FR 2043847 A1 19710219 FR 7019857 A 19700529 19857 i 2043847 la présente invention concerne un procédé de production d'antibiotiques, et en particulier de Rifamycine B et de Rifamycine Oe Il a été signalé que la Rifamycine B peut être 5 obtenue en cultivant Streptomyces mediterranei et qu'on peut obtenir la Rifamycine 0 en oxydant la Rifamycine B dans des conditions moyennes /"voir P„ Sens! et colle dans "Pharmaco Editione Scientifica, 15, 228 (1960)_7« So Umezawa a également trouvé que le microor-10 ganisme Nocardia C-52X est capable de produire la Rifamycine 0 directement dans un bouillon de culture (voir brevet japonais n° 15 518/1966)„ Pour mettre au point un procédé permettant de produire ces antibiotiques avec des rendements améliorés et à l'échelle industrielle, la demanderesse a effectué de lon-15 gues recherches qui lui ont permis de faire les constatations qui suivent et sur lesquelles est basée la présente invention» (1) un certain microorganisme, qui a été isolé par la demanderesse, est capable de produire les Rifamycines B et 0 simultanément j 20 (2) le microorganisme précité appartient au genre Streptomyces1 % (3) ledit microorganisme st ses mutants, quand on les cultive en présence d'un composé du fer, accumulent les Rifamycines B et 0 en une quantité très supérieure à celles 25 qui sont mentionnées dans la littérature supra» Oe microorganisme et un mutant de celui-ci , que permet d'obtenir une irradiation par les rayons ultraviolets et qui possède une grande capacité de production des Rifamycines B et 0, ont été appelés respectivement Streptomyces B-2847 et mutant jaune de, cf A Streptomyces B-2847 (ou, plus brièvement, B-284-7 et mutant jaune de B 70 19857 2 2043847 Microorganismes B-2847 (1) Caractéristiques morphologiques Les sporophores sont rectilignes ou ondulés, pas de spirales ou d'ondulations » Le mycélium aérien, sur un 5 extrait de levure glucosé, un extrait de malt, de la gélose ou de la gélose glyoérinée à 1'asparagine forme des amas d'hyphes d'une dimension variant entre 4 et 20 microns. Les conidies sont ellipsoïdes, d'une dimension variant entre 0,8 et 1,1 micron par 1,5 à 2,3 microns, avec une surface lisse et plate. 10 (2) Caractéristiques de culture s (a) Gélose de Czapek i Croissance s abondante, colonies plissées et soulevées avec une zone fendillée large sur leurs "bords j 15 jaune orange clair (Rdg. III, 17-d) à chrome foncé (Rdg.III, 17~b) Mycélium aérien s satisfaisant, blanc Envers : jaune chamois (Rdg* IV, 19-d) à jaune orange clair (Rdg» III, 17-d) 20 Pigment soluble ; jaune orange pâle (Rdg. III, 17-f) à chamois ocreux (Rdg» XV, 15*-b) (b) G-élose de Czapek glucosée s Croissance î colonies plus abondamment plissées que sur le milieu gélosé de Czapek, formation 25 d'un mycélium aérien; pigment soluble et couleur de l'envers î comme sur la gélose de Czapek. (c) Gélose de Czapek glyoérinée s Croissance s colonies abondantes, mais moins plissées 30 que sur les milieux (a) ou (b), presque identiques pour ce qui est des autres caractéristiques à celles qui sont obtenues sur les milieux (a) et (b). (d) Gélose glucosée à 1'asparagine : 35 Croissance s bonne % colonies jaune orange pâle péné trant dans l'agar Mycélium aérien s pauvre à moyen, mince et blanc Envers : jaune orange pâle Pigment soluble s néant 40 (e) Bouillon nutritif g 3 2043847 Croissance g croissance en surface ; petites colonies flottant sur la surface Mycélium aérien g blanc à gris souris pâle (Rdgo II, 15 ■»»«.£) Pigment soluble g néant Gélose nutritive g Croissanoe g médiocre à modérée $ colonies incolores Mycélium aérien g pauvre, grêle, blanc à gris souris pâle Pigment soluble g néant Envers s incolore à jaune orange pâle Bouillon nutritif glucosé g Croissance g abondante, se développant d'abord en • surface, formant ultérieurement des flocons Mycélium aérien g pauvre, grêle, blanc à chamois- capucine (Rdgo III, 13-f) Pigment soluble g jaune pâle Gélose nutritive glucosée g Croissanoe t abondante ? colonies plissées et «onl«*> vées, incolores à jaune de Mars (Rdgo III, 15~i) Mycélium aérien g modéré, grêle,blanc Envers g jaune de Mars Pigment soluble g brun jaunâtre Gélose nutritive glyoérinée g Croissance g abondante g colonies plissées ? brun Soudan (Rdgo III, 15-fc) Mycélium aérien s pauvre, blanc sur les bords Pigment soluble g brun jaunâtre Gélose à l5amidon § Croissance g modérée , colonies incolores Mycélium aérien s grêle et blanc Pigment soluble s néant Envers s incolore Oeuf entier g - Croissance g modérée g colonies plissées, chrome foncé (Rdg» III, 17-b) Mycélium aérien g néant Pigment soluble g néant 7û 19857 4 2043847 (l) Gélose à l'extrait de levure s Croissance s abondante j colonies plissées Mycélium aérien z grêle, blanc sur les bords des colonies 5 Envers g jaune de Mars Pigment soluble g jaune de Mars à jaune orangé (m) Tranche de pomme de terre s Croissance g médiocre g colonies brun jaunâtre pâle à brun pâle 10 Mycélium aérien g grêle , blanc Pigment soluble g néant (o) Tranche