FR 2092112 A1 19720121 FR 7115350 A 19710429 71 15350 2092112 La présente invention concerne la prévention des effets pathologiques d'une maladie des poulets connue sous le nom de maladie de Marek (MD)„ Plus précisément, elle concerne la production et l'utilisation d'un vaccin à virus vivants pour l'immunisation des poulets contre cette maladie. La maladie de Marek, qui est une maladie lymphoproli-férative, a été décrite pour la première fois en 1907 et est devenue un des fléaux les plus destructeurs de la volaille. Aux Etats Unis, une perte annuelle dépassant $ 150 millions a été attribuée aux maladies du type "leukosis", la maladie de Marek constituant le type le plus important (AAAP Report, Avian Diseases 11 : 694-702 - 1967). On a fait un effort considérable pour caractériser la MD (voir l'article de P. M. Biggs, Current Topics in Micro-biology and Immunology 43 : 93-125 - 1968), et on a montré que la maladie est provoquée par un herpesvirus du groupe B (Churchill, et Coll., Nature 215 ï 528-530 - 1967 » Solomon, et Coll., Proc. Soc. Exptl. Biol. Med. 127 : 173-177 - 1968 ; Kazerian, et Coll. Proc. Soc. Exptl. Biol. Med. 127 î 177-182 1968). les problèmes liés à la MD ont engendré une recherche considérable dans le développement des traitements et des préventions. Toutefois, des tentatives de lutte par des moyens génétiques, chimiques, biologiques et d'isolation et d'hygiène se sont révélées inefficaces (AAAP Report, supra, et Biggs et Coll. supra). Cependant, les études immunologiques se sont révélées prometteuses. Kottaridis et Coll., Nature 221:. 1258-1259 - 1969)» ont montré que des cellules provenant du fibroblaste de l'embryon de poulet cultivées avec de la moelle osseuse de poulets infectés par la MD, lorsqu'elles sont inoculées à des puussins d'un jour, provoquent une immunité. Churchill et Coll. Nature 221: 744-747 - 1969 ont produit un vaccin constitué par un virus de MD atténué vivant à partir d'une souche HPRS 16 auquel on devait faire subir au moins 33 passages à travers la culture de cellules avant que le virus soit atténué et ait perdu sa pathogenicité, mais le virus avait aussi perdu tout l'antigène A. Le vaccin résultant est complètement associé aux cellules. 71 15350 2 2092112 la demanderesse a préparé un vaccin à partir d'un virus vivant qui est de nature non-pathogène, qui n'est pas atténué, qui n'a pas perdu son antigène A, qui peut être cultivé rapidement pour donner des proportions utilisables par un nom-5 bre de passages à travers la culture de cellules qui peut être réduit à 9» et qui procure une protection essentiellement complète contre la MD lorsqu'il est administré à des poulets de 1-21 jours. Le vaccin peut aussi être rendu exempt de cellules, ce qui. rend le stockage beaucoup plus aisé. 10 Conformément à l'invention, on utilise un virus de souche AÎCC VR 584 pour inoculer une culture de cellules en monocoucheo Ce virus porte la désignation Avian Herpesvirus IY (AHIV) et sera aussi désigné herpesvirus du dindon (HVT). On fait incuber des cultures de cellules inoculées (par exemple 15 de rein de poussin, de fibroblaste d'embryon de poulet,' et de cultures de fibroblaste d'embryon de canard) jusqu'à ce que la plupart des cellules soient infectées par le virus. Les cellules sont retirées de la culture, séparées avec de la trypsine et remises en plaques sur des monocouches fraiches. De cette 20 manière, le