FR 2009244 A1 19700130 FR 6916774 A 19690522 69 16774 1 2009244 La présente invention est relative à un procédé d'obtention d'une préparation d'enzyme de haute pureté par purification d'une préparation brute de L-asparaginase obtenue à partir de cellules d'une souche productrice de L-asparaginase appartenant au genre 5 Serratia» Plus particulièrement, la présente invention vise la production d'une préparation purifiée de L-asparaginase ayant une activité anti-mitotique par purification de L-asparaginase brute avec un bon rendement et de façon économique à l'échelle industrielle. 10 La L-asparaginase, c'est-à-dire l'amidase de la L-aspara- gine (diastase hydrolysante dont le nombre d'enzymes est 3, 5, 1, l) est un enzyme qui hydrolyse la L-asparagine en donnant de l'acide L-aspsrtique et de l'ammoniaque® Elle est distribuée en quantités relativement importantes chez les animaux et les plantes, 15 mais beaucoup de ses propriétés sont encore inconnues. Au cours des dernières années, de nombreuses études ont été consacrées à la L-asparaginase, car on a constaté qu'un enzyme de ce genre, isolé de sources spécifiques, comme par exemple 1'asparaginase du sérum du cobaye, possède une activité anti-mitotique et une activité 20 particulièrement énergique contre les cellules leucémiques qui exigent de la L—asparagine. Toutefois, jusqu'à ce jour, la production d'une telle préparation d'enzyme ayant une activité antileucémique, en particulier sa production en vue d'une utilisation en pharmacie, était jugée difficile, parce qu'il existait de nom-25 breux problèmes àaésoudre avant qu'une telle production puisse être mise en routeo Certains de ces problèmes comprennent le fait que les enzymes anti—leucémiques de la L-asparaginase sont limités et que, de ce fait, cette activité anti-mitotique est constatée uniquement dans les^ enzymes produits par un certain type de sérums 30 d'origine animale/par Escherichia coli, et un procédé de purification d'enzymes provenant de ces sources présente de nombreux problèmes, et c'est pourquoi on a longuement cherché à résoudre ces problèmes. Le premier des inconvénients précités, qui réside dans le 35 mode de production industriel de L-asparaginase ayant une activité anti-mitotique, a été supprimé conformément à la présente invention en utilisant une culture submergée de microorganismes appartenant au genre Serratia» Ce procédé a été décrit dans la demande de brevet français n° 69 02616 du 5 février 1969 au nom de .ç. la demanderesse. La présente invention supprime un autre in— ^"u convénient de ce procédé de purification 69 16774 2 2009244 grâce à une étude, approfondie de la L-asparaginase obtenue à partir de microorganismes du genre Serratia. Jusqu'ici, on n'avait que très peu de connaissances relatives à la production, avec un bon rendement, de L-asparaginase purifiée à partir de cellules de 5 microorganismes du genre Serratia, et à l'obtention d'une préparation enzymatique pouvant être utilisée en pharmacieo On sait que les enzymes de ces microorganismes sont extrêmement instables et qu'on ne peut pas obtenir une préparation de grande pureté sans exécuter très rapidement toutes les opérations concernant la puri-10 fication de ces enzymes» Toutefois, on ne connait pas les raisons d'une telle instabilité et, de ce fait, on n'a jamais trouvé de solution fondamentale. ^}Toir "Biochem. Biophys Research Comme", Vol* 28 (2), pages 160-165 (1967)J. Evidemment, un procédé de purification tel que celui qu'on 15 a mentionné ci-dessus ne peut pas être facilement mis en oeuvre à l'échelle industrielle et, de ce fait, une utilisation pratique de la L-asparaginase provenant des microorganismes en question s'est trouvée freinée» La présente invention fait apparaître une nouvelle explication de ces problèmes obtenue grâce à des recher-20 ches concernant les propriétés des enzymes en question. Des souches du genre Serratia produisent, en même temps que la L-asparaginase, un facteur relativement énergique qui inactive l'activité enzymatique. Conformément à la présente invention', il a été en outre constaté que de tels facteurs d'inactivation sont extraits 25 conjointement quand la L-asparaginase est extraite par un procédé classique