FR 2053256 A1 19710416 FR 7028042 A 19700729 70 28042 1 2053256 Cette invention concerne un procédé de clarification de bouillons de fermentation. Plus particulièrement, cette invention concerne un procédé de clarification de bouillons de fermentations fongiques et bactériennes. Les procédés de clarification de cette 5 invention sont utiles dans la préparation d'enzymes,d'antibiotiques, d'acides organiques et d'autres substances utiles. Selon cette invention, il est fourni une méthode par laquelle on peut préparer des enzymes, des antibiotiques, et des acides sensiblement exempts de toutes quantités détectables d'impuretés. 10 En particulier, l'invention fournit une méthode de séparation améliorée des substances désirées qui doivent se trouver dans la phase liquide,d'avac^îipuretés qui sont abandonnées avec la matière insoluble en suspension à la fin du stade de filtration ou de centri fugation. 15 On divise les procédés de fermentation en type bactérien et en type fongique» Cependant, dans les deux procédés on opère sensiblement de la même manière. On utilise les procédés de fermentation'bactérienne pour préparer les enzymes. 20 On utilise lesprocédés de fermentation fongique pour préparer les enzymes, les antibiotiques, et les acides organiques. Les procédés ds fermentation sont bien connus dans la technique. En effet, ils existent depuis des centaines d'années. Actuellement, ces procédés commencent par la préparation sèche 25 de cellules ou de spores de l'organisme, organisme que l'on peut avoir préparé en lyophilysant une suspension des organismes dans un milieu liquide ou une dispersion de 1'organisme,dans du sable ou de la terre; Le premier stade mis en jeu est la croissance d'une culture sur un milieu à l'agar ou similaire. Souvent on utilise 30 en même temps des solutions salines. On met l'agar à incuber jusqu'à ce que la croissance ait été suffisantes ce moment là, on peut prélever les cellules de la surface et les mettre dans un flacon pour agitation. Les flacons pour agitation sont des flacons coniquesnunis ou dépourvus d'encoches dans les parois 35 et on les appelle ainsi eu égard au fait qu'on les place dans une machine qui secoue le flacon soit d'un mouvement rotatoire soit d'un mouvement de va-et-vient, dans une pièce où la température est réglée. Un mouvement d'agitation résulte en une forte augmentation de la vitesse de croissance, probablement grandement 40 due à l'amélioration du transfert d'oxygène et de gaz carbonique 28042 2 2053256 ainsi qu'au fait qu'on a une culture submergée par opposition à une culture simplement en surface. Quelquefois, on utilise plus d'un stade avec un flacon pour agitation pour obtenir assez d'inoculum ou de "semence" pour le premier récipient de culture 5 de semence. Ce récipient consiste en un récipient aéré, où ,1a température est régléepù l'on peut prélever des échantillons et où l'on peut faire des additions pour ajuster le pH et régler la formation de mousse. Lorsque la croissance aura été suffisante, on repiquera la semence dans un second récipient et peut être 10 dans un troisième jusqu'à obtention du volume désiré d'inoculum pour le fermenteur de production. Alors que dans les stades de préparation de la semence, le but était de cultiver des celluxes spécifiques, pour le fermenteur de production le but est de transformer le substrat en substance 15 désirée de la manière la plus économique. A ce stade de l'opération, on désire la formation de produit plutôt que la croissance. Pendantlesétapes de fermentation, la vitesse d'accumulation du produit varie aussi. Une période initiale où la formation du produit est lente est suivie par un stade d'accumulation rapide 20 qui, à son tour, est suivi d'une diminution de la vitesse de formation du produit. L'optimisation des conditions de croissance et de formation du prôiuit, ces conditions comportant.par exemple la température, le pH, le degré d'agitation, et le-besoin cîn oxygène, variera 25 avec la nature du produit que l'on prépare, on considère que le pouvoir de régler ces variables est dans le domaine de l'homme de l'art. Il s'ensuit donc que la mise au point de la récolte du produit final nécessite une coordination et une coopération étroites entre les biologistes qui effectuent l'opération de 30 fermentation, les ingénieurs de projets de l'unité de clarification, et les opérateurs appartenant à la zone de récupération du produit. Dans certains cas la récupération du produit peut faire intervenir la récupération de tout le contenu du fermenteur sans 35 séparation des cellules du milieu, conpe par exemple dans l'élimination des solvants de la bière dans la fermentation acétonique de la bière. Occasionnellement, on peut extraire un produit de la liqueur et un autre produit des cellules. Cependant, d'habitude, le produit désiré se trouve soit dans les cellules soit dans la 40 liqueur. Il s'ensuit donc que le premier stade dans la 70 28042 3 2053256 récupération du produit sera La séparation des deux phases. Souvent on peut aider la séparation par des traitements préliminaires tels qu'ajustement du pH ou réglage de la température. Dans les bouillons de fermentation qui doivent être soumis au procédé de 5 cette invention, le produit désiré est localise dans le filtrat (liqueur). L'homme de l'art sait que le choix du type d'équipement de séparation à utiliser est indépendant et de la nature du solide en suspension et du procédé de récupération ultérieur à utiliser. 