FR 2009493 A1 19700206 FR 6917294 A 19690528 69 17294 1 2009493 la présente invention est relative à de nouveaux vaccins et à leurs procédés de préparation. Les vaccins qui sont actuellement couramment utilisés entraînent la formation dans l'organisme récepteur d'anticorps aggluti-5 nants qui ne peuvent, par la suiter être distingués des antioorps produits par la réaction normale contre la maladie dtun organisme non vacciné. Il en résulte que, lorsque dans'un "but de contrôle, par exemple, on procède à la recherche des anticorps spécifiques d'une 10 maladie, il n'est pratiquement pas possible de savoir si on a affaire à un organisme malade ou à un organisme vacciné. Une telle confusion entraîne des inconvénients particulièrement graves,' en particulier dans le cas de la médecine vétérinaire et de maladies à évolution lente où les symptômes visibles ne 15 permettent pas de distinguer clairement un organisme malade d'un organisme vacciné. Cet inconvénient est par exemple particulièrement marqué dans le cas de la brucellose. Pour pallier cet inconvénient, on a déjà proposé d'utiliser des vaccins dits non-agglutinogènes qui ne donnent, en principe, 20 pas lieu à une formation d'anticorps agglutinants décelables dans l'organisme vacciné. Un procédé connu pour produire de tels vaccins dits non-agglutinogènes consiste à préparer ces vaccins à partir d'une souche microbienne cultivée en phase rugueuse» Les vaccins non-agglutinogènes connus ne donnent pas entiè-25 rement satisfaction car, malgré les contrôles de fabrication dont ils font l'objet, ils donnent lieu, dans certains cas, à la formation d'une quantité d'anticorps agglutinants qui ne peut être négligée et qui peut faire considérer comme malades des organismes qui ont été simplement vaccinés. 30 Le proeédé selon l'invention permet d'obtenir, d'une manière simple, des vaccins non-agglutinogènes qui ne donnent pas lieu à la formation dans l'organisme récepteur d'anticorps agglutinants ou qui ne donnent lieu qu'à la formation d'une quantité d'anticorps agglutinants qui est suffisamment faible pour éviter toute 35 confusion entre un organisme vacciné et un organisme malade. Grâce à l'invention, il est donc possible de modifier d'une manière simple un vaccin pour lui faire perdre son caractère ag-glutinogène, c'est-à-dire pour faire en sorte que l'organisme vacciné contienne des anticorps agglutinants en quantités suffi-40 samment faibles pour ne pouvoir être confondues avec les quantités 69 17294 2 2009493 d'anticorps agglutinants provoqués par la réaction de l'organisme vis-à-vis de la maladie. • Les vaccins selon l'invention présentent également l'avantage de posséder un pouvoir, vaccinant généralement supérieur à celui 5 des vaccins connus antérieurement.. .. La présente invention a pour objet.un. nouveau vaccin ne donnant pas lieu à la formation d'anticorps agglutinants dans l'organisme récepteur, ce vaccin étant essentiellement caractérisé par le fait qu'il résulte de la combinaison d'antigènes correspondant 10 à la maladie vis-à-vis de laquelle on désire conférer l'immunité et de sérum immun correspondant à la même maladie, la.quantité de sérum immun étant choisie comme celle nécessaire et suffisante pour sàturer la totalité des sites agglutinogènes des .antigènes• Il convient de souligner que les vaccins selon la présente 15 invention se distinguent des séroanavaccins de type connu, par le fait que les séroanavaccins ont pour objet de fournir en une seule fois à l'organisme récepteur les anticorps spécifiques lui permettant de lutter contre la maladie dont il est atteint et les antigènes lui permettant de, fabriquer lui-même ses propres anticorps, 20 tandis que selon la présente invention les proportions d'antigènes et de sérum, immun sont déterminées de manière précise pour permettre l'obtention d'un vaccin non-agglutinogène» Par ailleurs, les séroanavaccins de type connu sont obtenus en général par inactivatipn au formol d'un micro-organisme et ad-25 dition de sérum, tandis que les vaccins selon la présente inven-tion peuvent être constitués à base d'antigènes inactifs de toute nature• Conformément à l'invention il est préférable d'associer à l'antigène utilisé un sérum immun hétérologue, c'est-à-dire Tin 30 sérum provenant d'une espèce animale différente de celle, à laquell le vaccin est destiné. Dans