FR 2049188 A1 19710326 FR 7021977 A 19700615 70 21977 1 2049188 La présente invention concerne un tube de culture perfectionné pour la culture des bacilles tuberculeux et d*autres micro-organismes capnophiles ou pour la culture de micro-organismes anaérobies dans lequel une capsule de C02 gazeux ou une capsule 5 de composés établissant une condition anaérobie est placée dans le bouchon vissé du tube de culture au-dessus d'une poubelle située à l'intérieur du tube pour pouvoir être brisée. Quand le bouchon est vissé à fond à l'extrémité supérieure à vis du tube de culture, la capsule est brisée et 10 le COg échappe dans le tube de culture ou bien une condition anaérobie est établie dans le tube pour favoriser la croissance des micro-organismes. La quantité de C02 présente dans la capsule pouvant être brisée doit être- suffisante pour établir une concentration 15 de 2 à 5$ de C02 dans l'atmosphère du tube, cette concentration étant stimulante et même essentielle pour la croissance des mycobactéries sur le milieu de gélose 7H10. Il est admis que l,anhydride carbonique influe sur le processus physiologique des micro-organismes de différentes 20 façons. Il est considéré comme un constituant essentiel du milieu environnant pour différents micro-organismes. Il a été indiqué que l'incubation des bactéries sous une tension supérieure de C02 (1 à 5$) supprime le besoin de biotine pour certaines souches. Différents procédés ont été utilisés jusqu'ici pour 25 maintenir une atmosphère ayant une teneur augmentée de C02 dans les récipients de culture. Le procédé le plus courant pour l'incubation de culture avec des couvercles libres dans des incubateurs à C02 a 1»inconvénient que le milieu de culture sèche du fait de l'incubation prolongée nécessaire pour la 30 croissance des mycobactéries. Pour éviter cette difficulté,, les cultures ont été placées dans des sacs en matière plastique perméable au C02 mais non perméable à la vapeur d'eau pour l'incubation dans des incubateurs à C02. De nombreux laboratoires produisant des cultures pour les mycobactéries ne possèdent pas 35 d'incubateurs à C02 coûteux et par suite un procédé plus simple étudié utilise des sacs en Mylar de 180 x 360 millimètres imperméables au C02 pour contenir les cultures, avec une culture de mycobacterium phlei, qui est une mycobactérie saprophyte, 70 21977 2 2049188 dans une boîte de Pétri, et en scellant le sac» La croissance de la culture de mycobacterium phlei produit une quantité appropriée de CC>2 pour obtenir une tension supérieure de C02 à 1"intérieur du sac après un certain temps. 5 Ce procédé est actuellement courant dans de nombreux laboratoires, en particulier en raison du développement par Kubica et d'autres d'un procédé perfectionné de digestion d'un crachat avec de lfacétyl-L-cystéine normale pour isoler les bacilles tuberculeux des échantillons cliniques. . 1Q. Bien que ce procédé soit -excellent""pour éliminer les problèmes mentionnés ci-dessus, il implique un travail supplémentaire pour le maintien de la culture de mycobacterium phlei et de la quantité correcte d'inoculum sur une quantité limitée de milieu de gélose. De plus, il demande plus de huit jours 15 pour atteindre la concentration minimale nécessaire de C02 et il y a aussi un risque d'épuisement de la teneur en oxygène si l'incubation est prolongée quand la croissance du mycobacterium phlei continue. Dans le cas du fonctionnement anaérobie, la capsule 20 est de préférence divisée par une cloison verticale pour contenir des quantités égales de deux constituants établissant une condition anaérobie, par exemple une solution aqueuse à 10% de soude caustique et une solution aqueuse à 40fo d'acide pyrogallique qui après mélange forment un sel alcalin d'acide pyrogallique. 