FR 2026925 A1 19700925 FR 6944430 A 19691222 69 44430 1 2026925 La présente invention a pour objet un procédé et un réactif pour stabiliser les plaquettes du sang dans un échantillon de sang total frais ou de plasma riche en plaquettes, et permettant de compter les plaquettes dans 1®échantillon Le procédé 5 de l'invention consiste à ajouter à lséchantillon un composé stabilisant les plaquettes et les empêchant de seagglutinero Dans les cas de troubles de la coagulation du sang il est important de pouvoir déterminer de façon exacte le nombre de plaquettes trouvées dans le sang du patient» Cependant, si le 10 sang est prélevé et conservé pendant quelque temps, les plaquettes se sont agglutinées ce qui empêche un comptage exact de leur nombre» Le réactif selon l'invention contient environ 4 à 10 mg de pyridazine par ml d^un support liquide choisi parmi les solutions d'oxylate d9ammonium et de tris-(hydroxyméthyl)-amino-15 méthane» La présente invention est basée sur la découverte que l,addition d'une quantité déterminée de pyridazine à un échantillon de sang complet, tout de suite après son prélèvement, entraîne line réduction considérable de l'activation de surface 20 et de l'agglutination des plaquettes permettant ainsi d'étudier soigneusement et facilement le comportement des plaquettes» Un effet semblable est obtenu si de la pyridazine est ajoutée à un plasma riche en plaquettes. Ainsi en évitant l'agglutination des plaquettes, on peut compter exactement leur nombre dans l'échan-25 tillon. Cette technique est très importante pour le traitement de nombreuses maladies et plus particulièrement pour le traitement de l'infarctus du myocarde pour lequel il est essentiel de connaître l'activation de surface des plaquettes parce qu'elle se trouve en rapport direct avec la thrombose. Cette activation se reflète 30 dans un changement structural des plaquettes. Des plaquettes rondes, étendues, dendritiques abortives peuvent être comptées sous un microscope électronique à condition d'empêcher les plaquettes de s'activer et de s'agglutiner. L'invention a pour objet un réactif qui puisse être 35 utilisé facilement pour réduire l'activation de surface et l'agglutination des plaquettes du sang, facilitant ainsi le diagnostic par un comptage de ces plaquettes» 69 44430 2 2026925 L'invention a également pour objet un composé inhibiteur de 1'agglutination des plaquettes du sang qui, ajouté à du sang frais ou à un plasma riche en plaquettes, empêche l'agglutination des plaquettes et permette une étude facile et 5 exacte de leur comportemento L'invention a encore pour objet un réactif et son procédé d'application, permettant de déterminer 113 état du sang d'un patient ayant subi un infarctus du myocarde et évitant l'agglutination des plaquettes sanguineso 10 L'invention a aussi pour objet un réactif qui, employé pour une numération, évite l'agglutination des plaquettes et permet ainsi un comptage plus exact des plaquettes individuelles et une détermination plus précise de leur structure o L'invention a aussi pour objet des réactifs, 15 leurs méthodes d'emploi permettant le comptage des plaquettes sanguines dans des spécimens de sang pour lesquels le comptage immédiat des plaquettes n'est pas nécessaire, et améliorant l'efficacité ' des - 3 procédures de laboratoire et u du 2 c-diagnostic 1 : ; . , 20 L'invention a enfin pour objet un réactif qui puisse être utilisé pour le comptage de routine des plaquettes du sang liquide qui, pour cette raison, peut être facilement mesuré et manipulé. Ces objets et d'autres avantages décrits ci-dessous 25 sont réalisés d'une façon remarquable et inattendue, comme on le verra mieux par la description qui va suivre. Selon un mode de mise en oeuvre de l'invention, on ajoute à un échantillon de sang total frais ou de plasma riche en plaquettes une concentration suffisante du composé selon l'in-30 vention empêchant l'agglutination des plaquettes, à savoir la pyridazine, pour contrôler l'activation de surface et l'agglutination des plaquettes dans des échantillons de sang normaux et. pathologiqueso. Il semble que l'effet observé soit dû à l'influence de la pyridazine sur les substances