FR 2081547 A1 19711203 FR 7106704 A 19710226 71 06704 1 2081547 Les lysolécithines qui appartiennent au groupe des phospha-tides de la choline répondent aux formules : Q^-O-acyle 10 CH-OH ( + ) la CHO-P—O—CH_—CH--N(CH-), 2 //\ 2 2 3 3 ° °(-) CH0—OH I 2 ÇH-O-acyle ^ I (+) CH„-0—P—O—CH.-—CH_—N(CH_). 2 2 2 ° °(_) 15 Gf^-O-acyle ( + ) CH—O—P—O—CH_—CH0—N(CH_)_ /\ 2 2 33 0 °(-> Xc 20 CH2-0H dans lesquelles "acyle" représente le reste d'un acide gras ali- phatique. Du fait que l'atome de carbone en position bêta de la molécule de glycérine constitue un centre d'asymétrie, chacun de ces composés peut exister sous deux formes stéréo-isomères. 25 La fabrication des lysolécithines peut avoir lieu par voie chimique ou enzymatique. Elle est décrite dans la littérature, voir : G.H. de Haas et L.L.N. van Deenen, Biochem. biophysica Acta, /jKmsterdafip7 106 (1965) 315 et D. Arnold, H.U. Weltzien et O. Westphal, Liebigs Ann. Chem. 709 (1967), 231, 234. Ainsi, on 30 peut fabriquer les lysolécithines, par exemple, par décomposition enzymatique de lécithines sous l'action de phospholipase A^ ou de phospholipase A2« Ces réactions enzymatiques sont stéréospéci- fiques. Les phospholipases A^ et A2 ne peuvent décomposer que des L-lécithines. Lorsqu'on met en oeuvre des lécithines racé- 35 miques, la décomposition à l'aide de phospholipase A conduit donc à ton mélange de L-lysolécithine et de D-lécithine dans lequel on peut séparer les deux constituants par chromâtographie. Par voie purement chimique, on peut fabriquer des lysolécithines de formule la, par exmmple à partir de 2-benzylglycérine par acylation, 71 06704 2081547 introduction _-03bs llsm -wc élimination ^ydr-géno™ lytiqua du gronpe de protection beazyl«, conformément au schéma de réaction suivant (dans ces formules Bz représente le radical benzyle). La synthèse peut servir également à la fabrication de 5 lysolécithines optiquement actives® 10 15 2Q ch2-On ch-oh ch2-0' CH-CfiH5 1,3-bensylidène-glycérine ch2-oh CH-O-Bz ch_—oh • 2 2-jùenzyl-glyc.érine CH_-0-acyle I 2 CH-Q-Bz ! CH_—O—P—O—CH.,—CH0—Br 2 //\ 2 2 0/ Cl Js CH2-0> CH-O-Bz ! CH2-OJ CH-C6H5 2-benzyl-l,3-benzylidène-glycérine CH_-0-acyle I CH-O-Bz Br(CH2)2OPOCl2 n(c2h5)3 ch2-oh l-acyl-2-benzyl glycérine h2O CH2-0-acyle CH-O-Bz N(CH3)3 I CH„—O—P—O—CH_—CH0—Br 2 /A 22 O' OH 25 30 CH2-0-acyle CH-O-Bz (+) CH2-0-P-0-CH2-GH2-H(CH,)5 A (-) 1—acy1—2-benzy1-glycéro-phosphate-(3) de |3-:bromo-éthyle CH_-0-acyle I 2 ch-OH I (-) (+) CH2-0-P02-0-CH2-CH2-N(CH3)3 Lysolécithine la Dans les susdites publications, on décrit, par exemple, les 35 composés suivants de formules générales la - le, qui ont été fabriqués conformément au schéma de réaction représenté ci-dessus : l-palmitoyl-glycérine-phosphate-0)de monocholine monohydraté ; l-stéaroyl-glycérine —pho*phàt«-(3) de ®onacholine monohydraté ; BAD ORIGINAL 71 06704 3 2081547 1-stéaroyl-glycérine-phosphate-(2) de monocholine monohydraté ; 3-stéaroyl-glycérine-phosphate-{2) de monocholine monohydraté ; 2-stéaroyl-glycérine-phosphate-(3) de monocholine monohydraté ; 2-stéaroyl-glycérine-phosphate-(l) de monocholine monohydraté. 