FR 2011556 A1 19700306 FR 6920600 A 19690619 69 20600 1 2011556 La présente invention concerne un procédé et un appareillage destinés à la culture des microorganismes en utilisant comme source de carbone principale des hydrocarbures gazeux* On utilise dans la présente invention des hydrocarbures qui sont gazeux à la 5 température ambiante et à la pression atmosphérique, et ces hydrocarbures englobent le méthane, l'éthane, le propane, le n—butane, 1'iso-butane, l'éthylène, le propylène et les hydrocarbures similaires* Dans la technique antérieure de culture des microorganis-10 mes, les sources de carbone essentielles pour les microorganismes étaient habituellement contenues en quantités importantes dans le milieu de culture où se multipliaient les microorganismes,* Cependant, contrairement aux cas habituels, quand on effectue la culture des microorganismes qui assimilent des hydrocarbures 15 gazeux, il est difficile de maintenir de grandes quantités de ces gaz à l'état dissous dans les milieux de culture, car la solubilité des gaz dans l'eau est très faible à une température de 25°C et à une pression de 760 mm de mercureg Par exemple, la solubilité du méthane est de 24,4 p*p«m* (parties par million), celle 20 de l'éthane de 60^0 p*pem*, celle du propane de 62,4 p0p*m*, et celle du n-butane de 61,4 p*p*m* Il est possible d'améliorer ces solubilités en travaillant à une pression élevée ou à une basse température, mais le maintien de telles conditions nécessite des installations coûteuses 25 et la faible amélioration de la solubilité ne justifie pas ces dépenseso II faut par conséquent, fournir en continu au milieu de culture les hydrocarbures gazeux nécessaires pour la croissance des bactéries, comme on procède pour l'aération* Cependant, en n'utilisant que ce processus, seulement une très faible partie des 30 gaz fournis au milieu de culture s'y dissolvent et la majeure partie des gaz fournis à la phase liquide du milieu de culture sont perdus* Il faut donc fournir des concentrations en gaz nettement plus importantes pour assurer les quantités de gaz nécessaires à 35 la croissance des microorganismes* Il faut faire circuler ces gaz pour empêcher les pertes de gaz* L'utilisation de ces gaz par circulation comporte comme inconvénients l'accumulation des déchets et des changements de conditions dûs au produit et de plus nécessite un équipement supplémentaire* 40 ii ea-t bien entendu possible de pressuriser les gaz ou de 10 15 69 20600 2011556 maintenir la chambre de fermentation elle-même sous pression* Cependant, le renforcement de l'appareil pour résister à la pression est coûteux et désavantageux du point de rue économique» La présente invention a pour objet de remédier aux incon— 5 vénients de la technique antérieure de fermentation à l'aide de microorganismes utilisant comme source de carbone principale des hydrocarbures gazeux et d'améliorer la croissance effective des microorganismes utilisant comme source de carbone principale des hydrocarbures gazeuxo D'autres caractéristiques et avantages de cette invention apparaîtront au cours de la description* Au cours de leurs recherches concernant l'utilisation des hydrocarbures gazeux dans la fermentation, les inventeurs ont découvert jLa possibilité de fournir les hydrocarbures gazeux au milieu de culture en ajoutant à ce milieu comme troisième composant un solvant capable de dissoudre de grandes quantités d'hydrocarbures gazeuxo On peut utiliser comme troisième composant n'importe quel solvant capable de dissoudre les hydrocarbures gazeux* Du point de vue économique il est désirable que ces solvants aient une pression de vapeur suffisamment faible à la température de culture ou à la température de stérilisation et qu'ils soient peu volatils* Comme indiqué ci-après, dans les essais comportant la dissolution comme hydrocarbure gazeux du n-butane dons divers