FR 2030046 A1 19701030 FR 6932953 A 19690926 69 32953 1 2030046 La présente invention concerne de nouveaux produits polymères du type papaïne/EAM (comme défini ci-après), qui peuvent être préparés sans perte de l'activité enzymatique naturelle, et qui sont caractérisés par des propriétés remarquables. La préparation 5 de composés polymères à base de papaïne et de composés apparentés conformément au procédé classique est une opération difficile, et l'invention concerne également un procédé, qui implique (a) une inactivation de certaines parties de la molécule, par exemple par réaction avec un métal tel que le mercure, (b) la réaction de 10 l'enzyme inactivé avec le polymère pour donner un produit polymère privé d'activité enzymatique, puis (c) le rétablissement des sites actifs de la partie enzyme de la molécule de polymère et d'enzyme, pour donner le produit de polymère et d'enzyme doué d'activité enzy- y matique, procédé qui permet une réaction plus douce, une plus grande 15 souplesse, et l'obtention de plus grand^rendements du produit insoluble désiré offrant de plus grands pourcentages d'activité enzymatique naturelle. En outre, la Demanderesse; a découvert que ce produit de polymère et d'enzyme ou d'enzyme inactivé peut être préparé en utilisant,comme matière première contenant l'enzyme, une 20 matière relativement brute et fortement colorée, pour obtenir la matière enzyme-polymère insoluble désirée sous une forme pratique- i ment incolore, par réaction sélective du"polymère avec l'enzyme, plutôt qu'avec les impuretés colorées indésirables. L'un des buts de la présente invention est de fournir des 25 procédés et des produits conformes à ce qui précède. "BAM" désigne un polymère d'éthylène et d'anhydride maléi-que. Des polymères de ce type ont un grand intérêt pour la présente invention. L'expression "EAM—papaïne" ou "EAM/papaïne" désigne tui 30 copolymère d'éthylène et d'anhydride maléique auquel de la papaïne est attachée par une liaison de covalence. Le produit est le même tant si l'on fait réagir la papaïne directement avec un groupe anhydride du copolymère d'éthylène et d'anhydride maléique que si on la fait réagir avec un groupe carboxyle résultant de l'hydrolyse 35 d'un groupe anhydride du copolymère d'éthylène et d'anhydride maléique, que l'on utilise ou non une forme intermédiaire inactivée de la papaïne. Les groupes anhydride qui ne participent pas à la 69 32953 2 ^ 2030046 réaction dans laquelle le produit est obtenu én milieu aqueux sont présents dans ce produit sous la forme de groupes carboxyle ou carboxylate. Toutefois, ces groupes non-participants peuvent être transformés en groupes amide, imide, ester, etc, qui peuvent être 5 présents dans des polymères du type EAM, comme défini ci-après. L'expression "EAM-mercuripapaïne" désigne un copolymère d'éthylène et d'anhydride maléique auquel de la mercuripapaîne est attachée par une liaison de covalence. L'expression "insoluble dans l'eau" signifie que le produit 10 en question ne se dissout pas dans l'eau ou dans des solutions aqueuses, bien qu'il puisse posséder certaines caractéristiques telles qu'un haut degré de gonflement dû à la solvatation par l'eau» qui peut aller jusqu'à l'existence d'une forme gélifiée. Le terme "protéolytique" désigne l'aptitude à hydrolyser 15 les protéines (grande molécule), comme déterminé ordinairement par le processus de digestion de la caséine de Kunitz. Le terme "estérasique" désigne l'aptitude à l'hydrolyse des esters (petitesmolécules), déterminée habituellement vis-à-vis de l'ester éthylique de la benzoylarginine (EEBA) au moyen de la 20 méthode pH-statique de Smith et collaborateurs. Les dérivés insolubles de polymère et papaïne peuvent être préparés en faisant réagir l'enzyme cristallin ou brut avec le polymère en solution, ce qui aboutit à la formation d'un produit insoluble dans lequel la papaïne est attaché^ar une liaison de co-25 valence. Lorsqu'un anhydride ou un groupe carboxyle est présent dans le polymère, par exemple un polymère du type EAM, la fixation de l'enzyme sur le polymère par une liaison de covalence peut être effectuée directement par réaction ou couplage avec un groupe anhydride ou avec un groupe carboxyle en utilisant un agent activa-30 teur. Le produit est le même dans les deux cas. La gamme de pH de la réaction va habituellement de 5 à 9»5, mais de préférence d'environ 6 à 8. L'isolement et la purification sont généralement effectués conformément aux processus biochimiques normaux, et au moyen du processus général des exemples qui suivent. Attendu que la fixa-35 tion de l'eE2yme au polymère par une liaison de covalence est désirée, la réaction est ordinairement conduite à basses températures et à des pH relativement neutres, dans l'eau utilisée comme solvant, 69 32953 3 2030046 ou dans un mélange de solvants,, en utilisant jm solvant dans lequel l'enzyme est au moins partiellement soluble. la Demanderesse a découvert que le diméthylsulfoxyde (DMSO) convient particulièrement comme solvant, et son utilisation dans un solvant mixte fait l'ob-5 jet d'une autre invention. lorsqu'on procède de cette manière, on obtient des dérivés-actifs désirés de EAM-papaïne, mais le degré d'activité conféré -au produit polymère est parfois faible, ce qui est peuijêtre dû à une activation partielle de l'enzyme pendant le processus, et 10 la réaction laisse donc un peu à désirer du point de vue opératoire. C'est pourquoi on a cherché et trouvé un-procédé perfectionné. Le procédé perfectionné est généralement applicable à la préparation de produits à base d'un polymère et d'un enzyme dans lesquels un enzyme est fixé par une liaison de covalence à la molé-15 cule du polymère. Pour autant qu'on désire maintenir l'activité enzymatique de l'enzyme de départ dans le produit final, il est naturellement nécessaire, en premier lieu, que la liaison de l'enzyme au polymère se fasse par des groupes qui ne sont pas capables d'inactiver des sites actifs de la molécule de l'enzyme. Toutefois, lors-20 que la molécule d'enzyme porte plusieurs groupes réactifs qui se disputent les groupes réactifs du polymère, comme c'est le cas de l'EAM et de la papaïne, où non seulement des groupes amino, mais aussi des groupes sulfhydryle, entre autres, peuvent réagir avec le polymère, cette compétition peut avoir et a souvent pour conséquence 25 qu'une activité inférieure à l'activité optimale est conférée au produit de polymère et d'enzyme, ce qui est dû au moins en partie à une réaction compétitive entre ces divers groupes réactifs, j compris une activation partielle du produit final si les groupes réactifs constituent une partie des centres actifs de la molécule 30 d'enzyme et sont nécessaires à l'activité enzymatique, et aussi à cause d'une inactivation partielle fortuite de l'activité par destruction de sites actifs de. la molécule d'enzyme au cours de la réaction sous l'effet d'un réactif, d'un solvant ou d'autres conditions réactionnelles. 35 Parmi les divers groupes réactifs, qui entrent en compéti tion, des diverses molécules d'enzyme, on peut mentionner, outre les groupes amino et sulfhydryle, le groupe hydroxyle (y compris un 69 32953 * 2030046 groupe hydroxyle phénolique, le groupe carboxyle et le groupe imidazolyle. Ces groupes peuvent être présents dans des parties inactives de la molécule de 11enzyme, par exemple dans un fragment de cystéine, de sérine, de thréonine, d'histidine ou de tyrosine 5 d'aune molécule d'enzyme, où. le fragment particulier en question n'est pas considéré comme étant essentiel pour l'activité enzymatique, mais ils sont aussi souvent présents dans des parties actives de la même molécule d'enzyme, auquel cas les réactions compétitives de ces groupes entraînent au moins un certain degré 10 d'inactivation pendant la fixation à la molécule de polymère. Pour les raisons exposées ci-dessus, la Demanderesse a trouvé avantageux d'inactiver, de bloquer ou de protéger un ou plusieurs de certains groupes de la molécule d'enzyme avant la réaction avec la molécule de polymère, puis de conduire la 15 réaction de couplage (dans laquelle le fragment d'enzyme est attaché au polymère dans son état inactivé, bloqué ou protégé), de la manière déjà indiquée dans le paragraphe traitant du processus de couplage de la papaïne (les conditions typiques utilisées dépendront naturellement de la stabilité et de la réactivité de 20 l'enzyme et du polymère utilisés dans chaque cas particulier) , pour former un produit de polymère et d'enzyme privé d'activité enzymatique, puis de réactiver ou de débloquer le ou les groupes préalablement inactivés du fragment d'enzyme , pour donner le produit désiré de polymère doué d'activité enzymatique. On a 25 trouvé que l'un des moyens les plus simples d'inactivation ou de protection réside dans la formation d'un dérivé métallique de l'enzyme, par exemple le dérivé de mercure ou de ziac d'un enzyme portant au moins un groupe sulfhydryle, en l'occurrence le dérivé de mercure de la papaïne. l'utilisation de conditions non oxy-30 dantes pendant la formation de ces dérivés,par exemple la présence d'un agent modérément réducteur, comme c'est le cas de la cystéine, est avantageuse pour empêcher l'oxydation des groupes sulfhydryle libres de l'enzyme pendant leur inactivation. Des dérivés métalliques d'autres enzymes peuvent aussi être formés de cette manière 35 en vue de 1'inactivation ou de la protection d:un site actif de l'enzyme, par exemple la chymopapaïne, la ficine, la bromélaïne, et l'asclépaïne, pendant la fixation au polymère (notamment un BAD ORIGINAL 69 32953 s 2030046 polymère portant des groupes carboxyle/anhydride ) par l'intermédiaire d'autres groupes qui peuvent être du même type que les groupes inactivés, mais