FR 2045855 A1 19710305 FR 7020496 A 19700604 70 20496 _1" 2045855 La présente invention concerne ion appareil indicateur de stérilité destiné à vérifier l'efficacité de la stérilisation de micro-organismes j et son procédé d'utilisation. La stérilisation des instruments médicauxs de la verrerie et des 5 objets analogues est de pratique courante dans les hôpitaux et a pour but d'éviter la propagation des maladies® On utilise avec succès à cet effet des milieux stérilisants tels que vapeur, chaleur sèche, gaz stérilisants et radiations» Le problème se pose cependant, de déterminer le degré d'efficacité de ces procédés de stéri-10 lisation, et il est important d'avoir un appareil qui permette de vérifier rapidement, efficacement et sans manipulations de laboratoire compliquées le degré d'efficacité des milieux stérilisants tels que vapeur, chaleur sèche, gaz stérilisants et radiations. "La présente invention a pour objet un indicateur de stérilité 15 qui comprend (a) un compartiment externe transparent déformable dont les parois sont imperméables aux liquides et sensiblement imperméables aux gaz, ledit compartiment comportant au moins une ouverture et renfermant un nombre prédéterminé de microorganismes viables?(b) un élément de fermeture imperméable aux bactéries mais perméable 20 aux gaz qui ferme normalement ladite ouverture \ (c) un compartiment interne imperméable aux gaz et aux liquides, normalement fermé et ouvrable par pression, qui contient un milieu nutritif aqueux capable, avec incubation, de favoriser la croissance des micro-organis-mes viables lorsqu'ils sont en contact avec le milieu nutritif,le 25 dit compartiment interne étant disposé étroitement à l'intérieur du compartiment externe de manière à s'ouvrir par déformation du compartiment externe pour permettre au milieu nutritif de venir en contact avec les microorganismes ; et(d) un matériau détecteur contenu dans l'un au moins des compartiments et.capable de subir un change-30 ment de couleur visible par suite de la croissance des micro-organismes» Le procédé de 1'invention consiste successivement : à soumettre l'indicateur de la présente invention-à un cycle de stérilisation; à ouvrir le compartiment interne de l'indicateur par déformation du 3 5 compartiment externe pour amener le milieu nutritif aqueux en contact avec les microorganismes viables éventuellement survivants;et à faire incuber l'indicateur dans des conditions favorables à la croissance des microorganismes viables. 70 20496 -a- 2045855 Ie invention- sera mieux comprise à la lecture de la description détaillée fui va suivre et' à l'examen des dessins annexés, qui représentent, à titre d'exemple non.limitâtif, urvmode- de réalisation de l'invention» - 5 La fig® 1 est-une vue en coupe transversale d'un mode dg réalisa tion préféré d'un indicateur sttivant l'invention. La fig»- 2 est une vue en coupe transversale d'un couvercle percé d'une ouverture et destiné à s'emboîter'sur l'extrSnité ouverte de l'appareil dë- la figure 1. - 10 Sa fig. 3 est une vue en coupe transversale suivant la ligne 3=3 de la figure-1. la fig. 4 est une vue éclatée-de 19appareil de la figure 1» Dans l'appareil dé la présente'invention on peut utiliser des spores "bactériennes telles que Bacillus subtilis, Bacillus Btsarothermophilus, Olostridium sporogenes, etc.# et des spores xo^giques telles que l'eurosporaj Bithomyces ,3)aldinia, etc». Par "'aisroorganismes" il faut entendre ici les bactéries, les moisissu- l'es protozoaires, ete,;., q6est-à-dire les mieroorganismes qui peuvent être détruits par stérilisation. Les meilleurs résultats 20 sont obtenus aveôdes bactéries et des moisissures qui existent à la fois à l'état de "spores" et à l'état "végétdifj Les bactéries et les moisissures sont généralement plus résistantes à la stérilisation à l'état de spores qu'à l'état végétatif. Il en résulte que pour assurer une certaine marge de sécurité, on utilise avan-25 tageusement dés bactéries