FR 2003018 A1 19691107 FR 6905295 A 19690228 69 05295 1 2003018 La présente invention est relative à un procédé de culture de streptocoques hémolytiques et, plus particulièrement, à un procédé de culture pour obtenir des streptocoques hémolytiques ayant 'une grande aptitude à produire de la streptolysine S (abré-5 gée ci-dessous en SLS), ainsi qu'une activité anti-tumorale élevée. On sait depuis longtemps que les streptocoques hémolytiques les bactéries pathogènes de diverses infections telles que l'érysipèle, la gangrène, la fièvre puerpérale et d'autres, ont 10 line activité anti-tumorale et on a essayé récemment de traiter les tumeurs par les streptocoques hémolytiques. Mais, outre leur activité anti-tumorale, les streptocoques hémolytiques produisent des toxines hémolytiques et sont pathogènes, de sorte qu'ils ne peuvent pas être utilisés tels quels directement pour traiter 15 des tumeurs. On a essayé de nombreux procédés de traitement pour éliminer ces affections, le plus notable d'entre eux étant, par exemple, le procédé de traitement a la pénicilline décrit dans The Japanese Journal of Expérimental Medicine, vol. 36, pages 161-174 (1966). les cellules bactériennes destinées au traite-20 ment doivent être celles ayant une activité anti-tumorale, et on considère que plus l'activité anti-tumorale des cellules bactérienne est élevée, plus l'activité de ces cellules bactériennes est efficace pour le traitement des tumeurs. L'activité anti-tumorale des streptocoques hémolytiques est 25 étroitement apparentée avec l'aptitude à produire la SLS, l'une des toxines hémolytiques produites par les streptocoques hémolytiques, et il s'est révélé que, parmi les streptocoques hémolytiques naturels, seules les souches propres à produire la SLS ont une activité anti-tumorale et que l'activité anti-tumorale est 30 d'autant plus élevée que l'aptitude à produire la SLS est grande. Cette aptitude est utilisée comme indice de l'activité antitumorale des souches des streptocoques hémolytiques. Pour cultiver les streptocoques hémolytiques, en particulier pour la culture destinée au traitement des tumeurs, on emploie 35 habituellement un bouillon d'infusion de viande ou un milieu à base d'un extrait contenant des constituants hydrosolubles d' un autolysat de levure comme constituant principal. L'invention vise un procédé de culture qui permet de donner aux souches des streptocoques hémolytiques une activité anti-40 tumorale accrue. 69 05295 2 2003018 Suivant l'invention, on cultive les streptocoques hémolytiques ayant une activité anti-tumorale sur le milieu de culture additionné d'acide oxaloacétique ou de sels de celui-ci. les milieux de culture de base utilisés sont les milieux 5 de culture naturels ou semi-synthétiques. Gomme milieu de base, on utilise des milieux de bouillon d'infusion de viande et d'extraits de levure, le bouillon d'infusion de viande est décrit dans"Manual of Microbiological Methods" par la Society of American Bacteriologists, 1957, publié par McG-raw Hill Book Go. 10 On prépare les milieux d'extrait de levure en dissolvant, par exemple, des extraits de levures commerciales ou. des autoly-sats de levures dans de l'eau, en chauffant la solution après neutralisation et en la soumettant ensuite à une filtration pour enlever la fraction insoluble. On obtient des résultats intéres-15 sants par addition d'acide ribonucléique (abrégé ci-dessous en ARN) ou de noyau de ribonucléase (une fraction résistante à la RN-a-se de oancréas quand on applique cette dernière ribonucléase. à l'acide ribonucléique); (abrégé ci-dessous en MC). On peut utiliser l'acide oxaloacétique sous forme libre après neutralisa-20 tion, ou sous la forme de ses sels de métaux alcalins, tels que de sodium ou de potassium. La quantité optimale à ajouter dépend du milieu de culture et de la quantité de MB ou de HNC qu'il contient. C'est ainsi, par exemple, que, lorsqu'on utilise du bouillon d'infusion de viande, il est