FR 2007398 A1 19700109 FR 6910281 A 19690403 9 5 10 15 20 25 30 35 40 1 2007398 10281 La présente invention est relative à tun procédé de purification dfc L-asparaginase. Plus particulièrement, elle concerne un procédé de purification de préparations de L-asparaginase ayant une activité enzymatique élevée et, encore plus particulièrement, un procédé de purification de préparations de L-asparaginase obtenues à partir de cellules productrices de L-asparaginase qui ont été cultivées au sein d'un milieu nutritif approprié# La L-asparaginase, qui est un hydrolase de la-L-aspara-mide (ayant un nombre d'enzyme de 3, 5, 1»l) est un enzyme qui hydrolyse la L-asparagine en donnant de l'acide L-aspartique et de l'ammoniac• La L-asparaginase existe en quantités relativement importantes dans le règne animal aussi bien que dans le règne végétal, et cependant beaucoup de ses propriétés sont encore inconnues • Depuis quelque temps, on a porté une grande attention à la L-asparaginase parce qu'on a constaté qu'un type spécifique de cet enzyme, obtenu par exemple à partir du sérum'du cobaye ou d'une certaine souche d'Bacherichia coli. possède une activité antitumeur et en particulier, une activité élevée contre les leuco-blastes qui exigent de la L-asparagine* Jusqu'ici, la production à grande échelle de la L-asparaginase, en particulier en quantités suffisantes pour satisfaire une utilisation massive comme médicament, était extrêmement difficile en raison de problèmes tels que la difficulté de cultiver à grande échelle les cellules de microorganismes appropriés qui doivent être utilisées comme matière de départ et la difficulté de conserver l'activité de l'enzyme au cours de la purification. Par conséquent, il est devenu nécessaire de disposer d'un procédé de culture et de purification à grand rendement, qui puisse être mis en oeuvre à l'échelle industrielle pour obtenir, à partir de microorganismes producteurs de L-asparaginase, une préparation purifiée de L-asparaginase douée d'une activité anti-leucémique et ayant une valeur économique et pratique supérieure. La présente invention a donc pour objet : - un procédé perfectionné de production de préparations de L-asparaginase qui ne présente pas les inconvénients et les insuffisances des procédés de la technique antérieure} - un procédé de purification de L-asparaginasej - l'obtention économique et à l'échelle industrielle de préparations enzymatiques de L—asparaginase ayant une pureté élevée. 2 2007398 69 10281 ' ' Une telle production à 1'.échelle industrielle de L-asparaginase présente de toute évidence un intérêt particulier car, par exemple, lâ L-asparaginase obtenue à partir d'un microorganisme du genre Serratia possède une activité anti-leucémique# 5 . Conformément à Isl présente invention, on peut donc ob tenir dos préparations de L-asparaginase ayant une pureté élevée# Ces caractéristiques et avantages de la présente invention ainsi que d'autres apparaîtront à la lecture de la description et des revendications# 10 On pourrait penser à première vue que les enzymes ayant une activité de L-asparaginase conformes à la présente invention, par exemple la L-asparaginase obtenue à partir de souches du genre Serratia#ainsi que la L-asparaginase de sérum obtenue à partir de cobayes, peuvent être facilement purifiés parce qu'ils semblent 15 être dans un état stable en ce qui concerne leurs propriétés enzy-matiques à l'état brut de préparation, comme par exemple leur T- thermostabilité ét leur stabilité en fonction du pH» Toutefois, la production à grande échelle de ces enzymes ayant une activité de L-asparaginase a été impossible jusqu'à ce jour, en partie parce 20 qu'il se produit une perte totalement inattendu* de leur activité enzymatique, c'est-à-dire de leur activité spécifique, lorsque la pureté du L-asparaginase augmente# La demanderesse avait déjà mis au point un procédé de culture de microorganismes du genre Serratia qui possèdent une acti-25 vité de L-asparaginase supérieure à celle qu'on avait pu obtenir jusqu'ici# (Voir demande de brevet français n° 69 02616, du 5 Février 1969)• au nom da la, demanderesse . , . . . La demanderesse a maintenant réussi a mettre au point un 30 procédé de purification d'enzyttes possédant une activité de L-' asparaginase élevée à partir de bactéries du genre Serratia et d'autres genres, en vue d'obtenir des préparations ayant une pureté élevée# Par conséquent, conformément à la