FR 2003585 A1 19691107 FR 6906536 A 19690307 69 06536 i 2003585 la présente invention a pour objet an procédé de préparation de l'acide L-glutamique. Plus particulièrement l'invention a pour objet un procédé de préparation de l'acide L-gluta-mique par fermentation et de façon plus précise, un procédé de 5 préparation de l'acide L-glutamique par fermentation, ce procédé par fermentation utilisant de nouvelles souches capables d'assimiler des hydrocarbures, particulièrement des hydrocarbures gazeux. la demanderesse a déjà étudié des procédés de prépa-10 ration de l'acide L-glutamique utilisant des hydrocarbures peu coûteux pour la source de carbone utilisée comme produits de départ, et elle a déjà publié les résultats obtenus avec des bactéries capables de produire de l'acide L-glutamique à partir de n-paraffines . A la suite d'autres recherches, la demande-15 resse a maintenant découvert de nouvelles espèces de bactéries capables de produire de l'acide L-glutamique avec un rendement élevé à partir d'hydrocarbures gazeux utilisés comme source principale de carbone. Ce procédé est particulièrement avantageux car l'acide L-glutamique est une substance très utile à 20 la fois dans le domaine de la biochimie et de 1'alimentation« La présente invention a donc pour objet un procédé amélioré de préparation de l'acide L-glutamique qui constitue un aminoacide précieux, ce procédé surmontant les inconvénients et déficiences -des procédés antérieurs. 25 La présente invention a également pour objet un pro cédé de préparation de l'acide L-glutamique par fermentation, pouvant être effectuée de façon efficace et relativement simple» La présente invention a encore pour objet un procédé de préparation de l'acide L-glutamique par fermentation pouvant 30 être effectué avantageusement à l'échelle industrielle avec un coût de production bas et cela à partir de matières premières peu coûteuses donnant un rendement de production élevé. L'invention a enfin pour objet la préparation de l'acide L-glutamique. 35 D'autres objets et avantages de l'invention apparaî tront aux spécialistes dans la description et dans les revendications. Le procédé de fermentation utilisant les nouvelles espèces de microorganismes décrites par la présente invention et 40 utilisant des hydrocarbures gazeux comme source principale de 69 06536 2 2003585 carbone présente de nombreux avantages en vue d'une préparation de l'acide l-glutamique à l'échelle industrielle. Par exemple (1) le produit de départ utilisé comme source principale de carbone est abondant et peu coûteux, (2) le stockage, le 5 transport du produit de départ et son alimentation dans un milieu de culture sont faciles à effectuer, (3) la récupération du produit de départ résiduaire s'effectue de façon pratique, (4) le réglage de la concentration de la source de carbone pendant la fermentation est facile,(5) la liqueur de fermentait) tion à la fin de cette fermentation est limpide, (6) la séparation et la purification du produit préparé d'avec le produit résiduaire est relativement simple, etc., si l'on effectue la comparaison avec les procédés de fermentation habituels comme produits de départ des produits à base de saccharine ou des 15 hydrocarbures liquides,. Pour les raisons précités, le procédé de la présente invention, dans lequel l'acide L-glutamique est obtenu directement à partir d'hydrocarbures gazeux par fermentation en utilisant de nouvelles espèces de microorganismes, est considéré comme étant le procédé le moins coûteux de pré-20 paration de l'acide L-glutamique ayant été décrit jusqu'ieio Les nouvelles souches de microorganismes utilisées dans le procédé de la présente invention ont reçu les désignations de Corynebacterium alkanum, Brevibacterium butanicum et Brevibacterium paraffinolyticunu Ces microorganismes ont 25 été directement isolés à partir du sol et leurs caractéristiques bactériologiques sont les suivantes : Corynebacterium alkanum A) Propriétés morphologiques .Forme de/bacterie : habituellement sous la forme de 30 bâtonnets ou de cellules présentant fréquemment des séparations incomplètes ; on remarque des cellules ramifiées et des cellules comportant des séparations nettement marquées. 