FR 2043636 A1 19710219 FR 7018580 A 19700521 70 18580 i 2043636 La présente invention concerne d'une-façon générale les photomètres* et plus particulièrement un analyseur, photométrique pour déterminer simultanément la présence'1ï,une substance commune dans un grand nombre d'échantillons, les précipités étant enlevés ^ des échantillons avant leur transfert aux cuvettes respectives, ainsi qu'un procédé d'analyse photométrique. Un analyseur photométrique pour -déterminer simultanément la présence d'une substance commune dans un grand nombre d'échantillons séparés est décrit dans la demande de brevet ]_0 français n° 69 4^59^ déposée le 16/12/69 au nom de la demanderesse. Dans cet analyseur plusieurs chambres ou cuvettes pour les échantillons sont disposées dans un rotor centrifugeur pour constituer un système tournant de cuvettes. Un disque central de transfert facilite le mélange et le transfert des échantillons et des réactifs liquidesdirectement aux cuvettes. Dans certaines réactions intéressant le domaine biochimique les fluides des échantillons et des réactifs forment des précipités du fait du mélange'. Ces précipités gênent les mesures photométriques quand ils sont transférés au système de 20 cuvettes. Dans le système décrit dans la demande de brevet français n° 69 4559^ précitée, il n'existe aucun moyen pour empêcher ce transfert des précipités, et les réactions de précipitation ne peuvent pas être convenablement ajustées. Des filtrats exempts de protéines sont nécessaires 25 dans différents buts parmi lesquels l'estimation des nucléotides solubles dans des acides, des acides non amino et de nombreuses mesures cliniques parmi lesquelles la mesure du sucre dans le sang. Les agents de précipitation utilisés et les rapports entre les échantillons et les réactifs peuvent varier considérablement •jO dans ces essais et mesures. Un essai sensible pour la précipitation complète est le pouvoir absorbant ou absorbance du produit surnageant pour l'ultraviolet. Une protéine sédimentée incomplètement contribue à la fois à l'absorption et à la diffusion, ce qui rend impossible un tel essai. 25 L'invention a pour objet un analyseur photométrique pouvant éliminer les précipités des échantillons avant le transfert aux cuvettes respectives. 70 18580 2 2043636 L'invention a aussi pour objet un rotor à effet centrifuge dans lequel les échantillons liquides et les réactifs formant des précipités peuvent être mélangés et centrifugés dans un système unique pour donner un produit surnageant exempt de précipité. 5 L'invention a aussi pour objet un procédé pour l'ana lyse photométrique d'échantillons dans lesquels peuvent, se former des précipités. L'invention concerne un analyseur photométrique, dans lequel les précipités peuvent être enlevés d'un grand nombre. 10 d'échantillons séparés par centrifugation avant le transfert ' des échantillons aux cuvettes d'un système rotatif de cuvettes. L'appareil comporte un disque central de transfert qui -comporte une première série de chambres retenant séparément les solutions pendant la précipitation quand il est au repos et libérant 15 les solutions vers les chambres de sédimentation respectives pendant la rotation» Une troisième série de chambres reçoit les produits surnageants des chambres de sédiinentation respectives par écoulement par gravité quand le disque de transfert et le système de cuvettes sont amenés au repos. Les produits surnageants 20 peuvent ensuite être transférés par action centrifuge aux cuvettes respectives du système tournant de cuvettes entourant le disque de transfert par entraînement en rotation du disque et du système de cuvettes. Cette combinaison facilite la préparation et la mesure photométrique des produits surnageants exempts de 25 précipités. Les caractéristiques de l'invention ressortiront^plus particulièrement de la description suivante donnée à titre d'exemple, et faite en se référant aux de&s'ins annexés sur lesquels s 50 - la figure 1 représente sehématiquement en coupe un disque de transfert et le système photométrique selon urç, mode de mise en oeuvre de l'invention, et - les figures 2 à 6 réprésentent sehématiquement des phases successives du fonctionnement du disque de transfert de 55 la figure 1 pour le mélange# la sédimentation et le transfert des solutions liquides. 