FR 2026896 A1 19700925 FR 6944221 A 19691219 44221 i* 2026896 La présente invention concerne des compositions aqueuses contenant des enzymes amylolytiques servant à la dégradation de dérivés d'amidon et caractérisas par une stabilisation vis-à-vis de la perte de l'activité amylolytique. 5 On sait que l'on utilise des enzymes amylolytiques pour l'altération et/ou la dégradation de dérivés d'amidon. Far exemple, dans le brevet des Etats-Unis d'.amérique i^° 2 607 :?59 (19 Août 1962) on décrit des compositions contenant un enzyme amylo-lytique servant'à faciliter l'élimination de matériaux poreux "teLs 10 que des papiers peints, des étiquettes et des pâtes de type caséine de surfaces sur lesquelles ces matériaux poreux sont collés par un adhésif renfermant de l'amidon. Egalement, Jaag dans Seifen, Ole, ffette, Pactise 88, Ko. 24, pp. 7^9-793, (Nov. 1962) décrit l'utilisation d'enzymes amylolytiques dans des formulations de 15 blanchissage. Ces enzymes aident lé processus de nettoyage en attaquant les salissures et les taches d'amidon que l'on trouve sur des tissus tachés, et en décomposant et/ou en altérant ces taches pour les rendre plus facile à éliminer au cours du blanchissage. Les matériaux enzymatiques sont des produits coûteux et puissants 20 qui doivent être composés et utilisés judicieusement, ^uand ils sont utilisés dans des compositions aqueuses, ces enzymes sont instables et subissent une dégradation notable pendant des périodes de stockage prolongées, comme le montre la diminution importante de l'efficacité de dégradation de l'amidon et/ou d'élimina-25 tion des salissures et des taches. La diminution de l'activité a-mylolytique est particulièrement sévère aux températures élevées. En outre, des compositions aqueuses de blanchissage contenant des enzymes amylolytiques renferment souvent d'autres composants intéressants pour le procédé de blanchissage mais qui ont un effet 30 nuisible sur l'enzyme amylolytique. Des enzymes protéolytiques, par exemple, bien qu'utiles pour conférer des propriétés d'élimination des salissures et des taches protéiniques à des compositions de blanchissage, ont souvent tendance à présenter un tel effet nuisible sur les enzymes amylolytiques. 35 On a fait dans cette technologie des essais pour obte nir des compositions contenant des enzymes amylolytiques dans lesquelles l'activité enzymatique soit préservée par l'incorporation d'un agent stabilisant. Ces essais ont en général fait appel à l'incorporation dans ces compositions de sels de calcium solubles 40 dans l'eau. Un bulletin commercial décrivant des amylases bacté- 69 44221 2. 2026896 rielles provenant du Bacillus subtilis, publié par Daiwa Kasei K. K. d'Osaka, Japon, décrit la stabilisation de l'amylase bactériel-le par des ions calcium et sodium. De façon analogue, Hamada et col., Agr. Biol. Chem., 31, Eo. 1, pp. 1-6 (1967), décrivent l'ef-5 fet stabilisant des ions calcium sur l'ci-amylase. L'utilisation de sels de calcium pour empêcher la perte de l'activité amylolytique, en particulier aux températures élevées, n'a pas été pleinement satisfaisante, en particulier pendant de longues périodes de stockage à des températures élevées. En conséquence, le besoin de 10 compositions contenant des enzymes amylolytiques ayant une stabilité d'enzyme amylolytique améliorée s'est fait sentir. L'un des buts de l'invention en conséquence est de fournir des compositions aqueuses stabilisées contenant des enzymes a-mylolytiques qui conservent pratiquement leur activité amylolyti-15 que en cours de stockage. Un autre but de l'invention est de fournir des compositions aqueuses contenant des enzymës amylolytiques pratiquement stabilisées vis-à-vis de la perte d'activité, grâce à la présence de quantités mineures de stabilisateurs d'enzymes. 20 D'autres buts de la présente invention apparaîtront dans la description ci-après. On atteint ces buts ainsi que d'autres de la présente -invention en fournissant des compositions aqueuses contenant des enzymes amylolytiques renfermant des quantités mineures d'ion cal-25 ciûrn et de certains agents organiques, co-stabilisants. Les compositions aqueuses de la présente invention peuvent en outre contenir des composants détergents non ioniques ou zwitterioniques pour augmenter la stabilité des enzymes amylolytiques dans les compositions aqueuses conformes à l'invention et pour accroître les pro-30 priétés détergentes de ces compositions. La présente invention est basée en partie sur la découverte que l'on peut obtenir des périodes de stabilisation prolongées en introduisant dans les compositions contenant des enzymes une source d'ion calcium et un composé organique choisi parmi les glycols aliphatiques et le propane dioL 35 1,3- • Les compositions aqueuses stabilisées contenant des enzymes conformes à l'invention comportent (1) d'environ 65 % à environ 97 % d'eau; (2) d'environ 0,001 % à environ 1 % d'enzyme amylolyti- *!0 que. 69 44221 3- 2026896 (3) d'environ 0,001 % à environ 1 % par rapport à l'ion calcium d'un sel de calcium stabilisateur d'enzyme soluble dans 1'eau ; (4) d'environ 2 -,c à environ 27 % d'un composé organique 5 choisi parmi des glycols aliphatiques de formule : HO [c&.cfl. oj H dans laquelle x va d'environ 1 à environ d.00-, et du propane diol-1,3; et - (5) de O.