FR 2040473 A1 19710122 FR 7015787 A 19700429 70 15787 . 2040473 ' ' 1 'La présente invention concerne un procédé perfectionné de préparation des esters d'aieoyle inférieurs de l'a-L-aspartyl-L-phénylalanine (dénommé ci-après ct-APE).o L'a-APE possède des propriétés édulcorantes semblables h celles du sucre de canne qui le 5 font considérér comme" un'nouvel agent édulcorant (brevet belge •n° .717 375)- . ^ ... * Antérieurement à l'invention, on produisait lfa-APEl.par mise en contact d'un dérivé de 1!acide aspartique dans lequel des groupes protecteurs, ont "été fixés au groupe ami.no et #'-i.|arboxyle " ù 10 et dans lequel le groupe a-carboxyle a été transformé ën un groupe réactif, avec un ester de la L-phénylalanine, et élimination séparée de deux groupes protecteurs (brevet des Pays-Bas *0„P. I. n°68X>Qp). lie procédé sus-mentionné ne peut pas être appliqué sur une grande échelle puisqu'il comporte de nombreuses opérations et 15 nécessite de nombreuses matières premières et, de plus, le rendement total est très faible. L'invention concerne un procédé avantageux et industriel de préparation d'une a-APE ne possédant pas ces-défauts et qui est caractérisé par la réaction 'd'un anhydride L-aspartique protégé 20 à. l'azote, dans lequel un groupe protecteur est un groupe formyle, carbobenzoxy ou paraméthoxycarbobenzoxy, suruun ester aieoyBjie inférieur dé lajL-phénylalanine dans un solvant organique et par lllimi-nation du groupe protecteur par des moyens appropriés„ Il es&^ohnu qu'on obtient ;un-déîivé ûfràspa^tyliquejdu- type amidq^Qn 25 faisant réagir un anhydride aspartique protégé à l'azote sur une aminé, La réaction sus-mentionnée fournit un mélange de dérivés d'à et P-aspartyle. Le rapport de formation des dérivés a et 0 protégés à l'azote dépend non seulement du groupe protecteur à 30 l'azote et de l'aminé, particulière employée, mais aussi des solvants utilisés* Un dérivé du P-aspartyle se forme très fréquemment en quantité beaucoup plus importante. Dans le cas où l'on obtient une plus forte proportion -de. dérivé d*a-aspartyle, le rendement est faible si l'on utilise comme aminé un ester alcoylique d'amino-35 acide. Par exemple, un dérivé 0 se forme en plus grande quantité qu'un dérivé a dans la réaction de l'anhydride N-acétyl-L-asparti-que sur l'aniline (j. Chenu Soc„, 1953* ^53). Dans la réaction : 70 15787 2 2040473 de l'anhydride N-oarbobenzoxy-L-aspartlque-sur l'ester éthyli-que de la glycine, l'ester éthylique.-de 1§. P-N-carbobenzoxy-L-aspartylglycine est obtenu avec, un rendement de tandis que le rendement en dérivé a est seulement de.-19$. Si l''on-. 5 utilise un ester éthylique de la L-tyrosine à la -place- de l'ester éthylique dé la glycine, il se forme cependant 15$ d'un "ester éthylique de la P-N-carbobenzoxy-L-aspar.tyl-L-ty'rosine et 40$ du dérivé a correspondant, (j. Chenu, Sos.., 1952, 24), - La réaction selon 1"invention fournit, également en 10 même temps, des esters a et 3 d'alcoyle protégés à l'azote de la L-aspartyl-L-phénylalanine. Circonstance favorable, le dérivé a protégé à l'azote se forme de préférence avec un rendement élevé tandis que la quantité de dérivé (3 formée est très faible» L'a-APE a un pouvoir édulcorant très fort, au contraire les esters 15 alcoyliques inférieurs de la g-L-aspartyl-L-phénylalanine (déno-més 0-APE) préparés par élimination du groupe protecteur du dérivé P- protégé à l'azote ont un goût légèrement amer. Par conséquent, la P-APE doit être éliminée dans une proportion suffisante du produit