FR 2070886 A1 19710917 FR 7045377 A 19701216 70 45377 1 2070886 La présente invention concerne un" procédé de fabrication de l'acide 6-aminopénicillanique à partir de la benzylpéni-cilline (pénicilline G) en fractionnant une solution aqueuse de benzylpénicilline, ou son sel, au moyen d'enzymes contenus dans 5 la masse cellulaire du Thiobacillus trautweinii. Jusqu'à présent, pour produire l'acide 6-aminopénicillanique, on a utilisé divers micro-organismes ayant un enzyme ou un groupe d'enzymes fractionnant les pénicillines. : S. Murao ("Journal de la Société de Chimie Agricole du 10 Japon", 29, 400-407, 1955) utilisait, pour la production de l'acide 6-aminopénicillanique, de l'amidase de pénicilline, un enzyme tiré du Pénicillium chrysogenum Q 176 par l'action du sulfathia-zole sur ce champignon. L'amidase de pénicilline séparait l'acide phényl-acétique de la molécule de pénicilline G. Ce procédé était 15 difficile à mettre en application et ne garantissait pas l'obtention de quantités suffisantes d'acide 6-aminopénicillanique. Le brevet belge 569.728 décrit un procédé consistant à cultiver un Pénicillium chrysogenum dans des conditions usuelles mais sur line substance nourrissante exempte de précurseurs de 20 pénicilline tels que l'acide phényl-acétique ou l'acide phéno-xyacétique. Ce procédé permettait d'obtenir de très faibles concentrations d'acide 6-aminopénicillanique, ce qui rendait difficile l'isolement de l'acide et rendait le procédé peu profitable industriellement. 25 Les brevets américains 3.014.845, 3.014.846, 3.121,667', 3.144.395, 3.150.059, 3.260.653, 3.239.428, 3.272.715, et 3.297.546 décrivent des perfectionnements aux procédés de production de l'acide 6-aminopénicillanique consistant à utiliser d'autres espèces de microorganismes possédant des enzymes frac-30 tionnant la pénicilline. Cependant, les procédés décrits dans ces brevets présentent des inconvénients. Soit que l'ensemble du procédé (accumulation de la masse cellulaire et fractionnement) prenne trop de temps, soit que la composition des substances nutritives soit trop compliquée, soit que dans la composition de 35 ces dernières entrent des substances et des réactifs trop chers, soit que ces procédés présentent à la fois tous ces inconvénients. De plus, les microorganismes utilisés dans ces procédés forment, pendant la culture, une suspension cellulaire difficile à séparer du fluide de culture, ce qui exige l'emploi de centri-40 fugeuses à grande vitesse (15.000 à 20.000 tours/minute) pour 70 45377 2 2070886 obtenir la masse cellulaire. D'autre part, la précipitation des cellules au moyen de composés tensio-actifs, comme le propose le brevet américain 3.278,391 entraîne -une diminution de l'aptitude de la masse cellulaire à fractionner les pénicillines dès la 5 première opération de fractionnement, rendant sans profit l'emploi de la même masse cellulaire pour d'autres opérations de fractionnement. Tous ces inconvénients contribuent à l'augmentation des coûts de production de l'acide 6-aminopénicillanique. Le procédé selon la présente invention élimine ces 10 inconvénients. En effet, tant le processus d'accumulation de masse cellulaire que le processus de fractionnement sont brefs, et, en outre, il entre dans la composition des substances nutritives utilisées des matières premières et des réactifs bon marché et faciles à se procurer. De plus, le procédé selon l'invention 15 emploie le microorganisme thiobacillus-trautweinii qui forme une suspension cellulaire dans le fluide de culture ayant tendance à activer la "sédimentation et, pour cette raison, la séparation de la masse cellulaire est une opération facile n'exigeant pas de centrifugeuses à grande vitesse. 20 Un autre avantage du procédé selon l'invention réside dans le fait que l'on peut utiliser plusieurs fois la même masse cellulaire. Ceci contribue à rendre facile et bon marché la production d'acide 6-aminopénicillanique. Le procédé selon l'invention offre la possibilité 25 d'obtenir une concentration assez élevée de l'acide 6-aminopénicillanique dans un fluide après fractionnement, en raison de l'augmentation de l'aptitude de la masse cellulaire à fractionner la pénicilline après des opérations préalables consistant à, cultiver le Thiobacillus trautweinii sur une substance nutritive 30 semi-fluide et dans une substance nutritive solide de même que dans une substance nutritive