FR 2008194 A1 19700116 FR 6912962 A 19690424 12962 . 1 2008194 La-présente invention est relative à un nouveau procédé de préparation de peptides renfermant de la- cystine. On trouve dans la nature différents peptides renfermant de la cystine dans lesquels le pont bisulfure de la cystine se trouve dans un anneau, par exemple l1oxytocine, la vasopres-sine, la vasotocine, l'isotocine, la mésotocine, l'hormone de croissance, la thyrocalcitonine, l'insuline. Par ailleurs, le pont bisulfure de la cystine peut aussi relier entre elles des chaînes linéaires d'acides aminés, comme c'est le cas, par exemple, pour les deux ponts bisulfure entre la chaîne A et la chaîne B de l'insuline, ou dans le cas de glutathion. On connaît déjà différents procédés pour la synthèse de peptides renfermant des ponts bisulfure en dehors des peptides naturels comportant des ponts bisulfure, on a déjà préparé par synthèse un assez grand nombre d'analogues actifs, par exemple la désamino-oxy- ✓ 4- 4- 8 tocine, la ser -oxytocine, l'Âsn -oxytocine, la Val -oxytocine, 2 2 8 la Tyr (O-méthyl)-oxytocine, la Phé -Arg -vasopressine, la Ô 8 2 8 "5 Phé -Lys -vasopressine, la Phé -Orn -vasonressine, 1' Ile - -8 . , , , 4- T 8 4- , 8 Arg -vasopressine, l'Asn -Lys -vasopressine, l'asn -lys - vasopressine. Suivant les procédés connus pour réaliser le pont bisulfure , on élimine d'abord les groupes de protection du groupe mercapto dans une séquence d'acides aminés renfermant les deux restes cystéine à relier et dans laquelle les groupes mercapto sont protégés, par exemple par des groupes carbobenzoxy ou par des groupes benzyle, ou par le groupe trityle, le reste benzyle par exemple avec du sodium dans de l'ammoniac liquide, le reste trityle par exemple à l'aide d'acétate mercurique et d'hydrogène sulfuré, ou avec de l'acide chiorhydrique décanormal, et on oxyde ensuite en bisulfure le peptide renfermant les groupes mercapto libres, par exemple avec du 1,2-di-iodo-éthane, ou avec de l'oxygène. Ce procédé présente l'inconvénient que les méthodes d'élimination indiquées entraînent des réactions secondaires, en particulier dans le cas des peptides sensibles, et qu'on nuit par suite au rendement. On a maintenant trouvé qu'on obtient d'une façon plus simple et ménageante, et avec un meilleur rendement, des peptides renfermant de la cystine, et leurs dérivés, lorsqu'on traite par de l'iode la ou les 69 12962 2008194 séquence (s) d'acides aminés renfermant les restes cystéine à relier et dans laquelle ou dans lesquelles les groupes mercapto sont protégés par des groupes trityle. La réaction a lieu à la température ambiante, mais peut aussi, suivant la nature des 5 peptides, être effectuée à plus basse température ou à plus haute température, par exemple à des températures de zéro à 60°. On effectue de préférence la réaction dans un solvant dans lequel l'iode et le peptide sont au moins en partie solubles, de préférence dans un alcool tel qu'un alcanol inférieur par exem-10 pie l'éthanol ou, en particulier, le méthanol ou dans un mélange d'un alcool avec un solvant organique dans lequel le peptide est soluble, comme l'acétate d'éthyle, le diméthylformamide, le chlorure de méthylène, ou dans de 'l'acide acétique glacial» On veille avantageusement à ce qu'un excès d'iode soit présent, 15 par exemple en travaillant dans des solutions diluées et en ajoutant la solution du peptide à la solution iodée. Dans ce cas, on obtient exclusivement le monomère désiré. Si l'on procède par contre de façon inverse et ajoute par exemple goutte-à-goutte la solution d'iode dans une solution du peptide, on 20 forme alors des quantités considérables de polymère. A partir de la solution obtenue, l'iode en excès peut être éliminé, par exemple avec du thiosulfate. Lors de la réaction, on utilise comme substances de départ des peptides dans lesquels les groupes aminogènes libres 25 sont avantageusement protégés. Des groupes hydroxyle libres et des groupes carboxyle libres peuvent aussi, si on le désire, se présenter sous forme protégée. Comme groupes de protection des groupes aminogènes, on citera par exemple : les restes benzyle, trifluorométhyle, phtaloyle, p-toluène-sulfonyle, ou 30 surtout des groupes dérivant de l'acide carbonique, comme des groupes carbobenzoxy éventuellement substitués dans le reste aromatique par des atomes d'halogène, par des groupes al'coyle inférieur ou par des groupes alcoxy inférieur ou par des groupes carbalcoxy inférieur, des groupes benzyloxy-carbonyle colorés, 35 comme le groupe p-phénylazo-benzyloxy-carbonyle et le groupe p-(p'-méthoxy-phénylazo)-benzyloxy-carbonyle, le groupe toly-loxycarbonyle, le groupe 2-phényl-isopropyloxy-carbonyle, le groupe 2-tolyl-isopropyloxy-carbonyle et surtout le groupe 2-p-diphényl-isopropyloxy-carbonyle (voir le brevet français ' GC^ 69 12962 2008194 N° 1.554-.051 ) , ainsi que des groupes oxycarbonyle aliphatiques tels que, par exemple, le groupe allyloxy-carbonyle, le groupe cyclopentyloxy-carbonyle, le groupe tertio-amyloxy-carbonyle, le groupe adamantyloxy-carbonyle et, en premier lieu, le groupe 5 tertio-butyloxy-carboxyle. Les groupes carboxyle peuvent, si on le désire, être protégés, par exemple par amidation ou estérification. Comme esters, il y a lieu de citer, par exemple, ceux du méthanol, de l'éthanol, de l'alcool benzylique, de l'alcool p-méthoxy-10 benzylique, du 2,4-,5-trichlorophénol, du ÎT-hydroxy-succinimide, du N-hydroxy-phtalimide et surtout du tertio-butanol. Les groupes hydroxy, par exemple les restes de la sérine ou de la tyro-sine, peuvent être protégés, par exemple par estérification, par exemple avec l'alcool benzylique et, de préférence, avec le 15 tertio-butanol. Dans les restes de l'arginine, le groupe guani-dino peut, par exemple,être protégé par le groupe tosyle. Les peptides bisulfurés présentant des groupes de protection qui sont obtenus dans le présent procédé peuvent être utilisés directement pour la synthèse de peptides comportant une chaîne plus 20 longue d'acides aminés ou, si on le désire, les groupes de protection peuvent être éliminés d'une manière connue par hydrolyse ou par hydrogénolyse. Les peptides renfermant de la cystéine qui sont utilisés comme substance de départ, et leurs dérivés, sont connus 25 ou peuvent être préparés suivant des méthodes connues en elles-mêmes. Par dérivés il y a lieu d'entendre en particulier des peptides dans lesquels les groupes fonctionnels tels que, par exemple, les groupes aminogènes, les groupes carboxyle, les groupes hydroxy, sont pourvus des groupes de protection connus 30 indiqués ci-dessus ou d'autres groupes