FR 2008611 A1 19700123 FR 6915795 A 19690514 69 15795 2008611 La présente invention concerne une .ampoule scellée contenant un médicament pour le traitement de hernies de disques in-tervétébraux de mammifères, et elle concerne plus particulièrement le traitement permettant de traiter sûrement in vivo des 5 hernies de disques intervétébraux de mammifères pour soulager la pression s'exerçant sur les nerfs'et sur les racines des nerfs, sans faire appel à l'enlèvement chirurgical du disque présentant une hernie. La douleur associée à la hernie du disque intervétébral 10 est reliée à la lésion par compression de la racine du nerf provoquée par la luxation du tissu herniaire. Des symptômes persistants semblent être reliés au fait que la racine risque encore une inflammation chronique et de l'oedème. Le repos et diverses formes d'immobilisation interne et externe réalisent leur effet 15 thérapeutique en évitant que la racine subisse un autre traumatisme. On utilise le traitement à l'aide, de stéroldes pour la réaction anti-inflammatoire qu'il provoque et parce qu'il réduit l'oedème. On fait appel à une ouverture-des trous et à l'enlèvement du disque dans le but d'effectuer une décompression de la 20 racine du nerf. Plus généralement, les méthodes de traitement qui sont couronnées de succès permettent de donner plus de place à la structure des nerfs. Afin d'éviter une douleur récurrente et pour constituer une sauvegarde contre-de multiples procédures opératoires, on fait appel à la chirurgie avec une fréquence 25 accrue comme intervention majeure impliquant l'enlèvement du " disque, une ouverture des trous et une fusloijfextensive des os. Cependant, un tel traitement majeur peut ne pas.soulager lés symptômes. En outre, il comporte son propre risque inhérent et il peut, sans- nécessité, détruire forme et fonction. 30 Smith et ses collaborateurs, "Enzyme Dissolution of Nucleus Pulposus", Mature. 198. 1398 (1963), en utilisant la chymopapalne, ont indiqué avoir obtenu la dissolution du nucleus pulposus chez les lapins. Dans ce rapport et dans les articles subséquents, ("Enzyme Dissolution of Nucleus Pulposus in Humans", J.A.M.A.. 187. 35 137-140 (1964) et "Treatment of Lumbar Intervetebral Disc Lésions by Direct Injections of Chymopapain", J. of Bone & Joint Surg.. Brit. 49-B, 502-519 (1967)), les auteurs décrivent l'utilisation 69 15795 -2- 2008611 de la chymopapaïne chez les chiens présentant une paraplégie secondaire due à une hernie du disque et chez des être humains présentant un syndrôme de sciatique. Ces auteurs ont indiqué avoir obtenu des résultats cliniques favorables, bien que des 5 complications se produisent comprenant un cas de paraplégie et des cas fréquents de graves douleurs au bas du dos. Victdowson, "Effects of Chymopapain in the Intervertebral Disc of the Dog", J.A.V.M.A.. 150. 608-61 "t (1967), travaillant avec la chymopapaïne chez les chiens, a confirmé les effets favorables sur 10 l'espace des disques, mais des injections dans la moelle épinière, dans l'espace aous-arachnoïdien ou épidural, ont été suivies d'hémorragies, de démyélinisation et de satellitoee. En outre, cet auteur a indiqué que ces complications, à un degré variable, étaient des constatations constantes quel que soit le site de 15 l'injection. Shealy, "Tissue Reactions to Chymopapain in Cats", J. of Neuro Sura.. 26. 327-330 (1967), a ind^|ué en outre que la chymopapaïne n'a pas d'action spécifique sur/hucleus palposus et qu'en fait elle provoque de graves nécroses partout où elle est injectée, en produisant souvent la mort par hémorragie sous-20 arachnoïdienne et par hémorragie largement répandue. Un but de la présente invention consiste à retrouver les bons résultats que l'on obtient souvent par des procédures opératoires mineures par la dissolution sélective du nucleus palposus herniaire et dufibro-cartilage'annulaire. 25 Selon la présente invention, la Demanderesse fournit de la collagénase lyophilisée à utiliser pour une injection inter-vétébrale dans le traitement d'une hernie de disque intervété-bral, cette collagénase étant stérile et essentiellement exempte d'activité protéolytique et élastolytique. 