FR 2007469 A1 19700109 FR 6911808 A 19690416 69 11808 2007469 la présente invention est relative à des substances Jaypotoniques, appelées rugulovasine A et rugulovasine B, et à leur production. la présente invention est basée sur les constata tations suivantes : (1) la demanderesse a découvert certains micro-organismes capables de produire de nouvelles substances hypo-toniques î (2) ces microorganismes appartiennent aux gen-10 *«» Pénicillium, Corticlua. Pellicularia ou lenzites ; (3) les substances bypotoniques sont accumulées dans un bouillon de culture dans lequel les microorganismes précités sont cultivés ; (4) les substances ainsi accumulées peuvent être 25 récupérées dans le bouillon de culture dans un état de pureté désiré par des procédés connus per se. les nouvelles substances ont été appelées rugule-vasine A et rugulovasine B et seront désignées de cette manière dans la suite du présent exposé. 20 La présente invention a pour ob^et l'obtention de rugulovasine» Pour atteindre ee but de la présente invention, on fait incuber un aicr©organisme producteur de rugulovasine et appartenant aux genres Pénicillium. Corticlum. Pellicularia ou 25 lenzitea. au sein drun milieu contenant des sources de carbone assimilables,des sources d'azote digestibles et d'autres éléments nutritifs, de manière que le microorganisme accumule de la rugulovasine A et/ou de la rugulovasine B au sein du bouillon de culture dans lequel on récupère ensuite ces composés. 30 Dans la présente invention, on utilise un micro- organisme capable de produire au moins de la rugulovasine A ou de la rugulovasine B et appartenant aux genres Pénicillium. Qortieium, Pellicularia ou lenzites. y compris leurs variantes et leurs mutants. 35 Bien qu'il existe un grand nombre de microorga nismes de ce genre, les microorganismes suivants sont des souches typiques qui ont été déposées à l'Organisme "Institute Por Fermentation" à Osafca, Japon sous les numéros donnés entre parenthèses. 11808 2 2007469 Pénicillium rugulosum (IFO 4683) Peaicillium eQncavo-ruguloaam 6 (IFO 6017) Pénicillium coBeavo-rugulosun ?6-13 (IPQ 9135) Peaicillium concavo-rugulosum Mm-10 (IFO 9136) Peaicillium corylephiloideB (IFO 6227) Pénicillium purpurogeaua. (IFO 5722) Oorticium eaeruleum (IFO 4974) Pellicularia fllamaatosa (IFO 6523) Leazites trabea (IFO 6430) 10 Les propriétés microbiologiques de ces souches ae sont on général pas déterminées et il existe évidemment de nombreux mutants et de nombreuses variantes des mieroorgaais-mes producteurs de rugulovasine. Dans le procédé de la présente inventien, en 15 peut utiliser l'ua quelcoaque de ces microorganismes,que la variatioa ait été iaduite naturellement ou artificiellement, par exemple à l'aide de rayons X, de rayons ultraviolets ou de réactifs chimiques tels que la moutarde azotée, à condition que le aieroorgaaisme choisi produise la rugulovasine A et/eu 20 la rugulovasine B» La composition du milieu est facultative à condition que le microorganisme producteur de rugulovasine puisse se développer sur ce milieu. Ainsi, il peut contenir, à titre de source de carbone, des sucres tels que le glucose, le sacoha-25 rose, le maltose, etc., des alcools dérivés de sucres tels que le mannitol, le sorbitol, le dulcitol, la glycérine, etc.. et des acides organiques tels que l'aoide saeciaique, l'acide ai-trique, etc.., et à titre de source d'azote, uae peptoae, des amiaoaeides tels que l'acide aspartique, l'aeide glutamique, 30 etc.., les sels d'ammonium d'acides organiques tels que le suc-cinate d'ammonium, le citrate d'ammonium, etc.*. On peut également incorporer au milieu des sels minéraux tels que divers phosphates, le sulfate de magnésium et le chlorure de sodium. 