FR 2011520 A1 19700306 FR 6917545 A 19690529 69 17545 i 2011520 La présente invention est relative à- un procédé^pour l'isolement de composés difficilement solubles apprôpriés à-la transformation ultérieure en céphalosporine C ou en acide 7~amino-céphalosporanique, à partir de solutions qui sont obtenues en 5 préparant par fermentation de la céphalosporine C. Ces composés difficilement solubles sont les complexes difficilement solubles de la céphalosporine C avec des métaux lourds. Ces complexes .eux-mêmes sont aussi l'objet de l'invention. Comme on sait, on obtient, lors de la préparation de la 10 céphalosporine C par fermentation, une solution aqueuse dans laquelle la céphalosporine'C est renfermée en faible quantité, à côté de nombreuses autres substances dissoutes présentant en partie des propriétés physiques et chimiques analogues, par exemple à côté de quantités variables de céphalosporine N, qui est un an-15 tibiotique également hydrophile. La préparation à l'état pur de la céphalosporine C à partir de telles solutions de culture, ou à partir du produit brut obtenu à partir desdites solutions, ou à partir de solutions très diluées, par exemple de solutions aqueuses à 2 - ~y$>, est très compliquée et difficile. On obtient 20 le produit brut la plupart du temps sous la forme d'un mélange hétérogène graisseux d'une composition variable et de propriétés physico-chimiques variables, de sorte que le traitement doit fréquemment être modifié d'une charge à l'autre. Comme procédé pour l'isolement de la céphalosporine C 25 à partir de solutions de fermentation, on a proposé par exemple d'adsorber la céphalosporine C sur du charbon actif, d'éluer, d'adsorber la matière éluée sur de l'oxyde d'aluminium, d'éluer à nouveau, d'adsorber sur une résine échangeuse d'anions, d'éluer la céphalosporine C brute avec une solution aqueus'e - tampon d'un 30 pH de 2,5 à 8,0, par exemple avec de l'acétate de pyridine, et de soumettre ensuite cette céphalosporine C brute à une opération d'extraction avec des solvants (cf. le brevet allemand 1.014.7H). Suivant un autre procédé, la céphalosporine C doit être obtenue par un fractionnement à l'aide de solvants, en par-35 ticulier par répartition entre de l'eau et du phénol ou des phénols substitués par un alcoyle. Comme autre possibilité, il a été prévu de soumettre des éluats provenant de la colonne de charbon actif ou de la colonne d'oxyde d'aluminium ou de la colonne de la résine échangeuse d'ions à des conditions telles, en 69 17545 2 2011520 ce qui a trait à la température et à l'acidité, que la céphalosporine N- renfermée dans le filtrat de culture soit transformée en acide pénicillinique, mais que la céphalosporine C reste pratiquement non influencée,, ou "bien de détruire la céplialosporine 5 N en faisant agir dé la pénicillinase et de séparer ensuite la céphalosporine C par extraction fractionnée avec des solvants, ou bien par chromatographie avec une résine échangeuse d'ions. On a également tenter d'adsorber directement la céphalosporine 0 avec un échangeur d'ions, à partir du milieu traité à l'acide. 