FR 2044750 A1 19710226 FR 7015655 A 19700429 70 15655 1 2044750 Les recherches concernant les procédés de lutte biologique ont pris de plus en plus d'importance au cours de ces dernières années .11 est nécessaire de remplacer les procédés établis, impliquant l'utilisation de composés chimiques ésotériques à 5 résidus gênants et durables , comme décrit dans l'ouvrage de Rachel Carson "Silent Spring" „Un autre but de la lutte biologique est de fournir des solutions économiquement applicables à certains problèmes tels que dommages provoqués par Fomes apposus , champignon pathogène attaquant de nombreuses espèces -1-0 d arbres des fôrets . Lors des recherches effectuées sur les procédés de lutte biologique, on a souvent tenté de manipuler la population microbienne de la rhizosphère et autres,constituants du milieu ex -15 terne des plantes , particulièrement dans l.e sol „ La plupart de ces tentatives échouèrent souvent à cause de l'extrême diversité des facteurs chimiques at biologiques présents dans ce système, ayant pour résultat un grand pouvoir "tampon" » Un certain nombre de cas de succès notables ont été obtenus comme, par exeni-20 pie, dans le cas de la lutte contre la pourriture de la racine de coton (Phymatotrichum ), la pourriture de la racine du blé (Ophobiolus) ,1a gale de la pomme de terre (Streptomyces) , la fusariose du haricot , la pourriture de l'arachide et une pourriture (Fomes) de la racine de l'arbre à caoutchouc de Malai -25 sie. Dans le présent mémoire on appelle commensal, un microorganisme surtout un microorganisme vivant sur, dans ou avec un autre organisme, l'hôte , mort ou vivant, et qui n'est pas un parasite des propriétés de vàleur de cet hôte ni affecté par 30 cet h'ôte . Le commensal immunise 1 ' h'ote dans le sens habituel qui lui donne une résistance aux organismes nuisibles . La Demanderesse a conçu une nouvelle voie de lutte biologique , à savoir l'utilisation de conusensaux microbiens immunisants , qui a été mise en pratique en culture , et dont l'ef-35 ficacité a été démontrée sur la base des critères classiques de relations de cause à effet en microbiologie et domaines apparentés, les postulats de Koch . Les commensaux immunisants-sont des microorganismes qui peuvent se trouver dans le milieu interne par opposition au mi-40 lieu externe ou au voisinage , comme le sol par exemple, des végétaux et animaux supérieurs ou autres substrats, sans provoquer de dommages .L'existence de ces microorganismes fournit à leur hôte une protection contre certains organismes nuisibles . Parmi les brevets et demandes de brevets antérieurs concer-45 nant ce domaine et des domaines voisins ,on peut citer (1) les brevets des Etats-Unis d'Amérique N°3 255 095 et 3 424 655 de Jacques L. Ricard ,(2) la demande de brevet des Etats-Unis d'Amérique sous le titre "Wood Protection Process and Antibiotic"(Procédé de protec 70 15655 2044750 tion du bois et antibiotique pour sa mise en oeuvre) par Jacques L. Ricard et Walter B. Bollen, déposée par la Société Research Corporation. of New York City,, N.Y., pour le compte,de Oregon Sfcate Board of Higher Education, en janvier 1967, (3) la demande de bre-5 vet aux Etats-Unis d'Amérique pour "Immunizing Commensals Utiliza-tion Method" (Procédé d'utilisation des commensaux immunisants), déposée par Jacques L. Ricard en juin 1967, (4) la demande de brevet français pour "Procédé d'obtention de commensaux microbiens et leur utilisation pour la lutte contre les microbes, insectes et au-10- très organismes nuisibles aux plantes, aux animaux et à 1'homme, ' leurs produits, composants et dérivés3 ainsi que les substrats ; synthétiques"9 Ie 119 895, (5) la demande de brevet aux Etats-Unis d'Amérique sous le titre "Exfcruded Barlc Pellsfcs" par Jacques L» ; Ricard et Raymond A„ Curï'ier 5 déposé® le 10 février 1969® j 15 La présente invention décrit des perfectionnements, par rap- : port à ces demandes de brevets antérieures et notamment un procédé et un dispositif pour l'implantation d'autres microorganismes que : Scytalidum sp» Ces derniers commensaux immunisants présentent certains inconvénientsp en particulier un® lenteur de croissance, une 20 variation de,leurs activités antagonistes et un manque d'efficacité contre les insectes, qui peuvent être surmontés par l'utilisa- | • tion d'autres microorganismes. L'invention a pour but. de remédier ■ à ces inconvénients ét de fournir un procédé et un dispositif pour 1 agir de manière efficace contre les organismes nuisibles. . ! 25 L'invention a'pour objet un procédé pour lutter contre les' ' organismes nuisibles dans ou sur un substrat à protéger, caracté-risé en ce qu'on introduit dans ou sur ledit substrat un commensal microbien ayant un effet curâtif et/ou préventif sur l'action du- ; dit organisme nuisible. ■ ! 