FR 2012671 A1 19700320 FR 6923439 A 19690710 69 23439 2012671 On a désormais découvert une méthode pour détruire l'activité de la pénicilline dans un mélange d'un antibiotique pénicilline et d'un antibiotique céphalosporine sans affecter sensiblement l'activité de la céphalosporine. Selon cette méthode le mélange est traité 5 par une 2-mercaptoamine en quantité suffisante pour réagir avec sensiblement toute la pénicilline présente. Toute la pénicilline réagit, mais il n'y a notamment pas de réaction de la céphalosporine Ainsi donc, pratiquement n'importe quelle quantité d'impuretés pénicilline peut être éliminée de la céphalosporine sans perte de 10 céphalosporine. La 2-mercaptoamine à utili^r dans ce procédé est une 2-mercapto aminé contenant un groupe sulfhydryle libre et un groupe aminé basique sur les atomes de carbone adjacents. Cette mercaptoamine peut être représentée par la formule ï l'hydrogène, -GOgH, et -C^R ; et R est un radical alcoyle inférieur Par le terme "alcoyle inférieur" on entend un radical hydrocarbure monovalent correspondant à la formule C^EL,.^ où n est un entier de 1 à 9. Il faut entendre que le groupe carboxyle peut être présent 25 sous forme de l'acide ou d'un de ses sels comme le sel de sodium, de potassium, d'ammonium, ou d'ammonium substitué. Des exemples spécifiques de roercaptoamines qui peuvent être utilisés dans le procédé comprennent le 2-&.minoéthanethiol, le 2-diméthylaminoéthanethiol, la cystéine, l'éthylester de cystéine, la N-butylcystéine, et le 2-(N-30 hexylamino)éthanethiol. La cystéine est la mercaptoamine préférée. On ajoute la mercaptoamine au mélange des antibiotiques pénicil line et céphalosporine et on laisse réagir avec la pénicilline. La réaction est une réaction spontanée et elle a lieu en l'absence de catalyseur. Comme la réaction avec la céphalosporine ne consomme 35 pas de mercaptoamine, théoriquement toute la pénicilline sera éventuellement détruite si l'on ajoute une quantité de mercaptoamine équivalente à la quantité de pénicilline présente. Cependant, la réaction complète en pareil cas nécessiterait un temps incommodément long de sorte que, en pratique, on utilise un excès de mercaptoamine 40 De préférence, on utilise de 10 à 100 moles de mercaptoamine par 15 R R2 H H 1 2 dans laquelle R et R sont choisis dans le groupe de l'hydrogène 20 et des radicaux alcoyle inférieur ; R^ est choisi dans le groupe de 69 23439 2 20î2671 mole de pénicilline présente. On peut utiliser des quantités plus élevées mais cela n'offre aucun avantage supplémentaire. On effectue de préférence la réaction dans un milieu aqueux à un pH compris entre 6 et 8 et à une température comprise entre 25° 5 et 30°C. On peut aussi utiliser un système mixte d'un solvant organique et d'un solvant aqueux comme l'éthanol dans l'eau ou le dioxane dans l'eau. On peut utiliser un pH aussi bas que 4 ou aussi haut que 9. En dehors de ce domaine de pH la décomposition de la céphalosporine devient importante. Le pH optimal est d'environ 7,5. 10 La réaction peut être effectuée à des températures atteignant environ 40°C avant que la céphalosporine commence à se décomposer. Aux températures inférieures à environ 20°C la réaction de la mercaptoamine avec la pénicilline se fait plutôt lentement. Dans les conditions préférentielles la 2-mercaptoamine réagit 15 avec la pénicilline en un temps relativement court. La réaction peut être complète en un temps aussi court que 15 minutes ou peut nécessiter un temps aussi long que 2 heures. L'avancement de la réaction peut être suivi par analyse de la pénicilline. ta réaction du noyau de la pénicilline avec une mercaptoamine 20 résulte en une ouverture du cycle /3-lactâme avec formation d'un amide du type représenté dans la formule suivante. Pour les besoins de l'illustration la cystéine est utilisée comme mercaptoamine typique. 