FR 2001930 A1 19691003 FR 6902616 A 19690205 69 02616 1 2001930 La présente invention est relative à un procédé de production de L-asparaginase et, plus particulièrement, à uji procédé de production de L-asparaginase par fermentation. La présente invention vise encore plus particulièrement un procédé de production de pré-5 paratioœ d'enzymes contenant du L-asparaginase qui ont une grande 'activité, par culture de microorganismes producteurs de L-aspara-gina.se et appartenant au genre Serratia» Le L-asparaginase, c'est-à-dire l'hydrolase de la L-aspara-gine (indice d'enzyme 3, 5, 1, 1) est un enzyme qui hydrolyse la 10 L-asparagine en donnant l'acide L-aspartique et de l'ammoniaque. On le trouve en quantité relativement importante à la fois dans les plantes et chez les animaux. Toutefois, on ne connaît pas encore complètement ses propriétés. Malheureusement, la production en grande quantité de l'un 15 quelconque de ces enzymes, et en particulier leur production à une échelle permettant de satisfaire la demande importante qui en est faite, a été extrêmement difficile à réaliser. De plus, les rendements des enzymes obtenus par les procédés de production connus dans la technique antérieure sont faibles et, de ce fait, 20 les prix d'e revient sont élevés. Les procédés de fabrication de préparations à base de L-asparaginase qui étaient mis en oeuvre dans la technique antérieure n'ont donc qu'un intérêt pratique limité, et, de ce fait, on cherche depuis longtemps à mettre au point un procédé permettant d'obtenir des préparations purifiées 25 à base de L-asparaginase qui possèdent une activité anti-leucémique, d'une façon plus économique et plus pratique. De plus, un procédé permettant d'obtenir des cellules ayant une activité élevée de L-asparaginase serait très précieux. Par ailleurs, il a été très récemment exposé qu'en plus des 30 enzymes bruts mentionnés plus haut, le L-asparaginase produit par des microorganismes du genre Serratia marcescens possède également des propriétés intéressantes et que l'activité enzyma -tique des cellules est relativement élevée. Par suite, de tels microorganismes sont considérés comme des matières de départ très *35 avantageuses. Toutefois, il a été difficile de mettre au point des.procédés de culture de tels microorganismes, qui puissent être mis en oeuvre efficacement dans un milieu liquide pour 69 02616 2001930 «donner des cellules ayant une activité de L-asparaginase élevée, 1 en utilisant les procédés de culture submergée et de culture avec secousses du type classique, qui étaient généralement considérés comme des méthodes pratiques d'obtention des cellules désirées. 5 Par conséquent on a obtenu des préparations de L-asparaginase à partir de microorganismes par culture en surface sur un milieu solide (voir "Biochem. Biophys. Research Comm.", Vol.28 (2), pp.160-165 (1967) ). Ainsi, bien que le L-asparaginase obtenu en utilisant des microorganismes du genre Serratia marcescens possède 10 une valeur pratique suffisamment élevée, l'inconvénient que présente le fait qu'il n'existe pas de procédé d1obtention des cellules actives à l'échelle industrielle a empêché une application étendue du L-asparaginase dérivé de tels microorganismes. Par conséquent, la présente invention a pour objet : 15 - un procédé perfectionné de production de L-asparaginase, qui pallie les inconvénients et les insuffisances des procédés de la technique antérieure; - un procédé de production de préparations de L-asparaginase, qui peut être mis en oeuvre d'une manière efficace et 20 relativement simplej - un procédé de production de préparation d'enzymes ayant une grande activité de L-asparaginase, procédé qui peut être mis en oeuvre à l'échelle industrielle avantageusement et à peu de frais, et qui donne un rendement élevé en produit recherché; 25 - l'obtention de L-asparaginase à partir de microorganismes du genre Serratia. Les caractéristiques et avantages de la présente invention ainsi que d'autres apparaîtront aux techniciens à la lecture de l'exposé qui va suivre et des revendications. 