FR 2001095 A1 19690926 FR 6901532 A 19690127 69 01532 1 2001095 La présente invention est relative à un procédé de production d'acides gras supérieurs. Plus particulièrement, elle concerne un procédé de production d'acides gras supérieurs par fermentation et, encore plus particulièrement, un procédé de pro-5 duction d'acides gras supérieurs et de leurs esters par fermentation avec des micro-organismes assimilant les hydrocarbures. L'existence de micro-organismes qui se développent et qui prolifèrent dans un milieu de culture contenant, par exemple, des huiles légères, du kérosène, des n-paraffines et des hydro— 10 carbures analogues comme source de carbone principale est bien connue dans la technique. Le fait que de tels micro-organismes sont capables de produire des aminoacides et des acides organiques dans un milieu de culture contenant des hydrocarbures comme source de carbone principale a été mentionné dans la littérature. 15 En outre, on sait que des micro-organismes capables d'utiliser des hydrocarbures, spécialement des n-paraffines, produisent des acides gras comme métabolite intermédiaire, le nombre d'atomes de carbone de ces acides étant égal ou inférieur à celui des n— paraffines utilisées. Toutefois, les quantités d'acides gras pro-20 duites sont très faibles. On ne trouve pas de compte-rendu relatif à la production et à l'accumulation hors des cellules de quantités notables d'acides gras ou de leurs esters, dont le nombre d'atomes de carbone est supérieur à celui de la n-paraffine utilisée dans le milieu. 25 La présente invention a donc pour objet : - Tin procédé de fermentation en vue de la production hors des cellules d'acides gras supérieurs et de leurs esters possédant un nombre d'atomes de carbone supérieur à celui de l'hydrocarbure utilisé comme source de carbone dans le milieu de cultu— 30 re j - un procédé de production d'acides gras supérieurs et de leurs esters par fermentation, procédé qui peut être mis en oeuvre d'une façon efficace et relativement simple ; - un procédé de production d'acides gras supérieurs et de 35 leurs esters par fermentation, procédé qui peut être mis en oeuvre avantageusement à l'échelle industrielle et à -un prix de revient faible, en utilisant des hydrocarbures peu coûteux comme matière de départ dans le milieu pour obtenir un rendement élevé de produit ; 40 „ l'obtention d'acides gras supérieurs et de leurs esters. 6e? 01532 2 2001095 Les caractéristiques et avantages de la présente invention ainsi que d'autres ressortiront à la lecture de l'exposé qui va suivre : La demanderesse a noté . au cours de ses recherches, 5 que des micro-organismes assimilant des hydrocarbures sont capables de produire des acides gras supérieurs et leurs esters dans une liqueur de fermentation, principalement dans la couche huileuse de cette dernière, quand on les cultive en aérobie en utilisant une n-paraffine comme source de carbone principale • A cet 10 égard, il a été constaté qu'il existe de nombreux micro-organismes qui sont capables de produire et d'accumuler des quantités notables d'acides gras supérieurs et de leurs esters, dont le nombre d'atomes de carbone est égal ou très supérieur à celui de l'hydrocarbure de départ utilisé dans le milieu, quand on les cul-15 tive dans des conditions aérobies au sein d'un milieu nutritif aqueux approprié. On atteint donc les objectifs de la présente invention en cultivant en aérobie des micro-organismes capables d'utiliser des hydrocarbures, au sein d'un milieu de culture cozi4 tenant un hydrocarbure ou un mélange d'hydrocarbures comme source 20 de carbone principale. De cette manière, des acides gras supérieurs extrêmement avantageux ainsi que