FR 2051541 A1 19710409 FR 7017478 A 19700513 70 17478 1 2051541 là présente invention concerne le- procédé de préparation d'un inhibiteur de protéases provenant du pancréas animal- notamment de porc et de boeuf « résiduaire après l'extraction de l'insuline effectuée par l'action d'un acide minéral, notam-5 ment de l'acide phosph.oriq.ue. On sait que les inhibiteurs naturels de protéases existent dans les organismes d'origine soit végétale, soit animale. Mais seuls les inibiteurs d'origine animale ont.fait leurs preuves dans la thérapeutique, On a réussi à démontrer et à 10 isoler ces inhibiteurs,soit des organes différents, notamment du pancréas, du poumon, du foie, de la rate et similaires, soit des liquides du corps, notamment du sang, de.l'urine, du lait. Il y a plusieurs types d'inhibiteurs de protéases qui diffèrent parmi eux,soit, par leurs qualités chimiques, soit par le contenu d'acides 15 aminés, soit par la grandeur de la molécule, soit par leur stabilité, soit avant tout par leurs effets spécifiques à l'égard d'enzymes protéolytiques, de la trypsine, de la chymotrypsine, de la callicréine, de la thrombine, de la plasmase. En général on se sert, à titre de la matière 20 première, du poumon, du pancréas ou de 1a. parotide pour la prépara-• tion d'inhibiteurs de protéases efficaces au point de vue thérapeutique. D'habitude on extrait la matière première à l'alcool méthylique et on fait précipitér la fraction brute - contenant l'inhibiteur - à l'aidé de l'acétone./On écarte les albumineiM.es 25 à poids moléculaire plus élevé à l'aide de l'acide sulfosalicy~ lique, on éloigne ce dernier à l'aide d'échangeurs d:ions, on isole enfin le constituant actif par précipitation à l'aide de l'acétone* le principe^ de la présente invention a pour objet un procédé de préparation d'un inhibiteur de protéases en 30 partant des déchets du pancréas,soit du porc soit du boeuf,rési-duaires après l'extraction de l'insuline, procédé caractérisé en ce qu'on traite les résidus par.l'alcool éthylique à concentration, de 70 pour cent et on acidifie par un acide minéral, notamment par. un acide phospboriaue à un pH de 2^0 à 3,5. 35 Dans ces conditions une extraction simulta née de l'inhibiteur n'a pas lieu et l'inhibiteur, reste dans le bris du pancréas. Par ce procédé, on peut obtenir l'inhibiteur de protéases - en partant de la matière première décrite plus haut - avec un rendement maximal,une pureté absolue et une activité très 40 élevée. 70.17478 2 2051541 En procédant selon la présente invention on extrait le bris pancréatique d Origine, encore, humide après-l'exploitation précédente, à l'éthanol aqueux à. concentration, de .60. -70 pour cent ayant la chaleur de pH.de 10,0 à 13,Oj puis on écarte 5 de l'extrait l'alcool éthylique_par évaporation sous pression réduite et à une température de 40°G .au maximum, ensuite on élimine par refroidissement les lipoïâes de 1'extrait. concentré qu* on sépare; on élimine de. cet extrait aqueyx ainsi préépûré le complexe d'albuminoïdes sous forme d5un précipité, par action d'un,sel 10 organique soluble, notamment .du .sulfate d'ammonium ou.de..magnésium, on fait passer ce précipité en suspension aqueuse, ayant la. valeur de pH de 5,5 à 7,5, à la température de 50° - 80°Gyet par .action de l'acide trichloracétique ou de l'acide sulfosalicylique à concentration de 2 à .3 pour cent/ en rapport au poids/,.de.même.que 15 par le refroidissement subséquent à une température de 15° - 20°C on élimine les matières albuminoïdes gênantes sous forme d'un précipité qu'on écarte, on porte le pH du.filtrat contenant l'inhibiteur libéré à 7,0-7,5? on sature ce filtrat par le chlorure de sodium en quantité de 25 à 30 gr/100 ml et on l'acidifie parl'aci-20 de chlorhydrique afin d'obtenir la valeur de pH de 1,0 à 3,0, le précipité ainsi éliminé contient l'inhibiteur libre tout entier, on sépare le précipité et on en isole la portion enrichie par l'inhibiteur par une dissolution successive dans la solution tamponnée du chlorure de sodium .dont la