Brevet FR3164478A1 — publié le 20260116

Région p romot rice du gène régulateur gadR2 et son utilisation pour la surproduction d’acide gamma-aminobut y rique La présente invention concerne une région promotrice du gène régulateur gadR2 capable d’induire la surexpression de gadR2 , une cassette régulatrice gadR2 comprenant un gène régulateur gadR2 et sa région promotrice, ainsi que l’utilisation de ladite cassette pour induire une régulation positive du promoteur gadCB . L’invention concerne également un plasmide comprenant la cassette régulatrice gadR2 ainsi qu’une bactérie lactique transformée comprenant le plasmide, le plasmide et la bactérie pouvant être utilisés pour induire une surproduction d’acide gamma-aminobutyrique (GABA). L’invention concerne également un procédé de production de GABA comprenant la culture d’une bactérie lactique transformée selon l’invention et un procédé de production d’une bactérie lactique génétiquement modifiée productrice de GABA comprenant l’introduction dans ladite bactérie lactique d’un plasmide selon l’invention. Figure pour l'abrégé : aucune Région promotrice du gène régulateur gadR2 et son utilisation pour la surproduction d’acide gamma-aminobutyrique La présente invention concerne une région promotrice du gène régulateur gadR2 capable d’induire la surexpression de gadR2 , une cassette régulatrice gadR2 comprenant un gène régulateur gadR2 et sa région promotrice, ainsi que l’utilisation de ladite cassette pour induire une régulation positive du promoteur gadCB . L’invention concerne également un plasmide comprenant la cassette régulatrice gadR2 ainsi qu’une bactérie lactique transformée comprenant le plasmide, le plasmide et la bactérie pouvant être utilisés pour induire une surproduction d’acide gamma-aminobutyrique (GABA). L’invention concerne également un procédé de production de GABA comprenant la culture d’une bactérie lactique transformée selon l’invention et un procédé de production d’une bactérie lactique génétiquement modifiée productrice de GABA comprenant l’introduction dans ladite bactérie lactique d’un plasmide selon l’invention. Les bactéries lactiques sont largement utilisées dans l'industrie alimentaire (fromage, babeurre, crème fraîche, yaourt) pour leurs propriétés acidifiantes (conversion des sucres en acide lactique), texturantes (production d’exopolysaccharides) et préservatrices contre des bactéries pathogènes (production de bactériocines). Elles contribuent également à la saveur des produits laitiers et l'intérêt pour leur utilisation potentielle en tant qu'usines cellulaires pour l'industrie chimique (biocarburants, solvants, plastiques d'origine biologique) s'est accru ces dernières années. Une autre caractéristique attrayante des bactéries lactiques est leur capacité à produire une gamme de molécules ayant des applications dans le domaine de la santé, telles que des peptides bioactifs, des vitamines, de l'acide hyaluronique et du GABA. Le GABA, neurotransmetteur très répandu dans le système nerveux sympathique, fait l'objet d'une recherche particulière depuis plusieurs années en raison de ses nombreux avantages pour la santé. Le GABA joue un rôle crucial dans l'abaissement de la tension artérielle, réduit le risque d'adénocarcinome pulmonaire et possède des propriétés antidiabétiques, neuroprotectrices, antidépressives, anti-inflammatoires et antinociceptives viscérales. Les bactéries lactiques sont des bactéries capables de produire de grandes quantités de GABA. Toutefois, cette production de GABA diffère grandement selon les espèces et même selon les souches à l’intérieur d’une même espèce. L’organisation des gènes impliqués dans la production de GABA peut varier en fonction des espèces de bactéries lactiques, mais dans l’espèce Lactococcus lactis les souches ont un opéron gadCB : gadC codant le transporteur du glutamate et du GABA et gadB codant la glutamate décarboxylase. Ces deux gènes dépendent du même promoteur gadCB (P gadCB ). En amont, se trouve un gène, nommé gadR2 (ou gadR ), régulateur positif du promoteur gadCB (P gadCB ) et qui possède son propre promoteur. Les inventeurs de la présente invention ont maintenant découvert de façon surprenante que la région promotrice du gène gadR2 (P gadR2 ) peut induire une surexpression du gène régulateur gadR2 induisant une surexpression des gènes de l’opéron gadCB et la surproduction de GABA. Ainsi la présente invention concerne une région promotrice du gène régulateur gadR2 capable d’induire la surexpression de gadR2 , ladite région comprenant ou consistant en : (a) La séquence polynucléotidique comprenant ou consistant en la SEQ ID N°1; (b) Une séquence polynucléotidique au moins 80% identique à la SEQ ID N°1 et qui permet la surexpression du gène régulateur gadR2 ; ou (c) Une séquence complémentaire des séquences polynucléotidiques (a) ou (b), dans laquelle la séquence complémentaire et la séquence polynucléotidique ont le même nombre de nucléotides et sont 100% complémentaires. La présente invention concerne également une cassette régulatrice gadR2 comprenant un gène régulateur gadR2 et sa région promotrice P gadR2 selon l’invention. La présente invention concerne aussi l’utilisation d’une cassette régulatrice selon l’invention, pour induire une régulation positive du promoteur gadCB . Elle concerne également un plasmide comprenant une cassette régulatrice gadR2 selon l’invention. La présente invention concerne aussi une bactérie lactique transformée comprenant le plasmide selon l’invention. Elle concerne également l’utilisation d’un plasmide selon l’invention ou d’une bactérie lactique transformée selon l’invention, pour induire une surproduction d’acide gamma-aminobutyrique (GABA). La présente invention concerne aussi un procédé de production de GABA comprenant la culture d’une bactérie lactique transformée selon l’invention. La présente invention concerne également un procédé de production d’une bactérie lactique génétiquement modifiée productrice de GABA comprenant l’introduction dans ladite bactérie lactique d’un plasmide selon l’invention. Description détaillée Région promotrice du gène régulateur gadR2 (PgadR2) L’invention concerne une région promotrice du gène régulateur gadR2 (P gadR2 ) capable d’induire la surexpression du gène régulateur gadR2 ladite région promotrice comprenant ou consistant en : (a) La séquence polynucléotidique comprenant ou consistant en la SEQ ID N°1; (b) Une séquence polynucléotidique au moins 80% identique à la SEQ ID N°1 et qui permet la surexpression du gène régulateur gadR2 ; ou (c) Une séquence complémentaire des séquences polynucléotidiques (a) ou (b), dans laquelle la séquence complémentaire et la séquence polynucléotidique ont le même nombre de nucléotides et sont 100% complémentaires. L’identification de cette région promotrice spécifique permet