FR 2042372 A1 19710212 FR 7015016 A 19700424 78 15016 1 2042372 L'invention est relative aux peptides ; et elle concerne, plus particulièrement, un peptide extractible à partir de venin d'abeilles, des dérivés d'un tel peptide possédant d'intéressantes propriétés thérapeutiques, un procédé pour leur préparation, et une compo-5 sition pharmaceutique contenant de telles substances. L'invention a pour objet un docosapeptide ayant la structure (I) représentable de la manière suivante : 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 , S — S 1 1 10 Ile - Lys - ^ys - Asn- "jjCys - Lys - Arg - His - Val- Ile - Lys - j ] s — S Pro - His - Ile - 4jCys - Arg - Lys - Ile - •gCys - ffly - Lys - Asn - HH2 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 15 Au cours de la présente description, on utilise les abréviati ons normalisées de l'I.ÏÏ.P.A.C. pour les divers amino-acides qui constituent les chaînes peptidiques ; on utilise au cours de la présente description les abréviations dont les significations sont indiquées ci-dessous : 20 Arg = L-arginine His = L-histidine Lys = L-lysine Asn = L-asparagine 1 1 ^Gys =■ ~2 L-cystine Val = L-valine Gys = L-cystéine Gly = L-glycine Ile = L-isoleucine Pro = L-proline 25 Dans le peptide, le radical carboxyle en chaîne latérale sur les restes d'acide aspartique en 4 et 22 et le radical carboxyle terminal sur le reste d'acide aspartique en 22 sont amidés, et les 1 ponts disulfure liant les quatre restes -^cystine sont situés entre les restes 3 et 15 et entre les restes 5 et 19. 30 La position des ponts disulfure est confirmée par une dégrada tion sélective de la chaîne peptidique, en se servant de réactifs dont la sélectivité est connue, tout en maintenant les ponts disulfure intacts de façon telle que l'identification de fragments plus petits permette de déterminer sans ambiguïté la position des ponts 35 dans le peptide initial. Le peptide ayant la structure (I) se trouve naturellement dans le venin d'abeilles dont il peut être extrait en ayant recours, par exemple, à des méthodes chromatographiques. Selon un mode opératoire préféré, une fraction de bas poids moléculaire (en abrégé ï PM) 70 15016 a 2042372 du venin est soumise à une chromatographie avec échange d'ions et à une filtration au travers d'un gel sur un tamis moléculaire- La chromatographie avec échange d'ions est réalisable en amenant une solution tampon aqueuse contenant la fraction de bas PM en contact 5 avec une résine échangeuse de cations, par exemple un carboxyméthyl-dextranne tel que celui vendu sous la marque "CM Sephadex C25", un sulfoéthyl-dextranne tel que celui vendu sous la marque "SB Sephadex", ou une carboxyméthyl-cellulose, et en éluant le docosapeptide désiré à partir de la résine par un gradient de force ionique crois-10 - santé ou par un gradient de pH croissant• Le docosapeptide (I) est complètement basique et, quand on utilise un gradient de pH pour 1' élution, le peptide ne se dégage pas de la résine tant que le pH n' atteint pas au moins environ 9,5- Le tampon aqueux dans lequel le peptide brut est dissous avant purification est avantageusement un 15 tampon au formiate d'ammonium de concentration égale à environ 0,1 M et dont le pH est environ 4,7. On peut utiliser d'autres sels, mais le formiate d'ammonium est préféré parce qu'il est relativement facile à éliminer à partir du produit- purifié. Quand on utilise un gradient de force ionique croissante pour éluer le peptide à 20 partir de la résine, la concentration peut être échelonnée jusqu'à environ 2,0 M en utilisant un gradient de 2,5 M quand le peptide désiré se dégage à partir de la résine. Une autre purification peut s'effectuer par filtration au travers d'un gel ; de bons résultats ont été obtenus en utilisant des 25 gels de dextranne qui sont capables de fractionner des peptides ayant un poids moléculaire compris entre 1.500 et 30.000. Une telle substance est le "Sephadex G 50". Le peptide à purifier peut être dissous dans un tampon aqueux, convenablement du même type que celui utilisé dans la chromatographie avec échange d'ions, le