FR 2035942 A1 19701224 FR 7011182 A 19700327 70 11182 1 2035942 La présente invention concerne de nouveaux peptides qui sont des D^analogues de la sécrétine, leurs sels et les intermédiaires obtenus dans leur préparation. La sécrétine de porc répond à la formule suivante - 5 His-Sér-Asp-Gly-Thr-Phê^Thr-Sér-GLu-Leu-Sér-Arg-Leu-Arg-Asp-'Sér-Ala'-Arg-Leu- 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 GluCM^-Arg-Leu^Leu-GluCNH^-Gly-Leu-Val-NHj 10 20 21 22 23 24 25 26 27 et c'est donc un peptide contenant 27 résidas d'aminoacids contenant les aminoacides suivants : L-histidine (His); acide L-aspartique (Asp); L-sérine (Sér); glycine (Gly); L-thréonine (ïhr); L-phénylalanine (Phé)a acide L-15 glutamique (Glu)j L-glutamine ]_ Glu ( % L-leucine (Leu); L-arginine (Arg)j L-alanine (Ala); et L-valinamide (Val-Nï^). Ce peptide est sujet à l'attaque enzymatique qui raccourcit la durée de son action par suite de sa dégradation. La demanderesse a découvert selon l'invention que les formes D de 1"histidine, de la sérine5 de la 20 phénylalanine et de 1'arginine,,utilisëes dans la préparation de la sécrétine par synthèse,forment des analogues de la sécrétine qui sont résistantes à l'attaque enzymatique et présentent une activité de durée plus longue que la sécrétine. On peut préparer par synthèse les formes D de la sécrétine 25 et leurs sels au moyen de nouveaux intermédiaires que l'on combine ensuite jusqu'à formation des D-analogues de la sécrétine. Selon le procédé de l'invention, on peut préparer la D» sécrétine par synthèse en commençant par le L-valinamide et en ajoutant les aminoacides restants, un à la fois ou par groupes,, pour former le 30 peptide. On effectue cette addition en activant le groupe acide carboxylique dans 1 'ami|.oacide ajouté et en protégeant le groupe amino dans cet aminoacide, par transformation en dérivé benzyloxycarbonyle et ester de nitrophényle, et ensuite on fait réagir l'aminoacide avec un peptide préalablement préparé^ après élimination du groupement protecteur initialement présent dans le 35 peptide. 7011182 2 2035942 Parmi les groupements activants appropriés., on peut citer tous les groupements qui rendent plus réactive la fonction acide tels que les anhydrides mixtes (qui impliquent normalement l'acylation d'une aminé avec les anhydrides mixtess par exemple., d'un acylaminoacide et de l'acide 5 isovalêrique), les azides3 les chlorures d'acides, les produits de réaction avec les carbodiimidesa les composés N-acylés réactifs, les dérivés de 0-acyl-hydroxylamine et les esters réactifs,, tels que lfes esters d'alkyle ayant des substituants attirant les électrons (négatifs); les esters de vinyle, les esters d'énol, les esters de phényle, les esters de thiophényle, les esters 10 de nitrophényle3 les esters de 234-dinitrophényle3 les esters de trichloro-phényle et les esters de nitrophénylthiol. On préfère en particulier utiliser les esters de nitrophényle du point de vue du rendement,, de l'absence de sous-produits et de la facilité de purification qui s'ensuit. . Pour former les séquences peptidiques selon l'invention, 15 on peut protéger les fonctions amino par les groupements protecteurs des groupes amino couramment utilisés3 tels que benzyloxycarbonyle, nitrobenzyl-oxycarbonyle, méthoxybenzyloxycarbonyle, tertiobutyloxycarbon.yle3 phtalyle, o-nitrophênylsulfényle, tosyle,et ainsi de suite. Pour protéger les groupes carboxyle, on peut utiliser les groupes méthyle, éthyle3 tertiobutyle, 20 benzyle, nitrobenzyle, triméthyIfcenzy1e3 etc. Les groupements protecteurs du groupe hydroxy peuvent être des groupes benzyle3 tertiobutyle3 tétrahydro-pyranyle, et ainsi de suites et les groupements protecteurs du groupe guanidine peuvent être des groupes ni.tro5 tosyle3 p-nitrobenzyloxycarbonyle, et ainsi de suite, ou bien on peut avoir recours à la protonation. 25 On élimine les groupements protecteurs par des réactions connues, telles que réduction par le sodium dans l'ammoniac liquide, hydro-génolyse (par exemple en présence d'un catalyseur au palladium sur charbon), traitement par un acide halohydrique (tel que les acides bromhydrique et chlorhydrique) dans l'acide acétique ou traitement par l'acide trifluoracé» 30 tique. Pour préparer les aminés libres après traitement par un acide halohydrique dans l'acide acétique^ on traite le bromhydrate par une résine échangeuse d®ions3telle que 1'Amberlite IR400, neutralisée par une aminé telle que la triéthylamine. 35 Les sels de peptide ci-dessus mentionnés comprennent,par exemples les chlorhydrates, bromhydratess acétatess fluoracétates tels que le trifluoracétate,et les chloracétates tels que le diehloracétate. 