FR 2051554 A1 19710409 FR 7018042 A 19700519 70 18042 î 2051554 la présente invention concerne un procédé de culture à grande échelle de cellules vivantes 0 Plus particulièrement,, le but de la présente in» vention est de fournir un procédé et un appareillage pour 5 cultiver des cellules vivantes en couche monoceUulaire, ainsi que des eumycètes, des scliizomycètes et des algues et pour produire à grande échelle des virus? vaccins et produits biologiques à usage humain et vétérinaire. Comme on le sait, pour préparer des vaccins protégeant contre les mala-10 dies à virus, la culture des dits virus a été réalisée en passant par plusieurs stades chronologiques successifs : le gros animal domestique réceptif (soit un bovin, soit le cheval), le passage sur petits animaux de laboratoire, puis sur oeufs embryonnés et finalement la culture de cellules (soit 15 en couche monocellulaire, soit en suspension)® La production de virus sur culture de tissu mo-nocellulaire constitue un progrès technique et économique évident par rapport aux deux techniques antérieures.On sait également que la production à l'échelle industrielle de nora~ 20 breux vaccins nécessite de grandes quantités de cellules vivantes et que ces cellules ne peuvent pas se développer en suspension, dans des cuves de fermentation appropriées comme c'est le cas pour la production par synthèse biologique des antibiotiques, des alcaloïdes de lfergo.t et similaires. 25 De fait, la production de vaccins et de produits biologiques à usage humain se limite aux cultives tissulaires de cellules normales non cancéreusess telles que Ifes cellules de première explantation et des souches cellulaires. On sait que l'un des procédés classiques de cultures tissulaires 30 pour produire des vaccins, est réalisé en flacons de "Roux" ou de "Brocfcway". La capacité totale d'un flacon de Roux .est dtenviron 1 litre et la surface intérieure permettant le dé- 2 veloppement d'une couche monocellulaire est de 250 cm . Le milieu nutritif contenant une suspension cellulaire est 35 introduit dans les flacons stérilisés qui sont mis en 70 18042 2 2051554 incubation en position horizontale jusqu'à ce que le développement cellulaire ait produit une couche monocellulaire uniforme, le milieu de culture est éliminé et remplacé par un milieu d'entretien contenant le virus qui pénètre dans 5 les cellules et s'y multiplie, lorsque le virus a atteint la concentration convenable» on prélève le contenu des flacons qui est utilisé pour la préparation des vaccins. Le procédé en flacons de Roux immobiles a été nettement amélioré par le procédé dit des bouteilles tournantes, celles-ci étant pla-10 cées dans des paniers spéciaux en grillage inoxydable contenant chacun une vingtaine de fioles cylindriques. Grâce à ce procédé, on obtient une augmentation considérable de la capacité de production des vaccins pour un même volume. Cependant, ces deux procédés présentent des in-15 convénients considérables qui limitent la production industrielle s liés à la complexité de la manipulation et au fractionnement en de nombreux flacons. En conséquence, de nombreux manipulateurs expérimentés sont nécessaires et la contamination des produits biologiques est très fréquente du fait de 20 l'ouverture t du remplissagedu vidage et de la fermeture de chaque flacon. Un autre inconvénient des cultures tissiilaires en flacons, est l'impossibilité de déterminer et de contrôler le métabolisme des cultures tissulaires elles-mêmes en éliminant le gaz carbonique9 en introduisant de l'oxygène, une 25 nouvelle quantité de milieu nutritif ou de prélever les cellules du fait que le flacon est un ensemble fermé excluant toute manoeuvre automatique stérile. Il est évident que les inconvénients précités influent sur le prix des produits finis, Les laboratoires Abbott ont récemment décrit et breveté 30 un propagateur de culture tissulaire-. (Brevet du Canada N® 787 391 - Priorité du 23/12/1965 aux Etats-Unis d'Amérique). Le propagateur de culture tissulaire est constitué d'un certain nombre de plaques de verre ou de matière plastique appropriée fixées et espacées su^ un dispositif con-35 venable. Il est placé dans un récipient convenable portant à 70 18042 3 2051554 