Brevet FR3159612A1 — publié le 20250829

La présente invention a pour objet un procédé pour l’analyse du matériel génétique contenu dans un échantillon, en particulier un échantillon prélevé dans l’environnement. Les applications de la présente invention concernent plus particulièrement la détection et la caractérisation de microorganismes vivants lorsqu’ils sont présents au sein d’une matrice complexe dans un échantillon. Un procédé selon l’invention permet l’analyse du matériel génétique présent à l’intérieur d’une enveloppe intègre, et comprend au moins une étape de traitement par au moins une nucléase d’un échantillon biologique contenant ou susceptible de contenir i) de l’acide nucléique libre et/ou ii) de l’acide nucléique compris dans une enveloppe intègre. Figure pour l’abrégé : Figure 3 PROCEDE D’ANALYSE GENETIQUE D’UN ECHANTILLON Domaine de l’invention La présente invention a pour objet un procédé pour l’analyse du matériel génétique contenu dans un échantillon, en particulier un échantillon prélevé dans l’environnement. Les applications de la présente invention concernent plus particulièrement la détection et la caractérisation de microorganismes vivants lorsqu’ils sont présents au sein d’une matrice complexe dans un échantillon. La présente invention se situe donc dans le domaine de l’analyse du matériel génétique. Etat de la technique Les échantillons comprenant de la matière biologique, notamment ceux qui sont prélevés dans l’environnement, sont couramment très riches en composants de toutes sortes, incluant notamment des cellules et des débris de cellules, ainsi que de l’acide nucléique dit « libre », c’est-à-dire non compris dans une cellule, une enveloppe virale ou tout autre enveloppe. Pourtant, il est souvent nécessaire de distinguer spécifiquement, au sein d’un tel échantillon complexe, la présence de microorganismes intègre et potentiellement capables de se reproduire. Il est souhaitable de distinguer les microorganismes intègre des de microorganismes nonintègre et/ou incapables de se reproduire. La capacité de reproduction des micro-organismes est en effet conditionnée par leur intégrité. Un procédé actuellement utilisé pour atteindre l’intégrité de micro-organismes est l’amplification par culture, notamment sur boite de Petri. Cette technologie, outre son coût et les délais qu’elle implique, n’atteint que partiellement les objectifs recherchés puisque tous les microorganismes intègres ne sont pas forcément cultivables, ou ne prospèrent pas dans les conditions ou sur les matrices utilisées pour les cultiver. Un autre procédé est l’observation microscopique, réalisé lors d’un examen microscopique réalisé par un expert ou par cytométrie en flux. Cependant le niveau de précision et la fiabilité de ces mesures n’atteint pas le degré de précision des méthodes de biologie moléculaire et peuvent dépendre de l’expérience de la personne qui pratique l’observation microscopique ou la détection par cytométrie. Il existe donc un besoin de disposer d’un procédé d’analyse d’un échantillon permettant de distinguer spécifiquement les microorganismes intègres, ledit procédé étant rapide, efficace et reproductible. Les inventeurs ont maintenant mis au point un procédé d’analyse du matériel génétique présent dans un échantillon, dans lequel le matériel génétique contenu au sein de toute enveloppe intègre présente dans ledit échantillon est spécifiquement détecté. Un procédé selon l’invention permet donc de détecter de façon sensible et spécifique le matériel génétique non parasité par de l’acide nucléique dit « libre », c’est-à-dire non compris dans une enveloppe intègre. Les inventeurs ont également mis au point un procédé de modification du matériel génétique présent dans un échantillon, dans lequel le matériel génétique contenu au sein de toute enveloppe intègre présente dans ledit échantillon est spécifiquement modifié. Un procédé selon l’invention permet donc également de modifier de façon spécifique le matériel génétique non parasité par de l’acide nucléique dit « libre », c’est-à-dire non compris dans une enveloppe intègre. Une première étape du procédé selon l’invention consiste, lors de la préparation et de l’extraction préalables à l’analyse génétique par PCR, à digérer par une nucléase les molécules d’acide nucléique non enveloppé dans une membrane intacte. Dans un échantillon prélevé dans l’environnement, lesdits acides nucléiques libres proviennent notamment des cellules ou de virus dont la membrane est dégradée. Lesdits acides nucléiques peuvent également être contenus dans les spores de microorganismes en dormance. Un procédé selon l’invention conduit à la dégradation des acides nucléiques libres et non-compris dans un compartiment intègre, ce qui présente l’avantage d’éliminer, dans des matrices complexes et fortement concentrées en microorganismes, les acides nucléiques libres susceptibles de gêner la détection en PCR due à l’encombrement, discriminer les microorganismes et les compartiments intègres, d’une part, des microorganismes et compartiments non intègres, d’autre part. Il apparaît en effet que, notamment pour les applications de détection de la présence de microorganismes de toute nature, qu’ils soient eucaryotes, procaryotes ou viraux, une information pertinente, notamment pour évaluer la viabilité desdits microorganismes, concerne plus spécifiquement l’acide nucléique compris à l’intérieur d’enveloppes intègres. En effet, la capacité de reproduction des microorganismes est conditionnée par leur viabilité, qui est elle-même conditionnée par l’intégrité de leur matériel génétique, d’une part, et l’intégrité de leur structure, d’autre part. Un procédé selon l’invention comprend donc, préalablement à la réalisation d’une analyse, notamment par amplification par PCR, ou d’une modification, notamment au moyen d’une technique de type CRISPR/Cas9, une étape de préparation d’un échantillon et d’addition à l’échantillon préparé d’une nucléase choisie parmi les nucléases actives en présence d’une concentration saline élevée dans le milieu réactionnel, cette concentration saline élevée est en effet nécessaire pour l’amplification par PCR. Un procédé selon l’invention comprend la mise en contact, dans des conditions réactionnelles contrôlées, d’une nucléase et du matériel génétique présent dans l’échantillon. L’application de conditions réactionnelles contrôlées conduit à la dégradation de l’acide nucléique qui n’est pas compris dans une enveloppe intègre telle qu’une membrane cellulaire, une enveloppe de spore, une enveloppe virale ou une capsule synthétique. En revanche, lors de cette étape la nucléase ne traverse pas, ou de façon négligeable, ladite membrane cellulaire, enveloppe de spore, enveloppe virale ou capsule synthétique. Les acides nucléiques contenus au sein desdites