FR 2029678 A1 19701023 FR 7002784 A 19700127 70 02784 1 2029678 La présente invention concerne un procédé de culture de microorganismes capables d'utiliser le pétrole ou ses fractions. Plus particulièrement la présente invention concerne un procédé pour produire des cellules de microorganismes, comprenant la culture de ces microorganismes en milieu de culture 5 contenant du pétrole ou une fraction de pétrole comme source de carbone, et un acide gras ayant un nombre d'atomes de carbone peu élevé, tel que l'acide acétique, lactique, tartrique etpropionique ; et la séparation des cellules de microorganismes obtenues du bouillon de culture dans lequel un très fort rendement est atteint. 10 II y a eu récemment de nombreux rapports de recherches sur la produc tion de protéines, acides aminés, acides organiques, etc .. par culture de microorganismes en milieu de culture contenant des hydrocarbures comme source de carbone* Les inventeurs ont trouvé que, si l'on cultive des microorganismes sur un milieu de culture ordinaire contenant une source d'azote, de sels miné-15 raux, et du pétrole ou une fraction de pétrole comme source de carbone, le rendement en cellules de microorganismes peut être très fortement augmenté par addition d'une petite quantité d'acides organiques au milieu de culture. Il n'y a jamais eu de rapport semblable à celui de la présente invention. On peut néanmoins citer, malgré sa faible importance, le brevet suivant : "Procé-20 dé pour favoriser la fermentation d'hydrocarbures" Tanaka et al., Brevet japonais N° 27.295/65, dans lequel il est établi que la présence d'acides gras ayant un nombre d'atomes de carbone compris entre 6 et 18, ou de paraffines, réduit remarquablement le temps de culture dans un procédé de culture de microorganismes sur milieu contenant des hydrocarbures comme source de carbone. 25 On voit donc que l'invention décrite dans le brevet cité ci-dessus, caractérisée par la diminution de la durée de fermentation grâce à l'utilisation d'acides gras ayant un nombre de carbones élevé, diffère grandement de la présente invention, qui consiste en un procédé pour augmenter le rendement de cellules de microorganismes caractérisé par l'addition d'un acide gras de fai-30 ble nombre de carbones» tel que l'acide acétique, lactique, tartrique et pro-pionique. Un objet de la présente invention est de fournir un nouveau procédé de culture de microorganismes, par lequel les cellules de microorganisme sont obtenues avec un bon rendement par rapport à la quantité d'hydrocarbure 35 utilisé. Un autre objet de la présente invention est de fournir un nouveau procédé de culture de microorganismes qui est avantageux quant à l'efficacité d'incorporation des hydrocarbures dans les cellules. Un autre objet de la présente invention est de fournir un nouveau procédé de culture de microorganismes utilisant les hydrocarbures qui est avantageux pour la production indus-40 trielle. D'autres objets et avantages de la présente invention seront exposés 70 02704 2 2029678 ci-dessous dans la description détaillés. La présente invention concerne un procédé pour produire des cellules de microorganismes avec un fort rendement, en culture aérobie, consistant à ajouter de l'acide acétiquey lactique» tartrique, et/ou propionique au milieu 5 de culture contenant du pétrole ou une fraction de pétrole corne source da carbone. La présente invention est donc caractérisés par l'utilisation des acides gras cités, ayant un faible nombre de carbonese En conséquence» dans la présente invention, les conditions de culture» autres que l'utilisation des acides gras inférieurs cités9 telles que la composition