FR 2028973 A1 19701016 FR 7002289 A 19700122 70 02289 -1- 2028973 La découverte des propriétés antibiotiques remarquables de la pénicilline a suscitée- un grand intérêt dans ee domaine, ce qui a eu pour résultat de faire trouver un grand nombre d'autres substances antibiotiques précieuses comme la streptomycine, la 5 gramicidine, la subtiline, la bacitracine, la chlortétracycline, 1 * oxytétracycline et autres. En général ces antibiotiques sont particulièrement actifs contre certaines bactéries gram-négati-ves, d'autres sont actifs contre les bactéries gram-positives et quelques-uns sont actifs contre les bactéries gram-négatives 10 et les bactéries gram-positives. Toutefois 1*activité de ces antibiotiques est en général limitée à un petit nombre de micro-organismes pathogènes et on a continué de travailler dans ce domaine pour essayer de trouver d'autres antibiotiques qui seraierfc actifs contre d'autres pathogènes. 15 Bien qu'on ait trouvé que certains de ces antibioti ques ont une valeur inestimable pour le traitement de diverses maladies, on a constaté que certaines souches de pathogènes acquièrent une résistance à un antibiotique particulier, de sorte que l'antibiotique n'est plus actif contre de telles souches ré-20 sistantes. En conséquence, les déficiences des antibiotiques connus ont encore stimulé la recherche d'autres antibiotiques qui seraient actifs contre de nombreux pathogènes aussi bien que contre les souches résistantes, de microorgani, smes particuliers. 25 L'acide (*») (cis-1, 2 - époxypropyl)phosphohique, subs tance antibiotique active contre divers pathogènes, est obtenu par culture d'espèces appropriées de Streptomyces dans des milieux contenant des sources convenables de carbone ,et d'azote et des sels minéraux. Toutefois les rendements en antibiotique 30 qu'on peut obtenir dans les milieux de- fermentation usuels sont faibles et on a cherché un moyen dê produire l'antibiotique avec des rendements améliorés. ' La présente invention concerne des procédés améliorés pour la préparation de l'acide (—) (cis-1,2-époxypropyl)phospho-35 nique par fermentation. Un objet de l'invention est de fournir un procédé de production de l'acide (-) (cis-1, 2 - époxypr opyl)phosphonique par fermentation avec des rendements améliorés. D'autres objets apparaîtront dams la description détaillée de l'invention qui suit. 70 02289 -2- 2028973 Selon 1*invention, la demanderesse a déterminé que des souches appropriées de Streptomyces, quand on les cultive dans des milieux contenant des composés à fonction mercapto, donnent des rendements améliorés en acide (-) (cis-1,2-époxypropyl)-5 phosphonique. L'effet de 1*addition du composé mercapto est de produire des quantités accrues de 1*antibiotique par rapport à ce qu'on obtiendrait en 1*absence de composé mercapto. Ainsi, des milieux convenables contenant des sources adéquates de carbone et d'azote et des sels minéraux produisent des quantités su-10 périeures d'antibiotique quand on ajoute à de tels milieux un composé à fonction mercapto. Des milieux aqueux comme ceux qu'on emploie pour la production d'autres antibiotiques conviennent pour la production de l'acide (-) (cis-1,2-époxypropyl)phosphonique. De tels mi-15 lieux contiennent des sources de carbone et d'azote qui sont assimilables par le microorganisme, et des sels minéraux. En outre, les milieux de fermentation contiennent des traces de métaux nécessaires pour la croissance du microorganisme qui sont apportées communément sous forme d'impuretés se trouvant dans 20 les autres constituants du milieu. En général, des hydrates de carbone .comme, des sucres, par-exemple le sucrose, le maltose, le fructose, le lactose et ■ analogues et des ami dons comme des grains, par exemple l'avoine et le seigle, l'ami-don de maïs, la farine de maïs et analogues, 25 peuvent être utilisés soit seuls, soit en association comme sour-ces de.