FR 2085715 A1 19711231 FR 7108969 A 19710315 71 08969 i. 2085715 La présente invention se rapporte à de nouveaux peptides de corticotropine ayant un acide a-aminoisobutyrique comme reste d'aminoacide sur la partie terminale azotée à la place du reste de sérine dans la corticotropine naturelle, à leurs dérivés, à 5 leurs sels non toxiques d'addition avec les acides, aux intermédiaires de ces composés et à leurs complexes. Les peptides diacide 1-a-aminoisobutyrique]-corticotropine préparés par la présente invention sont utiles comme médicaments, parce qu'ils présentent des activités biologiques marquées telles qu'une activité de sti-10 mulation surrénale, une activité de stimulation de mélanocytes et une activité lipotrope. Au cours d'études sur les peptides de corticotropine, la demanderesse a découvert que le remplacement sur la partie terminale azotée par de l'acide a-aminoisobutyrique dans un peptide de 15 corticotropine améliore grandement ses propriétés biologiques et entraîne un renforcement de la puissance et de la prolongation de l'action. On a également découvert que ces propriétés améliorées sont dues à la diminution de sensibilité du peptide d'[acide 1-a-aminoisobutyrique]-corticotropine vis-à-vis de l'action de l'amino-20 peptidase intracellulaire. La présente invention est basée sur ces observations. Selon la présente invention, les peptides d'[acide 1-a-aminoisobutyrique]-corticotropine peuvent être préparés en condensant les aminoacides ensemble un par un, ou en condensant les 25 petits fragments de peptide ensemble d'une manière classique en soi. Plus particulièrement, ils peuvent être préparés (a) en faisant réagir un ester d'aminoacide ou un ester de peptide ayant un groupe aminé libre avec un autre aminoacide ou un autre peptide ayant un ou plusieurs groupes aminés protégés, en présence d'un 30 agent de condensation, ou (b) en faisant réagir un aminoacide ou un peptide ayant un groupe aminé libre et un ou plusieurs groupes carboxyliques protégés ou non protégés avec un autre aminoacide ou un autre peptide ayant un groupe carboxylique activé et vin ou plusieurs groupes aminés protégés, ou (c) en faisant réagir m 35 aminoacide ou un peptide ayant un groupe carboxylique libre et un ou plusieurs groupes aminés protégés avec un autre aminoacide ou lin autre peptide ayant un groupe aminé activé et un ou plusieurs groupes carboxyliques protégés, et en retirant les groupes de protection à partir du peptide protégé résultant par hydrogénolyse, 40 acidolyse, hydrolyse, hy 71 08969 S. 2085715 l'ammoniac liquide ou par d'autres moyens. Les liaisons de peptide sont formées par les procédés ordinaires. Des exemples de ces procédés sont le procédé à l'a-zothydrure, le procédé à la dicyclohexylcarbodiimide, le procédé 5 au carbonyldiimidazole, le procédé à l'anhydride mixte, le procédé à l'ester activé (par exemple le procédé à l'ester p-nitrophé-nylique, le procédé à l'ester de N-hydroxysuccinimide,le procédé & l'ester cyanométhylique, le procédé au thiolester p-nitrophény-lique, le procédé à l'ester pentachlorophényliqueX le procédé à 10 l'isoxazolium, le procédé au N-carboxyanhydride, le procédé au pyrophosphite de tétraéthyle, le procédé au chlorophosphite d'é-thyle, un procédé utilisant une combinaison des procédés précédents, ainsi que les procédés ordinairement utilisés dans la technique. Les peptides désirés sont également préparés par la syn~ 15 thèse des peptides dite en phase solide. Bien que les procédés mentionnés ci-dessus puissent être eœployés pour la format!or. de n'importe quelle liaison de peptide dans la préparation du présent peptide de corticotropine, les procédés les plus couramment pratiqués sont le procédé à la dicyclohexylcarbodiimide, le procédé 20 à l'azothydrure, le procédé à l'anhydride mixte et le procédé à l'ester activé. Dans la production des peptides d'[acide 1-a-aminoisobutyrique] -corticotropine, tous les groupes fonctionnels libres ne participant pas à la réaction sont avantageusement protégés, spé-25 cialement par des groupes qui peuvent être facilement retirés par hydrogénolyse, acidolyse, hydrazinolyse, hydrolyse ou réduction par le sodium dans l'ammoniac liquide. Le groupe carboxyle est a-vantageusement protégé par estérification, par exemple avec un alcanol inférieur (par exemple le méthanol, l'éthanol, le propa-30 nol, l'isopropanol, le t-butanol) ou par un aralcanol (par exemple l'alcool benzylique, l'alcool p-nitrobextzy 1 ique, l'alcool p-méthoxybenzylique) ou par formation d'amide. Ces groupes de protection du groupe carboxyle sont introduits par les procédés ordinaires . 35 Le groupe aminé est de préférence protégé en introdui sant un groupe tel que le groupe t-butyloxycarbonyle, le groupe t-amyloxycarbonyle, le groupe o-nitrophénylsulfényle, le groupe 2-(p-diphényl)-isopropyloxycarbonyle, le groupe benzyloxycarbony-le, le groupe p-ni trobenzyloxyc arbonyi e, le groupe p-méthoxyben-40 zyloxycarbonyle, le groupe tosyle* le groupe formyle ou le groupe 71 08969 3. 2085715 trityle, d'une manière classique. Pour la protection du groupe guanidyle de l'arginine, on utilise de préférence le groupe nitro, le groupe tosyle ou le groupe adamantyloxycarbonyle, mais la protection du groupe guanidyle n'est pas toujours nécessaire. Le 5 groupeco-amino de la lysine ou de l'ornithine est avantageusement protégé par des groupes de protection du groupe amino tels que ceux mentionnés ci-dessus. Le groupecarboxyle de l'acide glu-tâmique ou de l'acide aspartique est de préférence protégé par des groupes de protection du groupe carboxyle tels que mentionnés 10 ci-dessus, et le groupe imidazole de l'histidine peut être protégé par le groupe tosyle, le groupe benzyloxycarbonyle, le groupe benzyle ou analogues. En outre, le groupe hydroxyle de la sérine ou de la tyrosine peut être protégé par le groupe acétyle, le groupe benzyle ou le groupe t-butyle, mais cette protection n'est 15 pas toujours nécessaire. Le peptide d'[acide l-a-aminoisobutyrique]-corticotropi-ne selon la présente invention contient généralement les restes des aminoacides 1-16 à 1-39, spécialement les restes d'aminoacides 1-18 à 1-27, de la molécule de corticotropine. En plus de la subs-20 titution sur la partie terminale aminée, certains autres restes d'aminoacides de la séquence peuvent être encore remplacés par d'autres aminoacides différents, sans dégrader sensiblement l'activité corticotrope. Par exemple, le quatrième aminoacide, la mé-thionine, peut être remplacé par la norvaline, la norleucine, la 25 leucine, ou l'acide a-aminobutyrique j le cinquième aminoacide, l'acide glutamique, peut être remplacé par la glutamine j le quinzième et/ou le seizième aminoacides la lysine, peuvent être remplacés par l'ornithine ; le dix-septième et/ou le dix-huitième aminoacides, l'arginine, peuvent être remplacés par la lysine ou 30 l'ornithine, et/ou le vingt-cinquième aminoacide, l'acide aspartique, peut être remplacé par la valine. Parmi les peptides de corticotropine de la présente invention, on préfère spécialement ceux représentés par la formule générale (I) : a-aminoisobutyryl-L-tyrosyl-L-séryl-A-B-L-histidyl-35 L-phénylalanyl-L-arginyl-L-tryptophyl-glycyl-L-lysyl-L-propyl-L-valyl-glycyl-C-D-E-F, où A est le reste de L-méthionine, le reste de L-norvaline, le reste de L-norleucine, le reste de L-leucine ou le reste d'acide a-aminobutyrique j B est le reste d'acide L-glutamique ou le reste de L-glutamine ; C et D représentent cha-40 cun le reste de L-lysine ou le reste de L-ornithine ; E est le 71 08969 4" 2005715 reste de L-arginine, le reste de L-lysine ou le reste de L-orni-thine ; et F est le reste de L-arginine, le reste de L-arginyl-L-proline, le reste de L-arginyl-L-prolyl-L-valine, le reste de L-arginyl-L-prolyl-L-valyl-L-lysine, le reste de L-arginyl-L-prolyl-5 L-valyl-L-lysyl-L-valine, et le reste de L-arginyl-L-prclyl-L- valyl-L-lysyl-L-valyl-L-tyrosine, le reste de L-arginyl~L-prol/l-L-valyl-L-lysyl-L-valyl-L-tyrosyl-L-proline, le reste d'acide L-arginyl-L-prolyl-L-valyl-L-lysyl-L-valyl-L-tyrosyl-L-prolyl-L-aspartique, le reste de L-arginyl-L-prolyl-L-valyl-L-lysyl-L-valyl-10 L-tyrosyl-I-prolyl-L-valine, le reste de L-arginyl-L-prolyl-L- valyl-L-lysyl-L-valyl-L-tyrosyl-L-prolyl-L-aspartyl-L-al&nine, le reste de L-arginyl-L-prolyl-L-valyl-L-lysyl-L-valyl-L-tyrosyl-L-prolyl-L-aspartyl-L-alanyl-glycine, le reste de L-arginyl-L-pro-lyl-L-valyl-L-lysyl-L-valyl-L-tyrosyl-L-prolyl-L-aspartyl-glycyl-15 L-acide glutamique, le reste de L-arginyl-L-prolyl-L-valyl-L-lysyl-L-valyl-L-tyros.yl-L-prolyl-L-alanyl-glycyl-L-acide glutamique, le reste de L-arginyl-L-prolyl-L-valyl-L-lysyl-L-valyl-L-tyrosyl-L-prolyl-L-aspartyl-glycyl-L-acide glutamique, le reste de L-argi-nyl-L-prolyl-L-valyl-L-lysyl-L-valyl-L-tyrosyl-L-prolyl-L-aspar-20 tyl-glycyl-L-alanine, les amides correspondantes ou les esters correspondants. Le peptide (i) peut être préparé par réaction d'un ester d'aminoacide ou d'un ester de peptide ayant un groupe aminé libre avec un autre aminoacide ou un autre peptide ayant un ou plusieurs 25 groupes aminés protégés, en présence d'un agent de condensation, ou en faisant réagir un aminoacide ou un peptide ayant un groupe aminé libre et un ou plusieurs groupes carboxyliques protégés ou non protégés avec un autre aminoacide ou un autre peptide ayant un groupe carboxylique activé et un ou plusieurs groupes aminés 30 protégés, ou en faisant réagir un aminoacide ou un peptide ayant un groupe carboxylique et un ou plusieurs groupes aminés protégés avec un autre aminoacide ou un autre peptide ayant un groupe aminé activé et un ou plusieurs groupes carboxyliques protégés, dans l'ordre de la séquence d'aminoacides, tel qu'indiqué ci-dessus. 35 La réaction de couplage final pour produire le peptide (i) est réalisée, par exemple,en condensant un décapeptide protégé ayant la formule : R^-a-aminoisobutyryl-O-R^-L-tyrosyl-L-séryl-A-ff-R^-L-glutamyl-L-histidyl-L-phénylalanyl-L-arginyl-L-trypto-phylglycine dans laquelle R^ est un groupe de protection du grou-40 pe aminé ; R^ est un groupe de protection du groupe hydroxyle ; BAD ORIGINAL 71 08969 5. 2085715 est un groupe de protection du groupe carboxyle et A est tel que défini ci-dessus* avec un peptide protégé ayant la formule : M£-R^-L-lysyl-L-prolyl-L-valyl-glycyl-N'°-Rç--C-No5-Rg-D-E' -F ' dans laquelle R^, R_ et représentent chacun un groupe de protection 5 du groupe aminé j E1 est un reste de L-arginine, de L-lysine ou de L-ornithine protégé ou non protégé, et F' est un reste d'aminoacide ou un reste de peptide protégé ou non protégé, tel que défini ci-dessus, dans un solvant inerte, à line température de -20 *C à 60°C pendant environ 2 heures à 7 jours, et en retirant les 10 groupes de protection du peptide protégé résultant ayant la formule : R^-a-aminoisobutyryl-O-Rg-L-tyrosyl-L-séryl-A-if-R^-L-glutamyl-L-histidyl-L-phénylalanyl-L-arginyl-L-tryptophyl-glycyl-Mg-R^-L-lysyl-L-prolyl-L-valyl-glycyl-N^-R^C-N^-Rg-D-E'-F'où R-^ R2, Ry Rjj.» R5» r6* a» c* e* efc F' soiafc chacun tels que définis ci-des-15 sus, d'une manière classique en soi, à une température d'environ -20°C à 60°C, pendant environ 30 minutes à 24 heures. Les solvants inertes sont la diméthylformamiclej le diméthylsuifoxyde, le dioxa-ne, l'hexaméthylphosphorotriamide, une solution aqueuse de ces solvants et un mélange de ces produits. 20 Les procédés préférés pour la préparation de l'octadécapep- tide, du tétracosapeptide et de l'heptaoosapeptide sont présentés dans les graphiques I, II et III. Bzl GRAPHIQUE I » Préparation de l'ootadéoa- BOC-Tyr-ONP + H-Ser-OMe peptide Bai | BOC-Tyr.Ser-OMe I HCl/AcOH Bfl l Z-Ibu-OH + H-Tyr.Ser-OMe OBzl BOC-Glu-ONP + H-Hia.Phe.Arg.Trp.Gly-OH 0Bzl | BOC-Glu.His.Phe.Arg.Trp.Gly-OH OBzl OïLCOOH 5 Bzl Z-Ibu.Tyr." BOC-Met-ONP + H-dlu.His.Phe.Arg.Trp.Gly-' OH DCC Ser-OMe nh2nh2 OBzl BOC-Met.Glu.His.Phe.Arg.Trp.Gly-OH Bzl ] Z-Ibu.Tyr. Ser-NH5IH,} HNO, Bzl ' CK-COOH 3 Z-Ibu. Tyr. Seir-N^ + H-Met.Glu.His.Ph». Arg.tfrp.Gly-OH Bzl OBzl Z-Ibu.Tyr,Se-.Meb.C:su.His..Hu î accf iosu BOO BOO Bzl ÇBzl I BOC I- ! « J | Z- Ibu. Ty r. Se r. Me t. C .i.u. K i a.. Fhé , Areî. vp. i ; ly - 0 Su + H-Ly s.Pro.Val. Gly - Ly s. I.v 3. A,rg. Arg-Sïïg Bzl OBzl bcc BOC B(j)C Z-Ibu.Tyr.Ser.Met.dlû.His.Phe.Arg.Trp.Gly.L^s.Pro.Val.Gly.Lys.Lys.Arg.Arg- •NH„ 1 HP H-Ibu.Tyr.Ser. Me t.Glu. His. Ph ! o 1 00 £ f \ o ' 00 . en ; -J C.n Q GRAPHIQUE II : Préparation du tétracosapeptide Bzl (jfflzl Z-Ibu.Tyr.Se r.Met.Glu.His. Phe. Arg.. Trp. Gly-OH OBzl DCC, HOStt NO, no2 Z-Arg-OH + H-Pro-OMe DCC N|2 Z-Arg.Pro-OMe HBr/CH^GOOK Z-Val.Tyr-N^ + H-Pro-OMe NO, boc I 2 |2j, Z-Arg-OH + H-Arg.Pro-OMe M.A. NO- NO I2., I2 Z-Arg.Arg.Pro-OMe 1 HBr/CH,COOH N0o N0„ ■> 12 |2 boc Z-Val.Tyr.Pro-OMe H2/Pd Z-Lys-OH + H-Arg.Arg.Pro-OMe I M.A. BOC NO„ NO_ J I2 I2 Z-Lys.Arg.Arg.Pro-OMe OH" "BOC N0o NO„ I 12 12 Z-Lys-OH + H-Val.Tyr.Pro-OMe DCC BOC I " Z-Lys.Val.Tyr.Pro-OMe H /Pd B0C\. Z-Val-OH + H-Lys.Val.Tyr.Pro-OMe DCC BOC Z-Val. Lys. Val. Tyr .'Pro-OMe H /Pd BOC ,, * Z-Lys.Arg.Arg.Pro-OH + H-Val.Lys.Val.Tyr.Pro-OMe ! DCC, HOSu BOC NO_ N0„ BOC I I2 I2 I Z-Ly s. Arg'. Arg. Pro. Val. Ly s. Val. Tyr. Pro-OMe H„/Pd BOC BOC' BOC BOC I II I Z-Lys.Pro.Val.Gly.Lys-N^ + H-Lys.Arg.Arg.Pro.Val.Ly s.Val.Tyr.Pro-OMe BOC B®C BOC BOC Z-Lys.Pro.Val.Gly.Lys.Lya.Arg.Arg.Pro.Val.Lya.Val.Tyr.Pro-OMe Bzl' Z-Ibu.Tyr.Ser.Me t.Glu.His.Phe.Arg.Trp.Gly-OSu Bzl BOC I H./Pd BOC BOC BOC H-Lys.Pro.Val.Gly.Lys.Lys.Arg.Arg.Pro.Val.Lya.Val.Tyr.Pro-OMe BOC BOC B(j>C BOC Z-Ibu.Tyr.Ser.Met.Glu.His.Phe.Arg.Trp.Gly.Lys.Pro.Val.Gly.Lys.Lys.Arg.Arg.Pro.Val.Lys.Val.Tyr.Pro-OMe !"r H-Ibu.Tyr.Ser.Met.Glu.His.Phe.Arg.Trp.Gly.Lys.Pro.Val.Gly.Lys.Lys.Arg.Arg.Pro.Val.Lys.Val.Tyr.Pro-OMe OBzl 1 O co kO cr» sO x> o co en en GRAPHIQUE IÎI t no2 Préparation de l'heptaooaa- z-Arg-OH + H-Pro-OMe peptldi DCC N?2 Z-Arg.Pro-OMe . » HBr/AoOII N?2 NP2„ Z-Arg-OH + H-ArgTPro-OMe NO_ NC M.A. 'Pro-OMe T2 "k. t-Arg.Arg.*' [HBr/AcOH BOC N02 NO* Z-Lya-OH + H-Arg.Arg.Pro-OMe M.A. .w, NO-I |2v j2 Z-Lys.Arg.Arg.Pro-OMe OH" BOC KO, BOC NO_ NO_i I 12 ' I2* Z-Lya.Arg.Arg.Pro-OH OBu Z-Ala.Gly-OBu H_/Pd Z-Asp-OH + H-Ala.Gly-OBu . DCC OBu Z-Asp. Ala. Gly-OBu1" OBu H-/Pd Z-Pro-OH + H-Àsp.Ala.Gly-OBu^ + DCC OBu* Z-Pro.Asp.Ala.Gly-OBu1" OBu1 H /Pd Z-Tyr-ONP + H-Pro.Aap.Ala.Gly-OBu J^OBu" z Z-Tyr. Pro. J^sp. Ala. Gly-OBu1" OB Bu Hg/Pd Z-Val-ONP + H-Tyr.Pro.Asp.Ala.Gly-OBu .t 1 .OBu"6 t S Z-Val.Tyr.Pro.As p .Ala.Gly-OBu H2/Pd \- Bpc \ ' OBu" Z-Lys-ONP + H-Val. Tyr.Pro.Asp.Ala.Gly-OBu1" BfO | OBu" Z-Lys. Val. Tyr. Pro. Asp. Ala. Gly-OBu1" BOC OBu" Z-Val-ONP + H-Lya.Val.Tyr.Pro.Aap.Ala.Gly-OBu^ BOC ] OBu"6 Z-Val.Lys.Val.Tyr.Pro.Àsp.Ala.Gly-OBu^ BOC NO. NO-I J2 J2 BOC I H2/Pd t d OBu Z-Lya.Arg.Arg.Pro»OH + H-Val.Lys.Val.Tyr.Pro.A3p.Ala.Gly-OBu O OO -o o *0 DCC, HOSu . BOC OBu Z-Lya. Arg. Arg. Pro. Val. lys. Val. -yr. ?ro « Asp. 'Als. Gly-OBu^ B.OC NO? N0_ i 2 12 BOC I H«/Pd OBu .\ .t Bzl Z~Ibu.Tyr. Bzl Z-Ibu.Tyr. Bzl Ser. Met. Glu. HisPhe. Arg. Trp. Gly-OH DCC, HOSu Bzl I BOC BOC BOC Z-Lys.Pro.V&l.Gly.ïjys-N^ + H-Ly3.Arg.Arg.Pr0.Val.Lyn.Val.Tyr.Pr0 Asp.Ala.Gly-OBu BOC BOC BOC BOC OBu^ Z-Lys. Pi- a. Val. Oly. Lys .Lys. Arg. Arg .Pro «V al .Ala. Gly-QB»* H2/Pd BOC BOC BOC I , I J vo; BOC I o;ôut Ser. Me t. Glu. HisIPhe. Arg. Trp. Gly-OSu + H-Lys.Pro.Val.Ûly.Lys.Lys.Arg.Arg.Pro.Val-Lys,Val.ïyr,Pro -Asp. Al a. Gly-OSa*. # Bzl BOC Bpc BOC BOC C^u* s Ser. Me t. Glu «His. Phe. Arg. Trp. Gly. Ly 3. Pro. îfal. Gly. Lys .Lys. is.rg. Arg. Pro. Val. Ly s. Val. Tyr. Pro. Asp. Ala. Gly-OH t KF > H-I bu. Tyr. Ser. Me t. Glu .His , Phe. Arg. Trp. Gly. Lys. Pro. Val. Gly .Lys. Lys» Arg. Arg, Pro. Val. lys. Val. Tyr. Pro. Aap. Ala. Gly-OH | t e Bzl Z-Ibu.Tyr K> O OO Cn "-4 un 71 08969 10. 