FR 2000751 A1 19690912 FR 6901410 A 19690124 69 01410 1 2000751 la présente invention concerne un procédé de fermentation aérobie pour la production d'acides aminés extra-cellulaires qui utilise, comme source primaire de carbone, une charge d'hydrocarbures n-aliphatloues --n à C^f avec un milieu aqueux contenant des 5 sels minéraux p^ur 1? croissance et un micro-organiome capable de croître sur cette r-h-trge ■" ' hyor..carburesn-aliphatiques, le procédé étant con'luit en ,-.onc3 cellulose. Il est oréférable que l'hy-drocaxbure n-aliphatiqua soit la source unique de carbone dans le présent procédé, la charge d'hydrocarbure n-aliphatiaue préférée é-10 tant constituée principalement ds n-paraffines en 0^ à C^q. Grosso modo, la pr':.rente invention concerne donc un procédé de biosynthèse n;.ir fermentation, pour la production de concentrations élevées d'acides aMinés extra-cellulaires, aussi bien que l'utilisation des cellules résiduelles pour l'alimentation des animaux: 15 et des êtres humains. Plus particulièrement, la présente invention conQerne l'utilisation d'une charge d'hydrocarbures n-aliphatiques en à C^q, particulièrement des n-paraffines en à C^q comme source primaire de carbone selon le présent procédé. Conformément à la présente invention, on met en contact des n-paraffines en à 20 O^q avec un micro-organisme dans des conditions de fermentation, en présence de cellulose pour produire des rendements élevés en acides aminés extra-cellulaires. On peut conduire ce procédé en continu ou par charges discontinues. Jusqu'à présent ., la production microbiologique des acides a-25 minés, comme la lysine, l'.cide glutamique, l'isoleucine, la vali-ne, etc, exigeait l'utilisation de substrats de précurseurs à base d'hydrates de carbone coûteux, que l'on devait ajouter au "bouillon de fermentation. En outra, les rendements en acides aminés extra-cellulaires ont été faibles et la vitesse d'accumulation du produit, 30 très lente. TJne outra technique récente, et même plus prometteuse, pour la synthèse biologique d'c.eiûes. aminés extra-cellulaires et de protéine alimentaire- est l;-i culûure de micro-organismes sur des substrats dérivant du pétrole. Ce type de fermentation est ordinaire-35 ment conduit dans un bain do biosynthèse aqueux, contenant une charge d'hydrocarbure, un inoculum du micro-organisme à cultiver, un milieu de culturc aqueux, de l'oxygène, de l'azote et autres a--gents nutritifs indispensable;s Cette technique permet l'utilisation de charges hydrocarbonées qui sont largement disponibles dans 4-0 les quantité a qui sont nécessaires, et sont moins coûteuses que Fb&d o?:r,M il 69 01410 2 2000751 les hydrates de carbone. On sait également utiliser divers catalyseurs biologiques dans les procédés de fermentation, le procédé de biosynthèse selon la présente, invention est applicable à la biosynthèse de tous les micro-organismes qui sont capables de croître sur 5 des charges en hydrocarbures n-aliphatiques en à c30' particulièrement des n-paraffines en à C^q dérivées des fractions hydrocarbonées du pétrole. Bien quo la présente invention soit applicable à un large cadre do micro-organismes bactériens utilisables, il existe un certain 10 nombre'de micro-organismes qui sont spécialement appropriés à l'assimilation des hydrocarbures. Ces micro-organismes sont portés au Ta.b3.sau I ci-après, ainsi que leurs numéros d'enregistrement à 1'-A.T.C.C. qui ont été obtenus par la dépôt d'échantillons àl'Ainéri-can Type Culture Collectionn,212 M Street, Northwest, Washington 7, 15 D.C., ou d'autres nombres désignés. Le Micrococcus cerificans (14 987)» qui a été isolé et identifié par le Dr. R.E. KALLIO et ses collaborateurs : "Journal of Bac teriology?»