FR 2051630 A1 19710409 FR 7025379 A 19700708 70 25379 2051630 1 La présente invention concerne de nouvelles enzymes hydro-]ytiques intéressantes et un procédé pour leur préparation,leur isolement et leur- purification. L'invention concerne plus particulièrement les enzymes protéolytiques obtenues par culture 5 de l'espèce Cephalosporium ATCC 11550 ou ses mutants. Le micro™ organisme est appelé ci' dessous CS 52. L'invention comprend dans un autre de ses aspects, l'utilisation des enzymes protéolytiqucr dans divers domaines de la technologie. Des exemples de ces applications sont l'utilisation des produits de l'invention comme 10 constituants dans les compositions détergentes, l'utilisation comme agents lytiques des cellules comme bactéries , cellules sanguines rouges et blanches et plaquettes et l'utilisation des p roduits dans la dégradation des Mo-polymères comme protéines, hydrates de carbone,lipides. 15 L'expression "compositions détergentes" englobe un grand nombre de compositions détergentes contenant des constituants tensio-actifs, des azurants optiques, des parfums et autres con~~ t ituents bien connus dans cette technique. Il est aussi entoix qu»la préparation enzymatique dé la présente inventa en ne doit: ';pêg êtrm utilisée en association dans les compositions détergentes avec des composants qui fbnt disparaître l'activité «n-zymaticue. Ainsi, les détergents contenant du chlore ne peuvent en général pas être utilisés en association avec la préparation enzymatique de la présente invention. 25 Le produit enzymatique identifié ci-dessous et appelé "prodiit brut" est le produit de l'invention qui est le mieux adapté à une utilisation à l'échelle technique„ Naturellement les fractions du produit brut identifiées ci-dessous et appelées IP, 4,1, IP 6,1 et IP 10,5 peuvent aussi être techniquement uti-30 lisées pour diverses applications comme l'utilisation préférée comme composant dans les compositions détergentes, mais on préfère en général pour des raisons économiques utiliser le produit brut. Le produit brut peut être utilisé comme additif aux compositions détergentes à raison de 0y01 à 5% en poids environ, calculé sur le poids total de la composition finale, de préférence-à raison de 0,1 à 1$ environ en poids. Les domaines particuliers de la technologie mentionnés ci-dessus, dans lesquels les enzymes de la présente invention . peuvent trouver des applications utiles sont seulement destinés à être des exemples des possibilités et il est entendu que les baD ORIGINAL 70 25379 2051630 2. enzymes ayant les propriétés extrêmement intéressantes et inattendues décrites plus en détail ci-dessaus, peuvent avoir de nombreuses autres applications technologiques, faisant toutes partie du domaine de l'invention. Les domaines techniques dans lesquels 5 les préparations enzymatiques peuvent être utiliséossont par exemple la technologie des aliments comme dans les toulangeries et les brasseries dans le but par exemple de modifier le gluten dans le procédé de cuisson et dans le but de clarifier et d'éviter la sédimentation dans les liquides doux et fermentés* 10 Le microorganisme CS 32, cultivé sur milieux organiques s'est révélé capable de produire plusieurs enzymes hydrolytiques telles que des protéases, des amylases et des lipases. Certaines de ces enzymes peuvent être très utiles dans divers domaines de la technologie. Ainsi, certaines des enzymes peuvent être utilisées 15 comme constituants des compositions détergentes , certaines enzymes peuvent être utilisées comme agents lytiques des cellules et certaines enzymes peuvent être utilisées pour la solubilisa-tion des biopolymères. Spécialement intéressantes sont certain#1 « protéases produites par l'organisme en question,qui sont stables-20 à des températures élevées jusqu'à 60ÔC environ et qui sont particulièrement intéressantes .comme constituants dans les oompooi. « tions détergentes» Il est évident que ces propriétés sont particulièrement avantageuses pour l'utilisation envisagée des protëa-ses comme additifs aux compositions détergentes.. Une autre pro-25 priété des protéases qui est particulièrement intéressante pour leur utilisation envisagée comme.additifs aux compositions détergentes est leur pH optimum assez élevé, de l'ordre de 10 à 11 environ o - Dans un de ces aspects au sens large , le procédé qui J50 peut être convenablement utilisé pour la production des enzymes de la présente invention, consiste à cultiver l'organisme en question dans des conditions aérobie submergées dans un. milieu nutritif convenableo On préfère que le milieu nutritif contienne une source assimilable de carbone, d'azote et de sels minéraux-. On 35 peut faire ,varier fortement les conditions de croissance telles que la durée, la température et la concentration en ions hydrogène sans quitter le domaine de l'invention. A la fin. de la période de croissance, les enzymes ou le produit intéressant peuvent être récupérés du mélange par un certain nombre, de procédés tels que 40 centrifugation du mélange, dialyse de la solution et séchage p bad original 70 25379 3 2ÔS1630 pulvérisation de la solution résultante. On peut utiliser les procédés suivants pour isoler la préparation enzymatique obtenue par fermentation : 1 - Précipitation des enzymes après filtration du mélange 5 obtenu par fermentation. La précipitation peut être effectuée par: a) tannin b) lignine c) solvants organiques comme acétone , alcool iso- propylique, 10 d) sels minéraux comme sulfate de sodium, sulfate d'ammonium. 2 - Précipitation Ses enzymes après filtration du mélange et évaporation de la solution. La précipitation peut être effectuée avec : 15 a) tannin b) lignine c) solvants organiques comme acétone,alcool iso- propylique. d) sels minéraux comme sulfate de sodium, sulfate 20 d'ammonium. 3 - Séchage par pulvérisation du produit par : a) filtration du mélange, évaporation de la solution obtenue et séchage par pulvérisation de la solution résultante. b) filtration du mélange , évaporation de la solu-25 tion obtenue, dialyse de la solution ainsi obtenue et séchage par pulvérisation de la solution résultante. c) filtration du mélange, évaporation de la solution obtenue, précipitation d'un produit enzymatique comme décrit par exemple en 1 et 2 ci-dessus et séchage par pulvérisation du 30 produit ainsi obtenu. Les procédés appelés 1a, 2a et 3a sont particulièrement intéressants et sont préférés. On peut utiliser un grand nombre de substances comme sour ces de carbone dans les milieux nutritifs. Elles peuvent être soit 35 solubles soit insolubles dans l'eau, il faut seulement que les composés utilisés soient facilement assimilables par l'organisme. Comme exemples' on peut citer les pentoses comme arabinose,ribose et xylose; les monosaccharides comme mannose, levulose et galactose j les disaccharides comme tréhalose, maltose, lactose, cello- 70 25379 2051630 4 biose et sucrose, les polysaccharid.es comme l'amidon, les alcools supérieurs comme le glycérol, le mannitol, le sorbitol ot l'inositol; et diverses substances comme l'alcool éthylique et le carbonate de calcium. L'azote sous une forme assimilable 5 peut être fournie par des protéines animales ou végétales,soja caséine, peptones , polypeptides ou amino acides. On peut ajuster le pH par n'importe quelle base convenable comme soude, tampon phosphate , citrate de sodium, acétate de sodium ou tout autre substance convenable qui amène le pH dans "1° l'intervalle désiré. La température du milieu nutritif au cours de la fermentation du champignon peut avantageusement être maintenue entre 20 et 35°C environ. La température préférée est de 26 à 28°C. On peut faire fortement varier le temps nécessaire à la 15 production d'une quantité maxima d'enzymes protéolytiques selon la nature des constituants particuliers utilisés dans le milieu nutritif. Néanmoins, une durée de 30 à 120 heures environ est ■labitueromsnt considérée comme convenable. On peut ajouter des agents anti-moussants au milieu (?