FR 2081509 A1 19711203 FR 7104389 A 19710210 71 04389 2081509 L'invention concerne notamment une substance antitumorale nommée dicétocorioline D et son procédé de préparation. La dicéto-corioline B et la corioline B dont elle dérive sont de nouvelles substances découvertes par la Demanderesse. L'invention concerne 5 plus particulièrement un procédé de préparation de la dicétocorioline B en cultivant un basidiomycète pour produire de la corioline B, en recueillant la corioline B, puis en oxydant celle-ci selon un procédé connu pour transformer les groupes hydroxyle en groupes cé-tone. 10 Un des buts de la présente invention est de fournir un procédé de préparation de la dicétocorioline B. Un autre but de l'invention est de fournir un procédé de préparation de la corioline B, qui est utile pour la production de la dicétocorioline B. 15 Un autre but de l'invention est de fournir la dicétocorioline B, qui présente des effets inhibiteurs sur les bactéries grampositi-ves, la leucémie L-1210 de la souris et la tumeur ascitique d' — Ehrlich, et qui a une action inhibitrice sur la croissance des cellules du sarcome de Yoshida. Le mode d'action de cette substance 20 antitumorale est unique, elle inhibe 1'adénosine-triphosphatase transport de la membrane cellulaire. Un autre but de l'invention est de fournir la dicétocorioline B. L'invention a encore pour but de fournir une composition thé-25 rapeutique contenant,'à titre de principe actif, de la dicétocorioline B. D'autres buts et caractéristiques de l'invention apparaîtront au cours de la description qui va suivre, en se référant au dessin annexé sur lequel : 30 - la Fig. 1 représente le spectre d'absorption infra-rouge de la corioline B dans une pastille de bromure de potassium; et - la Fig. 2 représente le spectre d'absorption infra-rouge de la dicétocorioline B dans une pastille de bromure de potassium. La corioline B préparée suivant l'invention ne présente pas 35 d'activité physiologique, mais la dicétocorioline B préparée par oxydation de cette corioline B est une substance qui, même utilisée en petite quantité, a une action inhibitrice sur les bactéries gram-positives, la leucémie L-1210 et la tumeur ascitique d'Ehrlich et inhibe la croissance des cellules du sarcome de Yoshida. kO La corioline B préparée suivant le présent procédé possède les â 7't 04389 2. 2081509 pi-opriétés indiquées ci-dessov.s. La corioline B est obtenue sous forme d'écaillés et fond à 215-2l6°C» Elle est soluble dans le méthanol, l'éther, l'acétate d'éthyle, le chloroforme, le benzène et l'acétone, mais elle est 5 peu soluble ou insoluble dans le tétrachlorure de carbone, le n- hexane et l'eau. La corioline B ne présente d'autre absorption dans l'ultra-violet qu'une absorption terminale. Le spectre d'absorption infra-rouge de la corioline B pris sur une pastille de bromure de potassium est tel que représente à la Fig. 1, et ses nombres d'onde 10 d'absorption principale (cm sont 3^50, 33^0, 2920, 1720, 1470, 1405, 1390, 1375, 1350, 1320, 1290, 1270, 1250, 1225, 1175, nio, 1105, 1090, 1070, 1050, 1005, 990, 970, 950, 9k0, 895, 870, 845, 815» 775» 755s 730 et 680 cm ^. La corioline B a une masso moléculaire de 408 mesurée par spectrométrio de masse, et sa composition 15 élémentaire est la suivante : C : 67,36 fo et H : 8,88 elle ne contient pas d'azote. A partir de ces résultats d'analyse élémentaire et de la masse moléculaire mesurée par spoctrographio de masse, on aboutit à la formule (masso moléculaire ; 408 ) . A partir des études chimiques et de l'analyse des résultats de 20 la spectroscopie, on a trouvé que la corioline B possède la formule on elle est donc un ester de l'acide caprylique d'un sesquiterpène. La corioline B est produite en même temps que la corioline (demande japonaise N° 27*611/69)» dont l'invention résulte des études systématiques de la Demanderesse sur les antibiotiques produits 25 par des basidiomycètes, en utilisant le. même microorganisme que dans le cas de cette corioline. Des microorganismes capables de produire de la corioline B sont Coriolus consors (Berk.) Imazeki Xrpex consors (Berk.), qui sont conservés à l'Ecole d'Agriculture de l'Université d'Hokkaido 30 sous le N° d'entrée AHU 4901 et à l'Institut de la Fermentation, à Osaka, sous le N° d'entrée XF0 5309' La souche a été déposée à l'ATCC (American Type Culture Collection) sous le N° d'entrée ATCC 20305. La description de Cariolus Consors (Berk.) Xmazeki se trouve dans le Bulletin of Tokyo Science Muséum 6:80 (194-3) avec la réfé- BAD ORIGINAL 71 04389 3. 