Brevet FR3160468A1 — publié le 20250926

METHODE D’AUTHENTIFICATION ET DE DETECTION D’ADULTERATION D’HUILE D’ORIGINE MARINE La présente invention concerne une méthode d’authentification et de détection d’adultération d’une huile d’origine marine, caractérisée en ce que la méthode comprend : L’obtention de données moléculaires incluant : - La détermination de la composition en acides gras et/ou en composés dits insaponifiables de ladite huile, L’obtention de données isotopiques incluant : - La détermination du rapport des isotopes stables du carbone ( 13 C/ 12 C) d’acides gras et/ou des insaponifiables, - L’obtention d’un profil de ladite huile en fonction des données, - La comparaison du profil obtenu à des profils de référence d’huiles d’origine marine déterminée, - La conclusion que l’huile à identifier a un profil sensiblement égal à l’un des profils de référence et donc l’indication d'origine, si, à l‘issue de la comparaison, le profil correspond à un profil enregistré et, dans le cas contraire, la conclusion que ladite huile est un mélange ou d’une autre origine qu’une huile de poisson pure ou d’une huile de microorganisme pure, et une estimation des proportions de ce mélange. [Fig.1] METHODE D’AUTHENTIFICATION ET DE DETECTION D’ADULTERATION D’HUILES D’ORIGINE MARINE La présente invention appartient au domaine technique des huiles d’origine marine, en particulier des huiles de microalgues, destinées à la nutraceutique, la pharmacie, l’alimentation humaine ou animale et la cosmétique. Plus précisément, l’invention concerne une méthode permettant d’authentifier la nature d’une huile d’origine marine, en particulier des huiles de microalgues, et de détecter une éventuelle adultération de cette huile, c’est-à-dire de détecter un éventuel mélange de plusieurs huiles de différentes natures. L’invention concerne encore une méthode de création d’une bibliothèque de profils d’huiles marines de différentes natures pour la mise en œuvre de la méthode d’authentification, ainsi que la bibliothèque obtenue. ETAT DE LA TECHNIQUE Les acides gras polyinsaturés n-3 à longues chaînes (oméga 3) jouent des rôles importants pour la santé humaine et animale notamment dans la prévention de différents troubles et maladies. La principale source d’oméga 3 a longtemps été la consommation de poisson. Depuis, sont apparus sur le marché des compléments alimentaires riches en oméga 3, essentiellement en acide eicosapentaénoïque (EPA) et en acide docosahexaénoïque (DHA), représentant une source alternative respectueuse de l’environnement comparé à la pêche. Ces compléments ont été initialement formulés à partir d’huiles de poisson, et plus récemment d’huiles de microalgues. La culture de microalgues, très riches en oméga 3, devient la source majoritaire d’oméga 3 sur le marché des compléments alimentaires représentant plusieurs milliards de dollars par an. Les huiles oméga 3 provenant de microalgues sont recherchées par les consommateurs du fait de leur origine respectueuse de l’environnement, ou leur certification végane, halal ou kasher par exemple, et se vendent plus cher que celles de poisson. Un tel marché attire les fraudes qui consistent principalement à diluer des huiles de microalgues avec des huiles de poisson pour les revendre au prix d’une huile de microalgues pure. De telles pratiques nécessitent la mise au point d’une méthodologie pour tracer l’origine des huiles et notamment pouvoir détecter la présence d’huile de poisson dans les huiles de microalgues. A ce jour, les études sur les fraudes consistent majoritairement à identifier la présence d’huiles végétales (tournesol, raisin, palme, maïs etc.,) ou animales (porc, poulet etc.,) dans des huiles de poissons (morue, saumon, requin etc.,) ou à identifier leur provenance (géographique et aquaculture ou pêche). Ces études reposent généralement sur des analyses individuelles de la composition et/ou de la forme des acides gras présents dans les huiles ou les organismes concernés (triacylglycérols ou esters d’éthyle) par des analyses chromatographiques ou spectroscopiques combinées avec des analyses statistiques multivariées pour comparer des signatures de référence. Ces analyses restent limitées pour identifier de manière fiable des fraudes concernant des produits raffinés. BUT DE L’INVENTION Le but de la présente invention est de proposer une solution fiable permettant d’authentifier la nature d’une huile d’origine marine, en particulier une huile de microalgue hétérotrophe, et de détecter une éventuelle adultération de cette huile, c’est-à-dire de détecter un éventuel mélange de plusieurs huiles de différentes natures, en particulier un mélange d’huile de microalgues et d’huile de poisson. OBJETS DE L’INVENTION Selon un premier aspect, l’invention concerne une méthode d’authentification et de détection d’adultération d’une huile d’origine marine, en particulier une huile de microalgue hétérotrophe. Selon un second aspect, l’invention concerne une méthode de création d’une bibliothèque, ou base de données, de profils d’huiles d’origine marine de référence. Selon un troisième aspect, l’invention concerne une bibliothèque de profils d’huiles d’origine marine de référence. Ainsi, l’invention concerne une méthode d’authentification et de détection d’adultération d’une huile d’origine marine, caractérisée en ce que la méthode comprend : l’obtention de données moléculaires incluant : - la détermination de la composition en acides gras et/ou en composés dit insaponifiables de ladite huile, l’obtention de données isotopiques incluant : - la détermination du rapport des isotopes stables du carbone ( 13 C/ 12 C) d’acides gras et/ou des insaponifiables de ladite huile, - l’obtention d’un profil de ladite huile en fonction des données, La comparaison du profil obtenu à des profils de référence d’huiles d’origine marine déterminée, La conclusion que l’huile à identifier a un profil sensiblement égal à l’un des profils de référence et donc l’indication d'origine, si, à l‘issue de la comparaison, le profil correspond à un profil enregistré et, dans le cas contraire, la conclusion que ladite huile est un mélange ou d’une autre origine qu’une huile de poisson pure ou d’une huile de microorganisme pure, et une estimation des proportions de ce mélange. En particulier, les profils de référence d’huiles d’origine marine déterminée, c’est-à-dire dont la nature est connue, incluent les profils d’une huile de poisson pure, d’une huile de microalgue photosynthétique pure, d’une huile de microalgue hétérotrophe pure ayant été fermentée à partir d’un substrat carboné provenant d’une plante au cycle de Calvin en C3 ou en C4, d’une huile de plante terrestre ayant été génétiquement modifiée pour produire des acides gras oméga 3 à longue chaîne carbonée comme le DHA. Avantageusement, les profils de références sont disponibles sous la forme d’une bibliothèque, ou base de données, obtenue selon une méthode telle que décrite dans