qui ne sont pas essentiels pour l'activité. De préférence, le dérivé métallique ou dérivé d'une autre nature 5 de l'enzyme est également soluble dans l'eau et les solutions aqueuses tamponnées, mais il n'est pas essentiel que le degré de solubilité dans l'eau ou dans des mélanges de solvants soit suffisant pour permettre la réaction subséquente de couplage. I'inactivation et la protection ne dépendent pas elles-mêmes des fac-10 teurs de solubilité. D'autres groupes d'inactivation et de blocage peuvent aussi être utilisés pour produire des dérivés inactivés ou bloqués de l'enzyme, par exemple des éthers de pyranyle ou de tétrahydropyranyle, des acylates, des cétals , des énamines, des énoléthers, des esters, etc., conformément aux processus con-15 nus de formation de ces groupes et leur élimination finale de la molécule d'enzyme et de polymère pour rétablir l'activité enzymatique se fait également conformément aux conditions les plus douces possibles, selon un procédé connu, dans d'autres domaines, d'élimination de ces groupes, bien qu'il n'ait pas encore été suggéré 20 qu'une telle activation et une telle élimination en vue de la réactivation soient possibles dans le domaine auquel l'invention s'adresse. La nature exacte de l'élément ou du groupe utilisé à des fins d'inactivation, de protection ou de blocage est sans importance, pour autant que cet élément ou ce groupe joue le rôle 25 qu'on lui demande, à savoir 1'inactivation de sites actifs ou de groupes, et qu'il peut être éliminé en vue de rétablir ces sites actifs ou ces groupes après l'incorporation de l'enzyme dans la molécule de polymère, sans altérer le produit. De plus, une inactivation complète de l'activité enzymatique de 1'enzyme et 30 du produit intermédiaire de polymère et d'enzyme protégé n'est pas essentielle, et dans certains cas, un degré notable d'activité enzymatique subsiste dans l'enzyme inactivé et les produits de polymère et d'enzyme inactivés. Par exemple, le dérivé- de zinc de la papaïne peut retenir jusqu'à 20 i° de l'activité enzymatique 35 initiale, tout comme le produit formé d'EÀM et du dérivé de zinc de la papaïne. 69 32953 2030046 Après la réaction entre la molécule d'enzyme protégée, Q bloquée ou inactivée et le polymère pour donner le produit poly-mère-enayme inactivé, par exemple 1'EAM-mercuripapaïne, de la manière classique et conformément au processus usuel, l'élément 5 ou groupe d'inactivation est également éliminé conformément à des processus biochimiques classiques, par exemple l'utilisation d'une chélation dans le cas d'un agent métallique d'inactivation. lorsque l'élimination d'un métal est impliquée, on opère de préférence dans des conditions non oxydantes, de manière à empêcher 10 l'oxydation de gro.upes sulfhydryle qui sont en cours de réactivation. la présence d'un agent modérément réducteur, tel qu'un composé contenant des groupes sulfhydryle , est avantageuse dans un tel cas, et il s'agit par exemple de cystéine, de glutathion, de méthylmercaptan, d'acide thioglycolique, de mercaptoéthanol 15 ou d'une substance analogue. Des conditions non oxydantes peuvent aussi être réalisées en excluant l'oxygène atmosphérique au moyen de divers procédés connus, mais l'utilisation d'un agent modérément réducteur est préférée, car elle offre une garantie contre l'oxydation par des mécanismes d'oxydation qui sont propres au mélange 20 réactionnel, y compris même l'enzyme proprement dit. Dans le cas d'autres groupes de protection ou d'inactivation, l'élimination est effectuée d'une manière classique en vue de rétablir l'intégrité du type de groupe requis pour l'activité du fragment d'enzyme, et conformément aux données usuelles de conditions 25 réactionnelies douces, de températures et de pH relativement neutres qu'on utilise ordinairement en biochimie. le produit final de la réaction est donc, là aussi, le produit désiré enzyme-polymère actif insoluble, mais ordinairement les rendements sont plus grands et les taux de transforma-30 tion en produits d'activité désirée sont plus forts, et l'introduction des hauts degrés désirés d'activité enzymatique dans la molécule de polymère est généralement bien moins difficile à réaliser lorsqu'on utilise le procédé d'inactivation, de couplage et de réactivation qui vient d'être défini. En ce qui concerne 35 le polymère entrant dans cette réaction, il contient de préférence des liaisons carboxyle ou anhydride , notamment lorsque l'enzyme 69 32953 7 2030046 contient un groupe amino, hydroxyle (y compris un groupe hydroxyle phénolique) ou sulfhydryle qui n'est pas essentiel pour son activité enzymatique. lorsque l'enzyme contient un groupe carboxyle qui n'est pas essentiel pour son activité, le polymère peut con-5 tenir des groupes hydroxyle/amino libres destinés à réagir avec ce groupe carboxyle. le polymère est de préférence un polymère EAM ou un polymère d'un type analogue, mais ce peut être l'un quelconque dés types déjà décrits pour les réactions de couplage avec un enzyme, et dans chaque cas, il est susceptible d'une 10 fixation par liaison de covalence avec l'enzyme pour former un produit enzyme-polymère, soit directement, soit en utilisant un agent activateur. Comme autre aspect de la présente invention, la Demanderesse a découvert que la purification, y compris l'élimination 15 des impuretés colorées indésirables, lorsqu'on part d'un enzyme brut ou d'un dérivé brut d'enzyme, peut être avantageusement effectuée en formant un dérivé polymère directement à partir de l'enzyme brut ou du dérivé brut d'enzyme, dont des exemples représentatifs sont donnés par la papaïne et la mercuripapaïne. 20 la matière polymère contient de préférence des liaisons car-ou boxyle/anhydride , notamment lorsque l'enzyme contient un groupe amino, hydroxyle (y compris hydroxyle phénolique) ou sulfhydryle libre qui n'est pas essentiel pour son activité enzymatique. lorsque l'enzyme contient un groupe carboxyle qui n'est pas essen- 25 tiel pour son activité, le polymère peut contenir des groupes ou hydroxyle/amino libres en vue de réagir avec ce groupe carboxyle. le polymère est de préférence un polymère EAM ou un polymère d'un type analogue, mais il peut s'agir de l'un quelconque des types déjà décrits pour des réactions de couplage avec un enzyme 30 et, dans chaque cas, il est susceptible de s'attacher à l'enzyme par une liaison de covalence pour donner un produit enzyme-polymère soit directement, soit en utilisant un agent d'activation. l'utilisation de ces matières premières impures colorées contenant l'enzyme brut en vue de la réaction avec le polymère, en solution 35 ou suspension aqueuse ordinaire, aboutit à une fixation sélective de l'enzyme à l'exclusion des impuretés et notamment des matières 69 32953 2030046 pigmentées, qui restent dans le liquide surnageant pendant le processus de séparation et qui peuvent être facilement éliminées et jetées. Ceci est particulièrement vrai lorsqu'un produit polymère-enzyme insoluble est lavé de la façon classique avec de l'eau 5 et les solutions tampons usuelles, suivant la nature exacte du produit polymère-enzyme en cours de traitement et les conditions exactes de pH qui doivent donc être maintenues. Etant donné que des enzymes sont produits par un processus de culture cellulaire, y compris la production par fermentation à partir de cultures 10 de bactéries et de cellules animales, ou à partir de substances naturelles, par extraction, ilgfeontiennent souvent comme impuretés des substances colorées outre des toxines, des substances pyro-gènes et d'autres substances contaminantes indésirables qui ne sont que difficilement éliminées. L'extraction de l'enzyme 15 purifié de tels milieux naturels colorés et impurs par le procédé de l'invention, offre non seulement un moyen de purifier l'enzyme, mais fournit un produit polymère-enzyme, soit actif, soit inactif (en fonction de l'enzyme de départ, qui est naturel ou inactivé), produit qui est pratiquement dénué des impuretés 20 colorées indésirables qui sont présentes dans la matière première colorée contenant l'enzyme. Etant donné que ces impuretés colorées sont de nature ou de provenance inconnue, la fixation sélective de l'enzyme par le polymère est imprévisible. La formation d'un produit polymère-enzyme insoluble, pratiquement incolore, au moyen 25 de la réaction du polymère et de la matière enzymatique (y compris les dérivés de nature métallique et d'autres natures de l'enzyme) avec lequel des impuretés colorées sont en combinaison, réaction suivie d'un lavage aqueux du produit enzyme-polymère insoluble, compte parmi les buts de la présente invention. ÏJaturello&ent„ J>ar 30 si la matière enzyme-polymère est inactivee, par exemple/suits de l'u-d'une tilisation/ forme inactivée de l'enzyme, comme matière enzymatique colorée de départ, le produit formé par le polymère et l'enzyme inactivé relativement pur doit finalement/reactivé avant d'être utilisé. 35 Les enzymes contiennent généralement plusieurs groupes fonctionnels, par exemple des groupes amino, carbosyle, hydroxyle, 69 32953 9 2030046 imidazole, sulfhydryle et disulfure, qui ne sont pas essentiels pour l'activité catalytique ou la liaison au substrat. Ces groupes peuvent participer à la liaison de covalence entre l'enzyme et un polymère choisi comme support. Ces liaisons peuvent compren-5 dre l'une ou plusieurs des suivantes : amides, imides, esters, thioesters et disulfures. Ces fixations sont effectuées au moyen de procédés aptes à assurer toute protection désirée de l'enzyme. Il peut s'agir d'un blocage irréversible des sites doués d'activité enzymatique, comme déjà décrit de façon plus détaillée. 