FR 2001118 A1 19690926 FR 6901986 A 19690130 69 01986 i 2001118 La présente invention est relative à un procédé de production d'esters de sucres des acides gras, en particulier par fermentation, et plus particulièrement par fermentation à l'aide de microorganismes qui sont capables d'utiliser des hy-5 drocarbures. la demanderesse a constaté que des microorganismes capables de se développer grâce à l'utilisation d'hydrocarbures contiennent généralement des substances tensio-actives dans letus cellules ou à la surface de leurs cellules. De plus, 1'extrac-10 tion et l'identification de ces substances ont confirmé qu'elles sont des esters de divers sucres des acides gras. Les esters de sucres sont couramment utilisés comme agents tensio-actifs et dans diverses industriese Un procédé de fermentation permettant de produire des esters de sucres des acides gras, de façon peu 15 coûteuse et en peu de temps, est donc devenu une nécessité. La présente invention a pour objet : - un procédé de production d'esters de sucres des acides gras ; - un procédé de production d'esters de sucres des aci-0 des gras par fermentation, qui peut être mis en oeuvre d'une manière efficace et relativement simple ; - un procédé peu coûteux de production d'esters de sucres .des acides gras par fermentation, qui peut être mis en oeuvre avantageusement à l'échelle industrielle et qui permet 5 d'obtenir le produit recherché avec un rendement élevé ; - l'obtention dfesters de sucres des acides gras. Les caractéristiques et avantages de l'invention qui précèdent ainsi que d'autres apparaîtront au cours de la description qui va suivre et des revendications® 0 A la suite de recherches concernant la production de divers esters de sucres par fermentation à l'aide de microorganismes, en utilisant des matières de départ peu coûteuses, la demanderesse a constaté, conformément à la présente invention, que des quantités importantes d'esters de sucres des acides 5 gras sont obtenues et accumulées dans la liqueur de fermentation quand des microorganismes capables d'utiliser des hydrocarbures sont cultivés en aérobie dans un milieu nutritif a-queux. On peut utiliser une grande diversité de microorganismes dans la présente invention. Comme on l'a mentionné, les micro-0 organismes doivent être capables d'assimiler et d'utiliser les 69 01986 2- 2001118 hydrocarbures. A titre d*exemples de microorganismes convenant pour la mise en oeuvre de la présente invention, on peut citer les suivants : Arthrobacter paraffineus 5 Arthrobacter roseouaraffinus Arthrobacter hvdrocarboclastus Arthrobacter simplex Brevibacterium ketoglutamicum Micrococcus paraffinolyticus 10 • Corynebacterium hvdrocarboclastus Oorynebacterium p3eudodiphtheriticum Corynebacterium fascians Mycobact erium smegmatis Candida lipolvtica 15 Aspergillus oryzae Ainsi que le montre la liste qui précède, les microorganismes qui produisent et accumulent des esters de sucres des acides gras, en utilisant des hydrocarbures comme source de carbone, appartiennent à des genres et à des familles d'une nature 20 très diverse. Les souches utilisées dans la présente invention peuvent être cultivées dans un milieu de culture synthétique aussi bien que dans un milieu nutritif naturel, à condition que le milieu choisi contienne les éléments nutritifs essentiels pour le 25 développement de la souche choisie. De tels éléments nutritifs sont bien connus dans la technique et comprennent des substances telles qu'une source de carbone, une source d'azote, des composés minéraux et des produits analogues qui sont utilisés par le microorganisme en des quantités appropriées-30 Conformément à la présente invention, la fermentation a lieu dans un milieu nutritif aqueux contenant un hydrocarbure ou un