FR 2009615 A1 19700206 FR 6917630 A 19690529 69 17630 1 2009615 La présente invention a pour objet des dérivés de l'insuline qui ont une activité thérapeutique, ainsi que des procédés pour les utiliser. Elle concerrP plus particulièrement, des insulines acyl-substituées en particulier des insulines phényl- et phényl-5 glycol substitué, et plus spécialement la N-phénylglycyl-insuline la N-p-méthylphénylglycyl-insuline et la N-p-chlorophénylglycy1-insuline qui sont actives pour abaisser le taux de sucre dans le sang. L'utilisation de l'insuline comme agent pour abaisser le 10 taux de sucre dans le sang et contrôler les diabètes est connue. Toutefois, l'insuline par ella-même est instable et les présentations pharmaceutiques qui contiennent de l'insuline doivent être gardées en réfrigérateur et être stabilisées par l'addition de matières qui peuvent entraîner la formation de réactions secondai-15 res contraires chez certains individus susceptibles. En outre, l'insuline possède une durée d'action assez courte de 6 à 8 heures seulement environ, ce qui nécessite plusieurs administrations par jour. On a modifié l'hormone insuline en formant des dérivés tels que les complexes de zinc, les complexes de zinc et de protamine, 20 etc.; ils possèdent des durées d'action ou une activité plus longue, mais sont difficiles à préparer du fait que leur dimension particulaire agit sur la durée de leur activité, et ils sont difficiles à utiliser, car il faut disperser la matière active avant de l'administrer. En outre, de nombreux sujets diabétiques ne sup-25 portent pas facilement des doses régulières des formes actuelles d'insuline. Certains sujets, décrits ici comme "diabétiques résistant à l'insuline", présentent des signes de résistance à l'insuline . Ceux-ci sont surmontés en administrant des doses inhabituel-lement élevées des types actuels d'insuline. La résistance semble 30 provenir du développement d'anti-corps qui paraissent rendre inactifs le type actuel d^insuline. Ainsi, un besoin existe pour des formes d'insuline qui sont très efficacee/bomme agents hypoglycémi-ques dans le traitement des diabètes; qui présentent de longues durées d'activité avec un début d'action rapide; qui sont bien to-35 îérées par le sujet; et qui sont moins antigènes que les types actuels d'insuline. L'invention produit de tels composés. Les composés de l'invention sont des insulines acyl-substituée s dans lesquelles le groupe acyle est un groupe N-phénylglycyle ou N-phénylglycyle substitué, en particulier un groupe N-alkyle-inf. 69 1763Ô 2 2009615 phénylglycyle, tel que le groupe N-p-méthyLghénylglycyle, ou N-halo phénylglycyle tel que le groupe N-p-chlorophénylglycyle, c'est-à-dire un groupe de formule : 10 dans laquelle R est, respectivement, l'hydrogène, un alkyle inférieur ou un halogène. L'invention vise plus particulièrement un composé, la N-phénylglycyl-insuline, dans laquelle R dans le groupe aeyle est l'hy-15 drogène. La présente invention a également pour objet une méthode pour traiter les diabètes, qui consiste à administrer à un diabétique résistant à l'insuline 1 à 200 unités environ d'une insuline acyl-substituée dans laquelle le groupe acyle est tel que défini ci-20 dessus. Les nouvelles insulines acyl-substituées (I) de la présente invention peuvent être préparées par de nombreux procédés connus dans la technique pour synthétiser des peptldes. Tous consistent en général , à faire réagir l'insuline avec un dérivé réactif (a-25 gent d'acylation) d'une phénylglycine N-phényl- ou N-substituée jusqu'à ce que 11acylation soit à peu près complète, et à récupérer cette insuline acyl-substituée. Ler> dérivés appropriés de la phénylglycine N-phényl- ou