FR 2042325 A1 19710212 FR 7013387 A 19700414 70 13387 i 2042325 La présente invention concerne un nouvel antibiotique, son procédé de préparation par fermentation, des modes opératoires pour le recueillir et le concentrer à partir de ses solutions brutes, des modes opératoires pour le purifier et pour préparer ses sels. 5 L'invention concerne également des aliments pour animaux, en particulier destinés à l'utilisation .chefc les jeunes animaux domestiques, parmi lesquels on comprend les animaux de basse-cour tels que les poulets, les dindes, les canards et analogues, lesdits aliments pour animaux renfermant le nouvel antibiotique selon l'invention. Les nouveaux aliments selon 10 l'invention sont également utiles dans le cas des jeunes animaux appartenant à la catégorie du bétail, des chevaux, des porcs, des chiens et des moutons. Un problème considérable a été soulevé du fait de l'accélération de la croissance des jeunes animaux,domestiques et également du fait de 15 la protection nécessaire contre les maladies. L'importance économique d'un taux de croissance rapide est très grande, en particulier'dans le cas des animaux domestiques à croissance rapide tels que les animaux.de basse-cour, par exemple les poulets, les dindes, les canards et analogues. La proportion de nourriture qui est transformée en viande est d'autant plus 20 grande que la croissance est plus rapide. Il est également souhaitable d'empêcher les maladies, tout particulièrement chez les jeunes poulets. Pour ces deux sortes de motifs, on a proposé,dans le passé,1'utilisation de divers antibiotiques à spectre étroit, tels que la pénicilline, la bacitracine, la streptomycine et des antibiotiques à-large spectre, tels 25 que la tétracycline, 1'oxytétracycline ou la chlortétracycline et analogues. Lorsqu'on les mélange avec les aliments pour, aniôaux en quantités convenables, lesdits composés contribuent, en fait, à favoriser le gain de poids dans certaines circonstances et les produits vétérinaires favorisent également la protection contre les infections. Cependant, il existe cons-30 tamment une nécessité pour trouver des améliorations et l'invention concerne précisément une nourriture améliorée pour animaux. L'invention a pour objet une composition alimentaire pour animaux contenant les ingrédients alimentaires courants équilibrés du point de vue nutritif et une quantité efficace d'antibiotique dénommé 35 AM.374 en tant que nouvel additif promoteur de croissance. L'invention vise également l'antibiotique précité sous des formes diluées, en tant que concentrats bruts, et sous formes cristallisées. Les 70 13387 2042325 2 nouveaux produits précités sont actifs vis-à-vis de divers microrganismes comprenant les bactéries gram-positives. Les effets du nouvel antibiotique sur les microrganismes spécifiques, de même que ses propriétés chimiques et physiques, le différencient des antibiotiques précédemment décrits. est formé pendant la culture dans des conditions contrôlées dfun nouveau streptomycète isolé à partir d'une terre recueillie en Utah. Une culture viable du nouveau microrganisme a été déposée aux Etats-Unis d'Amérique à l'organisme désigné sous le nom de Culture Collection Laboratory, Northern 10 Utilization Research and Development Division, United States Department of Agriculture Peoria, Illinois, et elle a été ajoutée à sa collection permanente. Elle est librement disponible à cet organisme sous le n° d'enregistrement 15 conservé dans la collection de cultures des Laboratoires Lederle. Pearl River, New York, ont été fournies par le Dr. H.D. Tresner2 travaillant pour ces laboratoires. physiologiques et morphologiques de la culture selon les modes opératoires 20 indiqués en détails par Shirling et coll., /"Methods for Characterization of Streptomyces Species", Internat. Journ. of Syst. Bacteriol, _16: 313-340, (1966)_/. Les milieux qui ont été utilisés dans cette étude ont été choisis parmi ceux qui sont préconisés par Pridham et coll., /"A Seleetion of Media for Maintenance and Taxonomic Study of Streptomyces", Antibiotics Annual 25 (1956-1957), pp. 947-953_/, pour la culture des streptoraycètes. Les détails sont indiqués aux tableaux I - IV, annexés, et une description générale de la culture est indiquée ci-dessous. Les couleurs descriptives soulignées ont été empruntées à Jacobson et coll., /"Color Harmony Manual" Sème Ed. Le nouvel antibiotique, que la demanderesse a dénommé AM. 374, NRRL 3 582. La description et l'identification de ce nouveau microrganisme, On a effectué les observations des caractéristiques culturales, (1948) /. 30 Abondance de la croissance Modérée sur la plupart des milieux; bonne sur gélose-pomme de terre-dextrose; légère sur gélose-solution de Czapek. 35 Couleur du_m£célium aérien et/ou des sgores en masse Mycélium aérien blanchâtre sur la plupart des milieux : devient Ivoire (2 db) à Ivoire L.(2 ca) dans les zones de sporulation. BAD ORIGINAL 70 13387 3 2042325 Pigments_solubles Jaunâtres sur plusieurs milieux; aucun sur les géloses-solutions de Czapek, -asparagine-dextrose et -sels minéraux- amidon. 5 Couleur de 1'envers En teintes jaunâtres sur la plupart des milieux. Réactions physiologiques diverses Les nitrates ne sont pas réduits en nitrites dans un. bouillon orga- 10 nique au nitrate; liquéfaction complète de la gélatine en sept jours; aucune production de mélanine sur gélose-peptone-fer. Utilisation de la source de carbone selon la méthode de Pridham et coll., Al. Bact. 56: 107-114, (1948)_/» comme suit : utilisation moyenne à bonne de 1-arabinose, d-fructose, i-inosi-tol, lactose,'d-mannitol, d-mélibiose, salicine, d-tréhalose, d-xylose; uti-15 lisation médiocre à absence d'utilisation de 1-rhamnose, adonitol, d-mélézi-tose, d-raffinose et saccharose. Micromorphologie Mycélium aérien épars, donnant naissance à de longues chaînes en-20 chevêtrées et flexueuses de spores elliptiques à allongées, de dimensions : 0,5 à 0,6 ^u x 1,0 à 1,3 jU. Spores de surface lisse, déterminé par micros-copie électronique. précité fait partie du genre Streptomyces. On a effectué une comparaison de 25 la culture de NRRL 3 582 avec tous les échantillons de référence disponibles des autres streptomycètes ayant des caractères taxonomiques fondamentaux similaires. Deux espèces ont plusieurs caractéristiques en commun avec NRRL 3 582. Cependant, lorsqu'on examine les descriptions de la littérature concernant lesdites espèces apparentées, on trouve certaines différences fondamentales. 