FR 2102264 A1 19720407 FR 7129553 A 19710812 71 29553 -1- 2102264 L'invention concerne un nouvel antibiotique et des procédés de préparation de celui-ci par fermentation, d'isolement et de purification de celui-ci, ainsi que son utilisation comme adjuvant de croissance pour la volaille. Les effets du 5 nouvel antibiotique sur des bactéries particulières, joints à ses propriétés physiques et chimiques, le différencient des antibiotiques décrits précédemment. L'invention a aussi pour objet l'antibiotique X-5108 sous forme pure, sous forme diluée et sous forme de concentré 10 brut. Le nouvel antibiotique qu'il soit sous forme brute ou sous une forme plus purifiée, est actif contre divers microorganismes, comprenant des bactéries gram+ et gram" et favorise nettement la croissance de la volaille. Le nouvel antibiotique, appelé ci-après antibiotique 15 X-5108, est produit par une espèce nouvelle de Streptomyces, le Streptomyces sp. X-5108. Le nouveau streptomycète producteur d'antibiotique a été isolé d'un échantillon de sol recueilli aux Bermudes. Une culture viable de l'organisme, portant la désignation de laboratoire Streptomyces sp. X-5108, sous-culture 20 3191-2, a été déposée à 1'American Type Culture Collection, à Rockville, Maryland (Etats-Unis d'Amérique), où elle a été enregistrée sous le n° ATCC 21 386. L'espèce de Streptomyçes ici décrite et appelée Streptomyces sp. X-5108 comprend toutes les souches de Streptomyces qui produisent l'antibiotique X-5108 et 25 qui ne peuvent pas être nettement différenciées de la souche ATCC 21 386 et de ses sous-cultures, y compris des mutantes et variantes. Par "mutantes" on entend ici des mutantes obtenues à partir de l'organisme décrit, par divers moyens tels que des agents mutagènes chimiques, les rayons ultra-violets, les rayons 30 X, l'exposition au bactériophage etc.. Les propriétés de l'antibiotique X-5108 sont décrites ici et une fois que l'on connaît ces propriétés il est facile de différencier les souches productrices d'antibiotique X-5108 des autres souches. Voici une description générale de l'organisme Strepto-35 myces sp. X-5108, ATCC 21 386, basée sur des caractéristiques telles que le degré de croissance, le pigment, la morphologie etc... Les désignations descriptives de couleurs et de fragments colorés sont généralement celles qui sont recommandées par 71 29553 -2- 2102264 l'International Streptomyces Project (ISP) s Shirling, E.B. et D. Gottlieb, 1966, "Methods for Characterization of Streptomyces Species", Intl. J. Systematic Bact. 16 : 313 à 340. Les milieux utilisés pour obtenir les caractéristiques diagnostiques et la 5 description morphologique donnée ci-après sont ceux qui sont préparés par les Difco Laboratories pour l'ISP; l'identification et la composition des milieux sont indiquées au Tableau 1. Les noms de couleurs sont empruntés aux sources suivantes : ISCC-NBS, Ministère du Commerce des Etats-Unis, 1955» 10 "The ISCC-NBS method of designating colors and a dictionary of color names", National Bureau of Standards Circular 553» U.S. Government Printing Office, Washington D.C.; Tresner, N.D. et E.J. Backus, 1963, "System of color wheels for streptomyces taxonomy", Appl. Microb., 11 : 335 à 338; Eckerstrom, S et C.E. 15 Foss, 1958, Color Harmony Manual, 4ème édition, Container Corporation of America, Chicago, Illinois; H. Prauser, 1964. "Aptness and Application of Colour Codes for Exact Description of Colours of Streptomyces", Z. Allg. Mikrobiologie, 4 (1) : 95 à 98. Degré de croissance 20 La culture pïoduit un mycélium végétatif bien développé et ramifié et un mycélium aérien caractéristique sur de nombreux milieux. La végétation immergée est en relief, dure et grossière, et selon le milieu nutritif employé, elle apparaît incolore, jaune, brun-jaune ou brun-olive. Il existe des tacheséoir-brun 25 au bord de ]a végétation sur agar-agar avec levure et extrait de malt (milieu ISP 2). Couleur du mycélium aérien et/ou des spores en masse Le mycélium aérien est modérément développé, avec une texture veloutée, et pigmenté en blanc grisâtre, en gris clair 30 (d) et moyen (2 fe) et en gris jaunâtre (2 de) avec un bord blanc mince au premier stade de croissance. La couleur de la masse aérienne (Tresner-Backus Color wheel sériés) est Gy sur milieu ISP 2 à W-gy sur milieux ISP 4 et 5« Il se forme des anneaux concentriques et il se présente fréquemment une segmen-35 tation des colonies. Les caractéristiques de couleur placent la culture dans la série des gris (Pridham). La comparaison de certaines propriétés du Streptomyces sp. X-5108 avec celles d'autres membres de la série des gris est présentée au Tableau 2. 71 29553 -3- 2102264 Morphologie Des chaînes de spores formées sur le mycélium aérien .se ramifient de façon monopodique et sympodique, formant des chaînes droites, des "boucles, des crochets, des hélices allon-5 gées et irrégulières (3 à 4 spires), apparaissant aussi en une disposition en "balai. Les chaînes sont aussi "bien longues que courtes, mais principalement à plus de 10 spores. On observe des sclérotes sur la plupart des milieux. Les spores ont une forme ovale 'allongée.et cylindrique (phalangiforme-Tresner). La sur-*10 face des spores est lisse, sans aucune ornementation, ainsi •qu'on le détermine au microscope électronique (agar-agar à la purée de tomates, 10 jours à_28°C). Physiologie . Pigment soluble 15 Des traces de pigment brun se forment sur agar-agar à l'extrait de levure et à l'extrait de malt (milieu ISP 2) mais non sur les milieux ISP 3, 4 et 5»• Couleurs de l'envers Il se forme une couleur jaune à brun-jaune plus verte 20 en 7 à 21 jours sur milieux ISP 2, 4 et 5» Sur ïe guide des couleurs du Dr. Prauser, les couleurs formées à l'envers en 7 jours sont C 004b, Co 5m, avec bord incolore.(milieu 2) et Co 5a, Co 5b (milieux 4 et 5)• L'addition d'alcali ou d'acide ne produit aucun changement de la couleur de l'envers. 25 Réactions physiologiques diverses La culture est chromogène (produit de la mélanine) sur agar-agar peptone-fer et agar-agar tyrosine, ainsi que sur bouillon tryptone-extrait de levure. Une récapitulation de certaines des caractéristiques culturelles du Streptomyces sp. X-5108 est 30 présentée au Tableau 3. Les nitrates ne sont pas réduits dans le bouillon au nitrate organique; 1'amidon est hydrolysé activement et la gélatine n'est que très légèrement liquéfiée au bout de 14 jours. On trouve au Tableau 4 l'indication d'autres réactions physiologiques diverses du streptomycète. L'utilisation 35 des sources de carbone selon Pridham et Gottlieb (J, Bact., 56» 107 à 114 (1948)) est la suivante : (11 jours à 28°C) bonne utilisation du 1-arabinose, du d-fructose, du d-mannitol, du 1-rhamnose, du d-raffinose et du sucrose; utilisation médiocre 71 29553 -A- 2102264 du d-xylose, du 1-inositol et pas d'utilisation de la cellulose. On trouve au Tableau 5 d'autres informations concernant l'utilisation du carbone et de l'azote par le streptomycète. La culture se développe bien à 24-°C et à 37°C, mais non à 4-2 ni à 50°C. 5 D'après l'ornementation des spores, la morphologie gé nérale des spores et la ramification des sporophores, les couleurs en masse sur divers milieux et certaines réactions biochimiques et physiologiques, on conclut que le Streptomyces sp. X-5108 est différent de toutes les cultures de la série des gris 10 décrites dans la littérature. Pour cultiver le Streptomyces sp. X-5108 en vue d'obtenir l'antibiotique désiré X-5108, on peut utiliser diverses techniques de fermentation. En général, on peut utiliser les techniques de base suivantes, aussi bien en flacon qu'en cuve. 15 Dans la fermentation en flacon, on inocule une cuillerée de spores d'une culture inclinée sur agar-agar dans 100 ml de milieu nutritif, dans un flacon Erlenmeyer de 500 ml et on fait incuber