FR 2029689 A1 19701023 FR 7003025 A 19700128 70 03025 i 2029689* La présente invention, est relative à un. procédé de production d'acide citrique. L'invention concerne plus particulièrement un procédé de production d'acide citrique qui consiste à inoculer une bactérie accu-5 mulant l'acide citrique et assimilant les hydrocarbures, du genre Oorynebacterium. au sein d'un milieu de culture aqueux contenant, comme source de carbone principale, au moins un hydrocarbure paraf-finique normal contenant 9 à 20 atomes de carbone dans la molécule,, après quoi on fait incuber la culture à un pH compris entre environ 10 5 et 8 jusqu'à ce que l'acide citrique soit sensiblement accumulé dans le bouillon de culture et on récupère l'acide citrique dans ce bouillon. L'acide citrique fait l'objet d'une grande demande et est utilisé, par exemple, comme agent acidulant dans des boissons et 15 dans des sirop pharmaceutiques. En ce qui concerne la production d'acide citrique par fermentation, des procédés dans lesquels on utilise des microorganismes tels que les moisissures du genre Pénicillium. Asuergillus. etc... sont bien connus et ont été souvent cités dans la littérature. 20 Toutefois, ces procédés dépendent invariablement de l'utilisation de sucres et d'autres sources de carbone coûteuses, et la période de fermentation atteint 5 à 12 jours. Des procédés utilisant des levures et des bactéries ont été récemment décrits, mais les rendements d'acide citrique par rapport aux sources de carbone utilisées 25 n'ont jamais été aussi satisfaisants que ceux auxquels on pouvait s'attendre. La demanderesse a effectué une étude poussée concernant la fermentation avec des hydrocarbures comme sources de carbone, et a finalement découvert qu'un groupe de bactéries, particulièrement 30 celles appartenant au genre Corynebacterium. produisaient de l'acide citrique à partir de n-paraffines dans des conditions aérobies, avec des rendements exceptionnellement élevés. La présente invention est l'aboutissement des découvertes qui précèdent. Aux points de vue industriel et économique, le procédé de la 35 présente invention est de beaucoup supérieur aux procédés classiques du fait que (1) les hydrocarbures de la série des n-paraffines à utiliser comme sources de carbone sont disponibles en quantités importantes et sont peu coûteux, (2) la période de fermentation requise n'est que de 2 à 3 jours, soit moins de la moitié du temps 40 requis dans la technique antérieure, (3) les quantités plus petites d'impuretés dans la culture permettent une opération de purifica 70 03025 2 2029689. tion plus facile et (4) l'acide citrique est accumulé avec des rendements qui ne sont pas inférieurs à l'équivalent en poids des n-paraffines utilisées comme source de carbone. La présente invention a pour objet : 5 - un procédé de production d'acide citrique avec un bon ren dement ; -la réduction de la période de fermentation j - une opération de purification plus facile, grâce à laquelle le procédé de production d'acide citrique peut être industrialisé. 