-= 20 fermentation. Comme exemples d'agents anti-moussants on peut mentionner l'huile de soja, l'huile de ricin, les huiles suli nées, l'huile de lard, l'huile de ricin bromé-. Comme indiqué ci-dessus , la souche CS32 peut être cultivée dans un milieu de culture pour donner des enzymes hydrolytiques„ 25 Le milieu de culture peut être n'importe quel milieu connu dans la technique car l'organisme en question est capable' d'assimiler de nombreuses sources d'énergie. Pour obtenir une production économique et un rondement maximum en enzymes, on préfère toutefois utiliser certains milieux de culture. Par exemple, les sources 30 actuellement préférées d'hydrates de carbone dans le milieu de culture sont le sucrose, l'amidon, le glucose, la dextrine etc. Les sources préférées d'azote sont le soja, la levure de brasserie, ' la décoction de blé, la caséine, la farine de poisson etc. Les sels organiques nutritifs qui peuvent être incorporés dans le mi -35 lieu sont les sels susceptibles de donner des ions comme ammonium, sodium, potassium, calcium, magnésium, phosphate, chlorure, sulfate, nitrate etc. On peut aussi incorporer dans le milieu de culture les oligo-éléments essentiels. Ces oligo-éléments sont toutefois habituellement présents comme impuretés dans d'autres co.n-40 posants dans le milieu de culture. bad original 70 25379 2051630 5 Pour une croissance et une production maxima de CS 32 le milieu de culture avant inoculation, doit avoir un pH ajusté à une valeur comprise entre 4,5 et 9,5 environ de préférence un pH de 6 à 7. Le pH à la fin de la période de croissance dépend 5 des substances tampon présentes et du pH initiale On suit facilement le taux de production de protéases dans le milieu de culture au cours de la période de croissance de l'organisme en testant l'activité caséinolytique d'échantillons prélevés dans le milieu« Les déterminations de caséinase 10 sont décrites plus en détail ci --dessous . Le produit brut obtenu après isolement de la préparation enzymatique obtenue par culture de GS 32 est caractérisé par les points suivants : a) c'est un mélange de protéines 15 b) il est solufols dans l3@s«P l©s solutions salines et les solutions tampon ooe@i& les taispons phosphates, borates et citrates» c) il est stàble et conserve son activité enzymatique à température ordinaire pendant plus d'un an sous forme d'une poudre sèche. d) son spectre d'absorption ultra-violette est caractéristique 20 de protéines contenant des aiaiao=acides aromatiques„ - e) il présente une activité protéolytique vis«=à'~i?is de la caséine„ de la.fibrine, de 1'hémoglobinea de l'albumine, de la gélatine et de l'élastine; f) il a un optimum d'activité protéolytique avec la caséine comme 25 substrat à un pH supérieur à 10; g) il est capable d'hydrolyser des esters comme ester éthylique de N-tosyl-L-arginine (TAEE) ; ester méthylique de ÎT-a«benzoyl-L arginine (BAME) et N~a-benzoyl-D-L-arginine -[3 naphtylamide (BA1ÏA). h) il contient en plus des enzymes protéolytiques, des estérases, 50 ^s lipases et des amynasesj i) l'activité protéolytique peut être précipitée par des solvants organiques par exemple des alcools comme méthanol; acétone, tannins; lignines ou des sels par exemple sulfate d'ammonium, sulfate de sodium; 35 j) il a une température optima avec la caséine comme substrat de 60°C à pH 7,4 et à pH 9,0; k) il contient une fraction protéolytiquement active ayant un point isoélectrique de pH 4,1; 1) il contient une fraction protéolytiquement active,ayant un 40 point isoélectrique de pH 6,1 BWX***1* 70 25379 e 2051630 m) il contient une fraction protéolytiquement active ayant un point isoélectriqude pH 10,5; n) il a un pH optima vis-à-vis de la caséine, de l'élastine,de l'albumine, de BANA, de TAES et BAME respectivement à un pH 5 de 11 ou plus, 10, 11,5, 9,5, 10,5 ou plus et 7; o) il n'a pas d'activité de peptidase ou qu'une activité très faible vis-à-vis des substrats reportés dans le tableau 5î p) l'activité caséinolytique est pratiquement non affectée par la présence de Mn^+, Co^+, Ca2+, Mg2+ et EDTA 10 q) l'activité caséinolytique est pratiquement non affectée par la présente de Trasylol® r) l'activité caséinolytique est presque complètement inhibée par la présence de PMSF» D'autres caractéristiques du produit brut et aussi des 15 caractéristiques des produits IP 4,1s If 6,1 ©t IP 1095s identifiés ci-dessous apparaîtront au cours de la description suivante o L'expression "produit brut™ rencontrée dans cette description est utilisée pour représenter la préparation enzymatiqn 20 obtenue par culture de CS 32-préparé comme décrit dans l'exemple 4 et 5o Pour caractériser le produit de l'invention la préparation enzymatique appelés "produit brut" a été soumia.-au traitement selon le schéma suivant r 25 fractionnement des enzymes protéolytiques obtenues par culture de C?S 32 avec la diéthylaminoéthyl cellulose (DEAE) 5 g de produit enzymatique brut protéolytique précipité au tannin (15,3 U.C./mg) mis en suspension dans 200 ml d'eau, le pH étant ajusté à 7,0 30 , Centrifugation . lté sidu (écarté) Solution fraction 1, 1,8g (6,0 U.C./mg) 5 g de diéthylaminoéthyl cel lulose j Centrifugation i. Solution I Résidu 35 précipitée avec 500 ml d'acétone et soumise à la séparation iso-électrique (figure 2) lavé avec 2 x 10 ml d'eau fraction 2, 1,4 g(20,2 U.C./mg) Résidu 40 mis en suspension dans 100ml d'acétate d'ammonium 1 M bad origine 70 25379 2051630 ? \K Solution précipitée avec 300 ml d'acétone et soumise à la séparation iso-électrique (figure 3) Fraction 3, 0,6 g (5,5 U.C./mg) Echangeur mis en suspension dans 50 ml d'acétate d'am-monnium 1M Centrifugation résidu ^ Dans les figures ci-gointes, la figure 1 représente les résultats obtenus pour les mesures de densité optiques à 280 nm, d'activité de l'ester des nitro-4~phényle de la carbobenzoxy-L-10 leucine mesurée par la densité optique à 410 nm, et du pH sur les fractions obtenues par séparation isoélectrique du produit brut. La figure 2 indique d'une façon analogue les résultats obtenus pour les mesures de densité optique à 200 nm, d'activité estérasique, d'activité de l'ester de nitro-4-phényle de la 15 carbobenzoxy-L-leucine et du pH, sur les fractions obtenues par séparation isoélectrique de la fraction 2 selon le schéma de fractionnement. La figure 3 représente d'une façon analogue les résultats obtenus pour les mesures de densité optique à 280 nm, d'activité estérasique, d'activité de l'ester de nitro-4-phé-20 nyle de la carbobenzoxy-L-leucine et du pH, sur les fractions obtenues par séparations isoélectriquçàe la fraction 3 selon le schéma de fractionnement. On a utilisé un appareil d'électrofocalisation LKB 8100 Ampholiné"0"' pour la séparation isoélectrique du produit. 