et des moisissures à l'état de spores. Une marge de sécurité supplémentaire est assurée par l'emploi de mieroorganismes qui sont--plus résistants aux moyens de stérilisa-tien choisis que les mieroorganismes que le cycle de stérilisation doit détruire. ' 30 Bien que l1 appareil de l'invention soit décrit comme utilisé avec une'seule espèce dé mieroorganismes, il est à noter qu'il peut également être utilisé avec une pluralité d'espèces de mieroorganismes. C'est ainsi qu'un seul appareil'indicateur de stérilité peut renfermer trois espèces de mieroorganismes,. une première 35 espèce étant résistante à la chaleur,/une deuxième aux milieux stérilisants gazeux et:-la troisième- àuit radiations "telles que les rayons X» - • '■"?&' - ' '• - -'- t.1 t-.; L'appareil représenté-sur les"-dessins'compïend •an'compartiment externe formé par un tubè cylindrique flexiblè et transparent 10 40 qui comporte des parois 12 imperméables aux liquides et sensible 70 20496 2045855 ment imperméables aux gaz, et une extrémité ouverte 14. Le tube 10 contient une bande de papier-filtre 16 qui porte un nombre prédéterminé de microorganismes viables tels que des spores bactériennes. Le tube 10 contient également un compartiment interne 18, 5 normalement fermé et ouvrable par pression, tel qu'une ampoule en verre frangible, renfermant un milieu nutritif aqueux 20 qui est capable, avec une certaine incubationf de favoriser la croissance des spores lorsqu'elles viennent à son contact. Le compartiment interne 18 est logé étroitement dans le compartiment externe, comme 10 représenté sur les figs. 1 et 3, de sorte qu'une très faible partie seulement du volume du compartiment externe reste inoccupée. L'ampoule de verre 18 est séparée de la paroi 12 du tube 10 par la bande de papier-filtre 16, qui définit des cavités 24 et 26 entre la paroi 12 et l'ampoule 18. L'extrémité ouverte 14 du tube 10 est 15 munie d'un élément de fermeture imperméable aux bactéries et perméable aux gaz, tel qu'une pellicule 22. La pellicule 22 peut être scellée sur l'extrémité ouverte 14 du tube 10, par exemple par thermosoudage ou collage avec un adhésif, ou au moyen d'un couvercle 28 (retiré sur la figure 2) qui comporte une ouverture 29 ad ja-20 cente à la pellicule 22. Pendant une stérilisation avec un milieu de stérilisation gazeux, le milieu gazeux traverse la pellicule 22 et pénètre dans les cavités 24 et 26 pour venir en contact avec la bande de papier-filtre 16 imprégnée de spores. Gomme représenté sur la figure 4, l'appareil de la figure 1 est 25 facile à assembler. Dans l'ordre, on introduit dans l'extrémité ouverte 14 du tube 10 le papier-filtre 16 contenant les spores,puis l'ampoule de verre frangible 18, et on ferme l'extrémité ouverte 14 du tube à l'aide de la pellicule 22. L'un des compartiments de l'appareil de l'invention, ou les deux, 30 contiennent également un matériau détecteur non représenté qui est capable de subir un changement de couleur visible sous l'effet de la croissance des spores. Pour vérifier l'efficacité d'un cycle de stérilisation, on utilise l'appareil de la figure 1 de la façon suivante : 35 On place l'appareil de l'invention contenant des spores bactériennes sur un plateau avec une pluralité d'objets à stériliser par exemple avec de l'oxyde d'éthylène gazeux. On dispose le plateau dans une chambre de stérilisation appropriée, on fait le vide et on introduit de l'oxyde d'éthylène gazeux. L'oxyde d'éthylène 70 20496 _4" 2045855 traverse la pellicule 22 et pénètre dans les cavités 24 et 26 pour détruire les spores de mieroorganismes qui imprègnent le papier-filtre 16. A la fin de la période de, stérilisation,on fait de nouveau le vide dans la chambre de stérilisation puis on remplace 5 l'oxyde d'éthylène par de l'air filtré..On retire l'appareil indicateur du plateau» et on le serre entre le pouce et l'index pour briser l'ampoule de verre frangible 18, ce qui met le milieu nutritif 20 en contact avec la bande de