de protection connus pour la synthèse des peptides, ainsi que les composés qui, à la place d'un ou de deux restes cystéine à relier, renferment des restes désamino-cystéine. L'invention est décrite plus en détail dans les exem-35 pies non limitatifs qui suivent, dans lesquels les températures sont indiquées en degrés centigrades. Dans la chromatographie en couche mince, on utilise les systèmes suivants; 69 12962 2008194 Système 43 A : mélange (100 : 40 : 10) d'alcool amylique tertiaire, d'isopropanol et d'eau. Système 43 G : mélange (51 : 21 : 28) d'alcool amylique tertiaire, d'isopropanol et d'eau. Système 45 : mélange (70 : 30) de "butanol secondaire et 5 d'une solution aqueuse à 3 % d'ammoniac. Système 52 : mélange (75 : 7»5 : 21) de n-butanol, d'acide acétique glacial et d'eau. Système 53 : mélange (60 : 0,75 ' 39) de n-butanol, d'acide formique et d'eau. Système 70 : mélange (4-0 : 20 : 40) d'acétate d'éthyle, de 10 pyridine et d'eau. Système 101 : mélange (38 ": 24- : "8 : 30) de n-butanol, de pyridine, d'acide acétique glacial et d'eau. Système 102 E : mélange (50 : 30 : 10 : 10) d'acétate d'éthyle, de méthyl-éthyl-cétone, d'acide acétique glacial et d'eau. 15 Système 121 A : 'mélange (85 : 5 : 10) d'isopropanol, d'une solution à 26 % d'ammoniac et d'eau. On utilise les abréviations suivantes : BOG : tertiobutyl-oxycarbonyle ; TRI : trityle. L'exemple 1 montre la préparation de la séquence N-2q terminale protégée 1 - 9 de la thyrocalcitonine avec un anneau bisulfure ; les exemples 2 et 8 montrent la liaison bisulfure du fragment protégé 20 à 21 de la chaîne A avec le fragment protégé 18 à 21 ou 19 à 21 de la chaîne B de l'insuline ; les exemples 3, 7 et 9 montrent la préparation de dimère's peptidi-2^ ques protégés comportant un pont bisulfure ; les exemples 4- à 6 montrent la préparation de 1'oxytocine, de la Lys^-vasopressine 2 8 et de la Phé -, Lys - vasopressine suivant le nouveau composé. EXEMPLE 1 30 BOC-Cys-S ér(tBu)-Asn-Leu-oér-(tBu)-Thr(tBu)-Cys-Val-Leu-OH A une solution agitée de 3,73 g (14,78 m.moles) d'iode dans 5° ml de méthanol, on ajoute goutte-à-goutte à la température ambiante, au cours de 45 minutes, 2,50 g (1,478 m.mole) 35 de BOC-Cys(TRI)-Sér-(tBu)-Asn-Leu-Sér-(tBu)-Thr-(tBu)-Cys(TRI)-Val-Leu-OH dans 500 ml de méthanol. Lorsque l'introduction est terminée, on agite pendant une heure de plus à zéro degré avec une solution aqueuse 1,0-normale de thiosulfate (26,05 ml de 12962 5 2008194 thiosulfate normal). On concentre la solution limpide à 30° sous le vide de la trompe à eau jusqu'à un volume de 100 ml environ. On ajoute ensuite au tout 1,5 litre d'eau, filtre le produit qui a précipité et le lave à l'eau. Après séchage sur de l'hydroxyde de potassium, le produit "brut pèse 2,32 g. On le malaxe à deux reprises avec de l'éther de pétrole et, pour purifier, le soumet à une répartition à contre-courant dans un système (10 : 3 : 5 ï 4-) de méthanol, d'un tampon,de chloroforme et de tétrachlorure de carbone /tampon : 28,6 ml d'acide acétique glacial ; 19,25 g d'acétate.d'ammonium, complété à un litre avec de l'eau7. Après 135 stades, le produit principal se trouve dans les éléments 39 à 68 (rm =53 ; E = 0,65). On concentre le contenu de ces éléments à sec à 40° sous un vide poussé et élimine par sublimation l'acétate d'ammonium. Le composé obtenu, à savoir BOC-Cys-Sér(tBu)-Asn-Leu-Sér(tBu)Thr(tBu)-G^s-Val-Leu-OH (1,4-9 g - 83 % de la théorie) s'avère unitaire dans un chromatogramme en couche mince (gel de silice). Les valeurs de sont les suivantes : 0,4-2 dans le système 4-5 0,70 dans le système 121 A 0,75 dans le système 70 0,4-3 dans le système 53 0,22 dans le système 43 A. Le pouvoir rotatoire spécifique est : 23 L a~7j) ~ ~ 16° ( c = 2 dans le chloroforme) i Le nonapeptide protégé qui est utilisé comme matière de départ peut, suivant le procédé décrit dans la demande de brevet déposée en 3PRAUCE par la Demanderesse le 7 Novembre 1968 et ayant pour titre "Nouveaux peptides hypocalcémiants et procédé pour leur préparation", être préparé comme suit : î) H-Thr(tBu)-OMe Dans 200 ml d'acide acétique glacial et 3 g d'un charbon à 10 % de palladium, on hydrogène à la température ambiante 12,92 g (40 m.moles) de Z-Thr(tBu)-OMe. L'absorption d'hydrogène est terminée au bout d'une heure. On débarrasse'la solution du catalyseur par filtration et la concentre à 35° sous le vide de la trompe à eau. Après séchage à 35° sous un vide poussé, il en résulte 7^3 g d'une huile qui, d'après un chromatogramme en 69 12962 2008194 couche mince, est unitaire et est utilisée directement pour la suite du traitement. 2) DPC-Sér(tBu)-Thr(tBu)-OHe Dans 500 ml de chloroforme, on reprend 19 g (38,6 5 m.moles) de DPC-Sér(tBu)-OH, sous la forme du sel de cyclohe-xylamine, puis secoue à zéro degré à trois reprises avec 25 ml d'acide citrique normal et à 5 reprises avec 40 ml d'une solution semi-saturée de chlorure de sodium. Après avoir séché la solution sur du sulfate de sodium, on la concentre, puis re-10 prend l'écume obtenue dans 250 ml d'acétate d'éthyle. On ajoute au tout 5,36 ml (-38,6 m.moles) de tri-éthylamine, refroidit la solution à -10° et, tout en agitant, ajoute 5>13 ml (38,6 m. moles) de chlorocarbonate d'isobutyle. On agite pendant 10 minutes à -10° et ajoute ensuite goutte-à-goutte une solution 15 (refroidie à -12°) de 7?3 g (38,6 m.moles) de H-Thr-(tBu)-OMe dans 100 ml d'acétate d'éthyle, de manière que la température réactionnelle ne dépasse jamais -10°. Lorsque l'introduction est terminée, on agite encore pendant une heure à -10° et laisse reposer ensuite pendant line nuit à la température ambiante. 20 On débarrasse la solution par filtration du chlorhydrate de triéthylamine qui s'est formé et la lave à zéro degré, à trois reprises avec chaque fois 20 ml d'acide citrique normal et à 5 reprises avec une solution saturée de chlorure de sodium, la sèche et la concentre. Le produit brut est une huile repré-25 sentant 22,07 g. Pour la purifier, on en chromatographie un gramme sur une colonne de gel de silice (2,5 cm, 30 cm). Avec un mélange (1 : 1) d'éther de pétrole et d'acétate d'éthyle, on élue, après une fraction de tête de 110 ml, 787 mg de produit pur. 30 Dans un chromatogramme en couche mince sur du gel de silice, dans un mélange de toluène et d'acétone (7 : 3), la valeur de E^. est de 0,51. 