FR 2027116 A1 19700925 FR 6943426 A 19691216 69 5 10 15 20 25 30 35 40 43426 1 2027116 ' La présente invention se rapporte à un procédé pour préparer une nouvelle mucoprotéine pouvant servir de médicament, notamment à partir de l'appareil digestif de certains mammifères. On sait que les hormones qui inhibent la sécrétion des sucs gastriques sont sécrétées par l'appareil digestif des mammifères. L'une de ces hormones, appelée "gastrone", est contenue dans les sucs gastriques. Une autre hormone, appelée "entérogastrône" se trouve dans l'intestin grêle. Toutefois, la structure chimique réelle de ces hormones est encore inconnue. A la suite d'études dans ce domaine, les inventeurs sont parvenus à extraire des voies digestives de certains mammifères une nouvelle mucoprotéine remarquable par son influence sur la sécrétion des muqueuses, ainsi que par son action contre les ulcères; En conséquence, l'un des buts de l'invention est de fournir un procédé pour préparer une nouvelle mucoprotéine remarquable par son action sur la sécrétion des muqueuses et contre les ulcères. Un autre but de l'invention est d'apporter un procédé pour préparer une nouvelle mucoprotéine à partir de l'appareil digestif des mammifères. Enfin, 1'invention se propose d'indiquer un procédé économique et efficace de préparation d'une telle mucoprotéine. L'invention atteint les buts visés par un procédé consistant à soumettre l'appareil digestif d'un mammifère à une extraction dans l'eau, à ajouter un agent de précipitation à l'extrait obtenu pour provoquer la formation d'un précipité , à traiter ce précipité avec une protéase, puis à éliminer de celui-ci les impuretés ayant un faible poids moléculaire. La mucoprotéine de l'invention peut être extraite d'une grande variété de mammifères, comprenant les porcs, les moutons, les chèvres et les baleines. Il est préférable d'utiliser les baleines pour la mise en oeuvre du présent procédé, du fait qu'on peut se les procurer assez facilement en tant que matières premières industrielles. La teneur en mucoprotéines varie le long des voies digestives. G'est ainsi que la teneur en mucoprotéines est élevée dans la muqueuse de l'estomac et, en particulier, dans le revêtement muqueux de la mu-cose de la région des glandes du pylore et dans les intestins, en particulier dans la partie supérieure de l'intestin grêle. En conséquence, il est avantageux d'extraire les mucoprotéines de ces régions. La partie de l'appareil digestif, qui doit être traitée, est émincée ou hachée au moyen d'une machine spéciale et est soumise à une extraction dans l'eau bouillante, dans une solution alcoolique diluée, telle qu'une solution à 30% d'éthanol, dans une solution à 50% de méthanol ou dans une solution à 0,1 N d'acide chlorhydrique et de 50% d'éthanol, ou bien l'appareil digestif émincé est traité avec une solution aqueuse d'un acide dilué, telle qu'une solution à 43426 2 2027116 r 0,1 N d'acide chlorhydrique, une solution à 5% d'acide acétique ou une solution à 1% d'acide sulfurique. On sépare l'extrait des matières solides et on ajoute un agent de précipitation. Parmi les agents de précipitation appropriés, on peut citer l'acide 5 benzoîque, le sulfate d'ammonium, le chlorure de sodium, l'acide picrique, 1' a-cide tannique, l'acide phosphomolybdique, l'acide trichloroacétique, l'acide sulfosalicylique, etc . Pour favoriser la dispersion de l'agent de précipitation dans l'extrait, il est avantageux d'ajouter cet agent en le dissolvant ou en le mettant en suspension dans un solvant approprié. C'est ainsi, par exemple 10 que lorsque l'agent de précipitation, est l'acide benzoîque, il peut être avantageusement dissous