FR 2034473 A1 19701211 FR 7001577 A 19700116 70 01577 1 2034473 La présente invention concerne l'induction de la formation, in vivo et in vitro par l'emploi de polymères complexés, de substances qui inhibent la croissance virale, par exemple des interférons, ainsi que l'induction de résistance à l'infection virale 5 in vivo et in vitro par l'administration desdits polymères complexés. Elle vise plus particulièrement l'induction de la production d'interférons et l'induction de résistance à l'infection virale par l'administration de polymères complexés formés par ion mélange composé de deux homopolynucléotides ou d'un homopolynucléotide et 10 d'un homooligonucléotide. Dans la description et les revendications le terme inter-féron sera utilisé et doit être compris comme s'appliquant au même principe actif identifié dans la littérature par divers termes comme facteur d'inhibition virale et substance inhibitrice de virus. Dans 15 ce qui suit, on utilisera le terme homopolynucléotide pour désigner non seulement les homopolynucléotides mais aussi les homooligonu-cléotides, la différence étant seulement dans la longueur du polymère, c'est-à-dire que ce terme embrasse les polymères connus ayant de deux à des milliers d'unités à base de nucléotides. On prépare 20 ces polymères connus en traitant par des enzymes un diphosphate de nucléotide in vitro pour former le polynucléotide désiré dans divers nombres d'unités nucléotides, le nombre ne pouvant pas être connu avec précision0 Dans la recherche chimiothérapique virale, on espère pou-25 voir trouver un agent antiviral chimique à large spectre. A ce jour, les seuls agents à large spectre connus sont les interférons qui apparaissent dans le sang et les tissus des animaux et de l'homme au cours des infections virales ou autres, et semblent fournir un mécanisme possible pour arrêter la maladie virale, qui est séparé 30 et distinct des mécanismes immunologiques spécifiques. Toutefois, on n'a pas pu produire l'interféron en quantités pratiques pour l'emploi en chimiothérapie. Une autre tentative dans la chimiothérapie virale a été la recherche d'une substance chimiquement définie, non toxique, non antigène, non et facilement accessible qui stimu-35 lerait les cellules animales pour la production d'interféron, ce qui conférerait une protection contre l'infection virale. 70 01577 2 2034473 On a signalé de nombreux inducteurs d'interféron parmi lesquels des virus aussi bien viables qu1inactivés, l'endo-toxine, la phytohémagglutinine, agents de conjonctivites à inclusions (agents TRIC), Brucelle abortus et autres. Toutefois, pour chacun 5 d'eux, de sérieux défauts comme la toxicité, le caractère antigène et/ou la r eproduïtibilLté ont limité leur possibilité d'emploi pour le traitement de la maladie virale. La demanderesse a maintenant déterminé que des concentrations élevées d1interférons peuvent être induites dans l'animal 10 par l'administration de polymères complexés qui sont des agents synthétiques chimiquement définis, non toxiques, non antigènes,non reproductibles qui peuvent être préparés à partir d'homopoly-nucléotides facilement accessibles. Le polymère complexé peut être administré par voie parentérale, comme la voie sous-cutanée, intra-15 dermique, intrapéritonéale, intraveineuse , intramusculaire, par voie orale ou topiquement, de préférence sur une membrane muqueuse, par exemple par voie nasale et dans le tractus respiratoire» Ces polymères complexés sont préparés par mélange de deux homopolynucléotides qui sont eux-mêmes synthétiques et commercialement acces-20 sibles et peuvent être préparés par des procédés bien établis. Ces polynucléotides synthétiques sont bicaténaires et ils représentent ce qui suit : (a) complexation formée entre deux homo-poly_ribonucléotides (rI:rC, rA:rïï, rI:rBC), autocomplexation de polymères polyribonucléotidesalternés (rIO, rIBC, rAU) ou complexa-25 tion entre un polydéoxyribonucléotide et un polyribonucléotide (FI ADN - AE.N). La signification de ces symboles est la suivante : rlrrC - complexe d'acide polyriboinosinique et d'acide poly-ribocytidylique rA:rU - complexe d'acide polyriboadénylique et d'acide poly-30 ribouridylique rl+GpG - mélange d'acide polyriboinosinique et de cytidylyl cy-tidine rI:rBG - complexe d'acide polyriboinosinique et d'acide polyri-bobromocytidylique 35 rIC - copolymère alterné d'acides riboinosinique et ribo-cytidylique 70 01577 3 2034473 rIBC - copolymère alterné d'acides riboinosinique et bromo-ribocytidylique rAU - copolymère alterné d'acides riboadénylique et ribouri-dylique 5 FI ADN - ARN - complexe entre FI bactériophage ADN et ARN de séquence nucléotide complémentaire. Le trait sur le BG indique qu'une bromuration et d'autres composants halogénés ainsi que des composants alcoylés sont inclus dans l'invention. L'halogénation ou 1'alcoylation à courte chaîne 10 d'un composant des ribocopolymères alternés ou des ribohomopoly-mères complexés ne réduit pas la capacité d'induction de l'inter-féron et de résistance de l'hôte. Les homopolynucléotides utilisés dans la préparation des polymères complexés ont un squelette phosphate de pentose, de pré-15 férence dans lequel le pentose est le ribose ou le déoxyribose aussi bien qu'une base pyrimidine ou purine identifiable spécifique comme l'adénine, l'inosine, la cytosine, l'uracil, la guanine et analogues. La technique antérieure enseigne que le mélange de certains homopolynucléotides en solution aqueuse conduit à la formation d'un 20 polymère complexé identifiable par différents tests physiques et qui est différent de chacun des deux homopolynucléotides dont est issu le polymère complexé. Le rapport dans lequel les deux homopolynucléotides sont mélangés ne contrôle