FR 2010963 A1 19700220 FR 6919649 A 19690613 69 19649 2010963 La présente invention se rapporte à un procédé de purification de la L—asparaginase» Plus particulièrement, elle se rapporte à un procédé de purification de la L—àsparaginase obtenue à partir d'une culture de cellules d'un ricro—organisme 5 producteur de L-asparaginase» Encore plus particulièrement, l'invention se rapporte à la production de L-asparaginase présentant une activité anti-mytotique, ainsi qu'à des préparations en-zymatiques de grande pureté qui présentent une activité anti-mytotique. 10 La L-asparaginase, c'est-à-dire la L-asparagint- amide hydrolase (qui présente un nombre d'enzyme de 3,5,1,1), est an enzyme qui hydrolyse la L-asparagine en acide L-aspartique et ammoniac* Cet enzyme est assez répandu dans les mondes animaux et végétaux, toutefois un certain nombre de ses propriétés sont 15 encore inconnues* Il a récemment été accordé une grande attention à la L-asparaginase dérivée de certaines sources déterminées, comme par exemple la L-asparaginase produite dans le sérum de cobayes et dans certaines Souches d'Bscherichia coli , car on a découvert que les enzymes dérivés de telles sources présentent 20 une activité remarquable contre la leucémie aigu8» La production en masse de cet enzyme à des fins pharmaceutiques a toutefois été empêchée en raison de nombreux problèmes, et particulièrement en raison du fait que les types d'enzymes présentant une activité anti-mytotique sont limités* 11 est de plus difficile de mettre 25 au point un processus de purification permettant d'obtenir une préparation enzymatique purifiée susceptible d'être utilisée comme pharmac e ut ique o La demanderesse a d'abord résolu le problème des sources d'enzymes producteurs de L-asparaginase à activité anti-mytotique en cultivant à l'air un micro-organisme appartenant à l'espèce Serraiiia. sous agitation (voir la demande de brevet japonais n# 9116/68 correspondant à la demande française n2 6902616 déposée le 5 février 1969). Jusqu'à présent la L-asparaginase produite par des micro-organismes appartenant à l'espèce Serratia 35 s'est révélée extrêmement instable au cours des opérations de purification, perdant son activité de manière inattendue pendant ces opérations, en dépit du fait que ladite L-asparaginase soit naturellement stable dans un vaste domaine de pH et de température^ 69 19649 2010963 En raison de cette instabilité il était nécessaire d'effectuer très rapidement toutes les opérations de purification requises* ce qui rendait très difficile l'obtention à l'échelle industrielle d'une préparation de grande pureté® 5 ta présente invention a pour objet un procédé amélioré de production de L-asparaginase purifiée qui supprime les inconvénients et les déficiences des méthodes connues« La présente invention a également pour objet un procédé de purification de L-asparaginase qui peut être mené 10 à bien, d'une manière efficace et relativement simple, sans provoquer une perte sérieuse de l'activité anti-mytotique dans le produit résultants La présente invention a encore pour objet un procédé permettant la production économique, à l'échelle 15 industrielle, d'une préparation enzymatique purifiée de L-asparaginase présentant une activité anti-mytotique« L'invention a en outre pour objet une L—asparaginase de grande puretéo Ces différents objets et avantages de la 20 présente invention apparaîtront clairement de la description qui va suivre» A la suite de nombreuses études effectuées sur les causes de la perte d'activité mentionnée ci-dessus, la demanderesse a découvert qu'un micro-organisme appartenant à 25 l'espèce Serratia produit dans ses cellules, en même temps que de la L-asparaginase, des facteurs relativement puissants qui inactivent cette L-asparaginase» 11 s'ensuit que la L—asparaginase désirée perd son activité en raison du fait que ces facteurs d'inactivation sont extraits en mftme temps que la L-asparaginase 30 lorsque les cellules sont détruites. De plus, à moins d'éliminer ces facteurs, il est impossible non seulement d'obtenir avec un bon rendement une préparation purifiée de L-asparaginase, mais encore d'obtenir une préparation enzymatique à effet anti-mytotique suffisant, même si cette préparation est purifiée» 35 A la suite de nombreuses recherches effec** tuées à la suite de la découverte de ces facteurs d'inactivation» la demanderesse a découvert, conformément à. la présente invention., qu'il est très facile de mener k bien la purification de cet 69 19649 3 2010963 enzyme en dénaturant, et par là en rendant inefficaces, les facteurs d*inaetivation de la L-asparaginase, sans porter atteinte a l'activité de ladite