FR 2070057 A1 19710910 FR 6925209 A 19690724 69 25209 1 2070057 La présente invention, concerne la conservation de substances biologiques, notamment sang total. la conservation de substances biologiques telles que vaccins, • sérums, enzymes, hormones, sang, cultures bactériologiques de na-5 tures diverses et spécimens de tissus (entre autres denrées comestibles) , os et analogues pose depuis plusieurs décennies un problème particulièrement épineux. Du fait qu'elles n'ont qu'un temps de conservation relativement bref et qu'elles sont très demandées, ces substances ont atteint des prix excessifs. "10 Notamment pour le sang, on a conçu des installations com plexes qui, vu le temps bref de conservation et le haut prix de revient, ont imposé une comptabilité minutieuse des débits et des crédits par l'intermédiaire de "banques" de sang. A titre d'exemple, on va se référer ci-dessous pour décrire 15 l'invention à du sang total. Toutefois, le technicien en matière de conservation de substances biologiques verra que l'invention est aussi bien applicable à des substances biologiques autres que sang, moyennant bien entendu quelques modifications des combinaisons de pression et de température indiquées ci-dessous. 20 Lorsqu'il s'agit de sang, l'intérêt porte surtout sur les érythrocytes ou globules rouges. Le globule rouge est de forme globulaire et contient du cytoplasme enveloppé par une membrane semi-perméable. Cette membrane renferme le liquide qui est libre au sein de la cellule et, bien qu'on ne connaisse pas en détail 25 la structure intime de la membrane d'érythrocyte, on sait qu'elle comporte des mélanges complexes de protéines fibreuses, de lipides et de mucopolysaccharides. La membrane est souple, mais pratiquement non élastique et se rompt au delà d'un volume maximum critique. Quand la membrane se rompt, de l'hémoglobine est libé-30 rée dans le plama sanguin, où elle ne peut plus jouer son rôle essentiel, qui est de véhiculer l'oxygène et le gaz carbonique, dont les échanges sont assurés à travers la membrane perméable. A mesure que 1'érythrocyte vieillit dans l'organisme (dans le système circulatoire), sa composition se modifie. D'une maniè-35 re générale, l'activité des enzyàes est plus grande dans les globules jeunes et diminue à mesure que le globule vieillit. Normalement, les globules rouges ont, dans l'organisme vivaat, une vie d'environ cent-vingt jours, à la fin de laquelle certains organes du corps les éliminent sélectivement en les transformant par dis-40 sociation en déchets, et en recyclant certains déchets pour la 69 25209 2 2070057 formation de nouvelles cellules dans la moelle des os. Des études faites sur le pouvoir osmotique de la membrane de l'hématie ont permis d'acquérir des données de base sur la perméabilité de la membrane à certains solutés et à l'eau. Ces obser-5 vations ont mené à la conclusion que la membrane laisse passer l'eau, qui est le constituant principal du liquide intérieur et du plasma. On a conclu que la membrane d'hématie est imperméable au saccharose et aux métabolites et que des déplacements d'eau de part et d'autre de la membrane mènent à l'établissement d'unéqui-10 libre osmotique entre les globules et le plasma. le déplacement de l'eau et des molécules hydrophiles entre l'intérieur du globule et le milieu environnant, à travers la membrane, a probablement lieu soit par dissolution des molécules dans la substance de la membrane et diffusion d'un côté à l'autre 15 la connaissance de la nature précise du mouvement n'est pas nécessaire à la compréhension de l'invention, mais le fait qu'il 20 y ait bien déplacement physique à travers la membrane oblige à tenir compte des forces d'inertie et à éviter des modifications rapides ou violentes, sous peine de roupre lamembrane. Comme précédemment noté, les globules rouges ont, dans le système circulatoire, une durée de vie d'environ cent-vingt jours. 25 Par contre, isolés de l'organisme, les globules rouges se détériorent très rapidement. Parmi les facteurs qui influencent la conservation des globules rouges aux fins de thérapeutie de remplacement, figure au premier chef le maintien du rôle majeur des hématies : transfert de gaz opéré à travers leurs membranes pour 30 amener de l'oxygène des poumons aux cellules de l'organisme et pour prélever le gaz carbonique à ramener aux poumons. Pour assurer le maintien de ce rôle (c'est-à-dire la viabilité du globule), diverses considérations se révèlent très importantes : (1) contrecarrer la tendance du sang à subir hors des 35 vaisseaux l'effet de coagulation; (2) ralentir les processus métaboliques et (3) maintenir l'intégrité du globule (condition en partie liée à la précédente). En ce qui concerne la condition (2) ci-dessus, il est connu que les échanges gazeux à travers le globule résultent probable-40 ment de gradients de concentration et n'exigent pas de dépense 69 25209 3 2070057 d'énergie. De plus, il semble que le globule n'opère guère de synthèse de protéines ou de lipides après maturation et que son hémoglobine soit déjà complètement formée. Par contre, le globule en circulation doit conserver sa forme, sa composition ioniquein-5 