enveloppes sont donc préservés et analysables ou modifiables. Un procédé selon l’invention allie les avantages d’une méthode de biologie moléculaire telle que la PCR avec la pertinence d’analyse des méthodes d’observation microscopiques ou de culture. Un procédé selon l’invention présente en effet, d’une part, des avantages de rapidité, sensibilité, versatilité, reproductibilité et faible coût ainsi que, d’autre part, une détection sélective du ou des micro-organisme d’intérêt qui sont intègres et viables. Les applications de la présente invention sont nombreuses et variées. En effet, l’invention trouve une application particulière dans la détection de la présence de micro-organismes intègres et/ou viables dans un échantillon. Lesdits micro-organismes sont de préférence choisis parmi les bactéries, les levures et les virus. L’invention trouve également une application particulière pour le génotypage. C’est le cas par exemple du génotypage du pollen, du génotypage de microorganismes susceptibles de produire des toxines ou d’être résistants à des antibiotiques, du génotypage de protoplastes ou de gamètes. Enfin, l’invention est applicable à l’analyse d’acide nucléique synthétique encapsulé artificiellement dans des membranes synthétiques. Plus particulièrement, la présente invention a pour objet un procédé d’analyse du matériel génétique présent dans un échantillon, ce procédé comprenant une étape préalable de sélection d’une nucléase appropriée puis une étape de traitement de l’échantillon d’intérêt par ladite nucléase, dans des conditions réactionnelles spécifiques, préalablement à l’amplification par PCR d’au moins une séquence nucléotidique cible. Les inventeurs proposent en effet un moyen permettant de sélectionner au préalable une nucléase capable de dégrader spécifiquement l’acide nucléique libre tout en préservant l’acide nucléique compris à l’intérieur d’une enveloppe intègre, c’est-à-dire que ladite nucléase n’est pas active vis-à-vis dudit acide nucléique présent au sein d’une membrane intègre. La présente invention permet de détecter spécifiquement l’acide nucléique contenu au sein de toute enveloppe intègre, ladite enveloppe étant non seulement une membrane cellulaire mais également une enveloppe virale, une enveloppe de sporale ou une capsule synthétique. En particulier, la présente invention permet de détecter spécifiquement l’acide nucléique intracellulaire, c’est-à-dire l’acide nucléique compris dans une cellule intègre et donc considérée, a priori, comme viables. Description détaillée de l’invention Dans la présente description, le terme « comprenant » inclut le terme « incluant » et l'expression « consistant en ». Par exemple, une composition comprenant le composé X désigne une composition comprenant exclusivement le composé X ou peut également comprendre un autre composé. Selon un premier aspect, l’invention a pour objet un procédé d’analyse ou de modification du matériel génétique contenu dans une enveloppe intègre, comprenant au moins les étapes suivantes : a) traitement par au moins une nucléase d’une première fraction d’un échantillon biologique contenant ou susceptible de contenir i) de l’acide nucléique libre et ii) de l’acide nucléique compris dans au moins une enveloppe intègre, puis inactivation de ladite nucléase par tout procédé connu de la personne du métier, b) détection d’une séquence nucléotidique cible et d’acide nucléique dégradé par ledit traitement dans ladite première fraction, c) détection d’une séquence nucléotidique cible et d’acide nucléique dégradé par ledit traitement dans ladite première fraction, dans une deuxième fraction de l’échantillon biologique non soumise à un traitement par ladite nucléase, d) comparaison des résultats obtenus lors des étapes b) et c) de détection de la séquence nucléotidique cible et d’acide nucléique dégradé dans lesdites première et deuxième fraction, e) sélection d’au moins une nucléase capable de dégrader l’acide nucléique libre tout en préservant l’acide nucléique compris dans une enveloppe intègre, f) traitement par ladite au moins une nucléase d’une fraction test dudit échantillon biologique, g) application, à au moins une séquence nucléotidique cible de l’acide nucléique présent à l’intérieur de ladite enveloppe intègre, d’un procédé d’analyse ou de modification. Selon un premier mode de réalisation de ce premier aspect, l’invention a pour objet un procédé d’analyse du matériel génétique contenu dans une enveloppe intègre, comprenant au moins les étapes suivantes : a) traitement par au moins une nucléase d’une première fraction d’un échantillon biologique contenant ou susceptible de contenir i) de l’acide nucléique libre et ii) de l’acide nucléique compris dans au moins une enveloppe intègre, puis inactivation de ladite nucléase par tout procédé connu de la personne du métier, b) détection d’une séquence nucléotidique cible et d’acide nucléique dégradé par ledit traitement dans ladite première fraction, c) détection d’une séquence nucléotidique cible et d’acide nucléique dégradé par ledit traitement dans ladite première fraction, dans une deuxième fraction de l’échantillon biologique non soumise à un traitement par ladite nucléase, d) comparaison des résultats obtenus lors des étapes b) et c) de détection de la séquence nucléotidique cible et d’acide nucléique dégradé dans lesdites première et deuxième fraction, e) sélection d’au moins une nucléase capable de dégrader l’acide nucléique libre tout en préservant l’acide nucléique compris dans une enveloppe intègre, f) traitement par ladite au moins une nucléase d’une fraction test dudit échantillon biologique, g) amplification par une réaction de PCR d’au moins une séquence nucléotidique cible de l’acide nucléique présent à l’intérieur de ladite enveloppe intègre, h) analyse du matériel génétique présent à l’intérieur d’au moins une enveloppe intègre dudit échantillon biologique. Selon un deuxième mode de réalisation de ce premier aspect, l’invention a pour objet un procédé de modification du matériel génétique contenu dans une enveloppe intègre, comprenant au moins les étapes suivantes : a) traitement par au moins une nucléase d’une première fraction d’un échantillon biologique contenant ou susceptible de contenir i) de l’acide nucléique libre et ii) de l’acide nucléique compris dans au moins une enveloppe intègre, puis inactivation de ladite nucléase par tout procédé connu de la personne du métier, b) détection d’une séquence nucléotidique cible et d’acide nucléique dégradé par ledit traitement dans ladite première fraction, c) détection d’une séquence nucléotidique cible et d’acide nucléique dégradé par ledit traitement dans ladite première fraction, dans une deuxième fraction de l’échantillon biologique non soumise à un traitement par ladite nucléase, d) comparaison