Brevet FR3164116A1 — publié le 20260109

La présente invention concerne une cellule immunitaire comprenant un complexe protéique, ledit complexe protéique comprenant une kinase de la famille SRC et au moins une sonde stimuloactivable pour utilisation comme médicament. L’invention concerne également les complexes protéiques. COMPLEXES PROTEIQUES COMPRENANT UNE KINASE DE LA FAMILLE SRC MUTANTE ET UNE SONDE STIMULOACTIVABLE DOMAINE DE L’INVENTION La présente invention concerne une thérapie innovante. Plus précisément, elle concerne le domaine de la thérapie cellulaire dynamique et celle mise en œuvre dans le cadre des cellules tumorales. ETAT DE LA TECHNIQUE Le cancer est une maladie caractérisée par une croissance anormale et incontrôlée de cellules dans le corps, pouvant former des masses tumorales. En France, le cancer demeure un défi majeur de santé publique. Selon les statistiques, environ 400 000 nouveaux cas de cancer sont diagnostiqués chaque année, et plus de 150 000 décès liés au cancer surviennent annuellement. Les types de cancer les plus fréquents incluent le cancer du sein, du poumon, du côlon et de la prostate. Les femmes et les hommes sont touchés de manière relativement égale, mais l'incidence augmente avec l'âge. Les traitements contre le cancer ont considérablement évolué au fil des ans, intégrant des approches multidisciplinaires. Les principales modalités de traitement comprennent la chirurgie, la radiothérapie, la chimiothérapie, l'immunothérapie et les thérapies ciblées. La chirurgie vise à retirer la tumeur, tandis que la radiothérapie utilise des radiations pour détruire les cellules cancéreuses. La chimiothérapie implique l'utilisation de médicaments cytotoxiques, tandis que l'immunothérapie mobilise le système immunitaire pour cibler les cellules cancéreuses. Mise à part la chirurgie, les autres traitements anti-cancéreux permettent de faire évoluer les cancers vers la notion de maladies chroniques. Cela induit que ces maladies résultent de comportements cellulaires dynamiques et adaptatifs au cours du temps. Enfin, les thérapies ciblées visent des altérations spécifiques au niveau moléculaire. Le choix du traitement dépend du type de cancer, de son stade et d'autres facteurs individuels. Les avancées constantes dans la recherche sur le cancer visent à améliorer l'efficacité des traitements et à développer des approches plus personnalisées pour lutter contre cette maladie complexe. Parmi ces nouvelles approches, les thérapies cellulaires représentent une catégorie innovante de traitements médicaux qui exploitent les propriétés des cellules pour lutter contre diverses maladies (ces thérapies s’appliquant aux cancers mais également à d’autres pathologies). Une partie de ces stratégies thérapeutiques cellulaires consiste à réactiver des cellules immunitaires spécialisées dans la réponse antitumorale. En effet, cette réponse antitumorale est détournée par la capacité du microenvironnement tumoral à réprimer le ciblage des cellules cancéreuses par les cellules immunitaires, créant ainsi une zone immunosupprimée. C’est le cas, par exemple, des macrophages qui peuvent à la fois se différencier en cellules antitumorales (on parle alors des macrophages de type M1-like), ou en cellules pro-tumorales (on parle alors des macrophages de type M2-like). En effet, les macrophages qui pénètrent et restent au cœur de la tumeur sont soumis à l’environnement tumoral qui va détourner les macrophages de type M1-like vers des macrophages de type M2-like (également désignés TAM pour « Tumor Associated Macrophages »). Dans cet état de différenciation pro-tumoral, ces macrophages TAM sécrètent de multiples cytokines et chimiokines pro-tumorales et pro-angiogéniques pour aider à l’arrivée des nutriments aux cellules cancéreuses, favorisant la croissance de la tumeur. Ils vont aussi remodeler la matrice qui entoure les cellules cancéreuses favorisant la régénération de la matrice pour permettre la croissance de la tumeur et son invasion à d‘autres tissus, promouvant ainsi la formation de métastases. Et finalement, ces macrophages pro-tumoraux vont contribuer à l’immunosuppression en inhibant les cellules T et Natural Killer (NK) et en promouvant l’activation des cellules T régulatrices (Treg), chargées notamment d’inhiber les fonctions immunitaires. Ainsi, l’environnement tumoral est capable de détourner à son compte la réponse physiologique des macrophages arrivant dans des tissus lésés afin de réguler les processus de réparation. De plus, la zone immunosuppressive