FR 2006235 A1 19691226 FR 6911440 A 19690414 69 11440 1 2006235 La présente invention concerne un procédé de préparation de cellules de levure et/ou de produits de fermentation; ce procédé consiste à inoculer un milieu de culture contenant du méthanol comme principale source de carbone avec une souche de levure capable d'assimiler le 5 méthanol et de produire des cellules de levure et/ou des produits de fermentation, tels qu'aminoacides, acides organiques, nucléotides ou leurs dérivés; ce procédé consiste également à cultiver en aérobie le milieu inoculé de manière à produire des cellules de levure et/ou les produits de fermentation. 10 L'invention a pour objet un procédé de préparation avec un rendement élevé de cellules de levure et/ou des produits de fermentation en utilisant le méthanol comme source principale de carbone que l'on trouve dans le commerce à un prix raisonnable. On a déjà décrit jusqu'à présent un procédé de prépara-15 tion de cellules de levure et/ou des produits de fermentation dans un milieu de culture contenant une source de carbone, telle que hydrate de carbone, lessive ' ■ résiduaire sulfitique ou hydrocarbure, avec une souche de levures. D'après ce qui précède, la demanderesse a étudié un 20 procédé de préparation de certaines quantités de cellules de levure et/ou des produits de fermentation dans un milieu de culture contenant une source de carbone que l'on peut trouver facilement. Par conséquent, la demanderesse a découvert que certaines levures appartenant au genre Pichia, Hansenula ou Candida sont capables de pousser sur un milieu de culture contenant du 25 méthanol comme source principale de carbone et de produire des cellules de levure et/ou les produits de fermentation. Les levures qui conviennent à l'utilisation selon l'invention sont des souches du genre Pichia, Hanseiula ou Candida capables d'assimiler le méthanol et de produire des cellules de levure et/ou les 30 produits de fermentation à partir de ce méthanol une fois assimilé, par exemple Pichia pastoris CBS 704, Pichia haplophyla CBS 2028, Hansenula wickerhamii NRRL YB-4943 ou Candida parapsilosis IFO 0585. Les levures peuvent pousser de façon excellente sur des milieux de culture qui sont parfaitement classiques, sauf pour 1'utilisa-35 tion du méthanol comme source de carbone principale, et elles peuvent alors produire avec des cellules de levure dans le milieu de culture des amino-acides, tels que l'acide L-glutamique, la L-alanine, la L-valine, la L-lysine ou la L-thréonine, des acides organiques tels que l'acide 11440 2 2006235 o Les quantités habituelles de composés minéraux du phosphore, tels que PO^H^K, PO^HK^, PO^Na^ ou PO^HCNH^)^, doivent être présents. 15 On peut ajouter au milieu de culture les produits nutritifs organiques secondaires, tels que vitamines ou aminoacides, sous la forme de mélanges bruts, par exemple liqueur de trempage du maïs, peptone, extrait de viande, extrait de malt, extrait de levure ou Aji-éki qui est un hydrolysat de soja préparé par Ajinomoto Co., Inc. 20 On maintient en général le milieu à un pH faiblement acide ou à un pH neutre. Quand le pH du milieu diminue au cours de la fermentation, on peut ajouter pour maintenir un pH optimum des agents de neutralisation, par exemple carbonate de calcium, ammoniac, hydroxyde de potassium ou de sodium. 25 On réalise une culture aérobie en opérant habituellement à la température de 25 à 40°C, de préférence entre 27 et 34°G. La culture une fois terminée, on peut récupérer des cellules de levure par çentrifugation et/ou par filtration. On peut récupérer les produits de fermentation qui s'accumulent dans le bouillon de 30 fermentation par adsorption sélective sur des résines échangeuses d'ions convenables, ou encore on peut les cristalliser de manière connue à partir du bouillon. On peut résumer de la façon suivante les avantages de l'invention par rapport au procédé de culture classique, tel que fermenta-35 tion d'hydrocarbure, d'hydrate de carbone ou de lessive résiduaife sulfi-tique : 1) On prépare facilement le méthanol à l'échelle industrielle de manière économique selon un procédé de synthèse chimique organique. 11440 3 2006235 2) On récupère facilement du bouillon de culture les cellules de levure et/ou les produits de fermentation. 3) Les cellules de levure obtenues selon l'invention ne nécessitent pas de procédé de raffinage particulier parce qu'elles ne 5 contiennent pas de constituant de paraffine ou qu'elles n'ont pas d'odeur de pétrole puisqu'elles poussent sur un milieu méthanolique; elles diffèrent ainsi des levures qui poussent sur un milieu d'hydrocarbure. 