FR 2006068 A1 19691219 FR 6911134 A 19690410 69 11134 1 2006068 La présente invention se rapporte à tin procédé de synthèse de diesters d'acide phosphorique condénsé, qui répondent à la formule générale suivante s dans laquelle les symboles B et RM représentent t un reste organique tel que les restes alkyle, cycloalkyle ou aryle; un reste d'un 10 sucre y compris les nucléosids du type imidazole, du type flavine, du type pyridine, du type pyrimidine ou dut type purine, ou encore des mono- ou oligo-saccharides; un reste d'aminoacide, un reste de vitamine, ou un reste de stérolde, etc..., g et & étant égaux à 0 ou à un nombre entier tel que 1, 2, 3, etc.. Plus particuliè-15 rement, la présente invention est relative k un procédé de synthèse des diesters d'acide phosphorique condensé décrits ci-dessus en présence d'un solvant constitué par un ou plusieurs triesters d'acide phosphorique, procédé qui consiste k faire réagir un monoester ou un sel d'un monoester d'un mono- ou oligo-phosphoramidate, 20 le monoester répendant à la formule générale suivante t 25 (dans laquelle les symboles B et n ont la même signification que ci-dessus et le symbole B représente un groupe amino primaire, secondaire ou tertiaire ou bien une base organique cyclique^ ou à faire réagir un diester ou un sel de diester d'acide mono— ou oligo-phosphorique, le diester répondant k la formule générale 30 suivante t 35 (dans laquelle les symboles R et n ont la même signification que 5 ci-dessus et B' représente un groupe p- ou Y-py^^-yl®) avec un monoester ou un sel de monoester d'un acide mono- ou oligo-phosphorique, le monoester répondant à la formule générale t ©AD ORIGINAL 11134 2 2006068 5 (dans laquelle B" et m ont les mêmes significations que ci-dessus). Il a déjà été proposé de synthétiser des diesters d*acide phosphorique condensé en condensant des phosphoramidates et des monoesters d*acide phosphorique» Far exemple, plusieurs de ces procédés proposés dans la technique antérieure sont décrits 10 dans les articles suivants : H»G» Khorana et coll. "J« Chem« Soc6g 3756 (1958) 82 659 (1961)i JUL* Nussbaum et cell» "Tetrahedron". 20 2467 (1964); N«K« Kochetkov et coll» "Tetrahedron". 19. 1207 (1963)j 15 T« Furukava et eell» "Chem. Pharm» BullaJa-pan. 13, 16(1965) J.G. Hoffatt et cell» "J* Am.Ohem.Soc." 88, 838 (1966) Toutefois^ tous ces procédés présentent un ou plusieurs inconvénients* Par exemple, les temps de réaction sont excessivement longs, il est difficile d'obtenir une réaction complète, 20 de grandes quantités de sous-produits sont formées en plus des diesters désirés et les rendements sont indésirablement faibles, le rendement en produit désiré après la réaction étant généralement compris entre 20 et 80$ et le rendement en produit isolé étant compris entre 18 et 70$6» 25 lia présente invention a donc pour objet t — un procédé perfectionné de synthèse de diesters d*acide phosphorique condensé qui ne présente pas les inconvénients et les insuffisances des procédés de la technique antérieure; » un procédé de synthèse de diesters d'acide phosphorique 30 condensé, qui peut être mis en oeuvre d'une manière efficace et économique f — un procédé de synthèse de diesters d'acide phosphorique condensé donnant des rendements élevés en composés recherches en un temps plus court que celui qui pouvait être possible avec les 35 procédés de la technique antérieure» Ces caractéristiques et avantages de la présente invention ressortiront k la lecture de la description et des revendi-» □AD ORIGINAL 11134 3 2006068 cations qui vont suivre» En étudiant les procédés de production des eemposéa recherchés et grâce à diverses expériences, la demanderesse a constaté qu'on peut pallier les inconvénients des procédés clas-5 siques en utilisant un ou plusieurs triesters d'acide phosphorique comme solvant pour la rt action. De cetie manière, on peut résoudre des problèmes tels que la solubilité inédieere des Batières de départ, la longueur de la réaction (du fait que la réaction est-violente aux températures élevées, les procédés de la technique 10 antérieure étaient mis en oeuvre à la température ambiante et il fallait attendre environ 3 k 4 jours pour obtenir des rendements normaux), la production de divers sous-produits même à la température ambiante et les rendements faibles* En outre, le rendement peut Ôtre encore amélioré en chauffant le mélange de réaction jus— 15 qu'à environ 706C, car la solubilité des matières de départ augmente et la décomposition du diester d'acide phosphorique condensé ainsi obtenu est empêchée par l'utilisation d'un ou plusieurs triesters organiques d'acide phosphorique comme solvant réaction— nel. A cet égard, la demanderesse a constaté qu'on peut obtenir 20 un ester phosphorique condensé en 2 à 5 heures seulement, avec des rendements atteignant jusqu'à environ 90$ ou plus, quand la réaction est mise en oeuvre m environ 502C® De ce fait, conformément à la présente invention, on peut obtenir des diesters d'acide phosphorique condensé en 25 faisant réagir un ester ou un sel d'ester d'un mono— ou oligo—phos-phoramidatc (formule I), ou un ester ou un sel d'ester