35 En outre, pour favoriser le développement des mi croorganismes, on peut ajouter diverses vitamiaes ainsi que des acides nucléiques et les composés qui en dérivent* Bien entendu, un milieu contenant des ingrédients autres que ceux qui sont mentionnés ci-dessus peut égalemeat être utilisé à moins 40 69 11808 3 2007469 que le développement du microorganisme et l'accumulation du. produit final ne se trouvent ainsi fâcheusement affeetése On choisit et on règle les conditions de culture, par exemple la composition du milieu, la température d'incubà-5 tion, la durée de la culture, etc.» de manière à obtenir un rendement maximal en produit désiré et, en général,.quand on lait appel à un procédé de culture en surface dans lequel on utilise un milieu liquide, le pH du milieu peut être d'environ 4 à 7,5 t de préférence d'environ 5 à 6,5 et une température 10 d'incubation comprise entre environ 20 et 35°C, de préférence entre environ 26 et 30°0 ainsi qu'une période de culture d'environ 10 à 20 jours, conviennent parfaitement» Quand on exécute la culture en aérant et en agitant, un pH compris entre 5 et 7# une température comprise entre 20 et 35°C et une période de 15 culture comprise entre 4 et 10 jours sont appropriés.) Etant donné que les conditions optimales dépendent du type du milieu, de la souche du mieroerganisme et d'autres facteurs, on doit bien entendu choisir des conditions en tenant compte de ces facteurs» 20 Le bouillon de culture obtenu, en cultivant un mi croorganisme producteur de rugulovasine appartenant aux genres Pénicillium. Oorticium. Pellicularia ou Lenzites contient non seulement des quantités notables de rugulovasine A et/ou de rugulovasine B, mais de petites quantités d'alcaloïdes de l'ergot 25 de seigle connus dans la technique antérieure, comme la chano-clavine, la festuclavine, l'agroelavine, etc. Ces alcaloïdes sont contenus non seulement dans la phaâe liquide du bouillon, mais aussi dans les cellules microbiennes et, pour récupérer la rugulovasine A et/ou la rugulovasine B obtenues, il est avanta-30 geux dêextraire tout d'abord la totalité des alcaloïdes par un procédé classique dans l'extraction des alcaloïdes. Conformément à la présente invention, on isole ensuite des alcaloïdes la rugulovasine A et/ou la rugulovasine B ainsi obtenues , et lorsqu'on a obtenu.à la fois la-35 rugulovasine A et la rugulovasine B, on peut les récupérer indépendamment ou sous forme de leur mélange. Bien entendu, il est possible de récupérer tout d'abord les deux produits sous forme d'un mélange et de les séparer ensuite l'un de l'autre. Pour récupérer la rugulovasine A 40 et la rugulovasine B indépendamment ou sous forme d'un mélange, 69 11808 4 2007469 on peut faire appel à n'importe quel procédé classique conna. permettant de séparer deux substances ou plus de 4eux substances en plusieurs fractions. L'opération ci-dessus peut être exécutée en se basant sur les propriétés physico-chimiques des pro-5 âuits finaux, comme par exemple la différence de solubilité entre le produit final et une impureté, leur différence d'affinité pour l'adsorption, la différence de la vitesse de distribution entre deux phases liquides, la facilité relative avec laquelle on les sépare d'une solution, la sédimentation par des 10 acides,etco Il va sans dire qu'il est possible de récupérer d'autres alcaloïdes, tels que la chanoclavine, la festuclaviae, etc., qui existent également dans le bouillon, en mime temps que le produit final de la présente invention, de la manière 15 décrite ci-dess*s« En utilisant une combinaison appropriée des procédés précités, la rugulovasine peut être isolée du bouillon de culture sous une forme cristalline. Les propriétés physiques et chimiques de la rugulovasine obtenue de la manière exposés 20 en détail dans l'exemple 1 sont les suivantes s Propriétés physico-chimiques (Rugulovasine A) 10 La rugulovasine A cristallise dans le bonzèae, le chloroforme ou l'aeétonitrile sous forme de prismes en d'ai-25 guilles incolores fondant à 138*C (avec décomposition). 