N-substitué, tous étant préparés conformément à des techniques bien connues des spécialistes, comprennent 30 la N-chloroformyl-N-(phényl- ou substitué- phényl)-glycine.; l'anhydride de la N- c ar boxy- N - ( phényl - ou substitué-phényl)glycîne.; la N»(phényl- ou substitué-phényl)glycine substituée par des groupes de blocage carbobenzoxy, triphénylméthyle ou triflucroacétyle; des dérivés tels que 1'azide, le chlorure d'aeide, l'anhydride mixte, 35 l'ester actif, le carbodiimide, etc. Les dérivés anhydride d'acide N-chloroformyle et N-c arboxyamino sont particulièrement intéressants. Oîi procède de préférence en utilisant le dérivé N-chlorofor-myle, de la façon suivante„ 0 5 69 17630 3 2009615 OH + HgN—^Losi.ili jt e ^ —iTH———Insuline +00^ + HC1 I 15 R étant tel que défini ci-dessus. Les composés de l'invention de formule I sont de préférence ceux dans lesquels tous les groupes a -amino libres dans l'insu-20 line ont été substitués à peu près complètement par réaction avec un réactif formant le groupe acyle. Les dérivés O-acylés sont exclus expressement car si on peut les obtenir, ils doivent être formés par d'autres techniques. Les spécialistes dans ce domaine savent que bien que l'insuline est une molécule complexe ayant un poids 25 moléculaire relativement élevé (environ 24 000 à pH de 7,5 environ), chaque molécule de l'hormone contient 12 groupes a-amino libres à pH neutre (M.E. Krahl, "L'action de l'insuline sur les cellules", New-York, Academic Press,p. 160 (1961). Ce sont les groupes amino qui peuvent réagir avec l'agent d'acylation, par exemple le dérivé 30 N-phénylglycine de formule II, et les composés' de la présente invention contiennent donc de préférence environ 12 groupes acyle par molécule d'insuline. L'invention concerne toutefois également les insulines mono(acyl)substituées et poly(acyl)substituées, "mono" signifiant dans ce cas un, et "poly" par exemple 2 à 9 groupes 35 acyle environ ou davantage, attachés à chaque molécule d'insuline. En se référant plus particulièrement à la structure de l'insuline, telle que décrite, par exemple, par T.E. Prout dans "Métabolisme", 12, 673 (1963)» page 674, les groupes ce -amino libres acy-lés conformément à l'invention sont ceux de la glycine (en position 69 17630 4 2009615 A-1) de la phénylalanine (-1) et de la lysine (B-29). Par suite des empêchements stériques, aucune acylatlon ne se produit dans le groupe guanidine d§l'argine (B-22) et des noyaux imidazole de l'histidine (B-5 et B-10). Etant donné qu'à pH neutre, il y a 5 4 motifs basiques (chacun comprenant une chaîne A et une chaîne B) associés par molécule d'insuline, les groupes 12- a-amino, ceux des quatre glycines (A-1), des quatre phénylalanines (B-1) et des quatre lysines (B-21} sont acylés dans chaque molécule des composés de la présente invention. 10 Les spécialistes dans ce domaine considèrent en outre que la réaction de lanirthydrine egt le. meilleur test pour déterminer la présence des groupes a-amino. Quand on teste les insulines de la présente invention, comprenant la N-phénylglycyl-insuline, avec la ninhydrine et qu'on les corn re avec l'insuline bovine (insuline 15 non modifiée), cette insuline donne un résultat positif à l'essai avec la ninhydrine, tandis que les insulines modifiées donnent des résultats négatifs. Pendant cet essai, on fait bouillir toutes les insulines pendant deux minutes avec le réactif ninhydrine. La N-phénylglycyl-insuline, contrairement à de nombreux autres dérivés 20 des insulines ne flocule pas pendant l'essai, et la solution reste absolument limpide, indiquant une bonne stabilité à la chaleur de la N-phénylglycyl-insuline. L'absence d'une réaction positive des insulines