FR 2037234 A1 19701231 FR 7010211 A 19700320 70 10211 i 2037234 La présente invention a pour objets de nouveaux réactifs en forme de pilules, des méthodes de mesure et un appareil pour effectuer in vitro des réactions immun.ologiq.ues et analytiques, et plus particulièrement des essais de diagnostic, dans lesquels on 5 utilise ces réactifs. Les essais analytiques et immunologiques que vise la présente invention sont la plupart du temps des essais de laboratoire qui ont pour objectif la détermination de la présence ou de l'absence d'antigènes ou d'anticorps ou bien d'enzymes dans les fluides du 10 corps et servent pour le diagnostic de certaines conditions physiologiques ou pathologiques chez l'homme et les animaux. Su égard à la combinaison particulière des réactifs et du liquide d'essai utilisés, la réaction peut fournir un précipité auquel cas elle est connue sous le nom de réaction de précipitation. Si dans la 15 réaction qui intervient entre des substances incorporées dans un milieu liquide, au moins une de ces substances est un solide qui s'agglomère, la réaction est connue sous le nom de réaction d'agglutination. La formation du précipité ou l'agglutination, ou inhibition de l'agglutination, des particules spécialement traitées 20 est visible à l'oeil nu lorsque le précipité se forme ou que les particules s'agencent d'elles-mêmes après la réaction. Les essais immunologiques, qui sont par exemple des essais pour déterminer le type de groupe sanguin, la grossesse, ou des phénomènes analogues, sont habituellement effectués avec des réac-25 tifs tels que, par exemple, une suspension d'érythrocytes sensibilisés et une solution d'un antisérum approprié que l'on introduit dans une fiole à essais à l'aide d'une burette-compte-gouttes. Même si l'on peut titrer très soigneusement la suspension d'éry-. throcytes, l'utilisation de fioles et de burette-compte-gouttes 30 est non seulement onéreuse mais également susceptible de fournir -des résultats discutables du fait des limitations dans la précision des burettes-compte-gouttes ordinaires. De telles burettes ne sont pas habituellement calibrées et bien que la précision du diamètre de la goutte soit de grande importance, une telle précision 35 est rarement atteinte et le diamètre des gouttes est variable et imprécis. En vue d'obvier aux inconvénients des méthodes d'essais par fiole-burette compte-gouttes, on a déjà proposé d'effectuer les réactions d'agglutination en déposant une goutte, mesurée de façon 40 précise, d'un réactif sur une lame, ou sur un support de carton, 70 10211 2 2037234 et de laisser la goutte sécher, après quoi l'on peut déposer le liquide d'essai et observer les résultats. les méthodes de ce genre sont également soumises à des imprécisions dans l'application des réactifs ainsi que dans les observations faites. 5 II est également fréquemment nécessaire pour les réactifs im- munologiques, par exemple les érythrocytes sensibilisés, ou les matériaux sensibles à base de protéines, de les conserver à l'état congelé. Ceci rend nécessaire la présence d'un appareillage spécial de congélation qui est encombrant et demande du temps à cause du 10 problème de transfert des solutions réfrigérées. On a fait des efforts pour remédier aux limitations des méthodes d'essais par fiole burette compte-gouttes et aux méthodes du type à lame, en soumettant les réactifs, qui peuvent être incompatibles l'un avec l'autre en présence d'humidité, à une congélation par couches suc-15 cessives dans un récipient, suivie d'une lyophilisation des couches congelées, et un procédé de ce type a été décrit dans le brevet IJS 3 269 905. Cependant un tel mode opératoire nécessite -un appareillage spécial et des connaissances techniques, en outre il est onéreux et provoque une perte de temps lors de la mise en oeu-20 