FR 2073473 A1 19711001 FR 7041175 A 19701117 70 41175 1 2073473 Cette invention concerne un procédé par lequel on transforme la céphalosporine C en un dérivé soluble dans un solvant organique, en acylant le groupement aminé situé dans la chaîne latérale adipoyle par un groupement alcanoyle en C2-C4 a-halogéné ou aja-5 dihalogéné. On peut ensuite récupérer ce dérivé soluble dans le solvant facilement et efficacement dans le bouillon de fermentation aqueux par extraction par un solvant organique. Le groupement halo-alcanoyle inférieur solubilisant utilisé est un groupement dérivé d'un acide carboxylique en C2~C4 portant 10 un ou deux atomes d'halogène sur l'atome de carbone en a. L'atome d'halogène préféré est le chlore mais on peut également utiliser d'autres halogènes comme le brome et le fluor. Les exemples de groupements solubilisants appropriés comprennent les groupements chloroacétyle, dichloroacétyle, bromoacétyle, fluoroacétyle, 15 os-chloropropionyle, a,a-dichloropropionyle, a-chlorobutyryle et os-chloro-a-méthyl propionyle. Le groupement chloroacétyle a la préférence. On utilise les modes opératoires d'acylation classiques connus de l'homme de l'art en mettant le groupement solubilisant 20 sur le groupement aminé de la chaîne latérale de la céjihalos- porine C. On peut effectuer l'acylation en utilisant un halogénure d'haloalcanoyle ou un anhydride de l'acide halogéné. on a obtenu des résultats particulièrement bons en utilisant un chlorure d'haloalcanoyle comme le chlorure de chloroacétyle. De manière 25 surprenante, l'utilisation d'un anhydride mixte de l'acide chloroacétique tel que l'anhydride acétique chloroacétique donne presque exclusivement la N-chloroacétyl céphalosporine C. La présente invention fournit une méthode pour transformer la céphalosporine C en un dérivé soluble dans un solvant organique, 30 méthode qui consiste à acyler le groupement aminé situé dans la chaîne latérale adipoyle de la céphalosporine C par tm groupement alcanoyle en ^2~C4 «-halogéné ou a,a-dihalogéné. La présente invention fournit également une céphalosporine C soluble dans un solvant organique ayant la formule 70 41175 2 2073473 B02C-CH (CH2 ) 3CNH-CH-CH CIL, O RNH 0=C—N C—CHLOCCH- \ S 3 5 CT I co2h dans laquelle R est un groupement alcanoyle en e2-C4 a-halogéné ou a, oc-dihalogéné. Le principal objet dans la transformation de la céphalosporine 10 C en un dérivé soluble dans un solvant organique est d'aider à l'isolement de la céphalosporine C du bouillon de fermentation. Pour réaliser ce but il est nécessaire d'effectuer la réaction d'acylation dans le bouillon de fermentation. On peut facilement réaliser ceci. On filtre de préférence le bouillon avant l'étape 15 d'acylation et on peut également le concentrer pour éviter la manipulation de grands volumes d'eau. On peut alors extraire cette K-haloalcanoylcéphalosporine C du bouillon de fermentation par un solvant organique non miscible à l'eau. Par solvant non miscible à l'eau on entend un solvant 20 dont la solubilité dans l'eau est limitée, et pas nécessairement un solvant totalement insoluble, par exemple, l'acétate d'éthyle, qui est légèrement soluble dans l'eau, est un excellent solvant pour cette extraction. On effectue l'extraction de préférence à un pH acide. 25 Les solvants organiques que l'on peut utiliser dans l'étape d'extraction comprennent les esters d'alcoyle inférieur comme l'acétate d'éthyle, l'acétate de n-propyle, l'acétate d'isopropyle, et l'acétate de sec.