25 L'activité des préparations enzymatiques sur l'ester de p- nitrophényle de la carbobenzoxy-L-leucine a été mesurée de la façon suivante : Réactifs: On a mis en suspension 10 mg de l'ester de nitrophényle de 3° la carbobenzoxy-L-leucine dans 10 ml d'isopropanol dans 200 ml de tampon phosphate 0,05 M et on a ajusté le pH à 7,8. A 100 ml de solution enzymatique, diluée à 1:10 ou plus, on a ajouté 2,5 ml de substrat, on a mélangé et maintenu l'ensemble à 3?°C pendant 10 minutes puis on a refroidi à la tempe-35 rature ordinaire. On a ensuite ajouté 1 ml d-'éthanol, on a agité le mélange-résultant et on a immédiatement fait les lectures sur les tubes dans un spectrophotomètre à 410 nm en comparaison du témoin. Témoin : solution de substrat à 37'° C sans enzyme. . 40 On a utilisé la méthode pour les titrages qnîitatifs et comparatifs. bMJ OFttQlNAV- 70 J537' 8 2051630 Le- produit des tubes 40 à 44 dans la figure 2 a été rassemblé et déionisé par dialyse avec l'eau du robinet ou par pas- fypT' sage à travers une colonne de Sephade;^ „ Le produit déionisé a été ensuite séché par congélation. Ce produit avait une activité 5 protéolytique de 25 unités caséine par rng à pH 7,4 et avait un point isoélectrique de pH 10,5. Ce produit est appelé ci-dessous et dans les tableaux I.P. 10,5. De la même manière, le produit des tubes 15 à 19 dans la figure 3 a été rassemblé,déionisé, séché par congélation et son activité protéolytique et son point iso-10 électrique ont été déterminés-.. Ce produit avait une activité protéolytique de 1,0 unités caséine par mg à pH Jet avait un point isoélectrique de pH 4,1. Ce produit est appelé ci-dessous et dans les tableaux I.P. 4,1. De même, le produit des tubes 24 à 27 dans la figure j5 s'est révélé avoir une activité protéo-15 lytique de 0,24 unité caséine par mg à pH 7? 4 et un point isoléec-trique de pH 6,1 . La présente invention est en outre illustrée par les tableaux suivants : Le tableau I reporte le pH optimum de l'activité protéa-20 dique et estérasique de : a) le produit brut obtenu par isolement de la préparation enzymatique appelée dans le tableau : "brute": b) la fraction protéasique ayant un point isoéïectrique à pH 4,1, appelée dans le tableau I.P. 4,1. 25 c) la fraction protéasique ayant un point isoélectrique à pH 6,1, appelée dans le tableau I.P. 6,1 et d) la fraction protéasique ayant un point isoélectrique à pH 10,1, appelée dans le tableau I.P. 10,5. On a mesuré l'activité vis-à-vis de l'élastine, de la 30 caséine, de l'albumine, de BAME et de BANA. Les mesures d'activité ont été faites à 37°C en utilisant la caséine,, l'élastine et l'albumine comme substrat; à 40°C avec TAEE comme substrat et à 23°C avec BANA et BAME comme substrat. bad original Tableau I pH optimum du pvoduit brut , de I,P. 4,1, X. 6,1 et IP 10,5 Pourcentage d'activité maxima vis-à-vis de PH 2 Elastine Caséine Albumine K> tri . ta ' -«4 vû •P 4f1 IP 6,1 IP 10,5 brube IP 4,1 IP 6,1 IP 10,5 brute IP 4,1, IP 6,1 IP 10,5 brute 2 3 0 2 4 2,5 3 3 2 7 3,5 4 17 5 2 4 2 5 8 4,5 22 5 7 4 5 25 2 Y 46 32 14 26 5,5 32 18 19 34 6 100 40 9 15 20 1!» d I 24 o3 40 30 42 6,5' Sq 52 45 58 7 • ■ 75 68 14 38 51 33 58 44 34 75 4u 52 7,5 82 71 53 74 8 70 100 34 45 56 52 74 50 100 90 52 69 §,5 69 92 59 84 9 45 84 68 85 74 74 77 58 62 93 62 81 9,5 47 87 71 9& 75 73 10 87 100 86 100 86 76 40 69 89 10,5 45 84 . 45 100 90 75 11 100 74 100 89 100 100 31 81 100 85 11,5 33 20 92 100 12 ,v 10 22 16 33 vo K> O Cn C> U» o tableau I (suite) Pourcentage d'activité maxima. vis-à-vis de BAME BANA TAEE _ 0 10 Cn ' IF ' 4,1 IP 10,5 bruts IP 4,1 brute bruto 2 2,5 CO sO 5 5,5 1 4 2 3 4,5 5 4 1 5 10 1 9 4 39 5,5 25 26 22 20 6 90 55 49 44 50 9 0 6,5 95 82 74 .57 55 7 98 92 100 77 77 ' 7,5 97 100 98 82 88 19 8 100 • 96 97 89 91 8,5 99 96 95 95 95 47 9 95 87 86 95 ' 97 • 9,5 64 75 75 100 100 49 SJ 0 Cn 10 59 44 55 100 ' 96 10,5 22 12 51 97 92 100 O- 11 2 0 7 49 59 U> 0 11,5 15 12 4 70 25379 ^ 2051630 L'activité vis-à-vis de TAEE a été déterminée seulement pour le produit brut. Les produits I.P. 6,1 et I0P. 10,5 ne sont pas actifs vis-à-vis de BANA. Le produit I.P. 6,1 n'est pas actif vis-à-vis de BAME. 5 L'activité des préparations vis-à-vis de l'albumine a été mesurée de la manière suivante s réactifs; albumine,plasma du boeuf,cristallisée qualité A 0,5$ dans un tampon 10 acide trichloracétique 40 % ninhydrine selon Moore-Stein 2% tampon : Teorell-Stenhagen B.Z. 299 417 (1939) On a mélange 200 yul de la solution enzymatique avec 200^ul de substrat ayant le pH désire„ On a incubé le mélange "15 15 minutes à 37°C,° on l'a ensuite précipité par 250 ^ul d'acide trichloracétique puis centrifugé. Témoin; on a maintenu l'enzyme et le substrat à 37°C dans des récipients distincts et on les a mélangés après addition d'acide trichloracétique. 20 on a mélangé 500yUl du liquide surnageant avec 1 ml de ninhydrine et on a maintenu l'ensemble 25 minutes à 100°C, on a ensuite refroidi le mélange et ajouté 5 ml de n-propanol à 50/£« On a agité chaque tube et on a ensuite fait les mesures dans un spectrophotomètre à 575 nm par rapport au témoin. 25 L'activité de la préparation vis-à-vis de BAME a été mesu rée de la manière suivante,, La méthode utilise la différence d'absorption W à 254 nm entre la behzoylarginine et son ester méthylique. Réactifs : 30 N-a-benzoyl-L-arginine. ester méthylique +2HC1 32,9 reg dans 10ml de tampon tampon; phosphate de sodium + glycine- 0,2 M 1+1 On a mélangé une partie de BAME et 9 parties de tampon et on a ajustéle pH à la valeur désirée. A 3 ml de substrat, on a 35 ajouté 100yul de la solution enzymatique, on a mélangé et mesuré immédiatement l'absorption dans un spectrophotomè/ore à 25 nm. Après 15 minutes à température ordinaire (25°C) on a fait. une nouvelle lecture. La différence d'extinction entre ces deux déterminations 40 est une mesure de l'activité estérasique de l'enzyme. BAD ordinal 70 25379 12 2051630 L'activité des préparations vis-à-vis de BANA a été mesurée de la raanlèra su±vc»u0ë : Réactifs s N-a-benzoyl-D,L-arginine-f3-naphthylamide EC1 8 mg dans 10 ml de tampon acide trichloracétique KO% nitrite de sodium, préparation fraîche 0,1$ sulfamate d'ammonium 0,5$ N-(naphtyl-1)-éthylènediamine 5 mg dans 10 ral d'é- thanol tampon ; Teorell-Stenhagc-n B.Z. 299 417 (1939) On a ajusté la solution de_ substrat au pH désiré avec de l'acide chlorhydrique 2 N, et pour chaque mesure on a préparé deux échantillons de 2 x 200 ^ul, ^'un étant pour le témoin. On a ajouté 200^ul de la solution enzymatique à chaque échantillon à tester, on a maintenu les tubes à osrpîs 30 minutes à 37°C et on a ensuite fait la précipitation avec 250 yul d'acx-.