FR 2044785 A1 19710226 FR 7015890 A 19700430 70 15890 i 2044785 La présente invention est relative à un procédé pour isoler des antibiotiques hydrophiles. Lrisolement d'antibiotiques hydrophiles à partir de solutions de fermentation offre souvent de grandes difficultés, en particulier lorsque l'antibiotique est présent à côté 5 d'autres substances présentant des propriétés physiques et chimiques analogues. L'une des méthodes utilisées dans des cas de ce genre pour l'isolement d'antibiotiques faiblement acides ou faiblement basiques consiste à adsorber l'antibiotique sur des échangeurs d'ions. Cette méthode est également utilisée 10 pour l'isolement de la céphalosporine C.Bans ce cas, un problème encore non résolu jusqu'à présent de façon satisfaisante subsiste, qui réside dans la capacité d'adsorption trop faible et dans la sélectivité trop faible des échangeurs d'ions. Ceux-ci peuvent bien, avec une forte capacité absorber l'antibiotique à • 15 partir de solutions pures de céphalosporine Cs mais toutefois pas à-partir des solutions "souillées" qui sont obtenues lors de la fermentation. C'est, ainsi, par exemple, que lorsqu'on utilise des échangeurs d'ions à base de polyamines, de polystyrènes ou d'acide polyméthacrylique, on n'obtient pas 20 d'absorption satisfaisante de la céphalosporine C à partir des solutions de culture. On ne réussit pas non plus de façon satisfaisante, en combinant différents échangeurs d'ions, par exemple des échangeurs d'ions acides et basiques, à séparer les impuretés et à absorber ensuite l'antibiotique de la solution 25 préalablement purifiée, sans avoir de pertes relativement importantes. On a maintenant trouvé qu'on peut adsorber la céphalosporine C de solutions dans lesquelles elle se présente en mélange avec des impuretés provenant de la fermentation, à 30 l'aide de résines d'adsorption non-ioniques macro-poreuses d'une grande surface et qu'on peut ainsi obtenir en particulier une purification préalable satisfaisante des solutions de fermentation renfermant de la céphalosporine C. Les résines indiquées adsorbent de façon surprenante quantitativement la 35 céphalosporine C fortement hydrophile à partir dessolutions de fermentation, tandis qu'elles n'adsorbent pas la majeure partie des autres substances présentes dans la solution. On peut de cette manière séparer jusqu'à 85 % des impuretés de la 70 15890 2 2044785 céphalosporine C et éluer de façon pratiquement quantitative la céphalosporine G adsorbée, par exemple avec des alcools aqueux. La capacité de la résine d'adsorption peut être accrue en éliminant au préalable, par extraction, les impuretés li-pophiles. L'extraction a lieu, de préférence, dans un domaine 5 de pH acide, par exemple à 2 environ, avec un solvant ou mélange solvant non miscible à l'eau, ou de préférence avec un échangeur d'ions liquide par exemple celui dénommé "Amberlite LA-2", dans un solvant ou mélange solvant non miscible à l'eau, dans un domaine de pH de 2 à 7 environ. Comme solvant non miscible 10 à l'eau, on envisage par exemple des hydrocarbures aliphatiques, cyclo-aliphatiques, araliphatiques et aromatiques comportant au plus 12 atomes de carbone et pouvant, le cas échéant, être substitués par des atomes d'halogène comme le brome, le fluor, en particulier le chlore, par exemple l'hexane, l'heptane, le 15 cyclohexané, l'essence, l'éther de pétrole (bouillant à 110 -140°C), le kérosène (brouillant à 210 - 240°C), le tétrachlorure de carbone,' le chloroforme, le chlorure de méthylène, le méthyl-chloroforme, le chlorure d'éthylène, le perchloréthylène, le perfluoréthylène, le bromure d'isopropyle, le benzène, le to- . 