FR 2027476 A1 19700925 FR 6945607 A 19691231 69 45607 1 2027476 la présente invention se rapporte à la préparation de protéines modifiées, aux protéines modifiées elles-mêmes, aux solutions aqueuses en contenant et aux émulsions formées au moyen de ces solutions. 5 Les protéines à la modification desquelles se rapporte l'invention sont celles contenant des radicaux amino réactifs dérivant de la lysine, qui est" un aminoacide. Des exemples de telles protéines sont la caséine, la lactoglobuline, les albumines du sérum sanguin, outre les mélanges de ces protéines, par 10 exemple les protéines d'origine animale, comme les protéines . de lait, de lait écrémé ët de petit lait. Les solutions contenant ces protéines conviennent pour la préparation d1émulsions contenant une phase huileuse (ou grasse)- et une phase aqueuse. L'aptitude à la conservation de 15 ces émulsions, en particulier de celles dont la phase aqueuse est présente en grande partie ou complètement sous la forme de la phase continue, est médiocre, sauf si des précautions sont prises pour rendre et maintenir la phase aqueuse sensiblement exempte de bactéries et spores. Lorsque l'addition, d'un agent 20 de conservation, comme l'acide sorbique, doit être évitée, la phase aqueuse doit être stérilisée et la stérilisation d'une phase aqueuse contenant des protéines suscite des difficultés qui n'ont pas encore été résolues de manière satisfaisante. Ainsi, la stérilisation à 135° pendant 15 secondes provoque une 25. d 3 graves pour des émulsions à haute teneur en graisse auxquelles du citrate trisodique a été ajouté pour l'amélioration de la stabilité, par exemple des émulsions contenant plus de 80$ en 35 poids de graisse commestible et une phase aiueuse dont les protéines existent dans une grande mesure ou complètement à l'état de phase continue. L'invention a pour objet un procédé permettant de modifier ces problèmes de façon qu'une solution aqueuse d'une 40 telle protéine à un pH d'environ 4,5 à 6 puisse être pasteuri- 69 45607 2 2027476 sée sans coagulation, ce procédé consistant à traiter une solution aqueuse de la protéine à l'aide d'un agent d'acétylation, de manière qu'une fraction seulement des radicaux amino acétylables de la protéine soit acétylée et de manière à'ne pas provo-5 quer de dénaturation de la protéine. Le procédé objet de la présente invention permet de préparer une Ef-acétylprotéine et consiste à faire réagir une solution aqueuse d'une protéine contenant des radicaux amino réactifs dérivant de la lysine avec un agént d'acétylation jus-10 qu'à ce que 20 à 40$ de l'ensemble des radicaux amino réactifs soient convertis en radicaux acétylamino. L'effet du degré d'acétylation sur la dénaturation des peptides peut être déterminé suivant le procédé de Ingram publié dans Nature, 1956, 178, 792, par établissement de la 15 "carte des peptides"; Le procédé ëst basé sur la décomposition enzymatique de la protéine en peptides et sur la séparation ultérieure des peptides par chromatographie et électrophorèse. Lorsqu'on applique ce procédé, à l'aide de trypsine et d'oC -chymo-trypsine, à des protéines ayant subi une acétylation plus ou 20 moins poussée, on peut constater, à partir des "cartes" obtenues, que les propriétés des protéines ne sont pas sensiblement altérées aussi longtemps que 40$ au maximum des radicaux amino réae-tifs acétylables ont été acétylés, tandis que la dénaturation devient évidente lorsque le degré d'acétylation est plus poussé. 