FR 2026572 A1 19700918 FR 6943974 A 19691218 69 43974 1 2026572 Le dosage du glucose dans l'urine constitue à l'heure actuelle le meilleur moyen pratique dont dispose le praticien ainsi que le malade souffrant de diabète pour estimer et contrôler l'absorption des sucres, l'efficacité des médicaments anti-diabétiques et 5 l'état général d'une personne souffrant de diabètes mellitus. Pour être efficaces, ces dosages de sucre doivent être simples, rapides et susceptibles d'une exécution journalière par du personnel non spécialisé, et les résultats devant être d'une précision quantitative raisonnablement suffisante sur un intervalle de concentrations 10 pathologiques de glucose dans l'urine. Outre les essais cliniques, il existe un besoin dans l'industrie, et surtout dans les industries de traitement de denrées alimentaires et.de breuvages, d'un essai de détermination du glucose ou des sucres réducteurs, qui doit posséder les caractéristi-15 ques indiquées. Par exemple, une détermination quantitative des sucres dans le vin peut servir de moyen pour estimer le caractère plus ou moins "sec" du vin. la disparition ou l'absence de sucres réducteurs dans la bière peut permettre de déterminer la progression ou l'achèvement du processus de fermentation. Un autre exemple 20 de la nécessité d'un essai rapide et quantitatif pour les sucres est celui de l'industrie de.traitement des pommes de terre frites dites "chips", ou une trop forte proportion de sucre dans les pommes de terre crues donne des "chips" calcinés ou brunis. Les procédés connus pour détecter les sucres réducteurs dans 25 l'urine étaient basés sur le principe du chauffage d'un mélange de proportions aliquotes mesurées d'urine et d'une solution alca- ' line de cuivre (par exemple la solution de Benedict, Fehling ou de F0lin-McElroy) ou d'une solution alcaline de bismuth (par exemple la solution de Nylander ou d'Aiment). Dans les estimations quali-30 tatives, la précipitation de l'oxyde cuivreux à partir du composé cuivrique, ou la réduction de l'ion bismuth en bismuth métallique noir, indique la présence d'un hydrate de carbone réducteur. Dans les dosages quantitatifs des sucres dans l'urine, le procédé le plus courant qu'on utilisait jusqu'à maintenant était 35 celui de Benedict (Journal of the American Médical Association, Vol.57, Page 1193, 1911). Ce procédé consiste à ajouter des quantités dosées d'urine à une proportion aliquote d'une solution normalisée, tout en faisant bouillir cette dernière, jusqu'à une 69 43974 2 2026572 décoloration complète du composé cuivrique bleu contenu dans cette solution, pour former du thiocyanate cuivreux. On détermine par calcul le pourcentage de la substance réductrice dans l'urine. Dans le brevet des Etats-Unis d'Amérique NS 1.769.862 on a 5 décrit un procédé de détermination quantitative du sucre dans l'urine, procédé selon lequel (a) on mélange des proportions aliquotes mesurées d'une solution spéciale modifiée de Benedict contenant de la créatinine et un colloïde hydrophile avec une proportion aliquote mesurée d'urine ; (b) on chauffe le mélange 10 dans de l'eau bouillante pendant cinq minutes ; (c) si l'on constate un changement de la couleur bleue initiale, on compare la solution avec une gamme de couleurs et on estime le pourcentage correspondant de sucre. Tous les procédés mentionnés jusqu'à maintenant présentent un 15 inconvénient important. En effet, ils exigent l'utilisation d'une source extérieure de chaleur. On résout cet inconvénient par le procédé qui fait l'objet du brevet des Etats-Unis d'Amérique republié ne 23.705, dans lequel on décrit l'utilisation d'un comprimé dè composition de dosage contenant un sel cuivrique, une 20 substance acide et un excès d'une substance alcaline de telle sorte que lorsqu'on introduit le comprime dans un fluide aqueux renfermant des sucres réducteurs, la réaction exothermique de neutralisation entre l'acide et la base crée une chaleur suffisante pour permettre la réduction du sel cuivrique en oxyde cuivreux. 