FR 2060034 A1 19710611 FR 7025377 A 19700708 70 25377 1 2060034 La présente invention concerne la production d'un moût à bière utilisable pour la fabrication de boissons alcoolisées non-distillées, telles que la bière, l'aie, la bière de fermentation basse, et analogue; l'invention concerne également un système 5 enzymatique utilisable pour l'obtention d'un tel moût à bière, ainsi que la transformation dudit moût à bière en de telles boissons fermentées. La production des boissons précitées implique normalement, ainsi qu'il est bien connu, la formation initiale d'un moût 10 selon un procédé de trempe ou de brassage suivi d'un procédé de fermentation dans lequel les sucres fermentescibles, tels que le maltose, présents dans le moût sont transformés en alcool et en gaz carbonique. Dans le brassage de la bière, le moût est.habituellement produit en produisant la trempe d'une 15 bouillie de malt d'orge et de produits d'addition tels que des céréales traitées, des grains de céréales crus non germés tels que le maïs et le riz, ou quelque autre source d'hydrates de carbone. Les matériaux non modifiés à base d'amidon tels que les gruaus de maïs cru, doivent être précuits dans un appareil 20 de cuisson indépendant avant d'être ajoutés à la trempe ou maishe. Ceci est généralement effectué en les mélangeant avec de l'eau et du malt finement broyé et en faisant ensuite bouillir le mélange. Le malt liquéfie le matériau à base d'amidon, ce qui permet la transformation subséquente de l'amidon en sucre 25 pendant l'opération de brassage. Pendant l'opération de brassage ou de trempe, le malt, en raison des enzymes qu'il contient, joue un rôle important. Ainsi, les c ■70 25377 2 2060034 aussi aux propriétés caractéristiques de la bière, par exemple à la stabilité de l'écume et de la turbidité et à la .saveur de bière. Cette dépendance par rapport au malt qui est une caracté-5 ristique de la pratique actuelle est accompagnée par plusieurs inconvénients importants. Par exemple, le matériau est relativement coûteux en raison du coût élevé de l'orge d'une qualité convenant à la malterie, du temps et du coût de la transformation de 1-' orge en malt et spécialement en raison des investissements 10 nécessaires tant en ce qui concerne les installations que le travail impliqué par la production de ce malt. De plus, le malt contient des enveloppes (8-12 %) et, d'une façon typique, environ 2 à 3 % d'un liquide visqueux et gras qui tend à conférer une mauvaise couleur et un goût amer au moût. En outre, l'installation 15 nécessaire à la formation du malt tend à être complexe et coûteuse et nécessite une surveillance attentive des divers étapes de la fabrication par un personnel spécialisé. Depuis quelques temps, les brasseurs ont pris conscience . de l'influence de ces facteurs, de telle sorte que des proposi-20 tions ont.été faites en vue de diminuer l'importance du malt dans la fabrication d'un moût à bière. Ainsi, dans la description du brevet américain 3-081.172, au nom de la demanderesse,. on a décrit un moût de bière qui est obtenu à partir d'une trempe ou maische de grains de céréales crus, par exemple d'orge, traités 25 par un mélange disponible dans le commerce d'enzymes protéolytiques et amylolytiques, en remplacement partiel ou total du malt. La trempe est maintenue à des températures pour lesquelles les enzymes dégradent d'abord les protéines et transforment ensuite l'amidon solubilisé en sucres. 30 Ce procédé, qui a été employé avec succès pour la fabrication d'une bière acceptable dans les conditions d'un brassage véritable, entraîne une diminution très importante des coûts de production puisque l'orge ou le maïs non germé ou un matériau similaire à base d'amidon peut être utilisé pour fournir une 35 haute proportion des hydrates de carbone nécessaires à la fermentation, au lieu d'employer les grains germes beaucoup plus coûteux. Cependant, il est bien connu que la bière constitue 70 25377 3 2060034 une substance complexe possédant des caractéristiques physico-chimiques et organoleptiques très subtiles,telles que par exemple la couleur, la stabilité de la mousse, la stabilité du voile ou trouble, la tenue de la mousse et le goût. Il n'est pas 5 surprenant par conséquent que, dans un tel procédé enzymatique, de nombreux facteurs sont impliqués pour l'obtention d'un moût et d'une bière finale avec des caractéristiques apparentées à celles d'un moût de malt et d'une bière de malt classiques. Par exemple, des facteurs particulièrement importants qui influencent 10 les propriétés du moût et de la bière sont constitués par les niveaux d'activité et les concentrations relatives des protéases et amylases. Ainsi, la demanderesse a trouvé que les propriétés du moût et de la bière dépendent dans une large mesure des variations des degrés d'activité des protéases et amylases et 15 de leur concentration relative, car de telles variations peuvent altérer l'équilibre nécessaire entre la teneur en azote et la teneur en sucres et entre les sucres fermentescibles et les sucres non-fermentescibles. Malheureusement, comme cela arrive dans la pratique, de nombreuses préparations enzymatiques dispo-20 nibles dans le commerce ne sont pas standardisées en ce qui concerne leur activité, de sorte que le degré d'activité des enzymes varie souvent, éventuellement dans de larges limites, d'un échantillon ou lot à un autre. En conséquence, il est quelquefois difficile de commander le procédé enzymatique pour 25 obtenir un produit reproductible, et d'être capable de régler le procédé pour tenir compte des autres facteurs variables. la présente invention concerne donc un traitement enzymatique de matières premières à base d'amidon, afin de produire un moût à bière. 30 Un objet de l'invention consiste en un procédé enzymatique pour la transformation des matières premières contenant de l'amidon en un moût à bière de propriétés substantiellement reproductibles, lesquelles, par exemple une teneur éle'vée en sucre fermentescible ("atténuation" accrue) et une teneur en 35 azote formolé, sont généralement supérieures à celles des moûts préparés par le procédé du brevet précité. 70 25377 4 2060034 Un autre objet de l'invention consiste en un procédé enzymatique dans lequel la digestion de la substance à base d'amidon peut être facilement contrôlée et ajustée pour donner un moût à bière ayant des propriétés substantiellement 5 reproductibles. Un autre objet de la présente invention consiste en un système enzymatique d'activité définie et standardisée qui, lorsqu'il est utilisé pour la digestion de la substance à base d'amidon, donne un moût à bière satisfaisant et ce, 10 dans des conditions reproductibles. Ces moûts à bière, lorsqu'ils sont ensuite soumis à la fermentation, d'une façon consistante, donnent une bière avec de meilleures caractéristiques organoleptiques ainsi que de meilleures autres qualités, par exemple une tenue de la mousse 15 et une stabilité du voile, que la bière brassée à partir d'un moût obtenu par le procédé décrit dans le brevet précité. Un autre objet de l'invention consiste par conséquent en une bière ayant des caractéristiques de goût ou saveur améliorées ainsi que d'autres qualités améliorées, par exemple une tenue de 20 la mousse et une stabilité du voile ou trouble supérieures à celles de la bière brassée à partir d'un moût fabriqué selon le procédé décrit dans le brevet précité. D'autres caractéristiques de l'invention apparaîtront au cours de ladescription qui va suivre, en référence aux dessins 25 annexés dans lesquels : - les figures 1 à 3 sont des organigrammes montrant les divers étapes du procédé et leur incorporation dans l'ensemble du procédé, selon des modes de réalisation préférés de la présente invention; 30 - la figure 4 est un graphique donnant les intervalles de température et de temps définissant des cycles de brassage ou trempe satisfaisants, selon les modes de réalisation préférés de la présente invention.; - la figure 5 est un graphique représentant l'allure de 35 chauffe, c'est-à-dire la température en fonction du temps dans le cycle de brassage mis en oeuvre dans le processus des exemples ci-après; 70 25377 5 2060034 - les figures 6 à 11 sont des graphiques montrant les effets, sur les propriétés d'un moût typique, des variations des quantités et des concentrations relatives des amylases et protéases utilisées dans le procédé de brassage ou trempe. ^ - les figures 13 et 14 sont des graphiques montrant la rela tion entre les propriétés du moût et certaines variables, dans un procédé selon l'invention. Il a maintenant été trouvé que, conformément à l'un des aspects de la présente invention, les caractéristiques ou buts 10 précités peuvent être obtenus en faisant réagir, dans des conditions de température et de temps déterminées, une substance à base d'amidon, broyée, avec au plus 30 %, par rapport au poids de ladite substance à base d'amidon, de malt ou d'un extrait de malt et de protéase et d'c^i -amylase isolée^ en une quantité 15 d'au moins 0,5 unité de protéase Kunitz modifiée par gramme de substance à base d'amidon et d'au moins 80 unités d'-amylase Stein-Fischer modifiées par gramme de substance contenant de l'amidon, le rapport amylase/protéase, exprimé en termes d'activité, étant inférieur à 200 : 1 et, de préférence, compris entre 20 170 : 1 et 75 : 1. Selon un mode de réalisation préféré de la présente invention, une bouillie aqueuse de la substance à base d'amidon est mélangée avec, dans une première étape :■ (a) une protéase isolée utilisée seule; ou 25 (b) une protéase isolée mélangée au malt ou à l'extrait de malt; ou (c) un mélange d'enzymes isolées contenant à la fois la protéase et 1 -amylase; ou (d) un mélange d'enzymes isolées contenant à la fois la protéase et 1' -amylase, en même temps que le malt ou que l'extrait de malt. 30 I 0 et environ 6,5) on chauffe ensuite la bouillie à environ 40°-55°C pendant une durée d'environ 30 à environ 120 minutes. Pendant cette période, la protéase dégrade les protéines de poids moléculaire élevé présentes dans 35 la substance à base d'amidon, de façon à former des peptides de plus faible poids moléculaire et des amino-acides. A la fin ou vers la fin de cette période d'essai protéolytique, le malt ou l'extrait de malt et/ou 1'^ -amylase sont ajoutés s'ils n'ont 70 25377 6 2060034 pas été préalablement introduits dans l'étape initiale, la trempe est ensuite chauffée à environ 60°-80°C pour effectuer la solubilisation et la saccharification de la substance à base d'amidon. 5 On permet à la saccharification de se poursuivre jusqu'à l'obtention de l'éventail désiré-d'hydrates de carbone, en particulier jusqu'à l'obtention du rapport désiré entre les sucres fermentescibles et les sucres non-fermentescibles, avec la condition supplémentaire d'un moût à bière acceptable, la 10 saccharification est d'habitude substantiellement complète au bout de 30 à 120 minutes, comme il est par exemple montré par l'essai de coloration par l'iode, lorsque le degré désiré de saccharification a été atteint, les enzymes sont inactivées en élevant la température au-dessus de 80°C, c'est-à-dire entre 15 80 et 85°C, cette température plus élevée étant d'habitude maintenue pendant 2 à 12 minutes. Ensuite, le moût est séparé, de façon typique par filtration, des constituants solides et non digérés de la trempe (drèehe des brasseurs). Un procédé préféré conforme à la présente invention comprend 20 l'addition à la bouillie aqueuse de graines de céréales, d'un adjuvant céréalier, à la fin ou vers la fin du repos protéolytique ou repos de la trempe. Cette addition peut se faire sous la forme d'une masse liquéfiée de grains de céréales à base d'amidon non modifié telle que des gruaus de maïs, de la poudre ou farine 25 de maïs, de la farine de riz, de la farine de froment, de la farine d'orge, des grains de sorgho et analogues, qui ont été précuits dans un récipient séparé. Cet adjuvant céréalier peut aussi se présenter sous la forme d'une substance à base d'amidon préparée ou traitée préalablement, telle que par exemple des 30 paillettes ou flocons de maïs, de l'amidon de maïs, du glucose et analogue. De préférence, l'adjuvant céréalier est introduit en une quantité allant d'environ 10 à environ 60 $ et, d'une manière encore plus désirable, d'environ 42 à environ 55 f°, en poids desdits grains d'adjuvant céréalier par rapport au poids 35 du substrat de grains céréaliers de la bouillie aqueuse. Les èxpressions "enzyme isolée" ou "mélange d'enzymes isolées" utilisées ici relativement à la protéase et à 1' 0( -amylase se 70 25377 7 2060034 réfèrent à une enzyme ou à un mélange d'enzymes dérivé d'une source constituée par une plante, des bactéries ou des champignons et qui a été extrait et purifié, à une échelle industrielle, cette enzyme ou ce mélange d'enzymes possédant de plus une 5 activité importante de la protéase et/ou de 1' cK -amylase comme cela peut être le cas. D'autres enzymes, à part la protéase et/ou 1' (A -amylase, peuvent être aussi présentes, telles que par exemple les cellulases, les hémicellulases et les pectinases. Lorsqu'on utilise un mélange d'enzymes isolées, la protéase et 10 1' ck -amylase constituant le mélange peuvent être, et sont de préférence, obtenues à partir d'une source unique. Ces constituants peuvent également être obtenus à partir de sources différentes, auquel cas les enzymes résultantes sont mélangées l'une à l'autre dans les proportions correspondant au rapport 15 qui a été choisi. L'enzyme ou le mélange d'enzymes peut être utilisé par exemple sous la forme d'une solution ou bien il peut être supporté par un substrat solide. La détermination des activités de la protéase et de 1' dy, -amylase, auxquelles il sera fait référence à divers passages 20 de la présente description et des revendications annexées, résulte des essais biochimiques spécifiques suivants : Détermination de l'activité de la protéase : L'activité de la protéase est mesurée qu'en déterminant, au moyen du réactif de Polins, la quantité de tyrosine soluble 25 dans l'acide trichloracétique (TCA) libérés d'un substrat de caséine dans des conditions spécifiques de pH, de température et de temps. Le réactif précité est disponible à la'îPischer Scientific"sous la dénomination "So-p-24" comme réactif de phénol en solution 2N. La méthode employée est essentiellement 30 celle décrite par Kunitz dans le Journal de Physiologie Générale ST° 30, page 291, 1947» modifiée sur les points suivants : - 2 fo de caséine dans un tampon de phosphate 0,066M - pH 7,0 ; - 2 ml d"enzyme et 2 ml de substrat sont utilisés dans la réaction enzymatique; 35 - la durée de la réaction enzymatique est de 10 minutes à 37°C ; - la précipitation est obtenue au moyen de 4 ml de TCA 0,4M; et - la protéine précipitée est séparée en utilisant du papier-filtre Whatman K° 42. 