extrémité un couvercle de fermeture étanche à l'air muni d'une canalisation de récolte, d'une canalisation de gaz, d'une canalisation de soutirage et d'un agitateur. Ledit propagateur de culture tissulaire, qui cons 5 titue un progrès technique certain par rapport aux cultures en flacons tournants, présente des inconvénients importants. En réalité, il ne permet pas de réaliser le cycle complet en récipients clos de façon entièrement automatique, en permettant le contrôle soigneux de toutes les phases sans 10 risque de contamination par le milieu extérieur ou vers le mi lieu extérieur. La demanderesse a découvert un nouveau procédé et l'appareillage correspondant permettant de cultiver des cellules vivantes en couches monocellulaires ainsi que des eumycétes, des schizomycétes et des algues unicellulaires. 15 Un autre but de la présente invention est de four nir un nouveau procédé et l'appareillage correspondant pour produire des cultures cellulaires en couches monocellulaires à grande échelle de cellules de première explantation, de souches de cellules diploïdes, ainsi que de permettre la pro-20 duction ultérieure de virus, vaccins et produits biologiques à usage humain et vétérinaire. Le personnel, les pièces et l'équipement correspondants aux techniques habituelles précitées ne sont plus nécessaires. La culture cellulaire selon le procédé de la 25 présente invention, dénommé "procédé en colonnes tournantes" consiste à bloquer en un seul ensemble un grand nombre de colonnes entre des collecteurs placés aux «feux extrémités. Les colonnes sont constitués de verre, matière plastique ou d'autres matières convenant au développement cellulaire et pou-30 vant avoir des longueurs et des diamètres divers. L'ensemble est placé dans une pièce ou entouré d'une enveloppe à témpé-raturé • réglable, et muni d'un dispositif permettant au faisceau de colonnes de tourner selon l'axe principal et qui le maintient en position verticale. Il permet de réaliser le cy-55 c.le total de cultures de cellules vivantes en couches mono- BÀD original 70 18042 4 2051554 cellulaires, d'eutnycétes, de schizomycétes et d'algues, ainsi que la production de virus, vaccins et produits biologiques. D'autres caractéristiques et avantages de la présente invention ressortiront de la description qui va suivre, fai-5 te en regard des dessins annexés et donnant à titre explicatif mais nullement limitatif une forme de réalisation conforme à l'invention. Sur ces dessins, la figure 1 représente une vue schématique de 10 l'équipement, l'élément général de support de l'ensemble tournant 7 étant en position horizontale ; la figure 2 représente un schéma de l'équipement ; l'élément général de support de l'ensemble tournant étant en position verticale. 15 Les colonnes sont réunies en un même ensemble au moyen de collecteurs terminaux 2-3. Dans la partie des collecteurs terminaux qui enserrent les colonnes sont placés des robinets 3 qui permettent un fonctionnement total, partiel ou fractionné. Toutes les opérations nécessaires sur 20 les flacons correspondants sont réalisées au moment donné en ouvrant et en fermant les robinets des collecteurs terminaux. le faisceau de colonnes, réuni par les collecteurs terminaux 6, est fixé sur un élément général de sup- . port 7 et, grâce à des dispositifs particuliers 4-5» pour 25 tourner à vitesse réglable autour de son axe et peut passer de la position horizontale à la position verticale. L'ensemble est placé sur un'support fixe 8 dans une pièce ou entouré d'une enveloppe à température réglable munie d'un régulateur automatique maintenant la température 30 du milieu de culture dans une gamme prédéterminée. Les robinets des tubulures principales permettent de relier l'ensemble à différentes alimentations (détergent, eau du robinet et eau désionisée, vapeur en écoulement, canalisations de dis- / tribution et d'évacuation de liquides et de gaz' nécessaires à 35 la culture des cellules). BAD ORIG'NAL 70 18042 5 2051554 Plus particulièrement, la tubulure principale et les tubulures secondaires permettent grâce à leurs robinets 2, 3 de relier le faisceau de colonnes en totalité, ou une seule colonne si on le désire, non seulement aux diverses 5 alimentations