70 11182 3 2035942 Selon 1'invention3 les nouveaux composés répondent à la formule générale R-His-R-Sér-Asp-Gly-Thr-R-Phé-Thr-Sér-Glu-Leu-Sér-R-Arg-Leu-R-Arg-Asp-Sér-5 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 Ala-R-Arg-Leu-GluCNl^)-R-Arg-Leu^Leu-GluCNH^)-Gly-Leu-Val-NH^ 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 10 dans laquelle R indique la forme D ou L et l'un au moins des R est D. Les groupements ou séquences d'aminoacides que l'on peut utiliser dans la pratique de l'invention sont les suivants His=R»Sér-Asp=Gly~(S^_^); 15 12 3 4 Thr-R-Phé.-Thr-Sér-(S5_g) ; 5 6 7 8 20 Glu-Leu-Sér-R-Arg-Leu-(Sg ^; et 9 10 11 12 13 R-Arg-Asp-Sér-Ala-R-Arg-Leu-GluCNT^)-R-Arg-Leu-Leu-GlufNï^)-Gly-Leu-Val-14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 25 30 35 NH2_(S14-27) dans lesquels R est tel que défini ci-dessus. Les ' équat ions suivantes illustrent le procédé de l'invention S9~13 + S14-27 > S9"27 Sg_ZJ + S^g > > S5-27 + Sl~4 >Sl-27 Les nouveaux D-ana-logues de la sécrétine obtenus par le procédé de l'invention, administrés de manière semblable à la secrétine, sont actifs environ deux fois plus longtemps. Les exemples suivants illustrent l'invention sans toutefois en limiter la portée. 70 11182 4 2035942 EXEMPLE 1 Benzyloxycarbonyl-D~phénylalanyl=L~thréonyl-L-sérinate de méthyle. On ajoute 2,1 g de catalyseur au palladium sur charbon (10%) à une solution de 21 g (60 millimoles) de benzyloxycarbonyl-L-thréonyl-L^ 5 sérinate de méthyle dans un mélange de 200 ml d'éthanol absolu et 60 ml d'acide chlorhydrique N» On agite la suspension en atmosphère d'hydrogène pendant 7 heures. On filtre le catalyseur et oit concentre le filtrat sous vide. On dissout le résidu huileux dans 300 ml de diméthylformamide contenant 8,4 ml (60 millimoles) de triéthylamine et on .fait' réagir avec 29 g (72 10 millimoles) de benzy1oxycarbony1=D=phény1alaninate de p-nitrophényle. On conserve le mélange à la température ambiante pendant 6 heures. On élimine les solvants sous vide et on fait digérer le résidu dans l'acétate d'éthyle. On recueille le solide cristallisé, on le sèche et on le recristallise 4ans un mélange méthanol-eau (2:1). Rendement 16,5 g ( 557») . 15 EXEMPLE 2 Benzyloxycarbonyl~L-thréonyl~D-phénylalanine-L-thréonyl~L-sérinate de méthyle. A une solution de chlorhydrate de D-phénylalanyl-L-thréonyl-L-sérinate de méthyle, préparée par hydrogénolyse de 15 g (30 millimoles) de benzyloxycarbonyl-D-phénylalanyl-L-thréonyl-L-sérinate de méthyle dans 100 ml 20 de diméthylformamide contenant 5,04 ml (36 millimoles) de triéthylamine, on ajoute 15 g (36 millimoles) de benzyloxycarbonyl-L-thréonJnate de 2,4-dinitro-phényle. On laisse reposer le mélange pendant une nuit à la température ambiante. Après avoir éliminé le solvant sous vide, on fait digérer le 25 résidu dans l'acétate d'éthyle. On recueille le solide cristallisé, on le sèche et on le recristallise dans l'éthanol à 95%, Rendement 15,4 g. EXEMPLE 3 sérine. 30 On ajoute 1,7 ml d'hydrate d'hydrazine à une solution de 2,1 g (3,5 millimoles) de benzyloxycarbohyl-L~thréonyl~D=phénylalanyl-L» thréonyl=D-sérinate de méthyle dans 170 ml de méthanol. On conserve le mélange à la température ambiante pendant 20 heures et on recueille par filtration le précipité formé, on le sèche et on le recristallise dans le 35 méthanol. Rendement 1,56 g (74%). 70 11182 5 2035942 EXEMPLE 4 Benzyloxycarbonylhydrazide de la t-butyloxycarbonylnitro-D-arginyl-L-leucine. On ajoute 7,15 g (14,4 millimoles) de t-butyloxycarbonyl-nitro-D-argininate de 2,4-dinitrophényle à une solution glacée de 4,75 g 5 (12 millimoles) de trifluoracétate de benzyloxycarbonylhydrazide de la L- leucine et 1,68 ml (12 millimoles) de triéthylamine dans 24 ml de tétrahydro-furane. On ajoute encore deux portions de chacune 0,7 g de l'ester de dinitro-phényle à 1 heure d'intervalle. On laisse reposer le mélange à la température ambiante pendant une nuit et ensuite on ajoute 0,75 ml de diméthy1aminopropy1-10 aminé. Après 1 heure, on dilue le mélange réactionnel par 200 ml d'acétate d'éthyle et on lave la solution résultante une fois par l'acide citrique à 20%, une fois par l'eau, deux fois par l'ammoniaque 0S5N et quatre fois par l'eau. On sèche la couche organique sur MgSO^ et on évapore les solvants sous vide. On triture le résidu huileux dans l'éther jusqu'à ce qu'il 15 devienne solide. On recristallise le produit brut dans un mélange acétate d'éthyle-éther 1:9. Rendement 6,15 g (88%). EXEMPLE 5 Benzyloxycarbonylhydrazide de la t-butyloxycarbonyl-0=benzyl~L-séryl~nitro-D-arginyl-L-leucine. 