FR 2100783 A1 19720324 FR 7122318 A 19710618 71 22318 i 2100783 La présente invention concerne un nouveau composé appelé rabelomycine ainsi qu'un procédé pour sa préparation. L'invention concerne, en outre, les applications dudit composé comme antibiotique. 5 Le mirco-organisme utile pour la préparation de la rabelomycine est constitué par une espèce de Streptomyces, désignée ci-après sous le nom de Streptomyces olivaceus ATCC 21549. On a isolé ledit organisme à partir d'un échantillon de sol prélevé à Jean*-Rabel, Haïti. Une culture dudit organisme 10 vivant a été déposée et intégrée dans la collection des cultures de réserve de 1'American Type Culture Collection (Rookville, Maryland), à partir de laquelle on peut en disposer et où on lui a attribué le numéro ATCC 21549. Il est entendu que l'invention n'est nullement 15 limitée à l'utilisation de l'organisme particulier décrit ci-dessus, mais qu'elle comprend, entre autres, les mutants produits à partir de l'organisme décrit ci-dessus sous l'effet d'agents mutagènes, tels que, par exemple, les rayons X, le rayonnement ultraviolet et les moutardes azotées. 20 Pour l'Isolement et la caractérisation dudit organisme, on secoue une fraction de l'échantillon de sol dans de l'eau distillée stérile et on la dépose en plaque sur de la gélose nutritive contenant : Quantités en grammes 25 Gélose 15 Glycérol 10 Acide citrique 1,2 (nh4)2hpo4 0,4 KCl 0,08 50 MgCl2.6h20 0,418 MnCl2-4h20 0,036 FeCl^.ôhgo 0,023 ZnClg.6h20 0,021 coci2.6h2o 0,004 35 Eau distillée, q.s.p. 1000 ml On règle le pH du milieu à 7*0 et on le stérilise en autoclave à 121°C pendant 30 minutes. Après une incubation pendant 7 à 10 jours à 25°C, on isole des colonies de Streptomyces 71 22318 2100783 10 15 20 25 30 olivaceus ATCC 215^9 à partir de l'échantillon de sol déposé en plaque. On cultive ensuite les colonies ainsi isolées sur un milieu contenant : Quantité en grammes Extrait (fe boeuf 1,0 Extrait de levure 1,0 "NZ Aminé A" 2,0 Glucose 10,0 Gélose 15,0 Eau distillée, q.s.p. 1000 ml On règle le pH du milieu à 7*2 et on l'autoclave à 121°C pendant 30 minutes. L'organisme précité fait partie de la série à couleur de spores grises selon Pridham. Il produit une masse de spores de couleur gris moyen (ISCC n° 265), qui correspond à la vignette de couleur (2 Fe) dans le Color Harmony Manual. La sporulation est abondante sur les milieux normalisés de l'International Streptomyces Project : ISP-2, gélose extrait de levure-extrait de malt ; ISP-3, gélose farine d'avoine ; ISP-4, gélose sels minéraux-amidon. La couleur de l'envers desdits trois milieux précités est dans les tons kaki. Il ne se produit aucun pigment mélanoîde sur les milieux à base de matières protéinées. Au microscope, on observe que les sporophores se trouvent développées en spirales étendues et que la surface de spores est lisse. On expose ci-dessous un sommaire des similitudes et des différences entre Streptomyces olivaceus ATCC 215^9 et la souche type de Streptomyces olivaceus : S.olivaceus ATCC n° 2T549 gris 35 Série de couleur des spores Morphologie des sporophores Surface des spores Pigment mélanoîde Couleur de l'envers spirale ouverte lisse néant kaki S.olivaceus IMRU 5335 gris spirale ouverte lisse néant brun foncé 71 22318 3 2100783 10 Utilisation du carbone glucose d-mannitol i-inositol d-xylose 1-arabinose 1-rharanose d-fructose raffinose saccharose S.olivaceus ATCC n° 21549 + + + + + S.olivaceus IMRU 3335 + + + + + + + Les différences dans l'utilisation du rhamnose et du fructose sont considérées comme mineures et elles ne constituent pas une base pour considérer une séparation entre les espèces, 15 On décrit plus en détail ci-après les données concernant 1'antibiotique. Streptomyces olivaceus ATCC 21549 produit un antibiotique (rabelomycine) qui possède principalement une activité vis-à-vis des bactéries. 