Brevet FR3153665A1 — publié le 20250404

Méthode de diagnostic d’une peau exposée à l’ozone La présente invention concerne une méthode de diagnostic d’une exposition de la peau à l'ozone ainsi qu'une méthode d’identification de composé actif et une méthode d'évaluation de l'efficacité d'un composé, afin de prévenir et/ou de traiter les effets délétères liés à l'oxydation de certains constituants de la peau et à la modulation de l'expression de biomarqueurs en réponse à une exposition à l'ozone. La présente invention concerne également un kit et l’utilisation de celui-ci. Figure pour l'abrégé : néant Méthode de diagnostic d’une peau exposée à l’ozone La présente invention concerne une méthode de diagnostic d’une exposition de la peau à l'ozone ainsi qu'une méthode d’identification de composé actif et une méthode d'évaluation de l'efficacité d'un composé, afin de prévenir et/ou de traiter les effets délétères liés à l'oxydation de certains constituants de la peau et à la modulation de l'expression de biomarqueurs en réponse à une exposition à l'ozone. La présente invention concerne également un kit et l’utilisation de celui-ci. L'ozone ou trioxygène a pour formule chimique O 3 , c’est une variété allotropique de l'oxygène, bien moins stable que le dioxygène O 2 , en lequel il tend naturellement à se décomposer. L'ozone est naturellement présent dans l'atmosphère terrestre, formant dans la stratosphère une couche d'ozone qui intercepte les rayons ultraviolets du soleil. Cependant, dans les basses couches de l'atmosphère (la troposphère) c’est un des polluants de l’air les plus dangereux pour la santé. Cet oxydant très puissant peut être produit par les feux de forêts, les fortes températures, il est aussi produit dans les zones industrielles ou les centres urbains ayant un fort ensoleillement. Ainsi certains milieux sont régulièrement soumis à des pics d’ozone. L’individu dans son environnement quotidien et particulièrement en zone urbaine, peut être soumis à de multiples agressions au niveau des matières kératiniques, et notamment la peau, par ce polluant aérien. En effet l’ozone a des effets délétères liés à l’oxydation de certains constituants de la peau et à la modulation de l’expression des biomarqueurs qu’il induit. De ce qui précède, on comprend l'importance de trouver des biomarqueurs permettant de détecter l’exposition à l’ozone de la peau, afin de pouvoir traiter la peau de manière ciblée. La présente invention a pour objet de satisfaire à ce besoin. La demanderesse a découvert de manière surprenante plusieurs biomarqueurs modulés significativement dans des peaux exposées à l'ozone: l’élafine (PI3), la cornéodesmosine (CSDN), et SPRR3. Les méthodes selon l’invention sont donc basées sur la mesure de biomarqueurs modulés de façon significative, dans des tissus reconstruits exposés à l’ozone et/ou sur des échantillons de peaux exposés à l’ozone. Les biomarqueurs de la présente invention sont des gènes ou des protéines codées par ceux-ci, impliqués dans la différenciation épidermique. La modulation de ces biomarqueurs a notamment un impact sur la fonction barrière de la peau. Les biomarqueurs découverts par la demanderesse sont en particulier des marqueurs de profondeur et/ou d'accumulation de l’exposition à l’ozone. Ainsi, selon un premier de ses aspects, l'invention a pour objet une méthode de diagnostic, préférentiellement in vitro ou ex vivo , d’une exposition à l’ozone de la peau, chez un sujet, ladite méthode comprenant l’étape suivante : mesurer le niveau d’expression de PI3, et/ou de la CDSN, et/ou de SPRR3 dans un échantillon de peau dudit sujet. Eventuellement cette méthode de diagnostic selon l’invention comprend en outre l’étape suivante : b) sur la base du niveau d’expression mesuré à l’étape a., déterminer si la peau dudit sujet a été exposée à l’ozone. L’invention concerne également une méthode d’identification d’un composé permettant de prévenir et/ou de traiter les effets délétères de l’ozone sur la peau, ladite méthode comprenant les étapes suivantes : mesurer le niveau d’expression de PI3, et/ou de la CDSN, et/ou de SPRR3 dans un échantillon de peau d’un sujet, ledit échantillon étant traité avec ledit composé; comparer ledit niveau d’expression