FR 2029707 A1 19701023 FR 7003163 A 19700129 70 03163 1 2029707 l'invention concerne la production d'un antibiotique connu chimiquement sous le nom d'acide (-) (cis^l,2-époxypropyl) phosphonique et en particulier un nouveau procédé de production de cet antibiotique par fermentation de milieux nutritifs avec 5 des souches appropriées de microorganismes comme par exemple des Streptomyces. L'antibiotique est produit au cours de la fermentation de milieux nutritifs appropriés dans des conditions contrôlées. Des milieux aqueux comme ceux qu'on emploie pour la production 10 d'autres antibiotiques conviennent pour la production de l'acide (-) (cis-1.2-épox.ypropyl) phosphonique0 De tels milieux contiennent des sources de carbone et d'azote qui sont assimilables par le microorganisme, ainsi que des sels minéraux*. En outre les milieux de fermentation contiennent des traces de métaux nécessaires pour 15 la croissance du micro organisme qui sont communément apportés comme impuretés par les autres constituants du milieu. En général des hydrates de carbone comme des sucres, par exemple, du dextra-ne, du maltose, du galactose et analogues et des amidons comme des grains, par exemple d'avoine et de seigle, l'amidon de maïs, 20 la farine de maïs et analogues peuvent être utilisés soit seuls, . soit en association comme sources de carbone assimilable dans le milieu nutritifo La quantité exacte de la ou des sources d'hydrates de carbone dépend en partie des autres ingrédients du milieu» On a trouvé toutefois qu'une quantité d'hydrates de carbone co*-25 prise entre environ 1 et 6 fo en poids du milieu est suffisante# On peut utiliser une seule source de carbone ; on peut aussi associer plusieurs sources de carbone dans le milieuo Des sources d'azote satisfaisantes comprennent les innombrables matières protéiques comme les différentes formes d'hy-30 drolysats de caséine, la farine de soya, la liqueur de trempage de maïs, les distillers solubles, les hydrolysats de levure, la pâte de-tomates et analogues. Les diverses sources d'azote peuvent être utilisées seules ou en association et sont utilisées en quantités allant de 0,2 $ à 6 fo en poids du milieu aqueuxo 35 On forme l'acide (-) (cis-î,2-époxypropyl)phosphonique en cultivant, dans des conditions contrôlées, des souches de microorganismes comme, par exemple, les souches de Streptomyces qui produisent l'antibiotique. Un de ces microorganismes, qui a été 70 03163 2 2029707 isolé du sol, a reçu la référence MA-2898 dans la collection de cultures de Merck & Go., Inc., Rahway, New-Jersey ; des sous-isolés de la culture parente ont reçu la référence MA-2911, MA-2912 , et MA-2913« Ces cultures ont été placées en dépôt permanent dans la 5 collection de cultures de la Northern Utilization Research & Development Branch de 1'United States Department of Agriculture à Peoria, Illinois, et ont reçu les numéros de culture NRRL B-3357, NRRL B-3358, NRRL B-3359 et NRRL B-3360, respectivement. Ces microorganismes ont été classées dans l'espèce Streptomyces fradiae« 10 L'antibiotique est aussi produit par culture, dans des conditions contrôlées, d'autres souches de Streptomyces également isolées du sol et identifiées dans la collection de cultures de Merck & Co., Inc. comme cultures MA-2867» MA-2903, MA—2916, MA-2917 MA-3270, MA-3272 et MA-3267. Ces cultures ont été classifiées com-15 me membres de l'espèce Streptomyces viridochromogenes. Les cultures MA-2903, MA-2867, MA-2917 et MA-3270 ont été placées en dépôt per-mament dans la collection de cultures de la Northern Utilization Research and Development Division de 1'United States Department of Agriculture et ont reçu les numéros de culture NRRL-3413, NRRL-20 3415, NRBL-3416 et NRRL-3427; respectivement. La culture MA-3269 a été assignée à l'espèce Streptomyces wedmorensis et a reçu le numéro NRRL-3426. . En plus des espèces ci-dessus de microorganismes, on envisage aussi l'emploi d'autres microorganismes comprenant des 25 souches de Streptomyces soit isolées du sol, soit obtenues par mutation de ces organismes, comme celles obtenues par sélection naturelle ou celles produites par des. agents de mutation comme par exemple l'irradiation aux rayons X, l'irradiation ultraviolette, les moutardes à l'azote et analogues. 