Brevet FR3155007A1 — publié le 20250509

L’invention concerne un procédé pour trier des cellules d’intérêt dans un système clos. L’invention concerne également la population de cellules ainsi obtenue ainsi que son utilisation. (pas de figure) Procédé pour trier des cellules différenciées à partir de cellules souches pluripotentes La présente invention concerne un procédé pour trier des cellules différenciées à partir de cellules souches pluripotentes. Contexte de l’invention Les cellules souches pluripotentes humaines, qu’elles soient embryonnaires ou induites à la pluripotence présentent une capacité à proliférer à l’identique (chaque cellule-mère donnant naissance à deux cellules-filles identiques à la première) à l’infini, sans jamais entrer en sénescence comme le font toutes les autres cellules de l’organisme, et la capacité, dans d’autres conditions de culture, à se différencier pour donner naissance à n’importe quelle cellule de l’organisme (ectoderme, endoderme et mésoderme). Les cellules souches sont importantes en médecine régénérative (source d’intérêt majeur et prometteur pour réussir à fabriquer des organes), pour la modélisation, notamment de maladies, et le criblage pharmacologique. Les cellules souches pluripotentes apparaissent comme une alternative possible du fait de leur propriété de prolifération illimitée et leur capacité de différenciation permettant d’obtenir à partir d’un même donneur, tous les types cellulaires d’intérêt en grande quantité. De plus, les cellules souches pluripotentes permettent d’obtenir une population homogène de cellules différenciées, contrairement aux cultures primaires (hétérogénéité, limite en nombre, risque de sénescence). Des procédés pour différencier des cellules souches pluripotentes sont déjà connus. Cependant, il n’existe pas à ce jour de protocole de différenciation des cellules souches pluripotentes qui permettent d’obtenir une population pure en fin de différenciation. Des protocoles permettant d’aboutir au mieux à environ 70% de cellules d’intérêt à la fin de la différenciation sont généralement décrits dans la littérature (par exemple dans Gu, Curr Protoc Hum Genet , 98(1):e64, (2018) ; Olmer et al. Stem Cell Reports. 2018 May 8; 10(5): 1657–1672). Afin d’enrichir la population en cellules, il est donc généralement souhaitable de réaliser une étape de tri cellulaire après le protocole de différentiation. En pratique il est généralement souhaitable de disposer d’une population de cellules comprenant au moins 90% de cellules d’intérêt, encore plus préférentiellement au moins 95%. Deux méthodes sont déjà connues pour trier des cellules à l’issue d’un protocole de différentiation : la MACS et la FACS. Ces méthodes sont réalisées en mode manuel, avec des étapes réalisées sous hotte à flux laminaire et sensibles à la contamination. D’une part, la méthode MACS (Magnetic-Associated Cell Sorting) est décrite. Elle peut être définie par la séparation par billes magnétiques couplées à des anticorps. Elle est relativement rapide et permet de purifier une population cellulaire d’intérêt. Le tri cellulaire en manuel nécessite plusieurs étapes de préparation, avec lavages et centrifugations, ainsi qu’une étape d’incubation avec les anticorps spécifiques. Après une dernière étape de lavage et centrifugation, les cellules sont déposées en haut de la colonne et les cellules marquées sont retenues. Après plusieurs volumes de lavages par gravité, les cellules sont décrochées par force mécanique via le piston d’une seringue. Ces étapes sont longues et stressantes pour les cellules ce qui représente une limite de cette méthode. En outre, la méthode MACS possède plusieurs autres inconvénients : trier de grandes quantités de cellules nécessite un temps de purification considérablement long, la capacité des colonnes est réduite, le nombre de cellules à trier est limité et l’augmentation du nombre de colonnes augmente le risque d’erreurs de manipulation ou de pertes cellulaire. De plus, les colonnes magnétiques de séparation étant en système ouvert, il existe un risque de contamination extérieure ce qui rend la méthode incompatible avec les Bonnes Pratiques de Fabrication (BPF ou GMP - Good Manufacturing Practices). Ce risque est d’autant plus élevé que le nombre de colonnes utilisées est important. Les documents Masuda et al. ( Regen Ther. , 9:1-9, (2018)) ; Gu et al. ( Curr Protoc Hum Genet , 98(1):e64, (2018)) ; Olmer et al. ( Stem Cell Reports , 10, 1657-1672, (2018)) ; Mulfaul et al. ( Stem Cell Res Ther 11, 409 (2020)) ou Abutaleb et al. ( STAR Protocols , 2(2), (2021)) décrivent par exemple l’utilisation de la méthode MACS. La demande