vre. La présente invention vise plus particulièrement une composition de réactif analytique, caractérisée en ce qu'elle comprend une pilule stable, solide, renfermant une quantité prédéterminée d'un réactif d'essai, la dite pilule ayant été formée par congéla-25 tion puis par lyophilisation de gouttes dans une solution aqueuse ou une suspension du dit réactif. La présente invention a également pour objet de fournir des réactifs analytiques, de diagnostics et immunologiques sous forme de pilules stables, solides, sèches, en grains ou petites sphères, 30 chaque unité renfermant une quantité prédéterminée et mesurée de façon précise du réactif* Même si les réactifs à partir desquels on prépare les pilules réagissent les uns avec les autres et peuvent même être mutuellement incompatibles, les pilules elles-mêmes présentent l'avantage d'être stables et peuvent être placées en-35 semble dans un récipient commun pendant une période indéfinie de temps sans réagir les unes avec les autres. Néanmoins les réactifs dans les pilules sont facilement reconstitués et rendus prêts pour un essai analytique, immunologique ou de diagnostic par la simple addition d'un liquide à soumettre à l'essai. 70 10211 3 2037234 la composition, la préparation et l'utilisation des réactifs sous forme de pilules selon l'invention seront spécifiquement illustrées en considérant des réactifs pour essais immunologiquœ ou de diagnostic en vue de déterminer la présence de gonadotropine cho-5 rionique humaine (HCG-) dans 11 urine, cet essai étant utilisé pour le diagnostic de la grossesse. Cependant, il est évident, pour l'homme de l'art, que les principes de l'invention ne- sont limités en aucune façon à ces applications^ mais peuvent être étendus à la préparation et à l'uti-■JO lisation d'un grand nombre de réactifs sous forme de pilules pour l'analyse, l'immunologie et le diagnostic et, à une grande variété d'essais dans lesquels on peut utiliser un ou plusieurs réactifs sous forme de pilules différentes. En outre, des substances adjuvantes, par exemple des tampons, peuvent également être mises sous 15 forme de pilules selon la présente invention et peuvent être utilisées sous forme stable sèche avec une ou plus d'une pilule réactive pour essais de diagnostic. On prépare les réactifs sous forme de pilules selon l'invention de la manière générale suivante : 20 a) on forme une solution ou une suspension aqueuse du réactif présentant une concentration prédéterminée ; b) on forme une goutte, tombant librement, mesurée ou calibrée, de ladite solution ou suspension î c) on laisse cette goutte tomber à travers une masse liquide, 25 non miscible dans l'eau, présentant une densité inférieure à celle de l'eau dont la température varie approximativement entre la température ordinaire en surface et au maximum une température inférieure au point de congélation de la solution d evant être gelée à la partie inférieure de la colonne, après quoi on congèle ces gout-30 tes pour obtenir des pilules ou des grains congelés ; d) on recueille les pilules congelées renfermant une quantité prédéterminée du réactif à la partie inférieure de ladite masse liquide et ; e) on lyophilise les pilules congelées recueillies. 35 Le procédé de préparation des pilules selon l'invention sera mieux compris en se référant au dessin annexé, sur lequel : - la fig. 1 représente schématiquement un appareil pour la formation des gouttes de réactif et la congélation du réactif en pilules stables solides. 70 10211 4 2037234 On voit sur la fig. 1 que l'on prépare d'abord une solution, ou suspension^ aqueuse renfermant une concentration connue du réactif. On incorpore avantageusement à la solution, ou suspension, une quantité appropriée d'une substance inerte formant matrice d'un. 5 agent gonflant qui aide à donner du corps à la pilule lyophilisée. Parmi les agents gonflants appropriés, on peut citer les sucres tels que le sucrose, le mannose, le lactose et le mannitol, des matières d'origine protéiniques, par exemple les sérum protéines, les hydrolysats de lactalbumine et les hydrolysats de caséine. 