30 Ce commensal microbien ayant un effet curâtif et/ou préventif peut être choisi parmi les espèces suivantes î Trichoderma album 1 (=T„ polysporum), Trichoderma lignorum (=T„ viride). Gliocladium j roseum, Scytalidium sp, Ceratocystis piceae, Pénicillium rubrum. '! P." vermiculatum, Coryne sarcoides, Aspergillus .sp, Chaetomium sp, 1 35 Fusarium sp, Cephalosporium sp, Geotrichum sp, Leptosphaeria. les mycorhizes, Boletus bovinus, Retinocyclus abietis. P.ythium sp, Helminthosporium sativum„ Rhinotrichum macrosporum, Trichotheclum roseum, Calcarisporium parasiticum, Gonatobotrys simplex. Phyto- S cle rot i um rolfsii, Chae t omium 70 15655 3. 2044750 Fusarium roseum sp. eerealis, Cryptosporiopsis. Cephalosporium charticola, Verticillium, Pullularia pullulans, Pullularia lilaci-num, Pythium debaryanum, Tuberculina maxima; Cicinnobolus cesati. Pénicillium patulum. ?. njgçricans, Ceratocystis pluriannulata. 5 Pénicillium crustaceum, Mucor sp, Mortierella sp, Melanconium sp, Monilia sitophila, Rhizopus nigricans,Pyronema sp, Didymella exitialjs, Spicaria sp, Phoiaa sp, Mucor ramannianus, Hypoxylon punctualatum, Suillus granulatus, Russula» Beauveria bassiana. Paecilomyces farinosus, Lentinus lepideus, Ceratocystis fimbrjata. 10 les actinomycetes tels que Micromonospora globosa, Acylindrospo-rus et Streptomyces sp, les bactéries telles que Serratia marces-cens, Bacillus subtilis, B. polymyxa, Erwinia sp, -Pseudornonas sp et Achromobacteria sp. On peut améliorer le procédé selon l'invention en introdui-15 sant en outjfe un ou plusieurs des constituants suivants, à savoir: (a) un microorganisme dont les métabolites ou autres substances. physiologiquement similaires ont pour effet de provoquer une libération d'antibiotique dans au moins un microorganisme prédéterminé (b) un microorganisme agissant en synergie, essentiellement par s 20 transformation ou élimination de substances gênant le développe- : ment d'un commensal microbien utile, (c) un métabolite microbien capable de stimuler une activité antagoniste chez un ou plusieurs' commensaux microbiens, (d) un composé chimique capable de stimuler une activité antago-25 ' niste chez un ou plusieurs commensaux microbiens. Lrinvention a également pour objet un procédé de préparation de substances antibiotiques ou autres métabolites utiles pour la-mise en oeuvre du procédé de lutte décrit ci-dessus et concerne également les substances antibiotiques ou autres métabolites uti-30 les obtenus par ce procédé. L'invention vise aussi un dispositif d'inoculation pour faciliter la mise en oeuvre du procédé selon l'invention dans des conditions de culture, ce dispositif comprenant une pièce allongée en bois, en matière plastique ou autre matière appropriée, conçue 35 pour être enfoncée dans le' substrat à protéger et qui est imprégnée à l'aide du commensal microbien désiré ayant un effet curatif et/ou préventif vis-à-vis de l'action d'un microorganisme nuisible On décrira l'invention en se référant au dessin annexé, donné uniquement à titre d'exemple, dans lequel ; 7Q 15655 4. 2044750 - la Fig. 1 représente la préparation d'une substance et d'un' dispositif d'inoculation; et» • - les Fig. 2, 3 et 4 sont des vues latérales en perspective ; de divers modes de réalisation d'un dispositif (fléchette) d'inoeu- 5 lation selon l'invention. Le procédé de base de préparation des fléchettes d'inoculation' est le suivant : EXEMPLE 1. . ; Fléchettes d'inoculation (pour poteaux en sapin infectés par 10 • Poria carbonica, au stade de début de la décomposition, par exemple). On peut les préparer à partir de chevilles de bouleau. On peut choisir cette substance à cause de sa haute teneur en xylan - source d'énergie préférée de Scytalidium sp. - et parce qu'elle est plus dure que les poteaux de sapin. La dureté est nécessaire 15 pour la technique d'inoculation rapide décrite. Les stades principaux de la technique de culture sont représentés à la Fig. 1. On fait croître une culture 1 de Scytalidiua sp, fraîchement isolée du bois de coeur d'un poteau en sapin, sur gélose à 2,5 % d'extrait de malt. Les souches fortement antagonis-: 20 tes choisies sont caractérisées par la formation d'un pigment jau-ne hydrosoluble et le pouvoir de croître sur des colonies conçur- • rentes de Poria carbonica et Fomes aanosus. Pour assurer la pureté et l'homogénéité de la cultures on transfère un seul hyphe jaune de la colonie sur une pente 5 de gélose à Ieextrait de malt et on le 25 fait incuber environ deux semaines à température ambiante. Lorsque la gélose est recouverte de mycélium, on la casse