FR 2052985 A1 19710416 FR 7022336 A 19700617 70 22336 -1- 2052985 La découverte de la possibilité d'obtenir des agents thérapeutiques efficaces à titre de produits résultant d'une fermentation bactérienne a immensément accru l'arsenal nécessaire pour conserver l'état de bonne santé ou pour y revenir en cas de maladie. 5 On peut citer à l'appui de cette idée la découverte de la pénicilline, de la streptomycine, et aussi de certains agents à effet anti-tumeur résultant d'une fermentation microbienne. Malheureusement, en raison de l'utilisation très large et parfois mal effectuée de ces substances intéressantes, il s'est avéré que certaines sou-10 ches de certains micro-organismes développent une résistance à l'égard d'un agent chimiothérapeutique particulier, et il en résulte que l'agent choisi ne présente plus d'activité à l'égard de ces souches résistantes. Ceci, associé au fait qu'il existe encore de nombreux micro-organismes pathogènes connus, et d'autres facteurs 15 inconnus de la maladie pour lesquels il n'y a pas d'agent vraiment-efficace, a continué à stimuler un grand intérêt dans ce domaine. La présente invention concerne des substances chimiques nouvelles et des procédés pour leur préparation. Plus particulièrement, l'invention concerne une nouvelle substance basique et ses 20 sels d'addition d'acides ayant une activité anti-bactérienne et anti-tumeur intéressante ; la nouvelle substance basique, que l'on appelle également ci-après dans le présent mémoire le composé 593A, est obtenue par la culture d'une espèce, inconnue jusqurà présent, de Streptomyces griseoluteus dans des milieux de fermentation appropriés. 25 Un but de la présente invention est donc de fournir le com posé 593A et ses sels d'addition d'acides. Un autre but consiste à fournir des procédés pour préparer par fermentation le composé 593A, des procédés pour récupérer cette substance à partir des bouillons de fermentation, et des procédés pour préparer dés sels d'addi-30 tion d'acides dérivant du composé 593A. D'autres buts apparaîtront à l'examen de 1^ description détaillée fournie ci-après.' On forme le composé 593A, qui constitue la nouvelle substance selon la présente invention, en cultivant dans des conditions réglées 35 une souche, antérieurement inconnue, d'un micro-organisme. Le micro-organisme original, qui a été isolé à partir d'un sol recueilli dans la zone géographique de Richmond, République Sud-Africaine, a reçu 70 22336 -2- 2052985 la désignation de MA-1241 dans la collection des cultures de Merck & C°., Inc. Rahway, New Jersey, (Etats-Unis d' Amérique). La culture de départ, MA-1241, a été également déposée à la collection des cultures de la Northern Utilization Research and Development Branch 5 of the U.S. Department of Agriculture à Peoria, Illinois (Etats-Unis d'Amérique) (Branche Nord du Service des Recherches et des mises au point d'utilisation du Ministère de l'Agriculture des Etats-Unis d'Amérique), où cette culture est disponible sous la dénomination de RRRL 3412. 10 La fraction originelle isolée de la culture productrice du composé 593A, obtenue sous forme d'une seule colonie à partir du sol, a été placée sur une plaque de gélose stérilisée ayant la composition suivante : gélose ' 20 g 15 extrait de levure 10 g glucose 10 g MgS04.7H20 0,5g KH2P04 1,82 g Na2HP04 1,90 g 20 eau distillée 1 litre Après incubation de la plaque inclinée à 28°C, on a utilisé le produit résultant de la croissance pour inoculer un flacon de 250 ml, à secousses, contenant 50 ml d'un milieu stérilisé ayant la composition suivante : 25 extrait de boeuf 3g aminé N-Z * 10 g glucose . - 10 g NaCl • 5g ' eau distillée 1 litre 30 pH 7,2 avant la stérilisation „ * produit de, digestion enzymatique de la caséine. x Apres 48 heures d'incubation sur une secoueuse rotative a 25°C, on a utilisé l'inoculum végétatif pour inoculer un flacon à secousses de 250 ml contenant le milieu stérilisé suivant : 70 22336 -3- 2052985 glucose 10 g peptone 5 g extrait de levure 3 g . NaCl 12,705 g 5 KC1 ' 0,72 g Pe304(îîH4)2304.6H20 ■ - 0,35 "g MgCl2.2H20 5,32 g CaCl2.2H20 0,728 g eau distillée ■ 1 litre 10 le pH étant ajusté à 7,4 avant la stérilisation. Après une période supplémentaire de 48 heures d'incubation à 28eC sur une secoueuse, on a soumis un échantillon du bouillon filtré résultant à des essais et l'on a trouvé que cet échantillon possède une activité antibiotique et anti-tumeur. Malgré les nom-15 breux essais effectués, il nfa pas été possible d'identifier avec une substance connue le composé ainsi isolé et crest pourquoi on l'a appelé "Composé 593A". Un échantillon de la culture de départ a été conservé par lyophilisation et emmagasiné danses tubes stérilisés pour garantir 20 la présence d'une source de la culture en vue de travaux ultérieurs. Afin de tenter de classer le micro-organisme producteur du composé 593 A, on a cultivé des échantillons provenant de la culture de départ, lyophilisée e4" stable, et l'on a examiné les caractéristiques morphologiques et physiologiques de la culture ainsi ob-25 tenue et on les a comparées à celles des- micro-organismes connus. Il a résulté de cette étude que la culture de départ ressemble le plus étroitement à Streptomyces griseoluteus et, par conséquent,. on a attribué à ces cultures génératrices du composé ~V593A la désignation d'espèce de Streptomyces griseoluteus. 30 Les caractéristiques de la fraction isolée de. départ sont présentées au tableau I en comparaison des deux micrô-orgànismes les plus étroitement apparentés, Streptomyces griseoluteus et Strepiom^ces aureofaciens. Les descriptions des deux derniers micro-organismes connus sont celles indiquées dans "Manual of Determina-35 tive Bacteriology", de Bergey (7ème édition 1957) et dans l'ouvrage de Waksman "The Actinomycetes", volume 2 (1961). Toutes les BAD ORIGiNAt 70 22336 -4- 2052985 lectures indiquées sur ce tableau ont été dTfectuées après une incubation de 3 semaines à 28°C, sauf indication contraire, et le pH des milieux utilisés pour "ces études a été d'environ 6,8 à . 