FR 2003199 A1 19691107 FR 6905848 A 19690304 69 05848 2003199 1 La présente invention se rapporte à un procédé dé préparation de l'acide citrique par fermentation, procédé qui consiste à inoculer un milieu de culture contenants comme source de carbone principale, un hydrocarbure, à l'aide d'une levure du genre Candida capable d'assimiler l'hydro-5 carbure et de produire de l'acide citrique à partir de l'hydrocarbure assimilé, et à soumettre le milieu inoculé à une culture aérobie conduisant à la production d'acide citrique. Le procédé selon l'invention permet d'obtenir de l'acide citrique avec des rendements élevés à partir de sources de carbone principales consistant 10 en hydrocarbures existant dans le commerce à des prix modérés. On a déjà décrit antérieurement un procédé de préparation de l'acide citrique par fermentation dans un milieu de culture contenant comme source de carbone un hydrate de carbone, à l'aide d'une certaine souche de champignon. Mais ce type de produit, utilisable dans l'agriculture, fait 15 l'objet d'une demande importante, et son prix est soumis à de grandes variations en fonction des divers facteurs de l'économie agricole. La demanderesse a en conséquence recherché un procédé de fermentation permettant de produire de l'acide citrique en quantité dans un milieu de culture contenant des sources de carbone d'approvisionnement facile. Elle a 20 alors trouvé que certaines levures appartenant au genre Candida étaient capables de produire de l'acide citrique dans un milieu de culture contenant des hydrocarbures, de préférence une n-paraffine ou un mélange de n-paraffines de à comme source principale de carbone assimilable. Les levures qui conviennent à l'utilisation dans le procédé 25 selon l'invention sont des souches du genre Candida capables d'assimiler les hydrocarbures et de produire de l'acide citrique à partir des hydrocarbures assimilés et par exemple Candida lipolytica AJ 4541 (numéro de la Collection de Cultures des E. U. A. ATCC N° 16.617), AJ 4548 (ATCC 16.618), et Candida Tropicalis AJ 4478 (ATCC 15.114). 30 Les micro-organismes peuvent être cultivés sur des milieux de culture par ailleurs tout à fait classiques sauf l'utilisation d'hydrocarbures comme source de carbone principale. Ces milieux doivent contenir une source d'azote assimilable et les substances nutritives mineures usuelles nécessaires pour la croissance microbienne, par exemple certains ions minéraux et certains 35 agents organiques qui favorisent la croissance. Les hydrocarbures préférés sont ceux qui contiennent de 10 à 20 atomes de carbone dans une chaîne droite. La nature de la source d'azote ne constitue pas un facteur critique : on peut utiliser des sels d'ammonium comme le sulfate, le nitrate, le chlorure, le phosphate, le carbonate, de l'ammoniaque 1,0 gazeuse ou de l'urée. 69 05848 2 2003199 Des traces d'ions métalliques comme Fe*"1", Mh"1-1", Zn1"4" ou Mo' 1 1 , de vitamines et d'amino-acides améliorent les rendements. Les substances nutritives organiques mineures peuvent être introduites dans le milieu de culture sous forme de mélanges bruts, et par exemple sous forme de liqueur de 5 macération de maïs, de peptones, d'extrait de malt, d'extrait de levure ou de "Aji-eki" (produit japonais du commerce qui consiste en un hydrolysat de soya). On obtient en particulier de bons rendements par fermentation de Candida tropicalis en présence de biotine ou de dérivés de biotine comme agents organiques favorisant la croissance, en proportions de 0,1 gamma à 10 300 mg/1, de préférence de 0,1 à 1.000 gamma/litre ; par fermentation de Candida lipolytica, on obtient de Boris rendements en présence de thiamine et d'un agent organique favorisant la croissance en proportions de 5 à 1.000 gamma/liire, de préférence 50 à 500 gamma/litre. Les essais rapportes ci-après donnent des indications plus précises sur ces proportions. 