des résultats obtenus lors des étapes b) et c) de détection de la séquence nucléotidique cible et d’acide nucléique dégradé dans lesdites première et deuxième fraction, e) sélection d’au moins une nucléase capable de dégrader l’acide nucléique libre tout en préservant l’acide nucléique compris dans une enveloppe intègre, f) traitement par ladite au moins une nucléase d’une fraction test dudit échantillon biologique, g) modification d’au moins une séquence nucléotidique cible de l’acide nucléique présent à l’intérieur de ladite enveloppe intègre au moyen d’une technique de type CRIPR/Cas9. Par « échantillon biologique », on entend un échantillon contenant ou susceptible de contenir de la matière biologique, c’est-à-dire toute matière contenant des informations génétiques et qui est autoreproductible ou reproductible dans un système biologique. Selon un mode de réalisation particulier, un procédé selon l’invention est mis en œuvre à partir d’un échantillon biologique choisi parmi : un prélèvement issu de l’environnement ou un prélèvement d’origine humaine ou animale, et plus particulièrement : - un prélèvement liquide, notamment un prélèvement issu de l’environnement choisi parmi : les eaux souterraines, les précipitations, les eaux de surface, la glace et les fontes glaciaires, l’eau salée, la saumure, les eaux d’estuaire, les eaux usées, les eaux issues de procédé industriel et l’eau potable, - un prélèvement solide, notamment un prélèvement issu de l’environnement choisi parmi :un échantillon de terre, un échantillon végétal notamment de plante ou de fleurs, un support solide poreux, tel que notamment une lingette, - un prélèvement gazeux, notamment un prélèvement issu de l’environnement, - un prélèvement d’origine humaine ou animale, ledit prélèvement étant liquide ou solide, tel que notamment une biopsie ou un échantillon de sang, d’urine, de salive ou autre prélèvement corporel. Par « prélèvement liquide », on entend un prélèvement de nature majoritairement liquide, contenant éventuellement en outre des particules ou des éléments colloïdaux. Par « prélèvement solide », on entend un prélèvement de nature majoritairement solide. L'échantillon peut comprendre deux ou plusieurs cibles, il peut être purifié ou non purifié, et/ou clarifié ou non clarifié, préalablement au procédé selon l’invention. L'échantillon peut être un échantillon biologique qui a été traité pour être utilisé dans les procédés de l'invention. Dans certains modes de réalisation, si l'échantillon biologique n'interfère pas avec les méthodes de l'invention, il peut être utilisé non traité (et/ou non purifié). L’échantillon biologique peut comprendre notamment des cellules, des tissus, des produits sanguins, des fluides corporels et du matériel viral. Par « analyse du matériel génétique » on entend la caractérisation de l’acide nucléique présent dans un échantillon. Par « enveloppe », on entend les membranes cellulaires eucaryotes et procaryotes, les particules virales et toute autre enveloppe de type spore, ainsi que tout type d’enveloppe synthétique susceptible de contenir des acides nucléiques. Par « enveloppe intègre » on entend un contenant susceptible de délimiter un compartiment intérieur isolé de l’extérieur dudit compartiment. Ladite enveloppe peut notamment être d’origine naturelle ou d’origine synthétique. Par « matériel génétique contenu dans une enveloppe intègre » on entend le matériel génétique compris dans le compartiment délimité par une enveloppe intègre. Par « enveloppe », on entend un contenant choisi parmi une enveloppe cellulaire, comprenant notamment une membrane cellulaire et éventuellement une paroi, une enveloppe virale, une enveloppe de spore et une capsule synthétique. Par « acide nucléique », « polynucléotide » ou « oligonucléotide » on entend un polymère de monomères nucléotidiques ou un analogue de celui-ci, incluant les polymères doubles et simples brins, les désoxyribonucléotides, les ribonucléotides, leurs formes alpha-anomères, et les polymères similaires. Au sein desdits polymères d’acide nucléique, ou chaînes d’acide nucléique, les monomères sont notamment liés par des liaisons phosphodiester, le terme « liaison phosphodiester » faisant référence à des liaisons phosphodiester ou à des liaisons comprenant du phosphate ou des analogues de celui-ci, y compris des contre-ions associés. L’expression « polymère de monomères nucléotidiques » est également désigné par « chaîne de monomères nucléotidiques » ou « chaîne nucléotidique ». Par « séquence nucléotidique cible » on entend une séquence particulière d’un polymère d'acide nucléique à laquelle une amorce ou une sonde particulière est capable de s'hybrider spécifiquement. Dans un procédé selon l’invention, une ou plusieurs séquences nucléotidiques cibles peuvent être présentes au sein d’un polymère d’acide nucléique. Par « nucléase » on entend une enzyme dont la fonction principale, ou l’unique fonction connue, consiste en la dégradation partielle ou totale d’au moins un type d’acide nucléique. Une nucléase dégrade principalement les liaisons phosphodiester des brins d’acide nucléique. Ledit acide nucléique est de l’ADN, de l’ADNc ou de l’ARN. Selon un aspect particulier, ladite nucléase est une désoxyribonucléase, ou ADNase, ou DNase, qui hydrolyse l’ADN. Selon un autre aspect particulier, ladite nucléase est une ribonucléase ou ARNase, ou RNase, qui hydrolyse l’ARN. Le substrat desdites nucléases est un acide nucléique simple brin ou un acide nucléique double brin. Dans un procédé selon l’invention, ladite nucléase est une endonucléase ou une exonucléase. De plus, ladite nucléase peut être naturelle ou recombinante. Ladite nucléase peut être naturelle ou recombinante. Cette définition exclut les ADN polymérases capables de cliver les nucléotides. Selon un aspect particulier, un procédé selon l’invention comprend une étape de traitement par au moins une nucléase d’une première fraction d’un échantillon biologique contenant ou susceptible de contenir i) de l’acide nucléique libre et ii) de l’acide nucléique compris dans au moins une enveloppe intègre, ladite étape étant réalisée en condition réactionnelle spécifique susceptible de représenter les conditions réactionnelles rencontrées lors de l’analyse du matériel génétique d’un échantillon prélevé dans l’environnement. Ladite condition réactionnelle spécifique est notamment choisie parmi : - une concentration saline élevée, - une concentration élevée en tanins, - une concentration élevée en composants connus pour leur caractère inhibiteur des réactions d’amplification par PCR. Une étape traitement d’un échantillon par au moins une nucléase comprend la mise en présence : - d’une quantité effective de nucléase, exprimée en unités de nucléase, et - de l’échantillon, à une température