FR 2008078 A1 19700116 FR 6914757 A 19690508 69 14757 i 2008078 La présente invention concerne un procédé de synthèse de dérivés. "f5-hydrû-xylés d'acides alcanoïques tels que l'acide L-(+)-fi-hydroxyisé>butyrique par oxydation microbiologique. Ces dérivés pi-hydroxylés de ces acides, et, plus spécialement l'acide L(+)-^-hydroxyisobutyrique sont des composés importants utilisables par suite de l'existence simultanée d'une fonction acide et d'une fonction alcool comme produits de départ pour préparer des polyesters stéréoréguliers et d'autres polymères synthétiques par polycondensation. Ces acides sont facilement esté-rifiés par les procédés usuels en formant des esters qu'on peut transformer facilement en polyméthacrylates, par exemple par réaction donnant l8ester méthaa.: crylique monomère intermédiaire qu'on polymérisera ensuite sans isolement préalable. Par exemple, l'acide hydroxybutyrique pourrait avantageusement servir de point de départ pour préparer l'acide a-méthacrylique par déshydratation, si c'était une matière première facilement abordable. Ce n'est pas le cas, suivant la technique connue, car les préparations purement chimiques de cet acide ont de mauvais rendements. L'invention a donc essentiellement pour objet un procédé de préparation d'un acide L4+)-p-hydroxyalcanoïque par oxydation d'un acide alcanoïque ayant de quatre à six atomes de carbone et au moins un atome d'hydrogène fixé à l'atome de carbone en position p, caractérisé en ce qu'on opère par réaction microbiologique en présence d'un microorganisme choisi dans le groupe formé par Pseudomonas putida, Pseudomonas fluorescens, Arthrobacter crystallopietes, Mycobacterium species et Arthrobacter oxydans. Le procédé de l'invention donne de bons rendements en acide hydroxy-alcanoïque. Les acides carboxyliques qu'on peut ainsi oxyder par voie microbiologique pour préparer les acides L(+)-p-hydroxyalcanoï.ques sont des acides bien connus: ce sont par exemple, des acides aliphatiques monocarboxyliques à chaîne droite ou ramifiée, tels que les acides isobutyrique, isovalérique et isocaproïque. Des cultures des microorganismes formateurs d'acide L(+)-p-hydroxyisobutyrique peuvent être obtenues auprès de plusieurs organismes publics, tels que 1' "American Type Culture Collection" de Washington aux Etats-Unis d'Amérique (connu par le sigle ATCC). On peut aussi extraire ces cultures de microorganismes de produits naturels, notamment du sol, par les procédés usuels, bien connus des biologistes. Pour illustrer l'isolement d'un tel microorganisme du sol, on décrira le procédé suivant utilisé pour obtenir une nouvelle souche de Pseudomonas putida (référence ATCC ZI 244), dont les cultures peuvent être utilisées par le public sans restriction spéciale. 14757 2 2008078 On prépare un milieu de culture qui contient 2,0 g d'acide isobutyrique, 1,0 g de sulfate d'ammoniaque, 1,0 g de phosphate dipotassique, 0,2 g de sulfate de magnésium, 0S05 g de sulfate ferreux, 0,02 g de chlorure de calcium, 0,001 g de sulfate de manganèse, (les trois sulfates étant heptahydratés) et 0.0005.g de ^2*^00^, 21^0 par litre d'eau distillée. On disperse une couche de sol, épaisse de 38 mm, dans 250 ml de ce liquide et on incube pendant 9 jours ' dans une fiole d'Erlenmeyer de 500 ml à 30°C, sans agiter. Le liquide surnageant devient très trouble. On transfère 1 ml de cette culture dans 25 ml de milieu stérile dans une fiole Morton (modèle de la firme Bellco Glass des Etats-Unis d'Amérique) qu'on agite à raison de 400 tr/mn sur un agitateur rotatif (modèle G-10 de la firme New Brunswick des Etats-Unis d'Amérique) pendant trois jours. On répète encore deux fois ce transfert et cette incubation. On place la culture mélangée ainsi obtenue sur un milieu ayant la composition indiquée et solidifié par addition de 2/100 d'agar-agar. On sépare ainsi cinq cultures différentes et on les maintient séparément dans des tubes inclinés pour cultures aérobies contenant 1/100 d'extrait de levure et 1/100 de glucose dans un gel d'agar-agar. Les épreuves^de la "Society of American Microbiologists",(1957, de Skerman, 1967 et/Breed et collaborateurs, 1957, qui sont une série d'épreuves habituellement utilisées pour caractériser les bactéries, fournissent les résultats suivants sur une souche de la culture IBA-1. 