à environ 15 % d'un détergent choisi parmi des 10 détergents non ioniques et des détergents zwitterioniques. Les enzymes amylolytiques que l'on peut stabiliser en solution aqueuse par l'action de la combinaison décrite précédemment d'ion calcium et de composé organique sont des produits connus et peuvent être d'origine fongique, végétale, animale ou bac-15 térielle. Des enzymes amylolytiques, appropriés comprennent les a-amylases qui sont particulièrement bien adaptées pour dégrader des molécules d'amidon car elles attaquent les liaisons a-l,4-glu-cosidiques de l'amidon. Les chaînes courtes dégradées sont facilement dégagées de leur environnement par de l'eau ou des solutions 20 aqueuses de détergents. Des exemples d'enzymes amylolytiques appropriés comprennent les a-amylases provenant des moisissures y compris celles provenant de 1'Aspergillus oryzae, de 1'Aspergillus niger, de l'Aspergillus alliaceus, de 1'Aspergillus wentii, et du Pénicillium glaucum. Les a-amylases provenant de graines de céréa-25 les, de sources pancréatiques èt de bactéries telles que le Bacillus subtilis , le Bacillus macerans, le Bacillus mesentericus et le Bacillus thermophilus sont également intéressantes ici. Ces enzymes sont actifs dans la gamme de piL d'environ 4,5 à environ 10 et à des températures d'environ 16°C à environ 65°C. Ces a-amylases 30 présentent en général une activité optimale dans la gamme de pH d'environ 5,5 à environ 7,5- Les enzymes amylolytiques préférés ici sont les a-amylases provenant de l'organisme bactériel Bacillus subtilis. Ces amy-lases confèrent d'excellentes propriétés de désencollage et de di-35 gestion d'aaidon, et sont particulièrement utiles dans le blanchis sage de produits textiles ayant des salissures et des taches de na ture amidonique. On peut utiliser les enzymes amylolytiques servant ici à l'état pur. On les utilise en général sous forme d'une préparation 40 en poudre, que l'on trouve dans le commerce, dans laquelle l'enzyme 69 44221 4. 2026896 amylolytique est présent dans une proportion d'environ 2 à environ 80 % de la préparation. Le reste, c'est-à-dire environ 20 % à environ 98 comprend un véhicule inerte comme le sulfate de sodium, le sulfate de calcium., le chlorure de sodium, l'argile ou un pro-5 duit analogue. Dans la préparation des compositions aqueuses stabilisées dégradant l'amidon conformes à l'invention, on mélange ces préparations commerciales d'enzymes avec de l'eau et les autres composants de la composition. La teneur en enzyme actif de ces compositions' commerciales d'enzymes est le résultat des procédés de 10 fabrication utilisés, et n'est pas un facteur capital tant que les compositions finies de l'invention ont la teneur en enzyme précisée ci-après. On élimine généralement les matériaux inertes insolubles des compositions de 1'invention pour obtenir des compositions a-queuses qui soient limpides et pratiquement exemptes de dépôts 15 précipités. Des exemples spécifiques de préparations commerciales d'enzymes pouvant être utilisées ici, ainsi que les fabricants „ correspondants comprennent : l'a-amylase Diasmen (Daiwa Kasei KK, Tokyo, Japon); l'oc-amylase TBC-25 Rapidase (Rapidase, Seclin, France); l'a-amylase Novo Bacterial (îiovo industri, Copenhague, Dane-20 mark); l'a-amylase vïallerstein (ïïalle.rstein Company, Staten Island, îiew-ïork) ; les Rhozyme-33 et Riiozyme H-39 (Rdhrn & Haas, Philadelphie, Pennsylvanie). On préfère utiliser ici une préparation d'enzyme en poudre contenant de l'a-amylase tt un mélange de protéases alcaline 23 et neutre, commercialisée sous le nom de CRD-Protease (ou Monsanto Da-10) par la Monsanto Company, St. Louis; Missouri. Cette composition contient environ 3 % d'a-amylase et sert ici à fournir aux compositions de l'invention une activité enzymatique amylolytique et protéolytique• On préfère utiliser ici des mélanges de protéa-30 ses et d'a-amylases, ceux-ci comprenant les préparations d'enzymes décrites dans le brevet des Etats-Unis d'Amérique KT° 3 031 380 accordé à kinagawa et col. (24 Avril 1962). La quantité d'enzyme amylolytique utilisée dans les compositions conformes à l'invention peut varier en fonction de l'ac-33 tivité. de l'enzyme ou c'.e la préparation d'enzyme, des conditions de pH et de l'usage que l'on veut faire de la composition. Quand on utilise les compositions aqueuses stabilisées conformes à l'invention comme détachants, elles doivent contenir une quantité d'enzyme amylolytique suffisante pour éliminer les salissures et les '•'* taches de type amidon que l'on rencontre normalement en cours de 69 44221 5. 202&896 ■blanchissage. On prépare en général les compositions conformes à l'invention de telle sorte qu'elles contiennent d'environ 0,001 % à environ 1 je d'enzyme en poids de la composition aqueuse, en raisonnant sur l'enzyme pur. Quand on utilise une préparation d'enzy-5 me en poudre disponible dans le commerce comme source, d'enzyme amy--lolytique, la composition conforme à 1'invention contient d'environ 0,1 c/o à environ 4,0 % de la préparation contenant des enzymes amylolytiques en poudre telle qu'elle se présente sous sa forme commerciale,' par exemple contenant d'environ 2 ",c à environ 80 % d'en-10 zyme actif. On comprendra que lorsqu'on utilise ici de telles préparations, la quantité de la préparation nécessaire pour donner des compositions aqueuses ayant des teneurs voulues en activité a-mylolytique dépend du degré d'activité de la préparation contenant desr enzymes utilisée. On peut facilement déterminer les quantités 15 précises de ces produits à utiliser par des procédés connus dans la technologie, du moment que les compositions stabilisées conformes à l'invention donnent un degré d'activité d'enzyme amylolytique suffisant/pour obtenir un degré intéressant de propriétés de dégradation d'amidon. 