FR 2034552 A1 19701211 FR 7004581 A 19700210 70 04581 1 2034552 La présente invention est relative à un nouveau procédé de préparation de bléomycines antibiotiques et, plus particulièrement, à un tel procédé par inoculation et culture aérobie dans un milieu contenant une source nutritive d'une souche produisant 5 de la bléomycine appartenant aux actinomyces, dans lequel on effectue la culture en présence d'un composé amino ayant au moins i un groupe et au moins un groupe basique choisi parmi les groupes amino, imino, guanidino, amidino et sulfonium, et des composés cycliques contenant de l'azote, ou en présence d'un com-10 posé transformable dans la liqueur de culture en un composé amino précité, obtenant ainsi sélectivement une bléomycine connue ou nouvelle correspondant au composé amino précité ou à un composé amino dérivé des composés précités, puis on recueille la bléomycine connue ou nouvelle,par des moyens connus, du milieu de culture. 15 Les bléomycines sont des antibiotiques contré les tumeurs dé couverts par ïïmezawa et Collaborateurs, et sont obtenues par culture aérobie d'une souche produisant une bléomycine appartenant aux actinomyces Streptomyces vertieillus (par exemple ATGC N° 15003) sous agitation dans un milieu nutritif contenant de la gelée de 20 millet (constituant principal, maltose), du glucose, de la poudre de grain de soja,de 3aliqueur de macération de maïs, du chlorure de sodium, du phosphate de potassium, du sulfate de zinc, du sulfate de cuivre, etc., et par isolement et récupération de la liqueur de culture de la bléomycine obtenue, sous la forme du chlorhydrate 25 ou du sulfate, par mise en oeuvré de moyens tels qu'une résine échangeuse d'ions. Elles contiennent les constituants , A2» A'g» A^, A^, A5, Ag, B.j, B2, Bj, B^, , Bg et les constituants analogues (dénommés ci-dessous bléomycines) et, quand on soumet ensuite à un traitement d'enlèvement du cuivre, cès bléomycines sont ob-30 tenues sous forme de poudre blanche. On appelle du terme générique de bléomycine tous les antibiotiques contenant des bléomycines. (Brevet anglais n° 1.038.242). Quand on effectue la culture dans des conditions ordinaires, ces bléomycines sont obtenues simultanément, mais le rapport de cha-35 que bléomycine n'est pas défini et, dans la plupart des cas, on produit surtout/ les bléomycines A^et B2. Dans le dessèin d'obtenir un procédé permettant de parvenir sélectivement et avec des rendements favorables aux bléomycines désirées parmi celles mentionnées ci-dessus, on a étudié la structure 40 des bléomycines et on a trouvé qu'elles ont une structure partielle 70 04581 2 2034552 telle que représentée par la formule (I) ci-dessous et que R, dans de la ET —| la formule, varie suivant la nature de la bléomycine. If —-r— COR N-—ÎT -NH—-çh—CO~-iîH( chq ) q ji èliOH 2'2™~VS ^ (I) ÔH3 ' CH5 Bléomycine A0 : R = — NH —-(CH~),, —-SC^ ^ J . - flTT «« A'2: : R = —NH—(CH2)4—NH2 3 » A5 : R « — MÏÏ---(CH2)3--NI^-(GH2)4--«H2 10 M Afi : R = — NH—(CH?),—NH— (GH?) ,-HJH— (CHp)~—NH? * B2 : R = — NH—( GH2 ) 4~-4JH—C-^-N^ NH " B4 : R = — NH—( CH2 ) 4—N—( GH2 ) 4~NH—C—NH2 . H m 15 M2 Sur ces bases, on a continué les études et on a trouvé que lorsqu'on ajoute à la liqueur de culture des souches produisant de la bléomycine divers composés amino correspondant à la portion R de chaîne latérale dans la formule (I), ou dès composés amino trans-20 formables pendant la culture en les aminés correspondant à la portion de chaîne latérale, on peut obtenir les bléomycines désirées avec des rendements favorables et, quand on ajoute certains types de composés amino, on peut obtenir des bléopycines nouvelles, différentes de celles précitées, ces nouvelles bléomycines pouvant être 25 obtenues avec de hauts rendements lorsqu'elles sont séparées des liqueurs de culture et purifiées. Les composés amino précités utilisés dans l'invention peuvent être représentés parties cinq formules suivantes : D3 R G / /. (1) NH9-GH„-X-N . 3 R NH~-CH~-X-N - © /R (3) Iffi2-CH2-X-S (5) NÏÏ2-GH2-X' dans laquelle X = -(?H2)n~ » (9H2^n1 ~^H2^n2" 35 R6 i6 R6' -(GH2)n-B-(çH2)n2 ^ ; R6 R7 R°* BAD ORIGfNAL 70 04581 3 2034552 _(CH2)n^-(0H2)n2-ir-(aH2)n3-à6 R7 R6' R7lR6'f u E NH ÔRy 5 5 r R1, R2 = H, groupe alcoyle, -(GH2)n4-H , (ÇH2)n4'-QR9 à8 k8' -Q-E10 , -(?H2)n+» -yi-E 10* 1 aw 10 R -(0H2)n4" , -0-BH2 ^8"' HH X A K R , R, R = groupe alcoyle 15 N gT -O-(0H2)n-»C a . il 2' N-R / R6 2 3. 4 4' 4* 4 i » n~ ti n~ r>~ où il, n , n r H , n* , n , n^ est un nombre entier de 1 à 8, 25 n' un nombre entier de O à 8, E6, B6', H6", E7, H7', fi7" E8, E8', E8", E8"' , K9, B9', 10 10* 10" R , R , R est H ou un groupe alcoyle. La ligne pointillée dans la formule (par exemple -(CH2)n- etc) R6 30 indique que l'atome d'hydrogène est porté par n'importe quel atome de carbone du groupe alcoyle. Des exemples typiques de composés amino représentés par les formules générales précitées (1) à (5) et de composés transformables en ees composés amino pendant la culture sont indiqués ci-dessous, 35 1,2-diamiixoéthane HH2-(GH2}2-îîH2 1.3-diaminopropane NH2(GH2)^-lîH2 1.4-diaminobutane NH2(CE2)4-IïH2 1.5-diaminopentane HH2-(GH2)^-HH2 1.6-diaminohexane HH2-( CH2 ^ 6~ÏÏÏI2 70 04581 2034552 N-(2-aminoéthyl)~1,2-di aminoéthane N-(3-aminopropyl)-1,3-diaminopropane 5 N-(aminopropyl)-1,4- diaminobutane (spermidine) N-(5-aminopentyl)-T,5-diaminopentane N,lî •-bis ( 2-aminoéthyl )-10 diaminométhane N ,N ' -bis ( 2 (aminométhyl)1,2-diaminoéthane N,N,-bis(3-aminopropyl-1,4-' diaminobutane (spermine) 15 N ,N ' -bis ( 3-ami.TTopropyl )—1,6— diaminohezane N,N'-bis(5-aminopentyl)-1,5-diaminopentane 20 2,4,4-.^riméthylpent amé thylène-diamine ra2- nh2- nh2- kh2- nh2- nh2- nh2- nh2- nh2- GH2 ) 2-NH-( GH2 ) 2 -NH2 CH2 ) 3-NH- ( CH2 ) 3-NH2 GH2)3-NH-(CH2)4-lJtt2 CH2)5-NH-(CH2)5-NH2 ch2) 2-nh-gh2-mh-(ch2 )g-nh ch2 ) 2-nh- ( ch2 ) 2-nh- ( gh2 ) 2-mh2 CH2 ) 3-NH-( GH2 ) 4-M- ( GH2 ) 3-ffiî2 ch2 ) 3-nh- ( gh2 ) g-nh- ( ch2 ) 3-nh2 ch2 ) 5-nh- ( ch2 ) 5-kh-( ch2 ) 5-hh2 GH,GHX I 3, 3 nh2-ch2-c- 0h-(ch2)2-î1h2 chrf 1,2-diaminopropane 25 N-méthyl-1,3-diaminopropane N-butyl-1,3-diaminopropane N-oetyl-1,3-diaminopropane nh2-ch2-ch-ch2 NH„ nh2-(gh2)3-nhgh3 NH2_(CH2)3-lîHe4H9 nh2-(gh2)3-nh-(gh2)7-ch3 30 N ,N-diméthyl-1,2-diaminoéthane NH2(GH2)2N CE, / 3 N,N-diméthyl-1,3-diaminopropane NH2-(CH2)3-N 35 N,N-diéthyl-l,3-diaminopropane NH2-(CH2)3-N^^ .