certains cas cependant, un sérum immun homologue peut également être utilisé en association avec l'antigène. . • L'invention n".est pas limitée à un vaccin immunisant l'orga-35 nisme contre une maladie déterminée et elle peut être appliquée avantageusement à tous les; vaccins agglutinogènes. C'est ainsi que l'invention peut être utilisée pour réaliser des vaccins de types très divers tels que ceux contre la brucellose, les colibacilles, les salmonelloses, les staphylocoques, les streptocoques, 40 la tuberculose, la coqueluche, le choléra, la peste, la maladie 69 17294 3 2009493 de New-Castle, la grippe, etc... Ces vaccins peuvent être aussi bien à usage humain que vétérinaire. l'antigène utilisé selon l'invention peut être constitué à 5 base d'éléments ou d'extraits microbiens. Il peut, par exemple, être constitué par des bactéries entières inactivées par un moyen tel que le formol, la chaleur ou le merthiolate ou encore des bactéries entières vivantes appartenant à une souche atténuée ou avirulente. 10 L'antigène peut être aussi constitué par des bactéries agglu- tinogènes lysées, par exemple par action enzymatique, par ultrasons ou par voie chimique à l 'aide" de produits tels , que les bases ou les acides. L'antigène peut également être constitué par des parois de 15 bactéries ou par un antigène agglutinogène obtenu par extraction. 'La présente invention a également pour, objet un procédé pour • la préparation de vaccins non-agglutinogènes, ce procédé étant essentiellement caractérisé par le fait que l'on fait réagir sur "une certaine quantité d'antigènes agglutinogènes correspondant à 20 la maladie dont on désire assurer l'immunité, la quantité de sérum immun correspondant qui est nécessaire et suffisante pour saturer les sites agglutinogènes de l'antigène. " • ' Pour déterminer la quantité de sérum qui est nécessaire et suffisante, on peut opérer comme suit: 25 Dans une âérie de tubes à essai (série n° '1) ,on verse des quantités fixes d'antigène agglutinogène et des quantités variables de sérum immun agglutinant. On laisse les tubes, .du mélange antigène-sérùm à 37°C. On procède ensuite, dans chaque tube à essai, â la récolte du sérum qui peut s'effectuer par centrifugation, 30 lorsque l'antigène est particulaire ou par filtration et extraction sur colonne à chromatographie," lorsque l'antigène est soluble. Les sérums ainsi récoltés, à-partir de la série de.tubes (série n° 1), sont versés dans une nouvelle série de tubes à essai (série n° 2) et mis en présence de nouvelles quantités fixes 35 d'antigène agglutinogène. On laisse les tubes du nouveau mélange antigène-sérum 24 heures à 37°0. Les tubes de la série 2, dans lesquels se produit une nouvelle agglutination, sont ceux dans lesquels le sérum utilisé contenait encore des' anticorps agglutinants en excès. La plus petite quantité de sérum qui permet d'ag-40 glutiner à nouveau les antigènes de la série des tubes n°2 cor 69 17294 4 2009493 respond à la quantité nécessaire et suffisante- de sérum agglutinant à employer pour saturer la quasi-totalité des antigènes agglutinants utilisés dans la série n° 1. CM voit que cette méthode permet de_ déterminer facilement in 5 vitro les proportions d'antigènes et de sérum immun qui doivent être utilisées pour préparer les vaccins selon l'invention. Pour préparer le vaccin il suffit alors de procéder à la mise en présence de ces quantités correspondantes d'antigènes et de sérum immun de préférence sous agitation. 10 Selon une variante il est également possible de mettre les antigènes en présence d'un excès de sérum imiriun puis, par exemple par filtration, de séparer le sérum qui peut alors être utilisé à d'autres effets. A titre d'exemple, on a pu déterminer que.dans le cas d'un 15 vaccin contre la brucellose on obtient un vaccin parfaitement non-agglutinogène .ne donnant lieu à la formation d'aucun anticorps agglutinant avec line proportion, de 5 à. 10 milliards de bactéries par ml de sérum titrant 8.000 unités internationales» Dans le but de mieux faire comprendre l'invention, on va en 20 décrire maintenant.à titre d'illustration et sans aucun caractère limitatif un mode de réalisation donné dans les exemples ci-après: EXEMPLE 1. PREPARATION D'UN VACCIN ANTIBRÏÏCELLIQPE NON AGGLUTINOGENE. 1°) Préparation des constituants. 