FR 2008079 A1 19700116 FR 6914758 A 19690508 69 14758 i 2008079 L'invention concerne l'oxydation microbienne de composés organiques, et des compositions utilisables pour faire une telle oxydation. Elle concerne plus précisément, l'oxydation de divers polyols par un microorganisme particulier. 5 Les procédés microbiologiques d'oxydation de diverses substances orga niques sont connus, d'une manière générale. L'oxydation d'un alcool primaire en acide carboxylique est un phénomène commun dans les organismes vivants. Par conséquent, il n'est pas surprenant qu'un grand nombre de microorganismes oxydants aient été cultivés sur des milieux nutritifs appropriés, contenant 10 divers composés organiques pour obteixir soit des sous-produits par oxydation, soit des produits du métabolisme cellulaire. Néanmoins, ces cultures n'ont pas toujours été productives. Par exemple, de nombreux chercheurs ont indiqué qu'un polyol particulier, le pentaérythritol, n'est pratiquement pas attaqué par les bactéries et autres microorganismes, d'une manière générale, et que ce polyol 15 n'est pas oxydé, notamment, par les bactéries de l'acide acétique. On consul- • tera, par exemple, à ce sujet, les articles suivants : DeLey et Kersters :"0xidation of Aliphatic Glycols by Acetie Acid Bacteria) : Biological Reviews, vol. 28, n° 2, p. 164-180 ; Kersters et DeLey : "The Oxidation of Glycols by Acetic Acid 20 Bacteria", Biochim. Biophys. Acta : 71 (1963), p. 311-331. La possibilité de transformer microbiologiquement des composés organiques, notamment divers polyols, en acides carboxyliques correspondants présente un intérêt pratique considérable par suite de la valeur des acides qu'on ob- s tiendrait ainsi. Par exemple, des polyols tels que le glycérol, le glucose, 25 1'éthylèneglycol, le sorbitol, le mannitol, etc., pourraient ainsi servir d'intermédiaires pour préparer des acides importants, tels que les acide glu-conique, glycollique, succinique, ascorbique, etc. L'oxydation microbiologique du pentaérythritol en l'acide carboxylique correspondant, l'acide tris(hydroxyméthyl)acétique, présente un intérêt .parti -30 culier parce que les procédés chimiques divers permettant de passer du pentaérythritol. à l'acide tris(hydroxyméthyl)acétique n'ont généralement'que de très mauvais rendements ; ces procédés comprennent des nitrations et sont donc dangereux ou bien ils nécessitent 1'utilisation5très coûteuse industriellement, de platine comme catalyseur. Or l'acide tris(hydroxyméthyl)acétique est un 35 intermédiaire particulièrement précieux dans la préparation des 3-pyrazolidones substituées en position 3, telles que les composés décrits au brevet belge 700 008, qui sont des développateurs photographiques extrêmement précieux. Le passage des acides hydroxyméthylacétiques aux 3-pyrazolidones est décrit aux brevets français 1 131 853 et 1 114 874 ainsi qu'au brevet des Etats-Unis 40 d'Amérique 2 843 598. La technique chimique, d'une manière générale, et la 69 14758 2 2008079 technique photographique, en particulier seraient donc très nettement perfectionnées par un nouveau moyen d'oxyder les composés organiques et, notamment, par un moyen d'obtention de l'acide tris(hydroxyméthyl)acétique avec un bon rendement, par une opération ne présentant pas de danger et peu coûteuse. 5 On a trouvé, suivant l'invention, un procédé d'oxydation de composés organiques, par exemple, de composés contenant du carbone oxydable par voie microbiologique, tels que les alcools et les aldéhydes aliphatiques, aromatiques ou alicycliques. Ces composés peuvent être saturés ou non saturés, à chaîne droite ou à chaîne ramifiée, comme il est décrit plus loin. L'invention 10 concerne plus particulièrement l'oxydation des alcools, par exemple, des alcanols polyhydroxylés contenant jusqu'à dix huit atomes de carbone et, plus particulièrement, des composés à chaîne ramifiée, qui contiennent au moins une fonction alcool primaire. Ces polyols, tels que le pentaérythritol, se transforment en acides carboxyliques correspondants par fermentation avec un micro-15 organisme particulier, comme il est décrit en détail ci-après. L'invention s'applique très avantageusement non seulement au pentaérythritol, mais encore à des alcools primaires voisins, tels que le dipenta-érythritol, le 2-hydroxyméthyl-2-méthyl-l,3-propanediol, le 2-hydroxyméthyl-2-propyl-l,3-propanediol, le 2,2-diméthyl-l,3-propanediol, l'alcool