FR 2034743 A1 19701211 FR 7008228 A 19700306 70 08228 -1- 20 34743 La présente invention concerne de nouvelles substances anti-géniques insolubles dans l'eau et un nouveau procédé de préparation de ces substances. L'invention a également trait à de nouveaux agents antigéniques à effet retardé, contenant ces substances. 5 On sait depuis longtemps qu'une réaction se produit chez cer tains individus par ingestion et notamment inhalation de certaines particules ou matières naturelles et synthétiques,et en étant piqués par des insectes. Cette réaction est caractérisée par divers symptômes allergiques tels que des éternuements, une excitation 10 des glandes muqueuses, un oedème local, des éruptions cutanées, un choc et une vasodilatation. Les particules ou matières provoquant la réaction contiennent des principes actifs ou des matières douées d'activité allergénique et un résidu inactif. Ces réactions peuvent ou non être sévères en elles-mêmes ; toutefois, elles peu-15 vent conduire à des complications, d'ordre physiologique et psychologique . On a observé que 1'hyposensibilisation d'individus sujets à des symptômes allergiques a pour résultat d'empêcher ou de réduire notablement les effets nuisibles auxquels ces individus sont sujets. 20 Dans le traitement d'hyposensibilisation, un individu reçoit périodiquement des injections de force croissante d'un antigène ou d'une combinaison d'antigènes jusqu'à ce qu'une dose d'entretien ait été atteinte. L'antigène ou la combinaison d'antigènes que l'on administre est habituellement choisi à cause d'une relation suspectée 25 ou démontrée avec des symptômes ou des réactions allergiques observés. Cette dose est maintenue ou ajustée en fonction de l'époque de l'année et des manifestations allergiques de l'individu. De nombreuses formes d'extraits allergéniques ont été préparées et rendues disponibles en vue de leur utilisation dans un trai-30 tement d'hyposensibilisation. Des exemples de ces formes comprennent des extraits aqueux d'antigène, des émulsions d'antigène dans une huile (effet retardé), des combinaisons de l'antigène et de gélatine, etc. Malheureusement, du fait de la forte solubilité dans l'eau de 35 l'antigène de certaines des préparations mentionnées, dans le cas d'une injection, l'antigène est rapidement absorbé dans l'organisme de l'individu, ce qui fait apparaître une réaction allergique de 70 08228 _2_ 20 34743 l'organisme ou de la constitution. A cause de l'éventualité d'une telle réaction, on limite la force des doses et par conséquent, des injections fréquentes sont nécessaires. On a utilisé des émulsions dans une huile minérale pour retarder la libération ou l'absorption 5 de l'antigène ; toutefois, on a souvent constaté que ceci provoque la formation indésirable d'un abcès à l'endroit de l'injection, ou provoque d'autres réactions secondaires nuisibles au niveau ou à proximité du site d'injection. En outre, il a souvent été désirable de préparer des vaccins 10 prophylactiques, par exemple à partir de toxines bactériennes ou de toxoïdes et virus sous des formes aptes à produire une adsorption retardée lors de l'injection à un patient, ces formes offrant l'effet bénéfique d'une réponse prolongée des anticorps. Toutefois, un tel vaccin prophylactique a été difficile à obtenir par les 15 techniques antérieures. On a remédié à un grand nombre de ces insuffisances des formes déjà connues d'extraits antigènes en utilisant des extraits antigènes obtenus au moyen du procédé décrit dans le brevet des Etats-Unis d'Amérique N° 3.148.121. En bref, ce procédé consiste 20 à traiter une matière allergénique entière, non dégraissée, avec une aminé tertiaire hétérocyclique aqueuse utilisée comme liquide d'extraction, à séparer du résidu la phase liquide contenant les principes actifs, à jeter le résidu et à isoler les principes actifs de 1'aminé hétérocyclique tertiaire, par addition d'eau et 25 d'une solution d'alun à l'extrait liquide en vue d'insolubiliser les .principes actifs. Le complexe insolubilisé est ensuite lavé plusieurs