FR 2027027 A1 19700925 FR 6944440 A 19691222 69 44440 2027027 La présente invention est relative à l'induction d*interféron in vivo et jyi vitro . Plus particulièrement, la présente invention se rapporte à l'induction de la formation d'inter-feron ainsi qu'à l'induction de la résistance aux infections d'ori-5 gine virale par administration d'un complexe spécifié ayant une structure en double hélice et obtenu à partir (a) d'un hétéro-polynucléotide comprenant essentiellement de l'acide inosinique et de l'acide guanylique comme unités de nucléotides et (b) d'un homopolynucléotide comprenant essentiellement de l'acide cytidy-10 lique comme unité de nucléotide» L'interferôn est un genre 4 protéine qui est produit chez les vertébrés quand leurs cellules sont infectées par un virus et qui inhibe la reproduction du virus. Il est bien connu que l'activité d'un interferon n'est pas spécifique pour les virus 15 et qu'elle est spécifique pour les espèces animales. Compte tenu de la situation actuelle dans laquelle il n'existe pas de mesures prophylactiques ou thérapeutiques directes pour lutter contre diverses infections virales, un agent antiviral ne possédant pas de spécificité pour les groupes de virus présente une importance 20 clinique vitale» Compte tenu de la grande spécificité précitée de l'interferon pour les espèces animales en ce qui concerne son activité d'inhibition contre la reproduction des virus, on a cherché à mettre au point un inducteur d'interferon très actif 25 qui stimule les cellules animales en vue de la production d'inter-feron et qui confère ainsi une protection contre les infections virales* Il existe, comme on le sait, de nombreux inducteurs d'interferon tels que les virus vivants ou tués, l'endotoxine, la ^O phytohémagglutinine, le trachome, et les complexes à structure en double hélice d'acide polyinosinique et d'acide polycytidylique. Toutefois, des inconvénients très sérieux tels qu'une activité faible a limité l'utilisation de chacun de ces inducteurs dans le traitement des maladies virales# 35 Or, la demanderesse a constaté que des concentra tions élevées d'interferon sont induites dans un hôte du genre animal avec ce résultat que la résistance de l'hôte aux infections virales est également induite, par administration d'un com 64 44440 2 2027027 plexe à structure en double hélice obtenu à partir de (a) un hétéropolynucléotide comprenant essentiellement de l'acide inosinique et de l'acide guanylique comme unités de nucléotides et (b) un homopolynucléotide comprenant essentiellement de ^ l'acide cytidylique comme unité de nucléotide, et il a été également constaté que les interférons peuvent être induits en une concentration élevée dans une culture de tissu grâce à l'administration du complexe à structure en double hélice sus-mentionné« La présente invention a pour objet : 10 - un procédé pour induire une teneur élevée d'interféron dans un hftte ou une culture de tissu; - un nouveau type d'inducteur d'interféron qui permet une évaluation clinique} - des compositions pharmaceutiques comprenant les inducteurs 15 d'interféron précités} - un procédé de production de t«ls inducteurs d'interféron. Le complexe à structure en double hélice obtenu à partir de ljhétéropolynucléotide (a) et de 1'homopolynucléotide (b) destiné à être utilisé comme inducteur d'interféron dans la 20 présente invention peut être facilement préparé à partir de matières qui, par elles-mêmes, sont disponibles dans le commerce et qui peuvent être obtenues par des procédés bien connus* Par exemple, on copolymérise de l'inosine-5*.-dxphos-phate (désigné, par la suite par l'abréviation "IDP") et le 25 guanosine-5'-diphosphate (désigné ci-après par l'abréviation "GDP") en présence d'un polynucléotide-phosphorylase, ce qui donne 1'hétéropolynucléotide (a) comprennent essentiellement l'acide inosinique et l'acide guanylique comme nucléotides. Dans cette copolymérisation d'enzymes, on peut utiliser n'importe quelle 30 source connue de polynucléotide-phosphorylase bien que, comme l'a constaté la demanderesse, on puisse utiliser de préférence, à titre de source de polynucléotide-phosphorylase, les micro-orga-nismes Rhodopseudomonas spheroides. Sarcina lutea ou Sarcina marginata. A titre d'exemples typiques de ces microorganismes, on 35 peut mentionner Rhodopseudomonas spheroides (IFO N212203), Sarcina lutea (IFO Nfi 3232) et Sarcina marginata (IFO N2 3066). Dans la présente description , le N2 IFO désigne, un numéro d'accession donné par "Institute For Fermentation Osaka (IFO) à