FR 2053260 A1 19710416 FR 7028062 A 19700729 70 28062 1 2053260 La présente invention concerne la préparation d'un'moût à bière utilisable pour la préparation de boissors alcoolisées non-distillées, telles que la bière, l'aie, la bière de fermentation basse et analogue; l'invention concerne également un 5 système enzymatique utilisable pour l'obtention d'un tel moût à bière, ainsi que la transformation dudit moût à bière en de telles boissons fermentées. La production des boissons précitées implique normalement, ainsi qu'il est bien connu, la formation initiale d'un moût selon un procédé de brassage 10 ou de trempe suivi d'un procédé de fermentation dans lequel les sucres fermentescibles tels que le maltose présents dans le moût sont convertis en alcool et en gaz carbonique. Dans le brassage de la bière, le moût est habituellement obtenu en produisant le brassage d'une bouillie de malt d'orge et de 15 produits d'addition, tels que des céréales traitées, des grains de céréales crus non germés tels que le maïs et le riz, ou quelque autre source d'hydrates de carbone. Les matériaux non modifiés à base d'amidon, tels que les gruaus de maïs crus, doivent être précuits dans un processus de cuisson indépendant 20 avant d'être ajoutés à la trempe ou maiscte. Ceci est généralement effectué en les mélangeant avec de l'eau et du malt finement broyé et en faisant ensuite bouillir le mélange. Le malt liquéfie le matériau à base d'amidon, ce qui permet la transformation subséquente de l'amidon en sucre pendant l'opération de brassage. 25 Pendant l'opération de brassage ou de trempe, le malt, en raison des enzymes qu'il contient joue un rôle important. Ainsi, les o( -amylases liquéfient le matériau à base d'amidon des grains produisant principalement des sucres non-fermentes-cibles comme les dextrines, tandis que les -amylases 30 saccharifient l'amidon liquide en sucresfermentescibles, principalement en maltose. De plus, les enzymes protéolytiques cassent ou dégradent les protéines de poids moléculaire élevé pour former des peptides de plus faible poids moléculaire et également des quantités importantes d'amino-acides. Ces produits de 35 décomposition des protéines constituent non seulement des agents nutritifs pour la croissante subséquente de la levure, mais ils contribuent aussi aux propriétés caractéristiques de la bière, 70 28062 2 2053260 par exemple à la stabilité de l'écume et du voile et à la saveur de la bière. Cette dépendance par rapport au malt qui est une caractéristique de la pratique actuelle est accompagnée par plusieurs inconvénients importants. Par exemple, le matériau 5 est relativement coûteux en raison du coût élevé de l'orge d'une / qualité convenant la malterie, du temps et du coût de la transformation de l'orge en malt et spécialement en raison des investissements nécessaires, tant en/ce qui concerne les installations qu,en ce qui concerne le travail impliqué par 10 la production de ce malt. De plus, le malt contient des enveloppes (8 - 12%) et, d'une façon typique, environ 2 à 3% d'un liquide visqueux et gras qui tend à conférer une mauvaise couleur et un gout anfer au moût. En outre, l'installation nécessaire à la formation du malt tend à être complexe et 15 coûteuse et nécessite une surveillance attentive des diverses étapes de la fabrication par un personnel spécialisé. Depuis quelque temps, les brasseurs ont pris conscience de l'influence de ces facteurs, de telle sorte que des propositions ont été faites en vue de diminuer l'importance du malt dans la fabrication 20 d'un moût à bière. Ainsi, dans la description du brevet américain 3.081.172, au nom.de la demanderesse, on a décrit un moût à bière qui est obtenu à partir d'une trempe ou maische de grains de céréales crus, par exemple d'orge, traités par un mélange, disponible dans le commerce, d'enzymes protéolytiques 25 et amylolytiques, en remplacement partiel ou total du malt. La trempe est maintenue à des températures pour lesquelles les enzymes dégradent d'abord les protéines et transforment ensuite l'amidon solubilisé en sucre. Ce procédé, qui a été employé avec succès pour la fabrication 30 d'une bière acceptable dans les conditions d'un brassage véritable, entraine une diminution des coûts de production puisque l'orge ou le maïs non germé ou un matériau similaire à base d'amidon peut être utilisé pour fournir une haute proportion des hydrates de carbone nécessaires à la fermentation, au lieu 35 d'employer des grains germés beaucoup plus coûteux. Cependant, il est bien connu que la bière constitue une substance complexe possédant des caractéristiques physico-chimiques et organoleptiques 28062 3 2053260 très subtiles, telles que par exemple la couleur, la stabilité de la mousse, la stabilité du voile ou trouble, la tenue de la mousse et le goût. Il n'est pas surprenant, par conséquent, que dans un tel procédé enzymatique, de nombreux facteurs soient impliqués pour l'obtention d'un moût et d'une bière finale ayant des caractéristiques apparentées à celle d'un moût de malt et d'une bière de malt classiques. Par exemple, des facteurs particulièrement importants qui influencent les propriétés du moût et de- la bière sont constitués par les niveaux d'activité et les concentrations relatives des protéase et amylase . Ainsi, la demanderesse a trouvé que les propriétés du moût et de la bière dépendent dans une large mesure des variations des degrés d'activité des protéases et amylases et de leurs concentrations relatives, car de telles variations peuvent altérer l'équilibre nécessaire entre le teneur en azote et la teneur en sucres et entre les sucres fermentescibles et les sucres non-fermentescibles. Malheureusement, comme cela arrive dans la pratique, de nombreuses préparations enzymatiques disponibles dans le commerce ne sont pas standardisées en ce qui concerne leur activité de sorte que le degré d'activité des enzymes varie souvent, éventuellement dans de larges limites, d'un échantillon ou d'un lot à un autre. Un autre facteur dont la demanderesse a découvert l'importance sur les propriétés du moût et de la bière consiste en la compatibilité des enzymes. Les enzymes sont des protéines et, en tant que telles, elles peuvent être dégradées ou inactivées par d'autres enzymes. Puisque les protéases et amylases disponibles dans le commerce comportent différents systèmes dérivants de sources différentes, la compatibilité des constituants est dans une grande mesure inconnue et incontrôlable. En conséquence, il peut être difficile de fixer un schéma de brassage standardisé à l'effet d'obtenir des résultats valables et reproductibles en ce qui concerne le produit et à l'effet d'obtenir une bière ayant les qualités désirables de goût ou saveur, de corps, de stabilité, de composition chimique, de couleur, etc... et il peut être difficile d'être capable de régler les différents paramètres du procédé pour tenir compte d'autres facteurs de variation. 70 28062 4 2053260 La présente invention concerne un tel traitement enzymatique de matières premières à base d'amidon, afin de produire un moût à bière. Un objet de l'invention consiste en un procédé enzymatique 5 pour la transformation des matières premières contenant de l'amidon en un moût à bière de propriétés substantiellement reproductibles, lesquelles, par exemple une teneur élevée en sucre fermentescibles("atténuation" accrue) et une teneur en azote formolé, sont généralement supérieures à celles des moûts 10 préparés par le procédé du brevet précité. Un autre objet de l'invention consiste en un procédé enzymatique dans lequel la digestion de la substance à base d'amidon peut être facilement prédéterminée et réglée pour donner un moût à bière ayant des propriétés substantiellement reproduc-15 tibles. Ces-moûts à bière, lorsqu'ils sont par la suite fermentés, donnent, d'une façon consistante, une bière ayant de meilleurs caractéristiques organoleptiques, ainsi que de meilleurs autres qualités, par exemple une tenue de la mousse et une stabilité du voile, que la bière brassée à partir d'un moût obtenu par 20 le procédé décrit dans le brevet précité. Un autre objet de l'invention consiste par conséquent en une bière ayant des caractéristiques de goût ou saveur améliorées ainsi que d'autres qualités améliorées, par exemple une tenue de la mousse et une stabilité du voulie ou trouble supérieures à 25 celles de la bière brassée à partir d'un moût fabriqué selon le procédé décrit dans le brevet précité. D'autres caractéristiquesde l'invention appraitront au cours de la description explicative qui va suivre, en référence aux dessins annexés dans lesquels: 30 - les figures 1 à 3 sont des organigrammes montrant les diverses étapes du procédé et leur incorporation dans l'ensemble du procédé, selon des modes de réalisation préférés de la présente invention; - les figures 4 à 6 sont des graphiques donnant les intervalles 35 de température et de temps définissant d.es cycles de brassage ou trempe satisfaisants selon les modes de réalisation préférés de la présente invention; 70 28062 5 2053260 - les figures 7 et 8 sont des graphiques montrant les effets, sur les propriétés d'un mou* typique, des variations de la quantité de l'enzyme constituée par l'amyloglucosidase utilisée dans le procédé de brassage; 5 - les figures 9 à 11 sont des graphiques montrant la relation entre les propriétés de différents moûts et les quantités de différents systèmes enzymatiques utilisés dans le procédé selon l'invention; et, - les figures 1 2A et 12B sont des graphiques montrant la " 10 relation entre une propriété d'un moût et les quantités de différents systèmes enzymatiques utilisée dans le procédé selon l'invention. Il a maintenant été trouvé que, conformément à la présente invention, les caractéristiques ou buts précités ainsi que 15 d'autres qui leurs sont voisins, peuvent être obtenus en faisant réagir, dans des conditions de température et de temps déterminées une substance à base d'amidon, broyée, avec une enzyme protéo- lytique isolée, une # -amylase isolée, une amyloglucosidase isolée -et une source de fi -amylase ou une -amylase isolée, 20 lesdites enzymes protéolytique_, «X -amylase et amyloglucosidase étant présentes en une quantité d'au moins 0,5 unité de protéase Kunitz modifiée par gramme de substance à base d'amidon, d'au moins environ 45» et de préférence d'au moins environ 100, unités d' ® -3 25 à base d'amidon, et d'au moins 6,0 x 10 , de- préférence au moins environ 1,0 x 10"1 unité d'amyloglucosidase (AG) par gramme de substance à base d'amidon, respectivement. Dans toute la description ci-après, à moins que le ccntexte. ne l'exige autrement, les quantités d'enzymes indiquées sont exprimées en 30 poids par rapport au poics de substance à base d'amidon présente dans la bouillie. D'une manière avantageuse pour le déroulement du procédé, on traite une bouillie aqueuse de grains de céréales par exemple de l'orge, du froment ou du maïs broyés, par une quantité, allant 35 jusqu'à environ 30% en poids, de malt ou d'extrait de malt comme source de fj -amylase, et de préférence entre environ &fo et environ 20%, ladite source contenante muics tuvittuO,9» pi'éféi.txûe 70 28062 6 2053260 entre environ 0,9 et environ 2 à 2,5, unités de protéase Kunitz modifiées par gramme, au moins environ 100 unités d' o( -amylase Stein-Fischer modifiées par gramme, et au moins environ 1 x 10" y de préférence entre environ 1 x 10~^ et 10 x 10"^, unité 5 d'amyloglucosidase par gramme. Selon un mode de réalisation préféré de la présente invention, on introduit un adjuvant céréalier dans la bouillie aqueuse de grains de céréales au cours d'une phase appropriée. Cette addition peut se faire sous la forme d'une masse liquéfiée de 10 grains de céréales à base d'amidon non modifié, telle que des gruaus de maïs, de la poudre ou farinede maïs, de la farine de riz, de la farinede froment, de la farine d'orge, des grains de sorgho et analogues, qui ont été précuits dans un récipient séparé. Cet adjuvant céréalier peut aussi se présenter sous - 15 la forme d'une substance à base d'amidon, préparée ou traitée préalablement, tele que par exemple des paillettes ou flocons de maïs, de l'amidon de maïs, du glucose et analogue. De préférence, l'adjuvant céréalier est introduit en une quantité allant d'environ 10 à environ 60% et, d'une manière encore plus désirable, 20 d'environ 42 à environ 55%, en poids desdits grains d'adjuvant Céréalier par rapport au poids du substrat de grains céréaliers de la bouillie aqueuse. L'expression "enzyme isolée" .utilisée ici relativement à la protéase, à 1' -amylase, à 1'amyloglucosidase et à la 25 -amylase se réfère à une enzyme dérivée d'une source constituée par une plante, des bactéries ou des champigons, et qui a été extraite et purifiée à une échelle industrielle, et qui manisfeste, selon le cas, une activité importante de protéase, d' -amylase, d'amyloglucosidase et/ou de 30 amylase. D'autres enzymes, à part ces quatre enzymes parti- culières> peuvent être aussi présentes, telles que par exemple les cellulases, les hémicellulases et les pectinases. De plus, un mélange d'enzymes isolées contenant des quantités significatives ou importantes de deux (en particulier la protéase et l'amylase),trais 35 ou des quatre enzymes peut être utilisé dans le procédé de l'inva±ian. Ces constituants peuvent également provenir de sources différentes auquel cas les enzymes résultantes sont mélangées les unes aux 70 28062 7 2053260 10 autres pour donner les niveaux d'activité désirés pour les trois enzymes. Lfe.zyme ou le mélange d'enzymes peut être utilisé par exemple sous la forme d'une solution ou bien il peut être supporté par un substrat solide. La détermination de l'activité des divers systèmes enzymatiques auxquels il sera fait référence à divers passages de la présente description et des revendications annexées, résulte des essais biochimiques spécifiques suivants: Détermination de l'activité de la protéase - l'activité de la protéase est mesurée en déterminant, au moyen du réactif de Folins-Ciocalteau (ce réactif est disponible à la"Fischer Scientific" sous la dénomination "So-p-24" comme réactif de phénol en solution 2N) la quantité de tyrosine soluble dans l'acide trichloracétique (TCA) libérée d'un substrat de caséine dans des conditions spécifiques de pH, de température et de temps. La méthode employée est essentiellement celle décrite par Kunitz dans le Journal de Physiologie Générale, N° 30, page 291, 1947, modifiée sur les points suivants: 2q - 2% de caséine dans un tampon de phosphate 0,066M - pH 7,0; - 2 ml d'enzyme et 2 ml de substrat sont utilisés dans la réaction enzymatique; - la durée de la réaction enzymatique est de 10 minutes à 37°C 25 - la précipitation est obtenue au moyen de 4 ml de TCA 0,4M; et - la protéine précipitée est séparée en utilisant du papier-filtre Whatman N° 42. Dans cet essai, une unité de protéase constitue la quantité 2Q d'enzyme nécessaire pour produire un microéquivalent de tyrosine soluble dans le TCA, en une minute, dans les conditions de l'essai. Détermination de l'activité de ^ -amylase: - cette activité est mesurée en déterminant, au moyen de l'acide 3,5-dinitro-salicylique, la quantité de sucres 35 réducteurs (maltose) formés à partir de l'amidon solubilisé, dans des conditions spécifiques de pH, de température et de temps. La méthode employée est essentiellement celle 70 28062 8 2053260 décrite par Stein et Fischer dans le Journal de Chimie Biologique N° 232, page 869 (1958), cette méthode étant modifiée sur les points suivants: - on utilise, selon Lintner, de l'amidon soluble analytique-5 ment pur, disponible dans le commerce auprès de la "Merck Company"; - on prépare de l'amidon à 1% dans l'eau distillée, en temps que substrat; - l'enzyme est diluée dans un tampon d'acétate à 0,05 M -pH 10 6,0; - incubation à 37°C, pendant 5 minutes; et - mélange réactionnel dilué avec 10 ml d'eau. : Dans cet essai, l'unité d' p( -amylase représente la quantité d'enzyme nécessaire pour obtenir un microéquivalent de maltose 15 en une minute dans les conditions de l'essai. Détermination de l'activité de 1'amyloglucosidase: - l'activité d'une amyloglucosidase particulière est déterminée en mesurant, en mettant en oeuvre l'essai de sucres réducteurs selon Schoorl, la quantité de dextrose formée 20 à partir de l'amidon de maïs solubilisé, dans des conditions spécifiques de température et de temps, en suivant le processus d'expérimentation décrit dans le bulletin technique des "MiJes Laboratories Inc." N° 2 -122, page 21, 1962. Dans cette expérimentation, l'unité 25 d'amyloglucosidase (glucoamylase) est la quantité d'enzyme nécessaire pour obtenir 1g de dextrose à partir de 4g de substrat d'amidon, en une heure, à 60°C. Détermination de l'activité de la fi -amylase (enzyme de saccharification): 30 - l'activité d'une fi -amylase, d'ordinaire celle du malt, est exprimée sous la forme du pouvoir diastasique, en degrés Lintner, sur la base de la transformation de l'amidon soluble en maltose, selon le processus normalisé A.S.B.C., chapitre du malt - 6. 