ce qui suit. La combinaison d’analyses isotopiques et moléculaires permet d’améliorer la détection des fraudes, c’est-à-dire de déterminer si une huile d’origine marine, en particulier une huile de microalgue, supposée pure, a été mélangée avec une huile d’une autre origine, par exemple une huile de poisson. L’invention permet donc de déterminer si une huile est une huile produite par des microalgues hétérotrophes ou photoautotrophes, des poissons, ou un mélange des deux sources, ou une huile raffinée, en combinant différentes techniques analytiques permettant de déterminer la composition moléculaire et isotopique des lipides de ces huiles. L’invention présentée ici est un outil de diagnostic moléculaire et isotopique permettant de certifier la pureté d’une huile d’origine marine, en particulier une huile de microalgue. Il est à noter qu’au sens de l’invention, on entend par «microalgue » un microorganisme unicellulaire d’origine marine et plus précisément une microalgue hétérotrophe telle qu’une microalgue du genre Thraustochytrium, Schizochytrium, Nannochloropsis, Isochrysis, Phaeodactylum, Nitzchia, Staurosira, Crypthecodinium ou Ulkenia, préférentiellement du genre Schizochytrium . Selon un mode de réalisation, l’obtention de données isotopiques comprend, de plus, la détermination du rapport des isotopes stables de l’hydrogène ( 2 H/ 1 H) total et/ou de l’hydrogène d’acides gras et/ou des insaponifiables. Avantageusement, la détermination de la composition moléculaire des acides gras inclut la quantification et le calcul de l’abondance relative de l’acide docosapentaénoïque oméga-6 (DPA n-6 ou acide d’Osbond), de l’acide docosapentaénoïque oméga-3 (DPA n-3), de l’acide docosahexaénoïque (DHA) et de l’acide eicosapentaénoïque (EPA) ainsi que les calculs des ratios entre DPA n-6/DPA n-3 et DHA/EPA. Avantageusement, la détermination de la composition moléculaire des composés insaponifiables inclut la quantification et le calcul de l’abondance relative des stérols, notamment du cholestérol, ainsi que du squalène ou du squalane. Avantageusement, la détermination du rapport des isotopes stables du carbone des acides gras inclut la détermination, par chromatographie en phase gazeuse couplée à un four à combustion et un spectromètre de masse à rapports isotopiques, du rapport des isotopes stables du carbone ( 13 C/ 12 C) du DHA, de l’EPA, du DPA n-3, et du DPA n-6. Avantageusement, la détermination du rapport des isotopes stables du carbone des insaponifiables inclut la détermination, par chromatographie en phase gazeuse couplée à un four à combustion et un spectromètre de masse à rapports isotopiques, du rapport des isotopes stables du carbone ( 13 C/ 12 C) du cholestérol, du 24-méthylènecholestérol, du stigmastérol, du squalène et du squalane. Selon un mode de réalisation, la détermination du rapport des isotopes stables de l’hydrogène ( 2 H/ 1 H) total est obtenue par un analyseur élémentaire couplé à un spectromètre de masse à rapports isotopiques. Selon un mode de réalisation, la détermination du rapport des isotopes stables de l’hydrogène des acides gras inclut la détermination, par chromatographie en phase gazeuse couplée à un four à pyrolyse et un spectromètre de masse à rapports isotopiques, du rapport des isotopes stables de l’hydrogène ( 2 H/ 1 H) du DHA, de l’EPA, du DPA n-3, et du DPA n-6. Selon un mode de réalisation, la détermination du rapport des isotopes stables de l’hydrogène des insaponifiables inclut la détermination, par chromatographie en phase gazeuse couplée à un four à pyrolyse et un spectromètre de masse à rapports isotopiques, du rapport des isotopes stables de l’hydrogène ( 2 H/ 1 H) du cholestérol et du squalène. Avantageusement, l’obtention de données isotopiques inclut : la détermination de la différence du rapport isotopique du carbone entre le DHA, l’EPA, le DPA n-3, ou le DPA n-6, et/ou - la détermination de la différence du rapport isotopique du carbone entre le cholestérol, le squalène, l’EPA ou le DHA. et/ou - la détermination de la différence du rapport isotopique de l’hydrogène entre le DHA et l’EPA, DPA3, ou le DPA6, et/ou - la détermination de la différence du rapport isotopique de l’hydrogène entre le cholestérol, le squalène, l’EPA ou le DHA. Selon une caractéristique de l’invention, l’obtention d’un profil de ladite huile inclut une analyse en composante principale des données moléculaires obtenues, permettant de déterminer une proportion de pureté ou de mélange de ladite huile Selon une autre caractéristique de l’invention, l’obtention d’un profil de ladite huile inclut l’attribution d’un score d’adultération de l’huile entre 0 et 14 à partir des données isotopiques obtenues. L’invention concerne encore une méthode de création d’une bibliothèque de profils d’huiles, la méthode comprenant la détermination de profils de référence, chaque profil correspondant à une huile d’origine identifiée ou à un mélange d’huiles d’origine identifiée, caractérisée en ce que la méthode comprend, pour chaque profil : L’obtention de données moléculaires incluant : - la détermination de la composition en acides gras et/ou en composés dits insaponifiables de ladite huile, L’obtention de données isotopiques incluant : - la détermination du rapport des isotopes stables du carbone ( 13 C/ 12 C) d’acides gras et/ou de composés dits insaponifiables, L’obtention de profil de référence, pour chaque huile, ou chaque mélange, en fonction des données. Ainsi, selon l’invention, une base de données contenant des données moléculaires et isotopiques d’huile connue est créée afin de fournir une source d’informations qui permettra d’identifier une huile d’origine inconnue ou douteuse par comparaison du profil d’une telle huile avec des profils connus servant de références. Avantageusement, l’obtention de données isotopiques comprend, de plus, la détermination du rapport des isotopes stables de l’hydrogène ( 2 H/ 1 H) total et/ou de l’hydrogène d’acides gras et/ou des insaponifiables. Avantageusement, la détermination de la composition moléculaire des acides gras inclut la quantification et le calcul de l’abondance relative du DPA n-6, du DPA n-3, du DHA et de l’EPA et les calculs des ratios entre DPA n-6/DPA n-3 et DHA/EPA. Avantageusement, la détermination de la composition moléculaire des insaponifiables inclut la quantification et le calcul de l’abondance relative des stérols, notamment du cholestérol, ainsi que du squalène ou du squalane. Selon un mode de réalisation, la détermination du rapport des isotopes stables du carbone des acides gras inclut la détermination, par chromatographie en phase gazeuse couplée à un four à un oxydation et un spectromètre de masse à rapports isotopiques, du rapport isotopique du carbone du DHA, de l’EPA, du DPA n-3, et du DPA n-6. Selon un mode de réalisation, la détermination du rapport des isotopes stables du carbone des insaponifiables inclut la détermination, par chromatographie en