dans l'acétone. On recueille le précipité par des moyens classiques, tels qu'une filtra-tion à aspiration, une séparation centrifuge ou autre, on le lave avec de l'eau et au besoin, avec de l'alcool, de l'acétone, du benzène ou un autre solvant 15 organique approprié, puis on le déshydrate. On a trouvé que le produit brut contenant la mucoprotéine présente, à ce stade,de traitement, une bioactivité d'environ 20 mg/kg. Ce produit brut est ensuite raffiné pour obtenir une substance hautement active. On règle la solution aqueuse du produit brut à une concentration convenable, par exemple à 10% 20 et on ajuste son pH à environ 7. On élimine le précipité qui résulte de l'addition de l'acide et on réajuste la solution à un pH de 4. On recueille le précipité et on l'élimine. Par ce traitement, les protéines impures contenues dans le produit sont séparées par précipitation et éliminées. Ce post-traitement n'est pas toujours nécessaire et dans beaucoup de cas, la solution aqueuse bru-25 te ci-dessus peut être utilisée directement pour l'étape suivante.-Une protéase telle que la pepsine, la papaîne, la trypsine ou une prot,éase produite par Bacillus subtilis, telle que la pronase et la nagase, etc .. est ensuite ajoutée à la solution aqueuse du produit brut pour décomposer les protéines que celui-ci contient. On chauffe ensuite cette solution pour désactiver les enzy-30 mes et on élimine alors les impuretés à bas point moléculaire et les sels minéraux contenus dans la solution. Une technique quelconque peut être utilisée pour éliminer les impuretés à bas poids moléculaire et les sels minéraux. L'un de ces procédés consiste, par exemple, à extraite et à éliminer les impuretés, telles que les acides aminés 35 et les peptides, etc.. au moyen d'un alcool d'alcoyle inférieur. Un autre procédé consiste à éliminer les impuretés à bas poids moléculaire et les sels minéraux par une dialyse en utilisant une membrane semi-perméable ou une résine échangeuse d'ions. Toutefois, l'inconvénient de ces procédés est que le volume de la solution traitée, contenant les mucoprotéines, est grand et qu'un tra-40 vail considérable est nécessaire pour obtenir les mucoprotéines par concentra- 69 43426 2027116 tion et lyophilisation. On a découvert maintenant que les impuretés à bas poids moléculaire et les sels minéraux peuvent être éliminés et que la solution peut être concentrée en une seule étape en augmentant la pression de filtration et en utili-5 sant une membrane de dextrane suffisamment réticulée pour empêcher la diffusion des substances gélifiées dont le poids moléculaire est supérieure à 1000. Comme exemple d'une telle dextrane réticulée, on peut citer celle portant la désignation UM-1 ou IJM-2 produite par la "Amicaon Corporation of U.S.A. ". On applique la dextrane réticulée sur une plaque de support poreuse, par exemple, 10 en papier filtrant, etc .. et on la fixe sur celle-ci. Il est préférable d'utiliser une membrane de dextrane réticulée dont l'épaisseur est comprise entre environ 0,05 et environ 0,5mm avec un support en papier filtrant. Dans la mise en oeuvre du procédé de l'invention, on filtre la solution sous une pression élevée en agitant. La pression doit être maintenue entre 15 environ 3,5 et 8 kg/cm2, de préférence à environ 7 kg/cm2.0n règle le débit de façon à établir un débit moyen de 100 à 200 ml/h lorsqu'on utilise une membrane ayant un diamètre de 76 mm. De cette manière,les impuretés dont le poids moléculaire est inférieur à 1000 et les sels minéraux présents dans les mucoprotéines sont complètement 20 éliminés, en même temps que la majeure partie de l'humidité, facilitant ainsi la lyophilisation qui