FR 2003586 A1 19691107 FR 6906537 A 19690307 69 06537 2003586 la présente invention est relative à an procédé de production de cellules de microorganismes, procédé faisant appel à une culture en aérobie, en utilisant des hydrocarbures gazeux comme source de carbone principale. 5 Depuis peu de temps, des microorganismes utilisant les hydrocarbures contenus dans le milieu de fermentation sont utilisés en vue d'une production industrielle. En cherchant à utiliser divers hydrocarbures gazeux qui sont les moins coûteux et les plus abondants et en étudiant divers procédés, la deman-10 deresse a réussi à obtenir des microorganismes naturels appartenant aux genres Hocardia, Gorynebacterium et Brevibacterium et qui possèdent une grande capacité d'utilisation des hydrocarbures gazeux. la présente invention a donc pour objet. : 15 - un procédé perfectionné de production d'une nou velle espèce de microorganismes appartenant aux genres Nocardia, Corynebacterium et Brevibacterium ; - un procédé de production d'une nouvelle espèce de microorganismes appartenant aux genres Hocardia, Corynebacte- 20 rium et Brevibacterium» procédé dans lequel on utilise des hydrocarbures gazeux comme source de carbone principale et qui peut être mis en oeuvre d'une façon efficace et simple ; - un procédé de production d'une nouvelle espèce de microorganismes, procédé qui peut §tre mis en oeuvre avanta- 25 geusement et à peu de frais à l'échelle industrielle et qui donne un rendement élevé du produit recherché. D'autres caractéristiques et avantages de la présente invention ressortiront au cours de la description détaillée qui va suivre ; toutefois, il est bien entendu que la des-30 cription dé-taxlleë et les exemples spécifiques, bien que se rapportant à des modes de mise en oeuvre préférés, sont donnés uniquement à titre illustratif et qu'on peut y apporter de nombreuses modifications sans sortir pour cela du cadre de la présente invention. 35 Conformément à la présente invention, on a consta té qu'un procédé permettant de produire une nouvelle espèce de micro.organismes consiste à cultiver un microorganisme capable d'assimiler les hydrocarbures gazeux et appartenant aux genres Nocardia, Corynebacterium et Brevibacterium, en aérobie et dans 69 06537 2 2003586 an milieu nutritif aqueux, en présence d'au moins un hydrocarbure gazeux constituant la source de carbone principale. les microorganismes utilisés dans la présente invention sont des bactéries possédant une capacité remarquable 5 d'assimilation des hydrocarbures gazeux et qui se développent en utilisant des hydrocarbures galeux comme source de carbone principale,, Leur vitesse de croissance est très importante par comparaison avec celle des bactéries assimilant des hydrocarbures gazeux, par exemple des bactéries assimilant du méthane, qui é-taient connues jusqu'ici. On estime que le mode de développement 10- des microorganismes de la présente invention est très supérieur en ce qui concerne lrobtention de cellules de microorganismes ou de protéine de microorganismes en utilisant des hydrocarbures gazeux» les cellules de microorganismes ainsi obtenues sont utiles comme source de protéine, comme source d'aminoacides, comme 15 source d'acide nucléique, comme source de vitamines, etc. les micr.oorganismes utilisés dans la présente invention peuvent être n'importe lesquels de ceux qui appartiennent aux genres Nocardia, Corynebacterium et Brevibacterium. qui sont capables d'assimiler des hydrocarbures gazeux» En ce 20 qui concerne tout d'abord le genre Nocardia, les souches flocar-dia paraffinica (ATCC 21198 et ATCC 21199) et Hocardia butanica (ATCC 21197) sont toutes deux isolées du sol et leurs propriétés microbiologiques sont données ci-dessous. (I) Nocardia paraffinica. ATCC 21198 et ATCC 21199) 25 (A) Caractéristiques morphologiques (l) Forme du microorganisme : Habituellement en bâtonnets courts ; les cellules jaunes forment un mycélium, on trouve des cellules ramifiées et relativement longues, la formation des spores est fonction de la division du mycélium. 