35 D'autres caractéristiques concernant les différents consti tuants utilisés dans le procédé, leur fonction ainsi que des façons préférées de mettre en oeuvre ce procédé, seront maintenant 70 28062 9 2053260 décrites. Matériaux et leur fonction Matériau contenant de l'amidon Quoique des substances contenant de l'amidon, autres que les 5 grains de céréales, tels que par exemple le sarrasin ou blé noir, puissent être utilisées, on préfère utiliser comme substrat des grains tels que le seigle, le blé, l'orge ou le maïs dégermé ou des mélanges de ceux-ci. L'orge est le substrat céréalier préféré, puisque ses produits de digestion après attaque enzyma-10 tique correspondent plus étroitement à la composition en azote et en hydrates de carbone d'un moût à bière classique dérivé du malt. De plus, l'amidon d'orge est géila tinisé à des températures relativement basses, ce qui permet sa dégradation rapide, avant qu'une désactivation thermique BuréciaMs cteamj3^aesnesurvienne;De plus 1"5 on pense que les enzymes de l'orge, telles que la ji -amylase, qui sont libérées et activées pendant le procédé, jouent un rôle important dans la production de sucres fermentescibles. La demanderesse a trouvé que les dimensions des grains influencent d'une manière remarquable le procédé enzymatique. Ainsi, d'une 20 manière générale, plus le grain est fin, moins il faut d'enzymes pour la digestion, et plus la filtration et le lavage subséquents utilisant une trempe de brassage classique ou d es cuves-filtres sont difficiles. En conséquence, un système basé sur l'emploi de grains céréaliers fins implique une faible concentration 25 enzymatique, mais un coût de filtration élevé: D'autre part, les grains les plus grossiers, quoiqu'ils soient plus aisés à filtrer en utilisant un appareillage de filtration classique, exigent d'habitude une concentration plus élevée en enzymes. En pratique, la demanderesse a trouvé qu'un compromis satisfaisant 30 entre la concentration enzymatique et l'aptitude d'un moût à subir la filtration subséquente au moyen d'un appareillage classique de filtration, pouvait être obtenu en broyant les grains jusqu'à une dimension de particulles telle que la masse de celles-ci passe à travers un tamis N° 14 (tamis normalisé des 35 Etats-Unis), c'est-à-dire qu'elles ont une dimension moyenne inférieure à 1,41 mm. Si on le désire, les grains de céréales, tels que l'orge, peuvent être chauffée, par exemple entre 49°C 70 28062 10 2053260 et 76,5°C, ou traités avec des produits chimiques appropriés, avant formation de la bouillie. Enzymes 1) Protéase 5 La protéase isolée peut provenir d'une source constituée par des bactéries, des champignons, une plante ou un animal, quoique les protéases d'origine bactérienne soient celles que l'on préfère. Les protéases bactérienne peuvent être par exemple obtenues à partir de l'une quelconque des bactéries suivantes: 10 Bacillus subtilis. Bacillus amyloliquefaciens. Bacillus polymyxa, Bacillus megatorium et Bacillus cereus. Les protéases provenant de champignons peuvent être par exemple obtenues à partir de l'une quelconque des espèces suivantes: Aspergillus niger. Aspergillus oryzae. Aspergillus tamarii. 15 et Rhizopus sp. Les protéases d'origine végétale ou animaJe peuvent être par exemple la pepsine, la papaïne, la trypsine, la broméline, la ficine ou la pancréatine; beaucoup de ces protéases sont facilement disponibles dans le commerce. La demanderesse a 20 trouvé qu'il était souhaitable que la protéase contienne à la fois des constituants de protéase neutre et alcaline, car ceci est habituellement avantageux pour favoriser la digestion de l'amidon et la solubilisation des protéines des grains, avec libération de peptides à petites chaînes et obtention d'un 25 spectre ou répartition satisfaisant d'amino-acides (on pense que les deux sortes de protéases sont responsables de la libération de différents types d'amino-acides). Dans/des conditions appropriées, la protéase sert à trasnformer les protéines de poids moléculaire élevé de l'amidon 30 des grains de céréales en composés contenant de l'azote soluble, telle que les peptides et les amino-acides. Ces produits de décomposition des protéines donnent non seulement des agents nutritifs pour la croissante subséquente de la levure, mais ils contribustfaussi aux propriétés caractéristiques 35 de la bière, par exemple aux caractéristiques de l'écume et à une saveur moelleuse et douce. 70 28062 2053260 2 )_5*_^anj2lase L'amylase isolée peut être obtenue à partir d'une source constituée par des champignons ou par des bactéries, cette source étant par exemple constituée par l'une des espèces suivantes: 5 Bacillus subtilis, Bacillus amyloliquefaciens, Bacillus coagulans, Bacillus polymyxa. Bacillus megaterium, Bacillus cereus, Aspergilus oryzae. Aspergilus niger et Rhizopus sp. Dans des conditions appropriées, les © amylase hydrolyse au hasard les liaisons ç(. -D-( 1—•» 4) dans les molécules d'amylose et d'amylopectine, mais elle n'attaque 20 pas les liaisons (1—^6). En conséquence, les o( -amylases produisent une fragmentation rapide de l'amidon avec tout d'abord la production d 'oligosaccharides à chaîne branchée de poids moléculaire moyen et ensuite de dextrineslimites à chaîne branchée. Les produits finaux de la digestion de l'amidon sont 25 constitués par une grosse proportion de dextrines limites et par de plus faibles proportions de glucose et de maltose. L'effet primaire de la fragmentation induite par 1' t* -amylase est de solubiliser, c'est-à-dire de liquéfier l'amidon, en facilitant ainsi le contact entre les grains de céréales et 2Q les autres enzymes. 3) Mélange de protéase et d' w -amylase: Avec des espèces bactériennes appropriées, et en mettant en oeuvre des conditions de fermentation convenables, on peut isoler un mélange enzymatique comprenant un complexe de protéase 5 et d' o 70 28062 2 2053260 préparation d'un tel complexe enzymatique par fermentation, en utilisant une bactérie du genre Bacillus, d'une manière appropriée une nouvelle source de Bacillus subtilis ayant reçu la dénomination ATCC 21556. Puisque le procédé peut être 5 facilement contrôlé en vue d'obtenir la protéase et 1'amylase avec des bons rendements et à des concentrations appropriées pour le procédé subséquent de transformation enzymatique, un tel complexe enzymatique constitue une source avantageuse de protéase et d'amylase. Le complexe enzymatique peut être utilisé 10 sous la forme d'un bouillon de fermentation qui peut être éventuellement concentré par évaporation. Selon une variante, on peut aussi utiliser le complexe enzymatique sous une forme solide, de préférence en association avec un véhicule ou support, par exemple sous la £>rme d'un bouillon séché à l'état de 15 pulvérisation- ou d'un solide précipité mélangé avec un support inerte tel que l'amidon, le gyp^ la terre de diatomées ou analogue. 4) Amyloglucosidase L'amyloglucosidase, également connue sous le nom de glucoa-20 mylase ou dextrinase limite hydrolyse et dédouble les liaisons * -D-( 1-*4) et * _D_(1—6) des oligosaccharides de l'amidon avec enlèvement des unités de glucoses successives des extrémités non-réductrices des chaînes d'oligisaccharides. L'effet primaire de l,r amyloglucosidase est de transformer les hydrates de 25 carbone en le sucre fermenteseible qu'est ledext^ose. L'action spécifique de cette enzyme dans l'hydrolyse des liaisons (1-* 4) et (1—». 6), avec production du sucre fermentescible qu'est le dextrose, renforce l'action des amylases, spécialement 1'amylase de saccharification, habituellement une -amylase 30 dans la production de tels sucres à partir des oligosaccharides. Cet effet de 1'amyloglucosidase a pour conséquence une haute teneur en sucres fermentescibles, c'est-à-dire une atténuation apparente plus élevée, dans le moût, et, en conséquence, une plus forte teneur en alcool, dans la bière finale. 35 L'amyloglucosidase isolée peut être obtenue à partir d'une source constituée par des champignons, tels que par exemple: 70 28062 13 2053260 Aspergilus niger. Aspergilus awamori. Aspergilus oryzae. Rhizopus .i a van le us. Rhizopus niveus. Endomyces sp. Cette enzyme peut être utilisée sous une forme substantiellement pure ou sous la forme d'une préparation contenant de l'amyloglu-5 cosidase, tel qu'un bouillon de fermentation obtenu à partir d'une source constituée par des champignons produisant de 1'amyloglucosidase. 5) S -amylase La /£ -amylase peut être obtenue à partir de diverses 10 sources constituées par des plantes, telles que par exemple l'orge, le soja et la pomme de terre douce, en utilisant les techniques d'extraction courantes, ou à partir de sources constituées par des champignons. On utilise avantageusement comme source de $ -amylase, un malt broyé ou un extrait 15 se malt, car il a été trouvé que l'utilisation du malt, spécialement du malt d'orge, donne l'avantage supplémentaire de favoriser l'apparition, dans le moût et dans la bière qui en dérive, de facteurs caractéristiques du gout et l'on pense aussi que ce malt favorise la stabilité. De plus, le malt 20 possède une activité d' -amylase et une activité de dextrinase limite. Ces enzymes deviennent disponibles pendant le processus et elles facilitent la décomposition du grain lors de sa conversion en moût. Bien que le malt puisse être présent en une quantité alDant jusqu'à 30%, la demanderesse a trouvé que 25 entre enviion 8% et environ 20%, plus précisément entre environ 8% et 12%, en poids, l'utilisation du malt donnait des résultats optimaux correspondant au désir d'une basse teneur en malt. D'une façon st.- repriée, le malt employé est du malt d'orge ayant une activité diastasique d'environ 50 à 140° Lir.tner, 30 typiquement entre 100 et 140° Lintner. Normalement, le malt est employé sous la forme broyée, de préférence avec une dimension de particules telle que environ 70% ou plui: du malt passe à travers un tamis à 5 mailles par cm linéaire. La -amylase, ou la source contenant cette enzyme, s. 35 des conditions appropriées, attaque à leurs extrémités non-réductrices les chaînes d'amylose et d'amylopectine et leur enlève granduellement des maillons maltose. Il se produit une 70 28062 U 2053260 inversion de la liaison D-glucosidique et le maltose libéré est de configuration ^ . L'amylose avec un nombre pair d'unités de D-glucose est tranformé complètement en maltose, tandis que l'amylose avec un nombre impair d'unités est transformé en 5 maltose et en maltotriose qui contient l'unité de D-glucose, réductrice, de la moléculle initiale. L'amylopectine est hydrolysée comme l'amylose, l'attaque commençant aux extrémités non-réductrices des chaînes externes, quoique les liaisons (1-* 6) présentes dans 1'amylopectine ne sont pas attaquées par 10 l'amylase et restaUjéous la forme de dextrines limites branchées ou résiduelles. L'effet principal de l'attaque par la ^ -amylase est de produire des sucres réducteurs, principalement du maltose, qui sont disponibles pour une transformation ultérieure, dans le procédé de fermentation, en alcool. Les 15 ions calcium augmentent habituellement la résistance de ces enzymes à l'inactivation par la chaleur et, en conséquence, afin d'augmenter la stabilité des enzymes pendant le procédé, un sel de calcium, en l'occurence le carbonate de calcium ou le chlorure de calcium est souvent introduit en même temps 20 que l'enzyme ou les enzymes ou bien ajouté à l'eau dans les cas où la dureté (teneur en calcium) de l'eau tombe en dessous de 200 parties par million. 6) Quantités d'enzymes Indépendamment du fait de savoir si la protéase et 1'amylase 25 sont utilisées dans le procédé de transformation, séparément ou ensemble sous la forme d'un mélange enzymatique, l'amélioration importante des propriétés du moût et de la bière dans le cadre de la présente invention exige que la protéase soit présente en une quantité égale à 0,5 ou plus, de préférence 30 au moins 0,9, unité de protéase par gramme de substrat de grains céréaliers. Pour des quantités de protéase inférieures à 0,5 unité par gramme , il y a une solubilisation inadéquate des protéines des grains céréaliers qui est inhérente à une faible dégradation 35 des protéines de poids moléculaire élevé et à une faible libération des hydrates de carbone à partir des granules d'amidon. Il en résulte nettement que le moût ainsi obtenu possède une teneur 70 28062 15 2053260 de beaucoup réduite en composés contenant de l'azote, et particulièrement en composés contenant de l'azote soluble comme les amino-acides et les petits peptides et une teneur réduite en hydrates de carbone teld que les sucres fermentescibles, 5 ainsi que le montre l'essai de fermentation rapide/ désigné ci-aprés par Q .F. ,selo.n la norme A.O.A.C méthodes 10.120b relatt-ves à un processus concernait l'extrait fermercbesible)et les résultats d'attéiiuaiiai La demanderesse a trouvé que ces effets se présentent souvent dans la bière finale qui tend à posséder une faible teneur en 10 azote, ce qui peut influer sur sa saveur ainsi que sur d'autres facteurs et provoquer une diminution de la teneur en alcool. De plus, pour une teneur en protéase, en dessous de 0,5 unité par gramme, la trempe est difficile à filtrer et des temps de trempe prolongés sont nécessaires en utilisant l'appareillage 15 classique de brasserie. En plus d'un niveau d'activité minimal, le témoignage expérimental suggère qu'il existe un taux maximal de protéase compatible avec le degré désiré de solubili-sation des protéines et l'obtention d'un moût à bière satisfaisant, ainsi que d'une bonne bière, aux alentours d'environ 20 2 à 2,5 unités de protéase par gramme. Pour des teneurs en protéase dépassant beaucoup 2 à 2,5 unités de protéase par gramme, la teneur totale en azote dans-le moût résultant se situe aux environs de 1000 à 1400 mg/l et est si élevée que la bière finale possède une stabilité de voile et une stabilité 25 de mousse faibles, de même qu'une saveur "plate" inadmissible. De plus, pour des teneurs en protéase supérieures à 2-2,5, on n'obtient pas d'amélioration sensible des valeurs du rendement et de l'atténuation par rapport aux valeurs obtenues pour des teneurs en protéase plus faibles. 30 Pour des teneurs en amylase inférieures à environ 45 unités d'amylase par gramme de substance contenant de l'amidon, la demanderesse a trouvé qu'il se produisait une réduction importante de la dégradation de l'amidon. Ceci est montré par la diminution de la densité et des hydrates de carbone solubles, tels que 35 les sucres fermentescibles, de telle sorte que le moût résultant possède une valeur d'extrait diminuée (comme montré par la valeur Plato, exprimée en °P) et une fermentabilité diminuée 28062 16 2053260 Q.F.), et que la bière obtenue à partir d'un tel moût possède une teneur en alcool réduite. Il se produit aussi lin effet défavorable sur la saveur et la stabilité. Les données expérimentales indiquent qu'il existe une valeur optimale de la quantité d'amylase, se situant à environ 100 unités d'amylase par gramme, qui est compatible avec l'obtention d'un moût à bière satisfaisant et d'une bonne bière, selon un processus favorable sur le plan économique. Pour ce qui concerne 1'amyloglucosidase, pour des teneurs _3 inférieures à environ 6 x 10 unités de A. G. par gramme, il ne se produit pas d'amélioration digne d'être notée dans les caractéristiques du moût, ainsi qu'il résulte des valeurs de la fermentabilité (Q.F.) et de l'atténuation. Pour une amélioration substantielle des propriétés du moût, il est désirable que 1'amyloglucosidase soit présente en une quantité de l'ordre de 1 x 10~^ unité de A.G. par gramme, puisque cette teneur améliore habituellement la fermentabilité d'environ 0,3 à 0,4 unité et l'atténuation d'environ 1 à 2%, ce que le brasseur considère comme significatif ou important. Les résultats expérimentaux indiquent que l'amélioration la plus prononcée des propriétés du moût est obtenue avec une teneur en amyloglucosidase comprise entre environ 2 x 10"^ et environ 10 x 10"1 unités de A.G. par gramme, notamment d'environ 50 unités de A.G. par gramme. Pour des teneurs en amyloglucosidase au dessus de 100 unités de A.G. par gramme, l'amélioration obtenue dans les propriétés du moût est beaucoup inférieure à celle que l'on serait en droit de s'attendre en considérant la quantité d'enzyme effectivement présente, et il existe une tendance pour la bière résultante à avoir un gout aqueux, c'est-à-dire à manquer de corps. En conséquence, particulièrement en vue du coût relativemebt élevé de telles enzymes, il est avantageux de mettre en oeuvre des quantités d'amyloglucosidase inférieures à environ 100 unités de A.G. par gramme. Procédé mis en oeuvre Le traitement enzymatique des grains de céréales ,typiquement de l'orge, avec les quatres systèmes enzymatiques impliqués, peut être effectué de diverses façons, différents par exemple 70 28062 17 2053260 par l'ordre des additions d'enzymes, par les valeurs respectives de la température et du temps en fonction d'une activité enzymatique particulière. La formation initiale d'une bouillie aqueuse de substance à base d'amidon, notamment d'orge, est commune aux 5 différents modes de réalisation du procédé de l'invention. L'orge (ou d'autres grains de céréales)est de préférence présent dans la bouillie à une concentration d'environ 20 à environ 40 g pour 100 cc d'eau (rapport: 1/2,5 à 1/5)» et d'une manière encore plus désirable de 28g à 33g pour 100 cc d'eau (rapport: 1/3,0 à 1/3,5)• De préférence, la dureté de la bouillie aqueuse est comprise entre 20 et 35 parties équivalentes en poids de carbonate de calcium et de magnésium pour 1 million de parties en poids d'eau; si la dureté est inférieure à environ 20 parties par million, alors le carbonate de calcium 15 ou quelque autre sel de calcium peut être ajouté pour accroitre la dureté. L'addition d'ions calcium, sous la forme d'un sel, à ce stade, en vue d'accroitre la stabilité à la chaleur des enzymes (indépendamment de l'accroissement de dureté) constitue une variante appropriée quant à leur incorporation à un autre 20 stade du procédé, par exemple lors de la préparation du mélange enzymatique. Le pH de l'eau est ajusté à une valeur comprise entre environ 5,2 et environ 5,8. Habituellement, le pH reste substantiellement le même pendant tout le déroulement du procédé. Si le pH était à l'extérieur de l'intervalle de 25 valeurs précité, la transformation enzymatique ne serait alors pas aussi efficace. A. Dans le processus résumé par l'organigramme de la figure 1 ci-jointe, toutes les enzymes sont ajoutées, en une étape initiale, à la bouillie aqueuse de grains d'orge, à un pH compris 30 entre environ 5,0 et environ 6,5- Les enzymes peuvent être ajoutées simultanément, c'est-à-dire sous la forme d'un mélange enzymatique, ou successivement. Ensuite, les enzymes sont complètement dispersées dans la bouillie par agitation vigoureuse. La bouillie contenant les enzymes est ensuite 35 chauffée à environ 40-55°C, de préférence à environ 44-50°, pendant une durée d'environ 30 à environ 240 minutes, habituellement pendant environ 30 à 120 minutes et, de préférence, 70 28062 18 2053260 pendant environ 40 à 60 minutes. Pendant le chauffage, il est souhaitable d'agiter vigoureusement la bouillie, de façon à assurer un contact intime entre le substrat d'orge et l'enzyme ou les enzymes; Le chauffage dans cet intervalle de températures 5 pendant cette durée, permet à la fois la protéolysé des protéines des grains par les protéases et la digestion des grains d'orge par les systèmes enzymatiques de l'orge. Le déroulement de la réaction protéolytique se répercute directement dans la teneur en azote total, de même que dans la 10 teneur en © et que le gain obtenu en prolongeant dans le temps la réaction protéolytique au delà de cette durée était faible. A la fin de la protéolysé, la température de la boue est élevée, de valeur comprise entre environ 60 et environ 80°C, 25 de préférence entre environ 64 et environ 80°C. Lorsqu'une telle température est atteinte, on maintient la boue à une température se situant dans cet intervalle, pendant une période d'environ 30 à aiviron 120 minutes. Pendant cette durée, 1' c( -amylase à action liquéfiante 30 est hautement active pour la solubilisation de l'amidon par dégradation des polymères d'amylose et d'amylopectine dont est constitué l'amidon des grains de céréales. Pendant cette durée également, 1'amyloglucosidase et la -amylase agissent sur les chaînes de l'amidon pour produire des sucres fermentesciHes. 