aseptiquement, à l'aide d'une spatule en acier inoxydable ou d'un instrument similaire, en plusieurs fragments qu'on transfère sur environ 150' ml de bouillon de malt stérile h 2 % dans un flacon de 30 300'ml ou dans un Erlenmeyer 7 de 250 ml £n laisse la culture croître pendant environ trois semaines sans secouer, puis on la. transfère dans environ 1000 ml de bouillon de malt frais dans un ballon de fermentation de Fernbach de 2000 al ou dans un Erlenrreyer 9 de 2000 ml9 et on laisse incuber pendant environ trois semaines 35 à température ambiante, sans secouers On transfère ensuite le mycélium dans un mélangeur et on le met à en suspension dans environ 300 al de bouillon de malt à 2 % frais et stérile. On broie le mycélium juste suffisamment pour rompre 1s, masse mycélien-ne en fragments de moins de 1 cm de longueur» On dilue la suspen- 70 15655 5. 2044750 sion au 1/10 à l'aide de bouillon de malt stérile frais, et on verse sur des sections-stériles de chevilles de bouleau (11)• d1environ 100 mm de long et 5 mm de diamètre. On recouvre complètement ces sections par une suspension de souche FY de Scytalidium sp, et on 5 laisse incuber à température ambiante pendant trois semaines. Puis on élimine le bouillon, en le versante, et on fait incuber les sections pendant encore quatre à six semaines, ou jusqu'à ce que le bois se soit complètement imprégné d'hyphes de Scytalidium sp. (souche FY). . 10 On laisse évaporer l'humidité présente dans les récipients, car les hyphes semblent suivre les régions.très humides au sein de chaque cheville. Au fur et à mesure'que le séchage .se poursuit, le pigment jaune typique des souches activés de Scytalidium sp. apparaît sur le bois, ce qui indique que la section de cheville a été 15 bien imprégnée par la moisissure et que l'antibiotique a été libéré. Bien que la substance antibiotique puisse être incolore, son. apparition semble coïncider avec la libération de pigment jaune hydrosoluble de la part du mycélium. Après incubation, on soumet chaque section à des essais en 20 prélevant aseptiquement un copeau d'environ 1 cm de long, 0,3 cm de large et de 0,'1 à 0,2 cm d'épaisseur. On place le copeau à la périphérie d'une plaque de gélose à l'extrait de malt. Au centre de la même plaque, on place un inoculum de P. carbonica, sous forme d'un cube de gélose d'environ 0,5 cm de côté recouvert de mycélium du 25 'champignon de moisissure du bois. Si le copeau est efficacement imprégné de souche FY de Scytalidium sp, une colonie de ce champignon s'étale sur la gélose autour du copeau et présente le pigment jaune typique ainsi que les .propriétés antagonistes typiques vis-à-vis de P. carbonica. Les sections satisfaisantes sont ensuite séchées sous 50 vide à une température ne dépassant pas 38°C, jusqu'à poids constant. On place 1'inoculum dans un récipient stérile, par exemple un. tube en matière plastique, pour l'amener au point d'inoculation. Les sections 13 des chevilles de bouleau sont renforcées à l'une de leurs extrémités par une tête de flèche 15 en acier inoxydable. 35 On lance les fléchettes de bouleau dans les poteaux,- à l'aide, par exemple, d'un appareil de projection "Hilti DX 100 L". EXEMPLE 2. Fléchette complexe pour inoculation de plusieurs microorganismes. 70 15655 6. 2044750 la fléchette se compose de deux parties : l'une, 21, est une ; section de cheville telle que décrite à l'exemple 1 présentant des ■ perforations 27 d'environ 2 mm de diamètre, écartées les unes des autres d'environ 1 cm sur toute la longueur de la flèche. le centre 5 la cheville est évidé, formant un trou 25 d'environ 3 à 4 mm de ' diamètre » L'autre partie 25 est une autre section de cheville plus ; petite ayant des dimensions telles qu'elle s'encastre dans le trou 23 dé la partie 21. On manipule les deux parties de la même manière que la cheville en bois.utilisée pour la fléchette courante de 1'- : 10 exemple 1, à cela près qu'on utilise des champignons différents dans les deux parties. Par exemple, on peut cultiver Gliocladium rosëum dans la partie 21 tandis qu'on cultive Trichoderma album ; dans la partie 25. EXEMPLE 3 o ' ^ 15 Fléchette, complexe p,our inoculation de plusieurs microorganis- "mes. _ • Ce type de fléchette est composé d'une partie semblable à la partie 21 de l'exemple 2 précédent, mais le trou 23 est rempli de sciure de bois imprégnée par un ou plusieurs microorganismes. Par 20 exemples Gliocladium roseum peut se trouver dans la partie creusée : de la cheville et Ceratocystis picea peut être cultivé dans la sciu re de bois. La partie constituée'par de la sciure de bois est préparée comme suit : on humidifie de la sciure de bois jusqu'à saturation à 25 l'aide d'un bouillon de xaalt à 2,5 % et on l'introduit dans un Er-lenmeyer en une quantité égale à environ la moitié de la capacité du récipient. C'est ainsi, par exemple, que dans un Erlenmeyer de 3 250 cm , on introduit un volume de sciure de bois humidifiée égal % 3 à 125 cm . On stérilise le ballon par tyndallisation, on l'inocule 30 et on le fait incuber à température ambiante (environ 25°C). Une , fois qu'elle est imprégnée par les microorganismes inoculés, on sèche la sciure de bois à une température inférieure à 25°C, sous vide, et on la tasse doucement dans le trou de la partie creuse. Puis on"manie la fléchette de la même manière qu'à l'exemple 1. 