10 On atteint facilement les buts susmentionnés en inoculant une bactérie accumulant de l'acide citrique et assimilant les hydrocarbures, appartenant au genre Corynebacterium. au sein d'un milieu de culture aqueux contenant, comme source de carbone principale, au moins un hydrocarbure paraffinique normal ayant 9 à 20 atomes de' 15 carbone dans la molécule, après quoi on fait incuber la culture à un pH d'environ 5 à environ 8 jusqu'à ce que l'acide citrique soit accumulé en quantité notable dans le bouillon de culture, et on récupère dans ce dernier l'acide citrique accumulé de cette manière. La bactérie ci-dessus mentionnée, du genre Corynebacterium qui 20 doit être utilisée selon la présente invention, peut être une souche quelconque, à condition qu'elle soit capable d'utiliser les hydrocarbures mentionnés ci-dessus et de les convertir en acide citrique. On donne ci-après quelques exemples typiques de bactéries qui 25 peuvent être utilisées avantageusement dans la présente invention : Corvnebacterium sp. 1304 (IFO 12731) Oorynebaoterium sp. iT° 177 (IFO 12728) Corynebacterium sp. ïfo 416 (IFO 12729) Corvnebacterium sp. ffo 803 (IFO 12730) Oorvnebacterium sp. 981 (IFO 13114) Corynebacterium sp. 3J° 218 (IFO 13113) Corynebacterium sp. N° 117 (IFO 13115) Corynebacterium sp» E0 279 (IFO 13112) Corynebacterium sp. ]jo 384 (IFO 13117) Corynebacterium sp. 628 (IFO 13116). Dans la liste ci-dessus, les nombres IFO sont les numéros de dépôt à l'organisme "Institute of Fermentation, Osaka (Japon)". Les caractéristiques microbiologiques de ces bactéries typiques figurent dans les tableaux 1 et 2. 40 Oorynebaoterium SP.N°177 IFO 12728 TABLEAU 1 A Oorynebaoterium sp «if 4-16 1ÊÙ 12729 Oorynebaoterium SP.N°981 IFO 15114 0 oryneb aot erium BP.N° 218 IFO 15115 O o to o bO en Forme et dimension Colonies en forme de bâtonnets, de dimensions variables ; cellules relativement longues en forme de massue ; 0,7-0,9 x 1,2-1,8yu Colonies en forme de bâtonnets, de dimensions variables ; cellules relativement longues en forme de massue ; 0,8-0,9 x 1,3-1,8yu Colonies en forme de bâtonnets, de dimensions variables ; cellules relativement longues en forme de massue ; Colonies en forme de bâtonnets, de dimensions variables ; cellules relativement longues en forme de massue, dont certaines sont curvilignes. Mobilité Immobile Immobile Immobile Immobile Sporulation Asporogène Asporogène Asporogène Asporogène Coloration Réaction Réaction Réaction Réaction par le Gram positive positive positive positive Caractéristiques de culture : Plaque de gélose nutritive Croissance moyenne; bords irréguliers ; colonies convexes au centre, opaques, ternes, grises avec une touche jaunâtre. Croissance moyenne, bords irréguliers ; colonies plates, opaques, ternes, grises, avec une touche jaunâtre.- Croissance satisfaisante, bords irréguliers ; colonies convexes, sèches, opaques, ternes, grises avec une touche jaunâtre. Croissance satisfaisante, bords irréguliers ; colonies convexes, sèches, opaques, ternes, grises avec une touche jaunâtre K> O K> *£> O 00 sO Gélose nutritive inclinée Croissance moyenne, colonies en chapelet ou échinulées, opaques, ternes, grises avec ■une touche jaunâtre, sèches. Croissance moyenne, colonies en chapelet ou échinulées, opaques n/grises avec une touche jaunâtre, sèches, ./ternes, Croissance satisfaisante ; colonies en chapelet ou échinulées, grises avec une touche jaunâtre. Croissance satisfaisante ; colonies en chapelet ou échinulées, grises avec line touche jaunâtre. TABLEAU 1 A (suite... ) Oorynebaoterium ap.lî* 1?7. »Ô 12?28 Oorynebaoterium sp.N° 416 IFO 12729 Corynebacterium sp.N° 981 IFO 13114 Corynebacterium sp. M"0 218 IFO 13113 Bouillon liquide Il se forme une pellicule épaisse ; oolônies transparentes ; léger sédiment. Il se forme une pellicule épaisse ; colonies transparentes } sédiment. Il se forme une pellicule épaisse ; colonies transparentes ; sédiment. Il se forme une pellicule épaisse ; colonies transparentes ; sédiment. Température