35 L'effet net de 1' pc -amylase est de liquéfier ou de solubiliser l'amidon avec production de dextrines non-fermentescibles, tandis que l'effet net . à la fois de la ft -amylase et de 1 'amyloglucosidase 28062 19 2053260 10 est de produire des sucres réducteurs fermentescibles tels que le dextrose. Non seulement l1 -amylase possède un mode d'action différent de ceux de la p> -amylase et de l1amyloglucosidase, mais également ces différentes enzymes présentent des activités optimales à des températures différentes, la température optimale peut varier en fonction par exemple de la nature de la source d'enzyme. Normalement, cependant, les 0( -amylases d'origine bactérienne, stabilisées thermiquement par les ions calcium, possèdent une température optimale - entre environ 70 et 80°C. A titre de comparaison, les amyloglucosidases, par exemple l'amyloglusidase provenant de Aspergilus niger, et les -amylases par exemple la -amylase provenant du malt d'orge, 15 possèdent une température optimale comprise entre environ 55 et environ 60°C. En d'autres termes, 1' -amylase présente d'habitude un maximum d'activité à des températures plus hautes que la ^ -amylase ou 1'amyloglucosidase. En raison de cet arrière-plan de faits concernant le mode 20 d'action des t( -amylases, des amyloglucosidases et des - amylases, et des exigences correspondantes relativement à leur température d'utilisation, et comme résultat de recherches expérimentales détaillées, la demanderesse à formulé, pour cette étape du procédé, une relation préférée entre la température ^5 et le temps sur la base d'un processus de chauffage en deux stades. Un tel programme de températures échelonnées donne de meilleurs rendements et de plus hautes teneurs en sucres fermen-tescibles (atténuation apparente augmentée) dans le moût résultant, par comparaison avec le moût obtenu lorsqu'une tempé-30 rature substantiellement constante est maintenue pendant cette durée. Dans le processus par paliers de températures, la masse complexe est initialement maintenue à une température d'environ 60 à environ 70°C, pendant environ 30 à environ 90, et de préférence 35 pendant environ 30 à 60, minutes. La température de la masse est ensuite élevée entre environ 70° et environ 80°C et maintenue à cette plus haute température pendant environ 10 à environ 60, 70 28062 20 2053260 et de préférence pendant environ 10 à environ 30, minutes. Le premier stade de températures, de 60-70°C, de préférence 64-68°C, est intermédiaire entre les températures optimales d'activité de 1' 0( -amylase d'une part et de 1'amyloglucosidase et 5 de la -amylase d'autre part, mais il se situe encore en dessous de la température à laquelle 1'amyloglucosidase et la -amylase sont substantiellement inactivées. En conséquence, dans ce premier stade, les activités de 1' 0( -amylase, de 1'amyloglucosidase et de la jb -amylase sont plutôt relativement 10 importantes, quoique inférieures à des conditions optimales. L'action combinée de ces enzymes solubilise . l'amidon, avec production concomitante de sucres non-fermentescibles et elle saccharifie en même temps cet amidon avec production de sucres fermentescibles. Dans de nombreux cas, la demanderesse a trouvé 15 qu'il n'était pas nécessaire de maintenir pendant plus d'environ 60 minutes cette température pour donner une teneur en sucres fermentescibles à, ou proche de, un niveau acceptable, comme indiqué par une atténuation apparente d'environ 759^. Cependant, à la fin de cette période, le rendement ,qui rend compte de l'effica-20 cité de la transformation de l'amidon et qui est mesuré par la valeur de la densité, tend à être plutôt faible. Dans le second stade, lorsque la température est comprise entre environ 70 et environ 80°C, de préférence entre 75 et 80°C, l'activité de I -amylase est optimale ou approximativement optimale, de 25 sorte que la solubilisation de l'amidon se produit rapidement, ce qui améliore le rendement. En même temps, puisqu'il s'est déjà produit une fragmentation ou dégradation considérable des chaînes des molécules d'amidon lors du stade précédent, ce qui a donné de nombreuses autres molécules de poids moléculaire 30 faible ou intermédiaire avec beaucoup plus de parties terminales sur lesquelles la -amylase peut agir rapidement, 1' p( -amylase tend à produire, dans ce second stade, une plus haute concentration en sucres fermentescibles que celle à laquelle on pouvait s'attendre. En conséquence, l'accroissement du rendement 35 peut être obtenu sans réduction importante, si tant est qu'elle se produit^ du rapport des sucres fermentescibles aux sucres non-fermentescibles. La courbe de température en fonction du temps 70 28062 21 2053260 dans le cycle de brassage préféré selon le processus est représenté sur la figure 6 des dessins ci-jointe. Ce processus particulier peut être modifié en différant l'addition du malt jusqu'àprès addition de l'adjuvant céréalier (liquide ou solide) 5 et, dans le cas de cette modification, le mélange enzymatique isolé utilisé dans le premier stade peut être remplacé par une protéase seule, par exemple la broméline, la ficine, la pepsine ou la papaïne, et l'on peut ajouter une o{ -amylase isolée, c'est-à-dire en même temps que le malt et 1'amyloglucosi-10 dase, après introduction de l'adjuvant céréalier, si ces constituants n'ont pas été inclus au cours du premier stade. Selon une autre modification de ce processus particulier, le mélange enzymatique isolé utilisé dans le premier stade est remplacé par une protéase isolée, par exemple la broméline, 15 la fiQine, la pepsine ou la papaïne, à raison d'au moins 0,5, de préférence au moins 0,9 unité par gramme, et 1' -amylase, éventuellement en même temps que 1'amyloglucosidase, est ajoutée à la masse complexe après l'addition de l'adjuvant céréalier (liquide ou solide). L' -amylase peut être ajoutée sous la 20 forme d'une 0( -amylase isolée seule, ou comme constituant d'un mélange enzymatique isolé contenant aussi une protéase, de façon appropriée un complexe enzymatique dérivé d'une souche de Bacillus subtilis. B. Dans ce processus, comme résumé dans l'organigramme de 25 là figure 2 des dessins ci-joint> on ajoute l'enzyme protéolytique dans une étape initiale, éventuellement en combinaison, par exemple,sous la forme d'un mélange enzymatique isolé, avec 1' et, de préférence, entre environ 40 et environ 60 minutes, afin d'effectuer la protéolysé. Tout en chauffant, il est souhaitable d'agiter vigoureusement la bouillie de façon à assurer le contact intime entre le substrat d'orge et l'enzyme ou les enzymes. 35 Si 1' (X -amylase n'a pas été ajoutœdans l'étape initiale, elle est ajoutée alors à la fin ou vers la fin de l'étape de protéolysé. 70 28062 22 2053260 Quand. 1' ç( -amylase est présente dans la bouillie, on élève la température de celle-ci, par exemple par injection directe de vapeur ou par passage à travers un échangeur de chaleur approprié, jusqu'à environ 65-90°C, de préférence 5 jusqu'à environ 70-85°C. A une telle température, l'-cc -amylase est hautement active pour la digestion de l'amidon en agissant sur, et en dégradant, les polymères d'amylose et d'amylopectine dont est constitué l'amidon. Les produits finaux de la digestion de l'amidon par 10 1* 0( -amylase sont constitués par une grosse quantité de dextrines limites et par de plus petites quantités de glucose et de maltose. L'effet net de la fragmentation induite par 1* (X -amylase est de solubiliser, c'est-à-dire de liquéfier, l'amidon, de façon à faciliter le contact physique entre les 15 grains et la ^ -amylase à action saccharifiante à incorporer ensuite. La bouillie est maintenue dans cet intervalle de températures jusqu'à ce que l'amidon soit solubilisé d'une manière adéquate et la viscosité réduite à la valeur appropriée. De préférence, 20 un degré adéquat de solubilisation est obtenu, à une telle température, au bout d'environ 10 à environ 90 minutes, et plus . usuellement au bout d'environ 10 à environ 40 minutes. D'une manière générale, plus la température est élevée à l'intérieur de l'intervalle précité, plus courte est la période nécessaire 25 à l'obtention du degré désiré de solubilisation. Pendant cette période, la température peut varier à l'intérieur de l'intervalle, par exemple augmenter graduellement. A la fin de l'étape précédente, la trempe liquéfiée est refroidie, par exemple par passage à travers un échangeur de 30 chaleur ou simplement en la maintenant dans un récipient de réaction, jusqu'à environ 40-65°C, de préférence jusqu'à environ 50-60°C, et- l'on ajoute alors, soit simultanément soit successivement dans un ordre quelconque, 1'amyloglucosidase et la amylase ou source correspondante, et l'on disperse ces enzymes 35 par agitation rigoureuse. L'amyloglucosidase et la ji -amylase en contact intime avec l'amidon, attaquataux extrémités non-réductrices des chaînes restantes d'amylose et d'amylopectine, 70 28062 23 2053260 et elles attaquent aussi les produits de dégradation résultant de l'attaque précédentepar 1'C( -amylase, en enlevant graduellement ■ des maillons maltose avec production de sucres fermentescibles, L*amyloglucosidase attaque les liaisons (1—*>4) et (1-*-6) 5 dans les produits, c'est-à-dire les dextrines limites, de l'attaque précitée par 1' (X -amylase avec production d'une plus grande quantité de sucres fermentescibles, sous la forme de dextrose. Puisqu.' il se produit déjà une fragmentation considérable des chaînes d'amidon dans l'étape précédente, 10 impliquant l'action de 1' o Le tempg&e maintien dans cet intervalle de température nécessaire pour produire une teneur acceptable en sucres fermentescibles varie en fonction par exemple de la quantité et de 20 l'activité de 1'amyloglucosidase et de la jï -amylase (habituellement du malt). D'une manière usuelle, dans lecas de 8 à 20$ de malt ayant l'activité diastasique préféré de 100 à 140° Lintner et avec 1,0 x 10~^ou plus unité d'amyloglucosidase par gramme, un tempsde maintien compris entre 30 et 120 minutes est 25 satisfaisant. C. Ce processus, comme, résumé dans l'organigramme de la figure 3 des dessins ci-joint, constitue une modification du processus précédent B, dans lequel l'étape initiale est la liquéfaction à haute température impliquant la présence d' p{ -amylase. 30 Dansce processus, on ajoute 1' o( -amylase à la bouillie aqueuse de grains d'orge et on la disperse intimement dans celle-ci. Ensuite, on élève la température, par exemple par passag^de la bouillie à travers un échangeur de chaleur ou dans un récipient de réaction soumis à l'agitation, jusqu'à une valeur d'environ 35 65-90°C, de préférence d'environ 70_85°C. La bouillie est maintenue dans cet intervalle de températures, de préférence sous agitation continue, jusqu'à ce que l'amidon 70 28062 24 2053260 10 ait été adéquatement solubilisé et la viscosité réduite à la valeur appropriée. D'ordinaire, à une telle température, on obtient un degré convenatSe de solubilisation au bout d'environ 10 à environ 90 minutes, plus couramment au bout d'environ 10 à environ 40 minutes. D'une manière générale, plus la température est haute, plus la durée nécessaire à l'obtention du degré désiré de solubilisation est courte. Pendant cette période, la température peut varier à l'intérieur de l'intervalle précité, par exemple augmenter graduellement. A la fin de l'étape précitée, la trempe liquéfiée est refroidie à environ 40-65°C, de préférence à environ 50-60°C, par passage à travers un échangeur de chaleur.ou dans un récipient de réaction soumis à agitation et parcouru par un serpentin ou entouré d'une chemise. Ensuite, on ajoute la ^5 protéase et "l'amyloglucosidase isolées et la /i -amylase isolée ou.la source de -amylase, dans les quantités requises, et on les disperse complètement dans la trempe par agitation vigoureuse. Ces enzymes peuvent être ajoutées simultanément, par exemple sous Informe d'un mélange, ou bien elles peuvent 2® être ajoutées successivement, dans un ordre quelconque d'une manière continue ou en observant un intervalle d'arrêt de^ par exemple,15 minutes. Si on le désire, le pH du milieu dans cette étape peut être réglé à environ 5-6,5 de préférence à environ 5-6. Pendant cette période, la protéase tranforme les protéines en composés contenant de l'azote soluble, ce qui fournit des agents nutritifs pour la croissance subséquente de la levure et contribue aux propriétés caractéristiques de la bière, par exemple la stabilité de la mousse et du voile et un gout savoureux 30 doux. L'amyloglucosidase et la -amylase (d'ordinaire du malt) continue à agir sur l'amidon restant et les produits de réaction de 1'amylase, pour donner des sucres fermentescibles. Le temps de maintien dans cet intervalle de température nécessaire pour produire une t eneur acceptable en azote soluble 35 et une teneur acceptable en sucres fermentescibles varient de nouveau en fonction par exemple des quantités et activités de protéase et de malt. D'ordinaire, pour une quantité ou niveau 28062 25 2053260 enzymatique de protéase de 0,5 unité de protéase par gramme ou plus, une quantité d'amyloglucosidase de 1,0 x 10 ^ tou plus , • unité de A.G. par gramme, et pour 8 à 20$ de malt ayant une valeur diastasique préférée de 100-140° Lintner, un temps de maintien de l'ordre de 30 à 240 minutes, de préférence de 30 à 120 minutes, est satisfaisant. A la fin de chacune des étapes A à C, la température de la trempe est couramment élevée pendant une brève période, par exemple pendant 2 à 5 minutes, au dessus de 80_90°C afin d'inactiver les enzymes. Ensuite, la trempe est envoyée dans une cuve-filtre ou filtre pour trempe (filtre à moût), classique en brasserie, de façon à séparer le moût de la drêche. D'autres méthodes de séparation, par exemple . . la centrifugation, ou une combinaison de ces méthodes, telle que la filtration et la centrifugation, peuvent être utilisées. La trempe est de préférence filtrée sans refroidissement, mais, si on le désire, elle peut être refroidie avant filtration. Le produit de digestion filtré est ensuite lavé et amené au volume désiré. D. Ce processus est une modification de l'un quelconque des processus A à C, dans lequel on omei 1'amyloglucosidase isolée pendant le brassage, cette enzyme étant incorporée dans le moût, par exemple après que celui-ci ait été porté à l'ébul-lition, mais avant la fermentation. Pour l'obtention du moût lui-même, les étapes décrites pour chacun des processus A à C peuvent être utilisés, excepté le fait que ltmn'ajoute pas d'amyloglucosidase. Chacun des processus précités A à D est de préférence modifié par introduction d'un adjuvant céréalier dans la masse principale, à un stade approprié. L'utilisation d'un adjuvant céréalier permet de réduire substantiellement le coût et, en même temps, on considère qu'il donne une bière de couleur plus pâle avec un meilleur pouvoir de conservation. L'additif céréalier peut provenir de grains de céréales bruts ou non traités contenant de l'amidon ou de grains de céréales préparés ou prétraités, c'est-à-dire pré-gélatinisés, contenant de l'amidon. Les grains de céréales doivent être utilisés en une quantité allant d'environ 10 à environ 60$ et 70 28062 26 2053260 de préférence d'environ 42 à environ 45$, en poids par rapport au poids du substrat de céréales, par exemplede l'orge, dans l'étape initiale, de sorte que l^fcapport substrat de céréales/ additif céréalier dans la formulation de trempe est compris 5 entre 90:10 et 63:37- D'une manière courante, lors de la mise en oeuvre de la présente invention, le rapport substrat céréalier/ additif céréalier est compris entre environ 65:35 et 70:30. D'une façon tout à fait surprenante, de telles teneurs relativement élevées en additifs donnent normalement des moûts ayant des 10 teneurs en azote satisfaisantes. Les grains de céréales prétraités peuvent être introduits directement dans la masse principale, de préférence lorgne la formation initiale de la bouillie aqueuse. Les grains de 'céréales bruts ou non préparés sont d'autre part de préférence liquéfiés avant leur introduction 15 afin de gélàtiniser l'amidon qu'ils contiennent de façon à ce que celui-ci soit prêt à une liquéfaction subséquente et, lorsqu'il est combiné à la masse principale, à la saccharification. Ceci peut être accompli par précuisson des céréales dans un récipient séparé, habituellement appelé cuiseur de céréales. 