mesuré à l’étape a) au niveau d’expression correspondant dans un échantillon de peau non traité avec ledit composé ; identifier ledit composé candidat comme un composé permettant de prévenir et/ou de traiter les effets délétères de l’ozone sur la peau lorsque le niveau d’expression détectée dans l’échantillon de peau qui a été traité avec ledit composé est inférieur au niveau d’expression dans l’échantillon de peau qui n’a pas été traité avec ledit composé. L’invention concerne également une méthode d’identification d’un composé permettant de prévenir et/ou de traiter les effets délétères de l’ozone sur la peau, ladite méthode comprenant les étapes suivantes : effectuer un traitement d'un échantillon de peau choisi parmi un épiderme reconstruit et une peau reconstruite, par la mise en contact de l’échantillon de peau avec ledit composé; effectuer une exposition à l’ozone dudit échantillon de peau ; mesurer le niveau d’expression de PI3, et/ou de la CDSN, et/ou de SPRR3 dans l’échantillon de peau traité avec ledit composé ; comparer ledit niveau d’expression mesuré à l’étape c) au niveau d’expression correspondant dans un échantillon de peau exposé à l’ozone et non traité avec ledit composé ; identifier ledit composé candidat comme un composé permettant de prévenir et/ou de traiter les effets délétères de l’ozone sur la peau lorsque le niveau d’expression détectée dans l’échantillon de peau qui a été traité avec ledit composé est inférieur au niveau d’expression dans l’échantillon de peau qui n’a pas été traité avec ledit composé ; étant entendu que l’étape b peut être réalisée après l’étape a et inversement, et que les étapes a et b peuvent être répétées au moins 2 fois. L’invention concerne aussi une méthode d’évaluation de l’efficacité d’un composé permettant de prévenir et/ou de traiter les effets délétères de l’ozone sur la peau d’un sujet, ladite méthode comprenant les étapes suivantes : mesurer le niveau d’expression de PI3, et/ou de la CDSN, et/ou de SPRR3 dans un échantillon de peau dudit sujet avant le traitement avec ledit composé. effectuer un traitement de la peau dudit sujet avec ledit composé, mesurer le niveau d’expression de PI3, et /ou de la CDSN, et/ou de SPRR3, après l’étape b, dans un second échantillon de peau dudit sujet; comparer lesdits niveaux d’expression mesurés à l’étape a. et à l’étape c. ; évaluer l’efficacité dudit composé candidat quant à la prévention et/ou le traitement des effets délétères de l’ozone sur la peau. Dans un autre aspect, l’invention porte sur un kit comprenant : un moyen pour la mesure, dans un échantillon de peau, du niveau d’expression de PI3, et/ou de la CDSN, et/ou de SPRR3, et une notice d’instructions. L’invention porte aussi sur l’utilisation dudit kit pour l’identification d’un composé permettant de prévenir et/ou de traiter les effets délétères de l’ozone sur la peau. L’invention apparaîtra plus clairement à la lecture de la description qui va suivre, donnée uniquement à titre d’exemple non limitatif. Définition s générales Par « sujet » on comprend un être humain, de préférence âgé de 1 mois à 90 ans. Avantageusement, le sujet est susceptible d’avoir été exposé à l’ozone, en particulier à une exposition chronique ou aigue. Le stratum corneum est la couche la plus éloignée de l'épiderme, et comprend la surface de la peau. Elle est composée principalement de cellules mortes. Par « échantillon de stratum corneum », on entend ici un échantillon prélevé dans cette couche. Par exemple un tel échantillon peut être prélevé en frottant la surface de la peau ou en utilisant une surface adhésive telle qu’un disque D-squame® appliquée sur la peau. Par « exposition à l’ozone », on entend ici une exposition chronique ou aigue à l’ozone. Par « exposition chronique », on entend ici une exposition régulière, en particulier journalière, pendant une période donnée, de préférence une période de plus d’un an, en particulier une période de douze mois éventuellement interrompue à une ou plusieurs reprises pendant de courtes durées, typiquement des durées de moins d’un mois, de préférence de moins d’une semaine. Par « exposition aigue », on entend ici une exposition momentanée, en particulier de 12 heures à 5 jours, à au moins un