du milieu, la caté-10 gorie d'hydrocarbure utilisé, l'espèce de microorganismes, etc .. peuvent être déterminées d'après les procédés de culture connus. Par exemples dans la présente invention on a préféré utiliser des hydrocarbures à chaîne non ratifiée de plus de 10 atomes de carbone et spécialement ceux dont le point d'ébullxtion est compris entre 150 et 450° C. 15 Les hydrocarbures contenant plus de 20 à 45 % en poids de ces hydrocarbures non ramifiés peuvent aussi ê.tre utilisés cessis source de carbone pour certain nés espèces de microorganismes La culture de microorganismes selon la présente invention doit être réalisée en présence d'une solution aqueuse contenant les éléments nutritifs 20 solubles dans l'eau en plus des hydrocarbures cités ci-dessus. Ces éléments nutritifs peuvent être choisis cessas dar.s las procédés connus : par exemple de l'ammoniaque ou de l'urée comme source d'azote; éléments minéraux tels que de l'acide phosphorique, du magnésiu® et du potassium ; et une petite quantité d'éléments nutritifs organiques tels qu'un extrait de levure, ou une 25 infusion de graines. Tout microorganisme caprbie d'utiliser des hydrocarbures comme source de carbone, peut être employé pour la présente invention. Par exemple si l'on emploie une levure, les levures da la famille des Cryptococaccaé et spécialement celle du sous ordre des Cryptccoccoidae conviennent ; ou, si 30 l'on veut, on peut aussi utiliser les levures ascopores du sous ordre des Saccharomyceloidae. Parmi las espèces de levures utilisables, on peut citer : Candida lipolytica, Candida puicherrinsa, Candida utilis, Candida utilis va-riati major, Candida tropicalis, Torulopsis eollisculosa, Hansenuia anomala, Oidiun lactis, et Neurospora sitophila. Des levures citées ci-oassus, celles du 35 genre Candida ou Torulopsis sont préférables « Si l'on veut5 on peut choisir comme microorganisme des champignons parmi lesquels Pénicillium expansua est préférable. Enfin, si l'on veut, les microorganismes peuvent être des bactéries comme les Pseudomonales, les Eubacteriales, et les Actinomycetales. Les bacte-40 ries qui conviennent le mieux sont celles des familles Bacillus et Pseudomonas, 70 02704 3 2029678 dans lesquelles Bacillus megaterium, Bacillus subtilis, et Pseudomonas aeru-ginosa sont préférables. D'autres bactéries utilisables sont : Bacillus amylebacter, Pseudomonas natriegens, Arthrobacter sp, Micrococcus sp., Corynebacterium michiga-5 nense, Pseudomonas syringae, Xanthomonas begoniae, Flavobacterium sp. devorans Acetobacter sp., Actinomyces sp., Agrobacter sp., et Achromobacter sp. Les champignons utilisables sont ceux de la famille des Aspergillac-cae, dans laquelle les genres Pénicillium et Asperfillus sont préférables, spécialement Pénicillium Hxpansum. Le genre Aspergillacae est aussi un des 10 genres préférables. Selon la présente invention, la culture est réalisée en aérobiose, à une température et un Ph choisis convenablement en fonction de l'espèce de microorganisraes utilisées, et généralement compris entre 30° C et 38° C, et entre PH 3 et PH 8, respectivement. 