2085715 Bans les graphiques, les abréviations suivantes sont utilisées : Ibu = reste d'acide a-aminoisobutyrique, Tyr = reste de L-tyrosine, Ser « reste de L-sérine, Met « reste de L-méthionine, Glu = reste d'acide L-g&ïtamique, His =5 reste de L-histidine, Phe = 5 reste de L-phénylalanine, Arg = reste de L-arginine, Trp - reste de L-tryptophane, Gly « reste de glycine. Lys = reste de L-lysiae, Pro « reste de L-proline, Val = reste de L-valine, Asp = reste d'acide L-aspartique, Ala = reste de L-alanine, BOC = t-butyloxyearbo-nyle, Bzl = benzyle, 0Bufc = t-butoxy, j. Comme on l'a présenté dans les graphiques, le procédé préféré implique le couplage du tripeptide contenant les trois premiers aminoacides, c'est-à-dire 1'a-aminoisobutyryl-L-tyrosyl-L-15 sérine, ou du tétrapeptide, c'est-à-dire l,a-&iainoisobutyryl-ïJ- tyrosyl-L-séryl-L-méthionine, avec l'heptapeptide ou l'hexapeptide correspondant à la position 4-10 on 3-10, repenti veulent, de préférence par le procédé à 1 ' azothydmre, et,, de ce fait, le déca-peptide résultant est condensé avec le peptide correspondant eu 20 reste de la molécule, c'est-à-dire l'octapeptide (positions 11-18} dans le cas de la fabrication de le tétradécapepti- de (positions 11-24) dans la cas du tétraeosapeptide et l'bepta-décapeptide (positions 11-27) dans le cas de l'heptacosapeptide. Les autres peptides d*[acide 1-a-aminoisobutyrique]-corticotropine 25 peuvent être préparés de manière semblable en condensant le déca-peptide à partie terminale aminée avec le peptide correspondant à la portion à partie terminale carboxylique. Le décapeptide à partie terminale aminée, le tétrapeptide et le tripeptide sont tous de nouveaux composés qui n'ont jamais 30 été indiqués et sont des intermédiaires utiles pour la synthèse des peptides de corticotropine de la présente invention. Bi'en que le mode opératoire wentlcnné ci-dessus soit le mode opératoire préféré pour la production des présents peptides de corticotropine, il est possible de substituer les groupes de 55 protection, les procédés de couplage ou le procédé d'enlèvement de la protection utilisés ci-dessus à de» équivalents ou k des procédés équivalents, et de changer de manière appropriée les positions et l'ordre de couplage pour les fragments de peptides. Les groupes de protection employés dans la présente inven 40 tion peuvent être retirés par hydrogénolyae* hydrolyse* hydrasino BAD ORDINAL 71 08969 ii. 2085715 lyse, réduction par le sodium dans 1'ammoniac liquide ou par traitement avec un acide tel que l'acide trifluoracétique, l'acide for> nique, un acide halogénhydrique à l'état gazeux (par exemple l'acide chlorhydrique gazeux, l'acide bromhydrique gazeux, l'acide 5 chlorhydrique gazeux), un acide halogénhydrique (par exemple l'acide fluorhydrique, l'acide bromhydrique, l'acide chlorhydrique) ou un mélange de ces produits, d'une manière classique, selon la nature du groupe. Les peptides de corticotropine préparés par la présente 10 invention peuvent être purifiés par des procédés connus en soi, tels que la chromatographie sur colonne avec une résine échangeuse d'ions, une cellulose échangeuse d'ions ou le produit dit Sephadex échangeur d'ions, ou par un procédé de distribution à contre-courant. 15 Les peptides de corticotropine de la présente invention sont produits sous la forme de bases ou de sels d'addition avec les acides, non toxiques et pharmaceutiquement acceptables, selon les conditions réactionnelles utilisées. Egalement, ces sels peuvent être préparés par traitement des peptides avec des acides mi-20 néraux tels qu'un acide halogénhydrique (par exemple l'acide fluorhydrique, l'acide bromhydrique, l'acide chlorhydrique), un acide halogénhydrique gazeux (par exemple l'acide fluorhydrique gazeux, l'acide bromhydrique gazeux, l'acide chlorhydrique gazeux), l'acide sulfurique ou l'acide phosphorique, ou avec des acides orga-25 niques tels que l'acide acétique, l'acide formique, l'acide pro-pionique, l'acide glycolique, l'acide lactique, l'acide pyruvique, l'acide oxalique, l'acide malonique, l'acide succinique, l'acide maléique, l'acide fumarique, l'acide tartrique, l'acide citrique, l'acide benzoîque, l'acide méthanesulfonique, l'acide benzènesul-30 fonique ou l'acide toluènesulfonique, d'une manière classique. Une quantité équimolaire ou un excès de l'acide peut être utilisé pour la formation du sel. Les peptides d'[acide 1-a-aminoisobutyrique]-corticotropine ainsi obtenus présentent des activités biologiques marquées, 35 comprenant une activité de stimulation surrénale, une activité lipotrope et une activité de stimulation de mélanocytes, et ces activités sont supérieures à celles de la corticotropine naturelle et à celles de peptides apparentés, connus auparavant. Des évaluations des activités de stimulation surrénale 40 des présents peptides de corticotropine ont été réalisées selon 71 08969 12. 2085715 cinq procédés différents, en comparant celles de la corticotropine 1 naturelle de mouton (ocs-ACTH) et celles du produit Gly -ACTH(l-l8)-MHg [Bull. Chem. Soc. Japan 4^ 196 (1970)]. L'activité d'épuisement surrénal d'acide ascorbique dans un rat soumis à une hypophyso-5 sectomie a été évaluée par le procédé de United States Pharmaco-peia XVII, 147 (1965). L'activité stéroldogène in vivo par l'administration intraveineuse à un rat ayant subi une hypophysoseetomie a été évaluée par le procédé de Lipscomb et Nelson [Endocrinol., 71 13 (1962)] avec une modification peu importante [A. Tanaka et 10 C.H.Li, Endocrinol. Japonica 1J 180 (1966)]. L'activité stéroldogène in vivo a été également évaluée avec une souris "amorcée" au dexamethasone-pentobarbital [A. Tanaka et N. Nakamura, "Integrati-ve mechanism of neuroendocrine systea", Hokkaido University Médical Library Sériés. 1^ 49 (1968)3» En outre, l'activité stéroldogène 15 par l'administration intramusculaire à un rat ayant subi une hypophysoseetomie a été également déterminée, et, dans ce test, une préparation de peptide a été injectée dans le muscle de la cuisse et on a rassemblé un échantillon de sang provenant de l'aorte abdominale 30 minutes après l'injection. En outre, l'activité stérol-20 dogène, après l'administration intraveineuse à un rat ayant subi une hypophysoseetomie, a été déterminée de manière telle qu'une préparation de peptide a été injectée dans la veine fémorale et qu'on a rassemblé un échantillon de sang provenant de l'aorte abdominale 30 minutes après l'injection. Dans toutes les expériences, 25 on a utilisé comme norme la troisième norme de référence de corticotropine de l'USP et on a déterminé la production de 11-hydroxy-corticostéroldes (11-OHCS) par le procédé fluorophotométrique de Peterson [J. Biol. Chem. 225 25 (1957)]. Pour chaque procédé d'évaluation, on a d'ordinaire réalisé plusieurs déterminations et les 30 données obtenues indépendamment ont été soumises au traitement statistique par le mode opératoire de Sheps et Moore [J. Pharmacol. Extl. Therap. 128 99 (i960)]. Les résultats de ces évaluations sur les présents peptides de corticotropine sont donnés dans le tableau 1, par comparaison avec celles de la corticotropine naturelle (oc -35 ACTH) et d'un peptide de corticotropine connu apparenté Gly -ACTH (I-I8)-NH2. 71 08969 15. 2085715 TABLEAU 1 Activités de stimulation surrénale de peptides de corticotropine synthétiques et de la corticotropine naturelle. 5 Procédé Voie Peptide d'administration I II III Gly1-ACTH (I-I8)-NH2 as-ACTH Epuisement surrénal d' acide ascorbique Sous-cutanée 286 250 - 26 10 Stéroldogénèse in vivo dans : 100 Cannulation surrénale Intraveineuse 480 305 - 151 180 15 Souris ayant un blocage par le dexamethaso-ne-nembutal Intraveineuse 757 360 170 Sang périphérique Intraveineuse 590 380 325 177 Sang périphérique Intramusculaire 495 318 320 50 20 : ^es activités sont exprimées en unité USP/mg par rapport à. la troisième norme de référence de corticotropine USP. I = IBu1-ACTH(l-l8)-NH2, II = IBu1-Orn1^-AClH(1-18)-NHg, III = IBu1-ACTH( 1-27 ) -OH. Tels que présentés dans le tableau 1, les peptides de cor-ticotropine prépaies par la présente invention sont fortement actifs sous n'importe quel aspect concernant les activités de stimulation surrénale. La puissance est plus de deux fois celle de Gly1-ACTH(l-l8)-NH2 et de la corticotropine naturelle, lorsqu'on l'évalue par le procédé d'épuisement surrénal d'acide ascorbique et par le procédé de stéroldogénèse in vivo. En outre, on doit noter que les activités de I, II et III, estimées par les niveaux de 11-hydroxycorticostérolde dans le sang périphérique de rat, ne sont pas modifiées que les peptides soient administrés par voie intraveineuse ou intramusculaire. Cependant, dans Gly^-ACTH(1-18)-NH^ y- le rapport de puissance entre l'administration intramusculaire et l'administration intraveineuse est approximativement 1/3. Ces faits signifient que les peptides d'[acide 1-a-aminoisobutyrique]-corticotropine de la présente invention sont plus résistants à l'action de 1'aminopeptidase dans le tissu que l'analogue renfermant la 1-40 glycine. 71 08969 u. 2085715 Les peptides de corticotropine de la présente invention présentent une activité lipotrope marquée, qui est résumée dans le tableau 2 et comparée à celles de Gly1-ACTH(l-l8)-NH2et de la corticotropine naturelle de mouton (ag-ACTH). 5 TABLEAU 2 Activité lipotrope de peptides de corticotropine synthétiques et de corticotropine naturelle de mouton 10 Animal expérimenté Dose efficace minima (10~6mg/50mg de tissu) I II III jly^-ACTH- (I-I8)-NH2 a.-ACTH -3 Tissu adipeux de rat ..... 0,062 0,086 0,036 6,3 6,0 15 Tissu adipeux de lapin ... 0,47 0,013 0,001 0,35 7,1 NOTE : L'activité lipotrope a été déterminée selon le procédé dé-20 crit par Tanaka et collaborateurs [Arch. Biochem. Biophys. 99 294 (1962)], avec le tissu d'épididyme de rat et le tissu adipeux périrènal de lapin. L'augmentation de la concentration d'acides gras non estérifiés dans le milieu et le tissu est le paramètre. L'activité est exprimée sous for-25 me de la dose efficace minima pour 50 mg de tissu. I = Ibu1-ACTH(l-l8)-NH2, II = Ibu1-0rn15-ACTH(l-l8)-NH2, III « Ibu1-ACTH(l-27)-0H. L'évaluation pour l'activité de stimulation de mélanocytes in vitro des peptides d1[acide l-a-aminoisobutyrique]-corticotropi-20 ne a été réalisée selon le procédé de K. Shizume,A.B. Lerner et T.B. Fitzpatrick [Endocrinol. 54 553 (1954)3, en utilisant des fragments*de peau isolés de grenouilles dites Rana pipiens. Les résultats sont donnés dans le tableau 3» par comparaison avec Gly1-ACTH(l-l8)-NH2et ACTH(l-24)-0H (connu sous la marque déposée Synac-^ then de la Société dite Ciba, Ltd.). Une préparation pure d'hormone naturelle de stimulation d'a-mélanocytes (a -MSH) a été utilisée S comme norme de référence. 71 08969 15. 2085715 TABLEAU 3 Activité in vitro de stimulation de mélanocytes par les peptides de corticotropine synthétiques Composé expérimental Activité d'hormone stimulant les mélanocytes (unités/g) 0,8 x 10 1,1 x 10 1,6 x 10^ J3 10 10 10 2,1 x 10" 6,7 x 10: 8 15 20 Ibu1-ACTH ( 1-18 ) -NHg Ibu1-0rn15-ACTH(l-l8)-NH2 Ibu1-ACTH(l-27)-0H ACTH(1-24)-0H Gly1-ACTH(l-l8)-NH2 L'activité de stimulation de mélanocytes par les présents X — peptides de corticotropine est supérieure à celle de Gly -ACTH(1-18)-NH2 et de ACTH(l-24)-0H. La période (demi-vie) biologique des peptides de corticotropine et de la corticotropine naturelle a été déterminée par 1' activité lipotrope in vitro [A. Tanaka, B.T. Pickering et C.H. Li, Arch. Biochem. Biophys. 22. 294 (1962)] en tant que paramètre. Les résultats sont résumés dans le tableau 4. TABLEAU 4 Période (demi-vie) de corticotropine et de peptides synthétiques apparentés en tant qu'agents lipotropes in vitro Peptide In vivo a) (injection intraveineuse) In vitro incubé avec Plasma Muscle Ibu1-ACTH(l-l8)-NH2 Ibu1-Orn15-ACTH(l-l8)-NH2. Ibu^-ACTH ( 1-27 ) -0H 3,5 ma 6,0 mn 6,5 mn 32,4 mn. 97,6 mn 79*3 mn 122,9 «m 26l,8 mn 91,2 ma. ACTH Gly1-ACTH(1-18) -NH2 4,4 mn 1,9 mn 59,2 mn 30,0 mn 250,9 mn 42,6 mn 25 30 35 40 NOTE : a) Un échantillon de peptide a été injecté par voie intraveineuse dans la partie inférieure de la veine cave des rats, et des échantillons, qui ont été rassemblés à partir de l'aorte abdominale à des intervalles de temps appropriés et ont été acidifiés, ont été évalués pour déterminer l'activité lipotrope in vitro, b) Un échantillon a été dissous dans le plasma frais provenant de rat anesthésié ou dans le tampon au bicarbonate 71 08969 16. 2085715 dit de Krebs-Ringer, contenant des tranches de muscles de la cuisse des rats, de l'albumine de sérum de bovin et du glucose. Ces mélanges ont été alors soumis à l'incubation à 37°C et les prélèvements pris à partir des 5 mélanges à des intervalles de temps appropriés ont été évalués pour déterminer l'activité lipotrope in vitro. Les données indiquées ci-dessus montrent que les périodes (demi-vies) des peptides d'[acide 1-a-aminoisobutyrique]-corticotropine sont presque les mêmes que celles de la corticotropine na-10 turelle et sont bien plus longues que celles de Gly"l-acth(l-l8)-nh2, ce qui montre bien que le remplacement de la partie terminale aminée par l'acide a-aminoisobutyrique dans un peptide de corticotropine améliore grandement ses propriétés biologiques, au point de vue prolongation de l'action et renforcement de la puissance. 15 Les peptides d'[acide 1-a-aminoisobutyrique]-corticotropi ne préparés par la présente invention peuvent être transformés en complexes correspondants avec un métal lourd formant des complexes (par exemple le zinc, le cuivre, le fer, le nickel, le cobalt), un polyaminoacide formant les complexes (par exemple l'acide polyglu-20 tamique, l'acide polyaspartique, la copolyglutamyltyrosine, le co-polyaspartyl-acide glutamique) ou avec un mélange de ces produits. Le complexe présente une excellente propriété de longue durée d' action par rapport au peptide normal. Le complexe de métal lourd peut être préparé en traitant le présent peptide de eortieotropi-25 ne avec un composé de métal lourd, tel qu'un halogénure de métal lourd (par exemple le chlorure de zinc, le chlorure de cuivre, le chlorure de fer, le chlorure de cobalt, le chlorure de nickel), un acétate (par exemple l'acétate de zinc), un sulfate (par exemple le sulfate de zinc) ou un hydroxyde (par exemple l'hydroxyde 30 de zinc), en proportion approximative de 1 : 0,1-100 en poids dans des conditions faiblement acides, de préférence à un pH de 6,5 è 7*0, d'une manière classique. Parmi les métaux lourds, le zinc est celui qu'on préfère. Le complexe de polyaminoacide peut être préparé en traitant le présent peptide de corticotropine avec 35 un polyaminoacide suivant une proportion de 1 : 0,1 - 100 en poids dans des conditions faiblement acides, de préférence à un pH de 6,5 à 7,0, d'une manière classique. Les polyaminoacides utilisés sont des homopolymères ou des copolymères d'aminoacides et ils peuvent avoir la configuration L, la configuration D ou la confi-40 guration DL. Des exemples de polyaminoacides préférés sont l'acide 71 08963 17- 2085715 poly-L-glutamique, l'acide poly-D-glutamique, l'acide poly-DL-glu-tamique, l'acide poly-L-aspartique, l'acide poly-D-aspartique, 1' acide poly-DL-aspartique, la copoly-L-glutarayl-L-tyrosine et le copoly-L-aspartyl-L-acide glutamique. Le poids moléculaire préfé-5 ré du polyaminoacide est approximativement de 1.000 à 100.000, en particulier de 2.000 à 6.000. On préfère utiliser le polyaminoacide qui a été au préalable neutralisé avec un alcali (par exemple la soude). D'autres additifs convenables, tels que des agents de conservation (par exemple l'alcool benzylique, le phénol, le thi-10 mérosal), un tampon (par exemple un citrate, un phosphate, un carbonate) ou un agent de transformation en solution isotonique (par exemple le chlorure de sodium) peuvent être ajoutés à la préparation du complexe. On doit noter que les données expérimentales décrites ei-15 dessus ne sont présentées qu'à titre d'exemples. Puisque les autres composés de la présente invention ainsi que ceux décrits ci-dessus ont presque les mêmes caractéristiques et les mêmes avantages en tant que médicaments, les peptidês d'[acide 1-a-aminoisobutyrique]-corticotropine de la présente invention sont très utiles et avan-20 tageux dans des buts thérapeutiques, par exemple le traitement de rhumatismes articulaires aigus ou chroniques, de maladies dues à l'allergie et de maladies surrénales des êtres humains et des animaux domestiques, ou pour l'expérimentation de la fonction surré-nocorticale. 25 Ainsi, les présents peptides de corticotropine, leurs sels d'addition avec les acides et leurs complexes peuvent être administrés par voie orale ou parentérale sous des formes classiques en soi, par exemple des injections, des liquides, des suspensions, des émulsions ou des aérosols, de manière facultative avec 30 des supports convenables, des stabilisants convenables, des émulsions convenables, des produits convenables de conservation, des tampons convenables, des agents convenables de transformation en produits isotoniques et/ou des agents de mouillage convenables, lorsqu'une quantité active au point de vue thérapeutique de l'in-35 grédient actif est contenue. La dose efficace peut être facilement déterminée par les médecins sur la base des données décrites ici. Par exemple, une gamme typique de doses cliniques des peptides de la présente invention est d*approximativement 0,2 U/kg à 0,8 U/kg pour un adul-40 te normal. Le présent peptide de corticotropine est avantageuse 71 08969 18. 