FR 2068400 A1 19710827 FR 6934588 A 19691009 69 34588 1 2068400 la présente invention, à la réalisation de laquelle ont participé MM. BELItET Paul et TRUONG- wi THUON, a pour objet un procédé de préparation de composés in.doliq.ues hydroxylés et leur application en tant que médicaments. 5 L'invention a plus particulièrement pour objet un procédé de préparation de composés indoliques du type yoh.im.bine 10-hydroxylée consistant à effectuer une hydroxylation par voie enzymatique. On connaissait déjà des procédés d'hydroxylation par voie enzymatique de composés indoliques du type yohimbine. Ces procédés uti-10 lisaient surtout des micro-organismes, générateurs d'enzymes hydro-xylants, du genre Cunninghamella ou Streptomyces et ne donnaient, en général, que des rendements très faibles en composés 10 ou 11, hydroxylés /Ë.E. Hartman et coll. Appl. Microbiol. 12,138 (1964Y7• C'est ainsi que la demanderesse a vérifié que l'on n'obtenait 15 qu'un rendement de 5 % dans l'hydroxylation enzymatique de la corynanthine par Streptomyces platensis. Par ailleurs, en effectuant la même réaction sur 1'ajmalicine, la demanderesse a constaté qu'aucune transformation n'était observée. D'une manière inattendue, la Société demanderesse a trouvé que 20 certains micro-organismes étaient capables d'effectuer une hydro- xylation d'une manière sélective en position 10 et avec de bons rendements sur des composés indoliques du type de la yohimbine. le procédé, objet de l'invention, consiste essentiellement à soumettre des composés indoliques du type de la yohimbine à l'action 25 d'enzymes hydroxylants produits par des cultures de micro-organismes sélectionnés parmi le genre ffongronella. Dans un mode d'exécution actuellement préféré, on utilise comme micro-organisme l'espèce Gongronella urceolifera. l'hydroxylation microbiologique est effectuée avantageusement 30 à une température comprise entre 26se et 37SC pendant une période s1étendant sur un à quatre jours. l'hydroxylation sélective en 10 peut être mise en évidence, entre autres, par formation du dérivé 10-méthoxylé, c'est ainsi qu'après méthylation par le diazométhane de la 10-hydroxy 35 corynanthine, on obtient la 10-méthoxy corynanthine identique à l'Excelsinine isolée des écorces d'Aspidosperma excelsum par Benoin et coll. /panad. J. Chem. (1967) 45,7257. l'invention concerne également, à titre de produit industriel 69 34588 2 2068400 nouveau la 10-hydroxy ajmalicine ainsi que ses sels d'acide organique ou minéral.,. L'invention concerne aussi l'application comme médicaments des composés indoliques du type de la yohimbine hydroxylée en 10 ainsi 5 que de leurs sels avec des acides organiques ou minéraux thérapeuti-quement compatibles et plus particulièrement de l'hydroxy-10 corynanthine et de l'hydroxy-10 ajmalicine, Oes composés manifestent des propriétés pharmacologiques utiles associées à une faible toxicité. Ils exercent une action 10 sédative ou dépressive du système nerveux central. Ils possèdent une action hypotensive, bradycardisante et adrénolytique. Ils peuvent de ce fait trouver un emploi en tant que médicament pour le traitement des troubles du rythme cardiaque, de l'atonie intestinale, de l'hypertension artérielle, des aménorrhées 15 douloureuses,de 1'ànaphrodisie et de l'insuffisance de la sécrétion lactée. Ils peuvent être administrés par voie parentérale, buccale ou rectale, sous forme de solutions ou suspensions injectables conditionnées en ampoules ou en flacons multidoses, comprimés nus ou 20 enrobés, de suppositoires, de capsules, de sirops. La posologie utile peut varier largement en fonction de l'âge du patient et de l'indication thérapeutique. Elle s'échelonne entre 2 et 10 mg par prise et 5 et 25 mg par jour, chez l'adulte. 