70 25377 8 2060034 Dans cet essai, une unité de protéase constitue la quantité d'enzymes nécessaire pour produire un microéquivalent de tyrosine soluble dans le TCA, en une minute, dans les conditions de l'essai. 5 Détermination de l'activité de 1' ^ -amylase : Cette activité est mesurée en déterminant, au moyen de l'acide 3,5-dinitro-salicylique, la quantité de sucres réducteurs (maltose) formés à partir de l'amidon solubilisé,dans des conditions spécifiques de pH, de température et de temps, la 10 méthode employée est essentiellement celle décrite par Stein et Fischer dans le Journal de Chimie Biologique F0 232, page 869 (1958) cette méthode étant modifiée sur les points suivants : - on utilise de l'amidon soluble de Merk selon lintner; - on prépare de l'amidon à 1 ' % dans l'eau distillée, en tant 15 que substrat;. - l'enzyme dissoute est diluée dans un tampon d'acétate à 0,05M - pH 6,0 ; - incubation à 37°C, pendant 5 minutes; et - mélange réactioimei dilué avec 10 ml d'eau. 20 Dans cet essai, l'unité d' a. -amylase représente la quantité d'enzymes nécessaire pour obtenir un microéquivalent de maltose en une minute, dans les conditions dé l'essai. D'autres caractéristiques concernant les différents constituants utilisé dans le procédé et se trouvant en relation 25 avec les diverses étapes de l'ensemble dudit procédé seront maintenant décrites. Substance contenant de l'amidon : Quoique les substances contenant de l'amidon, autres que les grains de céréales, telles que par exemple le sarrasin ou blé 30 noir puissent utilisées, on préfère utiliser comme substrat des grains tels que le maïs dégermé, le seigle, le blé, l'orge ou des mélanges de ceux-ci. l'orge est le substrat céréalier préféré puisque ces produits de digestion après attaque enzymatique correspondent plus étroitement à la composition d'un moût 35 à bière classique dérivé du malt; de plus, l'amidon d'orge est gélatinisé à des températures relativement basses, ce qui permet sa dégradation rapide avant qu'unedésactivation thermique 70 25377 9 2060034 des amylases ne survienne. De plus, on pense que les enzymes de l'orge qui sont libérées jouent un rôle important dans la production de sucres fermentescibles. La demanderesse a trouvé que les dimensions des grains influencent d'une manière remarquable le 5 procédé enzymatique. Ainsi, d'une manière générale, plus le grain est fin, moins il faut d'enzymes pour la digestion, et -olus la filtration et le lavage subséquents utilisant une trempe de brassage classique ou des cuves-filtres sont difficiles. En conséquence, un système basé sur l'emploi de grains céréaliers fins implique une 10 faible concentration enzymatique, mais un coût de filtration élevé. D'autre part, les grains les plus grossiers, quoiqu'ils soient plus aisés à filtrer, en utilisant un appareillage de filtration classique, exigent d'habitude une cencentration plus élevée en enzymes. En pratique, la demanderesse a trouvé qu'un compromis satisfaisant 15 entre la concentration enzymatique et l'aptitude d'un moût à.subir la filtration subséquente au moyen d'un appareillage classique de filtration, pouvait être obtenu en broyant les grains jusqu'à une dimension de particule telle que la masse de celles-ci passe à travers un tamis F014 (Tamis normalisé des Etats-Unis), c'est-20 à-dire qu'elles ont une dimension moyenne inférieure à 1,41 mm. Si on le désire, les grains de céréales, tels que l'orge, peuvent être chauffés, par exemple entre 49°C et 76,5°C, ou traités avec des produits chimiques appropriés, avant/formation delà bouillie. Malt : 25 Le malt, qui est présent en petites quantités, aide à conférer les propriétés organoleptiques caractéristiques, telles qu'une saveur corsée, à la bière obtenue à partir du moût résultant de ce malt, et on pense également que ce malt favorise la stabilité. En outre , le malt possède une activité amylolytique due 30 à la présence de 1 en poids, la demanderesse a trouvé qu'aitre envirai 35 8 io et mviron 23$, de façai typique entre &fo et 12 $, en poids , on 70 25377 10 2060034 obtenait des résultats optimaux correspondant au désir d'avoir une faible teneur en malt. D'une façon appropriée, le malt employé est un malt normal pour bière ayant une activité diastatique comprise entre 120° et 140° lintner. le malt est 5 normalement employé sous la forme broyée, de préférence avec des dimensions de particules telles qu'environ 70° fo ou plus du malt passe à travers un tamis n° 14 (Tamis standardisé des Etats-Unis). Enzymes : 10 1.- Protéase La protéase isolée peut provenir d'une source constituée par des bactéries, des champignons, une plante ou un animal, quoique lesprotéases d'origine bactérienne soient celles que l'on préfère. Les protéases bactériennes peuvent être par exemple 15 obtenues à partir de l'une quelconque des bactéries suivantes : Bacillus subtilis, Bacillus amyloliquefaciens, Bacillus polymyxa, Bacillus megaterium et Bacillus cereus. Les protéases provenant des champignons peuvent être par exemple obtenues à partir de l'une quelconque des espèces 20 suivantes : Aspergillus niger, Aspergillus oryzae, Aspergillus tamarii et Rhizopus sp. Les protéases d'origine végétale ou animale peuvent être par exemple la pepsine, la papaîne, la trypsine, la bromeline, la ficine ou la pancréatine; beaucoup de ces protéases sont 25 facilement disponibles dans le commerce. La demanderesse a trouvé qu'il était souhaitable que la protéase contienne à la fois des constituants de protéase neutre et alcaline, car ceci est habituellement avantageux pour favoriser la digestion de l'amidon et de la solubilisation des protéines des grains, 30 avec libération de peptides à petite chaîne et obtention d'un spectre ou répartition satisfaisant d'amino-acides (on pense que deux sortes de protéases sont responsables de la libération de différents types d'amino-acides). 2 •- (/■ -amylas e 35 L1 et -amylase isolée peut être obtenue à partir d'une source constituée par des champignons ou par des bactéries, cette source étant par exemple constituée par l'une des espèces suivantes . 70 25377 " 2060034 Bacillus subtilis, Bacillus amyloliquefaciens, Bacillus coagulans, Bacillus polymyxa, Bacillus megaterium, Bacillus cereux, Aspergillus oryzae, Aspergillus niger et Rhizopus sp. 3.- Mélange de protéase et d' -amylase isolées 5 Le mélange d'enzymes isolées peut être obtenu en mélangeant de la protéase et de 1' o( -amylase standards disponibles dans le commerce, en proportions telles que les deux enzymes soient présentes dans le mélange à des concentrations qui sont appropriées pour la suite des opérations, dans un rapport, exprimé en termes 10 d'activité, inférieur à 200 : 1 , de préférence entre 170 : 1 et 75 ; 1 . De préférence, le mélange d'enzymes est sous la forme d'un complexe enzymatique obtenu par la fermentation d'un microorganisme approprié, notamment une bactérie du genre Bacillus 15 suivie par l'isolement des enzymes extracellulaires. D'une façon tout à fait surprenante, il a été trouvé que si la bactérie du genre Bacillus croît dans un milieu nutritif contenant une source de carbone, une source d'azote et des sels inorganiques, on obtenait un complexe enzymatique contenant les o^-amylsase 20 et protéase neutre et alcaline désirées avec de bons rendements et à des concentrations appropriées pour le procédé de transformation enzymatique subséquent, le rapport amylase/protéase pouvant être facilement contrôlé dans ce complexe enzymatique et, en cas de besoin, réglé pendant la fermentation à une valeur 25 désirée pour le procédé de transformation. Ainsi, ce procédé de fermentation permet la production directe d'un complexe enzymatique contenant l'p£-amylase et la protéase alcaline et neutre bien adaptées pour être utilisé^dans le procédé de conversion, sans avoir besoin d'équilibrer ensuite le rapport 30 protéase/amylase. Des résultats particulièrement bons sont obtenus quand la bactérie utilisée est unesouche de l'espèce Bacillus subtilis et, selon un mode de réalisation préféré de l'invention, lorsque le complexe"enzymatique est obtenu à partir d'une fermentation 35 en immersion dans un milieu nutritif approprié de la nouvelle souche Bacillus subtilis ATC021556 à partir de Bacillus ou d'une souche constituant une variante naturelle ou artificielle de 70 25377 12 2060034 celle-ci Ou encore une souche dérivant de celle-ci par mutation naturelle ou artificielle. le milieu utilisé pour la fermentation peut être soit un milieu naturel, soit un milieu artificiel, contenant au moins 5 une source de carbone, une source d'azote et des sels inorganiques. Comme source de carbone, on peut utiliser un mono-, di- ou poly-saccharide qui est assimilable par la bactérie, par exemple le glucose, le lactose, la farine, la farine ou poudre de soja, Ta Pharmamedia, le son, la caséine ou les hydrolisats 10 de caséine. Comme exemples de sels inorganiques, on peut citer les sels de magnésium, les sels de calcium, les sels de manganèse, les sels de zinc, ainsi que divers phosphates. Il a été trouvé préférable d'utiliser une association de mono- ou de di- , et de poly-saccharide, comme source de carbone, par exemple un 15 mélange comprenant 0,5 $ de lactose et 2,5 d'amidon. Quoique l'on puisse préférer les sels inorganiques comme source d'azote, les dérivés ornaiques de l'azote donnent généralement des rendements plus élevés. Les fermentations peuvent être effectuées dans des cultures 20 immergées, dans des.fermenteurs de construction classique ou dans des flacons agités. Le milieu est inoculé avec des bactéries d'une étape de semence liquide ou solide, l'incubation se faisant à une température de 30-45°C, de préférence 36°C, pendant une période de 28 à 40 heures. La culture est aérée, par exemple 25 à raison de 0,2-1,0 v/v par minute et agitée suffisamment afin de s'assurer qu'il n'y a pas une limitation de la vitesse de transfert de l'oxygène. Les méthodes classiques applicables à l'art de la fermentation, par exemple les processus et cycles de stérilisation, le contrôle anti-mousse, etc... sont mis en 30 oeuvre. Le rapport de llamylase à la protéase, si besoin en est, peut être ajusté par différents moyens au cours de la fabrication. De telles méthodes comprennent la modification des constituants du milieu, de la température d'incubation, pH, du degré d'agita-35 tion, du degré d'aération, de la durée de maturation, ainsi que d'autres processus. 13 2060034 A la fin de la fermentation, le complexe enzymatique est extrait par des moyens classiques, tels que par exemple par centrifugation et,si besoin en est, par filtration. Le bouillon de culture ainsi obtenu ne confère d'habitude aucune saveur 5 gênante à la bière finale, de sorte qu'il est généralement approprié d'employer simplement le bouillon de culture lui-même, si on le désire après concentration en utilisant par exemple un évaporateur, en tant que source de complexe enzymatique. On peut ajouter au bouillon de culture, en petites quantités 10 appropriées, des agents de stabilisation tels que par exemple le sorbate de potassium, le glycérol, le propylène-glycol ou le benzoate de sodium. Selon une variante, on peut aussi utiliser le complexe enzymatique sous une forme solide, de préférence en association avec un véhicule ou support, par exemple sous 15 la forme d'un bouillon séché à l'état de pulvérisation ou d'un solide précipité mélangé avec un support inerte tel que l'amidon, le gypse, la terre de diatomées ou analogue. Les ions calcium augmentent habituellement la résistance à 1'inactivation par la chaleur à la fois de^la protéase et de 20 l'amylase et, en conséquence, afin d'augmenter la stabilité des enzymes pendant le procédé de transformation, on incorpore souvent un sel de calcium, en l'occurrence le carbonate de calcium, dans une étape appropriée après formation du mélange enzymatique ou ultérieurement. 25 4.- Quantités d'enzymes et rapport enzymatique Indépendamment du fait de savoir si la protéase et l'amylase sont utilisées, dans le procédé de transformation, séparément ou ensemble sous la forme d'un mélange enzymatique, l'amélioration importante des propriétés du moût et de la bière dans le cadre 30 de la présente invention exige que la protéase soit présente en une quantité égale à 0,5 ou plus, de préférence au moins 0,9 , d'unités de protéase par gramme de substrat de grains céréaliers. Pour des quantités de protéase inférieures à 0,5 unité par gramme, il y a une solubilisation inadéquate des protéines des 35 grains céréaliers qui est inhérente à une faible dégradation élevé des protéines de poids moléculaire /et une faible libération des hydrates de carbone à partir des granules d'amidon. Il en résulte 70 25377 14 2060034 d'une manière nette, que le moût ainsi obtenu possède une teneur de beaucoup réduite en composés contenant de l'azote, et particulièrement en composés contenant de l'azote soluble comme les amino-acides et une teneur réduite en hydrates de carbone, tels 5 que les sucres fermentescibles ainsi que le montre l'essai de fermentation rapide Q.E. selon la norme A.O.A.C. méthodes 10.120 b et les données numériques d'atténuation. La demanderesse a trouvé que ces effets se présentent souvent dans la bière finale qui tend à posséder une faible teneur en azote, ce qui peut influer 10 sur la saveur ainsi que sur d'autres facteurs et provoquer une diminution de la teneur en alcool. De plus, pour une teneur en protéase en dessous de 0,5 unité par gramme, la trempe est difficile à filtrer et des temps de trempe prolongés sont nécessaires en utilisant l'appareillage classique de brasserie. 