FR 2047047 A1 19710312 FR 7022946 A 19700622 70 22946 î 2047047 La présente invention a pour objet un appareil et un procédé de détermination quantitative de la présence d'une substance dans un fluide soumis à un essai. L'invention concerne notamment un appareil et un procédé de détermination quantitative de la présence 5 d'un constituant donné dans une réaction enzyme-substrat. Le procédé de l'invention permet en outre de mesurer quantitativement la composition des liquides corporels qui sont susceptibles de servir de substrats à des enzymes. L'appareil et le procédé de l'invention permettent de déterminer quantitativement la teneur des liquides 10 corporels en composants tels que l'urée, le glucose et l'acide urique. L'appareil et le procédé de l'invention présentent de nom- i breux avantages importants par rapport à la technique antérieure notamment en ce qui concerne la vitesse, la facilité, la souplesse 15 d'emploi ainsi que la simplicité et la précision des déterminations. Bien que l'appareil et le procédé de la présente invention soient particulièrement applicables à la détermination quantitative de la présence d'un composant d'un système enzyme-substrat, ils s'appliquent également à la mesure d'un composant quelconque d'un 20 fluide soumis à l'essai qui, lorsqu'il est mis en présence d'un réactif spécifique d'essai produit.des variations ioniques caractéristiques qui peuvent être mesurées par des instruments sensibles à de telles grandeurs physiques. Dans la forme préférée de l'invention, des électrodes 25 espacées en contact intime avec un réactif d'essai immobilisé ou fixé sont mis en contact avec une solution contenant le composant à mesurer, des circuits électriques associés détectant toutes variations ioniques au sein du fluide qui entoure les électrodes. L'association des électrodes et du réactif d'essai à un appareil de 30 mesure constitue un système complet de mesure de la concentration de la substance que l'on désire détecter. Ce système nouveau de mesure est applicable à toute réaction d'essai dans laquelle un réactif d'essai immobilisé ou fixé produit une réaction qud se traduit par des valeurs électriques caractéristiques. La mesure de ces va-35 leurs électriques est ensuite directement convertie en concentration de la substance à détecter. D'autres caractéristiques et avantages de la présente invention ressortiront au cours de la description qui va suivre 70 22946 2 2047047 faite en regard des dessins annexés et donnant à titre explicatif, mais' nullement limitatif, 'taie forme de réalisation conforme à l'invention. Sur ces dessins, 5' la figure 1 représente une structure de sonde utilisée dans ■une forme de la présente invention ; la figure 2 représente une autre structure de sonde ; la figure 3 est un schéma synoptique d'un appareil réalisé selon les principes de l'invention ; 10 la figure 4 est un schéma électrique du circuit de mesure de vitesse de l'appareil de la figure 3 ; ' la figure 5 est un graphique qui illustre la relation existant entre la concentration de la substance à détecter et la conduction . maximale obtenue en utilisant l'appareil de l'invention. 15 La première forme de sonde illustrée à la figure 1 comprend une plaque plane 11 en "Plexiglass" de 1,6 mm d'épaisseur, dans laquelle sont percés deux trous que traversent des fils de platine 12 et 13 de 0,064 mm de diamètre repliés de manière à recouvrir partiellement la surface de la plaque 11. Les extrémités découvertes des 20 fils 12 et 13 sont parallèles sur un centimètre et espacées de deux millimètres. Des fils de connexion 14 et 15 sont fixés aux fils de platine 12 et -13 et "circulent dans line poignée cylindrique en polystyrène 16 mesurant 12,7 mm de diamètre par 150 mm de longueur, au voisinage de l'extrémité de laquelle est collée coaxialement la 25 plaque 11. Un manchon 17 en "Tygon" s1 emboîte télescopiquement avec un ajustage libre autour de la plaque 11 et la poignée 16 dépa&se au-delà de la surface extérieure de la plaque 11 pour constituer . avec cette dernière une cavité ou compartiment 18 constituant le support mécanique d'un disque 19 formé par un gel contenant un en-30 zyme et remplissant ladite"cavité. La composition et la préparation de la couche 19 sont décrites ci-après. La cavité 18 a dans cette forme de réalisation un diamètre de 12,7 mm et une profondeur de 1 mm. Les conducteurs 14 et 15 sont reliés à un appareil de mesure de conductivité" non représenté sur la figure 1 . 