10 On pompe la suspension ou la solution de réactifs de son ré cipient de stockage 1 par 11 intermédiaire d'un conduit flexible 2, en plastique, par exemple un tube en polyéthylène transparent, au moyen d'une pompe de dosage 3. Celle-ci est, de préférence, une pompe du type à pulsations, qui comprime le tube flexible au moyen 15 de rouleaux, mesurant par ce moyen une quantité prédéterminée de solution par unité de temps. On utilise, pour former des gouttes de dimensions précises, une pompe qui débiteenviron 2 ml/mn. De la pompe 3» la solution s'écoule à travers un compresseur par pulsions 4 de manière à maintenir un débit à peu près uniforme, La solu-20 tion passe ensuite par une pipette compte-gouttes 5, qui délivre une quantité prédéterminée, mesurée de façon précise, sous forme d'une goutte. Une telle goutte peut contenir par exemple, environ 0,025 à 0,07 ml. Pour des solutions d'antisérum et d'antigène HCGr, on choisit précisément 0,05 ml, puisque cela fournit des pilules 25 congelées de dimensions appropriées pour les essais prévus. La pipette 5 est placée à une hauteur appropriée au-dessus de la surface de la masse liquide insoluble dans l'eau 10, qui est placée dans un récipient 7» et dans laquelle la goutte est congelée. La pipette est placée au-dessus du niveau du liquide insoluble à une 30 hauteur appropriée pour éviter les éclaboussures tout en permettant une chute.libre suffisant à former une goutte de dimension et de vraiment forme/sphérique désirées, soit avanty soit après l'entrée dans le liquide insoluble dans l'eau. En vue de maintenir la hauteur à partir de laquelle la goutte tombe pour éviter la distorsion et 35 l,éclaboussement de la goutte, un tube d'aspiration 8 est placé à un niveau approprié. Etant donné que l'hexane est déplacé par le volume aqueux introduit sous forme de gouttes, cette conduite d'aspiration refoule l'excès d'hexane et de ce fait maintient un niveau constant. 70 10211 5 2037234 Le liquide non miscible à l'eau, utilisé pour la congélation, peut être un hydrocarbure ou vin hydrocarbure halogéné liquide, ou un mélange de ceux-ci. Parmi les liquides appropriés, on peut citer par exemple l'hexane, le disulfure de carbone, le chloroforme, 5 l'heptane, 1*iso-octane et le toluène, ainsi que des mélanges, par exemple 1 'hexane/chloroforme ou le benzène/hexane. Ces mélanges sont établis de manière qu'ils aient toujours line densité inférieure à celle de l'eau. Par exemple l'hexane présente une densité de 0,6593 à 20°/4°C. La densité peut être réglée à la valeur dé-10 sirée par mélange avec l'hexane d'un autre liquide, par exemple le tétrachlorure de carbone, afin de maintenir une vitesse contrôlée de chute de la goutte. La vitesse de chute est avantageusement de l'ordre de 15 cm/s, ceci dépendant de la longueur de la colonne de liquide. Plus la colonne est longue, plus la vitesse de chute 15 maintenue est rapide. Dans le corps liquide de congélation, est maintenue une variation de température qui va de la température ordinaire en surface et diminue en direction du fond de manière que la température tombe à environ -70°C dans cette partie inférieure. Avantageuse-20 ment le liquide est maintenu pendant une courte distance au-dessous de sa surface inférieure à une température d'environ 0° et 20°C. Au-dessous de ce niveau, le refroidissement du liquide est réglé de façon que la température tombe à -70°C à la partie inférieure. On peut toutefois utiliser n'importe quelle température plus basse 25 que celle indiquée, ceci dépend de la nature du