20 On dissout 7 g (12 millimoles) de benzyloxycarbonylhydra zide de la t-butyloxycarbonylnitro-D-arginyl-L-leucine dans 25 ml d'acide trifluoracétique maintenu à 10°C et on maintient la solution à la température ambiante pendant 15 mn. On élimine l'acide trifluoracétique sous vide à la température ambiante et on triture le résidu par l'éther. On filtre le solide, 25 on le lave à l'éther et on le sèche sous vide (K0H). On dissout ce trifluoracétate dans 36 ml de diméthylformamide glacé, on neutralise par 1,68 ml (12 millimoles) de triéthylamine, et on fait réagir avec le t-butyloxycarbo-nyl-O-benzyl-L-sérinate de p-nitrophényle, préparé à partir de 4,4 g (15 millimoles) de t-butyloxycarbonyl~0-benzyl-L~sérine. Après avoir laissé 30 reposer à la température ambiante, on dilue le mélange réactionnel par 300 ml d'acétate d'éthyle et on le lave une fois par l'acide citrique à 20% et deux fois par l3eau. On sèche la phase organique sur MgSO^, on élimine le solvant sous vide et on recristallise le résidu dans l'acétate d'éthyle. Rendement 6,3 g (70%). 35 EXEMPLE 6 Benz^loxycarbonylhydrazide_de_la t^but^loxycarbonyl-L^leucyl-O-benzyl-L-sér^l-nitro-D-ar ginyl-L-leucine . On prépare le tétrapeptide protégé de la même manière que le tripeptide protégé précédent. On recristallise dans l'êthanol absolu. Rendement 82%. 70 11182 6 2035942 EXEMPLE 7 Benzyloxycarbonylhydrazide de t=benzyloxycarbonyl«y ~benzyl~L-glutamyl-L-leucyl~0-benzyl-L-séryl»nitro-D-arginyl~L=leucine. On prépare le composé ci-dessus de la même manière que le 5 tëtrapeptide précédent. On recristallise dans le méthanol. Rendement 84%. EXEMPLE 8 Trifluoracétate de L-glutamyl-L-leucyl-L-séryl-L-arginyl-L-leucyl-nitro-D-arginyl«|3-benzyl-L-aspartyl-*0-benzyl-L-séryl-L-»alanyïsiitro-D-arginyl-"L-leucyl-L-glutaminykiitro-D-arginyl-L-leucyl-L-leucyl-L-glutaminyl-glycyl-leucyl-L-10 valinainide. On ajoute 0,9 ml d'acide chlorhydrique concentré à une solution de 1,35 g (1,8 millimole) d'hydrazide de t-butyloxycarbonyl-L-glutamyl-L-leucyl-k-séryl-L-arginyl-L-leucine,préparé par hydrogénolyse de l'hydrazide protégé dans 13,5 ml de diméthylformamide refroidi à -20°C 15 dans un bain de neige carbonique et acétone. On laisse monter la température du bain jusqu'à -15°C et on ajoute 1,35 ml (2,7 millimoles) d'une solution aqueuse à 14% de nitrite de sodium. Après 5 mn, on abaisse la température du bain à -25°C et on ajoute 1,25 ml de N=éthylpipéridine. A ce mélange contenant l'azide du t-butyloxycarbonylpentapeptide, on ajoute 2,8 g 20 (1,4 millimole) de trifluoracétate de nitro-D-arginyl-(3-benzyl=L-aspartyl«-O-benzyl-L-séryl-L-alanyl-nitro-D-arginyl-L-leucyl-L-glutaminylnitro-D-arginyl-L-leucyl-L-leucyl-L-glutaminylglycyl-L-leucyl-L-valinamide dans 13,5 ml de diméthylformamide. On conserve le mélange réactionnel à 5°C et, après 48 heures, on ajoute une nouvelle portion d'azide du t-butyloxycarbonyl-25 pentapeptide, préparé à partir de 150 mg de l'hydrazide correspondant. Après un total de 4 jours, on élimine les solvants sous vide et on désagrège le résidu dans l'acétate d'éthyle. On recueille le solide par filtration et on le sèche. On dissout le produit ainsi obtenu dans 30 ml d'acide trifluoracétique froid et on maintient la solution à la température ambiante pendant 30 15 mn. On élimine l'acide trifluoracétique sous vide et on désagrège le résidu dans l'éther, on filtre et on sèche. On lave deux fois le trifluoracétate avec 30 ml d'eau pour éliminer les sels et l'excès de pentapeptide. On recueille le produit insoluble par centrifugation et on sèche sous vide (KOH). Rendement 2,9 g (80%). 70 11182 7 2035942 EXEMPLE 9 L~glutamyl~L~leucyl~L~séryl~L-argiriyl-L-l.eucyl='D~arginyl-='L=aspartyl'"L-sêryl-L~alanyl~D~arginyl-L~leucyl~L-glutaminyl"D"arginyl-L-leucyl-L-leucyl~L-glutaminylglycyl-L-leucyl-L-valinamide. 5 On soumet à>1"hydrogénation sur un catalyseur à 10% de palladium sur charbon pendant 48 heures une solution de 1,4 g de l'amide du nonadécapeptide partiellement protégé dans 50 ml d'acide acétique aqueux (80%)s on élimine le catalyseur par filtration et on sèche le filtrat par congélation. Rendement ls25 g. 10 EXEMPLE 10 L-thréonyl-L-phénylalanyl-L-thréonyl-L-séryl-L-glutamyl-L-leucyl-L-séryl-L-arginyl-L-leucyl-D-arginyl-L~aspartyl~L-séryl-L-alanyl=D-argiîiyl'=L-leucyl-L~ glutaminyl-D^arginyl-L-leucyl-L-leucyl-L-glutamin.ylglycyl-L-leucyl-L-valinamide. On ajoute 0^45 ml (0S9 millimole) d'une solution aqueuse à 15 14% de nitrite de sodium à une solution de 450 mg (Os75 millimole) d'hydrazide de la benzyloxycarbonyl-L-thréonyl-L-phénylalanyl-L-thréonyl-L»sérine dans 5S6 ml de diméthylformamide contenant 0,37 ml d'acide chlorhydrique concentré., refroidie à -15°C dans un bain de neige carbonique-acétone. Après 15 mn, on abaisse la température du bain à -25°C et on ajoute 0,53 ml de N-éthylpipé-20 ridine. A ce mélange contenant l'azide du benzyloxycarbonyl-tétrapeptide, on