25 Les exemples qui suivent illustrent l'invention sans toutefois lui apporter aucun caractère limitatif. Exemple I : Préparation de l'hydroxy-10 corynanthine et de 1 ' hydroxy-1 0 a.imalicine Gomposition_du milieu de culture : 30 - Nitrate de sodium 3 g - Phosphate dipotassique 1,3 g - Sulfate de magnésium cristallisé 0,5 g - Chlorure de potassium 0,5 g - Sulfate ferreux cristallisé 0,01 g 35 - Extrait de levure 5 g - Dextrine 30 g - Eau q.s.p. 1 000 g Préparation de_lHaydroxy-10 corynanthine et de l'hydroxy-10 69 34588 3 2068400 ajmalicine : Songronella urceolifera (C.B.S. Baarn) est développé pendant trente heures à 28e dans le milieu ci-dessus, puis on ajoute le substrat (corynanthine ou ajmalicine) en solution alcoolique, à 5 raison de 200 mg par litre de milieu. On poursuit l'incubation à 282, jusqu'à rendement optimum déterminé par chromâtographie sur papier de prélèvements périodiques. Le filtrat de la culture alcalinisée à pH = 8 et le mycélium essoré sont extraits séparément par le mélange chloroforme-méthanol 4-1 ; le résidu d'évaporation des extraits 10 réunis est fractionné sur une colonne de florisil. Chromâtographie sur papier_imprégné de_méthanol à 50 : Le développement est obtenu à l'aide du mélange n-butanol-toluène-eau-acide acétique : 50-25-25-1 ; on révèle par le ferri-cyanure ferrique selon MM. PESEZ et J.BARTOS (Ann. pharm. fr. 1965, 15 22,281). Au départ de 3,6 g de corynanthine, on obtient ainsi 2,55 g d'hydroxy-10 corynanthine soit un rendement de 68 i°. Pour l'analyse, le produit est recristallisé en chloroforme-méthanol, le composé 10-hydroxylé fond à 23220. = -1032, 20 (ç = 0,4 i°, éthanol). Analyse : C21H26N2°4 = ^70,42 Calculé : C % 68,09 H" 96 7,07 H 1° 7,56 Trouvé : 68,0 6,8 7,6 De manière analogue, au départ de 1'ajmalicine, on obtient 25 l'hydroxy-10 ajmalicine fondant à 285SC, après cristallisation préalable dans le méthanol, rendement : 21 fo, faJ-Q = -382 (ç = 0,5 i°, méthanol). Analyse : ^21 ^"24^2^4 = ^®>4 Calculé : 0 fo 68,45 W° 6,56 30 Trouvé : 68,1 6,6 Pour autant que l'on sache, ce composé n'est pas décrit dans la littérature. Le chlorhydrate de l'hydroxy-10 ajmalicine cristallise du chloroforme-méthanol, après concentration et addition d'éther. 35 Petits prismes P. vers 280-2902C en tube (déc.). Analyse : C^I^^V HC1 = 404,9 Calculé : 01^ 8,77 Trouvé : 8,9 69 34588 4 2068400 Pour autant que l'on sache, ce composé n'est pas décrit dans la littérature. Exemple II : Etude pharmacologique des composés 5 Détermination de la toxicité_aiguë : Les essais de toxicité aiguë ont été effectués sur des lots de souris, de souche Rockland, pesant 20 g. Le chlorhydrate de 10-hydroxy■ajmalicine et la 10-hydroxy corynanthine ont été administrés par voie intrapéritonéale, à des doses croissantes. 10 Les animaux sont.gardés en observation pendant huit jours. Dans ces conditions expérimentales, la dose létale 50 % (DL^q) est de 150 mg/kg pour le chlorhydrate de 10-hydroxy ajmalicine et de 400 mg/kg pourla 10-hydroxy corynanthine. 1/ flVil QT*hvdrate de 10-hydroxy a.lmalicine 15 1e Potentialisation_du temps de_sommeil La potentialisation du temps de sommeil 'a été déterminée par le test à l'amytal (acide 5-éthyl 5-isoamyl barbiturique). Ce test est pratiqué sur des groupes de souris femelles pesant de 18 à 22 g et maintenues à 25SC pendant toute la durée de l'essai. 20 Le produit étudié est administré par voie intrapéritonéale, à différentes doses, -une heure avant l'injection intraveineuse de 80 mg/kg d'amytal. On note le temps de sommeil qui est le temps pendant lequelïéfLexe de redressement de la souris est négatif ; on exprime le temps de sommeil moyen pour chaque groupe en minutes. 