3) Z-Val-Leu-OMe Dans 120 ml de diméthylformamide, on dissout 19,9 g 35 (110 m.moles) de chlorhydrate de H-Leu-OMe et ajoute, à zéro ' degré, 14,6 ml (105 m.moles) de triéthylamineo On sépare par filtration le chlorhydrate de triéthylamine qui s1 est formé, ajoute le filtrat à line solution de 25,1 g (100 m.moles) de 69 12962 7 2008194 Z-Val-OH dans 200 ml de diméthylformamide à zéro degré, et ajoute ensuite 22,6 g (110 m.moles) de dicyclohexyl-carbodiimide sec. Après avoir agité pendant une heure à zéro degré et avo±r laissé reposer pendant une nuit en glacière, on filtre et con-5 centre la solution à 4-0° sous un vide poussé. On reprend le rési du huileux dans 30 ml d'acétate d'éthyle, refroidit la solution à zéro degré et la débarrasse de la dicyclohexyl-urée qui s'est formée. Après addition de n-hexane, le produit cristallise dans le filtrat au cours d'une nuit. Il fond à 102 - 105° et présente 10 un pouvoir rotatoire spécifique /"â.7jp= - 4-1° (c = 2,88' dans le méthanol). Dans un chromato gramme en couche mince sur du gel de silice, dans un mélange (98 : 2) de chloroforme et de méthanol, la valeur de R^ est de 0,55 et elle est de 0,60 dans un mélange 15 (7 î 3) de toluène et d'acétone. 4) DPC-Sér(tBu)-Thr(tBu)-Mî-ffii-, A 4,253 g (7*4 m.moles) de DPC-Sér(tBu)-Thr(tBu)-OMe dans 18 ml de méthanol, on ajoute 5,55 ml (110 m.moles environ) d'hydrate d'hydrazine et laisse reposer pendant 10 heures à la température ambiante et pendant deux heures à 40°. On reprend la solution réactionnelle dans 450 ml d'acétate d'éthyle et lave à quatre reprises avec une solution semi-saturée de chlorure de sodium. Après avoir séché la solution sur du sulfate de sodium, on la concentre jusqu'à 15 ml environ et y 25 ajoute environ 5 ml d'éther de pétrole. Au cours d'une nuit, il cristallise 3^7 g de l'hydrazide fondant à 132 - 134-°. Dans lin chromato gramme en couche mince sur du gel de silice, dans un mélange de toluène et d'acétone (7 •' 3), la valeur de R^ est de 0,40. ^ 5) 'Chlorhydrate de H-Val-Leu-OMe Dans 75 ml de méthanol, et en présence de 15 m.moles d'acide chlorhydrique et de 850 mg d'un charbon à 10 % de palladium, on hydrogène à la température ambiante 5»66 g (15 m. moles) de Z-Val-Leu-OMe. L'absorption d'hydrogène est terminée ■55 ' ■ y au bout de trois heures. On séparé le catalyseur par filtration et concentre la solution jusqu'à 15 ml environ. En ajoutant de l'éther, on fait cristalliser le produit. Il fond à 136 - 139°. 20 69 12962 2008194 Dans un chromato gramme en couche mince sur du gel de silice, dans un mélange de chloroforme et de méthanol (9 : 1), là valeur de R^ est de 0,4-5 et elle est de 0,43 dans un mélange (1 : 1) de toluène et d'acétone. 5 6) TRI-Cys(TRI)-Val-Leu-OMe On lave avec de l'acide citrique normal et avec une solution semi-saturée de chlorure de sodium 7,13 g (10 m.moles) du sel de diéthylamine de TRI-Cys(TRI)-OH dans du chloroforme à zéro degré, sèche la solution, la concentre et reprend l'écu-10 me obtenue dans 50 ml d'acétate d'éthyle. On ajoute au tout une solution (additionnée de 1,4 ml, scfit 10 m.moles de triéthyla-mine) de 3,22 g (10 m.moles) de chlorhydrate de H-Val-Leu-OMe dans 40 ml d'acétate d'éthyle à zéro degré, solution de laquelle on a éliminé par filtration le chlorhydrate de triéthylamine 15 qui a précipité. On ajoute ensuite à zéro degré 2,26 g (11 m. moles) de dicyclohexyl-carbodiimide sec, agite pendant deux heures et demie à zéro degré et laisse reposer pendant une nuit-en glacière. On sépare par filtration la dicyclohexylurée qui s'est formée et lave la solution à zéro degré avec un solution 20 normale d'acide citrique, avec une solution normale de bicarbonate de sodium et avec aine solution semi-saturée de chlorure de sodium, puis sèche sur du sulfate de sodium. On concentre la solution jusqu'à 20 ml environ, la refroidit à zéro degré et la débarrasse par filtration d'une autre quantité de dicyclo-25 hexylurée. En concentrant à sec, on obtient 8,53 g d'ester. Pour purifier le produit brut, on le chromatographie sur une colonne de gel de silice (5 cm, 55 cm). Après une fraction de tête de 400 ml, on élue le produit principal sous forme pure avec 300 ml d'un mélange (1 : 1) d'éther de pétrole et d'acétate 30 d'éthyle. Dans un chromatogramme en couche mince sur du gel de silice, dans un mélange de chloroforme et de méthanol (99 : 1), la valeur de R^ est de 0,43o 7) H-Cys(TRI)-Val-Leu-OMe 35 Dans 75 ml d'acétate d'éthyle, on dissout 11,08 g (13 m.moles) de TRI-Cys(TRI)-Val-Leu-OMe et ajoute goutte-à-goutte 12,3 ml d'eau, de manière que la solution reste constamment limpide. Au bout d'une heure d'agitation à la température 69 12962 2008194 ambiante, on ajoute à la solution limpide 64 ml d'eau, sépare le précipité par filtration et le lave avec de l'acide acétique froid à 50 %• On concentre le filtrat sous un vide poussé à 40°, jusqu'à obtention d'une huile qu'on reprend dans 250 ml 5 d'acétate d'éthyle et lave à zéro degré avec une solution binor-male de carbonate de sodium et avec une solution saturée de chlorure de sodium. Après séchage sur du sulfate de sodium, on concentre, ce qui fait qu'on obtient 7,07 g d'un produit blanc. Le chromatogramme en couche mince sur du gel de silice, 10 dans un système de chloroforme et de méthanol (98 : 2), montre, lors d'un arrosage avec le réactif de Reindel-Hoppe, une tache d'une valeur de R^ de 0,30. 8) DPC-Sér(tBu)-Thr(tBu)-Cys(TRI)-"V"a 1-Leu-OMe A 13,6 g (23,8 m.moles) de DPC-Sér(tBu)-Thr(tBu)-ÏÏH^ 15 dans 220 ml de diméthylformamide, on ajoute, à -12°, 32,26 ml d'acide chlorhydrique dans l'acétate d'éthyle (1,84-normal ; 59,25 m.moles) et 3*26 ml (28,55 m.moles) de nitrite de tertio-butyle. Au bout de 15 minutes à.-10°, on ajoute alors goutte-à-goutte une solution (refroidie à -10°) de 14,03 g (23,8 m. 20 moles) de H-Cys(TRI)-Val-Leu-OMe et de 8,315 ml (59,25 m.moles) de triéthylamine dans 100 ml de diméthylformamide de manière que la température réactionnelle ne dépasse jamais -9°. On agite pendant une heure encore à -10° et laisse ensuite reposer pendant une nuit à la température ambiante. On sépare par filtra-25 tion le chlorhydrate de triéthylamine qui s'est formé, concentre le filtrat à 40° sous un vide poussé, reprend le résidu huileux dans 500 ml d'acétate d'éthyle, lave avec de l'acide citrique normal, avec une solution normale de bicarbonate de sodium et avec une solution saturée de chlorure de sodium, 30 sèche, concentre jusqu'à 40 ml environ et ajoute à peu près 10 ml d'éther de pétrole. Au cours d'une nuit, il cristallise l'ester pentapeptidique protégé qui fond à 177 - 178°. Dans un chromatogramme en couche mince sur du gel de silice, dans un mélange de chloroforme et de méthanol 35 (98 : 2), la valeur de R^ est de 0,45 et elle est de 0,57 dans un mélange de méthanol et d'acétone (7 : 3). 