FR 2003971 A1 19691114 FR 6906993 A 19690312 69 06993 2003971 la présente invention se rapporte à un procédé de production de L-lysine et plus particulièrement à un procédé de production de L-lysine par fermentation» Encore plus particulièrement, le procédé de production de L-lysine par fermentation conformément à la présente invention utilise de l'alcool éthylique comme substrat» la L-lysine est un aminoacide extrêmement précieux à titre d,aminoacide essentiel. Des procédés de production de l-lysine par fermentation étaient déjà connus dans la technique antérieure. Toutefois, aucun d'entre eux ne mentionne ou ne suggère de produire la l-lysine à partir d'alcool éthylique (éthanol) comme substrat. Un tel procédé serait extrêmement avantageux, car 1*alcool éthylique est obtenu à peu de frais dans l'industrie du pétrole et on peut facilement le manipuler dans un procédé de culture. De plus, l'alcool éthylique présente l'avantage d'être soluble dans l'eau, contrairement à des substances telles que les hydrocarbures qui sont insolubles dans l'eau, et il peut être largement utilisé par divers microorganismes. Compte tenu de ce qui précède, la demanderesse a cherché à mettre au point un procédé de production de l-lysine par fermentation dans lequel on utilise de l'alcool éthylique comme matière de départ, et les recherches en question ont permis de mettre au point la présente invention qui a pour objet s - un procédé perfectionné de production de l-lysine qui supprime les inconvénients et les insuffisances des procédés de la 25 technique antérieure ; - tin procédé de production de l-lysine par fermentation peut être mis en oeuvre d'une manière efficace et relativement simple ; - un procédé de production de l-lysine par fermentation, qui peut être mis en oeuvre avantageusement à l'échelle industrielle, 30 à peu de frais, pour donner un rendement élevé du produit î - l'obtention de l-lysine. les caractéristiques et avantages de la présente invention qui viennent d'être mentionnés apparaîtront aux techniciens à la lecture de la description et des revendications qui vont suivre. 35 En étudiant la production de L-lysine par culture de divers microorganismes dans des milieux de culture contenant de l'alcool éthylique comme substrat, on a constaté, conformément à la présente invention, que des bactéries appartenant aux genres Corvnebac-terium, Brevibacterium. Arthrobacter. Baciiius et Nocardia sont 40 capables de produire de la L-lysine à partir d'alcool éthylique avec 10 15 20 69 06993 2 2003971 des rendements excellents. Les microorganismes utilisés dans la présente invention sont donc des souches productrices de L—lysine appartenant à ces genres et qui sont capables d'assimiler l'alcool éthylique. 5 Les souches utilisées dans la présente invention peuvent être cultivées dans un milieu de culture synthétique aussi bien que dans ûn milieu nutritif naturel, à condition que le milieu choisi contienne les éléments nutritifs essentiels pour la croissance de la souche cultivée* De tels éléments nutritifs sont bien connus dans 10 la technique et comprennent des substances telles qu'une source de carbone, une source d'azote, des composés minéraux et des produits analogues, qui sont utilisées par le microorganisme en des quantités appropriées. Comme on l'a mentionné ci-dessus, l'alcool éthylique est utilisé dans le milieu comme source de carbone principale. 15 D'autres sources de carbone peuvent également être incorporées dans le milieu et comprennent des substances telles que, par exemple, des hydrates de carbone comme le glucose, le .fructose, le maltose, Je saccharose, l'amidon, l'hydrolysat d'amidon, les mélasses, le man.™ aose, le glycérel, etc..., ou n'importe quelle autre source de @a3r«= £© bm& appropriée telle que des aôides organiques, par exempls de acétique9 iEaoiëo laeti Comme source d'azote, on peui' utiliser divers genres de eolc; 25 ou composés minéraux ou organiques, tels que l'urée $ l9am©5a±as£s.o liquide oo. ûes sels d&amonium comme le chlorure d'ammon±0m9 le mj.