FR 2042553 A1 19710212 FR 6929117 A 19690826 69 29117 t 2042553 Ii* invention se rapporte à des sirops de saccharification de l'amidon à forte teneur en maltose présentant une stabilité à la conservation et ayant une valeur d ' extrait fermentes cible (E»P. ) élevée et au procédé de préparation de ces sirops à l'aide d?un 5 enzyme maltogénique et d'amylo-1,6-glucosidase. invention se rapporte plus particulièrement aux sirops de transformation de • l'amidon à forte teneur en maltose, stables à la conservation, ayant un E.î1» minimal de 85 $> une valeur de E.D. minimale (équivalent en dextrose) d'environ 50 $, une teneur en maltose d*environ 10 60 à 80 et une teneur en maltotriose de 15 à 35 et à un procédé de préparation de ces sirops dans lequel on saechaiifie une pâte d*amidon contenant au moins 5 $ en poids de matière sèehe par un enzyme maltogénique et de l'amylo-1 ,6-glucosidase» La technologie générale de fabrication de ces sirops à 15 partir de 1*amidon, qui sont souvent dénommés sirops de saccharification de l'amidon, est bien connue, les sirops de saccharification de l'amidon qui ont une importance industrielle particulière sont les "sirops de glucose", ou les sirops obtenus à partir de l'amidon de maïs, les sirops de saccharification de l'amidon d'un type 20 spécial ont été très demandés, en particulier ceux qui possèdent un E.]P. élevé» En général, le E.E. ou le total des saccharides fer-mentescibles d'un ami don est la concentration totale en dextrose, en maltose et en maltotriose dans le sirop de saccharification de l'amidon. Les sirops à EJ, élevé conviennent en tant qu'additifs 25 de brassage dans la fabrication de la bière et dans le dénommé procédé de brassage de fabrication du pain utilisé dans les boulangeries industrielles du fait qu'ils contiennent une forte concentration en saccharides fermentescibles» Evidemment, ces sirops doivent demeurer limpides et fluides dans des conditions normales 30 de conservation. Oomme on le sait, les sirops de saccharification de l'amidon industriels sont ordinairement vendus avec une teneur en matière sèche d'environ 75 % ou avec une teneur supérieure dans le but d'empêcher une altération bactériologique pendant le transport 35 et la conservation» Gela impose certaines conditions limitatives à ces sirops. Pour empêcher la cristallisation ou la "prise en masse", il est nécessaire d'ajuster avec attention les teneurs en dextrose ou en maltose de ces sirops ou bien d'utiliser des récipients 69 29117 2 2042553 chauffés pour le transport et la conservation, ce qui entraîne des frais supplémentaires. Par exemple, les sirops de transformation de l'amidon ayant un E,ï. élevé et renfermant plus de 47 # de M.S (matière sèche) de dextrose ont une tendance marquée à la cristal-5 lisation. Dans des conditions de conservation défavorables, comme celles qui ont lieu pendant les mois d,automne et les mois d'hiver, on a décelé une cristallisation pour des concentrations en dextrose de l,ordre de 41 à 45 de M.S. D'un autre côté, le maltose a beaucoup moins tendance à cristalliser que le dextrose. 10 les sirops de transformation de l'amidon à E.P. élevé ont aussi été très demandés, en particulier ceux ayant me teneur en dextrose relativement faible (inférieure à 10 ^ en poids), car ces sirops conviennent bien pour la fabrication de bonbons durs où ils sont moins susceptibles de subir tm brunissement que les sirops de 15 glucose ordinaires et où ils permettent d'utiliser des pH un peu supérieurs pendant l'ébullition avec le saccharose sans qu'il se forme une couleur typique du saccharose qui soit excessive. Ces sirops à E.F. élevé contenant une concentration relativement faible en dextrose et des produits se formant à partir du dextrose sont 20 nettement moins hygroscopiques que les sirops de glucose classiques et les produits obtenus à partir de ces sirops. Cette propriété est particulièrement favorable pour retarder la cristallisation des bonbons durs pendant la conservation en magasin. 