-carbone assimilable dans le milieu nutritif. La: quantité exacte de la source ou des sources d'hydrates de carbone dépend ■ en partiejdes autres ingrédients du milieu. On. a trouvé toute-»•:- foist qu'il-suffit d'jine quantité d'hydrate de parbone comprise 30 entre 1 et 6 % en poids du milieu. On peut utiliser une seule source de carbone, ou bien çn peut associer plusieurs sources de carbone dans le milieu. Des sources d'azote satisfaisantes comprennent les innombrables matières protéiques comme diverses formes d'hydroly-35 sats de caséine, farine de soja, liqueur de trempage de maïs, Mistillers. solubles, hydrolysats de levure, pâte de tomates et analogues. Les diverses sources d'azote peuvent être utilisées " seules ou .en. association et en quantité allant de 0,2 à 7 % en 70 02289 2028973 poids du milieu aqueux. Des exemples de milieux convenables pour r la production de l'acide (-} (cis-1,2-époxypropyl)ph.osplionique sont donnés dans les exemples qui suivent. la fermentation utilisant le .microorganisme producteur 5 d'acide (-) (cis-1 « 2-époxyp ropyl)phosphortique peut être conduite à des températures d'environ 25-38°G. Pour obtenir les meilleurs résultats, il convient de conduire ces fermentations à des températures de 26-30°G. Le pH du milieu.nutritif convenant à la croissance du Streptomyces et à la production de l'antibiotique 10 peut varier d'environ 5»5 à 7*5» Bien que le nouvel antibiotique selon l'invention puisse être produit en culture en surface ou en culture submergée, on préfère actuellement effectuer la fermentation en culture submergée. Les fermentations à petite échelle sont con-15 duites en plaçant des quantités appropriées de milieu nutritif dans des fioles, en stérilisant les fioles et leur contenu par chauffage à 120°C, en inoculant les fioles soit avec des spores, soit avec une culture cellulaire végétative d'un Streptomyces produisant de l'acide (-) (cis-1,2-époxypropyl)phosphonique, en 20 bouchant les cols des fioles avec du coton et en laissant la fermentation se poursuivre à une température constante d'environ 28°C pendant 3 - 5 jours. Pour le travail à plus grande échelle, il est préférable de conduire la fermentation dans des cuves appropriées équipées d'une agitation et de moyens d'aération du 25 milieu de-fermentation. Dans cette méthode, le milieu nutritif est préparé dans la cuve et stérilisé par chauffage à 120°C. Après refroidissement le mélange stérilisé est- inoculé avec une source convenable de culture cellulaire végétative du Streptomyces et on laisse la fermentation se poursuivre pendant 2—4 30 jours tout en agitant et/ou aérant le milieu nutritif et en maintenant la température à environ 28°G. Cette méthode de production est particulièrement appropriée à la préparation de grandes quantités du nouvel antibiotique. Pour procéder à la production de l'antibiotique en 35 culture submergée, on peut ajouter au-bouillon de fermentation une petite quantité d'un agent anti-mousse convenable tel que de l'huile de soja, de l'huile de ricin, de l'octadécanol à 1 % dans une huile minérale ou du propylèneglycol polymérisé comme 70 02289 2028973 le Polyglycol 2.000 pour éviter un moussage excessif pendant la f ermentati on. la quantité de composé à fonction mercapto nécessaire pour améliorer le rendement en antibiotique dépend des ingré-5 dients spécifiques du milieu particulier et du composé à fonction mercapto particulier. Une quantité du composé mercapto aussi faible que 50 mg par litre donne des quantités d'antibiotique supérieures à celles qu'on obtient en l'absence du composé mercapto. D'une façon générale on préfère ajouter de 50 à 1000 mg 1Q du composé