WO2021176178 décrit aussi un procédé de différenciation de cellules souches pluripotentes en cellules endothéliales, comprenant une étape de tri des cellules (MACS) en système ouvert, sur des colonnes LS commercialisées par Miltenyi Biotec. D’autre part, la méthode FACS (Fluorescence-Associated Cell Sorting) est connue. Cette méthode peut être définie par la séparation par cytométrie de flux après marquage avec un anticorps fluorescent utilisant les mêmes techniques de préparation que la méthode MACS. Le document Sriram et al. ( Stem Cell Res Ther 6, 261 (2015)) illustre par exemple l’utilisation de la méthode FACS. Si la méthode FACS permet de purifier des populations sur des combinaisons de marqueurs et pas uniquement un marqueur unique (enrichissement en sous-populations d’intérêt), elle possède toutefois des inconvénients. En effet, le temps de process est très long (supérieur à 6 heures) pour de grosses quantités de cellules, ce qui est donc particulièrement délétère pour la viabilité des cellules, et ce qui rend la méthode FACS incompatible avec une montée en échelle industrielle. Le système utilise également un système de tubulures lavables, difficilement compatible avec les normes BPF car à usage non unique. Des solutions sont proposées pour des cartouches de tri par CytoMétrie de Flux (CMF) à usage unique (MACSQuant® Tyto® ; Miltenyi Biotec) mais ces solutions ne sont pas adaptées à un tri d’une forte proportion de cellules d’intérêt, c’est-à-dire une proportion supérieure à 50% de cellules d’intérêt. Le tri automatisé de cellules, en système clos, a déjà été décrit (voir Enrichment of human CD34+ cells - LP-34 Enrichment process - CliniMACS Prodigy® Tubing Set 310 - Miltenyi Biotec - https://static.miltenyibiotec.com/asset/150655405641/document_cp11oi2a8d3cb3jvrln69e5h7i?content-disposition=inline ). Il s’agit d’un procédé d’enrichissement magnétique automatisé de cellules humaines exprimant le marqueur CD34, à partir de produits issus du sang après leucaphérèse. D’après les résultats communiqués le procédé permet de récupérer une population de cellules comprenant entre 52 et 74% des cellules d’intérêts (exprimant le marqueur CD34). L’étape de tri cellulaire est donc une étape complexe, critique et limitante dans la montée en échelle industrielle d’un procédé de différentiation de cellules et dans sa mise en conformité vers des standards de production de cellules de grade pharmaceutique dans des conditions « cliniques », c’est-à-dire des conditions où les produits utilisés sont fabriqués selon les Normes BPF et peuvent donc être utilisés dans des études cliniques contrairement aux produits de grade « recherche » qui ne peuvent être utilisés que pour la recherche. Les normes « BPF » constituent une notion d’assurance qualité établie par la commission européenne (ou américaine) dans le cadre de la fabrication de médicaments à usage humain ou vétérinaire (EUDRALEX en France ou FDA aux Etats-Unis). Elles ont été créées pour limiter les risques de contamination croisée des produits, en insistant sur les pratiques d’hygiène, ainsi que les risques de confusion : étiquetage/identification. Les principes des BPF imposent l’écriture de modes opératoires et d’instructions permettant des productions de qualité régulière avec une traçabilité conforme. Ils intègrent également les procédés, la qualité du produit et la sécurité du personnel. Les BPF sont actuellement organisées en 3 parties : 1. Les bonnes pratiques de fabrication des médicaments à usage humain. 2. Les bonnes pratiques de fabrication pour les substances actives utilisées comme matière première dans les médicaments. 3. Les documents relatifs aux bonnes pratiques de fabrication donnant les recommandations sur les exigences internationales pour la certification de lots. A ce jour, il n’existe donc pas de moyen de trier des cellules d’intérêt en grande quantité selon les normes BPF, encore moins à l’issue d’un procédé de différentiation à partir de cellules souches pluripotentes. Or, les besoins sont de plus en plus nombreux, dans divers domaines d’application clinique, tels que l’obtention de tissus reconstitués utilisables en thérapie nécessitant la production de grandes quantités de cellules (plusieurs centaines de millions, voire plusieurs milliards). Il est donc nécessaire de pouvoir trier de très grandes quantités de cellules à la fin de la différenciation selon les normes BPF. La pureté de la population de cellules, obtenue après le tri, est également un facteur important : il y a en effet un besoin pour obtenir une population de cellules comprenant au moins 90% des cellules d’intérêt, de préférence au moins 