15 En plus d'un niveau d'activité minimal, le témoignage expérimental suggère qu'il existe un taux maximal de protéase compatible avec une bonne solubilisation des protéines et l'obtention d'un moût à bière satisfaisant ainsi que d'une bonne bière, aux alentours d'environ 2 à- 3 unités de protéase 20 par gramme. Pour des teneurs' en protéase dépassant beaucoup 2 à 3 unités de protéase par gramme, la teneur totale en azote dans le moût résultant, se situe aux environs de 1000 à 1400 mg/l et est si élevée que la bière finale possède une stabilité de voile et une stabilité de mousse faibles de même qu'une saveur "plate" 25 inadmissible. Pour des teneurs en amylase inférieures à environ 100 unités d'amylase par gramme de substance contenant de l'amidon, la demanderesse a trouvé qu'il se produisait une réduction importante de la dégradation de' l'amidon. Ceci est montré par la diminutionde 30 densité et des hydrates de carbone solubles tels que des sucres fermentescibles, de telle sorte que le moût résultant possède une atténuation et une densité (comme montré par la valeur Plato) diminuées, et que la bière obtenue à partir d'un tel moût possède une teneur en alcool réduite." Il se produit aussi un effet 35 défavorable sur la saveur et la stabilité. Comme dans le cas de la protéase, les données expérimentales indiquent qu'il existe une teneur maximale en amylase, se situant' à environ 200 à 250 70 25377 15 2060034 unités d'amylase par gramme, qui est compatible avec l'obtention d'un moût à bière satisfaisant et d'une bonne bière, selon un processus favorable sur le plan économique. En plus du contrôle des quantités absolues de protéase et 5 d'amylase, il est important que les proportions relatives de ces deux enzymes soient telles que le rapport amylase/protéase, exprimé en termes d'activité, soit inférieur à 200 : 1 et de préférence compris entre environ 160 : 1 et 80 : 1 . Si le rapport amylase/protéase est de beaucoup à l'extérieur de cet 10 intervalle, il se produit alors une détérioration des teneurs en azote et en hydrates de carbone ainsi qu'un déséquilibre pour les rapports azote soluble/azote total et sucres non-fermentescibles/sucres fermentescibles. Ainsi, pour des rapports de beaucoup inférieurs à 80 : 1, la demanderesse a trouvé que le 15 moût possède une aptitude à la fermentation (°p) qui chute - brusquement, ainsi qu'une teneur élevée inacceptable en azote total, ce qui peut modifier les conditions de stabilité du trouble ou voile et de stabilité de la mousse dans la bière finale; pour des rapport de beaucoup supérieurs à 20 environ 200 : 1, le moût est déficient en azote soluble et en amino-acides, l'atténuation et la teneur en acool tombent, ce qui est signe d'une transformation réduite. Bouillie aqueuse-étape (a) Les grains de céréales, c'est-à-dire l'orge de préférence, 25 sont présents dans la bouillie à une concentration d'environ 20 à environ 40 g, de préférence 28 g à 33 g pour 100 cc d'eau (rapport : 1/3,0 à 1/3,5). De préférence, la dureté de la bouillie aqueuse est comprise entre 20 et 35 parties équivalentes en poids, de carbonates de calcium et de magnésium pour 1.000.000 30 de parties en poids d'eau; si la dureté est inférieure à environ 20 parties par million, alors le chlorure de calcium ou quelque autre sel calcium peut être ajouté pour accroître la dureté. L'addition d'ions calcium, sous la forme d'un sel, à ce stade, en vue d'accroître la stabilité à la chaleur des enzymes (indé-35 pendamment de l'accroissement de dureté) constitue une variante appropriée quant à leur incorporation à tout moment au cours du procédé, c'est-à-dire lors de la préparation du mélange 70 25377 16 2060034 enzymatique. Le pH de l'eau est ajusté à une valeur comprise entre environ 5,2 et environ 5,8 . Habituellement, le pH reste substantiellement le même pendant tout le déroulement du procédé Si le pH était à l'extérieur de l'intervalle de valeurs précité, 5 la transformation enzymatique ne serait alors pas aussi efficace. Protéolyse-étape (b) Dans cette étape, la bouillie aqueuse contenant l'orge broyé et au moins la protéase, en tant qu'enzyme, est chauffée à environ 40°-55°C, de préférence à environ 44-48°0, pendant la 10 durée requise, de l'ordre d'environ 30 à environ 120 minutes, de préférence d'environ 40 minutes à environ 60 minutes. Pendant le chauffage, il est souhaitable dragiter vigoureusement la bouillie, de façon à assurer un contact intime entre le substrat d'orge et 1'enzyme. 15 Le chauffage dans cet intervalle de températures, pendant cette durée, permet à la fois la protéolyse des protéines des grains par les protéases et la digestion des grains d'orge par les systèmes enzymatiques de l'orge. Le déroulement de la réaction protéolytique se répercute 20 directement dans la teneur en azote total, de même que dans la teneur en ot -amino-acides (azote formolé) du moût . D'une manière typique, dans les moûts classiques, une teneur totale en azote d'environ 800 à 950 mg/l et une teneur en azote formolé d'environ 200 à 250 mg/l sont considérées comme satisfaisantes, quoique 25 ces valeurs puissent plutôt varier largement en fonction du type de bière à fabriquer. La demanderesse a trouvé que, pour une quantité de protéase de 0,5 unité par gramme ou plus, de préférence au moins 0,9 unité par gramme, et sous une température maintenue entre 44° et 48°C, ces quantités pouvaient être 30 habituellement obtenues au bout d'une durée relativement courte, de l'ordre d'environ 45 minutes, et que le gain obtenu en prolongeant dans le temps la réaction protéolytique au-delà de cette durée était faible. Additif céréalier 35 A la fin ou vers la fin de la durée de la réaction protéoly tique (lorsque la protéolyse est substantiellement complète), on introduit de préférence un additif céréalier dans la masse 70 25377 17 2060034 principale, l'utilisation d'un tel additif permet une économie substantielle et est considérée comme donnant en même temps une bière de couleur plus pâle avec un meilleur pouvoir de conservation ou stabilité. 5 l'additif céréalier peut provenir de grains de céréales bruts ou non traités contenant de l'amidon, tels que par exemple les gruaus de mais, la farine ou poudre de mais, la farine de froment, la farine d'orge, le riz, la farine de riz, le sorgho et analogues. Selon une variante, des grains de céréales à 10 base d'amidon, prétraités, c'est-à-dire pré-gélatinisés, tels que par exemple des paillettes ou flocons de maïs et analogues, peuvent être utilisés. Les grains de céréales doivent être utilisés en une quantité allant d'environ 10 à environ 60 fo et de préférence d'environ 42 $ à environ 55 i°, en poids par 15 rapport au poids du substrat de céréales, par-exemple de l'orge, dans l'étape initiale, de "sorte que le rapport substrat de céréales/additif céréalier dans le mélange destiné à la trempe ou brassage proprement dit, est compris entre 90 : 10 et 65 : 37 • D'une manière plus courante, lors de la mise en oeuvre de 20 la présente invention, le rapport substrat céréalier/additif céréalier est compris entre environ 65 : 35 et 70 : 30 . D'une façon tout à fait surprenante, de telles teneurs relativement élevées en additifs donnent normalement des moûts ayant des teneurs en azote satisfaisantes. 25 les grains de céréales prétraités peuvent être introduits directement dans la masse principale car de tels matériaux peuvent subir l'action des enzymes dans les étapes de liquéfaction et de saccharification. L'addition de grains de céréales solides après que la protéolyse soit substantiellement terminée peut être 30 avantageuse par le fait que ces grains ne sont pas soumis à la dégradation protéolytique comme Te sont les grains principaux de céréales eux-mêmes, c'est-à-dire le substrat de grains de céréales. En conséquence, on doit s'attendre à ce que les substances protéï-niques solubles présentes dans les grains de céréales solides 35 incorporés comme additif soient intégrées au moût dont elles forment de constituants. On croît que ces protéines peuvent contribuer à l'obtention de la tenue de la mousse que l'on désire 70 25377 18 2060034 pour la bière. De plus, l'utilisation de grains de céréales prétraités obvie à la nécessité d'une opération de cuisson avec production d'un additif céréalier liquéfié, en tant que partie intégrante de l'opération de fabrication du moût, ce qui est 5 en corrélation avec les économies réalisées dans le cadre du procédé. Les grains céréaliers bruts, c'est-à-dire non traités, doivent,"d'autre part,-être liquéfiés avant leur introduction, afin de gélatiniser l'amidon qu'ils contiennent, de façon à 1 0 rendre celui-ci approprié pour: une liquéfaction subséquente et ensuite, après association avec la masse principale, pour la saccharification. Ceci peut être accompli en pré-cuisant les céréales dans un récipient séparé,, généralement appelé cuiseur de céréales. 15 L'opération de pré-cuisson peut être effectuée, en mélangeant les grains de céréales bruts, par exemple les gruaus de mais, avec de l'eau et du malt d'orge finement broyé ou une o( -amylase isolée appropriée. Le mélange est chauffé à environ 70-80°C, pendant environ 10 à 30 minutes, pour gélatiniser l'amidon et les 20 le liquéfier par/ c 70 25377 ig 2060034 Solubilisation et saccharification-étapes (d) et (e) Après l'addition éventuelle de l'additif céréalier, on introduit dans la trempe ou maische 1' • -amylase isolée et/ou le malt, si ces substances n'ont pas encore été incorporées 5 pendant l'étape initiale de formation d'une bouillie aqueuse des grains de céréales. Dans le cas où le complexe enzymatique est utilisé pour fournir 1' •~N. -amylase nécessaire, une petite quantité additionnelle de protéase est aussi introduite à c-e stade, l'incorporation de protéase additionnelle de cette 10 façon, après que la protéolyse soit substantiellement complète, peut être avantageuse, quoique non nécessaire. Pour effectuer la solubilisation et la saccharification, la température de la trempe est portée jusqu'à environ 60°-80°C et maintenue à une température comprise dans cet intervalle, pendant la période 15 requise, d'environ 30 à environ 120 minutes. Pendant cette période, les amylases sont hautement actives pour la digestion de l'amidon en agissant sur les polymères d'amylose et d'amylopectine dont l'amidon est constitué, en les dégradant. Le polymère d'amylose précité est un polymère 20 polysaccharidique à chaîne non branchée constituée de longs chaînons d'unités glucose reliés selon le type BAD ORIGINAL : • 20 ' 70 25377 2060034 fragmentation induitc par 1' of -anylaso est de solubiliser c'est-à-dire de liquéfier, l't-i'ddon. D'autre part, la -amyl&so c orra; en ce a att^que/c les chaînes d ' arcylosc et d'amylc sc'.irie à "Leurs exfcréaitéo non-réductrices, et de leur retirer pr o jr essivc&on t- des unit en îaali.cse. Il se produit une inversion d'; 3-s. lia.ir.on D-glucosidique, et le maltose libéré possède uni» cûiifif?û.raticn A . L1 aiaylose avec un nombre ï pair d'unités de B-glucose est transformée complètement en maltose, tandis que l'amylose avec-un nombre impair d'unités est transformée en maltose et en maltotriose qui contient l'unité de D-glucose, réductrice, de la molécule initiale. Cette dextrine limite contient toutes les liaisons (1 6). Puisque la -amylacé attaque seulement l'extrémitéd.'une chaîne glucosi-tique, elle ne peut produire une rupture dans les maillons des particules de la molécule géante d'amidon, de sorte que la Ç> -s-.Tiylo.se possède une faible action solubilisante. L'effet principal de l'attaque par la jl -axcylase (saccharification) est de produire des sucres réducteurs, principalement du rsaltose qui sont disponibles pour la transformation subséquente, lors du processus de fermentation, en alcool. En résumé, 1' of-amylase liquéfie ou solubilise l'amidon avec production de dextrines non-ferraont^scibles, tendis que la -amylase saccharifie l'amidon pour produire des sucres fermentescibles réducteurs. Par conséquent, il est bien évident que, pour produire un moût avant un spectre ou une composition adéquat en hydrates de y J- -i. J. c carbone, avec respect de l'équilibre nécessaire entre les sucres fermentescibles et les sucres non-fermentescibles, un contrôle minutieux de la solubilisation et de la saccharification de l'amidon est nécessaire. Les c -amylase de l'orge et/ou du / BAD ORIGINAL 70 25377 21 2060034 malt, font d'habitude preuve d'une activité maximale à des températures inférieures à celles.correspondant à l'activité maximale de 1' o En raison de cet arrière-plan de faits concernant le mode 5 d'action des e( -amylases et des fZ -amylases et des exigences correspondantes relativement à leur température d'utilisation et comme résultat de recherches expérimentales détaillées, la demanderesse a formulé, pour cet étape du procédé, une relation préférée entre la température et le temps sur la base d'un 10 processus de chauffage en deux stades. Un tel programme de températures échelonnées donne de meilleurs rendements et de plus hautes teneuis en sucres fermentescibles (atténuation apparente augmentée) dans le moût résultant, par comparaison avec le moût obtenu lorsqu'une température substantiellement 15 constante est maintenue pendant cette durée. Dans ce processus par paliers de températures, la masse complexe est initialement maintenue à une température d'environ 64 à environ 68°0, pendant environ 35 à environ 60 minutes, la température de masse est ensuite élevée entre environ JO et 20 environ 80°0 et maintenue à ces plus hautes températures pendant environ 10 à environ 30 minutes, le premier palier de températures, de 64-70°C, est intermédiaire entre les températures optimales d'activité de 1' o( -amylase et de la p, -amylase, mais il se situe encore en dessous de la température à laquelle la J3-amylase 25 est inactivée. En conséquente, dans ce premier stade, l'activité de 1' c 70 25377 22 2060034 la