préférable d'ajouter 0,5 % 25 (en poids par volume) de ARN et 0,1 % (en poids par volume) d'acide oxaloacétique. Au lieu de ce dernier, on peut utiliser ses sels en une quantité représentant 0,1 f° compté en acide libre. Si on utilise un milieu d'extrait de levure, il n'est pas nécessaire d'ajouter 30 en plus du ARN ou du RNC, parce qu'une grande quantité de ARN est déjà présente 4ans le milieu d'extrait de levure, et une addition de seulement 0,2 % ou davantage (en poids) d'acide oxaloacétique ou de ses sels est suffisante. Il est préférable de maintenir la valeur du pH entre 7,0 et 7,5. 35 On effectue de préférence la culture par le procédé de cul ture stationnaire. La température utilisée est comprise.dans les gammes habituelles et, de préférence, est voisine de 37° C. Le temps de culture dépend du milieu utilisé et de la quantité, de bactéries inoculées, il est habituellement compris entre 14 et 40 20 heures o 69 05295 3 2003019 Les cellules bactériennes obtenues par la culture des streptocoques hémolytiques sur le milieu contenant de l'acide oxaloacétique ou ses sels, ont une aptitude plus élevée à produire de la SLS et une activité anti-tumorale plus élevée et elles conviens 5 nent pour la production d'agents contre les tumeurs, par exemple pour un traitement à la pénicilline précité ou un traitement thermique . Suivant l'invention, on peut utiliser comme streptocoques hémolytiques Streptococcus hemolyticus ATCC 21060 et ATCC 21059. 10 On utilise les streptocoques hémolytiques avec un groupe de streptocoques qui forment un anneau' d'hémolyse autour des colonies quand la culture s'effectue dans un milieu d'agar sanguin. Les exemples suivants illustrent l'invention. Dans ces exemples, les pourcentages d'additifs aux milieux de culture sont in-15 diqués en poids par volume. Exemple 1 On mélange 95,5 ml du bouillon d'infusion de viande (500 g de boeuf maigre broyé, 1000 ml d'eau distillée, 10 g de peptone et 5 g de NaOl) préparé à partir de boeuf frais (stérilisé par 20 intermittence, pH 7,22) à 7 ml d'acide oxaloacétique à 1 i° stérilisé par passage dans un filtre à milipore (neutralisé à pH 7,0 avec une solution aqueuse de carbonate de sodium à 10 fo) et à 3,5 ml d'une solution de BNC à 10 7° dans des conditions stériles. Ce milieu est dénommé milieu de culture I. 70 ml du bouillon 25 d'infusion de viande ordinaire sans addition d'aside oxaloacétique ni de MC est appelé milieu de culture II. A ces milieux I et II on inocule 0,3 ml du bouillon incubé de Streptococcus hemolyticus souche Su (ATCC n° 21.060) précultivé dans le bouillon d'infusion de viande, la culture ayant été 30 effectuée à 37° C pendant 20 heures. Milieu trouble à 610 ny* pH I 0,52 6,9 II 0,47 6,8 On divise le bouillon de culture en une fraction de 20 ml 35 et en une fraction de 50 ml et on utilise celle-là pour essayer l'activité anti-tumorale et celle-ci pour effectuer d'autres essais d'activité anti-tumorale et pour déterminer l'aptitude à produire de la SLS. Basai d',activité anti-tumorale (essai in vitro) 40 On recueille les cellules bactériennes par centrifugation 69 05295 4 2003018 de 20 ml du bouillon à 3500 tours/minute pendant 20 minutes, et on lave deux fois avec un milieu Dulbecco A, puis on disperse dans 2 ml de ce même milieu. On dilue la suspension successivement à 1, 2, 5, 10 et 20 fois et on détermine l'activité anti-tumorale 5 dans chaque solution diluée suivant la méthode CIR (voir, Motoichi Hatano, Ruysaku Shimizu, Shugyo Morita, et Takayoshi Yamagishi ; Medicine and Biology 74, page 293» 1967). C'est-à-dire qu'on prépare les échantillons suivants avec une suspension de cellules tumorales de souris de Ehrlich préparée séparément contenant 7 10 10' cellules/ml et avec une solution de chlorure mercurique (250 yug/ml). 