10 Généralement parlant, la récupération du produit final est divisés en une opération en deux stades. Le premier stade donne un produit brut de préférence un solide tandis que le second stade donne un produit pur. Le choix du procédé à utiliser dans un cas particulier dépend naturellement de la nature du produit, de sa 15 stabilité dams diverses conditions et de la sélectivité du procédé choisi. Parmi les méthodes de récupération des produits finals de la solution on peut mentionner l'extraction par solvant, la séparation par échange d'ions, l'adsorption ôt la chromato-graphie. 20 II n'est pas besoin de dire beaucoup sur le râle important joué par les produits de fermentation dans la médecine moderne. Le public connaît bien l'utilité des médicaments modernes miracles tels que la pénicilline et la tétracycline qui tous deux sont obtenus par des procédés de fermentation. 25 Dans les aimées récentes on a développé de nombreux emplois nouveaux et élargis, des enzymes fongiques. L'emploi des enzymes fongiques pour transformer 1*amidon et les dextrines en produits alimentaires comestibles sucrés tels que sirops sucrés, tablettes sucrées et dextrose cristallisé n'est que l'une des nombreuses 30 applications des préparations diastasiques d'enzymes fongiques. Dans les quelques mois écoulés on a porté beaucoup d'intérêt à certaines enzymes, à savoir les protéases et les amylases en ce qu'elles peuvent être utiles pour éliminer les taches telles que sang, chocolat, et encre d'étoffes souillées, taches 35 que l'on ne pouvait éliminer jusqu'ici par la seule action d'un surfactif. C'est en raison de ce nouvel intérêt pour l'emploi des enzymes pour éliminer les taches, que l'on a trouvé qu'il était nécessaire d'avoir une méthode plus rapide et moins chère pour sép^-40 rer dîavec/^îâpuretés qui y étaient en suspension le filtrat obtenu 70 28042 4 2053256 dans le milieu de fermentation et qui contenait l'enzyme. C'est pourquoi on a entrepris des essais qui faciliteraient la clarification de ces bouillons enzymatiques. Eventuellement, on a trouvé que le procédé de cette invention pourrait être utilisé non 5 seulement pour aider à la production d'enzymes fongiques, mais sensiblement dans tous les procédés de fermentation dans lesquels le produit désiré se trouvé dans la partie fi'.trat du bouillon de fermentation. Par conséquent, un objet de cette invention est de fournir 10 un procédé pour clarifier les bouillons de fermentation pour obtention d'enzymes et d'antibiotiques. Un autre obj«t de cette invention est de révéler un procédé qui permette des rendements élevés en enzymes et en antibiotiques que l'on doit préparer à partir de leurs solutions. 15 "Un autre objet encore de cette invention est l'élimination des matières solides indésirêes des bouillons de fermentation contenant les produits désirés. Un autre objet de la présente invention est de fournir un procédé de floculation pour séparer les impuretés insolubles en sus-20 pension d'avec les solutions d'enzymes et d'antibiotiques, et d'acides. On réalise ces buts et d'autres buts et avantages par la méthode de la présente invention qui sous son aspect le plus large est basée sur le fait qu'on a découvert que l'on peut ajouter 25 certains agents floculants spécifiques aux bouillons de fermentation pour clarifier lesdits bouillons de manière à ce que les produits finals restés dans la liqueur finale soient exempts d'impuretés qui sont agglomérées par l'agent floculant. 