FR 2002181 A1 19691017 FR 6904059 A 19690218 69 0405? 1 2002181 La présente invention concerne des pa.rticules actives capables d'une fixation chimique directe sur des substances biologiques, les réactifs biologiques insolubilisés formés par cette réaction de fixation et les procédés de préparation de ces parti-5 cules et de ces réactifs. L'invention a plus particulièrement trait à des particules réactives et des réactifs biologiques insolubilisés possédant une réactivité et une grosseur1 de particule réglées. On a utilisé dans le passé deux types généraux de particules auxquelles des substances biologiques peuvent être attachées 10 au moins temporairement. Le premier type comprenait des particules solides telles que le collodion, les particules de latex et les globules rouges sanguins, qui ont été utilisées en tant que particules inertes sur lesquelles diverses substances biologiques pouvaient être temporairement fixées par adsorption en raison des 15 caractéristiques de surfa.ce présentées par ces substances. On a constaté que de nombreuses substances biologiques ne peuvent pas être adsorbées sur ces particules inertes de manière à les retenir sur leurs surfaces pendant une période de temps suffisante pour permettre leur utilisation appropriée. Des exemples de particules 20 du second type comprennent les globules rouges sanguins qui ont été traités au formaldéhyde en vue de les stabiliser contre la lyse, puis avec un agence copulation chimique tel que'la bis-diazobenzidine. Ces particules ont été capables d'une réaction chimique avec des substances biologiques par copulation a.u moyen 25 de l'agent de copulation. Ces deux types de particules ont une utilité limitée par suite de leur réactivité et leur grosseur fixes. Ainsi, pour le second type de particules, les globules rouges sanguins stabilisés ont des dimensions et des propriétés de surface absolument unifor-30 mes et, lorsque les propriétés de surface sont modifiées par fixation d'agents de copulation chimiques, une nouvelle réactivité chimique est conférée aux surfaces. A part l'utilisation d'agents de copulation chimiques différents, on ne connaît aucun moyen permettant de modifier la réactivité de surface de ces particules 35 traitées, et attendu que les caractéristiques chimiques originelles de la particule de départ dictent toujours le choix des agents de copulation chimiques, une gamme de réactivité très étroite a 69 04059 2 2002181 seule été possible dans le passé pour ces particules. Une autre limitation réside dans l'impossibilité de faire varier la grosseur et, par conséquent, le poids des particules. Certaines particules, notamment les globules rouges sanguins, sont 5 assez- petites pour que leur sédimentation exige des temps très longs dans certains essais immunologiqu.es. Il est bien connu que ces essais doivent être observés pendant des périodes de temps de 1 à heures en vue de déterminer si une agglutination s'est ou non produite. Ces temps nécessaires pour les essais pourraient être 10 grandement réduits si l'on disposait de particules de plus grandes dimensions. L'invention a donc pour buts : - de fournir des particules réactives capables d'une fixation chimique directe sur des substances biologiques qui sont de 15 dimensions plus grandes et ont une réactivité variable comparativement aux particules de la technique antérieure ; - d'offrir des réactifs biologiques insolubilisés en particules de plus grandes dimensions et de plus grand poids que celles qui sont disponibles dans la technique antérieure ; 20 - de fournil- des procédés au moyen desquels on puisse prépa rer tant les particules réactives définies ci-dessus que les réactifs biologiques insolubilisés. Les deux usages principaux auxquels les réactifs biologiques insolubilisés en particules du type défini ci-dessus sont desti-25 nés, sont la conduite d'essais immunologiques et l'exécution de transformations et de processus enzymatiques. Pour la première de ces applications, on doit régler avec soin la réactivité et la grosseur des particules auxquelles les substances biologiques sont attachées. Un très grand diamètre de particule ne peut pas être 30 utilisé initialement, car une particule de grand diamètre serait ir-capable de subir l'agglutination désirée pour que les essais immunologiques soient praticables." Au contraire, .ces particules se sédimenteraient immédiatement, car la grosseur des particules et leur poids vaincraient les.forces d'agglutination plutôt fai-35 bles. Four être utiles en vue des processus de transformation enzymatiques, les particules de réactif doivent être de grosseur filtrable en vue d'empêcher l'entraînement des enzymes d'un stade 69 04059 3 2002181 du processus à un stade ultérieur dans lequel leur présence n'est pas désirée. Par conséquent, des particules de grandes dimensions sont indispensables. La présente invention offre un procédé au moyen duquel des 5 particules initialement petites telles que des hématies, des cellules microbiennes et des particules inertes enrobées de gélatine peuvent être utilisées en tant que particules de support auxquelles un ou plusieurs revêtements de matière protéinique peuvent être fixés par des liaisons de covalence au moyen d'agents 10 de copulation chimiques. Plusieurs de ces revêtements peuvent être formés sur les particules de support de manière que leur grosseur et leur poids finals soient beaucoup plus grands que dans les particules initialement disponibles. En suivant ce mode opératoire, on peut acquérir une plus grande maîtrise sur la réactivité dis-15 ponible pour la copulation de deux substances biologiques et sur la grosseur des particules. Les plus grands diamètres sont utiles du fait que les temps de sédimentation de particules de support telles qu'Escherichia coli peuvent être réduits à une période comprise entre 6 et 8 heures, par rapport aux temps de 12 et 18 heu-20 res qui sont exigés si ces particules ne portent aucun revêtement. En vue de préparer les particules réactives, oc ajoute tout d'abord des particules de s upport à surfaces extérieures de nature protéinique à un milieu liquide, puis on fixe par copulation au mcins une matière protéinique sur ces particules en utilisant un 25 premier agent de copulation chimique pour former un revêtement uniforme sur ces particules de support.Ensuite, on attache un second agent de copulatioï/chimique aux surfaces extérieures des particules uniformément revêtues de manière à présenter des groupes réactifs non fixés capables de réagir avec des substances 30 biologiques par formation de liaisons de covalence. En vue de former un réactif biologique insolubilisé par l'utilisation de cette particule réactive, il suffit simplement de mélanger une substance biologique avec les particules réactives dans un milieu liquide. Les groupes réactifs non fixés présents 35 sur les surfaces extérieures des particules réagissent alors avec la substance biologique et la lient par des liaisons de covalence aux surfaces extérieures en question. Comme décrit ci-dessus, on "U*tU07 4 ZUUZ l O I peut utiliser plusieurs revêtements de matière protéinique pour offrir une maîtrise appropriée de la grosseur des particules. Bien qu'une matière quelconque choisie dans une large gamme de matières biologiques puisse être fixée par copulation sur les 5 particules réactives de la présente invention, les substances douées d'activité antigénique fournissent les réactifs biologiques les plus intéressants. Ces substances sont des antigènes et des haptènes ayant des propriétés immunologiques et des enzymes possédant des propriétés enzymatiques. Ces substances sont appelées 10 ci-après "substances actives antigéniques". Dans chaque étape des processus décrits ci-dessus, les agents de copulation et les matières protéiniques utilisés peuvent être choisis pour conférer une réactivité spécifique désirée auz surfaces extérieures, à tout stade donné. 