de carotte g Croissance s médiocre à modérée, la carotte ne change pas de couleur 15 Mycélium aérien s blanc (o) lait tournesolé (37°C) g peptonisation lente sans coagulation ' — Pigment soluble g brun rougeâtre (p) Gélatine (25°C) g 20 Rapidement liquéfiée î formation d'un mycélium aérien blanc Pigment soluble s brun jaunâtre (q) Sérum de L8ffier (37®C) î Croissance s colonies minces, grêles, jaune orange ; 25 - liquéfaction faible Mycélium aérien g néant (r) Cellulose g Croissance g colonies incolores, virant graduellement au jaune orange 30 Mycélium aérien s blanc, cotonneux Cellulose g pas de décomposition (s) Gélose au maléate de calcium g Croissance g modérée § colonies jaune orange pâle, pénétrant dans la gélose 35 Mycélium aérien g grêle, blanc Envers g jaune orange pâle à chamois ocreux (Rdgo XV, 155 -b ) Pigment soluble s néant ou chamois (Rdg. XXX, 19"-b) (t.) Gélose - tyrosine 40 Croissance g modérée ; colonies incolores à jaune pauvre, 70 19857 5 2043847 Mycélium aérien î pauvre, blanc Envers s incolore Pigment soluble ; néant (u) Gélose peptonée s 5 Croissance s pauvre, modérée Mycélium aérien i pauvre, grêle, blanc Envers s incolore Pigment soluble s néant (3) Caractéristiques physiologiques s 10 (a) pH optimal i croissance peu importante à un pH compris entre 4 et 10 % croissance optimale à un pH compris entre 6 et 8 | (b) Température optimale s 15 croissance à des températures comprises entre environ 20 et 43°C et croissance optimale à 28°C ; aérobie (c) Hydrolyse de l'amidon X néant (d) Réduction des nitrates % positive 20 (e) Caractère chromogène s néant Quand on cultive B-2847 sur un milieu synthétique, ses colonies sont jaune chamois à jaune orangé clair, et on constate la production d'un pigment soluble dé couleur jaune orangé pâle à brun jaunâtre» 25 le mycélium aérien est blanc» Bien qu'il donne des pigments solubles brun jaunâtre sur les milieux protéinés, le microorganisme n'est pas chromogène » le microorganisme donne des résultats négatifs en ce qui concerne l'hydrolyse de l'amidon et des résultats 30 positifs en ce qui concerne la liquéfaction de la gélatine et la réduction des nitrates0 te tableau 1 montre l'utilisation des sources de carbone, observée par la méthode de Pridham & Gottlieb, à 28°C et pendant 10 jours^ 35 Tableau 1 Erythritol • - D-galactose +++ Adonitrol - -D-glucose + à ++ D-sorbitol - - D-fructose ++ i-inositol +++ Rhamnose +++ 40 D-mannitol + à ++ Mélibiose ++ 70 19857 6 2043847 Dulcitol + à. ++ Maltose ++ D-xylose ++ à +++ Saccharose +++ 1-arabinose +-§- lactose + à ++ 1-sorbose + Raffinose + à ++ Tréhalose +++ Succinate de sodium + à ++ Salicine + à ++ D-mannose ++ Esculine i + e=s a Amidon + à + + Inuline ++ Glycérine ++ Acétate de sodium + à ++ Témoin Citrate de sodium + à ++ Nota î +++ Croissance abondante ++ Croissance satisfai-+ Croissance modérée santé - pas de croissance £ Croissance pauvre 15 les sources de carbone pouvant être utilisées par B-2847 ou bien utilisées parfaitement par B-2847 comprennent 1'i-inositol, le mannitol, le dulcitol, le D-xylose, le 1-arabi-nose, le I-sorbosç, le D-galactose, le D-glucose, le D-fructose, le rhamnose, le mélibiose, le maltose, le saccharose, le lactose, 20 le raffinose, le tréhalose, la salicine, l'inuline, l'acétate de sodium, le citrate de sodium, le auccinate de sodium, le D-man-nose, l'amidon, la glycérine, etooe les sources de carbone qui constituent lféry™ thritol, l'adonitol, le D-sorbitol, l'esculine et des sources de 25 carbone analogues, ne sont que peu ou pas utilisées,, En ce qui concerne les caractéristiques morphologiques et les caractéristiques de culture, on se reportera à SeAo Wakstnara dans "The Actinomyeeùes8', vol„ 2» 152 (1961) et à ïo.&o Pridîaam dans .BAppl.î®d biology", 6 , 52 (1958) et ca 30 comprendra que B-2847 est us mioroorganisme très analogue à Streptomyces globisporus. S.teê-piomyoea autotrophlcua o Strep joEiy-ces orientalis»- Streptomyces Kiaberl et Streptomycas aburav^easls le myceli'Uua aëi'iea des mio-roozgmi'smes de esa espèces sont invariablemeat reeSiligoes ou ondulés et de.couleur 35 blanche» 'Toutefois, B-2847 diffère lui-même de Streutomycee globisporus en ce sens que, tandis que; le premier organisme donne des c-olonies jaune orangé, sur un milieu de-gélose synthétique un mycélium aérien blanc sur. des tranches de pommes de terre et se développe sur la cellulose;, le second organisme donne des co-40 lonies incolores sur la gélose synthétique, forme un mycélium 70 19857 F? i' 2043847 aérien jaune verdâtre sur des tranches de pommes de terre et ne se développe pas sur la cellulose B-2847 diffère également de Streptomyces auto-trophicus du fait que tandis que le premier organisme se déve-5 loppe de façon modérée sur la gélose à l'amidon liquéfie rapidement la gélatine et réduit les nitrates en nitrites, le second ne se développe que très peu sur la gélose à.l'amidon, ne géléfie pas la gélatine et ne réduit pas les nitrates» Streptomyces orientalis diffère également de B-=2847° Par exemple, Streptomy-10 ces orientalis ne pousse pas aussi vigoureusement sur la gélose de Czapek et ne donne pas de pigment soluble sur la gélatine. Toutefois, du fait que Streptomyces orientalis pousse hien sur la cellulose, par exemple, il paraît ressembler étroitement au microorganisme de la présente invention.» 