70 28042 5 2053256 On a beaucoup écritsur la nature de la réaction de floculation dans la séparation solide-liquide. Alors que l'on considère que le domaine de la séparation solide-liquide est un domaine complexe, on a beaucoup écrit pour aider ceux qui sont engagés 5 dans cette technique. On se reportera aux publications de La Mer, Black et Riddick par exemple. Est-il besoin de dire que, bien que les termes coagulation et floculation sont souvent utilisés indifféremment, c'est une chose qu'il ne faut pas faire. Le terme floculation doit etre 10 limité à sa signification d'origine dans les limites de la définition du mot latin floculus qui était une petite touffe de laine, ou une structure fibreuse lâche. Selon La Mer, la floculation est habituellement déterminée par l'action de substances de poids moléculaire élevé telles que les polyélectrolytes qui relient 15 par des ponts et ainsi unissent deux particules solides, ou plus, on une structure désordonnée qui est à trois dimensions et d'une nature lâche et poreuse. On estime qu'il n'est pas du domaine de cette demande de brevet de discuter des sujets tels qu'isothermes d'adsorption, 20 cinétique d'adsorption et de désorption,et thermodynamique de la réaction. Il suffit de faire remarquer ici qu'une dispersion colloïdale à laquelle on a ajouté un floculant passera de l'état dispersé à l'état floculé et repassera peut être à l'état dispersé selon 25 l'effet fourni peu: les variables ayant une influence sur la réaction. On voit donc qu'un graphique représentant l'amélioration de la vitesse de filtration (telle qu'elle est mesurée par le temps qu'il faut pour réunir le certain volume de filtrat) représentée en fonction de la concentration du floculant présente un 30 minimum marqué. On voit donc qu'il est possible de déterminer une concentration optimale en floculant pour obtenir une vitesse de filtration maximale. Les autres variables qui ont une influence sur la réaction de floculation comprennent le poids moléculaire du floculant, l'intensité de l'agitation, et la durée d'agitation 35 de la substance dispersée. On considère que le réglage de toutes ces variables est du ressort des artisans versés dans la question de la séparation liquide-solide. On sait que les halogénures cPAmmonium quaternaire ont été utilisés comme substances foculantes dans la préparation de 40 l'acide 6-aminopénicillanique. on se réfère au brevet E.U.A. 70 28042 6 2053256 N® 3.278.391."Alors que dans ce brevet le procédé était tout à fait spécifique c'est-à-dire relatif à la préparation d'un seul composé, le procédé décrit ici est général et concerne n'importe quel bouillon de fermentation. Tandis que dans ce brevet, le pro-5 duit final désiré était aggloméré avec le floculant, ici le floculant n'élimine que les impuretés et le produit désiré demeure dans la liqueur de laquelle on peut l'éliminer par précipitation, extraction par solvant, adsorption par échange d'ions ou volatilisation. 10 Les composés qui constituent le floculant de cette invention sont choisis dans la catégorie (A)des polymères de condensation de polyamines et (B) des polyvinyl imidazolines, ainsi que dans les mélanges de (A) et (B). Plus particulièrement, les composés de la catégorie (A) sont 15 les produits obtenus par réaction de une ou de plusieurs aminés difonctionnelles ou polyfonctionnelles qui contiennent au moins deux groupements aminés, et ont la formule : (I) H2N £ avec un composé de formule : 25 (II) L - CH2 Jz - M dans laquelle L et M sont des parties identiques ou différentes choisies dans le groupe composé du chlore, du brome, de l'iode et du groupement —CH - CH0 et z est un nombre entier de 1 à 4. V 30 0 Les composés de cette catégorie (A) doivent être dans la ■ gamme des poids moléculaires allant d'environ 10.000 à environ 1.000.000, la gamme de 40.000 à 150.000 ayant la préférence. Dans la préparation des composés de catégorie (A) on peut utiliser de nombreux composés de formule (I). Parmi ceux-ci, on peut mentionner les butylène diamine, pentaméthylène diamine, propylène diamine, hexaméthylène diamine, octyl diamine, bishexa- méthylène triamine, bistétraméthylène triamine, biséthylène triamine, tétraméthylène pentaminé, diéthylène triamine, etc... . 40 Parmi les composés de formule (II) utilisés dans ladite 70 28042 7 2053256 xo préparation on peut mentionner les dichlorure d'éthylène, dibromure de propylène, diiodure d'hexaméthylène, épichlorohydrine, oxyde de bramopropylène, oxyde de bromoéthylène, 1 chloro époxybutane, 1,2,3,4, diépoxy butane et 1,2,5,6 diépoxy hexane. Plus particulièrement, les composés de la catégorie (B) sont les polymères polyvinyl imidazolines, c1est-à-dire ceux qui sont des polymères à squelette carboné ayant les formules développées cycliques ramifiées suivantes : (III) - C = N i I R - N CH - T_ 15 dans laquelle T est \ / CH- (CH2)V CH3 20 R est un groupement alcoyle ayant de 2 à 6 atomes de carbone v est un nombre entier de 1 à 3 m est égal à 1 ou O w est égal à 1 ou 0 catégorie dans laquelle on prépare lesdits polymères ayant des formules développées cycliques ramifiées en faisant réagir un composé aminé de formule : 25 (IV) H m H (T) I » N - CH - (CH,) A W H - N - R 30 dans laquelle R, m et w sont tels qu'ils ont été définis précédemment et q est égal à 1 ou 0, avec un polymère ayant un squelette d'atomes de carbone, et contenant plusieurs groupements nitriles ramifiés, le groupements nitrile ramifié étant constitué d'un polymère que l'on a obtenu par polymérisation d'un nitrile non saturé seul ou associé à un monomère à insaturation éthyli-nique. 