FR 2102097 A1 19720407 FR 7128273 A 19710802 71 28273 i 2102097 Cette invention concerne un produit de fermentation'nouveau et utile appelé Antibiotique CP-21.635; elle concerne également sa production par fermentation, les méthodes de récupération et cfe concentration à partir de solutions brutes, telles que bouillons 5 de fermentation, et les procédés de purification. Le cadre de l'invention comprend ces produits sous des formes diluées, sous des formes concentrées brutes, et également leur forme cristalline pure. Tous ces nouveaux produits sont utiles pour combattre les micro-organismes, en particulier divers micro-organismes 10 Gram-positifs. En outre, ils sont utiles comme désinfectants contre ces micro-organismes et ils sont utiles pour aider à la purification de cultures mixtes destinées au diagnostic médicale et à la recherche biologique. Il se forme l'antibiotique CP-21.635 lorsqu'on cultive, 15 dans des conditions contrôlées, la souche d'une espèce de microorganisme connu sous le nom de Streptomyces olivaceus sensu Hûtter, que l'on a identifiée en en repiquant et en en testant une culture sur les milieux normalement utilisés pour 1'identification de ces micro-organismes. Une culture du micro-organisme 20 a été remise à l'American Type Culture Collection, Rockville, Maryland, et a été ajoutée à sa collection de micro-organismes sous la désignation ATCC 21542. Les caractéristiques culturaies de la souche,Streptomyces olivaceus sensu Htitter sont exposées dans le Tableau suivant. 25 Les couleurs du. mycélium aérien sont indiquées selon les guides de couleur appelés Color Wheel de Tresner et Backus et Color Guide de Ridgeway. r~ copy Milieu Aspect de la culture Couleur du mycélium aérien Eau gëlosée Plaques de gélose Synthétique Pauvre, mince, plat Modéré, plat, étalé Blanc Gris (5 fe) ou gris souris pâle de Ridgeway Plaques de -gélose aspa-ragirie glu-coaée Plaques de gélose nutritive Bon, surélevé Bon; plat Plaques de Bon, plat gélose glu- cçjsàe^ s 1 ' '■ 1 Plaque de Bon, un peu gélose d'Emer- surélevé son • ?0 L"; W '' Plaqués"de gélose à l'extrait de levure de Pridham plat,, étalé Gris(voisin de 5 fe) • ou gris souris pâle de Ridgeway Absente. - Faible, blanche Rouge,{5 de) ou gris bôb-ris pâle de Ridgeway* v. Gris~ (3 fe) ou gris.souris pâle de Ridgeway Couleur du Pigment . mycélium soluble , , _v égétatif Remarques ■ Blanc Absent tO CO Incolore Absent Chaînettes de spores de —I type RPt le plus sour* oj vent de plus de 50 spores; provenant directement de la gélose ou de ramifications plus proches de la gélose Gris- Jaune brunâtre pâle Jaune Absent très pâle Brun Brun clair Brun Brun pâle to K> ■■ „ O Brun foncé Brun Chaînettes de spores jsj comme celles décrites O sur gélose synthétique, *0 Spores lisses au micro-' scope électronique Aspect de la Couleur du culture mycélium Milieu" aérien Plaques de milieu gélo-sé Purée de tomates Farine d'avoine Plaques de gélose à la tyrosine Plaques de gélose au malate de calcium Plaques de gélose à la caséine Plaques de gélose à 11 amidon Plaques de gélose gélatine Morceau de pomme de terre Excellent, plat, étalé Bon, plat, mince Modéré, mince Bon, plat Bon, plat Bon, plat Modéré Gris (3 fe) ou gris souris pâle de Ridgeway Faible, blanche Absente Absente Gris très pâle Faible, blanche Absente Couleur du mycélium végétatif pigment soluble Remarques K> CO hO UJ Brun foncé Orangé foncé Brun Brun Spores cylindriques, extrémités carrées, le plus souvent de 1,1 x 0,6 ja/mesurant fe 0,6 x 0,6(U à 1,6 x 0,7 fi Digestion des cristaux de tyrosine Pourpre- rougeâtre clair Absent Pas de digestion Couleur crème Brun Digestion totale co Blanche Saumon brunâtre Brun pâle Absent Brun jaune pâle Gris Zone d'hydrolyse de 6 mm en 3 jours; 10-15 mm en 14 jours Zone de liquéfraction de 4 mm en 3 jours; 12 mm en 14 jours ro o NJ O 71 28273 4 2102097 Production de H2S (8 jours, test de la bandelette imprégnée d'acétate de plomb) : production importante à partir de chlorhydrate de cystéine, production à partir de peptone, de protéose-peptone, de tryptone, de Na2S203, de gélose 5 