FR 2001336 A1 19690926 FR 6902432 A 19690204 69 02432 -i 200133b La présente invention concerne la stabilisation d'enzymes par couplage des enzymes à un support inorganique contenant des groupements silanols réactifs par l'intermédiaire de liaisons hydrogène et de liaisons amine-silicate de façon que l'enzyme de-5 vienne insoluble et puisse être utilisé et réutilisé pendant un laps de temps prolongé. Un enzyme est un catalyseur 'biologique capable d'amorcer, • de promouvoir et de diriger une réaction chimique sans être consommé dans l'opération ou devenir une partie du produit formé. 10 C'est une substance protéinique dont la synthèse est effectuée par des plantes, des animaux et des micro-organismes. Tous les enzymes isolés jusqu'ici se sont révélés être des protéines, c'est-à-dire des polymères peptides d'amino-acides. Un enzyme peut contenir des groupements prosthétiques comme le dinu-15 cléotide de la flavine-adénine, la porphyrine, le nucléotide de la diphosphopyridine, etc. Certains enzymes exigent des ions de métaux comme Mg++ ou Kn++ pour leur activité. Les enzymes sont des macromolécules ayant généralement une masse moléculaire de plus de 6 000. Le point isoélectrique des enzymes, la valeur du pH à 20 laquelle la charge nette sur la surface des molécules est nulle, est compris entre un peu moins de 1,0 et 11,0. A cette concentration ou au voisinage de cette concentration des ions hydrogène,. les enzymes étant des protéines ont habituellement tendance à coaguler. 25 La spécificité des enzymes et leur capacité de catalyser des réactions de matières à de basses concentrations ont été particulièrement intéressantes dans l'analyse chimique, Des réactions catalysées par des enzymes ont été utilisées pendant quelque temps pour la détermination de n&iières, d'activateurs, d'inhibi-30 teurs et aussi des enzymes eux-mêmes. Jusqu'à une époque récente, les inconvénients résultant de l'utilisation d'enzymes ont sérieusement limité leur utilité. Les objections à l'utilisation d'enzymes ont été leur instabilité, leur manque de disponibilité, leur précision médiocre et le travail nécessaire pour effectuer 35 les analyses. De plus, le coût de l'utilisation de grandes quantités d'enzymes dans la chimie analytique, spécialement dans l'analyse courante, a été un problème particulièrement difficile. Des tentatives ont été effectuées pour préparer des enzymes sous une forme immobilisée sans perte d'activité de façon qu'un 40 échantillon puisse être utilisé d'une manière continue pendant de 69 02432 2 2001336 nombreuses heures. L'enzyme immobilisé est utilisé de la même manière que les enzymes solubles, c'est-à-dire pour déterminer la concentration d'une matière à l'étude sur laquelle l'enzyme agit, d'un inhibiteur qui inactive 1'-enzyme ou d'un activateur qui pro-5 voque une accélération de l'activité de l'enzyme. Des enzymes ont été diazotés sur des particules de cellulose et des perles de po-lyaminostyrène. Des tentatives ont été effectuées pour fixer physiquement les enzymes par adsorption, absorption ou échange d'ions. Des enzymes ont été aussi immobilisés sur des polypeptides de po-10 lytyrosyle, sur des matrices de collodion et enfermés dans des microcapsules semi-perméables formées de polymères synthétiques. Les supports utilisés antérieurement pour immobiliser les enzymes étaient tous des matières organiques, spécialement des polymères organiques. Le principal inconvénient de l'utilisation 15 de matières organiques est qu'elles sont sensibles à l'attaque microbienne comme conséquence de la présence d'atomes de carbone dans la chaîne du polymère, de sorte que le support est décomposé et l'enzyme solubilisé. De plus, le mécanisme de couplage se fait au moyen d'une liaison diazoïque par l'intermédiaire d'un groupe-20 ment de couplage, de sorte que les molécules d'enzyme sont fixées sur le support seulement à divers points distaux le long de la chaîne dé l'enzyme. Quand on les met en solution aqueuse, les molécules peuvent se déployer, dénaturant la protéine, avec pour conséquence une perte d'activité de l'enzyme. 25 D'une façon très surprenante, on a découvert un procédé pour stabiliser les enzymes en fixant l'enzyme sur un support inorganique qui est sensiblement à l'abri de l'attaque par les organisa mes microbiens et grâce auquel l'enzyme est solidement lié au support le long de la chaîne. En utilisant ces supports très sta-50 bles, on peut préparer des enzymes qui peuvent être utilisés et réutilisés pendant des laps de temps prolongés sans perte d'activité de l'enzyme. Il est ainsi possible de régler l'activité de l'enzyme et d'avoir une certaine certitude que lors de la réutilisation, son niveau d'activité sera à peu près constant. Ces ea-55 zymes stabilisés trouvent une utilisation considérable .dans les techniques analytiques, et on peut les utiliser, aussi dans la préparation de produits chimiques, dé produits pharmaceutiques et de denrées alimentaires. ' ' Selon la