Brevet FR3158745A1 — publié le 20250801

La présente invention concerne un procédé de diagnostic in vitro ou ex vivo des chances de survie d’un patient atteint de Lymphome B diffus à grande échelle (LBDGC) comprenant une étape de détection de l’expression d’au moins un des gènes biomarqueurs du LBDGC nouvellement identifiés. BIOMARQUEURS ET OUTIL PRONOSTIQUE POUR LES PATIENTS ATTEINT DE LYMPHOMES B DIFFUS A GRANDES CELLULES DOMAINE DE L’INVENTION La présente invention s’inscrit dans le contexte du diagnostic et du choix thérapeutique des Lymphomes B Diffus à Grandes Cellules (LBDGC ou DLBCL) et a pour objet un nouveau procédé de diagnostic in vitro ou ex vivo permettant d’estimer les chances de survie d’un patient atteint de LBDGC. L’invention a également pour objet un kit et l’utilisation de biomarqueurs pour un tel diagnostic in vitro ou ex vivo . ETAT DE LA TECHNIQUE Le Lymphome B Diffus à Grandes Cellules (LBDGC ou DLBCL) est le type de lymphome non hodgkinien (LNH) le plus courant. Le LBDGC est généralement diagnostiqué après l’âge de 60 ans et affecte un peu plus souvent l'homme. Cependant, il peut aussi survenir chez des enfants et jeunes adultes. Le LBDGC représente une forme fréquente et agressive d’hémopathie maligne avec près de 4000 nouveaux cas par an en France et une incidence en progression. Dans la majorité des cas, le LBDGC se développe dans les ganglions lymphatiques. Néanmoins, il peut aussi atteindre des organes ou des tissus qui se trouvent hors des ganglions lymphatiques (tels que les os, la moelle épinière, le sinus, les testicules, etc.). Dans un tel cas, on parle alors de localisation extra ganglionnaire. Lorsque le LBDGC se développe dans les ganglions lymphatiques, il se manifeste notamment par une augmentation anormale de ceux-ci, qui peuvent dès lors se sentir au toucher. D’autres symptômes, comme une fièvre inexpliquée, des sueurs nocturnes importantes et une perte de poids inexpliquée, peuvent aussi se manifester. Le diagnostic des LBDGC est basé principalement sur l’analyse histologique d’une biopsie ganglionnaire ou, plus rarement, d’une biopsie de moelle osseuse. L’analyse cytologique met en évidence un envahissement diffus par une population de cellules tumorales lymphocytaires de phénotype B, centroblastiques, immunoblastiques ou anaplasiques (Bonnet et al - Prise en charge du lymphome B diffus à grandes cellules en 2012 - Revue médicale suisse - ISSN: 1660-9379). Depuis plus de vingt ans, le traitement de référence du LBDGC consiste en une combinaison de chimiothérapies avec un traitement ciblé d’immunothérapie. Il s’agit du protocole d’immunochimiothérapie « R-CHOP », soit l’association d’une polychimiothérapie CHOP et d’un anticorps thérapeutique appelé rituximab (Rituxan ou Mabthera). Ce traitement a permis d’augmenter significativement la survie des patients avec 60% à 70% de rémission. Néanmoins, 30% à 40% des patients sont réfractaires ou rechutent dans les deux ans qui suivent la thérapie, ce qui reste considérable. A ce stade, la greffe de cellules souches hématopoïétiques restait la seule chance de guérison avant l’émergence des traitements par cellules CAR-T qui demeurent très lourds et couteux. Il existe donc un réel besoin de pouvoir identifier, le plus tôt possible, cette portion de patients atteints de LBDGC à risque élevé d’état réfractaire à l’immunochimiothérapie et ainsi permettre une prise en charge plus adaptée à leur condition (en leur évitant par exemple de subir un traitement chimiothérapeutique lourd et inefficace). En d’autres termes, afin de proposer un protocole de traitement optimal et adapté à chaque patient atteint de LDGCB, les équipes soignantes ont besoin d’indicateurs fiables permettant d’estimer le pronostic de survie du patient atteints de LBDGC, au moment du diagnostic ou dès que possible. A ce jour, le risque de rechute des patients atteints de LBDGC est essentiellement évalué en routine grâce à un score pronostic appelé IPI ( International Pronostic Index ) et qui est basé sur 5 paramètres clinico-biologiques ( Sehn , Blood, 2007 ). Une classification moléculaire basée sur les profils transcriptionnels (ABC/GCB) et associée au pronostic a également été décrite en 2002 ( Rosenwald , NEJM, 2002 ) et est classiquement évaluée par immunohistochimie sans avoir, pour le moment, d’impact réel sur le traitement proposé aux patients. Plus récemment, les avancées du séquençage à haut débit ont permis de proposer de nouvelles classifications basées sur les profils mutationnels ( Reddy , Oeil , 2017 ; Schmitz , NEJM, 2018 ; Wright Cancer Cell , 2020 ), certains groupes étant associés à un pronostic inférieur. Ces différentes classifications ont permis de mieux décrire les différentes formes de cette pathologie hétérogène et auront probablement à l’avenir un potentiel théranostique avec l’émergence de nouvelles thérapies ciblées. Cependant, ces différentes classifications n’ont actuellement pas d’intérêt en tant que biomarqueurs prédictifs de la réponse au traitement à l’échelle