30 (2) Dimension : 0,5 à 0,75 jn x 2,5 à 16 Jbl (3) Mobilité : immobile (4) Spores : donne des spores (5) Flagelles : ne forme pas de flagelles (6) Coloration par le G-ram : prend le Gram 3 5 (7) Résistance à la coloration par les acides : Posi tive. .(B) Caractéristiques de culture : (l) Bouillon gélose en plaque : croissance assez lente y forme circulaire,, rugueuse, ondulée et ombiliquée ; couleur rouge jaunâtre ; aspect mat et.opaque ; 2003586 065J7 2 (2) Bouillon gélose incliné : Croissance peu abondante ; filiforme ; couleur rouge jaunâtre ; inodore, fragile ; milieu de culture inchangé. (3) Bouillon : Formation d'une membrane en surface ; le bouillon de culture devient rarement trouble ; pas de sédiment. (4) Culot de gélatine : Croissance plus satisfaisante dans la partie supérieure que dans la partie inférieure; pas de liquéfaction de la gélatine. (C) Caractéristiques physiologiques : (1) Température optimale : 25 à 37°C (se développe faiblement à 42°C) (2) pH optimal : 6 à 9 (3) Utilisation d'oxygène : croissance aérobie (4) Lait tournesolé : Non modifié ou alcalin (5) HgS : Production de HgS (6) Indol : Ne donne pas d'indol (7) Amidon : Ne décompose pas l'amidon (8) Nitrates : Réduit les nitrates (9) Catalase : Réaction positive (10) Production d'ammonium : Nulle (11) Réaction de Yoges-Proskauer : Négative (12) Utilisation des sucres : Produit de l'acide à partir du glucose, du fructose, du mannose, du saccharose, du mannitol et du sorbitol. (13) Assimilation des hydrocarbures : assimile l'éthane, le propane, le n-butane, le n-dodécane, le n-tridéca-ne, le n-tétradécane, le n-pentadécane, le n-hexadécane et le n-heptadécane. Les microorganismes Nocardia paraffinica ATCC 21198 et ATCC 21199 ne diffèrent, pour autant qu'on le sache, que par la consistance de la gélose inclinée. ATCC 21198 se rompt facilement, tandis que ATCC 21199 est butyreux. (Il) Nocardia butanica. ATCC 21197 (A) Caractéristiques morphologiques : (1) Forme des microorganismes : Habituellement en bâtonnets courts. Les cellules jeunes forment un mycélium, cellules ramifiées et relativement longues ; la formation de spores est fonction de la division du mycélium. (2) Dimension : 0,5 à 0,75 x 2,5 à 16 jh. (3) Mobilité : Immobile o9 065J7 + 2003536 (4) Spores : Donne des spores (5) Flagelles : Ne forme pas de flagelles (6) Coloration par le Gram : Prend le Gram (7) Résistance à la coloration par les aci'des : 5 Positive. (B) Caractéristiques de culture : (1) Bouillon gélctsé en plaque : Croissance assez lente ; forme circulaire, rugueuse, ondulée et ombiliquée j couleur rouge sombre ; aspect mat et opaque. 10 (2) Bouillon gélose incliné : Croissance peu abon dante ; filiforme ; couleur rouge sombre ; terne ; inodore ; fragile ; milieu de culture inchangé. (3) Bouillon : Formation d'une membrane en surface bouillon presque clair ; pas de sédiment. 15 (4) Culot de gélatine : Croissance plus abondante dans la partie supérieure que dans la partie inférieure ; pas de liquéfaction de la gélatine. (C) Caractéristiques physiologiques î (1) Température optimale : 25 à 30°C (se développe 20 faiblement à 42°C). (2) pH optimal : 6 à 9 (3) Utilisation d'oxygène : Aérobie (4) lait tournesolé : Son modifié ou alcalin (5) H2S Production de HgS 25 (6) Indol : He étant»? pas d'.indol (7) Amidon : Ne décompose pas l'amidon (8) Nitrates : Réduit les nitrates (9) Catalase, : Réaction positive (10) Production d'ammonium : Nulle 30 (11) Réaction de Yoges-3?roskauer : Négative (12) Utilisation des sucres : Produit de l'acide à partir du glucose, du fructose, de l'arabinose, du mannose, du saccharose, du galactose, du xylose, du mannitol et du sorbi- ^ol<> (13) Assimilation des hydrocarbures—; Assimile 55 , l'éthane, le propane, le n-butane, le n-octane,. le n-undéeane, le n-dodécane, le n-pentadécane, le n-hexadécane et le ..n-hep-tadécane. On détermine la classe des deux microorganismes 40 d'après la classification de BSrgey (Mandai of Determinative 065:17 5 2003536 Bacteriology, 7ème éd.). Ces deux bactéries appartiennent à l'ordre des Aotinomycetales car leurs cellules sont rigides et dans certaines phases de