---fate. d3aw':ûaluai9 1© nitrate d'ammonium, l'acétate d'ammonium, le •Jaosphate d'asanonium, le carbonate d'ammonium, etc..., ou des s®l>e=» 'riane©3 naturelles contenant de l'azote comme la liqueur de macéra— 30 tion du maïs, l'extrait de levure, l'extrait de viande, la peptone» la farine de poisson, le bouillon, les hydrolysats de caséine, l8a-cide aminé de la caséine, les matières solubles du poisson, un extrait d'enveloppes de grains' de riz, un gâteau de soja dégraissé, un hydrolysat ou diverses substances qui en sont tirées par diges-35 tion. Ces substances elles-mêmes peuvent être utilisées isolément ou sous forme d'un mélange comprenant un nombre quelconque d'entre elles. Les composés minéraux qu'on peut ajouter au milieu de culture comprennent le sulfate de magnésium, le phosphate de sodium, le 40 phosphate monopotassique, le phosphate dipotassique, le sulfate de 69 06993 2003971 fer» le chlorure de manganèse» le chlorure de calcium, le chlorure de sodium, le sulfate de zinc, le sulfate de manganèse, le carbonate de calcium, etc.*. Si la croissance du microorganisme utilisé dans le processus 5 de fermentation de la présente invention demande un élément nutritif particulier, celuit-ei doit être bien entendu ajouté au milieu nutritif s'il n'est pas déjà contenu, par exemple, dans les substances organiques azotées se trouvant dans le milieu. En outre, d'autres facteurs de croissance, tels que des aminoaeides, des vi-10 tamines comme la thiamine, la cobalamine, etc...» ou la biotine, peuvent également être ajoutés au milieu. On peut donc voir que la composition du milieu nutritif utilisé dans la présente invention est identique à celle du milieu généralement utilisé pour la production d'aminoaeides par fermentation. 15 l'alcool éthylique est introduit dans le milieu de culture au début de la culture ou pendant celle-ci, en une seule fois ou par portions, en une quantité qui ne freine pas la production de L-ly-sine* De préférence, la quantité d'alcool éthylique ajoutée au milieu est comprise entre 10 g/litre et 200 g/litre. 20 les conditions de culture sont les mêmes que celles qui sont habituellement utilisées dans les fermentations des aminoaeides. la culture est effectuée en aérobie, par exemple en secouant la culture en aérobie, ou bien en aérant et en agitant une culture submergée, à une température comprise par exemple entre 20 et 40°C et à un pH 25 compris par exemple entre environ 5,5 et 9,5. On obtient les meilleurs résultats en maintenant un pH sensiblement neutre (pH 7) pendant la culture. On exécute la culture dans les conditions précitées j"usqu'à ce que des quantités notables de L-lysine soient produites dans la liqueur de culture résultante, ce qui demande en général 30 30 à 150 heures. Lorsque la culture est terminée, on récupère la L-lysine dans la liqueur de fermentation d'une façon classique, par exemple par traitement avec une résine échangeuse d'ions, extraction avec des solvants, précipitation, absorption, chromatographie, concentration, 35 etc... Un procédé particulièrement approprié comprend un traitement par une résine échangeuse d'ions comme décrit dans l'exemple 1 ci-dessous. Les exemples qui suivent sont donnés uniquement à titre indicatif et non. limitatif de la portée de la présente invention. Sauf 40 mention contraire, les pourcentages s'entendent en poids par litre 69 06993 2003971 d'eau. Les souches de microorganismes mentionnées à titre d'exemple et avantageusement utilisées dans la mise en oeuvre de la présente invention sont décrites dans le présent exposé. EXEMPLE 1 5 Le microorganisme d'ensemencement choisi est Corynebacterium frintfwti rvnrn (Micrococous fflutami rms : brevet japonais n° 3698/57} ATCC 13287), qui est un mutant producteur de L-lysine. On inocule ce microorganisme dans une fiole conique de 250 ml contenant 20 i&l d'un milieu de culture (pH 7,4) ayant la composition suivante : 10 Alcool éthylique 15 ml/litre Urée 2,5 g/litre K2HP04 • 0,5 g/litre KH2K>4 0,5 g/litre MgSO^, 7H20 0,25 g/litre 15 PeSO^, 7H20 0,01 g/litre MnSO^, 4H20 0,01 g/litre Biotine Aminé N-Z (marque de fabrique d'un hydrolyeat caséine—enz ytï5 10 g/litre 20 Rouge phénol 0,02 g/litre. On cultive ensuite le nicroorganieme en secouant la cultœ?® en aérobie, à 30°C pendant 96 heures. Pendant cette culture, on te au milieu, par portion de 4 ml et à quatre reprises, un mêlas.;;® de 3 parties d'alcool éthylique et de 1 partie d'une solution d'uré® 25 à 50 % (volume/poids), le rouge phénol contenu dans la liqueur do culture virant au jaune. Lorsque la culture est achevée, la liq&ena» de culture résultante contient 8,4 mg de L-lysine par millilitrso Après avoir séparé les cellules de microorganismes de la liqueur cultivée, on fait passer 1,1 litre du filtrat résultant à 30 vers une résine échangeuse d'anions faiblement baf (Amberli";; IRC-50), amenée au préalable au pH 7 à l'aide d'uïxe solution tan^•: r. 0,5 