peptide 30 désiré étant élué avec le même tampon. Le constituant principal de la fraction de bas PM obtenue à partir du venin d'abeilles est le peptide connu sous le nom de mel-litine, et quand cette fraction de bas PM est soumise à une chromatographie avec échange d'ions, la principale fraction basique qui 35 se trouve éluée est de la mellitine, et la fraction importante élu-ée ensuite est le docosapeptide désiré (I). Ce docosapeptide (I) peut ensuite être soumis à une autre purification par filtration au travers d'un gel, et le produit ainsi obtenu peut être soumis à une purification finale sur une résine échangeuse d'ions où il peut ê-40 tre traité dans des conditions analogues à celles mises en oeuvre 70 15016 3 2042372 au cours de la première opération de chromatographie avec échange d'ions- A titre de variante, la fraction de-bap-PM peut être purifiée d'abord par filtration au travers d'un gel quand le docosapeptide 5 (I) est pratiquement séparé de la mellitine, et le produit partiellement purifié dans lequel le docosapeptide (X) est la fraction principale peut alors être soumis à au moins une opération de chromatographie avec échange d'ions- Les impuretés salines présentes, qui. proviennent des solutions 10 tampons utilisées, sont éliminées de la manière classique, par exemple en faisant passer la solution sur un dextranne qui sépare le sel et en recueillant le peptide constituant le .maximum exclus- Le docosapeptide (I) peut être converti,en son dérivé du type tétra-thiol correspondant à la structure (III) suivante : 15 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 Ile - Lys - Cys - Asn - Cys - Lys - Arg - His - Val - Ile - Lys .-Pro - His - Ile - Cys - Arg - Lys - Ile - Cys - Gly - Lys - Asn - MH2 12 13 . 14 15 16 17 18 19 -20 .21. 22, par hydrogénation avec un réactif-tel qu'un dithio-érythritol ou un 20 mercapto-éthanol, qui sont connus comme convenables ?po,ur l'hydrogénation sélective-d'un pont disulfure dans-un peptide .de façon à donner le thiol correspondant- Le tétra-thiol se réoxyde très facilement et. exige d'être conservé dans une atmosphère inerte telle .que de.l'azote- Le tétra-thiol peut être réoxydé par -barbotage d' 25 air au travers d'une solution du tétra-thiol dans un-tampon aqueux quand le docosapeptide (I) initial est obtenu conjointement avec , . son isomère ayant.la structure (II) suivante : 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 I S —s —•—— 1 1 30 Ile - Lys - -^Cys-Asn - ^Cys-Lys - Arg - His - Val - Ile - Lys - -J S — S —— ~ i - ■ , I Pro - His - Ile - ^Cys-Arg - Lys - Ile - -^Cys-Gly - Lys - Asn - 12 13 14 15 16 17 18 .19 20 21 22. Ci-après est donné un exemple détaillé, bien entendu non limi-35 tatif, ayant pour but d'illustrer l'invention- La matière première est constituée par 6,1 g d'une fraction de bas PM obtenue par dialyse de 25 g de venin d'abeilles brut lyophi-. lise- Cette matière est chromatographiée sur une colonne de la ré 70 15016 4 2042372 sine de carboxyméthyl-dextranne vendue sous la marque "CM-Sephadex 025"• La résine est équilibrée à pH 4,7 avec un tampon au formiate d'ammonium 0,1 M. L'échantillon est appliqué dans ce tampon qui sert aussi à l'élution (20 ml heure"^) jusqu'à ce que l'on ait re-5 cueilli environ 1.800 ml de solution. Un premier gradient, obtenu en utilisant un tampon au formiate d'ammonium 1,25 M à pH 4,7 et un récipient mélangeur d'une capacité de 500 ml, est appliqué et maintenu jusqu'à ce que l'on ait recueilli environ 3-200 ml de solution. Un deuxième gradient obtenu comme ci-dessus, mais en utilisant un 10 tampon au formiate d'ammonium 2,5 M, est ensuite appliqué et maintenu jusqu'à cessation d'une élution, à partir de la colonne, d'une substance absorbant l'U.Y. Le peptide est élué, après que l'on a recueilli environ 4.500 ml de solution, sôus la forme d'un maximum venant à la suite de la 15 mellitine, peptide qui est le principal composant basique de la fraction basique de bas PM. Les fractions qui participent à la constitution du susdit maximum sont réunies et concentrées dans un évaporateur rotatif• Cette