35 Dimension f Mobilité 0,5 x 2,5 - 5,0 microns aucune Spore : non formé Flagella : non formé Coloration : "G-ram" : positive Fixation acides : pas de fixation 69 06536 3 2003585 B) Propriétés de culture (1) Colonies sur gélose, croissance moyenne, circulaire, souple, complète, convexe, coloration gris jaunâtre, \S luisante et opaque. 5 (2) Sur plan incliné de gélose, croissance moyenne, fili forme, aspect luisant, coloration gris jaunâtre, inodore, aspect butyreux ; le milieu de culture n'est pas modifié. (3) Bouillon nutritif, la croissance en surface est 10 faible, formation modérée en amas. (4) Culture sur bâton de gélose, aucune croissance ou croissance faible à l'extrémité supérieure. Pas de liquéfaction de la gélose. C) Propriétés physiologiques 15 (1) Température optimum : 25° - 30°C (la croissance à 35°C est faible) (2) pH optimum : 5,0 - 9,0 (aucune croissance à un pïï 4,0) (3) Demande en oxygène : aérobie (4) lait de tournesol : inchangé ou réaction alcaline 20 (5) Hydrogène sulfuré ; production (6) Indol : pas de production (7) Amidon : non décomposé (8) Production de nitrites à partir de nitrates (9) Catalase : positive 25 (10) Production d'ammonium : aucune (11) Essai de "Yoges -Proskauer" : négatif (12) Utilisation de sucres : production d'acide à partir du glucose, du fructose, du mannose, du saccharose, du lactose, du mannitol et du sorbitol 30 (13) Capacité d'assimiler les hydrocarbures : assimile le propane, le n-butane, le ja-dodécane, le n-tridécane, le ri-tétradécane, le n-pentadécane, le ri-hexadécane et le n-heptadécane. Brevibacterium butanicum 35 A) Propriété morphologiques Forme de la bactérie : habituellement en bâtonnets courts, on note fréquemment des cellules comportant une séparation incomplète, des cellules ayant une séparation d'un type marqué, mais toutefois on ne re- 40 marque pas de cellules ramifiées» 0 4 2003585 Dimension : 0,5 x 3,0 - 6,0 microns Mobilité : aucune Spore : pas de formation Flagella : pas de formation Coloration "Gram" i positive Fixation acides : aucune Propriétés de culture (1) Colonies sur gélose, croissance importante, circulaire, souple, complète, sans protubérance, coloration brun pâle, carmin et opaque» (2) Sur plan incliné de gélose, croissance abondante, en forme de chapiteaux, coloration brun pâle, inodore, aspect butyreux, le milieu de culture reste inchangé. (3) Sur bouillon de culture, la croissance à la surface a un aspect nembraneux, presque clair, pas de sédimentation* ,(4) Culture sur bâton de gélatine, la croissance à la partie" supérieure s'effectue mieux qu'à la partie inférieure et l'on n'observe aucune liquéfaction de la gélatine Propriétés physiologiques (1) Température optimum : 25° - 30°C (la croissance à la température de 37°C est faible). (2) pH optimum ; 6,0 - 9,0 (3) Exigence en oxygène : aérobie (4) Lait de tournesol : inchangé ou réaction alcaline (5) Hydrogène sulfuré : production (6) Indole : pas de production (7) Amidon : non décomposé (8) Production de nitrites à partir de nitrates (9) Catalase : positive (10) Production.d'ammonium : aucune (11) Test de "Vcges -Proskauer" : négatif (12) Utilisation de sucres : production d'acide à partir du glucose, du fructose, de l'arabinose, du mannose, du saccharose, du xylose, du mannitol et du sorbitol (13) Capacité d'assimilation des hydrocarbures ï assimile le propane, le n-butane, le ja-décane, le n-andécane, 69 06536 5 2003585 le n-dodécane, le n-tridécane, le n-tétradécane, le n-pentadécane, le n-hexadécan_e et le n-heptadécane0 Brevibacterium paraffinolyticum A) Propriétés morphologiques 5 (1) Forme de la "bactérie : "bâtonnets, on remarque fré quemment des cellules comportant un type de séparation marquée et on ne remarque pas de cellules ramifiées. Dimension : 0,5 x 2,5 -5,0 micron.; 10 Mobilité : aucune Spore : pas de formation Flagella : pas de formation Coloration "G-ram" : positive Fixation acides : aucune 15 B) Propriétés de culture (1) Colonies sur gélose, croissance abondante circulaire, souple, complète, convexe