FR 2035810 A1 19701224 FR 6932866 A 19690926 32866 -1- 2035810 La présente invention concerne uh procédé de préparation d'un nouveau complexe de prothrombine contenant les facteurs de coagulation suivants : prothrombine (facteur II), proconvertine (facteur VII), facteur B antihémophile (facteur IX) et facteur 5 Stuart-Prower (facteur X). Le processus de la coagulation sanguine est une activité physiologique compliquée qui implique l'interaction de nombreuses substances" trouvées dans le sang entier normal. On sait que certains facteurs associés au mécanisme de coagulation du sang man-10 quent totalement ou fortement chez certains individus. Parmi ces substances, il y a le facteur B antihémophile (facteur IX) qui est aussi connu sous le nom de composant thromboplastine du plasma (Fi'C) ou facteur Christmas. Chez des individus souffrant d'hémophilie congénitale connue sous le nom d'hémophilie B, le sang 15 est? partiellement ou complètement dépourvu de ce facteur. Les facteurs II, YII et X sont d'autres facteurs importants dans le mécanisme de la coagulation. Comme dans le cas du facteur IX, ces autres facteurs peuvent manquer partiellement ou totalement chez certains individus. 20 On sait déjà qu'un concentré de plasma contenant une association de plusieurs ou de tous les facteurs précédents serait extrêmement utile dans le traitement de malades manquant de tels facteurs. Ainsi, un complexe de prothrombine préparé à partir de plasma frais par adsorption sur sulfate de baryum est décrit dans 25 le brevet US. 2.999-791 et par 1'adsorption sur phosphate tri-calcique par Soulier et coll dans "La presse médicale", Vol* 72, p. 1225-28 (1964-). Bidwell et coll dans la revue "Brit. J. Haemat.", Vol. 15» P. 568-80 (1967) décrit la préparation d'un complexe de prothrombine à partir d'une fraction riche en globu-50 lines dénommée &£• La fraction est obtenue par Bidwel par précipitation alcoolique du plasma, puis elle est fractionnée ultérieurement pour donner un complexe de prothrombine par adsorption sur phosphate tricalcique et traitement à l'éther di-éthylique à basses températures. 55 la présente invention fournit une nouvelle méthode de préparation d'un complexe de prothrombine de grande puissance pour l'injection intraveineuse. Le terme de "complexe de prothrombine" représente ici un concentré de protéines du sang, qui sont actives dans le phénomène 40 de coagulation et comprennent principalement les facteurs II, 69 32866 -2- 2035810 VII, II et I. Selon la présente invention, on prépare un nouveau complexe de prothrombine à partir de la fraction III de plasma Cohn. Cette fraction est principalement une fraction de globulinês béta et 5 gamma du plasma sanguin, obtenue par précipitations successives avec de l'éthanol froid. Cette fraction III de plasma Cohn est décrite en détail dans la publication "J. Am. Chenu Soc. Vol. 68, p. ^-95-575 (1946)". Un avantage unique de la présente invention est que cette 10 fraction III employée, peut être préparée à partir de plasma vieilli, ainsi que du plasma frais. Ainsi, suivant l'invention, on peut utiliser un plasma recueilli depuis déjà un certain temps et qui serait autrement rejeté. Selon le procédé de l'invention, on met la fraction III de 15 plasma Cohn en suspension aqueuse, de préférence dans une solution saline physiologique normale (qui est line solution aqueuse . à environ 0,85 % de chlorure de sodium); on ajuste le pH entre environ 7»0 et 7»4; on sépare la suspensipri résultante et mélange complètement le liquide surnageant avec du phosphate de cal-20 cium tribasique dit phosphate tricalcique, pour adsorber les facteurs de coagulation. On obtient un précipité de protéines ad-sorbées sur phosphate tricalcique que l'on mélange soigneusement avec du citrate trisodique ayant une concentration d'environ 0,1 M à 0,2 M, pour éluer les facteurs de coagulation; le li-25 quide surnageant est séparé des particules de phosphate