FR 2006437 A1 19691226 FR 6911810 A 19690416 69 11810 1 2006437 La présente invention a pour objet un procédé de prépa-ratioijde la l-sérine et plus particulièrement un procédé de préparation de la L-sérine par fermentation. A l'aide de microorganismes dans un milieu nutritif approprié. 5 La L-sérine est un amino acide "bien connu qui est utilisé en médecine et en cosmétique. Ce composé peut être également utilisé dans la préparation d'autres composés intéressants comme par exemple la N-méthylsérine. Jusqu'ici pour obtenir la L-sérine, on a préparé d'abord 10 la DL-sérine, par un procédé synthétique et ensuite on a séparé le produit obtenu en ses deux isomères optiques correspondants. Récemment on a décrit un procédé de préparation de la L-sérine utilisant l'acide DL-glycérique comme substrat (brevet japonais n° 17728/67)• Toutefois, on ne connaît.jusqu'ici aucun procédé de ... 15 préparation de la L-sérine en des quantités suffisantes à partir de produits peu coûteux tels que des hydrates de carbone, des" hydrocarbures, d'autres sources de carbone et d'azote.,; .sans qu'il soit nécessaire d'utiliser comme produit de départ des substances d'un coût élevé telles que l'acide glycérique. • • - 20 L'un des objets de la présente invention est un procédé amélioré de préparation de la L-sérine qui surmonte les inconvénients et déficiences des procédés déjà connus. Un autre objet de l'invention est un procédé de préparation de la L-sérine par fermentation, ce procédé pouvant être 25 effectué d'une façon efficace et relativement simple. L'invention a encore pour objet un procédé de préparation de la L-sérine par fermentation, pouvant être effectué avantageusement à l'échelle industrielle à un coût de production bas et avec un rendement élevé. 30 L'invention a enfin pour objet un procédé de fabrica tion de la L-sérine. - - . D'autres objets et avantages de la présente invention apparaîtront plus clairement aux spécialistes dans la description suivante et dans les revendications. 35 Après des recherches variées relatives à la prépara tion de la L-sérine à l'échelle industrielle et à un coût bas, la demanderesse a maintenant découvert qu'on pouvait préparer des quantités suffisantes de L-sérine et les accumuler dans la liqueur de culture lorsqu'on effectue la cuLture d'une bactérie apparte-40 nant aux genres Arthrobacter, Brevibacterium ou Corynbacterium 11810 2 2006437 dans un milieu nutritif contenant des hydrates de carbone, des hydrocarbures ou d'autres sources de carbone etc. et, ce qui est important, sans ajouter de l'acide DL-glycérique dans ce milieu. L'utilisation d'un milieu ne contenant pas d'acide DL-glycérique 5 est l'une des caractéristiques de 1'invention» Les microorganismes utilisés dans la présente invention sont des bactéries appartenant aux genres Arthrobacter. aux genres Brevibacterium ou aux genres Corynebacterium. On a découvert que les souches mutantes exigeant de l'isoleucine sont particuliè-10 rement appropriées pour obtenir les résultats de la présente invention» Un milieu de culture synthétique aussi bien qu'un milieu de culture naturel est employé pour cultiver les souches utilisées dans la présente invention, et cela dans la mesure oii ce •J5 milieu contient les éléments nutritifs essentiels pour assurer la croissance de la souche utilisée.. Ces éléments nutritifs sont bien connus des spécialistes et ils comportent des substances telles qu'une source de carbone, une source d'azote, des composés minéraux et des composés analogues qui sont utilisés par le microorganisme 20 considéré en des quantités appropriées. On peut ainsi mentionner comme source de carbone par exemple des hydrates de carbone comme le glucose, le fructose, le maltose, le saccharose, l'amidon, l'hydrolysat d'amidon, les mélasses, le mannose, le glycérol, le sorbitol, le mannitol, etc., ou n'importe quelle autre source de 25 carbone appropriée comme des sucres alcools, des acides organiques comme par exemple l'acide acétique, l'acide lactique, l'acide pyruvique, l'acide fumarique, ou des amino acides comme l'acide aspartique, l'acide glutamique et des acides analogues etc. Dans le