néo-pentylique 20 etc. La réaction d'oxydation du pentaérythritol en acide correspondant par voie microbienne est tout-à-fait inattendue et surprenante, car il n'existe, à la connaissance de la demanderesse, aucune publication indiquant la poséi-bilité d'une fermentation de ce polyol produisant une oxydation ; en particulier; 25. ce polyol n'est pas touché par les bactéries de l'acide acétique ou par des bactéries telles que Bacillus, Saccharomyces, Pseudomonas, Flavobacterium, Nocardia, Rhizopus, Acetobacter, Mycobacterium, Lactobacillus, Pénicillium, Xanthamonas, Chromobacterium, Arthrobacter, Rhodospirillum, ou Helicostylum. Plus particulièrement, les espèces des genres indiqués ci-dessus ne montrant 30 aucune activité oxydante comprennent Flavobacterium aquatile, Flavobacterium suavolens, Flavobacterium devorans, Nocardia carolina, Pseudomonas putida et Arthrobacter oxydans. L'invention a essentiellement pour objet un procédé d'oxydation microbiologique d'un composé organiquej dans un milieu nutritif qui permet la 35 croissance de ce microorganisme, caractérisé en ce qu'on utilise le microorganisme aérobie Flavobacterium oxydans portant le numéro 21 245 dans la collection "American Type Culture Collection" conservée aux Etats-Unis d'Amérique (en abrégé "A.T.C.C. n° 21 245"). Suivant un mode avantageux de mise en oeuvre, ce procédé consiste 40 à oxyder du pentaérythritol en acide tris(hydroxyméthyl)acétique^ par culture 69 14758 3 2008079 aérobie en milieu nutritif aqueux. Suivant un mode plus particulier de mise en oeuvre, on introduit d'abord du pentaérythritol dans le milieu de fermentation, à une concentration comprise entre environ 5 g et environ 30 g par litre de milieu de culture, puis on augmente cette concentration jusqu'à une valeur 5 pouvant atteindre 150 g par litre environ, mais avantageusement voisine de 60 g par litre, de manière à obtenir une quantité satisfaisante d'acide tris(hydro-xyméthyljacétique. On peut ajouter du pentaérythritol à maintes reprises, la masse ajoutée étant, par exemple, de l'ordre de grandeur indiqué. Ceci dépend de la vitalité du 10 de la culture et de la fraction/pentaérythritol oxydée en acide tris(hydroxy-méthyl)acétique. Le procédé suivant l'invention permet d'oxyder avantageusement les composés ayant au moins une fonction alcool primaire, notamment les alcanols et les alcanepolyols, tels que le pentaérythritol. Ces alcools sont généralement 15 présents dans le milieu nutritif en quantité comprise entre environ 5 g et environ 100 g/1, avantageusement comprise entre 10 g et 60 g par litre de milieu de fermentation. Pour le pentaérythritol, la valeur de 100 g par litre correspond à peu près à la saturation vers 30°C. L'invention a également pour objet une composition de matière compre-20 nant le microorganisme Flavobacterium oxydans (ATCC n° 21 245) ou les produits de son métabolisme cellulaire et un milieu nitritif permettant la croissance de ce microorganisme et comprenant une source de carbone oxydable. Les matières organiques fournissant le carbone oxydable et servant simultanément de sources d'énergie dans le procédé suivant l'invention com-25 prennent tous les sucres, les amidons et sources analogues d'énergie analogues et les mélanges de ces diverses sources d'énergie. C'est ainsi qu'on peut utiliser le pentaérythritol, l'acide acétique, le sucrose, le glucose, le glycérol, l'acide succinique, 1'éthylèneglycol, l'acide citrique, etc., en quantité permettant un développement suffisant du microorganisme, par exemple comprise -3 -3 * , 30 entre environ 1.10 et environ 3.10 , en masse, cette quantité étant avanta- _3 geusement voisine de 2.10 Comme il est évident pour le spécialiste, le milieu de fermentation contient, à coté des composés indiqués ci-dessus| des sels minéraux sur lesquels le microorganisme peut se développer, et il doit aussi contenir une source 35 utilisable dlazote, de phosphore et de soufre, ainsi que des ions ferriques, des ions manganeux et des ions analogues, ainsi que des traces d'autres ions métalliques. Ces ions peuvent être apportés, par exemple, sous forme de nitrate d'ammonium, de diphosphate potassique , de sulfate ferreux, de sulfate de magnésium, etc. Ce milieu doit être dilué par une quantité convenable d'eau 40 et avoir un pH compris entre 5,5 environ et 8,5 environ, avantageusement entre 69 14758 4 2008079 7,2 et 7,6. On a