leurs esters sont produits et accumulés dans la liqueur de culture résultante. Des exemples de micro-organismes pouvant Stre utilisés dans la présente invention comprennent les suivants t 25 Arthrobacter paraffineus Arthrobacter roseopa-rafflmia Arthrobacter hydrocarboclastus Arthrobacter simplex Brevibacterium ketoglutamicum 30 Micrococcus paraffinolyticus Corynebacterium hydrocarboclastus Mycobacteriua smegmatis Candida lipolytica Aspergillus oryzae 35 II ressort des exemples de micro-organismes qu'on vient de mentionner, que des micro-organismes assimilant les hydrocarbures qui sont capables de produire et d'accumuler des acides gras supérieurs hors des cellules sont largement répartis parmi divers genres et diverses espèdee .11 n'exi3te donc pas de corrélation spé— 40 cifique et directe entre, par exemple, un genre particulier de 69 01532 3 2C01095 micro-organisme et son aptitude à être utilisé dans la présente \ invention» Conformément à la présente invention, on peut utiliser un milieu de culture synthétique ou un milieu nutritif naturel, à 5 condition que ces milieux contiennent les éléments nutritifs essentiels pour le développement de la souche de micro-organisme choisie. ï)e tels éléments nutritifs sont "bien connus dans la technique et comprennent des substances telles qu'une source de carbone, une source d'azote, des composés minéraux e t des élé-10 ments analogues qui sont utilisés en des quantités appropriées par le micro-organisme choisi. Comme on l'a déjà mentionné, la fermentation est mise en oeuvre conformément à l'invention dans un milieu nutritif aqueux contenant un hydrocarbure ou un mélange d'hydrocarbures comme 15 source de carbone principale» De préférence, la source de carbone contenue dans le milieu est constituée par des n-paraffines ayant 6 à 25 atomes de carbone ou par diverses fractions d'hydrocarbure contenant lesdites n-paraffines. Toutefois, on peut choisir n'importe quelle source de carbone à condition qu'elle puisse être 20 utilisée par le micro-organisme choisi. Ainsi, par exemple, on peut ajouter au milieu des cycloparaffines telles que le cyclo— hexane et le cyclooctane, des oléfines à chaîne droite et à chaîne ramifiée telles que le pentène-2, l'hexène-T, lfoctène-1, l'octène-2, etc., des cyclooléfines telles que le cyclohexène, 25 des hydrocarbures aromatiques tels que le benzène, les xylènes isomères, etc., et des hydrocarbures de pétrole tels que le kérosène, des huiles légères, des huiles lourdes, des huiles paraffi-niques, etc. Le milieu de fermentation peut en outre contenir, en même temps que l'hydrocarbure, de petites quantités d'autres 30 sources de carbone telles que des hydrates de carbone, comme par exemple le glucose, le fructose, le maltose, le saccharose, l'amidon, l'hydrolysat d'amidon, la mélasse, etc., ou n'importe quelle autre source de carbone appropriée telle que le glycérol, le mannitol, le sorbitol, les acides organiques, etc. On peut 35 utiliser une seule de ces substances ou un mélange comprenant deux ou plus de deux d'entre elles. La source d'azote peut être constituée par l'un quelconque de divers genres de sels ou composés minéraux ou organiques, tels que l'urée ou des sels d'ammonium tels que le chlorure d'am— 40 rnonium, le sulfate d'ammonium, le nitrate d'ammonium, le phospha— 69 01532 « 2001095 te d'ammonium, etc., ou encore des substances naturelles contenant de l'azote, comme la liqueur de macération du maïs, un extrait de levure, un extrait de viande, la farine de poisson, la peptone, le bouillon, les hydrolysats de caséine, les matières 5 solubles du poisson, un extrait des enveloppes de grains de riz, etc. Ces substances peuvent également être