la croissance, il se forme une structure ramifiée analogue à un mycélium. Dans cet ordre, elles appartiennent à la famille des Actinomycetaceae parce qu'un mycélium vrai est formé et aussi parce que des spores sont formés par fragmentation du mycélium. De plus, dans cette famille, elles appartiennent au genre Nocardia parce qu'elles sont obligatoirement aérobies et acido-résistantes. Dans ce genre, elles sont plus proches de Nocardia asteroides, Nocardia polychro-mogenes. Nocardia caprae et Nocardia minima. Comme on le verra dans le tableau ci-après, elles diffèrent de Nocardia asteroides par leur couleur, leur croissance dans un milieu glucosé et leur température optimale de croissance ; elles diffèrent de Nocardia polychromogenes par leur couleur, leur température optimale de croissance et leur action sur le lait; elles diffèrent de Nocardia caprae en ce qui concerne la croissance dans un milieu glucosé et dans un milieu constitué par un bouillon, la production de mycélium aérien, leur action sur le lait et leur résistance à la coloration par les acides, et elles diffèrent de Nocardia minima par la couleur, la température optimale de croissance et leur résistance à la coloration par les acides. De plus, ces nouvelles bactéries ont des caractéristiques marquées d'assimilation des hydrocarbures gazeux. On considère qu'elles forment une nouvelle espèce» Elles diffèrent l'une de l'autre par leur couleur,leur dimension au début de la culture et leur utilisation des sucres. C'est pourquoi on les a appelées respectivement Nocardia paraffinica et Nocardia butanica. TABEEAU I Nocardia asteroides Couleur (toiture jaune clair, foncé' à rouge jaunâtre Nocardia poly-ihromogenes Nocardia caprae Nocardia minima Initialement incolore.Rose chair ou corai;. au cours de la dernière période de croissance Nocardia paraffinica Nocardia butanica ATCC 21198 ATCC 21199 ATCC 21197 Rouge jaunâtre tr Rouge sombre O nO o o m Uî •-4 Croissance dans un milieu au, glucose Pellicule mince et jaunâtre Petite quantité de sédiment sous forme de flocons fins. formation de mycélium aérien Pellicule rouge jaunâtre. Pas de sédimen,t et bouillon presque clair Pellicule rouge sombre;' Pas de sédi-i ment et | bouillon presque clair CTv Croissance dans du bouillon Quantité modérée de sédiment floconneux» Formation de mycélium aérien - d° - - d° - Température optimale de croissance 31* 22-25° 22-25® 25 - 37° 25 - 35' N> O O u> Cn 00 O 065J7 7 2003586 I ai l v I "h 1 1 + + + I P} M 0 cq m • I O -h ti -H -P I S x) •h cq d l o 0->0> Cd l S l m I n© l rfH 1 1 I OH o cq cq 1 é5h Tj -H -p I 'ci ■H CQ d C^© co ! I I 1 o 1 & © © cq ^ Pi -P p3 cq fj © •» ctf co td © p4 1 -p ctf -h 0 cq S -P -P -h U Pî -ri CQ Pi CO O Ov© S ft cq cd h Pi 1 cl o 1 o •h © 1 -h -P H 1 +3 43 05 p 1 cïj «h fn-H 1 1—i ctf O Ctf 1 fs r—1 h 1 bO O 1 O 1 0 1 O 1 © 1 0 ! g 1 CQ 1 cq I "H 1 O 1 fH 1 O •« Pl Pj o cq O •H © © © *rH -P R CQ CQ -p cq ai 0 0 0 C!i © CQ CQ pi Pi -P © 1 -P fH H © •H cq -H O cq 1 'ri O Tj H £> cd 0 1 aj i—l p4 'H •H CQ CSÎ iH rH 1 Hl 0 ai 0 -P © fH Î>1 !-i n Oircl Gorynebacterium alkamxm (ATCC 21194), Brevibacterium paraffinolyticum (ATCC 21195) et Brevibacterium "butanicum (ATCC 21196) sont tous isolés du sol et possèdent les caractéristiques microbiologiques données ci-dessous. o9 06537 8 2003586 10 (I) Corynebacterium alkanum, ATCC 21194 (A) Caractéristiques morphologiques : (1) Forme des microorganismes : Habituellement sous forme de bâtonnets courts ; on trouve fréquemment des cellules incomplètes formées par scissiparité, des cellules ramifiées et des cellules formées par scissiparité, du type à éclatement. (2) Dimension : 0,5 ji x 2,5 à 5JL (3) Mobilité : Immobile (4) Spores : Ne donne pas de spores (5) Flagelles : Ne forme pas de flagelles (6) Coloration par le Gram : Prend le Gram (7) Résistance à la coloration par les acides : Positive. (B) Caractéristiques de culture : (1) Bouillon gélosé en plaque : Croissance modérée : forme circulaire, lisse, entière et convexe ; couleur gris jaunâtre ; aspect luisant et opaque. (2) Bouillon gélosé incliné : Croissance modérée, filiforme ; aspect luisant et butyreux ; couleur gris jaunâtre; 20 inodore ; milieu de culture inchangé. (3) Bouillon : Croissance en surface faible ; bouillon modérément trouble. (4) Culot de gélatine : Croissance faible dans la partie supérieure ; gélatine non liquéfiée. 