FR 2001575 A1 19690926 FR 6902949 A 19690207 69 02949 i 2001575 la présente invention est relative à un nouveau protéase alcalin et à son procédé de production, ainsi qu'à des détergents et autres produits de nettoyage contenant un tel enzyme» 5 Au cours de recherches concernant l'obtention de pro- téases alcalins, la demanderesse a constaté que certains micro-organismes appartenant au genre Fusarium ou au genre Gibberella produisent un protéase alcalin qui montre une activité protéo-lytique puissante à un pH voisin de 11„ 10 En outre, il a été constaté que ce protéase dégrade activement diverses sortes de protéines dans un intervalle de pH élevé, même en présence d'agents tensio-actifs et/ou d'agents chélatants, ce' qui a suggéré son utilisation dans l'industrie des détergentso 15 Jusqu'ici, bien que certains enzymes aient été uti lisés en blanchisserie, on n'a pas toujours obtenu des résultats satisfaisantso l'une des raisons possibles de cet échec réside dans le fait que la solution de nettoyage est généralement à un pH supérieur à 8. Une autre raison réside dans le fait que 20 l'activité de l'enzyme est parfois inhibée par des agents tensio-actif s et/ou des agents chélatants contenus dans les détergents* Dans cet ordre d'idées, la demanderesse a poursuivi ses recherches et elle a finalement mis au point un procédé de 25 production d'un protéase alcalin puissant, à l'échelle industrielle, et de détergents ou autres produits de nettoyage contenant cet enzyme, qu'on appellera plus simplement "protéase alcalin" dans ce qui va suivre,, La présente invention a donc pour objet l'obtention 30 d'un protéase alcalin qui possède une activité puissante dans l'intervalle de pH compris entre 8 et 12, et en particulier entre 10 et 11,5, ainsi que de détergents et autres produits de nettoyagê contenant le protéase alcalin.» Pour atteindre les buts de la présente invention, on 35 cultive, au sein d'un milieu de culture, une souche d'un microorganisme producteur de protéase alcalin et appartenant au genre ffusarium ou au genre G-ibberella. Certains microorganismes typiques produisant le protéase alcalin sont les suivants : BAD ORIGINAL 69 02949 2 2001575 Fusarium oxysporum (IFO 5942) batatas (IFO 4468) Fusarium oxysporum f. gladioli H o 5894) Fusarium oxysporum f. lini (IFO 5880) Fusarium oxysporum f. neveum ( IFO 4471) Fusarium oxysporum f. lini vasinfectum (IFO 4472) Fusarium solani (IFO 52 32) Fusarium sp. S-19-5 (IFO 8884) Gibberella fu.iikuroi (IFO 5268) Gibberella saubine^-tix (IFO 6608) 10 ç Les nombres IFO entre parenthèses sont les numéros donnés aux cultures déposées à l'organisme "Institut for Fermentation", à Osaka, Japon. 15 Parmi ces microorganismes, la souche Fusarium. sp. S- 19-5 est l'une des plus utiles pour la production d'un protéase alcalino Cette souche a été isolée de la terre par la demanderesse et elle possède les caractéristiques microbiologiques suivantes : 20 (i) Caractéristiques de culture (24°C, 7 jours) 1. Bouillie au malt : Bon développement ; couleur blanche ; formation de pellicules floconneuses, envers plissé ; pigment pourpre écarlate dans le milieu,, 25 2o Agar au malt : Bon développement, couleur blanche et aspect floconneux ; hyphes aériens abondants ; envers plissé ; pigment pourpre écarlate dans le milieu. 3c Solution de Csapeck : 30 Bon développement, couleur blanche ; pellicules flo conneuses, envers plissé ; pigment sensiblement absent 4. Agar de Csapeck : Bon développement ; couleur blanche, aspect floconneux envers plissé ; pigment sensiblement absent. 35 5» Gélatine : •■ Bon développement, 'couleur blanche et aspect floconneux ; pigment pourpre noirâtre foncé sur l'envers ; liquéfaction faible". 