mélange d'hydrocarbures comme source de carbone principale. Les hydrocarbures de ce genre comprennent des paraffines à chaîne droite ou à chaîne ramifiée (alcanes) ayant 6 à 25 35 atomes de carbone, comme le n-hexane, le n-octane, le n-décane, le n-dodécane, le n-hexadécane, le n-éicosane, l'isooctane, etc.. des cycloparaffines telles que le cyclohexane, et le cyclooctane, des oléfines à chaîne droite et à chaîne ramifiée, telles que l'hexène-1, l'octène-l^octène-S, etc... des cyclooléfines 40 telles que le cyclohexène, des hydrocarbures aromatiques tels 69 01986 3 2001118 •que le benzène, les xylènes isomères, etc.,et leurs mélanges, et des hydrocarbures dérivés du pétrole, tels que le kérosène, les huiles légères, les huiles lourdes, les huiles paraffiniques, etc. Outre l'hydrocarbure, le milieu de fermentation peut conte-5 nir de petites quantités d'autres sources de carbone, telles que des hydrates de carbone, comme par exemple le glucose, le fructose, le maltose, le saccharose, l'amidon, un hydrolysat d'amidon, la mélasse, etc.. ou de n'importe quelle autre source de carbone appropriée, telle que des acides organiques, comme par 10 exemple l'acide acéiique, l'acide lactique, etc. On peut également utiliser ces substances isolément ou sous forme de mélanges contenant deux ou plus de deux substances de ce genre. Comme source d'azote, on peut utiliser divers genres de sels ou composés minéraux ou organiques, tels que l'urée, l'am-15 moniaque liquide ou des sels d'ammonium tels que le chlorure d'ammonium, le sulfate d'ammonium, le nitrate d'ammonium, l'acétate d'ammonium, le phosphate d'ammonium, etc.., ou encore des substances naturelles contenant de l'azote, comme la liqueur de macération du maïs, un extrait de levure, un extrait de vian-20 de, la peptone, la farine de poisson, le bouillon, les hydroly-sats de caséine, un acide aminé de la caséine, les matières so-lubles du poisson, un extrait d'enveloppes de grains de riz, etc. De nouveau, on peut choisir une seule de ces substances ou un mélange de deux ou plus de deux d'entre elles. 25 Les composés minéraux qu'on peut ajouter au milieu de culture comprennent le sulfate de magnésium, le phosphate de sodium, le phosphate monopotassique, le phosphate dipotassique, le sulfate de fer, le chlorure de manganèse, le chlorure de calcium, le chlorure de sodium, le sulfate de zinc, etc0 30 En outre, dans le cas de certaines souches, il peut ô- tre également nécessaire d'ajouter certains éléments nutritifs essentiels au milieu de culture, comme par exemple des acides a-minés tels que l'acide aspartique, la thréonine, la méthionine, etc.., et/ou des vitamines, par exemple la biotine, la thiamine, 35 la cobalamine et des vitamines analogues. Quand on cultive un microorganisme conformément à la présente invention, on stérilise le milieu de fermentation et on inocule ensuite le microorganisme choisi. On conduit la culture dans des conditions aérobies, par exemple en secouant la culture 40 QD aérobie ou bien en agitant et en aérant une culture submergée, 69 01986 4 2001118 à une température comprise par exemple entre environ 25 et 40°C et à un pH compris par exemple entre environ 4 et 9. Pendant la culture, on ajuste le pH à une valeur comprise dans l'intervalle indiqué (de préférence à une valeur de 6 à 8) en ajoutant, par 5 exemple, une solution d'urée, une solution d'ammoniaque ou une solution de carbonate d'ammonium, la fermentation est habituellement terminée en deux à cinq jours. Dans la pratique, on considère que la fermentation est terminée lorsque la quantité totale mesurée des esters atteint une valeur maximale. 