FR 2028502 A1 19701009 FR 6945385 A 19691230 69 45385 1 2028502 La présente invention concerne un procédé de préparation dé protéase par culture de micro-organismes de la classe des Basidiomycetes dans un milieu de"culture contenant un hydrate de carbone convenable, une source d'azote, des sels minéraux et 5 d'autres matières nutritives. On connaît un grand nombre de protéases ayant diverses propriétés, par exemple les protéases d'origine animale, d'origine végétale ou provenant de micro-organismes, etc. Cependant,* si on considère les micro-organismes de la classe des Basidiomycetes. 10 on a seulement identifié l'enzyme produite par le genre Trametes. C'est la raison pour laquelle on a principalement employé jusqu'ici les micro-organismes de la classe Basidiomycetes. au contraire d'autres micro-organismes, seulement pour la culture de certains champignons comestibles en agriculture, et on n'a presque jamais 15 effectué d'études des produits métaboliques. La demanderesse a déterminé que, d'une façon surprenante, une quantité considérable de protéase ayant des propriétés nouvelles peut être produite par les micro-organismes de la classe Basidiomycetes autres que ceux du genre Trametes. 20 Sur les dessins annexés, la figure 1 est un diagramme mon trant la relation entre l'activité enzymatique et le pH pour des enzymes de la protéase produite par les organismes indiqués ; - la figure 2 représente l'activité enzymatique résiduelle observée après avoir laissé reposer 24 25 heures chacune de ces enzymes ; - la figure 3 montre la relation entre l'activité enzymatique et la température ; - la figure 4 indique la stabilité à la chaleur des enzymes, représentée par l'activité restante après. 30 chauffage à la température indiquée pendant 10 minutes. (L'activité de la protéase, sur les figures 1 et 3> a été mesurée par la méthode de Kunitz exposée dans "Agricultural and Biological Ghemistry" - volume 28, n2 11, pages 770-771 - 1964). Les propriétés des enzymes obtenues selon la présente in-35 vention sont décrites ci-après. Comme le montre la figure 1, le pH optimum des enzymes 69 45385 2 2028502 tombe dans -une des trois gammes 2,0-2,5 - 6-7 - 8-9, et on peut obtenir une enzyme dont le pH optimum est compris dans une de ces gammes, comme on le désire, par' un choix convenable de la souche ou des conditions de culture. Des ions métalliques autres que le 5 calcium ne sont pas nécessaires pour protéger ou favoriser l'activité enzymatique, mais l'enzyme, ayant un pH optimum compris entre 2,0 et 2,5 est inhibée par l'acide éthylène^diamine-tétracétique et l'enzyme ayant un pH optimum compris entre 8 et 9 est inhibée par l'acide para-chloromercuribenzoïque. La stabilité en fonction 10 du pH, la température optimale et la stabilité à la chaleur des présentes enzymes sont représentées sur les figures 2, 3et 4,mais on voit, d'après ces propriétés, que les présentes enzymes sont nettement différentes des enzymes produites par le genre Trgmgte». Les propriétés des enzymes du genre T-rawfitea se trouvent dans 15 "Agricultural and Biological Chemistry" - volume 28, page 774 -1964. L'emploi des enzymes de protéase s'est étendu du fait des développements des industries alimentaires, et la demande pour ces industries s'est accrue d'une façon remarquable. Pour ces applioa-20 tions, une activité de décomposition simplement supérieure ne «uffit pas, il faut aussi que l'enzyme n'ait aucune toxicité et ne donne aucun goût amer ou désagréable aux aliments ou aux boissons. A. cet égard, les enzymes produites par les micro-organismes de la classe des Basidiomycetes selon la présente invention diffèrent de celles 25 qui sont d'origine animale, végétale ou