FR 2051510 A1 19710409 FR 7016811 A 19700508 70 16811 2051510 La présente invention concerne une nouvelle substance antiinflammatoire et son procédé de préparation. On connaît divers agents anti-inflammatoires. En gros, on les divise en agents anti-inflammatoires stéroïdes tels que la 5 cortisone, la dexaméthasone, etc., et en agents anti-inflammatoires non stéroïdes, tels que les salicylates, les médicaments du type de la pyrazolone et 1'indométhacine. On connaît depuis peu et on utilise des préparations enzymatiques anti-inflammatoires.- Toutefois, les détails du mécanisme d'action pharmacologique des médicaments anti-10 inflammatoires sont inconnus et par conséquent, il semble qu'il existe une possibilité illimitée de découvrir de nouvelles substances possédant une activité anti-inflammatoire. Par ailleurs, des recherches ont été faites à l'échelle mondiale sur l'utilisation de métabolites de microorganismes comprenant 15 des substances antibiotiques destinées à l'usage médicinal. La Demanderesse a également effectué de nombreuses recherches et vient de découvrir qu'une substance douée d'une forte activité anti-inflammatoire est présente dans un bouillon de fermentation qui résulte de la fermentation d'un microorganisme qui sera défini 20 ci-après. Cette substance anti-inflammatoire est soluble dans l'eau, elle résiste à la chaleur, aux acides et aux bases alcalines et on n'avait jamais découvert jusqu'à présent qu'elle existe non seulement dans des microorganismes, mais aussi dans des végétaux et des animaux supérieurs. 25 Conformément à la présente invention, un microorganisme appartenant aux espèces Aerobacter cloacae, Aerobacter aerogenes, Bacillus subtilis, Micrococcus lys-ode ikticus et Pseudomonas aeruginosa, engendre un-processus de fermentation dans un milieu nutritif usuel contenant une source de carbone, une source d'azote 30 et des sels minéraux, et on isole du bouillon de fermentation une substance de haut poids moléculaire, douée de propriétés antiinflammatoires . D'autres caractéris.tiques et avantages de la présente invention ressortiront de la description détaillée qui va suivre, faite en 35 regard du dessin annexé sur lequel : la figure 1 est un graphique montrant la courbe de filtration sur gel d'une substance anti-inflammatoire conforme à l'invention, 70 16811 . 2051510 sur une colonne de "Sephadex"G-200 (en abscisses : nombre de fractions (5 ml)) ; et. la figure 2 est un graphique montrant un spectre d'absorption des rayons ultraviolets de la substance anti-inflammatoire conforme 5 à l'invention (en abscisses*, longueur d'onde (mp.), en ordonnées, densité optique). Dans la mise en oeuvre du procédé de l'invention, on peut utiliser tout microorganisme appartenant au groupe suivant : Aerobacter cloacae, Aerobacter aerogenes, Bacillus subtilis, 10 Micrococcus lysodeikticus et Pseudomonas aeruginosa. Toutefois, il est préférable d'utiliser ceux qui appartiennent au genre Aerobacter du fait que,par rapport aux autres, ils assurent l'obtention d'un plus haut rendement en substance anti-inflammatoire désirée. 15 Une description complète des microorganismes mentionnés ci- dessus a été donnée dans la littérature et ces microorganismes sont bien connus en pratique et peuvent être obtenus aisément à partir de culturespubliques, en sorte qu'il n'est pas nécessaire de les définir davantage. 20 Conformément à l'invention, ce microorganisme fait fermenter - un milieu de culture. le milieu peut se composer d'ingrédients nutritifs usuels utilisés de façon classique pour la fermentation sous l'action des microorganismes mentionnés ci-dessus. Par conséquent, le milieu contient des sources de carbone, des sources 25 d'azote et des sels minéraux. Plus particulièrement, on peut utiliser un bouillon usuel ou un autre milieu synthétique (par exemple un milieu à la peptone, au saccharose, à l'asparagine). La fermentation peut être conduite d'une manière classique dans des conditions aérobies. On peut utiliser tout mode classique 30 de culture en immersion sous agitation, de culture avec agitation par secousses ou de culture statique. Dans chaque cas,, la culture ou la fermetation peut être conduite à une température d'environ 30 à 40°C, de préférence à environ 35^37°C« _ . 