FR 2052958 A1 19710416 FR 7021531 A 19700611 70 21531 2052958 10 15 20 25 30 35 La présente invention est relative à un nouveau procédé de préparation de composés de la tétracycline contenant un substituant hydroxyle 12(a) en position cis par rapport à l'atome d'hydrogène 4(a). L'introduction stéréosélective ou stéréospécifique du groupe hydroxyle 12(a) dans la synthèse des composés de la tétracycline est d'une importance considérable dans la synthèse chimique d'antibiotiques biologiquement actifs du type tétracycline. Néanmoins, les composés de la tétracycline sont utilisables dans d'autres applications : les plus notables sont les applications qui utilisent leur efficacité comme agents chélatants. Le noyau de base des désoxy 12(a) tétracyclines auxquelles la présente invention est applicable, est le suivant : -OH (1) et 40 (1a) Ces composés existent sous diverses formes tautomères et, en outre, ils peuvent être mono- ou polysubstitués en diverses positions comme les positions 2, 4-, 5, 5(a)j 6, 7•> 8, 9 et 10. Par exemple, des substituants typiques qui peuvent apparaître en ces diverses positions sont les groupes brâmo, iodo, chloro, fluoro, triflnoro, trifluorométhyle, nitro, cyano, amino, cyanato, thiocya-nato, azido, alcoyle (inférieur) amino, hydroxyle, alcanoyl amino, alcoyle inférieur et alcoyle inférieur monosubstitué, le substituant pouvant être un groupe fluoro, alcoyl (inférieur) mercapto, alcoxy inférieur, amino, alcroyl (inférieur) amino, alcanoyloxy et alcanoylamino. Une grande variété de déaoxy 12(a)-tétracyclines utilisables pour les présentes applications, ont été décrites dans le brevet des Etats Unis d'Amérique IT° 3.188.34-8, dont le texte est cité à titre de référence. De nombreux produits d'hydroxylation 12(a) qui peuvent être préparés ont une faible activité biologique ou peuvent être inactifs. Dans certains cas, on peut obtenir des produits biologiquement actifs par introduction de groupes appropriés par traitement BAD ORIGINAL 0 21531 20529: ï C ? 10 15 20 25 30 chimique ou par traitement biochimique. Néanmoins, comme noté ci-dessus, même ces composés qui ont peu ou pas de valeur comme agents biologiquement actifs, peuvent trouver une application dans d'autres domaines. Les tétracyclines d'accès facile qui sont biologiquement actives ont les structures : N(C H7). (2) (2A) dans lesquelles R est un halogénure ou -un hydrogène, R^ est de l'hydrogène ou un groupe hydroxyle, Rp est de l'hydrogène ou un groupe méthyle, R^ est de l'hydrogène ou un groupe hydroxyle et R^ est un groupe amido, alcoylamido, acétyle ou cyano. L'élément le plus simple de la famille de la tétracycline ayant une activité biologique complète vis-à-vis des bactéries Gram-négatives et Gram-positives est la désoxy-6-dtméthyl-6-tétracycline de structure f(CH3)2 OH (3) HH- 35 C/ D'autres membres importants de la famille de la tétracycline, qui ont atteint une importante utilisation commerciale comme antibiotiques sont les suivants c1 ch3 OH 40 (4) BAD ORIGINAL 70 21531 25 35 OH 3 N(ch5)2 2052958 EH2 (5) 10 15 La synthèse chimique des composés de la tétracycline s'est révélée une tâche extraordinairement difficile. Ces difficultés sont largement attribuables à la sensibilité chimique du noyau de la tétracycline et au fait que lors de la synthèse ; on peut former stéréospécifiquement ou stéréosélectivement un certain nombre de centres asymétriques. Les procédés qui ont été développés jusqu'à présent pour la synthèse totale des composés de la tétracycline, ont consisté à préparer un précurseur ayant le noyau : ^ oh V"V 20 (1b) \ 12(a) 30 40 H0„ 0 0 qui, par abréviation, sera appelé par la suite dans la description et les revendications "précurseur de la tétracycline". Gomme noté ci-dessus, les précurseurs de la tétracycline utilisables dans la présente invention peuvent contenir une grande variété de substituants sur ^structure cyclique de base indiquée dans les formules (10) et (1D), La présente invention est relative à un nouveau procédé d'introduction stéréospécifique d'un groupe hydroxyle 12(a) dans le précurseur de la tétracycline, comme il sera décrit plus en détail ci-dessous, groupe hydroxyle qui est essentiellement cis ou essentiellement trans par rapport à l'hydrogène indiqué en position 4(a). On notera qu'on peut aussi utiliser les isomères optiquement symétriques des composés 1C et 1D, le groupe hydroxyle 12(a) qui est introduit, étant lui aussi optiquement symétrique. Il est intéressant de décrire en premier lieu an résumé un procédé qui a été mis au point pour la synthèse d'un important précurseur de la tétracycline à partir duquel on peut facilement obtenir l'oxytétracycline ayant la structure de la formule (5) ci-dessus. Le procédé pour la synthèse chimique d'un précurseur de BAD ORIGINAL 70 21531 , 2052958 la tétracycline à partir duquel on peut finalement obtenir l'oxy-tétracycline est schémati quement indiqué au dessin. On notera que le précurseur spécifique -composé (20), représenté au dessin- est aussi accessible par synthèse microbienne cou 5 plée avec des réactions chimiques appropriées du produit de fermentation. Il est aussi à noter que la présente invention ne concerne pas seulement l'hydroxylation 12(a) cis de ce précurseur spé cifique mais concerne