70 18580 3 2043636 La figure 1 représente sehématiquement un analyseur comportant un disque de transfert selon un mode de mise en oeuvre de l'invention. L'appareil comporte un ensemble formant un rotor en galette 1 qui comporte un corps de rotor 2 en acier 5 avec une bride avec des trous taraudés, des anneaux en verre 5 et 4, un anneau à cuvettes ayant dés encoches 5, en polytétrafluoréthylène, des anneaux de retenue en polytétrafluo-réthylène 6 et 7 et un anneau en acier 8 comportant une bride fixée par des vis à la bride du corps 2. Les anneaux 3, 4,-5# 6, 10 7 sont serrés entre le corps 2 du ressort et l'anneau 8 pour former un grand nombre de Guvettes 9 orientées radialeraent dans l'anneau à encoches 5. Des trous espacés 10 alignés axialemènt par rapport aux cuvettes 9, sont formés dans le corps 2, dans les bagues de retenue 6 et 7«fcQarBl:anneau 8 pour constituer des passages 15 axiaux.dartlnrés ■ à. un faisceau de lumière traversant les cuvettes. Un disque de transfert central amovible en deux pièces 11 comporte une série de- chambres 12 pour recevoir des échantillons liquides et les réactifs quand le rotor est arrêté. Chaque chambre 12 comporte plusieurs cavités cylindriques inclinées (dont deux 20 seulement sont représentées) communiquant à leurs extrémités. supérieures, et séparées par des cloisons lj à leurs extrémités inférieures. Les cloisons 13 empêchent le mélange des échantillons et des réactifs liquides quand le rl/tor est à l'arrêt tout en permettant le passage de ces liquides vers les chambres de 25 sédimentation 14 pendant la rotation du rotor. Un passage s'étendant vers l'intérieur et le bas 15 fait communiquer le fond de chaque chambre de sédimentation 14 avec l'extrémité supérieure d'une ehambre de réception 16 située en-dessous de chaque chambre de ; sédimentation. Un passage s'étendant vers 30 le haut et 1 'extérieiff 17 fait communiquer le fond de chaque chambre 16 avec l'extrémité intérieure radial© d'une cuvette 9. Un couvercle transparent amovible en "Lucite" réduit 1'évaporation et empêche.l'échappement des liquides pendant le transfert centrifuge. Un moteur d'entraînement d'un type conve-35 ~~~nable 19 supporte le rotor et le fait tourner. Une source de lumière photométrique et un dispositif de projection projettent un faisceau de lumière d'une intensité constante suivant un axe passant par une cuvette 9 et les trous 70 18580 4 2043636 associés 10 quand la cuvette est dans cet axe. Le faisceau de lumière représenté par une ligne en tirets, sur la figure 1 est réglé pour traverser les trous 10 et la cuvette 9 à leur passage dans l'axe du faisceau» La source de lumière photométrique comprend une lampe à incandescence 20 et un miroir réflecteur 21, le miroir étant monté en dessous du rotor pour diriger le faisceau de lumière réfléchi dans une direction pratiquement perpendiculaire au plan de rotation. Un dispositif ïfaoto-détecteur électronique 22 est monté au-dessus ^ — - ■--*-■■»» .1.. - „ \ du rotor 1 pour recevoir la lumière ayant traversé les cuvettes pendant la rotation. Le dispositif détecteur 22 produit électroniquement un signal proportionnel à la lumière reçue de la source 20 à travers la 'cu^e^te. Le détecteur 22 comprend un tube photomultiplicateur disposé directement au-dessus du cercle de cuvettes pour recevoir la lumière transmise vers le haut à travers les ouvertures alignées axialement. Les autres éléments électroniques représentés sehématiquement sur la figure 1 sont un tachymètre proportionnel 23 qui fournit un signal de tension proportionnel à la vitesse du rotor à un générateur -de signal en rampe 24 qui à son tour fournit un signal à un dispositif analyseur" d'impulsions 25. Un détecteur d® tour 26 synchronise la fréquence du générateur de signal en rampe à la vitesse du rotor.. L'analyseur 25 synchronisé répond proportionnellement aux impulsions fournies par le dispositif photodétecteur 22 et trie les impulsions d'après leur origine. Un dispoéitif de lecture des pointes d'impulsions 27 indique continuellement et simultanément la phototransmittance du liquide contenu dans chaque cuvette. La construction et le fonctionnement des dispositifs électroniques 23 à 27 sont décrits plus en détail dans la demande de brevet français n° 69 43593 déposée le 16/12/69 au nom de la demanderesse. Le fonctionnement d'un analyseur selon l'invention est expliqué ci-après en considérant les figures-2 à 6 sur lesquelles le disque 11 est représenté à plusieurs phases successives du fonctionnement. Comme le montre la figure 2, des suspensions de particules ou des solutions liquides devant être mélangées