générée par la tumeur affecte plusieurs autres acteurs du système immunitaire, en plus des macrophages. C’est le cas pour les cellules dendritiques, lesquelles, dans un contexte normal, présentent des antigènes pour activer le système immunitaire adaptatif, notamment les cellules T et B. Dans le contexte tumoral, les cellules cancéreuses empêchent la maturation des cellules dendritiques, bloquant par conséquence la réponse immunitaire. Concernant les cellules T et B, celles-ci sont inhibées par le microenvironnement tumoral et l’effet inhibiteur des autres cellules immunitaires. Elles perdent leur capacité à détecter les cellules cancéreuses. En outre, la promotion de l’activation des lymphocytes régulateurs (Treg et Breg) par la tumeur contribue également à l’inhibition du système immunitaire. Enfin, le reste des cellules immunitaires, notamment les cellules Natural Killer (NK), neutrophiles, éosinophiles et basophiles, subit également les effets inhibiteurs de cette zone immunosuppressive. Les champs de la thérapie cellulaire ont été profondément modifiés par l’introduction de cellules modifiées génétiquement, comme les cellules CAR-T dans le cas des cancers liquides (cancer où les cellules tumorales se trouvent principalement dans la circulation sanguine ou lymphatique plutôt que sous forme de masse tumorale solide dans un organe spécifique). Néanmoins, il existe un réel besoin de compléter l’éventail des solutions basées sur les thérapies cellulaires, notamment dans le cadre de la prévention et du traitement des cancers, afin de fournir aux équipes soignantes plus de solutions en ce sens. Les thérapies cellulaires dynamiques représentent un domaine encore très peu étudié actuellement dans le cadre de la cancérologie ou d’autres pathologies, telles que l’auto-immunité, maladies inflammatoires chroniques et la neurodégénérescence, alors qu’elles présentent des perspectives très prometteuses dans la prévention et le traitement de toutes ces pathologies. En effet, la réactivation de certaines fonctions indépendamment du programme de différenciation des cellules immunitaires et des capacités immunomodulatrices du microenvironnement tumoral permet d’imaginer des stratégies dites de « cheval de Troie » pour moduler et contrer les dynamiques de croissance et d’adaptation des cellules tumorales. Un réel frein à l’étude et développement des thérapies cellulaires dynamiques est la complexité de la dynamique des processus cellulaires de signalisation combinée à la pléiotropie des cellules dans lesquelles ces processus cellulaires sont mis en œuvre. Les inventeurs se sont intéressés aux rôles de l’ensemble des cellules immunitaires et notamment à ceux du macrophage, compte tenu de sa très haute pléiotropie fonctionnelle. En effet, les transitions physiopathologiques, telles que la progression tumorale ou les phénomènes de réparation tissulaire sont caractérisées par un très grand nombre de changements où les macrophages ont été souvent décrits comme ayant une fonction clé comparable à celle d’un chef d’orchestre. Or, contrôler finement la pléiotropie fonctionnelle des macrophages, ainsi que de l’ensemble des cellules immunitaires, indépendamment de son microenvironnement, est une réelle limitation à l’utilisation de ces cellules dans les thérapies cellulaires, notamment pour les thérapies cellulaires antitumorales. Dans ce contexte, les inventeurs ont ciblé la famille des kinases SRC (SFK pour Src Family Kinases), dont de nombreux membres sont exprimés dans les différentes cellules immunitaires et dans la même cellule immunitaire. Les macrophages peuvent en exprimer 6 membres (Src, Yes, Fyn, Fgr, Lyn et Hck) sur cette famille comprend huit membres (Src, Yes et Fyn qui sont ubiquitaires, ainsi que Fgr, Blk, Lyn, Lck, Hck) qui constituent des protéines régulatrices de signalisation impliquées dans une variété de processus cellulaires. Parmi ces membres, on trouve SRC, la première kinase SRC identifiée et qui donne son nom à la famille, qui joue un rôle clé dans la signalisation cellulaire, la croissance et la différenciation. Fyn, une kinase similaire à Src, est connue pour sa régulation de la croissance cellulaire, de la signalisation immunitaire et de la plasticité synaptique dans le système nerveux. Yes, une kinase similaire à Src, est impliquée dans la régulation de la croissance cellulaire. Src, Fyn et Yes sont des kinases ubiquitaires qui se trouvent dans tous les types cellulaires avec différents niveaux d’expression. Lyn, une kinase impliquée dans la