générales précitées^ meis également de créer une canalisation fermée et stérile^ avec des dispositifs spéciaux de distribution de quantités dûment mesurées et automatiquement enregistrées de liquides tels que des milieux nutritifs, des solutions tampons, des suspensions de cellu-10 les, de la trypsine ou d'autres enzymess des virus ou des gaz purs ou mélangés tels que l'oxygène, l'air, le gaz carbonique. Un raccordement provisoire peut également être réalisé avec des canalisations particulières pour le gaz carbo*= nique formé lors de la croissance des cellules et avec des 15 canalisations d'amenée et d'évacuation pour les liquides. S'il est nécessaire, les dispositifs permettent la mesure et l'enregistrement automatique ou semi-automatique des divers paramètres. Ces dispositifs de mesure et d'enregistrement peuvent être reliés selon des tectoniques classi-20 ques, à des dispositifs corrigeant les paramètres et les maintenant dans des gammes déterminées» De plus, chaque colonne ou le faisceau de colonnes est muni d'un dispositif de mesure et d'enregistrement du pH intérieur, avec un dispositif à fonctionnement automatique 25 permettant de maintenir le milieu de culture dans une gamme de pH désirée soit en modifiant le rapport de l'oxygène ou de l'air au gaz carbonique, soit en introduisant des solutions tampons. lorsqu'on utilise les colonnes tournantes pour 30 cultiver des cellules en couches monocellulairesj, un microscope est compris dans l'appareillage, permettant d'observer les cellules en couches monocellulaires à la surface des colonnes elles-mêmes à des grossissements divers sur toute la longueur des colonnes. 35 le cycle de fonctionnement comprend les stades suivants : UÂD ORIGINAL 70 18042 6 2051554 - lavage de l'appareillage par une solution détergente en le reliant au vide et rinçage à l'eau désionisée ; « stérilisation de l'appareillage à la vapeur en écoulement 5 5 ~ ensemencement de l'appareillage avec une suspension cellulaire dans un milieu de culture convenable ; - culture des cellules ensemencées à la surface des colonnes tournantes en position horizontale? La culture des cellules à la surface peut-être. 10 vérifiée au microscope, et se caractérise également par la formation d'une couche mince opalescente à la surface des colonnes. Lorsque le développement est terminé, les cellules sont prêtes soit pour la phase de dissociation enzymatique à la trypsine ou par d'autres enzymes adéquates si les cellules 15 en couches monocellulaires doivent être utilisées pour un autre ensemencement, soit pour la production de virus ou d'autres produits "biologiques» Ces deux opérations sont facilement réalisées grâce à la simplicité et à la facilité de manipulation de 20 l'appareil. Lorsque les cellules ou les autres produits biologiques sont recueillis, le cycle recommence par un lavage de l'appareil. La description ci-dessus montre que l'appareilla- 25 ge à colonnes tournantes présente les avantages suivants : - l'ouverture et la fermeture des robinets des tubulures principales, sont réalisées'en conditions stériles, de même que les opérations de remplissage et de vidage des flacons correspondants ; 30 - le transport des liquides est' réalisé par le vide et la pression ; - l'appareil est lavé rapidement en le remplissant et en le vidant sous l'action du vide et de la pression, alors que les autres procédés nécessitent des machi- 35 nés à laver \ BAD ORIGINAL 70 18042 7 2051554 - l'appareil est rapidement prêt au service grâce à la stérilisation par la vapeur en écoulement ; - les manipulations sont réduites et les manoeuvres sont réalisées en conditions parfaitement stériles, ce qui 5 évite les souillures du produit lors du travail et sup prime le risque de contamination du personnel ; - toutes les colonnes de l'appareil peuvent être employées simultanément, ou une partie seulement, ou successivement^ - lorsque l'appareil est monté, il est toujours prêt au 10 travail ; il n'a pas à être déplacé et peut être relié à des alimentations situées dans d'autres pièces par des tubulures ; » surveillance microscopique directe des phases de développement des cellules, et des.lésions cellulaires pro- 15 - voquées ; - possibilité de traiter