papier-filtre 16. On place ensuite l'indicateur dans "tan milieu d'incubation approprié (par 10 exemple on peut le placer dans de l'eau à 37°;C environ pendant 48 heures environ ). Les spores qui n'ont pas été détruites par l'oxyde d'éthylène commencent à germer et à croître pendant l'incubation, ce qui provoque le changement de couleur du matériau d étec-teur contenu dans l'indicateur. Ce changement de couleur peut être 15 observé à travers les parois transparentes 12 du tube 10 et indique à un observateur que le cycle de stérilisation n'a pas détruit toutes les spores sur le papier-filtre et était donc peut être insuffisant pour stériliser complètement les autres objets disposés sur le plateau. Au contraire, l'absence de changement de cou-20 leur indique que l'opération de stérilisation a détruit toutes les spores du papier-filtre et a donc été suffisant pour stériliser les objets disposés sur le plateau. On a décrit l'indicateur de stérilité de l'invention comme s'appliquant notamment aux milieux de stérilisation gazeux tels que 25 , l'oxyde d'éthylène, la vapeur et analogues. Son emploi n'est cependant pas limité aux milieux gazeux et peut servir à vérifier l'efficacité d'autres milieux stérilisants tels que la chaleur sèche et les radiations. Le compartiment externe de l'indicateur qui contient les micro—-30 organismes viables et dans lequel s'effectue leur croissance pendant l'incubation doit être transparent de sorte que tout changement de couleur apparaisse sans qu'il soit nécessaire de démonter l'appareil. En outre, ce compartiment externe doit être suffisamment déformable pour permettre la rupture du compartiment interne 35 par pression,.Enfin les parois du compartiment externe doivent être sensiblement imperméables aux gaz et aux liquides et, avec l'élément de fermeture, elles doivent de préférence enserrer étroitement le compartiment interne. On s'est aperçu qu'un contact étroit entre les compartiments interne et externe est souhaitable pour éviter 40 les interstices vides relativement grands dans lesquels des gaz -5- 2045855 70 20496 stérilisants pourraient être emprisonnés pendant l'opération de . stérilisation, ce qui risquerait de faire éclater le compartiment externe pendant la mise sous vide. De plus, la libération du gaz ainsi emprisosmé pendant la période 5 ultérieure d1 Incubation peut provoquer la destsmction des micro-■ organismes les plus fragiles panai ceux qui oat survécu à l'opération de stérilisation, ce qui fausse les résultats de l'essai. Par "contact étroit", il faut entendre que 70$ au moins, et mieux 80$ du volume du compartiment externe fermé sont occupés par le compar-10 timent interne. Si les parois du compartiment externe pouvaient absorber le milieu gazeux de stérilisation, le gaz pourrait s'échapper pendant l'incubation pour empêcher la croissance des mieroorganismes, ce qui fausserait également les résultats obtenus, Le compartiment externe contenant les mieroorganismes est avaxrbageu-15 sement fait dans une matière plastique qta± résiste suffisamment aw températures élevées pour supporter les opérations de stérilisation à la valeur ou à la chaleur sèche, qui n'absorbe pas les milieux stérilisants gazeux et qui est imperméable aux liquides. Paxmi les matériaux polymères qui possèdent de telles qualités., on peut ei-20 ter le polypropylène, les polyamides {"Hylons") et divers polyesters. les microorganismes qui sont utilisés dans la présents invention sont normalement portés par, ou contenus danss un support approprié. C'est ainsi que les microorganismes peuvent être supportés 25 par les parois internes du compartiment externe*, II est plus avaîï~-tageux cependant que les microorganismes soient supportés par un support séparé, tel que l'un de ceux décrits dans le brevet américain 2 931 757. Le support est avantageusement hydrophile et ne doit pas empêcher, la croissance des microorganismeso Â cet effet, 30 les matériaux hydrophiles en feuille tels que le papier-filtre,le tissu, etc.., sont particulièrement avantageux^, Pour favoriser la croissance des microorganismes pendant leur incubation il est souhaitable que ,les supports hydrophiles contiennent une petite quantité d'eau. Par exemple, des bandes,de papier-filtre porteuses des 35 spores, qui ont été conservées pendant quelques heures à 23°0 avec une humidité relative de 50$ donnent d'excèllents résultats. On peut .