terne et l'intégrité de sa structure. XI doit aussi maintenir son hémoglobine telle que produite. Toutes ces tâches exigent de l'énergie et l'hématie viable doit donc engendrer de l'énergie. Hors des vaisseaux, cette production d'énergie a pour effet de faire assurer par le globule rouge un processus métabolique jusqu'à ce 10 que le sucre sanguin soit épuisé et transformé en acide lactique. De ce fait, le pH du plasma prend une valeur basse insatisfaisante et l'équilibre osmotique entre liquides intracellulaire et extracellulaire est vite détruit. En ce qui concerne l'intégrité du globule -condition (3) ci-15 dessus-, la viabilité du globule est réfléchie par des essais d'hémolyse du globule et par la fragilité osmotique. L'hémolyse est la disparition de l'intégrité de la membrane du globule, tandis que la fragilité osmotique est définie par le degré de contrainte qui, imprimé au globule, provoque son élimination par la 20 rate ou par le foie. Toute perte est directement mesurable à l'aide d'un dispositif dit "hématocrite11, qui permet d'obtenir, par centrifugation du sang, le rapport plasma/globules rouges. On peut opérer une transfusion indirecte (et non directe de donneur à récepteur) en utilisant comme anticoagulant une solu-25 tion de citrate. Si l'on modifie cette solution de citrate par acidification et addition de glucose, on obtient un produit dit AGD (acide-citrate-dextrose) qui, ajouté à raison d'environ 15 g par 100 g de sang, donne une solution pouvant servir sans danger à la transfusion pendant un temps d'environ 21 jours si elle est 30 convenablement réfrigérée (aux environs de 4°G). On choisit la température de 4°C parce que supérieure au point de congélation, mais assez basse pour que le métabolisme soit nettement ralenti dans la solution sanguine demeurée à l'état liquide. A part la modification précitée apportée à la solution citri.-35 que, la mise au point d'un anticoagulant plus récent, dit GPD, qu'on décrira plus loin et l'idée d'opérer l'emmagasinage à basse température, en phase liquide, on n'a enregistré au cours de ces dernières années que très peu de progrès relatifs au maintien, pendant emmagasinage, de la viabilité des globules rouges. 40 Bien qu'en pratique diverses considérations très positives 69 25209 4 2070057 incitent à prolonger le temps de conservation sûre de globules rouges dans un état fonctionnel optimal, entre autres l'intérêt qu'il y aurait à disposer d'une réserve de sangs de types rares et à supprimer le gaspillage résultant de ce qu'il faut actuelle-5 ment jeter le sang au bout de vingt et un jours, aucune méthode, en dehors de celle décrite ci—dessus, ne s'est révélée permettre de constituer commodément et à bon compte des réserves de sang humain par doses individuelles (d'environ 500 ml). En voyant revivre des poissons qui avaient été emprisonnés 10 dans de la glace pendant des temps prolongés, on a été amené à la longue à consacrer des efforts à l'emmagasinage en phase solide (à l'état congelé). Toutefois, si l'on ramène du sang non protégé en deçà du point de congélation, on note une détérioration massive des globules rouges. 15 Pour expliquer cette détérioration, on a avancé trois théo ries : (1) les cristaux de glace extracellulaire appliqueraient aux cellules un effet de broyage physique; (2) l'eau cristalliserait à l'état pur, abandonnant des sels concentrés localement qui provoqueraient en combinaison une dénaturation des protéines et 20 une hypertonicité intracellulaire; (3) il y aurait bouleversement des relations spatiales à l'intérieur de la cellule. Chacune de ces théories a donné naissance à des procédés tendant à ramener sans détérioration les globules en deçà du point de congélation. L'un de ces procédés consiste à remplacer les 25 substances intracellulaires libres par un additif, tel que glycé-rol ou diméthyl-sulfoxyde, de nature à pénétrer dans les globules. Certes, on évite ainsi 1'endommagement des globules rouges pendant congélation, mais il faut ensuite éliminer les produits chimiques avant de pouvoir transfuser le sang. Il en résulte que la 30 mise en oeuvre de ces procédés et l'appareillage associé sont extrêmement coûteux. En variante, on a proposé d'opérer une congélation rapide en présence d'additifs à pénétration nulle ou lente telle que PVP (polyvinylpyrrolidone), dextrine, gélatine, saccharose, lactose 35 ou glueose. Toutefois, ces additifs soulèvent encore la difficulté qu'on vient d'exposer. On a encore proposé des méthodes plus élaborées et ésotéri-ques, consistant à congeler le sang par gouttelettes dans des courants d'azote liquide et à faire "baigner ces gouttelettes dans 40 des solutions aqueuses particulières, mais toutes ces techniques 69 25209 5 2070057 compliquées sont très au delà de la pâle compétence du technicien hospitalier courant et risqueraient en conséquence de donner des résultats peu sûrs. De plus, elles posent des problèmes de stérilité presque insurmontables. 