optimale 37°C 32°C 28 - 37°C 28 - 37°C pH optimal 6-8 5-8 6 u 8 6-8 o o ou o K> UT K> O K) -O O 00 -o TABLEAU 1 B Oorynebact erium sp. N°117 IFO 15115 bp.N° 27 terium Ï51l2 Oorynebaoterium ?p.N° 628 IFO 15116 --4 O O CjU O K> en Forme et dimension Colonies en forme de bâtonnets, de dimensions variables; cellules relativement longues en forme de massue. Colonies en forme de bâtonnets, de di-menèions variables; cellules relativement longues en forme de massue, dont certaines sont curvilignes. Colonies en forme de Colonies en forme bâtonnets, de dimen- de bâtonnets, de sions variables ; dimensions varia-cellules relativement bles ; cellules longues relativement 0,8-0,9p. x longues en forme 1,8-2,3jx de massue. Mobilité Immobile Immobile Immobile Immobile Sporulation Asporogène Asporogène Asporogène Asporogène U1 Coloration par Réaction Réaction Réaction Réaction le Gram positive positive positive positive , Caractéristiques de cutlure : Plaque de gélose nutritive Croissance satisfaisante ; bords irréguliers, colonies convexes, opaques, ternes, grises avec une touche jaunâtre, sèches. Croissance satisfaisante ; bords irréguliers ; colonies plates, sèches, opaques, ternes, grises avec une touche jaunâtre. Croissance satisfaisante ; bords irréguliers ; colonies plates, sèches, opaques, ternes, grises av«o une touche jaunâtre. Croissance satisfaisante ; bords irréguliers ; colonies plates, sèches, opaques, ternes, grises avec une touche jaunâtre. K> O K> sO O 00 vO Gélose nutritive inclinée Croissance satisfaisante ; colonies en chapelet ou équi-nulées brun-jaune. Croissance satisfaisante ; colonies échinulées, grises avec une touche jaunâtre Croissance satia- Croissance satisfaisante ; colonies faisante ; colonies échinulées, grieeo «n chapelet ou équi-avec une touche nulées, grises avec jaunâtre une touche jaunât] TABLEAU 1 B (suit 3 o o a ) Oorynebaoterium èn.P 11? ttù 13115 0 orvneb aot e r ium ST3.ÎT0 279 IFO 13112 C°ryneb£cteF;Lu$ SB.N° 384 IFO 13117 Corynebacterium SÏ).N0628 IFO 13116 Bouillon liquide Il se forme une pellicule épaisse; oolonies transparentes, sédiment» Il se forme une pellicule épaisse ; colonies transparentes, sédiment. Il se forme une pellicule épaissej colonies transparentes, sédiment* Il se forme une pellicule épaisse; colonies transparent es, s édiment. Température optimale 28 - 37°C 28 - 37°C 28 - 37°0 28 - 37°0 pH optimal 6-8 6-8 6-8 6-8 *•>4 O O 00 o hO en K) O K) *o CT-00 vû 70 03025 7 2029689 ÏABIEAH 1 O C orynebacterium sp.N° 803 IFO 12730 Corynebacterium sp.N0 1304 IFO 12731 Forme et dimension Colonies en forme de bâtonnets, de dimensions variables. Cellules plus longues en forme de massue. 0,9-11,1 x 2-3jx Colonies en forme de bâtonnets, de dimensions variables. Cellules plus longues en forme de massue, 0,9-11,1 x 2-3yu -^q Mobilité Immobile Immobile Sporulation Asporogène Asporogène Coloration par Réaction positive Réaction positive le Gram 15 Plaque de gélose Croissance satisfai- Croissance satisfai-nutritive santé ; bords irré- santé ; bords irréguliers ; colonies guliers ; colonies sèches, opaques, ombiliquées, sèches, ternes, d'un brun- opaques, ternes, grises jaunâtre clair. avec une touche de jaune. Gélose nutritive inclinée 25 Croissance satisfaisante ; colonies en chapelet ou échinulées, opaques, ternes, d'un brun jaunâtre clair. Croissance satisfaisante ; colonies en chapelet ou échinulées, opaques, ternes, grises avec une touche de jaune. Bouillon liquide II se forme une pelli- Il se forme une pellicule épaisse ; exile épaisse ; colonies colonies transparentes, transparentes, léger léger sédiment. sédiment. 