M et on lave la colonne de résine avec de l'eau. On recueille des fractions contenant de la L-lysine après élution avec une se3.:ar-tion d'ammoniaque 0,15N, on concentre ces fractions sous pression 35 réduite, on règle leur pH à 4 et on les concentre de nouveau. On obtient ainsi 5,6 g de cristaux de monochlorhydrate de L-lysine. TîiTHMPLB 2 Le microorganisme d'ensemencement est Brevibacterium ammonla-genes ATCC 19350, qui est un mutant producteur de L-lysine. On exé-40 cute la culture dans les mêmes conditions et de la même manière que e>9 06993 2003971 dans 1*6X6111516 1, à cette exception qu'on ajoute 5 mg/litre de thia-inine au milieu de fermentation de cet exemple 1. La concentration de L-lysine dans la liqueur cultivée, lorsque la fermentation est achevée, est de 3,1 mg/ml. 5 EXEMPLE 3 Le microorgaaisme d'ensemencement est le mutant Bacillus megaterium Kï 8110 (Bac-11) ATCC 21029, producteur de L-lysine. On inocule cette souche dans une fiole conique contenant 20 ml du milieu de culture suivant : 10 Alcool éthylique 15 ml/litre (HH4)2S04 20 g/litre EgHPO^ 0,5 g/litre XH2P04 0,5 g/litre MgS04, 7H20 0,25 g/litre 15 . PeS04, 7H20 0,01 g/litre MnS04,4H20 0,01 g/litre . CaCOj 20 g/litre Biotine 15^ag/litr© Aalne HZ 10 g/litre 20 Acide méso-diaminopimélique 100 mg/litre Rouge phénol 0,02 g/litre On cultive le microorgauiisme en secouant la culture en aéro-Me à 30°G, pendant 96 heures. Pendant la culturs0 on matefeient le milieu à un pH sensiblement neutre en ajoutant un mélange de 3 25 parties d'alcool éthylique et de 1 partie d'une solution d'ammoniaque, par portion de 0,5 ml, avec virage au jaune du rsug® phénol. La concentration de L-lysine dans la liqueur de culture lorsque la fermentation est terminée est de 2,3 mg/ml. ronawPT.Te A 30 Dm souches productrices de L-lysine et provenant de diverses bactéries, came mentionné dans le tableau ci-après, sont utilisées comme microorganisaes d'ensemencement. On exécute la culture dans les mêmes conditions et de la même manière que dans l'exemple 3, à cette exception qu'on a obtenu le milieu de culture en éliminant 35 l'acide méso-diaminopimélique du milieu de fermentation de l'exemple 1. Les quantités de l-lysine accumulées dans la liqueur de culture résultante lorsque la fermentation est achevée sont données dans le tableau ci-dessous. 69 06993 2003971 TABLEAU Cfoantité de L-lysine obtenue (mg/ml) 2,1 Souches utilisées Arthrobacter -para-P-PiTuraH ATOO 21298 Nocardia sp. ATCC 21337 2,7 Il est bien entendu qu'on peut apporter de nombreuses modifications à la description qui précède sans sortir pour cela du cadre de la présente invention. 69 06993 2003971 - REVENDICATIONS - 1.- Procédé de production de L-lysine, caractérisé par le fait qu'on cultive un micro-organisme producteur de L-lysine et capable d'assimiler de l'alcool éthylique, qui appartient aux 5 genres Corynebacterlum. Brevibacterium. Arthrobacter. Bacillus ou Nocardia. en aérobie et au sein d'un milieu aqueux contenant de l'alcool éthylique comme substrat principal contenant du carbone, .après quoi, on laisse la L-lysine s'accumuler dans la liqueur de culture résultante. 10 2.- Procédé conforme à la revendication 1, dans lequel la culture est effectuée à une température d'environ 20 à 40°C et à un pH d'environ 5,5 à 9,5. 3.- Procédé conforme à la revendication 2, dans lequel le pH est maintenu à environ 7. 15 4.- Procédé conforme à la revendication 1, dans lequel on ajoute environ 10 à 200 g/litre d'alcool éthylique au milieu. 5.- Procédé conforme à la revendication 4, dans lequel l'alcool éthylique est ajouté au milieu au début de la culture. 6.~ Procédé conforme à la revendication 4', dans lequel l'al-20 cool éthylique est ajouté au milieu après le début de la culture. 7.- Procédé de production de L-lysine conforme à l'une quelconque des revendications précédentes, dans lequel on recueille la L-lysine dans la liqueur de culture. 8.- Procédé conforme à la revendication 1, dans lequel le 25 micro organisme est Corvnebacterium glutmn-lcum ATCC 13287» 9.- Procédé conforme à la revendication 1, dans lequel le microorganisme est Brevibacterium ammonl«gènes ATCC 19350. 10.- Procédé conforme à la revendication 1, dans lequel le fflicroorganisme est Bacillus megaterium ATCC 21029. 30 11«- Procédé conforme à la revendication 1, dans lequel le microorganisme est Arthrobaeter paraffineos ATCC 21298. 12.- Procédé conforme à la revendication 1, dans lequel le microorganisme est Nocardia sp. ATCC 21337.