utilisées isolément ou sous forme de combinaisons comprenant deux ou plus de deux d'entre elles. Les composés minéraux qu'on peut ajouter au milieu de cul-10 ture comprennent le sulfate de magnésium, le phosphate de sodium, le phosphate monopotassique, le phosphate dipotassique, le sulfate de fer ou d'autres sels de fer, le chlorure de manganèse, le chlorure de calcium, le chlorure de cuivre, etc. En outre, il peut également être nécessaire d'ajouter cer-15 tains éléments nutritifs essentiels au milieu de culture, selon le micro-organisme particulier choisi, ces éléments nutritifs étant par exemple des aminoacides et/ou des vitslmines, comme par exemple la biotine, la thiamine, la cobalamine, etc. Pour exécuter la culture conformément au procédé de la pré-20 sente invention, on stérilise le milieu de fermentation utilisé. Au cours de la culture, on ajuste le pH du milieu à une valeur comprise entre 4 et 9, de préférence entre 6 et 8, en y ajoutant, si nécessaire, des substances telles qu'une solution d'urée, une solution d'ammoniaque ou une solution de carbonate d'ammonium. 25 La fermentation est habituellement terminée en deux à quatre jours. Le moment où la fermentation est terminée est celui où la somme des teneurs en acides gras supérieurs observée devient la plus élevée. On acidifie le liquide fermenté à l'aide d'un acide minéral et on le sépare par centrifugation ou bien on le 30 laisse décanter au froid, sans le traiter. Ensuite, on élimine la couche aqueuse se trouvant à la partie inférieure du liquide. On introduit dans la partie supérieure du liquide un alcali caustique ou mie solution alcoolique d'un alcali caustique, puis on chauffe le mélange à 80-100°C. On acidifie le mélange ainsi 35 traité en ajustant son pH à l'aide d'un acide minéral, puis on le soumet à une séparation centrifuge. On recueille le liquide résultant qui forme une couche surnageante transparente. On fait passer ce liquide surnageant à travers une colonne de gel de silice, puis on élue les n-paraffines résiduelles et on les élimine, 40 ce qui permet d'isoler et de récupérer les acides gras supérieurs 69 01532 5 2001095 résultants par élution avec du chloroforme. On peut faire appel à d'autres procédés classiques d'isolé— ment et de récupération des acides gras, bien que les procédés décrits ci-dessus et dans les exemples semblent les plus appro-5 priés. Généralement, on exécute la culture dans des conditions aérobies, par exemple par secousse/^aérobie de la culture ou par agitation et aération d'une culture submergée à une température d'environ 20 à 45°C et, comme noté ci-dessus, à un pH d'environ 4 à 10 9» Des acides gras supérieurs ou des esters de tels acides gras, dont le nombre d'atomes de carbone est supérieur à celui de l'hydrocarbure de départ utilisé dans le milieu, sont accumulés dans la liqueur de culture résultante et peuvent être ensuite récupérés et isolés de cette culture. Les esters obtenus sont les 15 alkyl esters des acides gras ainsi produits. On donne les exemples qui vont suivre uniquement à titre indicatif et non limitatif de la portée de la présente invention. Sauf mention contraire, les pourcentages s'entendent en poids par litre d'eau dans la totalité du présent exposé. 