FR 2070054 A1 19710910 FR 6918779 A 19690606 69 18779 i. 2070054 La présente invention se rapporte à un procédé de préparation de la L-Asparagi-nase à partir des organismes microbiens . En 1953, on a observé que le sérum du cobaye fait regresser certains types de tumeurs chez les souris et les rats . Huit ans plus tard, l'agent anti-tumoral 5 du sérum du èobaye a été identifié comme étant la L-Asparaginase . Par l'expression L-Asparaginase, on entend ici l'enzyme L-Asparagine amidohydrolase ayant le numéro de commission des enzymes 3.5.1.1. (Enzyme Commission Kumber) . L'analyse a montré que le cobaye normal donne seulement environ 30 unités internationales de L-Asparaginase ce qui rend trop élevé le coût de ce médicament 10' pour l'administration à l'homme . L'unité Internationale (ïï.I.) de L-Asparaginase est la quantité qui libère une micromole de NH^ de la L-Asparagine par minute à 37°C et au pH 8,0 « La posologie peut, par exemple pour un être humain, exiger 1 000 000 ÏÏ.I. ou plus, par jour, par personne . La production de telles doses nécessiterait l'extraction de sérum de plus de 30 000 cobayes par jour par personne traitée . 15 Les cobayes coûtant environ 10 F par tête, le coût de la posologie d'un jour pour une seule personne pourrait se monter à près de 300 000 F, pour les cobayes, somme à laquelle s'ajoutent les frais de fabrication de la grande quantité de sérum . En 1964-, on a su que la L-Asparaginase isolée de Escherichia coli (E. Coli) possède également des propriétés anti-tumorales . Plusieurs procédés ont été proposés 20 pour préparer de la L-Asparaginase à partir de E. Coli . Le E. Coli est normalement cultivé dans un milieu nutritif tel que des solutions de gelose-grain de soja tryptiease de peptone ou de Kornberg (H.A. Cambell et col. (1967) Biocheraistry 6,721). LesE. coli, après avoir été cultivés pendant une période de 15 à 20 heures sont recueillis pt les enzymes contenus dans les cellules bactériennes^après la 25 rupture des cellules par une technique par production de son, sont purifiés par divers procédés tels que ceux proposés par Hashburn et Wriston (1966) Nature 211, 1403 et Mashurn et Wriston (1964) Aich. Biochem. Biophvs. 105 , 451 Les milieux nutritifs employés ci-dessus ont donné des rendements relativement bas en L-Asparaginase . C'est ainsi qu'on peut s'attendre à ce qu'un ferment de 30 1 514 litres contenant un milieu nutritif classique donne environ 20 kg en "poids humide" de E. coli . De cette quantité de E. 6oli seulement environ 1 g de L-Asparaginase (environ 200 000 U.I.) peut être extrait par les techniques communément utilisées, et les coûts de la matière se montaart. à environ 200 000 F par million de U.I. 35 L'invention a pour â>jet un procédé de préparation de L-Asparaginase à partir 69 18779 2. 2070054 d'un organisme microbien qui comporte le stade de développement du microorganisme dans un milieu nutritif contenant une quantité importante de L-thréonine libre ou d'acide lactique libre,des amino-aoides libres et en particulier de l'acide L-gluta»ique e"fc&e la L-méthionine libres . 5 Grâce à l'invention, on peut préparer de plus grandes quantités de L-Asparagi nase à partir d'une quantité donnée Ain micaro-organisme, ce qui diminue les coûts de préparation de cet enzyme et rend économiquement possible son administration aux êtres humains . Les exemples suivants illustrent l'invention . 10 EXEMPLE 1 On prépare un milieu nutritif pour le développement dhn organisme microbien en diluant 20 litres d'une liqueur de macération de m^ïs, "Corn Steepvater" (Corn Products Co, New-York, N.Y.) avec 60 litres d'eau désionisée dont le pH est ajusté à pH 7,0-7,5 par de l'hydroxyde de potassium . On enlève le lourd précipité qui se 15 forme pendant l'ajustement du pE de la solution de Corn Steepvater par filtration, et on filtre à nouveau le filtrat après l'avoir chauffé jusqu'au point d'ébullition. On dilue ensuite le filtrat obtenu à 4-00 litres avec de l'eau désionisée et on stérilise à la vapeur . On cultive des E.coli (obtenn au Wadley Research Institute, Dallas, Texas, et identifié par leur Souche HAP) aérobiquement 20 pendant 12 à 18 heures à 37°C dans le milieu nutritif ci-dessus . Le milieu nutritif donne 3,1 ng (poids sec) de cellules par ml de culture et fournit des cellules contenant 