30 Température 28 - 32°C 32°C optimale pH optimal 6-7 5-9 70 03025 8 2029689 TABLEAU 2 Corynebacterium Corynebacterium Corynebacterium Corynebacterium SP.N° 177 SP.H0 416 st>.N° 803 sx».îf°130^- 5 Oxygène Aérobie Aérobie Aérobie Aérobie Lait tournesolé non modifié non modifié alcali-nisé alcali-nisé 10 Gélatine non liquéfiée non liquéfiée non liquéfiée non liquéfiée Sulfure d'hydrogène Production Production Production Production 15 Indole Pas de formation Pas de formation Pas de formation Pas de formation Amidon Pas d'hydrolyse Pas d'hydrolyse Pas d'hydrolyse Pas d'hydrolyse Nitrates Pas de réduction Pas de réduction Séduction Réduction 20 Essai à la catalase Positif Positif Positif Positif Essai à l'uréase Positif Négatif Positif Positif 25 Métabolisme des sucres (Méthode Leifson) Développement d'acide en anaérobie Développe- Non ment d'aci-modifiés de en anaérobie Développement d'acide en anaérobie Fermentation. Production Production Production Production des sucres d'acide d'acide d'acide d'acide sans forma- sans forma- sans for- sans for-tion visi- tion visi- mation vi- mation vi-30 ble de gaz ble de gaz sible de sible de gaz gaz 70 03025 9 2029689 Ces "bactéries se présentent invariablement en bâtonnets aspo-rogènes, en forme de massue, aérobies, immobiles, Gram-positifs, de dimensions irrégulières, et d'après l'ouvrage de Bergey "Manual of Determinative Bacteriology", 7ème édition, on peut déduire qu'elles 5 appartiennent à la famille des Corynebacteriacea. La famille des Corynebacteriacea comprend les bactéries du genre Corynebacterium. Lysteria. Erysipelothrix. Microbacterium. C^Tiiiifwnrm^g et Arthrobacter« Cependant, les bactéries du genre Lysteria sont mobiles, alors que les bactéries du genre Erysipelo-10 thrlx présentent une caractéristique de cellules filamenteuses allongées et sont faiblement aérobies. Alors que les bactéries du genre Microbacterium produisent de 1* acide lactique et du lait tournesolé acidulé, des orga.ni.smes du genre Cellulomonas sont capables de décomposer la cellulose. 15 Ainsi, n'importe lesquelles des bactéries ci-dessus mentionnées diffèrent donc des bactéries utilisées dans la présente invention. Le résultat précédent laisse présumer que les bactéries selon la présente invention appartiennent ai genre Arthrobacter ou au genre Corynebacterium. 20 II existe cependant des différences entre les deux genres. En premier lieu, alors que les jeunes cellules de bactéries du genre Arthrobacter sont gram-négatives, leurs cellules mûres sont gram-positives. En d'autres termes ce sont des variantes sensibles au G-ram. De plus, les bactéries appartenant au genre Arthrobacter for-25 ment des cellules sphéroïdes caractéristiques contrairement aux bactéries selon la présente invention, qui sont dépourvues d'une telle caractéristique. Il est donc évident que la présente bactérie appartient au genre Corynebacterium. 30 Naturellement, les microorganismes peuvent subir une mutation, de façon spontanée ou provoquée, et les présentes bactéries ne font pas exception à la règle. On comprendra cependant, que des variantes et mutants de ce genre peuvent naturellement, être utilisés dans le procédé de la présente invention, pour autant qu'ils soient encore 35 capables d'utiliser des hydrocarbures pour produire l'acide citrique. Le milieu de culture à utiliser dans la présente invention peut varier selon les souches utilisées, mais des sources de