30 Celles-ci sont indiquées dans le tableau V annexé. 35 des sporophores de NRRL 3 582 est du type Rectus-Flexibilis selon Pridham et coll. /Appl. Microbiol. 6: 52-79, (1958)_/, tandis que celle des deux autres espèces est du type Spira. Ce fait constitue une différence catégori- I>'après les caractéristiques générales observées, le microrganxsme En plus des différences précitées, NRRL 3 582 produit généralement une croissance nettement plus restreinte sur la plupart des milieux et sa sporulation tend à être plus clairsemée. On peut observer dans le tableau V, annexé, que la morphologie IAD OT* 70 13387 4 2042325 queœent fondamentale et, à elle seule, elle convient pour distinguer les organismes. Lorsqu'on la prend en considération en même temps que les autres différences indiquées, NRRL 3 582 se distingue suffisamment des autres organismes pour être considérés comme une espèce séparée. 5 En accord avec la couleur ivoire des spores produite par l'orga nisme, la demanderesse propose le nom de Streptomyces eburosporeus n.sp., comme désignation descriptive appropriée. Il est entendu que la production du nouvel antibiotique de l'invention n'est nullement limitée à l'organisme particulier cité ci-dessus ou à 10 des organismes répondant entièrement aux caractéristiques de croissance et aux caractéristiques microscopiques exposées ci-dessus qui ne sont indiquées qu'à titre d'illustration seulement. En fait, la demanderesse comprend dans le cadre de son invention et la revendique comme telle l'utilisation des mutants produits à partir de l'organisais décrit ci-dessus par des voies di-15 verses, telles que 1'irradiation par les rayons X, les radiations ultraviolettes, l'exposition aux moutardes & l'azote, l'exposition aux phages et analogues. Procédé_de fermentation 20 On peut effectuer la culture de l'organisme j>. eburosporeus dans une grande variété de milieux de cultures liquides. Les milieux qui sont utiles pour la production du nouvel antibiotique comprennent une source assimilable de carbone, telle que l'amidon, le sucre, les mélasses, le glycérol, et autres; une source assimilable d'azote telle que des protéines, des hydroly-25 sats de protéines, des polypeptides, des amino-acides, la liqueur de macération de mais, et analogues; et des anions et des cations minéraux, tels que potassium, sodium, calcium, sulfate, phosphate, chlorure, et analogues. On fournit des éléments à l'état de traces tels que le bore, le molybdène, le cuivre, et analogues, sous forme d'impuretés d'autres constituants des mi-30 lieux. On assure l'aération dans les réservoirs et les flacons en envoyant de l'air stérile à travers ou sur la surface du milieu de fermentation. On assure une agitation complémentaire dans les réservoirs au moyen d'un dispositif d'agitation mécanique à palettes. On peut ajouter si cela est nécessaire, un agent antmoussant tel que 1'cctadécano1 en quantité de 1" %s dans 35 l'huile de saindoux. BAD QRJGfNAlT 70 13387 5 2042325 Préparation, de l'inoculum On prépare un inoculum de S. eburosporeus dans des flacons à secousses, en inoculant 100 ml de milieu liquide stérile dans des flacons de 500 ml avec des résidus de raclage ou de lavage de spores provenant 5 d'une culture sur gélose inclinée. On utilise, en général, le milieu suivant : Mélasses 20 g Glucose 10 g "Bactopeptone" 5g 10 Eau q.s.p. 1 000 ml On fait ineubér les flacons à une température de 25-29°C, de préférence 28°C, et on les agite vigoureusement sur une secoueuse rotative pendant 30 à 48 h. On utilise les inocula de 100 ml ainsi obtenus pour inoculer des 15 lots de 1 litre et de 12 litres du même milieu dans des fermenteurs en verre de 2 litres et de 20 litres. On aère la dispersion d'inoculum avec de l'air stérile en poursuivant la croissance pendant 30 à 48 h. On utilise ces lots d1inocula pour inoculer des fermenteurs en réservoirs. Pour la production de l'antibiotique dans des fermenteurs en réservoir, on utilise de préférence le milieu de fermentation suivant : Farine de soja 10 g Cérélose 10 g 25 Chlorure de sodium 5 g Carbonate de calcium 1 g Résidus solubles de distillerie de maïs 5 g Eau q.s.p. 1. 000 ml 30 On inocule chaque réservoir avec 3 à 10 % de l'inoculum préparé comme décrit ci-dessus, on assure l'aération à la vitesse de 0,5-1,0 litre d'air stérile par litre de bouillon par minute et on agite le milieu de fermentation au moyen d'un agitateur à palettes entraîné à 200-400 tr/mn. On maintient la température à 25-29°C, en général à 28°C. On poursuit d'ordinaire 35 la fermentation pendant 65-90 h, et l'on récolte alors la boiîillie. 70 13387 6 2042325 Procédé de purification Après avoir terminé la fermentation, on filtre la bouillie fermentée contenant 1 "antibiotique de l'invention, de préférence à pH 6, pour éliminer le mycélium. On peut utiliser de la terre d'infusoires ou tout autre adjuvant 5 de t'iltration courant pour favoriser la filtration. Normalement, os lave le gâteau de mycélium avec de 11 eau et on réunit les liqueurs de lavage avec le filtrat. On adsorbe la fraction active de l'antibiotique sur une substance désignée sous le nom de Darco G-6Q ou un autre adsorbant à base de charbon de bois convenable, en utilisant environ 0,5 % (poids/volume) d'adsorbant. 