normalement pas le"rapport des deux homopolynucléotides incorporés dans le complexe. Un mélange 25 dans un rapport 1:1 molaire peut conduire à un polymère complexé contenant les deux bases azotées dans un rapport 1:1, 1:2 et/ou 2:1 ou quelque autre rapport d'entiers faibles, c'est-à-dire que le rapport résultant n'est pas une fonction du rapport dans lequel les composants sont mélangés mais il est déterminé par quelque tendance 30 naturelle à se combiner de la sorte qui est propre aux homopolynucléotides particuliers employés. Les polymères complexés sont ceux qui sont formés par mélange d'un homopolymère avec un autre homopolymère, la paire choisie étant complémentaire, par exemple un homopolymère d'acide adénylique 35 mélangé avec un homopolymère d'acide uridylique ou d'un de ses dérivés substitués, par exemple bromé .La paire mélangée peut aussi 70 01577 4 2034473 être les acides inosinique et polycytidylique ou leurs dérivés bromés ou autrement substitués. Il doit être entendu qu'à l'acide guanylique on peut substituer l'acide inosinique car c'est un dérivé, la liaison de ces paires est une liaison hydrogène ainsi que le 5 montre l'hypochromicité dans la région ultraviolette. En outre, l'un des composants du complexe doit être un polymère de purine et l'autre composant doit être un polymère de pyrimidine pour former un complexe actif. Les polymères complexés utilisés comme inducteurs d'inter-10 féron dans la présente invention sont préparés par des procédés de synthèse, des références de littérature étant ïhach, R.E., et P. Doty, 1965, Science 147. 1510, Krakow, J.S. et Myra Karstadt, PUAS 58» 2094 (1967), Milman G., Mangridge, R., MoJ. Chamberlin, PUAS 57, 1804-1810 (1967), "The Structure of a DNA-BNA Hybrid". 15 Par exemple, les polymères complexés sont préparés en mélangeant deux homopolynucléotides différents dansjun rapport molaire 1:1 en ce qui concerne les bases pendant quelques minutes à la température ambiante dans un système aqueux tamponné ayant un large intervalle de pH, c'est-à-dire entre environ 5,0 et 10,0 et une résistance 20 ionique entre environ 0,001 et 1,0. On peut utiliser des rapports différents de 1:1 comme indiqué précédemment. Des systèmes tampons qu'on a trouvé utilisables sont le phosphate de sodium 0,006 M en solution dans le chlorure de sodium à 0,85 # et la glycylglycine 0,01 M dans le chlorure de sodium à 0,59 On peut utiliser tout tam-25 pon non toxique. En fait, on peut n'utiliser aucun tampon car on a trouvé que la capacité tampon du système physiologique de l'animal auquel on doit administrer le mélange d'homopolynucléotides est satisfait pour promouvoir la formation du complexe désiré après administration, et induit la production d'interféron et la protec-30 tion de l'infection virale de la même façon.que lorsque les deux homopolymères sont pré-complexés. L'invention englobe aussi l'administration à l'hôte animal, y compris l'homme, des nucléotides qui formeront dans leur corps les polymères complexés qui serviront d'inducteurs d'interféron. 35 Un autre procédé qui peut être utilisé pour préparer les polymères complexés consiste à traiter un mélange de deux diphos- 70 01577 5 2034473 pliâtes de nucléotide ou de triphosphates de déoxynucléotide dans un tampon phosphate d'environ 7, avec la polymérase d'acide ribo-nucléique d'acide déoxyribonucléique appropriée. Un tel traitement entraîne une polymérisation des deux monomères en deux homopoly-5 nucléotides avec formation concomitante du polymère complexé. Les polymères complexés formés in vitro peuvent être caractérisés par un décalage hypochromique dans le spectre d'absorption ultraviolette, un fractionnement du gradient de densité du sucrose, la chromâtographie et la capacité d'induction de la formation d'in-10 terféron, activité qui n'existe dans aucun des homopolynucléotides à partir desquels est formé le complexe. La production "d'interféron permet de caractériser au mieux les polymères complexés utilisés dans le procédé selon l'invention, car les méthodes physiques manquent souvent d'une sensibilité suffisante. 15 La production d'interféron par administration des polymères complexés est démontrée par la protection des animaux hôtes aussi bien que les cultures de cellules venant d'une attaque par virus. L'interféron ainsi produit peut aussi être caractérisé par isolement de l'interféron induit par des méthodes connues, puis détermi-20 nation in vitro de ses propriétés inhibitrices de virus et carac-térisation par spécificité de l'hôte, sensibilité à la trypsine, point isoélectrique et détermination du poids moléculaire. L'induction de la formation d'interféron in vivo et/ou l'induction de la résistance à l'infection virale est obtenue par 25 administration d'un polymère complexé, préparé comme décrit ci- dessus, à un animal hôte comme un lapin, une souris ou autre. L'administration peut être parentérale ou topique, en particulier sur une membrane muqueuse, par exemple administration intranasale ou dans le tractus respiratoire. La dose efficace dépend de l'espèce 30 de l'hôte et dans une certaine mesure du virus contre lequel on cherche la protection. Chez les souris, le seuil est environ 0,5 mg/kg, tandis que pour les lapins, il est approximativement 0,05pg/kg. ces doses, il n'y a pas de signe apparent de toxicité soit localement au point d'injection, soit d'une façon générale 35 dans le bien-être de tout l'animal. L'efficacité des polymères complexés comme inducteurs d'in- 70 01577 6 2034473 terféron dans l'animal hôte peut être déterminée, entre autres, par l'administration parentérale du polymère complexé à un animal et par des prises de sang après environ 1 à 5 heures. Le sérum est séparé des prises coagulées du