30 Du fait de la difficulté inhérente de séparer l'acide (-) (cis-1.2-époxypropyl)phosphonigue pur des grandes quantités d'impuretés dans le bouillon de fermentation, il est très important de trouver un moyen d'accroître la concentration en antibiotique par rapport aux parties solides totales du bouillon. 3 5 Suivant la présente invention la demanderesse a détermi né que l'addition d'un ou plusieurs acides carboxyliques ou de leurs sels aux milieux de fermentation contenant un microorganisme capable de produire l'acide (-) (cis-1,2-époxypropyl)phospho- 70 03163 3 2029707 nique augmente la production de l'antibiotique. En particulier, l'addition d'acides organiques comme les acides glutamique, fuma-rique, succinique, o(-cétog lutarique, maléique, oxalacétique, a-conitique et isocitrique procure un accroissement important de 5 la production de l'antibiotique» On observe un certain effet stimulant quand d'autres acides carboxyliques comme les acides acétique et pyruvique sont employéso Dans le cas de ces derniers acides toutefois on obtient un effet plus prononcé quand ils sont employés en présence d'un des autres acides comme, par exemple, 10 l'acide glutamique, que lorsque l'unde ces deux acides est employé seul» la quantité d'acide carboxylique nécessaire pour stimuler la production de l'antibiotique varie selon l'acide particulier et le milieu utilisé» la concentration de l'acide utilisé varie selon le microorganisme particulier utilisé et les conditions de fermen-15 tation appliquées» Une production améliorée de l'antibiotique a été observée dans des milieux contenant d'environ 0,6 millimole à environ 30,0 millimoles d'acide carboxylique par litre» On préfère toutefois employer d'environ 3»0 millimoles à environ 12 millimoles d'acide par litre pour obtenir une bonne production de 20 l'antibiotique» Tous les acides dans le domaine de l'invention stimulent la production de l'antibiotique, mais n'ont pas d'effet de stimulation ou d'inhibition sur la croissance du microorganisme. les acides carboxyliques dans le domaine de la présente 25 invention peuvent être employés dans tout milieu de fermentation contenant un microorganisme qui est capable de produire l'acide (-) (çis-1,2-époxypropyl)phosphonique» l'acide à employer comme stimulant de production est ajouté de préférence sous forme d'un sel minéral soluble dans l'eau comme par exemple le sel de sodium, 30 de potassium ou de calcium, bien que l'acide libre puisse aussi être employé, l'acide carboxylique peut aussi être ajouté sous forme d'un sel ou d'un complexe apparaissant à l'état naturel comme il peut s'en trouver dans les nutritifs microbiens riches en l'acide ou les acides à utiliser» les agents nutritifs usuels con-35 tiennent une source de carbone assimilable, une source d'azote assimilable, des sels minéraux et des facteurs de croissance si nécessaire» On peut utiliser un seul acide pour stimuler la production, mais un acide particulier peut être utilisé en présence 70 03163 4 2029707 d'un ou plusieurs des autres stimulants acides, ces stimulants étant présents dans le milieu de fermentation comme agent nutritif ou comme additifs. Quand on emploie plus d'un acide faisant partie du domaine de l'invention pour stimuler la production de 5 l'antibiotique, on obtient une meilleure stimulation de la production que lorsqu'on emploie un seul acide* Par exemple, quand on ajoute du glutamate et du fumarate de sodium au milieu, à une concentration d'environ 6,0 millimoles par litre, la quantité d'antibiotique dans le bouillon est titrée à 23,8^g/al alors que 10 le titre est de 16,2 yU g/ml pour le glutamate de sodium et de 18,6 jju g/ml pour le fumarate de sodium quand ces acides sont employés seuls, la présente invention englobe aussi l'utilisation des acides carboxylique s en présence d'autres composés qui stimulent la production d'acide (-) (çis-1,2-époxypropyl)phosphonique 15 comme, par exemple, le cobalt et le phosphore. Bien que le nouvel antibiotique selon l'invention soit produit en culture en surface et en culture immergée, on préfère, en fait, effectuer la fermentation à l'état immergé. les fermentations à petite échelle sont conduites commodément en plaçant des' 20 quantités appropriées de milieu nutritif dans des fioles, en stérilisant les fioles et leur contenu par chauffage à i20°C, en inoculant les fioles avec soit des spores, soit une culture cellulaire végétative d'un microorganisme producteur d'acide (-) (cis-1.2-époxypropyl)phosphonique par exemple une souche de Streptomvces. 