2e Son poids moléculaire est d'environ 268. 3. Son analyse élémentaire donne G - 72,84 H » 5,76 * et B; - 9,99 ?60 4. Son pouvoir rotatoire dans la pyridine mm * OO 30 (a)_ J est nul, son dérivé dihydro possède des pouvoirs rota-D q o _ toires spécifiques (a) ■ ^22* (a)2 * -i tn\22 « i 43$ 546 * '578 a«)fj î formule moléculaire : Gig%8IÎ202 ' 149*-151*G} 35 absorption dans 1'infra-rouge : voir figure 4, sur laquelle on a t Q a porté le nombre d'onde, en cm en abscisse et le coefficient de transmission en ordonnée», 5o Elle est médiocrement soluble dans féther do pétrole, modérément soluble dans l'éther, le chloroforme, le 40 benzène et l'aeétonitrile, mais facilement soluble dans l'aeétata 69 11808 5 2007469 d'éthyle, l1 acétone, le méthanol, l'éthanol et la pyridine. Elle ne montre pas de fluorescence dans les solvants organigaes. Elle se dissout difficilement dans l'eau, mais est facilement dissoute dans les acides dilués. 5 6. Réaction avec les colorants j Réaction avec l'isonitrile Réaction de Dragendorff + Réaction d'Ehrlich + Réaction de Légal + 10 Réaction avec l'hydroxamate ferrique + Réaction de Fehling - Réaction avec de la 2,4-dinitrohydrazone -Réaction avee le chlorure ferrique - Décoloration du permanganate de potassium + ■*-5 7. Absorption dans l'ultraviolet aux longueurs dfondes do 224-, 277, 288 et 295 njt (voir figure 1), sur laquelle on a porté la longueur d'onde on abscisse et log c en ordonnée. 8. Absorption significative de l'infrarouge par 2G. les cristaux (disque do Or) aux longueurs d'onde de 685, 755, 1025, 1130, 1440, 1480, 1665 et 1755 cm"1 (voir figuro 2), sur laquelle on a porté le nombre d'onde en abscisse et le coefficient de transmission en ordonnée. 9. Elle donne ; un chlorhydrate de formule : 25 o,fiH,gOpHpjHSl, analyse élémentaire G « 62,80 ; H * 5,61 ; H » 9,17 jt 01 « 11,43 *, sous forme de prismes incolores, dans l'eau;-P.F0 225°C (avee décomposition), pouvoir rotatoire (a)22 nul , («)ff,*« 3* , D 43® 53 ~2* ®'t (°0■ = -1,9* (dans la pyridine) ; ->u 546 Oio un oxfrlate, de formule Gi6H16°2lî2»G2H2°4 » 80US form® d'aiguil les incolores dans l'eau, P.J1. 224°G (avee décomposition) , (a)22 B°° (dans la pyridine) ; un picrate, de formule Gl6®16G2^2#e6H3°7ï3' SOttS forme de prismes massifs jaunes dans le méthanol j P.F. 229°G (avec décomposition), (~)22 B 8 0° (dans la pyridine) j et de la dihydro-rugulovasine 1 de formule G16H18ir202, P.F. 149-151#G, (a)22 * -2,2* , 4-36 69 11808 6 2007469 15 («)?L , J3«. (a)^Q » «"1*5® rWl2 J I les abaorp-546 *"A»-> » 578 Hg tioas dans l1infrarouge,sont données dans la figure 4* (Rugulovasine B) le Rugulovasine B est une substance résineuse 5 huileuse incolore, qui cristallise difficilement dans les solvants ordinaires, 2* Son poids moléculaire est d'environ 268. 3• Analyse élémentaire de son oxalate s 0 63,40 1> | H 5,51 i et M 8,30 i» 4. Son pouvoir rotatoire (a)22 est nul dans la pyridine, mais son dérivé dihydro montre un pouvoir reta-toire spécifique £«7 ^546 * ** ^578* 5* Elle est médioorement soluble dans l'éther de pétrole, modérément soluble dans l'éther, le benzène et le chloroforme, mais elle se dissout facilement dans de nombreux autres solvants* Gomme dans le cas de rugulovasine A, sa solution dans des solvants organiques ne montre sensiblement pas de fluorescence. Elle est médiocrement soluble dans l'eau froide, mais se 2q dissout facilement dans les acides dilués* De mtme que la rugulovasine A, elle donne des sels cristallins par neutralisation avec des acides» 6* Elle montre les mêmes réactions avec les colorants que la'rugulovasine A. 25 7* Elle absorbe l'ultraviolet aux longueurs d'on de de 227, 278, 288 et 295 op. . 