- volume 78, n° 3» pages 441-448 (septembre 1959) » est particulièrement intéressant. En voici d'autres caractéristiques 20 d'identification: Morphologie : les cellules sont petites, Sphériques, tendant à être elliptiques dans les cultures âgées et des milieux riches en azote. Des cellules provenant d'un milieu défini ont en moyenne de 25 0,5 à 1,0 micron de diamètre et, à partir d'un milieu complexe elles ont des diamètres cellulaires moyens de 1,0 à 2,0 microns. les cellules se présentent isolées ou on grumeaux. On n'observe pas de granules immobiles, métachronetiques et de granules pseudo-anophiles. Division Classe Ordre TABLEAU I Famille G-enre ijspeoes Protophyta-Schizomycetes-Pseudomonad^lGs——Pseudomonadaceae—Pseudomonas -EubacterialGS ■ -Micrococosceae—p-Micrococcus I—Sarcina—-— —Li^ust ri—— -Pstudomallei- —Orvir la — Oevilicans Sp —Br e vib acteriacs ae-Br e vib ac t er ium ._I ns e et iphil ium I h'palii ■— Achromobacteracea-Alcaligens ■— Sp ~ -L-Corynebacteriaceag-Cell-omonas , G-U-'ba •Corynebacteri'am, , Sp _Actinomycetaie s Mycobact eriacsae. |. „.Act inomyc ot ac e ae. Lp auoomet ab olum Arthrobacter-i Simplex I Sp MycobactGrium Rhclehrous Nocardia —1 3p — -Sp- No.ATCO -15522 -15523 —15524 —14987 -QKB1518 ïïafcick —15528 -•4 5527 -15525 r—15526 -15529 ' — 15530 - 6946 -19140 O O o —a -C* o O) KJ O O O Cn 1 69 01410 ^ 2000751 4 Réaction de G-ram : Négative* Les colonies sur agar-a'gar défini sont petites (1 mm), circulaires, convexes présentant un bord complet. Des colonies sur gélo-5 se nutritive sont plus grandes (2 mm à 5 mm), mucoïde saillant, généralement rond. Dans une espèce, il puut y avoir plusieurs souches différentes comportant des variantes et des mutants naturels ainsi que des mutants induits. 10 Les caractéristiques morphologiques et do réaction de crois sance des autres micro-organismes énumérés ci-dessus, sont donnés par le "brevet des Etats-Unis d'Amérique N° 3.308.035. Les milieux de culture comportent un milieu aqueux contenant des sels minéraux et un excès d'oxygène. L'oxygène est fourni au mi-15 lieu de substrat de culture ou au bouillon, sous toute forme susceptible d'être assimilée facilement par le micro-organisme inoculé. On peut aussi utiliser des composés contenant de l'oxygène pour fournir l'oxygène dans la mesura où ils ne présentent pas d'effet défavorable sur la culture des micro-organismes et sur la conversion 20 de la charge d'hydrocarbures oxydés en cellules du micro-organisme. On peut fournir 1'oxygène sous forme de gaz contenant de 1'oxygène, tel que l'air sous la pression atmosphérique ou supérieure, ou d1air enrichi en oxygène dans lequel la concentration en oxygène peut aller jusqu'à 70 $ à 90 En général, on fournit au réacteur entre 25 environ 0,1 et 10, de préférence entre 0,8 et 2,5 volumes environ d'air par minute, par volume d^ liquide dans la cuve de fermentation. L'azote est essentiel à la croissance biologique. La source d'azoto peut être un composé quelconque contenant de l'azote, orga-30 nique ou minéral, qui est capable de libérer do l'azote sous 'une fore; appropriée à l'utilisation métabolique par le micro-organisme cultivé. D>s composés organiques appropriés de l'azote sont par exemple des protéines, des protéines hydrolysées par acides, des. protéines digérées par enzymes, un acide aminé, un extrait de le-35 vure, l'asparagine et l'urée. Des composés minéraux de l'azote appropriés sont l'ammoniac, l'Iiydroxyde d'ammonium, l'acide nitricrue ou ses sels comme le phosphate d'ammonium, le citrate d'ammonium, le sulfate d'ammonium, le nitrate d'ajumonium et le pyrophosphate acide d'ammonium. Un procédé très commode at» satisfaisant pour 40 fournir de l'azote au procédé consiste à utiliser l'hydroxyde d'am- 69 01410 5 2000751 monium, le phosphate d1 ammonium ou le phosphate acide d1 ammonium que l'or> Tout ajouter comme col, par lui-même ou bien qu'on peut p .