fluide de composition convenable et dans des conditions adéquates, ainsi qu'en raison d'un choix judicieux de conditions pendant le fractionnement de la pénicilline. L'utilisation d'une substance nutritive semi-fluide au 35 cours de la première opération préalable permet d'emmagasiner le Thiobacillus trautweinii dans de longues périodes sans qu'il perde son aptitude à la croissance et au fractionnement de la pénicilline et donne ainsi une greffe commode pour la substance nutritive solide, 43 L'utilisation d'une substance nutritive solide (milieu 70 45377 3 2070886 de culture) au cours de la seconde opération préalable augmente l'aptitude du Thiobacillus trautweinii à fractionner la pénicilline par suite de l'induction physiologique des enzymes fraction-neurs de pénicilline et donne ainsi une greffe commode pour le 5 milieu de culture fluide. L'utilisation d'un milieu de culture fluide au cours de la troisième opération préalable fournit une accumulation de masse cellulaire de Thiobacillus trautweinii ayant une capacité élevée de fractionnement de la pénicilline. 10 Les milieux de culture utilisés ne contiennent pas d'hydrates de carbone exerçant une influence négative sur l'aptitude à produire des enzymes fractionnant la pénicilline, ce qui est un avantage supplémentaire du procédé selon l'invention. L'utilisation d'une masse cellulaire de Thiobacillus 15 trautweinii en quantité de 20 g. de masse cellulaire pour 400 à 2.000 mg. de benzylpénicilline à fractionner, et l'exécution du fractionnement dans des conditions de pH et de température adéquates permet d'obtenir, sous forme fluide, une concentration d'acide 6-aminopénicillanique assez élevée en un temps assez 20 court. Le procédé selon l'invention consiste à. fractionner une solution aqueuse de benzylpénicilline ou son sel dans un milieu de pH compris entre 6,0 et 9,5 à une température comprise entre 15 et 45° C. au moyen d'enzymes contenus dans la masse cellulaire 25 du Thiobacillus trautweinii préalablement passé dans des milieux de culture convenables, puis à séparer la masse cellulaire de la solution contenant 1'acide 6-aminopénicillanique qui est extrait par les procédés usuels. Les bactéries de Thiobacillus trautweinii sont passées 33 successivement dans un milieu semi-fluide, un milieu solide, et un milieu fluide. Le milieu semi-fluide est un extrait d'Hottinger contenant 0,2 à 0,5 % en poids d'agar par rapport à la quantité d'extrait. L'extrait d'Hottinger est ion extrait aqueux de boeuf 35 préalablement attaqué par des enzymes pancréatiques et contenant environ 600 mg de nitrosàmine par 100 cmA d'extrait. Le milieu de culture solide contient une infusion de grain (50 % de la masse sèche) en quantité de 1 à 10 % du volume, de l'agar en quantité de 2 % en poids, et de, l'eau ordinaire en 40 quantité complémentaire jusqu'à 100 % du -volume, les pourcentages 70 45377 4 2070886 se référant à la quantité de matière constituant le milieu de culture. La masse cellulaire de Thiobacillus trautweinii obte-vue après passage est utilisée pour fractionner de la benzylpénicilline en quantité de 20 g. pour 400 à 2.000 mg de pénicilline. A cette fin, on ajoute la masse cellulaire sous forme de pâte à 300 ml d'eaU distillée, puis on y ajoute 1,2 ml de toluène, et, tout en agitant et en maintenant une température comprise entre 15 et 45° C., on introduit 400 à 2.000 mg de benzylpénicilline ou son sel. Le fractionnement s'effectue dans un milieu dont le pH est situé entre 6,0 et 9,5. La valeur du pH est maintenue dans ces limites par l'addition de 6 n KOH ou de NAOH. Le fractionnement se poursuit pendant un laps de temps compris entre 15 minutes et 4 heures. Quand il est terminé, la masse cellulaire est séparée par centrifugation et on extrait l'acide, par les procédés usuels, de la solution obtenue contenant l'acide 6-aminopénicillanique. Dans l'opération de fractionnement, la masse cellulaire (pâte) est utilisée en quantité de 1 à 10 % en poids, la pénicilline en quantité de 0,1 à 2 % en poids, et l'eau distillée en quantité suffisante pour compléter le volume jusqu'à 100 %, les pourcentages se référant à la quantité de fluide. On va maintenant décrire en détail la fabrication de l'acide 6-aminopénicillanique, conformément à l'invention, au moyen des exemples, non limitatifs, suivants dans lesquels les pourcentages sont des pourcentages du volume, sauf indication