20 luène, les xylènes, ainsi que des esters, en particulier des esters alcoyliques inférieurs, d'acides gras inférieurs, comme l'acétate d'éthyle, l'acétate de butyle, l'acétate d'amyle, des cétones, comme la méthyl-isobutyl-cétone, la méthyl-iso-amyl-cétone, des éthers comme l'éther di-isopropylique, des alcools 25 non miscibles à l'eau ou peu miscibles à. l'eau, comme le buta-nol, le 2-éthyl-butanol, 1'éthyl-hexanol, le cyclopentanol, le cyclohexanol. À partir des solutions de céphalosporine C obtenues par élution de la résine d'adsorption macro-poreuse, on peut 30 purifier suffisamment l'antibiotique à l'aide des échangeurs d'ions usuels pour qu'il•précipite directement à l'état d'acide libre, à partir des éluats ou puisse être cristallisé sous la forme d'un sel difficilement soluble. Le produit ainsi obtenu convient pour l'autre traitement direct en acide y-amino-cépha-35 losporanique et en ses produits d'acylation actifs. Le procédé conforme à l'invention est par suite caractérisé par le fait que, le cas échéant, après une purifica 70 15890 3 2044785 tion préalable par extraction à l'aide de solvants lipophiles et/ou d'échangeurs d'ions liquides dans un domaine de pH de 2 à 7 environ, on adsorbe sur des résines d'adsorption non ioniques, macro-poreuses, d'une grande surface, la céphalosporine G à partir de solutions dans lesquelles elle se présente 5 en mélange avec des impuretés provenant de la fermentation. Comme résines d'adsorption non ioniques, macroporeuses, on envisage des résines comportant un squelette de base aromatique et présentant un diamètre moyen de pores de 4 à 20 ma, de préférence de 7 à 10 nm, en particulier des • 10 résines de polystyrène d'une surface de 100 à 1.000 mètres carrés par gramme, par exemple des copolymères de styrène et de divinylbenzène (de la Firme Rohm & Haas Go.) qui sont cornus sous les marques déposées "Amberlite" XAD-1, XAD-2, XAD-4-, XAD-5,etc... 15 Le traitement par la résine d'adsorption est effectué avantageusement à un pH de là 8, de préférence de 2 à 3. Ce pH peut être ajusté à l'aide d'un acide quelconque, par exemple d'un acide organique, comme l'acide oxalique, ou à l'aide d'un acide minéral.comme l'acide chlorhydrique, l'acide phosphorique 20 ou, en particulier, l'acide sulfurique. Il est avantageux d'acidifier la bouillie de fermentation avant de la filtrer, et de filtrer ensuite de manière usuelle, avantageusement en présence d'un auxiliaire de filtration. La solution de culture ayant éventuellement subi 25 une extraction préalable est amenée en contact de manière usuelle avec la résine d'absorption. On travaille de préférence avec-des colonnes renfermant le lit de résine. L'adsorption a lieu alors pendant la percolation de la solution à travers la colonne. Le produit de percolation ne renferme pas d'an-30 tibiotique ou n'en renferme que des quantités minimes. Avec de l'eau, on chasse de la colonne la solution résiduelle. Le produit de percolation de lavage ne renferme pas non plus d'antibiotique ou n'en renferme que des quantités minimes. Pour éluer l'antibiotique de la résine, on peut uti-35 liser des mélanges d'eau et de solvants organiques miscibles à l'eau, en particulier des solutions aqueuses d'alcanols inférieurs. Particulièrement appropriée est une solution aqueuse à 10 - 20 c/o d'isopropanol. 