l'on obtient. La raison peut en être une meilleure stabilité de la préparation d'enzyme, du point de vue de son activité. Il va de soi que la présente invention n'a été décrite qu'à titre explicatif, mais nullement limitatif, et qu'elle est suscep-35 tible de diverses variantes sans sortir de son cadre. 7-i qr/jC _15_ PQ8062C REVENDICATIONS 1. Procédé perfectionné d'isomérisation d'un aldose en cétose, au moyen d'une préparation d'enzyme qui est capable d'isomériser le glucose en lévulose, caractérisé par le fait qu'il consiste à 5 conduire l'isomérisation en l'absence pratiquement totale d'air. 2. Procédé perfectionné d'isomérisation d'un aldose en cétose, au moyen d'une préparation d'enzyme qui est capable d'isomériser le glucose en lévulose, caractérisé par le fait qu'il consiste à conduire l'isomérisation dans une atmosphère non oxydante. 10 3. Procédé suivant la revendication 2, caractérisé par le fait qu'on injecte et fait barboter un gaz inerte dans le mélange à isomériser. 4. Procédé d'isomérisation de glucose en lévulose, caractérisé par le fait qu'il consiste à soumettre une solution contenant 15 du glucose à l'action d'une préparation enzymatique à base d'isomérase de glucose, à éliminer l'air pendant l'isomérisation et à isoler un produit contenant du lévulose. 5. Procédé suivant la revendication 4, caractérisé par le fait qu'on élimine l'air en conduisant l'isomérisation dans une 20 atmosphère inerte. 6. Procédé suivant l'une quelconque des revendications 2 et 5> caractérisé par le fait que l'atmosphère inerte est l'azote. 7. Procédé suivant la revendication 5, caractérisé par le fait que l'atmosphère inerte est l'argon. 25 8. Procédé suivant la revendication 5, caractérisé par le fait qu'on fait barboter un gaz inerte dans la solution pour éliminer l'air et pour créer une atmosphère inerte au-dessus de la solution, pendant l'isomérisation. 9. Procédé perfectionné d'isomérisation d'un aldose en cétose, 30 au moyen d'une préparation d'enzyme qui est capable d'isomériser le glucose en lévulose, caractérisé par le fait qu'il consiste à conduire l'isomérisation dans des conditions non oxydantes ,à un pH égal ou inférieur à 7,0, et à une température au moins égale à 65°C. 35 . 10. Procédé suivant la revendication 9, caractérisé par le fait que les conditions non oxydantes sont maintenues pendant l'isomérisation par l'utilisation d'une atmosphère inerte. BAD ORIGINAL 71 05^91 -16- 2080620 11. Procédé suivant la revendication 10,-caractérisé par le fait qu'on fait barboter un gaz inerte dans le mélange à isomériser pour éliminer l'air et pour créer une atmosphère inerte au-dessus du mélange à isomériser. 5 12. Procédé suivant l'une quelconque des revendications 3, 8 et 11, caractérisé par-le fait que lê gaz inerte- est l'azote. 13. Procédé suivant la revendication 8, caractérisé par le . fait que le gaz inerte est l'argon. 14. Procédé d'isomérisation de glucose en lévulose, caracté- 10 risé par le fait qu'il consiste à soumettre une solution contenant du glucose à l'action enzymatique d'une préparation d'isomérase de glucose en l'absence quasi totale d'air, à un pH égal ou inférieur à 7;0, et à une température au moins égale à 65°C, puis à isoler un produit chargé de lévulose. 15 15. Procédé d'isomérisation d'un aldose en un cétose, carac térisé par le fait qu'il consiste à soumettre une solution contenant un aldose à l'action d'une préparation d'enzyme capable d'isomériser le glucose en lévulose, dans des conditions non oxydantes, pendant une période de temps d'au moins 24 heures. 20 16. Procédé suivant la revendication 15, caractérisé par le fait qu'il consiste à soumettre la solution à l'action d'une préparation d'enzyme à un pH égal ou inférieur à 7,0 et à une température au moins égale à 65°C. 17. Procédé suivant la revendication 16, caractérisé par le 25 fait que les conditions non oxydantes résident dans le maintien de la solution dans une atmosphère inerte. 18. Procédé suivant la revendication 17, caractérisé par le fait que la solution contient du glucose et le produit d'isomérisation contient au moins 30 % en poids de lévulose sur base sèche-, 30 19- Procédé suivant l'une quelconque des revendications 14 et 18, caractérisé par le fait que la préparation d'enzyme dérive d'un micro-organisme du genre Streptomvces. 20. Procédé suivant la revendication 14, caractérisé par le fait que le micro-organisme du genre Streptomyces est l'espèce EL 35 olivochromogenes. 21. Procédé suivant la revendication 20, caractérisé par le fait que S. olivochromogenes appartient à la souche ATCC 21114. BAD ORIGINAL 71 0 5&9-1 -17- 9.08062P 22. Un produit chargé de lévulose, obtenu au moyen du procédé conforme à la revendication 14 et contenant au moins 35 f° en poids de lévulose et moins de 5 $ en poids de psicose, sur base sèche. 5 23. Produit chargé de lévulose, obtenu par application du procédé d'isomérisation suivant la revendication 15 à un hydrolysat d'amidon ayant un équivalent de dextrose d'au moins 95» caractérisé par le fait qu'il contient moins de 5 ^ en poids de psicose et au moins 35 % en poids de lévulose, sur base sèche. 10 24. Un produit d'isomérisation enzymatique d'un aldose, qui contient au moins 30 % en poids, sur base sèche, de cétose et moins de 2 io en poids, sur base sèche, de psicose. 25. Un produit d'isomérisation enzymatique d'un glucose, qui contient au moins 30 °fo en poids, sur base sèche, de lévulose et moins 15 de 2 % en poids, sur base sèche, de psicose. 26. Un produit d'isomérisation enzymatique d'hydrolysat d'ami,-don ayant un équivalent de dextrose de 95» qui contient au moins 30 % en poids, sur base sèche, de lévulose et moins de 2 fo en poids, sur base sèche, de psicose. 20 27. Un produit d'isomérisation d'un hydrolysat d'amidon de maïs conforme à la revendication 26, qui se distingue par une amélioration des caractéristiques de couleur et par une réduction de la teneur en acide. 28. Un produit d'isomérisation d'un hydrolysat d'amidon de 25 maïs suivant la revendication 27, sous la forme d'un sirop. â