20 KX KjfPT.TC 1 On cultive le micro-organisme Arthrobacter paraffineus AÏCC 15591 pendant 24 heures, par secousse en aérobie, au sein d'un milieu de culture contenant 1 % d'extrait de viande, 1 % de peptone et 0,3 % de sel ordinaire (chlorure de sodium), le milieu 25 étant au pH 7»2 (avant stérilisation). On inocule ensuite la culture d'ensemencement résultante, en une quantité de 10 % en volume, dans 3 litres d'un milieu de fermentation placé dans un récipient de fermentation d'une contenance de 5 litres. La composition du milieu de fermentation est la suivante : 30 KgHPO^ 0,2 % MgS04,?H20 0,1 % MnS04,4H20 0,002 % FeS04,7H20 0,02 % ZnS04,7H20 0,001 % 35 (HH/,.)2S04 1 % Liqueur de macération du maïs 0,1 % Shiamine 50^g /litre On cultive ensuite ce milieu à 30°C pendant 80 heures, 40 tout en l'agitant à une cadence de 600 tours/minute et en l'aé 6° 01532 6 2001095 rant avec de l'air stérilisé introduit avec un débit de 1 litre/ litre/minute .Au début de la culture, on ajoute au milieu 600 ml d'un mélange de n-paraffines contenant des fractions en On ajuste le pH du milieu à une valeur de 6,8-7,5 à l'aide d'une 5 solution d'ammoniaque concentrée, pendant la culture» On acidifie le liquide ainsi fermenté (2,5 litres) jusqu'à un pH de 2 en utilisant un acide minéral et on le soumet à une séparation centrifuge, après quoi on élimine la portion soluble dans l'eau de la couche inférieure par aspiration ; dans une portion de 0,5 litre 10 de la couche supérieure, on introduit 1,5 litre d'un mélange de soude caustique 2N et de méthanol, puis on chauffe le mélange résultant pendant 60 minutes sur un bain-marie bouillant , pourvu d'un condenseur à reflux. Ensuite, on filtre immédiatement. On lave encore le précipité ainsi obtenu avec 500 ml de méthanol. 15 On recueille le filtrat et les liqueurs de lavage, la quantité totale obtenue étant de 2,3 litres. On chasse le méthanol et on le récupère à 40°C, sous pression réduite. On centrifuge la portion résiduelle tandis qu'elle est chaude et l'on recueille une couche supérieure huileuse limpide. On laisse cette couche huileu-20 se reposer pendant la nuit au-dessous de 0°C et on recueille le précipité qui se forme. On le laveavec de l'acétone froide, ce qui donne 4,6 g d'une poudre cristalline de couleur jaune clair • Ensuite, on dissout la poudre dans de l'acétone, à chaud, puis on refroidit et on recristallise à quatre reprises, ce qui permet 25 de récupérer 2,8 g de cristaux blancs. Les résultats de l'analyse de ce produit sont les suivants 1 Point de fusion 67°C - 69°C Point de fusion du méthyl ester 51°C— 52°C Point de fusion du produit 50 acétylé 20°C - 21°C Poids moléculaire 513 Analyse élémentaire, % C 74,57 H 12,89 Formule empirique G32H64°3 En outre, l'identification de ce produit montre qu'il est ^ constitué par un mélange d'acides monocarboxyliques possédant un radical OH en position f3 et une chaîne ramifiée en position a, comme déterminé d'après la résonance paramagnétique, le spectre dans 1'infra-rouge, le spectre obtenu au spectrographe de masse et les résultats de la pyrolyse. Par conséquent, les chiffres 40 donnés plus haut sont des valeurs moyennes pour tua tel mélange 69 01532 7 2001095 d'acides gras. De plus, ces chiffres montrent que les acides gras contiennent un nombre d'atomes de carbone différent de ceux des n-paraffines utilisées comme source de carbone. La demanderesse a donné le nom d'acide arthronique, tiré d'Arthrobacter paraf-5 fineus, aux acides gras comportant un radical OH en position p et une chaîne ramifiée en position a. TÏÏYWPT.-R P De la même manière que dans 1'exemple 1, on cultive le micro-organisme Corynebacterium hydrocarboclastus ATCC 15592 en 10 utilisant un mélange de n-paraffines ayant 11 à 14 atomes de carbone comme source de carbone, dans un récipient de fermentation d'une contenance de 5 litres. Après line durée de culture de 8 heures, on ajoute une solution d'un sel de potassium de la pénicilline G, dans la proportion de 20 unités/mlo Après 72 heures de 15 culture, on traite 2 litres de la liqueur de fermentation résultante de la même manière que dans 11 exemple 1, ce qui donne 