sang, stérilisé et titré à plusieurs 5 dilutions dans des tubes de culture contenant des cellules de la même espèce d'animal que celui utilisé comme hôte. Après incubation à 35-0 pendant environ 18 à 24 heures les cultures de cellules sont soumises à l'attaque par l'un quelconque des virus cytopathiques connus,et incubées à nouveau à 35sO pendant environ 3 jours. Les 10 cultures sont alors examinées pour leurs effets cytopathiques et le titre en interféron est déterminé comme l'inverse de la dilution à laquelle 50 fo des tubes ne montrent pas d'effets cytopathiques. L'efficacité des polymères complexés comme inducteurs d'interféron et de résistance de l'hôte dans une grande variété de sys-15 tèmes cellulaires vivants, à la fois in vivo et in vitro. est montrée par le nombre considérable de cultures de cellules et d'hôtes dans lesquels l'interféron peut être trouvé. Des types représentatifs de ceux-ci sont l'embryon de poulet, la membrane chorioallan-toxque de poulet, membrane qui peut être dans l'oeuf aussi bien 20 qu'in vitro, la culture de cellules de rein de singe, la peau de lapin et les testicules de lapin in vitro. la culture de cellules de rein de veau, la culture de cellules de rein de lapin, la culture de cellules de amnion humain, 1'intrallantoïque dans l'oeuf, la culture de cellules M0K, la culture de cellules fibroblastiques de 25 souris, de prépuce humain, la culture de cellules d'embryon de poulet, la culture de cellules KB, le poumon de souris in vivo, le cerveau de souris adulte in vivo, la culture de cellules fibroblastiques de poulet, la glande thyroïde de l'homme adulte, la culture de cellules de poumon ou de rein d'embryon, les leucocytes de 30 l'homme, les lignes (3B, ME 29) de cellules d'embryon de souris dans des cultures et la culture de cellules d'embryon de souris primaire. D'après cela, on peut s'attendre que toute cellule vivante, soit dans l'hôte, soit dans un milieu de culture, et qui est capable de donner l'interféron, sera induite pour produire de l'interféron 35 sous l'influence des polymères complexés selon l'invention» Les interférons produits par le procédé ci-dessus se sont 70 01577 7 2034473 montrés spécifiques d'espèce en utilisant un titrage d'interféron par réduction de plaque qui comporte l'incubation d'une partie aliquote du sérum contenant de l'interféron avec des cultures de cellules individuelles de différentes espèces, suivie d'une attaque 5 par Tin virus comme le virus stomatitis vésiculaire ou autre virus cytopathogène, et l'incubation pour permettre la formation d'une plaque de virus. Le nombre de plaques sur des cultures traitées à l'interféron est comparé à celui dans des témoins infectés au virus non traités. On a observé dans ces essais que l'activité de 10 l'interféron est démontrée seulement dans les cas où les cultures de cellules sont de la même espèce animale que celle dç laquelle a été isolé le sérum contenant l'interféron. Les interférons induits par le procédé de la présente invention employant des polymères complexés peuvent être montrés comme 15 étant sensibles à la trypsine dans un essai d'interféron par la réduction de plaque, c'est-à-dire que l'activité de l'interféron est détruite par un traitement à la trypsine. L'interféron induit comme précédemment décrit est en outre caractérisé par des méthodes connues comme le point isoélectrique 20 et le poids moléculaire ainsi qu'il est décrit dans les exemples. Ce qui suit illustre la préparation des polymères complexés qui sont utilises dans le procédé selon l'invention. Préparation de polymères complexés Substance I : 25 Préparation d'un complexe d'acides polyinosinique et polycytidylique "Poly (I+C)" On prépare une solution d'acide polyinosinique (I) qui contient 550 pg/ml dans un tampon qui est 0,01 M en. .glycylglycine et 0,1 M en chlorure de sodium. On prépare une solution d'acide 30 polycytidylique (G) contenant 500 jig/ml dans le même tampon« Les solutions sont ensuite mélangées dans un rapport molaire 1 :1 par rapport aux bases. La solution résultante est utilisée directement comme source de polymères complexés, Poly (I+C) aussi appelés rI:rC. Elle a "un point moyen de transition fusion (Tm) de 60,5aC, force 35 ionique =0,1, 70 01577 8 2034473 Substance II : Préparation cL'-un complexe d'acides polyadényligue et polyuridylique "Poly (A-t-IJ)". En suivant le mode opératoire décrit ci-dessus pour la pré-5 paration de la substance I, mais en employant des quantités équi-molaires (par rapport aux bases) d'acides polyadénylique (A) et polyuridylique (U) au lieu des acides polyinosinique et polycytidylique, on produit le polymère complexé Poly (A+TJ) appelé aussi rA:rU0 II y a un Tm de 562C, force ionique = 0,1„-10 Substance III : Préparation d'un complexe d'acide polyinosinique et de cy-tidylylcytidine "Poly (I+CpC)" En suivant le mode opératoire décrit ci-dessus pour la préparation de la substance I, mais en employant, au lieu de l'acide 15 polycytidylique qui y est utilisé, une quantité équimolaire de cyti-dylylcytidine, qui est un oligonucléotide, et en utilisant un système tampon composé de phosphate de sodium 0,006 M dans une solution saline à 0,85 f° à pH 7, on obtient le polymère complexé Poly (I+CpC) appelé aussi rI:rCpC„ 20 En utilisant la méthode employée pour la préparation de la substance I, mais en substituant aux acides polyinosinique et polycytidylique des quantités équivalentes d'autres homopolynucléotides connus, on obtient, par exemple, les complexes suivants : poly (A+I), poly (G-+C), poly (A+DHU), poly (A+8U), poly (U+8A) dans 25 lesquels A, I, C et U ont les significations données précédemment, G- représente l'acide polyguanylique, DHU représente l'acide poly-dihydrouridylique et 8A et 8U représentent respectivement les acides polyadénylique et polyuri dylique dans lesquels chacun a 8 unités de nucléotide par polymère. Oes mêmes complexes peuvent aussi être 50 appelés rArrl et rG-:rC, etc. Substance IV : Préparation de déoxyribohomopolymères Le procédé de synthèse de ces produits est décrit par K..B„ Inman et R.L. Baldwin dans J. Mol. Biol. (1964) 8, 452. 