25 (C) Caractéristiques physiologiques : (1) Température optimale ; 25 à 30°C. Croissance extrêmement faible à 35°C. (2) pH optimal : 5 à 9 (croissance nulle au pH 4) (3) Utilisation d'oxygène : Aérobie 50 (4) Lait tournesolé. Non modifié ou alcalia (5) HgS : Production de HgS (6) Indol : ne donne pas d'indol (7) Amidon : Ne décompose pas l'amidon (8) Nitrates : Réduit les nitrates 55 (9) Catalase ï Réaction positive (10) Production d'ammonium : Nulle (11) Réaction de Voges-Proskauer : Négative (12) Utilisation des sucres : Produit de l'aeide à partir du glucose, du fructose, du mannose, du saccharose, du 40 lactose, du mannitol et du sorbitol. o9 0o5.'7 9 2003586 (13) Assimilation des hydrocarbures : Assimile le propane, le n-butane, le n-dodécane, le n-tridécane, le n-tétradécane, le. n-pentadécane, le n-bexadécane et le n-hep-tadécane. 5 (II) Brevibacterium butanicum, ATCC 21196 (A) Caractéristiques morphologiques s (1) Forme du microorganisme : Habituellement un bâtonnets courts ; on trouve fréquemment des cellules incomplètes formées par scissiparité et des cellules du type à é- 3_0 clatement produit par scissiparité , mais pas de cellules ramifiées» (2) Dimension : 0,5 ^ x 3 à 6 jti (3) ' Mobilité : Immobile (4) Spores : île donne pas de spores 15 (5) Flagelles : Ne forme pas de flagelles (6) Coloration par le Gram : Prend le Gram (7) Résistance à la coloration par les acides : Négative. (B) Caractéristiques de culture : 20 (1) Bouillon gélosé en plaque : Croissance abon dante, circulaire, lisse, entière et ombiliquée j Couleur brun pâle ; aspect terne et opaque. (2) Bouillon gélosé incliné : Croissance abondante, hérissée de saillies ; couleur brun pâle ; inodore ; aspect 25 terne et butyreux ; milieu de culture inchangée (3) Bouillon : formation d'une membrane en surface ; bouillon presque clair ; absence de sédiment. (4) Culot de gélatine : Croissance plus satisfaisante à la partie supérieure ; pas de liquéfaction de la gé- 30 latine. (C) Caractéristiques physiologiques î (1) Température optimale : 25 - 30°C. Faible croissance à 37°C. (2) pH optimal ; 6 à 9 35 (3) Utilisation d'oxygène : Aérobie (4) lait tournesolé : Non modifié ou alcalin (5) HgS : Production de HgS (6) Indol î Ne donne pas d'indol (7) Amidon : Ne décompose pas l'amidon 40 (8) Nitrates : Réduit les nitrates 065J7 10 2003586 (9) Catalase : Réaction positive (10) Production d'ammonium : Nulle (11) Réaction de Yoges-Proskauer : Négative (12) Utilisation des sucres : Produit de l'acide à partir du glucose, du fructose, de l'arabinose, du mannose, du saccharose, du xylose, du mannitol et du sorbitolo (13) Assimilation des hydrocarbures : Assimile le propane, le n-butane, le n-décane, le n-undécane, le n-dodécane le n-tridécane, le n-tétradécane, le n-pentadécane, le n-hexadécane et le n-heptadécane. (III) Brevibacterium paraffinolyticum, ATCC 21195 (A) Caractéristiques morphologiques : (1) Forme du microorganisme : Souvant en bâtonnets présence fréquente de cellules scissipares du type à éclatement mais pas de cellules ramifiées# (2) Dimension : 0,5^ x 2,5 à 5/1 (3) Mobilité : Immobile (4) Spores : Ne donne pas de spores (5) Flagelles : Ne forme pas de flagelles (6) Coloration par le Gram : Prend le Gram (7) Résistance à la coloration par les acides : Négative. (B) Caractéristiques de culture : . (1) Bouillon gélosé en plaque : croissance abondante, circulaire, lisse, entière, convexe ou en forme de massuej couleur rose pâle ; aspect luisant et opaque- (2) Bouillon gélosé incliné : Croissance abondante filiforme, couleur : gris jaunâtre, inodore ; aspect luisant et butyreux ; le milieu de culture n'est pas modifié. (3) Bouillon : croissance faible en surface ; bouillon de culture modérément trouble. (4). Culot de gélatine : Croissance faible à la partie supérieure ; la gélatine