5 Les lysolécithinesoccupent une position-clé dans le méta bolisme intermédiaire des phospholipides de la membrane cellulaire. Dans un métabolisme en équilibre dynamique, elles sont constamment formées à partir de lécithines et réacylées en lécithines ou dégradées en glycérôphosphorylcholine. Dans le cas de 10 D-lysolécithines par contre, le taux de réacylation au moyen d'a-cyl-transférases est inférieur à 10% ; celles-ci constituent donc des adjuvants immunologiques particulièrement précieux. Les lysolécithines sont des substances d'une grande activité interfaciale. Leur effet biologique majeur est constitué par 15 leur action cytotoxique. Cet effet nuisible sur la cellule est à attribuer essentiellement à leur aptitude à détruire les membranes cellulaires. Malgré cela, la DL^q de ces composés, dans l'essai sur les animaux, est relativement élevée, et parmi eux, en particulier, celle des L-lysolécithines, puisqu'ils sont, 20 dans l'organisme, l'objet d'un métabolisme très rapide. Pourtant, les lysophosphatides ne sont aucunement que des substances simplement cytotoxiques ; ils exercent, de plus - en fonction des doses - des effets biologiques très importants qui sont dus probablement avant tout à leur grande activité super-25 ficielle aux interfaces. Ainsi, il est par exemple connu que les lysophosphatides constituent les récepteurs essentiels des membranes pour la résorption des acides gras à partir du sérum. Par un prétraitement avec des quantités sublytiques de lysolécithine, on peut même obtenir une amélioration des membranes cellulaires. 30 II est en outre connu par la littérature scientifique que la lysolécithine active la croissance de bactéries, qu'elle augmente la phagocytose de macrophages péritonéaux, et qu'elle est même capable d'accélérer la croissance de cellules d'organismes supérieurs. 35 On vient à présent de trouver que les lysolécithines des formules la, Ib et le constituent d'excellents adjuvants immuno-logiques. Par adjuvants, on désigne en immunologie des substances qui intensifient la réponse immunitaire de l'organisme à un stimulus 40 antigénique et, par conséquent, la formation d'anticorps. A 71 06704 4 2081547 l'aide d'adjuvants, on réussit par exemple à supprimer le phénomène dit "paralysie immunitaire", c'est-à-dire à provoquer la formation d'anticorps même avec des antigènes qui, autrement, sont tolérés par l'organisme. 5 La mise en application de ces substances dans la pratique est fondée, par exemple, sur leur pouvoir d'augmenter le titre en anticorps des sérums. On a vérifié l'effet des lysolécithines la, Ib et le en tant qu'adjuvants de la façon suivante : 10 1. On a réalisé les essais en s'appuyant sur la méthode de Dresser (Immunology (1965) 261). Le principe du dispositif expérimental consiste en l'induction d'une tolérance par une protéine soluble. Dans ce dispositif expérimental, on détermine le pouvoir des substances de renforcer dans l'organisme la ré-15 ponse immunitaire vis-à-vis de la gammaglobuline bovine (GGB) qui est extrêmement faible, de telle manière que les anticorps protecteurs vis-à-vis de cette protéine soient nettement décelables. A cet effet, on applique à des souris par injection in-trapéritonéale une dose de 5 mg de GGB séparée par centrifugation 20 de tout agrégat. A cette dose, normalement au bout de 8 à 10 jours, aucun anticorps n'est décelable. Les animaux ne sont donc pas immunisés. Ils sont, sous ces conditions, incapables de donner une réponse immunitaire vis-à-vis de la GGB. Par contre, si l'on administre la GGB en combinaison avec un adjuvant, l'é-25 tablissement de la tolérance passagère est empêché et les animaux produisent maintenant des anticorps à 1'encontre de la GGB qui, autrement, est tolérogène (immunologiquement tolérée). 