Brevet FR3164122A1 — publié le 20260109

La présente invention concerne une composition cosmétique non-thérapeutique pour augmenter la respiration mitochondriale cellulaire des kératinocytes sous-jacents à la couche cornée de l'épiderme, comprenant un complexe d’actifs : des extraits de Melaleuca Alternifolia, des extraits de Lavandula Hybrida, et de la mélatonine. L’invention concerne également l’utilisation de cette composition cosmétique non-thérapeutique pour augmenter la respiration mitochondriale cellulaire des kératinocytes sous-jacents à la couche cornée de l'épiderme. Complexe d’actif pour augmenter la respiration mitochondriale cellulaire des kératinocytes sous-jacents à la couche cornée de l'épiderme La présente invention concerne une composition cosmétique non-thérapeutique pour augmenter la respiration mitochondriale cellulaire des kératinocytes sous-jacents à la couche cornée de l'épiderme, comprenant un complexe d’actifs : des extraits de Melaleuca Alternifolia , des extraits de Lavandula Hybrida , et de la mélatonine. L’invention concerne également l’utilisation de cette composition cosmétique non-thérapeutique pour augmenter la respiration mitochondriale cellulaire des kératinocytes sous-jacents à la couche cornée de l'épiderme. Art Antérieur Les recherches antérieures dans le domaine de la physiologie cutanée ont largement exploré les processus métaboliques et énergétiques des cellules de la peau (Hourigan R. Cellular energy metabolism and oxidative stress. In: MA Farage, KW Miller, HI Maibach, eds. Textbook of Aging Skin. Heidelberg; 2010: 313-320 - Cibrian D, et al. Metabolic pathways that control skin homeostasis and inflammation. Trends Mol Med. 2020; 26: 975-986 - Mangez C, et al. An integrative multi-omic analysis reveals a major metabolic rewiring between baby foreskin keratinocytes and adult female abdominal keratinocytes. Exp Dermatol. 2022 ; 31:622-627). Les kératinocytes sont des cellules riches en kératine qui perdent leur noyau et leurs organites en progressant vers la surface. La kératine confère à la couche cornée sa robustesse et son imperméabilité. Cette couche, la plus externe de l’épiderme, est constituée de kératinocytes qui se sont différenciés en cornéocytes. Cette barrière protectrice protège la peau contre les agressions extérieures telles que les infections, les produits chimiques et la déshydratation. La respiration mitochondriale des kératinocytes sous-jacents à la couche cornée de l'épiderme joue un rôle essentiel dans la production d'énergie nécessaire à leur survie et à leur fonctionnement. Les kératinocytes traversent plusieurs stades de différenciation avant de devenir des cornéocytes et nécessitent de l'énergie pour la synthèse de lipides, la prolifération cellulaire et la réponse au stress notamment (Roe D. F., et al. Topical Dissolved Oxygen Penetrates Skin: Model and Method. Journal of Surgical Research 159, e29–e36 (2010). - Stücker, M. et al. The cutaneous uptake of atmospheric oxygen contributes significantly to the oxygen supply of human dermis and epidermis. J Physiol 538, 985–994 (2002). - Baumgärtl H., et al. Initial Results of Intracutaneous Measurements of PO2 Profiles. in Clinical Oxygen Pressure Measurement (eds. Ehrly, A. M., Hauss, J. & Huch, R.) 121–128 (Springer, 1987). doi:10.1007/978-3-642-71226-5_15). Les mitochondries des kératinocytes produisent de l'ATP par la phosphorylation oxydative, qui utilise l'oxygène pour convertir les substrats énergétiques en énergie utilisable. Cette production d'énergie est cruciale pour les kératinocytes en cours de migration vers les couches superficielles de l'épiderme. En plus de leur rôle dans la production d'énergie, les mitochondries des kératinocytes participent à la régulation de l'apoptose, essentielle pour l'élimination des cellules endommagées ou stressées. Ainsi, la respiration mitochondriale est fondamentale pour le maintien de l'homéostasie et la fonction protectrice de l'épiderme, qui passe par le bon fonctionnement des kératinocytes sous-jacents à la couche cornée de l’épiderme. Il existe un besoin continu d'agents efficaces et spécifiques pour améliorer la respiration mitochondriale des kératinocytes, offrant ainsi des avantages cosmétiques pour la peau. Selon un premier aspect, l’invention concerne une composition cosmétique non-thérapeutique pour augmenter la respiration mitochondriale cellulaire des kératinocytes sous-jacents à la couche cornée de l'épiderme chez un sujet sain, comprenant de la mélatonine. Selon un mode de réalisation, ladite composition cosmétique comprend un extrait, de préférence de l’huile des feuilles, de Melaleuca Alternifolia . Selon un mode de réalisation, ladite composition cosmétique comprend un extrait, de préférence de l’huile des fleurs, de Lavandula Hybrida . Selon un mode de réalisation, l’invention concerne une composition cosmétique non-thérapeutique pour augmenter la respiration mitochondriale cellulaire des kératinocytes sous-jacents à la couche cornée de l'épiderme chez un sujet sain, comprenant : Un extrait, de préférence de l’huile des feuilles, de Melaleuca Alternifolia ; Un extrait, de préférence de l’huile de fleurs, de Lavandula Hybrida ; De la mélatonine. Selon un autre aspect, l’invention concerne l’utilisation cosmétique non-thérapeutique pour augmenter la respiration mitochondriale cellulaire des kératinocytes sous-jacents à la couche cornée de l'épiderme chez un sujet sain d’une composition comprenant : Un extrait, de préférence de l’huile des feuilles, de Melaleuca Alternifolia ; Un extrait, de préférence de l’huile de fleurs, de Lavandula Hybrida ; De la mélatonine. Selon un autre aspect, l’invention concerne un procédé de préparation d’une composition cosmétique non-thérapeutique, comprenant au moins une étape de mélange desdits extraits de Melaleuca Alternifolia et de Lavandula Hybrida , et de ladite mélatonine. Selon un autre aspect, l’invention concerne un kit pour la préparation d’une composition cosmétique non-thérapeutique pour augmenter la respiration mitochondriale cellulaire des kératinocytes sous-jacents à la couche cornée de l'épiderme, comprenant : Un extrait, de préférence de l’huile des feuilles, de Melaleuca Alternifolia ; Un extrait, de préférence de l’huile de fleurs, de Lavandula Hybrida ; De la mélatonine. Selon un autre aspect, l’invention concerne un procédé de soin cosmétique non-thérapeutique de la peau d’un sujet sain, comprenant une étape d’application sur la peau d’une composition cosmétique selon l’invention. Les modes de réalisations qui vont suivre s’appliquent aussi bien à la composition cosmétique non-thérapeutique selon l’invention, qu’aux utilisations, procédés et kits selon l’invention. Selon un mode de réalisation, ladite composition cosmétique non-thérapeutique comprend : Entre 0,00001% et 1% en poids de la composition dudit extrait, de préférence de l’huile des feuilles, de Melaleuca Alternifolia . De manière préférée, ladite composition cosmétique non-thérapeutique comprend : Entre 0,01% et 1% en poids de la composition dudit extrait, de préférence de l’huile des feuilles, de Melaleuca Alternifolia . Selon un mode de réalisation, ladite composition cosmétique non-thérapeutique comprend 0,00001%, 0,00005%, 0,0001%, 0,0005%, 0,001%, 0,005%, 0,01%, 0,05%, 0,1%, 0,15%, 0,2%, 0,25%, 0,3%, 0,35%, 0,4%, 0,45%, 0,5%, 0,55%, 0,6%, 0,65%, 0,7%, 0,75%, 0,8%, 0,85%, 0,9%, 0,95%, 1% en poids de la composition dudit extrait, de préférence de l’huile des feuilles, de Melaleuca Alternifolia . Selon un mode de réalisation, ladite composition cosmétique non-thérapeutique comprend : Entre 