phase gazeuse couplée à un four à combustion et un spectromètre de masse à rapports isotopiques, du rapport isotopique du carbone du cholestérol, du 24-méthylènecholestérol, du stigmastérol du squalène et du squalane. Selon un mode de réalisation, la détermination du rapport des isotopes stables de l’hydrogène total est obtenue par un analyseur élémentaire couplé à un spectromètre de masse à rapports isotopiques. Selon un mode de réalisation, la détermination du rapport des isotopes stables de l’hydrogène des acides gras inclut la détermination, par chromatographie en phase gazeuse couplée à un four à pyrolyse et un spectromètre de masse à rapports isotopiques, du rapport des isotopes stables de l’hydrogène du DHA, de l’EPA, du DPA n-3, et du DPA n-6. Selon un mode de réalisation, la détermination du rapport des isotopes stables de l’hydrogène des insaponifiables inclut la détermination, par chromatographie en phase gazeuse couplée à un four à pyrolyse et un spectromètre de masse à rapports isotopiques, du rapport des isotopes stables de l’hydrogène du cholestérol et du squalène. Avantageusement, l’obtention de données isotopiques inclut : la détermination de la différence du rapport isotopique du carbone entre le DHA, l’EPA, le DPA n-3, ou le DPA n-6, et/ou la détermination de la différence du rapport isotopique du carbone entre le cholestérol, le squalène, l’EPA ou le DHA, et/ou la détermination de la différence du rapport isotopique de l’hydrogène entre le DHA et l’EPA, le DPA n-3, ou le DPA n-6, et/ou la détermination de la différence du rapport isotopique de l’hydrogène entre le cholestérol, le squalène, l’EPA ou le DHA. Avantageusement, l’obtention d’un profil de ladite huile inclut une analyse en composante principale des données moléculaires obtenues. L’invention concerne encore une bibliothèque, ou base de données, de profils d’huiles marines obtenues par une méthode telle que décrite précédemment. L’invention repose ainsi sur différentes techniques : - Le profilage moléculaire et isotopique d’huiles, préférentiellement d’origine marine, par l’analyse combinée : d’acides gras, d’insaponifiables, en particulier de stérols, de la composition globale en isotopes stables de l’hydrogène (δ 2 H-IRMS bulk), de la composition en isotopes stables du carbone des acides gras (δ 13 C-CSIA-AG), de la composition en isotopes stables du carbone des stérols (δ 13 C-CSIA-STEROL), de la composition en isotopes stables de l’hydrogène des acides gras (δ 2 H-CSIA-AG), - La création d’une base de données de ces profils moléculaires et isotopiques sur différentes huiles ou aliments d’aquaculture de références (poissons, microalgues, mélanges, plantes terrestres génétiquement modifiées), - La sélection d’indices moléculaires et isotopiques permettant de distinguer les différentes sources d’huiles par des approches de statistiques multivariées type ACP ou autre, - La distinction entre différents substrats carbonés utilisés pour cultiver certaines souches de microalgues par δ 13 C-CSIA-AG/STEROL, - L’identification d’huiles raffinées ou mélangées sur la base des différents critères choisis ci-dessus, - L’attribution d’un score de pureté d’une huile relative à son origine. DESCRIPTION DETAILLEE Les caractéristiques de l'invention mentionnées ci-dessus, ainsi que d'autres, apparaîtront plus clairement à la lecture des exemples qui suivent, en lien avec les figures : FIG. 1 illustre une échelle de score obtenue après des analyses isotopiques de différentes huiles, FIG. 2 illustre le score plot de l’ACP de profils d’acides gras d’huiles marines de différentes sources, FIG. 3 illustre l’abondance du cholestérol dans des huiles marines de différentes origines, FIG. 4 illustre les signatures isotopiques 13 C de l’acide docosahexaenoïque (DHA) et eicosapentaénoïque (EPA) dans des huiles marines de différentes origines, FIG. 5 illustre les signatures isotopiques 13 C du cholestérol, du squalène, du DHA et de l’EAP dans des huiles marines de différentes origines, FIG. 6 illustre les signatures isotopiques 2 H globale et 13 C du DHA dans des huiles marines de différentes origines, FIG. 7 illustre le rapport isotopique de l'hydrogène de l'EPA et du DHA dans des huiles marines de différentes origines. EXEMPLE 1 : Préparation d’une base de données d’huiles d’origine marine déterminée Une base de données a été réalisée sur des huiles brutes ou raffinées, des extraits de culture de microalgues, des aliments destinés à l’aquaculture et des mélanges d’huiles faits manuellement : • 30 huiles de poissons • 34 huiles de Thraustochytrides • 5 huiles de microalgues photoautotrophes • 4 aliments d’aquaculture à base de poisson • 16 mélanges d’huiles de microalgues et de poisson. 1.1 Extractions des acides gras et des composés insaponifiables Les acides gras et les composés insaponifiables sont extraits, pour chaque huile ou aliment, par des méthodes connues de l’homme du métier. Extraction des acides gras. : Dans cet exemple, les acides gras sont extraits selon la méthode suivante : - Réchauffer les huiles brutes à 50°C entre 10 et 15 min pour les homogénéiser, - Peser 40 µl d’huile brute réchauffée (entre 20 et 40 mg) dans un tube en verre borosilicaté et dissoudre dans un mélange chloroforme-méthanol dans les proportions 2:1 (en volume), diluer jusqu’à obtenir une concentration d’environ 100 mg/l, - Prélever 2 ml de cette solution, les transférer dans un tube en verre et y ajouter 2 µg d’acide tricosanoïque (C23:0) comme standard interne, - Pour chaque batch d’analyse, préparer un blanc analytique qui ne contient pas d’huile mais uniquement le mélange chloroforme-méthanol et le standard interne. Il sera traité comme tous les autres échantillons pour le reste de la procédure, - Evaporer sous vide les 2 ml d’huile diluée, - Ajouter 1 ml d’un mélange d’hydroxyde de potassium-méthanol à 0,5 mol/l, - Chasser l’air de chaque tube avec du diazote gazeux, - Chauffer les tubes à 80°C pendant 30 min pour saponifier les acides gras liés (ester et triacylglycérols), - Laisser refroidir, - Ajouter 1600 µL d’un mélange d’acide sulfurique-méthanol (3.4%, v/v), - Chasser l’air de chaque tube avec du diazote gazeux, - Chauffer les tubes à 100°C pendant 10 min pour casser les liaisons ester résiduelles, protoner les ions carboxylates et transméthyler les acides gras libérés en méthyle esters d’acides gras (FAME), - Laisser refroidir, - Ajouter 800 µl d’hexane et 1,5 ml d’eau distillée saturée en hexane, - Mélanger, - Séparer les phases organique (supérieure) et aqueuse (inférieure) par centrifugation à 1000 rpm pendant 1 min, - Prélever et jeter la phase aqueuse inférieure à l’aide d’une pipette Pasteur, - Rajouter 1,5 ml d’eau distillée à la phase organique, - Mélanger, - Centrifuger, - Prélever la phase aqueuse inférieure et la jeter, - Répéter le lavage de la phase organique une seconde fois avec 1,5 ml d’eau distillée, - Mélanger, - Centrifuger, - Placer le tube au congélateur au moins 