-O'luire in^aitu., dans le milieu de fermentation aqueux, par barho-t.-.ge dj giz avunoni - c ou d'a1.2aonip.qu2 gazéifiée dans le bouillon ou 5 on injcotant d'j l'hydroxydo c".1 enaaoniun aqueux dans le bouillon, auquel on a préalablement ajouté r.n l'acide phosphorique, ce qui forme ainsi du phosphate acid 3 d'.an/uoniuin. De cette façon, on conserve la gamme d'e.aviron 3,0 à 8,5 voulue pour le pH et l'on fournit la quantité requise d'azote. Si le 10 micro-organisme comporte une levure, le pH préféré est compris entre 3,0 ot 7,5, par exemple de 4,0 à 5,0. Si le micro-organisne comporte une bactérie, le pH désiré est compris entré 5*0 et 8,5 et par exemple de 7»0 environ. On peut fournir l'hydroxyde d'ammonium au bain de biosynthèse en des quantités comprises entre 0,08 et 0,20 15 environ, de préférence entre 0,1 et 0,15 gramme environ d'azote par gramme de cellules sèches produites. Ceci donne entre 0,01 et i:0% en poids environ, de préférence entre 0,1 et 0,15 $ en poids environ d'azote calculé sur le total de bain de biosynthèse. Bn plus des 1' oxygène et d" 1' azote, il est nécessaire de feur-20 nir des quantités requises d'aliment s minéraux choisis au milieu d'alimentation de façon à assurer une croissance appropriée du micro-organisme et rendre maximale l'assimilation de l'hydrocarbure oxydé - par lis cellules du micro-organisme. Le potassium, le sodium, le fer le ma-mésium, le calciun, le manganèse, le phosphore et au-25 très amonts nutritifs, sont inclus dans le milieu de culture aqueux. Ces matières nécessaires peuvent ôtre fournies selon une technique quelconque mais sont fournies cle préférence par leurs sels hydroso-lubles. Le potassium peut 3tre fourni sous forme de chlorure de po-30 tassium, phosphatj de potassium, culfato de potassium, citrate de potassium, acétate de potassium et nitrate de potassium. Le fer vfc le phosphore peuvent être fournis sous la forme de leurs sulfates et phosphates tels quj 1j sulfate de fer et le phosphate de fer. Ordi-nairenrnt, la ma. j euro p?rtio du. phosphore est fournie commo phos-35 phatc-s d'ammonium. Lorsqu'on utilise le phosphate d'ammonium ou le phosphate acide d'ammonium, il sert de source combinée fournissant à la fois l'azote et le phosphore, pour 1? croissance de la cellule de micro-organisme. Une composition satisfaisante pour un milieu de fermentation, 40 particulièrement pour dos bactéries au début de la fermentation, est le suivant : 69 01410 2000751 Concentration (g/litre) Composant Peut être Utilisation UtilissHm utilisé habituelle uréférée hydrocarbure, n- ■ &1 îpllQ-tî i QU6 4-120 5-80 10-50 en C^-Cjq 5 Cellulose * 2-60 2.5-40 5-25 E^HPO^ 0,5-15 1-10 2-8 (hh4)2hpo4 5-15 7-13 8-12 1^a2^04 0,1-1,0 0,2-0,9 0,3-0,8 PeS04 ; 7 HgO 0,002-0,5 0,005-0,04 0,01-0,03 10 MgS04 i 7 ^0 0,1-0*7 0,2—0,6 0,3-0,5 MnS04 i 7 B^O 0,002-0,05 0,005-0,04 0,01-0,03 KaCl 0,002-0,05 0,005-0,04 0,01-0,03 Eau couplément pour faire 100 ?o en poids. * La cellulose est de préférence en bandes d'environ 3,1 à 51 mm de 15 large et de 12,7 à 152 mm de