FR 2070135 A1 19710910 FR 7037391 A 19701016 70 37391 1 2070135 La présente invention concerne un procédé de préparation d'alpha-aminobenzylpénicilline à partir de l'acide 6-amino-pénicillanique (appelé ci-après 6-APÂ) et de l'acide alpha-aminophénylacétique ou de dérivés fonctionnels et sels d'addi-5 tion d'acides de ces composés à l'aide d'un micro-organisme ou d'une enzyme produite par ce micro-organisme. L'alpha-aminobenzylpénicilline est un antibiotique important "bien connu et a donc fait 1*objet de beaucoup de travaux.. Toutefois, les procédés courants pour la préparation 10 de ce composé présentent un ou plusieurs inconvénients, ce qui a conduit la Demanderesse à chercher des procédés pour préparer l'alpha-aminobenzylpénicilline au moyen d'un micro-organismes Une partie du problème qui se pose avec les procédés de la technique antérieure est que les enzymes connues ne sont 15 pas d'une grande spécificité en ce qui concerne leur capacité de provoquer la formation de l'alpha-aminobenzylpénicilline désirée à partir du 6-APA et de l'acide alpha-amino-acétique. la pénicilline-acylase, produite par un micro-organisme bien connu, est une telle enzyme d'une faible spécificité concernant 20 le substrat» Dans la préparation d'alpha-aminobenzylpénicilline selon la technique antérieure, le 6-APA utilisé comme matière de départ est habituellement obtenu par hydrolyse de pénicilline Go En plus du 6-*&PA présent dans le produit d'hydrolyse, 25 il y a aussi une certaine quantité d'acide phénylacétique comme résultat de l'hydrolyse. En raison de la non-spécificité des enzymes connues, les tentatives en vue de préparer l'alpha-aminobenzylpéniciline à partir de 6-APA non purifié auquel on a ajouté de l'acide alpha-aminophénylacétique se heurtent à 50 un certain nombre de difficultés. Par exemple, la pénicilline G indésirable est reproduite à partir de l'acide phénylacétique et du 6-APA, tandis que l'alpha-aminobenzylpénicilline désirée est produite à partir de l'acide alpha-aminophénylacétique et du 6-APA dans les mêmes conditions. Par conséquent, quand on 55 prépare l'alpha-aminobenzylpénicilline à partir d'acide alpha-aminophénylacétique et de 6*-APA en présence d'acide phenylacé— tique, de la pénicilline G est toujours formée comme sous- 70 37391 2 2070135 produit, ce qui exige une grande quantité de 6-APÂ comme substrat. De plus, il est difficile de séparer l'alpha-aminobenzylpénicilline de la pénicilline G» Par conséquent, on a considéré comme avantageux dans les procédés .connus d'utiliser du 6-APA 5 purifié et d'éviter ainsi ces difficultés» Il serait souhaitable en réalité qu'on dispose de micro-organismes capables de produire seulement de l'alpha-aminobenzylpénicilline à partir de 6-APA contenant de l'acide phénylacétique comme substrat, de façon à éliminer l'opération de purification du 6-APA. 10 Selon la présente invention, on a trouvé des micro organismes qui élaborent une enzyme ayant une forte activité spécifique au substrat capable de produire l'alpha-aminobenzylpénicilline avec un rendement élevé non seulement sans aucune formation de 6-APA à partir de pénicilline G, mais encore sans 15 être influencée par l'acide phénylacétique éventuellement contenu dans la solution de réaction, et de plus sans former de pénicilline G comme sous-produit à partir de l'acide alpha-aminophénylacétique ou de son dérivé et du 6-APA. Ce fait est une découverte nouvelle, qui n'a pas été rapportée du tout anté-20 rieurement dans les sociétés académiques, et.est d'une très grande importance comme procédé à l'échelle industrielle pour la production d'alpha-aminobenzylpénicilline. la présente invention permet ainsi l'utilisation directe, sans purification, du 6-APâ d'une solution mixte de 25 