L-asparaginase» Sur la base de cette découverte, la demanderesse est parvenue à mettre au point un nouveau 5 procédé de production de L-asparaginase très pure à l'échelle industrielle On atteint les objectifs de la présente invention en produisant de la L-asparaginase à partir d'une culture de cellules d'un micro-organisme producteur de L-asparaginase appar-10 tenant a l'espèce Serratia et en ajustant le pH de la solution aqueuse brute de l'enzyme à 2,5-4,0 en présence du substrat de cet enzyme, la L-asparagine, à un moment opportun choisi au cours des opérations de purification, et de préférence au cours d'une des premières étapes de cette purification» Be cette manière les 15 facteurs d* inactivation. de la L-asparaginase perdent leur activité, tandis que la L-asparaginase elle-même est protégée contre cette perte d'activité, ce qui permet d'éviter la décomposition de l'enzyme souhaité» Il s'ensuit que la purification ultérieure est menée à bien avec un bon rendement» 20 La demanderesse avait déjà découvert que le traitement d'un liquide enzymatique brut à l'aide d'un acide est un moyen efficace de purification de la L-asparaginase, et avait en conséquence mis au point un procédé de purification utilisant un tel traitement acide (voir la demande de brevet japonais 25 22328/68). La présente invention propose un procédé encore plus efficace de purification de la L-asparaginase, qui est basé sur l'étude de l'effet d'un traitement acide sur les facteurs d'inac-tivation qui se trouvent dans le liquide de culture-o ûes études détaillées sur la différence de stabilité de la L-asparaginase et de ses facteurs d'inactivation ont ainsi permis de découvrir que les facteurs d*inactivation perdent leur activité rapidement à un pH inférieur ou égal à 3,5, cette perte d'activité étant irréversible, tandis que la L-asparaginasé conserve son activité même à un pH d'environ 2,5» Il a de plus été découvert que la perte 35 d'activité de la L-asparaginase par dénaturation acide est remarquablement atténuée par la présence de son substrat, la L-aspara- gine, alors que les facteurs d*inactivation ne sont absolument pas influencés par ce composé».Le tableau 1 - indique la perte d'activi- OAD ORIGINAL 30 69 19649 4 2010963 té des facteurs d1inactivation de la L-asparaginase par dénaturation acide et l'effet protecteur du substrat sur la L-asparaginase. Tableau 1 - pH Taux d'activité résiduelle de la L-asnaracinase ($) Sans substrat Avec substrat 9,0(aucun traitement 0 0 5,0 0 0 4,0 16 30 3,5 62 104 3,0 72 100 2,5 41 81 2,0 4 25 Le tableau 1 donne les résultats de mesures effectuées sur des solutions aqueuses brutes de L-asparaginase 20 renfermant des facteurs d1inactivation. solutions dont on a ajusté le pH aux valeurs indiquées dans le tableau, en 1*absence ou en —2 présence de 10 mole/l de L-asparagine, ce pH étant ensuite immédiatement réajusté à 5,5, pH optimum pour l'action des facteurs d'inactivation, et la solution étant abandonnée pendant deux 25 heures à 37fiC, après quoi on a mesuré l,activité résiduelle de la L-asparaginase dans le liquide réactionnelo Le taux d'activité résiduelle est exprimé en pourcentage de l'activité enzymatique de l'échantillon de liquide original, considérée comme égale à 100o Comme le montre le tableau 1, les facteurs d*inactivation survi— 30 vent à un pH supérieur ou égal à 4 et la L-asparagiiiase perd son activité complètement après deux heures de réaction à 37fiC à pH 5,5, de la môme manière que dans le cas où on n'effectue aucun traitemento Au contraire, les facteurs d*inactivation perdent leur activité à un pïï inférieur ou égal à 3,5 et 1'inactivation de lai 35 L-asparaginase due à ces facteurs d'inactivation peut être évitée presque complètement» Toutefois un traitement à pH inférieur ou égal à 3,5 provoque une dénaturation de la L-asparaginase elle-même, la perte d'activité par dénaturation étant très importante ©AD ORIGINAL 69 19649 5 2010963 à pH 2. Toutefois, cette perte d'activité de la L-asparaginase due au traitement acide est notablement atténuée lorsqu'on ajoute son substrat, la L-asparagine, à la solution* Ainsi, un traitement acide en présence du substrat permet d'inhiber ou de détruire les 5 facteurs d*inactivation tout en conservant l'activité de la L-asparaginaseo Comme il a été exposé ci-dessus, la présente invention permet de rendre presque complètement inactif» les seuls facteurs d*inactivation par ajustement du pH de la solution enzy- son 10 matique brute de L-asparaginase, en présence de/substrat, la L-asparagine, à une valeur inférieure ou égale & 3,5 —et de préférence comprise entre- 3,5 et 3,0 -. Il s'ensuit que l'on peut mettre en eeuvre