présente invention, on a découvert une composition 40 d'enzyme stabilisée insoluble comprenant un enzyme et un support 69 02432 •5 2001336 inorganique ayant une grande surface spécifique et des groupements silanols réactifs de façon que l'enzyme soit combiné avec le support à la fois par des liaisons hydrogène et des liaisons amine-silicate, On a trouvé aussi un procédé pour combiner l'en-5 zyme au support inorganique. Les enzymes qui peuvent être stabilisés comme décrit ici comprennent une grande variété d'enzymes que l'on peut classer en trois catégories générales : les enzymes hydrolytiques, les enzymes redox et les enzymes transférases. Le premier groupe,, les en-10 zymes hydrolytiques, comprend les enzymes protéolytiques qui hydrolyse nt les protéines, par exemple la papaïne, la ficine, la pepsine, la trypsine,'la chymotrypsine, la broméline» la Jsérati-nase; des carbohydrases qui hydrolysent les carbohydrates, par exemple la cellulase, l'amyJLase, la maltase, la pectinase, la "15 chitinase; des estérase^qui hydrolysent les esters, par exemple la lipase, la cholinestérase, la lécithinase, la phosphatase; des nucléases qui hydrolysent l'acide nucléique, par exemple la ribo-nucléase, la désoxyribonucléase; et des amidases qui hydrolysent les aminés, par exemple l'arginase, 1'aspariginase, la glutamina-20 se et l'uréase. Le deuxième groupe est celui des enzymes redox. qui catalysent les réactions d'oxydation ou de réduction. Elles comprennent la glucose-oxydase, la catalase, la peroxydase, la lipoxydase et les cytochromes. Dans le troisième groupe, se trouvent les enzymes "transférases" qui transfèrent des groupements 25 d'une molécule à une autre. Des exemples en sont la transaminase glutamique-pyrurique, la transaminase glutamique-oxalacétique, la transméthylase, la transphorylase phosphopyruvique. L'élément le plus significatif de la présente invention est que les supports sont des matières inorganiques contenant des 30 groupements silanols réactifs. Ces matières doivent avoir une grande surface spécifique et être insolubles dans l'eau. Par exemple dans"des supports en matière céramique, la quantité d'enzyme stabilisée sur la surface du support est fonction de la masse moléculaire de l'enzyme et fonction du diamètre des pores ainsi 35 que de la surface spécifique du support. Comme approximation grossière, le diamètre des pores doit être au moins égal ou supérieur à la racine carrée de la masse moléculaire de l'enzyme, et en général la surface spécifique doit être supérieure à environ O 0,1 m /g. En ce qui concerne les compositions chimiques, le sup-40 port en matière céramique doit contenir des groupements silanols 6° 02432 2001336 4- réactifs capables de former des liaisons ioniques avec les groupements aminés de la molécule d'enzyme. Le support préféré est le verre poreux soit sous la forme de particules soit sous la forme d'un élément d'une seule pièce comme un disque ou un cylindre. 5 Le verre présente l'avantage qu'il est dimensionnellement stable et qu'il peut être nettoyé à fond pour élimination des impuretés, par exemple par stérilisation. Un verre poreux utile comme support est facilement disponible et vendu dans le commerce par la firme Corning Glass Works sous la désignation Code 7930 Porous 10 Yycor Glass. Ce verre poreux peut être préparé avec diverses dimensions de pores comme décrit dans le brevet des Etats-Unis d'Amérique ÏT° 2.106.774 et dans le brevet français ÏT° 1.554,990. D'autres supports inorganiques à grande surface spécifique contenant des groupements silanols réactifs qui peuvent être également 15 utilisés comprennent la silice colloïdale disponible dans le commerce sous la désignation "Cab-O-Sil", la wollastonite qui est un silicate de calcium naturel, le gel de silice sec et les matières du même genre. La fixation de l'enzyme sur le support est une réaction à un 20 seul temps qui n'utilise pas d'agent de couplage. Cette réaction fait intervenir des liaisons hydrogène et des liaisons ioniques au moyen du groupement aminé de l'enzyme et du groupement silanol du support en matière céramique. Plus particulièrement, la liaison hydrogène peut se produire grâce aux groupements fonctionnels 25 de l'enzyme, par exemple des groupements carbonyle, amide, sul-fhydryle et hydroxyle; tandis que la liaison ionique est une liaison amine-silicate aux aminés terminales ou résiduelles de l'enzyme. Pour éviter uhe perte d'activité de l'enzyme, il doit y avoir une absence à peu près complète de liaisons aux emplace-30 ments actifs sur la molécule de l'enzyme. Brièvement, dans le procédé de la présente invention, la poudre d'enzyme est dissoute dans une solution tampon et essayée. L'enzyme est ensuite fixé sur un support en matière céramique réactive à surface prétraitée, généralement au-dessous de la tem-35 pérature ambiante. Lrenzyme en excès est éliminé et 1!enzyme fixé est rincé à l'eau distillée et à l'aide de la solution tampon. Ensuite, le support portant