25 en bouchant les cols des fioles avec du coton et en laissant la fermentation se poursuivre dans une pièce à température constante d'environ 28°C pendant 3-5 jours. Pour le travail à plus grande échelle, il est préférable de conduire la fermentation dans des cuves convenables pourvues d'un agitateur et de moyens d'aération 30 du milieu de fermentation. Dans cette méthode, le milieu nutritif est préparé dans la cuve et stérilisé par chauffage à 120°G. Après refroidissement, le milieu stérilisé est inoculé avec une source convenable dé culture cellulaire végétative du microorganisme et on laisse la fermentation se poursuivre pendant 2 à 4 jours en 35 agitant et/ou aérant le milieu nutritif et en maintenant la température à environ 28°C. Cette méthode de production de l'acide (-) (çis-1,2-époxypropyl)phosphonique est particulièrement appropriée à la préparation de grandes quantités du nouvel antibiotique. 70 03163 5 2029707 la fermentation utilisant un microorganisme producteur d'acide (-) (cis-1»2-époxypropyl)phosphonique peut être conduite à des températures allant de 20°C à 40°C environ*, Pour obtenir les meilleurs résultats, toutefois, il est plus approprié de con-5 duire les fermentations à des températures situées entre 26°Q et 30°Co le pH du milieu nutritif convenant à la croissance du microorganisme et à la production de lrantibiotique peut varier de 5,0 à 9,0 environ» l'intervalle préféré de pH est toutefois de 6,0 à 7,5 environ» 10 Pour mettre en oeuvre le procédé de fermentation, on prépare une suspension de cellules en ajoutant- du milieu stérile à une culture inclinée sur gélose d'un microorganisme producteur d'acide (-) (cis-1,2-époxypropyl)phosphonique» la culture provenant de la culture inclinée est alors utilisée pour inoculer une 15 fiole d'ensemencement et cette dernière est agitée pendant environ 1 - 3 jours à 28°C pour obtenir une bonne_croissance. la fiole d'ensemencement est alors utilisée pour inoculer les fioles de production» la fiole d'ensemencement peut aussi être inoculée à partir d'une culture lyophilisée ou d'un inoculum congelé» 20 On effectue généralement l'inoculation en utilisant environ 1 ml par 30 ml de milieu de production contenant la concentration désirée en l'acide carboxylique et on laisse la fermentation se poursuivre pendant 2-4 jours en agitant et/ou aérant le milieu nutritif et en maintenant la température à 28°0 environ» 25 Toutes les fioles de production, c'est-à-dire celles'qui contiennent un stimulant de production et les fioles utilisées comme témoins, sont alors titrées, en général après 3-4 jours, pour déterminer la quantité d'antibiotique produite dans chaque fiole» l'acide (-) (cis-1,2-époxypropyl)phosphonique est titré 30 de façon commode par un procédé à plaque à disque en utilisant Proteus vulgaris MB-838 (AT0G 21100 et NRB1 B-3361) comme organisme d'essai, la culture d'essai est maintenue sous forme d'une culture inclinée sur gélose nutritive (Difco) plus 0,2 $ d'extrait de levure (Difco)» les cultures inclinées inoculées sont incubées 35 à 37°0 pendant 18-24 heures et conservées aux températures du réfrigérateur jusqu'à usage ; des cultures fraîches sont préparées chaque semaine0 L1inoculum pour les plaques de titrage est préparé 70 03163 6 2029707 chaque jour en inoculant une fiole d'Erlenmeyer de 250 ml contenant 50 ml de bouillon nutritif (Difco) plus 0,2 $ d'extrait de levure (Difco) avec un grattage de la culture inclinée» la fiole est incubée sur une machine à secousses à 37°C pendant 18-24 heures» la 5 culture du bouillon ast alors ajustée à une transmittance de 40 $£ à une longueur d'onde de 660 en utilisant un appareil Spectro-nic 20 de Bausch & Lomb, par addition d'une solution d'extrait de levure à 0,2 $> à la culture. le bouillon non inoculé est utilisé comme témoin pour 10 cette détermination. 