6-APA et d'acide phénylacétique obtenue par l'hydrolyse de la pénicilline G par la pénicilline-acylase selon des procédés bien connus. De plus, l'alpha-aminobenzylpénicilline ainsi produite peut être facilement purifiée, donnant ainsi un produit qui est obtenu à bon marché à un rendement élevé et sur une 30 grande échelleo . Selon le procédé de l'invention, on fait réagir l'acide alpha-aminophénylacétique avec le 6—APÂ en présence d'un micro-organisme qui a une forte spécificité pour le substrat et n'est pas capable de former du 6-APÂ à partir de la 35 pénicilline G0 Les substrats peuvent être les acides libres ou leurs dérivés fonctionnels et sels d'addition d'acides comme on le décrira plus en détail ci-aprèso 70 37391 3 2070135 N'importe quel micro-organisme peut être utilisé du moment que le micro—organisme a une activité enzymatique ayant la propriété de produire seulement de 1 * alpha-aminobenzylpéni— cilline à partir de l'acide 6-aminopénicillanique et de l'acide 5 alpha-aminophénylacétique ou de leurs dérivés, qui ne forme pas du tout de 6-APA à partir de la pénicilline & et sans formation de pénicilline G comme sous-produit, même s'il y a de l'acide phénylacétique contenu dans une solution de réaction. Un exemple typique de tels micro-organismes est le genre "10 Pseudomonas. Le procédé de l'invention envisage l'utilisation des corps seulement des cellules des micro-organismes, d'une liqueur de culture obtenue par culture de ces micro-organismes ou de l'enzyme libre isolée comme on le décrira ci-après„ Pour 15 obtenir les corps de cellules, la liqueur de culture ou l'enzyme libre, on cultive les micro-organismes dans un milieu nutritif de manière que l'enzyme désirée soit produite. La culture est de préférence effectuée pendant un temps suffisant pour permettre l'accumulation extracellulaire de l'enzyme comme 20 on le décrira ci-après. Comme milieu pour la culture de ces micro-organismes, on utilise un milieu contenant une source de carbone appropriée comme du glucose, du saccharose, de l'amidon, des mélasses, de la glycérine, du sorbitol ou des produits naturels contenant 25 ces substances. Le milieu contient aussi une source d'azote appropriée, par exemple une source d'azote naturelle comme la peptone, l'extrait de viande, l'extrait de levures, la liqueur de macération de maïs, le "Mieki" (hydrolysat acide de farine de soja), l'acide glutamique et les matières du même genre ou 30 des sources d'azote inorganiques comme l'urée, l'ammoniac, le sulfate d'ammonium, le chlorure d'ammonium, le nitrate d'ammonium, etc.. De plus, sont présentes aussi de préférence des quantités appropriées de sels inorganiques comme des phosphates (phosphate primaire de potassium, phosphate secondaire de 35 potassium, etc..) ; des sels de magnésium comme le sulfate de magnésium ; des ions de métaux comme de fer, de sodium, de potassium, de manganèse, de zinc, de calcium, etc.., et des 70 37391 4 2070135 anions comme des ctilorure s et des nitrates. D'autres substances nutritives pour le développement de ces souches sont ajoutées au milieu sœi.vant le besoin. La culture est conduite dans des conditions aérobies, 5 comme par culture à secousses ou culture immergée avec aération et agitation» La température de culture est de 20 à 50°C, de préférence de 28 à 37°C et le pïï de culture est de 5*0 à 10,0, de préférence de 7*0 à 8,0. Le temps de culture est habituellement de 6 à 48 heures. De cette manière» l'enzyme 10 possédant une capacité de synthèse est formée dans les corps de cellules de la culture et également dans la liqueur de culture. Comme indiqué ci-dessus, l'enzyme utilisée dans le procédé de la présente invention peut être fournie sous la 15 forme de la liqueur de culture