-g-, GH, chlorure de 3-aminopropyl-triméthyl (Q / «nium Œ2- 3-»J;CIV 01 CIi3 C H N,N-diéthyl-1 ,2-diaminoéthane NH2(CH2)2N 2 5. CH. 70 04581 5 2034552 bromure de 3-amlaopropyl-triiaéthyl-ammonium ^2" 5 N-(3-diméthylaminopropyl ) -t, 3-diaminopropane N- ( 3-métiiylaminopropyl ) -1,2-diaminoéthane K-(3-méthylaminopropyl)~1,4-diamin obutane 10 N-(3-méthylàminopropyl)1,5-diaminohaxane N-(3-méthylaminopropym) 1,8-diaminooctane N-butyl-N'-3-aminopropyl-1,3-15 diam 1 n opropane N-(2-diméthylaminoéthyl) -1,3-diaminopropane N-(4-diméthylamihobutyl)-1,3-diam1n opropane 20 N-(6-diméthylaminohexyl)-1,3-diaminopropane N-(8-diméthylaminooctyl)-1,3-diaminopropane N-(3-hydroxypropyl)-1,3-25 diaminopropane N-(2-hydroxypropyl)-1,2— diaminoé thane N-(2-hydroxyéthyl)-1,3-diaminopr opane 30 N-(3-mé thozypropyl)-1,3-d iaminopropane H-(3-octyloxypropyl)l,3-diami n opropane N-3-amino-1-méthylpropyl)-35 1,3-diaminopropane U_(3-amino-1-éthylpropyl)-1,3-diaminopropane © /°H3 -(CH0).,-JÎ -USE,' oh, hh2- (ch2 ) 3-hh- ( ch2 ) ^ ch^ ïïho- kh„- ïïh0- kh~- nho- NHo- nh0- NH0- NHo- nh„- nh0- nh„- BH^- îjho- hho- oh2)2-hh(gh2)3-nhch5 gh2 ) 4-mh-( ghg ) 3-nh0h3 ch2 ) 6-nh-( ch2 ) 3-nhch3 ch2 ) g-mh-(gh2 )3-rhgh3 ch2)3-kh-(ch2)3-nh-c4hg .CH., ch2 ) 3-nh-( ch2-n c.gh; 3 CH, gh2)3-nh-(gh2)4-n ,GH^ ch2)3-hh-(ch2)6-n^ch^ CH- ch2 ) 3-nh- ( gh2 ) 8-n gh2)3-nh-(ch2)3-0h ch2 ) 2-nh-ch2-gh-gh3 oh ch2 )3-hh~(ch2)2-0h ch2 ) 3-hh- ( ch2 ) 3-0ch3 gh2)3-nh-(ch2)3-oc8h17 gh2)3-nh-gh-(ch2 )2-nh2 GH, 3 gh2 ) 3-nh-gh- ( gh2 ) 2-nh2 g2h5 70 Û4S81 6 2034552 N ,N-Ms ( 3-aminopropyl ) -méthylamine N,N-bis{3-aminopropyl)-éthylaaine 5 N,N-bis ( 3-aminopropyl ) -n-butylamine nh2-(ch2 ) 3-n- (ch2 ) 3-nh2 OH3 hh2-(gho)3-h-(ch2)3-hh2 "i2n5 ' - hh2- (ch2) 3-n- ( ch2) 3-nh2 n H ■■ 4 9 bromure de 3-am in opro py1-dimé thyl- (±) ^ ch., sulfonium lffi2-(0h2»3-f «Coh, Br ■ 5 chlorure de 3-aminopropyl-diméthyl- sulfonium V, 01 CH bromure de 3-acétaminopropyl- CH3GONH-(GH2)3^GH3 Br 3 diméthylsulfonium 15 Chlorure de 3-amino-3-carboxypropyl-diméthylsulfonium nh2-j3h-(ch2)2-s 4-(aminobutyl)-guanidine (agmatine) 3-amidinopropylamine $-3(aminopropyl)-pyrrolidine 20 N-(3-aminopropyl)-pipéridine N-(2-amino éthyl)-pipérazine N-(3-aminopropyl)-pipérazine (3-aminopropyl)morpholine N- ( 3-ami.nopro pyl ) -N1 -25 méthylpipérazine N-(3-aminopropyl) -N ' -éthylpipérazine N,N'-bis(3-aminopropyl)-pipérazine 30 N-^yrrolidino)-propyl7- 1,3-diaminopropane N-/J- ( pj.péridiho) -propy^Z- 1, 3-diaminopropane nh2- nh2- nh2-• hh2-uh2-nh2- nh2- © con% ci ; ch2)4-m-c-nh2 nh ch9 ) x-0-nho « 3 « 2 nh oh2)3- OH2)3-'0 ch-K-N^N ^ & \ / ch2)3-N^N gh2)3-na_xo .ch, ch. nh2- nh2- nh2- nh2-nh2- CH2)3-N^N-CH3 ch2)3-n^j>-c2h5 gh2 ) 3-n^3 n- ( ch2 ) 3-nh2 GH2)3-NH-(GH2)3-i(i]' ch2 ) 3-nh- ( ch2 ) -]Q 70 04581 2034552 N-3- (pipérazino ) -propyl- nh2_ ( ch2 ) 3-NH- (CH2) 1,3-diaminopropane N- (morphollaopropyl ) -1,3- HH2-(CH2)3-NH-(CH2)3-îrQo d iaminopr opane 5 N-benzyl-1,3-diaminopropane HH2- ( GH2 ) ^-HH-GH2 \Q/ ^ge2 - jr,N-dibenzyl-1 ,3-diaminopropane HH2~(GH2)^-N x^ ^ 2_\Q) N-( 1 -phényléthyl)-1 ,3- HH2-(0H2),-NH-0H- diamin opropane 1 ch5 10 u-(p-méthylbenzyl)-1,3- HH2-(CH2)3-HH-CH2-^^>-GH, diamin opropane m-xylènediamine MH2~ CH2- ch2-hh2 cho-kh. p-xylènediamine UH2-CH2 —^qv- N-eyclohexyl-1,3-diamino- y—y 15 propane 2 v 2'3 V-/ N-(2-phényléthyl ) -1,3-diaminopropane H-(2-p-tolyléthyl)-1,3-diaminopr opane mh2-(ch2)3-ïïh-(gh2 ) 2 nh2-(ch2)3-nh-(gh2)2 - 20 N-benzyl-N1 - ( 3-aminopropyl ) - jm- ( CH2 ) _-ÏÏH- ( GH2 ) 3-HH-GH2 -yq) 1,3-diaminopropane ^—' N- ( 1 -phényle thyl )-H1 - ( 3- ^ ( 0H ) «g.. ( 0H^ ) „_MH-CH- aminopropyl)-1,3-diaminopropane ; CH 3 ff-(2-furfUryl)-1,3- mp-(CHp),-BB-CHp_iO 25 diaminopropane N- ( 5-méthyl-2-furfuryl ) - m ^ gh^ ) -uh-ch2-ol oh, 1,3-diaminopropane ]JfN-diméthyl-1,3 diamino- CH^-HH- ( GH0 } ,-HH-GHx propane 3 2/3 3 30 4-pipér idylmé thylam i n e KH2-CH2 —^ 70 04581 8 2034552 2-(4-imidazolyl}-éthylamine (histamine) îï ,N-dimé thyl-N ' -acétyl-1, 3-diaminopropane 5 N,E-diméthyl-N1 -propionyl-1,3-diaminopropane 1-carboxy-4-diméthylamino-butylamine 1-carbamoyl-4-diméthylamino-10 "b ut yl aminé H fN-diméthyl-H ' -benzoyl- /Ô>-00JJH-(0H? ) 1,3-diaminopropane 3 Quand on ajoute par exemple du bromure de 3-aminopropyl-diméthylsulfonium ou du chlorure de 3-amino-3-carboxypropyl-diiné-15 thylsulfonium comme composé amino à un milieu nutritif, et qu'on cultive dans ce milieu une souche produisant de la bléomycine telle que Streptomyces verticillus, la productivité de bléomycine A2 est améliorée jusqu'à augmenter la teneur ($) de bléomycine A2 parmi toutes les bléomycines présentes dans la liqueur de culture. 20 De même, l'addition de chlorhydrate d'àgmatine augmente la teneur (fo) en bléomycine B2, l'addition de 1,4-diaminobutane augmente la teneur (%) de bléomycyne A'2 et l'addition de spermidine augmente la teneur en bléomycine A^. Cependant, l'addition de sperminè n'entraîne pas seulement la production de bléomycine Ag à chaîne laté-25 raie correspondante, mais également la production de bléomycine A^ ayant dans la chaîne latérale de la spermidine qui a été formée à partir de la spermine pendant la culture. Dans le cas d'une souche ayant une forte aptitude à transformer la spermine en spermidine, l'addition de spermine provoque, principalement, la production 30 de bléomycine De même, l'addition de, par exemple, du 1,2- diaminoéthane ou du 1,3-diaminopropane provoque la .production d'une nouvelle 2-aminoéthylamino-bléomycine ou 3-aminopropylâmino-bléo-mycine. En outre, un composé à chaîne polyamino tel que la F.N-bis (3-aminopropyl)-méthylamine donne principalement une bléomycine 35 nouvelle telle que la 3-(U-méthyl-N-3-aminopropylamino)-propylami-no bléomycine ayant la même chaîne latérale que celle du composé NH2-(0H2)2-^j' CH-, ch^co-hh- ( ch2 ) c2h5-co-kh-(ch2) .CH, iîh2-ch-(ch2) -n c00h 5 ch, SH2-0H-(0H2)rlf conh2 70 04581 9 2034552 ajouté et, en plus, donne une aminé de bas poids moléculaire, formée par transformation du produit ajouté au cours de la culture en une 3-N-méthylaminopropylam±no-bléomycine sous-produite. On sait bien que des microrganismes sont capables d'effectuer 5 des désestérifications, des désalcoylations et des décarboxylations et des composés amino qui se transforment a,u cours de la culture en aminés de chaînes latérales de bléomycines sont mis en jeu