densité, tend à être plutôt faible. Dans le second stade, lorsque la température est comprise entre environ 70 et environ 80°C, de préférence entre 75 et 78°0, l'activité de l'tf -amylase est optimale ou approximativement optimale, de sorte que la 5 solubilisation de l'amidon se produit rapidement, ce qui améliore Te rendement. En même temps, puisqu'il s'est déjà produit une fragmentation ou dégradation considérable' des chaînes de molécules d*amidon lors du stade précédent, ce qui a donné de nombreux autres molécules de poids moléculaire faible 10 ou intermédiaire, pour l'attaque, 1' (A -amylase tend à produire, dans ce second stade, une plus haute concentration en sucres fermentescibles que celle à laquelle on pouvait s'attendre. En conséquence, l'accroissement du rendement peut être obtenu sans réduction importante, si tant est qu'elle se produit, du 15 taux des sucres fermentescibles. Si on le désire, cependant, on peut obtenir un accroissement du taux des sucres fermentescibles par addition de malt après réglage de la température à environ 55-60°C. Séparation du moût-étape (f) 20 A la fin de l'étape précédente, la température de la trempe est augmentée pendant une courte période, par exemple pendant 2 à 5 minutes, jusqu'à dépasser 80°C pour inactiver les enzymes. Ensuite, la trempe est envoyée dans une cuve-filtre ou filtre pour trempe (filtre à moût), classique en brasserie, de façon à 25 séparer le moût de la drêche. D'autres méthodes de séparation, par exemple la centrifugation, ou une combinaison de ces méthodes, telle que la filtration et la centrifugation, peuvent être utilisées. La trempe est de préférence filtrée sans refroidissement, mais, si on le désire, elle peut être refroidie jusqu'à 30 la température ambiante avant filtration. le produit de digestion filtré est ensuite lavé et amené au volume désiré. le moût ainsi obtenu peut être utilisé directement pour la fabrication de la bière par les étapes habituelles du procédé classique, en constituant ainsi un produit de remplacement 35 total pouvant se substituer à un moût produit de manière classique, ce qui simplifie l'installation utilisée pour la fabrication et entraîne également d'autres économies» Selon une variante, le 70 25377 23 2060034 moût peut être soumis à une évaporation jusqu'à l'obtention d'un sirop, en utilisant par exemple un évaporateur à film, travaillant sous vide. Ce sirop peut être stocké jusqu'au moment -désiré, c'est-à-dire jusqu'à un moment où son emploi permet d'accroître la production d'un procédé classique aux périodes de pointe. Dans cette éventualité, on dilue, avant l'usage ce sirop avec de l'eau. Ce sirop contient avantageusement entre environ 70 et environ 85$ en poids de solides totaux, de préférence environ 75 à 80$. Selon une variante, le moût peut être séché de façon à constituer une poudre en utilisant par exemple un appareil de séchage à pulvérisation, cette poudre étant ensuite dissoute dans 11 eau pour donner un moût de la manière désirée et au moment désiré, lors de la concentration ou du séchage, il est nécessaire de contrôler soigneusement la température afin d'éviter le changement de couleur ainsi que d'autres atteintes aux propriétés de la bière. Des substances amères, comme les houblons, peuvent être ajoutées avant concentration ou séchage du moût. On emploie les processus classiques pour convertir le moût en bière. Par exemple, on mélange le moût avec des additifs donnant de l'amertume, tels que les houblons, et l'on porte à 1'ébullition. la chaleur inactive complètement les enzymes et stérilise le moût, tandis que l'extraction réalisée sur les houblons donne au moût des constituants donnant une saveur et/ou ayant des propriétés de conservation de la bière. le moût est ensuite refroidi et fermenté par addition d'une levure à bière appropriée telle qu'une "levure basse" utilisée couramment pour la fabrication des boissons alcooliques généralement connues sous le nom de bières de fermentation basse ou telle qu'une "levure haute" habituellement utilisée pour la fabrication des boissons alcooliques connues sous le nom de bière blondes, la levure utilise les sucres normalement fermentescibles qui sont présents dans le moût, la fermentation primaire du moût (levure basse) se produit", de façon typique, à environ 7°-14°C et demande environ" 5 à 10 jours. Cette fermentation primaire est suivie par la fermentation secondaire ou fermentation basse, ordinairement à environ 0°-5°C, pendant environ 2 à 8 semaines ou plus. Ensuite, la bière est clarifiée ou filtrée, carbonatée et conditionné. 70 25377 24 2060034 Des modes de réalisation préférés conformes à la présente invention sont illustrés par les organigrammes des figures 1 à 3 des dessins ci-joints. En se référant à la figure 1 , on voit que le procédé 5 donné dans l'organigramme de cette figure comprend le mélange dans une cuve de brassage de grains d'orge finement broyés constituant le substrat de céréales avec 8 à 20 fo, de préférence environ 10 %, en poids, par rapport au poids de substrat de céréales, de malt d'orge, d'un mélange d'enzymes isolées 10 stabilisées par un sel sous la forme d'un complexe enzymatique obtenu à partir d'une souche de Bacillus subtilis à raison d'environ 100 unités d' é* -amylase par gramme et d'au moins 0,9 unité de protéase par gramme (rapport Cette bouillie aqueuse est ensuite chauffée à 44°-48°C et maintenue à une température de cet intervalle pendant 40 à 60 minutes, de façon à permettre pendant ce temps à la protéase de dégrader les protéines de l'orge. Simultanément à ce traite-20 ment du substrat d'orge, l'additif céréalier est préparé en effectuant une opération de pré-cuisson. Celle-ci implique la formation initiale d'une bouillie aqueuse (en une quantité allant de 20 à 60 $ en poids par rapport au poids du substrat de grains de céréales) et d'une enzyme contenant de 1' p 70 25377 25 2060034 température est portée au-dessus de 78°0, en général aux alentours de 80°-85°C, et elle est momentanément maintenue à cette valeur de façon à désactiver substantiellement les amylases. Immédiatement après, la trempe est versée dans la cuve-filtre 5 et le moût est recueilli. Selon une variante de ce procédé, l'additif céréalier liquéfié est remplacé par des grains de céréales solides et prétraités, tels que des flocons ou paillettes de maïs, de préférence en une quantité d'environ 40 à 60 $ en poids, par rapport au poids du substrat 10 de grains de céréales. Le procédé représenté sur l'organigramme de la figure 2 est similaire à celui de la figure 1 , excepté le fait que l'addition du malt est différée jusqu'à la fin de l'introduction de l'additif céréalier (liquide ou solide). Selon une variante 15 de ce procédé, le mélange d'enzymes, isolées utilisé dans la première étape peut être remplacé par une protéase isolée, par exemple la broméline, la ficine, la pepsine ou la papaïne et après addition de cet additif céréalier, en même temps que le malt, une (X. -amylase isolée est ajoutée. 20 Le procédé représenté dans l'organigramme de la figure 3 est similaire à celui de la figure 1, excepté le fait que le mélange d'enzymes isolées utilisé dans la première étape est remplacé par une protéase isolée, par exemple la bromeline, la ficine, la pepsine ou la papaïne, à raison d'au moins 0,9 25 unité par gramme, et après incorporation de l'additif céréalier, liquide ou solide, 1' o C-amylase isolée utilisée seule, ou comme constituant d'un mélange d'enzymes isolées contenant également une protéase, un tel 30 mélange étant notamment formé par le complexe enzymatique obtenu à partir d'une souche de Bacillus subtilis. La forme de la relation entre la température et le temps lors de l'étape de solubilisation et de saccharification, dans le cycle global de brassage des processus préférés est montrée par 35 la courbe de la figure 4. Lorsqu'on utilise de l'orge comme substrat céréalier, on peut obtenir, en adoptant la succession d'étapes exposées dans 70 25377 26 2060034 les différents organigrammes, un moût de composition appropriée et de couleur claire convenable, avec une dégradation satisfaisante de l'amidon et des protéines. De plus, un tel moût possède normalement des teneurs plus élevées en sucres fermentescibles 5 et en azote, comme indiqué par des atténuations apparentes d'environ 72 à 75 % ou plus, des teneurs en azote total d'environ 800 à 950 mg/l ou plus, et des teneurs en azote formolé d'environ 200 à 250 mg/l ou plus, que dans le cas de moût obtenu conformément à l'enseignement du brevet mentionné plus haut. 10 EXEMPLES DE MODES DE REALISATION PREFERES Les exemples suivants sont fournis pour donner une meilleure compréhension de la présente invention. Bien entendu, ces exemples, qui sont donnés à titre d'illustration, ne doivent pas être interprêtés limitativement. 15 Exemple 1 Préparation d'un complexe d'enzymes isolées On a préparé un inoculum de Bacillus subtilis en -transférant les microorganismes d'un milieu nutritif à base d'agar, ou d'un, d^encemencement milieu de croissance approprié similaire, à un milieu stérile/ 20 constitué" d'hydrolysat de caséine *(2 Activité de l'amylase 1420 unités/ml (unités Stein- Fischer modifiées) Activité de la protéase 18,68 unités/ml (unités Kunitz 35 modifiées) Protéase neutre* 8,26 unités/ml (unités Kunits modifiées) 70 25377 27 2060034 Protéase alcaline* 10,42 unités/ml (unités Kunitz modifiées) Rapport amylase/protéase 113 : 1 (*) Par essai de détermination de la protéase totale à la fois 5 en présence et en l'absence d'un inhibiteur (phénylméthyl- sulfonylfluorure) qui détruit l'activité de la protéase alcaline. Ainsi, la valeur de protéase alcaline est donnée par la différence entre les indications de protéase totale et de protéase neutre. 10 Exemple 2 Préparation d'un filtrat .de culture On a transféré un inoculum de milieu de culture de Bacillus subtilis dans tua milieu d1encemencement du type indiqué dans l'exemple précédent, la fermentation des graines a été effectuée 15 dans un récipient de 15 litres, de construction classique, 'l'incubation de la fermentation s'est faite à 36°C (courant d'air de rz 28,317dm normaux/mn, agitation au moyen d'hélices de turbine de 5 à 7,5cm de diamètre tournant à raison de 400 tours par minute) jusqu'à obtention d'une croissance satisfaisante (8 à 12 heures). 20 II est habituellement nécessaire d'incorporer un agent antimoussant, tel que par exemple un silicone disponible dans le commerce, afin de minimiser la formation de la mousse, le milieu de culture mûri (1^poids/volume) est transféré, dans des conditions stériles, dans le milieu de production qui est constitué d'amidon 25 de blé (2,1$) de liqueur d'infusion de maïs(6,9$), cle lactose (0,71$) de sulfate de magnésium (0,05$), de carbonate de calcium (0,5$) et de phosphate monopotassique réglé au pH 6,2 avant stérilisation. On effectue la fermentation dans un fermenteur de 1000 litres, de construction classique, on effectue l'incubation à 30 36°C, on agite en adoptant une vitesse de 186 taurs par minute et on aère avec un courant d'air de 17dm normaux/mn pendant une période de 36 heures. Lorsque la fermentation est terminée, on récupère le bouillon par centrifugation avec une vitesse du bol de centrifugation égale à 8000 tours par minute et l'on filtre 35 ensuite de façon à obtenir un filtrat étincelant. l'analyse enzymatique donne les résultats suivants : 70 25377 28 2060034 Activité de l'amylase 1600 unités/ml (unités Stein- Eischer modifiées) Activité de la protéase 12,5 unités/ml (unités Kunitz modifiées) 5 Protéase neutre 7,7 unités/ml (unités Kunitz modifiées) Protéase alcaline 4,8 unités/ml (unités Kunitz modifiées) Rapport amylase/protéase 128:1 10 On a stabilisé le bouillon par addition de propylène-glycol (5,0fo en poids par unité de poids) et de sorbate de potassium. Exemple 3 Cet exemple illustre la préparation d'un moût à bière et de bière conformément à la présente invention, en utilisant une 15 installation existante. Partie A - Moût à bière Matières premières (a) Orge On a. utilisé de l'orge de conquête. Oet orge a été nettoyé 20 et ensuite décortiqué, ce qui a donné 10/6 en poids d'enveloppes, lesquelles ont été séparées par aspiration, les grains d'orge ont été ensuite broyés dans un broyeur du type connu sous la dénomination commerciale "Hobart Model 2020" ajusté au calibre N° 1. les grains broyés onfc été ensuite mélangés avec les enveloppes. 25 le mélange avait la composition suivante, déterminée par analyse granulométrique (en utilisant des tamis conformes aux normes américaines). Mesh. ET0 ^pondéral retenu sur le tamis 10 2 30 14 24 18 45 30 17 60 8 100 (Fraction receuillie dans le récipient: 22 %). 35 (b)- Malt On a utilisé de l'orge germé broyé ayant une activité 70 25377 29 2060034 diastatique de 137° Lintner. Sa composition a été déterminée par analyse granulométrique, en utilisant les tamis sus-mentionnés Mesh N° % pondéral retenu sur le tamis 10 10 5 14 16 18 26 30 28 60 12 100 4 10 (Récipient : 4 $) (c) Eau On a utilisé de l'eau de brassage de type habituel, ayant une dureté totale d'environ 30 parties par million et un pH de 5,4 . 15 (d) Sels On a ajouté à l'eau utilisée pour mettre l'orge sous forme de bouillie, 6 g de gypse et 9,5 g de chlorure de calcium (pour 56,9 litres)„ (e) Enzym,e 20 le complexe enzymatique, sous la forme d'un bouillon, obtenu par le procédé de l'Exemple 2 ci-dessus a été utilisé comme source d'enzymes. Il possédait une activité de 1600 unités d'amylase par millilitre et une activité de 12,5 unités de protéase, par millilitre, le rapport amylase/protéase 25 étant de 128 : 1 . (f) Additif céréalier On a utilisé comme additif céréalier des gruaus de maïs bruts ayant une teneur en humidité de 11,5 i° en poids, le spectre granulométrique a été déterminé par analyse au moyen 30 des tamis précités, ce qui a donné les résultats suivants : Mesh U° jo pondéral retenu sur le tamis 30 15,5 60 80 100 2,5 35 (Récipient : 2 fo) 70 25377 30 2060034 (g) Mélange destiné à la trempe ou brassage proprement dit Constituant Poids total Rapport poids pouvant être extrait Orge 6,205 kg 64 3>850 kg Gruaus de 5 maïs brut 3»468 kg 36 2,850 kg Malt 0,610 kg — 0,427 kg Cycle de trempe ou de brassage le cycle suivi est celui représenté par la courbe de la figure 5 des dessins ci-joints. 