0,00001% et 1% en poids de la composition dudit extrait, de préférence de l’huile de fleurs, de Lavandula Hybrida . De manière préférée, ladite composition cosmétique non-thérapeutique comprend : Entre 0,01% et 1% en poids de la composition dudit extrait, de préférence de l’huile des feuilles, de Lavandula Hybrida . Selon un mode de réalisation, ladite composition cosmétique non-thérapeutique comprend 0,00001%, 0,00005%, 0,0001%, 0,0005%, 0,001%, 0,005%, 0,01%, 0,05%, 0,1%, 0,15%, 0,2%, 0,25%, 0,3%, 0,35%, 0,4%, 0,45%, 0,5%, 0,55%, 0,6%, 0,65%, 0,7%, 0,75%, 0,8%, 0,85%, 0,9%, 0,95%, 1% en poids de la composition dudit extrait, de préférence de l’huile de fleurs, de Lavandula Hybrida . Selon un mode de réalisation, ladite composition cosmétique non-thérapeutique comprend : Entre 0,00001% et 10% en poids de la composition de mélatonine. De manière préférée, ladite composition cosmétique non-thérapeutique comprend : Entre 0,00001% et 1% en poids de la composition de mélatonine. Selon un mode de réalisation, ladite composition cosmétique non-thérapeutique comprend 0,00001%, 0,00005%, 0,0001%, 0,0005%, 0,001%, 0,0015%, 0.002%, 0.0025%, 0.003%, 0.0035%, 0.004%, 0.0045%, 0.005%, 0.0055%, 0.006%, 0.0065%, 0.007%, 0.0075%, 0.008%, 0.0085%, 0.009%, 0.0095%, 0,005%, 0,01%, 0,05%, 0,1%, 0,15%, 0,2%, 0,25%, 0,3%, 0,35%, 0,4%, 0,45%, 0,5%, 0,55%, 0,6%, 0,65%, 0,7%, 0,75%, 0,8%, 0,85%, 0,9%, 0,95%, ou 1%, ou 1,25%, ou 1,5%, ou 1,75%, ou 2%, ou 2,25%, ou 2,5%, ou 2,75%, ou 3%, ou 3,25%, ou 3,5%, ou 3,75%, ou 4%, ou 4,25%, ou 4,5%, ou 4,75%, ou 5%, ou 5,25%, ou 5,5%, ou 5,75%, ou 6%, ou 6,25%, ou 6,5%, ou 6,75%, ou 7%, ou 7,25%, ou 7,5%, ou 7,75%, ou 8%, ou 8,25%, ou 8,5%, ou 8,75%, ou 9%, ou 9,25%, ou 9,5%, ou 9,75%, ou 10% en poids de la composition de mélatonine. Selon un mode de réalisation, ladite mélatonine est vectorisée. De manière préférée, ladite mélatonine est vectorisée via un système de vectorisation par liposomes. De manière encore plus préférée, ledit système de vectorisation par liposomes comprend de l’eau, des phospholipides, de la mélatonine et des ferments Lactobacillus . Selon un mode de réalisation, ledit système de vectorisation par liposomes comprend : 89% d’eau en poids dudit système de vectorisation ; 5% de phospholipides en poids en poids dudit système de vectorisation ; 4% de mélatonine en poids dudit système de vectorisation ; 2% de ferments Lactobacillus en poids dudit système de vectorisation. Selon un mode de réalisation, ladite composition cosmétique non-thérapeutique comprend : Entre 0,00001% et 1% en poids de la composition dudit extrait, de préférence de l’huile des feuilles, de Melaleuca Alternifolia . Entre 0,00001% et 1% en poids de la composition dudit extrait, de préférence de l’huile de fleurs, de Lavandula Hybrida . Entre 0,00001% et 10% en poids de la composition de mélatonine. De manière plus spécifique, la composition selon l’invention permet d’augmenter la respiration et la production énergétique de l’épiderme d’un sujet. Ceci se traduit par une peau ayant une apparence plus belle pour l’utilisateur, donnant une impression visuelle de meilleure santé de la peau. La composition selon l'invention comprend un milieu cosmétiquement acceptable, c'est-à-dire compatible avec la peau du visage et/ou du corps. En d'autres termes, le milieu utilisé présente une couleur, une odeur et un toucher agréables et ne génère pas d'inconforts inacceptables (tels que notamment picotements, tiraillements, rougeurs), susceptibles de détourner le consommateur d'utiliser cette composition. Selon un mode de réalisation, la composition cosmétique selon l’invention comprend en outre au moins un agent cosmétiquement acceptable. Selon un mode de réalisation, ladite composition cosmétique non-thérapeutique comprend en outre au moins un agent cosmétiquement acceptable choisi parmi les agents apaisants, les agents restructurant, les agents régénérants, les agents revitalisants, les filtres solaires, les agents antirides, les agents hydratants, les agents anti-âges, les agents tensioactifs, les corps gras, les solvants organiques, les agents solubilisant, les agents épaississants et gélifiants, les lissants, les agents renforçant la fermeté, l’élasticité et/ou l’effet barrière de la peau, les antioxydants, les opacifiants, les eaux thermales, les agents matifiants, les filtres chimiques ou minéraux, les oligoéléments, les agents stabilisants, les agents moussants, les parfums, les émulsionnants ioniques ou non, les charges, les séquestrants et les chélateurs, les parfums, les filtres, les huiles essentielles, les matières colorantes, les pigments, les actifs hydrophiles ou lipophiles, les vésicules lipidiques encapsulant un ou plusieurs actifs et/ou les conservateurs. Selon un mode de réalisation, la composition cosmétique selon l’invention est administrée par application topique sur une zone de la peau. Selon un mode de réalisation, ladite composition cosmétique selon l’invention est formulée sous forme de crème, d'une pommade, d’un onguent, d’un baume, d’un masque, d'un lait, d'une lotion, d'un sérum, d’un spray, d'une pâte, d'une mousse, d'un aérosol, d’un stick, d’un shampooing, d’un après-shampooing, de patchs, d'une solution aqueuse hydroalcoolique ou huileuse, d'une émulsion huile-dans-eau ou eau-dans-huile ou multiple, d'un gel aqueux ou huileux, d'un produit anhydre liquide, pâteux ou solide, et/ou d'une dispersion d'huile dans une phase aqueuse à l'aide de sphérules, ces sphérules pouvant être des nanoparticules polymériques telles que les nanosphères et les nanocapsules ou des vésicules lipidiques de type ionique et/ou non-ionique. Selon un mode de réalisation, une quantité d’environ 0,1 à 50 mg/cm 2 , de préférence environ 0,25 à 25 mg/cm 2 , de manière encore plus préférée d’environ 2 à 10 mg/cm 2 , de composition cosmétique selon l’invention est appliqué sur la zone de la peau. Selon un mode de réalisation, la composition cosmétique selon l’invention est appliquée une à deux fois par jour, de préférence 2 fois par jour, pendant au moins 7 jours, de préférence au moins 15 jours, de manière encore préférée au moins un mois, et de manière particulièrement préférée au moins 2 mois. Selon un mode de réalisation, la composition cosmétique selon l’invention est appliquée dans le procédé selon l’invention 2 fois par jour pendant au moins 1 mois, de préférence 2 mois. De manière préférée, selon l’invention, ladite zone de la peau est le visage. Figures FIG. 1 est un graphique présentant les profils de la consommation d’oxygène des NHEK cultivés pendant 48 heures + 30 minutes en hypoxie [Fig 2] A, B et C sont des graphiques présentant les paramètres de la respiration mitochondriale des NHEK cultivés pendant 48 heures + 30 minutes en hypoxie FIG. 3 est un graphique présentant les profils de la consommation d’oxygène des NHEK cultivés pendant 48 heures + 2 heures en hypoxie [Fig 4] A, B et C sont des graphiques présentant les paramètres de la respiration mitochondriale des NHEK cultivés pendant 48 heures + 2 heures en hypoxie FIG. 5 B est un graphique présentant les profils de la consommation d’oxygène des NHEK cultivés pendant 48 heures + 24 heures. [Fig 6] A, B et C sont des graphiques présentant l’analyse des paramètres de la respiration mitochondriale des NHEK cultivés pendant 48 heures + 24 heures. FIG. 7 est un graphique présentant l’illustration de l’ECAR des NHEK cultivés pendant 48 heures + 30 minutes en hypoxie. FIG. 8 est un graphique présentant l’illustration de l’ECAR des NHEK cultivés pendant 48 heures + 2 heures en hypoxie. FIG. 9 est un graphique présentant l’illustration