suivant l'invention, de même que les composés amino représentés par les formules précitées (1) à (5). C'est ainsi, par exemple, que 10 des composés dans lesquels NH2- dans les formules précitées (1) à (5) a été acylé ou alcoylé, ou dans lesquels l'hydrogène du groupe méthylène en position 2- du NIL," a été remplacé par un groupe car-boxylique ou un- groupe amide et qui sont facilement métabolisés en aminés, peuvent être utilisés comme les composés amino représentés 15 par les formules (1) à (5) précitées. En général, les composés amino à ajouter sont utilisés soit tels quels, soit sous la forme de sels d'acides inorganiques, mais leur concentration dans la liqueur de culture varie suivant leur nature. C'est ainsi, par exemple, que dans le cas du bromure de 20 3-aïïiinopropyl-diméthylsulfonlum, de la spermine et de la spermidine, une concentration d'au moins 0,2 à 9,4 mg/ml est nécessaire, tandis que dans le cas du chlorure de 3-amino-3-carboxypropyl-diméthyl-sulfonium, il faut une concentration aussi élevée qu'au moins 40 mg/ml. En outre, dans le cas de la N-f3-aminopropyl)-morpholine 25 et du N-i/^-morpholino-propy3j7-1,3-diam in opropane, il suffit d'une concentration de 0,1 à 0,5 mg/ml environ, tandis que dans le cas de la N-(2-aminoéthyl)-pipérazine et du N(-3-méthoxypropyl)1,3-diaminopropane, une concentration d'environ 2 mg/ml est nécessaire. En général, cependant, une concentration de 4 mg/ml convient. 30 On effectue le procédé suivant l'invention de la manière sui vante î Il est préférable d'utiliser un milieu composé principalement de carbohydrates et de substances organiques contenant de l'azote, telles que de la gelée de millet, du glucose, de l'amidon, de la 35 poudre de graine de soja, une liqueur de macération de maïs, etc. et qui a été additionné de petites quantités de substances inorganiques, telles que par exemple du phosphate de potassium, du sulfate de cuivre, du sulfate de zinc, du chlorure de sodium, des nitrates, etc. Dans ce milieu, on cultive par voie aérobie 40 Streptomyces verticillus ou une souche produisant de la bléomycine 70 04581 10 2034552 parmi les diverses variantes de celle-ci selon les processus ordinaires» Ensuite, on filtre la liqueur de culture, et on adsorbe le filtrat sur, par exemple, une résine échangeuse de cations ayant un groupe réactif tel qu'un groupe carboxyle5 puis on élue avec une 5 solution aqueuse d'acide chlorhydrique. Ensuite, on soumet l'éluat successivement au stade d'adsorbtion sur du charbon actif, d'élu-tion par une solution aqueuse acétone-acide chlorhydrique, d'adsorbtion sur alumine, d'élution au méthanol, d'adsorbtion sur Sephadex (marque d'une poudre sèche insoluble composée de perles microscopi-10 ques qui sont des composés organiques synthétiques dérivés du dextrane polysaccharide; fabriqué par Pharmacia Fine Chemicals Inc.) et d'élution à l'eau distillée, ce qui fournit une poudre de chlorhydrate de bléomycine. Pour purifier davantage la poudre ainsi obtenue, il est préférable d'adopter une élution chromatogra-15 phique par une solution de chlorure d'ammonium ou dé formiate d'ammonium aqueuse, en utilisant du CM Sephadex comme support. Finalement, on adsorbe l'éluat sur du carbone actif, et on soumet au stade de lavage à l'eau et d'élution avec une solution aqueuse acétone-acide chlorhydrique, ce qui permet d'obtenir une bléomyci-20 ne pure. Si, grâce à l'invention, on peut obtenir dans le milieu de culture une bléomycine d'une manière suffisamment sélective, on peut omettre le stade de séparation à l'aide de Sephadex CM. Les bléomycines ont la propriété de former des chélates avec 25 du cuivre., et sont obtenues sous forme d'une poudre bleue à partir de la liqueur de culture, mais on peut enlever le cuivre en effectuant un traitement convenable à tous les stades d'extraction ou de purification. Plusieurs propriétés des bléomycines obtenues suivant l'inven-30 tion sont rapportées au Tableau "1. Tableau 1 N° Nom et propriété physique de l'additif (1) Teneur en nouveau composé (principal) dans 11 ensemble des bléomycines obtenues par extraction (fo) — : 1 Nom et structure de la chaîne latérale de la nouvelle bléomycine (principale) 1 bromhydrate de bromure de 3-aminopro pyl-diméthylsuifonium p.f. 87 - 88° C 72 bléomycine A2 2 chlorure de 3-aniino-3-carboxypropyl-diméthylsulfonium p.f. 139 - 140° G (décomp.) 87 bléomycine A2 3 sulfate d'agmatine p.f. 231° 0 76 bléomycine B2 4 1,2-diaminoéthane éb. 116 - 1T7° 0 80 2-aminoéthyl-bléomycine nh2(ch2)3nh- ' 5 1,3-diaminopropane éb. 135 - 136° C 85 3-aminopropyl-bléomycine nh2(gh2)5nh- 6 1,4-diaminobutane éb. 158 - 160° C 85 bléomycine A'g 7 spermid ine éb. 115°0/ 3 mm Hg _>» 90 bléomycine A^ 8 spermine éb. 150 - 160°C / 3 mm Hg 91 bléomycine A^ ■ , — , , . , , . * i i 1 - Propriétés du chlorhydrate des nouvelles bléomycines (principales) 11° Analyse élémentaire ($) (2) Pouvoir (mcg/mg) Chromatographie (Hf) (3) Réaction (4) Aspect Maximum d'absorption dans 0 H N S couche mince sur papier N S 1'ultravioiet (w ) 1 44,13 6,14 15,51 6,43 941 0,39 0,85 - joudre bleue 293 243 2 44,13 6,14 15,51 6,43 941 0,39 0,85 - - il 293 243 3 , 43,92 6,31 17,41 3,34 3094 0,72 0,66 - + M 293 244 4 43,12 6,15 1 6,60 4,21 1700 0,62 0,80 + , - il 293 244 5 43,15 6,20 16,51 4,18.' 4934 0,60 0,81 + - it 293 244 6 43,93 6,02 16,78 4,25 1232 0,66 0,81 + - n 293 244 . 7 43,81 6,34 16,39' 4,05 2700, 0,16 0,88 + - If 293 .244 8 43,81 6,34 16,39 4,05 2700 0,16 0,88 + - II 293 244 9 N,N-diméthyl-1,2-diaminoéthane éb. 105 - 108° 0 91 3-N ,N-diméthylain,inoéthylamino-bléomycine Qg j 10 N,N-diéthyl-1,2-diaroin oéthane éb. 147 - 151°e 84 3-N,N-diéthylaminoéthylamino-bléomycine °2H5x 02H5'N(°H2)2HH- ¥ 1 11 N,N-diéthyl-1,3-diaminopropane éb. 166 - 172° 0 r 95 3-N,N-dié thylaminopropylamino-bléomycine ophp- * ^N(0H5),NH-C2H5- 3 12 N-butyl-N ' - ( 3-aminopropyl )-1,3-diaminopropane .