FR 2001558 A1 19690926 FR 6902863 A 19690207 69 U2863 -1- 20u 'i 558 La présente invention se rapporte à un appareil et à un procédé pour séparer des macromolécules à partir de compositions liquides. On a mis au point en biochimie de nombreuses méthodes 5 d'analyse dans lesquelles il faut retirer les protéines d'échantillons liquides afin d'obtenir un échantillon à plus grande concentration en protéines, que l'on peut analyser efficacement, ou d'obtenir un filtrat plus débarrassé de protéines pour l'analyser, ou encore pour étudier les caractéristiques d'union aux 10 protéines de divers produits chimiques en combinaison avec divers échantillons de protéines. On a également mis au point toute une série d'autres méthodes d'analyse, non seulement des protéines mais des éléments macromoléculaires en général, dans lesquels il faut retirer de l'échantillon un composant macromolécu-15 laire. Les techniques opérationnelles applicables pour effectuer ces séparations dépendent bien entendu de la possibilité de disposer de dispositifs d'analyse appropriés. La plupart de ces séparations impliquent des techniques telles que la distillation 20 sous vide, la séparation par dialyse ou par chromatographie. Plus récemment, la création de membranes anisotropes, c'est-à-dire comportant une couche barrière extrêmement mince à pores microscopiques et une couche de support relativement épaisse à gros pores a donné un outil amélioré pour effectuer des sépara-25 tions par ultrafiltration. Leur utilité spéciale est diie largement à la combinaison de leur caractéristique extrêmement élevée de refus d'espèces particulières avec leur forte capacité de transport de masse. L'ultrafiltration est un procédé de sépars.tion grâce au-50 quel une solution contenant un soluté dont les molécules sont nettement plus grosses que celles du solvant dans lequel il est dissous est débarrassée de ce soluté par application d'une pression telle que le solvant soit contraint de traverser une membrane. Le terme "ultrafiltration" est celui qui est utilisé de 55 préférence pour désigner ces séparations activées par la pression dans des solutions dont le soluté a un poids moléculaire égal ou supérieur à environ 500 : on l'utilise aussi convenablement pour des procédés dans lesquels sont traitées, non des molécules dissoutes, mais des particules colloïdales. L'avantage BAD ORIGINAL 69 U2863 -2- 2001558 particulier de ces procédés de séparation par ultrafiltration au moyen de membranes réside dans leur rapidité, leur simplicité d'application et leur faible prix de revient par rapport à d'autres procédés de séparation tels que 1'évaporation, la dia-5 lyse, l'ultracentrifugation, la précipitation chimique, etc. Ces avantages - deviennent particulièrement importants lorsqu'on a à traiter des produits instables à la chaleur ou biologique-ment actifs, ou lorsqu'il existe un volume relativement grand de solvant dans la solution à traiter» 10 Cependant, on a constaté que les pores des membranes aniso- tropes sont si petits que leur utilisation a jusqu'à présent été limitée à des appareils assez gros pour qu'on puisse y monter un appareil agitateur. Cet appareil est nécessaire pour diminuer les phénomènes de polarisation par concentration normalement as-"15 sociés à l'utilisation de ces membranes. En variante, des traitements sous forte pression et fort débit permettent d'obtenir un excellent rendement des membranes anisotropes. Cependant, l'équipement relativement volumineux nécessaire pour exécuter ce genre de traitement ne convient pas pour la plupart des méthodes 20 d'analyse de laboratoire par lots successifs. Les inventeurs ont découvert un ensemble à membrane bon marché, pouvant être utilisé avec les appareils de laboratoire classiques et convenant aux analyses qui impliquent la séparation de macromolécules à partir de compositions liquides. 