FR 2035818 A1 19701224 FR 6939951 A 19691120 69 39951 i- 2035818 La présente invention a pour objet un procédé d'extraction d'insuline de glandes pancréatiques à l'aide dTun solvant d'insuline acidifié, procédé selon lequel on extrait le pancréas à l'aide d'un solvant acidifié au moyen d'acide sulfurique, de préfé-5 rence à un pH compris entre environ 2,4 et 5,2» puis on ajoute au mélange d'extraction de l'acide chlorhydrique, de préférence jusqu'à l'établissement d'un pH d'environ 2,0, et l'on continue l'extraction. Oh obtient de cette manière un extrait d'une teneur élevée en protéines que l'on peut néanmoins séparer aisément du rési-10 du tissulaire sous forme d'un liquide limpide, et on peut essorer en très peu de temps le précipité de protéines inactives formé par ajustement du pH de l'extrait à environ S. Pour l'extraction de glande? pancréatiques en vue de l'obtention d'insuline, on utilise dans la majorité des cas un solvant organi-15 que aqueux acidifié, ce solvant étant le plus souvent l'éthanol. Compte tenu de l'eau que ces glandes contiennent, la concentration d'alcool appliquée est habituellement comprise entre 50 et 80 fo en volume. Les valeurs de pH se situent habituellement dans la plage de 2 à 5, la durée de l'extraction étant d'environ 2 ou 3 heures. 20 Des acides tant organiques qu'inorganiques sont utilisables comme acide. La plupart de ceux-là présentent l'inconvénient que pour atteindre un pH faible, par exemple de 2, il faut mettre en oeuvre des quantités élevées, ce qui est peu économique. Cet inconvénient grève aussi les acides inorganiques moins forts. Les acides dont 25 l'utilisation est classique sont l'acide chlorhydrique, l'acide sulfurique et l'acide phosphorique. Avant l'extraction, les glandes congelées sont broyées ou coupées en petits morceaux, puis on les met en suspension, en agitant, dans à peu près deux fois leur volume d'alcool dilué acidifié 30 d'une telle concentration que la concentration finale du mélange d.1 extraction se trouve comprise entre 60 et 70 fo en volume. Le pH est ensuite habituellement ajusté à 2 ou à 3 à l'aide d'un acide approprié, après quoi la suspension est agitée à environ 10°C pendant 1 à 3 heures. Pour séparer l'extrait du tissu résiduaire, on 35 centrifuge, que ce soit ou non après addition d'un auxiliaire de filtration, la masse *obtenue jusqu'à ce que l'extrait soit aussi limpide que possible. Puisque cela équivaut à une durée de centri-fugation très longue et est par conséquent peu économique, on s'accommode ra dans la pratique, en traitant des extraits très diffici-40 les à centrifuger, d'une durée de centrifugation plus courte. En 69 39951 2 2035818 conséquence, l'extrait acide contiendra en général encore des restes de tissu finement divisé et des matières visqueuses. Il existe pour cette raison un besoin d'un procédé d'extraction fournissant un extrait très limpide après une centrifugation de courte durée. 5 Le résidu tissulaire centrifugé est habituellement aussi soumis à quelques centrifugations supplémentaires. On ajuste le pH de l'extrait obtenu à 8 ou à une valeur voisine à l'aide d'ammoniaque concentrée afin de former un précipité volumineux de protéines inactives et de résidus de tissu finement divisé. Ce précipité est 10 essoré après addition d'un auxiliaire de filtration. On a tendance à raccourcir autant que possible ce traitement au pH indiqué, premièrement afin de restreindre l'action sur l'insuline extraite de toute action enzymatique résiduaire susceptible de se produire dans des conditions défavorables, deuxièmement afin d'empêcher 15 autant que possible une réduction de l'insuline à ce pH par des groupes thiol actifs présents dans l'extrait et le précipité. La durée de la filtration étant déterminée par la filtrabilité du précipité, tant l'aptitude de