n'est pas liquéfiée. (C) Caractéristiques physiologiques : (1) Température optimale : 25 à 30°C. Croissance très faible à 35°C. (2) pH optimal : 5 à 9 (pas d.e croissance au pH 4) (3) Utilisation d'oxygène : Aérobie (4) lait tournesolé : Non modifié ou alcalin o9 0653/ 11 200358b (5) HgS : Production de HgS (6) Indol : Ne donne pas d'indol (7) Amidon : Ne décompose pas l'amidon (8) Nitrates : Réduit les nitrates 5 (9) Gatalase : Réaction positive (10) Production d'ammonium, m Nulle (11) Réaction de Yoges-Proskauer : Négative (12) Utilisation des sucres : Produit de l'acide à partir du glucose, du fructose, du saccharosef du lactose, du man- 10 nitol et du sorbitol. (13) Assimilation des hydrocarbures : Assimile le propane, le n-butane, le n-undécane, le n-dodécane, le n-tridé-cane, le n-tétradécane, le n-pentadécane, le n-hexadécane et le n-heptadécane. 15 On a classé Corynebacterium alkanum (ATCC 21194) selon le manuel de Bergey "Determinative Bacteriology'.' 7ème édition, d'après les caractéristiques données plus haut. Cette bactérie appartient à la famille des Coryne'baoteriaoeae car ses cellules sont en forme de bâtonnets, elle n'est pas acido-20 résistante, elle ne forme pas de trichomes, elle prend le Gram, elle ne fermente pas les sucres en anaérobie, elle ne forme pas d'endospores et ses cellules sont ramifiées. Dans cette famille, cette bactérie appartient au genre Corynebacterium parce qu'elle montre une scissiparité du type à éclatement avec une forme 25 incurvée, et parce que sa réaction de catalase est positive«Dans ce genre, Corynebacterium est plus proche de C oryne bac ter i um agropyri et de Corynebacterium rathayi mais est différent de C oryn e bac ter i um agropyri en ce qui concerne la dimension, la coloration par le Gram et la croissance dans un bouillon gélosé 30 incliné, et il diffère de C orynebac t er i um rathayi par la dimension, la croissance et la liquéfaction de la gélatine. De plus, il diffère des deux espèces susmentionnées par la consistance, de la gélose inclinée et par ses propriétés d'assimilation des hydrocarbures gazeux et liquides. Il est donc évident qu'on doit 35 la considérer comme faisant partie d'une nouvelle espèce» On l'a appelé Corynebacterium alkanum (ATCC 21194). la classification de Brevibacterium butanicum (ATCC 21196) a été effectuée de la même manière que ci-dessus. Cette bactérie appartient à la famille Brevibacteriaceae car elle forme 40 des bâtonnets, elle n'est pas acido-résistante, elle ne forme o9 06537 12 2003586 pas de trichomes, elle prend le Gram, elle ne forme pas d'en-dospores et ses cellules ne sont pas ramifiées. Dans cette famille, elle appartient au genre Brevibacterium, car ses bâtonnets non ramifiés ne forment pas de filaments. Dans ce genre, 5 on considère qu'elle est plus proche de Brevibacterium maris, de Brevibacterium fuscum et de Brevibacterium airmioniagenes qui apparaissent dans le tableau suivant. Toutefois, comme on peut le voir dans ce tableau, elle diffère de Brevibacterium maris par la dimension, la couleur et l'élévation des colonies, 10 la production d'hydrogène sulfuré et l'action sur le saccharose « Elle est différente de Brevibacterium fusctua par la dimension, la couleur et l'élévation des colonies, ainsi que par son développement dans une culture en culot ou dans du bouillon. Elle est différente de Brevibacterium ammoniagenes par la di-15 mension, l'élévation et la couleur des colonies et, de plus, par la consistance des colonies et la propiété d'assimilation des hydrocarbures gazeux et des hydrocarbures liquides. On doit donc considérer que cette bactérie appartient à une nouvelle espèce et elle a été appelée Brevibacterium butanicum (ATOO 20 21196). La classification de Brevibacterium paraffinolyticum (ATCC 21195) a été effectuée de la mSme manière que ci-dessus. Cette bactérie appartient à la famille Brevibacteriaceae car ses cellules sont en forme de bâtonnets, elle n'est pas aciào-ré-25 sistante, elle ne forme pas de trichomes, elle prend le Gram, elle ne forme pas d'endospores et ses cellules ne sont pas ramifiées. Dans cette