ajoute une solution de 1,2 g (0,5 millimole) d'amide du nonadécapeptide libre dans 3,3 ml de diméthylformamide et 1 ml d'eau. On conserve le mélange réactionnel à 5°C. On ajoute après 24 heures une seconde portion d'azide du benzyloxycarbonyl-tétrapeptide, préparé à partir de 90 mg de l'hydrazide 25 correspondant. Après un total de 48 heures, on élimine sous vide les solvants et on dissout le résidu dans 70 ml d'acide acétique aqueux à 90%, puis on hydrogène sur 500 mg de catalyseur à 107. de palladium sur charbon pendant 7 heures. On sépare le catalyseur par filtration et on sèche le filtrat par congélation. On distribue ce produit lyophilisé par 250 transferts 30 dans le système butanol~pyridine=acide acétique~eau (4:2:1:7). On observe un seul pic important. Rendement 740 mg. EXEMPLE 11 L-histidyl-L-sëryl-L-aspartylglycyl-L=thréonyl-L«.phénylalanyl-L—thréonyl-L-séryl-L-glutamyl-L-leucyl-L-sêryl-L-arginyl^L-leucyl-D-arginyl-L-aspartyl-'L-35 séryl-L-alanyl-D-arginyl-L-leucyl^L—glutamyl-D-arginyl-L-leucyl-L-Leucyl-L-glutaininylglycyl-L-leucyl-L-valinamide. On ajoute 0S09 ml d'acide chlorhydrique concentré à une solution agitée de 96 mg (0518 millimole) d'hydrazide de la t-butyloxycarbo-ïiyl-L-histidyl-L-séryl-L-aspartylglycine (obtenu par hydrogénolyse de 70 11182 8 2035942 l'hydrazide protégé) dans 1,5 ml de diméthylformamide refroidi à -20°C dans un bain de neige carbonique-acétone. On laisse monter la température du bain jusqu'à -15°C et on ajoute 0,15 ml (0,3 millimole) d'une solution aqueuse à 14% de nitrite de sodium. Après 5 mn, on abaisse la température du bain à 5 -25°C et on ajoute 0,13 ml de N-éthylpipéridine. A ce mélange, contenant l'azide du t-butyloxycarbonyl-tétrapeptide, on ajoute une solution de 168 mg (0,06 millimole) de l'amide du tricosapeptide libre dans 2,1 ml de diméthylformamide. On conserve le mélange réactionnel à 5°C. On ajoute après 24 heures une seconde portion d'azide du t-butyloxycarbonyl-tétrapeptide (préparé à 10 partir de 32 mg de l'hydrazide correspondant). Après un total de 48 heures,_ on élimine les solvants sous vide et on dissout le résidu dans 6 ml d'acide trifluoracétique froid. On maintient la solution à la température ambiante pendant 15 mn et on précipite le trifluoracétate d'heptacosapeptide avec 100 ml d'éther. On recueille le solide par centrifugation, on lave à l'éther, 15 et on sèche. Rendement 330 mg. On distribue ce produit par 200 transferts dans le système butanol-tampon pH 7 au phosphate 0,1M (1:1). On trouve l'amide d'heptacosapeptide désiré dans un pic séparé et on le recueille dans le système à deux phases par le procédé d'adsorption sur acide alginique. Rendement 62 mg. 20 EXEMPLE 12 Benzyloxycarbonyl^D-histidyl-O-benzyl-L-'Séryl-jâ-benzyl-L-aspartylglyeyl-t-thréonyl-L-phénylalanyl-L-thréonyl-O-benzyl- ,y-benzyl-L-séryl=p=benzyl-L-glutamyl-L-leucyl-O-benzyl-L-séryl^nitro-L-arginyl-L-leucyl-nitro-L-arginyl-g-benzyl-L-aspartyl~0-benzyl-L-séryl-L~alanyl-nitro-L-arginyl-L»leucyl-L-25 glutaminyl-nitro-L=arginyl-L-leucyl-L-leucyl-L-glutaminylgly.cyl-L—leucyl-L—valinamide. On ajoute 70 mg (1 millimole) de nitrite de sodium à une solution de 305 mg (1 millimole) d'hydrazide de la benzyloxycarbonyl-D-histidine dans un mélange de 4 ml d'acétate d'éthyle et 3 ml d'acide 30 chlorhydrique N en agitant dans un bain de glace et de sel. Après 3 mn, on ajoute 0,8 ml d'une solution aqueuse à 50% de carbonate de potassium et3après encore 3 mn, on arrête l'agitation et on laisse les deux phases se séparer. On extrait la phase aqueuse avec une seconde portion de 1 ml d'acétate d'éthyle et on la jette. On réunit les phases organiques et on 35 sèche à 0°C sur sulfate de magnésium. 70 11182 9 2035942 On ajoute cette solution d'azide de la benzyloxycarbonyl» D-histidine dans 3,5 ml d?acétate d'éthyle à une solution glacée de 780 mg du trifluoracétate d'hexacosapeptide dans un mélange de 6 ml de diméthylformamide et de triéthylamine (0,4 ml d'une solution à 14% en volume de 5 triéthylamine dans le formaldéhyde). On maintient le mélange réactionnel à 5°C. Après 24 heures, on ajoute une autre portion d'azide de benzyloxycarbonyl— D-histidine (1/3 de la quantité initiale). 