-butyle. Il est parfois avantageux de mélanger l'ester avec un dixième à un volume d'un alcancl inférieur comme 30 l'alcool éthylique ou l'alcool n-butylique. Les autres solvants appropriés comprennent les nitriles comme le butyronitrile et 1 * adiponitrirle et les cétones comme la cyclohexanone et la méthyl isobutyl cétone. Les solvants préférés sont 1'acétate d'éthyle, le butyronitrile et la cyclohexanone. 35 On peut séparer la N-haloalcanoylcéphalosporine c du solvant organique par tout procédé bien connu. Par exemple, on peut alcanaliser la solution pour préparer un sel du dérivé de céphalosporine C qui précipite du solvant organique par agitation, 70 41175 ' 2073473 de préférence par refroidissement de la solution. On peut alors soumettre ce dérivé isolé à une réaction de coupure de la chaîne latérale pour obtenir l'acide 7-aminocéphalosporanique. On peut également effectuer la réaction de coupure dans le solvant orga-5 nique utilisé pour 1'extraction de manière à ce qu'il ne soit pas nécessaire d'isoler la N-haloalcanoylcéphalosporine C. Les exemples suivants vont illustrer la préparation des dérivés de céphalosporine C solubles et leur extraction du bouillon de fermentation aqueux. Dans ce travail on a utilisé 10 deux méthodes de détermination de l'activité de la céphalosporine C. La première est une méthode par ultraviolet qui décèle non seulement la céphalosporine C mais aussi d'autres substances apparentées qui vont réagir avec le réactif d'acylation. La seconde méthode est une méthode à la nicotinamide qui est plus 15 spécifique de la céphalosporine C et on utilise les résultats de cette méthode pour calculer les rendements. Exemple 1 On a trouvé, par analyse par l'ultraviolet, qu'un litre de bouillon de fermentation de céphalosplrine C qui avait été filtré 20 et traité par résine échangeuse d'ions contient 89 g de substance analogue à la céphalosporine c et, par analyse à la nicotinamide on a trouvé qu'il contient 75,25 g de céphalosporine C. A ce litre de bouillon de fermentation on a ajouté 1 litre de solution de bicarbonate de sodium saturée contenant 25 ml de solution 25 d'hydroxyde de sodium à 25 pour cent et 500 ml d'acétone. En l'espace de quinze minutes on a ajouté 500 ml d'une solution de 72 ml de chlorure de chloroacétyle dans l'acétone. Pendant cette période d'addition on a maintenu le pH entre 8,0 et 8,7 et on a gardé le mélange réactionnel dans un bain glacé pour maintenir la 30 température dans la gamme de 20° a 28°C. On a agité le mélange réactionnel pendant encore quinze minutes après avoir achevé l'addition. Le volume total du mélange réactionnel était 3070 ml. A 1520 ml de ce mélange réactionnel d'origine on a ajouté 300 ml de benzène et on a ajusté le pH du mélange à 3,5 en 35 ajoutant 135 ml d'acide chlorhydrique 6 N. On a laissé les phases se séparer et on a rejeté le benzène conservant ainsi 1220 ml de solution aqueuse. On a utilisé ces 1220 ml en deux portions égales qui seront désignées comme solutions Al et A2. A la solution Al on a ajouté un volume égal d'acétate d'éthyl 40 et on a ajusté le pH à 2,0 en ajoutant de l'acide chlorhydrique 70 41175 4 2073473 6 N. On a séparé les phases et on a effectué une seconde extraction avec un volume égal d'acétate d'éthyle. Les extraits à-l'acétate d'éthyle réunis ont été séchés sur sulfate de sodium en laissant 1200 ml de solution d'acétate d'é&iyle que l'analyse 5 ultraviolette a montré contenir 11,5 g d'activité. A la solution à l'acétate d'éthyle on a ajouté 16,6 ml de quinoléine et on 'a ensemencé le mélange. On a agité le mélange une nuit à la température