cas où l'on utilise des microorganismes assimilant les hydro-30 carbures, on peut utiliser par exemple des n-paraffines, le kérosène ou des fractionscfe la distillation du pétrole comportant des huiles légères, des huiles lourdes, des huiles de paraffine et des huiles analogues dans le milieu nutritif comme source de carbone, ces produits pouvant 'être utilisés en association avec une ou plus d'une 35 autre source de carbone parmi celles mentionnées ci-dessus. On peut utiliser soit une seule source de carbone soit un mélange de deux ou plusieurs sources de carbone» Toutefois, conformément à l'invention,'le milieu nutritif ne doit pas contenir de l'acide DL-glycérique» En consé-40 quence, cette substance est exclue des sources de carbone utilisées 69 11810 3 2006437 dans le cadre et dans le but rechercha par la présente invention® Gomme source d'azote onpeut utiliser des catégories variées de sels ou de composés minéraux ou organiques comme l'urée, l'ammoniaque ou des sels d'ammonium comme le chlorure d'ammonium, 5 le sulfate d'ammonium, le nitrate d'ammonium, l'acétate d'ammonium, le phosphate d'ammonium, le carbonate d'ammonium etc., ou des substances naturelles contenant de l'azote comme la liqueur de macération du maïs, l'extrait de levure, l'extrait de viande, la peptone, la farine de poisson, ou des substances variées de diges-10 tion de ces produits, le bouillon, les hydrolysats de caséine, les extraits solubles de poisson, l'extrait de son de riz, les résidus de soja dégraissés ou des substances variées de digestion de ces produits, des hydrolysats de chrysalis, etc. Encore ici ces substances peuvent être utilisées seules ou en association de deux 15 ou de plus de deux. les composés minéraux pouvant être ajoutés au milieu de culture comportent le sulfate de magnésium, le phosphate de sodium, le phosphate monopotassique, le phosphate dipotassique, le sulfate ferreux, le chlorure de manganèse, le chlorure de 20 calcium, le chlorure de sodium, le sulfate de zinc, le sulfate de manganèse, le carbonate de calcium etc. Lorsque le microorganisme utilisé exige d'autres éléments nutritifs pour sa croissance, on doit bien entendu ajouter au milieu de culture les éléments nutritifs nécessaires pour 25 répondre à cette exigence particulière. Ces éléments nutritifs sont parfois confc enus dans les substances naturelles ajoutées au milieu de culture avec les sources d'azote et il n'est pas nécessaire d'effectuer une nouvelle addition de ces substances. Toutefois, si on le désire on peut ajouter des substances en tant que telles 30 dans le milieu et ajouter également des facteurs de croissance comme par exemple des amj.no acides, des vitamines comme la thia-mine, la cobalamine, etc. ou la biotine. On effectue la culture dans des conditions aérobies telles qu'un secouage aérobie de la culture, ou dans les condi-35 tions d'une culture submergée comportant une aération et une agitation, cela à une température de 20 a. 40°C par exemple et à pH d'environ 5,0 à 9,5 par exemple. Il est bien entendu que l'on peut faire varier la température et le pH même en dehors des limites décrites, cela, en accord avec les exigences de la croissance et 40 les particularités du microorganisme utilisé. Dans le but d'obtenir 69 11810 4 2006437 des rendements élevés en L-sérine, il est souhaitable de maintenir le pH du milieu de culture à un pH approximativement neutre (7}0) pendant la culture. Après environ 1 à 5 jours de culture dans ces conditions, on obtient la formation de quantités importantes de 5 L-sérine qui s'accumulent dans la liqueur de culture résultante0 Lorsque la culture est terminée, on retire du milieu de culture les cellules des microorganismes et les précipités indésirables, et l'on récupère la L-sérine à partir du mille u. de culture en utilisant des procédés habituels tels qu'un, feraite-10 ment dans une résine échangeuse d'ions, une extraction avec des solvants, un traitement de précipitation, d'adsorption, de cfcroma-tographie, de concentration ou un traitement analogue. Un précédé particulièrement approprié pour effectuer la récupération est-constitué par le traitement par une résine échangeuse d'ions-'décrit-15 dans l'exemple 1 ci-dessous. Les exemples non limitatifs suivants sont donnés à titre d'illustration de la présente invention et sauf mentira contraire les pourcents indiqués dans ces exemples et dans la iota*-lité de la description sont exprimés en poids par litre d'eau.