FR 2000641 A1 19690912 FR 6901148 A 19690122 69 01148 2000641 La présente invention est relative à m procédé de production de L-tryptophane. Plus particulièrement, elle concerne un procédé de production de L-tryptophane par fermentation, et encore plus particulièrement un procédé de production de L-trypto-5 phane par fermentation dans lequel on cultive des mutants exigeant de l'histidine au sein d'un milieu de fermentation approprié • Des procédés de production de tels tryptophanes par fermen tation étaient déjà connus dans la technique antérieure. Ces pro 10 cédés sont caractérisés, par exemple, par le fait qu'on ajoute de l'indole ou de l'acide anthranilique au milieu de culture (voir brevet américain n° 2.999.051, brevets japonais n° 12.384/60 et n° 4.632/64, brevet français n° 1.437«998 et bre vet américain n° 3.293*141). Toutefois, les précurseurs d'indole 15 ou d'acide anthranilique utilisés dans ces procédés sont coûteux Ainsi, lesdits procédés présentent l'inconvénient que le prix de revient du tryptophane est élevé. En outre, on ne peut pas utiliser de grandes quantités de ces précurseurs car ils freinent le développement des micro-organismes. 20 On a donc mis au point des procédés de production de L- tryptophane sans addition de précurseurs au milieu de fermentation. Par exemple, dans l'un de ces procédés,on utilise des mutants d'Escherichia coli [Journal of Fermentation Technology. Vol. 43, n° 5, pages 307-310 (1965)] et, dans un autre procédé, 25 on utilise"un milieu de culture contenant des hydrocarbures comme source de carbone. Toutefois, les rendements obtenus dans ces procédés sont faibles, spécialement dans le dernier procédé, ces rendements étant environ de 1 mg/litre seulement. La. présente invention a donc pour objet j 30 - un procédé perfectionné de production de L-tryptophane qui pallie les inconvénients et les insuffisances des procédés de la technique antérieure ; - un procédé de production de L-tryptophane par fermentation, qui peut être mis en oeuvre d'une façon efficace et relati 35 vement simple ; - un procédé de production de L-tryptophane par fermentation qui peut être mis en oeuvre avantageusement à l'échelle industrielle, et qui donne un rendement élevé de produit d'un prix de revient faible | 40 - l'obtention de L-tryptophane« 69 01148 2 2000641 Ces caractéristiques et avantages de la présente invention I ainsi que d'autres apparaîtront aux techniciens à la lecture de l'exposé qui va suivre. Au cours d'études poussées concernant la mise au point 5 d'un procédé microbiologique de préparation de l-tryptophane à partir d'hydrocarbures ou d'hydrates de carbone coûteux, sans utiliser de précurseurs, en vue de pallier les inconvénients des procédés classiques, la demanderesse a constaté, conformément à la présente invention, que des mutants qui exigent de l'histidi-10 ne pour leur croissance et qui appartiennent à l'un des genres Baçillus, Corynebacterium ou Arthrobacter, produisent et accumulent directement des quantités notables de L-tryptophane quand on les cultive au sein d'un milieu nutritif aqueux dans des conditions aérobies. Il est donc devenu possible d'obtenir du L— 15 tryptophane avec de grands rendements et à peu de frais, en utilisant des sources de carbone peu coûteuses telles que des hydrates de carbone, des hydrocarbures, etc. Les micro-organismes qu'il convient d'utiliser dans la présente invention sont des mutants de micro-organismes appartenant 20 auxgenres Baçillus, Corynebacterium et Arthrobacter qui exigent au moins de l'histidine pour leur croissance. Bien entendu, on peut utiliser des mutants qui exigent non seulement de l'histidine mais également d'autres substances pour leur croissance. Ces souches productrices de L-tryptophane peuvent être facilement 25 obtenues par les techniciens grâce à un traitement de mutation, par exemple par irradiation aux rayons ultra-violets, par exposition à diverses radiations telles que des rayons ou les rayons du cobalt 60, un traitement avec des agents chimiques, etc., et en utilisant simultanément une méthode de sélection appropriée. 