Carbone telles que les n-paraffines ou diverses matières brutes contenant des n-paraffines, par exemple le gas-oil et le gas-oil lourd, peuvent 40 être utilisées. Particulièrement désirables sont les hydrocarbures 70 03025 10 2029689 ayant 9 à 20 atomes de carbone dans la molécule, tels que le n-nonane, le n-décane, le n-undécane, le n-dodécane, le n-tridécane, le n-tétrade cane, le n-pentadécane, le n-hexadécane, le n-heptadécane, le n-octadécane, le n-nonadécane, et le n-éicosane, ainsi que leurs 5 mélanges. Les hydrocarbures sont généralement utilisés en une quantité telle que la concentration, dans le milieu de culture de la ou des paraffines normales ayant 9 à 20 atomes de carbone dans la molécule, soit au total de 3 à 20 ^ (volume/volume). 10 Etant donné que de tels hydrocarbures se dissolvent diffici lement dans l'eau, on les introduit dans un milieu de culture aqueux en agitant ou en secouant en vue d'obtenir une suspension contenant des particules très fines» Si on le désire, un agent de suspension, par exemple, un agent tensio-actif du type du monostéarate de polyoxy-15 éthylène sorbitan peut être utilisé. De tels hydrocarbures constituent par eux-mêmes des sources de carbone satisfaisantes, mais, si on le désire, des sources de carbone courantes telles que les hydrates de carbone (par exemple le glucose) peuvent être utilisées conjointement avec les hydrocarbures. 20 En ce qui concerne les sources d'azote, on peut utiliser divers sels minéraux d'ammonium tels que NH^Cl, (HH^JgSO^, (HH^gHPO^, JH^OH, NH^NO^, etc..., l'urée, les sels d'ammonium de divers acides organiques, par exemple l'acétate d'ammonium et diverses substances azotées organiques telles que la levure séchée, l'extrait de levure, 25 l'extrait de viande, la farine de poisson, la farine de soja, la liqueur de macération du maïs, la peptone, etc... Ces sources d'azote peuvent être utilisées isolément ou en combinaison. Si on le désire, on peut également ajouter au milieu utilisé, les. sels minéraux utilisés de façon classique, tels que les sels 30 de fer, de manganèse, de calcium, de magnésium, de potassium, de sodium, etc..., ainsi que divers éléments^nutritifs. Le pH du milieu peut être compris dans une gamme étendue permettant le développement de la bactérie utilisée et généralement on préfère un pH compris entre 5 et 8 et particulièrement entre 6 et 35 8. Si, au cours de la culture, le pH diminue sous l'effet de l'acide citrique produit, il est judicieux d'ajuster le pH du milieu pour l'amener dans l'intervalle précité tout en continuant le culture. A cet effet, on peut ajouter de temps à'autre au milieu de culture un agent neutralisant tel. que par exemple CaCO^, CafOHjg, 40 NHjOH, UaOH ou Na^CO^. Dans une variante, pour obtenir une action. 70 03025 ii 2029689 adéquate de tamponnement du milieu, on peut ajouter CaCO^ de façon préliminaire en une quantité déterminée selon la réduction possible du pH. Bien que la température d'incubation puisse varier dans une 5 certaine mesure en fonction de la bactérie particulière utilisée, elle est généralement comprise entre 20 et 40°C. lorsque le procédé objet de la présente invention est mis en oeuvre, il est préférable d'utiliser un milieu de culture liquide, et d'effectuer l'incubation dans des conditions aérobies, c'est-à-10 dire avec une aération dans des conditions statiques ou submergées. Au cours de cette opération, il est possible d'éliminer la mousse suivant les besoins, en utilisant des agents anti-mousse classiques quelconques tels que