FR 2060070 A1 19710611 FR 7028134 A 19700730 1 70 28134 2060070 La présente invention concerne de nouveaux polypeptides à action biologique et le procédé de leur préparation. Le brevet spécial de médicament de la deman-5 deresse demandé le 2 octobre 1963 sous le n* F.Y, 163 41Ô concerne de nouveaux polypeptides ayant une forte activité biiLogique répondant à la formule suivante X - Gly - Trp - Y - Asp - Phe - NHg dans laquelle, X représente un des groupes Z Z Z SO,H S0,H SO~H ii i i 3 i 5 i 3 $yr-, Tyr-Thr-, Tyr-Met-, Tyr-Yal-, Tyr-Phe-, Tyr-Nle-, SO,H SO,H SO,H SO,H SO,H SO,H « i 3 i 3 i 3 i 3 i 3 i 3 J Tyr-Abu-, Tyr-ïrp-, Tyr-Tyr-, Tyr- Tyr- et Pyr-Glu-Tyr-Thr; Y représente un groupe méthionyle (Met-), norleucyle (Nie-) ou aminobutyxyle (Abu-) î Z représente un groupe sulfo (HO^S)- ou phosphono (HO-)gOP-2Q ou leurs dérivés protégés, ainsi que le procédé de leur préparation. La demanderesse a découvert que d'autres po-lypeptides, répondant à la formule suivante, présentent une forte activité biologique, et sont plus stables que ceux gtj précédemment connus : R-X-Gly-Trp-Y-Asp-Phe—ÎTHg dans laquelle X représente un groupe thréonyle (Thr-)t métBionyle (Met-), valyle (Val-), phénylalanyle (Phe-), norleucyle (Nie-), aminobutyryle (Abu-), thryptophyle (ïrp^ 30 tyrosyle (Tyr-), glycyle (Gly-) j Y représente un groupe norleucyle ou méthionyle ; R représente un groupe Phe(SO^B ), 3-(4-sulfonyloxyphényl) propionyl- ou suifonyloxycinnamyl- et B représente un atome d'hydrogène, un métal alcalin ou al-35 calinoterreux ou une base organique. Les polypeptides décrits dans le brevet précité agissent sur la vésicule biliaire, les sécrétions biliaires gastriques et pancréatiques et ont un pouvoir hypotenseur. On a également montré que leur activité était 70 28134 2060070 due en particulier au groupe sulfo "bloquant le reste ty-rosyle. Cependant la liaison tyrosine-O-sulfate n'est pas très stable. En pratique, il se produit une hydrolyse spontanée, détachant le reste sulfurique et diminuant l'activité 5 biologique. la demanderesse a trouvé qu'en remplaçant le reste tyrosine-sulfate par'le radical R ci-dessus, caractérisé en ce qu'il contient un groupe p-sulfonylphényle, on conserve une bonne activité et que, de plus, comme la 10 liaison C-SO^H est stable contrairement à la liaison C-O-SO^H, il n'y a plus de baisse d'aotivité par hydrolyse spontanée. Un autre objet de l'invention est constitué par ' les dérivés protégée des polypeptides ci-dessus et le procédé de leur préparation. 15 Les polypeptides de la présente invention peuvent être préparés selon la synthèse connue en chimie des polypeptides, consistant essentiellement en une condensation successive d'aminoacides ou de polypeptides protégés de telle sorte que le polypeptide obtenu comporte la séquen-20 ce d'aminoacides souhaitée. Les aminoacides et les polypeptides que l'on condense successivement, ont leurs groupes amino et carbo-xyles ne devant pas entrer dans la formation de la liaison peptidique, convenablement