FR 2068412 A1 19710827 FR 6935974 A 19691021 69 35974 1 2068412 La présente invention concerne les acides ribonucléiques (hua) et d é so xyribonuclé ï que s (DNA) extraits de tissus humains et chimiquement modifiés, leurs procédés de préparation et les nouveaux médicaments en contenant. 5 On a déjà proposé les acides ribonuulélques extraits de la.levure comme médicaments propres à conférer une résistance aux infections respiratoires d'origine virale, l'invention vise à obtenir des compositions ayant une activité plus importante. On a constaté au cours de travaux préliminaire s que les 10 diverses variétés d'acides ribonucléi' que s ou désoxyribanucléïques, isolément ou en mélange, qui ont été extraites des tissus d'une espèoe animale donnée (par exemple reins de veaux eu embryons de poulets) et qui ont été traitées ensuite de telle façon que les bases puriques ou pyrimidiques qui entrent dans leur composition 15 aient subi des modifications chimiques telles que alcoylation, halogénation, acétylation, action de l'acide nitreuxs oxydation, cette liste de modifications chimiques n'étant pas limitative, présentent la propriété de rendre particulièrement réfractaires à diverses infections les cellules ou tissus de la même espèce 20 animale que celle dont ces acides nucléiques modifiés ont été primitivement extraits, lorsque ces derniers sont mis en présence de ces dites cellules ou tissus» Ainsi, les acides ribonucléïques extraits de rein de veau, puis méthylés, introduits dans le milieu de culture ou se 25 multiplient in vitro des cellules de rein de veau, empêchent le Myxovirus Parainfluenzae I (virus 'Sendaï) de se multiplier dans ces cellules ; une telle multiplication se produit dans le milieu de culture en l'absence d'acides nucléiques modifiés ou en présence des mêmes acides nucléiques non modifiés chimiquement. Ce 30 fait a été démontré de la façon suivante : les acides ribonucléique s totaux extraits de cellules de rein de veau sont méthylés sous l'action de 4 moles de sulfate de métbyXe par nucléotide dans le milieu réactionnel, puis mis au contact des cellules en culture pendant 1 heure à 37°C avant l'inoculation du virus Sendaï? 35 ces acides nucléiques ainsi méthylés inhibent de manière marquée 69 35974 2 2068412 le développement viral„ Si la concentration de la, solution d'acides nucléiques méthylés atteint 70o1Ô-^ g/ml ou plus9 l'inhibition de la multiplication virale est totale« Ce phénomène est en corrélation avec l'apparition dans les cellules de rein de veau de substances connues dans la littérature scientifique sous le nom cPi'nterférons", mais il n'est pas exclu que d1 autres facteurs interviennent dans le phénomène de protection,- Des manifestations analogues ont été observées dans le cas où les acides ribonucléïques ont été extraits à partir de poulet et où le virus étudié est le virus Sindbis connu pour se multiplier aisément dans les fibroblastes de poulet ; ici encore lorsque les acides ribonucléïques modifiés sont introduits dans le milieu de culture à la dose de 100„10~^ g/ml l'effet inhibiteur sur la multiplication virale est très important ? cet effet inhibiteur devient total lorsque la concentration utilisée est égale à 200 010"^ g/m! ou plus<> Dans les essais mentionnés ci-dessus, les acides ribonucléïques utilisés étaient des acides ribonucléïques "totaux", 2© c'est-à-dire des mélanges des diverses sortes d'acides ribonucléïques existant dans les cellulesf notamment d'acides nucléiques dits "ribosomiques" e* d'acides nucléiques dits "de transfert"» On a séparé les unes des autres ces deux variétés d'acides ribonucléïques „ Après méthylations on a constaté que les unes et les 25 autres, aux mêmes concentrations pondérales, présentaient exactement les mêmes propriétés biologiques que les mélanges. On a étudié l'influence des diverses modifications chimiques apportées aux acides ribonucléïques9 ribosomiques d'une ' partç, de transfert d'autre part? préparés à partir de poulet, sur 59 la multiplication du virus Sindbis» Un effet inhibiteur a été constaté dans tous les cass que la, transformation chimique soit la méthylation, 1'allylation, 1 ' acétylation, la désamination par l'acide nitreux, l'oxydation par 1'acide monoperphtalique, la bromuration, la chloruration, l'ioduration. Pour une variété bad original 10 15 69 35974 3 2068412 donnée d'acide ribonucléïque modifié l'effet inhibiteur constaté est d'autant plus marqué que la quantité d'acide nucléique modifié introduite dans le milieu de culture cellulaire est plus élevée, jusqu'à une concentration limite pour laquelle l'effet