FR 2032315 A1 19701127 FR 6945388 A 19691230 45388 -1- 2032315 10 la présente invention concerne "an procédé de fabrication de 1 'uridine-5 '-diphosplioglucose (désigné ci-après en abrégé par UDPG) par une méthode de fermentation. L'invention concerne plus particulièrement un procédé de fabrication de l'UDPG, économiquement et à l'échelle industrielle, en utilisant la fermentation bactérienne. L'UDPG est un composé utile en tant qu'additif dans le lait, (voir par exemple le brevet des Etats-Unis d'Amérique n° 3.231.385) et «n tant que réactif en biochimie. Il agit aussi en tant que coenzyme dans le métabolisme du glucose. Sa formule est la suivante : 15 20 25 CH20H H ùi Si s® ® f\0E B/% I | hoN—I 0 P 0 P— H OH I I ■P 0CH2 -0. H OH OH H l'UDPG se préparait auparavant par une méthode de séparation appliquée aux levures de panification (Journal of Biological 30 Ghemistry, vol» 184, p. 333, 1950) ou par un procédé de synthèse (Journal of American Society, vol. 80, p. 3756, 1958). Ces méthodes cependant n'ont pas donné entière satisfaction pour la fabrication de l'UDPG à l'échelle industrielle en raison du rendement et du prix de revient qui ne permettent pas la rentàbili-35 té. L'UDPG est actuellement considéré comme un produit excessivement coûteux. On sait également que l'UDPG s'accumule si l'on cultive tua mélange de monophosphate d'uridine (MPU) ou de phosphate d*u- 45388 -2- 2032315 ridine (DPU) avec un extrait de levures exemptes de cellules. (Archieves of Biochemistry and Biophysics, vol. 34, p'. 482, • 1951). Cependant ces supports sont également onéreux, de sorte que cette méthode particulière de fermentation de la levure n1-5 est pas non plus appropriée. Selon la présente invention, _on a découvert une méthode dans laquelle l'UDPG se forme et s'accumule en quantités considérables dans un liquide de culture bactérienne à partir des acides orotiques ou de l'uracile, qui sont des produits bon 10 marché. Cette méthode a des implications industrielles, car elle n'utilise pas le MPU ou le DPU comme matière de départ. La caractéristique la plus importante dçla présente invention est que l'on utilise une bactérie appartenant à une des espèces suivantes s Brevibacterium, Corynebacterium, Arthro-15 bacter ou Nicrococcus en tant qu'organismes de culture, et que l'on eultive cet organisme dans un milieu renfermant de l'acide orotique ou de l'uracile et de la levure sèche. En ce qui concerne la composition du milieu utilisé dans la présente invention, on peut employer tout milieu de cul-20 ture qui renferme une quantité appropriée de matière sucrée ou une autre source de carbone, telle que le glucose, l'hydrolysat d'amidon, la mélasse,ou analogue, une source d'azote, telle que l'urée, le chlorure d'ammonium, le nitrate d'ammonium, le sulfate d'ammonium, ou analogues, et des substances naturelles azo-25 tées, telles que l'extrait soluble de maïs, l'extrait de levure, les peptones, la farine de poisson, ou analogues. Si l'on utilise des souches ayant des exigences nutritionnelles, les substances qui répondent à ces exigences nutritionnelles doivent être ajoutées au milieu de culture en quantité appropriée. 30 Pour la mise en pratique de l'invention, on inocule un micro-organisme dans un milieu approprié et on y ajoute de l'acide orotique ou de l'uracile (ou les deux à la fois) ainsi que de la levure sèche pendant le traitement de culture. La culture est poursuivie jusqu'à ce que l'UDPG se soit accumulé en quanti-35 "té importante dans le liquide de culture. L'acide orotique et l'uracile peuvent être ajoutés au milieu de exil ture avant l'inoculation. Il est préférable de les utiliser à une concentration réunie totale de l'ordre de 0,1 g/1 à 50 g/1, mais de préférence 69 45388 -3- 2032315 de l'ordre de 0,5 g/1 à 10g/l. Les-dits composés, évidemment, sont utilisables sous forme de sels non toxiques. On peut obtenir des levures sèches en utilisant des méthodes connues, par exemple en employant un séchage par congélation ou un séchage à 5 l'air. En tant que levures, on peut utiliser divers micro-organismes, tels que : Saccharomyces cerevisiae, Saccharomyces lac-tis, Torulopsis spharica, Candi da guillermondii, Kloeckera africana, Zygosaccharomyces major, et similaires. La levure de boulanger ou la levure de brasserie non 10 séchées, que l'on trouve dans