bloqués par un groupe protecteur 25 que l'on peut éliminer par acidolyse ou hydrogénolyse ou d'autres procédés connus. On peut citer comme exemple de groupes protecteurs utilisés pour protéger le groupe amino : les groupes tosyle (p-toluène-sulphonyle), carbobenzyle (carbo-30 benzyloxy), carbo-t-butoxy, p-nitro carbobenzoxy, trityle (triphénylméthyle), formyle, trifluoro-acétyle et d'autres cçi«ramment utilisés en chimie des polypeptides. On peut citer comme exemple de groupes protecteurs que l'on peut utiliser pour protéger le groupe 35 carboxyle : les groupes méthyle, éthyle, t-butyle, benzyle, p-nitrophényle et autres couramment utilisés à cet effet. La condensation entre le groupe amino d'une molécule et le groupe carboxyle d'une autre molécule pour former la liaison peptidique est réalisée selon les procédés 3 70 28134 2060070 habituels de la chimie des polypeptides, par exemple en utilisant un dérivé acylé activé tel qu'un anhydride mixte, un azide, un p-nitrophénylester et un 2,4,5-trichlorophé-nylester ou par condensation directe entre le groupe amino 5 libre et le groupe carboxyle libre, en présence d'un agent de condensation convenable tel qu'un carbodiimide choisi parmi le dicyclohexylcarbodiimide, le l-cyclohexyl-3-mor-pholinyl-carbodiimide et les autres décrits dans la littérature» 10 La condensation peut être réalisée dans un solvant convenable du groupe des H,N-dialkylformamides , des nitriles aliphatiques inférieurs et des pyridines, par exemple dans le diméthylformamide, l'acétonitrile et la py-ridinejon commencé' la réaction entre -20°C et la tempéra-15 ture de la pièce et on la termine entre la température de la pièce et 35°C, en 10 heures à 10 jours. Le groupe sulfonyle présent dans les polypeptides de la présente invention peut être introduit, selon un procédé connu, en fin de condensation. Sinon , la 20 condensation peut être réalisée en utilisant un dérivé convenable du premier acide de la séquence peptidique qui le contienne. L'invention est illustrée par les exemples suivants donnés à titre purement explicatifs mais nullement 25 limitatifs. EXEMPLE 1 p.Phe(SO^Na)-Thr-Gly-Tr p-Me t-Asp-Phe-ÏÏH2 On a dissous 35 g de L-phénylalanine dans un mélange de 30 ml d'acide sulfurique à 96 $ et 15 ml d'o-^ léum à 60 $. On a chauffé la solution pendant une heure à 100"Cpuis on l'a versée dans de l'eau glacée. On a neutralisé le mélange par de l'hydroxyde de baryum, on a séparé le sulfate de baryum par filtration, puis on a fait passer la solution sur une colonne de 110 g de Dowex. Par évaporation du solvant on a obtenu 26 g de L-p-sulfophénylalanine /p-PheÇSO^H)^ fondant à 312° -313°0 ; -14,6° (0 = 1 dans l'eau) j E5 8 = °»9° Gll:i » El 2 = a.cy. (acide cystéique). 