25 A - Les bactéries du genre Brucella On utilise, soit une souche de Brucella comme par exemple Brucella abortiis. souche Buck 19, soit une souche de Brucella isolée sur un animal brucellique. La souche de Brucella choisie est ensemencée sur des milieux de cul tiare, soit liquides (bouil-30 lon-sérum, bouillon tryptose-glycériné), soit solides (gélose-sérum, gélose tryptose glycérinée). On ensemence, selon la technique bactériologique habituelle la souche de' Brucella sur vingt milieux de culture type " gélose-sérum inclinée" en boîtes de Roux de 1 litre stériles. Les boîtes 35 ensemencées sont placées à l'étuve à la température de +37°C pendant quatre jours. On receuille les colonies bactériennes obtenues en versant dix ml d'eau physiologique isotonique stérile dans chaque boîte et en mettant les bactéries en suspension dans l'eau. La totalité des diverses suspensions bactériennes est collec-40 tée dans un flacon stérile et on procède à une numération bacté- 69 17294 5 2009493 Tienne selon la méthode courante des dilutions et ensemencement sur gélose. . Par l'emploi de dilutions adéquates, on prépare-une- suspension bactérienne contenant environ cent milliards de bactéries 5 par ml de suspension. On prélève cinq ml de la suspension .bactérienne ainsi titrée dans un pot à centrifuger. On centrifuge ce prélèvement à grande vitesse pendant trente minutes. On obtient deux phases dans lë pot à centrifuger: - une phase liquide7 qui surnage, appelée A. 10 Elle est recueillie dans un flacon conservé à +4°C et con trôlée en vue d'établir l'absence totale de corps microbiens. - une phase pâteuse qui sédimëhte, appelée B, Elle est composée des corps bactériens. La phase B est prélevée et remise en suspension dans dix ml 15 d'une solution de formaldéhyde diluée' à cinq pour mille. La-suspension bactérienne formolée est placée, en tube à essai, dans un bain-marie, à la température de +58°C pendant trente minutes, puis elle est centrifugée pendant trente minutes' à grande vitesse. On. obtient deux phases dans le tube centrifugé: 20 - une phase liquide surnageante, qui est rejetée, - une phase pâteuse bactérienne, qui sédimente,. appelée B^. La phase B^ est constituée de Brucella inactivée par l'a chaleur et le formol. La phase bactérienne B^ est alors recueillie dans un tube à 25 essai et elle est remise en suspension dans la totalité de la phase A. Cette dernière suspension bactérienne (A + B^) est appelée suspension C et elle renferme -approximativement cinq cent milliards de Brucella inactivées, sous un volume de cinq ml environ. La suspension bactérienne C constitue le premier élément de 30 la présente substance. B - Le sérum antibrucellique. Un sérum antibrucellique, riche en anticorps, est obtenu par hyperimmunisation d'un animal homéotherme adulte à l'aide d'un vaccin antibrucellique agglutinogène. 35 On injecte, par exemple, par voie sous-cutanée,- à un mouton âgé de deux ans et indemne de toute affection, une suspension de souche Brucella abdrtus/Bucfe 19 comportant 20 milliards de bacteries vivantes.^" On procède à vme même injection huit jours et quinze jours après la première vaccination. Dix jours après la dernière injec-40" tien vaccinale, on saigne l'animal à jeun par ponction de la veine 69 17294 6 2009493 jugulaire. On prélève stérilement deux cents ml de sang dans un flacon. On laisse coaguler le sang, ôt on,recueille le sérum dans un nouveau flacon. Le sérum est inactivé- par un chauffage au bain-marie à +56°C pendant trente minutés. On contrôle.la stérilité du 5 sérum et on procède* au titrage des anticorps agglutinants.du sérum par la méthode de séro-agglutination lente de Wright en tube. Un sérum agglutinant titrant .8.000 unités internationales agglutinantes par ml-constitue le deuxième, élément- du. vaccin# 2°) Phase de.- synthèse'. - 1.0 La préparation finale est réalisée de la manière suivante:'- On verse dans un flacon stérile: - ,cinq ml de la suspension 0, - cent ml de sérum antibrucellique agglutinant titrant 8.000 unités internationales agglutinantes. 