20 Gram-positives. Pour former l'antibiotique, on cultive le Streptomyces olivaceus ATCC 21549 aux environs de la température ambiante, par exemple, à 25°C, dans des conditions aérobies submergées dans un milieu nutritif aqueux contenant un hydrate de carbone assimilable et une source d'azote orga-25 nique assimilable. On effectue la fermentation pendant plusieurs jours, par exemple, pendant environ 96 heures, l'antibiotique s'étant formé au bout de ce temps. Après la fin de la fermentation, on amène le bouillon avec HCl concentré à un pH d'environ 6 et on le filtre. On extrait 30 l'antibiotique à partir du mycélium (c'est-à-dire du gâteau de filtration) avec du méthanol. On concentre la solution méthalo-nique sous vide et elle abandonne une suspension aqueuse. On réunit la suspension aqueuse avec le filtrat du bouillon et on extrait le milieu aqueux, résultant de ladite réunion, au moyen 35 d'eau-acétate d'éthyle saturé. On sèche la phase organique avec du sulfate de sodium anhydre et on la concentre jusqu'à l'obten- 1 tion d'un sirop. On effectue une purification supplémentaire par une distribution du sirop à contre-courant avec le système 1 22318 4 2100783 méthanol : eau : hexane (J:1:4, volumes/volumes/volumes). On réunit les fractions ayant une activité biologique et on les extrait de nouveau dans l'acétate d'éthyle. On poursuit la purification du résidu, obtenu par concentration à siccité des extraits à l'acétate d'éthyle, en opérant par chromatographLe sur une colonne de DEAE-cellulose (diéthylaminoéthyl-cellulose), suivie par une chromatographie à l'échelle préparatoire sur des plaques de gel de silice. On obtient une purification finale par cristallisation et recristallisation à partir de benzène-méthanol. On indique ci-après les propriétés de la rabelomycine. La rabelomycine a la structure suivante : OH 0 OH On peut déshydrater la rabelomycine par réaction avec un acide minéral, tel que l'acide chlorhydrique concentré ou l'acide sulfurique concentré en formant la déhydrorabelo-mycine ayant la structure suivante : OH La rabelomycine forme des esters d'acides, par exemple, par traitement de la rabelomycine avec un halogénure d'acide, tel que le chlorure d'acétyle, ou un andhydride d'acide, tel que l'anhydride acétique, en présence d'une base telle que la pyridine. La rabelomycine forme également des esters d'amino-acides, tels que la glycine ou la phénylalanine. 1 22318 5 2100783 La rabelomycine contient trois groupes hydroxyle acylables et elle est capable de former des mono-, di- et triesters, selon la proportion présente entre l'agent acylant et la rabelomycine dans le milieu réactionnel. On peut séparer par chromâtograplie un mélange de monoesters, dans lequel l'un des deux groupes hydroxyle phénoliques est acylé par utilisation d'un équivalent d'agent acylant par équivalent de rabelomycine. En utilisant deux équivalents d'agent acylant par équivalent de rabelomycine, on provoque l'acylation des deux groupes hydroxyle phénoliques. Par traitement de la rabelomycine avec trois équivalents d'agent acylant, on peut également estérifier le groupe hydroxyle tertiaire. Cependant, la réaction prédominante est une déshydratation suivie par une acylation avec formation de triesters de déhydrorabelomycine. On peut également obtenir lesdits triesters à partir de la déhydrorabelomycine par traitement avec des agents acylants. Bien que l'on puisse utiliser tout agent acylant voulu, les agents acylants préférés sont les anhydrides d'acides et les chlorures d'acyle des acides carboxyliques à chaîne hydro-carbonée ayant moins de 12 atomes de carbone, tels que les