0,95 U.I. de L-Asparaginase par mg^poids sec) des cellules . La quantité de L-Asparaginase obtenue à partir des cellules de E. coli, 25 recueillies du milieu de liqueur diluée de macération de maïs décrit ci-dessus, est de 10 à 20 fois plus importante qu'avec les milieux' nutritifs employés auparavant pour le développement d'organismes microbiens donnant de la L-Asparaginase '. CTKMPT.F. ? On reprend le procédé de 1'exemple 1 sur une échelle plus petite, sauf qu'on 30 utilise chacun des microorganismes cités dans le tableau I pour ensemencer le milieu nutritif de liqueur diluée de macération de maïs . L'activité de la L-Asparaginase obtenue à partir de chacun des microorganismes et la quantité de cellules obtenues sont également données en détails au tableau I . 69 18779 3. 2070054 TABLEAU I Microorganismes Source Activité d'Aspara-* ginaae U.I. par mg (poids sec) de cellule Croissance des cellules en mg (poids sec) de cellule par ml de culture 5 E. coli 055:B5 1 E. coli 020 1 E. coli 02 1 E. coli 04 1 E. coli 11 303 2 10 E. coli PA 3 E. Soli PB 3 E. coli PC 3 E. coli 11 775 2 E. coli 14 948 2 15 E. coli HÀP (aérobique) 4 E. coli HAP (anaérobique) 4 E. coli K-202 3 Serratia Marcescens A 5968 1 Bacillus subtilis sous genre Niger 3 20 PseudoBonas aeroglnosa B-475 3 Pseudomonas aeruginosa 10145 3 0,083 0,093 0,237 0,054 0,780 0,207 0,336 0,211 0,515 0,386 0,950 0,400 0,805 0,188 0,160 0,960 0,055 4,13 3,06 2,06 4,05 2,60 3,75 3,80 3,68 2,92 2,24 3,10 0,44 1,44 2,28 1,56 0,92 3,00 * 1.Commanicable Disease Center, Atlanta, Georgie 2. American Type Culture Collection 3. Food and Drug Administration 25 4. Wadley Research Institute, Dallas, Texas . «yffWPT.R ^ On reprend le procédé de l'exemple I sur une échelle réduite, sauf que comme milieu nutritif on utilise une solution de macération de maïs obtenue par diffusion et préparée en dialysant 150 ml de Corn Steepwater à 33 $ (pH l) en présence de 30 1000 ml d'eau désionisée dans un tube de dialyse en cellulose à 5°C pendant 24 h en agitant constamment . On utilise la culture E. coli HAP pour ensemencer le milieu nutritif stérile . Le milieu nutritif donne 2,10 mg (poids sec) de cellules par ml de culture et fournit des cellules contenant 0,85 d'U.I. de L-Asparaginase par mg (poids sec) de cellules . 35 EXEMPLE 4 Un milieu nutritif synthétique contenant par litre 6,5 g d'acide L-glutamique, 1,5 g de L-méthionine, 6,5 œ1 d'acide lactique, 52 mg de MgClg. 6 HgO, 4,7 mg de 69 18779 4. 2070054 MnClg . 4 HgO, 0,3 mg de CaCl2 . 2 HgO, 3,0 mg de ZnClg, 6,0 mg de FeCl^ . 6 HgO, 118 mg de KgSO^, 48 mg de KC1, 4,3 mg dé. CuSO^. 5 HgO et 0,1 M de phosphate de potassium, pH 7*0 remplace le milieu de macération de maïs de l'exemple I . On reprend le procédé de 5 l'exemple I à line plus petite échelle, en se servant, comme dans l'exemple I, de la souche de E. coli HAP, qui a produit des cellules contenant 0,79 U.I. de L-Asparaginase par mg (poids sec) de cellules, le milieu nutritif donnant 1,52 mg (poids sec) de cellules par ml de culture . 10 Le rendement fortement accru de L-Asparaginase à partir des microorganismes cultivés dans le milieu de macération de maïs, en comparaison avec la production dans les milieux employés auparavant, est dû à la présenee de quantités importantes de L-thréonine ou acide lactique libres et d1aminoacides libres . Les amino-15 acides libres particulièrement importants sont l'acide L-gluta-mique libre et la L-méthionine et, bien qu'un milieu nutritif contenant ces composants en quantités suffisantes peut être obtenu synthétiquement, comme le prouve l'exemple précédent 4, un milieu nutritif préparé à partir d'une liqueur de macération de maïs est 20 bien plus économique à utiliser, car ce milieu disponible dans le commerce contient, sous la forme voulue, les constituants désirés . On peut utiliser divers autres milieux nutritifs possédant des quantités importantes de L-thréonine ou d'acide lactique et des aminoacides libres, y compris de l'acide L-glutamique 25 . et de la L-méthionine . Le tableau II donne la liste des milieux utilisables . Le tableau II donne également les détails de la teneur en cellules par ml de culture et de l'activité de l'aspa-raginase . TABLEAU II 30 Milieu de culture Source Activité de Développement x l'Asparagi- de cellules nase U.I. par en mg (p.sec) mg (poids sec)de cellule de cellules par ml de' culture 35 Hydrolysats de caséine Casitone . 