suit. Il est préférable d'éliminer l'agent de précipitation qui peut avoir été emprisonné dans le produit brut au cours de la précipitation, car la présence même de petites quantités seulement de cet agent est susceptible de diminuer 25 l'activité de la protéase qui est appliquée au produit par la suite. L'agent de précipitation peut être éliminé par l'un quelconque des procédés utilisés pour purifier le produit brut. C'est ainsi, par exemple, que cet agent peut être éliminé par une dialyse ou une filtration sous pression. Les propriétés chimiques de la mucoprotéine préparée selon le procédé ci-30 dessus sont encore inconnues, dans une large mesure. Toutefois, en gros, sa composition semble être la suivante : Azote (%) 12 - 9% Protéines (%) 55 - 35% Hexoses (%) 15 - 37» 35 Oses aminés (%) 25 - 5% Lipides S0.2~ + 4 Les résultats d'un essai effectué pour vérifier l'action contre les ulcères de la mucoprotéine obtenue par le procédé de l'invention, sont donnés 40 dans le tableau suivant. Cet essai a été conduit selon la méthode de Shay, 69 43426 2027116 comme suit : On effectue une laparotomie sous anesthésie à l'éther sur des rats mâles. Les rats qui pesaient de 250 à 350 grammes après 48 heures de jeûne, sont li-*-gaturés pars pylorica et la partie incisée est immédiatement suturée. En même 5 temps, une solution d'essai est injectée dans la veine caudale. Après huit heures, on procède à une laparotomie sous anesthésie à l'éther et on ligature l'oesophage directement au-dessus du cardia. On extrait l'estomac et on mesure le volume, ainsi que l'acidité, des sucs gastriques en utilisant une solution à 0,1 N d'hydroxyde de sodium avec de la phénolphtaléine comme indicateur. En 10 même temps, on observe la tendance à l'ulcération de la paroi gastrique comparativement à un groupe témoin ayant reçu une solution saline. TABLEAU Poids (g) Volume de Ulcération 15 Médicament 1 Dosage sucs gastriques (ml) Acidité (ml) Glande gastrique Rumen Témoin (solution saline) 1.0 mg/kg 307 9.5 (100%) 9.00 (1007=) 5/5 2/5 20 Mucoprotéine 2.5 mg/kg 273 2.6 (17.5) 2.11 (23.4) 1/5 0/5 Mucoprotéine 5.0 mg/kg 320 2.1 (21.8) 1.68 (18.7) 0/5 0/5 25 Sulfate d'atropine 1.0 mg/kg 307 4.7 (49.2) 5.28 (58.7) 4/5 0/5 Urogastrone 1.0 mg/kg 288 5.5 (58.2) 4.80 (53.3) 3/5 0/5 30 Sialogastrone 250 mg/kg 312 4.1 (42.9) 3.59 (39.9) 3/5 0/5 NOTA - L'acidité est exprimée en ml de solution à 0,1 N de HC1. Il ressort clairement du tableau ci-dessus que dans les groupes auxquels 35 2,5 mg/kg et 5mg/kg de mucoprotéine selon l'invention ont été administrés, les ulcères de la glande gastrique et du rumen ont été remarquablement supprimés et que la sécrétion des sucs gastriques ainsi que de l'acide gastrique ont été manifestement inhibées. Dans les groupes traités avec 1 mg/kg d'urogastrone et avec 250 mg/kg de sialogastrone, on a observé une inhibition limitée des ul-40 cères de la glande gastrique, tandis que dans le groupe ayant reçu 1 mg/kg de 69 43426 5 2027116 sulfate d'atropine, on n'a observé presqu'aucune inhibition des ulcères. EXEMPLE 1 - Dans une chambre à basse température, on dégèle progressivement la région de la glande pylorique du troisième estomac congelé d'une baleine et on sépare 5 soigneusement la muqueuse de celui-ci de manière à obtenir 12 kg de membrane. On émince cette membrane de muqueuse avec une machine classique et on ajoute environ 12 kg d'eau, puis on fait bouillir pendant environ 30 minutes. On laisse la solution reposer à la température ambiante, puis on la place dans une chambre froide (5°C) pendant seize heures. On sépare ensuite les substances solides en 10 utilisant un tissu de Nylon afin d'obtenir un liquide d'extraction. On prépare une solution comprenant 100 g d'acide benzoîque dissous dans un litre d'acétone et on l'ajoute progressivement à l'extrait en agitant. On agite à nouveau le mélange liquide pendant une heure et on le replace dans une chambre froide (à 5°C) pendant 16 heures. 