8. Les cristaux de son oxalate montrent des bandes d'absorption caractéristiques dans l'infrarouge (disque de KBr) aux longueurs d'onde de 685, 755, 1005,1095, 1255, 1455, 50 1610, 1705, 1765, 2240, 2790, 3020 et 3290 om""1 (voir figure 3) sur laquelle on a porté le nombre d'onde en abscisse et le coefficient de transmission en ordonnée0 9. Son chlorhydrate cristallise dans l'eau sous forme de prismes blancs fondant à 187°0 (avee décomposition) j 35 (a^2» 0° * +1»9°» * 0,5# * * °* D » 436 546 578 dans la pyridine) } P.Mo » environ 305 (par spectrescopie de masse), son analyse élémentaire calculée pour Glël6°2S2'E01> H20 donne 0 » 59,53 i° ? 1 - 5,93 i» i H = 8,68 £ j 01 - 10,99?* 11808 7 2007469 15 trouvé : 0 » 59,12 # j H = 5,99# j i » 8,63 ^ | Cl » 11,43 10. La dihydro rugulovasine B, répondant à la formule moléculaire » fond à 190 - 193*0 (avec dé composition) (a)22 » + 2,3® , (a)22 ■ + 0,9° , (a)22 « +0,5* 436 546 578 22 5 £ (a) _7 0oa spectre d'absorption dans l'infrarouge est donné dans la figure 5, sur laquelle on a porté le nombre d'onde en absoisse et le coefficient de transmission en ordonnée» La rugulovasine A et la rugulovasine B possèdent 10 en commun la formule moléculaire GigHx6C)2lî2 son'fc des composés qui, dans certaines conditions, peuvent être mutuellement convertis. Dans 1'expérience menée pour prouver ee fait, on a dissous chacune des deux substances dans un solvant et, après avoir porté à l'ébullition pendant 5 minutes la solution ainsi obtenue, on l'a soumise à une chromâtographie en coaehe mince, après quoi on a développé avee une solution de para-diméthyl-aminobenzaldéhyde dans de l'acide chlorhydrique dilué» 20 Les taches de couleur correspondant à la rugulo vasine A et B ont été analysées par colorimétrie en utilisant nn densitomètre» Les résultats des expériences qui précèdent sont donnés ci-dessous : Solvant utilisé Taux de conversion Taux de conversion 25 de la rugulovasine de la rugulovasine A en rugulovasine B B en rugulovasi- - ne A Ethanol 50 £ 12 Benzène 17 # 6 # Acétate d'éthyle 30 $> 0,1 30 Les chromatogrammes en couche mince des deux substances développées avec divers mélanges de solvants ont donné les valeurs Rf ci-après, qui les différencient de n'importe quel alcaloïde connu dérivé du microorganisme Clavice-ps et de 35 diverses moisissures» Mélanges de révé- (i) (II) (III) lateurs * Rugulovasine A 0,46 0,56 0,64 Rugulovasine B 0,55 0,56 0,64 11808 8 2007469 10 Révélateurs : (I) Chleroforme-Ethanol (10 : 1,5) (II) Chloroforme-diéthylamine (10 : l) (III) Benzèlfce-méthanbl (2:1) Activités physiologiques de la rugulovasine Action hypotonique et hradycardique de la rugulovasine A et de la rugulovasine B chez le chat anesthésiéo Composé Dose (mg/fcg médicamenteux de poids vif} ïïhre d'ani- Effet Durée de maux maxe l'effet (# de maxo réduc- (min0) tion) Durée de l'action (min*) action hypotonique Rugulovasine A 0,05 3 20 14 60 N 0,10 3 54 2 170 Rugulovasine B 1,0 6 21 150 > 240 w 2,0 4 44 120 >300 action bradycardique Rugulovasine A 0,05 3 14 15 60 n 0,10 3 28 5 .> 170 Rugulovasine B 1,0 6 11 60 ->240 II 2,0 4 33 120 ;>300 15 20 25 (Nota) : Administration par voie intraveineuse Action hypotonique de la rugulovasine A et de la rugulovasine B chez les rats souffrant d'hypertonie spontanée 30 35 Composé médicamenteux - Dose (mg/kg) Mode d'administration JfsTbre de rats Effet maxi. (mmHg) Durée de 1'effet max<>(h ) Durée de l'action (n r Rugulovasine A 5 S.C.* 5 25 1 7 10 _ A * P.O 4 21 7 7-24 Rugulovasine B 10 b»Co 4 17 4 7-24 20 s.e. 4 20 3 24 10. P.O 7 • 15 3 7-24 69 11808 9 2007469 (Hota) I# ha pression témoin initiale pour chaque groupe était de 180-195 aua.Hg 2c * SoCo ; Administration sous-catanéa P.O s Administration "par os 5 3. Soxicité aiguë On détermine la dose léthale (LD^q) des rugulo-vasines A et B en utilisant des groupes de souris comprenant chacun trois souris,.la moyenne des résultats étant donné# ci-dessous. 