présente invention, on 35 atteint les buts mentionnés précédemment quand on met en oeuvre le procédé qui va être décrit. Dans une première opération, les protéines inutiles qui sont contenues dans une solution enzymatique brute sont éliminées en majeure partie par un traitement de coagulation par un acide, la solution enzymatique brute étant obtenue 40 à partir de cellules de bactéries par rupture et par séparation centrifuge de débris, après quoi la L-asparaginase est rendue 69 10281 3 2007398 soluble. Dans une seconde opération, on maintient un pH égal ou inférieur à 4,5 ou bien égal ou supérieur à 8, de manière que 1'enzyme ayant une activité rzde L-asparaginase puisse être purifié. On peut effectuer cette opération en tenant compte de l'intervalle 5 de pH particulier dans lequel 1*activité dés enzymes de l'invention reste stable* La présente invention est donc relative à un procédé dans lequel on peut purifier la L-asparaginase pour obtenir avec un rendement élevé, une préparation de grande pureté* De préférence, l'effet de la purification peut être encore renforcé par l'ad-10 dition de chlorure de sodium, de glycérol, d'albumine, de L-asparagine, etc., à titre d'agent de stabilisation des enzymes* L'invention est donc caractérisée par le fait qu'on combine ces opérations pour purifier une L-asparaginase de grande pureté ayant une activité spécifique élevée, ce qui permet d'obtenir un produit 15 pouvant être mis en oeuvre dans le domaine pharmaceutique. Les cellules de bactéries utilisées comme matière de départ dans l'invention sont obtenues par un procédé de culture sur plaque bien connu ou par un procédé de culture submergée* (Voir demande de brevet français n* 69 02616, du 5 Février 1969)* au nom de la demanderesse 20 On recueille ensuite les cellules par séparation centrifuge ou d*une autre manière. Ensuite, on met les cellules résultantes en suspension dans une petite quantité d'une solution tampon, après quoi on obtient facilement de la L-asparaginase soluble par traitement dans un homogénéiseur, par pulvérisation, par 25 destruction par les ultrasons, par traitement avec un lysozyme, par autolyse ou par d'autres procédés. La L-asparaginase désirée est alors séparée des débris de cellules par centrifugation. Le liquide enzymatique binit obtenu de cette façon est relativement insensible aux variations du 30 pH et aux effets de la chaleur. Toutefois, ce liquide enzymatique brut contient une grande quantité de protéines impures et de pigments* Pour éliminer ces impuretés, on ajuste le pH du liquide entre 3,5 et 4,5* Ce réglage du pH détermine la dénaturation, la coagulation et la précipitation de la majeure partie des pigments 35 et des protéines inutiles. On peut facilement recueillir les précipités résultants par séparation centrifuge ou par d'autres procédés* D'autre part, le liquide surnageant conserve une activité de L-asparaginase élevée et ne perd pas son activité dans l'intervalle de pH spécifié* Par conséquent, on peut donc augmenter la cureté de l'enzyme de 10 à 20 fois par rapport à son activité spé- » 2007398 69 10281 cifique après la purification. Ensuite, on soumettra le liquide surnageant ainsi obtenu à une purification par absorption sur une résine ou une cellulose échangeuses d'ions, sans traiter oe liquide au préalable ou bien 5 après l'avoir dilué ou soumis à une dialyse pour amener sa force ionique à une valeur appropriée, après quoi on JlJfcA u la matière absorbée, on la purifie et on la condense. Dans une variante, on peut également rendre la L-asparaginase insoluble en ajoutant du sulfate d'ammonium, du sulfate de sodium, de l'acétone, du 10 méthanol,etc. On recueille le précipité résultant, on le dissout et on le condense* La préparation partiellement purifiée obtenue grâce au procédé de dénaturation par un acide décrit ci-dessus est instable par comparaison avec la L-asparaginase contenue dans 1*extrait 15 liquide brut précité» Un phénomène fréquemment observé est la perte rapide de l'activité de la préparation partiellement purifiée, « même à une température basse égale ou inférieure à 5* 0« La demanderesse a étudié ce phénomène et a constaté que la préparation enzymatique partiellement purifiée est extrêmement instable à un • 20 pH de 4,5 à 8. Il a été constaté qu'il faut maintenir le. pH du liquide traité entre 3 et 4,5 ou entre 8 et 11 et que ce réglage du pH permet d'.