facilement à la trypsine sous surveillance microscopique directe les couches monocellulaires qui sont destinées à d'autres ensemencements ; - réglage automatique ou semi-automatique de la température; 20 - possibilité d'utiliser différentes quantités de milieux de culture et d'entretien selon les besoins de la eulture ; - surveillance et réglage rapide automatique ou semi-automatique du pH pendant les différents stades de fonc- 25 tionnement ? - lorsqu'on emploie l'appareil pour cultiver des cellules en couches monocellulaires sur la paroi intérieure des • colonnes, le développement ne dépend pas de la longueur, du diamètre, ni du nombre des colonnes constituant l'ap- 30 pareil. Il convient de noter que le rapport entre la surface de la culture cellulaire en couches monocellulaires et le volume de milieu nécessaire aux cellules en développement, selon le procédé et l'appareillage de la présente invention, 35 est amélioré par rapport aux procédés usuels. 70 18042 8 2051554 Il en resuite que les quantités nécessaires de milieu, et d'enzymes coûteux tels que la trypsine, sont réduites, ce qui présente un gros intérêt économique, et que les milieux liquides contenant les virus ont une concentra-5 tion telle qu'on peut les utiliser dans les autres opérations de préparation des vaccins sans avoir à les concentrer. Le tableau I présente à titre illustratif mais non limitatif les résultats comparatifs obtenus avec les flacons de Roux, les propagateurs et les colonnes tournantes. 1° TABLEAU I Récipients 9Ufmiiipn^186 13 culpure surface cons de p -, ' en cm au volume Roux du milieu corres-15 Jlacon de Roux 120 250 2,09 - Propagateur de 1 1. 500 819 1,64 5 Propagateur de 20 7,5 1. 4 500 6 966 1,54 42 Colonne tournante 670-350 1 758 2,62-5,02 7 N° 1 0 = 5,6 cm h = 100,0 cm Colonne tournante 1 074-537 2 512 2,33-4,67 10 S#1 0=8,Oom h = 100,0 cm Colonne tournante 3 190-2 500 8 792 2,75-3,51 35 U° 1 0 = 5,6 cm h = 500,0 cm r Le tableau I montre que dans les mêmes conditions, plus le rapport de la surface au volume du milieu est 30 grand, meilleur est l'utilisation du milieu et la concentration en produits biologiques à la fin de l'opération, comme indiqué ci-dessus. L'invention est illustrée par les exemples suivants donnés à titre purement explicatif mais nullement limitatif. 25 l 70 18042 9 2051554 EM'tPIB 1 Couches monocellulaires de cellules en culture primaire On a traité par la trypsine des organes de mammifères et d8autres animaux selon les techniques classiques 5 de culture après les avoir prélevés dans les meilleures conditions, découpés en morceaux de 2 à 5 mm et lavés par des solutions tampons. Après contrôle, les cellules recueillies ont été mises en suspension dons les milieux de culture à la concen-10 tration souhaitée pour la mise en culture. L'ensemencement de l'appareil à colonnes tournantes dûment lavé et stérilisé, consiste à raccorder une canalisation entre le récipient contenant la suspension cellulaire et l'appareil lui-même en position verticale et à 15 distribuer la solution en s1 aidant du vide, de la pression ou d'une pompe à circulation. On ferme les différents robinets, l'admission du mélange de gaz stéril (air/gaz carbonique) est réglée de telle sorte que les conditions d'oxygénation et de pH soient les meilleures. 20 Après avoir incliné l'appareil en position ho-= rizontale, les cellules ensemencées sont incubées à 36~37c'Co On peut contrôler la formation régulière d'une couche monocellulaire uniforme à la surface des colonnes, dans chacune de ces phases, au microscope, et la formation 25 complète nécessite le même temps que pour drautres cultures ensemencées dans des récipients maintenus en position fixe. le tableau II montre quelques exemples des temps nécessaires pour l'obtention de souches monocellulaires complètes sur colonnes tournantes es flacons de Roux 30 immobiles. 70 18042 2051554 TABLEAU II Couches monocellulaires de cul Jours nécessaires à l'obtention de couches monocellulaires complètes 5, tures primaires de : Sur colonnes tournantes En flacons de Roux immobiles Rein de veau 5-6 jours 5-6 jours Rein de porc 5-6 jours 5-6 jours Rein de chien 3-4 jours 3-4 jours 10 Embryon de poulet 2-3 jours 2-3 jours Testicule de porc" 3-4 jours 3-4 jours Testicule de cheval 3-4 jours 3-4 jours EXEMPLE 2 15 Couches monocellulaires de souches de cellules et de_ lignées cellulaires. Le procédé en colonnes tournantes, permet d1obtenir une production industrielle de lignées cellulaires et de souches cellulaires. 