valeur de pH. monte..continue 1-25 lement de 1,7 à 9*0g on continue de travailler la fraction obtenue à un pH de 3,0 jusqu'à 6,0 après la déionisation afin d'obtenir l'inhibiteur pur,soit par lyophilisation, soit par précipitâtio»* On porte le pH de l'alcool éthylique aqueux pour l'extraction du bris de pancréas, d'origine*a~10f0 - 13,0 par 30 l'addition de l'hydroxyde d'un métal alcalin ou.de l'hydroxyde d1 ammonium. . On peut faire usage à titre de solution tamponnée de chlorure de sodium d'une solution à concentration de 22 à 25 p. cent de chlorure de sodium dans 0,01 M d'acide phos-55 phorique, ea élevant sa valeur de pH par addition d'bydroxyde de sodium* le procédé de préparation conforme à la présente invention a été expérimenté en tenant compte des., qualités, spécifiques des matières premières aussi bien que des qualités des 40 produits intermédiaires et en se proposant"pour but le rendement 70 17478 ' 2051541 et la pureté mg-sHmnrnr du produit final. On a. démontré..par cette expérience qu'il est convenable de maintenir pendant la première opération la concentration de l'agent d'extraction dans les.limites précisées plus haut. Si on travaille avec une conc.entration.de. 5 l'éthanol plus basse que 60 p. cents, une. quantité. volumineuse, des substances gênantes passe dans l'extrait, c'est, ce qui rend difficile le travail subséquent. Si au contraire la, concentration dépasse 70 p. cent, l'extraction de l'inhibiteur n'a guere lieu. C'est par l'évaporation de l'alcool éthylique. ,qu'on obtient la "10 solution aqueuse qu'il faut dépourvoir des.lipoïdes, le mieux par. le refroidissement. On sépare ensuite le .complexe albumineux ..de. la. solution pré-épurée sous forme d'un, précipité par.précipitation avec un sel; ce complexe contenant déjà l'inhibiteur., naturellement sous forme liée encore, la libération de l'inhibiteur a.lieu 15 au cours de la phase subséquente seulement , où on dédouble le complexe albumineux par l'action de l'acide trichloracétique ou de l'acide sulfbsalicylique à un pH de 6,0 à 7,0 et à une température, modérément élevée. Cette opération est la plus importante parmi les opérations du procédé tout entier, étant donné qu'un bon résul-20 tat final dépend de l'observation exacte de ses conditions optimales. Puis on écarte les: restes des albuminoïdes.gênants. Ensuite, on continue de travailler le filtrat et on en. sépare le précipité contenant l'inhibiteur libre tout entier, par précipitation avec le chlorure de sodium. .11 est possible de travailler.ee précipité afin. 25 d'obtenir le produit final : soit.on soumet.la solution aqueuse du précipité à la précipitation fractionnée par l'acide chlorhydrique en présence "du chlorure de sodium, soit on élue le précipité introduit sur la colonne d'une.substance.neutre appropriée, notamment de la silice gélatineuse.,par.-une.solution de chlorure. de sodium 30 dans l'acide phosphorique dilué pendant qu'on augmente continuellement la valeur de pH.de la solution.de 3,0 à 9,0. .Dans les deux cas on ne reçoit que les fractions ayant la valeur de pH de 3,0 à 6,0 qu'on travaille après la déionisation, afin d'obtenir la substance pure de l'inhibiteurj on procède par. une des manières connues 35 en soi, notamment par .la..lyophilisation ou par la précipitation à l'aide de l'acétone. On travaille, enfin .la ..substance obtenue jusqu'en formé finale demandée , à savoir soit.en. comprimés sublinguaux, soit en solutions .d'injection. . l'inhibiteur pancréatique de protéases, 40 préparé conformément à la présente invention, a fait sa preuve au 70 17478 4 2051541 cours des expériences pharmacologiques grâce à ses effets spécifiques très significatifs. Parmi la série d'inhibiteurs de protéases, cette préparation est l'inhibiteur de la fibrinolyse le. .plus, efficace, in vitro aussi "bien qu'in vivo. On a démontré cet effet in 5 vitro au cours d'évaluation thrombo-élastographique de la fibrinolyse du plasma du lapin activé par l'addition de la steptokinase. On a démontré aussi cet effet dans un système artificiel fibrino-gène-thromhine-fibrinolysine. C'est par ces deux tests d'efficacité qu'on a démontré l'activité la plus grande de cet inhibiteur parmi. 