individuelle. A ce jour, aucune méthode fiable et robuste ne permet de déterminer, dès le diagnostic de la maladie, les chances de survie d’un patient atteint de LBDGC et d’identifier avant même le début du traitement R-CHOP si ledit patient répondra favorablement ou non à un tel traitement. Par conséquent, la recherche de nouveaux indicateurs pour préciser les chances de survie des patients atteints de LBDGC est donc nécessaire pour permettre d’affiner les classifications existantes et ainsi permettre de proposer le traitement le plus adapté pour chaque patient. Dans ce contexte, en s’appuyant sur le travail des chercheurs de l’Institut pour l’Avancée des Biosciences (IAB) à Grenoble – qui, s’appuyant sur le fait qu’au cours de l’oncogenèse, la cellule subit des dérégulations sévères au niveau du génome et de l’épigénome qui impactent les profils d’expression de gènes, –ont identifié de nouveaux biomarqueurs reposant sur une expression ectopique d’un ou plusieurs gènes, dont l’expression est associée au pronostic des patients atteints de LBDGC. Les inventeurs ont ainsi développé une méthode inédite et un outil diagnostic associé permettant de proposer des nouveaux biomarqueurs capables, seul ou en combinaison, de prédire les chances de survie d’un patient atteint de LBDGC. Les inventeurs ont testé leur méthode sur de nombreuses cohortes de patients atteints de LBDGC, la validant pour chacune d’elle. De plus, les inventeurs ont démontré que la prédiction des chances de survie obtenue via cette nouvelle méthode représente un indicateur fiable et robuste, en tant que tel, et peut également être utilisée en complément des indicateurs déjà connus dans l’art antérieur afin d’affiner les classifications existantes. DESCRIPTION DE L’INVENTION La présente invention a donc pour objet un procédé de diagnostic in vitro ou ex vivo des chances de survie d’un patient atteint de Lymphome B diffus à grande échelle (LBDGC), comprenant une étape de détection de l’expression du gène FOXA3, seule ou en combinaison de l’expression d’au moins un autre gène choisi parmi : DNAJC6, EHHADH, OXTR, OTX1, TRIM9, MT1H et PCDH9, dans un échantillon biologique dudit patient. Ainsi, via la détection d’une expression ectopique d’au moins l’un des gènes précités, dans un échantillon biologique, le procédé de l’invention permet d’apporter un indicateur robuste, en tant que tel, aux équipes soignantes quant aux chances de survie du patient atteint de LDGCB dont ils ont la charge. En outre, cet indicateur supplémentaire peut être combiné à ceux existants (score IPI, Classification ABC/GCB), renforçant ainsi la robustesse de la prédiction établie. Cet indicateur présente également l’avantage de pouvoir être obtenu rapidement et simplement, via des technologies déjà déployées dans un grand nombre de centres médicaux, par exemple par un test RT-qPCR (PCR quantitative après transcription inverse), RT-MLPA (Reverse Transcription Multiplex Ligation-dependent Probe Amplification) ou RT-MLPSeq (Reverse Transcription-Multiple Ligation-dependent probe Sequencing). Par conséquent, l’obtention de cet indicateur supplémentaire via le procédé selon l’invention est peu onéreuse et standardisable à brèves échéances, dans les laboratoires desdits centres médicaux. La présente invention apporte une réelle contribution au panel d’outils diagnostiques des Lymphomes B Diffus à Grandes Cellules (LBDGC) dont disposent les équipes soignantes en vue de proposer la stratégie thérapeutique la plus adaptée à chaque patient atteint de LBDGC. Dans le cadre de l’invention, on entend les expressions « diagnostic in vitro » et « diagnostic ex vivo », se référant à des tests réalisés à l’extérieur du patient, après prélèvement de l’échantillon biologique sur ledit patient. Les tests réalisés sur des échantillons biologiques prélevés sur le(s) patient(s) et maintenus en laboratoire, généralement en conditions stériles, sans modification sur une courte durée (généralement moins de 24 heures), s’inscrivent dans le cadre d’un diagnostic ex vivo selon l’invention. Les tests menés sur de tels échantillons et sur un temps plus long, s’inscrivent généralement dans le cadre d’un diagnostic in vitro selon l’invention, puisqu’ils requièrent des étapes de culture cellulaire visant à maintenir en vie les cellules desdits échantillons biologiques prélevés. Dans le cadre de l’invention, l’expression « échantillon biologique » se réfère à un fragment de tissu (exérèse de la tumeur ou biopsie) susceptibles de contenir des cellules tumorales lymphocytaires de phénotype B (aussi appelées lymphocytes B cancéreux). Selon le domaine d’application de l’invention et à titre d’exemples non exhaustifs, l’échantillon biologique peut être tout type d’échantillon biopsique tumoral tels qu’un échantillon de biopsie tissulaire (notamment de ganglion(s), de moelle osseuse et de foie) ou un échantillon de sang, notamment un échantillon de sang périphérique. Dans le cadre de l’invention, les expressions « chance(s) de survie », « pronostic », « probabilité(s) de survie » ou encore « prédiction(s) de survie » sont des synonymes et désignent toutes l’estimation de la survie d’un patient atteint de LBDGC, au regard d’indicateurs propres à ce patient. Dans le cadre de l’invention, l’expression « détection de l’expression d’au moins un gène » signifie la quantification d’au moins un produit d'expression du gène. Le produit d’expression d’un gène, au sens de la présente invention, est toute molécule biologique issue de l’expression dudit gène. Par exemple, le produit d’expression du gène peut être un transcrit ARN ou une protéine obtenue après traduction d’un transcrit par les ribosomes. Par « transcrit », on entend les ARN, et en particulier les ARN messagers (ARNm), issus de la transcription du gène. Plus précisément, les transcrits sont les ARN produits par la transcription d’un gène suivi des modifications post-transcriptionnelles des formes pré-ARN. Dans le cadre de la présente invention, il est possible de quantifier le niveau d’expression d’un ou plusieurs transcrits ARN du même gène et/ou le niveau d’expression d’un ou plusieurs isoformes d’une protéine codée par un même gène. L’expression quantifiée dudit gène détecté est comparée à une valeur de référence. En dessous de cette valeur, le gène est considéré comme n’étant pas exprimé, au sens de l’invention. Il peut par exemple s’agir d’un bruit de fond technique qui ne doit pas être pris en considération dans le cadre de l’invention. A l’inverse, au-delà de la valeur de référence, l’expression du gène est considérée comme détectée. Il s’agit alors d’une expression ectopique, appelée également expression hors contexte, puisque les huit gènes identifiés par les inventeurs ne s’expriment pas dans les cellules lymphocytaires de phénotype B (ci-après « lymphocytes B ») d’un individu sain. La détection de l’expression du gène est réalisée par tout moyen connu de l’homme du métier. Dans le cas d’un transcrit ARNm, la détection peut être réalisée par une méthode directe, par tout procédé connu de l’homme du métier permettant de déterminer la présence dudit transcrit dans l’échantillon, ou par détection indirecte du transcrit après transformation de ce dernier en ADN par rétrotranscription, ou après amplification dudit transcrit ou après amplification de l'ADN obtenu après transformation dudit transcrit en ADN. De nombreuses méthodes existent pour la détection des acides nucléiques (voir par exemple Kricka et al., Clinical Chemistry , 1999, n° 45(4), p.453-458 ; Relier G. H. et al., DNA Probes, 2nd Ed., Stockton Press , 1993, sections 5 et 6, p.173-249 ). L’expression des gènes peut notamment être mesurée par Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction ou RT-PCR, de préférence par RT-PCR quantitative ou RT-qPCR (par exemple en utilisant la plateforme BiomarkTM de Fluidigm), par séquençage (de préférence par séquençage haut débit) ou par des techniques d’hybridation (par exemple avec des micropuces d’hybridation ou par des techniques du type NanoString® nCounter®). L’expression desdits gènes peut également être mesurée par Reverse Transcription-Multiplex Ligation-dependent Probe Amplification (RT-MPLA). Dans le cadre de l’invention, l’expression « valeur de référence » correspond à la valeur du niveau d’expression d’un gène considéré chez un ou plusieurs individus sains, c’est-à-dire n’étant pas atteint de LBDGC et/ou ne présentant aucune affection médicale spécifique. Cette valeur de référence peut être déterminée directement à partir de l’analyse d’un échantillon biologique d’un individu sain ou être la résultante de plusieurs valeurs issues de plusieurs échantillons biologiques d’un même individu sain et/ou de plusieurs individus sains. Dans le cadre de l’invention, le gène DNAJC6 se réfère au gène connu sous le nom « DnaJ heat shock protein family (Hsp40) member C6 » (identifiant Ensembl : ENSG00000185100), localisé sur le chromosome 1 (localisation chromosomique du gène selon le GRCh38/hg38 : chr1: 65,248,219-65,415,871) et codant actuellement pour 8 transcrits identifiés. Il a pour séquence nucléotidique la séquence SEQ ID NO : 1 ou une séquence présentant au moins 65% voire 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% ou même 99% d’identité avec la séquence SEQ ID NO : 1. Dans le cadre de l’invention, le gène EHHADH se réfère au gène connu sous le nom « enoyl-CoA hydratase and 3-hydroxyacyl CoA dehydrogenase » (identifiant Ensembl : ENSG00000113790), localisé sur le chromosome 3 (localisation chromosomique du gène selon le GRCh38/hg38 : chr 3: 185,190,624-185,281,990) et codant actuellement pour 6 transcrits identifiés. Il a pour séquence nucléotidique la séquence SEQ ID NO : 2 ou une séquence présentant au moins 65% voire 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% ou même 99% d’identité avec la séquence SEQ ID NO : 2. Dans le cadre de l’invention, le gène OXTR se réfère au gène connu sous le nom « oxytocin receptor » (identifiant Ensembl : ENSG00000180914), localisé sur le chromosome 3 (localisation chromosomique du gène selon le GRCh38/hg38 : chr 3: 8,750,381-8,769,628) et codant actuellement pour 4 transcrits identifiés. Il a pour séquence nucléotidique la séquence SEQ ID NO : 3 ou une séquence présentant au moins 65% voire 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% ou même 99% d’identité avec la séquence SEQ ID NO : 3. Dans le cadre de l’invention, le gène OTX1 se réfère au gène connu sous le nom « orthodenticle homeobox 1 » (identifiant Ensembl : ENSG00000115507), localisé sur le chromosome 2 (localisation chromosomique du gène selon le GRCh38/hg38 : chr2: 63,050,057-63,057,836) et codant actuellement pour 6 transcrits identifiés. Il a pour séquence nucléotidique la séquence SEQ ID NO : 4 ou une séquence présentant au moins 65% voire 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% ou même 99% d’identité avec la séquence SEQ ID NO : 4. Dans le cadre de l’invention, le gène TRIM9 se réfère au gène connu sous le nom « tripartite motif containing 9 » (identifiant Ensembl : ENSG00000100505), localisé sur le chromosome 14 (localisation chromosomique du gène selon le GRCh38/hg38 : chr14: 50,975,262-51,096,061) et codant actuellement pour 7 transcrits identifiés. Il a pour séquence nucléotidique la séquence SEQ ID NO : 5 ou une séquence présentant au moins 65% voire 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% ou même 99% d’identité avec la séquence SEQ ID NO : 5. Dans le cadre de l’invention, le gène MT1H se réfère au gène connu sous le nom « metallothionein 1H » (identifiant Ensembl : ENSG00000205358), localisé sur le chromosome 16 (localisation chromosomique du gène selon le GRCh38/hg38 : chr16: 56,669,814-56,671,129) et codant actuellement pour 2 transcrits identifiés. Il a pour séquence nucléotidique la séquence SEQ ID NO : 6 ou une séquence présentant au moins 65% voire 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% ou même 99% d’identité avec la séquence SEQ ID NO : 6. Dans le cadre de l’invention, le gène PCDH9 se réfère au gène connu sous le nom « protocadherin 9 » (identifiant Ensembl : ENSG00000184226), localisé sur le chromosome 13 (localisation chromosomique du gène selon le GRCh38/hg38 : chr13: 66,302,834-67,230,445) et codant actuellement pour 6 transcrits identifiés. Il a pour séquence nucléotidique la séquence SEQ ID NO : 7 ou une séquence présentant au moins 65% voire 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% ou même 99% d’identité avec la séquence SEQ ID NO : 7. Dans le cadre de l’invention, le gène FOXA3 se réfère au gène connu sous le nom « forkhead box A3 » (identifiant Ensembl : ENSG00000170608), localisé sur le chromosome 19 (localisation chromosomique du gène selon le GRCh38/hg38 : chr19: 45,863,989-45,873,797) et codant actuellement pour 2 transcrits identifiés. Il a pour séquence nucléotidique la séquence SEQ ID NO : 8 ou une séquence présentant au moins 65% voire 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% ou même 99% d’identité avec la séquence SEQ ID NO : 8. De préférence, la présente invention a pour objet un procédé tel que décrit précédemment et présentant les caractéristiques techniques suivantes, prises seules ou en combinaison : - l’étape de détection de l’expression d’au moins un gène choisi parmi : DNAJC6, EHHADH, OXTR, OTX1, TRIM9, MT1H, PCDH9 et FOXA3 consiste en la mesure de l’expression desdits gènes et, pour chaque gène, la comparaison de ladite mesure par rapport à une valeur de référence d’expression dudit gène pour un individu sain ; - la détection de l’expression des gènes est réalisée via au moins une technologie choisie parmi : RT-qPCR, hybridation in situ par fluorescence, RNA-SCOPE, séquençage à haut-débit RNA-seq, via RT-MLPA et RT-MLPSeq ; - l’étape de détection comprend la détection de l’expression d’au moins deux desdits gènes, de préférence d’au moins trois desdits gènes, préférentiellement d’au moins quatre desdits gènes, préférentiellement d’au moins cinq desdits gènes, préférentiellement d’au moins six desdits gènes, préférentiellement d’au moins sept desdits gènes et encore plus préférentiellement des huit gènes ; - l’étape de détection comprend la détection de l’expression d’au moins les deux gènes suivants : DNAJC6 et EHHADH ; - l’étape de détection comprend la détection de l’expression d’au moins les trois gènes suivants : DNAJC6, EHHADH et OXTR ; - l’étape de détection comprend la détection de l’expression d’au moins les quatre gènes suivants : DNAJC6, EHHADH, OXTR et OTX1 ; - l’étape de détection comprend la détection de l’expression d’au moins les cinq gènes suivants : DNAJC6, EHHADH, OXTR, OTX1 et TRIM9 ; - l’étape de détection comprend la détection de l’expression d’au moins les six gènes suivants : DNAJC6, EHHADH, OXTR, OTX1, TRIM9 et MT1H ; - l’étape de détection comprend la détection de l’expression d’au moins les sept gènes suivants : DNAJC6, EHHADH, OXTR, OTX1, TRIM9, MT1H et FOXA3 ; - l’étape de détection comprend la détection de l’expression des huit gènes ; et/ou - l’échantillon biologique du