inhibiteur 5 maximal est atteint. La concentration optimale varie suivant les cas entre 20.10""® g/ml et 100.10""® g/ml. Les propriétés conférant la résistance vis-à-vis de la multiplication virale, telles qu'elles sont décrites ci-dessus ne sont d'ailleurs pas particulières aux acides ribonucléïques modi~ 10 fiés } elles appartiennent également aux acides désoxyribonucléï-ques lorsque ces derniers ont subi des traitements chimiques analogues, notamment une méthylation. On a ainsi constaté que le développement du virus Sindbis est inhibé dans les fibroblastes de poulet, lorsque ces dits fibroblastes ont été mis en contact pen-15 dant deux heures à 37°C avec une solution de 9 grammes de chlorure de sodium par litre, contenant des concentrations comprises entre 10,10"® g/ml et 50,10*"® g/ml d'acide désoxyribonucléïque extrait de poulet, puis méthylé, De même, l'acide désoxyribonucléïque, méthylé par action du sulfate de méthyle à raison de 4 moles par 20 nucléotide dans le milieu réactionnel, présente la même activité que l'acide désozyribonucléïque méthylé par action de 6 moles de sulfate de méthyle par nucléotide, alors que l'acide déaosQrribo-nuoléïque "natif", n'ayant pas subi l'action du sulfate de méthyle est inopérant. Il a été enfin constaté que l'acide désoxyribo-25 nucléique présente pour une même concentration pondérale, un effet inducteur de résistance au développement viral identique à celui des acides ribonucléïques méthylés par l'action de 4 moles de sulfate de méthyle par nucléotide. Une concentration de 50,10 ® g/ml suffit pour inhiber à 80 $ la multiplication du virus. 30 Les propriétés des acides ribonucléïques modifiés et celles des acides désoxyribonucléïques modifiés étant analogues, on a recherché s'il en est de même dans le cas du mélange de ces deux variétés de substances. On a ainsi constaté qu'il n'existe aucune différence d'effet inhibiteur à l'égard du développement 35 du virus Sindbis dans les fibroblastes de poulet aux mêmes concentrations pondérales, entre 1: acide ribonucléïque. modifié} b9 35974 4 2068412 l'acide désoxyribonucléïque modifié, le mélange modifié d'acide désoxyribonucléïque (30 %) et d'acide .ribonucléïque. (70 fa) extraits de poulet, la modification ayant été obtenue par l'action de 4 moles de sulfate de méthyle par nucléotide, 5 II ressort de ces études que les substances naturelles dites "acides nucléiques" extraites des tissus d'une espèce animale donnée, sont capables d'induire dans les cellules de la même espèce animale un état de résistance vis-à-vis de diverses infections virales, lorsque ces. substances ont subi des modifica-tions chimiques diverses capables d'altérer les bases puriques ou pyrimidiques entrant dans leur composition. On a maintenant constaté, et c'est ce qui fait l'objet de la présente invention, qu'il en est de même dans le cas de l'espèce humaine, et que les acides nucléïques d'origine humaine, isolément ou en mélange, tels 45 qu'on peut les préparer par exemple à partir des leucocytes du sang ou des tissus placentaires, et après qu'ils aient été chimiquement modifiés, sont capables lorsqu'ils sont utilisés chez l'homme à des fins thérapeutiques, d'augmenter la résistance vis-à-vis d'infections virales de types très divers, notamment de 20 celles connues pour être sensibles aux substances de type "interférons". On peut donc soit prévenir une infection par un traitement approprié pendant la période d'incubation, soit en modifier favorablement le cours, la présente invention comprend également un procédé de 25 préparation de nouveaux médicaments qui consiste à soumettre, isolément ou en mélange, à des réactions chimiques telles que alkylation, notamment méthylation, éthylation, allylation, acyla-tions notamment acétylation, désamination, oxydation, halogénation, les acides ribonucléïques et désoxyribonucléïques extraits des 30 tissus humains, La caractéristique essentielle de l'invention ne réside pas dans des réactions chimiques particulières appliquées à des acides nucléiques mais, d'une manière générale, dans toutes les réactions chimiques appliquées aux acides ribonucléïques et d é so xyribonuclé ï que s extraits des tissus humains à condition 5g qu'elles ne modifient pas profondément la structure générale de ces acides, niais provoquent cependant des modifications dans les bases puriques ou pyrimidini que s constituant ces acides® BAD ORIGINAL 69 35974 5 2068412 l'extraction des acides ribonucléïques et désoxyribo-nucléïques des tissus d'origine humaine peut avoir lieu suivant tous procédés connus, en particulier au moyen de phénol, de phénol saturé d'eau, de phénol saturé de solutions tampons» Après 5 extraction des tissus, on peut utiliser pour la réaction chimique ultérieure, soit les acides ribonucléïques ou désosyribonucléïques totaux, soit des acides particuliers isolés des précédents tels que les acides nucléiques dits "ribosomiques" et les acides nucléiques dits "de transfert", 10 les tissus d'origine humaine utilisés peuvent être très divers, mais il est indiqué d'utiliser les tissus dont on peut disposer de manière courante tels que les placentas ou les leucocytes du sang. les exemples suivants sont donnés à titre non limitatif;. 