liquide et du réactif à traiter. Par exemple, on peut également utiliser des liquides cryogéniques, tels que l'azote liquide qui présente un point d'ébullition de -143°C, ou l'oxygène liquide qui présente un point d'ébullition de -183°C, 30 la température désirée de la colonne de liquide est obtenue soit en utilisant un mélange de réfrigération qui entoure le corps du liquide soit par réfrigération mécanique à des températures équivalentes. Par exemple, le mélange de réfrigération peut être une combinaison de glace carbonique et d'acétone, ou de glace 35 carbonique et de méthylcellosolve (éther monométhylique de diéthyl-èneglycol). Avantageusement, le niveau supérieur de la partie réfrigérée du liquide, qui est maintenu entre 0°C et 20°C, comprend une zone s'étendant au maximum jusqu'à 15 cm au-dessous de la surface du 70 10211 6 2037234 liquide. Ceci donne une chute de 15 cm à une température au-dessus de la congélation et ainsi la possibilité de formation d'une pilule vraiment sphérique. De cette manière, on forme des gouttes sphériques qui se con-5 gèlent en grains à mesure qu'elles descendent dans la colonne liquide. On recueille à la base de la colonne les grains congelés que l'on peut prélever et lyophiliser afin d'obtenir des sphères sèches stables contenant des quantités mesurées de façon précise des réactifs désirés. Les sphères congelées sont de préférence re-10 cueillies dans un panier à mailles en fil de fer et peuvent être facilement manipulées mécaniquement de manière à être placées dans un récipient de pré-congélation, par exemple un tube à essais, dans lequel on effectue la lyophilisation. De manière avantageuse les sphères gelées sont stockées pendant la réfrigération à des 15 températures de -50°C, ou inférieures, de façon à éliminer la croissance de cristaux à l'intérieur de ces sphères, ce qui pourrait les rendre friables. En vue de les lyophiliser, on place une ou plusieurs sphères de réactif dans un récipient de précongélation et on les transporte 20 sans les chauffer jusqu'à des chemises de précongélation d'un appareil de lyophilisation classique dans lequel se produit le séchage, par exemple à mie température de départ de -50°C qui s'élève pendant le séchage jusqu'à + 37°C à la fin et à une pression inférieure à environ 100 ^ au départ et atteignant 5 p. en fin de réac-25 tion, ce qui intervient 18 h à 24 h au plus tard. Etant donné que les pilules réactives sont placées dans un tube à essais approprié pour l'utilisation future, ce dernier peut être ensuite bouché en utilisant une fermeture imperméable à l'humidité et stocké pendant une période indéfinie. Un nécessaire à 30 essais de ce type est représenté à la fig. 2 du dessin. Comme il apparaît sur le dessir, le nécessaire à essais est constitué par un récipient tubulaire présentant une cloison transparente et une partie terminale adaptée à recevoir le liquide à tester et muni d'une fermeture imperméable à l'humidité. On place 35 dans le récipient au moins une pilule de réactif préparée selon l'invention. Le liquide à tester est mis au contact de la pilule ou des pilules en ouvrant la fermeture et en introduisant une quantité mesurée de liquide au moyen d'une burette-compte-gouttes. Il est évident que les principes de l'invention peuvent être 70 10211 7 2037234 appliqués non seulement à la préparation de réactifs analytiques mais également à la préparation de formas de dosages pharmaceutiques, en particulier celles nécessitant de petits dosages du médicament . 