trouvé que le milieu de fermentation contient avantageusement des produits stimulants la croissance des microorganismes, à côté des aliments proprement dits, ce qui augmente la production d'acide tris(hydroxyméthyl)-acétique : on ajoutera avantageusement, par exemple, de l'extrait de levure à 5 concentration comprise entre environ 0,1 g et environ 0,3 g par litre, cette concentration étant, de préférence, voisine de 0,2 g par litre. On peut utiliser d'autres stimulants de la croissance, tels que des mélanges de vitamines pures, des produits distillés solubles, des infusions de graines, etc. L'azote peut, évidemment, être apporté sous de nombreuses formes, par exemple sous 10 forme d'extrait séché de levure, à concentration de l'ordre de 1/100. Une telle proportion de levure apporte aussi d'autres aliments, tels que les ions sulfate, phosphate et de nombreux ions métalliques. Dans cette vaste famille d'aliments, il faut inclure, notamment,la farine des graines de coton et la farine de soja, par exemple. D'autres composés simples pouvant servir à appor-15 ter l'azote sont l'acide glutamique, la glutamine, les aspartates, l'urée, les ions nitrate , ainsi que les associations de ces différents corps, par exemple de l'asparagine avec l'acide glutamique. D'autres sources-d'azote sont également utilisables. Le microorganisme utilisé dans le procédé suivant l'invention est 20 capable d'oxyder des composés organiques variés, de préférence des alcools, tels que les alcanepolyols, par exemple le pentaérythritol, en composés oxydés, notamment en acides correspondants, tout en'consommant des hydrates de carbone ou tous autres composés apportant simultanément de l'énergie et des atomes de carbone. Ce microorganisme, dont les propriétés sont remarquables, a été 25 récemment découvert : il est désigné sous le nom de Flavobacterium oxydans. On a isolé ce microorganisme du sol, à Rochester, ville de l'Etat de New-York aux Etats-Unis d'Amérique, par un procédé de culture sélective dans lequel on ajoute 150 g de ce sol à 250 ml d'un milieu nutritif ayant la composition suivante : Composant Grammes par litre d'eau Pentaérythritol 20,0 (NH4>2S°4 2,0 K2HP04 2,0 MgS04,7H20 0,25 MnS04,7H20 0,17 FeS04,7H20 0,028 NaCl 0,0006 CaCl,2H20 0,001 ZnS04,7H20 0,0006 Extrait de levure 0,2 69 14756 5 2008079 On incube le microorganisme pendant deux semaines sans agiter, la température étant voisine de 30°G. On utilise des portions de cette culture pour'.ensemencer un milieu de culture, neuf et stérile, qu'on incube encore pendant une semaine, •à une température voisine de 3Q°C^ On a trouvé qu'il,est désirable d'agiter ce 5 milieu de culture, par exemple, à la vitesse de 400 t/mn pendant l'incubation. Une souche de Flavobactorium oxydans est conservée à Washington, aux Etats-Unis d'Amérique par l'organisme appelé "American Type Culture Collection", auqàel on peut demander des échantillons sous la référence Flavobactérium Oxydans (ATCC n° 21 245). 10 Quand on isole le microorganisme, on constate qu'il existe au moins deux souches ayant les caractéristiques physiologiques et les caractéristiques de culture ci-après qui les identifient et les distinguent d'autres microorganismes connus. Comme il est facilement compréhensible pour l'homme de l'art, d'autres mutants oxydants analogues dérivent spontanément de ces microorganismes 15 et sont facilement distingués de Flavobaeterium oxydans (ATCC n°.21 245). D'autres part, on peut également obtenir des mutations à partir de ces nouveaux microorganismes par action d'agents physiques tels qu'un rayonnement ultraviolet ou d'agents mutagènes chimiques tels que le méthanesulfonate d'éthyle. Deux de cès souches, qu'on désignera dans la suite par les. symboles Pe 25 et Pe 25 20 sm 1, diffèrent l'une de l'autre en ce que la première peut se développer et oxyder le pentaérythritol sans autre source de carbone, tandis que la seconde exige pour son développement une source de carbone autre que le pentaérythritol, comme il est expliqué plus loin. Ces deux souches se distinguent par le pH * qu'elles donnent à un milieu nutritif contenant du pentaérythritols ce que peut 25". déceler un...indicateur coloré, ainsi que par la dimension des colonies. On a trouvé que le microorganisme Elavobactorium oxydans dans. (ACTT n° 21 245) présente les caractéristiques de culture et les caractéristiques physiàlogiques suivantes, qu'il identifient et. lé distinguent d'autres microorganismes. ;• Caractéristiques de coloration Durée de culture - 18 h gram (-) 168 h gram variable (+) ou (-) Ne résiste pas aux acides. Morphologie des cellules (après croissance en milieu glucose/extrait.de levure pendant des périodes pouvant atteindre 7 jours) Forme Bâtonnets ayant .0,6, à 0,7 |1 de long et 0,8 |i à 1,0 de large, associés par paires ou par chaînes courtes ayant au plus environ huit éléments. 