niveau d’ozone supérieur à 0,05 ppm, de préférence supérieur à 0,07 ppm, plus préférentiellement supérieur à 0,09 ppm, encore mieux supérieur à 0,1 ppm. L’élafine (inhibiteur de peptidase 3, PI3) est une protéine de 117 acides aminés codée par le gène PI3. L’élafine est exprimée par de nombreux tissus et plus particulièrement dans les épithéliums (digestif, pulmonaire, peau) et aussi par les macrophages. L’élafine a d’importantes propriétés anti-inflammatoires, des propriétés microbicides et fongicides. L’élafine humaine est accessible dans uniprot sous le numéro P19957. La cornéodesmosine (CDSN) codée par le gène CDSN est une protéine spécifique des cornéodesmosomes, structures jonctionnelles de la couche cornée de l'épiderme. Elle est synthétisée au sein des kératinocytes épineux supérieurs. Elle a des propriétés adhésives et renforce la cohésion de la couche cornée. La cornéodesmosine humaine est accessible dans uniprot sous le numéro Q15517. La SPRR3 (Small proline-rich protein 3) est une protéine de 169 acides aminés codée par le gène SPRR3 . La protéine SPRR3 humaine est accessible dans uniprot sous le numéro Q9UBC9. Les gènes SPRR codent des protéines qui sont fortement induites pendant la différenciation des kératinocytes de l’épiderme in vitro et in vivo . La famille des SPRRs est caractérisée dans l’épiderme comme étant clé pour la formation de la fonction barrière protectrice de la peau, la qualité de ses propriétés mécaniques et sa protection de surface vis-à-vis d’une large famille de stimuli endogènes et externes. Par « niveau d’expression de PI3, et/ou de la CDSN, et/ou de SPRR3 », on entend le niveau d'expression en ARN messager (ARNm) du gène PI3, et/ou CDSN, et/ou SPRR3 respectivement, et/ou le niveau d’expression de la protéine codée par ce gène. Le niveau d’expression peut être exprimé sous forme d’une quantité, d’une concentration ou d’un ratio. Préférentiellement, le niveau d'expression en ARNm du gène codant est mesuré à l’aide d’une séquence nucléotidique complémentaire de l’ARNm du gène codant et s'hybridant spécifiquement à l’ARNm du gène codant ou, un fragment de celui-ci s'hybridant spécifiquement à l’ARNm du gène codant, cette séquence ou ce fragment comprenant 5 à 50 nucléotides, préférentiellement 10 à 20 nucléotides, ou à l’aide d’un couple d’amorces ou d’une sonde de 10 à 60 nucléotides, préférentiellement 15 à 30 nucléotides comprenant ladite séquence ou ledit fragment. Le niveau d’expression peut alors être mesuré par n’importe quelle méthode connue de l’homme du métier, par exemple par une PCR quantitative. Préférentiellement, le niveau d’expression de la protéine (ici PI3, et/ou CDSN et/ou SPRR3) est mesuré à l’aide d’un ligand spécifique de la protéine, comme par exemple un anticorps, de préférence monoclonal, un fragment Fab, un scFv ou un nanocorps, spécifique de cette protéine. Le niveau d’expression peut alors être mesuré par n’importe quelle méthode connue de l’homme du métier, comme par exemple par un Western Blot ou un test ELISA. En particulier, la mesure du niveau d’expression de la protéine peut être effectuée à l’aide d’un système miniaturisé tel qu’une puce microfluidique, comme celle décrite dans la demande internationale WO2011/126249, cette puce contenant des ligands spécifiques de la protéine. La puce peut ensuite être analysée au moyen d'un lecteur adapté pour déterminer si ladite protéine s’est liée audit ligand et conclure quant à la présence et la quantité de la protéine dans l’échantillon. Dans le cadre de l'invention, les termes « hybrider » ou « hybridation », comme bien connu de l'homme du métier, se réfèrent à la liaison d'une molécule d'acide nucléique à une séquence nucléotidique particulière dans des conditions appropriées, notamment dans des conditions stringentes. Le terme « conditions stringentes », tel qu'utilisé ici correspond à des conditions qui sont appropriées pour produire des paires de liaison entre les acides nucléiques ayant un niveau déterminé de complémentarité, tout en étant impropre à la formation de paires entre les acides nucléiques de liaison ayant une complémentarité inférieure audit niveau déterminé. Les conditions stringentes sont dépendantes des conditions d'hybridation et de