Osaka,(Japon)„ 69 44440 3 2027027 Lorsque le polynucléotide-phosphorylase se trouve dans les cellules de ces microorganismes, on récupère les cellules dans leur bouillon de culture et on peut les utiliser telles quelles, toutefois, on peut également utiliser, comme source de polynucléotide—phosphory— 5 lase, une matière traitée provenant des cellules, telle que celle qu'on peut obtenir en mettant les cellules en suspension -une quantité appropriée d'un tampon (par exemple au pH 6,5 à 8) et en soumettant la suspension à l'action d'un générateur de "base fréquence, en la traitant avec un sel tétrasodique d'acide éthylène-10 diamine tétraacétique, avec un lysozyme ou avec un solvant organique approprié ou en la soumettant à une homogénisation. Dans la pratique, on peut exécuter ladite copolymérisation en ajoutant la source de polynucléotide-phosphorylase à une solution de IDP et de GDP dans une solution de tampon à un pH 15 d'environ 6,5 à 10 et en maintenant le mélange résultant entre environ 30 et 60°C pendant environ une demi-heure à 10 heures, en présence d'ions magnésium et/ou d'ions manganèse* À titre de donneur d'ions métalliques de ce genre, on peut avantageusement utiliser, par exemple, le chlorure de magnésium, le chlorure de manganèse 20 et des produits analogues. La relation entre le rapport molaire de IDP et GDP dans le mélange et le nombre moyen d'imités d'acide inosinique par unité d'acide guanylique dans les hétéropolynucléotides (a) résultants appaaÉLt dans le tableau 1. 25 TABLEAU f Happort molaire IDP/GDP dans la préparation de (a) Sombre moyen d'unités d'acide inosinique par unité d'acide guanylique dans (a) 1 : 1 0,7 - 1,0 2:1 1,0-1,9 3 : 1 où (M 1 00 4:1 2,4 - 3,7 5:1 3,0 - 4,7 11 : 1 8,5 - 10,5 20 : 1 15,0 - 19,8 69 44440 4 2027027 1'hétéropolynucléotide (a) ainsi obtenu peut être facilement récupéré dans le mélange de réaction par des procédés bien connus. Par exemple, on peut précipiter 1»hétéropolynucléotide (a) par acidification du mélange de réaction ou par addition d'un 5 solvant organique approprié, par exemple d'alcool éthylique eu d'alcool méthylique» On fait réagir 1*hétéropolynucléotide (a) ainsi obtenu avec 1'homopolynucléotide (b) comprenant essentiellement de l'acide cytidylique, comme nucléotide, pour produire le complexe 10 & structure en double hélice de la présente invention. Cette réaction peut être mise en oeuvre par des procédés bien connus permettant d'obtenir une structure en double hélice entre deux poly-nucléotides. Par exemplet on mélange hétéropolynucléotide (a) et 1*homopolynucléotide (b) pendant 1 minute, à la température ambian— 15 te, dans une solution aqueuse d'un tampon dont le pH est compris dans un intervalle étendu, c'est-à-dire entre 5 et 10, et dans lequel la concentration molaire des sels est comprise entre environ 0,001 et 1 H, comme par exemple une concentration 0,06 M de phosphate de sodium dans une solution à 0,85^ de chlorure de sodium 20 et une concentration 0,01 M de glycylglycine dans une solution aqueuse à 0,59 1» de chlorure de sodium. Il e st avantageux d'ajouter au système de réaction un donneur d'ions magnésium ou un donneur d'ions sodium comme du chlorure de sodium, du chlorure de magnésium, de l'hydrogénophosphate disodique, etc... 25 la formation de la structure en double hélice du complexe ainsi obtenu à partir de 1'hétéropolynucléotide (a) et de 1*homopolynucléotide (b) est confirmée, par exemple, d'après le déplacement hypochromique dans le spectre d'absorption ultraviolet, par le gradient de densité dans le fractionnement au 30 saccharose ou par chromâtographie. Conformément à la présente invention, au point de vue de l'activité de 1'interféron, on utilise le complexe à structure en double hélice de 1*hétéropolynucléotide (a) et de 1'homopolynucléotide (b) dans lequel 1'hétéropolynucléotide (a) possède 35 une constante de sédimentation (s) comprise entre environ 2 et 15 unités Svedberg et le nombre moyen d'unités de l'acide inosinique est compris entre environ 0,7 et 20 par unité d'acide guanylique. Plus avantageusement, on utilise un tel complexe dont l'hétéropolynucléotide (a) possède une constarfc e de sédimentation comprise 40 entre environ 4 et 8 unités Svedberg et/ou dans lequel le nombre 44440 5 .2027027 moyen des unités d'acide inosinique contenues dans 1'hétéropolynu— cléotide (a) est compris entre environ 1 et 10 par unité d'acide guanylique„ I'homopolynucléotide (b) contenu dans le complexe à 5 structure en double hélice de la présente invention peut être un acide