35 EXEMPLE 4o ; .Fléchette complexe pour activer l'antagonisme du microorganisme introduite La fléchette qui est représentée à la Fig. 3 est semblable à celle de l'exemple- 2g mais la partie creuse 21 de la Fig. 2 est 70 15655 7 2044750 remplacée par une mince section 31 de bois de placage enveloppant une partie 33 qui peut être semblable à la partie 25 de l'exemple 2. La section en bois de placage est imprégnée de Poria carbonica. par exemple comme décrit à l'exemple 1, puis est chauffée dans un cou-5 rant de vapeur d'eau, à la pression atmosphérique, avant d'être sé-chée. On manie la partie 33 de la façon habituelle et on l'utilise pour la culture de souche FY de Scytalidium sp. La bande 31 en bois de placage est ensuite enroulée autour de la pièce. 33, est collée à l'extrémité conique à.l'aide d'un adhésif à la caséine ou au soja 10 et est mise .sous forme d'une fléchette 35 composite, comme décrit à l'exemple 1. - La section en bois de placage peut être imprégnée, en plus ou au lieu du mycélium fongique, par des métabolites ou dérivés chimiques. fongiques appropriés. 15 EXKMPLE 5. Fléchette complexe pour l'introduction de plusieurs champignons dans le substrat, en des points différents. Le procédé est fondamentalement celui décrit à l'exemple 2, mais la partie creuse 41 est séparée en deux constituants 41 a (en 1 20 matière plastique)-et 41b (en bois). Une partie au moins est munie des perforations habituelles. On utilise la partie 41b pour cultiver un microorganisme synergique, par exemple Poria vaporaria, tandis qu'une partie 43 formant noyau doit être imprégnée par un commensal immunisant, tel que Trichoderma album. On applique la flé-25 chette de telle manière que le commensal immunisant peut se déve-. lopper dans le bois de coeur tandis que le microorgahisme synergique croît dans la portion externe du poteau9 éliminant les substances toxiques. EXEMPLE 6. 30 Balle pour inoculation. On découpe des chevilles en bois, préparées par le procédé de l'exemple 1', en sections d'environ 30 mm de long, après séchage. On les monte ensuite dans des douilles à balles courantes, en utilisant une douille pour tête de flèche courante maintenue sur la che-35 ville en bois par une colje époxydique ou autre colle similaire. Les balles d'inoculation sont particulièrement utiles pour l'inoculation d'arbres adultes. 70 15655 8. 2044750 EXEMPLE 7. , ' Mini-fléchettes. On prépare ces flèches d'inoculation par le procédé de l.1 exemple 1, en utilisant du bois mesurant environ 2,0 x 50 nrnu Une fois 5 que les processus de culture et de séchage sont terminés, on découpe le bois en morceaux de 5 à 10 mm de long. • ■ On peut renforcer les mini-fléchettes par une pointe métallique ou un manchon métallique perforé suivant le dispositif décrit aux exemples- précédents» 10 ■ On peut les utiliser pour l'inoculation de jeunes arbres de trois à cinq ans, par exemple dans la région du collet de la racine. EXEMPLE 8. ^ Produits à inoculer en écorce extradée. On mélange de l'écorce finement broyée avec des spores séchés 15 L'invention a initialement été mise en oeuvre en utilisant Scytalidium sp0S souche FY. Ge champignon a, des caractéristiques principales désirables tels que 1® pouvoir de croître dans le bois 25 de coeur du sapin, de détruire divers basidiomycètes de décomposition du bois, de libérer'une substance antibiotique stable dans le substrat lorsqu'il pousse dans certaines conditions . Cependant, il présente plusieurs inconvénients ? par* exemple une vitesse de croissance relativement lente et un manque de constance dans la libéra-30 tion du métabolite antibiotique. Ce commensal n'a pas non plus de valeur connue pour protéger le substrat contre les insectes. L'invention a pour but de surmonter ces inconvénients : (1) en utilisant d'autres microorganismes en plus de5 au lieu de ou en association avec Scytalidium» .souche FYC L'intention a également .pour but 35 d'améliorer la vitessè de libération de !..6antibiotique par ÏY. L'invention a aussi pour but de réaliser iks action en synergie par d'autres microorganismes pour l'élimination ou la transformation de substances gênant la croissance des commensaux immunisants. La manque de constance dans la libération, de 1 Antibiotique et autres 70 15655 9. 