mercapto par, litre de milieu, bien que des quantités supérieures puissent être utilisées sans affecter la fermentation. La quantité optimale de composé mercapto produisant les rendements maximaux en antibiotique est facilement déterminée expérimentalement en utilisant l'essai à Proteus vulgaris pour 15 dé terminer-la quantité d'antibiotique produite. Dans la mise en pratique du procédé selon l'invention, on peut utiliser divers composés mercapto. Des exemples de ces composés qui peuvent être mentionnés sont la cystéine, l'homo-cystéine, les acyl cystéines comme 1*acétyl cystéine, le glu-20 tatillon et analogues. h:X HMPT.'R 1 Un milieu d'ensemencement (40 ml dans une fiole d'Er-lenmeyer à chicanes de 250 ml) ayant la composition suivante : Amidon de maïs 2 % 25 L-asparagine 0,5 % Citrate de sodium 0,4 % k2 H P04 0,1 % CaCl2,2H20 0,05 % MgS04,?H2Q 0,02 % 30 C0C12,6H20 0,01 % MnS0^,4H20 10 mg/litre GuCl2,2H20 0,25 mg/litre PeS0^,7H20 10 mg/litre HjEOj 0,56 mg/litre 35 eau distillée q^s. est ajusté à pH 6,8 - 7»0 et stérilisé par chauffage à 121° C 2 à 1,05 kg/cm pendant 15 minutes. Le milieu stérilise est inoculé avec Streptomyces fradiae KEEL B-3359 cultivé sur gélose inclinée ayant la composition suivante : 70 02289 -5- 2028973 Amidon de maïs 1 % / L-asparagine * 0,1 % K^PO^ 0,1 % Gélose 2,0% 5 eau du robinet q. s". Le milieu inoctilé est incubé à 28°.G sur une machine à secousses pendant 48 - 72 heures et est utilisé immédiatement ou conservé à 5°C jusqu'à utilisation. " * 1 ml de l'inoculum résultant est ajouté à 50 ml de 10 milieu stérile ayant l'a composition donnée ci-dessus dans des fioles d'Erlenmeyer de 250 ml. On inocule de la même manière d'autres fioles contenant la même quantité de milieu stérile auquel on ajoute une solution de Chlorhydrate de L-cystéine stérilisée par filtration sur Millipore. La concentration-finale en 15 chlorhydrate dé L-cystéinè dans le milieu est 500 mg/ml. Les fioles inoculées sont cultivées sur une machine à secousses à-220 t/mn à 28°C pendant 4 jours. Les cellules sont alors séparées par centrifugatioh et le bouillon clarifié est dilué avec le tampon Tris(hydroxyméthyl)-aminométhane 0,05 M ajusté à pH 20 8,0. La concentration en acide (-) (cis-1,2-épozypropyl)phospho-.. nique produite dans le bouillon de fermentation est déterminée par titrage avec Proteus vul&aris ÏÏESL B-336. Le tableau suivant montre la teneur en antibiotique des bouillons avec et sans addition de L-cystéine dans -trois 25 essais, : " " ' : teneur en antibiotiqueyug/ml -,*' h ' Essai 1 Essai 2 Essai 5 Addition • • Néant ' " -. " 19»3 12,8 30i -,500yug/ml chlorhydrate de L-cystéine .24,8 23,5 24,1 ' . Des résultats analogue s"'sont obtenus quand on utilise - -au lieu de Streptomyces fradiae KÊEL 13-3359 d'autres souches productrices d'acide (-) (cis-1,2-époxypropyl)phosphonique comme Streptomyces.fradiae MRBL.3358, 3359 et 3360, de Streptomyces 35 viridochromoKenes» comme MRKL 3413» 3414, 3415 >.* 3416 et 3427 ou Streptomyces wedmorensis ÎIEEL 3426 Le titrage utilisant Proteus vulgaris HBBL B-3361 est effectué comme suit : 70 02289 -6- 2028973 La culture d'essai est maintenue sous forme d'une culture inelinée sur gélose nutritive (Difco) plus 0,2 % d'extrait de levure (Difco). Les cultures inclinées inoculées sont incubées à 37°C pendant 18 - 24 heures et. conservées aux tempéra-5 tures du réfrigérateur pendant une semaine, des cultures fraîches étant préparées chaque semaine. L'inoculum pour les plaques de titrage est préparé chaque jour en inoculant une fiole d'Erlenmeyer de 250 ml contenant 50 ml de bouillon nutritif (Difco) plus 0,2 % d'extrait de 10 levure (Difco) avec un prélèvement- de la culture inclinée. La fiole est incubée sur une machine à secousses à 37°0 pendant 18-24 heures. La. culture