2081509 rence à la description originale par Berk. dans le Journal of Linnen Society 16 :51 (1878). On inocule dans un milieu approprié et on cultive en aérobie des mycelia d'un microorganisme produisant de la corioline B, ce 5 qui fournit un bouillon de culture contenant de la corioline B. Dans ce cas, on peut adopter un procédé de culture sur solide, mais, pour la production de masse, on préfère utiliser un procédé de culture sur liquide. La température de culture peut être une température à laquelle on peut faire croître le mioroorganisme produisant 10 la corioline B, et elle est d'ordinaire de 15 à 30°C, de préférence de 25 à 27°C. Le milieu pour la production de la corioline B contient des sources de carbone, des sources d'azote, des sels minéraux, des produits promoteurs de la croissance, etc. Des sources connues de carbone et d'azote, qui sont ordinairement utilisées 15 pour la culture des microorganismes peuvent être utilisées pour la culture du microorganisme produisant la corioline B. Comme sources de carbone, on peut utiliser des hydrates de carbone, des huiles et des graisses du commerce comme, par exemple, du glucose, de la glycérine, de l'amidon, de la dextrine, du maltose, du lactose, du 20 saccharose, des huiles, des graisses et de la mélasse. Ils peuvent être utilisés sous forme pure ou sous forme brute. Comme sources d'azote, on peut utiliser de la poudre de soja, de l'extrait de viande, de la peptone, de la levure de bière sèche, de l'extrait de levure, de la liqueur de macération de maïs, de la caséine, de la 25 poudre de graine de coton, de la farine de poisson, du nitrate d'ammonium et de l'urée. Comme sels minéraux, on peut utiliser du chlorure de sodium, du chlorure de potassium, du sulfate de magnésium, du carbonate et du phosphate de calcium, et de petites quantités de métaux lourds comme le cuivre, le manganèse, le fer et le 30 zinc. Comme il ressort de sa structure, la corioline B est biosyn-thétisée à partir de l'acide mévalonique, lequel est biosynthétisé à partir de l'acide acétique. Comme il est bien connu dans les études de biosynthèse de produits obtenus par l'intermédiaire de l'a-35 cide mévalonique en général, l'addition d'acide acétique ou mévalonique, spécialement par fractions, augmente le rendement en corioline B. L'addition d'un acide gras supérieur ou d'une graisse augmente aussi le rendement en corioline B. Un milieu contenant, par exemple, 5 $ de glucoèe, 0,2 71 04389 ^ 2081509 potassique, 0,1 de sulfate de magnésium, et 1,6 'fa de carbonate de calcium et qui a été ajusté a'pH 6,2, convient pour la production de corioline B. Dans une liqueur de culture, la corioline est présente surtout 5 dans la portion liquide, tandis que la corioline B est présente surtout dans la portion mycélium. La portion mycélium du bouillon de culture contenant la corioline B est séparée par un procédé connu tel que filtration ou séparation centrifuge, et le mycélium obtenu est extrait par un solvant organique, tel que le méthanol, le 10 butanol, l'acétate de butyle ou l'acétone, de sorte que la corioline B est présente dans le solvant organique. La couche de solvant organique contenant la corioline B extraite est séparée de la portion mycélium, puis le solvant est éliminé, ce qui fournit la corioline brute. Si nécessaire, on utilise un procédé de répartition à 15 contre-courant ou un procédé chromatographique pour éliminer