micro-organique en ce qu'elles sont exemptes de saveurs indésirables et possèdent de plus d'autres propriétés très avantageuses. On peut utiliser selon la présente invention toute souche, pourvu qu'elle soit d'un micro-organisme de la classe des Basidio-30 mycetes. mais on préfère particulièrement les souches appartenant au genre Daedaleopsis. au genre Irpex, au genre Lenzites. le genre Fomitopsis et le genre Goprinus étant-particulièrement préférable. Des exemples de ces souches préférées- sont Daedaleopsis styracina. Daedaleopsis nipponica. Irpex lacteus. Lenzites betulina. Fomitopsis 35 castanea. Fomitopsis pinicola, Fomitopsis cytisina. Coprinus macro-rhjzus f. microsporus, Goprinus radians etc. Les souches citées 69 45385 3 2028502 ci-dessus correspondent à la description donnée par Rokuya Imazeki et ïsuguo Hongo dans "G-enshoku Nikon Kinrui Zukan" (les champignons japonais colorés illustrés), mais ces souches peuvent être identifiées sous des noms différents suivant les différences entre 5 les méthodes de classification et de description, mais on peut utiliser toute souche telle que classée ci-dessus selon la classification de Imazeki et coll. Selon le procédé de la présente invention, on cultive le micro-organisme de la classe des Basidiomycetes dans un milieu ; on tû peut utiliser un milieu liquide ou solide. Habituellement, il est avantageux d'employer un milieu liquide. Dans ce eas, on peut utiliser des cultures immobiles ou des cultures aérées par agitation. Le milieu doit contenir les sources nutritives qui peuvent être utilisées par le micro-organisme particulier. En général, on 15 emploie comme source de carbone des hydrates de carbone comme le sucrose, le dextrose, le maltose, le lactose, l'amidon, la dextrine les mélasses de "blackstrap" et analogues. On peut employer comme source d'azote des substances minérales ou organiques contenant de l'azote comme les sels d'ammonium, les nitrates, la peptone, l'ex-20 trait de viande, la liqueur de macération de maïs, les gâteaux de soja, la farine de froment, la levure, l'urée et analogues. On peut utiliser, de plus, des substances minérales ou des sels métalliques comme les phosphates, les sels de potassium, les sels de magnésium, les sels de fer, les sels de zinc et analogues. En outre, on peut 25 aussi ajouter des vitamines, des agents accélérateurs de croissance et d'autres produits. Il est possible d'obtenir un rendement considérable en protéase en ajoutant au milieu des composés solubles de distillation. Dans la culture des micro-organismes de la classe des Basi-30 diomycetes. les conditions de culture varient quelque peu avec la souche à cultiver, la composition du milieu et autres paramètres, mais en général, l'accumulation de protéase atteint son maximum lorsqu'on effectue la culture à une température de 20 à 352C et à un pïï de 4 à 7 dans le milieu pendant 48 à 120 heures. Evidemment, 35 on préfère en général employer les conditions dans lesquelles on obtient le rendement maximum en protéase. 69 45385 4 2028502 La protéase obtenue selon la présente invention peut être précipitée et concentrée par addition de 50 à 65 % (volume/volume) d'un solvant organique, par exemple de l'acétone, de l'alcool ou analogue, ou de 40 à 70 % (poids/volume) d'un agent de précipitation 5 par exemple de sulfate d'ammonium, de chlorure de calcium, de chlorure de sodium ou analogue, à une solution aqueuse d'extraction dans le cas de cxilture en milieu solide ou à un filtrat de cxilture dans le cas de culture en milieu liquide. De plus, on peut aisément les purifier suivant le procédé habituel des résines échangeuses 10 d'ion» par dialyse, absorption» désorption ou autre. Les exemples