est ajustée à une transmittance de 40 % à une longueur d'onde de. 660 m^u en utilisant, un appareil Spectronic 20 de Bausch & Lomb par addition de 0,2 % d'extrait 15 de levure à la culture. Le bouillon non inoculé sert, de témoin Comme milieu dé titrage on utilise de la gélose nutritive (Difco) plus-0,2 % d'extrait de levure (Difco). Ce milieu 20 est préparé, stérilisé par âutoclavage et abandonné au refroidissement : jusqu'à 50°C. Après que le milieu a été inoculé, on en ajoute 10 ml à des boîtes de Pétri stériles et on,laisse le milieu se solidifier. ?. •- *»• 'r, -, Des échantillons' dac liquide;, surnageant- à titrer sont 25 dilués dans du tampon: tris ]0>05 M à pH 8 à une concentration 'appropriée." Defe' cyliîïdres^de Srinm, dejàiamètre intérieur sont placés'sufelia Hurf'ac^^e^fL plaque^ de gélose, dïessai ; trois cylindres'pour chaque «ehantillon sont normalement, pljacés sur une seule plaque. Trois cylindres sont placés en position alternée 5p par rapport -aux- échantillons et sont remplis avec une solution - . .standard contenant 1,5ytig/ml d'acide (-) (cis-1,2-époxypropyl)-phosphonique-(acide libre). Les plaques sont incubées à 37°C pendant 18.heures et on détermine ..les .diamètres oCes zones en mm. La zone d'inhibition, pour la..solution standard Varié entre 16,5 35 et-19 pa selon les jours, et, de çe fait, on fait une courbe standard avec chaque série de titrages, et l'activité de l'échantillon est déterminée au moyen d'un Homographe. 70 02289 -7- 2028973 EY7MPLE 2 En répétant le mode opératoire de l'exemple 1 en utilisant 500^ug/ml de D,L-homocystéine au lieu de L-cystéine, les titrages des bouillons résultants sont indiqués dans le tableau 5 suivant i Teneur en antibiotique yizg/ml Addition Essai 1 Essai 2 Néant 15,9 12,8 500yUg/ml de D,L-homocystéine 20,1 19,5 10 On obtient des résultats analogues en .utilisant au lieu de Streptomyces fradiae NERL 15-3359 d'autres souches productrices d'acide (-) (cis-1 ,2-époxypropyl)phospiioriique comme Streptomyces fradiae NERL 3358,3359, 3360, Streptomyces virido-chromogenes KRBL 54-15 * 3414, 34-15, 3416 et 3427 ou. Streptomyces 15 wedmorensis NERL 5426 •FrmrPTïFi 3 Dans un autre essai effectué selon les modes opératoires de l'exemple 1, on cultive Streptomyces fradiae NERL 13-5359 dans des milieux avec et sans 500yug/ml d'acétyl-L-20 cystéine avec les résultats suivants : Addition Teneur en antibiotique ^ug/ml Néant 11,0 500yOg/ml d'acétyl L-cystéine 1? ,8 500 yug/ml de chlorhydrate de L-cystéine 14,5 25 ursrFi/rPT.-R 4 Dans une autre expérience effectuée comme décrit dans l'exemple 1, on cultive Streptomyces fradiae NERL B-3359 dans des milieux avec et sans glutathion réduit avec les résultats suivants : 30 Teneur en antibiotique Kg/ml Addition Essai 1 Essai 2 Néant 11 >0 12,8 500yug/ml de glutathion 14,4 16,2 500yUg/ml de chlorhydrate de L-cystéine - 24,1 55 On obtient des résultats analogues en utilisant au lieu de Streptomyces fradiae KEEL 13-3559 d*autres souches productrices d'acide (-) (çis-1,2-époxypropyl)phosphonique comme Streptomyces fradiae NERL 5558, 5559 et; 5560, Streptomyces 70 02289 2028973 viridochromoKertes NERL 3413, 3414, 3415, 3416 et 3427 ou Streptomyces wedmorensis NEKL 3426. "RYTMPLE 5 Dans une autre expérience effectuée comme décrit dans 5 l'exemple 1 sauf qu'on ajoute du glutamate monosodique à 0,1 % auxJ milieux d'ensemencement et de production, on cultive Streptomyces fradiae NERL B-3359 dans des milieux avec et sans chlorhydrate de cystéine et 3),L-homocystéine avec les résultats suivants ï 10 Teneur en antibiotique ^ag/ml Addition Essai 1 Essai 2 Essai 3 Néant 22,7 16,9 25,8 500 ug/ml de chlorhydrate de ' L-cystéine 27,8 25,9 15 500yUg-/ml de D,L-homocystéine 22,3 31,7 ' EXEMPLE 6 Dans une autre expérience effectuée