d'un mono-ou oligo-phosphate de pyridyle (formule II), esters qui répondent aux formules générales suivantes j 30 (I) B _ 0 I — 0 i— P 0 \ g p I OU (II) S —0 -4- P — 0 ] — P — OR* , respectivement 35 (dans lesquelles les symboles R, R', n et B ont les mimes significations que ci-dessus) et un cionoester ou un sel de monoester d'acide mono- oit cl igo-phosphorique (formule III), ester qui répond à la formule gênés c.ie t BAD ORIGINAL 11134 4 2006068 (III) B* ~ 0 0 P - OH , I OH I 5(dans laquelle les symboles B" et n ont la même signification que triesters d1acide phosphorique, à une température pouvant atteindre environ 70#G, et en purifiant ensuite le mélange de réaction 1Q (sous forme d'une solution ou d'une suspension) par un procédé connu, en ajoutant on non de l'eau<> dans la présente invention comprennent tous les esters de mono-ou ci-dessus) en présence d'un solvant constitué par un ou plusieurs Les matières de départ qui peuvent être utilisées BAD ORIGINAL 11134 s 2006068 Camme exemples typiques des composés définis ci-dessus, on peut mentionner les esters phosphoriques comme l'adéno-sine-5*-phosphate, l'adénosine-2'-phosphate, l'adénosine-3'-phosphate, le désoxyadénosine-5*-phosphate, le désoxyadénosine-3*-5 phosphate, l'adénosine-2' ,S'-^yclo-phosphate-S'-phosphate, l'adé-nosine-5'-diphosphate, l'adénosine-5'-triphosphate, la guanosine— 5*-phosphate, la guanosine—5*—diphosphate, la guanosine-5*—triphos phate, la désoxyguanosine-5'-phosphate, la désoxyguanosine-5*— diphosphate, la désoxyguanosine-5*—triphosphate, l1inosine-5'— 10 phosphate, l*inosine-5*—diphosphate, l'inosine—5'-triphosphate, la xanthosine-5'—phosphate, la xanthosine-5*-diphosphate, la xan— thosine-5'-triphosphate, l'uridine-5*-phosphate, l'uridine-5'— diphosphate, l*uridine-5'-triphosphate, la désoxyuridine^-S'-phos-phate, la désoxyuridine-5*-diphosphate, la désoxyuridine—5'—tri— 15 phosphate, la cytidine-5'-phosphate, la cytidine-5*-diphosphate, la cytidine-5*-triphosphate, la désoxycytidine-5'-phosphate, la désoxycytidine-5'-diphosphate, la désoxycytidine-5'-triphosphate, la thymidine-5'-phosphate, la thymidine-5*-diphosphate, la thymi-dine-5*-triphosphate, le nicotinamide ribonucléoside-5*—phosphate, 20 1« 5-amino-4-imidazolecarboxamidine ribonucléoside-5*-phosphate, le 5-amino-4-imidazolecarboxamide ribonucléoside-5'-phosphate, le 3-isoadénosine-5'-phosphate, le pseudouridine-5*-phosphate, lts 5-halogénouridine-5*-phosphate, le 6-mercaptopurine ribonucléoside 5*-phosphate, le 6-azauridine-5*-phosphate, le 8-azaguanosine-5*— 25 phosphate, le 8-aza-adénosine-5'-phosphate, le N-acyladénosine-5*-phosphate, le N-acylguanosine-5*-phosphate, le N-acylcytidine-5*— phosphate, le thymidylyl-(5* ^ 3*)-thymidine-5'-phosphate, le thymidylyl-(5*' ) 3*)—2'-désoxyadénosine-5'-phosphate, le 2*-dé-s oxycytidylyl-(5 3*)—thymidine-5 *-pho sphate, 1*adénylyl— 30 (5* —^ 3*)-adénosine-5'-phosphate, 1*adénylyl—(5* )* 3*)—guano sine-5'-phosphate, l'uridylyl-(5* 3*)-adénosine-5'-phosphate, le guanylyl-(5'—) 3*)-cytidine-5'-phosphate, le thymidylyl-(5*——^ 3')-thymidylyl-(5*—^ 3*)-thymidine-5!-phosphate, le 2#-désoxycytidylyl-(5'—^ 3*).-désoxyadénylyl-(5*—^ 3*)-thymi-35 dine-5*-phosphate, l*#-I)-gl.ucose-1-phosphate, l'e-D-glucose-6- phosphate, le N-acétyl-«-D-glucosamine-1-phosphate, l'et-D-galacto-se-1-phosphate, le 1-phosphate de l'acide «-D-glucuronique, l'ct-D- SAD ORIGINAL 11134 6 2006068 mannose-1-phosphate, 1'«-D-ribose-1-phosphate, l,#-D-désoxyribosel-phosphate, 1'«-L-fucose-1-phosphate, le glycérol-1-phosphate(glyoé-rosphosphate^ le riboflavine-mononucléotide, le pyridoxine-5-phos~ phate, le pyridoxamine-5-phosphate, le pyridoxal-5-phosphate, 5 l'ester de thiamine-monophosphate, l'ester de thiamine-monophosphate S-substitué, le (+)-pantethëtae-4'-phosphate, le pantéthine 4,4*-bisphosphate, le pantothénoyl 4*-phosphate, le pantothénonitrile 4*-phosphate, le thiamine-diphosphate, la predniaolone-21-phosphate, le testostérone-17-phosphate, l'oestriol-17-phosphate, le prégnèno-10 lone-3-phosphate, le cholestérol-3-phosphate, l,oestradiol-17-phos-phate, le p-nitrobenzyl phosphate, le 2-cyanoéthyl phosphate, l'O-phosphoryl-N-acétylsérine, l10-phosphoryl-N-(tertiobutyloxycarbo-nyl)-serine, 1 * O-phosphoryl-N-carbobenzoxysérine, 1'O-phosphoryl-N-acétylthréonine, 1'0-phosphoryl-N-(tertiobutyloxycarbonyl)-thréoni-15 ne, 1*O-phosphoryl-N-carbobenzoxythréonine, l'acide G-phosphoryl- N-acétyl-p-hydroxyaspartique, l'acide O-fkoaphoryl-M-^ertiobutyloxy-carbonyl)—p-hydroxyaspartique, 11acide Q—phosphoryl-N-carbobenzoxy-P-hydroxyaspartique , 1* acide O-phosphoryl-N-acétyl-p—hydroxygluta» mique, 1 *acidc G-phosphoryl-N—(-tertiobutyloxycarbonyl)~p—iiydroxy— 20 glutamique, l'acide C-phosphoryl-N-carbobenzoxy—p—hydroxyglutamique, l'O-phosphoryl-^N*, N ^ —diacétyl— "tf—hydroxylyEine, l'O-phosphoryl— N*, -di—(tertiobutyloxycarbonyl)— "Y —hydroxylysine, l*0-phospho— ryl-N*, NÊ -di-(carbobenzoxy)- Y -hydroxylysine, l'0-phosphoryl-N-acétyl— -hydraxyproline, l'0-phosphoryl-N—(tertiobutyloxycarbo-25 nyl)- r-hydroxyproline, l'O-phosphoryl-N-carbobenzoxy- Y*-kydroxy-proline et leurs phosphoramidat^, dans