15 les conidies du microorganisme de l'invention sont ellipsoïdes, produisent un pigment soluble brun jaunâtre sur la gélatine et ne coagulent pas le lait» En ce qui concerne ûe telles caractéristiquess le microorganisme de la présente invention diffère de Streptomyces kimberi qui donne de petites co-20 nidies sphériques, ne forme pas de pigment soluble sur la gélatine et coagule le lait» Streptomyces aburaviensis diffère du microorganisme de la présente invention du fait qu'il forme un pigment soluble brun jaunâtre sur la gélose glucosée à l'aspara-gine et un pigment soluble sur la gélose au maléate de calcium. 25 les deux organismes diffèrent également l'un de l'autre en ce qui concerne les types des sources de carbone utilisées,, En se référant à 1» Ettlinger et coll. (Archiv ffir Mikrobioiogie Bd0, 31, 326, 1958) , on peut penser que B-2847 appartient au genre B» Sporen glatt,, II Iiqftmycel niveus. 30 Toutefois, parmi les espèces mentionnées, c'est-à-dire Streptomyces Rubrireticulio Streptomyces niveoruber„ Streptomyces fulvissimus et Streptomyces phaeochromogenus, les deux premières espèces mentionnées sont nettement différentes de B-2847 car elles donnent des sporophores en hélice ou en spirale» Strepto-35 myces fulvissimus donne des pigments soluhles, dorés et brillants ou oranges sur la gélose de Czapek ou sur la gélose glucosée à l'asparagine et pousse sur la gélose nutritive en prenant une couleur brun rougeâtre foncéj, ce qui le différencie nettement du microorganisme de la présente invention0 40 Streptomyces pha e ochr omoge n us est du type chro 70 19857 8 2043847 mogène et diffère donc nettement de B-2847 En ce qui concerne la formation de granules sclérotiques» on dispose de compte-rendus relatifs à Chainia (MoJo Thirumalachars Nature» 176„ 934». 1955)» à Streptomyces 5 griseu3 (M0L0 Gattani» Natures, 180 » 1293» 1957) » etc0 Toutefois» alors que les granules sclérotiques de ces organismes se développent invariablement sur un mycélium de support, les granules sclérotiques de B-2847 proviennent de son mycélium aérien et non pas de son mycélium dé supporte IQf En oe qui concerne cette caractéristique morphologique, le présent microorganisme ressemble à Streptomyces aerocolonigenes mais diffère de ce dernier en ce sens que B-2847 produit un mycélium aérien abondant sur la gélose glyoérinée de Czapek avec production d'un pigment soluble faiblement 15 jaunâtre, ne produit pas de pigment soluble sur la gélose glucosée à 1'asparagine et donne des colonies incolores sur la gélose à l'amidon® En outre» le microozganisme donne des réactions négatives avec la tyrosinase et les diastases et utilise 20 le rhamnose de façon parfaite et le raffinose de façon moyenne. Streptomyces aerocolonigenes ne forme qu'un mycélium aérien rare» produit un pigment soluble brunâtre sur la gélose de Czapek glycérinée et un pigment soluble brun pâle sur la gélose glucosée à l'asparagine, et donne des oolonies jaune abricot sur 25 la gélose à l'amidon. Il a été mentionné qu'il donne des réactions positives avec la tyrosinase et les diastases, qu'il est incapable d'utiliser le raffinose et qu'il semble incapable d'utiliser le rhamnose0 II a également été mentionnéf^es organismes pro-30 ducteurs de rifamyoîne tels que Streptomyces mediterranei (P. Margalith & G0 Beretta» s,Mycopathol0 et Mycol» Apple" » 13» 321, i960) » Streptomyces 4107A2 (Sn Sugawara nJc Antibiotics Ser.A", XVIII (1) , 29» 1964) et Streptomyces albovinaceus (R. Donavick, brevet- américain n° 2o999o048) sont capables de produire la Nan-35 cimycine» antibiotique qui a été ultérieurement identifié avec la Rifamycine B. Une comparaison de ces souches avec B-2847 montre que la souche Streptomyces mediterranei, par exemple, est différente de B-2847» ear il n'est pas mentionné qu'elle forme des 40 granules sclérotiques» et elle donne un mycélium blano rosâtre 19857 9 2043847 producteur de conidies sur les milieux nutritifs géloses synthétiques et ne produit pas de pigment soluble sur la gélose de Czapek au saccharose et sur la gélose glucosée à l'extrait de levure0 Les deux organismes diffèrent également l'un de 5 l'autre en ce qui concerne la réduction des nitrates, la pep-tonisation du lait et l'utilisation des sources de carbone. De même que pour Streptomyces mediterranei,, il n'a pas été mentionné que Streptomyces 4107 A g fo^me àes granules sclérotiques et son mycélium producteur de conidies est de couleur rose 10 à orange» Outre ces différences, Streptomyces 4107 .Ag se différencie lui-même nettement de B-2847 en ce qui concerne ses caractéristiques de culture sur la gélose de Czapek au saccharose, la gélose nutritive et la gélose à l'extrait de levure. 