5 Dans le domaine de l'immunologie, par la sélection de réactifs appropriés, on peut utiliser les pilules d'essai pour effectuer n'importe quelle réaction immunologique dans laquelle deux réactifs d'essai incompatibles sont en présence dans le même tube, tels que par exemple le test de la grossesse décrit plus complètement 10 ci-dessous, et aussi les essais de détermination des substances de groupe sanguin dans le plasma et le sérum, et de détermination des groupes sanguins, ainsi que pour déterminer les antigènes et anticorps de divers types, y compris le facteur rhumatoïde, 11antigène de la syphilis, l'antistreptolysine ou la mononucléose in-15 fectieuse, et d'autres essais d'agglutination ou de précipitine. De plus, en vue de démontrer à l'utilisateur du nécessaire à essais qu'elle est la forme de la réaction proposée, ou comme témoin, une pilule de la substance, pour essais peut être traitée dans un essai séparé à côté de l'échantillon en question à essayer 20 en utilisant deux tubes, par exemple une pilule lyophilisée d'urine gravide connue. les exemples suivants ne sont donnés qu'à titre indicatif d'une forme de réalisation de l'invention mais ils ne présentent en aucun cas un caractère limitatif. 25 la préparation d'une série de pilules réactives pour essais de détermination de la gonadotropine chorionique humaine dans l'urine sera décrite dans les exemples suivants : EXEMPLE 1 .- Préparation de pilules antisérum HGG-: 30 On utilise les réactifs suivants : Sucrose 10,2 g Chlorure de sodium 0,765 g Phosphate dibasique de sodium heptahydraté (lîa^HPO^H^O) 2,462 g 35 Phosphate monobasique de potassium (Eïï^PO^) 0,489 g Eau distillée q.s. 170,0 ml Anti gonadotropine chorionique humaine q.s. pour obtenir un facteur de sensibilité de 650 à 800 U.I. de HCGr/l et des réactions 5,5,3-1, 2-0 avec l'urine pour 0,500, 750 et 1000 U.I./l. d'urine, 70 10211 8 2037234 respectivement!* Une réaction d'ordre 5 signifie 1 'agglutination complète et 0 signifie une inhibition complète. On dissout les sels précités dans approximativement 150 ml d'eau. Le pH de la solution résultante est réglé à 7,2 (+ 0,05) 5 avec du HC1 0,1 II ou du NaOH 0,1 N. On ajoute la quantité nécessaire d'eau pour obtenir un volume de 170 ml. On congèle dans un bain de glace et on ajoute l'exacte quantité prédéterminée de sérum anti-HCGr pour obtenir la dilution désirée» Après quoi on conserve la solution congelée dans un bain de glace. 10 On remplit un appareil débiteur propre ayant la forme d'une pipette compte-gouttes microtitrée à 0,05 ml avec cet antisérum dilué par l'intermédiaire d'une pompe de dosage auto analytriee, jusqu'à ce que l'on pompe un ou deux ml, en prenant soin d'éliminer les bulles dans le tube débiteur. On arrête ensuite la pompe et on 15 place l'appareil débiteur microtitré en position dans la colonne de congélation. On met en marche la pompe et on commence la fabrication des pilules. On prélève les pilules de la colonne de congélation et on les stocke dans de l'hexane à l'intérieur d'un récipient clos dans une 20 enveloppe à glace carbonique ou dans un réfrigérateur mécanique, maintenu à -50° à -60°0. EXEMPLE 2.- Préparation de pilules d'érvthrocvtes sensibilisés. On traite une suspension d'érythrocytes de mouton de manière classique avec de la formaline et du tannin, on centrifuge et on 25 lave avec une solution tampon de phosphate chlorure de sodium d'un pH de 6,4, puis on les incorpore dans ce tampon. A ce mélange, on ajoute un égal volume d'une solution de 50 U.l. de HCG- par iol dans une solution tampon à pH 6,4. On stocke le mélange pendant 48 h à 37°C, après quoi on ajoute du formaldéhyde jusqu'à obtenir une 30 concentration finale de 0,25 i» (poids/volume) de formaldéhyde. On conserve ensuite ce mélange pendant 15 h à 37°C après quoi on centrifuge à nouveau les érythrocytes, on les lave avec une solution physiologique de sel, on les incorpore sous la forme d'une suspension à 10 fo volume/volume dans une solution physiologique de 35 sel renfermant 0,1 ^ de sérum albumine de bovin et on stocke jusqu'à l'utilisation à 0° - 4°C. On centrifuge ensuite les éry— throcytes, on