FR 2070155 A1 19710910 FR 7037390 A 19701016 70 37390 : -1" 2070155 La présente invention concerne un procédé de préparation d'aminocycloliexylpénicilline. Plus particulièrement, elle concerne la production enzymatique d'aminocyclohexylpânicilline à partir de pénicillines, spécialement d'acide 6-aminopénicilla-5 nique, en présence d'acide afflinocyclohexylcar"boxylique, d'esters et de sels d'addition d'acides correspondants. L'aminocyclohexylpénicilline est un antibiotique ayant un large spectre d'activité contre une grande variété de bactéries pathogènes Gram-négatives et Gram-positives. Cette pénicil-10 line est caractéristique en ce qu'elle est plus active in vivo qu'in vitro contre de nombreux organismes bactériens provoquant une infection cliez les humains. Elle est ainsi très différente de 1'ampicilline qui présente aussi un large spectre de propriétés antibactériennes, mais dont l'activité in vivo est inférieu-15 3?e à celle de 1 'aminocyclohexylpénicilline. L ' ami nocyclohexyl-pénicilline peut guérir des maladies provoquées par les organismes Staphylococcus' aureus, Diplococcus pneumoniae, Stre-pto-coccus sp, Ueisseria sp., Escherichia coli, Shigella sp. et de nombreux autres. 20 La dose d'aminocycloliexylpénicilline nécessaire pour administration orale est d'environ 1 gramme par jour. On a maintenant découvert un procédé'par lequel l'aminocyclohexylpénicilline peut être élaborée à partir de pénicillines, spécialement d'acide 6-aminopénicillanique (appelé ci-après 25 "6-APA") ainsi que d'autres pénicillines. Selon ce procédé, on fait réagir l'acide aminocycloliexylcarboxylique ou ses dérivés fonctionnels avec les pénicillines en présence d'une enzyme dérivée de micro-organismes de n'importe lesquels des genres Pseu-domonas, Kluyevera, Escherichia, Aerobaçter, Micrococcus, Strep-30 tomyces, Nocardia, Aspergillus ou Pénicillium. Comme on le verra ci-après, les corps de .cellules eux-mêmes ou le liquide de culture des micro-organismes peuvent être utilisés comme véhicule de réaction. Les Pseudomonas et Kluyvera sont les genres préférés. 35 L'une des matières de base utilisées dans le procédé de l'invention est un dérivé de pénicilline, c'est-à-dire un composé ayant la structure fondamentale : 70 37390 -2- 2070155 H H H/S\ /0H3 R - N - C - C G ( ^^3 c- 0 = G - A — G GOOH 5 H . ou des esters, sels et sels d'addition d'acides correspondants, où E est l'hydrogène ou un radical acyle normalement présent dans les dérivés de pénicilline. E est habituellement un groupe 10 pharmaceutiquement acceptable comme on en trouve dans les pénicillines V, G, etc, mais pas nécessairement. Des groupes typiques sont les groupes phénoxyacétyle, phénylacétyle, gamma-chlorocrotyle, mercapto-acétyle, etc. A peu près n'importe quel groupe peut être utilisé, ies seuls critères étant que la struc-15 ture du squelette de base de pénicilline doit être présente. On préfère utiliser le 6-APA ou la pénicilline G ou V. La pénicilline Y est la phénoxyméthylpénicilline et la pénicilline G est la benzylpénicilline. La pénicilline de départ est de préférence utilisée sous 20 la forme d'un sel, habituellement un sel de métal alcalin ou de métal alcalino-terreux et de préférence le sel de sodium, de potassium ou de. calcium. Les composés peuvent aussi, être utilisés sous la forme des sels d'addition d'acides comme lé chlorhydrate, le bromhydrate, le iodhydrate, le phosphate acide, etc. 25 L'acide aminocy c1ohexy1c arb oxyli que de départ peut être utilisé sôus la forme de l'acide libre, mais on préfère l'utiliser sous la.forme d'un, dérivé fonctionnel et en. particulier sous la forme d'un sel d'addition d'acide du dérivé. Des dérivés de l'acide utilisables sont les amides, esters d'alcoyles ou sels 30 de métaux alcalins du composé. On préfère utiliser les esters d'alcoyles ayant de 1 à 4 atomes de carbone et spécialement l'ester de méthyle .ou d'éthyle, bien que les sels de -sodium, ou de potassium puissent être utilisés aussi. Comme sels d'addition d'acides, on peut utiliser les sels d'acides dérivés des acides 35 minéraux comme le chlorhydrate, qui est préféré, ou le bromhydrate, 1'.iodhydrate, le phosphate acide ou le sulfate acide. Les schémas de principe suivants sont représentatifs du procédé de l'invention. 