tricalcique. On dilue de préférence le liquide surnageant avec de l'eau jusqu'à doubler son volume , puis on le soumet successivement à deux précipitations à l'éthanol froid : d'abord à pH voisin de 6,8 et à une concentration finale d'environ 14- % à 16 % 30 d'éthanol à environ -5°C, avec rétention du liquide surnageant; puis, ensuite à un pH voisin de 5,2 et à une concentration finale d'environ 25 % d'éthanol à environ -7°0» avec rétention . du précipité. Le précipité qui contient le complexe de prothrombine actif est alors mis en suspension dans une solution saline 35 citratée, en un volume inférieur à environ le 1/200 du volume de plasma initial que représente le complexe. Dans cette méthode, il est important d'effectuer une étape de coagulation après avoir mis en suspension la pâte de fraction III de plasma Cohn initiale. Cette étape de coagulation 40 élimine des protéines contaminantes ind~-ésirables provenant du 69 32866 -3- 2035810 procédé de fractionnement précédent, mis en oeuvre pour préparer la fraction III du plasma Cohn. Le pH initial de cette pâte de fraction en suspension est d'environ 5,4-; on effectue la coagulation en augmentant le pH de la suspension jusqu'à environ ?,0 5 à 7i^ à l'aide d'un réactif alcalin. Un réactif alcalin avantageux est constitué par une solution aqueuse de soude environ 1S". On peut également utiliser d'autres alcalins classiques, par exemple une solution aqueuse de bicarbonate de sodium à 10 %. Lorsqu'on a séparé le précipité provenant de l'étape de coa-10 gulation, ae préférence par centrifugation, on effectue 1'adsorption du liquide surnageant en ajoutant une petite quantité ae phosphate tricalcique. Le phosphate tribasique utilisé dans cette invention est une matière du type polymère, qui peut être représentée par la formule 10 CaO, 3 -^2^5' H2° ou ^arLS une va~ 15 riante par la formule : Ca,|Q(0H)2(:P0^)g. il est avantageux d'utiliser d'environ 0,5 à 2 % en poids de ce phosphate pour 1'adsorption des facteurs de coagulation; une concentration d'environ 1 fé est plus avantageuse. On a intérêt à mélanger le phosphate au liquide surnageant pendant environ 15 à 30 mn, pour 20 permettre une adsorption pratiquement maximum des facteurs de coagulation. Le précipité de phosphate tribasique ayant adsorbé les protéines est séparé par centrifugation, puis mis en suspension dans du citrate trisoaique, de préférence en un volume d'envi-25 ion. 1/50 du volume du plasma initial. Il est avantageux de mettre en oeuvre une solution aqueuse de citrate trisodique 0,1 M pour l'élution des facteurs de coagulation depuis le phosphate adsorbant. Le précipité est de préférence mis en suspension dans le citrate trisodique sous agitation constante pendant en-30 viron 15 à 30 mn, afin d'effectuer une élution pratiquement complète des facteurs de coagulation. On a intérêt ensuite à séparer les facteurs de coagulation élués des particules de phosphate tricalcique, par centrifugation sous agitation constante. Lorsqu'on a éliminé le précipité de phosphate, il est avanta-35 geux d'ajouter un anticoagulant, par exemple l'héparine, à la solution. On utilise environ 2 à 3 unités d'héparine par ml (unité de la pharmacopée américaine). On ajoute ensuite axviron 1 à 10 unités/ml d'anticoagulant supplémentaire au précipité remis en suspension, après la seconde précipitation à l'éthanol. 