FR 2010156 A1 19700213 FR 6917688 A 19690530 69 17688 1 2010156 La présente invention a pour objet un procédé de préparation de la L—asparaginase, et plus particulièrement un procédé de préparation par fermentation de la L—asparaginase, ce composé ayant une activité contre les tumeurs ou activité anti—tumeurs0 5 Plus particulièrement encore l'invention a pour objet un procédé de préparation de la L-asparaginase par une culture de microorganisme produisant de la L-asparaginase et appartenant au genre Serratia, dans un milieu nutritif approprié tout en maintenant un réglage déterminé de la quantité d'azote ammoniacal dans le milieu» 10 La demanderesse a déjà découvert un procédé de pré paration de la L-asparaginase ayant une activité anti-tumeur, par culture d'un ■icroorganisme appartenant au genre Serratia et produisant de la L-asparaginase, ce procédé étant effectué dans un milieu de culture liquide utilisé en remplacement du milieu 15 de culture solide habituel utilisé jusqu'ici (demande de brevet japonais nfi 9116/1968 correspondant à la demande française de brevet n2 de série 6902616, déposée le 5 février 1969)» Toutefois ces procédés comportent une difficulté inhérente consistant dans le fait qu'une petite quantité de cellules est seulement obtenue 20 car le milieu de culture utilisé présente une concentration relativement faible en source de carbone» Il en résulte qu'un des objets de la présente invention est un procédé de préparation de la L-asparaginase surmontant les inconvénients et déficiences des procédés antérieurs» 25 Un autre objet de la présente invention est un procédé de préparation de la L-asparaginase par fermentations ce procédé étant effectué de façon efficace et relativement simple, La présente invention a encore pour objet un procédé de préparation de la L-asparaginase par fermentation^ 30 pouvant Être effectué avantageusement k l'échelle industrielle et cela avec un bon rendement» L'invention a enfin pour objet la préparation de la L-asparaginasea Les objets et avantages ainsi que d'autres de la 35 présente invention apparaîtront plus nettement aux spécialistes 69 17688 2010156 en considérant la description et les revendications ci-après0 Conformément à la présente invention la demanderesse a découvert que l'on pouvait préparer de la L-asparaginase ayant une activité anti-tumeur en de larges quantités par fermentation? si 5 on règle d'une façon appropriée la teneur d'azote à l'état ammo-nàeal (NH^-N) dans le milieu de culture, sans tenir compte de la concentration de la source de carbone dans ce milieu. Ainsi la présente invention a également pour objet la préparation de la L-aspa— raginase ayant une activité anti-tumeur obtenue en cultivant un 10 microorganisme appartenant au genre Serratia dans un milieu de culture liquide au lieu du milieu de culture solide habituel indiqué dans les demandes de brevet précitées» D'autres recherches qui ont abouti à la présente invention, ont montré que l'on pouvait préparer avec des rendements importants de la L-asparaginase ayant 15 une activité anti-tumeur, lorsqu'on utilise une concentration relativement élevée en source de carbone dans le milieu de culture tout en réglant d'une façon déterminée la quantité d'azote présente sous la forme ammoniacale (NH^-N). De façon générale lorsqu'on utilise une concentration 20 relativement élevée de la source de carbone dans le milieu, il est également nécessaire d'utiliser en une large quantité des sels minéraux et des sels analogues pour maintenir la croissance du microorganisme dans la condition optimale. Dans le cas indiqué, le taux d'azote sous la forme ammoniacale dans le milieu de culture 25 varie selon la source d'azote (produits d'origine organique ou minérale) utilisés en présence de la source de carbone et de sources analogues. Lorsque la quantité de la source d*azote présente dans le milieu est importante, la croissance des microorganismes est bonne. Toutefois lorsqu'on effectue la culture en maintenant le 30 taux d'azote ammoniacal à un niveau élevé (10 mg/ml ou une proportion moindre) la formation des cellules souhaitées est alors favorable. * N'importe lesquels des microorganismes appartenant au genre Serratia et qui sont capables de produire de la L-asparaginase, 35 peuvent Stre utilisés dans la présente invêntiotto Toutefois on utilise tout particulièrement des microorganismes appartenant au genre Serratia marcescens» On inocule le microorganisme dans un milieu de culture ayant une