FR 2005256 A1 19691212 FR 6909316 A 19690328 69 09316 1 2005256 La présente invention concerne la préparation de 1'oestrololactone et un nouvel' intermédiaire, la 19-nortestololactone, utilisée dans son procédé de préparation. Plus particulièrement,, l'invention concerne la préparation microbiologique de 1'oestrololactone. 5 On sait que le produit final de l'invention peut être préparé par synthèse chimique, par exemple par oxydation de l'oestrone par l'eau oxygénée en milieu alcalin. On a aussi préparé ce produit par voie microbiologique en soumettant la 19-norprogestérone à l'action de micro-organismes. Le nouveau procédé selon l'invention utilise l'action 10 de micro-organismes sur le nouvel intermédiaire selon l'invention, la 19-nortestololactone. On a découvert que cet intermédiaire possède une activité antiandrogène et comme tel, il peut être utilisé dans le traitement de l'acné hyperandrogène. On peut aussi l'utiliser de manière semblable à 1'aldostérone. 15 On prépare le produit final selon l'invention par voie microbiologique en soumettant la 19-nortestostérone ou la 19-nor- A4-androstène-3,17-dione aux enzymes d'Aspergillus tamarii. Après ce stade, on récupère de manière connue le nouvel intermédiaire, la 19-nortestololactone. En soumettant cet intermédiaire à l'action d'un micro-organisme 20 1-déshydrogénant, par exemple Corynebacterium simplex, on récupère le produit désiré, 1'oestrololactone. Outre le micro-organisme 1-déshydrogénant ci-dessus, on peut utiliser d'autres micro-organismes dans la pratique de l'invention, tels que Nocardia restrictus, Pseudomonas testosteroni, Cylindrocarpon radicicola et Mycobacterium rhodochrous. 25 L'oestrololactone possède une activité antioestrogène et par conséquent, on peut l'utiliser dans le traitement des tumeurs du sein et de l'utérus. On peut le formuler en comprimés par des procédés connus et l'administrer en doses journalières de 0,10 à 10,0 mg/kg de poids du corps chez les humains et de 0,05 à 5 mg/kg de poids du corps chez les 30 animaux (par exemple vaches, lapines ou rattes). On peut administrer les composés sous forme de comprimés comme indiqué ci-dessus ou sous forme injectable. Dans ce cas, on les dissout dans une huile végétale (par exemple huile de sésame) ou dans l'eau salée et on les administre par voie parentérale. 35 lin général, les conditions de culture des micro-organismes selon l'invention sont les mêmes que pour la culture de diverses autres bactéries pour la production d'acides organiques ou de glycols, c'est-à-dire que l'on fait pousser le micro-organisme en conditions aérobies en 69 0931o 2 2005256 contact avec un milieu de fermentation convenable. Un milieu convenable contient essentiellement une substance azotée et una source de carbone et d'énergie. Cette dernière peut être un hydrate de carbone (tel que saccharose, mélasses, glucose, maltose, amidon ou ôextrine), un acide 5 gras, une graisse et/ou le stéroîde lui-même. De préférence, cependant, le milieu comprend une source assimilable de carbone et d'énergie en plus, du stéroîde. La source de facteurs azotés peut Être naturelle (par exemple farine de soja, liqueur de trempage de maïs, estroit de viande et/ou solubles de distilleries) ou synthétique (par exemple constituée par 10 des composés organiques ou minéraux synthétisafales simples tels que les sels d'ameaiun, nitrates alcalins aminoacides o-'s urée). Une alimentdion convenable en air stérile doit être maintenue pendant la fermentation par exemple par les précédés classiques consistant à exposer une large surface du milieu à l'air ou à utiliser 15 une culture aérée submergée. On peut ajouter 1® stéroîde à la culture pendant la période d'incubation ou