10 Des amides sont commodément formés par réaction de groupes amino portés par l'enzyme avec des groupes anhydride carboxylique portés par le polymère de support, dans l'eau, dans des milieux aqueux tamponnés ou dans des solvants en mélange. Des amides, des imides et des esters sont facilement formés par activation 15 de groupes carboxyliques du polymère, ou bien à titre de variante, par des groupegéarboxyle portés par l'enzyme, et par leur réaction avec des groupes hydroxyle, amino ou mercapto correspondants, portés par l'autre réactif. Cette activation peut être effectuée par réaction des groupes carboxyle avec divers carbodiimides, 20 carbodiimidazoles, le réactif de Woodward, etc., pour former des composés intermédiaires très actifs, capables de réagir avec d'autres groupes mentionnés ci-dessus, dans des conditions douces, lesquelles favorisent le maintien de l'activité enzymatique. Par conséquent, on peut dire du polymère choisi pour 25 cette réaction qu'il est susceptible d'un couplage ou d'une réaction avec l'enzyme, que ce dernier soit actif ou inactivé, soit directement, soit indirectement en utilisant un agent d'activation, comme déjà indiqué, et qu'il peut, dans chaque cas, s'attacher à l'enzyme par une liaison de covalence. Etant donné 30 que les groupes fonctionnels réactifs de protéines, y compris les enzymes, comportent souvent un empêchement, il est parfois utile d'avoir recours à un solvant organique en combinaison avec l'eau ou un tampon aqueux. Le choix d'un, tel solvant tient compte de la compatibilité avec le maintien de l'activité enzymatique. 35 On utilise ce solvant en quantité suffisante pour solvater en partie des portions entrées en réaction mutuelle de la molécule, ■et pour accroître ainsi l'aptitude des groupes fonctionnels choisis 69 32953 io 2030046 à réagir, la quantité de ce solvant étant habituellement inférieure q à 50 $ en volume, le diméthylsulfoxyde est un solvant particulièrement intéressant pour une telle application. Dans son contexte le plus large, le polymère auquel 5 l'enzyme doit être attaché conformément à un ou plusieurs aspects de la présente invention, contient des liaisons carboxyle ou anhydride, notamment lorsque l'enzyme contient un groupe amino, hydroxyle ou suifhydryle, qui n'est pas essentiel pour son activité enzymatique. lorsque l'enzyme contient un groupe carboxyle 10 qui n'est pas essentiel pour son activité, le polymère peut contenir des groupes hydroxyle ou ami no destinés à réagir avec de groupe carboxyle. le polymère peut être un polymère du type EAM ou d'un type analogue, ou bien ce peut être l'un quelconque des types déjà définis en vue des réactions de fixation avec 15 un enzyme, et dans chaque cas, il est capable d'un couplage ou d'une réaction avec l'enzyme pour effectuer la fixation par une liaison de covalence et pour donner le produit enzyme-poly-mère désiré. Etant donné qu'une liaison de covalence est indispensa-20 ble, il va de soi que le polymère utilisé comme support est conçu pour contenir au moins un site réactif sur chaque molécule de polymère avec laquelle l'enzyme peut réagir, soit directement, soit indirectement, pour former une liaison de covalence. Conformément à la présente invention, ce ou ces sites réactifs en 25 consistent de préférence/un groupe carboxyle ou anhydride carboxylique . Parmi les polymères qui conviennent pour la mise en pratique de la présente invention, on préfère des polyélectro-lytes polymères portant des motifs de formule : 30 -Z-CRk -(CHjJq-ÇRg-0=0 0=0 1 t n 69 32953 n 2030046 dans laquelle R^ et Rg sont choisis parmi un atome d'hydrogène, un atome d'halogène, (de préférence le chlore), un groupe alkyle ayant de là 4 atomes' de carbone (de préférence méthyle) un groupe cyano, phényle ou des combinaisons de ces groupes, à 5 condition que l'un ou l'autre seulement des groupes R^ et Rg soit un groupe phényle ; Z est un radical bivalent (de préférence alkylène, phénylalkylène, (alcoxy inférieur)-alkylène et acyloxyalkylène aliphatique inférieur) ayant de 1 a 18 atomes de carbone, q est égal à 0 ou 1, I et ï sont choisis parmi 10 les groupes hydroxy, -0-métal alcalin, OR, -OK-NH^, -OH-R^N, -OH-RpNH, -OH-RHHp, -NRR', et -(Q) -W-(ER'R') , groupes dans lesquels x est compris entre 1 et 4 et p est égal à 0 ou 1, R est choisi parmi les groupes alkyle, phénylalkyle ou phényle, ayant chacun de 1 à 18 atomes de carbone, R' représente un atome 15 d'hydrogène ou un groupe R, tandis que Q est un atome d'oxygène ou le groupe -NR'-, et ¥ est un radical bivalent, choisi de préférence parmi les radicaux alkylène inférieur, phényle, phénylalkyle, phénylalkylphényle et alkylphénylalkyle, ayant jusqu'à 20 atomes de carbone, X et Y, pris ensemble, pouvant représenter 20 un atome d'oxygène, et l'un au moins des symboles X et Y représentant un groupe hydroxyle, ou bien X et Y constituant ensemble un atome d'oxygène. Beaucoup de ces polymères sont disponibles dans le commerce, et d'autres sont de simples dérivés de produits disponibles dans le commerce, qui peuvent être facilement préparés 25 soit avant la réaction de fixation de 1'enzyme, soit en même temps que cette réaction, ou bien produits en tant que légère modification du polymère de base après la fixation, les polymères contenant les motifs du type EAM défini ci-dessus sont appelés ci-après "polymères du type EAM". 30 Etant donné que les molécules d'enzyme ont couramment un poids moléculaire extrêmement haut, même si le motif polymère illustré comme étant utilisable pour la fixation de l'enzyme n'apparaît qu'une fois dans une chaîne de polymère, par exemple une fois par plusieurs centaines de motifs, la réaction de l'en-35 zyme avec ce motif donne'un produit enzyme-polymère doué d'une activité enzymatique importante, et un produit dans lequel le fragment enzyme représente une partie importante du poids molécu 69 32953 12 2030046 laire du produit de polymère et d'enzyme. S'il y a plus d'un des motifs mentionnés, on peut obtenir des fixations multiples s'accompagnant d'une augmentation de l'activité enzymatique du produit. Comme on le montre ci-après, les motifs de la formule 5 donnée sont de préférence récurrents, n étant au moins égal à 8. Lorsque les motifs sont récurrents, les symboles des divers motifs récurrents n'ont pas nécessairement la même valeur dans tous ces motifs. En outre, lorsque les motifs sont récurrents, certains des groupes X et Y peuvent avoir des définitions autres qu'un 10 groupe hydroxy ou un atome d'oxygène. Par exemple, certains d'entre eux, mais non leur totalité, peuvent être présents sous la forme de groupes imide , c'est-à-dire des groupes dans lesquels X et Y représentent ensemble un groupe -NE.- ou -N-W-(îffl.'R' )x dans lequel R, V et R1 ont les définitions qui leur ont déjà été don-15 nées. ' Un type préféré de matière polymère intéressante pour la mise en pratique de l'invention consiste en un polymère d'un acide polycarboxylique à insaturation oléfinique ou d'tin dérivé de cet acide avec lui-même ou, dans des proportions à peu près 20 équimolaires, avec au moins un autre monomère copolymérisable avec lui. Le dérivé d'acide polycarboxylique peut être du type non-vicinal, comme l'acide acrylique, l'anhydride acrylique, l'acide méthaciylique, l'acide crotonique ou leurs dérivés correspondants, tels que des sels partiels, des amides et des esters, ou 25 bien du type vicinal, comme c'est le cas de l'acide maléique, l'acide itaconique, l'acide citraconique, l'acide a,a-diméthyl-maléique, l'acide a-butylmaléique, l'acide a-phénylmaléique, l'acide fumarique, l'acide aconitique, l'acide ct-chloromaléique, l'acide a-bromomaléique, l'acide a-cyanomaléique, y compris 30 leurs sels partiels, leurs amides et leurs esters® Il est avantageux d'utiliser l'anhydride de l'un quelconque des acides énumérés ci-dessus. Les comonomères qui peuvent être utilisés convenablement avec les monomères fonctionnels définis ci-dessus comprennent 35 des a-oléfines telles que l'éthylène, le propylënes llisobutylène, le 1-butène ou le 2-butène, le 1-hexène, le 1-oetène, le 1-décène, 69 32953 13 2030046 le 1-dodécène, le 1-octadécène et d'autres monomères vinyliques tels que le styrène, l'a-méthylstyrène_, le vinyltoluène, le pro-pionate de vinyle, la vinylamine, le chlorure de vinyle, le formiate de vinyle, l'acétate de vinyle, les éthers de vinyle 5 et d'alkyle, par exemple l'éther de méthylvinyle, des acrylates d'alkyle, des méthacrylates d'alkyle, des acrylamides et des alkylacrylamides, ou des mélanges de ces monomères. La réactivité de certains groupes fonctionnels, portés par les copolymères qui résultent de certains de ces monomères permet la formation d'au-10 très groupes fonctionnels utiles dans le copolymère formé, par exemple des groupes hydroxy, lactone, aminé et lactame. L'un quelconque de ces dérivés de polyacides peut être copolymérisé avec l'un quelconque des autres monomères énumérés ci-dessus, et avec tout autre monomère capable de former un 15 copolymère avec des dérivés de diacides. Les dérivés de polyacides peuvent être des copolymères de plusieurs comonomères, auquel cas la quantité totale des comonomères est de préférence à peu près équimolaire par rapport aux dérivés de polyacides. 