une surexpression du gène régulateur gadR2 , et de ce fait des gènes de l’opéron gadCB , ainsi qu’une surproduction de GABA. Par « surexpression du gène régulateur gadR2 », on entend en particulier une expression supérieure à l’expression du gène régulateur gadR2 obtenue avec une région promotrice contrôle, par exemple la région promotrice du gène régulateur ga d R2 de la souche modèle Lactococcus lactis ssp. lactis NCDO2118, également appelée souche NCDO2118. Plus particulièrement, la région promotrice selon l’invention permet une expression du gène régulateur gadR2 au moins 14 fois plus importante que l’expression obtenue avec une région promotrice contrôle de la souche NCDO2118. Par « surexpression des gènes de l’opéron gad CB », on entend en particulier une expression supérieure des gènes gadC et gad B par rapport à celle obtenue avec une région promotrice contrôle, par exemple la région promotrice de l’opéron gadCB de la souche modèle NCDO2118. Plus particulièrement, la région promotrice avec le régulateur gad R2 selon l’invention permet d’activer le niveau basal du promoteur P gadCB responsable de l’expression des gènes gadC et gadB d’un facteur 268 par rapport au niveau basal, et d’augmenter d’un facteur 3 par rapport à l’expression obtenue avec une région promotrice contrôle et son régulateur gadR2 de la souche modèle NCDO2118. Le niveau basal correspond à l’expression du promoteur gadCB sans le régulateur gadR2 . Par « surproduction de GABA », on entend une production de GABA supérieure à celle obtenue avec une région promotrice contrôle, par exemple la région promotrice avec le régulateur gadR2 de la souche contrôle NCDO2118, ou la région promotrice avec le régulateur gadR2 de la souche non productrice Lactococcus lactis ssp. lactis IL1403, également appelée souche IL1403. Plus particulièrement, la région promotrice selon l’invention permet d’obtenir une production de GABA 18 fois plus importante que la production obtenue avec une région promotrice contrôle de la souche NCDO2118 et 21 fois plus importante que la production obtenue avec la région promotrice de la souche peu productrice IL1403 (valeurs obtenues par culture des souches transformées par un plasmide portant ou non le promoteur et le régulateur en bioréacteur). Le GABA, également connu sous le nom d’acide gamma-aminobutyrique, est le principal neurotransmetteur inhibiteur du système nerveux central (SNC) et présente la structure suivante : Le GABA est produit par les neurones du SNC et par des bactéries lactiques présentes dans le système digestif telles que Lactococcus et Lactobacillus . On le trouve également dans de nombreux aliments fermentés, car les bactéries lactiques, telles que Lactococcus le produisent. Les bactéries produisent le GABA par l'action d'un système de décarboxylase de l'acide glutamique (GAD), qui comprend une enzyme GAD codée par les gènes gadA ou gadB et un antiporteur glutamate/GABA codé par le gène gadC . La SEQ ID N°1 répond à la séquence suivante : 5’-CTAATAGAGCAGATGATGAGCCCAGTATAAGCTTTCACACTGTTTTTATTAATAGCCTAAGAGAAATATAAAGTAATATAAATGTTTTTTATTATAAATTATGTAAGATATACTTTTTGTATGAACTGGTATAAAT TTGACG ATTAAGTCCTAAATA T GT TATAAT CTCAATTGCGTAATTTCTTAAATCCAGAAATAACAGCTACATTGACATACTGATTAAAGAGTATAGCCAATGAACTGTTATAAATCTTGAAAA A ACAATAAAAATAATAGTTTGGG GGATGTT GAGA-3’ Cette séquence comprend tous les nucléotides en amont de la séquence codante du gène gadR2 dont les boîtes -10, -35 et la région 5’UTR avec le RBS (Ribosome Binding Site). Ladite région promotrice comprend un SNP (single nucleotide polymorphism) consistant à l’inversion d’un A en T en amont de la boite -10, et l’insertion d’un A entre la boîte -10 et le RBS, par rapport à la région promotrice du régulateur gadR2 de la souche modèle NCDO2118 qui est prise comme contrôle (en gras dans Seq ID N°1). En particulier, le P gadR2 est issu de la souche Lactococcus lactis EIP3I (CNCM I-5388). La souche Lactococcus lactis EIP3I a été déposée à la CNCM (Collection Nationale de Cultures de Microorganismes, 25 rue du Docteur Roux, Paris) le 13 décembre 2018 sous le numéro I-5388. De tels polynucléotides peuvent être facilement obtenus par l'Homme du métier. Les polynucléotides selon l'invention peuvent par exemple être obtenus par synthèse d’ADN in vitro . Le polynucléotide peut ensuite être cloné dans un plasmide. Le terme "région promotrice" désigne ici à la fois l'ADN, y compris l'ADN du brin complémentaire, l'ADN génomique et l'ADN synthétique. Les polynucléotides peuvent avoir n'importe quelle structure tridimensionnelle. Un polynucléotide peut être double brin. Les polynucléotides isolés selon l'invention peuvent être purifiés ou recombinés. La région promotrice selon l'invention peut par exemple consister en un minimum de 160 nucléotides. Cette région promotrice selon l’invention est une séquence isolée. Le terme "isolée" en référence à un composant biologique désigne un composant biologique qui a été substantiellement séparé ou purifié des autres composants biologiques de la cellule de l'organisme, ou de l'organisme lui-même, dans lesquels le composant est naturellement présent, tels que d'autres ADN chromosomiques et extra-chromosomiques, des protéines, des cellules et des organites. Les "régions promotrices isolées" comprennent les molécules d'acide nucléique purifiées par des méthodes de purification standard. Ces termes englobent également les acides nucléiques préparés par amplification et/ou clonage, ainsi que les acides nucléiques synthétisés chimiquement. Par "séquence polynucléotidique identique à au moins 80 % à la SEQ ID N°1 et qui permet la surexpression du gène régulateur gadR2 ", on entend en particulier une séquence polynucléotidique identique à 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 ou 99 % à la SEQ ID N°1 et qui permet la surexpression du gène régulateur gadR2 . Par exemple, une séquence polynucléotidique « identique" à 95 % » signifie que la séquence du polynucléotide est identique à la séquence SEQ ID N°1 et permet la surexpression du gène régulateur gadR2 , à l'exception du fait que la séquence peut comprendre jusqu'à cinq altérations nucléotidiques pour 100 nucléotides de la SEQ ID N°1. En d'autres termes, pour obtenir un polynucléotide dont la séquence est identique à au moins 95 % à la SEQ ID N°1, jusqu'à 5 % (5 sur 100) des nucléotides de la séquence peuvent être insérés, supprimés ou remplacés par un autre nucléotide. En d'autres termes, les séquences doivent être comparées sur toute leur longueur (c'est-à-dire en préparant un alignement global). Par exemple, un premier polynucléotide de 100 nt (nucléotides) compris dans un second polynucléotide de 200 nt est identique à 50 % à ce second polynucléotide. Le programme needle, qui utilise l'algorithme d'alignement global de Needleman-Wunsch (Needleman et Wunsch, 1970, A general