FR 2029693 A1 19701023 FR 7003037 A 19700128 70 03037 i 2029693 L'invention concerne un procédé de culture de levures consommant des hydrocarbures et plus spécialement un procédé d'obtention avec un bon rendement de levures ou de produits de fermentation à partir d'hydrocarbures en réalisant une culture continue en deux cuves d'une espèce ayant d'excellentes 5 caractéristiques pour l'obtention par culture d'une levure consommant, comme source de carbone, des hydrocarbures, dans lequel un ou plusieurs hydrocarbures émulsionnés sont soumis à une fermentation dans une cuve de fermentation principale (seconde cuve) lesdits hydrocarbures étant obtenus sous forme d'émulsion dans une cuve d'émulsification (première cuve) dans laquelle on 10 introduit les hydrocarbures à haute concentration, la liqueur résiduelle de fermentation et un alcool. Plus spécialement encore, l'invention concerne un procédé de culture de levures consistant à cultiver une espèce du genre Torulopsis petrophilum, une espèce du genre Candida petrophilum ou une espèce du genre Brettanomyces petrophilum dans un milieu constitué par une fraction 15 d'hydrocarbures bouillant entre 200 et 360°C, et une solution aqueuse contenant des sels minéraux, des sources minérales -t organiques d'azote employées couramment pour la culture de microrganismes, à former une émulsion dudit milieu avec une partie de la liqueur résiduelle de fermentation précédemment employée et une faible proportion d'un alcool, tel que l'alcool méthylique, 20 éthylique ou propylique^qui lui est ajouté dans une cuve d'émulsification, à mettre en oeuvre la fermentation dans la cuve principale par l'emploi d'un ou plusieurs hydrocarbures émulsionnés et à séparer les cellules et autres produits de la fermentation. L'invention a pour objet un nouveau procédé de fermentation dans 25 lequel on obtient des cellules de levure avec un rendement élevé par rapport aux hydrocarbures utilisés comme matière première ; un nouveau procédé de culture de levures avec une durée de culture beaucoup plus courte, conséquence du raccourcissement de la durée de 1'émulsification ; un nouveau pi'océdé de culture de levures consommant des hydrocarbures, avantageux du point de vue 30 industriel. D'autres objets et avantages de l'invention seront mieux compris à l'aidé de la description détaillée qui va suivre. On savait déjà qu'un certain nombre de microrganismes sont capables de consommer des hydrocarbures comme seule source, de carbone, ces microrganismes 35 comprenant des batéries, des actinomycètes, des levures et des mycètes très variés. Cependant, on a observé qu'une gamme très limitée d'espèces consomment les hydrocarbures avec un rendement élevé mais 'on se heurte â beaucoup de difficultés pour utiliser de manière satisfaisante les cellules, notamment pour 70 03037 2 2029.693 la fabrication à une échelle industrielle de produits naturels utiles tels que les protéines, les acides nucléiques et les lipides à partir du pétrole. La demanderesse a fait une étude poussée des sources permettant l'obtention par voie naturelle de microrganismes, qui ont permis d'isoler 5 un certain nombre de levures fraîches utilisables pour l'objectif envisagé, qui appartiennent au genre Torulopsis, Candida et Brettanomyces. L'invention-est basée sur la découverte suivante : la levure peut se former de manière stable et avec un rendement élevé par introduction continue d'un milieu constitué par un ou plusieurs hydrocarbures, de l'azote 10 minéral, de l'azote organique, des sels minéraux auxquels on ajoute la liqueur résiduelle de fermentation employée antérieurement et une faible proportion d'un alcool dans une cuve d'émulsification, en formant principalement l'émulsion d!hydrocarbures dans la première cuve, c'est-à-dire celle d'émulsification et en provoquant la formation de mycéliums dans la seconde cuve 15 c'est-à-dire la cuve principale de fermentation en introduisant dans celle-ci la liqueur de fermentation émulsionnée provenant de la première cuve. Par l'emploi d'une fermentation