20 Lorsque la couche monocellulaire s'est formée, on peut réaliser diverses manipulations, dans des périodes de temps bien déterminées;, en plaçant plusieurs fois l'appareillage dans des positions différentes, (verticale, horizontale, tournanter etc..) de façon à réaliser les di-25 verses phases de trypsinisation et de récolte des cellules. La facilité de manipulation de l'appareil ci-dessus permet de réaliser rapidement et correctement les manipulations nécessaires à la trypsinisation d1un seul flacon de Houx. Ces manipulations peuvent être réalisées par une ou 30 deux personnes, simultanément, soit sur la totalité soit sur une partie de lfappareil. Les dimensions et le nombre des colonnes peut varier. Le tableau III montre quelques exemples de résultats obtenus en ensemençant l'appareil à colonnes tournan-35 tes avec des cellules BHK2]L • Les cellules ensemencées 70 18042 ii 2051554 provenaient de la trypsinisation d'une couche monocellulaire. TABLEAU III Récipient cellules "ïiurée Indice de r-- d'in- multi- ensemeecees recueillies oubatlon lloa. par cra' par cm^ „ î,. (s/verre) (s/verre) X6S 10 Colonnes Plaçons de Roux Colonnes Plaçons de Roux 75 000 75 000 100 000 100 000 260 500 248 350 623 162 582 300 44 44 66 66 3,47 3,31 6,23 5,82 15 20 25 30 Les temps nécessaires à l'obtention de couches monocellulaires complètes sur colonnes tournantes et en flacons de Roux immobiles pour certaines lignées et souches cellulaires figurent dans le tableau IV. Cellules BHK, PKt 21 15 J.L.S. V 6 T.V. T.A. P.A.S. TABLEAU IV ORIGINE Lignée Macpherson & Stoker Lignée UALL JOWA "SomBre 3e "Jours nécessaires à l'obtention de la couche monocellulaire complète sur colon- en flânes tour- cons de Roux immo-_]ail£a nantes 2-3 j. 2-3 j • 2-3 jours 2-3 jours Lignée J.L.S. Mémorial Cancer Research, Lept. Viral Oncology - Maywod ÎT.Y. Souches de thyroïde de veau *' Souches de testicule d'agneau* Souches" de poumon d'agneau foetal * R.C. Souches de rein de chien * 2-3 3- 2-3 2-3 D- • 2-3 3-4 j. 3-4 3-4 3-4 3-4 j. 3-4 Collection du laboratoire de la demanderesse. 70 18042 12 2051554 EXEMPLE 3 Production de virusC aphteux (F.M.D.V.) Selon le mode opératoire de l'exemple 1 et en utilisant du rein de porc, on a obtenu une couche monocel-5 lulaire après 5 à 6 jours d'incubation» le milieu de culture a alors été éliminé en lavant la' couche monocellulaire et en le remplaçant par un milieu d'entretien des cellules pendant la production du virus, en circuit fermé et stérile, et en utilisant la technique 10 entièrement automatisée précédemment décrite. On a introduit une souche de virus aphteux C (F.M.E.V.) en même temps que le milieu d'entretien précité. Après ensemencement du virus, l'appareil a été placé dans les meilleures conditions d'aération, de pH et 15 de température et le développement du virus a débuté. On a réalisé un certain nombre de prélèvements pour contrôler le développement du virus, dans des intervalles de temps réguliers, et toujours en circuit fermé et stérile. la production a atteint son maximum après 15-24 heures 20 d'incubation, la dose infectante 50 de la culture tissulaire pour 0,1 était de î (T.G.I.E.50) = 106'5-107,° . On obtient des résultats semblables en utilisant du rein de veau ou des cellules à la place du rein 25 de porc comme source de cellules primaires ou comme lignées cellulaires. EXEMPLE 4 Production du virus de la maladie de New Castle (F.C.Ii.Y. ) En opérant comme dans l'exemple 3, mais en uti-30 lisant une souche de virus N.C.D., on a obtenu un titre infectant 50 (EIDpjq) sur oeufs embryonnés pour 0,1 égal à 106'W'° après 28-72 heures d'incubation. On a obtenu des résultats semblables en utilisant des cellules de rein de veau ou des cellules B.H.Kg^ au lieu 35 de rein de porc comme source de cellules primaires ou comme lignées cellulaires. bad original 18042 13 2051554 EXEMPLE 5 Opérant comme dans les exemples précédents,mais en employant d'autres