virus est soumis à des successions de passages à travers la culture de cellules jusqu'à ce qu'on obtienne une quantité utile de cellules virulifères. Dans le passage final, les cellules sont dispersées avec de la trjrpsine, séparées du milieu de culture, redispersées dans un milieu de culture conte-25 nant de 5 à 10 $ de sulfoxyde de diméthyle, et ajustées à une concentration d'environ 10"* à 10^ PFU par ml. Les cellules virulifères, extraites du dindon, utilisées pour inoculer la première culture de cellules sont soit dans du sang entier héparinisé soit dans du tissu de rein qui a été lavé avec une solution sa-30 line tamponnée au phosphate et dispersé avec de la trypsine. On traite encore le vaccin ainsi produit en rompant les cellules infectées par le virus qui sont en suspension dans le milieu de culture et en retirant ces cellules du milieu, les-dites cellules étant caractérisées en ce qu'elles contiennent essentiellement le virus vivant, non-atténué et exempt de cellules. 71 15350 2092112 Les vaccins obtenus comme indiqué ci-dessus sont utilisés pour assurer une immunisation contre la maladie de Marek par administration à des poussins ou poulets de 1 jours à 3 semaines. 5 L'Avian Herpesvirus IV (AHIV) à partir duquel est pro duit le présent vaccin, est isolé d'échantillons de sang et de tissu de rein de dindons infectés. Les échantillons isolés portant la référence PC 126 provenaient de deux dindons âgés de 23 semaines d'un troupeau en Indiana. Lés autres échantillons 10 étaient les suivants : AC16 du sang d'un dindon de 16 semaines de Georgie, AC18 du tissu du rein d'un dindon de 18 semaines d'Indiana, et WTHV1 du tissu du rein d'un dindon du Wisconsin. Les études serologiques, l'essai au gel de précipitine sur gélo se (AGP), l'essai de neutralisation du virus (VN), et l'essai 15 à l'anticorps fluorescent (PA), démontrent que les 4 échantillons AHIV ne peuvent pas se distinguer du point de vue antigène mais se distinguent de 1'herpesvirus de la maladie de Marek (MDHV), tableau I 71 15350 4 2092112 TABLEAU 1 Antigène^ Sera1 PC 126 MDHV Témoin AGP VN4 FA AGP FA AGP et FA5 Hyperimmune : PC126 (c) + + ++ - + - AC16 (c) + + + - + AC18 (c) + + ++ - + - WTHVI (c) + + ++ - + - Cellule normale (c) - - - - - - Convalescent : FC126 (c) + + + + + — FC126 (t) + - ÎTD - ND MD-JM (c)5 + + + ++ ++ KD-GA (c)5 + + + ++ ++ - MD-RPL-39 (c)5 + + + ++ ++ - MD-FC127 (c)5 + - + ++ ++ Témoin : Non inoculé (c) — — — — — — Non inoculé (t) — — ND — ND 10 15 20 25 1 Sera identifié par l'antigène d'immunisation, la lettre entre parenthèses désigne l'original : poulet (c) ou dindon (t) Réactions AGP et FA étalonnées suivant l'intensité: ++ (intense), + (défini mais moins intense), - (négatif). Réactions FA contrôlées par l'absence de taches dans les cellules entre les plaques de virus. 4 Neutralisation du virus basée sur une réduction de pLaque de 50 ^ à une dilution finale du sérum de 1:20. 5 Quatre taches séparées de MDHY. 71 15350 5 2092112 Une des propriétés de 1'herpesvirus est que les cultures de cellules infectées développent des lésions focales discrètes qui, lorsqu'elles sont à maturité, sont constituées d'amas de cellules dégénérescentes, rondes, réfractiles. Ces 5 amas ou plaques induits par AHIT (les 4 échantillons) sont moi--phologiquement différents de ceux induits par MDHY. D'autres procédés pour obtenir le virus à partir du dindon seraient équivalents, mais les cellules du sang et du rein sont très virulifères et faciles à obtenir. Des cultures 10 standard en monocouches de cellules telles que de rein de poussin (CK) de fiborblaste d'embryon de poulet (CEP), et de fibroblaste d'embryon dé canard (DEF) ^Witter et Coll., Avian Disea-ses 13s 101-118 (1969jJ sont utilisées pour propager le virus car elles sont facilement infectées et croissent rapidement. 