à environ 28°C sur une secoueuse rotative pendant 7 jours au maximum. On prélève aseptiquement des échantillons 20 de bouillon entier pour des titrages in vitro, les 3ème, 5ème et 7ème jours. De même, pour la préparation de plus grands volumes de bouillon, on commence par préparer un inoculum dans des flacons Erlenmeyer de secoueuse de 6 litres ou dans des bonbonnes en "Pyrex" de 19 litres, conçues pour l'aération, le 25 prélèvement d'échantillons etc... On transfère alors ce bouillon dans les cuves de fermentation. On assure l'aération dans les bonbonnes et cuves en injectant de l'air stérile à travers le milieu de fermentation. Dans les cuves,, on assure une agitation supplémentaire au moyen d'impuiseurs mécaniques. On ajoute selon 30 les besoins des agents antimousse tels que l'huile de saindoux, l'huile de soja, etc.. pour empêcher la mousse. On peut cultiver le Streptomyces sp. X-5108 dans divers milieux liquides. Les milieux qui sont spécialement utiles à la production du nouvel antibiotique comprennent une source 35 assimilable de carbone telle que l'amidon, le glucose, la mélasse etc.., une source assimilable d'azote telle qu'une protéine, un hydrolysat de protéines, des polypeptides, des amino-acides, la liqueur de macération de maïs, des sels d'ammonium, 71 29553 -5- 21022è4 et des cations et anions tels que les ions potassium, sodium, calcium, magnésium, sulfate, phosphate, chlorure, etc.. Des oligo-éléments tels que le cobalt, l^éuivre, le fer, le molybdène, le bore, etc..., sont apportés comme impuretés d'autres constituants 5 du milieu. On peut mesurer in vitro l'activité de l'antibiotique X-5108 par sa zone d'inhibition d'une bactérie gram+, le Bacillus E, pa:çla méthode usuelle de diffusion sur agar-agar dans une boîte en cuvette. Ou encore, on peut utiliser comme bactérie gram+ 10 le Bacillus simplex. les deux bactéries donnent des zones d'inhibition d'environ 20 mm avec une solution définie arbitrairement à 1 unité/ml. Dans cette méthode de titrage, on cultive le micro-organisme à essayer dans un bouillon nutritif, par exemple le bouillon de soja Trypticase, pendant 24 à 42 heures à 28°C, dans 15 une secoueuse rotative (100 ml de milieu par flacon Erlenmeyer de 500 ml). On utilise une concentration d'inoculum de 0,25 à 0,5 % pour inoculer la couche d'ensemencement de 4 ml que l'on verse par dessus une couche préalablement durcie de 20 ml d'agar-agar nutritif de base dans unVerre de 100 ml ou une boîte de 20 Pétri perdue en matière plastique. On réfrigère les boîtes pendant au moins 2 heures avant de les emboutir et de-les remplir de la solution d'essai contenant l'antibiotique. On fait alors incuber les boîtes à 35°C pendant 18 heures et on mesure le diamètre des zones à 0,5 mm près. On fait alors des 25 calculs de puissance en unités/ml d'après des .courbes d'étalonnage . Les Tableaux 6 à 9 donnent des exemples des types de milieux que l'on utilise de préférence et les rendements d'antibiotique qu'ils permettent, dans des fermentations en flacon se-30 coué et en cuve aérée. A l'examen de ces tableaux, on peut voir que des matières azotées complexes provenant de diverses sources entretiennent la production d'antibiotique, par exemple : les matières végétales (farine de soja ou de graines de coton, farine d'avoine, solides de pulpe de tomate, produits solubles de 35 fermentation de maïs); les matières animales (farine de poisson, farine de viande digérée, hydrolysat d'aminoacides) et les cellules microbiennes (levure Torula). Un certain nombre de sources de carbone permettent une 71 29553 -6- 2102264 bonne croissance et une bonne production d'antibiotique, par exemple le glucose, le glycérol, la dextrine et l'amidon de maïs. Outre les sels minéraux déjà présents dans les milieux naturels, l'addition de sels tels que le phosphate de potassium, 5 le sulfate de magnésium et les oligo-éléments augmente parfois la croissance et le rendement d'antibiotique (selon les constituants déjà présents dans le milieu de base). L'un des milieux préférentiels pour la production d'antibiotique X-5108 dans de grandes cuves de fermentation contient 1 % de farine de graines 10 de coton dégraissée, 0,5 % de concentré de liqueur de macération de maïs, 1 % d'amidon de maïs, 0,1 % de KgHPO^ et 0,1 % de carbonate de calcium.. Le Streptomyces sp. X-5108 se développe bien aussi et produit de l'antibiotique sur certains milieux synthétiques dé-15 finis chimiquement contenant des sels d'ammonium, du nitrate ou des aminoacides (glutamate, arginine, glycine) comme sources d'azote, les sources de carbone étant le glucose, la dextrine, l'amidon, les citrates, acétates, etc.., avec addition de sels tels que le phosphate de potassium, le carbonate de calcium et 20 le sulfate de magnésium, et avec des oligo-éléments comprenant Fe++, Cu++, Mn++, Co++, Zn++. Les résultats de la fermentation du Streptomyces sp. X-5108 sur divers milieux synthétiques sont indiqués au Tableau 10. Généralement, les rendements d'antibiotique sur les milieux synthétiques indiqués au Tableau 10 ne sont 25 pas aussi élevés.que sur des milieux azotés complexes. La production d'antibiotique X-5108 est accrue par une forte aération du milieu de fermentation. En outre, on peut obtenir la production de l'antibiotique X-5108 à toute température permettant le développement satisfaisant du microorganisme. Par 30 exemple, on peut cultiver le Streptomyces sp. X-5108 dans des flacons de secoueuse qu'on fait incuber à 24°C, 28°C, 30°C et 32°C. Les titrages d'antibiotique au bout de 3» 4, 5 et 6 jours montrent que l'on peut obtenir à peu près le même rendement maximal à toute température de 24 à 32°C. Toutefois, le rendement 35 de pointe est obtenu en 3 à 4 jours à 30 et 32°C tandis qu'il faut 4 jours à 28°C et 5 à 6 jours à 24°C. Ordinairement, on obtient la production optimale d'antibiotique X-5108 en 2 à 10 jours environ. Le milieu de fermentation reste normalement assez 71 29553 -7- 2102264 proche de là neutralité, ou du côté acide, pendant la fermentation. Le pïï final dépend en partie des tampons présents et en partie du pH initial du milieu, qui est de préférence proche du point neutre avant la stérilisation. 5 Une fois que la fermentation est complète, on peut utiliser divers procédés pour isoler et purifier l'antibiotique X-5108. Les techniques appropriées d'isolement et de purification comprennent des techniques d'extraction par solvant telles que l'extraction discontinue ou dans des colonnes d'extraction 10 liquide-liquide à contre-courant à écoulement continu, et la chro-matographie par pénétration dans un gel en un système non aqueux. Dans un procédé préférentiel, on récupère l'antibiotique X-5108 du milieu de culture en séparant du bouillon de fermentation le mycélium et tous solides non dissous, par des moyens 15 usuels tels que la filtration ou la centrifugation. On extrait alors l'antibiotique X-5108 du bouillon filtré ou centrifugé en utilisant des techniques d'extraction par distribution, sous forme discontinue ou à contre-courant. On peut effectuer l'extraction au moyen d'un solvant dans une gamme de pH de 3 à 7»5 environ et 20 en utilisant comme solvant des esters non miscibles à 1'eau tels que l'acétate d'éthyle, l'acétate d'amyle, l'acétate de butyle et des esters aliphatiques similaires; l'acétate de butyle est préférable. Un système solvant préférentiel pouvant servir dans la technique de purification par distribution à contre-courant 25 est un mélange d'acétate d'éthyle, d'isopropanôl et de solution aqueuse 0,1M de phosphate secondaire de sodium. On peut effectuer la purification finale de l'antibiotique X-5108 par chromatographieavec pénétration dans un gel. On pratique cette purification par adsorption de préparations préa-30 lablement purifiées de l'antibiotique, par exemple de préparations obtenues par extraction au moyen de solvants, sur des gels de dextrane réticulé ou polymérisé. Dans un aspect préférentiel de cette technique de purification finale, on chromâtographie la préparation antibiotique préalablement purifiée sur du "Sephadex 35 DH-20" en éluant avec de l'alcool. Après filtration ou centrifugation du milieu de fermentation, on peut utiliser des techniques de chromatographie en couche mince ou sur papier pour doser l'antibiotique X-5108. 