FR 2005054 A1 19691205 FR 6909186 A 19690327 6* 09186 1 2005054 10 35 La présente invention est relative à un procédé de production d'uft mononucléotide de l'acide nicotinique. Plus particulièrement, elle concerne un procédé de production Le mononucléotide de l'acide nicotinique répond à la formule suivante : ,C00H 15 20 25 30 Ce composé est avantageux comme réactif biochimique, comme matière de départ pour la production de la nicotinamide— adénine-dinucléotide et de produits analogues* Par conséquent, on a cherché pendant longtemps à mettre au point des procédés de production d'un tel composé. Parmi les procédés connus dans la technique antérieure pour la préparation du mononucléotide de l'acide nicotinique, on connaît un procédé de production faisant appel à des enzymes J_ Journal of Biological Chemistry. Vol 236, p.525 (1961 et un procédé dans lequel on l'isole de levures j_ Archives of Biochemistrv and Biophysics, Vol. 82, p.83 (1959)_7 d-e Pénicillium chryso— genum /Nature, V0I0I8O, p«1203 (1957.17» Toutefois, aucun de ces procédés n'a donné satisfaction pour la production de mononucléotide de l'acide nicotinique à l'échelle industrielle» La présente invention a donc pour objet - un procédé perfectionné de production du nononucléotide de l'aci 69 09186 2 2005054 de nicotinique, procédé qui est exempt des inconvénients et des insuffisances des procédés de la technique antérieuref - un procédé de production du mononucléotide de l'acide nicotinique, qui peut être mis en oeuvre de façon relativement simple et 5 avec un bon rendementï — un procédé de production du mononucléotide de l'acide nicotinique par fermentation, procédé qui peut 8tre mis en oeuvre avantageusement à l'échelle industrielle, dont le prix de revient est peu élevé et qui donne un rendement élevé du produitj 10 - l'obtention du mononucléotide de l'acide nicotinique. Les caractéristiques et avantages de la présente invention apparaîtront au technicien à la lecture de la description et des revendicatfans qui vont suivre» A la suite de recherches étendues coacera^^irt un preci» 15 dé de production du mononucléotide d'acide nicotinique en utilisant des microorganismes, la demanderesse a constaté, conformément à la présente invention, que des quantités notables de ■onon.ucléo-tide d'acide nicotinique sont obtenues e~t accumulées dans la liqueur de culture résultante, si l'on opère la fermentation au 20 sein d'un milieu mfcitif aqueux auquel on a ajouté de l'acide nicotinique ou du nicotinamide. Ce fait n'avait jamais été mentionné dans la technique antérieure» Comme on l*a précisé plus haut, la détection ou l'isolement du mononucléotide d'acide nicotinique par les procédés de 25 la technique antérieure sont difficiles au point de vue industriel, en raison du prix élevé des matières de départ, des rendements faibles, etc., quel que puisse être leur intérêt au point de vue académique. Par comparaison, le procédé conforme à la présente invention est extrêmement intéressant au point de vue pratique et 30 permet d'obtenir le mononucléotide d'acide nicotinique très facilement et à peu de frais, avec un rendement élevé» Les caractéristiques saillantes de la présente invention comprennent, comme on l'a noté plus haut, l'addition d'acide nicotinique ou de nicotinamide au milieu de fermentation et -l'uti-35 lisation de bactéries appartenant aux genres Brevibacterium. Corvnebacterium. Arthrobacter- ou Micrococcus. à titre de micro-organismes» On peut utiliser un milieu de culture synthétique aussi 69 09186 3 2005054 bien qu'un milieu nutritif naturel pour cultiver les souches utilisées conformément à la présente invention, à condition que le milieu choisi contienne les éléments nutritifs essentiels pour la croissance de la souche utilisées De tels éléments nutritifs sont 5 bien connus dans la technique et comprennent des substances telles qu'une source de carbone, une source d'azote, des composés minéraux et des substances analogues, qui sont utilisées par le microorganisme choisi en des quantités appropriées. Ainsi, à titre de source de carbone, on peut mentionner par exemple, les hydrates 10 de carbone tels que le glucose, le fructose, le maltose, le saccharose, l'amidon, l'hydrolysat d'amidon, les mélasses, le mannose, le glycérol, etc., ou toute autre source de carbone appropriée telle que de^kcides organiques, comme par