fraction est ensuite admise à descendre dans une colonne de 20 "G-10 Sephadex", et on recueille le maximum exclus contenant le peptide» On concentre ce maximum par évaporation dans un évaporateur rotatif, puis on la fractionne par passage dans une solution de formiate d'ammonium au travers d'une colonne constitué par du gel de dextranne "G50 super fine Sephadex"• 25 Le maximum principal est le docosapeptide (I), et à ce stade de purification il se trouve à un degré de pureté de 80 à 90 $ et contient un contaminant comme le prouve une électrophorèse dans de l'acrylamide à pH 8,0. On réalise une purification finale par chromatographie à pïï 30 4,6 dans une colonne de carboxyméthyl-dextranne "CM-Sephadex C25". Le peptide est appliqué dans un tampon de formiate d'ammonium à pH 4,6, et un gradient, en se servant d'un tampon de formiate d'ammonium 1 M à pH 4,6 et un récipient mélangeur d'une capacité de 500 ml, est appliqué et maintenu jusqu'à ce que l'on ait recueilli 500 ml 35 de solution (30 ml/heure)- Un deuxième gradient, obtenu comme ci-dessus mais en utilisant du formiate d'ammonium 2M, est appliqué jusqu'à ce que l'on ait recueilli 1.000 ml de solution, puis on applique un troisième gradient en utilisant un tampon 2,5 M. Le peptide se trouve élué après que l'on a recueilli environ 1.400 ml. 40 On concentre le maximum dans un évaporateur rotatif, puis on dessale 70 15016 5 2042372 par passage dans une colonne de "G10 Sephadex". Le maximum exclus à partir de cette colonne est concentré par évaporation dans un évaporateur rotatif, puis est lyophilisé. Une électrophorèse du peptide résultant à pH 6,0 et pH 8,0 sur 5 un gel d'acrylamide à 15 % et à pH 8,0 sur un gel d'amidon met en évidence une seule bande se déplaçant vers la cathode. La mise en oeuvre de modes opératoires classiques pour la détermination de la nature et de la succession des amino-acides constituant des chaînes peptidiques prouve que le peptide recueilli est le docosapeptide 10 (I) comportant des ponts disulfure entre les restes ^cystine occupant les positions 3 et 15 et entre les restes -^cystine occupant les positions 5 et 19. On a découvert que le docosapeptide (I) inverse l'hypothermie induite par la réserpine chez la souris quand on l'administre intra-15 péritonéalement à une dose d'environ 20 mg/kg de poids du corps ; ceci indique une activité antidépressanté potentielle- Le docosapeptide (I), son isomère (II) dans lequel les ponts disulfure sont établis entre les restes ^cystine occupant les positions 3 et 19 et les positions 5 et 15, et le composé (III) du type tétra-thiol à 20 partir duquel les deux composés à ponts disulfure apparaissent par oxydation, ont une activité anti-inflammatoire. Les peptides sont actifs quand on les administre parentéralement ou rectalement et peuvent être présentés sous la forme de compositions pharmaceutiques convenables en vue du mode d'administration désiré en utili-25 sant un diluant pharmaceutiquement acceptable- Les propriétés pharmacologiques des peptides en question sont discutées ci-après. 1. Toxicité : La DL^q du docosapeptide (I) par voie intraveineuse est d'environ 10 mg/kg chez la souris. Des animaux auxquels on 30 a administré des doses non-léthales manifestent un spectre d'activité caractérisé par une hyperactivité, des tremblements continus et des convulsions intermittentes- Cet état de choses persiste pendant quelques heures. 2. Effets sur le chat anesthésié : Une dose (voie intraveineu-35 se) de 100 jig/kg de docosapeptide (I) provoque une légère chute de la pression sanguine qui a été bloquée par la mépyramine (médicament antihistaminique). 