25 0 ' S ' » /x /'CH- C ,H_ - CH_ - C - HH - CH - CW 'Ci '6 5 2 30 I CHs 0 = C NH r C - C0_H I 6 NH H0oC - C - H ^ i CH2 SH La structure du produit obtenu lorsque le groupe aminé est un groupe tertiaire est l'acide pénicilloïque correspondant. Les 35 mercaptoamines tertiaires comme, par exemple, le 2-diméthylamino-éthanethiol réagissent avec le noyau de la pénicilline mais ne réagissent pas avec le noyau de la céphalosporine. Le fait que la réaction de l'antibiotique avec une mercaptoamine a lieu ou n'a pas lièu dépend entièrement de la présence ou 40 de l'absence du noyau de la pénicilline comme représenté dans la 69 23439 3 2012671 Formule I. 'S. 5 / \ /CH3 YNH - CH - ÇH C YNH - CH - CH CH. I^H3 2 10 O = C N CH - C02H O = C ^.Q. - CH2Z œ2H Formule I Formule IX La nature des groupes substituants attachés au noyau n'a pas d'influence sur la réactivité. D'autre part, le noyau de la céphalosporine comme représenté dans la Formule II est tout à fait stable vis-à-vis des mercaptoamines et la stabilité n'est pas modifiée par la nature des groupes substituants. Par exemple Y et Y' dans les 15 Formules I et II peuvent être des groupes tels que hydrogène, phényl-acétyle, phénoxyacétyle, phénylglycyle, 2,6-diméthoxybenzoyle, 5-aminoadipamyle, ou 2-thiénylacétyle et Z peut être l'hydrogène, un groupe hydroxyle, ou acétoxy. Il est entendu que les groupes car-boxyle peuvent être présents sous forme de 1'acy.de libre, sous 20 forme d'un sel, ou sous forme d'un ester. Le procédé sera davantage illustré par les exemples suivants. Exemple 1 On a préparé trois échantillons de 200 ml d'un phosphate tampon ayant un pH de 7,5. On a ajouté au premier échantillon 1 g 25 d'acide 6-aminopénicillanique et 3,6 g de cystéine ; on a ajouté au second échantillon 1 g d'acide 7-aminocéphalosporanique et 3,6 g de cystéine ; tandis qu'on a ajouté au troisième échantillon 1 g d'acide 7-aminocéphalosporanique et pas de cystéine. On a agité les trois échantillons à la température ambiante pendant quatre heures 30 et ensuite on a congelé et lyophilisé les mélanges réactionnels. On a analysé chacun des résidus lyophilisés pour rechercher le p-lactame par spectroscopie infrarouge en utilisant des pâtes (mulls) d'huile minérale et en examinant la bande d'absorption caractéristique du {3-lactame à approximativement 1808 cm"^. L'échantillon 35 d'acide 6-aminopénicillanique ne présentait jamais d'absorption, ce qui indiquait une réaction complète avec destruction du cycle |3-lactame. Une analyse quantitative des deux échantillons d'acide 7-aminocéphalosporanique utilisant la bande d'absorption de l'ester à 1743 cm ^ comme étalon interne n'a présenté aucune différence de 40 la teneur en |3-laotame des deux échantillons. La réaction comnlète 69 23439 4 2012671 de l'acide 6-aminopénicillanique avec la cystéine a eu lieu tandis que dans les mêmes conditions il n'y avait pas de réaction de la cystéine avec l'acide 7-aminocéphalosporanique. Exemple 2 5 La perte d'activité antibiotique d'une pénicilline qui a réagi avec la cystéine a été montrésde la manière suivante. On a préparé une solution de 388 mg du sel de potassium de pénicilline V et de 1,2 g de cystéine dans 100 ml d'un phosphate tampon ayant un pH de 7,5. De la même manière on a préparé une seconde solution sans la 10 cystéine. On a prélevé périodiquement des échantillons des solutions et on a mesuré l'activité biologique de la solution vis-àvis de JB. subtilis en utilisant le mode, opératoire suivant. On a versé huit ml de gélose contenant B. subtilis dans des boites de plastique ayant approximativement S0 mm de diamètre. 