signalisation immunitaire, régule la prolifération cellulaire et la différenciation. Hck, exprimée principalement dans les cellules du système immunitaire, participe à la régulation de la réponse immunitaire. Blk, spécifique aux lymphocytes B, régule la signalisation liée au récepteur des cellules B. Fgr, similaire à Fyn mais exprimée principalement dans les cellules du système immunitaire, est impliquée dans divers processus cellulaires, notamment la croissance et la différenciation. Enfin, Lck, spécifique aux lymphocytes T, joue un rôle crucial dans la signalisation liée aux récepteurs des lymphocytes T. Néanmoins, d’autres fonctions spécifiques de chaque SFK dans les cellules immunitaires ont été très peu étudiées. Les modalités d’activation de chaque membre ou encore les mécanismes les mettant en œuvre au sein de chacune des cellules immunitaires sont encore peu connus. Par exemple, on ne sait pas encore expliquer pourquoi les macrophages expriment autant de membres différents de la famille des kinases SCR (6 sur les 8 existants) par rapport à d’autres cellules immunitaires. En s’appuyant sur les travaux relatifs aux approches de chimio-génétiques et d’opto-génétiques, véritables révolutions dans le domaine de la biologie de la signalisation puisqu’elles permettent d’induire un contrôle spatial et temporel de chacun de ces éléments de signalisation via l’intégration d’éléments encodés génétiquement et activables spécifiquement (par exemple via une petite molécule ou de la lumière), les inventeurs ont réussi à créer un complexe protéique comprenant la kinase SRC et une sonde photosensible, lequel a été activé par la lumière dans ces cellules épithéliales dans le but de démontrer l’efficacité du contrôle de l’activation spatio-temporelle de ce complexe (Kerjouan et al., 2021, Control of SRC molecular dynamics encodes distinct cytoskeletal responses by specifying signaling pathway usage ). DESCRIPTION DE L’INVENTION De manière inattendue et surprenante, les inventeurs ont réussi à mettre au point des complexes protéiques contrôlables pour chacune des kinases de la famille des kinases SRC, ces complexes pouvant être mis en œuvre dans des cellules immunitaires dans le but d’activer ou inhiber spécifiquement la kinase du complexe, en fonction de la réponse cellulaire souhaitée au sein de la cellule immunitaire concernée. Pour ce faire, les inventeurs ont déconstruit chacune des kinases de la famille SRC via des approches de biologie synthétique et de mutagenèse dirigée. Les inventeurs ont ainsi été capables de déterminer, de façon étonnante, que chaque kinase de la famille SRC n’active pas les mêmes réponses cellulaires dans les cellules immunitaires, indiquant qu’elles ne sont pas complètement redondantes fonctionnellement. Forts de cette découverte, les inventeurs ont ainsi pu produire des cellules immunitaires dans lesquelles il est possible d’activer ou d’inhiber des processus cellulaires ciblés, à distance et au moment désiré. Autrement dit, les complexes protéiques mis au point par les inventeurs permettent un contrôle intracellulaire dynamique des multiples processus cellulaires impliquant une ou plusieurs des kinases de la famille SRC, rendant ainsi possible, in fine , la réactivation de fonctions cellulaires d’intérêt. Par exemple, les inventeurs ont été capables de réactiver des fonctions macrophagiques d’intérêt (antitumorales, anti-inflammatoire, anti-neurodégénérescente, pro-réparatrice, etc.), d’une façon hautement dynamique via leurs complexes protéiques. Par simple activation lumineuse (et sans ajout d’aucun facteur exogène activateur), les inventeurs ont ainsi réussi à mimer l’effet de macrophages pro-tumoraux de type M2-like (induit par l’IL4), et de macrophages antitumoraux, de type M1-like (induit par le lipopolysaccharide LPS), dans des modèles tumoraux (sphéroïdes) in vitro ; contribuant ainsi à rendre le microenvironnement, dans lequel les macrophages se trouvaient, moins propice à la croissance tumorale. Ainsi, les complexes protéiques et les cellules immunitaires comprenant ces complexes ouvrent des perspectives très prometteuses dans la prévention et le traitement de pathologies, telles que les cancers, via des thérapies cellulaires dynamiques basées sur les cellules immunitaires et les complexes protéiques selon l’invention. Un objectif de la présente invention est donc de fournir de nouvelles solutions pour les équipes soignantes dans le cadre des thérapies cellulaires dynamiques, notamment dans le cadre des thérapies cellulaires