FR 2007810 A1 19700109 FR 6914151 A 19690502 69 14151 i 2007810 Cette invention concerne de nouveaux amides de peptide de formule générale : R-Met-Gly-Trp-Met-Asp-Phe-NH2 dans laquelle R représente le radical L-asparty1-0-sulfate-L-5 tyrosyle, le radical L-aspartyl-L-arginyl-L-aspartyl-O-sulfate-L-tyrosyle, ou le radical isoleucyl-L-seryl-L-aspartyl-L-arginyl-L-asparty1-0-sulfate-L-tyrosyle, ainsi que les intermédiaires pour les produire. Les amides de peptide de cette invention ainsi que leurs sels pharmaceutiquement acceptables, se sont avérés posséder 10 une action cholécystocinétique. Cette invention concerne de nouveaux amides de peptide de formule générale : R-Met-Gly-Trp-Met-Asp-Phe-NH2 dans laquelle R représente le radical L-aspartyl-0-sulfate-L-15 tyrosyle, le radical L-aspartyl-L-arginyl-L-aspartyl-O-sulfate-L-tyrosyle, ou le radical isoleucyl-L-seryl-L-asparty1-L-arginyl-L-asparty1-0-sulfate-L-tyrosyle, ainsi que les intermédiaires et les sels employés dans leur préparation. Les sels de peptide englobés par la formule ci-dessus com-20 prennent, par exemple, les chlorhydrates, les bromhydrates, les acétates, les fluoroacétates comme le trifluoroacétate, les chloro-acétates comme le dichloroacétate, etc..., ainsi que les sels d'ammonium comme les sels de dicyclohexylammonium, de triéthyl-ammonium, de morpholinium, de pyridinium, etc... 25. Les produits finaux de cette invention sont des amides de peptide contenant des restes amino acides de L-isoleucine (lieu), de L-serine (Ser), de L-arginine (Arg), de L-tyrosine (Tyr), d'acide L-aspartique (Asp) ,de L-méthionine (Met), de glycine (Gly), de L-tryptophane (Trp) et de L-phénylalanine (Phe). 30 On a découvert que ces produits possédaient une action cholécystocinétique. C'est-à-dire qu'ils sont capables de stimuler la contraction de la vésicule biliaire. Ils trouvent donc une utilité comme adjuvants de diagnostic dans l'examen aux rayons X de la vésicule biliaire, de la même manière que la cholécysto-35 kinine. A cette fin, on peut les administrer par voie intraveineuse ou sous-cutanée à une espèce animale (par exemple à des chats ou à des chiens) en une seule dose d'environ 0,0002 à 0,0003 mg/kg de poids corporel. A cette fin on peut les administrer par voie parentérale en 40 incorporant la dose appropriée du composé à des excipients pour 69 14151 2 2007810 former des produits injectables selon la pratique pharmaceutique courante. On peut préparer les composés de cette invention selon le schéma réactionnel suivant, dans lequel B représente le radical Z 5 benzyle et X et Y sont comme indiqués ci-dessous : ï« X-Ser B. r w X-Stir-NHNH - Y (X) B \V Ser-NHNH-Y (XI) X-Ileu-Ser-NHHH-Y (XII) 4/ X-Ileu-Ser-NHNH2 (XIII) OB. X-Asp-Tyr-NHNH-Y NO, OB i 2 j z u Met-Gly-Irp-Mat-Asp-Phe-NH2 X-A sp- Tyr-NHNH , (V)jJ —— X-Arg-Asp-Tyr-NHNH-Y (I) X-Asp-Tyr-Met- 3ly-Trp-Met-Asp-Phe-KH. N0o OB„ l 2 | Z J, SO-H i J (VI) Arg-Asp-Tyr-NHNH-Y (II) Asp~Tyr-Met-Gly-Trp~Met-Asp-Phe-NH0 I OB„ NO_ OB i z j 2 i z X-A sp-Arg-A sp- Tyr-NHNH-Y (III ) X-Asp-Arg-Asp-Tyr-NHNH2 (IV) (VIII) 37" X-Asp-Arg-Asp-Tyr-Iîet-Gly~Trp-Met--Asp-Phe-NH2 SO,H J/ (VII) SOnH I Asa-fkrg-Asp-Tyr-Met-G ly -Trp-Met-Asp- P'he-NH„ .i..iii. .■■■■ -11.11 i ».n wrnmmm mili ii ■■ , » ■ ■; i £ (IX) X-îleu-Ser-Asp-Arg-Asp-Tyr-Met-Gly-Trp- Met-Asp-Phe-NH, SO-H I 3 1 Ileu-Ser-Asp-Arg-Asp-Tyr-Met-Gly-Trp-Met-Asp-Phe-NfL (XIV) (XV) O -o —V Ln (Uv!) O *--4' 00 O 69 14151 4 2007810 Deux des produits de départ, à savoir la butyloxycarbonyl t srtiaixe-O-benzyl-L-serine et le benzyloxycarbonyl-hydrazide de ■butyloxycarbonyl tertiaire-p-benzyl-I.—aspartyl-tyrosine, sont bien cs-sasa» dans la technique. On peut préparer le troisième, l'amide 3 da I «f.êt!îionyl~glycyl-L-tryptophyl-L-méthionyl-L-asparty l-L-Fk&îsrlalanins, en faisant réagir le trifluoroacétate d'amide de g.