30 Les souches utilisées conformément à la présente invention peuvent être cultivées dans un milieu de culture synthétique aus*> si bien que dans un milieu nutritif naturel, à condition que ces milieux contiennent les éléments nutritifs essentiels pour la croissance de la souche choisie. De tels éléments nutritifs sont 35 bien connus dans la technique et comprennent des substances telles qu'une source de carbone, une source d'azote, des composés minéraux et des produits analogues, qui sont utilisés en des quantités appropriées par le micro-organisme choisi. Ainsi, on peut mentionner comme source de carbone, à titre d'exemple, des 40 hydrates de carbone tels que le glucose, le fructose, le maltose, 69 01148 5 20Û0641 le saccharose, l'amidon, l'hydrolysat d'amidon, la mélasse, le ' mannose, le glycérol, etc«, ou toute autre source de carbone appropriée telle que des acides organiques, comme par exemple l'acide acétique, l'acide lactique, l'acide pyruvique, etc0 On peut 5 utiliser ces substances isolément ou sous forme de mélanges com-deux prenant / ou plus de deux d'entre elles# lorsqu'on utilise des micro-organismes assimilant des hydrocarbures, la source de carbone incorporée au milieu nutritif peut §tre constituée par des hydrocarbures, comme par exemple des 10 n-paraffines, du kérosène ou des fractions de pétrole, y compris des huiles légères, des huiles lourdes, des huiles paraffi-niques, etc., eu bien par une combinaison de tels hydrocarbures avec un hydrate de carbone ou un mélange d'hydrates de carbone. la source d'azote peut être constituée par diverses sortes 15 de sels ou composés minéraux ou organiques, tels que l'tirée, une solution d'ammoniaque, ou des sels d'ammonium tels que le chlorure d'ammonium, le sulfate d'ammonium, le nitrate d'ammonium, l'acétate d'ammonium, le phosphate d'ammonium, le carbonate d'ammonium, etc., ou encore des substances naturelles contenant 20 de l'azote, comme la liqueur de macération du maïs, l'extrait de levure, l'extrait de viande,là'peptone, la farine de poisson, le bouillon, les hydrolysats de caséine (comme l'aminé NZ), un acide aminé de la caséine, des matières solubles du poisson, tui extrait d1 enveloppes de grains de riz, du gâteau de soja dégraissé, 25 un hydrolysat d'huile de chrysalide, ou diverses substances provenant de leur digestion.» De nouveau, on peut utiliser ces substances isolément ou sous forme de mélanges comprenant deux ou plus de deux d'entre elles» les composés minéraux qu'on peut ajouter au milieu de cul— 30 ture comprennent le sulfate de magnésium, le phosphate de sodium, le phosphate monopotassique, le phosphate dipotassique, le sulfate ferreux, le chlorure de manganèse, le chlorure de calcium, le chlorure de sodium, le sulfate de zinc, le sulfate de manganèse, le carbonate de calcium, etc. 35 Bien entendu, étant donné que les micro-organismes utilisés de façon appropriée dans la présente invention exigent des éléments nutritifs spécifiques pour leur croissance, Ses quantités appropriées de ces éléments nutritifs doivent Stre ajoutées au milieu de culture dans la mesure nécessaire» Ces éléments nutri— 40 tifs sont ordinairement contenus