40 Lorsque les deux précipitations alcooliques sont effectuées, 69 32866 2035810 le précipité obtenu dans l'alcool et remis en suspension, contient le complexe actif de prothrombine; il est avantageux ae le lyophiliser après avoir ajusté le pH à environ 6,8 et filtré pour éliminer toutes particules indésirables et en même temps obtenir 5 un produit stérile sans avoir besoin de chauffer. le produit sec lyophilisé est stable et peut être reconstitué avec de l'eau avant utilisation en administration intraveineuse. Cette administration au complexe de prothrombine sert à corriger temporairement les teneurs en facteurs II, VII, IX et X, chez des personnes 10 manquant de tels facteurs, à arrêter des saignements et/ou à empêcher des saignements attendus, par exemple lorsqu'ils sont associés à des maladies du foie et des maladies hémorrhagiques des nouveaux-nés. L'invention sera mieux comprise à la lecture de la descrip-15 tion détaillée qui va suivre de quelques exemples non limitatifs de modes de réalisation suivant l'invention. Dans ces exemples, tous les pourcentages et parties sont donnés en poids, sauf indication contraire. Exemple 1 20 On met en suspension une pâte de fraction III de plasma Cohn provenant de plasma frais, dans une solution saline à 0,85 %» avec un volume total égal à 1/5 du^ volume du plasma initial; on agite pour effectuer une suspension homogène. Le pH de la suspension est alors ajusté à 7 >2 avec une solution aqueuse de bicarbo-25 nate de sodium à 10 %. La suspension est centrifugée. Le liquide surnageant est additionné de phosphate tricalcique jusqu'à ureoan-centration de 1 %. On mélange pendant 30 mn, puis centrifuge la solution. Le précipité de phosphate est alors mis en suspension dans du citrate trisodique 0,1 M jusqu'à obtenir un volume égal 30 au 1/45 du volume de plasma initial. On mélange pendant trente minutes à 5°C5 puis centrifuge la solution pour éliminer les particules de phosphate tricalcique. Le liquide surnageant est additionné d'héparine jusqu'à une concentration de 3 unités d'héparine par ml. On ajoute un volume égal d'eau et ajuste le 35 PH à 6,8 avec de l'acide acétique 2N. On ajoute de l'alcool éthylique pour donner une concentration finale de 16 %, tout en abaissant peu à peu la température jusqu'à -5°C. On évacue le précipité formé. Le liquide surnageant est ajusté à pH 5,2 et on ajoute suffisamment d'alcool éthylique pour obtenir une concen-40 tration finale de 25 alors que la température est abaissée 69 32866 -5- 2035810 à -7°C. Cette suspension est centrifugée et le précipité est récupéré, puis dissous dans une solution saline citratée (une partie de citrate de sodium 0,1 M pour 9 parties de solution de chlorure de sodium à 5 %) jusqu'à donner un volume égal à envi-5 ron 1/225 du volume initial de plasma. Le pH est ajusté à 6,8 avec de la soude 1M". On ajoute 3 unités d'héparine par ml et filtre la solution à travers -une série où une combinaison de filtres Millipore dont*la taille des pores est échelonnée. La solution est versée sous des conditions aseptiques dans des fla-10 cens de verre stériles de 100 ml, à raison de 20 ml de solution par flacon. Après congélation dans les flacons et séchage à l'état gelé sous conditions aseptiques, les flacons sont fermés sous vide avec des bouchons stériles et capsulés. Le produit sec produit selon l'invention peut servir pour une injection intravei-15 neuse, après avoir été reconstitué avec 20 ml d'eau stérile par unité de produit sec. Exemple 2 On répète le mode, opératoire de l'exemple 1 à la différence que la fraction III du plasma Cohn provient de plasma vieilli 20 et non de plasma frais. Le plasma est obtenu à partir d'une masse de plasma vieux de deux semaines à deux mois et conservé à -25°C pendant des durées diverses allant jusqu'à neuf semaines, avant d'être traité, selon le mode opératoire décrit dans l'exemple 1. Après reconstitution avec de l'eau stérile, on teste le 25 complexe de prothrombine ainsi préparé, de la façon suivante : a) Teneur en facteur II. On recherche l'activité de la prothrombine selon les méthodes de Ware et Seegers, décrites dans la revue "Am. J. Clin. Pathol". Toi. 19, P» 471-82 (1949) et Wagner et coll. dans la revue "Blood Coagulation , Hemorrhage 30 and Thrombosis" édité par Tocantins et Eazal, publié par Grune et Stratton, Beat-York, p. 159-165 (1964). b) Teneur en facteur IX. On recherche l'activité du PTC selon la méthode de correction de temps de thromboplastine partielle activée par kaolin, décrite