15 Dans les conditions de laboratoire, on réalise le pre mier passage en ensemençant les cellules infectées de sang hépa-rinisé ou de tissu de rein, lavé avec une solution saline tamponnée au phosphate et ayant subi- une trypsinisation, sur des monocouches de 24-48 heures de cultures CK, CEF ou DEF qui sont en-20 suite maintenues pendant plusieurs jours à 37°C dans une atmosphère humidifiée contenant 3 à 4 $> de gaz carbonique, avec des changements périodiques du milieu de culture. Dans tous les passages ultérieurs, le milieu de culture des cellules surnageantes est décanté ou aspiré ; de la trypsine est ajoutée pour séparer 25 les cellules qui sont alors dispersées dans une petite quantité de milieu puis remises en plaques et cultivées sur des cultures fraiches de monocouches de cellules, comme décrit ci-dessus. On effectue les passages des cellules lorsque 75 ou plus, de la monocouche sont affectés cytopathiquement. On compte 30 le nombre de cellules dans une préparation et on détermine l'étendue de l'infection des cellules. A cet effet, on peut facilement voir et dénombrer au microscope les cellules lorsqu'elles sont dispersées par de la trypsine, ce qui donne la quantité totale de cellules cultivées ; on peut aussi utiliser un nombre 35 connu de cellules provenant de la culture infectée, pour inoculer une monocouche non-infectée de cellules CK ou équivalentes puis on fait incuber cette monocouche pendant un temps déterminé, habituellement 4 à 7 jours, après quoi on compte le nombre 71 15350 2092112 de plaques induites par le virus, ce qui donne le titre qui est une quantité hautement reproductive du degré d'infection, et on reporte le titre en unités de formation des plaques (PPU). Les cellules virulifères sont par suite soumises à plusieurs passages en série dans la culture de cellules jusqu'à ce qu'une quantité utilisable de cellules infectées soit obtenue. Un nombre total de 5 à 11 passages simples et multiples est suffisant et n'entraîne pas d'atténuation du virus. Plusieurs passages simples dont chacun multiplie par dix ou par cent le nombre de cellules infectées sont généralement nécessaires pour fournir la quantité de cellules dont il faut disposer pour les passages multiples ; par exemple un échantillon de cellules de sang ou de rein ayant un titre inférieur à 10 PPU après 6 ou 7 passages simples aurait au moins 10^ PPU, ce qui serait suffisant pour inoculer plusieurs autres cultures de cellules dont chacune à son tour croirait de dix à cent fois et serait ultérieurement divisée. La quantité et la concentration voulues pour le vaccin dépendent évidemment de l'échelle du programme de vaccination et de l'importance de la dose. Dans la pratique normale au laboratoire, on produira environ 10^ cellules qu'on retirera du milieu de culture, qu'on trypsinisera et qu'on remettra en suspension dans 100 ml d'un milieu de culture contenant 10 $ de DI4S0, ce qui donnera un vaccin final ayant une concentration d'environ 7 7 5 x 