aussi l'hydroxylation stéréospécifique ou stéréosélective des précurseurs de la tétracyline définis en géné-10 ràl dans les formules 10 et 1D ci-dessus, et ces précurseurs peuvent aussi être préparés. On peut préparer un grand nombre de précurseurs, par exemple au moyen du procédé de base illustré en particulier pour la préparation de l'oxytétracycline, en faisant les substitutions et modifications appropriées'de réactifs lors-15 qu'on désire obtenir d'autres composés de la tétracycline. Le précurseur de la tétracycline pour la synthèse de l'oxytétracycline est assemblé à partir de trois unités de base : la thiazolone de structure : c6H5 20 (6) _ 'S 0 1'oxo-3-glutaramate de méthyle de formule 25 ch5o2c jf com2 (7) et l'aldéhyde de formule : 30 CHO (8) CHj0CîIoC? JT La thiazolone (6) est préparée par traitement de la thio-35 benzoglycsine comme décrit par exemple par Muxfeldt et col. dans Journal of the American Chemical Society, volume, 89, pages 4-991-4-996 (13 Septembre 1967). L'oxo-3-glutamamate de méthyle composé (7) est obtenu par hydrolyse acide de l'énamine : BAD ORIGINAL 70 21531 CHj02C■ COffîL- 2052958 (9) M. 10 15 L'i ïamine (9), est elle-mène préparée par traitement soigneusement contrôlé de 1*oxo-3-glutarate de diméthyle par l'ammoniaque dans le méthanol et elle se caractérise par un point de fusion de 120-121°C. L'aldéhyde (8) est préparé en partant du produit de l'addition de 1'acétoxy-1-butadiène (11) et de l'acétafee de juglone (10) (voir le dessin). Le produit d'addition tricyclique (12) est transformé en aldéhyde (13). Un mode opératoire pour effectuer cette transformation est décrit en détail dans l'article de Muxfeldt de Angewandte Chemie volume 74, page 825-828 (1962). Brièvement résumé, le procédé consiste à traiter le produit d'addition (12) dans une réaction de Grignard par l'iodure de méthylmagnésium qui ajoute un groupe méthyle en position 9(a) : 0H (12a) 20 25 Cet intermédiaire est traité par l'acétone absolu et le sulfate de cuivre anhydre pour donner l'acétonide : CH-z CH, (12b) 30 35 L'oxydation de l'acétonide 12(b) par le chlorate de potassium en présence d'une quantité catalytique de tétroxydçd'osmium conduit au diol : CH>v/CH"3 40 (12c) BAD ORIGINAL 21531 g 2052958 La transformation du diol 12(c) en l'aldéhyde (13) a été effectuée en deux étapes en oxydant d'abord le diol par le tétra-asétate de plomb pour former le dialdéhyde (12d): (12d) 10 AcO 0 qu'on a ensuite cyclisé pour former l'aldéhyde (13). La transformation de l'aldéhyde (13) en mélange des aldéhydes isomères (14-) et (15) est effectuée par ozonolyse de l'aldé-15 hyde (13), traitement à l'eau de l'ozonide résultant et clivage du produit réactionnel par le carbonate de sodium. Les isomères purs (14) et (15) ont été caractérisés par des points de fusion respectifs de 140-143°C et 171-173°C. La pipéridine dans le benzène à reflux a transformé les al= 20 déhydes (14) et (15) en l'ènanine (16) avec un rendement de 91 L'ènamine (16) q été caractérisée par un point de fusion de 118-119°C. On a alcoylé 1'ènamine par l'éther de méthyle et de chlo-rométhyle en éther de méthoxyméthyle (17) (P = 81-84°0). Par ad-sorption de (17) sur gel de silice désactivé il se produit une 25 hydrolyse sélective de la fonction ènamine et l'aldéhyde huileux (8) se forme avec un rendement de 72 %. Le spectre de résonance magnétique nucléaire n'était compatible qu'avec une relation co-planaire trans des hydrogènes en positions 0-5 et C-5a, ce qui indique que l'hydrolyse conduisant à l'aldéhyde (8) était stéréo-30 spécifique. La condensation de l'aldéhyde (8) avec la thiazolone (6) en présence d'acétate de plomb basique dans le tétrahydrofurane conduit à la thiazolone (18) caractérisée par un point de fusion de 157-160°C. 35 Une association de bases fortes (par exemple butyl-lithium et t-butylate de potassium) a catalysé la réaction de la thiazolone (18) avec 1'oxo-3-glutaramate de néthyle (7) pour donner le composé tétracyclique (19) caractérisé par un point de fusion de 225°C (avec décomposition). E11 général, on peut utiliser n'impor-40 te quelle base forte qui ne détruit pas le produit tétracyclique BAD ORIGINAL 70 21531 7 2052958 désiré. La réaction a été effectuée à reflux dans le tétrahydro-furane comme solvant. Le groupe méthoxyméthyle a ensuite été éliminé par l'acide acétique pour donner le précurseur de la tétracycline (20). 5 La présente invention est relative au traitement des pré curseurs de la tétracycline de formules 1C ou 1D (le composé (20) étant un exemple d'un tel précurseur) dans des conditions conduisant à l'introduction d'un groupe hydroxyle en position 12a, ayant en prédominance la position cis par rapport à l'hydrogène 4a. Plus 10 particulièrement, selon la présente invention, on introduit ce groupe hydroxyle en faisant réagir le composé (20) avec l'oxygène moléculaire dans un milieu "basique utilisant un solvant aprotique. Pour les meilleurs rendements, on utilise aussi un agent destructeur des peroxydes dans le système ré.actionnel. 