25 L'importance de 1'acétylation des radicaux amino peut être déterminée comme décrit par Praenkel-Conrat, dans "Methods in Enzymology1' (Academic Press®, New York), Chapitre IV, page 247» par application de la réaction à la ninhydrine. Comme les radicaux amino réactifs acétylables d'une protéine peuvent compren-30 dre des radicaux amiiio autres que ceux provenant de la lysine, par exemple des radicaux amino IT-terminaux, on fait intervenir ces radicaux amino réactifs également dans l'appré^ciation du degré d'acétylation. Le degré maximum d'acétylation admissible dans le procédé de l'invention est donc de 40$ 35 Le degré minimum d'acétylation nécessaire est déter miné par le pH requis pour conférer à la phë'se aqueuse les propriétés bactériostatiques voulues et en général ce pH est de 5 à 5,2. Les protéines sont le moins solubles dans l'eau à leur point iscâ.ectrique et sont susceptibles de précipiter de la so-40 lution lorsque le pH est ajusté à leur point isoélectrique. Pour 69 45607 3 2027476 pasteuriser une solution aqueuse d'une protéine efficacement à ■on pH de 5, le point isoélectrique de la protéine doit être inférieur à cette valeur et on a découvert que l'acétylation abaisse le point isoélectrique et que l'abaissement nécessaire exige 5 un degré d'acétylation d'au moins 20$. De préférence, cependant, le degré d'acétylation est de 25 à 40$ et spécialement de 33 à 38$. les solutions aqueuses de protéines qui conviennent très bien comme matières de départ dans le procédé de l'invention 10 sont le lait écrémé à l'état naturel, concentré ou dilué, le -lait éerémé reconstitué obtenu par dispersion de poudre de lait dans de l'eau, le petit làit et l'albumine de sérum sanguin de boeuf ou de porc. lia protéine contient de préférence 4 à 15g de lysine pour 100g de"protéine, comme on peut le déterminer'par 15 hydrolyse totale. On utilise de l'anhydride acétique comme agent d'acétylation pour exécuter le procédé de l'invention, mais d'autres agents d'acétylation, comme le chlorure d'acétyle, conviennent aussi. 20 degré d'acétylation atteint dans le procédé dépend de divers facteurs, comme la température et la quantité d'agent d'acétylation. Avec l'anhydride acétique et à une température égale ou supérieure à la température ambiante, la réaction est en général rapide et achevée en qielques minutes et le degré d'a-25- cétylation atteint pour une quantité déterminée d'agent d'acétylation dépend de la vitesse de réaction relative avec l'eau en présence de la température de travail. Le degré d'acétylation est influencé aussi par la présence d'autres réactifs comme le citrate trisodique. Dans le cas de solutions aqueuses qui sont destinées 30 à la formation d'émulsions à haut pourcentage de graisse, comme indiqué ci-dessus, et quifsont additionnées de citrate trisodique comme stabilisant, ce composé peut être ajouté à la solution aqueuse avant l'acétylation. En pratique, le citrate trisodique est ajouté à raison de 0,5 à 2g pour 100ml de solution normale 35 de protéine, c'est-à-dire de solution contenant environ 3,5g de protéine dans 100ml de solution. Cependant, l'influence d'une modification de la concentration en citrate trisodique sur le degré d'acétylation est faible. De préférence, on prend des températures de 0 à 25°C. 40 Pour maintenir le pH de la solution contenant les protéines au- 69 45607 4 2027476 delà du point isoélectrique des protéines pendant l'acétylation, on peut neutraliser progressivement par addition d'alcali l'acide acétique qui se forme. De préférence, le pH est maintenu à une valeur de 4,5 à 8,5 et spécialement de 5 à 7,5. 5 la figure unique du dessin annexé montre comment, pour du lait écrémé contenant 1$ en poids de citrate trisodique, comme solution protéique, et dè l'anhydride acétique, comme agent d'acétylation, le degré d'acétylation atteint dépend de la température et de la quantité d'anhydride acétique. Sur cette 10 figure, le degré d'acétylation, en taux de convérsion des radicaux amino acétylables^ est porté en abscisse en fonction de la température qui est portée en ordonnée, pour des concentrations en anhydride acétique variant de 0,1 à 0,6$, les réactions étant exécutées par ailleurs dans des conditions comparables. 