10 de cellules infectées par le virus, ou .10 PPU/ml. Cette quantité de vaccin servira à inoculer un million de poulets avec une dose d'environ 5 x 10^ cellules ou 10^ PPU. La fraction de 100 ml de vaccin est habituellement divisée en 100 fioles de 1 ml qui sont refroidies lentement dans de l'azote liquide et stockées de cette manière jusqu'à ce qu'on en ait besoin pour effectuer une immunisation ou pour produire une quantité supplémentaire de vaccin. Des doses aussi faibles que 10^ PPU ont été utilisées avec succès pour garantir une immunité complète, et des doses aussi élevées que 7 x 104 PPU ont été administrées sans qu'on constate un effet pathogène. La nature non-pathogène de AHIY est d'origine et ne résulte pas d'une atténuation. Après 11 passages en série, le virus demeure non-atténué comme le prouve le fait 71 15350 7 2092112 que l'antigène A est toujours présent après le passage final» Etant donné que MDHV, qui un herpesvirus très voisin, doit subir au moins 33 passages pour être atténué, on peut s'attendre que 11 passages seulement de AHIV n'aient aucun effet sur le virus. TABLEAU 2 Vaccin 1 Attaque 2 Réponse MD $ Isolation du virus^" MD AHIV AHIV Contact 0 4/8 8/8 AHIV Intra-abdom 0 5/7 6/7 AHIV Néant 0 0/6 6/6 Néant Contact 75,0 1/3 0/3 Néant Intra-abdom 62,5 1/3 0/3 néant Néant 0 0/6 0/6 Virus MD 57,1 1/2 0/2 ^ la charge de vaccin n° 1 administrée à 0,2 ml, intra-abdom, à des animaux d'un jour. Chaque volatile a reçu 7,0 x 104 PPU. 2 les volatiles sont attaqués intra-abdom avec du sang complet MD ou en plaçant des volatiles infectés par MD et inoculés dans le même isolateur à l'âge de 5 semaines J La période d'expérimentation a duré 20 semaines à la fin de laquelle tous les survivants ont été autopsiés. 4 Le virus a été isolé des reins des survivants par la technique de culture indirecte des reins de poussins, et on a fait le rapport des survivants ayant le virus au nombre total de survivants. Le tableau II montre les résultats de l'immunisation avec le vaccin AHIV suivie d'une attaque par le virus vivant de MD. Il montre aussi une autre caractéristique du AHIV. Le virus du vaccin n'arrête pas la propagation du MDHV dans l'oiseau inoculé. Le AHIV et le MDHV sont isolés à partir de poulets âgés de 20 semaines mais tous les signes de pathogénicité induite par MD sont absents. Les poulets ne présentant de lésion importante sont examinés pour les lésions microscopiques. Les volatiles 71 15350 8 2092112 présentant une pathogénicité quelconque induite par MD, y compris des lésions microscopiques, sont notés comme donnant une réponse MD. Une caractéristique du présent vaccin qui le différen-5 cie des vaccins MDHY atténués est que le AHIY vivant est produit sans cellules et que le vaccin résultant est toujours efficace comme agent immunologique (voir exemple 7). Tous les vaccins exempts de cellules peuvent être stockés facilement sans exiger les conditions de stockage rigoureuses requises par les 10 vaccins à virus à cellules associées. La rupture des cellules peut être effectuée par diverses méthodes, par exemple par l'emploi des ultra-sons ou par congélation/décongélation. La première technique est préférable car elle est facile et rapide. Après exposition de 20 secondes à la 15 sortie d'un générateur d'ultra-sons, aucune cellule ou jaucun noyau intact n'est visible dans le vaccin lors de l'examen à 1' hémocytomètre. Exemple 1 