FR 2041793 A1 19710205 FR 7001627 A 19700116 70 01627 i 2.041793 r La présente invention concerne un procédé de préparation d'un enzyme protéolytique par fermentation» Récemment, les produits de blanchissage contenant une protéase alcaline ont pris une extension considérable. La 5 protéase alcaline convenant à l'utilisation dans des produits de blanchissage doit posséder lès propriétés suivantes : (1) l'activité protéolytique doit se manifester dans une gamme de pH alcalins, plus particulièrement dans une gamme de pH allant de 9 à. 11, et l'enzyme doit être stable dans 10 cette gamme "de. pH % (2) l'activité protéolytique doit se manifester à une température de 40 à 60°C et l'enzyme doit être stable dans cette.gamme de températures % (3) l'activité protéolytique ne doit pas être af-15 fectée par les divers composants contenus dans-les produits de blanchissage, par exemple les agents séquestrants comme le tripo-lyphosphate de sodium. ' Il est bien connu que les enzymes protéolytiques peuvent être: préparés par culture de micro-crganismes tels que 20 des mycètes ou des bactéries ; cependant, les enzymes protéolytiques obtenus par les procédés connus sont loin de donner entière satisfaction ; il leur manque une ou plusieurs des propriétés énumér^es ci-dessus et exigées dans le blanchissage. La demanderesse a trouvé qu'on pouvaittobtenir avec 25 des rendements élevés un enzyme protéolytique convenant à l'utilisation dans le blanchissage par culture de souches nouvellement isolées de bactéries appartenant au genre Bacillus subtilis. Les micro-organismes susceptibles,.d'-être utilisés dans l'invention comprennent Bacillus Aj-3205 (NRRL B-3699)t 30 Bacillus AJ-3206, Bacillus AJ-3207 et Bacillus AJ-3208 ('NRRL B-3700)o Les caractéristiques microbiennes de"Bacillus AJ-3205 et AJ-3208 ont été rapportées ci-a prèss • A J -3205 AJ-3208 Forme des cellules? bâtonnets de 0,4-0,6 x~~ bâtonnets de 0,6-0,8 x 35 l»5-3 microns 2-6 microns spore 0,6 x 1,0-1,5 microns, ellipsoïdes de 0,6-0,8 x ellipsoïdal, central 1,0-1,5 microns, cen-ou paracentral tral ou paracentral 70 01627 2 2041793 Sporange coloration' Grain mobilité 5 colonies sur gélose s 10 gélose inclinée piqûre sur géla-15 tine bouillon de NaCl 20 lait lait B„CoP • hydrolyse de l'amidon hydrolyse de la ca-25 séine utilisation du citrate réduction du nitrate gaz du bouillon de 30 nitrate en milieu anaérobie acétylméthylcablnol essai au Rouge de Méthyle AJ-?205 pas de gonflement net positive motile circulaires, plates, lisses, opalescentes, luisantes, butyreuses, brun-jaune pâle, milieu non modifié croissance modérée, lisse, opalescente, luisante, brun-jaune pâle liquéfaction bonne croissance à 10# de NaCl, croissance à 12,5# de NaCl, pas de croissance à 15# de NaCl peptonisé .alcalin positive positive positive positive pas de production production négatif A J -"3208 pas de gonflement net positive ' motile circulaires, plates à saillantes, opaques, mates, butyreuses, brun-pâle, milieu non modifié croissance modérée, surface irrégulière, opaque, mate, extension, brun-pâle liquéfaction bonne croissance à 10# de NaCl, croissance à 12,5# de NaCl, pas de croissance, à 15# de NaCl peptonisé^;-? alcalin positive positive positive positive pas de production production négatif COPY 70 01627 3 2041793 lysine décarboxylase indole bouchon de pomme 5 de terre H2S respiration en nitrate uréase acide mais pas de 10 gaz en milieu aérobie à partir de s 15 pas d'acide en milieu aérobie à partir de : 20 25 catalase relation de température 30 35 source - AJ"3205 négative pas de production croissance abondante production négative négative L-arabinose, glucose fructose, mannose, saccharose, maltose, tréhalose, cellobioss, amidon, glycérol,man-nitol, arbutine, es-culine, inuline et sallcine xylose, rhamnose, galactose, sorbose, lactose, raffinose, mélibiose, érythri-tol, adonitol, dul-citol, sorbitol, ino-sitol, et