l'extrait à la centrifugation que la filtrabilité du précipité à pH 8, sur laquelle l'aptitude à la 20 centrifugation a une influence, trouvent leur expression dans cette durée de la filtration. Le filtrat limpide obtenu est ajusté aussi vite que possible à un pH d'environ 3 et évaporé sous vide à environ l/5 de son volume. La graisse est éliminée du résidu, puis le résidu est filtré et la 25 protéine qu'il contient floculée par addition de 28 kg de chlorure de sodium par 100 1 de filtrat. L'insuline brute ainsi obtenue est ensuite purifiée davantage. Lors de la recherche d'un procédé d'extraction perfectionné ne provoquant aucune difficulté pour le traitement des glandes pancré-30 atiques, on ne doit pas perdre de vue le fait que la quantité de protéines extraite à l'aide du nouveau procédé ne doit pas diminuer appréciablement. L'expérience a en effet montré qu'une diminution appréciable du rendement en protéine est suivie d'une baisse du rendement en insuline. A ce propos, la Demanderesse a étudié 35 quelques acides quant à leur pouvoir d'extraction de protéine à l'aide du procédé d'extraction ci-dessus décrit. Du pancréas de porc a été extrait à l'aide de 2 fois son volume d'éthanol dont f jLBâJ.6 la concentration/a eté de 60 fo èn volume (durée d'extraction : 90 minutes à 8°C). L'extrait a été centrifugé pendant 10 minutes 40 à 1000 g. Après relargage à l'aide de solution saline à 28 fo, 69 39951 3 2035818 puis à 10 fot les quantités totales de protéine obtenue ont été comparées entre elles au moyen de la détermination du biuret. Le Tableau I montre le résultat de cet essai. Tableau I Acide ajouté HC104 H2S04 HC1 pH d'extraction 2,8 2,0 2,0 2,0 Volume du précipité en tfg de l'extrait brut 24,5 non fil-trable 12,5 31,6 Indice de biuret par kg de pancréas 47,17 23,40 63,55 Idem en fo d'extrait chlorhydrique 74 37 100 10 25 15 20 30 35 40 Ces données montrent que HC1 alcoolique extrait le plus de protéine. Le volume du précipité à filtrer est cependant très important, ce qui exige des durées de filtration très longues. H paraît en outre que HgSO^ alcoolique fournit un extrait dont le traitement est le plus facile, mais cet agent d'extraction a un pouvoir insuffisant d'extraction de protéine. Or on a trouvé un procédé d'extraction d'insuline de glandes pancréatiques à l'aide d'un solvant d'insuline acidifié, procédé caractérisé par le fait que l'on extrait d'abord le pancréas pendant un certain temps au solvant acidifié à l'aide d'acide sulfurique, on ajoute ensuite de l'acide chlorhydrique et l'on poursuit l'extraction du pancréas afin d'obtenir un mélange d'extraction susceptible d'être facilement centrifugé, après quoi on essore en très peu de temps le précipité qui se forme à un pH d'environ 8. H s'est également avéré que la quantité de protéine obtenue à l'aide de ce procédé d'extraction est comparable au rendement atteint par extraction à l'aide d'un alcool aliphatique inférieur acidifié au moyen d'acide chlorhydrique. Le solvant organique préféré pour l'insuline est l'éthanol. Les glandes pancréatiques à extraire peuvent provenir de n'importe quelle source, par exemple de gros bestiaux, de porcs, de baleines et de poissons. L'effet désiré est déjà perceptible après abaissement du pH du mélange d'extraction à 5,2 à l'aide d'acide sulfurique et 15 mn d'incubation du mélange suivies de 60 mn d'extraction consécutive à l'addition d'acide chlorhydrique. La durée de la filtration est alors rédxiite à moins de la moitié en compa- 69 39951 203581Ô raison avec celle de l'extrait à l'aide du seul acide- chlorhydrique. Si l'on extrait d'abord pendant 60 mn à l'aide d'acide chlorhydrique et ensuite à l'aide d'acide sulfurique, la durée totale d'extraction étant par ailleurs égale, il ne faut pas songer à 5 s'attendre à une meilleure aptitude des