1) suspension bactérienne (0,20 ml) + suspension de cellules tumorales (0,20 ml) 2) solution de chlorure mercurique (0,20 ml) + suspension de 15 cellules tumorales (0,20 ml) 3) suspension de cellules tumorales (0,20 ml) + milieu Dulbecco A (0,20 ml) 4) suspension bactérienne (0,20 ml) + milieu Dulbecco A (0,20 ml) 5) solution de chlorure mercurique (0,20 ml) + milieu Dulbecco A 20. (0,20 ml) Après incubation à 37° C pendant 2 heures, on dilue ces suspensions à 1ï10 avec le milieu Dulbecco A. L'absorption des couches surnageantes obtenues par centrifu-gation entre 3500 et 4000 tours/minute à 4° C pendant 15 minutes 25 est déterminée à la densité optique de 260 m et la valeur de la réaction de destruction des cellules (abrégée ci-dessous en CIR) est calculée par l'équation suivante : CIR (%) = a " * d) x 100 b - (c + e) 30 dans laquelle a, b, c, d et e sont les densités optiques des échantillons 1),-2), 3), 4) et 5). milieux dilutions X1 X2 X5 X10 X20 I 125 95 74 54 45 II 63 34 19 - 19 35 Essai d'activité anti-tumorale (essai in vitro - in vivo) On centrifuge à 3500 tours/minute pendant 20 minutes 50 ml 40 de bouillon incubé précité et on recueille les bactéries, puis 69 05295 5 2003018 on lave deux fois avec de l'eau physiologique et on met en suspension dans 2,5 ml du milieu basai de Bernheimer (abrégé ci-dessous en MBB) (solution obtenue en ajoutant de l'eau distillée à du maltose, du EÏÏ^PO^ et du MgSO^TH^O ajustée au pH de 6,8 à 5 7,0). On dilue 1,2 ml de la suspension à 5, 10, 20 et 40 fois avec du MBB et à chaque fraction de 2,5 ml de ces suspensions £T diluées on ajoute 0,5 ml de pénicilline (1,6 x 10^ unités/ml) dans de l'eau physiologique. On fait incuber à 20° C pendant 20 minutes, puis à 45° G pendant 30 minutes. On ajoute une sus-10 pension de cellules tumorales de Ehrlich à chaque suspension de coques diluée et on fait incuber à 37° G pendant 60 minutes. Ensuite, on injecte intrapéritonéalement à un groupe de cinq souris 0,5 ml (9 x 10^ cellules tumorales par souris) du mélange incubé. les rapports des souris survivant en bonne santé aux souris 15 soumises à l'essai 55 jours après l'injection sont donnés ci-dessous. dilutions milieux X5 XI0 X20 X40 20 I 5/5 5/5 2/5 0/5 II 4/5 3/5 0/5 0/5 Essai d'aptitude à produire de la SLS On prépare 2,5 ml d'une suspension de MBB des cellules bacté-25 riennes récoltées à partir de 50 ml du bouillon précité. On ajoute 1 ml d'une solution de RHC à 0,2 fo dans le MBB à chaque ml de la suspension ci-dessus et on fait incuber le mélange à 37° G pendant 2 heures. On centrifuge les cellules bàctériennes à 3500 tours/minute pendant 20 minutes et on dilue la couche surna-30 géante par étapes. A chacune des couches surnageantes diluées on ajoute un volume égal (1 ml) d'une suspension à 3 c/° (V/V) des erythrocytes de lapin dans le l'eau physiologique et on fait incuber le mélange à 37° G pendant 2 heures. On détermine l'unité hémolytique (di-35 lution déterminée pour une hémolyse de 50 %) par la méthode classique. L'aptitude à produire de la SLS (UH/ml) est de 30700 pour I et de 10240 pour II, respectivement. Exemple 2 Préparation d'un milieu d'extrait de levure : on dissout 40 3g d'extrait de levure (fourni par Ebios Yakuhin Kogyo K.K., Japon) dans 50 ml d'eau distillée, on ajuste le pH à 7,0-7,2 05295 6 2003018 avec une solution de soude caustique à 10# ,et on chauffe à 100°C pendant 60 minutes.On filtre le précipité produit et on réajuste le pH du filtrat avec une solution de soude caustique à 10#, puis on fait suivre d'un chauffage à 100°C pendant 30 minutes, ainsi que par une filtration . On ajoute de l'eau au filtrat obtenu, pour l'amener à 100 ml et on répartit dans des flacons stérilisés qu'on soumet à une stérilisation à la vapeur à 2 1 kg/cm pendant 10'minutes . On prépare 4 mllieax de 100 ml chacun à base du milieu d'extrait de levure à 3# précité et ayant un pH de 7,0 avec ou sans addition d'acide oxaloacétique, c'est-à-dire en contenant 0,1:10, 2:10 ou 4:10 %. A chacun de ces milieux, on Inocule 5 ml âu bouillon de culture d'hemolyticus streptoccus souche Su (ATCO C A1060) préalablement cultivé dans le