d'extraction des enzymes. Il est donc impossible d'obtenir une préparation de L-asparaginase purifiée avec un bon rendement si ces facteurs d'inactivation n'ont pas été éliminés, parce que la L-asparaginase perd son activité pendant les opérations 30 ultérieures de purification.) Il est donc évident qu'une préparation d'enzyme qui contient de tels facteurs d'inactivation ne peut pas avoir une activité anti-mitotique suffisante, même si on exécute la purification sans séparer les éléments d'inactivation précités» La demanderesse avait déjà mis au point un procédé de pu-35 rification de la L-asparaginase avec un bon rendement, procédé qui consistait à ajuster la qualité d'un liquide et à ajouter diverses substances pour séparer les facteurs d'inactivation. Ce procédé est décrit dans la demande de brevet français n° 69 10281 du 3 avril 1969 au nom de la demanderesse. Toutefois, ce procédé de pu~ rification est encore insuffisant pour séparer les facteurs d'inac-40 tivation et il présente en outre des 69 16774 3 2009144 inconvénients en ce qui concerne la production d'une préparation purifiée utilisable en pharmacie® La présente invention a pour objet : - un procédé de purification d'une préparation de L—aspara— 5 ginase, qui ne présente pas les inconvénients des procédés de la technique antérieure; - un procédé perfectionné de purification d'une préparation de L-asparaginase ayant une activité antimitotique, procédé qui peut être mis en oeuvre à une échelle industrielle et à peu de 10 frais. D'autres caractéristiques et avantages de la présente invention rassortiront de l'exposé détaillé qui va suivre, étant toutefois bien entendu que cet exposé et les exemples spécifiques, bien qu'ils correspondent à des modes de réalisation préférés de 15 la présente invention, ne sont donnés qu'à titre illustratif seulement et qu'on peut y apporter de nombreuses modifications sans sortir pour cela du cadre de la présente invention» Conformément à la présente invention, on a constaté qu'on peut obtenir une séparation sensiblement parfaite des facteurs 20 d'inactivation contenus dans la L-asparaginase grâce à un procédé de relargage, en particulier par précipitation fractionnée en utilisant du sulfate d'ammonium. Ainsi, la présente invention concerne un. procédé de production de L-asparaginase ayant une activité antinitotique utile» Le procédé de purification du L-asparaginase 25 conformément à la présente invention est un procédé industriel qui est caractérisé par le fait qu'il comprend un traitement de précipitation fractionnée au moyen d'un relargage avec du sulfate d'ammonium, dans n'importe quel stade d'un procédé de purification, de préférence au début de ce procédé, la L-asparaginase se 30 trouvant ainsi purifiée à partir de cellules cultivées d'un microorganisme producteur de L-asparaginase du genre Serratia» Antérieurement à la présente invention, il était connu qu'en purifiant la L-asparaginase obtenue en utilisant des micro organisme s du genre Serratia, il était possible de séparer les facteurs d'inac-35 tivation par un procédé de relargage et également que ce procédé pouvait être efficacement utilisé pour purifier la L-asparaginase» La présente invention vise un nouveau procédé basé sur ces moyens généraux. Les sels qu'on peut utiliser dans l'opération de relargage 40 de la présente invention comprennent des sels minéraux tels que le 69 16774 4 2009244 chlorure de sodium ou le sulfate d'ammonium» Toutefois, un relargage avec du sulfate d1ammonium est particulièrement efficace® Les sels sont ajoutés à la solution aqueuse brute d'enzyme sous la forme d'une solution aqueuse® A titre de préparation de L-aspa— 5 raginase destinée à être relarguée, on utilise un extrait de cellules de microorganismes du genre Serratia, une solution obtenue en éliminant les acides nucléiques de cet extrait par addition ++ d'ions Mn , une solution enzymatique brute résultant de la précipitation des impuretés par acidification de l'extrait liquide 10 ou une solution d'enzyme partiellement purifiée obtenue en soumettant la solution précitée à une chromatographie sur une colonne de DEAE-cellulose (diéthylaminoéthyl-cellulose) ou de CM-cellulose. On obtient les meilleurs résultats