70 28134 ^ 2060070 On a mis en suspension 14»4 g de p.sulfonyl-phénylalanine dans un mélange de 20 ml de soude IN et de 20 ml de dioxanne, on a ajouté 15 ml de formiate de t-buty-lazide, puis on a amené le pH du mélange réactionnel à 9,5 5 par de la soude E4N . On a agité le produit obtenu pendant quatre jours, en maintenant le pH à 9.,5 par addition continue de soude 4N. Après le second jour, on a ajouté de nouveau 10 2 ml de formiate dejt-butylazide. On a finalement évaporé le dioxanne, lavé à l'eau, puis acidifié par l'acide chlorhy-drique 2N, à 0°G. On a extrait la solution par du n-butanol et les extraits dans le butanol ont été évaporés sous vide à 25°C. On a dissous le résidu dans l'acétone anhydre, concen-15 tré à faible volume et dilué par l'éther anhydre. On a obtenu 8,2 g de Boc-p.PheCSO^Na), E^ g = 2,0 Glu ; E^ a.cy. On a caractérisé le produit comme suit : on a dissous un échantillon dans l'acétone anhydre et on a traité la solution pendant quelques minutes à -30°C par un excès de 20 Lowex. Après séparation par filtration de la résine, on a ajouté deux équivalents de dicyclohexylamine. On a séparé le sel de bis-dicyclohexylammonium du Boc-p.Phe(SO^H), fondant à 180°C, /ô7^ = + 31,6° (C = 1 dans le diméthylf ormamide). Le spectre de résonance magnétique nucléaire (diméthylsulpho-25 xyde-d6 ; Yarian A 60) montre une paire de doublets pour S = 7,06 et 7,46 (4H) correspondant à la substitution en para attendue. On a ajouté une solution de 367 mg de Boc-p. Phe(SO^Na) et 110 mg de N-hydroxysuccinimide dans 2 ml de diméthylformamide anhydre 206 mg de dicyclohexylcarbodiimide à -10°C. On a maintenu la solution à -10°C pendant 30 minutes et à la température de la pièce pendant 4 heures» On filtre directement le mélange dans un flacon contenant 791 mg de +H-2-Thr-Gly-Trp-Met-Asp-Phe-NH^, Cl"" (brevet belge 721 891) en utilisant 2 ml de diméthylformamide pour le lavage. '35 On ajoute 0,28 ml de tiiéthylamine et on lais se reposer le mélange obtenu à la température de la pièce pendant 24 heures, on le filtre et on dilue à l'acétate d'éthyle. Le précipité (980 mg) est purifié sur colonne 70 28134 2060070 d'Amberlite. On a obtenu 310 mg de Boc-ptPhe^O^Naî-Thr- Gly- Trp-Met-.Asp-Phe-13H2 » fondant à 220°C, £" ct_7 = -18,6° (c = 1 dans le diméthylf ormamide ) ; g = 0,40 Glu ? E1 g = 0,80 (acide cystéique). On a laissé reposer pendant plusieurs heures à 20°C une solution de 200 mg de Boc-p.Phe(S0^1Ta)-5!hr-Gly-Trp-Met-rAsp-Phe-ÏTHg dans 20 ml d'acide formique à 99 puis on l'a concentrée et diluée par de l'éther anhydre.On a obtenu 160 mg de p.Phe(S0^Fa)-Thr-Gly-Trp-Met-Asp-Phe-UH2» 10 Ei 2 = Glu î Ei 9 = 0,10 Glu ; E^ g = 0,14 Glu. En dissolvant le Boc-p. Phe(SO^ITa)-!Ehr-Gly-Irp-Met-Asp-Phe^ITHg dans le diméthylf ormamide et en traitant la solution pendant quelques minutes à -30°C par un excès de résine Dowex, on a obtenu le Boc-p.Phe(SO^H)-!Ehr-15 Gly-Trp-Met-Asp-Phe-ïTHg correspondant que l'on a séparé de la résine par filtration et dilution par l'éther éthylique anhydre. Le p.Phe(SO^H)-Thr-Gly-Trp-Met-lsp-Phe-NH2 correspondant est obtenu en éliminant le groupe protecteur 20 selon le mode opératoire précédemment décrit. EXEMPLE 2 p.Phe(SO^ÎTa)-lbu-Gly-Trp-ÎTle-Jisp- Phe-NIL, A partir du