10 On peut éluer la fraction active de l'antibiotique retenue sur le charbon de bois en agitant le charbon de bois pendant environ une demi-heure avec de l'acétone aqueuse à 40 % amenée à pH 2 avec de l'acide sulfurique concentré, en utilisant un volume d'éluat égal à environ un quart volume de bière initial. On concentre 1'éluat sous pression réduite en «ne phase aqueuse 15 égale à environ 1/lOème de son volume initial. On amène le pH de cette phase à environ 5,5 avec de 1'hydroxyde de baryum et on élimine par filtration le précipité de sulfate de baryum formé. On concentre en complément la solution (filtrat) amenée à environ 400-800 ml. On délaye ensuite ce concentrât avec de l'alumine acidifiée (en utilisant environ l/5ème de la quantité d'alumine 20 en grammes par comparaison avec le volume du concentrât) et on verse la dispersion ainsi obtenue sur une colonne convenable d'alumine acidifiée (en utilisant environ 10 fois la quantité d'alumine utilisée dans la charge), tassée à l'état humide dans le méthanol. On élue la fraction active de l'antibiotique à partir de la colonne avec du méthanol aqueux (en général 25-50 7») 25 et on recueille les fractions actives .appropriées. On combine les fractions actives et on les concentre jusqu'à faible volume (1 litre ou moins) sous pression réduite. On amène le pH de ce concentrât à environ 6,0 à 6,5 avec de 1'hydroxyde de baryum. On élimine de nouveau le précipité de sulfate de baryum qui se forme, par filtration, et on lyophilise le filtrat clair en 30 obtenant l'antibiotique AM 374 (brut). On purifie alors la substance lyophilisée, d'une manière complémentaire, par chromatographie en colonne sur une résine échangeuse d'ions convenable, telle que,- par exemple. CM Bephadex -C-25 (forme H*~). On peut éluer la colonne en utilisant des solutions d'acide sulfurique diluées. On amène 1'éluat contenant la fraction active de l'anti-35 biotique, situé selon son absorption à 280 ,à pli d'environ 6;3 avec de 1'hydroxyde de baryum. On élimine le précipité de sulfate de baryum qui s'est formé, par filtration, et on concentre le filtrat jusqu'à un volume JBAD ORIGINAL 70 13387 7 2042325 d'environ 30-80 ml. On amène le pH de cette solution à environ 8,0 avec une résine IR 45 (OH ). On élimine la résine par filtration et on ajoute le filtrat à une plus grande quantité d'acétone en agitant et on recueille le précipité qui se forme par filtration. On lave le précipité avec de lfacétone 5 et on le sèche à une température modérée sous pression réduite en obtenant l'antibiotique AM 374 sous la forme de base. On peut préparer un échantillon microanalytique en précipitant 10 la base AM 374 à partir d'acétone méthanolique et/ou éthanolique et en séchant -3 le précipité sous un vide poussé ÇlO mm), à 100°C pendant 2 jours. L'antibiotique AM 374 préparé de cette manière contient les éléments carbone, hydrogène, oxygène, azote et chlore pratiquement dans les pourcentages en poids suivants : 15 Carbone 54,54 Hydrogène 6,10 Oxygène 29,01 Azote 7,60 Chlore 2,47 20 La substance ne présente pas de point de fusion défini, et se dé-composeolentement au-dessus de 250°C. Le pouvoir rotâtoire est le suivant : /~oc7 D = 102° (.- 2,9°) (C = 1,045 dans l'eau). On trouve des maxima dans le spectre ultraviolet à : 1 7a 25 282 m.u (E, ° = 42) en solutions acides / i cm 1 7 282 m.u (E, 0 = 42,5) en solutions neutres / 1 cm 17 305 m,u (E, * = 51,5) en solutions basiques / 1 cm 1 7 épaulement à 260 nyu (E^ ^ = 92) en solutions basiques. 30 Un spectre d'absorption infrarouge de la base AM 374 dans une pas tille de KBr, préparée d'une manière type, montre une absorption caractéristique aux longueurs d'ondes suivantes exprimées en microns : 3,0, 3,45, 6,0, 6,20, 6,30, 6,67, 6,88, 7,05, 7,22, 7,35 épaulement, 7,52, 7,67, 8,2, 8,65 épaulement, 8,85, 9,45, 9,75, 9,90, 10,45 épaulement, 11,07, 11,5, 12,0, 35 12,35, 13,35, 14,4. La courbe en infrarouge est représentée à la figure 1 du dessin annexé. 70 13387 2042325 L'antibiotique AM 374 montre les valeurs R^ suivantes dans les systèmes de solvants indiqués ci-après, en utilisant Baclllus subtilis à pH 6,0 ou Corynebacterium xerosis, comme organismes de détection : 5 Valeur R. •f Système de solvants Q ,90 0.2Q NH^Cl aqueux à 5 % pyridine, 2 parties s-collidine, 2 parties sec-butanol, 1 partie eaus 1 partie La base de l'antibiotique AM 374 est aisément soluble dans l'eau et le diméthylsul£oxyderest modérément soluble dans le méthanol et soluble 15 à un degré moindre dans l'éthanol. tiques par les constantes de caractérisation indiquées ci-dessus et par son activité antimicrobienne. L'activité antimicrobienne in vitro du nouvel antibiotique de l'invention et de son produit d'hydrolyse est indiquée dans le 20 tableau VI annexé qui montre la concentration inhibitrice minimale requise pour inhiber la croissance de microrganismes représentatifs dans un milieu nutritif. microrganismes gram-positifs tels que les staphylocoques^ les pneumocoques 25 et les streptocoques. Le nouvel antibiotique est par suite utile comme agent thérapeutique pour le traitement des infections bactériennes chez les mammifères, qui sont provoquées par lesdits microrganismes. Le nouvel antibiotique peut être utilement pris pour traiter eu contrôler les infections précitées par une application topique ou une administration par voie parentérale. 30 L'utilité du nouvel antibiotique est démontrée par sa faculté de combattre les infections létales généralisées chez la souris. Le nouvel antibiotique montre une haute activité antibactérienne in vivo chez la souris contre Stapfaylocoecus aureus; souche Smith; Staphylococcus aureus, souche Rose; Streptococcus pyogeness C 203; et Biplococeus pneumoniae, 3V1, iors-35 qu'on l'administre par une seule dose sous-cutanée à des groupes de souris femelles de souche Carworth Farras CF-1, dont le poids est d'environ 20 g chacune, infectées par voie intrapérirtonéale avec une dose létale desdites L'antibiotique AM 374 se distingue clairement des autres arttibia- L'antibiotique AM 374 est actif in vivo également contre divers BAD ORIGINAL 70 13387 9 2042325 —2 —5 —6 bactéries, sous forme de dilutions 10 , 10, 10 et 10*" de cultures de 5 h sur bouillon de trypticase-soja-sang. Le tableau VII annexé illustre l'activité antibactérienne in vivo du AM 374, tandis que le tableau VIII, annexé, illustre l'activité anti-5 bactérienne _in- vivo du produit d'hydrolyse. L'invention est décrite ci-après avec plus de'détails en ce qui concerne les exemples particuliers suivants, nullement destinés à limiter l'invention dans son cadre et son esprit. 