permettant l’activité de la nucléase et pendant une durée suffisante pour constater l’activité de la nucléase. La personne du métier pourra aisément sélectionner la quantité effective de nucléase permettant une dégradation, au moins partielle et de préférence totale, de l’acide nucléique libre. Cette étape permet de sélectionner au moins une nucléase susceptible d’être active dans l’échantillon objet du procédé de test. Selon un aspect particulier, pour effectuer cette sélection, l’étape de traitement par au moins une nucléase d’une première fraction d’un échantillon biologique contenant ou susceptible de contenir i) de l’acide nucléique libre et ii) de l’acide nucléique compris dans au moins une enveloppe intègre, est réalisée en condition réactionnelle d’hyper salinité. Cette condition peut notamment être recrée par l’addition d’une concentration saline d’au moins 10 mM, au moins 20 mM, au moins 50 mM, ou 60 mM. Le sel utilisé pour ladite addition saline est notamment le chlorure de sodium (NaCl). Une personne du métier pourra choisir toute concentration appropriée de tout type de sel. En particulier, une nucléase active en présence d’une concentration saline élevée indique une nucléase dont l’activité catalytique de référence est conservée à hauteur d’au moins 70 %, de préférence au moins 80 % ou au moins 90% de son activité catalytique de référence dans un milieu caractérisé par une concentration saline élevée. Dans un procédé selon l’invention, la concentration en nucléase dans l’échantillon est définie en nombre d’unités (U), une unité de nucléase étant définie comme la quantité d’enzyme capable de dégrader totalement 1 µg d’ADN en 10 minutes à 37°C dans un volume de réaction de 25 µL, l’enzyme et le substrat étant suspendus dans un tampon approprié. Par « inactivation de ladite nucléase » on entend tout procédé connu d’inactivation enzymatique, notamment par inactivation thermique, en particulier en bain sec à 65°C pendant 10 minutes, ou par inactivation chimique, notamment par l’addition d’un tampon classique d’inactivation, bien connu de l’homme du métier. L’analyse génétique d’un échantillon est actuellement couramment réalisée au moyen de techniques telles que notamment la réaction en chaine de la polymérase (PCR pour « Polymerase Chain Reaction ) », plus particulièrement la PCR quantitative (q-PCR) et la PCR numérique (dPCR pour digital PCR). Par « PCR » on entend tout procédé d’amplification comprenant au moins une étape de PCR, plus particulièrement une étape de PCR quantitative (q-PCR) ou de PCR numérique (dPCR pour digital PCR). De préférence, un procédé selon l’invention comprend une étape d’amplification par dPCR. Un procédé selon l’invention est compatible avec l’ensemble des plateformes de PCR numérique sur le marché, en particulier en microgouttelettes et/ou micro compartiments. Parmi celles-ci, on peut citer des équivalents commerciaux tel que le QIAcuity Digital PCR System – QIAGEN et QX ONE Droplet Digital PCR (ddPCR) System - Bio-Rad. Ladite réaction de PCR est réalisée dans un dispositif multiplexe de PCR numérique. La présence d’une séquence nucléotidique cible est mise en évidence selon les procédés bien connus d’une personne du métier. Les signaux mesurés sont notamment des signaux détectés à une longueur d’onde caractéristique d’un colorant, des agents fluorescents ou des agents radioactifs. La détection du signal inclut tout type de détection tel que notamment une détection directe ou une méthode de transfert d’énergie entre molécules fluorescentes, comme par exemple le FRET (« Forster Resonance Energy Transfer » ). Les colorants sont choisis parmi tous les colorants disponibles permettant l'identification sélective d’une cible nucléotidique donnée. Une personne du métier saura aisément choisir parmi tous les colorants disponibles pour sélectionner des colorants distinguables lors de l’analyse multiplexe. En particulier, une personne du métier saura choisir deux fluorophores différents ou plus ayant des longueurs d'onde d'absorption et d'émission bien séparées les unes des autres. Les colorants peuvent être attachés à une amorce ou à une sonde, cet attachement à une amorce ou une sonde étant compatible avec une amplification par PCR, ou s'intercaler dans l'ADN, de préférence double brin, le cas échéant (colorants intercalaires). Dans un procédé selon l’invention, les colorants sont choisis parmi les colorants simples (i.e. non fluorescents) et les colorants fluorescents (fluorophores). Les fluorophores couramment utilisés dans le FRET comprennent la fluorescéine, la 5-carboxyfluorescéine (FAM), la 2'7'-diméthoxy-4'5'-dichloro-6-carboxyfluorescéine (JOE), la rhodamine, la 6-carboxyrhodamine (R6G), la N,N,N',N'-tétraméthyl-6-carboxyrhodamine (TAMRA). Les agents radioactifs sont choisis parmi tous les agents utilisables dans un procédé de dPCR multiplexe connus par une personne du métier. Ce sont notamment le phosphore 32, le tritium, le technétium-99m, l'iode 125 ou tout autre élément connu dans la technique. Selon un deuxième aspect, l’invention a pour objet un procédé d’analyse ou de modification du matériel génétique présent à l’intérieur d’une enveloppe intègre, ledit procédé comprenant au moins les étapes suivantes : a) traitement par au moins une nucléase d’un échantillon biologique contenant, ou susceptible de contenir, i) de l’acide nucléique compris dans au moins une enveloppe intègre et ii) de l’acide nucléique non compris dans une enveloppe intègre, ladite nucléase étant choisie parmi : une DNAse choisie parmi : - DNase TURBOTM (ref : AM2238/2239, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA) - DNase I-XT (ref : M0570, New England BioLabs, Beverly, MA) - DNase I (ref : M0303, New England BioLabs, Beverly, MA) b) application à au moins une séquence nucléotidique cible de l’acide nucléique présent à l’intérieur de ladite enveloppe intègre, d’un procédé d’analyse ou de modification. Selon un aspect particulier, un procédé d’analyse du matériel génétique présent à l’intérieur d’une enveloppe intègre, selon l’invention, comprend au moins les étapes suivantes : a) traitement par au moins une nucléase d’un échantillon biologique contenant, ou susceptible de contenir, i) de l’acide nucléique compris dans au moins une enveloppe intègre et ii) de l’acide nucléique non compris dans une enveloppe intègre, ladite nucléase étant choisie parmi : une DNAse choisie parmi : - DNase TURBOTM (ref : AM2238/2239, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA) - DNase I-XT (ref : M0570, New England BioLabs, Beverly, MA) - DNase I (ref : M0303, New England BioLabs, Beverly, MA) b) amplification par une réaction de PCR d’au moins une séquence nucléotidique cible de l’acide nucléique présent à l’intérieur de ladite enveloppe intègre, c) analyse du matériel génétique