modifiées de la présente invention avec la ninhydrine est considérée comme étant une preuve essentielle du blocage ou du 25 recouvrement des groupes a-amino. L'insuline utilisée ici peut provenir de n'importe quelle source ordinaire, habituellement utilisée. Par exemple, on peut utiliser l'insuline de boeuf, l'insuline de porc, l'insuline de baleine, etc. on peut utiliser par exemple comme matière première 30 l'insuline de bovin cristalline (approximativement 24 unités/mg) couramment disponible . Les conditions nécessaires pour transformer le dérivé N-chloroformyle de formule II en insulines acyl-substituées de la présente invention de formule I, ne sont pas spécialement critiques. 35 Ainsi, par exemple on peut utiliser 1/20 à 1/2 partie environ en poids du produit de formule II pour 1 partie en poids d'insuline (ceci fournit un excès stoechiométrique d'agent d'acylation, car l'insuline a un poids moléculaire de 24 000 au pH de la réaction et 69 17630 5 2009615 chaque molécule de cette dimension contient 12 groupes amino). La réaction se produit régulièrement et complètement à un pH compris entre environ 7,5 et 8,5 dans un tampon, tel que K^HPO^ 0,1 M et même à 0°C. Bien qu'on puisse ajoutèr l'agent d'acylation 5 en une fois (initialement), il est préférable de l'ajouter en plusieurs fois; à des intervalles de 15 minutes environ, jusqu'à ce que tout l'agent d'acylation soit ajouté. On sépare le produit en dialyssuit le mélange réactionnel avec de l'eau distillée froide, et en séchant par congélation (lyophilisation) la matière retenue 10 afin de laisser le produit sous forme de résidu. On peut préparer la N-chloroformyl-N-phénylglycine de formule Ii: au moyen'de techniques connues des spécialistes. Voir par exemple la méthode de Dvonch et Alburn, dans J. Org. Chem. 29, 3719 (1964). 15 Les composés de la présente invention peuvent être adminis trés sous une variété de présentations injectables dosées. Gomme pour l'insuline, la voie d'administration détermine la durée et la rapidité d'action. Les injections peuvent être faites aseptique-ment par voie sous-cutanée, bien que pour assurer une action rapi= 20 de on puisse opérer par injections intraveineuses ou intramuscu- * laires. La cuisse est un endroit convenant à l'injection sous-cu-tanée. Les doses par jour varient avec la composition particulière utilisée, la gravité des symptômes, et les animaux, tels que les 25 animaux domestiques, ou les animaux de laboratoire, par exemple les souris, les rats ou les singes, que l'on traite. La dose varie également avec la taille du malade. On calcule la dose à administrer sur une base unitaire de la même façon que pour l'insuline de zinc cristalline. Par exemple, avec un mammifère de 70kg 30 environ , la dose habituellement efficace est comprise entre environ 1 et 200 Unités par jour. On entend par "unités" les unités d'insuline du Codex. Bien entendu, comme dans le cas. de 1'insuline, chaque sujet nécessite une étude particulière pour, déterminer la durée, la nombre et la quantité de doses séparées journalières qui 35 sont les plus efficaces. Comme pour l'insuline, les taux de sucre dans l'urine et dans le sang servent de guide, le but thérapeutique recherché étant d'abaisser le taux de sucre jusqu'à la normale et ensuite de le maintenir. On formule les composés de la présente invention en une va 69 17630 6 2009615 riété de présentations dosées aqueuses stériles contenant divers électrolytes, tampons, stabilisants, etc. Ainsi, par exemple, le milieu aqueux stérile contenant|..les .composés de 11 invention "peut également--eontenir .du chlorure^deVsodium, de i'adétate de sodium, 5 du para-hydroxybenzoate de méthyle, de la glycérine," du phosphate de sodium dibasique*, de faibles quantités de stabilisants de phénol de métacrésol, etc. Une dose unitaire particulièrement intéressante comprend 20, 40 ou.80 unités/ml dans une solution saline physiologique stérile. 