69 12962 2008194 9) DPC-Sér(tBu)-Thr(tBu)-Cys(TRI)-Val-Leu-OH Dans 60 ml de dioxanne à 75 on dissout 2,830 g (2 m.moles) de DPC-Sér(tBu)-Thr(tBu)-Cys(TRI)-Val-Leu-OMe et ajoute 3 ml (6 m.moles) d'une solution binormale d'hydroxyde 5 de sodium. Au "bout d'une heure et demie à la température ambiante, on évapore le dioxanne à 40° sous le vide de la trompe à eau, ajoute de l'acétate d'éthyle et de l'eau, puis ajuste à zéro degré à un pH d'une valeur de 3 avec une solution normale d'acide citrique. On lave la phase obtenue à l'acétate d'éthyle 10 avec une solution de chlorure de sodium, la sèche et la concentre. Il en résulte un produit qui, d'après un chromatogramme en couche mince sur du gel de silice, est unitaire. La valeur de R^ est de 0,40 dans un mélange de chloroforme et de méthanol (7 : 3) et elle est de 0,55 dans le système 45. 15 10) H-S ér-(tBu)-Thr(tBu)-Cys(TRI)-Val-Leu-OH Dans 20 ml de chlorure de méthylène, on dissout 2,22 g (2 m.moles) de DPC-Sér(tBu)-Thr(tBu)-Cys(TRI)-Val-Leu-OH et ajoute 12 ml d'une solution aqueuse d'acide cbbracétique (obtenue à partir de 75 g d'acide chloracétique et de 25 ml d'eau). 20 On ajoute la solution limpide pendant 15 minutes à la température ambiante, refroidit à zéro degré et ajoute ensuite 70 ml d'eau. On ajuste à un pH d'une valeur de 6,5 avec une solution concentrée d'ammoniac, ce qui fait que le produit précipite. On sépare la solution aqueuse par décantation et malaxe le rési-25 du à trois reprises encore avec de l'eau, puis lyophilise ensuite. En malaxant à trois reprises le produit avec de l'éther, on obtient une poudre blanche qui s'avère unitaire dans un chro-matogramme en couche mince. On l'utilise sous cette forme pour la suite du traitement. 30 Dans un chromatograjume en couche mince sur du gel de silice, la valeur de R^ est de 0,48 dans le système 45, de 0,65 dans le système 101 et de 0,75 dans le système 52. 11) 2-Asn-Leu-OMe Dans 100 ml de diméthyiformamide fraîchement distillé, 35 on dissout 16,7 g de H-Leu-OMe et 46,0 g de Z-Asn-ORP.- On laisse la solution reposer pendant 19 heures à 25°. On ajoute ensuite au tout 1,2 litre d'eau et sépare par essorage le précipité cristallin. On sèche le dérivé dipeptidique à 40° sous vide et 69 12962 2008194 le recristallise à deux reprises dans un mélange de méthanol et d'eau. Il fond à 180 - 181° et présente un pouvoir rota- toire spécifique PO + 9° (-c = 2,05 dans le chloroforme). 5 12) H-Asn-Leu-OMe Dans 400 ml d'ion mélange de tertio-butanol et d'eau (9 : 1)) on dissout 15,0 g de Z-Asn-OMe et hydrogène en présence de 2 g d'un charbon à 10 % de palladium. Lorsque l'hydrogénation est terminée, on sépare le catalyseur par essorage 10 et concentre à 40°. On utilise directement le résidu pour la suite du traitement. 13) Z-Sér(tBu)-Asn-Leu-OMe Dans 100 ml de diméthylformamide fraîchement distillé, on dissout 8,90 g de H-Asn-Leu-OMe et 11,0 g de Z-Sér(tBu)-OH. 15 On refroidit la solution à zéro degré et y ajoute 3,90 g de N-hydroxy-succinimide et ensuite 8,70 g de dicyclohexyl-carbodiimide . Après avoir laissé reposer pendant 30 minutes à zéro degré et pendant 18 heures à 23°, on sépare par essorage la dicyclohexylurée qui s'est formée et verse le filtrat dans 800 20 ml d'eau glacée. On sèche à 40° sous vide le précipité cristallin qui se forme alors et le recristallise ensuite dans un mélange de méthanol et d'eau. Le composé ainsi obtenu sous une forme pure à l'analyse, de formule Z-Sér(tBu)-Asn-Leu-OMe fond à 202 - 205° et présente un pouvoir rotatoire spécifique 25 Z~a_7^ = -18° (c = 1,05 dans l'acide acétique glacial). 14) H-S ér(tBu)-Asn-Leu-OMe Dans 600 ml de méthanol, on dissout 6,3 g de Z-Sér(tBu) Asn-Leu-OMe et hydrogène en présence de 1,2 g d'un charbon à 10 % de palladium. Au bout d'une heure un quart, on sépare 30 le catalyseur par essorage et concentre à sec sous vide, à une température de bain de 30°. Le dérivé tripeptidique cristallin que l'on obtient alors présente, dans une chromato graphie en couche mince sur des plaques de gel de silice, dans un système constitué par un mélange (90 : 10) de chloroforme et de méthanol, 35 une valeur de de 0,11. 15) BOC-Cys(IBI)-SérÇtBu)-Asn-Leu-OMe Dans 30 ml de diméthylformamide fraîchement distillé, on dissout 5,0 g de H-Sér(tBu)-Asn-Leu-OMe et 6,7 g de BOC- 69 12962 12 2008194 Cys(TRI)-ONP. On laisse la solution jaune reposer pendant 42 heures à 26°. On fait ensuite précipiter en ajoutant 500 ml d'eau glacée et sépare par essorage le produit qui a précipité. On le dissout dans de l'acétate d'éthyle et lave la solution 5 avec une solution à 5 % d'acide citrique et ensuite avec de l'eau. Tout en refroidissant avec de la glace, et pour éliminer le p-nitrophénol, on lave ensuite à 5 reprises avec un mélange d'une partie en volume d'une solution à 5 ?» de carbonate de potassium et d'une partie en volume d'une solution à 10 5 % de bicarbonate de potassium, et ensuite avec de l'eau. Par séchage et concentration, la, solution d'acétate d'éthyle abandonne un produit résineux. On reprécipite celui-ci à quatre reprises dans de l'acétone et dans de l'éther de pétrole. Le dérivé tétrapeptidique obtenu dans ce cas sous la forme d'une 15 poudre solide présente un point de fusion de 181 à 182° et un pouvoir rotatoire spécifique = - 11° (c = 2,09 dans le méthanol). Dans une chromatographie en couche mince sur des plaques de gel de silice, les valeurs de R^ sont les suivantes î 0,57 dans 20 le système 43 A, 0,10 dans l'acétate d'éthyle, 0,05 dans un mélange (7 '• 3) de toluène et d'acétone, et 0,45 dans un mélange (9 î 1) de chloroforme et de méthanol. 16) BOC-Cys(TRI)-Sér(tBu)-Asn-Leu-NH-MEL, 25 Dans 70 ml de méthanol, on dissout 7,0 g de BOC-Cys- (TRI)-Sér(tBu)-Asn-Leu-Ome et ajoute à la solution (refroidie à zéro degré) 7 ml d'hydrate d'hydrazine. Au bout de 16 heures à zéro degré, on ajoute une solution glacée de 600 ml d'acide acétique binormal, malaxe bien le précité gélatineux, essore 30 et lave avec beaucoup d'eau jusqu'à neutralité. On sèche la poudre obtenue à 40° sous vide et la met ensuite en suspension dans 100 ml d'acétonitrile. Après malaxage, on essore et sèche à 40° sous vide. L'hydrazide de BOC-Cys(TRI)-Sér(tBu)-Asn-Leu obtenu présente un point de fusion de 216 - 218°. 