continue mise en oeuvre de cette manière, des produits de la fermentation autres que les mycéliums, par eicemple des amino-acideSj des acides organiques et des vitaminesj peuvent être obtenus à partir 20 des espèces susmentionnées avec un rendement élevé. Les conditions de fermentation employées dans les première et seconde cuves peuvent varier en fonction des espèces cultivées et des produits à obtenir. La température de culture est par exemple comprise entre 25 et 37cC et il est nécessaire de mettre en oeuvre la fermentation en présence 25 d'air en réglant le pH'du milieu. Les conditions de culture telles que la température et le pH peuvent être celles utilisées dans les procédés de la technique antérieure et ne sont pas spécialement limitées. On peut employer comme alcool, dans le procédé selon l'invention, des alcools inférieurs tels que le méthanol et l'éthanol ainsi que des 30 alcools supérieurs tels que les alcools lauryliques et cétyliques. La proportion d'alcool à ajouter est variable et de préférence comprise entre 0,03 et 0S5 %, en volume de l'a totalité du milieu. ' La séparation des cellules de la liqueur résultant de la fermentation peut être exécutée conformément aux modes opératoires employés dans les 35 procédés connus et comprend par exemple la séparation de la liqueur de fermentation en des liqueurs lourdes et légères à l'aide d'un séparateur Westfalia, l'ajustement di pH de la première à environ 5, l'addition d'un agmt tensio-actif non ionique, par exemple le monolaurate de polyoxyéthylène 70 03037 3 2029693 sorbitarte dans une proportion de 0,05 ml par litre de la première, le chauffage du mélange à 50°C, suivi d'agitation, la séparation des cellules de cette liqueur à l'aide d'un séparateur Westfalia du type à gicleur, le lavage des cellules à l'eau et le séchage de celles-ci dans un séchoir à 5 tambour. La séparation des produits de la fermentation peut être exécutée, par exemple, en soumettant le bouillon de fermentation d'où les cellules ont été retirées à un traitement par concentration ou par une résine échangeuse d'ions en vue d'une séparation fractionnée. Le premier point caractéristique de l'invention, à savoir 10 l'opération de culture continue, est décrit ci-après en se référant à la figure annexée qui représente un exemple d'un appareil employé dans le procédé selon l'invention. Comme l'indique cette figure, dans le procédé de fermentation continue à deux cuves, un milieu constitué par les hydrocarbures à concentration élevée, de préférence entre 5 et 40 % en volume, des sels minéraux, une source 15 d'azote et une source d'aliments organiques est placé dans la première cuve, dans laquelle on ajoute une faible proportion d'alcool et on procède ensuite à la culture et à 1'émulsification de l'hydrocarbure et l'émulsion provenant de la première cuve est introduite, continuellement ou par intermittence^ dans la seconde cuve dans laquelle on réalise la culture en introduisant un milieu 20 aqueux constitué par des sels minéraux, une source d'azote et une source d'aliments organiques ne contenant pas d'hydrocarbure. Il est nécessaire de mettre ea oeuvre la culture en présence d'air dans les première et seconde cuves. La fermentation principale, c'est-à-dire la production des cellules ou la formation de produits de fermentation, est effectivement réalisée dans la 25 seconde cuve. Il n'existe aucune restriction particulière concernant la nature des sels minéraux, de la source d'azote et de la source d'aliments organiques employés dans les première et seconde cuves, qui peuvent être choisis parmi ceux employés antérieurement. Par exemple, on peut employer comme sel minéral 30 du phosphate iflonopotassique ou dipotassique, du sulfate de magnésium, du . chlorure de sodium, du sulfate ferreux, du sulfate de manganèse, du sulfate de zinc, du chlorure de calcium, etc. On peut employer comme source d'aliments organiques des peptones, des aminés substituées à l'azote, de l'extrait de viande, de l'extrait de levure, une liqueur obtenue par macération du mai's, 