15 Procédés de préparation Exemple 1 a) Broyage de placentas Après prélèvement, des placentas sont lavés au sérum physiologique puis immédiatement congelés à -20°C. le broyage est 20 effectué dans le gobelet en verre d'un Mixer type "Tumis:'5 où l'on introduit successivement différents éléments dans les proportions suivantes : - 100 g de tissu congelé préalablement découpé en petits morceaux, - 200 ml de tampon trishydroxyméthyl amino méthane (désigné 25 ultérieurement sous le nom de Tris) -HC1 10~%1 pH 7S3, MgClp 10~2M, - 0,25 % de produit connu sur le marché sous le nom de Oémulsol ÎJPT6 comme agent tensioactif, - 300 ml de phénol saturé (par le tampon ïrls, MgClgprécédent), 30 additionné extemporanément de 1 fô de 8-hydroxyquinoléine. Ce dernier mélange sera désigné ultérieurement sous le nom de "phénol 76 69 35974 6 2068412 Le tissu est broyé à 3 reprises pendant 1 minute aveo une minute d'intermittence» Cette opération est répétée 10 fois pour broyer 1 kg de placenta. L'homogénat obtenu est additionné de 0,3 f> de dodécylsulfate de sodium et soumis à extraction en 5 vue de 1!obtention du RUA. L'émulsion précédente est soumise à 3 extractions successives à 4°C s v 1ère extraction s agitation pendant une heure, centrifugation 1© pendant 15 minutes à 2000 tours/minutes, prélèvement de la phase aqueuse et de la phase intermédiaire | le culot de centrifugation est mis à part. 2ème extraction : addition d'un volume égal de phénol 76 f> aux phases aqueuse et intermédiaire précédentes, agitation de la 13 suspension pendant 45 minutes, centrifugation, prélèvement de la phase aqueuse uniquement. 3ème extraction, ; addition d1 un 1/2 volume de phénol 76 f> à la phase aqueuse précédente, agitation de la suspension pendant 30 minutes3 centrifugation,, prélèvement de la phase aqueuse„ 23 Les acides nucléiques sont précipités à partir de la phase aqueuse finale par addition de 2 volumes d'éthanol, en présence de HaCl 0S 1 M» Après précipitation complète (4 à 16 h à -20°) 5 le culot est centrifugé, dissous dans ÏTaCl 10™^ M puis reprécipité par 2 volumes d!éthanol9 II est conservé à -20°C. 25 Les acides nucléiques ainsi obtenus contiennent 75-80 fo de KM, et 20-25 f> de DHA, Ce dernier est éliminé par action de la désoxyribonucléase dans les conditions suivantes ; le précipité formé par les acides nucléiques est dissous dans un minimum de tampon Tris-HCl ICT2!^ MgCl2 10~2M à pH 7?3. On fait agir la 3© désoxyribonucléase à raison de 0S1 jj,g/ml à 4°C pendant 20-30 minutes x après refroidissement de la solution dans la glace fondante 3 on procède à une extraction par 1/2 volume de phénol 76 fo dans le but d'éliminer les protéines enzymatiques $ finalement le BEA est précipité à partir de la phase aqueuse par 69 35974 7 2068412 addition de 2 volumes d'éthanol en présence de ïïaCl 0,1 M ; le précipité de BEA est débarrassé des traces de phénol par 2 ou 3 lavages successifs par le mélange éthanol-eau (70 : 30 v/v). c) méthylation A une solution des acides nucléiques ainsi obtenus dans NaCl 10 "II, on ajoute avec précaution et sous agitation 0,05 volume d'acétate de potassium 8 M de manière à obtenir une solution 0,4 M en acétate de potassium, le sulfate de méthyle redistillé a été ajouté dans la proportion de 4 moles par nucléotide. la réaction n'étant pas immédiate, on la laisse se poursuivre pendant 22 h à 4°0. la réaction étant terminée, les acides nucléiques méthylés sont précipités par 2 volumes d'éthanol en présence de 2 d'acétate de potassium, le précipité est centrifugé et lavé à deux reprises avec le mélange éthanol -ITaCl 0, 1 M (2 : 1 v/v) puis redissous dans ITaCl 10"%. la solution obtenue contenant de 1 à 2 mg/ml de BÏÏA méthylé est dialysée contre l'eau à 4°C pendant 16 à 24 h, puis lyophilisée. Exemples 2 à 4 On procède comme à l'exemple 1 mais utilise au lieu de 4 moles de sulfate de méthyle par nucléotide utilisées au dernier paragraphe respectivement 2, 6 et 8 moles par nucléotide. Exemple ,5 le culot de centrifugatipn obtenu lors de la 1ère extraction du ÏÏNA par le phénol dans l'exemple 1, et qui a été mis _p à part, est remis en suspension dans un tampon Tris-HCl 10 M _ — ? pH 7, 3, MgClg 10 M, à raison de 500 ml pour un culot correspondant à 100 g de tissu. On ajoute 2,5 fi de dodécylsulfate de sodium et agite vigoureusement durant 5 à 10 minutes, la suspension visqueuse est soumise à 2 extractions phénoliques à la température ambiante. 