35 Dans une chromatographie en couche mince sur des plaques de gel de silice, il présente les valeurs de R^ suivantes : 69 12962 13 2008194 0,55 dans un mélange de dioxanne et d'eau (98 : 2) 0,52 dans un mélange de chloroforme et de méthanol (8 : 2) 0,70 dans le système 102 E. ^ 17) BOC-Cys(TRI)-Sér(tBu)-Asn-Leu-Sér(tBu)-Thr(tBu)-Cys(TRI)-Val-Leu-OH A 1,075 g (1,26 m.mole) de B0C-Cys(TRI)-Sér(tBu)-Asn-Leu-KH-KHg dans "15 ml de diméthylformamide, on ajoute, à -15°, 1,71 ml d'acide chlorhydrique dans l'acétate d'éthyle 10 (1,84-normal , 5,15 m.moles) et 0,174 ml (1,51 m.mole) de ni-trite de tertio-butyle (1,74- ml dans une solution d'un millilitre de nitrite de tertio-butyle, complétée à 10 ml avec du diméthylformamide). On agite la solution pendant 15 minutes à -10° et ajoute ensuite goutte-à-goutte une solution (refroidie 15 à -12°) de 1,104 g (1,26 m.mole) de H-Sér(tBu)-Thr-(tBu)-Cys-(TRI)-Val-Leu-OH et de 0,61 ml (4,41 m.moles) de triéthylamine dans 15 ml de diméthylformamide. On agite le mélange réaction-nel pendant une heure à -10° et pendant quatre heures à la température ambiante. Après avoir concentré sous un vide poussé 20 jusqu'à un petit volume et avoir ajouté de l'eau, on obtient un produit pulvérulent que l'on malaxe à deux reprises avec de l'eau et sèche ensuite sous un vide poussé sur une solution d'hydroxyde de potassium. On purifie ce produit brut par recristallisation. dans le méthanol. A partir d'une solution 25 méthanolique saturée-à 50°, il se sépare au cours d'une nuit à zéro degré une poudre blanche qui s'avère unitaire dans un chromatogramme en couche mince. Dans un chromatogramme en couche mince sur du gel de silice, les valeurs de R^ sont les suivantes;: 30 0,54 dans le système 45 0 0,65 dans le système 121 A 0,50 dans le système 45 0,75 dans le système .70 0,40 dans un mélange (8 : 2) de chloroforme et de 35 méthanol. ! 2962 14 2008194 EXEMPLE 2 BOC-Cys-Asn-OtBu B0C-Val-Cys-Gly-Glu(0tBu)2 A 172 mg (0,2 m.mole) de BOC-Val-Cys(TRI)-Gly-Glu-(OtBu^ et à 128 mg de BOC-Cys(TRI)-Asn-OtBu dans 5 ml d'acétate d'éthyle et 2 ml de méthanol, on ajoute 254 mg (une milli-mole) d'iode dans 5 ml de méthanol et laisse la solution reposer pendant une heure à la température ambiante. A zéro degré, on décolore ensuite avec une solution normale de thiosulfate, reprend le mélange réactionnel dans 200 ml d'acétate d'éthyle et lave à trois reprises avec de l'eau. En concentrant la solution d'acétate d'éthyle (séchée avec du sulfate de sodium) on fait précipiter sous forme cristalline le composé de formule /B0C-Cys-Asn-0tBu72 (32 mg, fondant à 184 - 196°) et on le sépare par filtration. On concentre le filtrat à sec et malaxe le résidu à deux reprises avec de l'éther de pétrole. A partir du résidu insoluble, on obtient, par une chromatographie en colonne sur du gel de silice, 90 mg du composé (I). Celui-ci présente, dans un chroma-togramme en couche mince sur du gel de silice, une valeur de de 0,25 dans un système de -chloroforme et de méthanol (95 : 5) et une valeur de R^ de 0,30 dans un système de toluène et d'acétone (1:1). Comme second produit, on obtient lors de la chromatographie en colonne 5^- mg de ^/ÏÏOC-Val-Cys-Gly-GluXOtBuJl/^ présentant sur du gel de silice une valeur de R^ de 0,55 dans un système de chloroforme et de méthanol (9 : 1)« Le dimère cristallin mentionné ci-dessus, d'un point de fusion de 174 -196° présente les valeurs de R^ suivantes sur du gel de silice : 0,25 dans un mélange de chloroforme et de méthanol (1:1) . ■ 0,18 dans un mélange de toluène et d'acétone (1 : 1). Les deux peptides de départ peuvent être préparés comme suit : 69 12962 2008194 1) Z-Asn-OtBu On dissout 32 g (120 m.moles) de Z-Asn-OH dans 600 ml de dioxanne et fait passer dans la solution, à -30°, 300 ml d1isobutylène. Après avoir ajouté 12 ml d'acide sulfurique con-5 centré, on ferme le ballon et laisse reposer pendant 20 heures à zéro degré, en secouant de temps à autre, ce qui fait qu'on obtient une solution limpide. On débarrasse largement celle-ci, à la température ambiante, de 11 isobutylène en excès. A la solution obtenue, on ajoute, à zéro degré, une solution aqueuse de 10 44- g de bicarbonate de potassium, concentre ensuite jusqu'à un petit volume et reprend dans de l'acétate d'éthyle. On lave la phase organique avec une solution normale de bicarbonate et ensuite avec de l'eau jusqu'à neutralité. Après avoir séché la solution d'acétate d'éthyle avec du sulfate de sodium, on la 15 concentre, ce qui fait que le produit commence à cristalliser. On ajoute encore du n-hexane et filtre. Le point de fusion est de 100 - 102° et le pouvoir rotatoire spécifique est Z~a_7ip = -16° (c = 2 dans le méthanol). Dans un chromatogramme en couche mince, sur du gel de silice, 20 la valeur de est de 0,27 dans un mélange de toluène et d'acétone (7 : 3) et elle est de 0,4-3 dans l'acétate d'éthyle. 2) H-Asn-OtBu Dans 200 ml d'acétate d'éthyle, et en présence de 2 g d'un charbon à 10 % de palladium, on hydrogène 23,6 g 25 (73,2 m.moles) de Z-Asn-OtBu. Au bout d'une heure, il n'y a plus d'hydrogène qui soit absorbé. On sépare le catalyseur par filtration. En concentrant le filtrat, on fait cristalliser le produit qui fond à 96 - 98° et présente un pouvoir rotatoire spécifique 30 /""œ_7j) = + 2° (c = 2,1 dans le méthanol). Dans un chromatogramme en couche mince, sur du gel de silice, la valeur de R^ est de 0,^0 dans le système 52 et de 0,5?0 dans • le système 4-5. 3) BOO-Cys(TRI)-Asn-0tBu 35 A 18,52 g (40 m.moles) de B0C-Cys(TRI)-0H' et à 5,6 ml (4-0 m.moles) de triéthylamine dans 200 ml de tétrahydrofuranne, on ajoute, à -10°, 5,32 ml (40 m.moles) de chlorocarbonate d'iso-butyle et agite pendant 10 minutes à cette température. 69 12962 16 2008194 On ajoute goutte-à-goutte une solution (refroidie à -10°) de 7,52 g (4-0 m.moles) de H-Asn-OtBu dans 150 ml de tétrahydrofu-ranne et laisse le mélange' reposèr pendant une heure à -10° et pendant une nuit à la température ambiante. On sépare ensuite 5 par filtration le chlorhydrate de triéthylamine qui a précipité, concentre le filtrat à sec, reprend le résidu dans de l'acétate d'éthyle et lave avec une solution normale d'acide nitrique, avec une solution normale de bicarbonate de sodium et avec de l'eau. En concentrant la solution d'acétate d'éthyle et en 10 ajoutant de l'éther de pétrole, on fait cristalliser le produit. Ce dernier fond à 155 - 157° et présente un pouvoir rotatoire spécifique Ca_7]P ~ + 54-° (c = 2,1 dans le chloroforme). Dans un chromatogramme en couche mince, sur du gel de silice, 15 les valeurs de E^ sont les suivantes : 0,4-5 dans un mélange de toluène et d'acétone (1 : 1) 0,33 dans un mélange de chloroforme et de méthanol (95 : 5) 0,65 dans le système 4-5 A. 20 ^ Z-Gly-Glu(OtBu)2 A une solution de 23,2 g (0,11 mole) de Z-Gly-OH et de 15,54 ml (0,11 mole) de triéthylamine dans 200 ml de tétrahy-drofuraime, on ajoute, à -10°, 14-,97 ml (0,11 mole) de chloro-carbonate d'isobutyle et laisse reposer pendant 10 minutes à 25 -10°. On débarrasse du chlorhydrate de triéthylamine, par filtration, un mélange de 28,52 g (96,5 m.moles) de chlorhydrate de H-Glu(0tBu)2 et de 13,5 ml (96,5 m.moles) de chlorhydrate de triéthylamine dans 300 ml de tétrahydrofuranne, refroidit le filtrat à -10° et ajoute ensuite goutte-à-goutte, à -10°, dans 30 la solution ci-dessus. On agite encore pendant une heure à -10° et pendant deux heures à la température ambiante, sépare par filtration le chlorhydrate de triéthylamine qui a précipité et concentre le filtrat à sec. On reprend l'huile obtenue dans de l'acétate d'éthyle et lave avec une solution normale d'acide 35 citrique, avec une solution normale de bicarbonate de sodium et avec de l'eau. Après avoir évaporé l'acétate d'éthyle, on obtient le dérivé peptidique qui cristallise dans un mélange d'acétate d'éthyle et de n-hexane. Il fond à 74; - 76° et présente un pouvoir rotatoire spécifique ^fô_7jp = -17° (c = 2,2 dans le méthanol). 