15 Le solvant utilisé dans la présente invention est un sol vant qui ne détruit pas le produit désiré en présence d'une "base forte. En général ce sont des solvants aprotiques c'est-à-dire deB solvants qui ne libèrent pas de protons en présence d'une base forte. Comme exemples non limitatifs on peut citer les suivants 20 benzène, toluène, xylène, diglyme; tétrahydrofurane, dioxane, éther diéthylique, anisole, (ainsi qu'un certain nombre d'autres éthers), diméthylformamide, diméthylsulfoxyde et acétate d'éthyle. D'autres solvants analogues aux précédents seront évidents pour l'homme de l'art, y compris certains des solvants mentionnés dans 25 le'brevet cité précédemment N° 3.188.348. La base forte utilisée dans la présente invention peut être une base ayant la force suffisante pour ioniser les gro„upes hydro-xyles dans la structure de la tétracycline mais ne détruisant pas en même temps le produit. On utilise en général des bases comme 30 les amidures alcalins, les butylates alcalins, les métaux alcalins alcoyles de 1 à 6 atomes de carbone et les hydrures alcalins. Comme exemples, on peut citer l'hydrure de sodium, l'amidure de sodium, les alcoyl lithium et le tv-butylate de potassium. Il est évident que certains de ces produits, pa3?fexemple l'hydrure de po-35 tassium, sont dangereux à manipuler et sont de préférence à éviter lorsqu'il existe d'autres produits plus commodes. En règle générale, les alcoylates, hydrures, composés alcoyles, polyvalents, eèc. se sont révélés inutilisables; on peut néanmoins utiliser les alcoylates de magnésium t Les hydroxydes alcalins sont aussi inu-40 tilisables car ils détruisent la tétracycline. /û 21531 e 2052958 Finalement, on préfère travailler en présence d'un agent destructeur des peroxydes car tous les peroxydes formés au cours de l'oxygénation détruisent le composé tétracyclique désiré et diminuent ainsi le rendement. Les agents destructeurs des peroxy-5. des utilisables sont les ph.osph.ites de trialcoyle, le palladium ou le platine métallique, les ascorbates alcalins, les enzymes peroxydases, les mercnptans, les sulfures, les sulfones et diverses phosphines. L'agent destructeur des peroxydes ne doit pas attaquer la structure elle-même do la tétracycline. Il est évident 1B qu1 on préfère ne pas utiliser les produits qui sont difficiles à manipuler comme les mercaptans et les sulfures. On a découvert qu'une petite quantité d'humidité est parfois nécessaire pour initier la réaction. Lorsque la réaction semble démarrer avec difficulté, on peut ajouter au mélange réac-15 tionnel quelques gouttes d'eau. Le traitement d'un précurseur de la tétracycline comme le composé (20), dans les conditions précédentes par l'oxygène moléculaire sec (soit de l'oxygène pur, soit de l'air) dure de 2 à 15 minutes. La température est essentiellement la température or-20 dînaire bien qu'on puisse utiliser en principe toute température comprise entre le point de congélation et le point d'ébullition dû solvant. Pour la mise en oeuvre préférée de la présente invention, oh préfère ajuster la durée de la réaction de façon à ce qu'elle 25 soit juste suffisante pour consommer le produit de départ. Ceci peut être effectué com odement en. suivant l'avancement de la réac tion par photométrie ou colorimétrie. On a trouvé que ceci optini sait le rendement. Des durées de réaction prolongées au delà de la durée juste suffisante pour consommer le produit en réaction, 30 ont tendance à provoquer des dégradations et des pertes du produit désiré. Le traitement acide du produit hydroxylé élimine le groupe acétonide qui forme un pont sur les positions C-5 et C-6 du cycle de la tétracycline. La transformation de la tétracycline (21) en 35 oxytétracycline (5) n'est ensuite qu'une simple étape qui consiste à éliminer le chromophore thiobenzamide et lui substituer un groupe dinéthylamino. La présente invention est plus complètement illustrée dans les exemples suivants : 70 21531 15 25 30 9 EXEMPLE 1 2052958 L'exemple 1 est destiné à indiquer un procédé de préparation d'un précurseur typique de la tétracycline (en particulier le précurseur (20) représenté dans les dessins. 1. (a) oxydation du diol (12c). Cette préparation est reportée dans la thèse de doctorat de Edwin VEDEJS présentée à l'Université du Wisconsin en 1966. On a dissous 105 te du diol (12c) de structure 10 20 35 40 dans 5 litres d'acétone technique distillée 2 fois sur carbonate de potassium anhydre, à 40°C dans un tricol de 12 litres muni d'un agitateur, d'un réfrigérant et d'un tube desséchant. On a ajouté en une fois 157s5 S de tetraacebate de plomb, séché S heures à 40°C sous vide et on a maintenu l'agitation pendant 1 heure à 40°C/ On a retiré le bain de chauffage et on a ajouté 5 litres d'hexane. Au bout de 10 minutes, on a filtré les sels de plomb et on les a soigneusement lavés avec 2 litres d'un mélange benzène: chloroforme 1:1. Cn a rassemblé les phases organiques, on les a évaporé® et on a dissous le résidu dans le chloroforme. On a lavé la solution chlorofornique 2 fois à l'eau, on l'a séchée sur sui-fate de sodium et évaporée pour obtenir le dialdéhyde (12d) sous forne d'une huile jaune. Le produit était assez pur Jour être u-tilisé dans l'étape suivante. On a recristallisé le dialdéhyde (12d) de l'éther; il se caractérisait par un point de fusion de 135-138°C. En outre, on a vérifier la structure assignée à ce produit par les spectres infra-rouges, ultra-violet et le spectre de résonance magnétique nucléaire ainsi que par analyse élémentaire. 