^ycyl- L-tryptophyl L-raéthionyl-L-aspartyl-L-phénylalsnine avec l'sster de butyloxycarbonyl tertiaire-L-méthiony1-2,4,5-trichloro-phéjayle. On peut réunir les. suites de peptide indiquées dans , le 10 schëna réactiojsne.l ci-dessus.- 'selon une méthode de copulation Qormvxi quelconque pour la synthèse des peptide s, pour former les polypeptides indiqués tels qu'ils sont représentés. On forma d'abord des suites partielles en réunissant un à un les amino acides puis en réunissant les séquences obtenues les unes aux autres 15 pour obtenir le produit polypeptide désiré. Sinon, on peut préparer les peptides de cette invention en ajoutant successivement et un à un les amino acides appropriés à l'amide de L-méthiony1-glycyl-L-tryptophyl-L-méthionyl-L-asparty1-L-phényl-alanine. 20 On réalise de telles additions, par exemple, en activant le groupement acide carboxylique de l'amino acide qui doit être ajouté après avoir protégé le groupement aminé de cet amino acide, par exemple en le transformant en son dérivé de butyloxycarbonyle tertiaire, en transformant par exemple ce dérivé en un ester nitro-25 phénylique puis en faisant réagir cet ester actif avec un autre amino acide ou un autre peptide, si on le désire. Parmi les groupements activants convenables que l'on peut employer dans le procédé ci-dessus, on peut mentionner tout groupement qui permet à la fonction acide de devenir plus réactive, 30 comme les anhydrides mixtes (ce qui implique normalement l'acyla-tion d'une aminé par les anhydrides mixtes, par exemple d'un acyl-amino acide et de l'acide isovalérique), des azides, des chlorures, d'acide, des produits de réaction avec les carbodiimides, des composés N-acylés réactifs, des dérivés d'O-acyl hydroxylamine, 35 et des esters actifs, comme les esters alcoyliques portant des substituants attracteurs d'électrons (négatifs), des esters viny-liques, des esters énoliques, des esters phényliques, des esters halophényliques, des esters thiophényliques, des esters nitro-phényliques, des esters 2,4-dinitrophényliques, et des esters nitro-40 phénylthiolique s. bad original 69 14151 5 2007810 Dans la formation des suites de peptidœ de la façon précédente, le groupement protecteur du groupement hydroxyle peut être un radical benzyle, butyle tertiaire, tétrahydropyranyle, etc..., les groupements protecteurs de fonction carboxyle peuvent être des 5 groupements méthyle, éthyle, butyle tertiaire, benzyle, etc..., . les groupements protecteurs de groupements guanidine peuvent être des radicaux nitro, tosyle, p-nitrobenzyloxycarbonyle, ou une protonation, etc..., et lés groupements protecteurs des fonctions aminé (X et Y dans la formule ci-dessus) peuvent être des radicaux 10 benzyloxycarbonyle, tert-butyloxycarbonyle, trifluoroacétyle ou o-nitrophénylsulfényle, sauf qu'on ne peut employer le radical tert-butyloxycarbonyle en combinaison avec le radical o-nitro-phény1sulfényle. On doit alors remarquer que, puisqu'on -doit enlever sélecti-15 vement le groupement protecteur X des formules ci-dessus afin d'ajouter l'amino acide suivant dans la succession, il faut que X et Y soient différents. Diverses méthodes d'élimination des groupements protecteurs X et Y de la chaîne de peptide sont connues dans la technique. 20 Cependant, puisqu'il faut éliminer sélectivement X, la méthode choisie dépendra du groupement protecteur employé. Par exemple, lorsque X représente le radical tert-butyloxycarbonyle, on peut l'éliminer par traitement acide, par exemple à l'aide de l'acide trifluoroacétique ou d'un acide de ce genre. Lorsque X représente 25 le radical benzyloxycarbonyle, l'élimination peut se faire par hydrogénolyse, par exemple, en présence d'un catalyseur au palladium sur charbon. Dans les cas où X représente le radical trifluoroacétyle, on peut l'enlever par traitement avec un agent nucléophile (par exemple, l'hydrazine dans le méthanol, l'hydroxyde de sodium 30 dans le méthanol, ou un alcoxyde comme le méthoxyde de sodium ou l'éthoxyde