24 heures après cette addition, on ajoute goutte à goutte le mélange réactionnel à 500 ml d'acétate d'éthyle. On filtre le produit solide, on le lave à l'acétate d'éthyle et on le sèche sous 10 vide sur de la soude. Rendement 717 mg. EXEMPLE 13 Cfc N -benzyloxycarbonyl-nitro-D-arginyl-L-leucyl-L—leueyl-L-glutaminylglycyl-L- leucyl-L-valinamide. On refroidit dans 1'eau glacée une solution de 3,53 g de OC 15 N -benzyloxycarbonyl-nitro-D-arginine et 2S0 g de 2,4-dinitrophénol dans 60 ml de tétrahydrofuranne pendant l'addition de 2,1 g de dicyclohexylcârbodiimide. Après 1 heure à la température ambiante, on sépare par filtration le précipité de dicyclohexylurée et on le lave.avec 40 ml de tétrahydrofurane. On évapore à siccité sous vide le filtrat et les liqueurs de lavage combinés, on dissout 20 le résidu dans environ 10 ml d'acétate d'éthyle et on précipite avec environ 50 ml d'éther. On lave l'ester avec environ 50 ml d'éther et on sèche sous vide. On obtient 3,9 g d'amide d'hexapeptide que l'on dissout dans 150 ml de diméthylformamide à environ 80°G et on mélange avec une solu-25 tion de 1'ester réactif ci-dessus dans 50 ml du même solvant. On refroidit le mélange à la température ambiante et,après environ 4 heures, on dilue avec 1 litre d'éther. On filtre le précipité, on le lave avec 0,6 litre d'éther et 0,3 litre d'acétate d'éthyle et on le sèche à l'air. Rendement 4,5 g. EXEMPLE 14 3° Benzyloxycarbonyl-L^glutaminyl-nitro-D-arginyl-L-leucyl-L-leucyl-L-glutaminyl-glycyl-L-leucyl-=L-val inamide. On dissout 9,8 g de 1'heptapeptide protégé dans 50 ml d'acide acétique tiède, on refroidit et on traite par l'acide bromhydrique dans environ 50 ml d'acide acétique 4N. Après 1 heure à la température 35 ambiante, on ajoute 1,2 litre dréther à la solution, on filtre le bromhydrate, on le lave à l'éther et on sèche sous vide sur de la soude pendant un court instant. On dissout ensuite dans 100 ml de diméthylformamide et on alcalinise 70 11182 10 2035942 avec 10s4 ml de triéthylamine. On ajoute au mélange 5,0 g de benzyloxy-carbonyl-L—glutamate de p-nitrophényle et on abandonne à la température ambiante pendant une nuit; il se sépare des cristaux qui forment un masque semi-solide. On dilue le mélange avec 1 litre d'acétate d'éthyle, on filtre 5 le précipité, on le lave avec 500 ml d'acétate d'éthyle, 500 ml d'éthanol et avec l'acétate d'éthyle, avec 250 ml d'acétate d'éthyle chaud et 250 ml de chloroforme chaud. On sèche d'abord le produit à l'air et ensuite à 50°C sous vide. Rendement 11,0 g (1007»). EXEMPLE 15 10 Benz^lo^carbon^l-I^leucYl-L-glutaminYl-nitro-D-arginyl-L-leucYl^L-leucYl-L- glutaminylglycyl-L—leucyl-L—valinamide. On pulvérise 11,1 g de l'octapeptide protégé et on l'ajoute en agitant à 50 ml d'acide acétique. On ajoute lentement à la suspension 50 ml d'acide bromhydrique environ 4N dans l'acide acétique. On continue l'agitation 15 jusqu'à ce que toute la substance soit dissoute et ensuite pendant encore 30 mn; il faut un total de 3 heures. On précipite le bromhydrate d'aminé avec 1 litre d'éther, on filtre, on lave à l'éther et on sèche sous vide sur de la soude pendant un court instant. On dissout le bromhydrate dans 100 ml de diméthy1formamide et on ajoute à la solution froide 10,4 ml de triéthylamine, 20 puis 5,0 g de benzyloxycarbonyl-L-leucinate de p-nitrophényle. Après repos pendant une nuit à la température ambiantes on dilue le mélange avec 2 litres d'acétate d'éthyle. On filtre le précipité qui s'est formé et on le lave avec des portions de 200 ml d'acétate d'éthyle, de chloroforme, de chloroforme chaud et d'acétate d'éthyle chaud. On sèche le produit sous vide à 50°C. 25 Rendement 12,1 g (99%). EXEMPLE 16 OC H -benzylcxycarbonyl-nitro-B-arginyl-L-leucyl-L-glutaminyl-nitro-D-arginyl--L"leucyl-L—leucyl-L-glutaminylglycyl-L-leucyl-L—valinamide. On met en suspension 24,2 g de l'amide de nonapeptide dans 30 100 ml d'acide acétique et on ajoute lentement à la suspension 100 ml d'acide bromhydrique environ 4N dans 1Tacide acétique. On obtient en environ 1 heure une solution homogène et on la maintient à la température ambiante pendant encore 1 heure. On ajoute à la solution 2 litres d^éther. On filtre le bromhydrate précipité, on le lave à l'étlier5 on le sèche sous vide sur de 35 la soude pendant un court instant. On le dissout dans 250 ml de diméthylformamide; on refroidit la solution en alcalluisant avec 14 ml de triéthylamine. On ajoute 25,8 g de benzyloxycarbonyl-nitro-D-argininate de 2,4- 70 11182 ii 2035942 dinitrophényle et encore 5 ml de triéthylamine. Après 3 heures à la température ambiante;, la solution ne donne plus de réaction à la ninhydrine. Le jour suivant,, on dilue avec 2 litres d'acétate d'éthyle, on recueille le précipité et on le lave avec 500 ml d'acétate d'éthyle, 500 ml de chloroforme, 5 1,5 litre de chloroforme chaud et 500 ml d'acétate d'éthyle chaud. On sèche le produit à 50°C sous vide. Rendement 25,1 g (88%). EXEMPLE 17 Benzyloxycarbonyl-L~alanyl-nitro-D-arginyl-L-leucyl-L~glutaminyl-nitro-D-arginy1-L-leucy1-L-leucyl-L-glutaminylglycyl-L-leucyl-L-valinamide. 