lavage. Ces conditions peuvent être modifiées selon les méthodes connues de l'homme de l'art. Généralement, des conditions de haute stringence sont une température d’hybridation environ 5°C inférieure à la température de fusion (Tm), de préférence proche de la Tm des brins parfaitement appariés par bases. Les procédures d'hybridation sont bien connues dans la technique. Les conditions de haute stringence impliquent généralement l'hybridation à une température d’environ 50°C à environ 68°C dans une solution 5x SSC/5x solution de Denhardt /1,0% SDS, et un lavage dans une solution 0,2x SSC/0,1% SDS à une température comprise entre environ 60°C et environ 68°C. Par « niveau d’expression correspondant », on entend le niveau d’expression du même gène ou de la même protéine que celui dont le niveau a été mesuré dans une étape précédente. Par « effets délétères de l’ozone », on entend des irritations ou des réactions d’inconfort au niveau de la peau (incluant également la peau du cuir chevelu) qui peuvent se traduire en particulier par des rougeurs, des démangeaisons, des sensations de chaleur, de picotement et de tiraillement. Méthode de diagnostic d’une exposition à l’ozone de la peau La présente invention a pour objet une méthode de diagnostic d’une exposition à l’ozone de la peau, chez un sujet, ladite méthode comprenant l’étape suivante : mesurer le niveau d’expression de PI3, et/ou de la CDSN, et/ou de SPRR3 dans un échantillon de peau dudit sujet. Préférentiellement, cette méthode de l’invention est une méthode de diagnostic d’une exposition chronique à l’ozone. La méthode de l’invention est de préférence mise en œuvre in vitro ou ex vivo . L’échantillon de peau du sujet utilisé dans la méthode de diagnostic selon l’invention, est un échantillon prélevé, de préférence de manière non-invasive, sur la peau du sujet, préférentiellement sur le visage du sujet, en particulier sur la joue du sujet. Préférentiellement, l’échantillon de peau est une biopsie, une microbiopsie notamment réalisée à l’aide d’une aiguille, ou un échantillon de stratum corneum. Ainsi selon un mode de réalisation, cette méthode selon l’invention comprend une étape de prélèvement de l’échantillon de peau du sujet. Cette étape est préférentiellement effectuée de manière non-invasive, et en particulier ne nécessite pas d’anesthésie locale. Selon un mode de réalisation préféré, notamment dans le cas où le niveau d’expression mesuré à l’étape a. est le niveau d’expression de CDSN et/ou SPRR3, l’étape de prélèvement de l’échantillon est effectuée en frottant la surface de la peau ou en utilisant une surface adhésive telle qu’un disque D-squame®. Eventuellement la méthode de diagnostic selon l’invention comprend en outre l’étape suivante : b. sur la base du niveau d’expression mesuré à l’étape a., déterminer si la peau dudit sujet a été exposée à l’ozone. Dans un mode de réalisation particulier, l'étape b. est réalisée après comparaison du niveau d’expression mesuré à l’étape a. avec une valeur de référence. Dans un mode de réalisation, la valeur de référence est déterminée par la valeur moyenne du niveau d’expression mesuré dans une population déterminée qui n’a pas été soumise à une exposition à l’ozone, notamment une exposition aigue ou chronique à l’ozone. Dans un mode de réalisation particulier, la valeur de référence est déterminée par la valeur moyenne du niveau d’expression chez des êtres humains âgés de 1 mois à 90 ans. Conformément à l’invention une valeur de référence peut être déterminée par une pluralité d'échantillons, de préférence plus de 20, 30, 50, 100, 200 ou 500 échantillons. Le terme « comparaison » ici fait référence au fait de déterminer si le niveau d’expression du gène est essentiellement identique à une valeur de référence ou diffère de celle-ci. De préférence, le niveau d’expression du gène est considéré comme différent d'une valeur de référence si la différence observée est statistiquement significative. Si la différence n’est pas statistiquement significative, le niveau d’expression du gène et la valeur de référence sont essentiellement identiques. Sur la base de cette comparaison, on peut déterminer si la peau a été exposée à l’ozone. Typiquement, la peau est considérée comme