35 un hydrolysat de caséine, de la chair de poissons, un hydrolysat de eelle-ci, etc. On peut employer comme source d'azote des matières contenant de l'ëzote telles que l'ammoniaque, des sels minéraux et organiques d'ammonium tels que le chlorure, le sulfate, le nitrate, le carbonate, le phosphate et l'acétate d'ammonium ainsi que l'urée. 70 03037 4 2029693 Deuxièmement, l'invention est caractérisé par l'addition, au milieu dans la première cuve, de la liqueur résiduelle de fermentation employée antérieurement, de préférence dans un rapport de 5 à 75 % en volume basé sur la totalité du produit et, de plus, d'une faible proportion 5 d'un alcool tel que le méthanol ou l'éthanol. On peut utiliser comme liqueur résiduelle de fermentation la liqueur légère provenant de la séparation par centrifugation, comme indiqué sur la figure et parfois, la liqueur résiduelle de fermentation avant la séparation par centrifugation, ou son hydrolysat. Le trcisième point caractéristique de 1'invention consiste en 10 l'utilisation de trois espèces de microrganismes susmentionnés, qui ont une excellente capacité de consommation des hydrocarbures et des caractéristiques excellentes d'utilisation des aliments. L'association des caractéristiques susmentionnées conduit à de bien meilleurs résultats par le procédé selon l'invention que par les procédés. 15 antérieurs, comme cela va de soi d'après la description ci-après. Tout d'abord, la fermentation continue par l'emploi du procédé en deux cuves permet l'introduction des hydrocarbures à une concentration élevée, nécessitant ainsi une -cuve de fermentation plus petite dans laquelle la formation d'émulsion d'hydrocarbures exige beaucoup moins de temps qu'avec l'introduction à faible 20 concentration. Comme indiqué, le procédé- selon l'invention a pour caractéristiques, à la différence de ceux de la technique antérieure, l'incorporation d'une cuve d'émulsification, outre la cuve de fermentation principale. Deuxièmement, le rendement de la consommation d'hydrocarbures est très élevé dans l'invention. En général, il est connu, dans la technique antérieure, que les mycéliums de 25 levure sont formés à partir d'hydrocarbures," en particulier d'hydrocarbures à chaîne linéaire, dans le rapport de 1/1 en poids. Cependant, dans le procédé selon l'invention, les premiers sont obtenus avec un rapport supérieur à 1/1 à partir des seconds et les produits de la fermentation sont obtenus avec un rendement plus élevé que dtrns les procédés connus. A noter en particulier 30 qu'il n'existait aucun procédé dans lequel le poids de mycélium de levure obtenu H rapporté au poids d'hydrocarbure ajouté dépassait 100 %. Un rapport supérieur à 100 % peut être obtenu pour la première fois par le procédé selon l'invention, et cela grâce à la combinaison des trois types de caractéristiques susmentionnés. D'autres avantages de l'invention seront mieux compris à partir des explications, 35 expériences et exemples ci-après. Les effets de l'addition d'une liqueur résiduelle de fermentation et d'alcool en petites quantités sont décrits plus en détail par les expériences indiquées ci-après. 70 03037 5 2029693 15 35 1ère expérience Cette expérience a été réalisée en utilisant du Candida petrophilum ATCC n° 20.226. La composition du milieu dans la première cuve est la suivante : Paraffines à chaîne linéaire contenant 14 à 17 atomes de carbone 15 % en volume 10 0,004 g pour 100 cm 3 0,05 g pour 100 cm 3 0,01 g pour 100 cm 3 0,3 g pour 100 cm 3 0,2 g pour 100 cm 3 0,005 g pour 100 cm 3 0,1 g pour 100 cm 20 25 30 (pureté égale ou supérieure à 98 %) sulfate de manganèse sulfate de magnésium chlorure de calcium urée sulfate d'ammonium sulfate ferreux liqueur obtenue par macération du mai's 4 litres du milieu ayant la composition ci-dessus, de pH 4,5, sont introduits dans la première cuve de capacité 8 1 et les concentrations sont maintenues constantes par les sources d'aliments. En fait, les quantités consommées de sels minéraux, d'azote, et d'aliments organiques, fonction de la quantité