lesquels l'un des groupes hydrexyle libres du groupe phosphorique est remplacé par un groupe aminoo Au sujet de ce groupe amino, en plus du groupe -NIL,, on peut utiliser les groupes amino aliphatiques, alicycliques (cycloalipha-30 tiques), aromatiques ou hétérocycliques secondaires ou tertiaires, comme par exemple les groupes amino mono- ou di-substitués tels que les groupes mono- («u di-) méthylamino, mono- (ou di-) étîiyia-mino, mono- (ou di-)propylamino (y compris ses isomères), moue» (ou di-)butylamino (y compris leurs isomère»), mono- (ou di-}cycle-35 hexylamino, anilino, diphénylamino,monotolyla»ino (toluidine)s di-tolylamino (y compris ses isomères), mono- (ou di-)beE.zylamino, mono- (ou di-)xylylamino (y compris ses isomères), N-alkylsÈiilino SM) ORIGINAL. 69 11134 7 2006068 (par exemple N-méthylanilino, N-éthylanilino), N—alkyl—toluidino (y compris ses isomères) mono- (ou di—) naphtylamino ( y compris ses isomères), etc (esters de pyridyl phosphates), on utilise ceux dans lesquels l'atome d'hydrogène de l'un des groupes hydroxyle libres du groupe phosphorique est substitué par un groupe pyridyle et ses dérivés, et qui sont fixés en position «, p ou Y du groupe pyridyle* 10 Les sels minéraux ou organiques des dérivés d'acide phosphorique susmentionnés peuvent être utilisés,, Ces sels comprennent par exemple les sels de lithium, d'ammonium,"de sodium, de potassium, de triméthyl&mine, de triéthylamine, de tri-n-propylamin* (y compris ses sels d'amine isomères), de tri-n-butylamine (y corn-15 pris ses sels d'amine isomères), de cyclohexylamine, de pipéridine, • de pyridine, de dieyclohexylguanidine, de 4-morpholino-N-N'—dicycle— hexylcarbexamidine, etc... Toutefois, il est habituellement désira" ble d'utiliser un sel d'amine organique car sa solubilité dans le solvant réactionnel est plus élevée» 20 ce qui concerne les triesters organiques d'acide phosphorique qui caractérisent le procédé de la présente invention, on peut utiliser non seulement les triesters aliphatiques d'acide phosphorique, tels que le triméthyl phosphate, le triéthyl phosphate, le tri-n-propyl phosphate eu ses isomères, le tri-n-butyl phosphate 25 ou ses isomères, le tri-n-amyl phosphate ou ses isomères, le tri— hexyl phosphate, etc., mais aussi des tri-esters aromatiques d'acide phosphorique, comme le tri-o-crésyl phosphate, le tri-m-crésyl phosphate, le tri-benzyl phosphate, etc., ou des tri-esters alicycliques d'acide phosphoriqu* tels que le tricyclohexyl phosphate, le tri-30 eyclopentyl phosphate, etc0o« On préfère que les triesters soient liquides à la température ambiante afin de faciliter le traitement lorsque la réaction est terminée, mais des phosphates qui deviennent liquides quand ils sont chauffés peuvent également être utilisés» La réaction de condensation conforme à la présente in— 35 vention peut avoir lieu en quelques jours ou quelques semaines à la température ambiante ou a une température plus basse, comme dans les procédés classiques; toutefois, le temps de réaction est abrégé §00 69 11134 8 2006068 quand on chauffe jusqu'à environ 70fiCo Par exemple quand la réaction est exécutée à 50®C, sa durée peut être comprise entre environ 1 et 5 heures» A cet égard, si les réactifs et les produits restent en contact pendant un long moment après la fin de la réac— 5 tion, des réactions secondaires tendent à se produire# Il est donc désirable que la durée de la réaction ne dépasse pas le temps qui est nécessaire et que le produit désiré soit séparé de la matière; de départ n'ayant pas réagi dès que la réaction est terminée* Quand le procédé de la présente invention est mis en 10 oeuvre dans un solvant comprenant un triester organique d'acide phosphorique, il n'est pas particulièrement nécessaire d'ajouter un ou plusieurs solvants supplémentaires* Toutefois, on peut également permettre l'addition de divers solvants ou diluants, à condition, bien entendu, qu'ils n'aient pas d'effet contraire sur la réaction» 15 Par exemple, on peut ajouter des solvants qui étaient utilisés jusqu'ici tels que le diméthylformamide, le diéthylformamide, le diaéthylacétamide, le diéthylacétamide, le diaéthylsulfoxyde, le diéthylsulfoxyde, l'o-chlorophénol, le crésol (et ses isomères), le tricrésol (ou des mélanges de crésol), l'acétonitrile, le propio-20 nitrile, le butyronitrile, le valéronitrile, le capronitrile, le benzonitrile, le tolunitrile, et des composés analogues* Les diesters d'acide phosphorique condensé qui sont obtenus par le procédé ci-dessus peuvent être purifiés par des procédés classiques connus0 II est avantageux de séparer le produit 25 désiré sous la forme d*un sel de métal alcalin tel qu'un sel de lithium, de sodium, etc..»