95%. Cette étape constitue un verrou technologique à la production massive de cellules d’intérêt différenciées à partir de cellules souches pluripotentes. Bref exposé de l’invention La présente invention concerne une nouvelle méthode de tri cellulaire permettant la montée en échelle du tri cellulaire ainsi que sa mise en conformité vers des procédés de production de grade pharmaceutique. Plus particulièrement, la présente invention concerne un procédé pour trier des cellules d’intérêt dans un système clos, caractérisé en ce que les cellules d’intérêt sont des cellules différenciées à partir de cellules souches pluripotentes, et ledit procédé comprenant une étape de sélection desdites cellules d’intérêt à l’aide de billes magnétiques couplées à au moins un anticorps spécifique d’un marqueur exprimé à la surface desdites cellules d’intérêt. Le procédé selon l’invention présente notamment les avantages suivants : 1. La montée en échelle du tri cellulaire puisque ce procédé rend possible le tri d’une très grande quantité de cellules de façon plus simple, plus rapide et plus efficace que par les procédés décrits dans l’état de l’art. 2. La mise en conformité vers des procédés de production de grade pharmaceutique selon les normes BPF. 3. L’obtention d’une population de cellules ayant une pureté élevée. Le procédé selon l’invention permet ainsi de lever le verrou technologique à la production massive de cellules d’intérêt que constituait l’étape de tri cellulaire réalisée avec les protocoles décrits dans l’état de l’art. La présente invention concerne également la population de cellules, notamment de cellules endothéliales, obtenues par le procédé selon l’invention. La présente invention concerne également l’utilisation de la population de cellules endothéliales pour la fabrication d’un tissu dermique ou un substitut de peau. Description détaillée de l’invention La présente invention concerne un procédé pour trier des cellules d’intérêt dans un système clos, caractérisé en ce que les cellules d’intérêt sont des cellules différenciées à partir de cellules souches pluripotentes, et ledit procédé comprenant une étape de sélection desdites cellules d’intérêt à l’aide de billes magnétiques couplées à au moins un anticorps spécifique d’un marqueur exprimé à la surface desdites cellules d’intérêt. Par « cellules souches pluripotentes » on entend toute cellule indifférenciée, capable de s'auto-renouveler à l’infini, de se différencier en tous types cellulaires (ectoderme, endoderme, mésoderme). Dans un mode de réalisation lesdites souches pluripotentes sont des cellules souches pluripotentes humaines. Dans un mode de réalisation, les cellules souches pluripotentes sont des cellules souches humaines induites à la pluripotence. Les cellules souches pluripotente humaines sont obtenues par des méthodes qui ne nécessitent pas la destruction d’embryons. Par « cellules différenciées » on entend toute cellule spécialisée en un type cellulaire. Les cellules différenciées sont par exemple identifiables par des caractéristiques morphologiques ou l’expression de gène(s) spécifique d’un type cellulaire. Typiquement, il peut s’agir de cellules endothéliales, de fibroblastes, … Dans un mode de réalisation, les cellules différenciées à partir de cellules souches pluripotentes sont des cellules adhérentes ou non adhérentes. Dans un mode de réalisation, les cellules différenciées à partir de cellules souches pluripotentes sont des cellules endothéliales. Par « marqueur » on entend toute molécule située à la surface d’une cellule qui permet d’identifier le type de cellules. Il s’agit notamment de Cluster de Différentiation. Dans un mode de réalisation, le marqueur est ainsi choisi parmi CD31, CD34 et CD144, et est de préférence CD34. De préférence, l’anticorps selon l’invention est un anticorps de grade BPF (c’est-à-dire respectant les normes BPF). Encore plus préférentiellement, l’anticorps selon l’invention est un anticorps de grade BPF dirigé contre CD34. Dans un mode de réalisation préféré, les cellules différenciées sont des cellules endothéliales exprimant le récepteur CD34. Dans un mode de réalisation, la présente invention concerne ainsi un procédé pour trier des cellules d’intérêt dans un système clos, caractérisé en ce que les cellules d’intérêt sont des cellules endothéliales différenciées à partir de cellules souches pluripotentes, et ledit procédé comprenant une étape de sélection desdites cellules d’intérêt à l’aide de billes magnétiques couplées à au moins un anticorps spécifique du marqueur CD34 exprimé à la surface desdites cellules d’intérêt. Dans un mode de réalisation, les cellules différenciées