on. peut l'incorporer dans le milieu avant la stérilisation ou l'inoculation. Comme on l'a mentionné ci-dessus, lorsque l'on soumet le produit de départ aux enzymes d'Aspergillus tamarii3 on recueille la 19-20 nortestololactone. Il est aussi possible de récupérer ce nouvel intermédiaire en utilisant l'un des organismes suivants producteurs de lactones : Aspergillus flavipes. Pénicillium chrysogeraim, Pénicillium citrinum et Pénicillium lilacium. Les exemples suivants illustrent l'invention sans toutefois 25 en limiter la portée. EXEMPLE 1 19»nortestolactone. A - Fermentation. On met en suspension dans 5 ml é'uae solution aqueuse à 0,01% de laurylsulfate de sodium deux cultures de surface d'Aspergillus 30 tamarii (ATCC 10.836) sur tranches de gélose;, âgées de 10 jours, les tranches contenant le milieu nutritif A suivant : Glucose 10 g Extrait de levure 2,3 g k2hpo4 I g 35 Gélose 20 g Eau distillée q.s.p. 1 litre 69 09316 3 2005256 On utilise des portions de 1 ml de cette suspension pour inoculer 8 fioles coniques de 250 ml contenant chacun 50 ml du milieu stérilisé B suivant : Dextrose 10 g 5 Liqueur de trempage de maïs 3 g NH4H2P04 3 g Extrait de levure 2,5 g CaC03 2,5 g Eau distillée q.s.p. 1 litre 10 Après incubation pendant 40 heures à 25°C avec agitation continue (secoueuse rotative à 280 cycles/minute), 5,8 cm de course), on effectue des transferts de 57» en volume dans 50 fioles coniques de 250 ml contenant chacune 50 ml de milieu B fraîchement stérilisé. Après 24 heures, d'incubation dans les mêmes conditions que décrit ci-dessus, on ajoute le 15 stéroide (200 /ml) en introduisant dans chaque fiole un supplément de 0, 25 ml d'une solution stérile (40 mg/ml) de 19-nor A^-androstène-3,17-dione dans le N,N-diméthylformamide. On soumet à la fermentation un total de 500 mg de stéroîde. Après 26 heures supplémentaires d'incubation dans des conditions identiques à celles décrites ci-dessus, on récolte le pro-20 duit de fermentation. On réunit le contenu des fioles,on acidifie à pH 2 par l'acide sulfurique et on filtre à travers un tampon classificateur de Seitz. Le filtrat a un volume de 2700 ml. B - Isolement et caractérisation. On extrait le filtrat et les liqueurs de lavage combinés (2700 ml) trois fois avec 800 ml de méthylisobutylcétone 25 (MIBC). On combine les extraits de MIBC et on lave à l'eaus on sèche sur sulfate de sodium anhydre et on concentre à siccité sous vide pour obtenir environ 300 ml de produit brut. On soumet cette substance à la chromatogra-phie sur six plaques de verre de 40,64 x 20,32 cm, enduites d'une couche mince de gel de silice GF (produit de Merck) de 1 mm d'épaisseur, en uti-30 lisant du chloroforme contenant 5% en volume de méthanol comme solvant de développement. La bande absorbant dans l'ultraviolet et se déplaçant avec une mobilité égale au 3/4 de celle du substrat est la 19-norandrostènedione; on l'élue avec un mélange 1:1 en volume de méthanol et de chloroforme. Après évaporation du solvant, on distribue le résidu entre le chloroforme 35 et un mélange 1:1 en volume d'eau et de méthanol. La phase chloroformique, après évaporation à siccité sous vide, donne la 19-nortestololactone cristallisée. On la recristallise dans un mélange acétone-hexane pour donner environ 200 mg de produit brut, F environ 197°C; - 11,9° 69 09316 4 2005256 (c = 1,0 CHC13); analyse C 74,88% (calculé 74,97) H 8,44% (calculé 8,39%); Spectre UV A Et0H 238 m ,u (£, 18.000); Spectre IR A1®17 1723, 1652, r _1 max / ^ r max ' ' 1610 cm ; Spectre de RMN (dans CDCl^, avec standard TMS), 8,67^, 4,16 Xj . EXEMPLE 2 5 En suivant le procédé de l'exemple 1 mais en remplaçant la 19-nor A, -androstène-3,17-dione par une quantité équivalente de 19-nor-testostérone, on obtient aussi la 19-nortestololactone. EXEMPLE 3 Oestrololactone par culture de Corynebacterium simplex. 