69 14758 6 2008079 Motilité Non motile Asporagène Non encapsulé Colonies sur agar-agar (milieu glucose/extrait de levure) Durée de culture 72 h ' Forme circulaire Elévation convexe Surface lisse/ Marge entière Pigmentation initialement blanchâtre ; jaunit en 5 jours Ensemencement au trait sur agar-agar (milieu glucose/extrait de levure) Durée de culture Forme Consistance Pigmentation Culture sur bouillon Durée de culture Croissance superficielle Opalescence Sédimentation Quantité 72 h Filiforme butyreuse initialement blanche ; jaunit en 5 jours r 7 jouts nulle légère compacte petite Gulot de gélatine (glucose/extrait de levure et 5/100 de gélatine) Durée de culture 14 jours Liquifaction - nulle Croissance abondante croissance superficielle Colonies sur dextrose de poai&es de terre Durée de culture 7 jours Croissance nulle Milieu de Hugh-Leifson additionné d'hydrate de carbone Durée de culture Culture strictement aérobie reaction Glucose:/ légèrement acide Lactose: réaction alcaline Sucrose: réaction acide Glycérol: réaction acide Mannitol : réaction acide 14 jours - Pas dé dégagement gazeux - Pas de dégagement gazeux - Pas de dégagement gazeux - Pas de dégageaient gazeux -Pas de dégagement gazeux 14758 7 2008079 Action sur le lait Durée de culture Réaction au tournesol Essai d'Ulrich Sérum sanguin de Loeffler Durée de culture Croissance Milieu de Sim Durée de culture Motilité H2S Indole Milieu agarragar de Kligler au fer Durée de culture 14 jours Alcaline - Pas de coagulation; pas de réaction Réaction alcaline avec réduction 21 jours nulle 14 jours nulle nul nul h2S 14 jours nul Le dextrose et le lactose ne fermentent pas Milieu alcalin d'oeuf Durée de culture 14 jours Pas d*act£vité .protéolytique Epreuves spéciales Croissance importante en quatre jours dans un milieu contenant 5/100 d'éthanol et 1/100 d'extrait de levure ; le pH reste constant et égal à 7,5 - Pas de croissance dans un milieu contenant 10/100 d'éthanol et 1/100 d'extrait de levure. Croissance importante en sept jours en milieu citrate:formation d'une croûte mince Croissance importante en 72 hfeures en milieu contenant 3/100 de chlorure de sodium, contenant du glucose et de l'extrait de levure ; pas de développement si la concentration en chlorure de sodium est portée à 10/100 Aucune croissance en 14 jours en milieu d'acide urique Essai négatif au rouge de méthyle Essai de Vages-Proskauer négatif Amidon non hydrolysé Nitrite formé à partir de nitrate Cellulose non hydrolysée Croissance en fonction de la température Durée de culture 4°C 25 °C 30°C 37 °C 72 heures aucune croissance faible croissance forte croissance aucune croissance 69 14758 8 2008079 Sources supplémentaires de carbone Les deux souches se développant sur les acétates, les succinates, l|éthylèneglycol, le d-ribitol, le i-erythritol ou le d-xylose, qui sont des sources supplémentaires de carbone La couche Ee 25 seule se développe sur pentaérythritolj dipentaéry-thritol; 2-hydroxyméthyl-2-méthyl-l,3-propanediol ; 2-hydroxyméthyl-2-éthyl-l,3-propanediol ; 2-hydroxyméthyl-2-propyl-l,3-propanediol ; 2.2-diméthyl-l,3-propanediol ; alcpol néopentyl/;monoacétine ; d-xylitol ; d-arabitol, sorbitol Elle ne se développe pas ou se développe mal sur : 2-déoxy-d-glucose ; d-glucuronolactone ; dulcitol ; 2-(hydroxyméthyl)-2-nitro-l,3-propanediol ; 2-(hydroxyméthyl)-2-amino-l,3-propanediol ; 2-(hydroxyméthyl)-2,2-diphényl-l,3-propanediol ; 2-méthyl-2-nitro- 1.3-propanedio1 Sources supplémentaires d'azote Le développement se fait mal sur l'urée, mais se fait sur les ions nitrate, les ions ammonium, l'asparagine, les glutamates, les sources naturelles complexes d'azote telles que la farine des grains de coton, l'extrait de levure, la caséine hydrolysée, diverses peptones et la farine de soja. Les températures utiles de fermentation dans le procédé suivant l'invention vont de 20°G environ à 37°C environ, et on opère avantageusement entre 28°C et 30°C. La