éb. 125 - 126°C/3 mm Hg 96 3-/~ 3- (N-butyl ) -aminopropyl/^amino-propylamino-bléomycine C4HgNH(0H2)5NH(0H2)^NH- f" ' ' 13 N-(2-hydroxypropyl)-1,2-diaminoéthane éb. 123 - 126° C/12 mm Hg 95 2-(2(hydroxypropyl)-aminoéthylamino-bléomycine ch3chch2nh ( oh2 ) 2nh- oh Ni O in oo N> O en en K> 9 43,20 6,25 16,48 4,13 897 0,46 0,86 - - poudre bleue 294 244 10 45,01 6,35 16,14 3,91 1102 0,48 0,89 - - n 294 244 11 43,91 6,30 15,96 4,00 1036 0,40 0,87 - - n 294 244 12 43,00 6,62 16,40 3,78 5840 0,23 0,84 - si 294 ' 244 13 43,50 6,45 16,38 4,35 1020 0,65 0,84 - - H 294 244 o o in oo K> O oo Ln Ln K> 14 N- (.3-aminopropyl ) -pipérazine éb. 80 - 81 80 3-pipérazinopropylamino-bléomyc ine N/~XN-(GH0),NH- c. J 15 N-(1-phényléthyl)-N'-(3-aminopropyl)-1,3-diaminopropane éb. 150 - 153°C/ mm Hg 72 3-/5-(N-1-phényléthyl)-aminopropyl/-aminopropylamino-blé omycine (3>-ÇH-MH( 0H2 ) rNH( CH2 ) 3nh-GH3 16 1,2-diaminopropane éb. 118 - 119° 0 90 2-aminopropylamino-bléomycine ch3-ch-gh2-kh-hh2 17 N-méthyl-1,3-diaminopropane éb. 138-142° 0 81 3-N-méthylaminopropylamino-bléomycine ch3-nh-(gh2)3-nh- 18 N-butyl-1s3-diaminopropane éb. 114-11600/20 mm Hg 85 .3-N-butylaminopropylamino-bléomycine GH3-( CH2 ) 3-HH-( GH2 ) 3-inî- 19 N,N-diméthyl-1,3-diaminopropane éb..132 - 135>5°C 95 3-(N,N-diméthyl)-aminopropylamino-blé omy cine 3\ . N-(CHj,-BIH-gh^ * j 20 chlorure de 3-aminopropyl-triméthylammonium p.f. 200 - 201° 0 95 3-(N,N,N-triméthyl)-aminopropylamino-bléomycine ch,v@ OH^— N- ( GHp ) -z-NH-gh^| ^ 5 14 44,91 6,21 16,50 3,91 726 0,30 0,84 I | poudre bleue 294 244 15 | 45,51 6,42 16,45 3,20 2500 0,46 0,75 - - n : ,294 244 16 43,80 6,04 1 6,60 4,31 2173 0,66 0,81 + - If 294 244 17 1-3,97 6,24 16,42 4,18 860 , 0,51 0,83 - - » 294 244 18 43,30 6,31 16,20 4,32 1700 0,70 0,83 - - tl i 294 244 19 44,16 6,35 16,30 4,09 869 0,28 0,83 - 1! ■, 294 ,■ 244 20 44,71 6,41 16,21 4,00 633 0,38 0,89 - - H 294 244 * 21 N-/3-(N,N-d iméthyl)-aminopropyl_7-1,3-diaminopropane éb. 125W23 mm Hg 85 3-/^- ( N, N-dimé thyl ) -aminopropyl/"" aminopropylamino-bléomyc ine CH5 ^ N-(CH5) ,-BH- ( CH ) ,-NH-CH3 ^ 5 2 f 22 N#N-bis(3(aminopropyl)méthylamine ' éb. 97 - 100°C/2 mm Hg 72 3-(U-méthyl-N-âminopropyl)-aminopropylamino-blé omycine * HH2-(CH2)3-N-(CH2)5-NH- CH_ 3 23 N-(3-amino-1-méthylpropyl)-1,3-diaminopropane éb. 123-125° 0/21 mm Hg 70 3-(1-méthyl-3-aminopropyl)aminc-propylamino-bléomycine NH2- ( CH2 ) 2-ÇH-ÏÏH- ( CHg ) yEE- CH~ 3 24 ÏT-3-aminopropyl-pyrrolidine éb. 185 - 189° 0 95 3- ( pyrrolidino ) -propylamino-tflé omjrcine □MCH2)3-HH- 25 N-3-aminopropylpipéridine éb. 100° 0/20 mm Hg 98 3-(pipéridino)-propylamino-bléomyoine Qf-(0H2)5-NH- 26 N-3-aminopropylmorpholine éb. 219°C/733 mm Hg 100 3-(morpholino)-propylamino-bléomycine oQW-(CH2)3-MH- 21 43,80 6,35 16,91 4,05 1200 0,14 0,83 - - poudre bleue 294 244 22 43,20 6,20 17,00 4,09 1671 0,23 0,33 + - II 294 244 23 43,42 6,25 16,80 4,11 1820 0,32 0,84 + H 294 244 24 44,90 6,22 16,20 4,12 10 66 0,36 0,88 - II 294 244 25 44,71 6,38 16,17 4,21 1257 0,14 0,86 - - II 294 244 26 44,36 6,25 16,15 4,03 592 0,65 0,83 — - It 294 244 27 N-2-aminoéthylpipérazine éb. 280 - 281° C 87 2-(pipérazino)-éthylamino-bléomycine N^N-(CH2)2-Jffi- 28 ïïflï-bis-3-aminopropylpipérazine éb. 188-202°0/21 mm Hg 95 3-/T- 4-(3-aminopropyl) -pipérazino -propylamino-bleomycine NH2- ( CH2 ) ( OH2 ) 5-MH- 29 N-/3-pyrrolidino ) -propyl/-1,3-diaminopropane éb. 159-162°0/22 mm Hg 76 3-/3-(pyrrolid ino)-propyl/-aminopr opylamino-blé omycine QN-( OH2 ) 5-ÏÏH-( CH2 ) 3-ra- 30 N-/3-(pipéridino)-propyl/-1,3-diaminopropane éb. 164-167°0/21 mm Hg 89 1 3-/3- ( pipéridino) -propyl/"-amino-propylamino-bléomycine Çy~ (CH2 ) 3-UH- (GH2) 5-NH- 31 N-i/.3-(morpholino)-propyl7'-1,3- • ■■ diaminopropane 176-180°C/20 mm Hg 79 3-/3-(morpholino)-propylj-amino-propylamino-bléomycine O^N- ( GH2 ) 3-MH- ( CH2 ) j-HH- 32 N-(3~hydroxypropyl)-1.3-diaminopropane (chlorhydrate) p.f.119 - 120° C 85 3-(3-hydroxypropyl)-aminopropylamino-bléomycine HO-(OH2)3-ra-(CH2)3-NH- o o -Ch. U1 00 V£> K> O U> 45* en en K> 27 44,38 6,30 16,78 3,95 799 0,36 0,85 - _ poudre bleue 294 244 28 44,01 44,20 i 6,14 17,52 3,90 1130 0,25 0,86 + - t! 294 244 29 6,41 16,80 3,98 2564 0,1 0,88 i!3 294 244 30 44,30 6,51 i i 16,62 4 f 00 3580 . 0,14 0,88 (□ ( H 294 244 31 44,52 6,30 16,20 3,89 1201 0,38 0,87 ' , ■ » ' 294 244 32 437 6 6,40 1 01 j ,;3 | t i ' 9 • ' 0, '5 | i , I ! 33 chlorhydrate de N-(3-mé th. oxypropyl)-1,3-diaminopropane p0f. 225°C 88 3-(3-méthoxypropyl)-aminopropylamino-bléomycine GH3O-( CH2 ) 5-NH- ( CH2 ) 5-ÏIH- 34 N-benzyl-1,3-diaminopropane éb. 150 - 155° C/25 mm Hg 70 3-benzyIaminopropylamino-bléomycine ^5y-ch2-îjh- ( ch2 ) 3-nh- 35 N-( 1-phényléthyl)-1,3-diaminopropane éb. 148-150°. G/24 mm Hg 89 3-(1-phényléthyl)-aminopropylamino-blé omycine 36 . m-xylènediamine éb. 138 - 139°C/9 mm Hg 56 m-aminomé thylbenzy lamino-blé oiny c ine _ ch2-nh-nh2-oh2- 37 p-xylènediamine p.f. 35° C % 68 p-aminomé thylb enzylamino-blé omyc ine nh2-ch2-^o)—ch2-mïï- 38 N-cyclohexyl-1,3-diaminopropane éb. 124 - 125° C/21 mm Hg 89 3-cyclohexylaminopropylamino-bléomycine \ep>—nh- ( ch2 ) 3-nh- o Ln» 00 K> o u> -U en m 33 43,91 6,35 16,21 4,10 1335 0,54 0,87 - - poudré bleue 294 244 34 45,40 6,41 15,30 4,00 1986 0,53 0,70 - - II 294 244 35 45,39 6,42 15,13 4,13 2400 0,62 0,85 - - Vt 294 244 36 44,89 6,28 15,98 4,19 2546 0,61 0,66 + - ' II 294 244 37 44,80 6,30 15,70, 4,18 2350 0,58 0,64 + - II 294 244 38 44,91 6,60 15,27 4,03 5355 0,57 0,79 - - H 294 244 39 N-(3-cyclohexylaminopropyl)-1,3-diaminopropane éb. 180°G/21 mm Hg 90 • 3-(3-cyclohexylaminopropyl)-aminopr opy laiain o-b lé omy c in e (T) -IH(GH2)5-m-(CH2)3-NH- 40 îf-(2-furfuryl)-1,3-diaminopropane éb. 105-109° 0/3 mm Hg 42 3-/S'- ( 2 ( f urf uryXj7~^^°ProPylamik°-" bléomycine [Tjlj3H2-M- (CH.,) 3-NH- 41 4-pipéridylméthylamine éb. 78°0/5 mm Hg 73 4-pipéridylmé thylamino-blé omyc ine ■■N (^)-CH2-NH- 42 chlorhydrate de 2-( 4-iaiidazolyl )-éthylajnine 93 2- ( 4-imj.dazolyl ) -éthylamino-blé omy cine NH , .f |f n—^ch2)2-mh- o o 39 44,02 6,63 16,48 4,02 11215 0,24 0,80 - - poudre bleue 294 244 40 46,39 6,37 16,48 4,35 1450 0,67 0,83 - - t! 294 244 41 44,60 6,43 16,20 4,25 1394 0,41 0,72 - - I! 294 244 42 43,85 6,25 16,80 4,28 847 0,40 0,70 - - ft 294 244 K> O LU -&» (-n Cn 70 04581 .25 2034552 Aux dessins annexés, sont donnés les spectres d'absorption infrarouge et ultraviolet de plusieurs composés du Tableau 1, comme indiqué ci-dessous : Figure Spectre Nom du composé Composé 5 1 infrarouge 3-/5-(N~butyl)=aminoprQpyl7 12 aminopropylamino bléomycine 2 ultraviolet M " " 3 infrarouge 3-(1-méthyl-3-aminopropyl)- 23 aminopropylamino bléomycine 10 4 ultraviolet " 11 w 5 infrarouge 3-(3-cyolohexylarainopropyl)- 39 aminopropylamino bléomycine 6 ultraviolet n m n ' Notes : 15 (1) La teneur en bléomycine nouvelle (ou principale) est me surée en séparant par utilisation de Sephadex CM les bléomycines (mélange de bléomycines individuelles) obtenues par culture et purification dans chacun des exemples précités, et en soumettant ensuite à une speetrophotométrie d'absorption dans l'ultraviolet. 