10 EXEMPLE 1 Préparation de l'inoculum On prépare un milieu type, utilisé pour assurer la croissance de l'inoculum primaire, selon la formule suivante : Mélasses 20 g 15 Glucose 10 g "Bactopeptone" 5g Eau q.s.p. 1 000 ml On utilise des spores lavées ou raclées à partir d'une culture 20 de gélose inclinée de S. eburosporeus pour inoculer deux flacons contenant chacun 100 ml du milieu précité dans des flacons de 500 ml. On place les flacons sur une secoueuse rotative et on les agite vigoureusement pendant 48 h, à 28°C. On transfère l'inoculum résultant à partir des flacons dans un fermenteur en verre ayant une capacité d'environ 19 litres, contenant 25 12 litres de milieu stérile. On aère le fermenteur en verre avec de l'air stérile en poursuivant la croissance pendant environ 48 h, puis on utilise le contenu des fermenteurs pour ensemencer un réservoir fermenteur de 300 litres. 30 EXEMPLE 2 Fermentation On prépare un milieu de fermentation selon la formule suivante : Farine de soja 10 g Cérélose 10 g 35 Chlorure de sodium 5 g Carbonate de calcium 1 g Résidus solubles de distillerie de maïs 5 g Eau q.s.p. 1 000 ml 70 13387 10 204232S On stérilise le milieu de fermentation à 120°C avec de la vapeur d'eau sous une pression de 6,8 kg pendant 45-60 tœ. Le pH du milieu après la stérilisation est de 6S6. On inocule 300 litres de milieu stérile dans un réservoir fermenteur de 400 litres avec 12 'iifcres d'inocuîum tel que dé-5 crit à l'exemple 1, et on effectue la ferEentetion à 28®C en utilisant une huile mise dans le commerce sous le nom de lïodag. LG-S comme agent destructeur de mousse. On assure l'aération à la -vitesse de 0,5-litre d*air stérile par litre ce bouillie par minute. On agite la bouillie avec un agitateur à palettes entraîné à 300 tr/mn. Au bout d '''environ. 70 h de fermentation, on 10 récolte la bouillie. - EXEMPLE 3 Isolement et purification On filtre 300 litres de. la bouillis ferraenfcée avec-environ 2 % 15 (poids/volœis) d'an adjuvant de filtration fuiras par de la terre d'iafusoires et on lave le tampon de filtration avec environ 30'litres d'eau. On a au préalable amené la bouillie fermentee à pïï 6,0 avec de 1.'hydroxyde de sodium. On adsorbe la fraction active de 1'antibiotique présente dans le filtrat et les eaux de lavage réunis, sur 900 g de J>arco G~ôO et on éllaine les impuretés 20 colorées à partir de la suspension de charbon ce bais.en l'agitant avec environ 30 litres d*acétone aqueuse à 40 %. On élue la fraction active à partir du charbon de bois en 1'agitant avec 75 litres d'acétone aqueuse à 40 %, amenée à pH 2,0 avec de l'acide sulfurique concfetitié» On filtre la suspension, on concentre l'éluat sous pression réduite jusqu'à environ 4 litres de phase 25 aqueuse, et on amène le pH à 5,2 avec ds l'ïïydro.-.îyêe de baryum. On élimine le précipité de sulfate de baryum par filtrstioE et on concentre d'une manière supplémentaire le filtrat jusqu'à eavirou 700 sal. On délaye ce concentrât avec 100 g d'alumine traitée par an acide et on îe "/erse sur une .colonne comprenant 1 kg d'alumine traitéa par voie acide, dans du méthanol. On prépare 30 l'alumine, traitée par un acide en acidifiant une dispersion aqueuse d'alumine mise dans le commerce par la Firas Merck avec ds l'acide sulfurique concentré jusquvà l'obtention d'un pH constant de 3,0». au 1s filtrant, en la lavant avec de l'eau et du méthanol et en la séchant à l'air. On élue ensuite la colonne avec 5 litres île méthanol en faisant suivre par 60 litres de méthanol 35 aqueux à 50 % lui-même suivi de 10 litres êe- méthanol aqusux à 25 %. On combine les fractions appropriées contenant 1'antibiotique AM 374, déterminé par titrage biologique par rapport à Ç. itérerais, et on les concentre sous pression BAD ORIGINAL 70 13387 11 2042325 réduite jusqu'à environ 500 ml et on règle le pH à 6,2 avec de 1'hydroxyde de baryum. Qn élimine par filtration le précipité de sulfate de baryum et on lyophilise le filtrat en obtenant 5,1 g de AM 374 brut (pur à environ 30 à 50 %). 5 On dissout la quantité de 5,1 g de AM 374 brut ainsi obtenu dans 30 ml d'eau et on l'applique sur une colonne de CM Sephadex C-25 (sous forme -j- H). On prépare le Sephadex (250 g),pour 1'utiliser,en le délayant dans environ 3 litres d'eau et on amène son pH à 2,0 avec concentré. On dé cante lreau en excès et on lave plusieurs fois la résine avec de l'eau. On 10 verse la dispersion dans une colonne (7,6 cm de diamètre intérieur) et on la lave avec une quantité supplémentaire de 5 litres d'eau pour éliminer l'acide en excès. On élue la colonne avec un gradient compris entre 4 litres d'eau et 4 litres d'eau amenée à une valeur de pH de 1,4 avec de l'acide sulfurique 15 concentré, en faisant suivre par une quantité supplémentaire de 4 litres d'eau amenée à un pH de 1,4. On recueille les fractions (environ 100 ml chacune) et on mesure l'activité biologique (par rapport à C. xerosis) et l'absorption ultraviolette (à 280 nyu) sur des dilutions de 1 à 100 desdites fractions. On observe que les fractions 58 à 80 contiennent la majorité de 20 l'antibiotique désiré et on les réunit en une fraction commune. On amène le pH de cette fraction commune à 6,3 avec de 1'hydroxyde de baryum et on élimine par filtration le sulfate de baryum ayant précipité, au moyen de terre d'in-fusoires. On concentre le filtrat à environ 200 ml et on le lyophilise en obtenant environ 1,5 g d'antibiotique brut. On dissout l'antibiotique brut 25 dans 50 ml d'eau et on amène le pH de la solution.