FR 2011542 A1 19700306 FR 6920006 A 19690616 69 20006 i 20 î1542 La présente invention se rapporte à un procédé de purification de la L-asparaginase. Plus particulièrement elle se rapporte à un procédé permettant d'obtenir une préparation enzymatique anti-mytotique de grande pureté par purification de la L-asparaginase 5 obtenue par .exemple à partir d'une culture de cellules provenant d'une souche productrice de L-asparaginase appartenant à l'espèce Serratia. L'invention se rapporte encore plus particulièrement à un procédé dans lequel les facteurs qui inactivent la L-asparagi-nase se trouvent affaiblis ou éliminés. 10 La L-asparaginase, c'est-à-dire la L-asparagine-amide hydro- lase (le nombre d'enzyme étant 3, 5, 1, 1), est un enzyme qui hydrolyse la L-asparagine en acide L-aspartique et ammoniac. Sa distribution est relativement étendue mais de nombreux détails de ses propriétés sont encore inconnus. Ces dernières années il a été 15 porté une grande attention à cet enzyme du fait qu'il a été découvert que certains types, par exemple la L-asparaginase contenue dans le sérum d'un cobaye ou produite par certaines souches d'Escherichia coli, sont remarquablement efficaces contre la leucémie aiguë. Toutefois un certain nombre d'obstacles empêchent 20 une production massive de la L-asparaginase à l'échelle industrielle. Deux des principaux obstacles sont 1°) un approvisionnement insuffisant en sources d'enzyme en raison du nombre limité de types d'enzymes antimytotiques et 2°) les difficultés rencontrées dans l'obtention, par purification du produit obtenu à partir 25 desdites sources d'enzyme, d'une préparation qui soit suffisamment pure pour être utilisée en pharmacie. Ces difficultés ajoutées à d'autres ont empêché ou bloqué jusqu'à présent la production commerciale des enzymes. La demanderesse a d'abord résolu l'un des problèmes mention-30 nés ci-dessus concernant les sources d'enzyme en mettant au point une méthode de culture d'un microorganisme appartenant à l'espèce Serratia de manière à obtenir de la L-asparaginase (demande de brevet japonais N° 9.116/68 correspondant à la demande française N° 6902616, déposé le 5 Février 1969). 35 La demanderesse a ensuite résolu le problème de la purifica tion de la L-asparaginase. On savait en effet que la L-asparaginase produite par un microorganisme appartenant à l'espèce Serratia se révèle extrêmement instable au cours de_la phase de purification partielle et qu'il perd son activité de manière inattendue durant 40 le processus de purification, bien que ladite L-asparaginase soit 69 20006 2011542 stable naturellement dans un vaste domaine de pH et' de températures. En raison de ce fait il était nécessaire d'effectuer toutes les étapes de purification très rapidement. C'est pourquoi il'était extrêmement difficile d'obtenir une préparation de grande pureté 5 à l'échelle industrielle. Toutefois aucune réponse précise n'a été donnée concernant les causes de ce phénomène. L'un des objets de la présente invention est de proposer un procédé de production de L-asparagiïiase qui surmonté les inconvénients et les déficiences des méthodes connues. 10 Un ajutre objet de la présente invention est de proposer un procédé permettant de produire à l'échelle industrielle, de manière économique, une L-asparaginase de grande pureté, avec un bon rendement. Un autre objet de la présente invention est de proposer des 15 préparations enzymatiques purifiées de L-asparaginase possédant une activité antimytotique stable. Un dernier objet de l'invention est de proposer de la L-asparaginase purifiée et un procédé de purification permettant son obtention. 