elle-même, des corps de cellules eux-mêmes ou de l'enzyme libre purifiée obtenue à partir d'une solutiôn de corps de cellules rompus par relargage au chlorure d'ammonium, par une méthode de précipitation utilisant une addition d'acétone ou d'éthanol, par chromatographie sur colonne 20 etc... Qjiand les corps de cellules sont utilisés comme source d'enzyme, on peut utiliser une suspension-solution des corps de cellules ou on utilise des corps de cellules séchés à l'acétone. Quand on utilise la liqueur de culture elle-même, les substrats réagissants sont ajoutés à la liqueur de culture 25 pour réaction, après réglage du pH comme indiqué ci-après pour des conditions favorables de réaction. Le substrat 6-APA peut être fourni sous la forme de cristaux bruts de 6-APA obtenus à partir de l'hydrolysat de pénicilline ©■ ou d'une solution de 6-APÂ contenant de l'acide 30 phénylacétiqpe. Il est habituellement présent sous la forme des sels d'ammonium, de sodium et de potassium. L,e. substrat acide alpha-aminophénylacétique peut être utilisé sous la forme de l'acide libre ou d'un dérivé fonction®:®! de cet acide comme l'amide, d'esters d'alcoyles 35 comme de mêthyle, d'éthyle, de propyle, d'octyle, etc.. ou sous la forme des sels de métaux alcalins ou de métaux alcalino- 70 37391 5 2070135 terreux comme les sels de sodium, de potassium ou de calcium» De plus, l'un ou l'autre des corps en réaction ou les deux peuvent être utilisés sous la forme d'un sel d'addition d'acide, spécialement ceux des acides minéraux comme par exemple les 5 chlorhydrates, bromhydrates, iodhydrates, phosphates acides et sulfates acides. la réaction entre les substrats est conduite dans une solution de réaction préparée en ajoutant les substrats et une quantité appropriée de l'enzyme de préférence à une so-10 lution tampon à un pH constant, ou en ajoutant les deux substrats à la li-queur de fermentation elle-même, comme décrit ci-dessus. Les pH de réaction appropriés sont compris dans un large intervalle de 3 à 8, mais un pH particulièrement approprié pour la présente réaction est compris entre et 6,5<> 15 La température de réaction est comprise entre 25 et 50°C, de préférence entre 30 et 37°C. La réaction est conduite de préférence pendant 1 à 24 heures» Après l'achèvement de la réaction, 1'alpha-aminoben-zylpénieilli'né peut être facilement isolée par des méthodes 20 connues comme par extraction de transfert ou précipitation par un solvant organique j par échange d'ions, ou par chromatogra-phie sur colonne« La précipitation au point isoélectrique peut être utilisée également» L'alpha-aminobenzylpénicilline présente un large 25 spectre d'activité antibiotique contre des bactéries pathogènes Gram-positives et Gram-négatives» Les doses d'alpha—aminoben-zylpénicilline nécessaires pour administration orale sont comprises entre 1 et 6 g environ par jour. EXEMPLE 1 - 30 La souche Pseudomonas melanogenum ATGG 17808 est uti lisée comme micro-organisme d'ensemencement et un milieu comprenant 1% de peptone, 1% d'extrait de viande, 0,5% d'extrait de levures et 0,3% de chlorure de sodium est utilisé comme milieu d'ensemencement. On inocule la souche à l'aide d'une 35 feoucle de platine dans 300 cm^ du milieu d'ensemencement dans une fiole conique de 2 litres et on conduit la culture à 30°C pendant 24 heures en secouant. La liqueur de culture d'ensemen- 70 37391 6 2070135 cernent ainsi obtenue est ensuite inoculée dans 3 litres du milieu de fermentation principal décrit ci-après dans un fer-menteur cylindrique de 5 litres. la composition du milieu de fermentation principal 5 est la suivante : 1% de peptone, 1% d'extrait de levures, 0,5% d'extrait de viande, 0,5% cle glutamate de sodium, 0,25% de chlorure de sodium, pH avant stérilisation 7»3 (réglé à l'aide de NaCH 5^0 . Conditions d'agitation : 300 tours par minute. 