FR 2100660 A1 19720324 FR 7117104 A 19710512 71 17104 2100660 La présente invention concerne de nouveaux complexes de nucléotides multicaténaires qui induisent les cellules vivantes pour produire de 1'interféron, et les compositions pharmaceutiques contenant de tels complexes. Elle concerne en parti-5 culier des complexes bicaténaires d'acide polyribo-inosinique et d'acide polyribo-cytidylique (ri - : rCn) dans lesquels le poids moléculaire moyen de la composante acide polyribocytidy-lique du complexe est substantiellement plus petit que celui de la composante acide polyribo-inosinique; l'invention concerne 10 aussi les procédés de préparation de ces nouveaux complexes ri : rC : et les méthodes d'administration de ces nouveaux com-n n plexes ri : rC à des cellules animales vivantes pour stimuler * n n la production d1interféron dans ces cellules, et augmenter leur résistance à des infections virales. Ces complexes ri : rCQ 15 possèdent une activité maxima de production d'interféron avec une toxicité substantiellement réduite. Les interférons sont Les complexes rIn:rCn de la présente invention peuvent être utilisés comme inducteurs pour la production d'interféron, soit in vivo soit in_ vitro. L'emploi principal est 1'administra-30 tion soit intranasal soit par injection a l'hôte animal ou homme de façon que 1'interféron soit produit in vivo en quantités substantielles, en servant ainsi à la protection de l'hôte contre l'infection par une variété de virus. Ils sont également utilisables pour la production d'interféron dans des cultures de 35 cellules vivantes animales ou humaines. L'interféron ainsi produit peut être utilisé pour l'administration aux espèces correspondantes pour augmenter la résistance aux infections virales. Conformément à la présente invention, la demanderesse 71 17104 2 T 00660 a déterminé que des complexes rIn:rCn dans lesquels le poids moléculaire moyen des composantes a été substantiellement réduit, possèdent une haute activité comme inducteurs d'interféron et ont en même temps une toxicité réduite. De tels complexes 5 rIn:rCn à poids moléculaire plus faible sont produits directement à partir de complexes non-traités par exposition à une radiation sonore. Un tel traitement est effectué avantageusement en exposant une solution du complexe rIn:rCn d'une concentration d'environ 1 mg/ml à une radiation sonore produite par un 10 générateur équipé d'une sonde de 2 cm et ayant une puissance de 210 watt. On effectue la radiation sonore généralement en refroidissant et pendant des durées dépendant du degré de dépolymérisation qu'on désire atteindre. Des durées de radiations d'environ 30 secondes à environ 16 minutes sont généralement suffisantes 15 quand on utilise un générateur de radiations sonores de la puissance indiquée ci-dessus. L'examen des solutions de rl :rCn ainsi exposées à des radiations sonores montre, qu'avec des durées croissantes, la viscosité relative décroît d'une façon approximativement expo-20 nentielle. Des traitements pendant des périodes atteignant 16 minutes provoquent seulement une faible diminution de la capacité du complexe rIn:rCn dégradé à induire la formation d'interféron dans le lapin, alors que la capacité d'induire dans des cultures de cellules la résistance contre le virus VSV et contre l'infec-25 tion PMV chez la souris est un peu réduite. Selon une autre forme d'exécution de la présente invention, on prépare des complexes rIn:rCn dans lesquels les composants individuels