15 Comme il est montré dans les brevets japonais N° 24 511/65 et 24 592/65, quand des microorganismes sont cultivés en présence d'hydrocarbures comme source de carbone, leur développement est favorisé par addition de sels de métaux comme le fer, le magnésiun, le calcium. Mais il n'a jamais été rapporté que le rendement de microorganismes est remarquablement augmenté par ad-20 dition d'acide organique. Dans la littérature, pour les microorganismes cultivés en présence d'hydrocarbures comme source de carbone, le rendement de micro-organismes secs déterminé par rapport à la quantité d'hydrocarbure utilisé, est au mieux de 100 %. Aucun procédé connu, autre que celui de la présente invention ne donne un rendement supérieur à 100 %. L'effet de l'addition 25 d'acides gras de faible nombre de carbones, selon la présente invention, est exposé plus en détail dans l'exemple suivant. Exemple : Le milieu de culture utilisé contient : hexadecane normal (n - C16) 2 % (vol/vol) 30 urée 0,3 % (poids/vol) sulfate d'ammonium 0,2 % (poids/vol) sulfate de manganèse 0,004 % (poids/vol) chlorure de calcium 0,05 % (poids/vol) sulfate ferreux 0,05 % (poids/vol) *5 infusion de graines 0,05 % (poids/vol) On a inoculé Candida petrophilum (ATCC N° 20226) à ce milieu de culture, et les cultures ont été menées à 30° C et PH 4,0 à 4,8 pendant différents temps de fermentation, en ajoutant 0,1 % (poids/vol) d'acétate, lactate tartrate ou propionate de sodium respectivement.Candida petrophilum ainsi 40 cultivé a été séparé par centrifugation et pesé après séchage. Les résultats 70 02784 4 2029678 obtenus sont résumés dans le tableau 1 dans lequel les nombres entre paran- thèse représentent l'efficacité, définie par l'équation suivante (1 ) : quantité de microorganismes secs obtenus (g) Efficacité (%)== x 100 quantité d'h drocarbure ajouté (g) 5 TABLEAU 1. Influence des acides organiques sur le rendement en cellule de microorganismes. 10 15 On voit, d'après le tableau 1, que, quand on ajoute 0,1 % d'acide 20 organique, l'efficacité définie par l'équation (1) dépasse 100%, valeur la plus haute obtenue par les procédés connus. Ces valeurs supérieures à 100 % ne peuvent bien entendu être expliquées par l'apport d'acides organiques. On en conclut donc que l'effet de l'addition d'acides organiques est effectivement d'augmenter l'efficacité d'incorporation des hydrocarbures dans les cel-25 Iules. D'autre part, si au lieu d'acides ayant un petit nombre de carbones tels que l'acide acétique, tartrique, lactique comme dans la présente invention, on ajoute des acides gras ayant un nombre élevé de carbones, tels que l'acide laurique, palmitique, et stéa ique dont il est question dans le brevet japonais N° 27295/65, à une concentration comprise entre 0,05 et 0,3 % 30 (poids/vol.), on n'arrive pas à obtenir de résultats comparables à ceux du Tableau 1. L'influence de ces acides sur le rendement des cellules de micro-organismes a été étudiée plus à fond en faisant varier la concentration de deux acides choisis parmi les acides organiques cités, l'acide acétique et tartrique. Les résultats obtenus sont résumés dans le tableau 2, qui montre 35 que les effets les plus avantageux sont obtenus pour une concentration comprise entre 0,08 et 0,25 % (poids/vol.). En effectuant les mêmes expériences avec des souches de microorganismes utilisant les hydrocarbures autres que les levures, par exemple avec Pseudomonas aeruginosa N° 2120, on a obtenu les mêmes résultats qu'avec les levures. Ainsi, l'addition d'acides organiques 40 ayant un petit nombre d'atomes de carbone est avantageuse pour différentes | DUREE DE CULTURE • : Acide organi-^"^. : que 0,1% : (Poids /vol.) 28 32 40 | mg % mg % mg % I : Sans * Acétate de sodium : Lactate de sodium [ Tartrate de sodium • : Propionate de sodium 782 (50,5) 1136 (73,5) 1081 (70,0) 1216 (78,5) 1119 (72,2) 1126 -, (72,8) j 1620 (104,5) 1595 (103,0) 1588 (1C2,2) 1593 (102,9) 1200 (77,5)î 1695 (108,2); 1653 (106,8)ï 1690 (109,0); 1688 (108,0): 70 02784 5 2029678 10 35 sortes de microorganismes, et agit en augmentant 11 incorporation des hydrocarbures dans les cellules* TABLEAU 2. Influence de la concentration d'acides organiques sur