glandes au traitement. L'extraction à l'aide d'acide sulfurique s'effectue de préférence à un pH compris entre 2,4 et 5;2. Si l'on abaisse le pH d'extraction à l'aide d'acide sulfurique à 3,0, la durée d'extraction étant par ailleurs égale, la durée de la filtration à pH 8 est 10 réduite à l/5 de celle nécessaire après extraction à l'aide d'acide sulfurique à pH 5,2. Lors de la comparaison des durées de filtration du précipité obtenu à pH 8 après extraction par exemple de 100 g de pancréas de porc à ljaide de HgSO^ alcoolique d'une part et de HC1 alcoo-15 lique de l'autre, il s'avère que la première de ces extractions donne des durées de filtration très courtes, par exemple de 25 et de 60 s, tandis que la deuxième donne des durées de filtration d'environ 6 heures. Or on a également découvert que la durée de la filtration à 20 pH 8 après extraction selon la présente invention peut être encore appréciablement raccourcie, à savoir à des temps aussi courts que ceux après extraction à l'aide du seul acide sulfurique, par une prolongation de la durée de l'extraction à l'aide d'acide Sulfurique d'environ 15 à environ 30 mn et davantage. On préfère pour 25 cette raison effectuer l'extrâction à l'aide d'acide sulfurique pendant un laps de temps de 30 mn ou plus. La filtration du précipité obtenu par élévation du pH de l'extrait pancréatique centrifugé à environ 8 a été discutée ci-dessus. Selon quelques procédés, on élève le pH à une autre valeur de la 30 région allant d'environ 5 à 9; dans ce cas, l'application de la présente invention offre'également de grands avantages car l'amélioration appréciable de l'aptitude du mélange d'extraction acide à la centrifugation réduit fortement la durée de la filtration. On peut penser à soumettre le résidu du pancréas séparé de 35 l'extrait par centrifugation à une deuxième et peut-être à une troisième extraction. Il peut être avantageux d'effectuer au moins la deuxième extraction également selon le procédé de l'invention. Il est un fait bien connu que la centrifugation et la filtration d'extraits subséquents de la même matière de départ ne comportent 40 pas de problèmes aussi difficiles que celles des extraits précé 69 39951 5 2035818 dents. Les exemples ci-après illustrent en détail 1*invention. Les essais,dont ces exemples font mention,ont été effectués principalement à l'aide de pancréas de porc. On soulignera le fait que le 5 traitement de pancréas de porc est habituellement plus difficile que par exemple le traitement de pancréas de gros.bestiaux selon les procédés d'extraction classiques, à cause, entre autres, de leur teneur plus élevée en graisse. Exemple 1 10 Des portions de 200 g d'une quantité de pancréas de porc broyé et homogénéisé à fond sont mises en suspension dans 400 ml d'étha-nol à 81 fo en volume. On ajoute au mélange d'extraction l'acide mentionné dans le tableau ci-après jusqu'à l'établissement du pH indiqué. Sauf dans le premier essai, le pH est réduit à 2 après 15 la durée d'extraction indiquée. Pendant l'extraction, on maintient la température à 10°C. Quand le mélange a été extrait pendant au total 75 mn, on y ajoute 5 g d'auxiliaire de filtration. Puis le mélange est centrifugé pendant 10 mn, à environ 1000 g. Le pH de l'extrait est- ensuite ajusté à 8 à l'aide d'ammoniaque et le jjrecj-20. obtenu filtré par du papier-filtre (0 9 cm) à l'aide de 5 g d'auxiliaire de filtration. Puis on ajuste à 3 le pH du filtrat que l'on évapore à l/5 de son volume. On élimine la graisse du résidu d'évaporation, que l'on filtre. La protéine est précipitée par addition de 28 fo de NaCl. Le précipité est filtré, dissous et 25 précipité de nouveau par 10 fo de NaCl. La précipité est recueilli et dissous. On compare finalement les teneurs en protéine des solutions obtenues entre elles. (Voir tableau page 