method applicable to the search for similarities in the amino acid sequence of two proteins, J. Mol. Biol. 48:443-453) pour trouver l'alignement optimal (y compris les lacunes) de deux séquences en tenant compte de leur longueur totale, peut par exemple être utilisé. De préférence, le pourcentage d'identité selon l'invention est calculé à l'aide du programme needle avec un paramètre "Gap open" égal à 10,0, un paramètre "Gap Extend" égal à 0,5, et une matrice de Blosum 62. Le programme needle est par exemple disponible sur le site Web ebi.ac.uk. Une "séquence complémentaire" telle qu'elle est utilisée ici se réfère à une séquence qui s'hybride spécifiquement en solution, par exemple, selon les règles d'appariement des bases de Watson-Crick. En particulier, le gène régulateur gadR2 selon l’invention comprend ou consiste en la séquence polynucléotidique comprenant ou consistant en une séquence au moins 80% identique à la SEQ ID N°2. La SEQ ID N°2 répond à la séquence suivante : 5‘-ATGTATAAAAAATATGGAGATTGTTTTAAAAAGTTACGAAACCAAAAGAATTTAGGATTATCATACTTTAGTAAATTAGGAATAGACCGTTCAAATATATCTAGATTTGAACATGGAAAGTGTATGATGAGTTTTGAGCGCATAGATTTGATGTTAGAAGAAATGCAAGTGCCATTAGCTGAGTACGAATTGATAGTAAATAATTATATGCCGAATTTCCAAGAATTTTTTATATTAGAATTGGAAAAAGCTGAATTTAGTCAAAATCGAGATAAAATAAAAGAGTTATATTCTGAGGTTAAAGAAACAGGGAATCATTTACTGACGATTACCGTTAAAACGAAGCTTGGGACTATTAGTCAGACAGAAGTTAAGGAAATTGAAACTTATCTTTGTAATATTGAAGAGTGGGGATATTTTGAACTAACTTTATTCTATTTTGTATCTGATTATCTCAATGTCAATCAATTAGAATTGCTGCTTTTTAACTTTGACAAAAGATGTGAAAATTACTGTAGAGTCTTAAAATATAGAAGGAGACTATTGCAAATAGCCTATAAAAGCGTTGCGATATACGCGGCTAATGGAGAAAGAACAAAAGCCGAAAATATTTTAGAAATGACTAAAAAATATCGGACTGTAGGTGTTGATTTATATTCTGAAGTATTAAGACATCTTGCCAGAGGTATCATTATTTTTAATTTTGAAAATGCAGAAGTGGGAGAAGAAAAAATAAATTATGCGCTTGAAACTTTGGAAGAATTTGGAGGAATGAAGATAAAAGAATTCTATCAGAAAAAAATGGAAAAGTATTTGAAAAAGTCAATTTAG-3’. Par "séquence polynucléotidique identique à au moins 80 % à la SEQ ID N°2, on entend en particulier une séquence polynucléotidique identique à 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 ou 99 % à la SEQ ID N°2. Par exemple, une séquence polynucléotidique « identique" à 95 % » signifie que la séquence du polynucléotide est identique à la séquence SEQ ID N°2, à l'exception du fait que la séquence peut comprendre jusqu'à cinq altérations nucléotidiques pour 100 nucléotides de la SEQ ID N°2. En d'autres termes, pour obtenir un polynucléotide dont la séquence est identique à au moins 95 % à la SEQ ID N°2, jusqu'à 5 % (5 sur 100) des nucléotides de la séquence peuvent être insérés, supprimés ou remplacés par un autre nucléotide. En d'autres termes, les séquences doivent être comparées sur toute leur longueur (c'est-à-dire en préparant un alignement global). Par exemple, un premier polynucléotide de 100 nt (nucléotides) compris dans un second polynucléotide de 200 nt est identique à 50 % à ce second polynucléotide. Le programme needle, qui utilise l'algorithme d'alignement global de Needleman-Wunsch (Needleman et Wunsch, 1970, A general method applicable to the search for similarities in the amino acid sequence of two proteins, J. Mol. Biol. 48:443-453) pour trouver l'alignement optimal (y compris les lacunes) de deux séquences en tenant compte de leur longueur totale, peut par exemple être utilisé. De préférence, le pourcentage d'identité selon l'invention est calculé à l'aide du programme needle avec un paramètre "Gap open" égal à 10,0, un paramètre "Gap Extend" égal à 0,5, et une matrice de Blosum 62. Le programme needle est par exemple disponible sur le site Web ebi.ac.uk. Cassette régulatrice gadR2 La présente invention concerne également une cassette régulatrice gadR2 comprenant un gène régulateur gadR2 selon l’invention et sa région promotrice P gadR2 selon l’invention. Une cassette régulatrice selon l’invention est un fragment d’ADN naturel ou une construction recombinante comprenant une combinaison artificielle de fragments d'acide nucléique, y compris, mais sans s'y limiter, des séquences régulatrices et codantes qui ne se trouvent pas ensemble dans la nature. Par exemple, une construction d'ADN recombinant peut comprendre des séquences régulatrices et des séquences codantes provenant de sources différentes, ou des séquences régulatrices et des séquences codantes provenant de la même source et disposées d'une manière différente de celle que l'on trouve dans la nature. La cassette d'expression pourra comprendre des séquences régulatrices 5' et 3' liées de manière opérationnelle au promoteur P gadR2 et/ou gène régulateur gadR2 selon l’invention. Par "lié de manière opérationnelle", on entend un lien fonctionnel entre deux éléments ou plus. Les "séquences régulatrices" sont des nucléotides situés en amont (séquences 5' non codantes), à l'intérieur ou en aval (séquences 3' non codantes) d'une séquence codante et qui peuvent influencer la transcription, le traitement de l'ARN, la stabilité ou la traduction de la séquence codante associée. Les séquences régulatrices peuvent inclure, sans s'y limiter, les séquences de tête de traduction, et les séquences de reconnaissance de la polyadénylation. La présente invention concerne également l’utilisation d’une cassette régulatrice selon l’invention, pour induire une régulation positive du promoteur gadCB . L’opéron gadCB comprend le gène gadC qui code le transporteur du glutamate et du GABA et gadB qui code la glutamate décarboxylase, ces deux gènes dépendant du même promoteur gadCB (P gadCB ). Par « régulation positive », on entend que la cassette régulatrice selon l’invention va induire une activation de P gadCB , en particulier une suractivation de P gadCB . Cette régulation positive du promoteur gadCB permet une surexpression des gènes gadC et gadB , ce qui entraîne une surproduction de GABA. Par « surexpression des gènes gad C et gadB », et « surproduction de GABA », on entend la même définition que celle indiquée dans le paragraphe relatif à la région promotrice P gadR2 . Par « suractivation de P gadCB », on entend en particulier une activation supérieure de P gadCB par rapport à celle obtenue avec une région promotrice contrôle, par exemple la région promotrice de l’opéron gadCB de la souche modèle NCDO2118. Plus particulièrement, la région promotrice selon l’invention permet d’activer le niveau basal du promoteur P gadCB responsable de l’expression des gènes gadC et gadB d’un facteur 268 par rapport au niveau basal, et d’augmenter d’un facteur 3 par rapport à l’expression obtenue avec une région promotrice contrôle et son régulateur gadR2 de la souche modèle NCDO2118 (valeurs obtenues par fusion du promoteur à un gène rapporteur). Par « niveau basal » on entend la même définition que celle indiquée dans le paragraphe relatif à la région promotrice PgadR2. Plasmide La présente invention concerne également un plasmide comprenant une cassette régulatrice gadR2 