de sodium, etc...). Si X est le radical o-nitrophénylsulfényle, on peut l'enlever soit par traitement avec un acide doux ^par exemple avec un acide halohydrique (comme les acides bromhydrique ou chlorhydrique) dans un solvant comme l'acétate 35 d'éthyle, l'éther, ou un autre ester alcoylique ou alcoyl éther\jf, ou bien avec un agent nucléophile soufré, comme le thiophénoxyde de sodium, le nitrothiophénoxyde, etc... En procédant de cette façon, on obtient une élimination sélective-du - groupement protecteur X. On peut réaliser l'élimination sélective de Y pour 40 former 1'intermédiaire hydrazide de peptide protégé de la même 69 14151 6 2007810 manière que celle indiquée ci-dessus, la méthode d'élimination appropriée étant choisie en fonction du groupement protecteur employé. On peut enlever par des réactions connues les groupements 5 protecteurs des fonctions hydroxyle, carboxyle et guanidine, par exemple par hydrogénolyse, par traitement avec des acides-comme l'acide chlorhydrique, l'acide bromhydrique, l'acide trifluoro-acétique, etc..., par traitement avec un alcali comme 1'hydrcxyde de sodium ou de potassium, etc..., ou par traitement avec le sodium 10 dans l'ammoniac liquide. On peut réaliser la sulfatation'des peptides de cetta invention qui contiennent de la tyrosine par réaction du peptide avec de l'acide suifurique concentré à froid pendant une courte période de temps. On a cependant découvert que la sulfatation était grandement 15 facilitée et qu'on obtenait une augmentation appréciable du rendement de l'ester de peptide désiré en ajoutant du bisulfate de potassium à l'acide sulfurique concentré (par exemple, dans un rapport d'environ 5 à 20 moles de bisulfate pour une mole de peptide) . La réaction est menée pendant une période de temps d'environ 20 3 à 8 heures à des températures inférieures à 20° C, et de préférence inférieures à 0° C. L'invention va être illustrée plus en détail par les exemples suivants. Toutes les températures sont en degrés centigrades sauf précisions contraires : 25 Exemple 1 Amide de L-méthionvlcrlvcvl-L-trvptophvl-L-méthionvl-L-asps.rtvl-L-phénylalanine. A) Amide de tert-butyloxycarbonyl-L-méthionylglycyl-L-tryptophy1-L-méthionyl-L-asparty1-L-phénylalanine. On dissout 3,8 30 g de trifluoroacétate d'amide de glycyl-L-tryptophyl-L-méthionyl-L-aspartyl-L-phényl-alanine dans un mélange de 45 ml de diméthyl-formamide et de 1,4 ml de triéthylamine, et on ajoute 2,5 g d'ester de tert-butyloxycarbonyl-L-méthionine-2,4", 5-trichlorophényle. -Après trois heures d'agitation à la température ambiante, on dilue 35 le mélange réactionnel avec de l'acétate d'éthyle et on filtre le précipité, on le lave à l'acétate d'éthyle et à l'éther et on le sèche. Le rendement est de 3,4 g ; p.f. 180-182°. B) On dissout 1'hexapeptide protégé de A) (3,1 g) dans 20 ml d'acide trifluoroacétique froid, et on maintient la solution sous 40 azote à la température ambiante pendant 25 minutes. L'addition de 69 14151 7 2007810 250 ml d'éther fait précipiter le trifluoroacétate, que l'on filtre, que l'on lave à l'éther et que l'on sèche. Exemple 2 Benzvloxvcarbonylhvdrazide de tert-butyloxvcarbonvlnitro-L-arqinyl-5 fi-benzyl-L-asparty1-L-tyrosine (I). On a dissous 1,25 g de trifluoroacétate de benzyioxycarbonyl-hydrazide d'aspartyl-L-tyrosine dans 5 ml de diméthylformamide, et on a refroidi la solution dans un bain de glace. On a ajouté 0,28 ml de triéthylamine et 915 mg d'ester de N-hydroxysuccinimide 10 de tert-butyloxycarbonylnitro-L-arginine. On a laissé reposer le mélange réactionnel à la température ambiante et on a ajouté trois autres portions (83 mg chacune) d'ester actif au bout de 2, 3 et 6 heures. Après un temps total de réaction de 24 heures, on a ajouté 200 ml d'acétate d'éthyle et on a lavé la sçlution avec de l'acide 15 citrique aqueux à 20 % et avec de l'eau. Après séchage sur MgSO^,, on a chassé le solvant sous