10 Les exemples suivants illustrent la présente invention. EXEMPLE 1. ... .N- phényIgl y c yl - insuline On dissout 1 g d'insuline de zinc cristalline titrant 24 imités environ par mg dans 200 ml de KgHPO^ G 1 M en réglant le pH •35 a 10,0, et en le .ramenant immédiatement à 8,0. On ajoute ensuite • tout en agitant 60 mg de N-chloroforiuyi-N-phénylglyeine (préparée en faisant réagir la N-ph.énylglyoine avec du phosgène dans du dioxine à 40°C, suivant la méthode décrite par Dvonch et Alburn, dans ■ J.Org. Chem. 29, 5719 (1964)). Après 15 minutes, on ajuste le pH 20 à 7,5 et on ajoute encore à 15 minutes d'intervalle trois fois 60mg de N-chloroformyl-î^hénylglycine, 20 minutes après la dernière addition, on dialyse le mélange réactionnel en changeant trois fois 9 litres d'eau distillée froide. On lyophilise la matière retenue et on obtient 1,18 g de produit. L'activité du produit est d'environ 25 20,1 unités internationales/mg. EXEMPLE 2 N-phénylglycyl-insuline (Autre méthode) On procède comme décrit dans 1'exemple 1, excepté qu'on rem-- EXEMPLE 3 N-p-méthylphénylglyoyl^Insuline 35 On procède corasse décrit dans l'exemple 1, e;ccapté qu'on rem-» place la H-ohloroforayl-N-phénylglyein3 par une quantité stoechîo-métrique de N-chl&rofonayl-N=£-nîéthylphényiglycine. On obtient le., produit mentionné;. ci-dessus. BAD ORIGINAL 69 17630 7 2009615 EXEMPLE 4 N-p-chlorophénylglycyl-insullne On procède comme décrit dans l'exemple 1, excepté qu'on remplace la N-chloroformyl-N-phénylglycine par une quantité stoe-chiométrique de N-chloroformyl-N-j3-chloro phény lglycine. On obtient le produit mentionné ci-dessus. Pour évaluer au préalable les composés hypoglycémiques de l'invention, on détermine les effets in vitro et in vivo des composés de l'invention en procédant comme suit. L'activité de la N-phénylglycyl-insuline à gonfler les mito-chondries selon la concentration est utilisée comme indice de son activité. On prépare des mitochondries de foie de rat dans une so3.u-tion de saccharose 0,25 M contenant de l'acide éthylènediamine-té-^ tracétique 0,001 M (EDTA) suivant une méthode de centrifugation différentielle normalisée. On mesure l'effet des nouvelles insulines sur le gonflement des mitochondries dans les foies de rat fraîchement isolés en suspension dans une solution de KC1 0,125 M de tris-(hydroxyméthylamino)méthane 0,2 M et de gélatine partiellement hy-drOlysée à 0,1% , ayant un pH égal à 7,5, en utilisant un Spectro-photomètre de Be-ckman modèle B et en examinant les changements d'absorption de la lumière à 520 m^Ai. Voir l'article de R.L. Feni-chel, W.H. Bechnann et de H.E. Alburn, dans Biochemistry, 5, 461 .(1966). Les résultats obtenus sont indiqués dans le tableau I. TABLEAU I Activité des aminoacyl-insulines à gonfler les mi tochondrie s A - Concentration ; 5 x 10" H. A Changement de densité optique spontané à 520 m p. 10' 20' 20' Total N-phénylglycyl-insuline 50 37 65 152 B. Concentration : 2,5 x 10"^ M A Changement de densité optique spontané à 520 m JLÇ)' 20' 20' Total N-phénylglycyl-insuline 40 17 5 62 35 -fi C.