5 On s'est refusé d'une manière générale à appliquer de fortes pressions pour éviter la congélation en alléguant l'effet cytoto-xique que la pression exercerait sur les globules rouges et du fait que la congélation a inévitablement lieu par nappes successives, comme on l'exposera plus loin, ce qui détruit un nombre 10 démesuré d'hématies. La présente invention a pour buts de proposer : - un procédé pour la conservation prolongée de substances biologiques, ces substances ne présentant pas, au bout du temps de conservation, de dégradation sensible de la viabilité des cel- 15 Iules (quand la substance a été conservée à l'état vivant) et ayant des caractéristiques analogues à celles observées après l'emmagasinage classique de durée brève; - un procédé du genre décrit, particulièrement applicable à la conservation de sang total et permettant de maintenir pendant 20 conservation la viabilité des hématies; - un procédé pour la conservation de sang total par doses unitaires qui permette la stérilisation par techniques classiques; - un procédé et un appareil pour la conservation de sang total dont l'utilisation soit relativement simple et puisse être 25 assurée par du personnel n'ayant qu'un minimum d'expérience; - un appareil pour la conservation de sang total particulièrement applicable à des doses unitaires; - un appareil pour la conservation de sang total permettant d'atteindre les buts précités par un effet automatique qui assure 30 par lui-même, une fois le processus en cours, l'obtention de l'état optimal désiré. L'invention repose essèntiellement sur le contrôle attentif de la température et de la pression, opéré de manière à conserver ses caractéristiques à la substance biologique. Suivant un mode 35 de mise en oeuvre préféré, on obtient ce résultat en évitant les chocs de congélation ainsi que le phénomène de congélation lui-même. S'il s'agit de sang, on peut ainsi conserver son intégrité à l'hématie et à sa membrane, tout en ralentissant suffisamment le métabolisme pour éviter la détérioration. On a découvert, par 40 exemple, que si l'on imprime une pré-compression à du sang total 69 25209 6 2070057 à une température supérieure au pdiait de congélation et si l'on ajuste avec soin la pression pour rendre minimaux les chocs provoqués par la congélation "en nappes" en cas de "baisse de la température, on peut ramener sans effet nocif la température à un 5 niveau pour lequel la vitesse de métabolisme est négligeable. On a encore constaté que, lorsqu'on applique une telle précompression à du sang ayant sa densité maximale, puis qu'on confine le sang dans une enceinte non élastique, la dilatation subie par le sang en cas de baisse de la température assure automatiqu©--10 ment le maintien, d'après la pression de pré-compression, des conditions fonctionnelles nécessaires précitées jusqu'à une température de conservation finale donnée. Ainsi qu'on l'a constaté, outre qu'on améliore beaucoup le temps de conservation de substances biologiques en ramenant la 15 température au-dessous du point de congélation après pré-compression, la pré-compression en soi prolonge notablement le temps de conservation de substances biologiques telles que sang total. Oe résultat est apparemment dû à un ralentissement du métabolisme provoqué par Tin tassement des parois de cellule de la substance 20 emmagasinée. Les buts et caractéristiques précités de l'invention, leur mode d'obtention et l'invention elle-même seront mieux compris d'après la description qu'on va maintenant donner d'un mode de mise en oeuvre de l'invention, en se référant aux dessins annexés, 25 sur lesquels : - la fig. 1 est un diagramme portant en ordonnées les précompressions admissibles (en kg/mm2) et en abscisses les températures (en °C)$ - la fig. 2 représente en coupe à titre d'exemple un réci-30 pient d'emmagasinage suivant l'invention, et - la fig. 2a est une vue de détail des segments du piston montrés sur la fig. 2. Comme précédemment exposé, l'emmagasinage en phase solide de sang congelé n'est pas réalisable à grande échelle et l'applica-35 tion d'une forte pression destinée à éviter la formation de cristaux a été expressément décrite et proscrite par des auteurs faisant autorité comme impraticable et comme cytotoxique pour les globules rouges. Il existe toutefois une relation qu'on n'a pas étudiée à 40 fond et qui, loin d'avoir une simple valeur théorique, est abso 69 25209 7 2070057 lument confirmée au laboratoire, le sang comporte environ 90 % d'eau et, en conséquence, ses caractéristiques statiques, dynamiques et physiques sont telles qu'on peut prévoir son comportement, à divers égards importants, par analogie avec l'eau. Par exemple, 5 l'eau et le sang atteignent une densité maximale à 4°C (en fait, 3,98°C, mais ce chiffre n'étant pas critique à 0,02 % près, on adoptera ci-après la valeur d'approche de 4°(5. En conséquence, tant au-dessus qu'au-dessous de 4°0, l'eau (ou le sang)se dilate. Il y a aussi analogie dans le phénomène de congélation. Pen-10 dant congélation, on note une dilatation de 7 à 13 % en volume (selon la température et la pression appliquées). Du fait qu'il existe presque inévitablement un gradient de température entre le centre et les parois extérieures de l'enceinte de congélation, la congélation a forcément lieu par couches ou nappes successives et 15 chaque couche (dont l'épaisseur peut n'être