l'enzyme fixé est lessivé et essayé, jusqu'à ce qu'on obtienne une valeur stabilisée, et finalement l'enzyme stabilisé est conservé dans l'eau ou dans la solution 40 tampon à la température ambiante ou au-dessous. Pour la fixation 69 02432 5 2001336 de l'enzyme sur le support en matière céramique, on place la solution aqueuse d'enzyme en contact avec le support à une température au-dessous de la température ambiante, de préférence à 5°C environ, car les enzymes sont plus stables aux très faibles tempéra-5 tures. Après être resté en contact avec le support pendant 1 à 72 heures environ, l'enzyme stabilisé est lié à la surface de la matière céramique, et tout excès d'enzyme est enlevé. La fixation initiale de protéine par le verre dépend du point iso-électrique. Plus le point iso-électrique de la molécule est élevé, c'est-à-*10 dire plus la protéine est basique en raison de la présence de groupements amino, plus grande est la quantité de protéine fixée dans la réaction initiale qui est la liaison chimique de groupements amino basiques à des groupements silanols réactifs du verre. Il est importent que le pH de la solution durant la liaison soit 15 tel que l'enzyme ne se dénature pas, et de préférence ce pH doit être du côté acide du point iso-électrique. Il est important d'enlever par lessivage l'enzyme non fixé avant l'obtention d'une valeur d'essai stabilisée. Le lessivage peut demander quelques heures et même plusieurs jours. La durée de la période de lessivage 20 semble être fonction de la grosseur des pores de la matière céramique. Les matières céramiques à petit diamètre de pores, c'est-à-dire dont les pores se rapprochent des dimensions moléculaires de l'enzyme, exigent d'assez longues périodes de lessivage allant de 6 à 16 jours environ. Les matières à gros pores, comme le verre 25 fritté et la wollastonite, n'exigent que de courtes périodes de lessivage ou pas de lessivage du tout. Cela semble indiquer que le lessivage est un résultat de la combinaison d'enzymes faiblement fixés dans les pores et de vitesses de diffusion réduites dues à ce que les dimensions des pores sont proches des dimensions 30 moléculaires de l'enzyme. Une charge négative induite sur la première couche d'enzyme fixé peut entraîner une mauvaise fixation de la deuxième et de la troisième couche d'enzymes. Dans la préparation du support pour la fixation de l'enzyme, il est fréquemment nécessaire de prétraiter le support dans le 35 but de rendre les groupements silanols plus facilement disponibles et réactifs. Si, par exemple, le verre poreux n'est pas prétraité, il peut contenir de nombreuses substances polluantes différentes qui occupent les emplacements de fixation disponibles. Quand on nettoie la surface du verre, à peu près tous les empla-40 cements actifs deviennent disponibles. Une technique typique de 69 02432 6 2001336 nettoyage pour le verre poreux est la suivante. Un échantillon de verre poreux est nettoyé aux ultra-sons dans une solution diluée d'acide nitrique à 80°C environ pendant une heure et demie, puis rincée à l'eau distillée et transféré à un four. La température 5 est ensuite portée à 625°C environ et maintenue à ce niveau pendant 15 à 90 minutes tandis qu'on fait passer continuellement de l'oxygène à travers le four. L'échantillon est ensuite refroidi dans un courant d'oxygène et mis en équilibre sous pression réduite avec de la vapeur d'eau. Dans le cas de la wollastonite, la 10 matière est nettoyée aux ultra-sons dans l'eau jusqu'à ce que le pH soit presque nei^-cre, et ensuite soumise à un cycle de chauffage similaire à celui décrit pour le verre poreux. Le produit obtenu par le procédé nouveau de l'invention est un enzyme immobilisé qui est insoluble dans l'eau. L'enzyme .a été 15 stabilisé pour donner un niveau constant d'activité pendant une longue période. Quand on le conserve à des températures de 5°C ou même à la température ambiante pendant une période atteignant des mois, l'enzyme fixé présente un niveau constant d'activité avec exposition, "répétée aux conditions d'essai. La quantité d'enzyme 20 stabilisée est fonction de la masse moléculaire de l'enzyme ainsi que du diamètre des pores et de la surface spécifique du support de l'enzyme comme expliqué ci-dessus. Les exemples non limitatifs suivants montreront bien comment la présente invention peut être mise en oeuvre. 