2085715 ment administré sous la forme de dosage d'une injection, et l'administration est répétée aussi souvent que cela est exigé selon les indications du médecin. Les exemples suivants ne sont donnés qu'à titre d'illus-5 tration et non de limitation. EXEMPLE 1 (a) Acide benzyloxycarbonyl-a-amlnolsobutyrlque Dans une solution d'acide a-aminoisobutyrique (5,16 g) et de carbonate de sodium anhydre (5,30 g) dans de la soude N (50 10 ml), on ajoute du chloroformiate de benzyle (9,39 g) à 0°C, et le mélange est agité pendant 3 heures. Le mélange réactionnel est lavé avec de l'éther pour retirer l'excès de produit réagissant, a-cidifié avec de l'acide chlorhydrique 6N et extrait à l'acétate d'éthyle. Les extraits organiques sont combinés, séchés sur du 15 *ulfa.te de sodium et évaporés sous pression réduite pour donner un résidu cristallin, qui est recristallisé dans le mélange acétate d'éthyle-éther de pétrole pour donner 8,75 g du produit désiré, fondant entre 65 et 66°C. Analyse calculée pour C12 H15N04 : C, 60,75 î H, 6,37 * N, 20 5,90. Trouvé : C, 61,04 ; H, 6,36 ; H, 6,07. (b) Acide t-butyloxycarbonyl-a-aminoisobutyrique Dans une solution d'acide a-aminoisobutyrique (4,75 g) et de bicarbonate de sodium (4,25 g)* dans de la soude H (46 ml) et du dioxane (30 ml), on ajoute goutte à goutte une solution dans le 25 dioxane d'azidoformiate de t-butyle (7*25 g), et le mélange est agité entre 40 et 50°C pendant 5 jours. Une quantité supplémentaire d'azidoformiate de t-butyle (6,6 g) et de soude N (46 ml) est introduite et le mélange est agité pendant 2 jours à la même température. Le mélange réactionnel est concentré sous pression ré-30 duite pour retirer le solvant organique. Le concentré est refroidi et acidifié avec de l'acide chlorhydrique 4N, refroidi par de la glace, jusqu'à un pH de 3. La solution est extraite à l'acétate d'éthyle et la solution organique est séchée sur du sulfate de sodium. Après évaporation de la solution, les cristaux résultants 35 sont recristallisés dans l'éther pour donner 0,82 g du produit désiré, fondant entre 119 et 120°C. Analyse calculée pour CgH^NO^ : C, 53*19 î H, 8,43 î M* 6,89. Trouvé : C, 53*64 ; H, 8,39 * N, 7*19- (c) Ester p-nitrophényligue de t-butyloxycarbonyl-O-benzyl-L-ty- 40 rosine 71 08969 19. 2085715 Dans une solution de t-butyloxycarbonyl-O-benzyl-L-tyro-sine (2,97 g) et de p-nitrophénol (1,12 g) dans l'acétate d'éthyle, on ajoute une solution dans l'acétate d'éthyle de m,n'-dieyelo-hexylcarbodiimide (1,65 8) à. 0°C, et le mélange est maintenu à 4°C 5 pendant 3 heures. La dicyclohexylurée séparée est retirée par fil-tration et le filtrat est évaporé sous pression réduite. Le résidu solide résultant est mis en suspension dans de l'éthanol chaud et les cristaux précipités lors du refroidissement sont séparés par filtration, lavés avec de l'éthanol froid et séchés sous pres-10 sion réduite pour donner l'ester actif désiré (3*39 g) fondant entre 140 et l4l°C. [a]|2-0,3±0,4° (c = 0,983, acétate d'éthyle). Analyse calculée pour C27H28N2°7 : 65,84 ; H, 5,73 S N, 5,69. Trouvé : C, 65,93 i H, 5,73 ; N, 5,67. (d) Hydrazlde de benzyloxyearbonyl-a-amlnoisobutyryl-L-tyrosine 15 De l'acide benzyloxycarbony1-a-aminoisobutyrique (1,54 g) et de l'ester méthylique de la L-tyrosine (1,27 g) sont dissous dans de 1'acétonitrile, et, dans la solution, on ajoute une solution de n,n'-dicyclohexylcarbodiimide (1,34 g) dans de l'acétonitrile à 0°C. Le mélange est maintenu à 4°C toute la nuit. La n,m'-20 dicyclohexylurée précipitée est retirée par filtration et le filtrat est évaporé sous pression réduite pour donner un résidu, qui est dissous dans l'acétate d'éthyle. La solution est lavée avec de l'acide chlorhydrique n et du bicarbonate de sodium à 5 sé-25 chée sur du sulfate de sodium et évaporés sous pression réduite pour donner l'ester de dlpeptide sous forme d'un résidu sirupeux. Le résidu est dissous dans l'éthanol (15 ml) et on ajoute de l'hydrate d'hydrazine (0,8 ml). Après que le mélange réactionnel ait été maintenu à la température ambiante pendant 2 jours, de l'eau est ajoutée pour séparer l'hydrazide de dipeptide désiré sous for-30 me de cristaux (2,35 g). La recristallisation dans une solution a-queuse d'éthanol donne le produit désiré, fondant entre 164 et 165 °C.[a]p7-31,4 ± 0,7° (c - 1,078, méthanol). Analyse calculée pour C2iH26N4°5 5 60,86 % H, 6,32 ; N, 13,52. Trouvé : C, 60,95 î H, 6,41 ; N, 13,31. 35 (e) Ester méthylique de t-butyloxycarbonyl-O-benzyl-L-tyrosyl-L-sérine Dans une solution refroidie par de la glace de chlorhydrate d'ester méthylique de L-sérine (1,03 g), dans la diméthylforma-mide (8 ml), on ajoute de la triéthylamine (0,92 ml) et le ehlo-40 rhydrate de triéthylamine séparé est filtré. L'ester p-nitrophé- 71 08969 20. 2085715 nylique de t-butyloxycarbonyl-O-benzyl-L-tyrosine (2,96 g) est a-jouté au filtrat avec un peu de diméthylformamide, et le mélange est maintenu à 4°C pendant 2 jours. Après enlèvement du solvant pendant l'évaporation sous pression réduite à une température de 5 bain de 45 à 50°C, le résidu est dissous dans l'acétate d'éthyle et la solution est lavée successivement avec de l'acide chlorhydrique N refroidi par de la glace, de l'eau, de l'ammoniaque 2N et de l'eau, séchée sur du sulfate de sodium et évaporée sous pression réduite. La masse gélatineuse résultante est précipitée à 10 partir d'un mélange acétate d'éthyle-éther de pétrole. La reprécipitation à partir du mélange aéthanol-eau donne le dipeptide pur (2,75 g) fondant entre 73 et 77°C ; [a]|2 + 7,7 - 0,5° (c - 1,046, néthanol). Analyse calculée pour ^25^32^2°7 : C* 63,54 ; H, 6,83 ; 15 H, 5,93. Trouvé : C, 63,36 ; H, 6,97 J N, 5,71. (f) Hydrazlde de benzyloxyearbonyl-a-amlnoisobutyryl-O-benzyl-L-tyrosyl-L-sérine L'ester méthylique de t-butyloxycarbonyl-O-benzyl-L-tyro-syl-L-sérine (2,08 g) est dissous dans de l'acide chlorhydrique 20 gazeux N dans l'acide acétique (20 ml), et on laisse le mélange reposer à la température ambiante pendant 30 minutes. L'évaporation du solvant donne un résidu huileux, qui est solidifié lors d'un traitement avec de l'éther. Le solide qui a été séparé par filtration est dissous dans un mélange d'eau (6 ml) et de dichlorométha-25 ne (20 ml), et, dans cette solution, on ajoute du carbonate de potassium à 50 % refroidi par de la glace (6 ml). Le mélange est bien agité et la phase organique est séparée. La solution organique est séchée sur du sulfate de sodium et évaporée sous pression réduite. 30 L'ester méthylique d'O-benzyl-L-tyrosyl-L-sérine cristal lin obtenu ci-dessus est dissous dans de l'acétonitrile en même temps que de l'acide benzyloxycarbonyl-a-aminoisobutyrique (1,04 g) et, dans la solution, on ajoute une solution dans l'acétonitrile de N,N*-dicyclohexylcarbodiimide (0,91 g) à 0°C. Le mélange est 35 maintenu à 4°C toute la nuit. La dicyclohexylurée séparée est filtrée et le filtrat est évaporé sous pression réduite. Le résidu est dissous dans l'acétate d'éthyle, et la solution est lavée successivement avec de l'acide chlorhydrique N, de l'eau et une solution à 5 % de bicarbonate de sodium, séchée sur du sulfate de so-40 dium anhydre et évaporée sous pression réduite pour donner l'ester 71 08969 21. 2085715 de tripeptide brut qui montre sur un chromatogramme sur couche mince (dans l'acétate d'éthyle) la présence d'une quantité plus faible de composant supplémentaire. L'ester brut est alors dissous dans l'éthanol (20 ml), et on ajoute de l'hydrazine (1,0 ml). On laisse 5 le mélange réactionnel reposer à la température ambiante pendant 2 jours, et on le concentre sous pression réduite. Le résidu est dissous dans l'acétate d'éthyle, lavé à l'eau et séché rapidement sur du sulfate de sodium. Les précipités séparés au repos sont filtrés, lavés avec de l'acétate d'éthyle froid et de l'éther, et 10 séchés sous pression réduite pour donner l'hydrazide désiré (1,91 g). La reprécipitation à partir de l'éthanol dorme la matière pure fondant entre 151 et 153°C ; [«3^ - 2,2 - 0,4° (c = 1,062, acide acétique). Analyse calculée pour C^-jH-^N^O^ : C, 62,93 î H, 6,30 ; 20 N, 11,84. Trouvé : C, 62,98 ; H, 6,31 ; N, 11,81. (g) Ester p-nitrophénylique d'acide t-butyloxycarbonyl-^-benzyl-L-glutamique Le sel de dicyclohexylamine de l'acide t-butyloxycarbonyl-^-benzyl-L-glutamique (9*0 g) est agité avec le produit dit Dowex 25 50W x 8 (forme H+, volume à l'état humide : 18 cm^) dans de l'éthanol à 60 % pendant 30 minutes. Après que la résine ait été retirée par filtration, le filtrat est évaporé sous pression réduite pour donner un résidu, qui est dissous dans l'éther. La solution est séchée sur du sulfate de sodium et évaporée sous pression 25 réduite pour donner quantitativement l'acide libre. L'acide est dissous dans de l'acétate d'éthyle en même temps que du p-nitrophé-nol (2,4 g), et, dans cette solution, on ajoute de la N,N'-dicyclohexylcarbodiimide (3,6 g) à 0°C. On laisse le mélange réactionnel reposer toute la nuit. Après enlèvement de la dicyclohexylurée 30 précipitée par filtration, le filtrat est évaporé sous pression réduite pour donner un résidu, qui est cristallisé à partir de l'éthanol. La recristallisation à partir du même solvant donne l'ester actif (7,0 g) sous une forme pure, fondant entre 118 et 119°C ; [a]28 - 33,1 t 0,7 (c = 1,082, méthanol). 35 Analyse calculée pour C23H26^°8 : C* 60,26 ; H, 5*72 ; N, 6,11. Trouvé : C, 60,38 ; H, 5*80 ; N, 6,29. (h) t-butyloxycarbonyl-^benzyl-L-glutamyl-L-histidyl-L-phényl-alany1-L-arginy1-L-tryptophy1-glyc ine Dans ime solution d'acétate de L-histidyl-L-phénylalanyl-40 L-arginyl-L-tryptophyl-glycine (1,20 g) dans la diméthylformamide 71 08969 22. 2085715 (10 ml), on ajoute de l'ester p-nitrophénylique d'acide t-butyloxy-earbonyl-J-benzyl-L-glutamique (1,03 g) et de la diméthylformamide (25 ml), et le mélange est maintenu à 4°C pendant 3 jours. La solution résultante est ajoutée goutte à goutte dans un mélange d'a-5 cétate d'éthyle et d'éther (1 : 1 en volume) (200 ml). Les précipités formés sont rassemblés par filtration, lavés à l'acétate d' éthyle et à l'éther, et séchés sous pression réduite (rendement 1,86 g). Ces précipités sont redissous dans de l'acide acétique à 50 % (environ 10 ml), et de l'éthanol (environ 100 ml) y est ajou-10 té. Les précipités résultants sont rassemblés par filtration et lyophilisés à partir d'acide acétique pour donner 1,37 g du produit désiré; [a]22 - 23,9 - 0,6° (c « 1,020, acide acétique à 50 *). Analyse calculée pour C^Hg^N^gO-^. CH^COOH. 31^0 : C, 15 56,07 î H, 6,57 ; N, 14,81 ; CH^CO, 3,79- Trouvé : C, 56,40 j H, 6,22 Î n, 15,40 ; CH?C0, 3,25. Le pentapeptide de départ, c'est-à-dire la L-histidyl-L-phénylalanyl-L-arginyl-L-tryptophyl-glycine, peut être préparé par le précédé décrit dans Bull. Chem. Soc. Japan j58 H48 (1965) ou 20 dans la demande de brevet japonais n° 17.117/1969, déposée le 6 Mars 1969 , sous le titre "A Process for preparing a Hexapeptide Derivative". au nom de 3HEN0GI AND Co., Ltd. 25 ou par le procédé suivant. r% Ester méthylique de t-butyloxycarbonyl-L-phénylalanyl-H -tosyl-L-arginyl-L-tryptophyl-glycine p L'hydrazide de t-butyloxycarbonyl-L-phénylalanyl-M -tosyl-L-arginine (5,9 g) [préparé par le procédé décrit dans Bull. Chem. Soc. Japan 1465 (1964)] est traité avec du nitrite de sodium, 30 et 1'azothydrure précipité est mis à réagir avec l'ester méthylique de L-tryptophyl-glycine [préparé par hydrogénation catalytique d'ester méthylique de benzyloxycarbonyl-L-tryptophyl-glycine (4,1 g)] dans l'acétate d'éthyle pour donner 5,3 g Analyse calculée pour C^-jH^^gOgS . c, 59,12 -, H, 6,29 î *, 13,45 ; S, 3,85. Trouvé : c, 58,82 j H, 6,55 ï N, 13,15 î S, 3,76. Ester méthylique de benzyloxycarbonyl-L-histidyl-L-phényl-40 alanyl-n^-tosyl-L-arglnyl-L-tryptophyl-glycine 71 08969 23. 2085715 L'ester méthylique de tétrapeptide (5,0 g) obtenu ci-dessus est traité avec de l'acide formique à la température ambiante, pendant 4 heures. L'ester de tétrapeptide résultant est condensé avec 1'azothydrure de benzyloxycarbonyl-L-histidine (préparé à 5 partir de 2,7 g de l'hydrazide correspondant). Après achèvement de la réaction, le produit désiré est cristallisé dans l'éthanol. Rendement 3,9 g î point de fusion 188 - 190°C ; ~ 23,4 - 0,6° (e = 1,037, diméthylformamide). Analyse calculée pour C^H^N^O^S : C, 59,81 ; H, 5,72 ; 10 H, 15,34 î S, 3,19. Trouvé : C, 59,57 î H, 5,59 ; N, 15,37 S S, 3,27. Benzyloxycarbonyl-L-histidyl-L-phénylalanyl-NG-tosyl-L-arginyl-L-tryptophyl-glyc ine L'ester de pentapeptide (2,2 g) obtenu ci-dessus est sa-15 ponifié dans une solution aqueuse de méthanol pendant 30 minutes par l'utilisation de deux équivalents molaires de soude. Après a-chèvement de la réaction, le produit est cristallisé dans une solution aqueuse de méthanol pour donner 1,6 g de produit désiré, fondant entre 175 178°C ; [a]27- 21,4 - 0,6° (c = 1,066 dimé-20 thylformamide). Analyse calculée pour C^H^lij^O^QS.H^O : c, 58,38 j H, 5,70 ; N, 15,28 J S, 3,18. Trouvé : C, 57,95 S H, 5,83 î H, 15,19 î S, 3,58. L-histidyl-L-phénylalanyl-L-arginyl-L-tryptophyl-glycine 25 Le pentapeptide (1,23 g) obtenu ci-dessus est traité a- vec de l'acide fluorhydrique en présence d'anisol (1,3 ml) à 0°C pendant 30 minutes. Le chlorhydrate de pentapeptide débloqué est passé à travers une colonne de produit dit Amberlite CG-400 (forme acétate) pour le transformer en acétate correspondant. On fait 30 passer l'acétate à travers une colonne de carboxyméthylcellulose et on l'élue avec un tampon d'acétate d'ammonium ayant un gradient de concentration linéaire de 0,01 à 0,1 M. Le rendement est 0,76 g î " 1°*5 ~ 1»°° (c = l»oi|-3, acide chlorhydrique N). Le rapport d'aminoacides par la digestion d'aminopepti-35 dase de leucine est le suivant : histidine 1,00, phénylalanine 1,00, arginine 1,02, tryptophane 1,00, glycine 1,07. (i) Ester p-nitrophényligue de t-butyloxycarbonyl-L-méthionine Lé sel de dicyclohexylamine de la t-butyloxycarbonyl-L-méthionine (10,8 g) est traité avec le produit dit Dowex 50W x 8 40 (forme H+) de la même manière que celle indiquée dans l'exemple 71 08969 24. 2085715 1 (g). L'acide huileux résultant et le p-nitrophénol (2,5 g) sont dissous dans de l'acétate d'éthyle, et, dans la solution, on ajoute line solution dans l'acétate d'éthyle de N,N'-dicyclohexylcarbodiimide (5,2 g) à 0°C. On laisse le mélange reposer à 4°C toute 5 la nuit. La dicyclohexylurée précipitée est séparée par filtration et le filtrat est évaporé sous pression réduite pour donner un résidu qui est cristallisé dans l'éthanol. La recristallisation dans l'éthanol donne l'ester actif (7,8 g) fondant entre 96 et 97°C; [a]^ - 48,3 - 0,9° (C - 1,020, méthanol). 10 Analyse calculée pour CigHggHgOgS : C, 51,88 ; H, 5,99 î H, 7,56. Trouvé : C, 52,05 ; H, 5,97 î H, 7,68. (j) t-butyloxycarbonyl-L-méthionyl-jf-benzyl-L-glutafflyl-L-hlstidyl-L-phénylalanyl-L-arginyl-L-tryptophyl-glycine La t-butyloxycarbonyl-Jf-benzyl-L-glutamyl-L-histidyl-L-15 phénylalanyl-L-arginyl-L-tryptophyl-glycine (1,26 g) est dissoute dans l'acide trifluoracétique (6 ml) et le mélange est maintenu à la température ambiante pendant 30 minutes. Après que le mélange réactionnel ait été refroidi dans un bain de glace, l'addition d' éther donne l'hexapeptide partiellement débloqué sous forme de pré-20 cipités (1,34 g). Les précipités sont dissous dans la diméthylformamide (10 ml) et, dans la solution, on ajoute de la triéthylamine (0,46 ml) et de l'ester p-nitrophénylique de t-butyloxycarbonyl-L-méthionine (0,74 g). On laisse le mélange reposer à 4°C pendant 24 heures, puis on introduit un mélange, refroidi par de la glace, 25 d'acétate d'éthyle et d'éther (l : 4 en volume, 250 ml). Les précipités résultants sont séparés par filtration, lavés à l'éther et séchés sous pression réduite (rendement 1,56 g). Ce produit est mis en suspension dans l'éthanol (15 ml), et la suspension est chauffée jusqu'au point d'ébullition. Après refroidissement, on 30 rassemble les précipités par filtration, on les lave avec de l'éthanol froid et de l'éther et on les lyophilise avec de l'acide acétique pour donner 1,16 g du produit désiré ; [a]p2 - 18,5 - 0,5° (e = 1,072, diméthylformamide). Analyse calculée pour C^gH^^N^O^S.CH^COOH. 21^0 : C, 35 54,23 î H, 6,67 î M, 14,18. Trouvé : C, 54,51 ; H, 6,16 ; N, 13,94. (k) Benzyloxycarbonyl-a-aminoisobutyryl-O-benzyl-L-tyrosyl-L-séryl-L-méthlonyl-jT-benzyl-L-glutamyl-L-histidyl-L-phénylalanyl-L-arglny1-L-tryptophy1-glyclne Un mélange d'hydrazide de benzyloxycarbonyl-a-aminoisobu-40 tyryl-O-benzyl-L-tyrosyl-L-sérine (0,47 g), d'acide chlorhydrique 71 08969 25. 