Brevet FR3157433A1 — publié le 20250627

L’invention concerne un procédé pour l’isolement de cellules souches menstruelles (MenSC) comprenant les étapes de : a. la collecte de sang menstruel comprenant une suspension hétérogène comprenant un mélange de cellules comportant des cellules souches menstruelles dans un état non altéré ; b. le traitement de ladite suspension hétérogène par centrifugation en gradient de densité afin d’isoler une suspension homogène comprenant un mélange de cellules mononucléées comportant lesdites cellules souches menstruelles ; c. l’ajout de marqueurs fluorescents à ladite suspension homogène afin de marquer spécifiquement les cellules souches menstruelles, suivie par d. le passage de la suspension homogène ayant les cellules souches menstruelles marquées obtenues à l’étape c. à travers une cytométrie en flux afin d’isoler les cellules souches menstruelles de la suspension homogène, dans lequel les cellules souches menstruelles isolées sont dans l’état non altéré. Figure de l’abrégé : Figure 2 Procédé pour l’isolement de cellules souches menstruelles La présente invention concerne un procédé pour l’isolement de cellules souches menstruelles. Les cellules souches issues du sang menstruel, ou plus couramment « cellules souches menstruelles » (MenSC), sont une source nouvelle et prometteuse de cellules souches utilisées dans de nombreux domaines, dont la médecine régénérative. Les MenSC sont des cellules souches mésenchymateuses (MSC) qui possèdent une capacité de différenciation multipotente. Les MenSC ont été pour la première fois identifiées et caractérisées en 2007 (Meng et al., 2007) et ont depuis lors attirées une attention significative en raison de leurs propriétés uniques. Les MenSC se trouvent dans les pertes de sang menstruel et sont appelées cellules souches mésenchymateuses de l’endomètre (eMSC) lorsqu’elles résident dans la région périvasculaire à la fois de la couche basale et de la couche fonctionnelle de l’endomètre. Ces cellules peuvent jouer un rôle important dans la régénération et la réparation cycliques de l’endomètre. Comparativement aux cellules souches provenant de la moelle osseuse et des tissus adipeux, les MenSC possèdent plusieurs avantages. Un avantage majeur est que les MenSC sont probablement les cellules souches les plus faciles à collecter sur le corps humain. En outre, lorsqu’on les compare à d’autres types cellulaires (c’est-à-dire aux cellules non-souches), les avantages des MenSC résident dans le taux de prolifération élevé, la fréquence des unités formant colonie, la capacité de migration et les capacités de différenciation en lignées multiples. Outre ces avantages, les applications potentielles des MenSC en médecine régénérative sont vastes. Les MenSC ont été étudiées pour leur utilisation potentielle dans le traitement d’une variété de maladies dont les maladies du foie, le diabète, les accidents vasculaires cérébraux, la dystrophie musculaire de Duchenne, les maladies liées aux ovaires, l’infarctus du myocarde, le syndrome d’Asherman, la maladie d’Alzheimer, les lésions pulmonaires aiguës, les plaies cutanées, l’endométriose et les maladies neurodégénératives (Chen et al., 2019). Afin d’étudier les MenSC, ou plus généralement les MSC, la culture cellulaire est couramment utilisée. La culture cellulaire est un processus par lequel des cellules sont mises en croissance sous conditions contrôlées, généralement hors de leur environnement naturel. c’est-à-dire in vitro . Ainsi, pendant la culture cellulaire de MSC, quantité de cellule est augmentée par le développement des MSC in vitro . Ce développement in vitro des MSC est une pratique habituelle en biologie cellulaire, en médecine régénérative et dans d’autres secteurs de recherche. Cependant, la culture cellulaire est généralement un processus long et coûteux qui est accompagné de risques. Un risque majeur, par exemple, est la contamination de la culture cellulaire. Ceci a un effet négatif, souvent fatal, sur les résultats de l’étude ou les cellules elles-mêmes. En outre, le développement in vitro à long terme des MSC aboutit à des changements significatifs de leurs propriétés, dont des altérations de l’expression génique, de la stabilité génomique et/ou des propriétés immunomodulatrices. Également, des changements épigénétiques, et d’autres altérations morphologiques et/ou fonctionnelles dans les MSC ont été observés. Le fait que des MSC d’origine (p. ex. des MenSC) soient altérées pendant la culture cellulaire a des implications négatives pour le potentiel thérapeutique des cellules. Les changements pendant la culture cellulaire rendent impossible de fournir de résultats précis concernant les MenSC dans leur état non altéré d’origine. La présente invention améliore la situation. À cette fin, l’invention concerne un procédé pour l’isolement de cellules souches menstruelles (MenSC) comprenant les étapes de : a. la collecte de sang menstruel comprenant une suspension hétérogène comprenant un mélange de cellules comportant des cellules souches menstruelles dans un état non altéré ; b. le traitement de ladite suspension hétérogène par centrifugation en gradient de densité afin d’isoler une suspension homogène comprenant un mélange de cellules mononucléées comportant lesdites cellules souches menstruelles ; c. l’ajout de marqueurs fluorescents à ladite suspension homogène afin de marquer spécifiquement les cellules souches menstruelles, suivie par d. le passage de la suspension homogène ayant les cellules souches menstruelles marquées obtenues à l’étape c. à travers une cytométrie en flux afin d’isoler les cellules souches menstruelles de la suspension homogène, dans lequel les cellules souches menstruelles isolées sont dans l’état non altéré. Ainsi, l’invention est dépourvue de tout processus de culture cellulaire. Le procédé de l’invention (de la première étape à la dernière étape) ne comprend aucune étape ni processus de culture cellulaire. L’étape d. est effectuée directement à la suite de l’étape c. L’étape a. peut être effectuée au moyen d’une coupe menstruelle. La centrifugation en gradient de densité est de préférence un procédé Ficoll-Paque. Dans un mode de réalisation préféré, les marqueurs fluorescents utilisés à l’étape c. comprennent un ensemble de marqueurs positifs sélectionnés parmi le groupe constitué de CD90, CD73, CD105, CD44 et une combinaison de ceux-ci. Dans un autre mode de réalisation préféré, les marqueurs fluorescents comprennent un ensemble de marqueurs négatifs sélectionnés parmi le groupe constitué de HLA-DR, CD45, CD14, CD34, CD235a, CD19 et une combinaison de ceux-ci. Dans encore un autre mode de