20 L'activité amylolytique se rapporte ici à la tendance qu'a un enzyme amylolytique, à remplir la fonction voulue d'altération et/ou de dégradation catalytique de dérivés d'amidon. La stabilité se, rapporte ici a la tendance qu'a un enzyme amylolytique à conserver son activité enzymatique. On peut déterminer le degré 25 d'activité d'un enzyme amylolytique utilisable ici par de nombreux procédés. Un procédé convenable est la méthode d'essai au dinitro-3,5 salicylate. Conformément à cette méthode, on laisse un échantil Ion d'amylase. catalyser l'hydrolyse des liaisons. a-l,4-glucosidi-ques de l'amidon et des glycogènes pendant cinq.minutes à une tern-30 pérature de 37°C i un pE de 6,0. On arrête la réaction par addition de dinitro-3,5 salicylate de sodium tamponné, on révèle la coloration et on détermine la quantité de maltose par'la réponse spectro-photométrique et par comparaison avec des solutions d'hydrate de maltose pour analyse. L'amylase a une unité d'activité pour chaque 35 0,4 mg. drhydrate de maltose produit pendant l'hydrolyse dans les conditions précisées. La méthode de détermination d'activité d'amy-lase est bien connue et.èst décrite en détails par P. Bernfeld, Methods in -Enzymol. Vol. 1, p. 149 (1955). Comme on l'a montré précédemment, le présente invention "0 est en partie basée sur -la découverte surprenante que l'on peut 44221 6. 2026896 obtenir des périodes de stabilisation prolongées d'enzyme en incorporant dans des solutions aqueuses d'enzymes une combinaison de sel de calcium soluble dans l'eau et de composé co-stabilisant organique précédemment décrite. Les sels de calcium solubles dans l'eau 5 comprennent par exemple le chlorure de calcium, l'acétate de calcium, le citrate de calcium, le glycérophosphate de calcium, le gluconate de calcium, le glucoheptanate de calcium, le lactate de calcium, le lévulinate de calcium, le lactobionate de calcium, le malate de' calcium, le lactophosphate de calcium, le succinate de 10 calcium, le maléate de calcium, et le sulfate de calcium. On prépare les compositions stabilisées conformes à l'invention de telle sorte qu*elles contiennent d'environ 0,001 70 à environ 1 % d'ion calcium par rapport à la composition stabilisée. On utilise de préférence d'environ 0,005 % à environ 0,05 % d'ion calcium pour une 15 meilleure stabilisation. Comme décrit précédemment, certaines des compositions d'enzyme disponibles dans le commerce utilisables ici contiennent, outre l'enzyme actif,-certains matériaux inertes comme par exemple du chlorure de calcium ou du sulfate de calcium.' Quand — on utilise une telle préparation d'enzyme comme source d'enzyme a-20 mylolytique, on y incorpore aussi une quantité d'ion calcium. On obtient un supplément en ion calcium de façon commode par addition d'un, ou plusieurs des sels de calcium décrits, précédemment, afin d'obtenir une teneur en ion calcium à l'intérieur de la gamme précisée précédemment. Les sels de calcium préférés comprennent l'acéta-25 te-de calcium, le sulfate de calcium et le chlorure de calcium. Les agents organiques co-stabilisants qui, de- concert a-vec l'ion calcium., fournissent une activité d'enzyme amylolytique accrue, comprennent les glycols aliphatiques et le propanediol-1,3.. Les glycols aliphatiques utilisés ici ont pour formule : 30 HO[ch2CE2O] H dans laquelle x va de 1 à environ 200, et comprennent l'éthylène glycol et les polyéthylène glycols. Les polyéthylène glycols utilisables ici sont ceux pour lesquels x dans la formule décrite ci-dessus va de 2 à environ ^00, et comprennent le diéthylène glycol, 35 le triétbylène glycol et les polymères correspondants d'oxyde d'e-thylène dans lesquels le nombre moyen de groupes oxyéthylène va de 4 (tétraéthylène glycol) à environ dvd. Les glycols aliphatiques utilisables ici ont une consistance qui varie depuis celle de liquides légers jusqu'à celle de 40 solides cireux blancs, et se dissolvent dans l'eau en donnant des 69 44221 7, 2026896 solutions limpides. Des glycols aliphatiques que l'on préfère ici comprennent le diéthylène glycol et le triéthylene glycol. On préfère aussi les polyéthylène glycols dans lesquels la valeur moyenne de x va de 4 à environ 60. Ces polyéthylène glycols ont des mas-5 ses molaires moyennes d'environ ^OG à environ 3500 et sont disponibles sur le marché sous l'appelation commerciale "Oarbowax" avec une indication numérique qui renvoit à la masse molaire moyenne, par exemple 200, 400, 600, 1000 etc ... Une notation numérique crois santé correspond à une masse molaire croissante, à tin point de fu-10 sion plus élevé, et à une solubilisé dans l'eau décroissante. On peut utiliser ici des mélanges de glycols aliphatiques conformes à 1'invention. On a découvert que le propanediol-1,3 possède aussi un effet de