longueur. Des bandes intéressantes dé- sirables ont 6, 3 mm de large et 25 mm de long» D'autres agents nutritifs facultatifs que l'on peut inclure à l'état de traces comprennent « • Concentration (mg/litre) 20 Composant Peut être Utilisé Utilisé de utilisé habituellement ■préférence ZnS04 ; BjO 0-0,4 0-0,3 0-0,2 NagMoO^^ i HgO 0-0,06 0-0,05 0-0,04 CoClg 0-1,2 0-1,1 0-1,2 25 H5B03 0-0,08 0-0,07 0-0,06 CuS04 i 5 HjO 0-0,3 0-1,25 0-0,2 CaClg i 6 HgO 0-0,14 0-0,13 0—0,12 NiClg ; 6 HgO 0-0,01 0-0,008 0-0,006 Les agents nutritifs es isontiels et facultatifs peuvent être 30 fournis sous la- forme d'autres sels ou acides que ceux indiqués ci- dessus. Un milieu très satisfaisrjit est préparé comme suit i Milieu P, •1 35 (nh4)2hpo4 EgHPO^ g/litre d'eau d'alimentation 10 5 0,5 69 01410 2000751 7 A ce qui précède on ajoute 10 cm^/litre d'une solution saline A préparée comme suit ï Sel g/litre Solution A Eau distillée 5 HgSO^THgO 40 PeS04.7B^0 2 MnSO^.^O 2 HaOl 2 Le milieu précédent a un pH de 7» 8. Une variante du précédent est 10 un milieu dans lequel le phosphate est fourni sous la forme d'acide phosphorique. La température du bain de biosynthèse peut varier entre 20° et 55°C environ, en fonction La sourca de carbone, de ■préférence la source unique de carbone poux- le procédé de fermentation est une charge d'hydrocarbure n-20 aliphatique. La charge ' hydrocarbure n-aliphatique contient environ 1 à 30 atomes de carbone dans la molécule, de préférence 11 à 30 a-tomes de carbone. Une charge d'hydrocarbures n-paraffiniquesintéressante contient environ ds 11 à 20 atomes de carbone dans la molécule telle qu'une charge ayant la composition suivante : 25 Paraffines à chaîne droite Mélange (substrat A) Poids $ C13 1,6 Cu 4,8 C15 32,3 30 Cl6 29,8 C17 22,6 °18 8*1 Oj çj 0*8 100,0 35 Moins de 0,01 de corps aromatique. La récolte dos cellules Microbiennes et d ;s acides aminés accumulés dans le bouillon do fernsntation peut Stre .faite par des dispositifs appropriés. On peut d'abord séparer les cellules du bouillon de fermentation par centrifugation (par example en cuvette 40 close), par cyclones pour liquides ou hydrocyclones, par évaporation 69 01410 2000751 8 (par exemple pellicule tombante, pellicule essuyée), par filtration (par exemple sur micropores, ' par dialyse, par osmose inversée), floculation, repos et décantation (par exemple on ajoutant des flocu-lants, des coagulants ou des auxiliaires de filtration ou en variant 5 le pH ou la température), ou pal' toute autre t y clinique de séparation ou combinaison de techniques, las c.Xlules séparées et concentrées peuvent alors être séché es, par séchage par pulvérisation, séchage sur tambour, lyophillisation, séchage sous vide, séchage en cuvettes séchage au four ou tout autre processus de séchage ou combinaison 10 de procossus pour obtenir un produit final présentant une teneur en protéine extrêmement élevée et aucune impureté défavorable pour les animaux et les *tros humains. Les acides aminés accumulés dans le bouillon peuvent être récupérés par cristallisation fractionnée ou évaporation (par exemple 15 par pellicule tombante, pellicule essuyée,) séchage par pulvérisation, séchage sur tambour, lyophillisation, séchage sous vide, séchage en cuvettes,séchage au four. Un autre procédé général de récupération serait l'adsorption des acides aminés sur des résines é-changouses d'ions, suivie d'une élution sélective. 