dudit échantillon biologique, présent à l’intérieur d’une enveloppe intègre. Selon un autre mode de réalisation particulier de ce deuxième aspect, l’invention a pour objet un procédé de modification du matériel génétique présent à l’intérieur d’une enveloppe intègre, ledit procédé comprenant au moins les étapes suivantes : a) traitement par au moins une nucléase d’un échantillon biologique contenant, ou susceptible de contenir, i) de l’acide nucléique compris dans au moins une enveloppe intègre et ii) de l’acide nucléique non compris dans une enveloppe intègre, ladite nucléase étant choisie parmi : une DNAse choisie parmi : - DNase TURBOTM (ref : AM2238/2239, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA) - DNase I-XT (ref : M0570, New England BioLabs, Beverly, MA) - DNase I (ref : M0303, New England BioLabs, Beverly, MA) b) modification d’au moins une séquence nucléotidique cible de l’acide nucléique présent à l’intérieur de ladite enveloppe intègre au moyen d’une technique de type CRIPR/Cas9. De préférence, dans un procédé selon l’invention, ladite enveloppe est choisie parmi : une enveloppe cellulaire, une capsule virale et une capsule synthétique. L’invention est applicable à l’analyse d’acide nucléique synthétique encapsulé artificiellement au sein de tout type de membrane synthétique. Selon un aspect particulier, dans un procédé selon l’invention ladite nucléase est choisie parmi : - une DNAse de type « DNAse I-XT » distribuée par la société New England BioLabs. Selon un aspect particulier, un procédé selon l’invention comprend une étape supplémentaire dans laquelle l’échantillon préparé et traité par une nucléase est dilué préalablement à l’analyse par PCR proprement dite. La dilution de l’échantillon est de préférence d’au moins un facteur 10, de préférence d’un facteur 50, plus préférentiellement d’un facteur 100. Selon un aspect particulier, au moins deux dilutions différentes de l’échantillon sont analysées par PCR. L’avantage de cette étape de dilution consiste à fournir une dilution limite de l’échantillon, afin de favoriser la détection d’une cooccurrence significative de la présence de plusieurs micro-organismes dans un même échantillon par rapport à la détection d’une cooccurrence de plusieurs micro-organismes qui serait uniquement statistique. Un second avantage de cet aspect particulier d’un procédé selon l’invention consiste à fournir au moins deux résultats pour l’analyse génétique d’un même échantillon, et donc à permettre une analyse plus complète dudit échantillon. Par « au moins deux dilutions différentes », on entend deux, trois, quatre, cinq, six, sept, huit, neuf, dix, onze, douze, treize, quatorze ou quinze dilutions, ou davantage selon les besoins de l’analyse génétique. Selon un aspect particulier d’un procédé selon l’invention, l’étape d’amplification par une réaction de PCR, est précédée d’une étape de lyse des enveloppes susceptibles d’être présentes dans ledit échantillon intègre. Une méthode de lyse membranaire pourra aisément être mise en œuvre selon la nature de l’enveloppe dont la lyse est souhaitée. En particulier, ladite étape de lyse sera réalisée en ajoutant un tampon de lyse, bien connu de l’homme du métier, et en apportant un prétraitement mécanique à l’échantillon, ce prétraitement peut notamment consister en une étape de broyage ou de friction de l’échantillon en présence de billes de verre. Ce prétraitement thermique entraîne la fragilisation des membranes résistantes, notamment les membranes des spores et les membranes de certaines bactéries. Selon un aspect particulier du procédé selon l’invention, l’étape d’amplification par une réaction de PCR, est précédée d’une étape de destruction de ladite enveloppe intègre. Les kits utilisés sont : - NucleoMag DNA/RNA Water kit, Tampon de Lyse MWA1 (ref : 744220.4, Macherey Nagel, Allemagne) - NucleoMag Pathogen kit, Tampon de Lyse NPL1 (ref : 744210.4, Macherey Nagel, Allemagne) - NucleoMag Tissu kit, mpon de Lyse T1 (ref : 744210.4, Macherey Nagel, Allemagne). Un procédé selon l’invention est compatible avec l’ensemble des plateformes de PCR sur le marché, notamment la PCR numérique (dPCR), en particulier en microgouttelettes et/ou micro compartiments. Parmi celles-ci, on peut citer des équivalents commerciaux tel que le QIAcuity Digital PCR System – QIAGEN et QX ONE Droplet Digital PCR (ddPCR) System - Bio-Rad. Selon un aspect de l’invention, ledit procédé comprend une réaction de PCR réalisée dans un dispositif de PCR numérique (dPCR). Selon un aspect plus particulier, un procédé selon l’invention comprend une réaction de PCR multiplexe. Selon un aspect particulier, l’invention a pour objet l’utilisation d’un procédé selon l’invention d’analyse du matériel génétique pour la détection d’au moins un microorganisme dans un échantillon. Selon un autre aspect particulier, l’invention a pour objet l’utilisation d’un procédé selon l’invention d’analyse du matériel génétique pour la détection de la co-occurrence d’au moins deux microorganismes dans un même échantillon. Selon un aspect particulier, l’invention a pour objet l’utilisation d’un procédé selon l’invention d’analyse du matériel génétique présent dans un échantillon, pour la détection de la co-occurrence d’au moins deux micro-organismes dans un même échantillon. Selon un aspect particulier, l’invention a pour objet l’utilisation d’un procédé selon l’invention d’analyse du matériel génétique présent dans un échantillon pour le génotypage. Selon un aspect particulier, l’invention a également pour l’objet l’utilisation d’un procédé tel que défini précédemment pour : la détection de la cooccurrence d’au moins deux microorganismes dans un même échantillon biologique, pour le génotypage et/ou pour l’analyse du matériel génétique compris dans une enveloppe synthétique Selon un autre aspect particulier, l’invention a également pour objet l’utilisation d’un procédé de modification tel que défini précédemment pour la modification du matériel génétique compris dans une enveloppe synthétique. Par « génotypage » on entend la détermination d’une variation génétique à une position donnée du génome considéré. D’autres avantages et caractéristiques apparaîtront à l’examen de la description détaillée d’un mode de réalisation nullement limitatif, et des dessins annexés. La FIG. 1 de l’exemple 1 représente les diagrammes de dispersion des résultats obtenus dans des conditions réactionnelles « classiques » d’action de DNAse lors de l’amplification par dPCR d’échantillons préparés in vitro, les lignes A, B et C de la figure correspondent respectivement aux conditions suivantes : - A : culture de E. coli, - B : extrait d’ADN de E. coli et - C : culture de E. coli additionnée d’un extrait d’ADN de E. coli. De gauche à droite, les résultats montrent les échantillons