1ère extraction î addition de 1 volume de phénol 7agitation pendant une heure, centrifugation, prélèvement de la phase aqueuse. 69 35974 3 2068412 2ème extraction : addition de 1/2 volume de phénol 7agitation pendant 30 minutes, centrifugation, prélèvement de la phase aqueuse. le DNA est précipité par addition de 2 volumes 5 d'éthanol à la phase aqueuse finale ; les fibres sont recueillies, lavées successivement dans l'éthanol à 75, 85 et 95° et dissoutes dans ETaCl 10"*^ M; la solution obtenue présente une turbidité qui est dûe à la présence de glycogène. 0e dernier est éliminé par une centrifugation dê 2 heures à 105.000 g. 10 la solution de DEJA ainsi préparée est contaminée par 5-7$ de protéines. Ces dernières sont réduites à moins de 0,5 f> par 2 traitements successifs par le mélange chloroforme - alcool isoamylique (24 : 1 v/v). la concentration ionique de la solution renfermant 0,5-1 mg de DKA par ml est élevée à 0,1 M en NaCl ; 15 on procède ensuite à une agitation pendant 15 minutes aveo 1 /2 volume de mélange chloroforme - alcool isoamylique. Après centrifugation pendant 5 minutes à 2000 tours/minute, la phase aqueuse supérieure est prélevée et soumise à un deuxième traitement effectué dans les mêmes conditions. Finalement, les fibres de 20 MA sont reprécipitées par addition de 2 volumes d'éthanol à la phase aqueuse finale, le DHA ainsi obtenu est méthylé comme le BNA dans l'exemple 1 mais les fibres sont recueillies et lavées successivement dans l'éthanol 75» 85 et 95° avant d'être redissoutes dans UaCl 10"% puis dialysées contre ÎJaCl 10"*%. Après 25 une nouvelle précipitation par 2 volumes d'éthanol, les fibres sont recueillies et placées dans un dessicateur pendant 24 heures. Exemple 6 Des acides ribonucléïques'sont préparés comme à l'exemple 1 ils sont ensuite transformés en sels de triméthyl-3© hexadécylammonium. dans les conditions suivantes î à un volume de la solution dans NaCl 10"% d'acides nucléiques, on ajoute un volume de solution de bromure de triméthylhexadécylammonium de manière à ajouter une quantité légèrement supérieure à la quantité stoechiométrique9 Après 5 minutes d'agitation ménagée, le 35 précipité obtenu est centrifugé puis lavé trois fois par centrifugation aveo 2 volumes d'eau pour éliminer le sel d'ammonium en 69 35974 9 2068412 excès» Les précipités non séchés de nucleates d?ammonium quaternaire sont ensuite dissous dans 2 volumes fie diffiêthylfor» mamide (ce qui permet d'obtenir une solution renfermant de 0,5 à 1 mg d'acides nucléiques par ml) par une agitation, mécanique violente. On ajoute ensuite 10 moles de "bromure d'allyle par nucléotide. Après agitation, on laisse 22 heures à 4°C« Los acides nucléiques allylés sont ensuit® précipités par 2 volumes d'éthanol en présence de 2 fo d'acétate d© potassium. Le précipité est centrifugé et lavé à 2 reprises avec le mélange éthanol - ITaOl 0,1 M (2 : 1 v/v) puis redissous dans MaCQ. 10"*%. La solution obtenue contenant de 1 à 2 mg/ïïûL de RM est dialyse© contre l'eau à 4°C pendant 16 à 24 h, puis lyophilisés» Exemples 7 et 8 On procède comme à l'exemple 6 mais utilise au lieu des 10 moles de bromure d'allyle par nucléotide utilisées au dernier paragraphe respectivement 50 et 60 moles par nucléotide* Exemple .9 On prépare comme à l'exemple 5 des acides DMA j ceux-si sont allylés comme dans l'exemple 6 mais les fibres sont recueillies et lavées successivement dans l'éthanol à 75* 85 et 95° avant d'être redissoutes dans HaCl 10*"% puis dialysées contre ÏTaCl 10""%, Après une nouvelle précipitation par 2 volumes d'éthanol, les fibres sont recueillies et placées dans '«n dessicateur pendant 24 heures. Exemple 10 A une solution de EITA dans la diméthyl formaroide préparée comme dans l'exemple 6 on ajoute des quantités calculées égales en volume de tributylamine, de dioxane et d2 ajïbydride acétique de manière à avoir 30 moles de ce dernier- réactif par nucléotide. Après agitation, on laisse pendaat 20 heures à la température ordinaire (20°C). La durée de réactioa étant écouléej, les sels de sodium des acides nucléiques aeétylés sont précipités 69 35974 to 2060412 à partir des solutions organiques par aâ&itioa. d'iœe solution ds laCl 3 M (1/10 du volume total)ê Aprbs centrifugationt le culot est lavé , deux fois aveo le mélang© Ithaîiol -EaOl 0, 1 M (2 s 1 y/y) puis redissous dans HaCl 10"*%e la solution obtenue est dialyse© contre de l'eau à 4°C, puis lyophiliséeQ On procède comme à 18 exemple 10 mais utilise au lieu de 30 moles d'anhydride acétique respectivement 10 et 15 moles de oe réactif avec des volumes égaux de tributylamine et de dioxane* Exemple 15 A une solution dans ïTaC'X tO'"*7!'