FR 2047937 A1 19710319 FR 7023460 A 19700624 70.23460 t 2047937 La'présente invention concerne un procédé d'examen de-cellules pour le diagnostic d'une' maladie. Elle a plus particulièrement trait à un procédé«de traitement d'un échantillon de cellules prélevé sur un corps soumis' à l'examen, avec une substance marquée 5 par un élément radio-actif, substance ; qui est sélectivement absorbée par un ou plusieurs types prédéterminés de cellules que l'on désire identifier. Une information sur la présence nu l'absence d'une maladie est déterminée par détection du taux de radio-activité de l'échantillon. En outre, cette technique peut être appliquée au TO dépistage, en utilisant des échantillons prélevés sur plusieurs sujets et en appliquant un taux de rayonnement déterminé à une valeur normalisée commune pour éliminer les échantillons qui sont nettement exempts de maladie. La technologie des colorations médicales se base sur les t5 propriétés colo'rimé trique s du colorant, et sur l'affinité de certains colorants à se fixer par leur molécule sur des échantillons médicaux typiques. L'invention implique l'adjonction de propriétés radio-actives aux colorants par marquage radio-actif du colorant désiré, lequel émet ensuite un signal qui peut être détecté par 20 un compteur à scintillations, et mis sous une forme numérique en vue du traitement et de l'analyse dans une calculatrice. Toutefois, comme le montrera ce qui suit, l'invention permet de ne plus se baser sur la détection visuelle par la couleur et, attendu que la détection se base sur la propriété de radio-activité du "colorant", 25 elle permet d'utiliser une substance totalement incolore, marquée par un élément radio-actif, substance qui est sélectivement absorbée par les cellules que l'on cherche à identifier. La présente invention, telle que conçue à l'origine, concerne par exemple un procédé d'examen d'échantillons cytologiques 30 associé avec les méthodes de Papanicolaou pour la recherche du cancer. Plus typiquement, elle concerne un procédé de coloration ou de teinture d'un échantillon de tissu (par exemple un frottis vaginal) avec un ou plusieurs colorants marqués par un élément radio-actif, colorants qui se fixent par leur molécule à des types 35 prédéterminés de substances cellulaires. Comme conséquence de cette ■ coloration et d'un processus de lavage, il est possible d'établir la différence entre des cellules normales, des cellules malades 70 2346Q 2 2047937 et des cellules qui sont le siège d'une inflammation j et on peut de cette façon identifier un cancer présumé. Dans la technique antérieure, des méthodes ont été mises au point pour colorer des cellules, des bactéries, des virus, des 5 champignons et des échantillons de tissus avec des colorants qui sont rejetés, par exemple, par des cellules normales, mais absorbés par des cellules atteintes d'une maladie particulière, telle que le cancer. On a étudié de nombreux colorants qui se prêtent à ce type d'utilisation, et on connaît divers colorants qu'il est 10 intéressant d'utiliser en relation avec diverses maladies ou divers troubles. La coloration de cellules d'un échantillon de tissu s'est révélée être très précise en tan~t qu'indicateur visuel de .certaines maladies et de certains troubles tels que le cancer» La difficulté 15 d'exécution de ce type d'analyses réside dans le fait qu'elles sont longues et pénibles, et le cytologiste, ou le spécialiste effectuant l'examen, doit être très expérimenté. Ainsi, ce procédé est non seulement coûteux, mais il est pratiquement impossible d'effectuer des examens de ce type ou de rendre ce procédé automatique 20 sur la base d'analyses en série. Même pour le cancer seul, pour lequel il est possible que 5 i° des sujets nécessitant un tel examen s'y soumettent réellement, le nombre de techniciens expérimentés dont on dispose est insuffisant pour des manipulations supplémentaires bien plus nombreuses que celles qui sont exécutées 25 couramment. Les limitations du mode opératoire résident dans l'examen de l'échantillon. L'examen visuel, lent et pénible, ne peut pas être accéléré sans perte de précision des résultats. Ces pertes ne peuvent pas être admises. Par ailleurs, des techniques ont été 30 perfectionnées pour la manipulation et le traitement en série de lames portant