fois à l'eau pour éliminer la totalité de 1'aminé tertiaire hétérocyclique et il est finalement remis en suspension dans un véhicule acceptable du point de vue physiologique , par 30 exemple une solution de chlorure de sodium. Cet extrait antigéni-que est appelé "PEAP" et consiste en antigène extrait à la pyridi-ne et précipité à l'alun, car la pyridine est l'aminé tertiaire hétérocyclique que l'on préfère utiliser dans un tel.procédé. Bien que les extraits antigéniques obtenus au moyen dujpro- /précisé 35 cédé du brevet des Etats-Unis d'Amérique ÎT° 3-148.121/, représentent une amélioration notable par rapport aux extraits allergéniques antérieurs, ce procédé semble donner des rendements relativement fai- 70 08228 -3- 20 34743 blés, c'est-à-dire de l'ordre d'environ 50 $ des unités d'azote protéinique initialement présentes dans l'extrait aqueux à la py-ridine. L'invention a par conséquent pour "but d'offrir un procédé de 5 préparation de substances antigéniques insolubles dans l'eau, procédé dans lequel une grande partie des principes actifs contenus dans le liquide d'extraction est récupérée sous la forme de substances antigéniques insolubles dans l'eau. L'invention a aussi pour but d'offrir des agents antigéniques 10 à action retardée, contenant des substances antigéniques insolubles dans l'eau qui libèrent lentement les principes actifs et qui sont facilement absorbées sans crainte de réactions nuisibles de l'organisme ou d'autres effets secondaires nuisibles. D'autres caractéristiques et avantages de la présente inven-15 tion ressortiront de la description détaillée qui va suivre. L'invention concerne un procédé de préparation de substances antigéniques insolubles dans l'eau à partir d'extraits liquides ou de suspensions de matières antigéniques, de toxines ou toxoïdes bactériens et de virus, procédé qui consiste à rassembler l'extrait 20 liquide ou suspension avec une matière choisie entre un tannate d'aluminium préalablement formé et un tannate d'aluminium formé in situ pour séparer de l'extrait une substance antigénique insoluble dans l'eau, et à récupérer cette substance antigénique insoluble dans l'eau. L'invention concerne également les nouvelles substances 25 antigéniques insolubles dans l'eau obtenues au moyen de ce procédé et les agents antigéniques à effet retardé, consistant en une combinaison des substances antigéniques insolubles dans l'eau et de véhicules acceptables du point de vue physiologique. Dans la pratique de la présente invention, le procédé au 30 moyen duquel l'extrait liquide de la matière antigénique est préparé n'est pas considéré comme déterminant. On connaît de nombreux procédés de séparation de principes actifs ou de matières douées d'activité antigénique, de résidus inactifs. Des exemples de procédés d'extraction et de liquides permettant d'extraire des substan-35 ces douées d'activité allergénique sont donnés dans l'ouvrage "Fundamentals of Modem Allergy", Prigal, Editeur ; McG-raw-Hill Co., Inc., 1960. Par exemple, des liquides aqueux d'extraction com 70 08228 -4- 20 34743 prennent la solution dite de Coca ayant un pH d'environ 8,2, une solution saline tamponnée ayant un pH d'environ 7>Q> une solution tamponnée de formaldéhyde-sulfoxylate de sodium ayant un pH d'environ 7,4 et une solution plus concentrée de formaldéhyde-sulfoxy-5 late de sodium et de chlorure de sodium tamponné. On peut aussi utiliser d'autres liquides d'extraction, par exemple la solution aqueuse de pyridine décrite dans le brevet des Etats-Unis d'Améri-précité que N° 3.148.121/, pour préparer l'extrait liquide à partir duquel les substances antigéniques insolubles dans l'eau selon l'invention 10 sont formées. En outre, une solution de glycérine ou une solution de glycérine et de chlorure de sodium a été utilisée avec succès dans l'extraction de la matière antigénique désirée. De nombreux liquides d'extraction ont également été suggérés dans le domaine de l'extraction des cultures bactériennes et virales en vue de 15 l'utilisation des extraits comme agents