oligocytidylique comme l'acide octacytidylique et l'acide eytidylcytidine• Le rapport entre 1'homopolynucléotide (b) et 1'hétéropolynucléotide (a) est facultatif0 On peut obtenir de bons résul-10 tats en utilisant un complexe à structure en double hélice, dans lequel le nombre total d '.unités d'acide cytidylique dans l'homopolynucléotide (b) est compris entre environ 0,5 et 2, et est plus avantageusement égal à environ 1, par imité de nucléotide de 1'hétéropolynucléotide (a)« . mjt 15 la production d'interféron lors de l'administration du complexe à structure en double hélice de la présente invention est démontrée par la protection d'hôtes du genre animal ainsi que de cultures de tissus contre une attaque par deB virus. L'interférera ainsi produit peut également être caractérisé par des mé-20 thodes bien connues accompagnées de la détermination in vivo de ses propriétés inhibitrices et de la caractérisation par détermination de sa spécificité pour l'hôte, de sa sensibilité à la trypsine, de son point isoélectrique ou de son poids moléculaire. Selon la présente invention, l'induction de la forma-25 tion d'interféron in vivo et/ou l'induction de la résistance aux infections virales s'obtiennent en administrant à un hôte le complexe à structure en double hélice tel que décrit ci-dessus, l'hôte peut être unmimai à sang chaud tel qu'un mammifère, comme par exemple les souris, les bovins, les porcs, les chiens, les 30 chevaux, les chèvres, les moutons, les oiseaux comme les poules, les canards et les dindes, et à l'homme. On peut opérer de la même façon par voie parentérale, par exemple par voie sous-cutanée, intramusculaire, intradermique, intrapéritonéale, intraveineuse, ou par application locale, de préférence sur une muqueuse telle 35 que la muqueuse nasale interne. Dans la pratique, il est avantageux que le complexe à structure ën double hélice soit administré à l'hôte par voie sous-cutanée ou intramusculaire ou par le nez0 Bien que la dose efficace dépende de l'hôte, du mode d'administration et du virus contre lequel on veut assurer 40 la protection, une dose comprise entre environ 1 microgramme et 69 44440 6 2027027 et 2 milligrammes par kilog de l'hâta donne généralement les meilleurs résultats lors d'une administration sous-cutanée ou intramusculaire ç X ces doses on ne constate pas de signes de toxicité apparaissant localement à l'emplacement de l'injection, ou bien 5 se manifestant par des troubles de la santé de l'hôte» Quand on prépare les compositions pharmaceutiques contenant le complexe à structure en double hélice de la présente invention, on mélange une quantité faible de complexe avec un adjuvant pharmaceutique pris en une quantité importante, le choix de 10 l'adjuvant pharmaceutique est déterminé par le mode d'administration préféré et par des pratiques pharmaceutiques courantes. Dans le cas d'une administration par injection, par exemple par voie sous-cutanée ou intramusculaire, on peut utiliser un liquide injectable comme adjuvant pharmaceutique. Dans le cas 15 d'une application locale, on utilise de préférence comme adjuvant un liquide permettant une application locale sur une muqueuse de l'animal à sang chaud, l'induction de la formation d'interféron dans une culture de tissu peut être obtenue en injectant le complexe à struc-20 ture «n double hélice dans la culture de tissu. On utilise de préférence pour la culture les tissus d'animaux à sang chaud tels que mentionnés ci-dessus. On peut utiliser un tissu de foie, d'am-nios, d'embryon, de rate, de poumon, etc... On peut utiliser des cultures primaires ou secondaires obtenues par des procédés de 25 culture connus. Dans la pratique, on effectue l'administration en mettant les cultures de tissu en contact avec le complexe à structure en double hélice. Ce traitement par contact peut être avantageusement mis en oeuvre en ajoutant le complexe ou une solution du complexe à un fluide de culture contenant le tissu. Bien 30 que la concentration du complexe à structure en double hélice dans le fluide de culture dépend du genre de la culture, une concentration comprise entre environ 0,001 et 1000y-ug/ml donne de bons résultats. Il est avantageux d'effectuer ce traitement par contact à une température d'environ 28 à 40°C» 35 1'interféron ainsi obtenu peut être récupéré dans la culture de tissu par des procédés bien connus et être administré tel quel ou en combinaison avec un adjuvant pharmaceutique approprié à un an-imal à sang chaud de la même espèce que celle ayant fourni le tissu de la culture, pour induire