selon l’invention. Par "plasmide", on entend ici un ADN circulaire à double brin. Le plasmide peut comprendre un gène marqueur permettant de sélectionner les cellules comprenant ledit plasmide, une origine de réplication pour permettre à la cellule de répliquer le plasmide et/ou un site de clonage multiple permettant l'insertion d'un fragment d'ADN, en particulier la cassette selon l'invention. En particulier, ledit plasmide est choisi parmi ceux décrits dans le tableau 1. Nom plasmide Description Construction Vecteur Insert Mode opératoire pTRKH3-PermGFP Plasmide pTRKH3 exprimant la eGFP sous le contrôle du promoteur erm ; ery R (Addgene ref 27169) pTRKH3-eGFP pTRKH3-PermGFP délété du promoteur erm ; ery R Amplification A1+A2 de pTRKH3-PermGFP Ligation « blunt-end » du vecteur pTRKH3-pCB EIP3I -eGFP pTRKH3-eGFP exprimant la eGFP sous le contrôle du promoteur de gadCB de EIP3I; ery R Amplification A1+A2 de pTRKH3-PermGFP Amplification A4+A5 de ADNg EIP3I Clonage Gibson pTRKH3-pCB 2118 -eGFP pTRKH3-eGFP exprimant la GFP sous le contrôle du promoteur de gadCB de NCDO2118; ery R Amplification A1+A2 de pTRKH3-PermGFP Amplification A4+A5 de ADNg NCDO2118 Clonage Gibson pTRKH3-R2 EIP3I -pCB EIP3I -eGFP pTRKH3-pCB EIP3I -eGFP exprimant gadR2 de EIP3I sous le contrôle de son propre promoteur ; ery R Amplification A1+A6 de pTRKH3-pCB EIP3I -eGFP Amplification A7+A8 de ADNg EIP3I Clonage Gibson pTRKH3-R2 2118 -pCB 2118 -eGFP pTRKH3-pCB 2118 -eGFP exprimant gadR2 de NCDO2118 sous le contrôle de son propre promoteur; ery R Amplification A1+A6 de pTRKH3-pCB 2118 -eGFP Amplification A7+A8 de ADNg NCDO2118 Clonage Gibson pTRKH3-pR2 EIP3I -eGFP pTRKH3-eGFP exprimant la eGFP sous le contrôle du promoteur de gadR2 de EIP3I; ery R Amplification A2+A11 de pTRKH3-R2 EIP3I -pCB EIP3I -eGFP Ligation « blunt-end » du vecteur pTRKH3-pR2 2118 -eGFP pTRKH3-eGFP exprimant la eGFP sous le contrôle du promoteur de gadR2 de NCDO2118; ery R Amplification A2+A11 de pTRKH3-R2 2118 -pCB 2118 -eGFP Ligation « blunt-end » du vecteur pTRKH3-R2 EIP3I pTRKH3-ermGFP, dans lequel la cassette [ermGFP] a été remplacée par le régulateur gadR2 de EIP3I sous le contrôle de son propre promoteur Amplification A3+A16 de pTRKH3-R2 EIP3I -pCB EIP3I -eGFP Ligation « blunt-end » du vecteur [Tableau 1] La présente invention concerne également l’utilisation d’un plasmide selon l’invention, pour induire une surproduction de GABA. Ce qu’on entend par « surproduction de GABA » a déjà été explicité dans la partie relative à la région promotrice P gadR2 . Dans le cadre de la présente invention, l’utilisation du plasmide selon l’invention va permettre notamment de transformer une bactérie lactique dans le but d’obtenir une souche surproductrice de GABA. Bactérie lactique transformée La présente invention concerne donc également une bactérie lactique transformée comprenant le plasmide selon l’invention. La présente invention concerne également l’utilisation d’une bactérie lactique transformée selon l’invention, pour induire une surproduction de GABA. Les bactéries lactiques sont bien connues de l’homme du métier qui pourra opérer la transformation sur la base de ses connaissances générales. Des bactéries lactiques selon l’invention seront en particulier choisies parmi Lactococcus lactis ssp. lactis IL1403, telle que décrite dans Chopin A, Chopin MC, Moillo-Batt A, Langella P (1984) Two plasmid determined restriction and modification systems in Streptococcus lactis . Plasmid 11:260–263, Lactococcus lactis ssp. lactis NCDO2118, telle que décrite dans Oliveira LC, Saraiva TDL, Soares SC, Ramos RTJ, Sá PHCG, Carneiro AR, et al. Genome Sequence of Lactococcus lactis subsp. lactis NCDO 2118, a GABA-Producing Strain. Genome Announc . 2014;2:e00980-14., et Lactococcus lactis EIP3I (CNCM I-5388) telle que décrite dans Gomes P et al., 2023, FASEB J., https://doi.org/10.1096/fj.202301588R. La surproduction de GABA est telle que définie précédemment et proviendra de la présence du plasmide selon l’invention, comprenant lui-même une cassette régulatrice selon l’invention, ladite cassette comprenant la région promotrice selon l’invention capable d’induire in fine la surproduction de GABA. Procédé de production de GABA La présente invention concerne également un procédé de production de GABA comprenant la culture d’une bactérie lactique transformée selon l’invention. Tel que déjà mentionné, les bactéries lactiques sont bien connues de l’homme du métier qui pourra opérer la transformation sur la base de ses connaissances générales. La préparation des milieux de culture et la définition des conditions de culture permettant la croissance et la production de GABA dans les souches de bactéries lactiques de la présente invention sont bien connues de l'homme du métier; ces milieux de culture peuvent être adaptés à chaque souche spécifique de L actococcus lactis . En outre, la culture des bactéries lactiques transformées peut être effectuée entre 25 et 42°C. Dans certains cas, la culture des bactéries lactiques transformées peut se faire dans des conditions aérobies ou anaérobies. Les conditions de température peuvent être réglées à l'aide d'un bain thermostatique, d'un manteau chauffant, d'une jaquette, etc. En outre, le terme "conditions anaérobies" utilisé ici fait référence à un environnement à faible teneur en oxygène ou en absence d’oxygène dans lequel les bactéries lactiques peuvent proliférer. Par exemple, dans un tel environnement, les conditions anaérobies peuvent être assurées par l'utilisation d'une chambre anaérobie, d'une boîte anaérobie, d'un conteneur ou d'un sac hermétique contenant un désoxydant, ou autre, ou simplement en scellant un récipient de culture de manière hermétique. Le format de culture peut comprendre la culture statique, la culture par agitation et la culture en cuve. En outre, la durée de la culture peut être comprise entre 3 et 96 heures. Dans certains cas, le pH du milieu peut être maintenu entre 4,5 et 7,0 au début de la culture. Par exemple le milieu de culture et les conditions de cultures utilisées en bioréacteur peuvent être les suivantes : 5 g/L d’acide glutamique, 50 g/L de glucose et 5 µg/mL d’érythromycine dans un milieu de base avec de l’extrait de levure à 10 g/L, une régulation du pH à 6.6 pendant 7 h puis une baisse du pH à 4.6. De telles bactéries lactiques seront en particulier choisies parmi Lactococcus lactis ssp. lactis IL1403, telle que décrite dans Chopin A, Chopin MC, Moillo-Batt A, Langella P (1984) Two plasmid determined restriction and modification systems in Streptococcus lactis . Plasmid 11:260–263., Lactococcus lactis ssp. lactis NCDO2118, telle que décrite dans Oliveira LC, Saraiva TDL, Soares SC, Ramos RTJ, Sá PHCG, Carneiro AR, et al. Genome Sequence of Lactococcus lactis subsp. lactis NCDO 2118, a GABA-Producing Strain. Genome Announc . 