solvants, avec aération, la plus grande quantité de n-butane dissoute dans les solvants respectifs était à la pression atmosphérique* Il en résulte que les inventeurs s'en sont assurés, que ces solvants peuvent dissoudre de façon suffisante les quantités nécessaires d'hydrocarbures gazeux et qu'en outre ces solvants peuvent dissoudre plus de gaz oxygène que l'eau, ce qui peut être . considéré comme tin avantage dans une fermentation d'hydrocarbures où une utilisation élevée d'oxygène est désirable* 20 25 30 35 Solvant Quantité de n-butane dissoute (g/100 g solvant) Pression de vapeuz du solvant (mmHg/ 20°C) iso-tétradécane 7,0 • traces a—tridécane 7,5 traces iso-octane 2,6 0,01 40 L'invention sera mieux comprise à l'aide du dessin annexé dont la figure unique représente l'appareil de la présente 69 5 10 15 20 25 30 35 40 20600 '3 2011556 invention» Sur ce dessin un fermenteur 1 contient une quantité déterminée de milieu de culture et on y ajoute le solvant contenant à l'état de dissolution les hydrocarbures gazeuxo Après stérilisation on inocule les microorganismes dans le milieu de culture et on effectue la culture sous agitation en introduisant de l'air à la partie inférieure du récipient 1 par l'ajutage 140 Quand les microorganismes commencent à se multiplier et qu'on constate la diminution de la quantité d'hydrocarbures gazeux dissoute, on introduit dans le fermenteur 1 du solvant par l'intermédiaire du mélangeur d'hydrocarbures gazeux 10, tandis qu'une partie de la liqueur est retirée du fermenteuro Dans le fermenteur 1, la couche de solvant peut se réunir sous forme de bulles relativement près de la surface de l'eau» Par conséquent, il est entraîné par débordement au séparateur de solvant 2 et ensuite séparé en deux couches» La partie aqueuse de la couche séparée retourne par la partie inférieure de cette cuve au fermenteur 1» Une partie de la couche de solvant est envoyée au réchauffeur pour solvant 4 en utilisant la pompe de transfert 3, et le solvant est réchauffé à l'aide de vapeur d'eau en vue de vaporiser les hydrocarbures gazeux» L'hydrocarbure gazeux est séparé par le'séparateur d'hydrocarbure 5» La partie restante de la couche de solvant retourne au fermenteur 1 par l'intermédiaire du mélangeur 10 fournissant la quantité manquante d'hydrocarbures gazeux» L'hydrocarbure gazeux séparé par le séparateur 5 est liquéfié dans le liquéfacteur 6 et recueilli dans la cuve de stockage 7« Tandis que le solvant est continuellement refroidi par le réfrigérateur 8, une partie est directement envoyée à la cuve de stockage 11 par la pompe de transfert 9 et l'autre partie est envoyée à l'appareil de lavage 12 destiné à éliminer les déchets qui accompagnent les hydrocarbures gazeux, puis est retournée à la cuve de stockage 11» L'air insufflé dans le fermenteur 1 par l'ajutage 14 se dégage dans l'atmosphère par le tuyau 13» Par conséquent, les hydrocarbures gazeux sont maintenus dans le fermenteur à une concentration définie bien que ces gaz soient consommés et assimilés de façon continue» Par conséquent, la transformation des gaz en substances utiles telles que cellules bactériennes ou autres produits de fermentation et l'accumulation de ces produits s'effectue, facilement» 9 69 20600 4 2011556 On peut utiliser pour la fermentation proprement dite aussi bien un milieu de culture synthétique qu'un milieu de culture naturel) à condition que ce milieu contienne les produits nutritifs essentiels pour la croissance de la souche de microorganisme 5 utilisée» De tels produits nutritifs sont bien connus dans la technique et comprennent des substances telles qu'une source de carbone, une source d'azote, des composés minéraux et des composés similaires utilisés en quantités appropriées par le microorganisme» 10 On met en oeuvre la fermentation âelon la présente inven tion, dans un milieu nutritif aqueux contenant un