7,2. Les couleurs utilisées dans la description concordent avec les définitions de "The Color Harmony Manual", 4ème édition (1958 TABLEAU I Caractéristiques de 'culture de MA-1241 (593A) et des deux micro-organismes les plus étroitement apparentés 1—L O to K) UJ U> O Streptomyces griseoluteus Streptomyces aureofaciens (593A) Waksman Bergey Waksman Bergey Morphologie : Les sporophores apparaissent sous forme de' ojiaînes flexueuses, crochets et boucles. Les spores semblent ovales à cylindriques (950X) en chaînes de 3-10 (en moyenne) Dimension moyenne 1,2 x 1,7 micron Sporophores avec ramifications monopodes et irrégulières, flexibles et à crochets ou boucles Spores ovales à cylindriques, 1,0 à 1,2 sur 1,8 à 2,2 microns. Mycélium aérien : ramification monopode et ir^égulière des . hyp}ies,conidiesellip-soïdesà cylindriques, 1,0 à 1,2 sur 1,8 à 2,2 microns. Sporophores h ramification monopode, flexueuse produisant des spirales ouvertes. Spores sphériques à ovales, lisses.- Mycélium aérien : blanc devenant gris brunâtre à gris beige foncé en 5 à 10 jours. Sporophores droits, flexueux ; pas de spirales. Spores sphériques à ellipsoïdes, 1,5 micron comme plus grand diamètre. Culture végéta-tive : Voir note. Y1 Gélose de Croissance modérée. Croissance mince, inco Croissance unique Gzapek Dox Croissance végétative lore à couleur crème. ment dans le substrat. (Gélose au incolore, Dos inco Marge plumeuse, péné Parfois production saccharose lore» Mycélium trant dans le milieu'. d'un pigment très et au ni aérien clairsemé, Mycélium aérien pulvé légèrement brunâtre. trate) blgnc. rulent, blanc-grisâtre Pas de pigment à beige clair. soluble Absence de pigment so luble ou bien brun- jaunâtre Gélose ou Croissance modérée» Crois-glycérol et sance végétative brun-clair* à l'asparagine Dos brun clair» Mycélium aérien très clairsemé, blanchâtre» Pigment soluble brun très clair. K> O Cn K) vO 00 Ln TABLEAU I (Suite) Strentonivces griseoluteus Strentomvces aureofaciens (593A) Waksraan Bergey Waksman Bergey Gélose synthétique 1 Croissance mince, . incolore à couleur crème. Marge plumeuse, pénétrant dans le milieu. Mycélium aérien pulvérulent , blanc-grisâtre à beige clair. Pas.de pigment soluble ou bien un pigment brun-.iaunâtre. - Gélose au glucose el; à l'asparagine Croissance ridée, de couleur crème. Mycélium aérien, mince, blanc. Pigment brun-rougeâtre. O N> ho OJ U) a- Gélose avec glucose-» asparagine-extrait de viande Croissance hyaline, virant au jaune orangé ou au brun pourpre. Mycélium aérien, s'il ■y en a, blanc passant aubgris cendré ou au gris foncé avec un dos roux. Pigment soluble très faiblement jaunâtre, parfois discernable. Croissance hyaline passant au jaune orangé. Mycélium aérien abondant, blanc, passant au gris profond ou gris foncé avec un dos roux. Pigment faiblement jaunâtre. Gélose au Croissance ridée, de glucose couleur crème. Mycélium aérien mince et blanc. Pigment brun-rougeâtre. k> o en NJ «o 00 en TABLEAU I (Suite) (593A) Streptomyces griseoluteus Waksman Bergey Streptomyces aureofaciens Waksman Bergey -4 O K> K> U» Ul O Gélose avec purée de tomate et farine d1 avoine Bonne croissance. Croissance végétative brun clair. Mycélium aérien clairsemé, blanc. Pigment soluble brun moyen. Gélose Bonne croissance. d1Emerson Croissance végétative brune. Dos brun. Pas de mycélium aérien. Pigment soluble brun très clair. I3 Gélose Croissance ridée, transparente. Mycélium aérien, mince, blanc, pulvérulent. Pas de pigment soluble ou' bien un pigment brunâtre-n.iaunâtre. Bonne croissance, brunâtre clair. Pas de mycélium aérien. Pas de pigment soluble. Gélose nutritive Croissance ridée, transparente» Mycélium aérien mince, blanc, pulvérulent. Pas de pigment soluble ou brun-jaunâtre Bonne croissance, translucide à brunâtre. Pas de mycélium aérien. Pas de pigment soluble» Essai négatif à la mélamine. K> O en K) -o 00 en TABLEAU I (Suite) —I O (593A) Streptomyces griseoluteus Waksman Bergey Streptomyces aureofaciens Waksman Bergey K> K> U> UJ or- Gélose au Croissance légère à malate de modérée, calcium Croissance végétative incolore. Pas de mycélium aérien. Pas de pigment soluble. Géloue au Croissance végétative lait brun-jaunâtre clair, écrémé Mycélium aérien clairsemé, blanc. Pas de pigment soluble. 1 Hydrolyse Culture Bonne croissance, inclinée Croissance végétative peptone— brun clair, fer- Pas de mycélium aérien, extrait de Essai négatif à la levure mélamine Production de HgS Résultat négatif Résultat la plupart du temps négatif Gélose à Croissance modérée, la Croissance végétative tyrosine incolore. Pas de mycélium aérien. Pas de brunissement du milieu. NJ O en K> -O 00 en TABLEAU I (Suite) (593A) Streptomyces griseoluteus 1Waksman Bergey Streptomyces aureofaciens Waksman Bergey Morceau de Croissance modérée. Croissance abondante, Croissance abondante, Croissance liché- Croissance ridée, pomme de Colonies brun-clair ridée, de couleur ridée, de couleur noïde, jaune oral", éclair à rouge jaune orangé. terre à moyen. crème. orbme. Couleur du moroeau Pas de mycélium îfycéliuni aérien Mycélium aérien brun , à pourpre. inaltérée. aérien. blanc sale, mince, blanc sale, mince. Pas de mycélium Pas de pigment morceau devient Le morceau devient aérien. soluble. légèrement brunâtre.. légèrement brunâtre. ■Couleur de morceau inaltérée. ^4 O N> ro OJ UJ o* Gélose à 1'amidon Bonne croissance. Hydi'olyse, Croi ssance végétative ridée, brun-jaunâtre clair. Fas