activant et agglutinant les 35 plaquettes comme l'ADP, la thrombine, le collagène, la sérotonine, l'épinéphrine et le facteur de plaquettes III fournissant ainsi un mécanisme pour la stabilisation des plaquettes, assurant de cette façon un comptage facile et exact des plaquetteso 69 44430 3 2026925 Par lsaddition du composé empêchant 1°agglutination des plaquettes en concentration suffisante, qui sera définie ci-dessous, on peut contrôler Inactivité de surface et 1fagglutination des plaquettes dans des échantillons de sang normaux et patholo-5 giques ou dans un plasma riche en plaquettes et réaliser un comptage exact et total des plaquettes "stabilisées'8o On sait qu9il existe différentes techniques connues pour compter les plaquettes sanguines comme comptage par microscopie de phase, classification électronique de cellules, et microscopie 10 électronique.. Dans chaque technique 1°emploi de la pyridazine produit Inaction nécessaire dfinhibition de l®agglutination permettant un comptage exact et reproductiblee Cependant, des supports différents seront suggérés pour les différentes techniques quoique 15 la concentration effective de pyridazine reste essentiellement la même quelle que soit la technique choisie0 Ainsi, si on utilise la technique de microscopie de phase le support sera de l'oxylate dsammonium à 1 f«, tandis que si on utilise la méthode de classification électronique ou la 20 microscopie électronique, le support sera du tris-(hydroxyméthyl)-aminométhane 0,1 M (tampon tris) pH 7,6o Pour réaliser lTinvention par les techniques de classification électronique de cellules ou par la technique de microscopie électronique, un échantillon de sang du patient est 25 prélevé de la.manière connue en employant des techniques et un équipement classiqueso On ajoute ensuite un composé empêchant la coagulation, comme le citrate de sodium, l*héparine, le dicoumarol, ou des composés semblables» Ensuite la pyridazine contenue dans une solution de tampon tris est ajoutée à lséchantillon traité dans 30 le rapport de 9 ml de sang pour 1 ml de la solution de tampon tris (0,1 molaire à pH 7,6) ladite solution contenant 8 mg de pyridazineD L1échantillon préparé de cette manière peut être stockée On peut ensuite compter' les plaquettes sanguines de l'échantillon stabilisé de la manière habituelle par classification électronique ou avec 35 un microscope électronique car l'activation et 15agglutination des plaquettes dans lséchantillon de sang sont évitéesa 69 44430 4 2026925 Quoique les rapports donnés ci-dessus fournissent vraisemblablement les résultats optima, la quantité de pyridazine ajoutée peut varier dBenviron 4 mg à environ 10 mg par ml de solution tampon» 5 On a également découvert que le rapport d'une partie de solution tampon contenant de la pyridazine. pour 9 parties de sang fournit des résultats optima, quoique le poids de pyridazine (mg) par rapport au volume de solution de sang tamponné (en ml) puisse varier de 400 à 1000, ce qui peut être utile en plusieurs 10 caso Pour réaliser l8invention par 12emploi de la microscopie de phase, on ajoute à l'échantillon de sang un composé empêchant la coagulation comme mentionné ci-dessus» Le réactif empêchant l'agglutination est cependant préparé en employant une 15 solution à 1% d'oxylate d'ammonium pH 6,3 au lieu du tampon tris comme support pour la pyridazine» La quantité de pyridazine mélangée à l'oxylate d,ammonium peut varier d'environ 4 mg à environ 10 mg par ml d'oxylate et la quantité préférée est de Ô mg. Le réactif empêchant l'agglutination est ajouté 20 à l'échantillon de sang traité pour empêcher la coagulation et cet échantillon peut être stocké pour une étude ultérieure sous le microscope de phase» Le procédé de l'invention permet-donc de compter exactement les plaquettes du sang tout en éliminant la nécessité 25 d'un comptage immédiat des plaquettes. Le nouveau réactif de l'invention est utile pour le" diagnostic et peut être manipulé facilement et utilisé rapidement» Les exemples suivants illustrent l'invention sans toutefois en limiter la portée. EXEMPLE 1 On prépare un réactif empêchant l'agglutination des plaquettes utilisable pour des échantillons