25 La présente invention a pour but de résoudre les nombreux problèmes considérés ci-dessus et ceux rencontrés pour les cultures anaérobies et d'obtenir de meilleurs résultats avec un équipement bien moins coûteux. Un brevet antérieur intéressant est le brevet des 30 E.U.A. n° 3 24Ô 302 qui décrit l'introduction dans une boîte de Pétri d'une capsule contenant un agent ou des agents réducteurs ou d'autres produits chimiques pour établir des conditions atmosphériques désirées dans la boîte scellée. La capsule est placée dans l'un des angles de la boîte de façon que, quand le 35 couvercle est appliqué sur la boîte et est forcé-^rers le bas, la capsule soit brisée et libère son contenu pour qu'il échappe à l'intérieur scellé de la boîte afin d'établir les conditions atmosphériques requises» 70 21977 3 2049188 D'autres brevets intéressants sont les brevets des E.U.A. n° 2 285 651, 3 013 950, 3 055 808, 3 064 853 et 3 246 959 qui concernent le développement de la culture mais ne décrivent pas les caractéristiques de la présente invention,, 5 Un dispositif selon 1*invention comporte d'une façon générale un tube de culture perfectionné dont le bouchon à vis contient une capsule pouvant être brisée contenant du C02 gazeux ou des composés établissant une condition anaérobie et sous lequel sait situéesune coupelle ouverte et une rondelle d'étanchéité 10 de façon que, quand le bouchon est vissé à fond sur le goulot à vis du tube de culture,la capsule soit brisée en libérant le COg pour qu'il passe dans le tube de culture ou en établissant' une condition anaérobie à l'intérieur du tube de culture pour provoquer la croissance de la culture contenue dans ce tubeo 15 La présente invention a par suite pour objet une structure perfectionnée à bouchon et capsule pour un tube de culture, peu coûteux, très efficace et supprimant la nécessité d'un équipement auxiliaire de laboratoire coûteux<> L'invention a aussi pour objet un tube de culture 20 efficace dans lequel la culture croît plus facilement que dans les tubes classiques. L'invention a aussi pour objet un moyen perfectionné pour calculer la quantité de C02 ou de composés établissant une condition anaérobie devant être contenus dans la capsule pour un tube donné de culture. Les caractéristiques de l'invention ressortiront plus particulièrement de la description suivante, donnée à titre d'exemple et faite en se référant aux dessins annexés, sur lesquels : La figure 1 est une coupe, les pièces séparées les unes des autres, d'un ensemble selon un mode de mise en oeuvre de l'invention» La figure 2 est une coupe représentant les éléments de la figure 1 assemblés. 35 La figure 3 est une coupe semblable à celle de la figure 2, mais le bouchon vissé à fond et la capsule brisée0 30 70 21977 4 2049188 La figure 4 est une vue en plan de la coupelle de la figure 1 suivant un mode de mise en oeuvre de l'invention. La figure 5 est une coupe, les pièces séparées les unes des autres, d'un ensemble pour établir des conditions anaéro— 5 bies selon un mode de mise en oeuvre de 1*invention. La figure 6 est une coupe de 1*ensemble de la figure 5 assemblé» La figure 7 est une coupe semblable à celle de la figure 6 mais le bouchon vissé à fond et la capsule brisée, et 10 La figure 8 est une vue en plan de la coupelle de la figure 5 suivant un mode de mise en oeuvre de 1*invention. Le tube"de culture des figures 1 à 4 contient une capsule cylindrique en verre ou en matière plastique contenant un volume prédéterminé de CO^ gazeux ou d'un autre composé destiné 15 à passer dans le tube de culture après la rupture de la capsule. Un but de l'invention suivant ce mode de mise en oeuvre est de réduire les problèmes techniques de la fabrication de la capsule dans des conditions stériles et d'apporter un moyen perfectionné pour calculer la quantité de GOg ou d'un autre composé 20 devant être contenu dans la capsule pour un tube de culture donnée. Le tube de culture de la figure 1 comporte un bouchon 31, de préférence en résine phénolique ou une matière analogue d'un diamètre intérieur sensiblement égal au diamètre extérieur du goulot 32 du tube de culture qui comporte un pas de vis extérieur 25 33 complémentaire des rainures hélicoïdales complémentaires 34 de la surface intérieure de la jupe 35 du bouchon 31 pour permettre de visser le bouchon sur le col 32. Le fond du bouchon 31 comporte une cavité cylindrique centrale 36 destinée à recevoir la partie supérieure de la capsule 37 qui a sensiblement le même 30 diamètre que la cavité 36 pour s'adapter étroitement dans cette cavité. La capsule 37 est en verre ou en matière plastique mince ou en matière analogue, et quand elle est utilisée dans un tube moyen de Lowenstein-Jensen H° 03-273TS des Baltimore Biological 35 Laboratories, son rayon est de 0,4 centimètre et"sa hauteur de 2 centimètres. La contenance atmosphérique de ce tube de Lowenstein-Jensen est de 25 cm? et avec les dimensions précitées, 3 il contient un peu plus de 1 cm de CO^ ou d'un autre composé 70 21977 5 2049188 chimique qui après échappement dans le tube de culture fermé de façon étanche établit dans celui-ci la condition atmosphérique désirée» Bien entendu, pour des tubes de culture plus, grands, 5 les dimensions de la capsule cylindrique peuvent être choisies de la façon correspondante pour régler la tension de COg ou la condition atmosphérique à l8intérieur du tubeo Une rondelle en caoutchouc 38 est de préférence placée de façon étroite en dessous de l!