vide et on a fait cristalliser le résidu dans un mélange d'acétate d'éthyle et d'éther. Rendement 1,31 g. 20 Trifluoroacétate de benzyloxvcarbonvl-hydrazide de nitro-L-arginyl-g-benzyl-L-aspartyl-L-tyrosine (II). On a dissous 1,11 g de (I) dans 7 ml d'acide trifluoroacétique et on a maintenu la solution à la température ambiante pendant 15 minutes. On a chassé le solvant sous vide et on a trituré le résidu 25 avec de l'éther. Rendement 1,04 g. Benzyloxycarbonvlhydrazide de tert-butyloxycarbonvl-P-benzyl-L-aspartvl-nitro-L-arqinvl-g-benzvl-L-aspartvl-L-tyrosine (III). On a ajouté 0,17 ml de triéthylamine à une solution, refroidie 30 dans la glace, de 1,04 g de (II) dans 5 ml de diméthylformamide, puis 650 mg d'ester p-nitrophénylique d'acide tert-butyloxy-carbonyl-/3-benzyl-L-aspartique. Après 3 heures de repos à la température ambiante, on a dilué le mélange avec de l'acétate d'éthyle (100 ml) et on a lavé la solution avec de l'acide citrique aqueux 35 à 20 % et avec de l'eau. Après séchage sur MgSO^, on a chassé le solvant sous vide et on a trituré le résidu avec un mélange d'acétate d'éthyle et d'hexane. Rendement 1,08 g. Exemple 3 Exemple 4 Exemple 5 Hydrazide de tert-butyloxvcarbonvl-L-a 40 aspartyl-L-tyrosine (IV). à 9 14151 8 2007810 On a hydrogéné pendant 24 heures, sur 10 % de palladium sur charbon (150 mg), une solution de 900 mg de (III) dans un mélange de méthanol, d'acide acétique et d'eau (2:1:1). On a filtré le catalyseur et on a concentré le filtrat à sec. On a désagrégé 1© 5 résidu avec de l'éthanol et on l'a filtré. Rendement 402 mg. Exemple 6 Hydrazide de tert-butyloxycarbonvl-L-aspartvl-L-tvrosine (V). On a hydrogéné pendant 4,5 heures, sur 10 % de palladium sur charbon (800 mg), une solution de 5 g de benzyloxycarbonylhydrasi.de 10 de tert-butyloxycarbonyl-p-benzyl-L-aspartyl-L-tyrosine dans un mélange de méthanol, d'acide acétique et d'eau (2:1:1). On a filtré le catalyseur et on a concentré le filtrat à sec sous vide. On a, trituré le résidu avec de l'acétate d'éthyle. Rendement 3,1 g. Exemple 7 15 Amide de tert-butvloxvcarbonyl-L-aspartyl-L-tvrosyl-L-méthionvl-glvcvl-L-tryptophvl-L-méthionvl-L-asparty1-L-phénylalanine (VI). On a ajouté 0,12 ml d'acide chlorhydrique concentré à une solution de 100 mg de (V) dans 4 ml de diméthylformamide, on a refroidi dans vin bain d'acétone et de glace sèche à -20°. On a 20 laissé la température du bain monter jusqu'à -15° et on a ajouté 0,125 ml d'une solution aqueuse à 14 % de nitrite de sodium. Au bout de 5 minutes, on a abaissé la température du bain à -25° et on a ajouté 0,26 ml de N-éthylpipéridine, puis 180 mg de trifluoroacétate d'amide de L-méthionyl-glycyl-L-tryptophyl-L-méthionyl-L-25 aspartyl-L-phénylalanine dissous dans 1 ml de diméthylformamide. On a laissé reposer le mélange réactionnel à 5° et, au bout de 24 heures, on a ajouté une seconde portion d'azide de tert-butyloxy-carbonyl-L-aspartyl-L-tyrosine (sur les 40 mg de V). Au bout d'une autre période de 24 heures à 5°, on a versé le mélange réactionnel 30 dans 30 ml d'eau contenant 1 % d'acide acétique. On a séché le précipité. Rendement 200 mg. Exemple 8 ' Amide de tert-butyloxycarbonyl-L-aspartyl-L-arginvl-L-a spartyl-L-tyrosy1-L-méthionvl-glyeyl-L-tryptophy1-L-méthionyl-L-a spartyl-L-35 phénylalanine (VII). On ?. ajouté 0,12 ml d'acide chlorhydrique concentré à une solution de 170 mg de (IV) dans 1,2 ml de diméthylformamide, et on a refroidi dans un bain de glace sèche et d'acétone à -20°. On a laissé la température du bain monter jusqu'à -15° et on a ajouté 40 0,125 ml d'une solution aqueuse à 14 % de nitrite de sodium. Au 69 14151 9 2007810 bout de 5 minutes on a abaissé la température du bain à -25° et on a ajouté 0,26 ml de N-éthylpipéridine, puis 180 mg d'amide de N-méthionyl-glycyl-L-tryptophyl-L-méthionyl-L-aspartyl-L-phénylalanine dissous dans 1 ml de diméthylformamide. On a laissé reposer le mé-5 