4-70 ml d'une couche huileuse. On ajoute à la solution huileuse 3 litres d'une solution mixte d'éthanol et d'éther (3:1) et on mélange intimement ces constituants,puis on filtre, ce qui donne 20 3,2 litres d'un extrait limpide de couleur jaune orange. Ensuite, on élimine le solvant et on le récupère à 40°C sous pression réduite. On chauffe la solution résiduelle et on la centrifuge, ce qui permet de recueillir 200 ml d'une couche supérieure. Après avoir dilué la solution à 300 ml en y ajoutant du n-hexane, on la 25 fait passer à travers une colonne de gel de silice (5 x 15 cm). On fait passer suffisamment d'hexane à travers la colonne pour qu'il sorte à l'autre extrémité de celle-ci en entraînant les n-paraffines. On soumet le produit résultant à une chromatographie en uti— 30 lisant du chloroforme comme agent d'élution, ce qui permet de récupérer 0,5 g d'acide Corynomycolénique (C^H^0^0^ S d'acide palmitique, 0,1 g d'acide oléique et 1,3 g d'acide corynomycolique (C32H64°3^* EXEMPLE 3 35 On applique le procédé général décrit dans l'exemple 1. On cultive le micro-organisme Micrococcus epidermidis ATCC 155 avec secousse en aérobie, pendant 24 heures, dans un milieu d'ensemencement contenant 2 % de sorbitol, 1 % de peptone, 1 % d'extrait de viande et 0,3 % de sel ordinaire. On inocule la culture d'en— 40 semencement résultante, dans la proportion de 10 % en volume, 69 01532 2C01C95 dans un milieu de fermentation contenant des fractions de n-paraffines (C^-C2o) C0Iimie source de carbone„ Le milieu de fermentation utilisé a la composition suivante : mélange de paraffines (V/V) 5 (C15C20) 15 % 0,2 % KH^PO^ 0,2 % MgS04,7ïï20 0,1 % MnS04,4H20 0,005 % 0 FeS0^,7H20 0,01 % HH^NOj 1 % Liquenr de macération du maïs 0,05 % Thiamine 50 i^g /litre 15 On ajuste le pH du milieu à 7»5 avant la stérilisation* On effectue la culture de la mime manière que dans l'exem--pie 1, en utilisant un récipient de fermentation d'une contenance de 5 litres et en secouant en aérobie à 30°C. On traite la liqueur de culture résultante de la même manière que dans l'exem-20 pie 2, ce qui permet de récupérer et d'isoler 1,7 g d'acide arthronique, 0,2 g d'acide vaccénique et 0,3 g d'acide palmiti-que* •RTRMPT.-R 4 On inocule une culture d'ensemencement d'Arthrobacter 25 drocarboglutamicus ATCC 15583 dans un milieu de fermentation ayant la même composition que le milieu décrit dans l'exemple 3, à cette exception que la source de carbone est constituée par du kérosène. Après 10 heures de culture, on ajoute 10 unités/ml d'une solutioh d'un.sel de potassium de pénicilline G. On cultive 30 pendant un temps total de 82 heures. Après traitement de la liqueur de fermentation résultante de la même manière que dans l'exemple 2, on obtient 1,3 g/2 litres d'arthronate d'éthyle, 2,2 g/2 litres d'acide arthronique et 0,4 g d'acide palmitique. 35 TOŒMPLE 5 Le microorganisme d'ensemencement est le Mycobactft-rinm smegmatis ATCC 362. On le cultive pendant 24 heures dans un milieu d'ensemencement ayant la même composition que le milieu décrit dans l'exemple 3» et auquel on a ajouté 5 % de n-paraffines 40 (C15-C20) en supplément. On inocule la culture d'ensemencement 69 01532 9 2001095 résultante et on la cultive dans le même milieu de fermentation que dans l'exemple 1. Après 4 jours de culture, on traite 2,3 litres de la liqueur de fermentation résultante de la manière décrite dans 11exem— 5 pie 1. La séparation par chromatographie permet de récupérer 0,5 g d'acide stéarique, 1,2 g d'acide docosanoïque (CqoH/^Oq) et 1,7 g d'acide n-ditriacontanoïque o h:x KMPLE 6 On procède de la même manière que dans l'exemple 1, mais en 10 utilisant le micro-organisme Micrococcus