20 L'opération de précuisson peut être effectuée en mélangeant les grains céréaliers bruts, par exemple les gruaus de maïs, avec de l'eau et soit un moût d'orge finement broyé soit une 70 28062 27 2053260 de céréales bruts, par exemple en une quantité allant de 14 à 16 unités d'amylase par gramme de grains de céréales bruts. En suivant les processus A et B, on incorpore, de façon appropriée, l'additif céréalier liquéfié, après la période 5 initiale de réaction protéolytique; dans le cas du processus G, cet additif est incorporé, de façon appropriée, aPrés la liquéfaction à haute température. Lorsqu'on utilise l'orge comme substrat céréalier dans les processus précités, on obtient un moût convenablement équilibré, 10 légèrement coloré, en même temps qu'une dégradation satisfaisante de l'amidon et dasprotexn^ en adoptant la succession d'étapes décrites dans les divers organigrammes ci-joiniA De plus, un tel moût possède normalement une plus haute teneur en sucres fermentescibles et une plus haute teneur en azote, comme indiqué 15 par des atténuations apparentes d'environ 75$ ou plus, des teneurs en azote total d'environ 750 à 950 mg/l ou plus et de teneurs en azote formolique d'environ 200 à 250 mg/l, par comparaison avec les moûts qui peuvent être obtenus en suivant les enseignements du brevet précité. 28062 28 2053260 Le moût ainsi obtenu peut être utilisé directement ppur la fabrication de la bière par les étapes habituelles du procédé classique, en constituant ainsi un produit' de remplacement total pouvant se substituer à un moût produit de manière classique, ce 5 qui simplifie l'installation utilisée pour la fabrication et entraine également d'autres économies. Selon une variante, le moût peut être soumis à une évaporation jusqu'à l'obtention d'un sirop, en utilisant par exemple un évaporateur travaillant sous vide. Ce sirop-peut être ensuite stocké jusqu'au moment désiré, de 10 façon à accroitre la production d'un procédé classique en période de pointe. Dans cette éventualité, Qn dilue le sirop, avant usage, avec de l'eau. Ce sirop contient avantageusement entre environ 70 et environ 85 en poids de solides totaux, de préférence environ 75 à 80 fo. Selon une variante, le moût peut être,séché de façon à 15 constituer une poudre en utilisant par exemple un appareil de séchage par pulvérisation, cette poudre étant ensuite dissoute dans l'eau pour donner un moût de la manière désirée et au moment désiré. Lors de la concentration ou du séchage, il est nécessaire de contrôler soigneusement la température afin d'éviter le changement 20 de couleur ainsi que d'autres atteintes aux propriétés du moût. Les substances amères, comme les houblons, peuvent être ajoutées avant concentration ou séchage du moût. On emploie le processus classique pour convertir le moût en bière. Par exemple, on mélange le moût avec des additifs donnant 25 de l'amertume, tel que les houblons et l'on porte à 1'ébullition. La chaleur inactive complètement les enzymes et stérilise le moût, tandis que l'extraction réalisée sur les houblons donne au moût des constituants donnant une saveur et/ou des propriétés de conservation de la bière. Le moût est ensuite refroidi et fermenté par 30 addition d'une levure à bières appropriée telle qu'une "levure basse "utilisée ocuramment pour la fabrication de boissons alcooliques généralement connues sous le nom de bière de fermentation basse ou telle qu'une "levure haute" habituellement utilisée pour la fabrication des boissons alcooliques connues sous le notice bières blondes ou aies. 35 La levure utilise les sucres normalement fermentescibles qui sont présents dans le moût. La fermentation primaire du moût ("levure basse")se produit, de façon typique, à environ 7-14°C et demande 28062 29 2053260 environ 3 à 10 jours. Cette feraer-tatior primaire est suivie par la fermentation secondaire ou fermentation basse, ordinairement à environ C-5°C, pendant 2 à 8 semaines ou plus. Ensuite, la bière est clarifiée ou filtrée, carbonatée et conditionnée. Exemples de modes de réalisation préférés. Les exemples suivants sont fournis pour donner une meilleure compréhension de la présente invention. Bien entendu, ces exemples, qui sont donnés à titre d'illustration, ne doivent pas être interprétés limitativement. EXEMPLE 1 Cet exemple illustre la préparation d'un moût à bière et d'une bière selon la présente iivention dans des conditions effectives de brassage. Partie A-moû.t à bière 1 • Orge On a utilisé de l'orge de conquête ("conquest barley"). Cette orge à été nettoyée et ensuite décortiquée, ce qui a donné 10 fo en poids d'enveloppes, lesquelles ont été séparées par aspiration. Les grains d'orge ont été ensuite broyés dans un broyeur du type connu sous la dénomination commerciale "Ecbart Model 2020" ajusté au calibre n° 1. Les grains broyés ont été ensuite mélangés avec les enveloppes. Le mélange avait la composition suivante, déterminée par analyse granulonétrique (en utilisant des tamis conformes aux normes américaines). Nombre de mailles par cm linéaire fo pondéral retenu sur' tamis 3,5 2 5 24 7 45 11 17 24 8 40 2 2 Fraction recueillie dan§4.e récipient 2. Eau On a utilisé de l'eau pour brassage normal, ayant une dureté totale d'environ 30 parties par mi." lion et un pH compris entre 28062 30 2053260 5,3 et 5,6. 3. Addition de sel On a ajouté à l'eau utilisée pour faire une bouillie avec l'orge, 6 g de gypse et 9,5 g de chlorure de calcium, pour 56,75 5 litres d'eau. 4. Enzymes (a) et (t) : protéase et c/L -amylase Dans cet exemple, on a utilisé un mélange enzymatique isolé comme source simultanée de protéase et d1 oC -amylase. Ce mélange enzymatique provenait d'une source de Bacillus subtilis (ATCC 21556): laquelle a été préparée comme indiqué dans l'exemple 2 de la demande de brevet français, déposée au nom de la demandere.-;se, le 8 juillet 1970 , sous le n° et ayant comme titre "Procédé de production d'un moût à bière". Dans ce cas, le substrat obtenu a été soumis à des essais pour déterminer l'activité enzymatique ; les résultats étaient les suivants Activité de l'amylase 160C Unités/ml.(unités Stein-Fisber modifiées" Activité de la protéase...10,0 unités/nl(unités Kunitz modifiées) Protéase neutre.... 6,2 unités/ml(unités Kunitz modifiées) Prctéase alcaline 3,8 unités/ml(unités Kunitz modifiées) On a stabilisé le bouillon par addition de propylène-glycol (5,0 fo en poids/volume) et de sorbate de potassium (1 % en poids/ volrj'c-} . (c) -amylase On a utilisé du malt d'orge broyée comme source de & -amylase, lequel avait une activité diastasique de 137° Lintner. L'éventail granulométrique de la mcûture, détermiré par analyse aux tamis (en utilisant des tamis américains standardisés était le suivant : Nombre de mailles par cm linéaire % pondéral retenu 3C 35 sur le tamis 3»5 10 5 16 7 26 11 28 24 12 40 4 Fraction recueillie 4 dans le récipient 70 28062 31 2053260 10 15 20 30 35 (d) Amyloglucosidase L'amyloglucosidase utilisée était celle disponible dans le commerce auprès de Miles Laboratories, Inc., Irdiana, U. S. A. scus la dénomination commerciale "Diazyme". La substance particulière utilisée se présentait sous une forme pulvérulente ayant une activité normalisée égale à 160 AG/'g. Cette enzyme possède un pH optimal entre 3,5 et 5,0. Cependant, elle présente une bonne activité jusqu'à un pH de 7. La température optimale est de 50°C, quoiqu'elle possède une activité satisfaisante jusqu'à 60°C; elle est substantiellement inactive à des températures supérieures à 80°C. Elle contient aussi des petites quantités de cellulase, d'oC-amylase et ce protéase. Cette substance est stable lorsqu'elle est maintenue dans des récipients étanches, à l'état sec et au frais. 5. Gruaus de maïs On a utilisé comme additif céréalier des gruaus de maïs bruts ayant une teneur en humidité de 11,5 i° en poids. L'éventail granulométrique a été déterminé par analyse au moyen de tam:" ô américains stands disés, ce qui a donné les résultats suivants : Nombre de mailles par cm linéaire 11 24 40 Fraction recueillie dans le récipient 6. Mélange destiné au brassage pondéral retenu sur le tamis 15,5 80 2,5 2 Constituant Poids total Rapport Poids pouvant être extrait Orge 6,205 kg 64 3,850 kg Gru.aus de maïs brut 3,468 kg 36 2,850 kg Kslt(source de-amylase) 0,61 0 kg — 0,427 kg Partie 5 - cycle de brassage Le cycle suivi est celui représenté par la courbe de la figure 4 des dessins ci-joints. Etape (a) On ajoute 24 litres d'eau dans un récipient sous agitation et 28062 3g' 2053260 l'on agite lentement le bouillon contenant les enzymes, stabilisées au moyen d'un sel, correspondant à un degré enzymatique de 115 unités d' OC -amylase et de 0,7 unité de protéase par gramme d'orge à incorporer par la suite. On ajoute alors 6,205 kg d'orge broyée. 5 On agite vigoureusement la bouillie ainsi obtenue. Etape -lui On admet de la vapeur dans la chemise entourant le récipient afin de porter la bouillie aqueuse à la température de 44,5°C. On maintient cette température pendant 45 minutes, en agitant continuel-10 lement la bouillie. Etape (c) Simultanément, les gruaus de maïs bruts sont liquéfiés. On ajoute 12 litres d'eau à l'appareil de cuisson des grains et l'on agite lentement le bouillon contenant les enzymes, stabilisées par 15 un sel, à raison de 14 unités d' (X -amylase par gramme de gruaus bruts à ajouter ensuite. On ajoute alors 3,458 kg de ces gruaus et l'on agite vigoureusement la bouillie. Cette bouillie est tout d'abord chauffée jusqu'à 71°C et cette température est maintenue pendant 16 minutes. Ensuite, le trampe de maïs est portée à la 20 température d'ébullition en 2 minutes et maintenue à cette température pendant 2 autres minutes. La trempe liquéfiée est alors versée dans la trampe d'orge contenue dans lfe récipient sous agitation, à la fin de la durée de la réaction protéolytique de 45 minutes. La masse totale est agitée vigoureusement pour disperser la trempe de 25 maïs liquéfié.. Etape (d) La température de la masse globale est portée progressivement à 78°C (en une durée de l'ordre de 15 minutes) en utilisant à nouveau un chauffage à vapeur au moyen d'une chemise entourant le récipient. 30 On maintient cette température pendant 25 minutes, période au cours de laquelle 1' c 35 Etape (e) On transfert ensuite la masse liquéfiée au moyen d'une pompe alternatif, centrifuge ou diaptiragme, d^fuis le réacteur jusqu'à un 70 28062 33 2053260 second, récipient de réaction sous agitation, avec passage intermédiaire dans un échangeur de chaleur dans lequel on refroiditladite masse. Le temps de maintien dans 1'échangeur de chaleur est d'environ 2 minutes, la température du milieu à la fin de cette 5 période étant tombée jusqu'à environ 56°C. Etape (f) On ajoute rapidement, sans interruption, dans le second récipient de réaction, 0,610 kg de malt d'orge broyé et la "Diazyme" à raison de 6,4 x 10-^ unité d1amyloglucosidase par gramme de 10 substrat de grains d'orge, et l'on disperse par agitation. La durée de maintien dans ce récipient de réaction est de 1 heure.et l'on maintien la température, pendant cette période, au moyen d'un chauffage à la vapeur grâce à une chemise entourant le récipient, à environ 56°C, tout en agitant continuellement le milieu. 15 Etape (g) A la fin de cette période, la trempe ou maische saccharifiée est pompée dans une cuve-filtre dans laquelle on permet à ladite trempe la sédimentation pendant 10 minutes environ. On a noté que la clarté du filtrat (moût) recueilli était bonne. Le temps 20 d'écoulement était d'environ 30 minutes. Le moût ainsi obtenu était de,couleur claire et possède une composition équilibrée en amino-acides et en hydrates de carbone. Ce moût a été soumis à une ébullition dans une chaudière. Avant de faire démarrer 1'ébullition, on a ajouté 42,8 grammes de houblons 25 au moût dans la chaudière. On a fait bouillir le moût pendant 90 minutes. 30 minutes avant la fin de 1'ébullition, on ajoute une quantité additionnelle de 28,8 g de houblons et de 2,9 g de mousse d'Irlande, lesquelles additions ont été ensuite suivies, 5 minutes avant la fin de 1*ébullition, par l'addition d'encore 14,4 g de 30 houblons. Pendant 1*ébullition à l'air libre, le volume diminue par suite de 1'évaporation et passe d'environ 61 litres à environ 56-59 litres. A la fin de 1'ébullition, on place le moût dans le récipient à houblons où il reste pendant 10 minutes. On fait ensuite couler le moût lentement dans un récipient où on le laisse déposer pendant 35 30 minutes. Une analyse montrant les propriétés caractéristiques du moût (après 1'ébullition) est donnée dans le tableau I ci-après, qui comprend aussi, dans un but de comparaison, une analyse d'un 70 28062 34 2053260 moût de malt classique typique approprié pour la fabrication commerciale de la bière. TABLEAU T 5 Propriété Moût orge/enzyme Moût classique : Extrait (°P) 11,2 11,9 : Azote total (mg/litre) 962 875 : Azote formulé 240 243 : 10 pH 5,2 5,1 : Atténuation apparente (*) 78 79 : Par comparaison à un moût de malt classique, la composition en amino-acides du moût selon l'invention ne présente pas de différence 15 essentielle. Les particularités caractéristiques du moût selon le présent exemple et d'autres moûts obtenus par le procédé de la présente invention consistent en une atténuation accrue et en une basse teneur en hydrates de carbone, par comparaison avec les moûts résul-20 tants d'un procédé enzymatique dans lequel on a omis 1'amyloglucosidase. Partie C - bière Le moût a été refroidi jusqu'à 14,4°C dans un réfrigérant à plateau et on l'a laissé s'écouler dans le fermenteur, en le trans-25 formant directement en bière en employant le processus suivant. 1. Fermentation On ajoute une "levure basse" (Saccharomyces Carlsbergensis) au moût, à raisonds 100 g de levure comprimée pour 40 litres de moût. On place le moût dans une bonbonne ou tourie en verre et l'on fait 30 passer bulle à bulle de l'oxygène à travers ce moût de façon à . obtenir de l'oxygène dissous à raison de 20 parties par million. On met ensuite la levure en levain et on la mélange bien avec le moût. On affectue la fermentation pendant 7 jours à 14,4°C. A la fin 35 de la fermentation, on ajuste la teneur en anhydride sulfureux naturel de la bière de stockage primaire jusqu'à 15 parties par million par addition de métabisulfite de sodium. 70 28062 35 2053260 (b) Vieillissement On utilise pour le vieillissement un fût en acier inoxydable. On verse la bière dans le fût et l'on y ajoute 0,068 ml de proté-sal (une enzyme résistant au froid) ; on met ensuite le fût sous 2 5 une pression relative de gaz carbonique égale à 1,4 kg/cm . On effectue le vieillissement primaire à 1°C, pendant 14 jours, après quoi on filtre la bière. 3. Filtration On effectue la filtration primaire à travers un filtre de 10 clarification. La bière est filtrée dans un autre fût auquel on ajoute un adjuvant .de filtration connu sous la dénomination commerciale "Clearfil" (7,0 g). On filtre ensuite la bière à nouveau à travers un filtre de clarification comportant un revêtement d'adjuvant de filtration' "4C" (23 g) et l'on recueille le filtrat 15 dans un autre tonneau. Après cette filtration secondaire, on carbonate la bière jusqu'à 2,8-3,0 volumes. 4. Mise en bouteilles On met la bière en bouteilles à la sortie du tonneau en p maintenant une pression relative de 1,05 kg/cm de C02 ; avant 20 bouchage ou encapsulage, on laisse l'oxygène dissous s'échapper. 5'. Pasteurisation On pasteurise la bière à 60°C pendant environ 2 minutes. La durée totale de passage dans le dispositif de pasteurisation, en forme de tunnel, est de 26,6 minutes, la température de sortie 25 étant d'environ 27°C. 6. Stockage La bière mise en bouteilles est stockée à la température ambiante ou dans un réfrigérateur à +4°C. La saveur est testée immédiatement après mise en bouteilles et au cours du stockage. La 30 bière prête à la consommation est jugée au moyen d'une analyse physico-chimique normalisée et au moyen d'essais organoleptiques. Le tableau II ci-après donne les résultats obtenus, de même que ceux relatifs à l'analyse d'une bière commerciale dérivée d'un. moût de malt classique, utilisée comme témoin, dans un but de 35 comparaison. 28062 36 2053260 TaBT.mn TT : Propriété Bière orge/enzyme Bière classique. : :Extrait apparent ($) 2,4 2,4 : 5 :Extrait réel ($) 3,7 4,16 : îAlcool {fo) 4,2 3,8 : :Extrait initial ($) 12,0 11,9 : :Atténuation apparente {f°) . 