bouillon d'infusion de viande et on cultive ensuite à 37°C pendant 20 heures . Concentrations d'acide Trouble du bouillon oxaloacétique (#) incuvé à 660 m 0 0,36 0,1 0,40 0,2 0,46 0,4 0,50 On centrifuge le bouillon cultivé précité et on lave deux fols les cellules bactériennes à l'eau physiologique,puis on les met en suspension dans 5 ml de MBB et on effectue les expériences suivantes . Essai anti-tumoral (essai in vitro) On dilue à 10 fois avec du MBB la suspension dans du MBB des cellules bacCéiâenaes précitées,et à chaque ml on ajoute 1ml d'une suspension de cellules tumorales de Ehrlich dans de l'eau physiologique ,une solution de tampon phosphate (3 x 10^) (pH 7^2) et on fait incuber le mélange à 37°C pendant 90 minutes . On en prend 0,1 ml et on dilue 20 fois avec une solution froide tampon au phosphate .On ajoute 1 ml d'une solution aqueuse à 0,2% de-trypanbleu froid .Immédiatement après, on détermine le nombre des cellules colorées et celui des cellules non colorées (cellules vivantes) . On calcule l'activité In vitro suivant les formules suivantes . rapport % d'aptitude à la coloration des e.llules ° Je cellules oolorées^ 100 nombre de cellules totales 69 05295 7 2003018 tes résultats sont donnés dans le Tableau suivant . ■ Concentrations d'acide oxaloacétique % Rapport d'aptitude O 33 0,1 35 5 0,2 50 0,4 75 Essai anti-tumoral {essai in vivo) A 2 ml de la suspension de cellules bactériennes précitée dans du MBB on ajoute 0,1 ml d'une solution de pénicilline 10 (1*6 x 105 unités/ml) dans l'eau physiologique,et on fait Incuver le mélange à 37°C pendant 20 minutes, puis on chauffe à 45°C pendant 30 minutes . On dilue ensuite 10 fols la suspension de cellules traitée avec une solution de pénicilline précitée mélangée avec du MBB en une proportion de 1:5 et on l'infecte Intra-15 pérltonéalement à raison de 0, ml par souris et par 24 heures pendant 4 jours, à des souris qui ont reçu 24 heures auparavant une inoculation Intrapéritonéale de 10^ cellules tumorales d'Ehrlich . On utilise chaque fois un groupe de 10 souris .23 jours .après l'inoculation des cellules tumorales, les résultats sont 20 donnés par le tableau suivant . dilutions X10 acide oxaloacétique 0 % 5/10 0,2 % 8/10 Essai d'aptitude à produire de la SLS 25 A 1 ml d'une suspension des cellules bactériennes précitées dans du MBB on ajoute 1 ml d'une solution de ARN à Q% dans du MBB et on fait incuber le mélange à 37°C pendant 2 heures . On détermine l'activité hémolytique de la couche surnageante séparée de la même manière que ci-dessus . Les résultats sont rapportés dans le tableau suivant . Concentration en Aptitude à produire acide oxaloacétique de la SLS (UH/ml) 0 1700 0,1 4290 35 0,2 4670 0,4 6720 30 69 05295 8 2003018 REVENDICATIONS 1) Procédé de culture de streptocoques hémolytiques, caractérisé en ce qu'on cultive des.streptocoques hémolytiques ayant une activité anti-tumoralefaans un milieu additionné d'acide oxa- 5 loacétique ou d'un de ses sels. 2) Procédé suivant la revendication 1, caractérisé en ce que le sel d'acide oxaloacétique est le sel de sodium ou de potassium. 3) Procédé suivant la revendication 1, caractérisé en ce qu'on effectue la culture à 37°C environ, pendant 14 à 20 heures. 10 4) Procédé suivant la revendication 1, caractérisé en ce que le milieu est un bouillon d'infusion de viande additionné en poids par volume de 0,5 % d'acide ribonucléique et de 0,1 % d'acide oxaloacétique ou de ses sels. 5) Procédé suivant la revendication 1, caractérisé en ce que 15 le milieu contient un extrait à base de constituants hydrosolu- bles d'un autolysat de levure à titre de constituants principaux, additionné de 0,2 % en poids par volume ou davantage d'acide oxaloacétique- ou de ses sels. 6) Des streptocoques hémolytiques préparés par le procédé 20 revendiqué aux revendications 1 à 5. 7) Les applications thérapeutiques, notamment anti-tumorales, des streptocoques hémolytiques revendiqués à la revendication 6.