les imxmrotés. La poudre obtenue contenant la corioline B purifiéo ost dissouto dans une potite quantité d'un solvant organique capable do dissoudre la corioline B, tel que le méthanol, l'éthor ou l'acétate d'éthyle, puis on ajoute un solvant dissolvant difficilement la 20 corioline B tel que le n-hexane, l'eau ou le tétrachlorure de carbone, à la solution obtenue, grâce à quoi la corioline cristallise en aiguilles ou en écailles. La corioline B ne présente ni activité anti-bactérienne ni activité anti-tumorale. On obtient la dicétocorioline B en oxydant la corioline B par 25 un procédé connu pour oxyder les groupes hydroxyle secondaires en cétones. Comme agents oxydants utilisables dans le cas ci-dessus, on peut citer l'anhydride chromique dans l'acide acétique et le diméthyl sulfoxyde-dicyclohexyl carbodiimide. La dicétocorioline B est obtenue, par exemple, de la façon suivante : 30 On dissout des cristaux de corioline B dans l'acide acétique, et la solution obtenue est additionnée d'acide chromique et oxydée à 20-30°C pendant seize à trente heures. On ajoute de l'eau au système réactionnel, et la dicétocorioline obtenue est extraite par l'acétate d'éthyle. La couche d'acétate d'éthyle est lavée avec une 35 solution d'hydroxyde de sodium 01,Npuis à l'eau. La couche d'acétate d'éthyle lavée est déshydratée par du sulfate de sodium anhydre, puis concentrée sous pression réduite pour obtenir une poudre de dicétocorioline B brute. La dicétocorioline B brute est dissoute dans une petite quantité d'éther, puis recristallisée dans le n-kO hexane, ce qui donne la dicétocorioline B sous la forme d'aiguilles 71 04389 5. 2081509 incolores, fondant à 147-148°C. La dicétocorioline B est soluble dans le méthanol, l'éthor, l'acétato d'éthyle, l'acétone, le chloroforme et le benzène, mais elle est difficilement soluble ou insoluble dans le tétrachlorure 5 de carbone, le n-hexane et l'eau. La dicétocorioline B ne présente aucune absorption ultra-violette autre que l'absorption terminale. Le spectre d'absorption infra-rouge de la dicétocorioline B déterminé sur des pastilles de bromure de potassium est celui représenté à la Fig. 2, et les nombres d'onde d'absorption principale (cm- ) 10 sont 29^0, 2915, 2840, 1760, 1720, 1465, 1390, 1370, 1355, 1300, 1230, 1220, 1190, 1165, 1140, 1100, 1010, 930, 905, 870, 830, 770, 740 et 720. La dicétocorioline B a une masse moléculairo, mesurée par spectrométrie de masso, de 404, et son analyse élémentaire donne C : 69,02 'je et II : 8,08 *;o; ollo ne contient pas d'aaoto. Compto 15 tenu de cos résultats d'.analyse élémentaire et do la masse moléculairo mosuroo par spectrométrie de masse, on aboutit à la formulo moléculairo C^II^Og (masse moléculairo : 404). Des études chimiquos et l'analyso des spectres ont conduit pour la dicétocorioline B à la formule î âY\ 20 Les activités anti-microbiennes de la dicétocorioline B mesu rées par la méthode de dilution dans l'agar sont les suivantes : 71 04389 2081509 Concentration, inhibitrice minimale Microorganisme d'essai : Staphylococcus aureus 209-P (meg/ml) Bacillus anthracis Bacillus subtili s NRRL 558 Escherichia coli NIHJ Micrococcus fiavus Sarcina lutea 1001 tt Terajima Smith 12,5 25,0 12,5 12,5 12,5 12,5 25,0 50,0 Salmonella typhy Shigella flexneri 1 a (Ew 8) Proteis vulgaris 0X 19 Pseudomonas aeruginosa A3 Klebsiella pneumoniae PCX 602 >100,0 ;> 100,0 -> 100,0 ✓ * 100,0 100,0 Les activités de la dicétocorioline B sur la tumeur ascitique d'Ehrlich de la souris et sur la leucémie L-1210 de la souris sont indiquées ci-dessous. Des tests thérapeutiques sur des tumeurs ascitiques d'Ehrlich 5 ont été effectués pendant dix jours, en utilisant de la dicétocorioline B à des doses de 6,25 à 50 meg/souris/jour. Le résultat fut que toutes les souris témoin moururent dans les vingt-six jours après l'inoculation de cellules tumorales, tandis que 50 25 25 Jo, et 25 fo des souris qui avaient reçu une injection intra-péri-10 tonéale de