FR 2085925 A1 19711231 FR 7112346 A 19710407 71 12346 2085925 La présente invention concerne un nouveau procédé d'électrophorèse pour la séparation de composants chargés électriquement, de préférence pour la séparation de composés amphotères tels que des protéines et des amino-acides. La séparation s'effectue dans 5 un gradient migrateur de pH et de mobilité d'ampholytes de transport. Ce gradient de pH et de mobilité émigré conformément au principe isotachophorétique décrit plus loin. Attendu que le mode opératoire permet d'obtenir une séparation qui dépend de la mobilité de même que du pH, on obtient de très bons résultats. 10 On connaît déjà divers procédés de séparation par électro- phorèse. Dans 1'électrophorèse ordinaire, les composants à séparer émigrent dans un champ électrique et on obtient une séparation du fait que les composants émigrent à des vitesses différentes dans le champ. Le degré de séparation aue l'on obtient dépend donc de 15 la longueur du trajet de séparation. Toutefois, un long trajet de séparation requiert une très haute tension pour l'obtention d'une intensité suffisante du champ électrique. Si la séparation a lieu dans une colonne, les diverses substances sortent de la colonne à des vitesses différentes au moment de l'élution, ce qui n'est pas 20 désirable. De plus, les divers composés ne sont pas concentrés pendant la séparation, mais un composant qui a été introduit dans le champ dans une certaine gamme occupe,après la séparation, une gamme encore plus large à cause des effets de diffusion. Le degré de séparation ne donne donc pas satisfaction. 25 Dans la concentration isoélectrique, 1'électrophorèse est effectuée dans un gradient stable de pH que l'on obtient généralement par un mélange d'ampholytes. Le gradient de pH se stabilise de lui-même dans le champ électrique et aucune migration n'a lieu de la part des composants dans le mélange d'ampholytes, à l'état de repos. 30 Les composés, de préférence des protéines, que l'on doit séparer émigrent dans le champ et dans le gradient de pH à une vitesse déterminée par la mobilité des composants respectifs. La mobilité dépend de la valeur de pH de la solution ambiante et une protéine émigrera donc à une grande vitesse si elle se trouve dans une gamme 35 de pH très loin de la gamme correspondant à aon point iso-électrique « La vitesse de migration de la protéine est nulle lorsque le pH de la solution ambiante correspond au point isoélec- 71 12346 -2- 2085925 trique de la protéine. Par l'utilisation de la concentration isoélectrique, on peut obtenir un très haut degré de séparation et les zones obtenues sont concentrées dans le champ électrique. Toutefois, la quantité d'échantillon que l'on utilise peut être limi-5 tée, parce que dans ce cas, une précipitation des composants séparés peut avoir lieu si la limite de solubilité du composant dans la zone correspondante est dépassée. De plus, l'élution de la colonne soulève plusieurs problèmes. L'élution doit de préférence être effectuée sans suppression de la tension électrique, sinon la sépa-10 ration que l'on obtient peut être détruite par diffusion. Toutefois, les zones émigrent depuis la colonne comme dans 1'électrophorèse ordinaire, mais la colonne doit être vidée, quant au gradient de pH et aux zones. Si la valeur de pH de la zone correspondante doit être déterminée, il n'est pas possible d'éluer la colonne sans cou-15 per la tension. Dans un troisième procédé d1électrophorèse, appelé isota-chophorèse, on parvient à supprimer certains des inconvénients mentionnés ci-dessus. 1'isotachophorèse ou électrophorèse par déplacement (Martin & Everaerts, "Analytica Chimica Acta" 38 (1967), pages 20 233-237) est mise an oeuvre par application d'un champ électrique à travers un système électrolytique contenant les composants à séparer, de même qu'un électrolyte d'entrée et un électrolyte terminal. L'électrolyte d'entrée est un composant ayant la même charge que les composants à séparer, mais de mobilité globale plus forte. La 25 charge de 1'électrolyte terminal doit avoir le même signe que celle de 1'électrolyte d'entrée, mais sa mobilité globale doit être plus faible que celle de tous les composants à séparer. Lorsqu'un équilibre a été réalisé dans le système, tous les composants de même charge émjgrent à une vitesse égale à la vitesse du composant qui 30 a la plus grande mobilité globale, c'est-à-dire que tous les composants émigrent à la même vitesse que 1'électrolyte d'entrée et les composants forment des zones consécutives disposées