rl et rCn ont des poids moléculaires moyens réduits. On prépare avantageusement ces homopolymères à poids 30 moléculaire réduit par une polymérisation enzymatique contrôlée du diphosphate d'inosine et du diphosphate de cytidine en utilisant la polynucléotide-p" ...phorylase (PNPase) comme catalyseur enzymatique. Comme autre variante, on peut préparer des homopolymères rC de poids moléculaire relativement bas par dégrada-35 tion d'un homopolymère rCn à haut poids moléculaire au moyen des radiations sonores comme décrit ci-destous. On peut aussi dégrader un homopolymère rCn à haut poids moléculaire par traitement avec de la ribonuclêase, de préférence la ribonucléase-A 71 17104 -3- 2100660 pancréatique; ainsi un homopolymère rC ayant un poids molécu- c n laire moyen d'environ 1,9 x 1Cr , et une viscosité relative de 4-,1 (eau = 1,0) est dégradé en un rC^ partiellement dépolymérisé ayant une viscosité relative d'environ 1,08 par une digestion 5 de 30 minutes avec la ribonucléase. Les exemples suivants illustrent des procédés pour exécuter la présente invention mais il est entendu que ces exemples sont donnés dans le but d'une illustration et non d'une limitation. 10 Exemple 1 On prépare un complexe acide polyribo-inosinique : acide polyribo-cytidylique (rl^rrG^) comme décrit dans la demande de brevet américaine Ser. 684-.936 déposée le 22 novembre 1967» On expose des solutions de ce complexe (environ 200 ml) ayant 15 une concentration de 1 mg/ml en refroidissant, pendant des durées variables, à des radiations sonores en employant un générateur de radiations sonores (tel que le "Biosonic III" à 20.000 cycles) équipé d'une sonde de 2 cm, ayant une puissance de 210 watt. Chacune des solutions de rIn:r(^n dépolymérisé obtenues 20 après des temps variables de radiations est alors caractérisée par sa viscosité relative, le coefficient de sédimentation, le poids moléculaire moyen, le point médian de transitioiyfchermique (Tm°C), le pourcent d'hyperchromicité, la sensibilité relative à la ribonucléase et les spectres d'absorption ultraviolet. Les 25 valeurs obtenues* sont rassemblées dans le tableau suivant BAD ORiGlNAkj Durée de la radiation, en minutes Viscosité relative «:0, w Poids moléculaire moyen Tm°0 % hyperchromicité Sensibilité relative à RATase r/o (265 : 0,0 5,9 21 ,1 7,8 x 106 63,5 71,2 100 140 0,5 2,1 16,9 4,2 x 106 62,5 70,7 114 140 1,0 1,7 13,7 2,5 x 106 62,0 71,7 115 , 139 5,0 1,4 11,1 1,2 x 105 62,5 67,0 117 140 . - 4",° 1.3 9,5 7,4 x 105 61,5 67,0 129 139 6,0 1,2 8,5 5,6 x 105 61 ,0 62,0 143 139 12,0 1,1 7,9 4,6 x 105 60,0 59,0 147 143 16,0. 1,05 6,7 2,8 x 105 58,5 49,0 220 145 Les viscosités relatives sont mesurées avec un viscosimètre (Ostwald) ayant un temps d'écoulement de 120 secondes avec de l'eau à 25°C. Les coefficients de sédimentation sont déterminés en utilisant une ultracentrifugeuse ("Spinco Model E") équipée avec un système d'exploration dans l'ultraviolet. Les poids moléculaires sont calculés en utilisant l'équation empirique suivante qui rattache le coefficient de sédimentation directement au ** ^ O Q poids moléculaire : PM = 1,15 x 10p x SgÔ w * Pourcen't::a6e d'hyperchromicité est calculé comme l'augmentation en pourcent de la densité optique pendant la dissociation thermique, îm et la sensibilité à la RNase sont mesurés comme il est décrit dans la demande américaine Ser. 684.936 précitée. 