20 (2) le pouvoir est mesuré suivant un essai biologique utili sant un chlorhydrate de bléomycine exempt de cuivre (pouvoir 940 mcg/mg) comme substance témoin et M. tuberculosis 607 comme mi-erorganisme d'essai. (3) Chromâtographie en couche mince : agent d'absorption : 25 gel de silice, solvant = mélange 10:9:1 de méthanol à 10 % - acétate d'ammonium à 10 % et solution d'ammoniaque. Chromatographie sur papier:1e solvant est une solution de chlorure d'ammonium aqueuse à 10 (4) N = réaction à la nihydrine., S = réaction de Sakaguchi. 30 II est clair du Tableau 1 que les nouvelles bléomycines obtenues suivant l'invention sont semblables aux bléomycines connues par leur aspect et leur courbe d'absorption dans l'ultraviolet, mais en diffèrent par leur pouvoir (mcg/mg) et leurs valeurs de Rf. En outre, ce qui mérite une attention spéciale, est que^ quand ces sub-35 stances nouvelles sont hydrolysées par un acide fort et les hydro-lysats soumis à une chromatographie gazeuse, les composés amino utilisés comme additifs pour la culture, ou les composés amino formés pendant la culture, sont décelés et il s'est confirméque' ees;subs-tances opt des chaînes latérales' correspondant à ces composés aaino. 40 Suivant l'invention, il est devenu d'abord possible de recueil^ 70 04581 26 2034552 lir sélectivement avec de hauts rendements et sous forme pure, les bléomycines qui, parmi les autres, ont des propriétés thérapeutiques particulières. C'est ainsi que les bléomycines ^5 qui ont des propriétés anti-tumorales élevées et une toxicité, faible, 5 peuvent être obtenues sélectivement. En outre, il est maintenant possible d'obtenir une nouvelle bléomycine telle que la 3-amino-propylamino-bléomycine, qui a un effet excellent et une faible toxicité. Les exemples suivants illustrent l'invention. 10 Exemple 1 1 un milieu formé d'une composition de 6,4 i» de gelée de millet, de 0,5 # de glucose, de 3,5 % de poudre de graine de soja, de 0,75 de liqueur de macération de mais, de 0,3 $ de chlorure de sodium, de 0,1 io de phosphate de potassium secondaire, de 0,05 f° 15 de sulfate de zinc, de 0,01 % de sulfate de cuivre, de 0,2 % de nitrate de sodium et de 0,01 $ de ïoho N° 1 (marque pour un agent tensio-actif), on ajoute un bromhydrate de bromure de 3-aminopropyl-diméthylsuifonium à raison de 0,4 mg/ml pour ajuster le pH du milieu à 6,5. On charge séparément des portions de 100 ml du milieu 20 ainsi traité dans un flacon Sakaguchi et on stérilise. Ensuite, on inocule Streptomyces verticillus (ATCC N° 15003) dans le milieu, et on cultive à 27° C pendant 8 jours, sous agitation, à 100 tours/minute. Ensuite, on recueille les liqueurs de culture (4»5 l) et filtre pour obtenir 3»0 litres d'un filtrat (pouvoir 38,8 mg/ml, pouvoir 25 total 416,4 mg). On fait adsorber et passer ce filtrat de culture sur une colonne garnie de 200 ml d'Amberlite IRC-50 (résine échan-geuse d'ions de type H), on lave à l'eau et on élue avec de l'acide chlorhydrique 0,5 N. On neutralise 1,0 litre de l'éluat, on passe et adsorbe sur une colonne remplie de 100 ml de charbon actif, 30 on lave à l'eau et on élue en utilisant un mélange 1 s 1 (en volume) d'acétone et d'une solution d'acide chlorhydrique aqueuse 0,02 N, et on recueille les fractions actives sur Mycobacterium 607, puis on concentre à siccité. On dissout le résidu obtenu dans 5 ml d'une solution méthanolique . aqueuse à 80 % et on charge dans une colonne 35 remplie de 30 ml d'alumine neutre, puis on élue avee une solution méthanolique aqueuse à 80 %■. Ensuite, on recueille et concentre à siccité les fractions contenant de la bléomycine, pour obtenir 195 mg d'un chlorhydrate de bléomycine (pouvoir 650,7 mcg/mg, pouvoir total 172 mg). Le rendement à partir du filtrat de culture est de 40 30,5 Jt 27 2 0 34552 70 04581 zu On sépare le produit ainsi obtenu en ses bléomycines avec une solution aqueuse de formiate d'ammonium sur une colonne Sephadex CM pour trouver qu'il contient 72,2# de bléomycine Ag. Dans les exemples suivants le processus de séparation est dénommé procédé Sephadex CM. On effectue de la même manière que ci-dessus des essais en utilisant comme additifs les composés amino donnés au Tableau 2. Les conditions expérimentales et les résultats obtenus sont rapportés au Tableau 2. Tableau 2 Nom de 1'additif Concentration (mg/ml) Durée de la culture (h) Quantité de filtrat (litres] Pouvoir (mcg/ml) Pouvoir total (mg) Nom de la nouvelle bléomycine séparée sur Sephadex CM Poids (mg) Pouvoir facg/mg) Pouvoir' total (mg) Rendement à partir du filtrat de culture (*) bromhydrate du bromure de 3-aminopropyl-di-méthylsulf onium 0,4 192 3,0 138,8 416,4 bléomycine (teneur en A9 72,2 1o 195 650,7 127,0 30,5 chlorure de 3-amino-diméthylsulf onium 40,0 192 1,65 100,0 165,0 bléomycine (teneur en A9 87,2 fo) 140 300,0 42,0. 25,5 chlorhydrate d'agmatine 2,0 240 2,0 200,0 400,0 bléomycine (teneur en B0 76,2 %) d 164 800,0 131,2 ■ 32,8 spermine 0,2 264 1,1 150,0 165,0 bléomycine (teneur en Ac 90,8 fc) 3 62 1200 74,4 45,1 K) O UJ £* en en 70 04581 29 2034552 Exemple 2 A un milieu ayant une composition de 6,4 de gelée de millet, 0,5 de glucose, 3,5 % de poudre de graine de soja, de 0,75 i° de liqueur de macération de maïs, de 033 i° de chlorure de sodium, de 5 0,1 i<> de phosphate secondaire de .potassium;, de 0,05 i° de sulfate de zinc, de 0,01 fa de sulfate de cuivre, de 0,2 fo de nitrate de sodium et de 0,01 fo de Toho N° 1, on ajoute du 1,2-diaiainopropane à raison de 2 mg/ml pour régler le pH à 6,5. On charge séparément chaque portion de 100 ml du milieu ainsi traité dans un flacon 10 Sakaguchi et on stérilise. Ensuite, on,inocule Streptomyces verticillus ■(ATGC N° 15003) dans le milieu, et on cultive à 27° C pendant 192 heures, tout en agitant à 130 tours/minute. On recueille ensuite les liqueurs de culture (4,5 1) et filtre pour obtenir 3,56 1 d'un filtrat (pouvoir 190 mcg/ml', pouvoir total 15 676,4 mg). On fait passer et adsorbe oe filtrat de culture sur une colonne remplie de 200 ml d'Amberlite IRC-50 (résine synthétique de forme H), on lave à l'eau et