représentent au moins 20% des cellules au sein de la population de cellules à trier, notamment au moins 40%, et de préférence au moins 60%. Au moins 20% s’entend de toutes les valeurs comprises entre 20% et 100%, par exemple des valeurs 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 100%. Dans un mode de réalisation, les cellules différenciées représentent entre 20% et 80% des cellules au sein de la population de cellules à trier. Avantageusement, à l’issue de l’étape de tri une population de cellules comprenant au moins 90% des cellules d’intérêt est ainsi obtenue. De préférence, à l’issue de l’étape de tri une population de cellules comprenant au moins 95% des cellules d’intérêt est ainsi obtenue. Dans un mode de réalisation, la présente invention concerne ainsi un procédé pour trier des cellules d’intérêt dans un système clos, caractérisé en ce que les cellules d’intérêt sont des cellules endothéliales différenciées à partir de cellules souches pluripotentes et représentent au moins 40% des cellules au sein de la population de cellules à trier, et ledit procédé comprenant une étape de sélection desdites cellules d’intérêt à l’aide de billes magnétiques couplées à au moins un anticorps spécifique du marqueur CD34 exprimé à la surface desdites cellules d’intérêt. Selon un mode de réalisation préféré, lesdites cellules différenciées représentent au moins 60% des cellules au sein de la population de cellules à trier. Selon un mode de réalisation de l’invention, le procédé pour trier des cellules d’intérêt comprend : - (i) au moins une étape de marquage desdites cellules d’intérêt, au sein de la population de cellules à trier, par au moins un anticorps spécifique d’un marqueur exprimé à la surface desdites cellules d’intérêt, - (ii) optionnellement au moins une étape de lavage de la population de cellules à trier, - (iii) au moins une étape de sélection desdites cellules marquées à l’étape (i). Selon un mode de réalisation de l’invention, le procédé pour trier des cellules d’intérêt comprend : - (i) au moins une étape de marquage desdites cellules d’intérêt, au sein de la population de cellules à trier, par au moins un anticorps spécifique d’un marqueur exprimé à la surface desdites cellules d’intérêt, ladite population comprenant entre 20% et 80% de cellules d’intérêt, - (ii) optionnellement au moins une étape de lavage de la population de cellules à trier, - (iii) au moins une étape de sélection desdites cellules marquées à l’étape (i), et l’obtention d’une population comprenant au moins 90% de cellules d’intérêt. Selon un mode de réalisation de l’invention, le procédé pour trier des cellules d’intérêt comprend : - (i) au moins une étape de marquage desdites cellules d’intérêt, au sein de la population de cellules à trier, par au moins un anticorps spécifique d’un marqueur exprimé à la surface desdites cellules d’intérêt, ladite population comprenant entre 20% et 80% de cellules d’intérêt, - (ii) optionnellement au moins une étape de lavage de la population de cellules à trier, - (iii) au moins une étape de sélection desdites cellules marquées à l’étape (i), et l’obtention d’une population comprenant au moins 95% de cellules d’intérêt. De préférence, « au moins une étape de sélection » s’entend d’une étape de sélection sur une colonne de tri magnétique. Ladite étape de sélection permet notamment d’obtenir une population de cellules comprenant au moins 90%, avantageusement plus de 95%, de manière préférée plus de 98% des cellules d’intérêt. Selon un mode de réalisation de l’invention, le procédé pour trier des cellules d’intérêt comprend préalablement à l’étape (i) une étape de couplage des billes magnétiques à au moins un anticorps spécifique d’un marqueur exprimé à la surface des cellules d’intérêt. Selon un mode de réalisation, les billes magnétiques sont couplées à au moins un anticorps spécifique d’un marqueur exprimé à la surface des cellules d’intérêt préalablement à l’étape de marquage. Puis, les cellules d’intérêt sont incubées avec lesdites billes magnétiques et forment ainsi une suspension. La suspension est ensuite lavée puis dirigée dans la colonne qui est proche d’un champ magnétique (aimant) afin de réaliser la sélection positive des cellules, c’est-à-dire que les cellules qui ne sont pas attachées à l’anticorps couplé à la bille magnétique ne sont pas retenues sur la colonne. Le champ magnétique est ensuite retiré et les cellules d’intérêts sont entrainées par le liquide via une pompe péristaltique. Selon un mode de réalisation de l’invention, le procédé pour trier des cellules d’intérêt comprend : - (i) au moins une étape de marquage desdites cellules