jusqu'à former des capitules, rose pâle, luisante et opaque- (2) Sur plan incliné de gélose, croissance abondante, 20 filiforme, luisante, gris jaunâtre,aucune odeur, aspect butyreux, le milieu de culture n'est pas modifié (3) Sur bouillon nutritif, la croissance à la surface est faible avec formation modérée d'amas. 25 (4) Culture sur bâton de gélatine : aucune croissance ou croissance légère à la partie supérieure. Pas de liquéfaction de la gélatine. C) Propriétés physiologiques (1) Température optimum : 25° - 30°C (la croissance à 30 35°C est. extrêmement faible) (2) pH optimum ; 5,0 - 9,0 (on n'observe pas de croissance à un pH 4,0) (3) Exigence en oxygène î aérobie (4) lait de tournesol : pas de modification 'ou réae-35 tion alcaline (5) Hydrogène sulfuré : production (6) Indole : pas de production (7) Amidon : non décomposé (8) Production* de nitrites à "partir de nitrates 40 (9) Catalase : positive 06536 6 2003585 (10) Production d'ammonium : aucune (11) Test de "Yo gea -Proskauer" : négatif (12) Utilisation de sucres : production d'acide à partir de glucose, de fructose, de saccharose, de lactose, de mannitol et de sorbitol. (13) Propriétés d'assimilation des hydrocarbures : assimile le propane, le n-butane, le n-undécane, le n-dodécane, le n-tridécane, le n-tétradécane, le n-pentadécane, le n-hexadéeane et le n-hepta-décane A partir des propriétés ci-dessus, la demanderesse a étudié la situation taxonomique du Corynebacterium alkanum. en se référant à l'ouvrage en langue anglaise : "Bergey's Manual of Determinative Bacteriology" 7ème Edition (1957)o Ce microorganisme appartient à la famille des Corynebacteriaceae car les cellules ont la forme de bâtonnets, elles ne sont pas fixées par les acides, on n'observe"pas de triehomes, elles sont gram-positives, il n'y a pas de formation d*endospores, on observe la formation de cellules ramifiées et les sources ne subissent pas une fermentation anaérobie. En outre, cette souche appartient aux gènes Corynebacterium en raison de la séparation des cellules du type incurvé et net, la catalase étant positive, ce qui est caractéristique de cette famille. Cette souche est très voisine des souches Corynebacterium agropyri et Corynebacterium rathayi parmi les espèces Corynebacterium. Toutefois, comme l'indique le tableau 1, cette souche est différente de la souche Corynebacterium agropyri en raison de la dimension de ses cellules, de ses propriétés de coloration selon le test de "(Tram" et en raison de sa croissance dans une culture de bouillon-gélose sur plan inclinéo Cette souche est également différente de la souche Corynebacterium rathayi en raison de la dimension des cellules, de leur croissance et de leur aptitude à liquéfier la gélatine. De plus, cette souche est différente des deux espèces mentionnées ci-dessus en raison de son aptitude à former des colonies et d'assimiler les hydrocarbures gazéux et liquides. Cette souche est de toute évidence une espèce nouvelle et elle a donc reçu la désignation de Corynebacterium alkanum» la détermination taxonomique du Brevibacterium buta- 7 2003585 69 065^6 7 nicum a été effectuée par la même méthode que celle décrite ci-dessus. Cette souche appartient à la famille des Brevibacteria-ceae car les cellules ont la forme de "bâtonnets, elles ne sont pas fixées par les acides, elles ne forment pas des trichomes, 5 elles ont des propriétés gram-positives, elles ne forment pas d'endospores et elles ne sont pas ramifiées. En outre, cette souche appartient au gène Brevibacterium, car les "bâtonnets non ramifiés ne forment pas de filaments. Cette souche est considérée comme étant très voisine des souches Brevibacterium maris, 1° Brevibacterium fuscum et Brevibacterium ammoniagenes appartenant à ce gène. Toutefois, comme l'indique le tableau 2, cette souche est (a) différente de la souche Brevibacterium maris en raison de la dimension des cellules, de leur couleur et de la croissance des colonies sur gélose, de la production d'hydrogène sul-15 furé et de son activité sur le saccharose, (b) différente de la souche Brevibacterium fuscum en raison de la dimension