immunogéniques. Cta renvoie par exemple au brevet britannique ïï° 527.803 qui ^décrit un procédé d'extraction de cultures bactériennes,/qui"^consiste à utiliser un liquide tel que la guanidine pour solubiliser les principes actifs et les extraire du résidu bactérien inactif. Ce brevet donne 20 une énumération partielle d'exemples de liquides d'extraction, et il y a lieu de remarquer que de nombreux autres liquides et procédés sont évidents pour un spécialiste en ce domaine, et sont tout aussi intéressants à utiliser dans le procédé de lrinvention. Les nouvelles substances antigéniques insolubles dans l'eau 25 selon la présente invention peuvent être formées en utilisant des extraits liquides de diverses matières antigéniques. Ces matières comprennent des substances douées d'activité allergénique telles que la poussière ordinaire rencontrée dans les maisons et recueillie dans des aspirateurs et la poussière rencontrée dans certains 30 établissements industriels, par exemple la sciure de bois des épithélium, par exemple des pellicules de desquamation de chat, de chien,de chevalet de lapin ; des plumes, par exemple les plumes d'oie et de poulet ; des graines, telles que celles du coton et du kapok des insectes et des émanations d'insectes, tels qu'abeilles, bour-35 dons et moustiques ; des pollens d'arbres, de graminés et autres herbes, par exemple l'ambrosie, le dactyle, la fléole, les érables et les peupliers ; des moisissures, par exemple Asuergillus niger 70 08228 -5- 20 34743 et Alternaria. Des exemples d'autres matières antigéniques comprennent des bactéries telles que les pneumocoques, Ha-emophilus per-tussis et d'autres organismes hémophiliques G-ram-négatif s, des bactéries du groupe colibacillaire, typhique, dysentérique et Sal-5 monella et des cocci &ram-négatif s tels que Meningococcus, ainsi que d'autres toxines, toxoïdes et virus. Les principes actifs ou les substances douées d'activité al-lergénique sont extraits de manière bénéfique des particules ou matières provoquant la réaction conformément à des modes opératoi-10 res reconnus pour la formation d'extraits antigéniques. Dans ces modës opératoires, les substances sont mises-en contact avec les liquides d'extraction et on les laisse au repos après le contact. La durée du contact peut varier de quelques heures à quelques jours. Lorsque des allergènes sont extraits, les substances peuvent 15 être dégraissées avec un solvant tel que l'éther, avant la mise en contact, ou bien on peut utiliser des allergènes entiers, non dégraissés. Pour réaliser une extraction plus complète, les matières antigéniques sont mises en contact avec du liquide d'extraction neuf après séparation du premier liquide d'extraction. Après l'ex-20 traction, le liquide d'extraction contenant les principes actifs instables à la chaleur peut être filtré dans des conditions stériles sur un tampon filtrant ou une membrane filtrante. Comme on l'a mentionné dans ce qui précède, le procédé d'obtention de l'extrait liquide final de matière douée d'activité allergénique 25 n'est pas considéré comme étant déterminant vis-à-vis de la présente invention ; toutefois, il est recommandable d'utiliser les techniques convenables d'extraction biochimique pour obtenir la matière première douée d'activité physiologique qui est destinée au procédé de l'invention. 30 En outre, on peut obtenir des préparations semblables à par tir de solutions de toxines ou toxoïdes bactériens, par exemple les solutions qui dérivent des organismes responsables de la diphtérie ou du tétanos. On peut également produire des vaccins à. base de tannate à partir de suspensions de virus, par exemple le virus de 35 la grippe, en vue d'obtenir un vaccin à effet retardé contre la grippe. Naturellement, il est évident que les procédés fondamentaux peuvent donc être utilisés pour tout type d'antigène pour lequel un 70 08228 -6- 20 34743 vaccin du type à action retardée doit être préparé. Le tannate d'aluminium utilisé pour former les substances antigéniques insolubles dans l'eau selon