d’intérêt, au sein de la population de cellules à trier, par au moins un anticorps spécifique d’un marqueur exprimé à la surface desdites cellules d’intérêt, - (ii) optionnellement au moins une étape de lavage de la population de cellules à trier, - (iii) au moins une étape de chargement de la population de cellules à trier sur une colonne de tri magnétique, - (iv) au moins une étape de sélection desdites cellules marquées à l’étape (i) et retenues sur la colonne de tri magnétique au cours de l’étape (iii). Optionnellement, l’au moins une étape de lavage optionnelle (ii) est suivie par au moins une étape de centrifugation, notamment pour éliminer les billes libres. Optionnellement, l’au moins une étape de lavage optionnelle (ii) est suivie par au moins une étape de filtration, notamment pour enlever d’éventuels agrégats cellulaires qui pourraient boucher la colonne. Optionnellement, l’étape de centrifugation est suivie par une étape de filtration. Selon un mode de réalisation, aucune pression mécanique n’est exercée sur les cellules pour le relargage des cellules positives (d’intérêt) retenues sur la colonne ; le déplacement de flux se fait par pompe péristaltique, ce qui est moins stressant pour les cellules triées. Selon un mode de réalisation, à la suite de l’au moins une étape de marquage, les cellules marquées sont dirigées vers la colonne de tri par des tubulures stériles et l’action d’une pompe péristaltique. Dans un mode de réalisation, le système clos est un système automatisé, par exemple l’automate CliniMACS Prodigy®. Dans un mode de réalisation, le système clos est un système en tubulures, par exemple l’automate CliniMACS Prodigy® utilisé avec le kit CliniMACS Prodigy® TS 310. L’utilisation d’un système de tubulures permet notamment de ne pas manipuler les cellules en système « ouvert » dans un Poste de Sécurité Microbiologique (PSM), ce qui diminue le risque pharmaceutique et permet le tri de cellules selon les normes BPF. Selon un mode de réalisation, le procédé selon l’invention permet le chargement d’une population de 1 milliard de cellules, et d’effectuer le tri en une seule étape. Selon un mode de réalisation, un seul système clos automatisé est nécessaire et peut effectuer le tri des cellules d’intérêt en moins de 2h30, permettant une meilleure survie et récupération des cellules triées. Selon un mode de réalisation, la différentiation des cellules d’intérêt à partir de cellules souches pluripotentes et le tri desdites cellules d’intérêt sont réalisées au sein du même système clos. Selon un mode de réalisation, l’obtention de ladite population de cellules comprenant au moins 90%, notamment 95%, de cellules d’intérêt, qui a été obtenue selon l’invention peut être suivie d’une étape d’amplification. L’étape d’amplification est typiquement réalisée avec un milieu adapté à la culture des cellules endothéliales. De manière préférée, le milieu adapté à la culture des cellules endothéliales est le milieu CnT-Endo commercialisé par la société CelInTec. Lors de l’étape d’amplification ce milieu est supplémenté avec du VEGF et du sérum de veau foetal (2%). Dans un mode de réalisation, les cellules différenciées sont des cellules endothéliales obtenues par un procédé d’obtention caractérisé en ce que : - (a) à J0, lesdites cellules souches pluripotentes sont ensemencées à une densité de 40000 à 60000 cellules/cm 2 , de préférence environ 50000 cellules/cm 2 , sur une matrice et cultivées en présence d’un milieu adapté à la culture des cellules pluripotentes, comprenant en outre du facteur de croissance fibroblastique 2 (« Fibroblast Growth Factor 2 » ou FGF2) ; - (b) à J2, le milieu est remplacé par un milieu adapté à l’induction du mésoderme comprenant en outre un inhibiteur de GSK3 (Glycogen Synthase Kinase 3) et de la BMP4 (Bone Morphogenetic Protein 4) ; - (c) à J5 le milieu est remplacé par un milieu adapté à la culture des cellules endothéliales comprenant en outre du VEGF (Vascular Endothélial Growth Factor) et de la forskoline ; - (d) à J6, le milieu est à nouveau remplacé par un milieu adapté à la culture des cellules endothéliales comprenant en outre du VEGF (Vascular Endothélial Growth Factor) et de la forskoline. - (e) à J7 les cellules sont dissociées, - (f) optionnellement une étape d’obtention d’une population de cellules à trier comprenant au moins 20% de cellules différenciées, notamment au moins 40%, et de préférence au moins 60%. Par « matrice » ou « coating », on entend tout substrat permettant la culture des cellules souches en monocouche. De manière préférée, la matrice utilisée dans le procédé selon l’invention est une matrice protéique définie. De