sont placées dans les chambres 12-pendant que le disque 70 18580 5 2043636 de transfert 11 est arrêtée Le disque de transfert 11 est ensuite accéléré lentement pour provoquer de la façon représentée surH,a figure 3, le passage des liquides des chambres 12 vers Vkésvchambres de sédimentation 14 dans lesquelles les liquides 5 sont mélangés et la réaction de précipitation a lieu. La rotation est maintenue à grande vitesse jusqu'à ee que la matière en particules 30 soit séparée et décantée dans la partie radialement la plus extérieure de chaque chambre de s-édimentation 14 „ Le produit surnageant 31 exempt de précipité ayant une densité 10 inférieure à celle du précipité reste au-dessus du précipité de la façon représentée sur la figure 4 (en considérant bien entendu l'action centrifuge). L'entraînement du disque de transfert est ensuite interrompu pour son retour au repos, et les liquides s'écoulent vers le bas et l'intérieur à travers 15 les passages 15 vers les chambres 16 correspondantes de la façon représentée sur la figure 5„ La force centrifuge empêche le passage prématuré des liquides surnageantsà travers les passages 15, mais quand le disque de transfert vient à l'arrêt la gravitation prédomine pour provoquer l'écoulement dès 20 liquides surnageante à travers les passages 15. Ainsi que le montre la figure 6 le transfert consécutif des liquides surnageants passés dans les chambres 16 est provoqué par une nouvelle rotation qui fait échapper les liquides à travers les passages 17. Bien que les chambres de sédimentation 14 '25 représentées sehématiquement sur les figures 1 à 6 soient particulièrement adaptées pour retenir des précipités formant des pastilles adhérant fermement du fait de la centrifugation, ces chambres peuvent être modifiées pour comporter des cavités de petits diamètres dépassant vers l'extérieur pour contenir 30 des précipités ne formant pas des pastilles adhérant fermement-. L'invention est illustrée plus particulièrement par l'exemple suivant : EXEMPLE Dans un disque à 10 groupes de deux chambres 35 correspondant aux chambres 12 de la figure 2 une chambre de chaque groupe est chargée de 200 microlitres de pàsma humain 70 18580 6 2043636 partiellement hémolyse contenant suffisamment d'hémoglobine pour lui donner une couleur brillante permettant la détection d'une précipitation incomplète. La seconde chambre de chacun de ces 10 groupes est ensuite chargée de 200 microlitres d'une solution 5 de HCIO^ à teneur molaire 0,4 M. Le disque de transfert est ensuite accéléré et décéléré rapidement pour faciliter le mélange, puis est entraîné en rotation pendant 15 minutes à environ 6.850 tours par minute. Le disque de transfert est ensuite arrêté pour permettre le passage des liquides dans les chambres 10 16 de la façon représentée sur la figure 5•-■Un échantillon de 200 microlitres est tiré de chaque chambre 16, dilué avec 5 nil d'eau distillée, et examiné par rapport à de l'eau distillée dans une cellule à trajet de lumière d'un centimètre avec de. la lumière d'une longueur d'onde de 260 nm„ L'absorbance mesurée 15 dans une série de 10 échantillons centrifugés par le disque de transfert, est de 0,186 avec, un écart standard de 0,004 unité d'absorba^ce. Cela représente un essai sévère du systifttfe parce que la concentration du plasma dans des mélangés pouvant être précipités est habituellement bien plus faible. 20 Une série supplémentaire d'essais a été effectuée suivant cet exemple en utilisant des échantillons alternés de teinture et d'eau distillée, pour contrôler si une contamination a eu lieu entre les groupes voisins de chambres. Pour cet essai, les phases décrites par rapport aux figures 2 à 6 sont effectuées 25 pour le transfert des solutions de peinture, et de l'eau distillée des chambres 12 vers les chambres 16. A l'examen des contenus des chambres 16 il n'a été constaté aucune trace de contamination d'une chambre à l'autre. Le principe général de fonctionnement du disque de trans 30 fert décrit ci-dessus est utile aussi s'il n'y a pas de précipité çt Stl deux ou plus de deux solutions doivent être mélangées ensemble, subir une incubation pendant une durée prolongée et être ensuite transférées à un rotor à cuvettes pour l'analyse. Le disque de transfert 11 décrit ci-dessus 35 peut aussi être utilisé en combinaison avec le système pour la mesure et la conservation des échantillons décrits dans la demande de brevet français n° 70 08950 déposée le 12/3/1970 au nom de la demanderesse. 