25 EXEMPLE I : On prépare un enzyme représentatif du type nucléase appelé RNAase ayant les propriétés suivantes : masse moléculaire 12 700, point isoélectrique pH 7,8, activité de préparation 1530 unités/ mg. 30 Conditions d'essai : incubation pendant 4- minutes à 37°C dans un tampon acétate 0,1 M, pH 5,0. Matière à l'étude : acide ribonucléicue à 1% dans un tampon. Précipitant : acétate d'urany-le à 0,75% dans l'acide perchlorique à- 25%. Définition de l'unité d'activité : une unité est équivalente 35 à la quantité d'oligonucléotide soluble dans les acides qui provoque un accroissement de l'absorption spectrophotométrique à 260 myU- de 1,0 en quatre minutes au pH 5,0. Le support est un échantillon de verre poreux Code 7930, en forme de cylindre de 1,2 cm de diamètre extérieur, 1,0 cm de-dia-4*0 mètre intérieur, 5^08 cm de longueur, d'un poids de 2,0 grammes, 69 02432 '7 2001336 o o diamètre de pores 74 A, surface spécifique 113 m /g* L'échantillon est nettoyé par trempage dans HC1 1,2 M pendant 30 minutes. L'échantillon est ensuite placé dans un four et la température est élevée lentement à 550°C et maintenue à ce niveau pendant 3 5 heures. Après refroidissement, le verre est plongé dans un tampon acétate 0,1 M au pH 5»0 et mis en équilibre contre un tampon acétate 0,1 M, Eh 5,0, pendant toute une nuit. Fixation de l'enzyme : Le cylindre en verre est placé dans un tube à essai. Le tube est plongé dans un bain d'eau à 5°C et "10 on ajoute dans le tube 6 cm^ de solution contenant 0,5 mg de * RNAase par cnr dans un tampon acétate 0,1 M, pH 5,0. On laisse 9 réagir l'enzyme avec le cylindre pendant 6 heures à 5°C. Le cylindre est enlevé de la solution d'enzyme et on le traite deux fois par extraction avec le tampon. 15 Essai et conservation du cylindre à la RNAase : Le cylindre est essayé dans 20 cm^ de solution d'acide ribonucléique diluée à 1:1 au moyen de tampon acétate. Après 4 minutes d'incubation, une portion de 2 cm^ est prélevée pour analyse. Entre les analyses, le cylindre est d'abord lavé soigneusement à l'aide du 20 tampon et ensuite conservé dans le tampon à 5°C. Les résultats de cette étude indiquent une activité initiale de 0,040 mg/g de verre. Après une période de lessivage de 12 jours environ, le cylindre atteint un niveau d'activité relativement constant équivalent à 0,0075 mg de RNAase par gramme de 25 verre. L'activité reste à ce niveau pendant une période de 111 jours. On calcule la quantité de protéine fixée au verre en déterminant les densités optiques à 280 mf*- de la solution initiale d'enzyme, de la solution utilisée pour la fixation et des extraits. 30 Initialement, une proportion de 5% de l'enzyme fixé est active. Cette valeur tombe à 1,2% après la période de lessivage. EXMPEE II : On prépare un enzyme protéolytique représentatif, la papaï-ne, ayant les propriétés suivantes : masse moléculaire 21 000, 35 point iso-électrique pH 8,75» activité de préparation 0,01 uni-té/mg. Conditions d'essai (méthode Eunitz modifiée) : incubation de 60 minutes à 40°C dans un tampon phosphate 0,1 M, pH 5»8, qui contient 0,005 M de cystéine et 0,001 M d'acide éthylènediamine-40 tétracétique (EDTA). Matière à l'étude : caséine bouillie à 1% 69 02432 8 2001336 dans un tampon. Précipitant : acide trichloroacétique à 5%» Définition de l'unité d'activité : une unité est équivalente à la quantité de peptide soluble dans les acides produisant une variation dans la densité optique à 280 de 0,001 par 5 minute. Le support est ion échantillon de verre poreux Code 7930, en forme de cylindre de 1,2 cm de diamètre extérieur, 1,0 cm de diamètre intérieur, 2,54 cm de longueur, poids 1,27 gramme, diamètre de pores 68 S, surface spécifique 118 m^/g. L'échantillon 10 est nettoyé aux ultra-sons dans HNO^ 0,2 N à 80°C. L'échantillon est placé dans -un four et la température est portée lentement à 100°C et maintenue à ce niveau pendant 1 heure. Le verre est ensuite transféré à un dessicateur à eau pour mise en équilibre contre la vapeur d'eau. Le verre n'est pas équilibré avec le 15 tampon avant emploi. Fixation de l'enzyme : Le cylindre en verre est placé dans un tube à essai; on plonge le tube dans un bain à 5°C et on ajoute 4 cm^ de tampon phosphate 0,1 M, pH 6,95> contenant 4 mg de * papaïne par cm. On laisse réagir l'enzyme avec le cylindre pen-20 dant 1 heure et demie à 5°0. Le cylindre est enlevé de la solution d'enzyme et traité deux fois par extraction à l'eau. Essai et conservation du cylindre de papaïne : Le cylindre est essayé dans 5 cm^ d'une solution de matière en étude diluée à 1:1 à l'aide d'un tampon, contenant 0,005 M de cystéine et 25 0,001 M d'acide éthylène-diamine-tétracétique; après 1 heure d'incubation, une portion de 4 cm^ est prélevée pour analyse» Entre les analyses, le cylindre est traité par extraction à l'eau et ensuite conservé dans l'eau ou dans un tampon phosphate 0#t M, pH 5,8, contenant 0,01 M de cystéine et 0,002 M d'acide éthylènedia-50 mine-tétracétique à 5°C (la solution utilisée pour la conservation n'a pas d'effet apparent sur les résultats). Après une période de lessivage de 16 jours environ, le cylindre atteint un niveau d'activité relativement constant équivalent à 0,07 mg de papaïne par gramme de verre. L'activité reste 35 à ce niveau pendant une période de 122 jours. Initialement, une proportion de 90% de l'enzyme fixé est active. Cette valeur tombe à 4% après la période de lessivage. EXEMPLE III : En utilisant l'enzyme papaïne de l'Exemple II, on effectue ^"0 l'expérience suivante. 