15 D'autres avantages de la présente invention résident dans le fait que des groupes réactifs uniformes sont rendus disponibles par la matière protéinique à l'un quelconque des stades. Cette réactivité uniforme est possible par le fait que les groupes réactifs naturels présents sur les surfaces des particules.de support 20 telles que les globules rouges sanguins et les cellules microbiennes sont rendus inactifs lorsque ces particules sont revêtues de la matière protéinique. Comme autre avantage, étant donné que diverses matières protéiniques peuvent être utilisées et tant que revêtements, on peut utiliser des réactifs de copulation de 25 grande réactivité sans danger de rupture des enveloppes cellulaires des particules de support lorsque ces particules sont de nature cellulaire, puisque ces agents de copulation ne sont pas en contact avec les surfaces des cellules. Un autre avantage est qu'un colorant ou un pigment peut être ajouté dans l'un quelconque des revêtements 30 pour rendre plus visibles les particules de réactif. Lorsqu'on utilise des cellules microbiennes et des globules rouges sanguins comme particules de support, il est parfois avantageux d'éliminer tous les sites antigéniques naturels. Ceci est vrai en particulier lorsqu'on doit utiliser des cellules micro-35 biennes. Ceci est vrai également pour rechercher, dans des liquides biologiques, la présence de substances immunologiques dans \ lesquelles peuvent se trouver des anticorps relatifs aux groupes 69 04059 5 2002181 antigéniques, présents sur les particules de support, ce qui provoquerait une agglutination non spécifique et fausserait donc les résultats des essais si les sites antigéniques étaient laissés découverts. Ainsi, l'antigène ET des hématies de mouton, de cheval, 5 et "boeuf, l'antigène de Eorssman des hématies de mouton et les antigènes A, B et AB des hématies humaines peuvent tous être recouverts par le revêtement de matière protéinique. Les particules de support peuvent être des hématies, des cellules microbiennes, des particules enrobées de gélatine, ou leurs 10 mélanges. Les hématies utilisées comme particules de support peuvent être celles qui proviennent d'une grande diversité "d'animaux. A titre d'exemples d'hématies utilisables, on mentionne celles qui proviennent des animaux suivants : opossum, rat, lapin, cobaye, être humain, chèvre, cheval, mouton, alligator et tortue. Les héma-15 ties sont obtenues par prélèvement d'un échantillon de sang de l'animal et séparation des hématies du plasma par centrifugation. Les hématies sont ensuite récupérées et conservées dans une solution de chlorure de sodium physiologique avant de les faire réagir avec le premier agent de copulation. 20 Les cellules microbiennes utilisables comme particules de support dans la présente invention peuvent être celles de tout type de microorganisme auto-reproducteur qui se propage en dépendant ou non d'autres organismes. On peut utiliser des cellules bactériennes tant Gram-positives que Gram-négatives. On peut utiliser de même 25 des cellules de champignons et de protozoaires, ainsi que des particules virales. Ce sont généralement des organismes uni-cellulaires qui sont occasionnellement réunis en amas ou en groupes». Les cellules peuvent être utilisées sous cette forme, pourvu que leur groupement ne forme pas une particule de support assez grande pour que 30 le système d'essai qu'elle constitue ne s'agglutine pas en présence d'une substance qui est l'homologue de la substance anti-génique fixée aux cellules groupées. En général, les cellules microbiennes préférées sont des cellules bactériennes ou des groupes de ces cellules qui sont de morphologie et de grosseur uniformes et 35 qui ont des dimensions extérieuies maximales dans une direction d'environ 0,2 à 10 microns. Bien que ceci ne soit pas préféré, on peut utiliser un mélange de cellules différentes, mais uniformes. 69 04059 6 2002181 Parmi ces bactéries, les cellules microbiennes utilisables comprennent celles de la Division I du Règne Végétal, entrant dans l'Ordre I des Classes I, II et III. Les cellules de l'Ordre I de la Classe III comprennent les particules virales intracellulaires 5 gui ont des dimensions maximales d'environ 0,2 micron. On peut se référer à l'ouvrage intitulé "Bergey's Manual of Determinative Bacteriology" de R.S. Breedy E.G-.D. Murray, U.E. Smith, 7ème .édition, 1947» "Williams and Wilkins Company", pour 1'énumération complète des cellules bactériennes utilisables. Les 10 bactéries particulièrement utiles sont celles de la Classe II, Sous-ordre II, Famille IY (Pseudomonadaceae) et celles de la Classe II, Ordre IV, Famille IV (Enterobacter&aceae). Toutes les tribus de I à V sont considérées comme représentant des cellules microbiennes préféréès aux fins de la présente invention. De même, dans 15 la Classe II, Ordre IV, les Familles V (Brucellaceae), X (Lacto-bacillaceae) et XIII (Bacillaceae) sont considérées comme préférées. Les organismes des Ordres I et II de la Classe III peuvent être utilisés lorsque de plus petites grosseurs de particules d'environ 0,2 micron ou moins sont désirées. En particulier, les virus 20 de l'Ordre II ont une faible dimension qui limite leur utilité. Escherichia coli est une cellule bactérienne particulièrement préférée aux fins de l'invention. Une autre cellule microbienne particulièrement préférée est la levure de bière communément disponible,' Saccharomyces cerevisiae. Les stades de croissance des 25 cellules de levures sont également utilisés de préférence en tant que particules de support. D'autres cellules microbiennes préféréès sont- Bacillus sub-tilis, Lactobacillus leichmanni, Bacillus pumilus et Pseudomonas f ragi. 30 Ces cellules microbiennes peuvent être obtenues en cultivant une souche de chacune d'elles dans un milieu nutritif. Les cellules peuvent ensuite être récoltées à leur stade de croissance maximale. Les particules de support à surface rendue protéinique peuvent être formées en revêtant des particules insolubles ayant 35 une gamme de diamètres d'environ 0,1 à 10 microns, avec de la gélatine, matière protéinique, au moyen d'un procédé tel que le revêtement par coacervatiori ou l'enrobage. Par exemple, des par 69 04059 2002181 ticules de polystyrène telles que celles décrites dans le brevet des Etats-Unis d'Amérique E"0 3 234 096 peuvent être enrobées en les émulsifiant dans une solution de gélatine puis en séchant l'émulsicn par pulvérisation. Il suffit de déposer un mince film 5 de gélatine sur les surfaces des particules pour que les agents de copulation puissent réagir avec elle. De même, on peut préparer des particules de support entièrement à partir de gélatine en association avec des agents de réticulation appropriés tels que la polyacroléine solubilisée. 