2085715 N (2 ml) et de diméthylformamide (2 ml) est refroidi dans ton bain de glace, et, dans la solution, on ajoute goutte à goutte du nitri-te de sodium 2M refroidi par de la glace (0,44 ml). Le mélange est agité à 0°C pendant 4 minutes et puis extrait avec de l'acétate 5 d'éthyle refroidi par de la glace. Les extraits organiques sont combinés, lavés avec du bicarbonate de sodium refroidi par de la glace et séchés sur du sulfate de sodium. La solution résultante est mélangée avec une solution de trifluoroacétate de L-méthionyl-î-benzyl-L-glutamyl-L-hi sti dy1-L-phény1alany1-L-arginy1-L-trypt o -10 phyl-glycine [préparée quantitativement à partir de 0,4 mraole d'un dérivé de t-butyloxycarbonyle (j), par traitement avec l'acide tri-fluoracétique (3 ml)] et de triéthylamine (0,25 ml) dans la diméthylformamide (10 ml). Le mélange est concentré sous pression réduite à une température de bain de 20°C jusqu'à ce qu'il devienne 15 clair, et puis la solution est maintenue à 4°C pendant 24 heures. La majeure partie du solvant est retirée par évaporation sous pression réduite à une température de bain de 45°C. Les précipités (0,67 g) séparés lors de l'addition d'éther sont reprécipités avec le mélange méthanol-éthanol-eau pour donner 0,62 g du peptide brut. 20 Le peptide est soumis à une ehromatographie sur une colonne de gel de silice (de la Société dite Merck, 0,05 à 0,2 mm, 150 g) en utilisant un système de solvants formé de n-butanôl-acide acétique-eau dans le rapport 4 : 1 : 1 en volume, et l'on rassemble des fractions de 5 ml. Le produit désiré est détecté en mesurant l'ab-25 sorption à 280 m|4 ou par ehromatographie sur couche mince dans un système de solvants formé de n-butanol-aeide acétique-eau (4 : 1 :1 en volume). Les fractions (tubes n° 66-90) contenant le décapepti-de sont rassemblées et concentrées sous pression réduite pour donner un résidu gélatineux, qui est lyophilisé à partir d'acide acé-30 tique pour donner 0,51 g du produit désiré. Le produit donne une seule tache (Rf = 0,44, butanol-acide acétique-eau = 4 : 1 : 2 en volume, couche mince de gel de silice) sur un chromatogramme. Le chlorhydrate du produit a un pouvoir rotatoire optique spécifique. [a]^2 - 24,7 - 1,2° (c = 0,534, diméthylformamide). 35 Analyse calculée pour CggH^gN-^gO^S^CH^COOH^HgO : C, 57,26 ; H, 6,37 î N, 12,42. Trouvé : C, 57,31 i H, 5,82 ; N, 12,33-(l) Amide de a-aminoisobutyryl-L-tyrosyl-L-séryl-L-méthionyl-L- L-lysyl 40 nine 71 08969 26. 2005715 Dans me solution de benzyloxycarbonyl-a-aminoisobutyryl-O-benzyl-L-tyrosyl-L-séryl-L-méthionyl-îf-benzyl-L-glutamyl-L-his-tidyl-L-phénylalanyl-L-arginyl-L-tryptophyl-glycine (0,32 g) obtenu ci-dessus dans l'acide acétique, on ajoute de l'acide chlorhy-5 drique gazeux N dans l'acide acétique (0,4 ml) et le mélange est immédiatement lyophilisé. La substance lyophilisée est séchée sur des pastilles de soude sous pression réduite pour donner le chlorhydrate du décapeptide, qui est dissous dans la diméthylformamide (3 al) avec de la N-hydroxysuccinimide (0,08j5 g). Dans cette solu-10 tion, on ajoute une solution de N,N'-dicyclohexylcarbodiimide (0,15 g) dans la diméthylformamide (2 ml), et on laisse le mélange reposer toute la nuit à 4°C. La dicyclohexylurée séparée est rassemblée par filtration,et le filtrat est introduit dans de l'acétate d'éthyle refroidi par de la glace (50 ml) et de l'éther (50 ml). 15 Les précipités résultants sont rassemblés par filtration, lavés à l'acétate d'éthyle et à l'éther, et séchés sous pression réduite pour donner l'ester actif de décapeptide (0,36 g). Le triacétate de l'amide de NÊ-t-butyloxycarbonyl-L-lysyl-L-prolyl-L-valyl-glycyl-N^-t-butyloxycarbonyl-L-lysyl-N^-t-butyl-20 oxycarbonyl-L-lysyl-L-arginyl-L-arginine [préparé quantitativement à partir de 0,12 mmole du dérivé correspondant de Na-benzyloxycar-bonyle par hydrogénation catalytique selon le procédé décrit dans Bull. Chem. Soc. Japan 882 (1966)] est dissous dans de la diméthylformamide (2 ml) et on ajoute de la triéthylamine (0,18 ml). 25 La solution est mélangée avec une solution dans la diméthylformamide de l'ester actif obtenu ci-dessus, et le mélange (volume total : 4 ml) est maintenu à 4°C pendant 48 heures. Le mélange réactionnel est alors introduit dans de l'acétate d'éthyle refroidi par de la glace (100 ml), et les précipités séparés sont rassem-30 blés par filtration, lavés à l'acétate d'éthyle et à l'éther, lyophilisés à partir de l'acide acétique, et séchés sur des pastilles de soude sous pression réduite pour donner l'octadécapeptide protégé (0,56 g). L'octadécapeptide protégé obtenu ci-dessus est placé dans 35 un récipient de réaction (constitué de polyéthylène fluoré) avec de la L-méthionine (0,1 g) et de l'anisol (0,5 ml), et on introduit de l'acide fluorhydrique gazeux dans le récipient placé dans un bain d'acétone-glace sèche. Le mélange réactionnel (environ 10 ml) est agité à 0°C pendant 90 minutes, et évaporé sous pression 40 pour donner un résidu sirupeux, qui est dissous dans de l'eau re 71 08969 27. 2085715 froidie par de la glace. La solution est lavée à l'acétate d'éthyle et puis passée à travers une colonne (1,7 x 12 cm) de produit dit Amberlite CG-400 (forme acétate). La colonne est lavée avec des parties d'eau. Les solutions aqueuses combinées sont concen-5 trées jusqu'à approximativement 20 ml sous pression réduite et lyophilisées. Le peptide débloqué brut ainsi obtenu (0,65 g) est soumis, pour la purification, à une ehromatographie sur colonne (2,7 x 27 cm) de carboxyméthylcellulose (de la société dite Serva Co., 0,56 meq/g) en utilisant un tampon d'acétate d'ammonium (pH 6,8, 10 2.000 ml) avec un gradient de concentration linéaire de 0,02 à 0,6 M. Chaque fraction (10 ml/tube) est rassemblée et on enregistre l'absorption à 280 mp. Les fractions correspondant à un pic principal (tubes n° 156-180) et à sa saillie (tubes n° 181-200) sont séparément rassemblées et la masse du solvant est retirée par 15 évaporation sous pression réduite à une température du bain de 50 à 55°C. Les résidus sont lyophilisés jusqu'à poids constant pour donner I89 mg (F-l) et 76 mg (P-II) de poudre incolore provenant respectivement des premières fractions et de la dernière, F-I (189 mg) est chromatographié à nouveau sur une colonne de carboxymé-20 thylcellulose (2,2 x 25 cm) de la même manière que celle indiquée ci-dessus pour donner le peptide pur (137 mg, F-I-l) à partir d'un seul pic. Une petite saillie du pic donne F-I-2 (37 mg). F-II (76 mg) et F-I-2 (37 mg) sont combinés et la ehromatographie répétée deux fois pour obtenir 29 mg du peptide désiré. Le rendement to-25 tal en amide d'octadéeapeptide ainsi obtenu s'élève à 166 mg ; [a]25-58,4±l,9° (c = 0,514, acide acétique 0,1 N). °'m = " 25,1= 288 "V $1 - x9'7> ' = 281 mH(Elcm = 25,2), 288 m|4 (E^ = 24,4). Le peptide se comporte comme un seul composant vis-à-vis de la ninhydrine, des 30 réactifs de Pauly, d'Ehrlich, de Sakaguchi et à la méthionine (Ptlg) par ehromatographie sur couche mince (système de solvants : n-butanol-acide acétique-pyridine-eau = 30:6:20:24 en volume) et par électrophorèse sur papier (600 v/36 cm, dans l'acide acétique 2N). Les rapports d'aminoacides dans l'hydrolyse par un acide 36 (HC1 6N, 105°c, 40 heures) donnent les résultats suivants : séri-ne 0,83, acide glutamique 1,00, proline 1,07, glycine 2,10, acide a-aminoisobutyrique 0,99, valine 1,00, méthionine 1,02, tyrosine 0,97, phénylalanine 1,04, lysine 3,17, histidine 0,92, arginine 2,90. Le rapport tryptophane/tyrosine dans 1'amide d'oetadécapep-40 tide intacte a été déterminé par voie speetrophotométrique à une 71 0896e? 28. 2085715 valeur de 1,12. Lorsque la Ns-t-butyloxycarbonyl-L-lysyl-L-prolyl-L-valyl-glycyl-N£-t-butyloxycarbonyl-L-lysyl-NÉ-t-butyloxycarbonyl-L-lysyl-L-arginyl-L-arginine [préparée selon le procédé décrit dans Bull. 5 Chem. Soc. Japan 22, 882 (1966)] est utilisée comme octadécapeptide à terminaison carbonée dans la réaction indiquée ci-dessus, on obtient de manière semblable l'a-aminoisobutyryl-L-tyrosyl-L-séryl-L-méthionyl-L-glutamyl-L-histidyl-L-phénylalanyl-L-arginyl-L-tryp-tophyl-glycyl-L-lysyl-L-prolyl-L-valyl-glycyl-L-lysyl-L-lysyl-L-10 arginyl-L-arginine. EXEMPLE 2 (a) Ester méthylique de Ma-benzyloxycarbonyl-N^-t-butyloxycarbony1-L-lysyl-L-prolyl-L-valyl-glycyl-M^-t-butyloxycarbonyl-L-ornlthine L'ester méthylique de Na-benzyloxycarbony1-N^-t-butyloxy-15 carbonyl-L-ornithine [1,20 g, point de fusion 69 - 70°C, [oc]28-10,6 -0,5° (c = 1,092, méthanol)] est hydrogéné sur un catalyseur formé de noir de palladium dans le méthanol contenant de l'acide acétique à 10 pendant 2 heures. L'évaporation du solvant sous pression réduite donne l'acétate de l'ester méthylique de N^-t-butylo-20 xycarbonyl-L-ornithine sous forme d'un résidu sirupeux, qui est traité avec une solution aqueuse à 50 % de carbonate de potassium dans le dichlorométhane à 0°C. La couche organique est séchée sur du sulfate de sodium et évaporée sous pression réduite à une température de bain de 20°C. Le résidu résultant est dissous dans le 25 dichlorométhane (10 ml), et, dans la solution, on ajoute la Na-ben-zyloxycarbonyl-N£-t-butyloxycarbony1-L-lysy1-L-prolyl-L-valyl-gly-cine (1,83 g) préparée selon le procédé décrit dans Bull. Chem. Soc. Japan 2Z. 1471 (1964). Dans la solution, on ajoute une solution de N,N'-dicyclohexylcarbodiimide (0,60 g) dans le dichlorométhane à 30 0°C et on laisse le mélange reposer à 4°C pendant deux jours. A-près enlèvement de la dicyclohexylurée précipitée par filtration, le filtrat est concentré sous pression réduite pour donner un résidu sirupeux. Le résidu est dissous dans l'acétate d'éthyle, lavé avec de l'acide chlorhydrique N refroidi par de la glace et du 35 bicarbonate de sodium M, séché sur du sulfate de sodium et concentré sous pression réduite. Le résidu résultant est à nouveau dissous dans l'acétate d'éthyle (30 ml) et on lui ajoute de l'éther (30 ml) pour donner l'ester méthylique du pentapeptide désiré sous p/r , une forme pure. Rendement 2,24 g j [a]D -55,9-0,9°(c = 1,062, mé-40 thanol). 71 08969 29. 2085715 Analyse calculée pour ci}.2H6YNY°i2 : Ct ; H, 7,83 ; N, 11,37. Trouvé : C, 58,52 î H, 8,08 ; N, 11,33. (b) Hydrazide de Ng-benzyloxycarbonyl-Na-t-butyloxycarbony1-L-lysyl-L-prolyl-L-valyl-glycyl-N^-t-butyloxycarbonyl-L-ornlthlne 5 L'ester méthylique de pentapeptide (2,2 g) obtenu ci-des- sus est dissous dans du méthanol (30 ml), et on ajoute de l'hydrate d'hydrazine (0,26 ml). On laisse le mélange réactionnel reposer à la température ambiante pendant trois jours, et 1'hydrazide est précipité par l'addition d'eau. Les précipités sont rassemblés par 10 filtration et cristallisés dans Tin mélange méthanol-eau pour donner l'hydrazide désiré (2,1 g), fondant à 175 - 180°C ; [a]p^-35,8 ±0,7° (c = 1,040, diméthylformamide). Analyse calculée pour c4iH6yNg°n : c» 57,13 î H, 7,83 ; N, 14,62. Trouvé : C, 57,01 ; H, 7,87 i N, 14,41. 15 (c) Diacétate d'amide de Ng-benzyloxycarbonyl-N£-t-butyloxycarbo-nyl-L-lysyl-L-prolyl-L-valyl-glycyl-N^-t-butyloxycarbonyl-L-orni-thyl-N£-t-butyloxycarbonyl-L-lysyl-L-arginyl-L-arginine Dans une solution, refroidie par de la glace, de l'hydrazide du pentapeptide (0,95 g) obtenu ci-dessus dans du tétrahydro-20 furane à 90 % (10 ml), on ajoute de l'acide chlorhydrique N refroidi par de la glace (2,75 ml) et du nitrite de sodium 2 M (0,61 ml). Cki laisse 3e mélange reposer à 0°C pendant 5 minutes et on le règle à un pH de 7,4 à 7,6 par l'addition de triéthylamine (0,38 ml). Dans la solution, on ajoute une solution refroidie par de la glace de tri-25 acétate d'amide de Ne-t-butyloxycarbonyl-L-lysyl-L-arginyl-L-argi-nine [obtenu à partir de 0,92 mmole d'amide de Na-benzyloxycarbo-nyl-N&-t-butyloxycarbonyl-L-lysyl-H -nitro-L-arginyl-N -nitro-L-arginine par l'hydrogénation catalytique selon le procédé décrit dans Bull. Chem. Soc. Japan 22 882 (1966)] et de triéthylamine 30 (0,42 ml) dans du tétrahydrofurane à 80 % (7,5 ml). On laisse le mélange reposer à 4°C pendant trois jours et on le concentre sous pression réduite. Le résidu résultant est additionné d'acétate d' éthyle (10 ml) et d'acide acétique N (10 ml), et le mélange est bien agité. La phase aqueuse est extraite trois fois à l'acétate 35 d'éthyle et les extraits combinés sont concentrés sous pression réduite jusqu'à approximativement 10 ml. Le concentré est mélangé a-vec de l'acide acétique N, et le mélange est bien agité. Le concentré est totalement extrait avec du N-butanol saturé d'eau. L'extrait est séché sur du sulfate de sodium et concentré sous pression 40 réduite. Le résidu résultant est lyophilisé à partir d'acide acéti- 71 08969 30. 2085715 tique pour donner le produit désiré (0,85 g). [a]22-43,lil,5° (c = 0,5^0, acide acétique à 50 %). Analyse calculée pour C64H110M18°16-2CH3C00H-4H2° : c' 51,70 i H, 8,04 j n, 15,96 î CH-jCO, 5,H. Trouvé : C, 51,60 ; H, 5 7,72 î n, 15,62 ; CH^CO, 4,30. (d) Amide de g-amlnoisobutyryl-L-tyrosyl-L-séryl-L-méthionyl-L-glutamyl-L-histldyl-L-phénylalanyl-L-arginyl-L-tryptophyl-glycyl-L-lysyl-L-prolyl-L-valyl-glycyl-L-ornithyl-L-lysyl-L-arginyl-L-arginine 10 Le dérivé de décapeptide (0,32 g) obtenu dans l'exemple l(k) est transformé en ester de n-hydroxysuccinimide correspondant, d'une manière classique. L'ester actif (0,32 g) ainsi obtenu est ajouté à une solution d'un octapeptide (obtenu à partir de 0,19 g du dérivé d'octapeptide obtenu dans l'exemple 2(e) par hy-15 drogénation catalytique) et de triéthylamine (0,18 ml) dans la diméthylformamide (4 ml). Le mélange réactionnel est maintenu à 4°C pendant 64 heures et puis on l'ajoute goutte à goutte dans de l'acétate d'éthyle refroidi par de la glace (100 ml). Les précipités formés sont rassemblés par filtration, lavés à l'acétate d'éthyle 20 et à l'éther, et séchés sous pression réduite pour donner un octa-décapeptide brut protégé (0,49 g). Le produit brut (0,29 g) est dissous dans de l'acide fluorhydrique gazeux liquéfié (5-6 ml) avec de la méthionine (0,06 g) et de l'anisol (0,29 ml) à. une température de bain d'acétone-gla-25 ce sèche, et le mélange est agité à 0°C pendant 90 minutes, après quoi on retire l'acide fluorhydrique par évaporation sous pression réduite. Le résidu est dissous dans de l'eau refroidie par de la glace, et la solution est lavée deux fois avec de l'acétate d'éthyle. La solution aqueuse résultante est passée à travers une co-30 lonne (1,7 x 20 en) de produit dit Amberlite CG-400 (forme acétate) et la colonne est lavée avec des pgirties d'eau. Les effluents sont combinés, concentrés sous pression réduite et lyophilisés pour donner un octadécapeptide débloqué brut (0,34 g). L'octadécapeptide brut (0,34 g) est soumis à la purifica-35 tion par ehromatographie sur une colonne (1,7 x 36 cm) de carboxy-méthylcellulose (de la Société dite Serva, 0,56 meq/g) en utilisant un tampon d'acétate d'ammonium (pH 6,8) avec un gradient de concentration linéaire de 0,02 à 0,6m (1.500 ml). Des fractions (7,5 ml/tube) sont rassemblées et l'absorption à 280 m^A est enregistrée. Les tubes correspondants à un pic principal sont rassem- T*0 blés dans deux fractions séparées F-I (tubes 106-130) et F-II (tu 71 08969 31. 2085715 bes 131-155)- La masse du solvant est retirée par évaporation sous pression réduite et le résidu est lyophilisé à maintes reprises jusqu'à fournir un poids constant. P-I et F-II s'élèvent ainsi respectivement à 76 mg et 84 mg. F-II (84 mg) est soumis à une nou-5 velle ehromatographie sur une colonne de carboxyméthylcellulose de la même manière que celle indiquée ci-dessus pour donner F-II-1 (30 mg). F-I et F-II-1 sont combinés pour donner un octadécapepti-de désiré, partiellement purifié (106 mg). Pour une purification ultérieure, une partie de 65 mg de ce produit est à nouveau soumi-10 se à une ehromatographie sur une colonne (1,7 x 30 cm) de carboxyméthylcellulose (dite Whatman CM-52) en utilisant un tampon d'acétate d'ammonium (pH 6,9) avec un gradient de concentration linéaire de 0,02 à 0,6 M (1.500 ml). Les contenus des tubes correspondants à xm seul pic sont combinés, soumis à une évaporation et à 15 une lyophilisation pour donner l'octadécapeptide pur, c'est-à-dire 1'acétate d'amide d'a-aminoisobutyryl-L-tyrosyl-L-séryl-L-raéthio-nyl-L-glutamyl-L-histidyl-L-phénylalanyl-L-arginyl-L-tryptophyl-glycyl-L-lysyl-L-prolyl-L-valyl-glycyl-L-ornithyl-L-lysyl-L-argi-nyl-L-arginine (52 mg) ; [a]^-57,3-l,9° (c = 0,499 acide acétique 20 "P (Eî°m f i°>' - f 1 -f(^S 17*8) ; A. raS = 281 "f4 (Elcm 24'6)' 288 mF (Elcm 25'8)* Les rapports d'aminoacides dans l'hydrolysat par un acide (acide chlorhydrique 6N, 105°C, 40 heures) sont les suivants : sérine 0,80, acide glutamique 0,99» proline 1,04, glycine 2,03, acide a-25 aminoisobutyrique 0,95, valine 1,00, méthionine 1,03, tyrosine 1,04, phénylalanine 1,05, ornithine 1,08, lysine 2,00, histidine 1,01, arginine 3,12. Le rapport tryptophane/tyrosine dans l'octadécapeptide intact a été déterminé par voie spectrophotométrique à une valeur de 1,19- Le peptide se comporte comme un seul compo-30 sant lors de la ehromatographie sur couche mince (n-butanol-acide acétique-pyridine-eau = 30 : 6 : 20 î 24 en volume) et dans l'élec-trophorèse (600 V/36 cm, dans l'acide acétique 2N). EXEMPLE 3 (a) Ester t-butylique de benzyloxycarbonyl-L-alanyl-Klycine 35 La benzyloxycarbonyl-L-alanine (6,70 g) et l'ester t-bu tylique de glycine (3,95 g) sont dissous dans de l'acétate d'éthyle (30 ml), et, dans la solution, on ajoute une solution de N,N'-dicyclohexylcarbodiimide (6,20 g) dans de l'acétate d'éthyle à 0°C. On laisse reposer le mélange toute la nuit à 4°C, et la dicy-40 clohexylurée précipitée est retirée par filtration. Le filtrat est 71 08969 32. 