25 intérieurement à l'invention, on préparait des sirops ayant use forte tsneur en maltose par saccharification de l'amidon ou d'fcydrolysats d'amidon par les enzymes maltogénique s. Par exemple, on saccharifiait de l'amidon de maïs non modifié avec du malt pour obtenir des sirops ayant un E.D. d'environ 42 à 48, un E.î1. 30 d'environ 70 à 75 et une teneur en maltose d'environ 50 $ en poids des matières solides saccharifiées. Des sirops ayant un E.D. d'environ 50 à 55 et un EJ. d'environ 75 à 80 se préparaient par saccharification d'un sirop d'amidon partiellement hydrolyse par des amylases inertes comme cela est expliqué dans le brevet britannique 35 iT° 1.037»254o Ces sirops, en général, ont une concentration relativement élevée en saccharides ayant un D.P. de 4 ou plus (dépassant environ 20 $ en poids), ce qui permet d'obtenir des sirops ayant un E.î". inférieur à environ 80. Les sirops ayant un E.D. dépassant 69 29117 3 2042553 55 et un E.î". de 80 ou plus se préparaient en saccharifiant davantage les hydrolysats mentionnés précédemment avec des préparations d'amylo-1,4-glucosidase, exemptes de transglucosidase. Ce type de saccharification a pour conséquence la formation d'une grande 5 concentration en dextrose, et en général, la concentration en maltose du sirop diminue lorsque la concentration en dextrose •augmente. Récemment, on a exposé un procédé dans lequel on saccha-rifie une composition aqueuse d'amidon à 0,5 $ en poids par un 10 mélange de |3-amylase et d'amylo-1,6-glucosidase pour obtenir des produits contenant 95 à 99 # en maltose en poids. Bien qu'il soit impossible du point de vue économique de préparer des sirops de saccharification de l'amidon avec une aussi faible teneur en matières solides, ce procédé ne convient pas pour la production de 15 sirops industriels, stables à la conservation, à E.F. élevé, car ces sirops ont tendance à cristalliser si on les concentre à une teneur en matière solide nécessaire pour empêcher l'altération bactériologique pendant le transport et la conservation. Il semble que ce procédé ne convienne pas du tout pour la production du 20 maltose a l'état cristallin. L'objet de l'invention est de fournir des sirops de saccharification de l'amidon à teneur élevée en maltose et stables à la conservation ayant un E.î1. minimal de 85 un E.D. minimal de 50 ?t>, line teneur en maltose de 60 à 80 $ et une teneur en malto-25 triose de 15 à 35 La demanderesse vient de découvrir que les sirops de saccharification de l'amidon à teneur élevée en maltose et stables à la conservation renfermant de 75 à 85 $ en poids de matière solide ayant un E.î1. mi ni mal de 85 un E.D. minimal de 50, une 30 teneur en maltose de 60 à 80 fo en poids et une teneur en maltotriose de 15 à 35 ^ en poids, peuvent se préparer par saccharification d'une pâte d'amidon renfermant de 5 à 55 $ en poids de matière solide par un enzyme maltogénique tel que la j3-amylase et l'amylo-1,6-glucosidase. les sirops obtenus de cette manière renfer-35 ment en général 65 à 80 ?» de maltose, 18 à 33 fo de maltotriose avec des concentrations relativement faibles (habituellement inférieures à 2 tfc en poids) de dextrose et de saccharides ayant un D.P. de 4 ou - plus. Par suite de la teneur relativement forte en maltotriose, ces 69 29117 4 2042553 sirops à E.F. élevés ne cristallisent pas en les concentrant à une forte teneur en matière solide, et en conséquence, ils ne sont pas sujets à une altération bactériologique pendant le transport ou la transformation. 