on élue ensuite en utilisant un mélange 1 s 1 en volume d'une solution d'acétone et d'acide chlorhydrique aqueux 0,02 N, on recueille les fractions actives sur 20 Mycobacterium 607 et concentre à siccité. On dissout le résidu obtenu dans 4 ml d'une solution aqueuse de méthanol à 80 fo et on charge dans une colonne remplie de 70 ml d'alumine neutre, puis on élue avec une solution aqueuse méthanolique à 80 fo, Ensuite, on recueille les fractions contenant de la bléomycine et concentre à 25 siccité, puis dissout le résidu dans 2 ml d'eau et charge dans une colonne remplie de 20 ml de Sephadex G—25, et enfin élue en utilisant de l'eau distillée. On recueille là fraction vert bleuâtre obtenue et contenant de la bléomycine, on la met en suspension dans une solution aqueu-50 se de chlorure d'ammonium 0,02 N, -verse -■ dans une colonne remplie de 20 ml de Sephadex CM et on élue avec une solution aqueuse de chlorure d'ammonium 0,1 M. On reprend la fraction obtenue contenant la substance désirée et on la fait passer sur une colonne remplie de 5 ml de charbon 35 actif pour adsorber la substance désirée, puis on élue avec un mélange acétone-solution d'acide chlorhydrique aqueuse 0,02 ÎT. On concentre ensuite l'éluat à siccité pour obtenir 35 mg de 2-amino-propyl-amino-bléomycine (pouvoir 2,173 mcg/mg, pouvoir total 76,1mg) Le rendement à partir du filtrat de culture est de 11,25 40 On dissout 25 g de la substance ainsi obtenue dans 1 ml de 70 04581 50 2034552 méthanol, et on introduit du gaz sulfhydrique dans la solution pendant 10 minutes. On filtre ensuite eell-3-ci et concentre'le filtrat à siccité pour obtenir 20 mg de chlorhydrate de 2-aminopropyl-amino-bléomycine exempt de cuivre (pouvoir 2000 mcg/mg, pouvoir to~ 5 tal 40 mg), On hydrolyse ce produit exempt de cuivre par une solution d'acide chlorhydrique aqueuse 6 N, puis on soumet à une électrophorèse sur papier à pH 1,9 et sous une tension de:5O00volts ce qui permet de déceler le 1,2-diaminopropane. De^la même manière que ci-dessus, on effectue des expériences 10 en utilisant les composés amino mentionnés au Tableau 3« Les conditions opératoires et les résultats de ces essais sont indiqués au Tableau 3. Tableau 3 O S •H a m m PI Nom de l'ad-, ditif Concentration de l'additif (pig/ml) Temps de cul •ture (h.) (en se couant Quantité de filtrat (1.) ) Pouvoir (mcg/ml) Pouvoir total (mg) Nom de la nouvelle bléomycine séparée sur Sephadex CM Poids (mg) Pouvoir (meg/ mg) Pouvoir total (mg) Rendement à partir du filtrat de culture ($) 1 1,2-diamino-éthane 4,0 192 3,0 150,0 450,0 2-aminoéthylamino bléomycine 28,7 1700 488 10,8 2 N,N-diméthyl-1,2-diaminoéthane 3,0 240 2,98 154,0 458,9 3-N,N-diméthyl- aminoéthylamino- bléomycine 140 897 125,6 27,4 3 N,N-diéthyl-1,2-diaminoéthane 2,0 240 2,98 154,0 458,9 3TN,N-diéthyl- aminoéthylamino- bléomycine 140 1102 154,3 33,6 4 N,N-diéthyl-1,3-diaminopropane 2,0 240 2,84 181,3 514,9 3-N,N-diéthyl- aminopropylamino- bléomycine 230 1036 238,3 46,3 5 N-butyl-N ' - ( 3-aminopropyl)-1,3-diaminopropane • 2,0 240 3,12 113,4 353,8 3-J3~ ( N-buty1 ) - aminopropyl/-aminopropylamino-bléomycine 150 5840 876,0 24,8 6 -r N-(2-hydroxy- propylJ-1,2- diaminoéthane 0,6 —"-rt—rf-—- 240 3,00 140,0 420,0 2-(2-hydroxypropyl ) -amino-éthylamino-bléomycine 88 1020 898,0 21,4 n-^-aminopropyl) pipérazine u, o dW ^wU j U jj-pipéridinopro-pylamino-bléotry-wine 105 " fz*©— Y1!, o eO j '*1 O o •C* en oo K> O U> -fc* en Ln K> 8 N-(1-phényléthy] N'-(aminopropyl)-! ,3-diaminopropane 3,0 240 3,05 1020 3111 3-/5—(N—1-phényl- éthyl)-aminopropyl/-amino-propylamino-bléomycine 240 2500 600,0 19,3 9 N-( 2-furfuryO)-1,3-diaminopropane 3,0 240 3*00 380,0 1140 3-/ÏÏ-(2-furfuryiy aminopropylamino-bléomycine 86 1450 124,7 10,9 10 4-pipéridyl-méthylamine 2,0 240 3,08 170,9 526,4 4-pipéridylméthyl-amino-bléomycine 130 1394 181 ,2 34,4 1 1 chlorhydrate de 2-(4-imida-zolyl ) -éth-y lamine 1,0 240 2,88 189,6 493,0 2-(4-imidazolyl)- éthylamino- bléomycine 74 847 62,7 12,7 12 N-méthyl-1,3-diaminopropa-ne 1,5 264 3,10 129,8 402,4 3-N-méthylamino- propylamino- bléomycine 119,0 860 102,3 25,4 13 N-butyl-1,3- diaminopropa- ne 4,0 264 3,40 525,0 1785,0 3-K-butylamino- propylamino- bléomycine 214,7 1700 365,0 20,4 14 N,N-diméthyl- .. 1,3-diaminopropane 2,0 240 3,04 154,8 470,6 3-(N,N-diméthyl)-aminopropylamino-bléomycine 127,0 869 110,4 .23,5 5 ôhlorure de 3-aminopropyl-tri-mé thylamm onium 1,0 288 3,20 118,0 377,6 3- (N ,N, N-tr iméthyl) arnin opr opylamin o-bléomycine 124,0 633 78,5 20,8 6 KT-/3-(N,N-dimé-thyl)-aminopro-pyl7-1,3-diaminopropane 1,0 264 3,34 253,9 848,0 3-Z3-(N,N-diméthyl^ aminopropyl/-aminopr opylamino-blé o-mycine 162,5 1280 195 23,0 ' 7 18 N,N-bis-(3-amino propyl)-méthyla-mine 0,5 264 3,54 133,7 473,3 3-(N-méthyl-N-3-aminopropyl)-aminopropylamino bléomycine 3-N-méthylpropyl-amino-bléomycine 32,0 24,0 1671 860 53.5 20.6 11,4 4,4 N-(3-amino-1-méthylpropyl)-1,3-diaminopropane 1,0 264 3,20 331,0 1059,2 3-(1-méthyl-3-aminopropyl)-aminopropylamino-bléomycine 112,6 1820 205 19,4 1S N-3-aminopropyl-pyrrolidine 1,0 288 3,30 281 ,0 927,3 3-(pyrrolidino)- propylamino- bleomycine 355,0 1066 378,4 40,8 20 N-3-aminopropy1-pipéridine 1,0 288 3,00 317,0 931,0 3-(pipéridino)- propylamino- bléomycine 320,0 1257 402,2 42,3 21 N-3-aminopropyl-morpholine 0,1 240 2,94 145,8 428,7 3-(morpholino)- propylamino- bleomycine 175,0 5922 103,6 24,2 O O -fc* Ln OO NO O LU J* en en K> 22 N-2-aminoéthyl-pipérazine 2,0 288 3,12 111,0 I 346,0 2-(pipérazino)-éthyl-amino-bléomycine 75,0 799 59,9 17,3 23 N,N-Ms-3-amirL0-propylpipérazine 0,5 240 3,69 225,0 860,3 3-/T- 4-(3-aminopropyl) -pipérazi-no/-aminopropyl-amino-bléomycine 210,6 1180 248,5 29,9 24 N-/3-(pyrrolidi- noT-propyI/-1,3- diaminopropane 1,0 264 3,08 465,6 1434,0 3-/5- (pyrrolidino)-pr opyjy-am j. n opr o-pyl-amino-bléomy-cine 105,0 2564 269,2 18,8 25 26 N-/3-(pipériài-noppropyl/-1,3-diaminopropane 0,5 264 3,10 543,5 1684,9 3-/5-(pipéridino)-propyl/-amino-propylamino-bléo-mycine 140,0 3580 501,2 29,7 N-/3-(morpholi- , no)-propyl7-1,3-diaminopropane 0,5 264 2,94 139,0 408,7 3-/5- (morpholino)-propyl/-amino-propylamino-bléomycine 70,0 1201 84,1 20,6 27 N-( 3-hydroxypro-pyl)-1,3-diaminopropane (chlorhydrate) 0,7 264 3,02 i i ! 