10 Etape (a) On ajoute 24 litres d'eau à la cuve de brassage et l'on agite lentement le bouillon contenant les enzymes, stabilisé au moyen d'un sel, correspondant à un degré enzymatique de 115 unités d'1 c Etape (b) 20 On admet de la vapeur dans la chemise entourant la cuve de brassage ou de trempe . et l'on porte la température de la bouillie aqueuse à 46°C. Cette température est maintenue pendant 45 minutes, pendant lequel la bouillie est continuellement agitée. 25 Etape (c) Simultanément, les gruaus de maïs brut sont liquéfiés. On ajoute 12 litres d'eau à l'appareil de cuisson des grains et l'on agite lentement le bouillon- contenant les enzymes,' stabilis par un sel, à raison de 14 unités d'o 70 25377 31 2060034 45 minutes. Etapes (d) et (e) La température de la trempe globale est portée à 65,5°C (en une durée de l'ordre de 12 minutes) et cette température 5 est maintenue pendant 45 minutes, ce qui correspond au premier stade de saccharification. La température est ensuite portée à 74°C, en une durée de l'ordre.de 10 minutes, lorsqu'elle est atteinte, cette température est maintenue pendant 15 minutes, ce qui constitue le second stade de la saccharification. Au 10 bout de cette durée de 15 minutes, la trempe dont la digestion est réalisée,est portée à 82°C et maintenue à cette température pendant une minute. Etape (f) La trempe, à la température de 82°C, est versée directe-15 ment dans la cuve-filtre, le fond de cette cuve-filtre est rempli d'eau afin d'empêcher les particules de la trempe d'obstruer les fentes ou espaces entre les plateaux. On laisse la trempe sédimenter pendant 10 minutes et ensuite on effectue son enlèvement par raclage, après quoi le moût est recyclé pendant 20 5 minutes. Le moût est ensuite séparé par écoulement. Ce moût est alors bien clarifié. Une fois que le moût s'est écoulé jusqu'au niveau du lit, on commence le lavage avec de l'eau à 77°C. La clarification continue jusqu'à ce qu'un total de 61,3 litres 25 de moût soit collecté» Le temps d'écoulement est de 30 minutes. La durée totale du cycle de brassage est d'environ 300 minutes, ce qui représente à peu près le même temps que dans le cas d'un moût de malt classique fabriqué dans la même installation. le moût ainsi obtenu est de couleur claire et possède une 30 composition équilibrée appropriée en ce qui concerne les amino-acides et les hydrates de carbone. Une analyse montrant les propriétés caractéristiques du moût est donnée dans le Tableau I ci-après qui comprend aussi, dans un but de comparaison, une analyse d'un moût de malt classique typique approprié pour 35 la fabrication commerciale de la bière. 70 25377 TABLEAU I 2060034 Propriété Moût d'orge Moût classique Extrait (°Plato) 11,9 11 ,9 Azote total (mg/l) 926 875 Azote- formolé (mg/l) 294 293 pH 5,1 5,1 Atténuation apparente W 76,5 79,8 Par rapport à uxl moût de malt classique, la composition en amino-acides du moût selon l'invention est tout à fait similaire à celle dudit moût classique. 10 Partie B - bière Le moût a été transformé directement en bière en suivant le processus suivant : (a) L'ébullition Avant le démarrage de 1'ébullition, on a jouté 42,8 g 1 5 de houblons au moût dans la chaudière. On a fait bouillir le moût pendant 90 minutes. 30 minutes avant la fin de 1'ébullition, on a ajouté une quantité additionnelle de 28,8 g de houblons et de 2,9 g de mousse d'Irlande, lesquelles additions ont été ensuite suivies, 5 minutes avant la fin de l1 ébullition,- de 20 1'addition d'encore 14,4 g de houblons. Pendant 1'ébullition à l'air libre, le volume diminue par suite de 1'évaporation et passe d'environ 61 litres à environ 56-59 litres. A la fin de 1'ébullition, on place le moût dans le récipient à houblon oîx il reste pendant 10 minutes. On fait couler ensuite le moût 25 lentement dans le récipient où on le laisse déposer pendant 30 minutes» On refroidit ensuite le moût à 114,4°0 dans un refroidisseur à plateau et on le sépare par écoulement en l'envoyant dans le fermenteur. On ajoute ensuite une "levure basse" (Saccharomyces Carlsbergensls) à raison de 100 g de levure 30 comprimée pour 40 litres de moût. (b) Fermentation On place le moût dans une bonbonne ou tourie en verre et l'on fait-passer bulle à bulle de l'ogygène à travers ce moût de façon à obtenir de l'oxygène dissoud à raison de 20 ppm. On 70 25377 33 2060034 met ensuite la levure en levain et on la mélange bien avec le moût. On effectue la fermentation pendant 7 jours à 14,4°C. A la fin de la fermentation, on ajuste la teneur en anhydride sulfureux 5 naturel de la bière de stockage primaire jusqu'à 15 p.p.m. par addition de métabisulfite de sodium (p.p.m. = partie par million) (c) Vieillissement On utilise pour le vieillissement un fût en acier inoxydable. On verse la bière dans le fût et l'on y ajoute 0,068 ml de 10 protésal (une enzyme résistant au froid); on met ensuite le fût -r Gla.*t iv 0 sous une pression/de gaz carbonique égale à 1,4 kg/cm.2 . On effectue le vieillissement primaire à 1°C, pendant 14 jours, après quoi on filtre la bière. (d) Filtration 15 On effectue la filtration primaire à travers un filtre de clarification. La bière est filtrée dans un autre fût auquel on ajoute un adjuvant de filtration connu sous la dénomination commerciale "Clearfil" (7,0 g). On filtre ensuite la bière à nouveau à travers un filtre de clarification comportant un 20 revêtement d'adjuvant de filtration "4C" (23 g) et l'on recueille le filtrat dans un autre tonneau. Après cette filtration secondaire, on carbonate la bière à 2,8-3,0 volumës. (e) Mise en bouteilles 25 On met la bière en bouteilles à la sortie du tonneau en relative _ " maintenant une pression/de 1,05 kg/cm^; avant bouchage ou encapsulage on laisse l'oxygène dissous s'échapper. (f) Pasteurisation On pasteurise la bière à 60°C pendant environ 2 minutes. La 30 durée totale de passage dans le dispositif de pasteurisation, en forme de tunnel, est de 26,6 minute, la température de sortie étant d'environ 27°C. (g) Stockage La bière mise en bouteilles est stockée à la température 35 ambiante ou dans un réfrigérateur à +4°0 . La saveur est testée immédiatement après mise en bouteilles et au cours du stockage. La bière prête à la consommation est jugée au moyen d'une 70 25377 34 2060034 analyse physico-chimique normalisée et au moyen d'essais organo-leptiques. Le Tableau II ci après donne les résultats obtenus, de même que ceux relatifs à l'analyse d'une bière commerciale dérivée d'un moût de malt classique, utilisée comme témoin,dans 5 un but de comparaison. TABLEAU. II Propriété Orge Témoin Extrait apparent ($) 2,8 2,4 Extrait réel (%) 4,29 4,16 Alcool (% en poids) 3,7 3,8 Extrait initial {%) 11,85 11,6 Couleur (SBM) 2,9 3,1 pH 4,15 4,0 Iso-humulone (IBU) 18 17 Mousse (SIG-) 136 134 Diacétyle (ppm) 0,08 0,08 Protéines (fo) 0,26 0,32 S02 (ppm) 5,0 4,0 Fer(ppm) 0,10 0,12 Essai de force du voile (ETU) 110 160 En se reportant à ce tableau, on voit que la bière enzymatique de l'invention est analogue à la bière témoin, sauf en ce qui concerne la stabilité au voile, qui est supérieure dans le cas- de l'invention. En ce qui concerne les propriétés organolep-25 tiques, l'analyse statistique des résultats obtenus par des jurys de dégustation de bière expérimentés, a montré qu'il n'y avait pas de nette préférence pour l'une ou l'autre, et que la bière enzymatique était tout autant acceptable que la bière commerciale utilisée comme témoin. 30 Par comparaison avec la bière obtenue par le procédé du .brevet mentionné plus, haut, (dans le présent cas selon l'enseignement de l'Exemple 1 de ce brevet précité), la bière selon la présente -invention présente une saveur ou goût supérieur (bière ayant plus corps et étant moins douce), une teneur en alcool plus 35 grande et une stabilité améliorée, ce qui était prévisible puisque le moût à partir duquel cette bière a été faite avait 70 25377 35 2060034 une atténuation plus élevée et une teneur en azote formolé plus forte. Exemple 4 On met en oeuvre le même procédé que dans l'exemple précédent, 5 excepté le fait que l'addition de 0,610 kg de malt d'orge "broyé est différée jusqu'à la fin du repos protéolytique et l'incorporation de l'adjuvant céréalier liquéfié. Ce malt est ensuite ajouté rapidement et sans interruption dans la cuve de brassage et dispersé par agitation. 10 L'analyse du moût obtenu a donné les résultats suivants : Moût Extrait (°Plato) 11,2 Azote total (mg/l) 940 Azote formolé (mg/l) 255 15 pH 5,2 Atténuation apparente {%) 76,3 Les résultats de l'analyse montrent que ce moût constitue une matière première acceptable pour la fabrication de la bière et que, comme on s'y attendait, il fermente en donnant 20 une bière ayant, d'une façon caractéristiquer beaucoup de corps5 une bonne stabilité de la mousse et une bonne adhérence de la mousse. Exemple 5 On opère comme dans l'Exemple 4, mais on remplace le 25 complexe enzymatique de l'étape initiale par une protéase isolée et l'on introduit, comme source d' -amylase, le complexe enzymatique en une quantité correspondant à 115 unités d*o( -amylase par gramme de substrat d'orge, à la fin de la protéolyse et après incorporation de l'additif céréalier liquéfié. La protéase 30 particulière utilisée était une bromeline commerciale, qui est la papaïnase obtenue à partir du jus de pamplemousse et disponible auprès des Mann Research Laboratories, New York (ïï"°05300-293 dans le catalogue de cette Société). Cette bromeline solide a été utilisée en une quantité correspondant à 1,5 unité protéase 35 par gramme d'orge dans la bouillie aqueuse. Le moût obtenu a donné les résultats d'analyse suivants : 70 25377 36 2060034 Moût Extrait (°Plato) 11,7 Azote total (mg/l) 950 Azote formolé (mg/l) 234 5 pH 5,2 Atténuation apparente (%) 75,2 On a fait fermenter ce moût, ce qui a donné une bière qui avait un corps léger à modéré et un caractère houblonneux modéré; l'arôme était pur et neutre» 1O Exemple 6 Cet Exemple illustre l'effet des variations des quantités d'amylase et de protéase et du rapport amylase/protéase sur plusieurs propriétés intéressantes du moût. Les expériences ont été effectuées dans des unités de 15 brassage de laboratoire normalisées munies d'un euiseur et de coupelles de mélange de la trempe. On a utilisé les matières premières suivantes : Mélange destiné à former la trempe Cuiseur de mais 20 Mais 34,6 g Eau 1 40 ml Enzyme Complexe enzymatique de Eg.1 à 14 unités d'amylase/g de maïs Sels 0,03 g de gypse 25 Mélangeur de la trempe Orge 62,0 g Malt 6,2 g Eau 205 ml Enzymes comme indiqué ci-dessous 30 Sels 0,06 de gypse 0,095 g de chlorure de calcium L'orge et le maïs ont été broyés dans un broyeur de laboratoire jusqu'à une dimension moyenne de particule d'environ 35 1 ,41 mm. Eau Eau ordinaire pour le brassage, à pH 5,2 - 5,6 70 25377 37 2060034 Enzyme On a choisi quatre systèmes enzymatiques pour obtenir un intervalle de valeurs du rapport amylase/protéase. Ces systèmes enzymatiques, ainsi que les essais effectuée avec ceux-ci sont 5 indiqués ci-dessous : Système enzymatique ET0 de référence Unités d'âmylase Unit és de protéase Rapport ] amylase/ protéase \ Complexe enzymatique dérivant de Bacillus subtilis ATCC 21556 1 5.450/ml 6,2/ml 00 UD 1. l( 2 5.000/ml 30/ml 167 : 1 : Protéase pacifique A* 3 7.250/g 157/g 46,2 : 1 : Protéase pacifique G* - 10.100/g 490/g; 20,8 : 1 : Amylase pacifique i* - 105.000/g 340/g 508 : 1 : Mélange (G + l) 4 35.900/g 455/ g 75 : * Disponible dans le commerce auprès de la Western Biochemical Corporation, Californie» 20 la protéase pacifique G et l'amylase pacifique 1 ont été mélangées dans un rapport de 5/1 et le mélange obtenu a été désigné système enzymatique ÏT° 4. Chacun des quatre systèmes enzymatiques a été introduit dans le moût d'orge en quantités correspondant à 45» 80, 100, 114 et 150 unités d'amylase par 25 gramme d'orge, ce qui a donné les combinaisons suivantes de concentrations d1amylase et de protéase dans là trempe. 70 25377 38 2060034 Quantité d'amylase (en unités/g) • 45 80 100 114 150 Enzyme Quantité de protéase (en unités/g) ÏT° 1 0,05 0,09 0,11 0,13 0,17 CM o 0,27 0,48 0,60 0,68 0,9 N° 3 0,6 1 ,05 1 ,32 1 ,52 1,99 4 0,97 1 ,73 2,16 2,47 3,24 Cycle de trempe ou de "brassage proprement dit Le cycle de brassage représenté sur la figure 5 a été mis 10 en oeuvre dans chaque opération. Mode opératoire Dans chaque cas, on a utilisé un processus de brassage standard. L'eau du moût d'orge a été amené à une température constante de 49°C dans l'unité de brassage; on a ajouté les sels, 15 l'enzyme, l'orge et le malt dans cet ordre,en laissant environ 30 secondes entre chaque addition, afin de permettre un mélange total. On a noté le pH de la trempe. En même temps, on a liquéfié le maïs dans le euiseur de maïs en chauffant une bouillie aqueuse de gruaus de maïs, contenant l'(X -amylase, 20 à environ 70°C, en maintenant à cette température pendant 10 minutes, puis en portant brièvement à 1'ébullition. L'adjuvant de maïs liquéfié a été brassé dans la bouillie aqueuse de l'orge et l'opération de brassage a été poursuivie. A la fin du cycle, on a clarifié par filtration la trempe et l'on a noté la durée 25 de clarification. La clarté du moût séparé par écoulement a été estimée visuellement sur la base d'une échelle graduée allant de 1 à 5, 1 représentant un moût obscur et trouble, par opposition à 5 qui représente un moût clair et brillant. La • transformation de l'amidon a été aussi vérifié par l'essai 30 colorimétrique à l'Iode. Le lit de filtration a été lavé à l'eau jusqu'à un volume total de 610 ml. Le moût obtenu a été ensuite 'soumis à 1*ébullition pendant 1 minute, laissé refroidir, puis son volume a été a nouveau ajusté jusqu'à 610 ml. On a déterminé ensuite, sur le moût final, le degré Plato, l'azote total, 35 l'azote formolé et la fermentation rapide. 