30 ml du bouillon ajusté sont utilisés pour inoculer 1 litre de milieu. De la gélose nutritive (Difco) plus 0,2 $ d'extrait de levure (Difco) est utilisé comme milieu de titrage. Ce milieu est préparé, stérilisé par autoclavage et abandonné au refroidissement 15 à 50°C. Après que le milieu a été inoculé, on en ajoute 10 ml dans des boîtes de Pétri stériles et on laisse le milieu se solidifier. l'activité est exprimée en unités, taie unité étant définie comme étant la concentration de l'antibiotique par millilitre qui sur un disque de papier de 12,7 mm donne un diamètre de zone de 20 28 millimètres. On emploie quatre concentrations de l'antibiotique pour préparer la courbe standard, à savoir 0,3, 0,4, 0,6 et 0,8 unité par millilitre, chaque concentration étant obtenue par dilution dans du tampon tris-(hydroxyméthyl)-aminométhane 0,05 M ajusté au pH 8,0. On place quatre disques sur chacune des cinq plaques 25 pour la préparation de la courbe standard, chaque plaque contenant un disque de chacune des quatre concentrations en antibiotique indiquées ci-dessus, les plaques sont incubées pendant 18 heures à 37°C et on mesure les diamètres des zones d'inhibition en millimètres. On calcule un diamètre de zone moyen pour chaque concen-30 tration, d'après quoi on prépare une courbe standard sur un papier semi-log. la pente de la ligne obtenue est comprise entre 4 et 5. On titre les fioles de production en diluant l'échantillon dans le tampon 0,05 molaire à pH 8 à une concentration appropriée. l'organisme d'essai est Proteus vulgaris MB-838, et le mi-35 lieu de titrage est la gélose nutritive plus 0,2 d'extrait de levure. Qu'on emploie la méthode de plaque à disque ou de plaque à cylindre, on verse par plaque 10 - 15 ml de milieu. Quand on emploie la méthode de plaque à disque, les disques sont plongés 70 03163 7 2029707 dans 0,4 unité par millilitre de la solution d'antibiotique et sont placés sur la plaque en position alternée avec l'échantillon# les plaques sont alors incubées à 37°C pendant 18 heures et on détermine les diamètres des zones en millimètres» Quand on emploie 5 la méthode de plaque à cylindre, on utilise par plaque 6 cylindres, 3 de l'échantillon et 3 de la solution témoin» La solution témoin contient 1 t /ml d'acide libre» On emploie cinq plaques standard contenant 6 taux du standard allant de 0,25 Y /ml à 3,0 T /ml» Le titre est calculé au moyen d'un Bformographe et les résultats sont 10 reportés en unités ou gamma par millilitre» Une unité d'acide libre est égale à 2,8 T » L'antibiotique peut être purifié et récupéré par un certain nombre de méthodes» Dans l'une de ces méthodes, on absorbe l'antibiotique sur alumine ; l'alumine basique ou l'alumine lavée 15 à l'acide conviennent pour cette purification» L'antibiotique absorbé peut être élué de l'alumine le plus commodément par des solutions aqueuses ou hydroalcooliques d'hydroxyde d'ammonium ayant un pH d'environ 11,2 en recueillant l'éluat par fractions» La purification des fractions solides impures contenant le sel -20 d1ammonium de l'acide (-) (cis-1,2-époxypropyl)phosphonique peut aussi être effectuée en dissolvant le produit dans le méthanol, en ajoutant un volume égal de n-butanol, en évaporant le méthanol, en filtrant le produit insoluble dans le butanol et en obtenant une solution butanolique contenant le sel d'ammonium de l'antibio-25 tique de pureté améliorée» Le sel d'ammonium peut alors être obtenu en évaporant à sec la solution butanolique sous pression réduite» Le sel d'ammonium peut aussi être extrait de la solution butanolique avec de l'eau pour obtenir une solution aqueuse du sel d'ammonium de l'acide (-) (cis-1,2-époxypropyl)phosphonique» Le 30 sel de calcium de l'antibiotique est produit en ajoutant de l'hy-droxyde de calcium à la solution aqueuse sous pression réduite» En variante, on obtient également le sel de calcium en faisant passer une solution d'un autre sel de l'antibiotique sur une résine échan-geuse de cations sur le cycle calcium. Le sel de calcium eristal-35 lise de solutions aqueuses ayant une concentration de 10 mg/ml par repos ou par agitation. L'acide (-) (çis-1,2-époxypropyl)phosphonique et ses sels sont des agents antimicrobiens utiles qui sont actifs pour 70 03163 8 2029707 inhiber la croissance des bactéries pathogènes aussi bien grarn-positives que grain-négatives» Cet