} toutefois, il est également possible; d'isoler le produit final sous forme d'un sel relativement insoluble tel qu'un sel de calcium, un sel de baryum, un sel de mercure, ou un sel analogue, et de lft convertir en un acide libre eu en un sel 30 d'un métal alcalin soluble0 On peut également purifier le diester, l'isoler et le convertir en un sel par traitement du mélange de réaction avec du charbon activé, une résine échangeuse d'ions, un dérivé cellulosique échangeur d*ions ou des dérivés du produit échangeur d'ions "Sephadex* (marque déposée) et des produits ana— 35 logues pour adsorber et éluer les diesters d'acide phosphorique condensé contenus dans le mélange de réaction, après quoi on procède k un traitement par un procédé classique» A cet égard, le aé— 3AP ORIGINAL 69 11134 9 2006068 lange de réaction peut être soumis directement au traitement d'ad-sorption, ou bien on peut soumettre à ce traitement le mélange de réaction auquel on a incorporé de l'eau, ou encore une solution aqueuse préparée en incorporant de l'eau à un précipité obtenu en 5 introduisant un éther, un hydrocarbure halogène, une cétone, etcao, dans le mélange de réaction» De plus, étant donné que la quantité de diesters contenue dans le mélange de réaction préparé conformément à la présente invention est extrêmement élevée, on peut obtenir un grand rendement d'un produit de pureté élevée en exécutant 10 une seule fois le traitement d'adsorption et d'élution du type décrit ci-dessuso Les diesters d'acide phosphorique condensé obtenus conformément k la présente invention peuvent être utilisés par exemple comme co.enzymes, comme réactifs biochimiques, eto»»» 1? On donne di—après plusieurs exemples pour illustrer les modes de réalisation du procédé conforme à la présente invention* EXEMPLE 1 On introduit 30 ml de tri-n-propyl phosphate dans 20 180 mg (0,3 m mole) d'adénosine-5'—phosphoramidate de N,N*«dicyclo— hexylcarboxamidinium et de riboflavino-S^-phosphate de tri-n^butyl-ammonium, qu'on a préparé séparément à partir de 575 mg de ribo-flavine-5*-phosphate de pyridinium par un procédé consistant à. ajouter du benzène anhydre contenant 370 mg (2 m moles) de tri«~n— 25 butylamine à un sel de pyridinium, et à éliminer ensuite la pyridi— ne par évaporation azéotropique répétée, sous pression réduite, avec du benzène anhydre. Après avoir laissé le mélange pendant 4 jours dans l'obscurité, on y incorpore 50 ml d'eau et on 1*«Xh-trait à trois reprises en utilisant chaque fois 50 ml de chloro-30 forme. On ajuste le pH de la couche aqueuse à environ 7 et on fait passer la solution aqueuse à travers une colonne (4x 15 cm) de DEAE-cellulose (type Cl). Après avoir lavé la colonne de cellulose avec de l'eau, on y fait circuler un mélange de HG1 0,005 N et de LiGl 0,015 N pour séparer les mononucléotides et ensuite un mélange 35 de HG1 0,005 N et de LiCl 0,035 N, en un temps aussi court que possible, pour éluer une fraction de flavine-adénine dinucléotide (FAD). On neutralise cette fraction avec de la triéthylamine, on la con— 69 11134 10 2006068 centre sous vide, on la mélange avec 20 ml de méthanol et ensuite avec 400 ml d'acétone et 40 ml d'éther, ce qui donne tin précipitéo Tout en agitant le précipité de couleur orange ainsi obtenu, on y introduit 4 ml de méthanol et on le lave ensuite avec 40 ml d'acé-5 tone et 4 ml d'éthero Finalement, on dissout le précipité avec de l'eau et on soumet la solution à un séchage à basse températuret ce qui donne 122 mg d'un sel de lithium de FAD (LigFAD)0 EXEMPLE 2 On introduit 10 ml de pyridine anhydre et 706 mg 10 (2 m moles) de tri-n-octylamine dans 383 mg (1 m mole) d'adénosine-5*—phosphate (2H20)« On fait ensuite évaporer le mélange sous vide, puis on en élimine l'eau et la pyridine par un procédé de déshydratation répété comprenant l'addition et l'évaporation de pyridine, à trois reprises, et l'élimination de la pyridine par 15 évaporation azéotropique en utilisant du benzène anhydre» On ajoute encore au produit ainsi obtenu 430 mg (0,5 m aole) de prednisolone-21-phosphoromorpholidate parfaitement séché et ensuite 50 ml de tricyelohexyl phosphate contenant 0,5 m mole de tri-n-octylaminea On ehauffe le mélange à 60&C pendant 5 à 10 heures, on le refroidit 20 et on l'extrait à trois reprise^ en.utilisant chaque fois 50 ml d'eau et 50 ml d*éther» On recueille les couches aqueuses et on les concentre sous vide jusqu'à un volume d'environ 15 mlo Après avoir £juaté le pH du produit concentré à environ 7,5» on le fait passer k travers une colonne (2x30 cm) de DEA&-cellulose (type 25 HCOj**) » On lave la colonne avec de l'eau et on l'élue ensuite par chromatographie sur une colonne de résine échangeuse d'ionss selon un procédé faisant appel à un gradient d'élution linéaire, en utilisant 5 litres d'eau et 5 litres de bicarbonate de triéthylammo— nium 0j15 M à un pH d'environ 7»5o On recueille les fractions con— 30 tenant le dinucléotide désiré, et on fait évaporer la fraction résultante sous vide, jusqu'à siccité, ce qui donne 350 mg de _1 2 prednizolone-adénosine diphosphate /P -(prednisolone-21), P -(adénosine-5*) pyrophosphateT*, sous forme d'une poudre0 Le produit donne une seule tache ayant une valeur Rf de 0,59 au cours de la 35 chromatographie sur papier en utilisant comme solvant un mélange isopropanol-NHj-HgO (dans un rapport de 7:1:2),, 69 11134 n 2006068 EXEMPLE 3 On ajoute 1,4Z g de tri-n-octylamine à 492 mg (2 m moles) de pyridoxal-5-phosphate parfaitement séchéo On ajoute 50 ml de triméthyl phosphate et 374 mg (1 m mole) d'adénosine-5*-phosphoro-5 éthylamidate