ayant été exposée à l’ozone lorsque le niveau d’expression du gène est significativement supérieur à la valeur de référence et la peau n’est pas considérée comme ayant été exposée à l’ozone lorsque le niveau d’expression du gène est essentiellement identique ou significativement inférieur à la valeur de référence. Préférentiellement, la méthode selon l’invention comprend une étape de traitement de l’échantillon afin de préparer la mesure du niveau d’expression. Par exemple si l’échantillon de peau a été obtenu en utilisant une surface adhésive telle qu’un disque D-squame®, l’extrait protéique soluble peut être obtenu par un système d’extraction de protéines, tel que celui décrit dans la demande internationale WO2015/009085 qui permet de mettre en contact les échantillons D-squames avec un volume minimal de tampon d’extraction et ainsi d’obtenir un extrait protéique soluble. Les tampons appropriés pour l'extraction des protéines de la peau sont bien connus et comprennent par exemple le Tampon RIPA ou un tampon d'urée, ou encore un tampon comprenant 0,5% deoxycholate de sodium, 50 mM bicarbonate d’ammonium, 50 mM DTT, 1 μM Pepstatine ainsi que des inhibiteurs de protéases. Eventuellement la méthode de diagnostic selon l’invention comprend en outre l’étape suivante : c. si la peau dudit sujet est déterminée comme ayant été exposée à l’ozone à l’étape b., traiter la peau dudit sujet avec une composition cosmétique permettant de prévenir et/ou de traiter les effets délétères de l’ozone. Par « composition cosmétique permettant de prévenir et/ou de traiter les effets délétères de l’ozone » on comprend toute composition cosmétique connue de l’homme du métier permettant de réduire et/ou de ralentir l’apparition des effets délétères de l’ozone tels que les irritations ou les réactions d’inconfort au niveau de la peau les rougeurs, les démangeaisons, les sensations de chaleur, de picotement et de tiraillement provoqués par l’ozone. Dans un mode de réalisation de l’invention, la composition cosmétique comprend un composé permettant de prévenir et/ou de traiter les effets délétères de l’ozone sur la peau identifiée par la méthode de l’invention. Méthode s d’identification d’un composé permettant de prévenir et/ou de traiter les effets délétères de l’ozone sur la peau L’invention porte également sur une méthode d’identification d’un composé permettant de prévenir et/ou de traiter les effets délétères de l’ozone sur la peau, ladite méthode comprenant les étapes suivantes : mesurer le niveau d’expression de PI3, et/ou de la CDSN, et/ou de SPRR3 dans un échantillon de peau d’un sujet, ledit échantillon étant traité avec ledit composé; comparer ledit niveau d’expression mesuré à l’étape a. au niveau d’expression correspondant dans un échantillon de peau non traité avec ledit composé ; identifier ledit composé candidat comme un composé permettant de prévenir et/ou de traiter les effets délétères de l’ozone sur la peau lorsque le niveau d’expression détectée dans l’échantillon de peau qui a été traité avec ledit composé est inférieur au niveau d’expression dans l’échantillon de peau qui n’a pas été traité avec ledit composé. Selon un mode de réalisation préféré, les échantillons de peau d’un sujet utilisés dans la méthode d’identification d’un composé permettant de prévenir et/ou de traiter les effets délétères de l’ozone sur la peau ci-dessus, sont choisis parmi un explant de peau humaine, une biopsie cutanée, une microbiopsie notamment réalisée à l’aide d’une aiguille, cutanée et un échantillon de stratum corneum. Selon un mode de réalisation, cette méthode selon l’invention comprend au moins une étape de prélèvement de l’échantillon de peau d’un sujet. Cette étape est préférentiellement effectuée de manière non-invasive, et en particulier ne nécessite pas d’anesthésie locale. Selon un mode de réalisation préféré, l’étape de prélèvement de l’échantillon de peau d’un sujet est effectuée en frottant la surface de la peau ou en utilisant une surface adhésive telle qu’un disque D-squame®. Préférentiellement, cette méthode selon l’invention comprend une étape de traitement des échantillons afin de préparer la mesure du niveau d’expression. Par exemple si l’échantillon de peau a été obtenu