FR 2007367 A1 19700109 FR 6909893 A 19690401 69 09893 ... 2007367 La présente invention concerne le fabrication de vaccins contre la grippe et autres mr-.ladies à myxovirus, et elle a particulièrement trait à un procédé de récupération du virus du milieu de culture sous une forme pratiquement pure et avec un grand rendement; 5 La grippe « sa fornio para, la rougeole et les oreillons sont des maladies à myxovirus .Ce sont cfes causas déprimantes d'affections tant sévères que modérément aiguos chez l'homme. Pour réduire l'incidence de ces maladies, on dispose de vaccins préparés à partir do virus tués,, mais ces vaccinri ont 1* inconvénient d'être coûteux 10 à fabriquer sous une form/' extrêmement purifiée. Le virus à utiliser dans la fabrication du vaccin est cultivé dans des cellules vivantes, par exemple dans les cellules du liquide allantoTque dloeufs ou dans des milieux de culture contenant des cellules de tissus animaux, puis le virus doit fitrô récupéré sous la forme la plus pure 15 possible, et doit être exempt des cellules de la culture et de leurs constituants. Les vaccins antérieurs nront été jusqu'à présent disponibles que dans un état très impur, et les impuretés ( par exemple la protéine d'oeuf) peuvent provoquer une réaction sévère chez les sujets, sensibles à ces matières. 20 Les procédés antérieurs destinés à la récupération d'un virus .relativement purifié ont été essentiellement des opérations continues impliquant des manipulations peu commodes et compliquées. En outre, les procédés antérieurs n'éliminaient pas spécifiquement les contaminants- microbiens. Un procédé connu utilise des techni-25 ques d'adsorption et de désorption et, bien qu'il produise un virus assez pur avec un rendement re'lctivement fort, il prend du temps et donne par conséquent un produit coûteux. Une réduction du coût du virus- purifié est désirable, car elle augmente le nombre de personnes qui peuvent se permettre l'achat du.vaecin, qui 30 est si important pour leur santé. La présente' invention offre un procédé qui comprend des opérations pratiquement continues et ces opérations peuvent être aisément poursuivies sur une chaîne de production, à une grande échelle industrielle. Non seulement on obtient un virus très purifié, 35 mais ce virus est produit avec un fort rendement dans une période de temps relativement courte et on peut par conséquent fabriquer un vaccin peu coûteux. 69 09893 2_ 2007367 le procédé de la présente invention a recours à l'utilisation classique d'une -ultra-centrifugeuse, qui fonctionne par exemple à plus de 50.000g, mais la caractéristique de l'invention réside dans l'utilisation de phases de filtration juste avant cette ultra-centri-5 fugation pour éliminer les substances contaminantes qui sont plus grandes quç le virus et principalement les contaminants microbiens. Ces traitements préliminaires avant la sédimentation par ultra-eentrifugation permettent la préparation directe de vaccins stériles, très purifiés, c'est-à-dire en partant directement des produits 10 centrifugés sans traitements subséquents. les vaccins initialement sédimentés de la technique antérieure sont notablement moins purs et non stériles. Antérieurement à la présente invention, on a pensé qu'il devait être impossible d1 utiliser-une filtration préliminaire du milieu de 15 culture contenant le virus, avant la centrifugation, et ceci parce que les tampons filtrants devaient s'obturer rapidement et empêcher le passage du virus. On a estimé que si l'on utilisait des tampons de filtration présentant dos pores trop grands pour remédier à lr porto de virus sur les tampons, une trop grande quantité des conta-20 minants grossiers risquait de traverser le filtre. l'invention implique l'utilisation connue d'une ultra-centrifugeuse pour séparer le virus par sédimentation d'un liquide qui le contient, et la caractéristique de l'invention réside dans l'utilisation de conditions particulières de filtrations que l'on 25 fait intervenir juste avant la phase d'ultra-centrifugation. -L'invention implique la découverte , par la Demanderesse, selon laquelle'l'utilisation successive de filtres de grosseur de pores particulière, leur grande surface spécifique et un débit établi à travers ces filtres produisent un liquide contenant prati-30 queutent la totalité du virus qui est essentiellement exempt de substances contaminantes provenant des milieux de culture. Ce filtrat final peut être envoyé directement à l'ultra-centrifugeuse pour obtenir le virus sous sa forme concentrée. Ce virus concentre est de'stiiié à être utilisé dans la préparation d'un vaccin par remibe 35 ' 'en suspension d'une manière classique dans un liquide injectable tel qu'un tampon de phosphate physiologique. On définira lés détails particuliers de l'opération de 69 09893 2007367 filtration de l'invention, mais il y a lieu de mentionner tout d'abord qu'avant 11 opération d~ filtration, il vaut mieux effectuer