20 Ces différents objets et avantages de la présente invention apparaîtront plus clairement au cours de la description qui suit. A la suite de nombreuses études menées sur les causes de la perte d'activité décrite ci-dessus, la demanderesse a découvert qu'un microorganisme appartenant à l'espèce Serratia produit dans 25 ses cellules, en même temps que la L-asparaginase, un facteur relativement résistant qui inactive cette L-asparaginase. Il en résulte que la L-asparaginase désirée perd son activité au cours de traitements subséquents, du fait que ces facteurs désactivants sont extraits en même temps que la L-asparaginase lorsque les cel-30 Iules sont rompues. Ainsi, à moins d'éliminer ces facteurs, il est non seulement impossible d'obtenir une préparation de grande pureté de L-asparaginase avec un bon rendement, mais encore d'obtenir un effet antimytotique suffisant à l'aide d'une préparation enzymatique renfermant ces facteurs inactivants, même si le produit 35 renfermant les facteurs inactiviants est purifié. La demanderesse a découvert, conformément à la présente invention, qu'il est possible de purifier très facilement la L-asparaginase en détruisant l'activité desdits facteurs d'inactiva-tion sans porter atteinte à l'activité de la L-asparaginase. Cette 40 découverte a permis à la demanderesse de mettre au point un nouveau 69 20006 3 2011542 procédé de production de L-asparaginase très pure à l'échelle industrielle. Le procédé selon l'invention consiste à purifier la L-asparaginase, obtenue par exemple à partir de cellules d'une souche 5 appartenant à l'espèce Serratia, par chauffage d'un» solution aqueuse brute de cet enzyme dans des conditions convenables, à un moment approprié intervenant au cours du processus de purification, et de préférence le plus tôt possible» Cette étape de chauffage dénature les facteurs d'inactiva tion de la L-asparaginase, 10 prévenant ainsi une perte d'activité de la L-asparaginase désirée au cours des étapes ultérieures de purification. > On sait que les protéines comme les enzymes sont d'habitude dénaturées par chauffage et que leur activité biochimique est de ce fait modifiée. Toutefois les conditions de dénaturation ther-ï'5 aique et l'altération de l'activité biochimique provoquée par la dénaturation sont extrêmement variées et dépendent du type particulier de la protéine. Une recherche effectuée dans le cadre de la présente invention a permis de mieux comprendre l'effet obtenu par chauffage de la L-asparaginase et de ses facteurs d'inactiva-20 tion. La demanderesse a ainsi découvert que les facteurs d'inacti-vation perdent rapidement leur activité, de manière irréversible, à une température de 60°C ou plus, et que lorsqu'on les chauffe pendant au moins 5 minutes ils perdent entièrement leur aptitude à détruire la L-asparaginase, tandis que la L-asparaginase reste 25 stable à une température de 70°C. En outre la demanderesse a découvert que la stabilité à la chaleur de la L-asparaginase se trouve augmentée en présence de son substrat, la L-asparagine, et que son activité se maintient même après un traitement thermique de 30 minutes à 70°C, tandis que les facteurs d'inactivation ne sont en 30 aucun cas affectés par la présence de la L-asparagine. Les différences de stabilité thermique de la L-asparaginase et de ses facteurs d'inactivation sont indiquées dans le tableau 1. 69 20006 2011542 TABLEAU 1 Température de chauffage (°C) Taux d'activité conservée par la L-asparaginase (%) temps de chauffage (minutes) 30 60 sans avec sans avec sans avec A sub. sub. sub. sub. sub. sub. Non traité 0 0 0 0 0 0 55 3 20 1t 32 6 30 60 88 100 92 1t0 99 99 65 90 95 85 110 88 89 70 80 105 64 95 44 80 80 5 20 5 20 11 10 10 15 A sub. = substrat Le tableau 1 correspond à des expérimentations au cours desquelles une solution aqueuse brute de pH 8 de L-asparaginase renfermant des facteurs d'inactivation a été soumise à une température 20 donnée pendant une période de temps donnée, indiquées dans le tableau, en présence ou noh du substrat à une concentration de 10"2*. Le pH du liquide