15 Le précipité blanc qui se forme dans le liquide d'extraction est filtré par aspiration sous pression réduite et les solides sont soigneusement lavés avec de l'eau. On transfère les matières solides dans un séparateur centrifuge tubulaire et on les lave cinq fois avec 500 ml d'acétone et deux fois avec 300 ml d'éther, jusqu'à ce que l'on n'observe plus d'acide benzoîque. Les matières 20 solides sont ensuite déshydratées et l'on obtient aind. 20 g de produit brut. On fait dissoudre 10 g de ce produit brut dans un litre d'eau distillée et on règle le pH à 8. On fait dissoudre une solution comprenant 100 mg de trypsine dans 10 ml d'eau et on la digère pendant 24 heures à 37°C. Ensuite, afin de désactiver la trypsine, on fait bouillir le liquide pendant environ 15 minutes, puis 25 on le refroidit avant d'ajouter un litre de n-butanol, puis on secoue énergi-quement. La séparation centrifuge de ce mélange permet de recueillir une phase aqueuse qui est d'abord concentrée à 200 ml sous pression réduite, puis raffinée par lyophilisation. On obtient ainsi 3 g de poudre de mucoprotéine raffinée. EXEMPLE 2 - 30 On fait dissoudre 10 g de la poudre de produit brut obtenu par le procédé de l'exemple 1 dans un litre d'eau distillée. On ajoute 20 g de diéthylamino-éthyl-cellulose (DEAE cellulose) à la solution et on agite celle-ci pendant environ 3 heures. Immédiatement après, cette solution est filtrée par aspiration pour séparer les solides. Les solides sont soigneusement lavés avec de l'eau, 35 puis agités deux fois, chaque fois pendant 30 minutes dans 50 ml d'une solution aqueuse à 0,1 N d'hydroxyde de sodium afin dféliminer les substances absorbées dans la DEAE cellulose. On règle le pH de l'effluent à 8 avec de l'acide acétique et on prépare une solution en faisant dissoudre 100 mg de pronase dans 10 ml d'eau en vue d'effectuer une digestion à 37°C pendant 24 heures. On fait 40 bouillir la solution pendant environ 15 minutes pour désactiver la trypsine. On > 6 69 43426 2027116 place ensuite cette solution dans un tube de Cellophane et on la dialyse pendant 72 heures sous pression réduite en utilisant de l'eau afin d'obtenir un liquide concentré. On dilue ce liquide concentré danatine solution comprenant 7 parties d'éthanol et 3 parties d'une solution à 0,1 N d'acide chlorhydrique, 5 on concentre le liquide surnageant obtenu par une séparation centrifuge et on le déshydrate sous pression réduite. On obtient ainsi une poudre blanc-jaunâtre. EXEMPLE 3 - D'un cachalot mâle gelé, de 15 mètres de long, on sépare 4,7.5 kg de muqueuse de l'intestin grêle supérieur. On émince cette muqueuse au moyen d'une 10 machine spéciale et on ajoute deux fois son volume d'eau. On fait bouillir cette solution pendant environ 30 minutes, on la laisse refroidir à la température, ambiante, puis on la place dans une chambre froide (5°C) pendant seize heures. On sépare ensuite les matières solides en utilisant un tissu de Nylon afin d'obtenir un liquide d'extraction. Tout en agitant ce liquide d'extraction, on y 15 ajoute lentement une solution comprenant 950 mg d'acide benzoîque dissous dans un litre d'acétone. On agite le liquide pendant encore une heure et on le place à nouveau dans une chambre froide (5°C) pendant 16 heures. Ensuite, le précipité blanc qui s'est formé dans le liquide d'extraction est filtré par aspiration sous pression réduite et est