de mycélium aérien. Pas de pigment soluble. Hydrolyse L'amidon est hydrolyse. Réduction Production de Résultat positif. Production de nitrités de nitrités à partir à partir de nitrates. nitrates de nitrates. I f Lait Anneau en surface de couleur crème. Mycélium aérien sous forme de plaques ou taches blanches. Anneau de couleur crème ; plaques superficielles blanches Croissance limitée, surface brun-jaune. Coagulation et peptonisation variables (souvent néant ; existent parfois) Croissance limitée brun-jaune. Pas de coagulation ou de peptonisation. Lait Pas de croissance nuisible, écrémé Coagulation. Réaction acide (pH 5.0) Lait au Pas de croissance nuisible, tournesol Coagulation. Réaction acide. K> O en ho sO 00 en TABLEAU I (Suite) ^4 O Streptomyces griseoluteus Streptomvces aureofaciens (593A) Waskman Bergey Waksman Bergey Température Bonne croissance à 289C4 Pas de croissance à "50°C Croissance (Culture par piqûre ou micro- en profondeur sur dex aérqphile trose et extrait de levure) Bonne croissance en surface et le long du quart de la ligne des piaÛres. Culture en Pas de croissance au Pas de croissance. Pas de croissance. Anneau de surface Pas de liquéfaction. profondeur premier essai. de couleur crème. en gélatine Avec m inoculum plus Liquéfaction nulle à fort, la liquéfaction est limitée. complète au bout de 3 Pas de pigment soluble. semaines. Croissance en surface seulement. Pas de pigment soluble. Ni N> U> U» O Plaques de Bonne croissance. gélatine Croissance végétative ridée, nutritive brun-jaunâtre clair. Pas de mycélium aérien. Pas de pigment soluble. Liauéfaotion. hO O Cn KJ sO 00 en Bouillon au glucose Anneau de surface de couleur crème h brun. Mycélium aérien pulvérulent, blanc. Faible production d'un pigment bruru-rougefitre lWWW-9« , Utilisation des hydrates de carbone : glucose fructose rhamnose xylose mannose arabinose inositol raannitol lactose raffinose .■ saccharose + (pigment soluble brun clair) + (pigment soluble brun moyen) + (pigment soluble brun moyen) + (pigment soluble brun moyen) + (pigment soluble brun moyen) + (pigment soluble brun, très clair) -4 O hO U) u> o* O en KJ sO 00 en 70 22336 -12- 2052985 Les descriptions ci-dessus des micro-organismes producteurs du composé 593A sont données pour illustrer des souches appropriées de Streptomyces griseoluteus, que l'on peut utiliser pour produire le composé 593A, mais il va de soi que la présente invention ne se 5 limite pas aus micro-organismes répondant à ces descriptions particulières. La présente invention envisage également l'utilisation d'autres souches de Streptomyces griseoluteus isolées à partir d'une source naturelle ou obtenues à partir d'une mutation de ces microorganismes, comme ceux obtenus par la sélection naturelle ou ceux 1C- produits par des agents de mutation. On peut fabriquer le nouveau produit' selon la présente invention par des cultures effectuées en surface ou par des cultures submergées ; cependant, on préfère actuellement effectuer la fermentation à l'état submergé. On peut commodément préparer des charges 15 pour fermentation a petite échelle en plaçant des quantités appropriées de milieu nutritif dans des ballons, en stérilisant les ballons et leur contenu par chauffage au voisinage de Î20°C pendant 20 minutes, en inoculant aux ballons des cultures végétatives d'une souche de Streptomyces griseoluteus, productrice du oomposé 593A, 20 en fermant de façon lâche les ballons avec du coton et en laissant la fermentation se poursuivre sur une machine à secousses dans une enceinte ou pièce à température constante à 28°C durant 3 à 5 jours. On peut préparer des charges plus grandes de fermentation» en utilisant des cuves de dimensions appropriées et munies d'un agita-25 teur et d*un moyen pour aérer le milieu de fermentation. Dans ce procédé, on inocule une culture végétative au milieu et aux cuves contenant le milieu stérilisé. On laisse la fermentation se poursuivre durant 2 à 4 jours avec agitation ou aération constante du milieu nutritif à une température constante d'environ 28°C. Potir effectuer 30 la fermentation selon ce procédé, il peut être souhaitable d'ajouter une faible quantité d'un agent anti-mousse approprié. Des agents appropriés peuvent comprendre l'huile de soja, l'huile de ricin, de l'huile minérale contenant 1 d'octadécanol, ou un propylène-glycol polymérisé cofnmg/^olyglycol 2000. Ces agents vont ainsi combattre 35 tout excès de formation de mousse risquant de se produire dans le bouillon de fermentation durant cette fermentation. 70 22336 -13- 2052985: Les milieux aqueux, "tels que ceux utilisés pour la production des antibiotiques, cdnviehnent pour produire le composé 593A. De tels milieux contiennent des sources de carbone et d'azote assimilables par le micro-organisme ainsi que des sels minéraux. En 5 outre, les milieux, de fermentation contiennent des traces de métaux nécessaires pour la croissance du micro-organisme et que l'on fournit communément sous forme d'impuretés accidentelles dues à l'addition d'autres constituants du milieu. En général, on peut utiliser des hydrates de carbone comme 10 des sucres, par exemple le glucose, le maltose, le fructose, etc.» et des amidons comme des grains, par exemple des grains d'avoine et de seigle, de l'amidon de maïs, de la farine de maïs, etc., isolément ou en combinaison comme sources de carbone assimilables dans le milieu nutritif. La' quantité exacte de la ou des sources 15 des hydrates de carbone utilisées dans le milieu va dépendre en partie des autres ingrédients se trouvant dans le milieu, mais l'on trouve généralement qu'une quantité d'hydrate(s) de carbone comprise entre environ 1 et 6 ' fo en poids par rapport au milieu est satisfaisante. On peut utiliser