comme décrit dans l'exemple 5 eu utilisant de l'acétyl cystéine et du chlorhydrate de L-cystéine on obtient les résultats suivants ï 20 Teneur en antibiotique yUg/ml Addition Néant 13,1 500ytig/ml d'acétylcystéine 24,6 500yUg/ml de chlorhydrate de L-cystéine 16,5 25 La substance antibiotique, à savoir, l'acide (-) (cis- 1,2-époxypropyl)phosphonique, produite dans les bouillons de fermentation par le procédé selon l'invention peut être séparée par un certain nombre de procédés. ïïn de ces procédés comporte 1'adsorption de l'antibiotique sur des résines échangeuses d*a-30 nions, par exemple des résines composées de groupes ammonium quaternaire ou polyalcoylaminé attachés à un réseau de polymère styrène-divinylbenzène. L'antibiotique adsorbé est facilement élué de l'adsorbat sur résine par des solutions aqueuses ou hy-droaloooliques de sels comme le chlorure d'ammonium, le chlo-35 rure de sodium, lracétate de sodium et analogues. L'éluat ainsi obtenu peut être purifié davantage, si on le désire, par d'autres procédés de purification. Ainsi l'éluat peut être purifié par passage sur un lit de gel de polyacrylamide ayant des dimen 70 02289 -9- 2028973 sions de pores permettant le fractionnement de substances ayant des poids moléculaires entre 200 et 2000. La purification de l'antibiotique peut aussi être obtenue en faisant passer la solution d'antibiotique impur .sur une résine échangeuse de cations 5 fortement acide composée de groupes échangeurs acide sulfonique nucléaire attachés à un réseau de polymère styrène-divinylben-zène et développant la résine à l'eau. L'antibiotique peut aussi être purifié par adsorption sur alumine ; .1 ' alumine basique ou lavée à l'acide convient pour 10 cette purif i c ati on. L'antibiotique adsorbé peut être élue de l'alumine le plus commodément par des solutions aqueuses ou hydroalcooliques d'hydroxyde d'ammonium ayant un pH d'environ 11,2 et en recueillant l'éluat par fractions. La purification des fractions solides impures contenant le sel d'ammonium de 15 l'Antibiotique 833A peut aussi être effectuée en dissolvant le produit dans le méthanol, en ajoutant un volume égal de n-butanc3, en chassant le méthanol par évaporation et en filtrant les parties insolubles dans le méthanol, ce qui donne une solution bu-tanolique contenant le sel d'ammonium de l'antibiotique de pure-20 té accrue. Le sel d'ammonium peut alors être obtenu sous forme solide en évaporant la solution butanolique à sec sous pression réduite. Le sel d'ammonium peut aussi être extrait de la solution butanolique avec de l'eau pour obtenir uhê solution aqueuse du sel d'ammonium de l'acide (-) (cis-1,2-époxypropyl)phospho-25. nique- On prépare le sel de calcium de l'antibiotique en ajoutant -de l'hydroxyde de calcium à la solution aqueuse du sel -, d'ammonium et en chauffant la solution.résultante sous pression réduite. En variante, on peut aussi obtenir lè sel de calcium en faisant passer ,une solution d'un autre sel de l'antibiotique sur 30 une résine échangeuse de cations sur le cycle calcium.'Le sel ■ de calcium cristallise de solutions aqueuses ayant' une concentration, de 10 mg/ml, par-repos ou. avec agitation.' L'acide (-) (çis-1,2-époxypropyl)phosphonique et ses sels sont des agents anti-microbiens utiles qui sont actifs pour 35 empêcher la croissance de.s bactéries gram-positives et négatives. Cet antibiotique, et particulièrement ses sels, sont actifs contre les pathogènes Bacillus, Staphylocoques, Escherichia, SaTmonella et Proteus. Des types de ces pathogènes sont Bacillus 70 02289 -10" 2028973 subtilis, Esch.erich.ia coli, Salmonella Schottmuelleri, Salmonella Kallinarum, Salmonella gullorum, Proteus vulgaris, Proteus mirabilis, Proteus morganii, Staphylococcus aureus et Staphylococcus pyogenes. Ainsi l'acide (-) (cis-1,2 - ép oxyp r opy 1 ) pho sphoni que 5 et ses sels peuvent être employés comme agents antiseptiques pour éliminer les organismes nuisibles des appareillages pharmaceutiques, dentaires et médicaux et autres lieux sujets à l'infection par ces organismes. De même ils peuvent être utilisés pour séparer certains microorganismes de mélanges de microorganismes. 