6. Dextrose— nomme de terre" : BAD ORIGINAL 69 02949 3 2001575 Bon développement, couleur blanche et aspect floconneux ; surface irrégulière et surélevée ; envers plissé ; couleur blanche ou pourpre clair ; pigment pourpre libéré dans le milieu# 5 (2$ Caractéristiques microscopiques. Sur chacun des milieux ci-dessus, des conidiophores se développent à partir d'hyphes aériens, non ramifiés, de 10 à 60 jx de longueur et de 1,0 à 1,5 /U. de largeur, d'aspect hyalin» les conidies sont produites sur le sommet des conidiophores et 10 sont groupées en amas visqueux, de forme ovale ou réniforme, 1 ou 2 cellules, rarement 3 cellules, 3 à 8 ja. x 1 à 2jà. , aspect hyalin® Pas de caractéristique sexuelle„ les chlamydospores sont habituellement absents, mais existent parfois,, (3) Caractéristiques physiologiques : 15 lo Conditions de, développement : Concentration en ions hydrogène : se développe de préférence en milieu alcalin et à un degré optimal à un pH de 8 à 9. Température : température optimale d'environ 24°C ; peut se développer entre 15° et 28°C, bien que le dévelop-20 pement soit meilleur au voisinage de 15°C qu'à 28°C e Oxygène : pousse en aérobie. 2c Gélatine : légère liquéfaction. 3. Utilisation de l'alcool éthylique : Nulle 25 4. Dégradation de la pectine : très faible 5. Dégradation du tannin : Nulle 6. Dégradation des graisses et des huiles : Positive 7. Utilisation des hydrates de carbone : Utilise le maltose, le galactose, le mélibiose, le 30 saccharose, le tréhalose, le fructose, le mannose, le raffinose, la dextrine, l'amidon, le glucose et le lactose. Utilise très peu l'inuline, le xylose, l'arabinose et la cellulose. • Selon l'ouvrage "Dictionary of the Fungi" (G-.C. Ains»-worth, 5ème édition), ces caractéristiques microbiologiques mon-35 trent que cette souche particulière appartient au genre Fusarium, à la famille Tuberculariaceae, à l'ordre Moniliales. à la sous-classe Deutermycetes et à la classe Fungi Imperfecti. D'après la classification de Snyder & Hansen, la souche Fusarium est divisée en sections A-^ et Ag comme suit : 69 02949 4 2001575 A: développement de microconidies, habitue lie ment monocellulaireso -1g : développement de microconidies nul ou rare ; forme d'aiguilles, de virgule ou de haricots ; 5 mono- ou multicellulaires0 L'organisme Fusarium sp„ S-19-5 produit surtout des microconidies et peut être inclus dans le groupe Elegans de la section A„ Un microorganisme typique du groupe Elegans est Fusarium oxysporum et ce groupe comprend 36 espèces qui sont 2_q toutes des microbes pathogènes végétaux produisant des macroeo-nidies en abondance0 Toutefois, l'organisme Fusarium sp. S-19-5 ne produit que des microconidies dans la plupart des cas et la formation de macroconidies est très rare. Cette caractéristique démontre que l'organisme n'appartient à aucune des espèces de ce groupe connues jusqu'ici. Pour cultiver un microorganisme produisant des protéa-ses alcalines, on peut utiliser des milieux de culture et des conditions de culture classiques per se. 20 milieu peut être scus forme liquide ou solide. La culture peut être immobile, mais il est toutefois plus avantageux d'adopter des modes de culture avec secousses ou en aérobie. Dans la mesure où un microorganisme producteur de protéase alcalin peut pousser sur le milieu, ce dernier peut être 25 de n'importe quel type. Par exemple, il peut contenir, à titre de source de carbone, des substances telles que le glucose, le saccharose, la dextrine, l'amidon, la cellulose, le glycérol, le sorbitol et des produits analogues et, comme source d'azote, des substances telles que la peptone, un extrait de viande, un 30 extrait de levure, de la levure sèche, de la farine de soja, du tourteau de soja, des enveloppes de grains de riz, du son, un extrait de pomme de terre, de la caséine, du gluten, un hydroly-sat de caséine, de la liqueur de macération du maïs, des sels d'ammonium, des nitrates et d'autres composés azotés organiques 35 ou minéraux. A titre de sels minéraux, on peut incorporer par exemple divers phosphates, sulfates et chlorhydrates. Dans certains cas, pour favoriser le développement des microorganismes, on peut ajouter des vitamines, des aminoacides, des acides nucléiques et leurs composés associés, etc, de types divers. 