contraire. EXEMPLE 1 - On prépare un milieu semi-fluide composé de : ' Extrait d'Hottinger • 40 % Agar 0,2 % en poids- Eau distillée jusqu'à 100 % Le pH du milieu est fixé à 7,2 au moyen de soude caustique. Le milieu ainsi préparé est versé à chaud dans des éprou-vèttes de 10 ml chacune et stérilisé à une température de 110° C. pendant 30 minutes. Les éprouvettes contenant le milieu.sont inoculées au moyen d'une culture de bactéries d'une durée de 24 heures prélevée au moyen d'un oeillet dans un milieu semblable. L'incubation est poursuivie pendant 24 heures à une température de 28°* C. 70 45377 5 2070886 On prépare un milieu solide composé de: Infusion de grain (50 % de masse sèche) 8 % Agar 2 % en poids Eau courante jusqu'à 100 % 5 Le pH du milieu est fixé à 7,2 au moyen de soude caus tique. Le milieu ainsi préparé est versé à chaud dans des éprou-vettes de 10 ml chacune et stérilisé à une température de 110° C. pendant 30 minutes. Les éprouvettes contenant le milieu sont inoculées au moyen d'une culture de bactéries d'une durée de 24 10 heure prélevées au moyen d'un oeillet dans un milieu semi-fluide. L'incubation est poursuivie pendant 24 heures à orne température de 28° C. On prépare un milieu fluide composé de : Infusion de grain préparée (10% de la masse sèche) 15 % ^5 Peptone "Bacutil" 0,25 % en poids Chlorure de sodium technique 0,25 % en poids Eau courante jusqu'à 100 % Le pH du milieu est fixé à 7,2 au moyen de soude caustique. Le milieu ainsi préparé est versé dans des bouteilles 20 Erlenmeyer de 500 ml de capacité, à raison.de 50 ml dans chaque bouteille, et stérilisé à une température de 110°. C. pendant 30 minutes. Chaque bouteille contenant le milieu est inoculée au moyen de 0,25 ml d'une suspension de bactéries prélevées dans le milieu solide. On met la culture sur un agitateur rotatif tour-25 nant à 220 tours/minute et ayant 25 mm. d'excentricité, à une température de 28° C. pendant 18 heures. Une fois la culture terminée, la suspension cellulaire obtenue en milieu fluide est centrifugée à 3.000 tours/minute. Le fluide surnageant au-dessus du dépôt est éliminé par décantation. 30 Dans une bouteille d'une capacité de 500 ml on verse 300 ml d'eau distillée et on obtient d'un milieu fluide d'un volume de 3.000 ml une masse cellulaire (20 g. de masse cellulaire sous forme de pâte), en même temps qu'on ajoute 1,2 ml de toluène. On place la bouteille et son contenu dans lin bain-marie 35 à thermorégulation à une température de 35° C. et on introduit un petit agitateur dans la bouteille. L'agitation est poursuivie jusqu'à obtention d'une suspension cellulaire homogène dans le fluide. On ajoute alors, sans interrompre l'agitation, 400 mg de sel de sodium de pénicilline G correspondant à 2.000 unités/ml. 40 Le fractionnement est effectué dans un milieu ayant un 70 45377 6 2070886 pH de 8,0. Pour maintenir le pH à la valeur voulue, on ajoute du 6 n NAOH ou du 6 n KOH. Le fractionnement s'effectue en deux heures. La présence d'acide 6-aminopénicillanique produit pendant le fractionnement est confirmée par la méthode chromatographique 5 sur le talc dans le système : butanol:acétone:éther:eau (72:22,5: 22,5:8,5) selon l'étude de B. Wasilew et J. Cieslak "Chromatogra-phie sur le talc de pénicilline et acide 6-aminopénicillanique en couches minces" parue dans la revue polonaise "Antibiotiki" 10, 877, 1965. Lorsque la réaction est terminée, la masse cellulaire est séparée par centrifugation et le fluide obtenu est acidifié au moyen de 6nHCl à un pH de 2,0 puis soumis à une triple extraction au moyen d'acétate d'amyle. La pénicilline non fractionnée et l'acide phénylacétique passent à la phase organique. L'acide !5 6-aminopénicillanique restant dans la phase aqueuse est déterminé quantitativement par les procédés biologiques usuels après avoir été préalablement converti en benzylpénicilline au moyen de chlorure d'acide phénylacétique. L'organisme d'épreuve utilisé était le Bacillus subtilis 6633. 