FR 2100716 A1 19720324 FR 7119993 A 19710602 71 19993 i 2100716 La présente invention concerne le fractionnement des protéines plasmati-ques en vue de préparer, entre autres, la globuline d'immun-sérum et l'albumine. Le sang est constitué de globules sanguins solides en suspension dans le plasma. Les globules sanguins représentent environ 45 % du volume total tandis 5 que le reste, dit plasma sanguin, est constitué d'environ 90 % d'eau, 9 % de protéines, 0,9 °L de sels et de quantités inférieures de composés organiques. On trouve les protéines du plasma sanguin dans un grand nombre de corps à fonctions diverses telles que les enzymes, les anticorps et dans la régulation de l'équilibre eau-sel dans l'organisme. 10 On utilise fréquemment du sang entier et du plasma sanguin dans le trai tement de différents stades de maladies. Toutefois, on sait depuis longtemps que beaucoup de protéines, administrées pour combattre une maladie, aê sont pas toutes nécessaires. Au contraire, dans certains cas, elles peuvent être nocives. En conséquence, afin de profiter cliniquement au mieux des produits 15 actifs, il faut les isoler èt les enrichir. On obtient fondamentalement le matériau brut pour la formation d'une préparation d'albumine et de globuline d'immun-sérum en recueillant le sang rétro-placentaire dans les salles de travail des maternités et on obtient un excès de sang et de plasma pour préparer des solutions de globuline d'immun-sérum, qui 20 contient une quantité accrue d'anticorps pour le traitement de maladies spécifiques, en innoculant des antigènes bien définis aux donneurs de sang. On utilise- également le sang de convalescents dans le même but. En principe, le prix de cette globuline d'immun-sérum est élevé. Le matériau brut obtenu pour le fractionnement de l'antigène dépend du mode de collection et sera constitué soit 25 de sang entier, soit de plasma, soit de sérum. On tire souvent le sang d'un donneur de sang immunisé en utilisant la méthode dite de plasmaphérèse, suivant laquelle on mélange avec le sang, au moment du prélèvement une solution tampon acide citrique-citrate de sodium dextrose. Les globules sanguins peuvent être séparés du plasma par centrifugation et réinjectés dans le sang du donneur. 30 De nombreuses tentatives ont été faites pour découvrir un procédé qui rende possible l'isolement des protéines plasmatiques cliniquement importantes sans perte ou sans affaiblissement de leur activité biologique. Ce que l'on a recherché est un procédé de fractionnement selon lequel les protéines isolées conservent les mêmes propriétés que dans le sang. 35 Le procédé le plus ancien employé pour précipiter les protéines plasma- tiques est l'utilisation de sels neutres, plus spécialement du sulfate d'ammonium. Le procédé de relargage est un système comprenant quatre variables : la concentration en sel, la concentration en protéines, le pH et la température. De grandes quantités de sels neutres se trouvent incluses au cours de la 40 précipitation du sel et doivent être séparées par dialyse. On sait que ce procédé 71 19993 2 2100716 qui a été décrit par Schultze H.E. et al. Behringwerk-Mitteilungen N° 22, 1954, donne un rendement élevé. On utilise en Angleterre un procédé qui comprend, entre autres, un éther comme précipitant (Kekwik R.A. et al. Med. Reseerch Council Spc. Report Sériés 5 No. 286, London, Her Majesty's Stationary Office 1954). Le procédé d'échange ionique de Reid (Reid A.F. et al. Ind. Eng. Chem. 43, 1974, 1951) peut être aussi mentionné, comme peut l'être le procédé à l'alcool de Cohn. Ce dernier procédé est de loin le plus populaire et est largement accepté. Il est décrit, entre autres dans J. Am. Chem. Soc. 68 (1946) 459 et 72 (1950) 465, (Cohn et 10 al.) et 71 (1949) 541, (Oucley), et dans les brevets américains 2.390.074, 2.437.060 et 2.543.215, aussi bien que dans le brevet suédois 136.401. Selon le procédé mis en oeuvre par Cohn et al., au début de 1940, l'éthanol était utilisé comme précipitant. En faisant varier la concentration en éthanol à de faibles concentrations ioniques et de faibles températures, les protéines 15 plasmatiques sont subdivisées en cinq fractions principales. Si l'éthanol est remplacé par d'autres solvants organiques, par exemple 1'éther ou l'acétone, les possibilités sont encore accrues de trouver des conditions de précipitation convenables pour la séparation de mélanges de protéines complexes. L'avantage de l'utilisation de l'éthanol ou d'autres solvants