FR 2009331 A1 19700130 FR 6916880 A 19690523 69 16880 1 2009331 La présente invention concerne la production de D-arabitol par fermentation et elle a plus particulièrement pour objet un procédé de préparation de D-arabitol par culture aérobie d'un micro-organisme qui est Pichia ohmeri 230 5 (numéro de dépôt ATCC, c'est-à-dire American Type Culture Collection, 20.209) dans un milieu nutritif contenant des saccharides fermentables. le D-arabitol ainsi obtenu est une matière première importante pour la préparation du D-xylose en passant par le 10 stade intermédiaire de D-xylulose. Il existe une littérature abondante concernant la production de divers poly-alcools à partir de saccharides, par exemple de D-glucose au moyen de levures. Ainsi par exemple on prépare par voie biologique le D-arabitol en cultivant Pichia 15 miso qui est un micro-organisme appartenant à l'espèce Pichia, dans un milieu nutritif contenant du D-glucose (voir notamment brevet japonais N° 354-5/62). Un tel procédé présente cependant un inconvénient qui est une production médiocre de D-arabitol car il se produit une 20 formation simultanée de quantités très importantes dé .poly-alcools autres que le D-arabitol, par exemple de glycérol, d'érythritol et similaires. Des traitements fastidieux sont nécessaires pour isoler et ensuite purifier le D-arabitol recherché, en le débarrassant des autres produits présents qui 25 possèdent des propriétés analogues. On a démontré qu'un certain nombre de levures appartenant aux familles de Debaryomyces, Hansenula et Saccharomyces sont efficaces pour la préparation du D-arabitol à partir de saccharides. ces procédés présentent également un inconvénient 30 qui est du même ordre que lorsqu'on utilise Pichia miso. On a trouvé qu'on obtient du D-arabitol avec un rendement élevé et pratiquement sans formation d'autres poly-alcools quand on cultive par voie aérobie une souche d'un micro-organisme Pichia ohmeri. par exemple P. ohmeri 230 (dépôt N° 158 35 cLe Fermentation Eesearch Institute, Agency of Industrial Science and Technology au Japon et dépôt 20.209 ATCC), dans un milieu nutritif contenant des saccharides fermentables usuels comme le glucose, le saccharose, le msuonose, le fructose, etc. Les études taxologiques de ce micro-organisme particu-40 lier isolé du sol dans la région de Toshima près de Ibjcjro ont 69 16880 2009331 été effectuées seloa ïe procédé décrit par J» Lodder et ses collaborateurs dans l'ouvrage intitulé "The Yeasts a Taxono-mic StudyM publié par Interscience Publishers, New York, 1952. Le micro-organisme ainsi obtenu possède les propriétés 5 bactériologiques suivantes s (a) Milieu liquide ïîl : Après trois jours à 25°0, les cellules sont ovales, ovales allongées ou cylindriques dont les dimensions approximatives sont 1,5 à 5 microns z 1,5 à 12 microns. Il se forme des sédi-10 ments et des pellicules. (b) Agar-agar YM : Après deux semaines, la culture sur gélose inclinée apparaît d'une couleur jaune grisâtre. Au premier stade de développement, sa surface est lisse mais devient ultérieurement rugueuse. 15 La circonférence est ciliaire. (c) Pseudomycelium s La culture sur un milieu de dextrose de pommes de terre par le procédé sur agar-agar Balmau donne des pseudomycelia. (d) Spores x 20 Aucune formation de spores sur le milieu classique de formation de spores quand on inocule le micro-organisme seul. (Etant donné que Pichia ohmeri est l'une des espèces hétérothalliques, ce produit,à moins d'un croisement avec d'autres espèces, ne forme pas d'ascospores). 25 (e) Fermentation des saccharides : 1. glucose : positive 2. galactose s positive (lente) 3* saccharose : positive 4» malt ose % négative 30 5* lactose : négative 6. raffinose s positive (f) Assimilation de sources de carbone s Le glucose, 1© galactose, le saccharose, le maltose, lé sorbose, le cellobiosa, le tréhalose, le raffinose, l'éthanol, le glycé- 35 roi, 1'adonitol, 1© mannitol, le sorbitol, 1 ' a-méthyl-glucoside . _ , . . le lactose, le,mélibiose . et la salycxne sont assimiles alors que/îe ïaelecitose, le xylose, l'arabinose, l'érythritol, le dulcitol, 1'acide gluconique, 1'inositol et l'amidon ne sont pas assimilés. (g) Nitrates s non assimilés 69 16880 3 2009331 (h) Exigence® en vitamines i la biotine est nécessaire. (1) Activité uréasique ï pas d'activité dans le milieu de Christensen . (j) Pas de liquéfaction de gélatine. 