inclinée fer-peptone, de gélose fer-peptone plus extrait de levure (l'absence de pigment soluble dans les deux derniers cas indique l'absence de production de mélanine) Réduction des nitrates : pas de réduction des nitrates en nitrites au bout de 14 jours que ce soit dans un bouillon nitrate-10 dextrose ou dans un bouillon organique aux nitrates. Bouillon tryptone extrait de levure : pas de mélamine en trois jours. Lait écrémé : après 7 jours début de coagulation et de peptonisa-tion, pigment soluble rose très pâle; en 14 jours coagula-15 tion bonne, peptonisation effectuée au un tiers , pigment soluble saumon pâle et pH passé de 6,4 à 6,7. Croissance à 50° C: pas de développement. Aérobiose : développement seulement en surface du tube de gélose ensemencé. 20 Utilisation du carbone : utilisation bonne avec arabinose, galactose, glucose, glycérol, fructose, maltose, mannose, amidon, saccharose, tréhalose, xylose. utilisation pas aussi bonne mais nette avec raffinose, succinate de sodium. Utilisation douteuse avec inositol, lactose, rhamnose. Pas d'utilisa-25 tion avec cellulose, dulcitol, mannitol, sorbitol, acétate de sodium. Dans le cadre de cette invention entrent des procédés de culture du micro-organisme S. olivaceus ATCC 21542. La culture de ce micro-organisme a lieu de préférence dans un milieu nutritif 30 aqueux à une température d'environ 24-30° C, et dans des conditions submergées, aérobies, avec agitation. Les milieux nutritifs utilisés dans ce but comprennent, un glucide, tel que sueres,amidon glycérol, mélasses; une source d'azote organique telle que caséine, farine de soja, farine de viande, gluten de blé, farine de graines 35 de coton, matière dè digestion enzymatique de la caséine, une source de substances de croissance, telle que solubles de distilleries, extrait de.levure,ainsi que des sels minéraux, tel s que chlorure de sodium, chlorure de potassium, phosphate de potassium, sulfate de magnésium et des minéraux-traces tels que zinc et fer,peuvent égalaneit 40 être utilisés avantageusement. Si l'on se heurte à un moussage 71 28.273 5 2102097 excessif pendant la fermentation, on peut ajouter au milieu de fermentation des agents anti-moussants tels que les huiles végétales. Le pH a tendance à rester plutôt constant au cours de la fermentation, mais si des variations interviennent, on peut également 5 ajouter au milieu un agent tampon comme le carbonate de calcium. On peut obtenir un inoculum pour la préparation de 1'antibiotique CP-21.635 en utilisant des cultures du micro-organisme précité faites sur tubes de gélose inclinés sur des milieux tels que gélose d'Emerson ou boeuf lactosé. La culture peut être 10 utilisée pour ensemencer soit des flacons pour agitation soit des cuves d'inoculum, ou sinon, les cuves d'inoculum peuvent être ensemencées à partir des flacons pour agitation. Le développement du micro-organisme atteint habituellement son maximum au bout d'environ deux ou trois jours, cependant, des variations dans 15 l'appareillage utilisé, l'aération, la vitesse d'agitation, etc..., peuvent avoir une influence sur la vitesse à laquelle on atteint l'activité maximale. En général, on poursuit la fermentation jusqu'à ce qu'une activité antimicrobienne importante soit communiquée au milieu, une durée d'environ 24 heures à environ 20 4 jours étant suffisante dans la plupart des cas. L'aération du milieu dans les cuves de culture submergée est de préférence maintenue à environ 1/2 - 2 volumes d'air librë par volume de bouillon par minute. L'agitation est effectuée à l'aide d'agitateurs généralement familiers à l'homme de l'industrie de la fermentation. 