à environ 8,2 avec une résine IR 45 (sous forme OH ). On filtre la suspension et On lyophilise le filtrat. On dissout le produit de lyophilisation dans 40 ml d'eau et on précipite l'antibiotique par addition de 400 ml d'acétone. On recueille le précipité cristallisé par filtration et on le dissout dans une petite portion de 30 méthanol. Par addition d'acétone, oh précipite l'antibiotique AM 374 purifié que l'on recueille par filtration. Rendement 1,-18 g. On prépare un échantillon microanàlytique en précipitant le AM 374, obtenu comme décrit ci-dessus, à partir d'acétone éthanolique et on sèche le -3 précipité sous vide poussé (10 mm) à 100°C pendant 2 jours. On a déjà décrit 35 ci-dessus les résultats de l'analyse chimique de ce produit ainsi que les autres propriétés physiques et biologiques du nouvel antibiotique. 70 13387 12 2042325 EXEMPLE 4 Conversion de la base AM 374 en sulfate de AM 374 On dissout 150 mg de AM 374 base dans 60 ml de méthanol chaud auquel on a ajouté une goutte de solution 1 : i de méthaiioi-acide sulfcri- 5 que concentré. On filtre le précipité résultant et on le lave avec un peu de méthanol et d'acétone en obtenant 98 mg de sulfate de AM 374. D'une manière différente, on prépare le sulfate de AM 374 en amenant une solution aqueuse ae AM 374 base à pH d'environ 6,3 avec de l'acide sulfurique, en faisant suivre par une précipitation avec de l'acétone. 10 On prépare un échantillon microanalytique par précipitation à -3 partir d'acétone aqueuse et séchage du précipité sous vide poussé (10 mm) à 100°C pendant 2 jours. Le sulfate de AM 374 préparé de cette maniéré contient les éléments carbone, hydrogène, oxygène, azote, soufre et chlore, pratiquement dans les pourcentages en poids suivants : 15 Carbone 51,68 Hydrogène 5,85 Oxygène 30,25 Azote . 7,02 Soufre 1,36 20 Chlore 2,27 22 Le pouvoir rotâtoire du composé est le suivant : l_ ct_/ = 104° (- 2,8°) (C = 1,075 dans l'eau). On observe des maxima dans L'ultraviolet à : 25 282 m,u (E?" ^ = 44) en solutions acides / 1 cm 282 m,u (ET 0 = 43) en solutions neutres / 1 cm 305 m.u (E* % =48) en solutions basiques / 1 cm 30 épaulement à 260 m.u (E* % = 85) en solutions basiques. / 1 cm Un spectre d'absorption, infrarouge du sulfate de AM 374 dans une pastille de KBr, préparée d'une manière type, montre une absorption caractéristique aux longueurs d'ondes suivantes exprimées en microns r 3,0, 3,45, 5,75 épaulement, 5,90 épaulement, 5,99, 6,03, 6,20, 6,32, 6,67, 6,78 épaule-35 ment, 6,8-7, 7,05, 7,20, 7,53, 7,65, 8,25, S,65 épaulement, 8,87. 9,45, 9,73, 9,83 épaulement, 10,45 épaulement, 11,05, 12,0, 12,35, 13,3, 14,4. BAD origine 70 13387 13 2042325 EXEMPLE 5 Conversion du AM 374 base en chlorure de AM 374 On dissout 200 mg de AM 374 base dans 10 ml d'acide chlorhydrique, 0,1 ET et on concentre jusqu'à environ 2 ml sous pression réduite en observant 5 alors la formationd\mprécipité partiellement microcristallin. On le filtre, on redissout le précipité dans une quantité minimale dreau et on le reprécipite avec de l'aeétone. On filtre et on lave avec une petite quantité supplémentaire d'acétone en obtenant 116 mg du chlorure de AK 374. On prépare un échantillon microanalytique par précipitation à _3 10 partir dracé£one aqueuse et séchage du précipité sous vide poussé (10 mai) à 100°C pendant 2 jours. Le chlorure de AM 374 préparé de cette manière contient les éléments carbone, hydrogène, oxygène, azote et chlore, pratiquement dans les pourcentages en poids suivants r Carbone 52,20 15 Hydrogène 6,22 Oxygène 28,03 Azote 7,26 Chlore 6,34 20 Le pouvoir rotâtoire du composé est le suivant : — —25 + [_ a_/D = 106° (- 2,8) (C = 1,057 dans l'eau). On observe des maxima dans l'ultraviolet à : 1 % 282 nt/u (I, ° = 42) en solutions acides / i cm 1 % 282 m,u (E, ° = 39,5) en solutions neutres 25 / i cm 1 °U 305 m.u (E, ° = 52) en solutions basiques / 1 cm 1 % épaulement à 260 m^u (E^ ^ = 92) en solutions basiques. Un spectre d'absorption infrarouge du chlorure de AM 374 dans une 30 pastille de KBr, préparée d'une manière type, montre une absorption caractéristique aux longueurs d'ondes suivantes exprimées en microns : 3,0, 3,27, 3,40, 5,75 épaulement, 5,9& épaulement, 5,98, 6,15, 6,2&, 6,65, 6,82 épaulement, 7,03, 7,15, 7,50, 7,65, 8,25, 8,60, 8,83, 9,42, 9,70, 9,88, 10,45 épaulement, 11,05, 11,9, 12,3, 13,3, 14,37. 70 1338? 2042325 EXEMPLE 6 Produit d'hydrolyse acide do £M 37'4 base On dissout 1 g de i'antibiotique AM 374 sous forme de base dans 7,5 ml d'eau bouillante. On y ajoute 1,25 ssl d'acide chlorhydrique 5 ivI et 5 on fait bouillir la solution résultante psndcat 2 à 3 nui supplémentaires. On y ajoute une quantité supplémentaire de 2 si d'acide cbloràydrique 5 N et on refroidit la solution. On filtra la solution obtenue et on lave le précipité avec au total 3 ml d'acide ehîorkyd-ïiq-aa 5 M. On le redissout dans l'eau et on le concentre en obtenant m résidu. On. répète cette opéra- 10 tion deux fois encore puis on précipite le résidu à partir d'acétone aqueuse en obtenant 516 sag de produit d'hydrolyse acide., On prépare un êctiantilloa. EieroanalyîAe^e par précipitation à par- -3 tir d'acétone aqueuse et séchage du précipité sous vide gousse (10- ma) à 100*0 pendant 2 jours. Le produit cl'liycîrolysé *is Ml 374 préparé de cette 15 manière contient les éléments carbone, hydrogène, osygèaa, azote et chlore, pratiquement dans les pourcentages en poids suivants.: Carbone 52,54 Hydrogène 5,81 Oxygène 25,52 20 Azote 8632 Chlore 7,11 Le pouvoir rotâtoire du composé est la suivant : 69° (i 25 l'ultraviolet à : / a - 69° (- 3,6°) (C = 0,839 dans l'eau). On obsarje des maxima dans —» ls 1 7o 280 m.u (E. ° = 46) en solution- acidôs j Je cm 280 ia,u (E?" ^ = 51,5) en solutions neutres / 1 cm 300 myu (E^ ^ = 86} en solutions basiques 30 épaulement à 260 m.u (E?" ^ « 143) en solutions basiques. / i CCI Un spectre d'absorption infrarouga dù produit. d'hydrolyse de AM 37*: dans une pastille de KBr, préparée d'une manière typa présente une absorption caractéristique aux longueurs d'ondes suivsr-tes ezpriiaées en microns : 3,0, 35 3,3C épaulement, 3,43, 5,75 épaulement, S,-9£ ép^uiemeui:, 6,0 , 6,15 épaulement 6,25, 6,48 épaulement, 6,68, 6,85, 7,03, 7,15, 7.5, 7,67, 7,95 épaulement, 8,30, 8,55 épaulement, 8,86, 9,15, 9,45, 9,9, 10,45 épaulement, 11,1, 11,55 épauleîaent 3 11,9, 13,3, 14,4. BAD ORIGINAL 70 13387 15 2042325 EXEMPLE 7 Régime de base pour volaille Ingrédient g/kg 5 Maïs jaune moulu 514 Farine à l'huile de soja (44 300 Farine de gluten de maïs 50 Farine de poisson Mênhaden (60 %) 50 10 Graisse 40 Farine de luzerne déshydratée (17 %) 20 Chaux broyée 5 Phosphate dicalcique 12 15 Chlorure de sodbm 3 Minéraux à 11 état de traces ^ 1 2 Pré-mélange de vitamines 5 20 : les minéraux à l'état de traces sont le manganèse (6j0 %), l'iode (0,12 %), le fer (2,0 %•), le cuivre (0*2 %), le zinc (2,0 %}, le cobalt (0,02 %), et le calcium (25,5 %). 