FR 2051520 A1 19710409 FR 7017450 A 19700513 70 17450 -1- 2051520 La présente invention concerne l'utilisation d1éthyléthylène-imine comme agent inactivateur dans la préparation d'antigènes inactivés pour des compositions pharmaceutiques, par exemple des vaccins préparés à partir de virus. 5 La préparation de telles compositions nécessite des procédés et des agents d'inactivation, qui d'une part détruisent avec sûreté 1'infectiosité ou pouvoir infectant,mais doivent'd'autre part laisser intacte l'antigénicité ou potentiel antigénique. Pour obtenir des préparations inactivées avec sûreté, ce processus doit avoir 10 lieu dans une réaction du premier ordre, afin qu'on puisse déterminer, sans ambiguïté, l'instant de disparition totale du pouvoir infectant. Ceci n'est pas possible pour de nombreux agents inacti-vateurs usuels, comme c'est le cas par exemple de la formaline ou de la {3-propiolactone. D'autres agents qui ne'possèdent pas cet 15 inconvénient sont peu stables et montrent,' à la température ambiante, une perte incontrôlable d'activité, comme c'est le cas de l'acétyléthylène-imine. La Demanderesse vient de découvrir qu'on peut utiliser avec su.ccès comme agent inactivateur, dans la préparation d'antigènes 20 inactivés pour compositions pharmaceutiques, 1'éthyléthylène-imine qui inactive des virus dans une réaction du premier ordre, laisse intacte leur antigénicité et se conserve bien même à la température ambiante. On l'utilise en quantités de 0,01 à 1 % (volume/volume). 25 Suivant les conditions expérimentales, la durée d'application va de quelques heures à 5 jours. On opère à des températures comprises entre la température ambiante et 40°C. ; Exemple 1 On ajoute à une suspension du virus de la fièvre aphteuse 30 (du type 0^ selon Eaufbeuren) - c'est-à-dire un représentant des virus contenant de l'acide ribonucléique - sous la forme du liquide d'une culture infectée de cellules primaires de rein de veau, 0,1 % (volume/volume) d'éthyléthylène-imine, dont le pH a été préalablement réglé à une valeur neutre par addition.goutte à 35 goutte d'acide chlorhydrique. Le mélange est conservé à 37°C et des échantillons sont prélevés d'heure en heure. L'inactivation est interrompue dans chaque cas par addition de 10 volumes d'une 70 17450 -2- 2051520 solution à 20 % de thiosulfate de sodium. Les échantillons sont ensuite inoculés à l'état non dilué et à l'état dilué de 0,1 en 0,1 dans chaque fois dix petits tubes, avec "des cellules de rein de veau en quantité de 0,1 ml. Lés titres en virus que l'on-"détermine mon-5 trent une diminution progressive qui correspond à une réaction du premier ordre. Après une durée d'action de 5 heures, on ne peut plus déceler aucun pouvoir infectant même dans le cas de l'inoculation de cinq fois la quantité de virus indiquée ci-dessus.. On inocule par voie sous-cutanée à cinq cobayes une solution 10 virale.ainsi traitée pendant 6 heures, en une quantité de 1,5 ml» Les symptômes de la maladie n'apparaissent chez aucun de ces animaux, mais trois semaines après l'inoculation, un essai montre la présence dans le sérum d'anticorps exerçant un effet neutralisant contre le virus infectieux de départ, non traité au préalable. 15 Exemple 2 On répète le mode opératoire décrit dans l'exemple 1 en utilisant 0,05 i° en volume/volume d'éthyléthylène-imine au lieu de 0,1 jS en volume/volume de cette substance. Là aussi, on constate une diminution linéaire du pouvoir infectant au cours du traitement. 20 Au bout de 11 heures, même après inoculation d'une quantité cinq fois plus forte du virus, on ne décèle plus aucun pouvoir infectant. L'iïio.culation de .1,5 ml d'un virus traité- de la même façon pendant 24.heures n'occasionne l'apparition d'aucun symptôme de la maladie chez chacun de 20 cobayes. Trois semaines après l'in-25 gection, tous les animaux présentent, dans leur sérum, des anticorps exerçant un effet de neutralisation contre le virus de départ. Exemple 3 On répète le mode opératoire décrit dans l'exemple 1 en utilisant 0,05 % en volume/volume d'éthyléthylène-imine au lieu 30 de 0,1 fo de cette substance, et en opérant à une température de 22°C au lieu de 37°C. Là aussi, on constate une diminution