le commerce, peuvent être séchées par exemple par un traitement de séchage à l'acétone, par un séchage par congélation ou par un séchage à l'air. Une autre possibilité consiste à utiliser de la levure sèche, disponible dans le commerce, pour la panification, directement et sans aucun 15 traitement. On peut utiliser de la levure à diverses concentrations. D'une manière appropriée, une quantité de l'ordre de 5 g/1 à 200 g/1 est favorable à l'accumulation de l'UDPG en une courte période de temps. La fermentation s'effectue dans des conditions aérobies, 20 par exemple en utilisant une technique de culture par agitation ou une aération-agitation de la culture submergée. Les conditions du traitement de culture favorables et préférées sont : une température de -20 à 40° C, un pH de l'ordre de 4 à 9,5* La période de culture est en général de 2 à 8 jours. On peut ajouter de l'a-25 cide orotique ou de l'uracile au début de la culture, c'est-à-dire avant l'inoculation, ou pendant la période de culture avec la levure sèche. Comme le montrent les exemples, on obtient en général des résultats favorables si l'on ajoute l'acide orotique ou l'uracile pendant le traitement de culture et si l'on ajoute 30 ensuite la levure sèche lorsque la fermentation a commencé depuis un certain temps. On peut ajouter du phosphate minéral et des matières saccharinées en même temps que la levure sèche. On récupère l'UDPG dans le milieu de culture, lorsqu'une accumulation maximale importante a eu lieu. L'accumulation de l'UDPG peut 35 être suivie par des méthodes analytiques, telles que la chromato-graphie sur papier, la chromatographie en couche mince, et similaires. La séparation de l'UDPG du milieu de culture après 69 45388 -4- 2032315 10 achèvement du traitement de culture peut être effectuée par des techniques connues telles qu'un traitement par des résines échan-geuses d'ions et l'adsorption par de la poudre de carbone. On peut utiliser la méthode découverte par H.G. Pontis etjâutres (Biochemica Biophysica Acta vol. 26, p. 146 (1957)* Exemple 1 On utilise la race Brevibacterium ammoniag ene s ATCC 6872 en tant que souche d'ensemencement et on la cultive dans un milieu d'ensemencement renfermant 2 % de glucose, 1 % de peptone, 1 % d'extrait de levure, 0,3 % de NaCl et 30yOg/l. de biotine, à 30°C pendant 24 heures. Ensuite, on inocule la culture d'ensemencement, dans la proportion de 10 % en volume, dans un milieu de fermentation ayant la composition suivante : 100 g glucose 15 6 g urée 10 g KHgPO^ 10 g K2HP04 10 g MgS0^_. 7H2o 0,1 g CaClg'SHgO 20 30 yUg biotine 10 g extrait de levure On prépare le milieu de fermentation dans un litre d'eau et on ajuste son pH à 8 avec NaOÏÏ. Ensuite, on verse le * \ 2 milieu de fermenta^ion dans des flacons stérilisés à 1 kg/cm 25 pendant 10 minutes dans un autoclave. On verse des portions de 20 ml de milieu de fermentation dans des flacons coniques de 250 ml, qui sont stérilisés avant usage. Les flacons renfermant le milieu de fermentation inoculé sont cultivés d'une manière aérobie à 30°C. Après 72 heures 30 de fermentation, on ajoute de l'acide orotique à une concentration de 2 g/1 et la fermentation est poursuivie pendant 48 heures. Ensuite, on ajoute de la"levure sèche Orientale" à une concentration de 100 g/1 et on poursuit le traitement de culture pendant 2 heures. En conséquence, l'UDPG s'accumule dans le mi-35 lieu de culture, et sa teneur est de 3,6 mg/ml. On ajuste le pH de la partie surnageante centrifugée d'un litre de milieu de culture à la valeur de 7, et ensuite on la fait passer dans une colonne consistant en une résine échan- 69 45388 -5- 2032315 geuse d'ions fortement "basique Dowex 1x4 (type 01""). On prélève par extraction la portion de l'UDPG et" on la recueille en utilisant une des méthodes dénommées méthodes d'extraction graduelle consistant à faire passer dans la colonne une solution de chlo— 5 rure de sodium dissous dans HC1 (0,01 N), et la concentration augmente graduellement de 0,02 ÎT à 0,2 ET. Ensuite on reprend par extraction la portion d'UDPG recueillie après absorption par la poudre de carbone en utilisant 50 % d'alcool, puis ensuite, on la recueille. On concentre la portion d'UDPG obtenue sous pres- 10 si on réduite, on la neutralise avec de l'hydroxyde de baryum jusqu'à pH 8 et on la fait précipiter par