71 295S3 -8- 2102264 Etant donné les caractéristiques de couleur de l'antibiotique, on peut rendre visibles les taches par la méthode à indicateur fluorescent; en outre, on peut aussi utiliser avantageusement la bioautographie. On peut effectuer la chromatographie sur papier 5 mais on l'exécute de préférence sur des plaques de verre avec gel de silice. Le système solvant utilisé pour la chromatographie en couche mince est formé de c.hloroforme, de&éthanol et d'ammoniaque aqueuse. Le nouvel antibiotique de l'invention, X-5108, se pré-10 sente après purification sous la forme d'une substance jaune amorphê. On peut former des sels cationiques de l'antibiotique en utilisant l'antibiotique X-5108 et une base minérale ou organique pharmaceutiquement. tolérée- Parmi les sels de l'antibiotique X-5108 que l'on peut former figurent les sels alcalins tels que 15 les sels de sodium et de potassium et les sels alcalino-terreux tels que le sel de calcium. On peut former ces sels par exemple en utilisant des solutions aqueuses d'hydroxydes alcalins et alcalino-terreux. Ainsi, des solutions d'antibiotique X-5108 dans la soude aqueuse, 20 la potasse aqueuse ou la chaux éteinte aqueuse forment les sels de sodium, de potassium ou de calcium. On peut utiliser ces sels aux mêmes fins biologiques que l'antibiotique. Etant donné que les solutions de sels d'antibiotique X-5108, spécialement du sel d^éodium, sont beaucoup plus stables que des solutions de l'anti-25 biotique sous forme non saline, il est préférable d'utiliser des tampons légèrement alcalins pour la purification par distribution à contre-courant et des mélanges ammoniacaux de solvants pour la chromatographie en couche mince, ce qui ramène au minimum la concentration d'antibiotique dans la solution. 30 L'antibiotique contientles éléments carbone, hydrogène, oxygène et azote pratiquement dans les pourcentages suivants, en poids : Antibiotique Sel de sodium X-5108 35 Carbone 63,63 61,48 Hydrogène 7,81 7,81 Azote 3,48 3,32 Oxygène (par différence) 25,08 24,45 Sodium 2,94 ?1 29553 -9- 2102264 L'antibiotique X-5108 est soluble dans les alcools, par exemple le méthanol, l'éthanol, les propanols 1 et 2 et l'alcool butylique tertiaire, dans les esters non miscibles à l'eau tels que l'acétate d'éthyle, l'acétate d'amyle, l'acétate de butyle 5 et les esters aliphatiques similaires, et dans le chloroforme. L'antibiotique est insoluble dans l'eau. Le sel de sodium de l'antibiotique X-5108 est soluble dans l'eau, les alcools inférieurs comme le méthanol, l'éthanol, 1'isopropanol et le butanol et dans la Iï,Iï-diméthylformamide; il est légèrement soluble dans 10 l'acétone, l'acétate d'amyle, l'acétate de butyle et l'acétate d'éthyle, et insoluble dans le benzène, le chloroforme et l'éther éthylique. Toici diverses caractéristiques physiques de l'antibiotique X-5108 : 15 - La rotation optique du sel de sodium de l'antibiotique X-5108 est [a]jp = -82,8 (éthanol, c = 0,52). - Le spectre d'absorption d*infra-rouge de l'antibiotique X-5108 dans une pastille de KBr est indiqué par la figure 1. L'antibiotique présente une absorption caractéristique dans la ré— 20 gion infra-rouge du spectre aux longueurs d'onde suivantes, . —1 exprimées en cm : bande large à 3400, bande forte à 1660, bande large à 1580, bandes saillantes à 1580, 1380, 1250, 1100, 1040 et 995. - Le spectre d'absorption d'infra-rouge du sel de sodium de l'an-25 tibiotique X-5108 dans une pastille de KBr est représenté par la figure 2. Le sel de sodium présente une absorption caractéristique dans la région infra-rouge du spectre aux longueurs d'onde suivantes, exprimées en cm : bande large à 3400, bandes saillantes à 1645, 1570, 1500, 1388, 1105 et 1000. 30 - Le spectre d'absorption d'ultra-violet de l'antibiotique X-5108 à divers pH est indiqué par la figure 3. Les maximums d'absorption se produisent aux longueurs d'onde suivantes : ÏÏC1 0,1 n : X max 334 m >1 (E^m = 403) X max 233 m u (El% = 610) 1cm A max 206 m p. (E^£ = 500) AOf tampon pH 7 (isopropanol/ /l max 327 m u (E^ = 423) KpHPO.) A max 231 m y. (E^m = 660) 71 29553 -10- 2102264 KOH 0,1n : X max 327 m p (E^m = 416) \max 231 m |i (E^m = 647) - Le spectre de résonance magnétique nucléaire de l'antibiotique 5 est représenté par la figure 4. On obtient ce spectre en utilisant comme solvant CECI-* et comme étalon interne le tétra- 3 méthylsilane (TMS). Le spectre présente des signaux saillants à 0,92 ô, dans la région comprise entre 1,66 et 2,03 ô, à 3,16 et 3,43 6 et dans la région oléfinique. 10 L'antibiotique X-5108 a un large spectre antimicrobien comme le montre le Tableau 11. On détermine ce spectre en utilisant des titrages sur boîte en cuvette de diffusion à agar-agar, comme indiqué plus haut. L'antibiotique X-5108 présente une faible toxicité 15 buccale et parentérale, un^âctivité antistreptococcique marquée aussi bien par voie générale (buccale) que par voie locale (sous-cutanée), une activité contre le pneumocoque et dans la cocci-diose caecale. Chez la souris, l'antibiotique est relativement dépourvue de toxicité par voie buccale et sous-cutanée (DL^q : 20 > 2000 et 1320 mg/kg respectivement). L'antibiotique est actif par voie buccale (DC^q = 52 mg/kg) et par voie sous-cutanée (DC^q = 44 mg/kg) contre le Streptomyces pyogenes, il est actif contre le Diplococcus pneumoniae (DC^q = 807 mg/kg per os et 283 mg/kg par voie sous-cutanée), et aussi contre l'infection 25 par le Proteus vulgaris, gram~ . L'antibiotique X-5108 est actif comme adjuvant de croissance des volailles et augmente l'efficacité de l'alimentation des animaux. Ainsi, dans un autre mode d'exécution de l'invention, on utilise l'antibiotique X-5108 comme ingrédient actif 30 dans des compositions nouvelles et utiles qui, administrées par voie buccale aux volailles, donnent un taux de croissance accru et une meilleure efficacité de l'alimentation. On effectue l'administration de ces compositions exvfabri quant des aliments pour volailles équilibrés nutritivement qui satisfont les besoins 35 alimentaires des animaux tout en fournissant l'antibiotique X-5108 qui favorise activement la croissance. Quand, on utilise l'antibiotique X-5108 dans la préparation des compositions d'adjuvant de croissance, le constituant 71 29553 -11- 2102264 antibiotique est choisi dans le groupe qui comprend l'antibiotique et tous ses sels cationiques acceptables physiologiquement, de préférence le sel de sodium. Dans l'exposé ci-après, on utilise l'expression "antibiotique X-5108" pour désigner l'antibiotique 5 lui-même et ses sels cationiques physiologiquement tolérés. Les compositions stimulatrices de croissance selon l'invention qui contiennent comme ingrédient actif l'antibiotique X-5108 sont préparées par diverses méthodes. Selon l'une de ces méthodes, on ajoute directement l'antibiotique à un véhicule non 10 toxique comestible. Il est préférable que le véhicule soit une matière ayant une valeur nutritive pour les volailles; un aliment pour volailles très énergétique est le véhicule spécialement préférentiel. Dans le cas où l'on ajoute directement l'antibiotique aux aliments, on peut effectuer l'étape de mélange en utilisant 15 des techniques connues. Par exemple, on amène individuellement ou collectivement dans un mélangeur discontinu les matières nutritives qui constituent l'aliment pour volailles et