30 Selon la présente invention, la Demanderesse fournit égale ment la collagénase purifiée précitée pour l'utilisation indiquée, sous la forme d'une solution stérile. Selon la présente invention, la Demanderesse fournit en outre un procédé de traitement d'une hernie de disque intervété-35 bral d'un mammifère comprenant l'injection d'une quantité pouvant atteindre 10 cm d'une solution stérile de collagénase purifiée, qui est essentiellement exempte d'activité protéolytique et élas- 69 15795 -3- 2008611 tolytique, dans l'espace des disques intervertébraux. Selon la présente invention, la Demanderesse fournit en outre une ampoule scellée de collagénase stérile lyophilisée, en une quantité suffisante pour une,seule injection interverté- certaine de 5 brale et capable de recevoir une/quantité/solvant aqueux, la collagénase se présentant alors à une concentration d'environ 0,1 #, cette collagénase étant essentiellement exempte d'acitivi-té protéolytique et élastolytique. On peut atteindre avec succès l'objectif précité, sans en-10 dommager les tissus adjacents, les vaisseaux sanguins ou les os, en utilisant une collagénase stérile et purifiée, injectée dans l'espace des disques intervertébraux. Par suite de l'injection, le nucleus pulposus et le tissu fibro-cartilagineux du disque et de l'anneau, respectivement, sont sélectivement dissous avec un 15 soulagement résultant de la pression sur la racine du nerf adjacent . La collagénase est un enzyme rare que l'on trouve dans-certains filtrats de culture de clostridia, et plus particulièrement, dans les filtrats de culture de Olostridinm histolyticum 20 et Clostridium velchi ; le premier étant la source préférée. Telle qu'on la récupère initialement, la collagénase est impure et contient non seulement de la collagénase, mais une peptidase et une protéinase analogue à la trypsine, Sa récupération sous forme impure est décrite par Mandl et ses collaborateurs ("Iso-25 lation and Characterization of Proteinase and Collagenase from Cl. histolvticum". J. Clin. Invest.. "p2. 1323 (1953)). L'utilisation de cette matière a trouvé une certaine application pour débrider les brûlures du troisième degré, pour la séparation en-zymatique du derme et de l'épiderme CWhole Mounts for the Study 30 of Skin and its Appendages", J. Invest. Dermatol.. 23. 437-453 (1954)). La collagénase a également été utilisée dans des études de différents collagènes au microscope électronique ("Evaluation of Structural and Chemical Changes in Connective Tissue", Annals N.Y. Acad. Sci.. £6, 674-683 (1952)). La collagénase peut être 35 purifiée, par exemple par chromatographie, de façon à récupérer un enzyme consistant essentiellement en collagénase. En outre, par l'utilisation de techniques classiques pour enlever les bacté 69 15795 -4- 2008611 ries, on peut produire la collagénase sous forme stérile. La collagénase a été purifiée par électrophorèse d'une préparation d'enzymes obtenue par fractionnement au moyen de sulfate d'ammonium et elle a été l'objet d!une étude'biologique faite par 5 Mandl et ses collaborateurs ("Clostridium Histolyticum Collagénase, Its Purification and Properties". Archives of Biochem. and Biophysics. 74. 465-475 (1958)), où son activité a été étudiée en ce qui concerne son aptitude à attaquer le collagène et ses produits de dégradation et son inaptitude à attaquer les 10 substrats protéiniques, comme la caséine ou l'hémoglobine, ou les protéines fibreuses, la fibrine, la kératine et l'élastine. Le collagène dénaturé est sensible à de nombreux enzymes Au protéolytiques./contraire*du collagène inaltéré résiste à tous les enzymes protéolytiques communs. La collagénase, quand on 15 l'utilise selon la présente invention, semble être un enzyme microbien remarquable.en ce qui concerne sa capacité d'attaquer le collagène lui-même dans des'conditions physiologiques de pH et de température. On trouve le collagène en diverses quantités dans les tis-20 sus de l'organisme, comme les vaisseaux sanguins, les muscles, etc, et dans le cas du matériau du disque et du matériau fibro-cartilagineux adjacent de l'anneau, on a trouvé qu'en utilisant une solution diluée de collagénase, comme une solution à 0,1 96 injectée dans l'espace des disques au contact du nucleus pulposus 25 et de l'anneau, la solution de collagénase va agir sur le collagène contenu là, avec comme résultat une dissolution sensiblement complète du nucleus pulposus et une dissolution de la majeure partie du matériau fibro-cartilagineux de l'anneau. Les