1. (b) Cyclisation en aldéhyde saturé (12d) cette préparation est reportée dans la thèse de doctorat de Edwin Yedejs présentée à l'Université du Wisconsin en 1966. On a dissous le dialdéhyde huileux (12d) préparé comme décrit dsns l'exemple 1a dans 2,1 litres de xylène (qualité réactif) BAD OR'GINAL 0 21531 205295,, 10 et on a séparé la solution en 7 parties aliquotes de 300 ml. On a placé chaque aliquote dans un tricol de 2 litres muni d'un réfrigérant et d'un séparateur à eau. On a ajouté du xylène pour a-mener le volume de chaque récipient à 750 ral et on a porté le mé-5 lange à reflux. On "s ajouté une solution de 4,5 g de diazabicyclo-octane dans 75 d'acide acétique, en une fois, en maintenant une éTxLlition vigoureuse, puis on a ajouté une solution de 0,5 S de pipéridine dans 25 ml de xylène. On a ensuite porté à reflux là solution rouge foncée pendant 7 minutes. On a arrêté le chauf-10 fa:ge, on a ajouté 750 ml de benzène refroidi et on a refroidi le méiange 2 minutes dans un bain de glace. On a rapidement lavé la solution brun-foncé 5 fois à l'eau (avec des portions de 1 litre). On a lavé la phase aqueuse avec 2 litres de benzène, on a rassemblé les phases organiques et on les a séchéçs sur du sulfate de 15 sodium. On a rassemblé les 7 phases organiques et on les a évaporées à 60°C dans un évaporateur éclair. On a éliminé les dernières traces de xylène sous vide pour obtenir une gomme foncéâ, partiellement cristallisée. On a chauffé le produit avec 250 ml d'éther jusqu'à ce que tout le produit de gomme se soit dissous et on l'a 20 laissé cristallisé à température ordinaire. On a filtré le produit cristallisé brun et on a éliminé le produit caoutchouteux par lavage à l'éther froid contenant 20 % de benzène poupfabtenir 5'î g de l'aldéhyde insaturé. On a caractérisé ce produit par un point de fusion de 162-165°C (décomposition) après 3 recristallisations 25 de l'éther. On a vérifié sa structure par spectre infra-rouge, ultrë-violet, par le spectre de résonance magnétique nucléaire et par analyse élémentaire.' 1. (c) ozonolyse de l'aldéhyde insaturé (13) cette préparation est reportée danB la thèse de doctorat de Edwin "Vedejs pré-30 sentée à l'Université du Wisconsin en 1966 On a refroidi à -50°C une solution contenant 5 g de l'aldé-hyd&o insaturé (13) dans 300 ml de chloroforme distillé sur pento-xyde de phosphore. On a fait passer dans cette solution pendant 65 minutes entre -40 et -50°C de l'ozone, en excès de 10 % sur la 35 quantité stoechiométrique. On a ensuite éliminé l'excès d'ozone en faisant passer de l'azote dans la solution refroidie. On a laissé le mélange revenir à température ordinaire et on l'a utilisé directement dans la réaction suivante. On a obtenu un échantillon analytique de l'ozonide en éliminant le solvant à 35°C et en 50 le recristallisant plusieurs fois de lléther. On a noté un poin# BAD ORIGINAL 70 21531 2052958 11 de fusion caractéristique de 104°G (décomposition). On a en outre caractérisé l'échantillon au moyen de ses spectres infra-rouges et ultra-violets et au moyen d'une analyse élémentaire. ■! On a ajouté 25 ml d'eau à la solution chloroformique de l'o 5 2énide, directement après ozonolyse et on a laissé reposer le mélange "biphasé à température ordinaire pendant 2 jours en le secouant de temps en temps. On a ensuite séparé la phase aqueuse, on a séché la couche chloroformique sur sulfate de sodium et on l'a évaporée à 40°0. On a repris le résidu orange-pâle dans l'é-10 ther contenant un peu de chloroforme (20 ml au total) et on a laissé la solution s'évaporer lentement à température ordinaire. On a recueilli plusieurs fois des cristaux couleur crème pendant 2 jours, avec un rendement total de 3,7 S- Les cristaux ont été caractérises par un point de fusion de 130-138°G (décomposition^. 15 Néanmoins, par suite de l'instabilité chimique des cristaux à température ordinaire on n'a pas pu on obtenir 'une analyse satisfaisante. On a dissous les cristaux orange dans 1 litre de chlorure de méthylène distillé. On a ajouté 500 ml d'une solution de car-20 bonate de sodium 0,5 Î'T et on a vigoureusement agité le mélange pendant 2 heures. On a séparé la couche aqueuse rouge, on l'a lavée par 200 ml de chlorure de méthylène et jetée. On a rassemblé les phases organiques, on les a lavées avec 500 ml d'eau, séchées sur surface de sodium et évaporées,. L'huile résiduelle a cristal-25 lisé de 200 ml d'éther pour donner un produit cristallisé carac-téris* par un point de fusion de- 120-160°C ce produit cristallisé étant un mélange des aldéhydes isomères (14) et (15). La structure du mélange des aldéhydes (14) et (15) a été soigneusement vérifiée au noyen des spectres infra-rouges ultra-violets et de ré-30 sonance magnétique nucléaire des aldéhydes (14) et (15) séparés ainsi que par analyse élémentaire. 1. (d) Préparation de 1'ènamine (16). Cette préparation est décrite dans la thèse de doctorat de Edwin Vedejs présenté à l'Université du Wisconsin en 1966. 