addition d'alcool. On centrifuge le système et on lave le précipité avec de l'alcool et de l'éther, puis on le sèche dans un dessicateur à vide. En conséquence, on obtient 700 mg de sel de baryum d'UDPG. 15 Si l'on applique le mode opératoire ci-dessus en uti lisant la souche Brevibacterium ammoniagenes ATCC 6871 au lieu de Brevibacterium ammoniagenes ATCC 6872, il s'accumule 21 mg/ml d'UDPG dans le milieu de fermentation. Exemple 2 20 On applique le mode opératoire de l'Exemple 1, excepté que l'on utilise de l'uracile à la place de l'acide orotique, à concentration de 2 mg/ml. L'UDPG s'accumule dans le milieu de fermentation à une teneur de 3»3 mg/ml. Exemple 5 25 La fermentation est effectuée de la même manière que dans l'exemple 1, excepté que l'on ajoute de la levure sèche au milieu de culture, en mime temps que l'acide «rôtique.L'UDPG - s'accumule dans le liquide de culture à une teneur de 3,9 mg/ml. Exemple 4 30 On applique le mode opératoire de l'Exemple 1, excepté que l'on utilise des cellules de levure de boulanger ("levure Dia") séchées à l'acétone à la place de la "levure sèche Orientale" et que l'on ajoute le glucose à une concentration de 5 % en même temps que l'addition de levure sèche. L'UDPG s'accumule 35 dans le liquide de culture à une teneur de 3,6 mg/ml. Exemple 5 On effectue le traitement de culture de la même manière que dans l'Exemple 1 excepté que l'on utilise les divers micro 45388 —6- 2032315 organismes énumérés au Tableau 1. le taux d'accumulation dans chaque cas est également indiqué. TABLEAU 1 5 Mxcroorgamsmes :Taux d'accumulation de : UDPG (mg/ml) Corynebactérium ATCC 21084 * 3,* Arthrobacter ATGC 21085 : 2,8 Micrococcus sodonensis ATCO 15932 : 1,6 10 Arthrobacter citréous ATCC 11624 : 1,7 Corynebacterium mycétoïdes ATGC 21134 s 2,1 Exemple 6 Le traitement de culture est effectué de la même ma-15 nière que dans l'Exemple 1, excepté que l'on utilise les cellules séchées à l'acétone des micro-organismes indiqués au Tableau 2, en tant que levures sèches. Le taux d'accumulation de l'UDPG est indiqué au Tableau 2. TABLEAU 2 Microorganismes Taux d'accumulation àe UDPG (mg/ml) Saccharomyces cerevisiae ATGC 15248 : 2,3 Saccharomyces lactis ATCC 12425 î 2,1 Torulopsis sphaerica ATCG 8549 : 2,6 Zygosaccharomyces major ATCC 15249 1,2 Kloeckera africana ATCC 16512 : 0,9 Candida Kuillermondii ATCC 9058 : 0,7 30 La "levure sèche Orientale" et la levure "Dia* sont les dénominations commerciales de levures de boulanger commerciales, mises en vente par ll"Oriental Yeast Co., Ltdn, Tokyo, Japon et "Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd" Tokyo, Japon» Au point de vue classification, elles sont constituées par la race Saccharo-35 myces cerevisae. 45388 -7- 2032315 - EEVENDICATIOHS - 1 - Procédé de fabrication de 1 ' uridine-51 -diphospho-glucose caractérisé en ce qu'on cultive un microorganisme appartenant à l'une des espèces suivantes : Brevibacterium, Arthro-5 bacter, Corynebacterium ou Micrococcus, dans tin milieu de culture renfermant de la levure sèche et de l'acide orotique et/ou de l'uracile, qu'on provoque l'accumulation de 1'uridine-5'-diphos-phoglucose dans le milieu de culture, et qu'on récupère le produit dans le milieu de culture. 10 2 - Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que le traitement de culture est exécuté d'une manière aérobie. 3 - Procédé selon la revendication 2, caractérisé en ce que la levure sèche appartient à l'une des espèces suivantes : Saccharomyces, Torulopsis, Zygosaccharomyces, Kloeckera ou Can- 15 dida. 4 - Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que le pH du milieu pendant la fermentation est maintenu entre * et 9,5. 5 - Procédé selon la revendication 1, caractérisé en 20 ce que la température du milieu de culture est de l'ordre de 20 à 40°C. 6 - Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que la proportion globale d'uracile et d'acide orotique, est de l'ordre de 0,5 à 10 g/1. 25 7 - Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que le microorganisme appartient^ l'espèce Brevibacterium ammoniagenes. 8 - Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que le microorganisme appartient à l'espèce Micrococcus 30 sodonensis. 9 - Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que le microorganisme appartient à l'espèce Arthrobacter citreus.