1. Caractéristiques des taches après 18 h de culture sur milieu glucpse/extrait de levure. a- Gram négatif b- Ne résiste pas aux acides 2. Morphologie cellulaire après culture pendant une durée pouvant atteindre 7 jours sur milieu glucose/extrait de levure. a- Asporogène b- Motile au moyen de flagelles polaires 1-3 c- Bâtonnets longs de 0,75^ à Q,85(i et larges de 1,0^ à 1,25^, le plus souvent par paires ou par courtes chaînes (souvent de huit à douze bâtonnets par chaîne ) d- Non encapsulé 3. Colonies sur agar-agar (milieu glucose/extrait de levure) a- durée de culture ; 72 h b- forme : circulaire- les colonies anciennes présentent un renflement c- élévation : convexe d- surface : lisse e- marge : entière f- pigmentation : jaune-grisâtre terne 69 14757 3 2008078 4. Ensemencement au trait sur agar-agar a- durée de culture : 72 h b- type de croissance : filiforme c- consistance : butyreuse 5 d- pigmentation : jaune-grisâtre terne 5. Culture sur bouillon a- durée de culture : 14 j b- croissance superficielle : nulle c- opalescence : considérable 10 d- sédimentation : compacte e- quantité de sédiment : peu abondant et 6. Culot de gélatine (glucose/extrait de levurq? "57100 de gélatine) a- durée de culture : 14 j b- liquéfaction : nulle 15 c- croissance : abondant développement superficiel 7. Culture sur agar-agar/dextrose de pommes de terre a- durée de culture : 14 j b- croissance : faible c- pigmentation : jaune-grisâtre 20 8. Milieu de Hugh-Leifson additionné d'hydrates de carbone a- durée de culture : 14 j b- culture strictement aérobie c- glucose : réaction acide ; pas de dégagement gazeux d- lactose : réaction alcaline ; pas de dégagement gazeux 25 e- sucrose : réaction alcaline ; pas de dégagement gazeux f- glycérol : réaction acide ; pas de dégagement gazeux g- mannitol : réaction alcaline : pas de. dégagement gazeux 9. Action sur le lait a- durée de culture : 14 j 30 b- réaction alcaline au tournesol : pas de coagulation c- épreuve d'Ulrich : réaction alcaline avec réduction 10. Sérum sanguin de Loeffler a- durée de culture : 14 j b- croissance : nulle 35 11. Milieu de Sim a- durée de culture : 14 j b- motilité : observée en 24 h c- H2S : nul d- Indole : nul 69 14757 4 2008078 12. Milieu agar-agar de Kligler au fer a- durée de croissance : 14 j b- H2S : nul c- le dextrose et le lactose ne fermentent pas 5 13. Milieu alcalin d'oeuf a- durée de croissance : 14 j b- pas d'activité protéolytique 14. Epreuves spéciales a- pas de croissance en 14 j dans un milieu contenant 10/100 d'éthanol 10 et 1/100 d'extrait de levure ; faible croissance en 4 j dans un milieu contenant 5/100 d'éthanol et 1/100 d'extrait de levure ayant un pH de 6,5 b- pas de croissance en 14 j e« milieu d'acide urique —. r c- amidon non hydrolysé 15 d- épreuve négative au rouge de méthyle e- ne forme pas de nitrite à partir de nitrate r f- épreuve de Voges-Proskauer négative g- cellulose non hydrolysée en 14 j h- bonne croissance en milieu citrate 20 15. Croissance en fonction de la température a- durée de croissance : 72 h b- 4°C aucune croissance (même en 10 j) c- 25°C : forte croissance d- 30°C : développement abondant 25 e- 31°C : pas de croissance 16. Sources supplémentaires de carbone : acide isobutyriqUe, acide L(rf)-p-hydroxy isobutyrique, acide méthylmalonique acide a-méthacrylique, acide succinique, acide propionique, acide acétique, acide isovalérique, acide 2-méthyl-n-butyrique, acide 2-méthyl-n-valérique. 30 D'après cet ensemble d'épreuves, la culture étudiée est du genre Pseudomonas. Les épreuves supplémentaires nécessaires pour fixer l'espèce et le type donnent les résultats suivants. (On consultera l'article suivant î R.Y. Stanier, N.J. Palleroni and M. Doudoroff, JOURNAL 0E GENERAL MICROBIOLOGY 43, 159 (1966». 