des cellules, de la coloration at de la formation de colonies sur gélose, de la croissance de la culture sur bâton de gélatine et sur bouillon nutritif, et (c) différente de la souche Brevi-20 bacterium ammoniagenes en raison de la dimension des cellules, de la formation de colonies sur gélose et de la coloration de ses colonies. De plus, cette souche est différente des deux espèces précitées en raison de sa consistance dans les cultures sur plan incliné de gélose et de sa capacité d'assimiler des 25 hydrocarbures gazeux et liquides. Par conséquent, elle est considérée comme étant une nouvelle espèce de microorganisme et on lui a donné la désignation de Brevibacterium butanicunu On a déterminé la position taxonomique du Brevibacterium paraffinolyticum par la même méthode que celle décrite ci-30 dessus. Cette souche appartient à la famille des Brevibacte-riaceae car les cellules ont la forme de bâtonnets, elles ne sont pas fixées par les acides, elles ne forment pas des trichomes, elles sont gram-positives, elles ne forment pas d'endospores et elles ne sont pas ramifiées. Cette souche appartient 35 au gène Brevibacterium car les cellules non ramifiées ne forment pas de filaments. Elle est très voisine des souches Brevibacterium maris, Brevibacterium fuscum et Brevibacterium ammoniagenes parmi les souches de ce gène. Toutefois, comme l'indique le tableau 2, elle est (a) différente de la souche Brevibacterium 40 maris en raison de la dimension des cellules, de leur coloration, 69 0653b 8 2003585 de la croissance dans un "bouillon de culture, de son comporte— ment en présence de saccharose et de la production d'hydrogène sulfuré, ("b) différente de la souche Brevibacterium fuscua en raison de la taille des cellules, de la croissance d'une cultu-5 re sur "bâton de gélatine et (c) différente de la Brevibacterium ammoniagenes en raison de la dimension des cellules et de leur couleur. En outre, cette souche est différente de ces deux espèces en raison de sa consistance dans les cultures de gélose sur plan incliné et de sa capacité d'assimiler des hydrocarbures 10 gazeux et liquides. En conséquence, cette souche est également considérée comme étant une nouvelle espèce et on lui a donné l'appellation de Brevibacterium paraffinolyticum. De plus,cette souche est considérée comme étant différente de la souche Brevibacterium butanicum en raison de sa coloration, de son aspect 15 luisant et de son aptitude à utiliser les sucres® Tableaux 1 et 2 (voir pages 9-10) Les nouvelles souches décrites dans la présente demande ont fait l'objet d'un dépôt à 1'American Type Culture Collection" et elles ont reçu les désignations suivantes : 20 Corynebacterium alfcanum ATCC 21194 Brevibacterium paraffinolyticum ATCC 21195 Brevibacterium butanicum ATCC 21196 On peut utiliser conformément à l'invention soit un milieu de culture synthétique soit un milieu nutritif naturel 25 dans la mesure où. ce milieu contient les éléments nutritifs essentiels à la croissance de la souche particulière utilisée, et qu'il comporte un hydrocarbure comme source principale de carbone, étant donné la propriété des souches utilisées ici, d'assimiler les hydrocarbures. De tels éléments nutritifs sont bien 30 connus des spécialistes et ils comportent des substances telles qu'une source de carbone, une source d'azote, des composés minéraux et des composés analogues qui sont utilisés par les microorganismes en des quantités appropriées. On peut utiliser comme source principale de carbone 35 dans le procédé de la présente invention aussi bien des hydrocarbures gazeux que des hydrocarbures liquides. On utilise des hydrocarbures gazeux ayant de 2 à 4 atomes de carbone, comme l'éthane, le n-propane, 1'isopropane, le n-butane, 1'iso-butane et le tertio-butane. On peut utiliser des hydrocarbures alipha-40 tiques ayant 5 à 18 atomes de carbone comme par exemple le - cr sO TABLEAU 1 o cr-en Corynebacterium agropyri Corynebacterium rathayi Corynebacterium alkanum U> O" Dimension 0,4 - 0,6 x 0,6-1,1 micron 0,6 - 0,75 x 0,75-1,5 micron 0,5 x 2,5 - 5»0 micron Coloration en culture de bouillon-gélose sur