10 à 12 jours après l'administration de la protéine immunologi-quement tolérée, on injecte, aux animaux une nouvelle dose de GGB 30 marquée avec de l'iode-125. Si les animaux sont tolérants, l'antigène marqué se dégrade lentement comme la gamma-globuline de leur propre organisme. Si, au contraire, les animaux sont immunisés, il se produit un phénomène dit "élimination consécutive à l'immunisation", c'est-à-dire une disparition de l'antigène 35 marqué du circuit sanguin beaucoup plus rapide. On mesure donc les anticorps formés par la vitesse de disparition de la GGB marqué avec l'iode-125. Les essais avec la lysolécithine naturelle ont montré que les animaux traités avec la GGB et la lysolécithine font dis-40 paraître du circuit sanguin la protéine traceuse environ dix à 71 06704 5 2081547 cent fois plus rapidement que ceux d'un groupe de contrôle où l'injection préalable était effectuée avec un liquide consistant uniquement en une solution de chlorure de sodium. 2. Une autre méthode immunologique pour l'évaluation des an-5 ticorps, à l'aide de laquelle on peut déterminer la qualité d'un adjuvant, consiste à coupler l'immunogène (GGB) à des érythro-cytes et à incuber les cellules ainsi préparées avec le sérum dans une série à dilution progressive durant 20 heures à 4°C. Lorsque le sérum contient des anticorps, les érythrocytes sont 10 agglutinés. On désigne par "titre en anticorps d'un sérum" la dilution maximum à laquelle ce phénomène est encore perceptible. Même par cette méthode, nettement moins précise, on peut é-tablir d'une façon indiscutable que les lysolécithines sont des adjuvants d'une grande efficacité. 15 On peut administrer les lysolécithines des formules la - Xc suivant les procédés habituels. Une voie d'administration préférée est l'injection intrapéritonéale. On peut faire varier la dose entre de larges limites. On peut administrer, selon le degré de potentialisation désiré de la réponse immunitaire des 20 doses de 0,5 à 10 mg/kg. Les exemples suivants décrivent la fabrication de quelques-unes des préparations pharmaceutiques contenant, comme substances actives, des susdits composés. Exemple I.- Dragées contenant 100 mg 1-palmitoyl-glycérine-25 phosphate-® de monocholine monohydraté. 1 noyau de dragée contient : substance active 100,0 mg phosphate dicalcique, anhydre 73,0 mg amidon de maïs 55,0 mg 30 polyvinylpyrrolidone 5,0 mg carboxyméthylcellulose 5,0 mg stéarate de magnésium 2,0 mg 240,0 mg Procédé de fabrication : 35 On humecte d'une solution alcoolique de la polyvinylpyrro lidone à 10% le mélange du phosphate de calcium et de l'amidon de maïs avec la substance active, on fait passer la masse à travers un tamis de 1,5 mm d'ouverture de maille et on sèche à 45*C. On fait passer le granulé sec à nouveau à travers le même tamis 40 et on le mélange avec la carboxyméthylcellulose et le stéarate 71 06704 2081547 de magnésiu-s;, puis on tr an s foras® le mélange résultant en noyaux de dragées par coaaprsssion» Poids d'un noyau : 240 mg ; poinçon : 9 mm de diamètre. On recouvre, selon la technique connue, les noyaux ainsi 5 formés, d'un enrobage consistant essentiellement en sucre et talc, et on polit les dragées finies à l'aide de cire d'abeilles. Poids d'une dragée : 450 mg. Exemple 2»- Tablettes contenant 200 mg i-palmitoyl-glycérine-phosphate-(3) de 10 monocholine monohydraté.. 