69 02432 9 2001336 Echantillon de verre poreux : Code 7930, cylindre, diamètre extérieur 1,2 cm, diamètre intérieur 1,0 cm, longueur 2,54 cm, poids 1,26 gramme, diamètre des pores 68 S, surface spécifi-2 que 118 m /g. L'échantillon est nettoyé aux ultra-sons dans 5 HNOj 0,2 F à 30°C pendant 1 heure et demie. L'échantillon est placé dans un four et la température est portée lentement à 180°C et maintenue à ce niveau pendant toute une nuit. Le verre est refroidi et mis en équilibre avec la vapeur d'eau. Le verre n'est pas équilibré au tampon avant emploi. 10 Fixation de l'enzyme : Le cylindre en verre est placé dans un tube à essai; le tube est plongé dans un bain à 5°C, et on a-joute 4 cm^ de tampon phosphate 0,1 M, pH 8,7, contenant 1 mg de papaïne par cm^. Gn laisse réagir 1'enzyme avec le verre pendant 2 heures à 5°C. Le cylindre1 est enlevé de la solution d'enzyme 15 et traité par extraction par un tampon, pli 8,7. Conservation du cylindre à la papaïne : Entre les analyses, le cylindre est conservé dans un tampon phosphate 0,1 M, pH 5*8, contenant 0,01 M de cystéine et 0,002 M d'acide éthylènediamine-tétracétique à la température ambiante. 20 Le cylindre conserve un niveau constant d'activité équiva lent à 4 mg de papaïne par gramme de verre. L'activité reste à ce niveau pendant une période de 86 jours. EXEMPLE IV : En utilisant la papaïne de l'Exemple II, on effectue l'ex-25 périence suivante. Echantillon de verre poreux : Code 7930, cylindre, diamètre extérieur 1,1 cm, diamètre intérieur 1,0 cm, longueur 5,5 cm, poids 0,8 g (ce morceau de verre est la paroi intérieure d'un cylindre qui a été séparé au plan de lessivage). Diamètre de po-30 res 92 S, surface spécifique 60 m /g. L'échantillon est nettoyé aux ultra-sons dans HUO^ 0,2 N à 80°C, placé dans -un four, et la température est portée lentement à 200°C. L'échantillon est maintenu à cette température pendant toute une nuit. Le verre est refroidi et mis en équilibre avec la vapeur d'eau. L'échan-35 tillon n'est pas équilibré au tampon avant emploi. Fixation de l'enzyme s La papaïne est fixée au verre à partir d'un tampon phosphate 0,1 M, pH 6,95« Le verre est exposé à 5 cm^ de solution d'enzyme (4 mg de papaïne par cm^) pendant 1 heure à 5°0. Le verre est traité par extraction cinq fois à 40 l'eau et une fois à l'aide d'un tampon phosphate 0,1 M, pH 5,8, 69 02432 10 2001336 contenant 0,01 M de cystéine et 0,002 M d'acide éthylènediamine-tétracétique. Conservation du cylindre à la papaïne : Entre les analyses, le cylindre est conservé dans un tampon phosphate 0,1 M, pH 5S8, 5'contenant 0,01 M de cystéine et 0,002 M d'acide éthylènediamine-tétracétique à 5°C. Ce cylindre est essayé 40 fois pendant une période de 82 jours. Après une période de lessivage de 12 jours, on obtient un niveau relativement constant d'activité équivalent à 0,08 mg de 10 papaïne par gramme de verre, qui reste constant pendant une période de 70 jours. EXEMPLE V : En utilisant l'enzyme papaïne de l'Exemple II, on effectue l'expérience suivante. 15 Echantillon de verre poreux : Code 7930, cylindre, diamètre extérieur 1,2 cm, diamètre intérieur 1,0 cm, longueur 2,54 cm, poids 1,3 gramme, diamètre de pores 68 S, surface spécifique 118 p m /g. L'échantillon est nettoyé aux ultra-sons dans HNO^ 0,2 U à 80°C pendant 1 heure et demie. L'échantillon est transféré à un 20 four, et la température est portée lentement à 180°C et maintenue à ce niveau, pendant toute une nuit. Le verre est refroidi et mis en équilibre avec la vapeur d'eau. Le verre n'est pas équilibré au tampon avant emploi. Fixation et reticulation de l'enzyme : La papaïne est fixée 25 au verre à partir d'un tampon phosphate 0,1 M, pH 6,95 à 5°C. Le verre est exposé à 4 cm^ de solution contenant 2 mg de papaïne par cnr pendant 4 heures. Le verre est traité par extraction une fois à l'eau. L'enzyme fixé sur le verre est réticulé dans une solution à 1% de formaldéhyde pendant toute une nuit à 5°C. Le 30 cylindre est ensuite traité par extraction 3 fois à l'eau et finalement une fois à l'aide d'un tampon phosphate 0,1 M, pH 8,5, contenant 0,01 M de cystéine et 0,002 M de EDTA. Conservation du cylindre à la papaïne réticulée : Entre les analyses, le cylindre est conservé dans un tampon phosphate 0,1 M, 35 pH 5,8, contenant 0,01 M de cystéine et 0,002 M de EDTA à 5°C. Après une période de lessivage de 9 jours, le verre présente un niveau constant d'activité équivalent à 0,09 mg de papaïne par gramme de verre. Ce niveau se maintient pendant une période de 48 jours et semble être environ 1,3 fois celui de la papaïne fixée 40 non-réticulée. 