70 01577 9 2034473 Substance V : Préparation d'un complexe dans lequel l'un des composés est chimiquement modifié, par exemple ri:rBC Le polymère complexé rI:rBC est préparé par un procédé dé-5 crit par D.R. Davies et A.J. Rich dans J. Amer. Chem. Soc., 80, 1003 (1958) pour la préparation de rl:r0 sauf qu'on utilise le 5-bromocytosine-5'-triphosphate dans la synthèse de rBC. Le complexe a un Tm de 89,52C dans un tampon de force ionique de 0,1. On peut suivre le même procédé pour obtenir d'autres complexes à partir 10 d'autres polynucléotides bromés ou halogénés comme rA:rBU, rlsrClC etc. De la même façon, les bases peuvent être chimiquement modifiées par alcoylation de façon connue. Substance VI : Préparation d'un complexe de copolymère de polvribonu-15 cléotide alterné. Ce copolymère alterné est préparé par le procédé décrit par J.S. Krakow et coll., dans l'article ci-dessus mentionné. Le complexe a un Tm de 64-659C dans un tampon de force ionique de 0,1. Ces complexes alternés sont synthétisés, comme décrit dans 20 l'article, en utilisant une enzyme préparée à partir de microorganismes et appelée polymérase ARN. Les copolymères sont dans un rapport 1:1 et sont bicaténaires par liaison hydrogène des bases complémentaires alternées. Ces produits peuvent être faits en utilisant cette enzyme en présence d'un template qui peut être du dAÏ 25 ou de l'ADÎï dénaturé par la chaleur Ces copolymères alternés ne sont pas limités à des copolymères régulièrement alternés mais comprennent aussi des copolymères irrégulièrement alternés du moment que les composants sont dans un rapport défini. D'autres copolymères alternés sont préparés de façon analogue comme rAU:rAU etc. 30 Substance VII : Préparation d'un complexe de copolymère de ribonucléotide alterné utilisant un ribonucléotide halogéné. Un exemple d'un tel complexe est rIBC:rIBC préparé par le procédé de l'article de J.S. Krakow. Il a un Tm de 919C dans un 35 tampon de force ionique de 0,1. D'autres exemples sont rABU:rABU, r IC1C ; rlClC et c. 70 01577 10 2034473 Substance VIII : Préparation d'un complexe entre un polydéoxyribonucléo-tide et un polyribonucléotide Un exemple de oe complexe bicaténaire est PI ADF-ARN qui 5 est un complexe entre FI bactériophage ADN et un ARIT de séquences de nucléotides complémentaires. Le FI bactériophage ADN est utilisé ici comme un templat pour la synthèse enzymatique d'ARÏT. Le procédé de préparation de ce complexe et d'autres hybrides bicaténaires est décrit par G. Milman et coll. dans l'article cité plus haut. Le 10 complexe FI ADN-ARN a un Tm de 822C dans un tampon de force ionique de 0,1 « Les exemples qui suivent sont donnés pour démontrer l'induction d'interféron par administration de certains des complexes homopolynucléotides comme ceux qui sont décrits ci-dessus, aussi 15 bien chez les animaux hôtes vivants que dans des cultures de cellules isolées et il ne faut pas en déduire que d'autres polymères complexes prévus dans la présente invention, quoique non identifiés, ne stimuleront pas la production d'interféron de façon analogue. EXEMPLE 1 20 Induction d'interféron chez les lapins Les polymères complexés décrits ci-dessus sont administrés séparément à raison de 0,5 ml à des lapins de 4,5 à 5,0 livres par injection intraveineuse. Après environ 2 heures, on fait des prises de sang à chaque lapin par ponction cardiaque. Le sérum est séparé 25 de chacune des prises coagulées et stérilisées séparément par exposition à une irradiation ultraviolette. Des parties aliquotes de ces prises stérilisées sont employées dans les essais suivants. Détermination des titres en interféron Le sérum de lapin stérilisé de chaque lapin est titré sé-30 parément par des doubles dilutions en série à partir d'un milieu de culture utilisant 1:5-1:640 cellules comme diluant. Un échantillon de 1 ml de chaque dilution est ajouté à chacun de quatre tubes de culture de cellules de rein de lapin qui ont été tirées d'un milieu de culture usé. Après une incubation d'une nuit à 352C, les cul-35 tures en tubes sont de nouveau séparées et infectées avec 10 à 100 TGID^q (Tissue culture infectious dose,^) de virus stomatitis vési- 70 01577 n 2034473 culaire contenu dans 1 ml de milieu de croissance. Chacune des cultures en tube est incubée à 35-0 pendant encore 3 jours, puis examinée pour ses effets cytopathiques et notée (+) pour l'existence de tels effets ou (0) quand il n'y a aucun effet cytopathique. 5 le titre en interféron pour chaque échantillon est déterminé comme l'inverse de la dilution de sérum à laquelle 50 $ des tubes ne montrent pas d'effets cytopathiques. Le sérum des animaux non traités (c'est-à-dire les animaux témoins normaux) est titré dans chaque essai pour évaluer les facteurs normaux du sérum. Les titres ainsi 10 déterminés figurent dans le Tableau I. TABLEAU I Titre en interféron déterminé par des cultures de cellules de rein de lapin Titre en 15 Agent chimique Dose/animal interféron I + 0 (rI:rC) 2 pg > 640 11 0,5 pg 20-40 II 0,25 pg Poly I 25 pg 20 Poly 0 25 pg Témoin normal néant A + U (rA:rU) 200 PS 10-20 II 100 pg 10-20 tt 50 pg 40-80 25 It 25 pg 20-40 tt 12,5 pg 5-10 II 6,25 pg 5-10 Acide polyadénylique 200 pg ^ 5 Acide polyuridylique 200 pg 5 30 .Témoin normal néant 70 01577 12 2034473 TABLEAU I (suite) Titre en .Agent chimique Dose/animal interféron Poly I+CpC (rI:rCpC) 100 pg > 640 tt 10 pg 5 II 1 pg 5 CpC 50 pg 5 Témoin normal néant 5 10 Dans un essai de titrage basé sur l'exemple I, on a trouvé que les quantités des complexes qui, lorsqu'ils sont injectés par voie intraveineuse à des lapins, induisent la production de concentrations détectables d'interféron de sérum en deux heures, sont les suivantes : 0,5 pg de rlsrC - 25 pg de rA:rU - 100 pg de rI:rCpC 15 10,5 pg de rI:rBC, 10 pg de rIC:rIC - 12 pg de rIBC:rIBC et 5 pg de El ADU-ARET. Avec certaines de ces substances les quantités indiquées pour l'induction ne sont pas des quantités minimales. EXEMPLE 2 Induction d'interféron chez la souris 20 Une solution de poly (I+C) (substance I) ainsi que des so lutions d'acides polyinosinique et polycytidylique sont administrées séparément à raison de 0,2 ml à des souris de 16-18 g, par injection intraveineuse. Chaque solution est ainsi administrée à 25 souris. Après environ 2 heures, on fait des prises de sang à chacune des 25 souris. Le sérum est séparé de chacun des échantillons de sang coagulé. Les sérums des animaux qui ont reçu une injection du même polynucléotide ou de la même solution de polymère complexé sont réunis et stérilisés par irradiation ultraviolette et titrés par la technique de réduction de plaque sur des cellules d'embryon de sou-30 ris avec le virus stomatitis vésiculaire. Les sérums rassemblés des animaux non traités sont titrés de la même façon. 70 01577 13 2034473 TABLEAU II Stimulation de la "production d'interféron chez la souris déterminée par la technique de réduction de plaque Titre en Agent chimique Dose/animal interféron Poly I 55,0 pg Poly C 50,0 pg Poly I+C (rI:rC) 52,5 pg 256 Diluant tamponné témoin - - 10 normal EXEMPLE 3 Résistance induite contre l'infection par le virus Columbia SE chez la souris. L'infection de souris par Columbia SK donne les symptômes 15 de poiL ébouriffé, de léthargie et de paralysie flaccide puis la mort dans les 3-5 jours qui suivent l'injection pour la majorité des animaux. Pour évaluer l'efficacité des polymères complexés à induire une quantité protectrice d'interféron, le processus expérimental est le suivant : 20 La solution d'essai (0,5 ml) du polymère complexé d'homo- polynucléotide identifié dans le Tableau III est administrée par voie intrapéritonéale 18 heures avant l'infection à des souris pesant chacune entre 14 et 16 g. On injecte par voie sous-cutanée une quantité suffisante de virus Columbia SK pour tuer 90 fo des souris 25 en cinq jours après l'infection, et chaque souris est traitée avec 0,5 ml de la solution d'essai injectée par voie intrapéritonéale 3 heures après l'infection^ Des animaux traités de la même façon avec le polymère complexé ou 1'homopolynucléotide mais non infectés par le virus sont mis en observation pour avoir la preuve de la 30 toxicité produite par ces produits chimiques. Aucun indice de toxicité n'est observé sur les animaux traités mais non infectés. Les animaux continuent à manger normalement, croissent normalement et toutes les caractéristiques extérieures apparaissent normales. 70 01577 14 2034473 On tient chaque jour le compte des animaux vivants et des animaux morts ce jour. Les animaux sont observés pendant 10 jours.- TABLEAU III Résistance induite à l'infection de souris par le virus Oolumbia SK 5 Jours de Dose totale Survie survie Agent chimique par animal % moyens Tampon phosphate 3,3 4,7 Acide polyinosinique 0,91 mg. 0,0 4,3 ' Acide polycytidylique 1,00 mg. 0,0 4,2 Poly I+C (rI:rC) 1,05 mg. 40,0 8,5 Poly I+C (rlïrC) 0,53 m g. 20,0 7,1 Poly I+C (rI:rC) 0,26 mg. 6,7 6,0 Quand on emploie le même processus sauf qu'on omet la dose 15 de post-infection, on obtient des résultats comparables à ceux du Tableau III„ Dans d'autres essais on a trouvé que les souris sont protégées contre l'infection par le virus Columbia SK dans les combinaisons suivantes : 20 rI:rC administration intranasale et attaque par le virus par voie intranasale rI:rC administration intrapéritonéale et attaque par le virus par voie intrapéritonéale rI:rC administration intrapéritonéale et attaque par le virus par 25 voie intranasale» Dans un essai similaire on a trouvé qu'une dose de 16 mg de rl:r0 par souris administrée par voie intrapéritonéale les protège contre le virus de Sendai. • EXEMPLE 4 30 Résistance induite contre l'infection de souris par le virus de la pneumonie Le virus de la pneumonie des souris inoculé par voie na 70 01577 15 2034473 sale à des souris provoque une infection virale respiratoire allant jusqu'à la pneumonie avec la mort intervenant 6 à 7 jours après l'infection pour la majorité-des animaux. Des solutions de polymères complexés et d'homopolynucléo-5 tides sont testées pour leur aptitude de protection prophylactique contre le virus en question en prétraitant 20 souris de 8-10 g par voie intranasale avec 0,03 ml de la solution contenant le produit à examiner du Tableau IV, 4 heures avant l'inoculation intranasale du virus. On utilise suffisamment de virus pour tuer 75 °f° des ani-10 maux en 6-7 jours après inoculation. A la fin de l'expérience (14 jours) 59 des 60 souris infectées mais non traitées étaient mortes par l'infection au virus. On tient un compte journalier du nombre des animaux vivants et des animaux morts ce jour. Les animaux sont observés pendant 20 15 jours. TABLEAU IV . Résistance induite à l'infection de souris par le virus de la pneu- monie de la souris. Jours de 25 Dose totale Survie survie Agent chimique par animal io moyens Poly I+C (rI:rC) 31,5 pg 87,7 >14,0 Poly I+C (rlrrC) 15,8 pg 87,5 >14,0 Poly I+C (rI:rC) 7,9 pg 60,0 >14,0 30 Poly I 16,5 pg 5,6 7,0 Poly C 15,0 pg 0,0 7,0 Tampon phosphate - — . 