2014;2:e00980-14., Lactococcus lactis EIP3I (CNCM I-5388) telle que décrite dans Gomes P et al., 2023, FASEB J., https://doi.org/10.1096/fj.202301588R. Là encore, la surproduction de GABA est telle que définie précédemment et proviendra de la présence du plasmide selon l’invention, comprenant lui-même une cassette régulatrice selon l’invention, ladite cassette comprenant la région promotrice selon l’invention capable d’induire in fine la surproduction de GABA. En particulier, la culture obtenue de bactéries lactiques transformées produisant du GABA peut être directement utilisée. Dans certains cas, la culture de bactéries lactiques transformées peut être soumise à d'autres traitements, notamment la stérilisation, la purification brute par centrifugation et/ou la séparation solide-liquide par filtration, selon les besoins. En outre, les bactéries lactiques transformées selon l’invention peuvent se présenter sous la forme de cellules bactériennes viables et/ou sous la forme de cellules bactériennes humides ou de cellules bactériennes séchées. Les bactéries lactiques transformées selon l’invention peuvent également être des bactéries mortes, lesdites bactéries ayant conservé leur morphologie cellulaire intacte ainsi que l’activité GAD. Selon un mode de réalisation, ces bactéries mortes ont été inactivées avec de l’éthanol. En particulier, un produit stérilisé peut être préparé par un traitement de stérilisation des bactéries lactiques transformées. Le traitement de stérilisation peut comprendre la stérilisation par filtration, la désinfection par rayonnement, la désinfection par surchauffe et la désinfection par pression. Dans certains modes de réalisation, un produit chauffé peut être préparé par traitement thermique des bactéries lactiques transformées. Le traitement thermique peut comprendre un traitement à haute température (par exemple, 80°C à 150°C) de la bactérie lactique transformée pendant un certain temps (par exemple, de 10 minutes à 1 heure, ou de 10 à 20 minutes). Dans certains modes de réalisation, un produit déstructuré ou un extrait acellulaire peut être préparé en déstructurant, en fracturant, en réduisant la taille, en écrasant, en pulvérisant, en désintégrant ou en broyant les bactéries lactiques transformées. Par exemple, il est possible de procéder à une désorganisation physique (par exemple, agitation ou filtration), à un traitement de lyse enzymatique, à un traitement chimique et/ou à un traitement d'induction de l'autolyse. Dans certains modes de réalisation, un extrait peut être obtenu par extraction des bactéries lactiques transformées à l'aide d'un solvant aqueux ou organique adéquat. Par exemple, les bactéries lactiques transformées peuvent être immergées dans un solvant aqueux ou organique (par exemple, l'eau, le méthanol ou l'éthanol), ou peuvent être agitées ou soumises à un reflux dans le solvant. Dans certains modes de réalisation, les bactéries lactiques transformées peuvent être transformées en un produit pulvérulent (poudre) ou granuleux par séchage. Les méthodes de séchage comprennent le séchage par pulvérisation, le séchage en tambour, le séchage sous vide et la lyophilisation, qui peuvent être utilisés seuls ou en combinaison. Dans certains modes de réalisation, le GABA peut être purifié à partir des bactéries lactiques transformées par une méthode de séparation/purification connue. Des exemples de telles méthodes de séparation/purification comprennent : une méthode impliquant la précipitation de sels ou de solvants organiques en fonction des degrés de solubilité ; une méthode impliquant la dialyse, l'ultrafiltration ou la filtration sur gel en fonction des différences de poids moléculaire ; une méthode impliquant la chromatographie d'échange d'ions en fonction des différences de charge ; une méthode impliquant la chromatographie d'affinité en fonction des degrés de liaison spécifique ; et une méthode impliquant la chromatographie hydrophobe ou la chromatographie en phase inverse en fonction des degrés d'hydrophobicité, ou une combinaison de ces méthodes. Procédé de production d’une bactérie lactique génétiquement modifiée productrice de G ABA La présente invention concerne également un procédé de production d’une bactérie lactique génétiquement modifiée productrice de GABA comprenant l’introduction dans ladite bactérie lactique d’un plasmide selon l’invention. Tel que déjà mentionné, les bactéries lactiques sont bien connues de l’homme du métier qui pourra modifier génétiquement la bactérie lactique sur la base de ses connaissances générales. De telles bactéries lactiques seront en particulier choisies parmi Lactococcus lactis ssp. lactis IL1403, telle que décrite dans Chopin A, Chopin MC, Moillo-Batt A, Langella P (1984) Two plasmid determined restriction and modification systems in Streptococcus lactis . Plasmid 11:260–263, Lactococcus lactis ssp. lactis NCDO2118, telle que décrite dans Oliveira LC, Saraiva TDL, Soares SC, Ramos RTJ, Sá PHCG, Carneiro AR, et al. Genome Sequence of Lactococcus lactis subsp. lactis NCDO2118, a GABA-Producing Strain. Genome Announc . 2014;2:e00980-14, Lactococcus lactis EIP3I (CNCM I-5388) telle que décrite dans Gomes P et al., 2023, FASEB J., https://doi.org/10.1096/fj.202301588R. Les bactéries lactiques génétiquement modifiées, telles que décrites ici, peuvent être propagées dans des conditions et dans des milieux connus de l'homme du métier. Dans certains modes de réalisation, les bactéries lactiques génétiquement modifiées peuvent être préparées par culture dans des conditions adéquates à l'aide d'un milieu conventionnellement utilisé pour la culture de bactéries lactiques. Un milieu naturel ou synthétique peut être utilisé comme milieu de culture à condition qu'il contienne une source de carbone, une source d'azote, un sel minéral, un agent de sélection de la construction génétique (par exemple, l'érythromycine) et d'autres composants, et qu'il permette la culture de bactéries lactiques génétiquement modifiées avec efficacité. Pour produire du GABA, le milieu doit contenir du glutamate libre car c’est le précurseur du GABA. L’homme du métier peut sélectionner de manière adéquate un milieu connu approprié à une souche bactérienne à utiliser. Parmi les exemples de sources de carbone pouvant être utilisées, on peut citer le lactose, le glucose, le saccharose, le fructose, le galactose et la mélasse noire. Parmi les exemples de sources d'azote pouvant être utilisées, on peut citer les substances organiques contenant de l'azote telles que l'hydrolysat de caséine, l'hydrolysat de protéines de lactosérum et l'hydrolysat de protéines de soja. Parmi les sels minéraux pouvant être utilisés, on peut citer le phosphate, le sodium, le potassium et le magnésium. Parmi les exemples de milieux appropriés pour la culture de bactéries lactiques, on