! de MA obtenu comme à l'exemple 1, on ajoute avec précaution et sous agitation 0,1 volume d'acétate de sodium 2,5 Mj pïï 4,3 (de manière à obtenir une solution 0,25 M). le RUA est ensuite traité par 0,1 volume dsune solution préparée ext emporanément de nitrite de sodium 3 M, le mélange réactionnel est agité pendant 24 heures à là-température ambiante, les acides nucléiques modifiés sont précipités par 2 volumes d8 éthanol en présence de 2 fa d8 acétate de potassium, le précipité est centrifugé et lavé à 2 reprises avec le mélange éthanol -HaO'l 0, 1 I (2 ! 1 y/y) puis redissous dans ITaOl i0""%, la solution obtenue contenant de 1 à 2 ag/ml de MA est dialyse© contre l'eau à 4° pendant 16 à 24 h, puis lyophilisée. Exemple 14 On opère comme à 1'exemple 13 mais ©a remplaçant le 0,1 volume utilisé d8une solution de nitrite de sodium 5M pas3 0,2 volume de cette même solution^ Exemple 15 '«T:- »■ ».nftwa. i.tfSa On opère comme à l'exemple 13 mais remplace la solution de EîTA utilisée par une solution dans laCl 10°°% de DNA obtenue Gomme dans la première partie de 111 exemple 5 % les fibres sont recueillies et lavées successivement dans l'éthanol. à 75» 85 et 69 35974 h 2068412 95° avant d'être redissoutes dans UaCl 10""% puis dialysées contre ÎTaCl 10~%. Après une nouvelle précipitation par 2 volumes d'éthanol, les fibres sont recueillies et placées dans un dessicateur pendant 24 heures. Exemple 1 6 Une solution dans NaCl 10""% de RNA obtenu selon le procédé de l'exemple 1 est rendue 10 M en tampon phosphate pH 7 _2 4*+ et 10 M en Mg 0 On ajoute une solution aqueuse d'acide monoperphtalique, ajustée à pH 7 et contenant 2,5 moles d'acide monoperphtalique par mole de nucléotide, et laisse la réaction d'oxydation se poursuivre pendant 5 heures à 22°Ci la réaction étant terminée, les acides nucléiques modifiés sont précipités par 2 volumes d'éthanol en présence de 2$ d'acétate de potassium, le précipité est centrifugé et lavé à 2 reprises avec le mélange éthanol -ÎTaCl 0,1 I (2 : 1 v/v) puis redissous dans ÎTaCl 10""%. La solution obtenue contenant de 1 à 2 mg/ml de RFA modifié est dialysée contre l'eau à 4aC pendant 16 à 24 heures, puis lyophilisée. Exemples 17 et 18 On procède comme à l'exemple 16 mais en utilisant 7» respectivement 11,5 moles d'acide monoperphtalique au lieu de 2,5 moles. Exemple 19 i On oxyde par l'acide monoperphtalique comme à l'exemple 16 un DNA obtenu selon le procédé décrit dans la première partie de l'exemple 5 et termine comme à l'exemple 15. Exemple 20 Une solution de ribonucléate de triméthylhexadécyl-ammonium dans la diméthylformamide obtenue selon le procédé décrit à l'exemple 6 est déshydratée par passage sur silicoaluminate de sodium. On ajoute une quantité de brome 69 35974 12 2068412 préalablement dissous dans la diméthylformamide correspondant à ■une mole de brome par nucléotide» Après 30 secondes à une minute de réaction, la régénération du ribonucléate de sodium modifié est effectuée avec une solution de ÏTaBr dans la diméthylformamide 5 (1/4 du volume total) afin d'éviter l'introduction d'eau dans le milieu réactionnel. Après centrifugation, le culot est lavé deux fois avec le mélange éthanol -NaCl 0,1 M (2 : 1 v/v) puis redissous dans NaCl 10 JM. La solution obtenue est dialysée contre de l'eau puis lyophilisée* 10 Exemples 21 et 22 On procède comme à l'exemple 20 mais en utilisant 0,5, respectivement 4 moles de brome par nucléotide. Exemples 25, 24 et 25 On procède comme à l'exemple 20 mais en remplaçant le 15 brome par la ïï-chloro succinimide et en utilisant 1,5 ou 15 moles de ÎT-chlorosuccinimide par nucléotide. Les sels de sodium des BïTA • modifiés sont cependant régénérés par des solutions aqueuses de NaOl 3 M (1/10 du volume total) plutôt que par une solution organique de ïTaBr, 20 Après régénération des sels de sodium des acides nucléiques, on procède à une centrifugation de ces derniers. Les culots sont lavés deux fois avec le mélange éthanol -ÏTaCl 0^ • 1 M(2 ; 1 v/v) puis redissous dans NaCl 10"*%. Les solutions obtenues sont dialysées contre de l'eau puis lyophilisées. 