20 Bien que ces comonomères puissent être préparés par polymérisation directe des divers monomères, il est souvent plus facile de les préparer par une modification post-réactionnelle d'un copolymère existant. Des copolymères d'anhydride et d'un autre monomère 25 peuvent être transformés en copolymères contenant des groupes carboxyle par réaction avec l'eau, et en leurs sels d'ammonium, d'un métal alcalin ou alcalino-terreux et d'une alkylamine par réaction avec des composés de métaux alcalins, des composés de métaux alcalino-terreux, des aminés, l'ammoniac, avant, pendant 30 ou après la fixation de l'enzyme, etc. D'autres dérivés convenables des polymères mentionnés ci-dessus comprennent les esters partiels, par exemple d'alkyle et des amides, alkylamides, dialkylamides, phénylalkylamides partiels préparés par réaction de groupes carboxyle portés par la chaîne du polymère avec les 35 aminés choisies ou un alcool alkylique ou phénylalkyligue, de même que des aminoesters, des aminoamides, des hydroxyamides et des hydroxyesters, dont les groupes fonctionnels sont séparés 69 32953 14 2030046 par un alkylène inférieur, un groupe phényle, phénylalkyle, phé-nylakylphényle ou alkylphénylalkyle, ces dérivés étant préparés de la même manière avec la considération requise pour protéger les sites de fixation de l'enzyme, comme mentionné ci-dessus. D'autres 5 groupes aryle peuvent être présents à la place des groupes phényle. Des dérivés particulièrement intéressants sont les dérivés dans lesquels des groupes carboxyle à charge négative sont partiellement remplacés par des groupes amino ou des groupes de sels d1aminés. Ils sont formés par réaction de ces groupes carboxyle avec des 10 polyamines telles que la diméthylaminopropylamine ou des dialkyl-aminoalcools tels que le diméthylaminoéthanol, le premier formant une liaison amide avec le polymère et l'autre formant une liaison ester. Un choix approprié des dérivés mentionnés ci-dessus permet de régler les divers paramètres de comportement du produit enzyme-15 polymère de la présente invention. On connaît des exemples de polymères de diaeides ou d'anhydrides de diacides et d'une oléfine, notamment des polymères d'acide ou d'anhydride maléique ou d'une oléfine, du type EAM défini ci-dessus. En général, un tel copolymère a 20 un degré de polymérisation de 8 à 10.000, de préférence d'environ ÎOO à 5.000, et un poids moléculaire d'environ 1.000 à 1.000.000, de préférence d'environ 10.000 à 500.000. Ces polymères sont disponibles en nombre dans le commerce. Des copolymères particuliè-ment intéressants sont ceux qui dérivent de l'éthylène et de 25 l'anhydride maléique, dans des proportions à peu près équimolaires. Le produit est disponible dans le commerce. Les copolymères d'anhydride maléique ainsi obtenus présentent dans leur molécule des liaisons anhydride qui se répètent et qui sont facilement hydrolysées par l'eau en donnant 30 la forme acide du copolymère, la .vitesse d'hydrolyse étant proportionnelle à la température. Du fait que les réactions'de l'invention sont conduites dans des solutions ou suspensions aqueuses, en utilisant des mélanges d'eau et d'un solvant, le produit de fixation de l'enzyme au copolymère EAM par une liaison 35 de covalence porte des groupes carboxyle ou carboxylate attachés à ses chaînes adjacentes à l'enzyme, au lieu de groupes anhydride, en raison de l'hydrolyse de groupes anhydride, qui ne réagissent pas avec les enzymes pendant la réaction. 69 32953 15 2030046 Ceci est vrai également des groupes anhydride présenta dans d'autres polymères," tels que les polymères du type EAM, qui s'hydrolysent en groupes carboxyle ou carboxylate pendant la réaction. 5 Comme on l'a déjà mentionné, l'expression "insoluble dans l'eau" signifie que le produit en question ne se dissout pas dans l'eau ou dans des solutions aqueuses, même s'il peut avoir des caractéristiques telles qu'un haut degré de gonflement dû à une solvatation par l'eau, même jusqu'au point d'exister 10 sous la forme d'un gel. Des produits "insolubles dans l'eau" peuvent être séparés au moyen de procédés comprenant une fil-tration, une centrifugation ou une sédimentation. De telles caractéristiques sont conférées par une réticulation. Ainsi, des produits insolubles dans l'eau, conformément 15 à la présente invention, sont obtenus en faisant réagir l'enzyme avec un polymère insoluble dans l'eau ou en faisant en sorte que le produit de réaction entre 1'enzyme et le polymère ou 1'enzyme inactivé et le polymère devienne insoluble par réaction avec un agent polyfonctionnel de réticulation, tel qu'une polyamine 20 ou un polyol (y compris le glycol), lorsque cela est nécessaire. Le produit de réaction entre l'enzyme et le polymère ou l'enzyme inactivé et le polymère est souvent insoluble en soi, par suite de l'interaction entre le fragment d'enzyme et d'autres chaînes du polymère. Si le polymère est préalablement réticulé, de façon 25 à présenter une structure tridimensionnelle ou si, dans certains cas, il possède une chaîne linéaire de longueur suffisante, le polymère de départ est déjà insoluble dans l'eau. Il existe d'autres procédés de réticulation qui sont bien connus en pratique. Lorsque l'objectif visé est l'obtention de produits 30 dont l'insolubilité est prononcée, il est souvent avantageux d'utiliser, des copolymères qui contiennent déjà une certaine réticulation. De tels copolymères réticulés sont connus et peuvent être obtenus en conduisant la polymérisation, par exemple la copo-lymérisation de l'anhydride maléique et de l'hydrocarbure oléfi-35 nique, en présence d'un agent de réticulation, par exemple un composé contenant deux doubles liaisons oléfiniques, comme c'est 69 32953 16 2030046 le cas du divinylbenzène ou-du crotonate de vinyle, du poly-1,2-butadiène ou des alpha, oméga-dioléfines. la quantité d'agent de réticulation variera avec le degré désiré d'insolubilité, mais en général, elle est de l'ordre de 0,1 à 10 $ en poids 5 du mélange total de monomère. A titre d'exemple du procédé de préparation du réseau tridimensionnel de polymère, lorsque cela est nécessaire ou désirable, on peut utiliser un composé djfonctionnel pour ré-ticuler un copolymère préalablement fozmé d'un diacide et d'une 10 monooléfine en C2 à C1g. On peut y pervenir par la réaGtion entre le copolymère et une polyamine, par exemple 1'éthylène-diamine en quantité de 0,1 à 10 moles i°. Ainsi, on peut régler le degré de réticulation du polymère total. Il y a.lieu de remarquer que 15 11éthylènediamine n'est qu'un exemple typique d'un agent de réticulation, mais qu'on peut utiliser à cette-fin de nombreux autres composés, choisis par exemple dans la classe des alkylène-polyamines et d'autres polyamines analogues. Dosage de l'activité enzymatique 20 On détermine l'activité d?estérase de la papaïne et des dérivés de polymère EAM et de papaïne par la. méthode pH-statique (en utilisant un appareil d'auto-titration Eadiometer, Copenhague, modèle TTT) à 25°G. (voir Smith et Parker, "J. Biol. Chem. 255. 1387 (1958)). le mélange réactionnel (5 ml) contient 25 0,05 mole d'ester éthylique de benzoyl-1-arginine (EEBA), 0,05 mole de cyatéine et 0,002 mole d'éthylènediamine-tétraacétate (EDTA). On ajouté la papaïne (40 à 100 ng) ou le dérivé d'EAM et de papaïne (possédant une activité d'estérase analogue) au mélange réactionnel,et on suit la vitesse d'hydrolyse à un pH 30 de 6,3 dans le cas de la papaïne ou à un pH de 8-8,1 dans le cas des dérivés d'EAM et de papaïne. On utilise comme solution titrante une solution d'hydroxyde de sodium.0,1 M. les deux préparations de papaïne cristalline utilisées dans cet essai possèdent les activités d'estérase suivantes : 35 papaïne cristallisée 2X du commerce, 20 nmoles/min/mg de protéine ; papaïne cristallisée 2X du commerce, 14 iimoles/min/mg de protéine. 69 32953 n 2030046 les activités de protéase de la papaïne et des dérivés d'EAM et de papaïne sont déterminéegâu moyen de la méthode de digestion de la caséine de Kunitz. (Voir "J. G-en. Physiol." %0, 291 (1947)). le mélange réactionnel contient 1 ml d'une solution 5 à 1 fi de caséine [dans un tampon de tris-(hyâroxyméthylaminométhane) 0,1m, pH 7,5] et 0,2 ml d'EDïA 0,02M. la papaïne (2-12\ig) ou le et dérivé d'EAM/ de papaïne, possédant une activité d'estérase analogue, est ajouté , et le mélange à base de caséine est mis à incuber à 37° pendant 20 minutes, la réaction est arrêtée par 10 l'addition de 3 ml d'acide trichloracétique (ATC) à 5 fi, et on détermine la densité optique à 280 my. Cette méthode pratique d'analyse spectrophotométrique implique simplement la détermination de la densité optique à 280 m^i du filtrat d'acide trichloracétique (ou à 660 m^ après 15 réaction avec le réactif au phénol de Folin) et en comparant ce chiffre avec celui que l'on obtient dans un essai effectué sur un échantillon connu de papaïne ou d'EAM-papaïne de concentration équivalente. Conformément à cet essai, l'acide trichloracétique précipite la totalité des protéines en laissant 20 une liqueur surgageante contenant des peptides et des amino-acides. la densité optique de cette liqueur surnageante donne l'activité de la matière enzymatique soumise à l'essai, en indiquant la formation des amino-acides et des peptides par rupture de liaisons de la protéine de départ (caséine) soumise 25 à l'essai, le résultat peut être directement exprimé en imités de caséine par gramme (voir tableau IIA). (Une unité de caséine représente la quantité d'enzyme nécessaire pour produire une substance soluble dans l'acide trichloracétique équivalant à 0,5 lig de tyrosine à 37°C en 10 minutes, dans les conditions 30 de l'essai). l'activité de protéase des dérivés d'EAM et de papaïne est exprimée en milligrammes de papaïne fixée, par rapport à la papaïne naturelle utilisée comme témoin. lorsqu'on désire soumettre à un essai un dérivé métallique 35 inactivé des produits de polymère et de papaïne, par exemple le dérivé de mercure de l'EAM-papaïne, on doit éliminer l'ion métallique d'inactivation du produit devant subir l'essai, soit avant, 69 32953 18 2030046 soit pendant cet essai, par addition d'un agent convenable de chélation, de préférence dans un milieu non oxydant, ce qui empêche l'oxydation des groupes oxydables, par exemple les groupes sulfhydryle de l'enzyme. Dans les systèmes mentionnés ci-dessus, 5 ces groupes sont portés par 1'éthylène-diamine-tétraacétate et la cystéine. On prépare la mercuripapaïne en utilisant une papaïne cristallisée 2X du commerce comme matière première, au moyen du procédé de Smith, comme décrit par Kimmel et Smith dans la 10 revue "J. Biol. Chem." 207. 