en utilisant une surface adhésive telle qu’un disque D-squame®, l’extrait protéique soluble peut être obtenu par un système d’extraction de protéines tel que celui décrit dans la demande internationale WO2015/009085 qui permet de mettre en contact les échantillons D-squames avec un volume minimal de tampon d’extraction et ainsi d’obtenir un extrait protéique soluble. Les tampons appropriés pour l'extraction des protéines de la peau sont bien connus et comprennent par exemple le Tampon RIPA ou un tampon d'urée, ou encore un tampon comprenant 0,5% deoxycholate de sodium, 50 mM bicarbonate d’ammonium, 50 mM DTT, 1 μM Pepstatine ainsi que des inhibiteurs de protéases. Dans un mode de réalisation particulier, la méthode selon l’invention ci-dessus comprend une étape supplémentaire d‘exposition des échantillons à l’ozone. Cette étape est préférentiellement réalisée sur les deux échantillons dans les mêmes conditions. Elle peut être réalisée avant ou après traitement de l’échantillon de peau avec ledit composé. L’invention se rapporte en outre à une méthode d’identification d’un composé permettant de prévenir et/ou de traiter les effets délétères de l’ozone sur la peau, ladite méthode comprenant les étapes suivantes : effectuer un traitement d'un échantillon de peau choisi parmi un épiderme reconstruit et une peau reconstruite, par la mise en contact de l’échantillon de peau avec un composé à tester ; effectuer une exposition à l’ozone dudit échantillon de peau ; mesurer le niveau d’expression de PI3, et/ou de la CDSN, et/ou de SPRR3 dans l’échantillon de peau traité avec ledit composé ; comparer ledit niveau d’expression mesuré à l’étape c) au niveau d’expression correspondant dans l’échantillon de peau exposé à l’ozone et non traité avec ledit composé ; identifier ledit composé candidat comme un composé permettant de prévenir et/ou de traiter les effets délétères de l’ozone sur la peau lorsque le niveau d’expression détectée dans l’échantillon de peau qui a été traité avec ledit composé est inférieur au niveau d’expression dans l’échantillon de peau qui n’a pas été traité avec ledit composé ; étant entendu que l’étape b peut être réalisée après l’étape a et inversement ; les étapes a. et b. peuvent être répétées au moins 2 fois. Préférentiellement, cette méthode selon l’invention comprend une étape de traitement des échantillons afin de préparer la mesure du niveau d’expression. Dans un mode de réalisation préféré, l’invention se rapporte également à une méthode d’identification d’un composé permettant de prévenir et/ou de traiter les effets délétères de l’ozone sur la peau, ladite méthode comprenant les étapes suivantes : effectuer un premier traitement d'un échantillon de peau choisi parmi un épiderme reconstruit et une peau reconstruite, par la mise en contact de l’échantillon de peau avec ledit composé; effectuer une première exposition à l’ozone dudit échantillon de peau ; effectuer un second traitement de l’échantillon de peau par la mise en contact de l’échantillon de peau avec ledit composé ; effectuer une seconde exposition à l’ozone dudit échantillon de peau ; effectuer un troisième traitement de l’échantillon de peau par la mise en contact de l’échantillon de peau avec ledit composé ; effectuer une troisième exposition à l’ozone dudit échantillon de peau ; mesurer le niveau d’expression de PI3, et/ou de la CDSN, et/ou de SPRR3 dans l’échantillon de peau traité avec ledit composé ; comparer ledit niveau d’expression mesuré à l’étape g) au niveau d’expression correspondant dans un échantillon de peau exposé à l’ozone et non traité avec ledit composé ; identifier ledit composé candidat comme un composé permettant de prévenir et/ou de traiter les effets délétères de l’ozone sur la peau lorsque le niveau d’expression détectée dans l’échantillon de peau qui a été traité avec ledit composé est inférieur au niveau d’expression dans l’échantillon de peau qui n’a pas été traité avec ledit composé. Préférentiellement, cette méthode selon l’invention comprend une étape de traitement des échantillons afin de préparer la mesure du niveau d’expression. Les méthodes d’identification d’un composé de l’invention sont de préférence mises en œuvre ex vivo ou in vitro . De