10 Cette adsorption directe présente toutefois pour inconvénients que par suite de la présence d'autres anions, en dehors de la céphalosporine G, de très grandes quantités de la résine échangeuse d'anions étaient nécessaires et que, de plus, les ions chlorure étaient élués simultanément et provoquaient des difficultés dans 15 les stades ultérieurs du procédé. Finalement, on a décrit un procédé dans lequel le milieu de fermentation clarifié est ajusté à un pH de 2,8 à 4,0 avec un échangeur de cations renfermant des groupes fortement acides sous la forme H+, procédé dans lequel 1'échangeur de cations est séparé du milieu acidifié et dans le-20 quel celui-ci est débarrassé de pratiquement la totalité des ions chlorure et autres anions inorganiques à l'aide d'un échangeur d'anions forts sous la forme d'un sel avec un acide organique faible monobasique et volatil, et dans lequel finalement la céphalosporine C est obtenue à partir du produit de percolation, 25 par exemple par adsorption sur un échangeur d'anions sous la forme acétate et par réduction avec un tampon à base d'acétate de pyridine (voir le brevet allemand 1.126.564). Il est également connu de purifier la céphalosporine C brute par transformation en des sels cristallisables tels que le sel de sodium ou le sel 30 de baryum. Toutefois, ces sels ne peuvent être cristallisés que dans une solution relativement concentrée et préalablement purifiée, et à cause de la bonne solubilité dans l'eau de ces sels, on doit prendre en considération des pertes importantes lors de la cristallisation. 35 On a maintenant trouvé un procédé avantageux dans le- qiel on isole à partir d'une solution, en particulier aussi à partir d'une solution diluée et/ou impure, par exemple à partir de liquides de fermentation ou d'éluats, un complexe métallifère 69 17545 3 2011520 micro-cristallin de la céphalosporine C avec un métal lourd. Ce complexe métallifère peut être séparé sous une forme homogène, bien filtrable et stable, à partir de la solution souillée par d'autres substances solubles dans l'eau. Le complexe peut être 5 transformé facilement en céphalosporine ou en ses sels solubles dans l'eau, ou bien être utilisé directement pour la suite du traitement conduisant à l'acide 7-amino-céphalosporanique. Le procédé suivant l'invention est caractérisé par le fait qu'on précipite, dans une solution aqueuse diluée renfermant 10 de la céphalosporine G, ton complexe métallifère -de ladite céphalosporine C avec un métal lourd. Comme métaux lourds, il y a lieu de citer en particulier des métaux lourds bivalents comme le cuivre, le nickel, le plomb, le cobalt, le fer, le manganèse, le mercure, le cadmium, mais surtout le zinc. La précipitation a 15 lieu en solution aqueuse à l'aide d'un sel soluble dans l'eau du métal lourd correspondant, par exemple à l'aide de sulfates, d'halogénures, notamment du chlorure, et en particulier aussi à l'aide de l'acétate. Le complexe métallifère est précipité à. un pH de l'or-20 dre de 4 à 7 , de préférence de 5 à 6. La céphalosporine G peut se présenter dans la solution aqueuse sous la forme d'un sel, par exemple d'un sel de métal alcalin ou alcalino-terreux, ou sous la forme d'un sel d'ammonium, par exemple sous la forme du sel de sodium ou du sel de calcium, ou sous la forme d'un sel avec une 25 base organique comme la triéthylamine. La solution aqueuse peut également renfermer des solvants organiques miscibles à l'eau, par exemple des alcools comme l'éthanol ou l'isopropanol. Le complexe métallifère microcristallin peut facilement être séparé de la solution, par exemple par filtration, essorage, 30 centrifugation. Il est alors avantageusement lavé avec de l'eau et/ou avec des solvants organiques. En vue de transformer le complexe en céphalosporine G ou en ses sels solubles dans l'eau, tels que les sels de métaux alcalins ou les sels d'ammonium, on traite par exemple le comple-35 xe par une solution de bicarbonate ou par une solution diluée d'hydroxyde de sodium, ou par un échangeur de cations convenable (par exemple "Âmberlite IRC-50" ou "Amberlite IR-120", ou "Dowex