35 Au cours du développement du microorganisme, il est produit une substance anti-inflammatoire qui s'accumule dans le milieu de culture. Llaccumulation atteint habituellement son maximum au '0 16811 3 2051510 "bout d'environ 16 à 24 heures de fermentation. La substance anti-inflammatoire accumulée dans le bouillon de culture ou de fermentation peut être isolée et purifiée de diverses manières comme expliqué ci-après. 5 PROCEDE I Après la culture du microorganisme, le bouillon de fermentation que l'on obtient est soumis à une séparation centrifuge en une liqueur surnageante et des cellules. La liqueur surnageante est concentrée par exemple à environ 1/20 à une température exté-10 rieure d'environ 40°0 au moyen d'un évaporateur rotatif et il est chauffé en vue de sa stérilisation, par exemple à 100°C pendant environ 20 minutes. Après refroidissement, le liquide est centrifugé pour enlever la matière insoluble, puis il est transféré à une membrane dialysante et il est dialysé avec de l'eau de ville .15 pendant deux à trois jours pour éliminer, les substances de bas poids moléculaire. Ensuite, le liquide est de nouveau centrifugé pour éliminer toute matière insoluble et il est concentré à un volume convenable comme mentionné ci-dessus. Le concentré, après fractionnement à l'acétone ou sans un tel fractionnement, est filtré^ 20 sur gel au moyen d'un filtre formé par exemple de "Sephadex" G-100. La substance anti-inflammatoire ne passe dans la fraction que vers la fin. La fraction active est encore filtrée sur gel en utilisant le produit "Sephadex" G-200. Dans ce cas également, la fraction est active vers la fin et il s'agit d'une solution pratiquement 25 incolore. Cette solution est lyophilisée ou déshydratée par addition d'acétone. On obtient une poudre purifiée de la substance antiinflammatoire. La substance anti-inflammatoire peut aussi être isolée des cellules. Dans le cas du traitement d'une petite quantité de 30 cellules, l'extraction peut être conduite par broyage des cellules avec une poudre de verre à la silice dans un mortier. Toutefois, pour traiter une grande quantité de cellules, on peut utiliser les procédés suivants : 1) Utilisation de la pression osmotique. 35 Dans ce procédé, des cellules lavées sont mises en suspension dans une petite quantité d'eau et la suspension est introduite dans une solution de phosphate dipotassique 3M. Le tout est laissé pendant 16811 4 2051510 une nuit dans une pièce à basse température, puis placé dans une grande quantité d'eau. Ensuite, la suspension est concentrée au moyen d'un évaporateur rotatif"et centrifugée en donnant une liqueur surnageante que l'on utilise comme matière partiellement purifiée. 5 2) Procédé par congélation et décongélation. Dans ce procédé, des cellules lavées sont.mises en suspension dans une petite quantité d'eau, la suspension est ensuite introduite . dans un congélateur réglé au-dessous de -20°C, et elle est laissée à l'état congelé pendant plus d'une nuit, le produit congelé est 10 ensuite mis à fondre dans l'eau chaude. Cette opération est répétée deux ou trois fois. Ensuite, la suspension est centrifugée et la liqueur surnageante est utilisée comme matière partiellement purifiée. Dans chaque cas, la matière partiellement purifiée est con-15 centrée et chauffée par exemple à 100°C pendant 20 minutes pour éliminer par précipitation les protéines .et l'acide nucléique. La solution chauffée est refroidie puis centrifugée et la liqueur surnageante est dialysée avec de l'eau. La purification subséquente est effectuée comme expliqué ci-dessus en ce qui concerne la solu-20 tion de filtrat de culture. PROCEDE II Le bouillon de fermentation est ajusté à un pH de 3-4 avec un acide (par exemple l'acide chlorhydrique 3$0 et il est divisé par centrifugation en une .liqueur surnageante et en des cellules» . 