FR 2012170 A1 19700313 FR 6922290 A 19690702 69 22290 1 2012170 La présente invention a pour objet un procédé de production de l'enzyme lipase, et plus particulièrement un procédé de production de lipase par fermentation, ainsi qu'un procédé permettant de la récupérer du bouillon de fermentation* 5 lia technique antérieure mentionne l'existence de nom breux micro-organisme s producteurs de lipase, tels que des; genres Aspergillus. Pénicillium, Rhizopus. Mue or, Absidia. Oandida. Torulopsis* Brettanomyces. Bacillus. Streptococcus. Pseudomonus. Clostridium* Sclerotinia, etc„.. ; toutefois on ne connait aucun 10 rapport sur la production de lipase à partir de Ohromobacterium TJn objet de la présente invention est done de fournir un procédé de production de lipase enzymatique stable et 20 activeo Un autre objet de la présente invention est de fournir un proeédé industriellement avantageux permettant de produire cette lipase en utilisant comme formateur de lipase un micro-organisjee jusqu'à présenteinconnu. 25 Oes objets et autres avantages de la présente inven tion apparaîtront dans la description qui suite Le micro-organisme décrit ci-dessus possède les propriétés taxonomiques suivantes. 30 (a) - Conditions de développement (î) — Examen microscopique taille ; 0,6 « 1,2 )i forme : bâtonnets de petite dimension mobilité : faible 35 spores : aucune sporulation. BAD ORIGINAL 69 22290 2 2012170 (2) - Caractéristiques de la colonie Surface : ronde, convexe, brillante et visqueuse Couleur : marron, jaunatre pâle • ■ 5 Pigment : non formée Milieu de l'essai : a - milieu d'agar-agar, extrait de levure et mannite b - milieu de peptone et de glucose c - milieu d'agar-agar nutritif d'- milieu d'agar-agar et extrait de pommes de terre. (3) - Conditions du développement dans plusieurs milieux 10 15 Bouillon Milieu d'agar-agar et bouillon Milieu d'agar-agar, bouillon et glucose KLlieu de gélatine Peptone et eau développement développement bon développement développement développement 20 Milieu de pommes de terre • 1 développement lait de tournesol : développement forma tion d'aoidto (b) - Propriétés physiologiques J 25 (1) - Conditions de développement maximal pïï ' : 6,5 température : 26"C Condition aérobie ou anaérobie ï aérobie 30 (2) - Conditions du développement PH : 5,5 - 9,0 ïempératuré : 5 - 37°C Conditions aérobie ou anaérobie î aérobie. 35 (3) sorte dé baetérieè'r - i - : (Iraifriiégatiyes (4) Résistance aux acides ■ ' " • ' : ~ "tiégàtâï&Jhih-L (5) Essai au rouge de méthyle ' (6;)"Réactiva; de : Voges—ïrôslcauer'^s -i^ . ^ ^ c- p;;/- (7) Formation d'indo-le 'v '•>' • BAD ORIGINAL 69 22290 3 2012170 (3) Fromation de sulfate acide négative (9) Formation d*ammoniac - (10) Réduction de nitrates - (11) Formation de eatalase 5 (12) liquéfaction de la gélatine - (13) liquéfaction de; la easéine - (14) Hydrolyse de l'amidon - (15) Utilisation de citrate - (16) Coagulation du lait -1iO (17) Réduction au tournesol - (18) Réduction au bleu da méthylène - (19) Utilisation de sel d'ammonium et d'urée 15 20 (c) - Utilisation de sources de carbone arabinose + raffinose - xylose - serbitol - glucose + inositol - matmose + glyeérol - fructose + salicine - galactose + inuline lactose - dextrine - maltose - amidon - sacoh&rose + cellulose - tréhalose + 25 En examinant la taxonomie du aâero—organisme présentant les propriétés taxonomiq.iles ci-dessus, en se référant au "Manuel d'Identification des Bactéries en medecine* par S«T, Covan et K.Jo Steel, Cambridge Univ« Press, 1965» en ce qui 30 concerne son état de bactérie Grain-négative, sai forme de bâtonnets, sa mobilité, sa condition aérobie, sa réaction positive à la formation de eatalase, sa réaction négative à l'oxidase, et la décomposition du sucre par oxydation, cette souche peut