envisagé, l'a-APE. On sait en général que la séparation 20 des dérivés a et p de l'aspartyle est difficile («J» Chem. Soc., 1959» 3868). Cependant, un procédé de séparation facile des APE a et 3 ou bien des dérivés a et p protégés à l'azote est décrit dans l'invention. L'anhydride N-formyl-L-aspartique, l'anhydride N-carbo-25 benzoxy-L-aspartique et 1'anhydride N-p-méthoxycarbobenzoxy-L-as-partique, qui sont employés comme réactifs, peuvent être facilement obtenus à partir de l'acide L-aspartique avec un rendement ' élevé. Ledit anhydride L-aspartique protégé à l'azote est avantageusement préparé par synthèse en traitant par l'anhydride acéti-jjô que un acide L-aspartique protégé à l'azote. Il suffit d'employer l'anhydride acétique dans une proportion comprise entre 1 à l,2mol£s par mol® d'un acide L-aspartique protégé à l'azote.Ladite réaction est en général mise en oeuvre dans un solvant organique à une température comprise entre 0 et 60°Cc On fait réagir dans un solvant 35 organique 1'anhydride L-aspartique.protégé, à l'azote'"-ainsi"obtenu sur un ester d'alcoyle inférieur de la L-phénylalanine, -d'ans lequel le groupe alcoyle est un radical méthyle, éthyle ou propyle. 70 15787 3 2040473 On obtient ainsi un ester dfaieoyle inférieur protégé • à l'azote de 1'â-L-aspartyl-L-phénylalanine qui est le produit intermédiaire cherché. L'ester de la L-phénylalanine est en général employé dans là proportion de 1 à 2 moles d'anhydride L-aspar-5 tique protégé à l'azote. On peut utiliser des solvants organiques s'ils peuvent dissoudre Tes deux réactifs sans jamais réagir sur .. . eux. Des solvants typiques sont l'acétate d'éthyle, le propionate . de méthyle, le t-étrahydrofùrane, le dioxane, l'éther^ le chloroforme, le N,N-diméthylforir^m.ide, le benzène et l'acide acétique. 10 Bien.que eette réaction- de condensation se produise, sans à-coups à la température ambiante, la vitesse de réaction peut être . accrue par chauffage du mélange réactionnel. Cependant, si la température de réaction est trop élevée, une réaction ,secondaire telle que'la racémisâtion tend à se produire. Par conséquent, .15 ..ladite réaction de Condensation est en général mise en oeuvre à une température ".inférieure â 60°C, de préférence à ,.une tempé-... rature-inférieure à 30°C. . , En ce qui concerne le dérivé N-protégé obtenu,par la réaction, de condensation, on élimine le groupe protecteur .par des 20' procédés appropriés fonction de sa nature particulière, tels que l'hydrogénation catalytique et le traitement par l'acide bromhy-drique ou l'acide chlorhydrique. On obtient ainsi un ester de la L-aspartyl'-L-phénylalanine. L'ester de la L-aspartyl-L-phénylalânine ainsi obtenu 25 contient une faible prdportion de P-APE si le dérivé (3-N protégé n'est pas séparé des dérivés a N-protégés par les procédés men-. tionnés oi-aprèsAprès recristallisation dans l'eau ou dans de l'eau mélangée à un solvant organique solub'le dans l'eau tel que le méthanol et l'éthanol, on sépare de la solution par cristal-30 lisation uniquement l'a-APE. Il est donc facile de séparer les mé langes et p*AgSefc leurs constituants. La séparation est" également effectuée avant d'élimi-v ner les groupes protecteurs des dérivés a et p N-protégés. Les solubilités.des dérivés a et p N-protégés varient suivant le sol-35 vant, mais la différence entre celles des deuxdérivés dans un même solvant n'est pas très grande. Par conséquent, on considérait comme difficile la séparation à ce stade. A la suite de l'étude de la demanderesse, on a observé que la différence des solubilités 70 15787 t ; : 2040473 entre les dérivés a et N-protégés augmente par leur' mise en contact avec une aminé telle qu' une trialcoylamine>, vl 'aniline, la pyridine et les esters d"aminoacide pour former'les sëls correspondants, , • " •? 