chelating resin A-1" sous la forme sodique), ou bien on précipite le métal lourd à l'état de sulfure, ou bien on le trans-40 forme en un complexe difficilement soluble avec des agents 69 17545 4 2011520 organiques formant des complexes, comme la 8-hydroxy-quinoléine ou la 8-hydroxy-quinaldine. On peut aussi utiliser le complexe directement comme matière de départ pour préparer l'acide 7-amino-céphalosporani-5 que, par exemple suivant les procédés décrits dans le brevet belge 643.899 ou 720.185. En outre il est avantageux de purifier davantage le complexe par reprécipitation ou recristallisation, par exemple en dissolvant le complexe dans un acide, par exemple dans de 10 l'acide acétique, et en précipitant à nouveau dans la solution acide en ajoutant des bases, par exemple une solution diluée d'hydroxyde de sodium ou de la triéthylamine. Les complexes de métaux lourds de la céphalosporine C sont nouveaux et constituent également un objet de la présente 15 invention. Il s'agit de complexes 1:1, c'est-à-dire que le complexe renferme un atome du métal par mole de céphalosporine G. Le complexe migre, dans une électrophorèse sur papier, comme une tache de substance unitaire. La solubilité dans l'eau et dans les solvants organiques est très faible. Dans le tableau 20 qui suit, on a indiqué la solubilité en grammes pour 100 ml du complexe dans de l'eau, dans des alcanols inférieurs et/ou dans de l'acétone. TABLEAU 2b Solvant Complexe de cuivre Complexe de zinc Complexe de mercure 0°C 23 °o 0°G 23°C 0°C 23°0 Eau distillée 0,058 0,066 0,106 0,095 0,059 30 'vîéthanol ' 0,019 0,052 0,037 0,035 0,015 Ethanol 0,027 0,019 0,034 0,027 — 0,006 Isopropanol 0,022 0,015 0,010 0,001 0,006 âcétone 0,016 0,029 0,005 0,014 —— 35 *69 17545 5 2011520 Solvant Complexe de fer Complexe de cobalt Complexe de nickel Complexe de cadmium 5 eau distillée 0,2 0,08 0,14 0,04 23°C Pour préparer les solutions renfermant de la céphalosporine G qui sont utilisées comme matière de départ, on se sert 10 des méthodes usuelles pour l'isolement des produits naturels hydrophiles, par exemple des antibiotiques, des substances de croissance, des vitamines, à partir de liquides de fermentation. Comme méthodes de ce genre, il y a lieu de citer surtout : 1) une adsorption ou une absorption, par exemple sur 15 des charbons actifs comme la "Norit", sur des agents d'adsorption basiques comme l'oxyde d'aluminium, sur des résines non ionogènes de décoloration et/ou d'adsorption comme "Asmit" (produit de condensation de phénylène-diamine et de formaldéhyde de Imacti-Maatsch), "Amberlite XAD-1 ", "Amberlite XAD-2" "Amberlite XAD-4" 20 ou "Amberlite XAD-5" (produits de polymérisation du polystyrène disponibles chez Roehm et Haas), "Amberlite XAD-7" ou "amberlite XAD-8" (produits de polymérisation de l'acide acrylique), sur des échangeurs d'ions basiques comme "Amberlite IR-4B" (phénol-polyamine avec des groupes aminogènes primaires et secondaires, 25 faiblement basique), "Amberlite , "Amberlite IRA-93" (pro duits de polymérisation du styrène et du divinylbenzène comportant des groupes aminogènes primaires, secondaires et tertiaires, faiblement basique), "Amberlite XE-265" (polyamine, faiblement basique), "Amberlite 68" (produit de polymérisation de l'acide 30 méthacrylique, faiblement basique), "Amberlite IRA-400", "Amberlite IRA-401", "Amberlite IRA-402", "Amberlite IRA-410" (produits de polymérisation du styrène et du divinylbenzène comportant des groupes aminogènes quaternaires, faiblement basique), "Amberlite LA-1", "Amberlite LA-2" ou "Amberlite LA-3" (aminés 35 secondaires ou primaires liquides, d'un poids moléculaire élevé) ou sur des résines échangeuses d'ions convenables d'autres firmes comme "Dowex 1 à 4" (Dow Chemical Co.) "De-Acidit FF11 (The Permutit Co.), "Imac A 13", "Imac A 17", "Imac A 20", 5-40 (Imacti-Haatsch). 