FR 2009709 A1 19700206 FR 6916232 A 19690520 69 16232 1 2009709 La présente invention concerne un procédé de préparation de cultures mères actives sous forme de mousses et devant être cultivées sur un bouillon liquide en association avec dès hydrocarbures. La réussite de la culture de levures sur des hydrocarbures né-5 cessite en général l'utilisation de cultures jeunes et r#Eentes pouvant se reproduire immédiatement après leur transport sur de nouveaux milieux, la période de latence étant donc supprimée. Des procédés déjà connus de préparation de cultures mères, indiquées par exemple dans le brevet anglais ÎT° 914 568 et les 10 brevets français N° 1 385 719, N° 1 384 251 et N° 1 384 252 sont basés sur le développement d'une souche de levure dans un milieu nutritif contenant un hydrocarbure comme source unique de carbone et d'énergie chimique pour la fermentation principale. Un inconvénient d'une culture mère acclimatée dans un milieu 15 avec des hydrocarbures est sa faible stabilité. JUST F. SCHNABEL, W.A. ULMAN (Die Brauerei, Wiss. Beilage 1951, 4, 71) ont mentionné la conservation d'une charge de cellules de "Candida Tropicalis" cultivée sur des hydrocarbures pendant une nuit, car son activité décroît rapidement. Cette rapide perte d'activité est due, d'après 20 E.G. BORISENKO (Microbiologia 1967, 36, p. 240) à l'autolyse des cellules de levure qui, cultivées sur hydrocarbures, ont tendance à s'autolyser davantage que par culture sur hydrates de carbone. L'inconvénient ci-dessus, présenté par le développement d'une culture mère sur hydrocarbures, est supprimé idans une technique 25 décrite dans la demande de brevet Tchécoslovaque N°PV 634/68 déposée le 27 Janvier 1968, aux noms de Messieurs A. CEJKOVA et al.,selon laquelle on ajoute à la culture mère de fermentation, des produits inhibiteurs de l'autolyse, agissant en même temps comme sources d'énergie pour les levures. 30 La présente invention vise à améliorer la stabilité d'une cul ture mère développée sur hydrocarbures, et repose sur une préparation des cultures mères actives à l'état de mousse par développement sur un bouillon liquide en présence d'hydrocarbures. Conformément à l'invention, cette préparation comporte la dispersion 35 d'une émulsion liquide de levures et d'hydrocarbures sous forme d' une mousse, et la séparation par flottation des cellules de levure contenues dans la mousse ainsi produite, par addition d'un pétrole ou d'une mélange d'hydrocarbures purs. Suivant l'invention, lorsque la culture mère en cours de multi-40 plication a atteint le point voulu dans la j&iase de multiplica- ? 16232 2009709: . tion exponentielle, on y ajoute tui excédent d'alcanes normaux,de gas-oil, ou d'un autre produit de distillation du pétrole,non toxique pour les micro-organismes, et on sépare après agitation la mousse produite et les cellules entraînées, par la flottation. La 5 culture peut ensuite être mise en flacons et conservée sour forme de mousse. Un avantage de cette préparation consiste en ce que les hydrocarbures ajoutés séparent, par flottation, les cellules de levure du milieu nutritif de fermentation, ce q.ui remplace la sépa-10 ration, autrement indispensable, la méthode prolonge d'autre part la durée de stabilité, et enfin permet une augmentation du rendement. tes exemples qui suivent sont donnés à titre d'illustrations et ne constituent nullement des limitations à lfinvention. 