de produits obtenus, sont constamment remplacées. Lorsqu'on emploie une liqueur résiduellle de fermentation pour la formation d'épiulsion, on remédie aux insuffisances concernant la composition de la liqueur résiduelle avant l'opération. La culture en présence d'air est réalisée dans la seconde cuve Plus précisément 20 1 du milieu sont placés dans une cuve de 40 1 de capacité, dans laquelle on n'ajoute aucun hydrocarbure et on introduit continûment une solution aqueuse ayant la composition indiquée ci-dessus, sauf en ce qui concerne les hydrocarbures. Le tableau I ci-après indique les résultats de détermination de la durée de la formation d'émulsion (durée de séjour) dans la première cuve et le rendement de la formation de cellules dans la seconde cuve, dans le cas où la liqueur résiduelle de fermentation est ajoutée dans une proportion comprise entre 5 et 75 % en volume" du milieu total. On observe une diminution du temps nécessaire pour émulsionner les hydrocarbures grâce à l'addition de la liqueur résiduelle de fermentation dans la première cuve et une augmentation du taux de formation. Tableau 1 - Effets de la liqueur résiduelle de fermentation sur 1'émulsification et la formation de mycéliums. Durée d'émulsification Concentration de la liqueur résiduelle de fermentation (% en volume) 5 10 25 50 75 0 (1ère cuve, heures) ___________ 5 . -4 3,5 3 7 g de mycéliums séchés/g d'hydrocarbures ajouté, % 92 95 99 103 103 91 70 03037 6 2029693 Conditions de fermentation dans la 1ère cuve : 30°C, agitateur 300 tr/mn, aération 60 %, volume de liqueur 4 1, pH ajusté entre 4 et 5 par de l'ammoniaque en solution aqueuse. Conditions de fermentation dans la 2ème cuve : 30°C, agitateur 400 tr/mn, 5 aération 100 %, durée de séjour 4 h. 2ème expérience On utilise la même souche et le même milieu que dans l'expérience 1, sauf que la liqueur résiduelle de fermentation, qui est introduite dans la première cuve, est à la concentration de 25 °L en volume de l'ensemble du 10 milieu et on étudie l'ensemble en ce qui concerne l'effet d'une addition d'alcool dans la première cuve. Les résultats sont indiqués sur le tableau 2. Tableau 2 - Influence de l'addition d'alcool Concentration de l'alcoi en volume 0,05 % 0,1% Alcool 15 Méthanol 106 % 101 % Ethanol 108 % 118 % Propanol 111 % 118 % Isopropanol 112 °L 119 % Butanol 110 % 117 % 20 Pentanol " 109 % 116 % Hexanol , 106 % 106 % Heptanol 110 % 108 % Alcool caprylique 111 % 113 % Alcool nonylique 113 % 111 % 25 Alcool décylique 117 % 110 % Alcool laurylique 108 % 111 % Alcool Myristylique 105 % 112 % Alcool céthylique 110 % 112 "L Octadécanol 108 % 117 °L 30 Témoin 99 °L Les chiffres du tableau indiquent le rapport : (poids de cellules séchées/poids des hydrocarbures ajoutés) x 100. Comme on le voit nettement sur le tableau 2, l'addition simultanée de la liqueur résiduelle de fermentation et d'alcool produit-des effets 35 synergiques remarquables. L'effet de l'addition d'alcool peut être attribué au rendement accru de l'assimilation de l'hydrocarbure par les cellules maisiDn à l'assimilation de l'alcool comme source de carbone par les cellules. Cela se 70 03037 7 2029693 comprend par le fait qu'on obtient des rendements plus élevés en cellules par comparaison avec l'assimilation maximale possible de l'alcool dans les cellules. La proportion d'alcool ajouté est de préférence comprise entre environ 0,03 % et environ 0,5 % en volume de l'ensemble du milieu. 5 Comme décrit ci-dessus, l'emploi combiné d'une souche susceptible de consommer efficacement les hydrocarbures, l'emploi de deux cuves de fermentation, une cuve d'émulsification et une cuve principale de fermentation et l'addition dans la cuve d'émulsification de la liqueur résiduelle de fermentation utilisée antérieurement et d'une faible proportion d'alcool 10 convient très bien pour l'obtention de cellules de levure ou de produits de fermentation dans des conditions- stables, avec une rendement élevé, en peu de temps, en fonction de la quantité d'hydrocarbures et pour la séparation de ceux-ci. La fermentation en deux cuves selon l'invention est totalement différente en principe de la fermentation antérieure en deux cuves comportant 15 une cuve de vieillissement placée à la suite. Les exemples particuliers ci-après faciliteront la compréhension de l'invention. Exemple 1 On met en oeuvre une fermentation continue d'une levure dans deux 20 cuves de fermentation contenant des milieux ayant les compostions ci-après. 