25 Bien entendu, on effectue cette opération sans apport extérieur de chaleur. De plus, la matière alcaline est présente en excès par rapport à la quantité requise pour la réaction de neutralisation, de sorte que la réduction du sel cuivrique peut se dérouler dans un environnement à pH alcalin. 30 Depuis des années, on a, constaté que l'utilisation d'un tel procédé avec des comprimés dans des fluides contenant certains ingrédients porogènes ou de gélification aboutit fréquemment aux inconvénients suivants concernant les conditions de réaction de l'essai. 35 1 . La durée d'ébullition (de chauffage) du fluide peut être augmentée jusqu'à cinq fois la durée normalement requise. 2. Le mélange de réaction risque de soulever le comprimé et le sortir au moins partiellement de la solution, de sorte que le 69 43974 5 2026572 mélange d'essai ne sera pas chauffé suffisamment « 3. Les altérations de couleur peuvent être dissimulées au point de ne pas rendre facilement visible le point final. 4. La réaction risque de se dérouler dans des conditions 5 n'aboutissant pas à une dissipation correcte de la chaleur, si bien que les résultats sont erronés. 5. Certains constituants pathologiques dans le fluide à doser, et particulièrement dans l'urine, peuvent être coagulés par la réaction exothermique et aboutir à une suspension de couleur irré- 10 gulière, dont la lecture devient alors difficile. On a éliminé certaines des réactions fâcheuses précitées lors des dosages du glucose dans l'urine en ajoutant à cette urine certaines substances telles que l'alcool caprylique. Cependant, ces additions ont été effectuées sous la forme d'un stade ultérieur 15 après le début du processus d'essai, et les substances préconisées étaient toujours des liquides ou des solutions, ce qui exigeait l'emploi d'appareils supplémentaires de dosage et de distribution, l'utilisation d'autres solutions réactives, etc. L'invention a donc pour but de fournir une composition uni-20 taire d'essai du type mentionné qui procure des résultats uniformes indépendamment de la présence de constituants autres que des sucres réducteurs dans le fluide à contrôler. L'invention a également pour but d'éliminer les conditions adverses de réaction qui ont été indiquées plus haut. 25 On a maintenant découvert qu'une composition unitaire d'essai pour détecter la présence de sucres réducteurs dans des fluides aqueux contenant des ingrédients qui ont occasionné jusqu'à présent les conditions fâcheuses de réaction indiquées plus haut, est caractérisée en ce qu'elle comprend (a) un sel cuivrique, 30 (b) une matière acide, (c) une matière alcaline ou un mélange de matières alcalines et (d) un agent surfactif qui tend à former une pellicule monomoléculaire sensiblement continue à l'interface liquide-vapeur du fluide soumis à l'essai, ledit agent surfactif étant présent de façon uniforme dans la composition d'essai sur un 35 support particulaire solide pour ce surfactif. La base de tous les systèmes d'essai contenant des ions cui-vriques alcalins et qu'on utilisait jusqu'à maintenant était (a) un sel cuivrique, par exemple le sulfate cuivrique, (b) une 69 43974 r 4 2026572 substance à réaction alcaline telle que le carbonate de sodium et/ou l'hydroxyde de potassium et (c) un sel capable de maintenir l'hydroxyde cuivrique en solution. Fehling (Aimalen, Vol. 72, Page 106, de 1849) utilisait des tartrates normaux de métaux 5 alcalins (sels de Seignette), alors que Benedict (J. Biol. Chem. Vol. 3, Page 101, de 1907) utilisait des citrates normaux de métaux alcalins et Folin-McEllroy (J. Biol. Ohem. Vol. 33» Page 513, de 1918) utilisait des phosphates normaux de métaux alcalins. 