FR 2060252 A1 19710618 FR 6932369 A 19690923 69 32369 i 2060252 La présente invention est relative à la préparation de compositions enzymafciques, destinées notamment à être incorporées aux produits lessiviels et résultant d'un processus de fermentation en culture pure, notamment de Bacillus Subtilis. 5 Les procédés d'extraction des exo-enzymes des bouillons de culture sont connus0 Ils peuvent être classés en trois catégories : . - a) Précipitation par les alcools et cétones b) Précipitation par les sels minéraux 10 c) Adsorption sélective et désorption ces procédés étant mis en application seuls ou en combinaison. Parmi les agents de précipitation du type alcool et cétones, on cite l'acétone, l'alcool isopropylique, l'alcool éthyli-que et l'alcool mêthylique. 15 Parmi les agents de précipitation constitués par les sels minéraux, on cite le plus souvent le sulfate d'ammonium, les sulfates de sodium et de magnésium. L'emploi d'agents adsorbants .tels que l'alumine pour ad-sorber sélectivement les enzymes à extraire conduit à des procé-20 dés devant être utilisés généralement en combinaison avec un des procédés de fractionnement cités ci-dessus. Quelle que soit la méthode de purification choisie, la mise en oeuvre de ces procédés présente toujours un certain nombre d'inconvénients. 25 Les procédés consistant à utiliser un solvant comme agent d'extraction se caractérisent par leur manque de sélectivité. Ils conduisent de ce fait à l'obtention de produits impurs, : de faible activité qui nécessitent un second traitement pour être commercialisés. 30 En effet, l'addition au milieu à traiter d'acétone, pro voque la précipitation de la totalité des matières organiques insolubles de nature enzymatique ou non, et de la plupart des sels minéraux. D'autre part, la composition du produit ainsi obtenu dé-35 pend de la concentration du solvant dans le milieu; Que l'on 69 32369 2 2060252 opère avec des moûts fermentés ayant subi ou non une préconcentration, les quantités d'agent précipitant mises en jeu sont toujours considérables. On observe en outre qu'une préconcentra— tion des moûts s'accompagne généralement d'une perte d'activité. 5 Les procédés de traitement des moûts clarifiés par des sels minéraux présentent par rapport aux.précédents 1'avantage d'être sélectifs. Néanmoins, ils ne permettent généralement pas d'obtenir une poudre enzymatique pure de haute activité parce qu'il est 20 ..malaisé d'isoler le floculat obtenu. Celui-ci retient entre autres impuretés provenant des eaux mères d'imprégnation une quantité non négligeable du sel utilisé pour sa précipitation. Par exemple dans le cas où l'on utilise du sulfate d'ammonium comme agent de précipitation, on obtient des poudres ri-25 ches en. sel d'ammonium. Ce produit incorporé tel quel à des compositions détergentes alcalines leur communique une désagréable odeur d'ammoniac. . L'emploi d'autres sels tels que les sulfates de magnésium, le phosphate disodique, ne se justifie que dans des cas 2o particuliers où le produit fini a une valeur marchande suffisamment élevée. - Quant aux procédés d'extraction par adsorption et désorp-tion, il n'est pas nécessaire de commenter leur principal incon-. vénient qui est ,de ne point se suffire et de requérir l'applica-25 tion de l'un des deux procédés d'extraction ci-dessus pour obtenir des résultats convenables. Ces procédés restent pour l'instant du domaine du laboratoire. Le procédé faisant l'objet de la présente invention uti-. lise le sulfate de soude comme agent de précipitation. En effet, 30 dans des conditions opératoires précises il.permet d'obtenir, une précipitation sélective des composés organiques à activité enzymatique. Par ailleurs, 1'extraction de ces composés est aisée et permet d'obtenir des produits de composition bien définie, ayant une activité élevée, grâce à l'emploi, selon l'invention , 35 d'un adjuvant de filtration particulier. 69 32369 3 2060252 Un adjuvant convenable doit en effet remplir les conditions suivantes : a) Etre compatible avec l'utilisation ultérieure de la composition dans laquelle il doit entrer. 5 b) Etre quasi insoluble dans le milieu à filtrer c) Posséder par lui-même une bonne filtrabilitê. Or, alors qu'en théorie de nombreux composés semblent utilisables, l'expérience a révélé quen dans le cadre de 1'invention, le sulfate de calcium est le plus avantageux. 