10 Intraveineuse Intrapér&tonéalo Rugulovasine A-HG1 80 ag/kg • Rugulovasine B-HG1 70 mg/kg 1$Q ag/kg Les souris sont tuées en 2 minutes dans le cas de l'administration par voie intraveineuse et en 30 minntes lors de l'administration par voie intrapéritonéale. La dose efficace de rugulovasine A pour l'homme est comprise entre environ 0,2 et 0,5 mg par personne quand on l'administre par voie intraveineuse, et entre environ 1 ot 2«g par personne quand on l'administre per os. 20 Par ailleurs, la rugulovasine B peut être adminis trée en toute sécurité en une dose atteignant environ dix fois celle de la rugulovasine A, dans chaque cas* Les exemples qui vont suivre décrivent les modes de mise en oeuvre actuellement préférés de la présente inven-tion, sans toutefois limiter la portée de cette dernière. Les pourcentages s'entendent en poids par volume. Dans les exemples suivants, la relation entre les parties en poids et les parties en volume est identique à celle qui existe entre les grammes et les millilitres. 30 Exemple 1 Une solution dans lfeau du robinet contenant 10# de mannitol, 4 # de glucose, 1 $ d'acide succinique, 0,1 # de KHgPO^, 0,03 # de MgS0^,7^0 et 0,2 # de liqueur de macération du mais est ajustée au pH 5,6 avec une solution d'am- 35 moniaque aqueuse et on verse 1.000 parties en volume de la solution résultante dans un fermenteur (d'une eapacité de 2 000 parties en volume), puis on la stérilise. On inocule le microorganisme Pénicillium concavo-rugulosum 6 (IFO 6017) dans le milieu et on fait incuber en laissant au repos à 28-30°C, 11808 " 2007469 pendant 15 jours. Lorsque la oaltsee «st achevée, on filtre 1® ■bouillon pour en séparer le mycélium qu'on mélange avec 200 parties en volume d'acide sulfurique 0,15, en vue d'extraire les alcaloïdes contenus dans le mycélium « On combine cette solution 5 extraite ayee le filtrat du "bouillon et on alcalinise la solution combinée avec une solution d'ammoniaque aqueuse jusqu'à un pH égal ou supérieur à 10, après quoi on procède à plusieurs extractions en utilisant chaque fois 400 parties en volume d'acétate d'éthyle. Ensuite, on concentre jusqu'à siccité la p©r-10 tion formée par les solvants organiques combinés en opérant sous pression réduite, et on la dissout dans environ 10 parties en volume d'une solution aqueuse à 1 # d'acide phosphorique« Après avoir ajusté le pQ de la solution à 6 avec 5a0H 0,15, on la mélange avec 7 parties en volume de chloroforme. De cette 15 manière, la rugulovasine A et/ou la rugulovasine B se trouvent transférées dans la couche chloroformique, tandis que la chanocla-vine et les traces résiduelles d'alcaloïde restent dans la solution aqueuse. On concentre la couche chloreformiqae jusqu'à un volume approprié et on soumet le produit concentré à une extrac-20 tien à contre-courant en utilisant une solution tampon à l'acide phosphorique (pi 4) et dix ampoules à décantation. On constate alors que les phases chloroformiques contenues dans les ampoules renferment de la rugulovasine B» De e® fait, on réunit toutes les fractions chloroformlques. On divise en trois fractions les por-25 tions de solution tampon contenues dans les ampoules à décantation, à savoir une fraction correspondant aux ampoules 1 à 5, qui contient la majeure partie de la rugulovasine A, une fraction correspondant aux ampoules 8 à 10, qui contient la plus grande partie de la rugulovasine B, et une fraction correspondant aux 30 ampoules 6 et 7, qui contient à la fois la rugulovasine A et la rugulovasine B en des proportions sensiblement égales. On soumet la fraction contenant la rugulovasine A et la rugulovasine B à une extraction à contre-courant, une seconde fois, pour séparer les deux alcaloïdes l'un de l'autre de 35 la manière susmentionnée» On ajoute 5aOH 0,15 à environ 3 parties en volume de la fraction riehe en rugulovasine A (formée par le contenu des ampoules n* 1 à 5) pour ajuster le pH à 10 et on mélange avec environ 4 parties en volume d'acétate d'éthyle, jusqu*à ce 40 que le produit désiré soit