de l’ECAR des NHEK cultivés pendant 48 heures + 24 heures en hypoxie. FIG. 10 est un graphique présentant l’effet des produits sur l’activité de la citrate synthase, comparé au contrôle négatif TJ2. FIG. 11 est un graphique présentant l’effet des produits sur l’activité du complexe IV, comparé au contrôle négatif TJ2. FIG. 12 est un graphique présentant le dosage de l’ATP, comparé au contrôle négatif TJ2. Définitions L'épiderme comporte cinq couches distinctes. De la plus profonde à la plus superficielle, il y a la couche basale (ou germinative), où les kératinocytes se divisent et se renouvellent. Au-dessus se trouve la couche épineuse, composée de kératinocytes reliés par des desmosomes. Ensuite, la couche granuleuse contient des kératinocytes accumulant des granules de kératohyaline. La couche claire, visible uniquement dans la peau épaisse, est une fine bande de cellules dont le noyau se désagrègent ; leur donnant ainsi une apparence translucide. Enfin, la couche la plus externe est la couche cornée. La couche cornée est composée de kératinocytes différenciés, appelés cornéocytes. Ces cellules, riches en kératine, sont dépourvues de noyau et d'organites, offrant une barrière protectrice contre les agressions extérieures, comme les infections, les produits chimiques et la déshydratation. Cette couche imperméable et robuste est essentielle à la protection de la peau. Les cornéocytes proviennent de kératinocytes des couches profondes qui migrent et se transforment au fil du temps. La couche cornée est constamment renouvelée par desquamation, où les cellules mortes se détachent et sont remplacées par de nouvelles. Les kératinocytes sont les cellules épithéliales spécialisées qui se trouvent dans toutes les couches de l'épiderme, mais leur densité varie selon la profondeur de la couche. Au fur et à mesure que les kératinocytes se déplacent vers les couches supérieures de l'épiderme, ils subissent un processus de différenciation, produisant de plus en plus de kératine et finissent par se différencier en cornéocytes au sein de la couche cornée. Les kératinocytes remplissent plusieurs fonctions importantes, notamment la protection de la peau contre les dommages, la régulation de l'hydratation cutanée, la réparation des blessures et la réponse aux agents pathogènes. Ils jouent un rôle clé dans la protection de l'organisme contre les agressions extérieures telles que les infections, les rayons UV et la perte d'eau. La respiration mitochondriale cellulaire des kératinocytes de l'épiderme désigne le processus biochimique par lequel les kératinocytes situés dans l'épiderme, avant leur différenciation en cornéocyte et leur migration dans la couche cornée, utilisent l'oxygène pour métaboliser les substrats énergétiques, tels que les acides gras et les sucres, à travers une série de réactions enzymatiques dans les mitochondries. Ce processus génère de l'adénosine triphosphate (ATP), la principale source d'énergie cellulaire utilisée pour alimenter les fonctions cellulaires essentielles, telles que la division cellulaire, la différenciation, la migration et la synthèse de biomolécules. Maintenir ou augmenter la respiration mitochondriale des kératinocytes est crucial pour maintenir l'homéostasie cutanée, favoriser la régénération épidermique et répondre aux demandes métaboliques changeantes de la peau, tout en contribuant à la protection contre les stress environnementaux et les agressions externes. Par « augmentation » est entendu que la composition selon l’invention permet d’obtenir une respiration mitochondriale cellulaire des kératinocytes de l'épiderme, sous-jacents à la couche cornée, plus importante que sans l’application de ladite composition, de manière significative mais non-thérapeutique, chez le sujet sain. Par « sous-jacents à la couche cornée » sont entendus les kératinocytes présents dans l’épiderme, « en dessous » ou « avant » leur migration dans la couche cornée et leur différenciation en cornéocytes. Ces kératinocytes peuvent donc être présents dans la couche granuleuse, la couche épineuse, ou la couche basale de l’épiderme. Par « cosmétique non-thérapeutique » est entendu que la composition objet de l’invention a un effet technique non-thérapeutique permettant d’améliorer l’aspect visuel superficiel de la peau. Une telle composition n’agit pas comme un médicament pour le traitement de maladies dermatologiques, et est administrée chez un sujet sain. Par « sujet sain » est entendu un individu humain ne présentant pas de maladies dermatologiques qui seraient traitées par l’administration de la composition selon l’invention, qui permet seulement d’améliorer l’aspect visuel superficiel de la peau, de préférence du visage. « Melaleuca Alternifolia » est une espèce d'arbre originaire d'Australie, également connu sous le nom d'arbre à thé. Il appartient à la famille des Myrtacées et est largement reconnu pour les propriétés médicinales de son huile extraite des feuilles de l'arbre. Cette huile peut être obtenue après récolte des feuilles de l'arbre et leur distillation. Les feuilles sont généralement récoltées à maturité, puis broyées ou déchiquetées. Ensuite, ces feuilles sont placées dans un alambic ou un autre système de distillation où de la vapeur d'eau est passée à travers elles. Cette vapeur chauffe les feuilles, libérant les composés volatils contenus dans les glandes des feuilles. Ces composés volatils, y compris les terpènes et les phénols, sont ensuite condensés et collectés sous forme liquide. L'huile de Melaleuca Alternifolia obtenue par ce processus est ensuite filtrée pour éliminer les impuretés et obtenir une huile pure, prête à être utilisée dans la composition selon l’invention. Un exemple d’un tel extrait est commercialisé sous le nom Regenight™. Ce dernier comprend une fraction liposoluble surcyclée à partir de déchets de la distillation d’arbre à thé d’Australie, et standardisé en sesquiterpènes. « Lavandula Hybrida », également connue sous le nom de lavandin, est une plante hybride issue du croisement entre Lavandula angustifolia (lavande vraie) et Lavandula latifolia (lavande aspic). Cette plante appartient à la famille des Lamiacées et est largement cultivée pour ses fleurs aromatiques et ses huiles. L’obtention de ces extraits implique la collecte des sommités fleuries de la plante pour en extraire les composés aromatiques. Les sommités fleuries sont généralement récoltées à maturité, puis soumises à différents processus d'extraction, principalement la distillation à la vapeur d'eau. Pendant la distillation, de la vapeur d'eau est passée à travers les fleurs, chauffant ainsi les glandes à huile des plantes et libérant les composés aromatiques volatils. Ces composés sont ensuite transportés avec la vapeur, puis condensés pour former un mélange d'huile essentielle et d'eau, qui est ensuite séparé. L'huile de lavandin ainsi obtenue est ensuite filtrée pour éliminer les impuretés et obtenir une huile pure, prête à être utilisée dans la composition selon l’invention. Un exemple d’un tel extrait est commercialisé sous le nom Immunight™. Ce dernier est un extrait liposoluble de lavandin bio, standardisé en monoterpènes, obtenu par un procédé vert exclusif utilisant des solvants d’origine végétale La mélatonine est une hormone produite naturellement par la glande pinéale dans le cerveau. Elle joue un rôle crucial dans la régulation des cycles circadiens, qui sont les cycles naturels de sommeil et d'éveil sur une période d'environ 24 heures. Outre son rôle dans le contrôle des cycles veille-sommeil, la mélatonine joue également un rôle dans d'autres processus