FR 2010726 A1 19700220 FR 6918992 A 19690609 69 18992 1 2010726 lia présente invention a pour objet un procédé de préparation d'une composition enzymatique anti-tumeur ayant un degré élevé de pureté, par purification d'une enzyme brute de L-aspara-ginase obtenue à partir d'une culture de cellules d'un microorga-5 nisme produisant une L-asparaginase anti-tumeur. Plus particulièrement, la présente invention a pour objet la préparation d'une composition enzymatique anti-tumeur et purifiée de L-asparaginase, d'une façon économique et à l'échelle industrielle, en purifiant avec un bon rendement de 1'asparaginase brute. 10 La L-asparaginase c'est-à-dire l'hydrolase du L-aspara- gine-amide (indice d'enzyme 3> 5, 1, 1)» est une enzyme qui hydrolyse la L-asparaginase en acide L-aspartique et ammoniac. On la trouve de façon relativement importante dans le monde animal et le monde végétal. Toutefois de nombreuses caractéristiques con-15 cernant ses propriétés ne sont pas connues. On doit apporter la plus grande attention à l'étude de cette enzyme car selon l'objet de récentes publications, des types spécifiques de l'enzyme précitée par exemple la L-asparaginase produite par un sérum provenant d'un cobaye ou par Escherichia coli, ont une activité remarquable 20 dans le traitement de la leucémie aiguë. Toutefois de nombreuses difficultés restent à résoudre pour l'obtention d'une production acceptable au point de vue pratique, c'est-à-dire d'une production industrielle de l'enzyme précitée, car cette enzyme ayant une activité anti-tumeur présente 25 des types limités et par conséquent l'obtention des sources enzy-aatiques ne s'effectue pas de façon adéquate. En outre il est difficile de purifier l'enzyme brute pour obtenir une préparation utilisable comme produit pharmaceutique. Il résulte de ceci, qu'on a recherché une solution à ces difficultés. 30 En ce qui concerne le problème posé par l'obtention de la source enzymatique, la demanderesse a déjà déposé une demande de brevet relative à une culture aérobie agitée d'un microorganisme appartenant au genre Serratia (demande française de brevet No. de série 6 902 616 effectuée le 5 Février 1969). La demanderesse 35 a continué ses recherches de bases relatives au procédé de purification et elle a ainsi découvert tin nouveau procédé pour surmonter les difficultés de purification. Il est jusqu'ici connu qu'une L-asparaginase ayant une activité anti-tumeur et obtenue par des microorganismes, est sta-40 ble par nature dans une large gamme de valeurs de pH et de tempé 18992 2010 7.2 6 ratures. Toutefois la stabilité d'une préparation à l'état de purification partielle est extrêmement mauvaise, et en conséquence une perte inattendue de l'activité se produit pendant le stade de la purification. Il en résulte qu'il est extrêmement difficile 5 d'obtenir à l'échelle industrielle et avec un bon rendement une préparation ayant un degré.élevé de pureté, car il est essentiel que le procédé soit effectué très rapidement. Aucune explication définitive n'a été donnée jusqu'ici en ce qui concerne la raison de cette instabilité. Après avoir effectué des recherches relatives 10 à la cause de cette perte d'activité, la demanderesse a maintenant découvert qu'un facteur relativement puissant provoquant l'inactivité de la L-asparaginase est produit simultanément dans la cellule au moment où. L-asparaginase est produite, la perte d'activité de la L-asparaginase résultant du fait que cet élément d'inactiva-5 tion est extrait en même temps que la L-asparaginase lorsque la cellule est détruite. En conséquence, à moins que cet élément soit éliminé, il est non seulement impossible d'obtenir le degré de purification souhaité de la préparation de L-asparaginase, mais également on ne peut obtenir un résultat anti-tumeur efficace à 20 partir d'une préparation enzymatique contenant les facteurs d'inac-tivation précités, même dans le cas où. l'on obtient une telle préparation purifiée. La présente invention a pour objet d'éviter les inconvénients de l'art antérieur en ce qui concerne la purification d'une 25 préparation enzymatique de L-asparaginase. La présente invention a encore pour objet un procédé amélioré de purification d'une préparation enzymatique de L-asparaginase ayant une activité anti-tumeur, et cela avec un coût bas à l'échelle industrielle. 