a ensuite été ajusté à 5,5, pH optimum en ce qui concerne l'activité des facteurs d'inactivation, et le liquide a été abandonné pendant 2 heures à une température de 37°C, L'acti-25 vité de la L-asparaginase du mélange réactionnel ainsi obtenu a été mesurée. Le tableau 1 indique le taux de survie, (en %), de l'activité de la L-asparaginase du liquide réactionnel, rapportée à l'activité en L-asparaginase de l'échantillon original de liquide supposé égal à 1QO. 30 Comme le montre le tableau 1 les facteurs d'inactivation survivent à un chauffage de 60 minutes à une température de 55°C ou moins et détruisent presque complètement la L-asparaginase en 2 heures à pH 5,5 et 37°CS cm®© c'est le cas lorsque l'échantillon n'a pas été traité. Au contraire, un chauffage à une tempéra-35 ture de 60 à 70°C pendant seulement 5 minutes détruit les facteurs d'inactivation de manière suffisante pour éviter presque complètement que la L-asparaginase perde de son activité au cours des réactions ultérieures. Un chauffage à une température de 80°C ou plus entraîne une perte considérable d8 activité de la L-asparagi— BAD ORIGINAL 69 20006 5 201î542 nase elle-même, en raison d'une dénaturation de ce composé due à la chaleur. L'addition du substrat, la L-asparagine, permet de diminuer la perte d'activité de la L-asparaginase et de réaliser plus facilement une destruction ou une inactivation sélective des 5 facteurs d'inactivation, en augmentant la différence de stabilité thermique entre la L-asparaginase et les facteurs d8inactivation. Conformément à l'invention, il est possible de réduire ou de détruire de manière sélective l'efficacité des facteurs d'inactivation, de la manière décrite ci-dessus, en chauffant les solutions 10 aqueuses enzymatiques à une température de 60°C ou plus, et de préférence comprise entre 60 et 70°C, en présence ou non du substrat, la L-asparagine. 5 à 30 minutes suffisent pour ce traitement thermique. Il n'est pas souhaitable de chauffer pendant une période de temps trop longue du fait d'une dénaturation possible de la L-15 asparaginase. Le pH de la solution pendant le traitement thermique est de préférence compris entre 8,5 et 11. Dans ce domaine de pH la L-asparaginase est stable, tandis que les facteurs d'inactivation perdent complètement leur activité. Lorsque l'on ajoute de la L-asparagine à la solution on peut obtenir de meilleurs, résultats® 20 La L-asparagine est de préférence introduite à une concentration comprise entre 10" M et 10 M. Le traitement thermique selon l'invention. est de préférence mis en oeuvre au cours des premières étapes d'un processus de purification, et par exemple effectué sur l'extrait enzymatique brut. Toutefois, il peut également être mis 25 en oeuvre sur une préparation de grande pureté, en donnant un résultat satisfaisant. La pureté d'une préparation enzymatique obtenu© en détruisant complètement l'effet des facteurs dsinactivation selon le procédé de l'invention peut être aisément augmenté© grâce à différentes 30 méthodes ordinairement utilisées pour l'obtention des préparations enzymatiques pures, par exemple un® chronsaiographie par échange d'ions ou toute autre chromatographie utilisant des agents adsor-bants. Il est ainsi possible d'obtenir aisément, avec un bon rendement, une préparation utilisable comme pharmaceutique. 