au mélange résultant et on exécute la réaction a 40*C pendant 8 heurese Après avoir ajouté 50 ml d'eau au mélange de réaction, on extrait ce dernier à trois reprises en utilisant chaque fois 50 ml d'éther, dans l'obscuritéo On fait passer la couche aqueuse résultante à travers une colonne (2x7 cm) de "DEAE-Sephadex" (marque déposée, type 01**) • On lave la colonne avec de l'eau et on y fait passer un mélange de HCl à 0,03 N et de LiCl 0,015 H pour éliminer les mononucléotides» Ensuite, on élue la fraction principale désirée en utilisant avec un mélange de HCl 0,005N et de LiCl 0,05 N» On concentre la fraction sous vide et 15 on ajoute 100 ml de méthanol et d'acétone (rapport 2:5) au produit concentré résiduel, ce qui détermine la précipitation d'un produit de couleur jaune pâle, qui est un sel de Li de pyridoxal-adénosine diphosphate /P^ — (pyridoxal-5), P^ -(adénosine-5*) pyrophosphate/» On lave le produit précipité résultant avec de 1*éther et on le 20 sèche, ce qui donne328 mg de cristaux<> EXEMPLE 4 On ajoute 221 mg d'«-pyridyl ester d'adénosine-S'-*- pyridyl phosphate de 4-morpholine-ï,N*-dicyclohexylcarboxamidinium et 445 mg d*#-D-glucose-1-phosphate de tri-n-butylammonium à 10 ml 25 de tri-n—butyl phosphate, puis on laisse le mélange reposer à 40SC pendant 1 jour» Après avoir ajouté 10 ml d'eau contenant 120 mg' d'acétate de lithium, on extrait le mélange à trois reprises par 1'éther» On fait passer la couche aqueuse résultante à travers une colonne (1,5 x 10 cm) de "Dovex 1x2" (marque déposée, type Cl) et 30 on lave la colonne avec de l'eau. On élue l'#t-D—glucose-1-phosphate, 1 2 le produit AMP et le produit P , P -di(adénosine—5*)diphosphate avec HCl 0,0075 N et on élue ensuite le produit désiré (ADPG) avec un mélange de HCl 0,01 K et de LiGl 0,025 N. On neutralise la fraction constituée par ADPG avec LiOH, on la concentre sous vide, 35 et, après avoir ajouté 25 ml de méthanol et 120 ml d'acétone au produit concentré, on obtient un précipité. On lave ce dernier avec un mélange de méthanol et d'acétone et on le sèche, ce qui 69 11134 2006068 1 2 donne 151 mg d'un sel de lithium de P -(adénosine-5*), P •-(«—D«- glueose-1) pyrophosphate (LigADPG, 5 HjO)» EXEMPLE 5 Dans 10 ml de triéthyl phosphate, on introduit 5 213 mg d'#-pyridyl ester d'uridine-5' phosphate de 4-morpholine— N,Nidicyclohexylcarboxamidinium parfaitement séché et 445 mg d'gf.-> D~glucose-1-phosphate de tri-n-butyl^amaioniumo On laisse reposer le mélange ainsi préparé k 308C, pendant 2 à 3 Jours, puis on ajoute 10 ml d'eau et on l'extrait à trois reprises avec de l'éther» 10 On fait passer la couche aqueuse résistante à travers une colonne (2 x 10 cm) de "DEAE-Sephadex" (marque déposée, type Cl*") et on lave la colonne avec de l'eau* Après l'élution de IJMP, avec un mélange de HCl 0,003 N et de LiCl 0,02 N» on élue la fraction UDPG avee HCl 0,003 N et LiCl 0,06 Ko On ajoute LiOH pour ajuster à 4 15 le pH de la fraction UDPG résultante, on fait évaporer cette fraction sous vide jusqu'à siccité, on la dissout dans 5 ml de méthanol et on y ajoute ensuite une solution mixte comprenant 35 ml d'acétone et 5 ml d*éther, ce qui dorme un précipité blanc» On dissout de nouveau ce précipité dans 3 ml de méthanol et on y ajoute une 20 solution mixte comprenant 30 ml d'acétone et 5 ml d'éther, ce qui donne un autre précipitéo On lave le second précipité avec de l'é- ther et on le sèche sous vide à la température ambiante, ce qui 1 2 donne 158 mg d'an sel de lithium de P -(uridine-5*), P -(*-D—gluco- se-1) pyrophosphate (LigUDPG, ôHgO)» 25 EXEMPLE 6 On introduit 520 mg de cytidine-5'-phosphoramidate de dicyclohexylguanidinium et 150 mg d'O-phosphoryl-N—carbobenzoxy— L-sérine dans 50 ml de tribenzyl phosphate, puis on laisse le mélange résultant reposer à 40SC pendant 1 jour» Après avoir ajouté 30 50 ml d'eau, on extrait le mélange de réaction à trois reprises en utilisant chaque fois 50 ml d* éther,, On fait passer la couche aqueuse résultante à travers une colonne de "Dovex-1 X 8* (marque déposée, forme HCOO ) et on lave la résine avec de l'eau puis avec 3 litres de HCOOH 1N et de HCOONH^ 0,2 Mo Lorsque le produit 35 effluent cesse d'absorber l'ultraviolet, on fait passer environ 2 litres d'un mélange de HCOOH 2 N et de HC00NH4 0,2 M à travers la colonne, pour éluer la CDP-N-carbohenzoxy-L-sérine« On fait 69 11134 13 2006068 passer la fraction résultante à travers une colonne de 1 g de charbon activé pour adsorber le produit désiré, on lave le charbon avec de l'eau et on l'élue avec un mélange concentré MH^OH-HgO-EtOH (dans un rapport de 0,5 : 50s50)o On concentre l'éluat sous vide 5 jusqu'à siccité, ce qui donne la CDP-N-carbobenzoxy-L-sérine avec un rendement de 80fe (calculé sur la base de la L-sérine)» On ajoute i, ce produit 50 ml de MeOH à 30% et 100 mg de charbon contenant 10$ de palladium, puis on le soumet à une réduction catalytique pendant 8 heures» Après filtration, on ajoute 20 ml d'un mélange 10 concentré NH^OH-HgO-EtOH (dans un rapport de 0,5 ï 50 s 50) au gâteau résiduel pour éluer le produit désiré» On réunit le filtrat et l'éluat et on les concentre» Après