hydrocarbure gazeux ou un mélange de tels hydrocarbures qui constitue la source de carbone principale» On peut citer comme hydrocarbures gazeux appropriés le méthane, l'éthane, le propane, le n-butane, l'iso— 15 butane, l(éthylène, le propylène et les composés similaires* On peut également utiliser dans le milieu de fermentation en même temps que l'hydrocarbure de petites quantités d'autres sources de carbone telles que les hydrates de carbone, par exemple le glucose, le fructose, le maltose, le sucrose, l'amidon, l'hydrolysat d'à— 20 midon, les mélasses, etc.»» ou toute autre source appropriée de carbone telle que le glycérol, le mannitol, le sorbitol, les acides organiques etc.». Cependant, quand on utilise ces sources de carbone ils sont présents en une quantité beaucoup plus faible que la source de carbone principale, c'est-à-dire que les hydrocarbures 25 gazeux» Ces substances peuvent être utilisées soit seules soit en mélange de deux ou plus de deuxo On peut utiliser comme source d'azote toutes sortes de composés ou sels minéraux ou organiques tels que l'urée, l'ammoniac, les sels d'ammonium comme le chlorure d'ammonium, le sulfate 30 d'ammonium, le nitrate d'ammonium, le phosphate d'ammonium, le carbonate d'ammonium, l'acétate d'ammonium, etcoo» ou un ou plusieurs acides aminés en mélange ou des substances naturelles contenant de l'azote telles qu'une liqueur de macération de maïs, l'extrait de levure, l'extrait de viande, le produit dénommé "NZ-amine", 35 l'extrait de poisson, la peptone, du bouillon, les hydrolysats de caséine, les extraits solubles de poisson, l'extrait de son riz, etcoo» Ces substances peuvent être également utilisées soit seules soit en combinaison de deux ou de plus de deux» Les composés minéraux que l'on peut ajouter au milieu de 40 culture en quantités appropriées comprennent des phosphates tels 2011556 que le phosphate de sodium, le phosphate disodique, le phosphate dipotassique, le phosphate monopotassique, les ions métalliques tels que le sulfate de magnésium, le sulfate de manganèse, le sulfate de zinc, le sulfate de cuivre, le sulfate de fer ou autres 5 sels de fer, le chlorure de manganèse, le chlorure de cobalt, le chlorure de nickel, le chlorure de calcium, le carbonate de calcium, l'acide borique, le molybdate de sodium, etcoo« Il peut également être nécessaire d'ajouter au milieu de culture certains produits nutritifs essentiels suivant le microorganisme particulier 10 utilisé tels que des acides aminés, par exemple l'acide asparti- que, la thréonine, la méthionine, etc •<><>, et/ou des vitamines, par exemple la biotine, la thiamine, la cobalamine et des composés similaires* On met en oeuvre la fermentation dans des conditions aéro-15 bies telles que brassage aérobie de la culture ou agitation d'une culture immergée, à une température de 20° à 50°C environ et à un pH de 4 à 9 environ» Après tm à cinq jours environ de culture dans ces conditions, on constate que des quantités importantes de cellules de 20 microorganismes sont accumulées dans la liqueur de fermentations On peut utiliser comme microorganismes dans la présente invention tout microorganisme capable d'assimiler les hydrocarbures gazeux,• Les souches appartenant au genre Nocardia et Brevibacté-rium sont particulièrement utilèso 25 L'invention sera mieux comprise à l'aide des exemples non limitatifs ci—après : EXEMPLE 1 On effectue la culture de la souche Nocardia paraffinica» ATCC N° 21198 en utilisant comme hydrocarbure gazeux le n—butane et 30 comme solvant un mélange composé de 60 parties de n—tridéçane et la fermentatxon de 40 parties de tétradécaneo On met en oeuvre/pour multiplier les cellules dans un appareillage de même type que eelui décrit ei~des— sus,« La composition du milieu dé culture figure ei-aprèso Les conditions de culture sont les suivantes : 35 température 30°C; ^ aération j 1,0 vole/ par unité de volume et par minute; agitation : 250 tours, minute; quantité de solvant utilisée : 20$ par rapport au liquide} taux de circulation du solvant t 1,5 fois le volume de liquide par heure,*. 