FR 2010565 A1 19700220 FR 6918922 A 19690609 69 18922 1 2010565 la présente Invention concerne un procédé pour la production d'une composition antibiotique à partir d'un jus de fermentation contenant de la cyclosérine (CS) et de 1'O-carbamyl-D-sérine (OCS). La nouvelle composition convient pour une administration orale aux 5 animaux, La cyclosérine est un antibiotique à spectre large possédant une activité contre les bactéries Gram-négatives et Grain-positives. Elle est anphotère, soluble dans l'eau et forme des sels ou des complexes insolubles ou partiellement solubles avec l'argent, le 10 mercure, le zinc et le cuivre. le procédé décrit dans le brevet des Etats Unis d'Amérique N° 3«090«730 s'est révélé très satisfaisant pour la production de cyclosérine• Selon ce procédé, un microorganisme producteur de cyclosérine du genre Strentomyces est cultivé dans un milieu de fer-15 mentation aqueux constitué par une source d'hydrates de carbone, une source de magnésium, une source de potassium, une source de phosphate, une source de fer, une source de zinc, une source de manganèse et une source d'azote chimiquement définie à une température de 25°C à 37°C environ, durant une période d'environ trois à 20 cinq jours, le rapport hydrates de carbone/azote disponible dans ce milieu étant maintenu à environ 10-20/1* Bans ce procédé, 1'O-carbamyl-D-sérine est produite simultanément. Ses propriétés physiques et chimiques ainsi que le procédé de préparation par culture du Strentomyces nolvchromogenus sont dé-25 crits dans le brevet des Etats Unis d'Amérique H° 2.885.433. Elle se décompose lentement à des températures élevées. On sait que l'antibiotique bacsbracine favorise la croissance et augmente l'efficacité de l'alimentation chez l'animal. On sait aussi que l'activité de la bacitracine chez l'animal est augmentée 30 par combinaison de CS et à'OCS. Cependant, quand on administre soit de la CS, soit de l'OCS seule, en quantités équivalentes à celles du mélange CS-0CS, avec de la bacitracine, l'aptitude à favoriser la croissance n'est pas améliorée dans la même mesure que lorsque la combinaison CS-0CS est administrée avec la bacitracine. Cependant 35 l'emploi de CS-0CS dans l'alimentation est rendu plus difficile par le fait que la stabilité de la cyclosérine en présence d'humidité est faible et qu'il est nécessaire de préparer la CS et l'OCS séparément à l'état relativement pur, puis de les combiner dans les proportions voulues avec les autres constituants alimentaires immé- 69 18922 2 2010565 diatement avant l'absorption par les animaux pour obtenir les avantages d'amélioration de la croissance. Jusqu'ici, il n'était pas possible de préparer la combinaison CS-OCS par un procédé simple en raison des pertes élevées de CS, et le but de 1'invention est 5 d'apporter une solution à ce problème. On résout le problème mentionné par un procédé permettant d'obtenir une combinaison CS-OCS convenant à -une administration orale chez les animaux par un processus simple, de sorte qu'il n'est pas plus nécessaire de les préparer séparément, puis de les 10 combiner» Selon ce nouveau procédé, la CS et l'OCS sont formées dans un milieu nutritif selon les procédés connus. lia fermentation achevée, on ajoute une source de protéines selon une quantité suffisante pour stabiliser la cyclosérine, d'environ 2,6 à 5,3 g ou plus pour 1 kg de milieu de fermentation qui est habituellement 15 un jus de fermentation; on ajuste le pH à environ 8,2-8,8 avec de l'oxyde ou de l'hydroxyde de calcium (chaux). On concentre le mélange à une température inférieure à environ 60°C et sous une pression inférieure à la pression