la résistance de 40 l'animal vis-à-vis de diverses infections virales» 69 44440 7 2027027 les "références1* ci-après illustrent un procédé de production typique des complexes à structure en double hélice de l'hétéropolynucléotide (a) et de l1homopolynucléotide (b) qui sont utilisés dans la présente invention# Dans tout l'exposé, la 5 relation entre les parties en volume et les parties en poids est identique à celle qui existe entre les millilitres et les grammes et les pourcentages s'entendent en poids par volume, sauf mention contraire, Béférence 1 10 (A) Préparation du polynucléotide-phosphorylase : On inocule Bhodopeeudomonas spheroides (IFO N® 12203) dans 40 parties en volume d'un milieu de culture aqueux comprenant 1# de polypeptone, 1?t d'extrait de levure, 1# de dihydrogéno-phosphate de potassiu* et de glucosej puis on cultive le milieu à 28*0 15 pendant 24 heures. On récupère 10 parties en poids de cellules humides dans 200 parties en volume du bouillon de culture résultant et on les met en suspension dans 30 parties en volume d'une solution tampon au pH 8,1 contenant une concentration 0,01 M de tris(hydroxyméthyl)aminométhane, puis on traite la suspension 20 par les ultra-sons à 10 kilocycles par seconde. On retire les débris de cellule de la suspension par centrifugation. La couche >*rnagéant e constitue la source de polynucléotide-phosphorylase, (B) Préparation de 1*hétéropolynucléotide (a) g On mélange 10 parties en volume de la source de polynucléotide-25 phosphorylase mentionnée ci-dessus, parties en volume (voir tableau 2) d'une solution aqueuse à 40 mg/ml de IDP, parties en volume (voir t ableau 2) d*une solution aqueuse à 40 mg/ml de GDP, 10 parties d'un tampan au pH 8,1 constitué par une solution 1 M de tris(hydroxyméthyl)aminométhane, 5 parties en volume d'une 30 solution 0,1 M de chlorure de magnésium et 5 parties en volume d'une solution 0,01 M dé sel tétrasodique d'acide éthylènediamine-tétraacétique et on fait incuber à 37°C pendant 60 minutes. Après avoir ajouté 150 parties en volume d'alcool éthy— lique à 99$, on laisse le mélange reposer à 4°C pendant 15 minu-35 tes, ce qui èétermine la formation d'un précipité. On récupère le précipité par centrifugation et on le dissout dans 25 parties en volume d'eau distillée. On soumet la solution à une déprotéi-nisation à 3 reprise^ en utilisant chaque fois 25 parties en volume d'alcool isoamylique. On ajoute de l'alcool éthylique à la 40 solution aqueuse ainsi traitée, de manière à porter la concentra 6Î 44440 8 10 15 2027027 tion à 75% par rapport au volume entier, en même temps que 5 parties en volume d'un* solution 1M d'acétate de soiium au pH 5,4} on obtient ainsi un précipité de 1»hétéropolynucléotide (a). De la manière qu'on vient de décrire, on obtient les hétéropolynucléotides (a) mentionnés dans le tableau 2. (C) Formation d'une structure en double hélice entre l'hétéropolynucléotide (a) et 1'homopolynucléotide (b). On mélange 50 parties en volume d'une solution à 5 mg/ml de l'hétéropolynucléotide (a) mentionné dans le tableau 2, dans un tampon comprenant une solution 0,15M de NaOl et une solution 0,006 M de NagHPO^ et 50 parties en volume d'une solution à 5 mg/ml de 1'homopolynucléotide (b) mentionné dans le tableau 2 dissous dans la même solution tampon, ce qui permet d'obtenir le complexe à structure en double hélice de l'hétéropolynucléotide (a) et de 1'homopolynucléotide (b). les complexes à structure en double hélice ainsi obtenus sont mentionnés dans le tableau 2* TABLEAU 2 Conpltxe à structure en double hélice de I l'hétéropolynucléotide (a) et de 1 *homopolynucléofcidi (bl Echantillon H* Hétéropolynucléotide Homopolynucléotide (b) Rapport (b)/(a) *3) X1 T1 Rapport I/O- dans (a) *1) Constante , de sédimentation (a) *2) 1 10 10 0,7 7,5 s Poly.C. *(4) à 6 s. env. 1 2 13 7 1,9 4,5 s Poly.C.à4 s. env. 1 3 15 5 2,4 7 s. Poly.C. à 6s. env. 1 4 16 4 2,8 5 s. Poly.C. à 5s. env. 1 5 16,7 3,3 3,5 6 s. Poly.C. à 6s. env. 1 6 18,3 1,7 10,2 5,5 s. Poly.C. à 5so env. 1 7 18,3 1,7 10,2 4,5 s. Cytidyl-cyti-dine env. 1 8 19,1 0,9 18,0 6,5 s. PcLy.C. à 6 s. env. 1 20 25 30 35 40 69 44440 9 2027027 *(1) : Nombre moyen d'unités de l'acide inosinique par unité de l'àcide guanylique dans (a). *(2) : Constante de sédimentation de (a) en unités Svedberg. *(3) ï Nombre total d'unités d'acide cytidylique dans (b) par 5 unité de nucléotide dans (a). *(4) : Acide polycytidylique. Référence 2 (A) Préparation de la source de polynucléotide-phosphorylase: On inoexile Sarcina lutea (IFO n° 3232) dans 40 