stabilisation d'enzyme amylolytique comme indiqué précé-15 demment.jCe composé est un agent co-stabilisant préféré ici et il donne d'excellents effets de stabilisation. On utilise les composés organiques co-stabilisants d'enzyme amylolytique conformes à l'invention dans des proportions mineures mais efficaces allant d'environ 2 % à environ 27 % en poids 20 de la composition. On prépare de préférence les compositions stabilisées de telle sorte qu'elles contiennent d'environ 5 % à environ 20 % en poids d'agent co-stabilisant. On préfère cette dernière gamme du point de vue effets de stabilisation optimum, en particulier pendant de longues périodes de stockage à température 25 élevée. Bien que le mécanisme selon lequel les sels de calcium et l'agent co-stabilisant organique décrits ci-dessus agissent de concert pour protéger des enzymes amylolytiques de la perte d'activité ne soit pas connu avec précision, la combinaison de sel et de 30 composé organique fournit des degrés de stabilité d'enzyme nette-, ment plus importants que ceux que l'on peut obtenir par une stabilisation classique par le calcium seul. On observe cet effet de stabilisation îûême en présence de protéases qui ont tendance à exercer un effet nuisible de dénaturation sur les a-amylases. 35 On peut utiliser des détergents non ioniques et zwitte- rioniques solubles dans l'eau, comme' ingrédients optionnels, dans les compositions de cette invention. Ces détergents améliorent considérablement la stabilité au . stockage des enzymes amylolytiques utilisés ici et améliorent de façon significative les caractéris-40 tiques détergentes de la composition. En raison de ces caractéris- BAD ORIGINAL 69 44221 6. 2026896 tiques intéressantes, on préfère incorporer des détergents non ioniques et zwitterioniques dans les compositions aqueuses d'enzyme de l'invention. On peut utiliser ici les agents non ioniques et zwitterioniques dans des proportions allant de 0 a à environ 15 5 et de préférence de 4 :/c à 10 je, en poids de la composition d'enzyme . Des exemples d'agents non ioniques pouvant être utilisés ici comprennent : (1) les condensats d'oxyde de polyéthylène et d'alkyl 10 phénols, par exemple les produits de condensation d'alkyl phénols ayant un groupe alkyle contenant de b à 12 atomes de carbone environ en configuration de chaîne soit linéaire soit ramifiée, avec l'oxyde d'éthylène, ledit oxyde étant présent dans des quantités égales à 5 à 25 moles d ' oxyde d'éthylène par mole d'alkyl phénol. 15 Le substituant alkyle de tels composés peut provenir de propylène, de diisobutylène, d'octène ou de nonène polymérisés, par exemple. (2) Les détergents synthétiques non ioniques provenant de la condensation d'oxyde d'éthylène avec le produit de la réaction d'oxyde de propylène avec l'éthylène diamine. Par exemple, 20 des composés contenant d'environ 4-0 % à environ 80 % de polyoxyé-thylène en poids et ayant une masse molaire Cenviron 5 000 à environ 11 000, provenant de la condensation de groupes oxyde d'éthy-r-lène avec une base hydrophobe constituée par le produit de réaction de l'éthylène diamine et d'un excès d'oxyde de propylène, la dite 25 base ayant une masse molaire de l'ordre de 2 500 à 3 000, peuvent convenir. G) Le produit de condensation de 1 mole d'alcools aliphatiques ayant de 6 à 22 atomes de carbone, en configuration de chaîne soit linéaire soit ramifiée , avec de 5 à 40 moles d'oxyde 30 d'éthylène, par exemple un produit de condensation alcool de coco-oxyde d'éthylène ayant de 5 à 4u moles d'oxyde d'éthylène par mole d'alcool de coco, la fraction alcool de coco ayant de 10 à 14 atomes de carbone. (4) Les amides non substitués et les monoéthanol et dié-35 thanol amides d'acide gras ayant des fragments acyles d'environ 8 à environ cLd atomes de carbone. Ces fragments acyles proviennent normalement de glycérides naturels (par exemple huile de coco, huile de palme, huile de soja et suif), mais peuvent avoir des origines synthétiques (par exemple par oxydation du pétrole, ou par 40 hydrogénation de l'oxyde de carbone par le procédé ïischer-Tropsch). or lami. 69 44221 9. 2026896 (5) Des oxydes d'aminés tertiaires à longues chaînes répondant à la formule générale suivante : R2 - R-^OR4") JST —0 5 n|3 Br dans laquelle R"*" est un radical alkyle d'environ b à environ 22 atomes de carbone, R^ et R-5 sont chacun des radicaux méthyle, é-thyle, ou hydroxyéthyle, R4" est éthylène, et n va de 0 à environ 10 10. La flèche dans la formule est une représentation conventionnelle d' une liaison semi-polaire. Des exemples spécifiques de détergents oxydes d1aminés comprennent : l'oxyde de diméthyldodécylami-ne et l'oxyde de bis(hydroxy-2 éthvl)dodécylamine. (6)- Des oxydes de phosphines tertiaires à longues chaînes 15 répondant à la formule générale suivante : RR'R"P 0 dans laquelle R est un radical alkyle, alcényle, ou monohydroxy-alkyle ayant une longueur de chaîne allant de 10 à 22 atomes de carbone et R' et R" sont chacun des groupes alkyles ou monohydroxy-20 alkyles contenant de 1 à 3 atomes de carbone. La flèche dans la formule est une représentation conventionnelle d'une liaison semi-polaire. Des exemples d'oxydes de phosphines tertiaires convenables se rencontrent dans le brevet des Etats-Unis d'Amérique il" 3 304 263 délivré le. 14 Février 1967 et