5 Par conséquent, la séparation peut.aussi être éfféc- tuée facilement à ce stade„ Par exemple, quand un ester d'alcoyle inférieur de la phénylalanine est employé à raison de 2 moles par mole d'anhydride L-aspartique N-protégé, des dérivés a et 0 N-protégés existent dans la solution obtenue sous forme de leurs 10 sels d'ester d'alcoyle inférieur de la L-phénylalanine. La solubilité du sel d'un dérivé 0 dans divers solvants organiques'"tels que l'acétate d'éthyle est bien inférieure à celle du sel du dérivé a correspondant, par conséquent,, le dérivé 0 est facilemfeht séparé du mélange réactionnel« 15 Le procédé selon 1* invention présente ces avantages parce qu'il comporte mciis d'opérations que le procédé antérieurement connu, sa mise en oeuvre est facile et le produit envisagé est obtenu avec un rendement élevé à partir de l'acide aspartique. Bien qu'une 0-APE se formé aussi en même temps qu'une a-APE par 20 la réaction selon l'invention, la quantité de 0-APE est bien inférieure à celle d'a-APE. Le rapport de l'a-APE à la 0-APE est supérieur à 4,5/1. De plus, la séparation du mélange des os-et 0-/\FE^ ou des dérivés a et 0 peut être réalisée facilement. Par "Conséquent, l'invention concerne un excellent procédé industriel de- préparât±n 25 d'esters d'alcoyle inférieursde 1 'a-L-aspartyl-L-phénylalanine (a-rfiEE) Les exemples ci-après expliquent la mise en oeuvre de l'invention, EXEMPLE_1 9g de chlorhydrate d'ester méthylique de la L-phénylala-30 nine sont mis en suspension dans 80 ml de chloroforme et ensuite on neutralise cette suspension en ajoutant 4,4g de triéthylamine pour dissoudre l'ester. On ajoute 100ml d'éther à la solution obtenue et on refroidit le tout dans un bain de glace pendant lOmn. Ensuite, on sépare par filtration, puis lave à l'éthër, le 35 chlorhydrate de triéthylamine formé. On concentre le filtrat et les liqueurs de lavage sous pression réduite pour obtenir un ester méthylique de la L-phénylalanine. L'ester méthylique de la L-phénylalanine obtenu et 5g d'anhydride N-carbobenzoxy-L-aspar- ■70 15787 2040473 tique sont dissous dans 100ml d'acétate d'éthyle et on agite à la température ambiante pendant 5h puis on laisse reposer une nuit .Lés cristaux séparés se .dissolvent rapidemént par chauffage et l'on refroidit la solution à la température ambiante en agitant 5 à nouveau. Les 2,2g de cristaux séparés"sont recueillis par filtratlon. Après addition de 50 ml d'acétate d'éthyle au filtrat, la solution obtenue est lavée à l'acide cElorhydrique IN et ensuite à l'eau. Les liqueurs de lavage sont concentrées sous pres-10 sion réduite. On fait recristalliser le résidu à partir d'un mélange de méthanol et d'éther poir obtenir 3*5gde chlorhydrate d'ester méthylique de N-phénylalanine. La couche d'acétate d'éthyle est desséchée par du sulfate de sodium anhydre et concentrée sous pression réduite. Le 15 résidu est dissous dans x150 ml d'acide acétique à 75$ et est hydrogéné catalytiquement, en présence de lg de charbon palladié à 5à la température ambiante, en agitant. Après avoir séparé par filtratlon le catalyseur et concentré le filtrat sous pression réduite on fait recristalliser le résidu dans l'eau pour obtenir 4g 20 d'aiguilles d'un ester méthylique de l'a-L-aspartyl-L-phénylanine fondant à 234-235°C (avec décomposition). Les produits obtenus sont identiques en ce qui concerne leur spectre infrarouge, leur chromatogramme sur papier, leur point de fusion et leur composition élémentaire à un échantillon authentique préparé par un autre 25 procédé de synthèse. Analyse élémentaires C H "N(J6) observés 55,45 6,10 9>39 calculé pour C^H^O^.