préférence, dans les méthodes d’identification d’un composé de l’invention, la seule différence entre l’échantillon de peau traité avec ledit composé et l’échantillon de peau non traité avec ledit composé est ledit (ou lesdits) traitement(s) avec ledit composé. Typiquement, le traitement de l’échantillon avec ledit composé comprend la mise en contact de l’échantillon de peau avec ledit composé pendant au moins 5 minutes, au moins 10 minutes ou encore au moins 20 minutes. Typiquement, la mesure du niveau d’expression de PI3, et/ou de la CDSN, et/ou de SPRR3 est réalisée au moins 5 minutes, au moins 10 minutes ou encore au moins 20 minutes après le dernier traitement de l’échantillon avec ledit composé. Les étapes b, d ou h de comparaison des méthodes d’identification ci-dessus font référence au fait de déterminer si le niveau d’expression mesuré aux étapes a, c ou g, est essentiellement identique au niveau d’expression du même gène ou de la même protéine mesuré dans un échantillon de peau non traité avec ledit composé. De préférence, le niveau d’expression est considéré comme différent si la différence observée est statistiquement significative. Si la différence n’est pas statistiquement significative, les deux niveaux d’expression sont essentiellement identiques. Sur la base de cette comparaison, on peut déterminer si le composé permet de prévenir et/ou de traiter les effets délétères de l’ozone sur la peau. Typiquement, le composé est considéré comme permettant de prévenir et/ou de traiter les effets délétères de l’ozone sur la peau lorsque le niveau d’expression est significativement inférieur dans l’échantillon de peau traité avec ledit composé par rapport au niveau d’expression mesuré dans l’échantillon qui n’a pas été traité avec ledit composé, alternativement le composé n’est pas considéré comme permettant de prévenir et/ou de traiter les effets délétères de l’ozone sur la peau lorsque le niveau d’expression est essentiellement identique ou significativement supérieur dans l’échantillon de peau traité avec ledit composé par rapport au niveau d’expression mesuré dans l’échantillon qui n’a pas été traité avec ledit composé. De préférence, les étapes d’exposition à l’ozone sont réalisées de manières identique sur l’échantillon traité avec ledit composé et l’échantillon qui n’a pas été traité avec ledit composé. Les étapes d’exposition à l’ozone b, d ou f durent au moins 5 heures, plus particulièrement au moins 10 heures et de manière préférée au moins 18 heures. Ces étapes peuvent également être entrecoupées par des périodes d’incubation dans une atmosphère normale, ambiante. Typiquement les échantillons sont incubés dans une atmosphère enrichie en ozone pendant 18h puis une atmosphère normale pendant les 6 heures suivantes et ensuite à nouveau dans une atmosphère enrichie en ozone pendant 18h. Par « atmosphère » dans lequel l’échantillon de peau est incubé, on entend le gaz ou mélange de gaz dans lequel l’échantillon est placé. De préférence l’échantillon est incubé dans une atmosphère similaire à l’air ambiant. Par « atmosphère enrichie en ozone », on entend une atmosphère similaire à l’air ambiant comprenant au moins 0,05 ppm (partie par million) d’ozone, de préférence au moins 0,07 ppm d’ozone, plus préférentiellement au moins 0,09 ppm d’ozone ou encore au moins 0,1 ppm d’ozone. Méthode d’évaluation de l’efficacité d’un composé permettant de prévenir et/ou de traiter les effets délétères de l’ozone sur la peau L’invention porte également sur une méthode d’évaluation de l’efficacité d’un composé permettant de prévenir et/ou de traiter les effets délétères de l’ozone sur la peau d’un sujet, ladite méthode comprenant les étapes suivantes : a. mesurer le niveau d’expression de PI3, et/ou de la CDSN, et/ou de SPRR3 dans un échantillon de peau dudit sujet avant le traitement avec ledit composé, b. effectuer un traitement de la peau dudit sujet avec ledit composé, c. mesurer le niveau d’expression de PI3, et/ou de la CDSN, et/ou de SPRR3, après l’étape b, dans un second échantillon de peau dudit sujet; d. comparer lesdits niveaux d’expression mesurés à l’étape a. et à l’étape c. ; e. évaluer l’efficacité dudit composé candidat quant à la prévention et/ou le traitement des