ambiante et ensuite on l'a refroidi avant filtration. On a lavé le produit solide avec 25 ml d'acétone et on l'a séché 10 dans une étuve à vide pour obtenir 18,9 g du sel de quinoléine de la N-chloroacétylcépha'losporine C. A la solution A2 on a ajouté 200 ml d'acétone et 810 ml d'acétate d'éthyle. On a ajusté le pH à 2,0 par l'acide chlorhydrique 6 N et on a laissé les phases se séparer. On a séché 15 la solution à l'acétate d'éthyle sur sulfate de sodium pour obtenir 1080 ml d'extrait à l'acétate d'éthyle que l'analyse ultraviolette a montré contenir 12,9 g d'activité. A cette solution on a ajouté 18,6 ml de quinoléine et on a ensemencé le mélange. On a agité le mélange pendant une nuit et on l'a 20 refroidi avant d'en séparer les solides par filtration. On a lavé le produit solide à 1'acétone et on l'a séché dans une étuve à vide pour obtenir 17,8 g du sel de quinoléine de la H-chloroacétylcéphalosporine C. On a traité une autre portion de 1520 ml du mélange réac-25 tionnel d'origine par un égal volume d'acétate d'éthyle et on a ajusté le pH à 2,0 en ajoutant 235 ml d'acide chlorhydrique 6 N et on a séparé les phases. On a effectué une seconde extraction avec un égal volume d'acétate d'éthyle. La réunion des extraits à 1'acétate d'éthyle avait un volume de 3000 ml et 30 l'analyse ultraviolette a montré qu'elle contenait 30,9 g d'activité. Exemple 2 A un litre de bouillon de fermentation de céphalosporine C traité par une résine, contenant 32,5 g d'activité selon l'analyse 35 ultraviolette, et 26,15 g selon l'analyse à la nicotinamide, on a ajouté 300 ml d'acétone et 100 g de bicarbonate de sodium sec tout en maintenant le mélange dans un bain de glace à 10°C. On a ajusté le pH à 8,5 en ajoutant une solution d'hydroxyde de sodium à 25 pour cent. Tout en continuant à refroidir, on a 40 ajouté une solution de 45 ml de chlorure de dichloroacétyle dans ÔAD ORIGINAL 70 41175 5 2073473 255 ml d'acétone au mélange réactionnel en l'espace de 15 minutes. Pendant l'addition, on a maintenu le pH à 8,0-8,8 en ajoutant une solution d'hydroxyde de sodium à 25 pour cent. Lorsque l'addition a été achevée, on a retiré le mélange du bain de glace et 5 on l'a agité à 20°C pendant 20 minutes. On a ensuite ajusté le pH à 3,5 avec de l'acide chlorhydrique 6 N et on a ajouté 1700 ml d'acétate d'éthyle pour l'extraction tout en ajustant encore le pH à 1,9 par l'acide chlorhydrique 6 N. On a agité ce mélange pendant 15 minutes et on l'a centrifugé pour faire la séparation. ÎO La phase à l'acétate d'éthyle avait un volume de 1940 ml et l'analyse ultraviolette a mis en évidence 12,8 g d'activité. A l'extrait à l'acétate d*éthyle on a ajouté 41 ml de quinoléine en deux portions approximativement égales et on a ensemencé le mélange. Après avoir laissé le mélange reposer au réfrigérateur 15 pendant la fin de la semaine on l'a filtré. On a lavé les solides à l'acétone et on a séché à 35°C dans une étuve à vide pour obtenir 20,6 g du sel de quinoléine de la N-dichloroacétylcâpha-losporine C. Exemple 3 20 On a répété le mode opératoire de l'Exemple 2 en remplaçant le chlorure de dichloroacétyle par le chlorure de 2-chloropropionyle. La température s'est élevée à 40°C au cours de l'addition et il a été difficile de régler le pH qui variéit entre 7,5 et 9,3. Le produit de la réaction était la sel de quinoléine de la 25 N-(2-chloropropionyl)céphalosporine C. Exemple 4 En suivant le mode opératoire de l'Exemple 2 en utilisant 4400 ml de bouillon de fermentation contenant 145 g d'activité selon 1'analyse