lange réactionnel à 5° pendant 24 heures et on a ajouté une seconde portion de l'azide de tétrapeptide (sur les 68 mg de IV). Au bout de 24 heures on a versé le mélange réactionnel dans 30 ml d'eau. On a filtré et séché le précipité. Rendement 250 mg. Exemple 9 lo Amide de L-aspartvl-O-sulfate-L-tvrosvl-L-méthionvl-glvcvl-L-tryptophyl-L-méthionyl-L-aspartyl-L-phénylalanine (VIII). A) On a maintenu sous azote, à la température ambiante pendant 15 minutes, une solution de 320 mg de (VI) dans 7 ml d'acide trifluoroacétique. On a ajouté 100 ml d'éther et on a filtré le 15 précipité, on l'a lavé soigneusement à l'éther et on l'a séché. On a ajouté ce produit (280 mg) à 20 ml d'acide sulfurique concentré, refroidi à -20°. On a maintenu la solution dans un bain de glace sèche et d'acétone à -20° pendant 75 minutes. On a versé la solution d'acide sulfurique dans 80 ml d'eau glacée. On a centrifugé le 20 précipité, on l'a remis en suspension dans 30 ml d'eau glacée, et on a ajouté de l'hydroxyde de sodium 4N jusqu'à obtenir une solution claire. Après réacidification à pH 4 avec de l'acide sulfurique dilué, on a centrifugé le précipité formé, on l'a lavé deux fois à l'eau glacée et-on l'a séché. Rendement 155 mg. Une chromatographie 25 sur DEAE Sephadex (avec une solution tampon de carbonate d'ammonium) a donné l'ester sulfate d'octapeptide voulu : 30 mg. B) On a maintenu sous azote, à la température ambiante pendant 15 minutes, une solution de 330 mg de (VI) dans 7 ml d'acide trifluoroacétique. On a ajouté 100 ml d'éther et on a filtré le 30 précipité, on l'a lavé soigneusement à l'éther et on l'a séché. On a ajouté ce produit (300 mg) par portions à 18 ml d'acide sulfurique concentré, on a refroidi à -20° en agitant énergiquement. Au bout de 15 minutes on a ajouté une solution de 408 mg de bisulfate de potassium dans 3 ml d'acide sulfurique concentré. On a agité 35 le mélange réactionnel pendant 75 minutes à -15°, puis on l'a laissé reposer à -7° pendant 285 minutes. On a versé la solution d'acide sulfurique dans 400 ml d'éther froid; on a filtré le précipité, on l'a lavé avec de l'éther froid, et on l'a mis eh suspension dans de l'eau froide. On a alors réalisé la dissolution 40 complète en agitant avec précaution de l'hydroxyde de sodium 2N. 69 14151 10 2007810 L'acidification avec de l'acide chlorhydrique N a provoqué la précipitation de l'ester sulfate d'octapeptide voulu. Rendement 200 mg. Exemple 10 5 Amide de L-aspartvl-L-arqinvl-L-aspartvl-O-sulfate-L-tvrosyl-L-méthionvl-qlvcvl-L-trvptophvl-L-méthionvl-L-aspartvl-L-phényl-alanine (IX). A) On a maintenu à la température ambiante, scus azote, pendant 15 minutes, une solution de 250 mg de (VII) dans 6 ml 10 d'acide trifluoroacétique. Orç a ajouté 100 ml d'éther et on a centrifugé et lavé à l'éther le précipité. Rendement 212 mg. On a dissous ce produit dans 20 ml d'acide sulfurique concentré qu'on avait pré-refroidi dans un bain de glace sèche et d'acétone à -20°. Après une heure de repos dans le bain de refroidissement, 15 on a versé la solution d'acide sulfurique dans 100 ml d'eau glacée et on a séparé par centrifugation le précipité formé, on l'a redissous dans 30 ml d'eau en ajoutant avec précaution de l'hydroxyde de sodium 4N. Après acidification à pH 5 avec de l'acide sulfurique dilué, on a séparé le précipité par centrifugation, on 20 l'a lavé à l'eau et on l'a séché. Rendement 150 mg. On a isolé l'ester sulfate de décapeptide voulu par chromatographie sur DEAE Sephadex (avec une solution tampon de carbonate d'ammonium). Rendement 32 mg. B) En suivant la méthode de l'Exemple 9 B), mais en substituant 25 une quantité équivalente de composé VII au composé VI qui y est employé, on obtient le sulfate de décapeptide désiré avec un bcn ■rendement. Exemple 11 Benzvloxycarbonvlhydrazide de tert-butvloxycarbonyl-O-benzvl-L-30 serine (X). On a refroidi dans un bain de glace et d'eau 'une