10 Débit d'aération s 3 litres par minute Température : 30°C On conduit la culture pendant 24 heures, tandis que le pH du.système est ajusté à 7*5 durant l'opération de culture (à l'aide d'une solution mixte de 10% d'acide glutamique et 15 6% d'acide sulfurique). Après la fermentation, les corps de cellules sont séparés de la liqueur de fermentation par précipitation centrifuge et mis en suspension dans une solution tampxn1/30 M d'acide phosphorique de pH 6,0 de manière que les corps de cellules aient une concentration d'environ 5 mg/cm^, 20 à sec. On n'observe absolument pas de formation de 6-APA même si on laisse agir la pénicilline G sur la suspension résultante des corps de cellules. Des poudres brutes de 6-APÂ contenant de l'acide phénylacétique et de l'amide d'acide alpha-aminophénylacétique 25 sont ajoutées à la suspension de cellules de manière que le 6-APÂ soit présent à raison de 10 mg/cm^ et que l'acide alpha-aminophénylacétique soit présent à raison de 25 mg/cm^. la solution de réaction ainsi préparée est soumise à une réaction à 35°C pendant 3 heures, la quantité d'alpha-aminobenzylpénicil-30 line ainsi formée dans la solution de réaction est de 8,5 mg/cm3. On n'observe pas du tout de formation de sous-produit pénicilline Go la solution de réaction est réglée au pH 4,0 à l'aide d'acide chlorhydrique et centrifugée. Un litre du liquide sur-35 nageant est passé à travers une colonne garnie de Dowex 50W x 4 (résine échangeuse de cations fortement acide fournie par The Dow Chemical Co, E.U.A.) de façon que 1'alpha-aminobenzylpéni- 70 37391 7 2070135 cilline soit adsorbée. La résine est éluée à l'aide de tampon citrate 0,2 U (pH 4,25) et ensuite à l'aide de tampon citrate-phosphate 0,03 M (pH 7,0). La fraction active est concentrée et les sels sont éliminés à l'aide de Sephadex G—10 (destrane 5 disponible en provenance de Pharmacia Fine Chemicals Inc., E.TJ.A. ). Le concentré dont les sels ont été éliminés est adsor-bé sur du charbon actif et élué à l'aide de méthanol aqueux à 50%. L'éluat est séché par congélation pour donner une poudre brute d'alpha-aminobenzylpénicilline. Après recristallisation 10 à partir d'eau (pH 4,0), on obtient 4,2 g d'alpha-aminobenzylpénicilline pure. iotrmple 2 - On prépare une culture d'ensemencement de la souche Pseudomonas melanogenum ÂTCC 14535 de la même manière qu'à 15 l'Exemple 1 et on inocule 1,8 litre de la culture d'ensemencement dans 100 litres du milieu de culture d'ensemencement stérilisé dans un réservoir d'une capacité de 200 litres. On conduit la culture avec agitation à 250 tours par minute à un débit d'aération de 60 litres par minute et à une température de 20 30°C pendant 24 heures. Ensuite, 1000 litres de milieu de fermentation principal sont stérilisés dans une cuve d'une capacité de 2000 litres de la même manière qu'à l'Exemple 1 et 100 litres de liqueur de culture d'ensemencement, obtenus de la manière indiquée ci-dessus, sont inoculés dans le milieu de 25 fermentation principal. On conduit ensuite la culture en agitant à 100 tours par minute, à un débit d'aération de 200 litres par minute et à une température de 30°C pendant 12 heures, tout en réglant le pH durant la culture à 7»5 de la même manière qu'à l'Ecem-30 pie 1« On n'observe absolument pas de formation de 6-APA, même si on laisse agir la pénicilline G sur la liqueur de culture ainsi obtenue. De plus, un volume d'une solution de produit de décomposition par la pénicilline-acylase de pénicilline 35 G (teneur en 6-APA : 20 mg/cm^) obtenu selon des méthodes bien connues est ajouté à 1 volume de la liqueur de culture principale et on y ajoute 25 mg/cm^ d'ester de méthyle de chlorhydrate 70 37391 8 2070135 d'acide alpha-aminophénylacétique et on conduit la réaction en agitant à 100 tours par minute à une température de 35°C pendant 3 heures sans aération, tout en réglant le pH à 6,0 à l'aide d'ammoniaco La quantité d'alpha-aminobenzylpénicilline 5 ainsi formée dans la solution de réaction est de 8,9 mg/cm^0 On n'observe pas du tout de formation de sous-produit pénicilline G. TOTRMPT.