15 Ces deux organismes diffèrent encore l'un de l'autre en ce qui concerne l'utilisation des sources de carbone. Il n'a pas été mentionné que Streptomyces albovinaceus formait des granules sclérotiques.. En outre» Streptomyces albovinaceus diffère nettement de B-2847 en ce qui concerne ses caractéristi-20 ques de culture sur la gélose de Czapek les deux organismes sont également différents en ce qui concerne l'utilisation des sources de carbone et spé-25 cialement l'utilisation de l'arabinose, du dulcitol et de l'inuline. _ Les comparaisons qui précèdent entre les diverses caractéristiques de B-2847 et des organismes connus jusqu'à ce jour permettent d'aboutir à la conclusion que B-2847 30 appartient à une espèce nouvellec La demanderesse l'a donc appelé Streptomyces tolypophorus nov0 sp„ En outre, les caractéristiques de dul-ture du mutant jaune B-2847 sont données ci-dessous ? (Mutant jaune B-2847) 35 (a) Gélose de Czapek s Croissance s modérée,, jaune orange clair (Rdg. III, 17-d) Mycélium aérien s modérés, jaune orange pâle (Rdg» III,17-f) Envers g chamois orangé (Rdg° III, 15-d) à orange capucine (Rdg0 IIIj, 13-d) 40 Pigment soluble s néaat ou jaune orange pâle (Rdg.IÏI,15-f) 70 19357 10 2043847 ("b) Glucose gélosée de Czapek g Croissance s modérée, plus pliasée à la partie inférieure de la culture9 jaune orange pâle le mycélium aérien, le pigment soluble et la ^ couleur de l'envers sont comparables au my célium au pigment soluble et à la couleur observés avec la gélose de Czapek (c) Gélose de Czapek glyoérinée.g Croissance s mycélium aérien et couleur de l'envers s •Lo comparables au mycélium et à la couleur ob tenus avec la gélose de Czapek (d) Gélose glucosée à 1*asparagine g Croissance % modérée, plissée au fond de la culture, jaune orange pâle 15 Mycélium aérien g modéré, jaune orange pâle . Envers s laun© orange pâle à jaune orange clair Pigment soluble g néant (e) Bouillon nutritif g Croissance s pauvre à modérée, surface analogue à du liûhan 20 graduellement submergée, jaune orange clair Mycélium aérien § néant Pigment soluble s néant (f) Gélose nutritive s Croissance î modérée, incolore à brun jaune clair 25 Mycélium aérien g pauvre, blanc Envers s chrome foncé (Rdg® III, 17-b) Pigment soluble g néant ou jaune clair (g) Gélose nutritive glucosée g Croissance g abondante, plissée, soulevée, brune 30 Mycélium aérien ? jaune orange pâle Envers g noisette (Rdgo XIV s ll'-k) à brun(couleur foie) (Rdgo XIV9 7®-m) Pigment soluble î roux (Rdgo XIV, 7"~k) (h) Gélose nutritive glyoérinée g 35 Croissance s abondante, plissée et soulevée, brun orange Mycélium aérien s abondant,, jaune orange pâle Envers et pigment soluble g similaires à ceux qui sont observés sur la gélose nutritive glucosée (i) Oeuf entier g 40 Croissance g pauvre, jaune orange pâle à chamois orangé 70 19857 11 2043847 (Rdgo III, 15-d) Mycélium aérien g néant Pigment soluble ; néant ou brun jaune pâle (-■) Gélose à l'extrait de levure g 5 Croissance s abondante, plissée et soulevée Mycélium aérien s jaune orange pâle Envers et pigment soluble g similaires à ceux qui sont observés sur la gélose nutritive glyoérinée 10 (k) Tranche de pomme de terre g Croissance g modérée, plissée, jaune de chrome foncé (Rdg0 III, 17-b) à jaune de Mars (Rdg» III, 15=1} Mycélium aérien s néant 15 le milieu devient ultérieurement brun grisâtre (1) Tranche de carotte g Croissance s médiocre, jaune orange pâle Mycélium aérien s néant Couleur de la tranche non modifiée 20 (m) lait tournesolé (37°C) Croissance g pauvre, jaune orange pâle, anneaux graduellement submergés j le milieu devient faiblement acide; peptisation lente sans coagulation (n) Sérum de LBffler (37°C) 25 Croissance s pas de croissance avant le 14e jour (o) Cellulose g Croissance g pauvre, incolore Mycélium aérien s pauvre, blanc à jaune maïs (RdgoIY,19-f) Cellulose g non décomposée 30 (p) Gélose au maléate de calcium g Croissance g pauvre à modérée, jaune orange pâle Mycélium aérien s jaune orange pâle Envers g jaune orange pâle Pigment soluble s néant 35 (q) Gélose à la tyrosirse s Croissance i modérée, inccler® à jaune orange pâle Mycélium aérien ? modéré, pulvérulent, jaune orange pâle Envers g Terre de Siearse brute (Rdgo III, 17-i) Pigment soluble g néant 40 (r) Gélose peptonée 70 13857 12 2043847 10 15 20 25 Croissance g modérée, jaune orange Mycélium aérien ; pauvre9 se développe au fond du milieu rjaurie orange pâl® Envers ? jaune orange pâle Pigment soluble % néaru. les caractéristiques morphologiques et physiologiques du. mutant jaune B-2847 sont similaires à celles de la souche d®origine0 Utilisation des sources de carbone par le mutant .jaune B-2847 Tableau 2 D=galactose D-glu.cose D-fructose Saccharose ++ à +-M- lactose Erythritol + Adonitol - D-sorbitol + à + Dulcitol + D-xylose I-arabinose ++ Raffinose L-sorbose «=> D~manpose Tréhalose +++ Amldoia Esculine - G-lycérlne Inuline ++ Témoin Acétate de sodium ++ Citrate de sodium ++ Succinate de sodium ++ +-H- Croissance