avoir fait passer la solution concentrée à travers une colonne comprenant 10 ml de "Dovex—1 X 3* (marque déposée, type HCOO""), on lave la résine avec de l'eau 15 et on l'élue avec HCOOH 0,01 N (environ 100 ml)o On.recueille la fraction ce&ienant la CDP-L-sérine, puis on 1* fait passer s travers 1 g de charbon activé, on lave à l'eau et on élue le composé adsorbé avec 100 ml d'un mélange concentré NH^OH-H^O-EtOH (dans un rapport de 0,5 s 50 : 50)» On concentre l'éluat sous vide et on 20 y ajoute 100 mg de Ba (OAGjg, -^Pr®s dissolution de l'acétate de baryum on ajoute de l'éthanol, ce qui détermine la précipita-tien d'environ 200 mg de sel de baryum de CDP-L-sérine (G^H.jgOgS^Ba. G2H50H, HgO) » EXEMPLE T 25 On ajoute 0,5 g de 2'—désoxycytidine-5'-phosphora- midate de dicyclohexylguanidinium et 150 mg d'O-phosphoryl-N-oarbobenzoxy-L-sérine à 50 ml de triéthyl phosphate, on laisse le mélange reposer à; 40^0 pendant 1 à 2 jours, et on le traite d'une manière similaire'à celle qu'on a décrite dans 30 l'exemple 7, ce qui donne 150 mg de sel de baryum de 2'—désoxycy-tidine-5'-diphosphate-L-sérine (dCPD-L-sérine) (1/2 éthanoljSHgO) 0 EXEMPLE 8 On déshydrate parfaitement 117 mg (0,1 m mole) d'un sel de di(4-morpholine-N,Nt-dicyclohexyl-carboxamidinium) de 1 2 35 P -(guanosine-5'), P -(4-morpholine)-pyrophosphate (GrDP-morpholi- date) (eau de cristallisation : 4 molécules) par, distillation . , On exécute la distillatioff azeotropique sous vide azéotropique sous videTfcrois fois en utilisant de la pyridine et BAD original 11134 14 2006068 deux fois en utilisant du benzène anhydre» On sèche séparément 293 mg (0,4 m mole) de guanosine-5'—phosphate de tributylammonium, en utilisant le même procédé de déshydratation» On ajoute les deux composés ainsi séchés à 20 ml g de triéthyl phosphate et on laisse le mélange résultant reposer à la température ambiante (environ 25^0) pendant plusieurs jours» Après avoir ajouté 25 ml d'eau, on introduit le mélange dans une colonne (2 x 35cm) de DEAE-cellulose (type HCOtp, on lave soigneu*-sement avec de l'eau et on élue ensuite avec un gradient d'élution 10 linéaire, en utilisant 3,5 litres de bicarbonate de triéthylammo-nium (0,005 à 0,5 H)0 On obtient d'abord des fractions contenant du morpholidate de GDP ainsi que GMP pour la première zone,, le composé GDP pour la deuxième zone et enfin le composé GP^G pour la troisième zone (rendement de 82$) o On fait évaporer la troi-15 sième fraction sous vide jusqu'à siccité et on ajoute 25 ml de méthanol au résidu, puis on le fait évaporer sous vide jusqu'à sic-cité» On répète quatre fois le m&me processus d'évaporation» Finalement, on dissout le produit résultant dans 5 ml de méthanol ét on le mélange avec une solution acétonique 1 M d'iodure de sodium, Ï0 en une quantité équivalant au double, du radical phosphorique» On ajoute encore 25 ml d'acétone au mélemge et on lave le précipité blanc résultant avec de l'acétone, puis on le sèche sous vide, 1 3 ce qui donne le sel de sodium de P , P -di(guanosine-5')triphosphate „ 25 EXEMPLE 9 On ajoute 830 mg de D-mannose-tf—1-phospliato de bis-(tri-n-octylammonium) et 320 mg de guanosine-S'-phosphoromorpholi-date de 4-morpholine-N,N*-dicyclohexylcarboxamidinium à 25 ml de tri—o-crésyl phosphate, puis on fait réagir les composés précités 30 à la température ambiante pendant 3 à 4 jours0 Après avoir traité le mélange de réaction de la manière décrite dans l'exemple 2, on fait passer la couche aqueuse résultante à travers une colonne (2 x 30 cm) de "DEAE-Sephadex" (marque déposée, type HCOj), on lave la colonne avec de l'eau et on la soumet à une élution arec un 35 gradient d'élution linéaire, en utilisant 3 litres de bicarbonate de triéthylammonium 0,005 M (pH 7,5) et 3 litres de bicarbonate de triéthylammonium 0,15 M (pH 7,5)o On fait évaporer sous vide, gAD original 69 11134 15 2006068 la fraction principale résultante, jusqu'à siccité, et on la dissout dans 10 ml d'eau. On fait évaporer la solution résultante sous vide jusqu'à siccité» On répète encore le processus d'évapo-ration» Après avoir dissous le résidu dans une petite quantité 5 d'eau, on fait passer la solution à travers une colonne (2 x15 cm) de "Dovex-I" (marque déposée, type Cl~) et on élue le produit adsorbé en utilisant 3 litres de HCl 0,003 N et 3 litres d'un mélange de HCl 0,003 K et de LiCl 0,15 N» On ajuste la fraction désirée à un pH d'environ 5 en ajoutant LiOH et on la fait évapo-10 rer sous vide jusqu'à siccitéo On dissout le produit résiduel dans une petite quantité d'eau et on ajoute un mélange de méthanol et d'acétone à la solution, ce qui donne un précipité qu'on lave avec de 1*éther et qu'on sèche, ce qui donne 231 mg de sel de lithium de P -15 (guanosine-5*), P -(«-D-mannose-1)pyrophosphate (LigGDPM, ôHgO)» EXEMPLE 10 On déshydrate parfaitement 221 mg (0,2 m mole) d'adénosine 2',3*-cyclo-phosphate-5'-phosphoromorpholidate de bis-(4-morpholine-N,N,-dicyclohexylcarboxamidinium par une dis-20 tillation azéotropique sous vide avec de la pyridine anhydre et par distillation azéotropique sous vide avec du benzène anhydre» Séparément, on soumet 368 mg (0,6 m