80,0 79,5 : .•Couleur (SRM)' 3,0 3,1 : 10 :pH 4,7 4,0 : :Isohumolone (IBU) 18 17 : :Mousse (SIG) 136 134 i rDiacétyle (ppm) 0,04 0,08 : : Protéines ($) 0,32 0,32 : 15 :S02 (ppm) 3,9 4,0 : :Eer (ppm) 0,11 0,12 : :Essai de force du voile : (1 semaine) 120 200 : : Sulfure de diméthyle (ppm) ' 97 108 : 20 :Acétaldéhyle (ppm) 4,4 4,1 : - :Acétate d'éthyle (ppm) 30 34,3 : :n-Propanol (ppm) '5,4 6,7 : :iso-Butanol (ppm) 16,0 20,7 . : :Alcool amylique fptm) 63,2 68.2 : 25 En se reportant à ce tableau, on voit que la bière enzymatique de l'invention est similaire dans la plupart de ses propriétés, à la bière témoin, sauf en ce qui concerne la teneur en alcool qui est plus forte et la stabilité du voile qui, d'une façon importante, est meilleure. En ce qui concerne les propriétés organoleptiques, « 30 la bière orge/enzyme selon l'invention à une saveur relevée; l'analyse statistique des résultats obtenus par des jurys de dégustation de bière expérimentés, à montré qu'il n'y avait pas de nette préférence pour l'une ou l'autre, et que la bière enzymatique était autant acceptable que la bière commerciale utilisée comme témoin. 35 Par comparaison avec la bière obtenue par le procédé du brevet mentionné plus haut (dans le présent cas selon l'enseignement de l'exemple 1 de ce brevet précité), la bière selon la présente 70 28062 37 2053260 invention présenta- une saveur ou goût supérieur (bière ayant plus de corps) et une stabilité améliorée, ce qui était prévisible puisque le moût à partir duquel cette bière a été faite avait une atténuation plus élevée et une teneur en azote formolé plus forte. 5 EXEMPLE 2 On utilise dans cet exemple les mêmes matières premières que celles de l'exemple précédent, avec cependant les différences suivantes : -, 1. Le complexe enzymatique utilisé contenait 6370 unités modifiées 10 Stein-Fisher d' -amylase par millilitre et 44,3 unités Kunitz modifiées de protéase par millilitre et il aVait été obtenu à partir de Bacillus gnhtilis ATCC 21556. par un processus similaire à celui décrit dans l'exemple 1 de la demande de brevet français déposée le 8 Juillet 1970 au nom de la "demanderesse. 15 2. On a utilisé la Diazyme LD 30, disponible dans le commerce / auprès des Miles Laboratories, se présentant sous la forme d'un produit liquide ayant une activité de 30 imités d'amyloglucosidase (A. G.) par millilitre. 3. On a utilisé un mais broyé plus grossièrement répondant à 20 l'analyse granulométrique suivante : Mesh n° % pondéral retenu sur le tamis 10 - 14 0,75 25 18 10,3 30 - 37,25 60 • 44,75 100 4,6 Fraction recueillie dans le 30 récipient 2,4 Le processus adopté pour cet exemple était le même que celui de l'exemple précédent, excepté le fait que les enzymes ont été utilisées à raison de 100 unités d'ri -amylase, 0,7 unité de protéase et 0,47 unité de A. G. par gramme d'orge, tandis que la 35 température et la durée des étapes de solubilisation (étape d) et de saccharification (étape f) ont été modifiées comme indiqué dans le tableau ci-après. Avant ébullition, on a analysé les moûts 70 28062 38 2053260 ainsi obtenus en vue de déterminer différentes propriétés et les résultats obtenus pour chaque opération (effectuée 2 fois) sont donnés dans le tableau III ci-après. o nO CM m tn o CN TABLEAU III ( (Etape: ( Température (0 C ) 65 70 75 80 85 90 (Solubilisation (etape d) ( (Sacchari- (fica^ion (" ^étape f) Temps (ma) 40 30 30 20 20 10 Température (°c) 60 60. 55 50 45 40 Temps (mn) 30 60 60 60 90 90 "^Propriété s du moût ;Extrait .( op) 10,0 10,05 10,15 10,2' 10,4 10,2 10,2 10,15 10,1 10,2 10,35 10,45 / Azote total (mg/l) 758 757 782 785 770 745 751 756 722 710 702 710 /Azote formolé (mg/l) 204 201 210 195 190 192 185 190 182 187 185 184 {q.f. (°p) r 2,0 2,0 2,05 2,05 2,2 2,1 2,2 2,2 2,4 2,3 2,3 2,25 \ ^Atténuation ($) 80,0 79,69 79,8 '79,9 78,8 79,1 80,0 78,3 76,2 7,8,5 79,3 78,5 Ch es 70 28062 40 2053260 Tous les moûts ont donnés des bières acceptables, par fermentation selon le processus de l'exemple 1. EXEMPLE 3 Partie A - Matières premières 5 Dans cet exemple, les matières premières utilisées étaient les mêmes que dans l'exemple 1, excepté cependant les différences suivantes : 1. On a utilisé comme source de protéase une broméline commerciale (obtenue, à partir du jus de pamplamousse) disponible auprès 10 des Mann Research Laboratories, New-York, U. S. A. (n° 05300-293 dans le catalogue de cette firme). 2. La source d' OC -amylase était constituée par le complexe enzymatique isolé utilisé dans l'exemple précédent. 3- La source d'amyloglucosidase était constituée par la Diazyme 15 LD-30, se présentant à l'état liquide, qui titrait 30 unités de A. G-. par millilitre. Partie B - Cycle de brassage La relation entre la température et le temps au cours du cycle de brassage adopté est celle indiquée par la courbe de la figure 5 20 des dessins ci-joints. Etape (a) On ajoute 24 litres d'eau dans un récipient de réaction sous agitation et l'on y'ajoute lentement le bouillon contenant les enzymes stabilisés par un sel, ledit bouillon contenant 100 unités 25 d' ÛC -amylase et 0,7 unité de protéase par gramme d'orge à incorporer ensuite. On ajoute alors 6,205 kg d'orge broyée et l'on soumet à une agitation vigoureuse la bouillie ainsi obtenue. Etape (b) On élève la température de la bouillie aqueuse jusqu'à 78°C 30 (en 15 minutes environ) par injection directe de vapeur dans la masse. On maintient cette température pendant 25 minutes, au cours desquelles on agite continuellement la bouillie, et 1' 9( -amylase liquéfie ou solubilise les grains d'orge avec production d'oligosaccharides et de dextrines limitent à chaînes branchées. 35 Etape (c) On envoie alors la masse liquéfiée, depuis le récipient de réaction jusqu'à un échangeur de chaleur dans lequel elle est 70 28062 41 2053260 refroidie, en utilisant une pompe alternative du type à diaphragme. La durée de maintien dans l1échangeur de chaleur est d'environ 20 minutes, période à la fin de laquelle la température de la masse tombe jusqu'à environ 56-60°C. 5 Etape (d) Simultanément à la liquéfaction du substrat de grains d'orge, on prépare l'additif céréalier à partir des gruaus de mais brut. On ajoute 12 litres d'eau dans le cuiseur de maïs et l'on y.ajoute, sous agitation , le bouillon contenant l'enzyme stabilisée par un 10 sel (utilisés comme dans l'étape (a)), à un niveau enzymatique de 14 unités d' o( -amylase par gramme de gruaus de maïs brut à incorporer ensuite. On ajoute alors 3,458 kg de gruaus de maïs et l'on agite vigoureusement la bouillie. On chauffe d'abord cette bouillie à 71°C et l'on maintien cette température pendant 16 15 minutes. On amène ensuite le trempe de maïs à 1'ébullition, en 2 minutes, et on maintient à la température d'ébullition pendant 2 minutes. Etape (e) On fait passer le milieu de l'étape (c) de 1'échangeur de 20 chaleur à un second récipient de réaction sous agitation. On verse ensuite dans la masse liquéfiée dudit récipient la trempe liquéfiée provenant du cuiseur de maïs de l'étape (d). On agite vigoureusement la masse globale pour disperser la trempe de maïs liquéfié* Ensuite, on ajoute simultanément, sans interruption, la protéase sous forme 25 de broméline à raison de 0,7 unité de protéase par gramme, la Diazyme à raison de 2,5 x 10~^ unités de A. G-. par gramme et le malt d'orge broyé , et l'on disperse uniformément par agitation. La durée de maintien dans ce récipient de réaction est de 1 heure et, pendant cette durée, on maintient la température à environ 56°C, tout en 30 agitant la masse continuellement. Etape (f) A la fin de cette période, la trempe protéolysée et saccharifiée est pompée dans un filtre-presse classique dans lequel on permet à la trempe de sédimenter pendant environ 10 minutes. On 35 note que la clarté du filtrat recueilli ést bonne. La durée d'écoulement est d'environ 25 minutes. On porte le moût ainsi obtenu à 1'ébullition dans une chaudière 28062 42 2053260 par le même processus que dans l'exemple 1 . Le moût bouilli est ensuite analysé et les résultats sont donnés dans le tableau IV ci-après. TABLEAU IV 5 Propriété du moût Résultat : Extrait de moût (°P) ' 11,9 : Azote total (mg/litre) 757 : Azote formolé (mg/litre) 214 : pH 5,2 : Atténuation ($) 79 : Le moût est légèrement coloré et possède des teneurs en 15 amino-acides et en hydrate^&e carbone similaires à celles des moûts de malt classique . Partie C - bière Ce moût est transformé directement en une bière de bonne qualité en suivant le processus de la Partie C de l'exemple 1. 20 EXEMPLE 4 On utilise les mêmes matières premières et on suit les mêmes processus que dans l'exemple précédent, excepté le fait que la température et la durée des étapes de solubilisation (étape b) et de protéolysé /saccharification (étape e) sont modifiées comme 25 montrées dans le tableau V qui résume aussi les propriétés correspondantes des moûts (avant ébullition) ainsi obtenues dans chaque opération (effectuée en double). 28062 43 2053260 TABLEAU V :Etape Résultats :Solubi- fenpérature(°C.) 70 75 80 85 rlisation Temps Cmn'l! ^0 30 30 30 :Protéolyse/ Tempé-: :Saccharificatioi^ature: : (OG.) : 60 55 50 45 : Temps (mn): 60 60 60 60 : Propriété du moût : Extrait de moût (°P) : 10,1 o o 10,3:10,3 10,55 10,55 10,25 10,3: : Azote formolé ( mg/litre): 192 190 205 :201 208 195 191 197 : : Q. P. :2,2 2,2 2,25:2,3 2,2 2,2 2,25 2,3 : : Atténuation ($) :78,2 78,0 78,1:77,7 79,1 79,1 78,0 77,7: On fermente chacun des moûts de façon à obtenir une bière de • bonne qualité par le processus de l'exemple 1. EXEMPLE 5 Partie A - matièresfaremières Lés matières premières utilisées dans cet exemple sont analogues à celles utilisées dans l'exemple 1, excepté le fait que la protéase et 1'amylase suivantes sont utilisées dans certains cas comme indiqué ci-dessus. Protéase La protéase utilisée est une broméline, sous forme solide, fabriquée par les Mann Research Laboratories. (a) & -amylase On utilise une enzyme stable à la chaleur, obtenue à partir d'une souche de Bacillus subtilis. laquelle enzyme possède une haute activité d' Ci -amylase et présente aussi une certaine activité de protéase. Cette enzyme est disponible dans le commerce sous la désignation "HT-1000" (Miles Laboratories, Inc., Indiane, U. S. A.). (b) Dextrinase A On utilise la dextrinase A, disponible dans le commerce auprès des Miles Laboratories. Cette substance est une amylase d'origine 70 28062 44 2053260 fongique ayant une activité saccharogénique élevée pour la transformation des dextrines en maltose et en dextrose. Cette enzyme présente aussi une certaine activité de protéase. TABLEAU VI 5 Les enzymes ont été utilisées dans les associations suivantes avec du malt d'ôrge broyée (10,1 fo en poids) de 137° Lintner qui était présent dans chaque cas. Unités d'activité par g de substrat d'orge Enzyme Mélange A Mélange B Mélange C Broméline 0,8 * 1,2 HT-1000 68 105 120 Dextrinase A 125 140 100 Diazyme 6,4x10-1 33x10~1 8,5x10_1 * Dans ce cas, le HT-1000 et la dextrinase A ont apporté l'activité de protéase requise (environ 0,5 unité de protéase par 20 gramme) de sorte que l'on n'a pas ajouté, sous forme séparée, de protéase. Partie B - Cycle de brassage Dans chaque cas, on a employé le mélange enzymatique pour transformer les grains d'orge, en adoptant le cycle de brassage 25 représenté sur la courbe de la figure 6. Etape (a) On a ajouté 24 litres d'eau dans la cuve de brassage et l'on y a ajouté, sous agitation modérée, les mélanges appropriés contenant les quantités précitées/!.1 enzyme s. Ensuite, on a ajouté 6,205 kg 30 d'orge broyée et 0,610 kg de malt d'orge broyée. La bouillie ainsi obtenue a été vigoureusement agitée. Etape (b) On a admis de la vapeur dans la chemise de la cûve de brassage et orjik monté la température de la bouillie aqueuse à 46°C. Cette 35 température a été maintenue pendant 45 minutes, durée au cours de laquelle on a continuellement agité la bouillie. 70 28062 45 2053260 Etape (c) Simultanément, on a liquéfié les gruaus de maïs brut. On a ajouté 12 litres d'eau dans le cuiseur de maïs puis l'on a introduit, sous agitation modérée, le bouillon de culture contenant 5 1* -amylase stabilisée par vin sel, lequel bouillon est celui utilisé dans l'exemple précédent, de façon à introduire 14 unités d' Cl -amylase par gramme de gruaus de maïs brut à introduire par la suite. On a alors ajouté 3,458 kg de gruaus de maïs brut et l'on a agité vigoureusement la bouillie. On a d'abord chauffé, la 10 bouillie à 71°£et l'on a maintenu cette température pendant 16 minutes. Ensuite, on a amené la trempe de maïs à 1'ébullition (en 8 minutes) et l'on a maintenu à l'ébullition. pendant 2 minutes. La trempe liquéfiée a été ensuite versée dans la trempe d'orge dans la cuve de brassage à la fin des 45 minutes de la réaction protéoly-15 tique. Etape & ) On a élevé la température de la trempe globale à 65,5°C (en 12 minutes) et l'on a maintenu cette température pendant 45 minutes, ce qui a constitué une. première étape de saccharification. 20 Ensuite, on a élevé la température jusqu'à 74°C, en une durée de 10 minutes. Cette température a été alors maintenue pendant 15 minutes, ce qui a constitué une seconde étape de saccharification. A la fin de ces 15 minutes, on a élevé la température de la trempe digérée à 80°C et l'on a maintenu cette température pendant 1 25 minute. Etape: (e) On introduit directement la trempe à 80°C dans la cuve-filtre. Le fond de celle-ci est couvert d'eau pour empêcher les particules de ls^slsche d'obstruer les fentes des plaques de filtre. On permet 30 à la trempe de sédimenter pendant 10 minutes, après quoi on recycle le moût pendant 20 minutes. Le moût s'écoule alors. On note que la clarté est bonne. Une fois que le moût est descendu au niveau du lit, on commence le lavage avec de l'eau à 77°C. On poursuit le lavage jusqu'à recueillir un total de 61,3 litres de moût. La durée 35 d'écoulement est de 45 minutes. Le moût ainsi obtenu à partir de chacun des mélanges est de couleur claire et possède une composition équilibrée appropriée en 70 28062 46 2053260 amino-acides et en hydrates de carbone. Le tableau VII ci-après donne des résultats analytiques intéressants concernant ledit moût. TABLEAU VII Propriétés mélange A mélange B mélange C: Extrait (°P) 10,7 10,6 10,6 : Azote total (mg/litre) 820 818 842 : Azote formolé (mg/litre) 221 208 230 : pH 5,2 5,2 5,2 : Atténuation apparente ($) 79 81 82 : 10 15 20 25 30 35 Par comparaison de la composition en amino-acides desdits moûts et des sels d'un moût- de malt classique, on constate qu'il n'y a pas de différences essentielles. Partie C - transformation en bière Les moûts ont été ensuite transformés en une bière de bonne qualité en adoptant le même processus que dans l'exemple 1. EXEMPLE 6 Cet exemple illustre l'effet, sur les propriétés du moût, de l'augmentation de la quantité d'amyloglucosidases utilisée dans la transformation de l'orge. Les expériences ont été effectuées sur des unités de brassage de laboratoire normalisées-équipées de récipients ou coupoles de cuisson et de trempe. Les matières premières suivantes ont été utilisées : Mélange destiné à former la trempe On a utilisé des formulations différentes dans deux séries d'expériences effectuées en parallèle : Partie A Partie B Cuiseur de maïs : Maïs 28,3 g 32,1 g Eau 125 ml 140 ml « -amylase Complexe enzymatique de l'exemple 7 utilisé à raison de 14 unités d'amylase par gramme de maïs 70 28062 47 2053260 Sels 0,03 g de gypse Mélangeur de trempe : Orge 65,5 g 60,5 g Malt 7,0 g 7,0 g 5 Eau 225 195 Enzyme comme indiqué ci-après 0,06 g de gypse et 0,095 g de chlorure de calcium. Rapport {?<> en poids) 10 Orge 100 100 Malt 10,7 11,6 Maïs 44,0 53,0 L'orge a été broyée comme dans l'exemple 1 et possède une composition granulométrique similaire; le maïs a été broyé grossiè-15 rement comme dans l'exemple 2 et possède une composition granulométrique similaire. Enzymes : (a) et (b)-Protéase et 0* -amylase On utilise un mélange enzymatique isolé obtenu par fermentation 20 à partir de la souche de Bacillus subtilis ATCC 21556 en adoptant un processus similaire à œlui décrit dans l'exemple 1 de la demande de brevet, au nom de la demanderesse, mentionné plus haut. Ce mélange particulier soumis à l'analyse se révèle contenir 7670 unités d' (c) -amylase On a utilise un malt d'orge broyée qui titre 130° Lintner. 30 (d) Amyloglucosidase On a utilise de la Diazyme sous forme solide, contenant 160 A. G. par gramme, laquelle a été utilisée en quantités allant de 2 0 à 350 unités de A. G. par gramme d'orge x 10 . Eau 35 On a utilisé de l'eau ordinaire pour brasserie, ayant un pH de 5,4. 