une opération de clarification classique, mais cette opération n'est pas essentielle. C :-ttclarification préliminaire doit 5 éliminer les particules relativement grand3s ces milieux de culture, par exemple les amas cellulaires provenant du liquide allantoïque dans lequel le- virus c. été cultivé. A cette fin, il convient d'utiliser une centrifugeuse de type- à disque, de vitesse modérée (par exemple une centrifugeuse De Laval Modèle PX) fonctionnant dans 10 J„e domaine général de 15.000 g. Il va de soi qu'on peut utiliser d'autres méthodes de clarification grossière préliminaire, par exemple une sédimentation ordinaire avec décantation, et que, en fait, cette clarification préliminaire peut être totalement éliminée. Toutefois, eon élimination..nécessitera un. remplacement plus fré-15 que-nt du tampon suivant utilisé pour in, filtration initiale. Les opérations de filtration de la présente invention sont typiquement établies pour éliminer successivement les particules microtiennes et autres particules contaminantes de plus en plus petites, de manière que le filtrat soit un liquide stérile ne con-20 tenant que les particules de virus. Cette filtration implique les opérations successives énumérées ci-après : a) filtre préalable à pores relativement grands, par exemple tampons cellulosiques, terres de diatomées ou verre filé (par exemple du type "Millipore AP 20", filtre de verre filé fortement comprimé). 25 b) tampon à pores de 1,2 micron de préférence, mais les pores peuvefit être compris dans la gamme de 0,R à-2,0 microns. c) tampon à pores de 0,45 micron de préférence, mais les pores peuvent être compris dans la- gamme de 0,22 à 0,6 micron. Il importe que pour chaque opération de filtration, la surfa- 2 30 ce du tampon soit d'environ 100 cm par volume de liquid.e de 1 à p 1,5 litre et que le débit par 100 cm soit compris dans la gamme de 1 à 1,5 litre par heure . Pour accelérer cette opéra tion de filtration, s'il s'avère nécessaire d'atteindre ce débit, une pression d'air peut être appliquée à l'une des opérations de 35 filtration ou à toutes les trois. Si le volume de liquide est augmenté au-dessus de cette gamme, une certaine obturation du filtre peut se produire et ceci a pour conséquence d'empêcher certains virus de le traverser. Il importe que la surface de filtration soit 69 09893 2007367 relativement grande, comme défini ci-dessus, sinon l'opération est lente, une filtration complote dans chaque opération n'est pas obtenue et une perte de virus sur les tampons se produit. On constate que le filtrat finaU^rovenant de ces opérations est limpide et stérile et qu'il contient pratiquement toute la culture initiale des virus. En vue de sédimenter les particules de virus dans ce filtrat, on utilise la centrifugeuse à grande vitesse, qui peut opérer dans la gamme de 50.000 à 80.000g. A titre d'exemple de centrifugeuse de ce type, on mentionne la centrifugeuse Sharples Presurtite, Modèle Ï-1P.-Ceci a' pour effet de concentrer le virus en une suspension épaisse, et cette opération doit être conduite en tant qu'opération continue. Pour une production industrielle, il serait préférable d'utiliser une ultra-centrifugeuse de type à zonea par exemple une centrifugeuse à zones"Spinco H& 1-4" ou une centrifugeuse à zonesdu type "Oak Ridge KL1 Ce virus concentré final peut être -utilisé dès sa sortie de la centrifugeuse pour préparer un vaocin, en lui ajoutant un liquide injectable à une dilution appropriée, ou bien le magma peut être conservé sous un/? forme stérile, après lyophilisation, si on le désire, en vue d'une remise en suspension subséquente. Le virus peut être tué à un stade quelconque de-l'opération. Ceci peut avoir lieu avant la clarification initiale, s'il y en a V une,pendant l'une des opérations de filtration ou après ultra-centri-fugation. On peut utiliser des agents d'inactivation connus tels que la formaline, la quantité et la concentration étant conformes aux normes établies. Bien que la présente invention ait été décrite dans les exemples en se référant notamment au -virus de -la grippe qui a été cultivé dans du liquide allantoïque,puis tué, l'invention peut être pratiquée avec d'autres virus, cultivés dans un autre milieu de culture, du type contenant par exemple des cellules de tissus, et le virus peut ou non être tué. L'invention est illustrée par les exemples suivants, donnés à titre explicatif, mais nullementd.im.itatif : EXEMPLE 1 450 oeufs de poule fécondés sont infectés avec une souche A2 du virus de la grippe (JAP 170) et maintenus à 37°C pendant 40 heur es.Le liquide allantoïque contenant le virus, cultivé est prélevé 69 09893 _ 2007367 des oeufs par succion et recueilli pour former un volume commun d'environ 4.500 ml. Le liquide est ensuite traite aveqAu parafor-maldéhyde-à une concentration en volume de 1/400, à 35°C pendant 24 heures, pour inactiver 3-3 virus. 