paraffinolyticus ATCC 15582 comme souche d'ensemencement au lieu d1Arthrobacter paraf-fineus ATCC 15591, ce qui permet d'obtenir 2,6 g d'acide arthronique . Les exemples qui précèdent illustrent uniquement les con— 15 ditions de culture et les souches de micro-organismes particulières qu'on peut utiliser. Il est bien entendu qu'on peut utiliser n'importe quel micro-organisme ayant les propriétés sus-mentionnées. En outre, on peut bien entendu utiliser des mutants de tels micro-organis-20 mes. Il est évident qu'on peut apporter de nombreuses modifications à la description qui précède sans sortir pour cela du cadre de la présente invention. 69 01532 10 2001095 REVENDICATIONS 1. Procédé de production d'acides gras supérieurs et de leurs alkyl esters, qui est caractérisé par le fait qu'on cultive un micro-organisme assimilant des hydrocarbures, qui est ca° 5 pable de produire lesdits acides gras, dans des conditions aér© bies, au sein d'un milieu nutritif aqueux contenant un hydrocarba® re ou un mélange d'hydrocarbures comme source de carbone priaci« pale, et qu'on laisse accumuler les acides gras supérieurs et leurs alkyl esters dans la liqueur de culture résultante. 10 2. Procédé conforme à la revendication 1, caractérisé par le fait qu'on exécute la culture à une température d'environ 20 à 45°C et à un pH d'environ 4 à 9. 3. Procédé conforme à la revendication 1, caractérisé par 1© fait que le micro-organisme appartient à un genre pris dans le 15 groupe comprenant les souches Arthrobacter. Brevibacterjunu Corynebacterium. Micrococcus. Mycobacterium. Aspergillus et Candida. 4. Procédé conforme à la revendication 1, caractérisé par le fait que les acides gras supérieurs ont un nombre d'atomes de 20 carbone qui est supérieur au nombre d'atomes de carbone de l'hgr&o^ carbure de départ incorporé au milieu. 5» Procédé conforme à la revendication 1, dans lequel les acides gras supérieurs sont pris dans le groupe que fonnœt 1 »aci-de arthronique, l'acide corynomycolénique, l'acide palmitique, 25 l'acide oléique, l'acide corynomycolique, l'acide vaccéniques l'acide stéarique, l'acide n-docosanoïque et l'acide n-ditria» contanoïque. 6. Procédé conforme à la revendication 1, caractérisé par le fait que l'hydrocarbure précité est une n-paraffine ayant 6 30 à 25 atomes de carbone. 7« Procédé conforme à la revendication 1, caractérisé par le fait que de la pénicilline est ajoutée au milieu après le &é~ but de la culture. 8. Procédé conforme à la revendication 1, caractérisé par 35 le fait que le milieu nutritif aqueux contient au moins une n- paraffine ayant 6 à 25 atomes de carbone comme source de carbon* principale et qu'on récupère et isole les acides gras et leurs esters qui sont accumulés dans la liqueur de culture. 9. Procédé conforme à la revendication 1, dans lequel le 40 micro-organisme est 1 ' Arthrobacter paraffineus ATCC 1559*1. BAD ORIGINAL 6° 01532 n 2001095 10. Procédé conforme, à la revendication 1, caractérisé par le fait que ledit micro-organisme est le Corynebacterium hydrocarboclastrus ATCC 15592. 11. Procédé conforme à la revendication 1, caractérisé par 5 le fait que le micro-organisme est le Micrococcus epidermidis ATCC 155. 12. Procédé conforme à la revendication 1s dans lequel le micro-organisme est 1'Arthrobacter hydrocarboglutamicus ATCC le fait que le micro-organisme est le Mycobacterium smegmatis ATCC 362o 14. Procédé conforme à la revendication 1, caractérisé par le fait que le micro-organisme est le Micrococcus paraffinolyti~ 15 eus ATCC 15582. 15. Procédé conforme à la revendication 1, dans lequel l'hydrocarbure précité est le kérosèneo 15583. 10 13» Procédé conforme à la revendication 1, caractérisé par 6AD