atmosphérique, pour effectuer une réduction de volume de jus entre 1,0 èt 25# environ du volume initial, 20 puis on sèche de toute maniitre appropriée. On peut employer le procédé de l'invention pour.la préparation d'une combinaison CS-OCS à partir d'un jus de fermentation quelconque contenant les quantités adéquates de ces deux composés«Quand la fermentation est terminée, on verse dans un récipient le jua 25 tel quel ou filtré. On ajoute ensuite la source de protéines et on agite le mélange soigneusement pour obtenir un brassage satisfaisant. On ajuste ensuite le pH par addition graduelle (eh agitant soigneusement) de chaux vive ou éteinte finement broyée, soit sous forme pulvérulente, soit en suspension aqueuse. Le composé calcique 30 doit être exempïfc de contaminante nuisibles. On opère de préférence à un pH de 8,5» On concentre ensuite le jus comme décrit précédemment, puis on le sèche par tous moyens appropriés, par exemple par séchage par pulvérisation ou par séchage sur tambour. Le produit résultant est relativement stable et d'écoulement aisé. 35 Suivant m mode de mise en oeuvre préféré de l'invention, on ajuste le pH dans les limites de 11,2 à 11,8 environ, de préférence entre 11,4 et 11,6, au lieu de 8,2 à .8,8.- Un pH de 11,5 est particulièrement judicieux. Pendant l'ajustement du pH, une solubilisa-tion notable de la protéine s'effectue. On ajuste ensuite le pH du 69 18922 3 2010565 jus à environ 8,2-8,8 de préférence à 8,4-8*6» à l'aide d'un acide ayant un anion pharmaceutiquement acceptable. Suivant une variante, on filtre le jus pour obtenir une concentration plus élevée de CS-OCS dans le produit séché. Après filtration, on traite généralement 5 mais pas nécessairement le jus avec du charbon activé, selon les méthodes connues de l'homme de l'art. La protéine utilisée pour la mise en oeuvre de l'invention peut être d'origine animale ou végétale; elle doit pouvoir être dispersée dans l'eau pour donner une solution, généralement colloî-10 dale. Dans le cas présent, ce terme englobe les protéines précipitées qui peuvent être redispersées dans l'eau, môme si la redispersion exige l'action de bases. Le* protéines appropriées comprennent (cette liste n'est pas limitative) la caséine non coagulée, la gélatine, la zéine, l'albumine, le plasma sanguin animal, la protéine 15 de soja, etc...; la caséine est préférée. Les protéines doivent Ôtre de qualité apte à l'emploi dans l'alimentation animale, puisque la préparation est destinée à l'administration orale. Le lait en pjoudre est une source de caséine appropriée. Un excès de protéine n'est pas préjudiciable puisqu'il constitue un simple consti-20 tuant nutritif. L'acide employé pour ajuster le pH doit être de bonne qualité, exempt de tous contaminants nuisibles. Ces acides comprennent non liraitativement les acides chlorhydrique, sulfurique, phosphorique, acétique, propionique et butyrique. Cependant, les sulfates, y com-25 pris le sulfate de calcium, sont généralement considérés comme indésirables pour l'alimentation animale; aussi n'emploi»-t-on pas généralement d'acide sulfurique. On préfère les acides phosphorique, acétique et propionique, et plus particulièrement l'acide acétique. Les solides séchés constituant la composition antibiotique à 30 base de cyclosérine et d'OCS sont administrés oralement aux animaux pour provoquer une croissance améliorée comme décrit ci-avant. On peut administrer la composition de toute manière désirée; la plupart des méthodes d'administration sont connues. L'une d'ellescon-siste à ajouter une quantité efficace prédéterminée aux rations 35 journalières, par exemple, et de