70 28062 48 2053260 Cycle de brassage On a adopté, pout toutes ces expériences, le cycle de brassage représenté sur la figure 6, en utilisant le processus de brassage suivant. On a amené 1'eau de la trempe d1 orge, à une température 5 constante de 45°C dans les récipients ou coupoles de brassage ; on a ajouté les sels, les enzymes, l'orge et le malt dans cet ordre, en laissant environ 30 secondes entre chaque addition, en vue d'un mélange intime. On a vigoureusement agité la bouillie. On a noté le pH. Pendant ce temps, on a liquéfié l'amidaidans 10 le cuiseur de maïs en chauffant une bouillie aqueuse de gruaus de maïs contenant 1' & -amylase, jusqu'à environ 70°C, en maintenant à cette température pendant 10 minutes, puis en faisant bouillir rapidement. L'additif de maïs liquéfié a été soumis à la trempe _ dans la bouillie aqueuse d'orge et d'enzymes dans les récipients 15 de trempe et l'on a poursuivi le brassage. A la fin de ce cycle, on a élevé la température de la trempe jusqu'à 80°C et l'on a maintenu cette température pendant 2 minutes. On a ensuite filtré la trempe et l'on a noté le temps de filtration. La clarté du produit qui s'écoulait a été estimée visuellement sur la base d'une échelle 20 allant de 1 à 5, 1 représentant un moût obscur et trouble, par opposition à 5 qui représente un moût clair et brillant. La transformation de l'amidon a été aussi vérifiée par l'essai colorimé-trique à l'iode. Le lit de filtration a été lavé à l'eau juaqu'à un volume total de 610 millilitres. Le moût obtenu a été ensuite 25 soumis à 1'ébullition pendant 1 minute, laissé refroidir, puis son volume a été à nouveau ajusté jusqu'à 610 millilitres, avant de procéder à l'analyse. Résultats Les résultats des diverses expériences sont résumés dans le 30 tableau VIII ci-après, qui donne aussi les résultats correspondants pour l'expérience témoin concernant un malt (malt : 68 g ; maïs : 26 g). 00 PAR T I E A : Quantité de : PROPRIETES DU MOUT O : A.G./g d'orge x 10 : • • Extrait : Azote total : Azote formolé: Q.P. :Atténuation : (°P) . (mg/l) .(mg/l) • • (°P) : (?S) : : 0 : 10,4 : 847 : 234 : 2,4 : 76,9 : : 0,6 : 10,2 : 819 : 230 : 2,35 : 77,0 : : 2,5 : 10,3 : 833 : 236 : 2,35 . : 77,1 : : 5,0 : 10,4 : 838 : 228 : 2,3 : 77,9 : 10,0 : 10,2 : 814 : 227 : 2,2 : 78,4 : : 20,0 : 10,2 : 853 : 220 : 2,1 : 79,4 : : 40,0 : 10,5 : 805 : 220 2,0 : 81,0 : : 60,0 : 10,4 : 847 : 224 : 1,9 : 81,7 : : 80,0 : 10,1 794 : 218 : 1,75 : 82,7 : : 100,0 10,3 805 225 1,7 : 83'5 : : 150,0 . 10,3 838 227 1,55 ! 85,° . : 250,0 . 10,1 j 853 230 1,4 86,1 : 350,0 10,2 819 224 1,3 1 87,2 ! Malt témoin : 10,3 : 845 : 212 : 2,25 : 78,2 : K> O en UJ K> o- o !LâJLÏ!J;JLÏL_viii (suite) — — — K) 00 o Quantité de PROPRIETES DU MOUT P A R T I E B : A.G./g d'orge x 102 Extrait Azote Azote Q.P. Atténuation : (°P) total formolé (°P) (96) : : 0 10,0 805 232 2,35 77,0 : : 0,6 10,0 805 235 2,3 77,2 : = 2,5 10,1 852 237 2,3 77,0 : 5,0 9,9 894 241 2,1 78,8 : : 10,0 10,1 809 229 2,2 78,2 : : 20,0 10,1 856 223 2,1 78,8 : : 40,0 10,0 814 221 2,0 80,2 : 60,0 10,1 849 229 1 ,95 80,7 : : 80,0 10,3 842 235 1,8 82,2 : : 100,0 10,2 856 219 1.7 OJ t : 150,0 . 10,1 811 208 1,6 84,2 : : 250,0 10,1 827 i 222 1,5 85,1 : : . 350,0 10,2 829 221 1,45 86,0 : Malt témoin 10,3 : 845 212 2,25 78,2 : Cn LU NJ O O 70 28062 51 2053260 Conclusions L'amélioration de fermentabilité du moût résultant de l'incorporation de la Diazyme est illustrée par la courbe de la figure 7 sur laquelle on a représenté, en fonction de la quantité croissante 5 de Diazyme, la fermentabilité (essai de fermentation rapide Q.F.) et l'atténuation obtenues dans la partie A.Comme représenté, la fermentabilité et l'atténuation augmentent lorsque la quantité de Diazyme augmente, quoique lorsque la quantité de Diazyme croit au-delà d'environ 10 x 10-1 unités de A.G. par gramme d'orge, les 10 vitesses de croissance de la fermentabilité et de l'atténuation soient beaucoup plus faibles que pour das quantités moins importantes de Diazyme. Ceci est innatendu et indique que la quantité optimale de Diazyme associée avec un accroissement bénéfique maximal sur les propriétés du moût est obtenue pour des quantités de Diazyme infé-15 rieures à 10 x 10 -unités A.G. par gramme. La diminution marquée de la vitesse d'accroissement des propriétés du moût au-delà d'environ 10 x 10"1 unités de A.G. par gramme est donnée par la courbe de la figure 8 qui représente l'accroissement de l'atténuation en fonction de la quantité de Diazyme. L'examen de cette courbe montre 20 que l'accroissement le plus marqué de l'atténuation est obtenu entre environ 1 x 10" et environ 5 x 10" unités de A.G. par gramme. En répétant le processus de cet exemple en brasserie à petite échelle commerciale on a obtenu des moûts similaires qui ont été fermentes pour donner une bière par le processus de l'exemple 1. Les 25 bières obtenues à partir de moû.ts dans lesquels moins de 10 x 10 unité de A.G. avait été utilisée, étaient de bonne qualité avec beaucoup de corps et une saveur relevée. Les bières obtenues à partir de moûts dans lesquels on avait utilisé plus de 10 x 10 unités de A.G. n'avaient pas les mêmes excellentes qualités et possè-30 daient une saveur "plate", rappelant celle de la pomme. EXEMPLE 7 On a adopté le même processus que dans l'exemple précédent, en utilisant les mêmes matières premières, excepté le fait que l'on a mis en oeuvre un mélange pour trempe différent et un système 35 enzymatique différent, comme il suit : 70 28062 52 2053260 Composition de'la trempe Cuiseur de maïs : Maïs 27,3 g Eau , 90 ml 5 Enzyme .. Complexe enzymatiques décrit c i-dessous à 14 unités dJ^ _ amylase par gramme Sels 0,03 g de gypse Mélangeur de trempe : 10 Orge 62,0 g Malt 11,2 g Eau 230 ml Enzymes Comme décrit ci-dessous Sels 0,06 g de gypse' 15 0,095 g de chlorure de c.alcium Rapport : Orge 100 io Maïs 44 i° 20 Malt 18 % Le système enzymatique comprenait un complexe enzymatique isolé obtenu à partir de la souche ATCC 21556 de Baci11 us subtilis. en adoptant un processus similaire à celui décrit dans l'exemple 1 , de la demande de brevet précitée, au nom de la demanderesse et se 25 révélant contenir, d'après l'analyse, 6370 unités d' ff( -amylase par millilitre et 53,4 unités de protéase par millilitre (amylase/ protéase : 119/1), ledit système enzymatique comprenant en outre de la Diazyme, sous forme de poudre, se révélant contenir 160 unités de A. G-. par gramme. Ce système enzymatique a été employé dans les 30 mélangeurs de trempe en des quantités correspondant à 114 unités d' o( -amylase, 0,96 unité de protéase et des quantités variables de Diazyme (apportant l'A. G.), comme indiqué dans le tableau IX suivant. Résultats 35 Les résultats numériques obtenus par analyse de chacun des moûts préparés sont résumés dans le tableau IX ci-après qui comprend aussi les données correspondantes pour un moût témoin de malt (malt : 70 28062 53 2053260 68 g ; maïs : 26 g) TABLEAU IX Quantité de Diazyme Propriétés du moût 5 2 A.G./g d'orge x 10 Extrait (°P) Azote total mg/l . Azote formolé mg/l Q.F. (°P) Atténuation f*) 0 10,15 810 213 2,4 76,4 0,6 10,2 812 209 2,35 77,0 2,5 10,2 790 217 2,35 76,9 10 10,0 10,1 797 213 2,25 77,7 20,0 10,15 805 21 1 2,10 79,3 40,0 10,25 802 211 2,0 80,5 80,0 10,1 810 209 1,75 82,7 100,0 10,3 812 210 1,7 83,5 15 150,0 10,25 800 209 1,55 84,9 250,0 10,2 801 217 1 ,4 86,3 JI o • o 10.1 804 213 1.3 87.1 Malt témoin 10,3 815 200 2,35 77,2 25 30 35 20 Conclusions Les résultats ci-dessus confirment ceux de l'exemple 6, en particulier le fait que l'amélioration la plus marquée des propriétés du moût est' obtenue avec des quantités de Diazyme comprises - —1 — 1 entre environ 2,5 x 10 et environ 10 x 10 imités A. G. par gramme d1 orge. Chacun des moûts a été fermenté en une bière par le processus de l'exemple 1. Les bières obtenues à partir de moûts dans lesquels on avait utilisé moins de 10 x 10"^ imités A. G. par gramme étaient de saveur supérieure (plus de corps) à celle des bières obtenues à partir de moûts pour lesquels unités A. G. on avait utilisé moins de 10 x 10 -1 EXEMPLE 8 Cet exemple illustre les effets de quantités variables d'amylase, de protéase et d'amyloglucosidase sur plusieurs propriétés intéressantes du moût. Les expériences ont été effectuées sur des unités de brassage de laboratoire normalisées munies de récipients ou coupeD.es de cuisson et de mélange de trempe, en adoptant le processus de l'exemple 6. Les matières premières suivantes. 70 28062 54 2053260 ont été utilisées Composition de la trempe Cuiseur de maïs Maïs Eau .. Enzyme 34,6 g 140 ml Complexe enzymatique de l'exemple 1 à 14 unités d'amylaj par gramme de maïs Sels 0,03 g de gypse 10 Mélangeur de trempe : Orge 62,0 g Malt 6,2 g Eau 205 ml Enzyme comme indiqué ci-dessous 15 Sels 0,06 g de gypse 0,095 g de chlorure de calcium L'orge et le maïs ont été broyés dans un broyeur de laboratoire jusqu'à une dimension moyenne de particules d'environ 1,41 mm. 20 Eau On a utilisé de l'eau ordinaire pour brasserie de pH 5,2-5,6. Enzyme Quatre systèmes enzymatiques ont été choisis de façon à définir un intervalle pour les quantités d'amylase et de protéase. Ces 25 systèmes ainsi que les résultats d'analyse portant sur ceux-ci sont donnés ci-après. :Système enzymatique Unités d ' am.yla se Unités de protéase Amylase : protéase : Complexe enzymatique : obtenu à partir de :Bacillus subtilis : ATCC 21556 1 5.450/ml 6,2/ml 879:1 IT 2 5.000/ml 30/ml 167:1 : Protéase pacifique A*- 3 7.250/ml 157/gm 46.2:1 : Protéase pacifique G-* 10.200/«m 490/gm 20.8:1 :Amylase pacifique 1* _ 105.000 km. 340/g 308:1 : Mélange ( G- + 1 ) 4 33.900/gm 453/g 75:1 30 35 55 2053260 *disponible dans le commerce auprès de la Western Biochemical Corporation, Californie. On a mélangé la protéase pacifique G- et 1'amylase pacifique 1 dans le rapport de 3:1, le mélange obtenu étant désigné par "système 5 enzymatique n° 4". On a introduit chacun des quatre systèmes enzymatiques dans la trempe d'orge, en raison de 45, 80, 100, 114 et 150 unités d'amylase par gramme d'orge seul et en même temps que de la Diazyme, (sous forme de poudre, titrant 160 unités de A. G. par gramme) en des quantités allant de 10 à 350 unités A. G. 10 pour 100 grammes d'orge, ce qui à donné différentes valeurs du rapport protéase/amyloglucosidase pour chacun des quatre systèmes enzymatiques de base, comme indiqué dans le tableau X ci-après. Résultats Les résultats obtenus pour'chacun des moûts préparés sont 15 résumés dans le tableau X ci-après qui comprend aussi les résultats correspondants pour six opérations témoin pour des malts, dans lesquelles la composition utilisée pour la trempe était la suivante : Cuiseur de maïs Maïs 24,9 g 20 Malt 2,96 g Eau 90 ml Mélangeur de trempe Malt 65 g Eau ' 240 ml 25 Sels 0,06 g de gypse 0,095 g de chlorure de calcium o «o CM m vo o tableau x Amylase unités^g d'orge 45 45 Protéase : unités^g d'orge 0,05 • • • Diazyme A.G./100 g d1orge 0 10 20 40 80 150 250 350 0 10 20 40 80 150 250 350 : Propriétés du moût : Extrait du moût (°P) 9,* 9,9 9,9 10,0 9,8 9,7 10,0 9,8 ï 10,0 10,1 10,0 10,1 10,0 9,9 10,15 10,1 Azote total : mg/litre 440 430 455 440 450 450 455 440 : 640 630 655 640 650 645 J61Q 650 : Azote formolé + mg/litre 128 126 120 133 130 135 130 128 • • : 142 140 149 136 140 146 153 136 , Q.P. (°P) 2,5 2,3 2,2 2,1 1,9 1,65 1,45 1,4 r 2,4 2,25 2,05 2,0 1,8 1,6 1,4 1,35 Atténuation (#) «• 74,5 76,5 77,7 79,0 80,6 83,0 85,5 85,9 :76,C 77,7 79,5 80,2 82,0 83,8 86,2 86,6 : pH 5,5 5,5 5,6 5,5 5,5 5,5 5,6 5,5 ' 5,5 5,5 5,6 5,5 5,5 5,5 5,5 5,5 "Transformation * 5 5 4 5 5 5 4 4 : 5 5 5 4 5 4 5 5 .Clarté du produit 's•écoulant 2 2 2 3 2 2 3 2 2 2 3 3 2 2 2 2 'Durée d'écoulement :(en mn) 35 35 35 35 40 40 35 40 .3 5 55 35 30 35 30 30 35 VO LA CM GO CM o *o CN m . Amylase unitês/g d'orge : 45 : 45 . Protéase unités/g d'orge 0,6 . 0,97 Diazyme : A.G./100_g d^orge [o 10 20 40 80 150 250 i i ° S 00 o! j o i CvJ | = 1 O o m 150 250 350 : Propriétés du moût . Extrait du moût (°P) .10,2 10,2 10,3 10,2 10,3 10,35 10,1 10,2*10,2 10,4 10,3 10,2 10,25 10,3 10, 2 10,1 : Azote total mg/litre .720 745 710 710 725 740 720 72°^!° 260 260 225 2£5 945 _ 2ZQ __2£Q . Azote formolé mg/litre :165 161 173 161 165 177 159 • 168,-175 183 175 171 178 167 169 178 : Q.P. (°P) : 2,3 2,15 2,1 1,95 1,7 1,45 1,35 1,30 s 2,2 2,0 1,9 1,75 1,65 1,4 1 ,3 1,25 Atténuation (%) 77,4 78,9 79,6 81,4 83,5 85,9 86,6 87,2 78,9 80^ 81,6 82,8 83,9 86,4 87,2 87,6 : pH 5,4 5,5 5,5 5,5 5,5 5,5 5,4 5,5 :5,5 5,5 5,4 5,4 5,4 5,4 5,4 5,5 : Transformation * 5 5 5 5 5 5 5 5 ;5 5 5 5 5 5 5 5 : Clarté du produit s'écoulant ? 3 3 3 2 2 2 2 3 3 3 3 2 2 2 2 : Durée d'écoulement . (en mn) :35 30 30 30 35 35 30 30 : 30 30 30 30 30 • • • • 30 35 *o O 00 CN TABLEAU (Suite) O o -o CM on lo o CN TABLEAU X (suite) Amylase unités/g d'orge 80 80 Protéase -HsiîËsZéLâlsrs®- 0,09 0,48 Diayme A.G./100 g d'orge 0 10 20 40 80 150 250 350 0 10 20 40 80 150 250 350 Propriétés du moût Extrait du moût (°P) 9,8 9,8 9,8 1 0,0 9,9 9,85 9,9 9,85 1 0,2 1 0,2 1 0,1 10,3 10,2 10,0 10,1 100 Asote total .mg/litre Azote formolé _mg/litre 500 485 490 .505 490 470 515 - 505 68 0 7 0 0 6 8 5 6 7 5 6 9 0 65 5 .6 6 0 6 80 166 158 158 173 169 164 166 166 200 207 196 207 200 193 211 CD m Q.P. (°P) 2,4 2,3 2,1 1,95 1,85 1,65 1,4 1,3 2,15 2,1 1,9 1,8 1,7 1,5 1,3 1,2 Atténuation ($) -ES 75,5 76,8 78,6 80,5 81 ,3 83,2 85,8 66,8 78,9 79,4 81,2 82,5 83,3 85,0 87,1 8Q1 Transformation * 5,6 5,55 5,6 5,55 5,55 5,55 5,6 5,6 3 3 3 4 3 3 3 3 5,5 5,6 5,6 5,6 5,6 5,55 5,6 5,6 2 22232 2 2 Clarté du produit s1 écoulant 4 4 CN sO O OO CN O r- Durée d'écoulement (en mn) 35 35 35 35 35 35 35 35 35 30 35 30 30 30 35 35 TABLEAU X (suite) : -J t: : ! Amylase ! 80 j 80 j +_iJniiis/g_dj.orge + + + . Protéase . 1 ,05 . 1 ,73 . ! unités/g d'orge ! ! ! . Diazyme . A.G./100 g d'orge 0 10 20 ' 40 80 150 250 353 0 10 20 40 80 150 250 350 ; ! Propriétés du moût ! Extrait du moût (°P) 10,5 10,5 10^5 1Q6 10,5 10,4 10,6 "10,4 10,6 10,7 10,7 10,75 10,6 10,5 10,65 10,5 ! Azote total I mg/litre 840 845 860 830 830 820 825 850 1080 1080 1070 1075 1085 1060 1055 1C90i ! Azote formolé ;230 233 237 227 233 223 241 230 ; 265 265 268 274 271 263 274 269: . mg/litre . . ! ! Q.F. (°P) 2,1 2,0 1 ,85 1/5 1,7 1 ,4 1 ,2 1,1 2,2 2,1 1,9 1,8 \65 1,4 1,3 1,2\ : Atténuation (fo) 80,081,0 82,5 83,5 83£ 86*5 88,7 89,4 79,2 80,4 82,2 83,2 84,4 87,5 87,9 88,7: . pH 5,6 5,5 5,5 5,5 5,5 5,5 5,5 5,5 5,55 5,5 .5,5 5,5 5,5 5,5 5,5 5,5: . Transformation * 111 111 1 1 11 11 1 1 1 1 i ! ClarlÉ . du produit ! s•écoulant 455 55 4 5 5 54 45 4 4 3 4; ! Durée d1 écoulement 30 30 30 35 30 30 35 35 35 30 30 30 30 35 35 35 ! TABLEAU X (suite) :Amylase : unités/g d'orge 100 100 ; ••Prôteâse :unités/g d'orge 0,112 0,6 ; [Diazyme |A.G./100g d'orge 0 10 20 40 80 150 250 350 0 10 20 40 80 150 250 350 : 7Propriété du moût [extrait du moût (°P^ 10,1 10,1 10,1510,1 10,0 9,95 10,1 10,0 10,35 10,3 10,2 10,3|l0,35 10,25 10, 3 10,2 :mg/ïitre^al 530 530 540 550 535 520 525 535 :700 650 685 705 700 690 690 715 : : azote formolé :mg/litre 143 147 151 139 141 137 147 147 210 214 210 217 206 201 214 206 j ;Q.F. (°P) 2,3 2,2 2,0 1,9 1,8 1,55 1,35 1,3 2,25 2,1 2,0 1,9 1,7 1,5 1,3 1,2 | [Atténuation {%) 77,2 78,2 80,3 81,1 82,0 84,4 86,6 87,0 78,3 79,6 80,4 81,6 ®,6 85,4 87,4 88,2 j ; PH 5,4 5,5 5,5 5,55 5,5 5,5 5,5 5,5 5,55 5,5 5,5 5,5 5,5 5,5 5,5 5,5 j [Transforamtion * 3.4 4 4 3 3 4 4 2 2 2 1 111 2 ; : Clârt? du produit : s'écoulant 333333 3 4 5 5 5 4 5 5 5 4:; [Durée d'écoulement *(en mn) 35 35 . 35 35 30 35 35 40 30 30 30 35 35 30 35 35 i CN ■O O 00 CN O r- TABLEAU X (suite) CM ■O O 00 CN riUlj XeL• unités/g d'orge : 100 100 • Prôteâlê unités/g d'orge 1 ,32 2,16 ; Eiazymi A.G./ 1.00g d'orge 0 10 20 40 80 150 250 350 0 10 20 40 80 150 250 350 i Propriété du moût extrait du moût (°P) 10,7 10,8 10,75 10,7 10,7 10,6 10,6 10,65 10,9 10,95 10,9 10,85 11,0 10,8 10,9 10,85*: azote total mg/litre 850 830 855 875 860 845 860 830 1060 1035 1050 1050 1075 1080 1060 1060; azote formolé? mg/litre 238 246 236 242 242 246 249 236 286 280 286 290 278 278 292 280 ; Q.F. T°P7 M 2,0 M 1 j 8 1 j.55 M 1,2 1,15 ;2,15 2,0 M 1,7 . 1j6 1,35 1,3 1,2 : Atténuation [82,2 81,5 82,3 83,2 85,5 86,8 88,7 ■ i i 100 fcp L™. ;8°f3 81 ,7 82,6 84,3 85 5 87,1 88,1 88,9 ; pH :5,55 5,55 5,55 5,5 5,6 5,5 5,5 5,4 :5,6 5,5 5,55 5,55 5,55 5,55 5,55 5,55 : Transformation * 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 : Slarïe 5û produit s'écoulant 5 5 5 5 5 5 5 4 5 5 5 5 4 5 4 4 ; Duree d ' ecôûlëmëiït (en mn) 30 30 30 30 30 35 35 35 30 35 30 30 30 35 35 35 ; O r-» o -o CM m un o CM TABLEAU X (suite) Amylase unités/g d'orge 114 114 ': Protéase unités/g d'orge C ,128 0,68 : Diazyme A.G./100 g d'orge 0 10 20 40 80 150 250 350 0 10 20 40 80 1 50 250 350: Propriétés du moût Extrait du moût- (°P) 10,1 10,0 1.0,2 10,1 10,1 10,0510,2 1Q,1 10,3 10,3 10,1 10,3 10,2 10,2 10,1 10,1: Azote total mg/litre 530 550 530 540 540 525 550 530 780 790 775 800 810 780 795 765 : Azote formolé mg/litre 146 152 143 146 146 156 143 149 220 224 218 227 220 214 227 230 : Q.F. (°P) 2,4 2,3 2,1 2,0 1 ,85 1 ,55 1,45 1,3 2,2 2,1 2,0 1 ,85 1 ,7 1 ,45 1 ,3 1,3 : Atténuation (#>) 76,2 77,0 79,4 80,2 81 ,7 84,6 85,8 87,1 78,6 79,6 80,2 82,0 83,3 85,8 87,1 87,1 pH 5,6 5,55 5,55 5,55 5,55 5,6 5,6 5,6 5,6 5,55 5,6 5,6 5,6 5,6 5,6 5,6 Transformation * 1 1 1 2 2 2 2 2 1 1 1 1 1 1 1 1 Clarté du produit s'écoulant 4 4 4 4 4 4 4 4 4 5 5 5 5 4 4 4 Durée d'écoulement fen mn) 35 35 40 35 .40 35 40 40 35 30 30 30 30 30 30 CVJ VO CN -O O 00 CM O r- o -o CN m un o CN TABLEAU X (suite) Amylase unités/g d'orge 114. 1 H ; Protéase unités/g d'orge 1,52 2 ,47 Diazyme A.G./100 g d'orge , 0 10 20 40 80 150 250 350 0 10 20 40 80 150 250 350 : Propriétés du moût Extrait du moût (°P) 10,7 10,6 10,8 10,7 10,7 10,6 10,7 10,7 10,8 10,75 10,9 10,8 10,8 10,9 0,8 10,8: Azote total mg/litre 840 840 855 860 825 835 840 865 1020 1035 1030 1030 020 1005 1035 1040: Azote formolé mg/litre 249 257 252 247 252 244 252 247 285 293 287 285 278 281 285 278 Q.F. (°P) 2,15 2,0 1,9 1,75 1,6 1,35 1,3 1'? 