les lave avec une solution physiologique de sel et on les lyophilise de manière classique. En variante on lave les cellules tannées au formol et on les met en suspension dans une 70 10211 9 2037234 solution tampon de chlorophosphate de sodium à un pH de 7,6. A ce mélange, on ajoute un égal volume d'une solution de 50 U.I. de HGG/ml. On maintient ce mélange à 56°C pendant 18 h, après quoi on le lave et on le remet en suspension" dans du chlorure de sodium à 5 0,9 et on mélange des quantités égales avec une solution de formaldéhyde (1,5 5») dans une solution saline à 0,9 $. On stocke ce mélange à 2°—8°C pendant environ 1 semaine après quoi on lave les érythrocytes avec une solution à 0,9 $ de chlorure de sodium et on les met finalement à la concentration de 6,6 fo dans un mélange 10 de solution tampon au phosphate à un pH de 7,2 renfermant 6 °/t> de sucrose et 1,5 de sérum albumine de bovin. On lyophilise ce mélange et on le conserve au sec jusqu'à l'utilisation. Les érythrocytes de mouton, qui ont été ainsi sensibilisés par HCG- fixés chimiquement à leur surface, sont mis en suspension dans 15 un mélange de tampons et d'un diluant par exemple le sucrose ou la sérum albumine bovine, de manière à ce qu'ils contiennent dans chaque 0,05 ml la quantité optimale précise pour une détermination simple de l'HCG-. On fabrique les pilules d'érythrocytes en reconstituant les 20 érythrocytes sensibilisés lyophilisés au préalable jusqu'à 5/6 de leur volume originel, c'est-à-dire 12 ml de suspension lyophilisée à 6,67 fo dans le milieu de suspension final sont reconstitués avec 10 ml d'eau distillée. On pompe cette suspension par une pipette goutte à goutte microtitrée, on utilise un conduit en poly-éthylène de fin diamètre (l„D. = 0,023) pour réduire au minimum le dépôt des érythrocytes et la pompe n'est pas arrêtée pendant le processus, excepté momentanément. On transforme la suspension en gouttes calibrées comme précédemment décrit, gouttes que l'on laisse tomber à travers une colon-30 ne d'hexane refroidie par un mélange de glace carbonique et de méthylcellosolve, la température de l'hexane se situant entre environ la température ordinaire à sa surface supérieure et -70°C au voisinage de la base de la colonne« Les pilules sont prélevées et conservées comme à l'exemple 1. Préparation de pilules tampons : On utilise les réactifs suivants : Sucrose Chlorure de sodium Phosphate dibasique de sodium 10,2 g 0,765 g 40 heptahydraté (îla^HPO^TH^O) 2,462 g 70 10211 10 2037234 Phosphate monobasique de potassium (KHgPO^) Sel disodique de l'acide éthylènediamine tétracétique Eau distillée q«s. Bleu-noir d'Aniline (noir acide 1) 2,720 g 170,0 g 0,489 g 0,2 ml (Solution stockée) On dissout les sels ci-dessus dans environ 150 ml d'eau. On règle la solution à un pH de 7,2 à l'aide de ITaOH à 5,0 IT, on ajoute ensuite une quantité suffisante d'eau pour obtenir 170 ml. On ajoute ensuite0,2ml d'une solution colorante constituée d'une solution 1,0 mg/ml (solution de colorants déposée dans le réfrigérateur), cette solution n'a pas besoin d'être refroidie pendant la fabrication des pilules. On fabrique les pilules tampon de la même manière que celle décrite pour les pilules anti-sérum. Après la fabrication, la manipulation et le stockage sont identiques. "RTRMPT.?. 4.- Méthode "pour effectuer un essai de détermination de la grossesse. Au fond d'une éprouvette à essais telle que représentée à la fig. 2 du dessin, on place une pilule d*antisérum et une pilule d1érythrocytes sensibilisés HCG et une pilule tampon. On introduit dans l'éprouvette au moyen d'une burette compte-gouttes un échantillon d'urinea à tester, après quoi on introduit un volume additionnel d'eau environ égale à 4 fois la quantité d'urine ajoutée. On rebouche ensuite l'éprouvette et on l'agite de haut en bas pendant 30 secondes, après quoi on la laisse reposer, sans la bouger, pendant une période de deux heures» On examine à l'oeil nu le fond de l'éprouvette pour déterminer s'il existe une agglutination positive ou négative, la formation d'un anneau en forme de pet de nonne est une indication positive de la grossesse. EXEMPLE 5.