dans des substances organiques BÂD ORIGINAL S 9 01148 2000641 azotées telles que des sources d'azote et, de ce fait, ces exi- i gences sont satisfaites paj? l'utilisation de quantités appro^ priées de telles substances. Toutefois, il n'est pas impératif d'ajouter des substances organiques azotées au milieu en vue &@ 5 fournir à celui-ci les éléments nutritifs requis. Par suite, os. peut incorporer au milieu d'autres facteurs de croissance, tels que des amino-acides, des vitamines comme la thiamine, la co'cc On conduit la culture dans des conditions aéroMes, par 10 exemple en secouant la culture en aérobie , ou en aérant et sm agitant une culture submergée, à une température d'environ 201 à 40°C par exemple et à un pH d'environ 4 à 9)5 par exemple. Fez:? obtenir des rendements élevés en L-tryptophane, il est désirabl© de maintenir le milieu de culture à un. pH sensiblement neutre 15 (pH 7). Après environ 2 à 5 heures de culture dans de telles conditions, des quantités notables de L-tryptophane sont produitss et accumulées dans la liqueur de culture résultante. Lorsque la culture est terminée, on élimine les cellules des micro-orgasâs On comprendra mieux la présente invention à la lecture des exemples qui vont suivre et qui sont donnés uniquement à titre indicatif et non limitatif de la portée de la présente invention; Sauf mention contraire, les pourcentages mentionnés dans l'e^saf. 30 tout entier s*entendent en poids par litre d'eau. TOTBMPLE 1 Le micro-organisme d'.ensemencement est la souche Arthrs&apf ter paraffineus KÏ7112 (ATGC 21333), qui est un mutant exigerais de l'histidine. On inocule cette souche dans une fiole conique 35 de 250 ml, contenant 30 ml d'un milieu de culture (pH 7,4) ©snpr- --nant 2 % de sorbitol, 1 % d'extrait de viande, 0,5 % d'extrait de levure et 0,3 % de chlorure de sodium. On cultive le micro-organ: me en secouant la culture en aérobie , à 30°C, pendant 24 hcores . pour obtenir une culture d'ensemencement® 40 On inocule 2 ml de la culture d'ensemencement résultante BAD ORIGINAL 69 01148 S 2000641 ^dans une fiole conique de 250 ml contenant 20 ml d'un milieu de fermentation (pH 7,4-) ayant la composition suivante : Sorbitol 10 % bh4ci 2 % 0,2 % Ha^HPO^ 0,2 % MgSO^HgO 0,1 % FeSO^THgO 10 mg/litre MnS04,4H20 10 mg/litre ZnS04,7H20 10 mg/litre Chlorhydrate de thiamine 5 mg/litre Extrait de levure 0,3 % Aminé HZ 1 % CaCO, 2 % 15 On procède ensuite à la culture en secouant le milieu de culture en aérobie dans le milieu de fermentation, à 30°G et pendant 4 jours. On obtient ainsi dans la liqueur cultivée une quantité de L-tryptophane de 500 mg/litre. On. centrifuge la liqueur de culture résultante en vue d'é-20 11miner les cellules de micro-organismes qu'elle contient. On fait passer 5 litres de la liqueur surnageante obtenue à travers une résine échangeuse de cations fortement acide [résine"Diaion SI 104" (type H)] en vue d'adsorber le L-tryptophane. Après avoir lavé la colonne avec de l'eau, on concentre à siccité 25 l'effluent résultant de l'élution avec une solution d'ammoniaque 0,5N et on dissout la poudre cristalline brute résultante de L-tryptophane dans une petite quantité d'une solution aqueuse chaude à 50 % d'éthanol. On décolore ensuite cette solution avec du charbon actif et on la refroidit de nouveau. On obtient ainsi 30 1,5 g de cristaux de L-tryptophane. TOWPLE 2 Le micro-organisme d'ensemencement est le mutant Arthrobacter paraffineus KÏ7112 (ATCC 21533) exigeant de l'histidine. On conduit la culture en procédant de la manière décrite dans l'exem-35 pie 1 et en utilisant le même milieu que dans cet exemple, à cette exception que le milieu de fermentation contient 10 % de kérosène au lieu de sorbitol comme source de carbone. Après 4 jours de culture, le L-tryptophane est accumulé en une quantité de 400 mg/litre dans la liqueur de culture résultante. 