-trichloracetique. Témoin : on a maintenu "l'enzyme et le substrat dans des récipients séparés à 37°C et on les a mélangés après addition de l'acide trichloracétique. On a centrifugé les tubes et-on a mélangé 500^ul du liquide surnageant avec 500^ul de nitrite de sodium. Au bout de 3 minutes, on a ajouté 500^ul de sulfamate d'ammonium, on a intimement mélangé, et deux minutes plus tard on a développé la coloration par addition de 1 ral de N-(naphtyl-1 ) -éthylène diamine. Au bout de 15 minutes, on a fait les lectures sur les tubes dans un spectrophotomètre à 575 nm en fonction du témoin. L'activité élastolytique a été déterminée de la manière survante. On a homogénéisé 5,0 ml de tampon Teorell-Stenhagen ayant le pH désiré contenant 1$ d'élastine. On a dissous une quantité convenable d'enzyme dans 1,2 ml de tampon et on a agité le mélange à 37°C pendant des temps variables. On a ajouté 3 ml d'acide trichloracétique aux écha?atillons retirés. Après centrifugation, _ on a déterminé la densité optique à 280 nm. L'activité a été exprimée comme différente- de la densité optique pour une heure d'incubation, ajustée à une concentration de la préparation enzymatique de 1 mg par ml. On voit dans le tableau I que le pH optimum d'activité des préparations vis-à-vis des substrats utilises, est souvent bad orîg1nal 70 25379 2051630 13 à un pH assez élevé , ce qui est avantageux pour 1 usage envisagé des produits de la présente invention comme additifs aux compositions détergentes. Ainsi, le pH optimum de l'activité du produit brut vis-à-vis de la caséine est de 11 ou plus , vis-à-vis 5 de l'élastine de 10, vis-a-vis de l'albumine de t1,5, vis-à-vis de BANA de 9,5 vis-à-vis de TAEE de 10,5 ou plus. Le pH ôpti-mum du produit brut vis-à-vis de BAME est de 7- Le tableau II indique la stabilité thermique du produit brut, de IP 4,1, IP 6,1 et de IP 10,5 à pH 7,4 et pH 9,0. 10 Les échantillons ont été incubés sans substrat au pH et à la température indiquée pendant 30 minutes. La détermination de l'activité protéolytique a été ensuite faite à une '.température de 37°C sur la caséine comme substrat. 15 20 25 Tableau II Stabilité thermique Tempé - Pourcentage d'activité maximale ï?tUrS P" 7.» i: pH ;9.O' IP 4,1 IP 6,1 IP 10,5 brute IP 4,1 IP 6,1 IP 10,5 brute 20 100 95 96 100 99 • 100 98 100 37 98 100 100 100 100 93 100 . 97 50 81 83 94 89 51 36 76 63 60 12 10 33 37 2 . 0 7 5 70 1 2 2 3 1 4 3 80 2 2 1 1 4 1 90 . 2 0 1 2 6 100 2 2 0 0 6 30 On constate dans le tableau II que les préparations à pH 7,4 sont essentiellement stables encore à 50°C et que IP 10,5 et le produit brut conservent une activité considérable à pH 7,4 aussi à 6o°C. Le tableau III indique la température optimale à pH 35 7,4 et pH 9,0 du produit brut, de IP 4,1, de IP 6,1 et de IP 10,5. On a utilisé la caséine comme substrat pour les mesures d'activité à pH 7*4 et 9,0 10 15 25 30 35 70 25379 2051630 14 Tableau III Température optimale Tempe- Pourcentage d'activité maximl rature °c ,TT „ „ ' r~~r IP 4,1 IP 6,1 IP 10,5 brute IP 4,1 IP 6,1 IP 10,5 brute 20 8- 11 3 7 10 13 5 . 6 37 34 35 22 25 48 52 28 30 50 86 88 68 77 93 100 76 67 60 100 100 100 100 100 88 100 100 70 28 28 49 54 20 17 32 25 80 9 10 12 13 7 5 10 9 90 13 10 • 12 11 9 12 100 12 10 13 9 12 On constate dans le tableau III que les préparations testées ont une température optimale de 60°C environ. Le tableau IV indique la stabilité au pH du produit brut, de IP 4,1, de IP 6,1 et de IP 10,5. Les préparations enzy-20 matiques ont été incubées pendant 30 minutes à 37°C dans un tampon Teorell-Stenhagen, ajusté au pH. désiré. A la fin de la période d'incubation, les échantillons ont été mélangés à un tampon phosphate à pH 7? 4 et l'activité restante a été déterminée par digestion de la caséine. Tableau IV Stabilité à divers pH. 40 PH _ Pourcentage d 'activité maximale IP 4,1 IP 6,1 IP 10,5 . brute 2 15 3 0 1 3 24 7 86 59 4 34 15 99 77 5 ■ 84 95 100 80 6 95 93 93 73 7 100 93 98 77 8 98 100- 94 77 9 100 98 100 95 10 97 99 94 100 11 95 81 . 98 68 70 25379 15 2051630 On voit dans le tableau IV qun .1 p produit: bi'Ut et que le produit IP 10,5 sont plus stables à pH 3 que IP 4., 1- et IP 6,1. On voit aussi que tous les produits sont sensiblement stables à pH 10. L'activité peptidasique du produit brut a été mesurée vis-à-vis des substrats du tableau V ci-dessous. Tableau Yc glycyl-glycine 1 mg/ml dans phosphate 0,2 M pH 7,4 gly-gly-glycine 0. ,1 gly-L-leucine 0. ,3 L-leu-glycine 0. >3 _iï gly-L--proline o, .3 L-pro-glycine O; -3 _!? Z-gly-L-phénylalanino 1 Z-L-glu-L-tyrosine 3 _!î Z-gly-L-leu-amide 3 _ïî On a mélangé 100^ul dans 1'eau et 100^ul de substrat et on a placé le mélange dans l'eau à 37°C pendant 30 minutes. On a ensuite ajouté 1 ml de ninhydrine en solution à 2$, on a mainte- 20 nu l'étuve à 100°C pendant 20 minutes puis on les a ensuite refroidis à température ordinaire. Témoin; on a maintenu l'enzyme et le substrat dans des récipients séparés à 37°C et on les a mélangés après addition de niahidrine . 25 On a ensuite ajouté 5 ral de n-propanol à 50$ dans l'eau , on a agité le mélange résultant et mesuré l'absorption dans un spectrophotomètre à 575 nmen fonction du témoin. On a trouvé que le produit brut avait une activité peptidasique nulle ou très faible vis-à-vis des substrats du tableau 'Y . 30 - L'activité protéolytique vis-à-vis de la caséine a été déterminée essentiellement comme décrit par Bergkvist, Acta Chem. Scand 17 (1963) 1521-1540. On a mis en suspension 15 g de caséine (Merck, caséine Hammarsten) dans 400 ml d'eau en agitant vigoureusement. On a ajouté de la soude jusqu'à dissolution. On 35 - ajusté le pH à valeur désirée et dilué la solution à 500 .ni avec de l'eau. On a mélangé 3 ml de solution de caséine dans des tubes à essai avec 3 mi du tampon Theorell-Stenhagen (Biochemis-che Taschenbuch ed.Rouen H.M. Springer Verlag (1956)651) au pH désiré. 40 On a mis en équilibre à la température appropriée dans den BAD ORIGINAL ? 70 25379 ig 2051630 bains d'eau des tubes en parallèle avec les tubes à essai. On a ajouté aux tubes à essai une quantité convenable de l'enzyme dissoute. D'un des tubes en parallèle on a pipeté 2 ml immédiatement dans 3 ml d'acide trichloracétique à 10$. On a incubé 5 l'autre gcu de tubes à essai pendant exactement 30'minutes puis on en a retiré 2 ml qu'on a ajoutés à 3 ml d'acide trichloracétique à 10$, Après avoir laissé au moins 30 minutes à température ordinaire, on a centrifugé les tufees et on les a filtrés à travers de petits filtres bouchés par un tampon de coton. On 10 a mesuré la densité optique à 280 r/yu du centrifugat filtré. L'activité de l'enzyme exprimée en unités caséine par mg a été obtenue de la façon suivante : densité optique dé l'échantillon incubé moins densité optique de l'échantillon non incubé divisée par la quantité d'en-15 zyme dans les tubes à essais (exprimée en mg). Pour déterminer la stabilité de l'enzyme , on a dissous celle-ci dans un tampon et on l'a incubée sans caséine pendant un certain temps à une certaine température. On a ensuite «ffectué les déterminations de caséinage au pH on zt » la tempérâtuis désirée . Pour déterminer l'activité protéolytique au moyen d'ester éthylique de N-a-tosyl-L-arginine (TAEE) comme substrat, on a utilisé les produits chimiques suivants dans la solution finale. TAEE a une concentration 0,05 molaire et NaCl a une concentra-25 tion de 0,9$. La quantité de solution enzymatique ajoutée était de 0,2. ral et le volume de la solution testée de 10 ml. On a effectué le titrage avec de la soude 0,05 molaire en utilisant un appareil de titrage automatique Radiometer titration assembly type TTA4. 