15890 4- 2044785 Pour régénérer la résine/, conviennent les solutions aqueuses ou alcooliques aqueuses qui sont alcalines, par exemple un mélange de. méthanol et d'eau (l : 1) renfermant une solution normale d'hydro.xyde de sodium. Les résidus de la solution d'hy-droxyde de sodium peuvent par. exemple être éliminés par lavage 5 avec des acides, par exemple avec de l'acide sulfurique et/où avec de l'eau. Une solution aqueuse d'hyçochlorite de sodium est, par exemple, également appropriée pour la régénération ; l'agent d'oxydatipn .peut être éliminé de la Colonne avec un agent réducteur, par exemple avec une solution de "bisulfite 10 de sodium ou de thio-sulfate de sodium. En combinaison avec les agents de régénération mentionnés, on peut compléter la régénération par un traitement avec de l'acétone ou avec des mélange d'eau et d.'acétone *. La totalité du procédé d'adsorption et de régénération 15 de la résine peut, comme usuel, avoir lieu par charges ou en continu, dans des colonnes élémentaires ou dans des colonnes combinées. L'éluat renfermant la céphalosporine G peut être davantage purifié d'une manière usuelle, de préférence sur 20 des échangeurs d'ions basiques tels que "Amberlite IS-4B" (mélange de phénol et de polyamine comportant des groupes amino-gènes primaires et secondaires), "Amberlite IRA-68" (produit de polymérisation de l'acide méthacrylique), "Amberlite XE-65"» (polyamine), "IMAC" A 13 5?" ou "IMAC A 17 P" (de la Firme 25 Imacti-Liaatsch) . Ces échangeurs'd'ions présentent pour l'adsorp-tion de la céphalosporine C à partir de l'éluat une capacité nettement plus grande qu'à partir du filtrat de culture.. A partir des solutions ainsi davantage purifiées, on peut faire précipiter la céphalosporine C à l'état d'acide libre, par 30 exemple après concentration, par exemple avec des solvants organiques miscibles à l'eau comme l'acétone ou 1'isopropanol, ou bien on peut l'isoler sous la forme d'un complexe de métal lourd microcristallin difficilement . soluble, par exemple d'un complexe avec le cuivre, le mercure, le cadmium, le plomb, 35 le manganèse, le fer, le coba.lt, le nickel ou en particulier sous la forme du complexe zincique (voir la demande de brevet déposée en FftiilïCE par la Demanderesse le 29 mai 1Q69 sous le W° 69-1754*5 et ayant pour, titre "Procédé d'isolement 70 15890 5 2044785 de composés'difficilement solubles'). L'invention est décrite plus en détail dans les' exemples non limitatifs qui suivent, dans lesquels les températures sont indiquées en degrés centigrades. 70 15890 6 2044785 EXEMPLE 1 Lorsqu'on a atteint le maximum de la production de la céphalosporine G, on refroidit à' 15° une solution de culture qui 5 est obtenue d'une manière connue en cultivant dans une solution nutritive une souche de la famille Gepha1osporium produisant de la céphalosporine Gs puis acidifie, avec une solution à 50 % (poids/volume) d'acide sulfurique, à ixn.pH d'une valeur de 2,8 à 3,0. On sépare par filtration le mycélium et les constituants 10 insolubles de la solution nutritives en ajoutant des auxiliaires de filtration (par exemple le produit dénommé "Dicalite")0 Le filtrat de culture ainsi obtenu présente un pi de $ ; il renferme 2,1 g de céphalosporine G et 5>4 % d'un résidu sec. Il est coloré en brun<> 15 Dans une colonne en verre de 10 cm de diamètre, on place 6 litres du produit dénommé "Amberlite XÂD-2", conjointement avec de l'eau, de la manière qui est usuelle pour les échangeurs d'ionso Le lit de résine a une hauteur de 76 cm. A travers cette colonne, on percole 6 litres du filtrat de culture obtenu 20 suivant la méthode décrite ci-dessus, à une vitesse de 6 litres par heure« On chasse le'filtrat à la même vitesse de passage avec 3 litres d'eau désionisée et élue la colonne avec une solution aqueuse à 10 % d'isopropanol. Les produits de percolation par adsorption et par lavage sont recueillis par fractions d'un 25 litre et demi et les éluats de teinte jaune-orange par fractions d'un litre. Le produit dénommé "Amberlite XAD-S11 est régénéré avec 6 litres d'une solution aqueuse à 50 % de méthanol, rendue normale avec une solution d1hydroxyde de sodium, et l'agent de régénération est extrait par lavage à l'eau. La colonne est 50 alors prête pour une nouvelle adsorption. Le résultat de 1*adsorption et