6). Cet exemple montre nettement l'influence favorable de l'extraction à l'aide d'acide sulfurique suivie d'extraction à l'aide 30 d'acide chlorhydrique sur l'aptitude de l'extrait à la centrifugation et la durée de la filtration à pH 8. Le rendement en protéine atteint selon le procédé de l'invention est égal à celui obtenu après extraction à l'aide d'acide chlorhydrique. Exemple 2 35 On traite des portions de 200 g du même lot de pancréas de porc de la même manière que dans l'exemple 1, mais en les mettant à incubation pendant 30 minutes avec de l'acide sulfurique. Durée totale d'extraction 105 minutes. (Voir tableau page 6). 9 5 10 15 20 25 30 35 40 6 TABLEAU II Acide ajouté pH Durée de l'extraction en minutes Durée de la filtration à pH 8 en minutes Volume de la précipitation à pH 8 en fo de l'extrait brut Valeur du biuret par kg de pancréas en fo d'extrait chlorhydrique H Cl 2,0 75 335 36,1 69,38 100 H Cl puis H2S04 2,5 2,0 60 15 335 33,3 68,99 99 h2so4 puis HC1 5,2 2,0 15 60 158 11,1 71,85 103 H2S04 puis HC1 4,3 2,0 15 60 152 10,9 67,93 98 h2so4 puis HCl 3,7 2,0 15 60 84 10,8 62,18 90 H2S°4 puis HCl 3,3 2,0 15 60 35 6,4 67,99 98 H2S°4 puis HCl 3,0 2,0 15 60 33 7,7 65,03 94 TABLEAU III - Acide ajouté pH Durée de 1'extraction en minutes Durée de la filtration à pH 8 en secondes Volume de la précipitation à pH 8 en fo de l'extrait brut Valeur du biuret par kg de pancréas H2S°4 2,0 105 ' 76 4,7 31,05 H2S°4 puis HCl 2,5 2,0 30 75 33 4,3 41,91 H2S04 puis HCl 3,0 2,0 30 75 76 3,7 50.81 h2S04 puis HCl 3,5 2,0 30 75 60 4,0 66,23 Cet exemple montre que l'extraction plus prolongée à l'aide d'acide sulfurique intensifie appréciablement l'effet favorable 69 39951 7 2035818 sur 1'aptitude du mélange d'extraction à la centrifugation et la durée de la filtration à pH 8. Exemple 3 On effectue de la même manière que dans les exemples précédents 5 5 extractions de 2 quantités de 50 kg de pahcréas de gros bestiaux et de 3 quantités'de 50 kg de pancréas de porc; pH respectifs pendant l'extraction à l'aide d'acide sulfurique : 2,8, 2,8, 2,5, 2,8 et 3,0." Durée d'extraction : 30 mn dans chaque essai.Puis le pH est abaissé à 2,0 à l'aide d'acide chlorhydrique et l'extrac-10 tion continuée pendant 1 heure et l/2. Le résidu de pancréas obtenu après centrifugation (12 mn à 900 g) est extrait deux fois, à savoir d'abord à l'aide de'2,5 fois et puis de 1 fois son volume d'éthanol à 60 fo additionné'respectivement d'acide sulfurique et d'acide chlorhydrique jusqu'à établissement des valeurs de pH ci-15 dessus indiquées. Après centrifugation,-le pH de tout l'extrait est ajusté à 8 et le précipité formé écarté par filtration par un 2 filtre-presse de 3 m de surface. Dans tous ces cas, la filtration a lieu en l'espacé d'environ 12 mn, ce qui peut être considéré comme un perfectionnement exceptionnel par rapport aux 3 heures 20 que dure la filtration d'un extrait obtenu de la même manière à l'aide d'acide chlorhydrique à lui seul. 69 39951 8 2035818 EEVEMDICATIOMS 1 «*■ Procédé d'extraction d'insuline de glandes pancréatiques à l'aide d'un solvant d'insuline acidifié, caractérisé par le fait que l'on extrait d'abord le pancréas dans le solvant acidifié à 5 l'aide d'acide sulfurique, après quoi on ajoute de l'acide chlorhydrique au mélange d'extraction et l'on continue l'extraction. 2 - Procédé selon la revendication 1, caractérisé par le fait que'l'on effectue l'extraction à l'aide d'acide sulfurique à un pH compris entre environ 2,4 et 5,2. 10 3 - Procédé selon les revendications 1 ou 2, caractérisé par le fait que l'on effectue l'extraction à l'aide d'acide sulfurique pendant au moins 30 mn. 4 - Procédé selon la revendication 3, caractérisé par le fait que l'on effectue l'extraction après l'addition d'acide chlorhy-15 drique à un pH d'environ 2,0 pendant environ 75 mn.