0n peut obtenir des compositions stables d'essai ayant une 10 excellente spécificité pour réduire les hydrates de carbone et pour accomplir les buts de l'invention en préparant des mélanges solides secs contenant les ingrédients suivants dans les proportions correctes : a) Un sel cuivrique hydrosoluble ; 15 b) une substance alcaline solide qui est un oxyde ou un hydroxyde d'un métal alcalin ; c) un acide solide ou un sel solide à réaction acide capable de former un complexe hydrosoluble avec les ions cuivriques en solution alcaline, ces ingrédients pouvant être l'acide citrique, 20 l'acide tartrique, ou un sel acide d'un métal alcalin de l'acide citrique ; et d) un surfactif (décrit plus loin) et un support particulaire solide pour ce surfactif. Pour faciliter l'utilisation du produit, on préfère que les 25 mélanges secs soient comprimés de sorte que chaque comprimé est suffisant pour effectuer une détermination analytique. Quand on mélange une telle composition, sous forme de poudre ou d'un comprimé, avec un petit échantillon aqueux tel qu'un échantillon d'urine, les comprimés se dissolvent rapidement en dégageant une 30 forte quantité de chaleur. Il peut également être recommandé de diluer la solution d'essai avec de l'eau. En l'absence d'un hydrate de carbone réducteur, on obtient une solution bleu clair. Au contraire, en présence d'un sucre réducteur, il se forme un précipité vert, jaune ou rouge brunâtre d'oxyde cuivreux précipité et qui est 35 maintenu en suspension par la solution alcaline fortement concentrée. Pour déterminer quantitativement la quantité de l'hydrate de carbone réducteur présente dans l'échantillon, on peut comparer la couleur de la suspension avec certaines feuilles d'une gamme de 69 43974 5 2026572 couleurs normalisées correspondant à des concentrations connues de glucose (ou d'un autre hydrate de carbone réducteur) dans l'urine (ou dans un autre échantillon soumis à l'essai). Selon la loi de Beer, sur laquelle repose toute la technique 5 de colorimétrie, l'intensité de la couleur observée du précipité est directement proportionnelle à la concentration de la substance colorée (c'est-à-dire l'oxyde cuivreux). Comme cependant la concentration de- l'oxyde cuivreux est également directement proportionnelle à la concentration des hydrates de carbone réducteurs 10 qui étaient initialement présents dans l'échantillon, la couleur observée est elle-même directement proportionnelle à la concentration de la substance réductrice. les surfactifs que l'on utilise dans la présente composition sont des produits qui, quand on les mélange avec la composition 15 d'essai et on les introduit dans le fluide soumis à l'essai, tendent à former des pellicules monomoléculaires pratiquement non élastiques à l'interface liquide-vapeur du fluide dont on désire doser les sucres réducteurs. Parmi les matières de ce type, on citera notamment les diamides ou polyamides d'un poids moléculaire 20 élevé de composés tels que des diamines ou des polyamines alipha-tiques et aromatiques inférieures, l'huile de ricin, les huiles végétales polaires, les esters et les éthers polyéthénoxyliques, les polyglycols, les sulfonamides et disulfonamides d'un poids moléculaire élevé, les imidazolines d'un poids moléculaire élevé, 25 les huiles siliconiques, les alcools gras d'un poids moléculaire moyen, les phosphates inférieurs tels que le phosphate de tributyle, la cire d'abeille, les éthers cellulosiques et la cire microcristalline. On remarquera que certains de ces surfactifs sont des -corps solides à la température ambiante et, pour permettre de les 30 utiliser de la façon décrite ci-après, on doit les dissoudre dans un solvant organique convenable. On a découvert de façon étonnante, que bien que ces matières puissent être utilisées isolément sous la forme d'un additif ultérieurement introduit dans le composé d'essai, il est indispensable 35 pour les incorporer directement dans une composition de titrage