35 On a dissous le mélange des aldéhydes (14) et (15) préparés dans l'exemple 1(c) dans 125 ni de benzène distillé sur hydrure d'aluminium et de lithium. On a ajouté 2,8 g de pipéridine distillée sur hydroxyde de potassium et on a porté à reflux la solution rouge pendant 1 heure en utilisant un séparateur d'eau. On 40 a ensuite éliminé les solvants pour obtenir un résidu cristallisé 70 21531 2052958 12 "brun. Le produit recristallisé de l'éther, a été caractérisé par un point de fusion de 114-118°C. L'identification du produit a été confirmée par les spectres infra-rouges, ultra-violets et de résonance magnétique nucléaire ainsi que par analyse élémentaire. 5 :1. (e) éthérification de 1'ènamine 16. Cette préparation est reportée dans la thèse de doctorat ck Edwin Vedejs présentée à l'Université du Wisconsin d.n 1966. On a dissous l'ènanine (16) dans 250 ml de tétrahydrofurane sëc portés à reflux pendant 8 heures sur hydro&yde de potassium 10 et distillés sur hydrure d'aluminium et de lithium., sous azote et on a refroidi le système à 0°C. On a ajouté de l'hydrure de sodium (après élimination de l'huile minérale par l'hexane sec, le produit étant pesé sous azote) et on a laissé le mélange se réchauffer légèrement pour amorcer la formation de sel. On a con-15 trôlé la mousse en refroidissant le récipient réactionnel avec de l'eau glacéo. Lorsque le dégagement de huiles a cessé (30 minutes environ ont été nécessaires) on a ajouté goutte à goutte de l'éther de méthyle et de chlorométhyle fraîchement distillé pendant 1heure sous azote avec agitation. Après un total de 6 heures 20 d'agitation à température ordinaire, on a évaporé le solvant à 35°0. On a repris le résidu jaune dans l'éther et on a filtré le chlorure de sodium précipité. On a évaporé l'éther et on a cristallisé l'huile orange de l'hexane. On a recristallisé le produit cristallin résultant 2 fois du mélange ether-hexane et on l'a 25 jaractérisc par un point de fusion de 6>3-85°C. La structure de l'éther résultant d'ènamine (1?) a été confirmée par spectrosco-pie infra-rouge, ultra-violette résonance magnétique nucléaire, ainsi que par analyse élémentaire. 1. (f) préparation de l'aldéhyde (8) .Cette préparation est repor-30 tée dans la thèse de doctorat de Jared Ben Mooberry pré sentée à l'Université- Cornell en Février 1969 On a dissous 10 g de l'ènanine (17) préparée dans l'exemple 1e, dans 500 ni de benzène sec. On a ajouté J00 cLe gei 21531 2052958 13 1. (g) Préparation de la thiazolone (18). Cette préparation est reportée dans la thèse du doctorat de Jared Ben Mooberry présentée à l'Université Cornell en Février 1969 Une solution de la thiazolone sinple (6) a été préparée en 5 combinant 5*19 g de-dicyclohexylcarbodiinide et 4-,90 g d'acide thiohippurique dans 150 ni de tétrahydrofurane en agitant 1 heure à température ordinaire. On a dissous l'aldéhyde (8) préparé dans l'exemple 1f dans 100 ni de tétrahydrofurane et on a ajouté à la solution 3,8 g d'acctate de plomb basique (analyse 35 % PbO). On 10 a ajouté la suspension de la thiazolone brute sinple et de dicyclo hexylurée en deux portions égales à la solution vigoureusement a-gitée de l'aldéhyde (8) et de l'acétate de plomb. La seconde portion de la suspension de thiazolone sinple a été ajoutée 30 minutes après le commencement de la réaction qui a duré un total de 15 1 heure à température ordinaire. On a filtré le mélange hétérogène sur un verre fritté en utilisant de la "Colite" pour empêcher les pores du filtre de se boucher. On a évaporé le filtrat sous pression réduite, on l'a dissous dans 50 ml de chloroforme et empâté avec 4-0 g de gel de silice. On a filtré la suspension en utilisant 20 un grand verre fritté et on l'a lavée au chloroforme et à l'éther. On a concentré l'ensemble des filtrats et on les a cristallisés de l'éther. L'identification du produit ainsi obtenu a été vérifiée par comparaison de son spectre de résonance magnétique nucléaire avec le spectre d'une préparation semblable dont l'authen-25 ticité avait été au préalable confirmée par analyse du spectre dé résonance magnétique nuiéaire, infra-rouge et ultra-violet ainsi que par analyse élémentaire, Le "iode opératoire décrit dans l'exemple 1g peut aussi ê-tre mis en oeuvre en utilisant la méthode au tribromure de phos-50 phore pour la préparation de la thiazolone simple (6), préparation qui est décrite par Muxfeldt et col. dans Journal of American Chemical Society, volume 89, page 4991. 1. (h) Préparation de 1'oxo-3-glutaramate de méthyle (7). Cette préparation est reportée dans la thèse de doctorat de 35 Jared Ben Mooberry présentée à l'Université Cornell en Février 1969 L'hydrolyse de 22 g de 1'ènamine recristallisée (9) de formule 4-0 CH,0oC 7^ COÏÏHp (9) -> ^ un ^ 70 21531 205295d 14 (dans 360 ml de chloroforme) s'est produite rapidement par addition de 12 ni d'acide chlorhydrique concentre avec agitation vigoureuse. On a ensuite ajouté 20 g de sulfate de magnésium anhydre lorsque l'hydrolyse a été terminée. On a filtre la solution et on 5 a concentré sous vide. Par cristallisation de l'acétafee d'éthyle, on a obtenu 13,2 g d'un produit cristallisé blanc caractérisé par un point de fusion de 36-38°C. L'identité du produit ainsi obtenu a été vérifiée par analyse du spectre infrâ-rouge, ultra-violet et de résonance magnétique nuiéaire, ainsi que par analyse élé-10 mentaire, 1. (j) Condensation de la thiazolone en susbstance tétracyclique (19). Cette préparation est reportée dans la thèse de doctorat de Jared Ben Mooberry présentée à l'Université Cornell en Février 1969. 