2044750 substances présentant une activité d'inhibition ou de destruction des basidiomycètes a été observée par la demanderesse! au début de l'étude effectuée sur Scytalidium sps peu après qu'il ait été isolé du bois de pin en 1964, dans l'Oregon, Etats-Unis d'Amérique, alors 5 qu'on faisait pousser le champignon dans des conditions de laboratoire courantes. Les critères principaux du programme d'amélioration systématique effectué à l'aide du -dispositif de détection des mutants micro* biens (mutector) et qui- a eu pour résultat l'obtention de la souche 10 FY, ont été d'obtenir des résultats constants dans la formation de la substance antibiotique ainsi qu'une production suffisante de cette substance. Bien qu'elle soit très amélioréer-par rapport à "l'espèce -sauvage, la souche FY ne produit pas de substances antibiotiques lorsqu'elle est cultivée dans les conditions courantes du 15 laboratoire, pendant plusieurs semaines. Cette caractéristique n'est pas particulière à Scytalidium 'sp, mais a- déjà été décrite plusieurs fois dans la littérature technique "sous le npm de "sénescence" et expressions apparentées. Cependant, la demanderesse a découvert qu'on pouvait obtenir la constan-20 ce.déâirée dans la libération de l'antibiotique dans la souche FY améliorée par exposition, continue ou intermittente, à des métabolites, peut-être exclusivement volatils, provenant de certains basidibmycètes. La sénescence est particulièrement évidente■chez FY car la li-25 bération.de substances antibiotiques est associée à l'existence d'un pigment jaune hydrosoluble. Bien que le pigment jaune -lui-même ; ne soit pas actif, son apparition coïncide toujours avec une activité antagoniste de la part de FY. Les' métabolites de Poria carbonica sont particulièrement effi-30 caçes pour provoquer la libération d'antibiotique à partir de FY. F. annosus est particulièrement efficace, tandis que Poria vapora-rîa est très s&awais à cet égard. Les implications de cette caractéristique sont considérables en pratique et indiquent qu'on ne peut compter sur FY à titre préventif. - 35 Voici des exemples de conditions dans lesquelles FY-est inuti le : 1 - FY est introduit dans un arbre ou un poteau à.partir d'inducteurs, et se développe ensuite sans libérer d'antibiotique.--'On ne peut s'attendre à aucune protection résiduelle appréciable une 70 15655 10. 2044750 fois que FY a terminé sa croissance dans le substrat et s'autolyse ou présente une vie ralentie. : 2 - FY est introduit dans un arbre ou un poteau dans lequel des f-inducteurs ne sont présents que-dans une petite partie du substrat. 5 II y aura libération d l'antibiotique dans la zone dans laquelle les inducteurs sont présents,, mais non à une distance de quelques centimètres » 3 - FY est introduit dans un arbre ou un poteau déjà infecté par . un champignon de décomposition, du bois tel que Poria vaporaria qui 10 . ne fonctionne pas comme inducteur. FY ne tuera pas le champignon provoquant la décomposition. ; Cependants si l'agent inoculant contient plusieurs commensaux immunisants tels que FY et Trichoderma album» souche S-5, une induction continue est maintenue et il y a libération de substances 15 antibiotiques sur toute la zone dans laquelle les organismes inoculés s'établissent. Pour certaines indications, T. album est préférable à FY à cause de sa plus grande vitesse de croissance, en sus de la constance de son action antagoniste. Cependant, FY n'exerce ; pratiquement pas d'effet nuisible sur le péridium tandis que cer- -20 taines souches de Trichoderma provoquent dans le bois une déeompo- ; sition légère, une sorte de pourriture molle. Comme les spécialistes de la technique peuvent s'en rendre ' compte facilement, le même effet de libération d1 antibiotique peut : être provoqué chez FY par des métabolites fongiques isolés du mycé-25 lium ou par Poria carbonica ou composés chimiques similaires sépa- ' rés par synthèse de ces systèmes vivants. Dans certaines applications, comprenant la culture de FY comme producteur d'antibiotique dans des conditions artificielles, ces dernières possibilités peu- . vent être préférables à l'utilisation d'une substance non purifiée 30 provoquant la libération d'antibiotique comme, par exemple» du mycélium total de P. carbonica tué à chaud. On peut également prévoir des précurseurs d'antibiotiques dans la substance à inoculer ou dans le milieu de culture, dans les installations de préparation d'antibiotiques» Dans les