5 (k) Source d'isolement : sol prélevé dans la région de Toshima près de ïokyo. En raison des caractéristiques précitées de comportement bactériologique, on identifie la souche du micro-organis-- me comme étant une espèce de Pichia ohmeri et on lui a donné 10 le nom de Pichia ohmeri 230. La mise en oeuvre du procédé selon l'invention est basée sur l'utilisation avantageuse du micro-organisme spécifié ci-dessus, Pichia ohmeri N° 230. Selon le présent procédé, on obtient du D-arabitol en un rendement élevé par 15 culture aérobie du micro-organisme précité dans un milieu nutritif qui contient, à titre de source essentielle de carbone, un saccharide fermentable ce qui provoque une accumulation de D-arabitol, après quoi on récupère ce dernier produit par une technique usuelle. 20 En ce qui concerne les sources de carbone incorporées dans le milieu nutritif pour effectuer la fermentation selon l'isrention, on mentionnera tous les saccharides pour autant qu'ils soient assimilables par le Pichia ohmeri. On a trouvé que le glucose, le saccharose, le mannose, le maltose, le 25 fructose et des produits analogues sont spécialement avantageux. On peut également utiliser des milieux nutritifs naturels et artificiels qu' on prépare en mélangeant une source de carbone sélectionnée avec une source d'azote organique ou 50 minérale, par exemple le chlorure, le sulfate, le nitrate ou l'acétate d'ammonium, l'urée et des produits équivalents, en présence d'une petite quantité d'éléments nutritifs tels que léser liqueur de macération du mais, un extrait de levure,un acide casaminé , la peptone et des vitamines, ainsi que des substances 35 minérales comme K^PO^, BgSG^.THgO et similaires. Bien qu'un réglage du pH dans le milieu nutritif ne soit pas nécessaire pendant la culture, il est souhaitable de maintenir le pH entre environ 4 et 7 pour améliorer ainsi la production du D-arabitol. On règle avantageusement le pH, en 40 ajoutant par exemple du carbonate de calcium. ,a 4 69 16880 2009331 Quand on effectue la fermentation selon l'invention avec un milieu nutritif qui contient un saccharide en une concentration d'environ 10% en poids, on obtient alors du D-arabitol avec un rendement d'environ 40% par rapport au 5 poids votai du saccharide» Par ailleurs s loi? s au! on effectue la fermentation, avec un milieu nutritif qui contient un sac char ide en une concentration plus faible, par exemple de 3 à 5% en poids, et que le manque de saccharide est compensé par des introductions périodi-10 ques du saccharide de manière à maintenir sa concentration dans le milieu nutritif entre environ 3 et 5% pendant toute la durée du procédé, on obtient un rendement accru de D-arabitol, par exemple un rendement de 50% (8 à 9 g/dl) par rapport au poids total du saccharide. 15 En outre, on obtient une multiplication accélérée des cellules et un rendement accru de D-arabitol si l'on maintient le coefficient d'absorption d'oxygène (Kd) dans le milieu de culture aérobie dans l'intervalle de 7»7 x 10""^ à 4,15 x 10~^, qu'on mesure par le procédé d'oxydation de sulfite. Si l'on 20 utilise une valeur Kd inférieure à 4 x 10~®, la consommation de saccharide diminue et on sent une forte odeur d'ester, mais le rendement de D-arabitol diminue très fortement. Une fois la fermentation terminée, on isole le D-arabitol de la liqueur de culture par les techniques usuelles j 25 une telle technique consiste à enlever les cellules développées, à traiter la liqueur restante avec du carbone actif, à concentrer la liqueur et à recristalliser le résidu dans de l'éthanol chaud ou un produit analogue. Il est intéressant de faire remarquer que l'on peut 30 facilement effectuer l'isolement du D-arabitol de la liqueur de fermentation selon l'invention car cette liqueur contient le D- arabitol recherché en une concentration élevée, en l'absence \ « d'autres poly-alcools ayant des propriétés analogues. Les