Des échantillons de tissu de rein sont prélevés sur 20 deux dindons de 23 semaines (FC126), puis sont lavés dans une solution saline tamponnée au phosphate, émincés avec des ciseaux, lavés de nouveau et dispersés avec 0,025 $ de trypsine à 37°C. La suspension cellulaire résultante est ajoutée à une culture CK monocouche de 24 heures (Witter, et Coll., supra) 25 puis mise à incuber à 37°C pendant 1 jour. A ce moment, on change le milieu et on laisse la culture incubée pendant 15 jours supplémentaires. Pour chaque plaque, on a utilisé 25 ml d'un milieu de culture CK standard ayant la composition suivante : Milieu de base Eagles (BME)1 80 $> 30 Bouillon au phosphate de tryptose (30 g/1) 10 £ Bicarbonate de sodium aq. à 2,8 # 3 * Sérum foetal de bovin 5 t Pénicilline (100 unités / ml) \ Streptomycine(0,1 mg / ml) ) 6 35 Mycostatine (25 unités / ml) 1 Biochemists'Handbook. D. YanNostrand Co., Inc., Princeton, New Jersey, 1961, p. 1064. 71 15350 9 2092112 A la fin de la période d'incubation, la masse totale des cellules est lavée avec une solution saline tamponnée au phosphate, dispersée avec 4 ml de 0,05 $ trypsine, placée en tubes contenant une quantité de sérum de veau égale à 10 $ du 5 volume du tube, centrifugée à 1000 g, séparée du liquide surnageant, remise en suspension dans un ml environ du milieu de culture, et remise en plaques sur une culture fraiche CK de 24 heures qu'on a laissée incuber pendant 5 jours à 37°C. On fait propager le virus PC126 dans les cultures CK,de la manière décri-10 te plus haut, pendant 6 passages au total. Dans le dernier passage, les cellules sont lavées, trypsinisées, centrifugées comme précédemment et préservées par dispersion dans un volume total de 1 ml d'un milieu de culture contenant 15 $ de sérum de veau et 10 $ de DMSO. la suspension est congelée lentement aux tempé-15 ratures de l'azote liquide (- 70°C) pour être utilisée 'comme culture d'ensemencement à partir-de laquelle on préparé des quantités plus importantes de vaccin, la suspension finale a C une concentration cellulaire de 3,8 x 10 cellules/ml, et un titre de 5 x 104 PFU/ml 20 Exemple 2 Des échantillons de sang sont prélevés sur les deux mêmes dindons que dans l'exemple 1. le sang est héparinisé (20 unités /ml) et utilisé directement pour inoculer une culture de DEF en monocouche de 24 heures. On suit le même mode opéra- 25 toire que dans l'exemple 1 pour l'incubation et les passages en série pendant 7 passages au total, la teneur du milieu de culture DEP est la suivante Milieu (199 x 10) 40 $ ) voir ta- Milieu nutritif (F10x10) 50 bleau 3 30 Bouillon de' phosphate de tryptose (30 g/1) 5 JÉ Bicarbonate de sodium aq. à 2,8 $> 3 $ Sérum de veau 4 $> ^ Après le septième passage, deux portions de 1 ml du vaccin sont préservées comme dans l'exemple 1, la concentration 6 5 finale étant de 6,9 x 10 cellules totales contenant 1,5 x 10^ PPU de AHIV /ml. 10 71 15350 2092112 Exemple 3 Environ 3>3 x 104 PPU de AHIY de l'exemple 2 sont ensemencées sur une monocouche de DEP de 24 heures dans chacun des plats de culture en matière plastique de 150 x 25 mm, au 5 nombre de 6. le milieu de culture (25 ml / plaque) est le même que dans l'exemple 2. Le lendemain de l'infection, on change le milieu et on garde les cultures pendant encore 2 jours. A ce moment, plus de 75 i° àe la monocouche de DEP sont cytopathique-ment affectés et les cellules sont prêtes à être transférées. 