70 25377 39 2060034 Résultats les résultats complets des divers essais ou opérations sont résumés dans le Tableau III ci-après qui comprend aussi, dans un but de comparaison, les résultats obtenus à partir de six essais portant sur des malts témoins. TABLEAU 1X1 O unités d 1 analyse par g d'orge 45 80 100 ■unité de protéase par g d'orge 0,05 0,27 0,6 0,97 0,09^ 0,48 1,05 1,73 0,112 0,60 1 ,32 2,16 analyse/protéase x : 1 x —* 900 166 76 46 900 166 76 46 900 166 76 46 fi Plato (ap) du moût 9,8 • 10 10,2 10,2 9 8 10,2 10,5 10,6 10,1 .10,35 10,7 10,9 Fermentation iap£Le 2,5 2,4 2,3 2,2 2,4 2,15 2,1 2,2 2,3 2,25 1,9 2,15 azote totale X102 { 4,4 6,4 7,2 9,7 5,0 6,8 8,4 10,8 5,3 7 8,5 10,6 azote formolé (mg/litre) ,128 142 165 175 160 200 230 265 143 210 238 316 pH , 5,6 5,6 5,5 5,4 5,6 5,6 5,55 5,5 5,6 5,6 5,55 5,55 conversion * 5 5 5 5 4 2 2 2 „ 4 1 1 2 clarté du moût écoulé ** 3 3 3 3 3 4 4 .3,5 . 4 . 4 4. 4 durée d'écoulement (en minutes) 35 35 35 35 35 30 30 35 30 30 30 30 fermentabilité du moût (SP) 7,3 7,6 8,5 8 7,4 8,05 8,4 8,4 7,8 8,15 8,8 8,75 kj o o o o u> TABLEAU III (suite) ! unités d1 analyse ! par g d'orge 114 1 50 Malt témoin J ! unitésde protéase ! par g d'orge 0,128 0,68 1 ,52 2,47 ■ 0,168 0,90 1,99 *c\j k*\ 1 2 3 4 .5 6 moyen4 ne ! !analyse/protéase ! x : 1 x 900 166. 76 ■ 46 900 166. 76 46 - - - - - - ; ; ! 0 Plato (°P) ! du moût 10,1 10,3 10,7 10,8 . 10,1 10', 5 10,7 10,8 10,3 10,7 10,4 10,5 10,45 10,8 10,5 | jEerSëntation rapide 2,4 ■ 2,2 2,15 2,2 2,3 2,2 2 2,15 2,2.5 2,35 2,1 2,05 1 ,9 2,1 2, 1 | ! azote totale !X102 ($N) . 5,3 7,8 8,4 10,2 5,4 7,2 8,5 1 1 ,2 8,5 8,2 7,7 7,1 8,1 8,2 7,9 | ! azote formolé !(mg/litre) 146 220 249 2,95 150 225 265 318 200 212 217 248 262 246 235 ! pH i 5,6 5,6 5,55 5,55 5,6 5,6 . 5,55 5,55 5,.55 5,55 5,5 5,5 5,5 5,5 5,5 | ! conversion * ! 2 1 1 1 1 1 1 1 .1 1 1 1 1 1 1 ; ! clarté du moût ! écoulé ** 4 4 4 4 4 4 .4 4 3 3 4 3 . 3. 3 ! 5 ; ! durée d1 écoulement ! (en minutes) 30 30 .. 30 30 30 30 . .30 30. 40 40 30 30 30 30 30 ; !fermentabilité ! du moût (°P) 7,6 8,1 8,55 8,6 7,8 8,3 8,7 8,65 8,05 8,35 8,3 8,45 8,55 8,7 8,4 | o k> Ln u» ^-4 -^1 *Echelle de conversion (essai colorimétrique à 1 **Echelle de clarté 1 = obscur-trouble ; 5 = clair iode) 1 = clair; 10 = pourpre, -brillant. k> o O o o UJ 70 25377 42 2060034 Résultats Les "variations du pouvoir de fermentation du moût, de la teneur en azote total et de la teneur en azote formolé, en fonction des variations du rapport amylase/protéase, et l'extrait 5 de moût, l'aptitude à la fermentation du moût et la teneur en azote total, en fonction des variations de la quantité de protéase, sont données par les graphiques des figures 6 à 11 respectivement, des dessins ci-joints.'En se référant à ces figures, on voit les avantages nets résultant d'un processus mettant en oeuvre les 10 quantités d'amylase et de protéase et les rapports amylase/protéase selon la présente invention. Ainsi, comme montré par la figure 6, l'atténuation des moûts (aptitude à la fermentation des moût en JP?) tend à atteindre une valeur constante ou, d'une façon effective, décroît pour des rapports amylase/protéase inférieurs à environ 15 75 : 1 et'd'une façon marquée, à décroître pour des rapports supérieurs à environ 200 : 1 . La quantité d'azote total des moût croît jusqu'à un niveau élevé inacceptable pour des rapports inférieurs à 75 : 1 et tombe à des niveaux; relativement élevés pour des rapports supérieurs à environ 200 : 1 . En comparant les 20 diverses courbes des figures 6 à 8, on peut voir que l'équilibre optimal entre l'atténuation, la teneur en azote total et la. teneur en azote formolé, de même que la meilleure concordance entre les moûts orge/enzyme et les moûls de malt témoins, sont obtenues pour des quantités .d'amylase au moins égales à environ 25 80 unités d'amylase par gramme d'orge et pour un rapport amylase/ protéase inférieur à environ 200 : 1, ce rapport étant avantageusement compris entre 170 : 1 et environ 75 : 1 . En ce qui concerne la relation entre les propriétés du moût et la quantité de protéase, les figures 9 et 10 montrent 30 que l'extrait de moût (âP) et l'aptitude à la fermentation (atténuation-âP) croît lorsque la quantité de protéase croît jusqu'à environ 1,5 à 2,0 unités de protéase par gramme d'orge, après quoi on note un petit accroissement ultérieur. Une quantité de protéase d'environ 0,8 à 0,9 unité par gramme d'orge est 35 nécessaire pour obtenir la valeur moyenne d'extrait, témoin de malt. Il est aussi important d'avoir trouvé que les valeurs de l'extrait et de l'aptitude à la fermentation apparaissent comme 70 25377 43 2060034 étant en corrélation et comme étant influencées par la quantité d'amylase, par le fait que les valeurs les plus élevées sont obtenues pour une quantité d'amylase égale à 100 unités par gramme d'orge et non, comme l'on s'y attendait, avec une quantité 5 de 150 unités d'amylase. Cependant, comme montré par les figures, les courbes relatives à 114 et 150 unités d'amylase sont déplacée en dessous de la courbe relative à 100 unités d'amylase. la variation de la teneur en azote total des moûts en fonction d'une quantité croissante de protéase est montrée par la figure 11, qui 10 indique que la teneur en azote total croît lorsque la quantité de protéase croît. Cependant, d'une manière suprenante, pour une quantité donné de protéase, la teneur en azote total croît lorsque la quantité d'amylase décroît; par exemple, pour 1,0 unité de protéase par gramme d'orge, 150 unités d'amylase par gramme 15 donnent une teneur en azote total de 7*1 x 10 tandis que 80 2. unités d'amylase par gramme donnent 8,4 z 10 Par conséquent, afin d'obtenir une valeur d'azote total donnée, il est apparemment nécessaire d'utiliser une plus grande quantité de protéase lorsque la quantité d'amylase est plus grande. 20 Exemple 7 On opère comme dans l'Exemple précédent, sauf en ce qui concerne les détails suivants: (a) Mélange destiné à former la trempe Cuiseur de mais 25 Maïs 24,9 g Eau 90 ml Enzyme Complexe enzymatique de l'exemple "t Sels 30 Mélangeur de la trempe à 14 unités d'amylase/g de maïs 0,03 de gypse Orge Malt Eau 55,0 g 19,5 g 230 ml Enzyme, 35 Sels Comme indiqué ci-dessous 0,06 de gypse 0,095 g de chlorure de calcium 70 25377 44 2060034 la trempe pour les six expériences témoins portant sur le malt avait la composition suivante : Cuiseur de maïs Maïs 5 Malt Eau Mélangeur de la trempe Malt Eau 10 Sels 24,9 g 2,96 g 90 ml 65 g 240 ml 0,06 g de gypse 0,095 g de chlorure de calcium (b) Système enzymatique On a remplacé le complexe enzymatique ÏT° 2 par un autre complexe enzymatique (K0 5) dérivant également de Bacillus 15 subtilis ATCC 21556, en effectuant l'expérience avec 8000 unités d'amylase/ml et 38,8 unités de protéase/ml. les divers rapports amylase/protéase mis en oeuvre dans les différentes expériences sont données ci-dessous : 20 Quantité d'amylase (en unités/g 45 80 100 114 150 Enzyme Quantité de protéase (en unités/g) ÎT° 1 0,05 0,09 0,11 0,13 0,17 N° 2 0,22 0,39 0,48 0,55 0,73 ÏT° 3 0,60 1,07 1 ,33 1 ,52 1,99 N° 4 0,97 1,73 2,17 2,46 3,25 25 Résultats l'analyse des moût ainsi obtenus a montré qu'ils avaient les mêmes propriétés que les moûtg'de l'Exemple précédent et des graphiques correspondant aux figures 6 à 11. Ces graphiques montrent essentiellement les mêmes relations entre les propriétés 30 du moût d'une part et le rapport amylase/protéase ainsi que les quantités d'amylase et de protéase d'autre part. 70 25377 45 2060034 Exemple 8 On met en oeuvre le même processus que dans l'Exemple 3, en utilisant différents mélanges en tant que trempes et différents systèmes enzymatiques, comme indiqué dans le Tableau IV suivant, qui comprend aussi les résultats d'analyse effectués sur les moûts et bières ainsi obtenus, ainsi que les données numériques correspondantes pour un moût de malt classique et une bière classique servant de témoins. TABLEAU IV O ( . Expérience ET0 27 30 33 40 61 32 ) ( Mélange pour trempe / Orge 5851 5851 5851 5851 5578 2555 ) ( Malt" 1463 1463 1463 1463 1395 6510 j / Mais 2691 2691 2691 2691 2956 ( Système enzymatique *fn0^k^ 5 ' 6 7 8 9 Contrôle ) / Amylase unités/ml 3600 7945 8625 , 8775 33980 de malt ) ( Protéase unités/ml 30 60 93,8 62,5 235 ) / Amylase/pi'otéase 120: 1 132:1 92:1 140:1 130:1 \ ( Amylase Unités/g d'orge 114 , 114 114 114 203 ) / Protéase unités/g d'orge 0,95 0,86 1,24 0,81 0,92 s ( Analyse du moût ( Densité après ajustement £p) 10,4 10,5 10,4 10,3 "10,4 10,4 ) (Rendement (B.M.E.^) 97,4 99,5 97,5 96,8 98,9 99,4 ) ( Densité dans la chaudière (°$ 11,7 11,9 11,9 11,9 12,0 -N/ S/" O C\J TABLEAU 17 (suite) -«4 o ( Expérience ET0 27 30 33 40 61 32 ( Ijialvse cLu mouT; ( Test de fermentation rapide / (unités selon norme AOAO 2,7 2,6 ' 2,5 .2,5 2,6 2,5 ( méthode 10120 b) / Azote total (mg/litre) 873 868 861 879 883 868 ( Azote formolé (mg/litre) 270 252 258 252 263 272 pH 4,3 4,2 4,4 4,3 4,0 4,15 ( Atténuation apparente {fo) 77,1 77,3 77,0 77,8 78,0 79,0 { Analyse de la bière / Couleur SRM 2,6 2,5 2,5 2,9 - 2,4 ( Mousse SIG- 11 6 120 113 135 - 125 / fo d'extrait (apparent) 2,6 2,4 2,3 2,3 - 2,1 ( pH 4,40 4,30 4,50 4,20 - 4,25 / Azote formolé (mg/litre) 216 197 135 205 - 222 ( SOg (p.p.m.) 3 3 7 8 - 4 / Diacétyle (p.p.m.) 0,06 0,14 0,25 0,6 0,9 k> en lu "^4 -fa* k> o o o o uj TABLEAU IV (suite et fin) --4 o ( Expérience ÏT° 27 30 33 40 61 ) 32 ) ) ( Analyse "de la bièïe (suite"7) ) \ / Eer (p.p.m.) 0,02 0,04 0,06 0,09 - 0,05 ) ( Cuivre (p.p.m.) 0,11 0,13 0,11 0,16 - 0,11 ) / f> Protéines 0,35 0,35 0,35 0,37 - 0,33 ) ( fo Acidité 0, 18 0,16 0,16 0,17 - 0,17 ) / Iso-humulones (IBU) 21 ,0 18,0 21 ,0 ■ 15,0 - 18,0 ) ( fo d'extrait (réel) 4,33 4,15 4,70 4,13 - 4,10 ) / fo d'alcool (en volume) 4,85 4,92 4,95 4,89 - 5,06 /) ( fo d'extrait initial calculé 11,4 11,5 12,0 11,6 - 12,0 ) ; fo d'extrait fermenté 0,0 0,0 0,0 ) 0,0 ) 0,0 — ( à la levure ) 1,0 ) ) Taux de sédimentation initia! 190 1,0 ■1,0 1,0 — ( Pour essai d'une semaine 190 200 110 180 - 230 j \ J Rad PTU ) ) ( Voile de refroidissement ■ 60 65 60 / 50 55 — > rapide r. , , i , . . ' L J ) ) 70 25377 « 2060034 ^Système enzymatique Les systèmes enzymatiques N° 5 à N° 8 (expériences n° 27, n° 30, n° 33 et n° 40) se présentaient sous la forme de complexes enzymatiques obtenus par culture de Bacillus subtilis ATCC 21556, 5 en' adoptant d'une manière générale le processus de l'Exemple 2, ces complexes contenant à la fois une protéase neutre et une protéase alcaline. Le système enzymatique n° 9 (expérience R° 61) a été obtenu en mélangeant 56 ml du produit connu sous la dénomination commerciale "Tenase" (distribué par les Miles 10 Laboratories) titrant 14300 unités d'amylase/ml, avec le produit connu sous la dénomination commerciale "HTP 200" (distribué également par les Miles Laboratories) titrant 19680 unités d'amylase/g et 235 unités de protéase/g se répartissent comme suit : 110 unités de protéase neutre/g et 125 unités de protéase 15 alcaline/g. Conclusions les résultats précités indiquent que les moûts orge/enzyme et les bières correspondantes ont des propriétés physico-chimiques substantiellement similaires à celles d'un.malt témoin classique 20 et d 'une bière correspondante, respectivement. Les essais de dégustation effectués sur les diverses bières de l'invention ont montré qu'elles étaient toutes acceptables, avec une légère préférence pour la bière de l'expérience n° 33. Toutes ces bières se sont révélées pures et d'arôme neutre avec un.corps modéré à 25 élevé et un caractère houblonneux faible à modéré. Exemple 9 Dans cet exemple, on a mélangé entre elles différentes enzymes disponibles dans le commerce, dans des proportions définies, afin d'obtenir différents systèmes enzymatiques, dont 30 chacun a été utilisé pour transformer une formulation de grains donnée en un moût à bière, en utilisant différentes unités de brassage de laboratoire (pourvues d'un euiseur et de coupelles de mélange de la trempe) et on a suivi le processus de l'Exemple 3 décrit plus haut. 70 25377 50 2060034 Partie A (a) Formulation des grains Orge Maïs 5 Malt (b) Système enzymatique Amylase "Tenase" Activité de l'amylase 10 Quantité d'amylase fo Volume/poids d'orge Protéase Ficine Activité de la protéase '15 Quantité de protéase fo Poids/poids d'orge Amyias e/Protéase Partie B (a) Formulation des grains 20 Orge Maïs Malt (b) Système enzymatique Amylase 25 "Tenase" Activité de l'amylase Quantité d'amylase fo Volume/poids d'orge Protéase 30 Broméline Activité de la protéase Quantité de protéase f> Poids/poids d'orge Amylase/protéase _s_ 64,4 29,2 5,3 A- 100 44 8 14100 unité/ml 100 unités/g d'orge 0,7 543,6 unités/ml 1,1 unités/g d'orge 0,2 91 :1 ■ 60,0 32,4 7,2 100 54 12 14100 unités/ml 114 unités/g d'orge 0,8 203,5 unités/g 0,9 unité/g d'orge 0,44 1 27:1 70 25377 2060034 Partie G (a) Formulation des grains K J°_ Orge 64,4 100 Mais 39,9 48 5 Malt 5,1 8 (b) Système enzymatique Amylase "HT 1000" (Miles Laboratories) Activité de l'amylase 10 Quantité de l'amylase f> Yolume/poids d'orge Protéase Ficine Activité de la protéase 15 Quantité de protéase f> Poids/poids d'orge Amylase/Protéase Partie S (a) Formulation des grains 20 Orge Mais Malt (b) Système enzymatique Amylase 25 d'origine bactérienne "ÏT0V0" Activité de l'amylase Quantité d'amylase fo Volume/poids d'orge Protéase 30 Broméline Activité de la protéase Quantité de protéase f> Poids/poids d'orge Amylase/protéase 55400 unités/g 140 unités/g drorge 0,25 543,6 unités Q,S unité/g d'orge 0,16 155:1 62 T0 27,9 11,2 jl 100 44 18 9500 unités/g 100 unités/g d'orge 1 ,05 203,5 unités/g 1,2 unité/g d'orge 0,59 83:1 70 25377 52 2060034 Partie E (a) Formulation des grains g Orge 60,0 100 Maïs 32,4 54 Malt 7,1 12 5 (fa) Système enzymatique Amylase "HT 1000" (Miles Laboratories) Activité de l'amylase Quantité dramylase 10 fo Poids/poids d'orge Protéase Broméline Activité de la protéase Quantité de protéase 15 fo Poids/poids d'orge Amylase/propylase Partie E (a) Formulation des grains Orge 20 Maïs Malt (b) Système enzymatique Amylase "HTP 200" 25 Activité de l'amylase Quantité d'amylase f> Poids/poids d'orge Amylase/Protéase Protéase 30 "HTP 200" Activité de la protéase Quantité de protéase % Poids/poids d'orge Amylase/Protéase 55400 unités/g 