acides allcanoîques inférieurs (par exemple» les acides acétique et propionique), les acides allçénolques inférieurs, les acides aryl-carboxyliques monocycliques (par exemple, l'acide benzoîque), les acHes aryl-alkanoîques inférieurs monocycliques (par exempke, l'acide phénatétique, les acides cycloalkane-carboxyliques et les acides cycloalkène-carboxyliques. La rabelomycine forme des sels avec les bases, par exemple en faisant réagir la rabelomycine avec un hydroxyde de métal alcalin ou m hydroxyde de métal alcalino-terreux, tel que 1'hydroxyde de sodium, l'hydroxyde de potassium, 1'hydroxyde de calcium, 1'hydroxyde de baryum ou 1'hydroxyde de magnésium. La rabelomycine cristallisée a les propriétés physiques et chimiques suivantes : - couleur : jaune - point de fusion : 193°C (avec décomposition) -analyse élémentaire : C% = 67,17 -• ' - H# « 4,48 - " --■= r- , •' "!-••• £8,35 (par différence) 71 22318 e 2100783 L'analyse précitée et le spectre de masse à haut pouvoir de résolution permettent d'établir la formule empirique du composé de l'invention, à savoir C^H-^Og. Solubilité : soluble dans l'alcool, l'acétone, 5 le chloroforme j insoluble dans l'eau et dans l'éther de pétrole. Spectre d'absorption en ultraviolet : les maxima d'absorption en ultraviolet de la rabelomycine, cristallisée, 10 en méthanol neutre ou en HCl 0/ 02 N dans le méthanol sont les suivants : A max (mp) : £ 228 26.600 267 28.800 15 433 8 «000 Les maxima d'absorption en ultraviolet en NaOH 0,02 dans le méthanol sont les suivants : X max (nyi) : £ 258 26.200 20 282 (épaulement) 13.100 325 8.900 507 7.500 Spectre infrarouge : le spectre d'absorption de la rabelomycine en infrarouge., observé sous forme d'une solution 25 à 4 % dans le chloroforme^est reproduit dans la figure unique du dessin annexé. Les bandes d'absorption significatives, indiquées en inverses de centimètres, sont les suivantes : 30 35 3400 cm"1 1290 921 2974 1259 903 1700 1181 867 1675 1168 855 I630 1141 843 1602 1127 828 1566 1099 1463 1074 1448 1057 1375 979 1352 960 71 22318 7 2-100783 10 15 20 Pouvoir rotatoire s = -102 + 10° (0 = 1, CHCl-^)» Spectre RMN î on détermine le spectre de résonance magnétique nucléaire dans le chloroforme-d, en utilisant un spectromètre de RMM mis dans le commerce sous le nom de Varian T-60o Les déplacements chimiques en parties par million par rapport a la reférence interne zéro constituée par du tetra-méthylsilane, les multiplicités et les instensités relatives sont indiquées ci-dessous g Déplacement cMniquea Multiplicité*3 Air®d'intensité relatives 1,47 s 3 2,37 large 1 2,98 s 2 3s 06 s 2 6,92 s 1 7 à 8 m 3 11,60 s 1 12,21 s 1 a en parties par million par rapport au tétraméthylsilane utilisé comme référence interne zéro j s = singuletj, m = multiplet Dans un titrage par dilution en tube, répété deux fois, effectué avec la rabelomycine cristallisée., on détermine les concentrations inhibitrices minimales (C.I.M,) en microgrammes 25 par ml, comme suit s Micro-organisme' C„IoM Staphylococcus aureus 209P 6 .,3 Streptococcus pyogenes C203 1*2 Bacillus subtilis 4,7 ^0 Escherichia coli >50 Salmonella schot t mue lier i >50 Pseudomonas aeruginosa >25 Candida albicans >" 50 Trichophyton mentagrophytes > 25 On peut utiliser la rabelomycine dans les laboratoires de recherches et des hêjsitaux afin d'isoler des bactéries Gram-négatives à partir de sols ou à partir de linges ou de tampons ou encore à partir d'exsudats corporels dans lesquels 22318 s 2100783 des populations mixtes d'organismes Gram-positifs et Gram-négatifs sont présentes. On peut également utiliser la rabelomycine pour désinfecter le matériel de laboratoire contaminé par le Staphylococcus aureus, en particulier lorsque ledit matériel peut être sujet à