5 En résumé, les produits de cette invention se préparent en formant une dispersion aqueuse d'amidon contenant 5 à 55 fo de matières solides# Ensuite, on empâte et/ou on fluidifie la dispersion d'amidon pour obtenir un E.D» pouvant atteindre environ 35 en utilisant un acide, un enzyme, ou une combinaison des deux. La pâte 10 d'amidon obtenue est ensuite ajustée, si cela est nécessaire, à un pH de 4 à 6,5, de préférence à un pH.de 4>5 à 5»9 et à une teneur en matière solide de 5 à 55 % en poids, et saccharifiée en ajoutant un enzyme maltogénique et de l'amylo-1,6-glucosidase. On maintient la composition à une température de 11ordre de 29 à 77°C pendant 15 24 ou 100 heures ou pendant une durée suffisante pour obtenir le sirop désiré. Ensuite, de préférence, on purifie le sirop et on le concentre. L'amidon utilisé dans la présente invention peut être de l'amidon naturel, un amidon modifié ou un dérivé de l'amidon ayant 20 un faible D.S. (degré de substitution)• Parmi les amidons qui peuvent être utilisés dans la présente invention, on peut citer l'amidon de maïs, l'amidon de tapioca, l'amidon de riz, l'amidon de maîs cireux, l'amidon de pomme de terre, l'amidon de blé, l'amidon de-sorgho et l'amidon de milo cireux. L'enzyme maltogénique peut 25 provenir de différentes sources, par exemple de végétaux, d'animaux ou de microorganismes et peut être soit brut ou raffiné. Une source appropriée d'enzyme maltogénique et en particulier une source ayant une concentration élevée en (3-am.ylase est le malt d'orge. On peut se procurer du malt d'orge provenant de plusieurs sources 30 commerciales sous différentes dénomination, par exemple, le Fro-malt 72 qui est une orge maltée aux enzymes très actifs fabriquée par "Froedtert Malt Company", Milwaukee, Wisconsin, U.S.A. La quantité d1 enzyme maltogénique nécessaire associée à l'amylo-1,6-glucosidase pour saceharifier l'amidon afin d'obtenir 35 un sirop à E.F. élevé de cette invention est variable, et dépend par exemple, de la source et de la pureté de l'enzyme. Dans la plupart des cas, si on utilise un orge malté fortement actif du point de vue enzymatique comme source d'enzyme maltogénique, les concen 69 29117 5 2042553 trations en malt peuvent être de l'ordre de 0,1 à 2 $ en poids de l'amidon, calculé en matière sèche. L'enzyme amylo-1,6-glucosidase, dénommé souvent "pullula-nase" est un enzyme capable de n'hydrolyser sélectivement que les 5 liaisons glucosidiques a—1,6 de la fraction d'amylopectine de l'amidon. Les autres enzymes capables d'hydrolyser les liaisons, glucosidiques a-1,6 sont dénommés dans la littérature "iso-amylase" et "enzyme-R". La préparation d'un enzyme présentant l'activité de 10 1»amylo-1,6-glucosidase est exposée par Bender & Wallenfels dans "Biochemische Zeitschrift", Yol. 334, pages 79-95 (1961). On peut trouver d'autres reneeignements concernant l'utilisation et la production de cet enzyme dans "Methods of Enzymology", Vol. 8, pages 555-559 (1966). Selon les références ci-dessus, l'amylo-1,6-15 glucosidase peut être facilement préparée à partir de l'organisme Aerobacter aerogenes. Certaines souches de l'organisme Aerobacter aerogenes ont été mentionnées comme étant des sources particulière-. ment intéressantes pour préparer cet enzyme. Par exemple, on a découvert que Aerobacter aerogenes (TJ-58) qui est donné comme étant 