35 Dans la mesure où la composition du milieu de fermentation et la méthode de culture utilisées sont concernées, on utilise des procédés conventionnels pour obtenir les cellules contenant la L-asparaginase. On peut ainsi utiliser soit un milieu de culture synthétique soit un milieu nutritif naturel pour cultiver les 40 souches utilisées dans la présente invention, dans la mesure où 69 20006 Ô 2011542 où ces milieux renferment les éléments nutritifs essentiels indispensables à la croissance de la souche utilisée. De tels éléments nutritifs comprennent des substances renfermant du carbone, des substances renfermant de 1'azote ainsi que des composés minéraux 5 etc... qui sont utilisés par le microorganisme en quantités appropriées» Comme sources de carbone on peut mentionner par exemple les hydrates de carbone, comme le glucose, le fructose, le maltose, le sucrose, l'amidon, l'hydrolysat d'amidon, les molasses, etc.». ou n'importe quelle autre source de carbone convenable, comme les 10 acides organiques, par exemple1 acide acétique, 18acide lactique etc... Ces substances peuvent être utilisées soit seules soit en mélange« Comme sources d'azote, on peut utiliser différentes sortes de sels ou composés minéraux ou organiques, comme l'urée, l'ammoniac liquide ou les sels d'ammonium, comme le chlorure d'ammonium,, 15 le sulfate d'ammonium, le nitrate d'ammonium, le phosphate d'ammonium etc..* ou des substances naturelles renfermant de l'azote, par exemple une liqueur de macération de mais, un extrait de levure, un extrait de viande, une peptone, une farine de poisson, un bouillon, des hydrolysats de caséine, de l'extrait de bran de riz etc... Ces 20 substances peuvent également être utilisées seules ou en mélanges. Les composés minéraux qui peuvent être ajoutés au milieu de culture comprennent le sulfate de magnésium, le phosphate de sodium, le dihydrogénophosphate de potassium, le monohydrogénophosphate de potassium, le sulfate de fer, le chlorure de manganèse, le chlorure 25 de calcium, le chlorure de sodium, le sulfate de zinc etc... La fermentation ou culture des microorganismes s'effectue dans des conditions aérobies, par exemple par agitation à l'air de la culture ou agitation et aération d'une culture submergée à une température de par exemple 20 à 40°C, et à un pH de par exemple 6 30 à 8. Au bout de 10 a 72 heures de culture effectuée dans ces conditions les cellules contenant la L-asparaginase se trouvent accumulées dans, la liqueur résultante. Une fois la culture achevée les cellules peuvent être rompues de manière conventionnelle, un extrait enzymatique brut étant re-35 cueilli. Cet extrait est ensuite soumis au traitement conforme à la présente invention. L'exemple qui suit est donné à titre d'illustration de la présente invention, étant entendu que cet exemple ne présente aucun caractère limitatif. Sauf indication contraire, les pourcentages 40 y figurant s'entendent en poids par litre d'eau. BAD ORIGINAL 69 20006 7 2011542 RXFMPLE On. cultive dans un milieu nutritif aqueux- line souche de Serratia marcescens ATCC 60 et les cellules ainsi obtenues sont mises en suspension dans une solution tampon 0,01 M de chlorliydrate 5 de tris (hydroxyméthy1) méthyl ammonium de pH 8,5» Les cellules sont rompues par traitement de la solution pendant 10 minutes à l'aide d'un..générateur d'ondes supersoniques de 10 Kc. Le liquide résultant est soumis à une séparation centrifuge et le liquide surnageant est recueilli, fournissant un liquide enzymatique brut pré-10 sentant une activité en L-asparaginase de 0,1 unité d'activité spécifique* (L'unité d'activité spécifique est une unité internationale indiquant l'activité d'un «azyme par le nombre de micromoles de substrat décomposé par minute ; cette définition de l'activité spécifique sera utilisée tout au long de la présente demande). 15 On ajoute de la L-asparagine à l'extrait enzymatique brut, à une concentration de 10 M. L'extrait est ensuite chauffé pendant 30 minutes à une température de 60°C. Les précipités obtenus sont éliminés par centrifugation, livrant un liquide enzymatique brut qui présente une activité spécifique de 0,4. 