128 unités/g d'orge 0,23 203,5 unités/g 1,25 unité/g d'orge 0,61 102:1 _g_ 66,4 29,2 5,-3 100 44 8 19680 unités/g 114 unités/g drorge 0,58 .84:1 235 unités/g 1,36 unité/g d'orge 0,58 84:1 70 25377 53 2060034 Partie G (a) Formulation des grains g f" Orge 62. -0 100 Maïs 21, ,9 44 5 Malt 11. ,2 18 (b) Système enzymatique Amylase Concentré HT Activité de l'amylase 10 Quantité d'amylase fo Poids/poids d'orge Protéase Mélange de 1. Concentré HT 15 Activité de la protéase Quantité de protéase fo poids/poids d'orge 2. Pleine Activité de la protéase 20 Quantité de protéase fo Poids/poids d'orge Amylase/Protéase Partie H (a) Formulation des grains 25 Orge Mais Malt (b) Système enzymatique Amylase 30 Amylase d'origine bactérienne "M)V0" Activité de l'amylase Quantité d'amylase fo Poids/poids d'orge 283000 unités/g 140 unités/g d'orge 0,05 430 unités/g 1,0 unité/g d'orge 0,05 545,6 unités/g 1,0 unité/g d'orge 0,144 140:1 _g_ - 60,0 52,4 7,2 100 54 12 9500 unités/g 128 unités/g d'orge 1,54 70 25377 2060034 Protéase Ficine .Activité de la protéase Quantité de protéase 5 fo Poids/poids d'orge Amylase/Protéase Partie I (a) Formulation des grains Orge 10 Maïs" Malt (b-) Système enzymatique Amylase Concentré HT (Miles Laboratories) 15 Activité de l'amylase Quantité d'amylase f> Poids/poids d'orge Protéase Mélange de 20 1 . Concentré HT (Miles Laboratories) Activité de la protéase Quantité de protéase f> Poids/poids d'orge 2. Broméline 25 Activité de la protéase Quantité de protéase fo Poids/poids d'orge Amylase/Protéase Partie J 30 (a) Formulation des grains Orge Maïs Malt 543,6 unités/g 1,35 unité/g d'orge 0,25 95:1 j£_ 62,0 27,9 11,2 A. 100 44 18 28300 unités/g 144 unités/g d'orge 0,04 430 unités/g 1,4 unité/g d'orge 0,04 203,5 unités/g 1,4 unité/g d'orge 0,60 81 :1 64,4 30,9 5,1 100 48 8 70 25377 55 2060034 (b) Système enzymatique Amylase "HTP 200" Activité de l'amylase 19680 ■Quantité d'amylase 100 fo Poids/poxds d'orge 0,51 Amylase/Protéase 84:1 Pour chacune des parties A à J , on a liquéfié le mais dans le euiseur, en utilisant un pourcentage pondéral d'orge 10 broyé. Résultats On donne dans le Tableau Y c-dessous les résultats numériques d'analyse d'un moût à bière obtenu dans le cadre de chacune des parties A à J et d'un moût de malt classique, lesquels ont 15 été obtenus dans des conditions opératoires identiques, avec 60 fo en poids de malt. TABLEAU V *-4 o ! propriété du moût ; ! partie NJ en A B 0 ■P E E G- H I J malt témoin 00 j extrait (°P) 10,5 10,7 10,2 10,4 10,6 10,2 10,5 10,3 10,2 10,1 10,7 ! azote total !(mg/litre) 822 852 848 825 848 822 841 840 810 820 861 lazote formolé !(mg/litre) 218 242 246 220 246 218 .211 236 215 221 252 j pH 5,35 5,35 5,4 5,35 5,4 5,4 ' 5,3 5 f 35 5,4 5,4 5,3 ! atténuation apparente ! (%) 76 79 75 76,5 80,5 74 79,5 77 75,5 74,5 80 ! conversion * ! 1 1 1 1 1 1 1 1 2 1 1 vj1 en jclarté à l'écoulement ** 4 4 4 4 5 4 4 4 4 4 4 ! temps d1 écoulement ! (en minutes) 30 30 30 ■.35 30 30 30 30 35 35 30 * Echelle de conversion (essai colorimétrique à l'iode) 1 = clair; 10 ** Echelle de clarté 1 = sombre - trouble; 5 = clair - brillant. pourpre rs3 o o o o LO -u 70 25377 2060034 10 le moût de bière obtenu selon chacune des parties A à J a été fermenté de façon à donner une bière possédant une saveur, un arôme, une couleur et une stabilité acceptables. Exemple 10 Cet Exemple illustre l'effet de la variation de la quantité de malt utilisée sur les propriétés du moût. D'une manière générale, on a adopté Te processus à l'échelon laboratoire de l'Exemple 6 décrit plus haut, excepté le fait que l'on a employé le complexe enzymatique de l'Exemple 2 pour la transformation et que l'on a adopté les formulations de trempe suivantes : Partie A 15 20 25 30 Orge Maïs Malt Partie B Orge Maïs Malt Partie C Orge Maïs Malt Partie D Orge Maïs Malt Orge/Maïs = 66,6/33*4 Orge/Maïs = 65/35. Orge/Maïs = 62,4/35,8 fo en 'poids 100 50,1 0 ja en poids 100 53,6 . 6 fo en poids 100 55,86 ' 10 fo en poids ■ 100 57,0 18 Orge/Maïs = 63,7/36,3 70 25377 58 2060034 Partie E Orge Maïs Malt en poids 100 59,0 25 Orge/Maïs = 63/37 ; Tableau VI Propriété du moût Partie Partie A'Partie B • ".Partie C Partie D Partie E Extrait (°P) 10,5 * : 10,55 : 10,6 10,5 10,5 Test de fermentation . rapide/unités selon ' norme AOAC méthode 100206 2,6 ; - ! 2,25 2,15 2,20 Azote formolé mg/l 180 ? 199 : - 210. 218 220 Atténuation (f>) 75,2 : 77,3 l : 78,8: : *79,5 79,0 les résultats ci-dessus montrent- que l'extrait de moût garde des propriétés essentiellement constantes^indépendantes de la quantité de malt, quoiqu'il existe un léger picpour la partie C , . 20 (10 fo de malt);, le nombre d'unités de l'essai de fermentation rapide, ainsi que l'atténuation;, tendent à s'améliorer pour une teneur croissante en;malt gusqu-'à la teneur de \Q %, tandis que, M ) pour la teneur de 25 % en malt il n'apparaît pas d'amélioration effective par rapport a Ta teneur de 18 ^ en malt. 25 j Exemple > 11 Cet Exemple illustre .les essais, sur les propriétés du malt, d'une température et d'une durée variables pendant la réaction protéolytique. : D'une manière générale, on a adopté le processus à l'échelon 30 du laboratoire de l'Exemple 6', excepté le fait que l'on a utilisé le complexe .enzymatique de l'Exemple 2 pour la conversion, et que l'on a fait varier, comme montré dans le. Tableau VII ci-après, la température et la ;durée de laréaction protéolytique du cycle de brassage de la figure 5. Les propriétés intéressantes du 35 moût sont égQsnet données dans ce Tableau.' o Tableau VII IO ~~ ' en Température.(°G) 36 40 46 46 55 Temps (minutes) 30 60 50 60 30 Propriétés du moût (°P ) 9,8 9,85 10,3 10,2 10,45 10,5 10,3 10,25 10,2 10,3 Test de fermentation rapide 2,35 2,45 2,3 2,25 2,2 2,2 2,15 2,1 2,4 2,45 Azote formolé (mg/litre) 169 171 182 185 203 205 205 203 1 64 166 Atténuation {fo) 76,8 75,1 77,7 78,0 78,9 79,0 79,1 79,5 76,5 76,2 ro o o o o ou •o» 70 25377 60 2060034 la meilleure combinaison de celles des propriétés qui sont attribuables à la dégradation des protéines est obtenue lorsque la réaction protéolytique est effectuée à 46°C, pendant 50 à 60 minutes, ainsi qu'il est illustré par le graphique de la 5 -figure 12,sur lequel on a représenté la teneur en azote formolé et l'atténuation en fonction de la température. Exemple 12 Cet exemple illustre-les effets des variations de. température et de durée, lors de la solubilisation et de la sacchari-fication de l'orge, et il montre les avantages d'un processus de chauffage par paliers, conformément à des modes de réalisation préférés de l'invention. D'une manière générale, le processus à l'échelon du laboratoire de l'Exemple 6 décrit plus haut a été adopté, 1? excepté le fait que l'on a employé le complexe enzymatique de l'Exemple 1 pour la conversion et que l'on a fait varier, comme représenté dans les Tableau VIII et IX ci-après,- la température et la durée pour la solubilisation et la saccharification du cycle de brassage ou trempe de la figure 5. Des propriétés 2Q intéressantes du moût sont aussi données dans ces Tableaux. Processus en un seul stade Tableau VIII Température (°C) 62 62 62 71 76 80 Temps (minutes) 90 60 50 60 60 30 Extrait de moût (°P) 9,75 9,55 9,4 10,8 10,2 9,6 Essai de fermentation rapide (■unités selon norme AOAC (méthode 10020 b) 2,2 2,1 2,2 5,4 3,2 2,95 Azote formolé (mg/litre) 210 189 172 179 185 193 Atténuation ($) 77,4 78,0 76,6 68,5 68,6 69,3 Rendement (%) 86,5 84,6 83,5 96,2 90,7 85,1 TABLEAU IX ( ( ( ( (Stade ( ( ( ( f Primaire \ température (°c) Temps Jminutes) 60 45 60 60 64 45 68 | 35 ] Secondaire température (°0) Temps (minutes) 70 15 70 30 76 15 80 10 70 15 70 116 30 ;i5 80 10 70 15 70 30 76 15 80 10 70 15 70 30 76 15 ) 80 ) ) 10 \ ^Propriétés du moût ) ) % ( t Extrait de moût / (OP) 9:05 10,1 10,2 10,0 10,0 10,2 ;io^ 9,9 10,1 10,15 10,4 10P5 9,8 9,9 10,05 / ) 9,85 ] ( Essai de fermentation rapide 2,5 2,4 %3 2,45 2,5 2,4'i 2^5 2,4 2,4 2,25 2,15 2,3 2,5 2,4 2,25 ) 2,0 ) ( Azote formolé (mg/litre) 184 185 1 86 183 188 1 94:1 98 196 189 192 194 191 178 179 191 185 ) ( Atténuation (fo) 75,9 75,2 77i5 755 75,0 75,5:78,1 75,a 76,2 76,8 79,3 77,1 74,5 75£ 76,6 ) 19,1) ( ( Rendement (fo) .88,4 8Q7 90,7 8S£ 88,8 90,7! 91,6 87,9 89,7 902 92,5 89,2 8^9 87,9 89, 2 ) 87,4 ) ) ) 70 25377 62 2060034 Une comparaison entre les données numériques des Tableaux VIII et IX montre les avantages du processus de chauffage par paliers, en deux stades, ainsi qu'il apparaît à l'examen des valeurs excellentes des propriétés suivantes du moût : extrait, 5 nombre d'unités du test de fermentation rapide, teneur en azote formolé et atténuation (ces tableaux VIII et IX correspondent sensiblement à la mise en oeuvre de températures et de durées de réaction coînparables). Par exemple, un chauffage à 76°0 pendant 60 minutes dans le processus en un seul stade 10 (Tableau VIII) donne des valeurs respectives de 10,2 - 3*2 -185 et 68,7 i° pour l'extrait de moût, le nombre d'unités du test de fermentation rapide, la teneur en azote-formolé et l'atténuation, tandis qu ' à titre de comparaison, on obtient, dans le processus en deux stades (Exemple IX) en opérant 15 .pendant 45 minutes, à 64°C puis pendant 15 minutes à 76°C des valeurs correspondantes des propriétés, précitées du moût, respectivement égales à 10,4 - 2,15 - 194 et 79,3 . Exemple 15 Cet Exemple illustre l'effet, sur les propriétés du moût, 20 des variations de la quantité d'adjuvant introduit dans la formulation de trempe. . ] D'une manière générale, on.a adopté le processus et la formulation de tremps de l'Exemple 6, excepté le fait que l'on a utilisé le complexe enzymatique de l'Exemple 1 et que 25 l'on a fait varier, de la manière dans le Tableau X ci-après, la quantité de gruaus de mais incorporée comme adjuvant. Ce Tableau donne également les résultats numériques obtenus par analyse du malt. u1 o ro vji ro o vn vj1 TABLEAU X ( Maïs (fo en r poids par r.ap-( port à l'orge 1 1 12 30 44 53 55,8 58 60 70 j f Orge/Maïs 90; 10 89,3:10,7 77:23 69,5:30,5 65,2:34,8 64:36 63,3:36,7 62,5:37,5 58,8:41 ,2^ v Extrait de ( moût (°P) 10,4 10,4 10,4 10,4 10,6 10,6 10,5 10,6 10,6 ) ( Essai de fer-\ mentation ( rapide 2,9 2,65 2,6 2,4 2,3 2,3 2,3 2,3 2,35 ) ( Azote total ( (mg/litre) 231 222 214 195 192 186 185 186 185 \ ( Atténuation f° ( 72,1 74,5 74,9 75,4 78,3 78,3 78,2 78,3 78,0 j o n> en ou "*vj ch vjj k> o o o o eu £» 70 25377 64 2060034 Il résulte de l'examen des graphiques des figures 13 et 14, qui illustrent certaines caractéristiques de ces résultats, que le meilleur compromis entre les diverses propriétés est obtenu en travaillant avec des quantités d'adjuvant comprises 5 entre 44 et 60 $ en poids par rapport au poids d'orge. Exemple 14 On adopte le processus de l'Exemple précédent, excepté le fait que l'on utilise différents adjuvants comme indiqué dans le Tableau XI ci-après, lequel tableau comprend aussi des 10 données numériques résultant de l'analyse du moût ainsi obtenu. VjJ Vtf [\i IV) -» ui O vn O vn O vn TABLEAU XI " en to / Adjuvant Amidon de maïs (adjuvant préparé) Amidon de blé ) V ) UJ Farine d ' orge ( --4 > ^ ) ( fo en poids par rapport / à l'orge 12 44 53 58 12 44 53 58 ) ) 12 44 53 58 ) ) ( Extrait de moût (°P) / Essai de fermentation ( rapide / Azote formolé (mg/litre ( Atténuation 10,2 11,0 11,1 11,1 2,65 2,45 '2,35 2,35 232 202 195 182 74,0 77,7 78,8 78,8 10,3 10,3 10,25 10,5 2,5 2,35 2,3 ' 2,2 225 192 187 180 75,7 77,2 77,6 79,0 10,15 9,9 9,9 9,95) ) ) CTN 2,95 2,45 2,45 2,45) ^ ) ) 234 200 195 196 ! ) 70,9 74,3 74,3 74,5) ) kd o o-o o u) -fa. 70 25377 2060034 Exemple 15 On a préparé un moût à bière en adoptant le processus de l'Exemple 6, décrit plus haut, à l'aide d'une formulation de trempe comprenant : 5 Orge 11305 g 1135 g 5540 g Malt Mais Eau 40 litres 18 g 9 g Chlorure de sodium 10 Acétate de calcium et en utilisant un complexe enzymatique dérivé de Bacillus subtilis AICC 21 556 (par un processus similaire à celui de l'Exemple 1) à raison de 150 -unités d'amylase et de 1,05 unité de protéase par gramme d'orge. 1 5 On a divisé en deux portions le moût ainsi obtenu, qui possédait une valeur d'extrait de 10,8°P (degrés Plato). On a porté à 1'ébullition l'une de ces portions dans une chaudière ouverte pendant 2 heures; à la fin de cette durée, la valeur de l'extrait était de 12,8°P . Le moût porté à 20 1'ébullition a été alors refroidi, puis soumis à 1'évaporation dans rai évaporateur du type à film liquide ascendant, travaillant sous pression réduite, jusqu'à une teneur en solides d'environ 75 f°. Le produit concentré résultant était constitué par un sirop épais et facile à manipuler, ayant une teneur en azote 25 formolé de 299 mg/l . Après dilution de ce sirop jusqu'à la valeur d'extrait de 11°P, c'est-à-dire une teneur en solides de 11 fo, celui-ci a donné un moût reconstitué ayant des propriétés convenant à la fermentation dudit moût de façon à donner une bière. 30 L'autre portion du moût a été séchée de façon à donner une poudre, en utilisant un appareil de séchoir à pulvérisation (du type connu sous la dénomination commerciale "ÏTiro") en opérant avec une température d'entrée de l'air de 115°C et une 'température de sortie de l'air de 70°C. Le produit obtenu était 35 solubie dans l'eau et pouvait être dispersé dans l'eau, rendu amer avec des houblons ou de l'isohumulate de sodium en poudre, ensemencé avec de la levure, puis fermenté de la manière 70 25377 67 2060034 usuelle pour donner une bière. Bien entendu, l'invention n'est nullement limitée aux modes d'exécution décrits et représentés qui n'ont été donnés qu'à titre d'exemple. En particulier, elle comprend tous les moyens constituant des équivalents techniques des moyens décrits ainsi que leurs combinaisons, si celles-ci sont exécutées selon l'esprit de l'invention. 