^Etp 55,44 6,31 9>24. 30 ■ Les 2,2g de cristaux qui se séparent d'abord du mélange susmentionné obtenu par une réaction de condensation sont recristallisés dans'une solution d'acétate d'éthyle de manière à obtenir 1,3g d'aiguilles ayant une température de fusion entre 35 138 et 138,5°C. Ces aiguilles sont identifiées comme le sel de L-phénylalaninate de méthyle du N-carbobenzoxy-P-L-aspartyl-L-phé-nylalaninate de méthyle, par leur spectre infrarouge, leur composition élémentaire et le produit de leur hydrogénation. Les résultats de l'analyse élémentaire sont; 70 15787 2040473 C H N{%) observés ' 63,35 6,21 6,63 calculé pour s 63,25 6,14 6,92 5 On dissout les 1,3g de cristaux obtenus dans 100ml d'acide acétique à 75$ et on ajoute à la solution 0,2g de charbon palla-dié à 5$. Le mélange est hydrogéné catalytiquement à la température ambiante pendant 4h„ Après cristallisation d'un mélange d'eau et d'éthanol, on obtient 0,6g d'aiguilles d'ester méthyli-10 que de la P-L-aspartyl-L-phénylalanine fondant entre 128 et l89°C (avec décomposition). Sa composition élémentaire est; N($) observés 9>32 calculé pour ci4%8°5^2 *V^Hg0 9*24 15 EXEMPLE_2 On met en suspension 4,8g de chlorhydrate d'ester méthylique de la L-phénylalanine dans 40ml de chloroforme.On neutralise la suspension puis la dissout en ajoutant 2,3g de triéthyla-20 mine. La solution obtenue est refroidie dans un bain de glace et on y ajoute 50 ml d'éther. Au bout de 10 mn, on sépare par filtratlon le chlorhydrate de triéthylamine formé et le lave à l'éther. Le filtrat et les eaux de lavage sont concentrés de manière à obtenir l'ester méthylique de la L-phénylalanine. Cet ester est 25 dissous dans 50ml d'acétate d'éthyle et en y ajoute 5g d'anhydride N-carbo-benzoxy-L-aspartique. Le mélange réactionnel est agité à la température ambiante pendant lhet laisse au repos une nuit. La solution obtenue est lavé^'âvec une solution normale d'acide chlorhydrique et ensuite à l'eau, puis séchéeavec du sulfate anhydre de sodium. 30 Après concentration de la solution sous pression rédui te on dissout le résidu dans 150ml d'acide acétique à 75$ et on ajoute 0,8g de carbone palladié à 5$- Le mélange réactionnel est hydrogéné catalytiquement à la température ambiante pendant 5h. Après élimination du catalyseur, on concentre le filtrat sous pres-35 sion réduite. On fait cristalliser le résidu dans l'eau pour obtenir 3,2g d'aiguilles fondant entre 234 et 235°C (avec décomposition). Ces cristaux sont identifiés comme étant l'ester méthylique pur de l'a-L-aspartyl-L-phénylalanine par le spectre infrarouge, 70 15787 7 2040473 le point .de fusion, par analyse par électrophorèse sur papier (l'électrophorèse est mise en oeuvre dans. une. solution aqueuse d'acide, acétique de pH 2,77 sous 30 V/cm„ Le chromâtogramme présente une seule tache quand il est développé à la ninhydrine). 