organiques au lieu de sels 20 neutres est que leur volatilité permet de les éliminer facilement par lyophilisation. Un inconvénient du procédé de précipitation à l'alcool de Cohn est que les différents stades de précipitation doivent se faire à de basses températures pour éviter la dénaturation des protéines. De ce fait, la solution de 25 plasma doit être refroidie au-dessous de 0° C avant d'ajouter l'alcool, et cette température ne doit pas être dépassée durant quelque phase de fractionnement que ce soit. En dépit des nombreux avantages du procédé de Cohn, on a montré que l'isolement des protéines à l'aide de l'alcool comme précipitant provoque la formation d'agrégats d'albumine et de globulin® d'immun-sérum. 30 Plusieurs protéines importantes du point de vue clinique perdent leurs propriétés d'origine lorsqu'elles sont en contact répété avec l'alcool et se présentent dans les globulines d'immun-sérum sous forme irréversiblement agrégée et dénaturée. De ce fait, l'agrégat de globulines d'immun-sérum a une constante de sédimentation de 9,5 à 10,1 S. Mais de nombreux produits disponibles sur le 35 marché renferment 0,5 à 25 % d'une telle protéine. Le système de classification des globulines d'immun-sérum utilisé présentement est basé sur l'ouvrage Bull, World Health Organization 30 (1964), page 447, selon lequel elles sont classées par des symboles représentant la classe principale et les chaînes de polypeptides convenables. if ou Ig ont été choisis 40 comme symboles pour la globuline d'immun-sérum. Le symbole utilisé est suivi 71 19993 3 2100716 d'une lettre majuscule représentant la classe principale, par exemple G, îf' M ou IgG, IgM. Cette terminologie est utilisée tout au cours de la présente description. La globuline d'immun-sérum agrégée et injectée est secrétée beaucoup plus 5 vite que le matériau non agrégé ayant une constante de sédimentation de 7 S. La plasmine restant dans la fraction IgG après purification provoque la fragmentation de l'anticorps en raison de son activité protéolytique. Ceci implique également une élimination plus rapide. Ces deux facteurs influencent substantiellement les résultats cliniques lors d'un traitement avec ce matériau. 10 L'invention est décrite plus en détail ci-après en référence au dessin annexé dans lequel : - la figure 1 représente une colonne échangeuse d'ions selon l'invention; - la figure 2 représente une autre forme de réalisation de la colonne échangeuse d'ions ; et, 15 - les figures 3 à 6 représentent des courbes d'absorption de diverses préparations. Dans le procédé selon l'invention, on obtient,comme produit final, une IgG exempte d'agrégats, avec un rendement élevé, en utilisant les propriétés de charge dissemblables des protéines plasmatiques ainsi que leur solubilité 20 dans un système où une chromatographie d'échange ionique est employée en alternance avec une phase précipitation-dissolution. Un avantage particulier du nouveau procédé est que le fractionnement brut et la purification finale des composants séparés peuvent être effectués à la température ambiante dans des conditions aseptiques. Seule la phase finale 25 après l'isolement nécessite de travailler à une température inférieure à 0° C. Le matériau fractionné peut être examiné à l'aide d'une ultracentrifugation ou d'une autre forme convenable de filtration sur gel. La subdivision des protéines plasmatiques en plusieurs fractions brutes s'effectue comme suit. Tout d'abord, les globulines sont précipitées à un pH neutre par l'addition de 30 polyéthylène glycol dans des conditions telles que la fraction d'albumine reste en solution. Ainsi, à la concentration de 13 % dans le mélange réactionnel, le polyéthylène glycol précipite toute la globuline à une température de 15-25° C et pH 7 sans que l'albumine soit affectée. Le polyéthylène glycol utilisé comme précipitant a une massemoléculaire 35 moyenne de 6000 (Union Carbide, qualité USP, USA). De telles précipitations sont décrites dans le brevet britannique 1.006.258. La précipitation à l'aide du polyéthylène glycol ne se fait pas uniquement en fonction de la concentration en polyéthylène glycol, mais aussi en fonction de la teneur en ions, de la concentration en protéines, de la tempéra-40 ture et du pH, les modifications de pH entraînant les effets les plus grands. 