5 On fait passer le volume total recueilli à un débit de 3Q0isl par minute à travers une centrifugeuse De Laval (du type Gyro Tester) ou une centrifugeuse- analogue fonctionnant à 12.000 tours par minute ( environ 15.000g) et on recueille le liquide clarifié. On fait tout d'abord passer le liquide clarifié par eentrifti-10 gation à travers un filtre préalable-en verre filé de 500 cm , par exemple un filtre "Hilliporc" -n° 142, puis à travers un tampon fil- trant de 500 cm à pores de 1, ^ôiicron , -et finalement à travers un 2 tampon filtrant de 500 cm a pores de 0,45 micron. On applique une pression drair d'environ 1,4 bar dans:, chaque opération, et le 15 temps de filtration total est de 8 minutes. La récupération du vaccin à ce stade est de 86?ô, sur la base d'essais CCA normalisés. La concentration finale du vaccin est effectuée par sédimentation dans une centrifugeuse a grande vitesse, fonctionnant à 50.000 tours par minute, avec un débit de liquide d'environ l,Qlitre 20 par heure. Le virus sédimenté est utilisé pour préparer le vaccin. EXEMPLE 2 3500 oeufs de poule fécondés sont contaminés avec une souche B de virus grippal (B/œase) et maintenus à 37°C pendant 40 heures. On prélève le liquide allantoïque des oeufs par succion et on le 25 rassemble en un volume d'environ 35.000 ml. On traite le liquide avee du formaldéhyde dans une proportion en volume de 1/4000 à 35°C pendant 24 heures. On fait passer le volume de liquide total à un débit de 300ml/ minute à travers une centrifugeuse telle qu'un'feyro Tester " BeLaval 30 fonctionnant à 12.000 tours minute. On utilise de l'air oomprimé pour contraindre le liquide à traverser la centrifugeuse, et on mesure le débit au moyen d'un débit -mètre pour le maintenir approximativement à sa valeur. Le liquide clarifié est recueilli dans un récipient sous pression. 35 On force le liquide clarifié par centrifugation à traverser tout d'abord un tampon de filtrage préalable de 310Qfem (porte-filtre •. . ' 2 à plaques multiples) puis à travers un tampon filtrant de 3100 cm à pores de 1,2 micron et finalement à travers un tampon filtrant de 69 09893 _6_ 2007367 2 . 2300 cm à pores de 0,45 micron . L'air comprimé utilisé pour la filtration est sous pression de 1,4 bar, et la durée de filtration totale est de 15 minutes. La récupération du vaccin à ce stade est de 84^,sur la base d'un essai CCA normalisé. La concentration finale du vaccin est effectuée dans une centrifugeuse Sharples à grande vitesse fonctionnant à 50 de tours par minute t avec un débit du liquide/1,5 litre par heure. Le virus sédimenté est utilisé pour préparer le vaccin. EXEMPLE 3 On répète le mode opératoire de l'un ou l'autre des exemples précédents, à la différence que les oeufs de poule sont contaminés avec l'un des virus de la grippe, forme para, de la rougeole ou/des oreillons. Dans les exemples précédents la clarification par centrifuga-tion initiale peur être omise et le tampon filtrant initial peut être remplacé plus souvent. L'essai CCA normalisé, mentionné dans les exemples 1 et 2, concerne un essai d'agglutination des globules de poulet; cet essai d'hémagglutination implique la fixation des globules rouges de poulet sous l'aetioil de particules de viras;l'expérience indique que des vaccins sont d'autant plus efficaces, pour la protection des être humains contre certaines infections à virus qu'ils présentent de hautes teneurs à l'essai CCA, car ce résultat prouve qu'ils possèdent à un haut degré la faculté de produire des anticorps. METOE93 2007367 -7- j»I *ï.aoQ èaiXi^i fiEVE33DICATIOH3 mtfrnrtUft e£> ,,, , , , . ,, . . . , . , „ 1 -Procédé de préparation d'un mixovirus sedimenxe sxerile a par-s sr-eta s© i, xtfcQî . tir d'un milieu de culture liquide dans lequel le virus s ' es^riulti- plie, caractérisé par lt- fait qu'il consiste ( A) à faire passer eèrfr essivei Oc â ùiuH- «sx»xr eoBt sbtr$ 5 successivement le milieu de culture a travers les tampons filtrants ayant les porosités déterminées suivantes : . ■r-ïiïScL e'itl (1) filtre a pores relativement grands, «OiX-OâV (2) pores de 0,-8 a 2,0 microns-- (3) pores de 0,22 à 0,6 micron, et a«w? 5e.Si- lO (B) à centrifuger le filtrat dans la gamme de 50.000 à 89.000 g. -:,ttiïsiBtxic-c- litc-'j & no sX&"-»wox si 2 - Procédé suivant la revendication 1,caractérisé par le fait que la filtration est précédée d'une clarification par centrifugation -ijs.viJteî.a&o %bc[ d'environ 15.000g. 15 * 3 - Procédé suivant la revendication 1, caractérisé par le fait quo l'opération A implique une surface du tampon filtrant d'environ .£ 3s X 100 cm par volume de 1,0 à 1,5 litre. Lù£3it - »s * c 4 - Procédé suivant la revendication 1, caractérisé par le fait 0& UOgiïOl. a&J.- que l'opération est conduite à uq&ébit de 1,0 à 1,5 litre par. siraifini ôùiïsxït-20' heure. aoifo&fo'zg &± 5 - Procédé.suivant la revendication 1, caractérisé par le fait -3*Xq SlX'SfO Zii?* que tl"îopération 3 est une opération de centrifugation par zones. -Ites aaô aïlwlk