FR 2051711 A1 19710409 FR 7025818 A 19700710 70 25818 „x '2051711 En effectuant la récupération d'un produit de fermentation . à partir d'un bouillon de fermentation, habituellement on filtre ou on centrifuge le bouillon entier pour séparer la masse cellulaire qui s'est développée et les solides en suspension. Ensuite 5 on isole du filtrat limpide les produits microbiens solubles par des modes opératoires bien connus de l'homme de l'art. On peut, par exemple, précipiter les produits, les adsorber et les éluer du charbon activé, les séparer sur résines échangeuses d'ions ou les extraire par des solvants organiques non miscibles à l'eau. 10 La quantité de produit de fermentation désiré que l'on trouve dans le filtrat du bouillon de fermentation peut ne pas être une mesure vraie du rendement de fermentation total. Les antibiotiques et autres produits de fermentation peuvent être fortement liés aux matières protéiniques en suspension ou bien liés chimiquement 15 et physiquement à la masse cellulaire du micro-organisme en fermentation. Les produits microbiens liés ou non utilisables sont abandonnés dans le procédé de clarification. On a découvert que certaines enzynes, de préférence des protéases, des cellulases et le lysozyme, lorsqu'on les ajoute 20 aux milieux de fermentation séparément ou associéss avec un agent de chélation pendant ou après le processus de fermentation à raison d'au moins 10 ppm en pds/v, ont le pouvoir de solubiliser les antibiotiques et les produits microbiens apparentés liés aux solides en suspension ou contenus dans les membranes cellu-25 laires du micro-organisme de fermentation. Ce phénomène augmente d'environ 5 à environ 15% ou plus, la quantité de produit de fermentation récupérable dans les filtrats de bouillonsclarifiés. On réalise commodément le procédé de cette invention en ajoutant l'enzyme choisie, seule ou associée à un agent On obtient les meilleurs résultats en utilisant au moins environ 10 ppm en pds/v de l'enzyme et environ 10 ppm en pds/v de l'agent de chélation. Alors que l'on peut utiliser, si l'on 40 veut, des concentrations d'enzyme sensiblement supérieures, par 70 25818 2 2051711 exemple jusqu'à 5% ou plus, il n'y a ordinairement aucun avantage supplémentaire à utiliser plus d'environ 100 ppm en pds/v. La température et le pH de traitement ne sont pas essentiels, et à ces points de vue il n'est pas nécessaire de faire des change-5 ments spéciaux dans le procédé normal. L'effet de solubilisation ou de possibilité d'obtention accruede produits de fermentation fournis par les enzymes, avec ou sans agents de chélation, peut être étendu à une large gamme de produits microbiens. Les applications spécifiques comprennent lOles augmentations des quantités récupérables d' antibiotiques du type tétracycline (tétracycline, chlortétracycline, oxytétracycline), de streptomycine, dJoléandomycine, de pénicilline et de pénicillin-acylase (l'enzyme qui hydrolyse la benzylpénicilline et les autres pénicillines en acide 6-aminopénicillanique). 15 Alors que certaines enzymes industrielles brutes telles que les cellulases et les chitinàses sont partiellement efficaces, on obtient même des meilleurs résultats en utilisant des protéases. Ces enzymes dégradent les protéines et leurs produits de dégradation, les polypeptides, les peptides et autres substances, en 20 hydrolysant les liaisons -C0-NH-. On dispose d'un grand nombre . de préparations commerciales d'originesvégétale, animale et microbienne qui ont le pouvoir d'hydrolyser les liaisons amide et de digérer lés protéines et les substances protéiniques^, Ces protéases comprennent les enzymes telles que pepsine, trypsine, 25 chymotrypsines, papaîne, broméline, ficine, etc. L'enzyme préférée pour ce procédé est le lysozyme, une muramida'se qui hydrolyse la liaison /3-1,4-glyçosidi.que entre l'acide N-acétylmuramique et la N-acétylglucosamine dans le mucopolymère des membranes cellulaires microbiennes. Certaines 30 enzymes bactériennes lytiques (souvent décrites comme lysozymès • bactériens) possèdent des propriétés qui sont très analogues à l'action du lysozyme présent dans les oeufs, Le lysozyme du blanc d'oeuf est le plus connu des lysozymès disponibles dans le commerce. 