l'invention, à partir de l'extrait liquide, peut être préalablement formé, de préférence 5 comme gel ou suspension, avant l'addition à l'extrait antigénique. Ce tannate d'aluminium préalablement formé se prépare par combinaison d'une source soluble d'aluminium et d'acide tannique. Un gel est facilement préparé, par exemple avec une solution aqueuse d'acétate de sodium, une solution de sulfate (hydraté) de potassium 10 et d'aluminium ; et une solution d'acétate de sodium dans l'acide tannique. En outre, la solution peut contenir jusqu'à 50 gly- cérol. Les proportions de ces solutions, bien qu'elles ne soient pas déterminantes, sont de préférence choisies de manière à donner un rapport de 1'acide tannique à 1'ion aluminium de 1:3• Le gel 15 est ensuite séparé de la phase liquide par centrifugation ou par d'autres moyens de séparation, et il est lavé avec un liquide tel qu'une solution à 0,9 % de chlorure de sodium. Le gel lavé de tannate d'aluminium précipité est mis en suspension dans une solution de chlorure de sodium h. 0,3 % avant son addition à la solution 20 d'extrait antigénique pour former les substances antigéniques insolubles dans l'eau désirées. Le tannate d'aluminium peut aussi être aisément formé en ajoutant directement à l'extrait les réactifs appropriés. Pour former lé tannate d'aluminium dans l'extrait, on ajoute une source 25 soluble convenable d'aluminium et une solution d'acide tannique séparément e.t directement à l'extrait. Des exemples de sourcegèon-venables d'aluminium comprennent l'aluminate de sodium, le sulfate de potassium et dlaluminium, le sulfate d'aluminium* le lactate d'aluminium et le chlorure d'aluminium. On ajoute à l'extrait et 30 à la solution soluble d'aluminium, après les avoir rassemblés, une solution d'acide tannique pour obtenir un rapport de l'acide tannique à l'ion aluminium de 1:3» comme mentionné ci-dessus. On utilise une quantité suffisante de tannate d'aluminium ou de composés engendrant du tannate d'aluminium pour atteindre le 35 rendement maximal en substance antigénique insoluble dans l'eau et à p^u pour isoler/ près complètement la matiere antigenique de l'extrait. De préférence, on ajoute à l'extrait liquide un excès de tannate 70 08228 -7- 20 34743 d'aluminium ou de composés engendrant ce tannate. Un isolement pratiquement complet des matières antigéniques peut être obtenu avec des rapports en poids de l'aluminium à l'azote protéinique d'environ 2:1 à 15:1. On peut utiliser de plus grandes quantités 5 tout en obtenant encore un isolement pratiquement complet,- et on peut au besoin utiliser des quantités plus faibles, en fonction des conditions opératoires particulières.-.-TTfcs . 23.1 11 azote protéinique d'un .extrait s '.exprime couramment; par le nombre d'unités d'azote protéinique, l'unité étant égale à 10 0,00001 mgd'azote/ml sur la base de la teneur en azote protéinique de l'extrait. L'unité d'azote protéinique est couramment utilisée pour exprimer la force d'extraits allergéniqueset on peut donc l'utiliser pour interpréter la force des substances antigéniques insolubles dans l'eau formées selon l'invention. 15 Après que les substances antigéniques insolubles dans l'eau ont été recueillies et lavées, elles sont avantageusement mises en suspension dans un véhicule acceptable du point de vue physiologique qu'il convient d'utiliser comme injectable. Un tel véhicule peut consister en une solution isotonique stérile de chlorure de 20 sodium. De préférence, le véhicule choisi ne doit pas provoquer d'effets secondaires nuisibles, tels que des réactions allergiques secondaires, et il ne doit pas nuire à l'intégrité structurale des substances antigéniques insolubles dans l'eau selon l'invention. Un médicament de constitution appropriée, comprenant au moins 25 une substance antigénique insoluble dans l'eau selon l'invention, incorporée dans un véhicule correct, est avantageusement administré par injection à un patient à un taux qui dépend du traitement prophylactique ou thérapeutique désiré. Lorsque les substances antigéniques sont des allergènes destinés à un traitement d'hyposensi-30 bilisation, les activités initiales sont généralement inférieures à la dose d'entretien finalement désirée qui assure la protection requise. Chez un patient de forte corpulence, on préfère une dose d'entretien comprise entre environ 3000 et 5000 unités d'azote protéinique. Selon la taille et l'âge du patient et la façon dont 35 il réagit aux injections, on fait varier les doses administrées pour obtenir l'effet désiré. De tels médicaments sont habituellement administrés par voie sous-cutanée. 