15 EXEMPLE 1 On prépare une culture mère de " Candia Lypolitica " dans une cuve de fermentation de 30 litres emplie d'un liquide constituant le milieu de fermentation et contenant par litre t 7 g de phosphate monopotassique, 0,4 g d'azote sous forme de sel d'ammo-20 nium, 0,4 g d'azote sous forme d'urée, 0,2 g de sulfate de magnésium, 0,1 g d'un autolysat de levure, 0,1 g de chlorure de sodium et 10 g d'un mélange de n-alcanes en Le pH est au départ de 4,5 • Au cours de la 9° heure de fermentation aérobie, on ajoute des n-alcanes en quantités respectives de 5, 10, 15 et 20 jé en 25 volumes. La suspension est agitée et on note, à intervalles de 15 minutes, le poids sec de biomasse dans le liquide de culture et dans la mousse produite. Les résultats sont résumés dans le Tableau suivant : TABLEAU 1 30 Quantités de biomasse de fermentation dans le liquidé présent sous la mousse (en pourcents de la biomasse originale dans le milieu nutritif) Temps Quantités ajoutées de n-alcanes (en vol JÉ) d'agitation 0 5 10 15 20 0 100 100 100 100 100 15 100 8,4 8,1 6,5 5,3 30 100 7,5 8,1 7,5 6,4 60 104,9 8,6 8,9 8,4 7,1 120 113,0 10,3 11,5 11,5 10,4 69 16232 5 2009709 •RTRWTPEE 2 On effectue la culture comme dans l'Exemple 1. Au cours de la 9° heure de fermentation, on divise le milieu entre des tubes cylindriques calibrés pourvus de disques frittés d'aération, et 5 permettant de mesurer les volumes de mousse dans des conditions standardisées, suivant la méthode déorite par H.W. BRETZ, S.L. WANG et R.B. GRIEVES (Appl. ULcrobiol., 1967, U>, p. 76) et R.B. GRIEVES et S.L. WAHG (Appl. Microbiol., 1966, 14, p.778). On ajoute tin hydrocarbure au contenu de chaq.ue tube, en quantités res-10 pectives de 5, 10, 15 et 20 1» en volumes. Au bout de 15 minutes, on aesure les volumes de mousse et de liquide en excédent au dessous de la mousse. On mesure également la biomasse comme dans 1* Exemple 1. L'effet de flottation de chaque concentration en hydrocarbure est mesuré par la formule suivante, due à R.B. GRIEVES et 15 S.L* WANG (Biotechnol. Bioengn. 1967, £, p* 187) t HR - ïr Yr : Z1 J± dans laquelle : 2 est la biomasse au dessous de la mousse, r Yr est le volume résiduel du liquide au dessous de la mousse, 20 est le volume initial de la biomasse en suspension, est le volume initial de la suspension, et RR est le N rapport résiduel n traduisant l'effet de flottation suivant la concentration en hydrocarbure d'après le volume de mousse produit. 25 Bn raison du faible degré de dispersion, le volume de la pha se dispersée dans les mousses est notablement plus grand que le volume de l'émulsion initiale. En mesurant les volumes, d'une part des mousses, et d'autre part des liquides, on obtient les chiffres du Tableau 2 ci-après, avec les valeurs calculées corres-30 pondantes de RR : f 69 16232 4 TABLEAU 2 2009709 Yolumes de mousse et de liquide, suivant les quantités d'hydrocarbures ajoutées Concentrations Y 0 L U M E S RR 5 en hydrocarbure ■—: en Yol i» De mousse Se liquide sous Totaux la mousse (En pourcents du volume initial de l'émulsion) 0 0 * 100 . 10 5 57 79 134 0,066 *10 68 73 141 0,558 * 15 76 64 140 0,041 20 80 56 136 0,029 Comme on peut le voir dans le Tableau 2, le volume total de 15 la mousse et du liquide ne dépasse pas 140 £ du volume initial* En ce qui concerne les valeurs de RR, on peut voir que les concentrations les plus favorables en hydrocarbures sont de 5 etlOJÉ en volume, qui entraînent par la flottation, pour 15 minutes d* agitation, respectivement 91,6 et 91,9 de levure du milieu de 20 fermentation. EXEMPLE 5 La culture est réalisée comme dans l'exemple 1, sauf que le mélange de n-alcanes est remplacé par tin gas-oil distillant entre 294° et 360°, utilisé à une concentration de 10 jé en volume. Le 25 rendement à la flottation en