parties 10 en volume d'un milieu de culture aqueux comprenant 0,5$ d'extrait de levure, 0,2$ de liqueur de macération du maïs, 0,2$ de dihydrogéno-phosphate de potassium, 0,05$ de chlorure de magnésium et 0,5$ de saccharose, puis on cultive le milieu à 28°C pendant 18 heures. Ensuite 17 parties en poids de cellules humides récu-15 pérées dans 200 parties en volume.du bouillon de culture ainsi incubé sont mises en suspension dans 50 parties en volume d'un tampon constitué par une solution 0,02 M de tris (hydroxyméthyl) aminométhane au pH 7,2, puis on traite la suspension par les ultra-sons, à 10 kilocycles, pendant 3 minutes. On élimine les 20 débris de cellules de la suspension par centrifugation. On trait» la couche surnageante avec 1000 parties en volume de Sephadex G—100 (marque de fabrique désignant des particules da dextrane utilisées dans la filtration sur un gel ët vendues par Uppsala Co., en Suède) et on l'utilise comme source de polynucléotide-phosphorylase. 25 (B) Préparation de l'hétéropolynucléotide (a). On mélange 10 parties en volume de la source de polynucléotide-phosphorylase, X2 parties en volume (tableau 3) d'une solution aqueuse à 40 mg/ml de IDP, Tg parties en volume • (tableau 3) d'une -solution aqueuse à 40 mg/ml de GDP, 5 parties en volume 30 d'un tampon au pH 8,1 constitué par une solution 1M de tris- (hydroxyméthyl)aminométhane, 5 parties en volume de MnClg 0,1M, 15 parties en volume d'eau distillée et on fait incuber le mélange à 40°C pendant 180 minutes. Après avoir ajouté 200 parties en volume d'alcool 35 éthylique, on laisse le mélange reposer à 4°C pendant 20 minutes. On obtient ainsi un précipité qu'on récupère par centrifugation et qu'on dissout dans 25 parties en volume d'eau distillée. On soumet la solution à une déprotéinisation à 5 reprises en utilisant chaque fois 25 parties en volume de phénol saturé d'eau. 40 Après avoir éliminé le phénol restant dans la solution aqueuse 69 44440 'o 2027027 avec de l'éther diéthylique, on ajoute de l'alcool éthylique à cette solution, jusqu'à une concentration de 70$ par rapport au volume total, ainsi que 5 parties en volume d'une solution 1M d'acétate de sodium (pH 5,4), ce qui détermine la précipitation 5 de l'hétéropolynucléotide (a)„ De la manière qu'on vient de décrire, on obtient les hétéropolynucléotides (a) mentionnés dans le tableau 3• (G) Formation d'une structure en double hélice entre l'hétéropolynucléotide (a) et 1'homopolynucléotide (b). 10 On mélange 50 parties en volume d'une solution à 5 mg/ml de l'hétéropolynucléotide (a) mentionné dans le tableau 3 dans tua tampon comprenant une solution 0,15 M de NaCl et une solution de 0,006M de Na2HP0^ et 50 parties en volume d'une solution à 5 mg/ml de l'homopolynucléotide (b) mentionné dans le ta-15 bleau 3 dans la même solution tampon, ce qui donne le complexe à structure en double hélice de l'hétéropolynucléotide (a) et de 1' homopolynucléot ide (b). Les complexes à structure à double hélice ainsi obtenus sont mentionnés dans le tableau 3» 20 TABLEAU 3 25 30 35 40 Complexe à structure en double hélice de l'hétéropolynucléotide (a) et de 1*homopolynucléotide (b) Echan Hétéropolvnucl éotide (a) Homo- Bapport tillon N® *2 T2 Rapport I/G dans (a) *(1) Constante de sédimentation de (a) *(2) poly-nucléo-tide (b) (b)/(a) (3) 9 10 10 0,8 10 s Poly.C. à 10s.*(4! env. 1 10 13 7 1,2 8 s. Poly.C. à 8 s. - d® - 11 15 5 1,8 11 s. Poly.C® à 10 s. - d° - 12 16 4 2,4 12 s. Poly.C.-à 10 s. - d° - 13 16,7 3,3 9 s. Poly.C. à 9 s. - d° ~ 14 18,3 8,8 8 s. Poly.C. a S s. - d° - 15 18,3 1,7 8,8 10 s» Poly.C. à 10 s. - d° - 69 44440 n 2027027 16 19,1 0,9 16,3 9 s. Poly.C. - d° - à 9 s. 10 15 20 25 30 35 Nota s (1), (2), (3) et (4) s voir nota tableau 2. Les exemples ci-dessous sont simplement cbstinés à démontrer l'induction de 1'interféron par l'administration de complexes typiques à structure en double hélice de l'hétéropolynucléotide (a) et de l'homopolynucléotide (b) dans des «THma-mr vivants et dans des cultures de tissu» EXEMPLE 1 On administre par voie intraveineuse à des lapins pesant entre environ 2 et 2,5 kg, à raison de 5yug par lapin, une solution de 5yug/«l de chaque complexe à structure en double hélice mentionné dans les tableaux 2 et 3 dans une solution physiologique tamponnée par un phosphate (qui comprend 8 g de NaCl, 0,2g de KC1, 1,15g de NagHPO^, 0,2 g de KI^PO^, 0,1 g de CaClg et 0,1 g de MgClg, 6 HgO, le complément étant de l'eau distillée en quantité suffisante pour 1 litre)..Après 2 heures , on prélève des échantillons du sang de