3h pour que la phase aqueuse soit entièrement congelée, - Transférer uniquement la phase organique (FAME) non congelée dans un flacon pour chromatographie, - Chasser l’air du flacon avec du diazote gazeux et conserver le flacon à -20°C avant analyse. Extraction des composés insaponifiables : Dans cet exemple, les composés insaponifiables sont extraits selon la méthode suivante : - Réchauffer les huiles brutes à 50°C entre 10 et 15 min pour les homogénéiser, - Peser 40 µl d’huile brute réchauffée (entre 20 et 40 mg) dans un tube en verre borosilicaté et dissoudre dans un mélange chloroforme-méthanol dans les proportions 2:1 (en volume), diluer jusqu’à obtenir une concentration d’environ 100 mg/l, - Prélever 2 ml de cette solution, les transférer dans un tube en verre et y ajouter 2 µg de 5β-cholan-24-ol comme standard interne, - Pour chaque batch d’analyse, préparer un blanc analytique qui ne contient pas d’huile mais uniquement le mélange chloroforme-méthanol et le standard interne. Il sera traité comme tous les autres échantillons pour le reste de la procédure, - Evaporer sous vide les 2 ml d’huile diluée, - Ajouter 3 ml d’un mélange d’hydroxyde de potassium-méthanol à 1 mol/l, - Chasser l’air de chaque tube avec du diazote gazeux, - Chauffer les tubes à 100°C pendant 10 min pour saponifier les stérols liés (ester de stérols, stéryl glycosides etc.), - Laisser refroidir, - Ajouter 1600 µl d’hexane et 1,5 ml d’eau distillée, - Mélanger, - Séparer les phases organique (supérieure) et aqueuse (inférieure) par centrifugation à 1000 rpm pendant 1 min, - Prélever et jeter la phase aqueuse inférieure à l’aide d’une pipette Pasteur, - Rajouter 1,5 ml d’eau distillée à la phase organique, - Mélanger, - Centrifuger, - Prélever la phase aqueuse inférieure et la jeter, - Répéter le lavage de la phase organique une seconde fois avec 1,5 ml d’eau distillée, - Mélanger, - Centrifuger, - Placer le tube au congélateur au moins 3h pour que la phase aqueuse soit entièrement congelée, - Transférer uniquement la phase organique non congelée dans un flacon pour chromatographie, - Ajouter dans le tube 100 µl d’un mélange de bis(triméthylsilyl)trifluoroacétamide-chlorotriméthylsilane (BSTFA-TMCS, 99 :1, v/v), - Ajouter 100 µl de pyridine, - Chasser l’air de chaque tube avec du diazote gazeux, - Chauffer les tubes à 70°C pendant 30 min pour triméthylsilyler les stérols libres et autres lipides insaponifiables possédant un groupement hydroxyle, - Laisser refroidir, - Ajouter 800 µl d’hexane et 1,5 ml d’eau distillée saturée en hexane, - Mélanger, - Séparer les phases organique (supérieure) et aqueuse (inférieure) par centrifugation à 1000 rpm pendant 1 min, - Prélever et jeter la phase aqueuse inférieure à l’aide d’une pipette Pasteur, - Rajouter 1,5 ml d’eau distillée à la phase organique, - Mélanger, - Centrifuger, - Prélever la phase aqueuse inférieure et la jeter, - Répéter le lavage de la phase organique une seconde fois avec 1,5 ml d’eau distillée, - Mélanger, - Centrifuger, - Placer le tube au congélateur au moins 3h pour que la phase aqueuse soit entièrement congelée, - Transférer uniquement la phase organique non congelée dans un flacon pour chromatographie, - Ajouter 2 µg à 100 ppm de 5α-cholestane comme standard d’injection. 1.2 Obtention de données isotopiques 1.2.1 Analyse de la composition en isotopes stables du carbone des esters de méthyle d’acides gras par chromatographie en phase gazeuse couplée à four à combustion et un spectromètre de masse à rapport isotopique (CPG-c-SMRI) Chromatographe en phase gazeuse GC ISOLINK Trace ULTRA Thermo Fisher Scientific. Colonne polaire DB-WAX (30 m × 0.25 mm et une épaisseur de phase de 0.25 μm, Agilent). 1 µl de la fraction FAME est injecté en mode splitless à 250°C. Le flux d’hélium est fixé à 1,5 ml/min. L’analyse est faite en flux continu. La température initiale du four du chromatographe est de 60°C, puis augmente à 150°C à 50°C/min, puis à 170°C à 3,5°C/min, puis à 185°C à 1,5°C/min, puis à 225 °C à 2,4°C/min et finalement à 250°C à 5,5°C/min et maintenue à 250°C pendant 15 min. Le flux en sortie de colonne va vers un réacteur de combustion ISOLINK (Thermo Fisher) où les molécules sont converties en CO 2 (g) par combustion à 1000°C et oxydation sur des fils d’oxydes de nickel et de cuivre. Le CO 2 issu de la combustion de chaque acide gras est envoyé dans un spectromètre de masse à rapport isotopique Delta V Plus (Thermo Fisher Scientific) où sont détectés ces trois isotopologues principaux (m/z 44, 45 et 46). Les rapports isotopiques 13 C/ 12 C sont exprimés selon la notation delta (δ) par rapport aux standards internationaux (Vienna Pee Dee Belemnite pour δ 13 C), selon l’équation : R échantillon est le rapport isotopique 13 C/ 12 C mesuré dans l’échantillon, ici pour chaque acide gras méthylé, R standard est le rapport isotopique 13 C/ 12 C mesuré dans une référence, ici le CO 2 (g) co-injecté ayant une valeur δ 13 C connue. Chaque échantillon/fraction est analysé trois fois (triplicatas analytiques). La valeur moyenne des trois replicatas est utilisée comme valeur de 13 C d’un même échantillon. Les valeurs de δ 13 C sont calibrées par une calibration externe avec le mélange de standards certifiés en δ 13 C F8-3 de Schimmelmann Research (Indiana University Stable Isotope Reference Materials) composé de quatre esters de méthyl et quatre esters d’éthyl d’acide gras (C14:0, C16:0, C18:0, et C20:0). Le mélange est injecté avant et après les trois replicatas analytiques de chaque échantillon et la régression linéaire moyenne des deux calibrations est utilisée pour calibrer les valeurs de δ 13 C des acides gras de l’échantillon. Correction : Le groupement méthyl du méthanol greffé aux acides gras lors de la transméthylation est corrigé selon l’équation suivante : δ 13 C FA est rapport isotopique 13 C/ 12 C de l’acide gras libre, non méthylé, analysé à partir d’un standard en en CPG-c-SMRI. δ 13 C FAME est le rapport isotopique 13 C/ 12 C de l’ester de méthyl d’acide gras, la forme analysée en CPG-c-SMRI. δ 13 C MeOH est le rapport isotopique 13 C/ 12 C du méthanol utilisé lors de la transméthylation déterminé par différence entre les valeurs δ 13 C FA et δ 13 C FA de standard d’acide gras. n est le nombre d’atomes de carbone de l’acide gras libre considéré. 1.2.2 Analyse de la composition en isotopes stables de l’hydrogène des esters de méthyle d’acides gras par chromatographie en phase gazeuse couplée à spectromètre de masse à rapport isotopique (CPG-p-SMRI) - Chromatographe en phase gazeuse GC ISOLINK Trace ULTRA Thermo Fisher Scientific Colonne polaire DB-WAX (30 m × 0.25 mm et une épaisseur de phase de 0.25 μm, Agilent). 