1 19993 4 2100716 A l'opposé de l'éthanol, le polyéthylène glycol a un effet stabilisant sur les protéines à la température ambiante. Le précipité obtenu est séparé, de préférence par centrifugation et est extrait de telle manière que la fraction IgG est dissoute et chargée positivement, tandis que l'IgM, le fibrinogène et le plasminogène demeurent non dissous. Comme solution, on peut utiliser une solution tampon acide acétique-acétate de sodium à pH 5,8. Le précipité non dissous est séparé par filtration et la solution est traitée à l'aide d'un échangeur de cations à pH 5,8. L'échangeur de cations utilisé est de préférence du carboxyméthyl-dextrane (Sephadex CM 50). Le traitement à l'aide de l'échangeur d'ions se fait soit par lots, soit sur colonne. Afin de pouvoir utiliser les avantages de ces deux méthodes, la liaison rapide des protéines du traitement par lots à partir de plus grands volumes et le procédé plus simple d'élution sur colonne, on a mis au point une technique et un appareil spécial. Une solution de protéine et un gel d'échange ionique sont agités dans un réservoir piriforme 1 (figure 1, fermé à sa base par un bouchon 5 pourvu d'un filtre) jusqu'à ce que l'équilibre soit atteint. Lorsque l'agitation est arrêtée, une colonne de gel de l'échangeur d'ions se forme à la partie inférieure du réservoir. La colonne est séparée à sa partie supérieure par un bouchon pourvu d'un filtre 2 déplaçable à l'aide d'une tige 3 et conformé de manière à pouvoir descendre au travers de la phase renfermant les protéines non combinées pour atteindre le niveau supérieur de la colonne de gel où il constitue alors un joint hermétique entre le gel et ladite phase. Les bouchons 5, 2 pourvus de filtres sont reliés par l'intermédiaire de tubes à un robinet à quatre voies 7. De cette manière, on peut faire circuler les solutions et les conduire par différents passages à la colonne 4 en provenance de divers réservoirs, ou à partir de ladite colonne auxdits réservoirs, par exemple de l'élution par en dessous, du lavage par au-dessus, etc... Un appareil similaire ayant un réservoir cylindrique au lieu d'un réservoir piriforme est représenté à la figure 2. Après l'échange cationique, il reste dans la solution, entre autres, les P -lipoprotéines, les et -macroglobulines, les lipides, des traces d'albumine précipitée et une plus faible quantité de IgG. L'élution de l'échangeur d'ions se fait ensuite avec une solution éluan-te tampon ayant un pH plus élevé ou en augmentant la teneur en ions. Comme il ressort à l'évidence des figures, l'appareil est conçu de telle manière que l'élution puisse se faire soit en courant descendant, soit en courant ascendant. Ce dernier mode d'élution est essentiel, en particulier lorsque l'éluant a une densité supérieure à celle de la solution de protéine éluée, L'éluant utilisé est une solution de chlorure de sodium tamponnée avec 71 19993 5 2100716 du phosphate de sodium. En répétant la précipitation de l'éluat avec du polyéthylène glycol, on obtient la précipitation de toutes les globulines à l'exception d'une quantité moindre de transferrine. Le précipité est centrifugé et redissous dans une so-5 lution tampon de phosphate à pH 6,6. Il est ensuite centrifugé jusqu'à ce qu'il ne reste plus de précipité et agité avec un échangeur d'ions. Toutes les protéines restantes, à l'exception de la IgG, se trouvent alors liées à l'échangeur d'ions utilisé, à savoir le diéthylaminoéthyldextrane (Sephadex DEAE A 50). La solution de IgG est ensuite refroidie à - 0,3° G et on lui ajoute de l'étha-10 nol refroidi jusqu'à atteindre une concentration de 25 % pendant que la température est abaissée à - 7,0° G auquel point la IgG précipite complètement. Le précipité est séparé par centrifugation, mis en suspension dans de l'éthanol à 25 % refroidi, et lavé à - 7,0° C. Le précipité ainsi lavé est dissous dans une solution de glycine glacée et filtrée dans des conditions stériles. Après 15 lyophilisation, on prépare une solution de IgG à 16 - 16,5 % dans de la glycine 0,3 M. En utilisant le procédé selon l'invention, on obtient le fractionnement rapide à la température ambiante et dans des conditions aseptiques. Ce procédé peut être appliqué au laboratoire et sur une échelle industrielle et permet un 20 grand nombre de possibilités de séparation. La reproductivité de ce procédé est également très bonne, et indépendante du volume de départ . La dilution du liquide est petite et le volume soumis au fractionnement est inférieur à 150 % du volume de départ. La capacité d'échange ionique est utilisée au maximum. EXEMPLE 25 Isolation de la globuline d'immun-sérum à partir du plasma humain. Le plasma humain est conservé à l'état gelé à - 20° C, est ensuite dégelé à + 4,0° C et centrifugé pour séparer un résidu solide de fibrinogène, de fragments de cellules et de globules sanguins. Le facteur AHF est récupéré à partir de ce résidu solide. 