2085715 lavé avec de l'acide chlorhydrique N et du bicarbonate de sodium M refroidis avec de la glace, séché sur du sulfate de sodium et évaporé sous pression réduite pour donner un résidu qui est cristallisé dans l'éther et dans l'éther de pétrole pour donner 7,84 g du 5 produit désiré, fondant entre 41 et 42°C ; [a]2^-4l,6io,8°'( c = 1,026, rné thanol). Analyse calculée pour C^H^NgO^ : C, 60,70 ; H, 7,19 ; N, 8,33. Trouvé : C, 60,39 î H, 7,42 ; N, 8,25- (b) Ester t-butylique de benzyloxycarbonyl-g-t-butyl-L-aspartyl-10 L-alanyl-glyclne Le dipeptide (6,73 g) obtenu ci-dessus est hydrogéné sur du palladium en tant que catalyseur dans un mélange d'acide acétique à 10 méthanol, pendant 2 heures. Après enlèvement du solvant par évaporation sous pression réduite, le résidu résultant 15 est agité avec une solution de carbonate de potassium en présence de dichlorométhane. La phase organique est séchée sur du sulfate de sodium et concentrée sous pression réduite pour donner l'ester t-butylique de L-alanyl-glycine sous forme d'huile. L'acide benzyloxycarbonyl-P-t-butyl-L-aspartique (prépa-20 ré en traitant le sel de dicyclohexylamine correspondant (10,1 g) avec le produit dit Dowex 50W x 8 (forme H+) à la manière ordinaire) et l'ester de dipeptide obtenu ci-dessus sont dissous dans du dichlorométhane, et, dans la solution, on ajoute une solution de dicyclohexylcarbodiimide (4,13 g) dans le dichlorométhane à 0°C. 25 On laisse le mélange reposer à 4°C toute la nuit. Après enlèvement de la dicyclohexylurée résultante par filtration, le filtrat est concentré sous pression réduite. Le résidu résultant est dissous dans l'acétate d'éthyle, lavé avec de l'acide chlorhydrique N et du carbonate de sodium M refroidis par de la glace, séché sur du 30 sulfate de sodium anhydre et concentré sous pression réduite pour donner uns huile, qui est cristallisée dans un mélange d'éther et d'éther de pétrole. La recristallisation dans le même solvant donne le dérivé de dipeptide pur (7,05 g), fondant entre 111 et 112 °C ; [a]27-29,4-0,7° (c - 1,033, méthanol). 35 Analyse calculée pour C^H^N^Og > C, 59,16 ; H, 7,35 ; N, 8,28. Trouvé : C, 59,22 ; H, 7,38 j N, 8,24. (c) Ester t-butylique de benzyloxycarbonyl-L-prolyl-g-t-butyl-L-aspartyl-L-alanyl-glycine L'ester de tripeptide (6,10 g) obtenu ci-dessus est hy-40 drogéné sur du noir de palladium en tant que catalyseur dans un 71 08969 33. 2085715 mélange acide acétique à 5 % - méthanol pendant 5 heures. Après enlèvement du catalyseur, le filtrat est concentré sous pression réduite pour donner un résidu huileux, qui est agité avec une solution de carbonate de potassium en présence de dichlorométhane à 5 0°C. Les solutions organiques sont combinées et concentrées sous pression réduite pour donner l'ester t-butylique de g-t-butyl-L-aspartyl-L-alanyl-glycine. La benzyloxycarbonyl-L-proline (2,90 g) et l'ester de tripeptide obtenu ci-dessus sont dissous dans du dichlorométhane (50 10 ml), et, dans la solution, on ajoute une solution de dicyclohexylcarbodiimide (2,48 g) dans du dichlorométhane à 0°C. Le mélange est agité à 0°C pendant 30 minutes et on le laisse reposer toute la nuit à 4°C. La dicyclohexylurée précipitée est retirée par filtration et le filtrat est concentré sous pression réduite pour don-15 ner un résidu, qui est traité avec de l'éther pour la cristallisation. Les cristaux (6,45 g) sont dissous dans de l'acétone, et on retire une faible quantité de dicyclohexylurée insoluble. Après enlèvement du solvant, le résidu résultant est cristallisé dans l'éther. Le rendement est 6,00 g et le produit a un point de fusion 20 de 148-150°C ; [ct]27-66,0±1,0° (c = 1,036 , méthanol). Analyse calculée pour c^qh^n^o^ : C, 59,59 î H, 7,33 ; N, 9,27- Trouvé : C, 59,69 ; h, 7,46 ; N, 9,12. (d) Ester t-butylique de N,Q-dibenzyloxycarbonyl-L-tyrosyl-L-pro-lyl-3-t-butyl-L-aspartyl-L-alanyl-glycine 25 L'ester de tétrapeptide (5,00 g) obtenu ci-dessus est hy drogéné sur du noir de palladium en tant que catalyseur dans du méthanol contenant 1 ml d'acide acétique, pendant 4 heures. Après enlèvement du catalyseur par filtration, le filtrat est concentré sous pression réduite pour donner un résidu qui est agité avec du 30 carbonate de potassium à 50 % en présence de dichlorométhane à 0°C. Les solutions organiques sont combinées, séchées sur du sulfate de sodium, et concentrées pour donner l'ester t-butylique de L-prolyl-(3-t-butyl-L-aspartyl-L-alanyl-glycine. Le produit donne une seule tache par ehromatographie sur couche mince (gel de silice) dans le 35 système de solvants n-butanol-acide acétique-pyridine-eau = 30 : 6 : 20 : 24 en volume. Procédé à la carbodiimide La N,0-dibenzyloxycarbonyl-L-tyrosine (0,45 g, 1 mmole) et l'ester de tétrapeptide (l mmole) obtenus ci-dessus sont dissous 40 dans le dichlorométhane (10 ml), et, dans la solution, on ajoute 71 08969 3"' 2085715 une solution de dicyclohexylcarbodiimide (0,206 g) dans le dichlorométhane. On laisse le mélange reposer à 4°C toute la nuit, et les précipités résultants sont retirés par filtration. Le filtrat est concentré sous pression réduite pour donner un résidu, qui est 5 additionné d1éther pour donner des cristaux. La recristallisation dans l'acétate d'éthyle et dans l'éther donne le peptide désiré, fondant à 121-123°C. Le rendement est 0,51 g. Le produit se comporte sous forme d'une seule tache par ehromatographie sur couche mince (gel de silice) dans le système 10 de solvants chloroforme-méthanol-acide acétique = 90 : 10 : 3 en volume. Procédé à l'ester actif L'ester t-butylique de L-prolyl-g-t-butyl-L-aspartyl-L-alanyl-glycine (5,77 mmoles) est dissous dans de la diméthylforma-15 mide (30 ml), et, dans la solution, on ajoute l'ester p-nitrophény-lique de N,0-dibenzyloxycarbonyl-L-tyrosine (3,63 g). On laisse le mélange reposer à 4°C pendant trois jours. Après enlèvement du solvant par évaporation sous pression réduite, le résidu résultant est cristallisé dans l'acétate d'éthyle et dans l'éther. La recristal-20 lisation dans l'acétate d'éthyle donne 6,65 g du produit désiré, fondant entre 126 et 127°C ; [oc]2®-43,8^1,0° (c = 0,86, méthanol). Analyse calculée pour : C, 62,58 ; H, 6,59 i n, 7,76. Trouvé : C, 62,44 j H, 6,56 ; N, 7,52. (e) Ester t-butylique de benzyloxycarbonyl-L-valyl-L-tyrosyl-L-prolyl-p-t-butyl-L-aspartyl-L-alanyl-glycine L'ester de pentapeptide (6,60 g) obtenu ci-dessus est hydrogéné sur le palladium en tant que catalyseur dans du méthanol contenant de l'acide acétique à 10 pendant 4 heures. Après enlèvement du solvant par évaporation sous pression réduite, le résidu résultant est dissous dans le dichlorométhane. La solution est agitée avec du carbonate de potassium à 50 % à 0°C. La solution organique est séchée sur du sulfate de magnésium et concentrée sous pression réduite pour donner le diester de pentapeptide cristallin. Le produit est dissous dans la diméthylformamide (50 ml), et on ajoute à la solution l'ester p-nitrophénylique de benzyloxy-carbonyl-L-valine (2,72 g). Le mélange est mis à réagir à 4°C pendant deux jours et concentré sous pression réduite à une température de bain de 40 à 45°C pour donner le produit brut. Le produit brut est chromatographié sur une colonne de gel de silice (de la Société dite Merck, maille de 0,05 à 0,2 mm, 150 g). La colonne est 25 30 35 40 71 08969 35. 2085715 développée avec le mélange méthanol-chloroforme ayant un gradient de concentration linéaire de méthanol de 0 à 5 % pour donner 56 fractions (20 g/tube). Ultérieurement, la colonne est lavée avec un mélange méthanol-chloroforme (5 î 95,en volume/volume). Chaque 5 fraction est vérifiée par ehromatographie sur couche mince et des fractions (tubes n° 55-60) sont combinées. La solution est concentrée sous pression réduite, et le résidu est additionné d'éther pour donner 5,25 g du produit désiré ; [a]2^-70,5^1,1° (c = 1,031, méthanol). 10 Analyse calculée pour C44*Ï62^6°12'**2® : c, 59,71 ; H, 7,29 î N, 9,50. Trouvé : C, 59,65 i H, 7,19 i N, 9,30. (f) Ester t-butylique de na-benzyloxyearbonyl-N^-t-butyloxyearbo-nyl-L-lysyl-L-valyl-L-tyrosyl-L-prolyl-g-t-butyl-L-aspartyl-L-ala-nyl-glycine 15 L'ester d'hexapeptide (4,62 g) est hydrogéné sur du pal ladium en tant que catalyseur dans un mélange acide acétique à 10 ^-méthanol, pendant 4 heures. Après enlèvement du solvant par évaporation sous pression réduite, le résidu résultant est dissous dans l'acétate d'éthyle. La solution est refroidie avec de la gla-20 ce et agitée avec du carbonate de potassium à 50 %, La solution organique est séchée sur du sulfate de sodium et concentrée sous pression réduite pour donner le diester d'hexapeptide. Le peptide est dissous dans la diméthylformamide (40 ml), et, dans la solution, on ajoute de l'ester p-nitrophénylique de Na-benzyloxycarbo-25 nyl-N^-t-butyloxycarbonyl-L-iysine (2,56 g). On laisse le mélange reposer à 4°C pendant trois jours et on le concentre sous pression réduite à une température de bain de 40 à 45°C. Le résidu résultant est ehromatographié sur une colonne de gel de silice (de la Société dite Merck, maille de 0,05 à 0,2 mm, 150 g). La colonne 30 est lavée avec le mélange de méthanol-chloroforme ayant un gradient de concentration linéaire en méthanol pour rassembler 50 tubes (20 g/tube). Ultérieurement, on utilise le mélange méthanol-chlorofor-me (5 : 95, en volume/volume) pour le développement ultérieur. Les fractions (tubes n° 71-80) sont combinées et évaporées sous pres-35 sion réduite pour donner un résidu, qui est traité avec de l'éther pour fournir me masse gélatineuse. Le produit est lavé à l'éther et séché pour donner 4,38 g du produit désiré. 1*]^-64,5^1,0° (c = 1,037, méthanol). Analyse calculée pour C^Hg^NgO^ .HgO : C, 59,34 ; H, 40 7,61 ; N, 10,07. Trouvé : C, 60,05 ; H, 7,67 î N, 10,06. 71 08969 56' 2085715 (g) Ester t-butyllque de benzyloxyGarbonyl-L-valyl-N ^-t-butyloxy-carbonyl-L-lysyl-L-valyl-L-tyrosyl-L-prolyl-3-t-butyl-L-aspartyl-L-alanyl-glycine L'ester d'heptapeptide (3,5 g) obtenu cl-dessus est hy-5 drogéné sur du noir de palladium en tant que catalyseur dans un mélange d'acide acétique à 10 ^-méthanol, pendant 3 heures. Après enlèvement du solvant par évaporation sous pression réduite, le résidu résultant est dissous dans l'acétate d'éthyle. La solution est agitée avec du carbonate de potassium à 50 # à 0°C. Ensuite, 10 la solution organique est séchée sur du sulfate de sodium et concentrée sous pression réduite, pour donner un résidu qui est dissous dans la diméthylformamide (30 ml). La solution est additionnée d'ester p-nitrophénylique de benzyloxycarbonyl-L-valine (1,29 g). On laisse le mélange reposer à 4°C pendant deux jours et on le 15 concentre sous pression réduite à une température de bain de 40 à 45°C pour donner vin résidu. Le résidu est soumis à la ehromatographie sur \ine colonne de gel de silice (de la société dite Merck, maille de 0,05 à. 0,2 mm, 100 g), et la colonne est lavée avec un mélange chloroforme-méthanol ayant tin gradient de concentration li-20 néaire en méthanol de 0 à 5 ^ en volume pour rassembler 50 fractions (20 g/tube). La colonne est encore développée avec un mélange méthanol-chloroforme (5 : 95, en volume/volume). Des fractions (tubes n° 52-62), contenant le peptide désiré, sont rassemblées et concentrées sous pression réduite pour donner un résidu. Le ré-25 sidu est traité à l'éther, lavé et séché pour donner 3,35 g du peptide désiré ; [a]2^-69»2-l,0° (c = 1,061, méthanol). Analyse calculée pour cgo®91^9®l6 : c» 60,34 ; H, 7*68 ; N, 10,55- Trouvé : C, 60,30; H, 7,84 ; N, 10,28. 0» Cr (h) Ester méthylique de N -benzyloxycarbonyl-N -nitro-L-arginyl-L-30 prollne Dans un mélange de chlorure de thionyle (1,6 ml) et de méthanol (2,0 ml), refroidi dans tin bain de sel-glace, on ajoute de la L-proline (2,30 g) et on laisse reposer le mélange h la température ambiante toute la nuit. Après enlèvement du solvant par 35 évaporation sous pression réduite, le résidu résultant est dissous dans du dichlorométhane. La solution est additionnée d'eau (2 ml) et agitée avec du carbonate de potassium à 50 % refroidi par de la glace (4 ml) à 0°G. La solution aqueuse est extraite à maintes reprises avec du dichlorométhane et les extraits sont combinés. 40 L'extrait est séché sur du sulfate de sodium et concentré sous 71 08969 37. 2085715 pression réduite à une température de 20°C pour donner l'ester méthylique de L-proline sous forme de résidu sirupeux. rr r® La N -benzyloxycarbony1-N -nitro-L-arginine (6,18 g) est dissoute dans du méthanol, et la solution est concentrée sous pres-5 sion réduite pour donner un résidu sirupeux, qui est dissous dans l'acétonitrile. Dans la solution, on ajoute l'ester méthylique de L-proline obtenu ci-dessus, et on ajoute de la dicyclohexylcarbodiimide (3,61 g) à la solution à 0°C. On laisse le mélange reposer à 4°C toute la nuit. Les précipités cristallins sont rassemblés 10 par filtration, lavés avec de l'acétonitrile froid et séchés sous pression réduite. Le produit résultant (9*98 g) est dissous dans du méthanol chaud, et on retire par filtration la dicyclohexylurée insoluble. Le filtrat est concentré sous pression réduite pour donner un résidu, qui est recristallisé dans l'acétonitrile pour don- pp «J_ 15 ner 5,75 g du produit désiré, fondant à l62-l63°C ; [a]D -50,9-0,4° (c = 2,022, méthanol). Analyse calculée pour C2oH28^6°7 : G* 6,08 î N, 18,09. Trouvé : C, 51,63 ï H, 6,14 j N, 17,92. (Y P (i) Ester méthylique de N -benzyloxycarbonyl-N -nitro-L-arginyl- 20 nG-nitro-L-arginyl-L-proline L'ester de dipeptide (4,12 g) obtenu ci-dessus est dissous dans l'acide acétique saturé d'acide bromhydrique gazeux (10 ml). On laisse la solution reposer à la température ambiante pendant 60 minutes. Des précipités amorphes séparés lors d'une addition d'é-25 ther sont rassemblés par filtration, bien lavés à l'éther et séchés sur des pastilles de soude sous pression réduite pour donner rt le bromhydrate de l'ester méthylique de N -nitro-L-arginyl-L-proline. La Na-benzyloxycarbonyl-NG-nitro-L-arginine (2,83 g) est 30 dissoute dans du tétrahydrofurane anhydre (2,5 ml), et on ajoute de la tri-n-butylamine (1,63 g). La solution est refroidie dans un bain de glace-sel, et, dans la solution, on ajoute goutte à goutte du chloroformiate d'éthyle (0,96 g). Le mélange est agité pendant 30 minutes dans un bain de glace-sel et, dans le mélange, on ajou-35 te une solution de bromhydrate d'ester de dipeptide (2,96 g) obtenu ci-dessus et de la tri-n-butylamine dans du dioxane (40 ml) contenant de l'eau (1 ml). Le mélange réactionnel est agité à 0°C pendant 3 heures et on le laisse reposer à 4°C toute 1p nuit. Après enlèvement du 40 solvant par évaporation sous pression réduite, le résidu résultant 38. 2085715 est dissous dans un mélange de n-butanol à 10 ^-acétate d'éthyle. La solution est lavée avec de l'acide chlorhydrique N et du carbonate de sodium M, séchée sur du sulfate de sodium et concentrée sous pression réduite pour donner un résidu. Le résidu est dissous 5 dans un mélange méthanol-chloroforme (5 : 95, en volume/volume, 30 ml) et la solution est soumise à une ehromatographie sur une colonne de gel de silice (de la Société dite Merck, maille de 0,05 à 0,2 mm, 60 g). La colonne est lavée successivement avec du chloroforme (600 ml), le mélange méthanol-chloroforme (5 : 95, en vo-10 lume/volume, 200 ml), un mélange méthanol-chloroforme (7 : 93, en volume/volume, 1.000 ml), un mélange méthanol-chloroforme (10 : 90, en volume/volume, 400 ml), et vin mélange méthanol-chloroforme (1 : 1, en volume/volune, 400 ml) pour éluer le peptide désiré. 