dynamiques antitumorales. Ainsi, la présente invention concerne une cellule immunitaire comprenant un complexe protéique, ledit complexe protéique comprenant une kinase de la famille SRC et au moins une sonde stimuloactivable pour utilisation comme médicament. La présente invention apporte une réelle contribution dans la compréhension des processus cellulaires des cellules immunitaires impliquant au moins l’une des kinases de la famille SRC. En outre, l’invention apporte une réelle contribution au domaine des thérapies cellulaires et aux solutions dont disposent les équipes soignantes en vue de proposer le traitement thérapeutique le plus adapté à chaque patient, notamment aux patients atteints de cancers, notamment pour les patients atteints de cancers solides pour lesquels les traitements impliquant les thérapies cellulaires dynamiques sont rares. On entend par « complexe protéique » une entité moléculaire composée de deux ou plusieurs protéines distinctes qui interagissent de manière spécifique et coordonnée pour accomplir une fonction biologique particulière. Ce complexe est caractérisé par des liaisons physiques, biochimiques, stables et réversibles entre les différentes protéines qui le composent, créant ainsi une structure moléculaire fonctionnelle. Les protéines au sein du complexe peuvent jouer des rôles variés, tels que la régulation de processus cellulaires, la transmission de signaux, ou la réalisation de réactions biochimiques spécifiques. On entend par « cellule immunitaire » toute unité fonctionnelle du système immunitaire, une composante vitale du corps humain chargée de défendre l'organisme contre les agents pathogènes et de maintenir l'intégrité de la santé cellulaire. Ces cellules immunitaires peuvent inclure divers types, tels que les lymphocytes, les monocytes, les macrophages, les neutrophiles, et d'autres, chacun doté de fonctions spécifiques dans la réponse immunitaire. Les cellules immunitaires peuvent reconnaître et éliminer des pathogènes tels que les bactéries, les virus, et même des cellules anormales ou cancéreuses. Leur capacité à travailler de manière coordonnée et à réguler la réponse immunitaire est essentielle pour prévenir les maladies et maintenir l'équilibre de l'homéostasie corporelle. On entend par « une kinase de la famille SRC » une protéine modulaire appartenant à la famille des kinases SRC (SFK) et comportant plusieurs domaines fonctionnels. Parmi ces domaines figurent un domaine d’ancrage à la membrane, un domaine SH3 (Src Homology 3, facilitant les interactions protéine-protéine en se liant à des motifs riches en proline, jouant un rôle dans la régulation de l'activité enzymatique et l'assemblage de complexes protéiques), un domaine SH2 (Src Homology 2, responsable de la reconnaissance spécifique des motifs de phosphotyrosines, permettant la régulation de l'activité des kinases SRC en réponse à des signaux cellulaires), une région riche en proline (PRR), un domaine kinase (catalysant la phosphorylation de résidus de tyrosine spécifiques sur des protéines substrats, régulant ainsi divers processus cellulaires) et un domaine de régulation et de liaison intramoléculaire à l’extrémité C-terminale. L’ensemble de ces domaines permettent de générer deux liaisons intramoléculaires dont la dynamique va conduire à la libération des deux lobes du domaine kinase et ainsi contrôler le taux de phosphorylation de substrats. Ces domaines fonctionnels permettent aux kinases de la famille SRC, notamment lorsqu’elles sont agrégées les unes aux autres de sorte à former des clusters, de participer à des interactions extra-moléculaires protéine-protéine cruciales pour la régulation de divers processus biologiques, ainsi que de catalyser des réactions de phosphorylation impliquées dans la signalisation cellulaire. Dans le cadre de l’invention, l’expression « sonde stimuloactivable » désigne une entité moléculaire conçue pour répondre de manière spécifique à des stimuli externes, déclenchant ainsi une réaction mesurable ou une fonction biologique prédéterminée. Par « stimuli » on désigne tous les signaux ou facteurs physiques, chimiques ou biologiques qui provoquent une réponse spécifique dans un système, qu'il s'agisse d'un organisme, d'une cellule ou d'un mécanisme particulier. Ces stimuli peuvent être variés et inclure des éléments tels que la lumière, la chaleur, des substances chimiques, des signaux électriques, des variations de pression, ou d'autres formes de stimulations externes. La nature de la réponse dépend du type de