1 tablette contient : substance active 200,0 mg lactose 100,0 mg amidon de maïs 80,0 mg 15 polyvinylpyrrolidone 12,0 mg cellulose microcristailine 54,0 mg stéarate de magnésium 4,0 mg 450,0 mg Procédé de fabrication : 20 On prépare un mélange constitué de la substance active, du lactose, de l'amidon de maïs et de la polyvinylpyrrolidone et on l'humecte d'eau. On fait passer la masse humide à travers un tamis de 1,5 mm d'ouverture de maille, on le sèche à 45°C et on le fait passer de nouveau à travers le même tamis. On mélange 25 le granulé avec la cellulose microcristalline et le stéarate de magnésium et on transforme le mélange en tablettes par compression. Poids d'une tablette : 450 mg ; poinçon : 11 mm de diamètre. Exemple III.- 30 Gouttes buvables contenant 10 mg 1-palmitoyl-glycérine-phosphate- (3) de monocholine monohydraté par ml. 100 ml de solution pour gouttes contiennent : substance active 1,0 g p-oxybenzoate de méthyle 0,035 g 3 5 p-oxybenzoate de propvla propylèneglycol essence d'anis menthol sacaharinate de sodium 4q éthanol eau distillée q.s.p.f. 0,015 g 45,0 g 0,05 g 0,05 g 1,0 g 1,0 g 100,0 ml BAD ORIGINAL COPY 71 06704 7 2081547 Procédé de fabrication : On dissout la substance active dans un mélange de 45 g de propylèneglycol et de 45 g d'eau. On dissout dans l'éthanol les esters de l'acide benzoïque, le menthol et l'essence d'anis. On 5 réunit les deux solutions et on ajoute de l'eau jusqu'à un volume de 100 ml, après avoir ajouté aux deux solutions réunies le saccharinate de sodium. Exemple IV.- Ampoules contenant 50 mg l-palmitoyl-glycérine-phosphate-00 de mo-10 nocholine monohydraté. 1 ampoule contient : substance active 50,0 mg polypropylèneglycol 2500,0 mg acide tartrique 15,0 mg 15 eau distillée q.s.p.f. 5,0 ml Procédé de fabrication : On chauffe 200 g d'eau distillée jusqu'à environ 50°C et on ajoute la quantité nécessaire de propylèneglycol. Dans ce mélange, on dissout ensuite la substance active et l'acide tartri-20 que et on ajoute de l'eau jusqu'au volume indiqué. On filtre la solution sous des conditions stériles et on la conditionne dans des ampoules de 5 ml. Exemple V.- Ampôules contenant 20 mg 1-palmitoyl-glycérine-phosphate-(3) de 25 monocholine monohydraté. 1 ampoule contient : substance active 20,0 mg polypropylèneglycol 1000,0 mg acide tartrique 6,0 mg 30 eau distillée q.s.p.f. 2,0 ma Procédé de fabrication : On opère comme pour les ampoules à 50 mg. Comme il va de soi, et comme il résulte d'ailleurs déjà de ce qui précède, l'invention ne se limite nullement à ceux de 35 ses modes d'application, non plus qu'à ceux des modes de réalisation de ses diverses parties, ayant été plus spécialement envisagés ; elle en embrasse, au contraire, toutes les variantes. yM' COPY 71 06704 8 2081547 REVENDICATIONS 1. Utilisation, en tant qu'adjuvants immunologiques, de lysolécithines des formules : Cl^-O-acyle ( + ) la CH-OH I CH.-O-P—0—CH~—CH -N(CH-.) -> 2 //\ 2 2 3 3 ° V) 10 CH--OH I 2 CH-O-acyle I ( + ) CH_—O—P—O—CH„—CH„—N(CH0), Ib 2 /\ 2 2 33 15 0 °(-) CH^-O-acyle 1 ( + ) CH—O—P—O—CH„—CH0—N ( CH-, ) - le /\ 2 2 33 ? °(-) 20 CH2-OH dans lesquelles "acyle" représente le reste d'un acide gras aliphatique. 2. Adjuvants immunologiques, caractérisés par le fait qu'ils contiennent en tant que substance active, un ou plusieurs 25 composés des formules la à le selon la revendication 1.