10 esters de sucres des acides gras obtenus s'accu mulent en majeure partie dans la couche huileuse de la liqueur de fermentation. De ce fait, lorsque la fermentation est terminée, on élimine la partie aqueuse de la couche inférieure de la liqueur de fermentation en laissant cette dernière reposer dans 15 une pièce froide ou en faisant appel à une séparation centrifuge. On ajoute un mélange ( 1 : 1) de chloroforme et de métha-nol à la couche supérieure pour en extraire la totalité des lipides. On chasse le solvant à 40°C sous pression réduite et on récupère ensuite la partie huileuse de la couche supérieure par 20 séparation centrifuge. On fait passer à travers une colonne de gel de silice la couche huileuse ainsi obtenue et on élue cette colonne avec de l'hexane pour en éliminer les n-paraffines. Ensuite, on chasse les composés polaires par élution avec du chloroforme. Pour récupérer les esters de sucres des acides 25 gras, on procède à une élution avec une solution constituée par un mélange de chloroforme et de méthanol, on réunit les fractions respectives, on chasse le solvant, on ajoute de l'acétone froide et on réunit les précipités résultants qu'on purifie finalement avec de l'acétone. 30 exemples suivants sont donnés uniquement à titre illustratif et non limitatif de la portée de l'invention. Sauf mention contraire, les pourcentages s'entendent en poids par litre de liqueur de fermentation. Bien qu'on mentionne des souches particulières de microorganismes à titre d'exemple, il est 35 bien entendu qu'on peut utiliser n'importe quel autre microorganisme ou mutant possédant les propriétés décrites ci-dessus. Exemple 1 On cultive le microorganisme Arthrobacter paraffineus 40 ATCC 15591 dans un milieu d'ensemencement contenant 1 # d'ex— 6° 01986 5 2001118 trait de viande, 1 $ de peptone et 0,3 i° de chlorure de sodium, ce milieu étant au pH 7,2 avant la stérilisation, et on conduit la culture en secouant en aérobie pendant 24- heures. On inocule la culture d'ensemencement résultante, dans la proportion de 10$ 5 en volume, dans 3 litres d'un milieu de fermentation placé dans un récipient de fermentation d'une contenance de 5 litres et ayant la composition suivante : K2E2°a 0,2 £ MgS04 7H20 0,1 io MnSO^ , 4H20 0,002 $> EeS04 , 7H20 0,02 $> ZnSO^ , 7H20 0,001 i> CuCl4 , 2H20 1 mg/litre KH4N05 1 i° Liqueur de macération du maïs 0,1 # On exécute la culture à 30°C, tout en agitant, à une cadence de 600 tours/minute et en aérant avec de l'air stérile 20 introduit avec un débit de 1 litre/litre/minute pendant 80 heures. Au début de la culture, on ajoute au milieu de culture 600 ml d'un mélange de n-paraffines en e"t on ajuste le pH du milieu à 6,8 - 7,5 avec une solution d'ammoniaque» Lorsque la fermentation est achevée, on sépare 2,5 25 litres de la liqueur de fermentation par cëntrifugation, et on élimine par aspiration la partie hydrosoluble de la couche inférieure. On ajoute à la couche supérieure (0,4 litre) cinq fois son volume d'un mélange (1 : 1) de chloroforme et de mé-thanol. Après extraction accompagnée d'une agitation à la tem-30 pérature ambiante pendant 30 minutes , on filtre la couche supérieure. On lave le précipité, résultant avec le solvant susmentionné. On mélange le filtrat et la solution lavée et on a-juste leur volume à 3»2 litres. Ensuite, on chasse le solvant qui y est contenu à 40°C, sous pression réduite, puis on chauffe 35 la solution et on la sépare par centrifugation. On récupère la couche supérieure et on y ajoute du n-hexane.On dilue alors la solution résultante jusqu'à un volume de 250 ml et on la fait passer à travers une colonne de gel de silice (5»2 x 20 cm). Ensuite, on fait passer du n-hexane à travers la colonne pour en 69 01986 6 2001118 traîner les n-paraffines résiduelles. On fait alors passer du chloroforme à travers la colonne pour éliminer les substances non polaires. On