chaque lapin par ponction cardiaque. On sépare le sérum de chacun des échantillons coagulés après coagulation par centrifugation à une vitesse de 1500 tours/minute pendant 5 minutes. On dilue le sérum provenant de chaque lapin avec un milieu d'équilibre (2$ de lactalbumine de sérum de boeuf de Hantes dont la composition sera donnée ci-dessous) par dilution en série à 1:5 et 1:5120. On introduit un échantillon de 2 ml de chaque dilution dans quatre cultures en tube de cellules de rein de lapin, dont le milieu de croissance a été prélevé {10$ ôLe lactalbumine de sérum de boeuf de Hanks). On maintient chaque tube à 36®C pendant 16 heures. Après avoir prélevé l'échantillon de sérum de chaque tube, on ajoute 2 ml du milieu d'équilibre dans chaque tube. On infecte les cultures des tubes respectifs avec 100 DICTcrv (dose infectieuse • à 50$ pour une culture de pu tissu) de Vesicular Stomatltis Virus. on les fait incuber à 36°C pendant 48 heures supplémentaires, puis on observe l'apparition d'effets cytopathiques viraux. On calcule le titre d'interféron de chaque échantillon de sérum comme la réciproque de la dilution de sérum pour laquelle 50$ des cultures en tube ne montrent pas d'effets cytopathiques» Les résultats sont donnés daiis le tableau 4»' 69 44440 12 TABLEAU 4 2027027 5 10 15 20 2.5 Complexe à structure en double hélice désigné par le n° d'échantillon attribué dans les tableaux 2 et 3 Titre d'interféron du sérum de lapin 1 1280 2 5120 3 2560 4 2560 5 2560 6 2560 7 2560 8 1280 9 1280 10 t 5120 11 2560 12 2560 13 2560 14 2560 15 2560 16 1280 30 On prépare une solution à 2$ de lactalbumine de sérum de boeuf de Hanks en mélangeant 20 ml de sérum de boeuf avec une solution de lactalbumine de Hanks, de manière à porter 3e volume total à 1 litre. On prépare la solution de lactalbumine de Hanks en dissolvant 5 g d1hydrolysat de lactalbumine dans la solution 35 équilibrée de Hanks ayant la composition suivante, pour porter le volume total à 4 litres ï NaCl 8,0 g KC1 0,4 g CaCl2 0,2 g 40 MgSO,, 7H20 0,2 g NagHFO^, 2H20 0,06 g K^P04 0,06 g 69 44440 13 2027027 10 15 NaHC05 0,25 « d-glucose 1,0 g Rouge phénol 0,02 g Eau distillée (à trois reprises) q.s. pour 1 litre. On prépare la lactalbumine de sérum de boeuf de Hanks en mélangeant 100 ml de sérum de boeuf avec la solution de lactalbumine de Hanks jusqu'à un volume total de 1000 millilitres» A titre d'échantillons témoins, on prépare les divers complexes à structure en double hélice mentionné» dans le tableau 5 de la manière décrite dans les références 1 ou 2 et on détermine leur pouvoir d'induction d1 interféroncchez le lapin de manière décrite ci-dessus, les résultats sont donnés dans le tableau 5« TABLEAU 5 Témoin F® Complexe à structure en double hélice Titre d'interféron d ant le sérum . de lapin Polynudéotide au lieu de 1'hétéropolynucléotide (a) Polynudéotide au lieu do 1'homopolynucléotide (b) Référença 1 Poly.G-o Poly.C» 1 0 2 A11°1 Poly.I. 2 0 3 Vi Poly. I. 2 0 4 A1°11 Poly. I. 2 160 5 Poly.I. Poly.C. 1 640 6 Poly.I. Poly.C. 2 320 7 A,X, Poly.I. 2 0 8 °1X1 Poly. I. 2 0 9 c1&i Poly. I. 1 0 10 Poly. C. 1 0 11 I23A1 Poly.C. 1 160 12 I11 A1 Poly.C. 1 40 13 I5 A1 Poly.C. 1 A o 14 I23 °1 Poly.C. 1 160 15 11,0, Poly.C. 1 40 16 4 0, Poly.C. 1 20 25 30 35 40 6$ 44440 4 2027027 "A", "C", "X", "G" et "I" représentent respectivement les imités d'acide adénylique, d'acide cytidylique, d'acide xan-thylique, d'acide guanylique et d'acide inosinique dans le polynudéotide» Les nombres donnés en indice représentent les rapports 5 molaires des nucléoside-5diphosphates de départ correspondant aux unités de nudéotides» Ainsi, par exemple, l'indication polynudéotide "A^'G^" signifie qu'il s'agit d'un hétéropolynucléotide obtenu à partir d'adénosine-5'-diphosphate et de cytidine-51-diphosphate dans 10 un rapport molaire de'11 : 1. La même règle prévaut pour les autres indications. "Poly.I.", "Poly.C." et "Poly.G." désifenent respectivement l'acide polyinosinique, l'acide polycytidylique et 1*acide polyguanylique. "RYTiMPT/P! 9 Dans quatre cultures en tubes de cellules de rognon de lapin, dont le milieu de croissance a été prélevé, on introduit 2 hlL du milieu d'équilibre mentionné ci-dessus et contenant diverses concentrations de solutions du complexe à structure en double hélice appelé échantillon 2 dans le tableau 2 dans la solution physiologique 20 tamponnée au phosphate mentionnée ci-dessus et on maintient chaque tube à 36°C pendant 16 heures. Après avoir retiré l'échantillon de solution de chaque tube, on introduit 2 ml du