10 L'invention vise donc un procédé pour l'obtention de poudres enzymatiques à haute activité à partir de culture de Bacil-lus Subtilis, ce procédé consistant dans la combinaison d'opérations suivantes : 1) A partir d'un moût de culture pure de Bacillus Subti-15 lis, clarifié par filtratiori, centrifugation ou autre processus physique, on procède à une précipitation au moyen de sulfate de sodium ; 2) On procède ensuite à une filtration sur filtre à précouche sous vide du floculat obtenu, en utilisant comme adjuvant de 20 filtration le sulfate de calcium dihydraté, et 3) On recueille comme produit final la zone superficielle de la couche filtrante par grattage d'une pellicule d'épaisseur contrôlée. Plus précisément, on conduit la précipitation à l'aide 25 de sulfate de soude de façon à obtenir une concentration minimum de 28 % à une température comprise entre 28 et 60° C, de préférence entre 35 et 40° C, à un pH compris entre 6 et 11, de préférence entre 6,5 et 8. L'invention vise également, au titre de produits indus-30 triels nouveaux, d'une part le floculat résultant de la mise en oeuvre de la première étape du procédé, et d'autre part le produit sec résultant du procédé global. Le floculat se caractérise par une activité enzymatique très élevée et constante, dépassant 6000 unités/mg. Cette activité est ramenée à 4000 unités par la présence 35 d'une partie du sulfate de sodium ayant cristallisé au cours de 69 32369 4 2060252 l'isolement du floculat» Pour une même teneur en matières minérales, on obtient par les procédés antérieurs des produits dont l'activité de la phase organique ne dépasse pas 1500 unités/mg, soit 25 % de l'activité théorique. 5 Le produit final sec peut être obtenu avec n'importe quel degré de dilution désiré, selon l'épaisseur de la couche grattée, c'est-à-dire avec une activité contrôlée à volonté entre 600 et 4000 u/mg. Les avantages de l'invention apparaissent donc clairement: 10 - A partir d'un moût de culture pure, clarifié par filtra tion, centrifugation, ou tout autre procédé physique, le procédé faisant l'objet de la présente invention permet de séparer la totalité des composés enzymatiques recherchés. - On obtient ainsi des poudres enzymatiques à haute acti- 15 vité quelle que soit l'activité spécifique du moût clarifié utilisé comme matière première. - Ce procédé se caractérise par la simplicité de sa mise en oeuvre. Il ne nécessite aucune préconcentration des moûts à traiter, la précipitation des enzymes étant effectuée par simple 20 addition de sulfate de soude à une concentration convenable. - Le floculat obtenu dans la première étape se caractérise par sa haute activité et son excellente filtrabilité. Ces qualités rendent possible une filtration sur filtre à précouche industriel dans des conditions telles que le produit fini présente encore 25 une haute activité et soit compatible avec la formulation des détergents. - Le précipité séparé par filtration ne nécessite aucune purification ultérieure et conduit directement après séchage et conditionnement, au produit final. 30 - La récupération de l'agent de précipitation peut s'effec tuer facilement avec bon rendement, par cristallisation des eaux mères par simple refroidissement. - Du fait de sa simplicité de mise en oeuvre, le procédé de la présente invention se caractérise par l'importance relati- 35 vement faible des investissements qu'il requiert, comparativement 69 32369 5 2060252 à des procédés d1 extraction par l'acétone ou aux procédés d'extraction au sulfate d'ammonium. - Les produits mis en oeuvre pour l'exécution de ce procédé présentent l'avantage d'être économiques : le sulfate de so- 5 dium est un produit abondant et bon marché,, Il en est de même pour le sulfate de calcium et autres adjuvants classiques. En outre, ces produits sont parfaitement compatibles avec les compositions commerciales contenant des enzymes auxquelles ils ne confèrent aucune odeur hi autres propriétés physiques néfastes. Par ailleurs, 10 l'ion calcium a dans la plupart des cas un rôle protecteur des enzymes. - Le produit fini obtenu dans les conditions spécifiées ci-dessus peut être utilisé pour la formulation de détergents. Ces avantages apparaîtront encore plus clairement grâce 15 aux exemples ci-après, illustrant un certain nombre de modes de mise en oeuvre de l'invention. . EXEMPLE I. A partir de 10 litres d'un moût clarifié, provenant d'une fermentation aérobie d'une culture pure de Bacillus Subtilis 2o (LPS 327 120) et dont les caractéristiques principales sont les suivantes : - - D.O mesurée à TSOJà 0,37 pH 7,1 Activité protéolytique 6000 unités/ml ■ 2 5 T° ' ■ 35° C . . On ajoute, sous agitation et à température constante, 2800 grammes de sulfate de soude anhydre pur. On observe la formation d'un précipité.que.1'on sépare par filtration. 