10 les agents de copulation chimiques utilisables soit comme premier, soit comme second agent de copulation chimique conformément à la présente invention, sont généralement des composés qui portent deux ou plusieurs des groupes réactifs suivants : azo, acide sulfonique, groupes fluoro activés par des groupes nitro, 15 azide, imine et groupes chloro réactifs reliés à un noyau ayant des structures de résonance appropriées. Ces groupes réactifs sont capables de réagir avec les groupes aminé primaire, sulfhydryle (mercapto), carboxyle et hydrcxyle des matières constituant les surfaces des particules de support et les matières protéiniques de 20 même que les substances biologiques devant être fixées par copulation aux particules réactives. Une liste représentative de ces agents de copulation compreiid la bis-diazobenzidine, l'acide bis-diazobenzidine-disulfonique, la tétra-azo-p-phénylènediamine, le difluorodinitrobenzène, la 25 difluorodinitrodiphényl-sulfone, un carbodiimide, le diisocyanate de toluène, le chlorure cyanurique, la dichloro-s-triazine, le per- chlorate de N-tertiobutyl-5-méthylisoxazolium, un dialdéhyde, un aldéhyde à insaturation ct,p, et des mélanges de ces substances. Certains de ces agents de copulation, notamment les agents de cya- 30 nuration, les dialdéhydes et les aldéhydes à insaturation a,p, sont capables de protéger les hématies et les cellules microbien-meme nés au mcment/où elles se fixent par copulation à des groupes portés sur les surfaces des cellules, de sorte que ces cellules sont ensuite stabilisées contre la lyse. Par conséquent, lorsque 35 ces agents de copulation sont utilisés, aucun traitement de stabilisation ou de protection séparé n'est nécessaire. En vue de l'utilisation du perchlorate de l-tertiobutyl-5-méthylisoxazolium, 69 04059 s 2002181 r \ la surface sur laquelle il doit être fixé par copulation doit être préalablement traitée avec un réactif de succinylation tel que 1'anhydride succinique. Les carbodiimides qui peuvent être utilisés sont, entre au-5 très, les suivants : N,F'-dicyclohexyl carbodiimide, chlorhydrate de 1-éthyl-3(3-diméthylaminopropyl)-carbodiimide et métho-p-1oluène-sulfonate de 1-cyclohexyl-3(2-morpholinyl-(4)-éthyl-carbodiimide). Un difluorodinitrobenzène particulier qui peut être utilisé est le 1,3-difluoro-4>6-dinitrobenzène et un exemple de difluorodini-10 trodiphénylsulfone qui peut être utilisée est la. p,p'-difluoro-m,m'-dinitro-diphénylsulfone. La substance de revêtement des particules de support peut être une substance protéinique quelconque telle que les sérum-albumines ou les sérum-globulines obtenues de diverses espèces 15 animales ou peut être une autre substance" uniforme telle que les myoglobines ou les hémoglobines. On préfère en particulier la sérum-albumine de boeuf qui est facilement disponible. D'autrès matières telles que 1'ovalbumine, les globulines oc,|3 et Y peuvent aussi être utilisées, comme peuvent l'être également la {3-lipopro-20 téine et la thyroglobuline. Il est généralement désirable que la substance de revêtement utilisée soit suffisamment homogène pour- que son utilisation permette d'obtenir une surface uniforme. Les substances mentionnées ci-dessus satisfont toutes à ce critère. Les substances biologiques qu'on peut faire réagir avec 25 les particules réactives de la présente invention pour former des réactifs biologiques insolubilisés peuvent être l'une quelconque d'une grande diversité de substances douées de propriétés actives antigéniques (comme mentionné ci-dessus). Par conséquent, on peut utiliser divers antigènes possédant des propriétés immunologiques, 30 y compris ceux mentionnés ci-dessus comme pouvant être utilisés en tant que ma.tière de revêtement. En plus des substances mentionnées ci-dessus, on peut utiliser les suivantes : sérum-albumine humaine, gonadotropine chorionique humaine (G-CH), antigène des groupes sanguins A et B, a-glabulines de la. fraction de plasma humain, 35 Y -globulines de différentes espèces animales, transferrine humaine, antigène de Trichinella et matières antigéniques analogues d'organismes pathogènes ou naturels, la lutéostimuline, l'insuline et 69 04059 s 2002181 les dérivés protéiniques purifiés de 1a. tuberculine. Une autre classe de substances à activité antigénique qui peuvent être fixées par copulation aux particules réactives comprend les enzymes tels que diastase, maltase, zymase, amylase 5 et autres enzymes. Lorsqu'un enzyme est fixé par copulation à une particule de support, il peut être utilisé -pour effectuer des processus de transformation enzymatique d'une manière préférée. Ainsi, les trois premiers enzymes de 1'én.umération donnée ci-dessus peuvent être utilisés dans un procédé à trois étapes pour la trans-10 formation d'amidon en alcool, tandis que le dernier enzyme de cette énumération peut être utilisé pour transformer des empois d'amidon en solutions sucrées. L'avantage de l'utilisation des enzymes sous une forme insolubilisée en les fixant par copulation . sur des particules réactives conformément à la présente invention 15 est que les enzymes ne se confondent pas avec la substance en cours de traitement. Les particules sont retenues dans une position fixe ou emprisonnées dans un lit à travers lequel la. matière en cours de transformation peut passer. A titre d'autre exemple de processus de transformation enzymatique, des mélasses "black-20 strap" peuvent être transformées en alcool en fixant par copulation de l'invertase et de la zymase sur des particules réactives puis en faisant passer les mélasses sur ces particules. Il est également possible, par l'application de la présente invention, de fixer par copulation plusieurs de ces diffé-25 rentes substances actives antigéniques sur la couche extérieure de revêtement simultanément, en vue de fournir des particules réactives douées de réactivité multiple. Ainsi, on a fait réagir simultanément la Y -globuline humaine et 1a. Y -globuline de boeuf pour former des particules de réactif capables de déceler l'une 30 et l'autre de ces substances dans des échantillons biologiques par une inhibition du test d'agglutination. De même, la sérum-albumine de boeuf, la Y*-globuline humaine et la Y -globuline de boeuf ont été utilisées peur conférer une réactivité multiple au réactif biologique insolubilisé préparé conformément èj/La présente inven-35 tion. Etant donné que les anticorps relatifs à ces diverses substances sont des molécules de Y -globuline modifiées de telle façon 69 04059 io 2002181 qu'elles portent des sites récepteurs antigéniques pour les antigènes dont elles sont les contreparties immunologiques, la présence des anticorps-peut être mise en évidence par leur réaction avec leur antigène respectif ou l'anticorps relatif à la Y* -globu-5 line à partir de laquelle ils ont été formés. Les substances immunologiques antigéniques mentionnées ici sont des substances qui, lorsqu'elles sont introduites dans le système circulatoire d'un animal, produisent des anticorps spécifiques de cette substance antigénique particulière. Ces substances antigéniques comprennent 10 les sérum-protéines telles que la T -globuline et la sérum-albumine ou les substances des groupes sanguins "A" et "B" à partir