227,4 186,7 3-(3-hydroxypropyl )-aminopropylamino-blé omycine 166,1 1300 215,9 31,4 28 . N-(3-méthoxypro-pyl)-1,3-diaminopropane (chlorhydrate) 1,35 288 | 3,10 282,5 j | i i ! . I 875,8 3-(3-méthoxypropyl)-33 6,0 aminopropylamino-bléomycine l 1335 ' 448,6 " 51,2 L„. _1 *-4 O O tn 00 K) O U> -t» en en NJ 29 N-benzyl-1 ,3-diaminopropane 0,5 264 3,00 334,0 1182,0 3-benzylamino-propylamino-bléomycine 40,0 1986 79,4 7,9 30 N-(1-phényléthyl)-1,3-diaminopropane ■0,5 288 3,39 606,0 2054,3 3- ( 1-phényléthyl)- aminopropylamino- bléomycine . 96,3 2400 231 11 ,2 31 m-xy1ènediamine 2,0 288 2,77 292,4 809,9 m-aminométhyl-benzylamino-bléomycine 10,8 2546 27,5 3,4 32 p-xylènediamine 2,0 264 3,05 320,4 977,2 p-aminométhyl- benzylamino- bléomycine 33,3 2670 89,0 9,1 33 N-eyclohexyl-1,3 d iaminopr opane 0,5 264 3,38 1354,0 4576,5 3-cyclohexylamino-propylamino-bléomycine 330,0 5355 1767,2 38,6 34 N-(3-cyclohexyl-aminopropyl)-1,3-d iaminopropane 0,5 264 3,10 1600,0 4960,0 3-(3-cyclohexyl-aminopropyl)-amino-propylamino-bléomycine 178,0 11215 1996,3 40,3 70 04581 36 2034552 Exemple 5 A m milieu ayant une composition de 6,4 % de geléè de millet, de 0,5 i» de glucose, de 3,5 1° de poudre de graine de soja, de 0,75$ de liqueur de macération de maïs, de 0,3 f° de chlorure de sodium, 5 de 0,1 % de phosphate de potassium secondaire, de 0,05 de sulfate de zinc, de 0,01 $ de sulfate de cuivre, de 0,2 $ de nitrate de sodium, de 0,01"$ de silicium et de 0,01 $ de Toho IP Ir, on ajoute du 1,3-diaminopropane à raison de 2 mg/ml, pour régler, le pH à 6,5. On charge 12 litres du milieu ainsi traité dans un fermenteur en 10 verre de 20 litres, et on stérilise. On inocule dans ce milieu 800 ml d'une liqueur de culture de Streptomyces verticillus (ATGC N° 15003), qui a été soumis à une culture par secousses pendant 48 heures dans un milieu ayant la même composition que ci-dessus, puis on cultive à 27° sôus agitation à 350-370 tours/minute pendant 15 120 heures, tout en introduisant, chaque minute, de l'air en un volume égal à celui du milieu. On filtre 7,7 litres de la liqueur de culture, et on extrait le filtrat (5,6 litres, pouvoir 148,5 mcg/ml, pouvoir total 831,6 mg) et on purifie, comme à l'Exemple 1, pour obtenir 230 mg de chlorhydrate de bléomycine (pouvoir 734,8 mcg/mg, 20 pouvoir total 169 mg). Le rendement à partir du filtrat de culture est de 20,3 %• On analyse ce chlorhydrate suivant le procédé Sephadex CM, pour trouver qu'il contient 84,5 $ de 3-aminopropylami-no-bléomycine. On dissout 200 g du chlorhydrate dans 10 ml d'eau distillée et charge la solution dans une colonne de 50 ml de volu-25 me remplie de Sephadex CM mis en suspension dans une solution aqueuse de formiate d'ammonium 0,02 N, puis on développe et élue avec une solution aqueuse de formiate d'ammonium 0,1 H" pour obtenir une fraction contenant de la 3-aminopropylamino-bléomycine. On fait passer et adsorbe cette fraction sur une colonne remplie de 10 ml 30 de carbone actif, on lave à l'eau, et on élue à l'aide d'une solution 1:1 en volume d'acétone et d'acide chlorhydrique aqueux 0,02 N. Ensuite, on concentre la fraction active éluée à siccité pour obtenir 50 mg de chlorhydrate de 3-aminopropylamino-bléomycine (pouvoir 1 934 mcg/mg, pouvoir total 96,7 mg). Le rendement à partir du 35 chlorhydrate ci-dessus est de 65,8 $. On hydrolyse cette substance avec de l'acide chlorhydrique 6 N-, on en forme une solution de soude caustique à 10 %, puis on soumet à une chromatographie de gaz en utilisant une colonne remplie de Fluropack 80 revêtu de Silicone SP 96, ce qui permet de déceler un 40 pic de 1,3-diaminopropane. 70 04581 37 2034552 On dissout dans 5 ml de méthanol 30 mg du chlorhydrate de 3-aminopropylamino ainsi obtenu (pouvoir 1 934 Môg/mg, pouvoir total 58,02 mg) et on envoie de l'acide sulfhyurique dans la solution obtenue pendant 30 minutes, pour obtenir un précipité de sulfure de 5 cuivre. On recueille ce précipité par filtration, et le lave au méthanol. On réunit le liquide de lavage et le filtrat? et on concentre le mélange à siccité pour obtenir 25 mg de chlorhydrate de 3-aminopropylamino-bléoiaycine exempt de cuivre (pouvoir 1.850 mcg/mg, pouvoir total 46,35 mg). Le rendement à partir de la sub-10 stance contenant du cuivre est de 79,7 %• Dans 2 Inl d'eau distillée, on dissout 20 mg de ce chlorhydrate de 3-aminopropylamino-bléomycine exempt de cuivre (pouvoir 1,850 mcg/mg, pouvoir total 37 mg), on charge dans une colonne remplie de 5 ml d'une résine échangeuse d'anions Amberlite IRA-400 (résine 15 échangeuse d'ions du type acide sulfurique fabriquée par Rohm et Haas), et on élue à l'eau distillée. On concentre l'éluat à siccité pour obtenir 15,5 mg de sulfate de 3-aminopropylamino-bléomycine exempt de cuivre (pouvoir 1 850 mcg/mg, pouvoir total 28,68 mg). Le rendement à partir du chlorhydrate exempt de cuivre est de 77,5 % 20 En procédant comme ci-dessus, on effectue des expériences dans un fermenteur en verre à l'aide des additifs aminés indiqués au Tableau 4. Les conditions opératoires et les résultats obtenus sont rapportés au Tableau 4. Tableau 4 Nom de l'additif Ooncentrât ion de l'additif (mg/ml) Temps de culture (h.) Quantité de filtrat Pouvoir (mcg/mg) Pouvoir total (mg) Nom de la bléomycine séparée Poids (mg) Pouvoir (mcg/mg) Pouvoir total (mg) Rendement à par-tir du filtrat de culture 1,4-diamino-butane 2,0 120 4,9 140,0 686,0 bléomycine k2% 71,8 1 232 88,5 12,9 spermidine 0,4 163 5,0 122,2 611,0 hléomycine 44,7 2 543 113,7 18,6 O O J*» tn oo V>ï 00 K> O CO -fc* en On K> 70 Û4581 39 2034552 Exemple 4 On ajuste à pH 7,0 un milieu contenant 4,0 $ de poudre de graine de soja, 1,0 fo d'extrait de levure, 0,3 fo de chlorure de sodium, 1 ,0 fo d'huile de graine de soja, 0,0007 f> de sulfate de 5 cuivre 5H20, 0,0001 fo de sulfate de fer 7H20, 0,0008 f> de chlorure de manganèse 4H2O et 0,0002 fo de sulfate de zinc 7H2O. On charge séparément chaque portion de 120 ml de ce milieu dans un flacon Sakaguchi de 500 ml et on stérilise. On inocule dans le milieu une souche MA 267-A^ isolée en 1965 du sol de Musashino-cho, 10 Saitama-ken, Japon, qui a été identifiée comme une variante de Streptomyces' verticillus et qui produit particulièrement de la hléomycine A^. En outre, on ajoute du phosphate de spermidine, qui a été soumis à un traitement de stérilisation sur un filtre Millipore, à raison de 0,5 mg/ml, et on cultive la souche à 27° G 15 pendant 7 jours sous agitation à 130 tours/minute. On