2 µl de la fraction FAME sont injectés en mode splitless à 250°C. Le flux d’hélium est fixé à 3 ml/min durant l’injection puis 1 ml/min pendant le run. L’analyse est faite en flux continu. La température initiale du four du chromatographe est de 60°C, puis augmente à 150°C à 50°C/min, puis à 170°C à 3,5°C/min, puis à 185°C à 1,5°C/min, puis à 225 °C à 2,4°C/min et finalement à 250°C à 5,5°C/min et maintenue à 250°C pendant 15 min. Le flux en sortie de colonne va vers un réacteur de réduction ISOLINK (Thermo Fisher) où les molécules sont réduites et converties en H 2 (g) par pyrolyse à 1450°C dans un tube de céramique. Le H 2 issu de la combustion de chaque acide gras est envoyé dans un spectromètre de masse à rapport isotopique Delta V Plus (Thermo Fisher Scientific) où sont détectés ces trois isotopologues principaux (m/z 2, 3 et 4). Les rapports isotopiques 2 H/ 1 H sont exprimés selon la notation delta (δ) par rapport aux standards internationaux (Vienna StandardMean Ocean Water pour δ 2 H), selon l’équation : R échantillon est le rapport isotopique 2 H/ 1 H mesuré dans l’échantillon, ici pour chaque acide gras méthylé. R standard est lerapport isotopique 2 H/ 1 H mesuré dans une référence internationale, le VSMOW (Vienna StandardMean Ocean Water). Chaque échantillon/fraction est analysé trois fois (triplicatas analytiques). La valeur moyenne des trois replicatas est utilisée comme valeur de 2 H d’un même échantillon. Les valeurs de δ 2 H sont calibrées par une calibration externe avec le mélange de standards certifiés en δ 2 H F8-3 de Schimmelmann Research (Indiana University Stable Isotope Reference Materials) composé de quatre esters de méthyl et quatre esters d’éthyl d’acide gras (C14:0, C16:0, C18:0, et C20:0). Le mélange est injecté avant et après les trois replicatas analytiques de chaque échantillon et la régression linéaire moyenne des deux calibrations est utilisée pour calibrer les valeurs de δ 2 H des acides gras de l’échantillon. Correction : Le groupement méthyl du méthanol greffé aux acides gras lors de la transméthylation est corrigé selon l’équation suivante : δ 2 H FA est le rapport isotopique 2 H/ 1 H de l’acide gras libre, non méthylé δ 2 H FAME est le rapport isotopique 2 H/ 1 H de l’ester de méthyl d’acide gras, la forme analysée en CPG-p-SMRI. δ 2 H MeOH est le rapport isotopique 2 H/ 1 H du méthanol utilisé lors de la transméthylation déterminé par différence entre les valeurs δ 2 H FA et δ 2 H FA de standard d’acide gras. n est le nombre d’atomes d’hydrogène de l’acide gras libre considéré. 1.2.3 Analyse de la composition en isotopes stables du carbone des esters silylés de stérols et autres insaponifiables par chromatographie en phase gazeuse couplée à un spectromètre de masse à rapport isotopique (CPG-c-SMRI) : - Chromatographe en phase gazeuse GC ISOLINK Trace ULTRA Thermo Fisher Scientific. - Colonne RTX-65 (30 m × 0.25 mm et une épaisseur de phase de 0.25 μm, Restek). 1 µl de la fraction insaponifiable est injecté en mode splitless à 250°C. Le flux d’hélium est fixé à 1,5 ml/min. L’analyse est faite en flux continu. La température initiale du four du chromatographe est de 60°C, puis augmente à 250°C à 60°C/min, puis à 280°C à 2°C/min, et maintenue à 280°C pendant 5 min. Le flux en sortie de colonne va vers un réacteur de combustion ISOLINK (Thermo Fisher) où les molécules sont converties en CO 2 (g) par combustion à 1000°C et oxydation sur des fils d’oxydes de nickel et de cuivre. Le CO 2 issu de la combustion de chaque insaponifiable est envoyé dans un spectromètre de masse à rapport isotopique Delta V Plus (Thermo Fisher Scientific) où sont détectés ces trois isotopologues principaux (m/z 44, 45 et 46). Les rapports isotopiques 13 C/ 12 C sont exprimés selon la notation delta (δ) par rapport aux standards internationaux (Vienna Pee Dee Belemnite pour δ 13 C), selon l’équation : R échantillon est lerapport isotopique 13 C/ 12 C mesuré dans l’échantillon, ici pour chaque stérol triméthylsilylé R standard est le rapport isotopique 13 C/ 12 C mesuré dans une référence, ici le CO 2 (g) co-injecté ayant une valeur δ 13 C certifiée. Chaque échantillon/fraction est analysé trois fois (triplicatas analytiques). La valeur moyenne des trois replicatas est utilisée comme valeur de 13 C d’un même échantillon. Les valeurs de δ 13 C sont calibrées par une calibration externe avec le mélange de standards certifiés en δ 13 C F8-3 de Schimmelmann Research (Indiana University Stable Isotope Reference Materials) composé de quatre esters de méthyl et quatre esters d’éthyl d’acide gras (C14:0, C16:0, C18:0, et C20:0). Le mélange est injecté avant et après les trois replicatas analytiques de chaque échantillon et la régression linéaire moyenne des deux calibrations est utilisée pour calibrer les valeurs de δ 13 C des acides gras de l’échantillon. Le réacteur de combustion est re-oxydé 1h après les trois analyses d’un même échantillon (triplicata). 1.2.4 Analyse de la composition en isotopes stables de l’hydrogène des esters silylés de stérols et autres insaponifiables par chromatographie en phase gazeuse couplée à un spectromètre de masse à rapport isotopique (CPG-p-SMRI) : - Chromatographe en phase gazeuse GC ISOLINK Trace ULTRA Thermo Fisher Scientific. - Colonne RTX-65 (30 m × 0.25 mm et une épaisseur de phase de 0.25 μm, Restek). 1 µl de la fraction insaponifiable est injecté en mode splitless à 250°C. Le flux d’hélium est fixé à 1,5 ml/min. L’analyse est faite en flux continu. La température initiale du four du chromatographe est de 60°C, puis augmente à 250°C à 60°C/min, puis à 280°C à 2°C/min, et maintenue à 280°C pendant 5 min. Le flux en sortie de colonne va vers un réacteur de réduction ISOLINK (Thermo Fisher) où les molécules sont réduites et converties en H 2 (g) par pyrolyse à 1400°C dans un tube de céramique. Le H 2 issu de la combustion de chaque insaponifiable est envoyé dans un spectromètre de masse à rapport isotopique Delta V Plus (Thermo Fisher Scientific) où sont détectés ces trois isotopologues principaux (m/z 2, 3 et 4). Les rapports isotopiques 2 H/ 1 H sont exprimés selon la notation delta (δ) par rapport aux standards internationaux (Vienna StandardMean Ocean Water pour δ2H), selon l’équation : R échantillon est le rapport isotopique 2 H/ 1 H mesuré dans l’échantillon, ici pour chaque insaponifiable méthylé. R standard est le rapport isotopique 2 H/ 1 H mesuré dans une référence internationale, le VSMOW (Vienna StandardMean Ocean Water). Chaque échantillon/fraction est analysé trois fois (triplicatas analytiques). La valeur moyenne des trois replicatas est utilisée comme valeur de 2H d’un même échantillon. Les valeurs de δ 2 H sont calibrées par une calibration externe avec le mélange de standards certifiés en δ 2 H F8-3 de Schimmelmann Research (Indiana University Stable Isotope Reference Materials) composé de quatre esters de méthyl et quatre esters d’éthyl d’acide gras (C14:0, C16:0, C18:0, et C20:0). Le mélange est injecté avant et après les trois replicatas analytiques de chaque échantillon et la régression linéaire moyenne des deux calibrations est utilisée pour calibrer les valeurs de δ 2 H des insaponifiables de l’échantillon. 