30 on a étudié l'effet sur l'activité caséinolytique du produit brut par addition de divers métaux et inhibiteurs. On a incubé la préparation enzymatique dissoute dans 3 ml de tampon, avec 0,1 ml d'une solution 0,1 N selon la méthode testée, acide éthy-3ène diamine tétraacétique (EDTA) en solution 0,1 M, fluorure de 35 ïiiénylm^thyi fonyl e à 0,5$ (PMSP) et 0,1 ml d'une solution de TrasyloiS-i La durée d'incubation était de 10 minutes à 37°C. On a ensuite ajouté 3 ml d'une solution de caséine et on a déterminé l'activité protéolytique. Les résultats sont rassemblés dans le tableau 6. L'activité caséinolytique obtenue dans le 40 test a été comparée à l'activité caséinolytique dans des échan- bad original i 70 25379 ,7 2051630 "sillons témoin sans addition du produit à tester. Conrr.': j*". en a utilisé du tri-hydroxyméthyl)aminométhane 0,2 M à pH 7,4 et 10,0. Tableau VI Effet sur l'activité caséinolytique du produti brut des métau:: et inhibiteurs. 30 Produit ajouté Changement de l'activité % 10 0,03 M Mn2+ 0 0,03 M Zu2+ - 30 0,03 M Co2+ -'10 0,03 M Ca2+ +10 0,03 M Mg2+ 0 15 0,01 ml Trc;-jlol^' 0 0,03 M EDTA - 10 0,1 ml PMSP - 95 EDTA + PjVISP - 95 On constate dans le tableau VI que l'addition de PMSP une inhibition presque totale de l'activité caséinolytique mais que les ions métalliques testés ainsi que le tra-sylol® et le EDTA ne donnent pratiquement pas d'inhibition. Le Zn" ^ peut avoir une certaine activité inhibitrice. Il est particulièrement intéressant pour l'utilisation envisagée du produit de l'invention comme additif aux compositions détergentes que les ions calcium n'influencent apparemment pas l'activité caséinolytique de la préparation enzymatique. Le tableau 7 rassemble les résultats obtenus par addition de Trasylol® et d'inhibiteur soja au produit brut et aux produits IP 4,1 et IP 10,5, Ie titrage de l'activité étant fait sur BAME. Tableau 7 Fffet sur l'activité estérolytique vis-à-vis de BAME }3ar addi-'~on r\S) de Trasylol^ et d'inhibiteur soja. rrodu^ûs -cessés Pourcentage d'activité comparée à celle du témoin - ; • ' TrasylolOP soja : brute " 80 80 IP 4,1 10 10 o 1? 10,5'. • 90 90 70 25379 2051630 18 On constate dans le tableau 7 que le produit IP 4,1 est /rft inhibé à 90% par Trasylol ^ et l'inhibiteur soja. L'inhibition obtenue sur le produit brut peut être attribuée à l'inhibition du produit IP 4,1 présent dans le produit brut. 5 II est clair d'après ce qui précède que le produit brut de l'invention contient plusieurs enzymes protéolytiques. Ces enzymes protéolytiques peuvent être séparées les unes des autres par exemple par échange d'ions comme indiqué dans le schéma donné su préalable. En plus du DEAE, on peut aussi utiliser pour une 10 telle séparation des échangeurs d'ions contenant des groupes acides comme des groupes carboxyméthyles et dos groupes sulfo-éthyles et la sépartation peut aussi être effectuée par d'autres techniques comme par électrophorèse de zone, filtration sur gel et précipitation fractionnée. 15 Compatibilité de la préparation enzymatique (produit brut) avec.les compositions détergentes On a utilisé j5 compositions détergentes du commercej1'une contenant des perborates et de 40 à 50# en poids de phosphate; l'autre contenant 'jfo environ dé phosphate et pas de perborate; 20 un savon contenant 5% environ de phosphate. On a déterminé le pH optimum d'activité protéolytique, la stabilité au pH de l'activité protéolytique, la température optima de l'activité et la stabilité thermique du produit brut de la préparation enzymatique. -25 A. pH optimum de l'activité caséinolytiquë du produit.brut associé à des compositions détergentes'■ On a préparé les solutions suivantes : une solution contenant 5mg de composition détergente dans 100 ml d'eau (selution détergente). Une solution contenant 5 mg de la préparation enzymati-3° que brute par ml d'eau (solution enzymatique). L'autre étant une solution à yfo de caséine. On a ajusté le pH au moyen d'une solution tampon Teorell-Stenhagen. On a mélangé 2 ml de la solution tampon au pH désiré et 1ml 35 de la solution détergente avec 3 ml de la solution de caséine. On a établi la température de la solution résultante à 37°C on a ajouté 0,1 ml de la solution enzymatique et on a mesuré l'activité caséinolytique. Dans un but de comparais} n on a testé une solution témoin 40 ne contenant pas de détergent. Les résultats sont rassemblés 10 15 70 25379 2051630 19 daHS le tableau VIII. Tableau VIII Activité caséinolytique de la préparation enzymatique brute associée à une composition détergente. pH activité caséinolytique,pourcentage d'activité maximale de la composition détergente avec une teneur en phosphate de. i 40 - 50 fo 7 f 5 f solution 6,0 56 7 50 24 6,5 55 47 7,0 72 55 55 44 7,5 79 52 8,0 79 64 77 50 8,5 80 77 9,0 75 71 ' 97 58 9,5 89 97 10,0 100 100 100 76 10,5 80 100 11 ,0 68 100 20- B. Stabilité au pH de la préparation enzymatique "brute associée à des compositions détergentes On a utilisé des solutions identiques à celles utilisée dans le test A ci-dessus. On a mélangé 2 ml d'une solution ^5 tanïPon et 1 ml d'une solution détergente. On a ensuite agouté 0,1 ml de la solution enzymatique et on a incubé la solution ainsi obtenue pendant 30 minutes à 37°C| on a ensuite mesuré l'activité caséinolytique à pH 7*4 et à 37°0. Les résultats sont reportés dans le tableau 9. 70 25379 ao 2051630 Tableau 9 Influence du pH sur la stabilité de la préparation enz'/matique brute associée à des compositions détergentes 10 15 pU Activité caséinolytique,pourcentage d'activité maximale de la composition détergente avec une teneur en phosphate de 40-50 % 7 % 5 % solution témoin 2,0 4 2 2 1 3,0 4*- 0 59 4,0 5 10 79 77 5,0 18 15 80 6,0 23 100 100 73 7,0 40 93 8o 77 8,0 95 99 81 77r. 9,0 97 95 82 95 10,0 100. 72 67 100 11,0 71 50 38 68 C. Température optimale de l'activité caséinolytique de la prépa-20 ration enzymatique brute associée à des compositions détergentes La solution détergente et la solution de caséine utilisées étaient identiques à celles décrites en A ci-dessus. On a utilisé une solution enzymatique brute comprenant 3 mg de préparation enzymatique brute. On a ajusté le pH au moyen de 25 tampon phosphate 0,2 M pour l'ajuster à une valeur de 7,4 et au moyen du tampon Teorell-Stenhagen pour l'ajuster à une valeur de 9,0, On a mélangé 2 ml de la solution tampon' et 1 ml de la solution détergente avec 3 ml de la solution de caséine et on a jjO établi la température désirée par immersion de 3 minutes dans un bain d'eau. On a ensuite ajouté 0,1 ml de la soluiion enzymatique et on a déterminé l'activité caséinolytique. Les résultats sont rassemblés dans le tableau 10. 