1 0,36 1*50 Hy-Case amino 2 0,72 3*05 N-Z-anrine type E 2 0,50 2,00 N-Z-araine type NAK 2 0,85 2,40 Hycase S.F. 3 1, 02 2, 80 69 18779 5. 2070054 N-Z aminé type B 2 0,92 2,60 N-Z aminé type YT 2 0,69 2,40 N-Z aminé type A 2 0,65 2,80 N-^z. aminé type As 2 0,63 2,90 5 N-Z-case 2 0,64 2,10 Hydrolysats Lactalbumine ** Edamine 2 0,57 2,10 Edamine type S 2 0,65 2,10 Hydrolysat de poudre de peptone de soja 2 0,66 1,60 10 * 1. Difco, Détroit Michigan 2. Sheffield Chemical Norwich, New York: xx on a ajouté à ces milieux nutritifs de l'extrait de levure à 0,02 % . L'acide L-glutamique et L-méthionine qui sont tous deux des 15 aninoacides doivent être présents dans le milieu nutritif à l'état libres, ce qui signifie qu'ils ne doivent pas être contenus dans une molécule de protéine . Les milieux nutritifs contenant de l'acide L-glutamique et de la L-méthionine liés avec les molécules de protéine peuvent être rendus plus productifs par digestion 20 acide ou enzymatique . C'est ainsi que l'exemple 5 donne en détail le développement de E. coli HAP dans un milieu nutritif contenant des aminoacides liés à des molécules de protéine . En comparaison, on se référera 'exemple '6qui donne en détail le développement de E. coli/dans le même milieu, mais après libé-25 ration des aminoacides par digestion acide . exemple 5 On reprend le procédé de l'exemple 1, sauf que l'on utilise comme milieu nutritif un bouillon de culture (Difco, Détroit, MichiganJ_. Le milieu après préparation, comme décrit dans l'exemple 30 1, contient 0,8 g de bouillon nutritif par 100 ml. Le milieu nutritif donne 0,70 mg (poids sec) de cellules E. coli par ml de culture et l'activité de L-Asparaginase est de 0,08 U.I. par mg (poids sec) de cellules . EXEMPLE 6 35 On reprend le procédé de l'exemple 5 sauf qu'on hydrolyse le bouillon nutritif avant de mélanger le milieu dans HC1 6n dans un tube de verre scellé dans un autoclave sous 1,054 kg/cm2 pendant 24 heures . Le contenu de l'ampoule est séché sur NaOH dans un dessicateur sous vide à 37°C pour éliminer HC1 et l'eau . On re 69 18779 6. 2070054 constitue l'hydrolysat séché dans de l'eau désionisée et on en prépare un milieu nutritif comme décrit à l'exemple 1 . Le milieu nutritif donne 2,00 mg (poids sec) de cellules de E. coli par ml de culture et l'activité de L-Asparaginase est 5 de 0,95 U.I. par mg de cellules (poids sec) . La libération des aminoacides a beaucoup augmenté la productivité d'un milieu nutritif, comme cela ressort de la comparaison des exemples 5 et 6 . La liqueur de macération de maïs qui est disponible dans le 10 commerce contient de l'acide L-glutamique, de la L-méthionine et d'autres aminoacides libres, puisque les procédés industriels d'extraction de cette liqueur comme sous-£>roduit, utilisent un acide pour extraire les constituants contenus dans la solution de maïs . 15 Les milieux nutritifs qui contiennent soit de l'acide lac tique soit de la L-thréonine libre ainsi que de l'acide L-glutamique et de la L-méthionine libres en même temps que les nombreux composés minéraux qui se trouvent habituellement dans les milieux nutritifs donnent des rendements plus grands en L-Asparaginase 20 que n'importe quel autre milieu nutritif précédemment utilisé . Bien que la présence d'acide lactique ou de L-thréonine libre soit efficace en association avec l'acide L-glutamique et la L-méthio-nine libres, il va de soi que les milieux nutritifs contenant à la fois de l'acide lactique et de la L-thréonine sont également 25 efficaces . Un milieu nutritif, tel que décrit à l'exemple 4 mais sans qu'on lui ait ajouté de la L-méthionine, produit environ le même nombre de cellules de E. coli que le milieu de l'exemple 4 . Hn particulier, 1,51 mg (poids sec) de cellules par ml de culture 30 peuvent être obtenus dans l'exemple 4 . Pourtant, 11activit^Ae la L-Asparaginase diminue en l'absence de L-méthionine jusqu'à 0,57 U.I. par mg (poids sec de cellules) en comparaison des 0,79 U.I. par mg (poids sec) de cellules dans le cas de L-méthionine . 35 De mêrae, si l'acide lactique est absent du milieu de l'exemple 4 le développement des cellules diminue à 1,20 mg (poids sec) de cellules par ml de culture et l'activité de la L-Asparaginase diminue à 0,59 UÎI. par mg (poids sec) de cellules . L'absence d'acide L-glutamique dans le milieu de l'exemple 69 18779 7. 