complètement transféré dans la couche 69 11808 11 2007469 d'acétate d'éthyle0 On déshydrate cette solution dans l'acétate d'éthyle sur du sulfate de sodium anhydre et on la concentre à siceité. On dissout le résidu dans environ 5 parties en volume de benzène chaud et on laisse la solution reposer à la tempé-5 rature ambiante ce qui détermine la séparation de cristaux bruts de rugulovasine A avec un rendement de 0,48 partie en poids. On recristallise plusieurs fois les cristaux bruts dans le benzène, ce qui donne des aiguilles incolores qui 10 se décomposent à 138°C. l'analyse chimique de ce produit donne la composition suivante qui coïncide avec la formule moléculaire de Qi6^6°2S2 ne Pas "tourner la lumière polarisée, en solution dans la pyridine. Calculé pour cx6Hig02ïï2 15 0 71,62 # ; H 6,01 # | H 10,44 # Trouvé C 72,84 # ; H 5,76 # ; H" 9,99 # Par ailleurs, on traite la fraction chloroformique et la fraction tamponnée qui sont riches en rugulovasine B. A cet effet, on concentre la fraction chloroformique jusqu'à pf) obtention d'une quantité appropriée tout en ajustant la fraction tamponnée au pH 10 par addition de NaOH 0,1]J, puis on extrait chaque fraction à plusieurs reprises en utilisant chaque fois 0,5 partie en volume d'acétate d'éthyle, la rugulovasine B étant ainsi transférée en totalité dans la couche d'acétate d'éthyle,, 25 On déshydrate cette couche sur du sulfate de sodium anhydre et on la concentre à siccité. On dissout le résidu dans une quantité appropriée d'acide sulfurique O51IIÎ et on combine la solution résultante avee la solution chloroformée concentrée obtenue ci-dessus 30 On agite vigoureusement la solution combinée de manière que la rugulovasine B contenue dans le chloroforme se trouve extraite et passe dans la solution acide. On ajuste cette solution acide au pH 10 en ajoutant HaOH 0,l]f et on l'extrait plusieurs fois utilisant chaque fois 2 parties en volume d'acétate d'éthyle, 35 la rugulovasine B étant ainsi transférée dans la couche d'acétate d'éthyle. On déshydrate la couche d'acétate d'éthyle sur du sulfate de sodium anhydre et on la concentre à siccité, ce qui permet d'obtenir la rugulovasine B sous forme d'un sirop brut, avec un rendement de 0,32 partie en poids* On dissout ce 40 produit dans une petite quantité d'éthanol, on chauffe la 69 11808 12 200)469 solution résultante après avoir ajouté 0,5 partie en volume d'une solution aqueuse à 5 # d'acide oxalique et on la laisse ensuite reposer à la température ambiante, ce qui donne 0,27 partie en poids d'oxalate brut sous forme d'une masse de cristaux blan-5 châtres. Après recristallisation de ces cristaux bruts dans de l'eau chaude, on obtient des cristaux incolores co-? * lonnaires d'oxalate,de rugulovasine B, qui se décomposent & 217°C Ce produit possède la composition chimique sui-10 vante qui coïncide avec la formule moléculaire G-^gH^gOgNg.O^ Calculé t C 65,16 0 ; H 5,47 # j S 8,94 # Trouvé C 63,40 # } H 5,51 JÉ ; Tiï 8,30 ?É. Comme la rugulovasine A, ce produit ne fait pas 15 tourner la lumière polarisée en aucun sens» Des cristaux de ehanoclavine de forme coloanai-re peuvent être récupérés par des procédés classiques dans la solution aqueuse résiduelle obtenue après extraction de. la rugulovasine A et de la rugulovasine B par le chloroforme. 20 Exemple 2 De la manière décrite dans l'exemple 1, on cultive les microorganismes suivants et l'on obtient les rendements donnés ci-dessous*. 