particuliers ci-dessous illustrent de plus la présente invention. Exemple 1 On ajuste au pH 6,0 un milieu dont la composition comprend 15 3 $ de sucrose, 3 $> de poudre de soja, 0,3 # d'extrait de levure, 0,5 io de KH2P0^ et 0,02 de MgS0^,7H20 et, on inocule séparément des portions de 30 cm3 du milieu qu'on cultive en agitant à 28SC pendant 48 à 72 heures, avec Daedaleopsis stvracina (ATCC 20188), Irpex lacteus (ATCC 20123), Lenzites betulina (ATCC 11575), Fomitop-20 sis castanea (ATCC 20234), Fomitopsis cytisina (ATCC 20196), Fomitopsis pinicola (ATCC 20036), Coprinus macrorhizus f. microsporus (ATCC 20120), et Coprinus radians (ATCC 20014). Ces cultxires servent de cultures-mères pour inoculer des portions séparées de 15 litres de milieux ayant la même composition que ci-dessus, cul-25 tivées avec agitation sous aération à 282Q pendant 48 à 96 heures. Les liqueurs de cxilture sont filtrées pour enlever les cellules et on ajoute du sulfate d'ammonium aux filtrats en agitant doucement de façon que la teneur finale en sulfate d'ammonium atteigne 60 $ (poids/volume) ; on laisse ensuite reposer pendant 4 30 heures à 02C. Après addition de 2 $ d'un agent de filtration, les précipités résultants sont séparés par filtration et dissous dans une petite quantité d'eau. En filtrant à nouveau les précipités, on obtient des filtrats clairs brun-foncé. Les filtrats sont dialysés à 02C pendant 24 heures et on obtient,par séchage à froid des dia-35 lysats, des poudres brun-jaunâtre. L'activité de. ces poudres a été mesurée selon la méthode décrite dans "Koso Kenkyuho" - 69 45385 5 2028502 (Méthodes pour l'étude des enzymes) - volume 2, compilé par Shiro Akabori, et a donné les résultats ci-dessous. Souches utilisées v Rendement (g) Activité (PU/g) 5 Daedaleopsis styracina ATCC 20188 20 60.000 Irpex lacteus ATCC 20123 22 80.000 Lenzites betulina ATCC 11575 9 25.000 Fomitopsis castanea ATCC 20234 19 50.000 Fomitopsis cytisina ATCC 20196 21 15.000 10 Fomitopsis pinicola ATCC 20Ô36 24 19.000 Copriaus aacrorhizus ATCC 20120 f. microsporus 32 25.000 Coprinus radians ATCC 20014 25 20.000 Exemple 2 15 les liqueurs de fermentation obtenus par culture des mêmes souches dans les mêmes milieux et de la même façon que dans l'exemple 1 sont filtrées pour enlever les cellules et les filtrats recueillis sont refroidis à OSC. De l'acétone préalablement refroidie à ^2020 est lentement ajoutée à chacun des filtrats de façon à atteindre 20 une teneur finale en acétone de 65 ia (volume/volume) et il se forme un précipité. L'eau entraînée dans les précipités est pressée et les précipités sont recueillis par filtration. On lave une fois les précipités avec de l'éther et on les sèche sous vide ; on obtient alors des poudres brun-foncé. Leur activité mesurée comme décrit 25 plus haut a donné les résultats ci-après : - Souches utilisées Rendement Activité (g) (PU/g) Daedaleopsis styracina ATCC 20188 130 5.000 Irpex lacteus ATCC 20123 115 11.000 30 Lenzites betulina ATCC 11 575 180 1.500 Fomitopsis castanea ATCC 20234 195 1.200 Fomitopsis Qytisina ATCC 20196 210 600 Fomitopsis pinicola ATCC 20026 230 700 69 45385 6 2028502 Souch.es utilisées Rendement (g) /" suite__7 Coprinus maororhizus f. 5 microsporus ATCC 20120 Coprinus radians ATCC 20014 170 130 Activité (HJ/g) 1.800 1.400 Exemple 5 On ajuste au pH 5,5 un milieu contenant 3 & de sucrose, 2 % de gâteau de soja, 0,5 ^ de composés solubles de distillation, 0,5 ^ 10 de son de riz dégraissé, 0,8 i» de KHgPO^, et 0,1 de HgSO^THgO et les mêmes souches que dans l'exemple 1 sont inoculées à des portions du milieu séparées de 30 cm3 et cultivées en agitant 48 à 96 heures à 302C. A titre de comparaison, on effectue aussi