un temps de réaction compris entre quelques minutes et plusieurs heures sans observer de différences importantes» 15 Teutefeis, on traitement effectué en une courte période de temps; est préférable, en raison de l'effet possible sur la L-asparaginase0 On préfère également maintenir la température du traitement k des valears assez basses* On n'observe en- particulier, k 0 - 101CP aucune différence en ce qui concerne la pert* d'activité des'fac— 20 teurs d'inactivationo La quantité de substrat, c'est-k-dire de L-asparagine, ajoutée k la solution dépend de la concentration de l'enzyme, mais il suffit, dans les cas habituels, de l'ajouter 1k. une concentration de 10 mole/l ou plus» Différents acides minéraux et organiques peuvent ttre utilisés pour ajuster le pH, tou-25 tefeis l'acide chlorhydrique est le plus approprié en raison des étapes de purification ultérieures que l'on effectue. On préfère effectuer l'ajustement du pH conforme k l'invention au cours d'une des premières étapes du traitement, par exemple sur le liquide enzymatique brut; toutefois le traitement selon l'invention peut 3Û également ttre appliqué de manière satisfaisante k une préparation de grande pureté» Si l'on opère, conformément k l'invention, de manière k faire perdre complètement leur activité aux facteurs d'inactivation, il est possible d'augmenter facilement la pureté 35 de la préparation au cours d'opérations ultérieures, comme celles employées généralement dans différentes méthodes de purification pour préparations enzymatiques, par exemple la chromatographie avec échange d'ions ou d'autres chromatographies utilisant des agents 69 19649 6 2010963 adsorbants. On obtient de cette manière, avec un bon rendement, des préparations de L-asparaginase susceptibles d'être utilisées comme pharmaceutiques» Dans la mesure où la composition du milieu de 5 fermentation et la méthode de culture utilisée sont concernées, on utilise pour obtenir les cellules renfermant la L-asparaginase des traitements conventionnels mis en oeuvre dans les méthodes de fermentations On peut ainsi utiliser un milieu de culture synthétique ou un milieu nutritif naturel pour cultiver les souches 10 utilisées, dans la mesure où ces milieux renferment les éléments nutritifs essentiels à la croissance de cette soucheo Ces éléments nutritifs sont bien connus et comprennent des substances sources de carbone, des substances sources d'azote, des composés minéraux et d'autres composés analogues, qui sont utilisés par. 15 le micro-organisme en quantités déterminées» On peut ainsi utiliser comme source de carbone des hydrates de carbone comme le glucose, le fructose, le Mitose, le sacrese, l'amidon, l'hydre-lysat d'amidon, les molasses etc, eu toute autre source de carbone convenable telle qu'un acide organique, par exemple l'acide 20 acétique, l'acide lactique, etc» Ces substances peuvent être utilisées isolément eu en mélange» Comme source d'azote, on peut utiliser différentes sortes de sels ou de composés minéraux ou organiques tels que l'urée, l'ammoniaque ou les sels d'ammonium» par exemple le chlorure, le sulfate, le nitrate, l'acétate ou 25 le phosphate d'ammonium, etc<> ou des substances naturelles renfermant de l'azote, comme la liqueur de macération du maïs, l'extrait de levure, le cenéentré de viande, la peptone, la farine de poisson, le bouillon, les hydrolysats de caséine, l'extrait de bran de riz, etc» Ces substances peuvent également être utilisées 30 isolément ou en mélange de deux ou plusieurs,» Les composés minéraux qui peuvent être ajoutés au milieu de culture comprennent le sulfate de magnésium, le phosphate de sodium, le phosphate diacide de potassium, le phosphate acide de potassium, le sulfate de fer, le chlorure de manganèse, le chlorure de calcium, le 35 chlorure de sodium, le sulfate de zinc, etc0 La fermentation, ou culture, des microorganismes s'effectue dans des conditions aérobies, par exemple par agitation ^ l'air de la culture ou par agitation aération d'une culture 69 19649 7 2010963 submergée à une température de par exemple 25 à 40°C et à un pH de par exemple 4 à 8,5. Au bout de un à deux jours de-culture effectuée dans ces conditions les cellules contenant la l-asparaginase se trouvent accumulées dans la liqueur de culture résultante. 