que de 25 y.) subit pendant congélation une dilatation de 7 à 13 %• Si l'on fixe le volume en confinant l'enceinte ou autrement, une onde de pression se transmet dans toute la masse du liquide. Ainsi qu'on l'a noté en décrivant la membrane d'hématie, celle-ci est perméable etsou-20 pie, mais des variations brusques détruisent l'équilibre entre les liquides extracellulaire et intracellulaire. En conséquence, si on laisse la congélation intervenir par nappes successives, certaines hématies subissent une hémolyse ou, si l'effet est insuffisant pour détruire complètement l'intégrité de la membrane, 25 leur fragilité osmotique devient assez faible pour qu'après transfusion, les globules rouges affectés soient éliminés de la circulation. De l'eau ou du sang congelé, par exemple, sous pression d'une atmosphère et à 0°0, se dilateraient librement de 9 %, mais à cette température et sous cette pression, l'eau ou le sang ii ont* 30 du fait du changement d'état, qu'une compressibilité de 4,2 Ainsi, quand la dilatation rapide apparaît dans une capacité fixe, il se forme de la glace à concurrence d'une dilatation globale de 4,2 % de la capacité, limite au delà de laquelle de la glace ne peut plus se former à cette température. 35 En conséquence, pour l'eau ou le sang, l'aptitude à passera l'état solide dépend de la compressibilité et la Demanderesse a découvert que si l'on peut agir d'une manière ou d'une autre sur cette compressibilité, on peut éviter partiellement la cristallisation ou congélation. Dans le cas de sang humain, on évite ainsi 40 l'hémolyse des globules rouges sous l'effet des brusques hausses 69 25209 8 2070057 de pression provoquées par la cristallisation. Plus particulièrement, la Demanderesse a constaté qu'on peut appliquer à du sang le degré de pré-compression voulu pour absorber sa compressibilité normale, ce qui permet de supprimer ou de limiter ces brusques 5 hausses de pression. Comme le conçoit le technicien, le point de congélation dîun liquide dépend de la température et de la pression ambiantes. Ainsi, sous une pression p/j, le point de congélation est t^, mais sous tme pression pg supérieure à p^, le point de congélation est 10 tgi inférieur à t^. Aux fins de la présente invention, on peut définir la précompression comme l'application mécanique de pression positive opérée à toute température dépassant le point de congélation de la substance intéressée. 15 La pré-compression peut être appliquée en totalité à une mê me température (ce qui est le cas pour le mode de mise en oeuvre décrit ci-dessous), ou par stades comportant des hausses de pression apparaissant à des températures définies (la pression étant par exemple de 3»6 kg/mm^ à 4°C, de 2,1 kg/mm^ à-5°C et de 1 ^4-kg/ 2 20 mm à -8°C et ainsi de suite); Comme indiqué, on peut appliquer la compression à toute température dépassant celle de congélation; toutefois, on exprimera la pression de pré-compression par sa grandeur à la température de densité maximale, qui est de 4°C pour le sang. Pour déterminer 25 la pression de pré-compression, il suffit de ramener la température à 4°G et d'augmenter la pression. Par exemple, on supposera qu'on ait à appliquer, dans une enceinte non déformable, une près- O sion de 2,8 kg/mm à une température de 5.°C (toutes les pressions étant citées en valeurs absolues). Du fait gue le sang se contmo-30 te ensuite en revenant à 4°C, la pression de pré-compression re- p présente en fait la différence entre 2,8 kg/mm et la perte de pression due à la contraction subie par le saaag en tombant à 4°C. Il en est de même si l'on applique la pression à 3°C s la près- O sion de pré-compression est de 2,8 kg/mm , moins la chute de pres-35 sion due à la contraction. De résultats observés, on a déduit qu'une compression même faible affecte nettement la température à laquelle apparaît la dilatation rapide nécessaire pour permettre la formation de glace. La Demanderesse a constaté qu'on peut engendrer automatique-40 ment des pressions supplémentaires après le stade ou entre deux 69 25209 9 2070057 stades de pré-compression.Quand on enferme de l'eau ou une solution aqueuse dans une enceinte dotée d'un module d'élasticité et d'une limite élastique suffisants pour ne subir qu'un déplacement radial négligeable lorsqu'on ramène la température au-dessous de 5 4°C, le liquide engendre de la pression en tentant de se dilater. Il en résulte que le point de dilatation rapide auquel se forme la glace (qui est normalement de 0°C sous pression d'une atmosphère et plus faible sous pré-compression) baisse jusqu'à ce que les forces appliquées au liquide, tendant à la formation de glace, 10 deviennent supérieures à la pression appliquée. Il est à noter que, bien qu'il soit théoriquement désirable ■ (du seul point de vue de la congélation) d'appliquer au sang une pré-compression suffisante pour absorber en totalité sa compressibilité, il faudrait pour cela appliquer à 4°C une pression d'en-15 viron 8,4 kg/mm . Or, l'expérimentation montre que cette forte pression, appliquée en une seule fois, imprime aux parois desgLo-bules des déformations indésirables, de sorte que les globules risquent d'être éliminés par l'organisme après transfusion. On peut éviter ce risque en appliquant la pression par degrés, car 20 on a découvert que 1'endommagement des globules est fonction de la pression et de la température. Toutefois, il est rare que le seul facteur à considérer soit la congélation et, en fait, divers impératifs régissent, comme on l'exposera, le choix de la relation pression-température optimale. 