dicétocorioline B à des doses de 50 meg, 25 meg, 12,5 meg et 6,25 meg respectivement, eurent leur vie prolongée de plus de cinquante jours, et que l'on n'observa d'accumulation d'ascites sur aucune d'elles. De plus, lors de tests thérapeutiques sur la leucémie L-1210 de la souris, des souris auxquelles on avait admi-15 nistré de la dicétocorioline B à des doses de 200 à 125 meg dans les mêmes conditions que ci-dessus, présentèrent un indice de survie (nombre de jours de survie) de 178 à 157 contre 100 pour les souris témoin, et leur vie fut prolongée pratiquement au même degré que celle de souris qui avaient reçu 500 meg de cyclophosphamide 20 dans les mêmes conditions que ci-dessus. Ainsi, la dicétocorioline B présente des activités antitumorales sur les tumeurs de la souris. De plus, dans la culture de tissu de cellules de sarcome de Yoshida, on a pu inhiber 4-1,5 de leur propagation en utilisant la dicétocorioline B à la dose de 0,63 mcg/ml. 71 04389 7. •2081509 La dicétocorioline B a une faible toxicité; c'est ainsi que dans le cas où elle est administrée à la souris par voie intra-péritonéale, la DLj-q est de 37,5 mg/kg, et dans le cas où. elle est continuellement administrée à des souris pendant dix jours, 50 $ 5 des souris peuvent survivre pendant plus d'un mois même lorsque la dose totale atteint 75 mg/kg. Comme sesquiterpènes présentant des activités physiologiques parmi ceux produits par les basidiomycètes, figurent la corioline et l'illudine S et M, et comme substance qui leur est semblable 10 par la structure, on peut citer l'acide hirsutique C. Ceux-ci, cependant, diffèrent par leurs propriétés physico-chimiques, leur formule moléculaire et leur formule structurale de la dicétocorioline B et par suite s'en distinguent. Les exemples non limitatifs suivants sont donnés à titre d'il-15 lustration de l'invention. EXEMPLE 1. On plonge dans de l'eau de la sciure de bois (sciure de long) de Magnolia hypoleuca, on la fait bouillir, puis on chasse l'eau et on chauffe jusqu'à siccité. Dans un flacon à agitation de 100 ml, 20 on introduit 3 g de la sciure ci-dessus et 15 ml d'une liqueur de culture contenant 2 ^ de glucose et 0,5 cb de levure de bière sèche ("Ebios" fabriquée par Ebios Pharmaceutical Co.). Le flacon est bouché avec du coton, et le milieu de culture est stérilisé à 120°C pendant vingt minutes. Dans ce milieu de culture, on inocule un 25 microorganisme producteur de corioline B, qui a été cultivé en culture inclinée, puis on soumet le microorganisme à une culture sta— tionnaire à 2J°C pendant dix jours. On ajoute au flacon à agitation 50 ml de la liqueur de culture mentionnée ci-dessus, qui a été suffisamment agitée pour préparer une source d'inoculation; ensuite on 30 inocule la source d'inoculation dans un milieu de production de corioline contenant 5 i° de glucose, 0,2 $ de peptone, 0,2 fo de phosphate monopotassique, 0,1 'p de sulfate de magnésium, 1,6 fa de carbonate de calcium et 0,5 $ d'Ebios préalablement stérilisé à 120°C pendant dix minutes. La quantité de source d'inoculation est 35 de 10 ml pour 125 ml de milieu de production. La culture est effectuée de telle manière que l'on introduit séparément, dans chaque flacon à agitation de 500 ml, 125 ml du milieu de production et que la source d'inoculation est inoculée dans ce milieu, puis soumise à une culture secouée à 27°C pendant sept jours. Ensuite, on filtre 40 3 litres de la liqueur de culture ainsi cultivée, ce gui fournit 71 Û4389 8. 