69 02432 n 2001336 EXEMPLE VI : En utilisant l'enzyme papaïne de l'Exemple II, on effectue l'expérience suivante. Echantillon de verre fritté fin : Verre au borosilicate Code 5 7740, quatre disques de 20 mm à "bord droit, poids total 4,63 grammes, diamètre des pores 50 000 S, surface spécifique 0,2 m2/ g. L'échantillon est nettoyé aux ultra-sons dans HNO^ 0,2 N à 80°C pendant 1 heure et demie. L'échantillon est placé dans un four et la température est portée lentement à 200°C et maintenue 10 à ce niveau pendant 2 heures. Le verre est refroidi. Le verre n'est pas mis en équilibre avec un tampon ou de la vapeur d'eau. Fixation de l'enzyme ï La papaïne est fixée au verre à partir d'un tampon phosphate 0,1 M, pH 6,95. I»es 4 disques en verre sont exposés à 5 cm^ de solution d'enzyme (0,84 mg de papaïne 15 par cm^) pendant 17 heures à 5°C. Le verre est traité par extraction deux fois au tampon et deux fois à l'eau. Conservation des disques frittés à la papaïne : Entre les analyses, les disques sont conservés dans un tampon phosphate 0,1 M, pH 5S8, contenant 0,01 M de cystéine et 0.002 M de EDTA 20 à 5°C. Après une période de lessivage de 1 jour, le verre présente un niveau constant d'activité équivalent à 0,014 mg de papaïne par gramme de verre. Ce niveau est maintenu pendant une période de 83 jours. 25 EXEMPLE VII Ï En utilisant l'enzyme papaïne de l'Exemple II, on effectue l'expérience suivante. Particules de verre poreux de 0,177 à 0,250 mm, poids 1,0 gramme, diamètre des pores 900 S, surface spécifique 20 m2/g. 30 L'échantillon est nettoyé par chauffage à 625°C en présence d'oxygène pendant 15 minutes. L'échantillon est refroidi dans un courant de 0g et ensuite mis en équilibre sous pression réduite avec la vapeur d'eau. L'échantillon n'est pas équilibré au tampon avant emploi. 35 Fixation de l'enzyme : La papaïne est fixée au verre à par tir d'un tampon phosphate 0,1 M, pH 6,95. Un gramme de particules de verre est exposé à 4 cm^ de solution d'enzyme (4 mg de papaïne par cm^) pendant 70 heures à 5°C. Le verre est traité par extraction deux fois au tampon et ensuite à l'eau. Les particu-40 les enzyme-verre sont placées sur un morceau de papier filtre et 69 02432 12 2001336 le papier est attaché avec un fil. Les particules enveloppées dans le papier sont utilisées comme un "sac de thé" pour les déterminations d'enzyme. Essai et conservation des particules à la papaïne envelop-5 pées dans le papier : Le "sac de thé" est essayé dans 15 cm^ d'une solution de matière en étude diluée à 1:1 à l'aide d'un tampon (pH 5,8) contenant 0,005 M de cystéine et 0,001 M de EDTA. Après 1 heure d'incubation à 40°C, des portions de 4 cm^ sont prélevées pour analyse. Entre les analyses, le "sac de thé" est conservé à 10 5°C dans un tampon phosphate 0,1 Ivl, pH 5,8, contenant 0,01 M de cystéine et 0,002 M de EDTA. Après une période de lessivage de 1 jour, le verre présente un niveau constant d'activité équivalent à 33 ing de papaïne par gramme de verre. Ce niveau se maintient pendant une période de "15 43 jours. EXEMPLE VIII : En utilisant l'enzyme papaïne de l'Exemple II, on effectue l'expérience suivante. Verre de silice poreux formé par dessication d'un gel de si-20 lice exempt d'alcali - morceau de verre de forme irrégulière, poids 0,793 gramme, diamètre des pores 75 &, surface spécifique 398 m /g. L'échantillon est nettoyé par élévation lente de la température à 625°C en présence d'un courant de 0^, L'échantillon est maintenu à cette température pendant 45 minutes et en-25 suite refroidi par exposition à un courant de Og. Le verre est mis en équilibre avec la vapeur d'eau sous pression réduite. L'échantillon n'est pas équilibré au tampon avant emploi. Fixation de l'enzyme : La papaïne est fixée sur le morceau de verre ou gel de silice dans un tampon phosphate 0,1 M, pH 30 6,95» De verre est exposé à 6 cm^ de solution d'enzyme (2 mg de papaïne par cm^) pendant 17 heures à 5°C. Le verre est traité par extraction une fois au tampon et 10 fois à l'eau. Essai et conservation du bloc de gel de silice à la papaïne: Le bloc de verre est essayé dans 6 cm^ d'une solution de matiè-35 re en étude diluée à 1:1 à l'aide d'un tampon, pH 5,8, contenant 0,005 M de cystéine et 0,001 M de EDTA. Après 1 heure d'incubation à 40°0, une portion de 4 cm^ est prélevée pour analyse. Entre les analyses, le bloc est conservé à 5°C dans un tampon phosphate 0,1 M, pH 5,8, contenant 0,01 M de cystéine et 0,002 M de 40 EDTA. 69 02432 15 2001336 Après une période de lessivage de plus de 6 jours, le verre présente un niveau d'activité équivalent à environ 0,055 mg de papaïne par gramme de verre. EXEMPLE IX : 5 En utilisant l'enzyme papaïne de l'Exemple II, on effectue l'expérience suivante : Echantillon de wollastonite : Un cylindre de 0,9 cm de diamètre extérieur, 0,8 cm de diamètre intérieur, 2,54 cm de longueur poids 0,925 g, diamètre des pores de moins de: 150 S à 4 500 S, p 10 surface spécifique 0,1 m /g. L'échantillon est nettoyé par élévation lente de la température à 625°C en présence d'un courant de O2. L'échantillon est maintenu à cette température pendant 45 minutes et ensuite refroidi par exposition à un courant de 0^. La wollastonite est mise en équilibre avec la vapeur d'eau sous pres-15 sion réduite. L'échantillon n'est pas équilibré au tampon avant emploi. Fixation de l'enzyme : La papaïne est fixée sur la