distribuer celles-ci à l'animal ou aux animaux intéressés à leurs postes d'alimentation habituels. D'autres modes d'administration paraissent évidents à l'homme de l'art. Les exemples suivants illustrent l'invention; les détails de 9 18922 4 2u I 0jô5 mise en oeuvre peuvent être modifiés, dans le demain® des équivalences techniques, sans s8 écarter de 1* invention. Dans ces exemples,le jus est obtenu à partir de lots de fermentation produits selon le procédé suivant» 5 On cultive le Streptomyces orchidaceous durant une période de 24heures à 30°C dans un milieu d'ensemencement ayant la composition suivante : glucose 10 g/L farine de soja 20 10 carbonate de calcium 2 On place une fraction de 33800 1 du eilieu suivant dans un fermenteur et on stérilise le contenu pendant 5 minutes à 115°C» glucose 5# en poids MgS04,7 H20 0,05 15 0,05 FeSO^, 7 H20 0,002 ZnSO^, 7 H20 0,002 MnSO^ 0,001 Saindoux 0,4 20 On ajoute ensuite 0,48# d'urée stérile au milieu stérilisé. On ensemence 1© fermenteur avec 3000 litres de la culture préparée ci-dessus et on fait incuber le milieu à 30°C pendant 86 heures, ce milieu étant aéré avec un débit de 28 litfes/minute. Au bout de 86 heures, on vérifie que la fermentation est terminée. 25 EXEMPLE JT°1 On filtre et on traite avec du charbon activé un jus de fermentation préparé comme décrit ci-avant. Il titre 4,27 g/L de cyclosérine, 3,76 g/L d'O-carbamyl-D-sérine et contient 18,5 g/L de matières solides « Gît»- verse dans tm récipient une fraction de 38 kg de 30 jus filtré et on ajoute tout en agitant 100 g de caséine. On ajoute progressivement 17? g d'hydroxyde de calcium en poudre en agitant, jusqu'à ce que 1® pH atteigne environ 11,5» On ajoute alors lentement 140 ml d'acide acétique glacial jusqu'à ce que le pH atteigne 8,5. Où concentre ensuit®. "-.6 mélange à environ 7 îcg dans un évapo-35 rateur sous pression réduit©5 durant une période de 65 minutes environ. On sèche le mélange résultant par pulvérisation également durant 65 minutes environ; on obtient 572 g de produit titrant 9,34% (poids) de cyclosérine et 8j>96f» d'O-carbamyl-D-sérine, correspondant à un rendement d'isolemeat ils 68# de CS et 58# d'OCS. 69 18922 5 2010565 On stocke une fraction de produit sec dans un flacon fermé à 45°C pour évaluer sa stabilité. On sait que 1*O-carbamyl-D-séri-ne est beaucoup plus stable que la cyclosérine, de sorte qu'une préparation révélant une stabilité satisfaisante de cette dernière 5 pourra être considérée comme ayant une stabilité satisfaisante en ce qui concerne la première. En conséquence, on ne détermine pas la stabilité de l'OCS. On obtient les données suivantes. Temps % de CS initial 2 semaines 91 10 5 semaines 97 Ceci constitue tin test très sévère et on considère que l'échantillon possède une stabilité satisfaisante. EXEMPLE 2 On répète l'essai décrit dans l'exemple N°1 en ajoutant 200 g 15 de caséine au lieu de 100 g et en employant un volume d'acide acétique de 138 ml. Après évaporation et séchage par pulvérisation, le poids du produit atteint 1126 g; la teneur en CS est de 9,1% (en poids) et celle en OCS de 11,3%, ce qui représente un rendement de 72% pour la CS et de 79% pour l'OCS. 20 EXEMPLE N° 3 On répète l'essai décrit dans l'exemple 1T02 en ajustant le pH seulement à 8,5 au lieu de 11,5 et sans ajouter d'acide acétique. Le rendement est de 44% pour la CS et de 58% pour l'OCS. EXEMPLE N° 4 25 On répète l'essai décrit dans l'exemple N°1 en employant du jus non filtré et en séchant le mélange au tambour. Le produit résultant est utilisable pour accroître les propriétés favorisant la croissance du bétail des aliments contenant des