35 Comme exemples de composés de formule (IV) on peut mentionner l'éthylène aminé, l'éthylène diamine, la propylène diamine, la diéthylène triamine, 1'hexaméthylène diamine, la N-butyléthylène diamine. Comme exemples de nitriles non saturés, on peut mentionner 40 l'acrylonitrile, le méthacry1onitrile, le cyanostyrène, le 28042 8 2053256 vinylidène et le cyanure. Les monomères-à insaturation éthylénique, typiques,que l'on peut copolymériser-avec les nitriles comprennent le butadiène, le 2-pentène, le chlorure de vinyle et 1*acrylamide. 5 On n'a pas d'explication claire du mécanisme de l'efficacité inattendue de ces floculants particuliers. On suppose que le matériau polymère a des liaisons de covalence le long du squelette d'atomes de carbone, de sorte que lorsque deux particules, ou plus, de matières en suspension, dont chacune porte une charge 10 négative, sont attirées par les charges positives du polymère cationique, les particules se trouvent alors "effectivement" liées par covalence. Ceci revient à dire que les deux particules, dont chacune est reliée par liaison ionique au polymère, peuvent donc être considérées comme étant reliées par covalence par des 15 liaisons carbone-carbone covalentes dans le squelette du polymère. On pense que des particules additionnelles se trouvent piégées dans les limites des cavités stéréogéométriques qui existent éntre les particules précitées, désormais neutralisées. On voit que l'on ne peut appliquer cette théorie de piégeage 20 et de liaison par covalence aux systèmes d'ammonium quaternaire étant donné que ces molécules ne possèdent qu'une seule charge positive. Alors que cette théorie peut en effet être un moyen d'expliquer comment fonctionnaitles floculants de cette invention, elle n'expli-25 que pas pourquoi l'on a trouvé que d'autres floculants polymères sont inefficaces dans la clarification de bouillon de fermentation. Selon le présent procédé, on prépare un bouillon de fermentation selon des techniques classiques. Ce bouillon peut être du type fongique ou du type bactérien. 30 Les bouillons bactériens typiques que l'on peut clarifier com prennent les bouillons pour protéases, amylases et lipases. Les bouillons fungiques typiques que l'on peut clarifier par ce procédé comprennent les bouillons pour antibiotiques tels que pénicilline et tétracycline, et les bouillons dont on isole des 35 acides organiques tels que l'acide citrique. Bien que l'on puisse réaliser l'opération de clarification dans le réservoir de fermentation, du point de vue économique il est préférable de transférer le bouillon par pompage ou d'une autre manière dans un réservoir de séjour avant d'appliquer 40 le procédé de cette invention. On ajoute dans le réservoir de 70 28042 9 2053256 séjour un ou plusieurs des agents floculants indiqués précédemment, à raison de 0,05% à environ 5,0% en poids du bouillon total. Souvent, il est souhaitable d'ajouter à"la matière que l'on flocule un adjuvant de filtration tel que celui qui est vendu sous le nom 5 de Supercell. De même que le floculant, on ajoute l'adjuvant de filtration soit en continu soit en discontinu dans le réservoir ou un récipient équivalent tel qu'une cuve. Les particules en suspension, généralement réparties au 10 hasard, ont de 1/lOème de micron à plusieurs microns de longueur et sont aggloméréas par le polymère et s'accumulent en particules séparées dont le domaine granulométrique est plus étroit, à savoir de plusieurs millimètres à environ 1 à 2 centimètres dans leur dimension la plus grande et ainsi sont plus faciles 15 à séparer par centrifugation ou filtration. On filtre le bouillon ou on le centrifuge une ou plusieurs fois selon des techniques connues de manière à ce que les impuretés restent avec le floculant lorsqu'on fait la séparation et que le produit désiré soit dans le filtrat ou le "centrifugat" d'où on comme 20 peut le séparer/par exemple dans le cas de la terramycine, par précipitation. Les autres techniques de séparation comprennent l'échange d'ions et l'extraction par solvant. On voit que l'on peut floculer le bouillon de fermentation soit en continu soit en discontinu avec la même facilité. 