5 On obtient 1,1g d'un mélange cristallisé d'esters méthyliques-a-, et p- de la L-aspartyl-L-phényralanineà. partir de la liqueur-mère. • EXEMPLE_3 On ajoute, à une solution-de 2,67g d'acide, para-métho-10 xycarbobenzoxy-L-aspartique dans le tétrahydrofurane, 2,06g de dicyclohexylcarbodiimide dans 20 ml de tétrahydrofurane„ On obtient ainsi une solution d'anhydride N-p-méthoxycarbobenzoxy-L-aspar-tique. Au- bout d'une heure, on ajoute lentement à la solution ci-dessus-d'anhydride.20 ml d'pae so lut ion dans le chloroforme 15 préparée par neutralisation de 2,63g de chlorhydrate d'ester éthylique de L-phénylalanine par 1,68ml de triéthylamine,. et on agite pendant 2h. : Ensuite, la dicyclohexylurée produite est séparée par filtration et le filtrat est concentré, le résidu est dissous dans 50ml de chloroforme puis lavé à l'acide chlorhydrique dilué et 20 ensuite à l'eau„La solution obtenue est.-séchée. avec du sulfate de sodium anhydre et est ensuite concentrée de manière à obtenir des cristaux blancs. Les cristaux sont mis en suspension dans un mélange de 10ml de méthanol" et 15ml d'acide acétique,, La suspension est hydrogénée catalytiquement en présence de 0,8g de charbon 25 palladié à 5% à la température ambiante-pendant 4h. Après élimination du catalyseur, on concentre la solution obtenue sous pression réduite de manière à obtenir une poudre blanche* On. fait cristalliser cette poudre dans l'eau chaude .de manière à obtenir. 1,96g d'es-. ter éthylique.de 11 -a -L-aspartyl-L-phénylalanine. Ces cristaux 30 fondent entre 246 et 247°C (avec décomposition). Les résultats d'une analyse élémentaire sont les suivants.» • C H N($É) observé i . 56,57 6,60 8,80 calculé pour C1^H2005U2"«^h20 56,77 6,67 8,87 ■35 . • EXEMPLE_4 9g de chlorhydrate d'ester méthylique. de la N-phénylala-nine sont mis en suspension dans 80ml de chloroforme» On neutralise 70 15787 2040473 et dissout la suspension par addition de 4,4g de-Âtèiéfcfcyïamine. On refroidit la solution obtenue dans un bain de glace auquel on ajoute lOOral d'éther» Au bout de lOmn, on sépare par filtratlon le chlorhydrate.de triéthylamine formé et le lavé à l'éther. 5 On concentre le filtrat et les eaux de lavage èt ■ . on dissout le résidu dans 50ml de N,N- diméthylforrramide0 Après addition de 2,9g d'anhydride N-formyl-L-aspartique à la solution obtenue, on agite à la température ambiante pendant lh puis laisse reposer une nuit.. Après élimination du solvant sous pres-10 . sion réduite, on dissout le résidu dans l'acétate d'éthyle et le maintient pendant une nuit dans un réfrigérateur» Les cristaux séparés sont rassemblés par filtratlon et lavés à l'acétate d'éthyle» On obtient 6,4g de cristaux fondant entre 131 et 133°C. Après recristallisation dans l'acétate d'éthyle, on obtient des cris-15 taux fondant entre 134,5 et 135,5°C avec un rendement de 5,1g. Ces cristaux sont identifiés comme constitués par le sel de L-phé-nylalaninate de méthyle du N-formyl-L-aspartyl-L-phénylalaninate de méthyle, par leur .spectre infrarouge et leur composition élémentaire. Les résultats de l'analyse élémentaire sont les suivants. 20 C H N($) observé; 59,61 6,37 8,35 calculé pour C25H51°8N3! 59»87 6,23 8,38 Les 5g de cristaux sont dissous dans le chloroforme 25 puis lavés à 1'acide chlorhydrique dilué et à l'eau puis séchés avec du sulfate anhydre de sodium et concentrés» On dissout le résidu dans 75ml de méthanol aqueux à 75# et on ajoute un mélange de 1ml d'acide chlorhydrique concentré et 10ml de méthanol. On agite le mélange résultant pendant 24 heures à la température am-30 biante, et ensuite on neutralise un équivalent de solution de bicarbonate de sodium. Après conservation de la solution dans un réfrigérateur pendant une nuit, les 2>6g de cristaux séparés sont rassemblés par filtratlon; Ils fondent entre 233 et" 234°*C en se décomposant. L'analyse quantitative des cristaux est exécutée 35 de la manière indiquée dans l'exemple 2. -Elle confirme que les cristaux sont un ester méthylique de 1*a-L-aspartyl-L-phénylala-nine. La pureté des cristaux est supérieure ou égale à 95$. 