30 A la suite de recherches fondamentales relatives aux condi tions de développement de microorganismes producteurs de L-asparaginase appartenant au genre Serratia et en particulier aux procédés de culture et d'obtention de cellules ayant une activité de L-asparaginase élevée à un niveau pratique, la deman-35 deresse a constaté que de tels microorganismes ont des propriétés physiologiques très particulières et que, comme on l'a mentionné, il est très difficile d'obtenir des cellules ayant une activité 69 02616 3 2001930 élevée de L-asparaginase en les cultivant dans un milieu de cul- ' ture liquide ou en utilisant les conditions de culture qui sont généralement employées pour cultiver des microorganismes ordinaires. Par suite, conformément à la présente invention, on a cons-5 taté qu'il est possible d'obtenir efficacement des cellules ayant une activité élevée de L-asparaginase au sein d'un milieu de culture liquide, dans des conditions particulières qu'on décrira ci-après, grâce à une culture avec secousses ou à une culture submergée, si l'aération est limitée à un certain degré. De cette 10 manière, il est devenu possible de mettre au point un procédé de production à une échelle pratique de L-asparaginase précieux. D'une manière générale, l'invention est caractérisée par le fait qu'on cultive des microorganismes producteurs de L-asparaginase au sein d'un milieu liquide ayant une teneur limitée en source de 15 carbone et d'éléments analogues, en limitant l'aération dans une certaine mesure, grâce à quoi des cellules ayant une activité élevée de L-asparaginase se développent avec un bon rendement, ces cellules permettant d'obtenir des préparations d'enzymes ayant une activité élevée. 20 Les microorganismes utilisés conformément à la présente invention sont ceux qui possèdent une capacité de production de L-asparaginase et qui appartiennent au genre Serratia. Les microorganismes du genre Serratia marcescens sont particulièrement préférés. Les cellules obtenues en cultivant de tels microorga-25 nismes, conformément à la présente invention, au sein d'un milieu nutritif liquide, possèdent une activité de L-asparaginase qui agit spécifiquement sur la L-asparagine. Les cellules obtenues conformément à la présente invention ont normalement une activité correspondant à la décomposition de 20y 69 02616 4 200-1930 sin de 7>'et l'activité reste relativement stable dans l'inter- ' valle de pH compris entre 5 et 9. On n'observe pas de perte considérable d'activité dans l'intervalle de pH spécifié. Bien que l'enzyme soit une protéine ayant' un poids moléculaire relativement 5 élevé, il résiste à la chaleur et la température optimale de la réaction est d'environ 60°C. Les microorganismes utilisés dans la présente invention se développent de façon très satisfaisante sur un milieu solide de composition classique, par exemple sur un milieu à l'agar conte-10 nant diverses sources de carbone et d'azote, pour produire des cellules possédant l'activité de L-asparaginase désirée. Au contraire, ils se développent très médiocrement dans un milieu liquide de composition similaire au cours d'une culture avec secousses ou d'une culture submergée. En outre, les cellules ob-15 tenues ne montrent pas d'activité de L-àsparaginase. Comme on l'a fait ressortir dans ce qui précède, la demanderesse a constaté que ce phénomène n'a pas une cause unique, mais est le résultat de plusieurs causes telles que la léthalité des microorganismes due à une quantité excessive de constituants organiques mineurs, 20 une inhibition du développement des microorganismes et de la production de L-asparaginase par une concentration élevée de la source de carbone, et l'inhibition de la production de L-asparaginase par une quantité excessive d'oxygène. Afin de résoudre ces problèmes et de mettre au point un 25 procédé économique de préparation de L-asparaginase, on effectue la culture conformément à la présente invention dans un milieu liquide contenant Itfo en poids ou moins de sources de carbone, de préférence seulement 0,3?£ en poids ou moins, des quantités appropriées de sources d'azote minérales ou organiques, des matières 30 minérales et des quantités relativement faibles de substances naturelles azotées, de préférence 0,5?