25 La liqueur surnageante est refroidie à 4-5°C et du chlorure de potassium y est ajouté de manière que sa concentration soit de 1-5 i°, de préférence environ 3 Ensuite, on ajoute de l'éthanol de manière que la concentration finale en alcool puisse être de 40-80 16811 5 2051510 les propriétés des substances anti-inflammatoires ainsi obtenues ne diffèrent pas beaucoup avec le type de bactéries que l'on utilise pour la culture initiale. Ainsi, les substances anti-inflammatoires purifiées obtenues 5 au moyen du procédé de l'invention sont des substances insipides, inodores, incolores, hydrosolubles et neutres. Elles sont insolubles dans un solvant ordinaire tel que le méthanol, l'éthanol, l'acétone. le benzène, l'éther, etc. Conformément à une étude effectuée par filtration sur gel, (par exemple sur "Sephadex" G—200, "Bio-Gel" 10 P-500, etc.), on suppose que le poids moléculaire est supérieur à 200 000 (figure 1). L'azote ammoniacal dosé par la méthode micro-' analytique de Kjeldahl est d'environ 5 fi* Le spectre d'absorption des rayons ultraviolets (figure 2) ne montre une absorption qu'à de courtes longueurs d'onde , mais il ne présente pas d'absorption ; 15 maximale à 280 et 260 m|t, respectivement propre à la protéine ' et à l'acide nucléique. En ce qui concerne les réactions colorées, la réaction de Molish qui est une réaction colorée générale-- des saccharides est positive. La réaction à la ninhydrine, qui est une réaction colorée d'un groupe amino, et aussi la réaction du biuret, 20 qui est une réaction d'une liaison peptidique, sont positives. Mais la réaction à la xanthopr.otéine, qui est une réaction des protéines, est négative. La coloration à la rhodamine, qui est une méthode de détection des lipides, est négative par coloration directe, mais positive après extraction au chloroforme et au mé- 26 *5 25 thanol. Le pouvoir rotatoire spécifique [ (C = 1, eau). La teneur en phosphore, est d'environ 0,22 fi. En outre, cette substance n'est pas dialysable et elle est stable à 100°C pendant 10 minutes, de même qu'elle est stable à un pH de 4 à 10. Même par traitement avec un enzyme tel qu'une protéase ou une 30 amylase, l'activité anti-inflammatoire n'est pas réduite. L'activité anti-inflammatoire de cette substance est illustrée sur le tableau I, au moyen d'un échantillon obtenu par l'utilisation d'Aerobacter cloacae comme microorganisme. L'activité anti-inflammatoire est déterminée sur des rats la 35 conformément à la méthode de l'oedème de/patte, selon Martin. . Ainsi, on utilise un groupe de cinq rats mâles de la race Wister pesant chacun 100 à 150 g. On utilise de même comme témoiiiS an groupe 70 16811 6 2051510 de cinq rats. L'échantillon expérimental est dissous dans une solution physiologique de chlorure de sodium à. -une concentration de 10 ml/kg et on administre la solution obtenue. 30 minutes après l'administration de l'échantillon expérimental, on injecte par 5 voie sous-cutanée 0,1 ml de carraghénine à 0)5 fi dans la patte postérieure gauche et~0,J ml d'une solution physiologique de chlorure de sodium par voie sous-cutanée dans la patte postérieure droite. Deux à six heures .après l'injection--'de; carraghénine, on examine d'heure en heure l'effet anti-inflammatoire en mesurant 10 le volume de l'oedème. Le tableau I fait ressortir non seulement l'efficacité de l'administration usuelle, mais aussi celle de l'administration par voie duodénale. La toxicité DL^-q (chez les rats) est- de 750 )f/kg dans le cas 15 de l'injection par voie intraveineuse, 1 mg/kg dans le cas de l'injection intrapéritonéale et 3,1 mg/kg dans le cas de l'injection intramusculaire. TABLEAU I Taux (fi) d'inhibition de l'oedème., 20 • voie d'admi- Dose deux trois quatre cinq six nistration (mg/kg) heures heures heures heures heures Injection intra- veineuse 0,0025 62 70 78 56 56 25 Injection intrapéritonéale 0,020 84 72 66 42 22 Injection intramusculaire 0,025 54 58 64 56 53 Injectioç. sous-cutanée 0,100 53 52 53 49 46 30 Administration duodénale 25 75 57 52 32 15 II n'existe pas de médicament anti-inflammatoire non-stéroïde qui soit aussi stable, qui exerce un effet anti-inflammatoire en aussi faible quantité et qui puisse être utilisé par injection. Par conséquent, l'invention est surprenante et revêt un intérêt 35 dans le domaine pharmaceutique. En outre, la substance anti-inflamma-toire de l'invention peut être produite à l'échelle industrielles avec une reproductibilité avantageuse. 