- Application du principe de la pilule à un essai de diagnostic des enzymes. Le principe de l'essai cinétique U.70 pour la détermination de l'activité de la transaminase glutamate-pyruvate du sérum dans le sérum (S.G.P.Ï.) nécessite les réactions suivantes : (1) Réaction de détermination 70 10211 n 2037234 (2) Réaction de mise en évidence Acide py ravi que + NADHg L.D.H. ^ Acide L-laetique + ÏTAD. Dans les équations précédentes les abréviations signifient : G.P.T. - transaminase glutamate-pyruvate 5 NADH2 - nicotinamide-adénine-dinucléotide, forme réduite NAD - nicotinamide-adénine-dinucléotide, forme oxydée LDH - Déhydrogenase de l'acide lactique. Pour chaque molécule d'acide pyruvique prenant naissance dans la réaction (1), une molécule de NADH^ est oxydée en ÏÏAD. La dimi-10 nution de la densité optique est déterminée directement dans l'ultra-violet à 334 nm dans une cuvette photométrique à 25°C. a) "préparation de pilulep de tampon à. enzyme. On prépare les solutions de réactifs suivantes : Solution 1 î 250 ml de solution aqueuse 3 fois millimolaire 15 de nicotinamide-adénine-dinucléotide. la solution fraîche est conservée à 0°-4°C jusqu'.à l'utilisation. Solution 2 : 5Ç0 ml d'une solution aqueuse de déhydrogénase de l'acide lactique présentant au moins une activité LDH de 180 000 U,I. par litre. La solution fraîche est conservée à 0°-4°C 20 jusqu'à l'utilisation. Solution 3 ; 1250 ml de solution aqueuse 0,2 fois molaire de L-alanine. Solution 4 : 3 000 ml d'une solution aqueuse qui est 5 fois millimolaire dans de l'acide éthylènediamine-tétracétique et 50 25 fois millimolaire dans la triéthanolamine. Le pH de cette solution a été réglé à 7»5<> Les solutions 3 et 4 sont mélangées soigneusement et refroidies à 0°-4°0» On ajoute ensuite les solutions 1 et 2 et on agite soigneusement la solution. 30 on prépare les pilules tampon-enzyme à partir du mélange pré cédent comme décrit à l'exemple 1. On en remplit de petites fioles de polyéthylène comme représenté à la fig. 2, chaque fiole contient un nombre de pilules correspondant à 0,5 ml de solution tampon. Après la lyophilisation, on ferme les fioles avec un bouchon 35 vis rouge. b) Préparation de pilules de tampon-substrat : On prépare les réactifs suivants : Solution 5 s 200 ml d'a-céto glutamate de sodium aqueux 0,2 fois molaire. La solution fraîche est conservée à 0°-4°G jusqu'à 40 l'utilisation. 70 10211 12 2037234 Solution 6 î 800 ml d'une solution aqueuse présentant la composition de la solution 4» On refroidit la solution 6 à 0°-4°C et on la mélange ensuite intimement avec la solution 5. 5 On prépare les pilules tampon-support de 0,1 ml de cette solution mélangée selon l'exemple 1. On les met dans de petites fioles de polyéthylène comme représentées à la fig. 2, chaque fiole contenant orne pilule. Après lyophilisation, on ferme les fioles avec de petits bouchons vis bleus. 10 c) Réalisation de la détermination cinétique ÏÏ.V. : A une fiole préparée comme décrit dans cet exemple sous l'alinéa a), on ajoute 0,5 ml d'eau distillée et 0,2 ml du sérum à tester en utilisant des pipettes de Marburg. Après avoir secoué, on porte la solution résultante quantitativement dans une cuvette à 15 25°0 d'un spectro-photomètre "Eppendorf". La pré-incubation se produit pendant environ 10 mn. Pendant ce temps le substrat endogène dans l'échantillon a été transformé. La densité optique est lue jusqu'à ce qu'elle devienne constante. Ensuite on ouvre une fiole à bouchon bleu et on y ajoute 0,1 ml d'eau distillée avec 20 -une pipette de Marburg. On porte ensuite la solution claire quantitativement dans la cuvette et on mélange intimement le tout. Les lectures de densités optiques sont faites toutes les 30 secondes et la diminution est notée pendant au moins 2 mn. On effectue la moyenne des valeurs et l'activité S.G.P.T. de l'échantil-25 ion est calculée en utilisant la formuleî U.I. = à O.D./mn. x 667immole x mn"""' x litre"* ^ 70 10211 13 2037234 - UTiUI 0 HI 013 - 1.