l'échantillon, techniques qui impliquent même des processus chimiques minutieux, compliqués ou très sensibles. Ces processus sont bien connus et peuvent être régiq/convenablement et avec soin par des techniques d'analyses en série utilisant un 35 équipement automatique ou semi-automatique. La Demanderesse a mis au point, et ceci fait l'objet de la présente invention, un procécé de mise sous forme numérique de 70 23460 3 2047937 l'information histologiquë au niveau de sa source,, à savoir.la cellule elle-même. ' La méthode côlorimétrique limitait l'examen des cellules à des systèmes optiques dans lesquels le signal initial était trop 5 faible pour permettre d'atteindre un niveau signal/bruit convenable, ce qui interdisait l'automatisation, qui est indispensable pour un dépistage en série. La présente invention résulte de la recherche d'un moyen d'élimination de la nécessité d'un examen microscopique visuel de toutes les lamés traitées. L'invention offre un tel moyen. 10 Elle permet l'examen automatique d'échantillons de tissus par des • détecteurs non-humains, tels que des détecteurs de radiation de divers types connus, et elle nécessite dans un nombre relativement faible de cas, un nouvel examen de confirmation, par analyse visuelle subjective. 15 Plus typiquement, l'invention permet de remplacer le colo rant de l'indicateur coloré par une substance qui est marquée par un élément radioactif. Cette substance peut aussi être un colorant capable de donner une indication colorée, comme cela a été le .cas dans la technique antérieure, ou bien il peut s'agir d'une substance 20 dont la couleur ne joue pas, ou d'une substance qui ,est complètement incolore. Le concept de la présente invention a été élargi de manière que l'invention ne soit pas limitée à la détection du cancer, ni même à la détection de cellules anormales dans un échantillon:de 25 tissu qui peut aussi contenir des cellules normales. Le concept de la présente invention est lié à la détection de cellules marquées par un élément radio-actif. Ces cellules sont traitées avec une substance marquée par un élément radio-actif, substance qui est absorbée sélectivement par des cellules d'un.ou plusieurs types 30 cellulaires prédéterminés, que l'on cherche à identifier. L'invention peut être appliquée par exemple à des cultures de cellules pathogènes, de même qu'à des tissus et du sang ou d'autres, échantillons de liquides corporels. Les bactéries, les champignons et. d'autres microorganismes et virus entrent dans la définition du terme 35 "cellule" utilisé ici,pourvu, qu'ilgëoient susceptible^'un^é/bsorption sélective de substances marquées par un élément radio-actif. Comme indiqué ci-dessus, la présente invention offre aussi 70 23460 4 2047937 une nouvelle technique dé dépistage'; Dans ce procédé, des. échantillons similaires sont prélevés sur plusieurs sujets et identifiés quant à leur provenance, les échantillons sont traités et détectés comme indiqué précédemment; Ensuite, en utilisant un étalon commun 5 de radiation qui est prédéterminé, les échantillons qui sont nettement exempts de maladie sont éliminés, et on ne laisse que ceux qui dépassent ce taux de radiation, en vue d'un examen visuel ou d'autres essais. D'autres caractéristiques et avantages de la présente 10 invention ressortiront de la description détaillée qui va suivre,, faite en regard du dessin annexé qui illustre par un schéma synoptique, à titre d'exemple non limitatif, les diverses étapes du procédé de l'invention. la préparation des échantillons par des moyens classiques 15 10 est effectuée par des médecins ou des techniciens, de la manière actuellement courante. La préparation des substances 12 marquées avec un élément radio-actif peut faire appel à des techniques et des connaissances spéciales de la préparation d'un type donné de colorant. Le lavage de l'échantillon avec la substance marquée 20 par un élément radio-actif et le rinçage subséquent, effectués en 14, marquent l'échantillon avec la substance radio-active permettant l'absorption par des cellules anormales, puis on procède, si nécessaire, à un lavage qui élimine les quantités en excès qui n'ont pas été absorbées. Ces opérations peuvent être effectuées 25 par un cytologiste ou par un autre technicien expérimenté. Dans de nombreux cas, cette opération