71 17104 -5 2100660 Exemple 2 Chacun des produits rIQ:rCn partiellement dépolymérisés (viscosités relatives 1,05 à 2,1) obtenus par radiation sonore de complexes rl^-irC^ comme décrit dans l'exemple 1, est comparé 5 avec le complexe rl^trC^ non-traité (viscosité relative 3>9) pour sa capacité d'induire la production d'interféron dans le lapin; pour son interférence avec l'infection virale de FVM dans des cultures de cellules vivantes; et pour son pouvoir d'induire une résistance contre l'infection du virus PVM chez la souris. 10 Les résultats obtenus sont résumés dans le tableau suivant : r± n :rC utilisé n radiation viscosité poids molécu- sonore minutes 0,0 0.5 1,° 3,0 4,0 12,0 16,0 Témoin * relative 3,9 2,1 1,7 1,4 1 * 1 1,1 1,05 laire approximatif 7,8 x 10e Induction d'interféron ■v chez les lapins r 4,2 x 10e 2,3 x 10e 1,2 x 10e 7,4 x 10- 4,6 x 10' 2,8 x 10- / dose en titre en in-Aig/lapin terféron * 5 1 5 1 0 >640.320 160.320 >640.320 5.800 ^5-000 Interférence avec PVM dans culture de cellules dose min.efficace en^ug/ml 0,002-0,004 0,008 Protection souris contre PVM dose jag/souris ' * * % d'excès v survie sur le contrôle non-traité 4,0 1,0 0,25 94 80 60 O 4,0 1,0 0,25 90 75 60 4,0 1,0 0,25 47 55 20 i 4,0 1,0 0,25 75 42 20 0^ t 4,0 1,0 0,25 50 45 5 4,0 1,0 0,25 30 15 5 4,0 1,0 0,25 24 12 20 0,0 — Les sérums de chaque lapin sont collectés deux heures après l'administration de rl :rC et sont testés pour 1'interféron par la méthode de dilution de tube dans les cellules de rêin nde lapin primaires en utilisant le virus de stomatite vésiculaire comme virus à combattre. Les souris sont prétraitées avec 0,3 ml de solutions de rln:rC par voie intranasale 3 heures avant l'infection intranasale avec 30 DI^q de PVM. NO O O o o o 71 17104 -7- 2100660 Exemple 3 On réduit une solution d'un complexe polynucléotide (rl^irC^) ayant une concentration de 1 mg/ml, par radiation sonore à une viscosité relative d'environ 1,3 et on l'applique 5 à une colonne remplie d'agarose à 4 % en "billes (Sepharose B) et on élue avec un tampon phosphate-salin (0,006 M. phosphate de sodium; 0,15 ^ chlorure de sodium;. pH=7) en utilisant des volumes d'éluant (Ve) qui sont en excès par rapport au volume vide (Vo). On recueille par cette chromatographie neuf fractions séparées qui contiennent le complexe rl :rC avec des poids mo- ty* \ 6 léculaires moyens d'environ 6,0 x 10 a plus de 10 , et on les teste pour leur capacité d'induire la production d'interféron dans les sérums de lapin, et pour l'interférence avec l'infection virale PVM dans des cultures de cellules primaires de reins de lapins. Les résultats -sont réunis dans le tahleau suivant : Interférence avec Titre d'inter-PVM dans culture Dose par féron dans sé-de cellules lapin .rum de lapin/-— n ,ug activité relative ' en % de la fraction 1 10 15 20 25 Poids Fraction moléculaire estimé 30 1 > 105 2 80.160 100 2 6,4 x 10^ 2 640.160 3 4,4 x 105 2 320.000 200 4 2,8 X 105 2 20.800 100 5 ro S* O X 105 2 20.200 100 6 1,2 X 105 2 7 1,0 X 105 - 50 8 7,0 X 104 2,8 A MI • o o o 9 6,0 X 104 12,5 Témoin 45.000 35 Exemple 4 On expose à des radiations sonores 1'homopolynucléotide individuel acide polyribocytidylique rCn (Sw 20=9 2^ Pendant des périodes de 5 et de 15 minutes respectivement à des radiations sonores conformément à la méthode utilisée pour le traitement du comnlexe rl :rC dans l'exemple 1 ci-dessus. Le rC_ non-traité n n n et les rCn de poids moléculaires plus "bas, sont complexés avec 71 17104 -8- 2100660 10 rI~ (Sw,20=9,2)' Dans le tableau suivant sont indiqués les viscosités