0,0 7,0 On a aussi trouvé que les souris sont protégées contre une attaque intraveineuse de virus Vaccinia si le rI:rC leur est donné 35 par voie intrapéritonéale ou sous-cutanée comme traitement prophylactique. 70 01577 is 2034473 EXEMPLE "j Activité in vitro de polymères complexés comme substances inhibitrices de virus Chacune des cultures de cellules identifiées dans le Tableau 5 V est incubée pendant une nuit avec un des polymères complexés dans le milieu de croissance connu pour être nécessaire à la culture de cellules utilisée. Après avoir enlevé les solutions contenant le polymère complexé, chaque culture est infectée avec des suspensions de virus stomatitis vésiculaire (VSV), incubée et observée 10 pour la formation de plaque décrite dans lle,ssai montrant la spécificité d'espèce. TABLEAU V • Dose de polymère complexé enttsç/ml nécessaire pour induire la résis-à la formation de plaque VSV 15 Poly I+C Poly A+U Culture de cellules (rlîrC) (rA:rU) Rein de lapin primaire amnion humain primaire 0,04 26,25 Rein d'embryon humain primaire 1,25 - 20 Embryon de poulet primaire 0,33 > 100 Rein de bovin primaire 5,00 - Rein de chien primaire 1,25 - Embryon de souris primaire >5,25 ^100 L'efficacité relative des complexes comparée à celle de 25 leurs nucléotides non complexés est montrée, dans le Tableau Va en utilisant le même test. 70 01577 17 2034473 TABLEAD Va - Concentration en polymère complexé nécessaire pour induire la résistance à la formation de plaque de VSV sur des cultures de cellules de rein de lapin primaire. Polymère ug/ml Poly I >11" Poly C >10 Poly I+C (rI:rC) 0,00125 Poly A ' 1 >11- 10 Poly U >10 Poly A+U (rÂ:rU) 0,0015 rI:rBC 0,08 (non minimal) rICsrIC 0,003 15 rÏBC:rÏBC:: 0,04 rAU:rAU 0,04 PI DUA-RNA 0,6-1,25 En suivant les méthodes décrites dans les exemples 1-5 mais en utilisant la substance IV ou les polymères complexés cités après 20 la description de la substance III à la place des substances I, II et III, on obtient des résultats analogues. EXEMPLE 6 Démonstration de l'effet thérapeutique possible de l'inducteur d'interféron rI:rC donné par voie intranasale contre 25 une attaque intranasale par le virus de la pneumonie de la souris. On injecte à des souris par la voie intranasale du virus de la pneumonie et on leur donne ensuite par voie intranasale 32 pg de (rI:rC) 24, 48, 72 et 96 heures après l'attaque. Des animaux té-30 moins sont gardés pendant chaque jour d'attaque. Les résultats sont donnés dans le Tableau VI et il est à noter que l'inducteur d'interféron rI:rC est efficace comme agent thérapeutique pendant environ 72 heures après l'attaque par le virus de la pneumonie. 70 01577 18 2034473 TABLEAU VI Efficacité thérapeutique de l'induction par rlîrC pour la résistance de la souris à l'infection par le virus de la pneumonie. Traitement avec rlîrC (e) fo de survivants par 5 après attaque par virus. rapport aux témoins 24 heures 100 48 " 100 72 " 42 96 " 0 10 (e) rI:rC : 32 |ig/souris administrés par voie intranasale aux temps indiqués après l'attaque. EXEMPLE 7 Démonstration dans des essais sur animaux de la durée de protection de la souris contre l'attaque par le virus de 15 la pneumonie après une seule dose intranasale de l'induc teur d'interféron. Tous les animaux reçoivent une dose intranasale de 32 jag de rI:rC. Des animaux témoins sont gardés séparément pendant chaque période d'attaque. Les animaux sont attaqués par le virus de la 20 pneumonie de la souris 3 heures, 4 jours, 5 jours, 6 jours, 7 jours et 8 jours après la dose d'inducteur. Les résultats sont donnés dans le Tableau VII et il est évident qu'une seule dose de 32 ]ig par souris donne une protection notablement bonne pendant une période de six jours. 25 TABLEAU VII Durée de l'effet protecteur de l'induction de la résistance de l'hôte chez la souris à une attaque intranasale par le virus de la pneumonie chez la souris. Moment de l'attaque % de survivants par 30 après rlirO (e) rapport aux témoins 3 heures 100 4 jours 71 70 01577 19 2034473 TABLEAU VII (suite) Moment de l'attaque °/° de survivants par après rI:rC (e) rapport aux témoins 5 5 jours 100 6 jours . - - - 88 7 jours 24 8 j ours 24 (e) 32 p.g de rI:rC : tous les animaux ont reçu une dose intra-10 nasale 3 heures avant la première attaque. EXEMPLE 8 Test de la gravité de l'attaque par virus surmontée quand la résistance de l'hôte est Induite chez la souris par rltrO administré par voie intranasale. 15 Tous les animaux traités dans cette expérience reçoivent 16 /pg de rlîrC trois heures avant l'attaque par des doses graduées de virus de la pneumonie. L'attaque comportait de 31 à 10 000 LDj-q. Le virus est aussi donné par voie intranasale. Les résultats sont donnés dans le Tableau VIII qui montre qu'une dose de 16 p.g de 20 rI:rC trois heures avant l'attaque induit une excellente résistance à une attaque avec au moins 10 000 LD^q. TABLEAU VIII Etablissement du niveau d'efficacité de la résistance de l'hôte au virus de la pneumonie de la souris induite par rl:r0. . 25 Attaque' en LD^^. (e) fo de survie 10 000 . 93 3 150 73 1 000 87• 315 100 30 100 93 31,5 100 (e) Virus de la pneumonie de souris. Tous les animaux ont reçu 70 01577 20 16 |ig de rlrrC 3 heures avant l'attaque. 2034473 Identification des interférons les interférons sont identifiés comme étant des molécules de protéines à poids moléculaire relativement bas et possédant 5 la faculter d'interférer avec la reproduction virale seulement dans les cellules de la même espèce que celle qui a servi à préparer les interférons. La caractérisation des interférons a utilisé la démonstration de la spécificité pour l'espèce, l'activité antivirale, la sensibilité à la trypsine (test pour les protéines), le 1O point isoélectrique et les déterminations de poids moléculaire. Les test ci-après servent à identifier les substances actives inhibitrices de virus qui sont des interférons. Démonstration de la spécificité pour l'espèce des interférons induits. 