70 18580 7 2043636 La description ci-dessus est donnée seulement à titre d'exemple. îar exemple, le disque de transfert 11 peut être utilisé seul ou conjointement avec un système rotatif de cuvettes de la façon représentée. Quand le disque de transfert est utilisé 5 seul, il peut être appelé plus correctement un rotor. La désignation "disque de .transfert" est utilisé en raison de l'utilisation principale de cet organe conjointement avec le système tournant de cuvettes pour le transfert des liquides aux cuvettes individuelles. 10 Bien entendu, la description qui précède n'est pas limitative, et l'invention peut être mise en oeuvre suivant d'autres variantés, sans que l'on sorte de son cadre. 70 18580 8 2043636 REVENDICATIONS 1 „ Procédé pour l'analyse photométrique d'un grand nombre d'échantillons séparés pour déterminer simultanément la présence d'une substance unique dans ces échantillons caractérisé par l'introduction séparée dans une série de premières chambres 5 d'un rotor pendant que celui-ci est arrêté, de volumes de * liquides réagissant quand ils sont mélangés en produisant des solutions pouvant être mesurées photométriquement5 l'accélération du rotor à une vitesse de rotation à laquelle la force centrifuge provoque le passage de ce liquide de la série de premières chambres 10 à une série de secondes chambres dans lesquelles les liquides sont mélangés, l'augmentation de la vitesse de rotation du rotor jusqu'à une vitesse suffisante pour la séparation des matières solides des liquides contenus dans la série de secondes chambres pour la production de liquides surnageants exempts de matières 15 solides, la décélération du rotor jusqu'à une vitesse pour laquelle la gravitation provoque le passage des liquides contenus les secondes chambres dans une série de troisièmes chambres, l'accélération du rotor à une vitesse de rotation à laquelle la force centrifuge provoque le passage des liquides des troisièmes 20 chambres dans une série de cuvettes correspondantes, et la mesure continue de la phototransmittance des cuvettes pendant la rotation du rotor pour déterminer la concentration de la substance unique dans les liquides contenus dans les cuvettes« 2. Analyseur photométrique de solutions du type à 25 cuvettes tournantes comportant un disque central de transfert entouré d'un certain nombre de cuvettes pour l'analyse d'échantillons, caractérisé par un disque de transfert pour l'envoi dans les cuvettes d'échantillons exempts de matières solides, le disque comprenant un certain nombre de premières chambres pour recevoir 30 et contenir séparément des échantillons et des réactifs liquides quand le disque est à l'arrêt, un même nombre de secondes chambres situées radialement à l'extérieur par rapport aux premières chambres, ces secondes chambres étant disposées pour recevoir les échantillons et les réactifs liquides des premières chambres 35 du fait d'une rotation initiale du disque de transfert et pour retenir les échantillons et les réactifs pendant cette rotation 70 18580 9 2043636 initiale, et un même nombre de troisièmes chambres situées en dessous des secondes chambress ces troisièmes chambres communiqueront avec les secondes chambres pour recevoir au moins une partie du contenu des secondes chambres par écoulement par gra-5 vité quand le disque de transfert est arrêté et ces troisièmes chambres étant disposées pour retenir les liquides reçus des secondes chambres quand le disque est arrêté et pour permettre le passage des liquides vers les cuvettes d®analyse des échantillons quand le disque de transfert est à nouveau entraîné 10 en rotationa 3» Disque de transfert selon la revendication 1S caractérisé en ce que les premières,, les secondes et les troisièmes chambres sont disposées en séries circulaires autour de l'axe de rotation du disque de transfert0 15 4» Disque de transfert selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'un passage orienté vers l'intérieur et vers le bas fait communiquer chaque seconde chambre avec la troisième chambre correspondante. 5. Disque de transfert selon la revendication 1, 20 caractérisé par un passage orienté vers 1*extérieur et vers le haut entre chaque troisième chambre et le pourtour du disque de transfert. 6. Disque de transfert selon la revendication 5, caractérisé en ce que chaque'passage orienté vers l'extérieur et le • 25 haut se termine devant l'une des cuvettes pour l'analyse des échantillons.