25 II est évidemment nécessaire de maintenir des conditions d'asepsie tout au long du transfert du micro-organisme et tout au long de son développement. - On suit commodément le développement de l'opération de production d'antibiotique pendant la fermentation en testant par voie 30 biologique le bouillon à l'aide d'une souche sensible de Staphvlococcus aureus. On utilise une technique d'essai sur plaque classique dans laquelle la zone d'inhibition entourant un disque (fe papier filtre saturé de bouillon est employas comme mesure du pouvoir antibiotique. Lorsque le bouillon de fêrmentation a atteint 35 un pouvoir antibiotique convenable, on filtre le mycélium, ' habituellement sans ajuster le pH. L'emploi d'un adjuvant de type à diatomées tel que Super-cel facilite grandement la filtration. On peut utiliser divers types d'appareillages, par exemple filtre-presses, centrifugeuses, etc... .On peut utiliser le bouillon 40 filtré tel quel ou bien le sécher. Cependant, on préféré purifier 71 28273 6 2102097 encore le produit. La chromatographie en couche.mince et la chromatographie sur papier sont des instruments utiles pour analyser la composition des matières brutes et purifiées qui contiennent l'antibiotique 5 CP-21.635. Le Tableau I illustre quelques uns des divers systèmes chromatographiques et les valeurs de respectives de l'antibiotique CP-21.635.La recherche biautographique de l'activité antibiotique au moyen de plaques de gélose ensemencées avec S. aureus est une méthode utile pour déterminer la présence et 10 l'homogénéité de l'antibiotique CP-21.635. D'autres réactifs intéressants pour détecter 1'antibiotique sur couches minces conprennent l'acide sulfurique et le réactif de1 Van Urk (0,125 g de p-diméthylaminobenzaldéhyde et 0,1 ml de chlorure ferrique à 5% dans 100 ml d'acide sulfurique à 65%) . Les rayons ultra-15 violets constituent encore un.autre moyen de déterminer l'homogénéité de l'antibiotique CP-21.635 sur couchesminces et sur chromatogrammes sur papier et constituent également une méthode commode pour suivre la purification de l'antibiotique sur colonnes de chromatographie. 20 TABLEAU I Support chromatocrraphique Système solvant#- Valeur du R^ 25 Gel de silice A D C £ B 0,15 0,32 0,37 0,62 0,70 P 0,29 0,81 0,88 0,86 0,36 G 30 Papier H X J * 71 28273 ? 2102097 # A = acétate d'éthyle; B = chloroforme : acétone (1:1); C = acétate d'éthyle : méthanol (1:1); D = chloroforme : méthanol (9:1); E = butanol; F = solution aqueuse de NH^Cl à 5%; G = méthanol : solution aqueuse de NaCl à 1,5% (4:1), 5 papier tamponné par Na2SO^ 0,95M; H = méthylisobutyl cétone saturés d'eau : pipéridine (100:1); I = méthylisobutyl cétone saturé d'eau : acide acétique glacial (100:1); J = benzène saturé par du méthanol à 25% dans l'eau. On récupère l'antibiotique du bouillon de fermentation par 10 un certain nombre de procédés différents comprenant l'extraction par solvant et la chromatographie sur colonne ou leur association. Ces divers solvants organiques sont utiles pour extraire l'Antibiotique CP-21.635 du bouillon filtré. Le chloroforme est un solvant particulièrement efficace. On effectue de préférence 15 l'extraction par solvant avec un volume de solvant approximativement égal au volume de bouillon dont on veut sortir l'antibiotique. Il est souvent commode d'utiliser deux extractions, chacune étant effectuée avec un volume de solvant environ égal à la moitié du volume du bouillon. Divers appareillages tels que entonnoirs 20 de décantation, cuves agitées, et dispositifs d'extraction mécaniques tels que séparateurs centrifuges sont utiles au cours des extractions. La méthode préférée pour récupérer l'Antibiotique CP-21.635 est la suivante. On extrait le bouillon filtré, sans ajuster le 25 pH, deux fois par 1/3 à 1/2 volume de chloroforme, on réunit les extraits chloiroformiques, et on chasse le solvant sous vide à une température de bain d'environ 35-37° C, on ajoute du n-propanol pour éliminer l'eau résiduelle et on concentre la solution jusqu'à obtention d'une masse d'aspect goudronneux. On reprend le concentré 30 goudronneux dans le méthanol et on l'extrait plusieurs fois avec de l'heptane que l'on jette. On concentre la phase méthanolique sous vide jusqu'à obtention d'une masse goudronneuse, qui par trituration avec le diéthyl éther, donne un solide. On lave plusieurs fois le solide insoluble dans lléther avec de 1'éther 35 (jusqu1à ce qu'il reste peu ou pas de coloration) et on le sèche à l'air. On chromatographie la matière contenant l'antibiotique brut sur