biologiques, tels que la régulation de la pression artérielle, du système immunitaire, de la fonction ovarienne et de la fonction thyroïdienne. Un exemple de mélatonine utilisable selon l’invention est commercialisée sous le nom AC Melatonin Liposome™. Selon un mode de réalisation, ladite mélatonine peut être vectorisée. Par « vectorisée » est entendu l’inclusion de la mélatonine dans un système liposomal. Par « application topique », on entend au sens de la présente invention une application sur la peau (dont le cuir chevelu), et les muqueuses. Par « cosmétiquement acceptable », on entend au sens de la présente invention ce qui est utile dans la préparation d’une composition cosmétique, qui est généralement sûr, non toxique et ni biologiquement ni autrement non souhaitable et qui est acceptable pour une utilisation cosmétique, notamment par application topique au niveau de la peau. Par « fonction barrière épidermique », on entend, au sens de la présente invention la fonction protectrice de l’épiderme, notamment contre les agressions extérieures, et la régulation de la perte insensible en eau et des ions. Les ingrédients de ladite composition cosmétique selon l’invention sont combinés dans des quantités efficaces. Par « quantité efficace », on entend au sens de la présente invention une quantité suffisante pour obtenir l'effet attendu, pouvant être déterminé par l’Homme du métier. Par « application topique », on entend au sens de la présente invention une application sur la peau (dont le cuir chevelu). Dans la description et dans les exemples suivants, sauf indication contraire, les pourcentages sont des pourcentages en poids de la composition et les plages de valeurs libellées sous la forme « entre ... et ... » incluent les bornes inférieure et supérieure précisées. Les exemples ci-après sont présentés à titre illustratif et non limitatif du domaine de l'invention. Exemples Exemple 1 : Effet de la composition selon l’invention ( MEST22M01 ) sur la respiration mitochondriale dans des kératinocytes épidermiques humains normaux en condition d’hypoxie INTRODUCTION Dans la présente étude, l’effet de la composition selon l’invention (MEST22M01) a été évalué sur la respiration mitochondriale et la glycolyse dans des kératinocytes épidermiques humains normaux (NHEK) cultivés en condition d’hypoxie en utilisant la technologie Seahorse. Préalablement, un test de cytotoxicité a été réalisé en condition d’hypoxie en utilisant un test standard de réduction du WST-8 dans le but de déterminer les concentrations à tester. MATERIEL ET METHODES 1. Modèle biologique - Type cellulaire : Kératinocytes épidermiques humains normaux (NHEK), - Référence Synelvia BH032, utilisés au 2ème passage - Conditions de culture : 37°C, 5% CO 2, en hypoxie - Milieu de culture : DermaLife - Milieu d’essai : DermaLife optimisé pour le test 2. Composé testé Composition : Mélatonine sous forme de poudre à la concentration de 0.0015% en poids de la composition totale. Forme de poudre Solution intermédiaire : 10% en DMSO Concentration testée : 0.0015% (0.015% DMSO) 3. Test préliminaire de cytotoxicité - Type cellulaire : NHEK en milieu d’essai - Conditions de culture : 37°C, 5% CO 2, en hypoxie - Temps de préincubation des cellules : 24 heures - Temps d’incubation de l’actif : 24 heures - Paramètres d’évaluation : Réduction de WST-8. A la fin du traitement, les cellules ont été incubées en présence de WST-8 (sel de tétrazolium hautement soluble en eau) réduit en un produit hydrosoluble de couleur orange (formazan) par la succinate deshydrogénase (enzyme mitochondriale). Cette transformation est proportionnelle au nombre de cellules vivantes et à leur activité métabolique. La densité optique (DO) a été mesurée avec un spectrophotomètre à 450 nm (SPARK, TECAN,). 4. Culture et traitement Les kératinocytes ont été ensemencés en plaque 24 puits et cultivés en milieu de culture pendant 24 heures en normoxie. Le milieu a ensuite été remplacé par du milieu de culture contenant ou non le composé et le contrôle solvant (DMSO). Après 48 heures d’incubation en condition d’hypoxie, un deuxième traitement a été effectué. Les cellules ont été ensuite incubées, en hypoxie, 30 minutes, 2 heures ou 24 heures avant l’évaluation de la respiration mitochondriale et de la glycolyse. 5. Evaluation de l’activité mitochondriale La technologie Seahorse XF (Agilent) permet de mesurer simultanément et en temps réel la respiration mitochondriale et la glycolyse au sein d’une micro-chambre. La respiration mitochondriale est mesurée à partir du taux de consommation en oxygène (OCR) des cellules en temps réel. Les différents cycles de mesure réalisés suivant les injections séquentielles : - d’Oligomycine qui inhibe l’ATP synthase dans le but de déterminer la production d’ATP, - de FCCP (Carbonyl cyanide-4 (trifluoromethoxy) phenylhydrazone) qui stimule l’OCR et permet de déterminer la capacité respiratoire de réserve définie comme étant la différence entre la valeur maximale de respiration et la respiration basale, - de Rotenone et d’Antimycine A qui permettent d’arrêter la respiration mitochondriale dans le but de déterminer la respiration non-mitochondriale. Les résultats sont évalués par rapport à plusieurs critères : - La Respiration basale : correspond à la consommation d'oxygène des cellules pour une activité énergétique normale. Plus sa valeur est élevée plus la cellule est active. - La production d’ATP (Adénosine triphosphate) est directement proportionnelle au besoin énergétique des cellules. - La « fuite » des protons (H+ Leak) est souvent associée à une faible production d’ATP qui témoigne des dommages mitochondriaux. - La respiration maximale est directement proportionnelle à l’agilité métabolique de la cellule. Plus sa valeur est élevée, plus la cellule est réactive. En parallèle de l’OCR, la glycolyse est mesurée à partir du taux d’acidification extracellulaire (ECAR). L’ECAR est étroitement lié à la diminution du pH engendrée par l’activité glycolytique. L’unité de l’ECAR est par conséquent mpH/min (mpH = milli pH units). L’acidification extracellulaire est la somme de deux composantes : - l'acidification respiratoire, sous forme de CO 2, - l'acidification provenant de la glycolyse, sous la forme de lactate - + H+ . La contribution du CO 2 à l'acidification extracellulaire totale a été considérée comme négligeable par la plate-forme de mesure utilisée ici, l'analyseur Seahorse XF. 6. Traitement des données Les données brutes ont été transférées et traitées sous le logiciel Microsoft Excel® et le logiciel GraphPad PRISM ®. Les comparaisons intergroupes ont été réalisées à l’aide du test t de Student bilatéral non apparié. Les analyses statistiques peuvent être interprétées si n≥5 ; cependant pour n Formules utilisées dans cet exemple : - Erreur standard de la moyenne : esm = écart-type (Sd)/√n L’erreur standard de la moyenne (esm) représente l’écart de la moyenne de l’échantillon par rapport à la moyenne de la vraie population. L’esm est calculé en divisant le Sd par la racine carrée de la taille de l’échantillon. - Pourcentage de viabilité : viabilité (%) = (DO composé / DO témoin ) x 100 - Pourcentage par rapport au contrôle solvant : (%) = (valeur composé / moyenne témoin ) x 100 RESULTATS 1. Test préliminaire de cytotoxicité Tableau 1 : Résultats de cytotoxicité de l’actif MEST22M01 Témoin Contrôle Solvant (DMSO) MEST22M01 Hypoxie Hypoxie Hypoxie / 0.15% 0.00015% 0.0005% 0.001% 0.0015% 0.0075% 0.015% Viabilité (% témoin Hypoxie) 98 99 102 98 102 97 85 96 104 92 96 74 93 93 72 90 83 95 89 97 82 76 60 72 Moyenne 100 99 95 87 86 89 89 69 Esm 1 2 5 7 7 4 4 5 P (1) - ns ns ns ns * ns ** (1) : Seuil de significativité statistique ns : > 0.05, Non significatif * : 0.01 à 0.05, Significatif ** : 0.001 à 0.01, Très significatif *** : Dans la suite de l’étude, la concentration « 0.0015% » sera utilisée. 