40 Selon le mode de culture et les conditions à utiliser, 1'addition 69 02949 5 2001575 d'un agent anti-mousse synthétique ou naturel, par exemple d'huile de soja ou d'huile de silicones, peut permettre d'obtenir une accumulation accrue de l'enzyme» Quand on cultive les microorganismes, il est préféra-5 ble de préparer une pré-culture à petite échelle, après quoi on l'inocule dans un milieu de culture principal® Des conditions de culture telles que la température et le temps d'incubation, le pH du milieu, la vitesse d'aération, etc.. varient avec les microorganismes choisis et avec la com-10 position du milieu qu'on doit utiliser» Il est indispensable de choisir et de contrôler les conditions de façon que l'accumulation du protéase alcalin soit maximale» Dans de nombreux cas, les conditions préférées comprennent une température d'incubation de 20 à 30°C, un temps 15 d'incubation de 2 à 7 jours, un pH du milieu voisin de 7 et une cadence d'aération de 0,5 à 1,5 litre par minute et par litre du milieu» Ainsi, le microorganisme accumule une quantité abondante du protéase alcalin au sein de la culture. 20 Quand on utilise un milieu liquide, l'enzyme recher ché se trouve principalement dans la phase liquide de la culture. Il est donc préférable d'éliminer le mycélium par filtra-tion ou centrifugation et, ensuite, de récupérer l'enzyme en l'isolant du filtrat ou du fluide surnageant, selon le cas» 25 Quand on utilise un milieu solide, il est habituelle ment préférable d1extraire la culture au préalable avec de l'eau ou une solution aqueuse d'un sel minéral et, ensuite, de récupérer l'enzyme dans l'extrait résultant. En vue de récupérer et d'isoler l'enzyme contenu dans 30 le filtrat de culture, dans le fluide surnageant ou dans l'extrait, on peut faire appel à l'un quelconque des procédés connus per se d'isolement et de purification. Ces procédés comprennent un "relargage" de l'enzyme à l'aide d'un sel minéral tel que le sulfate de sodium, le sulfate d'ammonium ou le chlorure de so-35 dium, et une précipitation fractionnée de l'enzyme par addition d'un solvant organique hydrophile approprié tel que le méthanol, l'éthanol ou l'acétone. En outre, on peut concentrer une solution d'enzyme sous pression réduite et/ou la déminéraliser par dialyse. Il est également possible de mettre en oeuvre des pro-40 cédés tels qu'une adsorption et une désorption sur un gel de 69 02949 6 2001575 phosphate de calcium , de l'alumine, une bentonite, une résine échangeuss d'ions, etc..} une chromâtographie utilisant un dérivé de cellulose, comme par exemple la diéthylaminoéthyl cellulose, une filtration sur un gel, une précipitation, une électro-5 dialyse, une électrophorèse et l'élimination des impuretés sous forme d'un complexe d'un métal lourd. Le protéase alcalin obtenu et préparé de la manière qu'on vient de décrire est actif dans l'intervalle de pH général compris entre 8 et 12, en particulier dans l'intervalle de pH ]_0 compris entre 10 et 11,5o La température optimale en ce qui concerne l'activité de l'enzyme est comprise entre environ 20 et 60°C, en particuliac entre environ 40 et 50°C<> Un tel intervalle de température en ce qui concerne l'activité est parfaitement en accord avec les 15 conditions réelles de blanchissage. De plus, l'activité n'est pas inhibée par des agents tensio-actifs et/ou des agents chélatants qui sont des ingrédients des détergents ou des produits de nettoyage» Dans la présente invention, le protéase alcalin peut 20 être utilisé non seulement sous forme d'une préparation extrêmement purifiée, mais sous forme d'un enzyme brut qui est obtenu dans un état de pureté désiré pour l'application envisagée ; on peut utiliser une préparation d'enzyme pure ou brute comme ingrédient des détergents ou des produits de nettoyage. 