famille, elle appartient au genre Brevibacterium parce que ses bâtonnets non ramifiés ne forment pas de filaments. Dans ce genre, elle est plus proche de Brevibacterium 30 maris, Brevibacterium fuscum et Brevibacterium ammoniageneso Comme on le verra dans le tableau suivant, elle diffère de Brevibacterium maris par la dimention, la couleur, la croissance dans le bouillon, l'action sur le saccharose et la productioi). d'hydrogène sulfuré, et elle diffère de Brevibacterium fuscum 35 par la dimension et la croissance dans un culot de gélatine. De plus, elle diffère de Brevibacterium ammoniagenes, en ce qui concerne la dimension, la couleur, la consistance des colonies .et les propriétés d'assimilation des hydrocarbures gazeux et liquides. On considère donc qu'elle fait partie d'une nouvelle 40 espèce, et on l'a appelée Brevibacterium paraf finolyticum (ATCC 21195). On considère que Brevibacterium butanicum ÇATCC 21196) et Brevibacterium paraffinolyticum ÇATCC dliy1?) appartiennent -à deux espèces différentes, parce que leur couleur, ieur aspect luisant et leur utilisation des sucres ne sont pas 4-5 identiques. o- sD TABLEAU II Corynebacterium agropyric Corynebacterium rathavi Corynebacterium alkanum, ATCC 21194 Dimension, jx. 0,4 — 0,6 x 0,6 -1,1 0,6 - 0,75 x 0,75 - 1,5 0,5 x 2,5 - 5 Couleur1dans un bouillon çélosé incliné jaune jaune gris jaunâtre Coloration par le Gram variable Prend le Gram Prend le Gram Utilisation des sucres Glucose Saccharose Lactose Production d'acide Production d'acide Production d'acide Production d'acide Production d'acide Production d'acide Production d'acide Production d'acide Décomposition de l'amidon Paible - Huile Culot de gélatine le liquéfie pas la gélatine Graduellement liquéfiée après 7 semaines N'est pas liquéfiée Couleur et croissance en cours de culture sur du bouillon gélosé en plaque Jaune Rare Porte viscosité Jaune Croissance lente Gris jaunâtre Croissance modérée Aspect butyreux O O co Cn 00 o o- vO tableau iii Brevibacterium maris brevibacterium fuscum Brevibact erium ammoniaeenes Brevibacterium Brevibacterium paraffinolvti- butanicum cront ATCC 21195 ATCC 21196 Dimension, yu 0,7 - 0,8 x 1 - 1,2 0,6 x 1,5 0,8 x 1,4-1,7 0,5 x 2,5 - 5 0,5 x 2,5 - 5 Bouillon gélosé en plaque Jaune orangé ; convexe Jaune brunâtre; légèrement convexe Gris ou jaune délavé ; plate Rose pâle ; Brun pâle convexe ou en forme de massue Protubérances Culot de gélatine Ne liquéfie pas la gélatine Liquéfaction graduelle Ne liquéfie pas la gélatine Ne liquéfie pas Ne liquéfie pas la gélatine la gélatine Bouillon Formation d'une Formation de Trouble modéré Croissance £ pellicule pellicule, de près de la rare en surface; orange et d'un sédiment surface trouble modéré sédiment ; pas de trouble absence de trouble Utilisation des sucres : Saccharose Lactose Néant Néant h2s Production nulle Production d'acide Production d'acide Production d'acide Aucune production d'acide N> O O CO Cn co Coproduction Production 9 0 '> 15 2003586 En ce qui concerne la fermentation proprement dite, le milieu utilisé peut être un milieu de culture synthétique ou un milieu nutritif naturel à condition que le milieu choisi contienne les éléments nutritifs essentiels pour le développe-5 ment de la souche de microorganisme choisie. De tels éléments i nutritifs sont "bien connus dans la technique et comprennent des substances telles qu'une source de carbone, une source d'azote, des composés minéraux et des produits analogues, qui sont utilisés en des quantités appropriées par les microorga-10 nismes cultivés. Conformément à la présente invention, on exécute la fermentation au sein d'un milieu nutritif aqueux contenant un.ou plusieurs hydrocarbures gazeux comme source de carbone principale.. Les hydrocarbures gazeux en question comprennent 15 l'éthane, le propane et le butane. D'autres sources de carbone qu'on peut incorporer en petites quantités dans le milieu de fermentation comprennent les hydrocarbures liquides, tels que le n-dodécane, le n-tridécane , le n-tétradécane, le n-penta-décane, le n-hexadécane, le n-heptadécane, etcc, des hydrates 