35 La figure 2 illustre une autre forme de la sonde qui est constituée par une'tige de polystyrène 20 de 12,7 mm de diamètre sur 9,5 mm de longueur. Cette tige comporte deux trous de 0,64 mm percés en divergeant aussi près que possible l'un de l'autre dans 70 22946 2047047 l'extrémité, de la tige, et deux fils en. platine pur .21 et 22 d'un diamètre.de 0,64 mm et-d'une longueur de 15,9 mm sont introduits dans ces trous de manière que leurs extrémités se touchent en un point situé juste au-delà de la .surface de la tige 20. On enduit la 5 surface de la tige 20 et les fils 21 et 22 d'une couche de colle plastique (non représentée) que l'on laisse sécher, la surface d'extrémité de la tige 20 comportant la couche de colle est ensuite découpée perpendiculairement à son axe à une profondeur suffisante pour éliminer les parties des fils 20 et 21 qui sont en contact 10 électrique, de façon que leurs extrémités nues soient isolées l'une de l'autre, ce que l'on détermine par un procédé électrique. Une rondelle de polystyrène 25 épaisse de 0,17 mm ayant un diamètre extérieur de 12,7 mm et un diamètre intérieur de 2,8 mm, est ensuite collée coaxialement sur la surface d'extrémité de la tige 20 de fa-15 çon à laisser à nu les fils 21 et 22 dans une cavité centrale 24 • délimitée par la rondelle 23 et la surface de la tige 20, le diamètre de cette cavité étant de 2,8 mm et sa profondeur de 0,17 mm. Un câble blindé 25 à deux conducteurs fixé de manière convenable aux fils 21 et 22 circule dans une tige de polystyrène 26 de 150 mm de 20 long qui est collée coaxialement à la surface arrière de la tige 20 pour constituer une poignée. Dans une autre forme de réalisation de la sonde de la figure 2, la cavité 24 peut avoir un diamètre de 2,8 mm et une profondeur de 0,5 mm. 25 La préparation du gel utilisé pour le remplissage de la cavité 18 de la figure 1 ou de la cavité 24 de la figure 2 décrit ci-après dans une application destinée à la mesure de l'urée, est un gel de polyacrylamide contenant de l'uréase. Cependant, les spécialistes comprendront que d'autres types de gel et de membrane 30 contenant des réactifs d'essai peuvent être préparés de la même manière . . v On prépare un gel contenant de l'uréase avec les matières suivantes dans les proportions indiquées ; 1. 1 ml d'acrylamide à 400 g par litre 35 • 2. 4 ml de N-N-méthylène-bis-(acrylamide) à 23 g par litre (agent de réticulation) 3- 0,03 mg de riboflavine 4. 0,03 mg de persulfate de potassium 70 22946 4 2047047 5. 1,6 g d'uréase brute (Worthington) Le gel est préparé par le procédé' indiqué dans un article de Hicks et Updike, Anal. Chem. 58. 726 (1966) sauf que les solutions de monomère et de réactif de réticulation sont préparées 5 dans l'eau au lieu d'une solution tampon, l'enzyme uréase étant incorporé dans le gel. Le mélange est placé dans la cavité 18 de la sonde de la figure 1 qui contient ainsi 0,04 g d'uréase. Le gel introduit dans la cavité 24 de la sonde de la figure 2 est réalisé à partir des ingrédients suivants dans les proportions 10 indiquées : '1 . 1 ml d ' acrylamide à 400 g par litre 2. 4 ml de N-N-méthylène-bis-{acrylamide) à 23 g par litre (agent de réticulation) 5. 0,05 mg de riboflavine 15 4. 0,05 mg de persulfate de potassium 5. 0,64 g d'uréase brute (Worthington) Le mélange de la cavité 24 de la sonde de la figure 2 qui mesure 2,8 mm de diamètre et 0,17 mm de profondeur, contient 0,133 mg d'uréase alors que dans le cas d'une cavité de même diamètre 20 mais de 0,5 mm de profondeur, le poids d'uréase est de 0,4 mg. Selon les principes de l'invention, une sonde du type des figures 1 et 2 comprenant une paire d'électrodes espacées en contact avec un réactif d'essai immobilisé ou fixé et relié à un dispositif de mesure de la conductivité électrique dans le temps, est 25 mise en contact par l'intermédiaire du réactif immobilisé ou fixé avec une substance à mesurer. Une détermination quantitative de la présence de cette substance est obtenue par mesure de la conductivité électrique résultante et/ou des variations dans le temps de la conductance électrique desdites électrodes. 30 Les électrodes de la sonde SM sont reliées à ion appareil de mesure de conductivité CDM-2d du type radiomètre fabriqué par exemple par la Société Radiometer A/S, 72 EMDRUPVEJ DK2400, Copenhague NV, Danemark. Comme l'indique le schéma synoptique du système de la figure 3 la sortie de l'appareil de mesure de conduc-35 tivité C0NL alimente l'un des canaux d'un enregistreur graphique à bande à deux canaux EGrD, par exemple du typ'é Hewlett-Packard 7100B Strip chart Recorder, équipé de deux modules d'entrée 17500A, et d'un circuit de mesure de vitesse CMV" comprenant un circuit suiveur 70 22946 5 2047047 de pointes et uri circuit différenciateur. La sortie du circuit de mesure de vitesse est appliquée au second canal de l'enregistreur et un voltmètre numérique DVM, par exemple du type Hewlett-Packard 3440A équipé d'une unité multifonctions continues 5444A dont la 5 sortie est reliée à line imprimante IMP. La vitesse"de variation est étalonnée en micromhos/seconde en calculant le rapport millivolts/ micromho à la prise d'enregistreur de l'appareil de mesure de conductivité et en reproduisant une vitesse équivalente en micromhos/ seconde à l'aide d'un condensateur à charge linéaire. 