25 La possibilité de séparer le filtrat contenant le produit désiré d'avec la matière en suspension, telle qu'elle est réalisée par le procédé de floculation de cette invention, résulte en un rendement plus élevé et en une pureté plus élevée du produit final que ce qu'il a été possible d'obtenir jusqu'ici avec d'autres 30 systèmes de séparation pour un bouillon de fermentation. La raison pour laquelle on obtient des rendements plus élevés en enzymes à partir de la liqueur de préparation, est en relation avec la nature même des enzymes et des antibiotiques eux-mêmas. En solution aqueuse, ces produits sont instables et 35 tendent à se décomposer. On voit donc que dans un système de filtration normal à /^inSuièrielle, qui peut prendre de 10 à 12 heures par opération, une grande quantité de produit sera perdue en raison de la décomposition. Cependant, en utilisant la composition floculante telle que révélée ici, on a trouvé que pour une opéra-40 tion de même dimension, la durée de filtration peut être abaissée 28042 10 2053256 jusqu'à 6-8 heures-C'est à la fin de cette opération de filtration l'on isole le produit désiré de la solution, comme par exemple par séchage. Etant donné qu'il s'est décomposé moins de produit, on voit que le rendement final sera plus élevé. 5 II est également important de noter que les agents floculants utilisés ici n'ont pas d'effets nocifs sur le produit que l'on doit recueillir. 70 28042 11 2053256 Il y a plusieurs avantages à tirer de l'utilisation du procédé de floculation de cette invention, avant la séparation de la liqueur contenant le produit désiré d«'avec les solides indésirables. Alors que l'on ne dispose pas d'études de vitesse pour les 5 séparations par centrifugation et par échange d'ions, on a trouvé que les vitesses de filtration ont été augmentées jusqu'à 300%. On a trouvé que la turbidité de la liqueur finale était moins importante, ce qui est une indication de la pureté du produit final, et cela est dQ à l'élimination de l'excès d'insolubles 10 tels que la matière nutritive, par les agents floculants utilisés ici. Souvent on a trouvé que la quantité d'agent décolorant à utiliser pour obtenir la couleur désirée peut être réduite. On a également trouvé que l'on abaissait le nombre de spores 15 viables de 50% en soumettant le bouillon à ce traitement floculant. On sait que les spores viables, laissées sanssurveillance, vont mQrir et contribuer finalement à la dégradation du produit désiré. La production de ces enzymes par culture de microorganismes 20 dans un substrat nutritif liquide est une méthode bien connue dans l'industrie de la fermentation, et on la réalise dans un milieu de culture approprié contenant une source de carbone assimilable, une source d'azote digestible et d'autres éléments nutritifs néceâsaires à la croissance des champigrions ou des bactéries, 25 et par récupération à partir du bouillon résultant de l'enzyme désirée. Pour l'incubation, on peut utiliser un moyen connu en général, applicable à l'incubation des enzymes, par exemple, une culture solide utilisant du son dfe blé, une culture statique • utilisant 30 un milieu de culture liquide, une culture agitée et une culture immergée. Comme source de carbone assimilable on peut utiliser un glucide,ou plusieurs,entre l'amidon soluble, le glucose, le maltose, le saccharose et tout autre glucide approprié, et 35 comme source d'azote digestible, des substances ou des composés organiques tâlû que liqueur de. "cornsteep", son de blé, extrait de levure, extrait de viande, peptone, caséine et urée, et/ou comme source d'azote minéral on peut utiliser par exemple, des nitrates minéraux tels que nitrate de sodium et nitrate de 40 potassium ou des sels minéraux d'ammonium tels que sulfate 70 28042 12 2053256 d'ammonium, carbonate d'ammonium, phosphate d'ammonium et nitrate d'ammonium. On peut, si l'on veut, utiliser des sels minéraux, par exemple, des sels de sodium, des sels de potassium, des sels de calcium, des sels de magnésium, et des phosphates. 5 Cet exemple illustre la préparation d'un bouillon de fermen tation que l'on peut clarifier par le procédé de cette invention. "L'organisme choisi à utiliser est placé dans un milieu de développement sous forme d'une suspension bactérienne. Lorsqu'on désire utiliser le système enzymatique choisi, on transfère les bactéries dans un milieu- stérile et on met à incuber à une température de 20-35°C et de préférence à une température de 25-27°C pendant une durée de 24 à 120 heures. Ensuite on transfère aseptiquement le bouillon dans un fermenteur contenant une plus grande quantité du milieu de développement stérile. De nouveau on effectue l'incubation pendant une durée de 20-30 heures à une température de 20-35°C sous agitation constante et sous une aération suffisante pour maintenir tout le temps de l'oxygène dissous. On peut effectuer cette aération commodément en faisant barboter de l'air ou de l'oxygène dans le mélange de fermentation. Si l'on désire une grande quantité de cellules bactériennes, il peut être souhaitable de transférer de nouveau le bouillon final comme décrit dans un fermenteur plus grand contenant le même milieu, une quantité suffisante, par exemple, de manière à représenter un inoculum à 7,5%. On effectue de nouveau la fermentation dans les conditions décrites antérieurement. On transfère alors par pompage le produit bouillon final dans un réservoir de séjour." On utilise de la même manière le mode opératoire de culture 30 décrit ci-dessus pour préparer un bouillon de fermentation fongique. Parmi les genres d'organismes que l'on peut cultiver par une telle méthode, on peut mentionner les genres aspergillus, pénicillium, bacillus, les genres coliformes et clostridium. 