s'effectue d'une manière apparentée aux techniques actuelles de coloration qui sont tout à fait au point, et elle peut impliquer des processus analogues. - Une fois que l'échantillon a été préparé et marqué, 30 il est prêt à être utilisé pour l'examen. Toutefois, au lieu de recourir à un microscope, on détecte le taux d'absorption de la substance marquée par un élément radio-actif au moyen d'un détecteur convenable de rayonnement, par exemple des détecteurs de rayonnement de diverses- formes du commerce, de sensibilité cor-35 recte. La détection du taux d'absorption de la substance 16 marquée par un élément radio-actif est apparentée aux autres mesures de rayonnement qui s'effectuent à l'heure actuelle. Elle peut être 70 23460 5 2047937 confiée à des techniciens, ou bien elle peut être effectuée automatiquement dans un appareil convenable, le .comptage effectué par le compteur de rayonnement sur une période prédéterminée de temps peut être utilisé comme donnée d'un système automatique 18 de trai-5 tement des données, qui compare ce, résultat avec des critères déterminant^ t délivre en 20 les résultats d'une analyse comparative, au moyen d'un dispositif imprimant classique, par exemple du type associé avec des calculatrices numériques. Exemple 1 - On prépare des échantillons négatifs, positifs 10 vis-à-vis du cancer et inflammatoires de frottis vaginaux en utilisant la technique de Papanicolaou avec des méthodes classiques. La substance marquée par un élément radio-actif que l'on utilise pour colorer les lames est une solution aqueuse à 1 i<> de bleu de méthylène au (bleu de méthylène préparé par synthèse 15 de manière à contenir 1,3 millicurie/gramme). Les échantillons de tissu sont lavés avec une goutte de la solution de bleu de méthylène au et les cellules anormales absorbent la matière marquée par l'élément radio-actif. Les échantillons sont ensuite rincés à l'eau et séchés à la température 20 ambiante. On effectue ce lavage et ce rinçage au moyen de méthodes classiques pour la coloration des lames. Ensuite, l'échantillon marqué est détecté au moyen d'un compteur de rayonnement à scintillations^. phase liquide (modèle 724) fabriqué'par la firme Nuclear Chicago, après découpage des 25 lames pour adapter les dimensions des échantillons à celles du compteur. On utilise une solution classique dans le xylène des composés fluorés étalon , à savoir les POP et le P0P0P. Les résultats obtenus par analyse classique sont comparés au résultat après marquage avec l'élément radio-actif, et on cons-30 tate qu'ilgfeoncordent correctement. Les comptage^/proprement dits varient comme l'indique le tableau suivant ; 70 23460 6 2047937 du au Echantillons négatifs comptage ÏP 1 comptage ïï° 15 5 Echantillon^posi-tifs 1 000 2 000 Echantillons inflammatoires 10 000 30 000 et ils sont déterminés de manière à donner une indication du cancer par le taux détecté de rayonnement (c'est-à-dire le comptage 10 par scintillations).Dans tous les cas, la substance marquée par un élément radio-acti^ermet un examen visuel. Un examen visuel de l'échantillon est effectué indépendamment, et les résultats concordent à 100 $ dans les deux cas. Exemple 1(a) - Dans la conduite de l'essai décrit ci-15 dessus, on prépare des lames témoins de même que des lames portant des cellules normales du col de l'utérus, des cellules indiquant un cancer du col et des cellules enflammées (inflammation du col utérin),en utilisant la technique de Papanicolaou avec des méthodes classiques. 20 La substance marquée par un élément radio-actif, à savoir le bleu de méthylène au (solution aqueuse à 1 $) est utilisée pour colorer les lames. Les échantillons de tissu sont lavés avec une goutte de la substance marquée par l'élément radio-actif, et les cellules absorbent en quantités différentes la substance mar-25 quée. Les échantillons sont rincés à l'eau puis séchés. Le procédé de lavage est classique, excepté l'utilisation du bleu de méthylène radio-actif. Une lame/portant pas d'échantillon de tissu est traité§&vec une goutte de solution de bleu de méthylène au ^C, rincée puis séchée de manière à servir de blanc ou de témoin. 