on ajoute alors l'antibiotique. On fait fonctionner le mélangeur jusqu'à ce que le produit contienne partout une distribution uniforme d'ingré-20 dients. Les matières nutritives utilisées comme aliments pour volailles aux fins de l'invention et servant de véhicules à l'antibiotique X-5108 varient dang&ne certaine mesure selon les besoins particuliers du type de volailles à nourrir et l'usage 25 final que l'on fait des animaux. Toutefois, le plus souvent, ces aliments contiennent des sources de protéines telles que la farine de poisson, la farine de soja, le maïs, les produits d'arachides, etc.., et des sources d'hydrates de carbone telles que les graines, farines, sucres, etc.. En outre, on peut maintenir 30 l'équilibre minéral et vitaminiaue des animaux en incorporant à l'alimentation les minéraux voulus c'est-à-dire le sodium, le potassium, le magnésium, le carbonate de calcium, ètc, et les vitamines, c'est-à-dire les vitamines A, B^, D e"t thiamine. Bien entendu, l'alimentation peut aussi contenir d'autres additifs 35 usuels pour aliments. Dans un procédé préférentiel de fabrication des compositions d'adjuvant de croissance selon l'invention, on incorpore l'antibiotique X-5108 qui est l'ingrédient actif à un mélange 71 29SS3 -12- 2102264 préparatoire concentré que l'on peut alors ajouter à l'aliment pour volailles. Bans la préparation du mélange préparatoire sous forme solide contenant l'antibiotique X-5108, n'importe quel véhicule ou diluant- approprié peut jouer le rôle d'ingré-5 dientinerte à condition qu'il soit inerte à l'additif antibiotique actif et ne soit pas toxique pour les volailles qui reçoivent la composition. De nombreuses matières solides répondent à ces conditions et jouent donc un rôle satisfaisant aux fins de l'invention. Des exemples de ces matières solides sont des 10 sources de minéraux telles que les coquilles d'huîtres broyées, les céréales comestibles, les matières végétales, marines ou animales comme celles qui sont présentes dans les aliments commerciaux pour animaux, la farine de maïs, la farine de citron, la farine de soja, la farine de poisson, les déchets de viande, 15 les résidus de fermentation séchés, etc.. On peut mélanger l'antibiotique X-5108 à une ou plusieurs des matières solides appropriées indiquées plus haut pour donner une bouillie, des boulettes ou toute configuration désirée, par toute technique connue et appropriée. Par exemple, pour 20 former la composition, on peut diviser finement ou pulvériser l'ingrédient actif et les ingrédients inertes au moyen de tout broyeur commercial. Si la matière alimentaire n'est pas présente quand on effectue le broyage ou la pulvérisation, on peut distribuer la matière obtenue, selon l'invention, dans toute ma-25 tière alimentaire accessible convenablement. La quantité d'antibiotique X-5108 nécessaire pour obtenir la stimulation désirée de la croissance et l'accroissement désiré de l'efficacité des aliments est déterminante mais elle peut varier dans la gamme prescrite. De préférence, quand on 30 l'utilise avec l'alimentation des animaux, la composition améliorée d'adjuvant de croissance de l'invention comprend un aliment supplémentaire pour volailles dans lequel sont dispersées, par 100 parties en poids d'aliment, environ 0,0001 à 0,01 partie en poids de la matière active, c'est-à-dire l'antibiotique X-5108 35 ou ses sels pharmaceutiquement tolérés. Les concentrations d'antibiotique X-5108 supérieures à 0,01 partie en poids par 100 parties d'aliments ne donnent généralement pas des résultats meilleurs que 0,01 partie par 100 parties. Il n'est donc pas avanta 71 295S3 -1J- 2102264 geux d'utiliser des quantités supérieures à 0,01 partie en poids d'ingrédient actif par 100 parties en poids d'aliments. Dans un mode d'exécution préférentiel de l'invention, la composition nouvelle d'adjuvant de croissance comprend un aliment 5 supplémentaire pour volailles contenant, par 100 parties en poids d'aliment, environ 0,0005 à 0,0025 partie en poids d'ingrédient actif qui est l'antibiotique X-5108. Comme indiqué plus haut, la pratique préférentielle doi'invention consiste à préparer initialement un mélange pré-10 paratoire concentré contenant comme ingrédient actif l'antibiotique X-5108. La préparation d'un mélange préparatoire pouvant être ensuite ajouté à l'alimentation constitue une méthode appropriée d'utilisation de la composition d'adjuvant de croissance et assure la distribution convenable de l'ingrédient actif dans 15 tout l'aliment. La quantité d'antibiotique X-5108 présente dans le mélange préparatoire n'est pas déterminante quant à la possibilité d'application de l'invention. Les buts de l'invention sont atteints, quelle que soit la concentration d'antibiotique X-5108 dans le mélange préparatoire, si l'on utilise une quantité de 20 mélange préparatoire qui est capable de donner un aliment final contenant une proportion efficace d'antibiotique X-5108, telle qu'elle est définie plus haut. Le mélange préparatoire est une façon commode de fournir la composition au fabricant d'aliments ou à l'éleveur de volailles, qui peut alors mélanger des quanti-25 tés appropriées du mélange préparatoire aux aliments pour volailles dont il dispose, afin d'obtenir un aliment final contenant une proportion efficace d'antibiotique X-5108. On comprendra plus complètement la nature et les buts de l'invention en se référant aux exemples suivants. Sauf indi-30 cation contraire, toutes les parties sont en poids. Exemple 1 Fermentation du Streptomyces sp. X-5108 On inocule une suspension de sports de Streptomyces sp. X-5108 provenant d'une culture inclinée en tube à essais 35 sur agar-agar nutritif dans une bonbonne aérée en "Pyrex" de 19 litres contenant 15 litres d'un milieu de la composition suivante : 71 29553 -14- 2102264 1 % de farine de soja 1 % de cassonade 0,25 % de solides de liqueur de macération de maïs 0,1 % de EgHPO^ 5 0,1 % de CaCOj 0.5 % d'huile de saindoux comme agent antimousse. Après 4 jours de développement à 28°C avec aération, on transfère la végétation filamenteuse dans une cuve de fermentation en acier inoxydable de 380 litres contenant 227 litres de 10 milieu de la composition suivante : 1,% de farine de graines de coton dégraissée ("Proflo") 1 % d'amidon de maïs 0,25 % de solides de liqueur de macération de maïs 0,1 % de CaCO^ 15 0,1 % de K2HP04 et de l'huile de saindoux comme agent antimousse. On ajuste le pH du milieu à 6,8 avantl'inoculation. On aère la cuve et on laisse le développement se poursuivre pendant 5 jours. On filtre alors le contenu de la cuve sur de la terre 20 d'infusoires ("Hyflo Filter Cell"). On ajuste le pH du filtrat à 3,5 et on l'extrait par la moitié de son volume d'acétate de "butyle. On concentre l'extrait clarifié sous pression réduite en dessous de 40°C pour obtenir un sirop brun qui, après trituration avec de l'éther de pétrole, donne une poudre de solide qui est 25 l'antibiotique X-5108, titrant 120 unités de Bacillus E par mg. Exemple 2 Purification de l'antibiotique X-5108 par extraction discontinue au moyen d'un solvant Oh pratique le processus d'extraction discontinue au 30 moyen d'un solvant sur des charges de fermentation de 11.400 litres qui titrent in vitro environ 130 unités/ml contre le B. sim-plex. On extrait le bouillon filtré par l'acétate de butyle à un pH de 7,5. Après des lavages à l'eau, on concentre l'extrait organique par vaporisation à des températures inférieures à 50°C 35 et à la solution anhydre obtenue, on ajoute du sodiomalonate de diéthyle comme réactif pour porter le pH à 9,0. On élimine par filtration le précipité jaune qui s'est formé et on le lave avec de l'acétate de-butyle. Puis on le partage entre l'eau et l'acé 71 29553 -15- 2102264 10 tate de butyle et on ajuste le pH à 4. On sépare la phase organique et on la