10 A une solution de 25,5 g d'amide du décapeptide protégé dans 120 ml d'acide acétique, on ajoute lentement 120 ml d'une solution d'acide bromhydrique environ 4N dans .l'acide acétique. Après 1 heure et demie à la température ambiante, on précipite le bromhydrate par environ 2 litres d'éther, on le lave à l'éther et on le sèche rapidement sous vide 15 sur de la soude. On le dissout dans 180 ml de diméthylformamide, on ajoute 18 ml de triéthylamine à la solution, puis 9,3 g de benzyloxycarbonyl-L-alaninate de p-nitrophényle. On laisse la réaction se poursuivre pendant la nuit, puis on filtre le mélange, on lave le bromure de triéthylammonium avec 50 ml de diméthylformamide, on ajoute encore 3,1 g de l'ester actif et 20 1 ml de triéthylamine et on concentre la solution jusqu'à un faible volume. Après 2 heures, on dilue par 2 litres de chloroforme. On lave le précipité cristallisé par le chloroformé et on le sèche à l'air. Rendement en produit sec 25,6 g (95%). EXEMPLE 18 25 N-t-butyloxycarbonyl-O-benzyl-L-séryl-L-alanyl-nitro-D-arginyl-L-leucyl-L-glutaminyl-nitro-D-arginyl-L-leucyl-L-leucyl-L-glutaminylglycyl-L-leucyl-L-valinamide. A une suspension de 24,0 g du hendécapeptide protégé dans 160 ml d'acide acétique, on ajoute lentement 160 ml d'une solution 30 d'acide bromhydrique 4N dans l'acide acétique. Après environ 2 heures à la température ambiante, on dilue la solution avec 2 litres d'éther et on filtre le précipité, on le lave à l'éther et on le sèche sous vide sur de la soude. On dissout le bromhydrate dans 235 ml de méthanol; on refroidit la solution dans un bain d'eau glacée et on neutralise avec 25 ml de 35 triéthylamine. Il se forme une masse cristalline épaisse. On dilue la suspension avec 500 ml de chloroforme, on filtre les cristaux^ on les lave avec 1 litre de chloroforme et on sèche à l'air et enfin sous vide à 40°C. Rendement en monobromhydrate 18,4 g (80%). 70 11182 2035942 12 On traite 18sO g du monobromhydrate dans 800 ml dç diméthylformamide en présence de 1,5 ml de triéthylamine avec le N-t-butyloxycarbonyl-O-benzyl-L-sériiiate de p-nitrophényle. On prépare cet ester réactif à partir de 9,4 g de l'acide correspondants 5,5 g de p-nitrophénol et 6,6 g de dicyclo-5 hexylcarbodiimide dans 40 ml d'acétate d'éthyle. On sépare par filtration la N,N'-dicyclohexylurée et on élimine le solvant du filtrat sous vide. On utilise le résidu huileux, qui ne cristallise pas, sans purification. Après un jour à la température ambiante, on concentre le mélange sous vide à environ 50 ml. On ajoute 1,5 litre d'acétate d'éthyle et on filtre le précipité et on le 10 lave avec 500 ml d'acétate d'éthyle, 200 ml de chloroforme et encore une fois avec 500 ml d'acétate d'éthyle. Pendant le traitement par le chloroforme, le produit se transforme en une masse cristalline. On sèche'le dodéca-peptide protégé à 40°C sous vide. Rendement 19,1 g (93%). EXEMPLE 19 15 t-butyloxycarbonyl-g-benzyl-L-asgartyl-O-benzyl-L-séryl-L-alanyl-nitro-D- arginyl-L-leucyl-L-glutaminyl-nitro-D-arginyl-L-leucyl-L-leucyl-L-glutaminyl-glycyl-L—leucyl-L-valinamide. On dissout 18,8 g de l'amide du dodécapeptide protégé dans 120 ml d'acide trifluoracétique. Après environ 15 mn, on évapore la majeure 20 partie de l'acide trifluoracétique sous vide et on dilue le résidu sirupeux par 500 ml d'éther. On recueille le précipité, on le lave à l'éther et on le sèche sous vide sur de la soude. On obtient 19,0 g de trifluoracétate de 1'aminé libre n'ayant pas de point de fusion bien défini. On dissout 12,35 g de cette substance dans 500 ml de diméthylformamide; on ajoute à 25 la solution 0,70 ml de triéthylamine et 3,35 g de t-butyloxycarbonyl-|3-benzyl-L-aspartate de p-nitrophényle et,après 2 heures, une seconde portion de 3,35 g d'ester réactif et 0,35 ml de triéthylamine. On laisse reposer le mélange pendant une nuit à la température ambiante. On élimine sous vide la majeure partie du solvant et on dilue le résidu avec 160 ml d'acétate 30 d'éthyle. On filtre le tridécapeptide protégé, on le lave à l'acétate d'éthyle et on le sèche à l'air, puis sous vide à 40°C. Rendement 13,05 g(94%). EXEMPLE 20 OC N -t-butyloxycarbonyl-nitro-D-arginyl-^-benzyl-L-asgart^l-O-benzyl-L-sér^l-L-alanyl-nitro-D-arginyl-L-leucyl-L-glutaminyl-nitro-D-arginyl-L»leucyl-L-35 leucyl-L—glutaminylglycyl-L—leucyl-L-valinamide. On dissout 13,0 g du tridécapeptide protégé dans 100 ml d'acide trifluoracétique. Après environ 15 mn à la température ambiante, on élimine la majeure partie de l'acide trifluoracétique sous vide et on 70 11182 13 2035942 triture le résidu avec 900 ml d'éther. On filtre le trifluoracétate d'aminé libre, en le lave à l'éther et on le sèche sous vide sur de la soude (13,3 g). A une solution du trifluoracétate dans 145 ml de diméthylformamide, on ajoute 6,0 g de t-butyloxycarbonyl-nitro-D-argininate de 2,4-dinitrophényle, puis 5 1,0 ml de