200 jig/kg produisent une chute de pression sanguine plus importante après un blocage similaire- 3. Inversion de l'hypothermie induite par la résegpine chez la 40 souris : On administre à des souris, par voie intrapéritonéale, 70 15016 6 2042372 20 mg/kg de docosapeptide (I). Cette dose protège les animaux contre la baisse de température du corps provoquée par 25 mg/kg de ré-serpine administrés par voie sous-cutanée trois heures auparavant. La protection peut être exprimée par la diminution de la baisse, 5 voire même par l'élévation, de la température du corps des souris protégées par rapport à la baisse de la température observée sur des souris-témoins. L'effet est analogue à celui observable avec des médicaments antidépressifs du genre de l'imipramine et, à titre de comparaison, on procède similairement à l'épreuve de l'effet de 10 la nor-triptyline également avec comparaison avec des animaux-témoins» Les résultats (variations de température en °C) sont indiqués dans le Tableau ci-dessous : Temps en heures après l'injection 15 111/2221/233 1/2 Témoins ayant reçu une injection de soluté isotonique -1,3 -3,6 -4,45 -5,6 -6,0 -6,3 Peptide (I) 20 mg/kg +0,1 +1,6 +2,3 +0,3 -1,8 -1,85 Témoins -2,4 -3,4 -3,8 -4,0 -4,5 -4,9 20 Nortriptyline 20 mg/kg +0,9 +1,65 +1,8 +1,5 +1,4 +1,2 4. Effet sur l'activité spontanée chez la souris : L'administration, à des souris, de 5 mg/kg de docosapeptide (I) par voie intraveineuse provoque une diminution significative de l'activité motriœ spontanée telle qu'on peut la mesurer dans une cage "Basile" pour 25 la détermination de l'activité- A titre de comparaison, on administre une dose identique d' imipramine. Les valeurs moyennes caractérisant l'activité et mesurées sur des groupes de dix souris sont données dans le Tableau ci-après ; 30 on a indiqué pour chaque valeur 11 écart-type en plus ou en moins• 1®re demi-heure 2®me demi-heure après l'injection après l'injection Peptide (I) 5 mg/kg 831 ± 957 227 - 375 Témoins 1872 ± 688 882 ± 533 35 Imipramine 5 mg/kg 1640 ï 1404 1060 i 437 Témoins 1662 t 497 1065 ± 1122 On peut constater que le peptide ressemble aux antidépressants du genre de l'imipramine en ce qu'il inverse l'hypothermie induite 70 15016 7 2042372 par la réserpine chez la souris, mais diffère de l'imipramine par u-ne diminution du niveau d'activité spontanée chez la souris et par la production d'une baisse plutôt que d'une hausse de la pression sanguine- 5 5. Activité anti-inflammatoire : On détermine l'activité antiinflammatoire en ayant recours à la technique de l'oedème provoqué par la carrageenine sur les extrémités des membres postérieurs de rats- Des rats Wistar albinos mâles intacts pesant entre 140 et 180 g sont répartis au hasard en groupes de cinq, de sorte que cha-10 que groupe ait en moyenne le même poids du corps- On provoque une formation d'oedème dans la patte par injection d'une solution à 1 $ de carrageenine dans un soluté physiologique isotonique stérile à 0,9 f<> de î3aCl. On effectue les injections sous légère anesthésie à l'éther, et à ce moment même on injecte le peptide à essayer par 15 voie sous-cutanée dans la région du cou. On mesure le volume de la patte pléthysmographiquement avant l'injection de carrageenine et cinq heures après, ce laps de temps ayant préalablement été déterminé c.omme correspondant au maximum de la réaction. On utilise pour les calculs 1'"augmentation moyenne de 20 volume de la patte par rapport au volume de la patte n'ayant pas reçu d'injection, et pour .chaque groupe d'animaux. Les fractions peptidiques sont administrées à 1 ml/rat dans du soluté isotonique à 0,9 $ ; les animaux-témoins reçoivent 1 ml de ce même soluté isotonique sans peptide. On calcule les résultats 25 et on exprime l'activité anti-inflammatoire en diminution pour cent de l'accroissement de volume de la patte par comparaison avec les valeurs déterminées sur les animaux-témoins- Peptide Dose en mg/kg Inhibition $ Peptide (I) 0,25 22 30 Peptide (I) 0,5 41 Peptide (I) 1 ,0 51 Peptide (I) 2,0 53 Mélange de peptides (I) et (II) 1,0 52 Peptide (III) 1,0 50 35 Un échantillon de peptide (I) qui a été conservé pendant dix- huit mois est ensuite administré à la dose dë-1,0 mg/kg dans les conditions d'épreuve sus-spécifiées ; on constate ainsi qu'il produit une inhibition de 59 de l'oedème. L'activité anti-inflammatoire se trouve, perdue lorsque le pep- IS016 8 h 2042372 tide (III) est soumis à une carboxyméthylation ; elle se trouve perdue aussi lorsque le peptide (I) est trypsinisé. Gomme il va de soi, et comme il