fléchettes d1-35 inoculation, les précurseurs peuvent être fournis par imprégnation de la partie 21 des fléchettes décrites aux exemples 2 et 3o. La na-ture des précurseurs est aisément identifiable une fois que la composition et la structure de la substance antibiotique sont connues. Les études d'identification de la substance antibiotique (et, en 70 15655 2044750 conséquence, de ses précurseurs) sont considérablement simplifiées ; dans plusieurs cas car elle précipite dans des gels tels que les milieux de culture à la gélose, en formant des cristaux. On peut séparer ces matières solides du milieu à la gélose, parfois sans 5 autre séparation par chromatographie gazeuse ou autre procédé à cet effet. Dans divers cas, il peut être préférable de perfectionner certaines caractéristiques d'un commensal immunisant, par exemple la vitesse de croissance, .en ajoutant des substances chimiques dans la 10 fléchette ou la balle d'inoculation plutôt qu'en utilisant des espèces microbiennes différentes. Cela est facilement réalisable avec les fléchettes décrites à l'exemple 2 ou 3 par exemple, en imprégnant la-partie 21 avec des oligoéléments sous la forme de sels ou •de chélates, comprenant du zinc, du manganèse, du fer, du cuivre, 15 du chlore; des substances macro nutritives peuvent aussi être uti-. lisées, telles que l'azote sous forme-d'urée par exemple, le phosphore soûs forme de phosphates par exemple, ou le potassium. L'utilisation de. substances macro nutritives doit être soumise à des essais soigneux, car elle affectera parfois les besoins en énergie 20 du.commensal immunisant, le faisant attaquer les constituants carbonés du substrat d'une manière plus active, avec risque d'endommager la paroi du péridium. Certains commensaux immunisants (= Cl) sont sensibles à l'arse nie, au cuivre résiduels ou autres composés présents dans le bois 25 inoculé. Dans ces conditions, il est avantageux d'introduire en même temps que les commensaux immunisants, des microorganismes agissant en synergie tels que Poria vaporaria, Coniophora cerebella et Mucôr sp. qui sont -capables de surmonter l'effet inhibant de ces composés toxiques, mais que la CI empêche facilement d'endommager 30 le substrat d'une manière sensible. Il faut tenir compte de la croissance relative du CI et du microorganisme agissant en synergie ainsi que des sites d'inoculation relatifs» Une illustration courante de cette association pouvant être obtenue avec les fléchettes de l'exemple 4. est l'introduction simultanée de Poria vaporaria •' 35 dans le bois de sève et de Trichoderma album dans le bois de coeur d'un poteau en pin en service, traité par des sels de Boliden. On peut, dans un tel poteau, obtenir une protection des sections in- -ternes du poteau avec T» album. Cependant, les sels résiduels du traitement chimique peuvent gêner la croissance de cet organisme. 70 15655 12. 2044750 L'action préliminaire effectuée par P. vaporaria élimine cet obs- ; tacle en grande partie, permettant l'action ultérieure du CI. On sait que certains insectes destructeurs du bois sont re- ! poussés ou tués par divers microorganismes habitant le bois. Par { '5 exemple, on sait que les termites souterrains, Reticulitermes fla-vipies, R„ virginicus et R. hageni sont capables d'attaquer la cellulose d'un substrat exempt de champignons de décomposition, mais non lorsqu'il y a présence de cinnamate de méthyle, métabolite libéré par Lentinus lepideus» En conséquences pour certaines applica* 10 tiens, il est désirable d'introduire ces champignons individuellement,. comme dans le cas de Céphalosporium sp. pour le traitement préventif des arbres vivants contre des organismes pathogènes tels que Fomes annosus et des insectes tels qu' Hyloicus pinastri ou . Diprion pini. Dans d'autres.cas dans lesquels les termites peuvent 15 représenter un risque, une inoculation double avec Lentinus sp® et Scytalidium sp» (souche FY) pourrait être désirable, le premier champignon servant à libérer des substance s repoussant les termites et le dernier à empêcher l'attaque du bois par le premier organisme. Là encore, la fléchette décrite à l'exemple 4 serait utile 20 pour cette application. 70 15655 15. 2044750 . . - REVENDICATIONS. - 1 - Un procédé pour lutter contre les organismes nuisibles dans ou sur un substrat à protéger, caractérisé en ce qu'on introduit dans ou sur ce substrat un commensal microbien ayant un effet 5 curatif et/ou préventif vis-à-vis de l'action desdits organismes nuisibles. 