des sources de carbone indi-20 viduellement ou bien l'on peut combiner dans le milieu plusieurs de ces sources de carbone. Des sources satisfaisantes d'azote comprennent de très nombreuses matières protéiques comme diverses-formes d'hydrolysats de caséine, la farine de soja, la liqueur d'infusion de maïs, les 25 produits solubles de distillerie, les hydrolysats de levure, etc. On utilise diverses sources d'azote, isolées ou en combinaison, en des quantités comprises entre environ 0,2 et 6 % en poids du milieu aqueux. On peut récupérer le composé 593A à partir du bouillon par 30 filtration et concentration du filtrat sous vide jusqu'au dixième environ du volume d'origine, puis en soumettant les bouillons concentrés à des modes opératoires d'extraction. Par exemple, on peut récupérer le composé 593A à partir du bouillon ou de son concentré par extraction, à l'aide d'un solvant, 35 non miscible à l'eau,du produit, comme le butanol ou le chloroforme. Lorsqu'on soumet le bouillon à une extraction à pH 7, on obtient la base libre. En variante, on peut évaporer le bouillon 70 22336 -14- 2052985 à siccité. et l'extraire à l'aide d'un solvant approprié, tel qu'un alcanol inférieur, par. exemple le méthaiiol ou l'éthanoi. On peut obtenir-des formes plus pures du composé 595A par des cristallisations répétées au sein de méthanol chaud. Un autre 5 mode opératoire utilisable comprend l'absorption du composé sur des résines d'échange d'anions.comportant des groupes polyalkyl-amine fixés sur un réseau de polymère dé styrène et de divinyl-benzène. On élue aisément de la résine l'antibiotique absorbé en effectuant l'élution à l'aide d'eau. L'évaporation de l'éluat 10 jusqu'à siccité donne le composé 593A que l'on peut encore purifier par recristallisation fractionnée dans du méthanol. En variante, on peut purifier le composé 593A par absorption sur de l'alumine basique ou sur du gel de silice et puis élution à l'aide d'acétate d'éthyle ou de méthanol. 15 Titrage On peut commodément titrer le composé 593A et vérifier sggmme activité anti-tumeur en utilisant le système Tumeur Humaine sur oeuf/ hôte ou. le système de culture de cellules dé carcinome épidermoïde humain en milieu basai. Pour titrer le composé 593A par le système 20 de la tumeur humaine sur un oeuf comme hôte, on place des implants de tumeurs d'adénocarcinome humain sur les membranes chorioallantoï-diques d'oeufs embryonnés■de neuf jours. On fait incuber les oeufs durant quatre jours, puis l'on choisit pour l'essai les oeufs présentant les "prises" positives. On injecte ensuite le composé 593A 25 dans le sac vitellin de l'oeuf. Sept jours après l'injection, on recueille les oeufs et l'on pèse les tumeurs et les embryons provenant de groupes traités et de groupes témoins non traités, et l'on obtient de la façon suivante le pourcentage de l'inhibition de la croissance de la tumeur et de l'embryon dans l'oeuf traité: 30 Au moment de l'injection décomposé 593A» on sacrifie dix oeufs comportant une implantation de tumeur pour déterminer le poids moyen de la tumeur. On obtient ainsi une valeur que l'on soustrait de la valeur du poids moyen obtenu a partir des tumeurs . témoins traitées et non traitées au moment de la récolte pour 35 déterminer l'augmentation réelle du poids des tumeurs pendant la période de traitement. On obtient le pourcentage de retard de croissance dans le cas des oeufs traités en comparant l'augmentation 70 22336 -15- 2052985 du poids des tumeurs traitées avec l'augmentation, du poids des tumeurs témoins non traitées en utilisant la formule (îOO-î/C x 100). Le pourcentage de retard de croissance pour les embryons se détermine dlune manière similaire. 5 Pour les essais de l'activité anti-tumeur du composé 593A selon le système de culture de cellules de carcinome épidermoïde humain en milieu basai, on cultive des cellules de carcinome épi-dermoïde humain (KB) de.Eagle sur du verre dans des bouteilles de dilution de lait, chaque bouteille contenant 20 ml de milieu basai 10 de Eagle plus 10 de sérum de veau. Chaque bouteille reçoit 5 8 x 10 cellules. On renouvelle le milieu au troisième et au sixième jour. On recueille les cellules le septième jour à l'aide de trypsine, on les centrifuge et on les met en suspension dans des milieux de Eagle plus 5 de sérum de veau. On ajuste le vo— 15 lume du milieu de façon que chaque millilitre de la suspension con- 4 tienne 1,5 x 10 cellules. On distribue la suspension des cellules, en des quantités de 2,0 ml, dans des tubes à essai de 16 x 125 mm auxquels on a ajouté des agents soumis à l'essai en des volumes pouvant atteindre 0,2 ml au maximum. On prépare de façon similaire 20 des tubes témoins sans y introduire d'agent d'essai. On fait incuber les tubes dans une position verticale dans une atmosphère à 95 d'air et 5 i° de CO^ à 37°C. On examine au microscope, après cinq jours d'incubation, la feuille de cellules qui se forme au fond du tube. On compare la croissance dans les tubes traités avec 25 la croissance dans les tubes témoins et l'on estime pour chaque agent soumis à l'essai la dose ayant une efficacité cytotoxique moyenne (BE,-q ; dose qui inhibe 50 fo de la croissance des cellules). Lorsque l'on soumet le composé 593A à des essais d'action 30 sur l'adénocarcinome humain H.AD.1 à divers niveaux d'essai et que l'on trace un graphique du pourcentage résultant d'inhibition, on constate que la dose qui inhibe à 60 $ la croissance de la tumeur (BEg^) est égale à 17 i^g/oeuf. Cette dose se compare très favorablement avec celle d'autres agents anti-tumeur lorsque l'on 35 effectue des essais selon le même mode opératoire. Le tableau suivant illustre cette constatation : 70 22336 -16- 2052985 Agent anti-tumeur "^E ^ 5 93A 17 p.g/oeuf Azasérine ■ ■ - 1000 ^g/oeuf ïïadacidine . 