antibiotiques. EXEMPLE N° 5 30 On répète l'essai décrit dans l'exemple ïï°1 en remplaçant la caséine par de la gélatine. On obtient un rendement élevé en CS-OCS. La composition antibiotique possède une bonne stabilité. EXEMPLE N° 6 On répète l'essai décrit dans l'exemple N°1 en remplaçant 35 la caséine par de la zéine. On obtient un rendement élevé en CS-OCS. La composition antibiotique possède une bonne stabilité. EXEMPLE K° 7 On répète l'essai décrit dans l'exemple N°1 en remplaçant la caséine par de l'albumine (blancs d'oeufs séchés). On obtient un 69 18922 6 2010565 rendement élevé en OS-OCS. Là composition antibiotique possède une bonne stabilité. EXEMPLE N° 8 On répète l'essai décrit dans l'exemple N°1 en remplaçant la 5 caséine par du plasma sanguin animal. On obtient un rendement élevé en CS-OCS. La composition antibiotique possède une bonne stabilité. EXEMPLE 9 On répète l'essai décrit dans l'exemple 3tf°1 en remplaçant la caséine par la protéine de soja. On obtient un rendement élevé en 10 CS-OCS. La composition antibiotique possède une bonne stabilité® 69 18922 7 2010565 REVENDICATIONS 1Procédé pour la production d'une composition antibiotique à partir d'un jus de fermentation contenant de la cyclosérine et de 1'O-carbamyl-D-sérine, caractérisé par les stades opératoires sui-5 vants a) On ajoute une source de protéine au jus en quantités suffisante pour protéger la cyclosérine, b) on ajuste le pH du jus entre 11s»2 et Ha8 ©nriroa avec de l'oxyde ou de l'hydrosyde d© calcium? 10 c) on ajuste le pH entre 8,2 et 8,8 environ ave© vn acide ayant un anion pharmaceutiquameiït acceptable, d) on concentre le jus à une température allant jusqu'à 60°C et sous une pression inférieure à la pression atmosphérique pour réduire le volume de ce jus entre 1,0 et 25# ©nviroa du volume ini- 15 tial afin d'obtenir un milieu concentré, et e) on sèche le jus pour obtenir la composition antibiotique, 2,- Procédé suivant la revendication 1, caractérisé en ce qu'on filtre le jus pour éliminer les cellules de l'organisme et on isole la composition antibiotique par séchage par pulvérisation 20 du jus de fermentation. 3.- Procédé suivant la revendication 1, caractérisé en c© qu'on ajuste le pH avec un acide choisi dans le groupe formé par les a,e±=> des chlorhydrique, sulfurique, phosphorique, acétique, propionique et butyrique. 25 4.- Procédé suivant la revendication 1, caractérisé en ce qu'on ajoute au jus de fermentation un® source de protéine ehoisie dans 1© groupe formé par la caséine, la protéine de soja, la seine , la gélatine, l'albumine ou la protéine de sang animal. 5.- Procédé suivant la revendication 1, caractérisé en ce qu'on 30 ajoute la source de protéine en quantité suffisante pour protéger la cyclosérine, cette quantité étant de l'ordre d© 29S à 5$5 g ©u plus par kg de jus. 6.- Procédé suivant la revendication H, caractérisé en e® gtt0©a ajoute une source de caséine somme source de protéine0 35 7.- Procédé pour la production dBune composition antibiotique à partir de jus de fermentation contenant de la cyclosérine et de l'O-carbamyl-D-sérine, caractérisé par les stades opératoires suivants :- a) On ajoute une source de protéine au jus en quantité suffi- 18922 8 2010565 santé pour protéger la cyclosérine, b) on ajuste le pH du jus entre 8,2 et 8,8 avec de l'oxyde ou de l'hydroxyde de calcium, c) On concentre le jus à une température allant jusqu'à 60°C environ et sous une pression inférieure à la pression atmosphérique pour réduire ce jus à environ 1,0 à 25# du volume initial, pour obtenir un milieu concentré et, d) On sèche le jus pour obtenir la composition antibiotique.