manière préférée, la matrice est choisie dans le groupe constitué par Matrigel™, L7 coating™, la laminine et la vitronectine. De manière particulièrement préférée, la matrice est la matrice L7™ commercialisée par la société Lonza sous la référence FP-5020. Par « milieu adapté à la culture des cellules pluripotentes » on entend tout milieu qui contient les nutriments et facteurs permettant la culture in vitro de cellules pluripotentes. De manière préférée, le milieu adapté à la culture des cellules pluripotentes est choisi parmi le milieu iPS Brew XF GMP commercialisé par la société Miltenyi Biotec et le milieu iPS Stempro commercialisé par la société ThermoFisher. Lors de l’étape a), le milieu est supplémenté de « facteur de croissance fibroblastique 2 » ou « FGF2 » ou « Fibroblast Growth Factor 2 ». Typiquement, le FGF2 est utilisé à une concentration finale de 5 à 20 ng/ml, de préférence environ 10 ng/ml. Optionnellement, lors de l’étape a), le milieu est supplémenté d’un inhibiteur de ROCK. De manière préférée, l’inhibiteur de ROCK est fourni au sein du supplément Revitacell commercialisé par la société Gibco. Selon un mode de réalisation, les cellules souches pluripotentes sont décongelées avant l’ensemencement, en présence d’un inhibiteur de ROCK. Par « milieu adapté à l’induction du mésoderme » on entend tout milieu qui contient les nutriments et facteurs permettant l’induction de la voie mésodermique des cellules pluripotentes. De manière préférée, le milieu adapté à l’induction du mésoderme comprend les suppléments N2 et B27. Le milieu N2B27 est un mélange 1:1 de milieu KO DMEM-F12 CTS et du milieu Neurobasal CTS, supplémenté avec du Glutamax CTS, du N2 CTS, du β-mercapto-éthanol et du B27 CTS. Lors de l’étape b), le milieu adapté à l’induction du mésoderme comprend également un inhibiteur de GSK3 et de la BMP4. L’homme de l’art a, à sa disposition, un certain nombre d’agents connus pour inhiber la kinase GSK3. Typiquement, l’inhibiteur de GSK3 peut être le Chir99021 commercialisé par la société Tocris. Typiquement, la concentration finale en Chir99021 est comprise entre 5 et 10 µM, de préférence environ 6 µM. Typiquement, la concentration finale en BMP4 est comprise entre 15 et 50 ng/ml, de préférence environ 25 ng/ml. Par « milieu adapté à la culture des cellules endothéliales » on entend tout milieu qui contient les nutriments et facteurs permettant la culture in vitro de cellules endothéliales. De manière préférée, le milieu adapté à la culture des cellules endothéliales est le milieu CnT-Endo commercialisé par la société CelInTec. Lors de l’étape c) et de l’étape d), le milieu est supplémenté de VEGF et de forskoline. De manière préférée, le VEGF est fourni à une concentration finale comprise entre 100 et 300 ng/ml, de manière encore plus préférée environ 200 ng/ml. De manière préférée, la forskoline est fournie à concentration finale comprise entre 1 et 3 µM, de manière encore plus préférée environ 2 µM. Avantageusement, tous les milieux de culture et agents utilisés sont chimiquement définis et ne contiennent aucun additif d’origine animale non contrôlé aux normes de Bonnes Pratiques de Fabrication (ou BPF). La présente invention concerne également la population de cellules, notamment de cellules endothéliales, obtenues par le procédé décrit ci-dessus. De manière avantageuse, la population de cellules, notamment de cellules endothéliales, est homogène, c’est-à-dire que plus de plus de 90%, avantageusement plus de 95%, de manière préférée plus de 98% des cellules sont positives pour le marqueur (de préférence CD34). Cela illustre la pureté de la population de cellules obtenues après le tri cellulaire selon l’invention. La population de cellules ainsi obtenue comprend donc au moins 90% de cellules d’intérêt. La présente invention concerne également l’utilisation de la population de cellules endothéliales pour la fabrication d’un tissu dermique ou un substitut de peau. Exemples Exemple 1 : Comparaison des colonnes LS et du système en tubulures TS310 Matériels et méthodes L’obtention des cellules différenciées (cellules endothéliales) est réalisée selon la méthode décrite dans la demande WO2021176178. A la suite de l’étape de différenciation des cellules souches pluripotentes en cellules endothéliales une population d’au mieux environ 70% de cellules d’intérêt est obtenue. Une étape de tri cellulaire est ainsi effectuée afin de purifier la population en cellules d’intérêt CD34+. La demande WO2021176178 décrit l’utilisation de colonnes LS (Miltenyi Biotec). Il s’agit de colonnes stériles à usage unique, de faible capacité (possédant une charge maximum de 50 millions