un endommagement par les agents de désinfection courants. La rabelomycine et la déhydrorabelomycine sont également actifs sur le système nerveux central. Les exemples suivants sont destinés à illustrer l'invention avec plus de détails sans nullement la limiter dans son cadre et son esprit. EXEMPLE 1. On ensemence des milieux de culture inclinés, à base de gélose purée de tomate-farine d'avoine, avec Streptomyces olivaceus ATCC 21549. On les fait incuber pendant 14 jours et on les utilise ensuite pour inoculer 50 ml d'un milieu aqueux de farine de soja renfermés dans des flacons Erlenmeyer, de 250 ml. La composition du milieu de germination est la suivante Quantités en grammes Farine de soja (mise dans le commerce sous le nom de 15*0 Staley's 4S) Pommes de terre écrasées, déshydratées 15*0 Glucose 50,0 COClg^HgO 0,005 CaCO^ 10,0 Gélose 2,5 Eau distillée, q.s.p. 1,000 ml Avant l'inoculation, on stérilise ledit milieu pendant 350 minutes à 121°C et scus me pression de vapeur d'eau de 6,8 kg. On fait incuber les flacons de germination, inoculés, à 25°C pendant 72-96 heures sur une secoueuse rotative, fonctionnant à 280 tours par minute avec une course d'environ 5 cm. Conditions de fermentation. On effectue un transfert de 5 % (volumes/volumes) de milieu prélevé dans le flaoon de germination, dans des flacons Erlenmeyer de 500 ml contenant 100 ml du milieu suivant : 71 22318 9 2100783 Quantités en grammes Farine de soja (mise dans le commerce sous le nom de 30,0 Staley's 4S) Pommes de terre écrasées, déshydratées 15,0 15*0 5 Glucose CoC12.2H20 CaCO, Eau distillée q.s.p. 1.000 ml 0, 005 10,0 On fait incuber les flacons de fermentation et 10 on 1 es agite comme pour les flacons de germination. On prélève des échantillons respectivement au bout de 72 et 96 heures et on les centrifuge. On décante le milieu surnageant et on extrait le mycélium avec un volume de méthanol égal à celui du milieu surnageant décanté. On extrait le milieu surnageant avec 0,5 15 volume d'acétate d'éthyle saturé avec de l'eau* On examine les extraits à l'acétate d'éthyle aussi bien que les extraits métha-noliques par chromatograpHe sur gel de silice avec un système de solvants de composition suivante : chloroforme, méthanol, pipéridine (94:5:1» volumes/volumes/volumes). Dans ce système, 20 l'antibiotique a une valeur Rf d'environ 0,45. On décèle l'antibiotique par bioautographie par rapport à Staphylococcus aureus 209P.Les extraits au méthanol et à l'acétate d'éthyle provenant des fermentations de 72 et 96 heures ont une activité due à ]a rabelomycine, démontrée par chromatographie et Moauto-25 graphie. EXEMPLE 2. Streptomyces olivaceus ATCC 21549 dans un récipient en acier 30 inoxydable d'environ 380 litres, avec le milieu et les conditions opératoires qui sont décrits ci-dessous : Stade 1. olivaceus ATCC 21549 par lyophilisation dans du lait et on la 35 fait croître dans un milieu incliné à base de gélose purée de tomate-farine d'avoine. On met en suspension la croissance de surface, obtenue à partir d'un milieu incliné, dans 11 ml d'une On fait fermenter une charge de 250 litres de Inoculum : on conserve la culture de Streptomyces 71 22318 10 2100783 solution de "Dupanol" à 0,01 % et on utilise 3 ml de ladite suspension comme source d'inoculum. Milieu Quantités en grammes Farine de soja (mise dans le commerce 5 sous le nom de 15*0 Staley's 4S) Pommes de terre écrasées, déshydratées 15*0 Glucose 50,0 CoCl2,2HgO 0,005 10 CaCO, 10,0 3 Gélose 2,5 Eau distillée, q.s.p. 1.000 ml On fait incubèr 100 ml dudit milieu, contenant 3 ml de la suspension de S. olivaceus, dans un flacon Erlenmeyer 15 de 500 ml pendant 96 heures sur une secoueuse rotative à 25°C. La secoueuse fonctionne à 280 tours par minute avec une course de 5 cm environ. Stade_2. 