triéthylamine. Dans les 7 heures qui suivent, on ajoute encore un total de 1,1 ml de triéthylamine en plusieurs portions pour maintenir le mélange légèrement alcalin. Après environ 24 heures à la température ambiante, on ajoute encore 2,0 g de l'ester réactif et 0,7 ml de triéthylamine et, après encore 1 jour, on élimine la majeure partie du solvant sous vide. On triture 10 le résidu avec environ 1 litre d'acétate d'éthyle et on filtre la substance solide et on la lave à l'acétate d'éthyle et à l'éther. Après séchage à l'air et sous vide à 40°C, on obtient le tétradécapeptide protégé brut.Rendement 13,75g. EXEMPLE 21 ^15 arginyl~L-leucyl-L~leucyl»L~glutaminylglycyl-L~leucyl~L-valinamide. On dissout 13s7 g du tétradécapeptide protégé dans 105 ml d'acide trifluoracétique. Après repos pendant environ 15 mn s la température ambiante, on évapore le solvant sous vide et on triture le résidu avec 1 litre d'éther. On recueille par filtration le trifluoracétate d'aminé libre, on le 20 lave à l'éther et on le sèche sous vide sur de la soude (13,9 g). On dissout 13,9 g du trifluoracétate d'amine libre dans 150 ml d'acide acétique à 80%. On ajoute 1„5 g de catalyseur à 10% de palladium sur charbon et on fait passer 1'hydrogène dans le système pendant 48 heures. On sépare le catalyseur par filtration et on sèche le filtrat par 25 congélation. Rendement 12,2 g. EXEMPLE 22 D-histidyl-L-séryl-L-asgart^lgl^cYl-L-thréon^l-L-ghénglalanyl-L-thréonyl-L- séryl=L>"glutamyl-L-leucyl'=L"Séryl-L~arginyl-L-leucyl-L-arginyls*L=*aspartyl-L-séryl~L-alanyl-L-arginyl-L-leucyl-L~glutaminyl-L-argiïiyI-L-leueyl-L— 30 leucyl-L-glutaminylglycyl-L-leucyl-L-valinamide. On dissout 500 mg de 1'heptacosapeptide protégé, benzyloxy-carbonyl~D-histidyl=0-benzyl-L-séryl'=P"-benzyl-L-aspartylglycyl-L-thréonyl-L-phénylalanyl-L-thréonyl-O-benzyl-L-séryl-Y-benzyl-L-glutamyl-L-leucyl-O-benzyl-=L~séryl-nitr0=L-arginyl~L-leucyl-nitr0'=L~arginyl-[3~ben2yl-L-aspartyl-35 Q-benzyl 70 11182 14 2035942 dium sur sulfate de baryum et on hydrogène le mélange pendant 48 heures. On sépare le catalyseur par centrifugation à 1500 tr/mn et on sèche la liqueur surnageante par congélation. Rendement 444 mg. EXEMPLE 23 5 Benzyloxycarbonylhydrazide de la t-butyloxycarbonyl-O-benzyl-D-séryl-L-aspartylglycine. On dissout 10,8 g de benzyloxycarbonylhydrazide de la t-butyloxycarbonyl-p-t-butyl-L-aspartylglycine dans 50 ml d'acide trifluoracétique glacé et on maintient la solution à la température ambiante pendant 10 1 heure. On élimine l'acide trifluoracétique sous vide à la température ambiante et on triture le résidu dans l'éther. On filtre le solide, on le lave à l'éther et on le sèche sous vide (KOH). Rendement 7,1 g (16 millimoles). On dissout le trifluoracétate dans le diméthylformamide glacé, on neutralise par 4,62 ml (33 millimoles) de triéthylamine et on fait réagir 15 avec le t-butyloxycarbonyl-O-benzyl-D-sérinate de p-nitrophényle, préparé à partir de 7,1 g (24 millimoles) de t-butyloxycarbonyl-O-benzyl-D-sérine. On maintient le mélange réactionnel à la température ambiante pendant 2 heures, on dilue par 400 ml d'acétate d'éthyle et on extrait une fois avec l'acide citrique à 20% et trois fois par l'eau. On sèche la couche organique 20 sur MgSO^ et on élimine le solvant sous vide. On cristallise le résidu dans l'acétate d'éthyle. Rendement 7,7 g (80%). EXEMPLE 24 Benzyloxycarbonylhydrazide de la t-butyloxycarfconyl-L-histidyl-O-benzyl-D-séryl-L-aspartylglycine. 25 On ajoute 840 mg (12 millimoles) de nitrite de sodium à une solution de 3,22 g (12 millimoles) de t-butyloxycarbonyl-D-histidine dans un mélange de 48 ml d'acétate d'éthyle et 36 ml d'acide chlorhydrique II en agitant dans un bain de glace et de sel* Après 3 un, on ajoute 9,6 ml d'une solution aqueuse à 50% de carbonate de potassium et, après encore 3 mn, 30 on interrompt l'agitation et on laisse les deux phases se séparer. On extrait la phase aqueuse avec une seconde portion de 12 ml d'acétate d'éthyle et on la jette. On combine les phases organiques et on sèche à 0°C sur sulfate de magnésium. On ajoute cette solution d'azide de t-buty1oxycarbony1-35 L-histidine dans l'acétate d'éthyle à une solution glacée de trifluoracétate de benzyloxycarbonylhydrazide dé 0-benzyl«D=séryl='L-aspartylglycine, préparé à partir de 5,0 g du t-butyloxycarbonyl-tripeptide avec élimination du 70 11182 15 2035942 groupement protecteur avec 8 millimoles d'acide trifluoracétique dans un mélange de 24 ml de diméthylformamide et 2324 ml de triéthylamine. On maintient le mélange réactionnel à 5°G. Après 24 heures? on ajoute une nouvelle portion d'azide de t-butyloxycarbonyl-D-histidine préparé à partir de ls07 g de l'hydrazide correspondant. 