70 25379 2051630 21 . Tableau X Température optimale de l'activité caséinolytique de la préparation brute associée à des compositions détergentes Tempo- Activité caséinolytique,pourcentage de l'activité maximale rature de la composition détergente avec une teneur en phosphate de 10 15 °C 40 à 50$ 7% 5fo solutiontémoin PH 7,4 9,0 pH 7,4 pH 9,0 pH 7,4 pfi 9,0 pH ?,4 pH9,0 20 4 7 12 10 10 60 7 6 37 23 34 26 26 35 52 25 30 50 100 85 58 67 94 100 77 67 60 95 100 100 100 100 86 100 100 70 50 30 51 22 23 27 54 25 80 6 - 13 9 15 9 13 9 90 - - . 15 12 - - - 100 - - 13 16 - - - - - D. Stabilité thermique de la préparation enzymatique brute associée 20 à des compositions détergentes On a utilisé des solutions identiques à celles utilisées dans le test C. On a mélangé 2 ml de solution tampon et 1 ml de solution détergente avec 0,1 ml de solution enzymatique et on a incubé la solution résultante pendant 30 minutes à la température 25 cësirée; on a ensuite déterminé l'activité caséinolytique à 37°C. les résultats sont rassemblés dans le tableau X'I. Tableau XI Stabilité thermique de la préparation enzymatique brute associée à des compositions détergentes 30 Tempé- activité caséinolytique, pourcentage d'activité maximale rature de la composition détergente avec une teneur en .phos-oP phate. de 40 i 1 50^ 17° 57° - solution témoin pH 7,4 pH 9,0 pH 7 ,4 PH 9,0 pH 7, 4 pH 9,0 pH 7,4 pH 9,0 35 20 100 100 100 75 100 100 100 100 37 21 56 98 100 69 82 100 97 50 2 1 52 4 57 - 30 89 63 60 - - 7 2 20 - 37 5 70 - - - - 1 ' - - 3 3 40 80 - - - _ — 1 1 10 20 25 30 35 70 25379 2051630 22 E. L'activité caséinolytique relative de la préparation enzymatique brute associée à des compositions détergentes, comparée à l'activité caséinolytique obtenue sans addition de compositions détergentes a été mesurée à pH 7,4 et à 73°C. Les résultats sont rassemblés dans le tableau XII. Tableau XII Activité caséinolytique relative de la préparation enzymatique brute Type de détergent activité caséinolytique relative teneur en phosphate 40 à 50# .126 teneur en phosphate contenant du perborate 7# 128 teneur en phosphate 5# ' -144 (détergent savon) pas de détergent ajouté 100 Les résultats des. tests reportés dans les tableaux VIII-XII établissent que la préparation enzymatique brute de la présente invention est compatible avec des compositions détergentes ayant des teneurs fortes (40-50# en poids) ainsi que des teneurs faibles (5-10# en poids) de phosphate, pouvant aussi contenir des perborates comme brillants optiques. Les résultats montrent aussi que la préparation enzymatique est compatible avec les savons.Le pH optimum dans le savon, indiqué dans le tableau 8 n'est pas affecté» Le pH optimum dans les compositions contenant respectivement 4q à 50# de phosphate et 7# de phosphate,est légèrement diminué jusqu'à une valeur du pH de 10. Le maximum de stabilité pour la composition détergente indiquée dans le tableau 9 contenant 40 à 50# de phosphate est à pH 10 et pour la composition contenant 7# de phosphate et le détergent contenant 1g savon il est à piî 6. La température optimale indiquée dans le tableau 10 n'est pratiquement pas affectée dans toutes les compositions testées. La stabilité thermique indiquée dans-le tableau XI est la plus affectée dans le détergent contenant 40 à 50# des phosphates. On constate dans le tableau XII que l'activité caséinolytique totale de la préparation enzymatique n'est pas diminuée par mélange avec les compositions détergentes testées. Les exemples suivants illustrent encore cette invention; ils ne doivent pas être considérés comme en limitant le domaine 40 23 15 70 25379 d'application. Exemple 1 - Dans une série d'Erlenmeyers de 500 100 ml de l'un des milieux suivants ; 2051630 ml on a introduit & III IV 24 g 20 g 13,5 g conplén^nt à lOOOal II Farine de blé 20 g 10 farine de soja 20 g 13,5 g complément à 1000 ni 20 g 20 g 13.5 g coKiplénont à 1000 ml 30 g 40 g 13.6 g 20 eau du robinet cônplémeut à 1000r.il V décoction de blé 40 g 20 g 13,6 g complément à 1000 i-l 25 Les récipients ont été traités en autoclave à 120°C pen dant 20 minutes. Le pH a été ajusté à 6,8 environ avant stérilisation. Après refroidissement, on a inoculé les récipients avec une suspension aqueuse de l'organisme. L'incubation a été effectuée "à une température de 26-30°0 et elle a été arrêtée lorsque 30 l'activité protéolytique a passé par un maximum, ce qui se produit en 96 heures. Les résultats sont donnés dans le tableau I. Tableau I 35 sucrose pharmamedi cl kh2p04 eau du robinet Farine de blé farine de soja kh2PO4 eau du robinet sucrose farine de soja KE^PO^ eau du robinet sang de boeuf séché psucrose KHgPO^ eau du robinet décoction de blé Pharmamedi kh2po4 eau du robinet Organisme Activité en unités caséine par ml dans le milieu I II III IV V es 32 32 45,9 46,0 21,4 34,5 40 Exemple 2 - On à ajusté.à pH 6,9 au moyen de potasse 100 mg de farine de soja,175 g de sucrose, 67,5 g de phosphate monopotassique, 1 ml d'éraulsion KD-anti-mousse dans 5 ml d'eau et on a 70 25379 24 2051630 stérilisé l'ensemble à 127°C pendant 30 minutes dans un récipient de fermentation de 10 litres. On a refroidi le milieu nutritif et on l'a inoculé avec 100 ml d'une culture de 24 heures de CS 32, souche mutante et 5 on l'a incubé à 28°C avec agitation et aération. Au bout de 72 heures lorsque l'activité protéolytique a été estimée à 65 unités caséine/ml on a refroidi la fermentation. Exemple 3 - On a ajusté à pH 6,9 au moyen de potasse 100 g de f,a-10 rine de soja , 200 g de sucrose, 67,5g de phosphate monopotassique, 1 ml d'émulsion RD-anti-mousse dans 5 litres d'eau et on a stérilisé l'ensemble à 127°C pendant 30 minutes dans un récipient de fermentation de 10 litres. On a refroidi le milieu nutritif et on l'a inoculé avec 100 ml d'une culture de 24 heures 15 de CS 32 et on l'a incubé à 28°C avec agitation et aération pendant 36 heures environ. On a ajusté à pH 6,9, au moyen d? potasse 3 000 g de farine de soja, 6 000 g de sucrose, 2 025 S &e phosphate monopotassique, 10 ml d'émulsion RD-anti-mousse dans 150 litres d'eau 20 du robinet et on a stérilisé l'ensemble à 127°C pendant 30 minutes dans un récipient de fermentation de 300 litres. On a refroidi le milieu nutritif et on l'a inoculé avec la culture mentionnée ci-dessus puis incubé à 28°C avec agitation et aération. Au bout de 72 heures lorsque l'activité 25 protéolytique a été estimée à 40 unités de caséine/ml, on a refroidi le bouillon de fermentation. Exemple 4 Récupération d'une préparation enzymatique par précipitation Pour 1'isolement)(ie la préparation enzymatique du 30 bouillon de