traite comme ci-dessus, si ce n'est que l'on ajoute le réactif sodiomalonate de diéthyle jusqu'à pH 8,5. On acidifie à nouveau ce deuxième précipité et on 1'extrait par l'acétate de butyle frais. On traite alors l'extrait par le "Darco G-60" et on précipite finalement le sel de sodium de l'antibiotique X-5'108 en ajoutant du sodiomalonate de diétbyle jusqu'à pH 8,0. Après lavage et séchage, le sel de sodium jaune ainsi obtenu titre in vitro environ 430 unités/mg contre le Bacillus simplex. Le processus d'extraction décrit ci-dessus est récapitulé par le schéma de principe suivant : Schéma de principe pour l'isolement de l'antibiotique X-5108 11.400 litres de bouillon entier (récolte de 5 à 6 jotrs) Etape 1 ^'Eliminer les cellules en filtrant sur "Hyflo" ^800 litres de bouillon filtré (pH 7,5) Etape 2 Etape 3 (Si nécessaire, ajuste le pH avec H^PO^) Extraire par 2270 litres d'acétate de butyle 2200 litres de "1er acétate de butyle" Laver deux fois avec 95 litres de HgO Concentrer par vaporisation 303 litres de "1er concentré d'acétate de butyle" Etape 4 Etape 5 Etape 6 Ajouter du réactif sodiomalonate de diéthyle jusqu'à pH 9 (environ 1 à 1,5 litre de 1,7n) Eliminer le précipité par filtration, laver avec 3,8 litres d'acétate de butyle "1er précipité" Dissoudre dans 95 litres de H?0, ajuster le pH à 4 avec 15 °/° de H^POm ; Extraire à deux reprises par l'acétate de butyle (76 + 38 litres) 106 litres de "2ème acétate de butyle" Etape 7 Etape 8 Laver à deux reprises avec 7,6 litres de E^O Concentrer par vaporisation 15 litres de "2ème concentré d'acétate de butyle" Ajouter du réactif sodiomalonate de diétbyle jusqu'à PH 8,5; , Eliminer le précipité par filtration, laver avec 3,8 litres d'acétate de butyle" "2ème précipité" Dissoudre dans 76 litres de HoO, ajuster le pH à 5 avec 15 9^ de H~PC Extraire à deux : (57 + 28 litres) avec 15 % de lUPO^ ; Extraire à deux reprises par l'acétate de butyle 71 29553 -16- 2102264 79 litres de "3ème acétate de "butyle" Laver à deux reprises avec 7,6 litres de HgO fConcentrer par évaporation 15 litres de "3ème concentré d'acétate de butyle" Agiter avec 50 g de "Barco G-60" pendant 1 heure à la température ambiante, ^Filtrer et concentrer par vaporisation 7,6 litres de "4ème acétate de butyle" Ajouter du réactif sodiomalonate de diéthyle jusqu'à pH 3,0 Eliminer le précipité, par filtration, laver avec 3,8 litres-d'acétate de butyle, puis, 3,8 litres d'éther de pétrole (30 à 60°C), sécher' à 56°C et 0,5 im pendant 36 heures. Sel de sodium de 1'.antibiotique X-5108, sous forme de solide amorphe jaune. Exemple 3 Purification de l'antibiotique X-510.8 par distribution à contre-20 courant Instrument : nombre de tubes : 200 volume de la phase supérieure : 40 ml volume de la phase inférieure : 40 ml 25 Charge : 5 g d'antibiotique X-5108 obtenu par extraction au moyen d'un solvant d'un bouillon de. fermentation brut, dissous dans 40 ml de phase supérieure Système solvant : 30 acétate d'éthyle, isopropanol, solution aqueuse 0,1M de phosphate secondaire de sodium, 12:9:20 en volume Caractéristiques de distribution : nombre de transferts : 200 tube de pointe après 200 transferts : 159 35 rapport de distribution : 3,88 Processus On réunit les fractions 150 à 170 et on ajoute du buta-nol(1) pour extraire 11 antibiotique dans la phase organique. On jette la phase aqueuse et on lave à quatre reprises la phase or-40 ganique avec de l'eau. Finalement, on élimine de l'eau azéotro- Etape 9 5 Etape 10 10 Etape 11 15 71 29553 -17- 2102264 piquem'ent de la phase organique'fet on précipite le produit en ajoutant de l'éther de pétrole. On récupère 3 g de matière antibiotique ayant une puissance biologique double de celle de la matière première. 5 Exemple 4 Purification de l'antibiotique X-5108 par chromatographie sur "Sephadex LH-20" On prend une solution éthanolique de $00 mg d'un échantillon de 1'antibiotique préalablement purifié par distribution à contre-courant et on l'ajuste à un pH de 8 à 9 avec une solution de méthoxyde de sodium (papier indicateur humide) et on l'applique à une colonne de "Sephadex LH-20" (290 x 41 mm) équilibrée avec de l'alcool 3A. On développe la colonne avec de l'alcool 3A, la principale zone d'antibiotique sortant à un volume d'effluent de 950 à 1200 ml. Les fractions suivantes contiennent un certain nombre de zones colorées ayant une activité biologique négligeable. On réunit les fractions actives et on les évapore jusqu'à un petit volume auquel on ajoute de l'éther et de l'éther de pétrole pour précipiter l'antibiotique. Le solide jaune obtenu, qui est le sel de sodium de l'antibiotique X-5108, présente seulement une tache sur tic, = 0,19 (gel de silice F-254, détection par rayons ultra-violets) et = 0,29 (gel de silice/kieselguhr, détection bioautographique). Exemple 5 Préparation d'antibiotique X-5108 à partir du sel de sodium On dissout 0,464 g du sel de sodium&e l'antibiotique X-5108, obtenu par chromatographie sur "Sephadex LH-20" dans 4,6 ml d'eau glacée et on ajoute 10 ml d'acétate d'éthyle pour former un système à deux phases. A ce mélange, contenu dans un 30 entonnoir à décantation, on ajoute 1 ml de solution de phosphate primaire de sodium (50 g de HeŒyPO^ dans 100 ml d'eau). Le précipité formé initialement se dissout quand on agite.On jette la phase aqueuse et on lave à quatre reprises la phase organique avec un volume d'eau" glacée chaque fois et on la déshydrate 35 azéotropiquement (éthanol). On dilue le concentré (2 ml) avec deux volumes d'acétate d'éthyle et on ajoute de l'éther diéthy-lique goutte à goutte jusqu'à turbidité et finalement, oi*étjoute 30 ml d'éther de pétrole. On recueille le précipité obtenu par 10 15 20 25 ? 1 2955 3 -18- 2102264 filtration et on le sèche à la température ambiante pour obtenir l'antibiotique X-5108. Exemple 6 Mesure des effets de stimulation de croissance de l'antibiotique 5 X-5108 On prépare une ration de base contenant les ingrédients suivants dans les quantités suivantes : °/o en poids mais broyé 56,075 10 farine de viande et d'os (50 % de protéine) 4,000 farine de poisson (60 % de protéine) 4,000 farine de soja (50 % de protéine) 28,000 farine de luzerne déshydratée 1,000 15 graisse animale 4,000 méthionine 0,200 phosphate brut 0,250 carbonate de calcium 1,200 sel iodé 0,250 20 supplément vitaminique 1,000 supplément d'oligo-éléments 0,025 On ajoute de l'antibiotique X-5108 à cette ration à raison de 50 mg d'antibiotique par kg de ration. Pour déterminer les effets de stimulation de croissance 25 de l'antibiotique X-5108, on laisse les volailles se nourrir à volonté de la ration contenant le supplément d'antibiotique. Dans l'essai, on utilise des poussins à rôtir Cornish d'un jour, de sexes mélangés. Le test utilise 10 poussins à chaque répétition (5 mâles et 5 femelles). On laisse la ration à la disposi-30 tion des groupes de répétition. On fait une distribution statistique planifiée des répétitions pour égaliser les facteurs de chauffage, de lumière et de position. On observe les oiseaux pendant deux semaines et on détermine à plusieurs reprises le poids des groupes pendant la période, les poids individuels étant 35 déterminés au bout de 14 jours. On enregistre aussi la consommation d'aliments et on calcule l'amélioration de l'efficacité de l'alimentation, en comparaison des témoins. 