réalisation préféré, les marqueurs fluorescents comprennent à la fois les marqueurs positifs et négatifs ci-dessus. Dans un autre mode de réalisation, le procédé de l’invention est constitué des étapes a., b., c. et d. D’autres caractéristiques et avantages de l’invention ressortiront et/ou deviendront clairs à la lecture de la description suivante, qui comprend des exemples spécifiques donnés de manière illustrative et non limitative, ainsi que d’après les dessins sur lesquels : FIG. 1 représente des photographies d’isolement de cellules mononucléées de sang menstruel à l’aide d’une centrifugation en gradient de densité Ficoll-Paque ; FIG. 2 représente des tracés FACS de l’isolement de cellules souches menstruelles (MenSC) à partir de cellules mononucléées de sang menstruel non mises en culture ; et FIG. 3 représente un diagramme comparant le nombre de MenSC par millilitre de sang menstruel d’un échantillon avec et sans traitement hormonal. Les dessins et la description de la présente contiennent, dans l’ensemble, des éléments de nature définie. Par conséquent, la description et les dessins sont non seulement utilisés pour mieux comprendre la présente invention, mais également pour contribuer à la définition de celle-ci, le cas échéant. Les MenSC sont obtenues à partir de sang menstruel. La procédure courante pour la collecte de sang menstruel se fait à l’aide de ce que l’on appelle une coupe menstruelle. La coupe menstruelle est un dispositif conçu pour être inséré dans le vagin. La collecte est principalement planifiée pendant les écoulements les plus abondants du cycle menstruel. Une coupe restera généralement en place pendant environ 4 à 12 heures. Une fois que les effluents menstruels sont acquis, la coupe menstruelle est retirée et le sang est transféré vers un milieu stérile/tampon phosphate salin, PBS, avec des antibiotiques. L’isolement de cellules souches du sang peut être effectué par centrifugation en gradient de densité. Plus généralement, les techniques de centrifugation en gradient de densité, telles que la technique dénommée Ficoll-Paque, parviennent à isoler toutes les cellules mononucléées du sang menstruel collecté. Pendant la centrifugation, les érythrocytes et les granulocytes sédimentent vers la couche inférieure, laissant les cellules mononucléées facilement isolées. Dans l’état de l’art, les cellules mononucléées, et en particulier les MenSC, subissent exclusivement une culture cellulaire. Fréquemment, les cellules sont récupérées à partir de fluide menstruel sous la forme de cellules adhérant au plastique, similaires aux MSC de la moelle osseuse (bmMSC). Toutefois, les MenSC sont toujours préparées et placées en culture cellulaire, cf. Meng et al., 2007 ; Borlogan et al., 2010 ; Patel et al., 2008 ; Allickson et al., 2011 ; Cui et al., 2007 ; Khanjani et al., 2014 ; Chen et al., 2017 ; Chen et al., 2017 ; Zhao et al., 2018 ; Xiang et al., 2017 ; Khanmohammadi et al., 2014 ; Nikoo et al., 2014 ; Alcayaga-Miranda et al., 2015 ; Khanjani et al., 2015 ; Lai et al., 2015 ; Ren et al., 2016 ; Tan et al., 2016 ; Moreno et al., 2017 ; Wang et al., 2017 ; Cuenca et al., 2018 ; Liu et al., 2018 ; Liu et al., 2018 ; Xu et al., 2023 ; Du et al., 2016 ; de Pedro et al., 2023 ; Faramarzi et al., 2016 ; Darzi et al., 2012 ; Li et al., 2023 ; Li et al., 2019 ; Yang et al., 2023 ; Davoodi Asl et al., 2023 ; Manshori et al., 2023 ; Chen et al., 2023 ; Mirzadegan et al., 2023 ; Zhou et al., 2023 ; Roodbari et al., 2023 ; Lian et al., 2023 ; Manshori et al., 2023 ; Hojjat et al., 2023 ; de Pedro et al., 2023 ; Izanlou et al., 2023 ; Zafardoust et al., 2023 ; Yang et al., 2022 ; Hu et al., 2022 ; Miller et al., 2022 ; Sun et al., 2022 ; Fu et al., 2022 ; Mahdipour, 2022 ; Manshori et al., 2022 ; Mirzadegan et al., 2022 ; Sun et al., 2022 ; He et al., 2022 ; Li et al., 2022 ; Qiu and Tan, 2022 ; Sahraei et al., 2022 ; Hao et al., 2022 ; Skliuté et al., 2021 ; Dalirfardouei et al., 2021 ; Wang et al., 2021 ; Zhang et al. 2021 ; Yamchi et al., 2021 ; Arezoo et al., 2021 ; Sheikholeslami et al., 2021 ; Uzieliene et al., 2021 ; Aleahmad et al., 2021 ; Ghanavatinejad et al., 2021 ; de Pedro et al., 2021 ; Chang et al., 2020 ; Lopez-Caraballo et al., 2020 ; Chen et al., 2020 ; Ma et al., 2020 ; Gonçalves et al., 2020 ; Sun et al., 2019 ; Fathi-Kazerooni and Tavoosidana, 2019 ; Sun et al., 2019 ; Rosenberger et al., 2019 ; Yan et al., 2019 ; Varas-Godoy et al., 2019 ; Mahdipour et al., 2019 ; Dalirfardouei et al., 2019 ; Cen et al., 2019 ; Guo et al., 2019 ; Hu et al., 2019 ; Shokri et al., 2019 ; Liu et al., 2019 ; Li et al., 2019 ; Manshadi et al., 2019 ; Zhu et al., 2019 ; Wu et al., 2019 ; Fathi-Kazerooni et al., 2019 ; Feng et al., 2019 ; Wang et al., 2019. Le traitement des MenSC dans l’art est ainsi inévitablement lié à des procédures de culture cellulaire. Le Demandeur utilise une approche radicalement différente pour isoler les MenSC pour des études ultérieures. Plus particulièrement, le Demandeur passe outre toute culture cellulaire afin d’étudier les MenSC dans un état non altéré (parfois appelés MenSC à l’état natif). De fait, la culture cellulaire est une étape importante de la biologie moderne. Plus encore, la culture cellulaire a révolutionné notre compréhension des maladies et de leur traitement. Cependant, comme mentionné ci-dessus, le développement in vitro des cellules, et en particulier des cellules souches mésenchymateuses (MSC), peut aboutir à des changements significatifs dans leur expression génique, leur stabilité génomique et leurs propriétés immunomodulatrices. Ces changements ont de profondes implications pour le potentiel thérapeutique des MSC. Plus encore, toutes les études qui utilisent la culture cellulaire peuvent être biaisées par le fait que les cellules étudiées sont altérées. Dit autrement, les cellules ne sont pas dans un état d’origine après culture cellulaire. Ceci peut aboutir à une mauvaise interprétation et/ou à une mauvaise compréhension significatives des résultats d’étude ou de recherche. L’altération des cellules pendant la culture cellulaire peut provenir de (i) changements épigénétiques, (ii) changements génétiques, (iii) changements protéomiques et/ou (iv) changements morphologiques. Tous ces changements, pris seuls ou ensemble, ont pour résultat que les MSC avant culture cellulaire (dans leur état non altéré d’origine) sont très différentes des MSC après culture cellulaire (état altéré). (i) Changements épigénétiques Les modifications épigénétiques, telles que la méthylation de l’ADN (DNAm) et la modification des histones, jouent un rôle dans le développement, la différenciation et le vieillissement