70 37390 -3- 2070155 (a) Dans le cas où on utilise le 6-APA comme matière de départ : ,00 OH acide 1-aminocyclo-ÏLexylcarboxyli que H H/ \ /0H3 H~N—c—c c I \ / X 0=3 0=rC lï C — COOH. H acide.6-aminopénicillanique (6-APA) /S\ ^GH3 H H/ ^C^ p 00—Hïï-C—C / CHX \ \ f 3 0= C _ N G — COOH H aïïiinocycloliexylpérii cillineF acide 6- (1 -aminocycloliexane. cart)oxamide)pénicillaniqueJ ("b) Dans le cas où on utilise la pénicilline G comme matière de départ : COOH "KEL- S H H/ \ CHo-C0-HH-C-G C^ I \ / os. acide 1-aminocyclohexyl-carboxylique O—C — N pénicilline G 0— COOH H- akïï2 H H/"\ ch2.cooh + Vu n CO-UH-C—C V . / Xoh 0= G— N C— COOH H acide pÏLényl ac é ti que aminocyc 1 oliexylp éni cil line [acide 6-(1-aminocycloliexane, carboxamide)pénici11ani que] 70 37390 2070155 Les micro-organismes utilisés dans la présente invention sont ceux appartenant aux genres Pseudomonas, Eluyvera, Escheri-çhia, Aerobacter, Micrococcus, Streptomyces, gocardia, Asper-gillus ou Pénicillium, spécialement leurs souches qui ont acquis 5 une activité enzymatique très puissante pour la synthèse de 1'aminocyclohexylpénicilline comme conséquence d'une mutation héréditaire (provoquée par exemple par irradiation à l'ultraviolet, aux rayons S ou traitement par un agent provoquant une mutation). 10 Les "bactéries, actinomycètes et moisissures appartenant aux genres spécifiés utilisées dans la présente invention ont une très puissante activité en ce qui concerne la formation d'aminocyclohexylpénicilline à partir de 6-APA ou d'autres pénicillines et acides aminocyclohexylcarboxyliques. Le pH optimal 15 de l'activité enzymatique de ces micro-organismes se trouve dans un intervalle relativement large, s'étendant d'une légère acidité à la neutralité et à une légère basicité. Pour obtenir l'enzyme utilisée dans le procédé de l'invention, on cultive des souches de ces micro-organismes de façon 20 que l'enzyme désirée soit produite dans les corps des cellules et aussi de préférence dans la liqueur de culture. La culture est de préférence conduite pendant un temps suffisant pour permettre la production extracellulaire et l'accumulation de Ite-zyme comme décrit ci-après. 25 Gomme milieu de culture pour ces souches, on utilise un milieu contenant une source de carbone ou d'énergie comme le glucose, le saccharose, l'amidon, les mélasses, le sorbitol ou d'autres produits naturels contenant également une source d'azote organique. Par exemple, on peut utiliser la peptone, 30 l'extrait de viande, l'extrait de levures, la liqueur de macération de maïs, etc. Le milieu peut contenir aussi des quantités appropriées d'une source d'azote comme l'urée, l'ammoniac, le sulfate d'ammonium et le chlorure d'ammonium; ou une source naturelle d'azote comme la liqueur de macération de maïs, la pep-35 tone, l'extrait de viande, l'extrait de levures, etc. Des sels inorganiques comme des phosphates (phosphate primaire de potassium, phosphate secondaire de potassium, etc), des sels de magnésium comme le sulfate de magnésium, des ions de métaux comme 70 37390 -5- 2070155 de fer, de sodium, de potassium, de manganèse, de zinc, de calcium, etc et des ani.ons comme des chlorures et des nitrates sont de préférence présents aussi. Encore d'autres substances nutritives nécessaires pour le développement de ces souches sont uti-5 lisées suivant le besoin. La culture est conduite à une température de culture de 20 à 50°C et à un pH de 5»0 à 9»0 dans des conditions aérobies comme par des techniques de culture à secousses ou de culture immergée avec aération et agitation. Le