® On 20 décrit également dans ces exemples des souches de microorgaaismss typiques utilisées avantageusement dans la présente inventio^»-Exemple 1 vg On utilise comme bactérie d1 ensemencement -ste gouache Arthrobacter paraffineus EY 7127 AICC 21218, produisant-^; 25 L-sérine, qui est un micro organisme exigeant de l'isoleucinebeif-; de la méthionine. On inocule avec cette souche un flacon conzggïa. d'une capacité de 250 ml et contenant 20 ml/d'un milieu de' cuïfcîïr© d'ensemencement stérilisé contenant 2% de sorbitol, Vfo d'extrait de viande, Vfo de peptone, 0,5$ d'extrait de levure, 0,3$ de eisio-30 rure de sodium et 50 mg/L d'acide me so -diaminopimélique. On "effectue la culture avec un secouage aérobie à la température de ::3Q-G pendant 24 heures pour obtenir une culture d'ensemencement.tOs. inocule avec 2 ml de la culture d'ensemencement résultante une fiole conique d'une capacité de 250 ml contenant 20 ml d*un milieu 35 de fermentation stérile (pH 7,4) ayant la composition suivante : 5% d'un mélange de n -alkane 2% (Î®4)2S04 0,1% K2HPO4 0,1% EHgPO^ 40 o,1% MgS04.7H20 11810 5 2006437 OaOO, 1 mg/If thiamine 100 mg/L L-méthionine 1 ml/L de solution A 5 Composition de la solution A : 88 mg/L Ha2B407.1OHgO 37 mg/l (EH4)6Ko7024.4H20 970 mg/L PeCl^oe^O 8,8 mg/L * ZnS04.7H20 '10' 20 mg/L CuS04.5H20 7,2 mg/L ian.Cl2.4H20 On effectue ensuite la culture dans le milieu de fermentation à une température de 30°C pendant 96 heures. La quantité de L-sérine produite dans la liqueur de culture est de ?>3rng/m~1* 15 On fait passer à travers une colonne remplie avec une résine échangeuse de cations constituée par du polystyrène foirfcêment acide (résine échangeuse d'ions connue sous la désignation de Diaion SKI, et préparée par la Firme Mitsubishi Kasei Co« Ltd.), 2 litres du filtrat obtenu en éliminant les cellules des 20 microorganismes ainsi que les autres matières insolubles contenues dans la liqueur de culture, de façon à adsorber la L-sérine. On lave la colonne avec de l'eau et on effectue son élution avec de l'eau ammoniacale. On. concentre les fractions de L-sérine recueil-' lies. On obtient ainsi' 4,5 g de cristaux de L-sérine» 25 Exemple 2 On effectue la culture de la même façon et dans les mêmes conditions que celles décrites dans l'exemple 1 si ce n'est que le milieu de culture contient 5% de sorbitol au lieu du mélange de n -alkanes utilisé comme source de carbone dans le milieu de 30 fermentation. La quantité de L-sérine ainsi produite est de 2,3mg/ml. Exemple 3 On utilise comme source d'ensemencement Arthrobacter paraffineus Kl 7128ADCC 21219» qui est un microorganisme produisant de la L-sérine et exigeant pour sa croissance de 1'isoïeucine, de 35 l'acide diaminôpimélique ou de la lysine. On effectue la culture de la même façon que c'elle décrite dans 11 exemple 1 si ce n'est que l'onliilise un milieu de fermentation ayant'la composition suivant e : ; " 5io d'un mélange de n-alkane 4) 40 2% (m4)2so4 11810 6 2006437 0,1% K2HP°4.- 0,1% EHgPO^j. 0,1% MgS04.7H20 2% CaCO^ 1 mg/L thiamine 10 mg/L L-isoleucine 100 mg/L chlorhydrate de L-lysine 1 ml/L de la solution A (décrite .ci-dessus) La quantité de L-sérine ainsi produite dans - la 10 liqueur de culture résultante est de 2,5 mg/mlo Exemple 4 On effectue la culture de la même façon et dans les mêmes conditions que eelles décrites dans l'exemple 3» si ce n'est que l'on utilise un milieu de culture contenant 5% de sorbitol au 15 lieu du mélange de n-alkanes comme source de carbone dans le milieu de fermentation. La quantité de L-sérine ainsi produite dans la liqueur de culture résultante est de 1,8 mg/ml. Exemple 5 On utilise comme microorganismes d'ensemencement 20 les souches des microorganismes Brevibacterium kétoglutamicum ATCC 21222 et Corvnebacterium hydr ocarboclastus AÏCC 21221 produisant de la L-sérine» Ces