20 Inoculum : 100 mi en provenance du premier stade. Milieu î le même qu'au stade 1. On fait iicuber 1000 ml du milieu et de 1'inooulum dans un flacon Erlenmeyer de 4000 ml pendant 72 heures à 25°C sur une secoueuse à mouvements alternatifs. On fait fonctionner la secoueuse à 120 coups par 25 minute avec une course d'environ 5 cm. Stade_2' Inoculum : 1000 ml du stade 2. Milieu : le même qu'au stade 1. On fait incuber 30 30 litres du milieu et de 1'inoculum dans un récipient de fermentation de 38 litres pendant 96 heures à 25°C. Pendant l'incubation, on agite le bouillon et on l'aère au taux de 0,6 m par minute, relatif à la vitesse superficielle de l'air. 35 Stade_4. Inoculum : 12 500 ml provenant du stade 3. 71 22318 u 2100783 Milieu Quantités en grammes Farine de soja (mise dans le commerce sous le nom de 30,0 Staley's 4S) 5 Pommes de terre écrasées, déshydratées 15,0 Glucose 15,0 CoCl2.2H20 0,005 CaCO^ 10,0 Eau distillée, q.s.p. 1.000 ml 10 On fait incuber pendant 96 heures, 250 litres du milieu contenant l1inoculum. Pendant l'incubation, on agite fe bouillon et on l'aère au taux de 0,6 m par minute, relatif à la vitesse superficielle de l'air. 15 EXEMPLE 3. On amène 240 litres du bouillon de fermentation, obtenu comme décrit à l'exemple 2,à pH 6,0 avec de l'acide chlorhydrique concentré et on les filtre en-obtenant 72,5 kg de gâteau mycélial insoluble et 190 litres de filtrat. 20 EXEMPLE 4. On extrait le gâteau de filtration (72,5 kg), obtenu selon l'exemple 3* à. raison de 3 fois avec des portions respectives de 100 litres de méthanol. On élimine le gâteau 25 entre les extractions. On concentre les extraits méthanoliques combinés jusqu'à 13,5 litres pour éliminer le méthanol et on ajoute la suspension aqueuse résultante aux 190 litres de filtrat obtenus selon l'exemple 3. 30 EXEMPLE 5. On extrait 3 fois les couches aqueuses combinées avec des portions de 70 litres d'acétate d'éthyle saturé avec de l'eau. On concentre sous vide les extraits à l'acétate d'éthyle réunis, en obtenant environ 400 g d'un sirop brun. On distribue 100 g du sirop ainsi formé entre les 2 couches du 35 système de solvants suivants : méthanol, eau, hexane (3:1;4, volumes/volumes/volumes). On effectue la distribution dans 6 entonnoirs à décantation 'de 500 ml en utilisant 200 ml de 1 22318 2100783 chaque couche respective de solvant de la partie supérieure et de la partie inférieure par entonnoir. On effectue 12 transferts. On réunit les fractions ayant une activité biologique, localisées par un dosage par diffusion sur un disque de papier portant de la gélose par rapport à Staphylococous aureus 209P, on les concentre pour éliminer les solvants et on les extrait de nouveau dans de l'acétate d'éthyle saturé avec de l'eau. On sèche l'extrait à l'acétate d'éthyle avec NagSO^ anhydre et on le concentre à siccité. On obtient 30 g de résidu sec. EXEMPLE 6. On disaxfc 30g du résidu obtenu à l'exemple 5 dans 20 ml de méthanol. On place la solution sur le sommet d'une colonne de DEAE-cellulose, de 3*8 cm x 45 cm, contenant environ 40 g de DEAE-cellulose (mise dans le commerce sous le nom de Gellex-D par la firme Bio-Rad Laboratories, Richmond, Californie) chargés dans du méthanol. On développe la colonne avec du méthanol et on recueille des fractions de 20 ml. On réunit les fractions ayant une activité biologique, déterminées par dosage par diffusion sur disque de papier portant de la gélose, par rapport à Staphylococcus aureus 209P, et on les concentre à siccité en obtenant 1 g de résidu. EXEMPLE 7. On dépose en stries 1 g du résidu obtenu à l'exemple 6, dissous dans MeOH, à 2 cm à partir du bas de plaques de gel de silice ayant une épaisseur de 1000 ju et des dimensions de 20 cm x 20 cm (mises dans le commerce sous le nom de Quanta/Gram, par la firme Quantum Industries, Fairfield, New Jersey 07006). On développe les plaques avec du méthanol à 10 % dans le benzène. On recueille la rabelomycine, apparaissant en bande jaune (Rf = 0,5), en grattant la plaque et on l'élue à partir du gel de silice avec de l'acétone. On concentre l'éluat à l'acétone à siccité et on rechromatographie le résidu dissous dans un faible volume de MeOH, sur des plaques de gel de silice comme décrit ci-dessus. 