15 Le ballon à fond rond de 500 ni et tout le reste de l'appa reillage utilisé dans cet exemple ont été séchés à l'étuve à 125°0. Toutes les rénctions ont été effectuées en atmosphère d'azote (sauf extraction). Le tétrahydrofurane a été distillé sur hydrure d'aluminium et de lithium et conservé sous azote jusqu'à utilisation 20 On a dissous 1'oxo-3-glutaramate de méthyle (7) préparé dans l'exemple 1h (3*18 g) dans 85 ml de tétrahydrofurane dans le récipient réactionnel. Après avoir refroidi la solution à -78°C, on a ajouté 7,7 d'une solution 2,6 molaire de butyl-lithium dans l'hexane. On a agité la solution homogène pendant 10 minutes tout 25 en préparant une solution de 9*5 g de la thiazolone (18) préparée dans l'exemple 1g dans 180 ml de tétrahydrofurane. On a agité lentement la solution de thiazolone dans la solution vigoureusement agitée du sel héni-amide en maintenant la température à -78°C. Gn a réchauffé ce mélange à température ordinaire en 1 heure et denic-30 avant de le porter à reflux pendant encore 1 heure et demie. Après refroidissement de nouveau à -78°0, on a traité le mélange homogène par 1 ml de tertiobutanol (décanté de l'hydrure de calcium). ei/^)ar 8,8 ml de butyl lithium. On a réchauffé le mélange à température ordinaire pendant 20 minutes environ et on a ajouté 270 agj de tor-35 tiobutylate de potassium. On a chauffé le mélange à 50°C pendant 1 heure puis on l'a porté à reflux pendant 2 heures. 0^ a ajouté des quantités supplémentaires de tertio-butylate de potassium 50 minutes après le début du reflux (0,38 g) et de nouveau 95 minutes après le début du reflux (1,0 g). On a laissé la solution «ncle; 40 après reflux, se refroidir à température ordinaire pendant 1 heure. 70 21531 2052958 15 puis on l'a neutralisée par 6 ml d'acide acétique. Après neutralisation, on a concentré le mélange réactionne1 sous pression réduite, on l'a dissous dans le cliloroforne, lavé à l«'eau, év£"ooré plusieurs fois d'un mélange de benzène, d'éthanol 5 et de chloroforme pour éliminer les dernières traces d'eau puis dissous da^is le mélange chloroforne-éther. La cristallisation du produit de la solution chloroforme-éther a été provoquée par addition de gel de silice. On a séparé par filtration le produit précipité et le gel de silice et on les a lavés au chloroforme et 10 à l'éther. On a rassemblé les filtrats, on les a concentrés, dissous dans une petite quantité de chloroforme, ensemencés avec un peu de produit et laissé de nouveau cristalliser. On a obtenu 2,5 g de la tétracycline (19). Elle a été caractérisée, après recristallisation do l'acétone, par un point de fusion de 225°C (décon-15 position). La structure du produit isolé (19) a été vérifiée essentiellement par son spectre ultra-violet et par le fait que par hydrolyse, elle a été transformée en la tétracycline (20). La structure du produit a été en outre confirmée par spectroscopie infrarouge et résonance magnétique nucléaire et par analyse élémentaire. 20 1. (k) Préparation du précurseur de la tétracycline (20). Cette préparation est reportée dans la thèse du doctorat de Jared Ben Mooberry présentée à l'Université Cornell en Février 1969 On £ introduit 2,4 g du produit de cyclisation (19) préparé 25 l'exi •:..') dans voi récipient à fond rond de 500 ni con- tenant 200 ni d'acide acétique et 200 ni d'eau. On a agité ce né-lange et on a chauffé rapidement en 6 minutes jusqu'à reflux ; à ce moment la solution est devenue homogène, Après 2 minutes de reflux, on a rapidement refroidi la solution dans l'eau froide puis 30 on l'a concentrée sous pression réduite. La température n'a pas dépassé 3CJG pendant 11évaporation. Par cristallisation du chloro-fîEe on c .ï,0 g du précurseur (20) qui a été caractérisé par un point do fusion de 220°C (avec décomposition). La chronato-graphie en couche mince sur un polyamide (tétrachlorure de carbone: 35 benzène:acide fornique 100:100:1) n'a pas présenté de signçâ'épi-nérisation en position C-4 au cours de l'hydrolyse. La structure du précurseur de tétracycline (20) a été confirmée par spectroscopie infra-rouge, ultra-violet et de résonance magnétique nucléaire ainsi que par analyse élémentaire. BAD ORIGINAL 70 21531 2052958 16 EXEMPLE 2 Ois hydroxylation en 12a du précurseur de tétracycline (20) Cette préparation est reportée dans la thèse de doctorat de »- Jared Ben Mooberry présentée à l'Université Cornell en 5 Février 1969 On a dissous 524- ng du précurseur de tétracycline (20) dans 50 ni de tétrahydrofurane et 50 al de dinéthylformanide (décanté de l'hydrure de calcium). On a ensuite ajouté à la solution 0,25 ni de phosphite de triéthyle (distillé sur sodium) et 550 mg 10 d'hydrure de sodium en dispersion à 50 % dans l'huile. On a fait barboter de l'oxygène dans la solution au noyen d'un tube à dispersion des gaz pendant 15 ninutes. On a lentenent ajouté 0,14- ni d'eau pendant les 3 premières minutes. La réaction a semblé être te minée au bout de 10 ninutes car une partie aliquote en solution 15 dans le borate avait une très faible absorption à 4-50 millinicrons. On a ajouté de l'acide acétique et de l'eau (vigoureux dégagenent d'hydrogène) jusqu'à obtenir une solution homogène et jusqu'à ce qu'on atteigne un pH de 5 environ. On a ajouté un