12962 17 2008194 Dans un chromatogramme en couche mince, sur du gel de silice, la valeur de R^ est de 0,50 dans un mélange de toluène et d'acétone (7:3)» 5) H-Gly-Glu(0tBu)o Dans 30 ml d'acétate d'éthyle, et en présence de 250 mg d'un charbon à 10 % de palladium, on hydrogène 2,7 g (6 m. moles) de Z-Gly-Glu-(OtBu)2• Au "bout de 4 heures, l'absorption d'hydrogène est terminée. On sépare le catalyseur par filtration et concentre la solution. On obtient le produit sous la forme d'une huile qui s'avère unitaire daas une chromatographie en couche mince. Les valeurs de R^ sur du gel de silice sont les suivantes : 0,27 dans un mélange de toluène et d'acétone (7 : 3) 0,37 dans un mélange de chloroforme et de méthanol (9 ; 1) 0,50 dans le système 4-3 A. 6) TRI-Cys(TRI)-Gly-Glu(OtBu)2 A 26,6 g (44 m.moles) de TRI-Cys(TRI)-0H et à 13,9 g (44 m.moles) de H-Gly-Glu(0tBu)2 dans 350 ml d'acétate d'éthyle, on ajoute, à zéro degré, 9,06 g (44 m.moles) de dicyclohexyl-carbodiimide, agite pendant deux heures à zéro degré et laisse reposer pendant une nuit en glacière. On sépare ensuite par filtration la dicyclohexylurée qui a précipité, lave le filtrat avec de l'acide citrique normal, avec une solution normale de bicarbonate de sodium et avec de l'eau, sèche la solution , puis concentre. Le produit cristallise dans un mélange d'acétate d'éthyle et de n-hexane. Il fond à 107 - 110° et présente un pouvoir rotatoire spécifique /~a_7^p = + 8° (c = 2,0 dans le méthanol). Dans un chromatogramme en couche mince, sur du gel de silice, les valeurs de R^ sont les suivantes : 0,70 dans un système de toluène et d'acétone (7 :3) 0,78 dans un mélange de chloroforme et de méthanol (98 : 2). 7) H-Cys(TRI)-Gly-Glu(OtBu)^ A 3,156 g (3,5 m.moles) de triéthylamine dans 20 ml d'acide acétique glacial, on ajoute à la température ambiante 5 ml d'eau, de manière que le précipité formé se redissolve constamment. Au bout de 10 minutes environ, il se produit ion 12962 18 2008194 louche et il y a formation d'un précipité. On agite pendant une heure, ajoute ensuite 15 ml d'eau et filtre. On concentre le filtrat à 4-0° sous un vide poussé, reprend le résidu dans de l'acétate d'éthyle, puis lave à zéro degré avec une solution demi-normale de "bicarbonate de sodium et avec de l'eau. On malaxe avec de l'éther de pétrole l'écume obtenue après évaporation. Dans un chromâtogramme en couche mince sur du gel de silice, le produit présente les valeurs de R^ suivantes : 0,40 dans un mélange de chloroforme et de méthanol (95 : 5) 0,55 dans un mélange de toluène et d'acétone (1 : 1) 0,60 dans le système 43 A„ 8) BOC-Val-Cys(TRI)-Gly-Glu(OtBu)2 A 7,17 g (33 m.moles) de BOC-Val-OH et à 4,62 ml (33 m.moles) de .triéthylamine dans 80 ml d'acétate d'éthyle, on ajoute, à -10°, 4,4 ml (33 m.moles) de chlorocarbonate d'iso-butyle.et agite pendant 10 minutes à -10°. On ajoute goutte-à-goutte une solution (refroidie à -10°) de 21,92 g (33 m.moles) de H-Cys(TRI)-Gly-Glu(0tBu)2dans 400 ml d'acétate d'éthyle, puis maintient le mélange pendant une heure encore à -10° et pendant 10 heures à la température ambiante." On concentre ensuite à sec, malaxe le résidu à deux reprises avec chaque fois 200 ml d'eau et le sèche sur du pentoxyde de phosphore. On dissout le résidu dans 450 ml de méthanol chaud. Le produit cristallise au cours d'une nuit à zéro degré. Il fond à 213 - 215° et présente un pouvoir rotatoire spécifique _7jp = + 19° (c = 2,2 dans le chloroforme). Dans un chromatogramme en couche mince sur du gel de silice, les valeurs de R^ sont les suivantes : 0,18 dans un système de cyclohexane et d'acétate d'éthyle (1:1) 0,65 dans un système de toluène et d'acétone (1 . 1) EXEMPLE 3 A 172 mg (0,2 m.mole) de BOC-Val-Cys(TRI)-Gly-Glu- . (0tBu)2 dans 5 ml d'acétate d'éthyle et 2 ml de méthanol, on ajoute 127 mg (0,5 m.mole) d'iode dans-2,5 ml de méthanol et laisse le mélange réactionnel reposer pendant une heure à la 69 12962 19 2Ô08194 températtire ambiante. On décolore ensuite la solution à zéro degré avec une solution normale de thiosulf ate, reprend dans 200 ml d'acétate d'éthyle et lave à trois reprises avec de l'eau. Après avoir concentré la solution d'acétate d'éthyle, 5 on obtient un produit qu'on malaxe à deux reprises avec de l'é-ther de pétrole. Le composé de formule /E0C-Val-Cys-Gly-Glu(0tBu)2_72 s qui est insoluble dans l'éther de pétrole, s'avère unitaire dans une chromatographie en couche mince. Le rendement est de "123 mg, 10 soit 100 cjo. 15 i 1 BOC-Gys-Tyr (tBu)-Ile-Gln-Asn-Gys-Pro-Leu-Gly-MH2 A -une solution de 620 mg d'iode dans 150 ml de méthanol on ajoute goutte-à-goutte à 25°, au cours de 4-5 minutes, tout en agitant fortement, 500 mg de BOG-Cys(TRI)-Tyr(tBu)-Ile-Gln-Asn-Cys (TRI) -Pro-Leu-Gly-NÏÏ^ en solution dans 100 ml de métha-20 nol. On agite pendant une heure de plus, puis refroidit ensuite la solution à 5° et la décolore en y ajoutant une solution aqueuse 1,0-normale de thiosulfate de sodium. On. concentre ensuite la solution sous le vide de la trompe à eau jusqu'à un volume de l'ordre de 5 ml et fait précipiter le produit en ajou-25 tant beaucoup d'eau. On le sépare par essorage et le sèche sous vide sur de l'hydroxyde de sodium. En vue de transformer le produit en lfoxytocine libre, on le met en suspension dans 5 ml d'acide chlorhydrique concentré glacé et dissout tout en agitant. Au bout de 10 minutes à zéro degré, on dilue la solution avec 30 20 ml d'eau glacée, ajoute au tout 5 ml d'acide acétique glacial, filtre sur une colonne d'un échangeur d'ions "Merck N° II" faiblement basique, sous la forme acétate, puis lave avec de l'acide acétique à 20 On concentre ensuite sous vide à 30°, dissout le résidu dans de l'eau et lyophilise la solution. 