éviter une réduction de l'activité des enzymes conformes à la présente invention* XI est possible d'augmenter la pureté de la préparation au cours d'opérations ultérieures, à vo-25 lonté* La perte soudaine d'activité décrite ci-dessus ressort de l'étude du tableau suivant qui est relatif à des expériences exécutées au pH 7« Dans ces expériences, on a fait appel à une électrodialyse pour tenter d'éliminer le sulfate d'ammonium conte-30 nu dans des précipités formés par addition de sulfate d'ammonium au liquide surnageant résultant de la dénaturation par un acide* Le résultat des expériences apparaissant dans le tableau permet de comparer le changement d'activité avec le taux d'élimination du sulfate d'ammonium en trois stades différents exécutés aux pH res-35 pectifs de 4, 7 et 9» à. une.température uniforme de 5* C« Comme mentionné ci-dessus, une perte brusque d'activité a été notée au pH 7 pendant le procédé d'élimination par électrodialyse. Ce résultat montre qu'il est essentiel que le pH pendant 1'électro-dialyse et des traitements similaires soit .compris entre 3 et 40 4,5 ou entre 8 et 11. * * *. i» i fi 4 J 69 10281 5 Tableau 2007398 Durée de 1'électrodialyse, minutes t»H du liquide éle c trodialys é * »o 7,° j 9A° Activité Sulfate d'ammonium Activité Sulfate d'ammonium Activité Sulfate d'ammonium 0 100 100 100 100 100 100 30 98 54 99 62 102 60 60 88 5,4 90 3° 81 21 90 102 0,3 100 2,1 110 M 120 117 0,06 2 0,05 110 0m Note t Les chiffres représentent des pourcentages. / Dans un procédé de purification par «âsorption, la L- Les exemples suivants, qui sont donnés uniquement à titre illustratif, permettront de mieux comprendre la présente invention sans toutefois limiter sa portée# L'activité de la L-asparaginase est mesurée en imités, une unité correspondant à l'activité enzy-25 matique qui décompose 1 p-mole de L-asparagine par minute. 69 10281 6 2007398 EXEMPLE 1 On utilise 100 g de cellules résultant de la culture en aérobie du microorganisme Serratia marcescens ATCC 60 au sein d'un milieu de culture nutritif liquide agité, et on met ces cel-5 Iules en suspension dans 150 ml d'une solution tampon 0,01 M tïis-HCL ^"tris(hydroxyméthyl)aminométhane et acide chlorhydriqu^ , au pH 8,5» On traite la suspension avec un générateur d'ultrasons de 10 Kc , ce qui donne un extrait enzymatique liquide brute L'activité de L-asparaginase de cet extrait liquide est de Q,1 unité par 10 mg de protéine» On ajuste lentement le liquide extrait au pH 3#5 avec une solution d'acide chlorhydrique« On soumet immédiatement le liquide extrait à une séparation centrifuge, pour éliminer la majeure partie des cellules détruites et des précipités coagulés. La pureté spécifique du liquide surnageant ainsi obtenu est 12 15 fois supérieure à celle de l'extrait enzymatique brut. Le taux d'activité obtenu est de 80$. EXEMPLE g On ajuste au pH 4 un liquide surnageant qui est au pH 3,5 et qui a été obtenu conformément à l'exemple 1t en utilisant 20 line solution aqueuse de soude caustique. On ajoute ensuite 0,01 30 On élimine les sels du liquide enzymatique purifié ainsi obtenu par électrodialyse au cours de laquelle on maintient le pH à 4. On ajoute ensuite une petite quantité de glycérol, puis on amène ensuite rapidement le pH du liquide enzymatique purifié à 9 et on le purifie par adsorption sur de la diéthylaminoéthylcel-35 lulose. On élue alors l'enzyme en augmentant graduellement la concentration d'une solution de chlorure de sodium tout en maintenant le pH à 9. Le liquide enzymatique ainsi obtenu, qui est conforme à la présente invention, est ensuite séché à basse température. La pureté de la préparation résultante est 1.300 fois 40 supérieure à celle de l'extrait de cellules brut obtenu de la 7 2007398 manière décrite dans 1*exemple 1. EXEMPLE 3 - On ajoute une solution saturée à 90$ de sulfate d'ammoniun au liquide surnageant au pH 3*5 obtenu conformément à l'exemple 1 « 5 Cette addition a pour effet de déterminer la formation de précipités qu'on recueille et qu'on dissout» On dialyse la solution ainsi obtenue tout en maintenant son pH à 9» en utilisant une solution tampon 0,01 M tris-HC1 qui est au j3H 9» dans un tube en cellulose qui rénférme une petite quantité de glycérol. Pendant la dialyse, 10 l'activité de L-asparaginase est conservée presque quantitativement. Après la dialyse, on purifie le liquide résultant par adsorption sur de la diéthylaminoéthylcellulose, sans autre traitement, et on l'élue avec une solution tampon 