30 • Uh; autre objet de l'invention est encore un procédé amé lioré de purification d'une préparation enzymatique de L-aspara-ginase, ce procédé ayant pour résultat d'inhiber l'activité des facteurs d'inactivation de la L-asparaginase et de stabiliser ainsi la préparation de L-asparaginase au cours de la purification. 35 D'autres objets et domaines d'application de la présente invention apparaîtront plus clairement dans la description détaillée ci-après. Toutefois il est bien entendu que cette description détaillée et les exemples spécifiques indiqués correspondants à des modes de mise en oeuvre préférés sont donnés seulement à titr^ffi.1-40 lustration de la présente invention, de nombreuses modifications BAD ORfGlNAL 69 18992 3 2010726 pouvant être apportées par les spécialistes sans qu'on sorte de son cadre. La demanderesse a maintenant découvert que l'on pouvait effectuer de façon efficace la purification de 1*enzyme précitée, 5 par le fait que l'on empêche certains éléments-d1inactivation de la L-asparaginase d'exercer leur activité, sans diminuer toutefois l'activité de la L-asparaginase. La présente invention permet donc d'obtenir un procédé industriel de préparation de la L-asparaginase. Cette découverte était inconnue jusqu'ici et la présente invention 10 constitue un nouveau procédé de purification de L-asparaginase basé sur cette nouvelle découverte. Le procédé de purification de L-asparaginase selon la présente invention comporte l'inhibition de l'activité des facteurs d'inactivation et ainsi la purification avec un bon rendement de la 15 L-asparaginase souhaitée Pour effectuer ce procédé, on purifie la L-asparaginase à partir de cellules d'un microorganisme produisant de la L-aspara-ginase. Conformément à la présente invention on obtient l'inhibition des facteurs d'inactivation en ajoutant un ion d'un métal 20 lourd dans la solution enzymatique brute à un moment approprié du procédé de purification, c'est-à-dire au stade pour lequel les éléments d'inactivation de la L-asparaginase coexistent avec la L-asparaginase et pour lequel l'enzyme souhaitée a tendance à perdre son activité. 25 Les ions de métaux lourds utilisés dans la présente inven tion comme facteurs d'inhibition de 1'inactivation, comportent des ions de métaux variés parmi lesquels les ions des métaux des groupes I et II de la classification périodique. L'argent, le cadmium, le cuivre et le zinc sont particulièrement efficaces dans la pré-30 sente invention. On utilise ces métaux sous la forme de leurs sels avec des acides minéraux ou organiques comme des chlorures, des sulfates, des nitrates, des acétates et des sels analogues. Les échantillons enzymatiques qui sont efficacement traités par l'addition d'ions métalliques sont constitués par un extrait de cellu-35 les liquide, un liquide enzymatique brut obtenu en soumettant le liquide précité d'extraction des cellules à un procédé d'élimination des acides nucléiques ou à un procédé de précipitation acide, ce procédé de précipitation ayant fait l'objet d'un brevet préalable de la demanderesse (demande de brevet français N° 40 demandée le 22 Mai 1969). On. obtient aussi un effet encore plus re 69 18992 * 2010726 marquable avec un. degré de purification plus élevé, lorsque la préparation devant être utilisée contient des facteurs d*inactivation. la concentration des ions métalliques diffère selon la quantité des facteurs d*inactivation présents, une concentration dans 5 la gamme d'environ 10"" à 10~ M (ou mole) et même à une concentration