exemple les acides acétique, lactique, pyruvique, etc« On peut utiliser ces substances 15 isomément ou sous forme de mélanges en contenant un nombre quelconque» Comme source d'azote, on peut utiliser divers genres de sels ou composés minéraux ou organiques, tels que l'urée, l'ammoniaque liquide ou des sels d'ammonium tels que le chlorure 20 d'ammonium, le sulfate d'ammonium, le nitrate d'ammonium, l'acétate d'ammonium, le phosphate d'ammonium, le carbonate d'ammonium, etc., ou encore des substances naturelles contenant de l'azote, comme la liqueur de macération du maïs, un extrait de viande, un extrait de levure, la peptone, la farine de poisson, le bouillon, 25 les hydrolysats de caséine (comme l1aminé NZ), un acide aminé de la caséine, des matières solubles du poisson, des extraits d'enveloppes de grains de riz, un gâteau de soja dégraissé et les hydrolysats de fèves, ou diverses substances résultant de leur digestion, etc. On peut également utiliser une seule de ces substances ou 30 des mélanges comprenant un nombre quelconque d'entre elles» Les composés minéraux qu'on peut ajouter au milieu de culture comprennent le sulfate de magnésium, le phosphate de sodium, le phosphate monopotassique, le phosphate dipotassique, le sulfate ferreux, le chlorure de manganèse, le chlorure de cal-35 cium, le chloruré de sodium, le sulfate de zinc, le sulfate de manganèse, le carbonate de calcium, etc» Si l'on choisit des souches ayant âes exigences nutritives spécifiques, les substances requises pour satisfaire 69 09186 4 2005054 ces exigences doivent être bien entendu ajoutées au milieu de culture . Elles comprennent par exemple des amino-acides, des vitamines telles que la thiamine, la cobalamine, etc..., ou la biotine» Conformément à la présente invention, on ajoute 5 l'acide nicotinique ou le nicotinamide au milieu nutritif, au début de la fermentation ou au cours de celle-ci, en une seule fois ou par intermittence. On peut ajouter l'acide nicotinique et le nicotinamide au milieu sous la forme de leurs sels non toxiques, tels que leurs sels de sodium, leurs sels de potassium, leurs 10 sulfates, leurs chlorhydrates, leur ascorbate, etc. Il est bien entendu que l'utilisation de tels équivalents entre dans le cadre de la présente invention. La quantité de composé ajouté peut varier en fonction du microorganisme choisi et des conditions de culture utilisées. En général, la quantité d'acide nicotinique ou de nico-15 tinamide est comprise entre 0,1 et 100 mg/ml, de préférence entre 1 et 20 mg/ml» On effectue la culture en aérobie, par exemple en secouant la culture dans des conditions aérobies ou en aérant et en agitant une culture submergée, à une température comprise 20 par exemple entre environ 20 et 40°C et à un pH compris par exemple entre 4 et 9,5. Après environ 2 à 8 jours de culture dans de telles conditions, on obtient des quantités notables de mononucléotide d'acide nicotinique qui se sont accumulées dans la liqueur de culture résultante» 25 Lorsque la culture est achevée, on récupère le mononucléotide d'acide nicotinique dans la liqueur de fermentation par xm procédé classique, par exemple par traitement avec une résine échangeuse d'ions, par extraction avec un solvant, par précipitation, par adsorption, par chromatographie, par concen-30 tration ou d'une manière analogue» Les exemples suivants sont donnés uniquement à titre illustratif et non limitatif de la portée de l'invention» Sauf mention contraire, les pourcentages mentionnés dans ces exemples ainsi que dans le reste de l'exposé s'entendent en poids par 35 litre d'eau» Les souches de microorganismes utilisées avantageusement dans la présente invention et mentionnées à titre d'exemples sont décrites dans le présent exposé. EXEMPLE 1 Le microorganisme d'ensemencement est Brevibae— 40 terium ammoniagenea ATCC 6872» On cultive cette souche dans un 69 09186 5 2005054 milieu d'ensemencement contenant 2$ de glucose, 1# de peptone, d'extrait de lewre, 0,3# de STaCl et 30 yug/l de biotine, à 30°0 et pendant 24 heures. On inocule la liqueur d'ensemencement résultante dans une proportion de 10$ en volume dans un milieu de fer— 5 mentation ayant la composition suivante : G-lucose 100 g Urée 6 g kh2PO4 10 g K2HP0^ 10 g 10 MgS04, 7H20 10 g CaClgf 2H20 0,1 g Biotine 30^ug Extrait de levuro 10 g Quand on prépare le milieu de fermentation, on 