30 Ensuite, les échantillons marqués sont détectés par un compteur de rayonnement à scintillations en phase liquide (modèle 724) de la firme Nuclear Chicago, comme dans l'exemple 1. Les comptages détectés pour les diverses lames sont reproduits sur le tableau suivant : 70 23460 2047937 7 Exemple particulier Coups/minute . . Gamme des divers j échantillons, coups/minute Lame témoin 20 - 10-37 5 Cellules normales du col utérin 140 8-250 Cancer du col utérin 414 300-2.400 10 Inflammation du col utérin 12.953 8.000-30.000 Les résultats obtenus par analyse visuelle classique au microscope sont comparés avec les résultats de marquage radioactif obtenus en utilisant le compteur de rayonnement,, et on trouve qu'ilgfconcordent correctement. 15 Exemple 2 - On prépare des lames témoins de même que des lames portant des cellules normales du col utérin, des cellules indiquant un cancer du col et des cellules enflammées (inflammation du col utérin) en utilisant la technique de Papanicolaou avec des méthodes classiques. 20 La substance marquée par un élément radio-actif, à savoir l'hématoxyline à l'hydrogène H (hématoxyline traitée par marquage catalytique au tritium, 750.000 microcuries/gramme), est utilisée pour colorer les lames. Les échantillons de ti3au et le témoin sont lavés avec la solution marquée par l'élément radio-actif (à 25 2 io dans l'eau) et les cellules absorbent en différentes quantités la substance marquée. Les lames £ont lavées à l'eau et séchées en suivant le mode opératoire classique, comme dans l'exemple 1. Ensuite, les échantillons marqués sont détectés par un compteur de rayonnement à scintillations en phase liquide de 30 la firme Nuclear Chicago, comme dans l'exemple 1. 'Les comptages détectés pour les diverses lames sont récapitulés sur le tableau suivant : 70 23460 2047937 8 5 10 Les résultats obtenus par l'analyse usuelle classique au microscope sont comparés avec les résultats de marquage radioactif obtenus en utilisant le compteur de rayonnement, et on constate qu'ils concordent correctement. 15 Exemple 3 - On prépare des lames témoins et des lames portant des cellules anormales de la prostate, qui sont le siège, respectivement, d'une hypertrophie de la prostate et d'un adénoear-cinome de la prostate. Aucun tissu normal de la prostate n'est examiné. Les échantillons sont préparés de la façon classique en 20 utilisant les coupes normales en bloc de paraffine , les techniques de montage en paraffine et le procédé d'élimination de la paraffine. La substance marquée par l'élément radio-actif que l'on utilise pour colorer les lames est de fuchsine basique à 2 5 l'hydrogène H (fuchsine basique traitée par marquage catalytique au tritium, 43 mi 11icuries/30 mg, dissoute dans 100 ml d'alcool à 95 i° ). On prépare la solution en ajoutant à 1 ml de la solution de fuchsine basique au tritium, 0,4 g de fuchsine basique normale, 0,8 g de phénol, 2 ml d'alcool à 95 ^ et 10ml d'eau distillée. 30 Les échantillons de tissu et le témoin sont lavés avec la substance marquée par l'élément radio-actif, et des types différents de cellules absorbent en quantités différentes cette substance marquée. Les lames sont lavées à l'eau puis séchées. Le mode opératoire utilisé est classique. * Coups/minute Gamme des divers échantillons - coups/minute lame témoin 12 8-22 cellules normales du col utérin 60 • 35-105 cancer du eol utérin 180 120-450 cellules enflammées (inflammation du col utérin) 3.460 800-12.000 70 23460 9 2047937 Ensuite, certaines des lames de chaque type sont décolorées en utilisant une solution normale de décoloration contenant 1 ml d'acide chlorhydrique concentré et 99 ml d'alcool à 95 f°, pendant deux minutes, puis on effectue un lavage à l'eau courante pendant 5 cinq minutes. Les comptages réels effectués en utilisant le mode opératoire de l'exemple 1, sur les diverses lames préparées, sont récapitulés sur le Tableau suivant : Exemple particulier 10 Coups/minute Gamme des divers échantillons, coups/minute Lame témoin 27 13-48 15 Hypertrophie de la prostate (sans décoloration) 39.510 20.000-40.000 âdénocarcinome de la prostate (sans décoloration) 47-014 42.000-76.000 20 Hypertrophie de la prostate (avec décoloration) 7.471 4.000-8.500 Adénocarcinome de la prostate (avec décoloration) 12.514' 9.000-22.000 Il ressort des résultats précédents qu'on obtient un 25 meilleur étalement avec la décoloration. Là encore, les résultats obtenus par l'analyse visuelle classique au microscope sont comparés avec les résultats de marquage radio-actif obtenus en utilisant le compteur de rayonnement, et on constate qu'ils concordent correctement. 