comprennent : l'oxyde de diméthyldo-25 décylphosphine et l'oxyde de bis-(hydroxy-2 éthyl)dodécylphosphine. (7) Des sulfoxydes à longues chaînes ayant pour formule : 0 5^6 Rp - S - R° dans laquelle R .est un radical alkyle contenant d'environ 10 à 22 30 atomes de carbone, de 0 à environ 5 liaisons éthers et de 0 à environ 2 substituants hydroxyles, un fragment au moins de R^ n'étant pas interrompu par des liaisons éthers et contenant d'environ 10 à g environ 18 atomes de carbone, et dans laquelle R est un radical alkyle contenant de 1 à 3 atomes de carbone^et de 0 à 2 groupes 35 hydroxyles. Des exemples spécifiques de ces sulfoxydes sont : le dodécyl méthyl suifoxyde et l'hydroxy-3 tridécyl méthyl suifoxyde. , Les detergents synthétiques zwitterioniques pouvant être utilisés, ici peuvent être décrits d'une façon générale comme des dérivés de composés aliphatiques ammonium, phosphonium et sulfonium 40 quaternaires, dans lesquels le radical aliphatique peut être en * BAD ORfGflVAL 44221 10. 2026896 chaîne droite ou ramifiée, et dans lesquels un des substituants a-liphatiques contient de 5 k 22 atomes de carbone environ et un autre contient un groupe anionique de solubilisation dans l'eau, par exemple carboxy, sulfo, suifato, phosphato, ou phosphono. Des exem-5 pies de composés tombant sous le coup de cette définition sont le 0>T,N-dim.étbyl N-hexadécylamraonio)-3 propanesulfonate-1 et le (N,U-diméthyl H-h.exadécylammonio)-3 hydroxy-2 propanesulf onate-1. Pour plus d'exemples de détergents synthétiques zwitterioniques, voir Dieh.1 et Smith., "Laundering Fabrics in Cold ffater Containing a 10 Synthetic Detergent Composition", brevet Canadien 708 147, délivré le 20 Avril 1965, à la page 6, lignes 1-22. On donne ici cette publication particulière à titre de référence. On peut utiliser des mélanges de divers détergents non ioniques ou des mélangés de détergents non ioniques et de déter-15 gents zwitterioniques. On préfère ici les produits de condensation dé 1 mole d'alcool aliphatique ayant de 8 à 22 atomes de carbone a— vec.de 5 à 40 moles d'oxyde d'éthylène, par exemple 1x0 alcool de suif éth-oxylé par 11 à -jQ moles d'oxyde d'éthylène et un alcool de coco éthoxylé par 6 moles d'oxyde d'éthylène. On préfère aussi les 20 (N,N-diméthyl N-alkylammonio)-3 hydroxy-2 propanesulfonates-1 dans lesquels le groupe alkyle a de 8 à 2.2 atomes de carbone, par exemple (N,N-diméthyl E- falkyl de cocoj ammonio)-3 hydroxy-2 propanesul-fonate-1 et les (E ,ïï-dim.éthyl îT-alkylammonio)-3 propanesulfonates-1 dans lesquels le groupe alkyle a de 8 à 22 atomes de carbone, par 25 exémple (K,W-diméthyl N- [alkyl de suifj ammonio)-3 propanesulf ona-te-1. Ces composes, outre le fait qu'ils fournissent par eux-mêmes ■une stabilité d'aiaylase, améliorent la stabilisation par le calcium et le composa organique co-stabilisant. lïn outre, ils procurent d'excellentes propriétés détergentes. 30 On prépare les compositions stables de la présente inven tion de telle sorte qu'elles contiennent d'environ 65 à environ-97 % en poids d'eau. On utilise de préférence d'environ 72 à environ 95 % d'eau. On préfère employer de l'eau déminéralisée, bien que l'usage n'en soit pas prescrit ici. 35 ' On peut mélanger ensemble les divers composants des com positions d'enzyme de cette invention dans n'importe quel ordres On préfère cependant préparer d'abord un mélange d'eau et de stabilisant, puis y ajouter les enzymes pour éviter toute dégradation ou désactivation qui pourrait se produire si on" ajoutait l'enzyme dans 40 de l'eau ne contenant pas la combinaison de stabilisation d'enzyme 3&D ORJGINAI 69 44221 n. 2026896 de l'invention. On peut ajoutor les composants détergents optionnels à n'importe quel moment. le pxi des compositions aqueuses stabilisées d'enzyme conformes à l'invention varie généralement d'environ 5,0 à 10,0, et 5 de préférence varie d'environ 6,5 à environ 8,5» On obtient des effets de stabilisation maximale dans cette gamme de pB. préférée. On peut augmenter le pu par une base, par exemple hydroxyde de sodium ou de potassium, ou l'abaisser par un acide, par exemple l'acide chlorhydrique. 10 On préféré également, bien que ce ne soit pas obligatoire, ajouter un agent préservatif aux compositions pour éviter une croissance bactérielle et fongique. L'acétate phényl mercurique que l'on . utilise généralement ici dans des proportions allant de 10 environ à environ 4-0 parties par million des compositions, est un préserva-15 tif efficace. Tout agent préservatif compatible avec les composants des compositions peut être utilisé ici. Les compositions aqueuses stabilisées conformes à l'invention peuvent aussi contenir n'importe quel adjuvant usuel des détergents, des diluants et des additifs, tant que ceux-ci n'inter-dO fèrént pas de façon notable avec l'activité des composants enzyma-tiques. On peut par exemple utiliser ici des parfums, des agents' anti-ternissants, des sels inertes comme le sulfate de sodium, des agents anti-redéposition, des agents bactériostatiques, des colorants, des agents fluorescents, des agents moussants, des dépres-25 seurs de mousse, el/des composés analogues, sans diminuer les propriétés intéressantes de ces compositions. On préfère que les compositions de la présente invention contiennent en outre certains enzymes proteolytiques. Ces enzymes comprennent les protéases alcalines, les protéases neutres, et les protéases acides qui aident 30 matériellement à éliminer les taches et salissures protéiniques de textiles soumis au blanchissage. On préfère utiliser d.?s enzymes protéolytiques en combinaison avec les enzymes amylolytiques de la présente invention afin de faciliter l'élimination d'un vaste domaine de taches et de salissures variées. Les enzymes protàolyti-35 ques préférés sont les subtilisines, obtenues à partir de l'organisme bactériel, Bacillus subtilis. ^uand on incorpore des enzymes protéolytiques dans les compositions de la présente invention, il est souhaitable d'inclure un quelconque des produits de stabilisation d'enzyme protéolytique connus dans la technologie pour amélio-. 