soigneusement lavé avec 20 de l'eau. Ce précipité est ensuite transféré dans un séparateur centrifuge tabulaire et est lavé cinq fois avec 500 ml d'acétone et deux fois avec 300 ml d'éther jusqu'à ce que l'on n'observe plus d'acide benzoîque. Après déshydratation, on obtient 28,16 grammes de produit brut. On fait dissoudre 10 grammes de ce produit brut dans un litre d'eau distillée et on règle le pH à 8. Une so-25 lution comprenant 100 mg de trypsine dissoute dans 10 ml d'eau est'ajoutée, puis la solution est soumise à une digestion pendant 24 heures à 37°C. La trypsine est ensuite désactivée par une ébullition d'environ 15 minutes, puis refroidie. On ajoute un litre de n-butanol et on secoue énergiquement. Par séparation centrifuge, ' on recueille une phase aqueuse à la base que l'on concentre 30 à 200 ml sous pression réduite. On obtient une poudre de mucoprotéine raffinée par une déshydratation à froid. EXEMPLE 4 - On fait dissoudre 25 g d'un produit brut préparé.de la même manière que dans l'exemple 3 dans 500 ml d'eau et on règle le pH de la solution à 7 en uti-35 lisant de l'ammoniaque. On fait ensuite bouillir, la solution pendant environ 5 minutes à 100°C, on la refroidit et on l'agite pendant environ 4 heures. Après avoir laissé reposer une nuit,.on sépare un précipité de ce liquide par-centrifugation et on ajoute un litre d'eau ayant un pR de 7. En procédant comme dans l'exemple 3, le liquide est divisé en un précipité et en un filtrat 40 et on ajoute ce filtrat au filtrat précédent. On règle ensuite le pH du filtrat 43426 7 2027116 ' à 4 àvec de l'acide acétique, o.n le fait bouillir pendant environ 5 minutes, on le refroidit et on le soumet à une centrifugation. On lave le précipité ainsi obtenu avec 100 ml d'une solution d'acide acétique ayant un p>H de 4. En mélangeant le liquide lavé avec le filtrat précédent et en .procédant à une lyophilisation du mélange, on obtient une substance active. On fait ensuite dissoudre 10 g de cette substance dans un litre d'eau pure, et on la raffine comme dans l'exemple 1 pour obtenir une mucoprotéine raffinée. EXEMPLE 5 - On fait dissoudre un produit brut préparé comme dans 1'exemple 3 dans 10 fois son volume d'eau. On y ajoute une solution saturée de sulfate d'ammonium à 20°C, et on règle le pH à 7 afin d'obtenir un concentré de sulfate d'ammonium à 50% de la concentration de saturation. On laisse reposer cette solution pendant une nuit à 20°C dans une chambre thermostatique, et on la soumet à une centrifugation pour séparer un précipité et un liquide surnageant. On met le précipité en suspension dans de l'eau, puis on le soumet à une dialyse à 4°C pendant 48 heures, en utilisant une membrane de Cellophane. On lyophilise le dialysat interne pour obtenir une substance active. On traite 10 grammes de cette substance comme dans l'exemple 3 pour obtenir une- mucoprotéine raffinée. EXEMPLE 6 - On émince 2500 g de muqueuse gastrique et on y ajoute deux fois son volume d'eau. Après 30 minutes d'ébullition, l'extraction est achevée. Après refroidissement, on filtre le liquide et on mélange à nouveau le résidu avec deux fois son volume d'eau, puis on le fait bouillir pendant 30 minutes. On combine les deux liquides d'extraction avec les résidus et on laisse reposer pendant une nuit à 5°C. OnfLltre ensuite le mélange liquide. On ajoute au filtrat en agitant une solution préparée en faisant dissoudre 500 mg d'acide benzoîque "dans un litre d'acétone. On continue d'agiter pendant cinq heures, puis on laisse reposer le liquide pendant une nuit à 5°C. On sépare le précipité par On ajoute deux litres d'eau à 20 g de ce produit brut et on règle le pH à 7. Par centrifugation, on