0 16811 7 2051510 L'invention est illustrée par les exemples suivants : Exemple 1 Deux litres d'un bouillon d'ensemencement préparé par culture préalable d'une souche d'Aerobacter cloacae sont inoculés 5 dans 100 litres d'un milieu de culture consistant en" 1 fi de peptone et de l'eau de ville. Après l'inoculation, la culture est conduite dans des conditions aérobies à 3-7°C pendant 16 heures. Après la culture, les cellules sont isolées par centrifugation. Le filtrat est additionné de chlorure de potassium, de manière que la concen-10 tration soit de 3 fi • Ensuite, on ajoute de l'éthanol en refroidissant, en une quantité telle que la concentration finale en alcool soit de 50 fi. On laisse la solution au repos pendant environ 17 heures. Lorsqu'on observe la précipitation de la substance anti-15 inflammatoire en fonction de la concentration en chlorure de po-"tassium ajouté, on constate que lë précipité flotte à la surface et ne se dépose pas au fond, tant que la concentration en chlorure de potassium ajouté n'atteint pas 2 fi. Toutefois, la concentration de 2 fia n-'est pas suffisante pour sédimenter de façon satisfaisante.. 20 le précipité. Lorsque du chlorure de potassium est ajouté de manière que la concentration soit de 3 à*5 fi°, le précipité se dépose presq>3 quantitativement, en sorte que la décantation peut être effectuée sans difficulté. Le précipité blanc obtenu est' recueilli par décantation, 25 dialysé avec de l'eau pour éliminer l'éthanol, puis lyophilisé. Le rendement est de 64 g. L'action anti-inflammatoire de cet échantillon est représentée sur le tableau II. Exemple 2 On répète le mode opératoire de l'exemple.1,,à la diffé-30 rence qu'on utilise une souche d'Aerobacter aerogenes. On obtient 7,0 g d'un produit lyophilisé. L'action anti-inflammatoire de cet échantillon est représenté^èur le tableau II. Exemple 3 On répète le mode opératoire de l'exemple 1, à la diffé-35 rence qu'on utilise une souche de Bacillus subtilis. On obtient 5,8 g d'un produit lyophilisé. L'activité anti-inflammatoire de cet échantillon est reproduite sur le tableau II. 70 16811 a 2051510 10 15 20 25 Exemple 4 On répète le mode opératoire de l'exemple 1, à la différence qu'on utilise une souche de Micrococcus lysodeikticus. On obtient 4,8 g d'un produit lyophilisé. L'activité anti-inflammatoire de cet échantillon est reproduite sur le tableau II. Exemple 5 On répète le mode opératoire de l'exemple 1, à la différence qu'on utilise une souche de Pseudomonas aeruginosa. On obtient 8,1 g d'un produit lyophilisé. L'activité anti-inflammatoire de cet échantillon est reproduite sur le tableau II. TABLEAU II Echantillon d'essai Exem- Voie Doae d'admi- mg/kg nistra-tion Taux (?&) d'inhibition de l'oedème deux heures trois heures quatre heures cinq heures s xx heures injection in-trapéri- pie 1 tonéale 0,01 71 63 43 33 25 !t 2 H o « o 51 45 43 32 22 II 3 M 0,20 73 62 58 51 43 1t 4 n 0,20 57 51 53 37 24 1! 5 î! 0,050 52 56 51 45 38 30 35 Exemple 6 -On inocule une souche d'Aerobacter cloacae dans un milieu de culture consistant en 1 g d'extrait de viande, 1 g de peptone, 0,3 g de chlorure de sodium et 100 ml d'eau de ville (ajustée à un pH égal à 7,0) dans .un flacon à secousses d'une capacité de 500 ml, et on agite le mélange par secousses en conduisant la culture à 37°£ pendant environ 20 heures. Le bouillon obtenu est centrifugé à 10 000 tours/minute pendant 10 minutes, pour le séparer en cellules et en une liqueur surnageante. La liqueur surnageante transparente est concentrée à environ 1/20 en utilisant un évapora-teur rotatif. Ce concentré est chauffé dans l'eau bouillante sur un bain d 'huile pendant environ 20 minutes. Le précipité est isolé par centrifugation. La liqueur surnageante est transvasée dans un tube en "Cellophane" et dialysée avec de l'eau de ville. Le liquide interne dialysé est centrifugé pour éliminer ia matière insoluble, 16811 9 2051510 puis il est concentré et filtré sur gel en utilisant le produit "Sephadex" G-100 équilibré à l'eau. l'élution est effectuée avec de l'eau, la fraction est marquée avec le réactif coloré de Molish à la ninhydrine absorbant les rayons ultraviolets, la substance 5 anti-inflammatoire est extraite par élution en une fraction qui traverse le produit "Sephadex" .G-100. la substance anti-inflammatoire est recueillie et lyophilisée ou déshydratée par addition d'acétone, pour obtenir un produit purifié, le rendement à partir d'un litre de bouillon initial de fermentation est de 230 mg* 10 l'activité anti-inflammatoire de cette substance est repro duite sur le tableau III. TAELEAU III Taux (fi) d'inhibition de l'oedème Dose . deux