20 ml 0,3 g 0,3 g 0,1 g 0,1 g 0,05 g 0,01 g 0,005 g 0,2 g 100 ml 0,3 g 0,1 g 0,1 g 0,1 g La levure employée est la Candida Petrophilum ATCC n° 20:226. Milieu de la première cuve : paraffines à chaîne linéaire contenant 14 à 17 atomes de carbone (pureté égale ou supérieure à 98 %) 25 sulfate d'ammonium urée phosphate monopotassique phosphate dipotassique éthanol 30 sulfate de magnésium sulfate ferreux liqueur résultant de la macération du maïs eau du robinet pH = 5,5 35 Milieu se la seconde cuve : sulfate d'ammonium phosphate monopotassique phosphate dipotassique chlorure de sodium 70 03037 2029693 sulfate de magnésium 0,01 g sulfate ferreux 0,005 g vitamine B-^ 100 eau du robinet 100 ml 5 pH = 4,5 Le milieu de la première cuve contient 25 % en volume d'hydrocarbures et le milieu de la seconde cuve ne contient pas d'hydrocarbure. La liqueur fermentée est transvasée de la première cuve dans la seconde pour mettre en oeuvre la culture continue avec les durées de séjour et dans les conditions 10 indiquées ciaprès. Dans les première et seconde cuves, de capacités respectives 8 1 et 40 1 on introduit, respectivement, 4 1 et 20 1 du milieu correspondant. Les cellules de la seconde cuve sont séparées par centrifugation après achèvement de la fermentation et l'on fait passer la liqueur légère dans la première cuve de façon à préparer urjtnélange de liqueur légère et de milieu 15 frais dans, le rapport en volumes 4/6 pour la fermentation à l'intérieur. La durée de séjour dans la première cuve est de 3 h et la fermentation est achevée en 4 h dans la seconde cuve. Les conditions de fermentation dans la première cuve sont : 30°C, pH 5 à 6, ajusté avec de l'ammoniaque, agitateur : 400 tr/mn et aération 60 %. Les conditions dans la seconde cuve sont : 33°C, pH 20 entre 4,5 et 5, agitateur 400 tr/mn et aération 100 %. La liqueur fermentée ainsi obtenue est soumise à une séparation par centrifugation à l'aide d'un séparateur Westfalia, en liqueurs légère et tourde. On ajoute à la liqueur lourde un ester d'acide aliphatique de sorbitane, à raison de 0,05 g par litre de liqueur fermentée et le mélange est chauffé à 50°C, puis soumis à une 25 séparation par centrifugation. On lave les cellules ainsi séparées à l'eau, et on les sèche sur un séchoir à tambour. Le rendement est de 109 g de cellules de levure sèche pour 100 g d'hydrocarbures ajoutés. Le rendement en cellules séparées est de 92 %, ce qui permet de les employer comme source de protéines pour l'alimentation des animaux. 30 Exemple 2 On cultive du Torulopsls petrophilum ATCC n" 20.225 par un procédé absolument identique à celui de l'exemple 1. L'alcool employé est du propanol. Le propanol est introduit continuellement dans la première cuve à la concentration d'environ 0,05 % en volume. On réalise une fermentation continue en utilisant canne 35 seconde cuve une cuve du type Waldhof de capacité égale à celle de l'exemple 1. Avec des conditions de fermentation et de traitement après séparation des cellules absolument identiques à celles de l'exemple 1, on obtient des mycéliums séchés à raison de 104 g par 100 g d'hydrocarbures ajoutés. 