2081509 100 g d'une substancè solide contenant-le mycélium. Cette substance est additionnée de" 300 ml d'acétone et soumise à une extraction avec agitation, par laquelle la corioline B est extraite du* mycélium. Le mycélium est filtré, et le filtrat est concentré sous pres-5 sion réduite pour éliminer l'acétone. Ensuite, le résidu est extrait deux fois par 100 ml d'acétate d'éthyle puis séché sous pression réduite, ce qui donne 4 g d'une substance brune. Cette substance brute est dissoute dans une petite quantité d'acétone, et la solution obtenue est additionnée de n-hexane, jusqu'à ce que la so-10 lution devienne légèrement trouble, puis on la laisse refroidir, ce qui entraîne le dépôt de cristaux de corioline B pure. EXEMPLE 2. On dissout 1,5 g des cristaux de corioline obtenus dans l'exemple 1 dans 65 ml d'acide acétique. On ajoute à la solution obtenue 15 650 mg d'anhydride chromique, et on laisse le mélange réagir à 25°C pendant vingt-quatre heures. Après la réaction, on ajoute au mélange réactionnel 600 ml d'eau, et on l'extrait ensuite trois fois par 300 ml d'acétate d'éthyle. La couche d'acétate d'éthyle est lavée avec 300 ml d'hydroxyde de sodium 0,1 K puis avec 300 ml d'eau; 20 elle est déshydratée sur sulfate de sodium et débarrassée de l'acétate d'éthyle par distillation sous pression réduite, ce qui fournit une poudre blanche. Cette poudre est dissoute dans une petite quantité d'éther, et la solution obtenue est additionnée de n-hexane, jusqu'à ce qu'elle devienne légèrement trouble, puis on la 25 laisse refroidir, ce qui fournit 700 mg de dicétocorioline B sous la forme de cristaux blancs en aiguilles. EXEMPLE 3. 3 litres d'une source d'inoculation préparée de la même manière que dans l'exemple 1 sont inoculés dans 40 1 d'un milieu contenant 30 5 $ de glucose, 0,2 % de peptone, 0,2 % de phosphate monopotassique, 0,1 $ de sulfate de magnésium, 1 % de carbonate de calcium et 0,01$ d'huile de silicone préalablement stérilisée à 120°C pendant dix minutes, dans un récipient de culture de 70 1 en acier inoxydable, puis on effectue la culture à 27°C pendant dix jours, tandis que 35 l'on introduit 20 litres d'air par minute et que l'on agite à 200 tours/minute. Ensuite, on filtre la liqueur cultivée pour obtenir 1,2 kg de matières solides contenant le mycélium. Cette masse de mycélium est soumise au même traitement d'extraction et de purification de la corioline B que dans l'exemple 1, ce qui donne 51 g de 71 04389 9- 2081509 substance brute, à partir desquels on obtient ensuite 18 g de corioline B cristalline. La corioline B ainsi obtenue est soumise au même traitement d'oxydation que dans l'exemple 2, ce qui donne 7,9 g de dicétocorioline B. 71 04389 10. 2081509 - REVENDICATIONS. - 1 - Un procédé d© préparation de corioline B, caractérise on ce qu'on cultive on aérobies dans un milieu nutritif, un microorga-nisme produisant de la corioline B, appartenant au genre basidio- 5 mycète, pour produire de la corioline B, et on sépare la corioline B du milieu* 2 - Un procédé suivant la revendication 1, caractérisé en ce que l'on effectue la culture à 15-30°C. 3 - Un procédé suivant la revendication 1, caractérisé en ce 10 qu'on effectue la séparation de la corioline B en utilisant un solvant organique où la corioline se dissout. h - Un procédé suivant la revendication 1, caractérisé en ce que le microorganisme producteux-.de corioline B est Coriolus consors. 15 5 - Un. procédé suivant la revendication 1, caractérisé on ce que 1e fflioroorganisme producteur de corioline B est Coriolu s consors ATCC 20305 » 6 - Un procédé do préparation de dicétocorioline B, caractérisé en ce qu'on cultive en aérobie dans un milieu nutritif un micro-20 organisme producteur fie corioline B appartenant au genre basidio- mycète pour produire de la corioline B, on sépare la corioline B du bouillon de culture, puis on oxyde la corioline B séparée au moyen d'un agent oxydant capable d'oxyder les groupes hydroxyle secondaires en cétones. 25 7 r Un procédé suivant la revendication 6, caractérisé en ce que l'agent oxydant est l'anhydride chromique. 8 - La dicétocorioline B de formule : 9 - La corioline B de formule : â j 71 04389 2081509 OII 10 - Une composition thérapeutique présentant notamment une activité anti-bactérienne et anti-tuinorale caractérisée en ce qu'elle contient, comme principe actif, de la dicétocorioline B suivant la revendication 8 ou telle qu'obtenue par un procédé suivant la revendication 6 ou 7•