linéaire progressive de l'infectiosité. Au bout de- 52 heures, on ne peut plus déceler aucun virus infectieux. Exemple 4 35 En suivant le mode opératoire de l'exemple 1 et en utilisant 0,05 % en volume/volume d'éthyléthylène-imine au lieu de 0,1 % en volume/volume de cette substance, on traite le virus de la fièvre 70 17450 -3- 2051520 aphteu.se pendant 16, 18 et 24 heures. Par inoculation de chaque fois _9 ml à des cultures de cellules rénales de veau de même qu'après injection intramusculaire de chaque fois 10 ml à trois jeunes porcs réceptifs, on ne constate aucun signe d1infectiosité, 5 La solution virale inactivée est mélangée en parties égales avec l'adjuvant neutre de Freund et on inocule 2 ml de ce vaccin à chacun de cinq porcs. Après la vaccination, on peut déceler dans le sérum de tous les animaux des anticorps à effet neutralisant. Huit semaines après la vaccination avec le vaccin inactivé pendant 10 16 heures, quatre porcs sur cinq, et avec les àeux autres vaccins trois porcs sur cinq, présentent _1'imnunité vis-à-vis d'une infection massive avec des virus actifs du même type, les autres animaux étant moins atteints que les témoins. Exemple 5 15 En procédant comme décrit dans l'exemple 2, on traite le virus de la fièvre aphteuse pendant 24 heures avec de 1r é thylé thylène-imine et on constate son innocuité comme dans l'exemple 4. On ajoute à la suspension de virus 50 mg/ml de DEAE-dextrane et on injecte ce vaccin en quantités de chaque fois 10 ml à 20 porcs, par voie ■ 20 sous-cutanée. Les animaux produisent tous des anticorps à effet neutralisant contre le virus actif. Huit semaines après la vaccination, 18 porcs sur 20 ont acquis l'immunité vis-à-vis de l'infection par des virus actifs de la fièvre aphteuse, de même type, et les 2 porcs restante présentent des symptômes très atténués par 25 rapport aux témoins n'ayant pas subi de traitement préalable. Exemple 6 - • Le procédé décrit dans l'exemple 1 est appliqué à l'inacti-vation du virus de la rhinotrachéite bovine infectieuse, c'est-à-dire un représentant des virus contenant de l'acide désoxy-30 ribonucléique, au lieu du virus de la fièvre aphteuse. On constate là aussi une diminution progressive du pouvoir infectant, qui correspond à une réaction du premier ordre. Après une durée d'action de 16 heures, on ne peut plus déceler aucune infectiosité. On injecte, par voie intramusculaire, à chacun de dix cobayes, 2 ml 35 d'une solution virale traitée pendant 16 heures. Trois semaines après la vaccination, on peut déceler dans le sérum de ces animaux la présence d'anticorps à effet neutralisant contre le virus de la 70 17450 -4- 2051520 rhinotrachéite bovine infectieuse. Exemple 7 On repète le mode opératoire décrit dans l'exemple 6 en utilisant 0,05 f<> en volume/volume d'éthyléthylène-imine au lieu de 5 0,1 % de cette substance. On constate là aussi une diminution linéaire du pouvoir infectant et au bout de 20 heures, on ne peut plus déceler aucun pouvoir infectant. Exemple 8 On ajoute de la manière'décrite dans l'exemple 1 à une sus-10 pension du virus de Sindbis sous la forme d'un liquide infecté de culture de cellules rénales du jeune hamster, parallèlement 0,05 i» en volume/volume d'éthyléthylène-imine qui a déjà été conservée pendant 14 mois à la température ambiante, et de l'éthyléthylène-imine fraîchement préparée et conservée à 4°0 seulement. On pré-15 lève d'heure en heure des échantillons qu'on neutralise "par addition d'une quantité totale de 2 fo de thiosulfate de sodium et on inocule ces échantillons à l'état non dilué de même qu'à l'état dilué de 0,1 en 0,1, en une quantité de 0,03 ml à chacune de cinq jeunes souris, par voie intracérébrale. Le pouvoir infectant de la 20 solution -virale disparaît progressivement en totalité et de la même façon pour les deux inaetivstions. Ceci signifie que l'éthyl-éthylène-imine conservée pendant 14 mois à la température ambiante a conservé la même activité que 1*éthyléthylène-imine fraîchement préparée et conservée au réfrigérateur. 70 17450 -5- 2051520 REVENDICATION Application de l'éthyléthylène-imine comme agent inactivateur dans la préparation d'antigènes inactivés pour compositions pharmaceutiques.