lignées de virus, on a obtenu la pro~ duction des virus suivants % maladie du chien (017), rhinotrachéite infectieuse bovine (IBR), "muQosal desease" (M.L.V.) , para inxluenza (P.I.), rage (R»Va), hépatite infectieuse du chien (C.H.V.)f virus de la rougeole et autres, tant dans le domaine vétérinaire que dans le domaine humain. EXEMPLE 6 En travaillant dans des conditions convenables, on a réalisé des cultures d'eumycétes telles que par exemples, Pénicillium ehrysogenum, de schizomyeétes tels que Bacillus subtilis et d'algues unicellulaires telles que Chlorelia. Il va de soi que la présente invention n'a été décrite et représentée qu'à titre explicatif mais nullement limitatif, et qu'elle est susceptible de diverses variantes sans sortir de son cadre. bad original, 70 18042 14 2051554 t878IIICilI0»8 1. Appareil pour la culture âe cellules vivantes d'origine animale ainsi que d'eumycétes, schizomycétes et algues unicellulaires dans un milieu convenable, caractérisé 5 en ce qu'il est constitué d'un grand nombre de colonnes de longueur et de diamètre variable 3 où. peuvent se développer des cellules, lesdites colonnes étant serrées à leurs extrémités par des tubulures convenables et fixées sur un élément de support leur permettant de tourner autour d'un axe et de 10 passer de la position horizontale à la position verticale, l'appareil lui-même étant entouré d'une enveloppe à température réglable, 2/ Appareil de culture de cellules vivantes en couches monocellulaires pour produire des virus, vaccins et 15 produits biologiques à usage humain et vétérinaire dans un milieu convenable selon la revendication 1, caractérisé en ce que ledit appareil est constitué d'un faisceau de plusieurs colonnes formées d'une matière convenable telle que le verre, les matières plastiques et d'autres matières oom-20 patibles avec le développement des cellules, de longueur et de diamètre divers, dans lesquelles les cellules peuvent se développer en couches monocellulaires, et en ce que le faisceau de colonnes est serré à ses deux extrémités par des collecteurs fixés sur un support tournant qui permet la ro-25 tation du faisceau de colonnes à une vitesse variable autour d'un axe et leur permet de passer de la position horizontale c à la position verticale, et en ce que les colonnes sont serrées à leurs extrémités entre des collecteurs principaux et secondaires munis de robinets, permettant de les relier au-30 tomatiquement, en constituant des circuits fermés et stériles à diverses alimentations, et en ce que l'appareil est placé dans une pièce ou entouré d'une enveloppe à température réglable. 3. Appareil selon la revendication 1 ou 2, cs-35 ractérisé en ce que les collecteurs terminaux principaux du faisceau de colonnes sont reliés en circuit fermé et stérile 70 18042 15 2051554 à diverses alimentations comprenant des canalisations d'eau, de détergent, de vapeur, d'eau désionisée, de gaz nécessaires à la croissance des cellules, d'addition de liquides tels que des milieux, solutions tampons, trypsine, canalisations 5 d'amenée et de départ de gaz ou de liquides. 4. Appareil selon les revendications 1 à 3, caractérisé en ce que la canalisation conduisant les gaz est munie d'un dispositif de régulation et d'enregistrement du volume gazeux admis au moyen d'un dispositif à fonctionnement 10 automatique, 5. Appareil selon une des revendications 1 à 4, caractérisé en ce que le faisceau de colonnes est muni d'un régulateur et d'un enregistreur de pH maintenant le milieu de cultures dans une gamme de pH déterminée. 15 6. Appareil selon une des revendications 1 à 5, caractérisé en ce que ledit appareil est placé dans une pièce ou entouré d'une enveloppe à température réglable muni de dispositifs automatiques maintenant le milieu de culture dans une gamme de température déterminée. 20 7. Procédé de culture de cellules vivantes d'o rigine animale ou d'eumycétes de schizomycétes et d'algue unicellulaire caractérisé en ce que l'on utilise l'appareil suivant la revendication 1. 8. Procédé de production de virus, de vaccins 25 et de produits biologiques à usage humain et vétérinaire caractérisé en ce que l'on utilise l'appareil suivant les revendications 2,3,4,5 et 6. bad orig'nal