concentration de 1 à 15$ en source de 69 17688 3 2010156 carbone (hydrates de carbone comme le glucose, le saccharose, le fructose, le glycérol et des produits analogues) et contenant en outre une quantité appropriée de la source d'azote (comportant des composés organiques et minéraux), des sels minéraux et d'autres 5 éléments nutritifs» On effectue ensuite la culture en maintenant la quantité d'azote sous la forme ammoniacale dans le milieu de culture à une concentration de 10 mg/ml ou à une concentration inférieure, de préférence à une concentration de 5 mg/ml ou inférieure» 10 Le tableau 1 indique, dans le but de montrer l'effet remarquable du procédé de l'invention, les résultats d'essais comparatifs entre le procédé de l'invention et celui effectué selon les demandes de brevets antérieures décrites ci-dessus. Les résultats analytiques indiqués sont ceux obtenus lorsque la 15 culture est terminée» TABLEAU 1 20 Procédé de préparation la L-asparaginase Produit analysé Procédé A Procédé B Procédé C NH3-N (azote ammoniacal) trace 9 mg/ml trace 25 cellules humides 16 mg/ml 65 mg/ml 44 mg/ml activité de la L-asparaginase 65 unités/ml 13 unités/ml 196 unités/ml 30 activité spécifique du liquide enzymatique brut 18,6 unités/mg 1,05 unités/mg 27,9 unités/mg Procédé A : On effectue une culture aérée comportant une agitation pendant 16 heures à la température de 3Q2C dans un milieu de culture ayant un pH de 7,0 et contenan-fc 35 .0,3% de glucose, 1,0$ d'extrait de viande, 1,0% de peptone, 0,5% de chlorure de sodium et*0,5% d'extrait de levure (se référer à la demande de brevet japonaise n2 9116/1968). 69 17688 4 2010156 Procédé B : On opère de la^m&mè façon que dans le procédé A, si ce n'est que la quantité de glucose est de 4,0$ et que l'on ajuste le pH à 7,0—8,5 avec de l'eau'ammoniacale ( se référer à la demande japonaise de brevet n* 5 9116/1968) Procédé C : On effectue une culture aérée comportant une agitation pendant 36 heures à 30&C dans un milieu de culture contenant 4,0$ de glucose, 2,0$ d'extrait de viande, 2,0$ de peptone, 0,5$ d'extrait de levure et 0,5$ de 10 chlorure de sodiumo On ajuste le pH du milieu à 7,0- 8,5 avec de l'hydroxyde de sodium (procédé de la présente invention)0 Comme on peut le constater dans le tableau 1, l'activité pour 1 ml de liquide de culture selon le procédé de 15 l'invention est 3 à 4 fois plus élevée que celle obtenue dans les procédés précédents» De plus l'activité spécifique du liquide de culture est 1,5 fois plus forte» Les relations existant entre la quantité d'azote présente sous la forme ammoniacale dans le aeilieu de culture et 20 l'activité anti-tumeur de la L-asparaginase ainsi que son activité spécifique sont indiquées dans le tableau 2» TABLEAU 2 Azote sous la forme ammoniacale 0 0,1 mg/ml 0,5 mg/ml 5,0 mg/ml 10,0 mg/ml Activité de la L-asparaginase 194 unités/ml 193 unités/ml 132 unitég&L 54 imtés/mL !1 «rit es/ml Activité spécifique du liquide enzyma— tique brut 27 unités/mg 26,5 unités/mg 19,5 unité s/ng 9,8 unité sj6g 0,8 unrbés/mg Les préparations L-asparaginasé ainsi obtenues, présentent de ce fait une activité anti—tumeur capable de guérir 35 complètement une leucémie expérimentale chez la soiiris de façon similaire à la demande de brevet précitée© Un milieu de culture synthétique aussi bien qu'un milieu de culture naturel est approprié pour effectuer la 69 17688 5 2010156 culture des souches utilisées dans la présente invention, dans la mesure où ce milieu contient les éléments nutritifs essentiels s. la croissance de cette souches Ces éléments nutritifs sont bien connus des spécialistes et ils comportent des substances telles qu'une 5 source de carbone, une source d'azote, des composés minéraux et des composés analogues qui sont utilisés en des quantités appropriés par le microorganisme utilisé» On peut ainsi mentionner comme source de carbone, par exemple des hydrates de carbone comme le glucose, le fructose, le maltose, le saccharose, l'amidon9 10 l'hydrolysat d'amidon, les mélasses etc<>. On effectue la fermentation ou la culture des micro-organismes dans des conditions aérobies telles qu'un secouage aérobie de la culture ou une culture submergée soumise à une aération 35 et à une agitation, cela à une température par exemple d'environ 20 à 40&C et à un pH par exemple d'environ 6,0 à 10,0o Après 1 à 3 jours'de culture dans ces conditions, on obtient l'accumulation de la L-asparaginase dans la liqueur de culture résultante. 