10 La figure 4 représente les détails du circuit de mesure de vitesse de variation. Comme illustré, la sortie des prises d'enregistreur de l'appareil de mesure de conductivité type 2CDM-2d (non représenté) est reliée par une diode- 30 à l'entrée positive 28 d'un amplificateur 29 du circuit suiveur de pointes. Uh condensateur 30a 15 qui, dans la pratique, peut avoir une, valeur de 1,0 microfarad, est connecté entre l'entrée positive 28 de l'amplificateur et la masse, comme illustré. Uh condensateur 31 de 0,1 microfarad est connecté entre les bornes de compensation du retard d'entrée de l'amplificateur 29. Un circuit de réaction 31a relie la sortie de l'amplifi-20 cateur 29 à son entrée négative 33. Le circuit suiveur de pointes (SP sur la figure) sert à réduire l'ondulation normalement présente dans la sortie d'un enregistreur. La sortie de l'amplificateur 29 est appliquée à une résistance 34a de 680 ohms en série avec tm condensateur 34 dont la capa-25 cité est de l'ordre de 600' microfarads, et qui alimente 1'entrée négative 35 d'un amplificateur 36 du circuit différenciateur DIF servant à fournir une tension de sortie proportionnelle à la vitesse de variation du signal de sortie de l'enregistreur. Une résistance 37, par exemple de 100 kilohms, est connectée entre l'entrée posi-30 tive 58 de l'amplificateur 56'et la masse. Un condensateur 41 d'une capacité de l'ordre de 0,1 microfarad, est connecté entre les bornes de compensation de retard d'entrée de l'amplificateur 56. Un circuit de réaction comprenant une résistance 42, par exemple de 100 kilohms, va de la sortie 45 de l'amplificateur différenciateur 56 à 55 son entrée négative 55» La sortie de l'amplificateur 56 est appliquée à une résistance 44, par exemple de 500 kilohms, reliée à une prise fixe 45 d'un potentiomètre 46 dont la valeur est par exemple de 100 kilohms. 70 22946 s 2047047 L'autre prise fixe 47 du potentiomètre 46 est reliée à la masse, comme représenté. Le curseur 49 du potentiomètre 46 alimente un voltmètre numérique BVM:, par exemple du type Hewlett-Packard 3440A équipé d'un module enfichable multifonctions 3444A d'essai et/ou 5 d'un enregistreur à bande, par exemple du type Hewlett-Packard 7100B équipé d'un module d'entrée 17500A. La figure 5 illustre les courbés de vitesse de variation de la conductivité mesurée en fonction de la concentration initiale en urée. Ces courbes illustrent la possibilité d'obtenir une sensi-10 bilité à la vitesse en utilisant la sonde de conductivité décrite. Il est évident que le maximum de dK/dt est fonction de l'épaisseur du gel et de la quantité d'enzyme qu'il- contient, ainsi qu'également de Ta concentration en urée. Les caractéristiques sont obtenues par un étalonnage initial de l'ensemble en fonction de dK/dt en utili-15 sant un circuit' à courant continu, comme décrit précédemment. Des essais furent faits à l'aide de la sonde de la figure 1 dans les solutions agitées, alors que les sondes illustrées à la figure 2, qui sont miniaturisées, furent essayées dans des solutions non agitées. C'est le gel qui couvre les fils, et non pas la solution, qui 20 constitue le principal milieu de conduction. L'appareil de la présente invention peut également comporter une membrane externe semi-perméable couvrant-le support dans lequel est immobilisé l'enzyme. Une telle membrane externe a l'avantage de régler la diffusion du fluide soumis à 1'essai dans le gel et d'em-25 pêcher la sortie du réactif d'essai par diffusion. La membrane externe peut être constituée par n'importe quelle pellicule semi-perméable, par exemple en "Cellophane", "Nylon", etc. L'emploi d'une telle pellicule externe augmente sensiblement la longévité de la sonde. 