24 heures après cette addition, on concentre le mélange réactionnel à siccité sous vide et on recristallise le résidu deux fois dans l'éthanol aqueux à 50%. Rendement 4a4 g (70%). 70 11182 16 2035942 REVENDICATIONS 1. A titre de produits industriels nouveaux desheptacosapeptides, caractérisés en ce qu1ik répondent à la formule R-His-R-Sér-Asp-Gly~Thr-R-Phé-Thr-»Sér-Glu=Leu=S.ér-R~Arg-Leu-R~Arg~Asp-Sér-5 Ala-R-Arg-Leu-GluCNI^)-R-Arg-Leu-Leu-GlufNH^)-Gly-Leu-Val-NH^ dans laquelle R indique la forme D ou L, et l'un au moins des R signifie D. 2. Procédé de préparation de D-analogues de la sécrétines caractérisé en ce que l'on fait réagir la forme D de l'histidine, de la 10 sérines de la phényl-alanine ou de l'arginine avec des aminoacides pour former les D-analogues désirés de la sécrétine de formule f R-His-R-Sér-Asp-Gly-Thr-R-Phé-Thr-Sér-Glu-Leu-Sér-R-Arg-Leu-R-Arg-Asp-Sér-1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 .15 16 15 Ala-R-Ar g-Leu-Glu(NH^)-R-Arg-Leu-Leu-GluCNH^)-Gly-Leu-Val-NH^ 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 dans laquelle R est tel que défini ci-dessus. 20 3. Procédé selon la revendication 2S caractérisé en ce que l'on fait réagir Glu-Leu-Sér-R-Arg-Leu avec R-Arg-Asp-Sér-Ala-R-Arg-Leu-GluCNH^J-R-Arg-Leu-Leu-GluCNH^J-Gly-Leu-Val-NH^j on fait ensuite réagir le produit ainsi formé avec Thr-R-Phé-Thr-Sér3 et on fait enfin réagir avec His-R-Sér-Asp-Gly, l'un au moins des R des réactifs indiquant la forme D. 25 4. Heptacosapeptidesprotégé util® comme intermédiaires dans ■ le procédé selon les revendications 2 et 3, caractérisés en ce qu'ils répondent à la formule (R-His protégé)-(R-Sér 0->protégé)-(L-Asp p-protégé)-Gly-L-thr-R-Phé-L-Thr-30 (L-Sér 0-protégé)-(L-Glu d*-protégé) — L-leu-(L-Sér 0-protégé)-(R-Arg m -protégé)-L-leu-(R-Arg w-protégé)-L-Asp-(L-Sér 0-protégé)-L-Ala-(R-Arg Uj-protégé)"L-Leu-L-Glu(NH2)-(R-Arg u»-protégé)-L-Leu-L-Leu-L-GluCNH^)-Gly-L-Leu~L~Val-NH2 35 dans laquelle R est tel que défini à la revendication 1. 70 11182 17 2035942 5. Tétradécapeptidesprotégéjutil® comme intermédiairesdans le procédé selon la revendication 13 caractérisé en ce qu1 ils répondent formule 5 (R-Arg u>-protégé)-(L-Asp (3-protégé)-(L-Sér 0-protêgé)~L-Ala-(R-Arg ct>-protége>-L-Leu~L-Glu ( NH^) - ( R-Arg u>-protégé)-L-Leu-L-Leu-L-GluO^H^-Gly-L-Leu-L-Val-NI^ dans laquelle R est tel que défini à la revendication 1. 6„ Tétradéeapeptides librœ3utiles comme intermédiaires dans le 10 procédé selon les revendications 2 et 3S caractérisés en ce qu'ils répondent la formule R-Arg-L-Asp-L-Sér-L-Ala-R-Arg-L-Leu-L-GluCNH^-B-^Arg-L-Leu-L-Leu-L-GluCNH^)-Gly-L-Leu-L"Val-NH2 15 dans laquelle R est tel que défini à la revendication 1. 7. Nonadécapeptidesprotégésjutiles comme intermédiaires d'ans le procédé selon la revendication 2 ou 3S caractérisés en ce qu1ils répondent la formule 20 (L-Glu y-protégé)-L-Leu-(L-Sér 0-protégé)-(R-Arg t-»-protégé)-L-Leu=(R-Arg «^-protégé)-(L~Asp p-protégé)-(L-Sér 0-protégé)-L-Ala-(R-Arg «/-protégé)-Leu-L-GlufWH^)-(R-Arg W -protégé^L-Leu-L-Leu-L-GluCNH^-Gly-L-Leu-L-Val-Nï^ 25 dans laquelle R est tel que défini à la revendication 1„ 8. Nonadécapeptide libres3utiles comme intermédiaires dans le procédé selon la revendication 2 ou 3S caractérisé en ce qu ' ils répondent la formule 30 L-"Glu-L-Leu-L-5ér-R-Arg-L-Leu-R-Arg-»L— Asp-L-Sér-L-AIa^R-Arg-C-Leu-L-Gl^NH^)-R-Arg-L-Leu-L~Leu-L«Glu(NH )-Gly-L=Leu-L-Val-NH2 dans laquelle R est tel que défini à la revendication 1. 9. Tricosapeptides protégés3utiles comme intermédiaire dans 35 le procédé selon la revendication 3S caractérisé en ce qu'ils répondent à la formule 70 11182 18 2035942 L-ïhr-R-Phé~L-Thr-(L-Sér O-protégé)-(L-Glu V -protégé)-L~Leu-(L-Sér O-protégé)-(R-Arg U*-protégé)-L-Leu-(R-Arg W-protégé)-(L-Asp p-protégé)-(L-Sér 0-protégé)-L«Ala—(R-Arg W-protégé)-L-Leu-L-Glu(NH2)-(R-Arg 5 dans laquelle R est tel que défini à la revendication 1. 10. Tricosapeptides libres3utiles comme intermédiaires dans le procédé selon l'une quelconque des revendications 2 et 3, caractérisés en ce qu'ils répondent à la formule 10 L-=Thr->R-Pfaé-L-Thr-L-Sër=-L~Glu"L-Leu=L-Sér-R'=Arg-L-='Leu-R-Ârg-L-Asp"L-Sër-L-Ala-R-Arg-L-Leu-L-Glu(NH2)-R-Arg-L-Leu-L-Leu-L-Glu(NH?)-Gly-L-Leu-L-Val-NH2 dans laquelle R est tel que défini à la revendication 1. 15 11. D-analogues de la sérine et peptides intermédiaires utiles comme agents antiacides5 caractérisés en ce qu'ils consistent en produits selon les revendications 1, 6, 8 et 10, ou leurs sels pharmaceutiquanent acceptables. 12. Compositions thérapeutiques contenant comme ingrédients actifs l'un au moins des médicaments selon la revendication 11. 20 13. Formes pharmaceutiques d'administration des compositions selon la revendication 12.