30 Après séchage, on obtient 15"grammes d'un produit ayant les caractéristiques suivantes : Teneur en sulfate de soude 34 % • " en matières organiques 66 % L'activité protéolytique est mesurée à pH 9 par la méthode 35 à la caséine, le dosage des acides aminés libérés étant effectué 69 32369 6 2060252 par la méthode de Folin-Ciocalten. Activité 4000U/mg EXEMPLE 2. A partir de 10 litres d'un moût clarifié dans les mêmes conditions que précédemment mais dont les caractéristiques sont : 5 D.O mesurée à 7 50 myU 0,35 pH 7,3 Activité 4000 unités/ml T° 31°C On ajoute, sous agitation et en maintenant la température 10 constante, 3000 grammes de sulfate de soude anhydre pur. Après formation du floculat on applique le même mode de séparation que celui décrit dans l'exemple précédent et, après séchage, on obtient 10,6 grammes d'un produit ayant les caractéristiques suivantes : Teneur en sulfate de soude 38 % 15 Teneur en matières organiques 62 % Activité mesurée dans les mêmes conditions que précédemment 3800U/mg. EXEMPLE 3 ; On prend 10 litres d'un moût clarifié obtenu par fermen-20 tation d'une culture pure de Bacillus Subtilis (LPS 327 400) ayant les caractéristiques suivantes : D.O mesurée.à 750 rtiyU 0,29 pH 6,2 Activité 3000 unités/ml 25 On ajoute, sous agitation, 3500 g de sulfate de sodium anhydre pur, la température étant maintenue à 45°C. Le précipité obtenu est séparé par filtration et après séchage, on récupère 11,1 grammes d'une poudre de composition : Sulfate de sodium 40 % 30 Matières organiques 60 % Activité protéolytique mesurée par la même méthode que précédemment mais à pH 7 : 2700, unités/mg. EXEMPLE 4: A partir de 10 litres d'un milieu identique à celui de 35 l'exemple précédent, et dont les caractéristiques sont : 69 32369 7 2060252 D.O mesurée à 750 m U 0,27 / pH 6,4 Activité à pH 7 (même méthode que précédemment) : 2500 u/ml On ajoute, sous agitation, 3500 g de sulfate de sodium 5 anhydre pur à une température de 38°C. Après filtration et séchage, on obtient 9,250 grammes d'une poudre ayant la composition suivante : Sulfate de sodium 40 % Matières organiques 60 % j0 Activité protéolytique à pH 7 : 2700 unités/mg EXEMPLE 5 : Du moût clarifié provenant de la fermentation d'une culture pure de Bacillus Subtilis (LPS 327 120), et dont les caractéristiques sont : 25 D.O mesurée à 750 m^U 0,31 pH 7,3 Activité 8000 u/ml est additionné de 28 % en poids de sulfate de sodium anhydre à une température de 40°C. 2o La suspension obtenue est alimentée sur un filtre à pré couche de sulfate de calcium dihydraté, ayant une surface filtrante de lm2 ; la vitesse de rotation du tambour est de 20 tours par heure et le vide à l'intérieur du tambour est de 200 torrs. On règle le grattage de telle façon que l'on prélève 750 25 grammes de sulfate de calcium à l'heure. Après l'heure du fonctionnement, la quantité de moût traité est de 500 litres, et l'on obtient une poudre qui a, après séchage les caractéristiques suivantes : Teneur en sulfate de calcium 42,8 % 30 " en sulfate de sodium 19,5 " en matières organiques 37,7 Activité protéolytique à pH 9 2300 unités/mg Après une heure de fonctionnement, on modifie la profondeur de coupe de manière à prélever 1500 grammes par heure de sulfate 35 de calcium. 69 32369 Dans ces conditions, 500 40 minutes et la poudre obtenue, tiques suivantes : Sulfate de calcium " de sodium Matières organiques Activité pH 9 2060252 litres de moût sont filtrés en a, après séchage, les caractéris- 50,3 % 16,5 33,2 2000 unités/mg 69 32369 9 2060252 REVENDICATIONS 1) Procédé pour l'obtention de poudres enzymatiques à haute activité à partir de cultures de Bacillus Subtilis, caractérisé en ce que, dans une première étape, à partir du moût de culture préalablement purifié par des moyens physiques, on précipite 5 l'enzyme au moyen de sulfate de sodium, dans une seconde étape, on filtre le floculat qui s'est formé sur un filtre à précouche sous vide en utilisant comme adjuvant de filtration du sulfate de calcium dihydraté, et enfin, dans une troisième étape on recueille un produit final sec par grattage d'une zone superficielle de la cou- 10 che filtrante, le degré d'activité de ce produit étant contrôlé par l'épaisseur de cette zone. 2) Procédé selon 1, caractérisé en ce que, dans la première étape on traite la matière première par du sulfate de soude pour obtenir une concentration minimum de 28 % à une température compri- 15 se entre 28 et 60° C, de préférence entre 35 et 40° C, à un pH compris entre 6 et 11, de préférence entre 6,5 et 8. 3) Floculat enzymatique à activité de l'ordre de 6000 unités /mg, résultant de la mise en oeuvre de la première étape du procédé selon 1 et 2. 20 4) Poudre enzymatique à activité contrôlée entre 600 et 4000 u/mg, résultant de la mise en oeuvre du procédé global selon 1 et 2.