des cellules et des organismes. Dans le contexte des MSC, la culture cellulaire est associée à des changements par méthylation de l’ADN spécifiques, en particulier dans les gènes du développement et les gènes de boîte homéotique (Redaelli et al., 2012 ; Schellenberg et al., 2011 ; Koch et al., 2013 ; Bork et al., 2010). Ces changements par méthylation de l’ADN associée à la sénescence (SA-DNAm) sont enrichis en régions intergéniques et apparaissent comme étant associées à des marques d’histones répressives (Schellenberg et al., 2011 ; Koch et al., 2012). Ces découvertes suggèrent que la culture cellulaire des MSC est associée à un programme épigénétique étroitement régulé (Wagner, 2012). Les mécanismes qui sous-jacents à ces changements ne sont pas complètement compris. Certains documents (Franzen et al. 2021) suggèrent que les changements sont aléatoires et non dirigés, et qu’ils peuvent s’accumuler au cours du temps pendant la culture cellulaire en raison de l’absence de pression sélective. (ii) Changements génétiques Le document Jeske et al., 2021 divulgue que des cellules souches mésenchymateuses dérivées du tissu adipeux humain (hASC) subissent une transition d’un phénotype anti-inflammatoire à pro-inflammatoire pendant le développement in vitro (c’est-à-dire la culture cellulaire). De plus, certaines hASC présentent des niveaux de méthylation de l’ARN réduits pour les gènes responsables de la différenciation ostéogénique et adipogène, ainsi que les gènes impliqués dans des voies de signalisation cellulaire qui sont corrélées au phénotype pro-inflammatoire. D’autres études ont découvert des changements similaires dans l’expression génique pendant le développement in vitro de MSC provenant de différentes sources. Par exemple, le document Gu et al., 2016 divulgue que les niveaux de méthylation de l’ARN de P21, P53 et APE1/Ref-1 sont significativement augmentés dans les phases intermédiaires et tardives du développement in vitro de cellules souches mésenchymateuses du cordon ombilical humain (hucMSC). Le document Xiang et al., 2019 divulgue que les BMSC du passage 6 et du passage 10 (on notera que le mot « passage » fait référence à un transfert de cellules vers un nouveau receveur avec un milieu frais pour maintenir une densité optimale pour la croissance) expriment de façon cohérente un ensemble distinct de gènes, dont des gènes impliqués dans le cycle cellulaire, la réplication de l’ADN et la méiose des ovocytes. Le document Redaelli et al., 2012, a examiné la stabilité génomique de cellules souches mésenchymateuses de la moelle osseuse humaine (hBM-MSC) pendant le développement in vitro . Ils ont découvert que les hBM-MSC possèdent généralement un caryotype normal, mais qu’il existe une tendance variable vers des pertes chromosomiques aléatoires et, dans de rares cas, des aneuploïdies clonales. La longueur des télomères diminue avec le nombre croissant de passages. D’autres documents divulguent la preuve de l’instabilité génomique pendant le développement in vitro des MSC. Par exemple, Jiang et al., 2017 divulgue que les BMSC du passage 3 possèdent une régulation du cycle cellulaire, une réplication de l’ADN et des voies de réparation des mésappariements régulées à la baisse. De plus, plusieurs gènes associés à l’activité de la télomérase et à la stabilité chromosomique sont également notablement supprimés dans les BMSC du passage 3. En outre, la culture cellulaire de MSC a présenté une accumulation de foyers γH2AX, un marqueur bien connu d’instabilité génomique. En conséquence, la sélection du passage approprié est une procédure critique avant la transplantation de MSC allogéniques chez des patients receveurs, étant donné que des propagations in vitro peuvent amener des MSC à acquérir des changements génétiques qui peuvent aboutir à une transformation maligne (Pustovalova et al., 2016 ; Al-Azab et al., 2022). (iii) Changements protéomiques L’expression des protéines change dans les cellules souches mésenchymateuses dérivées du tissu adipeux humain (hASC) et les cellules souches mésenchymateuses de la moelle osseuse (BMSC) pendant le développement in vitro . Le document Jeske et al. 2021 divulgue que le développement in vitro des hASC aboutit à des altérations globales de l’expression des protéines, affectant des fonctions clés telles que la morphologie, l’assemblage et l’organisation cellulaires ; le métabolisme des glucides ; la biochimie des petites molécules ; et la modification post-traductionnelle. Le document Xiang et al. 2019 a divulgué que les BMSC du passage 6 et du passage 10 présentent des différences dans les niveaux de protéines de gènes conservés impliqués dans le cycle cellulaire, la réplication de l’ADN et la méiose des ovocytes. Une analyse en réseau pondérée de la co-expression génique a confirmé ces découvertes et a également révélé la manière dont le passage cellulaire affecte la réponse à l’irradiation dans les BMSC. (iv) Changements morphologiques Les cellules souches mésenchymateuses dérivées du tissu adipeux humain (hASC) subissent des transformations morphologiques et présentent des changements dans leurs propriétés fonctionnelles pendant la culture cellulaire (c’est-à-dire le développement in vitro ). Elles passent d’une forme en fuseau à une apparence aplatie et allongée. De plus, la capacité des unités formant colonie (CFU) diminue significativement dans les passages supérieurs (passage 12) comparativement aux passages plus précoces (passage 5). De surcroît, l’augmentation de l’activité SA-β-Gal indique une sénescence renforcée dans les hASC du passage 12. Notamment, le métabolisme énergétique et les voies NAD-Sirt associées à la sénescence cellulaire restent stables tout au long du développement in vitro des hASC (Jeske et al., 2021). Dans un autre document, les hASC conservent initialement de faibles niveaux d’aneuploïdie dans les passages précoces (passage 0 à passage 4). Cependant, le développement de culture prolongé (5 à 16 passages) résulte en une augmentation significative des pourcentages d’aneuploïdie, sans déclencher de malignité (Roemeling-van Rhijn et al., 2013). Dans le cas de cellules souches mésenchymateuses du cordon ombilical humain (hucMSC), certains documents divulguent une sénescence réplicative pendant une culture in vitro prolongée. Ces cellules subissent des changements morphologiques qui comportent une réduction du nombre et de la longueur des microvillosités et un gonflement des noyaux. Les taux de prolifération des hucMSC déclinent également au cours du temps. De plus, il y a une augmentation de la sénescence, un arrêt du cycle cellulaire G0/G1, et une capacité de différenciation