abondante 4* Croissance modéré© - Pas de croissance "f ++ 4"4~+ 4-4-4-4*+4* ca 4-++ +• à ++ +++ 2l + croissance bonne croissance pauvre 30 35 Ces deux scuîhes, à savoir B-2847 et le mutant de B-28479 ont été dépesées à 1eorganisme "Institute for Ferme n ta t iosa1'^ et IPO-13'151 o à 0sakap au apon sous les numéros IPO-12554 40 Dans la procédé conforme à la présente invention, on cultive Streptomyces B-2847 ou son mutant jaune sur un milieu contenant un composé du .fer» les comparés du fer que peut contenir le milieu peuvent être minéraux ou organiques et sous forme ferrique ou ferreuse, mais en préfère utiliser dans la présente invention des composés minéraux du fer comme le chlorure de fers le sulfate de ferp le nitrate de fer, le phosphate de fer, l'iodure de fer, l'oxyde de fers lchydroxyde de fer et des composés analogueso la quantité de ce composé du fer est de 70 19857 13 2043847 préférence comprise entre environ 0,005 et 082 c'est-à-dire qu'elle est environ 10 à 400 fois supérieure à la quantité couramment utilisée (à savoir environ 0,0005 à 09001 # par rapport au milieu total)o 5 Dans le procédé de la présente ihvention» on cultive B-2847 ou le mutant jaune de B-2847 sur un milieu contenant une grande proportion du composé du fer0 Le procédé donne les Rifamycines B et 0 dans le bouillon de culture, en une quantité équivalant à environ 10 5 fois celle qui peut être obtenue avec un milieu classique. Ainsi, la présente invention est relative à un procédé de production des Rifamycines B et 0 qui consiste à cultiver Streptomyces B-2847 (I3?0 12554) ou le mutant jaune de B-2847 (IFO 13151) dans un milieu nutritif contenant des sources de carbone 15 assimilables et des sources d'azote digestibles, en présence d'environ 0,05 à 0,5 $> d'un composé minéral du fer, dans des conditions aérobies, jusqu'à ce que les Rifamycines B et 0 recherchées se soient accumulées en quantité notable dans le bouillon de culture, dans lequel on les récupère ensuite dans 20 ce bouillon0 On peut encore augmenter les rendements en Rifamycines B et 0 en cultivant B-2847 ou son mutant jaune sur un milieu contenant, en plus de cette grande quantité de composé du fer, des constituants tels que le sulfate de manga-25 nèse, le sulfate de magnésium;, le sulfate de baryum, le sulfate de potassium, etc0 Ces constituants supplémentaires, c'est -à-dire les sulfates précités, peuvent être utilisés isolément ou en combinaisorio Ces sels minéraux sont contenus dan3 le mi-30 lieu en une quantité qui est de préférence comprise entre environ 0,001 et 0,005 soit environ 10 fois la quantité couramment utilisée dans la culture de micr©organismes„ Bien que le milieu puisse être liquide c« solide, il est plus commode d'utiliser un milieu liquide 0 Ua tel milieu contient des 35 sources de .carbone et d'azote, ainsi que dsautres ingrédients. . Des sources de carbone appropriées comprennent, par exemple, le glucose, 1J isaositol,. le xylose, le galactose, le -fructose, le saccharose, etc„ «tandis que les sources d'azote peuvent comprendre diTerses matières organiques et miné-40 raies contenant de l'azote, comme les peptoaes, la farine de 70 19857 14 2043847 soja, la liqueur de macération du maïs, un extrait de viandes, le son de riz, î11 urée , les sels d'ammonium, etcffl En plus de ces éléments nutritifs, on peut également incorporer divers sels minéraux tels que le chlorure de sodmni, des phosphates, 5 etCooj et divers sels métalliques tels que les sels de calcium, de zinc, de manganèse, ete» Si nécessaire, on peut éga= lement ajouter an agent anti-mousse qui peut être une huile d8origine aaimale, végétale ou minérale„ Pour cultiver B-2847 ou le mutant jaune de 10 B-2847 sur un milieu contenant ces constituants , il est avantageux ^^érer^et d'agiter un milieu liquide, bien qu'on puissq/utiliser une culture en surface» Bien que la température et le temps d'incubation, ainsi que le pH du milieu, doivent avoir des valeurs 15 telles qu'elles permettent d'obtenir un développement maximal de l'organisme choisi et m rendement maximal en Rifamycines B et 0, une culture avec secousses pendant environ 2 à 7 jours est habituellement avantageuses De préférence, on maintient le milieu à un 20 pH neutre ou faiblement acide et la température optimale d'incubation est comprise entre environ 20 et 45°C et de préférence entre 25 et 35°C Les conditions de culture, telles que la composition et le pH du milieu, la température d'incubation, 25 1°importance de 13agitation, etCoo9 doivent bien entendu être choisies en fonction de l'organisme et des conditions extérieures 9 de manière à obtenir les meilleurs résultats possibles» Pour récupérer les Rifamycines B et 0 dans le bouillon de culture, on peut faire appel à n'importe quel 30 procédé de récupérât ion de métabolites de micro organisme s con-ns dans la technique antérieure» Par exemple, on peut mettre en oeuvre des procédés basés sur la différence de solubilité des Rifamycines B et 0 et ded impuretés, sur leur différence