plus élevée étant "bien appropriée. Une concentration excessivement élevée d'ions métalliques inhibe l'activité de la L-asparaginase elle-même. On peut aisément éliminer ces ions métalliques à l'aide d'un pr^édé utilisant une résine échangeuse 10 d'ions ou bien un procédé/dialyse après avoir effectué la séparation des facteurs d'inactivation d'avec la L-asparaginase. On peut inhiber complètement l'activité des facteurs d'inaetivation en ajoutant des ions métalliques. Ainsi on peut purifier la L-asparaginase de façon à l'obtenir dans un état extrêmement stable et on 15 peut purifier l'enzyme souhaitée avec un rendement élevé, ce qui rend possible l'obtention d'une préparation ayant une pureté élevée. On décrit ci-après un exemple de traitement réellement effectué, dans lequel on obtient l'inhibition de l'activité des 20 facteurs d*inactivation par l'addition d'un ion d'un métal lourd. L'activité des facteurs d'inactivation de la L-asparaginase est une action forte même pour de basses températures depuis 0 à 15°C, ces facteurs étant actifs dans une large gamme de pH d'environ 4,0 -8,5. En particulier l'activité la plus forte est obtenue par un 25 pH d'environ 5,5. Pour cette raison une préparation enzymatique de L-asparaginase contenant ces éléments d'inactivation est extrêmement instable sous la forme de solution aqueuse dans l'étape de la préparation de la L-asparaginase dans les conditions précitées. Le tableau suivant indique le taux d'activité conservé 30 par la L-asparaginase et mesuré pour des échantillons dans lesquels on a ajouté des sels de métaux lourds variés à des concentrations —3 de 10 M. Ces échantillons de solutions aqueuses enzymatiques contiennent les facteurs d'inactivation de la L-asparaginase produits par Serratia ATCC 60. Les échantillons sont maintenus pen-35 dant 2 heures à 37°C au pïï indiqué dans le tableau. TABLEAU Effet des ions de métaux lourds sur la stabilité de la L-asparaginase. 69 18992 5 2010.726 to 15 20 25 30 35 40 Additifs : Taux en # de L-asparaginase encore : : active : aucun additif CuSO, AgNO- : Cd(]J03)2 ZnCl, pH 9,0 98 100 98 95 101 : HggClg 80 : HaCl : Na2304 KSO, 95 95 96 pH 7,5 : pH 5,5 s 98 100 105 88 65 10 11 80 105 90 65 30 Comme il apparaît clairement dans le tableau ci-dessus, les ions des métaux lourds et plus particulièrement du cuivre, de l'argent, du cadmium et du zinc, inhibent fortement l'activité des éléments d'inactivation môme à un pH de 5,5 qui est le pH le plus favorable pour les éléments d'inactivation précités, évitant ainsi une perte de l'activité de la L-asparaginase. L'activité de ces additifs est également mise en évidence lorsqu'on les utilise à une concentration de 10""^ H ou à une concentration supérieure à celle déjà indiquée. On peut augmenter la pureté des préparations ainsi obtenues dans 1 «quelles l'activité des éléments d'inactivation a été inhibée, par les procédés variés utilisés habituellement pour la purification enzymatique comme par exemple par line chromatogra-phie à l'aide d'une résine échangeuse d'ions, par adsorption chro-matographique ou par des procédés analogues. On peut obtenir de cette façon et avec un bon rendement des préparations utilisables comme produits pharmaceutiques. Les exemples non limitatifs suivants sont indiqués à ti 18992 6 2010726 tre d'illustration de la présente invention» Exemple 1 On cultive Serratia marcescens AICC 60 dans un milieu liquide. On sépare par eentrifugation les cellules après leur dé-5 veloppement et l'on obtient des cellules humides. On met en suspension ces cellules humides dans une solution tampon contenant 0,01 M du composé connu sous la désignation de "tris", et ayant un pH de 8,5. On traite cette suspension par un générateur d'ultrasons de 10 KC pendant 10 minutes. Après avoir soumis la suspension 0 à une séparation par eentrifugation, on recueille un liquide surnageant qui constitue une solution enzymatique brute ayant