milieu•d'équilibre dans chaque tube. On détermine l'infection des cellules dans chaque tube avec 100 DICT™ de Vesicular Stomatitis Virus et on fait ineuber DU 25 à 36*0 pendant 48 heures, puis on observe l'apparition des effets cytopathiques viraux. On peut ainsi déterminer que la concentration de l'échantillon 2 pour laquelle 50$ des cultures en tubes ne montrent pas d'effets cytopathiques est de 0,1yug/ml. 30 Le même procédé montre que la concentration du comple xe à structure en double hélice de l'acide polyinosinique et de l'acide polycytidylique appelé témoin 5 dans le tableau 5» pour laquelle 50$ des cultures en tube ne montrent pas d'effet cytopathi-que, est de 0,65yug/ml. 35 EXEMPLE 3 On administre le virus Influenza Virus type A. souche PR8. à des souris pesant 18-20 g» 3 heures après l'infection, chacun des échantillons 12 du tableau 3 et le témoin 6 du tableau 5 utilisés sous forme 40 dtane solution à 1500^ug/ml dans la solution au phosphate tamponnée, 69 44440 15 2027027 est administré par voie nasale à 20 souris, la dos» totale étant de 30 ^ug par animal. On observe les souris pendant 14 jours, les résultats sont donnés dans le tableau 6. 5 TABLEAU 6 Echantillon Nombre de jours pendant lesquels les animaux restent en vie Animaux restant en vie, $ non administré 6,5-7,1 0 Témoin 6 10,3 - 11,3 30 Témoin 12 12,0 - 13,6 50 Témoin 10 11,8 - 13,4 70 EXEMPLE 4 On inocule Sarcina marginata (IFO 3066) dans 40 parties en volume d'un milieu de culture aqueux comprenant 1,2$ de polypeptone, 0,5$ de cellules de levure séehées, 0,0$ de KHgPO^ , 20 0,2$ de KgHPO^ et 1,5$ de- glucose, puis on cultive le milieu à 28°C pendant 18 heures. On récupère 15 parties en poids de cellules humides dans 200 parties en volume du bouillon de culture et on les met en suspension dans 30 parties en volume d'un tampon au pH 7,5 constitué par une solution 0,05M de t ris (hydroxyméthyl ) aminomé thane , 25 puis on traite la suspension par les ultra-sons à 10 kilooycles, pendant 30 minutes. On centrifuge le mélange et on traite le liquide surnageant avec 100 parties en volume de "Sephadex G—100" et ensuite avec 250 parties en volume de diéthylaminoéthyl cellulose, ce qui donne 60 parties en volume de solution de polynucléotide-30 phosphorylase. En présence de 12 parties en volume de la solution de polynucléotide-phosphorylase, on- traite une solution aqueuse à 40 mg/ml de IDP et une solution aqueuse à 40 mg/ml de GDP, dans le rapport mentionné dans le tableau 7 en opérant comme décrit dans 35 le paragraphe (2) de la référence 1, ce qui donne l'hétéropolynucléotide (a) apparaissant dans le même tableau» On fait réagir l'hétéropolynucléotide (a) ainsi obtenu avec 1'homopolynucléotide (b), de la manière décrite dans le paragraphe (3) de la référence 1, ce qui donne les complexes à 40 structure en double hélice mentionnés dans le tableau 7» 44440 16 2027027 On Inocule à des souris pesant 14-18 grammes le micro-organisme Japanese Encephalitis Virus» Vingt-quatre heures après 1*infection, chacun des échantillons mentionnés dans le tableau 7» se trouvant chacun sous 5 forme d'une solution à 150 yug/ml dans la solution physiologique tamponnée au phosphate, est administré par voie intra-veineuse à 20 souris, la dose totale étant de 30 ^ug par animal. On observe les souris pendant 21 jours. Les résultats sont donnés dans le tableau 7. o- nO • TAKIÏRATT 7 ^ -t». Complexe à structure en double hélice de 1*hétéropolynucléotide (a) et de 1'homopolynucléotide (b) Animaux restant en vie % Temps moyen pendant lequel les animaua restent en vie, jours Hétéropolynucléotide (a) Constante de sédimentation de (b) Rapport (bV(a) ■^apport molaire *(5) Rapport I/Q- dans (a) Constante de sédimentation de (a) 11 9,8 4 b. 4 s. env» 1 40 14,6 4 2,8 6 s» 5 Sa env-, 1 65 15,0 2 1,2 4 s. 4 s» env.1 40 16,0 1 0,8 7 s. 5 s. env.1 55 13,6 Poly» Io à 5 s« 4 s. env01 36 12,0 Non administré 0 .10,8 *(5) : Rapport molaire IDP/GEP dans la préparation de (a) K> O • to O ^4 69 44440 2027027 REVENDICATIONS 1* A titre de médicament, un complexe à structure en double lié 11 ce obtenu à partir (a) d'un hétéropolynucléotide dont les unités de nucléotide sont constituées par de l'acide inosinique 5 et de l'acide guanylique, et (b) d'un homopolynucléotide dont l'unité de nucléotide est constituée par l'acide cytidylique, la constante de sédimentation de l'hétéropolynucléotide (a) étant comprise entre 2 et 15 unités Svedberg, et le nombre moyen des unités d'acide inosinique dans l'hétéropolynucléotide étant compris 10 entre 0,7 et 20 par unité d'acide guanylique, ce complexe étant utilisé comme inducteur d'interféron dans un sujet ou une culture de tissu, principalement lorsque l'hôte est un animal à sang chaud. 