20 de carbone, comme par exemple le glucose, le fructose, le mal-tose, le saccharose, l'hydrolysat d'amidon, les mélasses, etc., et d'autres sources de carbone appropriées telles que le gly-cérol, le mannitol, le sorbitol, les acides organiques, etc0 Comme source d'azote, on peut utiliser divers 25 genres de sels ou composés organiques ou minéraux, tels que l'usée, l'ammoniaque ou des sels d'ammonium comme le chlorure d'ammonium, le sulfate d'ammonium, le nitrate d'ammonium, le phosphate d'ammonium, etc., ou bien un ou plusieurs aminoacides ou encore des substances naturelles contenant de l'azote comme 30 la liqueur de macération du maïs, l'extrait de levure, l'extrait de viande, la chair de poisson, une peptone, du bouillon, un hydrolysat de caséine, des matières solubles de poisson, un extrait de déchets d'enveloppes de grains de riz, etc. Ces substances peuvent elles-mêmes être ajoutées isolément ou en com-35 binaison. Les composés minéraux qui peuvent être ajoutés au milieu de culture en des quantités appropriées comprennent le phosphate de sodium, le phosphate acide disodique, le phosphate monodipotassique, le phosphate dipotassique, des ions métalli-40 ques comme le sulfate de magnésium, le sulfate de manganèse, 69 06537 16 2003586 le sulfate de zinc, le sulfate de cuivre, le sulfate de fer oa d'autres sels du fer, le chlorure de manganèse, le chlorure de cobalt, le chlorure de nickel, le chlorure de calcium, le carbonate de calcium, l'acide borique, le molybdate de sodium, etc<> 5 II peut être également nécessaire d'ajouter certains éléments nutritifs essentiels dans le milieu de culture, en fonction du microorganisme particulier choisi, comme par exemple des amino-acides tels que l'acide aspartique, la thréonine, la méthionine, etco., et/ou des vitamines, comme par exemple la biotine, la 10 thiamine, la cobalamine, etc. la culture a lieu en aérobie, à une température d'environ 20 à 50*0 et à un pH d'environ 4 à 9» l'hydrocarbure gazeux choisi est'introduit à l'état gazeux. Entre autres, il peut être admis en même temps que de l'air eu de l'oxygène avec 15 lesquels il se trouve ainsi mélangé. Les gaz utilisés comprennent l'éthane, le propane ou le butane. La concentration du gaz n'est pas limitée d'une façon particulière, Divers procédés de fermentation qui sont connus dans les processus de fermentation classiques, avec utilisation 2o de saccharines ou d'hydrocarbures liquides comme source de carbone principale, peuvent être mis en oeuvre. Par exemple, la vitesse de fermentation peut être notablement accélérée par l'addition de petites quantités d'hydrocarbures liquides non utilisés par les microorganismes, de substances ayant ub effet 25 similaire à celui qui précède, ou encore d'agents tensio-actifs, destinés à augmenter la vitesse de dissolution des hydrocarbures gazeux dans le milieu liquide. Lorsque la fermentation est achevée, les cellules de microorganismes peuvent être séparées de la liqueur de cul-30 "ture d'une façon classique. On donne les exemples ci-après uniquement à titre indicatif et non limitatif de la portée de la présente invention, les pourcentages s'entendant en poids sauf mention contraire O 35 . EXEMPLE 1 On introduit dans un récipient de fermentation d'une contenance de 5 litres, 2,7 1 d'un milieu de culture au pH 7,2 comprenant 0,05 t de XH2P04 ; 0,05 1° de Na2HP04,12H20 j 0,01 56 de MgS04.7H20 ; 0,001 £ de MnS04,4H20 j 0,001 de PeSO^, 69 06S37 17 2003586 7H20 ; 0,001 i> de ZnS04,7H20 ? 0,001 $ de 0aCl2,2H20 ; 10 "C/l de H3B03, 10 Tf/1 de Na2Mo04,2H20 ; 50 t/1 de CuS04,5H20 ; 10'f/l de CoCl2,2H20 ; 50^/1 de NiCl2,6H20 ; 0,05 $ de liqueur de macération du maïs et 0,2 $ de NH^O^ et on stérilise ce milieu. ^ Ensuite, la souche Nocardia paraffinica ATCC 21198, cultivée au préalable avec secousses pendant 24 heures dans un milieu de culture contenant 0,25 i° d'extrait de levure, 0,5 $ d'extrait de viande, 0,5 $ de peptone, 0,25 $ de chlorure de sodium et 2 ^ de sorbitol, et se trouvant au pH 7,2, est inoculée jq dans le milieu de culture mentionné en premier, dans une proportion de 10 et on