10 d'autres inhibiteurs de protéases. Il faut mentionner que cet inhibiteur ne manifeste aucun effet anticoagulant, comme c'est le cas chez l'inhibiteur provenant de soya par exemple* On a effectué l'évaluation d'efficacité in vivo à l'aide de thrombo-élastographe chez des lapins auxquels on avait appliqué d'avance la streptokinase 15 Au cours d'une autre expérience in vivo on a suivi l'évolution, du temps d'effet de l'inhibiteur "appliqué en doses différentes,soit par application intra-veineuse, soit par application sous-cutanée. Au cours de ces expériences l'inhibiteur manifesta une efficacité significative. 20 D'autres qualités pharmacalogique.s de la pré paration sont favorables. La toxicité, e.st presque nulle, .les doses thérapeutiques ne manifestent aucune influence défavorable sur, la tension et sur la respiration des animaux, la haute pureté de cette substance /jui a le caractère d'un peptide à poids moléculaire bas/, 25 exclut la possibilité quelconque de. la.sensibilisation. l'inhibiteur de protéases préparé selon la présente invention est applicable au point de vue thérapeutique dans les domaines différents d'indication, qui "sont caractérisés par perturbations d'équilibre da système fibrinolytique, notamment en 30 gynécologie, en cas d'états post-opératoires divers, pendant les maladies du pancréas et similaires. On administre la préparation, en forme finale,soit per os/ en forme des comprimés sublinguaux/, soit par voie parentérale, avant tout par voie intra-veineuse notamment en cas d'états aigus, où.".il faut atteindre rapidement le rehaus 35 sement du niveau de l'inhibiteur de protéases dans l'organisme. la présente invention concerne également les produits conformes à ceux obtenus par le présent procédé ou procédés similaires. L'invention est décrite ci-après à titre nôn 30 limitatif dans les exemples ci-après. Selon l'exemple 1 on isole 70 17478 5 2051541 l'inhibiteur par précipitation fractionnée, selon.l'exemple 2.on l'isole par dissolution.successive; cette dernière façon d'isolation fournit un produit, essentiellement, plus pur. Exemples : 5 1/ - On broyé finement le bris pressé du pancréas - soit de porc, soit de boeuf -résiduaire après l'extraction d' l'insuline; on le mélange en agitant. a.vec. l'alcool éthyli-que - aqueux à concentration de 66 pour cent.de double volume/ en rapport au poids/, après y avoir ajouté. 0,5 pour cent d'une, solution 10 d'hydroxyde de sodium.à-concentration de 20 pour-cent. On soumet le mélange réactionnel à l'extraction en agitant intensément pendant trois heures à la.température normale. Puis on centrifuge la .portion liquide, on soumet le bris de nouveau à l'extraction dans les mêmes conditions et on le travaille pour la seconde fois. On réunit ensui-15 te les extraits éthanoliques, on les filtre et on les concentre à l'évaporateur à vide à une température de 35 à 40°C. On laisse, reposer l'extrait concentré pendant quelques heures à la température normale afin_d'éliminar ..les substances. secondaires à caractère de lipoïdes. On lave ces substances, après, leur séparation, dans 20 une petite quantité d'eau tiède et on ajoute cette eau de lavage à l'extrait.concentré. Ensuite on ajoute lentement en agitant le sulfate d'ammonium solide-.à cet extrait et cela en quantité de 550 gr par 1 litre de l'extrait. Ou bien on essore le précipité en y ajou-' tant du kieselguhr, ou bien on le centrifuge. Puis on met ce yreé-25 cipité en suspension dans l'eau en quantité cinq fois plus grande par rapport au poids, on l'agite et on le dissout partiellement en portant le pH à 6 - 7 à l'aide de la solution d5hydroxyde de sodium à concentration de 20 p. cent. Ensuite on chauffe la suspension à 50°C et on. y ajoute - en agitant intensément - l'acide trichlora-50 cétique sous forme d'une solution concentrée jusqu'à la concentration finale de 2,5 pour