35 Alors que certaines des activités des enzymes ont été décrites précédemment, leur mode'd'action dans le nouveau procédé n'a pas.été encore bien établi , et le champ d'application de la présente invention ne doit pas être limité à. une théorie ou à un mécanisme particulier. 40 On a trouvé que les bouillons de fermentation traités par ,70 25818 3 ,2051711 les enzymes sont filtrés plus rapidement et plus facilement que les bouillons non traités. Ceci facilite à un degré considérable ce stade qui prend du temps, qui est associé à de nombreux procédés de fermentation. 5 On a également trouvé qu'un agent de chélation a un effet bénéfique en augmentant la quantité récupérable d'antibiotiques, notamment des types tétracycline qui sont fortement liés par le calcium ou le magnésium. Dans le mode de réalisation préféré de cette invention, on utilise l'acide éthy1ènediamine tétra-10 acétique en association avec une enzyme chacun étant à une concentration d'au moins 10 ppm en pds/v. Les exemples suivants sont donnés pour illustrer plus en détailela présente invention, mais ils ne doivent pas être considérés comme en limitant le champ d'application. 15 EXEMPLE I On ajoute du lysozyme {chlorure de lysozyme; 900 unités/mg, Eisai Co., Ltd., Japon) à un bouillon entier de fermentation de S.rimosus à 1 ' oxytétracycline., à raison d ' approximativement 30 ppm en pds/v à la fin du cycle de fermentation, on agite le bouillon 20 pendant 3-5 heures à une température de 28°C, On acidifie le bouillon par l'acide sulfurique jusqu'à pH 2,0-2,2 et on le filtre. L'activité du filtrat limpide, évaluée par la méthode de l'essai turbidimétrique avec Klebsiella pneumoniae, est supérieure de 1% à celle obtenue avec le bouillon entier non traité. 25 EXEMPLE II Approximativement 48 heures avant la fin du cycle de fermentation de S.rimosus pour oxytétracycline, on ajoute du lysozyne et de l'acide éthylènediamine tétraacétique au bouillon de fermentation à raison de lOO ppm en pds/v de chacun d'eux. On laisse 30 le phénomène de fermentation évoluer de la manière habituelle. Ensuite on acidifie le bouillon entier, on le filtre et on l'évalue. L'activité du filtrat limpide est supérieure de 10% à celle du bouillon témoin (fermentation normale sans lysozyme et acide éthylènediamine tétraacétique). 35 EXEMPLE III On répète le procédé de l'Exemple I en utilisant la broméline (Broméline, 500 unités/mg, Meji Seika Co., Ltd„f Japon) au lieu du lysozyme,avec des résultats comparables. EXEMPLE IV 40 On ajoute du lysozyme à du bouillon entier de fermentation 70 25818 4 2051711 de S.aureofaciens à la chlortétracycline à raison de 50 ppm en pds/v à la fin du cycle de fermentation. On agite le bouillon pendant 3-5 heures à une température de 28°C. Ensuite on acidifie le bouillon entier avec de l'acide sulfurique jusqu'à pH 2,0-2,2 et 5 on le filtre. L'activité du filtrat limpide est de 9.200 "^/ml comparativement à 8500 V'/ml pour le témoin non traité. EXEMPLE V On ajoute de la protêase (Neulase, 7 unités/mg, Amano Pharma. Co., Ltd. japon) à raison de 50 ppm, pds/v, au bouillon de 10 S.aureofaciens à la chlortétracycline à la fin du cycle de fermentation, et on agite pendant 2 heures à 28°C avant de filtrer. Le bouillon filtré titre 10.000 ^/ml comparé à 8700 % /val. pour du bouillon non traité. EXEMPLE VI 15 A la fin d'un cycle de fermentation de S.aureofaciens pour chlortétracycline, on ajoute du lysozyme à raison de 30 ppm en pds/v. On agite le bouillon pendant approximativement 5 heures à 28°C. Ensuite on acidifie le bouillon entier au-dessous de pH 2,5, on le filtre et on le titre. L'activité est de 16.000 /ml 20 comparativement à 14.700 % /ni pour le témoin de fermentation (sans addition de lysozyme). EXEMPLE VII On répète le procédé de l'Exemple V en utilisant la protéase (Ce 207,10 unités/mg, Amano Pharma. Co., Ltd., Japon) au. lieu du 25 lysozyme, avec des résultats comparables. EXEMPLE VIII On ajoute du lysozyme à un bouillon de fermentation de S.aureofaciens à la tétracycline à raison de 20 ppm en pds/v et on agite pendant 20-24 heures à 28°C.