plan incliné jaune jaune gris jaunâtre Coloration "Gram" variable positive positive Utilisation de sucres G-lucose Sucrose lactose Production d'acide Production d'acide Production d'acide production d'acide Production d'acide Production d'acide production d'aàide Production d'acide KO Aptitude à décomposer l'amidon Faible / Nulle Culture sur bâton de gélatine Non liquéfié liquéfié progressivement après 7 semaines Non liquéfié N> Coloration et croissance en culture de bouillon-gélose sur plateau Jaune Faible Aspect très visqueux Jaune Croissance lente G-ris jaunâtre Croissance moyenne Aspect butyreux O O U> Cn co m vO SAB1EAU 2 O =======================================================:=================:=:===:===:====:====:========!3 O en Brevibacterium Brevibacterium Brevibacterium Brevibacterium Brevibacterium U.j maris iuscum ammoniagenes paraffinoly- butanicum ! C- tic uni Dimension 0,7-0,8 x 0 - 0,6 x 1,5 0,8 x 1,4-1,7 0,5 x 2,5-5,0 0,5 x 2,5-5,0 1,2 micron micron micron. micron micron Culture sur jaune oranger, jaune brônatre gris ou jaune rose pâle, con- brun pâle, bouillon-gélose oonvexe légèrement pâle, aspect vexe ou en protubéran- en plateau convexe aplati capitule ces Culture sur non liquéfié liquéfié non liquéfié non liquéfié non liquéfié bâton de graduellement gélatine 1 ! H Bouillon limpide avec trouble avec mobilité modé- faible crois- ° nutritif formation formation rée près de la sancé à la d'une pelli- d'une pellicu- surface surface, for- cule orange efc le et sédimen- mation d'amas sédimentation tation modérée Utilisation de sucre : Saccharose néant - - production production d'a- d'acide cide . lactose néant - - - d° - - d° - (sj ; : ■ O Hydrogènfi aucune pro- - - Production Production ^ sulfuré duction q-, 00 =:.==3=====:s======:a==============================================~======================-= =* ■ (j-. 69 06536 îi 2003585 n-pentane, le n-octane, le n-décane, le n-dodécane, le is-hexadé* cane, l'isopentane, l'isooctane, etc., du. cycloparaffine comme le cyclohexane et le cyclooctane, des oléfines à chaîne droite ou à chaîne ramifiée comme le pentène-2, l'hexène-1, l'octène-1, 5 l'octène-2, etc., des oyclooléfines comme le cyclohexène et les composés analogues. Il est également possible d'utiliser comme source principale de carbone, des hydrocarbures aromatiques comme le benzène, les xylènes isomères, etc.. et leurs mélanges ainsi que des mélanges d'hydrocarbures comme le kérosène, les 10 huiles légères, les huiles lourdes, l'huile de paraffine, etcc Bien entendu on peut utiliser dans le milieu de culture des mélanges de deux ou plus de deux de ces substances. On peut utiliser dans le milieu de culture de petites quantités d'autres sources de carbone telles que des sucres ou ^ des sucres alcools, comme par exemple le glucose, le fructose, le maltose, le saccharose, l'amidon, l'hydrolTsat d'amidon, les mélasses, etc., o^ n'importe quelle autre source de carbone appropriée telle que des acides organiques comme par exemple l'acide acétique, l'acide lactique, etc.. et des alcools comme 20 l'éthanol, le n-butanol, etc. On peut également utiliser ces substances soit séparément soit en mélanges de deux ou de plus de deux. On peut utiliser comme source d'azote dans la présente invention, des sources d'azote organique ou minéral dont on se 2^ sert habituellement dans les fermentations de l'acide glutami-que. Ces sources comportent des catégories variées de sels d'acides organiques ou minéraux ou de composés comme l'urée, l'ammoniaque ou les sels d'ammonium comme le chlorure d'ammonium, le silicate d'ammonium, le nitrate d'ammonium, l'acétate d'am-50 monium, le phosphate d'ammonium, etc.. ou des substances naturelles et contenant de l'azote comme la liqueur de macération du maïs, l'extrait de levure, l'extrait de viande, la peptone, la farine de poisson, le bouillon, les hydrolysates de caséine, l'acide casamino, les extraits solubles de poisson, l'extrait de son de riz, etc. Là encore, on peut utiliser ces substances soit séparément soit en combinaison de deux ou de plus de deux. Les composés minéraux pouvant être ajoutés