- Composition de réactif analytique, caractérisée en ce qu'elle comprend une pilule stable, solide, renfermant voie quantité prédéterminée d'un réactif d'essai, ladite pilule étant formée par congélation puis lyophilisation de gouttes d'une solution 5 aqueuse ou d'une suspension du dit réactif. 2.- Composition selon la revendication 1, caractérisée en ce que le réactif est un réactif immunologique ou de diagnostic. 3.- Pilule stable congelée et lyophilisée, caractérisée en ce qu'elle contient une quantité prédéterminée d'un antisérum, d'un 10 antigène, d'un enzyme ou d'une substance tampon. 4.- Pilule stable congelée et lyophilisée selon la revendication 3, caractérisée en ce qu'elle contient une quantité prédéterminée d'érythrocytes d'animal, sensibilisés avec de la gonadotropine chorionique humaine. 15 5«- Composition de réactifs d'essais selon la revendication 1, pour déceler la présence de gonadotropine chorionique humaine dans l'urine, caractérisée en ce qu'elle comprend : a) une pilule stable congelée et lyophilisée renfermant une quantité prédéterminée d'érythrocytes de mouton sensibilisés avec 20 de la gonadotropine chorionique humaine et b) une pilule stable congelée et lyophilisée renfermant "une quantité prédéterminée d'antisérum de la gonadotropine chorionique humaine suffisante pour réagir avec la concentration des dits érythrocytes sensibilisés à l'HCG- et une quantité additionnelle de 25 HCG. 6.- Composition selon la revendication 5, caractérisée en ce qu'elle comprend aussi une pilule stable, congelée et lyophilisée, renfermant une quantité prédéterminée de tampons à base de phosphate. 30 7.- Procédé de préparation d'un réactif d'essai analytique, immunologique ou de diagnostic selon la revendication 3» caractérisé en ce que : a) on formé une solution aqueuse ou une suspension d'un réactif ayant une concentration prédéterminée ; 35 b) on forme une goutte mesurée ou calibrée de façon précise tombant librement de la dite solution ou suspension ; c) on laisse cette goutte tomber à travers la masse d'un liquide non miscible avec l'eau présentant une densité inférieure 70 10211 2037234 à celle de l'eau et présentant un intervalle de température compris entre approximativement la température ordinaire à sa surface supérieure et au maximum une température inférieure au point de congélation de la solution à congeler à la partie inférieure de la 5 colonne, après quoi on congèle les dites gouttes en grains ou pilules congelés. d) on recueille les pilules congelées renfermant une quantité prédéterminée de réactifs à la base de la masse de liquide et e) on lyophilise les pilules congelées recueillies. 10 8.- Procédé selon la revendication 7f caractérisé en ce que la goutte tombant librement présente un volume compris entre environ 0,025 et environ 0,07 mm3» 9«- Procédé selon la revendication 7» caractérisé en ce que le liquide non miscible avec l'eau est un hydrocarbure, un hydro-15 carbure halogéné ou un mélange de ces derniers. 10.- Procédé selon la revendication 7, caractérisé en ce que r la vitesse de chute de la goutte dans le liquide non miscible avec l'eau est d'environ 15 cm/s et que la température de la partie supérieure de la masse de liquide non miscible avec l'eau est 20 maintenue à une température située entre 0°C et la température ordinaire »