de capacité d'absorption , gï sur la différence de leurs for-35 ces de liaison ioniques, ou bien procéder à un relargage au cours duquel les fractions actives se trouvent précipitées dans la solution,, à une dialyse, à une distribution à contre*» courant, eto»,, et on peut utiliser ces procédés seuls ou en combinaison, ou bien les appliquer à plusieurs reprises si 40 nécessaire» 70 19857 is 2043847 De façon plus spécifique, étant donné que les Rifamycines B et O sont des antibiotiques sclubles dans les graisses et respectivement acide et neutre, et étant donné qu'elles se présentent en majeure partie dans la portion 5 fluide du bouillon de culture, il est avantageux de filtrer tout d'abord le bouillon de culture„ de récupérer ces antibiotiques dans le filtrat et, enfinp de les purifier,, Si on porte le filtrat à un pH faiblement basique et si on l'extrait par un solvant organique, la 10 Rifamycine 0 migre dans la phase formée par le solvant organique et la Rifamycine B reste dans la couche aqueuse» linsip les deux antibiotiques peuvent être facilement séparés l'un de l'autre» On peut ensuite purifier chacun d'entre eux en combinant des procédés de purification 15 tels qu'une distribution„ une précipitation fractionnée, une adsorption, une recristallisation, etco Etant donné que les mycélia eux-mêmes possèdent .une activité antimicrobienne, il est possible de récupérer les antibiotiques dans les myoélia grâce à une extraction par l'a-20 cétone ou lcéthanol„ par exemple^ et de concentrer l'extrait sous vide3 le produit concentré étant ensuite traité de la même manière que dans le cas du filtrat» La Rifamycine B restant dans la phase aqueuse peut être transférée dans une phase organique par aeidifi-25 cation de la solution aqueuse, qu'on extrait ensuite par un solvant organique» Des exemples de solvants qui conviennent pour l'extraction comprennent les esters d-acides gras organiques, par exemple l'acétate dséthy'ie, 1!acétate de butyle, etc», 30 diverses cétones, par exemple la méthyl isobutyl cétone, divers alcools, par exemple le «-butancl, l'alcool n-amylique, etc0 35 Les couches crganiques résultantes sont res-= pectivement lavées à l'eau, déshydratées et concentrées sous pression réduite» On peut directement récupérer les cristaux bruts dans le produit concentré résultant.. Dans une variante,un solvaat organique à faible polarité, tel que 'l'éther de pét.ro-40 le, le R-hexane ou le cyclchexane, peut être ajouté au produit 19857 2043847 concentré pour détermines la précipitation des cristaux bruts de Rifamycine O oa de Rifamycine B., selon le cas. On peut également séparer les substances désirées des produits concentrés respectifs en utilisant une matière adsorbante0 5 On peut purifier les cristaux bruts par pré cipitation fractionnée5 en utilisant un solvant organique appro-prié0 Dans le cas de la Rifamycine O, par exemple, qui est médiocrement soluble dans l'éther diéthylique, on peut purifier le 'produit brut en ajoutant une quantité appropriée d'éther 10 diéthylique et en éliminant ensuite les autres constituants solubles à Ieaide d'une filtration0 Quand on utilise un adsorbant pour purifier le produit brut, la matière active est adsorbée sur l'adsor-bant et on la récupère ensuite par élution avec un solvant ap~ 15 proprié5 qui peut être par exemple un gel de silice, un gel de silice traité par l'acide oxalique ou du charbon activé0 le type du solvant varie en fonction de la nature de l'adsorbant0 Dans la chromâtographie sur une colonne de gel de silice, par exemple, on peut éluer la fraction active 20 en désorbant tout d'abord les impuretés à l'aide d'un solvant à polarité faible, comme le benzène ou l'éther diéthylique,et en faisant ensuite circuler dans la colonne un solvant à polarité élevée^ comme 1'aeétate d'éthyle, l'acétone ou l'éthanol , ou encore un mélange approprié de tels solvants* 25 Dans le cas d'une ehromatographie en couche mince, on développe le chromatogramme et on élue ensuite la fraction désirée contenue dans la couche active,, les propriétés physiques et chimiques des Rifamycines 0 et B, préparées comme décrit dans les exemples 5 et 30 6 sont les suivantes s (Rifamycine 0) Prismes jaune pâle ; point de décomposition e 160°0 .Analyse élémentaire peur C* , s j y 4 c i-4 •62 911 (6,37 (1,83 35 Trouvé s 0 ' H ^ ' I Orne 4,40 Calculé s C 62,14 i H 6,29 ? H :sS6 § OMe 4,12 Rotation spécifique g £a?'^* .