de 1'élution est le suivant : de 65 à 70 % environ du filtrat de culture se trouvent dans les fractions de percolation et de lavage, biologiquement inactives, ainsi que dans les deux premières fractions d'éluat 35 qui ne renferment qu'une trace de la céphalosporine G„ Les fractions de l'éluat biologiquement actives ont un volume de 12 litres et renferment 95 % de la céphalosporine C présente dans le filtrat de culture3 ainsi que de 20 à 25 % des 70 15890 7 2044785 impuretés du filtrat de culture0 Les fractions de l'éluat qui sont actives .sont exemptes d'anions minéraux» EXEMPLE 2 5 A travers la colonne qui est décrite dans l'exemple 1 et est remplie du produit dénommé "Amberlite XA.D-2", on percole, à une vitesse de 12 litres par heure, quatre litres d'un filtrat de culture qui renferme par litre 2,2 g de céphalosporine C et 10 qui est obtenu suivant la méthode décrite dans l'exemple 1, mais avec de l'acide oxalique à la place d'acide sulfurique0 On chasse le produit de percolation avec 3 litres d'eau désionisée et élue la colonne avec un total de 12 litres d'une solution aqueuse à 10 % d'isopropanol. Pour régénérer le produit "Amberlite XAD-2", 15 on fait passer à travers la colonne une solution d'hypochlorite de sodium renfermant 3 % de chlore actif, et ensuite 4- litres d'une solution à 0,2 °/o de bisulfite de sodium. Le cycle commence ensuite de nouveau par 1'adsorption de 4 litres de filtrat de culture» Le rendement moyen de plusieurs cycles successifs en 20 céphalosporine C est de 85, 2 % dans les fractions actives de l'éluat qui sont exemptes d'anions minéraux» Dans les premières fractions de l'éluat, qui renferment encore des anions minéraux, 11 se trouve 9,2 % que l'on peut obtenir à nouveau par adsorption, Les éluats principaux actifs renferment de 30 à 35 % 25 impuretés présentes dans le filtrat de culture. EXEMPLE 3 A travers une colonne remplie de 30 litres du produit 30 dénommé "Amberlite XAD-2", on percole, à une vitesse de 30 litres par heure, 30 litres d'un filtrat de culture qui est obtenu suivant la méthode décrite dans l'exemple 1 et qui renferme 2,10 g de .céphalosporine C par litre. Le diamètre interne de la colonne est- de 15 cm. On chasse le filtrat de culture avec 15 35 litres d'eau désionisée et élue la colonne avec 60 litres d'une solution aqueuse à 10 % d'isopropanol. La vitesse d'élution est de 60 litres par heure. La majeure partie de la céphalosporine C se trouve dans les 4-5 litres d'éluat. Le produit dénommé i r 15890 8 2044785 "Amberlite XAD-2" est ensuite régénéré par percolation successive de 15 litres d'une solution normale d'hydroxyde de sodium, de 10 litres d'une solution 0,2-normale d'acide sulfurique et de 10 litres d'eau. Le cyele commence ensuite à nouveau par 5 adsorption de 30 litres de filtrat de culture. Le rendement moyen de plusieurs cycles successifs en céphalosporine C dans les fractions actives de l'éluat, qui sont exemptes d'anions minéraux, est de 95 Environ 3 % de la céphalosporine C se trouvent dans les premières fractions de l'éluat qui renferment 10 encore des ions chlore et des ions sulfate. A partir de ces fractions, on peut obtenir l'antibiotique par une nouvelle adsorption» Les éluats actifs principaux renferment 28 % de la substance sèche présente dans le filtrat de culture. Le produit dénommé "Amberlite IRA-68" est mis en suspension dans une solu-15 tion aqueuse à 10 % d'isopropanol et placé dans une colonne en verre d'un diamètre interne de 5 cm0 Le volume de remplissage est d'un litre. A travers cette colonne, on percole 4-5 litres de l'éluat obtenu ci-dessus» La solution d'adsorption renferme 1.367 mg de céphalosporine G par litre-, pour une fraction de 20 substance solide de 0,684 %» La vitesse d'adsorption est de 10 