desquelles des recherches de groupe sanguin peuvent être faites ainsi que les autres antigènes énumérés ci-dessus. L'expression "contrepartie imrrunologique" utilisée ci-dessus 15 désigne soit un antigène, soit un anticorps qui réagit spécifiquement avec l'anticorps ou l'antigène correspondant. Comme mentionné ci-dessus, les particules réactives peuvent être pourvues d'un colorant ou d'un pigment en vue d'améliorer le contraste visuel offert par les réactifs biologiques insolubilisés 20 finals par rapport au fond environnant. Des pigments tels que l'hématoxyline, la fuchsine et le violet cristallisé peuvent être utilisés à cette fin. Un autre traitement préparatoire optimal des cellules microbiennes consiste à les laver avec un solvant organique tel que des alcools, des éthers, etc, pour éliminer toutes 25 couches de polysaccharides ou de cires qui peuvent être présentes et pourraient gêner la réaction entre les particules de support et les agents de copulation. Les réactifs biologiques insolubilisés de la présente invention peuvent être utilisés en tant que particules d'indicateurs 30 immunologiques en faisant réagir les particules réactives avec des substances à activité antigénique spécifiques. Lorsque la contrepartie imrrunologique de la matière fixée par copulation sur les particules réactives doit être directement décelée par l'utilisation des particules d'indicateur immunologique, le test est appelé 35 test d'agglutination directe et est conduit en mélangeant les particules d'indicateur avec un échantillon d\j^Liquide soupçonné de contenir la contrepartie immunologique et en observant le résul 69 04059 n 2002181 tat d'agglutination ou de non agglutination obtenu. L'apparition d'une agglutination dénote la présence de la substance recherchée, tandis que 1!absence d'agglutination dénote l'absence de cette substance. Le test d'agglutination peut être effectué en fixant par 5 copulation un antigène aux particules réactives de la présente invention, puis en décelant directement 1a. présence de la contrepartie immunologique dans l'échantillon liquide. Les mêmes particules d'indicateur peuvent être utilisées pour déceler une matière ayant un site réactif analogue à la substance 10 immunologique fixée aux particules réactives par inhibition du test d'agglutination. Par exemple, lorsqu'on recherche un antigène, on peut ajouter une certaine quantité de l'anticorps respectif au milieu testé avant ou en même temps que les particules d'indicateur, qui consistent en particules réactives fixées par co-15 pulation à l'antigène. Si le liquide de l'échantillon contient l'antigène, ce dernier réagit avec l'anticorps ajouté au milieu d'essai et l'anticorps est ainsi incapable de s'agglutiner avec le système indicateur. Par conséquent, 1'agglutination qui se produirait autrement est inhibée et les réactifs biologiques forment 20 une sédimentation dans le récipient d'essai. Cet essai d'agglutination peut être effectué avec les particules d'indicateur appropriées pour déceler la présence soit de l'anticorps, soit de l'antigène dans des échantillons liquides. On peut donc déceler soit un antigène, soit un anticorps avec les particules d'indicateur 25 de la présente invention. Le test d'agglutination et l'inhibition de ce test sont normalement conduits conformément à deux méthodes. L'une est appelée méthode d'agglutination sur lame et l'autre est appelée méthode d'agglutination à l'appareil de micro-titrage. La première est 30 basée sur le mélange des réactifs d'essai et de l'échantillon liquide sur une surface plane de verre et est généralement conduite ■ sur une base purement qualitative en vue de déceler une concentration prédéterminée de la. matière que l'on recherche. L'autre est conduite en plaçant les réactifs d'essai pour chaque test dans une 35 série de cavités ménagées en rangée à la face supérieure d'une plaque de matière plastique ou autre plaque appropriée. La disposition linéaire des cavités permet 1^/dilution en série de l'anticorps 69 04059 12 2002181 utilisé pour le test d'agglutination ou d'inhibition de l'agglutination. la dilution en série est effectuée en plaçant tout d'abord une goutte d'un diluant dans chaque cavité de la rangée puis en ajoutant un volume d'une goutte d'une solution d'anticorps ini-5 tiale ayant une dilution initiale de, par exemple, 1:5, à lgfcremiè-re cavité en utilisant un fil terminé en anse ou en hélice étalonné .pour retenir une goutte de liquide. Ensuite, on plonge l'anse dans la première cavité et .on prélève une goutte de liquide qu'on mélange ensuite avec le diluant contenu dans la seconde 10 cavité. La dilution de la première cavité est alors de 1:10 et celle de la seconde cavité est de 1:20. Ce processus de dilution en série est répété jusqu'à ce que toutes les cavités de la rangée aient été traitées, ce qui produit une série de solutions d'anticorps dans chaque cavité différant d'un facteur 1/2 de la 15 cavité précédemment traitée. Pour le test d'agglutination, on ajoute directement aux cavités une goutte d'une suspension de particules d'indicateur en suivant les préparations des dilutions en série. Si l'on doit effectuer une inhibition du test d'agglutination, on ajoute dans chaque cavité uneyfcjuantité d'antigène non r 20 fixé q&i généralement excède la quantité d'anticorps, avant l'addition du réactif biologique insolubilisé. Lorsque des tests doivent être effectués sur des échantillons de liquides corporels, ces échantillons sont ajoutés en tant qu'antigène et, en général, les dilutions en série de l'anticorps sont réglées de manière que 25 la concentration de l'anticorps équivalant à la concentration de l'antigène que l'on s'attend à déceler se situe dans la partie médiane de la dilution en série. Cette façon de procéder permet une identification du titre.de 1'antigène dans l'échantillon de liquide corporel et par conséquent un dosage semi-quantitatif de 30 cet antigène. Les procédés de fabrication des particules réactives et des réactifs biologiques insolubilisés de la présente invention impj_iquen1/&iverses étapes de réaction dont toutes peuvent être et sont de préférence conduites à la température ambiante dans un 35 nombre quelconque de milieux liquides tamponnés. Les particules de support sont dispersées dans le milieu liquide de manière qu'elles aient une concentration en suspension de 1 à 10 On fait 69 04059 13 2002181 ensuite réagir ces particules de support avec le premier agent de copulation à la température ambiante (20 à 25°C) pendant une période de temps suffisante pour permettre la réaction, habituellement moins d'une heure. On fait réagir les particules de sup-5 port ainsi traitées avec la première substance de revêtement par addition de cette substance à un milieu liquide dans lequel ces particules traitées et réactives se trouvent en suspension. La réaction peut être effectuée pendant une période de temps inférieure à 1 heure, à la température ambiante. Cette série d'éta-10 pes, à savoir la réaction avec un agent de copulation puis avec la substance de revêtement, peut être répétée avec succès un nombre de fois quelconque désiré en vue de former à volonté une particule ayant les dimensions et le: poids désirés, pour toute application particulière. Lorsque les dimensions et le poids désirés ont 15 été obtenus, la