FR 2000145 A1 19690829 FR 6900243 A 19690110 69 00243 -1- 2000145 La présente invention concerne un nouveau procédé de fabrication de L-leucine, de façon à la fois économique et particulièrement convenable à la production industrielle. la L-leucine est un aminoacide qui constitue un élément nutri-5 tif essentiel pour les êtres humains et les animaux en général. Jusqu'à présent, la L-leucine a été obtenue à partir de la souche mutante Micrococcus Glutamicus. ainsi qu'il est décrit dans le brevet Japonais N* 14.395 de 1963» Mais cette souche nécessite, pour sa croissance, la présence spécifique de valine, 10 et la quantité de L-leucine formée n'est pas indiquée. Le procédé de la présente invention permet d'obtenir facilement la L-leucine à partir d'un microorganisme du genre Coryne-bacterium» cultivé dans un milieu contenant une source de carbone, une source d'azote, des substances minérales, diverses 15 substances nutritives, et ainsi que des promoteurs de isoleucine, méthionine, phéiiylalanine ou valine, ou des mélanges de ces promoteurs. Ce procédé permet d'accumuler de façon reproductible la L-leucine, dans le bouillon de culture, en quantités supérieures 20 à environ 10 mg/ml (concentration en sucre » 10 à 20 g/dl). Les souches mutantes convenant & l'invention nécessitent un milieu nutritif spécifique qui les distingue des souches usuelles employées dans les fermentations industrielles, ainsi que des souches mutantes décrites dans le brevet Japonais N° 14.395» 25 Parmi les microorganismes convenant particulièrement au procédé de l'invention, on peut citer les souches mutantes de Corynebaoterium glutamicum (syn. Micrococcus glutamicus, décrites dans le brevet Japonais N° 8.698 (1967) et identifiées sous les ATCC 21.301 et 21.335 (de 1'"American Type Culture Collection^ 30 En outre, d'autres souches mutantes de Corynebaoterium glutami-cua conviennent aussi au procédé de l'invention. Les souches ATCC 21.301 et 21.335 sont obtenues respectivement à partir des souches Corynebacterlum glutamlcum KY-10108 et MF-142, productrices d'acide L-glutamique, par traitement à 35 la N-méthyl-N ' -nitro-H-nitrosoguanicLine. Les souches mutantes obtenues sont différenciables des souches mères de la façon suivante : lorsqu'on les cultive dans un milieu "minimal1' (tel que décrit dans Amino Acids and Kucleic Acids. 53, (1964)), en présence de 100 Y Ail de isoleucine, 40 méthionine, phénylalanine, valine, ou de leurs mélanges, à 28°C 69 5 10 15 20 £5 30 35 40 00243 "2" 2000145 pendant 30 heures, leurs croissances présentent les propriétés décrites au Tableau I s TaHKEAÏÏ I Aminoacide ajouté Croissance (Densité optique à 570 mu) Néant 0,00-0,05 Isoleucine 0,11-0,15 Méthionine 0,16-0,20 Phénylalanine 0,16-0,20 Valine 0,06-0,10 Isoleucine et phénylalanine > 0,20 Isoleucine, méthionine, phénylalanine et valine > 0,20 On voit d'après les données du Tableau I qu'il est possible de propager les souches dans un milieu minimal, sans addition d*aminoacides, mais avee une vitesse très faible de propagation. On voit aussi-le r8le de promoteurs Joué par les aminoaeides ajoutés, l'action de la phénylalanine étant la plus nette au premier stade de propagation. En d'autres termes, il est clair que les souches mutantes obtenues nécessitent les aminoaeides du groupe précité. Les propriétés bactériologiques de Corynebacterium glutamicum sont décrites dans The Journal of General and Applied Microbiologie Vol. 18 , 279-301 (1967). C'est ainsi qu'il est connu qu« les souches mutantes, présentant les propriétés décrites.ci-dessus, dérivent de souches mères, capables de produire l'aoide L-glutamique, et appartenant aux groupes de Micrococcus» Brevi-bacterium. Corynebacterium et Eicrobacterium. Les milieux de culture convenant à l'invention comprennent tous milieux, naturels ou synthétiques, contenant dés quantités convenables de sources de carbone et d'azote, des substances minérales et autres