relatives des complexes rl :rC résultants; leur apti- * n n ' tude à induire la production d'interféron dans les lapins; et leur capacité de résistance contre l'infection VSV dans des cul tures de cellules : induction d' radiation viscosité sonore, relative minutes rl :rC n n O 3,0 in- Titre terféron chez inter- le lapin, dose féron yUg/lapin 5 20.320 1 10.4-00 interférence avec VSM dans cultures de cellules, dose minimale effective (^ug/ml) 0,002-0,004- 15 15 1,7 1,5 Témoin (pas d'inducteur) 5 1 0 320.64-0 5.160 320.64-0 160.64-0 0,001-002 0,002-0,004- 20 25 Exemple 5 On traite une solution de rC (S n) contenant 1 mg n v w,20=9,2y 0 de rCn/ml, avec 0,01yug/ml de ribonucléase pancréatique pendant des périodes variant de 0 à 30 minutes, et on complexe les fractions de rC^ dégradés par la ribonucléase avec rIQ (Sw 20-9 2) non-traité, en concentration équimoléculaire. (L'addition de la solution de rl arrête immédiatement la dégradation du rC par la ribonucléase). On a réuni dans le tableau suivant les viscosités relatives, les spectres d'absorption dans l'ultraviolet, les hypochromicités et les essais biologiques des complexes rIn:rGn : Essais physiques rIn:rGn Essais biologiques rIn:r0n traitement ' rCn' minutes viscosité relative 248 m yu E1% N Hypochromicité % Dose protectrice minima,, PVM souris * VSV dans culture lapins Dose minima effective (yUg/ml) \ de cellule Activité relative % ** 17104 0 4,1 127 39,7 1 0,001-0,002 2,5 1,64 131 38,0 1 0,001-0,002 1-00 5,0 1 ,44 136 35,8 4 0,001-0,002 100 7,5 1,31 145 31,5 4 0,002-0,004 50 "10,5 1,25 155 26,7 4 0,004-0,008 25 15,0 1 ,18 167 20,8 >16 0,008-0,015 13 20,0 1,12 179 15,3 0,03-0,06 3,3 i 50,0 co • 196 7,1 0,13-0,25 0,8 dose intranasale minima enyug/ml' qui protège au moins 4-0 % des souris traitées contre une infection avec 30 LD^Q de PVM qui sans traitement serait.fatale. comparé à l'échantillon du temps 0. KO O O O O o 71 17104 -10- 2100660 Exemple 6 On synthétise des homopolymères rl et rC^ de différents poids moléculaires par polymérisation enzymatique contrôlée de diphosphate d'inosine, et diphosphate de cytidine respectivement, 5 en utilisant la phosphorylase de polynucléotide comme catalyseur. Les homopolymères rl et rCn. résultants, de poids moléculaires variés, sont complexés en quantité équimoléculaire avec des i*Cn> resp. rl à haut poids moléculaire. L'aptitude de ces complexes ainsi formés d'induire une résistance contre le virus de stoma-10 tite vésiculaire (VSV) dans des cultures de cellules de reins de lapins primaires, et de protéger les souris contre le virus de la pneumonie de la souris (PVM), en comparaison avec rl^rC^ préparé en utilisant des homopolymères à haut poids moléculaire (Sw 20=9 2) Pour cliacUG des rCn, sont réunis dans le ta- 15 bleau suivant : . . Composante rl n Composante rC n S v;, 20 Poids molé- Nombre mo-culaire moyen yen des unités de nu-cléotide 3w,20 Poids molé- Nombre mo~ culaire moyen yen des unités de nu-cléotide Activité relative * contre VSV dans culture de cellule (% 9,2 1,9 x 105 550 9,2 1,9 x 10^ 9,2 1,9 x 105 550 4,0 3,7 x 104 9,2 1,9 X 105 ■ 550 3,0 2,1 X 104 9,2 1,9 X 105 550 1,7 X 105 6,0 7,8 X 104 220 9,2 1,9 X 105 3,0 2,1 X 104 60 9,2 1,9 X 105 1,1 X 103 3 9,2 1.,9 X 105 560 100 110 100 65 100 5 560 20-50 560 5 560 0 témoin rC -plus n * petit rln plus O petit i i Pourcentage de l'activité comparée au témoin rIn:rCn dans lequel chaque composante a S w,20=9,2' K3 O O O o> o Coefficient: de sédimentation rl n 9,2 rC 