également utiliser comme supports de spores, des feuilles de métal tel cjue de l'aluminium ou de l'acier inoxydable ainsi que du _verre (par exemple des billes de verre) de la porcelaine, etc..... 70 20496 ~S" 204S85S Pour que la reproduction soit assurée, il est souhaitable que le compartiment externe contienne un nombre approximatif prédéterminé de mieroorganismes, ce qui est facile à obtenir avec des spores bactériennes ou fongiques# On prépare une suspension aqueuse de 5 spores ayant une concentration volumétrique'de spores connue, on humecte un support (tel qu'un papier filtre) avec un petit volume prédéterminé de la suspension et on sèche le support'.Ce procédé permet de calculer facilement le nombre approximatif des spores contenues dans le support, mais on peut également utiliser d'autres 10 méthodes. 'Clommë indiqué précédemment, le compartiment externe qui contient les mieroorganismes comporte au moins une ouverture qui permet au milieu stérilisant gazeux (tel que vapeur ou oxyde'd*éthylène) de Tenir en contact avec les mieroorganismes pendant la stérilisation# i[5 aelvs ouverture est normalement fermée ou obturée avec un élément ue fermeture imperméable aux bactéries mais perméable aux gasSoPcra? esû' élément de fermeture on peut utiliser comme matériaux des ma- fibreux tels que coton, laine "de verre* tissu, etÊ...les aousses polymères à alvéoles ouverts et les pellicules plastiques 20 seE'i-pemiéables telles que celles décrites dans le brevet américain 3 346 464c Les matériaux fibreux ou cellulaires sont préférés poux la facilité avec laquelle ces matériaux transmettent les gaz stérilisants® Un matériau particulièrement avantageux est une feuille de polyéthylène fibreux vendu sous la dénomination commerciale de 25 "Tyvek" par la Sté E.I0 Du Pont de Uemours and Go, En effet, les éléments de fermeture fibreux ou cellulaires servent de filtres aux bactéries ou aux moisissures et les dimensions de leurs ouvertures îie doivent pas être supérieures à 0,5 microns environ (afin d'être capables o.2 empêcher le passage de particules ayant des dimensions 30 supérieures à 0,5 micron environ). les milieux nutritifs aqueux qui sont utilisés dans la présente invention, sont bien connus dans ce domaine. Parmi les milieux nutritifs les plus avantageux on peut citer les solutions aqueuses de "ïryptic Soy Broth" qui sont vendues par la Société dite Difco 35 Laboratories, Inc, le thioglyeolate fluide et la "Dextrose Irypto-ne" vendue également par la Sté Difco Laboratories Inc. Le "Tryptie Soy Broth" est particulièrement avantageux. Pour éviter la contamination, un tel milieu nutritif aqueux est normalement stérilisé après avoir été introduit dans le compartiment interne . 70 20496 -7- 2045855 Le compartiment interne qui contient le milieu nutritif aqueux est en matériau imperméable aux gaz et aux liquides, et il peut s'ouvrir lorsqu'on exerce une pression sur lui» pour permettre au milieu nutritif de pénétrer dans le compartiment externe contenant 5 les microorganismes. Le compartiment interne est avantageusement fait dans un matériau frangible, tel que du verre et, comme indiqué précédemment, il est logé étroitement à l'intérieur du compartiment externe de sorte qu'il peut être cassé ou brisé lorsqu'on déforme le compartiment externe, par exemple en le pressant entre le pouce 10 et l'index. En variante, le compartiment interne peut être fermé par un bouchon qui est expulsé pour libérer le contenu du compartiment interne lorsqu'on exerce une pression sur ce dernier. On