peut citer le milieu liquide MRS, le milieu GAM, le milieu BL, le bouillon de foie de Briggs, le lait animal, le lait écrémé et le lactosérum dérivé du lait. Le jus de tomate, le jus de carotte, d'autres jus de légumes, le jus de pomme, le jus d'ananas et le jus de raisin sont des exemples de milieux naturels qui peuvent être utilisés. La bactérie lactique génétiquement modifiée obtenue par le procédé selon l’invention peut être utilisée et traité selon les méthodes décrites dans le paragraphe relatif au procédé de production de GABA. Tel que susmentionné le GABA permet d’agir sur les douleurs intestinales, les troubles de l'humeur, la gestion du stress, et plus globalement sur la santé et la nutrition humaine et animale. Il est également utilisé en tant que bloqueurs d'amertume et/ou arômes alimentaires. Ainsi, les bactéries lactiques selon l’invention pourront être utilisées dans la santé et/ou la nutrition humaine et animale. L’invention est maintenant illustrée par les figures et exemples suivants. Figures FIG. 1 : Stratégie de construction des différents plasmides utilisés FIG. 2 : Protocole de mesure de fluorescence en point final FIG. 3 : Alignement des séquences des promoteurs P gadR2 des souches L. lactis EIP3I et NCDO2118 FIG. 4 : Mesure de l'activation des promoteurs P gadCB avec ou sans régulateur dans les souches EIP3I et NCDO2118 FIG. 5 : Mesure de l'activation du promoteur P gadR2 dans les souches L. lactis EIP3I et NCDO2118 Exemples Etude de l’expression d es gènes g ad chez différentes souches de L. lactis Les niveaux d'expression des différents gènes gad de 2 souches de L. lactis (EIP3I (CNCM I-5388) telle que décrite dans Gomes P et al., 2023, FASEB J., https://doi.org/10.1096/fj.202301588R) et NCDO2118 (Oliveira LC, Saraiva TDL, Soares SC, Ramos RTJ, Sá PHCG, Carneiro AR, et al . Genome Sequence of Lactococcus lactis subsp. lactis NCDO2118, a GABA-Producing Strain. Genome Announc . 2014;2:e00980-14) ont été mesurés en fusionnant les promoteurs gadR2 , les gènes gadR2 et les promoteurs gadCB avec l'eGFP (forme améliorée de la protéine fluorescente verte GFP) dans un plasmide pTRKH3-eGFP et le plasmide a été introduit dans la souche de référence L. lactis IL1403. Matériel et méthodes Analyse in silico Les séquences des régions promotrices (P gadCB et P gadR2 ) et des gènes gadR2 des souches EIP3I et NCDO2118 ont été alignées grâce au l’algorithme CLUSTALW (paramètres par défaut utilisés) disponible dans le logiciel MEGA11 (Molecular Evolutionary Genetics Analysis) Le logiciel BENCHLING a été utilisé pour la construction des plasmides in silico ainsi que pour le design des oligonucléotides. Construction des différents plasmides utilisés dans l’étude La FIG. 1 illustre les stratégies utilisées pour la construction des différents plasmides. Le tableau 1 décrit le mode de clonage utilisé pour chaque plasmide (clonage GIBSON ou clonage ligation blunt-end ). Le tableau 2 décrit la séquence des oligonucléotides (ou amorces) utilisés pour réaliser les différents clonages. Nom Amorce A1 SEQ ID N°3: 5’ TCGACCTGAATGGAAG 3’ A2 SEQ ID N°4 : 5’ ATGAGTAAAGGAGAAGAACTTTTC 3’ A3 SEQ ID N°5 : 5’ GGATCCACAGGACG 3’ A4 SEQ ID N°6 : 5’ CCGGCTTCCATTCAGGTCGA GTATTAAGACATCTTGCCAG 3’ A5 SEQ ID N°7 : 5’ AGTTCTTCTCCTTTACTCAT CATACCTCCTTATATTTATGATTG 3’ A6 SEQ ID N°8 : 5’ GTATTAAGACATCTTGCCAG 3’ A7 SEQ ID N°9 : 5’ AATGATACCTCTGGCAAG 3’ A8 SEQ ID N°10 : 5’ CCGGCTTCCATTCAGGTCGA CTAATAGAGCAGATGATGAGC 3’ A11 SEQ ID N°11 : 5’ TCTCAACATCCCCC 3’ A16 SEQ ID N°12 : 5’ CTAAATTGACTTTTTCAAATACTTTTCC 3’ Oligonucléotides utilisés ( Queue flottante en gras ) Les oligonucléotides ont été synthétisés par EUROFINS GENOMICS. Tous les clonages ont été réalisés dans la souche E. coli DH5α. Plus précisément, le plasmide pTRKH3-Perm-eGFP (Ref Plasmid 27169) a été acheté chez Addgene (Addgene Europe, Teddington, UK). Ce plasmide contient 2 origines de réplication ( ori P15A permettant sa réplication chez E. coli , et ori pAMβ1 permettant sa réplication chez L.lactis ) , un gène de résistance à l’érythromycine permet la sélection chez E. coli (ery 150 µg/mL) ou L. lactis (ery 5 µg/mL) ainsi que la eGFP sous le contrôle du promoteur du gène conférant la résistance à l’érythromycine (Perm) A1- Le plasmide pTRKH3-eGFP (T-) a été obtenu par délétion du promoteur Perm après amplification PCR de 10 pg d’ADN matrice du pTRKH3-Perm-eGFP avec les oligonucléotides A1 et A2 (0.5 µM final pour chacun). L’amplification a été réalisée avec la CloneAmp HiFi PCR Premix (cat. No. 639298) de chez TaKaRa (TaKaRa Bio Europe SAS) dans un volume final de 25 µL et selon les recommandations du fournisseur. Les conditions de PCR sont les suivantes : Dénaturation 2 min à 98°C ; Dénaturation 10 sec à 98°C ; Hybridation 10 sec à 58°C ; Élongation 1 min 30 à 72°C ; 30 cycles PCR sont effectués (étape 2 à 4) ; Élongation 2 min à 72°C. (La température d’hybridation a été déterminée grâce au logiciel Tm calculator (https://tmcalculator.neb.com/#!/main), le temps d’élongation est de 5 sec / kb). A2- Après amplification, 5 µL du mix PCR sont passés sur gel afin de vérifier la taille du fragment amplifié (7600 pb), et les 20 µL restants sont purifiés avec le kit QIAquick PCR de chez QIAGEN (Ref 28104) selon le protocole du fabricant. A3- L’ADN purifié (100 ng) est ensuite phosphorylé avec la T4 polynucleotide kinase (Ref M0201S de chez New England Biolabs) et ligaturé grâce à la T4 DNA ligase (M0202S de chez New England Biolabs) selon les recommandations du fournisseur. A4- 5 µL d’ADN ligaturé (= clonage blunt end ) sont utilisés pour transformer des cellules d’ E. coli NEB 5α (dérivée de la souche E. coli DH5α) chimio-compétentes (C2987H de chez New England Biolabs). La sélection se fait sur LB + ery (150 µg/mL). A5- Une colonie est ensuite mise en culture, l’ADN plasmidique est extrait grâce au kit Monarch Plasmid Miniprep (Ref T1010L de chez New England Biolabs) et selon les recommandations du fournisseur. La séquence de l’ADN est vérifiée par séquençage Sanger (EUROFINS). B1 - Les plasmides pTRKH3-pCB EIP3I -eGFP et pTRKH3-pCB 2118 -eGFP ont été construits par remplacement de Perm par pCB EIP3I ou pCB 2118 respectivement. Plus précisément, l’ADN vecteur pTRKH3-Perm-eGFP a été amplifié par PCR avec les amorces A1 et A2 comme décrit plus haut. Les ADN insert pCB EIP3I ou pCB 2118 faisant 350 pb chacun ont été amplifiés par PCR avec comme matrice l’ADN génomique (1 ng) des souches EIP3I et NCDO2118 respectivement. L’amplification a été réalisée avec la DNA polymerase Q5-HF (M0491 de chez New England Biolabs) dans un volume final de 50 µL avec les amorces A4 et A5 et selon les recommandations du fournisseur. Les conditions de PCR sont les suivantes : Dénaturation 2 min à 98°C ; Dénaturation 10 sec à 98°C ; Hybridation 30 sec à 58°C ; 30 sec à 72°C ; 30 cycles PCR sont effectués (étape 2 à 4) ; Élongation 2 min à 72°C. (La température d’hybridation a été déterminée grâce au logiciel Tm calculator (https://tmcalculator.neb.com/#!