mole) de sel de baryum de (+)-pantéthéine-4'-phosphate (ôHgO) à un traitement par échange d'ions, en utilisant une résine MDovex-50M (marque déposée, type 25 Ht), on y ajoute 1,2 m mole de tri-n-butylamine et on la déshydrate parfaitement par distillation azéotropique en utilisant de la pyridine et du benzène anhydre» On dissout les deux composés séchés ainsi obtenus dans 10 ml de triéthyl phosphate» On laisse la solution reposer à la température ambiante (environ 252C) pen-30 dant 24 heures et on la concentre sous vide. Après avoir ajouté 10 ml d'eau, on extrait la solution à trois reprises en utilisant chaque foie 10 ml d'éther et on fait évaporer sous vide, jusqu'à siccité, la couche aqueuse résultante» Après avoir dissous le résidu séché dans 10 ml de HCl 0,1 on laisse la solution 35 reposer à la températureanbiante pendant environ 1 heure» Ensuite», on fait évaporer la solution sous vide, jusqu'à siccité, on ajoute 5 ml de méthanol au résidu et on fait de nouveau évaporer le; mé— 69 11134 16 2006068 lange sous vide, jusqu'à siccité» Après avoir répété ce processus à deux reprises, on dissout le résidu dans 3 ml d'eau on agite la solution à un pH d'environ 6 avec NH^OH et on y ajoute 4 ml de 2-mercaptoéthanol» On laisse le mélange reposer pendant la nuit, 5 puis on le dilue avec environ 50 ral d'eau et on le fait passer à travers une colonne (2 x 30 cm) de "DEAB-Seplladex,, (marque déposée, type Cl*") » Après lavage à l'eau, on exécute une élution avec un gradient d'élution linéaire, en utilisant 1,5 litre de HCl 0,003N et 1,5 litre d'un mélange de HCl 0,003 N et de LiCl 0,15 N (y compris CoA et iso-CoA} rendement d*environ 80}É), on ajuste son pH à environ 4,^4vec LiOH et on la fait évaporer sous vide jus— qu'à siccité„ On ajoute 5 ml de méthanol et 50 ml d'acétone au résidu et on agite parfaitement le mélange» On recueille le précipité 15 résultant et on le traite de nouveau avec ufe. mélange méthanol— acétone0 On répète le lavage avec le mélange aéthanol-acétone jusqu'à ce que les ions Cl aient disparu du liquide surnageant? après quoi on sèche le précipitéo On dissout le précipité résultant dans une solution aqueuse à 50$ de 2-mercapto-éthanol et on laisse Ja 20 solution résultant* reposer pendant la nuit à la température ambiant te0 On la fait ensuite passer à travers une colonne (3,5 x 50 cm) "d'ECTEOLA-cellulose" (type Cl*")» On lave la colonne avec de l*eau et on l'élue avec un gradient d'élution linéaire en utilisant 2,5 litres d'un mélange de LiCl 0,03 K de HCl 0,003 N et un mélange 25 de LiCl 0,10 N et de HCl 0,003 N„ On ajuste séparément la fraction A (iso-CoA) et la fraction B (CoA) à un pH d'environ 4,5 en ajoutant LiOH , et on introduit séparément le mélange de méthanol et d*acétone dans les deux fractions pour déterminer la formation d'un précipité» On obtient ainsi 39 mg d'un sel 30 de Li de CoA (coenzyme A) et 2f5 mg d'un sel de Li d'iso-CoAo Il est bien entendu qu'on peut apporter de nombreuses modifications à la description; qui précède sans sortir pour cela du cadre de la présente invention* 69 11134 17 20Ô6068 t REVENDICATIONS 1. Procédé de production de diesters d'acide phosphorique condensé, caractérisé par le fait qu'il consiste à faire réagir un composé choisi parmi les esters de mono-phosphoramidate, 5 les esters d'oligo-phosphoramidate, les diesters d'acide mono-phosphorique, les diesters d'acide oligo-phosphorique et leurs sels, avec un composé choisi parmi les mono-esters d'acide mono-phosphorique, les monoesters d'acide oligo-phosphorique et leurs sels, en présence d'un trieater d'acide phosphorique# 10 2» Procédé conforme à la revendication 1, dans lequel le trieater d'acide phosphorique répond à la formule générale : n 15 0 f *3, dans laquelle , Eg et R^ représentent un rtiical aliyle, cyclo-alkyle ou aryle. 20 les 3. Procédé conforme à la revendication 1, dans le quel/Aie sters d'acide phosphorique condensé répondent à la formule générale t 25 E— 0 —: —0 E" dans laquelle E et E" sont des restes organiques et m et n sont égaux à zéro ou représentent des nombres entiers. 30 4. Procédé conforme à la revendication 3* dans lequel les symboles R et E" réprésentent des restes organiques tels que des restes alkyle, cycloalkyle, aryle, des restes d'un sucre, de s restes d'aminoacides, des restes de vitamines et des restes de stéroïdes. 35 5. Procédé conforme à la revendication 4 dans lequel les restes d'un sucre sont choisis parmi les restes de ribonucléo-side, les restes de désoxyribonucléoside, les restes de pentosyl-, désoxypentosyl-, liesoxyl-, désoxyhexosyl- et heptosyl-nucléosides, le pentose, le désoxypentose, l'hexose, le désoxyhexose, l'heptose, 40 le désoxyheptose, 1'oligosaccharose et leurs dérivés. SAD ORIGINAL 69 11134 18 2006068 6. Procédé conforme à la revendication 4» dans lequel on choisit les restes d'un sucre parmi ceux dans lesquels un groupe d'acide phosphorique est relié à un radical OH en une position quelconque de ce sucre, 5 7» Procédé conforme à la revendication 5» dans lequel les restes de nucléoside sont choisis parmi les nucléosides du type imidazole, du"type pyridine, du type pyrimidine, du type flavine, du type purine et leurs dérivés» 8. Procédé conforme à la revendication 4f dans 10 lequel les restes d'aminoacides sont choisis parmi les sérijaes N-substituées, les thréonines N-substituées, les acides /S-hydroxy-aspartiques R-substitués, les homosérinep N-substituées, les acides -hydroxyglutsuaiques N-substitués, la Y-hydroxyproline N-subatituée et les *Y"-hydroxyly aines N-aub s t it ué « s * 15 9*Procédé conforme à la revendication 4» dans lequel les restes de vitamines sont choisis parmi les restes du type pyridoxine, du type pyridoxal, du type pantéthine, du type panté— théine, du type pantothénoyle, du type pyridoxamine, du type thia-mine, ou leurs dérivés. 