15 Pour des solutions dont la teneur en protéine est plus élevée ou plus faible que celle du lait écrémé, la relation en- : tre le degré d'acétylation, la température et la quantité d'anhydride acétique peut être déterminée de façon analogue., les conditions pour l'acétylation à l'échelle industrielle peuvent 20 ainsi être établies. Si on le désire, d'autres substances peuvent être ajoutées à la solution avant l'acétylation, par exemple pour une amélioration de la saveur. Il est évident que ces substances ajoutées avant l'acétylation doivent être insensibles à l'agent 25 d'acétylation. les protéines modifiées de l'invention sont des K~ acétylprotéines dérivant d'aminoacides qui comprennent de la lysine, de préférence à raison de 4 à 15g pour 100g de protéine, et contiennent des radicaux N-acétyle à raison de 20 à 40$ et de 30 préférence de 33 à 38$ de l'ensemble des radicaux âmino réactifs de la protéine non acétylée correspondante, les protéines partiellement acétylées peuvent être isolées de la solution résultant de l'acétylation, par exemple par iyophilisation ou bien séchage par pulvérisation. Cependant, lorsqu'elles sont desti-35 nées à la préparation d1émulsions, il est préférable que les protéines modifiées ne soient pas isolées et que les solutions des protéines acétylées soient utilisées directement. Les solutions de protéines acétylées obtenues conviennent non seulement comme phase aqueuse pour des émulsions 40 d'huiles comestibles, mais peuvent être utilisées aussi avec 69 45607 5 2027476 avantage dans d'autres émulsions ayant un pH relativement bas, par exemple les émulsions à usage cosmétique. l'invention a pour objet un procédé de préparation d* une émulsion aqueuse d'huile, suivant lequel on émulsionne une 5 huile et spécialement un glycéride huileux comestible avec une solution aqueuse d'une protéine modifiée conformément à l'invention, de préférence pour former une émulsion huile-dans-eau, par exemple contenant 80 à 84$ en poids d'huile, et elle a également pour objet -une telle émulsion huile-dans-eau. De préférence, le 10 pH de l'émulsion est de 4,4 à 6 et 1'émulsion est pasteurisée. Avec avantage, la teneur en protéine de la phase aqueuse de ces émulsions est de 1 à 5$ et, de préférence, de 1,5 à 4,0$ en poids. On a découvert également que les personnes susceptibles de souffrir "d'allergie au lait" lors de la consommation d'ali-15 ments contenant des protéines normales du lait manifestent une moindre tendance aux réactions allergiques lorsqu'elles consomment les protéines de lait acétylées de l'invention. l'invention est illustrée par les exemples suivants dans lesquels les températures sont données'en °C. les exemples 20 1 à 5 -décrivent la préparation de protéines ÏT-acétylées et l'exemple 6 est relatif à la préparation d'une émulsion en contenant. EXEMPLE 1 " A 100ml de lait écrémé pasteurisé contenant au total 3,5$ en poids de protéines, on ajoute 1g de citrate trisodique 25- (soùs forme du dihydrate) et on dissout le sel à la température ambiante. Après refroidissement à 5°» on ajoute 0,4ml d'anhydride acétique et on agite le mélange vivement, puis on ajuste le pH de la solution résultante à 5, après quoi on soumet la solution à la pasteurisation pendant 30 minutes à 80°. Après refroidissement, 30 le degré d'acétylation, déterminé par le procédé de Fraenkel- Conrat, est de 39$. Aucune précipitation n'a lieu pendant la pas- i teurisation, tandis que la pasteurisation du lait écrémé non traité, exécutée dans les mêmes conditions, provoque la coagulation des protéines. 