une activité en l-asparaginase exprimée en activité spécifique, de 0,15 imités pour 1 mg de protéine (cette unité est une unité internationale indiquant l'activité enzymatique pour la quantité de subs-5 trat de 1-asparagine exprimée en^A- M hydrolysée en une minute, et l'activité spécifique sera indiquée par la suite de la même façon). On ajoute à ce liquide surnageant, du sulfate de cuivre que l'on _x dissout jusqu'à une concentration de 10 ■* M, ce qui produit l'inhibition de l'activité des éléments d'inactivation. On ajoute ensuite 20 du chlorure de manganèse, jusqu'à line concentration de 0,05 M, on chauffe le liquide résultant pendant 5 minutes à 50°C et on élimine par eentrifugation le précipité formé ce qui permet d'obtenir ainsi un liquide enzymatique brut ayant une activité spécifique de 0,4. On soumet ce liquide enzymatique à un traitement de relarguage en 25 lui ajoutant du sulfate d'ammonium dans une gamme de concentrations d'environ 0,3 à 0,7 par rapport à la concentration de saturation à 0°C. On recueille par eentrifugation les précipités relargués, et l'on obtient ainsi une protéine, enzymatique brute. Dans 30 une solution tampon contenant 0,05 M de "tris" ayant un pH de 8,5. _3 et contenant du sulfate de cuivre à une concentration de 10 ' M, on dissout 20g de cette protéine enzymatique brute et on soumet le tout à une dialyse dans une solution tampon ayant la même composition. On fait adsorber ensuite la protéine enzymatique précitée par de 35 la "DEAE-cellulose", on la soumet à une chromatographie à l'aide d'une solution aqueuse de chlorure de sodium contenant des ions cuivre et l'on obtient la séparation d'une fraction contenant une L-asparaginase ayant un degré élevé de pureté.et d'activité. Après dilution de cette fraction, celle-ci ne contient plus de faeteurs 40 d'inactivation. La L-asparaginase reste extrêmement stable après 69 18992 7 2010726 avoir effectué 1'élimination des ions cuivre par dialyse. On peut continuer la purification de cette enzyme partiellement purifiée, par un autre traitement chromâtographique avec la "PME-cellulose", une chromatographie avec le biogel P-150 5 ou un traitement analogue, et l'on obtient une asparaginase purifiée ayant une activité spécifique de 110, le rendement étant de 30JÊ. Cette préparation de Ii-asparaginase présente une activité anti-tumeur permettant de guérir complètement une leucémie expérimentale de la souris avec une dose de plusieurs 10 Exemple 2 On traite de la même façon que dans l'exemple 1 des cellules obtenues par culture de Serrât ia mar ces cens, JlT00 19180, à partir de laquelle on obtient tua extrait liquide. On ajoute à cet _3 extrait du nitrate d'argent jusqu'à une concentration de 10 M. 15 On purifie ensuite cet extrait liquide en suivant les mêmes étapes que dans l'exemple 1 mais on remplace le sulfate de cuivre de l'exemple 1 par du nitrate d'argent. On obtient une préparation enzymatique de l-asparaginase ayant une activité spécifique de 105» avec un rendement du taux d'activité de 35%» Cette prépara-20 tion est également efficace dans le traitement expérimental de la leucémie chez la souris. Il est. bien évident que la présente invention peut comporter de nombreuses variantes et modifications sans qu'on sorte de son cadre* 69 18992 8 2010726 REVENDICATIONS 1°) Procédé de purification d'une préparation enzymatique de L-asparaginase obtenue à partir d'un microorganisme produisant de la L-asparaginase, dans lequel le microorganisme précité 5 produit en même temps que la L-asparaginase des facteurs produisant 1*inactivation de l'activité enzymatique de la L-asparaginase, ce procédé étant caractérisé par le fait qu'on obtient l'inhibition de l'activité des facteurs d'inactivation de la L-asparaginase et qu'on stabilise ainsi la préparation de L-asparaginâse au cours 10 du procédé de purification dans lequel on ajoute à la préparation enzymatique précitée un ion d'un métal lourd choisi dans le groupe formé par le groupe I et le groupe II du tableau de classification périodique et qu'on récupère la L-asparaginase purifiée ayant une activité anti-tumeur efficace.. 