réduite. Un document divulgue que les hucMSC subissent une sénescence réplicative pendant une culture in vitro prolongée (Gu et al., 2016). De plus, les cellules souches embryonnaires humaines présentent des altérations chromosomiques instables dans des MSC différenciées, aboutissant à une sénescence réplicative après culture prolongée (Karagiannidou et al., 2014). Un autre document divulgue des différences dans le pourcentage de cellules apoptotiques et la répartition du cycle cellulaire (Xiang et al., 2019). Des cellules stromales de la moelle osseuse (BMSC) ont été soumises à un passage et une irradiation in vitro en deux étapes, passage 6 et passage 10. En comparant les BMSC du passage 6 et du passage 10, des différences dans le pourcentage de cellules apoptotiques et la répartition du cycle cellulaire ont été observées. Les BMSC du passage 6 ont présenté des taux d’apoptose plus faibles, une proportion réduite de cellules dans la phase S, et une proportion plus élevée dans la phase G1 que les BMSC du passage 10. Également, les BMSC au passage 3 ont présenté un potentiel chondrogénique plus faible et une instabilité génomique plus élevée que les cellules mononucléées de moelle osseuse (BMMNC) fraîchement isolées. Cette tendance était cohérente à la fois dans le contexte de la réparation du cartilage et dans les configurations in vitro . Les BMSC du passage 3 ont également démontré une activité de la télomérase réduite et des altérations de la structure chromosomique, indicatives d’une sénescence cellulaire (Jiang et al., 2017). Après le premier passage, les BMSC affichent une réduction notable de leur taux de prolifération et perdent graduellement leur potentiel de multi-différenciation. Leur efficacité de formation osseuse in vivo diminue significativement par rapport à de la moelle osseuse fraîche (Banfi et al., 2000). Typiquement, les cellules souches mésenchymateuses (MSC) présentent une morphologie en forme de fuseau avec un petit corps cellulaire, quelques processus minces, et un grand noyau avec un nucléole différencié pendant une culture in vitro . Cependant, avec une culture prolongée, ces MSC subissent des changements morphologiques, devenant plus grandes et perdant leurs caractéristiques de type fuseau, apparaissant souvent aplaties. Notamment, une sénescence induite par le développement in vitro prolongé des MSC du tissu adipeux résulte en des altérations morphologiques, dont une taille et une complexité accrues, en leur donnant un aspect « de type œuf au plat » (Truong et al., 2019). La présence d’espèces réactives de l’oxygène (ROS) a un impact négatif sur la capacité des MSC à supprimer les cellules immunitaires, telles que les lymphocytes T. Le stress oxydatif joue un rôle central dans la sénescence réplicative des MSC, limitant leur nombre de passages et leur pouvoir cellulaire (Denu and Hematti, 2016 ; Al-Azab et al., 2022). En outre, un déclin à la fois de l’activité ALP et du dépôt de calcium est observé dans les MSC au passage 2 par rapport au passage 1. Ceci est indicatif d’une diminution de la prolifération et d’une diminution de la capacité des MSC avec le vieillissement (Chen et al., 2005). Certaines des références décrites ci-dessus ne concernent pas directement des études avec les MenSC. Cependant, elles concernent au moins des MSC d’autres types. Étant donné le fait que les MenSC sont des MSC particulières, il est hautement probable que lesdits changements (i) épigénétiques, (ii) génétiques, (iii) protéomiques et/ou (iv) morphologiques affectent directement les MenSC. Plus généralement, le développement in vitro (ou la culture cellulaire) des MSC est une pratique courante en biologie cellulaire et en médecine régénérative. Cependant, ce qui précède décrit que la culture cellulaire peut aboutir à des changements significatifs dans les cellules, dont des altérations de l’expression génique et de la stabilité génomique, des changements épigénétiques et d’autres altérations morphologiques et fonctionnelles. La présente invention prend en charge l’isolement de MenSC fraîches. MenSC fraîches signifie des cellules qui n’ont été altérées d’aucune manière par la culture cellulaire. Les MenSC isolées avec la présente invention sont dans leur état d’origine. Les MenSC obtenues avec la présente invention possèdent les propriétés physiologiques telles qu’on les trouve dans le corps humain. Elles n’ont pas été altérées par des changements (i) épigénétiques, (ii) génétiques, (iii) protéomiques et/ou (iv) morphologiques. L’invention fournit ainsi des cellules qui sont hautement pertinentes pour la recherche dans tout domaine, et en particulier dans les domaines de la thérapeutique et/ou de la médecine régénérative. Les cellules de l’invention n’ont été modifiées par aucun processus de culture cellulaire, par exemple en ce qui concerne les sites de méthylation. Les MenSC fraîchement isolées, c’est-à-dire les MenSC non altérées, sont au moins proches de leur état naturel. Elles sont isolées avant toute culture cellulaire, et par conséquent sont épargnées des effets potentiellement transformateurs du développement in vitro . Ceci signifie qu’elles conservent leurs profils d’expression génique et leur stabilité génomique d’origine, ce qui les rend plus efficaces pour des applications thérapeutiques et/ou de diagnostic. De surcroît, les cellules fraîchement isolées n’ont pas été exposées à l’environnement artificiel d’un milieu de culture, qui peut induire des réponses de stress et d’autres changements dans les cellules. Elles sont également exemptes du risque de contamination qui accompagne la culture cellulaire. Un autre avantage est que les cellules fraîchement isolées peuvent fournir une image plus précise de la population cellulaire dans le corps. En revanche, les cellules mises en culture peuvent surreprésenter certaines sous-populations en raison de taux de croissance différentiels. L’invention utilise le tri cellulaire activé par fluorescence (FACS). Le FACS est un type spécialisé de cytométrie en flux qui fournit un procédé pour le tri d’un mélange hétérogène de cellules biologiques dans deux contenants ou plus, une cellule à la fois, sur la base de la diffusion d’une lumière spécifique et de caractéristiques de fluorescence de chaque cellule. C’est une opération scientifique connue car elle fournit un enregistrement rapide, objectif et quantitatif de signaux de fluorescence provenant de cellules individuelles ainsi qu’une séparation physique de cellules d’intérêt particulier. L’utilisation du FACS dans la présente invention pour l’isolement des MenSC implique quatre étapes principales : (1) Préparation de l’échantillon, (2) Marquage