4-0 rer'ainsi l'activité de l'enzyme protéolytique après un stockage. J* , . bA0 ORîGn^- 69 44221 2026896 Des produits de stabilisation d'enzyme protéolytique adéquats sont décrits par exemple dans le brevet .belge No. 7^3 873 attribué le 14 kai 1969 à Charles Bruce ifecGarty. On peut utiliser lts compositions de cette invention com-5 me détachants, additifs de détergents, ou comme compositions de nettoyage détergentes par elles-mêmes. On peut enfermer ces compositions dans d..s flacons pulvérisateurs et les utiliser facilement pour retirer des taches relativement petites sur des tissus, ou bien on peut les utiliser en plus grandes quantités comme additifs 10 d'autres compositions détergentes. On peut substituer ces compositions aux agents de blanchiment aux hypochlorites car elles éliminent toutes les tachts que ces agents de blanchiment éliminent, ne diminuent pas la résistance des fibres textiles, et n'attaquent pas ni ne dégradent des agents fluorescents ou des agents de blanchi-15 ment optiques. __vec l'addition de détergents non ioniques et/ou zwitterioniques optionnels, on peut utiliser ces compositions par elles-mêmes comme compositions de nettoyage qui se révèlent excellentes dans des conditions de lavage très diverses. EXEMPLES. 20 Les exemples suivants ne servent qu'à illustrer l'inven tion en détail et lorsqu'on les considère en même temps que la description qui précède, ils aident à déterminer la pleine portée de la présente invention. Ces exemples sont purement illustratifs et n'ont pas pour but de restreindre l'invention. ïouâ . : les par-25 ties, pourcentages et rapports donnés ici sont exprimés en poids sauf indications contraires. On a préparé les compositions suivantes, ,t on les a stockées dans des,bouteilles en verre fermées pendant les durées indiquées dans le tableau I. Chaque composition contenait 10 % en poids 30 de l'agent co-stabilisant organique; 1 %• de CRD-Protease de Monsanto (un mélange disponible dans le commerce de protéases et d'amy-lases provenant du Bacillus subtilis); et 89 d'une solution de réserve aqueuse contenant 0,01 % d'acétate do calcium monohydraté et 0,^9 % de chlorure de sodium. On a mesuré l'activité amylolyti-35 que de chaque composition aux intervalles indiqués par la méthode d'essai précédemment décrite. un a également évalué la rétention d'activité enzymati-que d'échantillons de reférence stockés dans des conditions identiques. uans Référence-1, on n'a pas utilisé d'agent organique co-40 stabilisant. Dans itéférence-2, il n'y avait pas d'agent organique 69 44221 13- 2026896 co-stabilisant et on avait remplacé la solution de réserve par de l'eau distillée, c'est-à-dire qu'il n'y avait pas d'acétate de calcium monohydraté ni de chlorure de sodium. Les résultats sont donnés dans le Tableau ci-dessous : 5 Tableau 1. Exemple 7o Ca Agent organique pourcent. __ d'activité res- co-stabilisant tante après stockage à 38°C pendant semaines 2 4 6 8 10 Référence- -1 0,0023 aucun . -54 34 29 17 Référence- -2 aucun aucun 0* — — — 1 0,0021 éthylène-glycol 70 51 34 28 2 0,0021 diéthylène-glycol 71 64 44 37 3 0,0021 -1 -3-pr opane-diol 60 47 43 35 15 x 3 jours. • On a préparé les compositions stabilisées suivantes, exem- •3 r? r ^^ ^ pies 4 a' 29. Dans chaque exemple, on a soigneusement mélangé l'eau (contenant l'acétate de calcium monohydraté et le chlorure de sodium) l'agent co-stabilisant organique et l'éthanol (quand on en 20 utilisait), on a ajouté le détergent non ionique ou zwitterionique, et on a ajouté finalement l'enzyme. Les enzymes utilisés-; étaient l'Alcalase (une préparation d'enzyme protéolytique ayant une teneur en enzyme cristallisé d'environ 6 % et provenant du Bacillus subtilis); et/ou la GRD-Protéase de Monsanto (un mélange d'enzymes pro-25 téolytiques et amylolytiques dérivé du Bacillus subtilis). On a u-tilisé l'éthanol," le cas échéant, comme stabilisant de l'enzyme protéolytique. Dans chaque exemple, on a utilisé une solution a-queuse de réserve, précédemment décrite, en une quantité suffisante pour compléter la composition à lOu %. Oh a stocké les compositions 30 pendant les durées indiquées dans le Tableau II à une température de 38°C et on a évalué leur activité amylolytique comme précédemment décrit. L^s compositions des Exemples 4 à 9 se comportent comme de bons détachants, comme additifs de compositions détergentes et comme de bons détergents de blanchissage par elles-mêmes. 