antibiotique et plus particulièrement ses sels sont actifs contre les pathogènes Bacillus, Esche-richia. Staphylooooci. Salmonella et Proteus et leurs souches ré-5 sistant aux antibiotiques» Des exemples de ces pathogènes sont Escherichia çoli, Salmonella schottmHel 1 efi - S«imonella gallinarum Proteus vulgaris. Proteus mirabilis. Proteus mm-ffaiTi-i et Staphv-loccus aureus» Ainsi, l'acide (-) (cis-1.2-époxypropyl}-phosphonique et ses sels peuvent être utilisés comme agents antiseptiques pour 10 éliminer les organismes nuisibles des appareillages pharmaceutiques dentaires et médicaux et en d'autres lieux sujets à l'infection par ces organismes» De même ils peuvent être utilisés pour séparer certains microorganismes de mélanges de micro organisme s» les sels de l'acide (-) (çis-1,2-époxypropyl)phosphonique sont également 15 utiles dans le traitement de certaines maladies causées par les infections bactériennes chez l'homme et les animaux et sont particulièrement précieux dans ce domaine car ils sont actifs contre des souches résistantes de pathogènes» Ces sels ont une valeur particulière car ils sont efficaces quand ils sont administrés par 20 voie orale, bien qu'ils puissent aussi être administrés par voie parentérale» les exemples qui suivent sont donnés pour illustrer et non pour limiter l'invention. Exemple 1 25 Une cuillerée de cellules provenant d'une culture incli née sur gélose de Streptomyces fradiae HEB1 B-3360 ayant la composition suivante : Ai Milieu de culture inclinée Quantité 30 Amidon de maïs 10,0 grammes Asparagine 1,0 gramme 1,0 gramme Gélose 20,0 grammes 35 H20 1 000 al. pH = 7,0 est utilisée pour inoculer une fiole d'Erlenmeyer à chicane de 70 03163 9 2029707 250 ml contenant 40 ml d'un milieu d'ensemencement ayant la composition suivante : la fiole inoculée est incubée à 28°C pendant 2 jours sur un agitateur tournant à 220 t/mn avec une course de 50 mm 15 environ. On prépare huit fioles d'Erlenmeyer de 250 ml contenant chacune 30 ml d'un milieu ayant la composition suivante : Ç. Milieu d'ensemencement c J Amidon de mais Asparagine Quantité 10,0 grammes 1,0 gramme 1,0 gramme 1000 ml. 10 pH = 7,0 Milien de production Quantité 20,0 grammes 0,5 gramme 5,0 grammes 0,5 gramme 0,5 gramme 0,2 gramme 0,03 gramme 20 Amidon de Maïs E2HP04 Asparagine 0aCl2,2H20 25 BaCl MgS04,7H20 FeS04,7H20 Tracesd'éléments mélange N° 2 * Ascorbate de sodium 10 ml. 0,5 gramme 1,0 gramme 30 Citrate de Sodium H20 distillée 1000 ml. pH = 7,0 70 03163 * 10 2029707 Formule des traces d'éléments mélangé U° 2 1,0 gramme 1,0 gramme 25 mg. 100 mg* 56 mg. 19 mg. 200 mg. 1000 ml. Une solution aqueuse de glutamate monosodique est alors ajoutée aux fioles pour obtenir une concentration finale en glutamate monosodique comme indiqué dans le tableau ci-après. Ces fioles sont stérilisées, refroidies et inoculées par addition de 1,0 ml 20 du milieu d'ensemencement décrit ci-dessus. les fioles inoculées sont incubées à 28°C sur un agitateur tournant à 220 t/mn avec une course de 50 mm environ et une fiole est retirée après trois jours une autre après quatre jours d'incubation, les contenus de chaque fiole sont centrifugés à 8 500 t/mn pendant 10 mn et le bouillon 25 est décanté des solides, les bouillons surnageants sont titrés en utilisant Proteus vulgaris MB-838 comme organisme d'essai, les titres déterminés pour les bouillons obtenus après trois et quatre jours d'incubation sont indiqués ci-après : 30 Milieu g«/l D-l méthionine g^L. Glutamate monosodique pH 3 jours Antibio-estimation tique de crois- uni tés/ml sance. 3 jrs 4jrs Production de base 0 0 8,1 + 3 0 0,1 35 Production de base Production 0 1,0 8,5 + 3 0 0,29 de base 1 ,0 0 7,9 + 3 0 0,1 Production de base 1 ,0 1,0 8,4 + 3 0,52 0,51 PeS0>,7BL0 5 MnS04,4H20 CuC12,2H20 CaCl2 0 H5B03 (hh4)6M07024,4H20 ZnS04,7H20 HgO distillée 70 03163 n 2029707 Une unité est égale à 2,8 JXj g/ml d'acide libre. Comme on le voit ci-dessus, en utilisant le milieu de base la production d'acide (-) (çis-1,2-époxypropyl)phosphonique est portée de 0,1 à 0,29 unité par ml par addition de glutamate 5 monosodique. En utilisant le milieu de base plus la D-I> méthioni-ne, la production d'acide (-) (çis-1,2-époxypropyl)phosphonique passe de 0,1 à 0,52 unité