temps de culture est 10 habituellement de 1 à 7 jours. De cette manière, l'enzyme utilisée poux la synthèse est formée dans les corps de cellules de la culture et habituellement dans la liqueur de culture également . Comme indiqué précédemment, la source de l'enzyme uti-15 lisée dans le procédé de l'invention peut être la liqueur de culture elle-même, les corps de cellules, la liqueur de culture sans les corps de cellules ou l'enzyme libre seule, après purification par relargage au sulfate d'ammonium, dialyse, précipitation à l'acétone ou à l'éthanol, chromatographie sur co-20 lonne, etc. Quand on utilise les corps de cellules, on préfère les utiliser dans une suspension ou à l'état séché à l'acétone. Quand on utilise la liqueur de culture, les matières de départ sont ajoutées à la liqueur de culture et soumises à la réaction avec elle après réglage du pH comme indiqué ci-après. • 25 La réaction enzymatique est conduite dans un liquide de réaction contenant les deux matières de départ et' une quantité appropriée de l'enzyme. Le milieu de réaction peut bien être la liqueur de fermentation elle-même à laquelle on a ajouté les matières de départ. De préférence, on ajoute une solution tampon au 30 milieu de réaction pour faciliter la réaction dans un intervalle optimal de pH. La réaction est possible dans un large intervalle de pH de 3 à 8, mais un intervalle de 4,5 à 7»5 est particulièrement approprié. La réaction -est habituellement conduite à des températures de 25°C à 50°C, mais de préférence entre 30°C et 35 38°C pendant 1 à 24 heures. Après achèvement de la réaction, 1'aminocyclohexylpénicilline peut être isolée et recueillie par des techniques bien connues en combinaison appropriée comme une extraction de 70 37390 -6- ■2070155 transfert, précipitation par l'addition d'un solvant organique ou précipitation au point isoélectrique. De plus, un échange d'ions, la chromatographie sur colonne, etc, peuvent être utilisés à des fins d'isolement. 5 Ii' aminocyclohexylpénicilline obtenue dans le procédé de l'invention est utilisable comme médicament efficace pouvant guérir des maladies causées par les organismes Staphylococcus aureus, Diplococcus pneumoniae, Streptococcus sp., Neisseria sp., Escherichia çoli, Shigella sp. et de nombreux autres. 10 La dose d1aminocyclohexylpénicilline nécessaire pour administration orale est d'environ 1 gramme par jour. Les exemples non limitatifs suivants illustrent des modes de mise en oeuvre préférés de la présente invention. Exemple 1 15 On utilise le micro-organisme Pseudomonas melanogenum ATCC 17808 comme micro-organisme d'ensemencement et un milieu contenant 1 % de peptone, 1 % d'extrait de viande, 0,5 % d'extrait de levures et 0,3 % de chlorure de sodium comme milieu d'ensemencement. A l'aide d'une boucle de platine, on inocule le micro— 3 20 organisme d'ensemencement dans 20 car du milieu dans une fxole d'Erlenmeyer de 250 cm^ et on conduit la cult'ure à 30°C pendant 3 24 heures en secouant. Ensuite, on inocule" 2 cm de la liqueur 3 de culture d'ensemencement dans 20 cnr d'un milieu de fermenta- 3 tion principale placés dans une fiole d'Erlenmeyer de 250 cm . 25 La composition du milieu de' fermentation principale est la suivante : 0,5 % de peptone, 0,5 % d'extrait de levures, 0,5 % de L-glutamate de sodium et 0,3 % de chlorure de sodium; pH avant stérilisation : 7*3 (réglé à l'aide de NaOH '5®f)« Au bout de 48 heures à partir du début de la culture à 30 secousses à 30°C, les corps de cellules sont séparés de la liqueur de fermentation par séparation centrifuge et lavés deux fois à l'aide d'une solution aqueuse à 0,9 % de chlorure de sodium. Les corps de cellules sont ensuite "mis en suspension dans un tampon acide phosphorique 1/30 M au pH 6,8 avec une teneur en 35 cellules sèches"de 10 mg/crn^. A cette suspension, on ajoute assez de 6-APA et d'ester de méthyle du chlorhydrate de l'acide a.m i nocyc 1 