stimulus et de la sensibilité du système récepteur. Dans le cadre de l’invention, les stimuli sont des signaux qui déclenchent des réponses d’agrégations et conformationnelles au sein de la kinase du complexe protéique concerné. Lorsqu’une sonde est stimuloactivable sous l’effet de la lumière, on parle de sonde stimuloactivable photosensible. Une telle sonde présente l’avantage de permettre une dynamique d’activation très grande (pouvant être de l’ordre de la seconde et ce, pendant plusieurs heures in vivo ) et contrôlable spatialement. Elle nécessite néanmoins l’implantation d’un système d’illumination. Toutefois une simple LED peut permettre l’activation de telles sondes photosensibles rendant son utilisation peu onéreuse. Lorsqu’une sonde est stimuloactivable sous l’effet de la présence d’une ou plusieurs substances chimiques, on parle de sonde stimuloactivable chimiosensible. Ce type de sonde est avantageux car elle ne nécessite pas l’utilisation ou l’implantation d’un système d’activation mais présente une dynamique d’activation plus faible et un contrôle spatial moins précis qu’une sonde stimuloactivable photosensible. On entend par « vecteur d’expression » tout vecteur génétique connu pour une mise en œuvre en ingénierie génétique, notamment un plasmide, un cosmide, un virus, un lentivirus, un bactériophage, et contenant les éléments nécessaires pour la transcription et la traduction de l’une des séquences codant les complexes protéiques selon l’invention. Par l’expression « une séquence présentant au moins 65% d’identité avec une séquence de référence » on entend que la séquence présente 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95% 96%, 97%, 98% ou même 99% d’identité avec ladite séquence de référence. De préférence, la présente invention a pour objet une cellule immunitaire pour utilisation comme médicament présentant les caractéristiques techniques suivantes, prises seules ou en combinaison : - la sonde stimuloactivable est une sonde photosensible et/ou chimiosensible ; - ladite cellule immunitaire est choisie parmi : macrophage, lymphocyte T, cellule NK, lymphocyte B, plasmocyte, mastocyte, cellule dendritique, ostéoclaste, mégacaryocyte, basophile, éosinophile et neutrophile ; - la kinase de la famille SRC est choisie parmi : - Src, Fyn, Lyn, Hck et Fgr, lorsque ladite cellule immunitaire est un macrophage, - Lck, Fyn et Lyn, lorsque ladite cellule immunitaire est un lymphocyte T, - Fyn, Src et Lck, lorsque ladite cellule immunitaire est une cellule NK, - Blk et Lyn, lorsque ladite cellule immunitaire est un lymphocyte B ou un plasmocyte, - Src et Lyn, lorsque ladite cellule immunitaire est un mastocyte, - Src, Fyn, Lyn, Hck et Fgr, lorsque ladite cellule immunitaire est une cellule dendritique, - Src, Fyn, Lyn, Hck et Fgr, lorsque ladite cellule immunitaire est un ostéoclaste, - Src, Fyn, Lyn, Hck et Fgr, lorsque ladite cellule immunitaire est un mégacaryocyte, - Lyn, lorsque ladite cellule immunitaire est un basophile, - Lyn, Hck, Fgr et Lck, lorsque ladite cellule immunitaire est un éosinophile, ou - Fgr, Hck et Lyn, lorsque ladite cellule immunitaire est un neutrophile ; - ledit complexe protéique comprend ou consiste en une séquence d’acides aminés choisie parmi les séquences SEQ ID NO: 1 à 47 ou comprend ou consiste en une séquence présentant au moins 65% d’identité avec une séquence d’acides aminés choisie parmi les séquences 1 à 47 ; - ladite cellule immunitaire comprend plusieurs complexes protéiques, chaque complexe protéique comprenant une kinase de la famille SRC et au moins une sonde stimuloactivable ; - l’utilisation de ladite cellule immunitaire comme médicament dans la prévention ou le traitement des cellules tumorales. L’invention a également pour objet une combinaison d’au moins deux cellules immunitaires selon l’une quelconque des variantes précédemment décrites. La présente invention a également pour objet une méthode de prévention ou de traitement chez l’être humain comprenant l’implantation d’au moins une cellule immunitaire selon l’une quelconque des variantes précédemment décrites. De préférence, ladite méthode est une méthode de prévention ou de traitement des cellules tumorales chez l’être humain. Avantageusement, ladite cellule immunitaire implantée est un macrophage. En outre, certains des complexes protéiques fabriqués par les inventeurs sont nouveaux et inventifs en tant que tels. A ce titre, la présente invention a également pour objet un complexe protéique comprenant une kinase de la famille SRC et au