25 Ils ont aussi découvert un ensemble à membrane qui se net toie automatiquement en service, ce qui diminue les difficultés dues à la polarisation par concentration, qui convient à l'utilisation dans ces centrifugeuses et qui comporte une grande chambre pour x'ecueillir les produits solides sans boucher exces-50 sivement la surface efficace de séparation de la membrane. L'invention a pour but de fournir un dispositif destiné à séparer des macromolécules à partir de compositions liquides lorsqu'une force est appliquée à la composition pour faire passer le liquide à travers la membrane, ce dispositif comprenant 35 'une membrane anisotrope capable de laisser passer le liquide tout en arrêtant les macromolécules, et un support perforé pour cette membrane, et étant caractérisé par.le fait que la membrane et son support sont réalisés de façon à être montés de sorte que la surface de la membrane fasse un petit angle avec le sens ^AD ORlGINAt 69 02863 -3- 2001558 d'application de la force.Elle a également pour but de fournir un procédé pour séparer des macromolécules d'une composition liquide, dans lequel on applique à cette composition une force qui refoule le liquide à travers une membrane anisotrope retenant les 5 macromolécules,caractérisé par le fait que l'on maintient la surface de la membrane légèrement inclinée par rapport au sens d'application de la force. L'ensemble est utilisable avec les centrifugeuses classiques et comprend une membrane anisotrope associée à un support perfo-10 ré ou à gros pores,cette membrane étant disposée par rapport à l'ensemble de manière que la force qui rend la filtration possible tende également à maintenir nette la surface de la membrane en supprimant l'inconvénient créé par le fait que les pores extrêmement petits de la membrane seraient colmatés par les matiè-15 res solides ou les boues de l'échantillon soumis à la filtration. A cet effet,les surfaces filtrantes de la membrane tournées vers le haut font un angle relativement aigu avec le vecteur de la force centrifuge,avantageusement un angle inférieur à environ 22°30,et plus avantageusement inférieur à environ 15°.Cet angle 20 aigu donne un moyen d'assurer qu'une plus grande partie du vecteur de la force centrifuge est orientée vers le bas suivant la surface de la membrane.Oes forces font que la boue et les macromolécules ,qui sans cela tendraient à colmater la surface de la membrane en y adhérant,ne peuvent glisser vers le bas en contact 25 intime avec la surface à pores microscopiques qui touche la paroi de 1'appareil,ce qui assure un nettoyage continu pendant l'utilisation de l'ensemble. Dans un but de commodité,on désignera par la suite les supports ajourés et à gros pores par le terme générique de "supports perforés". 30 Les membranes utilisables dans le dispositif selon l'invention sont les membranes très anisotropes,à pores submicroscopiques, en polymères ayant une bonne intégrité mécanique,très avantageusement les polymères thermoplastiques cristallins et/ou vitreux connus.Ils sont décrits plus complètement dans la deman- 35 cLe 69 02863 2n01558 pour les membranes, l'on peut laisser sécher pendant leur stockage sans qu'ils perdent leurs caractéristiques bénéfiques de structure et de traitement. Ces polymères sont ceux dont la capacité d'absorption de l'humidité est inférieure à environ 10 %' 5 en poids à 25°C et 100 %'d'humidité relative. Ces membranes sont particulièrement avantageuses parce que, contrairement aux membranes anisotropes connues, elles peuvent être conservées en atmosphère relativement sèch©; elles n'ont pas besoin d'être expédiées, ni conservées dans l'eau entre leurs périodes d'utilisa-10 tion. Parmi ces polymères se trouvent le polymère modacrylique (c'est-à-dire à chaîne longue et comprenant en poids 35 à 65 pou. cent d'acrylonitryle) vendu par la Société Union Carbide Corpora tion sous le nom commercial de Dynel, les polycarbonates tels que celui vendu sous la marque Lexan, le chlorure de polyvinyle, 15 etc.... Les membranes anisotropes à pores submicroscopiques utilisables dans la mise en application de l'invention consistent en une pellicule d'épaisseur macroscopique en polymère poreux ayant généralement une épaisseur comprise entre 0,05 et 1,25 mm- L'une 20 des surfaces de cette pellicule est une couche barrière d'"épi-derme" excessivement mince niais relativement dense d'une épaisseur d'environ 0,1 à 5 microns, d'un polymère microporeux dont le diamètre moyen des pores est de l'ordre du millimicron, par exemple de 1 à 500 millimicrons, soit environ un dixième à un 25 centième de l'épaisseur de 1'épiderme. Le reste de la pellicule est une couche de support composée d'un polymèr-e à pores beaucoup plus gros, que le fluide peut traverser avec une faible résistance hydraulique. Lorsqu'on utilise une membrane de ce genre comme "filtre moléculaire", "l'épiderme" en contact avec le flui 30 de sous pression, pratiquement toute la résistance au passage du fluide dans cette membrane s'exerce dans son épiderme et les molécules ou particules dont les dimensions sont supérieures à celles des pores de