25 A titre d'agents tensio-actifs contenus dans les pro duits détergents, on peut citer divers composés comprenant des agents tensio-actifs anioniques du type des sels d'acides gras, du type des sulfates ou du type des sulfonates, comme un savon d'acides gras naturels (NS), les alkylsulfates (DAE), les sul-30 fates d'oléfines, les n-sulfonates d'ct-oléf ines (A-OS), le tétra-propylbenzène sulfonate (ABS) et le n-alkyl-benzène sulfonate (LAS), ainsi que des agents tensio-actifs non ioniques du type des éthers ou des esters, comme par exemple les polyoxyéthylène— alkyléthers, les polyoxyéthylène-alkylphénol éthers, les alkyl 35 esters de polyols, les polyoxyéthylène-alkylesters, les esters de sucres, etc. Les détergents ou les produits de nettoyage peuvent contenir des adjuvants actifs tels qu'un tripolyphosphate, un sulfate, un carbonate, un borate, ainsi que la carbaxyméthyl 40 cellulose, des azurants optiques, des parfums, des agents de 69 02949 7 2001575 "blanchiment tels que des perborates, des agents chélatants, comme par exemple ÏÏ^CHgCOOIïa)^ , des agents protégeant la peau, par exemple le diméthyl laurylaminoxyde, des désinfectants, par exemple une aminé tertiaire, etc. 5 On mélange le protéase alcalin avec d'autres consti tuants du produit, qui peut être sous forme d'une poudre, de granules ou d'un liquide, et, quand le mélange résultant est un liquide, on peut le sécher pour obtenir une poudre ou des granules par des moyens classiques tels qu'une lyophilisation. 10 Etant donné qu'il n'existe pas de système d'unités in ternationales pour ce genre d'enzyme, il est difficile d'indiquer la dose d'enzyme dans les détergents ou les produits de nettoyage en général. Dans la présente invention, on détermine l'activité du 25 protéase alcalin par le .procédé de Kunitz modifié qu'on va décrire (voir "J. Gen. Physiol" 20, 291, 1947)» On mélange 1 ml d'une solution aqueuse à 2 fo de caséine (Hammarsten) et 0,5 ml d'un tampon 0,1 M glycine-lîaOH (pH 11) avec 0,5 ml d'une solution d'enzyme. On fait incuber 2 ml du. mélange résultant à 37°C 20 pendant 20 minutes, puis on arrête la réaction en ajoutant 3 ml d'une solution aqueuse à 5 $ d'acide trichloracétique. On laisse ' le mélange reposer à 37°C pendant 30 minutes, ce qui détermine la précipitation de la caséine qui n'a pas digéré. On sépare cette caséine par filtration et on détermine la densité optique du fil-25 trat à 275 mp. , la quantité de caséine digérée étant calculée à partir de ce résultat sous forme de tyrosine. Une unité de l'activité de protéase (UP) est définie comme étant la quantité de l'enzyme qui dissout une quantité de caséine équivalant à 1 yig de tyrosine par minute, dans les conditions d'analyse, l'activité 30 spécifique d'un échantillon d'enzyme est exprimée en UP/mg. la portion du protéase alcalin à incorporer dans des détergents varie selon leur type 0 Dans le cas d'un détergent destiné au lavage du linge, la quantité préférée peut être généralement comprise entre 5 et 10.000, en unités par gramme du dé-35 tergent et, dans la pratique, entre 10 et 5.000 unités/gramme. Un détergent contenant un protéase alcalin, préparé de la manière précitée, exerce une action de nettoyage extrêmement puissante sur les taches dues de nature protéinique et faites par la sueur, le sang, le bouillon et le lait, taches qui sont 40 difficiles à enlever par lavage avec un détergent ordinaire. 69 02949 8 2001575 De plus, le détergent peut être utilisé pour le prélavage aussi "bien que pour le lavage principal» Dans le pré-lavage, les matières salies sont habituellement trempées dans une solution de détergent à la tempé-5 rature ambiante pendant plusieurs heures, tandis que le lavage principal est de préférence exécuté à une température élevée, comprise entre 40 et 60°C, pendant 1 heure environ. les exemples qui vont suivre décrivent des modes de réalisation actuellement-préférés de l'invention, étant bien en-10 tendu que ces exemples n'ont aucun caractère limitatif» Dans la totalité de l'exposé, les pourcentages sont donnés en poids par volume, et dans les exemples suivants, la relation entre les parties en poids et les parties en volume est identique à celle qui existe entre les grammes et les mil-15 lilitreso Sur le dessin annexé : la fig. 1 montre le spectre d'absorption U.Y, la longueur d'onde en mj)i étant pertée en abscisse et EiQm e» ordonnée j 20 3-a fig» 2 montre le spectre d'absorption dans l'infra rouge, la longueur d'onde (ji) et le nombre d'onde (cm"1) étant portés en abscisse et la transmission (?