+ 68^ (c - 2,0 ; dioxanne) Spectre d'absorption dans 1eultraviolet et le visible dans l'é-^ thanol s voir figure 1 (sur laquelle la longueur d'onde, en mH> 70 19857 2043847 10 est poftée en abscisse et E.C est porté en ordonnée),, Spectre d'absorption dans l'infrarouge (Nujol} ; voir figure 2 «!! (sur laquelle le nombre d'ondesj, om „ est porté en abscisse et le facteur de transmissicH est porté en ordonnée)0 (Rifamycine B) Aiguilles jaunes § point de décomposition s 165°C Analyse élémentaire pour C3 9^-49^x4 - « Trouvé g C 61,35 ; H 6,49 ? S 1,73 Calculé g C 61,97 ; H 6,53 s N 1,85 At= pi Rotation spécifique g £ a7^ « 8,2S- (C = 1 ; méthanol) Spectres d'absorption dans l'ultraviolet et la lumière visible ? voir figure 3) sur laquelle la longueur d'onde, ml1, et E ^cm sont portés respectivement en abscisse et en ordonnée),, 15 Spectre d'absorption dans l'infrarouge (méthode au bromure de potassium) g voir figure 4 (sur laquelle le nombre d'onde, ■L cm" et le facteur de transmission 9 i<>9 sont respectivement portés en abscisse et en ordonnée)Q Pour identifier la Rifamycine B, on oxyde le 20 produit en Rifamycine 0 ou bien on le soumet à une hydrolyse oxydante en Rifamycine S, puis on effectue l'analyse élémentaire et les mesures spectroscopiques (absorption dans l'ultraviolet, dans le visible et dans 1°infrarouge)„ les résultats confirment que les produits sont identiques à des échantillons authenti-25 queso (Spectre antimierobien) g En utilisant;, comme milieu de titrage, de la gélose nutritive- quand des bactéries générales servent d'orga» nismes de titrage,, on mesure les 'concentrations minimales d'in~ hibition à 37°0S après 20 heures,. - 30 Dans le cas des bactéries acido-^ésistantes, on utilise de la gélose nutrit-ive glyoériaéô (37'®C § 48 heures)., et on utilise de la gélose autrî-t-ive glueosée pour les levures et les champignons (28®C 1 48 heures)» les résultats sont donnés dans le tableau 3o.: 35 Tableau 3 Rifamjrcine Ô Rifamycine33 mcg/1 mcg/1 Esoherichia coli IPO 3044 ">50 ~?50 Profceus vulgaris IEO 3045 ^50 *p*50 40 Pseudomonas aeruginosa IEO 3080 P" 50 5 0 19857 2043847 Tableau 5 (suite) Rifamycine O Rifamycine B 10 mcs/1 mcg/l StaphyXococeus aureus FOA 209P 0,2 0,5 Bacillus subtilis PCI 219 1 5 Baolllus cereus IFO 3466 10 20 Bacillus brevis .110 3331 1 10 Mycobaeterium avium IFO 3153 7-50 ^50 Myeobacterium std0 ATCC ! 607 >50 7 50 Candida albicans o m 0583 >"50 •^50 As-pergillus niger IFO 4066 ^"50 ^50 Xanthomonas oryzae IFO 3995 . 10 10 Les Rifamycines B et O. sont des composés intermédiaires importants utilisés dans la production d'un nouvel antibiotique, à savoir la "Rifamycine SV" , et elles peu-15 vent être converties en Rifamycine SV de la manière décrite dans "Arzneimittel Forschung88 8a 951 (1965)» Dans le présent exposé et dans les exemples qui vont suivre, les pourcentages s'entendent en poids et la relation entre les parties en poids et les parties en volume 20 est identique à celle qui existe entre les grammes et les millilitres» EXEMPLE! 1 Dans des milieux de culture ayant la composition donnée ci~dessous, on introduit un sel tel que le sulfa-25 te ferreux, le sulfate ferrique, le chlorure ferreux ou le chlo rure ferrique, en une quantité variable, à savoir.0,01 0^05$ 0,1# et 0,5 $>o On inocule chaque milieu avec Streptomyces B~2847 (IFO 12554) et on le fait incuber à 28âC pendant 4 jours» On mesure le rendement combiné en Rifamyciaes B et 0 30 dans la portion fluide de chaque bouillon résultant le 2e jcur, le 3e jour et le 4e jouis Dans le tableau, l'indication ""témoin signifie que-le résultat esc obteuu avec un milieu témoin ao contenant aucun composé du ier0 Tableau 4 35 Sel de fer ($) tjH 3 .jours (fo calculé sous forme de fer) p Activité, aie g/ml FeS04 0,01-(0,004) 6,75 110 0,05 (0,018) 7,05 210 0,1 -(0,037) 7,75 330 70 19857 2043847 10 15 Tableau 4 (suite) Sel de fer ($ calculé sous (*) forme dé fer) pH 3 jours FeSO^ 0,5 0,184) 7,75 300 Fe2(S04)3 0,01 0,001) 6,95 130 0,05 0,007) 6,95 190 0,1 0,014) 7,4 300 0,5 0,07) 7,35 275 FeClg 0,01 0,004) 6,9 145 0,05 0,023) 7,45 300 0,1 0,044) 7,8 300 0,5 0,225) 7,45 160 FeCl3 0,01 0,003) 6,95 145. 0,05 0,017) 7,4 300 0,1 0,034) 7,65 300 0,5 0,172) 7,45 275 Pas d'addition (Témoin) 6,7 70 20 25 EXEMPLE 2 On inocule une culture de Streptomyces B-2847 (IFO 12554) dans un milieu ayant la composition ci-dessous, qu'on a stérilisé au préalable pendant 15 minutes, sous une pression de 1,5 atm. Glucose 5 $> Peptone Liqueur de macération du maïs Farine de soja FeSO^ Chlorure de sodium 30 Carbonate de calcium précipité (Ajusté au pH 7 avec HTaOH) On fait incuber le milieu inoculé à 28°C pendant 72 heures» De cette manière, on peut obtenir un bouillon 35 de culture contenant au total 150 mcg/ml de Riîamycines B et 0. EXEMPLE 5 Dans un fermenteur ayant une capacité de 100 parties en volume, on introduit 60 parties en volume "d'un milieu contenant 2 $ de glucose, 2 $ de glycérine, 0,2 # de peptone, 40 1,5 i> de farine de soja, 0,05 # de FeSO^, 0,05$de MgSO^ et 0,5 i 1,0 io 1,0 i> 0,05 0,3 # 0,5 1° 70 19857 20 2043847 0,05 $ de oarbonate de calcium précipité (ajusté au pH 7 avec NaOH)o On stérilise le fermenteur dans les conditions décrites dans l'exemple 2, puis on inocule le mutant jaune de Streptoè myces B-2847 (IFO 13151) et on fait incuber à 28°C pendant 66 5 heures» Le procédé donne un bouillon de culture contenant 300 mog/ml au total des Rifamycines B et 0„ EXEMPLE 4 Dans un fermenteur ayant une capacité de 2000 parties en volume, on introduit 500 parties d'un milieu 10 de culture contenant 3 $> de glucose, 2 $ de farine de soja et 0,5 $> de carbonate de calcium précipité (ajusté au pH 7 avec NaOH), on stérilise sous une pression de 1,5 atmosphère pendant 15 minutes et on inocule ensuite Streptomyces B-2847 (IFO 12554) ». 