30 Une partie en volume de la solution claire centrifugée est précipitée à une température de 15 - 25° C avec une demi-partie en volume d'une solution à 39 % de polyéthylène-glycol dans une solution de citrate de sodium 0,05 M ajustée à pH 7,0 avec de l'acide citrique. La concentration finale de 13 % de polyéthylène glycol dans le mélange 35 réactionnel précipite pratiquement toutes les globulines qui sont séparées par centrifugation pendant 10 mn à la vitesse de 300 g. La solution résultant de la centrifugation renferme essentiellement de l'albumine que l'on récupère. Le précipité séparé par çentrifugation est dissous dans une partie en volume d'une solution tampon d'acétate de sodium 0,05 M à pH 5,8, les protéines 40 étant dissoutes à l'exception du fibrinogène, de l'IgM et du plasminogène. Ces 1 19993 6 2100716 derniers sont séparés par centrifugation à la vitesse de 1500 g pendant 15 minutes. La solution claire restante de globuline est agitée pendant 40 minutes à la température ambiante dans le réservoir piriforme avec l'échangeur de cations (Sephadex - CM 50) en équilibre avec une solution tampon d'acétate de sodium 0,05 M, pH 5,8 et avec une quantité de plasma brut correspondant à 6 g d'échangeur d'ions sec par kg. On laisse l'échangeur d'ions avec les protéines qui y sont liées revenir au rppos et on le sépare des protéines non combinées au moyen dr bouchon mobile 2 pourvu d'un filtre. La fraction de protéine liée est ensuite éluée en courant ascendant avec une solution tampon de phosphate de sodium 0,05 M contenant du chlorure de sodium 0,2 M et ayant un pH de 7,8. La globuline éluée a un pH d'environ 7. Après dilution avec de l'eau distillée à raison d'une partie en volume (en considérant le volume de départ)), la solution est de nouveau précipitée avec une solution de polyéthylène glycol (PEG) à 39 % dans une solution tampon de phosphate de sodium 0,05 M, pH 7,0, avec une concentration finale en PEG de 13 %. Ainsi, toutes les globulines sont précipitées à l'exception d'une plus petite quantité de transferrine. Le précipité de globulines est centrifugé pendant 10 minutes à la vitesse de 300 g et est dissous dans une partie en volume de solution tampon de phosphate de sodium 0,02 M à pH 6,6. Le précipité dissous est centrifugé pendant 10 minutes à la vitesse de 300 g et agité à la température ambiante pendant 20 minutes avec un échangeur d'anions (Sephadex DEAE A 50) avec une quantité de plasma brut correspondant à 6 g d'échangeur d'ions sec par kg, et en équilibre avec une solution tampon de phosphate de sodium 0,02 M à p'H 6,6. De cette manière, toutes les protéines restantes, à l'exception de l'IgG, sont liées à l'échangeur d'ions. L'IgG non combinée est ensuite refroidie à - 0,3° C et mélangée au cours de l'abaissement continuel de température et sous vigoureuse agitation, avec contrôle de la température de l'introduction, avec de l'éthanol à 75 % refroidi, de telle manière que la chaleur de la solution soit rapidement répartie et évacuée. A la concentration finale en éthanol de 25 % et à - 7° C, la globuline d'immun-sérum est complètement précipitée. Le précipité est séparé par centrifugation à - 10° C pendant 15 minutes à une vitesse de 1500 g, mis en suspension dans 1/6 de partie en volume d'éthanol à 25 % dans une solution tampon de phosphate de sodium 0,005 M, à pH 7,0, à - 7° C et recentrifugée. Le précipité lavé de cette manière est dissous dans 1/20 de partie en volume d'une solution de glycine glacée 0,1 M filtrée au travers d'un filtre d'amiante dans des conditions stériles, gelée et lyophilisée. Après lyophilisation, on peut préparer une solution de globuline d'immun-sérum à 16 - 16,5 % dans de la glycine 0,3 M en vue de son utilisation clinique. 