FR 2007277 A1 19700102 FR 6913188 A 19690425 69 13188 1 2007277 La pfésente invention concerne un procédé pour la préparation d'amyloseBà chaines longues et d'amylosesà chaines courtes à partir de l'amidon. L'amylopectine, le constituant principal de l'amidon, est en 5 général obtenue aisément à l'état relativement pur, sous la forme d'amidon glutineux de riz ou de blé. Quant à l'amylose pure, elle ne se trouve pas à l'état naturel libre, et son obtention présente des difficultés, parce que sa teneur dans les différents amidons est limitée. Au cours des dernières aimées, des tentatives, quel-10 quefois industrielles, ont eu lieu en vue de la séparation de l'a-mylopectine et de l'amylose de l'amidon. Cette tendance coïncide avec l'introduction sur le marché de variétés de maïs riche en amy-lose. Les méthodes de préparation d'amylose, à partir de l'amidon, 15 appliquées ou signalées jusqu'à présent, mettaient à profit invariablement les différences qui existent entre la structure moléculaire de l'amylose et celle de l'amylopectine. Parmi ces procédés, celui de SCHOCK consiste à former un complexe entre l'amylose, un alcool ou un acide aliphatique, et séparer ainsi, par précipitation, 20 l'amylose de l'amylopectine. Un autre prodédé utilise la précipitation fractionnée de ces deux substances dans une solution aqueuse de sulfate de magnésium. On a également appliqué la précipitation de l'amylose à partir d'un gel d'amidon, sous l'effet d'une force hydro-dynamique ou par vibration aux ultrasons. Une autre méthode 25 connue réside dans la précipitation fractionnée des deux substances à partir d'une solution aqueuse, sans adjuvantt Ces méthodes de l'art antérieur procèdent toutes par séparation d'amylose et d'amy-lopectine, toutes deux de haut poids moléculaire, telles quelles, et pour cela, elles n'ont pas permis une séparation vraiment pous-30 sée et l'obtention des deux substances à 15état de grande pureté. La présente invention permet, au contraire, de séparer aisément l'amylose de l'amidon et de l'obtenir à l'état très pur, sous la forme de chaines. longues et courtes. Le procédé suivant l'invention consiste à décomposer l'amylopes-35 tine de l'amidon par l'action de 1'alpha-glucosidase-1,6 en dextri-ne à chaines droites, de bas poids moléculaire, c'est-à-dire en amylose à chaines courtes, et à séparer ensuite par fractionnement les grosses molécules d'amylose présente initialement des petites molécules formées, autrement dit, les longues chaines d'amylose 40 des chaines courtes. 13188 2 2007277 Comme décrit dans la demande de brevet français du 1er Avril 1969, sous le titre "Procédé de préparation d'amyloses à bas jsii moléculaire" (Société dite Hayashibara Company), l'amylopectia^ peut être scindée par l'action de l'alpiha-giucosidase-1,6 profitai 5 par des bactéries telles que Pseudomonas, Aerobacter, et en particulier par des souches d'Escherichia intermedia ATCC 21073, Lsiis.-bacille plantarum ATCC 8008, Micrococcus lysodeikticus l£Ék SSï" ., Nocardia corallina ISO 3338, Azotobacter niai eus, Bacille.' eesœss. Erwinia aroideae, Agrobacter tumefaciens, Leueonostoc citçov^s-Ha» 10 Mycobacterium phlei, Pediococcus acidilactici, Sarcina laÉea-ratia plymuthica, Staphylococcus aureus, Streptococcus fasecali^, etc. Tout spécialement, les enzymes du lactobacille et e résistant à la chaleur,peuvent avantageusement décompose^ I^s eo;-^ tions d'amidon à des températures assez élevées de 50 à 6Q*k» -15 en évitant la rétrogradation de l'amidon. - « 4.