2 : Le pré-mélange de vitamines contient par kg d'aliment, 125 mg d'hydroxy-toluène butylé, 500 mg de DL-méthionine, 3 300 unités internationales de 25 vitamine/A, 1 100 unités internationales de vitamine D^, 2,2 unités in ternationales de vitamine E, 11 nyug de vitamine 4",4 mg de ribofla vine, 27,5 mg de niacine, 8,8 mg d'acide pantothénique, 500 mg de chlorure de choline, 1,43 mg d'acide folique et 1,1 mg de ménadione-bisulfite de sodium pour 5 g de mais jaune moulu. 30 On place des poussins du jour (6 mâles et 6 femelles par groupe), achetés chez un fournisseur du commerce, dans des enceintes chauffées et on les place dans une salle que l'on maintient à environ 24°C. On pèse tous les groupes de poussins au début des essais et à la fin, c'est-à-dire au bout de 20 jours. On leur fournit de la nourriture et de l'eau à volonté. On utilise 35 le régime de base décrit ci-dessus pour tous les essais. Les essais compren-nent lf utilisation' dé (a) teirioins non. traités, (b) animaux traités avec 10 ppm de AM 374, (c) animaux traités avec 2 ppm de AM 374. Les valeurs ob 70 î3387 16 2042325 tenues sont indiquées dans le tableau IX annsxé, dans lequel ,on peut observer que, sux deux doses de traitement par AM 374, il se produit une amélioration prononcée de la croissance des poussins traités, 5 EXEMPLE 8 Composition du régime (TABLEAU X) Ingrédient Concentration (%) Maïs jaune moulu 51,4 ÎO Farine à l'huile de soja (44 %) 30,0 Farine de gluten de maïs 5,0 Farine de poisson Menhaden (60 %) 5,0 Graisse (NRG-50) 4,0 15 Farine de luzerne déshydratée (17 %) 2,0 Chaux -broyée (33 % de Ca) 0,5 Phosphate dicalcique 1,2 Chlorure de sodium 0,3 20 Minéraux à l'état de traces 0,1 2 Pré-mélange de vitamines 0,5 ; Produit du commerce désigné sous le nom de "Lime Crest Z-2 Delamix", qui contient 25 ,.5 % de calcium, 6,0 % de manganèse, 2,0 % de fer, 2,0 °L de 25 zinc, 0,12 % d'iode et 0,02 % de cobalt. 7 : Assure 3 300 Unités Internationales (IJ.Ï.) de vitamine A, 1 100 U.I. de vitamine D^» 2,2 U.I. de vitamine E, 500 mg-de chlorure de càoline, .500 mg de DL-méthionine, 125 mg d'éthoxyquine, 27,5 mg de niacine. 8,8 mg d'acide panthoténique, 4,4 mg de riboflavines 1,43 mg d'acide, folique, 30 1,lmg de ménadione, 0,011 mg de vitamine E,0. par kg de nourriture. EXEMPLE 9 Préparation de comprimés contenant le AM 374 On incorpore le composé srlti-and:;ogèn&, AM 374, dans un comprimé 35 pharmaceutique type ssIon la formulation suivants : ORIGINAL 70 13387 17 2042325 10 Ingrédient Par comprimé, en mg AM 374 50 Lactose 225 Amidon de maïs (pour mélange) 50 Amidon de mats (pour pâte) 25 Stéarate de magnésium 5 355 On mélange ensemble l'ingrédient actif, AM 374, le lactose et l'amidon de mais pour mélange. On met en suspension I'amidon de maïs pour pâte dans l'eau en un rapport de 100 g d'amidon de mats pour 8QO ml d'eau et on chauffe en agitant en formant une pâte. On utilise ensuite la pâte 15 résultante pour granuler la poudre mélangée. On utilise si cela est nécessaire une quantité supplémentaire d'eau. On fait.passer les granules humides à travers un tamis de 2^4 mm de côté d'ouverture et on les sèche à 49°C. On fait passer les granules secs à traders un tamis de 1*00 sna de côté d'ouverture et on les lubrifie avec du stéarate de magnésium. On soumet ensuite la 20 granulation à une compression pour former des comprimés (poids d'un comprimé: 355 mg) dans une machine à former des comprimés convenable. Chaque comprimé contient 50 mg de l'ingrédient actif. EXEMPLE 10 25 Préparation de capsules à enveloppe dure contenant le AM 374 On peut administrer l'ingrédient actif, AM 374y dans des capsules à enveloppe dure. Une formulation que l'on trouve utile pour préparer les-dites capsules est la suivante : Par capsule. Pour 1 000 capsules, 30 Ingrédient mg fe 35 AM 374 50 50 Lactose 90 90 Stéarate de magnésium 1 1 141 141 70 13387 ie 2042325 5 On mélange l'ensemble l'ingrédient actif, le -lactose et le stéarate de magnésium. On utilise îe mélange pour rsinplir des capsules à enveloppa dure ayant une dimension: convenable avec un poids de remplissage de 141 mg par capsule. EXEMPLE- II Préparation d'une solution peux administration par voie .buccale contenant AM 374 10 Ingrédient Quantité % en poids/volume AM 374 1 jQQ Gel de silicate d * aluminium- magnésium rj. 50 15 Saccharose ?>0.00 Méthylparabène 0,08 Propylparabène 0 *02 Parfum qg 20 Eau distillée q.. s.p. 100,00 On dissout les parabènes et le sficcfaaross dans environ deux tiers du volume final d'eau distillée à 80°C et os y ajoute le gel de silicate, en agitant. On refroidit la solution à 40°G. On ajoute." en agitant, l'ingrédient actif et 25 le parfum. On amène la solution refroidie à son volume final avec de l'eau distillée. La solution contient.50 œg d®ingrédiant actif par dose de 5 ml de la solution. EXEMPLE 12 30 On peut incorporer le constituant actif AM 374 dans une solution injectable selon la formulation suivante : Ingrédient Quantité % en poids/volume Ali 374 5,0 Polyéthylèneglycol 4 000, conforma 35 à la pharmacopée des Etats-Unis d'Amérique 4.0 Chlorure de sodium, conforme à la pharmacopée des Etats-Unis d'Amérique 0,30 BAD ORIGINAL 70 13387 i9 2042325 Quantité %> en poids/volume 0,90 q.s.p. 100 j 0 On prépare le véhicule en mélangeant ensemble tous les ingrédients précités, excepté le AM 374. On rend stériles le véhicule et l'ingrédient actif amenés sous forme micronisée par des moyens convenables. On prépare 10 une solution de l'ingrédient actif dans le véhicula en délayant l'ingrédient actif tout d'abord avec une portion du véhicule et en ajoutant ensuite la portion restante du véhicule en agitant. Une dose de 1 ml de cette solution contient 50 mg de l'ingrédient actif. Ingrédient Alcool benzylique, qualité "pur pour réactif" 5 Eau pour injection. 