Sephadex LH-20 (Pharmacia Fine Chemicals Inc., Piscataway, New Market, N.J.) en utilisant le méthanol comme solvant de développement. On recherche l'activité antibiotique des fractions 40 obtenues sur la colonne en utilisant la méthode des disques sur 71 28273 8 2102097 plaques de gélose ensemencées avec S. aureus. On réunit les fractions actives, on les évapore sous pression réduite et on les purifie encore par chromatographie sur gel de silice ou sur alumine neutre, en utilisant les systèmes chloroforme-5 méthanol (9:1), . acétate d'éthyle ou acétate d'éthyle-méthanol (9:1) comme système solvant de développement. On peut également purifier les fractions actives provenant de la filtration sur Sephadex par chromatographie sur cellulose eh utilisant de la méthylisobutyl cétone saturée d'eau comme solvant, lorsqu'on 10 évapore les fractions actives sous vide à la température ambiante, l'Antibiotique CP-21.635 se sépare de l'acétate d'éthyle sous forme d'un solide cristallin. L'Antibiotique CP-2Î..635 est principalement actif vis-à-vis de diverses souches de Staphylococcus aureus qui sont résistantes 15 aux autres antibiotiques connus. Le Tableau II illustre le spectre antibiotique vis-à-vis de ces micro-organismes et d'autres micro-organismes. On a réalisé ces tests en ensemençant un bouillon nutritif contenant diverses concentrations de l'antibiotique pur avec l'organisme particulier précisé. La "concentration 20 inhibitrice minimale" (CIM) indiquée dans le Tableau II est la concentration minimale de l'antibiotique (en microgrammes/ millilitre) à laquelle la croissance de l'organisme ne se fait plus. Etant donné que la concentration la plus élevée utilisée dans ce test était 200 ;ug/ml la "concentration inhibitrice 25 minimale" n'est pas établie avec précision dans les cas où la . concentration dépassait apparemment 200 yug/ml. On a effectué l'essai dans les conditions normalisées. L'Antibiotique CP-21.635 protège les souris infectées à titre expérimental' par diverses souches de Staphylococcus aureus. Il est efficace par les deux 30 voies d'administration orale et sous-cutanée et n'est pas toxique aux doses thérapeutiquement efficaces. Le Tableau III illustre l'activité in vivo de l'Antibiotique CP-21.635. 71 28273 9 2102097 TABLEAU II CIM 10 Staphylococcus aureus souches 5 (normale) 12,5 A/R 400 multi-résistante 3,12 A/R 376 " " 25,0 A/R K3 " " 12,5 A/R K4 " " 12,5 HI 14 Pen/rés 25,0 HI 22 Pen/rés 25,0 S 51 T/Oleand/rés 3,12 96 " 12,50 15 134 " 12,50 Streptococcus pyogenes C203 >200 8668 >200 " R109 résist. >200 20 faecalis A121 >200 Diplococcus pneumoniae I >200 Kycobacterium sp. 607 > 200 Escherichia coli 266 , >200 25 Pseudomonas aeruginose 173 >200 " pyocyanea 10490 >200 Aerobacter aerocrenes 2 >200 Klebsiella pneumoniae 132 > 200 Shiqella sonnei SH4 >200 30 Salmonella choleraesuis 242 > 200 Pasteurella multocida PM >200 Malleomyces mallei 10399 >200 Vibrio comma > 200 71 28273 10 2102097 10 organisme infectant S. aureus 400 S. aureus 5 TABLEAU XII Dose mer/kcr 2860 1430 715 352 176 Pourcentage de protection 522 261 Orale 100 60 20 60 60 Sous-cutanée ÎOO 80 80 80 60 Les exemples suivants sont donnés à titre d'illustration et ne doivent pas être considérés comme limitant cette invention; de 15 nombreuses variantes de ceux-ci sont possibles tout en restant dans le cadre et l'esprit de l'invention. EXEMPLE I On prépare un milieu aqueux stérile ayant la composition suivante : _ 20 ingrédients Farine de soja Cérélose Amidon de mais Solubles de distillerie 25 Chlorure de sodium Carbonate de calcium Grammes/litre 10,0 10,0 10,0 5,0 5,0 1,0 On repique une culture de Streptomyces olivaceus sensu Hiitter ATCC 21542 faite sur gélose inclinée dans 100 ml de ce milieu contenu dans un flacon d'Erlenmyer de 300 ml et on secoue 69-72 30 heures jusqu'à obtention d'un bon développement. On ensemence les fermenteurs contenant le milieu stérile décrit précédemment avec 5% v/v de 1*inoculum développé. On maintient la température à 27-28° C et on agite le bouillon à 1700 tpm et on l'aère • à raison de 1 35 volume d'air par