total de 300 ni d'eau avant extraction à l'acétate d'éthyle. On a lavé les extraits 20 organiques plusieurs fois à l'eau pour éliminer complètement le dinéthylformanide. Après évaporation de l'acétate d'éthyle, on a dissous le résidu dans 20 ml d'acide chlox-hydrique 0,01 méthano-lique. On a laissé l'hydrolyse se produire pendant 1 heure et demie à température ordinaire avant d'extraire la solution méthano-25 lique à l'hexane pour éliminer l'huile minérale. On a concentré le mélange sous vide, on l'a dissous dans l'acétate d'éthyle, lave à l'eau pour éliminer l'acide restant et concentré de nouveau. On a dissous ce concentrât dans 2 ni de chlorure de "éthylène contenant 3 gouttes d'acide fornique et on l'a empâté avec 2 g 30 de polyamide en poudre pour colonne. Par séchage à l'air on a obtenu une poudre fluide qu'on a déoosceau sommet d'une colonne contenant 10 g de polyamide pré-traité par 2 ni de chlorure de méthylène et 0,03 ni d'acide fornique. On a utilisé du chlorure de méthylène pour éluer une bande jaune contenant une faible 35 quantité du précurseur de tétracycline (20) n'ayant "pas réagi et un second produit qu'on a pensé être un sous-produit hydroxylé en 11a contenant le groupe acétonide intac,t. Le produit désiré a ensuite été élue à l'acétone. La cristallisation du prodi it de l'acétate d'éthyle a donné 189 ^g d'un produit cristallisé j 4-0 jaune clair caractérisé par un point de fusion de 200°C BAD ORIGINAL 70 21531 2052958 17 * (décomposition ). L'identification du produit a été confirmée par analyse du spèctre infra-rouge, ultra-violet et de résonance magnétique nucléaire ainsi que par analyse élémentaire. Le spectre de résonance magnétique nucléaire indiquait nettement la présence 5 dîune mole d'acétate d'éthyle et l'absence du groupement acétonide. EXEMPLE 3 Préparation d'oxytétracycline On a laissé reposer 206 mg de la tétracycline hydroxylée (21) avec de l'todure de méthyle dans 3 ml de tétrahydrofurane à 10 température ordinaire pendant 20 heures. Après encore 12 heures à -20°0, on a éliminé le solvant sous vide. On a dissous le concentrât dans 4 ni de tétrahydrofurane et 2 ml d'acide chlorhydrique 0,5 H. L'hydrolyse a duré 1 heure et demie à température ordinaire. On a dilue le mélange à l'eau et on l'a extrait successive-15 ment à l'éther, -là l'acétate d'éthyle et au n-"butanol. On a évaporé les extraits de n-butanol à 25°C sous vide élevé pour cristalliser le chlorhydrate d'auine de la dédiméthylaninooxytétracy-cline, On a ajouta 166 mg du chlorhydrate d'aminé à 0,122 ml de 20 ïï, N-diisopropylethylamine, 0,18 ml de sulfate de diméthyle, 5 ni dè tétrahydrofurane et 0,04 ml d'éthanol. On a agité magnétiquement le mélange h-.'-1orogène pendant 17 heures à température ordinaire, et il était encore hétérogène au bout de cette période d'agitation. La chromatographie en couche mince sur polyamide a 25 montré que le piraduit principal à ce moment était identique à l'oxytétrrcycline authentique. On a ajouté une faible quantité de méthanol au mélange pour dissoudre le so.lide et on a concentré la solution sous vide pour obtenir une huile visqueuse. On y a ajouté 1 ml de tétrahydrofurane et on a maintenu la solution à 30 -78°C pendant 24 heures. On a séparé par filtration le solide qui a précipité. On a concentré le filtrat sous vide et on y a ajouté 0,6 ni de lT,N-diisopropyléthylaviine, 2 gouttes d'acide acétique, 1 :.:1 de chlorure de méthylène et 1 ni de tétrahydrofurane. On a empâte la solution avec 1 g de polyamide pour colonne et on 35 l'a séchée à l'air pour obtenir une poudre fluide (1/2 heure d'exposition environ à l'air). On a pré-traité 5 g de polyamide par 5 gouttes d'o.cide acétique et 5 gouttes de chlorure de méthylène avant de les- tasser fortement dans une petite colonne. On a placé au sommet de la colonne le mélange de dl-oxytétracycline brut et 40 de polyamide, on l'a bien tassé et on l'a recouvert d'une couche BAD ORIGINAL '0 21531 2052956 10 15 20 18 de sable. On a élué une tête jaune au chlorure de méthylène qui a laissé la dl-oxytétracyline absorbée au voisinage du sonnet de la colonne; celle-ci est apparue sous forme d'une zone fluorescen te rougeâtre par illumination à 366 millimicrons. On a ensuite élue l1oxytétracycline synthétique par un mélange acide acétique: aaétone:chloroforme (1:15584), Après évaporation jusqu'à obtention d'un solide amorphe on a recristallisé 1'oxytétracycline ra-cémique de l'acétone» La spectroscopie infré-rouge, ultra-violet-tê et de résonance magnétique nucléaire ainsi que l'analyse élémentaire ont nontré que le produit était identique à une oxytétra. cycline authentique et contenait 0,8 noie d'acétone par mole de produit dans le produit cristallisé sec. Un titrage biologique du produit a montré que la dl-oxytétracycline synthétique était à peu près exactement 50 % aussi active que le produit authentique préparé par ferment a tionli EXEMPLE 4 ture On a dissous 1,0 g du précurseur de tétracycline de struc* ' Cl ME00GcHc 6 5 C0ÏÏHC (CH. 3^3 30 35 40 dans 40 ni de dinéthylformamide et 100 ml de tétrahydrofurane. On a ajouté 280 rig de phosphite de triéthyle puis 200 ng d'hydru-re de sodiun en dispersion dans l'huile minérale. On a fait barboter de l'oxygène dans la solution pendant 10 minutes et la coloration est passée d'orange fluorescent à vert profond. Une gout te de cette solution placée dans du borate de sodiun néthanolique a nontré que l'absorption dans la région visible du spectre avait disparu et avait été remplacée par un nouveau maximum de 350 nillimicrons environ. On a ensuite acidifié la solution oxygénée à l'acide acétique, on l'a diluée au chloroforme, lavée 4 fois à l'éther, séehée sur sulfate de sodium et évaporée. On a obtenu 4.