Boc-lbu-Gly-KH-NIîg £"fonâan',:: à 133° - 135°C ; /â_7 = -6° (c = 0,7 dans le diméthylfor-25 mamide)_7 et du Trp-ÎTle-Asp-Phe-NHg» Pa;r condensation avec un azide (selon le procédé décrit dans le brevet belge 721 891) on^ggbtenu le Boc-lbu-Gly-Trp-ITle-iisp-Phe-KHg , fondant à 194°C/(décomposition) ; [û._J ^ = -26,6° (c = 1 dans le diméthylsulfoxyde). L'hydrolyse acide a 5° donné l'ibu-Gly-Trp-Hle-Asp-Phe-MHg 5 E1 2 = °»49 Glu* On a condensé cet hexapeptide, comme décrit dans l'exemple 1, avec le Boc-p.Phe(SO^îIa), obtenant le Boc-p.Phe(SO^îIa)-J\bu-Gly-Trp-Nle-Asp-Phe-NH2 • /â_7^° = -17° (c = 1 dans le diméthylformamide) ; E^ g = 0,25 Glu, qui, par hydrolyse 35 acide, donne le p.Phe(S0^Na)-iibu-Gly-a]rp-lIle-isp-Phe-ÎIH2 correspondant ; E1 2 - 0r20 Glu ; E^ g = 0,14 Glu. En opérant comme dans l'exemple 1, on a obtenu le p.Phe(SO^H)-Abu-Gly-Trp-Nle-Asp-Phe-NH2 par l'intermédiaire de son dérivé protégé. 70 28134 2060070 EXEMPLE 3 p.Phe(SO^lTa) -Va 1-Gly-Trp-Nle -Asp-Phe -ÎTHg En opérant comme dans l'exemple 2, par condensation du Boc-Val-Gly-ÎIH-l!TH2 , fondant à 86° - 88®C, avec le Trp-Nle-Asp-Phe-NH2 on a obtenu le Boc-Val-Gly-Trp-Nle-Asp-Phe-ITHg fondant à 196° - 198°C (décomposition) , -25,8° (c = 1 dans.le diméthylsulfoxyde), qui donne le Val-Gly-ïrp-ÎJle-Asp-Phe-NHg correspondant j Ei j = 0,48 Glu. La condensation de cet hexapeptide avec le Boc-p.Phe(SOxNa ) donne le Boc-p.Phe(SO,Na)-Val-Gly-Trp-Nle- _20 ^ Asp-Phe-EEg correspondant , [ûj-ft - -19° Ce * 1 dans le diméthylformamide) ; E^ g » 0,23 Glu , qui par hydrolyse acide donne l'heptapeptide libre p.Phe(SO^ÎTa)-Val-Gly-Trp-Nle-Asp-Phe-NHg, 2 = 0,19 Glu ; E^ Q = 0,14 Glu. En opérant comme dans l'exemple 1, on a obtenu le Phe(S O^ H)-Va1-Gly-Tr p-Nle-Asp-Phe-NHg par l'intermédiaire de son dérivé protecteur. EXEMPLE 4 p. Phe (SO^Na ) -Thr-Gly-Trp-Nle-Asp-Phe-lTHg En opérant comme dans l'exemple 2, par condensation du Boc-Thr-Gly-NH-îIHg (point de fusion 129°-130°C,) -7,6" (c = 1 $ dans le diméthylformamide) avec le Trp-îTle-Asp-Phe-NHg, on a obtenu le Boc-Thr-Gly-Trp-Nle-Asp-Phe-EHg fondant à 181-183°0 (décomposition) r -22,5° (o = 1,2 io dans le diméthylsulf oxyde) qui par hydrolyse acide, donne le +H2-Thr-Gly-Trp-Nle-Asp-Phe-NH2,C1" ; E1 2 S 0,5 Glu. La condensation du Boc-p.Phe(SO^Na) avec cet hexapeptide, comme décrit dans les exemples précédents, donne le Boc-p.Phe(SOjîîa)-Thr-Gly-Trp-¥le-Asp-Phe-IÎH2 - -18° (o = 1 dans le diméthylf ormamide). L'hydrolyse par l'acide formique donne l'heptapeptide libre p.Phe(SO^Na)-Thr-Gly-Trp-Nle-Aap-Phe-mîg Ex 2 = o,19 Glu ; E5 8 = 0,14 Glu. En opérant comme dans l'exemple 1, on a obtenu le p.Phe(S05H)-Thr-Gly-Trp-Nle-Asp-Phe-NH2 par l'intermédiaire de son dérivé protégé. 