2* Complexe à structure en double hélice selon la revendication 1, caractérisé par le fait qu'il est administré à l'ani-15 mal à sang chaud en une dose 1 p. g à 2 mg par kilo de l'animal. 3. Complexe selon la revendication 1, caractérisé par le fait qu'il peut être administré par injection. 4. Complexe selon la revendication 1, caractérisé par le fait qu'il peut être administré par application locale sur les 20 muqueuses de l'animal. 5* Complexe selon la revendication 1, dans lequel le polynudéotide possède une constante de sédimentation de k à 8 unités Svedberg. 6. Complexe selon la revendication 1, dans lequel le 25 nombre moyen d'unités d'acide inosinique est de 1 à 10 par unité d' acide guanylique. 7* Complexe selon la revendication 1, dans lequel le nombre des unités totales d'acide cytidylique dans 1'homopolynucléotide (b) est de 0,5 à. 2 par unité de nucléotide de l'hétéro-30 polynudéotide. 8. Complexe selon la revendication 7» dans lequel le nombre des unités totales d'acide cytidylique dans 1'homopolynucléotide (b) est égal à 1. 9. Composition pharmaceutique pouvant être administrée à un 35 animal à sang chaud, caractérisée par le fait qu'elle comprend sensiblement (a) une quantité faible d'un complexe à structure en double hélice, constituant l'ingrédient actif inducteur d'interféron / \ , de- obtenu en utilisant (a) un hétéropolynucléotide comprenant essentiellement 2027027 l'acide inosinique et de l'acide guanylique comme unités de nucléotide, et (b) un homopolynucléotide comprenant essentiellement de l'acide cytidylique comme unité de nucléotide, l'hétéropolynucléotide (a) ayant une constante de sédimentation comprise entre 5 environ 2 et 15 unités Svedberg, et le nombre moyen des unités d'acide inosinique étant compris entre environ 0,7 et 20 par unité de l'acide guanylique, et (B) une quantité principale d'un adjuvant pharmaceutique approprié. 10. Composition pharmaceutique selon la revendication 9, 10 dans laquelle l'adjuvant est un liquide injectable. 11. Composition phaimaceutique selon la revendication 9, dans laquelle l'adjuvant est un liquide convenant pour une application locale sur des muqueuses de l'animal à sang chaud. 12. Composition pharmaceutique selon la revendication 15 9» dans laquelle l'hétéropolynucléotide (a) possède une constante de sédimentation comprise entre environ h et 8 unités Svedberg. 13* Composition pharmaceutique selon la revendication 9, dans laquelle le nombre des unités totales d'acide cytidylique dans 1'homopolynucléotide (b) est compris entre environ 0,5 et 2 20 par unité de nucléotide contenue dans l'hétéropolynucléotide (a). 14. Composition pharmaceutique selon la revendication 13» dans laquelle le nombre précité est d'environ 1. 15» Procédé dé production d'un complexe à structure en double hélice dans lequel on utilise comme matières de départ 25 (a) un hétéropolynucléotide comprenant essentiellement de l'acide inosinique et de l'acide guanylique comme unités de nucléotide, et (b) un homopolynucléotide comprenant essentiellement de l'acide cytidylique comme unité de nucléotide, ce procédé étant caractérisé par le fait qu'il consiste à copolymériser de l'inosine-S^-diphos-30 phate et de la guanosine-51-diphosphate en présence d'un polynudéotide phophorylase d'un microorganisme tel que Bhodop s eudomonas spheroides, Sarcina lutea et Sarcina marginata. et à faire réagir l'hétéropolynucléotide (a) résultant avec 1'hompolynucléotide (b), la quantité molaire de 1'inosine-5'-diphosphate étant au 35 moins sensiblement égale à celle de la guanosine-5'-diphosphate. 16. Procédé selon la revendication 15, dans lequel on exécute la copolymérisation au sein d'un milieu aqueux à un pH compris entre environ 6,5 et 10, à une température d'environ 30 à 60-C. 4o 17» Procédé selon la revendication 15, dans lequel 69 44440 19 69 44440 20 2027027 la constante de sédimentation de l'hétéropolynucléotide (a) est comprise entre environ 2 et 15 unités Svedberg, et le nombre moyen des unités d'acide inosinique est compris entre environ 0,7 et 20 par unité d'acide guanylique. 5 18. Procédé selon la revendication 15, dans lequel le microorganisme est Rhodopseudomonas spheroides. 19• Procédé selon la revendication 15, dans lequel le microorganisme est Sarcina lutea. 20. Procédé selon la revendication 15, dans lequel 10 le microorganisme est Sarcina Marginata.