moins une sonde stimuloactivable comprenant ou consistant en une séquence d’acides aminés choisie parmi les séquences 2 à 47 ou comprenant ou consistant en une séquence présentant au moins 65% d’identité avec une séquence d’acides aminés choisie parmi les séquences 2 à 47. La présente invention a également pour objet une molécule d’acides nucléiques comprenant ou consistant en une séquence d’acides nucléiques choisie parmi les séquences 49 à 95 ou comprenant ou consistant en une séquence présentant au moins 65% d’identité avec une d’acides nucléiques choisie parmi les séquences 49 à 95, ladite molécule d’acides nucléiques codant un complexe protéique selon l’invention. La présente invention a également pour objet un vecteur d’expression comprenant une molécule d’acides nucléiques selon l’invention. La présente invention a également pour objet une cellule hôte comprenant un complexe protéique selon l’invention, une molécule d’acides nucléiques selon l’invention ou un vecteur d’expression selon l’invention. Figure : FIG. 1 : représente A/ les deux voies d’évolution du microenvironnement tumoral après recrutement des macrophages, B/ les résultats de l’évolution de microenvironnements tumoraux au sein de modèle in vitro 3D et C/ les résultats de l’activation de trois complexes protéiques selon l’invention au sein de macrophages sur l’évolution d’un microenvironnement tumoral. La présente invention est illustrée de manière non limitative par les exemples suivants. EXEMPLES DE REALISATION Exemple 1 : Matériel et méthode Obtention des complexes protéiques et des cellules comprenant lesdits complexes Clonage des OptoSFKs Chaque plasmide d’expression a été construit par amplification de la séquence nucléique codante de chaque SFK (espèces : poulet, souris ou humaine) par l’ADN polymérase haute-fidélité PHUSION ® , les amorces utilisées pour la PCR sont listées dans le tableau « Table 1 » et correspondent aux séquences SEQ ID NO: 96 à 119. Lesdites séquences nucléiques codant ces complexes protéiques opto-SFK sont les séquences SEQ ID NO: 1 à 23. Les produits d’amplification (amplicons) ont été ensuite insérés en utilisant la méthode de Gibson assembly (NEB) dans un vecteur pSico-CRY2-mCherry linéarisé par double digestion enzymatique NheI/PacI. Production de lentivirus, infection cellulaire et tri des lignées Les lentivirus ont été produits par co-transfections des plasmides pC57GPBEB GagPol MLV, pSUSVSVG et chaque plasmide d’intérêt en utilisant la Lipofectamin2000® sur des cellules HEK293 FT (don généreux du Dr. Nègre, plateforme ANIRA) étalées dans des plaques 6 puits à 50% de confluence. Le milieu a été renouvelé au bout de 24 heures. Les particules virales présentes dans le surnageant de culture ont été collectées 72 heures plus tard et filtrées avec un filtre 0,45μm. Les cellules RAW 264.7, lignée cellulaire de macrophage murin, ont été étalées sur boite 6 puits à 60% de confluence le jour de l’infection et le surnageant filtré a été directement utilisé pour infecter ces cellules d’intérêt. Puis le milieu de culture a été changé 24 heures après l’infection. Après 10 jours de décontamination, les cellules ont été triée par FACS (Aria cell sorter 2000, BD) en se basant sur le niveau d’expression de l’optoSFK fluorescent mCherry en utilisant un laser 561nm. Conditions de cultures cellulaires et d’expérimentation Les cellules ont été cultivées à 37°C et 5% de CO 2 dans un milieu RPMI 1640 glutamax (GibcoTM, ThermoFisher), supplémenté avec 10 % de sérum fœtal bovin (GE Healthcare) et 1 % (v/v) de pénicilline-streptomycine (Dutscher, P06-07100) pour obtenir un milieu RPMI complet. La lignée cellulaire de carcinome du côlon de souris BALB/c, CT26 (provenant de l'ATCCTM), a été gracieusement donnée par le Dr. Carole Fournier (équipe HAINAUT, laboratoire IAB, Grenoble). Ces cellules cancéreuses ont également été cultivées dans un milieu RPMI complet. Les fibroblastes embryonnaires de souris (MEF) ont été offerts par le Prof. Reinhard Fässler (Martinsried, Allemagne) et ont été cultivés dans un milieu DMEM complet supplémenté de 10 % de sérum de veau fœtal et de 1 % de pénicilline-streptomycine avant d'être co-cultivés avec les cellules CT26 et RAW dans un milieu RPMI complet. Les modèles de tumeurs en 3D (sphéroïdes et organoïdes) ont été générées dans des plaques de culture à adhérence ultra-faible (ultra-low attachement, ULA) de 96 puits (174925, NunclonTM SpheraTM 96-Well, ThermoFisher Scientific). Trois lignées cellulaires ont été utilisées : 800 cellules par