non traités (colonne de gauche), traités par la DNAse I (colonne du centre) ou traités par la DNAse XT (colonne de droite). Pour chacune des figures, le nombre de partitions positives (Part. +), de partitions négatives (Part. -) et le seuil de détection sont indiqués. La FIG. 2 de l’exemple 1 représente les diagrammes de dispersion des résultats obtenus dans des conditions réactionnelles d’action de DNAse en forte salinité, avec : - ligne A : un extrait d’ADN de E. coli, et - ligne B : un extrait de culture de E. coli additionné d’un extrait d’ADN de E. coli. De gauche à droite, les résultats montrent les échantillons non traités (colonne de gauche), traités par la DNAse I (colonne du centre) ou traités par la DNAse XT (colonne de droite). Pour chacune des figures, le nombre de partitions positives (Part. +), de partitions négatives (Part. -) et le seuil de détection sont indiqués. La FIG. 3 de l’exemple 2 schématise les étapes d’un procédé selon l’invention. Il est bien entendu que les modes de réalisation qui seront décrits par la suite ne sont nullement limitatifs. On pourra notamment imaginer des variantes de l’invention ne comprenant qu’une sélection de caractéristiques décrites par la suite isolées des autres caractéristiques décrites, si cette sélection de caractéristiques est suffisante pour conférer un avantage technique ou pour différencier l’invention par rapport à de l’état de la technique antérieur. La présente invention se comprendra mieux à la lecture des exemples suivants, qui sont donnés pour illustrer l’invention et non pour en limiter la portée. EXEMPLES Exemple 1 : Détection in vitro de microorganismes intègres Matériel et méthodes Des échantillons sont préparés à partir d’une culture in vitro de E. coli selon différentes conditions réactionnelles présentées dans le tableau 1 ci-dessous : Echantillon A Echantillon B Echantillon C Préparation de l’échantillon Culture bactérienne E. coli Extraits d’ADN de E. coli Culture bactérienne E. coli + Extraits d’ADN de E. coli Traitement + DNAse Pas de DNAse + DNAse Pas de DNAse + DNAse Pas de DNAse La culture Escherichia coli est réalisée à partir d’un glystock, c’est une culture de 14H à 37°C sous agitation à 300 rpm dans du milieux LB (lysogeny broth)). L’extraction est réalisée avec le kit NucleoMag DNA/RNA Water (ref : 744220.4, Macherey Nagel, Allemagne) à partir d’une prise d’essai de 100 µL de la culture. La condition « culture bactérienne E. coli » correspond à 100 µL de ladite culture, la condition « extraits d’ADN de E. coli » correspond à l’ADN extrait de 100 µL de ladite culture, la condition « culture bactérienne E. Coli + extraits d’ADN de E. coli » correspond à 100 µL de la culture additionnés de l’ADN extrait de 100 µL de la culture. Les échantillons sont conservés à 4°C dans l’attente de leur traitement ultérieur. Le cas échéant, les échantillons sont additionnés d’une nucléase dans les conditions suivantes : - addition de la DNAse I ou de la DNAse I-XT du fournisseur NEB (New England BioLabs), selon les recommandations du fournisseur, soit 2u de DNase I-XT ou DNase I, Buffer 10X dans un volume final de 100 µL. Les conditions réactionnelles sont : soit les conditions classiques recommandées par le fournisseur, soit les conditions en forte condition saline. Soit : - DNase I-XT Reaction Buffer (10x) + 2 unités DNase I + qsp 100 µL H 2 O Nuclease free. Incuber 15 min à 37°C et - DNase I-XT Reaction Buffer (10x) + 2 unités DNase I + qsp 100 µL H 2 O Nuclease free. Incuber 10 min à 37°C, puis ajouter de 1 µL de 0,5M EDTA puis incubation à 10min-75°C puis ajout de 1 µL d’une solution NaCl stock de 6M. Les échantillons sont ensuite analysés par PCR. Les produits et kits suivants sont utilisés : QIAcuity Nanoplate 26K 24 well (Ref. ID : 250001) et QIAcuity Probe PCR Kit Qiagen, (Ref. ID : 250102). Dans le mix PCR, les amorces sens et antisens sont présentes à une concentration finale de 450 nM, la sonde 5’-HEX-CCTGCCGCGTTGGCAATGTCGAGT-BHQ-1-3’ (SEQ ID N°1) est présente à une concentration finale de 125 nM. Les séquences nucléotidiques, les conditions d’amplification et les conditions de détection du signal sont respectivement décrites dans les tableaux 2, 3 et 4 ci-dessous. SEQ ID N° Description Séquence 1 Détection E. coli – sonde CCTGCCGCGTTGGCAATGTCGAGT 2 Détection E. coli – amorce sens CCAGTTTGCGTTCAATACCG 3 Détection E. coli – amorce antisens GTCGCTAGAAAACGTCCGTA ETAPES Température Durée Cycles Dénaturation initiale 95°C 2 min 1 Dénaturation 95°C 15 sec 40 Hybridation/élongation Tm(final) : 58°C 6 sec Imagerie 1 Fluorescence Canal Durée d’exposition (ms) Gain HEX Jaune 700 8 Résultats Les résultats sont analysés par QIAcuity Software Suite, ils sont exprimés en nombre de copies par microlitre d’échantillon et présentés dans le tableau 5 suivant : Echantillon Conditions/facteur de dilution Traitement Concentration copie/microl Partitions valides Partitions positives Partitions négatives A Standard Contrôle - 3788,8 25390 23833 1557 A Standard DNAse I ND 25466 25466 0 A Standard DNAse XT 1800,2 25384 18612 6772 B Standard Contrôle - ND 25359 25359 0 B Standard DNAse I 751,2 25319 10507 14812 B Standard DNAse XT 1228 25422 22 25400 B FD 100 Contrôle - 331,1 25285 5503 19782 B FD 100 DNAse I 2476 25377 47 25330 B FD 100 DNAse XT 0 25444 0 25444 B NaCl 60 mM Contrôle - ND 25366 25366 0 B NaCl 60 mM DNAse I 321,8 25398 5353 20045 B NaCl 60 mM DNAse XT 0,907 25752 17 25255 C Standard Contrôle - 10615,2 25460 25450 10 C Standard DNAse I ND 25370 25370 0 C Standard DNAse XT 2665,7 25362 21930 3432 C FD 100 Contrôle - 3389,4 24768 22544 2224 C FD 100 DNAse I ND 25368 25368 0 C FD 100 DNAse XT 2411,8 25397 20926 4471 C NaCl 60 mM Contrôle - 10242,4 25355 25341 14 C NaCl 60 mM DNAse I 13095,7 25367 25365 2 C NaCl 60 mM DNAse XT 18461 25326 18461 6865 La FIG. 1 représente les diagrammes de dispersion des résultats obtenus dans des conditions réactionnelles « classiques » d’action de DNAse avec : - ligne A : un extrait de culture de E. coli , - ligne B : un extrait d’ADN de E. coli , et - ligne C : un extrait de culture de E. coli additionné d’un extrait d’ADN de E. coli. De gauche à droite, les résultats montrent les échantillons non traités (colonne de gauche), traités par la DNAse I (colonne du centre) ou traités par la DNAse XT (colonne de droite). Dans le cas de l’extrait de culture de E. coli ( FIG. 1 ligne A), les résultats expérimentaux montrent que la DNAse I n’a pas clivé l’ADN alors que la DNAse XT a clivé une partie de la culture. Une mortalité bactérienne est observée, ce qui a conduit à de l’ADN libre qui a été clivé par la DNAse XT. Dans le cas de l’extrait d’ADN de E. coli ( FIG. 1 ligne B), les résultats expérimentaux montrent que la DNAse I a partiellement clivé l’ADN alors que la DNAse XT a presque totalement clivé