35 L1oxytocine brute obtenue peut, si on le désire, être davantage purifiée suivant le procédé décrit par Yamashiro dans la publication intitulée "Nature 201 ", 76 (1964-). 69 5 10 15 20 25 30 35 4-0 12962 20 2008194 Le dérivé nonapeptidique protégé qui est utilisé comme matière de départ, à savoir BOC-Cys(TRI)-Tyr(tBu)-Ile-Gin- Asn-Cys( TRI) -Pro-Leu-Gly-ïïH^ peut être préparé comme suit : 1) TRI-CysÇTRI)-Pro-Leu-Gly-M2 Dans 500 ml de diméthylformamide fraîchement distillé, on dissout 30 g de H-Pro-Leu-Gly-NH^? puis ajoute à la solution, préalablement refroidie à 5°, 70 g de TRI-Cys-0?RI)-OH, 20 g de ïT-hydroxy-succinimide et 30 g de dicyclohexyl-carbodiimide. Àu "bout de 30 minutes à zéro degré, on échauffe à la température ambiante et laisse reposer pendant 18 heures. On sépare ensuite par essorage la dicyclohexylurée qui" a précipité, concentre le filtrat à 40° sous un vide poussé et ajoute un litre d'éther de pétrole au résidu. Après avoir malaxé à fond le produit insoluble, on sépare la solution d'éther de pétrole par décantation. On reprend dans de l'acétate d'éthyle le précipité insoluble dans l'éther de pétrole, lave la solution à zéro degré avec de l'acide citrique dilué, avec de l'eau, avec une solution de bicarbonate de sodium et à nouveau avec de l'eau, la sèche avec du sulfate de sodium et la concentre à sec. Le dérivé tétrapep-tidique brut ainsi obtenu, à savoir TRI-Cys(TRI)-Pro-Leu-Gly- est pour être purifié, dissous dans du méthanol, puis filtré sur une colonne de "Sephadex LH 20". On concentre les fractions obtenues et contrôle leur pureté à l'aide d'une chromatographie en couche mince sur des plaques de gel de silice, dans un système constitué par un mélange (99 : 1) de chloroforme et de méthanol. On réunit les fractions pures, les concentre et les sèche. 2) H-Cys(TRI)-Pro-Leu-Gly-ML, Pour éliminer le groupe Ï^-TRI, on dissout 5 g de TRI-Cys(TRI)-Pro-Leu-Gly-ïïH2 dans 100 ml d'acide acétique à 80 % et laisse la solution reposer pendant une heure à 35°• On ajoute ensuite au tout 100 ml d'eau et laisse reposer pendant 5 heures à zéro degré. On sépare ensuite par essorage les cristaux de triphénolcarbinol qui se sont formés, concentre le filtrat à sec et sèche le résidu à 30° sous un vide poussé. Pour le transformer en la base libre, on dissout dans du chloroforme le composé de formule H-Cys(TRI)-Pro-Leu-Gly-WH2 obtenu à l'état d'acétate, lave la solution avec une solution diluée de bicarbonate de sodium, sèche sur du sulfate de sodium et concentre. BAD ORIGINAL 69 12962 21 2008194 3) Z-Tyr(tBu)-Ile-Gln-Asn-OH Dans ?0 ml d'eau et 1,5 ml de triéthylamine, on dissout 4,05 g de H-Ile-Gln-Asn-OH, ' puis ajoute 200 ml de diméthylformamide. On ajoute ensuite 8 g d'ester p-nitrophénylique de 5 Z-Tyr(tBu) /préparé à partir de Z-Tyr(tBu)-OH et de p-nitro-phénol à l'aide de dicyclohexyl-carbodiimide, fondant à 88 -89° après recristallisation dans ion mélange de méthanol et d'eau_7, puis laisse reposer pendant 72 heures à la température ambiante. On concentre alors sous vide à 40° jusqu'à 20 ml en-10 viron, ajoute 100 ml d'une solution demi-normale de bicarbonate de sodium et 200 ml d'éther, sépare la solution éthérée et refroidit la phase aqueuse dans de la glace. Après avoir acidifié avec de l'acide chlorhydrique binormal, on sépare par essorage le composé de formule Z-Tyr(tBu)-Ile-Gln-Asn-OH qui s'est formé 15 et le lave avec de l'eau glacée. Pour le purifier, on le précipite à nouveau avec de l'éther dans une solution de diméthylformamide . 4) H-Tyr C tBu)-Ile-Gln-Asn-OH Dans 50 ml d'acide acétique à 90 5£, on dissout 1,2 g 20 du dérivé tétrapeptidique obtenu sous 3), puis hydrogène en présence de 0,5 g d'un charbon à 10 % de palladium. Lorsque l'hydrogénation est terminée, on sépare le catalyseur par essorage, évapore le filtrat à sec sous vide et sèche le résidu à 40° sous un vide poussé. 25 5) BOC-Cys(TRI)-Tyr(tBu)-Ile-Gln-Asn-OH On met le produit obtenu sous 4) en suspension dans 35 ml de diméthylformamide et 0,5 ml de triéthylamine, puis fait passer en solution par addition d'eau. On ajoute alors 1,0g d'ester p-nitrophénylique de BOC-Cys(TRI) et laisse le mélange 30 réactionnel reposer pendant 48 heures à 28°. On concentre ensuite à 35° sous un vide poussé, ajoute au résidu 100 ml d'une solution normale glacée d'acide chlorhydrique, puis sépare par essorage le dérivé pentapeptidique brut. Après lavage avec de l'eau glacée et séchage, on reprécipite à plusieurs reprises 35 dans un mélange de diméthylformamide et d'éther. Pour purifier davantage, on dissout dans du méthanol et chromatographie sur line colonne de "Sephadex LH 20". 69 12962 ** 2008194 6 ) 300-CTsCrEI')-TTr(tBu1-Xle-ain-Asn-CTBCtRX')-Ero-Leu-&lT-mi2 Dans 50 ml de diméthylformamide et en ajoutant un gramme de N-hydroxy-succinimide, 0x1 dissout 2,1 g du dérivé tétrapeptidique obtenu sous 2) et 3,3 g de BOC-Cys(TRI)-Tyr-5 (tBu)-Ile-Gln-Asn-OH. Après avoir refroidi la solution à -20°, on y ajoute 0,9 g de dicyclohexyl-carbodiimide, puis laisse reposer pendant deux heures à -20° et ensuite pendant 48 heures à la température ambiante, en ajoutant chaque fois, au bout de 6 heures, de douze heures et de dix-huit heures une autre quan-10 tité de 200 mg de dicyclohexyl-carbodiimide. On sépare ensuite par filtration le dicyclohexyl-- carbodiimide qui s'est formé, concentre le filtrat jusqu'à un petit volume sous un vide poussé, à xine température de bain de 4-0°, et précipite le dérivé nonapeptidique par addition d'éther. On sépare la poudre par 15 essorage, la sèche, la malaxe avec de l'eau, la sépare à nouveau par essorage et la sèche. Le composé de formule BOG-Cys(TRI)-Tyr(tBu)-Ile-Gln-Asn-Cys(TRI)-Br o-Leu-Gly-ffiig que l'on obtient ainsi à l'état brut est, pour être purifié, soumis à une répartition à contre-courant dans le même système 20 que celui décrit dans l'exemple 1. EXEMPLE 5 BOC-Cys-Tyr(tBu)-Phé-Gln-Asn-Gys-Pro-Lys(BOC)-Gly-KHp 25 A une solution de 1.120 mg d'iode dans 500 ml de méthanol, on ajoute goutte-à-goutte à la température ambiante, au cours de 4-5 minutes, en agitant fortement, une solution de 800 mg de BOC-Cys(TRI)-Tyr(tBu)-Phé-Gln-Asn-Cys(TRI)-Pto-30 Lys(B0C)-Gly-NH2 dans 500 ml de méthanol. On refroidit ensuite la solution à 2° et la décolore en y ajoutant goutte-à-goutte une solution aqueuse normale de thiosulfate de sodium. On concentre ensuite jusqu'à un petit volume sous le vide de la trompe à eau, à une température de bain de 30°, puis fait préci-35 piter le produit en ajoutant beaucoup d'eau. On le sépare par essorage et le sèche dans un exsiccateur sous vide. En vue de le transformer en lysine-.