5 Une fois la culture terminée les cellules peuvent être rompues de manière conventionnelle, un liquide enzymatique brut étant recueilli,, On soumet alors ce liquide à un traitement conforme à la présente invention. L'exemple qui suit est donné à titre d'illustra-10 tion de l'invention et ne présente aucun caractère limitatif. Sauf indication contraire, les pourcentages y figurant s'entendent en poids par litre d'eau. Exemple On cultive une souche de Serratia marcescena 15 ATCC 60 sous agitation et aération, jusqu'à ce que l'on obtienne une quantité suffisante de cellules. Ces cellules sont mises en suspension dans une solution tampon 0,01 M de chlorhydrate de tris (hydroxyméthyl)méthylamine de pH 8,5, soumises pendant 10 minutes aux ultrasons émis par un générateur d'ondes ultrasoniques de 20 10 kilo cycle s puis séparées par centrifugation0 la couche surnageante est recueillie, livrant un extrait liquide enzymatique brut présentant une activité en L-asparaginase de 0,12 unité d'activité spécifique (l'unité d'activité spécifique est une unité internationale qui indique l'activité d'un enzyme par le nombre de 25 jVl moles de substrat décomposées en une minute; cette définition de l'activité spécifique sera utilisée tout au long de la présente demande). Après avoir ajouté le substrat, c'est-à-dire la L-asparagine, à l'extrait liquide à la concentration de 10 sole/1 30 on ajoute goutte à goutte de l'acide chlorhydrique dilué dans la solution maintenue à 0°C, de manière à ajuster le pH à 3,4« On abandonne la solution résultante pendant 5 minutes puis on élimine les précipités formés par séparation centrifuge de manière à récupérer la couche surnageante, ce qui permet d'obtenir une solution 35 enzymatique présentant une activité spécifique de 1,0o les facteurs d'inactivation de la solution enzymatique résultante ont complètement perdu leur activité au moment de la récupération, mais l'on n'observe pas de perte d'activité de la L-asparaginase, même si l'on abandonne la solution à 40 pH 5,5. On ajuste le pH de quatre litres de cette solution (d'ac- v dr\u uiïiGlNAL, 19649 8 2010963 tivité totale égale à 4.500 unités) à 4,5 et on agite en ajoutait de la carboxyméthyl cellulose sur laquelle la substance active s'adsorbe complètement. On élue la substance active ainsi adeorcée sur la carboxyméthylcellulose à l'aide de quatre litres d'une solu-5 tion tampon-tris (pH 9*0), de manière à obtenir une solution de L-asparaginase présentant une activité totale de 3 l■ BAD original 19649 9 2010963 RBVMDICATIONS 1. Procédé de purification de la L-asparaginase obtenue à. partir d'une culture de cellules d'un micro—organisme producteur de L-asparaginase appartenant à l'espèce Serratia. caractérisé par le fait que l'on ajoute de la L-asparagine à la solution aqueuse enzymatique recueillie à partir desdites cellules et que l'on ajuste le pH de ladite solution à une valeur égale ou inférieure à 4,0. 2. Procédé selon la revendication 1 dans lequel le pH de ladite solution est ajusté à .environ 2f5 - 4,0. 3. Procédé selon la revendication 1 dans lequel le pH de ladite solution est ajusté à environ 3,0 - 3,5. 4. Procédé selon la revendication 1 dans lequel on ajoute à ladite solution environ 10 mole par litre de L-asparagine, 5. Procédé selon la revendication 1 dans lequel on utilise de l'acide chlorhydrique pour ajuster le pH de la solution. 6. Procédé selon la revendication 1 dans lequel le Micro-organisme est Serratia marcescens. 7. Procédé d'obtention d'une préparation de L-asparaginase purifiée présentant une activité anti-mytotique stable, caractérisé par le fait que l'on cultive un micro-organis-me producteur de L-asparaginase appartenant à l'espèce Serratia dans des conditions aérobies en milieu nutritif aquetm, que l'on récupère à partir de la liqueur de culture résultante une solution brute renfermant l'enzyme, que l'on ajoute de la L-asparagine à la solution, qu'on ajuste le pH de la solution à 2,5-4,0 et que l'on récupère la L-asparaginase de cette solution. 8„ Procédé selon la revendication 7 dans lequel on soumet la L-asparaginase obtenue à des opérations de purification supplémentaires de manière à obtenir une préparation de L-asparaginase extrêmement pure. 9. Procédé selon la revendication 7, dans lequel on effectue l'ajustement de pH à une température comprise entre environ 0 et 10°C. ■ 10o Procédé selon la revendication 7 dans lequel on ajuste le pH de ladite solution à environ 3,0 - 3,5. 11. Procédé selon la revendication 7 dans le- ' —2 quel on ajoute à ladite solution environ 10 mole par litre de 19649 ..2010963 L-asparagine . 12» Procédé selon la revendication 7 dans lequel on utilise de 1*acide chlorhydrique pour ajuster le pH de la solution» 13» Procédé selon la revendication 7 dans lequel le micro-organisme est Serratia marcescens. 14. Procédé selon la revendication 7 dans lequel le micro-organisme est Serratia marcescens ATCG 60. 15. Préparation de L-asparaginase produite selon le procédé de la revendication 8 et présentant une activité spécifique d'au moins 120o