70 15787 2040473 EXEMPLES On met en suspension 16g, soit 0,06 mole d'acide N-carbobenzoxy-L-aspartique dans 24 ml d'acétate d'éthyle et on ajoute à la suspension 7,7g soit 0,072 moler. d'anhydride à 36%. 5 On agite la suspension à la température ambiante pendant six heures pour obtenir de l'anhydride N-carbobenzoxy-L-aspartique. Par ailleurs., on met en suspension 15,5g de chlorhydrate d1ester, méthylique de la L-phénylalanine dans un mélange de 100ml d'eau et de Ï50 ml d'acétate d'éthyle. On ajoute 7,3g 10 de carbonate acide de sodium à la suspension et ân agite, puis on laisse se former deux couches distinctes. i La couche d'acétate d'éthyle est ajoutée à la solution ci-dessus d'anhydride N-carbobenzoxy-L-aspartique en agitant pendant 15 mn. Â^f^s cette addition, on continue.à agiter pendant 15 six heures à la température ambiante. Le solvant est séparé par distillation sous pression réduite. Le résidu est dissous dans un mélange de 90ml de méthanol et 45 ml d'eau et on y ajoute ensuite 2,2g de carbonate acide de sodium. On ajoute lg de charbon palladié à 5# à la solution, et on hydrogène l'ensemble pen-20 dant cinq heures à la température ambiante. Le catalyseur est séparé par filtratlon et le filtrat est concentré sous pression réduite. On dissout le résidu dans 1,51 d'eau, dont 5 microlitres sont soumis à la même analyse par électrophorèse sur pa^Ler que dans l'exemple 2. On forme sur. le papier une tache avec de la 25 ninhydrlne associée à unssl de cadmium de la manière décrite par J. Heilmann et al. (Z. Physiol. Chenu, 309» 210 (1957). Les taches colorées correspondant à l'ester méthylique de 1'a-L-aspartyl-L-. phénylalaàine et à l'ester méthylique de la {3-L-aspartyl-L-phényla-lanine sont séparées par découpage et éluées (avec du méthanol et 30 les coefficients d'absorption des éluat^s sont mesurés à 510 milli-microns. 0'n apprend qu'il y a l4,8g (rendement : 81$) d'un ester méthylique de l'a-L^-aspartyl-L-phénylalanine et 3,3g (rendementsl8$) d'un ester méthylique dejla p-L-aspartyl-L-phénylalanine dans la totalité de la solution. Cette solution est concentrée sôus pressjm 35 réduite. Le. résidu est recristallisé dans l'eau pour obtenir 11,4g d'aiguilles (rendement 63$). Le fait que les cristaux sont uniquement de l'ester méthylique de 1'a-L-aspartyl-L-phénylalanine est confirmé par une électrophorèse sur papier. Bien entendu, diverses modifications peuvent être.apportées par l'homme de l'art du procédé qui vient d'être décrit uni-V quement à titre d'exemple: non Limitatif, sans sortir du carfre de l'invention. ~ ; 70 15787 10 2040473 REVENDICATIONS 1o Procédé de préparation dsun ester d?alcoyle inférieur de 1%-L-aspartyl-L-phénylalanine de formule : H9N-GH-C0NH-CH-G00R C 5 S caractérise en ce qu'on fait reagir un anhydride L-asparfcique- 1Q N-protégé dans lequel le groupe protecteur est un radical formyle, carbobenzoxy ou para-méthoxycarbobenzoxy, sur un ester d'alcoyle inférieur de la L-phénylalanine dans un solvant organique et en ce quffon élimine ensuite le groupe protecteur du produit intermédiaire constitué par un ester d8alcoyle inférieur de la 15 N-protégée-a-L-aspartyl-L-phénylalânine, R étant un radical alcoyle inférieur dans ladite formule»