1.3 Obtention de données moléculaires 1.3.1 Analyse des acides gras par chromatographie en phase gazeuse couplée à un détecteur à ionisation de flamme (GC-FID) - Chromatographe en phase gazeuse Varian CP8400 à double colonne et dihydrogène comme gaz vecteur. - Colonne polaire DB-WAX (30 m × 0.25 mm et une épaisseur de phase de 0.25 μm, Agilent). - Colonne apolaire DB-5 (30 m × 0.25 mm et une épaisseur de phase de 0.25 μm, Agilent). Injection dans chacun des deux injecteurs en mode splitless maintenus à 220°C. eLa température initiale du four du chromatographe est de 60°C, puis augmente à 150°C à 50°C/min, puis à 170°C à 3,5°C/min, puis à 185°C à 1,5°C/min, puis à 225 °C à 2,4°C/min et finalement à 250°C à 5,5°C/min et maintenue à 250°C pendant 15 min. Les deux sorties de colonnes sont équipées d’un détecteur à ionisation de flamme maintenu à 300°C. L’identification des méthyles esters d’acides gras se fait par comparaison des temps de rétention sur les deux colonnes avec des mélanges de standards de chez Merck (mélanges Supelco 37 Component FAME, PUFA n°1, PUFA n°3, Bacterial Acid Methyl Ester). Chaque méthyle ester d’acides gras est quantifié en comparant son aire d’intégration par rapport à celle du standard interne. Les proportions d’acide gras sont exprimées par rapport à la quantité totale d’acide gras par huile. 1.3.2 Analyse des insaponifiables par chromatographie en phase gazeuse couplée à un spectromètre de masse - Chromatographe en phase gazeuse Shimadzu GC-2010 Plus avec de l’hélium comme gaz vecteur. - Colonne polaire RTX-65 (30 m × 0.25 mm et une épaisseur de phase de 0.25 μm, Restek). 1 µl est injecté en mode splitless avec une température d’injecteur de 270°C. La température initiale du four du chromatographe est de 60°C, puis augmente à 250°C à 60°C/min, puis à 280°C à 2°C/min, et maintenue à 280°C pendant 5 min. La température de la ligne de transfert est de 280°C. La source du spectromètre de masse à ionisation électronique a une énergie de collision de 70 eV et une température de 250°C. L’analyse est conduite en mode balayage (SCAN) de 50 à 1000 a.m.u. L’identification des esters silylés de stérols se fait par comparaison avec les spectres de masse des standards injectés, ceux trouvés dans la littérature et par interprétation des fragmentations. 1.3.3 Analyse des insaponifiables par chromatographie en phase gazeuse couplée à un détecteur à ionisation de flamme (GC-FID) - Chromatographe en phase gazeuse Shimadzu GC-2010 Plus avec du dihydrogène comme gaz vecteur. - Colonne polaire RTX-65 (30 m × 0.25 mm et une épaisseur de phase de 0.25 μm, Restek). 1 µl est injecté en mode splitless avec une température d’injecteur de 270°C. La température initiale du four du chromatographe est de 60°C, puis augmente à 250°C à 60°C/min, puis à 280°C à 2°C/min, et maintenue à 280°C pendant 5 min. La sortie de colonne est équipée d’un détecteur à ionisation de flamme maintenu à 300°C. L’identification des esters silylés de stérols se fait par comparaison des temps de rétention avec un mélange de standards individuels et par identification par chromatographie en phase gazeuse couplée à un spectromètre de masse (voir ci-dessous). Chaque ester silylé de stérols est quantifié en comparant son aire d’intégration par rapport à celle du standard interne. Les proportions de stérols sont exprimées par rapport à la quantité totale de stérol de chaque huile. 1.4 Traitement des données isotopiques A partir des données acquises pour chaque huile de référence, certaines données sont sélectionnées car discriminantes. 1.4.1 En particulier : - Une huile de microorganisme ayant été fermentée à partir d’un substrat carboné (glucose, dextrose, etc.) provenant d’une plante au cycle de Calvin en C4 (maïs, canne, etc.) doit présenter des rapports isotopiques du carbone d’acides gras et d’insaponifiables supérieurs à -20‰, particulièrement : Le rapport isotopique du carbone du DHA doit être supérieur à -15.5‰ Le rapport isotopique du carbone de l’EPA doit être supérieur à -14.5‰ Le rapport isotopique du carbone du DPA3 doit être supérieur à -15‰ Le rapport isotopique du carbone du DPA6 doit être supérieur à -16.5‰ Le rapport isotopique du carbone du Cholestérol doit être supérieur à -10‰ Le rapport isotopique du carbone du Squalène doit être supérieur à -8‰ - Une huile de microorganisme ayant été fermentée à partir d’un substrat carboné (glucose, dextrose, etc.) provenant d’une plante au cycle de Calvin en C3 (blé, betterave, etc.) doit présenter des rapports isotopiques du carbone d’acides gras et d’insaponifiables inférieurs à -20‰, particulièrement : Le rapport isotopique du carbone du DHA doit être inférieur à -27.5‰ Le rapport isotopique du carbone de l’EPA doit être inférieur à -28‰ Le rapport isotopique du carbone du DPA3 doit être inférieur à -29.5‰ Le rapport isotopique du carbone du DPA6 doit être inférieur à -28‰ Le rapport isotopique du carbone du Cholestérol doit être inférieur à -25‰ Le rapport isotopique du carbone du Squalène doit être inférieure à -22‰ - Une huile de microorganisme pure doit présenter : - Une différence de rapport isotopique du carbone analysée par GC-c-IRMS entre le DHA, l’EPA, le DPA3 ou le DP6 inférieure à 3 ‰ - Une différence de rapport isotopique du carbone analysée par GC-c-IRMS entre le cholestérol et l’EPA ou le DHA inférieure à 5 ‰ - Une huile de microorganisme pure doit présenter un rapport isotopique total de l’hydrogène analysé par EA-IRMS supérieur à -210‰ - Une huile de poisson pure doit présenter un rapport isotopique total de l’hydrogène analysé par EA-IRMS inférieur à -220‰ - Une huile de microorganisme pure doit présenter un rapport isotopique de l’hydrogène de l’EPA analysé par GC-p-IRMS supérieur à -205‰ - Une huile de poisson pure doit présenter un rapport isotopique de l’hydrogène de l’EPA analysé par GC-p-IRMS inférieur à -210‰ - Une huile de microorganisme pure doit présenter une différence de rapport isotopique de l’hydrogène entre le DHA et l’EPA inférieur à -20‰ - Une huile dite de microorganisme présentant des valeurs de rapport isotopique du carbone d’acides gras hors des limites exprimées précédemment a de grandes probabilités d’être adultérée avec de l’huile de poisson ou d’avoir subi des processus de raffinage poussés. - Une huile de poisson doit présenter des rapports isotopiques du carbone d’acides gras et d’insaponifiables entre -20‰ et -35‰, particulièrement : Le rapport isotopique du carbone du DHA doit être compris entre -28.5‰ et -23.5‰ Le rapport isotopique du carbone de l’EPA doit être compris entre -29.5‰ et -24.5‰ Le rapport isotopique du carbone du DPA3 doit être compris entre -31.5‰ et -23.5‰ Le rapport isotopique du carbone du DPA6 doit être compris entre -27.5‰ et -26.5‰ 1.4.2 Détermination d’un score isotopique d’adultération Sur la base des valeurs seuils déterminées en 1.4.1, un score est calculé pour chaque huile ( FIG. 1 ). Sur une échelle de 0 (huile de microalgues pure) à 14 (adultération très probable) : • Une huile d’origine 100% microalgue doit avoir un score de moins de 2 • Une huile d’origine 100% poisson doit avoir un score compris entre 5 et 7 • Une huile dite d’origine 100% microalgues ayant un score entre 2 et 4 contient possiblement de l’huile de poisson • Une huile dite d’origine 100% microalgues ayant un score supérieur à 10 contient très probablement de l’huile de poisson. 