2. Effet sur la respiration mitochondriale 2.2. Traitements 48 heures + 30 minutes L’analyse de la respiration mitochondriale après un traitement de 48 heures suivi d’un nouveau traitement de 30 minutes, en hypoxie, est décrite en FIG. 1 et dans les tableaux suivants : Tableaux 2, 3 et 4 : Résultats de la respiration mitochondriale des NHEK cultivés pendant 48 heures + 30 minutes en hypoxie Traitement Respiration Basale Condition de culture Composés testés Concentration Respiration basale (pmol/min) Moyenne (pmol/min) Esm (pmol/min) % contrôle solvant (DMSO) Esm (%) P (1) Hypoxie Témoin - 4.8 (2) 20.2 1.1 165 9 nc 21.2 19.1 Contrôle solvant (DMSO) 0.015% 11.8 12.2 1.0 100 8 - 14.1 10.8 MEST22M01 0.0015% 1.3 (2) 24.1 1.3 197 11 nc 22.8 25.4 Traitement Production d’ATP Condition de culture Composés testés Concentration Production d’ATP (pmol/min) Moyenne (pmol/min) Esm (pmol/min) % contrôle solvant (DMSO) Esm (%) P (1) Hypoxie Témoin - 6.5 (2) 10.5 0.7 123 8 nc 11.1 9.8 Contrôle solvant (DMSO) 0.015% 7.5 8.5 1 100 12 - 10.6 7.6 MEST22M01 0.0015% 3.2 (2) 14.1 0.4 165 5 nc 13.7 14.5 Traitement Respiration maximale Condition de culture Composés testés Concentration Respiration maximale (pmol/min) Moyenne (pmol/min) Esm (pmol/min) % contrôle solvant (DMSO) Esm (%) P (1) Hypoxie Témoin - 33.3 (2) 43.3 6.3 129 19 nc 49.6 37 Contrôle solvant (DMSO) 0.015% 31.4 33.5 1,1 100 3 - 33.8 35.2 MEST22M01 0.0015% 36.4 (2) 49.1 2.4 147 7 nc 46.7 51.5 Pour les tableaux 2, 3 et 4 : (1) : Seuil de significativité statistique nc : non calculable ns : > 0.05, Non significatif (2) : Donnée invalidée * : 0.01 à 0.05, Significatif ** : 0.001 à 0.01, Très significatif *** : En présence de l’actif MEST22M01, la respiration basale et maximale, ainsi que la production d’ATP, ont augmenté comparées au contrôle solvant DMSO, en condition d’hypoxie ([Fig 2]) 3. Traitements 48 heures + 2 heures L’analyse de la respiration mitochondriale après un traitement de 48 heures suivi d’un nouveau traitement de 2 heures, en hypoxie, est décrite en FIG. 3 . Tableaux 5, 6 et 7 : Résultats de la respiration mitochondriale des NHEK cultivés pendant 48 heures + 2 heures en hypoxie Traitement Respiration Basale Condition de culture Composés testés Concentration Respiration basale (pmol/min) Moyenne (pmol/min) Esm (pmol/min) % contrôle solvant (DMSO) Esm (%) P (1) Hypoxie Témoin - 16.5 21.6 3.1 104 15 nc 21.3 27.1 Contrôle solvant (DMSO) 0.015% 24.7 20.8 3.9 100 19 - 16.8 8.5 (2) MEST22M01 0.0015% 24.5 26.9 2.2 130 11 nc 24.8 31.4 Traitement Production d’ATP Condition de culture Composés testés Concentration Production d’ATP (pmol/min) Moyenne (pmol/min) Esm (pmol/min) % contrôle solvant (DMSO) Esm (%) P (1) Hypoxie Témoin - 14.2 17.7 1.8 104 11 nc 20.2 18.7 Contrôle solvant (DMSO) 0.015% 17.4 17.0 0.4 100 2 - 16.5 7 (2) MEST22M01 0.0015% 20.3 21.8 1.1 129 7 nc 21.1 24.1 Traitement Respiration maximale Condition de culture Composés testés Concentration Respiration maximale (pmol/min) Moyenne (pmol/min) Esm (pmol/min) % contrôle solvant (DMSO) Esm (%) P (1) Hypoxie Témoin - 35 36.5 2.1 103 6 nc 33.8 40.7 Contrôle solvant (DMSO) 0.015% 34.9 35.4 0.6 100 2 - 36 7.1 (2) MEST22M01 0.0015% 34.8 41.4 6.7 117 19 nc 34.7 54.8 Pour les tableaux 5, 6 et 7 : (1) : Seuil de significativité statistique nc : non calculable ns : > 0.05, Non significatif (2) : Donnée invalidée * : 0.01 à 0.05, Significatif ** : 0.001 à 0.01, Très significatif *** : En présence de l’actif MEST22M01, la respiration basale et maximale, ainsi que la production d’ATP, ont augmenté comparées au contrôle solvant ([Fig 4]). 2.4. Traitements 48 heures + 24 heures L’analyse de la respiration mitochondriale après un traitement de 48 heures suivi d’un nouveau traitement de 24 heures est décrite en FIG. 5 . Tableaux 8, 9 et 10 : Résultats de la respiration mitochondriale des NHEK cultivés pendant 48 heures + 24 heures en hypoxie – Calculs vs contrôle solvant (DMSO) hypoxie Traitement Respiration Basale Condition de culture Composés testés Concentration Respiration basale (pmol/min) Moyenne (pmol/min) Esm (pmol/min) % Contrôle solvant (DMSO) Esm (%) P (1) Hypoxie Témoin - 20.9 22 1.2 179 10 nc 20.6 24.3 Contrôle solvant (DMSO) 0.015% 5.5 12.3 3.7 100 30 - 13 18.4 MEST22M01 0.0015% 10.6 17.7 3.8 144 31 nc 19.1 23.5 Traitement Production d’ATP Condition de culture Composés testés Concentration Production d’ATP (pmol/min) Moyenne (pmol/min) Esm (pmol/min) % Contrôle solvant (DMSO) Esm (%) P (1) Hypoxie Témoin - 14.2 15.8 1.4 173 15 nc 14.5 18.6 Contrôle solvant (DMSO) 0.015% 5.6 9.1 1.9 100 20 - 9.7 12 MEST22M01 0.0015% 7 11.8 2.5 130 27 nc 15 13.5 Traitement Respiration maximale Condition de culture Composés testés Concentration Respiration maximale (pmol/min) Moyenne (pmol/min) Esm (pmol/min) % Contrôle solvant (DMSO) Esm (%) P (1) Hypoxie Témoin - 30.7 34.1 2.8 143 12 nc 32.0 39.6 Contrôle solvant (DMSO) 0.015% 22.5 23.8 1.2 100 5 - 22.7 26.2 MEST22M01 0.0015% 22.1 33.1 5.6 139 23 nc 39.7 37.6 Pour les tableaux 8, 9 et 10 : (1) : Seuil de significativité statistique nc : non calculable ns : > 0.05, Non significatif (2) : Donnée invalidée * : 0.01 à 0.05, Significatif ** : 0.001 à 0.01, Très significatif *** : Après 72h, en présence de l’actif MEST22M01, la respiration basale et maximale, ainsi que la production d’ATP, ont augmenté comparées au contrôle solvant ([Fig 6]). 3. Effet sur la glycolyse 3.1. Analyse de la glycolyse après traitement par l’actif MEST22M01 Quel que soit le temps de traitement des cellules en hypoxie, nous n’observons pas de variation de l’ECAR dans le milieu de culture en présence ou absence de l’actif (Figures 7-8-9). CONCLUSION Dans nos conditions expérimentales sous hypoxie, et comparativement à son contrôle (solvant DMSO), le traitement des kératinocytes par l’actif MEST22M01 a augmenté : - De 97% la respiration basale, 65% la production d’ATP et 47% la respiration maximal après 48h+30 min d’incubation - De 30% la respiration basale et 29% la production d’ATP après 48h + 2h d’incubation. A 48h + 24h de traitement, l’actif MEST22M01 a augmenté de 44% la respiration basale, 30% la production d’ATP et 39% la respiration maximale . Le traitement des kératinocytes, 48 heures + 30 minutes ou 48 heures + 2 heures ou 48 heures + 24 heures, sous hypoxie, par l’actif MEST22M01 a augmenté la consommation de l’oxygène au niveau de la respiration basale et de la production d’ATP témoignant d’une production énergétique passant principalement par la voie respiratoire plutôt que glycolytique. Exemple 2 : Effet s de la composition selon l’invention ( MEST22M01 ) , en hypoxie, sur la production de ROS dans des kératinocytes stimulés par l’H2O2 et sur la synthèse de mélanine dans des mélanocytes faiblement pigmentés INTRODUCTION Dans le présent exemple, les effets de la composition selon l’invention MEST22M01 ont été évalués sur différents paramètres en condition d’hypoxie. Plus précisément, les effets de ce composé ont été évalués sur : - La production d’espèces réactives de l’oxygène (ROS, Reactive Oxygen Species) induite par une stimulation par l’H2O 2 dans des kératinocytes épidermiques humains normaux (NHEK). La production de ROS a été quantifiée à l’aide d’une sonde fluorescente : DCFH-DA résistante à la photo-oxydation, - La synthèse de mélanine dans des mélanocytes épidermiques humains normaux faiblement