£) étant portée en ordonnée ; la fig. 3 montre la relation entre le pH (en abscisse) 25 et l'activité relative en fo (en ordonnée) ; la fig. 4 est un diagramme montrant la relation entre la température en °0 (en abscisse) et l'activité relative en $ (en ordonnée) ; la fig» 5 est un diagramme montrant la relation entre 50 le pH (abscisse) et l'activité résiduelle en $ (en ordonnée) ; la fig» 6 est un diagramme montrant la relation entre la température en °C (en abscisse) et l'activité résiduelle en io (en ordonnée). Exemple 1 35 Dans un récipient de fermentation (d'une capacité de 2.000 parties en volume), on introduit 500 parties en volume d'un milieu liquide composé de 5 ^ de farine de soja dégraissée, de 5 ^ de glucose et de 2 $ de phosphate monosodique, le pH de ce milieu ayant été ajusté à 7, on stérilise ce milieu, on l'i-40 nocule avec le microorganisme Fusarium sp„ S-19-5 (IFO 8884) et 69 Û2949 9 2001575 on le fait incuber à 26°C pendant 5 jours, tout en aérant et en agitant, pour préparer une culture à'ensemencement,. On inocule cette culture d'ensemencement dans 30o000 parties en volume d'un milieu liquide identique à celui qui garé-5 cède et qui est contenu dans un récipient de fermentation d'une capacité de 50„000 parties en volume, puis on fait incuber à 25°C pendant 144 heures, tout en aérant à raison de 45.000 parties en volume par minute et tout en agitant à une vitesse de 500 tours/minute. Pendant l'incubation, on supprime la formation 10 de mousse en ajoutant 'de temps à autre une quantité appropriée d'huile de soja. les variations de la valeur du pH et de l'activité de protéase au cours de la culture sont données ci-après : Temps de 15 culture _0_ 18 50 42 54 66 78 90 122 144 (heures) pH de la culture 7,30 6,40 6,30 6,12 6,35 6,72 7,30 7,09 7,50 7,50 Activité d'enzyme - 67 141 1430 2250 2270 2520 2520 2760 2540 2Q (UP/ml) Exemple 2 On refroidit à environ 5°C la culture obtenue après 144 heures, de la manière décrite dans l'exemple 1, et on la fait ensuite passer à travers un filtre-presse, en utilisant le produit "Hyflo Super-Cel" (Johns-Manville Products Corp., EoU.A) comme auxiliaire de filtration, ce qui permet de séparer le mycélium. On obtient ainsi 20.000 parties en volume de filtrat auquëL on ajoute du sulfate d'ammonium saturé 0,6 ET, et on recueille le précipité "relargué" par filtration avec l'auxiliaire de filtration. On dissout dans environ 6.000 parties en volume d'eau froide le précipité de sulfate d'ammonium résultant, contenant l'auxiliaire de filtration, et on sépare les matières insolubles par filtration. On ajoute ensuite du sulfate d'ammonium saturé 0,6 N au filtrat, de manière à précipiter de nouveau l'enzyme, et on recueille ce dernier par centrifugation, on le dissout dans 1.000 parties en volume d'eau froide, on le dialyse en u-tilisant de l'eau froide et un diaphragme en vessie de poisson, pendant 4 jours, et on le lyophilise, ce qui donne une poudre d'enzyme brutee le procédé ci-dessus permet d'obtenir 30 parties en poids de la poudre d'enzyme brute d'une couleur "ferunâtre» ,„„n 10 2001575 69 02949 l'activité spécifique de cet échantillon est d'environ 980 UP/mg. Exemple 3 Dans 3.000 parties en volume d'eau froide, on dissout 30 parties en poids de la poudre d'enzyme brute préparée dans ^ l'exemple 2 et on filtre la solution d'enzyme pour en séparer les matières insolubles, en utilisant l'auxiliaire de filtration, ce qui donne une solution claire. Après avoir ajouté du sulfate d'ammonium 0,6 ÎT au filtrat clair, on obtient un précipité de l'enzyme qu'on dissout de nouveau dans 1.500 parties 10 volume d'eau froide, après quoi on décolore cette solution avec du charbon de bois, on la dialyse en utilisant de l'eau fro'ide à 4 - 5°C , pendant 4 jours, et on la lyophilise pour obtenir une poudre, le procédé qu'on vient de décrire donne 4,5 parties en poids d'une poudre d'enzyme