litres par heure. La solution d'adsorption est chassée avec un litre d'eau. Le produit de percolation d'adsorption et de lavage renferme 3 % de la céphalosporine C utilisée et environ 35 à 40 % des impuretés présentes dans la solution d'adsorption» 25 La céphalosporine G est éluée à l'aide d'un tampon à l'acétate de pyridine, d'un pH de -5,5» Le tampon est 0,44-molaire en pyridine et 0,2-molaire en acide acétique» La vitesse d'élution est d'un litre par heure. Sur la quantité de céphalosporine G utilisée, 92,3 % se trouvent dans trois litres d'éluat 30 de la fraction principale, avec une teneur de 18,5 .g de céphalosporine G par litre. Une autre quantité de 3 % se trouve dans 1,25 litre des fractions secondaires» Les fractions principales, d'un pH de 4,9, sont additionnées de 185 S d'acétate de zinc» A la solution limpide, 35 on ajoute en agitant, au cours de 20 minutes, 3 litres d'isopropanol» Vers3a fin de l'addition, le-complexe zincique de la céphalosporine C commence à cristalliser» On refroidit le mélange à 2° et agite pendant 4 heures à cette température» On sépare 70 15890 9 2044785 le précipité par essorage et le lave à deux reprises avec chaque fois 300 ml d'eau et à une reprise avec 300 ml d'acétone,:puis sèche à 40° sous vide. Le rendement est de 36,6 g de complexe zincique de céphalosporine G, qui se présente sous la forme 5 d'une'poudre "blanche d'une teneur de 91,6 déterminée par mesure de l'absoprtion en ultra-violet. EXEMPLE 4 10 L'adsorption/élution décritë dans l'exemple 3, sur "Amberlite IHA-68", est effectuée d'une manière analogue avec le produit dénommé "Amberlite XE-265", tandis qu'on adsorbe 50 litres de l'éluat "XAD-2" obtenu suivant l'exemple 3- Le produit de percolation d'adsorption et de lavage renferme 15 • 5,9 % de la céphalosporine G mise en oeuvre et environ 40 à 45 % des impuretés présentes dans la solution d'adsorption» La céphalosporine G est éluée comme décrit dans l'exemple 3 avec un tampon à l'acétate de pyridine. Sur la quantité de céphalosporine C utilisée, 75,4 % se trouvent dans 20 4 litres d'éluat des fractions principales, avec une teneur de • 12,05 g par litre en céphalosporine G» Une autre quantité de 9,5 % est renfermée dans 2,75 litres de fractions secondaires. On concentre les fractions principales jusqu'à 400 ml et, tout en agitant, verse lé concentrât dans 4,8.litres d'iso-25 propanol. On sépare par essorage le précipité volumineux, le lave avec 200 ml d'isopropanol et 200 ml d'acétone,■ puis le sèche à 40° sous vide. Il en résulte 45 g d'une poudre beige qui, d'après le test biologique, est constituée pour 84,3 % par de la céphalosporine G. Le rendement de précipitation est de 56 % 30 A partir de la liqueur-mère, on peut obtenir en majeure partie la céphalosporine C résiduelle après concentration et précipitation répétée. EXEMPLE 5 35 On charge avec 200 ml de "Amberlite XAD-2" dans de l'eau une colonne en verre de 2,5 mm de diamètre. On acidifie à un pH d'une valeur de 2, avec de l'acide sulfurique, 200 ml d'un filtrat de culture renfermant 1,96 g de'céphalosporine C par litre et obtenu suivant l'exemple 1, puis percole à Une 0 15890 2044/85 vitesse de 400 ml par heure à travers le produit dénommé "Amberlite XAD-2", On chasse le filtrat avec 100 ml d'eau désionisée et élue la céphalosporine G avec une solution aqueuse à 10 % d'isopropanol. On régénère la colonne suivant, la méthode 5 décrite dans l'exemple 2 et l'utilise: à nouveau pour l'adsorp-tion. Les fractions du produit de percolation et les fractions de lavage ne renferment pas de céphalosporine G® Dans les premières fractions de l'éluat, qui renferment encore des anions minéraux, il y a 8 % et, dans les autres fractions de l'éluat, 10 90 % de la céphalosporine G présente dans