33 Eyem-nle 4 - On suit le mode opératoire de 1 ' exemple 3, à la différence qu'on n'utilise que des échantillons décolorés, sans ajouter de fuchsine basique normale à la fuchsine basique marquée au tritium. Par conséquent, il ne se produit aucune absorption microscopique visible de la couleur et une détection radio-active est 35 seule possible. Les résultats sont les suivants : 70 23460 10 2047937 5 10 Exemple 5 - On utilise le mode opératoire et la substance de l'exemple 3 pour la détection visuelle et radio-active de la malaria, de staphylocoques, de pneumocoques, ,de la tuberculose, de bactéries coliformes, de la leucémie et de la trypanosomiase. Les 15 échantillons 2, 3 et 9, mentionnés ci-dessous sont respectivement des échantillons de sang infecté de souris et d'être humain. Les échantillons 4, 5 et 7 sont des cultures sur gélose des microorganismes mentionnés, prélevés sur des patients malades. L'échantillon 6 provient d'une coupe normale en paraffine d'un poumon hu-20 main malade. L'échantillon 8 provient d'une culture sur coeur de souris du micro-organisme mentionné, prélevé sur un malade. Les résultats obtenus sont les suivants : Exemple particulier 25 30 35 Exemple particulier Coups/minute Gamme des divers échantillons, coups/minute jame témoin 22 13-48 îypertrophie de la prostate (avec décoloration) 14.842 13.000-15.000 idénocarcinome de la prostate (avec décoloration) 17.567 15.000-18.000 Coups/minute Gamme des divers échantillons, coups/minute 1. Lame témoin 22 1 3-48 2. Plasmodium "Vivax (forme humaine de la 1 .096 800-1.200 malaria) 3. Plasmodium berghei (malaria de la souris] 833 ~ 600-900 4. Staphylococcus aureus 3-513 2.500-4.000 5. Pneumocoque 1 .046 800-1.200 6. Tube rculose (humaine) 2.029 1.500-2.500 7. E. coli 818 100-900 8. Trypanosoma cruzi (forme humaine de la 2.296 1.800-3.000 maladie de Chagas) 9. Leucémie (humaine) 1.377 1 /000-1.800 70 23460 2047937 Exemple 6 - Des échantillons 'du même type que ceux qui sont soumis à l'essai de l'exemple 5 sont traités en utilisant le mode opératoire et la solution de "bleu de méthylène au ^ de 1'exemple 1. Les résultats obtenus sont les suivants : 5 Exemple particulier 3oups/minute Gamme des divers échantillons, coups/minute I. Lame témoin * 18 16-22 1. Plasmodium vivax (forme humaine de la malaria) 59 43-78 5. Plasmodium berghei (malaria de la souris) 351 250-500 4-. Staphylococcus aureus 1 .353 1.000-7.000 5. Pneumocoque 114 80-200 5. Tuberculose (humaine) 207 150-300 7. E. coli 1.966 1.650-2550 3. Trypanosoma cruzi (forme humaine de la maladie de Chagas) 352 250-500 9. Leucémie (humaine) 152 100-200 •Bien qu'on se réfère, dans les exemples précédents, à des techniques utilisant des lames des échantillons, il y a lieu de remarquer que la présente invention n'est pas limitée à l'examen sur 25 lames des échantillons, mais qu'elle peut être appliquée à des échantillons sous d'autres formes., par exemple des formes liquides préparées par traitement de l'échantillon, par exemple dans un récipient, avec la substance marquée par l'élément radio-actif, en ajoutant de l'eau pour éliminer par rinçage la substance marquée 30 non absorbée et en séparant l'échantillon marqué de la phase liquide, par exemple par centrifugation. Une dispersion cellulaire peut être préparée au moyen de l'un quelconque de plusieurs procédés classiques, par exemple par les ultra-sons et/ou par des moyens mécaniques. 70 23460 12 2047937 revendications 1. Procédé d'examen de cellules pour le diagnostic d'une maladie, caractérisé par le fait qu'il consiste à traiter vin échantillon des cellules prélevées sur un corps à examiner, avec une 5 substance marquée par un élément radio-actif, qui est capable d'être absorbée par des cellules d'un ou plusieurs des types cellulaires prédéterminés que l'on cherche à identifier, puis à détecter le taux de radio-activité de l'échantillon pour déterminer, par le degré d'absorption de la substance marquée par l'élément radio-10 actif, une information sur la présence ou l'absence de la maladie. 2. Procédé suivant la revendication 1, caractérisé par le fait que les cellules détectées sont des cellules pathogènes. 