° en poids ou moins, ce milieu étant à un pH de 5 à 9 et à une température d'environ 40°C, La durée de la culture est normalement d'environ 24 heures et on obtient ainsi 10 à 20 g/litre de cellules contenant du 35 L-asparaginase. On conduit la culture en secouant la culture en aérobie ou bien en aérant et en agitant une culture submergée. --Toutefois, l'aération doit être limitée de façon désirable à 69 02616 5 2001930 .une valeur aussi faible que"possible, à condition que la crois- I sance des microorganismes ne soit pas affectée de façon nuisible. En général, on utilise une quantité d'air égale ou inférieure au double de la quantité de milieu, en voiume, et une agitation rela-5 tivement lente est appropriée pour obtenir des cellules ayant une activité élevée de L-asparaginase. Les souches utilisées dans la présente invention peuvent être cultivées dans un milieu de culture synthétique ou dans un milieu nutritif naturel, à condition que le milieu choisi contienne les 10 éléments nutritifs essentiels pour le développement de la souche choisie et à condition que les conditions de culture mentionnées ci-dessus soient respectées. Les éléments nutritifs appropriés sont bien connus dans la technique et comprennent des substances telles qu'une source de carbone, une source d'azote, des composés 15 minéraux et des produits analogues. Ainsi, à titre de source de carbone, on peut mentionner par exemple les hydrates de carbone tels que le glucose, le fructose, le maltose, le saccharose, l'amidon, l'hydrolysat d'amidon, la mélasse, etc.., ou n'importe quelle source de carbone appropriée telle que des acides organi-20 ques, comme par exemple l'acide acétique, 1?acide lactique, etc. On peut utiliser ces substances isolément ou sous forme de mélanges comprenant deux ou plus de deux d'entre elles. Comme source d'azote, on peut choisir diverses sortes de sels ou composés minéraux ou organiques, tels que l.'urée, des sels d'ammo— 25 nium tels que le chlorure d'ammonium, le sulfate d'ammonium, le nitrate d'ammonium, l'acétate d'ammonium, le phosphate d'ammonium, etc.., ou encore des substances naturelles contenant de l'azote, comme la liqueur de macération du- maïs, la liqueur de levure, un extrait de levure, un extrait de viande, la peptone, 30 la farine de poisson, du bouillon, des hydrolysats de caséine, un acide aminé de la caséine, les matières solubles du poisson, un extrait d'enveloppes de grains de riz, etc.. Ces substances elles-mêmes peuvent être utilisées isolément ou en mélanges comprenant deux ou plus de deux d'entre elles. Les composés 35 minéraux qu'on peut ajouter au milieu de culture comprennent le sulfate de magnésium, le phosphate de sodium, le phosphate monopotassique, le phosphate dipotassique, le sulfate de fer, le 69 02616 2001930 phlorure de manganèse, le chlorure de calcium, le chlorure de sodiumf le sulfate de zinc, etc. Lorsque la culture est terminée, on isole les cellules du milieu de culture par centrifugation ou par filtration et on *5 détruit les cellules par des procédés connus, ce qui donne des extraits ayant une activité de L-asparaginase. Pour récupérer et purifier le L-asparaginase contenu dans les extraits, on peut soumettre ces derniers à des traitements classiques habituellement utilisés pour la purification des enzymes, comme une préci-10 pitation par du sulfate d'ammonium, une précipitation par des solvants, une chromatographie avec diverses résines échangeuses d'ions ou une adsorption, afin d*obtenir des préparations de L-asparaginase assez pures pour être utilisées comme produits pharmaceutiques. 15 Les exemples qui suivent sont donnés uniquement pour illus trer ùn procédé de production de préparations de L-asparaginase, conformément à la présente invention, et ne doivent pas être considérés comme ayant un sens limitatif. Sauf mention contraire, les pourcentages s'entendent en poids par litre d'eau. 20 EXEMPLE 1 On cultive le microorganisme Serratia marcescens ATCC 60 dans un milieu liquide contenant 2fo de bouillon sec, tout en aérant et en agitant la culture, pendant 7 heures à 30°C. La liqueur de culture résultante constitue une culture d'ensemence— 25 ment et on l'inocule dans une proportion de 10% en volume dans 10 litres d'un milieu de fermentation ayant la composition suivante : Glucose 0,3$ Extrait de viande 1 $ Peptone 1 fo 30 Chlorure de sodium 0,5$ Extrait