15 ESSAI 1 On verse dans des flacons à secouer et on stérilise des portion? de 20 ml d'un milieu à pH 6,0 et contenant 4 7o d'un mélange de n-paraffinac du commerce (paraffines en C10-C1;L : traces ; n-paraffines en C12 : 7 %, en C13 : 24 %, en C^ : 19 %, en C15 : 39 %, en C±6 : 8 %, en C : 1 % et en 2° C18-C20 : traces), 1,5 % de (NH 4)2S04, 0,2 % de KH2P04, 0,1 % de MgSO^ . 7H20, 0,002 % de MgSQ^, 4H20, 2 % de CaCO^ et les proportions de biotine rapportées dans le tableau 1 ci-après (on a stérilisé séparément le sulfata d'ammonium, le carbonate de calcium et les n-paraffines). On inocule chacun J.»., 25 milieux par Candida tropicalis AJ 4478 (ATCC 15.114) soumise à une culture préalable de 48 h sur la gélose inclinée décrite dans l'exemple 1 ci-après et on soumet à culture aérobie sous secousses à 31,5°C pendant 3 jours. Le tableau 1 ci-après rapporte la vitesse de croissance des leva~ proportions de biotine 0 0,1 1 100 1000 croissance (D.0.) * acide c trique ^ 0,11 ' 0,58 ' 1,05 ' 1,10 ' l,î€ - : 0,7 : 2,8 : 2,4 : 0,8 - :17,5 :70,0 :60,0 :20,0 35 * croissance : densité optique du milieu de culture dilué 26 fois à la longueur d'onde de 562 mjî. Parmi les dérivés de biotine qui conviennent, on citera la desthiobiotine, le biocytine, le d-sulfoxyde de biotine, l'acide biotine disffi carboxylique, llacide 7,8-diamino-pélargonique, l'acide 7-céto-8-amino-pélsrgc {^0 que, l'acide 7-amino-8-céto-pélargonique, l'acide 7,8-dicéto-pélargonique, l'acide 7-amino-8-hydroxy-pêlargonique, l'acide pimélique et l'acide oléiçue. 69 05848 3 2003199 ESSAI 2 10 15 20 25 30 35 Dans une modification du mode opératoire de l'essai 1, on remplace respectivement les proportions de biotine rapportées dans le tableau 1 et les 1,5 7o de sulfate d'ammonium contenus dans le milieu de culture par les proportions de thiamine ou de liqueur de macération de mais rapportées dans le tableau 2 ci-après et 0,25 % de nitrate d'ammonium. On inocule des fractions de ces milieux par Candida lipolytica AJ 4541 (ATCC 16.617) et on soumet à culture aérobie comme décrit dans l'essai 1. Le tableau 2 ci-après rapporte la vitesse de croissance de la levure et les rendements en acide citrique dans les bouillons. TABLEAU 2 proportions de thiamine croissance (D0) rendement en acide citrique, % : atfm: 0,50 16,3 : 1 : 0,64 19,0 3 0,69 30,3 : 5 : 0,64 32,5 : 10 : 0,73 34,5 50 0,71 44,5 : 100 0,71 49,5 : 500 : 0,71 51,5 .1000 0,70 45,8 .(ml/dl) :0,005 : 0,67 23,3 :0,01 : 0,67 29,8 .0,02 0,68 34,0 '0,05 : 0,70 36,6 :0,1 : 0,72 39,0 .0,5 0,72 52,0 proportions de liqueur de macération de mai's Le pH du milieu de culture est maintenu neutre ou légèrement acide. Comme la corcertration en ions hydrogène du bouillon de fermentation augmente en cours de fermentation à cause des acides organiques accumulés, on peut ajouter des agents neutralisants comme le carbonate de calcium, l'ammoniaque, l'hydroxyde de potassium et l'hydroxyde de sodium en quantités suffisantes pour maintenir les conditions optimales de pH. Dans la mise en oeuvre du procédé selon l'invention, l'hydrocarbure utilisé comme source de carbone est dispersé dans le milieu de culture par ailleurs aqueux et maintenu à l'état dispersé par des moyens mécaniques, par exemple par une agitation qui assure également une aération correcte du milieu. Pour faciliter la dispersion de la phase organique on peut ajouter des surfac-tifs mais