patient est un échantillon de ganglion dudit patient. L’invention a également pour objet un kit pour le diagnostic in vitro ou ex vivo des chances de survie d’un patient atteint de Lymphome B diffus à grande échelle (LBDGC) comprenant des moyens de détection de l’expression d’au moins un gène choisi parmi : DNAJC6, EHHADH, OXTR, OTX1, TRIM9, MT1H, PCDH9 et FOXA3, dans un échantillon biologique dudit patient. L’invention a également pour objet une utilisation d’au moins un gène parmi DNAJC6, EHHADH, OXTR, OTX1, TRIM9, MT1H, PCDH9 et FOXA3, en tant que biomarqueur pour le diagnostic in vitro ou ex vivo des chances de survie d’un patient atteint de Lymphome B diffus à grande échelle (LBDGC), dans un échantillon biologique dudit patient. Avantageusement, l’utilisation selon l’invention est une utilisation d’au moins deux desdits gènes, de préférence d’au moins trois desdits gènes, préférentiellement d’au moins quatre desdits gènes, préférentiellement d’au moins cinq desdits gènes, préférentiellement d’au moins six desdits gènes, préférentiellement d’au moins sept desdits gènes et encore plus préférentiellement des huit gènes, en tant que biomarqueur pour le diagnostic in vitro ou ex vivo des chances de survie d’un patient atteint de Lymphome B diffus à grande échelle (LBDGC), dans un échantillon biologique dudit patient. FIG. 1 : représente la survie moyenne dans le temps de patient atteints de LBDGC et appartenant à différentes cohortes, en fonction de la détection de l’expression du gène DNAJC6; FIG. 2 : représente la survie moyenne dans le temps de patient atteints de LBDGC et appartenant aux différentes cohortes testées, en fonction de la détection de l’expression des gènes DNAJC6 ou EHHADH; FIG. 3 : représente la survie moyenne dans le temps de patient atteints de LBDGC et appartenant aux différentes cohortes testées, selon qu’ils expriment 0-1, ou 2-3 des gènes suivants DNAJC6, EHHADH et OXTR; FIG. 4 : représente la survie moyenne dans le temps de patient atteints de LBDGC et appartenant aux différentes cohortes testées, selon qu’ils expriment 0-1, ou 2-4 des gènes suivants DNAJC6, EHHADH, OXTR et OTX1; FIG. 5 : représente la survie moyenne dans le temps de patient atteints de LBDGC et appartenant aux différentes cohortes testées, selon qu’ils expriment 0-2, ou 3-5 des gènes suivants DNAJC6, EHHADH, OXTR, OTX1 et TRIM9; FIG. 6 : représente la survie moyenne dans le temps de patient atteints de LBDGC et appartenant aux différentes cohortes testées, selon qu’ils expriment 0-2, ou 3-6 des gènes suivants DNAJC6, EHHADH, OXTR, OTX1, TRIM9 et MT1H; FIG. 7 : représente la survie moyenne dans le temps de patient atteints de LBDGC et appartenant aux différentes cohortes testées, selon qu’ils expriment 0-2, ou 3-7 des gènes suivants DNAJC6, EHHADH, OXTR, OTX1, TRIM9, MT1H et PCDH9; FIG. 8 : représente la survie moyenne dans le temps de patients atteints de LBDGC et appartenant aux différentes cohortes testées selon qu’ils expriment 0-2, ou 3-8 des gènes suivants DNAJC6, EHHADH, OXTR, OTX1, TRIM9, MT1H, PCDH9 et FOXA3. La présente invention est illustrée de manière non limitative par les exemples suivants. EXEMPLES DE REALISATION Exemple 1 : identification et validation des huit gènes biomarqueurs Les inventeurs ont établi une liste de gènes présentant une expression spécifique ou prédominante à certains tissus humains et non exprimés ou faiblement exprimés les lymphocytes B de patients sains. Plus de 2000 gènes ont été retenus à cette étape. Parmi les gènes retenus, les inventeurs ont ensuite procédé à une étape de sélection des gènes dans la cohorte (également appelé « jeu de données » ci-après) NCICCR-DLBCL (TCGA) pour lesquels une activation ectopique dans les lymphocytes B a été observée dans plus de 10% des cas. 617 gènes ont été sélectionnés à cette étape. Lors de l’étape suivante, les inventeurs ont identifié les gènes candidats capables de prédire individuellement le pronostic vital des patients atteint de LBDGC dans la cohorte Duke 1001 DLBCL (Duke University). Pour cela, ils ont établi un seuil d’activation pour chaque gène parmi les 617, en utilisant la méthode bio-informatique « ectopy », développée par les inventeurs et publiée dans le journal international BMC Genomics (Jacquet et al. 2023 PMID 37592220). La méthode « ectopy » vise à identifier des activations ectopiques des gènes normalement silencieux à partir des jeux de données transcriptomiques de cancers, à évaluer leur impact sur la probabilité de survie des patients et à déterminer les biomarqueurs candidats les plus robustes. Les inventeurs ont ainsi trouvé que pour 89 gènes, parmi les 617 gènes identifiés préalablement, l’activation aberrante du gène a été significativement associée à une probabilité de survie plus courte des patients dans la cohorte d’entrainement. Le modèle à risque proportionnel de Cox (modèle reconnu dans ce domaine et étant décrit dans la publication « Analysis of survival data. Cox & Oakes . 