appartenir au genre Chromobactérium, 35 La comparaison des propriétés t agronomiques de ce A'hTfnBcAaa-fcftTiTiw et du type de culture appartenant au genre Chromobactérium obtenu à partir de la Collection Cultures du type Américain, confirme que cette souche productrice de lipase est la bactérie Chromobactérium viscosum» 69 22290 ♦ 2012170 le tableau suivant indique les différences de caractéristiques entre le micro-organisme de l'invention et Ghromobac-térium viscosum AIGG 6918« Souche de Ghromobaeterium ç l'invention viscosum AÎGC 6918 liquéfaction de la caséine + + Utilisation de citrate + - " d'arabinose + - " de lactose - + 10 " de raffinose - + " de sorbitol - + " de dextrine - + ïoutefois ces deux 3ouch.es se ressemblent dans de nom-15 breuses autres propriétés taxonomiques, telles que leurs propriétés aveç de nombreux milieux et leurs propriétés physiologiques et, pour des espèces différentes d© Ghromobaeterium, ces souches ne se différencient pas tellement l'une de l'autre» Cette souche productrice de lipase est appelée dans l'invention Chromobactérium 20 viscosum var8 paralipolyticum, et a été déposée à l'Institut de Recherches en Fermentation, Agence des Sciences Industriêlles et technologie, Ministère du commerce et de l'industrie international, Japon, sous le numéro;KO HAŒSU KEB KIU Kl n® 157 o la Demanderesse a également déterminé que Chromo-25 bactérium viscosum AfOC 6918 et Ghromobaeterium violaceum ÀïOC 12 472 peuvent produire une lipase enzymatique« Chromobactérium viscosum var» varali-polytieum décrit ci-dessus, est seulement donné pour illustrer les micro-organismes pouvant être utilisés dans l'invention, et la présente 30 invention comprend également l'utilisation d'autres souches productrices de lipase appartenant au genre Ghromobaeterium,» Dans le procédé de l'invention on produit la lipase en inoculant un milieu nutritif approprié avec un Ghromobaeterium producteur de lipase par exemple Ghromobaeterium viscosum var0 35 T>araliT) olytieum. les milieux nutritifs qui sont intéressants pour produire la lipase peuvent comprendre une source de carbone assimilable telle que le glucose, le lactose, le saccharose, le SAD ORlGlNAt 69 22290 5 2012170 maltose, l'amidon, soluble, l'amidon, la dextrine, les molasses, etc.». ; une source assimilable d'azote telle que la poudre de soja, la poudre de soja dégraissée, la poudre de graine de coton, la peptone, l'extrait de viande, l'extrait de levure, la 5 levure sèche en poudre, la liqueur de macération d® maïs, l'hydrolysat de caséine, l'urée, le sel d'ammonium, etc... les milieux comprennent en outre; des sels, tels que le phosphate, de magnésium, de calcium, de potassium ete.e. On peut en général ajouter au milieu d'autres sortes 10 de matières organiques ou inorganiques essentielles au développement de® micro-organismes ou à la production d* enzyme <> La demanderesse a également déterminé qu'on peut augmenter la production de lipase quand le micro-organisme producteur de lipase appartenant au genre Chromobactérium est 15 cultivé dans un milieu contenant des huiles et des graisses, la présente invention comprend donc un procédé de production de lipase dans lequel on cultive le miero-organisme producteur de lipase appartenant au genre Qhromobacterium dans un milieu contenant des huiles et des graisses, et dans lequel on isole 20 la lipase enzymatique* Les huiles et les graisses qui peuvent être ajoutées au milieu de l'invention sont les graisses et les huiles animai-lés telles que la graisse de pore, la graisse de boeuf, le beurre, l'huile de= baleine, l'huile de poisson ou une huile 25 végétale telle l'huile d'olive, l'huile de soja, l8huile de graines de coton, l'huile de sésœae, l'huile de colza, l'huile d'arachides, l'huile d® noix de coco, etc00. Ces