épaulement 39 du fond du bouchon 10 31, le diamètre extérieur de cette rondelle étant égal au diamètre intérieur du bouchon 31 en dessous de lîépaulement 39» Une coupelle métallique 40 est placéd dans le bouchon 31 sous la rondelle 38 de la façon représentée sur les figures 2 et 3, et cette coupeUe comporte de préférence une cavité centrale 15 cylindrique 41 ayant les dimensions voulues pour recevoir étroitement la partie inférieure de la capsule 37 quand le bouchon, la capsule , la coupelle et ses éléments sont assemblés» la coupelle 40 comporte à lsextrémité supérieure un rebord ou bride circulaire 42 d*un diamètre extérieur égal au 20 diamètre intérieur du bouchon 31 en dessous de lîépaulement 39 et le même diamètre que le diamètre extérieur de la rondelle 38 de façon que la bride 42 de la coupelle 40 s?adapte étroitement dans le bouchon 31 contre la rondelle 38 en dessous de lîépaulement 39 du bouchon 31. 25 Le fond 43 de la coupelle 40 comporte des trous 44 (figure 4) dans un but expliqué ci-après» Une toile métallique ou un tissu fin 45 est fixé contre la face intérieure du fond 43 de la coupelle 40 pour éviter le passage dans le tube de culture de fragments de la 30 capsule 37 après la rupture de celle-ci. Une seconde rondelle en caoutchouc est placée sur le bord supérieur du goulot 32 du tube de culture, cette rondelle ayant les dimensions voulues pour s'adapter étroitement sous la bride 42 de la coupelle 40 afin d*établir un joint étanche entre 35 la surface inférieure de la bride 42 et le bord supérieur du goulot 32 du tube de culture quand le bouchon 31 est vissé â fond» La figure 1 représente en coupe séparés les uns des autres le bouchon 31, la capsule 37, la rondelle 38, la coupelle 40 70 21977 6 2049188 et la rondelle 46 avant leur assemblage de la façon représentée sur les figures 2 et 3 sur le col 32 du tube de culture.» Le bouchon, la capsule et la structure comportant la coupelle sont de préférence préalablement assemblés pour constituer 5 un ensemble en plaçant dfabord la rondelle 30 dans le bouchon 31 contre lîépaulement 39 du bouchon et en introduisant ensuite la capsule 37 dans la cavité 36 du bouchon 31° La coupelle 40 est ensuite introduite dans le bouchon 31, la partie inférieure de la capsule 37 pénétrant dans la cavité 41, après quoi la 10 rondelle 46 est placée autour de la coupelle 40 contre la grille 42 de la coupelleo Cet ensemble est ensuite empaqueté de façon stérile. Avant; lfutilisati-on, cet ensemble est sorti du paquet stérile, et il est placé de façon aseptique à l'extrémité du col 32 du tube de culture, pour qu'avant le vissage à fond du 15 bouchon la capsule 37 soit tenue étroitement entre le fond de la cavité 36 et le fond 43 de la coupelle 40 de la façon représentée sur la figure 2. Après cet assemblage, une* rotation supplémentaire du bouchon dans le sens des aiguilles d'une montre comprime la 20 capsule en verre ou en natière plastique 37 entre le bouchon 31 et le fond 43 de la coupelle 40, de sorte que la capsule 37 est brisée de la façon représentée sur la figure 3 et libère le 00^ gazeux qui passe à 1*intérieur du tube de culture à travers les trous 44 du fond 43 de la coupelle 40. Le tamis fin placé en 25 dessous des trous 44 de la coupelle 40 empêche le passage de fragments de la capsule dans le tube de culture. Les figures 5, 6, ? et 8 représentent un tube de culture suivant un autre mode de mise en oeuvre de 14invention pour 1*établissement d'une condition anaérobie dans le tube» 30 La figure 1 est une coupe d'un bouchon avec une capsule et d'une structure à coupelle analogue à l'ensemble des figures 1 à 4, avec les modifications décrites ci-après. Le bouchon et les rondelles en caoutchouc sont à peu près identiques aux éléments correspondants des figures 1 à 4 et par suite sont désignés par 35 les mêmes références numériques. La principale différence entre les deux modes de réalisation réside dans lia structure de la capsule et dans la forme du fond de la coupelle et du tamis placé en dessous. 