4) Gomme les cellules de levure qui poussent sur un milieu méthanolique présentent de bonnes propriétés de parfum ou de goût, 10 il est facile de les utiliser dans l'alimentation de l'homme ou de l'animal. 5) Le rendement des cellules de levure par rapport à l'alimentation de méthanol est de 50% ou davantage. Les exemples suivants illustrent 1'invention sans 15 toutefois en limiter la portée. EXEMPLE 1 On part de 20 ml du milieu de base de pH 5,0 contenant 0,5% de N03NH4, 0,5% de PO^HCNH^, 0,2% de PO^K, 0,1% de S04Mg,7H20, 2 ppm de Fe ,2 ppm de Mn et 2 ppm de Zn , 0,02% de liqueur de trempage 20 du maîs et 2% de CO^Ca; on les verse dans un flacon à secousse de capacité 500 ml et on les stérilise (on procède à une stérilisation séparée du CO^Ca). On ajoute dans le flacon 1,5% de méthanol stérilisé en les faisant passer dans un filtre Seitz. On inocule le flacon avec Pichia pastoris CBS 704 que l'on a ensemencé au préalable sur un milieu de tranche de gélose con-25 tenant 1% d'extrait de levure, 1% d'extrait de malt, 0,5% de NaCl (pH 6,5), l'opération s'effectuant en 24 heures à la température de 31°C, et que l'on a cultivé en aérobie pendant 3 jours à la température de 31,5°C. On maintient le bouillon de culture à pH 5,0-6,5 par addition d'ammoniaque. La culture une fois terminée, on dissout le CO^Ca rési-30 duel dans le bouillon par addition de HC1. On lave deux fois à l'eau distillée les cellules de levure récupérées à partir du bouillon par centri-fugation et on les sèche ensuite à' la température de 105°C. On obtient 0,84 g des cellules séchées par 100 ml de bouillon. De plus, il s'accumule dans le liquide surnageant du bouillon de culture 100 mg/dl d'acide L-35 glutamique, 50 mg/dl de L-lysine et 50 mg/dl d'acide °( -cétoglutarique. Dans le milieu de base ne contenant pas de méthanol, on obtient 25 mg/dl des cellules séchées, mais on n'obtient pas d'aminoacides ou d'acides organiques. 11440 4 2006235 EXEMPLE 2 On inocule le même milieu que dans l'exemple 1 avec Hansenula wickerhamii NRRL YB-4943. On réalise la fermentation en opérant exactement selon le même procédé que dans l'exemple 1. Après 3 jours, on obtient 0,76 g/dl des cellules séchées. Il s'accumule dans le liquide 5 surnageant du bouillon de culture 150 mg/dl d'acide L-glutamique, 50 mg/dl de L-thréonine, 30 mg/dl d'alanine, 70 mg/dl d'acide citrique et des traces d'acide fumarique. Dans le milieu de base ne contenant pas de méthanol, on obtient 20 mg/dl des cellules séchées5mais on n'obtient pas d'aminoacides ni d'acides organiques. 10 EXEMPLE 3 Pichia haplophyla CBS 2028. On réalise la fermentation en opérant exactement selon le même procédé que dans l'exemple 1. Après 3 jours, on obtient 0,79 g/dl des cellules séchées. De plus, il s'accumule dans le liquide 15 surnageant du bouillon de culture 80 mg/dl d'acide L-glutamique, 50 mg/dl de L-valine et 50 mg/dl d'acide citrique. Dans le milieu de base ne contenant pas de méthanol, on obtient 22 mg/dl des cellules séchées,mais on n'obtient pas d'aminoacides ni d'acides organiques. de l'exemple 1, on réduit à 0,8% la quantité de méthanol dans la composition du milieu. Après 3 jours, on obtient à partir du bouillon de culture de Candida parapsilosis IF0 0585, 0,41 g/dl des cellules séchées et 30 mg/dl d'hypoxanthine. Dans le milieu de base ne contenant pas de méthanol, on 25 obtient 18 mg/dl des cellules séchées,mais on n'obtient pas d'hypoxanthine. On inocule le même milieu que dans l'exemple 1 avec 20 EXEMPLE 4 Dans un autre mode de mise en oeuvre du mode opératoire 69 11440 5 2006235 REVENDICATIONS 1. Procédé de préparation de cellules de levure et/ou de produits de fermentation, ledit procédé consistant à inoculer un milieu de culture contenant du méthanol comme source principale de carbone avec une souche de levure capable d'assimiler le méthanol et de produire des 5 cellules de levure et/ou des produits de fermentation à partir du méthanol assimilé et à cultiver en aérobie le milieu inoculé de manière à produire des cellules de levure et/ou les produits de fermentation. 2. Procédé selon la revendication l,dans lequel la souche de levure utilisée appartient au genre Pichia, Hansenula ou Candida. 10 3. Procédé selon les revendications 1 et 2, dans lequel le produit de fermentation est constitué par un ou plusieurs aminoacides, acides organiques et nucléotides ou leurs dérivés. 4. Procédé selon les revendications 1 à 3, qui consiste de plus à séparer les cellules de levure et/ou les produits de fermentation 15 du bouillon de culture.