35 1. Pigmentation a- fluorescence sur milieu MB" de King b- pas de phénazine sur milieu "A11 de King 2. Il ne faut pas utiliser comme unique source de carbone les composés suivants tréhalose, inositol, mannitol, ion maléate, ion adipate, acétamide, glycine, 40 d-galactose, JL-tryptophanné, d,l-cynurine 69 14757 5 2008078 3. On peut utiliser comme unique source de carbone les composés suivants : ions nicotinate, hippurate ou a-aminovalerate. Ces résultats montrent (voir article précité) que cette culture de Pseudomonas appartient à l'espèce putida (biotype A). 5 Suivant un mode de mise en oeuvre de l'invention, on oxyde 1sacide isobutyrique sous l'action d'un microorganisme choisi dans le groupe précité, cultivé dans des conditions aérobies dans un milieu favorable à la croissance de ce microorganisme. Pendant la croissance de cet organisme, l'acide isobutyrique est oxydé par une série de.réactions successives : un des composés inter» 10 médiaires est l'acide L(+)-(3-hydroxyisobutyrique, qui s'accumule dans le milieu de fermentation quand on opère dans des conditions contrôlées. Bien qu'on puisse utiliser des milieux solides pour cultiver ces microorganismes il est recommandable d'utiliser un milieu nutritif aqueux, qui doit contenir des sources de carbone, d'azote et d'éléments minéraux qui permettent 15 la croissance convenable du microorganisme. L'acide isobutyrique peut former la source de carbone à lui tout seul. D'autres sources de carbone disponibles sont la farine de maïs, les protéines, les acides aminés, les hydrates de carbone, les amidons, la dextrine, les mélasses et les sucres tels que le glucose, le fructose, le mannose, le maltose, le sucrose, etc., tandis, que le glycérol, 20 les alcools, l'acide acétique, etc. sont des exemples de sources de carbone assimilable. L'azote peut être apporté, sous forme assimilable, par des sources telles que les protéines animales ou végétales solubles ou insolubles, la farine de soja, la caséine, les peptones, les- polypeptides ou les acides aminés l'urée, les sels ammoniacaux tels que le sulfate d'ammonium, les macérations 25 de graines, etc. Parmi les constituants minéraux que les milieux nutritifs peuvent contenir, on citera le calcium, le magnésium, le potassium et le sodium ainsi que, à l'état de traces, le chrome, le cobalt* le cuivre^ le fer et le zinc ; le soufre peut être apporté à l'état de sulfate, de cystéine, de méthio-nine, etc., tandis que le phosphore peut être apporté par des sources telles 30 que les orthophosphates, les métaphosphates et les pyrophosphates, sous forme de sels ou d'esters, notamment ou par des liqueurs de macération de graines. Il est très avantageux d'ajouter au milieu aqueux nutritif un promoteur tel que de l'extrait de levure. Les cultures des microorganismes utilisés dans la mise en oeuvre de 35 l'invention sont habituellement incubées à température comprise entre 25°C environ et 30°C environ dans des conditions aérobies» Aux, températures nettement supérieures à 30°C, les taux de production diminuent, tandis qu'aux températures inférieures à 25°C, la vitesse de croissance diminue lentement. " Le pH du milieu est généralement maintenu entre 7,0 environ et.. 9-,5■ environ. 40 Ordinairement, le pH initial est compris entre environ 8",G et environ 8,5 ; 69 14757 6 2008078 au cours de la fermentation il croît et peut atteindre parfois 9,5;. On obtient régulièrement de bons taux de production quand on maintient le pH entre 8,0 et 8,5 environ après la période de croissance naturelle à un pH voisin de 8*5. L'aération convenable peut être obtenue en produisant la fermentation dans des 5 conditions aérobies, par culture en surface, mais il est recommandable de faire une culture immergée dans des conditions aérobies. Généralement, il faut de 24 h environ à 50 h environ pour obtenir les meilleurs taux de production. On peut ajouter au milieu nutritif l'acide alcanoïque, par exemple l'acide isobutyrique quand on ensemence le milieu avec une culture du mieroorganisme 10 choisi en cours de croissance ou bien quand cet organisme s'est déjà notablement développé dans le milieu nutritif dans des conditions aérobies. On peut aussi faire croître le microorganisme sur un milieu nutritif (qui peut