25 Le chlorhydrate de 10-hydroxy ajmalicine a été administré aux doses de 1,2 et 5 mg/kg. Les résultats obtenus sont réunis dans le tableau suivant : Lots Doses Temps de sommeil moyen Témoins 0 46,1 Chlorhydrate de 10-hydroxy ajmalicine 1 mg/kg 2 mg/kg 5 mg/kg 64.1 79.2 74,0 Ces résultats montrent que le produit étudié potentialise 30 nettement le temps de sommeil dès la dose de 1 mg/kg. 22 Test_au pentaméthylènetétrazol : 69 34588 5 2Q68400 On utilise des groupes de 10 souris femelles ; le produit étudié, en suspension dans un liquide dispersif aqueux, a été injecté par voie intrapéritonéale, aux doses de 1, 2 et 5 mg/kg ; le groupe témoin ne reçoit que le dispersif. 5 Une demi-heure après l'injection, on perfuse aux souris une solution de pentaméthylènetétrazol dans le sérum physiologique, à la concentration de 3 mg/cm3, la perfusion par voie intraveineuse est pratiquée à la vitesse de 1 cm3 par minute. Au cours de la perfusion, les progrès de l'intoxication sont 10 caractérisés par les trois critères suivants : 1) Seuil de l'effet convulsivant (myoclonies des oreilles). 2) Crise de convulsions cloniques. 3) Convulsion tonique avec apnée et généralement suivie de mort. Les doses de pentaméthylènetétrazol correspondant à ces effets 15 sont notées. Le tableau suivant résume les résultats obtenus. Produit étudié Doses de pentaméthylènetétrazol en mg/kg Doses administrées Mouvement des oreilles Crise clonique Crise tonique Témoins 0 45,5 49,3 88,6 Chlorhydrate de 10-hydroxy ajmalicine 1 mg/kg 2 mg/kg 5 mg/kg 41,7 39.1 39.2 45.3 42,7 42.4 86.1 88.2 68,5 Ces résultats montrent que le produit étuidé possède un effet potentialisateur vis-à-vis du pentaméthylènetétrazol, analogue à 20 celui de la réserpine. II/ 10-hvdroxy corynanthine : On a déterminé la tolérance chez le chien, par voie intraveineuse à différentes doses ; on constate à toutes les doses, de la polypnée ; le produit n'a aucune action sur l'acétylcholine et 25 l'histaminé. L'hypertension provoquée par une dose d'adrénaline double de la dose-test est inversée par une dose de 10 mg/kg du produit étudié et commence à réapparaître soixante minutes après. A 1*électrocardiogramme, on note de la tachycardie aux doses 30 de 2 et 5 mg/kg et de la bradycardie à la dose de 10 mg/kg. 69 34588 * 2068400 H B » I H PI C A 1 I 0 1 S 1. Procédé ae préparation ae aérivés de la yohimbine caractérisé en ce que l'on soumet un alcaloïde choisi dans le groupe constitué par 1'ajmalicine et la corynantnine à l'action d'enzymes 5 nydroxylanus produits par aes cultures ae micro-organismes appartenant au genre G-ongronella et obtient. le dérivé 10-hydro-xylé correspondant que l'on peut transiormer en sel u'addition avec un acide minéral ou organique ufcLérapeutiquemejit compatiDle. 2. Procéaé de préparation selon 1. aans lequel les enzymes 10 nyaroxylants sont produits par aes cultures de micro-organismes appartenant à l'espèce G-ongronella urceolifera. 3. Procédé de préparation selon 1. caractérisé en ce que l'action des enzymes hydroxylants est effectuée à une température comprise entre 26 et 37° pendant une périoae comprise entre 24 et 96 heures. 15 4. L'hydroxy-10 ajmalicine et ses sels d'acide minéral ou organique . 5. A titre de médicament les dérivés du type hydroxy-10 yohimbine ainsi que leurs sels avec les acides minéraux ou organioues thérapeutiquement compatibles. 20 6. A titre de médicament selon 5. l'hydroxy-10 ajmalicine et ses sels d'acide minéral ou organique. 7. A titre ae médicament selon 5. l'hyaroxy-10 corynanthine et ses sels a'acide minéral ou organique. 8. Les compositions pharmaceutiques contenant comme principe 25 actif au moins un composé selon les revendications 5. à 7. en association avec un excipient pharmaceutique inerte.