25 La fig. 1 est un diagramme pré-compression-température d'em magasinage final indiquant la limite entre les domaines sûr et f 2 hasardeux. Par exemple, une pré-compression de 3,5 kg/mm permet la conservation sûre à une température de -12°C ou plus (si l'on suppose négligeable la dilatation de l'enceinte de contention). p 30 D'autre part, une pré-compression de 2,1 kg/mm exige une température d'emmagasinage d'environ -3,5°C ou plus. En deçà de ces températures, l'hémolyse résultant de la congélation par nappes successives est trop accusée pour qu'on obtienne de bons résultats à la transfusion. 35 En théorie, il semblerait que la température d'emmagasinage sûre la plus basse figurant sur le diagramme assure un ralentissement optimum du métabolisme, mais il existe en fait, à toute température, une limite à la pression qu'on peut appliquer a du sang. La déformation des membranes est aussi fonction de la pres-40 sion et, en conséquence, dans le domaine sûr indiqué sur lafig.1, 69 25209 10 2070057 les pourcentages d'hémolyse des globules varient» de sorte que pour chaque valeur de pré-compression, la plus indiquée des températures sûres n'est pas nécessairement la plus basse. On a constaté qu'on obtient les meilleurs résultats avec une pré-compres-5 sion de 2,8 à 4,2 kg/mm2 et, cette gamme de pressions correspondant à la pente la plus faible de la courbe, c'est elle qui offre le plus de latitude pour le choix des températures d'emmagasinage On va maintenant considérer la fig. 2 et décrire à titre d'exemple un appareil pour la mise en oeuvre du procédé suivant 10 l'invention, ainsi que l'application, choisie à titre d'exemple, de ce procédé à la conservation de sang. L'enceinte d'emmagasinage du sang doit être en un matériau ayant une limite d'élasticité assez élevée pour résister à des p pressions internes dë l'ordre de 14 kg/mm . Ce matériau doit aus-15 si avoir -un module d'élasticité ou de Young suffisant pour que les pressions mises en oeuvre ne provoquent qu'une dilatation ou qu'un déplacement radial négligeable. Par ailleurs, le coefficient de • dilatation thermique doit être de nature à avoir pour effet, dans la gamme de températures prévue, d'accroître la pres-20 sion ou d'être compensé par la dilatation élastique résultant de la pression. De plus, il y a avantage à ce que l'enceinte soit aisément adaptable à une stérilisation à l'autoclave et à ce que ses faces intérieures ne soient pas mouillables par le sang et puissent prendre un fini spéculaire (pour limiter 1 *endommagement 25 des globules rouges). Le matériau qui semble à ce jour le plus indiqué pour former l'enceinte est le nickel. De préférence, on forme l'enceinte par dépôt électrolytique de nickel sur un gabarit ayant une forme ovoïde et un volume égal à celui d'une dpse de sang. Ce gabarit 30 est revêtu d'argent ou d'un autre matériau convenable pour élec- \ trode, et est très finement poli. On le place ensuite dans un bain électrolytique dans lequel on l'agite ou on le fait tourner. Alors qu'une électrode est fixée au gabarit, l'autre électrode (anode), en nickel pur, est suspendue à distance dans le bain. 35 Entre l'anode et la cathode apparaît un effet électrolytique qui provoque le dépôt d'ions nickel, de sorte qu'il se forme lentement une enceinte telle que représentée sur la fig. 3.. Une épaisseur de paroi d'environ 3»2 mm se révèle suffisante pour résister aux pressions internes apparaissant dans les conditions décrites O 40 (pré-compression de 4,1 kg/mm ). 69 25209 2070057 L'enceinte présente, à une extrémité, deux trous 11 et 12 qui la traversent à une fin qu'on exposera et, à l'autre extrémité, un taraudage de réception d'un manomètre classique 13. Dans l'extrémité opposée au manomètre est enfilé un piston de tranamis-5 sion 14, usiné à des cotes précises et qui présente deux rainures annulaires espacées 15 et 15* de réception de joints d'étanchéité. Chaque joint d'étanchéité, représenté en détail sur la fig. 2a, est en deux pièces : la première est une tore 16, en caoutchouc de silicones de qualité médicale, qui engendre une sollici-10 tation élastique à l'intérieur d'une bague en "Téflon" 22' à section rectangulaire. Ce joint combiné, étanche au liquide, n'est pas mouillable par le sang et est facile à stériliser à l'autoclave. Le second joint 15' est prévu par mesure de sécurité. Il comporte deux pièces analogues (16* et 22') juxtaposées au lieu 15 d'être concentriques, ceci pour réduire le frottement, qui se révèle excessif quand le tore et la bague sont placés comme dans le joint 15* La face extérieure du piston 14 doit être aussi finement polie et satisfaire aux mêmes conditions fonctionnelles que l'inté-20 rieur de l'enceinte et que les joints. Autrement dit, il faut qu' elle ne soit pas