pigmentés (NHEM-LP). Préalablement, un test de cytotoxicité a été réalisé sur des NHEM-LP en utilisant un test standard de réduction du WST-8 dans le but de déterminer les concentrations à tester. MATERIEL ET METHODES 1. Modèles biologiques Kératinocytes épidermiques humains normaux (NHEK) - Type cellulaire : NHEK, référence Bioalternatives K341, utilisés au 3 e passage - Conditions de culture : 37°C, 5% CO2 - Milieu de culture : Keratinocyte-SFM optimisé pour le test, complémenté avec Epidermal Growth Factor et Extrait pituitaire - Milieu d’essai : Keratinocyte-SFM optimisé pour le test Mélanocytes épidermiques humains normaux – faiblement pigmentés (NHEM-LP) - Type cellulaire : NHEM-LP, référence Bioalternatives NHEM-2 utilisés au 10ème passage (test préliminaire de cytotoxicité) et au 12ème passage (test de mélanogénèse) - Conditions de culture : 37°C, 5% CO 2 - Milieu de culture : Medium 254 optimisé pour le test (HMGS-2 sans PMA) - Milieu d’essai : Medium 254 optimisé pour le test 2. Composé testé Composition : Mélatonine sous forme de poudre à la concentration de 0.0015%. Forme de poudre Solution intermédiaire : 10% en DMSO Concentration testée : 0.0015% (0.015% DMSO) 3. Production des ROS par des NHEK stimulés par H 2O2 3.1. Culture et traitements Les kératinocytes ont été ensemencés en plaques 96 puits et cultivés en milieu de culture pendant 24 heures. Le milieu a ensuite été remplacé par du milieu d’essai contenant ou non (témoin) le composé ou le contrôle solvant (DMSO – 0.015%) et les cellules ont été pré-incubées en hypoxie pendant 48 heures. Après la pré-incubation, les cellules ont été placées en normoxie et le milieu a été remplacé par la sonde fluorescente : DCFH-DA résistante à la photo-oxydation puis les cellules ont été incubées pendant 30 minutes à 37°C. Après rinçage en PBS, le traitement par le composé ou le contrôle solvant a été renouvelé et l’H2O 2 (testé à 250 μM) a été ajouté. Les cellules ont été incubées pendant 30 minutes. Après stimulation, le milieu a été remplacé par du PBS contenant ou non le composé ou le contrôle solvant puis les cellules ont été incubées pendant 20 minutes avant mesure des ROS. Toutes les conditions expérimentales ont été réalisées en n=5. Afin de déterminer le signal de bruit de fond, un contrôle en l’absence de sonde a été réalisé pour la condition témoins stimulés en condition hypoxie en n=5. Pour le calcul des effets, les valeurs de bruit de fond ont été soustraites aux valeurs brutes mesurées. 2. Mesure des ROS L’intensité de la fluorescence émise (λex = 485 nm, λ em = 538 nm) a été mesurée à l’aide d’un lecteur de microplaques Synergy H1 (BioTek). L’intensité de fluorescence de la sonde métabolisée est proportionnelle à la quantité de ROS. La production de ROS est exprimée en unité de fluorescence. 4. Tests sur NHEM-LP 4.1. Test préliminaire de cytotoxicité - Type cellulaire : NHEM-LP en milieu d’essai - Temps d’incubation : 24 heures en hypoxie puis 24 heures en hypoxie avec le composé - Paramètres d’évaluation : Réduction de WST-8 et observations morphologiques au microscope. A la fin du traitement, les cellules ont été incubées en présence de WST-8 (sel de tétrazolium hautement soluble en eau) réduit en un produit hydrosoluble de couleur orange (formazan) par la succinate deshydrogénase (enzyme mitochondriale). Cette transformation est proportionnelle au nombre de cellules vivantes et à leur activité métabolique. La densité optique (DO) a été mesurée avec un spectrophotomètre à 450 nm (VERSAmax, Molecular Devices). 4.2. Mélanogénèse 4.2.1. Culture et traitements Les mélanocytes ont été ensemencés en plaques 24 puits et cultivés en milieu de culture pendant 24 heures en normoxie. Le milieu de culture a été renouvelé et les cellules ont été cultivées en hypoxie pendant 24 heures supplémentaires. Le milieu a ensuite été remplacé par du milieu de culture contenant ou non (témoin) le composé ou le contrôle solvant (DMSO – 0.015%) puis les cellules ont été incubées en hypoxie pendant 10 jours avec renouvellement des traitements après 3 et 7 jours d’incubation. Toutes les conditions expérimentales ont été réalisées en n=5, excepté pour la référence en n=3. 4.2.2. Dosage de la mélanine A la fin de l’incubation, la mélanine a été extraite par lyse des cellules avec une solution de NaOH 0.5 N. La densité optique (DO) des échantillons a été mesurée à 405 nm, puis la quantité de mélanine a été déterminée en comparaison avec une gamme de mélanine exogène (courbe de mélanine incluant des standards de 0.39 à 100 μg/ml). Les résultats ont été exprimés en μg/ml de mélanine, en pourcentage de témoin. 5. Traitement des données Les données brutes ont été transférées et traitées sous le logiciel Microsoft Excel®. Les comparaisons intergroupes ont été réalisées à l’aide du test t de Student bilatéral non apparié. Les analyses statistiques peuvent être interprétées si n≥5 ; cependant pour n Formules utilisées dans ce rapport : Erreur standard de la moyenne : esm = écart-type (Sd)/√n L’erreur standard de la moyenne (esm) représente l’écart de la moyenne de l’échantillon par rapport à la moyenne de la vraie population. L’esm est calculé en divisant le Sd par la racine carrée de la taille de l’échantillon. Pourcentage de viabilité : viabilité (%) = (DO composé / DO témoin ) x 100 RESULTATS 1. Production de ROS par des kératinocytes stimulés avec H2O2 en condition d’hypoxie Tableau 11 : Effet du composé MEST22M01 sur la production de ROS par des kératinocytes stimulés avec H2O2 en condition d’hypoxie Composés testés Concentration ROS ROS-bruit de fond (RFU) Moyenne (RFU) Esm (RFU) % Témoin stimuli (hypoxie) Esm (%) P (1) % Contrôle solvant Esm (%) P (1) Conditions stimulées: H 2 O 2 - 250 μM Hypoxie Témoin - 13134 10768 11697 14231 15029 12972 785 100 6 - 89 5 ns Contrôle solvant (DMSO) 0.015% 10790 16330 14755 15259 16118 14650 1006 113 8 ns 100 7 - MEST22M01 0.0015% (DMSO – 0.015%) 10740 16925 17570 15365 11047 14329 1449 110 11 ns 98 10 ns (1) : Seuil de significativité statistique ns : > 0.05, Non significatif * : 0.01 à 0.05, Significatif ** : 0.001 à 0.01, Très significatif *** : RFU : Relative Fluorescence units Dans les conditions expérimentales de ce test, quand les kératinocytes ont été cultivés en hypoxie, leur stimulation par l’H2O 2 a permis d’observer un taux élevé de dérivés réactifs de l’oxygène (12972 RFU). Le traitement des cellules cultivées en hypoxie par le contrôle solvant (DMSO testé à 0.015%) n’a pas eu d’effet significatif sur la production de dérivés réactifs de l’oxygène. En comparaison avec le contrôle solvant, le composé MEST22M01, testé à 0.0015% en hypoxie, n’a pas eu d’effet sur la production de dérivés réactifs de l’oxygène dans les kératinocytes stimulés par l’H2O2. 2. Mélanocytes en condition d’hypoxie 2.1. Test préliminaire de cytotoxicité Tableau 12 : Effet du composé MEST22M01 sur la viabilité des mélanocytes faiblement pigmentés après 48 heures d’incubation en hypoxie dont les 24 dernières heures en présence du composé Composés testés Concentration Absorbance (DO450nm) Moyenne (DO450nm) Esm (DO450nm) % témoin (hypoxie) Esm (%) P (1) Observations morphologiques Hypoxie Témoin - 0.816 0.946 0.873 0.863 0.880 0.876 0.021 100 2 - + MEST22M01 7.5 x 10-5 % 0.752 0.788 0.895 0.787 0.881 0.821 0.028 94 3 ns + 1 x 10-4 % 0.798 0.870 0.897 0.850 0.869 0.857 0.016 98 2 ns + 7.5 x 10-4 % 0.809 0.803 0.876 0.846 0.850 0.837 0.014 96 2 ns + 1.5 x 10-3 % 0.765 0.814 0.862 0.802 0.855 0.820 0.018 94 2 ns + 7.5 x 10-3 % 0.704 0.732 0.801 0.674 0.763 0.735 0.022 84 3 ** + 0.01% 0.641 0.712 0.750 0.697 0.711 0.702 0.018 80 2 *** + 0.075% 0.244 0.241 0.258 0.243 0.261 0.249 0.004 28 0 *** +/-, * 0.1% 0.174 0.181 0.184 0.188 0.189 0.183 0.003 21 0 ** +/-, * Légendes + : population normale ; +/- : réduction de croissance ; - : toxicité ; 0 : mortalité cellulaire g : grains de composé ; op : opacité due au composé ; * : modifications morphologiques ; ag : cellules agglutinées Les résultats du test de viabilité au WST-8 et l’observation des tapis cellulaires ont conduit à sélectionner la concentration à tester dans la suite de l’exemple : Concentration testée : 0.0015% (0.015% DMSO). 