35 Dans les exemples ci-après qui sont illustratifs de la préparation du floculant utilisé dans ce procédé, les parties et les pourcentages(sont donnés en poids sauf spécification contraire. EXEMPLE I 40 On a ajouté 674 grammes de polyhexaméthylène polyamine de qualité technique à 721 grammes d'eau et on a chauffé le mélange à 75°C. On a ajouté goutte à goutte 135 grammes d'épichlorhydrine au mélange, tout en agitant le mélange. Lorsque l'on a eu ajouté 70% d'.épichlorhydrine, on a commencé à ajouter en même temps 117 grammes d'hydroxyde de sodium (concentration de 50 pour cent). Lorsque l'on a eu fini d'ajouter de 1'épichlorhydrine, il y avait encore approximativement 53 grammes d'hydroxyde de sodium à ajouter. 10 15 20 25 28042 13 2053256 Pendant ces deux additions on a maintenu la température à environ 75° et le pH était d'environ 9,7. On a ajouté assez d'une solution de HjSO^ concentrée à 50 pour cent pour abaisser le pH à 5,0. On a ajouté assez d'eau pour que le volume total soit porté à 5 3500 cc. EXEMPLE II On a dilué de la bis-hexaméthylène triamine puœavec de l'eau pour obtenir un produit qui avait un équivalent aminé de 11,5. A 100 grammes de ce mélange d'eau et d1 aminé, on a ajouté encore 10 146 grammes d'eau. On a ajouté 53 grammes d*épichlorhydrine en l'espace de 90 minutes. On a maintenu le pH à 9,5 en ajoutant occasionnellement de la soude caustique. On a maintenu la température dans les limitesde 60 à 65°C. Lorsqu'on a eu fini d'ajouter 1*épichlorhydrine, on a ajouté 75 grammes d'eau et assez d'acide 15 sulfurique concentré pour abaisser le pH à 5,0. On a dilué le mélange à un volume de 900 cc. La viscosité de ce produit final est 100 cps à 25°C. EXEMPLE III On a chauffé 465 grammes de 1,6-hexane diaïitine à 90°C. On a 20 ajouté 146 grammes de dichlorure d'éthylène en l'espace de deux heures tout en maintenant la température à 90°C. On a ajouté assez d'eau au système pour maintenir la viscosité au-dessous de 500 cps. Lorsqu'on a eu achevé d'ajouter le dichlorure d'éthylène on a laissé la réaction se poursuivre encore deux heures. A la même 25 température on a ajouté la quantité d'acide sulfurique nécessaire pour abaisser le pH à 4,5. Le poids total final du produit a été amené à 3.330 grammes avec de l'eau. ' EXEMPLE IV On a dilué de la bis-hexaméthylène triamine pure avec de l'eau 30 pour obtenir un produit qui avait un équivalent d'aminé de 11,5. A 100 grammes de ce mélange eau-amine on a ajouté encore 146 grammes d'eau. On a ajouté 53 g ïammes d'épichlorhydrine en l'espace de 90 minutes. On a maintenu le pH à 9,5 en ajoutant occasionnellement de la soude caustique. On a maintenu la température dans les 35 limites de 60 à 65°C à la pression atmosphérique. Lorsqu'on a eu fini d'ajouter 1'épichlorhydrine, on a ajouté 75 grammes d'eau et assez d'acide chlorhydrique concentré pour abaisser le pH à 5,0. On a dilué le mélange à un volume de 900 cc. La viscosité de ce produit final est lOO cps à 25°C, mesurée par le système Brookfield. 28042 14 2053256 EXEMPLE V On a dilué de la tétraéthylènepentamine pure avec de l'eau pour obtenir un produit qui avait un équivalent d'aminé de 6,0. A 100 grammes de cette aniine à une température de 60-10°C on a 5 ajouté en l'espace de 90 minutes 38 grammes de 4-bromo-l,2-époxy butane. On a maintenu le pH du mélange de réaction à 9,5 en ajoutant périodiquement de la soude caustique. Lorsqu'on a eu ajouté tout le 4-bromo-l,2-époxy butane, on a ajouté 100 grammes d'eau et assez d'acide sulfurique pour amener le pH à 5,0. On a dilué 10 le produit final à 1.000 cc et il avait une viscosité de 100 cps à 25°C. EXEMPLE VI En l'espace de 2 heures, on a ajouté lentement 100 grammes, de 1,4-dibromo-butane à 150 grammes de 1,6-hexane diamine à une 15 température de réaction de 90°C. On a maintenu la viscosité de la masse de réaction à une valeur inférieure à 700 cps en ajoutant occasionnellement de l'eau. Lorsqu'on a eu ajouté tout le 1,4-di-bromo butane, on a maintenu la température de réaction à 90°C pendant encore 2 heures. Lorsque la réaction a été achevée, on a 20 ajusté le pH à 5,0 avec de l'acide sulfurique et on a dilué le produit à 1.000 grammes avec de l'eau. Les exemples VII à IX illustrent la préparation de composés de la catégorie (B). EXEMPLE VII 25 A un flacon muni d'un purgeur à azote et contenant 400 grammes de