2070054 4 donne 0,30 mg (poids sec) de cellules par ml de culture et une activité de la L-Asparaginase de 0,85 U.I. par mg (poids sec) de cellules . Donc, pour obtenir la productivité optimale des cellules 5 et l'activité optimale de la L-Asparaginase, l'acide lactique ou ses équivalents de L-thréonine libre et d'acide L-glutamique libre et L-méthionine libre doivent être tous présents . On a également observé qu'un milieu nutritif contenant un excédent d'environ 10 % par volume de liqueur de macération de 10 maïs ne donne pas des quantités plus grandes de L-Asparaginase que les milieux en contenant environ 10 % . Les milieux nutritifs contenant entre 5 et 10 $ de liqueur de maïs sont préférés, car la productivité de la L-Asparaginase diminue quand la concentration descend au-dessous de 5 % par volume . 15 Des essais ont également montré que la présence de glucose dans un milieu nutritif, même à une concentration de 0,1 ^ en poids, compromet beaucoup la productivité de la L-Asparaginase . Le procédé suivant 1'inventior^ermet d'augmenter d'une façon importante la production de L-Asparaginase à partir de quantités 20 données d'un organisme microbien . La L-Asparaginase, comme mentionné ci-dessus, est utile comme médicament, car elle provoque la régression complète des tumeurs dans les animaux, et est actuellement administrée aux êtres humains pour s'efforcer de guérir les leucémies et d'autres 25 types de cancers . 69 18779 8. 2070054 revendications 1. Procédé de préparation de la L-Asparaginase à partir d'un organisme microbien, caractérisé en ce qu'on cultive l'organisme dans un milieu nutritif contenant de l'acide L-glutamique, 5 de la L-méthionine libres et un constituant choisi parmi la L-thréonine libre, l'acide lactique libre et leurs mélanges . 2. Procédé selon la revendicatiorj^, caractérisé en ce que le milieu nutritif est une liqueur de macération de maïs diluée à l'eau . 10 3. Procédé selon la revendication 2, caractérisé en ce que la liqueur diluée à l'eau est filtrée après justement du gH à environ l 7 et stérilisée . 4. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que le milieu nutritif est la casitone . 15 5. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que le milieu nutritif est l'amino-Hy-case . 6. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que le milieu nutritif est la N-z-amine, type E . 7. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que 20 le milieu nutritif est la N-Z-amine, type NAK . 8. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que le milieu nutritif est la N-Z^ aminé, type B . 9. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que le milieu nutritif estyLa N-Z-amine, type YT . 25 10. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que le milieu nutritif est la N-Z. aminé, type A . 11. Procédé selon la revendication 1,_ caractérisé en^ce que le milieu nutritif est la N-Z aminé type AS . 12. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que 30 le milieu nutritif est la N-Z Case . 13. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que le milieu nutritif est la Hy-Case S.F. 14. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que le milieu nutritif est 1'Edamine . 35 15. Procédé selon la revendication. 1, caractérisé en ce que le milieu nutritif est 1'Edamine type S . 16. Procédé selon la revendication 1,caractérisé en ce que le milieu nutritif est le bouillon de culture hydrolysé . bad original 69 18779 9. 2070054 17. Procédé selon la revendication 1, caractérié en ce que le milieu nutritif est l'hydrolysat de poudre de peptone de soja . 18. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que le milieu nutritif contient une protéine hydrolysée qui contient 5 des quantités importantes de L-thréonine, de L-méthionine et d'acide L-glutamique . 19. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que le milieu nutritif est à peu près exempt de glucose . 20 Procédé de préparation de la L-Asparaginase à partir d'un 10 organisme microbien, earactérisé en ce qu'on cultive l'organisme dans un milieu nutritif contenant de l'acide L-glutamique, de la L-méthionine, de la L-thréonine, de l'acide lactique ou leurs mélanges .