tissus adjacents, comme les vaisseaux sanguins et les muscles, contien-30 nent aussi du collagène ; mais dans ces tissus adjacents, la proportion de collagène par rapport au matériau des autres tissus qui n'est pas solubilisée par la collagénase est plus grande, et l'on a déterminé dans la pratique de la présente invention que l'enzyme exerce peu d'effet physiologique ou chimique sur ces 35 tissus adjacents et qu'il n'y a virtuellement pas de dégâts pour eux en ce qui concerne leur intégrité ou leur fonctionnement physiologique chez le mammifère vivant. De façon similaire, l'enzyme 69 15795 -5- 2008611 n'a aucun effet adverse apparent sur l'os adjacent. Pour l'utilisation physiologique selon la présente invention, l'enzyme peut être récupéré sous forme de sa solution stable et purifiée, qui est soumise à lyophilisation pour le pro-5 duire sous forme de poudre sèche. La poudre sèche est stable quasi-indéfiniment. A la température ambiante, une solution à 0,1 i» ést stable durant 24 heures. Sa stabilité est liée à la concentration de l'enzyme, au pH et au type de tampon que l'on utilise avec, l'activité est optimale à un pH de 6,4, mais il y 10 a une gamme d'activité comprise entre 6,2 et 7,8. En outre, sa zone d'activité maximale est affectée par la nature de tout tampon que l'on peut éventuellement utiliser. Lorsqu'on effectue une injection dans l'organisme d'un mammifère, les tampons naturels de l'organisme tendent à maintenir un pH d'environ 7,4 et, lorsque 15 le pH de l'enzyme est différent de ce pH, et bien que be pH de l'enzyme soit différent dudit pH, les tampons de l'organisme tendent à ramener le pH d'une solution injectée vers un pH qui est approximativement celui de l'organisme. -Comme dit ci-dessus, l'activité de la collagénase est élevée au pH et à la' températuré de 20 1'organisme. Cependant, il est habituellement souhaitable de porter le pH de la solution qui est injectée à un pB adjacent à celui de l'organisme en utilisant quelque tampon, comme un tampon aux phosphates, ou en utilisant la solution saline physiologique classique, à savoir une solution à 0,85 % de chlorure de sodium qui a un pH 25 de 7 environ. Alors que, d'ordinaire, l'activité de l'enzyme n'a pas besoin d'être inhibée après injection, néanmoins son activité peut être aisément inhibée par l'emploi, de la cystéine, à bas pS, _2 _p d'acide para-chloromercurique 10 M, d'acide iodo-acétique 10 M et divers anti-sérums de chevaux. 30 Dans la mise en oeuvre de l'invention, on injecte une solu tion purifiée et stable de collagénase, de préférence une solution à environ 0,1 $ tamponnée à environ pH 7, directement dans l'espace des disques, de façon à venir en contact direct avec le nucleus pulposus et l'anneau qui l'entoure. La quantité de solution 35 dépend de la dimension de l'espace du disque. Dans le cas d'un chien de taille moyenne, par exemple, une quantité approximative de 2 cm^ suffit habituellement, tandis que dans le cas d'un être 69 15795 20086 Tï humain, l'espace du disque est tel que l'injection peut être de l'ordre de 10 cm environ. Après achèvement de l'injection aucun traitement supplémentaire n'est nécessaire autre que des observations supplémentaires, telles que celles faites d'habi-5 tude et qui sont du genre d'un examen aux rayons X, de l'étude du pouls, de la température, de l'analyse des urines, etc. Afin de permettre une meilleure compréhension de la présente invention, celle-ci va maintenant être décrite à l'aide des exemples non limitatifs suivants : 10 Exemple 1 On a utilisé le procédé de la présente invention pour effectuer une dissolution sélective du nucleus pulposus et de matière fibro-cartilagineuse du disque et de l'anneau dans la cor-lonne vertébrale de chiens vivants. On a démontré avec succès la 15 valeur de la présente invention dans le cas de dix chiens, en opérant de la façon suivante. On a d'abord anesthésié chaque chien en utilisant un barbi-turate à courte durée d'action administré par voie intra-veineuse. L'incursion s'est effectuée par le bas de l'abdomen dans neuf cas 20 et dans la musculature para-vertébrale dans un, cas, de façon à, permettre l'exposition rétro-péritonéale opératoire et à permettre l'injection dans l'espace des disques intervertébraux lombaires. Afin de déterminer expérimentalement la sûreté du traitement, l'aiguille pour