2,2 2,1 1 ,9 1,8 1,6 1 ,45 1,2 1,2 Atténuation ($) 79,9 81 ,1 82,4 83,6 85,0 87,3 87,9 88,7 79,6 80,5 82, 5 83,3 85,2 86,7 88,8 89,7 pH I VJl 1 1 - 1 1 VJl 1 1 VJl 1 1 1 5,55 5,55 5,55 1 VJl 1 1 - 1 1 VJl 1 1 VJl 1 5,6 5,6 5,6 5,6 5,6 5,6 5,55 5,6 5,5 5,6 5,6 Transformation * 1 1 1 1 1 2 1 1 1 2 1 1 1 1 1 1 Clarté du produit s1 écoulant 5 5 5 5 5 5 4 4 5 5 5 5 5 4 4 4 Durée d'écoulement (en mn) 30 30 30 30 30 30 35 30 30 35 30 30 30 30 ITi 1 1 1 1 O 1 KN 1 1 1 1 VÛ CN «O O 00 CM O r- o CM on LO o CN TABLEAU X (suite) Amylase 150 • 'Protéase : unités/g d'orge 0,168 0,90 :Diazyme .A.G./100 g d'orge 0 10 20 40 80 150 250 350 0 10 20 40 80 150 250 350 : Propriétés du moût : Extrait du moût (°P) 10,1 10,0 10,1 10,15 10,0 9,9 10,05 10y0 10,5 10,6 10,55 10,4 10,5 10,5 10i4 10 : Azote total mg/litre .540 560 540 550 555 530 525 550 720 750 745 720 725 720 705 745 Azote formolé , ; mg/litre "50 146 153 148 146 156 146 153 225 229 232 225 221 218 229 232 :Q.r. (°P) :2,3 2,2 2,0 1,85 1,7 1,45 1,3 1,25 2,2 2,0 1,9 1,8 1,6 1,4 1,25 1,2 .Atténuation ($) 77,2 78,0 80,0 81,8 83,085,4 87,0 87,5 79,0 81,1 82,0 82,7 84,8 86,6 88,0 88,6 : PH 5,5 5,5 5,45 5,5 5,5 5,5 5,5 5,5 5,5 5,5 5,5 5,4 5,5 5,5 ■5,5 5,5 "Transformation & *4 4 4 5 5 4 5 5 1 1 1 1 1 ■ 1 1 1 .Clarté du produit "s'écoulant '• 2 2 2 3 ' 3 3 2 3 4 4 5 5 5 5 5 5 .Durée d'écoulement "(en mn) :35 40 35 35 35 35 35 35 30 30 30 30 30 30 30 30 150 vo CM >0 O 00 CN O CD •O CM m un o CN TABLEAU X (suite) : Amylase : 150 : 150 .unités/g d'orge .Protéase "unités/g d'orge 1,99 3,24 "Diazyme :A.G./100g d'orge 0 10 20 40 80 150 250 350 0 10 20 40 80 150 250 350 : Propriétés du mcût .Extraitdu nDÛt ( °Pi 10,7 10,75 10,8 10,6 10,7 10,7 10,6 10,6 10,8 10,85 10,8 10,75 10,9 10,65 10,7 10,7 in vo :Azote total .mg/litre .Azote formolé 'mg/litre -» .Q.F. (°P) "850 870 850 865 840 870 875 865'1120 1100 1095 1120 1130 1100 1135 1115 265 274 262 267 269 259 269 274 318 -+ 1 302 297 305 302 299 297 298 :2,0 2,0 1,8 1,7 1,35 1,35 1,2 1,2.2,15 2,0 1,85 1,7 1,55 1,3 1,2 1,2 _:Atténuation_(/0)__j.8_1?3_81_JL4_82A3_S4+û_S5^û_B2J.â_SS*2_8S*2:_8pjJ_8J_j6__82_,9__84_,2_ :ph :5,5 5,4 5,4 5,5 5,55 5,55 5,5 5,5 :5,45 5,45 5,45 5,5 1 1 1*11 85,8 87,8 88,8 88,8 5,5 5,5 5,5 5,5 "Transformation *' 1 1 » + .Clarté du produit "s'écoulant ' 5 5 t + .Durée d'écoulement "(en mn) "30 30 1 5 1 1 5 5 1 5 : 5 1 5 1 5 1 5 1 1 5 5 CN -O O 00 CN 30 30 30 35 35 35 :30 35 35 35 30 30 30 30 O r- 28062 66 2053260 T_A_ B _L_E_A_U X_ (suite) : Témoins de Malt : Résultats N° 1 N° 2 N° J> "U° 4 ïï° _5 : N°6 valeur moraine : Propriétés du : moût Extrait du moût : (op) : 10,3 10,7 10,4 : 10,5 10,45 : 10,8 10,5 : Azote total : . (mg./litre) 850 820 770 . 745 810 . 820 802 : Azote formolé : . (mg./litre)• 200 212 217 . 248 262 . 246 235 : Q.P. («P) : 2,25 2,35 2,1 : 2,05 1 ,7 : 2,1 2,1 * Atténuation ($) 78,2 78,0 79,8 : 80,5 81,8 : 80,5 79,8 : PH : 5,5 5,5 5,5 : 5,5 5,55 ! 5,55 5,5 : Transformation* : 1 2 1. : 1 1 : 1 1 . Clarté du produit s'écoulant* 4 5 : 5 : 4 4 : 4 4,5 "Durée d'écoule-: ment (en mn) : 30 30 : 35 : 30 : 30 : 30 : 31 * Echelle de transformation (essai colorimétrique à l'iode) ; 1 = clair ; 10 = pourpre * Echelle de clarté: 1 = obscur.- trouble; 5 = clair - brillant 70 28062 67 2053260 Conclusions : Les relations entre l'extrait de moût (°P), les teneurs en azote formolé et en azote total, ainsi que les quantités d'enzymes (protéase et amylase) sont représentées respectivement par les 5 courbes des figures 9 à 11, tandis que la relation entre l'atténuation et les quantités d'enzymes (protéase et amyloglucosidase) est représentée par les courbes des figures 12A et 12B des dessins ci-joints. En se référant aux figures 9 à 11, on voit que celles-ci représentent les variations des valeurs moyennes d'extrait, d'azote 10 formolé et d'azote total, respectivement, pour une teneur croissante en protéase et à des teneurs fixes en amylase allant de 45 à 150 unités d' -amylase par gramme. Les figures 9 et 10 montrent que pour obtenir des valeurs d'azote formolé et d'extrait de moût comparable à celles des malts témoins, il est nécessaire de travail-15 1er avec des quantités d' -amylase supérieures à 45 unités d' V -amylase par gramme et des quantités de protéase supérieures à 0,5, de préférence 0,9, unités de protéase par gramme. Ces courbes montrent aussi que, pour des quantités de protéase supérieures à 2-2,5 unités par gramme, il se produit une petite amélioration 20 additionnelle de l'extrait de moût et de la teneur en azote formolé. Il est aussi important de remarquer que les valeurs de l'extrait de moût apparaissent en corrélation avec, et influencés par, la quantité d'amylase., par le fait que les valeurs les plus élevées sont obtenues avec une quantité d'amylase de 100 unités 25 par gramme d'orge et non, comme on pourrait s'y attendre, avec une quantité de 150 unités d'amylase... Cependant, comme représenté, les courbes relatives à 114 et 150 unités d'amylases sont toutes deux au dessus de la courbe concernant 100 unités d'amylase. La variation de la teneur en azote total des moûts, pour des teneurs 30 croissantes en protéase, est représentée sur la figure 11, qui montre que la teneur en azote total croît avec des teneurs croissantes en protéase. Cependant, d'une manière surprenante, pour une quantité donnée de protéase, la teneur en azote total croit lorsque la quantité d'amylase décroit ;par exemple, pour 1,0 unité de protéase 35 par gramme d'orge, 150 unités d'amylase par gramme donne une teneur en azote total de 700 mg/litre, tandis que 100 unités d'amylases par gramme donne 790 mg/litre. Par conséquent, pour obtenir une valeur 70 28062 68 2053260 donnée en azote total, une teneur plus élevée en protéase apparaît nécessaire lorsque, la quantité d'amylase croît. Sur la figure 12A, on a représenté la variation de l'atténuation (en fo) en fonction de teneurs croissantes en protéase pour les 5 cinq quantités d'ft -amylase qui vont de 45 à 150 unités d'« -amylase par gramme, l^uantité de Diazyme étant fixée à 40 unités de A. G. pour 100 grammes d'orge. En se reportant à ce graphique, on voit que les points correspondants à ces diverses données sont bien reliés par la courbe -représentée. Ces graphiques montrent que, pour les 10 différentes quantités d1 « -amylase étudiées, l'atténuation augmente lorsque la quantité de protéase. augmente jusqu'à environ .12 unités de protéase par gramme, valeur au-delà de^aquelle on n'observe plus4'amélioration de l'atténuation. Cette découverte est confirmée,, dans son essence, pailla figure 12B, dans laquelle 15 des courbes similaires à celles de la figure 12A donnent les variations d'atténuation en fonction de la quantité de protéase, pour différentes quantités de Diazyme allant de 0 à 350 unités de A. G. pour 100 grammes d'orge (les points ayant servi à construire ces courbes ont été omis par souci de clarté). 20 EXEMPLE 9 On a adopté le même processus que pour l'exemple précédent, en utilisant les mêmes matières premières, excepté le fait que la composition de la trempe était similaire à celle de l'exemple 7, c'est-à-dire qu'elle comprenait 18 fo en poids de malt au lieu de 25 10 Résultats Les moûts ainsi obtenus ont été analysés pour déterminer les mêmes propriétés que celles des moûts de l'exemple précédent et des courbes correspondant à celles des figures 9 à 12B ont été 30 représentées. Ces courbes ont montré qu'il existait essentiellement la même relation entre les quantités de protéase, d'amylase et d'amyloglucosidase et entre les propriétés du moût. EXEMPLE 10 On a suivi le processus de l'exemple 5, en adoptant à 35 nouveau des conditions de brassage réelles, avec différentes formulationss de trempe et différents systèmes enaymatiques, comme résumé., dans le tableau XI ci-après qui comprend aussi les résultats 70 28062 69 2053260 d'analyse concernant les moûts et bières ainsi obtenus, de même que les résultats correspondants pour un moût de malt classique e~k une bière classique considérés comme témoins. 28062 70 2053260 TABLEAU XI Opération N° : B-40 B-44 : B-43 B-42 B-41 B-31 :B-32 Composition de la trempe Orge (g) 6145 6145 6145 .6145 6145 6145 - Malt (g) 1230 1230 1230 1230 .1230 1230 6510 Maïs (g) 2700 2700 2700 2700 2700 2700 2555 Rapport Orge ($) 100 100 100 100 100 100 Maïs (%) 44 44 44 44 44 44 Malt (#) 20 20 20 20 20 20 Système enzymatique Té- N° 1 ' 2 3 4 5 6 .moin Amylase unités/ml : 3600 7945 8625 8775 7670 15700 Protéase unités/ml 30 60 93,8 62,5 70 108 Diazyme unités/g - 160 160 160 160 160 Amylase/Protéase . 120:1 132:1 92:1 140:1 1 10:1 130:1 Amylase unités/g d1 orge 114 114 114 114 114 114 Protéase unités/g d1 orge 0,95 0,86 .1.24 6,81 1,0 0,73 Diazyme unités/g d1 orge x 10 — 11,4 22,9 34,3 45,7 46,7 Analyse du moût : Extrait obtenu (°P): 10,4 10,6 10,6 10,4 10,5 10,65 10,4 Extrait à la chau dière (°P) 11,9 11,8 12,0 11,8 11,9 12,05 12,0 Q.P. : 3,0 2,7 2,6 2,5 2,3 2,3 2,6 Azote total(mg/l.) * 879 865 893 893 872 921 866 Azote formolé (mg/l} 252 246 255 252 258 258 272 pH : 4,2 4,35 4,25 4,3 4,3 4,25 4,15 Atténuation appa ; rente (fo) 74,8 77,1 78,3 78,8 80,7 80,9: 79,0: 28062 7f 2053260 T_A _B_L_E_ A_U XI_ (Suit e) .Opération N° B-40 ; B- 44 : B-43 B-42 B-41 B-31 B-32 ; : Analyse de la : . bière : Air (ml) : 1,5 : 0,1 : 0,7 0,5 0,2 N.D. N.D. : . CO2 (volume) . 2,7 .2,44 : 2,6 2,89 2,58 N.D. N.D. . . Couleur SBM . 2,9 .2,4 : 2»4 2,4 2,5 2,7 2,4 . . Ecume SIG- 135 : 115 . 121 123 120 126 125 : . Atténuation appa- . rente (%) 2,3 '' 2,3 " 2,3 2,2 2,1 2,0 2,1 : ! pH ! 4,2 : 4,35 : 4,3 4,3 4,35 4,3 4,25 : Azote formolé (mg/l) 205 *' 232 : 227 216 216 216 222 : : S°2 .... : 8,0 : 3,0 : 6,0 8,0 ' 4,0 2,0 4,0 : ; Diacéty]g (ppm) ' 0,06 : 0,25 : 0,24 0,29 0,38 0,40 0,19 : . Fer (ppm) . 0,09 . 0,05 . 0,06 0,08 0,05 0,04 0,05 . Cuivre (ppm) 0,16 ' 0,05 * 0,16 0,05 0,11 0,16 0,11 * : Protéines ($) '• 0,37 : 0,49 : 0,33 0,34 0,34 0,31 0,33 : ; Acidité (#) 0,17 . 0,18 . 0,17 0,17 0,17 0,17 0,17 . Isohumulones (IBU) 15 17 16 16 18 18 18 * : Extrait réel {%) î 4,13 : 4,04 : 3,82 4,14 3,88 4,03 4,10 : ; Alcool ( 3,83 . 3,99 . 3,93. 3,96 4,0 4,04 3,90 . Alcool ($ en volume) 4,89 ' 5,10 ' 5,02 5,05 5,11 5,17 5,05 * : Extrait initial : . calculé (#) 11,6 . 1.1,8 : 11'5 •11,8 11,7 11,9 11 > 4 . Extrait fermenté à : la levure {%) : 0 : 0 : 0 0 0 0 0 . Taux de sédimenta- . tion initial 1,0 : 1,0 : 1,0 1,0 0 1,0 1,0 : : Voile de refroidis-: . sement rapide 70 : 55 : 55 50 60 75 60 . . Essai de force du * voile 80 : 160 ! 120 120 130 140 180 : (1 Semaine Rad - : F.T.U.)* : : 'T. + .+ *F.T.U. : turbidité exprimée en unités de formazine 70 28062 72 2053260 * Système enzymatique Les systèmes enzymatiques n° 1 à 5 (opérations n° B-40 à 44) étaient sous la forme de complexes enzymatiques obtenus par culture de la souche ATCC 21556 de Bacillus subtilis. en adoptant 5 un processus similaire à celui décrit dans l'exemple 2 de la demande précitée au nom de la demanderesse et contenant à la fois de la protéase neutre et de la protéase alcaline. Le. système enzymatique n° 6 (opération,. B-31) a été obtenu en mélangeant 56 millilitres du produit connu sous la dénomination commerciale 10 "Tenase" (dispcnible dans le commerce au; ès des Miles Laboratories) titrant 14300 unités d'amylases par millilitre, et 20 g du produit connu sous la dénomination commerciale "HTP200" (disponible aussi dans le commerce auprès des Miles Laboratories) titrant 19680 unités d'amylases par gramme et 412 unités de protéase 15 par gramme, comprenant 193 unités de protéase neutre par gramme et 219 unités de protéase alcaline par gramme. Conclusions Les résultats indiquent que les moûts d'orge/enzyme et les bières en dérivant ont des propriétés physico-chimiques substan-20 tiellement similaires à celles issues du niait classique témoin. Les effets de dégustation effectués sur les diverses bières ont montré, qu'elles étaient toutes acceptables, avec une très légère préférence pour la bière de l'opération B-42. Toutes ces bières se sont révélées propres et d'arome neutre avec une saveur 25 de type modéré à un type à corps bien développé et un caractère doux à modérément houblonneux. EXEMPLE 11 Dans cet exemple, on a mélange entre elles différentes enzymes disponibles dans le commerce, en proportions définies, pour 30 obtenir différents systèmes enzymatiques, chacun desquels a été alors utilisé pour transformer une formulation de grains donnée en un moût à bière, en employant des unités de brassage de laboratoire (équipées de récipients ou coupoles de cuisson et de brassage) et en suivant les lignes générales du processus de l'exemple '6 ci-avant. 70 28062 73 2053260 PARTIE A 1. Composition des grains Orge 60 100 5 Maïs 32,4 54 Malt 7,2 12 2. Système enzymatique Amylase 10 "Tenase" (Miles Laboratories) Activité de 1'amylase (unités/ml).... 14^00 Quantité d'amylase (unités/g d'orge). 100 Volume d'orge 0,7 volume/poids 15 Protéase Ficine Activité de la protéase (unités/g)...543,6 Quantité de protéase (unités/g d'orge)i 0,9 volume/poids Poids (?5 d'orge) 0,16 20 Amylase: Protéase 111:1 Amyloglucosidase Diazyme (Miles Laboratories) Activité (unités A.G./g) 160 25 Quantité (unités A.G./g d'orge) 0,40 Poids (fo d'orge) 0,25 poids/poids PARTIE B 1. Composition des grains JL 30 Orge 66,4 100 Maïs 29,2 44 Malt 5,8 8 70 28062 2053260 74 2. Système enzymatique Amylase "Tenase" (Miles Laboratories) Activité de 1*amylase (unités/ml) 14100 Quantité d'amylase (unités/g d'orge)... 128 5 Volume ($ d'orge) 0,9 volume/poids Protéase Ficine Activité de la protéase (unités/ml)....543,6 10 Quantité de protéase (unités/g d'orge). 1,5 Poids (fi d'orge) 0,27 poids/poids Amylase:Protéase 85:1 Amylogluco sidase 15 Diazyme (Miles.Laboratories) Activité (unités A.G./g) 160 Quantité (unités A.G-./g d'orge) 0,8 Poids (fi d'orge) 0,5 poids/poitte 20 PARTIE C 1. Composition des grains Jl. Orge 62,0 100 Maïs 27,9 44 25 Malt 11,2 18 2. Système enzymatique Amylase "Tenase" (Miles Laboratories) 30 Activité de l'amylase (unités/g) 14100 Quantité d'amylase (unités/g d'orge).. 150 Volume (fo d'orge) 1,60 volume/pojds Protéasa Broméline Activité de la protéase (unités/g)....203,5 Quantité de protéase (unités/g d'orge) 1,1 Poids (fi d'orge) 0,5 poids/poids Amylase:Protéase 136:1 70 28062 75 2053260 2. Système enzymatique (suite) Amyloglucosidase Diazyme (Miles Laboratories) Activité (unité A.G./g) 160 5 Quantité (unités A.G./g d'orge) 0,6 Poids ('fo d'orge) 0,37 poids/poids PARTIE D 1. Composition des grains 10 Orge 62,0 100 Mais 27,9 44 Malt 11,2 18 Ç 2. Système enzymatique Amylase "HT 1000" (Miles Laboratories) Activité de l'amylase (Unités/ml).... 55 400 Quantité d'amylase (unités/g d'orge).114 20 Poids ($ d'orge) 0,2 poids/poids Protéase Broméline Activité de la protéase (imités/olQ. .. .203,5 „ Quantité de protéase (unités/g d'orge) 0,9 25 Poids (fo d'orge) . .. 0,4 poids/poids Amylase rProtéase 1 27:1 Amyloglucosidase 30 Glucoamylase pour traitement des grains Activité (unités A.G./g). 40 Quantité (unités A.G./g d'orge) 0,8 Volume (% d'orge) 2,0 volume/poids 70 28062 76 2053260 PARTIE E 1. Composition des grains Orge 64,4 Maïs. 30,9 Malt 5,1 100 48 8 2. Système enzymatique Amylase 10 Amylase bactérienne Novo Activité de l'amylase (unités/g).... 9500 Quantité d'amylase (unités/g d'orge) 128 Poids ($ d'orge) 1,34 poids/poids 15 20 Protéase Ficine Actiyjjé de la protéase (unités /g)...543,6 Quantité de protéase (unités/g d'ag^ 0,9 Poids (96 d'orge) 0,ï6 Amylase : Protéase 142:1 poids/poids Amyloglucosidase Grlucoamylase de distillation (Miles Laboratories) Activité de l'amylase (unités/ml)...100 25 Quantité d'amylase (unités/g d'orge) 0,4 Volume (fo d'orge) 0,4 volume/poids PARTIE F 1. Compostion des grains 30, . - Orge 60 100 Maïs 32,4 54 Malt 7,2 12 70 28062 77 2053260 PARTIE F (Suite) 2. Système enzymatique Amylase "HT 1000" (Miles Laboratories) 5 Activité de l'amylase (unités/^......... 55 400 Quantité d'amylase (unités/g d'orge).... 128 Poids ($ d'orge) 0,2 poids/poids Protéase 10 Broméline Activité de la protéase (unités/g) 203,5 Quantité de protéase (unités/g d'orge).. 1,1 Poids ($ d'orge).. 0,5 Amylase: Protéase 116:1 15 Amyloglucosidase Grlucoamylase pour le traitement des grains Activité (unités A.G./ml) 40 Quantité (unités A.G-./g d'orge) 0,6 20 Volume d'orge) 1,5 volume/poids PARTIE G 1. Composition des grains JL 25 Orge 66,4 100 Mais 29,2 44 Malt 5,3 8 2. Système enzymatique 30 Amylase Amylase bactérienne Novo Activité de l'amylase (unités/g) 9500 Quantité d'amylase (unités/g d1 orge).... 150 Poids (f° d'orge) 1,5 poids/poids 70 28062 78 2053260 1. Système enzymatique - (suite) Protéase Ficine Activité de la protéase (unités/g) 543,6 5 Quantité de protéase (unités/g d'orge). 1,5 Poids (f<> d'orge) 0,27 poids/poids Amylase : Protéase ' 100:1 Amyloglucosidase 10 Glucoamylase de distillation (Miles Laboratories) Activité (unités A.G./ml) 100 Quantité (unités A.d'orge) — 0,4 Volume d'orge) 0,4 volume/pcrids 15 PARTIE H 1. Composition des grains Orge 64,4 100 Maïs 30,9 48 20 Malt 5,1 8 2. Système enzymatique Amylase "Tenase " (Miles Laboratories) 25 Activité de l'amylase (unités/g 14100 Quantité d'amylase (unités/g d'orge)... 100 Poids (i> d'orge) 0,7 volume/pœâs 30 28062 79 2053260 2. Système enzymatique (suite) Protéase Broméline Activité de la protéase (unités/g)..203,5 5 Quantité de protéase (uités/g d'orge) 1,1 Poids {fo d'orge) 0,5 poids/poids Amylase : Protéase 91:1 Amyloglucosidase 10 G-lucoamylase de traitement des grains Activité (unités A.G./ml) 40 Quantité (unités A.G-./g d'orge)...... 0,6 Volume ($> d'orge) 1,5 volume/poids 15 PARTIE I 1. Composition des grains g. JË_ Orge 60,0 100 Mais 32,4 54 20 Malt. 7,2 12 2. Système enzymatique Amylase "HTP 200" (Miles Laboratories)* ' ^ Activité de l'amylase (unités/g).... 19680 Quantité d'amylase (unités/g d'orge)128 Poids (fo d'orge) 0,65 poids/poids 70 28062 80 2053260 2. Système enzymatique (suite) Protéase "HTP 200" (Miles Laboratories)* Activité de protéase (unités/g) 235 5 Quantité de protéase (unités/g d'orge). 1,5 Poids {fo d'orge) 0,6 poids/poids Amylase : Protéase 85:1 * "HTP 200" possède à la fois une activité d'amylase et une activé de protéase. 