9,2 3,0 3,0 Témoin Protection des souris contre infection PVM /■ _ v ^ Nombre total Excès de survie, o Dose de survie % du témoin -k* ug/souris 4 19/20 88,3 1 17/20 78,3 0,25 7/20 78,3 4 16/19 87,5 1 17/20 78,3 0,25 15/20 68,3 4 8/20 33,3 1 5/20 18,3 ï 0,25 2/20 3,3 4 6/20 23,3 1 5/20 18,3 0,25 1/20 0 0 4/60 i _A ro to —4 O o o o o 71 17104 -13- 2100660 Exemple 7 On ajoute à 250 ml d'une solution contenant 1 mg/ml de r^n 20=9 2) ^ans un tampon phosphate-salin (PBS) (contenant 0,006 M phosphate, 0,15 M chlorure de sodium, et ayant un pH 5 de 7,0), 0,1 ml d'une solution contenant 0,25 ^ug de ribonucléase pancréatique A. On mélange bien les solutions et on laisse procéder la digestion pancréatique pendant une période d'environ 90 minutes pour donner une solution de rC^ (S^. 20-2 5^ dégradé. On ajoute environ 250 ml d'une solution contenant 1,07 mg/ml 10 de l'homopolymère rl à haut poids moléculaire dans PBS directement à la solution de rCn dégradé (contenant l'enzyme ribonucléase) et on mélange bien les solutions ce qui arrête l'activité de la ribonucléase et forme le complexe de rl et de rC dé- . n n gradé. 15 -On ajoute deux volumes d'éthanol absolu froid (-20°C) à la solution contenant le complexe rCn dégradé:rl . On laisse reposer le mélange pendant 15 heures à -20°G et on sépare le produit précipité par centrifugation, on lave avec 200 ml d'éthanol et on sèche pour obtenir environ 500 mg de rCn dégradé:rl 20 comme masse blanche fibreuse. On la dissout dans 100 ml de solution PBS et on ajoute 0,1 ml d'une solution 0,1-M MgC^ (concentration finale de MgC^ 0,01-M) pour donner une solution contenant environ 5 mg/ml de complexe rIn:rCQ. L'aptitude de ce complexe contenant rCn dégradé pour protéger les souris contre l'in-25 fection de PVM, comparée à celle du complexe rIn:rGn préparé avec des homopolymères de rIQ à haut poids moléculaire et de rCn également à haut poids moléculaire; et les toxicités relatives de ces deux complexes sont indiquées dans le tableau suivant : Protection des souris contre Toxicité Complexe de rl à haut poids moléculaire avec infection PVM Dose totale Nombre rl :rC survie / • traités yug/souns rCn dégradé rC^ à haut^oids moléculaire 4 ■1 0,25 4 1 0,25 témoin (PBS) 0 15/20 16/20 8/20 13/20 16/20 9/20 3/60 Survie % sur témoin 70 75 35 60 75 40 n. r dose totale mg/souris 2 1 0,5 0,25 0,5 0,25 0,125 0,063 nombre survie traités 20/25 25/25 25/25 25/25 20/25 25/25 25/25 25/25 ld50 approx. mg/kg . 30,4 4,65 O 45» i -A On notera que, comparé au complexe rIn:rCn à haut poids moléculaire, rCQ dégradé:rl garde sans diminution l'aptitude à la résistance antivirale contre PVM dans la souris, mais montre une réduction significative de la toxicité. Le LD^Q calculé à partir de ces données est environ 6,5 fois plus avantageux pour le complexe rC^ dégradé:rl que pour le produit à haut poids moléculaire, alors que les activités comme inducteur de la résistance de l'hôte sont approximativement les mêmes. N> O O o cr-o 71 17104 -15- 2100660 - BEVENDIGATIONS - 1 - Procédé pour la préparation d'un polynucléotide multicaténaire remarquable par son aptitude à induire la production d'interféron, caractérisé en ce qu'on complexe un homopoly- 5 nucléotide contenant au moins 500 unités de nucléotides. 2 - Procédé pour la préparation d'un complexe rl :rC remarquable par son aptitude à induire la production d'interféron, avec une toxicité réduite, caractérisé en ce qu'on complexe rl contenant au moins 500 unités de nucléotides avec rC contenant n 10 moins de 100 unités de nucléotides. 