3000-7000 p.g/oeuf 5 Hydroxyurée 20 000 pg/oeuf 6-mercaptopurine 8000 p.g/oeuf Méthyl-mitomycine 10-130 V-gJoeuf Mputarde à l'azote 250 p.g/oeuf Streptonigrine 3-4 p.g/oeuf 10 Tenuazonate de sodium ■ 150-420 p.g/oeuf Triéthylènemélamine 3-12 p.g/oeuf Selon l'activité antibiotique mentionnée ci-après, le composé 593A et ses sels sont d'utiles agents antimicrobiens. Par exemple, on peut les utiliser pour enlever d'un équipement pharma- qux 15 ceutique etc., des micro-organismes/sont sensibles à l'action de ce composé, ou bien pour séparer certains micro-organismes de solutions contenant des mélanges de plusieurs micro-organismes. De même, comme indiqué ci-dessus, le composé 593A et ses sels possèdent une puissante activité anti-tumeur et constituent 20 des composés commodes de référence pour les essais d'autres composés en vue de déterminer la présence ou l'absence de cette activité. Lorsque l'on a étudié, l'activité du composé 593A contre les cellules de carcinome épidermoïde humain KB, on a trouvé 25 que la dose de l'effet cytotocique moyen DE^q comprise entre 0,03 et 0,1 p.g par millilitre. En plus de l'activité anti-tumeur présentée par le composé 593A, ce composé 593A présente également une activité antibiotique lors d'essais effectués contre Proteus vulgaris MB 838, Vibrio 30 percolans MB 1272, Pseudomonas stutzaria MB 1231, et Brucelia bronchiseptica MB 965. Lorsqu'on utilise le composé 593A pour réduire la croissance d'une tumeur,.on peut administrer ce composé par voie orale ou parentérale à-l'hôte. Comme dans- le cas de la plupart des produits 35 ayant une activité similaire, la dose administrée ne peut être fixée de façon rigide. Par conséquent, on détermine au mieux la posologie en commençjant le traitement à un faible niveau, par 70 22336 -17- 2052985 exemple 0,5 mg a 2 mg par kilo du corps et par jour et.-l'on augmente la dose de 10 à 50 ^ par jour ou tous les deux jours, à condition de ne pas noter de réactions inopportunes. Ainsi, l'examen des fonctions vitales de. l'organisme et, en particulier, les études 5 du sang sont nécessaires pour établir la dose totale à administrer. Propriétés du composé 593A. le composé 593A est une substance basique formant des sels avec des acides. Ainsi, la base libre, que l'on peut extraire du bouillon à pH 7 forme, lors de réactions avec des acides minéraux 10 ou organiques, le sel correspondant de l'acide comme le chlorhydrate, le sulfate, l'acétate, le propionate, etc. Le composé contient comme éléments du carbone, de l'hydrogène, de l'azote, de l'oxygène.et du chlore. -Une analyse typique du chlorhydrate montre que ce sel contient 40,23 fo de carbone* 15 5,85 $ d'hydrogène ; 12,76 $ d'azote ; 8,50 $ d'oxygène et 32,82 $ de chlore. Cette analyse indique que la formule moléculaire est C^H^IT^OCl.HCl. Le chlorhydrate ne fond pas à une température inférieure à 330°C. La figure 1 montre le spectre d'absorption des rayons infra-20 rouges par le chlorhydrate du composé 593A en pâte ou suspension dans l'huile minérale ("Nuj-ol"). A la figure 1, les fréquences _ -] sont en abscisses (en centimètre ). Lorsqu'on fait réagir le composé 593A (base libre) avec l'anhydride acétique en présence de pyridine à des températures 25 allant de 0°C à la température ambiante, on obtient un dérivé acé- tylé ou acétate qui fond à 228°-229°C avec décomposition. La figure 2 montre le spectre d'absorption de l'infrarouge de cet acétate, après la cristallisation au sein de méthanol, l'acétate étant en pâte dans l'huile minérale ("Nujol"). A la figure 2 éga- — 1 30 lement, les fréquences sont en abscisses (en centimètre ). Le composé 593A est soluble dans l'eau, les alcanols infé-rieurs comme le méthanol, l'éthanol et le butanol, et le chloroforme. La base libre a une faible solubilité dans l'eau à pH 7 mais elle se*dissout par chauffage. Le produit est soluble dans 35 des solutions acides aqueuses à pH 2, en formant le sel de l'acide. On peut transformer la base libre en un chlorhydrate eh acidifiant une solution méthanolique contenant la base libre à 70 22336 2052985 — I O — lraide d'une solution dans un alcanol inférieur (de préférence une solution méthanolique) d'acide chlorhydrique. Le composé 593-A est stable à la température ambiante durant 24 heures dans une solution aqueuse à pH 2 et 10. Il est labile après 3 à 5 minutes 5 en solution aqueuse à 100°C à pH 7. On trouve qu'à 50 à 60°C, la dégradation se produit lentement, un peu de base libre étant encore décelable au bout de 3 heures. L'hydrolyse d'acide (HC16N 16 heures à 100°C) conduit à une dégradation complète. EXEMPLE 1 10 Fermentation productrice du composé 593A On met en suspension une culture lyophilisée de micro-organismes générateurs du composé 593A (Streptomyces griseoluteus HRBRL 3412) dans 2 ml d'un milieu constitué d'extrait de levure (iQg/ï) 15 et de dextrose (10 g/l) plus des sels (. MgSO^, 7 HgO : 0,5 g/l, tampon de phosphate : 20 ml/l) et l'on utilise le tout pour inoculer des milieux de culture inclinée contenant le même milieu plus 2 ^ de gélose. On fait ensuite incuber les milieux de culture inclinée à 28°C durant cinq jours ou jusqu'à ce qu'il y ait une bonne sporulation. 