d'utiliser à la fois un véhicule ou support et le surfactif. les véhicules sont des substances solides inertes sur ou dans lesquelles le surfactif peut être dispersé ou mélangé dans des conditions 69 43974 b 2026572 uniformes. Parmi les véhicules ou supports convenables, on citera les silicates de sodium et d'aluminium, la terre d'infusoires, la poudre de talc, le bioxyde de titane et le kaolin. On préfère les silicates et par exemple les silicates de sodium, de magnésium et 5 d'aluminium ou des mélanges de. tels silicates. Les surfactifs sont incorporés dans le véhicule avant le mélange avec la composition de titrage et pour cela il suffit de broyer les ingrédients ensemble dans un mortier, un homogénéisa-teur ou un autre dispositif mélangeur d'ingrédients. Sj_ le surfac-10 tif est un liquide ou une huile, on peut le dissoudre dans un solvant, l'ajouter au véhicule inerte et évaporer le solvant pour laisser une dispersion régulière du surfactif sur ou dans le véhicule. Si l'on considère maintenant les concentrations des surfactifs 15 et des véhicules éventuels, on a pu constater que ces concentrations sont très variables et dépendent principalement du type et de l'activité du surfactif choisi. D'une façon générale, on utilise environ 0,01 à 1 ,0 fo en poids environ de surfactif dans une composition de titrage et on peut régler le rapport entre le surfac-20 tif et le véhicule de manière à obtenir le maximum de surfactif par unité de poids du véhicule et conserver néanmoins une poudre à écoulement libre. D'une façon générale, le rapport entre le surfactif et le véhicule peut être compris entre 1:60 et 0,6:1. Eventuellement, on peut incorporer des diluants, des exci-25 pients et des agents accessoires ou auxiliaires dans des compositions sèches. On peut ajouter une faible proportion d'un bicarbonate ou carbonate d'un métal alcalin (par exemple du bicarbonate ou du carbonate de sodium). Quand on incorpore la composition sèche contenant une telle matière dans l'échantillon liquide à titrer, 30 l'acide solide ou le sel à réaction acide vient réagir avec le bicarbonate ou le carbonate de métal alcalin, avec dégagement d'anhydride carbonique gazeux. L'effervescence ainsi produite sert à accélérer la désagrégation mécanique de la composition, surtout si cette dernière est sous forme d'un comprimé. La réaction se 35 trouve ainsi accélérée et la détermination se fait plus rapidement. Etant donné que le dégagement total de la chaleur se produit ainsi dans un laps de temps plus court, on réduit la perte de chaleur par rayonnement, conduction et évaporation, et on réussit à 69 43974 7 2026572 détecter des traces d'hydrates de carbone rédacteurs qui auraient passé inaperçues dans d'autres conditions. On peut utiliser un dessiccant comme le chlorure de calcium, un diluant et un excipient sans influer fâcheusement sur la sensi-5 bilité et la spécificité des compositions. On peut incorporer des agents auxiliaires comme la créatinine et les colloïdes hydrophiles, dont la présence dans la solution de titrage est recommandée par Sheftel, pour empêcher la formation de la forme rouge de l'oxyde cuivreux. 10 Parmi les ingrédients appartenant au groupe (a) ci-dessus (c'est-à-dire les sels cuivriques hydrosolubles) que l'on peut utiliser pour préparer les compositions selon l'invention, on citera le sulfate, le chlorure et l'acétate cuivrique. Parmi les ingrédients du groupe (b), c'est-à-dire les oxydes 15 et les hydroxydes de métaux alcalins, que l'on peut utiliser dans les compositions de titrage, on mentionnera l'hydroxyde de sodium et l'hydroxyde de potassium. Parmi les ingrédients du groupe (c), c'est-à-dire les acides solides et les sels solides à réaction acide qui forment des com-20 plexes hydrosolubles avec les ions cuivriques dans la solution alcaline, que l'on peut utiliser pour préparer les compositions de titrage, on mentionnera