15 Chaque fraction est vérifiée par ehromatographie sur couche mince, et les fractions contenant le peptide désiré sont combinées. La solution est concentrée sous pression réduite pour donner un résidu, qui est traité à l'acétate d'éthyle pour fournir des précipités gélatineux. Les précipités sont rassemblés par filtration, la-20 vés à l'acétate d'éthyle et séchés sous pression réduite pour fournir 3,8 g du peptide désiré, fondant entre 115 et 120°C avec décomposition ; [a]2^-37,l-0,8° (c = 0,967, acide acétique), -30,5 ±0,7° (c «s 0,950, diméthylformamide). Analyse calculée pour C26®39®*11010,H2® : C' ^5'^® * 6.05 ; N, 22,54. Trouvé : C, 45,52 } H, 5,92 i N,.22,85. 25 (j) Ester méthylique de Na-benzyloxycarbonyl-N ^-t-butyloxycarbonyl- rt n L-lysyl-N -nitro-L-arginyl-N -nitro-L-arglnyl-L-proline L'ester de tripeptide (3,7 g) obtenu ci-dessus est dissous dans de l'acide acétique (10 ml) saturé d'acide bromhydrique gazeux, et on laisse la solution reposer à la température ambian-30 te pendant 90 minutes. De l'éther anhydre est ajouté à la solution pour précipiter le bromhydrate d'ester de tripeptide. Les précipités sont recristallisés dans le mélange méthanol-éther pour donner 4.6 g de solide amorphe. Le produit présente une tache principale (Rf 0,64) et des taches moins importantes (Rf 0,44, 0,52) par 35 ehromatographie sur papier dans le système de solvants n-butanol-acide acétique-pyridine-eau = 30 : 6 : 20 : 24 en volume. La Na-benzyloxycarbonyl-N^-t-butyloxycarbonyl-L-lysine [préparée à partir du sel de dicyclohexylamine correspondant (3,05 g) par traitement avec le produit dit Dowex 50W x 8 (forme H+)] et 40 de la tri-n-butylamine (1,11 g) sont dissoutes dans du tétrahydro- 71 08969 39. 2085715 furane anhydre (20 ml), et la solution est refroidie dans un bain de glace-sel. Dans la solution, on ajoute du chloroformiate d'éthyle (0,65 g), et le mélange est agité dans un bain de glace-sel pendant 30 minutes. Dans le mélange, on ajoute une solution de 5 l'ester de tripeptide obtenu ci-dessus et de la tri-n-butylamine (2,0 g) dans du dioxane (30 ml) contenant de l'eau (3 ml), et le mélange résultant est agité à 0°C pendant 3 heures. Après avoir laissé le mélange reposer à 4°C toute la nuit, il est concentré sous pression réduite pour donner un résidu, qui est dissous dans 10 l'acétate d'éthyle contenant du n-butanol à 10 La solution est lavée successivement avec de l'acide chlorhydrique N et du carbonate de sodium M refroidis par de la glace, et séchée sur du sulfate de sodium. La solution est concentrée sous pression réduite pour donner un résidu, qui est reprécipité deux fois avec le mé-15 lange acétate d'éthyle-éther pour donner 3,82 g du produit désiré ; [a]29-37,9-0,7° (c = 1,064, méthanol). /y Ç r® (k) N -benzyloxycarbonyl-N -t-butyloxycarbonyl-L-lysyl-N -nitro-L- p arginyl-N -nitro-L-arginyl-L-proline L'ester de tétrapeptide (3,8 g) obtenu ci-dessus est dis-20 sous dans du méthanol (10 ml), et, dans la solution, on ajoute de la soude N (5,1 ml). Le mélange est mis à réagir à la température ambiante pendant 90 minutes et acidifié avec de l'acide chlorhydrique N (5,1 ml). Après enlèvement du méthanol par évaporation sous pression réduite, le résidu huileux résultant est extrait a-25 vec du n-butanol à 10 ^-acétate d'éthyle. Les extraits sont concentrés sous pression réduite pour donner un résidu, qui est recristallisé à partir du mélange méthanol-éther pour donner 2,6 g du produit désiré ; [a]2^-36,7-0,8° (c = 0,977, méthanol). Analyse calculée pour C^gH^N^O^^HgO : 30 6,67 ; N, 19,89. Trouvé : C, 47,64 j H, 6,43 î N, 19,28. (l) Ester t-butylique de Na-benzyloxycarbonyl-N^-t-butyloxycarbo- C* c nyl-L-lysyl-N -nitro-L-arginyl-N -nitro-L-arginyl-L-prolyl-L-valyl- N^-t -butyloxycarbonyl-L-lysyl-L-valyl-L-tyrosyl-L-prolyl-3-t-butyl-L-aspartyl-L-alanyl-glycine 35 La tripeptide (1,19 g) obtenu ci-dessus est dissous dans du méthanol (1,5 ml), et, dans la solution, on ajoute de l'acide acétique (1 ml). La solution est hydrogénée sur du noir de palladium en tant que catalyseur dans un courant d'hydrogène pendant 4 heures. Après enlèvement du solvant par évaporation sous pression 40 réduite, le résidu résultant est dissous dans l'acétate d'éthyle. 71 08969 40. 2085715 La solution est refroidie et agitée avec du carbonate de potassium à 50 % froid. La phase organique est séchée sur du sulfate de sodium et concentrée sous pression réduite pour donner le diester d*octapeptide. Le diester d1octapeptide est dissous dans la dimé-5 thylformamide (30 ml), et, dans la solution, on ajoute une solution de N®-benzyloxycarbonyl-N^-t-butyloxycarbonyl-L-lysyl-NG-nitro-L- n arginyl-N -nitro-L-arginyl-L-proline (1,32 g), de N-hydroxysucci-nimide (0,173 g) et de dicyclohexylcarbodiimide (0,310 g) dans la diméthylformamide. On laisse le mélange reposer à 4°c pendant deux / 10 jours et la dicyclohexylurée séparée est retirée par filtration. Le filtrat est concentré sous pression réduite à une température de bain de 40 à 45°C pour donner un résidu, qui est soumis à la purification par ehromatographie sur vme colonne de gel de silice (de la Société dite Merck, maille de 0,05 à 0,2 mm, 40 g). La co-15 lonne qui a été préalablement préparée avec le mélange méthanol-chloroforme (2 î 98, en volume/volume) est développée avec le même solvant pour rassembler 50 fractions (10 ml/tube), et la colonne est encore développée avec le mélange méthanol-chloroforme (15 ; 85, en volume/volume). Des fractions (tubes n° 34-66) sont eombi-20 nées et concentrées sous pression réduite pour donner un résidu, qui est dissous dans l'acétate d'éthyle et traité avec le mélange méthanol-acétate d'éthyle pour précipiter le produit désiré (rendement 1,73 g) ; [ a] p2-78,5-1,1° (c = 1,030, méthanol). Analyse calculée pour c88î*l40N22°26'**2® : c» 54,48 ; H, 25 7,38 j N, 15,88. Trouvé : C, 54,l4 ; H, 7,53 î N, 15,88. r (m) Ester t-butyllque de N -t-butyloxycarbonyl-L-lysyl-L-arginyl-L- arginyl-L-prolyl-L-valyl-N^-t-butyloxycarbonyl-L-lysyl-L-valyl-L- tyrosyl-L-prolyl-3-t-butyl-L-aspartyl-L-alanyl-glycine. L'ester de dodécapeptide (577 mg) obtenu ci-dessus est 30 hydrogéné sur du palladium en tant que catalyseur dans de l'acide acétique à 90 % (15 ml) toute la nuit. Après enlèvement du solvant par évaporation sous pression réduite, le résidu est lyophilisé à partir de l'eau et séché sur des pastilles de soude sous pression réduite pour donner 570 mg du produit désiré. Le rapport d'amino-35 acides d'un hydrolysat par un acide est le suivant s acide aspar-tique 1,19, proline 2,29, glycine 1,00, alanine 0,99, valine 2,15, tyrosine 0,91, lysine 2,11, arginine 1,96. Analyse calculée pour c8oh136n20°20 • 2ch^c00h. 4h20 : c, 53,37 î h, 8,11 j N, 14,82 j ch^co, 4,55. Trouvé ï c, 53,07, h, 40 7,57 ; N, 14,82 ; ch^co, 4,57. 71 08969 W' 2085715 (n) Ester t-butylique de N^-t-butyloxycarbonyl-L-lysyl-L-prolyl-L-valyl-glycyl-N 6-t-butyloxycarbonyl-L-lysyl-H^-t-butyloxycarbo-nyl-L-lysyl-L-arginyl-L-arRinyl-L-prolyl-L-valyi-N^-t-butyloxycar-bonyl-L-lysyl-L-valyl-L-tyrosyl-L-prolyl-g-t-butyl-L-aspartyl-L-5 alanyl-glycine L'hydrazide de Na-benzyloxycarbonyl-N^-t-butyloxycarbonyl-L-lysyl-L-prolyl-L-valyl-glycyl-N^-t-butyloxycarbonyl-L-lysine (0,492 g) [préparé selon le procédé décrit dans Bull. Chem. Soc. Japan 2X 1.471 (1964)] est dissous dans la diméthylformamide (4 10 ml) et la solution est refroidie avec de la glace. Dans la solution, on ajoute de l'acide chlorhydrique N (1,375 ml) et du nitrite de sodium 2M (0,303 ml) refroidis par de la glace, et le mélange est agité à 0°C pendant 4 minutes. L'azothydrure résultant est extrait avec de l'acétate d'éthyle refroidi par de la glace et les extraits 15 sont combinés. L'extrait est lavé avec line solution de bicarbonate de sodium saturée froide et séché sur du sulfate de sodium. L'azothydrure ainsi obtenu est ajouté à une solution du dodécapeptide (0,275 mmole) obtenu ci-dessus et de triéthylamine (0,127 ml) dans une solution aqueuse de diméthylformamide (4 ml) contenant de l' 20 eau (0,2 ml). Le mélange réactionnel est concentré sous pression réduite à une température de bain de 10°C à 15°C jusqu'à ce que le mélange devienne clair. On laisse la solution reposer à 4°C pendant 24 heures et, dans la solution, on ajoute 1!azothydrure de pentapeptide (préparé à partir de 0,138 mmole de 1'hydrazide cor-25 respondant par le procédé tel que décrit ci-dessus). On laisse le mélange reposer à la même température toute la nuit, et le solvant est retiré par évaporation sous pression réduite pour donner un résidu, qui est précipité par addition d'éther. Les précipités sont dissous dans le mélange n-butanol-acétate d'éthyle (1:2, 30 en volume/volume) et la solution est lavée avec de l'acide acétique N. La solution organique est séchée sur du sulfate de sodium et lyophilisée à partir d'acide acétique pour donner l'ester d' heptadécapeptide (1,12 g). Le peptide obtenu ci-dessus est hydrogéné sur du palla-35 dium en tant que catalyseur dans l'éthanol en présence d'acide a-cétique pendant 90 minutes. Après enlèvement du solvant par évaporation sous pression réduite, le résidu résultant est lyophilisé à partir de l'acide acétique (rendement 1,007 g). Une partie (0,37 g) du lyophilisât est soumise à la puri-40 fication par filtration sur gel sur vme colonne (2,3 x 143 cm) du 71 08969 42. 2085715 produit dit Sephadex G-25 en utilisant de l'acide acétique à 20 Chaque fraction de 5 ml est rassemblée et on enregistre l'absorption à 275 nu*. Les fractions (tubes n° 32-45) contenant le peptide désiré sont rassemblées, concentrées et lyophilisées à partir d'a-5 cide acétique pour donner 0,21 g de l'ester d'heptadécapeptide ; [a]jjp—74,2^1,6° (c = 0,667, acide acétique à 50 #). (o) a-aminoisobutyryl-L-tyrosyl-L-séryl-L-méthlonyl-L-glutamyl-L-histidyl-L-phénylalanyl-L-arglnyl-L-tryptophyl-glycyl-L-lysyl-L-prolyl-L-valyl-glycyl-L-lysyl-L-lysyl-L-arginyl-L-arginyl-L-pro-10 lyl-L-valyl-L-lysyl-L-valyl-L-tyrosyl-L-prolyl-L-aspartyl-L-alanyl-glycine Dans une solution de benzyloxycarbonyl-a-aminoisobutyryl-0-benzyl-L-tyrosyl-L-séryl-L-raéthionyl-?Cbenzyl-L-glutamyl-L-his-tidyl-L-phénylalanyl-L-arginyl-L-tryptophyl-glycine [préparée se-15 Ion le procédé décrit dans l'exemple 1 (k)] dans l'acide acétique, on ajoute de l'acide chlorhydrique gazeux N dans l'acide acétique (0,45 ml), et le mélange est immédiatement lyophilisé, suivi d'un séchage sous pression réduite sur des pastilles de soude. Le chlorhydrate de décapeptide résultant est dissous dans la diméthylfor-20 mamide (3 ml) avec de la N-hydroxysuccinimide (0, 083 g), et, dans la solution, on ajoute une solution de dicyclohexylcarbodiimide (0,15 g) dans la diméthylformamide (2 mi). On laisse le mélange reposer à 4°C pendant 24 heures et la dicyclohexylurée précipitée est retirée par filtration. Le filtrat est déversé dans un mélan-25 ge acétate d'éthyle-éther refroidi par de la glace (1:1, en volume/volume, 100 ml), et les précipités qui s'étaient formés sont rassemblés par filtration. Les précipités sont lavés avec de l'acétate d'éthyle et de l'éther et séchés sous pression réduite pour donner l'ester actif de décapeptide. 30 L'acétate d'ester d'heptadécapeptide (0,300 g) obtenu ci- dessus est dissous dans de la diméthylformamide (3 ml), et on a-joute de la triéthylamine (0,17 ml). La solution est mélangée avec une solution de l'ester de décapeptide obtenu ci-dessus dans la ' diméthylformamide et le mélange (volume total : 5 ml) est agité à 35 4°C pendant trois jours. Le mélange réactionnel est introduit dans de l'acétate d'éthyle refroidi par de la glace (50 ml), et on a-joute de l'éther (50 ml). Les précipités formés sont rassemblés par filtration, lavés à l'éther et séchés sous pression réduite pour donner l'heptacosapeptide protégé brut (0,60 g). 40 L'heptacosapeptide protégé obtenu ci-dessus est placé 71 08969 43. 2085715 10 15 20 25 30 35 dans un récipient de réaction constitué de polyéthylène fluoré, en même temps que de la méthionine (0,1 g) et de l'anisol (0,6 al), et on introduit de l'acide fluorhydrique gazeux dans le récipient réactionnel dans un bain d1acétone-glace sèche. Le nélange réactionnel (environ 20 ml) est agité à la température ambiante pendant 40 minutes et concentré sous pression réduite pour donner un résidu, qui est dissous dans de l'eau et de la glace. La solution est lavée avec du chloroforme et passée à travers une colonne (1,4 x 30 cm) de produit dit Amberlite CG-4B (forme acétate). La colonne est bien lavée avec des parties d'eau et les solutions aqueuses t éluées sont combinées. La solution est concentrée sous pression réduite et lyophilisée. Le peptide résultant (0,41 g) est soumis à la purification par ehromatographie sur une colonne (2,2 x 30 cm) de carboxyméthylcellulose (dite Serva, 0,56 meq/g) avec un tampon d'acétate d'ammonium (pH 6,5, 2.000 ml) ayant un gradient de concentration linéaire de 0,02 à 0,6 M. L'absorption à 280 vcji est enregistrée et des fractions (10 ml/tube) sont rassemblées. Les fractions P-I (tubes n° 91-104) et P-II (tubes n° 105-130) correspondant à un pie principal sont séparément rassemblées. La masse du solvant est retirée par évaporation et le résidu est lyophilisé à maintes reprises jusqu'à poids constant. Les fractions F-I et P-II s'élèvent respectivement à 100 mg et 180 mg de l'heptacosapeptide débloqué. P-II est chromatographié à nouveau sur de la carboxyméthylcellulose, de la même manière que celle indiquée ci-dessus, pour donner F-II-1 (80 mg) et F-II-2 (85 mg) comme première moitié et comme reste du pic principal, respectivement. F-I et F-II-1 sont combinés (180 mg) et chromatographiés à nouveau pour donner le peptide désiré assez pur, tel qu'on peut en juger d'après la ehromatographie sur couche mince sur une plaque de cellulose dans un système de solvants n-butanol-acide acétique-pyridine-eau = 30 : 6 : 20 : 24 en volume. Une partie de 147 mg du produit obtenu ci-dessus est soumise à la ehromatographie sur vme colonne (2,0 x 30 cm) de carboxyméthylcellulose (dite Whatman CM-52) en utilisant un tampon d'acétate d'ammonium (pH 6,5, 2.000 ml) avec un gradient de concentration linéaire de 0,02 à 0,5 M. Les fractions correspondant à un seul pic sont combinées, évaporées et lyophilisées pour donner 71 08969 M. 2085715 Le rapport d1aminoacides dans l'hydrolysat par un acide est le suivant : acide aspartique 0,99, sérine 0,89, acide glutamique 1,00, proline 3,93, glycine 3,00, alanine 1,02, valine 2,80, méthionine 1,01, tyrosine 1,90, phénylalanine 0,99, acide a-amino-5 isobutyrique 1,19, lysine 4,52, histidine 1,22, arginine 2,91. Le rapport tryptophane/tyrosine dans l'heptacosapeptide intact a été déterminé par voie spectrophotométrique à une valeur de 0,54. EXEMPLE 4 (a) Ester méthylique de benzyloxycarbonyl-L-valyl-L-tyroslne 10 La benzyloxycarbonyl-L-valine (5,78 g) et l'ester méthy lique de L-tyrosine (4,49 g) sont dissous dans de la diméthylformamide (10 ml) et, dans cette solution, on ajoute de la dicyclohexylcarbodiimide (4,75 g) avec du dichlorométhane (50 ml) à 0°C. Le mélange est maintenu à 4°C toute la nuit. La dicyclohexylurée qui s' 15 est séparée est retirée par filtration et le filtrat est évaporé sous pression réduite. Le résidu est dissous dans de l'acétate d'éthyle et la solution est lavée avec de l'acide chlorhydrique N et du bicarbonate de sodium M, et séchée sur le sulfate de magnésium. L'évaporation du solvant donne un résidu cristallin qui est recris-20 tallisé à partir du mélange acétate d'éthyle-éther ; rendement 8,47 g, point de fusion 154-155°C ; [a]22-l8,3-0,6° (c = 0,98, méthanol). Analyse calculée pour C23H28H2°6 : C' ^4,47 ; H, 6,59 , N, 6,54. Trouvé : C, 64,58 ; H, 6,62 ; N, 6,58. 25 (b) Hydrazide de benzyloxycarbonyl-L-valyl-L-tyrosine Dans une solution d'ester méthylique de benzyloxycarbonyl-L-valyl-L-tyrosine (6,42 g) dans la diméthylformamide (10 ml) et dans l'éthanol (30 ml), on ajoute de l'hydrate d'hydrazine (1,8 ml) et on laisse reposer le mélange à la température ambiante pendant 30 24 heures. Les cristaux séparés sont filtrés, lavés avec de l'éthanol froid et de l'éther et séchés sur de l'acide sulfurique sous pression réduite ; rendement 6,26 g, point de fusion 243 - 244°C PP + (décomposition), [a]D -12,0-0,5° (c = 1,01, diméthylformamide). Analyse calculée pour C^HggN^O^ : C, 61,67; H, 6,59 ; 35 N, 13,08. Trouvé-: C, 61,50 ; H, 6,8l ; N, 12,54. (c) Ester méthylique de benzyloxycarbonyl-L-valyl-L-tyrosyl-L-pro-llne Dans du méthanol (20 ml) préalablement refroidi avec un bain de sel-glace, on ajoute goutte à goutte du chlorure de thio-40 nyle (1,5 ml) et puis de la L-proline (2,0 g). Le mélange est main 71 08969 45. 2085715 tenu à la température ambiante toute la nuit et évaporé sous pression réduite. Le résidu sirupeux résultant est dissous dans l'eau (environ 5 ml) et du dichlorométhane (20 ml) est ajouté. Le mélange est refroidi et est agité avec du carbonate de potassium à 50 % 5 refroidi par de la glace (10 ml). La pha&e aqueuse est extraite à maintes reprises avec du dichlorométhane. Les extraits organiques sont combinés, séchés sur du sulfate de magnésium et évaporés sous pression réduite pour donner l'ester méthylique de L-proline sous forme de base libre. 