de sang total ou avec un plasma-riche en plaquettes dans lesquels les plaquettes doivent être comptées soit par un microscope électronique soit par un comptage électronique de celluless employant un compteur électronique Coulter, en mélangeant 80 mg de pyridazine avec 10 ml d'une solution 0,1 molaire à pH 7,6, de tris-(hydroxyméthyl)-amino-méthane (tampon tris) et en agitant pour disperser uniformément 30 69 44430 5 2026925 10. la pyridazine dans la solution de tampon» EXEMPLE 2 On prépare un réactif empêchant l'agglutination des plaquettes utilisable pour des échantillons de sang total ou ton plasma riche en plaquettes, dans lesquels les plaquettes doivent être comptées par la microscopie de phase, en mélangeant 800 mg de pyridazine avec 100 ml d'une solution à 1% d'oxylate dsammonium, en 1*agitant pour assurer une dispersion de pyridazine dans la solution dsoxylate, et en ajustant le pH de la solution résultante à 6,3 par l'addition d'acide chlorhydriquèo EXEMPLE 3 On a mis au point une charte dressais de laboratoire pour apprécier l'efficacité des nouveaux réactifs et déterminer ^ la concentration nécessaire pour empêcher l'agglutination in vitro des plaquettes lorsque des agents agglutinants, connus comme le collagène ou le diphosphate d'adénosine sont ajoutés à l'échantillon., L'échantillon se compose d'un ml de plasma animal ou humain riche en^plaquettes, dont les plaquettes ont déjà été 2Q comptées, 0,3 ml de tampon tris 0,1 M à pH 7,6j 0,1 ml d'un des agents d'agglutination de plaquettes, collagène ou diphosphàte d'adénosine; et 0,1 ml de pyridazine dans une solution de tampon tris (Ô mg/0,1 ml)» d0n étudié le réactif pour voir s'il ne contient pas une turbidité optique en faisant une comparaison spectro-25 photométrique avec des échantillons de contrôle de solution à d'oxylate d'ammonium pu de tampon tris 0,1 M à pH 7,6» On effectue l'étude de l'échantillon par une détermination des changements de la densité optique, associée à l'agglutination des plaquettes, entre d'une part un échantillon 3q contenant un agent agglutinant, ■ comme le -collagène,, ou l'ADP, et d'autre part un échantillon contenant l'agent agglutinant et un agent empêchant l'agglutination., Le degré d'inhibition de l'agglutination des plaquettes est déterminé par une étude de la densité optique des deux échantillons0 35 EXEMPLE k Si on prélève les échantillons de sang pour le.comptage des plaquettes par microscopie de phase, on doit le faire très soigneusement car un prélèvement incorrect peut entraîner la for 69 44430- 6 2026925 mation de caillots qui empêcheront l'exactitude de l'étude, quel que soit le réactif utilisée Une bonne technique pour obtenir un échantillon de sang consiste en une ponction veineuse suivie de l'addition d'un 5 réactif empêchant la coagulation, tout en veillant à ce que le temps s®écoulant entre la prise de sang et l'addition du réactif empêchant la cqagulation reste minime0 Des résultats excellents sont obtenus si le sang est pris avec une aiguille n° 20 f et une seringue recouverte de silicone0 L'échantillon de sang est 10 alors transféré dans une éprouvette recouverte de silieone et maintenue à 25 °C et le réactif empêchant la coagulation est ajouté immédiatement à l'échantillon; ce réactif est l'éthylènediaminé tétraacétate (EDTA) à une concentration de 1 mg par ml de sang» L*éprouvette est alors couverte de "Parafilm" et retournée 15 10 fois. Une autre technique pour obtenir des échantillons de sarig consiste à le prélever par piqûre d'un capillaire du doigt ' dans des conditions stériles. Dans cette méthode le sang peut être pris directement dans une pipette à globules rouges. 