71 19993 7 2100716 La globuline d'immun-sérum obtenue est exempte d'agrégat, a une masse moléculaire uniforme et a conservé ses propriétés neutralisantes dès antigènes. Les produits pyrogènes, se trouvant, le cas échéant, dans le matériau brut sont éliminés au cours du procédé de purification. La même chose s'applique à l'anti-5 gène au (au = antigène australien), protéine que l'on trouve dans le sang des personnes atteintes d'hépatite à virus. Le rendement est élevé et la globuline est stable. Du fait que le matériau séparé par précipitation ou lié à l'échangeur d'ions contient toujours du matériau non précipité ou non combiné, la purifica-10 tion finale s'effectue selon une méthode grâce à laquelle le matériau isolé se trouve dans le surnageant au cours de la précipitation et dans le matériau non combiné après le traitement avec l'échangeur d'ions. En liant cette partie du mélange de composants qui a la concentration la ,plus faible, la capacité de l'échangeur d'ions peut être utilisée au maximum par rapport à la quantité 15 totale de composants présents. Pour l'examen des produits on a établi des courbes de filtration sur gel pour des préparations obtenues de différentes manières. Des solutions d'essai renfermant environ 16 % d'IgG ont été filtrées sur gel d'agarose (Biogel 1,5 A) dans des colonnes (8 x 750 mm) dans une solution tampon Tris-HCl 0,1 M, à 20 pH 8,0, avec du NaCl 0,5 M et 2 % de n-butanol. La prise d'essai était de 50 pl et les mesures ont été effectuées à 280 et 260 nm sur une couche de 1 mm d'épaisseur coulant dans une cuve. La courbe établie pour 280 nm est continue et la courbe pour 260 nm est interrompue. 25 La figure 3 représente la courbe d'absorption de l'IgG préparée par la méthode au sulfate d'ammonium de Schultze. Les figures 4 et 5 représentent les courbes d'absorption de l'IgG préparée selon des variantes de la méthode de Cohn. La figure 6 montre une courbe d'absorption d'une préparation d'IgG obtenue selon l'invention. Ces courbes illustrent que l'agrégat qui se forme - le premier 30 pic des courbes des figures 3, 4 et 5 - manque à la figure 6 et que l'interruption due à la séparation incomplète de la plasmine - le pic final des courbes des figures 3, 4 et 5 - a complètement disparu. La symétrie de la courbe d'absorption de la préparation selon l'invention montre la distribution moléculaire uniforme dans ce matériau. 71 19993 8 2100716 REVENDICATIONS 1.- Procédé de fractionnement de protéines plasmatiques, caractérisé par les étapes suivantes : a) la séparation des globules sanguins et des fragments de cellules du 5 plasma sanguin; b) la précipitation des globulines plasmatiques à l'aide du polyéthylène glycol à la concentration de 10 à 15 % en poids et à pH 6,5 - 8,0, de préférence 7,0; c) la séparation par centrifugation du précipité et, le cas échéant, 10 l'extraction de l'albumine de la solution restante; d) la dissolution du précipité à pH 5,8 dans une solution tampon acide acétique-acétate de sodium 0,05 M et la séparation par centrifugation du fibrinogène et de l'IgMnon dissouts; e) l'adsorption des globulines sur un échangeur de cations, de préférence 15 du carboxyméthyldextrane, à pH 5,8, et l'élution avec du chlorure de sodium 0,2 M dans une solution tampon de phosphate à 0,05 M, à pH 7,5 - 8,0, de préférence 7,8; f) la précipitation du polyéthylène glycol à pH 6,5 - 8,0, de préférence 7,0, la centrifugation et la dissolution du précipité dans une solution tampon 20 de phosphate 0,2 Ma pH 6,6; g) l'adsorption de toutes les globulines à l'exception de l'IgG sur un échangeur d'anions, de préférence du diéthylaminoéthyldextrane, à pH 6,6; h) le refroidissement de la solution d'IgG à - 0,3° C et la précipitation de l'IgG avec de l'éthanol à la concentration de 25 % en volume, entre -5° C 25 et -10° C, de préférence à -7° C; i) la séparation du précipité, la mise en suspension et le lavage avec 25 7o en volume d'éthanol à pH 7,0, entre -5° C et -10° C, de préférence à -7° C, puis une nouvelle centrifugation; j) la dissolution dans la glycine et la filtration dans des conditions 30 stériles; k) la lyophilisation et la préparation d'une solution d'IgG à 16 - 16,5 % dans de la glycine 0,3 M en vue de son injection. 2.- Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que la précipitation des globulines plasmatiques de l'étape b) est effectuée à l'aide d'une 35 concentration en polyéthylène glycol de 13 % en poids. 3.- Procédé selon la revendication 1 ou 2, caractériséfen ce que, au cours de la précipitation à l'aide du polyéthylène glycol, à l'étape b), la température est maintenue entre 10 et 25° C, de préférence entre 15 et 18° C. 4.- A titre de produits industriels nouveaux, les protéines fractionnées 40 par le procédé constituan t l'objet de l'une quelconque des revendications 119993 2100716 1 à 3. 5.- A titre de médicaments, les protéines fractionnées par le procédé constituant l'objet de l'une quelconque des revendications 1 à 3.