partiellement purifiée 15 ayant une activité spécifique de 1.580 UP/mg. On dialyse 4,5 parties en poids de la poudre d'enzyme, dissoute dans 450 parties en volume d'un tampon "Tris«-HCl 0,01M au pH 9, en utilisant un tampon "Tris"-HCl 0,01 M au pH 9» pendant 3 jours ; on la place sur une colonne de diéthylaminoéthyl 20 cellulose préalablement équilibrée avec le tampon "Ïrisiî-HG1 et on élue avec le même tampon. On recueille environ 675 parties en volume d'une fraction riche en enzyme, on la dialyse en utilisant de l'eau froide pendant 3 jours et on la lyophilise, ce qui donne une poudre. Le procédé ci-dessus donne 0,35 partie d'une 25 poudre d'enzyme purifié ayant une activité spécifique de 5.400 UP/mgo On soumet à une chromâtographie sur une colonne du produit "Sephadex G—100", préalablement lavé avec le tampon "Tris"-HG1, 0,35 partie en poids de la poudre d'enzyme purifiée, dis-30 soute dans 335 parties en volume de tampon "Tris"-HCl 0,01 M . On recueille 62 parties en volume de la fraction active, on la soumet à une dialyse en utilisant de l'eau froide, pendant 3 jours, et on la lyophilise, ce qui donne 0,15 partie en poids d'une poudre d'enzyme très pure, l'activité spécifique de cet 35 échantillon est de 6.500 UP/mg. les caractéristiques enzymologiques de cet échantillon sont les suivantes : (l) Couleur et forme : poudre blanche. 69 02949 ii 2001575 (2) Analyse élémentaire typique {%) : C 46,72 ; H 6,59 ; N 15,03. (3) Constante de sédimentation : environ 3,19 x ÎO"1-^. 5 (4) Poids moléculaire (par la méthode d'Archibald) : 2,65 x 1021" (+ 5$). (5) Spectre d'absorption dans l'ultravilet (U.V. /voir flg.l/ absorption à 275-280 mp : B ^ m =7,0 {6) Spectre d'absorption dans l'infrarouge (I.R.) /voir fig.2/ 10 bandes d'absorption significatives à n 5,38/1, 6,05/*, 6,55/», 6,88 /a, 7,15/», 8,12yu et 9,30^. (7) Point isoélectrique (par électrophorèse sur papier) : pH environ 11. (8) Solubilité : 15 Soluble dans 1'eau et' les solutions aqueuses de sels minéraux ayant une force ionique de 0,01 à 0,1 /j. Insoluble dans le méthanol, l'éthanol, l'acétone et l'éther éthylique. (9) Relation entre le pH et l'activité (voir fig.3) ; pH optimal : environ 11. 20 (10) Relation entre la température et l'activité (voir fig. 4) Température optimale à environ 50°C. (11) Stabilité du pH (voir fig. 5)> Pas d'activation à un pH compris entre 5 et 8 ; perte d'activité de 10$ au pH 11,5 (incubation pendant 1 heure à 37°C). 25 (12) Relation entre la stabilité efe la température (voir fig.6) Perte d'activité nulle au-dessous de 55°C ; perte d'activité de 20$ à 65°C et perte d'activité de 80$ à J0°C (incubation pendant 10 minutes au pH 5). Exemple 4 30 Influence de plusieurs agents tensio-actifs sur le protéase alcalin Pour une telle étude, on prépare cinq détergents différente, selon la formule du tableau I, les agents tensio-actifs utilisés étant un sel sodique d'un acide gras naturel normal en C-^ - C-^g ^ (NS), un alkylsulfate de sodium normal en C-^ (DAS)n un a-oléfi-ne-sulfonate de sodium normal en C.^. - C-^g (A0S), le tétrapropyl-benzène sulfonate de sodium (ABS) et un alkylbenzène sulfonate normal de sodium en C12, et les détergents résultants étant désignés par les abréviations respectives NS, DAS, A0C, ABS et LAS. 69 02949 12 2001575 Tableau 1 Composant quantité Agent tensio-actif 25 Triphosphate de sodium 40 Sulfate de sodium 29 ■5 Silicate de sodium 5 Carboxyméthyl cellulose 1 On dissout 5 mg de chacun des détergents dans 2 ml d'une solution d'enzyme préparée en dissolvant 2 mg de la poudre d'enzyme brute, obtenue dans l'exemple 2, dans 100 ml d'un -1-0 tampon "Iris"- HC1 0,05 M du pH 11, et on détermine l'activité d'enzyme de la solution résultant par la méthode d'analyse spécifiée. Les résultats sont donnés dans le tableau 2 sur lequel on voit que l'activité d'enzyme n'est pas inhibée par ces différents détergents. ^ On prépare les détergents contenant un enzyme en mé langeant 0,05 g de la poudre d'enzyme brute obtenue dans l'exemple 2 avec 100 g de chacun des différents détergents susmentionnés,, Tableau 2 20 Type de détergent Activité de Activité relative ajouté protéase (UP/ml) 30 Néant 19,6 100 NS 20,0 102 DAS 19,2 98 25 &02 19,4 99 ABS 19,2 98 LAS 19,8 101 * Activité relative _ (UP/ml avec le détergent) -^qq (UP/ml sans le détergent) On compare l'action détergente de ces détergents contenant un enzyme avec celle des détergents correspondants ne contenant pas d'enzyme, dans les conditions d'essai du blanchissage exposées dans le tableau 30 69 02949 13 2001575 35 Tableau. 