quand ce relargage est effectué aussitôt que possible au cours de la purification, et lorsqu'il 15 est appliqué à une solution exempte d'acides nucléiques ou d'impuretés dues à la précipitation par un acideo En ce qui concerne la température utilisée dans ce traitement de relargage, le rendement est meilleur lorsque la température ést basse mais, ordinairement, l'intervalle de température utilisé est compris entre 20 0°C et —5°C. Le pH pendant ce traitement de relargage peut 'être compris dans un intervalle étendu, allant de 3 à 10, mais il est désirable d'effectuer ce traitement soit à un pQ d'environ 4, soit à un pH d'environ 9. En ce qui concerne le procédé de relargage à utiliser dans 25 la mise en oeuvre de la présente invention, un sel, qui est avantageusement du sulfate d'ammonium, est ajouté à une solution enzymatique aqueuse jusqu'à un point de saturation de 0,3 ou 30$ en poids de la quantité requise pour la saturation, et la fraction relarguée par cette addition est séparée par séparation centri— 30 fuge ou par filtratio'n® Au liquide surnageant résultant, on ajoute encore du sulfate d'ammonium jusqu'à un point de saturation de 0,5 et on précipite les facteurs actifs de la L-asparaginase dans la fraction relarguée de cette manière, ces facteurs actifs étant récupérés par séparation centrifuge ou filtration0 Grâce à ce 35 traitement, la L-asparaginase est récupérée presque en totalité, mais les facteurs d'inactivation ne sont pas précipités en même temps que cette fraction et la L-asparaginase se trouve donc séparée de tels facteurs. Le tableau ci-dessous permet de comparer la stabilité de la 40 L-asparaginase contenue dans les préparations, avant et après le 69 16774 5 2009244 -traitement de relargage, et il ressort de ce tableau que les facteurs d'inactivation sont séparés par ledit traitement de relargage» Pour obtenir les résultats de ce tableau, un extrait de cellules de Serratia marce scens ATCC 60 est traité par un procédé 5 décrit dans l'exemple 1 ci-après» Ce tableau permet de comparer la stabilité des échantillons ainsi obtenus, avant et après la formation du précipité par addition de sulfate d'ammonium, en donnant la réduction d'activité mesurée à diverses valeurs de pH, à une température de 20°C et pendant 12 heures. L'activité d'une solution 10 initiale utilisée dans les essais effectués pour obtenir les chiffres de ce tableau est de 2,51 unités/ml. Le tableau donne l'activité résiduelle après 12 heures, comme on l'a mentionné. Une activité résiduelle plus faible portée dans le tableau correspond à une perte d'activité plus importante» L'activité qui décompose 15 1 micron (mole) de L-asparagine, par minute, en acide L-aspartique et en ammoniac est appelée par la suite 1 unité. TABLEAU Effet du fractionnement exécuté avec du sulfate d'ammonium sur la stabilité de la L-asparaginase. 20 âctivité enzymatique résiduelle (Unités/ml) juGu&llvlilOZrs^ pil 9,0 8,5 8,0 6,0 5,0 3,5 Avant fractionne-nent 2,01 0,98 0,33 0,21 1,06 2,47 Après fractionnement 2,49 2,51 2,50 2,48 2,45 2,40 La perte maximale d'activité de la L-asparaginase due à des facteurs d'inactivation de la L-asparaginase se manifeste dans l'intervalle des pH neutres, mais des échentillons déjà fractionnés avec du sulfate d'ammonium sont très stables, même dans un intervalle de pH neutres. Ceci montre que les facteurs d'inactiva-tion sont totalement éliminés de tels échentillons» Avec ce procédé de relargage utilisant du sulfate d'ammonium, 15 la L-asparaginase est habituellement purifiée dans une mesure telle que sa pureté se trouve être deux ou trois fois supérieure à celle de la préparation de départ» La pureté des préparations ainsi obtenues, dont les facteurs d1inactivation ont été éliminés, peut être encore facilement augmentée en mettant en oeuvre les divers 40 proofi.es couramment utilisés pour la pétrification des enzymes, 69 16774 6 2009244 par exemple une chromatographie par échange d'ions ou une chroma-tographie par adsorption» De cette manière, une préparation de L-asparaginase convenant en pharmacie peut être obtenue avec un bon rendement. 