par ml par addition de glutamate monosodique. Exemple 2 10 Une cuillerée de cellules provenant d'une culture incli née sur gélose de Streptomyces fradiae NRBl B-3360 ayant la composition suivante : A . Milieu de culture inclinée Quantité 15 Amidon de maïs 1 $ Ii-asparagine - 0,1 % K2HPO4 0,1 % Culture inclinée sur gélose- = 2 % 20 est ajoutée à 40ml d'un milieu d'ensemencement dans une fiole Erlenmeyer à chicane de 250 ml, le milieu d'ensemencement ayant la composition suivante ï B . Milieu d'ensemencement Quantité 25 Amidon de maïs 2 fo L-asparagine- 0,5 % 1-glutamate monosodique 0,1 $ Citrate de sodium 0,4 % K2HPO4 0,1 ^ 30 CaCl2,2H20 0,05# MgS04,7H20 0,02 % CoC12,6H20 0,01 fo HgO distillée 35 pH =7,0 70 03163 12 2029707 On ajoute une solution de traces d1 éléments pour donner les concentrations minimales suivantes : Formule des traces d'éléments : 5 MnSO ,7H20 -, 10 mg/l 4 Cu012,2H20 0,25 mg/l FeS04,7H20 10 mg/l 0,56 mg/l 10 15 20 25 La fiole inoculée est incubée à 28°0 pendant 3 jours puis maintenue à 5°C jusqu'à emploi. On prépare deux fioles d'Erlenmeyer de 250 ml contenant ehacune 30 ml d'un mi lieu ayant la composition suivante ï G. Milieu de production Quantité Amidon de Maïs 2 % L^asparagine- 0,5 Citrate de sodium 0,4 $> K2HPG4 * 0,1 % CaCl2,2H20 0,05# MgS04,7H20 0,02 % CoCl2,6H2Q 0,01 # Traces d'éléments ** • H20 distillée pH = 7,0 ** Comme défini précédemment On ajoute ensuite une solution de glutamate monosodique aux fioles 30 pour donner une concentration finale de 0,1 56. Ces fioles sont stérilisées, refroidies et inoculées par addition de 1,0 ml du milieu d'ensemencement préparé comme indiqué précédemment. Les fioles inoculées sont incubées à 28°C sur un agitateur tournant à 220 t/mn avec une course de 50 mm-environ et la fiole est re-35 tirée après quatre jours. Quand la fermentation est terminée, les cellules sont séparées par centrifugation et le bouillon est dilué avec du tampon tris 0,05 M (pH 8,0). La concentration en antibiotique produite dans le bouillon de fermentation est déterminée par 70 03163 13 2029707 la méthode de titrage biologique» l'organisme de titrage est Proteus vulgaris MB-838. Les résultats de trois fermentations effectuées de cette manière sont donnés ci-après î 5 Expérience ÎJ° Glutamate monosodique Antibiotique y/ml. ajouté 4 jours 10 13,2 0,1 % 19,6 11 0 15,9 10 0,1 % 25,8 III 0 11,1 0,1 fc 16,9 Exemple 3 15 Une cuillerée provenant d'une culture vieille de sept jours de Streptomyces fradiae NBBL B-3360 ayant la composition suivante : Milieu de culture inclinée Quantité Amidon de maïs 1 »0 # 20 L-asparagine 0,1. fo k2hpo4 0,1 fo Agar 2,0 f> pH = 7,0 est utilisée pour inoculer une fiole Erlenmeyer de 250 ml à trois chicanes contenant 40 ml d'un milieu d'ensemencement ayant la composition suivante ï Milieu d'ensemencement Quantité 30 Amidon de maïs 2,0 f> L-asparagine 0,5 fo D-L methionine 0,1# Glutamate monosodique 0,1 fo Oitrate de sodium 0,4 fo 55 e2hpo4 0,1 fo CaCl2,2H20 0,05 fo MgS04,7H20 0,02 fo 70 03163 14 2029707 CoC12,6H20 PeS04,7H20 Traces d'éléments *** pH = 7,0 *** Comme défini précédemment. Formule des traces d'éléments i mg./l. 10 MnS04,4H20 10 CuC12,2H20 0,25 H3B03 0,56 ZnS04,7H20 0,2 15 (HH4)6Mo7024,4H20 0,002 1*inoculum est cultivé à 28°0 avec agitation pendant 48 heures. On prépare cinq fioles d'Erlenmeyer de 250 ml contenant chacune 30 ml d'un milieu de production ayant la composition sui-20 vante : Milieu de production de base Quantité Glucose 2,0 fo l-asparagine 0,5 f° 25 D-l methionine 0,1 f> Citrate de sodium 0,4 f> K2hpo4 0,1 f> CaCl2,2ïï20 0,05 f» MgS0A,7H90 0,02 f° 30 4 2 CoCl2,6H20 0,01 fo FeS04,7H20 0,001 f> Trace d'éléments *** pH = 7,0 35 *** Comme défini précédemment. On ajoute ensuite une solution aqueuse de glutamate monosodique dans les fioles pour donner une concentration finale en glutamate 0,01 fo 0,001 f> 70 03163 15 2029707 monosodique comme indiqué dans le tableau ci-après* Ces fioles sont stérilisées, refroidies et inoculées par addition de 0,5 ml de milieu d'ensemencement préparé comme indiqué précédemment» les fioles inoculées sont incubées à 28°C sur un agitateur rotatif 5 tournant à 220 t/mn pendant 72 heures» lies contenus de chaque fiole sont centrifugés et le bouillon est décanté