au milieu de culture sont constitués par le sulfate de magnésium, le phosphate de sodium, le phosphate monopotassique, le phosphate iQ dipotassique, le sulfate de fer, le chlorure de manganèse, le 69 0 bD . > t ) 12 2003585 chlorure de calcium, le chlorure de sodium, le sulfate de zinc, etco On effectue la fermentation de la culture des microorganismes de l'invention dans des conditions aérobies telles 5 qu'un secouage aérobie de la culture ou une agitation avec aération d'une culture submergée, cela à une température par exemple d'environ 20 à 50°C et à un pH par exemple d'environ 4,0 à 9,0» Après un laps de temps d'environ 3 à 7 jours de culture dans ces conditions, on recueille une grande quantité d'a-10 cide L-glutamique accumulée dans la liqueur de culture résultante. Si l'on utilise des hydrocarbures gazeux, on les introduit sous la forme de gaz mélangés avec de l'air ou de l'oxygène et l'on utilise alors un procédé de culture du type com-15 portant une aération» Il n'est pas nécessaire d'utiliser une concentration des gaz limitée à une valeur particulière» On peut utiliser dans la présente invention les techniques variées utilisées dans les fermentations habituelles de produits à base de saccharine ou d'hydrocarbures liquides. Par 20 exemple la rapidité de la fermentation est extrêmement accélérée lorsqu'on ajoute dans le milieu, de petites quantités d'hydrocarbure non utilisable comme le pristane, d'autres substances ayant des effets similaires ou des agents de surface introduits dans le but d'augmenter le taux d'hydrocarbure gazeux 25 dissous dans le milieu de culture. La fermentation est terminée lorsque la production d'acide L-glutamique indique une valeur maximale' Lorsque la culture est terminée, on peut récupérer l'acide L-glutamique en utilisant les moyens habituels tels que le traitement sur une 30 résine échangeuse d'ions, l'extraction par des solvants, la précipitation, l'absorption, un procédé chromâtographique ou des procédés analogues» Selon un procédé utilisé de préférence, on fait passer la culture à travers une résine échangeuse d'ions dans le but d'absorber l'acide L-glutamique. On effectue ensuite 35 l'élution de la résine, on concentre le tout et on le refroidit,, On récupère les cristaux obtenus et ensuite on les recristallise si on le désire, dans le but d'obtenir des cristaux purs. Les exemples non limitatifs suivants sont indiqués à titre d'illustration de la présente invention, et sauf indica-40 tion contraire, les pourcentages s'entendent en poids. :9 Ooj> 13 2003585 Exemple 1 On utilise comme microorganisme d'ensemencement Corynebacterium alkanum ATCC 21194. On cultive ce microorganisme dans une secoueuse aérobie pendant 24 heures avec un milieu 5 d'ensemencement contenant 0,25 $ d*extrait de levure, 0,5 fo d'extrait de viande, 0,5 $ de peptone, 0,25 $ de chlorure de sodium, et 2,0 $ de sorbitol à un pH de 7,2 et on obtient ainsi une culture d'ensemencement» On inocule cette culture d'ensemencement à la proportion de 10 $ en volume dans 2,7 litres d'un mi-10 lieu de fermentation préalablement stérilisé contenu dans un fermentateur d'une capacité de 5 litres, le milieu précité ayant la composition suivante : 0,05 7° kh2p°4 0,05 $> Ha2HP04,12H20 0,01 i MgS04,7H20 o * o o H MnS04,4H20 H O O «t O î'eS04,7H20 0,001 io ZnS04, 7H20 o o o H CaCl2,2H20 10 h3bo3 io yi ÏTa2Mo04,2H20 50 VI cuso4,5h2o 10 >£/! CaCl2,2H20- 50 Y) /I UiCl2,6H20 0,05 # liqueur de macération 1,5 Io (kh+)2so4 le pH du milieu est 7,2. On effectue la culture à environ 30°C pendant 96 heures tout en agitant à la vitesse de 600 tours par minute et en 35 aérant le milieu avec un mélange gazeux contenant du n-butane et de l'air (50 : 50 Y/Y) ^le débit étant de 1 litre de gaz par minute pour un litre de liquide. On maintient le pH du milieu à 7,2 pendant la culture en ajoutant au milieu une solution d'ammoniaque. lorsque la fermentation est terminée, la quantité 40 d'acide l-glutamique produite accumulée dans la liqueur de cul- 9 065.1o 14 2003585 tore est de 18 mg/mlo On sépare les cellules des microorganismes d'avec la liqueur de fermentation à