des dérivés de polyoxypropylène, de l'huile de soja, de l'huile de silicone, de l'huile de lard, 15 etc... Selon la présente invention, on isole et on récupère l'acide citrique accxunulé dans le milieu par n'importe quel procédé connu. Ainsi, des opérations telles qu'une neutralisation, un chauffage, un refroidissement, une précipitation, une filtration, une 20 centrifugation, une concentration, une décoloration, une cristallisation et un séchage, et également si nécessaire,un traitement par une résine échangeuse d'ions, peuvent être effectuées seules ou en combinaison. I'acide citrique peut être facilement récupéré sous une forme cristalline par de telles opérations. 25 les exemples suivants sont donnés de façon à illustrer encore la présente invention, mais on comprendra cependant qu'ils ne limitent pas la portée de cette dernière. Dans toute la description, les pourcentages sont donnés en poids par volume, et les rendements sont calculés en poids d'acide 30 citrique produit par poids d'hydrocarbures paraffiniques normaux consommés. la relation entre les parties en poids et les parties en volume est identique à celle qui existe entre les grammes et les millilitres. 35 EXEMPLE 1 On inocule une culture de Oorvnebacterium sp. U° 416 (IEO 12729) à 120 parties en volume d'un milieu (pH 7) qui contient une fraction, de pétrole (4 fo) contenant une n-paraffine (92 fo) ayant 10 à 12 atomes de carbone, EHgPO^ (0,2 fo), MgSO^, 7H20 (0,05 fo), EeSO^, 40 THgO (0,02 fo), ÎÎH^Cl (0,4 fo), un extrait de levure (0,1 fo) et CaCO^ 70 03025 12 2029689 (3 f») et on fait incuber à 32°C pendant 64 heures. Le procédé donne 41,4 mg d'acide citrique par millilitre. On ajuste la culture au pH 6,8 en ajoutant NaOH 3N. On chauffe le bouillon à 95°C pendant environ 15 minutes et on le refroidit 5 à la température ambiante. On récupère le sédiment résultant par filtration. On met le produit en suspension dans 50 parties en volume d'eau, puis on y ajoute H2S04 5N, de façon à ajuster la suspension au pH 2. On filtre le sédiment ainsi formé ef on fait concentrer le filtrat sous pression réduite jusqu'à obtention d'un 10 sirop de concentration faible. On fait reposer le sirop dans une pièce froide, ce qui provoque la séparation de cristaux d'acide citrique. Le rendement obtenu est de 3,4 parties en poids, sous forme d'anhydride citrique. EXEMPLE 2 15 On inocule une culture de Corynebacterium sp. W° 803 (IFO 12730) à 40 parties en volume d'un milieu (pH 7) qui contient une fraction de pétrole (4 f>) contenant des n-paraffines (87 fo) ayant 16 à 20 atomes de carbone, KHgPO^ (0,2 fo) MgSO^, 7HgO (0,05 f") > MhS04, 7H20 (0,002 fo) FeS04, 7H20 (0,01 #), HH^O^ (0,5 fo), de 20 l'urée (0,1 fo), de la levure séehée (0,05 f>) et CaCO^ (3 f>) et on fait incuber à 28°0 pendant 3 jours. Le procédé donne 36 mg d'acide citrique par millilitre de bouillon. On traite 100 parties en volume de bouillon de la même façon que dans l'exemple 1, ce qui permet d'obtenir 3,24 parties en poids d'acide citrique sous forme de 25 cristaux. EXEMPLE 5 On inocule une culture de Corynebacterium sp. N° 1304 (IFO 12731) au même milieu que dans l'exemple 2 et on fait incuber à 32°C pendant 2 jours, ce qui provoque l'accumulation de 32 mg d'acide 30 citrique par millilitre de bouillon. On traite 100 parties en volume de bouillon de la même façon que dans l'exemple 1. Le procédé donne 2,8 parties en poids d'acide citrique sous forme de cristaux. EXEMPLE 4 35 On inocule une culture de 0orynebacterium sp. ÏT° 803 (IFO 12730) à 