515 (1954) ou au moyen d'une variante de ce procédé. On ajoute 33 mg de chlorure mercurique dissous dans 10 ml de tampon tris 0,5 M (pH 8,1) à une solution de 23 mg de papaïne dans de la cystéine 0,005 M et de 1'éthylènediamine -tétraacétate 0,002 M à un pH de 6,0 (15 ml) pré-incubée à 37°C 15 pendant 15 minutes. On agite le mélange réactionnel pendant quelques minutes, puis on le soumet à une dialyse totale vis-à-vis d'un tampon tris 0,05 M à un pH de 8,0, puis vis-à-vis d'un tampon au phosphate 0,05 M à un pH de 7,8. La solution dialysée de mercuri-papaïne est utilisée directement dans les expériences 20 de fixation. Les rendements de mercuri-papaïne sont d'environ 70 fi. En utilisant la papaïne brute comme matière première, on prépare la mercuri-papaïne selon une légère variante du procédé décrit ci-dessus. On agite pendant une heure une suspension 25 de poudre de papaïne brute (10 g) dans de la cystéine 0,005 M et de l'EDTA 0,002 M à un pH égal à 6 (300 ml) , et on sépare par filtration la matière insoluble. On ajoute ensuite au filtrat de couleur jaune du chlorure mercurique (900 mg) dissous dans du tampon tris 0,5 M à un pH de 8,1 (40 ml). On effectue comme 30 ci-dessus une dialyse totale vis-à-vis de tampon tris 0,005 M puis de phosphate 0,005 M. La solution dialysée de mercuri-papaïne est utilisée directement pour la liaison. Les rendements en mercuri-papaïne sont habituellement de 60 à 70 fi de l'activité totale de la poudre brute, mais on 35 peut atteindre des rendements s'élevant jusqu'à 80 fi en conduisant cette opération avec le maximum de précaution. 69 32953 19 2030046 Le dérivé de zinc de la papaïne eat connu en pratique (voir Cayle, brevet des Etats-Unis d'Amérique H° 3.284.316), et on peut le préparer d'après le mode de préparation décrit ci-dessus, et dans le brevet précité. Gomme autres sels de métaux 5 qui peuvent aussi être préparés pratiquement de. la même manière et utilisés comme agents enzymatiques protégés ou inactivés, conformément aux exemples suivants, on mentionne les sels de cuivre, de manganèse, de cobalt, de calcium, de baryum, de nickel et de métaux analogues de la papaïne, de la ficine, de 10 la bromélaïne et de 11asclépaïne, en plus des sels de mercure et de zinc de ces enzymes. Exemples 1 à 8 - Dérivés insolubles de l'EAM et de la mercuri- papaïne Couplage de la mercuri-papaïne à des polymères d'EAM. 15 Le procédé général utilisé dans la préparation de dérivés d'EAM de la mercuri-papaïne est le suivant : On ajoute goutte à goutte une solution, habituellement dans le diméthylsulfoxyde (DMSO) d'EAM déshydraté (55 mg/5 ml) à une solution refroidie à la glace, agitée énergiquement, 20 de mercuri-papaïne (11,5 mg) dans du phosphate 0,05 M à un pH de 7,8 (75 ml), puis on ajoute la quantité appropriée d'hexamé-thylènediamine utilisée comme agent de réticulation (1 ml d'une solution d'hexaméthylènediamine à 1 fi par 100 ml d'EAM)»On conserve une nuit au réfrigérateur la solution agitée à l'aide 25 d'un agitateur magnétique. On centrifuge le précipité insoluble de mercuri-papaïne inactivé et d'EAM (centrifugeuse Sorval, SS-3, 12.000 tours/miniffce, 10 à 15 minutes) et on le lave plusieurs fois à l'eau. Dans.la plupart des cas, la première liqueur surnageante est dénuée d'activité enzymatique après l'é-30 limination du mercure, ce qui indique la fixation efficace de la mercuri-papaïne à l'EAM dans ces conditions. Dans chaque cas, pour rétablir les sites actifs du fragment de papaïne, il est nécessaire, soit pendant l'essai, soit avant celui-ci, d'éliminer le mercure à l'aide d'un agent 35 de chélation, dans des conditions non-oxydantes, par exemple les conditions modérément réductrices offertes par la présence de la cystéine, du méthyl-mercaptan, du glutathion, du mercapto-éthanol, de l'acide thioglycolique ou d'un autre composé contenant 69 32953 20 2030046 un groupe sulfhydryle. Les dérivés insolubles d'EAM et de papaïne, préparés de cette manière, possèdent de 56 à 85 fi de l'activité initiale d'estérase. 5 Des poudres lyophilisées des divers échantillons d'EAM/ papaïne préparés de cette manière, retiennent de 70 à 80 fi de l'activité des matières avant la lyophilisation. Certains des résultats de liaison concernant l'EAM-papaïne obtenus de cette manière en utilisant de la papaïne 10 cristallisée du commerce sont résumés sur le tableau I. L'activité d'estérase a été déterminée comme décrit dans ce qui précède sous le titre "dosage de l'activité enzymatique". Exemples 9 à 11 - Produit d'EAM et de mercuri-papftTne et produit d'EAM et de dérivé de zinc de la papaïne. 15 On obtient des préparations d'EAM/mercuri-papaïne dé rivées de poudres brutes de papaïne en suivant essentiellement le même processus que celui qui est décrit dans les exemples 1 à 8. La solution dialysée (de couleur jaune-brunâtre) de mercuri-papaïne est utilisée directement pour le couplage avec une solu-20 tion de diméthylsulfoxyde de l'EAM, sans autre concentration ou précipitation de la mercuri-papaïne. Les dérivés insolubles d'EAM/mercuri-papaïne que l'on obtient sont pratiquement incolores, notamment après les opérations usuelles de lavage, la plus grande partie de la matière colorée restant dans la 25 liqueur surnageante du mélange réactionnel. Les mêmes résultats d'élimination de la couleur s'obtiennent lorsqu'on utilise la papaïngforute elle-même, plutôt que la mercuri-papaïne. On obtient à peu près les mêmes résultats lorsqu'on 30 utilise le dérivé de zinc de la papaïne pour préparer les produits insolubles correspondants de l'EAM et du dérivé de zinc de la papaïne. En outre, on observe la même purification ou la même élimination de couleur lorsqu'on utilise de la ficine, de la bromélaïne, de l'asclépaïne, de la lipase^ de la cellulase 35 ou de la chymopapaïne relativement brute, ou des dérivés relativement bruts et fortement colorés de mercure ou de zinc, en 69 32953 21 2030046 vue de la réaction avec l'EAM ou avec un polymère du type de l'EAM, le résultat dans chaque cas étant un produit polymère essentiellement incolore. La purification la plus importante s'obtient lorsque l'enzyme est d'origine bactérienne, comme c'est le cas 5 de la lipase ou de la cellulase bactérienne, et lorsqu'il s'agit notamment de la purification d'enzymes produits par des microorganismes tels que Bacillus subtilis. Les résultats concernant les produits obtenus par fixation de mercuri-papaïne "brute" sur des polymères du type EAM, 10 suivie de l'élimination du mercure, sont récapitulés sur les tableaux II et IIA, les dosages auxquels il est fait allusion sur le tableau II correspondant aux indications déjà données sous le titre "dosage de l'activité enzymatique". Les résultats donnés sur le tableau IIA ont été obtenus au moyen de la méthode 15 de détermination de la densité optique, également déjà décrite. On obtient pratiquement les mêmes résultats avec le dérivé insoluble correspondant d'EAM et de composé de zinc de la papaïne. TABLEAU I Fixation de la mercuri-papaïne à des polymères d'EAM Dérivés d'EAM et de mercuri-papaïne Poudre lyophilisée Mercuri-papaïne dans le mélange réaction- Suspension aaueuse nel (diverses prépa- R rations) a ?t Activité totale, Activité Activité Activité Poids, ■r, tt - i en"" unités d'estérase* initiale totale initiale mg Exem- mg Unités zyme au * ,mi+«Sq pie d'esterase* support d'esterase* O >o UJ tsj vO en Lu 1 2 3 4 2^5 v 11 j 5 8 42,5 79^9 285 127 1:15 1:10 1:5 1:5 23^8 53 186^2 99,5 56 67 65;3 73 19 45 17 r\> IV) 5 6 7 8 8 8 42 28 j6 127 127 1029 700 1:1 3:1 1:1 1:5 108 99^5 735;5 499^2 85 73 71,4 71j3 66 52 974 K> O eu o o * Après élimination du mercure. O TABLEAU II Fixation de la mercuri-papaïne brute à des polymères d'EAM Mercuri-papaïne Dérivés d'EAM et de mercuri-papaïne Rapport Suspension aqueuse Poudre lyophilisée réactionnel . n. de 1«enzyme au Activité Activité Activité -Activité Poids, Exem- Unités d'estérase* support totale* initiale, totale*, initiale unités fi unités fo mg d'estérase d'estérase pie 9 10.000 unités (500 mg de papaïne) 1:1 4.320 43,2 3.124 31 2.276 10 2.000 unités (100 mg de 1:2 1.025 51,3 705 35 320 papaïne) 11 7.600 unités 1:5 7.890 103 5.640 71,5 4.373 (380 mg de papaïne) * Après élimination du mercure Exemple Rapport de Dilution l'EAM à la papaïne 9 lîl 103 10 1:2 105 11 1:5 103 * Unités de caséine par gramme. a* sO TAB1EAU IIA U> K> / / sO Densité optique u/g* Densité optique u/g* ^ à 660 m(i à 280 m|a ^ 1,40 290.000 0,24 49.000 0,48 98.000 1,85 300.000 0,24 39.000 0,45 73.000 ro 4* K) O UJ O o o> 69 32953 25 2030046 Exemples 12 à 16 - Produit d'EAM/mercuripapaïne modifié à la dimé thvlaminopropylamine et à l'aminopropanol. On transforme des dérivés d'EAM/mercuri-papaïne en dérivés polycationiques et dérivés de polyalcool par couplage 5 de préparations d'EAM/mercuri-papaïne contenant le support en excès avec (a) la diméthylaminopropylamine (DMAPA ; (CH^)2 ou ("b) du 3-aminopropanol, respectivement, en utilisant le chlorhydrate de 1-éthyl-3-(3-diméthylaminopropyl)-carbodiimide comme réactif de couplage à la place du dicyclohexyl-10 carbodiimide que l'on utilise plus couramment. Une préparation typique est décrite ci-après. On centrifuge une suspension aqueuse d'EAM/mercuri-papaïne (rapport du support à l'enzyme, 5:1), correspondant à 100 mg de poudre sèche (1,06 x 10 J moles de carboxyle ; 350 15 unités d'estérase). On recueille le culot de centrifugation d'EAM/mercuri-papaïne, et