huiles et graisses peuvent être ajoutées dans le milieu à raison de 0,5 à 5 fo environ,, Les graisses solides, telles que la graisse de 30 porc, la graisse de boeuf ou le beurre se mettent facilement en suspension dans le milieu par une stérilisation à la vapeur, et peuvent donc être utilisées par le micro-organisme producteur d« lipase. On peut cultiver le micro-organisme utilisé dans l*in~ 35 vention de plusieurs façons différentes, telles que dans une culture liquide ou une culture solide. Bu point de vue industriel, il est préférable d*opérer dans une culture aérobie immergée 9 BAD ORIGINAL 69 22290 6 2012170 Pour effectuer la culture de l'organisme en vue de produire; la lipase de l'invention, la température à laquelle on effectue la culture doit en général être comprise dans la gamme permettant le développement du micro-organisme producteur de 5 lipase et de préférence entre 24 et 28°0o La durée dans le milieu de culture, "bien que variant avec les conditions utilisées, est en général comprise entre 2 et 6 jours, et au moment où le bouillon de culture présente une production maximale de lipase, la culture doit naturellement 10 être terminée» 11 n'est pas nécessaire de contrôler le pH du milieu, qui est maintenu presque toujours constant, toutefois, il est préférable d'ajuster le pH à 6-7 au moment où l'on prépare le milieu. 151 On isole la lipase du milieu de culture par de® moyens classiques permettant de séparer et de purifier la li-« pase enzymatique» Dans le cas de culture solide, on procède pour extraire la liqueur par une extraction à l'eaai ou autre méthode analogue connue dans la technique antérieure» Dans le 20 «as d'une culture liquide, on procède de préférence par une filtration sous vide, par centrifugation ou autre méthode analogue de la technique antérieure, puis on filtre la totalité de la liqueur afin de séparer les mieelles et obtenir un filtrat» 251 On ajoute à cet extrait ©u filtrat, avec ou sans con centration, un sel soluble tel que le sel ordinaire, le sulfate d9ammonium, etc..» ou un solvant organique miscible à l'eau tel que l'éthanol, l'aeétone, et autres solvants analogues, afin de précipiter la lipase0 On peut encore sécher par pulvérisation 30 le filtrat en ajoutant un stabilisant subsidiaire tel que la dextrine de malt, le lactose, la earboxy-méthylcellulose, le polyéthylèneglycol, le lait écrémé, la caséine, le sorbitol, ete.o. On peuj/encore procéder par une lyophilisation, par une absorption sur résine échangeuse d'ions, par filtration du gel 35 et autres méthodes semblables. Ses méthodes de séparation et de purification peuvent être utilisées alternativement ou en combinaison, et on obtient ainsi de la poudre d'enzyme ayant une activité en lipase» ORIGINAL 69 22290 7 2012170 la lipase produite par le procédé de l'invention est stable et active® la poudre de lipase brute obtenue dans l'exemple 1 a donc les propriétés suivantes : Stabilité à divers pH, 20°G, pendant 24 heures : plus de 80 $> 5 restent actifs à un pH da 4,0 - 9,0 j plus de 70 $» restent actifs à pH 3 - 10» pH maximal î Actif entre pH 4»0-9,0, activité maximale à pH 6-70 10 Rapport activité à pH 6 « 100 pH 4 ** 80 pEL 9 « 80 pH 10 * 70 pH 3 » 40 15 la stabilité à la chaleur après traitement à 37-95° pendant 10 minutes : 90 ^ restent actifs à une température inférieur* à 80°Q, 60 $ à 90°Co température asximaie ; environ 50°0« lia lipase préparée par le procédé de l'invention est 20 extrêmement stable et active de sorte qu'on peut obtenir un échantillon d'enzyme brut par précipitation au moyen d'un alcool, la lipase enzymatique peut donc être utilisée dans une grande gamme d'applications telles que comme agent facilitant la digestion, agent de nettoyage, agent facilitant l'élimination des 25 eaux usées» Sans