20 La cellulose est de préférence des "bandes d'acétate de cellu lose ou des sachets de cellulose qui sont préparés par traitement do pâte de bois par.l'acide acétique, l'anhydride acétique et l'acide sulfurique comme catalysorr. La cellulose est complètement acé-tylée (trois groupes acétate par notif de glucose) et, en même temps 25 1'acide sulfurique provoque la dégradation du polymère de cellulose do sorte que le produit no contient environ que 200 à 300 motifs de glucose par chaîne polymère. A ce point dans le procédé, l'acétate de cellulose est partiellement hydrolysé par addition d'eau jusqu'à ce que demeurent de 2 à 2,5 groupes acétate par motif de glucose. 30 Ce produit est une matière thermoplastique. Ainsi qu'on l'a souligné ci-dessus, des résultats intéressants et inattendus sont fournis par l1addition de bandes de cellulose ou de sachots de cellulose au processus de fermentation, en ce que la production des acides aminés ext ra-collulp ire s en est nettement aug-35 mentée. La présente invention peut être plus aisément comprise en se référant au dessin annexé qui on illustre l'une des formes de mise en oeuvre.-En se référant spécifiquement au dessin annexé, on voit un récipient ou flacon 10 contenant un bouchon/comportant 2 trous, 4-0 On insère un tube do verre 3 dans le bouchon 1, auquel est attaché 69 01410 2000751 9 à la partie supérieure un tampon amovible 2, et à l'extrémité inférieure, un sachet de cellulose 4. On place une solution concentrée de sel P.j 5, à l'intérieur du sachet de cellulose 4, qu'on place à l'intérieur de la solution saline avec le substrat A 6. 5 Pour permettre à'illustrer encore davantage la présente inven tion, on effectue des fermentations selon les exemples suivants : EXEMPLE 1 On conduit un processus do fermentation stérile aérobie dans l'appareil tel qu'illustré au dessin annexé. On ajoute 20 ml d'un 10 concentré 5 X stérile de milieu de sels P^ dans un sachet de cellulose. On introduit 80 ml d'une solution salins stérile à 0,85 contenant 2,0 ml du substrat A dans le ballon. On inocule la solution saline avec un inoculum. à 1 fo de Hicrococcus cerificans AT OC n° 14 987 que 1'on a cultivé sua? substrat A pendant 24 heures et 15 l'on conduit la fermentation dans un agitatsur mécanique rotatif à 300 tours minute à 30°0 pendant 72 heures. On prélève périodiquement des échantillons de bouillon î on sépare alors par centrigugation les cellules bactériennes et los autres impuretés, ut l'on détermine la quantité d'acides aminés extra-cellulaires dans le centrifugat 20 limpide, à l'aide des procédés de titrage suivants. Une de ces séries de procédés de titrage est décrite dans"la seconde édition de "Microbiological Assay of the Vitamin-B-complex and amino acida" (1952)*, par E.C.3ART01T, WRIŒïZÎ, Pitman Publishing Company, New York, N.Y. Une autre technique de titrage utilisée est le "Technicon Auto 25 Analyzer" qui fournit tin système analytique automatique basé sur un systène de chromâtographie par échange d'ions, établi par SPACKMAN, M00EE & STEIÎT. On obtient les résultats ci-après. Production décides aminés extra-cellulaires en utillsg-nt Micrococcus Oerificans f14987) mg/l d'acides aminés A Alanine Allo-I solaucine Arginine Acide asparoique Acide cystwiqua Cystine Acido glut,?.nique Glycine • Histidine Isolouoin,? Leucine Lysine Méthiénino Méth. ( suif o,-ïyc] s ) Ornithine Phényla lanine Proline Sérine Thréonine Tyrosine Yaline Total d'acidea aminés ag/l û Conditions de fermentation Inoculum "Mi cerif icans "(ml) 0 Substrat A (ml) 2,0 Sachet de cellulose oui Durée de fomentât ion (jours) 3 P = présent à l'état de tracs. M/ +> +• â 9 W S 1,0 0 oui 3 • 17 3.720 78 2.850 49 ' - 4.610 720 p .760 840 18 té 520 87 780 60 1.810 21 4.120 109 2.540 68 4.610 260 210 260 P p p 24 7.090 123 5.640 87 G.260 29 3.070 144 2.030 78 3.160 1.300 p 970 p 2.680 1.370 p:. 