condition de CT26, 400 cellules par condition de MEF et 400 cellules par condition de RAW (ou optoSFK-RAW). Les cellules ont été placées dans la plaque de 96 puits avec du RMPI complet. Après une centrifugation à 1200 tr/min pendant 5 minutes, les cellules ont été incubées pendant 7 jours. Des images en contraste de phase ont été prises aux jours 3, 5 et 7. Le LPS (LPS-EB Ultrapure, InvivoGen, tlrl-3pelps) et l'IL4 (IL-4 murine recombinante, Peprotech, 214-14) ont été utilisés à 1,5 µg/mL et 15 ng/mL respectivement. Le milieu n'a pas été changé pendant toute l'expérience. Les cellules exprimant la construction OptoSFK-RAW ont été éclairés pendant 3 heures à 0,005 Hz de stimulation lumineuse et ont été maintenus pendant 1 heure dans l'obscurité pour le repos. Exemple 2 : Résultats Comme précédemment indiqué, les macrophages (MOs) s'infiltrent fortement dans les tumeurs solides (appelées macrophages associés aux tumeurs - TAM) et peuvent être reprogrammés par le microenvironnement tumoral (TME) en MOs de type M2 (M2-like), soutenant ainsi la croissance tumorale (Fig. 1A). D'autres études ont montré que les macrophages de type M1 (M1-like) pouvaient réduire la taille des tumeurs (Fig. 1A). Au regard de l’état de l’art, il est extrêmement difficile de contourner le TME, puisque celui-ci reprogramme très efficacement les macrophages de type M2. Sur la base des modèles in vitro 3D décrits, un modèle de sphéroïdes tumorales hétérotypiques a été développé pour tester la capacité des complexes protéiques selon l’invention à reprogrammer directement les macrophages en MO de type M1, dans un modèle de TME. Pour ce faire, un sphéroïde mixte de cellules tumorales (CT26), de fibroblastes (MEF) et de macrophages (RAW), mimant simplement mais efficacement de nombreuses caractéristiques d’une tumeur solide en 3D, a été construit (Fig. 1B). La première étape a été de tester le modèle, afin de confirmer sa capacité à reproduire certaines caractéristiques des activités pro- ou antitumorales des macrophages. Pour ce faire, ces sphéroïdes mixtes ont été cultivés en présence d'IL-4 (induisant la différenciation des macrophages en MOs de type M2) ou de LPS (induisant la différenciation des macrophages en MOs de type M1). Après 7 jours de croissance tumorale, le traitement à l'IL-4 a spécifiquement augmenté la croissance tumorale par rapport au contrôle, montrant les caractéristiques pro-tumorales de type M2 des macrophages RAW (Fig. 1B). A l’inverse, le traitement par LPS a permis de réduire la taille et l'homogénéité des sphéroïdes, démontrant ainsi la capacité des macrophages RAW traitées par LPS à induire des caractéristiques antitumorales de type M1 (Fig. 1B). Ces résultats hautement reproductibles (n=6) ont confirmé la possibilité de moduler la croissance tumorale par différentes activations de la lignée cellulaire des macrophages RAW. En utilisant les macrophages modifiés comprenant des complexes protéiques selon l’invention (en l’occurrence les trois complexes optogénétiques optoSFK suivants : OptoSrc, OptoHck et OptoLyn), les inventeurs ont déterminé que les macrophages RAW comprenant les complexes protéiques optoSFK photo-activés reproduisaient les activités pro- ou antitumorales in vitro . En utilisant le modèle décrit ci-avant, en présence de tels macrophages RAW génétiquement modifiés pour exprimer les complexes OptoSFKs photo-stimulés pendant 7 jours avec une fréquence de stimulation cyclique, les expériences menées ont démontré que : - l'activation des macrophages RAW OptoSrc induit une augmentation reproductible de la taille des sphéroïdes (Fig. 1C), imitant l'effet des macrophages RAW de type M2 dépendantes de l'IL-4 ; - l'activation des macrophages RAW OptoLyn réduit ou bloque la croissance des sphéroïdes hétérotypiques (Fig. 1C), imitant l'effet du LPS ; - l'activation des macrophages RAW OptoHck n’a pas d’effet significatif sur la croissance des sphéroïdes, insinuant que cette construction n’a aucune activité pro ou antitumorale (Fig. 1C). Ces expériences démontrent qu’une meilleure compréhension des processus cellulaires des cellules immunitaires impliquant au moins l’une des kinases de la famille SRC permet, in fine , d’établir et de proposer des stratégies de traitements préventifs et thérapeutiques hautement dynamiques basées sur des thérapies cellulaires dynamiques impliquant des cellules immunitaires et les complexes protéiques selon l’invention. En ce sens, les inventeurs ont mis en évidence les corrélations suivantes entre les différents membres de la