FR 2008064 A1 19700116 FR 6914660 A 19690507 69 14660 1 2008064 La présent» Invention est relative à un procédé de production d'acide L-glutamique, de levure et d'autre^feubstanees utiles dans lequel on utilise un milieu de culture contenant des hydrocarbures, tels que des fractions de pétrole, une huile pa-5 raffinique et des paraffines normales (ou n-paraffines) comme source d'hydrocarbure. Elle concerne également un procédé de production d'acide L-glutamique, de levure et d'autres substances utiles avec un rendement satisfaisant, qui consiste à ajouter des fractions d'hydrocarbures à point d'ébullition élevé au 10 début de la culture, et ensuite des hydrocarbures contenant des fractions à point d'ébullition inférieur qui sont utilisées dans la culture* En général, en ce qui concerne le développement de microorganismes sur des hydrocarbures servant de source de carfeo-15 ne, il a été mentionné que les n-paraffines ayant 10 à 13 atomes de carbone ou des fractions du pétrole contenant de telles a-paraffines possèdent une activité faible pour cette croissance et que l'on ne peut pas obtenir de bons résultats quand on produit l'acide I-glutamique, l'inosine ou une levure. Par exemple, 20 ce fait a été mentienné au sujet des mioroorganismes producteurs d'acide glutamique dans "Journal of Agricultural Chemical Society ef Japon" (ïippon Hogeikagaka KaIsha),vol. 40 (1), pages 26-32 (1956) et dans "Abstraots of Proceeding of the Annual Meetiftg ef Agricultarai Chemical Society of Japon" (Nippon Hegeikagaka-25 kai leenyoshiahu.) pages 370-371 (1968) $ au sujet de la levure» il a été mentionné dans "Agrioultural and Biological Chemistry* vol. 29 (9), pages 796 - 803 (1965), dans "Oil and Oil Chemistry (Sekiyu. to Sekiyakagaku) vol. 11 (11), pages 26-31 (1967), etc. Un procédé 4e production d'acide L-glutamique, de levure et 30 d'autres substances utiles avec un bon rendement, en utilisant des fractions de pétrole ou des n-paraffines dont les nombres d'atomes de carbone sont compris dans une gamme étendue, doit donc être mis au point pour obtenir les produits de fermentation à peu de frais à partir de bactéries ou de levures utilisant 35 des hydrocarbures# La demanderesse a cherché à réduire le'prix de revient de l'acide glutamique, de la levure et d'autres substances utiles en utilisant des n-paraffines ayant un nombre d'atomes de carbone faible ou des fractions de pétrole contenant de telles 40 n-paraffines, ce qui a posé un problème au point de vue teck-nique» 69 14660 2 2008064 On a ainsi constaté qu'il est possible de former des substances avantageuses de ce genre avec un bon rendement, en cultivant des microorganismes ou une levure sor des n-pàraffi-nes ou des fractions de pétrole contenant des n-paraffines à 5 titre de source de carbone, et en ajoutant ensuite dés n-paraffines ayant un nombre inférieur d'atomes de carbone ôtrbien des fractions de pétrole contenant de telles n-paraffines» On va maintenant décrire le mode de ûulture conformément à la présente invention. On inocule le microorganisme 10 Corynebacterium petrophilum. décrit dans le brevet japonais 67/510, dans un milieu de culture contenant du n-hexadéoane comme source de carbone principale, comme décrit dans le tableau 1, on le cultive en aérobie pendant environ 15 Meures, pais on ajoute 4,5 g/dl de n-paraffines ayant 8 à 13 atomes de oarbone 25 et, ensuite 50 U.I /ml de pénicilline #* On obtient 2,5 g d'acide L-glutamique par dl après 72 heures de culture* TABLEAU 1 n-hexadécane 0,4 g Sulfate ferreux 0,004 g sulfate d'ammonium 0,3 g Extrait de levure 0,2 g 20 Urée 0,8 g Eau courante 100 ml Phosphate mon»- ^ potassique 0,1 g Sulfate de magnésium 0,05 g Bans le milieu de culture donné dans le tableau 2, on inocale Candida petronhilom n.sp, qui a été déorit dans le brevet japonais 65/20666, on cultive pendant 15 heures et on ajoute 1,6 g/dl de n-paraffines ayant 10 à 13 atomes de oarbone» après quoi on cnltllra pendant encore 20 heures* La quantité de microorganismes séckés contenue dans le milieu de culture est de 2 g/dl. gABLEAU 2 n-hexadécane 0,4 g Sulfate ferreux 0,004 g. Sulfate d'ammonium 0,1 g Extrait de levure 0,1 g 35 Urée 0,2 g Eau courante 100 ml Phosphate menopo- tassique 0,1 g ^ . Sulfate de magnésium 0,05 g De tels procédés de production par culture d'acide L-40 glutamique, d'inesine et de levura avec un bon rendement, en 25 30 69 14660 3 2008064 utilisant des hydrocarbures ayant an intervalle d'ébullition inférieur, pourraient s'appliquer largement & d'autre» bactéries, telles que Corynebacterium hydrocarboclastas M 104 et Corynebac-teriom eleofils kp-6-1414, comme décrit dans le brevet japonais 5 68-6989. 