injection a été avancée suffisamment pour s'éten-25 dre non seulement à travers l'espace des disques, mais aussi juste au-delà et dans le canal de la moelle épinière, mais sans pénétrer dans la dure-mère spinale. On a injecté 2 cm d'une solution aqueuse à 0,1 $> de collagénase purifiée et stérile. Envi-— 3 • ron 1 cm de la solution est resté dans l'espace du disque. Le 30 cm^ restant de la solution s'est déchargé dans le canal spinal, bien qu'il y ait un peu de perte par l'ouverture de l'aiguille lors du retrait de l'aiguille. Le traitement a été effectué de _ cette façon, afin de vérifier complètement l'absence d'effets secondaires nuisibles sur les muscles adjacents, l'os, les vais-35 seaux sanguins et, plus spécialement, en ce qui concerne un contact éventuel avec la dure-mère. En pratique ordinaire, l'injection serait effectuée de façon à confiner autant que possible de 69 15795 -7- 2008611 la solution injectée dans l'espace du disque. Pendant une période de 7 à 10 jours après l'injection, chaque chien est resté parfaitement capable de se déplacer. Les dénombrements sanguins, les analyses d'urine, les relevés de 5 température et de pouls sont tous restés dans des limites normales. En outre, il. n'y-a pas eu d'effets neurologiques décelables. Après 7 à 10 jours, neuf des chiens ont été sacrifiés et, après 2 jours, un chien a été sacrifié, et l'on a comparé une radiographie aux rayons X de la portion traitée de la moelle épinière 10 avec une radiographie correspondante effectuée avant l'injection. En outre, la section en cause de la colonne vertébrale comprenant les vertèbres adjacentes a été enlevée et découpée en moitiés, de façon à rendre la région en cause disponible pour une dissection et pour une étude -photographique et microscopique. Dans chaque 15 cas, on a observé que le nucleus pulposus et une majeure partie du matériau fibro-cartilagineux de l'anneau ont été complètement absents et qu'il n'y a pas ëu d'attaque décelable du cartilage hyalin, des ligaments antérieurs ou postérieurs, de l'os adjacent ou de la dure-mère. . 20 Exemple 2 On a soumis deux chiens à une laminectomie lombaire et l'on •Z a injecté 2 cm d'une solution stérile à 0,1 *%> de collagénase pu-"rifiée dans l'espace extra-dural. Dans le cas de deux chiens sup-plémentaires, on a effectué une injection intra-durale de 2 cm 25 de la même solution. On a observé durant 2 jours les deux chiens qui ont reçu l'injection extra-durale. On a observé durant 2 jours un des chiens qui a reçu l'injection intra-durale et on a observé l'autre durant une semaine. Il n'y a eu dans aucun cas de signe de lésion de la moelle épinière. Les chiens sont restés 30 parfaitement capables de se déplacer sans faiblesse dans les pattes de derrière. Il n'y a eu, de même, aucun signe d'incontinence. Le but de ces essais a été de démontrer que, même dans les conditions extrêmes d'une injection accidentelle extra-durale ou même intra-durale, l'action sélective de la collagénase puri-35 fiée est telle qu'il n'y a pas de dommage apparent de la moelle épinière. 69 15795 -8- 2008611 Exemple 3 Durant une laminectomi^feur un être humain vivant, on a retiré de l'espace du disque une matière qui s'est avérée aux essais et à l'examen microscopique s'identifier à du nucleus 5 pulposus ou à de l'annulus fibrosis avec quelques mélanges de l'un à l'autre. On a placé environ 1/3 de gramme de la matière retirée, consistant de façon sensiblement totale en nucleus pul-posus, dans 1 cm d'une solution à 0,1 % de collagénase purifiée dans une solution aqueuse stérile. On a placé une quantité simi-10 laire, consistant essentiellement en fibro-cartilage, dans une quantité correspondante de la solution à 0,1 $ de collagénase. Simultanément, on a placé une quantité correspondante d'une petite artère et d'un os, respectivement, dans une quantité correspondante de la-solution à 0,1 Exemple 4 On a enlevé d'un cadavre humain des moitiés de vertèbres adjacentes avec un disque placé entre elles et on a soumis à une dissection en parties constituantes pour effectuer une attaque 25 enzymatique sur la matière se trouvant dans l'espace du disque. Dans ces conditions, il est difficile de distinguer en gros entre le nucleus pulposus et le fibro-cartilage dégénéré (annulus fibrosis). Néanmoins, dans un tube à essai séparé, on a immergé environ 1/3 de gramme