dans "Hyland Eeference Manual of 35 Coagulation Procédures", publié par les laboratoires Hyland, Los Angeles, Californie, p. 19-21 (2ème édition, 1964). c) Activité de la thrombine. On détermine la présence de la thrombine en cherchant le temps de coagulation du plasma normal recalcifié, à des dilutions diverses, selon la méthode de 40 Bidwell et Dike, "Treatment of Hemophilia and Ahher Coagulation 69 32866 -6- 2035810 Disorders", édité par Biggs et Mac Farlane, publié par P.A. Dav:is Go. Philadelphie, p. 62-69 (1966). d) Teneur totale en protéines. Elle est déterminée par absorption U.V. à 280 nyu. 5 Ces différents essais montrent que le complexe de prothrombine de cet exemple ne présente aucune activité de la thrombine et contient (en moyenne) environ 7,84 mg de protéines par ml. L'activité moyenne du facteur IX de ces échantillons est environ dix fois celle d'un volume équivalent de plasma entier normal. 10 L'activité moyenne du facteur II est environ cinq fois celle - d'un volume équivalent de plasma entier normal. Comme le plasma normal entier contient environ 70 mg de protéines par ml, l'activité du facteur IX dans le complexe de prothrombine de cet exemple est contenue dans seulement un quatre vingt dixième 15 (1/90) de la quantité de protéines présente dans le plasma fournissant une quantité égale d'activité de facteur IX et -l'activité du facteur II est renfermée dans seulement 1/45e .de la quantité de protéines présente dans le plasma1 fournissant une quantité égale d'activité de facteur II. 20 Le complexe de prothrombine de l'exemple précédent présente aussi une activité des facteurs VII et X élevée par rapport aux valeurs trouvées daij.s du plasma entier normal. Ces facteurs sont généralement mesurés simultanément dans la détermination du complexe de proconvertine Stuart-Prower. 25 Bien entendu, l'invention n'est nullement limitée aux exemples décrits, elle est susceptible de nombreuses variantes accessibles à l'homme de l'art, suivant les applications envisagées et sans qu'on s'écarte poux cela, du cadre de l'invention. 69 32866 -7- 2035810 - R&Yàïi ivIGATI ORS - 1 - Procédé de préparation d'un complexe de prothrombine qui consiste à : ajuster le pH d'une suspension aqueuse de fraction III ae plasma Cohn entre environ 7,0 et 7,4-; à séparer la sus- 5 pension résultante et à mélanger soigneusement le liquide surnageant avec du phosphate de calcium tribasique pour adsorber les facteurs de coagulation, à mélanger complètement le précipité de phosphate-protéines adsorbées avec du citrate trisodique pour éluer lesàits facteurs de coagulation, à séparer la suspension 10 résultante et à soumettre le liquide surnageant à deux précipitations successives par l'éthanol froici, la première à un pH d'environ 6,8 et à une concentration finale d'environ 14 % à environ 16 % d'éthanol à environ -5°C» avec rétention du liquide surnageant, l'autre à un pH d'environ 5,2 et à une concentration fi-15 nale d'environ 25 % d'éthanol à environ -7°C, avec rétention du précipité qui est le complexe actif de prothrombine. 2 - Procédé suivant 1, dans- lequel la fraction III de plasma Cohn provient de plasma vieilli. 3 - Procédé suivant 1, dans lequel la fraction III du plasma 20 Cohn provient de plasma frais. 4 - Procédé suivant l'une des revendications précédentes, qui comprend de plus la suspension du complexe actif de prothrombine dans une solution saline citratée, à un volume inférieur à environ le 1/200e du volume de la masse initiale de plasma que le 25 complexe représente. 5 - Procédé suivant la revendication 4 caractérisé en ce qu'on lyophilise le complexe pour obtenir un produit pratiquement sec. 6 - Complexe de prothrombine préparé selon le procédé décrit 30 dans l'une des revendications précédentes. 7 - Utilisation du complexe suivant la revendication 6, pour le traitement de malades chez lesquels les facteurs de coagulation sont absents ou fortement déficients.