le tableau I ci—après, on compare les rapports de décomposition de la poudre de lipase brute obtenue par précipitation au moyen d'un alcool comme décrit ci-dessus» (le rapport de décomposition de l'huile d'olive est considéré comme 30 étant égal à 1,0), "1 BAD ORIGINAL 69 22290 2012170 Bableaa X (T 10 15 Substrats 20 25 Huile d'olive Huile de graines de coton Huile de sésame Huile de soja Huile d'arsttcliid© ». Huile de colza Graisse dœ pore Graisse de boeuf Beurre "ïween 60 " Méthode; - Préparation Rapport de décomposition 1,0 0,90 0,86 2,20 0,90 0,90 2,0 1,2 1,2 0,50 eau substrat poudrœ d® lipas© 24 volumes 1 volume 37,5 mg pour 1 g de substrat Incubation à pH : 7, à 30°0 pendant 10 heures. L'effet de la lipase obtenus par le procédé de la présente invention est inhibé au moyen d'ion métallique comme indiqué dans le tableau II suivant. Sableau II 30 Ion métal (10~^ go ion/1.) Fe++, Fe*4-*, K+, Sa*, Pb+*, Go++, »- ■ i » 1 I „L ,4- Mn , Sn , Sn , Ba , Ga d*inhibition 35 Zn++, Al+++, Ni++, Mg++ 10-20 io Ou*, Cu++, Hg++ > 20 Jt BAD ORIGlNAi 69 22290 9 2012170 Les exemples suivants illustrent la présente invention,, l'activité de la lipase décrite dans 1®exemples ci-après est déterminée par les méthodes de titrage suivantes : Méthode de titrage I -5 On utilise comme substrat l'huile d!olive0 (a) Mélange réactionnel ! solution de l'enzyme : 1 ml Tampon phosphate 0,1 M, pH 7,0 : 5 ml Emulsion d'huile d'olive : 10 ml0 10 On prépare l'.émulsion d'huile d'olive ci-dessus en homo généisant un mélange de 80 ml d'une solution aqueuse à 2 $ d*alcool polyvinylique et de 20 ml d'huile d'olive (Pharmacopée Japonaise), à 5-10°0 pendant 10 minutes et sous 11„000 tours/minute„ 15 (b) - Mode opératoire On effectue la réaction à 37°0 pendant 50 minutes, puis on rompt l'émulsion en ajoutant immédiatement 30 ml d'un mélange d'éthanol et d'acétone ( 1/1 ), puis on la titre avec JTaOH 0,05 ÎT, en présence de phénolphtaléine comme indicateur. 20 Gn utilise comme témoin un ensyme dénaturé ehauffé à 100°G pendant 10 minutes0 l'activité est exprimée par le nombre de ml entre les ml d'échantillon témoin et les ml titrés ei-dessus. (c'est-à-dire que 1 al * 1 unité)„ 25Méthode de titrage II - On utilise comme substrat de la graisse de porc (a) - Mélange réactionnel : solution de l'enzyme : 1 ml tampon phosphate Q,1 M, pH 7,0 : 5 ml 30 Emulsion de graisse de porc : 10 ml On prépare l'émulsion de graisse de porc décrite ci-dessus en homogénéisant un mélange de 20 g de graiss.e de porc fondue, 10 ml de "Sween 60" et 70 ml d'eau, pendant 10 minutes à HoOOO tours/minute® 35 (b) - Mode opératoire On secoue le mélange réactionnel dans un tube en forme de 1 en utilisant un agitateur M0nod, à 40°G, pendant 60 minutes, en. romptel'émulsion en ajoutant immédiatement 30 ml d'un mélange BAD ORIGINAL 69 22290 10 2012170 d'éthanol et d'acétone (1/1), puis on la titre avec BiaOH 0}05 N en présence àa phénolphtaléin© comme indicateur„ Gomme témoin, on utilise un enzyme dénaturé chauffé à 100°G pendant 10 minutes,, L'activité est exprimée par le nombre de-ml entra les ml d'é-5 chantillon témoin et les ml titrés ci-dessus (c'est-à-dire 1 ml = 1 unité)o ïïiY-CTPT.-ft 1 On introduit dans une fiole Erlenmeyer de 500 ml, 10 stérilisés à 120°0 pendant 20 fautes, 100 al d'un milieu aqueux (pH 6,5) comprenant 2 de graisse de porc, 2 fo d8amidon, 2 $ de poudre de soja dégraissés Op5 i° de sulfate d'araaoniuia, 0,2 d® IŒIgP0^j 0,5 io de CaOO^ et 0,1 fi de MgSO^.THgO, puis on l'inocule avec Qhromobaoterium. viscosum var c- par alj-p olytieum » et on agite 15 la culture pendant 4 jours à 20°0 à 300 tours/minute, On obtient 75 ml de filtrat de culture contenant 11,5 unités par ml de lipase, déterminées comme décrit dans; la méthode II ei-dessus. On ajoute dans le bouillon