des cellules, (3) Tri des cellules, et (4) Collecte des cellules. (1) Préparation de l’échantillon : Du sang menstruel est collecté, typiquement à l’aide d’une coupe menstruelle. L’échantillon collecté est ensuite traité pour isoler les cellules mononucléées par centrifugation en gradient de densité, telle que Ficoll-Paque. (2) Marquage des cellules avec des marqueurs fluorescents : À la suite de l’isolement des cellules, l’invention utilise des marqueurs fluorescents spécifiques pour l’identification et l’isolement des MenSC. Ces marqueurs ciblent les antigènes de surface spécifiques des MenSC, tels que CD90, CD73, CD105 et CD44, tout en excluant également les populations cellulaires indésirables dans l’échantillon par le ciblage de marqueurs tels que HLA-DR, CD45, CD14, CD34, CD235a et CD19. (3) Tri des cellules avec le FACS : La suspension de cellules marquées est chargée dans la machine de FACS. Lorsque les cellules traversent le faisceau laser de la machine, elles produiront un signal de fluorescence. La machine de FACS détecte cette fluorescence et sépare les cellules en fonction de leur signal. (4) Collecte des cellules : Les MenSC triées sont ensuite collectées pour une utilisation ultérieure. La présente invention est dépourvue de toute culture cellulaire. L’invention fournit une source de collecte simple et fiable de MenSC fraîchement isolées pour une utilisation ultérieure. L’invention permet à des cellules qui proviennent directement d’un patient d’être traitées pour une analyse, en évitant ainsi l’ajout de processus de culture cellulaire intermédiaires qui altèrent les cellules d’intérêt. Bien que le développement in vitro ait sa place en biologie cellulaire et en médecine régénérative, l’utilisation de cellules fraîchement isolées et non altérées offre un renfort précieux dans ces domaines techniques. L’invention fournit une image plus précise des conditions in vivo , et améliore ainsi le développement de stratégies thérapeutiques plus sûres et plus efficaces. L’état de l’art divulgue que les MenSC peuvent être identifiées et/ou isolées par des marqueurs cellulaires spécifiques. Cependant, les marqueurs spécifiques divulgués dans l’art sont utilisés uniquement et exclusivement après culture cellulaire. La présente invention utilise les connaissances issues des enseignements de l’art antérieur opposé concernant les marqueurs cellulaires. De fait, les MenSC possèdent les marqueurs classiques de l’International Society for Cellular Therapy (ISCT). Elles sont positives aux marqueurs de MSC dont CD29, CD44, CD73, CD90, CD105 et STRO-1. Elles n’expriment pas de marqueurs de lignée hématopoïétique tels que CD34, CD45, CD133, CD14, CD38 et l’isotype DR de l’antigène leucocytaire humain (HLA-DR). Dans un mode de réalisation préféré de l’invention, les marqueurs fluorescents sont sélectionnés parmi le groupe constitué de CD90, CD73, CD105, CD44, HLA-DR, CD45, CD14, CD34, CD235a, CD19 ou toute combinaison de ceux-ci. CD90 est un marqueur se trouvant sur la surface des lymphocytes T, des cellules hématopoïétiques et des MSC, dont les MenSC. Sa présence est la clé de la confirmation de l’identité de ces cellules. CD73 est une enzyme connue sous le nom d’ecto-5’-nucléotidase et joue un rôle dans la migration des MSC. C’est un marqueur important pour l’identification des MSC, dont les MenSC. CD105 est un marqueur associé au tissu et aux cellules souches mésenchymateuses (MSC). Sa présence sert à identifier les MenSC et d’autres MSC. CD44 est un récepteur de l’acide hyaluronique et est couramment trouvé sur les cellules souches tissulaires et les MSC, ce qui en fait un marqueur crucial pour l’identification des MenSC. HLA-DR sert de marqueur pour les cellules dendritiques et les macrophages, les deux étant des cellules présentant des antigènes. La présence de HLA-DR aide à identifier et exclure ces types cellulaires. CD45 est un marqueur pan-leucocytaire, ce qui signifie qu’il s’exprime sur la surface de la plupart des globules blancs. Dans le contexte de l’analyse par FACS, il est essentiel pour l’exclusion des populations de leucocytes non ciblées. CD14 est un marqueur spécifique des monocytes. Les monocytes sont un type de globule blanc, et leur présence peut être exclue à l’aide de ce marqueur. CD34 est un marqueur des cellules souches hématopoïétiques. Il est employé pour exclure les cellules souches hématopoïétiques de l’analyse, garantissant que seules les MenSC et d’autres types cellulaires pertinents soient pris en compte. CD235a est un marqueur spécifique aux érythrocytes, ou globules rouges. Son utilisation garantit l’exclusion des globules rouges de l’analyse. CD19 est un marqueur qui identifie les lymphocytes B, un type de lymphocyte. Ce marqueur est utilisé pour exclure les lymphocytes B de l’analyse. Dans un autre mode de réalisation de la présente invention, les marqueurs positifs qui peuvent être utilisés dans la présente invention sont par exemple : CD9 (Marqueur des MSC, associé à l’angiogenèse - Également marqueur des éosinophiles, des mégacaryocytes et des plaquettes) ; CD29 (Molécule d’adhésion sur cellules souches mésenchymateuses et hépatiques) ; CD73 (Ecto-5’-nucléotidase, impliquée dans la migration des MSC) ; CD41a (Marqueur des plaquettes et des mégacaryocytes) ; CD44 (Récepteur de l’acide hyaluronique se trouvant sur les cellules souches tissulaires et les MSC) ; CD90 (Marqueur des lymphocytes T, des cellules hématopoïétiques et des MSC) ; CD105 (Marqueur tissulaire et des MSC) ; Oct-4 (Marqueur des cellules souches embryonnaires) ; CXCR4 (Marqueur des cellules hématopoïétiques et endothéliales, des neurones et des cellules souches (embryonnaires et adultes)) ; CD166 (Marqueur des cellules stromales mésenchymateuses humaines) ; CD49f (Marqueur des cellules souches hématopoïétiques à long terme (LT-HSC)) ; MHC I (HLA-ABC) (présent dans toutes les cellules nucléées) ; CD13 (Marqueur des fibroblastes, des péricytes, des cellules épithéliales, des cellules initiatrices de tumeur et des cellules souches) ; CD54 (Marqueur des cellules présentant un antigène) ; CD55 (Marqueur des leucocytes, des érythrocytes, des plaquettes et des cellules NK) ; Vimentine (Marqueur des cellules endothéliales et mésenchymateuses) ; CD59 (Marqueur des cellules souches hématopoïétiques) ; CD10 (Marqueur des lymphocytes et des cellules stromales) ; CD140b (PDGFRβ) (Marqueur des MSC et des fibroblastes) ; SUSD2 (Marqueur des cellules souches pluripotentes humaines naïves). Dans un mode de réalisation de la présente invention, les marqueurs négatifs qui peuvent être utilisés dans la présente invention sont par exemple : CD14 (Marqueur des