0,01 M tris-HC1 au pH 9» qui contient du chlorure de sodium. La pureté d'enzyme du liquide élué 15 résultant est 660 fois supérieure à celle de l'extrait de cellules brut obtenu dans l'exemple 1. Il est bien entendu qu'on peut apporter de nombreuses modifications à la description qui précède et appliquer le procédé de l'invention à la purification de la L-asparaginase obtenue à 20 partir de cellules d'autres microorganismes comme les microorganismes Escherichia coli. Erwinia aroideae et Brwinia carotovora» XI est entendu que de telles applications du présent procédé ne s'écartent pas du cadre de l'invention comme le consprendront facilement les techniciens» 69 10281 8 2007398 REVENDICATIONS 1*- Procédé de purification de la L-asparaginase à partir d'un extrait brut obtenu à partir de cellules résultant de la culture d'un microorganisme producteur de L-asparaginase au sein 5 d'un milieu nutritif, ce procédé étant caractérisé par le fait qu'il comprend des opérations consistant à ajuster le pH de l'extrait à 4,5 ou moins et à dénaturer et précipiter les protéines impures présentes dans cet extrait liquide. 2»- Procédé conforme à la revendication 1, qui comprend 10 en outre la purification de la fraction surnageante de l'extrait traité peur un acide par adsorption sur un échangeur d'ions et l'élution de la L-asparaginase ainsi adsorbée. 3*- Procédé conforme à la revendication 1, qui comprend en outre le réglage du pH de la fraction surnageante de l'extrait 15 traité par un acide à une valeur de 8 ou plus, 1'adsorption du produit surnageant résultant par un échangeur d'ions et l'élution de la L-asparaginase adsorbée* 4«- Procédé conforme à la revendication 1, caractérisé par le fait que la partie surnageante de l'extrait traité par un 20 acide est adsorbée sur un premier échangeur d'ions, après quoi on ajuste le pH du produit de l'élution à 8 ou plus, on purifie 1® produit résultant de l'élution par adsorption sur un second échangeur d'ions et on élue la L-asparaginase ainsi adsorbée* 5.- Procédé conforme à la revendication 2, dans lequel 25 1'échangeur d'ions est la carboxyméthylcellulose. 6*- Procédé conforme à la revendication 3, dans lequel 1 *échangeur d'ions est la diéthylaminoéthylcellulose* 7*- Procédé conforme à la revendication 4, dans lequel le premier échangeur d'ions est la carboxyméthylcellulose et le 30 second échangeur d'ions est la diéthylaminoéthylcellulose* 8.- Procédé conforme à la revendication 1, dans lequel le microorganisme appartient au genre Serratia. 9*- Procédé conforme à la revendication 1, dans lequel le pH de l'extrait est ajusté à une valeur comprise entre 3,5 et 35 4,5. 10*— Procédé conforme à la revendication 2, dans lequel la substance d'élution est une solution de chlorure de sodium* 11*- Procédé conforme à la revendication 2, dans lequel on ajoute à la couche surnageante un agent stabilisant les enzymes 4û tel que la L-asparagine, le glycérol, l'albumine ou le chlorure d» 69 10281 9 2007398 sodium* 12.- Procédé de purification du L-asparaginase à partir d'un extrait brut, qui a été obtenu à partir de cellules résultant de la culture d'un microorganisme producteur de L-asparaginase ap- 5 partenant au genre Serratia marcescens. au sein d'un milieu nutritif, le procédé comprenant le réglage du pH de l'extrait à une valeur comprise entre 3,5 et 4,5» et la dénaturation suivie de la-précipitation des protéines impures contenues dans ledit extrait. 13.- Procédé conforme à la revendication 12, dans lequel 10 on ajoute un agent stabilisant les enzymes tel que la L-asparagine, le glycérol, l'albumine ou le chlorure de sodium à la partie surnageante de l'extrait liquide précité, on purifie cette partie surnageante par adsorption sur de la carboxyméthylcellulose et on élue la L-asparaginase adsorbée, tout en maintenant le pH de la 15 fraction surnageante à 3-4,5* 14«- Procédé conforme à la revendication 13, dans lequel on soumet la solution d'enzyme résultante à une électrodialyse à un pH de 3 à 4,5, on ajuste le pH du liquide entre 8 et 11, on puri fie le liquide par adsorption sur de la diéthylaminoéthylcellulose ' 20 et on élue la L—asparaginase ainsi adsorbée. 15.- Procédé conforme à la revendication 12, qui consiste en outre à dialyser une fraction surnageante dudit extrait traité à un pH de 8 à 11 , à purifier cette fraction surnageante par adsorp tikon sur la diéthylaminôcellulose et à éluer la L-asparaginase 25 ainsi adsorbée.