détecte la croissance des microorganismes qui survivent après 15 la stérilisation au changement de couleur d'un matériau détecteur contenu dans l'un au moins des deux compartiments. Le matériau détecteur est avantageusement soluble dans le milieu nutritif aqueux et le colore pendant la croissance des microorganismes de sorte qu'un changement de couleur est facile à observer à travers les pa-20 rois transparentes du compartiment externe.Les matériaux utilisables dans la présente invention sont bien connus. On peut citer notamment les indicateurs colorants sensibles au pH tels que le bleu de bromothymol, le pourpre de bromocrésol, le rouge de phénol etc...,les indicateurs colorants agissant par oxydo-réduction,tels 25 que le bleu de méthylène, etc..Ces matériaux subissent généralement des changements de couleur sous l'effet d'un phénomène dû à la croissance, des micro organisme s, tel que modification de pH, potentiels d'oxydo-réduction, etc.. Bien entendu, l'invention n'est nullement limitée au mode de 30 réalisation décrit et représenté; elle est susceptible de nombreuses variantes, accessibles à l'homme de l'art, suivant les applications envisagées et sans qu'on s'écarte pour cela du cadre de l'invention. 70 20496 -8- 2045855 ~BEVENDICATIONS- 10- Appareil indicateur de stérilité destiné à "vérifier l'efficacité d'un cycle de stérilisation, ledit appareil étant caractérisé en ce qu3il comprend (a) m compartiment externe transparent déformais! e dont les parois sont iapemêables aux liquides et sensible-5 ment impersaéables aux gazs ledit compartiment comportant au moins une ouverture et renfermant m aosbr® prédéterminé de microorganismes viables ;(b) un élément de fermeture imperméable aux bactéries mais perméable aux gaz qui ferme normalement ladite ouverture;(c) un compartiment interne imperméable aux gaz et aux liquide s, normale-10 ment fermé et ouvrable par pression, qui contient un milieu nutritif aqueux capable, avec incubation, de favoriser la croissance des micro-organismes viables lorsqu'ils sont en contact avec le milieu nutritif, ledit compartiment interne étant disposé étroitement à l'intérieur du compartiment externe de manière à s'ouvrir par dé-15 formation du compartiment externe pour permettre au milieu nutritif de venir en contact avec les microorganismes; et(d) un matériau détecteur contenu dans l'un au moins des compartiments et capable de subir un changement de couleur visible par suite de la croissance des micro-organismes. 20 2.- Appareil suivant la revendication 1, caractérisé en ce que le compartiment interne est constitué par une ampoule de verre frangible fermée. 3.- Appareil suivant la revendication 2, caractérisé en ce que le compartiment externe est un tube cylindrique transparent et déforma- 25 ble ayant une extrémité ouverte et pouvant recevoir étroitement l'ampoule de verre frangible précitée. 4.- Appareil suivant la revendication 3, caractérisé en ce que les mieroorganismes sont supportés par un support en forme de bande logé dans le compartiment externe, 30 5.- Appareil suivant la revendication 4, caractérisé en ce que l'élément de fermeture est une pellicule de polyéthylène fibreux. 6,- Appareil suivant la revendication 5, caractérisé en ce qu'il comporte un couvercle qui maintient normalement la pellicule fibreuse sur l'extrémité ouverte du tube, ledit couvercle comportant une 35 ouverture adjacente à ladite pellicule. 70 20496 -9- 2045855 T.- Procédé de vérification de l'efficacité d'un cycle de stérilisation ledit procédé consistant successivement à soumettre l'appareil indicateur défini en 1, à un cycle de stérilisation; à ouvrir le compartiment interne par déformation du compartiment exter-5 ne après achèvement du cycle de stérilisation pour amener le milieu nutritif aqueux en contact avec les mieroorganismes viables éventuellement survivants; et à faire incuber l'appareil dans des conditions favorables à la croissance des microorganismes viables.