10 A - Fermentation. On met en suspension dans 5 ml d'une solution aqueuse à 0,01% de laurylsulfate de sodium deux cultures de surface de Corynebacterium simplex (ATCC 6946) sur tranches de gélose,, âgées de 2 semaines, les tranches contenant le milieu nutritif A suivant : Glucose 10 g 15 Extrait de levure 2,5 g k2hpo4 1 g Gélose 20 g Eau distillée q.s.p. 1 litre On utilise des portions de 1 ml de cette suspension pour 20 inoculer 8 fioles d'Erlenmeyer de 250 ml contenant chacune 50 ml du milieu stérilisé B suivant Extrait de viande de boeuf 1,5 g Extrait de levure 3 g Peptone 6 g 25 , Dextrose 1 g Eau distillée q.s.p. 1 litre Après incubation pendant 24 heures à 25°C avec agitation continue (secoueuse rotative à 280 cycles/minute, 5,8 cm de course), on effectue des transferts de 5% en volume dans 8 fioles d'Erlenmeyer de 30 250 ml contenant chacune 50 ml du milieu B fraîchement stérilisé. Après 24 heures d'incubation supplémentaire, en utilisant les mêmes conditions que décrit ci-dessus, on ajoute le stéroîde (500 %/ml) en introduisant dans chaque fiole un supplément de 0,25 ml d'une solution stérile (100 mg èf /ml) de 19-nortestololactone dans le NjN-diméthylform^.-35 mide. On soumet à la fermentation un total de 200 mg. Après 48 heures supplémentaires d'incubation, en utilisant des conditions identiques à celles décrites ci-dessus, on réunit le contenu des fioles, on acidifie le bouillon à pH 2,0 par l'acide sulfurique et on extrait deux fois par 69 09316 5 2005256 200 ml de méthylisobutylcétone. On centrifuge la phase de MIBC dans laquelle toutes les cellules bactériennes sont en suspension. On agite le sédiment de cellules avec 50 ml d'acétone et après centrifugation, on agi les cellules avec deux fois 50 ml d'un mélange 1:1 de méthanol et chloro-5 forme, en séparant chaque fois les cellules par centrifugation. On réunit les extraits à la MIBC, l'acétone et le méthanol-chloroforme. On sèche l'extrait sur Na^SO^ anhydre et on évapore à siccité sous vide. On recristallise le résidu cristallin d'oestrololactone trois fois dans 1*acétone pour obtenir 110 mg de produit pur, F 337°C. Spectre UV CHCl^ 281 ,u mâx / 10 ( £ 2.050), 285 iyi ( £ 1880). EXEMPLE 4 Préparation de 1'oestrololactone à partir de cellules lavées de Corynebacterium simplex. En suivant le procédé de l'exemple 3 sauf que l'on utilise 15 la testostérone à la place de la 19-nortestololactone, on récolte au bout de 72 heures par centrifugation les cellules de la culture de Corynebac ter ium simplex. On lave les cellules tassées trois fois avec un tampon au phosphate contenant 0,005 niole de KI^PO^ et 0,005 mole de Par litre et ajusté à pH 7,0. On met ensuite en suspension les cellules lavées dans le 20 même tampon jusqu'à un volume égal au 1/4 du volume de la culture initiale. On ajoute le substrat, la 19-nortestololactone, et l'accepteur d'hydrogène, c'est-à-dire la 2-méthylnaphtoquinone, sous forme de solutions dans l'étha-nol pour donner des concentrations finales de 100 y/ml et 0,04 mM respectivement, la quantité d'éthanol introduite étant maintenue inférieure à 25 57» du total. On laisse reposer le mélange réactionnel à 30°C pendant 4 à 6 heures, après quoi, on l'extrait par la MIBC, l'acétone et le mélange méthanol-ctiloroforme exactement de la même manière que décrit à l'exemple 3. On traite également les extraits combinés exactement de la même manière que décrit à l'exemple 3 pour obtenir 1'oestrololactone pure, F 337°C. 30 EXEMPLE 5 Obtention d'oestrololactone à partir de cellules de Corynebacterium simplex séchées à l'acétone. En suivant