recueille .les fractions (600 ml), on les élue avec un mélange (95 : 5) de chloroforme et de méthanol, on chasse 5 le solvant à 40°C sous pression réduite, on ajoute de l'acétone chaude pour dissoudre le mélange et on le laisse reposer dans une pièce froide, ce qui donne .un précipité se présentant sous forme d'un gel. Quand on répète le procédé de dissolution par l'acétone et de précipitation d'une façon similaire à celle 10 qu'on vient de décrire, on obtient 5,9 g d'une substance de couleur jaune pâle analogue à un gel. A la suite de divers essais d'identification, on constate que le produit obtenu est un mélange d'esters possédant une liaison ester par molécule de glucose et deux liaisons ester par 15 molécule de tréhalose, avec un acide gras supérieur (acide ar— thronique) possédant un groupe hydroxyle en p et une ramification en a . Ce produit est capable de disperser des mélanges d'eau et d'huile minérale ou "bien d'eau et n-paraffines d'une façon extrêmement efficace. 20 Exemple 2 On cultive le microorganisme Oorynebacterium hvdrocarboclastus ATOC 15592, dans le même milieu de fermentation et dans les mêmes conditions que dans l'exemple 1, à cette exception que la source de carbone est constituée par un mélange de 25 n-paraffines en On exécute la culture dans un réci pient de fermentation d'une contenance de 5 litres. Après 72 heures de culture, on traite 2,3 litres de la liqueur de fermentation résultante de la même manière que dans l'exemple 1. On obtient ainsi 0,65 litre d'une couche huileuse. On y ajoute 3° 4,5 litres d'un mélange (2 : l) d'éthanol et d'éther et, après avoir mélangé suffisamment, on filtre la solution. On chauffe à 40°C sous pression réduite 5,1 litres de la solution d'extraction de couleur jaune orange, pour en éliminer le solvant, et après avoir chauffé la solution résiduelle, on récupère la solu-35 tion transparente constituant la couche supérieure par centri-fugation. Ensuite, on exécute une chromatographie sur colonne de la manière décrite dans l'exemple lc On peut ainsi séparer,sous forme d'une substance unique, 3,6 g d'ester de tréhalose d'un acide gras, ayant pour formule expérimentale G20H41°2* °Q ol3"t:lea'' 4-0 en outre, 0,2 g d'un ester de glucose d'un acide gras. 69 01986 7 2001118 Exemple 3 On cultive le microorganisme Micrococcus epidermidis ATCC 155 dans un milieu de culture contenant 2 $ de sorbitol, 1 io de peptone, 1 fo d'extrait de viande et 0,3 $ de chlorure 5 de sodium, en secouant en aérobie pendant 24 heures et en utilisant comme source de carbone, un mélange de n-paraffines contenant des fractions en C12""C15, àe la man;i-®r0 décrite dans l'exemple 1. On inocule la culture d'ensemencement résultante, dans une proportion de 10 ft> en volume, dans un milieu de fer-10 mentation ayant la composition suivante : Kérosène 10 $ K2HP04 0,2 KH2P04 0,2 io 15" MgS04 , 7H20 0,1 * MnS04 , 4H20 0,005 % PeS04 , 7H20 0,01 io CuS04 , 5H20 1 mg/litre 20 (HH4)2S04 1 £ Liqueur de macération du maïs 0,1 # Ihiamine 20 ^ig/ litre On ajuste le pH de ce milieu à 7,5 (avant la stérâ- 25 lisation). On cultive le microorganisme en secouant la culture en aérobie à 30°C, dans un récipient de fermentation de 5 litres, cqnformément au procédé décrit dans l'exemple 1. On récupère et on purifie le produit par le procédé décrit dans 30 l'exemple 2. On obtient ainsi 6,3 g d'un mélange d'esters de sucres comportant la liaison ester du tréhalose comme sucre constitutif et 2 moles d'acidè arthronique. Exemple 4 On cultive le microorganisme Mycobacterium sp« ATCC 35 12297, à titre de microorganisme d'ensemencement, dans un milieu d'ensemencement préparé en ajoutant 5 $ de n-paraffines à un milieu d'ensemencement ayant la composition donnée dans l'exemple 2. On cultive