70 08228 -8- 20 34743 D'autres détails de l'invention ressortent des exemples suivants. EXEMPLE 1 5,0 g d'un mélange de pollen de grande et petite Ambrosia, 5 après avoir été dégraissés avec de l'éther anhydre, puis séchés, sont placés dans un flacon de verre et recouvert de 70 ml d'une solution aqueuse tamponnée d'extraction contenant 0,8 fo de chlorure de sodium, 0,5 f° de phénol et des tampons au phosphate de sodium et au phosphate de potassium pour ajuster le pH à 7»0. On laisse 10 ce mélange au repos à la température ambiante (environ 23 °Q) pendant 5 jours, après quoi on verse par décantation la liqueur surnageante et on recouvre le résidu de 30 ml de solution d'extraction tamponnée fraîchement préparé. On laisse ce mélange frais au repos pendant 2 heures à la température ambiante. La seconde solution 15 surnageante d'extraction est versée par décantation et le résidu est jeté. On rassemble les liqueurs surnageantespuis on les filtre sur membrane en vue de les stériliser. On trouve que le volume résultant de 85 ml contient 50.000 unités d'azote protéinique par ml. . _ _ 20 On ajoute 170 ml d'une solution d'aluminate de sodium à 1 fi à l'extrait stérilisé, puis on ajoute une solution à 10 fo d'acide tannique jusqu'à ce qu'on n'observe plus d'insolubilisation de substance antigénique. On sépare la substance antigénique insoluble dans l'eau par décantation et on la lave 5 fois avec une solution 25 de chlorure de sodium. Le nombre d'unités d*azot^fcrotéinique de la substance antigénique insoluble dans l'eau montre un taux de récupération de 100 i» de l'antigène sur la base des unités d'azote protéinique des extraits rassemblés stérilisés. La substance antigénique insoluble dans l'eau est mise en 30 suspension dans une solution de chlorure de sodium, le volume final de cette suspension étant ajusté à un volume égal au volume initial de l'extrait tamponné. TOTBMPLE 2 Dans cet exemple, on suit à peu près le même mode opératoire 35 que dans l'exemple 1, à la différence qu'on utilise.de la poussière ménagère à la place du pollen d.'Ambrosia. La poussière ménagère est placée directement dans la solution d'extraction sans être dégrais- 70 08228 -9- 20 34743 sée. La substance antigénique insoluble dans l'eau résultante a un nombre d'unités d'azote protéinique de 40.000, ce qui représente un taux de récupération de 100 fi> de l'antigène. Cette substance antigénique insoluble dans l'eau est ensuite traitée comme décrit 5 dans 1'exemple 1. EXEMPLE ? Le mode opératoire de cet exemple est pratiquement le même que celui de l'exemple t, à la différence qu'on utilise un mélange de pollens de graminées à la place du pollen d'Ambrosia. Le pour-10 centage de récupération et la forme de la substance antigénique insoluble dans l'eau correspondent à ce que l'on obtient dans 1'exemple 1. EXEMPLE 4 On place 5 g de pollen d'Ambrosia dans un flacon et on ajoute 15 un volume de solution d'extraction juste suffisant pour recouvrir le pollen. La solution d'extraction consiste en une solution aqueuse à 50 fi de pyridine, à laquelle on ajoute un tampon au phosphate pour ajuster le pH à 7>0. On laisse ce mélange s'extraire, en agi- ijÇTnp^t tant de temps en / , pendant 2 jours à la température ambiante. 