monocytes) ; CD34 (Marqueur des cellules souches hématopoïétiques) ; CD38 (Marqueur des cellules souches hématopoïétiques différenciées) ; CD45 (Marqueur pan-leucocytaire) ; CD133 (Marqueur des cellules hématopoïétiques/des angioblastes) ; MHC II (HLA-DR) (Marqueur des cellules dendritiques et des macrophages (cellules présentant un antigène)) ; LIN (Cellules souches embryonnaires humaines indifférenciées) ; CD31 (Marqueur des monocytes, des mégacaryocytes et des plaquettes, également marqueur endothélial) ; CD50 (Exprimé presque exclusivement sur les cellules hématopoïétiques) ; CD271 (Marqueur des cellules souches mésenchymateuses multipotentes) ; EpCAM (Marqueur épithélial) ; SSEA-3 (Marqueur des cellules souches) ; TRA-1-60 (Marqueur des cellules souches pluripotentes humaines) ; CD40 (Marqueur des lymphocytes B) ; CD83 (Marqueur des cellules dendritiques matures) ; CD86 (Marqueur des macrophages et des lymphocytes B) ; CD19 (Marqueur des lymphocytes B) ; CD79a (Marqueur des lymphocytes B) ; CD80 (Cellules dendritiques, lymphocytes B activés, lymphocytes T et macrophages) ; CD5 (Marqueur des lymphocytes T) ; CD8a (Marqueur des lymphocytes T cytotoxique et suppresseur) ; CD15 (Marqueur des cellules myéloïdes) ; CD20 (Marqueur des cellules immunitaires) ; CD144 (Marqueur des cellules endothéliales) ; CD11b (Marqueur des monocytes et des macrophages). L’état de l’art a caractérisé ces cellules avec les marqueurs susmentionnés uniquement après la mise en culture des MenSCs. Certains documents divulguent un enrichissement des MenSC pendant la culture cellulaire. Pour cela, des marqueurs spécifiques peuvent être utilisés pour trier les cellules. Ceci a été effectué avec le marqueur CD117 (Patel et al., 2008 ; Borlogan et al., 2010 ; Allickson et al., 2011). Toutefois, d’autres documents montrent que les MenSC sont négatives pour CD117 (Cui et al., 2007 ; Chen et al., 2017 ; Chen et al., 2017 ; Xiang et al., 2017 ; Wang et al., 2017 ; Zhao et al., 2018 ; Mahdipour et al., 2019 ; Dalirfardouei et al., 2019 ; Cen et al., 2019 ; Guo et al., 2019 ; Zhu et al., 2019 ; Wu et al., 2019 ; Chen et al., 2020 ; Skliuté et al., 2021 ; Dalirfardouei et al., 2021 ; Yang et al., 2022 ; Zhou et al., 2023). L’enrichissement des MenSC avec CD117 reste controversé. CD146 a également été utilisé pour sélectionner les MenSC pour un enrichissement (Yamchi et al., 2021), mais ici encore, un autre document montre que les MenSC sont faibles à négatives pour CD146 (Hu et al., 2019). Ce marqueur est également controversé. Outre l’utilisation de marqueurs controversés pour distinguer les MenSC, l’état de l’art utilise le tri cellulaire comme un outil pour enrichir et/ou sélectionner leur population. Quelle que soit la technique d’enrichissement ou de tri cellulaire qui est utilisée, après cette étape, les cellules continuent de subir la culture cellulaire. Dans d’autres modes de réalisation de la présente invention, des marqueurs supplémentaires peuvent être utilisés dans la présente invention. Cependant, certains marqueurs présentent des résultats controversés et sont classés comme marqueurs positifs dans certaines études, et comme marqueurs négatifs dans d’autres. Des exemples de marqueurs controversés sont : SSEA-4 (Marqueur des cellules souches embryonnaires) ; Nanog (Marqueur des cellules souches) ; CD117 (c-kit) (Marqueur des progéniteurs multipotents de cellules souches hématopoïétiques) ; CD49a (Marqueur des cellules NK) ; Sox2 (Marqueur des progéniteurs multipotents) ; CD106 (Marqueur des macrophages) ; STRO-1 (Marqueur des MSC) ; CD146 (Marqueur endothélial et des péricytes) ; (c-myc Marqueur multipotent). EXEMPLES Du sang menstruel est collecté à l’aide d’une coupe menstruelle (n’importe quelle coupe du commerce est appropriée) et versé dans un tube contenant un milieu de collecte (DMEM, Pen/Strep 100 U/ml, Amphotéricine B, L-Glutamine 2 mM, EDTA 2 mM). Facultativement, un test rapide du VIH peut être effectué (p. ex. Hexagon HIV 1&2 57002P – Servibio) afin de poursuivre avec un échantillon qui est VIH négatif. Les cellules mononucléées sont isolées à l’aide d’une centrifugation en gradient de densité avec Ficoll-Paque (Dutscher, 17-5446-02), à l’aide du protocole spécifique suivant. A. LAVAGE DE L’ÉCHANTILLON A1. Transférer l’échantillon dans un tube Falcon de 50 ml. A2. Ajouter du PBS jusqu’à un volume de 50 ml. A3. Centrifuger le tube à 400g pendant 10 minutes. A4. Retirer soigneusement le surnageant, en ne laissant que le culot cellulaire. A5. Répéter une étape de lavage. A6. Retirer le surnageant sans perturber le culot cellulaire. A7. Utiliser un filtre de 70 μm pour filtrer le sang et retirer tout débris endométrial. B. ISOLEMENT FICOLL B1. Mélanger le Ficoll (Ficoll-Paque PREMIUM 1,084) en retournant le contenant plusieurs fois. B2. Retirer le bouchon du contenant et utiliser une pipette pour mesurer le volume requis de Ficoll (3 ml). B3. Préparer deux tubes à centrifuger pour chaque échantillon de sang et ajouter ces 3 ml de Ficoll à chaque tube. B4. Déposer soigneusement 4 ml de sang dilué sur le Ficoll dans chaque tube, en évitant de mélanger. B5. Centrifuger les tubes à 400g pendant 40 minutes à 20 °C, sans le frein. B6. Collecter soigneusement la couche de cellules (anneau de couche de cellules mononucléées) au-dessus du Ficoll, en prenant soin de ne pas collecter la phase Ficoll. B7. Transférer la couche de cellules mononucléées dans un tube à centrifuger stérile de 15 ml. B8. Remplir le tube avec du PBS et mélanger délicatement pour homogénéiser le contenu. B9. Centrifuger le tube à 500g pendant 15 minutes à 20 °C. B10. Retirer le surnageant. B11. Remplir le tube avec du PBS et mélanger délicatement pour homogénéiser le contenu. B12. Centrifuger le tube à 500g pendant 15 minutes à 20 °C. B13. Retirer le surnageant. C. CONGÉLATION DES CELLULES C1. Remettre en suspension le culot cellulaire dans du StemMACS Cryo-Brew à 5 millions de cellules par ml. C2. Transférer rapidement la suspension de cellules dans des flacons cryogéniques. C3. Placer les flacons dans une cuve de congélation à l’isopropanol et stocker immédiatement à –80 °C. La FIG. 1 représente des photographies d’isolement de cellules mononucléées de sang menstruel à l’aide d’une centrifugation en gradient de densité Ficoll-Paque. Le panneau A de la FIG. 1 représente une photographie de la couche de cellules mononucléées obtenue à la suite d’une centrifugation en gradient de densité. Le panneau B de la FIG. 1 représente une photographie de cellules mononucléées de sang menstruel isolées, extraites de la couche de cellules mononucléées et par la suite lavées avec du PBS. Les cellules sont