5 Tissu sali (5 cm x 10 cm) : Préparé par la méthode de "Japan Oil and Pat Chemical Association" en utilisant un mélange 1 : 1 de poussière, d'un épurateur d'air 5 et de caséine au lieu ce noir de carbone. Solution de nettoyage : 600 ml Concentration de détergent : 0,2 $ Température de lavage : 40°C X0 Temps de lavage : 30 minutes Temps de rinçage : 10 n:inutesc l'action détergente est évaluée par un jury® On utilise cinq morceaux d'étoffe salie pour essayer chaque détergent et, après les opérations successives de lavage, de rin-15 çage et de séchage dans l'essai de blanchissage spécifié, une cotation étant attribuée par cinq membres d'un jury d'après les normes de classement suivantes : Normes de classement : " + 2 " : la propreté du tissu lavé avec un détergent 20 contenant un enzyme est nettement supérieure à celle du tissu lavé avec le même détergent ne contenant pas d'enzyme, 11 + 1 " : La propreté du tissu lavé avec un détergent contenant un enzyme est légèrement supérieure 25 à celle du tissu lavé avec le même détergent ne contenant pas d'enzyme. " 0 " : On n'observe pas de différence notable de propreté entre les deux tissus comparés0 Les résultats du classement sont donnés dans le ta-30 bleau 4, qui donne l'activité détergente des détergents contenant un enzyme et celle des détergents correspondants ne contenant pas d'enzyme, à des fins de comparaisons î Tableau 4 Tvoe de détergent Cotation donnée par le .iury Points totaux —B —Â B C J) JS NS + /•> +2 +2 +2 +2 +10 LAS + 2 +1 +2 +2 +2 + 9 A OS + 1 +1 +1 +2 +1 + 6 69 02949 14 2001575 Type de détergent Tableau 4 (suite) Cotation donnée par le .jury E +2 +2 A B C D ABS +2 +2 +1 +2 LAS +2 +1 +1 +2 Points totaux + 9 + 8 10 15 20 25 Exemple 6 On cultive pendant 6 jours de la même manière que dans l'exemple 1, plusieurs microorganismes du genre Fusarium et du genre Gibberella, Après centrifugation de la culture, on obtient des fluides surnageants qu'on utilise comme solutions d'enzymes,, A 2o000 parties de chacune de ces solutions, on ajoute 5 parties en poids du détergent LAS décrit dans l'exemple 4, et on détermine l'activité de protéase de la solution résultante par la méthode spécifiée» les résultats, qui apparaissent dans le tableau 5, montrent que le détergent LAS ne freine pas l'activité des enzymes obtenus en utilisant des microorganismes producteurs de protéases. Microorganisme Tableau 5 Activité d'enzyme (UP/ml) avec un détergent sans détergent 30 Fusarium oxysporum (IFO 5942) Fusarium oxysporum f. lini (IFO 5880) Fusarium oxysporum f. niveum (IFO 4471) Fusarium solani (IFO 5232) Gibberella fujikuroi (IFO 5268) Gibberella saubinetti (IFO 6608) 200,8 550,5 315,8 230,2 73,2 530,2 199,2 553,8 307,2 235,0 75,6 523,4 35 Exemple 7 On prépare un détergent liquide utilisé à la cuisine» Dans 55 parties en volume d'eau chaude (60-65°C), on dissout 18 parties en poids de tétrapropylbenzène sulfonate de sodium, 69 02949 15 2001575 12 parties en poids de n-alkylphénoléther-sulfate de sodium en Ci2» 5 parties en poids de lauryldiéthanolamide et 10 parties en poids de xylènesulfonate de sodium» Après avoir laissé ré-froidir la solution, on y ajoute encore 0,5 partie en poids de 5 la poudrs d'enzyme "brute préparée dans l'exemple 2 et une petite quantité de parfum, ce qui donne un détergent liquide utilisé à la cuisineo Exemple 8 On prépare un shampooing en dissolvant, dans 64 par-10 ties en poids d'eau chaude (60 - 65°C), 5 parties en poids de lanoline acétylée, 6 parties en poids d'alkylolamine (american Alcolac Corp.) et 25 parties en poids de "luponol XL" (E0I<> du Pont de Uemours Company)o lorsque la solution est refroidie, on y ajoute 0,2 partie en poids de la poudre d'enzyme "brute prépa-15 rée dans l'exemple 2 et ,une petite quantité de parfum, ce qui donne un shampooing. 