15 2°) Procédé selon la revendication 1 dans lequel le mi croorganisme produisant la L-asparaginase appartient au genre Serrât ia. 3°) Procédé selon la revendication 1 dans lequel on ajoute l'ion d'un métal lourd à la préparation enzymatique, au 20 stade du procédé de purification pour lequel le facteur d*inactivation de la L-asparaginase coexiste avec la L-asparaginase et pour lequel l'enzyme souhaitée a tendance à perdre son activité. 4°) Procédé selon la revendication 1 dans lequel on ajoute les ions de métaux lourds à la préparation enzymatique, sous 25 la forme d'un sel d'un acide organique ou minéral. 5°) Procédé selon la revendication 3 dans lequel on utilise comme préparation enzymatique de L-asparaginase devant être traitée, un extrait de cellules de microorganismes appartenant au genre Serrâtia. 30 6°) Procédé selon la revendication 3 dans lequel on uti lise comme préparation enzymatique de L-asparaginase devant être traitée, un préparation ne contenant pas d'acide nucléique. 7°) Procédé selon la revendication 3 dans lequel on élimine par une précipitation à l'aide d'un acide, les impuretés con-35 tenues dans la préparation enzymatique de L-asparaginase devant être traitée. 8°) Procédé selon la revendication 1 dans lequel on ajoute l'ion métallique lourd, au cours du traitement de purification lorsque le pïï de la préparation enzymatique est d'environ 40 4,0 à 8,5. 69 18992 9 2010726 9°) Procédé selon la revendication 1 dans lequel on ajoute l'ion métallique lourd, au cours du traitement de purification lorsque la température de la préparation enzymatique est d*environ 0°C - 15°C. 5 10°) Procédé de purification d'une préparation enzymati que de l-asparaginase obtenue à partir d'un microorganisme appartenant au genre Serratia, produisant de la l-asparaginase, dans lequel le microorganisme précité produit en même temps que la 1-asparaginase des facteurs d'inactivation de l'activité enzymatique 10 de la l-asparaginase, ce procédé étant caractérisé par le fait qu'on inhibe les facteurs d'inactivation de l'activité de la 1-asparaginase et qu'on stabilise ainsi la préparation de Ir-aspara- ginase pendant le procédé de purification par le fait qu'on ajoute —6 ""3 à la préparation enzymatique précitée environ 10" à 10 M d'au 15 moins un ion d'un métal lourd choisi dans le groupe formé par le groupe I et le groupe II du tableau de classification périodique, ces métauz étant pris sous la forme d'un sel d'un acide organique ou minéral tels que des chlorures, des sulfates, des nitrates ou des acétates et qu'on récupère la l-asparaginase purifiée ayant 20 une activité anti-tumeur efficace. 11°) Procédé selon la revendication 10 dans lequel on utilise comme microorganisme Serratia marcescens ATCC. 60. 12°) Procédé selon la revendication 10 dans lequel on utilise comme microorganisme Serratia marcescens AÏCC. 19180. 25 13°) Procédé selon la revendication 10 dans lequel on ajoute l'ion d'un métal lourd au cours du procédé de purification lorsque le pH de la préparation enzymatique est d'environ 5,5. 14°) Procédé selon la revendication 10 dans lequel on choisit l'ion d'un métal lourd dans le groupe formé par l'argent, 30 le cadnium, le cuivre et le zinc. 15°) Procédé selon la revendication 10 dans lequel on choisit le sel d'un métal lourd dans le groupe formé par le sulfate de cuivre, le nitrate d'argent, le nitrate de cadmium, le chlorure de zinc, le chlorure mercurique, le chlorure de sodium 35 et le sulfate de sodium. 16°) le produit obtenu selon le procédé de la revendication 5. 17°) le produit obtenu selon le procédé de la revendication 6. 40 18°) le produit obtenu selon le procédé de la revendication 7 • 19°)le produit obtenu selon le procédé de la revendication 10.