17545 6 2011520 2) Une répartition entre des solvants, par exemple entre de l'eau et du phénol ou des phénols substitués par un alcoyle, à un pH acide ou faiblement basique. 3) Une destruction chimique ou biologique des sous- 5 produits, par exemple à l'aide d'acides comme l'acide sulfurique ou l'acide oxalique, ou à l'aide d'échangeurs d'ions acides, par exemple "Amberlite IR-120" (produit de polymérisation du styrène et du divinylbenzène comportant des groupes sulfoniques) ou à l'aide d'enzymes, par exemple à l'aide de pénicillinase. 10 L'invention est décrite plus en détail dans les exem ples non limitatifs qui suivent, dans lesquels les températures sont indiquées en degrés centigrades. EXEMPLE 1 15 A 150 ml d'une solution renfermant 7,7% environ de céphar- losporine et une quantité triple à quadruple d'impuretés provenant du filtrat de culture, on ajoute, tout en agitant et en refroidissant dans un bain de glace, une solution de 44 g d'acétate de zinc cristallisé-/^(OOCCH^g.2 HgOj7 dans 88 ml d'eau, 20 le mélange restant encore limpide. Tout en agitant fortement et en continuant de refroidir à la glace, on fait ensuite couler, depuis une ampoule à brome, en un fin jet, pendant 10 à 15 minutes, 260 ml d'éthanol sec, puis ensemence avec une trace d'un complexe zincique de 25 céphalosporine C et continue d'agiter pendant une heure un quart. Le louche qui se forme devient alors très fort au bout d'un quart d'heure, et un fin précipité cristallin commence à se séparer. On sépare le précipité sur l'entonnoir filtrant, le lave avec peu d'un mélange (6 : 4) d'éthanol et d'eau, et en-30 suite avec de l'alcool à 95 puis sèche le résidu sous un vide poussé. On obtient sous forme pratiquement pure 6,2 g du complexe zincique de la céphalosporine. Spectre ultra-violet : = 262 mjx (s - 7*300); Spectre infra-rouge dans le nujol, voir figure 1. 35 Dans une électrophorèse sur papier , dans un tampon à base de phosphate de potassium et-de sodium (1/15 molaire : pH : 5»5» une heure et demie, 2.000 volts), le complexe migre- sous la forme d'une taché de substance Unitaire qui peut'être"-décelée 69 17545 7 2011520 avec le spectre en ultra-violet ou avec un mélange de ninhydrine et de collidine, la plage de migration vers l'anode étant de 10 cm. La solution de départ peut être préparée comme suit : 5 Suivant la méthode décrite dans le brevet britannique 968.324, on filtre la solution de culture, renfermant la céphalosporine G, en ajoutant un auxiliaire cle filtration, porte le filtrat à un pH de 3 avec un échangeur d'ions fortement acide sous forme acide, et fait passer à travers un échangeur basique 10 sous la forme acétate, pour échanger les anions minéraux contre l'acétate, adsorbe la céphalosporine G sur "Amberlite IR-4B" et élue avec un tampon à l'acétate de pyridine, puis précipite la céphalosporine C brute avec de l'acétone à partir de l'éluat concentré* filtre et sèche. On dissout dans 156 ml d'eau 43,5 g 15 du précipité obtenu (teneur en céphalosporine C : 27,5 %«) EXEMPLE 2 Dans 3,8 ml d'eau, on dissout 1,3 g d'un précipité 20 de céphalosporine C brute (pureté 23 %), qui a été obtenue suivant le procédé décrit dans l'exemple 1. On ajoute au tout une solution de 1,1 g d'acétate de zinc dans 2,4 ml d'eau. On ajoute ensuite goutte-à-goutte 8,2 ml d'alcool isopropylique et agite pendant 5 heures à