particule peut être rendue réactive par traitement avec un second agent de copulation, qui peut être conduit conformément à la description donnée ci-dessus pour le premier agent de copulation, et la particule réactive ainsi préparée peut être ensuite amenée à réagir directement avec l'une quelconque des subs-20 tances biologiques décrites ci-dessus. Cette réaction avec les substances biologiques est conduite de la même manière dans un milieu liquide, à la température ambiante. En général, les agents de copulation utilisés dans la présente invention possèdent une réactivité suffisamment grande peur 25 réduire le temps nécessaire pour la copulation à des périodes de temps de 10 à 30 minutes, à la température ambiante. Les cellules microbiennes sont les particules de support préférées, car elles s'obtiennent facilement au moyen de techniques de culture bien connues. Bien qu'aucun agent de copulation 30 -particulier ne soit pi'éféré par rapport aux autres, la bis-diazo-benzidine (BDB) peut être utilisée pour toutes les matières de revêtement et substances biologiques mentionnées ici. La matière protéinique préférée utilisée pour former les revêtements autour des particules de support est la sérum-albumine de boeuf. 35 Les particules réactives préférées peuvent ensuite être formées en cultivant des cellules microbiennes ayant des caractéristiques non pathogènes telles qu'Escherichia coli^, en récoltant 69 04059 m 2002181 ces cellules puis en les faisant réagir à la température ambiante dans un milieu liquide avec la BDB. les particules de support traitées peuvent ensuite être revêtues avec la. sérum-albumine de boeuf (SAB) par réaction avec cette albumine dans un milieu 11 -5 quide à la température ambiante pendant environ 15 minutes. La particule de support revêtue peut ensuite être rendue réactive par une autre application."de BDB. Les particules réactives ainsi produites peuvent être amenées à réagir directement avec l'une quelconque des substances biologiques décrites ci-10 dessus pour former des particules d'indicateur immunologique ou des réactifs de transformation enzymatique. D'autres caractéristiques et avantages de la présente invention ressortir ont des exemples suivants qui sont donnés: à titre explicatif, mais nullement limitatif. L'expression "solution 15 de chlorure de sodium" désigne une solution physiologique de chlorure de sodium de concentration égale à 0,85 $. EXEMPLE 1 On lave trois fois dans une solution de chlorure de sodium 10 ml d'une suspension à 2,5 % de cellules de E. coli traitées 20 à la formaline. Après la dernière centrifugation, on jette la liqueur surnageante et on remet en suspension 0,25 ml des cellules agglomérées dans 6 ml de tampon de phosphate à un pH de 7,33. Ensuite, on ajoute à la suspension 5 ml de sérum-albumine de boeuf (SAB) dans une solution de chlorure de sodium (40 mg/5 ml). On 25 ajoute ensuite 20 rcl de bis-diazobenzidine diluée à 1:5 dans le tampon de phosphate et la solution de chlorure de sodium, pH 7,3> et on place le mélange total sur une secoueuse méeanique rotative pendant 20 minutes à la température ambiante. Les cellules prennent une couleur brunâtre pendant cette période de temps. La pré-30 paration est ensuite centrifugée et remise en suspension dans la SAB à 0,6 ^ dans la solution de chlorure de sodium, et on la laisse encore réagir pendant 15 minutes à la température ambiante. On la lave ensuite trois fois avec la solution de chlorure de sodium, et on la conserve en vue de son utilisationjfcomme parti-35 cules de support revêtues. 69 04059 15 2002181 EXEMPLE 2 Les particules de support revêtues de l'exemple 1 sont fixées par copulation sur une substance biologique, à savoir la gonadotropine chorionique humaine (GCH) en utilisant un carbodi-5 imide. On lave une fois avec la solution de chlorure de sodium 0,25 ml des particules de support agglomérées revêtues de SAB. On leur ajoute 2 ml de GCH contenant 10 mg d'hormone par ml et on agite la préparation. On ajoute ensuite à la suspension de 10 cellules une solution de 0,2 g de U,ÏT'-dicyclohexyl carbodiimide dans 0,5 ml de tétrahydrofuranne et 1 ml d'eau. On fait incuber la préparation à la température ambiante pendant environ 18 heures sans interrompre l'agitation par secousses. On lave ensuite les cellules trois fois avec 20 ml de carbonate de sodium 0,01 N, 15 puis trois fois avec de l'acide chlorhydrique 0,01 F et trois fois avec 30 ml d'eau distillée en vue de les débarrasser de l'agent de copulation en excès. Finalement, les cellules sont lavées deux fois avec une solution de chlorure de sodium à 0,6 'fo de SAB puis remises en suspension à 4 % de cellules dans la même solution. Le 20 produit obtenu se compose des particules de support (E. coli) revêtues de SAB et présente alors une surface extérieure de' GCH qui est fixée par copulation au revêtement de SAB au moyen du carbodiimide utilisé comme agent de copulation. Ce réactif biologique a été éprouvé contre 1'antisérum de lapin relatif à la 25 GCH et avec le sérum de lapin normal en utilisant tant la méthode d'agglutination sur' lame que la méthode d'agglutination à l'appareil de micro-titrage. Les résultats ont montré que le réactif formé est très sensible à la GCH et spécifique de cette hormone, sans indice d'agglutination non spécifique. 30 EXEMPLE 3 On répète l'exemple 2 en utilisant comme agent de copulation le même carbodiimide, avec 2 ml d'une solution contenant 40 mg d'insuline à la place de la GCH et avec 2 ml de solution de sérum-albumine humaine (SAH) contenant 10 mg de l'antigène. Ces réac-35 tifs biologiques ont été éprouvés de la même façon contre un antisérum de lapin relatif à chacune de ces substances biologiques et contre du sérum de lapin normal, en donnant des résultats analogues. . 69 04059 2002 IS l r "i EXEMPLE 4 Les particules de support revêtues de l'exemple 1 sont rendues réactives par addition de réactif de Woodward L après un traitement de succinylation initial. Ces particules réactives 5 sont ensuite liées séparément par copulation avec la SAH et l'insuline. On centrifuge ensuite 0,25 ml des particules de support revêtuee^Le SAB et agglomérées, puis on lave la liqueur surnageante trois fois avec de l'eau distillée. On ajoute ensuite la liqueur 10 surnageante à 20 ml de solution aqueuse à 0,1 % de bicarbonate de sodium, et on agite. On ajoute alors 3 mg d'anhydride succinique et on agite la suspension par secousses pendant une nuit à 4°C. Les cellules sont ensuite lavées trois fois à l'eau distillée, remises en suspension dans 5 ml d'eau distillée et on ajoute à la 15 suspension 10 microlitres de triéthylamine, en agitant. On ajoute ensuite 17 mg de réactif de Woodward L (perchlorate de ÎT-tertiobu-tyl-5-méthylisoxazolium), puis on ajoute au bout de 10 minutes la substance biologique devant être liée par copulation. En vue de la première copulation, on ajoute 10 mg de SAH 20 dans 2 ml de solution de chlorure de sodium, on agite le mélange par secousses à 25°C pendant une nuit, on lave trois fois à l'eau distillée et on remet en suspension dans 5 ml d'eau distillée. En vue de l'essai d'agglutination et d'inhibition de l'agglutination, on remet le réactif biologique en suspension dans la solu-25 tion de chlorure de sodium contenant 0,6 % de SAB. Ce processus de copulation est ensuite répété pour une seconde copulation dans laquelle 2 ml de solution de chlorure de sodium contenant 0,2 % d'insuline sont ajoutés à la suspension de particules réactives. 