sépare un liquide surnageant et on ajoute deux litres d'une solution saturée de sulfate d'ammonium à celui-ci. On laisse ensuite cette solution reposer pendant une nuit à 5°C, puis on sépare par centrifugation un second précipité. On lave également ce précipité avec 500 ml d'une solution saturée"de sulfate d'ammonium. On fait ensuite'dissoudre-le précipité dans 500 ml d'eau et on le filtre sous pression. Cette filtration sous' pression est réalisée en versant 250 ml de la solution dans un récipient ayant un diamètre de 76 mm et une capacité de 400 ml. On agite cette solution au moyen d'un agitateur -- SOPY 69 43426 8 2027116 magnétique et on effectue une filtration sous un débit moyen de 50 ml/h en utilisant une membrane UM-2. On applique une pression de 7 kg/cm^ au moyen d'un compresseur. Quand le . résidu a été réduit à environ 50 ml, on ajoute encore une fois 250 ml de la 5 solution ci-dessus et on la filtre de la même manière. Quand le résidu a été réduit à 50 ml, on ajoute 100 ml d'eau pure que l'on concentre à nouveau à 50 ml. Après déshydratation à froid du résidu, on obtient 11,8 grammes de mucoprotéine brute. On ajoute 10 grammes de cette mucoprotéine à 1000 ml d'eau et on règle le pH de la solution à 8. On fait dissoudre une solution contenant 10 100 mg de trypsine dans 10 ml d'eau et on laisse digérer pendant 24 heures à 37°C. On fait bouillir cette solution pendant 15 minutes pour désactiver la trypsine, puis on procède à une filtration sous pression en utilisant une membrane UM-2 et un débit moyen de 120 ml/h. Après lyophilisation, on obtient 0,372 g de mucoprotéine raffinée. Le rendement de la mucoprotéine par rapport 15 à la muqueuse gastrique est de 0,18 g/kg. EXEMPLE 7 - On traite 1650 g de muqueuse de l'intestin grêle comme décrit dans l'exemple 6. On obtient 3,45 g de mucoprotéine que l'on soumet ensuite à une digestion avec de la trypsine. Par une filtration sous pression subséquente, en uti-20 lisant une membrane UM-1 et sous un débit moyen de 100 ml/h, on obtient 0,85 g de mucoprotéine raffinée. Il va de soi que de nombreuses modifications peuvent être apportées aux exemples qui ont été décrits, sans sortir pour autant du cadre de l'invention. 43426 9 2027116 REVENDICATIONS 1.- Procédé de préparation d'une nouvelle mucoprotéine qui consiste à soumettre l'appareil digestif d'un mammifère à une extraction dans l'eau, à ajouter un agent de précipitation à l'extrait ainsi obtenu, à recueillir le précipité, à traiter ce précipité avec une protéase, à en éliminer les impuretés ayant un?bas poids moléculaire et à récupérer la mucoprotéine. 2.- Procédé selon la revendication 1, qui consiste à utiliser,comme régions de l'appareil digestif à soumettre au traitement, la muqueuse de l'estomac et la muqueuse de 1'intestin grêle. 3.- Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que l'agent de précipitation est une substance telle que l'acide benzoîque, le sulfate d'ammonium, le chlorure de sodium, l'acide picrique, l'acide tannique, l'acide phosphomolybdique, l'acide trichloroacétique et l'acide sulfosalicylique. 4.- Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'on éliMne les impuretés ayant un bas poids moléculaire par une filtration sous pression en utilisant une membrane de dextrane réticulée à travers laquelle les substances gélifiées ayant des poids moléculaires supérieurs à 1000 ne peuvent pas diffuser. 5.- A titre de médicament, utilisable notamment pour soigner les ulcères, la mucoprotéine préparée selon l'une quelconque des revendications 1 à 4. 6.- A titre de produit industriel nouveau, la mucoprotéine préparée selon l'une quelconque des revendications 1 à 4.