filtré de l1éthanol jusque ce qu'on obtienne une concentration en aleool de 75 $, ce 20 qui donne 3,43 g de poudre de lipase brute, L5activité de la poudre d8 enzyme est de 198 unités/g, déterminée eoams décrit dans la méthode II ci-dessus, Isa poudre de lipase brute ainsi obtenue révèle en outre dès trace3 d2 activité protaase, on ne décèle toutefois'aucune 25 activité alpha-amylase, béta-amylase, et lipoprotéinlipase, etc0o® TginilVTPT.TS g On proeède comme décrit dans l'exemple 1, excepté qu'on n8ajoute pas dans le milieu de graisse de porc. On obtient 30 26 g de poudre de lipase brutetitrant 15 unités/g, EXEMPLE 3 On procède comme décrit dans l'exemple 1, excepté qu'on utilise à la place de la graisse d© porc, de l'huile d'olive 35 On obtient 3,01 g de poudre de lipase brute. L'activité de la poudre d'enzyme, déterminée comme décrit dans la méthod® I ci-dessus est de 109 unités/g. BAD ORfGiMA^ 69 22290 n 2012170 Egaras «. On procède comme décrit dans l'exemple 1, excepté qu*on remplace la graisse de pore par d® l'huile de soja® On obtient 3»32 g de poudr® de lipase brute« Inactivité de cette 5poudre d*enzyme déterminée comme décrit dans la méthode I ci-dessus est dœ 100 u^i'fcés/g® •gYTgWPTÏE! 5 On introduit dans un fermenteur de 30 litres, stérili-10 sé à 120°0 pendant 30 minutes, 20 litres d'un milieu aqueux (pH 6,5)" comprenant 2 fi de graiss;e de porc, 2 fi d*amidon, 2 fi de poudre de soja dégraissée, 0,3 fi de sulfate d*ammonium, 0,2 fi de KHgPO^, 0,5 fi de CaCOj, 0,1 fi de MgS0^«7Hg0 et 5 ml d*un agent anti-mousse (Disform CA 220 ï fabriqué par la ïîippon Oils and 15 Fats Go® Ltd® Sokio). On inocule 1 litre du milieu de culture de Ohromo-bad&rium viscoaum var0 paraili-oolvticum effectuée dans le même milieu à 26*0 pendant deux jours, et on le laisse à 26"G pendant 2 jours sous une aération de 20 litres/minute7 et en agitant à 20 raison de 300 tours/minute, on obtient le bouillon de culture titrant 8,3 unités/ml de lipase. On introduit le bouillon dans 4-00 ml d*un milieu aqueux stériliaé. constitué âm même milieu que ei» dessus, dans un récipient de fermentation en acier inoxydable (on ajoute 100 ml ô'xès. agent ssti-moiisssait) et on le laisse à 25 26*0 pendant 4. jours, sous une aération de 400 l/minute, et en agitant à raison de 300 to'.irc/mlnutes c, ©22. obtient 265 litres; d® bouillon de culture après eentrifugation dans une centrifugeuse du type Sharples® L'activité du bouillon déterminée comme décrit dans 30 la méthode II ci-dessus est de 13 fO unités/ml» On concentre ensuite ee filtrat jusqu'à 125-litrea, par une concentration par injection (évaporation 25 litres/heure» température : 30°G)o On sèohe par pulvérisation le concentrât ainsi obtenu à une température d'entrée de 120*0 et une tempé-35 rature de sortie de 70°G, et on obtient 8*1 kg-de poudre de lipase brute, présentant une aetivitçéle 251 unités/gs comme déterminée par la méthode II ci-dessus® 9 BAD ORIGINAL 69 22290 12 2012170 EXEMPLE 6 On. introduit dans un fermenteur de 30 litres, 20 litres d'un milieu liquide (pH 6,5) comprenant 2 $ èe graisse de pore, 2 i» d1 amidon, 2 fa de; poudre de soja dégraissé, 0,3 $ 5 de sulfate d.1 ammonium, 0,2 $ de KHgPO^, 0,5 # CaGO^, 0,1 $ de MgSO^eîHgO et 5 ml d'un agent anti-moussant « Après stérilisation à 120°0 pendant 30 minutes, on inocule 1 litre d'une culture aqueuse de Qliromobaetérium viscosum var0 paralypoliticum fermentée pendant 2 jours à 26 °G dans le même milieu, et on la 10 laisse pendant 4 jours .