avantageusement contenir de l'acide isobutyrique comme source de carbone, ceci n'étant pas indispensable) jusqu'à ce que ce microorganisme ait atteint un développement 15 stationnaire. On enlève alors du milieu nutritif les cellules qui ne se développent pas (cellules dites "au repos"), par eentrifugation par exemple. Ces cellules au repos pourront former de l'acide L(-r)-fs-hydroxyisobutyrique si on les disperse à nouveau dans une suspension d'acide isobutyrique (avantageusement neutralisée par de la potasse) dans des conditions aérobies. Dans ce pro-20 cédé de fermentation utilisant des cellules au repos, il est avantageux de réduire l'aération, par exemple à environ le tiers de l'aération utilisée avec des cultures en cours de croissance et d'ajouter de petites quantités d'ion carbonate et dé glucose. Ces substances réduisent la vitesse de destruction de 1'acide L(+)-8-hydroxyisobutyrique. 25 Suivant un mode avantageux de mise en oeuvre, la fin de la fermentation est faite en utilisant des cellules au- repos. On utilise des cellules en cours de croissance jusqu'à ce que la culture ait atteint son développement maximal, puis, dans une seconde phase de la fermentation où la croissance est arrêtée, on modifie les conditions opératoires* essentiellement en réduisant l'aération 30 pour obtenir une fermentation au moyen de cellules au repos. On a trouvé que ce mode opératoire, décrit aux exemples qui suivent, augmente la quantité formée . du produit qu'on désire préparer et réduit notablement la quantité d'acide alcanoïque utilisé comme matière première restant en fin d'opération. La concentration de l'acide alcanoïque dans le procédé suivant l'invention 35 peut varier d'environ 1 g à environ 150 g par litre de milieu de'culture ; elle dépend du microorganisme particulier choisi et dépend du choix fait entre les deux variantes : fermentation avec colonie de microorganismes en-e,ours de croissance ou bien fermentation avec iaicroorganism.es au repos. Par exemple quand on utilise Pseudomonas putida (ATCC N° 21 244), une concentration en 40- acide isobutyrique dépassant 20 g/1 inhibe la croissance de La culture ; quand 69 14757 7 2008078 on fait la fermentation avec des microorganismes au repos, une concentration dépassant 10 g/1 produit une inhibition avec le même microorganisme. On utilise habituellement une concentration en acide alcanoïque plus grande avec les autres microorganismes formant de l'acide hydroxyisobutyrique indiqués ci-dessus. 5 Après achèvement de l'oxydation par voie microbiologique, on peut séparer le produit formé du milieu de fermentation par des moyens variés, tels que l'échange d'ions ou l'extraction par un solvant non miscible à l'eau, avantageusement par de l'éther, après avoir rendu acide le mélange de fermentation. L'extrait contient l'acide hydroxyisobutyrique et l'acide alcanoïque n'ayant 10 pas réagi ; on concentre cet extrait sous vide à petit volume, et on peut même chasser ainsi tout le solvant ; on obtient finalement un résidu liquide. On peut purifier l'acide L (+)-(3-hydroxybutyrique par distillation. Néanmoins, la distillation de cet extrait pour obtenir l'acide libre est accompagnée d'une décomposition considérable du produit, et la stabilité du produit obtenu n'est 15 pas parfaite : au repos, l'acide libre se condense lentement et sa déshydratation est catalysée par les acides. Il est donc recommandable d'isoler le produit sous forme de dérivé plus stable que l'acide lui-même, par exemple sous forme d'ester ou de sel. On a donc intérêt à transformer l'acide en ester ou en sel, puis à isoler ce dérivé par un moyen usuel. On peut préparer les esters de 20 l'acide hydroxyisobutyrique à partir d'un alcool, avantageusement à partir d'un alcanol inférieur, en utilisant un catalyseur d'estérification convenable, tel que le borotrifluorure d'éthyle. Parmi les sels stables de l'acide hydroxyisobutyrique, on peut citer les sels de métaux alcalins, de lithium ou de potassium, par exemple, de métaux alcalino-terreux, de calcium ou de baryum, par 25 exemple, ou encore les sels de nickel. Les exemples suivants illustrent, l'invention. EXEMPLE 1.