ce microorganisme avec secousse en aérobie pendant 24 heures. On inocule la culture d'ensemencement 40 résultante dans le même milieu de fermentation que dans 69 01986 8 2001118 l'exemple 1, et on la cultive dans les mêmes conditions que dans ledit exemple, la fermentation est terminée après 4 jours et on récupère alors dans 1,6 litre de liqueur de fermentation, une quantité de 2,3 g d'ester de tréhalose d'un aiide monocarboxy-5 lique, ayant la formule expérimentale G^2^64°2* Exemple 5 On cultive le microorganisme Arthrobacter roseoparaf-finus ATCC 15584 pendant 72 heures, de la manière décrite dans l'exemple 3» Il se sépare de la liqueur de fermentation résul-10 tante 1,2 g/litre de diester de tréhalose de l'acide stéarique, 0,3 g/1 de monoester de glucose de l'acide arthronique et 1,3 g d'un mélange de mono- et tri-esters de saccharose avec l'acide stéarique. Exemple 6 15 On répète l'exemple 4 mais en utilisant le microorga nisme Micrococcus paraffinol.vticus ATCC 15582 comme souche d'ensemencement au lieu de Mycobacterium sp. ATCC 12297» ce qui permet de récupérer, dans 1,6 litre de la liqueur de fermentation résultante, 3,5 g de l'ester de tréhalose d'un acide mono-20 carboxylique, ayant pour formule expérimentale Qj2^64®2* Il est bien entendu qu'on peut apporter de nombreuses modifications à la description qui précède, sans sortir pour cela du cadre de la présente invention. 69 01986 9 2001118 R E- V ENDICATIONS 10 Procédé de production d'esters de sucres des acides gras, caractérisé par le fait qu'on cultive en aérobie un microorganisme assimilant les hydrocarbures et capable de produire lesdits esters, au sein d'un milieu nutritif aqueux contenant un hydrocarbure ou un mélange d'hydrocarbures comme sour ce de carbone principale, en laissant les esters des acides gras s'accumuler dans la liqueur de culture résultante® 2» Procédé conforme à la revendication 1, caractérisé par le fait que l'hydrocarbure précité est une n-paraffine ayant 6 à 25 atomes de carbone0 3o Procédé conforme à la revendication 1, caractérisé par le fait que l'hydrocarbure précité est le kérosène# 4« Procédé conforme à la revendication 1, caractérisé par le fait qu'on choisit le microorganisme parmi les genres Arthrobacter. Brevibacterium» Micrococcus. Corynebacterium. Mycobacterium, Candida et Aspergillus. 5. Procédé conforme à la revendication 1, caractérisé par le fait qu'on exécute la culture entre environ 25 et 40°C et à un pH d'environ 4 à 9« 6# Procédé conforme à la revendication 1, caractérisé par le fait qu'on récupère les esters d'acides gras dans la liqueur de culture obtenue. 7. Procédé conforme à la revendication 1, caractérisé par le fait que l'hydrocarbure est une n-paraffine ayant 11 à 18 atomes de carbone. 8. Procédé conforme à la revendication 1, caractérisé par le fait qu'on récupère les esters d'acides gras dans la couche huileuse de la liqueur de fermentation résultante. 9« Procédé conforme à la revendication 1, caractérisé par le fait que ledit microorganisme est 1'Arthrobacter paraffineus ATCC 15591. 10. Procédé conforme à la revendication 1, caractérisé par le fait que le microorganisme est le Corynebacterium hydrocarboclastus ATCC 15592. 11. Procédé conforme à la revendication 1, caractérisé par le, fait que le microorganisme est le Mycrococcus epidermidis ATCC 155. 12. Procédé conforme à la revendication 1, caractérisé par le fait que le microorganisme est le Mycobacterium. sp. 69 01986 10 2001118 ATCC 12297. 13. Procédé conforme à la revendication 1, caractérisé par le fait que le microorganisme est 1'Arthrobacter rose-oparaffinus ATCC 15584. 14. Procédé conforme à la revendication 1, caractérisé par le fait que le microorganisme est le Micrococcus paraff inol.vticus ATCC 15582.