cet épiderme sont retenues sélectivement. Du fait que l'épiderme est aussi extraordinairement mince, la résis 35 tance hydraulique totale au passage du fluide dans-la membrane est très faible, c'est-à-dire que la membrane présente une perméabilité surprenante aux fluides. De plus, on a constaté que leur tendance à être colmatées ou bouchées par les molécules ou particules est extrêmement faible si l'on prend des mesures 69 02863 -5- 2001558 suffissonment efficaces pour empêcher les matières de s'accumuler sur leur surface. Il faut distinguer ces membranes anisotropes des membranes isotropes, dites, parfois "Homogènes", qui sont analogues aux 5 filtres classiques, les tentatives faites pour donner à ces membranes isotropes la grande capacité d'arrêt désirée augmentent leur résistance hydraulique au point qu'elles sont pratiquement inutilisables comme éléments filtrants. Il faut aussi faire une distinction entre les membranes anisotropes du genre utilisable 10 avec le dispositif selon l'invention et les filtres diffusants où la diffusion moléculaire a lieu sous l'effet d'un gradient de concentration ou d'activité. Ces membranes diffusantes - dont certaines peuvent présenter des caractéristiques anisotropes de passage - n'ont pratiquement pas de pores et ne conviennent pas 15 pour obtenir de grands débits. Les membranes connues en acétate de cellulose qui sont souvent utilisées pour dessaler l'eau sont des exemples de ces membranes diffusantes. D'autres caractéristiques et avantages de la présente invention ressortiront de la description qui va suivre, faite en 20 regard des dessins annexés et donnant à titre explicatif, mais nullement limitatif, plusieurs formes de réalisation conformes à 11 invention. Sur ces dessins : - la figure 1 est une vue schématique en élévation et en 25 coupe d'un ensemble membrane-support selon l'invention ; - la figure 2 est une vue en plan de l'ensemble de la figure 1 ; - la figure 3 est une vue en perspective cavalière d'une membrane amovible utilisée dans l'ensemble de la figure 1 ; 30 - la figure 4 est une vue schématique en élévation et en coupe d'un deuxième ensemble membrane-support selon l'invention dans lequel la membrane adhère à un support poreux ; - la figure 5 est une vue latérale d'un ensemble membrane-support selon l'invention dans lequel le liquide filtré est reçu 35 dans un tube central ; - la figure 6 est une vue schématique en coupe d'une membrane anisotrope utilisable dans le dispositif dfultrafiltration selon l'invention ; - la figure 7 est une vue en coupe d'un cône de support 40. ajouré conforme à l'invention ; et : 69 02863 -6- 2001558 - la figure 8 représente un autre support destiné à porter une membrane conique en formant un ensemble selon l'invention,, On voit en se reportant à la figure 1 qu'un ensemble 12 à insérer dans un tube de centrifugation comprend un ensemble fil-5 trant à col 14 qui constitue un moyen pour maintenir l'ensemble 12 en place dans le tube et"qui comporte plusieurs rebords concentriques 16 et 18. Cette multiplicité des rebords donne un moyen de permettre au dispositif 12 de s'adapter à des tubes de diverses dimensions, le rebord 16 constituant -on moyen de sup-10 port de ce dispositif dans de gros tubes et le rebord 18 un moyen de support dans des tubes plus étroits. Une paroi conique de support 20 très poreuse, en polyéthy-lène à liaute densité fritté, conformée au récipient 21 et faisant partie intégrante du col 14 soutient une membrane anisotro-15 pe 22. Celle-ci, que l'on voit en particulier sur les figures 3 et 6, est en une pellicule modacrylique ainsi qu'on le décrira plus complètement plus loin et se compose d'une couche superficielle 24 extrêmement mince et dense et d'une couche de support 26 plus épaisse à gros pores (figure 6). Elle est constituée 20 convenablement par une feuille triangulaire qui a été façonnée en forme de cône 28 (figure 3) grâce à une jonction par recouvrement 30 scellée à chaud. On a constaté qu'en service la force centrifuge maintient ce cône 28 en contact étroit avec la paroi 20. 