wollastonite dans un tampon phosphate 0,1 M, pH 6,95. L'échantillon est exposé à 4 cm-' de solution d'enzyme (2 mg de papaïne par crn^) 20 pendant 17 heures à 5°C. La wollastonite est traitée par extraction une fois au tampon et 10 fois à l'eau. Essai et conservation du cylindre papaïne-wollastonite : Le cylindre est essayé dans 5 cm^ d'une solution de matière en étude diluée à 1:1 à l'aide d'un tampon, pH 5»8, contenant 0,005 M 25 de cystéine et 0,001 M de EDTA. Après 1 heure d'incubation à 40°C, un échantillon de 4 cm^ est prélevé pour analyse. Entre les analyses, le cylindre est conservé à 5°C dans vin tampon phosphate 0,1 M, pH 5»8, contenant 0,01 M de cystéine et 0,002 M de EDTA. Bien que les valeurs d'activitç&ans cette étude soient très 30 dispersées, on peut voir qu'aucune période de lessivage n'apparaît. Le niveau d'ensemble d'activité pendant line période de 35 jours semble être de 0,11 mg de papaïne par gramme de wollastonite. EXEMPLE X : On préparé un enzyme représentatif du type redox, la gluco-35 se-oxydase, ayant les propriétés suivantes : masse moléculaire 150 000, point isoélectrique 4,3, activité de préparation 45,5 unités/mg. Conditions d'essai : L'incubation est effectuée à la température ambiante dans un tampon phosphate 0,01 M, pH 750. Matière 40 en étude : 22,4 mg de P-D-glucose par cm? de tampon (concentra 69 02432 14 2001336 tion finale 18 mg par cm^). Pour déterminer la quantité de produite, on prélève une portion de 2,5 cm^ de mélange de réaction et on ajoute 0,025 cm*' d'O-dianisidine à 1% dans le méthanol et ensuite 0,5 cm^ de solution de peroxydase (0,04 mg/cm^). 5 Définition de l'unité d'activité : une unité est équivalen te à la vitesse de production de 1 micromole de HgOg par heure à la température ambiante. La production de ^Og est déterminée par sa décomposition en présence de peroxydase et d'O-dianisidine. L'oxydation de 1'O-dianisidine est déterminée par l'accrois-10 sement de la densité optique à 460 m^. Echantillon de verre poreux : Cylindre en verre Code 7950, diamètre extérieur 1,2 cm, diamètre intérieur 1,0 cm, longueur 2,54 cm, poids 1,3 gramme, diamètre des pores 68 S, surface spé- o cifique 118 m /g. L'échantillon est nettoyé aux ultra-sons dans 15 HNOj 0,2 N à 80°C pendant 1 heure et demie. L'échantillon est transféré à un four et la température est élevée lentement à 180°C et maintenue à ce niveau pendant toute une nuit. Le verre est refroidi et mis en équilibre contre un tampon phosphate 0,01 M, pH 7 » 0, pendant une heure. 20 Fixation de l'enzyme : L'enzyme est fixé sur le verre à par tir d'un tampon phosphate 0,01 M, pH 7,0. Le cylindre est exposé à 4 cm^ de solution de glucose-oxydase (2 mg/cm^) pendant 1 heure à 5°C. Le cylindre est traité par extraction à l'eau. Conservation du cylindre à la glucose-oxydase : Le cylindre 25 est conservé dans un tampon phosphate 0,01 M, pH 7j0, à la température ambiante, entre les analyses. Après une période de lessivage de 3 jours, le cylindre présente un niveau d'activité équivalent à 0,0001 mg de glucose-oxydase. 3° EXEMPLE XI s En utilisant l'enzyme glucose-oxydase de l'Exemple X, on effectue l'expérience suivante. Echantillon de verre poreux : particules de 0,177-à 0,250 mm, poids 1,0 gramme, diamètre des pores 900 S, surface spécifique p 35 20 m /g. L'échantillon est nettoyé par chauffage à 625°C en présence d'oxygène pendant 15 minutes. L'échantillon est refroidi dans un courant de O2 et ensuite mis en équilibre sous pression réduite contre la vapeur d'eau. Le verre n'est pas équilibré au tampon avant emploi, 40 Fixation de l'enzyme : La glucose-oxydase est fixée sur le 69 02432 2001336 15 verre à partir d'un tampon phosphate 0,1 M, pH 6,95* Un gramme de particules de verre est exposé à 4 cm^ de solution d'enzyme (5 mg de glucose-oxydase par cm^) pendant 70 heures à 5°C. Le verre est traité par extraction deux fois au tampon et ensuite à l'eau. Les 5 paxticules enzyme-verre sont transférées sur un morceau de papier filtre et le papier est attaché à l'aide d'un fil. Les particules enveloppées dans le papier sont utilisées comme un "sac de thé" pour des déterminations d'enzyme. Essai et conservation des particules de glucose-oxydase en-10 veloppées dans le papier : Le "sac de thé" est essayé dans 125 cm^ de solution 0,01 M de tampon phosphate, pH 6,95» contenant 18 mg de glucose par cm^ à la température ambiante. Des portions de 2,5 cm^ sont prélevées à des intervalles de 3 minutes pour analyse. Entre les analyses, le "sac de thé" est conservé à 5°C 15 dans un tampon phosphate 0,01 M, pH 6,95- Pendant les 17 premiers jours du stockage, on ne note aucune période apparente de lessivage et le verre semble présenter un niveau constant d'activité équivalent à 0,123 mg de glucose-oxydase par gramme de verre. Le 21ème jour, on note une chute bru-20 fraie du niveau d'activité à 40% environ. Cette perte d'activité est attribuée aux expositions de l'enzyme à des vapeurs de CS2 et de C2H^0H. Avec