- Le mode opératoire de la culture des souches, utilisé suivant la présente, invention, et l'obtention des enzymes utiles^Sfii^ Sï-crits ci-après. Le pseudomonas amyloderamosa ATCC 21262 était cultivëSâ&ns 20 milieu contenant 2% de maltose, 0,2% de glutamate de soc^ffife, ? de phosphate/îâonopotassîq^é et M, ol%^âeS®uî^ate de magnésie:. '. molécules d'eau. Le milieu était d'abord stérilisé, puis avec la bactérie, et la souche était cultivée avec agitation, : pendant 120 heures. Alors le liquide de la culture était 'fia 25 mycellium par ultra-centrifugation, puis dilué à une «mca^^^ion de 75% avec de l'acétone, pendant qu'il était refroidi en l\ précipitation de l'enzyme produit. L'enzyme était ensuite par centrifugation, congelé et séché sous vide jusqu'à conaisfc*?^ pulvérulente. - 30 L'Escherichia intermedia ATCC 21073 était cultivé souët cousses de 125 t/min., après l'ensemencement de 100ml d'un'L dans une coupelle en platine ; le milieu contenait 0,5% 0,8% de peptone et 0,5% de nitrate de sodium. Après 48 heures, à 30°C, le liquide de la . culture était séparé du mycellium isbp 35 fugation et précipité par l'addition de sulfate d'amrooniwsEi • . concentration de 15 à 48%. Le précipité, contenant 1 ' enzp»^ ,v^ séparé et séché. ' Dans le cas d'une souche de Lactobacille, ce dernier é€ tivé au repos à 30°C, pendant 2 à 4 jours, dans un milieu ec; 40 1% de peptone, 0,5% d'extrait de levure, 0,1% de phosphate .BAD0RK3INAL 69 13188 3 2007277 sique, 0,05% NaCl, 0,05% de MgS047H20, 0,001% de FeSO^^O, 0,0002% de MnSO^HjO, 0,7% d'amidon liquéfié et 0,5% de maltose. Le Micrococcus était inoculé à 100ml, de pH7, d'un bouillon contenant 1% de maltose, 0,5% de peptone, 0,25% d'extrait de levure 5 0,2% d'urée, 0,2% d'extrait de viande, 0,1% de K^HPO^, '0,05% de KCL et 0,05% de MgSO^H^O. Après une journée de culture en tube incliné, . le liquide était transféré dans un récipient de 20 litres sur une machine à secousses, et la culture était continuée sous aération, avec secousses d'environ 200 t/min., à 30°C pendant 3 jours. 10 Pour les Nocardia et autres souches, la culture à lieu dans un fermenteur à secousses, sur un milieu contenant 1% de peptone, 0/5% d'extrait de levure, 0,1% de KHPO^, 0,05% de NaCL, 0,05% de MgS047H20, 0,001% de FeS047H20 et 1,4% d'amidon liquéfié à 26°C pendant 3 jours. 15 Les cultures provenant des lactobacilles et des micrococcus, obtenues comme indiqué plus haut, étaient centrifugées, les bactéries étaient lavées à l'eau pure, et ensuite mises en suspension dans une solution tampon à pH7, contenant 0,1% S.D.S., puis soumises à l'autolyse avec secousses à 30°C, pendant 2 jours y après 20 une nouvelle séparation centrifuge, on effectuait la précipitation avec du sulfate d'ammonium saturé à 0,8. Les précipités, ainsi Obtenus, étaient redissous dans l'eau, dialysés avec l'eau pendant une journée et centrifugés. Les solutions, ainsi obtenues, étaient employées comme enzymes dans la mise en oeuvre de la présente in-25 vention. Dans le cas des Nocardia et autres, les opérations étaient les mêmes jusqu'à la précipitation au sulfate d'ammonium : à partir de là, l'enzyme était séparé par centrifugation. Le degré de polyatérisation des amyloses de bas poids moléculai-30 re, obtenues par la décomposition suivant l'invention, est de l'ordre de 18 à 25 ou moins, contre environ 700 à 1 000 pour l'amylose naturelle. Cette différence est mise à profit, conformément à la présente invention, pour réaliser le fractionnement des amyloses ; on arrive ainsi à fractionner, sans difficultés, des amyloses de 35 