450 p 1.830 7 2.910 34 870 p 2.390 3.650 p 2.660 p 3.970 80 p P p p 5 440 25 440 10 920 5.100 p 3.640 2.1°-0 5.440 124 4.680 268 3.790 25 1.240 950 1.80C 19 4.260 94 1.850 80 3.250 7 2.140 34 1.240 p 2.350 590 p 100 92C 10 2.350 50 1.230 P 2.490 182 51.370 902 33.890 700 52.050 1,0 1,0 1,0 1,0 1,0 1,0 2,0 2,0 2,0 2,0 2,0 2,0 non oui non oui non oui 1 1 2 2 3 3 69 01410 2000751 n EXEMPLE 2 On effectua dos opérations supplémentaires de fermentation aérobie, en utilisant des bandes do cellulose. On conduit une série de trois fermentations stériles dano dos flacons de fermentation de 500 5 ni contenant 100 r,:l du milieu P.,, 2,0 ml du substrat A et 1,0 g de bairu Le C ellulose (6,3 x 2^ mm). On inocule le milieu avec un ino- culin à 1 £ ds I-îi cr o c o c en ; cerif icans ATCC n° 14987. On oonduiib. les forcc stations dans un agitateur oécanique rotatif à 300 tours/minute à 300°0.' L-.?e flacons de fomentation sont enlevés périodiquement a-10 près 1, 2 et 3 jours, et le bouillon est récolté et titré comme à l1 exen.plc 1. Les résultats sont opposés au Tableau III JA3I34JT III Durée de la fermentation Acid-; -sine 15 Allo-isoleucine Alanine Arginine Acido aspartique 20 S Amino-acides Acide glutanique Glycine Leucine Histidine 25 Isoleucine Ornithine Phénylalanine Proline Sérine 30 Tyrosine Yaline 1 jour ry,7l 868 2.555 854 2.932 202 4.619 1.914 1.056 1.321 662 2; 398 4; 071 731 U332 243 1.345 2 jours Total 758 3.610 869 3.758 905 4.635 4.733 1.286 1.152 907 1.444 5.735 924 1.690 523 1.243 34.172 3 jours w/1 584 2.710 389 1.860 562 3.116 2.783 374 977 246 1.577 3.235 360 1.090 124 553 20.540 27.103 D'après ce qui précède, il est évident que la cellulose (sachet ou bandes) augmente nettement les rendements en acidus aminés de-hau-35 te qualité. 69 01410 2000751 12 REvaifflig^iGiis 1 ; Procédé de f arment-at ion pour la production d'acides ami.. , ext r a-c c-llulair e s caractérisé ôn cg que l'on utilise une fraction d'hydro^-r^ur-s 5. j.pétrole dons un bouillon comportant un milieu 5 aqusux de sels minéraux do ^eoissanco, un gaz contenant de l'ox;/ ;' -ne, vua micro-organisce bactérien capable de croître sur cetta frac tion "1 hydrocarbures, en piv ; hvîo 03 cellulose et dans des conditions de- fomentation adapté33 pour favoriser la croissance, ce i a... assure un rendement ~lové en acides aminés extra-cellulaires. 10 2. Procédé t.il que défini selon la revendication 1, caracte ■- sé on co ÇU3 la fraction d! .r'ir-iC-.-trburss comporte essentiellement des p-.raffines normales en 0'. à C^q. 3. Procédé tel qu3 dé fini.'selon la revendication 2, caractérisé en ce que la fraction kTr.rocprboniês conprend des paraffines 15 normales en à et 1? fraction en 0^ à excède 80 en poids. 4. Procédé tel que défini selon 1-? revendication 1, caractérisé en ce que la cellulose choisie consiste en bondes d'acétate cellulose et en sachat s do cellulose, qui sont préparés par trait3- 20 mont de pulpe ou pâte de boio avec un acide. 5«Procédé tel que défini selon la revendication 4» caractérisé en ce que la cellulose st totalement acétylée. 6. Procédé tel que -éfini selon la revendication 1, caractérisé en co que le r,iicro-organie'.io set une bactérie l'iicrococcus ceri- 25 f icans L2Q0 n° 14987 et on co quw le pHest conservé dans la garnir" de 5,0 à 8,5» et en ce qu;i 1 x teripérature est conservée dans la é.--me do 25 à 45°0 environ. BAD ORIGINAL