15 On fait incuber le milieu inoculé à 28°C pen dant 66 heures» On inocule ensuite la culture résultante, dans une proportion de 3 i° du miliéu, dans une cuve d'une capacité de 200o000 parties en volume, contenant 100o000 parties en volume d'un milieu» Ce milieu.comprend 2 # de glucose, 3 $> d'a-20 midon soluble, 1 # de farine de soja, 1 # de liqueur de macération du maïs, 0,5 $ de peptone, 0,05 $> de FeSO^ (soit 0,018 calculé sous forme d'ions ferreux), 0,05 de MgSO^, 0,05 # de MnSO^p 0,005 # de KNO^, 0,3 $ de NàCl et 0,5 # de carbonate de calcium précipité (ajusté au pH 7 avec NaOH). 25 On fait ensuite incuber à 28°C pendant 66 heures, tout en aérant à un taux de 100 # et en secouant à la cadence de 200 tours/minutes0 On ajuste 84«000 parties en volume du bouillcn de culture au pH 7,2, après quoi on extrait oe bouillon avec le 30 tiers de son volume d'acétate d'éthyle ou de ohloroforme» On lave la couche d'acétate d'éthyle à deux reprises avec la moitié de son volume d'eau chaque fois, on la sèche et on la concentre sous pression réduite» On ajoute au produit concentré 2o000 parties en volume d'un mélange IslO d'éther diéthylique 35 et d'éther de pétrole, ou d'éther diéthylique et de n-hexane, et on obtient ainsi 70 parties en poids d'une poudre brute. On extrait cette poudre à deux reprises aveo 30 fois son volume d'éther diéthylique chaque fois, et on filtre pour récupérer la matière insoluble» 40 On dissout 60 parties en poids de la poudre 19857 2043847 résultante dans 1000 parties en volume d'acétone et on la fait adsorber sur 300 parties en poids de charbon activé de la qualité pour chromatographie (préparé par Takeda Chemical Industries, Ltd„)o On élue le charbon avec de l'acétone et on recueille en-5 viron 14»000 parties en volume de fractions de couleur jaune0 On concentre ensuite ces fractions et l'addition d'acétate d'éthyle au produit concentré donne des cristaux de couleur jaune pâle, avec un rendement de 16,4 parties en poids0 Après chromatographie de la liqueur-mère 10 sur 200 parties en poids d5un gel de silice acidifié au préalable avec de l'acide oxalique, on élue le chromâtogramme avec un mélange Isl de benzène et dsacétate d'éthyle, qui contient 1 $> d'acide oxalique» On recueille les fractions de couleur jaune pâle, on les lave à l'eau, on les déshydrate et on les 15 concentre ; on obtient ainsi 5,2 parties en poids de cristaux jaune pâle de Rifamycine 0» Quand on concentre l'extrait dans l'acétâte d'éthyle ou le chloroforme, la Rifamycine 0 se sépare parfois sous forme de cristaux» Dans ce cas, on récupère les cristaux 20 par filtration et on les recristallise» On peut purifier là liqueur-mère par chromatographie sur un gel de silice» le rendement est d'environ 30 parties en poids0 EXEMPLE 5 25 On utilise 78»000 parties en volume du bouillon de culture préparé d'une manière similaire à celle qu'on a décrite dans l'exemple 4 et on ajuste le pH à 8 en ajoutant de la soude caustique 211, puis on extrait avec le tiers de son volume d'acétate d5étfiyleo On ajuste 80„000 par-30 ties en volume de la couche aqueuse au pH 2,5 avec de l'acide sulfurique 2É et on extrait cette couche aqueuse avec le tiers et le cinquième de son volume d'acétate d'éthyle,. On combine les extraits et on les lave à deux reprises en utilisant chaque fois la moitié de leur volume 35 d'eau» Ensuite, on les'déshydrate et les concentre» L'addition d'éther de pétrole au produit concentré permet d'obtenir 66 parties en poids de Rifamycine B en poudre» Dans 2o000 parties en volume d'acétate d'é-•-thyle, on dissout 8 parties en poids de la poudre brute préci 19857 2043847 respectivement 1000 parties et 700 parties, en volume, d'un tampon au phosphate (pH 7,2)» On réunit les couches aqueuses, on les lave avec de l'acétate d'éthyle et on ajuste le pH à 3. On extrait la solution à deux reprises en utilisant chaque 5 fois 400 parties en volume dracétate d'éthyle, puis on lave l'extrait à l'eau, on le déshydrate et on. le concentre sous pression réduite,, l'addition de n-hexane au produit concentré forme une poudre jaune qu'on dissout dans 450 parties en volume d'un mélange 1 % X d'acétate d'éthyle et d'acétone, après quoi 10 on laisse la solution refroidir,, Ce procédé donne 0,36 partie en poids de Rifamycine B sous forme d'aiguilles jaunes . 19857 25 2043847 REVENDICATIONS le Procédé de production des Rifamycines B et O, caractérisé par le fait qu5il consiste à cultiver, le microorganisme Streptomyces B~2847 (IFO 12554) ou 5 le.mutant jaune de B-2847 (IFO 13151) au sein d'un milieu nutritif contenant des sources de carbone assimilables et des sour-• ces d'azote digestibless en présence de 0S05 à 0 20 Procédé selon la revendication 19 caractérisé par le fait que la température d'incubation est comprise entre 20°C et 45°0o