fermentation se fait en milieu aérobie. Il est avantageux de disposer d'un agitateur tournant, mais on peut aussi se servir d'un autre 5 moyen d'agitation : on peut par exemple, seçouer les ballons de culture. Il est remarquable qu'on puisse régler convenablement la vitesse de croissance des microorganismes en agissant sur la température, l'aération et les conditions d'ensemencement. Dans des milieux riches en matières nutritives, une vitesse de croissance des microorganismes inférieur à la vitesse maximale 10 permet une induction maximale d'enzymes oxydantes. En particulier, on règle facilement la vitesse de croissance des microorganismes dans des appareils de fermentation munis d'agitateurs par exemple en abaissant la température de 30°G vers 22°C, vers 24°C ou, de préférence, vers 23°C. De plus, on utilise de faibles ventilations, comprises entre environ 0,10 volume et environ 15 0,14 volume d'air, avantageusement voisines de 0,12 volume d'air, par minute et par volume de milieu de fermentation. On a trouvé aussi qu'il est avantageux d'ensemencer à partir du milieu de la phase de croissance logarithmique, c'est-à-dire dans la période comprise entre environ 40 h et 72 h de culture. L'ensemencement est fait avantageusement 20 au bout de 48 h. L'exemple 6 ci-après montre que la croissance de Flavobacterium oxydans (ATGC n° 21 245) est du type logarithmique, ce qui montre que l'oxydation enzymatique du pentaérythritol est très proche du maximum possible : pendant l'incubation, la quantité de pentaérythritol oxydée en acide tris (hydroxyméthyl)acétique dépasse presque toujours 50% et est généralement de 69 14758 9 2008079 l'ordre de 97% environ. La formation de ce composé est concomitante de la disparition du pentaérythritol dont seulement une très petite partie disparaît par des réactions secondaires. Le pH du milieu de culture croît dîabord de 7,0 environ à 9,0 environ, puis décroît vers 5,6 quand l'acide tris(hydroxyméthyl) 5 acétique s'accumule. Le pH reste généralement compris entre 3,0 et 9,5, avantageusement entre 6,0 et 8,0 environ. Généralement, la croissance de la culture se produit pendant les trois premiers jours de l'incubation, le développement restant ensuite stationnaire, bien que, l'oxydation continue. On neutralise le produit d'oxydation, par 10 exemple l'acide tris(hydroxyméthyl)acétique formé dans le milieu nutritif avec un composé basique convenable tel que le carbonate de potassium ou le carbonate de calcium, par exemple. En ajoutant, par fractions successives du pentaérythritol à celui qui est déjà présent en concentration comprise entre 1/100 environ et 3/100 environ, de manière que sa concentration massique totale soit 15 de l'ordre de 10/100 ou mieux de l'ordre de 6/100, on obtient des productions atteignant 64 g par litre, soit 97/100 du chiffre théorique. Pour obtenir un produit pur d'oxydation, par exemple de l'acide tris— (hydrcxyméthyl)acétique pur, on centrifuge la totalité du bouillon de culture pour enlever les microorganismes. On neutralise le produit clair obtenu 20 jusqu'à pH 7,0, par exemple, par addition d'hydroxyde de potassium, d'hydro-xyde de sodium, de chaux, etc. On met le bouillon de culture neutralisé en contact d'une résine échangeuse d'ions et on adsorbe l'acide sur celle-ci, puis on élue cet acide au moyen d'une solution acice aqueuse. On a trouvé , qu'on utilise avantageusement une résine échangeuse d'anions fortement basique. 25 On termine avantageusement l'élution au moyen d'acide formiquè. On récupère aisément le produit d'oxydation, par exemple l'acide tris-(hydroxyméthyl)acétique, à partir de la solution aqueuse, par exemple en évaporant celle-ci à sec dans des conditions favorables. On peut, si on le désire, purifier davantage le produit d'oxydation, par recristallisation par exemple 30 en utilisant comme solvant de recristallisation un solvant organique tel que l'éthanol, le benzène ou l'isopropanol ou encore un mélange de tels solvants, tel qu'un mélange d'éthanol et de benzène par exemple. Puisque l'oxydation biologique des composés carbonés comprénd une série d'étapes nettement séparées fournissant toute une série de composés inter-35 médiaires et aboutissant généralement à l'anhydride carbonique comme terme final, il est très avantageux, quand il est nécessaire de décomposer lé carbonate, de provoquer un barbotage dans la colonne d'échange quand on ajoute l'acide