ôhexylc arb oxyli que pour obtenir 1,5 mg/cm^ et premier et" 5 mg/cm^ du deuxième, respectivement. On conduit ensuite la 70 37390 -7- 2070155 réaction à 3-5°0 pendant 4 heures pour obtenir 1,35 mg/cm^ d'aminocycloliexylpénicilline formée dans la solution de réaction. Exemple 2 Gomme micro-organisme d'ensemencement, on utilise 5 Kluyvera citrophila ATCC 21585. Les conditions de culture sont les mêmes qu'à l'Exemple 1, mais on utilise un milieu de fermentation principale préparé en ajoutant 0,2 % d'acide phénylacé-tique au milieu de l'Exemple 1. On conduit la réaction de la même manière qu'à l'Exemple 1, en utilisant les corps de cel-10 Iules obtenus au bout de 48 heures à partir du début de la culture, mais en utilisant 3 mg/crn^ de sel de potassium de pénicilline G- dans la solution de réaction de l'Exemple 1 à la place du 6-APA. De plus, on utilise le chlorhydrate d'amide de l'acide am inocyc1ohexylc arb oxyli que à la place de l'ester de méthyle du 15 chlorhydrate de l'acide aminocyclohexylcarboxylique. De cette manière, il se forme 2,5 mg/cm^ d*aminocyclohexylpénicilline dans la solution de réaction au bout de 5 heures à partir du début de la réaction. Exemple 3 20 On utilise Escherichia coli AŒCC 13281 et Aerobacter aerogenes ATCC 8308 comme micro-organismes d'ensemencement dans deux essais séparés. Les conditions de culture sont les mêmes' qu'à l'Exemple 1. Au bout de 48 heures à partir du début de la culture, les corps de cellules sont recueillis, mis en suspension 25 dans un milieu aqueux comme décrit dans l'Exemple 1 et ensuite versés dans une grande quantité d'acétone. Après filtration à la trompe, on obtient des corps de cellules séchés à l'acétone en lavant à l'éther les cellules séparées par filtration. On conduit la réaction enzymatique dans les mêmes condi-30 tions qu'à l'Exemple 1, en utilisant les corps de cellules séchés à l'acétone comme source de l'enzyme. On ajoute une quantité supplémentaire de 0,5 mg/cm^ de 6-APA à la solution de réaction 3 heures après le début de la réaction et on continue la réaction pendant encore 2 heures. De cette manière, la quantité 35 d'aminocyclohexylpénicilline accumulée après 5 heures à partir de l'addition du substrat correspond à 1,20 mg/cm dans le cas ■z de Escherichia coli et à 1,18 mg/cmy dans le cas de Aerobacter aerogenes. . 1 ©AD ORIGINAL 70 37390 -8- 2070155 Exemple 4 On utilise deux souches de Streptomyces phaeochromogenes ATCC 21289 et de Uo cardia globerula ATCC 2*1292 comme microorganismes d'ensemencement dans deux essais séparés. Un milieu 5 contenant 3 % d8amidon soiuble, 2 % de poudre de soja, 0,5 % d'extrait de levures et 0,1 % de carbonate de calcium à un pH de 7»3 (avant stérilisation) est utilisé comme milieu de fermentation principale. Les autres conditions de culture sont les mêmes qu'à l'Exemple 1. Le quatrième jour de la culture, on 10 ajoute 2,5 mg/cm^ de pénicilline (pénicilline G dans le cas de Stx°eptomyces phaeochromogenes et pénicilline V dans le cas de Kocardia globéraia) et 10 mg/cia^ de iîester d°éthyle du sulfate d'acide aminocyclohexylcarboxylique. Le pH de la liqueur de fermentation est réglé à 6,8 et on continue encore la fermenta-15 tion. Durant la fermentation, le pH de la liqueur de fermentation est réglé à 6,8 à des intervalles de 1 heure à l'aide d'acide chlorhydrique ou d'une solution d'hydroxyde de sodium. De cette manière, les quantités d8aminocyclohexylpénicilline accumulées dans la liqueur de fermentation au bout de 6 heures après 20 l'addition des substrats correspondent à 1,12 mg/cm^ dans le cas de Streptomyces phaeochroffiogenes et à 1,85 mg/ciir dans le cas de Nocardia globerula. Exemple 5 On utilise deux souches d'Aspergillus oryzae ATCC 16450 25 et de Penicillitim chrysogenum ATCC 10135 comme micro-organismes d'ensemencement dans deux essais séparés. Un milieu contenant 3 % de saccharose, 0,2 % de nitrate de sodium, 0,1 % de phosphate