ultraviolette et 133 ml de chlorure de chloro-30 acétyle on a obtenu 11800 ml d'extrait à l'acétate d'éthyle contenant 123,4 g de N-chloroacétylcéphalosporine c. Exemple 5 On a refroidi dans un bain de glace quatre litres de bouillon de fermentation filtré ayant un pH de 4,4, contenant 5,77 mg de 35 céphalosporine C par millilitre selon l'analyse à la nicotinamide. A ce bouillon froid on a ajouté 20 g de borate de sodium décahydraté et 1200 ml d'acétone. On a ajusté le pH de ce mélange à 8,5 en ajoutant une solution d'hydroxyde de sodium à 25 pour cent. Au mélange refroidi on a ajouté lentement une solution de 40 74 ml de chlorure de chloroacétyle dans 600 ml d'acétone tout en 70 41175 6 2073473 maintenant le pH à 8,5. Lorsque l'addition a été achevée, on a agité le mélange encore 30 minutes en maintenant le pH à 8,5. On a abaissé le pH à 4,5 en ajoutant de l'acide sulfurique â 25 pour cent, os a ajouté 6800 ml d'acétate d'étteyle et on 5 a abaissé le pH à 2,0 en ajoutait esscore de l'acide sulfurique. Après une agitation de 15 minutes,, il s'était formée une émul-sioïs et les phases ne voulaient pas se séparer. A l'émulsion on a ajouté 200 ml d'acétone et 150 ml d'un briseur d'émulsion commercial. On a séparé les phases et on a fait une seconde 10 extraction de la phase aqueuse par l'acétate d'éthyle en utilisant 1 litre d'acétate d'éthyle. La réunion des phases à l'acétate d'éthyle avait un volume total de 3,6 litres. On 1'a concentrée à 4,5 litres et séparée dans deux béchers. On a ajouté dans chaque becher 70 ml de quinoléine et on a agité 15 le mélange pendant une nuit. Dans un becher il s'est formé des cristaux tandis que dans l'autre il s'est séparé une huile. Le liquide surnageant a été séparé de l'huile par décantation et ensemencé. Ensuite on a concentré la solution jusqu'à ce que des, solides commencent à se former. On a joint 1"® mélange 20 à l'autre moitié où il s'était antérieurement formé des cristaux. On a agité le mélange et on l'a refroidi pendant une heure, puis on l'a filtré, on a lavé le sel solide de quinoléine de la N-chloroacétylcéphalosporine C avec une petite quantité d'acétone et on l'a séché dans ur.e étuve à vide à 40°C pour 25 obtenir 15,3 g. Exemple 6 On a ajusté le pH de 10 litres de bouillon de fermentation filtré à 6,2 et on a concentré dans un évaporatéur éclair à 1,8 litre. L'analyse ultraviolette a montré que ce bouillon 30 concentré contient 46,5 g d'activité de céphalosporine C par litre. On a refroidi le bouillon filtré concentré dans un bain de glace et on a ajouté 18 g de borate de sodium décahydraté et 540 ml d'acétone, on a ajusté le pH à 8,5 avec une solution d'hydroxyde de sodium à 25 pour cent. On a lentement ajouté 35 une solution de 56,5 ml de chlorure de chloroacétyle dans 4085 ml d'acétone tout en maintenant le pH à 8,5-9,0 en ajoutant une solution d'hydroxyde de sodium à 25 pour cent. On a agité le mélange 15 minutes lorsque l'addition a été achevée. Au mélange on a ajouté 1530 ml d'acétate d'éthyle, on a ajusté le pH à 40 2,0 avec de l'acide sulfurique à 25 pour cent. On a agité le BAD ORIGINAL 70 41175 7 2073473 mélange 15 minutes et on a séparé les phases par centrifugation. On a fait une seconde extraction avec 1500 ml d'acétate d'éthyle et on a réuni les deux extraits à l'acétate d'éthyle pour avoir un volume total de 3825 ml. On a concentré les extraits réunis 5 à 750 ml et on a ajouté 1 litre d'acétate d'éthyle saturé avec de l'eau. On a ajouté de la quinoléine (100 ml), on a refroidi le mélange au réfrigérateur, on l'a