30 L'appareil de la présente invention utilisant de l'uréase immobilisée ou fixée dans un polymère, une membrane ou tout autre moyen semi-perméable, permet par exemple de distinguer entre des concentrations différentes d'urée er/solution aqueuse, entre environ 6 et 1200 mg pour 100 g (0,001 mole à 0,2 mole, 6Ç) ppm à 12 000 ppm) 35 par mesure de la conductivité électrique et/ou de sa variation dans le temps. On peut ainsi mesurer la concentration d'autres substances en solution aqueuse, par exemple du glucose et de l'acide urique, à Copy 70-22946 7 .2047047 l'aide de sondes contenant un enzyme ou un réactif d'essai immobilisé produisant une variation ionique avec la substance à mesurer. Le procédé et l'appareil de la présente invention permettent une surveillance continue "in vivo" des patients et une série de 5 dispositifs semblables à celui qui vient.d'être décrit, mais adaptés à la mesure de diverses substances, peut être .incorporée dans un ensemble automatisé pour la mesure rapide et continue de divers échantillons présents, par exemple sur un.système transporteur. Les dimensions de l'appareil ne..dépendent que de l'état, des techniques 10 actuelles et il se prête à une miniaturisation poussée pour la surveillance in vivo de la concentration en certaines substances spécifiques des liquides biologiques, tels que le sang. De plus, l'appareil de l'invention et en particulier ses électrodes peuvent être réalisés avec un grand nombre de formes et de dimensions adaptées 15 aux différentes applications. On peut également modifier à volonté le circuit électronique pour obtenir des mesures plus sensibles et plus sélectives vis—à-vis des interférences, de la .concentration de la substance à détecter, etc. Il va de soi que la présente invention n'a été décrite 20 ci-dessus qu'à titre explicatif, mais nullement limitatif, et que l'on pourra y apporter toutes variantes entrant dans son cadre et son esprit. Cop,>y 70"22946 8 2047047 REVENDICATIONS « 1. Procédé de détermination quantitative de la présence dans un fluide d'une substance qui, lorsqu'elle est mise en contact avec un réactif d1 essai spécifique, produit une variation ionique, 5 ledit procédé étant caractérisé en ce qu'il consiste à mettre en contact.ledit fluide avec un support dans lequel est fixé ledit réactif d'essai puis à mesurer la variation ionique engendrée sur ou dans ledit support. 2. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que 10 le réactif fixé dans le support est un enzyme et en ce que la substance à détecter est le substrat dudit enzyme. 3. Procédé selon la revendication 2, caractérisé en ce que l'enzyme est l'uréase et le substrat l'urée. 4. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que 15 le support est semi-perméable et en ce que l'enzyme y est immobilisé. 5. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que le support est un polymère dans lequel est immobilisé l'enzyme. 6. Procédé selon la revendication 5, caractérisé en ce que le support est un gel de polyacrylamide dans lequel est immobilisé 20 l'enzyme. 7. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que la variation ionique est déterminée à l'aide dlun appareil de mesure de la conductivité. 8. Appareil pour la détermination quantitative de la présence lorsqu'elle est 25 dans un fluide d'une substance qui,/mise en contact avec un reae-tif d'essai spécifique, produit une variation ionique, ledit appareil étant caractérisé en ce qu'il comporte un système d'électrodes et un support dans lequel est fixé le réactif d'essai, ce support étant en contact électrique avec le système d'électrodes. 30 S. Appareil selon la revendication 8, caractérisé en ce que le système d'électrodes est constitué par une paire d'électrodes espacées. 10. Appareil selon la revendication 9, caractérisé en ce qu'un circuit de détection des variations des caractéristiques 35 électriques desdites électrodes est relié à ces dernières. 11 . Appareil selon la revendication 9, caractérisé en ce qu'un circuit électrique relié auxdites électrodes mesure la conductivité entre ces dernières. 70 22946 9 2047047 12. Appareil selon la revendication 1î, caractérisé en ce que le circuit électrique mesure également la variation de la conductivité dans le temps. 13. Appareil selon la revendication 8, caractérisé en ce 5 que le réactif fixé dans le support est un enzyme.' 14. Appareil selon la revendication 8, caractérisé en ce que ledit support est un support semi-perméable dans lequel est immobilisé un enzyme. 15. Appareil selon la revendication 8, caractérisé en ce 10 que le support est un support semi-perméable dans lequel est immobilisé de l'uréase. 16. Appareil selon la revendication 8, caractérisé en ce que la substance .fixée dans le support est un enzyme et en ce que le support est recouvert d'une membrane semi-perméable. 15 17. Appareil selon la revendication 15, caractérisé en ce que la membrane semi-perméable eat.-ea ^SeUophane". 18. Appareil selon la revendication 13, caractérisé en ce que le support est un gel de polyacrylamide.