cultive à 30°C tout en agitant à l'aide d'un agitateur tournant à une vitesse d'environ 600 tours/minute et en aérant avec un mélange de gaz introduit à raison de 1 litre/litre/minute (la concentration de n-butane dans l'air étant de 1,3$) 15 pendant 72 heures. On maintient le pH à 7,2 pendant la culture en ajoutant une solution d'ammoniaque. Lorsque la culture est terminée, la quantité de bactéries obtenue est de 10 mg par ml de milieu, sous forme de cellules sèches. On obtient 30 g de cellules par séparation centri-20 fuge suivie d'un lavage à l'eau et d'une dessiccation. ~F.Y~BM~P'1ÏF. P On cultive Nocardia butanlca (ATCC 21197) de la manière décrite dans l'exemple 1, tout en aérant à l'aide d'un gaz mixte (concentration du propane dans l'air de 1,5 #) pendant 72 25 heures, à cette exception que la source de carbone est constituée par du propane. A la fin de la culture, la quantité de bactéries accumulées sous forme de cellules sèches est de 10 mg/ml de milieu. EXEMPLE 3 30 On cultuve Nocardia paraffinioa (ATCC 21199) de la manière décrite dans l'exemple 1, à cette exceptior/que la source de carbone est constituée par du n-butane pris en une concentration élevée, l'aération étant faite avec un mélange de gaz (concentration du n-butane dans l'air de 20 fo). On obtient ainsi, 35 après 72 heures de culture, 25 mg de cellules sèches/ml du milieu. EXEMPLE 4 On cultive Brevibacterium paraffinolvticum ATCC 21195 de la même manière que dans l'exemple 3 en utilisant un 40 milieu de culture comprenant 0,05 $ de KH2P04 ; 0,05 ^ de 69 065 •- V *; is 2003586 Na2HP04,12H20 ; 0,01 £ de MgS04,7H20 j 0,001 £ de MnS04,4H20 ; 0,001 $ de VeS0A,lK20 ; 0,001 f> de ZnS04,7H20 ; 0,001 £ de CaGl2,2H20 ; 10 ^ /l de H3B03 ; 10 * /I de Na2Mo04,2H20 ; 50"6/l de CuS04,5H20 ; 10 -£ /I de CoC12,2H20 ; 50 y/1 de 5 NiCl2,6H20 ; 0,05 $> de liqueur de macération du maïs et 0,2 $ de (NH4)2S04, à cette exception qu'un mélange gazeux (50 : 50) de butane et d'air est utilisé pour l'aération. Après 96 heures de culture, on obtient ainsi 4 mg de cellules sèches/ml du milieu. 10 -P.Y-RMPLE 5 On cultive Brevibacterium butanicum (ATCC 21196) de la manière décrite dans l'exemple 4* On obtient ainsi, après 96 heures de culture, 5 mg de cellules sèches/ml du milieu. EXEMPLE 6 15 On cultive Corynebacterium alkanum (ATCC 21194) de la manière décrite dans l'exemple 4. Après 96 heures de culture, on obtient 3 mg des cellules sèches/mit du milieu. Il est bien entendu qu'on peut apporter de nombreuses modifications à la description qui précède sans sortir pour 20 cela du cadre de la présente invention. k 06537 19 2003586 REVENDICATIONS 1. Procédé de production de cellules de microorganismes douées de propriétés d'assimilation des hydrocarbures gazeux et appartenant aux genres Nocardia. Corynebacterium et Brevibac-5 terium. ce procédé étant caractérisé par le lait qu'on cultive . lesdits microorganismes en aérobie, au sein d'un milieu nutritif aqueux et en présence d'au moins un hydrocarbure gazeux constituant la source de carbone principale , après quoi on isole et on récupère les cellules de microurganismes ainsi obtenues0 10 2. Procédé conforme à la revendication 1, dans le quel le microorganisme est Nocardia paraffinica ATCC 21198. 3. Procédé conforme à la revendication 1, dans lequel le microorganisme est Nocardia paraffinica ATCC 21199. 4. Procédé conforme à la revendication 1, dans le-15 quel le microorganisme est Nocardia butanica ATCC 21197. 5. Procédé conforme à la revendication 1, dans lequel le microorganisme est Brevibacterium paraf f in olyt ic um ATCC 21195. 6. Procédé conforme à la revendication 1, dans le-20 quel le microorganisme est Brevibacterium butanicum ATCC 21196. 7. Procédé conforme à la revendication 1, dans lequel le micr'oorganisme est Corynebacterium alkanum ATCC 21194» 8. Procédé conforme à la revendication 1, dans lequel l'hydrocarbure gazeux est l'éthane, le propane, ou le n- 25 butane® 9. Procédé conforme à la revendication 1, dans lequel le microorganisme est cultivé en aérobie à une température d'environ 20 à 50°C et à un pH d'environ 4 à 9»