21 Exemple 26 6 y f •' ^1 in» ii ii i ^III Du chlorure d'iode en solution dans la diméthylformamide est ajouté à une solution de MA dans le même solvant, obtenue comme à l'exemple 6, à la concentration de 2 moles de ICCL par nucléotide dans le mélange réactionnel. Après 2 heures de réaction 30 à 4°0j, le BÏTA est régénéré à partir de la solution organique par addition d'une solution de NaOl 3 M (1/10 du volume total). Après 69 35974 13 2068412 centrifugation, le culot est lavé deux fois avec le mélange éthanol- lîaCl 0, 1 M (2 : 1 v/v) puis redissous dans ïïaCl 10""%, la solution obtenue est dialysée contre de l'eau à 4° puis lyophilisée. 5 Exemples 27 et 28 On procède comme à l'exemple 26 mais en utilisant 4, respectivement 6 moles de ICI par nucléotide0 Caractères phvsicochimiaues et analytiques les acides nucléiques extraits des tissus humains sont 10 solubles dans lîaCl 10"*%. la dissolution des BM est facile, celle des DNA nécessite une agitation douce et un temps cl® dissolution de 48 h au minimum, les acides nucléiques étant dissous on peut9 sans inconvénient, élever la concentration, ionique fies solutions (par exemple jusqu'à 0,2 M en ÎTaCl, en citrate, etc*. • ) » les Î5 solubilités maximales sont les suivantes s HNA ï 5 mg/ml. Au-delà il s'agit de suspensions, DNA S à partir d'une concentration de 500 (ig/ml, les solutions sont visqueuses. De3 études ont montré que-l'intégrité moléculaire des 20 acides nucléiques (hétérologues ou homologues modifiés) n'était pas indispensable pour produire un effet inhibiteur contre l'infection virale» D'autres travaux, notamment ceiis de Kâ¥ADE et TJJIHARA (îTature 1969, ,221. 569)» montrent que les MA ayant subi une hydrolyse alcaline ou l'es mélanges de mononucléotides 25 sont inactifsi Ces faits indiquent qu'une certaine structure polyribonucléotidique est nécessaire pour lsexpression de l'activité biologique recherchéej les MA et DlîÀ de placenta ont été soumis à diverses méthodes de contrôlée a) Méthode spectrophotométrique 30 les MA et MA extraits à partir de placenta présentez?* un spectre d'absorption dans l'ultraviolet qui est caractéristique des acides nucléiques, c'est-à-dire présentani* ua minimal 69 35974 H 2068412 d'absorption à 250 mp, et un maximum à 260 mp,l Les rapports des densités optiques SS.J3; ,^PP, ffA sont également en accord avec les DO à 260 mp. valeurs généralement admises pour les acides nucléiques® b) Ult rac ent rifugat i ons f - Détermination des constantes de sédimentation La constante de sédimentation est directement reliée à la masse moléculaire et elle dépend des dimensions de la particule en solutions Les mesures des coefficients de sédimentation (S) ont été réalisées en utilisant la méthode d5absorption @ en Uî avec des cellules en KelP0 -Centrifugation des acides nucléiques dans un gradient linéaire de concentration en saccharose Les solutions d'acides nucléiques déposées à la surface dsua gradient de saccharose puis centrifugéesmigrent à des | vitesses différentes suivant la masse et la forme de leurs mole-' cules. On a réalisé les centrifugations dans une ultracentriru-geuse'préparative pendant 16 heures à 4° aveo des gradients linéaires de concentration de saccharose de 20 à 5 p.100» Les B1TA présentent un profil polydisperse correspondant 9 à des- molécules qui possèdent des constantes de sédimentation comprises entre 30 et 4 S» Les DEA apparaissent sous forme de pics unique® caracté~ ristiques qui sédimentent essentiellement entre les concentrations de 9 à 13 fâ en saccharose» Les mesures d1 ultracentrtfiigation 5 analytique permettent d'attribuer aux DMA une constante de sédimentation de 15 S environ. Analyse des acides nucléiques modifiés L'analyse des BEA et des DHA chimiquement modifiés a été effectuée par chromatcgraphie bidimensiormelle sur papier 9 Whatman 1C Le procédé d'hydrolyse et les solvants utilisés sont variables suivant la modification, considéréec La nature et le taux des modifications chimiques obtenues en fonction du nombre de moles de réactif introduites dans le milieu, réactionnel sont donnés dans le tableauQ Suivant la natiîra et le taux de la, 3 modification chimique9 on obserr© ta® déstabilisation plus ou. 69 35974 15 206B412 moins importante de la structure secondaire visible par l'altération des courbes de fusion. Pour des taux de modification très élevés, on assiste à des coupures de la molécule d'acide nucléique, les caractères de solubilité des acides nucléiques modifiés sont 5 identiques à ceux des MA et des DNA non modifiés NATURE ET TAUX DES MODIFICATIONS CHIÏÎIQUES OBTENUES AVEC LES RNA et DNA EXTRAITS DE PLACENTAS HUMAINS, EN PONCTION DU NOMBRE DE MOLES DE REACTIP INTRODUITES DANS LE MILIEU REACTIONNEL. 