l'acide citrique (mono-hydraté) et l'acide tartrique. En raison de l'hygroscopicité des compositions selon l'inven-25 tion, il est souhaitable, mais absolument pas obligatoire, d'employer les réactifs anhydres au lieu des produits hydratés correspondants. Ainsi, le sulfate cuivrique anhydre donne des compositions plus stables que ne le fait ce même sulfate hydraté et cette meilleure stabilité apparaît avec tous les ingrédients possédant 30 deux formes, c'est-à-dire un état à forte teneur en eau et un état à faible teneur (ou même à teneur nulle) en eau. Toutefois, si un produit hydraté ne manifeste pas de tendance à la déliquescence à la température rencontrée en utilisation sur les lieux où on se propose de l'employer, on peut choisir cette forme pour préparer 35 les produits selon l'invention. La chaleur dégagée pendant la réaction des compositions selon l'invention avec l'urine ou un échantillon analogue est due principalement à deux réactions exothermiques. La première de ces 69 43974 8 2026572 réactions est la chaleur de la mise en solution de l'oxyde ou de l'hydroxyde de métal alcalin dans le fluide aqueux ; la seconde chaleur étant celle de neutralisation de l'acide solide ou du sel à réaction acide avec l'hydroxyde de métal alcalin. La chaleur 5 dégagée suffit pour réduire le complexe cuivrique en oxyde cuivreux, qui forme un précipité ayant la couleur caractéristique. On peut également utiliser des compositions sèches pour la détection qualitative et l'estimation quantitative des hydrates de carbone réducteurs autres que le glucose. C'est ainsi qu'on peut 10 les utiliser pour détecter la pentosurie, pour estimer le dosage de galactose dans l'urine pendant un essai de tolérance à la galactose de la fonction hépatique ou de l'hyperthyroïdisme, ou encore le dosage ,de lactose dans le lait. Dans le présent mémoire, les expressions "détection" et 15 "détecter" désignent aussi bien les estimations qualitatives que quantitatives des sucres réducteurs dans les fluides soumis à 1'essai. Les exemples suivants servent à illustrer l'invention sans aucunement en limiter la portée. 20 EXEMPLE 1 Préparation d1 une composition de réactif de titrage On prépare une composition de base de la composition de titrage à l'aide des ingrédients suivants, dont les quantités sont indiquées pour un élément d'essai unitaire : 25 Sulfate de cuivre 19,35 mg Hydroxyde de sodium 232,5 mg Acide citrique 200,0 mg Carbonate de sodium 80,0 mg On prépare un second mélange en ajoutant 15,0 ml d'alcool 30 n-octylique à 20,0 g de silicate de sodium dans un mortier et en broyant avec un pilon jusqu'à une dispersion régulière de l'alcool dans ou sur le silicate. On obtient un mélange particulaire fin d'un surfactif avec son véhicule. On ajoute le second mélange à la composition de base et on les mélange intimement, le rapport pon-35 déral étant de 1 mg du second mélange par unité (532 mg) du mélange de base. Avec ce mélange on prépare des comprimés dont chacun contient une quantité unitaire du produit de titrage. On prépare d'autres mélanges d'alcool n-octylique avec du silicate de sodium et 69 43974 9 2026572 on les ajoute à la composition de base en une proportion comprise entre 0,25 et 3 mg environ par unité de composition de base. On constate que la proportion optimale se situe entre 0,3 et 1 , 5 mg du second mélange par unité de la composition de base# 5 EXEMPLE 2 On procède comme dans l'exemple 1 sauf qu'on remplace l'alcool n-octylique par une huile siliconique (diméthyl-polysiloxane ayant une viscosité égale à environ 60.000 es à 25fiC environ). On constate que la concentration optimale de ce mélange huile siliconique/ 10 silicate de sodium est comprise entre 0,5 et 10 mg par unité de la composition de base. EXEMPLE 3 On procède comme dans l'exemple 1, sauf qu'on remplace le silicate de sodium par de la poudre de talc. 15 EXEMPLE 4 