conformément à leur mobilité globale respective. De plus, les composants ayant des charges opposées, appelés ions antagonistes, émigrent dans une 35 direction opposée. La séparation que l'on obtient dépend ainsi totalement des différences de mobilité des composants, mais si des composants ayant des valeurs de mobilité voisines doivent être sépa 71 12346 2085925 rés, il est nécessaire d'introduire un autre composant dans le système, cet autre composant ayant une valeur de mobilité intermédiaire entre les valeurs de mobilité des composants à séparer. De plus, le composant doit avoir des propriétés qui permettent 5 de le détecter séparément. Dans la concentration isoélectrique, les divers composants sont concentrés dans différentes gammes de pH et l'échantillon s'étend sur tous le gradient de pH, des ampho-lytes séparant les diverses zones d'échantillons. Dans le nouveau procédé conforme à l'invention, tous les 1C inconvénients indiqués ci-dessus sont éliminés. Dans le procédé de l'invention, les avantages de la concentration isoélectriaue s'obtiennent par un procédé d'isotacho-phorèse. Si les composants à séparer sont amphotères, ils n'atteignent pas leurs points isoélectriques parce que les ions antagonis-15 tes utilisés conformément à l'invention doivent exercer un effet de tamponnement et consistent en un acide faible ou une base faible. La séparation obtenue dépend de lg&obilité des composants de même que des points isoélectriques si les composants sont des protéines ou d'autres composés amphotères. Lorsqu'on utilise le procédé con-20 forme à l'invention, une protéine est chargée pendant la séparation, ce qui signifie que la solubilité augmente. Le procédé peut donc être utilisé sur une base pratiaue et la quantité d1 échantillon que l'on utilise n'est pas déterminante. On obtient un effet de concentration. Comme dans 1'isotachophorèse ordinaire, il est éga-25 lement possible d'accroître le degré de séparation par l'utilisation d'un contre-courant et d'allonger ainsi le trajet de séparation qui doit être couvert par les composants. Dans ce cas, la solution électrophorétique doit être stabilisée par quelque milieu convenable, généralement une poudre. Une telle stabilisation peut aussi 30 être utilisée lorsqu'il n'y a pas de contre-courant, mais le milieu de stabilisation est alors généralement un gel, par exemple un gel du type de la gélose ou un gel de polyacrylamide. Si le nombre de composants contenu dans le mélange d'ampholytes est suffisant, les composants à séparer doivent toujours 35 être séparés par des ampholytes, ce qui accroît le degré de séparation. Les propriétés du système peuvent être modifiées par variation de l'ion antagoniste, de l'ion de 1'électrolyte d'entrée ou de l'ion 71 12346 2085925 terminal. La valeur convenable de pH de la zone terminale se détermine par les mobilités globales et la concentration des ions antagonistes, des ions de 1'électrolyte d'entrée et des ions terminaux. Le mélange d'ampholytes est ionisé par les ions antagonistes 5 de sorte qu'on obtient ou bien un mélange acide, ou bien un mélange basique, ce qui signifie l'établissement d'un gradient migrateur de pH. Par une modification appropriée de l'ion de 1'électrolyte d'entrée et des ions antagonistes, on peut modifier le gradient de pH de certains mélanges d'ampholytes, en le faisant passer par exem-10 pie d'un pH de 5-7 à un pH de 6-8, ce qui modifie naturellement le degré de séparation du système. Le gradient de pH peut aussi être modifié par l'utilisation d'un mélange d'ampholytes ayant une composition différente. Le mélange d'ampholytes pourrait consister en un mélange 15 conforme au brevet suédois n° 314 227, ce mélange consistant en acides aminocarboxyliques auxquels sont attachés différents groupes protéolytlques tels que des groupes azotés et des groupes carboxyli-ques. Il est également possible d'utiliser d'autres mélanges actuellement non disponibles dans le commerce. Pour les spécialistes ob. 20 ce domaine, il est également possible ou bien d'effectuer la synthèse d'un mélange contenant un grand nombre de composants ayant chacun un degré différent de substitution,ou bien de mélanger des composants connus. Si l'on doit obtenir un gradient uniforme de pH et de mobilité, il est nécessaire que le nombre de composants soit grand, 25 c'est-à-dire que la différence des gradients de pH et de mobilité entre les composants soit faible. Toutefois, il n'est pas possible de déterminer le nombre décomposants qui sont requis, car ceci dépend de l'intervalle devant