a-méthyl-glucoside positive bonne croissance entre 25 et 50°C» La température maximale pour la croissance est de 5Tj5°C sur gélose à infusion de cervelle-coeur» Pas de croissance à 60°C„ La température minimale est de 20°CoPas de croissance à 17°C sol AJ-3208 négative pas de production croissance abondante production négative négative L-arabinose, glucose, fructose, mannose, saccharose, maltose,tréhalose, cellobiose,amidon, arbutine, esculine et salicine xylose, rhamnose, galactose, sorbose, lactose, raffinose, mélibiose, glycérol, éry-thritol, adonitol, dul-citol, manitol, sorbitol, inuline et a-méthylglucoside positive bonne croissance entre 25 et 50°Co La température maximale pour la croissance est de 57j5°C sur gélose à infusion de cervelle-coeur. Pas de croissance à 60°C. La température minimale est de 20°C» Pas de croissance à 17 °C sol 70 01627 4 2041793 On a procédé à une comparaison stricte entre les caractéristiques des souches décrites ci-dessus et celles des souches, décrites dans l'ouvrage "Bergey's Manual of Dëtermina-tive Bacteriology", j^me édition, et on a considéré que ces 5 souches appartenaient au genre Bacillus subtilis„ Cependant, les souches susceptibles d'être utilisées dans là présente invention possèdent des propriétés biochimiques remarquables qui diffèrent des caractéristiques du Bacillus subtilis connu, possédant ou non la capacité de produire une protéase alcaline., j 10 notamment, les souches AJ-3205, AJ-3206, AJ-3207 et AJ-3208 présentent une croissance normale sur des milieux contenant un agent séquestrant comme le tripolyphosphate de sodium à des concentrations non inférieures à 8 % ou le nitrilotriacétate de sodium à des concentrations non inférieures à 3 %, alors que .15 la plupart des souches connues appartenant au genre Bacillus subtilis, y compris Bacillus subtilis ATCC 6051, Bacillus subtilis IAM 1026, Bacillus subtilis IAM 1145, Bacillus subtilis IAM 11G7j Bacillus subtilis IAM 1193, Bacillus subtilis IAM 1214, Bacillus subtilis IAM 1108, Bacillus subtilis 1033 et Bacillus 20 subtilis IAM 1076 ne peuvent pas croître sur. un milieu contenant 3 % de tripolyphosphate de sodium, 0,2 ■% d'éthylène diâmine té-tracétate ou 1 % de nitrilotriacétate de sodium. On a rapporté dans le tableau I annexé les résultats d'expériences au cours desquelles on a cultivé les micro-aganismes 25 sur des milieux contenant des proportions variées de tripolyphosphate de sodium (TPP)0 Dans tous les essais, le'milieu de culture contenait 0,5 g/dl d'amidon soluble, 1,0 g/dl d'extraits de viande, 1,0 g/dl de polypeptone et 0,25 g/dl de NaCl» On a inoculé des portions de 10 ml du milieu par chacun des micro-30 organismes et on a cultivé à 31,5 °C sous secousses-» La croissance bactérienne a été déterminée par mesure du pouvoir d'absorption du milieu de culture sur.la lumière» Bacillus subtilis AJ-3205, AJ-3206, ÀJ-3207 et AJ-3208 possèdent des caractéristiques taxonomiques presque identiques, 35 et leur résistance aux agents séquestrants ainsi que l'activité protéolytique de leur.protéase varient légèrement. Ainsi donc, les micro-organismes susceptibles d'être utilisés dans l'invention peuvent être caractérisés en ce qu'ils 70 01627 5 2041793 appartiennent au genre Bacillus subtilis, ils manifestent une résistance aux agents, séquestrants comme le tripolyphosphate de sodium, le nitrilotriacétate de sodium ou 1féthylènediamine-tétracétate,; et ils sont capables de produire une protéase al-5 câline stable dans une gamme de pH alcalins et à une température comprise entre 40 et 60°C,- ladite protéase n'étant pas désactivée par les agents: séquestrants. Pour produire la protéase conformément à 1'invention on cultive le micro-crganisme sur un milieu nutritif approprié. 