on le met en suspension (a) dans 16 ml * de diméthylami.nopropylamine 1 H à un pïï de 6,8 (16 x 10 moles) et (b) 16 ml de propanolamine 1 M (pH 6,8). le réactif de couplage (1.000 mg ;• 5 ï 10"^ moles) dissous dans l'eau (1,5 ml) est 20 ensuite ajouté, puis le mélange réactionnel est abandonné pendant une nuit sous agitation dans la chambre froide. Le précipité est ensuite centrifugé et le culot de centrifugation est lavé jusqu'à ce qu'il soit exempt des réactifs aminés. Les résultats obtenus sont récapitulés sur le tableau III. 25 Le dérivé de polyalcool du produit EAM/mercuri-papaïne, c'est-à-dire le produit du couplage, à la manière des exemples 12 à 16 de 1'EAM/mercuri-papaïne avec la propanolamine, apiès élimination du mercure, montre la large courbe d'activité en fonction du pH caractéristique de l'enzyme naturel (optimum 30 de pH dans la gamme de 6 à 6,8). De même,, en partant de la dialkylaminoalkylamine ou de l'aminoalcanol approprié, on prépare d'autres dérivés de dialkylaminoalkylamine et d'aminoalcool, par exemple le dérivé de diéthylaminobutyle ou de dibutylaminooctyle de l'EAM/mercuri-35 papaïne ou dérivé de zinc de la papaïne, et le produit réactivé correspondant d'EAM/papaïne (ou EAM-ficine, EAM-chymopapaïne, • EAM-asclépaîne ou EAM-bromélaïne), de même que lé dérivé 69 32953y 26 2030046 d1aminoéthanol ou d'aminooctanol de 1'EAM/mercuri-papaïne ou de l'EAM et du composé de zinc de la papaïne (ou de l'EAM-ficine, 1'EAM-chymopapaïne, l'EAM-asclépaïne ou l'EAM-bromélaïne) et le produit réactivé correspondant d'EAM/papaïne (ou d'EAM-5 ficine, EAM-chymopapaïne, EAM-asclépaïne ou EAM-bromélaïne). Exemple 17 - EAM/mercuri papaïne modifiée à la propyi ami ri p Dans une expérience portant sur le couplage de la pro-pylamine à l'EAM/mercuripapaïne à la manière de l'exemple 12, on obtient un précipité montrant une activité enzymatique rela-10 tivement faible (19 de l'activité initiale) après élimination du mercure. De la même manière, le couplage de différentes alkylamines inférieures donne différents produits d'EAM/papaïne (ou d'EAM-ficine, EAM-chymopapaïne, EAM-asclépaïne ou EAM-bromé-15 laïne) modifiés avec 1'alkylamine inférieure, par exemple le dérivé modifié à la butylamine du produit d'EAM/compoeé de mercure ou de zinc de la papaïne (ou-de l'EAM-ficine, l'EAM-chymopapaïne , l'EAM-asclépaïne ou l'EAM-bromélaïne) et le produit correspondant modifié à la butylamine et réactivé,d'EAM/papaïne 20 (ou d'EAM-ficine, EAM-chymopapaïne, EAM-asclépaïne ou EAM- bromélaïne) et le produit modifié à 1'octylamine de l'EAM/dérivé de mercure ou de zinc de la papaïne (ou de 1lEAM-ficine, 1'EAM-chymopapaïne , l'EAM-asclépaïne ou l'EAM-bromélaïne) et le produit correspondant, modifié à l'octylamine et réactivé de 25 l'EAM/papaïne (ou l'EAM-ficine, l'EAM-chymopapaïne, l'EAM-asclépaïne ou l'EAM-bromélaïne). Les dérivés polycationiques d'EAM/mercuri-papaïne, (obtenus par couplage de l'EAM/papaïne avec la diméthylamino-propylamine), à la manière des exemples 12 à 16, montrent une 30 large courbe d'activité en fonction du pH, essentiellement identique à celle de la papaïne cristallisée (optimum de pH dans la gamme de 6 à 7). Ainsi, le déplacement de la courbe d'activité en fonction du pH vers des valeurs de pH plus acide auxquelles le modèle électrostatique permet de s'attendre (voir G-oldstein, 35 Levin et Katchalski (1964), "Biochemistry'J^., 1913), n'est pas observé dans le cas des dérivés polycationiques de la papaïne. 69 32953 27 2030046 Le dérivé neutre de polyalcool (EAM-papaïne modifié^â 1'aminopropanol) de l'exemple 16, après activation, montre un comportement de stabilité au pH analogue à celui de la papaïne cristallisée, c'est-à-dire une inactivation à un pH d'environ 3, 5 mais avec des paliers un peu plus larges. Le produit d'EAM-papaïne polycationique modifié à la diméthylaminopropylamine des exemples 13 et 15, après activation, montre un déplacement de la courbe de stabilité au pH vers des gammes plus acides, c'est-à-dire qu'une inactivation 10 se produit à un pH d'environ 2. Exem- Rapport Activité Poids Agent pie de l'en- totale, approxi- modi- zyme au unités matif, fica- support d'estérase* mg teur TABLEAU III Dérivés modifiés d'EAM/mercuri-papaïne Dérivés modifiés d'EAM/mercuri-papaïne* Suspension aqueuse Poudre lyophilisée Activité Activité Activité Activité Poids, totale initiale totale initiale mg unités fi unités fi d'estérase* d'estérase* 12 13 14 15 16 17 1:10 1:5 1:1 1:5 1:5 1:5 42,6 171 350 350 33 33 79 85 50 170 20 20 * Après élimination du mercure ( 1 ) Dimé thylami'no pr o pylamine. 7ï7 DMAPA V,J~/ 20 1M,PH 7,65 DMAPA 116 1M,PH 7,65 DMAPA lM,pH 6,85 175 DMAPA 2M,pH 6,85 115 Aminopro- 33,6 panol 1M,PH 7,7 Propylamine 6,24 lM,pH 7,65 48 68 50 33 100 19 42 70 75,5 24,6 20 21,6 37,0 195 O* sO UJ N) «O en UJ ro oo Ni O UJ o 69 32953 29 2030046 Exemple 18 - BAM-mercurif icine et EAM-ficine On met en suspension dans 200 ml d'eau distillée 10 g d'extrait brut de ficine. On élimine les impuretés insolubles par centrifugation. On ajoute 100 mg de chlorure mercurique 5 et on agite le mélange pendant 30 minutes. La protéine est précipitée par addition d'acétone froide- (2 volumes) et on recueille la matière solide par centrifugation, puis on la redissout dans 20 ml de tampon tris 0,01 M à un pH de 8,0. Le processus général des exemples 1 à 8 pour la pré-10 paration de l'EAM-mercuri-papaïne est utilisé pour le couplage de la mercuri-ficine avec des polymères. d'EAM, la mercuri-ficine remplaçant la mercuri-papaïne. Après activation du produit polymère par élimination du mercure en utilisant 1 ' éthylène-diami.ne-tétraacétate et 15 le mercapto-éthanol, on trouve que le produit d'EAM et de ficine possède de 75 à 90 fi de l'activité enzymatique initiale. Exemple 19 - EAM-mercuribromélaïne et EAM-bromélaïne On met en suspension dans 200 ml d'eau 1 g de bromélaïne (de qualité pour l'industrie alimentaire) et on ajoute 50 mg de 20 chlorure mercurique dans 10 ml d'eau. Après agitation de la solution pendant 30 minutes, on la dialyse à 5°C, pendant une nuit, vis-à-vis de 16 litres de tampon tris 0,01 M à un pH de 7,5, et on utilise directement la solution dialysée pour préparer le dérivé d'EAM conformément au processus des exemples 1 à 8, en 25 remplaçant la mercuri-papaïne de ces exemples, par la mercuri- bromélaïne. Après activation par. élimination du mercure en utilisant l'EDTA et le mercaptoéthanol, on traite le produit d'EAM et de bromélaïne de la manière usuelle, et on constate qu'il possède de 75 à 90 fi de l'activité enzymatique initiale. 30 Exemple 20 - Réactivation des dérivés d'EAM et d'enzyme Le procédé général utilise l'un quelconque des dérivés de polymère et d'un composé métallique d'enzyme décrits dans l'un ou l'autre des exemples qui précèdent. Procédé A 35 On ajoute,tout en agitant,à 500 ml d'une solution contenant 0,005 mole de cystéine et 0,002 mole d'EDTA à un pH égal à 6, 5 g 69 32953 30 2030046 d'un dérivé d'EAM et de" mercuri-papaïne (préparé dans l'exemple l) et on agite le mélange pendant une heure à la température ambiante. Au bout de cette période de temps, on dialyse le mélange vis-à-vis d'une solution aqueuse de cystéine et d'EDTA, et on 5 effectue ensuite une seconde dialyse totale vis-à-vis d'une solution aqueuse de cystéine à la température ambiante, puis on lyophilise le mélange pour obtenir l'EAM/papaïne (4,5 g) qui est exempte d'ion mercure. Le dérivé insoluble d'EAM-papaïne, préparé de cette manière, possède de 65 à 85 fi de l'activité ini-10 tiale d'estérase. Procédé B Comme dans le procédé A, on traite le dérivé d'EAM et de mercuri-papaïne avec la solution diluée de cystéine et d'EDTA. Cette solution est ensuite lyophilisée directement, sans dialyse 15 préalable, pour donner le produit .actif d'EAM et de papaïne. Exemple 21 - Produit d'EAM et de dérivé de zinc de la papaïne. et EAM-papaïne. Préparation du dérivé de zinc de la papaïne On ajoute à 30 ml d'une solution,à un pH de 6,0,de 55 mg 20 de papaïne brute dans de la cystéine à 0,005 M, tout en agitant, une solution de chlorure de zinc (50 mg) dissous dans du tampon tris 0,2 M à un pH de 7,8 (30 ml). Après agitation, la solution est soumise à une dialyse totale vis-à-vis d'un tampon tris 0,01 M et cette solution est utilisée directement en vue de la 25 fixation à l'EAM. Couplage du dérivé de zinc de la papaïne au polymère EAM Le procédé général utilisé dans la préparation des dérivés d'EAM du composé de zinc de la papaïne est le même que 30 celui décrit dans les exemples 1 à 8 pour la préparation des dérivés d'EAM de la mercuri-papaïne, sauf que le dérivé de zinc de la papaïne remplace la mercuri-papaïne. Les rendements de produit sont compris dans la gamme de 90 à 95 fi* Après activation par élimination du zinc (par traitement 35 avec une solution de cystéine et d'EDTA, conformément au mode opératoire décrit dans l'exemple 1, procédés A et B), on constate que le dérivé d'EAM et de papaïne possède 85 à 90 fi de l'activité 69 32953 31 2030046 initiale. En l'absence d'une élimination préalable de l'ion zinc, le produit d'EAM et de dérivé de zinc de la papaïne a une activité protéolytique de seulement 15 à 20 $ de l'activité initiale. Exemple 22 - EAM-papaïne obtenue en utilisant une papaïne organi-5 quement stabilisée On prépare l'EAM-papaïne en procédant à une protection préliminaire des groupes sulfhydryle de la papaïne par transformation de ces groupes en groupes disulfure, suivie de la réaction de la papaïne ainsi inactivée avec l'EAM, conformément au procédé 10 des exemples 1 à 8. Le produit insoluble d'EAM et de papaïne protégée est isolé par filtration ou centrifugation et lavé à l'eau, puis réactivé par traitement dans une atmosphère d'azote avec une solution 1 M de mercaptoéthanol à un pH compris entre 4 et 6. Le produit réactivé présente une quantité sensible, environ 15 75 fi f de l'activité enzymatique initiale. La transformation des groupes sulfhydryle de la papaïne en liaisons disulfure est effectuée en faisant réagir la papaïne avec une solution de cystéine 2 M à un pH compris entre environ 6 et 9, dans des conditions modérément oxydantes, que l'on peut 20 maintenir en faisant barboter de l'air à travers le mélange réactionnel sous agitation. Le produit ainsi obtenu est un dérivé de cystéine de la papaïne, qui peut être utilisé directement dans le processus de couplage, sans isolement ni autre purification. A titre de variante, la cystéine en excès peut être éliminée 25 du mélange réactionnel avant le couplage par des moyens physiques, par exemple par dialyse. Exemple 25 - Produits de papaïne et de copolymères de styrène et d'anhydride maléique Le couplage de papaïne cristallisée à une variante de 30 copolymère de styrène et d'anhydride maléique (L:l) dans un tampon aqueux en utilisant le processus classique, à des rapports du support à l'enzyme de 1:3 à 5:1, donne des dérivés insolubles de polymère et de papaïne ayant jusqu'à 20 fi environ de l'activité enzymatique initiale. 