1.5 Traitement des données moléculaires Analyses statistiques multivariées : A partir des données acquises pour chaque huile de référence, des analyses en composantes principales (ACP) sont calculées de façon séparée entre acides gras et stérols. Les ACP sont construites à partir des contributions relatives de chaque acide gras ou composés insaponifiables par rapport à leurs concentrations totales respectives. Les contributions de chaque variable (i.e. l’abondance de chaque acide gras ou stérol) sont étudiées en sortie des modèles ACP pour déterminer les variables les plus discriminantes (contribution ou valeur de cosinus² sur les deux premières composantes principales) et réduire ensuite le nombre de variables utilisées, car le nombre d’échantillons doit être supérieur au nombre de variables explicatives (abondance d’acides gras ou de stérols). Par simple analyse visuelle des profils d’acides gras et de stérols de la base de données d’huiles, d’autres indices moléculaires sont choisis en fonction de la capacité à discriminer différentes sources d’huiles. Plus précisément : • Une huile de microorganisme pure doit présenter une composition en insaponifiables avec moins de 60% de cholestérol. • Une huile de poisson pure doit présenter une composition en insaponifiables avec : - plus de 90% de cholestérol - moins de 10% de 24-méthylènecholestérol - moins de 5% d’autres stérols. • Une huile de microorganisme non raffiné doit présenter une composition en acide gras avec un rapport DPA n-6/DP n-3 supérieur à 15. • Une huile de microorganisme non raffiné doit présenter une composition en acide gras avec rapport DHA/EPA inférieur à 5. • Une huile de poisson non raffiné doit présenter une composition en acide gras avec rapport DHA/EPA inférieur à 5. Calculs de pureté : Un modèle ACP est calculé sur la base des critères et indices moléculaires choisis. Ce modèle permet d’identifier la source d’une huile (microalgue ou poisson), ou s’il s’agit d’un mélange d’huile de microalgue et de poisson, et si l’huile est brute ou raffinée. La pureté d’une huile dite de microalgue peut ainsi être caractérisée selon l’équation : où : - X est la coordonnée dite de ‘mélange’ d’une huile selon l’axe 1 (PC1) du modèle ACP - Les lettres alphabétiques sont des facteurs de proportionnalité - Cx:yn-z correspond à l’abondance relative de cet acide gras par rapport au total des acides gras de l’huile déterminé par GC-FID - ‘somme(oméga3)/somme(oméga6)’ correspond au rapport de la somme des abondances relatives des acides gras insaturés dits ‘n-3’ sur celle des ‘n-6’ - ‘DHA/DPA n-6’ correspond au rapport des abondances relatives de l’acide docosahexaénoïque (C22:6n-3) sur celui de l’acide docosapentaénoïque (C22:5n-6) - ‘DHA/DPA n-6’ correspond au rapport des abondances relatives de l’acide docosahexaénoïque (C22:6n-3) sur celui de l’acide eicosapentaénoïque (C22:5n-3) - ‘Cholestérol’ correspond à l’abondance relative du cholestérol par rapport à la somme des insaponifiables et phytostérols analysés par GC-FID. Des valeurs seuil de X permettent d’estimer un pourcentage de pureté d’une huile de microalgue et d’identifier des mélanges avec des huiles de poisson ou un processus de raffinage avancé. La Table 1 représente les valeurs seuils et calcul de pureté microorganisme/poisson Par ailleurs, l’origine (espèce, zone de pêche) d’une huile de poisson peut être déterminée selon l’équation suivante: Y est la coordonnée dite ‘poisson’ d’une huile selon l’axe 1 (PC1) de l’ACP La Table 2 représente les valeurs seuil et calcul d’origine poisson : EXEMPLE 2 : détermination de l’origine d’une huile L’origine d’une huile devant être déterminée, des échantillons tests sont préparés selon les méthodes de l’exemple 1.1. Des analyses de données isotopiques et moléculaires sont réalisées selon les méthodes de l’exemple 1.2 à 1.5. Sur un premier batch d’échantillons tests, l’analyse statistique multivariée en composantes principales (ACP) présente des signatures d’acides gras d’huiles de microalgues, d’huiles de poissons, d’huiles de microalgues raffinées et d’huiles de poissons raffinées ( FIG. 2 ). Cette approche permet d’identifier les huiles de microalgues coupées avec de l’huile de poisson, dont la signature se situe entre les deux signatures microalgues et poisson. L’abondance relative du cholestérol par rapport aux autres stérols trouvés dans les huiles peut également aider à identifier l’origine d’une huile ( FIG. 3 ). Le cholestérol représentant plus de 90% des stérols dans les huiles de poissons et les huiles de microalgues en contenant mois de 60%, une huile de microalgue présentant une abondance de cholestérol entre ces deux valeurs peut être considérée comme suspecte. C’est ce qui est mis en évidence dans les deux huiles raffinées, qui possèdent des taux de cholestérol anormaux pour leur source. Le mélange d’huiles mis en évidence par les acides gras est là aussi détecté du fait de son taux anormalement haut en cholestérol. L’analyse de la composition isotopique du carbone en composés spécifiques d’acides gras permet de distinguer différentes origines d’une même molécule au sein d’une huile ( FIG. 4 ). La signature isotopique du carbone du DHA et de l’acide eicosapentaénoïque (EPA) d’une même huile brute de microalgues ou de poisson est relativement proche lorsque l’huile est de bonne qualité. Au contraire, dans un mélange, cette signature diffère entre les deux acides gras par l’apport d’une source différente d’acide gras par rapport à l’huile de base. Cette approche permet également de distinguer des huiles provenant de microalgues ayant été cultivées sur des substrats carbonés d’origine différente (glucose de maïs C4 comparé à glucose de blé C3 par exemple), ce qui est important dans l’optique de maximiser la traçabilité des huiles de microalgues. Cependant, les huiles de microalgues cultivées sur substrat C3 ont une signature 13 C proche de celle des poissons, et une autre approche est nécessaire pour distinguer ces deux sources. Ces hétérogénéités de signature 13 C sont également visibles entre le cholestérol, le squalène, le DHA et l’EPA ( FIG. 5 ). Contrairement à la signature isotopique du carbone sur composé spécifique seul, sa combinaison avec la composition globale d’une huile en isotopes stables de l’hydrogène permet de clairement distinguer l’empreinte des huiles de poisson de celle de l’huile de microalgues cultivée sur substrat carboné en C3 ( FIG. 6 ). La signature isotopique de l’hydrogène du DHA et de l’EPA d’une même huile brute de microalgues ou de poisson