formique. En ce cas, on acidifie le bouillon de fermentation préalablement centrifugé jusque vers pH 4 avec un acide convenable, tel que l'acide 40 formique, puis on fait barboter de l'azote dans le bouillon "pendant une heure ; 69 14758 10 20tt80*9 en ajuste alors le pH vers 7 par addition d'une base convenable. tel'e On peut facilement déterminer la quantité de produit .if oxydation tel 5 que l'acide tris(hydroxyméthyl)acétique contenu dans le bcai^'on en isolant, cet acide ; on peut, aussi utiliser la chromatographie en pLai:s gazeuse. Ceci sera exposé plus loin. On ne s'écartera pas de l'invention en faisant varier les conditions de température et de pression entre des limites acceptables. L'homme de l'art 10 sait que des variations importantes sont tolérables. D'autre part, bien qu'on décrive plus spécialement un mode opératoire considéré comme particulièrement avantageux, il est évident au spécialiste que de nombreuses variantes sont possibles : par èxeràpla on peut introduire le composé oxydable dans le milieu nutritif après une première incubation du 15 microorganisme. Une autre variante consiste à ajouter l'organisme bactérien à un milieu initial contenant le composé organique, D'autre part, on peut ajouter les organismes bactériens sous forme d'ensemencements comprenant des cellules entières, des cellules broyées, des extraits cellulàires, etc., de manière à permettre la croissance des bactéries* Quand les cellules sont 20 broyées, par exemple, on peut utiliser différents moyens physiques et chimiques, notamment des vibrations. On observe que Flavobacterium oxydans (ATCC n° 21 245) pert progressivement son pouvoir oxydant quand on le cultive sur un milieu riche et non spécifique, tel qu'un milieu contenant 1/100 d'extrait de levure et 17o de glu-25 cose ou le milieu produisant un acide indiqué ci-dessus. Pour être certain que le microorganisme est suffisamment actif pour donner une quantité importante de produit d'oxydation, on a sélectionné les souches actives de culture, et on les a conservées ultérieurement. On distingue facilement ces colonies trois jours à cinq jours après dispersion dan,; un milieu de culture contenant du 30 pentaérythritol par coloration avec un indicateur de pH. Les cultures contenant des souches actives présentant alors, la coloration acide, tandis que les autres ne sont pas acides. On prélève les colonies ainsi caractérisées ; on les disperse dans un milieu assurant leur, survivance sans les altérer.,, tel que du sérum physiologique et on les disperse dans des milieux .nutritifs, tels que 35 des gels d'agar-agar placés dans des' tubes inclinés. On'-laisse croître; ces cultures pendant 2 jours à température voisine de 30°C,puis on les conserve à température plus basse-sans qu'elles perdent Leur activité avant plusieurs mois. DLautres procédés de conservation sont possibles : on peut',- par exemple, lipophiliser les cultures dans une suspension aqueuse telle que du lait écrémé. 40 Scellées convenablement ces cultures restent actives pendant très longtemps.. 6.9 14758 11 2008079 Pour étudier l'oxydation biologique du composé oxydable tel que le pentaérythritol, on peut, comme il a été dit, opérer par chromatographie en phase gazeuse. On utilise alors un appareil usuel de chromatographie en phase gazeuse comprenant un dispositif de mesure de conductivité thermique, la 5 colonne est un tube d'acier inoxydable, ayant 1,80 m de long et 3,2 mm de diamètre extérieur, garni de diatomite calcinée, en agrégats (produit "Chromosorb W", vendu par la firme Hewlett-Packard aux Etats-Unis d'Amérique) imprégné de 10/100 de caoutchouc de silicone (SE-30). Le débit d'hélium est de 30 ml/mn ; la température à l'orifice d'injection est de 295°C et la tempéra-10 ture de la colonne est réglée par un dispositif à programme et varie progressivement de 120°C à 265°C, la vitesse de montée en température est de 30°C par minute ; le dispositif de mesure de conductivité travaille à 300°C, le courant dans le pont étant de 150 mA. Ce procédé consiste à évaporer à sec un échantillon de 1 ml de bouil-15 Ion fermenté, en utilisant un appareil de séchage par congélation. On ajoute au résidu 0,3 ml de chlorotriméthylsilane, 0,3 ml de 1,1,1 , 3,3,3-hexamé-thyldisilazane et 0,3 ml d'une solution pyridinique d'octadécane (0,08 g d'octadécane étendu à 1 ml avec la pyridine). On attend 4 h et on analyse l'échan- 3 fclllon par