5 Les exemples non limitatifs suivants ne limitent pas le fractionnement à l'utilisation de sulfate d'ammonium. EXEMPLE 1 On cultive Serratia marcescens ATCC 60 dans un milieu liquide et on sépare par centrifugation les cellules ainsi déve-10 loppées, ce qui donne des cellules humides. On met les cellules humides en suspension dans; une solution tampon tris-HCl 0,01 M au pH 8,5, puis on homogénéise et on extrait en utilisant un générateur d'ondes supersoniques de 10 KG pendant 10 minutes et ensuite par séparation centrifuge. On recueille la solution surna-15 geante résultante, ce qui donne un extrait enzymatique brut ayant une activité spécifiquecfe L-asparaginase de 0,15 unité par mg de protéine (par&suite, l'activité spécifique sera exprimée de façon similaire, c'est-à-dire sur la même base)® A cette solution d'extrait, on ajoute MnC^ jusqu'à une concentration de 0^05 M. 20 Ensuite, on chauffe cette solution à 50°C pendant 15 minutes et on la centrifuge pour éliminer le précipité formé, ce qui donne une solution enzymatique brute dépourvue d'acides nucléiques. Dans 10 litres de cette solution enzymatique brute, dépourvue d'acides nucléiques (activité totale dé 10^000 unités), on dissout 25 du sulfate d'ammonium en poudre fine qu'on introduit lentement à une température de 0°C, jusqu'à obtention d'une concentration correspondant à une saturation de 0,3. Le précipité résultant de cette addition est éliminé par séparation centrifugeo Au liquide surnageant ainsi obtenu, on ajoute encore du sul-30 fate d'ammonium qu'on dissout dans ce liquide jusqu'à une concentration correspondant à un point de saturation de 0,5, puis on laisse refroidir la solution résultante pendant la nuit. Il se forme ainsi un précipité qu'on recueille par séparation centrifuge, ce qui donne une protéine brute dont le poids humide est de 15 go 35 Cette protéine brute a une activité spécifique de 2,3 et une activité totale d'environ 9<>000 unités, et elle ne contient absolument pas de facteur d'inactivation de la L—asparaginase. L'activité de la protéine brute est extrêmement stable à chaque valeur de pH, à une température de 60°C ou moins, et on ne constate sen-40 siblement pas de diminution de l'activité pendant les opérations BAD OR»PMfsfAL 69 16774 7 2009244 de purification ultérieures. On dissout de nouveau cette préparation d1enzyme partiellement purifiée dans la solution tampon susmentionnée et on la soumet à la chromatographie en utilisant le produit DEAE-cellulose, un bio-gel, ou des produits analogues, ce qui donne une préparation purifiée de L-asparaginase ayant une activité spécifique de 105 et un taux d'activité d1environ 25$» La préparation de L-asparaginase ainsi obtenue montre une activité antimitotique qui permet de guérir totalement la leucémie expérimentale chez la souris, à une dose de plusieurs microgrammes. EXEMPLE 2 On cultive Serratia marcescens ATCC 19180 et on traite la culture de la même manière que dans l'exemple 1, ce qui donne un extrait enzymatique brut ayant une activité spécifique de L-aspara— ginase de 0,11„ On ajuste le pH de cet extrait à 4 à une température de 0°C, et on récupère le précipité ainsi formé par séparation centrifuge, ce qui donne une couche surnageante ayant une activité spécifique de 1, à la suite de la précipitation par un acide. On ajoute du sulfate d'ammonium à 16 litres du liquide surnageant ayant une activité totale de 2„700 unités de L-asparagi-nase et on y dissout ce sulfate de la même manière que dans l'exemple 1, jusqu'à une concentration correspondant à un point de saturation de 0,2o On élimine le précipité ainsi formé et on recueille de nouveau le liquide surnageant. On ajoute du sulfate d'ammonium à ce liquide surnageant, en une concentration correspondant à un point de saturation de 0,6 et on peut ainsi récupérer la L-asparaginase par séparation centrifuge. L'activité spécifique de la protéine brute résultante est de 1»58, mais le taux d'activité est presque quantitatif et ladite protéine brute ne contient absolument pas de facteurs d'inactivation de la L-asparaginase. On traite cette préparation partiellement purifiée avec le produit DEAE-cellulose, ce qui donne une préparation ayant une activité spécifique de 21 avec un rendement d'environ 70$. Cette préparation est efficace contre la leucémie chez la souris de la même manière que la préparation d'enzyme obtenue dans l'exemple 1. Il est bien évident qu'on peut apporter de nombreuses modifications à la description qui précède sans sortir pour cela du cadre de la présente invention. 