25 Dans un but explicatif, il est commode pour décrire l'in vention de se référer à une ligne perpendiculaire imaginaire passant par le milieu du récipient poreux 21 et constituant son axe principal 29» Lorsqu'on utilise des parois de support tournées vers le haut telles que la paroi 20, il est très avantageux 30 que l'angle formé entre elle et cet axe 29 ne soit pas supérieur à environ 22,5 degrés. Cet angle assure qu'une plus grande composante de la force centrifuge qui agit sur la membrane tend à balayer continuellement la matière retenue jusqu'au fond du récipient 21, ce qui maintient la surface de la membrane 22 nette de 35 contaminants réduisant le passage du liquide. La figure 4 représente une autre forme de réalisation de l'invention. Dans cette forme, une membrane anisotrope 22a, qui est essentiellement du même genre que celle utilisée sur la figure 1-, est conformée de -façon à adhérer à la paroi 20a en poly- 69 02863 -7- 2001558 oléfine poreuse frittée de l'ensemble 12a. Cette polyoléfine est un polyéthylène à haute densité d'une épaisseur d'environ 0,7 mm vendue par le service Atlas Minerais and Chemical Division de la Société Electric Storage Battery Company sous la mar-5 que Vyon. Cet ensemble 12a à membrane 22a adhérente est utilisable particulièrement dans les applications où la membrane peut être lavée et utilisée plusieurs fois. Ici le colmatage des pores de la membrane sur la paroi 20a est complètement évité parce que 10 la plus grande partie de la surface 31 tournée vers le bas de cette membrane est protégée de l'impact des particules sous 1'accélération de la pesanteur créée dans la centrifugation. De plus, la partie relativement plus grande 32 recevant les boues de l'appareil décrit sur la figure 4 convient particulièrement 15 bien pour les séparations effectuées sur des compositions liquides qui comprennent une grande quantité de matières solides. Ces matières sont recueillies dans cette partie 32 sans boucher excessivement la surface utile de la membrane. Dans cette forme de réalisation, le fond 33 peut être recouvert par la membrane ou 20 rendu étanche par un revêtement non poreux 34 comme le montre la figure-4. La figure 5 représente encore un autre ensemble à membrane 35 conforme à l'invention, où la membrane anisotrope 22b est montée sur la paroi extérieure d'un tube récepteur poreux 37 25 disposé au milieu. Ce tube est monté dans un support 39. eu mousse thermoplastique façonnée à la configuration du tube de centrifugation en verre 40. En service, le filtrat 42 est recueilli à l'intérieur du tube 37 tandis que la boue 44 est recueillie autour de son périmètre extérieur. 30 On voit sur la figure 7 Q.ue le cône 50 de support de la membrane peut être formé d'une paroi non poreuse 52 percée d'assez de trous 54 pour fournir des passages appropriés de 1®. composition vers cette membrane. De tels cônes ajourés 50 donnent un débit suffisant pour certains buts, mais il est souvent 35 désirable d'interposer entre eux et la membrane qu'ils contiennent une surface irrégulière, par exemple légèrement ondulée, afin d'empêcher la face aval de la membrane, qui est appliquée étroitement contre eux, d'être aveuglée. Sur la figure 8, le support 60 est conformé de telle sorte 69 02863 -8- 2001558 que le rebord 62 d'un cône 63 de plus grand diamètre coopère avec un tube centrifuge 64 en maintenant ce cône vertical. Des nervures 68 faisant partie intégrante du cône et réparties sur ses cotés ont pour rôle de fournir un passage au fluide filtré. 5 A sa partie inférieure, un orifice 70 fournit un moyen permettant de faire passer le filtrat dans le fond du tube 64- qui constitue une chambre convenable de conservation et de traitement de l'échantillon de matière filtrée. La membrane utilisée dans les formes de réalisation a été 10 formée de la manière suivante : On a préparé une solution comprenant 240 grammes de chlorure de zinc et 3300 grammes de diméthylformamide. On l'a préparée par agitation à environ 20°C. Après repos pendant 16 heures, on en a prélevé environ 3*8 litres et on les a traités au moyen de 15 70 gouttes d'acide chloxhydrique aqueux à une concentration de 37 %• On a ajouté cet acide goutte à goutte jusqu'à ce que le trouble de la solution non traitée se soit dissipé. On a utilisé 850 grammes de la solution obtenue pour dissoudre 114,8 grammes d'une résine modacrylique fibreuse vendue 20 par la Société Union Carbide Corporation sous la marque Dynel type 130. La solution résineuse obtenue avait une viscosité de 320 centipoises à 25°C et une teneur en matières solides de 11,9 % '■ On en a introduit une certaine quantité dans un tube de 25 centrifugation de 100 millilitres et on l'a centrifugée pendant 30 minutes dans une centrifugeuse de laboratoire (le modèle CH. vendu par la Société Internation Equipment Co). On a fixé des bandes de Téflon sur les quatre côtés d'une plaque de verre