l'aide d'une centrifugeuse lorsque cette fermentation est terminée,, On ajuste ensuite le pH de la 5 liqueur à 2,0» On fait passer la liqueur à travers une résine échangeuse de cations qui est de l'Amberlite IR-120 type H, et l'on effectue l'élution de la résine avec une solution d'ammoniaque,, On concentre l'effluent ainsi obtenu et on le refroidit,, On obtient 41 g de cristaux d'acide l-glutamique» 10 Exemple 2 On effectue la culture de la façon décrite dans l'exemple 1, cela en utilisant le Brevibacterium butanicum ATCC 21196, si ce n'est/^ue on utilise comme source principale de carbone un mélange gazeux de propane et d'air dans la proportion de 50:50 15 (V/V)e Après 96 heures de culture, la quantité d'acide l-glutamique accumulée dans la liqueur de culture résultante est de 15 mg/mlo On obtient ainsi environ 33 g d'acide l-glutamique selon un procédé de récupération effectué de la même façon que dans 20 l'exemple 1. Exemple 3 On utilise comme souche d'ensemencement Brevibacterium paraffinolyticum ATCC 21195* On cultive ce microorganisme dans une secoueuse aérobie pendant 24 heures à un pH de 7,2 dans un 25 milieu d'ensemencement contenant 0,25 $ d'extrait de levure, 0,5 ^ d'extrait de viande, 0,5 io de peptone, 0,25 $> de chlorure de sodium, 2,0 io de sorbitol et l'on obtient ainsi une culture d'ensemencement» On inocule cette culture d'ensemencement selon une proportion de 10 $ en volume dans 2,7 litres d'uni milieu de 30 fermentation préalablement stérilisé contenu dans un fermenta-teur d'une capacité de 5 litres» la composition de ce milieu étant la suivante : 35 40 0,05 t KH2P04 0,05 io Ua2HP04,12H20 0,01 i> MgS04,7H20 0,001 i MnS04,4H20 0,001 io î'eS04,7H20 0,001 io ZnS04,7H20 69 065V; 15 2003565 0,001 56 CaCl2,2H20 10 f /I H3BO3 10 $ /i Na2Mo04,2H20 50 ^/1 CUSO4,5H2O 10 TS /I COC12,2H20 50 >C/1 NiCl2,6H20 0,3 t liqueur de macération du maïs 1,5 * (ÏÏH4)2S°4 10 le pH du milieu, est 7,2> On effectue la culture de la même façon et dans les mêmes conditions que celles décrites dans l'exemple 1. Après 30 heures de culture, on ajoute ensuite au milieu 5° unités/ml de sel de potassium de la pénicilline G et l'on continue la 15 culture» Après 96 heures de culture, on obtient la production de 10 mg/ml d'acide l-glutamique dans la liqueur de culture. lorsqu'on effectue la culture de la même façon mais sans ajouter de la pénicilline, la quantité d'acide l-gluta-20 mique produite est de 0,3 mg/ml. Exemple 4 Dans un fermentateur d'une capacité de 5 litres, on prépare 2,7 litres d'un milieu de culture contenant les composants suivants : 25 0,05 1° kh2po4 0,05 f Na2HP04,12H20 0,01 Io MgS04,7H20 H o o •t o MOS04,4H20 30 0,001 i FQS04,7H20 0,001 io ZnS04,7H20 0,001 io 0aCl2,2H20 35 10 ^ /I H3BO3 10 %fl Na2Mo04,2H20 50 Y/1 CUS04,5H20 10 x /I 0oG12,2H2O 40 69 OôSJô 16 2003585 50 y /I NiCl2,6H20 0,05 i° liqueur de macération du mais 1,5 i (kh4)2SO4 I i<> n-dodécane 5 0,05 io Nonion IiP-20 et on stérilise le toute le pH du milieu est 7»2 On prépare une culture d'ensemencement de Corynebacterium alfcanum ATCC 21194 de la même façon que celle décrite 10 dans l'exemple 10 On inocule la culture d'ensemencement au milieu de culture précité selon une proportion de 10 $ en volume,, On effectue la culture de la même façon que celle décrite dans l'exemple 1 pendant une durée de 96 heures, lorsque la culture est terminée on recueille 21 mg/ml d'acide 1-gluta-15 mique accumulé dans la liqueur de culture. On peut remarquer d'après la description ci-dessas» que l'addition d'agents antibiotiques et d'agents de surface att milieu, accélèrent la fermentation et diminue le rendement en acide L-glutamique. Comme exemple d'agents antibiotiques et d'a-20 gents de surface ou agents dispersifs pouvant être utilisés à cet effet, on peut citer des substances telles que celles décrites dans la demande de brevet des Etats-Unis d'Amérique n° de série 643.832, déposée le 6 juin 1967<> On peut citer comme agents antibiotiques appropriés, la penioilline, la bacitraoiae, 25 la cyclocérine, la kanamyeine, la streptomycine, la spiramyoine, la Cefalotine, la Cephaloridine, et la novobiocine. Comme agents de surface appropriés on peut citer les substances anioniques, cationiques et non ioniques ainsi que des acides gras et des esters organiques, à poids moléculaire élevé. On peut également 30 utiliser des mélanges d'agents antibiotiques et d'agents dispersifs o II est bien évident que de nombreuses variantes sont possibles sans que l'on sorte du cadre de la présente invention. 