10 Amyloglucosidase Giucoamylase de distillation (Miles Laboratories) Activité (unités A.G./ml) ...100 Quantité (unités A.G./g d'orge) 0,8 15 Volume (?S d'orge) 0,8 volume/poids .PARTIE J 1. Compoëtion des grains 20 0rSe 64,4 100 Mais 30,9 48 Malt 5,1 8 2. Système enzymatique Amylase "HTP"200" (Miles Laboratories) 25 Activité de l'amylase (unités/g) 19680 Quantité d'amylase (unités/g d'orge).128 Poids .{f° d'orge) 0,65 poids/poids Protéase "HTP 200" (Miles Laboratories) Activité de la protéase (unités/g).... 2350 Quantité de protéase (unités/g d'orge) 1,5 Poids (% d'orge) 0,5 Amylase rPi'btéase : 85:1 35 70 28062 81 2053260 2. Système enzymatique (Suite) Amyloglucosidase Diazyme (Miles Laboratories) Activité (unités A.G/g) 160 5 Quantité (unités A.G./g d'orge) 0,8 Poids (1° d'orge) 0,5 poids/poids Dans chacune des parties A à J, le maïs a été liquéfié dans l'appareil de cuisson en utilisant 12# en poids de malt broyé. Résultats Le tableau XII ci-après résume les résultats numériques provenant de l'analyse d'un moût à bière/'obtenu à partir de l'une des parties A à J et à partir d'une opération sur un moût témoin de malt, dans des conditions de procédé identiques (malt :68 g; maïs : 26 g). -4 O TABLEAU XII |Propriété du moût PARTIE "I B C D E F "G H T J témoin* : Extrait de moût(°P) 10,4 10,6 10,4 10,2 10,5 10,7 10,7 10,4- 10,65 10,6 10,5 jAzote total(mg/l) 760 820 760 775 780 805 800 820 800 794 822 :Azote formolé (mg/l) 238 260 245 242 233 238 270 242 260 255 250 ipH 5,3 5,4 5,4 5,35 5,3 5,4 5,4 5,3 5,4 5,3 5,3 :Q.F. (°P) 1,8 1,65" 1,85 1,6 1,85 1,7 1,8 1,7 1,65 1,7 2,4 :Atténuation apparente 83,2 : % 82,7 84,4 82,2 84,3 82,4 84,1 83,6 84,5 84,0 77,1 \Transformation * 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 •.Clarté du produit [s1 écoulant ** 4 5 4 4 5 5 ' 4 4 4 4 4 : Temps d' écoulement ! (mn) 30 30 30 30 35 30 30 30 35 30 35 * Echelle de transformation (essai colorimétrique à l'iode) 1 = clair } 10 = pourpre ** Echelle de clarté 1 = obscur - trouble : 5 = clair -brillant K> O en OJ N> O"* O 28062 83 2053260 Le moût à bière obtenu selon chacune des parties A à J a été fermenté en une bière ayant un goût, un arôme, une couleur et une stabilité acceptables. Bien entendu la présente invention n'est nullement limitée 5 aux modes d'exécution décrits et représentés qui n'ont été donnés qu'à titre d'exemple. En particulier, elle comprend tous les moyens constituant des équivalents techniques des moyens décrits ainsi que leurs combinaisons si ;celles-ci sont exécutées selon l'esprit de l'invention. 70 28062 84 2053260 REVENDICATIONS 1. Procédé de préparation d'un moût à bière, caractérisé en ce qu'il consiste à faire réagir une "bouillie de substance à base d'amidon broyé, dans des conditions de température appropriées et pendant des durées convenables, avec une enzyme protéolytique 5 isolée, une « -amylase isolée, une amyloglucosidase isolée et une source de J1» -amylase ou une -amylase Isolée, l'enzyme protéolytique, 1' -amylase et l'amyloglucosidass étant présentes en quantités d'au moins environ 0,5 unité de protéase Kunitz modifiée par gramme de substance à base d'amidon, d'au moins 10 environ 45 unités d'o -•* ' gramme de substance à base d'amidon et d'au moins environ 6,0 x10 unité d'amyloglucosidase par gramme de substance à base d'amidon, -respectivement. 2. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que la 15 quantité d' ot -amylase est d'au moins environ 100 unités Stein- Fischer modifiées par gramme de substance à base d'amidon. 3. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que la quantité d1amyloglucosidase est d'au moins environ 1,0 x 10~ unité d'amyloglucosidase par gramme de substance à base d'amidon. 20 4. Procédé selon l'une des reveçidications précédentes, caracté risé en ce que la source de p-amylase est constituée par du malt ou de l'extrait de malt, utilisé en une quantité allant jusqu'à environ 30 en poids. 5. Procédé selon l'une des revendications précédentes, caracté-25 risé en ce que l'on traite une bouillie aqueuse de grains de céréales par environ 8 à 20 i» en poids de malt, au moins environ 0,9 unité de protéase Kunitz modifiée par gramme de substance à base d'amidon, au moins environ 100 unités d' 0( -amylase Stein-Fischer modifiées par gramme de substance d'amidon et au moins environ 1x10~ unité 30 d'amyloglucosidase par gramme de substance à base d'amidon. 6. Procédé selon l'une des revendications précédentes, caractérisé en ce que la protéase est comprise en une quantité allant d'environ 0,9 à environ 2-2,5 unités de protéase Kunitz modifiée par gramme de substance à base d'amidon. 35 7. Procédé selon l'une des revendications 1 à 5, caractérisé 70 28062 85 2053260 en ce que l1amyloglucosidase est présente en une quantité allant —1 —1 d'environ 1x10 à 10x10 unité d'amyloglucosidase par gramme de substance à base d'amidon. 8. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 7, 5 caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes : (a) on mélange une bouillie aqueuse de grains de céréales avec le malt ou l'extrait de malt et l'enzyme protéolytique, l1 o( -amylase et 1'amyloglucosidase (b) le pH du mélange résultant étant compris entre environ 10 5,0 et environ 6,5,on maintient ledit mélange à une température comprise entre environ 40 et environ 55°C, pendant une durée de •l'ordre de 30 à 240 minutes, notamment de l'ordre de 30 à 120 minutes (c) à la fin de la durée précitée, ou vers la fin de cette 15 durée, on introduit dans la masse principale, sous forme d'additif à celle-ci, entre environ 10 et environ 60 % en poids, par rapport au poids de substrat de grains de céréales, des grains de céréales (d) on élève la température de la masse globale combinée à 20 une valeur comprise entre environ 60 et environ 80°C (e) on maintient la température de la masse précitée dans cet intervalle, pendant une durée d*environ 30 à environ 120 minutes, notamment de l'ordre de 30 à 90 minutes, de façon à obtenir la composition en hydrates de carbone requise pour un moût à bière, 25 et (f) on sépare le moût ainsi obtenu du résidu solide. 9. Procédé selon la revendication 8, caractérisé en ce que, au lieu d'Introduire le malt ou l'extrait de malt dans l'étape (a), on introduit celui-ci vers la fin, ou après achèvement, de l'étape (b) 30 ou de l'étape (c). 10. Procédé selon la revendication 8 ou 9, caractérisé en ce que au lieu d'introduire 1'« -amylase dans l'étape (a), on introduit celle-ci vers la fin, ou après achèvement, de l'étape (b) ou de l'étape (c). 35 11- Procédé selon l'une des revendications 1 à 7 caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes : a) on mélange une bouillie aqueuse de grains de céréales avec l'enzyme protéolytique et éventuellement avec | 'u -amylase; 70 28062 86 2053260 ^b) le pH du mélange résultant étant compris entre environ 5,0 et environ 6,5, on maintient ledit mélange à une température comprise entre environ 40° et environ 55°C, pendant une période de l'ordre de 30 à 240 minutes, notamment de l'ordre de 30 à 120 5 minutes; (c) on introduit dans la masse principale, sous la forme d'un additif à celle-ci, entre environ 10 et environ 60# en poids, de grains de céréale, par rapport au poids du substrat de grains de céréales, ainsi que,si elle n'a pas été ajoutée au cours de l'étape 10 (a), l'ot - amylase; (d) on élève la température de la masse globale combinée à une valeur comprise entre environ 65° et 90° C, notamment comprise entre environ 70° et 85°C; (e) on maintient la température de ladite masse à une valeur 15 comprise dans ledit intervalle, pendant une durée de l'ordre de 10 à 90 minutes, notamment de lbrdre de 10 à 40 minutes, afin de solubiliser l'amidon; (f) on refroidit la masse liquéfiée à une température comprise entre environ 40° et environ 65°C, notamment entre environ 50° et 20 60°C; (g) on mélange la masse liquéfiée avec le malt ou l'extrait de malt et l'on y ajoute l1amyloglucosidase; (h) on maintient la température de ladite masse dans l'intervalle allant d'environ 40° à environ 65°C pendant une durée de 25 lbidre de 30 à 120 minutes; et (i) on sépare le moult ainsi obtenu du résidu solic'e. 12. Procédé selon la revendication 11, caractérisé en ce que au lieu d'ajouter 1' « -amylase pendant l'étape (a) on ajoute celle-ci à la fin, ou vers la fin, de l'étape(b) ou de l'étape (c). 30 13- Procédé selon l'une des revendications 1 à 7, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes : (a) on mélange une bouillie aqueuse de grains de céréales avec 1' « -amylase; (b) le pH du mélange résultant étant compris entre 5,0 et 6,5 35 on élève la température du mélange à une valeur comprise'entre environ 65° et environ 90°C, notamment comprise entre environ 70° et environ 85°C; (c) on maintient la température du mélange précité à une 70 28062 87 2053260 valeur comprise dans ledit intervalle pendant une durée de l'ordre de 10 à 90 minutes, notamment de l'ordre de 10 à 40 minutes; (d) on refroidit la masse liquéfiée à une température comprise entre environ 40° et environ 65° C, notamment comprise 5 entre environ 50 et environ 60°C; (e) à la fin de la durée précitée, ou vers la fin de cette durée, on introduit dans la masse principale, sous la forme d.'un additif à celle-ci, entre environ 10 et 60 % en poids de grains de céréales, par rapport au poids du substrat d§ferains 10 de céréales; (f) avant, en même temps, ou à la suite de l'incorporation de l'additif de céréales, on mélange la masse liquéfiée avec le malt ou avec l'extrait de malt, 1'amyloglucosidase et la protéase ; . .. 15 (g) on maintient la température de la masse globale combinée à une valeur comprise entre environ 40° et environ 65°C, notamment entre environ 50° et environ 60°C pendant une durée de l'ordre de 30 à 240 minutes,notamment de l'ordre de 30 à 120 minutes, et ; 20 - (h.) on sépare le moût ainsi obtenu du résidu solide. 14. Procédé selon l'une des revendications précédentes, caractérisé en ce que, au lieu d'ajouter l'amyloglucosidase pendant le processus de brassage lui-même, on ajoute ladite amyloglucosidase au moût obtenu. 25 15. Procédé selon l'une des revendications précédentes, carac térisé en ce que la substance à base d'amidon est présente sous la forme 'd'une bouillie aqueuse, à une concentration comprise entre environ 20 et environ 40 grammes pour 100 centimètrecubes d'eau. 30 16. Procédé selon l'une des revendications précédentes, carac térisé en ce que la substance à base d'amidon est constituée par de l'orge, avec des dimensions moyennes de particules au plus égales à 1,41 millimètre. 17. Procédé selon l'une des revendications précédentes, carac- 35 térisé en ce que la protéase isolée est choisie parmi la ficine, la broméline, la papaïne, la pancré^ine, les protéases d'origine fongique, ou des mélanges de toutes ces variétés d'enzymes. 70 28062 88 2053260 18. Procédé selon l'une des revendications 1 à 16, caractérisé en ce que la protéase isolée est une protéase d'origine bactérienne choisie par exemple parmi les espèces suivantes :Bacillus subtilis. Bacillus_amvloliquefaciens, Bacillus polymyxa. Bacillus megate- 5 rium. et Bacillus cereus. 19. Procédé selon l'une des revendications précédentes, caractérisé en ce que 1' «-amylase isolée est une amylase d'origine fongique, choisie par exemple parmi les espèces suivantes : Aspergillus n-iger. Aspergillus oxyzae. Aspergillus candidus et 10 certaines espèces de Rhizopus. 20. Procédé selon l'une des revendications 1 à 18, caractérisé en ce que l'0 Bacillus subtilis. Bacillus amyloliquefadaas.Bacillus polymyxa. 15 Bacillus coagulans. Bacillus cereus. ët Bacillus megaterium. 21. Procédé selon l'une des revendications 1 à 9, 11, 12 et 14 à 16, caractérisé en ce que la protéase et 1' ^ -amylase sont utilisées sous la forme d'un mélange enzymatique isolé obtenu par fermentation d'une bactérie du genre Bacillus. 20 22. Procédé selon la revendication 21, caractérisé en ce que la bactérie précitée est constituée par une souche de l'espèce Bacillus subtilis. 23. Procédé selon la revendication 20, caractérisé en ce que la souche utilisée est la souche ATCC 21556 de l'espèce Bacillus 25 subtilis. 24. Procédé selon l'une des revendications précédentes, caractérisé en ce que 1'amyloglucosidase isolée œt une amyloglucosidase d'origine fongique, obtenue par exemple à partir de l'une des espèces suivantes : Aspergillus niger. Aspergillus awamori. Aspergil- 30 lus oxyzae et certaines espèces de Rhizopus et Endomyces. 25. Procédé selon l'une des revendications précédentes, caractérisé en ce que la malt est un malt d'orge broyée d'activité diastatique comprise entre environ 50° et environ 140° Lintner, lequel est utilisé en une quantité comprise entre environ 8 % et 35 environ 20 $ en poids. 26. Procédé selon l'une des revendications 8 à 25, caractérisé en ce que l'additif de céréales utilisé est choisi parmi les gruaus 28062 89 2053260 de maïs, la farine ou poudre de maïs, le sorgho, la farine de froment, la farine d'orge, le riz ou la farine de riz. 27. Procédé selon la revendication 26, caractérisé en ce que la liquéfaction est réalisée en mélangeant une bouillie aqueuse 5 de grains de céréales bruts avec du malt, de l'extrait de malt ou une 0( -amylase isolée, à raison d'au moins 10 unités d'# -amylase Stein-Fischer modifiées par gramme de grains de céréales. 28. Procédé selon la revendication 27, caractérisé en ce que la même a -amylase isolée est utilisée pour la liquéfaction de 10 l'additif de céréales et pour la solubilisation de la substance à base d'amidon. 29. Procédé selon l'une des revendications 8 à 25, caractérisé en ce que l'additif de céréales est une substance pré-gélatinisée telle que par exemple des flocons ou paillettes de maïs, de l'amidon 15 de maïs ou du glucose. 30. Procédé selon l'une des revendications 17 à 29, caractérisé en ce que l'additif de céréales est utilisé en une quantité comprise entre environ 42 # et environ 55 # en poids par rapport au poids des grains de céréales. 20 31. Procédé selon l'une des revendications 8 à 10 et 13 à 30, caractérisé en ce que l'étape de solubilisation et de saccharification (étape e) est effectuée en deux stades, la masse globale étant initialement maintenue entre environ 60° et environ 70°C pendant une durée de l'ordre de 30 à 90 minutes, notamment de l'ordre 25 de 30 à 60 minutes, après quoi la température est élevée jusqu'à une valeur comprise entre environ 70° et environ 80°C, la trempe étant maintenue à une température comprise dans cet intervalle pendant une durée de l'ordre de 10 à 60 minutes, notamment de l'ordre de 10 à 30 minutes. 30 32. Procédé selon l'une des revendications 11, 12 et 14 à 30, caractérisé en ce que la masse liquéfiée provenant de l'étape (e) est refroidie par passage à travers un échangeur de chaleur. 33. Procédé selon l'une des revendications 13 à 30, caractérisé en ce que la température de la bouillie aqueuse est élevée dans 35 l'étape (a) par passage à travers un échangeur de chaleur. 34.-Procédé selon l'une des revendications précédentes, caractérisé en ce que avant l'étape de séparation, on porte la température 70 28062 90 2053260 de la trempe à une valeur suffisamment élevée pour inactiver les enzymes. 35. Procédé selon l'une des revendications précédentes, caractérisé en ce que l'on sèche les moûts résultants, auquel peu- 5 vent être ajoutés des adjuvants donnant de l'amertume, de façon à obtenir une poudre. 36. Procédé selon l'une des revendications 1 à 34, caractérisé en ce que le moût résultant, auquel peuvent être ajoutés des adjuvants donnant de l'amertume, est concentré de façon à se 10 présenter sous la forme d'un sirop. 37. Moût à bière, caractérisé en ce qu'il est préparé par un procédé selon l'une des revendications 1 à 36. 38. Procédé pour la préparation d'une bière ou d'une boisson alcoolisée similaire, caractérisé en ce que, après addition des 15 adjuvants donnant de l'amertume, on soumet à la fermentation alcoolique le moût à bière obtenu par le procédé selon l'une des revendications 1 à 34. 39. Procédé pour la préparation d'une bière ou d'une boisson alcoolisée similaire, caractérisé eh ce qu'il consiste à fermenter 20 un moût constitué, en partie ou en totalité, par une solution aqueuse du produit sec ou concentré obtenu selon la revendication 35 ou 36. 40. Bière ou boisson alcoolisées similaire, caractérisée en ce qu'elle est obtenue par, le procédé selon la revendication 38 25 ou 39. 41. Mélange d'enzymes isolées utilisable pour la préparation d'un moût à bière selon le procédé de l'une des revendications 1 à 36, caractérisé en ce qu'il contient de 1'%-amylase, de la protéase et de 11amyloglucosidase possédant une activité protéolytique 30 et une activité de liquéfaction et de saccharifacation de l'amidon équilibrées et facilement réglables, susceptible. de digérer, lorsqu'il est employé en quantités appropriées, une subBtance- à base d'amidon, de façon à la transformer en un produit ayant des propriétés acceptables et substantiellement reproductibles, 35 notamment une composition en hydrates de carbone, permettant l'utilisation dudit produit comme moût à bière. 42. Mélange enzymatique selon la revendication 41, caractérisé 70 28062 91 2053260 en ce que la protéase dudit- mélange contient de la protéase alcaline et de la protéase neutre. A3' Mélange enzymatique selon la revendication 41 ou 42, caractérisé en ce que l'p^ -amylase et le protéase sont sous la forme d'un complexe enzymatique obtenu par fermentation, en utilisant une bactérie du genre Bacillus.