20 un descendant direct de la souche initiale isolée par Bender & Wallenfels, s'est avéré être une source particulièrement bonne de cet enzyme. On peut aussi utiliser diverses espèces mutantes activées par les rayons ultra-violets de Aerobacter aerogenes (6-58)• Les autres souches mentionnées d'Aerobacter aerogenes que l'on 25 peut utiliser sont Aerobacter aerogenes ATCC 9621 et AÏCC 15050. On peut obtenir des préparations d'amylo-1,6-glucosidase ou de pullulanase à partir de l'organisme Aerobacter aerogenes par des méthodes de culture connues. Une technique appropriée est décrite dans la publication de Bender & Wallenfels citée précédem-30 ment. Si on le désire, on peut purifier la préparation brute avant son utilisation. Cependant, l'utilité de l'enzyme dans le procédé de cette invention ne se limite pas à des préparations d'une quelconque pureté spécifique. Evidemment, l'utilisation d'un enzyme pratiquement exempt d'agents de contamination serait avantageuse. 35 La quantité d'amylo-1,6-glucosidase n'est pas particuliè rement critique et elle dépend en grande partie de la concentration de l'amidon, de l'activité de l'enzyme et des conditions de réaction. En général, on utilise 0,05 à 2 unités d'amylo-1,6-glucosidase 69 29117 6 2042553 par gramme d*amidon et de préférence de 0,25 à 1 unité par gramme d'amidon. Par unité d*amylo-1,6-glucosidase, on entend la quantité d'enzyme présent dans 1 ml de solution qui, avec l'excès de pullu-lan comme substrat dans les conditions normalisées de l'essai» 5 porte la valeur réductrice, en une heure et à 45°, à une valeur qui est équivalente à un mg de maltose. Plus précisément, les produits de cette invention se préparent en formant une dispersion aqueuse d'amidon contenant 5 à 55 # de matières solides. Ensuite, on empâte l'amidon et/ou on le 10 fluidifie pour obtenir un E.D. pouvant atteindre 35 en utilisant un acide ou un enzyme ou une combinaison des deux. Toutes autres choses restant identiques, les substrats d'amidon empâtés, non-fluidifiés, fournissent des sirops ayant un E.î1. supérieur de 2 Jé à celui des substrats fluidifiés» Cependant, du point de vue pure-15 ment technique, il est préférable de fluidifier le substrat d'amidon pour obtenir un E.D. de 15 à 25 en utilisant une œ-amyla-se, de préférence de l'a-amylase stable à la chaleur, provenant du Baci11us subtilis à la température de 60 à 100°C. la pâte d'amidon obtenue est ensuite ajustée si cela est nécessaire, à un pïï de 20 l'ordre de 4 à 6,5, de préférence à un pH de 4>5 à 5»9» et à une teneur en matières solides de 5 à 55 ^ en poids, puis elle est saccharifiée en lui ajoutant une préparation d'enzyme maltogénique et de l'amylo-1,6-glucosidase. On peut ajouter la préparation d'enzyme maltogénique et l'amylo-1,6-glucosidase en même temps 25 ou successivement et l'on obtient les meilleurs résultats en les ajoutant en même temps. La composition est ensuite mise en incubation à une température de l'ordre de 29 à 77°C pendant 24 à 100 heures pendant une durée suffisante pour obtenir un produit de saccharification ayant tin E.D. d'au moins 50 $, une teneur en 30 maltose de 60 à 80 #, une teneur en maltotriose de 15 à 35 une teneur en levure fermentescible d'au moins 85 %■> Le sirop sera ensuite raffiné et concentré à une teneur en matières solides de 75 à 85 Les exemples suivants servent à expliquer l'invention. 