20 Aucune perte d'activité de la L-asparaginase due aux fac teurs d'inactivation de cette L-asparaginase n'a pu être observée dans le liquide enzymatique brut obtenu. Les protéines précipitées par addition de sulfate d'ammonium à une concentration de 0,3 à. 0,7 par rapport à la saturation ont été récupérées par séparation centrifuge. Ces protéines ont ensuite été dissoutes dans une solu-25 tion tampon de chlorhydrate de tris (hydroxyméthyl) méthyl ammonium. Cette solution a ensuite été soumise à une dialyse et le liquide obtenu à une chromatographie à l'aide de diéthylamiiio-éthylcellu-lose et à une chromatographie à l'aide de biogel D 200. On a obtenu ainsi, avec rai rendement de 30 $, une préparation de L-asparaginase 30 purifiée présentant une activité spécifique de 110» Cette préparation se révéla posséder une activité antimytotique qui amena, à la dose de quelques microgrammes la guérison complète d'une leucémie expérimentale provoquée chez une souris. Il est évident que l'invention ainsi décrite peut subir un certain nombre de modifications sans que ces modifications puis-35 sent être considérées comme sortant du cadre de l'invention. 69 20006 8 2011542 REVENDICATIONS 1 - Procédé de purification de la L-asparaginase obtenue à partir d'une culture de cellules d'un microorganisme producteur de L-asparaginase apportenant à l'espèce Serratia. caractérisé par le 5 fait que l'on chauffe le liquide enzymatique obtenu à partir de la culture desdites cellules à une température comprise entre 60 et 80°C. 2 - Procédé selon la revendication 1, caractérisé par le fait que la température de chauffage est comprise entre 60 et 70°C. 10 3 - Procédé selon la revendication t, caractérisé par le fait que l'on ajoute au liquide de la L-asparagine. 4 - Procédé selon la revendication 1, caractérisé par le fait que le microorganisme est de la souche Serratia marcescens. 5 - Procédé selon la revendication 1, caractérisé par le 15 fait que l'étape de chauffage est effectuée au cours d'une des premières étapes du processus de purification. 6 - Procédé selon la revendication 1 caractérisé par le fait que ladite étape de chauffage est effectuée sur une préparation de L-asparaginase au moins en partie purifiée. 20 7 - Procédé de production d'une préparation de L-asparagi- nase purifiée présentant une activité antimytotique stable, caractérisé par le fait que l'on cultive dans des conditions aérobies un microorganisme producteur de L-asparaginase appartenant à l'espèce Serratia dans un milieu nutritif aqueux, que l'en reciwtille 25 un liquide brut renfermant l'enzyme à partir de la liqueur de culture obtenue,l'en ajoute de la L-asparagine à ce liquide, que l'on chauffe ce liquide à une température comprise entre 60 et 80°C pendant un temps suffisant pour rendre inefficaces les facteurs d'inactivation de la L-asparaginase et que l'on recueille la L-30 asparaginase à partir de ce liquide. 8 - Procédé selon la revendication 7, caractérisé par le fait que la L-asparaginase obtenue est ensuite soumise à d'autres traitements de purification® 9 - Procédé selon la revendication 7, caractérisé par le 35 fait que la température d© chauffage est comprise entre 60 et 70°C. tO - Procédé selon la revendication 7, caractérisé par le fait qu'on, ajoute au liquide de la L-asparagine dans la proportion d'environ t0~ à 10 moles par litre. 11 - Procédé selon la revendication 7 caractérisé par le 69 20006 9 2011542 fait que l'on chauffe le liquide pendant un temps compris entre 5 et 30 minutes* 12 - Procédé selon la revendication 7, caractérisé par le fait que le pH du liquide pendant l'étape de chauffage est maintenu 5 à une valeur comprise entre environ 8?5 et 11. 13 - Procédé selon la revendication 7S caractérisé par le fait que le microorganisme utilisé est de l'espèce Serratia marcescens. 14 - Procédé suivant la revendication 7, caractérisé par le 10 fait que le microorganisme utilisé est le Serratia taar ces cens ATCC 60. 15 - Préparation de L-asparaginase produite selon le procédé de la revendication 8 et présentant une activité spécifique d'au moins ItO.