trois quatre cinq six mg/kg heures heures heures heures heures 0,3 87 88 89 82 74 0,1 79 74 72 68 56 0,03 42 36 35 10 0 0,3 83 86 88 79 - 72 1,0 56 57 58 62 65 1,0 21 28 25 36 56 de l'administration intraveineuse chez des est d'environ 50 V/kg et la dose Dl^ est d'environ 7,5 mg/kg. Exemple 7 On lave à l'eau 14,5 g (poids humide)/&es cellules obtenues 30 à partir d'un litre du bouillon de fermentation de l'exemple 6, et on les met en suspension dans 150 ml d'eau. On congèle la suspension à -20°C et on la laisse fondre en 17 heures environ, puis on la place de nouveau dans le congélateur et on répète la même opération. On centrifuge cette solution à 20 000 tours/minute pen-35 dant 20 minutes, puis on traite à la chaleur la liqueur surnageante. Ensuite, en répétant le mode opératoire de l'exemple 1, on sépare la substance anti-inflammatoire et on la purifie pour obtenir 158 mg Voie d'adminis-15 tration Injection intraveineuse 1! I! Injection intra-20 péritonéale Injection intramusculaire Injection sous-cutanée 25 ' Dans le cas rats, la dose DEj-q 70 16811 10 2051510 de produit purifié. Exemple 8 On lave à l'eau 14,5 g (poids humide) des mêmes cellules que dans l'exemple 7 et x»n les met en suspension dans 100 ml d'une 5 solution de phosphate dipotassique 3M. On laisse la suspension pendant environ 17 heures dans une chambre à basse température et on la verse progressivement dans 20 litres d'eau, tout en agitant. Ensuite, on concentre cette solution aqueuse à environ 100 ml avec un évaporateur rotatif et on la centrifuge à 20 000 tours/mi-10 nute pendant 20 minutes pour éliminer les cellules détruites. La liqueur surnageante est dialysée avec de l'eau. Ensuite, en répétant le mode opératoire de l'exemple 1, on procède à la séparation et à la purification pour obtenir 180 mg d'une substance anti-inflammatoire. 15 Exemple 9 On inocule 1'organisme Aerobacter cloacae dans un milieu de culture consistant en 0,5 g de peptone, 0,5 g de phosphate monopotassique, 0,2 g de sulfate de magnésium à 7 molécules d'eau et 100 ml d'eau de ville (pH ajusté à 7,0) dans un flacon à secousses 20 d'une capacité de 500 ml, et on agite le mélange par secousses pour procéder à la culture à 37°C pendant environ 20 heures. On traits le bouillon de fermentation obtenu de la même manière que dans l'exemple 1, pour obtenir 350 mg d'une substance anti-inflammatoire à partir d'un litre du bouillon initial de fermentation. 70 16811 n 2051510 KEMPICAMOIIS 1. Substance anti-inflammatoire, caractérisée par le fait qu'elle est insipide, inodore, incolore, soluble dans l'eau et neutre et présente un poids moléculaire supérieur à 200-000, cette 5 substance étant obtenue à partir d'un bouillon de fermentation résultant de la culture d'une souche d'un microorganisme appartenant aux espèces Aerobacter cloacae, Aerobacter aerogenes, Bacillus subtilis, Micrococcus lysodeikticus et Pseudomonas aeruginosa. 2. Procéd^éle préparation d'une substance anti-inflammatoire, 10 caractérisé par le fait qu'il consiste à cultiver un microorganisme appartenant à l'une des espèces Aerobacter cloacae, Aerobacter aerogenes, Bacillus subtilis, Micrococcus lysodeikticus ou Pseudomonas aeruginosa, dans un milieu nutritif contenant une source de carbone, une source d'azote et des sels minéraux, et à 15 isoler une substance anti-inflammatoire de haut poids moléculaire du bouillon de fermentâtioi/que l'on obtient. 3. Procédé suivant la revendication 2, caractérisé par le fait que la substance anti-inflammatoire est précipitée dans un filtrat du bouillon de fermentation par addition d'éthanol, en . 20 présence de chlorure de potassium. ■ 4. Procédé suivant la revendication 3, caractérisé par le fait que le chlorure de potassium est ajouté au filtrat de manière que sa concentration soit de 1-5 fi, puis l'éthanol est ajouté au mélange en une quantité telle que la concentration en alcool soit 25 de 40 à 80 fi>, ce qui provoque la précipitation de la substance antiinflammatoire . 5. .Procédé suivant la revendication 2,, caractérisé par le fait qu'on concentre un filtrat du bouillon de fermentation, puis on le dialyse pour éliminer des substances de bas poids moléculaire, 30 et on le soumet ensuite à une filtration sur gel, pour obtenir une fraction contenant la substance anti-inflammatoire.