10 Le milieu comprend une source de carbone assimilable, des sources . d'azcte assimilable et une petite proportion de sels minéraux. Parmi les sources.de carbone qui conviennent, -on citera l'amidon, l'amidon soluble, la dextrine et l'amidon traité par un acide ; ces sources de carbone sont introduites dans le milieu à des 15 concentrations, de 5 à 10 g/dl. Parjmi les sources-d'azote qui conviennent, on citera les flocons de soya, la farine de soya, les extraits de tourteaux de soya, la caséine du lait, le petit lait, la polypeptone,. les extraits de viande, les peptides et les aminoacides.. 20 _ La culture peut être effectuée à un pH compris . entre 5,5 et 7,5 , à une température comprise entre 25 et 37°C, de préférence'entre 51 et 34°C, pendant une durée de'24 à 60 heures, en milieu aérobie» La protéase produite et accumulée dans le bouillon 25 de culture peut en être isolée par des techniques classiques j ainsi par exemple, on sépare les cellules bactériennes par fil-tration ou centrifugation et on précipite la protéase par addition, au liquide surnageant7de sels comme le sulfate d'ammonium ou le sulfate de sodium ou d'un solvant organique. La protéase 30 précipitée peut être isolée ..par centrifugation. " Les résultats rapportés dans les tableaux 2 et 3 annexés montrent que les protéases obtenues par le procédé selon l'invention possèdent-une stabilité à la température en présence d'agents .séquestrants égale ou supérieure à celle de la "Maxatase 35. (produite par la.firme "Koninklijke Nederlàndische Gist - en . Spiritusfabriek N.V. Delft, Pays Bas") laquelle est l'une des meilleures préparations d'enzyme du commerce pour l'usage en blanchissage. Tous les essais ont été effectués de la manière 70 01627 6 2041793 suivante : on a dissous de lfenzyme en*poudre possédant une activité de 60.000 unités par gramme dans une solution tampon H^BO^-KCl-NagCO^ M/10, à la concentration de 0,06 %, én présence de 2 ou 4 % de tripolyphosphate de sodium (TPP), 1 # de 5" nitrilotriacétate de sodium (NTA) ou 2 % d'éthylènediamine tétracétate (EDTA) à pH 9,5 , on a abondonné le mélange au repos pendant la durée indiquée et on a alors déterminé l'activité protéolytique résiduelle. Les résultats obtenus sont rapportés dans le tableau H annexé. 10 Pour les besoins de l'invention, l'activité pro téolytique a été déterminée par la méthode Anson, c'est-à-dire par hydrolyse de la caséine du lait à pH 9,5 (tampon H^B0^-KC1-NagCO-j M/10) à 37°C pendant 10 mn, on a teint la tyrosine soluble dans l'acide trichloracétique par le réactif de Folin et on a 15 déterminé la quantité de colorant libérée. L'unité d'activité protéolytique est celle qui correspond à la libération d'un microgramme de tyrosine par minute, (voir Tableau III annexé). Les exemples suivants illustrent l'invention sans toutefois la limiter ; dans ces exemples, les indications de 20 parties et de % s'entendent en poids, sauf indications contraires. EXEMPLE 1 : ' On prépare un milieu de culture contenant 1 g/dl d'extraits de viande, 1 % de polypeptone, 0,5 .g/dl d'extraits de flocons de soya et 5 g/dl d'amidon soluble ; on règle le pH 25 du milieu à 7,0 et on stérilise des portions de 50 ml de pe milieu dans des fiôles à-sedouer dé 500 ml pendant 20 mn à 120°C. Chacun des milieux est inoculé par Bacillus subtilis AJ-3205 (NRRL B-3699) cultivé au préalable sur un bouillon incliné à 31° C pendant 24 • heures ; on.cultive ensuite S 31,5°C 30 pendant 48 heures sous secousses. On constate que le bouillon de culture contient 2650 unités/ml de protéase (soit environ 5,3 g/1 de protéase). On centrifuge 950 ml du bouillon de culture recueilli dans 20 fioles pour en séparer les cellules bactériennes (10 mn 35 à 10.000 tours/minute), on mélange 880 ml du liquide surnageant avec 340 g de sulfate d'ammonium et on maintient le mélange dans une-boîte à glace pendant une nuit. On isole les précipités formés par centrifugation (30 mn à 12.000 