71 22318 13 2100783 On effectue la cristallisation de la fraction ayant une activité biologique à partir des plaques de gel de silice dane le système benzène-méthanol. La rabelomycine cristallise sous forme d'aiguilles jaunes que l'on obtient 5 en quantité d'environ 70 mg. EXEMPLE 8. On prépare la déhydrorabelomycine comme suit : On dissout la rabelomycine dans de l'acide sulfu-10 rique concentré. On y ajoute ensuite de l'eau et on extrait le mélange résultant avec de l'acétate d'éthyle. Par élimination du solvant, on obtient la déhydrorabelomycine brute que l'on purifie d'une manière complémentaire par chromatographie sur gel de silice et recristallisation à partir d'acétate d'éthyle. 15 EXEMPLE Q. On prépare le diacétate de rabelomycine comme suit : On traite un échantillon de rabelomycine dans le diméthylformamide sec avec deux équivalents d'anhydride acétique 20 et une quantité catalytique de pyridine à la température ambiante pendant 24 heures. On précipite le produit brut par addition d'eau et on le purifie par chromatographie sur gel de stLice. EXEMPLE 10. 25 On prépare le sel de sodium de la rabelomycine . comme suit s On dissout un échantillon de rabelomycine dans un équivalent de NaOH 0,1 N. On amène la solution résultante à siccité sous vide en formant le sel de sodium solide. 71 22318 14 2100783 REVENDICATIONS 1. Procédé pour préparer les composés de formules suivantes I et II : 10 15 20 25 30 II et leurs sels de métaux alcalins et alcalino-terreux, ainsi que leurs esters, ledit procédé éteint caractérisé en ce qu'on cultive les micro-organismes de l'espèce Streptomyces olivaceus dans un milieu nutritif aqueux comprenant un hydrate de carbone assimilable et des sources d'azote organiques assimilables, dans des conditions aérobies sabœergées, en formant le produit de formule I, et, si on le désire, on déshydrate ledit produit de formule I en formant le produit de formule II, et si on le désire, on fait réagir lesdits produits de formules I et II respectivement avec un hydroxyde de métal alcalin et de métal alcalino-terreux en formant respectivement leurs sels de métaux alcalins et alcalino-terreux et, si on le désire, on acyle lesdits produits de formules I et II en formant leurs esters. 2. Procédé selon la revendication, caractérisé en ce qu'on utilise comme micron-organisme Streptomyces olivaceus ATCC 21549. 3. Composés industriels nouveaux, utiles notamment pour la désinfection de matériel de laboratoire, caractérisés en ce qu'ils consistent en composés de formules suivantes I et II 71 22318 15 100783 OH 0 et II 10 et leurs sels de métaux alcalins et alcalino-terreux., ainsi que leurs esters. 4„ Nouveaux médicaments utiles notamment pour leur activité sur le système nerveux central^ caractérisés en ce qu'ils consistent en composés de formules I et II selon 15 la revendication 3 et Jsurs sels alcalins et alcalino-terreux et esters pharmaceutiquement acceptables, 5. Compositions pharmaceutiques renfermant un ou plusieurs composés actifs selon la revendication 4 en association avec un véhicule pharmaceutiquement acceptable . 20 6. Formes pharmaceutiques en vue de l'adminis tration des compositions selon la revendication 4a par voies orale et parentérale.