25 . Hier©organisme Quantité totale d'alca loïde obtenue Pénicillium rugulosum (ÏFO 4683) 23 mg/1 Lenzites trabea (IFO 6430) 2,5 mg/1 Exemple 3 On ajuste au pH 5,6 une solution dans l'eau du 30 robinet contenant 6 # de sorbitol, 4 # de glucose, 1 # d'acide suecinique, 0,1 # de KHgPO^, 0,03 # de MgSO^, 7HgO et 0,2 # de liqueur de macération du maïs en y ajoutant une solution d'ammoniaque aqueuse, puis on inocule 30.000 parties en volume de ce milieu avec 1.500 parties en volume d'une culture d'ensemence-35 ment d'un mutant (U6-13, IFO 9135), obtenu par irradiation aux ultraviolets du microorganisme Pénicillium concavo-rugulosum B* 6 (IFO 6017)• On a préparé cette culture d'ensemencement en cultivant le mutant dans un milieu ayant la même composition 40 que ci-dessus, à 28*C et pendant 3 jours. On exécute la culture 11808 " 2007469 principale à 28-30°G, tout en aérant et en agitant constamment. Le 5ème jour de la-culture, on traite le "bouillon de la manière décrite dans l'exemple 1 et l'on récupère ainsi 2,3 parties en poids de rugulovasine A et 1,8 partie en poids de rugulovasine B. 5 Exemple 4 On ajuste au pH 6 une solution dans de l'eau courante contenant 3 i° de mannitol, 2 fi de glucose, 1 # d'acide succinique, 0,1 de KHgPO^, 0,03 # de MgSO^, 7Hg0 et 0,3 # de peptone, en y ajoutant une solution d'ammoniaque,puis on 10 introduit 50.000 parties en volume de la solution dans un fer-menteur d'une capacité de 100.000 parties en volume. Après stérilisation, on inocule le microorganisme 0ortieiua caeruleun (IFO 4974) dans ce milieu et on cultive en surface à 28°0, pendant 14 jours. 15 On traite ensuite le bouillon de la même ma nière que dans l'exemple 1 et l'on récupère ainsi 0,5 partie en poids de rugulovasine A et 0,3 partie en poids de rugulovasine B. Exemple 5 On utilise le môme milieu que dans l'exemple 4 20 «"t on y fait incuber le microorganisme Pellicularia filament osa (IFO 6523) tout en agitant, à 30°C et pendant 12 jours. On traite environ 50.000 parties en volume du bouillon de culture résultant de la môme manière que dans l'exemple 1, ce qui permet de récupérer 0,25 partie en poids de rogu-25 lovasine A et 0,1 partie en poids de rugulovasine B. Exemple 6 Dans un fermenteur (d'une capacité de 120.000 parties en volume) on verse environ 30.000 parties en volume d'une solution dans l'eau du robinet contenant 2 # de glucose, 30 2 de saccharose, 0,15 # de chlorure d'ammonium , 0,05 # d'urée, 0,1 # de KHgPO^, 0,05 # de MgS04, 7H20, 0,01 1° de FeS04,7H20, 10 /ig/1 de biotine et 1 mg/litre de chlorhydrate de vitamine B^, puis on stérilise ce mélangec On inocule le microorganisme Lenzites trabea 35 (IFO 6430) dans le milieu, et on fait incuber à 24°C pendant 7 jours,tout en aérant et en agitant constamment© Après avoir traité le bouillon résultant de la môme manière que dans l'exemple 1, on récupère 0,11 partie en poids de rugulovasine A et 0,3 partie en poids de rugulovasine Bo 69 11808 14 2007469 Exe tapie 1 On utilise Pesaioilliûm ooncavo-ragalosum Mn-10 (IFO 91J6), qui est an mutant dérivé à® Penecillicua coaoavo-rugulosum n* 6 (IÏO 6017) par irradiation aux rayons ultraviolets, et on le fait incuber dans d@s proportions croissantes, lo Culture inclinés 10 15 2o 20 25 30 Milieu Dextrose de poame de terre Extrait de levure Acides aminés da la caséine Agar-agar pH 5,6 Conditions t Incubation à 28°G pendant 72 à 96 heures Culture d'ensemencement Milieu Mannitol Glucose Acides succiniques Liqueur de macération du mais KHgPO^ 3,9 * 1,0 i 1,0 0 2,0 je 3,0 i 1,0 # 1,0 ¥> M i 0,1 0,03; 35 MgS04>7H20 Eau du robinet pH 5,6 Conditions : 500 ml dans chacun de deux ballons de 2 litres ; incubation à 28*G en agitant à la vitesse de 150 tours/minute pendant 48 heures 3. Culture principale Milieu Identique au milieu d'ensemencement conditions 1 100 litres dans une cuve de 200 litres Incubation à 28*C, tout en aérant et en agitant pendant 126 heures,, On soumet le bouillon de culture résultant an procédé décrit dans l'exemple 1 et on obtient 5 g de rugulova-sine A et 3,3 g de rugulovasine B. 69 11808 15 2007469 RE7EBDICAÎIOIS 1. Procédé de production de rugulovasine A et/ou de rugulovasine B, qui consiste à faire incuber un micro-organisme producteur de rugulovasine et appartenant aux genres 5 Pénicillium» Cortieium. Pellicularia ou Ii 2. Procédé conforme à la revendication 1, dans lequel le pH d'incubation est compris entre environ 4 et 7,5» 3o Procédé conforme à la revendication 1, dans lequel la température d'incubation est comprise entre environ 15 20 et 35°C. 4o Procédé conforme à la revendication 1, dans lequel le microorganisme est Pénicillium rugulosum. 