des parties solides» Le bouillon est ensuite dilué avec du tampon HOl-tris-0,05 M( pH 8,0) et les bouillons sont titrés en utilisant Proteus vulgaris MB-838 comme organisme d'essai» les titres obtenus avec 10 le bouillon après incubation de 72 heures sont indiqués ci-après : Milieu Milli mole s/litre 7/ml Glutamate monosodique 7 15 20 ajouté Antibiotique Production de base 0 10,8 Production de base 0,6 10,4 Production de base 3,0 12,6 Production de base 6,0 18,4 Production de base 12,0 22,3 30 35 Exemple 4 la production d'acide (-) (cis-1,2-époxypropyl)phospho-nique est conduite comme indiqué dans l'exemple 3» On a obtenu les 25 résultats de titrage suivants qui montrent l'effet de l'addition de divers acides carboxyliques au milieu de fermentation î Milieu Acide ajouté * Quantité Antibiotique Milli mole s/litre mg»/ml» Production de base lïone 0 12,0 Production de base Glutamate 6,0 19,7 Production de base Pumarate 6,0 18,5 Production de base Succinate 6,0 16,2 Production de base -Ketogluta- rate 6,0 17,4 Production de base Malate 6,0 19,7 Production de base Ci s-mt-al acétate 6.0 1 9.1 * sous forme de sels de sodium. 70 03163 16 2029707 Exemple 5 La production d'acide (-) (çis-1,2-époxypropyl)phospho-nique est conduite comme indiqué dans l'exemple 3« On a obtenu les résultats de titrage suivants qui montrent l'effet de l'addition de divers acides carboxyliques seuls et en association avee le glutamate de sodium, sur la production de l'antibiotique. La croissance du microorganisme dans les fioles de fermentation est mesurée d'après le poids sec de mycélium par millilitre du bouillon de culture# 10 15 20 25 30 35 Milieu Acide carboxylique ajouté Quantité Millimoles/litre Croissance poids sec mg/ml. AntibiO' tique yWg./ml. Production néant - 6,8 8,6 de base Production de base Glutamate 6,0 4,8 16,2 Production de base Acétate 6,0 4,8 10,4 Production de base Pyruvate 6,0 5,0 9,7 Production de base Pumarate 6,0 6,8 18,6 Production de base Succinate 6,0 7,4 16,4 Production ot -Kéto- de base glutarate 6,0 6,6 16,0 Production de base Malate 6,0 6,6 24,5 Production Cis-oxal- de base acétate 6,0 6,5 15,9 Production Glutamate de base + acétate 6,0 6,2 20,2 Production Glutamate de base + pyruvate 6,0 7,2 23,0 Production Glutamate de base + fumarate 6,0 6,1 23,8 70 03163 17 2029707 Production de base Production de base Production de base Production de base Glutamate + succinate Glutamate + o(-céto-glutarate Glutamate + malate Glutamate + oxalacétate 6,0 6,0 6,0 6,0 6,8 7,0 6,7 7,0 22,4 23,0 23,0 21,4 10 * sous forme de sels de sodium. Comme on peut le voir de ce qui précède, aucun des acides nra d'effet de stimulation ou d'inhibition sur la croissance du microorganisme. 15 Exemple 6 la production de l'acide (-) (cis-1,2-époxypropyl)phos-phonique est conduite comme indiqué dans l'exemple 3. On a obtenu les résultats de titrage suivants qui montrent l'effet de l'addition des acides glutamique, maléique et fumarique sur la produc-20 tion de l'antibiotique. la croissance du microorganisme dans les fioles de fermentation est mesurée d'après le poids sec du mycélium par millilitre de bouillon de culture. 25 30 35 Milieu Production de base Production de base Production de base Production de base Production de base Production de base Acide Quantité Croissance Antibioti- carboxylique Millimoles/litre poids sec que ajouté * mg./ml. ^g./ml. Néant Glutamate 1-malate 1-malate 1-malate Fumarate 6,0 0,6 6,0 60,0 0,6 7,5 7,1 7.4 5,7 7.5 8,0 15,3 29,0 15,2 24,8 7,7 16,0 70 03163 18 2029707 Production de base Fumarate 6,0 5,7 23,9 Production de base Fumarate 60,0 6,6 8,9 * sous fonne de sels de sodium 70 03163 19 2029707 BEVEjflDI GATIONS 1- Procédé de préparation de l'acide (-)(cis-1,2-époxy-propyl)phosphonique dans lequel on cultive un microorganisme producteur d'acide (-) (çis-1,2-époxypropyl) phosphonique dans un 5 milieu nutritif aqueux dans des conditions aérobies jusqu'à ce qu' on obtienne une activité antibiotique substantielle dans ledit milieu, caractérisé en ce qu'on ajoute au milieu nutritif un ou plusieurs acides organiques ou leurs sels pour accroître la production dudit antibiotique. .10 2- Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que l'acide organique est l'acide acétique, pyruvique,maléique, fumarique, succinique, C*-cét bglutarique, glutamique ou oxalacé-tique• 3 - Procédé selon la revendication 1 caractérisé en œ 15 que le microorganisme est un Streptomyces. 