l’ADN. Dans le cas de l’extrait de culture de E. coli additionné d’un extrait d’ADN de E. coli ( FIG. 1 ligne C), les résultats expérimentaux montrent que la DNAse I n’a pas clivé l’ADN alors que la DNAse XT a clivé une partie de l’ADN libre. Dans la FIG. 2 , les lignes A et B représentent respectivement les diagrammes de dispersion des résultats obtenus dans des conditions réactionnelles d’action de DNAse en forte salinité, avec une concentration de 60 mM de NaCl avec : - ligne A : un extrait d’ADN de E. coli , et - ligne B : un extrait de culture de E. coli additionné d’un extrait d’ADN de E. coli. De gauche à droite, les résultats montrent les échantillons non traités (colonne de gauche), traités par la DNAse I (colonne du centre) ou traités par la DNAse XT (colonne de droite). Dans le cas de l’extrait d’ADN de E. coli ( FIG. 2 ligne A), la DNAse I est sensible à la présence de NaCl à la concentration de 60 mM, avec la présence d’un cluster « en pluie » alors que la DNAse XT a clivé la presque totalité des ADN libres. Dans le cas de l’extrait de culture de E. coli additionné d’un extrait d’ADN de E. coli ( FIG. 2 ligne B), la DNAse I n’a pas clivé l’ADN alors que la DNAse XT a clivé une partie de l’ADN libre. Les résultats montrent aussi l’ADN non clivé correspond à la bactérie E. coli intègre. Une mortalité a été observée dans la culture bactérienne. Conclusion Ces résultats montrent qu’en condition contrôle sur matrice simple, c’est-à-dire un échantillon « non-environnemental », avec ou sans NaCl, la DNase I-XT est active et présente un pourcentage de digestion de l’ADN libre plus important que celui de la DNase I. Exemple 2 : Détection de la présence de la souche bactérienne Microthrix dans des prélèvements de l’environnement Matériel et méthodes La FIG. 3 schématise un procédé selon l’invention, dans lequel la matrice comporte de l’acide nucléique libre et des micro-organismes. L’addition à ce milieu d’une DNAse à haute tolérance conduit à la dégradation spécifique de l’acide nucléique libre, sans agir sur l’acide nucléique enveloppé dans un microorganisme intègre. Après le traitement par la DNAse, l’acide nucléique est extrait de l’environnement puis est amplifié par dPCR. Les prélèvements dans l’environnement constituent une matrice complexe, comprenant des inhibiteurs de PCR, et notamment une forte concentration en sels et en tanins et la présence d’acides nucléiques libres. Les échantillons sont prélevés à différents points d’une station d’épuration, afin de détecter la présence de la souche bactérienne Microthrix dans son environnement naturel. L’échantillon « entrée de STEP » est prélevé avant traitement dans la station d’épuration des eaux usées (STEP). L’échantillon « digesteur » est prélevé pendant le traitement des déchets de type boue en anaérobie. L’échantillon « boue de recirculation » est prélevé dans la boue après son traitement dans le digesteur. Les échantillons sont conservés à 4°C dans l’attente de leur traitement ultérieur. Les échantillons, boue de station d’épuration ou eaux usées de station d’épuration, sont ensuite prétraités comme indiqué ci-dessous. Les boues d’épuration sont traitées comme suit à partir de l’échantillon brut réceptionné, d’un volume jusqu’à un litre ou un kilogramme : - Homogénéiser par 10 retournements - Prélèvement de 200 μL dans un tube 2 mL - Centrifugation à température ambiante (TA) : 15mn-5000 g - Élimination du surnageant - Ajout 20 µL DNase I-XT Reaction Buffer (10x) + 2 µL (4unité) DNase I-XT + 178 µL H 2 O Nuclease free - Resuspendre le culot puis incuber 15 min à 37°C. Centrifuger 5min à 5000 g puis éliminer le surnageant - Ajout de 2 billes de verre (diamètre 6 mm) - Cycle GENOGRINDER : 1 cycle de 30 sec à 1400 cpm - Centrifugation à TA : 30s-5000 g - Ajouter 200 μL PBS 1x - Vortex : 5 min-1500 rpm - Centrifugation à TA : 5 mn-500 g - Transférer le surnageant dans un tube 1,5 mL identifié. L’échantillon est prêt pour extraction. Pour la matrice boue de station d’épuration : Ajout 20 µL DNase I-XT Reaction Buffer (10x) + 2 µL (4 unités) DNase I-XT + 178 µL H 2 O Nuclease free. Le culot est resuspendu puis incubé 15 min à 37°C, une centrifugation 5 min à 5000 g et l’élimination du surnageant sont réalisés. Les eaux usées de station d’épuration sont traitées comme suit, à partir de l’échantillon brut réceptionné (jusqu’a 1 L) : - 10 retournements - Prélèvement de 15 mL - Centrifugation à TA : 15 min-3234 g - Elimination du surnageant - Ajout 20 µL DNase I-XT Reaction Buffer (10x) + 2 µL (4 unités) DNase I-XT + 178 µL H 2 O Nuclease free. Resuspendre le culot puis incuber 15 min à 37°C. Centrifuger. L’échantillon est prêt pour extraction. Pour la matrice eaux usée : ajout 20 µL DNase I-XT Reaction Buffer (10x) + 2 µL (4 unités) DNase I-XT + 178 µL H 2 O Nuclease free. Resuspendre le culot puis incuber 15 min à 37°C. Le culot est resuspendu puis incubé 15 min à 37°C, une centrifugation 5 min à 5000 g et l’élimination du surnageant sont réalisés. Les échantillons sont ensuite analysés par PCR. Les produits et kits suivants sont utilisés : QIAcuity Nanoplate 26K 24 well (Ref. ID : 250001) et QIAcuity Probe PCR Kit Qiagen, (Ref. ID : 250102). Dans le mix PCR, les amorces sens et antisens sont présentes à une concentration finale de 450 nM, la sonde 5’-FAM- TGAAATCTCAGGGCCCAACCCTGAGC-BHQ-1-3’ (SEQ ID N°4) est présente à une concentration finale de 125 nM. Les séquences nucléotidiques, les conditions d’amplification et les conditions de détection du signal sont respectivement décrites dans les tableaux 6, 7 et 8 ci-dessous. SEQ ID N° Description Séquence 4 Détection Microthrix - sonde TGAAATCTCAGGGCCCAACCCTGAGC 5 Détection Microthrix – amorce sens TCGTAGGTGGTTGAGTAAGT 6 Détection Microthrix – amorce antisens GACTCTAGTCAGAGCAGTATC Etapes Température Durée Cycles Dénaturation initiale 95°C 2 min 4 Dénaturation 95°C 15 sec 40 Hybridation/élongation Tm(final) : 58°C 60 sec Imagerie 1 Fluorescence Canal Durée d’exposition (ms) Gain FAM Vert 700 8 Les résultats sont analysés par QIAcuity Software Suite et Easydata. Les résultats sont exprimés en nombre de copies par litre d’échantillon. Le tableau 9 présente les résultats par date de prélèvement. Nom de l’échantillon Date de prélèvement DNAse Absente Présente Entrée STEP 20-09-22 ND ND Boue de recirculation 20-09-22 3,87E+07 8,45E+06 Digesteur 20-09-22 1,59E+07 2,42E+07 Entrée STEP 22-09-22 7,07E+04 ND Boue de recirculation 22-09-22 2,29E+08 2,68E+06 Boue bassin BIO 2 22-09-22 2,42E+08 9,63E+06 Digesteur 22-09-22 1,15E+08 1,49E+07 AL IM - DIGESTEUR 22-09-22 1,62E+08 1,45E+08 Entrée STEP 27-09-22 7,20E+04 ND Boue de recirculation 27-09-22 2,05E+08 1,03E+07 Digesteur 27-09-22 9,28E+07 1,11E+07 Entrée STEP 29-09-22 ND ND Boue de recirculation 29-09-22 2,39E+08 4,53E+07 Digesteur 29-09-22 7,64E+07 