15 Les proportions de vaccin et de sérum rapportées ci-dessus sont celles qui ont été déterminées conformément à la méthode qui a été décrite ci-dessus. Le mélange est placé au bain-marie à la température de +37 °C pendant soixante minutes, puis à l'étuve à 37°0 pendant 24 heures s 20 sous agitation intermittente et modérée, puis à 4°0 pendant 24 heures. On obtient ainsi la substance finale sous un volume de cent cinq ml, renfermant cinq cent milliards de Brucella inactivées. On procède au contrôle de stérilité du produit final. Le vaccin préparé comme il vient d'être indiqué est ensuite 25 soumis aux contrôles habituels concernant l'innocuité et l'efficacité. Il est de plus soumis à un contrôle spécial en vue de déterminer son caractère non agglutinogène. Pour cela le vaccin est injecté à des animaux dans le sérum desquels on recherche la pré-30 sence d1agglutinine, par exemple 15 jours, 30 jours et 45 jours après l'injection de sérum. EXEMPLE 2. PREPARATION D'UN VACCIN NON AGGLUTINOGENE CONTEE LA MALADIE DE NEW CASTLE. 35 La culture du virus de New-Castle s'effectue sur oeuf de pou let embryonné de 10 jours. On injecte le virus par voie chorio-allantoïdienne. On laisse incuber pendant 30 heures à l'étuve à une température de 38°5, puis l'on sort de l'étuve et l'on conserve les oeufs 40 ainsi incubés à une température 4°C pendant 12 heures. 69 17294 7 2009493 On prélève ensuite le liquide chorio-allantoïdien, puis on titre le virus par test d'hémagglutination. A l'aide du virus obtenu on réalise un vaccin et un sérum comme indiqué à l'exemple 1, puis, on détermine les quantités 5 correspondantes et on réalise le mélange comme également indiqué à 11 exemple 1. Il est bien entendu que les modes de mise en oeuvre qui ont été décrits ci-dessus ne sont donnés qu'à titre d'illustration et sans aucun caractère limitatif de la portée de l'invention, 10 et que ces modes de mise en oeuvre pourront recevoir toutes modifications désirables. 69 17294 8 2009493 REVENDICATIONS 1. Vaccin ne donnant pas lieu à la formation d'anticorps agglutinants dans l'organisme récepteur, caractérisé par le fait qu'il résulte de la combinaison d'une certaine quantité d'anti- 5 gènes agglutinogènes correspondant à la maladie dont on désire conférer l'immunité avec la quantité de sérum immun correspondant nécessaire et suffisante pour saturer la totalité des sites agglutinogènes de l'antigène. 2. Vaccin selon la revendication 1 caractérisé par le fait 10 qu'il immunise contre une maladie choisie dans le groupe que constituent: la brucellose, les colibacilloses, les salmonelloses, les maladies à staphylocoques ou à .streptocoques, la tuberculose, la coqueluche, le choléra, la peste, la maladie de New-Castle et la grippe. 15 5. Vaccin selon au moins une des revendications précédentes caractérisé par le fait que l'antigène utilisé est à base d'éléments ou d'extraits microbiens. 4. Vaccin selon au moins une des revendications 1 ou 2 caractérisé par le fait que l'antigène utilisé est constitué par des 20 bactéries entières inactivées par exemple au formol, à la chaleur ou au merthiolate ou encore des bactéries vivantes appartenant à une souche atténuée.. 5» Vaccin selon au moins une des revendications 1 ou 2 caractérisé par le fait que l'antigène utilisé est constitué par des 25 bactéries agglutinogènes lysées par action enzymatique, par .ultrasons ou par action chimique par exemple d'une base ou d'un acide. 6. Vaccin selon au moins une des revendications 1 ou 2 caractérisé par le fait que l'antigène utilisé est constitué par des parois de bactéries. 30 7» Vaccin selon au moins une des revendications 1 ou 2 carac térisé par le fait que l'antigène utilisé est un antigène agglutinogène obtenu par extraction. 8. Vaccin selon au moiïis une des revendications précédentes ca ractérisé par le fait que le sérum utilisé est un sérum hétérologue 35 9« Vaccin selon au moins une des revendications 1 à 7 carac térisé par le fait que le sérum utilisé est un sérum homologue. 10. Procédé de préparation d'un vaccin selon au moins une des revendications précédentes caractérisé par le fait que l'on met en présence une certaine quantité d'antigènes agglutinogènes 40 et la quantité de sérum immun correspondant qui est nécessaire 69 17294 9 2009493 et suffisante pour saturer la totalité des sites agglutinogènes de l'antigène, 11. Procédé de préparation d'un vaccin selon au moins une des- revendications 1 à 9 caractérisé par le fait que l'on met en présence de l'antigène agglutinogène un excès de sérum immun correspondant et qu'on élimine ensuite l'excès de sérum. 12. Vaccins et procédés de préparation tels que décrits dans les exemples 1 et 2.