recueille et filtre des liqueurs de culture 5,2 litres, et on extrait et purifie le filtrat (4,5 litres, pouvoir 196 mcg/ml, pouvoir total 253 mg) de la même manière que dans l'Exemple 1, pour obtenir 137 mg d'une poudre brute de chlorhydrate de bléomycine A^ (pouvoir 1 846 20 mcg/mg, pouvoir total 253 mg). le rendement à partir de la liqueur de culture est de 28,8 f. On soumet cette poudre brute à une chromatographie en utilisant une colonne remplie de 25 ml de Sephadex ff-50 et on élue à l'eau distillée. On recueille et concentre à siccité les fractions actives obtenues colorées en bleu, de sorte 25 qu'on obtient 53,5 mg d'une poudre bleue (pouvoir 2613 mcg/mg, pouvoir total 140 mg) et on n'obtient que de la bléomycine A^. Le rendement à partir de la poudre brute est de 55,4 $. L'extinction ^1cm ^ ^ produit ainsi obtenu est de 116, et on décèle la spermidine de sa chaîne latérale en soumettant à la chromato-30 graphie de gaz un hydrolysat du produit par l'acide chlorhydrique 6 N . 70 04581 40 2034552 REVENDICATIONS 1. Un procédé de préparation de bléomycines antibiotiques en inoculant et cultivant par voie aérobie dans un milieu contenant une source nutritive une souche produisant de la bléomycine appar-5 tenant aux actinomyces, caractérisé en ce qu'on effectue la culture en présence d'un composé amino ayant au moins un groupe -Ç-CH2-NH2 et au moins un groupe basique choisi parmi les groupes amino, imino, guanidino, amidino et suifonium et les composés cycliques contenant de l'azote, ou en présence d'un composé transfor-ÏO niable dans la liqueur de culture en un tel composé amino, obtenant ainsi une bléomycine connue ou nouvelle, correspondant à ce composé amino ou à un composé amino dérivé du composé précité, et on recueille la bléomycine connue ou nouvelle par des moyens connus du milieu de culture. 15 2. Procédé suivant la revendication 1, carâctérisé en ce que le composé amino a l'une dès formules suivantes ^1 © R3 (1) nh2-ch2-x-n-^ 1 , (2) nh2-ch2-x. 20 25 30 Vr . ' * 2 d5 r3 (3) NH2-CH2-X-Sv . , (4) NH2-CH2-X-N I R (5) NH2-CH2-X» dans lesquelles X = -(GH2)n-, -(?H2)n,- -(CH2)n2- R6 R6 - R6' -(ÇH2)n-N-(ÇH2)Il2- , -(0H2)n-f-(Ç»H2) 2-f-(GH2)n3 R6 R7 à6' R6 R7 R6' R7 R6" -(CVn"f" . NH OR R1, R2 = H, groupe alcoyle, -(GH2)n4-HT -(ÇH^^'-OR9', i8 R8' -(®2)n4»ir>E'0' , * 1 Ai \/V» 35 R8n 0 40 -(CH2)n4"'- RSm M 3 4 5 R , R , R^ = groupe alcoyle 70 04581' 41 2034552 s: = -NQ , -iQ , -hQH-E6 , E7 -NO-(ÇH2)n-N "O k6 N ï'ci = o"®6 - " -h7'-(?h2)eo-b» 2 3 4 41 4" 4'" dans lesquelles n, n , n , n , n , n , n est un nombre entier de 1 à 8, n* est un nombre entier de O à 8, 10 H6 R6' R6" R7 R7' R8 R8' R8" R8"' R9 R9' il y JX y XL | XL | xl | XL ^ XL | il | XL ^ XL ^ XL ^ 10 10'' 10" R , R , R sont de l'hydrogene" ou des groupes alcoyle, les lignes en pointillés dans les formules indiquant qu'un atome d'hydrogène sur une chaîne carbonée peut être porté, en toutes positions du groupe alcoyle. 15 Procédé suivant la revendication 2, caractérisé en ce ^ue NH9-CH9-X-N^ est le 1,2-diaminoéthane, le 1,2-diaminopro- * XR^ pane, le 1,3-diaminopropane, le 1,4-diaminobutane, l'agmatine, la spermidine, la spermine, le 1,2-diaminopropane, le N-méthyl-1,3-diaminopropane, le ïï-butyl-1,3-diaminopropane, le N,N-diméthyl-1,2-20 diaminoéthane, le ÎT,N-diéthyl-1,2-diaminoéthane, le N,N-diméthyl-1 ,3-diaminopropane, le U,N-diéthyl-1 ,3-diaminopropane, la K,N-bis-(3-aminopropyl)-méthylamine, le N-(3-amino-1-méthyl-propyl)-1,3-diaminopropane, le N-(2-hydroxypropyl)-1,2-diaminoéthane, le N-(3-hydroxypropyl)-1,3-diaminopropane, le N-(3-méthoxypropyl)-1,3-diami-25 nopropane, le N-benzyl-1,3-diaminopropane, le N-(1-phénétyl)-1,3-diaminopropane, le N-(1-phényléthyl)-H1-(3-aminopropyl)-1,3-diaminopropane, le N-cyclohexyl-1,3-diaminopropane, le N-(3-cyclohexyla* mino-propyl)-1,3-diaminopropane, le ÏT-butyl-N'-3-aminopropyl-1,3- diaminopropane, la m-xylènediamine ou la p-xylènediamine-ou le N/J" (N,N-diméthyl)-3 aainopropyl.7-1,3-diaminopropane. 30 4„ Procédé suivant la revendication 2, caractérisé en ce que NB^-CH^-X-N— R est le chlorure de 3-am i n opr opyl-tr ime thyl-R5 ammonium ou le bromure de 3-aminopropyl-triméthylammonium. 5. Procédé suivant la revendication 2, caractérisé en ce 35 que © . R^ NH0-CH0-X-S * d B? suifonium, le bromure de 3-acétaminopropyl-diméthylsulfonium, le chlorure de 3-amino-3-carboxypropyl-diméthylsulfonium ou le chlorure de 3-amino-3-carbamoylpropyl-diméthylsulfonium. 70 04581 2034552 6 - Procédé suivant la revendication 2, caractérisé en ce que NHp-CH^j-X-N la N-3-aminopropylpyrrolidin.e, la N-3-aminopropylpipéridine, la N-3-8minoprop,ylmorpholine, la N-2-aminc-éthylpipérazine, la N-3-aminopropylpipérazine, la N-bis-amino- 5 propylpipérazine, le N-(3-pipéridinopropyl)-l,3-c[iasiinopropane ou le N-(3-morpholino-propyl)-l,3-diaroinopropane ou le N-(3-pyrroli-dino)-l,3 diaminopropane. 7 - Procédé suivant la revendication 2, caractérisé en ce que NH2-CHg-XIe N-(2-furfuryl )-l, 3-diaminopropane, la I0 4-pipéridyl-méthylamine ou la 2-(4-Imidazolyl)-éthylamine. 8 - Nouvelles bléomycines ayant dans la zone d'absorption de l'ultraviolet, un pic d'absorption à 244 xa/J et un maximum d'absorption à 290-295 ayant une structure partielle représentée par les formules : n—j— co-r x5 -m-ch-co-nh-(ch2 ) 2-fgi1 0H0H I oh5 . r = -NH-(OH2)2-NH2 -nh-(GH2)5-HH2 20 -NH-(GH?)2-ÎJ ^ * CH, D -hh- ( chq ) o-n ° 2h5 2 ¥5 'GH3 -ch3 /C2H5 -nh-(CH2)3-NCG2H5 30 -im- ( GH2 ) 3-KH- ( GH2 ) h -NH- ( GH2 ) 2-NH-0H2-CH-GH5 OH 25 -nh-(ch2)3-n: 35 -ra-(CH2)3-NwN -NH-(GH2) 3-NH-(GH2) 5-KH-GH--{0) GH, D 70 04581 43 2034552 -nh-ch 0-ch-ch, 2 | 3 nh2 -nh-(ch2)3-nh-ch3 -nh-(oh2 ) 3-nh- (ch2 ) 3-ch3 ®/0H3 ch3- -nh- ( gh2 ) ( gh2)-3-n ^ 10 -uh-(gh2)5-îî-(ch2)3-mh2 ch, -hh-(ch2)5-nh-çh-(ch2)2-mh2 20 25 30 35 ch, 'ce, CH, 15 -nh-(ch2)3-ît*| -hh-(ch2)3-i(2> -nh-(ch2)3-i -hh-(ch2)2-i -nh- ( ch2 ) .<> ( ch2 ) 3-nh2 -nh-( ch2 ) 3-nh-( ch2 ) 3-îq -nh- (ch2 )3-nh-(ch2 ) j-hq -nh- ( ch2 ) 3-nh- (ch2) 3-n^0 -nh-(ch2)3-nh-(ch2)3-0h -nh- ( ch2 ) 3-nh- ( ch2 ) 3-och3 -nh- ( ch2 ) 3-nh-ch? - 2 \^/ -nh-(ch2)3-nh-ch- -nhch2- ch3 ch0-nh. -nh-ch2 - -nh- ( ch2 ) 3-nh- ( gh2 ) 3-nh 70 04581 44 2034552 -EH- (CH2 ) 5-ÏÏH-CH2-iÇÎ -mh-GH2- H 9 - A titre de médicament, les nouvelles bléomycines suivant la rëvendication 8, notamment pour leur activité anti-tumorale et anti-microbienne.