- Concentration ; 1,25 x 10" M A Changement de densité optique spontané à 520 nr/U 10' _201 22' Total N-phénylglycyl-insuline 44 9 -15 40 20 69 17630 8 2009615 Les données du tableau I montrent que le composé possède une bonne activité. On évalue in vivo 1'aminoacyl-insuline de l'invention en procédant de la façon suivante(voir article de H.E. Alburn et de R.L. 5 Fenichel, dans Nature 215, 515 (1967)• Après avoir obtenu un premier échantillon de sang de 0,1 ml prélevé dans les coeurs de rats Sprague Dawley mâles légèrement endormis à l'éther que l'on a fait jeûner pendant 18 heures pour analyser le taux de sucre dans le sang, on injecte par voie intra-10 péritonéale dans les animaux des concentrations différentes en unités/kg de poids du corps de l'insuline N-phénylglycyl-substituée de l'invention. On prélève d'autres échantillons de sang de 0,1ml dans les coeurs de ces animaux à des intervalles de temps réguliers afin d'analyser le sucre dans le sang. On constate qu'après avoir 15 administré 1,25 unité/kg de poids du corps, le taux moyen de glucose, qui était de 72 mg # au temps zéro, tombe à 60 mg# au bout de 50 minutes et à 47 mg% au tout de 90 minutes ;et qu'après avoir administré 2,5 unités/kg, le taux moyen de glucose, qui était de 65 mg # au temps zéro, tombe à 45 mg # au bout de 50 minutes à 20 55 mg # au bout de 90 minutas et à 55 mg # au bout de 150 minutes. La N-phénylglycyl-insuline abaisse donc considérablement le taux de sucre dans le sang basé sur la réponse des doses. On a essayé en outre la N-phénylglycyl-insuline en procédant à un essai d'immunisation, et aux essais de diagramme sur le rat 25 et du morceau de graisse. On constate que cette insuline est beaucoup moins antigène que l'insuline de porc pure dans l'essai d'immunisation et qu'elle est active dans les essais du morceau de graisse. Dans un essai d'immunisation réalisé sur. les insulines de la 50 présente invention, avec les deux systèmes d'anticorps de C.R. Morgan et de A. Lazarov, Diabets, 12, 115-126 (1963)j on récupère 55# de N-phénylglycyl-insuline dans cet essai, et 100# en utilisant une insuline de porc ordinaire et 137# avec l'insuline de zinc de boeuf. Ceci montre que le pouvoir de l'insuline modifiée le l'invention à fixer les anticorps est de beaucoup inférieur à celui de 35 l'insuline de boeuf normal et nettement inférieur à celui de l'insuline de porc qui est l'insuline choisie actuellement pour les diabétiques résistants à l'insuline. Il va de soi que la présente invention n'a été décrite qu'à titre explicatif, mais nullement limitatif, et qu'elle est susceptible de diverses variantes sans sortir de son cadre. 9 17630 9 2009615 REVENDICATIONS 1 - Insuline N-phénylglycyl- ou N-phénylglycyle-substitué. 2 - N-alkyl-inf.-phénylglycyl-insuline. 3 - N-haloalkylphénylglycyl-insuline. 5 4 - N-p-méthylphénylglycyl-insuline. 5 - N-p-chlorophénylglycyl-insuline. 6 - Procédé de préparation d'une insuline N-phénylglycyl ou N-phénylglycyle substitué, caractérisé par le fait qu'on acyle l'insuline avec un dérivé réactif de la phénylglycine N-phényl- 10 ou N-phénylglycine-substitué au moyen de méthodes connues dans la technique pour synthétiser les peptides. 7 - Procédé selon la revendication 6, caractérisé par le fait que le dérivé réactif est une N-chloroformyl-(N-phényl- ou N-substitué-phényl)-glycine ou un dérivé N-carboxyaminoanhydride 15 de la N-phényl- ou N-substitué-phénylglycine. 8 - Procédé selon la revendication 7, caractérisé par le fait que le dérivé réactif est un azide, un halogénure d'acide, un anhydride mixte, un ester actif ou un carbodiimide de la N-phényl- ou N-substitué phénylglycine substitué sur l'atome d'azote 20 par un groupe de blocage. 9 - Insuline N-phénylglycyl- ou N-phénylglycyle substitué préparée au moyen d'un procédé tel que revendiqué dans l'une quelconque des revendications 6 à 8 inclus, 10 - Présentation injectable dosée comprenant une insuline 25 N-phénylglycyl- ou une N-phénylglycyl-substituée, telle que revendiquée dans l'une quelconque des revendications 1 à 5 ou 9, et un diluant approprié.