chargées dans le dispositif de FACS et triées sur la base de leur intensité de fluorescence. Dans le présent exemple, les cellules mononucléées de sang menstruel sont comptées à l’aide d’une trieuse de cellules MACSQuant® Tyto®. Le protocole suivant est appliqué. Les cellules mononucléées de sang menstruel sont centrifugées 5 min, à 400g, à 20 °C et le culot résultant est remis en suspension dans 100 µL de PBS/BSA 10 %/EDTA 2 mM. Les cellules mononucléées de sang menstruel sont colorées par Viobility (1 µL pour 1.10 7 cellules) et des anticorps ciblant les protéines de surface à une dilution de 1/50 qui est équivalente à 2 µL/Ac pour 10 6 cellules. Les cellules mononucléées sont colorées avec les anticorps suivants : CD105 VioBright V423 (Miltenyi 130-129-182), CD44-VioBright B515 (Miltenyi 130-126-975), CD73-PE (Miltenyi 130-129-182) CD90 APC (Miltenyi 130-114-861), CD19 PE Vio770 (Miltenyi 130-113-647), CD34 PE Vio770 (Miltenyi 130-124-456), CD45 PE Vio770 (Miltenyi 130-110-634), HLA-DR PE Vio770 (Miltenyi 130-111-791), CD14 PE Vio770 (Miltenyi 130-110-521), CD235a PE Vio770 (Miltenyi 130-120-474). Incuber 20 min à 4 °C dans le noir et laver ensuite avec 1 ml de PBS/BSA 10 %/EDTA 2 mM. Centrifuger 5 min, à 400g, à 20 °C. Amorcer la cartouche (cette étape est spécifique à l’utilisation de la machine trieuse de cellules MACSQuant® Tyto® utilisée dans le présent exemple). Ajouter 500 µl de PBS/BSA 10 %/EDTA 2 mM dans le compartiment d’entrée de la cartouche. Injecter de l’air dans une seringue, fermer l’évent pour amorcer la fraction négative. Attendre 5 secondes et observer la fraction négative se remplir. Placer la cartouche sur l’aimant et répéter le même processus pour la fraction positive. Retirer tout tampon en excès de l’entrée. Pour un rendement optimal, utiliser la distribution de Poisson et remettre en suspension le culot cellulaire dans un volume approprié de PBS/BSA 10 %/EDTA 2 mM. Filtrer l’échantillon. Utiliser un filtre de 30 µm au minimum, 20 µm étant recommandé. La FIG. 2 représente des tracés de FACS et une stratégie de déclenchement de l’isolement de cellules souches menstruelles (MenSC) à partir de cellules mononucléées de sang menstruel non mises en culture. Les MenSC sont définies par Lignée- CD90+ CD73+ CD105+ CD44+. La Lignée est définie par CD45+ CD34+ CD19+ CD14+ HLA-DR+. Le présent exemple isole ainsi les MenSC non altérées d’un échantillon de sang. La sensibilité de la présente invention ouvre de nouvelles voies pour des applications en médecine thérapeutique et régénérative. En outre, l’invention fournit un nouvel outil pour un diagnostic. À cet égard, une application est liée au comptage cellulaire des MenSC dans le sang menstruel. Il a été démontré que les contraceptifs hormonaux ont un impact sur le nombre des cellules souches par l’altération du microenvironnement périvasculaire où un type clé de cellules souches endométriales se trouve (Schwab and Gargett., 2007 ; Spitzer et al., 2012). D’autres études ont montré qu’un traitement hormonal avec un progestatif a abouti à une différenciation des cellules stromales de l’endomètre (Deligdisch-Schor and Mareş Miceli, 2020), qui est finalement associé à une réduction des cellules souches présentes dans le tissu endométrial. Les traitements hormonaux contraceptifs ont également été liés à ce qu’on appelle l’amincissement de l’endomètre (Meresman et al., 2002). Un endomètre plus fin possède un nombre réduit de cellules souches. Globalement, il apparaît que les traitements contraceptifs hormonaux ont un impact sur le nombre de cellules souches dans le sang menstruel, c’est-à-dire sur le taux de MenSC. La présente invention fournit un outil puissant pour identifier rapidement un nombre de cellules anormales. La FIG. 3 représente un diagramme comparant le nombre de la quantité de MenSC par millilitre de sang menstruel d’un échantillon avec et sans traitement hormonal. Dans la présente description, l’invention est décrite en référence à un tri cellulaire par cytométrie en flux. Cependant, il existe un certain nombre d’alternatives au tri cellulaire, chacune avec ses propres avantages et inconvénients. Certaines des alternatives les plus courantes sont brièvement décrites ci-dessous. Tri cellulaire à activation magnétique (MACS) : Le MACS utilise des billes magnétiques recouvertes d’anticorps pour cibler des types cellulaires spécifiques. Les billes sont incubées avec la suspension de cellules et un champ magnétique est utilisé pour isoler les cellules ciblées du reste de l’échantillon. Le MACS est une technique relativement simple et peu coûteuse, mais elle n’est pas aussi polyvalente que d’autres techniques de tri cellulaire. En outre, avec les techniques de MACS, il est généralement difficile de parvenir à un résultat ayant une pureté élevée. Technique d’adhérence sur plastique des cellules : l’adhérence sur plastique des cellules utilise des anticorps pour capturer des types cellulaires spécifiques sur une coupelle ou une autre surface. Les cellules sont incubées avec une surface recouverte d’anticorps qui capture les types cellulaires cibles. Les cellules non liées sont éliminées au moyen d’étapes de lavage. Les cellules liées sont ensuite collectées pour une analyse ou une expérimentation ultérieure. L’adhérence sur plastique des cellules est une technique douce qui peut être utilisée pour isoler les cellules sans les endommager. Cependant, elle n’est pas aussi efficace que d’autres techniques de tri cellulaire. Ici encore, il est généralement difficile de parvenir à un résultat ayant une pureté élevée. Centrifugation en gradient de densité avancée : la centrifugation en gradient de densité avancée est une technique qui utilise un gradient de différentes densités pour séparer les cellules sur la base de leur taille et de leur poids. La suspension de cellules est couchée sur le gradient, et les cellules sont ensuite centrifugées. Les cellules migreront vers différents niveaux du gradient en fonction de leur taille et de leur poids. La population cellulaire souhaitée peut ensuite être collectée auprès de la couche appropriée du gradient. La centrifugation en gradient de densité est une technique polyvalente et efficace. Cependant, cette technique est généralement difficile à optimiser pour des types cellulaires spécifiques. Dispositifs microfluidiques : les dispositifs microfluidiques sont des dispositifs à petite échelle qui sont utilisés pour manipuler et trier les cellules. Ces dispositifs utilisent typiquement une combinaison d’un écoulement de fluide et de champs électriques pour séparer les cellules sur la base de leur taille, de leur forme et d’autres propriétés. Les