69 17688 6 2010156 Lorsque la culture est terminée, on peut retirer la L-asparaginase par des procédés habituels tels qu'un traitement à l'aide d'une résine échangeuse d'ions, une extraction par des solvants, une précipitation, une absorption, un traitement par chro— 5 matographie ou un traitement analogue» Les exemples non limitatifs suivants sont indiqués à titre d'illustration de la présente invention et sauf mention contraire les pourcentages indiqués dans ces exemples, dans la description et les revendications, s'entendent en poids par litre 10 d'eau» Exemple 1 On cultive Serratia mercescens ATCC-60 dans un milieu de culture contenant 2$ de bouillon sec que l'on agite et aère pendant 7 heures à la température de 302Co On utilise le milieu de 15 culture résultant comme culture d'ensemencement,» On inocule cette culture d'ensemencement dans un fermentateur ayant une capacité de 5 litres et selon une proportion de 10$ en volume pour 3 litres d'un milieu de fermentation ayant la composition suivante s 4,0$ glucose 20 2,0$ peptone 2,0$ extrait de viande 0,5$ extrait dë levure 0,5$ chlorure de sodium* On effectue ensuite la culture à 302C pendant 36 heures 25 tout en agitant à la vitesse de 400 tours par minute et en aérant le tout avec un débit de 3 litres par minute<> On ajuste le pH du milieu à 7,0 - 8,5 avec de l'hydroxyde de calcium. On sépare les cellules résultantes à l'aide d'un séparateur par centrifugation. et l'on obtient 210 g de cellules humideso 30 On met en suspension les cellules ainsi obtenues dans une solution tampon dite "tris" contenant 0,01 M (pH 8,5) et on les soumet à un traitement dans un oscillateur sonique (10 Kc) pendant 10 minutes pour obtenir la destruction des cellules0 On obtient un extrait liquide brut ayant une activité de L-asparaginase 35 de 150 unités/ml et une activité spécifique de 25,0 unités pour 1 mg de protéine. On soumet cet extrait liquide à un traitement d'élimination de l'acide nucléique effectué avec des ions Mn**, on élimine les protéines comportant des impuretés par chauffagé, par 69 17688 7 2010156 précipitation, fractionnée avec du sulfate d'ammonium, par chroma— tographie avec de la diéthylaminoéthyl cellulose, par des biogels ainsi que par des procédés analogues, la protéine enzymatique étant purifiée au cours de ces traitements pour donner une L-asparagina-5 se ayant une activité spécifique de 1o500 unités pour 1 mg de protéine avec un rendement d'environ 20$o Cette préparation présente une activité anti-tumeur capable de guérir complètement une leucémie expérimentale avec des doses de plusieurs dizaines deyug« Exemple 2 10 On cultive Serratia marcescens ÀTCC 19180 de la m$me façon que celle décrite dans l'exemple 1 pour préparer une culture; d'ensemencement» On inocule cette culture d'ensemencement dans un fermentateur ayant une capacité de 5 litres et dans la proportion de 10$ en volume pour 3 litres clun milieu de fermentation 15 ayant la composition suivante $ 8 $ glycérol 3 $ peptone 0,25$ sulfate de potassium 0,05$ phosphate de potassium 0,05$ phosphate dipotassique 0,05$ sulfate de magnésium 10 mg/L sulfate ferreux 10 mg/L sulfate de manganèse 10 mg/L sulfate de cadmium iJ ^5 a o sulfate de cuivre 10 mg/L sulfate de zinc<> On effectue la culture pendant 60 heures k 302C dans des conditions aérobies avec une agitation de 400 tours par minute et une aération avec un débit de 3 litres par minute» On 30 ajuste le pH du milieu à 7,0-8,5 avec une solution d'hydroxyde de sodium à 40$, On sépare les cellules ainsi obtenues par un séparateur centrifuge pour obtenir 360 g de cellules humides,, On soumet ces cellules aux mêmes traitements que ceux décrits dans l'exemple 1 pour purifier les enzymes, et on obtient ainsi une 35 préparation ayant une activité spécifique de 2o000 unités pour 1 mg de protéine avec un rendement d'environ 20$o Cette préparation enzymatique présente comme dans l'exemple 1 une activité efficace contre la leucémie chez la souris<> 69 17688 8 2010156 Exemple 3 On cultive Serratia marcescens KY 4104 ATCC de la mtme façon que celle décrite dans l'exemple 1 dans le but de préparer une culture d*ensemencementa On inocule cette culture d 'ense— 5 mencement dans un baà de fermentation ayant une capacité de 2o000 litres et dans la proportion de 10$ en volume dans 1«000 litres d'un milieu de fermentation ayant la même composition que celle décrite dans l'exemple 20 On effectue ensuite la culture k 302C pendant 60 heures avec une agitation aérobie de la culture à 10 