le rendement en microorganismes. CONCENTRATION D'ACIDES Quantité Efficacité ORGANIQUES (%) (mg) (%) O 1200 77,5 Acétate de sodium 0,04 1500 96,8 0,06 1558 100,4 0,08 1611 104,0 15 0,10 1683 108,6 0,14 1679 108,2 0,25 1698 109,5 0,30 1539 99,3 20 Tartrate de sodiun 0,04 1461 74,4 0,06 1513 97,7 0,08 1597 102,9 0,10 1675 108,0 25 0,14 1437 92,8 0,25 1588 102,6 0,30 1331 ' 86,1 N.B. Les conditions expérimentales sont les mêmes que pour le ta-bleau 1. Candida petrophilum a été cultivé pendant 40 heures, séparé par centrifugation et pesé après séchage; lsefficacicé a été calculée d'après l'équation (1), l'hydrocarbure étant le n-hexadécane. Ces acides gras ayant un petit nosibre dï3tOTies de carbone peuvent être ajoutés de préférence au cours de la préparation du milieu de culture, ou avant le début de la croissance exponentielle des microorganismes. Des mélanges de plus de deux acides organiques du groupe acide acétique, lactique, tartrique et propionique peuvent aussi être employés pour augmenter le rendement en cellules de microorganismes. La présente invention sera mieux comprise à l'aide des exemples 40 suivants, qui sont uniquement donnés à titre d'illustration, et ne limitent 70 02794 6 2029678 en rien le domaine de l'invention® EXEMPLE 1. Le milieu de culture contient : rt-hexadecane 2 % (Voî/VOL) 5 urée G33 % (PoMs/vol) Sulfate d'aninsriii© 0,2 % (Poids/i 5i) Sulfate de martganàsa 0,0SS (Poids/?®!) chlorure de caleiœ. 0»0§ & (Poids/Val) Phosphate diacide de potassiœ 0,2 % (Poids/vol) 10 sulfate dé magnésiens 0,05 % (Poids/vol) sulfate ferreux 0*C6 £ (Poids/vol) infusion de greines 0,05 % (Foids/roî) L'acétate de sodivxn a été ajouté pour terminer à 4 L. de ce ssilieu de culture, à une concentration finale de 0,1 % (Poids/volX Après avoir ajus-15 té le PH à 6,0, on a versé 1s mille»? de eeltere dans ua récipient à fermentation d'un volume de 10 L« Puis la sousfce 4a Candida pitsophil'js (ATCC 20226) qui avait été précultivée dans le mSm t?îlieus a été inoculé® à une concentration de 4 % (VOL/VOL) par rapport à la quantité total® du isilieu de fermentation cité ci-dessus» et cultivée en aerobiose pendant deux jours à une tem-20 pérature comprise entre 33 et 35 ® C® Pendant la fermentation» le PH a été ajusté à une valeur comprise entre 4,0 et 4,8 par addition d'une solution aqueuse d®hydroxvde de sodium» Après culture- les micrsorgaP.isr.2s ont été séparés parcentrifugation, lavés à l'eau» ssehés et pesés® On a fait une expérience témoin» identique» mais sans addition d'acétate de sedim. La quan-25 tité de cellules de microorganismes obtenus était 6.9 s 8 g à partir des 4 L» de milieu de culture avec acétate de sodius, et 60»8 g à partir d'î milieu sens acétate de sodium. EXEMPLE 2. La souche de Candida petrophilum (ATCC 2Q226) a été inoculée de la 30 même manière à un milieu de culture identique mais contenant 2 % (vol/vol) d'une fraction obtenue par distillation du pétrole brut de Jthafji entre 260 et 360° C. (densité 0,837) au lieu de l'hexadecane normal utilisé dans 1*exemple 1• Après addition de 0»t % de tartrate de sodiun» la culture a été réalisée de la même manière que dans l'exemple 1 . Après culture les microorganismes 35 ont été séparés et pesés. Une expérience témoin, sans addition d'acide tartrique, a été conduite de la même manière. La quantité de cellules de microorganismes obtenue était 38 g à partir des 4 L. de milieu de culture avec acide tartrique, et 32 g à partir du milieu sans acide tartrique. 