- On fait une série de fermentations dans des fioles Morton de 125 ml, contenant 25 ml d'un milieu nutritif aqueux stérilisé, ayant la composition suivante : TABLEAU I 30 Milieu de culture contenant de l'acide isobutyrique Granmtes/litre d'eau (NH4)2S04 2,0 Extrait de levure (provenance "Difco") 0,2 MgS03, 7HzO 0,25 FeS04, 7H20 0,029 MnS04, 7H20 0,017 NaCl 0,006 ZnS04, 7H20 0,0006 CaCl2, 2H20 0,0001 Acide isobutyrique 0,5 à 150 69 14757 2008078 On ajuste le pH du milieu nutritif par addition d'hydroxyde de potassium et on ensemence des échantillons de 125 ml de ce milieu avec un des microorganismes indiqués au tableau IJL La concentration de l'acide isobutyrique séché varie de 5/1000 à 15/100. On utilise pour ensemencer un des supports de 5 l'acide isobutyrique la culture ayant la concentration immédiatement inférieure. Chaque fermentation est faite à 25°C-300C. On agite constamment les bouillons de culture et on fait barboter de l'air dans ce milieu agité. Le pH pendant la fermentation monte à 8,5, puis on le maintient entre 8,0 et 8,5. Pendant la fermentation, on centrifuge des échantillons des bouillons de 10 culture pour éliminer les cellules bactériennes et les autres résidus, et on analyse le résidu pour doser l'acide L(+)-p-hydroxybutyrique. Les résultats sont consignés au tableau II. TABLEAU II Acide~L(+)-p-hydroxybutyrique formé (en g/1) Organisme pour une concentration en centièmes du support en acide isobutyrique égale à Durée de la culture au 0,5 2 4 8 ÎO 15 moment de l'analyse $ > 24 h 24 h 72 h 72 h 72 h 96 h Arthrobacter crystallopietes 0,1 faible pas de croissance--— croissance Mycobacterium phlei 0,2 -d°- . -d°- Mycobacterium sp. 0,4 0,7 faible pas de croissance croissance Pseudomonas fluoréscens trace 0,7 -d°- -d°- Pseudomonas putida 1,8 1,6 -d°- -d°- (ATCC N° 21 244) Arthrobacter oxydans 0 2,6 Hj5 7,2 5,2 3,3 (ATCC N° 14 358) On dose par chromatographie en phase gazeuse l'acide p-hydroxyisobu-15 tyrique en opérant comme suit. On commence par sécher l'échantillon par congélation, puis on transforme-celui-ci en dérivé triméthylsilylé, qu'on soumet a la chromatographie en phase gazeuse en utilisant le dodécane comme étalon interne. On mesure les aires sous les pics de chaque composant et on calcule le rapport de ces aires. Ce rapport est fonction de la teneur en acide p-hydroxy-20 isobutyrique et on utilise une courbe d'étalonnage. On obtient des résultats analogues quand on remplace l'acide isobutyrique par d'autres acides alcanoïques tels que l'acide isovalérique ou l'acide capro'ique : on obtient les dérivés p-hydroxylés correspondants. Aux exemples qui suivent, les concentrations en acide isobutyrique sont 25 obtenues par extraction sélective de l'acide par du sulfure de carbone et 69 14757 ' 2008078 dosage par spectrophotométrie dans l'infrarouge. EXEMPLE 2.- Production d'acide L(+)-B-hydroxyisobutyrique par des cultures en cours de croissance On fait plusieurs essais de fermentation dans un appareil en acier 5 inoxydable, ayant une capacité de 15 1 : l'air arrive dans l'appareil par un unique orifice placé sous un agitateur à six pales, un autre agitateur étant disposé à mi-hauteur sur l'arbre de l'agitateur. On inocule 11,5 1 du milieu nutritif décrit à l'exemple 1, contenant 2/100 d'acide isobutyrique, avec un litre d'une culture de Pseudomonas putida 0 (ATCC N° 21 244) cultivée pendant 48 h sur un milieu nutritif analogue. Cette première culture a été d'abord inoculée avec un milieu de culture contenant 5/1000 d'acide isobutyrique qui est, lui-même, inoculé directement à partir d'une culture en tube incliné. Les fermentations finales (sur 11,5 1) sont faites à 26°C-28°C, la vitesse d'agitation étant de 600 tr/mn, le débit 5 d'aération étant de 0,26 WM (le sigle WM signifiant : volume d'air par volume de bouillon de culture et par minute). La mousse est réglée automatiquement par addition d'un agent tensioactif anti-mousse, "Antifoam C", vendu aux Etats-Unis d'Amérique par la firme Dow Corning. Les résultats obtenus sont consignés au tableau III. 0 TABLEAU III Durée totale de Acide isobutyrique Acide L (+)-^-hydroxyisobutyrique l'essai (en h) subsistant (en g/1) formé (en g/1) 24 10,5 4,0 23 5,0 5,1 22 6,5 4,3- 23 6,5 3,8 22 6,2 4,2 26 3,2 EXEMPLE 3.