de nucleus pulposus, de fibro-cartilage, 30 de cartilage hyalin et de ligement antérieur ^respectivement, dans un otsP d'une solution à 0,1 $ de collagénase purifiée. Au bout de 18 heures, la dissolution du nucleus pulposus et du fibro-cartilage était complète. Dans des conditions similaires de contact avec la solution à 0,1 fo de collagénase, l'échantillon de 35 cartilage hyalin et l'échantillon 69 15795 -9- 2008611 La pratique de la présente invention présente de l'utilité bien pour l'application vétérinaire aussi/que dans le cas des êtres humains. Par exemple, les chiens, en particulier les dachshunds risquent des lésions avec hernie résultante des disques spinaux. 5 Dans le traitement des êtres humains, on envisage d'effectuer l'entrée dans l'espace du disque pour l'injection de la solution de collagénase en partant du dos du patient, l'aiguille d'injection passant à travers la dure-mère et le fluide spinal, et à travers le ligament postérieur, en utilisant une technique simi-10 laire à celle qui est classique pour un prélèvement spinal pour l'enlèvement du fluide spinal, sauf que l'introduction de l'aiguille est poursuivie au-delà à l'intérieur de l'espace du disque. Ou bien, afin que 1'aiguille ne vienne pas au voisinage de la dure-mère, on peut utiliser une approche latérale vers l'espace 15 du disque. Que l'on utilise la collagénase à des fins vétérinai-pour res ou /Le traitement d'êtres humains, on peut utiliser des techniques classiques de radiographie aux rayons X pour localiser le disque hernieux. - Dans un autre aspect de la présente invention, on fournit 20 la collagénase sous forme dosée appropriée pour une seule injection intervertébrale dans un mammifère vivant et, à cette fin, une solution stérile purifiée de collagénase est introduite dans une ampoule en quantité suffisante pour fournir environ 10 cm d'une solution ayant une concentration d'environ 0,1 jé. 25 On soumet ensuite la solution à la lyophilisation pour produire la collagénase à l'état sec et stérile et l'on scelle l'ampoule. Au moment de l'utilisation, on ajoute directement à l'ampoule le milieu aqueux destiné à l'injection. Comme dit ci-dessus, le .solvant aqueux peut contenir une faible quantité d'un tampon ou 30 de solution saline pour assurer la valeur voulue du pH. La solution de collagénase est prête à servir dès qu'elle est préparée de cette façon. On peut utiliser des modes opératoires connus pour la purification de la collagénase, comme le mode opératoire décrit par 35 Keller et Mandl ("The Préparation of Purified Collagenase", Arch. Biochem. Biophys.. 101, 81 (1963)). A titre de mesure de précaution, il convient de soumettre une portion d'essai de la 1 69 15795 -io- 2008611 collagénase produite à des fins cliniques à des essais pour s'assurer de l'absence complète d'activité protéolytique et élastolytique. Il est souhaitable également de vérifier sa stérilité et son absence de caractère pyrogène. L'activité 5 minimale préférée pour la collagénase est de 200 unités, que l'on peut déterminer par le procédé d'essai de Mandl et ses collaborateurs ("Isolation and Characterisatioiv6f Proteinase and Collagenase from Cl. histolyticum". J. Clin.. Invest., 32, 1323 (1953)). Les amino-acides libérés sont exprimés en micro-10 moles de leucine par milligramme de collagénase. 69 15795 -11- 2008611 - RK«ffll)ICATIOHS - 1 - Ampoule scellée contenant un médicament, caractérisée par le fait qu'elle contient de la collagénase purifiée et lyophilisée, destinée à servir à une injection inter-vertébrale, 5 cette collagénase étant prévue pour recevoir une certaine quantité d'un solvant aqueux, de façon à former une solution stérile de collagénase à la concentration d'environ 0,1 #, cette collagénase étant essentiellement exempte d'activité protéolytique et élastolytique, et l'ampoule étant prévue de façon à conte-10 nir une dose mesurée de cette solution suffisante pour une seule injection intervertébrale, cette dose pouvant aller jusqu'à 10 cm . 2 - Une ampoule scellée selon la revendication 1, caractérisée par le fait que la collagénase est sous forme d'une solution stérile à un pH de 6,2 à 7,8. 15 3 - Une ampoule scellée selon la revendication 2, caracté risée en ce qu'elle est tamponnée par un tampon de phosphates ou par une solution à 0,85 % de chlorure de sodium à un pH d'environ 7.