toluène, 27 grammes d'un homopolymère d'acrylonitrile de viscosité moyenne, de poids moléculaire égal à lO.OOO, on ajoute lentement,à 60-70°C,65 grammes d'hexanediamine pure en l'espace de 2 heures. On maintient la réaction à 60-70°C jusqu'à ce que 30 le dégagement d'ammoniac cesse. On évapore le produit à sec. EXEMPLE VIII Dans un récipient contenant 800 grammes de benzène, 185 grammes d'un polymère, que l'on prépare en polymérisant du cyanostyrène avec du butadiène dans la proportion de 1,4, on ajoute 15 grammes 35 d'éthylène diamine, en atmosphère inerte, dans des conditions de réaction sensiblement similaires à celles de l'Exemple VII. EXEMPLE IX On peut préparer de la même manière, un produit dérivé de la réaction de la diétliylène triamine et d'un polymère provenant de 40 la polymérisation du méthacrylonitrile. 28042 15 2053256 Ces exemples illustrent quelque uns des avantages que l'on peut obtenir en utilisant le traitement floculant de cette invention. EXEMPLE X 5 A un bouillon de fermentation de protéase classique on ajoute 5% en poids d'un adjuvant de filtration constitué de terre à diatomées. On filtre ce mélange en utilisant un filtre sous vide que l'on a pré-enduit d'un adjuvant de filtration. On trouve que 2 la vifeesse de filtration est de 12,2 lttn de surface filtrante 10 par minute. On trouve que le filtrat a une turbidité si élevée qu'il est nécessaire de répéter le procédé précédent. On répète le procédé en utilisant un lot frais d'adjuvants de filtration. On trouve que la vitesse est de 11,4 l/m de surface filtrante par minute. Le produit final est toujours trouble, 15 observation faite à l'oeil nu. Lorsqu'on réalise le mode opératoire précédent avec 1-1/2% d'un floculant polymère, obtenu en faisant réagir la polyhexaméthylène polyamine avec 11épichlorhydrine de la manière décrite antérieurement, et qu'on l'ajoute au bouillon, on trouve que la vitesse de 20 filtration est de 16,3 l/m de surface filtrante. Le liquide n'est pas sensiblement trouble et il n'est pas nécessaire d'effectuer une seconde opération de filtration. EXEMPLE XX On filtre un échantillon de 100 grammes de bouillon de tétra-25 cycline, que l'on a traité avec 5 grammes d'un adjuvant de filtration, sur un entonnoir de Buchner que l'on a préalablement enduit de 2 grammes d'un adjuvant de filtration constitué de terre à diatomées, à une vitesse de filtration de 31 ml par minute. Le filtrat est trouble, et contient de la matière en suspension 30 résiduelle. Pour essayer d'obtenir un produit plus limpide, on effectue une seconde filtration à une vitesse de 40 ml/minute sur un adjuvant de filtration neuf. Ce filtrat est moins trouble. Lorsqu'on ajoute 2% en poids d'un floculant obtenu en faisant réagir la polyhexaméthylène diamine et 1'épichlorhydrine, 35 on trouve que la vitesse de filtration pour le premier essai est d'environ 40 millilitres par minute. Etant donné que le filtrat a la limpidité d'un cristal, il n'est pas nécessaire de faire une autre filtration. On voit que comparativement aux témoins, on obtient un produit 40 limpide, sensiblement exempt d'impuretés, à une vitesse plus grande 28042 16 2053256 et avec moins de^séparationspar filtration lorsqu'on ajoute le floculant au bouillon avant la séparation. EXEMPLE XII On dissout un échantillon du produit obtenu selon la méthode 5 de l'Exemple VII, dans une solution diluée d'acide sulfurique de manière à ce qu'ils'y trouve dissout 10% en poids de polymère. A 100 grammes d'un bouillon de fermentation d'amylase classique, qui contient des impuretés solides en suspension, on ajoute 3 grammes d'adjuvant de filtration constitué de terre à diatomées. 10 A cela on ajoute 20 grammes de la solution à 10% de polymère dans l'acide sulfurique. On filtre ce mélange total sur un filtre à vide que l'on a préalablement recouvert d'un adjuvant de filtration. La quantité de filtrat recueillie en un temps donné est plus grande dans le cas où on a ajouté la solution de polymère 15 floculant au bouillon que dans le cas du témoin sans polymère. On estime que la limpidité dans le premier essai de filtration avec addition du polymère est assez bonne pour ne pas justifier une seconde opération de filtration. Ce n'est pas le cas avec le témoin. 20 EXEMPLE XIII On note des observations analogues lorsqu'on utilise le produit polymère de l'Exemple VIII comme agent floculant pour les bouillons de fermentation. Comme il a été décrit, l'utilisation des composés floculants 25 déterminés comme il est décrit ici, fournit une séparation plus efficace du filtrat, du centrifugat, etc., d'avec les impuretés solides indésirables. Cette séparation plus facile et plus efficace résulte en rendements accrus et en dépenses plus faibles de temps et d'argent étant donné que le nombre de séparations successives 30 peut être diminué, comme on l'a montré. En outre, il n'y a pas d'effet nuisible su-r le produit final, acide, enzyme ou antibiotique, ét la quantité de produit perdu est sensiblement nulle. On voit donc que la mise au point d'un procédé de floculation de . bouillons de fermentation est d'une importance sensible. 