15 On a laissé refroidir les boites jusqu'à la température ambiante et on a déposé 4 disques ayant chacun 6 mm de diamètre, sur les boites de gélose. A mesure que les échantillons étaient retirés des solutions antibiotiques, ils étaient dilués de 1 à 1000. Quinze^jul de ces échantillons dilués étaient déposés sur les 20 disques. Deux disques dans chaque boite contenaient le mélange témoin tandis que deux disques contenaient le mélange réaction-nel contenant de la cystéine. Les boites ont été conservées toute une nuit et lues le jour suivant avec un lecteur de zones Fisher-Lilly. Le diamètre des zones,en millimètres,est une 25 indication de la dose d'antibiotique actif présente dans les mélanges réactionnels au moment où on a pris l'échantillon. On trouvera les résultats de cet essai dans le tableau suivant. DIAMETRE MOYEN DES ZONES Temps (min.) Cystéine Témoin 30 14 14,2 14,7 28 15,2 50 14,8 65 14,8 122 15,1 35 180 14,9 251 14,8 Il faut noter qu'après 28 minutes l'échantillon de pénicilline contenant la cystéine était totalement inactif tandis que l'échantillon ne contenant pas de cystéine présentait une activité totale 40 après 251 minutes. La cystéine a réagi avec la pénicilline, détruisant 69 23439 5 2012671 son activité. Exemple 3 On a déterminé l'activité de la céphalothine e\f/La céphalothia© traitée par la cystéine comme dans l'Exemple 2. On a préparé 5 l'échantillon d'essai à partir de 418 mg de céphalothine et de 1,2 ej de cystéine dans 100 ml du phosphate tampon ayant un pH de 7,5. L'échantillon témoin contenait 418 mg de céphalothine et 100 ml du tampon. Les résultats sont présentés dans le tableau suivant. DIAMETRE MOYEN DES ZONES 10 Temps (min) Cystéine Témoin 2 18,4 18,8 20 18,1 19,1 34 19,3 18,8 45 18,4 18,8 15 60 17,9 18,4 88 18,0 18,0 118 18,1 18,1 150 17,9 17,8 178 17,5 17,4 20 206 18,8 18,3 248 17,6 17,9 L'échantillon traité par la cystéine et l'échantillon témoin ont tous deux montré une activité essentiellement constante vis-à-vis de B. subtilis tout au long de la période d'essai. Il ressort de 25 ces résultats qu'il n'y a pas eu de réaction de la céphalothine avec la cystéine. Exemple 4 On a traité des échantillons de benzylpénicilline séparément avec des excès de 10 et 100 fois de cystéine, de 2-aminoéthanethio1, 30 et de 2-diméthylaminoéthanethiol à 25°C dans un phosphate tampon ayant un pH de 7,5. On a suivi le développement de la réaction par un essai biologique. Dans tous les cas il y avait une disparition complète de l'activité biologique de la bsnzyIpénlei11ine en l'espace de quatre heures. 35 Exemple 5 On a traité une série de pénicillines et de cêphalosporines avec un excès de dix fois de cystéine à un pH de 7,5 à la température ambiante. On a suivi les résultats à l'aide d'un essai microbiologique. Dans le cas des pénicillines aucune activité biologique 40 n'a pu être déceléa après une heure. D'autre part, l'activité {BftO ORIGNAL 69 23439 6 2012671 biologique est demeurée inchangée après quatre heures avec les céphalosporines. Les structures des pénicillines et des céphalospo-rines utilisées sont données ci-dessous avec référence aux formules X et XI. Pénicillines Y' O C6H5CH2C~ 10 O M CgHgOCHgC- 15 s/ ;J-ch2c- Céphalosporines l O H -ch_c- O c,hechc- '6 57 NH cghgchc-nh_ O M -occh- O -occh. -h O M 20 CACHONS., Uch2c- -H OCH- 25 cghg - C - € - c- 30 n - ch. C6H5CH2C- O c,hc0ch„c-6 5 2 -h -H Exemple 6 Cet exemple explique la destruction de