70 13387 20 2042325 REVENDICATIONS 1 - A titre de produit industriel nouveau, l'antibiotique dénommé 5 AM 374, ledit composé étant caractérisé par ses propriétés indiquées comme suit ; a) il est efficace pour inhiber la croissance des bactéries gram-positives sous sa forme cristallisée essentiellement pure ou sous forme d'un sel, 10 b) il est facilement soluble dans l'eau et le diméthylsulfoxyde, est modérément soluble dans le méthanol et l'éthanol, et relativement insoluble dans les autres solvants organiques courants, c> il présente les valeurs suivantes à 1'analyse élémentaire : C 54,54 ; H 6,10 ; 0 29,01; N 7,60; Cl 2,47, 15 d) il présente des maxima dans le spectre ultraviolet à : 282 m.u. 1 % 17» (E, ° = 42} dans les solutions acides282 m.u (E, "• = 42,5) dans les solu-1 cm y / 1 cm tions neutres, 315 m,u (E ° =° 51,5) dans îes solutions basiques3 un épaulement rtj / i. cm à 260 m,u (E, ° = 92) dans les solutions basiques, ' 1 cm _ Ljs" + e) il présente un pouvoir rotâtoire /eç = - 102° (- 2,9e) 20 (C = 1,045 dans l'eau), et f) il a un spectre d'absorption infrarouge caractéristique tel que représenté à la figure 1 annexée. 2 - Procédé pour la préparation de l'antibiotique selon la revendication 1, ledit procédé étant caractérisé eu ce qu'on cultive une nouvelle es- 25 pèce d'une souche de Streptomyces eburosporeus, productrice de l'antibiotique AM 374, dans un milieu nutritif aqueux dans des conditions aérobies jusqu'à ce qu'une activité antibactérienne notable soit conférée audit milieu par la production de l'antibiotique AM 374, et on complète cette opération par les traitements courants. 30 3 - Procédé selon la revendication 2, caractérisé en ce que le trai tement de complément consiste à isoler l'antibiotique AM 374 obtenu, à partir du milieu de culture. 4 - Compositions vétérinaires renfermant l'antibiotique AM 374 selon la revendication 1 ou l'an de ses sels, en vue du traitement des infections 35 chez les animaux 3 ledit antibiotique pouvant être un mutant. 5 - Nourriture ou boisson pour animaux, caractérisée par le fait qu'elle contient un inhibiteur de croissance de bactéries gram-positives, i ^AD ORIGINAL 70 13387 21 2042325 identifié comme l'antibiotique AM 374 selon la revendication 1, ou comme l'un de ses mutants. 6 - Composition nutritive pour animaux comprenant une alimenta-" tion de nutrition équilibrée, et caractérisée en ce qu'elle contient l'anti- 5 biotique AM 374 selon la. revendication 1 ou l'un de ses mutants. 7 - Nourriture ou boisson pour animaux, caractérisée par le fait qu'elle contient un inhibiteur de croissance des bactéries gram-positives, préparé selon le procédé de la revendication 2. 8 - Composition alimentaire pour animaux comprenant un régime de 10 nutrition équilibré, caractérisée en ce qu'elle.contient l'antibiotique AM 374 préparé selon le procédé de la revendication 2 ou l'un de ses mutants. TABLEAU I Caractéristiques culturales de Streptomyces eburosporeus. nouvelle espèce NRRL 3582 Incubation : 14 jours Température : 28°C Milieu Abondance Mycélium Aérien et/ou Spores Pigment Couleur de l'envers de la soluble j croissance , Gélose - Solution de Czapek légère Mycélium aérien blanchâtre, devenant ivoire (2 db) à ivoire clair (2 ca) dans les zones de sporulation, Sporulation légère. Néant Jaune melon clair (3ea) Remarques Croissance restreinte -4 O UO U> OO ■^1 Gélose - Asparagine-Dextrose Modérée Mycélium aérien blanchâtre, clairsemé. Pas de sporulation Néant Bambou (2 fb) Croissance restreinte, bords des colonies Gélose de Hickey et Tresner Modérée Mycélium aérien blanchâtre, Jaunâtre Croissance de devenant ivoire (2 db) à formation ambre çlair surface papilleuse ivoire clair (Z ca) dans les légère , (3 ic) zones de sporulation. Sporulation légère. >T) t" H \ £ Gélose - Extrait de levure Modérée Mycélium aérien blanchâtre, trace de sporulation Jaunâtre ambre clair formation (3 ic) légère Surface ridée Gélose - flocons d'avoine de Kuster Modérée Mycélium aérien blanchâtre, devenant Ivoire (2 db) à ivoire clair (2 ca) dans les zones de sporulation. Sporulation légère. Brun- jaune melon jaunâtre clair (3 ea) formation légère hydrolyse modérée de l'amidon Gélose - Purée de tomate - farine d'avoine Modérée Mycélium aérien blanchâtre, devenant ivoire (2 db) à ivoire clair T2 ca) dans les zones de sporulation. Sporulation légère. Jaune orange Ambre clair formation modérée (3 ic) Surface papilleuse fO O to LU NJ en TABLEAU I (suite) Milieu Abondance Mycélium Aérien et/ou Spores Pigment Couleur de 1' 1 envers Remarques de la soluhle croissance Gélose - Pomme de terre- Mycélium aérien blanchâtre, Jaune- Ambre clair Légère hydrolyse dextrose Bonne . clairsemé, devenant ivoire orange (3 ic) de l'amidon. {,2 db) à ivoire clair (2 ca) formation Surface des dans les zones de sporulation. modérée colonies ridée Sporulation légère. à rimeuse Gélose de Bennett ; Modérée Mycélium aérien blanchâtre, Jaunâtre Ambre clair Surface plissée clairsemé. Trace de sporula formation (3 ic) et papilleuse tion. légère —I O UJ u> 00 !