le filtrat de culture. EXEMPLE 6 Sur un extracteur à contre-courant et avec 15 litres 15 d'une solution constituée par 5 % du produit dénommé "Amberlite LA-2" (base libre) dans de 1'éthyl-hexanol, on extrait 50 litres d'un filtrat de culture obtenu suivant la méthode décrite dans l'exemple 2 et renfermant 2,12 g de céphalosporine G et 54 g environ d'impuretés par litre. Les fractions dissoutes dans le 20 filtrat de culture extrait diminuent d environ 3,6 °/o k 3,55 %• Avec de l'acide sulfurique à 50 %, on ajuste, à un pi de 2,7, 12 litres du filtrat de culture extrait, percole à une vitesse de 6 litres par heure à travers 6 litres du produit dénommé "Amberlite XAD-2" et chasse avec trois litres d'eau désionisée. 25 Le produit qui passe ne renferme pas de céphalosporine G0 La céphalosporine G adsorbée est éluée avec un total de 12 litres d'une solution aqueuse à 10 °/o d'isopropanol. L'éluat renferme 97 % de là céphalosporine G présente dans le filtrat de culture (2 % environ se trouvent dans une fraction préliminaire saline)0 30 Dans l'éluat3 il y a encore 15 % des impuretés du filtrat de culture. Le produit dénommé "Amberlite XAD-2", est ensuite régé néré comme décrit dans l'exemple 2 et est percolé complémentaire ment encore avec trois litres d'un mélange d'acétone et d'eau 35 dans une proportion de 1 % 1„ On chasse l'acétone avec de l'eau, après quoi la colonne est prête pour une nouvelle adsorption. 15890 ii 2044785 REVENDICATIONS 1. Procédé pour isoler la céphalosporine C à partir de solutions dans lesquelles elle se présente en mélange avec' des impuretés provenant de la fermentation, caractérisé par le fait qu'on traite les solutions, le cas échéant après 5 une purification préliminaire par extraction avec des solvants lipophiles et/ou des échangeurs d'ions liquides dans un domaine de pH de 2 à 7 environ, sur- des résines d'adsorption macroporeuses non ioniques de grande surface. 2. Procédé suivant la revendication 1, carac- 10 térisé par le fait qu'on utilise, comme résine d'absorption, ■une résine d'un diamètre moyen de pores de 7 à 10 nm. 3. Procédé suivant l'une quelconque des revendications 1 ou 2, caractérisé par le fait qu'on effectue le traitement par la résine d'adsorption dans des solutions d'un pH 15 de 1 à 8. 4. Procédé suivant l'une quelconque des revendications 1 à caractérisé par le fait qu'on utilise, comme solution de départ, un filtrat de culture qui a été extrait préalablement avec un échangeur d'ions liquide dans un sol- 20 -vant organique non miscible à l'eau, à un pH de l'ordre de 2 à 6. 5. Procédé suivant l'une quelconque des revendications 1 à 4, caractérisé par le fait que pour éluer la céphalosporine C de la résine d'adsorption, on utilise un mélan- 25 ge d'eau et d'un solvant•organique miscible à l'eau. 6. Procédé suivant l'une quelconque des revendications 1 à 4, caractérisé par le fait que pour éluer la céphalosporine C de la résine d'adsorption, on utilise un mélange d'eau et d'un alcanol inférieur. 15890 2044785 7. Procédé suivant l'une quelconque des revendications 1 à 6, caractérisé par le fait qu'on effectue le procédé en continu. 8. Procédé suivant.1'une quelconque des revendi- 5 cations 1 à 7, caractérisé par le fait qu'on purifie davantage ave.c des échangeurs d'ions la solution obtenue qui renferme de la céphalosporine C et qu'on isole cette dernière le cas échéant sous forme libre ou sous la forme de ses sels ou complexes . 10 9* Les solutions renfermant de la céphalosporine C qui sont obtenues suivant le procédé décrit dans l'une quelconque des revendications 1 à 8. 10. La céphalosporine C qui est obtenue suivant le procédé décrit dans l'une quelconque des revendications 1 à 15 8, sous forme libre ou'sous la forme de ses sels ou complexes.