-R 3 - On prépare une culture d'ensemencement de la souche 10 Pseudomonas ovalis ÂTCG 15175 de la même manière qu'à l'Exemple 1. et on inocule 1,5 litre de la culture d'ensemencement dans 15 litres de milieu de fermentation principal placés dans un fermenteur cylindrique d'une capacité de 30 litres. La composition du milieu de fermentation principal 15 est la suivante : 2,5% de Mieki, 1,0% de peptone, 0,5% de glutamate de sodium, 0,02% de phosphate4 primaire de potassium et 0,02% de sulfate de magnésium ; pH avant la stérilisation : 7,2. On conduit la culture en agitant à 250 tours par mi-20 nute, à un débit d'aération de 10 litres par minute et à une température de 30°C pendant 24 heures, tout en réglant le pH durant la culture4à 7»5 de la même manière qu'à l'Exemple 1» On n'observe pas du tout de formation de 6—APA, même quand on laisse agir la pénicilline G sur la liqueur de culture ainsi 25 obtenue» La réaction des substrats est conduite, de la même manière qu'à l'Exemple 2, en utilisant la liqueur de culture comme source d'enzyme. La quantité d'alpha-aminobenzylpénicilline ainsi formée dans la solution de réaction est de 7,4 mg/cm^ et on 30 n'observe pas du tout de formation de sous-produit pénicilline G» 70 37391 9 2070135 BEVBMIICAIIOlfS 1) Un procédé de production d * alpha-aminobenzylpéni-cilline, caractérisé en ce qu'on fait réagir l'acide 6-amino-pénicillanique et l'acide alpha-aminophénylacétique, leurs 5 dérivés ou des sels d'addition d'acides de ces composés en présence d'une enzyme dérivée d'un micro-organisme appartenant au genre Pseudomonas, cette enzyme ayant la propriété de former de 1'alpha-aminobenzylpénicilline à partir d'acide 6-amino-pénicillanique et d'acide alpha-aminophénylac étique sans for-10 mer d'acide 6-aminopénicillanique à partir de la pénicilline G et en même temps sans former de pénicilline G à partir d'une solution contenant de l'acide phénylacétique et de l'acide 6-aminopénicillanique. 2) Un procédé selon la revendication 1, caractérisé 15 eu ce que la réaction est conduite à un pH compris entre 3 et 8 et à une température comprise entre 25°G et 50°Co 3) Un procédé selon la revendication 2, caractérisé en ce que le pH est compris entre 5»5 et 6,5 et que la température est comprise entre 30°C et 37°C. 20 4) Un procédé selon la revendication 2, caractérisé en ce que la réaction est conduite pendant 1 à 24 heures. 5) Un procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que l'enzyme est produite par culture aérobie du microorganisme dans un milieu nutritif à une température comprise 25 entre 20°0 et 50°0 et à un pH compris entre 5 et 10. 6) Un procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que l'enzyme est contenue dans les corps de cellules des micro-organismes et que la réaction est conduite en présence de ces corps de celluleso 30 7) Un procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que l'enzyme est présente dans une -liqueur de culture obtenue à partir des micro-organismes et que la réaction est conduite en présence de cette liqueur de cultureo 8) Un procédé selon la revendication 1, caractérisé 35 en ce que le micro-organisme est une souche de Pseudomonas melanogenum. 9) Un procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que le micro-organisme est une souche de Pseudomonas ovalis.