20 Le sang est ensuite soigneusement, dilué en l'ajoutant au réactif préparé dans l'exemple 2. Le contenu de chaque pipette est alors déchargé dans une chambre d'un hémocytomètre où il est maintenu pendant environ 15 minutes, et sur lequel on place une feuille "de papier filtre mouillé pour maintenir une certaine 25 humidité. Les plaquettes sont alors comptées par microscopie de phase de contraste, avec l'emploi d'un condensateur ayant un anneau 43X, un objectif de phase 43X (contraste sombre moyen) et des oculaires 10X. 30 Les plaquettes se présentent sous la forme de corps ronds ou ovales ayant une teinte rose. Si on met les objectifs au point, on peut voir que les plaquettes ont une ou plusieurs formes très fines. Les plaquettes sont comptées pour chaque chambre dans les quatre carrés des coins et dans le carré central 35 comme on le fait pour les globules rouges. Si le total des plaquettes comptées dans lesdits carrés est plus petit que 100,on explore d'autres carrés jusqu'à obtenir au moins un nombre de 100 plaquettes. Le nombre de pla 69 44430 7 2026925 10 3 quettes par mm de- sang est alors trouvé en multipliant le nombre de cellules comptées par la dilution et en divisant ce chiffre par 0,004 fois le nombre de carrés comptéso EXEMPLE 5 On prélève un échantillon du sang de 5 patients différents, par piqûre au doigt, pour examen en microscopie de phase, comme dans l'exemple 4. Chaque échantillon est fractionné en 2 parties l - une première partie à laquelle on n?ajoute pas d"antiagglutinant - une deuxième partie à laquelle ori ajoute 8 mg de pyridazine par ml dféchantillono Le résultat des comptages effectués immédiatement, après 4 h et après 24 h est. donné dans le tableau ci-dessous s 15 Patient n° Addition d'agent empêchant la coagulation Immédiatement Après 4 heures Après 24 heures 1 non 252,500 215.000 212o500 oui 245.000' 280o000 252o500 2 non 140.000 142.500 110.000 20 oui 140.000 147.000 1420500 3 non 287.500 272.500 247.500 oui 280.000 270.000 265.000 . 4 non 307.500 247.500 287=500 oui 300.000 300.000 290.000 25 5 non 262.500 197.500 182o500 oui 275.000 272.500 28O0OOO EXEMPLE 6 On prélève un échantillon du sang de 5 patientss ayant été atteints d'un infarctus du myocarde, par la technique de la ponction veineuse décrite dans l'exemple 4° Le comptage des plaquettes par mrn^ est effectué par la microscopie de phase, d'abord immédiatement, puis après 4 heures et après 24 heures pour des échantillons auxquels on n'a pas ajouté de la pyridazine 35 (marqués "-A")5 auxquels on a ajouté 1 5 6 mg de pyridazine par ml d'échantillon (marqués "-B") et auxquels on a ajouté 4^0 mg de pyridazine par ml d'échantillon (marquês!S-C,})e 69 44430 8 2026925 Les résultats pour chaque échantillon sont donnés dans le tableau ci-dessous. Echantillon patient n° 1-A -B _C Immédiatement 185.000 245 oOOO 245c000 Après 4 h 175»000 247°000 240c000 Après 24 h 159°000 250.000 240o000 10 2-A -B -C 82 o500 142o500 140.000. 60o000 130.000 132.000 85.000 112o500 145 o000 15 3«A -B -C 230.000 212.500 225o000 175.000 222.500 225.000 200.000 220.000 225.000 20 25 30 35 4-A -B -C 5-A -B -C 197.500 255.000 247.500 265.000 295.000 282.000 162.500 175.000 237.500 195.000 275.000 275.000 182.500 195 o 000 252.500 180.000 262.500 267.500 EXEMPLE 7 Un autre moyen pour compter les plaquettes comprend lfutilisation d*un compteur électronique Coulter. Le principe d*un tel comptage est basé sur le fait que si des particules ou des cellules passent à travers une petite ouverture en même temps qu'un courant électrique, chaque particule ou cellule présentera une résistance temporaire au courant parce qu*elle occupe temporairement 1'ouverture. Si le volume de la cellule devient plus grand, la résistance augmentera. Cette résistance peut être transformée en un signal proportionnel qui peut être détecté électroni--quement. Ainsi, si un volume connu d'une suspension de particules ou de cellules est passé à travers l'ouverture, il est possible de compter électroniquement le nombre de cellules ou particules dans ce volume. De grandes cellules, comme les globules rouges et les globules blancs, produisent un signal relativement important 69 44430 9 2026925 et sont comptées par cette méthode dans laquelle on emploie une ouverture de 100 y. de diamètre,, Comme le volume des plaquettes varie de 2 à 30 p soit 1/40 à 1/3 des globules rouges, la résistance qu'elles présentent est plus petite» Ainsi, pour simplifier 5 le signal produit par les plaquettes, il est nécessaire de réduire la dimension d' ouverture -à 50 p. et d?augmenter le voltage du courant passant par ladite ouvertureo Un échantillon de plasma riche en plaquettes est obtenu par la technique des deux seringues, selon laquelle on 10 prélève par ponction 9 ml de sang veineuXo L®échantillon de sang est placé rapidement dans une éprouvette recouverte de silicone et mélangé avec un ml d'une solution de citrate de sodium de 3, 8j>c Après addition du citrate empêchant la coagulation, l'échantillon est divisé en deux portions' de 10 ml Le plasma riche en plaquettes est alors dilué pour le comptage électronique en ajoutant 20 lambdas de plasma riche en plaquettes à 100 ml d'une solution saline de 0,85% ne contenant pas des particules, ce qui donne une dilution de 1/5000. 