chromatographie de gaz. Les volumes injectés sont de 1,4 mm à 20 1,6 mm . La quantité d'acide tris(hydroxyméthyl)acétique dans 1 ml de bouillon de culture est mesurée de la manière suivante. On trace une droite d'étalonnage avec des échantillons contenant de 1 mg à 40 mg d'acide tris(hydroxyméthyl)-acétique, de qualité pour analyse, qu'on transforme en dérivés triméthylsilylë' qu'on analyse : on porte en abcisses la quantité d'acide tris(hydroxyméthyl)-25 acétique et en ordonnées le rapport de la surface de crête du dérivé trimé-thylsilyle à la surface de crête de 1'octadécane. Pour analyser un échantillon de bouillon de culture par chromatographie de gaz, on mesure le rapport des surfaces de crête du produit et de 1'octadécane et on se reporte à la droite d'étalonnage. 30 Le spectre infrarouge de l'acide tris(hydroxyméthyl)acétique et le spectre de masse de l'acide triméthylsilylé préparés par oxydation microbio-lagique sont identiques à ceux qu'on obtient avec des produits préparés par oxydation du pentaérythritol catalysée avec du platine. Les exemples suivants illustrent l'invention» 35 EXEMPLE 1 - On fait une série de fermentations dans des fioles d'Erlenmeyer de 125 ml munies de fermetures Morton en acier inoxydable. On introduit dans chaque fiole 25 ml d'un mélange nutritif ayant la composition suivante : 69 14758 12 2008079 Acide acétique (source de carbone) 2 g Extrait de levure 10 g Pentaérythritol 20 g Eau q.s.p. 1000 ml On neutralise le mélange par addition d'hydroxyde de potassium de manière à obtenir un pH de 7, et on stérilise le tout par séjour à l'autoclave sous pression de 105 kPa pendant 15 mit. On ensemence ensuite chaque fiole avec une boucle apportant environ 0,75 mg (masse sèche) de culture qu'on a fait croître 5 pendant deux jours, dans un tube à essais incliné, en milieu nutritif à 30°C. On agite les fioles, maintenues à 30°G à + 1°G près, dans un agitateur rotatif tournant à 400 tr/mn. On obtient les résultats suivants. N° de la fiole Acide produit en g/1 pour une durée de fermentation de 2 jours 4 jours 7 jours 1 5,38 10,00 10,27 2 6,80 12,50 15,65 3 6,25 10,30 11,42 4 2,65 8,41 lr0,60 5 5,70 10,32 11,08 6 6,03 10,20 11,15 7 5,25 10,77 11,07 8 7,35 10,48 14,85 9 3,13 9,72 12,05 10 5,90 10,00 10,85 11 3,50 10,00 11,28 12 2,40 9,80 11,31 On ajoute 200 mg de carbonate de chaux à la fiole n°2 le deuxième jour, ainsi qu'à la fiole n° 8 le quatrième jour. 10 EXEMPLE 2 - On opère comme à l'exemple 1 en ajoutant 250 mg de pentaérythriîpl et 200 mg de carbonate de calcium au troisième jour, au quatrième jour, au cinquième jour et au sixième jour. On obtient les résultats suivants . Temps Acide tris(hydroxyméthyl) (en j) acétique (en g/1). 0 0 3 13,2 4 19,1 5 22,3 , 6 35,5 7 45,0 11 64,0 69 14758 13 2008079 EXEMPLE 3 - En opérant dans un' petit appareil-de' fermentation muni d'un agitateur et d'un dispositif automatique de neutralisation avec une solution de carbonate de potassium, le rendement de l'oxydation du pentaérythritol en acide tris(hydroxyméthyl)acétique peut atteindre 97%. 5 On opère dans un appareil cylindrique en verre, ayant un diamètre de 7 cm, une hauteur de 14 cm et une capacité utile de 650 ml. On utilise un agitateur magnétique de 5 cm, tournant à 1200 tr/mn. Le "débit d'air est de 80 ml par minute p^r millilitre de bouillon de fermentation,: et la'température est de 30°C. Quand/mousse atteint un niveau fixé d'avance,un détecteur de 10 mousse déclenche l'addition d'un agent à action superficielle "Antifoam G" vendu par la firme Dow Corning aux Etats-Unis d'Amérique . Le milieu utilisé et l'ensemencement sont identiques à ceux de l'exemple 1. On ajoute 10 g de pentaérythritol solide le deuxième jour et le cinquième jour et le pH est maintenu à 7,0 + 0,3 par addition d'une solution molaire de carbonate de 15 potassium à partir du deuxième jour. Les' résultats sont les suivants . Temps Acide tris(hydroxyméthyl) (en 'j) acétique (en g/1) 0 O 2 8,8 5 34,7 7 54,3 EXEMPLE 4 - Les essais sont conduits comme à l'exemple 3, sauf qu'on fait varier l'aération. En 48 h on.obtient les résultats suivants. ' Volumes d'air/mn " Acide tris(hydroxyméthyl) Volume de milieu de fermentation acétique(en g/1) 0,06 2,2 0,12 8,8 - 0,25 - . traces •. . EXEMPLE 5 - On opère de manière ana-logue à l'exemple 3, mais on fait varier la concentration, initiale de pentaérythritol. Les résultats sont les suivants. Pentaérythritol Acide tris(hydroxyméthyl) (en %) • ■ acétique (en g/1) 0,5 4,6 ; 1,0 8,0 2,0 16,0 4,0 17,0 6,0 , " 17,3 8,0 18,2 10,0 4,0 i. 20 EXEMPLE 6 - En opérant suivant le procédé décrit à l'exemple 3, on prélève divers échantillons à des intervalles de temps donné sur des cultures incubées 69 14758 14 2008079 à 30°C. On dose le pentérythritol.. et l'acide. On mesure la masse de bactéries sèches par spectrophotométrie (mesure d'absorption à 650 -nm) en utilisant une coutbe d'étalonnage préalable, ce qui permet de suivre le développement des bactéries. 