-4. t ■ x ^ 1 ' J a. J. HHCOOcHe- une totracyclme cis hydroxyle q^^de structure : ; 65 " OH v C0MÎC(CH7), 0 0 BAD ORIGINAL 70 21531 2052958 15 20 25 30 35 19 * La structure du produit résultant a été vérifiée par spectroscopio infra-rouge et ultra-violette ainsi que par analyse élémentaire. On a aussi récupéré des sous-produits, c'est-à-dire 220 ng d'un produit recristallisé identifié comme ayant le groupe hydroxyle en position trans sur le carbone C-12 et 104- ng d'un sous-produit i-dentifié comme ayant le groupe hydroxyle en position 11â. EXEMPLE 5 10 On a hydroxyle 1,0 g du précurseur de tétracycline : Ci JE ohhg(ch3)5 par l'oxygène exactement comme décrit dans l'exemple 4-, Dans ce cas toutefois, la réaction était assez propre pour qu'après extraction, le produit auquel on a assigné la structure : Cl jshoocchc 6 5 OH CH3b COEHC(.CH5)3 OH 0 puisse être directement cristallisé du méthanol. On a obtenu 0,74-g de produit cristallisé pur. La structure assignée a été vérifiée par spectre ultra-violet et analyse élémentaire. On obtient des résultats semblables à ceux reportés dans les exemples 2, 4- et 5 lorsqu'on utilise dans les exemples ci-dessus des solvants comme l'éther diéthylique, le dioxane, l'ani-sole, le toluène et le benzène à la place du mélange tétrahydrofurane -dinéthylf orpamide. De même, on peut remplacer le phosphite de triéthyle par des produits comme le diméthylsuifoxyde, la tri-phénylphosphine et la triéthylphosphine. Des bases fortes convenables qui peuvent être utilisées au lieu de l'hydrure de sodium, sont le t-butgziate de potassium, le butyl-lithium, le phényl lithium et l'amidure de sodium. EXEMPLE 6 On a hydroxylé 0,500 g du précurseur de tétracycline de structure : BAD OR'GINAL 70 21531 20-52958 20 KHOOCgH^ exactement comme décrit dans l'exemple 4-. Après séparation chromât ographique du produit final, on a obtenu vdeux composés : 200 mg (4-0 c/o derendement) d'un produit hydroxylé en trans en po-10 sition 0-12a« Le point de fusion était de 275-280°C avec décomposition. L'identité du produit a été confirmée par analyse spec-trographique et élémentaire et 50 mg (10 % de rendement) de produit hydroxylé en cis en position C-12a. L'identité du produit a été confirmée par spectrographie 15 et analyse élémentaire. BAD ORIGINAL 70 21531 2052958 21 REVENDICATIONS 1. Procédé d'hydroxylation stéréospécifique en 13a) de désoxytétracycline 12(a), dans lequel on met en contact un précup seur de désoxytétracycline 12(a) ayant un noya.u de formule 10 ou 15 avec de l'oxygène moléculaire, ledit procédé étant caractérisé en ce qu'on effectue l'hydroxylation en 12a pendant que le précurseur de désoxytétracycline 12(a) est dissous dans un solvant 20 qui est inerte vis-à-vis de la structure tétracycline, en présence d'une base forte qui est capable d'ioniser les groupes hydrô-xyles de la tétracycline sans détruire cette structure. 2. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'il est mis en oeuvre en présence d'un agent de destruction des pero- 25 xydes, qui est inerte vis-à-vis de la structure cyclique de tétracycline . 3. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que le solvant est choisi parmi les suivants : tétrahydrofurane, di-méthylformanide, benzène, toluène, xylène, diglyme, dioxane, éther 30 diéthyliquo, anisole, diméthylsulfoxyde et acétate d'éthyle. 4-. Procédé selon la revendication 1 caractérisé en ce que la base forte est choisie parmi les hydrures alcalins, les ami-dures alcalins, les uétaux alcalins alcoyles de '1 à 6 atomes de carbone et les butylates alcalins. 35 5. Procédé selon la revendication 2, caractérisé en ce que l'agdnt destructeur des jjeroxydes est choisi parmi les composés suivants : phosphite de triméthyle, palladium, platine, ascorba-tes alcalins, enzymes peroxydases, triphénylphosphine et triéthyl-phosphine. Ç, Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce BAD ORIGINAL 70 21531 2052958 22 qu'on ajoute au solvant réactionnel une quantité d'eau efficace pour favoriser la réaction d'hydroxylation. 7. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que le précurseur de dœoKytétracycline 12(a) est la d,l-thiobenzanido- 5 4-désoxytétracycline 12(a). 8. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que le précurseur de tétracycline est la d,l-(F-t-butylauido)-2-ben-zanido-4—désoxy-6-déniéthyl-6-chloro-7-Eiéthoxy-lO-désoxytétracycli-ne 12(a). 1C 9« Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que le solvant est le dinéthylfornamide ou le tétrahydrofurane. 10. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que la base est l'anidure de sodiun, l'hydrure de sodiuri ou le t-bu-tylate de potassiun. 15 11• Procédé selon la revendication 2, caractérisé en ce que l'agent de destruction des peroxydes est le phos-hite de trinéthy-le. BAD ORIGINAL