20 Les résultats de la détermination sont exprimés en unités benzylpénicilline, une de ces unités benzylpénicilline (de sel de sodium) correspondant à 0,658 d'une unité d'acide 6-aminopénicillanique. La concentration de pénicilline dans le fluide préparé jusqu'au processus de fractionnement se monte à 2.000 25 unités/ml. Une fois le franctionnement terminé, la concentration d'acide 6-aminopénicillanique se monte à 355,3 unités/ml. L'acide 6-aminopénicillanique présent dans les fluides après fractionnement est isolé par un des procédés usuels. EXEMPLE 2 3° La composition qualitative et quantitative des milieux de culture, leurs procédés de préparation, les conditions de culture du Thiobacillus trautweinii et le procédé d'obtention de la masse cellulaire sont identiques à ceux de l'exemple 1. La quantité de masse cellulaire appliquée au fractionnement de la pénicilline et les conditions de fractionnement sont également identiques à celles de l'exemple 1 mais la quantité de pénicilline a été fixée à 2.000 mg dans 300 ml de fluide, ce qui correspond à 10.000 unités/ml. Les procédés de détermination de l'acide 6-aminopénicillanique sont les mêmes que ceux de l'exemple 1. ^ La concentration de pénicilline dans le fluide préparé 70 45377 7 2070886 pour le fractionnement était de 10.000 unités/ml. Une fois le fractionnement effectué, la concentration d'acide 6-aminopénicillanique était 1.645 unités/ml. EXEMPLE 3 5 La composition qualitative et quantitative du milieu semi-fluide et du milieu solide, de même que leur procédé de préparation, sont identiques à ceux de l'exemple 1. Cependant, la peptone a été éliminée de la composition du milieu fluide, qui avait alors la composition ci-après : 10 Infusion de grain préparée (10 % de la masse sèche) 15 % Chlorure de sodium technique 0,25 % en poids Eau courante jusqu'à 100 % Le procédé de préparation du milieu fluide, les condi-15 tions de culture du Thiobacillus trautweinii et le procédé "d'obtention de la masse cellulaire sont identiques à ceux de l'exemple 1 mais la quantité de pénicilline appliquée était 2.000 mg ce qui correspond à 10.000 unités/ml. La détermination de l'acide 6-aminopénicillanique a été faite par les mêmes métho-20 des que dans l'exemple 1. La concentration de pénicilline dans le fluide préparé pour le fractionnement était de 10.000 unités/ml. Une fois le fractionnement achevé, la concentration d.'acide 6-aminopénicilla-nique était de 1.414,7 unités/ml. 70 45377 2070886 REVENDICATIONS 1. Procédé de fabrication d'acide 6-aminopénicillanique à partir de la benzylpénicilline, caractérisé en ce que la solution, aqueuse de benzylpénicilline ou de son sel dans un milieu de 5 pH compris entre 6,0 et 9,5 est fractionnée à une températtire comprise entre 15 et 45° C. au moyen d'enzymes contenus dans la masse cellulaire du Thiobacillus trautweinii préalablement passée dans des milieux de culture adéquats, la masse cellulaire étant ensuite séparée de la solution contenant l'acide 6 aminopénicil- 10 lanique qui est enfin extrait par les procédés usuels. 2. Procédé selon la Revendication 1, caractérisé en ce que les bactéries de Thiobacillus trautweinii passent successivement dans un milieu semi-fluide, dans un milieu solide, et dans un milieu fluide. 15 3. procédé selon les Revendications 1 ou 2, prises séparément, caractérisé en ce que les bactéries de Thiobacillus trautweinii sont cultivés sur des milieux contenant seulement des substances protéineuses, outre la source carbonée et azotée. 4. procédé selon l'une quelconque des Revendications 20 1 à 3, prises séparément, caractérisé en ce que, pour la culture du Thiobacillus trautweinii, on utilise des milieux dont le pH est compris entre 3,0 et 10,0. 5. Procédé selon l'une quelconque des Revendications 1 à 3, prises séparément, caractérisé en ce que le Thiobacillus 25 trautweinii est cultivé à une température comprise entre 10 et 40° C. 6. Procédé selon l'une quelconque des Revendications 1 à 4, prises séparément, caractérisé en ce que le Thiobacillus trautweinii est cultivé pendant un laps de temps compris entre 30 6 et 36 heures. 7. procédé selon l'une quelconque des Revendications 1 à 6, prises séparément, caractérisé en ce que la masse cellulaire de Thiobacillus trautweinii est utilisée eh une quantité de 20 g. pour une quantité de benzylpénicilline comprise entre 400 35 et 2.000 mg. 8. Procédé selon l'une quelconque des Revendications 1 à 7, prises séparément, caractérisé en ce que, pendant le fractionnement de la benzylpénicilline, la valeur du pH est corrigée au moyen de bases inorganiques. 40 9. procédé selon l'une quelconque des Revendications 70 45377 9 2070886 1 à 8, prises séparément, caractérisé en ce que l'opération de fractionnement de la benzylpénicilline est poursuivi pendant une durée de 15 minutes à 4 heures.