30 EXEMPLE 5 On prépare des particules de support revêtues en suivant le mode opératoire de l'exemple 1, excepté qu'on utilise 10 mg de SAB dans 25 ml de solution de chlorure de sodium et 10 ml de bis-diazobenzidine diluée à 1:5 dans la solution de chlorure de 35 sodium tamponnée au phosphate, à un pH de 7» 3. Ces particules servent ensuit^&e particules de support, comme suit : Les particules revêtues sont remises en suspension dans le tampon de phos- 69 04059 17 2002181 phate à un pH de 7» 3 à 7>4 et on ajoute les dilutions de sut s-tances actives antigéniques en solution de chlorure de sodium suivantes, à des lots séparés de suspension de particules : Y -globu-line de cheval 100 UA (unités d'antitoxine) et 200 UA dans 2,5 ml 5 de solution de chlorure de sodium ; un mélange de Y" -globuline humaine, 20 mg dans 2,5 ml de solution de chlorure de sodium, et de Y -globuline de boeuf dans 2,5 ml de solution de chlorure de sodium ; 1 ml de sérum humain dans 1,5 ml de solution de chlorure de sodium ; et 1 ml de plasma humain dans 1,5 ml de solution de 10 chlorure de sodium. On ajoute ensuite 10 ml de BDB diluée à 1:80 dans le tampon de phosphate,à un pH de 7»3 à 7,4, à chaque échantillon et or. agite par secousses le mélange obtenu pendant 20 à 30 minutes à la température ambiante pour permettre la réaction de la BDB avec les particules de support poui' former des particules 15 réactives, puis fixer les substances biologiques par copulation aux particules réactives au moyen de la BDB. Les réactifs biologiques sont ensuite lavés séparément avec la solution de chlorure de sodium et remises en suspension dans cette solution qui contient, pour certains des échantillons, 1 io de sérum de lapin 20 normal (SLN) ou 0,6 $ de SAB. Ces réactifs biologiques sont ensuite utilisés pour les tests d'agglutination et d'inhibition de l'agglutination conformément à la technique de micro-titrage. Les résultats montrent que les réactifs permettent la détection spécifique des antigènes 25 fixés et de leur anticorps. Des temps de sédimentation d'environ 6 à 8 heures sont observés peur ces réactifs", comparativement à des temps de 12 à 18 heures pour des réactifs préparés avec des particules de support (E. coli) non revêtues. EXEMPLE 6 30 Des particules de support sont préparées avec deux revête ments primaires, un premier revêtement de SAB et un second revêtement de Y -globuline humaine, et sont ensuite liées par copulation à un antigène, la Y* -globuline de boeuf. Le premier revêtement est ajouté en suivant le mode opératoire de l'exemple 1 35 excepté qu'on utilise 5ml de suspension à 2,5 ^ de cellules de E. coli traitées à la formaline, 10 mg de SAB dans 2,5 ml de solution de chlorure de sodium et 10 ml de BDB diluée à 1:5 dans 69 04059 18 2002181 une solution de chlorure de sodium tamponnée au phosphate, à un pH de 7,3 à 7,4. On ajoute ensuite 20 mg de Y -globuline humaine dans 2,5 ml de solution de chlorure de sodium à 0,125 ml des cellules 5 rassemblées puis 10 ml de BDB diluée à 1:80 dans la solution dé chlorure de sodium tamponnée au phosphate et on place le mélange sur un agitateur rotatif à secousses pendant -20 minutes à la température ambiante, la préparatior/fest ensuite centrifugée et remise en suspension dans la solution de chlorure de sodium, puis 10 on la laisse encore réagir pendant 15 minutes à la température ambiante, les particules de support portant le double revêtement sont ensuite lavées trois fois avec la solutioi)ÉLe chlorure de sodium, puis on ajoute 20 mg de Y-globuline de boeuf dans 2,5 ml de solution de chlorure de sodium aux cellules rassemblées, et 15 ensuite 10 ml de BDB diluée à 1:160 dans une solution dè chlorure de sodium tamponnée au phosphate. On place le mélange sur une secoueuse rotative pendant 20 minutes à la température ambiante, puis on le centrifuge et on le traite comme ci-dessus pour permettre à la réaction de se poursuivre. 20 Ce réactif biologique a permis des tests immunologiques de recherche de la Y -globuline de boeuf et son anticorps. Un type de particules de support revêtues analogue est préparé en suivant étroitement le processus ci-dessus, en utilisant les cou'ches primaires suivantes : SAB, SAB et r -globuline humaine. 25 L'antigène fixé par copulation àcette particule de support à triple revêtement est la Y -globuline humaine. EXEMPLE 7 Quatre échantillons de 2 ml d'une suspension à 2,5 ^ de cellules de E. coli traitées à la formaline sont lavés trois fois 30 dans la solution de chlorure de sodium. Après la dernière centri-fugation, on jette la liqueur surnageante et on remet eu suspension les cellules rassemblées dans 1 ml de tampon au phosphate de sodium et potassium à un pH de 8,4. On ajoute ensuite les quantités d'agents de copulation mentionnées sur le tableau I à la 35 suspension de particules de support, après dissolution dans 2 fc d'acétone, et la préparation est agitée et mise à incuber pendant une demi-heure à 37°C puis centrifugée et remise en suspension 69 04059 19 2002181 10 15 dans 1 ml du tampon à pH 8,4 ci-dessus. Les matières protéiniques énumérées sur le tableau I sont ensuite ajoutéés en quantités comme indiqué dans 0,25 Ml du tampon à pH 8,4 et la. préparation est agitée, mise à incuber pendant 1 heure à 37°0, centrifugée, lavée trois fois avec 5 ml de solution de chlorure de sodium tamponnée au phosphate à un pH de 7,2, et remise en suspension dans 1,5 ml de solution de chlorure de sodium tamponnée au phosphate. Ensuite, on ajoute les substances actives antigéniques énumérées sur le tableau I en quantités comme indiqué dans 1,5 ml de solution de chlorure de sodium, on ajoute ensuite 5 ml de BDB diluée à 1:80 dans la solution de chlorure de sodium tamponnée au phosphate à un pH de 7,3 à 7,4, et on plane la préparation sur une secoueuse rotative pendant 20 minutes à la température ambiante, pour former les réactifs biologiques. On récupère ces réactifs par centrifugation, on les lave trois fois avec la solution de chlorure de sodium et on les remet en suspension dans la solution de chlorure de sodium en vue de l'utilisation. TABLEAU I 20 U° du lot Agent de copulation, en p.g Substance protéi- Substance active antigénique, en mg nique, en mg 25 1 DKDFB, * 25 2 DNDFB, 50 . 3 EEPS,** 25 4 ENPS, 50 Y -globuline de boeuf, 5 SAB, 10 Y-globuline de boeuf, 5 SAB, 10 30 SAB, 5 Y -globuline de boeuf, 2,5 SAB, 5 Y -globuline de boeuf, 2,5 * 1,3-dinitro-4,6-dinitrobenzène ** p,p'-difluoro-m,m'-dinitro diphényl sulfone Ces réactifs ont ensuite été utilisés avec succès chacun 35 pour le test immunologique de d étection de la présence des substances actives antigéniques et de leurs anticorps. 