et l'on a.utilisé une lame racleuse pour coucher 30 une pellicule de la solution de résine centrifugée. L'épaisseur totale de cette pellicule étant d'environ 0,25 à 0,28 millimètres. Après avoir attendu environ une minute pour permettre aux imperfections de la surface de disparaître, on a plongé la pellicule dans un bain d'eau courante à environ 23°C pendant une 35 minute. Puis on a retiré la pellicule de la plaque de verre et on l'a essayée. On a constaté que la membrane, d*un diamètre d'à peu près 75 Miij laisseitjpasser à peu près 3 cm^ d'eau en 30 secondes sous une pression d'environ 3»85 kg/cnr. On a constaté qu'elle refu 69 02863 -9- 2001558 sait 100 % des protéines d'un échantillon de sang et d'un échantillon d'urine centrifugés pendant 15 minutes dans une centrifugeuse médicale. Ces essais ont été faits dans le dispositif représenté sur les figures 1 et 3» Après utilisation, on l'a reti-5 rée, lavée et réutilisée plusieurs fois sans diminution discernable de son efficacité. Pour obtenir la membrane conique représentée sur la figure 3} on l'a simplement découpée en triangle et soudée à chaud pendant 2 secondes avec une pince de thermosoudage classique de la-10 boratoire vendue sous le nom de Quick-Seal Ty-210. Il faut veiller à former un cône ayant l'angle convenant pour s'ajuster étroitement contre la paroi de support en poly-éthylène fritté à gros pores, afin que la force centrifuge ne le déchire pas. 15 Bien que la figure -8 montre une paroi à nervures droites, on a constaté que des parois à nervures irrégulières telles que celles à texture repoussée imitant le cuir sont également très satisfaisantes pour assurer un bon passage du liquide entre la paroi du cône et la membrane. 20 Dans nombre des applications dans lesquelles on utilise le dispositif selon l'invention, il est désirable qu'une certaine quantité minTirm-m du liquide y soit retenue. Une manière simple d'obtenir ce résultat est de faire remonter la pointe non perforée d'un cône tel que le cône 63 en 1'arrêtant à une hauteur 25 égale à la hauteur de liquide que l'on désire retenir. On peut obtenir le même résultat avec un cône perforé tel que le cône 63' en ménageant une partie non perforée à sa pointe, cette partie se prolongeant jusqu'à la hauteur de liquide que l'on désire retenir. 30 Bien que l'invention ait été largement décrite en relation avec les propriétés particulières de la force centrifuge dans les traitements par ultrafiltration du genre considéré, on comprendra que le dispositif selon l'invention est aussi utilisable si l'on se sert d'une force pneumatique ou autre pour faire passer le 35 liquide à travers la membrane. Il va de soi que la présente invention n1a été décrite ci-dessus qu'à titre explicatif mais nullement limitatif et que l'on pourra y apporter toutes variantes sans sortir de son cadre. 69 02863 -10- 2001558 EEYEroiOATIONS; 1. Appareil pour séparer des macromolécules à partir de compositions liquides lorsqu'une force est appliquée à ce liquide pour lui faire traverser -une membrane, comprenant une membra- 5 ne anisotrope capable de laisser passer le liquide tout en retenant les macromolécules et un support perforé pour cette membrane, caractérisé par le fait que cette membrane et ce support sont disposés de façon à être montés de sorte que la surface de la membrane fasse un petit angle avec le sens d'application de la 10 force. 2. Appareil selon la Revendication 1, caractérisé par le fait que l'angle est inférieur à 22,5 degrés. 3- Appareil selon les Revendications 1 ou 2, caractérisé par le fait que la force est la force centrifuge. 15 4. Appareil selon l'une quelconque des Revendications pré cédentes, caractérisé par le fait que la membrane est montée sur le support de façon amovible. 5« Appareil selon l'une quelconque des Revendications 1 à 3, caractérisé par le fait que la membrane adlière au support. • 20 6. Appareil selon l'une quelconque des Revendications pré cédentes, caractérisé par le fait que la membrane et le support sont coniques. 7» Procédé pour séparer des macromolécules à partir d'une composition liquide, dans lequel on applique à la composition 25 une force qui fait refouler le liquide à travers une membrane anisotrope retenant les macromolécules, caractérisé par le fait que l'on maintient la surface de la membrane légèrement inclinée par rapport au sens d'application de la force. 8» Procédé selon la Revendication 7j caractérisé par le 30' fait que la force est la force centrifuge.