solution de 3 g de tert-butyloxycarbonyl-O-benzyl-L-serine et de 1,7 g de benzyloxycarbonylhydrazine dans 20 ml de dichlorométhane. On a ajouté 2,06 g dë dicyclohexylcarbodiimide et on a agité le mélange 35 pendant 2 heures dans le bain froid et pendant 4 heures à la température ambiante. On a filtré le précipité formé et on a lavé le filtrat avec de l'acide citrique à 20 %, avec de l'eau, avec du bicarbonate dé sodium saturé et avec de l'eau. Après séchage sur MgS04, on a chassé le soivant sous vide pour obtenir un résidu 40 huileux :4,3 g. 69 14151 ii 2007810' Exemple 12 Trifluoroacétate benzyloxvcarbonylhvdraziâe ai5 Q-benayl-L- serine (XI). On a maintenu à la température ambiante pendant 15 minutes 5 une solution de 4,3 g de (X) dans 20 ml d'acide trifluoroacétique. On a chassé sous vide l'acide trifluoroacétique et on a fait cristalliser le résidu dans un mélange d'éther et d'hexane. Rendement 3,9 g. Exemple 13 10 Benzvloxycarbonylhydrazide de tert-butvloxvcarbonvl-L-isoleucvl-O-benzyl-L-serine (XII). On a ajouté 1,4 ml de triéthylamine à une solution, refroidie dans la glace, de 4,5 g de (XI) dans 20 ml de diméthylformamide, puis on a ajouté 4,18 g d'ester de N-hydroxysuccinimide de tert-15 butyloxycarbonyl-L-isoleucine. On a maintenu le mélange réactionnel à la température ambiante pendant 6 heures et on l'a dilué avec 200 ml d'acétate d'éthyle. On a lavé cette solution avec de l'acide citrique à 20 %, avec de l'eau, avec du bicarbonate de sodium saturé et avec de l'eau. Après séchage sur MgSO^, on a chassé le 20 solvant sous vide et on a fait recristalliser le résidu dans un mélange d'éther et d'hexane. Rendement 5,2 g. Exemple 14 Hvdrazide de tert-butyloxvcarbonyl-L-isoleucyl-serine (XIII). On a hydrogéné pendant 6 heures, sur palladium sur charbon 25 (280 mg), une solution de 2,8 g de (XII) dans un mélange de méthanol, d'acide acétique et d'eau (2:1:1). On a filtré le catalyseur, on a concentré le filtrat à sec et on a fait cristalliser le résidu dans l'éther. Rendement 1,5 g. Exemple 15 30 Amide de L-isoleucyl-L-sérv1-L-aspartyl-L-arginvl-L-aspartyl-O-sulfate-L-tvrosvl-L-méthionvl-qlvcvl-L-trvptophvl-L-méthionyl-çflycvl-L-trvptophvl-L-méthionvl-L-aspartvl-L-phénylalanine (XV). On a ajouté 0,24 ml d'acide chlorhydrique concentré à une solution de 170 mg de (XIII) dans 1 ml de diméthylformamide re-35 froidie dans un bain de glace sèche et d'acétone à -20°. On a laissé 1b. température du bain monter à -15° et on a ajouté 0,25 ml d'une solution aqueuse à 14 % de nitrite de sodium. Au bout de 5 minutes, on a abaissé la température à -25° et on a ajouté 0,6 ml de N-éthylpipéridine, puis une solution de 500 mg de (IX) dans 40 2 ml de diméthylformamide. Après 24 heures de repos à 5e, on a 69 14151 12 2007810 concentré à seù le mélange réactionnel et on a dissous le résicta {Y1V) dans 3 ml d'acide trifluoroacétique. On a maintenu la solutiea sous azote % la température ambiante pendant 15 minutes. On a ajouté de l'éther et on a filtré et lavé soigneusement à l'éther le préci-5 pVtê„ Ta. chromatographie sur DSAE Sephadex (solution tampon c?3 carbonate d'»™jnonium) a. donné l'ester sulfate de dodëcapeptide désiré : 300 mg. Exemple 16 Hydsazida de tert-butvloxvcarbonvl-L-arqinvl-L-aspartvl-L-tvrosiiie — i gifc. .» i ■ i ■ , m ■! 11 n«nn m. : ' --g-—mi ■■■ ■~rr lai im i i 1 r-n^tinnff—n~~n—n^^—1 r^n-wi imiBWii—^—)n i ' 1 Il 11 ■ ■ i i ,| 10 (xvx), On a hydrogéné pendant 24 heures, sur 10 % de palladiœa sur charbon (50 mg),une solution de 300 mg de (I) dans un mélange d© raéthanol, d'acide acétique et d'eau (2:1 si) . On a filtré le catalyseur et on a concentré le filtrat à sec. On a désagrégé le résidu 15 avec de l'acétate d'éthyle et on l'a filtré. Rendement 150 mg. Exemple 17 Amide de tert-butyloxvcarbonvl-L-arqinvl-L-aspartvl-L-tvrosyl-Ir-méthionvl-glvcvl-L-tryptophvl-L-méthionvl-L-aspartvl-L-phénvl-alanine (XVII). 