- Production d'acide L(-t-)-6-hydroxyisobutyrique par des cellules au repos On recueille par centrifugation à 0°C-5°G les cellules obtenues dans la culture en croissance de Pseudomonas putida (ATCC Ne 21 244) obtenue à l'exemple 2 dans l'appareil de fermentation de 15 1 ; on remet ces cellules en suspension dans un milieu concentré cinq fois et contenant 1/100 d'acide isobutyrique (neutralisé par de l'hydroxyde de potassium et ajusté à un pH compris entre 8,0 et 8,5 par addition de carbonate de potassium), 2/1000 de glucose et 2/1000 de phosphate dipotassique» On dilue ce milieu concentré, contenant les cellules en suspension, jusqu'à un volume total de 10 1, et on l'aère, à raison de 0,10 WM, en agitant à 300 tr/mn, à la température de 28°C. On maintient le pH entre 8,0 et 8,3 par addition d'acide chlorhydrique normal 69 14757 2008078 au moyen d'un régulateur automatique de pH. Les résultats obtenus sont consignés au tableau IV. TABLEAU IV Durée totale de Acide isobutyrique Acide L(+)-p-hydroxyisobutyrique l'essai (en h) subsistant (en g/1) formé (en g/1) 23 2,6 4,4 23 3,0 4,2 27 0,8 7,0 29 0,8 4,1 EXEMPLE 4.- Production d'acide L(+)-B-hydroxyisobutyrique par cultures en ^ phase de croissance stationnaire Les conditions d'inoculation et de croissance sont celles de l'exemple 2. Quand ta croissance maximale est atteinte (généralement après 22 h), on réduit la vitesse d'agitation à 300 tr/mn, et on réduit l'aération à 0,10 WM. Quand la concentration en acide isobutyrique diminue à moins de 1 g/1, la fermenta-10 tion s'arrête. Les résultats sont consignés au tableau V. TABLEAU V Durée totale de Acide isobutyrique Acide L(+)-p-hydroxyisobutyrique l'essai (en h) subsistant (en g/1) formé (en g/1) 43 0,7 8,4 46 0,8 - 9,3 47 0,0 6,0 69 14757 11 2008078 REVENDICATIONS 1. Procédé de préparation d'un acide L(+)-p-hydroxyalcanoïque par oxydation d'un acide alcanoïque ayant de quatre à six atomes de carbone et au moins un atome d'hydrogène fixé à l'atome de carbone en position caractérisé 5 en ce qu'on opère par réaction microbiologique en présence d'un microorganisme choisi dans le groupe formé par Pseudomonas putida, Pseudomonas fluorescens, Arthrobacter oxydans, Arthrobacter crystallopietes et Mycobac-terium. 2. Procédé conforme à la revendication 1, caractérisé en ce que l'acide alcano- 10 ïque qu'on oxyde est l'acide isobutyrique . 3. Procédé conforme à la revendication 2, caractérisé en ce qu'on oxyde l'acide isobutyrique par un microorganisme en cours de croissance. 4. Procédé conforme à la revendication 1, caractérisé en ce que l'oxydation du dit acide alcanoïque comprend la fermentation d'un milieu dans lequel les 15 dits microorganismes peuvent se développer ou subsister à l'état de repos. 5. Procédé conforme à la revendication 2, caractérisé en ce qu'on cultive les dits microorganismes dans un milieu nutritif aqueux dans des conditions aérobies, en culture submergée, jusqu'à croissance maximale de ces microorganismes, et qu'on ajoute alors de l'acide isobutyrique au milieu de fer- 20 mentation. 6. Procédé conforme à la revendication 5, caractérisé en ce qu'on sépare les microorganismes du milieu de culture quand leur croissance est terminée et qu'on ajoute ces microorganismes à un milieu aqueux contenant de l'acide isobutyrique, dans des conditions aérobies. 25 7. Procédé conforme à l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que le microorganisme utilisé est Pseudomonas putida, conservé sous la référence 21 244 à Washington, aux Etats-Unis d'Amérique, ("American Type Culture Collection"). 8. Procédé conforme à l'une quelconque des revendications précédentes, caracté- 30 risé en ce qu'on cultive le microorganisme dans un milieu nutritif aqueux dans des conditions aérobies en présence d'acide isobutyrique, à un pH compris entre 7,0 et 9,5 , à température comprise entre 25°C et 30°C, et qu'on récupère de l'acide L(+)-[i-hydroxyisobutyrique.