fermentation de l'exemple 3, on a filtré le bouillon dans un filtre-presse Seitz feuilles 3/1250 avec 1 % de Dicalite pour faciliter la filtration. On a ajusté la solution claire (150 litres, activité 38 unités caséine/ml) à pH 5 avec de l'acide phosphorique et on a précipité les enzymes par une 35 solution de 900 g de tannin dans 3 litres d'eau. Après une heure d ragitation , on a centrifugé la suspension dans un séparateur centrifuge. On a traité le précipité tannin-enzyme humide (4600g) par 1 000 ml d'acétone froide (-10°C) qu'on a ajoutés lentement 40 avec agitation. Après dissolution partielle du précipité , on a 70 25379 25 2051630 encore ajouté en une seule fois 20 000 ml d'acétone et on a filtré le mélange. On a lavé le solide à l'acétone et on l'a sébhé à l'air à température ordinaire pendant la nuit. Rendement 615 g avec une activité de 7,8 unités 5 caséine/mg. Exemple 5 - Récupération d'une préparation enzymatique par séchage par pulvérisation. Pour l'isolement d'une préparation enzymatique à par-10 tir d'un bouillon de fermentation comme dans l'exemple 3, on a filtré Te bouillon dans unfiltre-presse Seitz feuilles 3/1250 avec 1# de Dicalite pour faciliter la filtration. On a évaporé la solution claire (41,5 litres, activité, 33 unités caséine/ml) dans un évaporateur en film fin à 15°C jusqu'à volume de 4,8 15 litres ; activité 175 usités caséine/ml. On a séché par pulvérisation la solution pour obtenir 970 g d'un produit avec une activité de 0,95 unités caséine/mg. L'activité protéolytique de la préparation enzymatique brute de la présente invention a été comparée avec celle d'une 20 enzyme protéolytique provenant d'Aspergillus oryzae, Protéase 1 (R. Bergkvist , Acta ChPm. Scand.17 (1963) 1521 1540). Les substrats testés sont la caséine, la gélatine, l'élastine, et TAEE. Avec la gélatine, on a utilisé une méthode viscosimétrique (S. Lindvall, 0 Magnusson et K Orth. Acta Chem. Scand. 23 (1969), 25 p 2165). Les résultats sont reportés dans le tableau II ci-dessous Tableau II Rapport entre l'activité protéolytique pour une préparation enzymatique brute obtenue à partir de CS 32 selon la méthode décrite dans l'exemple 4 et l'activité protéolytique de la protéase I 30 (Bergkvist, loe. cit.) Substrat Activité protéolytique de la préparation enzymatique brute activité protéolytique de la protéase I Caséine 0,48 Gelatine 0,44 Elâstine 4,0 TAEE • 0,13 35 L'activité de la préparation enzymatique brute vis-à-vis de l'élastine est supérieure à celle de la Protéase I, alors 40 70 25379 2051630 26 que l'activité de la préparation enzymatique brute vis-à-vis de la gélatine, de la caséine et de TAEE est inférieure à celle de j.a Protéase I. Exemple 6 - On a ajusté à pH 6,8-7,0 au moyen de potasse 100 g de farine de soja, 200 g de sucrose, 67,5 g de phosphate monopotassique, 1,00 ml d'émulsion RD anti-mousse dans 5 litres d'eau et on a stérilisé l'ensemble à 125°C pendant 50 minutes dans un récipient de fermentation de 10 litres. On a refroidi le milieu nutritif et on l'a inoculé avec 100 ml d'une culture de 24 heures de CS 52 et on l'a incubé à 28°C avec agitation et aération pendant 50 heures environ. On a ajusté à pH 6,8-7,0 au moyen de potasse 3 000 g de farine de soja, 6 000 g de sucrose, 2 025 g de phosphate monopotassique, 50 ml d'émulsion RD anti-mousse dans 150 ml d'eau du robinet et on a-stérilisé l'ensemble à 125°C pendant 30 minutes dans un récipient de fermentation de 300 litres. On a refroidi le milieu nutritif et on l'a inoculé avec la culture mentionnée ci-dessus puis incubé à 28°C avec agitation et aération. Au bout de 90 heures, lorsque l'activité protéolytique a été estimée à 80 unités ca'séine/ml on a refroidi le bouillon de fermentation. Exemple 7 - Récupération d'une préparation enzymatique par précipitation Pour l'isolement de la préparation enzymatique à partir d 'un bouillon de fermentation comme dans l'exemple 6, on a filtré le bouillon dans un filtre-presse Seitz - feuilles 3/1250 sans additif de filtration - et on a a juste le pH à.5,5 au moyen d'acide phosphorique. On a refroidi à 10-15°C la solution claire (140 litres, activité 79 unités caséine/ml). On a précipité les enzymes par une solution de 900 g de tannin dans 5,0 litres d'eau. Après 1 heure d'agitation, on a centrifugé la suspension dans un séparateur centrifuge. On a traité le précipité humide tannin-enzyme (1830 g), par 500 ml d'acétone froide (-10°C) qu'on a ajouté lentement avec agitation. Après dissolution partielle du précipité , on a encore ajouté en une seule fois 8 000 ml d'.acétone et on a filtré le mélange au bout de 60 minutes. On a lavé le solide à l'acétone et on l'a séché sous vide à température ordinaire pendant la nuit. 70 25379 27 2051630 Rendement : 405' S avec une activité de 18 unités caséine/mg. Exemple 8- Récupération d'une préparation enzymatique par précipitation Pour l'isolement de la préparation enzymatique à pai'tti-5 d'un bouillon do fermentation conrao (fans l'exemple 6, on a filtré le bouillon dans un fiIfero-presse Seitz - feuilles 3/1250 sans additif de filtration •• et on a-ajusté 1c- pH à 5,5 au moyen d'acide phosphorique. On a refroidi à 10-15°C la solution claire (140 litres)'activité 71 unités caséine/ml et on l'a évaporée dans un 10 évaporateur à film fin à 20JC jusqu'à un volume de 30 litres, activité 300 unités caséine/mg. On a précipité les enzymes par une solution de 875 g de tannin dans 2,9 litres d'eau. Après 1 .heure d'agitation, on a centrifugé la suspension dans un séparateur centrifuge. On a 15 traité le précipité humide tannin-enzyme (3256 g) par 2 000 ml d'acétone à moins 10°C qu'on a ajouta lentement avec agitation. Après dissolution partielle du précipité, on a encore ajouté en une seule fois 18 600 ml d'acétone et on a filtré le mélange au bout de 60 minutes. 20 On a lavé le solide à l'acétone et on l'a séché sous vido à température ordinaire pendant la nuit. Rendement : 612 g avec une activité de 11,0 unités casé;'— ne/mg. Exemple 9 - 25 On a. ajusté à pH 5,9 au moyen de potasse 3,0 kg de fa rine de soja, 6,0 kg de sucrose, 2,0 kg de phosphate raonopotassi-cue, 0,5 litres d'émulsion RD anti-mousse dans 100 litres d'eau du robinet et en a stérilisé l'ensemble à 125°C pendant 30 minutes dans un récipient de fermentation de 360 litres. 50 On a refroidi le milieu nutritif et on l'a inoculé avec 400 ml d'une culture de 24 heures de CS 32 et on l'a incubé à 28°C avec agitation et aération pondant 48 heures. On a ajusté à pH 6,8-7,0 au moyen de potasse 200 kg de farine de soja, 350 kg do sucrose, 32 kg de potasse, 57 kg d'acide si phosphorique concentré,, 2,0 litres d'émulsion RD anti-mousse dans 8 000 litres d'eau du robinet et on a stérilisé l'ensemble pendant 30 minutes à 125°C dans un récipient de fermentation de 17 000 ?.i • très. On a refroidi le milieu nutritif et on l'a inoculé avec ^0 la culture mentionnée ci-dessus puis incubé à 28°C avec agitation BAD oMGINM- 70 25379 2051630 28 et aération. Au bout de 83 heures lorsque l'activité protéolytique a été estimée à 40 unités caséine/ml on a refroidi le bouillon de fermentation. 