69 02949 16 2001575 REVENDICATIONS lo Procédé de production d'un protéase alcalin, qui consiste à cultiver un microorganisme producteur de protéase alcalin appartenant au genre Fusarium ou au genre Gibberella au sein d'un milieu contenant des sources assimilables de carbone 5 et des sources d'azote pouvant être digérées, dans des conditions de culture aérobies , jusqu'à ce que le protéase alcalin se soit accumulé dans la culture, après quoi on le récupère dans ladite culture. 20 Procédé conforme à la revendication 1, dans lequel 10 le microorganisme producteur de protéase alcalin appartient au genre Fusarium oxysporum. 3. Procédé conforme à la revendication 1, dans lequel le mieroorganisme producteur de protéase alcalin appartient au genre Fusarium nov» sp 15 4. Procédé conforme à la revendication 1, dans lequel le microorganisme producteur de protéase alcalin appartient au genre Gibberella saubinetii. 5o Procédé conforme à la revendication 2, dans lequel le microorganisme producteur de protéase alcalin est la souche 20 Fusarium bxysporum (IFO 5942). 6. Procédé conforme à la revendication 3, dans lequel le microorganisme producteur de protéase alcalin est la souche Fusarium sp. S-19-5 (IFO 8884). 7. Procédé conforme à la revendication 4, dans lequel 25 le mieroorganisme producteur de protéase alcalin est la souche Gibberella saubinetii (IFO 6608). 80 Procédé conforme à la revendication 1, dans lequel la température d'incubation est comprise entre environ 20 et 30°(i 9. Procédé conforme à la revendication 1, dans lequel 30 le pH d'incubation est compris entre environ 6 et 9 • lo» Protéases alcalins, produits par des microorganismes producteurs de protéases alcalins appartenant au genre Fusarium ou au genre Gibberella, ces protéases possédant les propriétés suivantes ; 35 a) Constante de sédimentation (S20w^ à1environ 3,19 x 10"13 ; (b) Poids moléculaire d'environ 2,65 x 10^" (déterminé par la méthode d'Archibald) ; 69 02949 17 200i575 (c) Analyse élémentaire : environ 46,72 % en poids de carbone, environ 6,59 % en poids d'hydrogène et 15,3 % en poids d'azote ; (d) Absorption maximale dans l'ultraviolet : longueur 5 d'onde de 275 à 280 np ; (e) Absorption dans l'infrarouge : les bandes d'absorption significatives sont les suivantes : 3 p (forte) ; 3,38 (moyenne) ; 6,05 (forte) ; 6,55 y (forte) ; 6,88 (faible) ; 7,15 jj (moyenne) ; 10 8,12 p (moyenne) ; 9,30 (faible) ; (f) Point isoélectrique : au voisinage du pH 11 ; (g) Activité optimale au pH 8 à 12 et à une température d'environ 40 à 50°C ; (h) Stabilité : stable dans l'intervalle de pH de 5 à 8 \5 après 1 heure d'incubation a 37°C ; (i) Perte d'activité : 20 à 80 % après chauffage à 65°C et à 70°C, pour une période d'incubation de 10 minutes au pH 5. 11. Produit détergent comprenant essentiellement au moins un 20 agent tensio-actif et un protéase alcalin conforme à la revendication 10. 12. Produit détergent conforme à la revendication 11, contenant environ 5 à 10.000 U.P. du protéase alcalin par gramme de produit final (U.P. = unités de protéase, cornue déterminé par le procé- 25 dé Kunitz modifié). 13. Produit détergent conforme à la revendication 11, dans lequel l'agent tensio-actif précité comprend un agent tensio-actif anionique et un agent tensio-actif non ionique. 140 Agent tensio-actif conforme à la revendication 12, dans 30 lequel l'agent tensio-actif anionique est un sel d'acide gras, un alkyl sulfate, un sulfate d'oléfine, un alkyl sulfonate, un sulfonate d'oléfine ou un alkylaryl sulfonate. 15. Agent tensio-actif conforme à la revendication 13, dans lequel l'agent tensio-actif non ionique est un polyoxyéthylène-35 alkyléther, un polyoxyalkylène-alkylphénol éther, un polyoxyéthy-lème-alkylester, un alkyl ester de polyol ou un ester de sucres.