structures similaires. Le mode opératoire général, dans la mise en pratique de l'invention, comprend d'abord la dispersion de l'amidon. Etant donné que l'amidon est oxydable et décomposable aux températures élevées, des précautions convenables doivent être prises. A 100°C, il est 40 recommandable d'utiliser un appareillage hermétique, travaillant 69 13188 4 2007277 en continu, sous atmosphère de gaz inerte, par exemple, de bons résultats sont obtenus avec un agitateur à lames multiples, à chauffage continu, décrit dans le brevet japonais n° 426 978, l'amidon étant chauffé sous agitation dans un récipient complètement fermé, 5 à 100°C, en vue de ses gélatinisation et dispersion. La seconde opération est la décomposition de l'amylopectine par l'action de l'alpha-glucosidase-1,6 ; pour cela, la solution d'amidon dispersée doit être refroidie à 45°C, température optimale pour l'action en-zymatique. Comme la solution reste fortement visqueuse à 45®C, et 10 rétrograde avec le temps, elle doit être refroidie et mélangée avec l'enzyme, instantanément ; un moyen pour réaliser cela consiste à introduire à la fois l'amidon gélatinisé et la solution d'enzyme, à l'état atomisé, en haut d'un réfrigérant à vide, de façon à mélanger intimement les deux liquides, et en même temps refroidir le mé-15 lange à 45°C. La solution, mélangée de cette manière, est alors introduite dans une grande masse de liquide de décomposition, dans un bac de stockage et mélangée par agitation. Il en résulte une décomposition et une chute de la viscosité, sans qu'il y ait temps pour la rétrogradation. Ainsi 1 'BJBylopectine seule est décomposée en d» 20 trine à chaines droites ou amylose de bas poids moléculaire. Le poids moléculaire de cette amylose est plusieurs dizaine* de fois plus bas que celui de l'amylose naturelle. La troisième phase opératoire consiste à fractionner le mélange en amylose naturelle ■ (chaines longues) et amylose de bas poids moléculaire (chaines coue-25 tes) par différence de leur poids moléculaire ; cela peut être effectué par une des voies suivantes. (I) Un premier procédé consiste à effectuer la précipitation fractionnée en solution aqueuse. Alors que la solubilité de l'amylose à chaines longues ne dépasse pas 0,1% à la têmpéréture ordinaire, 30 celle des molécules ne présentant qu'un degré de polymérisation de 18 à 25, c'est-à-dire amylose à chaines courtes, est généralement d'environ 1 à 5% à 10®C et 5 à 13% à 40°C. Ainsi, si un amidon de céréale ou de pomme de terre, ou similaire, contenant 75 à 80% d'amylopectine,en solution aqueuse à 10%, est soumis à l'action 35 de l'a-glucosidase-1,6, la concentration en amylose à chaines courtes est d'environ 8% dans la solution résultante ; cette amylose précipite lentement aux températures voisines de 40°C ; donc pratiquement, lorsque la décomposition de l'amidon a lieu à 45°C il n'y a pas de précipitation d'amylose de bas poids moléculaire. Il en 40 résulte qu'à partir de la solution réactionnelle seule l'amylose 69 13188 5 2007277 à chaines longues, c'est-à-dire à haut poids moléculaire précipite; elle peut être isolée par centrifugation et lavages répétés avec de l'eau. La solution restante est concentrée jusqu'à 10%, et maintenue à une température ne dépassant pas 5°C : dans ces conditions 5 la majeure partie de l'amylose à chaines courtes précipite. Cette amylose est purifiée par lavages à l'eau froide du précipité obtenu. Par concentration sous vide ou atomisation de la solution restante, on arrive à récupérer la totalité de l'amylose. (IX) Un autre procédé réside dans la précipitation au butanol. Dans 10 ce cas on ajoute 4 à 7% de butanol-1 à une solution résultant de la décomposition enzymatique. La solution est homogénéisée par chauffage, et refroidie lentement pendant 20 heures. Il se produit alors une précipitation sous l'effet du butanol, lé précipité peut être séparé par centrifugation, et purifié par recristallisation. 