secondaire de potassium, 0,05 % de sulfate de magnésium, 0,05 % de chlorure de potassium et 0,001 % de sulfate ferreux à 30 un pH de 6,8 avant stérilisation est utilisé comme milieu de % fermentation principale. On place 50 car du milieu de fermenta-txon princxpale dans un flacon de Sakaguchi de 500 cnr et à l'aide d'une boucle de fil de platine on inocule le micro-org'a-nisme d'ensemencement. Le 5ème jour, après avoir secoué la cul-35 ture à 27°C, on ajoute du 6-APA et de 1'aminocyclohexylcarboxy-late de potassium à la liqueur de fermentation de manière que ces composés soient présents à raison de 2,0 mg/cm^ et de 10 mg/cm^, respectivement. Le pH de la liqueur de fermentation BAD original 70 37390 -9- 2070155 est ensuite réglé à 5>0 et on continue encore la fermentation. Les quantités d'aminocyclohexylpénicilline accumulées dans la liqueur de fermentation au bout de 6 jours à partir du début de •x la culture sont de 2,02 mg/cnr dans le cas de Aspergillus oryzae 5 et de 2,31 mg/cirr dans le cas de Pénicillium chrysosenum, respectivement. Après la séparation du mycélium, on fait passer environ 2 litres de la liqueur de fermentation à travers une colonne garnie de 50 cm'' de la forme ÏTa+ de Dowex 50 W x 4 (résine échan-10 geuse de cations fortement acide fournie par The Dow Chemical Co, E.U.A.) tamponnée à l'aide de tampon citrate 0,2 M (pH 2,0).avant emploi. Le produit adsorbé sur la résine est ensuite élué à l'aide de tampon citrate 0,2 M (pH 4,0) et ensuite à l'aide de tampon citrate 0,2 M (pH 7,0). Les fractions combinées contenant 15 la pénicilline sont adsorbées sur du charbon actif (1,5 litre) et ensuite éluées à l'aide de méthanol à 70 %. L'éluat est concentré sous vide à 40°C. En ajoutant lentement de l'acétone au concentré, on obtient des cristaux bruts du produit désiré. La production est de 2,3 g. 70 37390 -10- 2070155 - BEvaroioAnoits - 1 - Un procédé de préparation d'aminocycloliexylpénicilline, caractérisé en ce qu'on fait réagir une pénicilline avec un composé choisi parmi l'acide aminocyclohexylcarboxylique, 5 ses dérivés et leurs sels d'addition d'acides en présence d'une enzyme génératrice' d'aminocyclohexylpénicilline dérivée de la culture d'un micro-organisme appartenant aux genres Pseudomonas, Kluyvera, Escherichia, Aerobacter, Micrococcus, Streptomyces. Nocardia, Aspergillus ou Pénicillium. 10 2 - Un procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que la pénicilline est choisie parmi l'acide 6-aminopénicil-lanique, ses esters d'alcoyles, ses sels de métaux alcalins ou de métaux alcalino-terreux ou leurs sels d'addition d'acides. 3 - Un procédé selon la revendication 1, caractérisé en 15 ce que la pénicilline est la Pénicilline G. 4 - Un procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que la pénicilline est la Pénicilline V. 5 - Un procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que la réaction est conduite à un pH compris entre 3 et 8 et 20 à une température comprise entre 25°C et 50°C. 6 - Un procédé selon la revendication 5» caractérisé en ce que le pïï est compris entre 4,5 et 7»5 et la température est comprise entre 30°0 et 38°0. 7 - Un procédé selon la revendication 5» caractérisé en 25 ce que la réaction est conduite pendant 1 à 24 heures. 8 - Un procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'on produit l'enzyme par culture aérobie du micro-organisme dans milieu nutritif à une température comprise entre 20°0 et 50°G et à un pH compris entre 5 et 9. 30 9 - Un procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que l'enzyme est contenue dans les corps de cellules des micro-organismes et que la réaction est conduite en présence de ces corps de cellules. 10 - Un procédé selon la revendication 1, caractérisé en 35 ce que l'enzyme est présente dans une liqueur de culture obtenue à partir des micro-organismes et que la réaction est conduite en présence de cette liqueur de culture.