zéro degré. Après avoir essoré et séché, on 25 obtient 208,5 mg d'un cristallisât pratiquement incolore. EXEMPLE 3 Dans 14,5 ml d'eau, on dissout 4 g d'un précipité de 30 céphalosporine C brute (pureté 40 %) qui a été obtenue suivant le procédé décrit dans l'exemple 1. On ajoute à la solution 0,6 ml de triéthylamine et 1,8 g d'acétate de cuivre hydraté dans 40 ml d'eau. On ensemence la solution limpide, d'un vert foncé soutenu, avec un complexe cuprifère cristallin de cépha-35 losporine C et laisse reposer en glacière pendant une nuit. On sépare par essorage le précipité microcristallin et le lave successivement avec 100 ml chaque fois d'eau glacée, d'alcool à 95 % et d-'éther, puis sèche sous vide, ce qui fait qu'on obtient 1,298 g d'un complexe zincique de céphalosporine à 88 69 17545 8 2011520 Le spectre absorption en ultra-violet présente un maximum à 266 - 267 mp- (e = 10.000) et un minimum à 232 mjx . On obtient à partir du filtrat, après addition de 2 parties en volume d'alcool, encore un précipité de 0,690 g de 5 matière à 60 % environ. Le complexe cuprifère de céphalosporine 0 qui est utilisé pour l'ensemencement peut être préparé comme suit : Dans 31,8 ml d'eau distillée, on dissout tout en agitant, 3,184 g de céphalosporine G à 89,5 % sous la forme de l'a-10 cide libre, puis ajoute à la solution 1,5 ml de triéthylamine. On ajoute aussitôt à cette solution (pH = 7>5 environ) une solution de 1,685 g d'acétate de cuivre hydraté dans 73,8 ml d'eau (pH 4,8). A partir de la solution limpide, de teinte vert foncé, il commence à se séparer un précipité d'un bleu verdâtre clair. 15 On laisse reposer pendant une nuit à zéro degré et sépare par filtration le produit microcristallin. On le lave avec 25 ml d'eau froide, à deux reprises avec 25 ml d'éthanol à 95 % et à quatre reprises avec de l'éther, puis le sèche sous vide. On obtient 3,227 g (environ 94 % de la théorie) du complexe cuprifère 20 pur de la céphalosporine C. Ce complexe présente dans le spectre ultra-violet, dans une solution décimolaire de carbonate de sodium, une valeur X = 266 - 267 om (s = 11.300). Dans le spectre infra-rouge, liidJL dans le nujol, on peut entre autres voir les bandes suivantes : 25 291 (épaulement, w) 5 3,01 (m) ; 5,71 (s) ; 6,01 (s) ; 6,03 (s); 6,13 (épaulement, m) 6,51 (m) ; 7»85 (wm) ; 8,15 (m) ; 8,38 (w) j 8,55 (w) ; 8,75 (w) ; 8,96 (w) ; 9,28 (wm) ; 9,68 (wm)p., cf. figure 2. L'analyse élémentaire fournit N = 8,5 % (calculé 8,8 ^ 30 S = 6,7 % (calculé 6,7 %) ; Cu (méthode oscillographique) = 14,1 % (calculé 13,7 %)» EXEMPLE 4 35 Dans 8 ml d'eau distillée, on dissout 0,50 g du sel de sodium, dihydrate à 85 % environ de la céphalosporine G (Arçpy = 260 nm, 7*350 dans l'eau). A la solution jaune, on ajoute 0,27 g de chlorure de nickel (anhydre) dans 2 ml d'eau, 69 17545 9 2011520 ce qui fait que sa valeur de pH s'abaisse de 5»5 à 4,0. On ajoute à la solution limpide, de couleur verte, de l'éthanol jusqu'à l'apparition d'un louche et.conserve pendant une nuit en glacière. On sépare par essorage, les fins cristaux, les lave 5 à l'eau, avec un mélange d'alcool et d'eau, puis avec de l'alcool, et les sèche. Dans une solution centinormale d'acide acétique, le produit vert pâle présente un coefficient d'extinction de 8,650 à 267 nm. Le pouvoir rotatoire spécifique est : /~a_7^ = + 82° £ 1° (c = 0,996 ÇS)dans une solution 10 demi-normale de NaHCO^. Le test quantitatif à 1 ' hydr oxylamine fournit une teneur de 100 %. Pour ce qui concerne le spectre infra-rouge dans le nujol, voir la figure 3« 15 25 EXEMPLE 5 Le complexe de cobalt—(II) de la céphalosporine