de levure 0,5$ Le milieu de fermentation est au pH 7. On exécute ensuite la culture à 30°C pendant 16 heures, tout en aérant à une cadence de 5 litres d'air par minute et en agi-35 tant à la vitesse de 200 tours par minute. On isole les cellules ainsi obtenues au moyen d'une centrifugeuse, ce qui donne 160 g de cellules humides. BAD ORIGINAL U^bib '• 2U0Î93U On met les cellules en suspension dans une solution tampon ' "Trisn-HCl au pH 8,5 (tris-(hydroxyméthyl) aminométhane-HGl), puis on traite la suspension résultante pendant 10 minutes en utilisant » un générateur d'ultrasons de 10 kc pour détruire les cellules. Par 5 centrifugation, on obtient une solution extraite brute ayant une activité de L-asparaginase de 18,6 unités par mg de protéine. On H—f* ✓ traite la solution extraite avec Mn en vue d*éliminer les acides nucléiques et on la chauffe pour faire précipiter les protéines impures qui sont ensuite séparées. On exécute ensuite un frac-10 tionnement avec du sulfate d'ammonium et un traitement chromato-graphique avec de la diéthylaminoéthyl cellulose et des biogels, ce qui purifie la protéine enzymatique et donne une préparation d'asparaginase avec un rendement de 15$. L'activité spécifique de la préparation d'asparaginase est de 1500 unités par mg de pro-15 tëine. EXEMPLE 2 On cultive le microorganisme Serratia marcescens ATCC 19180 dans les conditions décrites dans l'exemple 1, pour préparer une culture d'ensemencement. On inocule la culturebd'ensemencement 20 résultante, dans 150 litres d'un milieu de fermentation liquide ayant la composition décrite dans l'exemple 1. On cultive pendant 16 heures tout en aérant à une cadence de 100 litres par minute et en agitant à la vitesse de 100 tours/minute. La centrifugation du milieu cultivé donne 1,45 kg de cellules humides. 25 On traite les cellules de la même manière que dans l'exemple 1. On purifie l'enzyme résultant et on obtient une préparation de L-asparaginase avec un rendement approximatif de 20$. Cette préparation possède une activité spécifique de 2000 unités par mg de protéine. 30 II est évident qu'on peut apporter de nombreuses modifica- y tions à la description qui précède sans s'écarter pour cela du cadre de la présente invention. Il est en outre bien entendu que l'invention ne concerne pas les produits décrits lorsqu'ils sont utilisés comme remèdes. 69 02616 2001930 REVENDICATIONS 1) - Procédé de production d'une préparation de L-asparaginase caractérisé par le fait qu'il consiste à cultiver un micro-organisme producteur de L-asparaginase et appartenant au genre Serratia dans des conditions aérobies, l'aération étant suffisam- 5 ment limitée pour permettre le développement des microorganismes, au sein d'un milieu nutritif aqueux contenant 1$ en poids ou moins de source de carbone, les cellules contenant du L-aspara-ginase s'accumulant dans la liqueur de culture résultante et étant ensuite isolées et récupérées dans cette liqueur sous forme 10 d'une préparation d'asparaginase. 2) - Procédé conforme à la revendication 1, dans lequel on exécute la culture à une température d'environ 20 à 40°C et à un pH d'environ 5 à 9. 3) - Procédé conforme à la revendication 1, dans lequel le 15 microorganisme précité est le microorganisme Serratia marcescens. 4) -.Procédé conforme à la revendication 1, dans lequel le milieu nutritif contient 0,3$ en poids ou moins de source de carbone. 5) - Procédé conforme à la revendication 1, dans lequel 20 l'élément nutritif contient également 0,5$ en poids ou moins d'une substance naturelle contenant de l'azote. 6) - Procédé conforme à la revendication 1, dans lequel on utilise une quantité d'air égale ou inférieure au double de la quantité du milieu en volume. 25 7) - Procédé conforme à la revendication 1, dans lequel le temps de culture est d'environ 24 heures. 8) - Procédé conforme à la revendication 1, dans lequel le microorganisme est la souche Serratia marcescens ATCC 60. 9) - Procédé conforme à la revendication 1, dans lequel le 30 microorganisme est la souche Serratia marcescens ATCC 19180. 10) - Procédé conforme à la revendication 1, dans lequel la préparation de L-asparaginase résultante possède une activité correspondant à la décomposition d'environ 20/«