des cultures de la même façon dans des milieux identiques, à la diffé-15 rence près qu'ils ne contiennent pas de composés solubles de distillation. On mesure l'activité des filtrats obtenus par filtration des bouillons de culture par la méthode d'Anson modifiée décrite dans "Agricultural and Biological Chemistry" - volume 31, page 542, 1967, et on obtient les résultats ci-après : 20 Souches utilisées Activité (densité optique par cm3 à 660 ny.) 25 Sans addition de composés solubles de distillation Avec addition de composés solubles de distillation Daedaleopsis styracina ATCC 20188 0,540 1,080 Irpex lacteus ATCC 20123 0,950 1,900 Lenzites betulina ATCC 11575 0,760 1,400 30 Fomitopsis castanea ATCC 20234 0,435 0,870 Fomitopsis cytisina ATCC 20196 0,780 1,460 Fomitopsis pinicola ATCC 20036 0,860 1,600 Coprinus maororhizus f. microsporus ATCC 20120 0,585 - 1,070 35 Coprinus radians ATCC 20014 0,470 0,910 69 45385 7 2028502 Exemple 4 On mélange dans les proportions de 10:1:1 du son de froment, du son de riz dégraissé et des composés solubles de distillation et on les stérilise après les avoir suffisamment impré-5 gnésd'eau. On pulvérise séparément et uniformément les milieux solides ainsi préparés de formes mycéliennes des souches respectives cultivées dans les mêmes milieux que dans l'exemple 1 et on les cultive à 2820 pendant 7 à 10 jours. Après leur culture, on les réduit en poudre et on les met en suspension dans 5 fois leur volume 10 d'eau. On extrait les enzymes à la température ambiante sous faible agitation pendant quatre heures. L'activité des filtrats obtenus par filtration figure ci-après : 15 Souches utilisées Activité (densité optique par cm3 à 660 mu). 20 Fomitopsis cytisina ATCC 20196 Fomitopsis pinicola ATCC 20036 Coprinus macrorhizus f. microsporus ATCC 20120 Coprinus radians ATCC 20014 Daedaleopsis styracina ATCC 20188 Irpex lacteus ATCC 20123 Lenzites betulina ATCC 11575 Fomitopsis castanea ATCC 20234 0,810 1,520 0,980 0,730 1 ,020 1,120 0,660 0,520 69 4S385 a 2028502 Revendications 1. Procédé de préparation de protéase caractérisé en ce qu'il comprend une phase dans laquelle on cultive un organisme de la classe des Basidiomycetes dans un milieu convenable. 5 2. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que la protéase est accumulée dans ledit milieu, puis récupérée. 3. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que ledit milieu contient un hydrate de carbone assimilable et une source d'azote. 10 4. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que ledit milieu contient des composés solubles de distillation. 5. Procédé selon la revendication 1 caractérisé en ce que ledit organisme est une souche d'un des genres suivants : Daedaleopsis. Irpex. Lenzites. Fomitopsis et Coprinus. 15 6. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que ledit organisme est Daedaleopsis styracina. 7. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que ledit organisme est Daedaleopsis nipponica. 8. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que ledit 20 organisme est Irpex lacteus. 9. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que ledit organisme est Lenzites betulina. 10. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que ledit organisme est Fomitopsis castanea. 25 11. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que ledit organisme est Fomitopsis pinicola« 12. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que ledit organisme est Fomitopsis cytisina. 13» Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que ledit 50 organisme est Goprinus macrorhizus f.microsporus. 14. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que ledit organisme est Coprinus radians.