être couvert par le gradient. Si des protéines doivent être séparées conformément au pro-30 cédé de l'invention, il est en outre désirable que le mélange d'ampholytes n'absorbe pas la lumière ultra-violette dans la gamme d'absorption des protéines. A titre de variante, il pourrait naturellement être pratique d'avoir une solution absorbant les rayons ultraviolets lorsqu'on sépare des composants qui n'absorbent pas la lumière 35 ultra-violette. Le procédé conforme à l'invention est illustré en détail par quelaues exemples. BAD ORIGINAL 71 12346 -5- 2085925 Les solutions mentionnées dans les exemples ont les compositions suivantes : Tampon au gel. pH = 6.1 5,2 g de base "tris" 5 39 ml d'acide orthophosphorique 1 M 0,5 ml de tétraméthyléthylènediamine ("Temed") Eau distillée, quantité suffisante pour 100 ml Tampon au gel. pH = 4.0 0,9 g de base "tris" 10 3,0 ml d'acide acétioue cristallisable 0,3 ml de "Temed" Eau distillée, quantité suffisante pour 100 ml Tampon au gel. pH = 6.6 6,0 g de base "tris" 15 39 nil d'acide orthophosphorique 1 M 0,9 ml de "Temed" Eau distillée, quantité suffisante pour 100 ml Tampon au gel. pH = 4.5 2,0 g de base "tris" 20 3,0 ml d'acide acétique cristallisable 0,3 ml de "Temed" Eau distillée, quantité suffisante pour 100 ml Solution de gel. 30 (en poids/volume) 2,9 g d'acrylamide 25 1 g de bisacrylamide Eau distillée, quantité suffisante pour 100 ml / Solution de catalyseur 4 mg de riboflavine Eau distillée, quantité suffisante pour 100 ml 30 Solution de saccharose. 25 i° (en poids/volume) 25 g de saccharose Eau distillée, quantité suffisante pour 100 ml 71 12346 "6" 2085925 Tampon pour électrode 30 g de glycine 6 g de base "tris" Eau distillée, quantité suffisante pour 200C ml 5 Exemple 1 On introduit un mélange consistant en 3 ml de tampon au gel (pH =6,1), 3 ml de solution de gel à 30 #, 3 ml de solution de saccharose à 25 12 ml d'eau distillée et 3 ml de solution de catalyseur dans une colonne verticale dfélectrophorèse. Avant l'in-10 troduction de la solution, on ferme une extrémité de la colonne avec un papier filtr§4u'on sature avec le mélange à introduire. Le papier filtre est maintenu en place avec une pellicule de matière plastique. Le mélange de gel est polymérisé par radiation ultraviolette pendant 45 minutes et on obtient un gel solide. On intro-1 5 duit à la partie supérieure de ce gel une nouvelle solution consistant en 2 ml de tampon au gel à un pH de 6,1, 2 ml de solution de gel à 30 fs, 2 ml de solution de saccharose à 25 fo, 7 ml d'eau distillée, 2 ml de solution de catalyseur et 1 ml de "Ampholine" (marque déposée) pH = 4-8. Ce dernier composant est un mélange 20 d'ampholytes du commerce, contenant un amino-acide, vendu par la firme LKB-Produkter AB, de Stockholm. Ce dernier mélange est également polymérisé par radiations ultra-violettes. Finalement, on introduit un troisième mélange dans la colonne, ce troisième mélange consistant en un tampon de "tris" et de glycine, c'est-à-dire le même 25 mélange que celui qu'on utilise dans la chambre d'électrodes. L'échantillon de protéine de 7 ml qui doit être séparé est mélangé avec 1,25 ml de tampon au gel à un pH de 6,1 et 1,25 ml de solution de saccharose et le mélange est dilué avec de l'eau distillée pour ajuster le volume à 10 ml. Les composants des échantil-30 Ions sont ainsi ionisés et chaque échantillon est introduit dans la colonne d'éledtrophorèse. L'échantillon est de préférence introduit au-dessus de la partie supérieure du gel. La tension est appliquée et 1'électrophorèse est effectuée sous intensité constante de 10 millia*p BAD ORIGINAL 71 12346 -7" 2085925 Lorsque des conditions de régime constant ont été établies, tous les ions des sytèmes émigrent à la même vitesse que les ions phosphates et les composants de l'échantillon sont séparés dans le gradient migrateur de pH. Lorsque la colonne est éluée, le con-5 tenu est fractionné et on effectue une analyse immunochimique classique des fractions. Conformément à cette analyse, les fractions contenant 1'orosomucoïde et la préalbumine sont rassemblées et le mélange est soumis à une ultrafiltration et dialysé vis-à-vis d'eau distillée jusqu'à un volume de 10 ml. 1C Exemple 2 Cette expérience est mise en route de la même manière que l'expérience précédente, c'est-à-dire que la colonne est garnie avec un mélange contenant 3 ml de tampon au gel à un pH de 4,0, 3 ml de solution à 30 % de gel, 3 ml de solution à 25 de saccha-15 rose, 12 ml d'eau distillée et 3 ml de solution de catalyseur. Le mélange est polymérisé