souches proviennent des souches parentes Brevibacterium ketoglutamicum ATCC 15588 et Corynebacterium hydro-carboclastus ATCC 15592 et exigent de l'isoleucine pour leur I ' v 25 croissance. On cultive ces microorganismes de la même façon que décrite dans 1' exemple 1 si ce n'est que l'on utilise un milieu de fermentation ayant la composition suivante ï 5% d'un mélange de n-alkane (^12~^14^ 30 2% (îîH4)2S04 0,1% *2HP04 0,1% KH2P04 0,1% MgS04.7H20 2% CaCO^ 35 1 mg/L thiamine 0,5%. UZ-Amine (un ensemble d'hydrolysats de caséine) 1 ml/L de la solution A (décrite ci-dessus) Le pH du milieu est de 7»4« La quantité de L-sérine ainsi produite dans la 40 liqueur de culture résultante est indiquée dans le tableau 1 pour 11810 7 2006437 chacune de ces souches» TABLEAU 1 Microorganismes utilisés Quantité de L-sérine produite Brevibacterium ketoglutamicum 5 ATCC 21222 1,7 mg/ml Corynebacterium hydrocarboclastus ATCC 21221 1,9 mg/ml. Il est bien entendu que la présente invention peut comporter de nombreuses variantes sans qu'on sorte de son 10 cadre. 11810 8 2006437 REVENDICATIONS 1. Procédé de préparation de la 1»serine caractérisé par le fait qu'on, effectue la culture d'un microorganisme produisant de la l-sérine appartenant à un genre choisi dans le groupe formé 5 par Arthrobacter. Brevibacterium et Corynebacterium. dans des conditions aérobies dans un milieu nutritif aqueux ne contenant pas d'acide DL-glycérique comme substrat, qu'on accumule la L-sérine dans la liqueur de culture résultante et qu'on récupère la L-sérine à partir du bouillon de culture. 10 2. Procédé selon la revendication 1 dans lequel on effectue la culture à une température d'environ 20 à 40°C et à pH d'environ 5»0 à 9»5» 3. Procédé selon la revendication 1 dans lequel le milieu nutritif contient au moins un hydrate 4» Procédé selon la revendication 1 dans lequel on utilise un microorganisme capable d'assimiler les hydrocarbures et un milieu de culture contenant au moins un hydrocarbure comme source principale de carbone. 20 5. Procédé selon la revendication 4 dans lequel on utilise comme hydrocarbure une n-paraffine* 6. Procédé selon la revendication 1 dans lequel on utilise comme microorganisme une souche mutante exigeant pour sa croissance de l'isoleucine» 25 7. Procédé selon la revendication 1 dans lequel on utilise comme microorganisme Arthrobacter paraffineus ATCC 21218. 8. Procédé selon la revendication 1 dans lequel on utilise comme microorganisme Arthrobacter paraffineus ÂTCG 21219. 9. Procédé selon la revendication^dans lequel on 30 utilise comme microorganisme Brevibacterium ketoglutamicum ATCC 21222. 10. Procédé selon la revendication 1 dans lequel on utilise comme microorganisme Corynebacterium hydro carboclastus 11. Procédé de préparation de la L-sérine caractérisé 35 par le fait qu'on effectue la culture d'un microorganisme produisant de la L-sérine appartenant au genre choisi parmi le groupe formé par Arthrobacter. Brevibact erium et Corynebacterium. dans des conditions aérobies et dans un milieu nutritif aqueux ne contenant pas d'acide DL-glycérique comme substrat, à une tempéra- 40 ture d'environ 20 à 40°C et à un pH d'environ 5»0 à 9»5, qu'on 11810 9 2006437 accumule la L-sérine dans la liqueur de culture résultante et qu'on récupère la L-sérine formée à partir de cette liqueur» 12. Procédé selon la revendication 11 dans lequel on utilise comme microorganisme une souche mutante exigeant pour 5 sa croissance de 1 ' isoleuciiie. 13. Procédé selon la revendication 11 dans lequel on utilise comme microorganisme Arthrobacter paraffineus ATCC 21218 14» Procédé selon la revendication 11 dans lequel on utilise comme microorganisme Arthrobacter paraffineus ATCC 21219-10 15. Procédé selon la revendication 11 dans lequel on utilise comme microorganisme Brevibacterium ketoglutamicum ATCC 21222. 16. Procédé selon la revendication 11 dans lequel on utilise comme microorganisme Corynebacterium hydrocarboclastus 15 ATCC 21221. 17. Procédé selon la revendication 11, dans lequel on récupère la L-sérine à partir de là liqueur de culture résultante à l'aide d'un traitement par une résine échangeuse d'ions»