volume de bouillon par minute. Après 69-72 heures on filtre le bouillon en s*aidant de Super-Cel, et on l'extrait deux fois avec an demi volume de chloroforme à chaque fois. On réunit les extraits chloroformiques, on chasse le solvant sous vide et an reprend la nasse goudronneuse par le méthanol. On 40 extrait la solution méthanolique six fois par l'heptane. on 71 28273 xi 2102097 concentre la phase méthanolique sous vide jusqu'à obtention d'un goudron. Lorsqu'on le triture avec du diéthyl éther ce matériau donne un solide qu'on lave plusieurs fois à 1*éther et qu'on sèche à l'air. 5 On purifie l'antibiotique brut par chromatographie par filtration sur gel à l'aide de Sephadex LH-20 (Pharmacia Fine Chemicals Inc., Piscataway, New Market, N.J.) en utilisant le néthanol comme solvant de développement. On réunit les fractions actives, on les concentre alors sous pression réduite et on les 10 chromatographie sur alumine neutre à l'aide d'acétate d'éthyle comme solvant de développement. Lorsqu'on concentre les fractions actives à la température ambiante, l'Antibiotique CP-21.635 se sépare de l'acétate d'éthyle sous forme d'un solide cristallin. L'Antibiotique CP-21.635 est un solide cristallin neutre .15qui fond entre 244 et 254° C en se décomposant, et son analyse donne les proportions moyennes suivantes s Carbone 55,17 Hydrogène 5,84 Azote 15,99 20 Soufre 4,02 Oxygène (par différence) ...... 18,98 En spectrométrie de masse, l'Antibiotique CP-21.635 présente un pic d'ion moléculaire à 779 unités de masse. Ces données conduisent, par lé calcul, à la formule moléculaire c^gH^^NgSOg. 25 L'Antibiotique CP-21.635 possède une activité optique, — 28 un pouvoir rotatoir de a_/ = 88,2° ( C, 1,17% dans le méthanol). Ses maxima d'absorption ultraviolette en solution méthanolique ont lieu à 222, 283 et 291 nyu avec des coefficients d'extinction de 49.000, 5.100 et 4.300 respectivement. 30 Le spectre infrarouge de l'Antibiotique CP-21.635 est repré- ssnté sur la Figure jointe, dans laquelle l'ordonnée donne le pourcentage de transmission et l'abcisse donne la longueur d'onde (p). Une solution chloroformique présente une absorption caractéristique dans la région infrarouge aux longueurs d'ondes suivantes 35 en microns i 2,95, 3,03, 3,43, 5,78, 5,87, 6,00, 6,07, 6,17, 6,50, 6,55, 6,63, 6,70, 6,80, 7,10, 7,35, 7,50, 7,70, 7,80, 8,85, 9,03, 9,15, 9,45, 9,67, 9,95, 10,30, 10,70 et 10,85. L'Antibiotique CP-21.635 donne des réactions positives à la 2,4-dinitrophényl-hydrazine et au réactif de Van Urk mais ne réagit pas avec la 40 ninhydrine. 12 2102097 REVENDICATIONS 1. Procédé de production de la substance antibiotique CP-21.635, qui consiste à cultiver Je micro-organisme Streptomyces olivaceus sensu Htitter dans un milieu nutritif aqueux contenant une source de glucides, une source d'azote 5 organique et de sels minéraux dans des conditions submergées aérobies jusqu'à ce qu'une activité antimicrobienne importante soit transmise audit milieu. 2. Procédé selon.la revendication 1, dans lequel on récupère la substance antibiotique du bouillon de fermentation. 10 3. Composé neutre ayant la formule brute C^gH^gN^SOg qui sous forme cristalline a un point de fusion de 245-254°Ç (avec — 28 décomposition) et un pouvoir rotatoire de a_y ,-gg = + 88,2° à une concentration de 1,17 % dans le méthanol, des maxima d'absorption dans la région ultraviolette du spectre à 222, 283 et 15 291 mp avec des coefficients d'extinction de 49.000, 5.100 et 4.300 respectivement, et ayant la composition pondérale moyenne de 55,17 % dé carbone, 5,84 % d'hydrogène, 15,99 % d'azote, 4,02 % de soufre et 18,98 % d'oxygène (par différence) et qui, dissous dans le chloroforme, présente une absorption caractéris-20 tique dans la région infrarouge aux longueurs d'ondes suivantes exprimées en microns : 2,95; 3,03; 3,43; 5,78; 5,87; 6,00; 6,07; 6,17? 6,50; 6,55; 6,63; 6,70; 6,80; 7,10; 7,35; 7,50; 7,70; 7,80; 8,85; 9,03; 9,15; 9,45; 9,67; 9,95; 10,30; 10,70 et 10,85. 4. Composition à-action thérapeutique, contenant comme 25 ingrédient actif le composé de la revendication 3.