40 70 02794 7 2029678 EXEMPLE 3, Une paraffine non ramifiée de 10 à 14 atomes de carbones (pureté 9£?o) (2 % vol/vol), de l'urée (0,15 % poids/vol), du sulfate d'ammonium (0,15 % poids/vol), du chlorure de calcium (0,1 % poids/vol), du sulfate ferreux 5 (0,05 /o poids/vol), et une infusion de graines (0,05 /o poids/vol), ont ete mélangés pour donner 4 L. de milieu de culture. Puis on a ajouté au milieu de l'acétate de sodium (0,1 % poidsAol). Après avoir ajusté le PH à 6,0 on a versé le milieu de culture dans un récipient à fermentation de 10 L. La souche de Pseudomonas aeru-ginosa (N° 2120) précultivée dans les mêmes condi-10 tions a été inoculée à raison de 4 % (vol/vol) par rapport au volume de solution de fermentation, et cultivée pendant deux jours en aérobiose à 30° C. Pendant la fermentation, le PH a été ajusté entre 6,0 et 6,8 avec de l'hydro-xyde de sodium. Après culture, les microorganismes ont été séparés par cen-trifugation. Uneexpérience témoin, sans addition d'acétate de sodium, a été 15 conduite de la même manière. Le milieu de culture contenant de l'acétate de sodium a produit 66,1 g de cellules de microorganisme, tandis que le milieu sans acétate de sodium a produit 58,2 g. EXEMPLE 4. La souche de corynebacterium petrophilum (N° 1002) (ATCC 21404) a 20 été inoculée au même milieu de culture que celui de l'exemple 3, dans les mêmes conditions, et cultivée de la même manière. Après une culture de 2 jours les microorganismes ont été séparés par centrifugation. Une expérience témoin, sans addition d'acétate de sodium, a été conduite de la même manière. La quantité de cellules de microorganisme obtenue était de 57,3 g avec addition d'acé-25 tate de sodium, et 49,7 g sans acétate. EXEMPLE 5. De l'acétate d'ammonium (0,2 % Vol/vol) a été ajouté pour terminer à 4 L. du milieu de culture de l'exemple 1. Après avoir ajusté le PH à 6,0 la solution de culture a été versée dans un récipient de fermentation de 10 L. 30 La souche de Torulopsis petrophilum, précultivée dans le même milieu, a été inoculée au milieu de fermentation à raison de 4 % (vol/vol) par rapport au volume de milieu de culture. Puis la culture a été conduite en aérobiose pendant aeux jours. Une expérience témoin sans addition d'acide acétique, a été conduite de la même manière. La quantité de cellules de microorganismes obte-35 nue était 68,2 g à partir des 4 L. de bouillon de culture avec acide acétique, et 59,5 g sans acide acétique. 40 70 02784 8 2029678 REVENDICATIONS 1• Procédé pour produire des cellules de microorganismes capables d'utiliser les hydrocarbures, en aérobiose, dans un milieu de culture contenant comme source de carbone, du pétrole ou une fraction de pétrole 5 obtenue par distillation, une source d'azote minéral, des sels minéraux et éléments nutritifs organiques, et pour séparer les cellules de microorganismes du bouillon de culture, caractérisé par l'addition au milieu de culture d'au moins un acide gras inférieur, choisi dans le groupe constitué par les acides acétiqu acétique. , lactique» tartrique et propionique. 10 2. Procédé suivant la revendication 1, dans lequel les acides gras à petit nombre d'atomes de carbone sont ajoutés à une concentration comprise entre 0,08 et 0,25 % (poids d'acides gras/volume total du milieu de culture). 3. Procédé suivant la revendication 1, dans lequel les microor- 15 ganismes appartiennent aux genres Candida, Pseudomonas, Corynebacterium ou Torulopsis. 4. Procédé suivant la revendication 1 dans lequel les acides gras de petit nombre d'atomes de carbone sont ajoutés au milieu de culture . à une étape intermédiaire de la préparation du milieu de culture, avant le 20 début de la croissance exponentielle des microorganismes. 5. Cellules de microorganismes obtenues par le procédé suivant la revendication 1. COPY