35 Exemple 30 ^ On a formulé une composition aqueuse stabilisée d'enzyme conformément à l'invention à partir des composants suivants : Composant. Poids %. a-Amylasa (Diasmen, Daiwa Kasei &K) 1 40 Chlorure de calcium 0,01 SAD 69 44221 lit 2026896 Composant (suite). Poids %. Polyéthylène Glycol 4000 10 Alcalase (6 %• d'enzyme protéolytique) 1 Ethanol 10 5 Eau 78 On peut utiliser cette composition sans dilution comme composition d'élimination de taches et de salissures pour éliminer ou faciliter l'élimination de aatière dérivée de l'amidon ou de protéines à partir de matériaux textiles. On démontre l'efficacité 10 d'élimination de saleté ut de taches même après des périodes prolon gées de stockage (8 semaines) à des températures élevées (^9°C). On peut utiliser la composition de cet exemple comme additif de formulations détergentes commerciales. Quand on ajoute environ 0,32 ml. de la composition par litre de solution de lavage, on obtient 15 d'excellentes propriétés d'élimination des saletés et des taches. tableau il. Ex.;% Ca++ yôi % co-stabi- % En L— % agent % restant après E-: lisant or- zyme surfactif ' s stockage à 38°C rtha: ganique 3K>1: O.r 03 J- cî: rH: O -p. s cîCî : pendant :maines - se- : 03' * o.- flW A B: C: D: E: 2 4:6: 8 4 0,0017 10 :Diéthylène :G-lycol (10%) 0,5 0,5 5 — —. — — 100 100 66 100 5 0,0019 5:diéthylène -.Glycol (5%) °,5 0,5 5 — — — — 100 79 50 50 6 0,0017 10:Triethylène : Glycol (10%) 0,5 0,5 5 — — — — 100 83 58 63 7 0,0U19 5:Triéthylène : Glycol (5%) 0,5 0,5 5 — — — — 98 70 53 30 8 0,0017 10rPolyethylène :Glycol 580 : ( 10%) - 0,5 0,5 5 — — — — 90 83 45 33 9 0,0019 5 :Polyéthylène :Glycol 380 :( 5%) 0,5 0,5 5 — — — — 82 61 31 11 10 0,0017 10 :Polyéthylène :Glycol 4000 : (10%) 0,5 0,5 5 — — — — 70 42 18 7 40 BAD ORIGINAL 69 44221 i5. 2026896 r TABLEAU II (suite). Ex. :% Ca++: %: yb co-stabi- :% En- : % agent :% restant après : :E-: lisant or{5;a-:zym.e : surf actif g ; stockage à ^8°C : :1±ia: nique :.-jd:o i-: rpendant se- 5 : mol: : - ;maines 4 : : : : S |ld : A: B: C:-D: E: 2 : 4 : 6 : 8 H o ; ; ; ; - 11 .0,0019.5 :|îSiM88e": ' . = . '. : :?5») .0,5:0,5: 5: — :—: — :—: 79: J2: 18: 4 10 12 :0,0Û20: —:Triéthylène : : :::::: : : : : : : Glycol '(10%) :0,5:0,5: — : — — : 90:100:100:100 13 :0,0020:—:Polyéthylène : : :::::: : : : : : :Glycol 4000 : : :::::: : : : : : (10%) :0,5:0,3>:--— : 78: 87: 83: 82 15 14 :0,0019:10:Méthylène : : : : : : : Glycol (10%) :0,5:0,5: — r 3: — : — : — : 68: 75: 59: 59 15 :0,0017:10:Diéthylène : : :::::: : : : : : ' : Glycol (105.) :0,5:0,5: — : 5:--: — : 95: 77: 45: 54 16 :0,0017:10:Triéthylène : : :::::: : : : 20 ï : : Glycol (10%) :o,5:0,5: —5:~:100: 85: 75: 74 17 :0,0017ï10:Polyéthylène : : :::::: : : : : : :Glycol 380 : ::::::: : : : : ; : :(109i) :0,5:0,5:— s — : — : 5: — : 91: 73: 64: 65 18 :0,0017:10:Polyéthylène : : : : : 25 : : :Glycol 4000 : : ::::::: : : : . : : (10%) :0,5:0,5: — : — : — : 5:--: 87: 69: 57: 64 19 :0,0020:—:Diéthylène : : :::::: : : : : : : Glycol (10%) :0,5:0,5:~: — — : 96: 73: 73: 75 20 :0,0018:—:Diéthylène : : :::::: : : : 30 : : .-Glycol (10%) : :1,0;10: —: — : — : —: : 95: : 89 21 :0,0018:—:Diéthylène : : :::::: : : : : ' : : Glycol (10%) : —:1,0: — :10: —: — : — : —: 87: : 72 22 :0,0018 : — :Diéthylène : : :::::: : : : : : :Glycol (10%) : :1,0: — : — :10:~: — : : 59: : 49 35 23 :0,0018:—:Diéthylène : : : : : : : Glycol (10%) : :1,0: —: —: —:10: —: : 51: : 36 24 :0,0018: — : Méthylène : : :::::: : : : ': : .-Glycol (10%) : :1,0: —: — : — : —:10: : 48: — :-30 25 :0,0018: — :Propanediol- : : :::::: : : : 40 : : : 1,3 (10*.-) ' : :1,0:10: —: — : — : —: : 89: :81 69 44221 16. 2026896 TABLEAU II (suite). Ex. :% Ca++: jb: % co-stabi- :% En- : % agent restant après 3£ *. : :E-: lisant orga-:zyme : surfactif : stockage à 38°C : :tha: nique : - ~xa':p - :pendant se- 5 : :nol: : : :maines : : : : A: B: C: D: E: 2 : 4 : 6 : 8 ; ; ; 3g ; ; ; ; ; ; ; 26 :0,0018:—:-ropanediol- : : :::::: : : : : : : 1,3 (10%). : :1,0: — :10:~: — : — : : 77: : 72 10 27 :0,0018:—:Propanediol : : :::::: : : : : : :1,3 (10%) : :1,0: — : —:10: — : — : : 86: : 65 28 :0,0018:—:Propanediol : : ::::::: : : : : :1,3 (10>c) : :l,û: —: —: —:10:—: :100: : 55 29 :0,0018:—:Propanediol : : :::::: : : : 15 : : :1,3 (10%) : :1,0: —: — : — : —:10: :100: : 74 ' x A — Alcool de suif éthoxylé par 11 moles d'oxyde d^êthylène x B,— Alcool de suif éthoxylé par 30 moles d'oxyde d'éthylène x C — Alcool de coco éthoxylé par 6 moles d'oxyde d'éthylène x D — EAPb - (Iï jN-diméthyl ïï-alkylammonio)-3 hydroxy-2 propane- 20 sulfonate-1 dans lequel le groupe alkyle provient d'une cou pe moyenne d'alcool de coco :■ 2 C-^O' ^ C12' ^ 0/'° ^14 9 % c15. x E — (N,ET-diméthyl M-(alkyl de suif ) ammonio)-3 propanesulf onate-1. Exemple 31. 25 On obtient des résultats semblables quand on utilise les composés organiques co-stabilisants suivants au lieu des composés co-stabilisants utilisés dans les exemples 1 à 29, l'enzyme amylolytique étant également stabilisé en solution aqueuse : éthylène ë,ly col, diéthylène glycol, triétbylène glycol; tétraéthylène glycol; 30 polyéthylène glycol 200; polyéthylène glycol 300; polyéthylène glycol 380; polyétl$.