5» Procédé conforme à la revendication 1, dans lequel le microorganisme est Penicillium coneavo-rugulosum» 20 6. Procédé conforme à la revendication 1, dans lequel le microorganisme est Pénicillium c orylophilo ides « 7» Procédé conforme à la revendication 1, dans lequel le microorganisme est Pénicillium purpurogenum. 8. Procédé conforme à la revendication 1, dans 25 lequel le microorganisme est Cortieium oaeruleum. 9. Procédé conforme à la revendication 1, dans lequel le microorganisme est Pellicularia filamentosa. 10. Procédé conforme à la revendication l,dans lequel le microorganisme est Lenzites trabea. 30 11* Rugulovasine A qui est un métabolite d'un microorganisme, douée d'une activité hypotonique et caractérisée par les propriétés suivantes : (a) Elle forme des priâmes ou des aiguilles incolores fondant à 138*0(avec décomposition) ; 35 (b) Son poids moléculaire est d'environ 268 ; (c) Son analyse élémentaire donne : 0 72,84 $ ; H 5,76 # ; IT 9,99 22 (d) Son pouvoir rotatoire (a) dans la pyridine est nul, mais son dérivé dihydro possède les rotations spéci- ^0 fiques suivantes î 16 11808 2007469 /"M- J (a.)22 - 22» , (a)22 = -1,3'*, (a)22 . -1,5» ! Mg 435^ 546 578 (0) Elle est soluble dans l'acétate d'éthyle, l'aeétoae, le méthanol, l'éthanol et la pyridine et est peu soluble 5 dans l'éther de pétrole, l'éther , le chloroforme, le benzène et l'aeétonitrile j (f) Ses réactions arec les. colorants soot les suivantes : Réaction- avee l'isonitrile -Réaetion arec le réactif de Bragendorf + 10 Réactios avec le réactif d'Ehrlich + Réaction aveo le réactif de Légal + Réaction avec l'hydroxamate ferrique + Réaction avec la liqueur de Fehling Réaction avee la 2,4-dinitrohydrazone 15 Réaction avee le chlorure ferrique - Décoloration du permanganate de potassium + ; (g) Absorption dans l'ultraviolet t Absorbe l'ultraviolet aux longueurs d'ondes de t 224, 277, 288 et 295 millimiorons | 20 (h) Ses cristaux montrent des bandes d'absorption dans 1*infra-rouge (disque KBr) pour les nombres d'onde suivants t 685, 755, 1025, 1130, 1440, 1480,1665 et 1755 on""1. (1) Elle donne un chlorhydrate (G^gH^gOglTgfHGl) sous 25 forme de prismes incolores fondant à 225°0 (aveo dé composition) ; l'analyse élémentaire donne G 62,80 #, 1 5,61 $ j ¥ 9,17 i> , Cl 11,43 12* Rugulovasine S, un métabolite d'un micro-organisme, douée de propriétés hypotoniques et caractérisée par 3° les propriétés suivantes * (a) Elle forme une huile résineuse inoolore, cristallisant difficilement j (b) Son poids moléculaire est d'environ 268 ; (e) L'analyse élémentaire de son oxalate donne 6 63,40 # j 55 H 5,51 t î S 8,30 (d) Son pouvoir rotatoire (a)^2 dans la pyridine est nul, mais son dérivé dihydro possède les pouvoirs rotatoires spécifiques suivants t t (a)22 » +2,3* , (a)22 = + 0,9?, (a)22 - +0,5** 40 436 546 578 69 11808 17 2007469 (e) Elle est modérément soluble dans l'éther, le benzène, et le chloroforme mais elle est peu soluble dans l'éther de pétrole ; (f) Ses réactions aveo les colorants sont identiques à 5 celles de la rugulovasine A j (g) Absorption dans l'ultraviolet : Absorbe l'ultraviolet à 227 , 278, 288 et 295 millimiorons ; (h) Les cristauz.de son oxalate montrent des bandes d'absorption significatives dans l'infrarouge (disque de 10 EBr) à 685, 755, 1005» 1095, 1255, 1455, 1610, 1705, 1765» 2440, 2790, 3020 et 3290 cm"1 j (i) Elle donne un chlorhydrate (C^gH-yj02&2,HGl»H2G) sous forme de prismes blanes fondant à 187*C (avec décomposition) ; l'analyse élémentaire donne s 15 G 59,12 i> ; H 5,99 # j X 8,63 # l 01 11,43