est relativement proche lorsque l’huile est de bonne qualité ( FIG. 7 ). Au contraire, dans un mélange, cette signature diffère entre les deux acides gras de par l’apport d’une source différente d’acide gras par rapport à l’huile de base. Cette hétérogénéité de signature isotopique caractéristique des mélanges poisson/microalgues corrobore celle observée pour les isotopes stables du carbone ( FIG. 3 ). Méthode d’authentification et de détection d’adultération d’une huile d’origine marine, caractérisée en ce que la méthode comprend : l’extraction des acides gras et/ou composés dits insaponifiables de ladite huile, l’obtention de données moléculaires de ladite huile incluant : la détermination de la composition en acides gras et/ou en composés dits insaponifiables de ladite huile, l’obtention de données isotopiques de ladite huile incluant : la détermination du rapport des isotopes stables du carbone ( 13 C/ 12 C) d’acides gras et/ou des insaponifiables, puis, l’obtention d’un profil de ladite huile en fonction desdites données, puis, la comparaison du profil obtenu à des profils d’huiles de référence incluant les profils de référence d’une huile de poisson pure, d’une huile de microalgues photosynthétique pure, d’une huile de microalgues hétérotrophe pure ayant été fermentée à partir d’un substrat carboné provenant d’une plante au cycle de Calvin en C3 ou en C4, d’une huile de plante terrestre ayant été génétiquement modifiée pour produire des acides gras oméga 3 à longue chaîne carbonée comme le DHA, puis, la conclusion que l’huile à identifier a un profil sensiblement égal à l’un des profils de référence et donc l’indication d'origine, si, à l’issue de la comparaison, le profil correspond à un profil enregistré et, dans le cas contraire, la conclusion que ladite huile est un mélange ou d’une autre origine qu’une huile de poisson pure ou d’une huile de microorganisme pure, et une estimation des proportions de ce mélange. Méthode selon la revendication 1, caractérisée en ce que l’obtention de données isotopiques comprend, de plus, la détermination du rapport des isotopes stables de l’hydrogène ( 2 H/ 1 H) total et/ou de l’hydrogène d’acides gras et/ou des insaponifiables. Méthode selon la revendication 1 ou 2, caractérisée en ce que la détermination de la composition moléculaire des acides gras inclut la quantification et le calcul de l’abondance relative du DPA n-6, du DPA n-3, du DHA et de l’EPA et les calculs des ratios entre DPA n-6/DPA n-3 et DHA/EPA. Méthode selon l’une des revendications précédentes, caractérisée en ce que la détermination de la composition moléculaire des insaponifiables inclut la quantification et le calcul de l’abondance relative des stérols, notamment du cholestérol, ainsi que du squalène ou du squalane. Méthode selon l’une des revendications précédentes, caractérisée en ce que la détermination du rapport des isotopes stables du carbone des acides gras inclut la détermination, par chromatographie en phase gazeuse couplée à un four à combustion et un spectromètre de masse à rapports isotopiques, du rapport des isotopes stables du carbone du DHA, de l’EPA, du DPA n-3, et du DPA n-6. Méthode selon l’une des revendications précédentes, caractérisée en ce que la détermination du rapport des isotopes stables du carbone des insaponifiables inclut la détermination, par chromatographie en phase gazeuse couplée à un four à combustion et un spectromètre de masse à rapports isotopiques, du rapport des isotopes du carbone ( 13 C/ 12 C) du cholestérol, du 24-méthylènecholestérol, du stigmastérol du squalène et du squalane. Méthode selon l’une des revendications précédentes, caractérisée en ce que la détermination du rapport des isotopes stables de l’hydrogène ( 2 H/ 1 H) total est obtenue par un analyseur élémentaire couplé à un spectromètre de masse à rapports isotopiques. Méthode selon l’une des revendications précédentes, caractérisée en ce que la détermination du rapport des isotopes stables de l’hydrogène ( 2 H/ 1 H) des acides gras inclut la détermination, par chromatographie en phase gazeuse couplée à un four à pyrolyse et un spectromètre de masse à rapports isotopiques, du rapport des isotopes stables de l’hydrogène ( 2 H/ 1 H) du DHA, de l’EPA, du DPAn-6 et du DPAn-3. Méthode selon l’une des revendications précédentes, caractérisée en ce que la détermination du rapport des isotopes stables de l’hydrogène des insaponifiables inclut la détermination, par chromatographie en phase gazeuse couplée à un four à pyrolyse et un spectromètre de masse à rapports isotopiques, du rapport des isotopes stables de l’hydrogène ( 2 H/ 1 H) du cholestérol et du squalène. Méthode selon l’une des revendications précédentes, caractérisée en ce que l’obtention de données isotopiques inclut : la détermination de la différence du rapport isotopique du carbone entre le DHA, l’EPA, le DPA n-3, ou le DPA n-6, et/ou la détermination de la différence du rapport isotopique du carbone entre le cholestérol, le squalène, l’EPA ou le DHA, et/ou la détermination de la différence du rapport isotopique de l’hydrogène entre le DHA et l’EPA, DPA3, ou le DPA6, et/ou la détermination de la différence du rapport isotopique de l’hydrogène entre le cholestérol, le squalène, l’EPA ou le DHA. Méthode selon l’une des revendications précédentes, caractérisée en ce que l’obtention d’un profil de ladite huile inclut une analyse en composantes principales des données moléculaires obtenues, permettant de déterminer une proportion de pureté ou de mélange de ladite huile. Méthode selon l’une des revendications précédentes, caractérisée en ce que l’obtention d’un profil de ladite huile inclut l’attribution d’un score d’adultération de l’huile entre 0 et 14 à partir des données isotopiques obtenues. Méthode de création d’une bibliothèque de profils d’huiles, la méthode comprenant la détermination de profils de référence, chaque profil correspondant à une huile pré -identifiée, caractérisée en ce que la méthode comprend, pour chaque profil : l’extraction d’acides gras et/ou de composés dits insaponifiables de chaque huile, l’obtention de données moléculaires incluant : la détermination de la composition en acides gras et/ou en composés dits insaponifiables de chaque huile, l’obtention de données isotopiques incluant : la détermination du rapport des isotopes stables du carbone ( 13 C/ 12 C) d’acides gras et/ou de composés dits insaponifiables de chaque huile, puis, l’obtention d’un profil de référence, pour chaque huile, en fonction des données. Méthode selon la revendication 13, caractérisé en ce que l’obtention de données moléculaires est telle que définie dans l’une des revendications 3 à 4. Méthode selon la revendication 13 ou 14, caractérisée en ce que l’obtention de données isotopiques est telle que définie dans l’une des revendications 2 et 6 à 11. Bibliothèque de profils d’huiles obtenue par une méthode telle que décrite dans l’une des revendications 13 à 15.