10 Dans une solution refroidie d!hydrazide de benzyloxycarbo- nyl-L-valyl-L-tyrosine (6,0 g) dans la diméthylformamide (20 ml) et dans de l'acide chlorhydrique N (35 ml), on ajoute du nitrite de sodium 2M refroidi par de la glace (7,7 ml), et le mélange est agité à 0°C pendant 4 minutes, après quoi 1'azothydrure d'acyldi-15 peptide est extrait deux fois avec de l'acétate d'éthyle refroidi par de la glace. Les extraits organiques sont combinés, lavés avec du bicarbonate de sodium M refroidi par de la glace et séchés sur du sulfate de magnésium. Une solution de 1'azothydrure ainsi obtenu est ajoutée à l'ester méthylique de L-proline préparé ci-dessus 20 et le mélange est maintenu à 4°0 pendant deux jours. Le mélange réactionnel est alors lavé avec de l'acide chlorhydrique N, de 1' eau et du bicarbonate de sodium M, sëuhé sur du sulfate de magnésium et évaporé sous pression réduite. Le résidu résultant (5,9 g) est dissous dans le mélange méthanol-chloroforme o '• 95, en volu-25 me/volume) et la solution est soumise à une colonne de gel de silice (E. Merck, 0,05 - 0,2 mm, 170 g) qui a été préparée a/ec le même mélange méthanol-chloroforme. Ce système de scivants est également utilisé pour l'élution. Les fractions contenant un composant principal (Rf = 0,57, brûlage à l'acide sulfurique) dans une 30 ehromatographie sur couche mince (gel de silice G, mélange méthanol-chloroforme 1 : 9, en volume/volume, en tant que solvant) sont rassemblées et évaporées sous pression réduite pour fournir le tripeptide désiré sous forme d'un résidu en mousse ; rendement 5,44 g, [a]22-60,6-1,0° (c = 1,01, méthanol). 35 Analyse calculée pour CggH^^N^O^. ; C, fc>3,98 ; H, 6,71 ; N, 8,00. Trouvé : C, 63,70 î H, 6,77 î N, 8,00. Ot »* (d) Ester méthylique de N -benzyloxycarbonyl-K"-t-butyloxycarbonyl-L-lysyl-L-valyl-L-tyrosyl-L-proline L'ester méthylique de benzyloxycarbonyl-L-valyl-L-tyrosyl-40 L-proline (2,63 g) est dissous dans du méthanol et est hydrogéné 71 08969 H6. 2085715 sur du palladium pendant 3 heures. Après enlèvement du catalyseur par filtration, le solvant est évaporé sous pression réduite pour donner l'ester méthylique de L-valyl-L-tyrosyl-L-proline sous forme d'une base libre. La Na-benzyloxyearbonyl-NLi-t-butyloxyearbonyl-5 L-lysine (obtenue à partir du sel de dicyclohexylamine (2,82 g) à la manière ordinaire) et l'ester de tripeptide obtenu ci-dessus sont dissous dans du dichlorométhane et on y ajoute une solution dans le dichlorométhane de dicyclohexylcarbodiimide (1,03 g) à. 0°C, Le mélange est maintenu à 4°C toute la nuit et, après enlèvement 10 de la dicyclohexylurée séparée, le solvant est évaporé sous pression réduite. Le résidu est dissous dans l'acétate d'éthyle et la solution est lavée avec de l'acide chlorhydrique N refroidi par de la glace, de l'eau et du bicarbonate de sodium M, et séché sur du sulfate de magnésium. L'enlèvement du solvant par évaporation sous 15 pression réduite donne un résidu incolore moussant, qui est précipité à partir du mélange acétate d'éthyle-éther ; rendement 3,61 g ; [a]p2-56,3-1,0° (c = 1,00, méthanol). Analyse calculée pour c^h^n^o^q : C, 62,13 i h, 7,35 i N, 9,29. Trouvé : c, 62,13 ; H, 7,35 ; N, 9,20. 20 (e) Ester méthylique de benzyloxycarbonyl-L-valyl-N^-^-butyloxycar-bonyl-L-lysyl-L-valyl-L-tyrosyl-L-proline L'ester méthylique de Na-benzyloxycarDonyl-N ''-t-butyloxy-carbonyl-L-lysyl-L-valyl-L-tyrosyl-L-proline (1,51 g) est hydrogéné dans le méthanol sur du palladium pendant 3 heures. Après que 25 le catalyseur ait été séparé par filtration, le filtrat est évaporé sous pression réduite pour donner 1:ester méthylique de N^-t-butyloxycarbonyl-L-lysyl-L-valyl-L-tyrosyl-L-proline sous forme de résidu en mousse. L'ester de tétrapeptide est dissous dans le dichlorométhane avec la benzyloxycarbonyl-L-valine (0,50 g) et on 30 y ajoute à 0°C line solution de dicyclohexylcarbodiimide (0,41 g) dans le dichlorométhane. On laisse le mélange reposer à 4°C toute la nuit. La dicyclohexylurée séparée est retirée par filtration et le filtrat est évaporé sous pression réduite. Le résidu est redissous dans l'acétate d'éthyle et la solution est successivement la-35 vée avec de l'acide chlorhydrique N refroidi par de la glace, de 1'eau et du bicarbonate de sodium M, séchée sur du sulfate de magnésium et évaporée sous pression réduite. Le résidu résultant est précipité avec le mélange acétate d'éthyle-éther (1,43 g) et reprécipité avec de l'acétonitrile ; rendement 1,14 g; [a]p2-66,4-l,l° 40 (c = 1,03, méthanol). 71 08969 47. 2085715 Analyse calculée pour c44H64^6°n : c, 61,95 » H, 7,56 ; N, 9,85. Trouvé : C, 61,87 î H, 7,66 ; N, 10,05. (f) Ester méthylique de Ng-ben2yloxycarbonyl-NE,-t-butyloxycarbonyl-L-lysyl-N^-nltro-L-arp;lnyl-Ng-nltro-L-arglnyl-prolyl-L-valyl-Hfc-t- 5 butyloxycarbonyl-L-lysyl-L-valyl-L-tyrosyl-L-proline L'ester méthylique de benzyloxycarbonyl-L-valyl-N^-t-bu-tyloxycarbonyl-L-lysyl-L-valyl-L-tyrosyl-L-proline (0,51 g) est hydrogéné dans du méthanol sur du palladium pendant 3 heures. Le catalyseur est filtré et le solvant est retiré par évaporation sous 10 pression réduite. Le résidu est séché sur des pastilles de soude, puis il est dissous dans la diméthylformamide (2 ml). Dans cette solution, on ajoute la Na-benzyloxycarbonyl-N^-t-butyloxycarbony1- n f* L-lysyl-N -nitro-L-arginyl-N -nitro-L-arginyl-L-proline (0,53 g) et de la N-hydroxysuccinimlde (0,10 g), et une solution de dicy-15 clohexylcarbodiimide (0,19 g) dans le dichlorométhane (8 ml) est introduite à 0°C. Le mélange est maintenu à 4°C pendant 2 jours et puis on l'ajoute goutte à goutte dans xm mélange acétate d'éthyle-éther (1 : 10, 100 ml) pour fournir des précipités qui sont lavés à l'éther et séchés (1,13 g). Ces précipités sont dissous dans le 20 mélange méthanol-chloroforme (1 : 9, en volume/volume) et la solution est soumise à l'action d'une colonne de gel de silice (E. Merck, 0,05 - 0,2 mm, 40 g) qui a été préparée avec le mélange méthanol-chloroforme (1 : 9, en volume/volume). L'élution est réalisée avec le même système de solvants. Les fractions contenant un 25 composant principal (Rf = 0,25, brûlage dans l'acide sulfurique) dans une ehromatographie sur couche mince (gel de silice G, système méthanol-chloroforme 1 : 9 en volume/volume en tant que solvant) sont rassemblées, évaporées sous pression réduite et lyophilisées à partir d'acide acétique pour donner le nonapeptide désiré ; ren-30 dement 0,48 g, [oc]22-74,8il,2° (c = 1,00, méthanol). Analyse calculée pour cy2H113N19°21*H2° : C' 54,09 ; H, 7,25 ; N, 16,65. Trouvé : C, 54,06 ; H, 7,35 î N, 16,40. (g) Ester méthylique de N^-t-butyloxycarbonyl-L-lysyl-L-prolyl-L-valy1-glycy1-N^-t-butyloxycarbonyl-L-lysyl-N£-t-butyloxycarbonyl- 35 L-lysyl-L-arginyl-L-arginyl-L-prolyl-L-valyl-Ng-t-butyloxycarbonyl-L-lysyl-L-valyl-L-tyrosyl-L-proline L'ester méthylique de Na-benzyloxycarbonyl-Nt-t-butyloxy-carbonyl-L-lysyl-L-nitroarginyl-L-nitroarginyl-L-prolyl-L-valyl-N6*-t-butyloxycarbonyl-L-lysyl-L-valyl-L-tyrosyl-L-proline (0,39 g) est 40 soumis à une hydrogénolyse sur du palladium dans de l'acide acétique 71 08969 18. 2085715 à 90 % pendant 6 heures. Après enlèvement du solvant par évaporation sous pression réduite, le résidu est lyophilisé à partir d'acide acétique pour donner l'ester méthylique de N^-t-butyloxyear-bonyl-L-lysyl-L-arginyl-L-arginyl-L-prolyl-L-valyl-N^-t-butyloxy-5 carbonyl-L-lysyl-L-valyl-L-tyrosyl-L-proline (0,42 g). Dans une solution refroidie d'hydrazide de Na-benzyloxy-carbonyl-N^-t-butyloxycarbonyl-L-lysyl-L-prolyl-L-valyl-glycyl-N^-t-butyloxycarbony1-L-lysine (0,32 g) dans du tétrahydrofurane à 90 ^ (5 ml), on ajoute successivement de l'acide chlorhydrique N 10 refroidi par de la glace (0,9 ml) et du nitrite de sodium 2 M (0,2 ml) et le mélange est agité à 0°C pendant 4 minutes. Dans cette solution, on ajoute alors de l'acétate d'éthyle refroidi par de la glace (15 ml) et du bicarbonate de sodium M (5 ml). La couche organique est lavée à nouveau avec du bicarbonate de sodium M re-15 froidi par de la glace et séchée sur du sulfate de magnésium à 0°C. La solution résultante de 1'azothydrure de pentapeptide est ajoutée à ton mélange du nonapeptide obtenu ci-dessus et de triéthylamine (0,067 ml) dans de la diméthylformamide (3 ml). Le mélange est concentré sous pression réduite à une température de bain de 20 20°C jusqu'à ce que le précipité qui s'est séparé disparaisse et est maintenu à 4°C pendant deux jours. Une quantité supplémentaire de 1'azothydrure (préparé à partir de 0,18 mmole de 1'hydrazide tel qu'indiqué ci-dessus) est ajoutée. Le mélange est maintenu à 4°C toute la nuit et est alors introduit dans l'éther (100 ml). 25 Les précipités qui se sont séparés sont filtrés, lavés à l'éther et séchés sous pression réduite (0,68 g). La reprécipitation avec le mélange méthanol-acétate d'éthyle donne une préparation brute d'ester méthylique de Na-benzyloxycarbonyl-N^-t-butyloxycarbonyl- ç c L-lysyl-L-prolyl-L-valyl-glycyl-N -t-butyloxycarbony1-L-lysyl-N - 30 t-butyloxycarbonyl-L-lysyl-L-arginyl-L-arginyl-L-prolyl-L-valyl- N^-t-butyloxycarbonyl-L-lysyl-L-valyl-L-tyrosyl-L-proline (0,65 g). Une partie de 0,200 g du tétradécapeptide obtenu ci-dessus est hydrogénée sur du palladium dans de l'acide acétique à 90 % pendant 3 heures et demie. Après enlèvement du solvant par 35 évaporation sous pression réduite, le résidu est lyophilisé à partir de l'acide acétique pour donner une préparation brute du tétradécapeptide libre en Na. Il est alors soumis à la purification par ehromatographie sur une colonne (1,7 * 33 cm) de carboxyméthylcellulose (dite Serva, 0,70 meq/g) en utilisant un tampon d'acétate 40 d'ammonium (pH 5,9* 2.000 ml) avec un gradient de concentration 71 08969 *9. 2085715 linéaire de 0,005 - 0*25 M. Des fractions de 8 ml sont rassemblées et on enregistre leur capacité d'absorption à 275 ^ « Les fractions correspondant à un pic principal (tubes 131-140) sont rassemblées et la masse du solvant est retirée par évaporation sous 5 pression réduite. La lyophilisation ultérieure du résidu donne une pi préparation pure du peptide désiré ; rendement 0,154 g ; [a]^ -67,0±2° (c = 0,551, méthanol). (h) Hydrazide de benzyloxycarbonyl-a-aminoisobutyryl-L-tyrosyl-L-séryl-L-méthionine 10 Dans une solution refroidie par de la glace d'hydrazide de benzyloxycarbonyl-a-aminoisobutyryl-L-tyrosine (2,3 g) dans de l'acide chlorhydrique N (15 ml), on ajoute goutte à goutte du nitrite de sodium 2 M refroidi par de la glace (3,0 ml) et le mélange est agité pendant 4 minutes, puis, après ce temps, 1'azothydrure est 15 extrait avec de l'acétate d'éthyle refroidi par de la glace. L'extrait organique est lavé trois fois avec du bicarbonate de sodium M refroidi par de la glace et séché sur du sulfate de magnésium à 0°G. Une solution dans l'acétate d'éthyle de 1'azothydrure de dipeptide ainsi obtenu est ajoutée à une solution d'ester méthylique 20 de L-séryl-L-méthionine (obtenue à partir de 5 roraoles d'ester méthylique de t-butyloxycarbonyl-L-séryl-L-méthionine) dans la diméthylformamide (5 ml) et le mélange est maintenu à 4°C pendant 65 heures. Quand la réaction est terminée, le mélange est lavé successivement avec de l'acide chlorhydrique N,* de l'eau et du biearbo-25 nate de sodium M, séché sur du sulfate de magnée font et évaporé sous pression réduite pour donner un résidu à l'aspect de mousse, qui est reprécipité deux, fois à partir du mélange acétate d'éthyle-éther pour donner une préparation brute de l'ester méthylique de tétrapeptide (2,8l g).- L'ester brut est alors dissous dans de l'al-30 cool éthylique (25 ml) et on introduit de l'hydrate d'hydrazine (2,4 ml). Le mélange est maintenu à la température ambiante toute la nuit, La majeure partie du solvant est retirée par évaporation sous pression réduite et le résidu est agité avec de l'eau (10 ml) et de l'acétate d'éthyle (20 ml). La couche aqueuse est extraite 35 à l'acétate d'éthyle encore deux fois. Les solutions organiques sont combinées et lavées à l1eau. Des précipités gélatineux, qui se sont séparés lors de l'évaporation de la solution d'acétate d'éthyle, sont rassemblés, lavés avec de l'acétate d'éthyle froid et de l'éther et séchés sous pression réduite (2,47 g). La reprécipi-40 tation du mélange éthanol-aoétate d'éthyle donne 1'hydrazide de BAD OB1G1NAL 71 08969 50. 2085715 tétrapeptide pur. Rendement : 1,86 g. (i) Benzyloxycarbonyl-a-aiainoisobutyryl-L-tyrosyl-L-séryl-L-mé-thionyl-y-benzyl-L-glutamyl-L-histidyl-L-phénylalanyl-L-arginyl-L-tryptophyl-glyeine 5 La t-butyloxycarbonyl-T-benzyl-L-glutamyl-L-histidyl-L- phénylalanyl-L-arginyl-L-tryptophyl-glycine (0,23 g) est dissoute dans l'acide trifluoracétique (environ 1,5 ml) et le mélange est maintenu à la température ambiante pendant 30 minutes. L'addition d'éther donne des précipités qui sont filtrés, lavés à l'éther et 10 séchés pour donner l'hexapeptide libre en position Na (0,24 g). L'hydrazide de benzyloxycarbonyl-oc-aminoisobutyryl-L-ty-rosyl-L-séryl-L-méthionine (0,25 g) est dissous dans de la diméthylformamide (1 ml) et on ajoute de l'acide chlorhydrique N (1 ml). Le mélange est refroidi dans de la glace et on lui ajoute du 15 nitrite de sodium 2M refroidi par de la glace (0,22 ml). L'azothy-drure résultant est extrait avec de l'acétate d'éthyle refroidi par de la glace. L'extrait organique est lavé avec du bicarbonate de sodium M refroidi par de la glace, séché sur du sulfate de magnésium, et est alors combiné avec une solution de l'hexapeptide 20 obtenu ci-dessus et de la triéthylamine (0,125 ml) dans de la diméthylformamide (5 ml). Le mélange est concentré sous pression réduite à une température de bain de 15-20°C jusqu'à ce qu'il devien ne clair et est maintenu à 4°C pendant 40 heures. Le mélange réactionnel est alors introduit dans le mélange acétate d'éthyle-éther 25 (1:1 en volume, 100 ml) et les précipités qui sont séparés sont filtrés, lavés avec de l'acétate d'éthyle et de l'éther et lyophilisés à partir d'acide acétique (0,32 g). (j) Ester méthylique de a-aminoisobutyryl-L-tyrosyl-L-séryl-L-mé-thionyl-L-glutamyl-L-histidyl-L-phénylalanyl-L-arginyl-L-trypto-30 phyl-glycyl-L-lysyl-L-prolyl-L-valyl-glycyl-L-lysyl-L-lysyl-L-ar-ginyl-L-arginyl-L-prolyl-L-valyl-L-lysyl-L-valyl-L-tyrosyl-L-pro-line Dans tine solution de benzyloxycarbonyl-oc-aminoisobutyryl~ L-tyrosyl-L-séryl-L-méthionyl-^T-benzyl-L-glutamyl-L-histidyl-L-25 phénylalanyl-L-arginyl-L-tryptophyl-glycine (0,257 g) dans de l'acide acétique, on ajoute de l'acide chlorhydrique N dans l'acide acétique (0,3 ml) et le mélange est immédiatement lyophilisé et sé ché sous pression réduite sur des pastilles de soude. Le chlorhydrate de décapeptide résultant est dissous dans de la diméthyl-40 formamide (3 ml) avec de la N-hydroxysuccinimide (0,069 g) et on 71 08969 51. 2085715 ajoute de la N,N'-dicyclohexylcarbodiimide (0,12 g). On laisse le mélange reposer à 4°C pendant 24 heures et l'urée qui s'est séparée est retirée par filtration. Le filtrat est alors introduit dans un mélange acétate d'éthyle-éther, refroidi par de la glace 5 (1 s 1 en volume) et les précipités qui sont formés sont rassemblés par filtration, lavés avec de l'acétate d'éthyle et de l'éther et séchés sous pression réduite pour donner l'ester actif de décapeptide (0,29 g). ^ Le tétradécapeptide, l'acétate d'ester méthylique de M -10 t-butyloxycarbonyl-L-lysyl-L-prolyl-L-valyl-glycyl-N ^-t-butyloxy-carbonyl-L-lysyl-N^-t-butyloxycarbonyl-L-lysyl-L-arginyl-L-argi-nyl-L-prolyl-L-valyl-N ^-t-butyloxycarbonyl-L-lysyl-L-valyl-L-ty-rosyl-L-proline (0,248 g), est dissous dans de la diméthylformamide (2 ml) et on ajoute de la triéthylamine (0,15 ml). Dans cette 15 solution, on ajoute une solution dans la diméthylformamide de 1' ester actif du décapeptide obtenu ci-dessus et le mélange est maintenu à 4°C pendant 48 heures. Le mélange réactionnel est alors introduit dans de l'acétate d'éthyle refroidi par de la glace (100 ml) et les précipités qui se sont séparés sont filtrés, lavés à 20 l'acétate d'éthyle et à l'éther, lyophilisés à partir de l'acide acétique et séchés sur des pastilles de soude sous pression réduite, en fournissant le tétracosapeptide protégé brut (0,48 g). Le peptide protégé (0,20 g) obtenu ci-dessus est traité avec de l'acide fluorhydrique gazeux anhydre à 0°C pendant 90 mi-25 nutes, à la manière ordinaire, en présence de méthionine (0,05 g) et d'anisol (0,2 ml) sous forme de produits de balayage radicalai-res. Après enlèvement de l'acide fluorhydrique gazeux par évaporation sous pression réduite, le résidu est dissous dans l'eau et la solution est lavée à l'acétate d'éthyle. La solution aqueuse 30 est alors passée à travers une colonne de produit dit Amberlite CG-400 (forme acétate) ; la colonne est lavée avec des parties d'eau. La solution combinée est concentrée sous pression réduite et lyophilisée. Le peptide débloqué brut ainsi obtenu est soumis à une ehromatographie sur une colonne de carboxyméthylcellulose 35 (dite Serva, 0,70 meq/g) en utilisant un tampon d'acétate d'ammonium (pH 6,5, 2.000 ml) avec un gradient de concentration linéaire de 0,02 - 0,6 M, de la même manière que celle décrite dans l'exemple 2. On obtient ainsi l'ester méthylique de a-aminoisobutyryl-L-tyrosyl-L-séryl-L-méthionyl-L-glutamyl-L-histidyl-L-phénylalanyl-40 L-arginyl-L-tryptophyl-glycyl-L-lysyl-L-prolyl-L-valyl-glyeyl-L- 71 08969 52. 