15 Pour assurer une séparation complète des deux types d'amylose, il est important d'éviter un exès de butanol, et de régler la température de refroidissement aux environs de 40®C, évitant ainsi le dépôt d'amylose à courtes chaines. (III)Un des procédés, applicable également, consiste à effectuer 20 la précipitation par l'adjonction d'un sel minéral, notamment de sulfate de magnésium. On ajoute en particulier 10% de ce sel à une solution de décomposition glucosidasique de l'amidon à 10%. Le mélange est chauffé à environ 90°C, puis refroidi lentement jusqu'à 40°C, pour laisser précipiter l'amylose. Le précipité est séparé 25 et lavé plusieurs fois, jusqu'à l'élimination complète de sel. La solution restante est concentrée, refroidie et précipitée ; le précipité est séparé et recueilli, (IV) Il est également possible d'utiliser le procédé qui consiste à chauffer vers 70° à 80°C la solution réactionnelle, sans aucune 30 adjonction, et provoquer la cristallisation et la précipitation des amyloses cherchées par l'action des ultra-sons. Comme on voit les amyloses de poids moléculaires très différents peuvent être séparées par cristallisation fractionnée de leurs solutions aqueuses, éventuellement avec l'adjonction d'un 35 alcool ou d'un sel, ou par une action sonique. Il est éventuellement possible d'avoir recours à l'ultra-centrifugation. Ainsi l'invention permet-elle ltobtention aisée d'amyloses naturelles sous la forme de substances de bas poids moléculaire avec une distribution régulière et uniforme des longueurs de chaines, ce qui pouvait 69 13188 6 2007277 être difficilement réalisé jusqu'à présent. L'invention est illustrée par les exemples non limitatifs qui suivent. EXEMPLE 1 5 Une suspension aqueuse à 15% d'amidon de maïs purifié, de pH 5 à 6, est passée par une colonne à agitateur à lames multiples, et portée à 100°C par injection de vapeur, ainsi gélatinisée sous agitation. La concentration de la solution gélatinisée est ramenée à 10%, avec le même pH, et la solution est injectée dans un réfrigé-ÎO rant à vide, pour être refroidie rapidement à 50°C. En même temps, une solution d'a-glucosidase, produite par de l'Aérobacter, est injectée dans le réfrigérant à raison de 50 unités par gramme d'amidon ; elle est rapidement et intimement mélangée avec la solution gélatinisée. Le mélange refroidi est immédiatement versé dans une 15 cuve de décomposition, où il est maintenu à 45°C sous agitation. Après une heure de séjour dans la cuve, le mélange est introduit en continu dans le réacteur principal, dans lequel il reste environ 40 heures à 45°C. Lorsque la précipitation commence, le mélange réactionnel est chauf-20 fé à 80°C pendant 10 à 15 minutes, après quoi, le précipité formé (I) est séparé par centrifugation et lavé à l'eau froide. La solution restante est lentement refroidie de 80°C à 50°C sous agitation durant 20 à 40 heures ; le précipité (II), qui se forme alors, est centrifugé et lavé deux fois à l'eau froide. Les deux précipités 25 (I) et (II) sont déshydratés et mis sous la forme de solides secs. D'autre part, le liquide restant est refroidi à 5°C et agité pendant 12 heures de