par radiation ultra-violette et on ajoute un second mélange composé d'un ml d4"Ampholine" (marque déposée) de pH égal à 3-7, 1,5 ml de solution de saccharose à 25 $ et 100 ml de base "tris", de même qu'un échantillon de 10 ml de solution pro-20 venant de l'expérience décrite ci-dessus. De plus, on ajoute le tampon de "tris" et glycine et on entreprend 1'électrophorèse. Pendant cette expérience, l'intensité de courant est de 7 milli-ampères. L'analyse subséquente indique que les composants de l'échantillon se sont complètement séparés et que 1'orosomucoîde a acquis la pureté 25 immunochimique, mais non la préalbumine. Comme dans l'expérience précédente, les fractions provenant de la préalbumine sont mélangées et le mélange ainsi obtenu est traité par ultrafiltration et dialysé. Exemple 3 On introduit deux mélanges différents dans la colonne»comme 30 dans la première expérience,et on polymérisé legfaélange^feinsi introduits.Au lieu du tampon au gel (pH = 6,1) utilisé précédemment, on utilise un tampon ayant une valeur de pH de 6,6. On utilise également 1 ml d* "Ampholine" (marque déposée) à un pH de 5-7. L'échantillon est formé par 9 ml du mélange obtenu par dialyse dans la 35 seconde expérience et cet échantillon est dilué avec 1,5 ml de tampon au gel à un pH de 6,6 et de 1,5 ml de solution de saccharose à 25 Après cette séparation, on obtient la préalbumine chimiauement 71 12346 2085925 pure de même que la préalbumine contenant un peu d'albumine. Exemple 4 On effectue cette expérience en vue de régler le gradient de pH et par conséquent on n'ajoute pas d'échantillon. Les condi-5 tions expérimentales sont les mêmes que dans la seconde expérience décrite ci-dessus, à la différence qu'on utilise un tampon au gel ayant une valeur de pH de 4,5 et dn'Ampholine" (marque déposée) à un pH de 3-8. On arrête l'expérience avant que l1électrolyte d'entree consistant en ions acétate n'ait émigré en dehors du gel. Le gel 10 est élué de la colonne et divisé en 10 parties, chacune étant traitée à l'eau distillée. La valeur de pH des zones respectives est ensuite déterminée et on constate que le pH varie presque linéairement de 4,5 à 8,5 d'un bout à l'autre du gel. La longueur du gel est d'environ 8 cm. 71 12346 2085925 REVENDICATIONS 1. Procédé de séparation isotachophorétique de composants chargés .électriquement, contenus dansrne solution, danâ lequel les composants ayant la même charge et le même signe émigrent 5 dans un champ électriaue à une vitesse égale à la vitesse du composant ayant la plus grande mobilité globale, les composant» fcrtuuit des zones consécutives dont l'ordre est déterminé par la mobilité globale des composants et dans lequel les composants de charge opposée, appelés ions antagonistes, émigrent dans une direction 10 opposée, procédé caractérisé par le fait qu'on ajoute un mélange d'ampholytes aux composants à séparer en vue de former un gradient migrateur de mobilité et de pH dans le champ électrique, chaque amphclyte du mélange ayant une mobilité et un point isoélectrique différents,la différence de mobilité d'ampholytes successifs étant 15 faible et chaoue ampholyte du mélange ayant une valeur définie du pH correspondant au point isoélectrique de 1'ampholyte respectif , cette valeur du pH étant déterminée par les ions antagonistes utilisés, lesquels sont tamponnés, et la gamme de mobilité du mélange d'ampholytes est choisie de manière à couvrir la gamme de mobilité 20 des composants à séparer. 2. Procédé suivant la revendication 1, caractérisé par le fait que les ions antagonistes sont choisis de manière à établir un gradient de pH qui convient pour la séparation désirée. 3• Procédé suivant la revendication 1, caractérisé par le 25 fait que les composants chargés électriquement quel'on doit séparer sont formés par des composés amphotères tels que &es protéines ou des amino-acides. 4. Procédé suivant l'une quelconque des revendications 1 à 3, caractérisé par le fait que le mélange d'ampholytes est formé 30 par au moins trois groupes polyprotiques, dont l'un est un groupe carboxylique et un. autre est un atome basique d'azote. 5. Procédé suivant l'une quelconque des revendications 1 à 4, caractérisé par le fait que la solution à séparer est stabilisée au moins à un certain degré par un gel. 71 12346 "10" 2085925 6. Procédé suivant l'une quelconque des revendications 1 à 4, caractérisé par le fait que la solution à séparer est stabilisée par une poudre et les composants à séparer émigrent par électrophorèse à contre-courant avec un liquide.