2085715 lysyl-L-lysyl-L-arginyl-L-arginyl-L-prolyl-L-valyl-L-lysyl-L-valyl L-tyrosyl-L-proline (0,074 g), [oc]21-75t2° (c = 0,5, acide acétique 0,1 N). EXEMPLE 5 5 On dissous de l'acétate de Ibu^-ACTHfl-lSJ-NHg (0,5 mg) dans du chlorure de zinc 40 mM (0,25 ml) à la température ambiante et, dans la solution, on ajoute une solution (0,25 ml) de phosphate acide disodique (40 mM) contenant du chlorure de jsodium (4,5 mg). Ainsi, on obtient une suspension du complexe désiré et elle 10 est réglée à un pH de 7*0 par addition de soude 0,IN. EXEMPLE 6 De l'acétate de Ibu1-ACTH(l-l8)-NH2 (0,5 mg) est dissous dans de l'eau distillée (0,15 ml). Dans la solution, on ajoute une solution (0,1 ml) d'acide poly-L-glutamique (0,5 mg ; poids molé-15 culaire environ 1.500 à 2.000) qui a été neutralisée avec de la soude 0,1N. Le mélange est agité pendant plusieurs minutes et on lui ajoute vme solution (0,25 ml) de tampon phosphaté M/30 contenant du chlorure de sodium (4,5 mg). La préparation de complexe ré sultante est réglée à un pH de 7,0 avec de la soude 0,1N. 20 EXEMPLE 7 De l'acétate de Ibu^-ACTH(l-l8)-NH,2 (1,0 mg) est dissous dans de l'eau distillée (0,2 ml). Dans cette solution, on ajoute en agitant une solution d'acide poly-L-aspartique (2 mg, poids moléculaire environ 3.000), qui a été neutralisée avec de la soude 25 0,1N (0,3 ml) avant utilisation, et ainsi une suspension de précipités blancs est formée. La suspension désirée du complexe est préparée en ajoutant à la suspension une solution (0,5 ml ; pH 6,8) de phosphate acide disodique-phosphate diacide de potassium M/15 contenant du chlorure de sodium (9*0 mg), et en réglant la 30 suspension à un pH de 7,0 avec de la soude 0,1N. EXEMPLE 8 ■=j 1 De l'acétate de Ibu -ACTH(l-l8)-NH2 (0,5 mg) est dissous dans du chlorure de zinc 100 mM (0,15 ml). D'autre part, de l'acide poly-L-glutamique (0,5 mg ; poids moléculaire environ 2.000 à 35 3.000) est neutralisé avec de la soude 0,IN (0,1 ml) et, dans cette solution, on ajoute du chlorure de sodium (4,5 mg) et du phosphate acide disodique (40 mM) (0,25 ml). Les solutions ainsi obtenues sont combinées et agitées à la température ambiante pour constituer une suspension du complexe désiré, qui est neutralisé 40 avec une quantité appropriée de soude 0,1N. 71 08969 53. 2085715 EXEMPLE 9 De l'acétate de Ibui-ACTH(l-l8)-NH,, (0,5 mg) est dissous dans de l'eau (0,1 ml) à la température ambiante, et on y ajoute du phosphate diacide de potassium-phosphate acide disodique M/15 5 (0,25 ml) contenant 4,5 mg de chlorure de sodium. De la copoly-L-glutamyl-L-tyrosine (20 mg) (poids moléculaire 21.850) est neutralisée par l'addition de soude 0,1N (0,15 ml). La solution neutralisée est ajoutée à la solution de peptide obtenue ci-dessus et le mélange est agité pour constituer une suspension du complexe dési-10 ré, qui est réglée à un pH de 7*0 avec de la soude 0,1N. EXEMPLE 10 De l'acétate de Ibu1-ACTH(l-l8)-NH2 (0,5 mg) est dissous dans de l'eau (0,1 ml), et on y ajoute un tampon phosphaté M/15 (0,25 ml) (pH 7*0) contenant 4,5 mg de chlorure de sodium. La co-15 poly-L-glutamyl-L-tyrosine (7 mg ; poids moléculaire environ 21.850) est neutralisée avec de la soude 0,1N. La solution neutralisée (0,1 ml) est ajoutée à une solution de peptide obtenue ci-dessus pour donner une suspension qui devient immédiatement claire. A la solution, on ajoute du thimerosal (0,1 mg) dans l'eau (0,05 ml), 20 et la solution claire résultante est réglée à un pH de 7*0 par addition de soude 0,1N. EXEMPLE 11 De l'acétate de IbuJ"-0rn1^-ACTH(l-l8)-NHp (0,5 mg) est dissous dans du chlorure de zinc 40 mM (0,25 ml) à la température 25 ambiante, et, dans la solution, on ajoute une solution (0,25 ml) de phosphate acide disodique 40 mM contenant du chlorure de sodium (4,5 mg). Ainsi, on obtient une suspension du complexe désiré et elle est réglée à un pH de 7*0 par l'addition d'une quantité appropriée de soude 0,IN. 30 EXEMPLE 12 De l'acétate de IbuJ'-ACTH(l-24)-0Me (0,5 mg) est dissous dans du chlorure de zinc 40 mM (0,25 ml) à la température ambiante, et, dans la solution, on ajoute une solution (0,25 ml) de phosphate acide disodique 40 mM contenant du chlorure de sodium 35 (0,45 mg). Ainsi, on obtient une suspension du complexe désiré, et elle est réglée à un pH de 7*0 par l'addition d'une quantité appropriée de soude 0,1N. EXEMPLE 13 De l'acétate de Ibu1-ACTH(l-27)-0H (0,5 mg) est dissous 40 dans du chlorure de zinc 40 mM (0,25 ml) à. la température ambian- 71 08969 5». 2085715 te, et, dans la solution, on ajoute une solution (0,25 ml) de phosphate acide disodique 40 mM contenant du chlorure de sodium (0,45 mg). Ainsi, on obtient une suspension du complexe désiré et elle est réglée à vin pH de 7,0 par addition d'une quantité appro-5 priée de soude 0,1N. D'une manière semblable à celle indiquée ci-dessus, les autres peptides d'[acide 1-a-aminoisobutyrique]-corticotropine peuvent être transformés en complexes correspondants. La présente invention n'est pas limitée aux exemples de 10 réalisation qui viennent d'être décrits, elle est au contraire susceptible de variantes et de modifications qui apparaîtront à l'homme de l'art. 71 08969 55. 2085715 REVENDICATIONS 1 - Composé, caractérisé en ce qu'il est choisi dans le groupe se composant des peptides d'[acide 1-a-aminoisobutyrique]-corticotropine, de leurs dérivés, de leurs sels non toxiques d'ad- 5 dition avec les acides et de leurs complexes. 2 - Composé, caractérisé en ce qu'il est choisi dans le groupe se composant de peptides d'[acide 1-a-aminoisobutyrique]-corticotropine ayant des restes d'aminoacides correspondant à la séquence 1-16 à 1-39 de la molécule de corticotropine naturelle, 10 de leurs dérivés, de leurs sels non toxiques d'addition avec les acides et de leurs complexes. 3 - Composé, caractérisé en ce qu'il est choisi dans le groupe se composant de peptides d'[acide 1-a-aminoisobutyrique]-corticotropine où le quatrième aminoacide est un membre choisi dans 15 le groupe se composant de L-méthionine, de L-norvaline, de L-nor-leucine, de L-leucine et d'acide a-aminobutyrique ; le cinquième aminoacide est un membre choisi dans le groupe se composant d'acide L-glutamique et de L-glutamine ; le quinzième et le seizième aminoacides représentent un membre choisi dans le groupe se compo- 20 sant de L-lysine et de L-ornithine ; le dix-septième et le dix-huitième aminoacides représentent un membre choisi dans le groupe se composant de L-arginine, de L-lysine et de L-ornithine ; et le vingt-cinquième aminoacide est un membre choisi dans le groupe se composant d'acide L-aspartique et de L-valine ; de leurs dérivés, 25 de leurs sels non toxiques d'addition avec les acides et de leurs complexes. 4 - Composé, caractérisé en ce qu'il est choisi dans le groupe se composant de peptides d'[acide 1-a-aminoisobutyrique]-corticotropine ayant des restes d'aminoacidescorrespondant à la 30 séquence 1-16 à 1-39 de la molécule de corticotropine naturelle, dans laquelle le quatrième, le cinquième, le quinzième, le seizième, le dix-septième, le dix-huitième et le vingt-cinquième aminoacides sont tels qu'indiqués dans la revendication 3 ; de leurs dérivés, de leurs sels non toxiques d'addition avec les acides et 35 de leurs complexes. 5 - Composé, caractérisé en ce qu'il est choisi dans le groupe se composant de peptides d'[acide 1-a-aminoisobutyrique]-corticotropine ayant des restes d'aminoacides correspondant à la séquence 1-18 à 1-27 de la molécule de corticotropine naturelle, 40 représentés par la formule : a-aminoisobutyryl-L-tyrosyl-L-séryl- 71 08969 56. 2085715 A-B-L-histidyl-L-phénylalanyl-L-arginyl-L-tryptophyl-glycyl-C-D-E-F, où A est un membre choisi dans le groupe se composant de reste de L-raéthionine, de reste de L-norvaline, de reste de L-norleu-cine, de reste de L-leucine et de reste d'acide a-aminobutyrique ; 5 B est lin membre choisi dans le groupe se composant de reste d'acide L-glutamique et de reste de L-glutamine ; C et D représentent chacun un membre choisi dans le groupe se composant de reste de L-lysine et de reste de L-ornithine j E est un membre choisi dans le groupe se composant de reste de L-arginine, de reste de L-lysine 10 et de reste de L-ornithine, et F est un membre choisi dans le groupe comprenant le reste de L-arginine, le reste de L-arginyl-L-proline, le reste de L-arginyl-L-prolyl-L-valine, le reste de L-arginyl-L-prolyl-L-valyl-L-lysine, le reste de L-arginyl-L-prolyl-L-valyl-L-lysyl-L-valine, le reste de L-arginyl-L-prolyl-L-valyl-15 L-lysyl-L-valy1-L-tyrosine, le reste de L-arginyl-L-prolyl-L-valyl-L-lysyl-L-valyl-L-tyrosyl-L-proline, le reste de L-arginyl-L-prolyl-L-valyl-L-lysyl-L-valyl-L-tyrosyl-L-prolyl-L-acide aspartique, le reste de L-arginyl-L-prolyl-L-valyl-L-lysyl-L-valyl-L-tyrosyl-L-prolyl-L-valine, le reste de L-arginyl-L-prolyl-L-valyl-L-lysyl-L-20 valyl-L-tyrosyl-L-prolyl-L-aspartyl-L-alanine, le reste de L-arginyl-L-prolyl-L-valyl-L-lysyl-L-valyl-L-tyrosyl-L-prolyl-L-aspartyl-L-alanyl-glycine, le reste de L-arginyl-L-prolyl-L-valyl-L-lysyl-L-valyl-L-tyrosyl-L-prolyl-L-aspartyl-glycyl-L-acide glutamique, le reste de L-arginyl-L-prolyl-L-valyl-L-lysyl-L-valyl-L-tyrosyl-L-25 prolyl-L-alanyl-glycyl-L-acide glutamique, le reste de L-arginyl-L-prolyl-L-valyl-L-lysyl-L-valyl-L-tyrosyl-L-prolyl-L-aspartyl-glycyl-L-alanine, l'ester correspondant et 1'amide correspondante ; de leurs sels non toxiques d'addition avec les acides et de leurs complexes. 30 6 - Composé, caractérisé en ce qu'il est choisi dans le groupe comprenant des peptides d'[acide-l-a-aminoisobutyrique]-eorticotrdpine représentés par la formule générale : a-aminoisobu-tyryl-L-tyrosyl-L-séryl-A-B-L-histidyl-L-phénylalanyl-L-arginyl-L-tryptophyl-glycyl-L-lysyl-L-prolyl-L-valyl-glycyl-C-D-E-F dans la-35 quelle A est un membre choisi dans le groupe se composant de reste de L-méthionine, de reste de L-norvaline, de reste de L-norleuci-ne, de reste de L-leucine et de reste d'acide a-aminobutyrique ; B est un membre choisi dans le groupe se composant de reste d'acide L-glutamique et de reste de L-glutamine ; C et D représentent 40 chacun un membre choisi dans le groupe se composant de reste de L- 71 08969 57. 2085715 lysine et de reste de L-ornithine ; E est un membre choisi dans le groupe se composant de reste de L-arginine, de reste de L-lysine et de reste de L-ornithine et F est un membre choisi dans le groupe se composant de reste de L-arginine, de reste de L-lysine, de res-5 te de L-ornithine, de reste d'ester de L-arginine, de reste d'ester de L-lysine, de reste dJester de L-ornithine, de reste d'amide de L-arginine, de reste d'amide de L-lysine et de reste d'amide de L-ornithine ; de leurs sels non toxiques d'addition avec les acides et de leurs complexes. 10 7 - Composé, caractérisé en ce qu'il est choisi dans le groupe se composant de peptides df[acide 1-a-aminoisobutyrique]-corticotropine représentés par la formule générale : a-aminoisobu-tyryl-L-tyrosyl-L-séryl-A-B-L-histidyl-L-phénylalanyl-L-arginyl-L-tryptophyl-glycyl-L-lysyl-L-prolyl-L-valyl-glycyl-C-D-E-F-prolyl-L-15 valyl-L-lysyl-L-valyl-L-tyrosyl-G, dans laquelle A est un membre choisi dans le groupe se composant de reste de L-méthionine, de reste de L-norvaline, de reste de L-norleucine, de reste de L-leu-cine et de reste d'acide a-aminobutyrique ; B est un membre choisi dans le groupe se composant de reste d'acide L-glutamique et de 20 reste de L-glutamine ; C et D représentent chacun un membre choisi dans le groupe se composant de reste de L-lysine et de reste de L-ornithine ; E et F représentent chacun un membre choisi dans le groupe se composant de reste de L-arginine, de reste de L-lysine et de reste de L-ornithine et G est un membre choisi dans le grou-25 pe se composant de reste de L-proline, de reste d'ester de L-proline et de reste d'amide de L-proline ; de leurs sels non toxiques d'addition avec les acides et de leurs complexes. 8 - Composé, caractérisé en ce qu'il est choisi dans le groupe se composant de peptides d'[acide 1-a-aminoisobutyrique]-30 corticotropine représentés par la formule générale : a-aminoisobu-tyryl-L-tyrosyl-L-séryl-A-B-L-histidyl-L-phénylalanyl-L-arginyl-L-tryptophyl-glycyl-L-lysyl-L-prolyl-L-valyl-glycyl-C-D-E-F-L-pro-lyl-L-valyl-L-lysyl-L-valyl-L-tyrosyl-L-prolyl-G, où A est unnem-bre choisi dans le groupe se composant de reste de L-méthionine, de 35 reste de L-norvaline, de reste de L-norleucine, de reste de L-leucine et de reste d'acide a-aminobutyrique ; B est un membre choisi dans le groupe se composant de reste d'acide L-glutamique et de reste de L-glutamine ; C et D représentent chacun un membre choisi dans le groupe se composant de reste de L-lysine et de reste de L-40 ornithine ; E et F représentent chacun un membre choisi dans le 71 08969 58. 2085715 groupe se composant de reste de L-arginine, de reste de L-lysine et de reste de L-ornithine et G est un membre choisi dans le groupe se composant de reste de L-aspartyl-L-alanyl-glycine, de reste de L-aspartyl-glycyl-L-alanine, de reste de L-alanyl-glycyl-L-aci-de glutamique, de reste de L-aspartyi-glycyl-L-acide glutamique, de reste de L-valyl-L-alanyl-glycine, de l'ester correspondant et de 1'amide correspondante ; de leurs sels non toxiques d'addition avec les acides et de leurs complexes. 9 - Composé, caractérisé en ce qu'il est choisi dans le groupe se composant de peptides d1[acide 1-a-aminoisobutyrique]-corticotropine représentés par la formule générale : a-amindsobuty ryl-L-tyrosyl-L-séryl-L-méthionyl-L-glutamyl-L-histidyl-L-phényl-alanyl-L-arginyl-L-tryptophyl-glycyl-L-lysyl-L-prolyl-L-valyl-gly-eyl-X-L-lysyl-L-arginyl-Y, dans laquelle X est un membre choisi dans le groupe se composant de reste de L-lysine et de reste de L-ornithine et Y est tin membre choisi dans le groupe se composant de reste de L-arginine, de reste d'ester de L-arginine et de reste d'amide de L-arginine ; de leurs sels non toxiques d'addition avec les acides et de leurs complexes. 10 - Composé, caractérisé en ce qu'il est choisi dans le groupe se composant de peptides d'[acide 1-a-aminoisobutyrique]-corticotropine représentés par la formule :a-aminoisobutyryl-L-tyrosyl-L-séryl-L-méthionyl-L-glutamyl-L-histidyl-L-phénylalanyl-L-arginyl-L-tryptophyl-glycyl-L-lysyl-L-prolyl-L-valyl-glycyl-X-L-lysyl-L-arginyl-L-arginyl-L-prolyl-L-valyl-L-lysyl-L-valyl-L-tyro-syl-Y, dans laquelle X est un membre choisi dans le groupe se composant de reste de L-lysine et de reste de L-ornithine, et Y est un membre choisi dans le groupe se composant de reste de L-proline, de reste d'ester de L-proline et de reste d'amide de L-proline ; de leurs sels non toxiques d'addition avec les acides et de leurs complexes. 11 - Composé, caractérisé en ce qu'il est choisi dans le groupe se composant de peptides d'[acide 1-a-aminoisobutyrique]-corticotropine représentés par la formule générale : a-aminoiso-butyryl-L-tyrosyl-L-séryl-L-méthionyl-L-glutamyl-L-histidyl-L-phénylalanyl-L-arginyl-L-tryptophyl-glycyl-L-lysyl-L-prolyl-L-va-lyl-glycyl-X-L-lysyl-L-arginyl-L-arginyl-L-prolyl-L-valyl-L-lysyl L-valyl-L-tyrosyl-L-prolyl-L-aspartyl-L-alanyl-Y, où X est un mem bre choisi dans le groupe se composant de reste de L-lysine et de reste de L-ornithine et Y est toi membre choisi dans le groupe se 71 08969 59. 2085715 composant de reste de glycine, de reste d'ester de glycine et de reste d'amide de glycine j de leurs sels non toxiques d'addition avec les acides et de leurs complexes. 12 - Composition pharmaceutique à propriété corticotrope, 5 caractérisée en ce qu'elle renferme un ou plusieurs produits décrits dans l'une quelconque des revendications 1 à 11, éventuellement en association avec un ou plusieurs supports pharmaceuti-quement acceptables.