71 29553 -19- 2102264 On fait simultanément une expérience témoin dé la façon décrite ci-dessus, si ce n'est que les poussins utilisés dans l'expérience témoin peuvent se nourrir, à volonté, d'une ration qui contient les mêmes ingrédients nutritifs mais sans 5 l'additif antibiotique X-5108. On divise le gain moyen pour chaque groupe d'essai par le gain moyen du groupe témoin négatif et on multiplie le quotient par 100 pour obtenir le pourcentage de gain de poids. Le gain est le poids final du poussin au bout des 2 semaines 10 d'essai moins le poids initial à 1 jour. (poids final moyen - poids initial du groupe d'essai) x iqo = (poids final moyen - poids initial du groupe témoin % de gain de poids. Le Tableau 12 ci-après récapitule les résultats de l'expérience. TABLEAU 12 Supplément d'antibiotique (mg/kg d''aliment) Gain en 2 semaines (moyenne sur 40 poussins) g + erreur normale) % de gain Efficacité de 1'alimentation % d'amélioration de l'efficacité de l'alimentation Témoin de base Antibiotique Z-5108 Témoin de base Antibiotique X-5108 Témoin de base Antibiotique X-5108 Témoin de base Antibiotique X-5108 Témoin de base Antibiotique X-5108 0 ■ 50 154 - 8 185 - 12 100 120 1,55 1,39 + 12 TABLEAU 13 Supplément Taux fourni mg/kg Nombre d'oiseaux Gain en 2 semaines, g Gain % Efficacité de l'alimentation Amélioration de l'efficacité de l'alimentation, % Témoin de base - 4-8 • 149 100 1,54 - Antibiotique X-5108 50 24 175 117 1,37 + 12 Témoin de base - 30 152 100 1,4-7 - Antibiotique X-5108 50 18 173 114 1,38 + 7 Témoin de base - 30 146 100 1,59 - Antibiotique X-5108 25 18 180 123 1,37 + 16 Témoin de base - 48 149 100 1,51 •m Antibiotique X-5108 18 183 123 1,39 + 9 Témoin de base - 48 149 100 1,54 Antibiotique X-5108 10 18 185 124 1,41 + 13 Témoin de base - 48 149 . 100 1,54 - Antibiotique X-5108 100 18 182 122 1,33 + 14 71 29553 -22- 2102264 Par le tableau ci-dessus, on voit que les poussins nourris avec la ration additionnée de 50 mg d'antibiotique X-5108 par kg d'aliment présentent une croissance accrue relativement aux témoins. En même temps, comme l'indique une amélio-5 rationde 10 % de l'efficacité de l'alimentation, les mêmes oiseaux font un usage plus efficace de leurs aliments. Exemple 7 On répète plusieurs fois l'expérience décrite à l'exemple 5, j compris le témoin, en utilisant la même ration de base 10 que dans l'exemple 5» Dans ces essais, on fait varier la proportion d'antibiotique X-5108. On fournit aux poussins d'essai des rations alimentaires -additionnées de l'ingrédient actif à raison de 5, 10, 25, 50 et 100 mg/kg. On répète ces essais pour confirmer les résultats. Dans l'essai témoin, on fournit à qua-15 tre groupes de répétition de 10 oiseaux une ration de base dépourvue de l'antibiotique. Dans tous les essais, on observe le taux de croissance en 2 semaines relativement au groupe témoin. On enregistre aussi la consommation d'aliments et on calcule l'amélioration de l'efficacité de l'alimentation en comparaison 20 des -témoins. Le Tableau 13 indique les résultats de cette série d'expériences. 71 29553 -23- 2102264 Milieu 1 10 Milieu 2 15 20 Milieu 5 25 30 35 TABLEAU 1 Milieux de développement ISP Bouillon tryptone-extrait de levure Bacto-tryptone ("Difco") . 5,0 g Bacto-extrait de levure ("Difco") 3,0 g eau distillée - 1,0 litre pH 7,0 à 7,2 avant passage à l'autoclave. Distribuer 5 ml de bouillon dans des tubes à essais d'un diamètre de 20 mm ou davantage. Agar-agar extrait de levure-extrait de malt /S 0 g ,10.,0 g 4,0 g 1,0 litre 20,0 g Bacto-extrait de levure ("Difco"). Bacto-extrait de malt ("Difco") Bacto-dextrose ("Difco") eau distillée ajuster à pH 7,3, puis ajouter : agar-agar Bacto liquéfier 1'agar-agar par traitement à la vapeur à 100°C pendant 15 à 20 minutes. Distribuer une quantité appropriée à la culture inclinée, dans au moins. 6 tubes pourL chaque culture. Stériliser à l'autoclave; refroidir les "tubes sous forme de cultures inclinées. Agar-agar à la farine d'avoine 20 g 18,0 g la vapeur 20 g de farine d'avoine farine d'avoine agar-agar Cuire ou traiter à dans 1000 ml d'eau distillée pendant 20 minutes. Filtrer sur une mousseline. Ajouter de l'eau distillée pour ramener le volume du filtrat à 1000 ml. Ajouter une solution de sels d'oligo-éléments : 1,0 ml de solution contenant 1 g de chacun des sels FeSO^^H^O, MnClg^B^O et ZnSO^^B^O dans 100 ml d'eau distillée. Ajuster le pïï à 7,2 avec KaOH. Ajouter 18 g d'agar-agar; liquéfier par traitement à la vapeur à 100°C pendant 15 à 20 minutes. 71 29553 -24- 2102264 Milieu 4 : Sels minéraux - agar-agar à l'amidon Solution I : Amidon soluble "Difco" "10,0 g. Faire une pâte de l'amidon avec une petite quantité d'eau distillée froide et porter à un volume 5 de 500 ml Solution II : KgHPO^ (poids anhydre) MgS04.7H20 NaCl 10 (KH/,)pSO4 CaCo/ eau distillée solution de sels d'oligo-éléments tion comme dans le milieu 3 15 le pH doit être de 7,0 à 7,4; ne pas l'ajuster s' est compris dans cette gamme. Mélanger la suspension d'amidon et la solution de sels. Ajouter de 1'agar-agar ("Difco") 20 Liquéfier 1'agar-agar par traitement 100°C pendant 15 à 20 minutes. Milieu 5 : Agar-agar glycérol et asparagine L-asparagine (poids anhydre) glycérol 1,0 g 1,0 g 1,0 g 2,0 g 2,0 g 500 ml 1,0 ml de solu- "il 20,0 g la vapeur 25 1,0 g 10,0 g 1,0 g 1,0 litre 1,0 ml de solu- 30 Milieu 6 35 KgHPO^ ('poids anhydre) eau distillée solution de sels d'oligo-éléments tion comme dans le milieu 3; Le pH de cette solution est d'environ 7,0 à 7,4. Ne pas l'ajuster s'il est compris dans cette gamme. Agar-agar 20,0 g Liquéfier 11agar-agar par traitement à la vapeur à 100°C pendant 15 à 20 minutes. Agar-agar peptone, extrait de levure, fer Agar-agar bacto-peptone-fer, déshydraté ("Difco") 36,0 g Bacto-extrait de levure ("Difco") 1,0 g eau distillée 1,0 litre le pH doit être de 7,0 à 7,2 avant passage à l'autoclave; l'ajuster si nécessaire. 71 29553 -25- 2102264 Liquéfier l1agar-agar par traitement à la vapeur à 100°C pendant 15 à 20 minutes. Milieu 7 : Agar-agar tyrosine glycérol 15,0 g 5 L-tyrosine ("Difco") 0,5 g L-asparagine ("Difco") 1,0 g K^HPO^ (poids anhydre) 0,5 g MgSO^•7^20 0,5 g NaCl 0,5 g 10 FeS04.7H20 0,01 g eau distillée 1,0 litre solution de sels d*oligo-éléments 1,0 ml de solution comme dans le milieu 3 Ajuster le pH entre 7,2 et 7,4. 15 Agar-agar Bacto 20,0 g Liquéfier par traitement à la vapeur à 100°C pendant 15 à 20 minutes'. Solutions de sels d'oligo-éléments (utiliser comme indiqué dans les milieux 3, 4, 5 et 7) 20 FeS04.7H20 0,1 g MnCl2.4H20 0,1 g ZnS04.7H20 0,1 g eau distillée 100,0 ml Agar-agar purée de tomate (Berger) 25 glucose 10,0 g KgHPO^ 1,0g purée de tomate - 20,0 £ peptone Wilson 1,0 g CaCOj 2,0 g 30 agar-agar 15,0 g eau du robinet 1000,0 ml Stériliser à une pression de 6,8 kg pendant 30 minutes. Ajuster le pH à 6,9. TABLEAU 2 Propriété^ ^ Streptomyces X-5108 S.antibio-ticus Pfizer 15784-1 S.aureofa-ciens Le-derle A-377 S.griseolu-teus Umeza-wa S.purpureo- fuscus Waksman S.viridi-faciens S.sp.Rivett et Peters, n° 11 Surface des spores Sm Sm Sm Sm Sm Sm Sm Morphologie RA RA RA RA RA . RA RA Couleur Gy Gy Gy Gy Gy Gy Gy Production de méls mine + + + + Production d'antibiotique X-5108 oléandomy-cine chloroté-tracycl-ine grisoluté i ne anti-trichomonas tétra-cycline streptoline Source de carbone: Glucose + + + + + + + d-xylose + + + + + - — 1-arabinose + + + - + - + 1-rhamnose + + - - — — d-fructose + + + + - + + d-raffinose + - - - - — — d-mannitol + + - + - — — i-inositol + - - - - - — salicine non essayé - - - - - + Galactose + + + + + + ■ - + K> sO Un Ut ro cr\ K3 O K> ro o -P» (1) Les données sur des cultures autres que Streptomyces X-5108 sont tirées de la littérature. Sm f lisse au microscope électronique; RA = retinaculum apertum; Gy = série des gris; + = développement; - - pas d'utilisation. TABLEAU 5 CARACTERISTIQUES CULTURELLES DU STREPTOMYCES SP. X-5108 (Incubation : 14 jours; température : 28°C) hO -O Ln en U> i ru I (1) Le développement est bon aussi sur tous les milieux liquides suivants : bouillon de tryptone F? ■ (pigment soluble foncé; négatif indol '3 jours), bouillon nutritif 5DA, bouillon sucrose Czapelc, bouillon glucose Krainsky et bouillon citrate de calcium-glycérol. qv (2) Le développement est bon en 8 jours sur ce milieu à des températures de 24°C, 28°C, 