cela n'est pas indispensable. La quantité d'hydrocarbure présente dans le milieu de culture ne constitue pas un facteur critique, mais la surface 69 05848 4 2003199 libre de l'hydrocarbure dispersé est un facteur qui affecte légèrement la vitesse de fermentation. La proportion optimale d'hydrocarbure est déterminée facilement, pour un appareillage particulier de secousse ou d'agitation, par quelques essais préliminaires. On a constaté qu'une proportion de 8 /£ d'hydro-5 carbure, par rapport au poids total du milieu de culture, donnait des résultats satisfaisants dans les conditions d'agitation uniforme observées dans les exemples qui suivent ; cependant, cette concentration doit être considérée comme simplement illustrative. On peut observer des proportions plus faibles ou plus fortes d'hydrocarbures sans modifications importantes 10 des résultats obtenus. Les exemples siivants illustrent l'invention sans toutefois la limiter ; dans ces exemples, les indications de parties et de pour cent s'entendent en poids sauf indication contraire. EXEMPLE 1 15 On verse dans un flacon à secouer de 500 ml et on stérilise 20 ml d'un milieu à pH 6,0 contenant 4 % d'un mélange de n-paraffines du commerce (n-paraffines en C^-C^ : traces, en : 7 en : 24 %, en C^ : 19 %, en : 39 %, en C^ : 8 %, en C^ : 1 % et en C^g-C20 : traces), 2 % de (NH4)2S04, 0,2 % de KH2P04, 0,1 % de MgSO^ 7H20, 0,002 % de MnS04, 4^0, 20 0,03 % de liqueur de macération de maïs et 2 % de CaCO^ (le sulfate d'ammonium, les n-paraffines et le carbonate de calcium ont été stérilisés séparément). On inocule le milieu contenu dans le flacon par Candida tropicalis AJ 4478 (ATCC 15.114) soumise à une culture préalable sur la gélose inclinée décrite ci-après pendant 48 h et on soumet à culture aérobie sous secousses pendant 25 3 jours à 31,5°C. Gélose inclinée : on prépare le milieu dont le pH est réglé à 7,4 à l'aide de K0H et qui contient 0,1 % de NH^O^, 0,02 % de MgS04, 711^0, 0,15 % de KH2P04, 0,35_ 7. de Na2HP04, 0,001 % de CaCl2, 0,0005 % de FeS04, 7H20, 2,0 % de gélose et de l'eau de ville. On insère ensuite le disque de pulpe qui a été 30 macéré dans un mélange de n-paraffines de C^Q à C^q comme source de carbone dans le tube à essais contenant le milieu décrit ci-dessus. Il s'accumule 2,6 g/dl d'acide citrique dans le bouillon de culture le rendement s'élève à 65 %. Après séparation des cellules microbiennes par centrifugation, on soumet le filtrat du bouillon de culture à un traitement 35 usuel d'absorption et de désorption sur résine échangeuse d'ions, ce qui donne 1,6 g/dl de cristaux d'acide citrique. EXEMPLE 2 On place dans des flacons à secouer de 500 ml et on stérilise des portions de 20 ml d'un milieu à pH 6,0 contenant 2,5 % d'un mélange de 69 05848 5 2003199 10 15 20 25 30 n-paraffines du commerce, 0,2 % de NH^NO^, 0,2 % de KH^PO^, 0,1 % de MgSO^, 7H20, 0,02 % de FeS04, 7H20, 0,002 % de MnS04, 4H20, 0,02 7» de liqueur de macération de maïs et 2 % de CaCO^ (les n-paraffines, le nitrate d'ammonium et le carbonate de calcium ont été stérilisés séparément). Lorsqu'on inocule ces milieux de culture par Candida lipolytica AJ 4541 (ATCC 16.617) ou AJ 4548 (ATCC 16.618) et qu'on soumet à culture aérobie connue décrit dans l'exemple 1, il s'accumule dans les différents bouillons les quantités d'acide citrique indiquées dans le tableau 3 ci-après. TABLEAU 3 : acide citrique "i7dï % Candida lipolytica AJ 4541 (ATCC 16.617) : 1,2 : 48,0 Candida lipolytica AJ 4548 (ATCC 16.618) : 1,1 : 44,0 EXEMPLE 3 Dans une modification du mode opératoire de l'exemple 1, on ramène la teneur de 2 % de CaCO^ du milieu de culture à 0,5 %. On maintient le pH du milieu de culture entre 6,0 et 7,0 par addition de NaOH. Au bout de 3 jours, il s'est accumulé 2,85 g/dl d'acide citrique dans le bouillon de culture de Candida tropicalis AJ 4478 (ATCC 15.114) et le rendement s'élève à 71,3 %. EXEMPLE 4 Dans les modifications du mode opératoire de l'exemple 1, on remplace les 4 % du mélange commercial de n-paraffines par les n-paraffines individuelles contenant de 10 à 20 atomes de carbone comme source de carbone. On inocule les divers milieux de culture par Candida tropicalis AJ 4478 (ATCC 15.114) et on soumet à culture aérobie comme décrit dans l'exemple 1 j les quantités d'acide citrique accumulées dans les divers bouillons sont rapportées dans le tableau 4 ci-après. TABLEAU 4 nombre d'atomes de carbone de la n-paraffine : acide g/dl citrique : % 10 1,82 45,5 11 : 1,60 : 40,0 12 : 2,05 : 50,1 13 2,00 50,0 14 : 2,31 : 57,8 15 : 2,03 : 50,1 16 2,50 62,5 17 : 2,63 : 65,8 18 : 2,56 : . 64,0 19 2,78 69,5 . 20 2,00 : 50,0 35 69 05848 6 2003199 EXEMPLE 5 On prépare des milieux contenant 5 % du mélange de n-paraffines du commerce, 0,25 % de NH4N03, 0,2 7= de KH2P04, 0,1 % de MgS04, 7H20, 0,02 % de FeSO^, 7^0, 0,002 % de MnSO^, 4H20, 200 gamma/l dé chlorhydrate de thiamine 5 et 2 % de CaCO^. On inocule ces milieux par Candida lipolytica AJ 4541 (ATCC 16.617) et AJ 4548 (ATCC 16.618) et on soumet à culture aérobie comme décrit dans l'exemple 1 ; les quantités d'acide citrique accumulées dans les dein: bouillons et de cristaux obtenus à partir dés bouillons sont rapportées dans le tableau 5 ci-après. 10 TABLEAU 5 acide citrique micro-organismes . ' """âccûmûïl"""""" : iépâïé"i5ûi"f8r£r" : (g/dl) (a) :de cristaux (g/cLU Candida lipolytica AJ 4541 : 3,86 : 77,2 : 2,23 15 Candida lipolytica AJ 4548 : 3,62 : 72,5 : 2,15 EXEMPLE 6 Dans une modification du mode opératoire de l'exemple 5, on remplace les 200 gamma/1 de chlorhydrate de thiamine par 0,5 °L de liqueur de macération de maîs. Il s'accumule 3,92 g/dl d'acide citrique dans le 20 bouillon de culture de Candida lipolytica AJ 4541 (ATCC 16.617) et le rendement s'élève à 78,5 %. EXEMPLE 7 Dans une modification du mode opératoire de l'exemple 5, on remplace les 200 gamma/l de chlorhydrate de thiamine du milieu par 0,1 % 25 d'extrait de levure. Il s'accumule 3,55 g/dl d'acide citrique dans le bouillon de culture de Candida lipolytica AJ 4548 (ATCC 16.618) et le rendement s'élève à 71 %. 69 05848 7 2003199 REVENDICATIONS 1. Un procédé de préparation de l'acide citrique par fermentation, procédé qui consiste à inoculer un milieu de culture contenant une source d'azote assimilable, les substances nutritives mineures nécessaires, et au 5 moins un hydrocarbure comme source de carbone principale, à l'aide d'un microorganisme du genre Candida capable d'assimiler cet hydrocarbure et de produire de l'acide citrique à partir de lhydrocarbure assimilé, et on soumet le milieu inoculé à culture aérobie jusqu'à production d'acide citrique. 2. Un procédé selon la revendication 1, dans lequel l'hydrocarbure 10 est une paraffine à chaîne droite contenant de 10 à 20 atomes de carbone. 3. Un procédé selon la revendication 1, dans lequel les substances nutritives mineures comprennent des traces de thiamine, de biotine, ou de dérivés de biotine, suffisantes pour augmenter le rendement en acide citrique. 4. Un procédé selon la revendication 1, dans lequel le micro-organisme 15 est Candida lipolytica AJ 4541 (ATCC 16.617), AJ 4548 (ATCC 16.618) ou Candida tropicalis AJ 4478 (ATCC 15.114). 5. Un procédé selon la revendication 4, dans lequel on isole l'acide citrique à partir du bouillon de culture.