70 21977 7 2049188 La capsule 47 représentée sur la figure 5 est de préférence en verre ou en une matière analogue dure et fragile et elle a les mêmes dimensions, c'est-à-dire un rayon de 0,4 centimètre et une longueur de 2 centimètres, son volume étant légèrement 3 5 supérieur à 1 cm » L'épaisseur de l'extrémité inférieure 4â de la figure 5 est de préférence plus faible à l'extrémité inférieure 48, et la capsule est de préférence divisée verticalement par une cloison 49 en deux chambres égales 50 et 51 contenant des quantités égales, 3 10 c'est-à-dire 0,5 cm de deux réactifs se combinant pour former un sel alcalin d'acide pyrogallique absorbant rapidement l'oxygène du milieu environnant. Pour faciliter la fabrication, la capsule 47 peut être formée de deux éléments semi-cylindriques identiques séparés, chacun pour l'un des deux réactifs.» 15 II a été déterminé qu'une solution aqueuse à 10$ de potasse caustique et une solution aqueuse à 40% d'acide pyrogallique chacune de 0,5 crn^ mélangées dans un tube de culture O standard fermé de façon étanche et contenant environ 25 cm d'air atmosphérique établissent une condition anaérobie satis-20 faisante pour la croissance des anaérobiesstricts. Si la capsule 47 a un rayon de 0,4 cm et une hauteur de 2 cm, chacun des compartiments définis par la cloison 49 3 contient 0,5 cm de l'un des réactifs, c'est-à-dire de solution aqueuse à 10$ de potasse caustique et de solution aqueuse à 25 d'acide pyrogallique. Ces réactifs sont stables quand ils sont dans les capsules cellées. La partie supérieure de la coupelle 52 est identique à la partie supérieure de la coupelle de la figure 1, et elle comporte à l'extrémité supérieure une bride circulaire 53 s'adap-30 tant étroitement sous la rondelle 38 et l'épaulement 39 du fond du bouchon 31. Cependant, le fond de la coupelle 52 n'est pas perforé comme celui de la coupelle 40 et comporte de préférence une disposition en croix de la façon représentée sur la figure 8, 35 ce fond étant constitué par des barreaux en Y 54 et 55 perpendiculaires l'un à l'autre dans le fond ouvert de la coupelle 52 pour supporter l'extrémité inférieure de la capsule 47. 70 21977 2049188 En dessous du fond de la coupelle 52 est fixée une toile 56 en forme de sac de préférence remplie de coton absorbant 57 dans un but indiqué ci-après» Le sac en tamis 56 (figures 7 et Ô) dépasse vers 5 le bas sur une distance appréciable à l'intérieur du goulot 32 du tube de culture quand l'ensemble formé par le bouchon, la capsule, les rondelles et la coupelle est assemblé de la façon représentée sur la figure 6. Le mode d'assemblage des éléments des figures 5 à Ô est le même que celui des éléments des figures 10 1 à Le bouchon, la capsule, la coupelle et les rondelles sont préalablement assemblés, et sont empaquetés de façon stérileo Pour 1*utilisation, l'emballage stérile est enlevé et. la coupelle 52 est introduite dans le goulot 32 du tube de culture au-dessus de la rondelle 46. Le bouchon 31 est ensuite vissé sur le goulot 15 32 du tube de culture de façon que la capsule 47 soit tenue fermement entre la cavité 36 du bouchon et le fond croisillonné 52 de la coupelle, de la façon représentée sur la figure 6. Une rotation supplémentaire du bouchon de la façon représentée, sur la figure 7 provoque la rupture de la partie 20 inférieure affaiblie de la capsule 47 et la libération de quantités égales de réactifs, c'est-à-dire de solution aqueuse à 10$ de potasse caustique et de solution aqueuse à 40$ d'acide pyrogallique, ces solutions s*écoulant dans le coton du sac 56 en dessous de la coupelle 52 pour former dans le coton un sel alcalin d'acide 25 pyrogallique absorbant l'oxygène libre de l'intérieur du tube de culture. Le coton absorbant 67 contenu dans le sac 56 absorbe les réactifs liquides et le produit de la combinaison et empêche leur chute à l'intérieur du tube de culture. 