cent. On chauffe la suspension à 70°C en agitant sans cesse; on maintient cette température pendant 5 minutes, puis on refroidit la suspension à 15 - 20°Gv on la laisse reposer pendant 35 une heure ou deux et en sépare le précipité" par filtration. On porte le pH du filtrat limpide à 7,5 à l'aide d'une.solution de îtfaOÏÏ à concentration de 20 pour cent et on y ajoute le chlorure de sodium solide en quantité de -28 gr/100 ml. On ajoute lentement'l'acide i chlorhydrique à concentration dç 10 pour cent au liquide légèrement troublé en agitant jusqu'à ce qu'on porte le pH à-2,0. Un précipité 70 17478 2051541 volumineux s'élimine,qu'on essore ou centrifuge et qu'on continue de travailler,soit en état humide,soit après l'avoir anhydrisé à l'acide des dissolvants organiques miscibles avec l'eau, notamment à l'aide de l'acétone ou de l'éther. 5 On continue de purifier le précipité contenant l'inhibiteur libre tout entier de la façon suivante ; on le dissout dans l'eau afin'-d'obtenir une solution à concentration de 5 I pour cent à un pH de 795P on ajoute à cette solution le chlorure de sodium solide en quantité de 25 gr/100 ml, ce qui donne lieu, à ■jq un louche léger. On ajoute ensuite lentement - en agitant intensément - goutte à goutte l'acide chlorhydrique à concentration ' de 10 pour cent et un précipité se forme immédiatement. Après avoir porté le pH à 6,0 on centrifuge le précipité/ fraction A/ et on continue de l'acidifier afin de porter le pH à 4,5. Un. nou-\5 veau précipité s'élimine/ fraction B/ qu'on centrifuge. Par suite d'une acidification subséquente afin de proter le pH à 3,0. un précipité se sépare de nouveau/ fraction C/• Enfin- après avoir porté le pH à 1,5 la fraction péptidique tout entière s'élimine/ fraction D/. les fractions A et D exercent une. activité inhihitrice 20 faible à l'égard de la trypsine. C'est la fraction B qui est la plus efficace? la fraction C contient également,une portion active de l'inhibiteur® On rassemble les fractions A et B peu. efficaces de plusieurs opérations et on les purifie ensemble par un fractionnement nouveau. 2g O'est à l'aide des échangeursd'ions qu'on ... . dessale la fraction E - réunie éventuellement avec la fraction G après leur dissolution dans l'eau. On isole 1'inhibiteur de cette solution dessalée-, soît- par la lyophilisation, soit par la .précipitation, à l'acétone et par anhydrisation du précipité à l'aida de 20 dissolvants orge-niques miscibles avec l'eau. L'activité représente 2000 à 5000 unités de oalljcréSne/ 1mg. Le rendement est de 8 fe 10 millions d5unités de eallicréïne en sortant de 100 kg du bris pancréatique d8 origine. 2/ - On effectue l'extraction à l'alcool 35 éthylique fla séparation des lipides,, de même que la séparation, dse portions albœsiaoïdes à poids moléculaire plus élevé ,à .1'aid® de l'acide trichlor-aoétique t de la-même façon que selle décrite à l'exemple 1./. C'est par un fractionnement sur la colonne du kieael-guhr qu'on remplace le traitement subséquent concernant 1© présipi-40 té actif en dissolution dans la solution de Na Cl - à savoir le fractionnement à l'aide de l'acide chlorhydrique. 70 17478 7 2051541 C'est ainsi qu'on réussit à obtenir une purification plus efficace et à écarter en même temps les matières colorantes. On dissout le. précipité, dans 0,01 M de la. solution de l'acide phosph.oriq.ue contenant 22 - 25 pour cent-de 5 chlorure de sodium à un pH de 1 7 et on le met dans un tube. de.. . diamètre intérieur de 35 mm. .Une colonne de. kieselguhr se forme ayant une hauteur d'environ 210 mm.. Après le dépôt on. introduit dans la colonne une suspension préparée de .2 gr du précipité actif, mélangé par agitation avec un tiers.de la quantité de la suspension 10 d'origine dukieselguhr, mise en usage pour la préparation, de. la colonne, ce qui fait accroître, la colonne d'environ 70 mm. On lave la colonne dans 0,01 M d'acide phosphorique et on met en marche immédiatement l'élution par gradient .linéaire - à savoir par le mélange de la solution de 0,01 M d .'acide phosphorique avec 22 -15 25 pour cent de chlor.ure.jje...sodium. /pH 1,7/. -. .avec la même solution dont on a porté le pH à 9,0 à l'aide, d'une, solution d'hydroxyde, de sodium à concentration de.10 pour cent. La vitesse de passage représente. 