de cellules totales), à utiliser dans un Poste de Sécurité Microbiologique (PSM), ce qui correspond à un système dit « ouvert ». Il est également décrit dans cette demande l’utilisation d’anticorps anti-CD144 de grade « for Research Use Only » (RUO), ce qui signifie « uniquement destinés à la recherche ». L’étape de tri cellulaire selon l’invention est ici réalisée en système automatisé, par l’automate de culture cellulaire CliniMACS Prodigy® (Miltenyi Biotec) et du système en tubulures CliniMACS Prodigy® TS 310. Comparaison Le tri à l’aide de colonnes LS selon la demande WO2021176178 et le tri en système clos selon l’invention ont été comparés. Ces caractéristiques sont résumées dans le Tableau 1. L’efficacité de tri désigne le pourcentage de cellules récupérées après le tri cellulaire (qu’elles soient d’intérêt ou non) versus le nombre total de cellules avant tri. Colonne LS (manuelle) Colonne TS 310 (automatisé) Charge maximum expérimentale (M cellules totales) 5,00 E +07 1,00 E +09 Efficacité de tri Environ 80% Pression Mécanique Fluidique Temps de tri pour 1 e 9 cellules totales 3 heures / opérateur (3 opérateurs) 2 heures (1 opérateur) Type de système « ouvert » sous PSM Clos en tubulures Anticorps de tri CD144 ou CD34 (RUO-grade) CD34 (GMP-grade) Comparaison des colonnes LS et TS310 Montée en échelle vers un procédé de bioproduction L’utilisation du kit TS 310, incluant une colonne de tri magnétique, permet de passer de 50 millions de cellules chargées sur la colonne a 1 milliard de cellules (x20), et d’effectuer le tri en une seule étape. Un seul manipulateur est nécessaire et peux effectuer ce tri en moins de 2h30, permettant une meilleure survie et récupération des cellules triées. En comparaison, 18 colonnes manuelles seraient nécessaires, nécessitant 2 à 3 operateurs en parallèle pour un temps total de plus de 3h par operateur. Ainsi, cette invention aboutit à un procédé plus simple (1 seul opérateur, uniquement mobilisé pendant la phase de préparation), plus rapide, et plus efficace. L’invention permet ainsi de lever le verrou technologique à la production massive de cellules endothéliales que constituait l’étape de tri cellulaire réalisée avec les protocoles décrits dans la littérature. Diminution majeure du risque pharmaceutique Un des aspects majeurs dans la production pharmaceutique est la réduction du risque de contamination (bactériologique, virologique…). L’utilisation d’un système de tubulure, permettant de ne plus manipuler les cellules en système « ouvert » sous PSM. Toutes les étapes sont réalisées au sein du système clos. Les cellules marquées sont notamment dirigées vers la colonne de tri par des tubulures stériles et l’action d’une pompe péristaltique. En procédé manuel, le risque de contamination bactériologique est le plus élevé au moment de l’étape de tri. L’utilisation du kit TS310 permet d’effectuer le tri de manière stérile, sans recours à une manipulation des cellules/colonnes sous PSM. De plus, aucune pression mécanique n’est exercée sur les cellules pour le relargage des cellules positives retenues sur la colonne (déplacement de flux par pompe péristaltique), ce qui est moins stressant pour les cellules triées. Le procédé est plus sécurisé par rapport au tri sur colonne manuelle. L’invention permet ainsi une diminution majeure du risque pharmaceutique. L’utilisation d’anticorps de grade BPF. Le risque pharmaceutique concernant l’utilisation d’anticorps pour l’étape de tri cellulaire a été maitrisé par le remplacement des anticorps CD144 RUO par un anticorps CD34 GMP, disposant d’une documentation fournisseur beaucoup plus complète, ce qui sécurise le procédé. La population d’intérêt exprime les marqueurs CD144 et CD34 d’une manière comparable et les efficacités des tris avec les deux anticorps sont comparables également. Après le tri, les fractions positives (retenues) et négatives (non retenues) présentent des phénotypes similaires selon les 2 types de tris . Les résultats, obtenus sur des colonnes LS, sont présentés dans le Tableau 2 . Anticorps utilisé (MACS) Anti-CD144 Anti-CD34 Total des cellules obtenues à l’issue de l’étape de différentiation 327 E 6 Total des cellules triées 120 E 6 Quantité de cellules retenues (fraction positive, cellules exprimant le marqueur) 68.1 E 6 (56.8%) 72.4 E 6 (60%) Quantité des cellules non retenues (fraction négative, cellules n’exprimant pas le marqueur) 42.7 E 6 (35.5%) 53 E 6 (44.7%) Comparaison entre deux anticorps Exemple 2 : Pureté de la population de cellules obtenues Les cellules différenciées sont obtenues par la méthode décrite dans l’Exemple 1. La pureté avant et après l’étape de tri