des analyses répétées durant les 24 heures suivantes, on note un rétablissement de l'activité à 78% du niveau constant initial d'activité. Des pertes supplémentaires d'acti-25 vité sont notées après des périodes supplémentaires de 20 jours et 41 jours. Après 64 jours de stockage, le niveau d'activité présenté est équivalent à 0,04 mg de glucose-oxydase par gramme de verre. A ce stade, on note qu'un développement microbien important apparaît sur la surface du papier du "sac de thé". Les 30 pertes d'activité, par conséquent, peuvent être dues à la production d'un inhibiteur ou à la destruction de l'enzyme par le microbe. Certains des résultats des exemples ci-dessus sont résumés dans le tableau suivant. Les résultats sont comparés à ceux ob~ 35 tenus avec un tube en verre non poreux. 69 02432 16 2001336 TABLEAU Relation entre la quantité d'enzyme fixée et les caractéristiques du support Support Diamètre Enzyme (masse Surface Mg d'enzyme des moléculaire) spécifi- fixés par g pores que de matière (1) (m2/g) céramique Tube de verre non très au borosili- poreux Papaïne (21 000) petite 0 cate Exemple VI 50 000 Papaïne (21 000) 0,2 0,014 Exemple VII 900 Papaïne (21 000) 20 0,33 Exemple IV 92 Papaïne (21 000) 60 0,08 Exemple II 68 Papaïne (21 000) 118 0,07 Exemple XI 900 Glucose-oxydase 20 0,12 (150 000) Exemple X 68 Gluc ose-oxydas e 118 0,0001 15 (150 000) Les résultats de ce tableau indiquent que : (1) Quand la surface spécifique du support est accrue, la 2o quantité d'enzyme (papaïne) fixée est accrue d'une manière correspondante, jusqu'à ce que les dimensions des pores soient voisines des dimensions moléculaires de l'enzyme. A ce moment, une surface spécifique moindre du support est disponible pour la fixation, avec pour conséquence une réduction de la quantité d'en- 25 zyme fixée. (2) L'effet des dimensions moléculaires de l'enzyme, par exemple la masse moléculaire, indique que pour un support poreux donné, quand la masse moléculaire de l'enzyme augmente, la quantité d'enzyme fixée diminue. Toutefois, il existe une grosseur de 50 pores optimale pour un enzyme particulier, et ce stade est atteint quand le diamètre des pores est équivalent à approximativement la racine carrée de la masse moléculaire de l'enzyme. Il est évident que l'invention n'est pas limitée aux modes de mise en oeuvre décrits, et qu'on peut y apporter toutes va-55 riantes. 69 02432 17 2001336 REVENDICATIONS 1. Une matière composite à "base d'enzyme stabilisé qui est à peu près insoluble dans 1'eau et est capable de catalyser des réactions d'une nanière répétée sans perte d'activité, caractéri-5 sée en ce qu'elle comprend un enzyme ayant des groupements amino disponibles couplé à un support inorganique qyant une grande surface spécifique et des groupements silanols réactifs, cet enzyme étant couplé au support au moyen de liaisons amine-silicate et de liaisons hydrogène. 10 2. Une matière composite à base d'enzyme stabilisé conforme à la revendication 1, caractérisée en ce que l'enzyme est choisi parmi les enzymes hydrolytiques, les enzymes redox et les trans-férases. 3. Une matière composite à base d'enzyme stabilisé conforme 15 à la revendication 1, caractérisée en ce que le support a une sur- p face spécifique supérieure à 0,1 m /g et est choisi parmi une matière céramique poreuse, la silice colloïdale, la wollastonite et un gel de silice desséché poreux. 4-, Une matière composite à base d'enzyme stabilisé conforme 20 à la revendication 3> caractérisée en ce que le support consiste en Verre poreux. 5. Une matière composite à base d'enzyme stabilisé conforme à la revendication 4, caractérisée en ce que l'enzyme est la papaïne et le support est un verre poreux à haute teneur en silice 25 ayant une grosseur de pores de 68 à 900 S. 6. Une matière composite à base d'enzyme stabilisé conforme à la revendication 3, caractérisée en ce que le support consiste en silice colloïdale. 7. Un procédé de préparation d'une matière composite à base 30 d'enzyme stabilisé, caractérisé en ce qu'on met en contact une solution aqueuse d'un enzyme ayant des groupements amino disponibles avec un support inorganique ayant une grande surface spécifique et des groupements silanols réactifs, à des températures allant jusqu'à la température ambiante et pendant un laps de temps suf-35 fisant pour une fixation notable de l'enzyme sur le support, et on élimine tout enzyme non fixé en excès. 8. Un procédé conforme à la revendication 7, caractérisé en ce que l'enzyme est choisi parmi les enzymes hydrolytiques, les enzymes redox et les transférases. 69 02432 18 2001336 9. Un procédé conforme à la revendication 7» caractérisé en ce que la solution est à un pH tel qu'on évite une dénaturation de 11 enzyme. 10. Un procédé conforme à la revendication 7» caractérisé 5 en ce que le support est un verre poreux qui a été soumis à un traitement préalable pour que les groupements silanols du support deviennent facilement disponibles et réactifs.