2,5. - 5,0 ml/ 1 minute; on prend les fractions .à 25 ml. Au,cours de l'élution on, 20 augmente successivement, la valeur.de pS de. .la solution d' élution, . 'la concentration du chlorure de sodium restant toujours constante L'éluat au commencement - jusqu'à la valeur de pH 3f0 - est pratiquement inactif, puis la fraction peptidique active s'écoule/ contrôlée à l'aide de l'agent de Follin/ jusqu'à la valeur de pH 25 5,0 - 5,4. Les portions subséquentes sont déjà moins actives. On continue de travailler, l'éluat contenant la fraction active afin d'obtenir l'inhibiteur demandé tout, en, procédant selon l'exemple 1. L'activité du produit obtenu.: .2000 - 5000 unités de callicréïne/ 1 mg. 30 Bien entendu, l'invention n'est pas limitée -aux exemples de réalisation ci-dessus décrits et représentés, à partir desquels on pourra prévoir d'autres formes et d'autres modes de réalisation, sans pour cela sortir du cadre de l'invention. 70 17478 O 2051541 REVENDICATIONS 1) Procédé de préparation d'un inhibiteur- des . protéases provenant du pancréas animal, notamment de porc et.de. boeuf,résiduaire après l'extraction.de l'insuline - procédé carac- 5 térisé en ce qu'on traite les résidus pour l'alcool éthylique à concentration de 70 pour cent et on acidifie par"un acide minéral, notamment par l'acide phosphorique à un pH de 2,0 à 3,5. 2) Procédé suivant la revendication 1fcaractérisé en ce qu'on extrait les résidus pancréatiques d'origine encore 10 humidesaprès l'exploitation précédente à l'alcool éthylique aqueux à concentration-de 60 - 70 pour cent à un pH de 10?0 à 13,0, on sépare de l'extrait l'alcool éthylique par évaporation sous pression réduite et à une température ne surpassant pas 40°C, on sépare par refroidissement de l'extrait concentré les lipoïdes 15 qu'on sépare; on élimine de cet extrait aqueux.ainsi préépuré le complexe d'albuminoïdes sous la forme d'un.précipité par l'action d'un sel minéral soluble, notamment du sulfate d'ammonium.ou de. magnésium; on fait passer ce précipité, en suspension aqueuse, ayant la valeur de pH de 5,5 à 7,5; à la température de .50 - 80°C et 20 par l'action de l'acide trichloracétique ou de l'acide sulfosali-cylique à concentration de 2 à 3 pour cent/ en rapport au poids/, . de même que par le refroidissement subséquent à la température de i 15 à 20°C. on élimine les matières albuminoïdes non désirées sous forme d'un précipité qu'on écarte après; on.porte le pH du.filtrat ^ contenant l'inhibiteur libéré à 7,0 - 7,5 pn sature ce filtrat par le chlorure de sodium en quantité de 25 à 30 gr/100 ml et on l'acidifie par l'acide chlorhydrique afin d'obtenir la valeur de pH de 3,0 à 1,0; le précipité ainsi éliminé contient l'inhibiteur libre tout entier, on sépare le précipité et on en isole la portion 30 enrichie de l'inhibiteur par une dissolution successive dans une solution tamponnée de chlorure de sodittm. dont la valeur de pH monte continuellement de 1 ,,7 à 9,0; on continue de travailler la fraction obtenue à un pH de 5g0 jusqu'à 6,0 après la déionisation, afin d'obtenir l'inhibiteur pur soit par lyophilisation, soit par précipitation» 3°) Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'on porte le pH de l'alcool éthylique aqueux pour l'extraction du bris de pancréas d'origine à 10^0 - 13,0 par l'addition d'hydroxyde d'un métal alcalin ou d'hydroxyde d'ammonium. 4®) Procédé selon la revendication 1, caractérisé 70 17478 9 2051541 en ce qu'on fait usage,comme solution tampon du ehlorure.de. sodium y d'une solution à concentration de 22 - 25 pour cent de .chlorure de sodium dans 0,01 M d'acide phosphorique, alors qu'on fait monter sa valeur de pH par l'addition de l'hydrqxyde. de sodium. 5 5°) Produits conformes à ceux obtenus par le procédé des revendications l'a 3.