70 28134 7 2060070 EXEMPLE 5 3-(4-aulf onyloxyphényl) -pr opionyl-Abu-G-ly-Trp-Nle-Asp-Bae-BBg On a ajouté 2,060 g de dicyclohexylcarbodi-^ imide à une solution composée de 1,640 g d'acide 3-(4-hy-droxyphényl)propionique et de 1,150 g de N-hydroxysttocini-mide dans 30 ml de dioxanne anhydre, refroidie à 10°C environ. On a laissé reppser le mélange pendant une 10 nuit à la température de la pièce, on a filtré la dicyclohes* xylurée et on a évaporé le filtrat sous vide. Le résidu, repris par l'éther, a • ■ionné 1,510 g de 3-( 4-hydroxyphényl) propionate de N-hydroxysuccinimide fondant à 123*-125°C. On a ajouté 0,390 g de 3—(4-hydroxyphényl) 15 propionate de N-hydroxysuccinimide à une solution constituée de 0,757 g de Abu-Gly-Trp-Nle-Asp-Phe-HH^HCl et de 0,203 g de triéthylamine dans 20 ml de diméthylformamide, refroidie à 0°C. Après une heure de repos à 0°C et 40 heures à la température de la pièce, on a acidifié la solution par une 20 solution aqueuse saturée d'acide citrique et on a versé le mélange dans 700 ml d'eau glacée. Après filtration, on a malaxé plusieurs fois le précipité avec de l'éther, puis avec de l'acétate d'é-thyle. 25 On a dissous le résidu dans le diméthylfor- mamide et reprécipité dans l'acétate d'éthyle. On a obtenu 0,515 g de 3-(4-hydroxyphényl) propionyl-A"bu-Gly-Ir p-Nle-Asp-Phe-ffiî2 fondant à 195°-197°C. Au complexe pyridine-anhydride sulfurique, 30 préparé à -10°C à partir de 10 ml de pyridine anhydre et de 0,6 ml d'acide chlorosulfonique, on a ajouté une solution de 0,210 g de 3 - ( 4-hy dr oxyph é ny 1 ) pr op i o nyl-A b u-Gly-Trp-Nle -Asp-Phe-NHg dans 3,5 ml/ diméthylformamide anhydre. Après 18 heures d'agitation à la température 35 ambiante, on a versé la solution dans 20 ml d'une solution molaire de bicarbonate de sodium. La suspension alcaline formée a été séchée sous vide. Le résidu a été repris par le diméthylformamide, filtré sur plaque poreuse et lavé au diméthylf ormamide . La solution filtrée a été séchée sous vide; 70 28134 2060070 le résidu a été repris par le chloroforme, filtré sur plaque poreuse, lavé à l'éther anhydre et séché. Le produit hrut a été purifié par passage sur colonne d'Amberlite et dilué par une solution d'éthanol à 50 io dans l'eau. On a obtenu 100 mg de produit pur : ^ = 0,64 acide cystéique. EXEMPLE 6 p.suif onyloxy.^— ciimamyl-Abu-Gly-Trp-lIle-Asp-Phe-IIHg Selon le mode opératoire de.l'exemple 5» on a obtenu à partir de 1,660 g dicyclohexylcarbodiimide 1,430 g de p.hydroxyoinnamate de N-hydroxysuccinimide fondant à 189°-191°C. En opérant de la môme manière, à partir de 757 mg d'Abu-Gly-Trp-Wle-Asp-Phe-NHgjHCl et de 390 mg de p-hydroxycinnamate de N-hydroxysucc in imide on a obtenu 470 mg de p-hy dr oxyo i n n a my 1-A bu-Gly-Tr p-NIe-A sp-Phe-NH2 fondant à 208°—210°C. Comme dans l'exemple précédent, on a obtenu 90 mg de produit à partir de 200 mg de p-oxycinnamyl-L-ami-nobutyryl-glycyl-L-tryptophyl-L-norleuoyl-L-aspartyl-L-phénylalanylamide. Ei g = °»64 acide cystéique. Il va de soi que la présente invention n'a été décrite et représentée qu'à titre purement explicatif mais nullement limitatif et qu'elle est susceptible de diverses variantes sans sortir de son cadre. 