69 04059 20 2002181 EXEMPLE 8 2 ml d'une suspension à 2,5 i° de cellules de E. coli traitées à la formaline dans une solution de chlorure de sodium tamponnée au phosphate (STP) à un pH de 7,2 à 7,4 sont mélangés avec 5 2,5 mg de Y -globuline de boeuf dans 3 ml de STP. Ensuite, on ajoute 100 mg de chlorhydrate de 1-éthyl-3(3-diméthyl aminopropyl)-carbodiimide dissous dans 5 ml de solution de chloruré de sodium et on fait incuber la préparation pendant 1 heure à la température ambiante, en agitant par secousses. Les particules de support re-10 vêtues sont ensuite lavées trois fois avec 10 ml de STP contenant 1 tfo de sérum de lapin normal. Les particules sont ensuite remises en suspension dans 1,5 ml de solution de chlorure de sodium contenant 1> fo de sérum de lapin normal. Ces particules de support revêtues sont ensuite lavées une fois avec"le tampon de phosphate à 15 un pH de 8,4, remises en suspension dans 1,5 ml de ce tampon, puis . on mélange à la suspension 5 mg de SAB en suspension dans 1,5 ml de solution de chlorure de sodium et 5 ml de BDB diluée à 1:80 dans la solution de chlorure de sodium tamponnée au phosphate, à un pH de 7,2 à 7,4. La préparation est ensuite traitée comme dans l'exem-20 pie 1. Elle constitue un réactif immunologique prêt à l'emploi. EXEMPLE 9 Des particules de support revêtues sont préparées en suivant le mode opératoire de l'exemple 1, en utilisant 5 ml de cellules de E. coli traitées à la formaline, .1,25 ml de solution de. chlorure, de 25 sodium contenant 5 mg de T -globuline de boeuf et 10 ml de BDB diluée à 1:40 dans une solution de chlorure de sodium tamponnée à un pH de 7,2 à 7,4. Ensuite, on applique un revêtement extérieur de X -globuline de boeuf sur les particules en utilisant une méthode de copulation de BDB à deux étapes, dans laquelle les par-30 ticules revêtues sont mises en contact avec 5 ml de BDB diluée à 1:80 dans une solution de chlorure de sodium tamponnée au phosphate et réagissent avec l'agent de copulation pendant environ 20 minutes à la "température ambiante. Les particules réactives obtenues sont lavées avec lasolution de chlorure de sodium, puis on ajoute 35 5 mg de T -globuline de boeuf dans 1,25 ml de solution de chlorure de sodium et on laisse la réaction entre les particules et la 'V-globuline se poursuivre pendant 18 heures à la température 69 04059 2002181 10 15 ambiante sans interrompre l'agitation par secousses, après quoi on les traite de la même manière que dans l'exemple 5. Cette méthode de copulation à.deux étapes a pour effet que les particules réactives sont formées séparément en utilisant la BDB sans que la substance biologique soit présente. EXEMPLE 10 En suivant les modes opératoires décrits dans les différents exemples précédents, on prépare plusieurs particules revêtues destinées à être utilisées dans la préparation de réactifs biologiques du type décrit ici. Le tableau II montre les particules de support, les agents de copulation et les substances protéiniques utilisées, ainsi que leurs quantités dans les diluants suivants : pour les particules de support : solution de chlorure de sodium ; pour la BDB : solution de chlorure de sodium tamponnée au phosphate, pH 7>2 à 7,4 ; pour les carbodiimides : tétrahydrofuranne ; pour le réactif de Woodward : traitement et diluant de l'exemplé 4 et pour les matières p rotéiniques : solution de chlorure de sodium. TABLEAU II 20 Particules de support, 10 ml de suspension à 2,5 % Agent de copulation et quantité Substance protéinique et quantité 30 25 E. coli 35 DCC* Carbodiimide 0,2 g dans 0,5 ml Réactif de Woodward L 17 mg Réactif de Woodward L 17 mg BDB 20 ml, dilution 1:5 BDB 20 ml, dilution 1:5 Carbodiimide de Marier* 0,05 mg dans 5 ml sérum-albumine humaine 10 mg dans 2 ml sérum-albumine humaine 10 mg dans 2 ml Y* globuline de cheval 400 UA dans 2 ml sérum-albumine humaine 3 mg dans 5 ml X -globuline de cheval 200 UA dans 5 ml sérum-albumine humaine 10, 20, 40 et 80 mg dans 1 ml 69 04059 22 2002181 TABLEAU II (Suite) 5 Particules de support, 10 ml de suspension à 2,5 # Agent de copulation et quantité Substance protéinique et quantité Lactobacillus leichmannii BDB, 20 ml, dilution 1:5 BSA. 40 mg dans 5 ml !! BDB 20 ml, dilution 1 :5 Y" -globuline de cheval 10 200 UA dans 5 ml Bacillus pumilus BDB 20 ml, dilution 1 : 5 sérum-albumine humaine 3 mg dans 5 ml !! BDB 20 ml, dilution 1 :5 Y -globuline humaine 200 UA dans 5 ml 15 !! Réactif de Woodward L W mg sérum-albumine humaine 10 mg dans 2 ml Bacillus subtilis BDB 20 ml, dilution 1 ;5 sérum-albumine humaine 3 mg dans 5 ml 20 1! BDB 20 ml, dilution 1 : 5 "Y -globuline de cheval 200 UA dans 5 ml Pseudomonas fraei BDB 20 ml, dilution 1 :5 sér.um-albumine humaine 3 mg dans 5 ml » BDB 20 ml, dilution 1 :5 -globuline de cheval 25 200 UA dans 5 ml H DCC* Carbodiimide 0,2 g dans 0,5 ml sérum-albumine humaine 10 mg dans 2 ml * le - carbodiimide DCC est le ïr,ïP-dicyclohexyl- et" le 30 carbodiimide et le carbodiimide de Merler est le métho-p-toluènesulfonate de 1 -cycloh.exyl-3( 2-morpholinyl-(4)-éthyl carbodiimide). ■ Chaque type de ces particules de support revêtues peut être utilisé avec les agents de copulation mentionnés ici pour former des particules réactives qui peuvent être utilisées pour 69 04059 23 2002181 insolubiliser une large gamme de s-ubstances biologiques et pour produire des réactifs à partir d'elles. EXEMPLE 11 Les particules de support revêtues peuvent être lyophilisées 5 en vue de la conservation à sec. On décrit ci-après un procédé de lyophilisation. 5 ml de suspension à 2,5 de cellules de E. coli traitées à la formaline sont lavées trois fois avec la solution de chlorure de sodium, remises en suspension dans 3 ml de solution de chlo-10 rure de sodium tamponnée au phosphate, à un pH de 1,2 à 7>4j et on ajoute à la .. suspension 2,5 mg de GCH (2590 unités internationales par ml), dissous dans 2,5 ml de solution de chlorure de sodium. Ensuite, on ajoute 10 ml d'une dilution à 1:5 de DBD dans une solution de chlorure de sodium tamponnée au phosphate, à un 15 pH de î,2 à 7>4, et on fait tourner la préparation pendant 20 minutes, puis on la lave une fois avec la solution de chlorure de sodium et deux fois avec une solution de chlorure de sodium contenant 0,6 fo de SAB. On ajuste ensuite la concentration des cellules entre 3 et 4 i° après centrifugation en ajoutant une solu-20 tion de chlorure de sodium contenant 0,6 $ de SAB et 6 ^ de saccharose. Cette préparation est ensuite déposée sous forme de gouttes séparées sur des lames de verre et en quantités de 0,5 et 1,0 ml dans des fioles de verre et lyophilisées pendant 24 à 48 heures entre -40°C et -51°C sous un vide de moins d'environ 25 150 microns de mercure. Les fioles de verre sont bouchées sous vide et conservées en unlieu de faible humidité. Les particules revêtues ainsi séchées sont stables pendant des périodes de temps indéfinies. 69 04059 24 2002181 - BEVEHDICATIOMS - 1) Particule réactive appropriée à l'utilisation dans un réactif "biologique contenant un grand nombre de particules semblables, caractérisée par le fait que cette particule est capable 5 d'une fixation chimique directe à une substance biologique et comprend une particule de support solide présentant une portion de surface extérieure protéinique, au moins un revêtement de matière protéinique recouvrant cette portion de surface extérieure extérieure chaque revêtement ayant également une portion de surface/protéini-10 que, au moins un premier agent de copulation fixant ce revêtement à la portion de surface extérieure protéinique directement sous-jacente par une liaison de covalence, et un second agent de copulation attaché au revêtement protéinique le plus extérieur par . une liaison de covalence et capable de réaliser par une liaison 15 de covalence une fixation de la particule revêtue à la substance - biologique. 