1,01E+07 Entrée STEP 04-10-22 1,77E+06 3,27E+06 Boue de recirculation 04-10-22 1,99E+08 3,21E+06 Digesteur 04-10-22 1,10E+08 E+06 Le tableau 10 présente les résultats par type d’échantillon. Nom de l’échantillon Date de prélèvement DNAse Absente Présente Entrée STEP 20-09-22 ND ND Entrée STEP 22-09-22 7,07E+04 ND Entrée STEP 27-09-22 7,20E+04 ND Entrée STEP 29-09-22 ND ND Entrée STEP 04-10-22 1,77E+06 3,27E+06 Boue de recirculation 20-09-22 3,87E+07 8,45E+06 Boue de recirculation 22-09-22 2,29E+08 2,68E+06 Boue de recirculation 27-09-22 2,05E+08 1,03E+07 Boue de recirculation 29-09-22 2,39E+08 4,53E+07 Boue de recirculation 04-10-22 1,99E+08 3,21E+06 Digesteur 20-09-22 1,59E+07 2,42E+07 Digesteur 22-09-22 1,15E+08 1,49E+07 Digesteur 27-09-22 9,28E+07 1,11E+07 Digesteur 29-09-22 7,64E+07 1,01E+07 Digesteur 04-10-22 1,10E+08 E+06 Boue bassin BIO 2 22-09-22 2,42E+08 9,63E+06 AL IM - DIGESTEUR 22-09-22 1,62E+08 1,45E+08 Les résultats expérimentaux montrent une différence observée entre les boues de recirculation et le digesteur, entre les échantillons traités à la DNAse et les échantillons non traités. Sur les échantillons en entrée de STEP du 22-09 et du 27-09, la DNAse cliverait tout l’ADN libre et il n'y aurait pas de bactéries intègres. Pour l'échantillon du 4-10-22, il n'y aurait que des bactéries intègres. Les échantillons non traités à la DNAse sont plus concentrés que les échantillons traités à la DNAse, l’écart entre les deux groupes d’échantillons est de 1 à 2 log. Les échantillons « Microthrix sans DNAse » contiennent de l’ADN libre et des bactéries intègres. Les échantillons « Microthrix avec DNAse » contiennent des bactéries intègres. Conclusion Les résultats montrent une différence de quantification avec ou sans traitement DNase I-XT. Ces résultats sont compatibles avec la présence d’ADN libre dans l’échantillon brut, éliminée par le traitement DNase I-XT. Procédé d’analyse ou de modification du matériel génétique présent à l’intérieur d’une enveloppe intègre, comprenant au moins les étapes suivantes : a) traitement par au moins une nucléase d’une première fraction d’un échantillon biologique contenant ou susceptible de contenir i) de l’acide nucléique libre et/ou ii) de l’acide nucléique compris dans une enveloppe intègre, b) détection d’une séquence nucléotidique cible et d’acide nucléique dégradé par ledit traitement dans ladite première fraction, c) détection d’une séquence nucléotidique cible et d’acide nucléique dégradé par ledit traitement dans ladite première fraction, dans une deuxième fraction de l’échantillon biologique non soumise à un traitement par ladite nucléase, d) comparaison des résultats obtenus lors des étapes b) et c) de détection de la séquence nucléotidique cible et d’acide nucléique dégradé dans lesdites première et deuxième fraction, e) sélection d’au moins une nucléase capable de dégrader l’acide nucléique libre tout en préservant l’acide nucléique compris dans une enveloppe intègre, f) traitement par ladite au moins une nucléase d’une fraction test dudit échantillon biologique, g) application à au moins une séquence nucléotidique cible de l’acide nucléique présent à l’intérieur de ladite enveloppe intègre, d’un procédé d’analyse ou de modification. Procédé selon la revendication 1, dans lequel l’étape g) consiste en une amplification par une réaction de PCR d’au moins une séquence nucléotidique cible de l’acide nucléique présent à l’intérieur de ladite enveloppe intègre et est suivie par une étape d’analyse du matériel génétique dudit échantillon biologique. Procédé selon la revendication 1, dans lequel l’étape g) consiste en une modification d’au moins une séquence nucléotidique cible de l’acide nucléique présent à l’intérieur de ladite enveloppe intègre au moyen d’une technique de type CRIPR/Cas9. Procédé d’analyse ou de modification du matériel génétique présent à l’intérieur d’une enveloppe intègre, comprenant au moins les étapes suivantes : a) traitement par au moins une nucléase d’un échantillon biologique contenant ou susceptible de contenir i) de l’acide nucléique libre et ii) de l’acide nucléique compris dans une enveloppe intègre, ladite nucléase étant choisie parmi : une DNAse choisie parmi la DNase I-XT, la DNase TURBO, b) application à au moins une séquence nucléotidique cible de l’acide nucléique présent à l’intérieur de ladite enveloppe intègre, d’un procédé d’analyse ou de modification. Procédé selon la revendication 4, dans lequel l’étape b) consiste en une étape d’amplification par une réaction de PCR d’au moins une séquence nucléotidique cible de l’acide nucléique présent à l’intérieur de ladite enveloppe intègre et analyse du matériel génétique dudit échantillon biologique qui est présent à l’intérieur d’une enveloppe intègre. Procédé selon la revendication 4, dans lequel l’étape b) consiste en une modification d’au moins une séquence nucléotidique cible de l’acide nucléique présent à l’intérieur de ladite enveloppe intègre au moyen d’une technique de type CRIPR/Cas9. Procédé selon l’une des revendications précédentes, dans lequel ladite enveloppe intègre est choisie parmi : une enveloppe cellulaire, une capsule virale et une capsule synthétique. Procédé selon l’une des revendications précédentes, caractérisé en ce que ladite nucléase est: une DNAse de type « DNAse I-XT » du distributeur New England BioLabs. Procédé selon l’une quelconque des revendications 2, 5 ou 7-8 précédentes, caractérisé en ce que l’étape d’amplification par une réaction de PCR, est précédée d’une dilution de l’échantillon, ladite dilution étant d’au moins un facteur 10, de préférence d’un facteur 50, plus préférentiellement d’un facteur 100. Procédé selon l’une quelconque des revendications 2, 5 ou 7-9 précédentes, caractérisé en ce que l’étape d’amplification par une réaction de PCR, est précédée d’une étape de destruction de ladite enveloppe intègre. Procédé selon l’une quelconque des revendications 2, 5 ou 7-10 précédentes, caractérisée en ce que l’étape d’amplification par une réaction de PCR, est réalisée dans un dispositif de PCR numérique (dPCR). Procédé selon l’une quelconque des revendications 2 ou 7-11 précédentes, caractérisée en ce que ladite réaction de PCR est multiplexe. Utilisation d’un procédé selon l’une quelconque des revendications précédentes pour la détection de la présence d’au moins un microorganisme dans un échantillon. Utilisation d’un procédé selon la revendication précédente pour : la détection de la cooccurrence d’au moins deux microorganismes dans un même échantillon biologique, pour le génotypage et/ou pour l’analyse du matériel génétique compris dans une enveloppe synthétique Utilisation d’un procédé selon l’une quelconque des revendications 1, 3 et 6-8 pour la modification du matériel génétique compris dans une enveloppe synthétique.