69 065.36 17 2003585 REVENDICATIONS 1. Procédé de préparation de l'acide L-glutamique ca ractérisé par le fait qu'on effectue une culture d'un microorga nisme choisi dans le groupe formé par Corynebacterium alkanum 5 ATCC 21194, Brevibacterium paraffinolyticum ATCC 21195 et Brevi bacterium butanicum ATCC 21196 cette culture étant effectuée dans des conditions aérobies, dans un milieu nutritif aqueux contenant comme source principale de carbone un hydrocarbure ou un mélange d'hydrocarbures, l'acide L-glutamique étant accumulé 10 dans la liqueur de culture résultante» 2. Procédé selon la revendication 1 dans lequel on effectue la culture à une température d'environ 20° à 50°C et à un pH d'environ 4,0 à 9,0. 3. Procédé selon la revendication 1 dans lequel l'hy 15 drocarbure utilisé est un hydrocarbure gazeux ayant de 2 à 4 atomes de carbone. 4. Procédé selon la revendication 3 dans lequel on ajoute dans le milieu de culture l'hydrocarbure gazeux précité sous la forme d'un mélange gazeux avec de l'oxygène ou avec de 20 l'air. 5. Procédé selon la revendication 1 dans lequel l'hydrocarbure précité est un hydrocarbure liquide ayant de 5 à 18 atomes de carbone. 6. Procédé selon la revendication 1 dans lequel 25 l'hydrocarbure utilisé est une fraction de la distillation du pétrole. 7. Procédé selon la revendication 6 dans lequel l'hydrocarbure utilisé est du kérosène. 8o Procédé selon la revendication 1 dans lequel on 50 ajoute au milieu un hydrocarbure non utilisable• 9. Procédé selon la revendication 1 dans lequel on ajoute au milieu de culture un agent de surface. 10. Procédé selon la revendication 1 dans lequel on ajoute au milieu de culture un agent antibiotique. 35 11. Procédé selon la revendication 10 dans lequel l'agent antibiotique utilisé est la pénicilline. 12. Procédé de préparation de l'acide L-glutamique caractérisé par le fait qu'on effectue la culture d'un microorganisme choisi dans le groupe formé par Corynebacterium alka-40 ATCC 21194, Brevibacterium paraffinolyticum ATCC 21195 et 69 06536 18 2003585 Brevibacterium butanicum ATCC 21196, cela dans des conditions aérobies à une température d'environ 20° à 50°C, à un pH d'environ 4»Q à 9»0, dans un milieu nutritif aqueux'contenant un hydrocarbure ou un mélange d'hydrocarbures ayant de 2 à 18 atomes 5 de carbone comme source principale de carbone,qu'on obtient l'accumulation de l'acide L-glutamique dans la liqueur de culture résultante et qu'on récupère l'acide L-glutamique à partir de cette liqueur» 13o Procédé selon la revendication 12 dans lequel l'hy 10 drocarbure utilisé est la n-paraffine. 14. Procédé selon la revendication 12, dans lequel l'hydrocarbure utilisé est un hydrocarbure gazeux ayant de 2 à 4 atomes de carbone. 15» Procédé selon la revendication 14, dans lequel 15 on introduit dans le milieu de culture un hydrocarbgge gazeux sous la forme d'un mélange gazeux avec de 1'oxygène/de l'air® 16. Procédé selon la revendication 12, dans lequel cft utilise comme microorganisme Corynebacterium alkanum ATCC 21194« 20 17o Procédé selon la revendication 12, dans laquel on utilise comme microorganisme Brevibacterium paraffinolyticum ATCC 21195. 18. Procédé selon la revendication 12, dans lequel on utilise comme microorganisme Brevibacterium butanicum ATCC 21196 25 19» Procédé selon la revendication 12 dans lequel on récupère l'acide L-glutamique à partir de la liqueur de culture par un traitement avec une résine échangeuse d'ions. 20, Procédé selon la revendication 12 dans lequel on introduit dans le milieu de culture un additif choisi dans le 30 groupe formé par des hydrocarbures non utilisables, des agents de surface et des agents antibiotiques, dans le but d'accélérer la fermentation.