-vasopressine, on dissout le composé de formule 69 12962 23 2008194 BOC-Cys-Tyr ( tBu) -Phé-Gln-Asn-Cys-Pr o-Lys (BOC )-Gly-NH^ dans "10 ml d'acide chlorhydrique concentré glacé, tout en agitant. Au "bout de 10 minutes à zéro degré, on dilue avec 50 ml d'eau glacée et ajoute au tout 5 ml d'acide acétique glacial. 5 On filtre ensuite sur une colonne d'un échangeur d'ions "Merck U° xi" faiblement "basique, sous la forme acétate, filtre, puis concentre l'éluat à sec. Le dérivé nonapeptidique protégé qui est utilisé comme matière de départ, de formule i 0 Boc-Cys ( TRI)-Tyr ( tBu) -Phé-Gln-Asn-Cys (TRI) -Pr o-Lys ( BOC )-Gly-KH2, peut être préparé d'une manière analogue à celle indiquée dans l'exemple 4 pour l'amide nonapeptidique protégé, par condensation de BOC-Cys(TRI)-Tyr(tBu)-Phé-Gln-Asn-OH avec H-Cys(TRI)-Pro-Lys(BOC)-Gly-NB^ en présence de dicyclohexyl-carbodiimide 15 et de N-hydroxy-succinimide. La préparation des produits intermédiaires peut avoir lieu également d'une manière analogue. EXEMPLE 6 20 BOC-Cys-Phé-Phé-Gln-Asn-Cys-Bro-Lys(BOC)-Gly-NH^ Ce composé peut, suivant le procédé décrit dans l'exemple 5, être préparé à partir de BOC-Cys(TRI)-Phé-Phé-Gln-Asn-Cys(TRI)-Pro-Lys(B0C)-Gly-KH2 ^ être transformé en Phé^-, Lys^-25 vas opr e s s ine. EXEMPLE 7 Dans 25 ml de méthanol, on laisse réagir pendant une heure à la température ambiante 1,524 g de BOC-Cys(TRI)-Gly-30 Glu(0tBu)2 et 508 mg d'iode. En ajoutant goutte-à-goutte une solution aqueuse normale de thiosulfate de sodium, on décolore la solution réactionnelle à zéro degré et précipite le produit avec 50 ml d'eau. Après avoir séché le produit brut, on le malaxe à trois reprises avec chaque fois 10 ml d'éther de pétrole.-35 Eo- cristallisant le résidu dans un mélange d'acétate d'éthyle et d'éther de pétrole, on obtient 945 mg, soit 91 %, du composé de formule /B0C-Cys-Gly-Glu(OtBu)2_72 12962 24 2008194 qui fond à 150 - 152° et présente une valeur de Rf de 0,60 dans un mélange de chloroforme et de méthanol (9 : 1)<> EXEMPLE 8 On fait réagir et traite, comme indiqué dans l'exemple 7 7,762 mg (1,0 m.mole) de BOC-Cys(TRI)-Gly-Glu(0tBu)2 et 634 mg (1,0 m.mole) de BOC-Cys(TRI)-Asn-0tBu sur 508 mg (2,0 m.mole) d'iode. Le produit présente, dans un chromatogram-me en couche mince sur du gel de silice, trois taches dans un système de chloroforme et de méthanol (9 : 1) J R^ = 0,60 (/B0C-Cys-Gly-Glu(0tBu)2_72 - I) R^ = 0,25 (^E0C-Cys-Asn-0tBu72 = H) » e"k R^ = 0j45 (BOC-Cys-Asn-OtBu B0C-Cys-Gly~Glu/T)tBu72 = III)» La séparation a lieu par line répartition à contre-courant, dans un système constitué par un mélange (4:2:1 : 3) cLe méthanol d'une solution décimolaire d'acétate d'ammonium, de chloroforme et de tétrachlorure de carbone. Au bout de 100 stades, le composé (II) se trouve dans les éléments 56 à 76 (rm ^ = 65 ; K = 1,85). On vide ces éléments, garnit de phase inférieure fraîche et effectue cent autre stades. Le composé (III) se trouve alors dans les tubes 8 à 25 (^max =16 ; E = 0,09) et le composé (I) dans les éléments zéro à 5» En concentrant ces fractions et en éliminant l'acétate d'ammonium par sublimation, on obtient les trois composés sous line forme qui s'avère pure dans une chromatographie en couche mince : Le composé (I) fond à 150 - 152° après cristallisation dans un mélange d'acétate d'éthyle et d'éther de pétrole ; le rendement est de 225 mg.(statistique : 260 mg). Le composé (II) fond à 194- - 196° après recristallisa tion dans un mélange de méthanol et d'éther ; le rendement est de 162 mg (statistique : 195 mg). Le composé (III) est amorphe ; le rendement est de ' 463 mg. Si l'on effectue la réaction avec une millimole de BOC-Cys(TRI)-Gly-Glu(0tBu)2 « avec 2 millimoles de BOC-Cys(TRI) Asn-OtBu et 3 m.moles d'iode, on isole alors 580 mg du composé (III) (statistique : 606 mg). 69 12962 25 2008194 EXEMPLE 9 A 254- mg (\ine millimole) d'iode dans 5 ml d'acide acétique glacial, on ajoute une solution de 380 mg (0,5 m.mole) de BOC-Cys(TRI)-&ly-Glu(0tBu)2 et de 45 mg (0,55 m.mole) d'acé-5 tate de sodium anhydre dans 5 ml d'acide acétique glacial, puis agite pendant une heure à la température ambiante. En ajoutant une solution normale de thiosulfate de sodium (1,7 ml), on décolore la solution "brute ; on ajoute une autre quantité de 5 ml d'acide acétique glacial et lyophilise. On reprend dans de 10 l'eau la poudre résultante, filtre et lave "bien le résidu avec de l'eau. Après séchage sur du pentoxyde de phosphore, on obtient, par recristallisation dans xm mélange d'acétate d'éthyle et d'éther de pétrole, 205 mg, soit 80 %, de /BOC-Cys-Gly-Glu-(0tBu)2_72 fondant à 151 - 152°. 12962 26 2008194 REVENDICATIONS 1. Procédé de préparation de peptides renfermant de la cystine et de leurs dérivés, à partir de séquences d'acides aminés renfermant de la cystéine, et dans lesquelles les groupes mercapto sont protégés par des groupes trityle, caractérisé par le fait qu'on traite par de l'iode la ou les séquences d'acides aminés renfermant les restes cystéine à relier. 2. Procédé suivant la revendication 1, caractérisé par le fait qu'on effectue la. réaction à des températures de zéro à 60°C. 3- Procédé suivant les revendications 1 ou 2, caractérisé par le fait qu'on effectue ,1a réaction dans du méthanol. 4. Procédé suivant les revendications 1 ou 2, caractérisé par le fait qu'on effectue la réaction dans de l'acide, acétique glacial. 5. Procédé suivant les revendications 1 à 4, caractérisé par le fait qu'on utilise, comme substance de départ, une séquence d'acides aminés renfermant de la cystéine, dans laquelle il y" a deux restes cystéine, de sorte qu'on forme le pont bisulfure donnant lieu à la'formation d'un peptide cyclique. 6. Procédé suivant les revendications 1 à 5j caractérisé par le fait qu'on effectue la réaction en solution diluée . 7. Procédé suivant les revendications 1 à 4, caractérisé par le fait qu'on utilise comme substance de départ une séquence d'acides aminés qui ne renferme qu'un reste cystéine, de sorte que le dimère est formé avec le pont bisulfure. 8. Procédé suivant les revendications 1 à 4, caractérisé par le fait qu'on utilise comme substances de. départ deux séquences différentes d'acides aminés qui renferment chacune un reste cystéine, de sorte que 2 séquences différentes d'acides aminés sont formées, qui sont reliées par un pont bisulfure. 9. Les peptides et dérivés renfermant de la cystine qui sont obtenus suivant le procédé des revendications précé 12962 27 2008194 dentes. 10. Les dérivés peptidiques renfermant de la cystine qui sont décrits dans les exemples.