2 - Un procédé suivant la revendication 1, caractérisé en ce que le commensal microbien ayant un effet curatif et/ou préventif est choisi parmi Tricho-derma album, (=T. polysporum), Trichoderma 10 ljgnorum ,(=T0 viride)t Gliocladium roseum, Scytalidium sp, Ceratocystis piceae, Pénicillium rubrum, P„ vermiçulatum, Coryne sarcoi-des, Aspergillus sp, Chaetomium sp, Fusarium sp, Cephalosporium sp, Geotrichum. sp, Leptosphaeria, les mycorhizes, Boletus bovinus, Retinocyclus abietis, Pythium sp, Helminthosporium sativum, Rhlno-15 trichum macrosporum, Trichothecium roseum, Calcarisporium paras!ti-cum, Gonatobotrys slmplex. Phytophthora paras!tica„ Sclerotium rolfsii, Ghaetomlum globosum, Fusarium roseum sp cerealis, Crypto-sporiopsi s, Cephalosporium charticola, Verticillium, Pullularia pullulans. Pullularia lilacinum, Pythium debaryanum, Tuberculina 20 maxima, Cicinnobplus c e sat i, Pénicillium patulum, P0 nigricans, Ceratocystis pl'uriannulata, Pénicillium crustaceum, Mucor sp, Mortierella sp, Melanconium sp, Monilia sitophila, Rhizopus nigri-cans, Pyronema sp, Didymella exitialis, Spicaria sp, Phoma sp, Mùcor ramannianus, Hypoxylon punctualatum, Suillus granulatus, 25 Russula, Beauveria bassiana, Paecilomyces farinosus, lentinus lepi-deus, Ceratocystis fimbriata, les actinomycètes tels que Micromobo-spora globosa, Açylindrosporus et Streptomyces sp, les bactéries telles que Serratia marcescens, Bacillus subtilis, B. polymyxa, Ervinia sp, Pseudomonas sp et Achroraobacteria sp, Cytôspora Leucos-30 tome, Leptographium sp, Alternaria sp. 3 - Un procédé suivant la revendication 1 ou 2, caractérisé en ce qu'on introduit en outre un microorganisme dont les métabolites ou substances physiologiquement similaires sont actives pour provoquer la libération d'antibiotique dans au moins un microorga-35 nisme prédéterminé (commensal microbien). 4- Un procédé suivant l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce qu'on introduit en outre un microorganisme agissant en synergie essentiellement par transformation ou élimination de substances gênant la croissance d'un commensal mi-40 crobien utile. . ' 70 15655 H' 2044750 5 - Un procédé suivant l'une quelconque des revendications ; précédentes, caractérisé en ce qu'on introduit en outre un métabolite microbien capable de stimuler l'activité antagoniste d'un ou plusieurs commensaux microbiens. 5 6 - Un procédé suivant l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce qu'on introduit en outre un composé chimique capable de stimuler l'activité antagoniste d'un ou plusieurs commensaux microbiens., 7 - Un.procédé suivant la revendication 1, caractérisé en ce 10 •qu1 on.utilise les commensaux microbiens pour obtenir une action à ! la fois curâtive et préventive par implantation dans le substrat de Trichoderma album et de Gliocladium roseum seuls ou l'un avec l'autre ou en association avec Scytalidium sp ou n'importe quel au-tre commensal microbien utile. . 15 8 - Un procédé suivant la revendication '1, caractérisé ©n ce ; «• ' qu'on utilise les commensaux microbiens pour obtenir une action préventive, essentiellement par implantation dans le substrat de Ceratocystis piceae, Cephalosporium sp ou Coryne sp. j 9 - Un procédé suivant la revendication 1, caractérisé en ce 20 que le microorganisme agissant en synergie est Mucor sp, pour agir; contre les composés d'arsenic. • •. 10 - %ta procédé suivant la revendication 1, caractérisé en ce que le microorganisme agissant en synergie est Poria vaporaria. pour agir contre les composés de cuivre. 25 11 - Un procédé suivant la revendication 1, caractérisé an ce qu'on utilise des commensaux microbiens,, par exemple Cephalosporium sp et Lentinus sp, essentiellement pour empêcher que le substrat " f soit infesté par des insectes tels que Reticulitermes sp, Hyloicu's . sp et Diprion sp. • 30 12- Un procédé de préparation de substances antibiotiques ou autres métabolites utiles caractérisé en ce qu'on cultive une ou plusieurs espèces microbiennes telles que Trichoderma album. (-T. polysporum), Trichoderma lignorum (=T„ viride.)., Gliocladium roseum", Scytalidium sp, Ceratocystis piceae, Pénicillium rubrum. P.- vermi-35 culatum, Coryne sarcoides, Aspergillus sp, Chaetomium sp,- Fusarium sp, Cephalosporium spP Geotrichum spf. Leptosphaeria. les mycorhizes, Boletus bovinus, Retinocyclus abietis, Pythium sp, Helminthosporium sativum, Rhinotrichum macrosporum, Tricothecium roseum. Calcarisporium paratiticum, Gonatobotrys simplex, Phytophthora '70 15655 1$. 2044750 parasitica. Sclerotium rolfsii, Chaetomium globosum. Fusarium • .