5 Exemple 10 - Récupération d'une préparation enzymatique par séchage par pulvérisation. Pour l'isolement d'une préparation enzymatique à partir d'un bouillon de fermentation comme dans l'exemple 9? on a fil-10 tré le bouillon sur un filtre à tambour rotatif sous vide revêtu de 100 kg de Dicalite. On a évaporé la solution claire ( 10 000 litres, activité 40 unités caséine/ml) dans un évaporateur en film mince à 25°C jusqu'à un volume de 1100 litres, activité 300 unités caséine/ml. 15 On a séché par pulvérisation la solution pour obtenir 318 kg de produit avec une activité de 1,0 unités caséine/mg. On peut mentionner l'exemple suivant d'une composition détergente contenant la préparation enzymatique brute de la présente invention. 20 Exemple 11 - Composition détergente contenant la préparation enzymatique brute (pourcentage en poids calculé sur le produit final), dodécylbenzène-sulfonate 14 tripolyphosphate de sodium 7 25 silicate de sodium 6 gluconate 5 produit enzymatique (produit brut) 1 carbor.yméthylcellulose 1 sulfate de sodium ^ gg 30 carbonate de sodium l / On peut ajouter le cas échéant des additifs tels que: azurants optiques/ parfums, colorants, etc. On peut aussi mentionner comme exemples non limitatifs de compositions détergentes les compositions semblables conte- 35 nant la préparation enzymatique de la présente invention et a) du savon comme constituant tensio-actif1 20# environ en poids de perborate calculé en NaB0_, 4Ho0 et les constituant;: 3 2 habituels comme brillants optiques, parfums, colorants, sulfate de sodium,carbonate de sodium, triphosphate de sodium et silicate de sodium ou bad original i 40 70 25379 2051630 29 b) du dodécylbenaène sulfonate comme constituant tensio--actif, 33# environ en poids de perborate calculé en HaBO^, 4H 0 et les constituants habituels comme indiqué en a) ci-dessus„ Un détergent savon mentionné en a) peut contenir 5# environ en poids de tri phosphate de sodiuinj Une composition coirmc indiqué en b) ci-dessus peut contenir jusqu'à 40-50# en poids de triphosphate de sodium» bad original 70 25379 J0 2051630 BKreimTnftTTOMS . _ 1 - Un mélange enzymatique iiydrolytique ayant, les caractéristiques suivantes ; a) c'est un mélange deprotéines; 5 b) il est soluble dans l'eau/les solutions salines et les solutions tampons comme les tampons phosphate, borate et citrate; c) il est stable et conserve son activité enzymatique à température ordinaire pendant plus d'une heure sous forme de poudre sèche. 10 d) son spectre d'absorption ultra-violet est caractéristique de protéines contenant des amino-acides aromatiques; e) il est protéolytiquement actif vis-à-vis de la caséine, de la fibrine, de l'hémoglobine, de l'albumine , de la gélatine et de l'élastine; 15 f) il a un optimum protéolytique avec la caséine comme substrat à un pH supérieur à 10; g) il est capable d'hydrolyser des esters comme ester éthylique de Na-tosyl-L-arginine(TAEE) ; ester méthylique de Na.-benzoyl-L-arginine (BAME) et îî-ci-benzoyl-D-L-arginine-Ç>-naphtylamide (BANA) 20 h) il contient en plus des enzymes protéolytiques des estérases, lipases et amylases; i) l'activité protéolytique peut être précipité par des solvants organiques par exemple des alcools comme éthanol; l'acétone, les tannins, les lignines; ou les sels par exemple sulfate d'am-25 moniura, sulfate de sodium; • j) il a une température optima avec la caséine comme substrat dè 60°C environ à pH 7,4 et à pH 9,0 k) il contient une fraction protéolytiquement active ayant un point isoélectrique de pH 4,1; 30 i) n contient une fraction protéolytiquement active ayant un point isoélectrique de pH 6,1; m) il contient une fraction protéolytiquement active ayant un point isoôlectrique" de pH 10,5; n) il a un pH optimum avec la caséine, l'élastine, l'albumine, 35 BANA,TAEE et BAME comme substrats respectivement à pH 11 ou plus, 10, 11,5, 9,5, 10,5 ou plus et 7; o) iln'a pas d'activité peptidasique ou qu'une activité très faible vis-à-vis de glycyl-glycine, Gly-gly,glycine, gly-L-leu-cine, L-leu-glycine, gly-L-proline, L-pro-glycine, Z-gly-L-40 phénylalanine, Z-L-gly-L-tyrosine et. Z-gly-L-leu-amide,. bad original 70 25379 31 2051630 p) l'activité caséinolytique est pratiquement non affectée par la présence de Mn2+, Co2+, Ca2+5 Mg2+ et EDTA q) l'activité caséinolytique n'est pratiquement pas affectée 'p) par la présence de Trasylol- 5 r) l'activité caséinolytique est presque complètement inhibée par la présence de PMSP. 2 - Un mélange enzymatique hydrolytique conforme à la revendication :] décrit en substance. 3 - Un procédé de production d'un mélange enzymatique 10 hydrolytique conforme à la revendication 1 qui consiste à soumettre à la fermentation dans des conditions submergées aérobie dans le milieu nutritif, le microorganisme Cephalosporium ATCC 11 550 et à recueillir dans la culture le produit hydrolytique obtenu. 15 4 - Un procédé conforme à la revendication 3 dans lequel le milieu nutritif contient des sources assimilables de carbone, d'azote et de sels minéraux. 5 - Un procédé conforme à la revendication 3 ou 4 dans lequel le pH au début de la fermentation est de 4,5 à 9,5» 20 6 - Un procédé conforme à la revendication 5 dans lequel le pH au début de la fermentation est de 6 à 7. 7 - Un procédé conforme à l'une quelconque des revendications 3 à 6 inclus dans lequel la fermentation est effectuée à une température de 20 à 35°C. 25 8 - Un procédé conforme à la revendication 7 dans lequel la fermentation est effectuée à 2o-28°C. 9 - Un procédé conforme à l'une quelconque des revendications inclus dans lequel le mélange obtenu à la fermentation est filtré et les enzymes hydrolytiques sont récupérées 30 de la solution résultante par précipitation. 10- Un procédé conforme à la revendication 9 dans lequel la précipitation est effectuée au moyen de tannin; 11 - Un procédé conforme à la revendication 9 dan^iequel la précipitation est effectuée par un solvant organique, par 35 ia lignine ou par un sel minéral. 12 - Un procédé conforme à la revendication 11 dans lequel le solvant organique est choisi parmi l'acétone et l'alcool iso-propylique. 13 - Un procédé conforme à l'une des revendications 3-8 inclus dans lequel le mélange est filtré et la solution résul- i bad original 70 25379 2051630 32 tante est soumise à un séchage par pulvérisation. 14 - Un procédé conforme à la revendication 13 dans lequel la solution filtrée est évaporée avant séchage par pulvérisation. 5 15 - L'utilisation d'un mélange enzymatique hydrolytique conforme à la revendication 1 en tant qu'additif pour les compositions détergentes. 16 -■ Une composition détergente contenant de 0,01 à 5# en poids d'un mélange enzymatique hydrolytique conforme à la 10 revendication 1. 17 - Une composition détergente conforme à la revendication 16 contenant de 0,1 à 2% en poids du mélange enzymatique hydrolytique. 18 - L'utilisation du microorganisme ATCC 11 550 dan^a 15 production d'enzymes hydrolytiques pratiquement stables à la chaleur. bad original