3. Procédé suivant la revendication 3, caractérisé par le fait que les cellules détectées sont des cellules d'un échantillon 15 de tissu rendu anormal par une maladie. 4. Procédé suivant la revendication 1, caractérisé par le fait qu'il est appliqué à la détection du cancer, du cancer du poumon, du cancer de la prostate, d'une infection vaginale, d'une maladie infectieuse, de la malaria, de la trypanosomiase, d'une mala- 20 die parasitique, de la tuberculose, de micro-organismes des genres Staphylococcus et Pneumococcus, d'une infection intestinale, d'une infection pulmonaire, d'une pneumonie, de la maladie de Chagas et de la leucémie. 5. Procédé suivant la revendication 1, caractérisé par le 25 fait qu'on utilise l'hématoxyline à hydrogène H, la fuchsine ba- . sique à hydrogène "'h et le bleu de méthylène au carbone ^C. 6. Procédé de détection de cellules pathogènes, entrant dans des classes choisies, caractérisé par le fait qu'il consiste à traiter un échantillon prélevé sur un corps soumis à un examen, 30 avec une substance marquée par un élément radio-actif, substance qui est sélectivement absorbée par des cellules d'un ou plusieurs types prédéterminés que l'on cherche à identifier, puis à détecter le taux de radio-activité de l'échantillon pour déterminer, par le degré d'absorption de la substance marquée, une information sur la 35 présence ou l'absence de maladie. 7. Procédé d'examen d'échantillons de tissus, caractérisé par le fait qu'il consiste à traiter un échantillon de tissu avec une substance marquée par un élément radio-actif, qui est choisie 70.23460 2047937 de manière à être absorbée par des cellules d'un type prédéterminé et rejetée par d'autres cellules, et à détecter le taux de radioactivité de l'échantillon de tissu pour déterminer, par le degré d'absorption de la substance marquée par l'élément radio-actif, une 5 information sur la proportion de cellules du type prédéterminé des cellules de l'échantillon entier. 8. Procédé suivant la revendication 7, caractérisé par le fait que la substance marquée par un élément radio-actif que 11 on utilise colore également les cellules de type prédéterminé et est 10 rejetée par d'autres." 9. Procédé suivant la revendication 7, caractérisé par le fait que le marquage radio-actif non colorimétrique de l'échantillon est significatif. 10. Procédé suivant la revendication 7, caractérisé par le 15 fait que l'échantillon de tissu contient des cellules du type prédéterminé, de dimensions trop petites pour apparaître par des techniques colorimétriques de coloration, mais absorbant la substance marquée en quantités suffisantes pour line identification positive. 11. Procédé suivant la revendication 7, caractérisé par le 20 fait que le contenu de l'information d.e l'échantillon de tissu proprement dit est mis sous une forme numérique directement par émission radio-active, en sorte qu'il peut être utilisé directement comme entrée d'une calculatrice. 12. Procédé suivant la revendication 7, caractérisé par le 25 fait que le motif de distribution des cellules du type prédéterminé est produit par radio-activité en utilisant la distribution de l'émission radio-active de l'échantillon. 13. Echantillon de tissu coloré avec une substance marquée par un élément radio-actif, qui est choisie de manière à être ab- 30 sorbée par des céllules d'un type prédéterminé et rejetée par d'autres cellules. 14. Procédé de dépistage d'une maladie d'un type particulier, appliqué à plusieurs sujets, caractérisé par le fait qu'il consiste à recueillir et identifier des échantillons similaires provenant de 35 plusieurs sujets, à traiter chaque échantillon avec une substance marquée par un élément radio-actif, qui est destinée à être absorbée sélectivement par des échantillons du type soumis à la recherche, à détecter le taux de radio-activité de chaque échantillon pour 70 23460 14 2047937 déterminer le degré d'absorption de la substance marquée par l'élément radio-actif et à utiliser un niveau normalisé commun de rayonnement qui est prédéterminé pour éliminer les échantillons qui sont nettement exempts de maladie. 5 T5* Procédé suivant la revendication 14, caractérisé par le fait que les échantillons qui n'apparaissent pas nettement exempts de maladie sont traités ensuite par une technique classique.