15 dissout les produits ci-dessus dans 1 litre d'eau, et on ajuste le pH de la solution à 8 avec NaOH. Ensuite, on verse le milieu de fermentation dans des fioles individuelles et on le stérilise en autoclave, à une pression de 1kg/cm , pendait 10 minutes. Après l'inoculation, on verse des portions de 20 ml 20 du mélange des milieux d'ensemencement et de fermentation dans des fioles coniques de 250 ml. On cultive ensuite en secouant en aérobie, à 30°C. -Après 72 heures de culture, on ajoute un amide d'acide nicotinique à la liqueur de fermentation, en une quantité 25 telle que sa concentration soit de 2 mg/ml. On poursuit ensuite la culture pendant 24 heures. On obtient ainsi 2,3 mg/ml de mononucléotide d'acide nicotinique qui s'est accumulé dans la liqueur de fermentation# On récupère le mononucléotide d'acide nicotinique 30 par adsorption sur une résine de polystyrène échangeuse d'anion^ fortement basique /Lowex n°1 (type acide foimique)_7 » suivie d'une élution avec une solution aqueuse de formiate d'ammonium. "RTBMPTÏF! ? On effectue la culture de la même manière que dans 35 l'exemple 1, à cette exception qu'on ajoute de l'aeide nicotinique au milieu, en remplacement du nicotinamide. La quantité de mononucléotide d'acide nicotinique obtenue dans la liqueur de culture résultante est de 2,3 mg/ml. EXEMPLE 3 40 On effectue la culture comme décrit dans l'exemple 69 09186 6 2005054 1, à cette exception que le microorganisme d'ensemencement est Corvaebacterium sp« ATCC 21084» au lieu de Brevibacterlum ammonia— genea» La quantité de mononucléotide d'acide nicotinique produite dans la liqueur de culture est de 1,7 mg/ml« 5 EXEMPLE 4 On effectue la culture comme décrit dans l'exemple 1, à cette exception qu|on utilise Arthrobacter sp. ATCC 21085 comme " microorganisme d'ensemencement, au lieu de Brevibacterlum ammoniagenes. La quantité de mononucléotide d'acide nicotinique 10 obtenue dans la liqueur de culture est de 1,3 mg/ml. EXEMPLE 5 - - Le micro organisme d'ensemencement est Micro coccua 80donensis ATCC 15932. On exécute la culture de la même manière et dans les mêmes conditions que dans l'exemple 1. La quantité de 15 mononucléotide d*acide nicotinique accumulée dans la liqueur de fermentation est ainsi de 0,4 mg/ml. ' - Il est bien entendu qu'on peut apporter de nombreuses modifications à la description qui précède sans sortir pour cela du cadre de la présente invention. 69 09186 7 2005054 REVENDICATIONS 1. ProcTédé de production du mononucléotide de l'acide nicotinique, et caractérisé par le fait qu'on cultive en aérobie un microorganisme producteur de mononucléotide d'acide nicotinique 5 et "appartenant à l'un des genres Brevibacterium, Cor.vnebactérium. Arthrobacter ou Mi tirnaoecus. cette culture étant effectuée au sein d'un milieu nutritif aqueux contenant de l'acide nicotinique ou du nicotinamide, et à laisser le mononucléotide précité s'accumuler dans la liqueur de culture résultante» 10 2, Procédé conforme à la revendication 1, dans lequel la culture est effectuée entre environ 20 et 40°C et à un pH d'environ 4 à 9»5. 3. Procédé conforme à la revendication 1, dans lequel l'acide nicotinique ou le nicotinamide sont ajoutés au milieu de 15 culture au début de la période de culture# 4« Procédé conforme à la revendication 1, dans lequel l'acide nicotinique ou le nicotinamide sont ajoutés au mil jeu de culture après le début de la période de culture0 5. Procédé ccnforme à la revendication 1, dans lequel 20 1*acide nicotinique ou le nicotinamide ajoutés au milieu sont utilisés sous la forme de leurs sels de sodium, de leurs sels de potassium, de leurs sulfates ou de leurs chlorhydrates. 6. Procédé conforme à la revendication 1, dans lequel on ajoute environ 1 à 20 mg/ml d'acide nicotinique au milieu de 25 culture, 7. Procédé conforme à la revendication 1 s dans lequel on ajoute environ 1 à 20 mg/ml de nicotinamide au milieu de culture» 8. Procédé conforme à la revendication: 1, dans lequel 30 le microorganisme est Brevibacterium ammoniagenes ATCC 6872» 9. Procédé conforme à la revendication 1, dans lequel le microorganisme est Corynebacterium sp. ATCC 21084 10. Procédé conforme à la revendication 1, dans lequel le microorganisme est Arthrobacter su. ATCC 21085» 35 11. Procédé conforme à la revendication 1, dans lequel le microorganisme est Micrococcus sodonensis ATCC 15932.