2.2. Effet sur la mélanogenèse Tableau 13 : Effet du composé MEST22M01 sur la synthèse de la mélanine dans des mélanocytes faiblement pigmentés en condition d’hypoxie Composés testés Concentration Mélanine (μg/ml) Moyenne (μg/ml) Esm (μg/ml) % témoin (hypoxie) Esm (%) P (1) % Contrôle solvant Esm (%) P (1) Hypoxie Témoin - 10.4 9.9 11.4 12.2 10.8 10.9 0.4 100 4 - 95 4 ns Contrôle solvant (DMSO) 0.015% 12.0 12.1 11.2 11.3 11.0 11.5 0.2 105 2 ns 100 2 - MEST22M01 0.0015% (DMSO – 0.015%) 12.4 12.0 12.4 11.9 11.5 12.0 0.2 110 1 * 105 1 ns (1) : Seuil de significativité statistique ns : > 0.05, Non significatif * : 0.01 à 0.05, Significatif ** : 0.001 à 0.01, Très significatif *** : Comparativement au témoin, le traitement des mélanocytes cultivés en hypoxie par le contrôle solvant DMSO, testé à 0.015% pendant 10 jours, n’a pas modulé la quantité de mélanine dans les mélanocytes. En comparaison avec ce contrôle solvant, le composé MEST22M01, testé à 0.0015% en hypoxie, n’a pas eu d’effet significatif sur la synthèse de mélanine par les mélanocytes. CONCLUSION Les résultats obtenus indiquent que, dans les conditions expérimentales de cette étude, le composé MEST22M01, à la concentration testée, n’a pas d’effet sur les paramètres évalués (production de dérivés réactifs de l’oxygène par des kératinocytes stimulés par l’H2O2 en hypoxie et synthèse de mélanine par des mélanocytes cultivés en hypoxie). En mettant cette conclusion en lien avec la conclusion de l’Exemple 1, il est observé que le composé MEST22M01 a augmenté la respiration cellulaire, sans induire une augmentation de la production de dérivés réactifs de l’oxygène ; jouant ainsi son rôle d’antioxydant : puisque sans antioxydant, une augmentation de la respiration cellulaire entraîne mécaniquement une augmentation de la production de dérivés réactifs de l’oxygène (Gardès-Albert M., et al. “Espèces réactives de l'oxygène : Comment l'oxygène peut-il devenir toxique ?” (2003) ; Cadenas E., et al. Mitochondrial free radical generation, oxidative stress, and aging. Free Radic Biol Med 29, 222–230 (2000) ; Migdal C., et al. Espèces réactives de l’oxygène et stress oxydant. Med Sci (Paris) 27, 405–412 (2011) ; Rinnerthaler M., et al. Oxidative Stress in Aging Human Skin. Biomolecules 5, 545–589 (2015)). Exemple 3 : Evaluation de la composition selon l’invention , où la mélatonine est sous 2 formes différentes, sur l’oxygénation cellulaire sur explants de peau humaine ex vivo INTRODUCTION Cette étude a pour but d’évaluer l’action d’un actif sous deux formes sur le métabolisme (oxygénation) cellulaire sur explants de peau humaine ex vivo. La phase ex vivo permettra de reproduire une application du produit sur la peau. La phase histologique permettra d’évaluer l’évolution des paramètres biologiques par colorations et/ou immunomarquages. La phase analytique permettra d’évaluer la densité mitochondriale, ainsi que l’activité de 2 complexes de la chaîne respiratoire mitochondriale. L’activité sera évaluée par : Un dosage de l’activité de la citrate synthase ; Un dosage de l’activité du cytochrome c oxydase (Complexe IV) ; Un dosage de l’ATP (produit de l’activité du Complexe V). MATERIEL ET METHODE Schéma de l’étude : Les explants ont été mise en survie à J-1. A J0 les produits sont appliqués sur les explants. A J1 les produits sont appliqués sur les explants. A J2 les produits sont appliqués sur les explants, puis les explants sont arrêtés après 8h d’incubation. Produits testés Produit A = extrait de Lavandula Hybrida Produit B = extrait de Melaleuca Alternifolia Produit C = mélatonine sous forme de poudre Produit D = mélatonine sous forme liposomale Préparation des explants 13 explants de 11±1 mm de diamètre ont été préparés à partir d’une plastie abdominale d’une femme âgée de 37 ans (référence P2933-AB37) avec un phototype II selon la classification de Fitzpatrick. A J-1, les explants ont été mis en survie en milieu BEM (BIO-EC’s Explants Medium) à 37°C en atmosphère humide, enrichie de 5 % de CO2. L’étude est réalisée sur tissu cutané, obtenu à partir de résidus chirurgicaux (chirurgie esthétique) d'un donneur, dans le respect de la Déclaration d'Helsinki et de l'article L.1243-4 du Code de la santé publique français. Cette dernière ne nécessite aucune autorisation préalable d'un comité d'éthique pour le prélèvement et l'utilisation de déchets chirurgicaux. Répartition des explants Les explants ont été répartis en 3 lots comme suit : Lot T : DPBS 1X – 3 explants – Temps d’arrêt à J2 Lot P1 : Produit P1 = C (mélatonine sous forme de poudre) à 0,0015% + A ( Lavandula Hybrida) à 1% + B ( Melaleuca Alternifolia ) à 1% + DMSO 0,015% en DPBS 1X – 5 explants – Temps d’arrêt à J2 Lot P2 : Produit P2 = D (mélatonine sous forme liposomale) à 0,0015% + A ( Lavandula Hybrida) à 1% + B ( Melaleuca Alternifolia ) à 1% en DPBS 1X – 5 explants – Temps d’arrêt à J2 Préparation des produits : Les produits ont été préparés à J0 puis stockés à 4°C le long de la phase ex vivo. Application des produits A J0, J1 et J2, pour les explants du lot T, le DPBS 1X a été appliqué en topique, à raison de 5 μl par explant de 1 cm2 (≈ 2 mg/cm²) et étalés à l’aide d’une spatule. A J0, J1 et J2, pour les explants des lots concernés, les produits P1, P2 ont été appliqués en topique, à raison de 5 μl par explant de 1 cm2 (≈ 5 mg/cm²) et étalés à l’aide d’une spatule. Prélèvements A J2 (8h après la dernière application), les 3-5 explants de chaque lot ont été prélevés. Traitements histologiques Après 24h dans le formol tamponné, les prélèvements ont été déshydratés et imprégnés en paraffine à l’aide d’un automate de déshydratation Leica PEARL. Ils ont été mis en bloc à l’aide d’une station d’enrobage Leica EG 1160. Des coupes de 5 μm ont été réalisées à l’aide d’un microtome type Minot, Leica RM 2125 et montées sur des lames de verre histologiques. Les échantillons congelés ont été coupés en sections de 7 μm ou 20 μm d’épaisseur à l’aide d’un cryostat Leica CM 3050. Les sections ont ensuite été montées sur des supports différents selon le type d’envoi. Les observations microscopiques ont été réalisées en microscopie optique, à l’aide d’un microscope Leica type DMLB, Olympus BX43 ou Olympus BX63. Les prises de vue ont été réalisées avec une caméra Olympus DP72 ou DP74 et le logiciel cellSens (Olympus). Contrôle de la viabilité cellulaire La viabilité cellulaire a été observée sur coupes en paraffine après coloration au trichrome de Masson variante de Goldner. Elle a été évaluée par un examen microscopique. Dosages biochimiques et enzymatiques Les dosages ont été réalisés à partir des explants congelés à -80°C. Les explants de peau congelés ont été broyés en tampon phosphate pH=7.8 par un homogénéisateur à turbine (Turax), puis soumis à une disruption des cellules aux ultrasons (Ultrasonic disruptor, Bransonic). Après centrifugation à 4000 tr/min, à 18°C, le surnageant a été récupéré pour les dosages. Dosage des protéines totales : Les protéines totales ont été détectées par une technique de Bradford automatisée, utilisant