ène glycol 600; polyéthylène glycol 1000; polyéthylène glycol 1500 ; polyéthylène glycol 4000; polyéthylène glycol 6000 et propanediol-1,3- On obtient des résultats semblables quand on utilise les 35 enzymes amylolytiques ci-après au lieu de ceux utilisés dans les Exemples 1 à 29, l'a-amylase étant stabilisée en solution aqueuse : l'a-amylase Diasmen; l'a-amylase TÏÏC-25 de .Rapidase; l'a-amylase Novo Bacterial; l'a-amylase de vïallerstein; la Khozyme-33 et la Shozyme H-39« 40 On obtient des résultats analogues quand on substitue les 17. 69 44221 2026896 détergents non ioniques et zwitterioniques suivants aux éthoxylates cf* alcool de suif, éthoxylate d'alcool de coco, (Iï,lT-diméthyl N-j^alkyl de coupe moyenne de cocoJammonio)-3 hydroxy-2 propanesulfo-nate-1 et (N,H-diméthyl N-jalkyl de suif]ammonio)-3 propanesulfona-5 te-1 utilisés dans les Exemples 4 à 11, 14 à 18 et 20 à 29, la stabilisation par l'ion calcium et le composé organique co-stabilisant étant améliorée, et d'excellentes propriétés de nettoyage étant obtenues : décyl phénol éthoxylé par 20 moles d'oxyde d'éthylène par mole de décyl phénol, amide hexadécanoïque; diéthanol amide hexadé-10 canoïque, oxyde de diméthyldodecylamine, oxyde de diméthyldodécyl-ph.osph.ine, et dodécyl méthyl suif oxyde, le produit de condensation de l'oxyde d'éthylène avec le produit de condensation de l'oxyde de propylène et du propylène glycol, la partie oxyde d'éthylène du composé représentant 50 % de la masse totale du composé et la masse 15 molaire totale du composé étant environ 1700; le produit de condensation de l'oxyde d'éthylène avec le produit de condensation de l'o xyde de propylène et de l'éthylène diamine dans lequel le produit contient environ 65 % d'oxyde de polyéthylène en poids et la masse molaire totale du composé est de 6000. 20 On obtient des résultats semblables quand on remplace l'a cétate dé calcium monohydraté des exemples 1 à 29 par les sels de calcium suivants dans des quantités qui fournissent une même quantité d'ion calcium, la stabilisation de l'enzyme amylolytique en solution aqueuse étant également observée : chlorure de calcium, ci 25 trate de calcium, glycéroph.osphate de calcium, gluconate de calcium glueoheptanato de calcium, lactate de calcium, lévulihate de calcium, lactobionate de calcium, malate de calcium, lactoph.osph.ate de calcium, succinate de calcium, maléate de calcium et sulfate de calcium. bad 0R^AL 69 44221 18. 2026896 REVENDICATIONS. 1. Composition aqueuse stabilisée d'enzyme caractérisée en ce qu'elle comporte en poids, par rapport à la composition : (1) d'environ 65 % à environ 97 % d'eau; 5 (2) d*environ.0,001 % à environ 1 % d'enzyme amylolytique; (3) d'environ 0,001 % à environ 1 % en ion calcium d'un sel de calcium stabilisateur d'enzyme, soluble dans l'eau; - (4) d'environ 2 ys à environ 27 7o d'ion composé organique co-stabilisant choisi parmi des glycols aliphatiques de formule : 10 " H0rC£uCH,,0l H L. 2 2 Jx dans laquelle x va d'environ 1 à environ 20u; et le propanediol-1,3; et (5) de 0 à environ 15 % d'un détergent choisi parmi des détergents non ioniques et des détergents zwitterioniques. 15 2. Composition selon ls revendication 1 caractérisée en ce que l'enzyme amylolytique est une oc-amylase caractérisée par une activité amylolytique dans le domaine de piL d'environ 4,5 à environ 10 et à une température d'environ 16°C à environ 65°C. 3. Composition selon la revendication 2 caractérisée en 20 ce que l'oc-amylase provient du Bacillus subtilis. 4. Composition selon la revendication 3 caractérisée en ce que l'a-amylase est présente en une proportion d'environ 0,01 % à environ 0,5 %. 5- Composition selon la revendication 4 caractérisée en 25 ce que l'ion calcium est présent en une proportion d'environ 0,005% à 0,05 % et en ce que le composé organique co-stabilisant est présent en une proportion d'environ 5 % à environ 20 %. 6. Composition selon la revendication 5 caractérisée en ce que le composé organique co-stabilisant est choisi parmi l'éthy-30 lène glycol; le diéthylène glycol; le triéthylène glycol; des glycols de formule : H0[cH2CH2q]xH dans laquelle ls valeur moyenne de x est de 4 à environ 80; et le propanediol-1,3. 35 7« Composition selon la revendication 6 caractérisée en ce qu'elle comporte d'environ 4 % à environ 10 %■ d'un détergent non ionique ou zv/itterionique. 8. Composition selon la revendication 7 caractérisée en ce que le détergent est choisi parmi des produits de condensation 40 de 1 mole d'alcool aliphatique ayant de 8 à 22 atomes de carbone ï 69 44221 i9. " 2026896 avec de 5 à 40 moles d1 oxyde d1 éthylène ; des (lT,lT-diméthyl N-alkyl-amm.onio)-3 propanesulf onate-1 dans lesquels l'alkyle a de 8 à 22 atomes de carbone; et des (N,E-diiaéthyl îî-alkylammonio)-3 hydroxy-2 propanesuifonate-1 dans lesquelles 1'alkyle a de 8 à 22 atomes de 5 carbone. 9. Composition selon la revendication 8 caractérisée en ce que le détergent est le ($T,lN-diméthyl ïï-(alkyl de coco)ammonio) -3 hydroxy-2 propanesulfonate-1 et en ce que le composé organique co-stabilisant est le triéthylène glycol. 10 10. Composition, selon la revendication 8 caractérisée en ce que le sel de calcium est choisi parmi l'acétate de calcium, le sulfate de calcium et le chlorure de calcium. 11. Composition selon la revendication 8 caractérisée en ce qu'elle comporte une protéase. 15 12. Composition selon la .revendication 11 caractérisée en ce que la protéase est une protéase alcaline provenant du Bacillus subtilis. BAD ORIGIF^Ê-