/main), le temps d’élongation est de 20 sec / kb). B2- Après amplification des fragments inserts, l’ADN est passé sur gel et purifié sur colonne QIAGEN comme décrit précédemment en A2. B3- Les amorces A4 et A5 portent des queues flottantes (nucléotides en gras) permettant l’hybridation à l’ADN vecteur pTRKH3-Perm-eGFP préalablement amplifié par A1 et A2. Ceci permet de faire un assemblage de type GIBSON. Ainsi 50 ng d’ADN vecteur pTRKH3-Perm-eGFP amplifié avec A1 et A2 seront mélangés à l’ADN insert EIP3I ou NCDO2118 amplifié avec A4 et A5 dans des proportions molaires de 1 mole de vecteur pour 3 moles d’insert. Le clonage GIBSON sera réalisé grâce au kit NEBuilder® HiFi DNA Assembly Master Mix (E2621 de chez New England Biolabs). B4- 4 µL du produit GIBSON sont ensuite utilisés pour transformer des cellules d’ E. coli NEB 5α chimio-compétentes (C2987H de chez New England Biolabs). La sélection se fait sur LB + ery (150 µg/mL). B5- Une colonie est ensuite mise en culture, l’ADN plasmidique est extrait grâce au kit Monarch Plasmid Miniprep (Ref T1010L de chez New England Biolabs) et selon les recommandations du fournisseur. La séquence de l’ADN est vérifiée par séquençage Sanger (EUROFINS). C1 - Les plasmides pTRKH3- R2 EIP3 - pCB EIP3I -eGFP et pTRKH3- R2 2118 - pCB 2118 -eGFP ont été construits en clonant en amont des pCB EIP3I et pCB 2118 des gènes régulateurs gadR2 EIP3I et gadR 22118 sous le contrôle de leur propre promoteurs (R2 EIP3I et R2 2118 ). Les vecteurs pTRKH3-pCB EIP3I -eGFP et pTRKH3-pCB 2118 -eGFP, ont été amplifiés par PCR avec les amorces A1 et A6 et les inserts R2 EIP3I et R2 2118 ont été amplifiés à partir des ADN génomiques avec les amorces A7 et A8 et un clonage GIBSON a été réalisé comme décrit précédemment dans la partie B. D1 - Les plasmides pTRKH3- pR2 EIP3 I -eGFP et pTRKH3- pR2 2118 -eGFP ont été obtenus en délétant les fragments [ gadR2 EIP3I -pCB EIP3I ] et [ gadR2 2118 -pCB 2118 ] des plasmides pTRKH3-R2 EIP3- pCB EIP3I -eGFP et pTRKH3-R2 2118 -pCB 2118 -eGFP respectivement. Ces derniers ont été amplifiés par PCR avec les amorces A2 et A11 et recircularisés selon le protocole décrit dans la partie A (ligation blunt end ). E1- Le plasmide pTRKH3-R2 EIP3I a été obtenu en délétant la cassette [pCB EIP3I -eGFP] du plasmide pTRKH3-R2 EIP3- pCB EIP3I -eGFP. Pour cela, celui-ci a été amplifié par PCR avec les amorces A3 et A16 et recircularisé selon le protocole décrit dans la partie A (ligation blunt end ). Electro-transformation de la souche Lactococcus lactis IL1403 La préparation de cellules électro-compétentes a été réalisée en suivant le protocole de Le Bourgeois P et al ., 2000 (Electrotransformation of bacteria, Chapter 6, Springer Lab Manual, N. Eynard, J. Tessié (eds) Springer-Verlag Berlin Heidelberg 2000) avec les ajustements suivants : les cellules sont préadaptées à la glycine lors d’une première pré-culture de 5 mL en M17 + glucose à 5 g/L + saccharose à 0.5 M + 1% de glycine pendant 24 h à 30°C sans agitation. Puis une deuxième préculture est réalisée en inoculant 50 µL de la première préculture dans le même milieu de culture excepté la glycine qui est rajoutée à 2%. Enfin la culture finale est réalisée dans le même milieu que la deuxième préculture, à 30°C sans agitation jusqu’à obtenir une DO comprise entre 0.5 et 0.8. La suite du protocole est réalisée selon Le Bourgeois P et al ., 2000, cité ci-dessus. Les cellules rendues compétentes sont aliquotées à raison de 75 µL dans des microtubes, puis congelées immédiatement pendant 1 min dans de l’azote liquide et stockées à -80°C. Pour la transformation, un aliquot est décongelé dans la glace. 15 ng de plasmide sont ajoutés directement aux cellules et incubés 4 min dans la glace, puis transférés dans une cuve d’électroporation préalablement refroidie. Les conditions du choc électrique sont : 2.40kV, 400 ohms, 25 µF. Puis 900 µL de M17 + glucose à 5 g/L + saccharose à 0.5 M sont immédiatement ajoutés et les cellules sont transférées dans un microtube pour une expression phénotypique de 3 h à 30°C sans agitation. 100 µL de direct ou de la dilution 10 -1 sont étalés sur boite GM17 + Agar + 5 µg/mL érythromycine et incubés 48 h à 30°C. Mesure du niveau de fluorescence Le protocole est illustré par la FIG. 2 . Plus précisément, 1 mL de Yeast Extract (YE) à 10 g/L + Erythromycine (ery) à 5 µg/mL est ensemencé avec les différentes souches IL1403 transformées avec les plasmides décrits ci-dessus à partir de cryotubes de conservation. La croissance dure la nuit à 30°C sans agitation. Puis 10 µL de cette préculture sont ensemencés dans 1 mL du YE + ery 5 µg/mL et mis en culture à 30°C sans agitation. Après 8 h de croissance, 10 µL de cette dernière préculture sont ensemencés dans 1 mL du milieu précédemment décrit et mis en culture la nuit à 30°C sans agitation. 4 réplicats biologiques sont réalisés. Cette culture est ensuite centrifugée à 6000 rpm pendant 5 min et le culot bactérien est repris dans 1 mL de tampon PBS. Cette étape est réalisée une deuxième fois. Puis cette suspension bactérienne est diluée au 11 ième dans du tampon PBS et déposée dans une microplaque à fond plat (Microtest Plate 96 well , Ref 82.1581001 de chez Starsted). 8 réplicats techniques sont réalisés. La fluorescence émise est lue grâce à un fluorimètre (BIOTEK, Synergy H1, Microplate Reader) en utilisant les longueurs d’onde suivantes : 485 nm (excitation) et 514 nm (émission). Résultats Analyse in silico de s promoteurs P gad CB , P gadR2 et des gènes régulateurs gadR2 des souches EIP3I et NCDO2118 L’alignement des séquences a permis de montrer que les promoteurs P gadCB des souches EIP3I et NCDO2118 sont identiques. Par contre, l’alignement des séquences des promoteurs P gadR2 des souches EIP3I et NCDO2118 montre 2 différences : 1 SNP (single nucleotide polymorphism) en amont de la boîte -10 (T dans la séquence EIP3I à la place de A dans la séquence NCDO2118), et l’insertion d’un A en amont du RBS pour la séquence de la souche EIP3I. Ces résultats sont illustrés dans la FIG. 3 . L’alignement des séquences des gènes gadR2 permet de montrer qu’elles sont identiques pour les souches EIP3I et NCDO2118. Comparaison de l’activité des promoteurs P gadCB des souches L. lactis EIP3I et NCDO2118 sous le contrôle de leur régulateur gadR2 respectifs. Le niveau d’activité des différents promoteurs P gadCB a été étudié grâce à la fusion avec le marqueur fluorescent eGFP. Les différentes constructions portées par des plasmides réplicatifs chez Lactococcus lactis ont été introduites par transformation dans la souche IL1403, souche faiblement productrice de GABA et servant de référence. Les résultats sont indiqués