-d t-f H H £ Gélose - Sels minéraux Amidon Modérée Mycélium aérien blanchâtre, devenant ivoire (2 db) à ivoire clair (2 ca) dans Iês zones de sporulation. Légère sporulation. Néant Jaune melon clair (3 ea) ro o 4> fO LO K3 Cn » O Milieu TABLEAU II Micromorphologie de Streptomyces eburosporeus, nouvelle espèce NRRL 3582 Mycélium Aérien et/ou structures Forme des spores Dimensions des sporifères spores Surface des spores U) U> c© Gélose " Flocons d'avoine de Kuster Mycélium aérien clairsemé donnant naissance à de longues chaînes enchevêtrées et flexueuses de spores . Elliptique à allongée Spores de 0,5-0,6 ,u X 1,0 - 1,3 /u Lisse, ainsi que déterminé par microscopie électronique '"d F H H M fc51 K> O U> K) en TABLEAU III *«4 O Milieu Période d'incubation Abondance de Température : la croissance 28°C Réaction physiologique Bouillon organique au nitrate 7 jours Bonne Pas de réduction des nitrates Bouillon organique au nitrate 14 jours Bonne Pas de réduction des nitrates Gélatine 7 jours ! Bonne Liquéfaction complète Gélose - Peptone - Fer 24 heures Modérée Pas de production de mélamine UO CjO CD ^4 F R e K> o ■ta. K> UO K> Cn A 70 13387 PL. V/ll» 2042325 TABLEAU IV Schéma de l'utilisation de la source de carbone par Streptomyces eburosporeus, nouvelle espèce NRRL 3582 Source de carbone Adonitol 1-Arabinose d-Fructose i-Inositol Lactose d-Mannitol d-Mélézitose d-Mélibiose d-Raffinose 1-Rhamnose Salicine Saccharose d-Tréhalose d-Xylose Dextrose Témoin négatif Incubation : 10 jours Température : 28°C Utilisation O 3 2 3 3 3 O 3. 0 ' 1 3 O 3 3 3 O 3-Bonne utilisation 2-Utilisation moyenne 1-Utilisation médiocre O-Aucune utilisation TABLEAU V Comparaison de Streptomyces NRRÏH 3582, avec S. albidoflavus et J3. odorifer Streptomyces NRRL Mécylium aérien et/ou branches Sporophores longs, portant des spores flexueuxet enchevêtrés S. albidoflavus S. odorifer Sporophores courts, formant Sporophores longs, rectilignes, des spirales ramifiés ; formant des spirales. O U> UO CD ^4 Forme des pores Elliptique à allongée Sphérique Sphérique i-d F • Liquéfaction de la gélatine Liquéfaction complète Liquéfaction rapide Liquéfaction lente ■— H \ P? Pigments solubles Surtout jaunâtres Surtout jaunâtres Surtout brûnatres Croissance sur gélose-Asparagine-Dextrose Croissance jaunâtre ; Mycélium aérien blanchâtre,, clairsemé Croissance brune ; Mycélium aérien devenant jaune blanchâtre Croissance de couleur crème à brunâtre ; Mycélium aérien abondant, de couleur çyème. O K) U> K> Cn 70 13387 PL. VIl/lU' 2042325 TABLEAU VI Activité antimicrobienne £n vitro de l'antibiotique AM 374 et de son produit d'hydrolyse. . Concentrations minimales inhibitrices (laicrogrammes par ml). Antibiotique Produit d'hydrolyse AM 374 Staphylococcus aureus ATCC 6538 P Staphylococcus aureus N° 69 Staphylococcus aureus Rose ATCC 14154 Staphylococcus aureus Smith ATCC 13709 Streptococcus pyogenes C203 Streptococcus faecalis ATCC 8043 Streptococcus sp., non hémolytique N° 11 Streptococcus sp., p-hémolytique 80 My eob a c t e r i um smegmatis ATCC 607 Salmoaella typhosa ATCC 6539 Proteus vulgaris ATCC 9484 Escherichla coli U311 Escheriehia coli DY Klebsiella pneumoniae Souche AD Enterobacter aerogenes N° 75 Pseudomonas aeruginosa ATCC 10145 3,1 3.1 6.2 6,2 0,62 3.1 6.2 6,2 y 250 >250 >250 T 250 y 250 -^250 7-250 >250 .6,2 3.1 6.2 6,2 1 ^2 5 6,2 6,2 6,2 125 y 250 •7 250 -y 250 -7250 ■7 250 >250 y 250' En utilisant la méthode de dilution en gélose. TABLEAU VII Activité antibaçtérienne in vivo de l'antibiotique AM 374 Nombre de souris survivantes/nombre total des souris, 14 jours après l'infection. Dose mg/kg de poids du corps 320 80 20 5 1,25 0,32 Staphylococcus aureus souche Smith 20/20 20/20 1/20 2/20 Staphylococcus aureus épuche rose 20/20 18/20 4/20 0/20 Streptococcus pyogenes C 203 20/20 20/20 3/20 0/?0 Diplococcus pneumoniae SV1 20/20 20/20 15/20 0/20 Chez les souris témqinç, infectées et non traitées, 95-100 % d'entrés elles meurent 5 jourç après l'infection. ^4 O LU UO CO F H H H > e K) O K3 U> K> Cn 70 13387 PL. IX/ltL 2042325 TABLEAU VIII Activité antibactérienne in vivo du produit d'hydrolyse de AM 374 Souris survivantes/totales 14 jours après l'infection Dose mg/kg Staphylococcus aureus de poids du corps souche Smith 20 5/5 5 3/5 1, 25 ' o/5 0,32 1/5 0,08 0/5 tableau IX Activité sur la croissance et sur la nutrition de poussins recevant des rations contenant le AM 374 H 1 2 3 4 5 6 7 8 Amélioration % Additif alimentaire Taux (ppm) Expérience N° Gain de 0-20 (g) jours Aliment/gain Taux de survie gain A/G Aucun —- A 266 1,70 29/30 AM 374 10 284 1,62 30/39 6,8 4,9 Aucun B 288 1,75 39/40 AM 374 2 302 1,63 18/20 4,9 7,4 La colonne 4 / Gain de 0-20 jours (g)J représente le gain de poids total pendant la durée de 20 jours de l'essai. La colonne 5 (Aliment/gain) représente le rapport entre le nombre de grammes d'aliment consommé par gramme de gain de poids du corps. La colonne 7 /"Amélioration % (gain)_J représente le pourcentage d'amélioration du gain de poids (par exemple ; 315 266 x 100 100 - 18,4) La colonne 8 /"Amélioration % A/G^7 représente le pourcentage d'amélioration du rapport en grammes d'aliment par gramme du gain de poids ( par exemple : 1,7 1,5 x 100 - 100 - 13,3) "^4 O UO UJ oo --4 >v ih s hO O 4s» S> U> K> Ui T A B h E A (? % li i • o """ *3 4 5 6 7 8 Additif alimentaire Taux Expérience Gain de 0-20 jours Aliment/gain Taux de survie Amélioration % (ppm) r (g) gain A/G Aucun 1559 266 . 1,70 29/30 «*•*»»» — ■»»«*•-t Pénicilline '200 315 1,50 28/30 18,4 13.3 Payzcme 1Q 298 1,58 30/30 12,0 7,6 AM374 ,10 284 1,62 30/30 : 6,8 4,9 AV2S0 10 282 1,59 28/30 6,0 6,9 Aucun 1563 288 1,75 39/40 Pénjlci i. line 200 317 1,70 20/20 • 10,0 2,9 Payzooe 10 289 1,75 20/20 0,3 0,0 à» 7 4 2 302 1,63 18/20 4,9 7,4 &V290 2 312 1,70 20/20 8,3 2,9 La colonne 4 /"Gain de 0-20 jouÈs (g)_7 représente le gain de poids total, pendant la durée de 20 jours de l'essai. La colonne 5 t/gain) représenté le rapport entre le nombre de grammes d'aliment consommé par gramme de gain de pp.-,la du .corps. La c.?l&nne 7 /"Awéïioratioa % (ga'in)^7 représente le 'pourcentage d'amélioration du gain de poids (par- exemple : f ■1 266 100 J 100 a .18,4) La colonne 8 / Amélioration % A/GJ représente le pourcentage d'amélioration du rapport en grammes d'aliment par gramme du gain de poids (par exemple : >-4 O U> LU œ *-4 >-d F X H \ {s § S Q 13 7 1,5 100 100 = 13,3) ïïovis de marque d'une acétoneguanylhydrazone,- facteur de croissance animale. hO CD ■fc* NJ U> K) en