filtré, et on a lavé le solide avec 200 ml d'acétone et on a séché à 40°C dans une étuve à vide pendant une nuit pour obtenir 51,8 g du sel de 10 quinoléine de la N-chloroacétylcéphalosporine C. Exemple 7 On a ajusté le pH d:une solution de 4,6 g de sel de sodium de céphalosporine C ayant une pureté de 89 pour cent dans 30 ml d'eau, à 9,0 en ajoutant une solution d'hydroxyde de sodium à 15 20 pour cent. On a ajouté goutte à goutte une solution de 1,3 ml de chlorure de chloroacétyle dans 8,7 ml d'acétone tout en maintenant le pH à 8,0-9,3 en ajoutant de l'hydroxyde de sodium à 10 pour cent. L'addition a nécessité approximativament 15 minutes et on a agité le mélange encore 5 minutes. On a ensuite ajusté 20 le pH à 6,5 avec de l'acide chlorhydrique 6 N, on a ajouté 80 ml d'acétate d'éthyle, et on a abaissé le pH à 2,0 avec de l'acide chlorhydrique 6 N. Après une agitation de 5 minutes, on a séparé les phases et on a séché la phase à l'acétate d'éthyle sur sulfate de sodium. On a ajouté une solution méthanolique saturée d'acétate 25 de sodium alors que le'pH était à 7,2 lequel est passé à 7,7, avec agitation. On a filtré le solide blanc qui s'est séparé, on l'a refroidi et séché dans un dessicateur pendant une nuit pour obtenir 2,5 g du sel de sodium de N-chloroacétylcéphalospori-ne C. 30 Les dérivés de la céphalosporine C solubles dans un solvant organique ont la formule S /s\ HO-G-CH(CH„)-CNH-CH-CH CH0 O ^ I « «J |f I ^ (| 35 RNH 0=C—N C-CBLOCCH, \ ^ 3 C B C02H dans laquelle R est un gagyupement alcanoyle en Cj-C4 a-halogéné 40 ou c;,«-dihalogéné. L'halogène préféré est le chlore et le 70 41175 8 2073473 groupement haloalcanoyle préféré est le groupement chloroacétyle. En plus d'obtenir les acides libres tels que représentés dans la formule précédente, on peut également obtenir ces dérivés sous la forme de sels. Ces sels peuvent être les sels de métaux 5 alcalins, de métaux alcalino-terreux, d'aminés des acides carbo-xyliques. Les aminés typiques qui ont été utilisées pour former les sels sont la quinoléine, la cyclohexylamine, la 5-éthyl-2-méthylpyridine, la 2-picoline, la 3-picoline, le 4-picoline, la N-éthylmorpholine, la N-méthylmorpholine, la 2,6-lutidine, 10 la N,N-diéthylcyclohexylamine, l'hexaméthylènetétramine, la N,N-diméthylbenzylamine, ou la N,N'-dibenzyléthylènediamine. 70 41175 ' 2073473 REVENDICATIONS 1. Une méthode de transformation de la céphalosporine C en un dérivé soluble dans un solvant organique, qui consisté à acyler le groupement aminé situé dans la chaîne latérale 5 adipoyle de la céphalosporine C avec un groupement alcanoyle en C2-C4 a-halogéné ou a,a-dihalogéné. 2. Une méthode comme dans la revendication 1, dans laquelle l'halogène est le chlore. 3. Une méthode comme dans la revendication 1 ou 2, dans 10 laquelle le groupement halo-alcanoyle est le groupement chloroacétyle . 4. Une méthode comme dans la revendication 1, 2 ou 3, dans laquelle l'acylation est effectuée dans le bouillon de fermentation aqueux. 15 5. Une céphalosporine C soluble dans un solvant organique, ayant la formule O ^ S H / H0oC-CH(CHo)_CNH-CH-CH ^CH. O Z 1 6 O 11 1 4 * 20 RNH 0=C—N . ^C-CH2OCCH3 C I co2H dans laquelle R est un groupement alcanoyle en C2-C^ a-halogéné 25 ou a,a-dihalogéné. 6. Un composé comme dans la revendication 5, dans lequel 11halogène est le chlore. 7. Un composé comme dans la revendication 5 ou 6, dans lequel R est un groupement chloroacétyle. 8. Une composition thérapeutiquement active comportant comme ingrédient actif un composé comme dans la revendication 5.