25 La dilution 1/5000 est alors comptée au moyen d'un compteur Coulter avec une ouverture de 50 y, un réglage de courant d'ouverture de 7 et un seuil de 25» La solution saline sans plaquettes est aussi comptée pour déterminer le comptage de fond dû au bruit électronique et aux débris de cellules et cette valeur 30 est soustraite du comptage obtenu en comptant l'échantillon contenant des plaquettes» "Le comptage des plaquettes pour un plasma riche en O O plaquettes est-égal au comptage électronique 10 /mm . Cette valeur, pour du plasma riche en plaquettes, peut être transformée 35 en un comptage de sang par la formule.suivante : Le comptage pour le sang est égal au comptage pour le plasma riche en plaquettes X (100 fois le volume du sang total)0 69 44430 10 2026925 10 15 20 25 30 Le tableau A donne le résultat du comptage de plaquettes de la première portion du plasma riche en plaquettes effectué à 0,6 et 24 heures et le tableau B donne les résultats obtenus de la seconde portion des échantillons de plasma riche en plaquettes (à laquelle on avait ajouté 8 mg de pyridazine par ml d*échantillon) aux mêmes intervalles. Tableau A Plasma riche en plaquettes 3 Comptage des plaquettes mm Temps en heures N° 0 . . 6 24 1 133.000 115.000 04.000 2 190*000 156.000 88.000 3 155.000 100.000 58.000 4 218.000 190.000 141.000 5 260.000 216.000 . 140.000 6 ' 282.000 217.000 130.000 moyenne 207.000 165.000 106.000 Tableau B Après 1*addition du réactif de diagnostic 3 Comptage des plaquettes mm 0 6 24 " 1 ' 214.000 217.000 221.000 2 252.000 244.000 247.000 3 200.000 193.000 202.000 4 260.000 264.000 269.000 5 305o000 314o0Q0 300.000 6 . 292.000 303.000 293.000 moyenne 253.000 255.000 255.000 EXEMPLE 8 • Une autre étude est réalisée in vitro avec un microscope électronique pour étudier l'activation quantitative et la capacité d'agglutination des plaquettes du sang dtun sujet normal et de patients ayant été atteints d'un infarctus du myocarde cliniquement constaté. 69 44430 n 2026925 Pour cette étude on prélève un échantillon de sang total en employant une technique à 2 seringues. On ajoute aux échantillons de 1/héparine ou du citrate de sodium afin dJempêcher la coagulation.» L* échantillon ainsi traité est alors divisé en 5 des parties égales; l'échantillon témoin contient 9 parties de sang complet et une partie de tampon tris 0,1 molaire pH 7,6. L'échantillon d'essai contient 9 parties de sang complet et une partie d'une solution tampon tris contenant une quantité déterminée de pyridazine. Les concentrations de pyridazine sont dans les limites 10 de 0,075 mg/ml de sang total à 1s0 mg/ml de sang total» Les échantillons témoins et d'essai sont soumis à une aetivation de surface sous des conditions standardo. Les plaquettes de sang dans les échantillons subissent une série dsactivations morphologiques qui peuvent être mesurées et claâsifiées quantitativement et diffé-15 rentiellement avec un microscope électronique. Une classification quantitative et différentielle des plaquettes de sang est basée sur le comptage de 100 plaquettes dans le champ de grille d'un microscope électronique. Les agglutinations de plaquettes sont aussi comptées et rapportées comme nombre d'agglutination par 20 100 plaquettes comptées. Pour les sujets de contrôle normaux, les plaquettes montrent une petite aetivation de surface et seulement une petite tendance à l'agglutination. L'indivudu moyen a environ 5!