levure est déterminé comme dans l'exemple 2, le gas-oil étant utilisé aux concentrations de 5, 10, 15 et 20 volumes f». Les meilleurs résultats sont obtenus avec une concentration en gas-oil de 10 i» en volume. On sépare 92,2 £ de la levure du 30 milieu dans la mousse. Le RR est égal à 0,062. EXEMPLE 4 La culture et la flottation sont effectuées comme dans -1* Exemple 1, en utilisant 10 Jé en volume d'hydrocarbure. La mousse et la biomasse incorporée sont pesées pour chaque opération et 35 conservées d'une part en réfrigérateur à la température de 4° et d'autre part en thermostat à 20*. On étudie le phénomène d'autoly-se par la perte en phosphore, en azote protéinique, par le pH, et 69 16232 5 2009709 par la perte en poids sec en 132 heures. On étudie en même temps l'autolyse d'une pâte de fermentation séparée, d'une teneur en matière sèche de 24,3 $6.,Pour la mousse conservé® au réfrigérateur, l'autolyse ne commence qu'à la 132* heure. On constate des pertes 5 de 9,1 i» de ^8jig d'azote protéinique pour. 100 ml de fil trat. Dans la pâte, l'autolyse commence à la36° heure, avec une perte de 9,4 $> du total de la biomasse* Dans la mousse conservée en thermostat, l'autolyse commence à la 132° heure, avec une perte de 20,2 56 du ^2^5 86,25 jxg 10 d'azote protéinique. Pour la pâte en thermostat, l'autolyse se produit à la 24° heure avec perte de 7»9 # du PgO^. A la 132° heure, la perte en P2OJ5 est de 86,9 Jé* lia quantité d'azote protéinique passe de 49»0 jxg à la 24° heure à 350,0 ^ig à la 132° heure, pour 100 ml. La perte en matière sèche dans la mousse était dans 15 ces conditions de 8,2 et de 31,7 & dans la pâte» EXEMPLE 5 On effectue la culture et la flottation comme dans l'Exemple » 3, en utilisant 10 vol. & de gas-oil. On étudie l'autolyse de la levure dans la mousse et dans la pâte comme dans l'Exemple 4* L' 20 autolyse commence dans la pâte au bout de 24 heures, tandis qu'on ne constate aucuneautolyse dans la mousse même après 5 Jours de conservation à la température ambiante ou à température élevée* EXEMPLE 6 La mousse et la pâte préparées conformément à 1'Exemple 4 25 sont, après 48 et 72 heures de conservation, utilisées coma* ino-culum dans l'essai de fermentation décrit à propos de l'Exemple 1* L'inoculum est introduit à raison de 2,0 g de biomasse, comptés en poids sec, par litre de milieu de fermentation* On a étudié dans tous les cas la période de latence du développement de la 30 biomasse. Au bout de 48 et 72 heures de conservation de la mousse à la température de 20°, la période de latence était d'une heure, tandis que dans le cas de la pâte, les périodes de latence étaient respectivement de 6 heures et de 8,5 heures pour des .délais de 48 35 et 72 heures. 69 16232 6 2009709 REVENDICATIONS 1) Procédé de préparation de cultures mères actives sous forme de mousses et devant être cultivées en association avec des hy drocarbures j, selon lequel une émulsion de fermentation comprenant un milieu nutritif, des micro-organismes, des cellules, et au 5 moins un hydrocarbure, est convertie, en une phase exponentielle, en une phase mousseuse en dispersion par addition d'un excédent d'un mélange de n-alcanes, d'un gas-oil ou d'un autre produit de la distillation du pétrole n'ayant pas d'effets toxiques sur les micro-organismes « 10 2î) Procédé conforme à la revendication 1, selon lequel les cellules des micro-organismes sont séparées du milieu de fermentation, de préférence par flottation. 3) Procédé conforme aux revendications 1 et 2, selon lequel la mousse séparée avec la biomasae est conservée et utilisée 15 comme culture mère.