20 La masse du résidu pollinique est,ensuite isolée par filtration, l'extrait est filtré sur un papier-filtre normal, puis il est filtré sur membrane en vue de sa stérilisation. On rassemble un volume de 100ml de l'extrait aqueux de pyridine et un volume de 160 ml d'une solution d'aluminate de sodium à 1 fi et on ajoute une solu-25 tion à 10 fi d'acide tannique jusqu'à ce qu'on n'observe plus d'in-solubilisation de la substance antigénique. On sépare la substance antigénique insoluble dans l'eau par filtration et on la lave 5 fois avec une solution de chlorure de sodium. Le nombre d'unités d'azote protéinique de cette substance antigénique insoluble dans 30 l'eau indique un taux de récupération de 100 fi de l'antigène sur la base du nombre d'unités d'azote protéinique de l'extrait stérilisé» La substance antigénique insoluble dans l'eau est mise en suspension dans une solution de chlorure de sodium, le volume final de la suspension étant ajusté à un volume égal au volume ini-35 tial de la solution stérilisée d'extrait. 70 08228 -10- 20 34743 EXEMPLE 5 On place 7»5 g de pollen de fléole des prés dans un flacon et on recouvre le pollen de 100 ml d'une solution d'extraction au chlorure de sodium tamponnée au"tris"[NaCl: 5 g ; azide de sodium : 5 1 g ; tris-(hydroxyméthyl)aminométhane:5 millimdles ; HC1:1,22 mil-limole ; eau, quantité suffisante pour 1000 ml]. On laisse ce mélange au repos pendant 5 jours en agitant âe temps en tamps, à la température ambiante. Ensuite, la solution d'extraction est séparée du résidu de pollen par filtration et dialysée vis-à-vis de 10 glycérol aqueux en trois étapes, jusqu'à ce qu'on obtienne une concentration finale en glycérol de 50 fi. La solution finale de glycérol contient 423 (J.g d'azote protéinique par ml. On mélange 10 ml de la solution de glycérol avec 250 mg de gel de tannate d'aluminium contenant 11,4 mg d'aluminium. Le gel 15 de tannate d'aluminium est préparé en mélangeant les ingrédients suivants' : mélange de glycérol et d'eau à 50 fi : 10 volumes ; acé- et d'aluminium tate de sodium à 2 fi, sulfate (hydrate) de potassium/a 5 fi '• 4 volumes et acétate de sodium à 2 fi, acide tannique à 5 fi ' 2 volumes. Le gel de tannate d'aluminium est centrifugé et lavé trois 20 fois avec du chlorure de sodium à 0,9 ^ et le produit final est mis en suspension dans du chlorure de sodium à 0,9 fi. On laisse le mélange d'extrait et de gel de tannate d'aluminium au repos pendant 1 jour à la température ambiante et on le centrifuge pour séparer de la phase liquide la substance antigénique insoluble dans l'eau. 25 La substance antigénique insoluble dans l'eau est lavée 4 fois avec une solution de chlorure de sodium et remise en suspension dans du chlorure de sodium. On trouve que la substance antigénique insoluble dans l'eau contient pratiquement 10.0.$ de l'azote protéinique initial présent dans la solution d'extraction au glycérol. 30 EXEMPLE 6 On mélange un volume de 10 ml de la solution de glycérol contenant du pollen de fléole, préparée dans l'exemple 5,avec 4 ml d'une solution aqueuse à 5 fi de sulfate de potassium et d'aluminium contenant de l'acétate dés sodium à 2 fi et 2 ml d'une solution aqueuse 35 à 5 fi d'acide tannique et d'une solution d'acétate de sodium à 5 fi-On laisse ensuite le mélange au repos pendant 1 jour. Il se forme une substance antigénique insoluble dans l'eau qu'on recueille, 70 08228 20 34743 qu'on lave comme décrit ci-dessus et dont on détermine la teneur en azote protéinique.' La substance antigénique insoluble dans l'eau contient pratiquement 100 % de l'azote initial disponible dans l'extrait de glycérol. 5 EXEMPLE 7 Cinquante cinq cobayes femelles vierges du type albinos.de race mixte, pesant chacun 250 à 275 g» sont utilisés pour mettre à l'épreuve une préparation antigénique insoluble dans l'eau à base de pollen d'Ambrosia, obtenue conformément à l'exemple 1. La 10 méthode d'estimation a été décrite par Gordon et Mansmann, "J. Allergy" %6 » 239-248, 1965. On injecte une faible dose unique de 100 ng d'azote protéinique de matière antigénique dans la nuque de chaque cobaye. On traite vingt cobayes par injection de substance antigénique insoluble dans l'eau à base de pollen d'Ambro-15 sia dans une solution de chlorure de sodium, et on traite vingt-cinq cobayes