70 03037 9 2029693 Le rendement de la séparation des cellules par l'utilisation d'un séparateur West&lia est de 92 %. On peut employer les cellules ainsi obtenues telles quelles comme source de protéine pour l'alimentation des animaux. Exemple 3 5 On met en oeuvre une fermentation continue d'une levure dans deux cuves de fermentation contenant des milieux ayant les compositions ci-après, en utilisant du Candida petrophilum \ATCC n° 20.226. Milieu de la première cuve : hexadécane normal 20 ml 10 sulfate d'ammonium 0,3 g urée 0,3 g phosphate monopotassique 0,1 g phosphate dipotassique 0,1 g propanol 0,05 ml 15 phosphate de magnésium 0,01 g phosphate ferreux 0,005 g liqueur provenant de la macération du mais 0,2 g eau du robinet 100 ml PH =5,5 20 Milieu de la seconde cuve : sulfate d'ammonium 0,3 g sulfate acide de potassium 0,1 g' phosphate dipotassique ' 0,1 g sulfate de magnésium 0,01 g 25 sulfate ferreux 0,005 g mélasse résiduelle 0,3 g chlorure de triméthyloctadécylammonium 0,05 g eau du robinet 100 ml pH = 5,5 30 On inocule un milieu semblable à celui de l'exemple 1 avec la levure et on le place dans le même récipient. Les cellules, q>rès achèvement de la fermentation dans la seconde cuve, sont séparées par centrifugation et l'on fait passer là liqueur légère dans la première cuve servant à la mise en" oeuvre de la fermentation de manière à former un mélange de liqueur légère 35 et de milieu frais dans le rapport 4/6. La durée de séjour dans la première cuve est de 3 h et la fermentation dans la seconde cuve est achêvée en 5 h. 0n met en oeuvre une fermentation continue dans les conditions ci-après : dans"la première cuve, 30°C, pH compris entre 5 et 6, 70 03037 10 2029693 agitateur 500 tr/mn et 100 % d'aération et, pour la seconde cuve , 30°C, pH compris entre 5 et 6, agitateur 400 tr/mn et aération 100 %. On sépare des cellules de la liqueur de fermentation ainsi obtenue par séparation centrifuge et la liqueur fermentée est acidifiée par de l'acide sulfurique. On ajoute 5 ensuite de l'éther à la liqueur fermentée acidulée à raison de 300 ml du premier par litre de la seconde. On recommence deux fois 1'extraction et l'éther est séparé sous pression réduite de l'extrait. On laisse reposer le résidu dans un endroit froid de façon à obtenir 14 g d'acide citrique cristallin à partir d'un litre de liqueur fermentée. 1,0 Exemple 4 On met en oeuvre la culture du Brettanomvces petrophilum ATdC: n° 20.224 dais des conditions absolument identiques à celles de l'exemple 1, sauf qu'on emploie des paraffines à chaîne linéaire contenant 11 à 15 atomes de carbone (pureté égale ou supérieure à 98 %). Les cellules de levure sont 15 obtenues à raison de 102 g de produit sec pour 100 g d'hydrocarbures ajoutés. 70 03037 11 2029693 REVENDICATIONS 1 - Procédé de culture de levures consommant des hydrocarbures par un procédé de fermentation continue, caractérisé en ce qu'il comprend : a) la culture de Torulopsis petrophilum, Candida petrophilum ou Brettanomyces 5 petrophilum, une espèce de levure consommant des hydrocarbures en tant que source de carbone dans un milieu contenant une fraction d'hydrocarbures bouillant entre 200 et 360°C ; b) la mise en oeuvre de ladite culture en . présence d'air dans un appareil constitué: 1) par une cuve d'émulsification destinée principalement à former une émulsion desdits hydrocarbures et d'une 10 solution aqueuse et 2) une cuve principale de fermentation pour provoquer la formation par fermentation de cellules ou de substances utiles, ces cuves étant branchées en série; c) l'introduction, dans ladite cuve d'émulsification, d'un milieu contenant : lesdits hydrocarbures à une concentration élevée, la liqueur résiduelle de fermentation provenant de la cuve principale 15 de fermentation et un alcool à une concentration de, au maximun^ 035% en volume, calculé par rapport à la totalité du volume dudit milieu; et d) l'introduction dans ladite cuve principale de fermentation de la liqueur de fermentation émulsionnée obtenue dans ladite cuve d'émulsification. 2 - Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que ledit 20 hydrocarbure est à chaîne linéaire. 3 - Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que la concentration dudit hydrocarbure dans la cuve d'émulsification est comprise entre 5 et 40% en volume par rapport au volume total du milieu. 4 - Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que la 25 liqueur résiduelle de fermentation est introduite dans la proportion de 5 à 75% en volume calculée comme ci-dessus.