20 A la culture inclinée sporulée, on ajoute 10 ml d'un milieu ayant un pH de 7 à 7,2 et constitué de : dextrose 1 % aminé N-Z 1 £ (produit de digestion enzymatique de la caséine) 25 NaCl 0,5 1° extrait de viande 0,3 /o eau distillée en quantité suffisante pour compléter et on gratte ce qui a été obtenu sur la culture inclinée pour 1' introduire dans la suspension et l'utiliser '■pour inoculer une fiole 30 d'Erlenmeyer de 250 ml, contenant des chicanes, et comportant 3 50 ml du même milieu. On place ensuite la fiole ainsi inoculée sur une secoueuse rotative et l'on fait incuber à 28°C durant 72 heures ou Jusqu'à obtention d'une bonne croissance végétative. On utilise ensuite un inoculum de 10 ml de la croissance 35 résultante pour inoeuler une fiole d'Erlenmeyer de 2 litres comportant des chicanes et contenant 500 ml de milieu stérilisé ayant la même composition que celle indiquée ci—dessus, et l'on place 70 22336 -19- 2052985 ensuite la fiole, inoculée, sur une secoueuse rotative que l'on ..fait incuber durant 72 à 96 heures à 28°"C ou jusqu'à obtention .d'une bonne croissance-végétative. On"utilise'le bouillon de fermentation ainsi obtenu pour 5 ' inoculer une cuve de fermentation en acior inoxydable, de 197 litres, contenant 160 litres du milieu ayant la même composition que celle indiquée ci-dessus. On fait incuber le milieu inoculé à 28°C avec agitation à. 150 tours par minute tout en maintenant un débit d'air de 85 litres par minute dans le bouillon de fermen-10 tation. "Durant la période de fermentation de 72 à 96 heures, on ajoute de faibles quantités d'un agent anti-mousse ("Polyglycol 2000") pour" empêcher le moussage-de la" charge. On utilise ensuite S,3 ^ du bouillon résultant pour inoculer une cuve de fermentation en acier inoxydable, de 770 litres de 15 capacité, contenant 440 litres d'un milieu ayant un pH de 7 à 7,2 et ayant la composition suivante : dextrose 10,0 g/l &C1 0,72 g/l peptone 5,0 g/l " FeSCfyOm^SO 6H20 0,035 g/l NaCl 12,7 g/l MgC1.6H20 5,-32 g/l 20 extrait de levure 3,0 g/l CaCl2.2H20 0,728 g/l eau distillée ; quantité nécessaire pour compléter On fait incuber 1'inoculum durant 120 à 160 heures avec agitation à 130 tours pa^rfoinute tout en maintenant un débit d'air 25 de 283 litres par minute dans le bouillon, en ajoutant en cas de nécessité un agent anti-mousse. EXEMPLE 2 On soumet 385 litres du bouillon de culture obtenu par le processus de fermentation décrit à l'exemple 1 à-une filtration 30 et l'on concentre sous vide jusqu'à un volume d,f*nriron 61,5 litres et l'on lyopnilise une portion de bouillon ainsi concentré, cette portion étant de 19,7 litres. EXEMPLE 2a 4 Récupération du composé 593A à partir 35 du bouillon de culture par extraction à l'aide de n-butanol à pH 2 On ajuste à pH 2 19,7 litres du bouillon concentré-obtenu 70 22336 -20- 2052985 ci-dessus à l'aide d'acide chlorhydrique, et l'on extrait cinq fois avec 11,5 litres de butanol humide. On mélange alors les extraits butanoliques et on les concentre jusqu'à ce qu'ils ne contiennent plus dex butanol. l'extraction butanolique ci-dessus en utilisant de l'hydroxyde de sodium et l'on effectue cinq extractions avec 11,5 litres de butanol. On mélange alors les extraits butanoliques et on les concentre sous vide jusqu'à ce que le résidu ne contienne plus de butanol. 10 On ajuste alors à ur pH de 7 la solution alcaline concentrée résultante, on la lyophilise et on la soumet à des essais d'activité anti-tumeur. Voici l'activité anti-tumeur observée : On trouve que la dos^efficace moyenne de l'effet cyto- toxique contre les cellules KB est comprise entre 3 et 9 p-g/ml. 15 lors d'essais contre H.Ad.1 à des doses de 10 mg et de 5 mg par oeuf, l'inhibition de la tumeur est de 80 °fo et de 60 fo, respectivement . EXEMPLE 2b Récupération du .composé 593A 2Q par extraction à l'aide de méthanol On extrait à l'aide de méthanol 25 g du bouillon lyophilisé obtenu ci-dessus en mettant le bouillon lyophilisé en suspension dans 125 ml de méthanol et en filtrant le mélange. On obtient un résidu insoluble dans le méthanol que l'on met de nouveau en suspen— 25 sion dans 125 ml de méthanol et que l'on filtre, on mélange les filtrats contenant les extraits solubles dans le méthanol et l'on concentre ces filtrats mélangés pour obtenir une solution aqueuse en opérant sous vide, puis on lyophilise. Lorsqu'on titre cette fraction pour en déterminer l'action contre H.Ad.1, à des doses de 30 15 mg, 7,5 mg, et 3,75 mg par oeuf, on inhibe la croissance des tumeurs à 85 58 i» et 28 ?£, respectivement. On trouve que la dose efficace moyenne pour un effet cytotoxique contre les cellules de carcinome épidermoïde humain KB est légèrement supérieure à 10 [ig/ml. 5 On a un pH de 10-le résidu aqueux acide obtenu de 70 22136 -21- 2052985 EXEMPLE 2c Récupération du composé 593A par extraction à l'aide de méthanol - - Transformation en hase libre, 5 en chlorhydrate et en acétate On met 1 kg de bouillon filtré et lyophilisé, représentant une portion lyophilisée provenant d'un bouillon de 50 litres concentré, obtenu à l'exemple 2, en suspension dans 5 litres d'éthanol absolu. On filtre ensuite le mélange pour enlever la matière inso-10 lubie et puis l'on concentre le filtrat pour obtenir une solution aqueuse. On dilue ensuite la solution aqueuse ainsi concentrée en lui ajoutant de l'eau jusqu'à un volume de 1 litre et l'on ajuste le pH à 7 avec l'hydroxyde de sodium. On lyophilise 100 ml (1/10) de cette solution aqueuse et l'on trouve lors d'un titrage biolo-15 gique que la dose ayant une efficacité cytotoxique moyenne contre les cellules KB (cellules de carcinome épidermoïde humain) est de 10 (ig/ml ; à la dose de 5 mg par oeuf, la croissance de la tumeur H.Ad.1 est inhibée à 78 $ et à la dose de 1,7 mg par oeuf cette 16S inhibition est de 64 f°. On soumet/900 ml restants de la solution 20 à une extraction à l'aide de 6 portions de 900 ml chacune de butanol. On concentre le premier extrait de 900 ml sous vjde pour obtenir de l'eau et l'on sépare par filtration la fraction cristalline que l'on a observée, on la dilue à l'eau et on la lyophilise. 