32°C et 37°C mais non à 42°C. (A \ Milieu (solide)^ ' Degré de croissance Mycélium aérien et/ou spores Pigment soluble Couleur de 11 envers Agar-agar sucrose Czapek bonne (2) bonnev J mycélium aérien blanchâtre, sporulation bonne, blanche légèrement brun foncé légèrement jaune Aspajagine-dextrose 0,25% mycélium aérien duveteux à poudreux, blanc, devenant gris fumé^ sporulé aucun orange à jaune pâle. Agar-agar purée de tomates peptone bonne mycélium aérien blanc à gris clair; sporulation bonne, grise aucun chamoi s-orange Agar-agar amidon bonne sporulation bonne, devenant gris-fumée, bord blanc aucun jaune-orange Agar-agar glucose Krainsky bonne mycélium aérien blanc, sporu-lationfeonne, devenant gris fumée aucun jaune citron Agar-agar mycophile (BBL) bonne pas de sporulation légèrement foncé légèrement jaune Agar-agar .nutritif à l'extrait de levure bonne pas de sporulation foncé grisâtre à brun-jaune Ag^r-agar glycérol " passable à bonne (10 jouis) humide, couleur crème aucun légèrement jaune Tampon de pomme dé terre bonne non sporulé noir - Tampon de carotte bonne ' non sporulé - - TABLEAU 4- REACTIONS PHYSIOLOGIQUES DU STREPTOMYCES SP. X-5108 Milieu Temps d'incubation (jours) Degré de croissance Réaction physiologique Bouillon de nitrate organique . 8 modérée, non sporulée pas de réduction des nitrates, pas de gaz Bouillon de nitrate organique 13 bonne, pigment foncé pas.de réduction des nitrates, pas de gaz Gélatine (15 %) à 18°C 5 passable; pigment soluble foncé pas de liquéfaction de la gélatine Gélatine-(15 %) à 18°C 12 passable à bonne; pigment noir-brun; pas de sporulation légère liquéfaction Agar-agar peptone fer (Kligler) 14 bonne; sporulatipn très légère chromogène (formation de méla-mine) Lait de tournesol 6 croissance superficielle passable couleur du tournesol inchangée; pas de coagulation ni de clarification Lait de tournesol 13 croissance superficielle passable; non sporulée couleur légèrement brunâtre ; pas de coagulation ni de clarification Agar-agar oeuf Dorset 3 bonne; légère sporulation blanche - Agar-agar oeuf Dorset 10 très bonne; le plus souvent sporulée; gris clair léger pigment foncé 71 29553 -29- 2102264 TABLEAU 5 Utilisation des sources de carbone et d'azote par le Streptomyces sp. Z-5108 (Incubation : 14 jours; température : 28°C) Source de carbone M ) Utilisationv ' Source de carbone Utilisation^ ^ 1-arabinose 1 Acétate 3 1-rhamnose 3 Citrate 2 d-xylose 3 Malate 2 d-mannitol 3 Oxalate 1 i-inositol 3 Salicylate 0 glucose 3 Succinate 2 fructose 3 , Tartrate 0 sucrose 3 Phénol (0,1 %) 0 raffinose 3 amidon 0-1 d-ribose 3 Source d'azote d-galactose 3 . d-mannose 3 (MI4)2SO4 1 cellobiose 3 MOj 1 lactose 3 nitrite de Na 1 maltose 3 Acétamide 1 dextrine 0 Asparagine 3 dulcitol 0 Tyrosine 3 érythritol 0 dl-Tryptophane 2 Sorbitol 1 témoin négatif 0 - 1 Glycérol 0-1 (1) 3 = bonne utilisation; 2 = utilisation passable; 1 = utilisation médiocre; O = pas d'utilisation. Le témoin négatif, sans carbone, donne 0. 71 29553 -30- 2102264 On utilise des suspensions de spores dans l'eau dis-.tillée pour les inoculations et on les prélève sur des cultures inclinées sur agar-agar à la tomate. L'utilisation des composés de carbone et d'azote est étudiée sur le milieu de base suivant : 5 KH2P04 2,38 g MnCl2.4H20 0,0079 g K2HP04 5,65 g ZnS0v7H20 0,0015 g MgS04.7H20 1,00 g agar-agar 15 g CuS04.5H20 0,0064 g eau distillée 1 litre ]?eS04.7H20 0,0011 g milieu ajusté à un pH de 6,8 à 7»0. 10 Pour essayer des sources de carbone sur ce milieu de base, on ajoute 2,64- g/1 de (NH4)2S04 comme source commune d'azote on ajoute les sources, de carbone à une concentration de 1 %, sauf pour les sels de sodium des acides organiques que l'on utilise à une concentration de 0,15 %• Pour essayer les sources d'azote, 15 on utilise le milieu de base synthétique à 1'agar-agar plus 1 % d'amidon plus la source d'azote à une concentration de 0,1 g d'azote par litre. 71 29553 -31- 2102264 TABLEAU 6 Effet des variations du milieu nutritif sur le rendement d'antibiotique du Streptomyces sp. Z-5108 dans des flacons de secgueuses. Tous les milieux contiennent 1 % de dextrine, 0,1 % de KpHPO^ et 0,1 % de CaCO^. On inocule 1 ml de suspension de spores de Streptomyces sp. X-5108 dans chaque quantité de 100 ml de milieu. Expé- Toutes les sources d'azote sont ajou- Age, Puissance rience tées à des concentrations de 1 %, jours antibiotique n° sauf 17 et 23 (2 %) en unités E p ar ml 1 farine de viande digérée 6 50 2 BY-100 (Commercial Solvents Corp.) 5 45 3 "Proflo" (Traders Oil Mill Co.) 5 23 4 farine d'avoine (Qaker Oats Co.) 5 32 5 soyalose (farine de soja dégraissée) 5 30 8 farine protéinique d'arachides 5 41 9 farine protéinique de noix de coco 5 50 10 solides de purée de tomates 5 57 11 farine d'huile de lin 5 37 12 farine de maïs 5 33 13 grains de maïs séchés de distillerie avec produits solubles (H. Walker) 5 74 14 "Soludri" (Schenley Distillers) 5 51 15 farine de poisson (Gorton's) 5 25 16 déchets de poisson (Wilkinson) 5 16 17 mélange de sucre de lait et d'albumine 5 50 19 levure Torula séchée 5 38 20 autolysat national de levure 5 16 21 hydrolysat d'enzyme de soja 5 33 22 hydrolysat d'acide protéinique de blé (Huron Mills) 5 12 23 poisson condensé homogénéisé 5 27 24 protopeptone n° 366 (Wilson Labs) 5 18 25 solides de liqueur de macération de maïs 5 26 71 29553 -52- 2102264 TABLEAU 7 Effet des variations du milieu nutritif sur le rendement d'antl biotique du Streptomyces X-5108 dans des flacons de secoueuse Expé- Composition du milieu, Age, Puissance ant rience 0, jours biotiqu S - n° /0 unités E/ml 1 1 farine de viande digérée, 1 dextrine 4 4-0 2 1 résidu de grains de fermentation (BY-100), 1 dextrine 4 67 3 . 1 farine de graines de coton dé graissée ("Proflo"), 1 dextrine 4 52 4 1 déchets de poisson 4 40 5 1 grains de maïs séchés de distillerie avec produits solubles (H. Walker), 1 dextrine 6 158 7 (5) mais pas de CaCO^ 4 19 8 (5) mais pas de CaCO^ ni de E^HPO^ 4 34 9 (8) mais avec seulement 0,25 "Proflo" 4 12 10 (8) mais avec 2,0 "Proflo" 4 47 11 1 "proflo", 1 glucose 6 21 12 1 "proflo", 1 amidon 6 21 15 1 "Proflo", 1 glycérol 4 35 14 1 "Proflo", 1 cassonade 4 14 15 1 "Proflo", .1 maltose 4 22 16 1 "Proflo", 1 lactose 4 26 17 1 "Proflo", 1 mannitol 6 25 Tous les milieux contiennent 0,1 % de K^HPO^ et 0,1 % de CaCOj sauf indication contraire. On inocule 1 ml de suspension de spores de Streptomyces sp. X-5108 dans chaque quantité de 100 ml de milieu. TABLEAU 8 EFFET DES VARIATIONS DU MILIEU NUTRITIF SUR LE RENDEMENT D'ANTIBIOTIQUE DU STREPTOMYCES X-5108 DANS DES FLACONS DE SECOUEUSE ET DES CUVES AEREES. Sauf indication contraire, chaque milieu contient 0,5 % de CaCO^ et 0,1 % de K^HPO^ nu Composition du milieu, % solides produits so- amidon glucose de purée lubies de de maïs de to- distillerie mates Rendements d'antibiotique, unités B. simplex/ml Flacons, Cuves, 6 jours 7 jours (opérations en double) K> nO Un U"v u* 1 2 3 4 5 6 7 1 2 0 1 1 1 1 1 0 2 1 1 1 1 1 1 1,5 0 0 0,5 0,5 , 0,5 0 1,5 0 •Proflo" 1 amidon 0,1 CaCO^ 0,1 KgHPO^ 150 100 91 140 180 54 94 100, 120 71, 46 88, 119 150, 124 125, 126 non essayé 97 (4 jours) i I K3 O SJ K) O ■fc* 71 29553 -34- 2102264 TABLEAU 9 FERMENTATIONS EN CUVE AVEC DIVERS MILIEUX Expé- Jour de Puissance, rience Composition du milieu, % la ré- unités E/ml (a) coite K12 1 produits solubles de distillerie 6 67 séchés, 1 dextrine, 0,1 E^HPO^, 0,1 CaCOj K13 1 1-glutamate de Na, 1 dextrine, 5 100 0,1 solides de liqueur de macération de maïs, 0,15 K^HPO^, 0,05 MgSO^ K11 1 solides de purée de tomate,1 pro- 7 200 duits solubles de distillerie séchés, 1 amidon de maïs, 0,5 glucose, 0,5 CaCOj, 0,1 K2HP04 K4 0,5 "Proflo" (b) , 0,5 produits solu- 4 91 "bles séchés de distillerie, 0,5 solides de purée de tomates, 0,5 pâte d'extrait de viande (protopeptone n° 366), 1 amidon, 0,1 CaCO^, 0,1 K2HP04 K16 1,0 "Proflo" (b), 0,5 liqueur de ma- 4 260 cération de maïs, 1,0 amidon de maïs, 0,1 CaCO^,- 0,1 K2HP04 (a) K11, K12 et K13 se font tous dans des cuves de fermentation en acier inoxydable de 380 litres dans lesquelles on introduit généralement 246 litres de milieu; K16 se fait dans une cuve de fermentation en acier inoxydable de 2800 litres (charge 1890 litres) et K4 dans une cuve de fermentation en acier inoxydable de 15.900 litres (charge 12.100 litres). (b) Le "Proflo" est un produit de graines de coton dégraissé de Traders Oil Mill Co., Fort Worth, Texas. 