le réactif "Bradford reagent" de Sigma, ref B6916. La concentration de protéines totales des explants (3-5 explants par lot) est exprimée en g/L (cf. annexes). Dosage de la citrate synthase : L’activité de la citrate synthase a été mesurée selon la technique colorimétrique de Srere (1969) basée sur la mesure de l’apparition du coenzyme A qui porte un groupement sulfhydrile SH. Ce groupement réagit avec l’acide dinitrothiobenzoïque (DTNB) apporté dans le milieu réactionnel. La réaction est suivie par mesure de la densité optique à une longueur d’onde de 415 nm. L’activité de la citrate synthase (3-5 explants par lot) est exprimée en U/g de protéines. Dosage du Complexe IV – Cytochrome C Oxidase : L’activité du complexe IV a été mesurée par un dosage spectrophotométrique à 546 nm. L’activité du complexe IV (3-5 explants par lot) est exprimée en U/g de protéines. Dosage de l’ATP : Le dosage de ATP a été réalisé en chemiluminescence en utilisant le réactif CellTiter-Glo™ (Promega, réf. G755A, lot 494567) selon la méthode décrite par Kimmich et al. Analytical Biochem, 1975, 69 :187-206. La concentration en ATP des explants (3-5 explants par lot) est exprimée en μmol/g de protéines. Analyse statistique : Test de Wilcoxon - Mann Whitney Le test de Wilcoxon - Mann Whitney permet la comparaison de deux échantillons indépendants et de petite taille, à savoir chaque produit vs le témoin au même jour. La différence entre deux lots est significative si p * : significatif avec p ** : significatif avec p *** : significatif avec p Ns : non-significatif RESULTATS Activit é de la citrate synthase Tableau 14 : Activité de la citrate synthase Citrate synthase (U/g protéine) T-J2 P1 – J2 P2 – J2 Moyenne 43.7 74.5 79.9 Écart-type 0.9 9.8 15.3 Les résultats sont présentés en FIG. 10 . Le produit 1 (P1J2) induit une augmentation significative de 71%* Le produit 2 (P2J2) induit une augmentation significative de 83%* Test Wilcoxon - Mann Whitney Non-significatif = ns ; Significatif * : p Activité du complexe IV Tableau 15 : Activité du complexe IV Complexe IV (U/g protéine) T-J2 P1 – J2 P2 – J2 Moyenne 6.4 6.6 11.0 Écart-type 2.2 2.0 2.3 Les résultats sont présentés en FIG. 11 . Le produit 1 (P1J2) induit une augmentation non-significative de 70% ns Le produit 2 (P2J2) induit une augmentation significative de 83%* Test Wilcoxon - Mann Whitney Non-significatif = ns ; Significatif * : p Dosage de l’ATP Tableau 16 : Dosage de l’ATP ATP (µmol/g protéine) T-J2 P1 – J2 P2 – J2 Moyenne 7.1 9.1 17.3 Écart-type 6.3 3.5 9.9 Les résultats sont présentés en FIG. 12 . Le produit 1 (P1J2) induit une augmentation non-significative de 28% ns Le produit 2 (P2J2) induit une augmentation non-significative de 143% ns Test Wilcoxon - Mann Whitney Non-significatif = ns ; Significatif * : p DISCUSSION Les produits P1 et P2 induisent une augmentation statistiquement significative de la densité mitochondriale, visible à travers la hausse de l’activité de la citrate synthase. Le produit P2 stimule l'activité de la chaîne respiratoire mitochondriale, à travers son complexe IV, de manière statistiquement significative ; ainsi qu’à travers son complexe V, de manière non significative mais substantielle, visible de par l’augmentation de la production d’ATP (énergie cellulaire). Composition cosmétique non-thérapeutique pour augmenter la respiration mitochondriale cellulaire des kératinocytes sous-jacents à la couche cornée de l'épiderme chez un sujet sain, comprenant : Un extrait, de préférence de l’huile des feuilles, de Melaleuca Alternifolia ; Un extrait, de préférence de l’huile de fleurs, de Lavandula Hybrida ; De la mélatonine. Composition cosmétique non-thérapeutique selon la revendication précédente, comprenant : Entre 0,00001% et 1%, de préférence entre 0,01% et 1%, en poids de la composition dudit extrait, de préférence de l’huile des feuilles, de Melaleuca Alternifolia . Composition cosmétique non-thérapeutique selon l’une quelconque des revendications précédentes, comprenant : Entre 0,00001% et 1%, de préférence entre 0,01% et 1%, en poids de la composition dudit extrait, de préférence de l’huile de fleurs, de Lavandula Hybrida . Composition cosmétique non-thérapeutique selon l’une quelconque des revendications précédentes, comprenant : Entre 0,00001% et 10%, de préférence entre 0,00001% et 1%, en poids de la composition de mélatonine. Composition cosmétique non-thérapeutique selon l’une quelconque des revendications précédentes, comprenant : Entre 0,00001% et 1%, de préférence entre 0,01% et 1%, en poids de la composition dudit extrait, de préférence de l’huile des feuilles, de Melaleuca Alternifolia ; Entre 0,00001% et 1%, de préférence entre 0,01% et 1%, en poids de la composition dudit extrait, de préférence de l’huile de fleurs, de Lavandula Hybrida ; Entre 0,00001% et 10% de préférence entre 0,00001% et 1%, en poids de la composition de mélatonine. Composition cosmétique non-thérapeutique selon l’une quelconque des revendications précédentes, ladite composition comprenant en outre au moins un agent cosmétiquement acceptable choisi parmi les agents apaisants, les agents restructurant, les agents régénérants, les agents revitalisants, les filtres solaires, les agents antirides, les agents hydratants, les agents anti-âges, les agents tensioactifs, les corps gras, les solvants organiques, les agents solubilisant, les agents épaississants et gélifiants, les lissants, les agents renforçant la fermeté, l’élasticité et/ou l’effet barrière de la peau, les antioxydants, les opacifiants, les eaux thermales, les agents matifiants, les filtres chimiques ou minéraux, les oligoéléments, les agents stabilisants, les agents moussants, les parfums, les émulsionnants ioniques ou non, les charges, les séquestrants et les chélateurs, les parfums, les filtres, les huiles essentielles, les matières colorantes, les pigments, les actifs hydrophiles ou lipophiles, les vésicules lipidiques encapsulant un ou plusieurs actifs et/ou les conservateurs. Composition cosmétique non-thérapeutique selon l’une quelconque des revendications précédentes, ladite composition étant formulée sous forme de crème, d'une pommade, d’un onguent, d’un baume, d’un masque, d'un lait, d'une lotion, d'un sérum, d’un spray, d'une pâte, d'une mousse, d'un aérosol, d’un stick, d’un shampooing, d’un après-shampooing, de patchs, d'une solution aqueuse hydroalcoolique ou huileuse, d'une émulsion huile-dans-eau ou eau-dans-huile ou multiple, d'un gel aqueux ou huileux, d'un produit anhydre liquide, pâteux ou solide, et/ou d'une dispersion d'huile dans une phase aqueuse à l'aide de sphérules, ces sphérules pouvant être des nanoparticules polymériques telles que les nanosphères et les nanocapsules ou des vésicules lipidiques de type ionique et/ou non-ionique. Procédé de soin cosmétique non-thérapeutique de la peau d’un sujet sain, comprenant une étape d’application sur la peau dudit sujet d’une composition cosmétique selon l’une quelconque des revendications 1 à 7. Utilisation cosmétique non-thérapeutique d’une composition selon l’une quelconque des revendications 1 à 7, pour augmenter la respiration mitochondriale cellulaire des kératinocytes sous-jacents à la couche cornée de l'épiderme chez un sujet sain. Kit pour la préparation d’une composition cosmétique non-thérapeutique pour augmenter la respiration mitochondriale cellulaire des kératinocytes sous-jacents à la couche cornée de l'épiderme, comprenant : Un extrait, de préférence de l’huile des feuilles, de Melaleuca Alternifolia ; Un extrait, de préférence de l’huile de fleurs, de Lavandula Hybrida ; De la mélatonine.