35 Etant donné que l'on peut faire certaines modifications dans le produit précédent et également dans le procédé sans s'écarter du domaine d'application de l'invention considérée ici, il est entendu que tout ce qui est dit dans le mémoire précédent doit être interprété comme illustrâtif et non dans un sens limitatif. 28042 17 2053256 REVENDICATIONS 1. Un procédé de séparation de la portion liquide voulue d'un bouillon de fermentation d'avec les impuretés en suspension, caractérisé en ce que l'on ajoute un floculant au bouillon avant 5 la séparation. 2. Un procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que le floculant comporte au moins l'un des polymères de condensation cbpolyamines préparé s en faisant réagir au moins une aminé poly-fonctionnelle qui contient au moins deux groupements aminé, lesq 10 quelles aminés polyfonctionnelles ont la formule : HjN C (CHQ)^ - NH J - H dams laquelle Q est l'hydrogène, un groupement alcoyle ayant de un à quatre atomes de carbone, ou un groupement aminoalcoyle dans lequel la partie alcoyle contient de on à quatre atomes de 15 carbone; x est un nombre entier de 2 à 8 compris, et y est un nombre entier de 1 à 4 compris; avec un composé de formule L - C CH2 _7z - M dans laquelle L et M sont les entités identiques ou différentes et sont le chlore, le brome, l'iode, ou le groupement - CH - CI^ 20 V et z est un nombre entier de 1 à 4 compris. 3. Un procédé selon la revendication 1 ou 2, caractérisé en ce que le floculant ajouté est le produit de réaction obtenu en polymérisant une polyhexaméthylène diamine avec un membre choisi 25 dans le groupe composé de 1'épichlorhydrine et du dichlorure d'éthylène. 4. Un procédé selon la revendication 1, 2 ou 3, caractérisé en ce que le procédé de séparation consiste à filtrer ou à centrifuger. 30 5. Un procédé selon la revendication 1, 2, 3 ou 4, caractérisé en ce que l'on utilise un adjuvant de filtration conjointement avec le floculant. 6. Un procédé pour séparer la portion liquide d'un bouillon de fermentation d'avec Jes impuretés solides en suspension trouvées 35 dans celui-ci, caractérisé en ce que l'on flocule le bouillon et qu'ensuite on sépare le bouillon d'avec lesdites impuretés. 7. Un procédé selon la revendication 6, caractérisé en ce que l'opération de floculation consiste à ajouter au bouillon de fermentation, 40 au moins l'un des polymères de condensation de polyamines 28042 1S 2053256 préparés en faisant réagir au moins une amirie polyfonctionnelle qui contient au moins deux groupements aminé, lesquelles aminés polyfonctionnelles ont la formule : I^N C (CHQ)x - NH - H 5 dans laquelle q est l'hydrogène, un groupement alcoyle comprenant de un à quatre atomes de carbone, ou un groupement aminoalcoyle dans lequel la partie alcoyle contient de un à quatre atomes de carbone; x est un nombre entier de 2 à 8 compris, et y est un nombre entier de 1 à 4 compris; avec un composé de formule 10 L - -7"z ~ M dans laquelle L et M sont les entités identiques ou différentes et sont le chlore, le brome, l'iode ou le groupement - CH - CH0 V et z est un nombre entier de 1 à 4 compris. 15 8. Un procédé selon la revendication 6 ou 7, caractérisé en ce que l'opération de floculation consiste à ajouter au bouillon de fermentation, le produit de réaction obtenu en polynérisant de la polyhexaméthylène diamine avec un membre choisi dans le groupe composé de 1'épichlorhydrine et du dichlorure d'éthylène. 20 9. Un procédé selon la revendication 6, 7 ou 8, caractérisé en ce que l'on ajoute un adjuvant de filtration au bouillon avant de faire la floculation. 10. Un procédé selon la revendication 6, 7, 8 ou 9, caractérisé en ce que l'on effectue la séparation en filtrant. 25 11. Un procédé selon la revendication 1 ou 6, caractérisé en ce que le floculant comporte au moins une des polyvinyl imidazolines qui ont une structure cyclique ramifiée de formule - C = N l I 30 R - N CH - T \ / CH2 dans laquelle T est un groupement /"(CH.) CH,_/ 2 V J et R est un groupement alcoyle ayant de 2 à 6 atomes de carbone v est un nombre entier de 1 à 3 35 m est égal à O ou 1 w est égal à O ou 1 12. Un procédé selon la revendication 1 ou 6, caractérisé en ce que le floculant ajouté est préparé par réaction d'acrylonitrile polymérisé et d'hexane diamine. 28042 19 2053256 13. Un procédé selon la revendication 1 ou 6, caractérisé en ce que le £loculant est un mélange d'au moins un polymère de condensation de polyamineset d'au moins une polyvinylimidazoline.