71 29553 -35- 2102264 TABLEAU 10 PRODUCTION D'ANTIBIOTIQUE PAR LE STREPTOLCYCES Z-5108 SUR DIS MILIEUX SYNTHETIQUES. Composition du milieu, °/o Age, Puissance axrfci-jours "biotique, unités E/ml 1,0 glutamate de Na, 1 dextrine, 0,1 K2HP04, 0,05 MgS04 1,0 mélange d1aminoacides (1) 1 dextrine, 0,1 E^HPO^, 0,1 sels n° 1 USP "bouillon BBL Czapek-Dox (2) 1,0 arginine, 1,0 dextrine, 0,1 K2HP04, 0,1 CaC03, 0,05 MgS04 1,0 acide dl-aspartique, 1,0 dextrine, 0,1 K2HP04, 0,1 CaCOj, 0,05. MgS04 0,1 glutamate de Na, 0,6 (NH4)2HP04, 1 glucose, 1 dextrine, 0,1 K2HP04, 0,1 CaCO^, 0,1 KOI, 0,05 MgS04 0,33 (NH4)2S04, 1,5 glucose, 0,1 citrate de Na, 0,05 acétate de Na, 0,5 NaCl, 0,025 MgS04.7H20, 0,01 K2HP04, 0,01 KH2P04, 0,3 CaCO^, 0,001 MnS04.4H20, 0,004 ZnS04.7H20, 1,6 x 10"6 E^Cr^ 5 5 6 6 7,6 11,5 4,4 0,8 0,8 6,6 20 (1) Sta-Mino B de Staley (2) 3 % sucrose, 0,3 % NaNO^, 0,1 % K2HP04, 0,05 % MgS04, 0,05 KCl, 0,001 % PeS04, vendu par Baltimore Biological Laboratories. 71 29553 -36- 2 102264 TABLEAU 11 SPECTRES ANTIMICROBIEÎÏS IN VITRO DE L'ANTIBIOTIQUE X-5'ï08 Organismes essayés Diamètre des zones mm (1) Sel de sodium "brut de l'antibiotique X-5108 1 mg/ml d'inhibition. Sel de sodium pur de 11 antibiotique X-5108, 1 mg/ml Escherichia coli Paecilomyces varioti Mycobacterium phlei Bacillus simplex Pseudomonas aeruginosa Aerobacter aerogenês Streptomyces cellulosae Sarcina lutea Bacillus E Bacillus subtilis Serratia marcescens Candida albicans Pénicillium digitatum Saccharomyces cerevisiae Staph. aureus Bodenheimer* s bacillus Proteus vulgaris 17,3 (18) . O (0) 1925,3 39,3cs(20)2) 14,0 (12,5) 12,017 (1.4,5) 31,3 (21)5) 27,7cs(21,5)3) 3) 36,3çns(31) 16,0 22,7 (1724) 14^22,7(22) trace (0) 0 0 (0) 14,5CS(13) 20,8CS(18) 16,3 21,2 (20) 3) 18,0 (18,5) 0 (0) 20,2^7'5 40,3CS(20)2) 15,0 (13) 14,319(15,5) 33,0 (21 29,7CS(22)3) 37 .2cns(32)5) 17,023(1724) 15,7^(22,5) trace (0) 0 0 (0) 15,8cs(14) 21,7CS(18) 16,722,2(20)5^ (1) Lorsqu'il y a des chiffres en double, celui qui est en haut à droite indique la présence d'une zone secondaire d'inhibition moins nette. Les abréviations "es" et "ens" veulent dire, respectivement, bords de la zone clairs et nets, ou clairs et non nets. (2) à la concentration de 0,001 mg/ml (3) A la concentration de 0,1 mg/ml; pour le Bacillus E, à 0,01 mg/ml, la grandeur de la zone est de 22 mm pour /306o 71 29553 -37- 2102264 - REVENDICATIONS - 1 - Procédé de préparation de la nouvelle substance antibiotique appelée X-5108, caractérisé par le fait que l'on cultive le Streptomyces sp. X-5108 dans un milieu nutritif aqueux 5 contenant des sources-assimilables d'hydrates de carbone, d'azote et de sels minéraux, en milieu aérobie immergé, jusqu'à ce qu'une activité antibiotique notable ait été communiquée à ce milieu par la formation d'antibiotique X-5108, et que l'on récupère alors ce dernier à partir dudit milieu aqueux. 10 2 - Procédé selon la revendication 1, caractérisé par le fait que l'organisme utilisé est le Streptomyces sp. X-5108, ATCC 21.386. 3 - Procédé selon l'une des revendications 1 et 2, caractérisé par le fait que l'on conduit la culture de Streptomyces 15 sp. X-5108 à une température d'environ 24 à 32°C environ. 4 - Procédé selon la revendication 1, caractérisé par le fait que pour récupérer l'antibiotique X-5108, on filtre le milieu aqueux, on extrait Infiltrât par un solvant de l'antibiotique X-5108 qui n'est pas miscible à l'eau et on retire 20 l'antibiotique X-5108 de l'extrait au solvant. 5 - Procédé selon la revendication 4, caractérisé par le fait que le solvant non miscible à l'eau est l'acétate de butyle. 6 - Procédé selon la revendication 1., caractérisé par 25 le fait que l'on effectue la récupération par distribution à contre-courant d'un échantillon de l'antibiotique brut isolé du milieu de fermentation. 7 - Procédé selon la revendication 1, caractérisé par le fait que l'on effectue la récupération en chromatographiant 30 par pénétration dans un gel l'antibiotique brut isolé du milieu de fermentation. 8 - Procédé de fabrication de compositions augmentant l'efficacité des aliments et stimulant la croissance des volailles, caractérisé par le fait que l'on mélange environ 35 0,0001 à environ 0,01 partie en poids d'antibiotique X-5108 ou d'un sel physiologiquement toléré de celui-ci à 100 parties en poids d'un ingrédient inerte non toxique. 71 29553 38 2102264 9 - Procédé selon la revendication 8, caractérisé par le fait que l'on utilise, comme ingrédient inerte non toxique, un aliment nutritif à grande énergie pour volailles. 10 - Procédé selon la revendication 8, caractérisé 5 par le fait que l'on utilise un sel alcalin de l'antibiotique X-5108. 11- Procédé de préparation de compositions augmentant l'efficacité des aliments et stimulant la croissance des volailles, caractérisé par le fait que l'on mélange l'antibiotique 10 X-5108 ou un sel physiologiquement toléré de celui-ci à un ingrédient inerte non toxique pour former un prémélange concentré qui, lorsqu'on l'ajoute à un aliment usuel pour volailles, donne un aliment contenant, par 100 parties en poids, environ 0,0001 à environ 0,01 partie en poids d'antibiotique X-5108 ou sel de 15 celui-ci. 12 - Composition obtenue par un procédé selon l'une des revendications 8 à 10. 13 - Composition obtenue par un procédé selon la revendication 11. 20 14 - Procédé visant à stimuler la croissance des vo lailles et à augmenter l'efficacité de leurs aliments, caractérisé par le fait qu'on leur administre par voie buccale une composition selon la revendication 12. 15 - Une nouvelle substance antibiotique efficace pour 25 inhiber la croissance de bactéries Gram positives et Gram négatives appelée antibiotique X-5108 qui est une substance jaune amorphe caractérisée comme suit : a) analyse : carbone 63,63 $ ; hydrogène 7>81 $ ; azote 3,48 i» ; 30 oxygène 25,08 (par différence) ; b) soluble dans le méthanol, l'éthanol, le 1- et le 2-propanol, l'alcool tert. butylique, l'acétate d'éthyle, l'acétate d'amyle, l'acétate de butyle 35 et le chloroforme ; c) un spectre d'absorption infra-rouge caractéristique comme décrit dans la figure 1 ci-après ; 71 29553 39 2 10226 4 d) un spectre de résonance magnétique nucléaire caractéristique comme décrit dans la figure 4 ci-après ; - et ses sels cationiques acceptables en pharmacie* ^ 16 - le sel de sodium de l'antibiotique Z-5108 reven diqué dans la revendication, lequel sel est une substance amorphe jaune caractérisée comme suit : a) analyse : carbone 61,48 fo ; - — -hydrogène 7,81 $ ; azote 3,32 $ ; oxygène 24,45 1° (par différence) ; sodium 2,94 1° ; b) soluble dans l'eau, le méthanol, l'éthanol, l'isopropanol, le butanol et le N,ÎI-diméthyl-formamide : 15 20 25 30 c) présentant une rotation optique de [a] ~ ~ 82,8 (éthanol, c = 0,52) J d) un spectre d'absorption infra-rouge caractéristique comme décrit dans la figure 2 ci-après ; e) un spectre ultra-violet, caractéristique comme décrit dans la figure 3 ci-après avec des maxima à : 0,1 H HC1 î pH 7 tampon 0 0,1ÎT KOH : X max 334 mp fT?1^ ^E1 cm = 403) l max 233 mp v A cm = 610) X max 206 mp ^1 cm = 500) X max 327 mp r-p1^ ^E1 cm = 423) X max 231 mp x 1 cm = 660) X max 327 mp ^E1 cm = 416) X max 231 mp. tE1 cm = 647).