la vitesse de 100 tours par minute et avec une aération à un débit de 400 litres par minuteo On ajuste le pH du milieu à 7,0—8,5 avec une solution d'hydroxyde de potassium à 40$ pendant la durée de la culture» On sépare les cellules ainsi obtenues par un séparateur centrifuge et l'on obtient 130 kg de cellules humides» 15 On traite les cellules «fafcmues de la même façon que celle décrite dans l'exemple 1 et l'on obtient un liquide enzymatique brut ayant une activité en L-asparaginase de 198 unités/ml avec une activité spécifique de 27,6 unités pour 1 mg de protéineo On continue la purification du liquide brut de la même 20 façon que celle décrite dans l'exemple 1 et l'on obtient une préparation de L-asparaginase ayant une activité spécifique de 2a000 unités pour 1 mg de protéine avec un rendement d'environ 25$« Cette préparation enzymatique est efficace contre la leucémie de la souris de la même façon que celle indiquée dans l'exemple 1« 25 11 est bien entendu que la présentç'invention peut comporter de nombreuses variantes et modifications sans qu'on sorte de son cadre» 69 17688 9 2010156 REVENDICATIONS 1• Procédé de préparation de la l-asparaginase ayant "une activité anti—tumeur comportant la culture d'un microorganisme produisant de la l-asparaginase et appartenant au genre Serratia, 5 dans des conditions aérobies dans un milieu nutritif aqueux et selon lequel on récupère la l-asparaginase précitée à partir de la liqueur de culture résultante, caractérisé par le fait qu'on maintient la quantité d'azote contenue dans le milieu sous la forme d'azote ammoniacal à la concentration de 10 mg/ml ou à une concen-10 tration inférieure» 2. Procédé selon la revendication 1f dans lequel on utilise comme microorganisme Serratia marcescens. 3. Procédé selon la revendication 1 dans lequel on utilise un milieu nutritif contenant de 1 à Î5en poids de source 15 de carbone. .... on maintient 4. Procédé selon la revendication 1 dans lequel7la quantité d'azote ammoniacal contenue dans le milieu à 5 mg/ml ou à ute quantité inférieure. 5. Procédé selon la revendication 1, dans lequel 20 on ajuste le pH du milieu nutritif à 7,0 à 8,5 avec une solution d'un hydroxyde alcalin. 6. Procédé de préparation de l-asparaginase ayant une activité anti-tumeur comportant la culture d'un microorganisme produisant de la l-asparaginase appartenant à la catégorie Serratia 25 marcescens, dans des conditions aérobies et dans un milieu nutritif aqueux contenant au moins une source de carToone et une Bource d'azote, caractérisé par le fait que l'on maintient la quantité d'azote ammoniacal dans le milieu à la concentration de 10 mg/ml ou à une concentration inférieure, et qu'on récupère une prépara-30 tion de l-asparaginase à partir du liquide de culture résultant0 7. Procédé selon la revendication 6, dans lequel on effectue la culture à une température d'environ 20 à 40°C et à un pH d'environ 6,0 à 10,0. 8. Procédé selon la revendication 7, dans lequel 35 on utilise comme microorganisme Serratia marcescens AICC 60o 9. Procédé selon la revendication 7 » dans lequel on utilise comme microorganisme Serratia marcescens ATCC 19180« 10. Procédé selon la revendication 7* dans lequel on utilise comme microorganisme Serratia marcescens Kï 4104 ATCC. 40 11. Procédé selon la revendication 7 , dans lequel 69 17688 1Q 2010156 on utilise un milieu nutritif contenant de 1 à 15$ en poids de source de carbone,, 12. Procédé selon la revendication 7, dans lequel on maintient la quantité d'azote ammoniacal contenue dans le mi-5 lieu de culture à 5 mg/ml ou à une quantité inférieure» 13» Procédé selon la revendication 6 dans lequel on ajuste le pH du milieu nutritif à 7,0 à 8,5 à l'aide d'urie solution d'un hydroxyde alcalin» 14. Procédé de préparation d'une l-asparaginase 10 ayant une activité anti-tumeur caractérisé par le fait qu'on cultive un microorganisme choisi dans le groupe formé par Serratia marcescens ATCC 60; Serratia marcescens ÂTCC 19180 et Serratia marcescens ET 4104 ATCC, dans des conditions aérobies et dans Tin milieu nutritif aqueux contenant au moins de 1 à 15% en poids 15 d'une source de carbone et d'une source d'azote, la quantité d'azote ammoniacal contenue dans le milieu étant maintenue à 5mg/ml ou à une quantité inférieure et qu'on récupère une préparation de l-asparaginase à partir du liquide de culture résultant# 15. Une préparation de l-asparaginase purifiée 20 ayant une activité spécifique d'au moins 1.500 unités pour 1 mg de protéine»