20 On a ajouté 0,12 ml d'acide chlorhydrique concentré à une solution de 138 mg de (XVI) dans 1,2 ml de diméthylformamide, et on a refroidi dans un bain de glace sèche et d'acétone à -20°. On a laissé la température du bain monter à -15° et on a ajouté 0,125 ml d'une solution aqueuse à 14 % de nitrite de sodium. Au bout de 25 5 minutes, on a abaissé la température du bain à -25° et on a ajouté 0,26 ml de N-éthylpipéridine, puis 180 mg d'amide de L-méthionyl-glycyl-L-tryptophyl-L-méthionyl-L-aspartyl-L-phénylalanine dissous dans 1 ml de diméthylformamide. On a laissé reposer le mélange réactionnel à 5° pendant 24 heures et on a ajouté une seconde por-30 tion de l'azide de tétrapeptide (sur les 51 mg de XV). Au bout de 24 heures on a versé le mélange réactionnel dans 30 ml d'eau. On a filtré le précipité et on l'a séché.' Rendement 235 mg. Exemple 18 Amide de Ii-arainvl-L-aspartvl-O-sulfate-L-tvrosvl-L-méthionvl-civcvl-35 L-trvptophyl-L-méthionyl-L-aspartvl-L-phénvl-alanine(XVIII). En suivant la méthode de l'Exemple 9, mais en substituant 235 mg de (XVII) à (VI), on obtient le produit ci-dessus. Rendement 140 mg. Exemple 19 40 Amide de tert-butvloxycarbonvl-L-servi-L-aspartvl-L-arginvl-L- BAD ORIGINAL 69 14151 13 • -2007.810 a spartyl-O- suifate-L-tyrosvl-L-méthionyl-qlycyl-L-tryptophyl-L-méthionyl-L-aspartyl-L-phénylalanine (XIX). On a ajouté 0,24- ml d'acide chlorhydrique concentré à une solution de 115 mg d'hydrazide de tert-butyloxycarbonyl-L-serine 5 dans 1 ml de diméthylformamide refroidi dans un bain de glace sèche et d'acétone à -20°. On a laissé la température du bain monter à -15° et on a ajouté 0,25 ml d'une solution aqueuse à 14 % de nitrite de sodium. Au bout de 5 minutes, on a abaissé la température à -25° et on a ajouté 0,6 ml de N-éthylpipëridine, puis une solution 10 de 500 mg de (IX) dans 2 ml de diméthylformamide. Après 24 heures de repos à 5°, on a concentré à sec le mélange réactionnel et on a trituré le résidu avec de l'eau, puis on l'a filtré et lavé avec de l'éthanol. Rendement 290 mg. Exemple 20 15 Amide de L-servl-L-aspartvl-L-arcrinvl-L-aspartvl-O-sulfate-L- tvrosvl-L-méthionvl-glvcyl- L-tryptophyl- L-méthionvl- L-aspartyl-L-phénylalanine. On a dissous 290 mg de (XIX) dans 3 ml d'acide trifluoroacétique et on a maintenu la solution à la température ambiante sous 20 azote pendant 15 minutes. On a ajouté 100 ml d'éther et on a filtré le précipité, on l'a lavé à l'éther et on l'a séché. La chromatographie sur DEAE Sephadex a donné l'ester sulfate d'undécapeptide désiré. Rendement 200 mg. Exemple 21 25 Amide de 0-sulfate-L-tvrosyl-L-méthionvl-glvcvl-L-trvptophvl-L-méthionyl-L-a spartyl-L-phénylalanine. En suivant la méthode de l'Exemple 9, mais en substituant à (VI) une quantité équivalente d'amide de L-tyrosyl-L-méthionyl-glycyl-L-tryptophyl-L-méthionyl-L-asparty1-L-phénylalanine, on 30 prépare le produit ci-dessus. 69 14151 14 2007810 REVENDI CATI ON S 1. Un composé de formule : R-Met-Gly-Trp-Met-Asp-Phe-NI^ et ses sels pharmaceutiquement acceptables, où R est choisi dans le groupe composé des radicaux : 5 O-sulfate-L-tyrosyle, L-asparty1-0 -suifate-L-tyrosyle, L-arginyl protégé-L-aspartyl-L-tyrosyle, L-arginyl-In-a spartyl-L-tyrosyle, L-arginyl^L-aspartyl-O-sulfate-L-tyrosyle, 10 L-aspartyl protégé-L-arginyl-L-âspartyl-L-tyrosyle, L-aspartyl- L-arginyl-L-aspartyl-L-tyrosyle, L-asparty1-L-arginyl-L-asparty1-0-sulfate-L-tyrosyle, L-seryl protégé-L-a spartyl-L-arginyl-L-a spartyl-0-sulf ate-L-tyrosyle, 15 L-seryl-L-a sparty1-L-arginyl-L-a spartyl-O-sulfate-L-tyrosyle, Isoleucyl protégé-L-seryl-L-aspartyl-L-arginyl-L-asparty1-0-sulfate-L-tyrosyle, Isoleucyl-L-seryl-L-a spartyl-L-arginy1-L-a spartyl-0-sulfate-L-tyrosyle- 20 2. Un composé selon la revendication 1, dont le nom est amide de tert-butyloxycarbonyl-L-aspartyl-L-tyrosyl-L-méthionyl-glycyl-L-tryptophyl-L-méthionyl-L-aspartyl-L-phénylalanine. 