mouillable par le sang, qu'elle soit facile à stériliser et qu'elle ne détériore pas les globules rouges. Un piston en acier inoxydable se révèle satisfaisant. Pour assurer l'étanchéité et permettre la mise sous pression de l'enceinte, on 25 visse sur l'extrémité 18 de celle-ci un capuchon en acier 17* On peut choisir à volonté le pas des filets du taraudage, ce dernier devant être assez profond pour résister aux pressions internes prévues. Le pas des filets est régi par la nature des moyens à utiliser pour déplacer angulairement le capuchon sur l'enceinte 30 pendant pré-compression. Des filets prévus à raison de sept par 25 mm se révèlent convenables pour association à une clé de torsion présentant un bras de levier.de 45 cm de long. Une bille d'acier 19 joue le rôle d'antifriction entre le capuchon 17 et le piston 14. Le capuchon et le piston présentent 35 tous deux-comme représentés des dépressions sphériques offrant à la bille un meilleur appui. Un tel agencement permet de déplacer le piston en ligne droite, en vissant le capuchon en acier, sans lui appliquer de couple notable. Pour pouvoir retirer aisément le piston, on peut y ménager un taraudage 20 destiné à recevoir un 40 organe d'extraction (non représenté). 69 25209 12 2070057 Le manomètre 13 représenté sur la figure fournit des renseignements assez précis sur la pré-compression et sur la pression finale, mais il n'est nécessaire que pour des vérifications inta> médiaires et l'on peut faire refermer hermétiquement l'extrémité 5 de l'enceinte qui le porte sur la figure par un indicateur de pression-limite (par exemple piston à repères colorés) ou le supprimer complètement. On peut alors se contenter d'ajuster avec précision la capacité de l'enceinte et le pas du taraudage et de porter à l'extérieur du capuchon et de l'enceinte des repères per-10 mettant à l'opérateur de déterminer la pression intérieure d'après la position angulaire du capuchon. Ainsi, pour une enceinte ayant la capacité voulue pour contenir environ 57 cl de sang et comportant un piston d'un diamètre de 19 mm, il faut que le piston décrive, à 4°C, une course d'environ 32 mm pour appliquer une pré- O 15 compression de 2,8 kg/mm . On peut donc porter sur le capuchon et sur l'enceinte des repères établis d'après la relation liant, à 4°C, la course du piston à la pression. Bien entendu, il faut prévoir, entre les trous 11 et 12 et le niveau où s'amorce;: l'évase-ment du tronçon 21 de l'enceinte, une distance suffisante pour 20 que le piston puisse décrire la course correspondant à la plus grande compression à appliquer éventuellement. Le sang prélevé sur le donneur peut passer dans l'enceinte (préalablement stérilisée) soit directement, soit indirectement par l'intermédiaire d'un réseau fermé, en matière plastique. Ce 25 réseau ou l'en®einte, suivant le cas, contient une dose suffisante d'anticoagulant. Quand on utilise de l'anticoagulant ACD (citrate trisodique, dextrose, acide citrique), la dose est de 15 ml d'anticoagulant par 100 ml de sang. Pour l'anticoagulant GPD plus récent (citrate trisodique, acide citrique, phosphate de sodium 30 monobasique, dextrose), sans doute préférable, la dose est de14ml par 100 ml de sang. Dans les deux cas, pour introduire le sang dans-l'enceinte, on fait reculer le piston jusqu'à démasquer les trous d'accès. On donneàl'enceinte une inclinaison de 4-5 à 60p, les deux trous étant contenus dans un même plan vertical, et l'on 35 introduit le sang par le trou inférieur jusqu'à ce que l'enceinte soit complètement remplie, (ce que signale la:présence de sang visible par le trou supérieur). On ramène alors le piston contre le sang et l'on visse le capuchon sur l'enveloppe. On ramène aussi rapidement que possible 40 la température de l'enceinte à 4°C. Il faut assurer très vite ce 69 25209 13 2070057 refroidissement, à l'aide d'un bain à température constante dans lequel on plonge l'enceinte. A mesure que la température régnant dans l'enceinte baisse, le sang se contracte. Le piston se meut librement vers l'intérieur de l'enceinte et demeure donc en con-5 tact avec le sang. Quand la température de l'enceinte et du sang s'est stabilisée à 4°C, on fait tourner le capuchon en acier, par exemple jusqu'à imprimer au sang une pré-compression de 4,1 kg/mê Cette pré-compression réduit à peu près le volume de 3,4 %. A cette température et sous cette pression, on constate que l'ac-10 croissement net de volume de l'enceinte est inférieur à 0,1 %.Cet accroissement de volume résulte de la contrainte qu'engendre la pression appliquée, diminuée de la contraction due au refroidissement à 4°C. On applique la pré-compression prescrite de manière contrô- 2 15 lée, de préférence à raison de 0,7 kg/mm ou moins par minute. On augmente la pression de manière aussi linéaire que possible pour éviter des variations de pression transitoires qui rompraient les membranes du fait que le globule serait inapte à maintenir l'équilibre. On peut rendre la hausse de pression linéaire en déplaçant 20 le capuchon à vitesse angulaire sensiblement constante. On constat qu'on peut obtenir ce résultat avec une précision convenable en agissant à la main à l'aide