40 69 20600 69 20600 6 2011556 Composition de la liqueur de culture kh2po4 0,1$, NaHP04ol2H20 0,1$, MgS04.7H20 0,01$, MnS04.7H20 0,001$, FeS04o7H20 0,002$, ZnS04o7H20 0,001$, CaCl2e2H20 0,001$, H3bo3 10 f/1, Na2Mo04o2H20 10 y/1 CuS04o5H20 50 y/lf CoCl2o2H20 lOy/l (nh4)2so4 0,2$ 10 15 20 Yitamine — HC1 1 mg/l Liqueur de macération de maïs» polypeptone, extrait de levure et extrait de viande; 0,05$ de chaque; PH 7,2o On constate la croissance satisfaisante des cellules et on obtient respectivement après 48 heures et 72 heures qui suivent l'inoculation 10 mg/ml et 25 mg/ml de cellules sèches. On cultive le même microorganisme que celui-ci-dessus indiqué en faisant circuler de l'air contenant 1,5$ d'hydrocarbure gazeuxo On obtient respectivement après 48 et 72 heures qui suivent l'inoculation 2 mg/ml et 5 mg/ml de cellules sèches. EXEMPLE 2 On cultive le microorganisme Brevibacterium ketoglutamicum ATCC n° 15587 capable d'assimiler les hydrocarbures gazeux, en utilisant du gaz propane dans une liqueur de culture ayant la même composition-que celle indiquée dans l'exemple 1, liqueur à laquelle 1 o 25 30 40 on ajoute comme solvant pour/gaz propane 20$ d'hydrocarbures paraf— finiques normaux ayant de 9 à 13 atomes de carbone» On effectue la culture dans un fermenteur de 5 litres, équipé d'un agitateur et dans les conditions de culture suivantes : température de culture î 30°Cj taux d'aération î 1,0 volume par imité de volume de liquide et par minute; vitesse de l'agitateur z 250 tours minuteo On utilise comme gaz d'aération de l'air et l'air contenant 1,5$ de gaz propane est utilisé et recyclé. On utilise•comme témoin une liqueur de culture ne contenant pas de solvants On obtient comme résultat de la culture 10,4 mg/ml de cellules sèches après 120 heures de culture tandis que 1,2 mg/ml sont obtenus après 120 heures dans la liqueur de culture témoin« Dans la liqueur de culture selon l'invention, 12,5$ de solvant restent non consommés et on peut considérer qu'un rendement suffisamment élevé est obtenu avec cette liqueur de culture, même 69 20600 7 2011556 si on prend en considération la consommation du solvant» Il est bien entendu que la description et les exemples illustrent des modes de réalisation préférés et que diverses modifications peuvent être apportées à l'invention sans sortir pour cela 5 du cadre de celle-ci» 69 20600 2011556 REVENDICATIONS 1°) Procédé de culture de microorganismes, caractérisé par le fait qu'on cultive un miooorganisme capable d'assimiler les hydrocarbures gazeux, dans des conditions aérobies, dans un milieu 5 nutritif aqueux contenant au moins un hydrocarbure gazeux comme source de carbone principale et un solvant dudit hydrocarbure gazeux et que l'on récupère dans la liqueur de culture les cellules de microorganismes» 2°) Procédé aivant la revendication 1, caractérisé par le 10 fait qu'on utilise comme solvant n'importe quel solvant capable de dissoudre les hydrocarbures gazeux. 3°) Procédé suivant la revendication 2, caractérisé par le fait qu'on utilise un solvant choisi parmi l'isotétradécane,. le n-tridécane et 1'iso-octane. 15 4°) Procédé suivant la revendication 1, caractérisé par le fait que l'hydrocarbure gazeux est, choisi parmi le méthane, l'é-thane, le propane, le n-butane, 1'isobutane, l'éthylène et le propylène. 5°) Procédé suivant la revendication 1, caractérisé par le 20 fait qu'on utilise le microorganisme Nocardia paraffinica» ATCC n° 21198, ou le microorganisme Brevibacterium ketoglutamicum ATCC n° 15587o 6°) Procédé suivant la revendication 1, caractérisé par le fait qu'on met en oeuvre la culture à une température de 20° à 25 50°C environ et à un pH de 5 à 9 environ»