15 Des échantillons (3 ml) de dilutions en double série dans un milieu de culture des échantillons d'interférons de l'exemple 1 stérilisés par irradiation ultraviolette sont ajoutés à des monocouches de divers types de cellules cultivées séparément dans des fioles de 30 ml à culture de tissu. Après incubation d'une nuit, 20 les échantillons de sérum sont évacués et remplacés par 0,5 ml d'une suspension de virus stomatitis vésiculaire et les cultures sont incubées à nouveau à 359C pendant encore 1,5 heure. Une surcouche de 5 ml d'un milieu de culture contenant de la méthylcellulose comme agent de solidification est ajoutée à chaque fiole et l'in-25 cubation est poursuivie pendant encore 3-4 jours à 35-C pour permettre la formation de plaque de virus. Le milieu de surcouche est alors retiré et les cellules sont teintes avec de la carbol fuchsine. Les nombres de plaques sur les monocouches traitées à l'interféron sont comparés à ceux des monocouches témoins infectées au viras non 30 traitées. L'inverse de la dilution de l'interféron donnant au moins une réduction de 50 $ dans le nombre de plaques est considéré comme le titre en interféron de cet échantillon. Les titres ainsi déterminés illustrent la spécificité pour l'espèce, c'est-à-dire que l'interféron induit dans un animal d'une espècê donnée est actif seule-35 ment dans les cellules dérivées d'un animal de cette même espèce. Ces titres sont donnés dans le Tableau IX» 70 01577 21 2034473 TABLEAU IX Spécificité pour l'espèce des interférons induits, dans des essais avec attaque par le virus stomatitis vésiculaire. 5 Agent chimique 10 I+C lapin > 2048 I+C souris 8 128 16 - A+U lapin 32 512 - I+CpC lapin - > 2048 - non traité lapin 16 (e) BSC ligne de cellule établie, dérivée de cellules du rein du singe vert d'Afrique. Démonstration de la sensibilité à la trypsine de l'interféron induit. 20 Du sérum contenant de l'interféron provenant d'animaux in duits avec un polymère complexé est isolé par chromâtographie sur CM-Sephadex (substance échangeuse de cations obtenue par introduction de groupes carboxyméthyle sur une résine Sephadex) Titre en interféron determiné sur cultures de cellules. Source sérum Embryon Embryon Rein Singe de de de BSC poulet . souris lapin (e) 70 01577 2034473 TABLEAU X Sensibilité à la trypsine de l'interféron induit Traitement Titre en interféron Interféron induit par Poly (I+C) + trypsine 16 5 " » n Poly (I+C) 256 Trypsine témoin 16 Interféron induit par Poly (1+CpC) + trypsine 8 " H n Poly (j+cpc) 1024 Trypsine témoin 8 10 Détermination du poids moléculaire de l'interféron induit Les poids moléculaires des interférons induits par des polymères complexés sont déterminés par la méthode suivante. Des colonnes de 2 x 35 cm sont garnies avec des grains de Sephadex G-200 15 hydraté et lentement percolées pendant 2 à 3 jours avec le tampon phosphate de sodium 0,006 M - NaCl 0,15 M, pH 7 pour obtenir l'équilibre (Sephadex est une substance insoluble hydrophile formée par la réticulation du polysaccharide dextrane. La désignation "G-2001' indique le degré de réticulation et, par conséquent, la porosité 20 du gel hydraté). Des quantités de 1 ml du sérum contenant l'interféron induit préparé comme décrit dansl'exsmple 1 sont appliquées à la colonne. La vitesse de circulation dans la colonne est réglée à 20-25 ml par heure et des fractions sont recueillies par 3 ml. Les fractions sont examinées pour la teneur en interféron par la 25 méthode de réduction de plaque et le poids moléculaire de chaque échantillon est calculé'd'après la formule = 146 / 1,480-V/Yo1/^ dans laquelle M est le poids moléculaire, Y est le volume d'élu-tion du produit examiné et Vo est le volume à vide.de.la colonne. Cette méthode donne des valeurs dans 10 fo des poids reportés quand 30 on fait l'essai avec des protéines purifiées. 70 01577 23 2034473 les résultats des déterminations de poids moléculaire sont les suivants : Interféron de lapin Poids moléculaire Induit par Poly (I+C) 49000 - 52000 5 Détermination du point isoélectrique -de l'interféron. Les échantillons de sérum contenant de l'interféron préparé comme décrit dans l'exemple 1 sont dialyses pendant une nuit contre un tampon au phosphate de sodium 0,1 M, pïï 6,0 ou simplement dilués 10 1:3 avec le tampon. 20 ml de chaque échantillon sont appliqués à une colonne de 1,5 x 10 cm de CM-Sephadex équilibrée avec le même tampon et l'interféron est élué avec des portions successives de 5 ml de phosphate de sodium 0,1 M avec un incrément croissant de , 0,2 unité de pH. L'effluent est recueilli par portions de 5 ml et 15 on mesure, l'activité interféron de chacune d'elles. Le pH de la fraction avec l'activité maximale est noté et le point isoélectrique est câlculé en ajoutant une unité jH de 0,4. Le point isoélectrique ainsi déterminé pour les interférons induits dans le lapin par l'administration de Poly (I+C) est de 6,8 à 6,9. 20 La description qui précède concernant la préparation de polymères complexés et les exemples illustrant le procédé selon l'invention décrivent spécifiquement certains aspects de l'invention. Ils ne doivent pas être considérés comme limitant l'invention car le procédé de l'invention peut être mis en pratique avec des poly-25 mères complexés préparés à partir d'homopolynucléotides, homooligo-nucléotides ou leurs analogues connus administrés parentéralement ou topiquement comme décrit ici. EXEMPLE 9 Préparation orale-nasale 30 Comme préparation prophylactique intranasale contre les virus respiratoires comme le coryza, une dose de 0,01 à 10 mg de polymère complexé rI:rC est à appliquer aux membranes orales et nasales tous les 2 ou 3 jours. Cette période d'administration est due à la durée prolongée de l'interféron induit. 