Comparaison des compositions de titrage selon l'invention avec les compositions de la technique antérieure Dans chacun de deux petits tubes d'essai appelés P 1 et 2, on verse 2 gouttes d'urine contenant 300 mg $ de protéine ajoutée (al-20 bumine de sérum bovin) et 1 9^ de glucose ajouté ainsi que 10 gouttes d'eau distillée. On ajoute également à un troisième tube d'essai appelé h2 3 deux gouttes du même échantillon d'urine mais sans protéine ajoutée et 10 gouttes d'eau distillée. On introduit un comprimé préparé de la façon décrite dans l'exemple 1 dans le tube 25 N2 1 et on ajoute dans chacun des tubes P 2 et 3 un comprimé préparé comme dans l'exemple 1 mais en l'absence de 1 mg de surfactif et de véhicule. Les durées d'ébullition pour les tubes 1 et 3 sont sensiblement les mêmes (environ 20 secondes) alors que le tube n2 2 a une durée d'ébullition de 55 secondes plus longue (75 secondes au 30 total). Le comprimé dans le tube N2 2 tend à se soulever hors du tube alors que l'ébullition dans les tubes P 1 et 3 se déroule de façon régulière et réglée. Ainsi, l'utilisation d'un agent surfactif dans un système de réaction de titrage contenant un constituant pathologique (protéine) permet une durée d'ébullition normale, alors 35 qu'en l'absence du surfactif le temps d'ébullition est de trois à quatre fois plus long que le temps normal. Il va de soi que la présente invention n'a été décrite qu'à titre explicatif, mais nullement limitatif, et qu'elle est susceptible de diverses variantes sans sortir de son cadre. 69 43974 10 2026572 revendications 1. Composition d'essai sous • forme solide sèche pour détecter des sucres réducteurs dans une solution aqueuse, ladite composition utilisant un mélange d'un sel cuivrique solide hydrosoluble, 5 une matière acide solide et une certaine quantité d'une matière alcaline solide supérieure à celle qui est nécessaire pour neutraliser la matière acide et en une proportion adéquate pour dégager pendant la neutralisation suffisamment de chaleur pour convertir le sel cuivrique en oxyde cuivreux par l'action de tout sucre réduc-10 teur présent, caractérisée en ce qu'elle contient également un surfactif qui tend à former une pellicule non-élastique sensiblement monomoléculaire à l'interface liquide-vapeur du fluide que l'on soumet à l'essai pour les sucres réducteurs et un véhicule solide pour ledit surfactif.' 15 2. Composition selon la revendication 1, caractérisée en ce que la matière alcaline est un hydroxyde d'un métal alcalin. 3- Composition selon la revendication 1, caractérisée en ce que la matière alcaline est un mélange d'un hydroxyde de métal alcalin et d'un carbonate d'un métal alcalin. 20 4. Composition selon la revendication 1, caractérisée en ce que la matière acide est l'acide citrique ou l'acide tartrique. 5- Composition selon la revendication 1, caractérisée en ce que le sel cuivrique est le sulfate cuivrique. 6. Composition selon la revendication 1, caractérisée en ce 25 que le surfactif est choisi dans les groupes comprenant des diami-des et des polyamides d'un poids moléculaire élevé, l'huile de ricin, les huiles végétales polaires, les esters et les éthers polyé-thénoxyliques, les polyglycols, les sulfonamides et les disulfona-mides d'un poids moléculaire élevé, les imidazolines d'un poids mo-30 léculaire élevé, les huiles de silicones, les alcools gras d'un poids moléculaire moyen, les phosphates inférieurs, la cire d'abeille, les éthers cellulosiques et la cire microcristalline. 7• Composition selon la revendication 1 , caractérisée en ce que le véhicule solide est choisi dans le groupe comprenant le si- 35 licate de sodium, le silicate d'aluminium, la terre d'infusoires, la poudre de talc, le bioxyde de titane et le kaolin. 8. Composition selon la revendication 1, caractérisé en ce que le surfactif est l'alcool n-octylique et le véhicule est le silicate de sodium.