d'une clé de torsion. Après l'avoir mis sous pression de 4,1 kg/mm , on ramène l'enceinte à -13°C dans un bain contrôlé. On rend encore la modi-25 fication de température aussi rapide que possible, mais en prenant cette fois une précaution : la variation de température ne doit pas être assez rapide pour que la tendance du sang à se dilater fasse monter la pression à une vitesse dépassant celle qui 2 provoque la rupture des membranes (une vitesse de 0,7 kg/mm se 30 révèle satisfaisante). Le diagramme montre que la température de -14°C est la température de sûreté minimale sous la pression choisie; Ainsi, la température de -13°C est assez intérieure au domaine de sécurité, tout en étant aussi faible que possible pour ralentir le métabolisme. On emmagasine alors le sang à cette tem-35 pérature. Lorsqu'on doit utiliser le sang, on procède à l'inverse. On ramène la température à 4°C, puis on supprime la pré-compression, 2 encore de préférence à raison d'environ 0,7 kg/mm par minute et assez régulièrement pour éviter les effets fâcheux des variations 40 de pression transitoires. A l'essai, du sang emmagasiné suivant 69 25209 14 2070057 l'invention pendant des temps atteignant six mois se révèle trans-fusable et donne, à l'essai à l'hématocrite, à l'essai de fragilité osmotique et à tous les essais destinés à déterminer la viabilité des hématies, des résultats comparables à ceux obtenus sur 5 du sang conservé par technique classique à 4°C pendant plusieurs jours. Jusqu'à présent* on n'a pas opéré d'essai après plus de six mois, mais des principes courants d'extrapolation permettent raisonnablement de penser que le sang demeurerait encore transfu-sable au bout de plusieurs années d'emmagasinage. 10 On constate qu'on améliore beaucoup le temps de conservation, de substances biologiques en ramenant la température en deçà du point de congélation après pré-compression, mais aussi qu'en soi, i la pré-compression prolonge notablement le temps de conservation de. substances biologiques telles que sang total. Ce résultat s'ex-15 plique apparemment par un ralentissement du métabolisme des substances conservées résultant du tassement des parois des globules. On peut ensuite emmagasiner les substances biologiques à température classique (par exemple de 4°C). Dans ce cas, on peut appliquer la pré-compression soit en tant que stade intermédiaire, en 20 comprimant la substance biologique, puis en la décomprimant (au bout d'un temps d'une seconde à plusieurs heures) avant .d'emmagasiner la substance, soit en variante en maintenant la pré-compression pendant la totalité de l'emmagasinage. Bien qu'on se soit référé pour décrire l'invention à un^appa-25 reil particulier et à une substance biologique donnée, il est clair que cette description n'est donnée qu'à titre d'exemple et est dépourvue de tout caractère limitatif. Par exemple, le technicien verra d'emblée, d'après l'exposé ci-dessus, que de nombreuses autres substances biologiques ont une forte teneur en eau 30 ou comportent comme constituant principal un liquide à point de congélation supérieur ou approximativement égal à la température d'emmagasinage désirée. On peut appliquer dans de tels,cas le procédé suivant l'invention sous réserve de modifier la relation pré-compression-température d'emmagasinage selon la nature de la 35 substance (et de celle du liquide de conservation éventuellement ajouté). 69 25209 15 2070057 REVENDICATIONS 1. Procédé pour la conservation de substance biologique telle que sang total, caractérisé en ce qu'on pré-comprime ladite substance sous une pression qui est fonction d'une température déter- 5 minée à atteindre pendant mise en oeuvre et en ce qu'on ramène ladite substance à la température d'emmagasinage finale en lui conservant un volume sensiblement constant. 2. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que la pré-compression de la substance s'opère en plusieurs stades, 10 chaque température déterminée étant inférieure à la précédente et la dernière température déterminée étant celle d'emmagasinage. 3. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que la température déterminée est la température finale d'emmagasinaga 4. Procédé de conservation de sang, caractérisé en ce qu'on 15 ramène la température du sang entre O et -21°C en maintenant le sang dans un état liquide stable. 5. Procédé selon la revendication 4, caractérisé en ce qu'on maintient le sang à l'état liquide stable en le pré-comprimant sous une pression supérieure à celle qui permettrait sa congéla- 20 tion à la température réduite choisie. 6. Procédé de conservation de sang total, caractérisé en ce qu'on pré-comprime le sang sous une pression qui dépend d'une température déterminée à atteindre pendant mise en oeuvre et en ce qu'on ramène le sang à la température finale d'emmagasinage en 25 lui conservant un volume sensiblement constant. 7. Procédé de conservation de sang selon la revendication 6, caractérisé en ce que la pré-compression s'opère en plusieurs stades, chaque température déterminée étant inférieure à la précédente et la dernière température déterminée étant celle d'emma- 30 gasinage. 