10 On effectue le transfert en retirant le milieu de cul ture, en lavant les cellules une fois avec une solution saline tamponnée au phosphate (PBS), en ajoutant 4 ml d'une solution à 0,25 1° de trypsine, et en laissant réagir pendant 5 minutes, les cellules non tassées sont ensuite placées dans des tubes 15 contenant une quantité de sérum de veau équivalente à environ 10 i<> du volume pour ralentir l'action de la trypsine. Après sédimentation par centrifugation à environ 1000 g pendant 5 minutes, les cellules sont remises en suspension dans le milieu de culture et toutes les cellules des 6 plaques sont divisées en 20 48 plaques de 150 x 25 mm contenant des monocouches de DEP de 24 heures. Trois jours plus tard après manipulation comme dans le cycle de croissance précédent et quand l'effet cytopathique est bien avancé, les cellules sont récoltées par trypsinisation com-25 nie décrit précédemment, mises en suspension dans le milieu contenant 10 fo de DMSO, congelées lentement et stockées dans de l'azote liquide. On obtient environ 100 fioles de 1. ml contenant ap- 7 ft proximativement 10 cellules et 10 PPU par fiole. Exemple 4 30 le produit de l'exemple 1 est traité de la manière dé crite dans l'exemple 3. Le vaccin résultant est stocké dans environ 100 fioles de 1 ml contenant 3»5 x 10^ PPU/ml de AHIY. Exemple 5 On fait passer le produit de l'exemple 1 5 fois supplé-35 mentaires dans des cultures de CK pour obtenir un vaccin ayant une concentration en AHIY de 6,5 x 104 PPU/ml. 71 15350 2092112 Exemple 6 les vaccins produits dans les exemples 3, 4 et 5 sont utilisés pour inoculer des poulets âgés de 1 jour à 3 semaines qui ont été ensuite attaqués à 1 jour - 5 semaines soit par des injections intra-abdominales de MDHV soit par contact avec d'autres poulets infectés par MDHV. Les doses de vaccin AHIV variaient de 48 à 3 x 104 PPU dans 0,2 ml (Tableau 4) Exemple 7 Un lot de vaccin ayant 10® PPU/ml est préparé à partir du produit de l'exemple 1 par 4 passages supplémentaires dans des cultures CK et 3 dans des cultures CEP, Une portion' de ce vaccin est soumis aux ultra-sons avec un appareil Bronwill Bio-sonik utilisant une sonde-en aiguille avec une intensité de 70 pendant 20 secondes. Après >ce traitement, aucune cellule ou aucun noyau intact n'est visible lors de l'examen à l'hémocytomè-tre„ Une seconde portion du vaccin est congelée rapidement à - 70°C sans DMS0. Des injections intra-abdominales de 0,2 ml des vaccins soumis aux ultra-sons et congelés rapidement, contenant chacun environ 500 PPU / 0,2 ml sont utilisées pour immuniser des poussins d'un jour, en donnant les résultats suivants î Durée d'attaque par Réponse Vaccin MDHV (intra-abdominal) MD, $ - O . 0 78 Soumis aux ultra-sons 3 semaines Congelé rapidement 3 semaines sans DMS0 Néant 3 semaines TABLEAU 3. g./lit: re Composant 199 F10 L- arginine (HC1) 0,070 0,211 L-histidine (HC1) 0,020 0,021 L-lysine HC1 0,070 0,029 DL-tryptophane (£) 0,020 0,0006 DL-phénylalanine (£) 0,050 0,005 DL-méthionlne (£) 0,030 0,004 DL-sérine (£) 0,050 0,011 DL-thréonine (£) 0,060 0,004 DL-leucine (£) 0,120 0,013 DL-lsoleuclne (£) 0,040 0,003 DL-valine (£) 0,050 0,004 acide PL-glutamique (L, anhy) 0,150 0,015 acide DL-aspartique (£) 0,060 0,013 DL-alpha-alanln e (£) 0,050 0,009 L-proline 0,040 0,012 L-hydroxyproline 0,010 Glycine - 0,050 0,008 L-glutaminé 0,100 0,146 L-cystine 0,020 