4 - Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que l'acide organique est présent dans le milieu nutritif en quantité équivalant à environ 0,6 à 30,0 millimoles par litre. 5 - Procédé de préparation de l'acide (-) (cis-1.2-épo-20 xypropyl)phosphonique dans lequel on cultive un microorganisme producteur d'acide (-) (cis-1,2-époxypropyl)phosphonique dans un milieu nutritif aqueux dans des conditions aérobies jusqu'à ce qu'on obtienne une activité antibiotique substantielle dans ledit milieu, caractérisé en ce qu'on ajuste la teneur en acide organi-25 que dans le milieu de fermentation par addition au milieu d'un acide organique ou d'un de ses sels jusqu'à ce qu'on obtienne une concentration substantiellement non toxique de l'acide en excès de 0,60 millimole par litre. 6 - Procédé selon la revendication 5 caractérisé en c e 30 que l'acide organique est l'acide acétique, pyruvique, maléique, fumarique, succinique, ot-cétoglutarique, glutamique ou oxalacé-tique. 7 - Procédé selon la revendication 5 caractérisé en ce que le microorganisme est un Streptomyces. 35 8 - Procédé de préparation de l'acide (-) (cis-1.2-épo- xypropyl)phosphonique dans lequel on cultive un microorganisme producteur d'acide (-) (çis-1,2-époxypropyl)phosphonique dans un milieu nutritif aqueux dans des conditions aérobies jusqu'à ce 70 03163 20 2029707 qu'on obtienne une activité antibiotique substantielle dans ledit milieu, caractérisé en ce qu'on ajoute un ou plusieurs acides ou sels organiques au milieu nutritif pour accroître la production et on isole l'acide (-) (çis-1,2-époxypropyl)phosphonique du 5 bouillon de fermentation résultant. 9 — Procédé selon la revendication 8 caractérisé en ce que le microorganisme est un Streptomyces. 10 - Procédé selon la revendication 8 caractérisé en ce que l'acide organique est présent dans le milieu nutritif en quan- 10 tité équivalant à environ 0,60 à 30 jO millimoles par litre de milieu» 11 - Procédé selon la revendication 9 caractérisé en c e que le Streptomyees est une souche de Streptomyces fradiae. 12 - Procédé selon la revendication 9 caractérisé enoe 15 que le Streptomyces est une souehe de Streptomyces wedmorenala- 13 - Procédé selon la revendication 9 caractérisé en ce que le Streptomyces est une souche de Streptomyees viridochromo-genes. 14 - Procédé de préparation de l'acide (-) (çis-1,2-épo- . 20 xypropyl)phosphonique dans lequel on cultive un Streptomyces producteur d'acide (-) (cis-1,2-époxypropyl)phosphonique dans un milieu nutritif aqueux dans des conditions aérobies jusqu'à ee qu'on obtienne une activité antibiotique substantielle dans ledit milieu, caractérisé en ce qu'on ajoute au milieu nutritif un ou plusieurs 25 acides ou sels organiques pour accroître la production dudit antibiotique• 15 - Procédé selon la revendication 14 caractérisé en ce que l'acide organique est l'acide acétique, pyruvique, maléique, fumarique, succinique, ot -cétoglutarique, glutamique ou oxolacé- 30 tique. 16 - Procédé selon la revendication 14 caractérisé en ce que le Streptomyces est une souche de Streptomyces fradiae. 17 - Procédé selon la revendication 14, caractérisé en ce que le Streptomyces est une souche de Streptomyces yedmorensis. 35 18 — Procédé selon la revendication 14 caractérisé en ce que le Streptomyces est une souche de Streptomyces viridochromo-genes. 19 - Procédé de préparation de l'acide (-) (çis-1,2- 70 03163 21 2029707 époxypropyl)phosphonique dans lequel on cultive un microorganisme producteur d'acide (-) (cis-1,2-épozypropyl)phospiionique dans un milieu nutritif aqueux dans des conditions aérobies jusqu'à ce qu' on obtienne une activité antibiotique substantielle dans ledit 5 milieu, caractérisé en ce qu'on ajoute de l'acide glutamique ou un de ses sels plus de l'acide acétique, pyruvique, fumarique, succinique,od-cétoglutarique ou oxolacétique ou un de leurs sels au milieu nutritif pour accroître la production dudit antibiotique. 20 - Procédé selon la revendication 19 caractérisé en ce 10 que le micro organisme est un Streptomyces.