10 en milieu aqueux Modification Moles de réactif pai ; Nature et touchées pourcentage des bases nucléotide Adénine Guanine Cytosine 15 1-méthyl-adénine 7-méthyl-guanine 3-méthyX-cytosine 20 Méthylation par le sulfate de méthyle 2 4 6 traces 5 à 12 10 à 15 10 15 à 25 20 à 30 traces traces 8 45 à 55 17 8 à 12 hypoxanbhire xanthine uracile 25 Désaninatloi par l'acide nitreux 50 100. 1 à 2 3 à 4 1 à 2 3 à 4 2 4 à 5 30 1-hydroxy-adénine(A) destruction de l'adénine (B) A B Destruction de la guanine 1-hydro xy-cytosine(C) destruction de la cytosine (D) C D 35 Oxydation par l'acide monoperphtalique 2,5 7 11,5 16 14 27 22 34 23 13 29 34 5- 9 12 17 16 18 ! 1 69 35974 '« 2868412 NATURE ET TAUX DES-MODIFICATIONS CHIMIQUES OBTENUES AVEC LES BNA ET DNA EXTRAITS DE PLACENTAS HUMAINS, EN FONCTION DU NOMBRE DE MOLES DE REACTIF INTRODUITES DANS LE MILIEU REACTIONNEL. en milieu diméthylformamide 25 30 IModificatiorj Moles de . ; j . réa,ctif ! ! i par I ! i nucléotide Nature et pourcentage des bases touchées 10 I iBromuration ••par le brome 15 j Chlo ruratlon jpar la N-'chlorosuc-icinimlde l I 20 » îloduration ; ;par le chlo-p •rure d'iode ;Allylation par le bromure d'aUlyle Acétylation par 1 ' anhy-idride acé-j tique 1 4 10 50 60 10 15 30 Guanine 8-bromo-guanine 30 à 35 70 à 80 Cytosine 5-bromo-cytosine 5 à 10 20 à 35 Uracile (dans le cas des RNA) 5-bromouracile 13 80 Destruction 1 j 2 à 4 5 ! 25 15 i 35 ! 7-allyl- guanine 4 à 6 6 8 6-acétyl-cytosine 53 62 65 5-chloro uracile ' - - i _ I 2 à 3 1 1 i 20 1 i 5-iodo-6—hydro* 1 j xy-5 » 6-dihydro- i uracile - 7 40 55 bad original 69 35974 17 2068412 les résultats sont exprimés par le rapport ; molesbase modifiée 1Q0 mol* base 'intacte +" moles ^se°°Sîifiés" La.thymine, dans le cas des DM, n'est pas touchée au 5 cours des réactions mises en oeuvre. Propriétés pharmaco logique s la toxicité des MA et DM modifiés a été étudiée sur le MA méthylé de placenta humain, le DM méthylé de placenta humain et un mélange constitué par 75 f° MA méthylé de placenta humain» 10 et 25 f> DM méthylé de placenta humain. Par la voie orale, les trois produits ont été administrés en suspension dans un mucilage de gomme arabique à 10 /&. Le DM modifié d'origine placentaire après une pulvérisation grossière, est insoluble dans l'eau, à la concentration de 0,06 f>, 15 Par contre, les deux autres produits ont été mis en solution aqueuse, en 48 heures, à la concentration de 0,25 % et les solutions ont été rendues isotoniques par adjonction de QUîa immédiatement avant les injections. Chez la souris, les acides nucléiques, le MA et le mélange "MA plus DM" méthylés sont 20 atoxiques à la dose de 3.000 mg/kg p.o. et à celle de 125 mg/kg i.v. Le DM méthylé d'origine placentaire est atoxique à 1.500 mg/kg p.o. Enfin, quelle que soit la voie d'administration, aucune symptomatologie n'est induite, chez la souris, par ces acides nucléiques modifiés, / 25 A titre d'exemples, on indique ci-dessous l'action d© quelques acides nucléiques modifiés du placenta humain sur divers virus et la formation de fortes concentrations d! inter-féron dans les leucocytes humains en culture, 1) Les acides nucléiques extraits du placenta humain, puis méthylés 30 à. raison de quatre moles de sulfate de méthyle par nucléotide dans le milieu réactionnel, inhibent le développement du virus de l'herpès, du virus de la stomatite vésieuleuse et du virus Sindbis dans les cellules diploi'des humaines en culture. ;4 69 35974 •« 2068412 les essais ont été conduits de la façon suivante» Des cellules diploïdes humaines sont cultivées en couche monooellu— laires sur une surface de 30 cm2» Lorsque le tapis cellulaire recouvre toute cette surface.» on introduit dans le milieu de 5 culture des doses croissantes d'acides ribonucléï que s placentaires humains méthylés. Quatre heures plus tard, on change le milieu et on inocule le flacon avec une quantité de virus choisi telle que, dans des flacons témoins où n'ont pas été introduits d'acides nucléiques, ou bien dans lesquels ont été introduits des acides 1© nucléiques natifs, non modifiés, on décompte une cinquantaine de plages de nécrose après quarante-huit heures de culture à 37°0» On constate ainsi que la concentration de 200,10"^ g/ml dfacides nucléiques méthylés inhibent à 95$ le développement viral. Des résultats identiques sont obtenus avec de l'acide 15 déso,iyribonucléique placentaire humain, après méthylation ou enctre' aveo un mélange d'acides ribonucléïques et d'acide