famille des kinases SRC et les processus biologiques associés : - kinase Src : activation macrophage-dépendante d’une réponse anti-inflammatoire et pro-régénératrice des tissus, contrôle de la dégradation osseuse, - kinase Fyn : activation des cellules NK, - kinase Yes : régulation des propriétés de différenciation et d’auto-renouvèlement des cellules souches, - kinase Hck : régulation de l’activation des neutrophiles, - Kinase Fgr : régulation du métabolisme lipidique via les macrophages, - Kinase Blk : régulation de la prolifération, différentiation et sécrétion des anticorps par les cellules B, implication dans les processus de pathologies auto-immunes, - kinase Lyn : régulation des fonctions des cellules B, activation d’une action antitumorale des macrophages, régulation des mastocytes, régulation négative de l’auto-immunité et des processus inflammatoires, - kinase Lck : régulation et activation de lymphocytes T pour induire une réponse CD4 ou CD8 en aval du récepteur du TCR. Cellule immunitaire comprenant un complexe protéique, ledit complexe protéique comprenant une kinase de la famille SRC et au moins une sonde stimuloactivable pour utilisation comme médicament. Cellule immunitaire pour utilisation selon la revendication 1 , dans laquelle la sonde stimuloactivable est une sonde photosensible et/ou chimiosensible. Cellule immunitaire pour utilisation selon l’une des revendications 1 ou 2 , ladite cellule immunitaire étant choisie parmi : macrophage, lymphocyte T, cellule NK, lymphocyte B, plasmocyte, mastocyte, cellule dendritique, ostéoclaste, mégacaryocyte, basophile, éosinophile et neutrophile. Cellule immunitaire pour utilisation selon la revendication précédente, dans laquelle la kinase de la famille SRC est choisie parmi : - Src, Fyn, Lyn, Hck et Fgr, lorsque ladite cellule immunitaire est un macrophage, - Lck, Fyn et Lyn, lorsque ladite cellule immunitaire est un lymphocyte T, - Fyn, Src et Lck, lorsque ladite cellule immunitaire est une cellule NK, - Blk et Lyn, lorsque ladite cellule immunitaire est un lymphocyte B ou un plasmocyte, - Src et Lyn, lorsque ladite cellule immunitaire est un mastocyte, - Src, Fyn, Lyn, Hck et Fgr, lorsque ladite cellule immunitaire est une cellule dendritique, - Src, Fyn, Lyn, Hck et Fgr, lorsque ladite cellule immunitaire est un ostéoclaste, - Src, Fyn, Lyn, Hck et Fgr, lorsque ladite cellule immunitaire est un mégacaryocyte, - Lyn, lorsque ladite cellule immunitaire est un basophile, - Lyn, Hck, Fgr et Lck, lorsque ladite cellule immunitaire est un éosinophile, ou - Fgr, Hck et Lyn, lorsque ladite cellule immunitaire est un neutrophile. Cellule immunitaire pour utilisation selon l’une quelconque des revendications précédentes, dans laquelle ledit complexe protéique comprenant ou consistant en une séquence d’acides aminés choisie parmi les séquences SEQ ID NO: 1 à 47 ou comprenant ou consistant en une séquence présentant au moins 65% d’identité avec une séquence d’acides aminés choisie parmi les séquences 1 à 47. Cellule immunitaire pour utilisation selon l’une quelconque des revendications précédentes, comprenant plusieurs complexes protéiques, chaque complexe protéique comprenant une kinase de la famille SRC et au moins une sonde stimuloactivable. Cellule immunitaire pour utilisation selon l’une quelconque des revendications précédentes, dans la prévention ou le traitement des cellules tumorales. Combinaison d’au moins deux cellules immunitaires telles que définies dans l’une quelconque des revendications précédentes pour utilisation comme médicament. Complexe protéique comprenant une kinase de la famille SRC et au moins une sonde stimuloactivable comprenant ou consistant en une séquence d’acides aminés choisie parmi les séquences 2 à 47 ou comprenant ou consistant en une séquence présentant au moins 65% d’identité avec une séquence d’acides aminés choisie parmi les séquences 2 à 47. Molécule d’acides nucléiques comprenant ou consistant en une séquence d’acides nucléiques choisie parmi les séquences 49 à 95 ou comprenant ou consistant en une séquence présentant au moins 65% d’identité avec une d’acides nucléiques choisie parmi les séquences 49 à 95, ladite molécule d’acides nucléiques codant un complexe protéique selon la revendication 9. Vecteur d’expression comprenant une molécule d’acides nucléiques selon la revendication 10. Cellule hôte comprenant un complexe protéique selon la revendication 9, une molécule d’acides nucléiques selon la revendication 10 ou un vecteur d’expression selon la revendication 11.