10 Les sels de l'acide (-) (cis-1,2-époxypropyl)phosphonique sont également utiles pour traiter les maladies causées par des infections bactériennes chez l'homme et les animaux et ils sont particulièrement précieux dans ce domaine ear ils sont efficaces contre des souches résistantes de pathogènes. Ces sels sont par-15 ticulièrement précieux car ils sont actifs quand ils sont admi-' nistrés par voie orale, bien qu'ils puissent aussi être administrés par voie parentérale. Quand l'acide (-) (cis-1, 2-époxypropyl)phosphonique ou ses sels sont utilisés pour combattre des bactéries chez 20 l'homme et les animaux inférieurs, ils peuvent être administrés par voie orale sous forme de capsules ou de comprimés ou en solution ou suspension liquide. L'antibiotique peut aussi être administré par voie parentérale en injection. Ces formulations peuvent être préparées en utilisant des diluants, agents de granu-25 lation, de préservation, des liants, agents aromatisants et agents d'enrobage appropriés bien connus de l'homme de l'art. L'acide (-) (cis-1,2-ép oxyp r opy 1 ) pho sphoni que peut être représenté par la formule : H H £-0S 30 H5C-C^ ^C—P "O' OH Cette substance est un composé acide qui est appelé acide (-) (cis-1,2-époxypropyl)phosphonique en accord avec la nomenclature chimique actuelle; le (-) indique que cet acide phospho-35 nique fait tourner la lumière polarisée dans le sens inverse de celui des aiguilles d'une montre (vers la gauche pour l'observateur) quand la rotation du sel disodique est mesurée dans l'eau (concentration 5 %) à 405 myii. La désignation cis utilisée dans 70 02289 -11- 2028973 le nom de l'acide signifie que les atomes d'hydrogène attachés aux atomes de carbone 1 et £ de l'acide propylphosphonique sont du même côté du cycle oxyde. La formule structurelle de cette substance antibiotique a été représentée dans un plan pour des raisons de commodité. Toutefois, l'antibiotique peut aussi être représenté dans l'espace comme suit : 0 OH .P xi r\ ^ ^ 10 \ / \ / XOH JC - G ou C \ 0 AtT -0- \f^03 s °' H P^ ^OH 15 70 02289 -12- 2028973 - REVENDICATIONS - 1 - Procédé de production de l'acide (-) (cis-1,2—-époxypropyl)ph.ospfronique en rendements améliorés caractérisé en ce qu'on cultive xm microorganisme producteur dudit acide en 5 présence d'un composé à fonction mercapto. 2 - Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que le microorganisme est une espèce de Streptomyces. 3 - Procédé selon la revendication 2, caractérisé en c ce que l'espèce de Streptomyces est Streptomyces fradiae. 10 4- - Procédé selon la revendication 2, caractérisé en ce que l'espèce de Streptomyces est Streptomyces viridochromo-genes. 5 - Procédé selon la revendication 2, caractérisé en ce que l'espèce de Streptomyces est Streptomyces wedmorensis. 15 6 - Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que le composé mercapto est la cystéine. 7 - Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que le composé mercapto est l'iiomocystéine. 8 - Procédé selon la revendication 1, caractérisé en 20 ce que le composé mercapto est le glutathion. 9 - Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que le composé mercapto est une cystéine acylée. 10 - Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que le composé mercapto est la D,L-h.omocystéine. 25 11 - Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que le composé mercapto est la L-cystéine.