35 EXEMPLE 2 On ajoute 1g de citrate trisodique dihydraté à 100ml de lait écrémé pasteurisé à 20° et on laisse le sel se dissoudre en 30 minutes, puis on ajoute 0,1ml d'anhydride acétique et on agite le mélange soigneusement à'20° pendant 45 minutes. Le degré d'a-40 cétylation de la protéine dë la solution résultante est de 20$ 69 45607 6 2027476 comme on peut l'établir, EXEMPLE 3 On ajoute 1g de citrate trisodique trihydraté à 100ml de lait écrémé pasteurisé à 20° et on laisse le sel se dissou-5 dre en 30 minutes. On chauffé la solution à 60°, puis on y ajoute 0,2ml d'anhydride acétique, après quoi on agite le mélange vivemént à 60° pendant 30 minutes. On refroidit la solution résultante, on ajuste son pH à 5 et on détermine alors que le degré d'acétylation de la protéine est de 35$„ 10 EXEMPLE 4 Sous agitation, on ajoute en 3 minutes., 1,: partie de citrate trisodique dihydraté à 100 parties en poids d'une solution aqueuse à 5$ d'albumine de"sérum de boeuf (fraction connue sous le nom de "fraction 5") à un pH de 5,7 et on poursuit l'a-15 gitation du mélange pendant encore 27 minutes. On élève à 7,0 le pH de la solution résultante qui était de 6,2 en y ajoutant une petite quantité d'hydroxyde de sodium IN, après quoi on ajoute 0,3 partie d'anhydride acétique en 1 heure tandis qu'on maintient la température à 20° et le pH à 7,0"par addition périodique d'hy-.20 droxyde de sodium "aqueux IN. On lyophilise la solution résultante pour obtenir une poudre brun pâle dont la protéine a un degré d'acétylation de 37$ comme on peut l'établir. EXEMPLE 5 On prépare du sérum de sang de porc par centrifugation 25 de sang de porc coagulé à 20°. A 100 parties en poids du sérum on ajoute sous agitation en 3 minutes, 1 partie de citrate trisodique, puis on poursuit l'agitation pendant encore 27 minutes à 20° de manière à obtenir une solution rouge pâle d'un pH de 8,1.'En 1 heure, on ajoute à cette solution à 20°, 0,4 partie 30 d'anhydride acétique, de sorte que le pH tombe à'6,0/ On lyophilise la solution résultante pour obtenir une poudre rose pâle dont la protéine a un degré d'acétylation de 35$ comme on peut ie déterminer. EXEMPLE 6 35 Cet exemple illustre la préparation d'une émulsion-^ huile-dans-eau. A une phase grasse pour margarine ayant des dilatations de 890, de 665, LgQ de 420, de 245, D^q de 125 et àe 25 (comme on peut le-mesurer suivant lë procédé décrit par H A "Boekenoogen dans "Analysis and Characteristics of 40 Oils, Fats and Pat Products", volume 1, 1964, pages 1£3 à 145), 69 45607 7 2027476 on ajoute 0,5$ en poids d'esters partiels distillés à 90$ de monoglycérides issus du glycérol et d'un mélange d'acide palmi-tique et d'acide stéarique. On fait fondre 83 parties de cette phase grasse par chauffage à environ 60° et on y ajoute lente-5 ment 17 parties de la solution aqueuse de protéine de lait écrémé ïï-àcétylée décrite dans l'exemple 1, en entretenant l'agitation à l'aide d'une hélice dans un récipient muni d'une chemise à 60° pour former une émulsion huile-dans-eau. On homogénéise alors cette émulsion ayant un pH de 5 par passage au broyeur 10 colloïdal ajusté à un intervalle de 0,6mm avec une vitesse cir-conférentielle moyenne de 11 mètres/seconde, puis on exécute une pasteurisation à 80° pendant 30 minutes, après quoi on verse en milieu aseptique le produit dans des récipients et on le conserve anfin pendant 12 heures à 5°. Après 6 semaines de conservation, 15 1'émulsion n'accuse pas de modification de consistance et on ne constate pas de croissance de micro-organismes par conservation de cette émulsion à 20°. 69 45607 8 2027476 REVENDICATIONS 1°) Procédé de préparation de protéines modifiées, caractérisé'par le fait qu'il consiste à faire réagir une solution aqueuse d'une protéine contenant des radicaux amino réac-5 tifs provenant de la lysine avec un agent d'acétylation, jusqu'à ce que 20 à 40$ de l'ensemble des radicaux amino réactifs en présence soient convertis en groupes acétylamino et, si on le désire, à isoler ensuite la protéine modifiée de la solution aqueuse. 