68 70 25377 2060034 REVENDICATIONS 1. Procédé de production d'un moût à bière dans lequel on soumet une solution aqueuse d'une substance broyée à base d'amidon, par exemple des grains de céréales broyés tels que de l'orge, du blé ou du mais, à l'action d'une protéase et d'une amylase, de 5 telle sorte que les protéines présentes dans ladite substance à base d'amidon soient tranfarmées en composés solubles contenant de l'azote, et on solubilise et transforme ladite substance, par saccharification, en sucres, après quoi on filtre la trempe ou maishe et on enlève l'eau, ce procédé étant caractérisé en ce que, 10 on réalise la protéolyse, la liquéfaction et la saccharification subséquente de la substance broyée à base d'amidon en faisant réagir ladite substance, dans des conditions déterminées de température et de temps, avec au plus 30 i° en poids, par rapport au poids de ladite substance à base d'amidon, de malt ou d'extrait 15 de malt et de protéase et d' o( -amylase isolée, à raison d'au moins 0,5 unité de protéase par gramme de substance à base d'amidon (unités Kunitz modifiées) et d'au moins 100 unités dxoC -amylase par gramme de substance à base d'amidon (unités Stein-Éischer modifiées) respectivement, le rapport de ladite amylase à ladite 20 protéase, exprimés en termes dractivité, étant inférieur à 200 : 1. 2. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que la quantité précitée de malt ou d'extrait de malt et de protéase et d1-amylase isolées est au plus égale à 20 % en poids par rapport au poids de substance à base dramidon. 25 3- Procédé selon la revendication 1 ou 2, caractérisé en ce que le nombre d'unités précité de protéases est d'au moins 0,9 unité par gramme de substance à base d'amidon, le nombre d'unités _ précité d' c* -amylase est d'au moins 100 'unités par gramme de substance à base d'amidon, le rapport de ladite amylase à ladite 30 protéase, exprimé en termes d'activité étant compris entre 170 : 1 et 75 : 1 . 4- Procédé selon la revendication 1 ou 2, caractérisé en ce que le nombre d'unités précité de protéase est d'au moins 0,9 unité 70 25377 69 2060034 par gtanme de substance àbese d'amidon,le nombre d'unités précité d' of-amy-lase est d'au moins 100 unités par gramme-de substance à base d'amidon, le rapport amylase/protéase, exprimé en termes d'activité, étant compris entre 170 : 1 et 75 : 1. 5 5. Procédé selon l'une des revendications précitées, carac térisé en ce que la protéase précitée est constituée par un mélange de protéase neutre et de protéase alcaline. 6. Procédé selon l'une des revendications précédentes, caractérisé en ce que la protéase et 1' (X -amylase sont utilisées sous la forme d'un mélange enzymatique isolé. 7. Procédé selon l'une des revendications précédentes, caractérisé en ce que la protéase et l'(K -amylase sont ajoutées séparément et en séquence. 8. Procédé.selon l'une des revendications 1 à 6, caractérisé 15 en ce qu'il comprend les étapes suivantes : (a) opération de mélange d'une bouillie aqueuse de grains de céréales avec le malt ou un extrait de malt et un mélange enzymatique isolé contenant la protéase et l'oC -amylase; (b) le pË du mélange résultant étant compris entre environ 20 5,0 et environ 6,5, maintien de ce mélange à. une température comprise entre environ 40°C et environ 55°C5 pendant une période d'environ 30 à 120 minutes; (c) à la fin de la période précitée, ou vers la fin de cette période, introduction dans la masse principale, en tant qu'adjuvant 25 de celle-ci, de grains de céréales, àraison, d1 environ 10 à environ 60 fo en poids, par rapport au poids total du substrat de grains de céréales; (d) élévation de la température de la masse globale jusqu'à une valeur comprise entre environ 60 et environ 80°C; 30 (e) maintien de la température de ladite masse dans cet intervalle pendant une période comprise entre environ 30 et environ 120 minutes, de façon à obtenir la composition en hydrates de carbone requise pour.un moût à bière; (f) séparation du moût ainsi obtenu.du résidu solide. 35 g. Procédé selon la revendication 8, caractérisé en ce que lQ^maintien de la température de la masse précitée, selon le paragraphe (e) s'effectue pendant une période comprise entre 70 25377 70 2060034 environ 30 et environ 90 minutes. 10. Procédé selon l'une des revendications 1 à 7, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes :- (a) opération de mélange d'une bouillie aqueuse de grains de 5 céréales avec la protéase isolée; (b) le pH du mélange résultant étant compris entre environ 5,0 et environ 6,5, maintien de ce mélange à une température comprise entre environ 40 et 55°C> pendant une période d'environ 30 à 120 minutes; 10 (c) à la fin de la période précitée, introduction du malt ou de l'extrait de malt dans la masse principale; (d) élévation de la température de la masse globale à une valeur, comprise entre environ. .60 et environ 80°C; (e) maintien de la température de cette .masse dans ledit 15 . intervalle, pendant une période d'environ 30 à environ 120 minutes, de façon à obtenir la composition en hydrates de carbone requise pour un moût à bière; (f) séparation du .moût ainsi obtenu du.résidu solide, 1' lX -amylase isolée étant ajouté en même temps que. la protéase 20 isolée ou en même temps que le malt ou extrait .de-malt. 11. Procédé selon la revendication 10, caractérisé en ce que 1 ' 25 12. Procédé selon l'une des revendications 1 à 5 et 7, carac térisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes : (a) opération de mélange d'une bouillie aqueuse de grains de céréales avec la protéase isolée; (b) le pHdu mélange résultant étant compris entre environ 30 5,0 et environ 6,5, maintien de ce mélange à une température comprise entre environ 40°0 et environ 55°0, pendant une période d'environ 30 à environ 120-minutes;. (c) à la fin de la période précédente, ou vers la fin de cette période, introduction de 1* cC-amylase isolée dans ladite masse; 35 (d). élévation de la- température de la masse globlale jusqu'à une valeur comprise entre environ 60 et environ 80°C; (e) maintien de la température de ladite masse à l'intérieur 70 25377 71 2060034 de cet intervalle, pendant une période d'environ 30 à environ 120 minutes, pour obtenir la composition en hydrates de carbone requise pour un moût à bière; (f) séparation du moût ainsi obtenu du résidu solide, 5 le malt ou l'extrait de malt étant ajouté au cours de l'étape (a) ou au cours de l'étape (c). 13. Procédé selon l'une des revendications précédentes, caractérisé en ce que la substance à base d'amidon est présente dans la bouillie aqueuse à une concentration comprise entre envi- 10 ron 20 et environ 40 g pour 100 cc d'eau. 14. Procédé selon l'une des revendications précédentes, caractérisé en ce que les grains de céréales utilisés sont constitués par des grains d'orge ayant un diamètre moyen de particule Inférieur à 1,41 mm. 15 15. Procédé selon l'une des revendications précédentes, carac térisé en ce que le malt ou l'extrait de malt est présent en quantités comprises entre environ 8 ^ et environ 20 fo. 16. Procédé selon l'une des revendications 1 à 14, caractérisé en ce que le malt ou l'extrait de malt est présent en une quantité 20 comprise entre environ 8 f> et environ 12 fo. 17. Procédé selon l'une des revendications 8 à 16, caractérisé en ce que l'étape de protéolyse (b) est effectuée à environ 44-48°C, pendant environ 40 à environ 60 minutes. 18. Procédé selon l'une des revendications 10 à 17, carac- 25 térisé en ce qu'on introduit un adjuvant céréalier dans la masse principale à la fin ou vers la fin de l'étape de protéolyse (b). 19. Procédé selon l'une des revendications 8 à 18, caractérisé en ce que l'adjuvant céréalier utilisé est constitué par des gruaux de maïs, de la farine ou de la poudre de maïs, 30 du sorgho, de la farine de blé, - de la farine d'orge, du riz ou de la poudre ou farine de sorgho, cet adjuvant étant liquéfié. 20. Procédé selon la revendication 19 T caractérisé en ce que l'on effectue la liquéfaction par mélange d'une bouillie aqueuse de grains de céréales bruts, avec du malt, de l'extrait de malt 35 ou de 1' oC -amylase isolée, à raison d'au moins 10 unités d'0(-amylase par gramme de grains de céréales (unités Stein-Pischer modifiées). 70 25377 72 2060034 21. Procédé selon la revendication 20, caractérisé en ce qu'on emploie, lors de la liquéfaction de l'adjuvant céréalier, la même -amylase isolée que celle utilisée dans l'étape de solubilisation et de saccharification (e) de la substance à base d'amidon, dans la masse globale. 22. Procédé selon la revendication 21, caractérisé en ce qu'on utilise l'^-amylase isolée'sous la forme d'un constituant d'un complexe enzymatique provenant directement de la fermentation d'une bactérie de l'espèce Bacillus. 23- Procédé selon l'une des revendications 8 à 18, caractérisé en ce que l'adjuvant céréalier est une substance pré-gélatinisée choisie parmi les flocons ou paillettes de maïs, l'amidon de maïs, le glucose et analogue. 24. Procédé selon l'une des revendications 18 à 23, caractérisé en ce que l'adjuvant céréalier est utilisé"a raison d'environ 42 f> à environ 55 f° en poids par rapport au poids de substrat de céréales. 25- Procédé selon l'une des revendications 8 à 24, caractérisé en ce que l'étape de solubilisation et de saccharification (e) est effectuée entre 64 et 80°C, pendant environ 45 à 90 minutes. 26. Procédé selon la revendication 22, caractérisé en ce que l'étape de solubilisation et de saccharification (e) est effectuée selon un processus en deux stades au cours duquel la masse globale est initialement maintenue entre environ 64 et environ 70°C, pendant environ 35 à environ 60 minutes, après quoi, la température est élevée jusqu'à une valeur comprise entre environ 70 et environ 80°C, la trempe étant maintenue à une température comprise dans cet intervalle pendant environ 10 à environ 30 minutes. 27. Procédé selon l'une des revendications 8 à 26., caractérisé en ce que, après l'étape de solubilisation.et de saccharification (e), la température de la trempe est élevée au-dessus de 80°C, pour inactiver substantiellemenfi.es enzymes. 28. Procédé selon l'une des revendications précédentes, caractérisé en ce que la protéase isolée est choisie parmi la ficine, la bromeline, la papaïne, la paneréatine, les protéases ■provenant des champignons, ainsi.que parmi les mélanges de toutes ces protéases. 70 25377 73 2060034 29- Procédé selon l'une des revendications 1 à 27, caractérisé en ce que la protéase isolée est constituée par une protéase d'origine bactérienne choisie parmi les BaciUlus subtilis, Bacillus amyloliquefaciens. Bacillus polymyxa, Bacillus megaterium et 5 Bacillus cereus. 30. Procédé selon l'une des revendications 1 à 27, caractérisé en ce que 1'oC -amylase isolée est une amylase provenant de champignons, choisis parmi les Aspergillus niger, Aspergillus oxyzae, Aspergillus candidus^ et certaines espèces de Rhizopus. 10 31. Procédé selon l'une des revendications 1 à 29, caracté risé en ce que 1'# -amylase est une amylase d'origine bactérienne provenant de bactéries choisies parmi les Bacillus subtilis, Bacillus amyloliquefaciens, Bacillus polymyxa, Bacillus coagulans, Bacillus cereus et Bacillus megaterium. 15 32. Procédé selon l'une des revendications 6, 8, 11 et 13 à 31, caractérisé en ce que le mélange enzymatique isolé est un complexe enzymatique provenant de la fermentation d'une bactérie du genre Bacillus. 33. Procédé selon la revendication 32, caractérisé en ce que 20 la bactérie est une souche de l'espèce Bacillus subtilis. 34. Procédé selon l'une des revendications 8 à 33, caractérisé en ce que le mout résultant est séché de façon à donner une.poudre. 35. Procédé selon la revendication 34, caractérisé en ce qu'on ajoute des adjuvants donnant de l'amertume audit moût 25 résultant. 36. Procédé selon l'une des revendications 8 à 33, caractérisé en ce que le moût résultant est concentré. 37- Procédé selon la revendication 36, caractérisé en ce qu'on ajoute des adjuvants donnant de l'amertume audit moût 30 résultant. 38. Procédé selon la revendication 36, caractérisé en ce que la concentration est effectuée par évaporatiôn. 39. Moût à bière, caractérisé en ce qu'il est préparé par le procédé selon l'une des revendications 1 à 38. 35 40. Procédé de production d'une bière ou d'une boisson alcoolisée similaire, caractérisé en ce qu'on soumet le moût à bière obtenu par le procédé selon l'une des revendications 1 à 33, 70 25377 74 2060034 après l'addition d'un adjuvant donnant de l'amertume,, à une fer- V mentation alcoolique. 4'1. Procédé de production d'une bière ou d'une boisson alcoolique analogue, caractérisé en ce qu'il consiste à fermenter un moût constitué, en partie ou en totalité, par une solution aqueuse du concentré ou produit sec obtenu par le procédé de l'une des revendications 34 à 38. 42. Bière ou boisson alcoolique analogue, caractérisée en ce qu'elle est obtenue par le procédé selon la revendication 40 ou 41 • 43. Mélange enzymatique isolé, pour la fabrication du moût et de la bière, caractérisé en ce qu'il contient de 1'-amylase et delà protéase, dans un rapport amylase/protéase d'au moins 200 : 1, exprimé en termes d'activité, de telle sorte que ce mélange présente une activité protéolytique équilibrée et facilement réglable ainsi qu'une activité de liquéfaction et de saccharification. de l'amidon équilibrée et facilement réglable, afin de digérer, lorsqu'il est utilisé en quantité appropriée, une substance à*base d'amidon pour la transformer en un produit ayant les propriétés, acceptables et substantiellement reproductibles, et en particulier une composition en hydrates de carbone, pour être utilisé dans un moût à bière. 44. Mélange enzymatique isolé selon la revendication 43, caractérisé en ce que le rapport $ -amylase/protéase est compris entre environ.M70 : 1 et 75 : 1, exprimé en termes d'activité. 45. Mélange enzymatique isolé selon la revendication 43 ou 44, caractérisé en ce que la protéase contient une protéase neutre et une protéase alcaline. 46. Mélange enzymatique isolé selon l'une des revendications 43 à 45, caraptérisé en ce.qu'il se présente sous la forme d'un complexe enzymatique, ayant le rapport amylase/protéase désiré, ledit complexe étant"obtenu par fermentation d'une bactérie du genre Bacillus. 47. Complexe enzymatique.selon la revendication 46, caractérisé en ce que ladite bactérie est une souche de l'espèce Bacillus subtilis.