avec un extrait d'Ambrosia obtenu par extraction à la pyridine et précipitation à l'alun. Chaque- animal est utilisé une seule fois. 9 jours après l'injection, on soumet la moitié des animaux à une cuti-réaction et 15 jours après l'injection, on sou-20 met l'autre moitié des animaux à une cuti-réaction. Chaque animal est soumis à la cuti-réaction par voie intradermique, avec 10 et 100p,g d'azote protéinique d'un extrait aqueux d'Ambrosia préparé pratiquement comme décrit dans la première partie de l'exemple 1. Chaque endroit de la peau soumise à l'essai est observé et on me-25 sure en mm les diamètres de la papule formée, 4» 24 et 48 heures après la cuti-réaction. On effectue des biopsies en vue de l'estimation physiologique. Dix animaux témoins non immunisés sont soumis au test de la même manière. Quatre heures après la cuti-réaction, on observe que les ani-30 maux qui ont reçu la substance antigénique insoluble dans l'eau présentent des zones de réaction avec formation d'une papule dont le diamètre est en moyenne de 11,4 mm et on constate que les animaux ayant reçu l'antigène extrait à la pyridine et précipité à l'alun présentent des zones de réaction avec formation d'une papu-35 le ayant un diamètre moyen de 11,5 mm, pour une application de 100 [ig. En ce qui concerne les cuti-réactions à 10 p.g, on observe que les animaux ayant" reçu la substance antigénique- insoluble dans l'eau présentent des zones de réaction avec formation d'une papule 70 08228 -12- 20 34743 ayant un diamètre moyen de 9>4 mm et que les animaux ayant reçu l'antigène extrait à la pyridine et précipité à l'alun présentent des zones de réaction avec formation d'une papule ayant un diamètre moyen de 8,8 mm., en combinant les résultats à 9 et 15 jours. 5 Toutefois, 15 jours après les injections, on constate que les animaux ayant reçu la substance antigénique insoluble dans l'eau présentent des zones de réaction avec formation d'une papule ayant un diamètre moyen de 11,7 mm au taux de 10 p.g, tandis que les animaux ayant reçu l'antigène extrait à la pyridine et, précipité à 10 l'alun présentent des zones de réaction avec formation d'une papule ayant un diamètre moyen de 7»82 mm. 70 08228 -13- 20 34743 KEVmCTCATIOllB 1. Procédé de préparation d'une substance antigénique insoluble dans l'eau, caractérisé par le fait qu'ii consiste à rassembler un extrait antigénique avec une matière choisie entre un tan- 5 nate d'aluminium préalablement formé et un tannate d'aluminium formé in situ pour obtenir une substance antigénique insoluble dans l'eau, et à récupérer la substance antigénique insoluble dans l'eau. 2. Substance antigénique insoluble dans l'eau, caractérisée Bar revendication 1. 10 le fait qu'elle est obtenue au moyen du procédé suivant la / 3. Agent antigénique à effet retardé, comprenant une substance antigénique insoluble dans l'eau préparée au moyen du procédé de la revendication 1, et un.véhicule acceptable du point de vue physiologique, qui convient pour cette substance. 15 4. Procédé suivant la revendication 1, caractérisé par le fait que le tannate d'aluminium préalablement formé est préparé en combinant une source soluble d'aluminium avec de l'acide tanni- ^ue ' par le fait que 5. Procédé suivant la revendication 4» caractérisé/la source 20 soluble d'aluminium est l'almrn*nate de sodium, le sulfate de potassium et d'aluminium, le sulfate d'aluminium, le lactate d'aluminairîx. ou le chlorure d'aluminium. ]_e fait que 6. Procédé suivant la revendication 1,caractérisé/ le tannate d'aluminium formé in situ est préparé en combinant séparément avec 25 l'extrait liquide une source soluble d'aluminium et de l'acide tannique. 7. Procédé suivant la revendication 6, caractérisé par le fait que la source soluble d'aluminium est l'aluminate de sodium, le sulfate de potassium et d'aluminium, le sulfate d'aluminium, le 30 lactate d'aluminium ou le chlorure d'aluminium. 8. Procédé suivant la revendication 1, caractérisé par le fait que l'extrait liquide est préparé avec une solution aqueuse de pyridine.