30 Les exemples précédents concernent l'utilisation du tube de Lowenstein-Jensen N° 03-273TS précité ayant une contenance de 25 crn^. Dans le cas d'un tube de culture plus grand ou plus petit, les dimensions du bouchon et de la capsule doivent être modifiées d'une façon convenable pour obtenir l'augmentation 35 désirée de la tension de C02 à l'intérieur du tuba de culture. Pendant l'utilisation du bouchon et de la capsule le tube est complètement fermé de façon étanche à tout moment, ce qui évite l'écoulement vers l'extérieur du milieu de culture 70 21977 9 2049188 et maintient le rapport voulu entre COg et l'air à l'intérieur du tube. Le bouchon contenant la capsule supprime la nécessité d'appareils incubateurs à CC^ importants et coûteux ou de chambres à gaz compliquées pour la culture des micro-organismeso L'invention supprime aussi la nécessité d'utiliser les cultures de bactéries comme sources de CO2 et élimine aussi la possibilité d*épuisement de 1'oxygène Bien entendu, le bouchon et la capsule peuvent avoir nrimporte quelles dimensions et capacités nécessaires selon la dimension du tube de culture et de pourcentage de COg nécessaire à l'intérieur du tube. Normalement, la capsule contient moins de 3 2 cm de CC^ gazeux, mais cette quantité peut être augmentée en fonction du volume atmosphérique du tube de culture. Les bouchons doivent être stérilisés et être vissés de façon hermétique avant l'utilisation pour assurer des conditions aseptiques. S'il est nécessaire d'ouvrir le tube de culture, le remplacement du bouchon et de sa structure rétablit le pourcentage correct de COg dans l'atmosphère du tube. Le bouchon à capsule selon l'invention est principalement destiné à éliminer de nombreuses difficultés rencontrées dans la culture des microbactéries, mais il peut aussi être utilisé avec succès pour la culture à partir dvéchantillons cliniques de micro-organismes pathogènes dont la croissance n?est pas possible sans une augmentation de CQg. Les tubes de culture tels que décrits ci-dessus conviennent particulièrement pour être utilisés sur place et quand des incubateurs à C02 ou des chambres à gaz ne sont pas disponibles. Un autre avantage est que les micro-organismes-sont cultivés avec un rendement élevé et dans des conditions uniformes. Bien entendu, la description qui précède n'est pas limitative, et l'invention peut être mise en oeuvre suivant d'autres variantes, sans que l'on sorte de son cadre 70 21977 10 2049188 REVENDICATIONS 1„ Ensemble à bouchon pour tube de culture comportant un goulet à vis caractérisé par un bouchon cylindrique comportant un 5 filetage intérieur, une coupelle métallique cylindrique à fond perforé comportant une bride périphérique de diamètre extérieur égal au diamètre intérieur du bouchon et un fond perforé* une capsule cylindrique pouvant être brisée contenant un produit favorisant la croissance de la culture, la partie inférieure de la- capsule 10 étant logée dans la coupelle, une rondelle sur la bride de la coupelle, le diamètre extérieur de cette rondelle étant égal au diamètre extérieur de la bride, et une rondelle d'étanchéité entre la bride de la coupelle et le bord du goulot du tube de culture de façon que quand le bouchon est vissé à fond sur le goulot du tube 15 de culture la capsule soit brisée et que son contenu passe dans le tube de culture à travers des trous formés dans le fond de la coupelle. 2„ Ensemble à bouchon selon la revendication 1 caractérisé en ce que la capsule est en verre mince. 20 Ensemble à bouchon selon la revendication 1 caractérisé en ce que la capsule est en matière plastique. 4„ Ensemble à bouchon selon l'une des revendications là 3 caractérisé en ce que le rayon de la capsule est de l'ordre de 0,4 cm et sa longueur est de l'ordre de 2 cnu 25 5- Ensemble à bouchon selon l'une des revendications 1 à 4 ca ractérisé en ce que la capsule estremplie de COr, gazeux. 6. Ensemble à bouchon selon l'une des revendications 1 à 4 caractérisé en ce que la capsule est divisée par une cloison en deux chambres égales contenant des quantités égales de deux réactifs 30 se combinant du fait de la rupture de la capsule pour établir une condition anaérobie. 7. Ensemble à bouchon selon la revendication 6 caractérisé en ce que les réactifs sont constitués par une solution aqueuse à 10$ de potasse caustique et une solution aqueuse à 40$ d'acide pyrogal- 35 lique se combinant pour former un sel alcalin d'acide pyrogallique. 8. Ensemble à bouchon selon l'une des revendications 1 à 6 caractérisé en ce que "le fond de la coupelle est muni d'un tamis 70 21977 n 2049188 à mailles fines pour empêcher le passage de fragments de la capsule dans le tube de culture. 9. Ensemble à bouchon selon l'une quelconque des revendications 1 à 7 caractérisé par un sac à mailles fines rempli de coton fixé au fond de la coupelle et dépassant au-dessous de ce fond.