1984. ISBN 978-0-412-24490-2 ») a été utilisé dans l’analyse de survie pour identifier les gènes candidats. En phase de validation, les statuts d’activation (ON : exprimé, OFF : éteint) des 89 gènes ont été établis dans trois cohortes LBDGC de validation GSE117556A, GSE31312 et GSE181063 disponibles dans la base de données publique NCBI GEO (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/). L’impact significatif de l’activation aberrante (statut ON du gène) sur la survie globale des patients a été confirmé dans toutes les cohortes de validation pour les 8 gènes suivants parmi les 89 gènes candidats retenus : DNAJC6, EHHADH, OXTR, OTX1, TRIM9, MT1H, PCDH9 et FOXA3. Ces 8 gènes ont été retenus pour créer un panel de biomarqueurs pronostics de LBDGC. Pour chaque patient, le nombre de gènes activés parmi les 8 gènes de ce panel est calculé pour obtenir un score pronostic. Ce score ainsi obtenu permet de prédire la probabilité de survie pour chaque patient atteint de LBDGC. Enfin, ce panel de biomarqueurs pronostics de LBDGC a été testé dans trois cohortes entièrement indépendantes (GSE10846, GSE117556B et l’agrégation de cohortes GSE53786, GSE32918 et GSE87371- disponibles dans la base de données publique NCBI GEO (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/), qui n’ont pas servi à l’identification des 8 gènes biomarqueurs finalement retenus. Les inventeurs ont démontré que le nombre de gènes dont l’expression ectopique a été détectée est significativement associé à la probabilité de survie globale dans toutes les cohortes de test. Les inventeurs ont ainsi démontré la robustesse et la fiabilité de ce nouveau panel de biomarqueurs pronostics de LBDGC pour le diagnostic des chances de survie des patients atteints de lymphomes B diffus à grandes cellules. En outre, les inventeurs ont vérifié toute corrélation possible entre les expressions de ces huit gènes dans l’ensemble des jeux de données mentionnés. Ils ont confirmé que ces expressions n’étaient pas corrélées. En effet, aucune expression de ces huit gènes n’est corrélée dans leur tissu d’origine, à savoir : le cerveau pour les gènes DNAJC6, TRIM9 et PCDH9, le foie pour les gènes EHHADH et FOXA3, le péritoine - rétropéritoine pour les gènes EHHADH et MT1H, la peau pour le gène OTX1 et le sein et l’utérus pour le gène OXTR. Cette étape est nécessaire pour confirmer qu’aucun de ces gènes n’est redondant en termes d’impact prédictif. Enfin, les inventeurs ont démontré que l’indicateur fourni par le procédé de diagnostic selon l’invention et de l’outil pronostic associé est distinct et complémentaire des indicateurs existants (score IPI, Classification ABC/GCB) en utilisant des méthodes d’analyse de survie multivariées (modèle de Cox). Exemple 2 : Résultats Les huit gènes biomarqueurs retenus après la phase de validation ont été utilisés, seul ou en combinaisons variées, dans de multiples cohortes de patients atteints de LBDGC, afin de confirmer la robustesse du procédé de diagnostic selon l’invention et de l’outil pronostic associé. Ces derniers forment, seul ou en combinaisons, des biomarqueurs permettant de classer les patients atteints de LBDGC en fonction de leur expression ectopique (se traduisant par un statut d’activation ON) dans les tissus biologiques des patients atteints de LBDGC dont on souhaite estimer les chances de survie. En outre, les inventeurs ont démontré que plus le nombre de gènes biomarqueurs, parmi les huit gènes biomarqueurs retenus in fine , présentent le statut activé (statut ON), moins le pronostic vital du patient est favorable comme le démontrent les résultats suivants. Pour chaque jeu de données (cohorte) testé, les patients ont été séparés en deux groupes selon leur statut d’activation du ou des gènes choisis. La différence des probabilités de survie entre les deux groupes établis a été calculée par le modèle de Cox. Les inventeurs ont prouvé que le nombre de gènes activés est significativement corrélé à la probabilité de survie des patients dans tous les jeux de données considérés (p-valeur de Cox Dans l’ensemble des cohortes, les niveaux d’expression des différents gènes ont été mesurés par les technologies de RNA-seq (pour séquençage de l’ARN) ou de puces à ARN de type Affymetrix. Néanmoins, les inventeurs ont également vérifié et confirmé que leur procédé et l’outil associé pouvaient être avantageusement standardisés sur d’autres technologies, telles que les méthodes de RT-qPCR ou RT-MLPA ou RT-MLPSeq. Dans une pratique clinique, des tests RT-qPCR, RT-MLPA ou RT-MLPSeq possèdent plusieurs avantages par rapport au séquençage à haut-débit RNA-seq. Ils sont sensiblement moins couteux, standardisables et largement disponibles dans les laboratoires hospitaliers. 2. 