le procédé de l'exemple 4, on dilue les cellules tassées avec un égal volume de tampon au phosphate à pH 7S0. On ajoute 35 goutte à goutte cette suspension de cellules avec agitation constante dans dix fois son volume d'acétone refroidie à une température ne dépassant pas 5°C. On filtre immédiatement à la trompe sur un BUchner le dépôt qui se forme au fond du récipient. On utilise à la place de la suspension de 9 09316 6 2005256 cellules lavées à l'exemple 4 une suspension de 10 mg de cellules sériée? à l'acétone par ml de tampon à pH 7,0, que 1*011 prépare en mélangeant les cellules avec le tampon dans un mélangeur Waring. On ajoute le substrat et l'accepteur d'hydrogène de la même manière que décrit à l'exemple 4„ En 5 suivant le même procédé pour l'incubation, 1'extraction et ainsi de suite, on obtient également l'oestrololactone sous fems cristallisée, F 367°C. EXEMPLE 6 Obtention d'oestrololactone à partir d'une préparation d'enzymes de Corynebacterium simplex exempte de cellules. 10 En suivant le procédé de 1'exemple 4a on place les cellules tassées dans un mortier avec un poids égal d'alumine finement pulvérisé et on traite pendant 20 minutes dans un oscillateur à magnétostriction Raytheon. On centrifuge à 2000 G le mélange traité, pour séparer les débris de cellules et l'alumine. 15 On place dans un tube à essai 1 mg de 19-nortestololactone, 500 de 2-méthylnaphtoquinone et 2,0 ml de la préparation de A déshydro-génase exempte de cellules décrites ci-dessus et on amène le volume à 5,0 ml par un tampon au phosphate de sodium 0,03M. On laisse reposer le mélange pendant 1 heure à 30°C, après quoi, on l'extrait par la méthyl-20 isobutylcétone, l'acétone et le méthanol-chloroforme exactement de la même manière que décrit à l'exemple 1. On soumet 1'extrait combiné à la chroma-tographie sur papier en utilisant 1'éthylèneglycol comme phase stationnaire et le toluène comme phase mobile. On observe une tacha se déplaçant avec le même R^ (0,17) et présentant les mêmes réactions colorées caractéris-25 tiques que l'oestrololactone obtenue à l'exemple 3. 69 09316 7 2005256 REVENDICATIONS 1. Un procédé de préparation de I'oestrololactone,caractérisé en ce que l'on soumet la 19-nortestololactone à l'action d'un micro-orga- 5 nisme 1-déshydrogénant. 2. Un procédé selon la revendication 1 dans lequel le microorganisme est Corynebacterium simplex, Nocardia restrictus, Pseudomonas testosteroni, Cylindrocarpon radieicola ou Mycobacterium rhodochrous. 3. La 19-nortestololactone utile comme intermédiaire dans le procédé selon la revendication 1. 4. Un procédé pour préparer la 19-nortestololactone, caractérisé en ce que l'on soumet la 19-nortestostérone ou la 19-nor- A androstène-3,17-dione à l'action d'un micro-organisme producteur de lactone . 15 5. Un procédé selon la revendication 4 dans lequel le micro organisme est Aspergillus flavipes ou Aspergillus tamarii. 6. A titre de médicament antioestrogène utile en médecine humaine et en médecine vétérinaire, l'oestrololactone. 7. Les compositions pharmaceutiques contenant l'oestrolo-20 lactone et un support pharmaceutiquement acceptable. 8. Les formes d'administration des compositions selon la revendication 7, notamment les comprimés administrés aux doses journalières de 0,10 à 10 mg/kg de poids du corps en médecine humaine et de 0,05 à 5 mg/kg de poids du corps en médecine vétérinaire. 25 9. A titre de médicament antiandrogène, utile notamment dans le traitement de l'acné hyperandrogène, la 19-ncrtestololactone. 10. Les compositions pharmaceutiques contenant la 19-nortestololactone et un support pharmaceutiquement acceptable. 11. Les formes d'administration des compositions selon la 30 revendication 10,