11 a été confirmé qu'on peut ainsi adapter le matant n'exigeant pas d'adénine et provenant de Corynebacterium petrophilum pour la production d'inbsine, ainsi que Candida linolytièt ea. Candida tropicalis. îorulopsis petrophilum. à titre de levure utilisant des hydrocarbures, pour la production de levure» 10 On comprendra mieux l'invention à la lecture des exem ples suivants qui sont donnée uniquement à titre indicatif et non limitatif. Exemple 1 On introduit 50 ml du milieu de culture du tableau 1 15 dans un ballon de 500 ml et on cultive en secouant après avoir inoculé Corynebaoterium hydrocarboelagtns M 104. Après 15 heures, on ajoute 4,6 g de n-paraffines ayant 10 à 13 atomes de carbone et ensuite 30 U0I./ml det pénicilline G. La quantité d'acide glutamique formée dans le milieu de culture après 70 heures de cul-20 ture est de 1,5 g/dl» Par contre, on obtient seulement 0,5 g/dl d'acide L-glutamiqae quand on exéoute la fermentation de façon similaire, mais en ajoutant 4,4 g n-paraffines ayant 10 à 13 atomes de carbone avee 0,4 g/dl de a-hexadécane dès le début de la culture. 25 EXEMPLE 2 On produit de l'acide L-glutamique par le procédé décrit dans l'exemple 1. Au débat de la culture, on ajoute des fractions de pétrole contenant principalement des n-paraffines ayant 14 à 18 atomes de carbone, puis après 15 heures, on ajoute des n-30 paraffines contenant principalement 9 à 18 atoœes de carbone, o® qui détermine la formation d'acide L-glutamique. On obtient 1,9 g/ dl d'acide L-glutamique en utilisant des souches de Gorynebaot«-rium aleophilus. Exemple 5 35 On ajoute 10 mg/dl d'adénine au milieu de culture du tableau 1, qu'on cultive avec secousses après avoir inoculé le matant Corynebacterium petrophilum H* 1002 n'exigeant pas d'adénine. Après 15 heures, on ajoute 4,6 g de n-paraffine ayant 10 à 13 atomes de carbone» La quantité d'inosine formée dans le mi-40 lieu de culture après 70 heures est dé 0,25 g/dl. Par contre, 69 14660 4 2008064 cm n'obtient que 0,05 g/dl d'iassia® quand an exécute la fermentation de façon similaire, à cette exception qu'on ajouta an début de la cuitora 4,6 g de n-psœaffines ayant 10 à 13 atomes de carbone en mime temps que 0,4 g de n-hexadécane* 5 Exemple 4 On verse 5 1 du milieu, de culture du tableau 2 dans an ferœenteur d'une contenance de lu 1» On inocule ensuite Oandl&a tropicalis et on cultive à 30°0 , en agitant à une vitesse de 500 tours/minute et avec «se cadence d'aération de 10 5 1/min. Après 10 heures de cuitare, se ajoute des n-paraffines ayant 9 à 16 atomes de saxhorn* Ota obtient aiasi une levure qu'on recueille par séparation centrifuge et en séchant la solution de culture. On obtient environ 1 kg de levure pour 1 kg d5hydrocarbure ajouté. 69 14660 5 2008064 IlTEHDICif IOIS 1. Procédé de production de substances utiles telles que l'acide l-glutamique, l'inosine et une levure, avec un bon rendement, au sein d'un milieu de culture contenant des 5 hydrocarbures comme source de carbone principale, ce procédé étant caractérisé par le fait qu'on cultive une bactérie et une levure utilisant des hydrocarbures, qu'on provoque leur développement en utilisant au début de la culture une paraffine & chaîne droite ou des fractions d'hydrocarbures bouillant dans 1Q un intervalle d'ébullition supérieur et en ajoutant ensuite des fractions d'hydrocarbures à point d'ébullition intérieur, dont le nombre d'atomes de carbone est oompris dans un grand intervalle. 2. Procédé conforme à la revendication 1* dans 15 lequel les fractions d'hydrocarbures à point d'ébullition supérieur contiennent 14- à 18 atomes de carbone. 3. Procédé conforme à la revendication 1, dans lequel la fraction d'hydrocarbure à point d'ébullition supérieur est l'hexadécane 20 4. Procédé conforme à la revendication 1, dans lequel le nombre d'atomes de carbone de la fraction à point d'ébullition inférieur est compris entre 8 et 13» 5. Procédé conforme à la revendication 1, dan» lequel la bactérie est choisie dans le groupe comprenant Oervae» 25 bactorium petrophilum. Corynebacterium hydrocarboclastus M 104 Corynebacterium oleofils fcp-6-1414 et un mutant de Corinebacte-rium petrophilum n'exigeant pas d'adénine pour sa croissance* 6. Procédé conforme à la revendication 1, dans lequel la levure appartient au groupe que forment Candida petro- 30 philam n.sp, Candida lipolytica. Candida tropicalis et Toru-lopsis petrophilum. 7» Procédé conforme à la revendication 1» dans lequel le milieu de culture est constitué par des fractions de pétrole,oa par une huile paraffinique ou encore par une n-pa- 35 ra*fiae» 8. Procédé conforme à la revendication 7,: dans lequel le milieu de culture est une a-paraffine» 9. Procédé conforme à la revendication 7, dans lequel le milieu de culture comprend une n-paraffine et des fractions de pétrole contenant principalement des n-paraffiaes.'