cellulaire selon l’invention est contrôlée par analyse en cytométrie en flux. Les résultats obtenus sont présentés dans le Tableau 3 . Total des cellules obtenues à l’issue de l’étape de différentiation 1.6 E 9 Total des cellules triées 1 E 9 Quantité de cellules retenues (fraction positive, cellules exprimant le marqueur) 401 E 6 Quantité des cellules non retenues (fraction négative, cellules n’exprimant pas le marqueur) 480 E 6 Caractéristiques des cellules triées et résultats Les résultats suivants sont obtenus : - Le pourcentage de cellules exprimant le marqueur CD34 dans la fraction totale avant le tri cellulaire est de 42.5%. - Le pourcentage de cellules exprimant le marqueur CD34 dans la fraction retenue après le tri cellulaire est de 96%. - Le pourcentage de cellules exprimant le marqueur CD34 dans la fraction non retenue après le tri cellulaire est de 3%. La population de cellules obtenues après le tri cellulaire selon l’invention exprime ainsi à plus de 95% le marqueur CD34. Une population de cellules comprenant plus de 95% de cellules d’intérêt est ainsi obtenue. L’invention permet ainsi de purifier une population de cellules endothéliales de manière mieux contrôlée, plus efficacement, plus rapidement et à plus grande échelle. Procédé pour trier des cellules d’intérêt dans un système clos, caractérisé en ce que les cellules d’intérêt sont des cellules différenciées à partir de cellules souches pluripotentes, et ledit procédé comprenant une étape de sélection desdites cellules d’intérêt à l’aide de billes magnétiques couplées à au moins un anticorps spécifique d’un marqueur exprimé à la surface desdites cellules d’intérêt. Procédé pour trier des cellules d’intérêt selon la revendication 1, dans lequel ledit marqueur est choisi parmi CD31, CD34 et CD144, de préférence CD34. Procédé pour trier des cellules d’intérêt selon l’une quelconque des revendications précédentes, dans lequel lesdites cellules différenciées à partir de cellules souches pluripotentes sont des cellules endothéliales. Procédé pour trier des cellules d’intérêt selon l’une quelconque des revendications précédentes, dans lequel lesdites cellules différenciées représentent au moins 20% des cellules au sein de la population de cellules à trier, notamment au moins 40%, et de préférence au moins 60%. Procédé pour trier des cellules d’intérêt selon l’une quelconque des revendications précédentes, comprenant : - (i) au moins une étape de marquage desdites cellules d’intérêt, au sein de la population de cellules à trier, par au moins un anticorps spécifique d’un marqueur exprimé à la surface desdites cellules d’intérêt, - (ii) optionnellement au moins une étape de lavage de la population de cellules à trier, - (iii) au moins une étape de sélection desdites cellules marquées à l’étape (i). Procédé pour trier des cellules d’intérêt selon l’une quelconque des revendications précédentes, dans lequel ledit système clos est un système en tubulures. Procédé pour trier des cellules d’intérêt selon l’une quelconque des revendications précédentes, dans lequel les cellules différenciées sont des cellules endothéliales obtenues par un procédé d’obtention caractérisé en ce que : - (a) à J0, lesdites cellules souches pluripotentes sont ensemencées à une densité de 40000 à 60000 cellules/cm2, de préférence environ 50000 cellules/cm2, sur une matrice et cultivées en présence d’un milieu adapté à la culture des cellules pluripotentes, comprenant en outre du facteur de croissance fibroblastique 2 (« Fibroblast Growth Factor 2 » ou FGF2) ; - (b) à J2, le milieu est remplacé par un milieu adapté à l’induction du mésoderme comprenant en outre un inhibiteur de GSK3 (Glycogen Synthase Kinase 3) et de la BMP4 (Bone Morphogenetic Protein 4) ; - (c) à J5 le milieu est remplacé par un milieu adapté à la culture des cellules endothéliales comprenant en outre du VEGF (Vascular Endothélial Growth Factor) et de la forskoline ; - (d) à J6, le milieu est à nouveau remplacé par un milieu adapté à la culture des cellules endothéliales comprenant en outre du VEGF (Vascular Endothélial Growth Factor) et de la forskoline. - (e) à J7 les cellules sont dissociées. Procédé pour trier des cellules d’intérêt selon l’une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que les cellules souches pluripotentes sont des cellules souches humaines induites à la pluripotence. Population de cellules, notamment de cellules endothéliales, obtenues par le procédé tel que défini selon l’une quelconque des revendications 1 à 8. Utilisation de la population de cellules endothéliales de la revendication 9 pour la fabrication d’un tissu dermique ou un substitut de peau.