résulte d'ailleurs déjà de ce qui précède, l'invention ne se limite nullement à ceux de ses modes d'application, non plus qu'à ceux des modes de réalisation de ses diverses parties,, ayant été plus spécialement envisagés ; elle en embrasse, au contraire, toutes les variantes- 70 15016 9 2042372 Revend!c ations 1. Docosapeptide caractérisé en ce qu'il a la structure : 1 2 3 4 5 6 7 8 91011 , S —- S 1 I . i 5 He - Lys - ^Cys - Asn - ^Cys - Lys - Arg - His - Val - Ile - Lys - S — S il i Pro - His - Ile - gCys - Arg - Lys - Ile - ^Cys - Gly - Lys - Asn - 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 2. Docosapeptide caractérisé en ce qu'il a la structure : 101 2 3 4 5 6 7 8 91011 S — S 1 1 1 Ile - Lys - TfCys - Asn - -^Cys - Lys - Arg - His - Val - Ile - Lys - l S — s ï P Pro - His - Ile - ^ys - Arg - Lys - Ile - rjCys - Gly - Lys - Asn - ÏÏH2 15 12 "13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 3« Docosapeptide caractérisé en ce qu'il est un produit d'hydrogénation d'un docosapeptide selon la revendication 1 ou 2 et a la structure : 1 234 56789 10 11 20 Ile - Lys - Cys - Asn - Cys - Lys — Arg - His - Val - Ile - Lys -Pro - His - Ile - Cys - Arg - Lys - Ile — Cys - Gly - Lys - Asn - HH2 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 4. Procédé pour recueillir un peptide à partir de venin d'abeilles en soumettant le venin à une séparation chromatographique, 25 caractérisé en ce que le peptide recueilli est un.docosapeptide ayant la structure suivante : 1 23 45 678 9 1011 i S — S 1 1 Ile - Lys - ^Cys - Asn- -pCys - Lys - Arg - His - Val- Ile - Lys - 30 j i S — S Pro - His - Ile - -^Oys - Arg - Lys - Ile - ^Cys - Gly - Lys - Asn - KH2 12 1 3 1 4 1 5 1 6 1 7 1 8 1 9 20 21 22 5- Procédé selon la revendication 4, caractérisé en ce que 1' COPY 70 15016 10 2042372 on soumet une fraction de bas poids moléculaire, obtenue par dialyse de venin d'abeilles brut lyophilisé, à une chromatographie avec échange d'ions et à une filtration au travers d'un gel. 6. Procédé selon la revendication 5, caractérisé en ce que 1' 5 on met en contact une solution de ladite fraction de bas poids moléculaire, dans un tampon aqueux, avec une résine échangeuse de cations, et on élue le docosapeptide désiré à partir de la résine par un gradient de force ionique croissante ou par un gradient de pH croissant* 10 7- Procédé selon la revendication 6, caractérisé en ce que 1' on amène une solution de ladite fraction de bas poids moléculaire, dans un tampon aqueux au formiate d'ammonium, au contact d'une résine de carboxyméthyl-dextranne et on élue le docosapeptide désiré par un gradient de force ionique croissante atteignant jusqu'à envi-1 5 ron 2,5 M. 8. Procédé selon l'une quelconque des revendications 5 à 7, caractérisé en ce que, avant ou après une chromatographie avec é-change d'ions, une solution dans un tampon aqueux contenant le docosapeptide désiré est mise en contact avec un gel de dextranne capa-20 ble de fractionner des peptides ayant un poids moléculaire compris entre 1.500 et 30.000, et on élue le docosapeptide désiré à partir du gel avec le même tampon. 9« Procédé pour la production d'un docosapeptide tel que défini dans la reweniication 3, lequel procédé est caractérisé en ce 25 qu'il consiste essentiellement à hydrogéner un docosapeptide tel que spécifié dans la revendication 1 avec un réactif connu comme propre à réaliser 1'hydrogénation sélective d'un pont disulfure dans un peptide pour donner le dith'iol correspondant. 10. Procédé pour la production d'un docosapeptide tel que dé-30 fini dans la revendication 2, lequel procédé est caractérisé en ce qu'il consiste essentiellement à oxyder un docosapeptide tel que spécifié dans la revendication 3 avec un réactif connu comme propre à réaliser l'oxydation sélective des deux radicaux thiol convenablement situés sur une chaîne peptidique pour donner un pont disul-35 fure. 11. Composition pharmaceutique comprenant un peptide et un véhicule pharmaceutiquement acceptable, caractérisée en ce que le peptide est une substance selon l'une quelconque des revendications 1 à 3.