10 2°) Procédé suivant la revendication 1, caractérisé par le fait'qu'on acétyle 33 à 38$ de l'ensemble des radicaux amino réactifs. 3°) Procédé suivant les revendications 1 ou 2, caractérisé par le fait que la protéine à acétyler contient'4 à 15g 15 de lysine pour 100g de protéine, quantité qui est déterminé'par hydrolyse totale. 4°) Procédé suivant la revendication 3, caractérisé par le fait'que la protéine est une protéine de lait. 5°) Procédé suivant la revendication 4, caractérisé 20 par le fait' que la protéine de lait est présente sous forme de protéine de lait écrémé. 6°) Procédé suivant l'une quelconque des revendications 1 à 5, caractérisé par le fait que l'agent d'acétylation est l'anhydride acétique. 25 7°) Procédé suivant l'une quelconque des revendica tions 1 à 6i caractérisé par le fait que la température de réaction est de O à 25°C. 8°) Procédé suivant l'une quelconque des revendications 1 à 7, caractérisé par le fait que pendant toute la durée 30 du procédé, le pH de la solution aqueuse est maintenu à une valeur de 4,5 à 8,5. 9°) Procédé suivant la revendication 8, caractérisé par le fait'qu'on maintient le pH entre 5 et 7,5. 10°) Procédé suivant l'une quelconque des revendica-35 tions 1 à 9, caractérisé par le fait que la solution aqueuse de la protéine contient également du citrate trisodique. 11°) Procédé suivant l'une quelconque des revendications 1 à 10, caractérisé par le fait que, lorsque l'acétylation est achevée, on fait évaporer jusqu'à séccité la solution 40 aqueuse de la protéine modifiée, par lyophilisation ou bien par 69 45607 9 2027476 séchage par pulvérisation. 12°) Protéine modifiée dérivant d'aminoacides comprenant de la lysine, caractérisée par le fait que 20 à 40$ de l'ensemble des radicaux amino réactifs ont été convertis en ra-5 dicaux acétylamino. 13°) Protéine modifiée suivant la revendication 12, caractérisée'par le fait que 33 à 38$ de l'ensemble des radicaux amino réactifs ont été convertis en radicaux acétylamino. 14°) Protéine modifiée suivant les revendications 12 10 ou 13, préparée par un procédé suivant l'une quelconque des re-- vendieations 1 à 11. 15°) Solution aqueuse d'une protéine modifiée suivant l'une quelconque des revendications 12 à 14. 16°) Procédé de préparation d'émulsions contenant Une 15 phase aqueûsè et une phase grasse, caractérisé par le fait qu'on émulsionne la phase grasse dans une solution aqueuse d'une protéine modifiée suivant la revendication 15. 17°) Procédé suivant la revendication 16, caractérisé par le fait que la phase grasse est un glycéride"huileux comes-20 tible qu'on émulsionne avec la solution aqueuse pour former une émulsion huile-dans-eau. 18°) Procédé suivant la revendication 17, caractérisé par le fait que la quantité de glycéride huileux"est comprise entre 80 et 84$ du poids de 1'émulsion. 25 19°) Procédé suivant la revendication 18, caractérisé par le fait qu'on prépare une émulsion ayant un pH de 4,5 à 6, après quoi on la pasteurise. 20°) Procédé suivant l'une quelconque des revendications 16 à'19, caractérisé par le fait que la solution aqueuse 30 a une teneur en protéine de 1 à 5$ en poids. 21°) Procédé savant la revendication 20, caractérisé en ce que la'solution aqueuse a une teneur en protéine de 1,5 à 4,0$ en poids. 22°) Emulsion comprenant une phase grasse et une phase 35 aqueuse, caractérisée en ce que la phase aqueuse est une solution aqueuse d'une protéine modifiée suivant la revendication 15. 23°) Emulsion suivant la revendication 22, obtenue par un procédé suivant l'une quelconque des revendications 16 40 à 21.