69 01148 6 2000641 •RTTEMPT.TC 3 Le micro-organisme d'ensemencement est le Baçillus subtilis ATCC 14662 (mutant exigeant de l'histidine, de l'adéniné, de la tyrosine et de 1 'arginine). On l'inocule dans une fiole conique 5 de 250 ml contenant 30 ml d'un milieu de culture (pH 7,4) compre» nant 2 % de glucose, 1 % d'extrait de levure, 1 % de peptone et 0,25 % de chlorure de sodium. On cultive la souche en secouant la culture en aérobie à 30°C, pendant 24 heures, ce qui donne une culture d'ensemencement à 10 On inocule 2 ml de la culture d'ensemencement résultante dans une fiole conique de 250 ml contenant 20 ml d'un milieu de fermentation ayant la composition suivante t Glucose 5 % KgHPO^ 0,05 % 15 KHgPO^ 0,05 % (hh4)2so4 1 % MgS04,7H20 0,02556 Biotine . 30 " mg/litre Extrait de levure 0,1 % 20 Aminé -HZ 0,25 % CaC05 2 % Le pH du milieu de fermentation est de 7,4. On conduit la culture en secouant la culture en aérobie à 30°C, pendant 4 jours. La liqueur de culture résultante con-25 tient ainsi 200 mg/litre de L-tryptophane. EXEMPLE 4 Le micro-organisme d'ensemencement est le Corynebacterlum glutamicum KT9104 (ATCC 21334), qui est un mutant exigeant de l'histidine. On exécute la culture de la mime manière que dans 30 l'exemple 3 et en utilisant le même milieu que dans cet exemple* De cette manière, la liqueur cultivée contient 500 mg/litre de • L-tryptophane. Il est bien évident que l'on peut apporter de nombreuses modifications à la description qui précède, sans sortir pour ce— 35 la du cadre de la présente invention. ,;9 31 148 7 2000641 REVENDICATIONS ' 1. Procédé de production de L-tryptophane, caractérisé par le fait qu'on cultive un micro-organisme exigeant de l'histidine et appartenant à un genre pris dans le groupe comprenant les sou-5 ches Corynebacterium« Arthrobacter et Baçillus « ce micro-organis— me étant capable de produire du L-tryptophane dans des conditions aérobies, au sein d'un milieu nutritif aqueux, le L-tryptophane s'accumulant dans la liqueur de culture résultante» 2» Procédé conforme à la revendication 1, caractérisé par 10 le fait qu'on cultive le micro-organisme à une température d'environ 20 à 40°C et à un pH d'environ 4 à 9t5« 3• Procédé conforme à la revendication 1, caractérisé par le fait que le milieu nutritif contient au moins un hydrate de carbone à titre de source de carbone» 15 4» Procédé conforme à la revendication 1, caractérisé par le fait que le milieu nutritif contient au moins un hydrocarbure comme source de carbone» 5« Procédé conforme à la revendication 1, caractérisé par le fait qu'on maintient le pH au voisinage de 7 pendant la cultu— 20 re. 6. Procédé conforme à la revendication 1, caractérisé par le fait que le micro-organisme est la souche Arthrobacter parâf-fineus ATCC 21333» 7» Procédé conforme à la revendication 1, caractérisé par 25 le fait que le micro-organisme est la souche Baçillus subtilis ATOC 14662. 8. Procédé conforme à la revendication 1, caractérisé par le fait que le micro-organisme est la souche Corynebacterium glutamicum ATCC 21334. 30 9» Procédé conforme à la revendication 1, caractérisé par le fait que le milieu nutritif contient un hydrate de carbone ou du kérosène comme source de carbone. 10. Procédé conforme à la revendication 1, dans lequel on récupère le L-tryptophane dans la liqueur de culture résultante 35 grâce à un traitement par une résine échangeuse d'ions.