à 26°G, dans des conditions d'aération de 20 litres/minute et d'agitation de 300 tours/minute0 On élimine par filtration les micelles et on obtient 14,8 litres de filtrat qui a une activité en lipase de 11,4 unités/ml, telle que déterminée par la méthode II ci-dessus 0 15 On ajoute dans le filtrat 490 g de dextrine de malt, puis on le sèche par pulvérisation à une température d:*entrée de „120°G et une température de sortie de 70°Go On obtient 927 g de poudre de lipase brute* L'activité de cette poudrœ d'enzyme est d© 126 uu.ités/g, telle que déterminée par la méthode ei-20 dessus. EXEMPLE 7 On procède comme décrit dans l'exemple 6, excepté qu'on remplace la graisse de pore par de l'huile d'olive, et 25 on obtient 15,6 litres de bouillon de, culture; titrant 5»9 unités/ ml, comme déterminé dans la méthode. I ci-dessus. On concentre le bouillon de culture en utilisant un appareil à concentrer par injections à 30°0, le taux d'évap or action est de 25 litres/heure, et on obtient 7,5 litres de eoncen-30 trat (activité en lipase % 11,0 unités/ml). On ajoute de l'étha-nol jusqu'à ce qu'on ait une concentration en alcool de 75 fi et on obtient 495 g de poudre de lipase brute„ L'activité de cette poudre d'enzyme est de 107 unités/ml, déterminée par la même méthode que ci-dessus. 35 EXEMPLE 8 On ajoute goutte à goutte de l'acétone à 80 ml des filtrats de culture; obtenus comme déerit dans l'exemple 1 (activité en lipase ï 11,0 unités/ml, titrée par la méthode II ci- BAD ORIGINAL 69 22290 13 2012170 dessus) à 5°G, jusqu'à une concentration en acétone de 30 $, afin de séparer un précipité par centrifugation à 9o000 tours/minutee On traite la partie surnageante comme décrit ai-dessus afin d'isoler le précipité en utilisant respectivement des eoncentra-5 tions en acétone de 60 # et de 80 On lave les préeipités séparés avec des concentrations en acétone de 30, 60 et 80 $, chacun avec respectivement 30, 60 et 80.$ d*acétone, et on abandonne séparément chaque solution de lavage. 10 On procède à nouveau eomme ei-dessus et on sécha sous vide les précipités» l'activité et le rendement en poudre de lipase séchée .obtenue ci-dessus sont les suivants : _ Concentrait ion en aeétone Activité en lipase (unité/g) Rendement {g) 30 15 1,03 60 60 0,70 80 1530 0,31 EXEMP1E 9 On remplace ghromobaeterium viscosum var» paralipolvti-20 eum de 1* exemple 1 par Ghromobaeterium viseosum AiEOQ 6918 ou Chroaobacterium violaeeum ATGC 12<>472 et on obtient les résultats suivants : Poudre d® lipase brute Rendement Activité fihirôHiobacterium. viscosum 38 unités/g. AÏGC 6918 1,3 g nhTomobaeterium. violaeeum. 35 unités/g. ATCC 12«472 1,5 g BAD ORIGINAL 69 22290 14 2012170 BEVSmiOAIIOUS 1o Procédé de production d'un enzyme lipase dans lequel on cultive un micro-organisme du genre Ghromobaeterium dans un milieu de culture contenant une source de carbone e-j^d*azote assimilable et dans lequel on sépare l'enzyme produit du milieu de 5 culture « 2» Procédé de production d'un enzyme lipase dans lequel on cultive un micro-organisme du genre Chromobactérium dans un milieu d® culture contenant une source de carbone, cl*azote assimilable, et des huiles et des graissass et on sépare l'enzyme du 10 milieu de culture. 3o Procédé selon la revendication 1 ou 2, dans lequel le micro-organisme est une souche telle que Chromobactérium viscosum var0 paralipolytieum KO HATSU KEN KIN Kl N° 137, Chromobactérium viscosum AÏCG 6918 et Chromobacteri tua violaeeum 15 ATCG 12o472„ . 4ffl Procédé selon la revendication 1 ou 2, dans lequel la culture du micro-organisme est effectuée à 24 - 280°C pendant 2 « 6 jours0 5s Procédé selon la revendication 1 ou 2, dans lequel 20 le milieu de ©ulture contient des quantités essentielles de sels organiques ©t inorganiques. 6o Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, dans lequel on sépare l'enzyme produit du milieu de culture en utilisant un agent de précipitation, par absorption 25 et séchage par pulvérisation» 7» Enzyme, préparé au moyen d'un procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 7, BAD ORIGINAL