1 3 - Procédé selon la revendication 2, caractérisé en ce que le coefficient de sédimentation de rl est supérieur à 9,2 et que le coefficient de sédimentation de rCn est compris entre environ 2,5 et 4,0, et que le rIQ:rCn résultant possède une to- 15 xicité réduite et une aptitude à induire la production d'interféron qui n'est substantiellement pas diminuée. 4 - Procédé caractérisé en ce qu'on soumet un polynucléotide multicaténaire composé d'unités d'homopolynucléotides de hauts poids moléculaires moyens, à une radiation sonore en for- 20 mant ainsi un polynucléotide multicaténaire contenant des unités d'homopolynucléotides d'un poids moléculaire moyen substantiellement réduit, et remarquable pat- son aptitude à induire la production d'interféron, avec une toxicité réduite. 5 - Procédé caractérisé en ce qu'on soumet un complexe 25 rl^rrC^ à une radiation sonore en formant un complexe rl zrO-^ remarquable en ce qu'il contient des unités a'homopolymères rl et rCQ d'un poids moléculaire réduit, et remarquable d'autre part par une aptitude à induire la production d'interféron non-diminuée, avec une toxicité réduite. 30 6 - Procédé caractérisé en-ce qu'on soumet un homo- polymère rC à une radiation sonore en formant ainsi le rC cor-* n n respondant avec un poids moléculaire moyen réduit. 7 - Procédé caractérisé en ce qu'on soumet un homopoly-mère rOn à l'action de ribonucléase en formant ainsi le rC^ de 35 poids moléculaire moyen réduit. 8 - Procédé de préparation d'un homopolymère rC de poids moléculaire relativement faible caractérisé en ce qu'on soumet le diphosphate de cytidine à une polymérisation enzyma- BAD ORIGINAL.! 71 17104 -16- 2100660 tique contrôlée en utilisant la phosphorylase de polynucléotide comme catalyseur enzymatique. 9 - Méthode de stimulation de la production d'interféron dans les cellules animales vivantes, caractérisée en ce qu'on 5 administre à ces cellules un complexe rIn:rCn dans lequel la composante rl contient au moins environ 500 unités de nucléotides, et que la composante rCn contient moins d'environ 100 unités de nucléotides. 10 - Méthode de stimulation de la production d'interféron 10 dans les cellules animales vivantes, pour augmenter leur résistance à des infections virales, caractérisée en ce qu'on administre à ces cellules un complexe rIn:rCn dans lequel la composante rl a un coefficient de sédimentation au-dessus d'environ 9,2 et que la composante rC^ a un coefficient de sédimentation entre 15 environ 2,5 et 4,0. 11 - Un polynucléotide multicaténaire remarquable par son aptitude à induire la production d'interféron, avec une toxicité réduite, caractérisé en ce qu'il comprend un complexe de deux polynucléotides, l'un contenant au moins 500 unités de nucléotides 20 et l'autre moins de 100 de telles unités. 12 - Un complexe rl^rrC^ remarquable par son aptitude d'induire la production d'interféron, avec une toxicité réduite, caractérisé en ce que la composante rl dudit complexe contient au moins 500 unités de nucléotides, et que la composante rC^ 25 contient moins de 100 unités de nucléotides. 13 - Un complexe rIn:rCn remarquable par une aptitude à induire une production d'interféron non-diminuée avec une toxicité réduite, caractérisé en ce que la composante rl dudit complexe a un coefficient de sédimentation au-dessus d'environ 9,2 30 et que la composante rC^ a un coefficient de sédimentation entre environ 2,5 et 4,0.