2) Particule réactive suivant la revendication 1, caractérisée en ce que la particule de support est choisie parmi les globules rouges sanguins, les cellules microbiennes et les parti- 20 cules à surface enrobée de gélatine. 3) Particule réactive suivant la revendication 1, caractérisée par le fait que la particule de support a un diamètre maximal d1 environ 10 microns. 4) Particule réactive suivant la revendication 1, caracté-25 risée par le fait que la matière protéinique est choisie parmi les albumines et les T -globulines. 5) Particule réactive suivant la revendication 1, caractérisée par le fait que plusieurs revêtements superposés de matière protéinique recouvrent la particule de support. 30 6) Particule réactive suivant la rerendication 1, caracté risée par le fait que le premier et le second agent de copulation sont choisis parmi la bis-diazobenzidine, l'acide bis-diazobenzi-dine-disuLfonique , la tétraazo-p-phénylène-diamine, le difluorodinitrobenzène, la difluorodinitrodiphénylsulfone, un carbodiimide 35 le diisocyanate de toluène, le chlorure cyanurique, la dichloro-s-triazine, le perchlorate de N-tertiobutyl-5-méthylisoxazolium, un dialdéhyde, un aldéhyde a, (3-insaturé, et des mélanges de ces 69 04059 25 2002181 composes. 7) Particule réactive suivant la revendication 1, caractérisée par le fait que le second réactif de copulation est la bis-diazobenzidine. 5 8) Particule réactive suivant la revendication 1, caracté risée par le fait qu'elle a des dimensions telles qu'elle permet la formation de motifs d'agglutination lorsque plusieurs de ces particules fixées par copulation à une substance immunologique sont amenées en contact lavec la contrepartie de cette substance. 10 9) Procédé de préparation de particules réactives capables d'une fixation chimique directe à des substances biologiques, caractérisé par le fait qu'il consiste à ajouter à un milieu liquide des particules de support portant des portions de surface protéinique extérieure, à fixer par copulation sur ces particules 15 au moins une substance protéinique en utilisant un premier agent de copulation pour former ainsi un revêtement protéinique sur les particules de support individuelles, puis à attacher à ces particules revêtues un second agent de copulation permettant la fixation des particules revêtues aux substances biologiques. 20 10) Procédé suivant la revendication 9, caractérisé par le fait que les particules de support ont un diamètre maximal d'en viron 10 microns. 11) Procédé suivant la revendication 9 » caractérisé jar le fait que plusieurs revêtements superposés de matière protéini-25 que sont fixés par copulation aux particules de support avant la fixation à ces particules dusecond agent de copulation. 12) Procédé suivant la revendication 9, caractérisé par le fait que les particules de support sont choisies parmj^Les globules rouges sanguins, les cellules microbiennes et les parti- 30 cules à surface enrobée de gélatine. 13) procédé suivant la. revendication 9> caractérisé par le fait que la substance protéinique est choisie parmi les albumines et les "V-globulines. 14) Réactif biologique insolubilisé, caractérisé par le 35 fait qu'il comprend plusieurs particules de support présentant des portions de surface extérieure protéiniques, au moins un revêtement de substance protéinique fixé par des liaisons de co- 69 04059 2002181 valence aux particules de support individuelles au moyen d'un premier agent de copulation chimique, les particules revêtues portant une substance active antigénique qui est fixée à elles par l'intermédiaire d'un second agent chimique de copulation. 5 15) Réactif biologique suivant la revendication 14, carac térisé par le fait que les particules de support sont choisies parmi les globules rouges sanguins, les cellules microbiennes et les particules à surface enrobée de gélatine. 16) Réactif biologique suivant la revendication 14,carac- 10 térisé&ar le fait que les particules de support ont un diamètre maximal d'environ 10 microns. 17) Réactif biologique suivant la rewendication 14, caractérisé par le fait que la matière protéinique est choisie parmi les albumines et les Y*-globulines. 15 18) Réactif biologique suivant la revendication 14, carac térisé par le fait que plusieurs revêtements superposés de matière protéinique sont présents sur les particules de support. 19) Réactif biologique suivant la revendication 14, caractérisé par le fait que la substance active antigénique est choisie 20 entre les antigènes et les enzymes. 20) Réactif biologique suivant la revendication 14, caractérisé par le fait que le premier et le second agent de copulation sont choisis parmi la bis-diazobenzidine, l'acide bis-diazobenzi-dine-disulfonique, la tétraazo-p-phénylènediamine, le difluoro- 25 dinitrobenzène, la difluorodinitrodiphénylsulfone, un carbodiimide, le diisocyanate de toluène, le chlorure cyanurique, lg&iiûhloro-S-triazine, le perchlorate de ÏT-tertiobutyl-5-méthylisoxazolium, un dialdéhyde, un aldéhyde a,P-insaturé, et des mélanges de ces substances. 30 21) Réactif biologique suivant la revendication 14, carac térisé par le fait que la substance active antigénique est choisie parmi les substances immunologiques et les substances enzymatiques. 22) Réactif biologique suivant la revendication 14, caractérisé en ce qu'il est capable de déceler une substance immunolo- 35 gique et que 1a. substance active antigénique qu'il contient est la contrepartie immunologique de cette substance immunologique. 23) Procédé de préparation d'un réactif biologique insolu 69 04059 2î 2002181 bilisé, caractérisé par le fait qu'il consiste à ajouter à un milieu liquide des particules de support présentant des portions de surface extérieure protéiniques, à fixer par copulation sur ces particules au moins un revêtement de matière protéinique en uti-5 lisant un premier réactif chimique de copulation, puis en fixant par copulation une substance active antigénique à la matière protéinique portée par ces particules en utilisant un second agent de copulation chimique. 24) Procédé suivant la revendication 23, caractérisé par 10 le fait que le réactif biologique est récupéré du milieu liquide et séché jusqu'à un état anhydre. 25) Procédé suivant la. revendication 23, caractérisé par le fait que les particules de support sont choisies parmi les globules rouges sanguins, les cellules microbiennes et les particules 15 enrobées de gélatine. §6) Procédé suivant la revendication 23* caractérisé par le fait que la matière protéinique est choisie parmi les albumines et les Y -globulines. 27) Procédé suivant la revendication 23, caractérisé par 20 le fait que plusieurs revêtements superposés de matière protéinique sont fixés par copulation aux particules de support avant d'attacher par copulation à ces particules la substance active antigénique . 28) Procédé suivant la revendication 23, caractérisé par 25 le fait que la substance active antigénique est choisie entre un antigène et un enzyme. 29) Procédé suivant la revendication 23, caractérisé en ce qu'il permet de déceler une substance immunologique et que la substance active antigénique qu'il contient est la contrepartie 30 immunologique de cette substance immunologique.