dans la FIG. 4 La mesure de la fluorescence a permis de montrer que Le gène régulateur gadR2 est nécessaire à l’activation du promoteur P gadCB (activation d’un facteur 268 pour P gadCB EIP3I et d’un facteur 70 pour P gadCB 2118 ) L’activation du promoteur P gadCB EIP3I sous le contrôle de son régulateur gadR2 EIP3I est 3 fois supérieure à l’activation du promoteur P gadCB 2118 sous le contrôle de son régulateur gadR2 2118 . Comme les séquences des promoteurs P gadCB EIP3I et P gadCB 2118 sont identiques ainsi que les gènes gadR2 dans ces 2 souches, les différences observées doivent provenir du niveau d’activation des promoteurs P gadR2 Comparaison de l’activité des promoteurs P gadR2 des souches EIP3I et NCDO2118 Le niveau d’activité des différents promoteurs P gad R2 a été étudié grâce à la fusion avec le marqueur fluorescent eGFP. Les résultats sont indiqués dans la FIG. 5 . Le promoteur P gadR2 de la souche EIP3I est 14 fois plus fort que le promoteur P gadR2 de la souche NCDO2118. Il semble donc que les différences de séquence entre ces 2 promoteurs (inversion d’un A en T en amont de la boîte -10 et/ou insertion d’un A pour la souche EIP3I) lui permettent d'exprimer davantage le régulateur. Etude de l’impact de P gadR2 de la souche L. lactis EIP3I sur la production de GABA chez différentes souches de L. lactis L’étude a été mise en place pour illustrer la surproduction de GABA dans 2 souches différentes : la souche IL1403 qui produit très peu de GABA et la souche NCDO2118 dont l'opéron gadCB est déjà bien fonctionnel. Matériels et méthodes Six souches transformées ont été étudiées : 1- EIP3I portant le plasmide pTRKH3-R2 EIP3I , 2- EIP3I portant le plasmide témoin pTRKH3-eGFP, 3- NCDO2118 portant le plasmide pTRKH3-R2 EIP3I , 4- NCDO2118 portant le plasmide témoin pTRKH3-eGFP, 5- IL1403 portant le plasmide pTRKH3-R2 EIP3I et 6- IL1403 portant le plasmide témoin pTRKH3-eGFP. Elles ont été cultivées sur le milieu M17 avec 20 g/L de glucose et 5 µg/mL d’érythromycine en mode statique, à 30°C et prélevées en phase exponentielle de croissance (densité optique à 580 nm, DO 580 ≈ 2), pour être aliquotées dans des cryotubes de 2 mL en présence de 20% volume/volume de glycérol et stockées à -80°C. Ces stocks ont servi à la réalisation des précultures et cultures en bioréacteur. Les cultures microbiennes ont été réalisées en duplicate dans des bioréacteurs de 2 L (BiostatB plus, Sartorius, Melsungen, Allemagne) avec du milieu M17 (Tableau 3) supplémenté avec 5 g/L d’acide glutamique, 50 g/L de glucose et 5 µg/mL d’érythromycine. L’incubation s’est effectuée à 30°C sous agitation (250 rpm) en micro-aérobiose (aération initiale du milieu puis arrêt des échanges gazeux avec le milieu). Le pH a été maintenu à 6.6 par 10 N de KOH pendant 7 h puis le pH a été ajusté à 4.6 par ajout d’acide orthophosphorique. Ingrédients g/L Tryptone 2.5 Digestion peptique de tissus animaux 2.5 Digest de tourteau de soja 5 Extrait de viande 5 Extrait de levure 2.5 Acide ascorbique 0.5 Sulfate de magnésium 0.5 Glycérophosphate de sodium 19 Composition of medium M17 Les cultures ont été inoculées avec des cellules issues de précultures en Erlenmeyer flask dans un milieu similaire mais sans acide glutamique. Elles ont été récoltées pendant la phase exponentielle et concentrées afin d'obtenir une densité optique (DO) initiale à 580 nm de 0.25 dans le fermenteur. La croissance a été suivie par mesure de l’absorbance à 580 nm (Libra S11, Biochom, une unité d’absorbance est équivalente à 0.3 g/L). Les échantillons ont été collectés toutes les 30 min pendant 15 h puis au point 24 h, conservés à -20°C après élimination de la biomasse par centrifugation (4 min à 13 000 rpm à 4°C) pour ultérieurement quantifier les concentrations en GABA par HPLC selon la méthode décrite par Laroute V, Yasaro C, Narin W, Mazzoli R, Pessione E, Cocaign-Bousquet M, et al. GABA Production in Lactococcus lactis Is Enhanced by Arginine and Co-addition of Malate. Front Microbiol. 2016; 7: doi: 10.3389/fmicb.2016.01050. Préparation du plasmide pTRKH3-R2 EIP3I et plasmide témoin ( pTRKH3-eGFP) cf § Construction des différents plasmides utilisés dans l’étude, partie A1 et E1 Résultats Les résultats sont indiqués dans le [Tableau 4] ci-dessous. GABA représente la concentration de GABA (mM) mesurée à 12 heure de culture. T12h GABA (mM) EIP3I T- (pTRKH3-eGFP) 16.83 ± 3.05 EIP3I avec plasmide pTRKH3-R2 EIP3I 25.22 ± 2.21 NCDO2118 T- (pTRKH3-eGFP) 1.74 ± 0.29 NCDO2118 avec plasmide pTRKH3-R2 EIP3I 31.71 ± 2.56 IL1403 T- (pTRKH3-eGFP) 0.40 ± 0.01 IL1403 avec plasmide pTRKH3-R2 EIP3I 36.40 ± 1.09 P gadR2 de la souche EIP3I permet une surexpression du gène régulateur g adR2 de EIP3I ce qui permet d’augmenter la production de GABA de cette souche hyper productrice dans les conditions de fermentation. La surexpression du gène régulateur gadR2 de EIP3I dans la souche NCDO2118 lui confère la capacité de produire de plus grandes quantités de GABA. La surexpression du gène régulateur g adR2 de EIP3I dans la souche IL1403 lui confère la capacité de produire de plus grandes quantités de GABA. Région promotrice du gène régulateur gadR2 capable d’induire la surexpression de gadR2 ladite région promotrice comprenant ou consistant en : (a) La séquence polynucléotidique comprenant ou consistant en la SEQ ID N°1 ; (b) Une séquence polynucléotidique au moins 80% identique à la SEQ ID N°1 et qui permet la surexpression du gène régulateur gadR2 ; ou (c) Une séquence complémentaire des séquences polynucléotidiques (a) ou (b), dans laquelle la séquence complémentaire et la séquence polynucléotidique ont le même nombre de nucléotides et sont 100% complémentaires. Région promotrice selon la revendication 1, dans laquelle le gène régulateur gadR2 comprend ou consiste en la séquence polynucléotidique comprenant ou consistant en une séquence au moins 80% identique à la SEQ ID N°2. Cassette régulatrice gadR2 comprenant un gène régulateur gadR2 tel que défini dans la revendication 2 et sa région promotrice telle que définie dans la revendication 1. Utilisation d’une cassette régulatrice selon la revendication 3, pour induire une régulation positive du promoteur gadCB . Plasmide comprenant une cassette régulatrice gadR2 selon la revendication 3. Bactérie lactique transformée comprenant le plasmide tel que défini dans la revendication 5. Utilisation d’un plasmide selon la revendication 5 ou d’une bactérie lactique transformée selon la revendication 6, pour induire une surproduction d’acide gamma-aminobutyrique (GABA). Procédé de production de GABA comprenant la culture d’une bactérie lactique transformée selon la revendication 6. Procédé de production d’une bactérie lactique génétiquement modifiée productrice de GABA comprenant l’introduction dans ladite bactérie lactique d’un plasmide selon la revendication 5.