désoxyribonucléïque méthylés dans la proportion relative 70 f>, 30 2) Les acides nucléiques extraits du placenta humain, puis méthylés à raison de quatre moles de sulfate de méthyle par E3 nucléotide dans le milieu réactionnel, induisent dans les leucocytes humains en culture» la formation de fortes concentrations d'interféron. On introduit dans une préparation de leucocytes g humains contenant 10 cellules par centimètre cube » des acides ribonucléïques placentaires humains méthylés à la coneentrat ion de 100,10~6 g/mla Après douze heures d'incubation à 37°Ciî on. titre les substances de type interféron apparues dans le milieu0 Pour cela on fait des dilutions progressives de ce milieu et on détermine la dilution la plus élevée, qui, introduite dans le milieu de culture de cellules diplal'àes humainess inhibe à 50 f> le développement du virus Sindbis 0 On trouve ainsi que les dilutions ayant cette propriété sont comprises entre 1 /25'S et 1/512* Les mêmes observations sont faites aveo Ie acide &ad original 3g 4o d? •"P.-3 69 35974 19 2068412 dêso:xyr ibonucléique placentaire, humain, méthylé, ou le mélange (70r/ôf 30/j) d'acides ribonucléïques et désosyribonucléïques placentaires, humains, méthylés. les acides nucléiques "natifs", non chimiquement trans-5 formés sont sans effet. Applications thérapeutiques les acides nucléiques modifiés selon l'invention permet-tent de prémunir les cellules des voies aériennes supérieures contre la contamination par les virus des grippes, en période 10 d'épidémie. Ils peuvent être utilisés en injections parentérales et dans ce cas, être' présentés en solutions rendues isotoniques par addition de sels. Pour l'usage externe, on pourra égalerient utiliser des 15 solutions analogues, soit en instillations (collyres, collutoires), soit en bains ou applications humides, soit sous la forme d'aérosols. On pourra également présenter ces substances sous forme sèche, finement pulvérulente, à utiliser soit directement par saupoudrage ou pulvérisations, soit après mise en solution 20 ou en suspension dans des liquides appropriés. Tant pour les injections parentérales que pour l'usage externe il sera souvent utile d'employer des solutions aussi concentrées que possible, à la limite de la solubilité, mais il sera nécessaire de tenir compte de la viscosité des solutions. 25 A titre indicatif la concentratiofi de l'ordre de 1 centigramme par centimètre cube parait une concentration moyenne généralement avantageuse ; mais cette concentration pourra éventuellement, si on le désire, être largement augmentée ou au contraire abaissée. Pour l'usage externe, les concentrations optimales au 30 niveau des tissus, sont comprises entre un dixième de milligramme et un milligramme par centimètre cube. Pour les injections paren-térales la dose injectée en une fois à un homme adulte est de l'ordre de un centigramme* Une dose dix fois moindre manifeste encore de l'activité, mais il peut être utile dans certains cas 35 de l'élever plusieurs dizaines de fois. 69 35974 30 2068412 L'usage de collyres permet d'arrêter dans son développement la kératite herpétique. L'injection parentéraie chez le nourisson pendant l'incubation de maladies à virus (rougeole par exemple) diminue la gravité de l'infection® 69 35974 21 2068412 1BT8HICHI0IS 1 ) Nouveaux médicaments constitués par ou contenant des acides ribonucléïques ou désoxyribonucléïque s d'origine humaine et chimiquement modifiés. 5 2) Un procédé de fabrication de médicaments qui consiste à soumettre des acides ribonucléïques ou désoxyribonucléïques extraits de tissus d'origine humaine à des réactions chimiques dans des conditions telles que la structure générale de ces acides ne soit pas profondément modifiée mais que les bases 10 puriques et pyrimidiniques qui les constituent subissent dea _ modifications. 3) Procédé selon la revendication 2) caractérisé par le fait que la réaction chimique est une réaction d'alkylation. 4) Procédé selon la revendication 2) caractérisé par le fait que 15 la réaction chimique est une réaction d'acylation. 5) Procédé selon la revendication 2) caractérisé par le fait que la réaction chimique est une réaction de désamination^ 6) Procédé selon la revendication 2) caractérisé par le fait que la réaction chimique est une réaction d'oxydation, 20 7) Procédé selon la revendication 2) caractérisé par le fait que la réaction chimique est une réaction d'halogénation. 8) Administration à l'être humain des acides ribonucléïques et désoxyribonucléïques d'origine humaine et chimiquement modifi pour le traitement des infections d'origine virale0