• roseum sp. cerealis, Cryptosporiopsis, Cephalosporium charticola. Verticillium, Pullularia pullulans, Pullularia lilaclnum, Pythium debaryanum, Tuberculina maxima, Cicinnobolus cesati, Pénicillium 5 patulum, P. nigricans, Ceratocystis pluriannulata, Pénicillium crustaceum, Mucor sp,. Mortierella sp, Monilia sitophila. Rhizopus nigricans, Pyronema sp, Didymella exitialis. Spjçaria sp, Phoma sp, Mucor ramannianus, Hypoxylon punctualatum, Suillus granulatus. Russula. Beauvaria bassiana, Paecilomyces farinosus, Lentinus lepj-10 deus, Ceratocystis fimb'riata, des actinomycètes tels que Micromono-spora globosa. Acylindrosporus et Streptomyces sp. des bactéries telles que Serratia marcescens, Bacillus subtilis,- B. polymyxa, Erwlnia sp, Pseudomonas sp et Achromobacteria sp, dans un bouillon nutritif liquide capable d'entretenir la croissance du champignon 15 et comprenant, le cas échéant, des précurseurs d'antibiotiques, on sépare les mycéliums et on évapore le bouillon résiduel. 13 - Un procédé suivant la revendication 12, caractérisé en ce qu'on utilise un métabolite fongique ou un composé capable de stimuler l'activité antagoniste d'un ou plusieurs commensaux micro-20 biens pour la préparation d'un antibiotique ou d'un métabolite à partir de^ commensaux microbiens tels que Scytalidium sp (couche FY)) ou autres microorganismes antagonistes» . 1-4 - Un procédé suivant la revendication 12, caractérisé, en ce que ladite espèce microbienne est Trichodérma album ou Gliocladium 25 ' roseum. 15 - Un procédé de préparation, à partir de Poria carbonica. d'un inducteur de libération d'antibiotique dans Scytalidium sp, (souche FY), dans un.milieu nutritif liquide capable d'entretenir la croissance du champignon, selon lequel on sépare.les mycéliums 30 et évapore le bouillon résiduel. 16 - Une substance antibiotique ou un métabolite d'antibiotique obtenu par un procédé suivant les revendications 12 à 14. • 17 - Une substance comprenant un agent de libération d'un antibiotique obtenue par un procédé suivant la revendication'15. 35 18 - Une substance repoussant ou tuant les insectes .obtenue par un procédé suivant la revendication 12, l'espèce microbienne étant Cephalosporium sp ou Lentinus sp. 19 - Un procédé suivant l'une quelconque des revendications 1 à. 11, caractérisé en ce qu'on enfonce dans le substrat à protéger 70 15655 16. 2044750 une pièce allongée en bois, en matière plastique ou autre matière appropriée qui a été préalablement imprégnée par ledit commensal microbien ayant un effet curatif et/ou préventif vis-à-vis de l'action dudit microorganisme nuisible. 5 20 - Un dispositif utilisable pour la mise en oeuvre du pro cédé suivant la revendication 19, constitué par une pièce allongée en bois, en matière plastique et/ou autre matière appropriée qui est imprégnée par ledit commensal microbien ayant un effet curatif et/ou préventif vis-à-vis de l'action dudit microorganisme 10 nuisible. 21 - Un dispositif suivant la revendication 20,■ pour le traitement de poteaux, d'arbress adultes, etc, caractérisé en ce que la pièce allongée en bois, matière plastique, etc, a la forme d'une fléchette ayant en coupe transversale un diamètre compris entre 2 15 et 10 mm, et mieux, entre 3 et 7 mm et ayant une longueur comprise entre 50 et 200 mm,. et mieux, entre-70 et 130 mm. 22 - Un dispositif suivant la revendication 21, caractérisé en ce que l'une des extrémités de la fléchette est pourvue d'uns tête de flèche en matière dure, par exemple en acier inoxydable 2® pour faciliter sa pénétration dans le substrat. , 23 - Un dispositif suivant la revendication 20, pour traiter de jeunes arbres et plants9 caractérisé on oe que la pièce allon- : gée en bois, matière"plastique, etc, a la forme d'un petit bâton ayant une longueur de 5 à 10 mm muni3 sas échéant, d'une pointe ^5 ou d'un manchon métallique ou en autre substance dure... 24 - Un dispositif suivant la revendication 19, constitué par des pastilles d'écorce extr-udées et/ou autre matière -appropriée dans lesquelles sont disséminées des spores microbiens, des cellules végétatives, ou des pastilles d'hyphes et/ou des fragments 30 d'hyphes, lesdites pastilles d'écorce étant enrobées d'un liant approprié à la caséine , ou au soja, ou autre pour former une protection autour des racines sur les plants végétaux à protéger b l'aide de commensaux immunisants. • . 25 - Un dispositif suivant la revendication 19* caractérisé 35 en ce qu'il est formé d'un dispositif, comprenant au moins deux parties, dont l'une est inoculée avec le premier commensal immunisant et au moins l'une des autî"-es partiel est inoculée avec un autre commensal, immunisant différemment-ou un substrat oui favorise la nouvelle activité dudit premier commensal immunisant. 40 26 - Un dispositif selon la revendication 25» caractérisé en 70 15655 17. 2044750 ce qu'une des parties a la forme d'un noyau allongé et au moins l'une des autres parties a la forme d'une enveloppe allongée nui enveloppe ledit noyau.