éléments nutritifs. Le glucose constitue une source de carbone préférable, mais on peut aussi utiliser, ensemble ou séparément, d'autres sources de carbone assimilable, comme les fructose, mannose, galactose, maltose, sucrose, l'amidon hydrolysé, les mélasses, la glycérine, l'acide acétique etc. Comme source d'azote, on peut utiliser les dérivés nitrès organiques ou minéraux, comme l'ammoniac, l'urée, le sulfate ou 69 00243 ~3~ 2000145 le chlorure d'ammonium, l'acétate d'ammonium, les sels d'ammonium de divers autres acides organiques, etc. Les substances minérales pouvant être ajoutées au milieu de culture, comprennent divers sels de Fe, Mn, Lg, Co, Zn, Ni, Cr, 5 etc, ainsi que divers composés de l'acide phosphorique. Les aminoaeides convenant spécifiquement aux souches, selon l'invention, sont les isoleucine, méthionine, phénylalanine, valine, ou leurs mélanges. Les quantités de ces aminoaeides qu'il convient d'ajouter dépendent des conditions de la culture, 10 ainsi que de la nature des aminoaeides utilisés, mais elles sont préférablement de l'ordre da 50 à 1000 //ml. On peut «Jouter, si on le désire, des éléments nutritifs, comme des aminoaeides (par exemple la cystine, la cystéine» l'acide glutamique, etc.) et des vitamines (comme la biotine, 15 la thiamine, etc) ou encore l'extrait de levure, l'aliment à base da soja, vendu sous la dénomination commerciale de "Mieki* par la Société dite Ajinomoto Co., l'aau de vie de grain, la peptone, les protéines hydrolysées, l'extrait da viande, des cellules de microorganlames hydrolysées, etc. 20 La fabrication de L-leucine est effectuée selon le procédé de l'invention, par fermentation aérobie, entre 25 et 40°C, da préférence entra 27 et 37*0. La pfi du milieu peut varier dans de larges limites, mais il est préférable de l'ajuster dans la gamme de 5,5 à 8,5, par un agent neutralisant convenable (tel 25 que l'ammoniaque, la soude, la potasse, la chaux, l'urée, etc.) au cours de la culture^ La L-leucine est accumulée au cours de celle-ci, qui dure de 3 à 6 Jours, de la L-tyrosine pouvant se former comme sous produit, dans certaines conditions. Après la fin de la culture, les cellules de microorganismes 30 sont éliminées du bouillon, par exemple par filtration ou cen-trifugation, puis on traite le filtrat de façon convenable, comme par une résine fortement acide, échangeuse de cations. La L-leucine absorbée est ensuite éluée, concentrée et refroidie, de façon usuelle, pour fournir des cristaux bruts de ce 35 composé. L'invention sera mieux comprise à la lecture de la descrip-tien détaillée qui va suivre de quelques exemples non limitatifs de modes de réalisation suivant l'invention. Example 1 ito On innocule par Corynebacterium glutamicum KT-10108-No. 190, 69 00243 2000145 on milieu de culture contenant 1 g/dl de peptone, 1 g/dl d'extrait de viande, 0,5 g/dl d'extrait de levure, 0,3 g/dl de chlorure de sodium et 2 g/dl de glucose, et de pH » 7»0. On poursuit la culture de ce milieu pendant 24 heures pour obtenir une cul-5 ture d'ensemencement. La fermentation est effectuée dans un milieu de culture contenant glucose (10 g/dl), (HH^)2S0^ (2 g/dl)» KHgPO^ (0,15 g/dl)» KgHPO^ (0,05 g/dl), MgS04.7H20 (0,05 g/dl), phénylalanine (150 ¥^ml), isoleucine (100 y/ml), méthionine (100 y /ml), 10 valine (100 y/ml), biotine (100 Y /ml) et CaCO^ (2 g/dl). On place des fractions de 20 ml de ce milieu dans des flacons d'Erlenmeyer stérilisés, et le milieu de culture stérile de chaque flacon est innoculé par 1 ml de la culture d'ensemencement* La fermentation dure 5 jours» à 28*G» sous agitation* On 15 accumule ainsi 9,5 mg/ml de L-leucine dans le milieu de culture de chaque flacon. Un litre des bouillons réunis est centrifugé» pour éliminez les cellules de microorganismes, puis on fait passer le filtrat à travers une colonne remplie de la résine acide, échangeuse de 20 cations, sous sa forme H, vendue sous la dénomination commerciale de "Dianion SK No. 1wpar la Société dite MITSUBISHI KASEI KOGYO K.K. La résine est ensuite lavée avec une solution aqueuse 0,2 N d'ammoniac pour éluer la L-leucine. On réunit les fractions éluées, qu'on concentre, puis laisse reposer, pour obtenir 6»5 g 25 de cristaux bruts de L-leucine, que l'on ajoute à du méthanol (700 ml} 70 % en poids). On chauffe pour dissoudre, et laisse refroidir la solution par repos, puis on sépare le précipité formé qu'on lave au méthanol (70 % en poids) pour obtenir la L-leu-cine purifiée. 