G est préparé, d'une manière analogue à celle de l'exemple 4, à partir de 0,50 g du sel de sodium,dihydrate de la céphalosporine C et de 0,525 g d'acétate (tétrahydrate) de cobalt-(II), avec addi-20 tion de 0,1 ml d'acide acétique glacial. Le précipité microcristallin, de couleur rose, devient d'un bleu violacé par séchage sur du pentoxyde de phosphore. EXEMPLE 6 Le complexe de cadmium (de teinte légèrement beige) de la céphalosporine C est préparé d'une manière analogue à celle de l'exemple 4, à partir de 0,50 g du sel de sodium dihydrate de la céphalosporine C et de 0,560 g d'acétate de cadmium (dihydrate) 30 avec addition de 0,1 ml d'acide acétique glacial. Son pouvoir rotatoire spécifique, dans une solution décimolaire de complexone (EDTA.Na4) est de + 79° ± 20° (c = 0,958 %). EXEMPLE 7 35 Le complexe de fer-(II) de la céphalosporine C est pré paré d'une manière analogue à celle de l'exemple 4, à partir de 0,50 g du sel de sodium dihydrate de la céphalosporine C et de 0,342 g de chlorure de fer-(II). (dihydrate). Il est obtenu sous la forme de micro-cristaux de teinte brun-gris. 69 17545 10 2011520 REVENDICATIONS 1. Procédé pour l'isolement de composés difficilement solubles convenant pour la transformation ultérieure en cépha-5 losporine C ou en acide 7-amino-céphalosporanique, à partir de solutions obtenues lors de la préparation par fermentation de la céphalosporine C, ledit procédé étant caractérisé par le fait qu'on précipite les complexes difficilement solubles de la céphalosporine C avec un métal lourd. 10 2. Procédé suivant la revendication 1, caractérisé par le fait qu'on précipite le complexe dans une solution diluée et/ou dans une solution aqueuse impure. 3* Procédé suivant la revendication 1 ou 2, caractérisé par le fait qu'on précipite le complexe dans un liquide de 15 f er ment at i on. 4. Procédé suivant la revendication 1 ou 2, caractérisé par le fait qu'on précipite le complexe dans les éluats. 5« Procédé suivant l'une ou plusieurs des revendications 1 à 4, caractérisé par le fait qu'on utilise, comme métal 20 lourd, un métal lourd bivalent. 6. Procédé suivant l'une des revendications 1 à 5» caractérisé par le fait qu'on utilise le cuivre ou le mercure comme métal formateur de complexe. 7. Procédé suivant l'une des revendications 1 à 5, 25 caractérisé par le fait qu'on utilise le zinc comme métal formateur de complexe. 8c Procédé suivant l'une des revendications 1 à 7, caractérisé par le fait qu'on précipite le complexe en solution aqueuse, à l'aide d'un sel de métal lourd soluble dans l'eau. 30 9. Procédé suivant l'une des revendications 1 à 8, caractérisé par le fait qu'on précipite le complexe en présence de solvants organiques miscibles à l'eau. 10. Procédé suivant l'une des revendications 1 à 8, caractérisé par le fait qu'on précipite le complexe en présence 35 d'alcanols inférieurs miscibles à l'eau. 11. Procédé suivant l'une des revendications 1 à 10, caractérisé par le fait qu'en vue de le purifier davantage, on fait passer le complexe en solution à l'aide d'un acide dilué et précipite ensuite à nouveau par addition de bases jusqu'à un 40 pH de 8 au plus. 69 17545 n 2011520 12. Les complexes de la céphalosporine C avec des métaux lourds "bivalents. 1J. Le complexe mercurique de la céphalosporine G. 14. Le complexe cuprique de la céphalosporine G. 5 15* Le complexe zincique de la céphalosporine C. 16. Le complexe ferrique de la céphalosporine C. 17. Le complexe cobaltique de la céphalosporine C. 18. Le complexe nickélifère de la céphalosporine C. 19. Le complexe cadmifère de la céphalosporine C.