Composant Mg./litre 199 F10 PeS04, 7H20 2,0 CuS04, 5H20 0,004 ZnSO^, 7H20 0,051 Tween 80 5,0 ATP 1,0 acide adénylique 0,200 Déoxyribose 0,500 D-ribose 0,500 acétate de sodium, 0,050 3H20 Adénine 10,0 G-uanine 0,300 Xanthine 0,300 Hypoxanthine 0,300 ' 4,00 Uracile 0,300 Thymine 0,300 Thiamine (HC1) 0,010 1,0 Pyridoxine HC1 0,025 0,206 Riboflavine 0,010 0,376 Pyridoxal HC1 0,025 TABLEAU 3 (Suite). g./lit ;re Mg,/litre Composant 199 P10 Composant 199 F10 L-tyrosine 0,040 0,002 ïïiacine 0,025 L-cystéine HC1 (Sans HC1) 0,0001 0,025 Uiacinamide 0,025 0,615 L-asparagine 0,013 pantothénate de la (D) 0,010 0,715 NaC1 8,0 7,4 _i-inositol 0,050 0,541 KC1 0,400 0,285 acide ascorbique 0,050 MgS04, 7H20 Na2HP04, 7H20 0,200 0,153 acide folique 0,010 1,0 0,090 0,290 acide jD-amino-bènzoïque 0,050 kh2p°4 0,060 0,083 Biotine 0,010 0,024 CaC12 (2H20) 0,140 0,044 Ménadiène 0,010 NaHC05 0,350 1,2 Gluthione 0,050 Pe(N03)2 Dextrose 0,0001 Vitamine A 0,100 1,000 1,100 Calciférol 0,100 Pyruvate de sodium 0,110 Cholestérol 0,200 Rouge de phénol 0,020 0,0012 Vitamine B12 1,0 acide lipoïque 0,0002 Thymidine Choline C1 ÎTa2-alpha-toco-phérol phosphate 0,500 0,010 1,0 0,698 h-* I ^ un v>j vji O ro o vo ro IV) TABLEAU 4. VJ h-* M VJ1 V» VJ1 O Traitement Exemple No.de Dose de Temps de Temps de Mode de réponse vaccin utilisé vaccination vaccination traitement traitement MD io PPU .1ours semaines 3 1 x 103 1 3 Intra-abdom„ 0,0 3 1 x 103 1 3 Contact 0,0 3 480 1 • 3 Contact 12,5 3 48 1 3 Contact 42,8 3 520 7 (1 jour) C0ntact o o 3 690 14 (1 jour) Contact 17,6 3 480 21 (1 jour) Contact 55,0 4 3 x 104 1 5 Intra-abdom. o •t o 4 3 x 104 1 5 Contact o «• o 5 1 x 104 1 2 Intra-abdom. o o 5 1 x 104 1 3 Intra-abdom. 0,0 5 1 x 104 1 4 Intra-abdom. o * o 5 1 x 104 1 5 Intra-abdom. 0,0 Néant Néant — 5 Intra-abdom. 75,0 Néant Néant — 5 Contact 88,0 Néant Néant 3 Intra-abdom. 40,0 Néant Néant — 3 Contact 70,0 Néant Néant — (1 jour) Intra-abdom. 100,0 Néant Néant — Néant — 0,0 l\D O KO ro t-* h-i ro 71 15350 15 2092112 REVENDICATIONS 1. Procédé de préparation d'un vaccin vivant actif con tre la maladie de Marek caractérisé en ce qu'il comprend des passages multiples d'herpesvirus de dindon dans une culture de tissu. 5 2^ Procédé de préparation d'un vaccin caractérisé en ce que de l'Avian Herpesvirus IV est dérivé par des passages multiples dans une culture de cellules incubées suffisants pour produire un virus vivant, non atténué, non pathogène, avec de.l'antigène A qui est actif contre la maladie de Marek chez les pou- 10 lets. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que le vaccin est préparé à partir d'une culture de cellules de fibroblaste en monocouche. Procédé selon la revendication 3, caractérisé en ce que le tissu de culture provient de reins de poussins, de fibroblaste d'embryons de poussins ou de fibroblaste d'embryons de canards. 5. Procédé selon la revendication 4, caractérisé en ce que le tissu de culture est de l'embryon de canard. 