50 Les résultats analytiques obtenus par chromatographie sur papier et à l'analyseur automatique d*aminoaeides, montrent que les caractéristiques de la L-leucine obtenue selon l'invention, sont les mêmes que celles de la L-leucine préparée selon les procédés usuels. En particulier le produit obtenu est biologlquement 35 actif et convient pour la propagation de souches utilisées pour effectuer les essais biologiques caractéristiques de L-leucine. Son point de fusion est de 298°C (avec décomposition). Exemple 2 On effectue une fermentation dans les mêmes conditions que 40 celles de l'exemple 1, Sauf que le milieu contient du glucose 69 00243 -5- 2000145 (12 g/dl), de l'extrait de levure (0,5 g/dl, (EH4)2S04 (2 g/dl)5 KH2P04 (0,15 g/dl), K2HP04 (0,05 g/dl), MgSO^^HgO (0,05 g/dl), FeS04c7H20 (0,002 g/dl), MnS04.4H20 (0,002 g/dl), biotine (50 y/1) et OaCO^ (2 g/dl). Après une durée de fermentation de 5 4 jours à 29°C, on obtient 11,0 mg/ml en moyenne de L-leucine dans le milieu de culture de chaque flacon. Exemple 3 On effectue une fermentation dans les mêmes conditions que celles de l'exemple 1, excepté qu'on emploie Oorynebacterium 10 glutamicum ëï]?-142-No. 53 et un milieu contenant PeSO^.yHgO (0,002 g/dl), MnS04.4-H20 (0,002 g/dl), glucose (12 g/dl), pep-tone (1 g/dl), (HH4)2S04 (2 g/dl), KH^O^ (0,15 g/dl), K2HK>4 (0,05 g/dl), MgS04.7H20 (0,002 g/dl), biotine (50 #/ 1 et-CaCOj (2 g/dl). On obtient 11,4 mg/ml en moyenne do L-leucine 15 dans le milieu de culture de chaque flacon. Bien entendu, l'invention n'est nullement limitée aux exemples décrits, elle est susceptible de nombreuses variantes accessibles à l'homme de l'art, suivant les applications envisagées et sans qu'on s'écarte pour cela du cadre de l'invention. 00243 2000145 - KEYESDICAIIOMS - 1 - Procédé de fabrication de L-leucine selon lequel on effectue une culture aérobie d'un microorganisme producteur de L-leucine, du type Corynebacterium, dans un milieu de culture 5 contenant une source de carbone, une source d'azote, des substances minérales, des éléments nutritifs et un promoteur du groupe des isoleucine, méthionine, phénylalanine, valine, ou de leurs mélanges, et on isole la L-leucine obtenue, dudit milieu de culture. 10 2 - Procédé tel que décrit en 1 dans lequel le microorganisme est Ooxynebacterium glutamicum. 5 - Procédé tel que décrit en 2 dans lequel le microorganisme est Corynebaoterium glutamicum ATCC 21.301. 4 - Procédé tel que décrit en 2 dans lequel le microorganism# 15 est Corynebacterium glutamicum ATCC 21.335* 5 - Procédé tel que décrit en l'une quelconque des revendications 1 à 4 dans lequel la température du milieu de culture est maintenue entre environ 25 et 40°C. 6 - Procédé tel que décrit en 5 dans lequel on maintient la 20 température du milieu de culture entre environ 27 ©t 37°C. 7 — Procédé tel que déerit en l'une quelconque des revendications précédentes dans lequel le pH du milieu de culture est ajusté entre environ 5,5 et 8,5* 8 - Procédé tel que décrit en l'une quelconque des revendiea-25 tions précédentes dans lequel la durée de la culture est d'environ 5 à 6 jours. 9 - L-leucine obtenue selon un procédé présentant une ou plusieurs caractéristiques telles que décrites en l'une quelconque des revendications 1 à 8. 50 10 - Utilisation de la L-leucine suivant 9 comme élément nutritif ou comme complément alimentaire pour les 8tres humains et les animaux.