35 Exemple 1 - On disperse neuf cents grammes d'amidon de maïs non modifié (en base sèche) dans 6 litres d'eau, on ajuste le pH à 5, et on cuit la dispersion dans un cuiseur à injection du type décrit 69 29117 7 2042553 dans le brevet des E.U.A. H"0 3.101.284, a une pression de 3,9 kg/ 2 cm pendant 15 minutes. On refroidit l'amidon cuit à 50°0 et on ajoute 1,2 g d'amylase de malt de Wallerstein (exempt d'oc-amylase) et 2 unités d1 amylo-1,6-glucosidase, par gramme d'amidon. Après 5 la saccharification pendant 48 heures à 50°C, le sirop a un E.D. de 57,6. Après 112 heures, le sirop d'amidon a un E.D. de 57,7, une teneur en dextrose de 1,3, et il renferme 70 fi de maltose et environ 29 fi de maltotriose. Exemple 2 - 10 On porte le pH d'une dispersion aqueuse d'amidon de maîs à 35 fi à la valeur de 8,1 et on cuit cette dispersion dans un cui- seur à injection du modèle décrit dans le brevet- des E.U.A. $T° 2 3.101.284 sous une pression de 4,6 kg/cm pendant 5 minutes. On expulse la pâte pour l'introduire dans une solution 15 d'œ-amylase (Bacillus subtilis) contenant 2,5 unités SKB d'amylase par gramme d'amidon et on la maintient à 88°G pendant 2 heures. On inactive l'oc-amylase en la chauffant à 96°0 pendant 20 minutes et on obtient, une pâte d'amidon ayant un E.D. de 15,7» Après refroidissement de la pâte d'amidon à la température ambiante et réglage 20 du pH à une valeur de 5,7, on ajoute un extrait aqueux de malt de distillerie équivalent à 1,5 fi de malt, calculé sur l'amidon (en matières sèches) et 2 unités d'amylo-1,6-glucosidase par gramme d'amidon. On dilue la pâte d'amidon et on la divise en portions renfermant respectivement 5,67 fi de matières solides, 10,94 fi de 25 matières solides, 16 fi de matières solides, 20,65 fi de matières solides, 25,06 fi de matières solides et 31,44 fi de matières solides. Après dilution, les hydrolysats sont mis en incubation à 54°C pendant 68 heures, puis passés à la vapeur et ensuite filtrés. 30 Ces propriétés des sirops d'amidon saccharifiés sont consignés dans le Tableau I ci-dessous. TABIEAU I Matières fi fi fi fi solides E.D. Dextrose Maltose Maltotriose E. E. 5,67 fi 57,7$ traces 75,83# 21,74$ SI,51fi 10,94 57,5 traces 76,92 21,25 98,17 16,00 56,5 traces 79,16 19,52 98,68 20,65 56,9 1,14 77,53 19,22 97,89 69 29117 8 2042553 25,06 56,8 1,75 73,60 21,80 97,15 31,44 55,1 1,95 73,16 20,70 95,81 Les sirops précédents ne cristallisent pas par concentration à "une teneur en matières solides de 80 69 29117 9 2042553 BETMDI0MI0U3 1. Sirop de saccharification de l'amidon à haute teneur en maltose et stable à la conservation ayant un E.î". minimal de 85 un E.D. minimal de 50 fot une teneur en maltose de 60 à 80 fa 5 et une teneur en maltotriose de 15 à 35 $. 2. Composition selon la revendication 1, dans laquelle le sirop renferme au moins 75 en poids de matière solide. 3. Procédé de préparation d'un sirop de saccharification de l'amidon à teneur élevée en maltose, stable à la conservation, 10 et ayant un E.F. élevé, qui consiste à saceharifier une pâte d'amidon contenant de 5 à 55 $ en poids de matières solides, où. l'amidon a un E.D. pouvant atteindre 35» par une combinaison enzymatique comprenant un enzyme maltogénique et de l'amylo-1 ,6-glucosidase. 4. Procédé selon la revendication 3, dans lequel on ne 15 fluidifie pas l'amidon. 5. Procédé selon la revendication 3» dans lequel on fluidifie l'amidon pour obtenir un E.D. de 15 à 25» 6. Procédé selon la revendication 5» dans lequel l'amidon est fluidifié par une cc-amylase stable à la chaleur. 20 7. Procédé selon la revendication 5» dans lequel l'oc- amylase comprend un enzyme stable à la chaleur provenant du Bacillus subtilis. 8. Procédé selon l'une quelconque des revendications 4» 5, 6, 7 et 8, dans lequel on concentre le sirop obtenu ayant un 25 E.F. élevé pour obtenir une teneur en matières solides de 75