20 6_. Procédé de préparation d'un vaccin à partir d'Avian Herpesvirus IV vivant, caractérisé en ce qu'il comprend les opérations suivantes : a) on inocule une culture de cellules en monocouches choisie dans le groupe comprenant le rein de poussin, le fibro- 25 blaste d'embryon de poulet et le fibroblaste d'embryon de canard par ledit virus, b) On fait incuber la culture de cellules inoculées jusqu'à ce que 75 $> environ des cellules soient infectées par ledit virus; 30 c) on retire les cellules de la culture, incubée résul tante, on sépare les cellules avec de la trypsine et on les remet en plaques sur des cultures de cellules en monocouches fraîches 5 les d) on/fait passer en série à travers des cultures de 35 cellules du même type et de la même manière que décrit ci-dessus jusqu'à ce qu'une quantité utile de cellules virulifères soit obtenue ; et 71 15350 16 2092112 e) on préserve ladite quantité utile de cellules en dispersant les cellules dans le passage final avec de la trypsine, en séparant les cellules de la portion liquide de la dispersion résultante, en mettant les cellules en suspension dans 5 une quantité suffisante de milieu de culture contenant environ 10 i> de diméthylsulfoxyde, ledit vaccin étant caractérisé en ce qu'il est un virus vivant, non atténué et associé aux cellules. 7» Procédé selon l'une des revendications 1, 2 et 6, ca ractérisé en ce que l'on sépare l'Avian Herpesvirus IY des cel-10 Iules de la culture de tissu. 8. Procédé selon la revendication 7, caractérisé en ce qu'on effectue la séparation des cellules de la culture de tissu en rompant lesdites cellules par emploi des ultra-sons puis en éliminant les cellules rompues. 15 Un vaccin pour immuniser la volaille contre la maladie de Marek, caractérisé en ce qu'il comprend une quantité efficace d'herpesvirus de dindon vivant. 10. Un vaccin dérivé par de multiples passages d'Avian Herpesvirus IY dans une culture de cellules incubées, caractéri- 20 sé en ce qu'il contient un virus vivant, non atténué et non pathogène, avec de l'antigène A et en ce qu'il est actif contre la maladie de Marek des poulets. 11. Un vaccin selon la revendication 10, caractérisé en ce que le virus est associé aux cellules. 25 12,. Un vaccin selon la revendication 11, caractérisé en ce que les particules de virus sont exemptes de cellules. 12- Un vaccin pour immuniser la volaille contre la maladie de Marek, préparé selon le procédé de la revendication 1, suivi d'une rupture des cellules infectées mises en suspension dans le 30 milieu de culture et de l'élimination des cellules rompues du milieu, caractérisé en ce qu'il contient essentiellement un virus vivant, non-atténué et exempt de cellules. 14» Un vaccin selon la revendication 13, caractérisé en ce qu'il contient de 5 à 10 56 en volume de diméthyl sulfoxyde. 35 15. Procédé d'immunisation des poulets contre la maladie de Marek, comprenant l'administration d'un vaccin comprenant une quantité efficace d'herpesvirus de dindon. 16. Procédé selon la revendication 15» caractérisé en ce 71 15350 2092112 que les poulets ont entre environ 1 jour et environ trois semaines. 17» Procédé de traitement des poulets pour les immuniser contre la maladie de Marek, qui comprend l'administration aux 5 poulets âgés de 1 jour à 3 semaines d'un vaccin produit à partir d'échantillons isolés KÎ126 d'herpesvirus de dindon. 18. Procédé selon la revendication 16, caractérisé en ce que le vaccin est soumis ensuite à une rupture des cellules infectées mises en suspension dans le milieu de culture par l'emploi 10 des ultra-sons, suivie d'une élimination des cellules rompues du milieu. 19. Procédé selon la revendication 4, caractérisé en ce que la culture de tissu est le rein de poulet. 20. Procédé selon la revendication 4, caractérisé en ce 15 que la culture de tissu est l'embryon de poulet.