l'activité de la pénicilline en présence de l'activité de la céphalosporine. On a mis 35 de la céphalothine {1 g) dans un flacon et on ajouté 10 mg de pénicilline V et 400 mg de cystéine. On a ensuite ajouté dans le flacon du phosphate tampon (100 ml) ayant un pH de 1,5* On a prélevé périodiquement des échantillons du flacon et on les a testés. La méthode utilisée pour déceler la pénicilline V était la méthode 40 standard d'extraction par l'êther diisopropylique, qui peut déceler bad original 69 23439 7 2012671 des quantités de pénicilline aussi faibles que 0,5 ppm. En l'espace de deux heures il n'y avait plus d'activité de pénicilline V dans le flacon. L'activité de la céphalosporine était inchangée au bout de ce temps. - 5 On a montré que les pénicillines sont des allergènes de bas poids moléculaire en ce qu'elles subissent une réaction irréversible avec les protéines tissulaires pour former un antigène complet, entraînant ainsi des allergies. On a suggéré que cette réaction avec les protéines a lieu par l'intermédiaire du cycle /3-lactame. 10 Les céphalosporines qui ont été traité^par cette méthode sont dépourvues de pénicillines contenant ce cycle p-lactame et sont donc dépourvues de cette cause potentielle de réponse allergique. 69 23439 8 2012671 10 REVEND ICATIONS 1. Une méthode pour détruire sélectivement l'activité biologique de la pénicilline dans un mélange d'un antibiotique pénicilline et d'un antibiotique céphalosporine sans affecter de façon 5 importante l'activité biologique de la céphalosporine, laquelle méthode comprend le traitement du mélange par une 2-mercaptoamine ayant la formule î «i- ?3 ? N— C -r— c SH I I H H 1 2 où R et R sont choisis dans le groupe de l'hydrogène et des 3 radicaux alcoyle inférieur ; R est choisi dans le groupe de PïîjSro-gène, -COjH, et -CO^R ; et R est un radical alcoyle inférieur, à sn pH compris entre 4 et 9 et à une température comprise entre 20® et 15 40°C, le rapport molaire de la 2-mercaptoamine à la pénicilline étant d'au moins 1. 2, La méthode selon la revendication 1, dans laquelle le rapport molaire de la 2-mercaptoamine à la pénicilline est compris entre 10 et 100c 20 3. La méthode selon la revendication 1 ou 2, dans laquelle la 2-mercaptoamine est la cystéine. 4. La méthode selon la revendication 1, ou 2, ou 3, dans laquelle le rapport molaire de la cystéine à la pénicilline est compris entre 10 et 100. 25 5. La méthode selon la revendication 1, ou 2, ou 3, ou 4, daas compris laquelle le traitement est effectué à un pH/entre 6 et 8 et à une température comprise entre 25 et 35°G. 6. Une méthode pour éliminer les impuretés de pénicilline d'une céphalosporine contaminée par elles, qui comprend le traitement 30 de la céphalosporine impure par une 2-mercaptoamine ayant la formule 3 35 1 2 où R et R sont choisis dans le groupe de l'hydrogène et des 3 radicaux alcoyle inférieur ; R est choisi dans: le groupe de l'hydrogène, -CK^H, et -COjR ! et R est un radical alcoyle inférieur, à un pH compris entre 4 et 9 et à une température comprise entre 20° et 40 40°C, le rapport molaire de la 2-mercaptoamine à l'impureté de bad original 69 23439 9 2012671 pénicilline étant d'au moins 1. 7. La méthode selon la revendication 6, dans laquelle le rap~ port molaire de la 2-mercaptoamine à l'impureté de pénicilline est compris entre 10 et 100. 8. La méthode selon la revendication 6 ou 7, dans laquelle la 2-mercaptoamine est la cystéine.. 9. La méthode selon la revendication 6, ou 7;ou Qe dans laquel le pH est compris entre 6 et 8 et la température est comprise entre 25° et 35°C. 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