120 parties en volume d'un milieu (pH 7) qui contient du n-octadécane (4 fo), KH2P04 (0,2 fo), MgS04, 7H20 (0,05 f>), MnS04, 7H20 (0,001 fo), FeS04 (0,01 %), HH^ (0,5 #), de l'urée (0,1 fo), une liqueur de macération du maïs (0,05 fo) et CaCO^ (3 fo) et on 40 fait incuber à 28°C pendant 2 jours. Ce procédé dorme 44,2 mg d'aci 70 03025 13 2029689 de citrique par milligramme du bouillon résultant. On traite 100 parties en volume du bouillon de la même manière que dans l'exemple 1, ce qui donne 3,66 parties en poids d'acide citrique sous forme de cristaux. 5 EXEMPLE 5 On inocule une culture de Oorynebaoterium sp. N° 177 (IFO 12728) au même milieu que dans l'exemple 1 et on fait incuber à 34°C pendant 3 jours. Le procédé donne un bouillon contenant 24 mg d'acide citrique par millilitre. On traite 100 parties en volume 10 du bouillon, de la même façon, que dans l'exemple 1, ce qui donne 1,7 partie en poids d'acide citrique sous forme de cristaux. •rtrmple 6 On inocule les cultures suivantes au même milieu que dans l'exemple 2 et on fait incuber à 28°C pendant 3 jours, puis on 15 traite le bouillon de la même façon que dans l'exemple 1. Souche . Numéro d'accession Acide citrique mg/ml de bouillon Rendement par rapport à la n-paraffine, : % Récupération dans 100 ml de bouillon, S ïorynebacterium sp.N0 981 ïorynebact erium sp.N0 218 borynebact erium sp.N0 117 ïorynebact erium sp.N0 279 IFO 13114 IFO 13113 IFO 13115 IFO 13112 33 44 41 46 92 110 102,5 115 2,7 3,1 2,9 3,35 Corynebact erium sp.N0 384 IFO 13117 43 107,5 3,05 Corynebacterium sp.N0 628 1 IFO 13116 38 95 2,7 70 03025 14 2029689 - BBraroiCAIIONS - 1.- Procédé de production d'acide citrique, caractérisé par le fait qu'il consiste à inoculer une souche accumulant l'acide citrique et assimilant les hydrocarbures, du genre Corynebact erium 5 au sein d'un milieu de culture aqueux contenant, comme source de carbone principale, au moins un hydrocarbure paraffinique normal contenant 9 à 20 atomes de carbone dans la molécule, à faire ensuite incuber la culture à un pH compris entre environ 5 et 8 jusqu'à ce que l'acide citrique soit accumulé en quantités notables dans le 10 bouillon de culture, et à récupérer l'acide citrique accumulé dans ce bouillon. 2.- Procédé selon la revendication 1, dans lequel la température d'incubation est comprise entre 20 et 40°C. 3.- Procédé selon la revendication 1, dans lequel le pH du 15 milieu de culture est maintenu entre 6 et 8. 4.- Procédé selon la revendication 1, dans lequel la bactérie est Corynebact erium sp. N° 177, IFO 12728. 5.- Procédé selon la revendication 1, dans lequel la bactérie est Corynebact erium sp. ÎT° 416, IFO 12729. 20 6.- Procédé selon la revendication 1, dans lequel la bactérie est Corynebacterium sp. 3J° 803, IFO 12730. 7.- Procédé selon la revendication 1, dans lequel la bactérie est 0orynebacterium sp. 1304, IFO 12731. 8.- Procédé selon la revendication 1, dans lequel la bactérie 25 est Corynebacterium sp. H"0 981, IFO 13114. 9.- Procédé selon la revendication 1, dans lequel la bactérie est Corynebact erium sp. ÏT° 218, IFO 13113. 10.- Procédé selon la revendication 1, dans lequel la bactérie est Corynebacterium sp. ÎT° 117, IFO 13115. 30 11.- Procédé selon la revendication 1, dans lequel la bacté rie est Corynebacterium sp. N° 279, IFO 13112. 12.- Procédé selon la revendication 1, dans lequel la bactérie est Corynebacterium sp. U0 384, IFO 13117. 13.- Procédé selon la revendication 1, dans lequel la bacté-35 rie est Corynebacterium sp. ÎT° 628, IFO 13116.