exemples suivants, dans lesquels tous les pourcen-35 tages sont en poids, servent à illustrer l'invention sans aucunement en limiter la portée s Exemple 1 Dans un ballon d'une capacité de 500 ml, on verse 50 ml d'un milieu nutritif contenant 10% de glucose, 0,4% d'extrait de 40 levure, 0,3% de KS^PO^ et 0,1% de MgSO^.7^2°t ayant un pH de 6,6. BÀD ORIGINAL 69 16880 5 2009331 On. stérilise le ballon à 120°C pendant 10 minutes. A ce milieu on ajoute 1,5% de CaCOj préalablement stérilisé et ensuite 4 ml d'un bouillon de Pichia ohmeri N° 230 déjà développé, qu'on prépare en cultivant séparément ce micro-5 organisme dans une autre fraction du même milieu nutritif pendant deux jours. On secoue ce ballon à 30°C pendant 4 jours sur un appareil de secouage ayant une course de 7 cm, à 125 cycles par minute. A la fin de ce laps de temps, on obtient une liqueur culti-10 vée qui contient 4,3 g/dl de D-arabitol ce qui correspond à un rendement/ff% par rapport au poids total du glucose de départ. Une analyse chromatographique confirme que la liqueur cultivée est pratiquement exempte de poly-alcools autres que le D-arabitol et le résidu de glucose. 15 Exemple 2 Sans un appareil de fermentation en bocal d'une capacité de 30 litres, on charge 18,5 litres d'un milieu nutritif contenant 2% de glucose, 0,1% d'extrait de levure, 0,2% d'urée, 0,1% de KHgPO^ et 0,1% de MgSO^THgO, puis on stérilise à 120°0 20 pendant 15 minutes. On Introduit dans l'appareil 100 g de OaCO^ qui a été précédemment stérilisé par la chaleur. On inocule le contenu de l'appareil de fermentation avec un litre d'un bouillon de Pichia ohmeri H° 230 déjà développé, qu'on prépare séparément en cultivant la souche pendant 25 24 heures à 30°0 dans un milieu nutritif renfermant 4% de glucose, 0,1% de EHgBO^. et 0,1% de lâgSO^.THgO. On cultive le tout à 30°G avec une aération de 20 litres g par minute et une agitation de 200 tours/minute[Kd=(8-5)x10 ]. On introduit continuellement une certaine quantité de solution 30 aqueuse à 70% de glucose pour maintenir la concentration du glucose dans le milieu nutritif entre 4 et 5% pendant toute la durée de la culture. On interrompt l'introduction du glucose au bout de 95 heures et on poursuit la culture jusqu'à une durée totale de 120 heures. 35 La consommation totale du glucose pendant:la période indiquée de fermentation est de 17 g par décilitre de liqueur. La liqueur résultante contient 8,6 g/dl de D-arabitol ce qui correspond à un rendement de 50% par rapport à la quantité totale du glucose utilisé. 69 16880 6 2009331 On soumet un litre de la liqueur cultivée à la centri-fugation pour provoquer une sédimentation des cellules, que l'on sépare ensuite par filtration. A ce filtrat, on ajoute une certaine quantité de Ca(0H)2 et on chauffe. On traite le tout avec une petite quantité de carbone actif. Après avoir éliminé les substances solides par filtration, on concentre le filtrat sous pression réduite à 60°C pour lui donner la consistance d'un sirop. Après une période de repos de 16 heures, le sirop se transforme en une masse cristallisée que l'on récupère et qu'on recristallise dans de l'éthanol chaud à 99%. On obtient 70 g de D-arabitol sous forme de cristaux prismatiques. Le produit est insoluble dans l'éthanol froid et ne réduit pas une solution de Fehling. On ne constate aucune baisse du point de fusion quand on mélange ce produit avec un échantillon authentique. Le spectre d'absorption dans 1'infra-rouge est conforme à celui de l'échantillon authentique. 69 T6880 7 2009331 REVETOICAHOHS 1/ Un procédé de production de D-arabitol, caractérisé en ce qu'il consiste à inoculer un micro-organisme de Pichia ohmeri capable de former de façon prédominance du D-arabitol 5 dans un milieu nutritif contenant un saccharide fermentable comme source de carbone essentielle, à cultiver ce micro-organisme dans le milieu nutritif par voie aérobie et à récupérer le D-arabitol accumulé de la liqueur cultivée. 2/ Un procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce 10 que le micro-organisme est le Pichia ohmeri N° 230 (numéro de dépôt ATCC, c'est-à-dire American Type Culture Collection, 20.209).