70 28134 2060070 REVENDICATIONS 1. Procédé de préparation de polypeptides à action "biologique répondant à la formule suivante : R-X-Gly-Trp-Y-Asp-Phe-ÎTH2 5 dans laquelle X est choisi parmi les groupes thréonyle, méthionyle, valyle, phénylalanyle, norleucyle, aminobuty-ryle, thryptophyle, tyrosyle, glycyle ; Y est choisi dans les groupes norleucyle et méthionyle ; 10 R est choisi dans les groupes PheCSO^B), 3-{î-- sulfonyloxyphényl)propionyl- et suifonyloxycinnamyl et B est choisi dans le, groupe, constitué par un atome d'hydrogène, un métal alcalin ou alcalinoterreux et une hase organique, caractérisé en ce que l'on condense 15 un aminoacide ou un polypeptide avec un autre aminoacide ou polypeptide, dont les groupes amino et carboxylique n'entrant pas dans la formation de la liaison peptidique, sont convenablement bloqués par un groupe protecteur convenable, de façon à ce que le polypeptide obtenu ait la séquence 20 souhaitée, la condensation étant réalisée entre -20°C et 35°C pendant une durée de 12 heures à 10 jours. 2. A titre de produit industriel nouveau et de médicament, un polypeptide répondant à la formule R-X-G-ly-Tr p-Y~A s p~Ph e -NH9 25 dans laquelle X est choisi dans les groupes thréonyle, méthionyle, valyle, phénylalanyle, norleucyle, ammnobuty-ryle, thryptophyle, tyrosyle, glycyle ; Y est choisi dans les groupes norleucyle et 30 méthionyle ; R est choisi dans les groupes Phe(SO^B)-, 3-(4-sulfonyloxyphényl)propionyl- et suifonyloxycinnamyl- B est choisi dans le groupe constitué- par un atome d'hydrogène, un métal alcalin ou alcalinoterreux 35 ou une base organique. 3. Le polypeptide répondant à la formule Phe (SO^H)-Thr-G-ly-Trp-Nle-Asp-Phe-îIH2. 4. Le polypeptide répondant à la formule Phe(S0^H)-Abu-Gly-Trp-Nle-A sp-Phe -HHg 70 28134 10 2060070 5» Le polypeptide répondant à la formule Phe ( S O^H ) -Va1-Gly-Trp-Nle -A sp-Phe -NHg • 6. Le polypeptide répondant à la formule Boc-Phe (SO^Hj-îPhr-G-ly-Trp-ÎIle-iisp-Phe-NHg. 5 11 Le polypeptide répondant à la formule Boo-Phe ( SO^H) -Ahu-G-ly-Trp-îne-Asp-Phe-HHg « 8. Le polypeptide répondant à la formule Boc-Phe ( SO^H ) -Va 1-Gly-Trp-Nle-A sp-Phe -NHg. 9. Le polypeptide répondant à la formule 10 p.Phe (S0jUa)-Thr-Gly-Trp-ÎIle-Asp-Phe-IirH2. 10. Le polypeptide répondant à la formule p.Phe(SO^Na)-Abu-Gly-Trp-Nle-Asp-Phe-NHg• 11. Le polypeptide répondant à la formule p. Phe ( SO^Ha ) -Val-Gly-Trp-Nle-A sp-Phe-NHg. 15 12. Le polypeptide répondant à la formule Boc-p.Phe ( S03ïfa ) -Ihr-G-ly-Met-Asp-Phe-NHg. 13. Le polypeptide répondant à la formule p.Phe(SO^Wa)-Thr-Gly-Trp-Met-Asp-Phe-NH2. 14. Le polypeptide répondant à la formule 20 Boc-p.PheCSO^ÎfeO-Thr-Gly-îrp-Nle-Asp-Phe-ÏTHg • 15. Le polypeptide répondant à la formule Bo c-p .Phe ( S O^Na ) -Abu-Gly-Trp-ÏTle-A sp-Phe-NHg. 16. Le polypeptide répondant à la formule Boc-p,Phe(S0^Ha)-Vël-Gly-Trp-ÎTle-Asp-Phe-NH2. 25 17. Le polypeptide répondant à la formule 3-(4-s ulf onyloxyphé nyl)pr opi onyl-Abu-Gly-Irp-Nle-Asp- Phe-îTHg. 18. Le polypeptide répondant à la formule p.s ulf o nyloxyo i n na my 1-Ah u-Gly-Trp-Nle-As p-Phe-ïJHg