35 L'application peut se faire par une suspension aqueuse dans un pulvérisateur de façon qu'une pulvérisation délivre environ 70 01577 2034473 0,01 à 10 mg. On peut aussi préparer et utiliser une présentation en aérosol en employant comme d'habitude des fluorochlorhy-drocarbures comme propellants. En outre, la préparation peut être appliquée sous forme de gouttes nasales. 5 Cette préparation peut aussi être utilisée thérapeu- tiquement environ tous les 2 ou 3 jours dans le cas d'une infection respiratoire réelle. Le médecin traitant peut décider qu'une application plus fréquente (comme journellement) ou moins fréquente (tous les 4 jours) peut être indiquée» 10 L'un des autres inducteurs selon l'invention peut remplacer le rI:rC de cet exemple en tenant compte de l'activité relative de divers inducteurs comme indiqué précédemment. EXEMPLE 10 Préparation oculaire 15 Pour l'emploi prophylactique et thérapeutique dans les yeux, on prépare une formule classique, par exemple avec de l'huile d'arachide stérile, de façon qu'une goutte contienne de 0,01 à 10 mg du polymère complexe rlîrC ou d'un autre des inducteurs ci-dessus. Une seule goutte est à appliquer à l'oeil tous 20 les 2 ou 3 jours. Les gouttes sont à appliquer à un oeil infecté par Herpes, Adenovirus et Taccinia et aussi Trachoma. On l'applique en même temps à l'oeil non infecté à titre prophylactique. Une pommade oculaire classique peut aussi être préparée 25 de façon que la petite quantité ordinairement appliquée contienne de 0,01 à 10 mg du rI:rCo La base peut être, par exemple, un gel polyéthylène-vaseline liquide. EXEMPLE 11 Préparation cutanée 30 Pour l'application à la peau sur des parties à vif, l'inducteur d'interféron peut être ajouté à des bases classiques pour pommades, crèmes, lotions ou préparations liquides de façon qu'un gramme contienne de 0,1 à 100 mg de rlîrC, par exemple. 35 L'application est à faire tous les 2 ou 3 jours. EXEMPLE 12 Injection stérile Un type de préparation pour l'administration par voie 70 01577 25 2034473 Parentérale est une solution ou suspension huileuse ou aqueuse stérile classique comme du sérum physiologique. Un cc d'une telle préparation contient de 0,1 à 100 mg de l'inducteur d'interféron choisi et est à injecter tous les 2 ou 3 jours dans 5 les cas d'infection virale. 70 01577 26 2034473 Revendications 1o Procédé pour induire la formation d'interféron dans des cellules vivantes caractérisé en ce qu'on administre auxdites cellules un polymère complexé choisi dans le groupe formé par des copoly-5 mères alternés de polynucléotide, des complexes de deux homopolynucléotides contenant des composants nucléotides substitués et des hybrides entre un polydéoxyribonucléotide et un polyri-bonucléotide contenant des composants nucléotide substitués. 2. Procédé selon la revendication 1 caractérisé en ce que la liai-10 son des couples est une liaison hydrogène ce qui est mis en évidence par l'hypochromicité dans la région ultraviolette. 3* Procédé selon la revendication 1 dans lequel les cellules sont dans un hôte vivant. 4» Procédé selon la revendication 1 dans lequel les cellules sont 15 dans un hôte vivant et le polymère complexé est administré systématiquement . 5. Procédé selon la revendication 1 dans lequel les cellules sont dans un hôte vivant et le polymère complexé est administré topiquement . 20 6. Procédé selon la revendication 1 dans lequel les cellules ont été séparées d'un hôte vivant et sont dans un milieu de culture® 7 o Procédé selon la revendication 1 dans lequel le polymère complexé est composé de complexes de deux homopolynucléotides différents contenant des unités de nucléotide substitué choisi dans le 25 groupe formé par les acides adénylique, uridylique, inosinique et cytidylique substitués. 80 Procédé selon la revendication 1 dans lequel seulement l'un des polynucléotides est chimiquement modifié. 9. Procédé selon la revendication 1 dans lequel le polymère complexé 30 est rI:rBC0 10. Procédé selon la revendication 1 dans lequel le polymère complexé est rIC:rIC. 11. Procédé selon la revendication 1 dans lequel le polymère complexé est rIBC:rIBC. 35 12. Procédé selon la revendication 1 dans lequel le polymère complexé est FI ÂDÎf-ARN. 70 01577 27 2034473 13. Composition pharmaceutique caractérisée en ce qu'elle induit la formation d'interféron dans des cellules vivantes quand on l'administre à de telles cellules, composition comprenant un support pharmaceutique et un polymère complexé choisi dans le 5 groupe formé par des copolymères alternés de polynucléotides, des complexes de deux homopolynucléotides contenant des composants nucléotide substitué et des hybrides entre un polydéoxy-ribonucléotide et un polyribonucléotide contenant des composants nucléotide substitués,, 10 14. Composition selon la revendication 13 dans laquelle le polymère complexé est composé de complexes de deux homopolynucléotides différents contenant des unités nucléotide substitué choisies dans le groupe formé par les acides adénylique, uridylique, inosinique et cytidylique substitués. 15 15. Composition selon la revendication 13 dans laquelle un seul des polynucléotides est chimiquement modifié. 16. Composition selon la revendication 13 dans laquelle lè polymère complexé est rlrrBC. 17. Composition selon la revendication 13 dans laquelle le polymère 20 complexé est rIC:rIC. 18. Composition selon la revendication 13 dans laquelle le polymère complexé est rIBCrrIBC. 19. Composition selon la revendication 13 dans laquelle le polymère complexé est FI ADN-AKN.