35 L'utilisation de mercuri-papaïne ou du dérivé de zinc de la papaïne, conformément au procédé des exemples 1 à 8, donne le même résultat avec une facilité un peu plus grande et un 69 32953 32 2030046 pourcentage un peu plus fort de l'activité enzymatique initiale dans le produit/polymère et de papaïne. Lorsqu'on utilise de la papaïne ou son dérivé de mercure ou de zinc à l'état relativement brut, le produit, après 5 le lavage usuel à l'eau et avec des solutions aqueuses tamponnées, se caractérise par l'absence notable de la couleur initialement présente dans l'enzyme brut utilisé comme matière première. Exemple 24 - Produit de papaïne et de copolymères d'éther de vinyl-méthyle et d'anliydride maléique.' 10 Lé couplage de papaïne cristallisée et d'une variante de copolymère e^/d'étïier de vinylméthyle et d'anhydride maléique (l:l) , dans un tampon aqueux, à des rapports du support à l'enzyme de 1:3 à 5:1, donne des dérivés insolubles de polymère et de papaïne ayant jusqu'à environ 50 fi de l'activité enzymatique 15 initiale. L'utilisation du dérivé de mercure ou de zinc de la papaïne conformément au procédé des exemples 1 à 8, donne le même résultat avec .une facilité un peu plus grande et un pourcentage un peu plus fort de l'activité enzymatique initiale du produit de 20 polymère et de papaïne. Lorsqu'on utilise de la papaïne ou son dérivé de mercure ou de zinc à l'état relativement brut, le produit, après le lavage usuel avec de l'eau et des solutions aqueuses tamponnées, se caractérise par l'absence notable de la couleur initialement pré-25 sente dans l'enzyme brut utilisé comme matière première. Exemple 25 - Produit de papaïne et de copolymères d'acétate de vinyle et d'anhydride maléique. Le couplage de papaïne cristallisée à' une variante de copolymère d'acétate de vinyle et d'anhydride maléique (1:1), 30 dans un milieu aqueux tamponné, à des rapports du support à l'enzyme de 1:3 à 5:1, donne des dérivés insolubles de polymère et de papaïne ayant jusqu'à environ 60 fi de l'activité enzymatique initiale. L'utilisation du dérivé de mercure ou de zinc de la 35 papaïne, conformément au procédé des exemples 1 à 8, donne le même résultat avec une facilité un peu plus grande et un pourcen 6$ 32953 33 2030046 tage un peu plus fort de l'activité enzymatique initiale du produit de polymère et de papaïne. Lorsqu'on utilise une papaïne ou son dérivé de mercure ou de zinc à l'état relativement brut, le produit, après le lavage 5 usuel avec de l'eau et des solutions tamponnées aqueuses, se caractérise par une absence notable de la couleur initialement présente dans l'enzyme brut utilisé comme matière première. Exemple 2-6 - Produit de papaïne et de cyclocopolymères d'éther de divinvle et d'anhydride maléique. 10 Par couplage de papaïne cristallisée avec une variante de cyclocopolymère d'éther de divinyle et d'anhydride maléique (présentant une répétition de motifs consistant en segments adjacents d'éthylène et d'anhydride maléique qui sont en outre liés les uns aux autres par une liaison éther), dans un milieu 15 tamponné aqueux, à des rapports du support à l'enzyme de 1:3 à 5:1, on obtient des dérivés insolubles de polymère et de papaïne ayant jusqu'à environ 50 i° de l'activité enzymatique initiale. L'utilisation du dérivé de mercure ou de zinc de la papaïne, conformément au procédé des exemples 1 à 8, donne le 20 même résultat, avec une facilité un peu plus grande et un pourcentage un peu plus fort de l'activité enzymatique initiale dans le produit de polymère et de papaïne. Lorsqu'on utilise de la papaïne ou son dérivé de mercure ou de zinc à l'état relativement brut, le produit, après le lavage 25 usuel avec de l'eau et des solutions tamponnées aqueuses, se caractérise par l'absence notable de la couleur initialement présente dans l'enzyme brut utilisé comme matière première. Exemple 27 - Produit de papaïne et de polymères d'anhydride polymaléique 30 Par couplage de papaïne cristallisée et d'un polymère d'anhydride polymaléique, dans un milieu tamponné aqueux, à des rapports du support à l'enzyme de 1:3 à 5:1, on obtient des dérivés insolubles de polymère et de papaïne ayant jusqu'à environ 70 $ de l'activité enzymatique initiale. 35 L'utilisation du dérivé de mercure ou de zinc de la papaïne, conformément au procédé des exemples 1 à 8, donne le même résultat avec une facilité un peu plus grande et un pourcentage un peu 69 32953 34 2030046 plus fort de 11activité enzymatique dans le produit de polymère et de papaïne. Lorsqu'on utilise de la papaïne ou son dérivé de mercure .ou de zinc à l'état relativement brut, le produit, après le lavage 5 usuel avec de l'eau et des solutions aqueuses tamponnées, se caractérise par l'absence notable de la couleur initialement présente dans l'enzyme brut utilisé comme matière première. Exemple 28 - Produit de papaïne et de polymères d1 anhydride polyacrylique. 10 Par couplage de papaïne cristallisée et d'un polymère d'anhydride polyacrylique, dans un milieu tamponné aqueux à des rapports du support à l'enzyme de 1:3 à 5:1, on obtient dès dérivés insolubles de polymère et de papaïne ayant jusqu'à environ 50 $> de l'activité enzymatique initiale. 15 L'utilisation du dérivé de mercure ou de zinô de la papaïne* conformément au procédé des exemples l à 8, donne le même résultat -avec une facilité un peu plus grande et un pourcentage un peu plus fort de l'activité enzymatique initiale dans le produit" de polymère et de papaïne. 20 Lorsqu'on utilise de la papaïne ou son dérivé de mercure ou de zinc à l'état relativement brut, le produit , après le lavage initial avec de l'eau et des solutions tamponnées aqueuses, se caractérise par l'absence notable de la couleur initialement présente dans 1*enzyme brut utilisé comme matière première, con-25 formément au phénomène déjà observé et mentionné dans les exemples 9 à 11. 30 4 69 32953 35 2030046 REVENDICATIONS 1. Procédé de préparation d'un produit doué d'activité enzymatique, consistant en un enzyme fixé par une liaison de covalence à un polymère, caractérisé par le fait qu'il consiste 5 à faire réagir ou à coupler un enzyme, dans lequel au moins un site actif, mais non la totalité de ces sites, a été au moins partiellement inactivé, avec un polymère, susceptible d'une liaison de covalence avec cet enzyme par l'intermédiaire d'un groupe réactif restant, pour donner un produit de polymère et d'enzyme 10 au moins partiellement inactivé, puis à rétablir au moins un groupe préalablement inactivé dans le fragment d'enzyme du produit d'enzyme et de polymère, pour donner le produit désiré doué d'activité enzymatique. 2. Procédé suivant la revendication 1, caractérisé par 15 le fait que-l'enzyme présente dans sa molécule, en plus du site actif, un autre groupe sulfhydryle, hydroxyle, amino, imidazolyle, carboxyle ou disulfure réactif. 3. Procédé suivant la revendication 1, caractérisé par le fait que le polymère porte un groupe carboxyle ou anhydride. 20 4. Procédé suivant la revendication 1, caractérisé par le fait que 1'enzyme est inactivé par inactivation d'au moins un groupe sulfhydryle de la molécule d'enzyme. 5. Procédé suivant la revendication 1, caractérisé par le fait qu'on fait réagir un dérivé métallique d'un enzyme, 25 dans lequel un groupe sulfhydryle est inactivé par-réaction avec le métal, avec un polymère pour produire un dérivé métallique de l'enzyme attaché par une liaison de covalence au polymère, puis on fait réagir le produit avec un agent de chélation pour rétablir le groupe sulfhydryle du fragment d'enzyme de la 30 molécule, et pour foimer le produit polymère-enzyme désiré doué d'activité enzymatique. 6. Procédé suivant la revendication 5, caractérisé par le fait que le métal est un métal bivalent, notamment le mercure ou le zinc. 35 7. Procédé suivant la revendication 5, caractérisé par le fait que la réaction avec l'agent de chélation a lieu dans •des conditions non oxydantes, par exemple en conduisant cette 69 32953 36 2030046 réaction avec l'agent de chélation en présence d'un agent modérément réducteur, de préférence un composé contenant un groupe sulfhydryle, par exemple un mercaptan, la cystéine, l'acide thio-glycolique ou le glutathion. 5 8. Procédé suivant la revendication 5, caractérisé par le fait qu'il consiste à produire tout d'abord le dérivé métallique de l'enzyme contenant un groupe sulfhydryle. 