25 Un titrage biologique de l'échantillon lyophilisé montre que la dose à effet cytotoxique moyen contre les cellules KB est de 0,1 à 0,3 p.g/ml. La croissance de la tumeur H.Ad.1 est inhibée à 68 $ et à 23 ^ à des doses de 50 et de 25xg par oeuf, respectivement. De l'extraction initiale à l'aide d'éthanol, on obtient un 30 résidu insoluble que l'on soumet à une extraction à l'aide de 2500 ml d'éthanol absolu. Après filtration, on concentre la fraction soluble dans l'éthanol en opérant sous vide jusqu'à obtention d'un faible volume. On observe une fraction cristalline que l'on relargue et çépare par centrifugation ; on la met en suspension 35 dans l'eau et on la lyophilise. On mélange une petite quantité de la fraction cristalline obtenue avec environ 5 ml d'eau et environ 10 ml de méthanol et 70 22336 -22- 2052985 l'on concentre à siccité aprèg^ddition d'environ 10 ml de méthanol deux fois. On dissout ensuite les solides finals dans 25 à 35 cil de méthanol absolu et on laisse reposer à la température ambiante pendant 12 heures, après quoi il se sépare une petite quantité de 5 matière cristalline. On refroidit ensuite l'échantillon jusqu'à 45°C durant quatre jours et l'on sépare par centrifugation la fraction cristalline résultante que l'on sèche sous vide, la matière cristalline ainsi obtenue se décompose à 330°C en laissant un résidu brun. 10 Cette fraction cristalline présente une valeur de la dose moyenne à effet cytotoxique de 0,01 à 0,02 ng/ml et elle inhibe la croissance.de la tumeur H.Ad.1 (adénocarcinome humain) à 84 f° à la dose de 33 H-g/oeuf et 82 fo à la dose de 11 y,g/oeuf. On concentre le° liqueurs-mères jusqu'à un faible volume 15 pour enlever une .seconde récolte de solides ayant une valeur de dose moyenne à effet cytotoxique contre les cellules KB de 0,03 p.g/ml. On dissout 80 mg de l'échantillon cristallin dans de l'acide chlorhydrique N/10, puis on neutralise lentement avec une solution N/10 d'hydroxyde de sodium pour transformer l'échantillon 20 en la base libre. Il se forme un précipité au voisinage de pH 7. On recueille ce précipité dans un tube de centrifugeuse et on le sèche sous vide pour obtenir 54 mg de composé 593A sous forme de la base libre. Analyse : 25 Calculé pour C^H^^OCl : Cl, 20,3 $ Trouvé : Cl, 19,07 On dissout la base libre ainsi obtenue dans du méthanol, on sépare une trace d'impureté, insoluble et l'on acidifie la solution par addition d'une solution alcoolique d'acide chlorhydrique. On 30 évapore le solvant sous pression réduite jusqu'à obtention d'un faible volume. Il se forme au repos des cristaux blancs du chlorhydrate. On purifier les cristaux par recristallisation dans le méthanol et on les sèche sous vide. On n'observe pas de point de fusion à une ^température inférieure à 330°C. 35 Par titrage du chlorhydrate cristallin, on obtient un poids d'équivalent égal à 215; pH 1/2 = 5,4. 70 22336 -23- 2052985 Analyse : Calculé pour C^H^B^OC^ (211) : C, 39,.8 ; H, 5,74 î N, '13,25 î 0, 7,59 ; Cl, 33,5. -Trouvé : C, 40,23; H, 5,85 ; N, 12,76 ; O, 8,5 ; Cl, 32,82. 5 Dosage biologique dans des oeufs oontre la tumeur H.Ad.1 (adénocarcinome humain). Dose Morts % d'inhibition de: croissance fig/oeuf Embryon Tumeur 50 1/8 12 102 10 25 0/8 - 3 83 12,5 0/8 -23 46 6,25 1/8 - 8 -29 Il résulte des données ci-dessus que la valeur estimée pour la dose efficace à 60 ^ contre H.Ad.1 est de 17 i-tg par oeuf. 15 Pour le spectre d'absorption de l'infrarouge : Voir la figure 1. On prépare l'acétate du composé 593-A en traitant 8 mg de la base libre par 2 mg d'anhydride acétique et 2 gouttes de pyridine à la température ambiante durant 5 heures. On évapore l'excès de 20 réactif sous pression réduite, et l'on fait ensuite cristalliser le dérivé acétylé dans de 1'éthanol aqueux sous forme de lames trapues, fondant à 228°-229°C avec décomposition. Analyse : Calculé pour CgH^N^ClO^ (235) ; 25 C, 46,2 ; H, 6,46 ; N, 11',8 ; Cl, 15,1 ; Acétyle, 18,3 Trouvé : C, 46,36; H, 6,65 ; N, 12,32 ; Cl, 14,50 ; Acétyle, 19,4 Pour le spectre d'absorption de l'infrarouge : Voir la figure 2. EXEMPLE 2d 30 - Extraction du composé 593A à l'aide de butanol à pH 7 On dissout une portion, égale à 50 g,, du bouillon lyophilisé obtenu ci-dessus dans 250 ml d'eau à un pH de 7 et l'on effectue 5 extractions avec 250 ml de butanol, comme décrit dans l'exemple 2a. On mélange les extraits et on les concentre sous vide pour obtenir 35 une solution aqueuse que l'on soumet à une centrifugation. Il se sépare une fraction insoluble que l'on redissout dans l'eau et lyophilise et qui, soumise à un titrage biologique, s'avère avoir contre les cellules KB une dose efficace moyenne légèrement infé- 70 22336 -24- 2052985 rieure à 0,3 \ig/ml, EXEMPLE 3 Extraction directe à l'aide d'éthanol de la base libre de 593A à partir du 5 bouillon On soumet 4 685 g de bouillon lyophilisé, obtenu suivant le mode opératoire de l'exemple 1, à une extraction à l'aide d'éthanol absolu en mettant la matière lyophilisée en suspension dans 30 litres d'éthanol absolu. On filtre ensuite le mélange éthanoli-10 que pour enlever la matière insoluble, et l'on concentre le filtrat à un faible volume. On sépare par filtration une fraction cristallin^ qu'on observe dans le filtrat concentré et l'on lave à l'éthanol/ sèche sous vide les cristaux obtenus. La matière cristalline résultante est active contre les cellules KB (cellules 15 du carcinome épidermoïde humain) à la dose de 0,1 à 0,3 p.g/ml. On dissout 341 mg de la matière cristalline obtenue dans 2,5 ml d'eau à pH 2 et l'on filtre. On rejette le résidu insoluble dans l'acide et l'on ajuste le filtrat obtenu à un pH de 8,0 à l'aide de bicarbonate de sodium. On observe une fraction cristal-20 line résultante que l'on sépare par filtration, et on lave les cristaux à l'acétone et à l'éther et on les sèche sous vidé. Lors d'un titrage biologique, la matière cristalline (base libre) présente une valeur de la dose efficace moyenne contre les cellules KB de 0,3 M-g/ml et contre H.Ad.1, la croissance de la 25 tumeur est inhibée, à 71 °/° et à 84 i° par des doses de 50 \ig et de 25 y-g/oeuf, respectivement. On fait recristalliser 51»9 mg de cette matière cristalline en la dissolvant dans 17 ml de méthanol chaud et l'on concentre la solution résultante à 1,2 ml. On sépare par filtration la 30 fraction cristalline résultante, on la lave à l'éther éthylique et on la sèche sous vide. Voici les activités que l'on trouve pour cette fraction : a. Contre les cellules KB, la dose efficace moyenne est de 0,03 à 0,1 p.g/ml ; 35 b. Contre H.Ad.1, la croissance est inhibée à 77 % et à 58 io par des doses de 50 y.g et de 25 ^.g/oeuf, respectivement. 