tours/mn), et on les 70 01627 7 2041793 sèche sous vide pendant une nuit sous refroidissement. On obtient 15,2 g (rendement de- l'isolement : 82 %) d'une poudre d'enzyme brute contenant 125.000 unités de protéase/g. On mélange la poudre d'enzyme avec 16,5 g de sul-5 fate de sodium anhydre jusqu*à homogénéité ; on obtient ainsi 31 g d'un concentré d'enzyme pour blanchissage, contenant 60.000 unités de protéase par gramme. EXEMPLE 2 On cultive Bacillus subtilis AJ-3206 sur un milieu 10 contenant 1 g/dl d'extraits de tourteau de soya, 1,5 g/dl de caséine, 7 g/dl d'amidon soluble, 0,05 g/dl de KHgPO^, 0,02 g/dl de MgSO^, 7Hg0 et 0,£ g/dl de CaClg (pH 7,0) par un mode "opératoire, identique à celui de l'exemple 1 ; le bouillon cultivé pendant 48 heures contient alors 3960 unités de protéase/ml 15 (environ 8 g/l de protéase)» - . A partir de 850 ml de bouillon clair, on obtient 28 g de poudre d'enzyme brute contenant 100.500 unités de protéase/g. EXEMPLE 3 i 20 On cultive Bacillus subtilis AJ-3207 par un mode opératoire identique à celui de l'exemple 1 ; en 48 heures de culture, on produit 2920 unités de protéase par ml (environ 5>8g/l). EXEMPLE 4 i On cultive Baeillus subtilis AJ-3208 (NRRL B-3700) 25 pendant 48 heures comme décrit dans l'exemple 2 ; on produit ." 4050 unités de protéase par ml (environ 8,1 g/l). On traite 900 ml du milieu de culture par un procédé analogue à celui "décrit dans l'exemple !• ; on obtient 29 g d'une poudre d'enzyme brute contenant 112.000 unités de protéase/g. 70 01627 8 2041793 REVENDICATIONS l) Procédé' de préparation d'une protéase alcaline, caractérisé en ce que l'on cultive un micro-organisme appartenant au genre Bacillus subtilis présentant une résistance aux agents 5 séquestrants et capable de produire une protéase alcaline stable dans une gamme de pH alcalins et à une température comprise entre 40 et 60°C et non désactivée par les agents chélatants, sur un milieu nutritif contenant une source de carbone assimilable , une source d'azote assimilable et des sels minéraux, dans des 10 conditions aérobies, et on recueille la protéase produite dans ces conditions dans le milieu de culture, 2) Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que le micro-organisme résiste au tripolyphosphate de sodium, au nitrilotriacétate de sodium ou à l'éthylènediaminetétracétate,, 15 5) Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que l'on cultive un micro-organisme à un pH de 5,5 à 7,5. 4) Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que le micfo-crganisme est la souche AJ-3205 (NREL B-3699) .ou la souche AJ-3208 (NRRL B-37OO) de Bacillus subtilis Concentration en TPP (g/dl) 0 1,0 2,0 4,0 6,0 8,0 10,0 Bo sub. ATCC 6051 24 h • 48 h 72 h 0,720 0,700 . 0,550 0,520 0,660 0,630 0,130 0,450 0,460 0 0 0 0 .00 TABLEAU I 0,230 0,730 0,860 0,330 0,710 0,830 o,o4o 0,330 o,6io 0,100 0,370 0,600 0 o,i4o 0,530 0,080 0,280 0,560 0 0 0,030 0,060 0,260 0,280 -si o o K> Turbidlté B. sub. AJ-3208 B. sub. A J-5205 24 h • 48 h ' 72 h 24 h 48 h 72 h 0,460 0,800 0,820 0,600 0,500 0,380 0,520 0,820 0,870 0,600 0,510 0,380 0,490 0,820 0,860 0,550 0,660 0,780 ■ ? 1 10 NJ O 4^» •O eu 70 01627 Pl. II-2 2041793 TABLEAU II Protéase activité protéolytique résiduelle (#) produite en présence de (température, durée) par la souche 2# de TPP 40°C.60 mn 4# de TPP S5°C.30 mn 1% de NTA 4CS°C,60 mn 2% d'EDTA 45°C,60 mn AJ-3205 100 52 65 70 AJ-3206 80 46 58 63 AJ-3207 82 48 60 60 AJ-3208 80 44 60 65 Maxatase 75 38 42 54 - TABLEAU III Conservation activité protéolytique résiduelle {%) (minute) en présence de 2# de LAS"'' en présence de 4% d'un à 45°C produit de blanehis- sage^ à 40°C Protéase de Maxatase Protéase de Maxatase AJ -3208 AJ -"5208 . 20 90 87 100 75 30 84 82 100 - 65 40 .80 76 95 60 60 70 70 92 48 1) acide alkylbenzène sulfonique linéaire 2) produit de blanchissage du commerce Copy