° de plaquettes rondes, 9% de dendritiques abortives, 75% de dendritiques, 25 35% de forme intermédiaire et 6% de forme étendue. On trouve approximativement 5% de plaquettes agglutinées. Au contraire, les plaquettes des patients ayant été atteints d'un infarctus du myocarde cliniquement constaté montrent une aetivation de surface extrême avec un développement d'aggiu-30 tination de plaquettes larges et nombreuses> Le type de plaquettes le plus souvent rencontré en % par rapport au sujet normal est le type des plaquettes intermédiaires et étenduesoOn constate une diminution substantielle du nombre de plaquettes classées commedendritiques abortives, dendritiques et rondes qui sont les types de 35 plaquettes les plus normaux. Si l'on donne à ces patients de l'héparine soit du coumadine à temps court, l'état activé de leurs plaquettes reste inchangé et les plaquettes intermédiaires et étendues dominent 69 44430 12 2026925 dans- les comptages différentielso Cependant, on observe que l'héparine bloque partiellement la capacité d'agglutination des plaquettes et que la coumadine n'a aucun effet de réduction de leur nombre d'agglutination. 5 Si on ajoute de la pyridazine in vitro au sang total contenant des plaquettes de sujets normaux,, le degré de l'activation de surface est diminué et le nombre d'agglutination de plaquettes diminue aussi remarquablement0 Si on ajoute de la pyridazine aux plaquettes de sang 10 total des patients ayant été atteints d'un infarctus du myocarde, le comptage différentiel des plaquettes est inversé et ne peut pas être distingué du comptage d'un sujet normale Les plaquettes dendritiques dominent dans le comptage différentiel plutôt que les plaquettes intermédiaires et étendueso 15 De plus, la pyridazine empêche aussi remarquablement la formation d'agglutination de plaquettes et dépasse largement l'héparine dans son action inhibitrice sur la formation d'agglutination de plaquettes. La pyridazine réduit aussi la tendance des globules rouges et des leucocytes à adhérer à la surface 20 activée. L'invention n'est pas limitée aux formes de réalisations décrites et l'homme de l'art pourra y apporter diverses modifications, sans pour autant sortir de son cadre. 69 44430 r 13 2026925 REVENDICATIONS 1 » Procédé pour stabiliser les plaquettes du sang dans un échantillon frais de sang total ou dans un plasma riche en plaquettes, permettant la détermination du nombre de plaquettes, dans 1*échantillon par une technique de comptage des plaquettes, 5 caractérisé par l'addition d'un réactif empêchant la coagulation des échantillons et une addition ultérieure d'une quantité déterminée d'un réactif stabilisant les plaquettes, contenant de la'pyridazine à l'échantillon ainsi traité. 20 Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que 10 ledit réactif stabilisant comprend de la pyridazine et un support liquide choisi parmi les solutions d'oxylate d'ammonium et de t ri s-(hydroxyméthyl)-aminométhane. • 3» Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que le réactif comprend 4 à 10 mg de pyridazine par ml de support. 15 4* Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que ladite technique est la microscopie de phase et ledit support est une solution diluée d'oxylate d'ammonium. 5. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que ladite technique est le comptage électronique des cellules 20 ou la microscopie électronique et ledit support est une solution diluée de tris-(hydroxyméthyl)-aminométhane. 6. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que le rapport dudit réactif à l'échantillon de sang est de 1:9 en volume. 25 7« Réactif pour stabiliser les plaquettes de sang dans un échantillon de sang frais traité pour empêcher la coagulation ou un plasma riche en plaquettes, caractérisé en ce qu'il contient de 4 à environ 10 mg de pyridazine par ml d'un support liquide choisi parmi les solutions élevées d'oxylate d'ammonium et de 30 tris-(hydroxyméthyl)-aminométhane. 69 44430 14 2026925 8o Réactif selon la revendication 2, caractérisé en ce que ledit porteur est une solution d'oxylate d'ammonium de 1 foQ 9° Réactif selon la revendication 2, caractérisé en ce que ledit porteur est une solution 0,1 molaire de tris-(hydroxy-5 méthyl)-aminométhanes pH 7,6» 10o Réactif selon la revendication 2, caractérisé en ce qu'il contient environ 8 mg de pyridazine„