9. Procédé suivant la revendication 1, caractérisé par le fait que l'enzyme contient des groupes sulfhydryle qui sont 1O inactivés par transformation en liaisons disulfure, et le produit intermédiaire polymère-enzyme inactivé est réactivé par nouvelle transformation des liaisons disulfure en groupes sulfhydryle. 10. Procédé suivant la revendication 1, caractérisé par le fait que le polymère est un polymère du type de l'éthylène et 15 de l'anhydride maléique, de préférence un copolymère d'éthylène et d'anhydride maléique, et l'enzyme est de préférence la papaïne. 11. Produit de polymère et d'enzyme, caractérisé par le fait qu'il comprend un enzyme dont un site réactif a été au moins partiellement inactivé, de préférence par transformation 20 en un dérivé métallique ou dérivé de cystéine, mais qui est susceptible d'une réactivation, portant dans sa molécule un autre groupe réactif, tel qu'un groupe sulfhydryle, hydroxyle, amino, imidazolyle, carboxyle ou disulfure, qui n'est pas essentiel pour l'activité enzymatique de l'enzyme, cet enzyme étant atta-25 ché par une liaison de covalence à un polymère qui est susceptible d'une liaison de covalence avec l'enzyme par l'intermédiaire de l'un des groupes réactifs de l'enzyme et d'un groupe réactif du polymère. 12. Produit de polymère et d'enzyme, caractérisé par le 30 fait qu'il comprend un enzyme dont un site réactif a été au moins partiellement réactivé, mais qui est susceptible de réactivation, portant dans sa molécule un autre groupe réactif, tel qu'un groupe sulfhydryle, hydroxyle, aminor imidazolyle, carboxyle ou disulfure qui n'est pas essentiel pour l'activité 35 enzymatique de l'enzyme, attaché par une liaison de covalence à un polymère qui est susceptible d'une telle liaison de covalence avec l'enzyme par l'intermédiaire de l'un des groupes réac 69 32953 37 2030046 tifs de l'enzyme et d'un groupe réactif du polymère. 13. Produit suivant la revendication 12, caractérisé par le fait que l'enzyme, de préférence un dérivé de métal ou de cystéine d'un enzyme, est attaché par une liaison de covalence 5 .à un polymère par l'intermédiaire d'un groupe carboxyle ou anhydride du polymère. 14. Produit suivant la revendication 12, caractérisé par le fait qu'un çnzyme, de préférence un dérivé de métal d'un enzyme, qui porte dans son état naturel un groupe sulfhydryle, de même 10 qu'un groupe amino et/ou hydroxyle, est attaché par une liaison de covalence à un polymère par l'intermédiaire d'un groupe carboxyle ou anhydride du polymère. 15. Produit suivant la revendication 12, caractérisé par le fait qu'il comprend de la papaïne dont un site réactif a 15 été inactivé, mais est capable, d'une réactivation, attachée par une liaison de covalence à un polymère par l'intermédiaire d'un groupe carboxyle ou anhydride du polymère. 16. Produit suivant la revendication 12, caractérisé par le fait qu'Uv^omprend un dérivé de métal, par exemple de mercure 20 ou de zinc, de la papaïne, attaché par une liaison de covalence à un polymère par l'intermédiaire d'un groupe carboxyle ou anhydride du polymère. 17. Produit suivant la revendication 12, caractérisé par le fait que le polymère est un polymère du type éthylène- 25 anhydride maléique, de préférence le polymère d'éthylène et d'anhydride maléique. 18. Produit suivant la revendication 12, caractérisé par le fait qu'il comprend un polymère d'éthylène et d'anhydride maléique et un dérivé de métal bivalent de la papaïne, de pré- 30 férence un polymère d'éthylène et d'anhydride maléique et le dérivé de zinc de la papaïne, ou un polymère d'éthylène et d'anhydride maléique et la mercuripapaïne. 19. Produit, suivant la revendication 12, caractérisé par le fait qu'il consiste en un produit modifié par une dialkylamino- 35 alky lamine du polynère d'éthylène et d'anhydride maléique (EAM) et d'un dérivé de métal bivalent de la papaïne, par exemple le produit modifié à la diméthylaminopropylamine de l'EAM et de la 69 32953 38 2030046 mercuri-papaïne ou du dérivé de zinc de la papaïne, ou un produit modifié par une alkylamine inférieure de l'EAM et d'un dérivé de métal bivalent de la papaïne, par exemple le produit modifié à la propylamine de l'EAM et de la mercuri-papaïne ou du dérivé 5 de zinc de la papaïne, ou un produit modifié par un aminoalcanol inférieur d'EAM et d'un dérivé de métal bivalent de la papaïne, par exemple le produit modifié à l'aminopropanol de l'EAM et de la mercuri-papaïne ou du dérivé de zinc de la papaïne. 20. Produit insoluble de polymère et d'enzyme doué 10 d'activité enzymatique, caractérisé par le fait que l'enzyme est attaché par une liaison de covalence à un polymère par l'intermédiaire d'un groupe anhydride ou carboxyle du polymère et d'un groupe réactif de l'enzyme qui n'est pas essentiel pour son activité enzymatique, un composé du groupe des dialkylamino-15 alkylamines, des alkylamines et des aminoalcanols inférieurs étant également présents dans ce polymère et attachés à ce dernier par une liaison de covalence. 21. Produit suivant la revendication 20, caractérisé par le fait qu'il comprend un polymère du type de l'EAM contenant un 20 enzyme et une dialkylaminoalkylamine, dans lequel l'enzyme est attaché par une liaison de covalence au polymère, par l'intermédiaire d'un groupe anhydride ou carboxyle du polymère, par exemple le produit diméthylaminopropylami de-EAM-papaïne , ou un polymère du type de l'EAM contenant un enzyme et une alkylamine, 25 dans lequel l'enzyme est attaché par line liaison de covalence au polymère par l'intermédiaire d'un groupe anhydride ou carboxyle du polymère, par exemple le propylami.de de l'EAM-papaïne, ou un polymère du type de l'EAM contenant un enzyme et un aminoalcanol inférieur, dans lequel l'enzyme est attaché par une liai-30 son de covalence au polymère par l'intermédiaire d'un groupe anhydride ou carboxyle du polymère, par exemple l'ester d'amino-propanol de 1rEAM-papaïne. 22. Procédé de préparation d'un produit insoluble d'enzyme et de polymère doué d'activité enzymatique, dans lequel 35 l'enzyme est attaché par une liaison de covalence au polymère, par l'intermédiaire d'un groupe anhydride ou carboxyle du polymère et d'un groupe réactif de l'enzyme qui n'est pas essentiel pour 69 32953 39 2030046 son activité enzymatique, un composé du groupe comprenant les dialkylaminoalkylamines, les alkylamines et les aminoalcanols inférieurs étant également présent dans le polymère et attaché à lui par une liaison de covalence, procédé caractérisé par le 5 fait qu'il comprend une étape de couplage ou de réaction d'un enzyme ou d'un enzyme au moins partiellement inactivé, susceptible d'une liaison de covalence, avec ce polymère contenant, attaché par une liaison de covalence, une dialkylamino-alkylamine, une alkylamine ou un aminoalcanol inférieur par l'intermédiaire d'un 10 groupe réactif de l'enzyme qui n'est pas essentiel pour l'activité enzymatique, et un groupe réactif du polymère, ou une étape de réaction d'un composé choisi parmi des dialkylaminoalkylamines, des alkylamines et des aminoalcanols inférieurs avec un.produit insoluble de polymère et d'enzyme dont l'enzyme, ou au moins 15 un enzyme au moins partiellement inactivé,est fixé par une liaison de covalence par l'intermédiaire d'un groupe qui n'est pas essentiel pour l'activité enzymatique, et le produit de polymère et d'enzyme contient des groupes résiduels anhydride ou carboxyle, et une étape d'activation de tous sites réactifs préala-20 blement inactivés du fragment d'enzyme du produit de polymère et d'enzyme, pour donner le produit de polymère et d'enzyme désiré, doué d'activité enzymatique. 23. Procédé d'épuration et de décoloration d'une matière enzymatique contenant en combinaison des impuretés colorées 25 indésirables pour éliminer toutes les impuretés, y compris les impuretés colorées indésirables , et pour donner un produit de polymère et d'enzyme de pureté et de coloration améliorées, caractérisé par le fait qu'il consiste à coupler ou à faire réagir l'enzyme brut avec un polymère, susceptible d'une liaison 30 de covalence avec l'enzyme dans le mélange, pour donner un produit purifié d'enzyme et de polymère ayant uq&egré réduit de coloration indésirable, puis à séparer ce produit d'enzyme et de polymère. 24. Procédé suivant la revendication 23, caractérisé 35 par le fait que le polymère contient un groupe carboxyle ou anhydride carboxylique et est de préférence un polymère du type de l'EAM. 69 32953 40 2030046 25. Procédé suivant la revendication 23, dans lequel le produit est insoluble dans l'eau, caractérisé par le fait qu'il comporte de préférence une étape de lavage à l'eau du produit. 26. Procédé suivant la revendication 24, dans lequel 5 la matière enzymatique comprend un enzyme porteur d'un groupe sulfhydryle ou un dérivé métallique d'un tel enzyme, et le polymère est un polymère du type de l'EAM. 27. Procédé suivant la revendication 24, caractérisé par le fait que la matière première contenant l'enzyme et le produit 10 de polymère et 1' enzyme sont tous deux au moins partiellement inactivés et le produit de polymère et d'enzyme est ensuite réactivé. 28. Procédé suivant la revendication 24, caractérisé par le fait que la matière enzymatique consiste .en un dérivé de 15 métal bivalent de la papaïne, de préférence le dérivé mercurique ou le dérivé de zinc de la papaïne, et le polymère est l'EAM. 29. Procédé suivant la revendication 24, caractérisé par le fait que la matière enzymatique consiste en papaïne, et le polymère est l'EAM. 20 30. Procédé suivant la revendication 24, caractérisé par le fait que l'enzyme est choisi entre la papaïne, la chymopapaïne, la ficine, la bromélaïne, l'asclépaïne, la cellulase, la lipase, une protéase, et des mélanges d'enzymes produits.par des microorganismes de l'espèce Bacillus subtilis.