70 22336 -25- 2052985 . EXEMPLE 4 Extraction du composé 593A de bouillon de culture à l'aide de chloroforme On ajuste à un pH de 3,5 18. litres de bouillon filtré, 5 provenant d'une fermentation d'un micro-organisme générateur de composé 593A, ce bouillon étant préparé selon le mode opératoire indiqué à l'exemple 1, et l'on effectue trois extractions'avec des portions.de 6 litres chacune de chloroforme. _ On dissout au total 5 kg de chlorure de sodium dans la solu-10 tion d'extrait de bouillon (la phase aqueuse obtenue de l'extraction au chloroforme ci-dessus). On ajuste le pH à 10 avec de l'hydroxyde d'ammonium et l'on extrait avec cinq portions de 9 litres chacune de chloroforme. On trouve que la dose efficace moyenne de chaque extrait soluble dans le chloroforme contre des cellules 15 de KB est d'environ 0,3 p.g/ml. En traitant une solution méthanoli-que du troisième extrait à l'aide d'une solution méthanolique d'acide chlorhydrique, on obtient 140 mg.de cristaux blancs (sous forme du chlorhydrate) et cette matière présente une activité (dose efficace moyenne DEj-q) de moins de 0,03 (ig/ml contre les 20 cellules de KB (carcinome épidermoïde humain). On dissout 1 g du second extrait ci-dessus dans 5 ml de chloroforme, on dilue avec 2 ml d'acétate d'éthyle et l'on fait passer cette solution dans une .colonne de 1,91 cm x 14 cm d'alumine basique Brockman (en suspension dans l'acétate d'éthyle). L'élu-25 tion de la colonne à l'aide de 250 ml d'acétate d'éthyle enlève toute la couleur et donne 192 mg d'une gomme qui, lors d'un titrage biologique, présente une do^e moyenne à effet cytotoxique contre KB de 0,3 p.g/ml. L'élutiofl ^e la colonne avec 250 ml de méthanol donne 737 mg de gomme présentant une dose à effet cyto-30 toxique moyen contre les cellules de KB légèrement inférieure à 0,03 p.g/ml. La transformation de cette fraction en chlorhydrate donne 123 mg de cristaux blancs dont l'activité contre les cellules KB se situe entre 0,03 et 0,1 p,g/ml. Lorsque l'on dissout 1 g de la gomme provenant du premier 35 extrait chlorof ormique dans 5 ml de chloroforme et qu'on dilue avec 2 ml d'acétate d'éthyle, qu'on fait passer à travers une colonne de 1,91 cm x 6,35 cm de gel de silice (en suspension dans 70 22336 -26- 2052985 l'acétate d'éthyle),qu'on'élue la colonne avec 250 ml d'acétate d'éthyle, on obtient 245 mg' de gomme présentant une activité à une dose légèrement inférieure à 0,3 p-g/ml contre les cellules de KB (carcinome épidermoïde humain). La transformation de cette frac-5 tion- en chlorhydrate donne 193 mg de cristaux blancs présentant une activité d'environ 0,03 p.g/ml. Le composé 593-A et ses sels peuvent servir pour déceler la présence de virus lysogènes dans des souches bactériennes. A cette fin, l'addition de 10 à 30 décomposé par millilitre de 10 culture des bactéries en croissance va provoquer la lyse des cellules contenant les virus lysogènes. 70 22336 - 27 - 2052985 iSVBEDICAIIOMS 1 . Un nouveau produit ayant une activité anti-bactérienne et anti-tumeur, caractérisé par les propriétés suivantes : a) il s'agit d'une base qui forme des sels avec des acides ; b) ce pro-5 duit contient comme éléments le carbone, l'hydrogène, l'azote, 1'oxygène et le chlore selon les proportions moléculaires jHgOCl ; c) ce produit est soluble dans l'eau, les alcanols inférieurs et le chloroforme ; d) le produit forme un chlorhydrate ayant un spectre d'absorption de l'infrarouge représenté à la fi-10 gure 1 ; et e) le produit forme un acétate par réaction avec l'anhydride acétique en présenoe de pyridine à la température ambiante, cet acétate fondant à 228°C-229°"C et ayant le spectre d'absorption de l'infrarouge présenté à la figure 2 ; ainsi que les sels d'addition d'acides de ce produit. 15 2. Le produit selon la revendication 1, appelé composé 593A. 3. Les sels du composé 593A selon la revendication 1 avec les acides. 4. Le chlorhydrate du composé 593A selon la revendication 1. 5. Procédé pour produire un nouveau conroosé à effet anti-20 tumeur (composé 593A), ce procédé étant caractérisé en ce qu'on fait croître une culture, génératrice de composé 593A, de Streptomyces griseoluteus dans un milieu nutritif aqueux jusqu'à ce qu'une activité anti-microbienne soit conférée à ne milieu. 6. Procédé selon la revendication 5, caractérisé en ce qu'on 25 utilise la souche Streptomyces griseoluteus KRRL 3412. 7. Procédé pour produire le composé 593A, caractérisé en ce qu'on fait croître une culture, productrice du composé 593A, de Streptomyces griseoluteus dans un milieu nutritif aqueux jusqu'à ce qu'une activité anti-microbienne importante soit conférée à 3C ce milieu et l'on récupère ce composé 593A du bouillon de fermentation ainsi obtenu. 8. Procédé selon la revendication 7, caractérisé en ce qu'on utilise la souche Streptomuces griseoluteus ÎJRRL 3412. 9. Procédé selon la revendication 7, caractérisé en ce qu'on récupère le produit par extraction à l'aide d'un alcanol inférieur 35 ou à l'aide de chloroforme.