69 16774 8 2009244 REVENDICATIONS 1°) Procédé perfectionné de purification d'une préparation de L-asparaginase obtenue à partir d'un microorganisme producteur de L-asparaginase du genre Serratia, ce micro organisme produisant, 5 en même temps que la L-asparaginase, des facteurs qui inactivent l'activité enzymatique de la L-asparaginase, le perfectionnement consistant à séparer les facteurs d'inactivation de la L-asparaginase au cours du procédé de purification par relargage de tels facteurs, grâce à l'addition d'un sel minéral, ce qui permet de 10 récupérer de la L—asparaginase purifiée ayant une activité antimitotique effective» 2°) Procédé conforme à la revendication 1, dans lequel la préparation de L-asparaginase destinée à être relarguée est extraite de cellules de microorganismes du genre Serratia» 15 3°) Procédé conforme à la revendication 2, dans lequel la préparation de L-asparaginase devant être relarguée est une solution qu'on a obtenue à partir de cet extrait en y ajoutant des ions manganèse pour éliminer les acides nucléiques qu'il contient. 4°) Procédé conforme à la revendication 2, dans lequel la 20 préparation de L-asparaginase destinée à être relarguée a été obtenue en précipitant les impuretés dudit extrait par acidification» 5°) Procédé conforme à la revendication 2, dans lequel la préparation de L-asparaginase destinée à être relarguée résulte 25 d'une purification partielle de la solution enzymatique, par traitement de cette solution avec de la diéthylaminoéthyl-cellulo- apres quoi se ou de la CM—cellulose,/cette solution est soumise \à un traitement chromatographique. 6°) Procédé conforme à la revendication 1, dans lequel le 30 traitement de relargage est mis en oeuvre au début du procédé de purification. 7°) Procédé conforme à la revendication 1, dans lequel on_ exécute le traitement de relargage quand la préparation a été débaxrassée des acides nucléiques. 35 8°) Procédé conforme à la revendication 1, dans lequel le traitement de relargage est mis en oeuvre quand la préparation a été débarrassée des impuretés par précipitation obtenue en ajoutant un acide» 9°) Procédé conforme à la revendication 1, dans lequel le 40 sel minéral est le chlorure de sodium ou le sulfate d'ammonium. 69 16774 9 2009244 10°) Procédé conforme à la revendication 1, dans lequel le traitement de relargage est mis en oeuvre à une température d'environ 0 à 5°C et àunpH d'environ 3 à 10» 11°) Procédé perfectionné de purification d'une préparation ^ de L-asparaginase obtenue à partir d'un microorganisme producteur de L-asparaginase du genre Serratia, ce microorganisme donnant, en même temps que la L-asparaginase, des facteurs qui inactivent l'activité enzymatique de la L-asparaginase, le perfectionnement résidant dans le fait que les facteurs d'inactivation sont séparés de la L-asparaginase pendant un stade quelconque du procédé de purification grâce à un relargage de tels facteurs, obtenu en éliminant d'abord une fraction précipitée par l'addition d'une solution aqueuse d'un sel minéral jusqu'à un point de saturation ne dépassant pas 0,3, après quoi on élimine une fraction précipitée ^ en ajoutant ladite solution aqueuse du sel minéral jusqu'à un point de saturation d'au moins 0,5, et on récupère la L-asparaginase purifiée ayant une activité antimitotique effective» 12°) Procédé conforme à la revendication 11, dans laquelle les fractions précipitées sont éliminées par séparation centrifuge ou par filtration. 13°) Procédé conforme à la revendication 11, dans lequel le microorganisme est Sérratia marcescens, ATCC 600 14°) Procédé conforme à la revendication 11, dans lequel le microorganisme est Serratia marcescens, ATCC 19180» 25 15°) Procédé conforme à la revendication 11, dans lequel on exécute le relargage à un pH d'environ 4 ou un pH d'environ 9o 16°) Procédé conforme à la revendication 11, dans lequel le sel minéral est le sulfate d1ammonium. 17°) Produit obtenu par la mise en oeuvre du procédé con-3Q forme aux revendications 1 à 16. 20