façon-à donner un précipité d'amylose à chaines courtes, qui est ensuite centrifugé et lavé à l'eau froide. Les eaux-mères résultantes sont concentrées sons vide et le résidu ob-30 tenu est séché. Les précipités (I) et (II) sont constitués par de l'amylose à chaines longues, d'un degré de polymérisation de 750 et leur rendement ressort à 20 %. Par contre, le précipité secondaire est constitué par de l'amylose 35 à chaines courtes, d'un degré de polymérisation de 30, et il est obtenu avec un rendement de 65%. Quant au résidu, formant un rendement de 10%, il correspond à un degré de polymérisation de 20. EXEMPLE 2 Jusqu'à la précipitation, les opérations sont conduites comme dans l'exemple 1, sauf que la gluco'sidase provient de l'action de l'Es- 69 13188 7 2007277 chérichia. A sa sortie du réacteur principal, la solution est amenée à 50°C, ce qui donne lieu au précipité (I), que l'on sépare par centrifugation. Le liquide restant est refroidi lentement à 5°C ; il se 5 forme alors un précipité (II). Chacun des précipités est lavé séparément à l'eau et séché sous vide ou par pulvérisation. La solution finale,réunie aux eaux de lavage, est concentrée sous vide, puis séchée par pulvérisation, ce qui donne un produit solide (III). lO Le précipité (I) est une amylose de haut poids moléculaire, tandis que les produits (II) et (III) sont des amyloses à bas poids moléculaire ; les rendements en les trois produits sont respectivement de 17%, 63%, èt 15%. EXEMPLE 3 15 La même solution d'amidon liquéfié qu'à l'exemple 1 est pulvérisée dans un réfrigérant à vide pour y être rapidement refroidie à 70°C. Son pH est 6. On lui ajoute en continu de la glucosidase, provenant du Lactobacille ou du Nocardia, à raison de 40 unités par gramme d'amidon. 20 La solution homogène est agitée dans une cuve primaire à 60°C, durant une demi-heure à une heure ; de là elle est transférée en continu dans le réacteur principal, où la réaction a lieu à 55®C pendant 45 heures. La séparation, effectuée comme dans l'exemple 2, conduit de mène 25 aux trois sortes de produits, (I), (II) et (III) de degrés de polymérisation et avec des rendements comparables à ceux de cet exemple. EXEMPLE 4 Des enzymes ont été préparés à partir de cultures des diverses bactéries, citées dans la présente description, autres qu'Aérobacter, 30 Pseudomanas, Nocardia et Lactobacillus, par relargage au sulfate d'ammonium, suivi de dialyse. Leur utilisation suivant le mode opératoire de l'exemple 1 a donné sensiblement les mêmes résultats. EXEMPLE 5 Une suspension aqueuse de fécule de pomme de terre à 10%, de pH 5, 35 est gélatinisée et dispersée comme dans l'exemple 1. Le pH est ensuite ramené à 4,5 , la suspension est refroidie et additionnée d'enzyme, obtenu à partir du Pseudomonas, à raison de 50 unités par gramme de fécule. La réaction a lieu à 45°C ; le précipité (I), formé en 30 heures, est séparé par centrifugation et lavé à l'eau. La 69 13188 8 2007277 solution restante est refroidie à 50°C et laissée au repos pendant 12 heures il se forme alors un précipité (II) que l'on sépare comme le précédent. Les eaux-mères obtenues sont concentrées et sé-chées par atomisation. 