8. Procédé de conservation de sang selon la revendication 6, caractérisé en ce que ladite température déterminée est la température finale d'emmagasinage. 9. Procédé de conservation de sang selon la revendication 6 35 ou 7, caractérisé en ce que la pression de pré-compression est ^ p r comprise entre 0,01 et 8,4 kg/mm et en ce que la température d'emmagasinage finale est comprise entre +3 et -21°C. 10. Procédé de conservation de sang, caractérisé en ce qu'on 69 25209 16 2070057 introduit le sang dans une enceinte stérile, apte à résister à p line pression intérieure choisie pouvant atteindre 25 kg/mm et à des températures variant entre 4 et -21°C sans que son. volume change sensiblement, en ce qu'on pré-comprime le sang contenu O 5 dans cette enceinte sous une pression de 0,01 à 8,4 kg/mm et en ce qu'on ramène ladite enceinte et le sang qu'elle contient à une température finale d'emmagasinage comprise entre +3 et -21°G, choisie de manière à minimiser l'hémolyse des globules rouges sous la pression d'emmagasinage. 10 11. Procédé selon la revendication 10, caractérisé en ce que o ladite pré-compression est comprise entre 2,8 et 4,2 kg/mm , en ce qu'elle est appliquée en un seul stade à une température dépas- i sant 0°0 et en ce que la température d'emmagasinage finale est de -6 à —14°C. 15 12. Procédé de conservation de substances biologiques telles que sang total, caractérisé en ce qu'il comprend la pré-compression de la substance sous une pression comprise entre 0,01 et 8,4 2 kg/mm , la pression croissant à une vitesse assez faible pour éviter des variations de pression transitoires nocives, en ce qu'on 20 maintient cette pression pendant au moins une seconde, puis en ce qu'on emmagasine la substance à une température déterminée. 13. Procédé selon la revendication 12, caractérisé en ce qu'on opère à un stadè intermédiaire une décompression à une vitesse assez faible pour éviter des variations de pression transi- 25 toires nocives avant d'emmagasiner la sub&tance biologique. 14. Enceinte d'emmagasinage de sang, caractérisée en ce qu' elle comprend une enveloppe en un matériau ayant un module d'élasticité, une limite élastique, un coefficient de dilatation thermique et une épaisseur lui permettant de résister à une pression 30 intérieure choisie, pouvant atteindre 25 kg/mm , et à des températures variant entre 4°C et -21°C sans subir de modification de volume sensible, cette enveloppe définissant une cavité d'emmagasinage de sang, un piston pouvant pénétrer hermétiquement à cou-lissement dans cette cavité et un moyen à effet de levier permet- 35 tant d'enfoncer à force le piston dans la cavité pour accroître la pression régnant dans cette dernière, la surface du piston et la face inférieure de l'enveloppe qui définit la cavité étant en un matériau inerte vis-à-vis du sang. 15» Enceinte selon la revendication 14, caractérisée en ce 40 que ladite cavité a un volume d'environ 500 ml et en ce que ledit 69 25209 17 2070057 matériau est du nickel. 16. Enceinte d'emmagasinage de sang, caractérisée en ce qu' elle comprend une enveloppe en un matériau ayant un module d'élasticité, une limite élastique, un coefficient de dilatation ther-5 mique et une épaisseur lui permettant de résister à une pression intérieure choisie, pouvant atteindre 25 kg/mm2, et à des températures variant entre +4 et —21°C sans subir de changement de volume sensible, cette enveloppe présentant une cavité d'emmagasinage de sang et comportant un tronçon tubulaire qui communique 10 avec cette cavité, un piston agencé pour se rapprocher et s'écarter à coulissement, de manière étanche, de ladite cavité dans ledit tronçon tubulaire et un capuchon vissé sur l'extrémité du tronçon tubulaire de l'enveloppe pour enfoncer le piston vers l'intérieur de la cavité. 15 17* Enceinte d'emmagasinage de sang selon la revendication 16, caractérisée en ce qu'elle comprend encore une bille interposée entre le piston et le capuchon pour réduire le frottement qui s'exerce entre eux. 18. Enceinte d'emmagasinage de sang selon la revendication 20 16 ou 17, caractérisée en ce qu'elle comprend encore un moyen de communication avec l'intérieur de la cavité. 19. Enceinte pour l'emmagasinage de sang selon la revendication 18, caractérisée en ce que ledit moyen de communication comporte deux trous, percés dans ledit tronçon tubulaire, qui éta- 25 blissent une communication avec l'intérieur avec ladite cavité quand le piston est écarté de cette cavité et qui sont refermés hermétiquement par ce piston quand celui-ci s'enfonce vers ladite cavité. 20. Enceinte d'emmagasinage de sang selon la- revendication 30 16, 17, 18 ou 19, caractérisée en ce que le piston comprend au moins un joint d'étanchéité, logé dans une rainure annulaire qu'il présente, assurant 1'étanchéité statique et dynamique entre le piston et ledit tronçon tubulaire de l'enceinte. 21. Enceinte d'emmagasinage de sang selon la revendication 35 20, caractérisée en ce que ledit joint comprend un tore en caoutchouc et une bague en "Téflon" entourant ce tore. 22. Sang total transfusable ou produit biologique conservé à l'état liquide pendant au moins trois mois par procédé selon les revendications 1 à 13«