5 Les résultats sont les suivants : Temps Pentaérythritol pH Croissance des Acide tris-hydroxyméthyl) (h) (K/l) bactéries (g/1) acétique.(g/1). 0 20,0 ■ 7,0 0,0 ... 0,0 24 : 20,0 ■ 0,1 ■- 0,0 40 18,3 8,0 1,7 3,2 . 48 . ' 17,8 7,9 2,5. 4,0 60 12,8 7,2 4,4 8,0 72 10,2 6,8 4,6 10,0 80 9,4 6,2 4,6 11,2 96 8,6- 5,8 4,6 12,2 120 7,8 5,4 4,5 13,0 Les exemples qui précèdent illustrent les résultats obtenus dans l'oxydation microbiologique du pentaérythritol en acide tris(hydroxyméthyl)-acétique, ce qui est un mçde de mise en oeuvre particulièrement avantageux de l'invention. Néanmoins, comme il a été dit, on peut oxyder biologiquement 10 d'autres composés carbonés oxydables par un processus analogue. C'est ainsi, ■ notamment, que Flavobacterium oxydans (ATCÛ n° 21 245) oxyde des alcools tels que l'alcool néopentylique, le sorbitol, le mannitol, etc., des aldéhydes -tels que le xylose, le ribose, etc. 69 14758 15 2.0 OW 9 REVENDICATIONS 1 - Procédé d'oxydation microbiologique d'un composé organique dans un milieu nutritif, caractérisé en ce qu'on utilise le microorganisme aérobie Flavobacterium oxydans (souche ATCC n° 21 245). 5 2 - Procédé conforme à la revendication 1, caractérisé en ce que le dit milieu nutritif contient une source de carbone permettant la croissance du microorganisme. 3 - Procédé conforme à la revendication 1 ou 2, caractérisé en ce que le milieu nutritif contient un alcool, notamment un alcanol ou alcane-10 polyol, avantageusement un alcane-tétrol. 4 - Procédé conforme à la revendication 2, caractérisé en ce que la source de carbone, comprend du pentaérythritol, de l'acide acétique, de l'acide succinique, de l'acide citrique, du glycérol, du glucose,de l'éthylène-glycol ou du sucrose. 15 5 -r Procédé conforme à l'une quelconque des revendications 1 à 4, caractérisé en ce qu'on maintient la température entre 20°C et 37°C, avantageusement entre 22°C et 24°C, le débit d'aération entre 0,10 volume et 0,14 volume d'air par minute et par volume de milieu de culture et qu'on utilise un microorganisme prélevé après un"délai de croissance compris entre 40 h et 20 72 h. 6 - Procédé conforme à la revendication 5, caractérisé en ce qu'on apporte le microorganisme en sélectionnant par prélèvement les colonies productrices d'acide cultivées dans un milieu nutritif contenant un composé pouvant donner cet acide par oxydation, puis on disperse ce microorganisme sur un 25 milieu permettant sa conservation, on le fait croître sur un milieu nu tritif, on le récolte et on le conserve en attente d'utilisation. 7 - Application du procédé conforme aux revendications 1 à 6, caractérisée en ce qu'on utilise le procédé pour former de l'acide tris(hydroxyméthyl)-acétique par oxydation du pentaérythritol. 30 8 - Application conforme à la revendication 7, caractérisée en ce que le milieu nutritif contient de 5 g à 100 g de pentaérythritol par litre. 9 - Application conforme à la revendication 7, caractérisée en ce que le milieu nutritif contient d'abord de 5 g à 30 g en masse, d'éléments nutritifs, par litre, puis qu'on ajoute, par apports successifs, du 35 pentaérythritol jusqu'à une teneur voisine de 150 g/1. 10 - Application conforme à la revendication 7, caractérisée en ce qu'on main tient le pH du milieu nutritif entre 3,0 et 9,5. 11 - Application conforme à l'une quelconque des revendications 7 à 10, carac térisée en ce qu'on sépare les microorganismes du milieu aqueux nutritif 40 qu'on recueille tout le bouillon de culture, qu'on neutralise ce bouillon 69 14758 16 2008079 et qu'on sépare l'acide tris(hydroxyméthyl)acétique. 12 - Composition comprenant un microorganisme ou les produits de son métabolisme cellulaire et un milieu nutritif permettant le développement de ce microorganisme, caractérisée en ce que le dit microorganisme est Flavobacterima 5 oxydans (ATCC n° 21 245).