5 On recueille ainsi 90% de matières dont les degrés de polymérisation P et les rendements R sont î P R& Précipité (I) -amylose à chaines longues 850 15 (II)- " " courtes 35 35 10 Résidu sec 25 40 EXEMPLE 6 A ÎOOO ml de la solution d'amidon décomposé par voie enzymatique, suivant l'exemple 5, on ajoute 55 ml de butanol-1. Le tout est chauffé à 85°Cet homogénéisé sous agitation, puis refroidi à 40*C 15 en 30 heures. Le premier précipité déposé est séparé, soigneusement lavé à l'eau, et séché. A la solution résiduelle on rajoute 10 ml de butanol, et l'on refroidit le mélange à 5°C ou plus bas, ce qui produit un nouveau précipité ; celui-ci est séparé et lavé comme le précédent. Les 20 poids en grammes(g) et degrés de polymérisation (P) des produits obtenus sont respectivement : 3 P Premier précipité 750 Second précipité 31 25 Résidu 20 EXEMPLE 7 A ÎOOO ml de la solution de l'exemple 5, après décomposition, on ajoute 100 g de sulfate de magnésium, et le mélange est porté à 90°C. Après refroidissement à 40°C, on a recueilli au bout de 24 30 heures 12 g d'amylose naturelle. La solution restante est concentrée à 10%, puis elle est refroidie et centrifugée après 12 heures. Les précipités, ainsi obtenus, sont lavés à l'eau jusqu'à élimination du sel : ils sont constitués respectivement par des amyloses à longues et à courtes chaines de haute pureté. 35 EXEMPLE 8 La solution décomposée de l'exemple 5 est amenée à une concentration de 12% ? pendant qu'elle subit un refroidissement à partir de 85°C, on la soumet à l'action d'ondes ultra.-sonores. Cela permet d'abréger de plusieurs heures la durée de la précipitation. Après 69 13188 9 2007277 refroidissement à 40°C, pendant 3 heures, on obtient 10% d'amylose à longues chaines et 60% de chaines courtes. 69 13188 10 2007277 REVENDICATIONS 1. Procédé pour l'extraction d'amyloses de l'amidon, qui consiste à scinder l'amylopectine de l'amidon, par l'action de l'a-gluco-sidase-1,6 , en amyloses à chaines courtes, et à séparer ensuite les amyloses à longues chaines, existantes, des amyloses à chaines courtes. 2. Procédé suivant la revendication 1, caractérisé en ce que la séparation des deux sortes d'amyloses met à profit leur différence de solubilité, les amyloses à longues chaines étant précipitées de préférence entre 40° et 90®C, les amyloses à chaines courtes à ou au-dessous de 5°C. 3. Procédé suivant la revendication 1 ou 2, caractérisé en ce que, après la précipitation des deux sortes d® amyloses, les eaux-stères restantes sont concentrées et une nouvelle fraction d*amyloses à chaines courtes est précipitée à basse température. 4. Procédé suivant une des revendications 1 à 3, caractérisé en ce que la séparation est réalisée par précipitation fractionnée en présence d'un alcool, notamment du butanol-1. 5. Procédé suivant une des revendications 1 à 3, caractérisé en ce que la séparation est réalisée par précipitation fractionnée en présence d'un sel, notamment le sulfate de magnésium. 6. Procédé suivant .jptff'-âlHi^jccr^ttxidicatiôns 1 à 5, caractérisé en ce que la séparation par précipitation fractionnée est accélérée par l'action d'ondes ultra-sonores. 7. Procédé suivant une des revendications 1 à 6, caractérisé en ce que ladite glucosidase provient d'une culture de bactétitS Esche-richia, Lactobacillus, Micrococcus, Nocardia, Azotobacter, Bacil-lus, Erwinia, Agrobacterium, Leuconostoc, Mycobacterium, Pedio-coccus, Sarcina, Serratia, Staphylococcus, Streptococcus, ou Pseudomonas. 8. Procédé suivant une des revendications 1 à 6, caractérisé en ce que l'enzyme employée est résistante à la chaleur, et la suspension de l'amidon liquéfié est maintenue entre 60* et 70*C environ, avec un pH de 5 à 7, le mélange étant maintenu à environ 45° à 55*C après l'addition de l'enzyme. 9. Procédé suivant la'revendication 8, caractérisé en ce que la glxt-cidase provient du Pseudomonas, et l'amidon est à un pH de 3 à 5,5.