1 : Utilisation d u gène DNAJC6 en tant que biomarqueur ( FIG. 1 ) Dans ce test, réalisé sur l’ensemble des cohortes décrites précédemment, les patients de chaque cohorte ont été différenciés en fonction : - de la détection de l’expression du gène DNAJC6 (groupes « A ctivated » sur la FIG. 1 ) et - de l’absence de détection de l’expression de ce gène (groupes « Not activated » sur la FIG. 1 ), dans leurs échantillons biologiques respectifs (ces gènes étant connus pour ne s’exprimer que de manière ectopique dans les lymphocytes B). On remarque pour chacune des cohortes que les patients du groupe « Not activated » pour lesquels aucune expression ectopique est détectée présentent de meilleures chances de survie que les patients du groupe « Activated » pour lesquels l’expression du gène est détectée. 2. 2 : Utilisation d’une combinaison des gènes EHHADH et DNAJC6 en tant que biomarqueurs ( FIG. 2 ) Dans ce test, réalisé sur l’ensemble des cohortes décrites précédemment, les patients de chaque cohorte ont été différenciés en fonction : - de la détection de l’expression des gènes DNAJC6 et/ou EHHADH (groupes 1-2 sur la FIG. 2 ) et - de l’absence de détection de l’expression de ces gènes (groupes 0 sur la FIG. 2 ), dans leurs échantillons biologiques respectifs (ces gènes étant connus pour ne s’exprimer que de manière ectopique dans les lymphocytes B). On remarque pour chacune des cohortes que les patients du groupe 0 pour lesquels aucune expression ectopique est détectée présentent de meilleures chances de survie que les patients du groupe 1-2 pour lesquels l’expression d’au moins un des deux gènes est détectée. 2. 3 : Utilisation d’une combinaison des gènes EHHADH , DNAJC6 et OXTR en tant que biomarqueurs ( FIG. 3 ) Dans ce test, réalisé sur l’ensemble des cohortes décrites précédemment, les patients de chaque cohorte ont été différenciés en fonction : - de la détection de l’expression d’au moins deux gènes suivants DNAJC6, EHHADH et OXTR (groupes 2-3 sur la FIG. 3 ) et - de l’absence de détection de l’expression de ce gène ou de la détection de l’expression d’un de ces trois gènes (groupes 0-1 sur la FIG. 3 ), dans leurs échantillons biologiques respectifs (ces gènes étant connus pour ne s’exprimer que de manière ectopique dans les lymphocytes B). On remarque pour chacune des cohortes que les patients du groupe 0-1 pour lesquels au maximum l’expression d’un des trois gènes est détectée présentent de meilleures chances de survie que les patients du groupe 2-3 pour lesquels l’expression d’au moins deux des trois gènes est détectée. 2. 4 : Utilisation d’une combinaison des gènes EHHADH , DNAJC6, OXTR et OTX1 en tant que biomarqueurs ( FIG. 4 ) Dans ce test, réalisé sur l’ensemble des cohortes décrites précédemment, les patients de chaque cohorte ont été différenciés en fonction : - de la détection de l’expression d’au moins deux gènes suivants EHHADH, DNAJC6, OXTR et OTX1 (groupes 2-4 sur la FIG. 4 ) et - de l’absence de détection de l’expression de ce gène ou de la détection de l’expression d’un de ces quatre gènes (groupes 0-1 sur la FIG. 4 , dans leurs échantillons biologiques respectifs (ces gènes étant connus pour ne s’exprimer que de manière ectopique dans les lymphocytes B). On remarque pour chacune des cohortes que les patients du groupe 0-1 pour lesquels au maximum l’expression d’un des quatre gènes est détectée présentent de meilleures chances de survie que les patients du groupe 2-4 pour lesquels l’expression d’au moins deux des quatre gènes est détectée. 2. 5 : Utilisation d’une combinaison des gènes EHHADH , DNAJC6, OXTR , OTX1 et TRIM9 en tant que biomarqueurs ( FIG. 5 ) Dans ce test, réalisé sur l’ensemble des cohortes décrites précédemment, les patients de chaque cohorte ont été différenciés en fonction : - de la détection de l’expression d’au moins trois gènes suivants EHHADH, DNAJC6, OXTR, OTX1 et TRIM9 (groupes 3-5 sur la FIG. 5 ) et - de l’absence de détection de l’expression de ce gène ou de la détection de l’expression d’un ou deux de ces cinq gènes (groupes 0-2 sur la FIG. 5 ), dans leurs échantillons biologiques respectifs (ces gènes étant connus pour ne s’exprimer que de manière ectopique dans les lymphocytes B). On remarque pour chacune des cohortes que les patients du groupe 0-2 pour lesquels au maximum l’expression de deux des cinq gènes est détectée présentent de meilleures chances de survie que les patients du groupe 3-5 pour lesquels l’expression d’au moins trois des cinq gènes est détectée. 2. 6 : Utilisation d’une combinaison des gènes EHHADH , DNAJC6, OXTR , OTX1, TRIM9 et MT1H en tant que biomarqueurs ( FIG. 6 ) Dans ce test, réalisé sur l’ensemble des cohortes décrites précédemment, les patients de chaque cohorte ont été différenciés en fonction : - de la détection de l’expression d’au moins trois gènes suivants EHHADH, DNAJC6, OXTR, OTX1, TRIM9 et MT1H (groupes 3-6 sur la FIG. 6 ) et - de l’absence de détection de l’expression de ces gènes ou de la détection de l’expression d’un ou deux de ces six gènes (groupes 0-2 sur la FIG. 6 ), dans leurs échantillons biologiques respectifs (ces gènes étant connus pour ne s’exprimer que de manière ectopique dans les lymphocytes B). On remarque pour chacune des cohortes que les patients du groupe 0-2 pour lesquels au maximum l’expression de deux des six gènes est détectée présentent de meilleures chances de survie que les patients du groupe 3-6 pour lesquels l’expression d’au moins trois des six gènes est détectée. 