10. Procédé conforme à la revendication 4 dans 20 lequel les restes de stéroïdes sont ; • . -j. de la testosterone, choisis parmi les restes du type/ae'la prégnenolone, de la predni- solone, de l'oestriol, de l'oestradiol, du cholestérol, et leurs dérivés» 25 11. Procédé conforme à la revendication 4» dans lequel la réaction est exécutée à une température élevée pouvant atteindre environ 70°C» 12. Procédé conforme à la revendication 1, dans lequel les esters précités de mono-phosphoramidate et d'oligo-30 phosphorami date répondent à la formule générale suivante : -R, 35 dans laquelle R et n ont les significations données dans la reven-, dication 3 et B représente un groupe amino primaire, secondaire ou tertiaire, ou une base cyclique organique. 13. Procédé conforme à la revendication 1, dans lequel les diesters d'acide monophosphorique et les diesters 40 d'acide oligo-phosphorique répondent à la formule générale : COPY 69 1 1 134 19 2006068 10 R1. O —-R, dans laquelle fi et n ont la même signification que dans la revendication 3 et R1 représente un groupe cC-» ou ^-pyridyle» 14® Procédé conforme à la revendication 1, dans lequel les monoesters d'acide mono-phosphorique et les monoesters d'acide oligo-phosphorique répondent à la formule générale i U SA HO —P—f- O— P —f O —Rw. IV i r OH \ OH/ dans laquelle RM et m ont la signification donnée dans la revendication 3» 15 15* Procédé caforme à la revendication 14» dans lequel on maintient les réactifs à une température comprise entre environ O et 70°C pendant environ 1 heure à 1 semaine. 16. Procédé de production de diesters d'acide phosphorique condensé, qui consiste à faire réagir, en présence d'un 20 triester d'acide phosphorique, entre environ 0°G et 70°C et pendant environ 1 heure à 1 semaine, un composé I choisi parmi les esters de mono-phcrphoraniàate, les esters d'clico-phosphoramidate, les diesters d'acide moncphosphorique, les diesters d'acide oligo-phosphorique et leurs sels, lesdits esters de mono-et oligo-25 phosphcramidate refondant à la formule générale s i)H Ih (aans laquelle R est un reste organique choisi parmi les restes 30 alkyle, cycloalkyle, aryle, les restes d'un sucre, les restes d'amino—acides5 les restes de vitamines et les restes de stéroïdes, n peut être égal à 0 ou représenter un nombre entier et B représente un groupe aminc primaire, secondaire ou tertiaite ou une lace cyclique orpai.ijue) et ces -'.lester» a 'aei-ic- nono-et 35 oligo-pho snhorique répondit à la iurmule générale t II'- o —p —f_o -- a, OH COPY 11134 20 2006068 (dans laquelle R et n ont 1 es mêmes significations que ci-dessus et R1 représente un groupe o R", 10 dans laquelle R" et m ont les mêmes significations respectives que R et n. 17. Procédé conforme à la revendication 16, dans lequel les composés (I) et (II) sont choisis pariai l'adénosine-5'-phosphoramidate de K,N'-dicyclohexylcarboxamidinium, le sel de 15 tri-n-butylammonium de riboflavine-5*-phosphate, le riboflavine-5'-phosphate, 1'adénosine-5-phosphate, la prednisolone-21-phos-phoromorpholidate;le pyridoxal-5-phosphate, 1'adénosine-5'-phos-plioroéthylamidate , l1 -pyridyl ester d1adénosine-51-phosphate, 1' &-pyridyl ester d'adénosine-5-phosphate de ^morpholine-NjH"'-20 dicyclohe xylcarhoxamid inium, 1' OÇ-pyridyl ester d'uridine-5*-phosphate de 4-morpholine-N,N1-dicyclohexylcarboxamidinium, 1' 0(-D-glucose-1 -phosphate de tri-n-butylammonium, 1' OÇ-D-glucose-1-phosphate, le cytidine-5'-phosphoramidate de dicyclohexyl guani-dinium, l'O-phosphoryl-N-carbobensoxy-L-sérine, le 21-désoxycyti-25 dine-51-phosphoramidate de dicyclohexylguanidinium, le sel de di(4-àorpholine-N,R'-dicyclohexyl-carbobenzidinium) de - p (guanosine-51), P -(4-morpholine)-pyrophosphate (morpholidate de GDP), le guanosine-5'-phosphate de tributylammonium, le guano-sine-5'-phospliate, le D-mannose- oL-1 -phosphate de bis-(tri-n-30 o etylammonium), le guanosine-51-phosphemorpholidate de 4-morpho-line-N,N'-dicyclohexylcarboxamidjjiium, l'adénosine-2',3'-cyclo-phosphate-5'-phosphomorpholidate de bis-(4-morpholine-H,G1-d i cy clc cari: o xamid inium ) et le sel de (+)-pantétliéine~4'-phosphate# 18c Procédé conforme à la revendication 1Cf dans 35 lequel le triester d'acide phosphorique est choisi parmi le t'ri-n-^piosphate f 3e tricyclohexyphosphate, le tri-méthy^hosphate,, le tri-n-butyl phosphate, le tri éthrl phosphate, le tribensyl phosphate et le tri-c-crésyl phosphatec BAD ORIGINAL