- On acidifie le bouillon 30 entier au-dessous de pH 2,5, on le filtre et on 1*évalue. L'activité du filtrat limpide est supérieure de 12% à celle du bouillon non traité. EXEMPLE m On répète le procédé de l'Exemple V en utilisant la papaïne 35 au lieu du lysozyme, avec des résultats comparables. EXEMPLE X On répète le procédé de 1'Exemple IX avec du bouillon de S.griseus à la streptomycine au lieu de bouillon de S.aureofaciens à la tétracycline, en obtenant un accroissement comparable de 40 l'activité par rapport à celle du bouillon non traité. 70 25818 5 2051711 EXEMPLE XI On répète le procédé de l'Exemple X, avec du bouillon de S.antibioticus à l'oléandomycine. au lieu de bouillon de S.griseus à la streptomycine, avec des résultats comparables. • * 5 EXEMPLE XII On ajoute du lysozyme à raison d3 environ 100 ppm en pds/v à un bouillon entier de fermentation d®une culture de Proteus rettgeri, ATCC n° 9918/ fermenté antérieurement pendant environ 22 heures. Ensuite on agite le bouillon pendant encore 3-6 heures. On déter-10 mine la quantité de pénicillinacylase présente en ajoutant de.la benzylpénicilline qui est hydrolysëe- en acide 6-aminopéni.cilianique. On filtre le bouillon, on 1°ajuste à pH 2,5-3,0 par de 1■acide chlorhydrique dilué et on l'extrait par la méthylisobutylcétone ' pour éliminer la benzylpénicilline non transformée. On porte le 15 pH de la phase aqueuse contenant l'acide 6-aminopénicillanique à 7,5, et on ajoute.du chlorure de phénylacétyle. Après avoir • laissé 50 minutes à la température ambiante en agitant continuellement, on ajuste le pH à 6,5 et on fait un bioessai pour ' évaluer la benzylpénicilline..On obtient des concentrations. 20 de pénicillinaeylase notablement plus élevées avec le bouillon -traité au lysozyme qu'avec le bouillon non traité. • *. - ■ EXEMPLE- -XIII Approximativement 48 heures avant la fin ds un cycle de fermentation de S.aureofaciens à la chlortétracycline, on;ajouté 25 10 ppm en pds/v de lysozyme et 10 ppm en pds/v d"acide éthylène~ -diamine tétraacétique au bouillon de fermentation de S.aureofaciens. On laisse le .processus de ferraentation évoluer de. la manière habituelle. Ensuite on acidifie le'bouillon entier, on le * f iltre ; et on le titre. L'activité du filtrat limpide provenant du bouillon 30 traité est de 12.300 ^/ml comparativement à 11.200 /ml pour, le . . bouillon témoin. EXEMPLE XIV On répète le procédé de 1'Exemple XIII avec la cellulase au lieu du lysozyme, avec des résultats comparables. 35 ■ .EXEMPLE Xv" • • : On ajoute du lysozyme, 7.0 ppm en pds/v, à un bouillon de fermentation de Pénicillium chrysoqenum à la pénicilline le cinquièms jour d'un cycle de fermentation de six jours. R la fin: de l'essai de fermentation, l'activité du bouillon traité par: 40 l'enzyme est approximativement supérieure de 5% à celle d'un essai 70 25618 6 2051711 témoin avec un bouillon non traité. Dans un essai similaire, où l'on a ajouté 10 ppm en pds/v d'acide éthylènediamine tétraacétique avec 10 ppm en pds/v de lysozyme le quatrième jour du cycle de fermentation de six jours, l'activité est approxi-5 mativément supérieure de 7% comparativement à celle du témoin. 70 25818 7 205171Î REVENDICATIONS 1. Un procédé pour augmenter la quantité d'antibiotiques et de pénicillinacylase récupérable d'un bouillon de fermentation, caractérisé en ce que l'on introduit au moins environ 10 ppm en 5 pds/v de protéase, de cellulase ou de lysozyme audit bouillon avant de récupérer lesdits antibiotiques et ladite pénicillinacylase dudit bouillon. 2. Le procédé de la revendication 1, caractérisé par le fait qu'il est également introduit au moins environ 10 ppm en pds/v 10 d'un agent de chélation. 3. Le procédé de la revendication 2, caractérisé par le fait que ledit agent de chélation est l'acide éthylènediamine tétraacétique . 4. Le procédé de la revendication 1, caractérisé par le fait que 14 lesdits antibiotiques sont la tétracycline, l'oxytétracycline, la chlortétracycline, la streptomycine, 1'oléandomycine ou la pénicilline.