2. 7 : Utilisation d’une combinaison des gènes EHHADH , DNAJC6, OXTR , OTX1, TRIM 9, MT 1H et FOXA3 en tant que biomarqueurs ( FIG. 7 ) Dans ce test, réalisé sur l’ensemble des cohortes décrites précédemment, les patients de chaque cohorte ont été différenciés en fonction : - de la détection de l’expression d’au moins trois gènes suivants EHHADH, DNAJC6, OXTR, OTX1, TRIM9, MT1H et FOXA3 (groupes 3-7 sur la FIG. 7 ) et - de l’absence de détection de l’expression de ces gènes ou de la détection de l’expression d’un ou deux de ces sept gènes (groupes 0-2 sur la FIG. 7 ), dans leurs échantillons biologiques respectifs (ces gènes étant connus pour ne s’exprimer que de manière ectopique dans les lymphocytes B). On remarque pour chacune des cohortes que les patients du groupe 0-2 pour lesquels au maximum l’expression de deux des sept gènes est détectée présentent de meilleures chances de survie que les patients du groupe 3-7 pour lesquels l’expression d’au moins trois des sept gènes est détectée. 2.8 : Utilisation d’une combinaison des gènes DNAJC6, EHHADH, OXTR, OTX1, TRIM9, MT1H, PCDH9 et FOXA3 en tant que biomarqueur ( FIG. 8 ) Dans ce test, réalisé sur l’ensemble des cohortes décrites précédemment, les patients de chaque cohorte ont été différenciés en fonction : - de la détection de l’expression d’au moins trois des gènes suivants DNAJC6, EHHADH, OXTR, OTX1, TRIM9, MT1H, PCDH9 et FOXA3 (groupes 3-8 sur la FIG. 8 ) et - de l’absence de détection de l’expression de ces gènes ou de la détection de l’expression d’un à 2 de ces huit gènes (groupes 0-2 sur la FIG. 8 ), dans leurs échantillons biologiques respectifs (ces gènes étant connus pour ne s’exprimer que de manière ectopique dans les lymphocytes B). On remarque pour chacune des cohortes que les patients du groupe 0-2 pour lesquels au maximum l’expression de deux des huit gènes est détectée présentent de meilleures chances de survie que les patients du groupe 3-8 pour lesquels l’expression d’au moins trois des huit gènes est détectée. 2.9 : Conclusions Il ressort clairement de ces données expérimentales qu’un procédé, un kit et une utilisation selon l’invention permettent de fournir un indicateur quant aux chances de survie de patients atteints de LBDGC qui est 1/ supplémentaire et complémentaire à ceux déjà à disposition des équipes médicales, 2/ robuste et fiable en tant que tel et 3/ pouvant être obtenu rapidement et selon des technologies déjà déployées dans un grand nombre de centres médicaux, par exemple par un test RT-qPCR ou un test RT-MLPA ou MLPSeq. En outre, les données présentées démontrent également que la robustesse de cet indicateur est renforcée plus le nombre des huit gènes biomarqueurs (dont l’expression est détectée) utilisés est important. Enfin, cet indicateur fourni par le procédé de diagnostic selon l’invention et par l’outil pronostic associé étant complémentaire et distinct des indicateurs existants (score IPI, Classification ABC/GCB), sa combinaison avec ces derniers permet d’affiner encore davantage la détermination des chances de survie des patients atteints de Lymphome B diffus à grande échelle (LBDGC). Procédé de diagnostic in vitro ou ex vivo des chances de survie d’un patient atteint de Lymphome B diffus à grande échelle (LBDGC), comprenant une étape de détection de l’expression du gène FOXA3, dans un échantillon biologique dudit patient. Procédé selon la revendication précédente, dans lequel l’étape de détection comprend en outre la détection de l’expression d’au moins un gène choisi parmi : DNAJC6, EHHADH, OXTR, OTX1, TRIM9, MT1H et PCDH9. Procédé selon l’une quelconque des revendications précédentes, dans lequel l’étape de détection de l’expression du ou des gène(s) consiste en la mesure de l’expression desdits gènes et, pour chaque gène, la comparaison de ladite mesure par rapport à une valeur de référence d’expression dudit gène pour un individu sain. Procédé selon l’une quelconque des revendications précédentes, dans lequel la détection de l’expression des gènes est réalisée via au moins une technologie choisie parmi : RT-qPCR, hybridation in situ par fluorescence, RNA-SCOPE, séquençage à haut-débit RNA-seq, via RT-MLPA et RT-MLPSeq. Procédé selon l’une quelconque des revendications précédentes, dans lequel l’étape de détection comprend la détection de l’expression d’au moins deux desdits gènes, de préférence d’au moins trois desdits gènes, préférentiellement d’au moins quatre desdits gènes, préférentiellement d’au moins cinq desdits gènes, préférentiellement d’au moins six desdits gènes, préférentiellement d’au moins sept desdits gènes et encore plus préférentiellement des huit gènes. Procédé selon la revendication 5, dans lequel l’étape de détection comprend la détection de l’expression des huit gènes. Procédé selon l’une quelconque des revendications précédentes, dans lequel l’échantillon biologique du patient est un échantillon de ganglion dudit patient.