dispositifs microfluidiques deviennent de plus en plus populaires pour le tri cellulaire, étant donné qu’ils offrent un certain nombre d’avantages par rapport aux procédés classiques, tels qu’un débit élevé, de faibles volumes d’échantillon et des dommages cellulaires minimaux. Cependant les dispositifs restent très coûteux et ne sont pas appropriés pour la détection de matières sécrétées. Il subsiste également un risque de dommage cellulaire et un passage à grande échelle est problématique. En plus de ces alternatives classiques, il existe un certain nombre de technologies émergentes qui sont actuellement en cours de développement pour le tri cellulaire. Ces technologies comportent, par exemple, ce qui suit. Tri cellulaire acoustique : le tri cellulaire acoustique utilise des ondes sonores pour séparer les cellules sur la base de leur taille et de leur compressibilité. C’est une technique non invasive qui peut être utilisée pour trier les cellules sans les endommager. Tri cellulaire optique : le tri cellulaire optique utilise la lumière pour séparer les cellules sur la base de leur taille, de leur forme et de leur indice de réfraction. C’est une technique à haut débit qui peut être utilisée à de très hautes vitesses. Tri cellulaire par diélectrophorèse : le tri cellulaire par diélectrophorèse utilise des champs électriques pour séparer les cellules sur la base de leurs propriétés diélectriques. C’est une technique polyvalente qui peut être utilisée pour trier les cellules sur la base d’une variété de facteurs, tels que la taille, la forme et la charge de surface. Les techniques alternatives ci-dessus en termes de tri cellulaire, ainsi que les technologies émergentes, sont listées dans le tableau 1 ci-dessous : ALTERNATIVE AVANTAGE(S) INCONVÉNIENT(S) MACS Simple, peu coûteuse, douce Pas aussi polyvalente que le tri cellulaire, difficile de parvenir à une pureté élevée Adhérence sur plastique des cellules Douce, peut être utilisée pour isoler les cellules sans les endommager Pas aussi efficace que le tri cellulaire, difficile de parvenir à une pureté élevée Centrifugation en gradient de densité Polyvalente, efficace Peut être difficile à optimiser pour des types cellulaires spécifiques Dispositifs microfluidiques Débit élevé, faibles volumes d’échantillon, dommage cellulaire minimal Coûteux Tri cellulaire acoustique Non invasif Encore en développement Tri cellulaire optique Débit élevé Coûteux & encore en développement Tri cellulaire par diélectrophorèse Polyvalent Coûteux & encore en développement Tableau 1 : Techniques alternatives et technologies émergentes en tri cellulaire Par conséquent, étant données les techniques alternatives et technologies émergentes en tri cellulaire, la présente invention peut être définie d’une manière large comme un procédé pour l’isolement de cellules souches menstruelles (MenSC) comprenant les étapes de : 1. la collecte de sang menstruel comprenant une suspension hétérogène comprenant un mélange de cellules comportant des cellules souches menstruelles dans un état non altéré (ou natif) ; 2. le passage de ladite suspension hétérogène par une opération de tri cellulaire afin d’isoler des cellules souches menstruelles dans un état non altéré (ou natif), dans lequel ladite technique de tri cellulaire est dépourvue de tout processus de culture cellulaire. L’opération de tri cellulaire peut combiner différentes techniques/technologies de tri cellulaire. Dans le mode de réalisation préféré de l’invention décrit dans la présente, l’étape 2. comprend les sous-étapes de : i. le traitement de ladite suspension hétérogène par centrifugation en gradient de densité afin d’isoler une suspension homogène comprenant un mélange de cellules mononucléées ; ii. l’ajout de marqueurs fluorescents à ladite suspension homogène afin de marquer spécifiquement les cellules souches menstruelles, suivie par iii. le passage de la suspension homogène ayant les cellules souches menstruelles marquées obtenues à l’étape c. à travers une cytométrie en flux afin d’isoler les cellules souches menstruelles de la suspension homogène, dans lequel les cellules souches menstruelles isolées sont dans l’état non altéré (ou natif). BIBLIOGRAPHIE : Al-Azab, M., Safi, M., Idiiatullina, E., Al-Shaebi, F., Zaky, M.Y., 2022. 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Procédé pour l’isolement de cellules souches menstruelles (MenSC) comprenant les étapes de : a. la collecte de sang menstruel comprenant une suspension hétérogène comprenant un mélange de cellules comportant des cellules souches menstruelles dans un état non altéré ; b. le traitement de ladite suspension hétérogène par centrifugation en gradient de densité afin d’isoler une suspension homogène comprenant un mélange de cellules mononucléées comportant lesdites cellules souches menstruelles ; c. l’ajout de marqueurs fluorescents à ladite suspension homogène afin de marquer spécifiquement les cellules souches menstruelles, suivie par d. le passage de la suspension homogène ayant les cellules souches menstruelles marquées obtenues à l’étape c. à travers une cytométrie en flux afin d’isoler les cellules souches menstruelles de la suspension homogène, dans lequel les cellules souches menstruelles isolées sont dans l’état non altéré. Procédé selon la revendication 1, dans lequel l’étape d. est effectuée à la suite de l’étape c. et est dépourvue de tout processus de culture cellulaire. Procédé selon l’une quelconque des revendications précédentes, dans lequel ledit procédé est dépourvu de tout processus de culture cellulaire. Procédé selon l’une quelconque des revendications précédentes, dans lequel l’étape a. est effectuée au moyen d’une coupe menstruelle. Procédé selon l’une quelconque des revendications précédentes, dans lequel ladite centrifugation en gradient de densité est un procédé Ficoll-Paque. Procédé selon l’une quelconque des revendications précédentes, dans lequel lesdits marqueurs fluorescents comprennent un ensemble de marqueurs positifs sélectionnés parmi le groupe constitué de CD90, CD73, CD105, CD44 et une combinaison de ceux-ci. Procédé selon l’une quelconque des revendications précédentes, dans lequel lesdits marqueurs fluorescents comprennent un ensemble de marqueurs négatifs sélectionnés parmi le groupe constitué de HLA-DR, CD45, CD14, CD34, CD235a, CD19 et une combinaison de ceux-ci. Procédé selon l’une quelconque des revendications précédentes, dans lequel lesdits marqueurs fluorescents sont constitués de CD90, CD73, CD105, CD44, HLA-DR, CD45, CD14, CD34, CD235a et CD19. Procédé selon l’une quelconque des revendications précédentes, constitué des étapes a., b., c. et d.