3. Un composé selon la revendication 1, dont le nom est amide de L-asparty1-0-sulfate-L-tyrosyl-L-méthionyl-glycyl-L-tryptophyl- 25 L-méthionyl-L-aspartyl-L-phénylalanine. 4. Un composé selon la revendication 1, dont le nom est amide de tert-butyloxycarbonyl-L-aspartyl-L-arginyl-L-aspartyl-L-tyrosyl-L-méthionyl-glycyl-L-tryptophyl-L-méthionyl-L-asparty 1-L-phénylalanine. 30 5. Un composé selon la revendication 1, dont le nom est amide de L-asparty 1-L-arginyl-L-aspa'rty 1-0-sulfate-L-tyrosyl-L-méthionyl-glycyl-L-tryptophyl-L-méthionyl-L-aspartyl-L-phénylalanine. 6. Un composé selon la revendication 1, dont le nom est amide de benzyloxycarbonyl-L-isoleucyl-L-seryl-L-aspartyl-L- 35 arginyl-L-aspartyl-0-sulfate-L-tyrosyl-L-méthionyl-glycyl-L-tryptophy1-L-méthionyl-L-a sparty1-L-phénylalanine. 7. Un composé selon la revendication 1, dont le nom est amide de L-isoleucyl-L-seryl-L-aspartyl-L-arginyl-L-aspartyl-O-sulfate-L-tyrosyl-L-méthionyl-glycyl-L-tryptophyl-L-méthionyl-L- 69 14151 15 2007810 aspartyl-L-phénylalanine» 8. Un composé de formule : r-nhnh2 dans laquelle R est choisi dans le groupe composé des radicaux 5 L-aspartyl protégé-L-tyrosyle, L-arginyl protégê-L-aspartyl-L-tyrosvle, L-aspartyl protégé-L-arginyl-L-aspartvl-L-tyrosyle, et isoleucyl protégé-L-servie„ 9. Un composé selon la revendication 8, dont le nom est hydrazide de t.ert-butyloxycarbonyl-L-aspartyl-ï-tyrosine „ Xo 10. Un composé selon la revendication 8, do.r»t le nom est hydrazide de tert-butyloxycarbonyl-L-i soleucyl-serine„ 11. Un composé selon la revendication 8. dent, le nom est hydrazide de tert-butyloxycarbonyl-L-asparty1-L-arginyl-L-asparty1-L-tyrosine. 15 12. Un hydrazide choisi dans le groupe formé par les composés de formule : R-NHNH-Y dans laquelle R est choisi dans le groupe composé des radicaux X-L-seryle protégé, L-seryle protégé, X-L-isoleucyl-L-seryle 20 protégé, X-L-arginyl protégé-L-aspartyl protégé-L-tyrosyle, et L-arginyl protégé-L-aspartyl protégé-L-tyrosyle, X-L-aspartyl protégé-L-arginyl protégé-L-aspartyl protégé-L-tyrosyle,et parleurs sels, où R est choisi dans le groupe composé des radicaux L-seryle protégé et L-arginyl protégé-L-aspartyl protégé-L-tyrosyle; et 25 dans laquelle X et Y sont des groupements protecteurs de fonction aminé choisis dans le groupe composé des radicaux benzyloxycarbonyle, tert-butyloxycarbonyle, trifluoroacétyle et o-nitrophényl-sulfényle, pourvu que, lorsque X ou Y est le radical tert-butyloxycarbonyle, l'autre groupement protecteur soit autre que le radical o-nitro- 30 phénylsulfényle. 13. Un composé selon la revendication 12, dont le nom est benzyloxycarbonylhydrazide de tert-butyloxycarbonylnitro-L-arginyl-/S-benzy 1-L-aspartyl-L-tyrosine. 14. Un composé selon la revendication 12, dont le nom est 35 trifluoroacétate de benzyloxycarbonylhydrazide de nitro-L-arginyl-p-benzyl-L-aspartyl-L-tyrosine. 15. Un composé selon la revendication 12, dont le nom est benzyloxycarbonylhydrazide de tert-butyloxycarbonyl-jî-benzyl-L-aspartyl-nitro-L-arginyl-|î-benzyl-L-asparty 1-L-tyrosine. 40 16. Un composé selon la revendication 12„ dont le nom est 69 14151 i, 2007810 b^nsyloxycarbonylhydra zide de tert-butyloxycarbonyl-O-benzyl-L- seriae. 17, Un composé selon la revendication 12, dont le nom est trifluoroacétate de benzyloxycarbonylhydrazide de O-benzyl-L-serine. 5 18. Un composé selon la revendication 12, dont le nom est fcenzyloxycarbonylhydra ziâ® de tert-butyloxycarbonyl-L-i soleucyl-O-banzyl-Ii- serine. 19- Une méthode de sulfatation d'un peptide contenant .une partie L-tyrosine, qui comprend la réaction dudit peptide avec un 10 mélange de bisulfate .de potassium et d'acide sulfurique concentré. 20c Un composé selon la revendication 8, dont le nom est hydrazide de tert-buty1 oxycarbomyl- L-arginyl- L-a sparty 1-L-tyro sine. 21» Une composition pharmaceutique contenant comme ingrédient actif un composé selon la revendication 1. saû original