effets délétères de l’ozone sur la peau. La méthode de l’invention est de préférence mise en œuvre in vitro ou ex vivo . Les échantillons de peau du sujet utilisés dans la méthode d’évaluation selon l’invention, sont prélevés de préférence de manière non-invasive, sur la peau du sujet, préférentiellement sur le visage du sujet, en particulier sur la joue du sujet. Préférentiellement l’échantillon de peau est une biopsie, une microbiopsie notamment réalisée à l’aide d’une aiguille, ou un échantillon de stratum corneum. Ainsi selon un mode de réalisation, cette méthode selon l’invention comprend plusieurs étapes de prélèvement d’échantillon de peau du sujet. Cette étape est préférentiellement effectuée de manière non-invasive, et en particulier ne nécessite pas d’anesthésie locale. Selon un mode de réalisation préféré, notamment dans le cas où le niveau d’expression mesuré à l’étape a. est le niveau d’expression de CDSN et/ou SPRR3, l’étape de prélèvement de l’échantillon est effectuée en frottant la surface de la peau ou en utilisant une surface adhésive telle qu’un disque D-squame®. De préférence, la seule différence entre l’échantillon de peau de l’étape a. et l’échantillon de peau de l’étape c. est ledit traitement avec le composé. L’échantillon de peau de l’étape c. est prélevé après que la peau dudit sujet ait été traitée avec ledit composé. Dans un mode de réalisation, l’échantillon de peau de l’étape c. est prélevé après que la peau dudit sujet ait été traitée avec ledit composé pendant au moins 14 jours, de préférence au moins 28 jours. Typiquement, cet échantillon est prélevé au moins 5 minutes, au moins 10 minutes ou encore au moins 20 minutes après le dernier traitement de l’échantillon avec ledit composé. Préférentiellement, cette méthode selon l’invention comprend une étape de traitement des échantillons afin de préparer la mesure du niveau d’expression. Par exemple si l’échantillon de peau a été obtenu en utilisant une surface adhésive telle qu’un disque D-squame®, l’extrait protéique soluble peut être obtenu par un système d’extraction de protéines tel que celui décrit dans la demande internationale WO2015/009085 qui permet de mettre en contact les échantillons D-squames avec un volume minimal de tampon d’extraction et ainsi d’obtenir un extrait protéique soluble. Les tampons appropriés pour l'extraction des protéines de la peau sont bien connus et comprennent par exemple le Tampon RIPA ou un tampon d'urée, ou encore un tampon comprenant 0,5% deoxycholate de sodium, 50 mM bicarbonate d’ammonium, 50 mM DTT, 1 μM Pepstatine ainsi que des inhibiteurs de protéases. L’étape d. de comparaison ici fait référence au fait de déterminer si le niveau d’expression mesuré à l’étape a. est essentiellement identique au niveau d’expression du même gène ou de la même protéine mesuré à l’étape c. De préférence, le niveau d’expression est considéré comme différent si la différence observée est statistiquement significative. Si la différence n’est pas statistiquement significative, les deux niveaux d’expression sont essentiellement identiques. Sur la base de cette comparaison, on peut évaluer l’efficacité d’un composé à prévenir et/ou de traiter les effets délétères de l’ozone sur la peau d’un sujet. Typiquement, plus le niveau d’expression est inférieur dans l’échantillon traité avec ledit composé par rapport au niveau d’expression mesuré dans l’échantillon qui n’a pas été traité avec ledit composé, plus le composé est considéré efficace pour prévenir et/ou de traiter les effets délétères de l’ozone sur la peau lorsque. Alternativement le composé n’est pas considéré efficace pour prévenir et/ou de traiter les effets délétères de l’ozone sur la peau lorsque le niveau d’expression est essentiellement identique ou significativement supérieur dans l’échantillon de peau traité avec ledit composé par rapport au niveau d’expression mesuré dans l’échantillon qui n’a pas été traité avec ledit composé. Kit La présente invention porte également sur un kit comprenant : un moyen pour la mesure, dans un échantillon de peau, du niveau d’expression de PI3, et/ou de la CDSN, et/ou de SPRR3, et une notice d’instructions. Par « moyen pour la mesure du niveau d’expression » on entend un ligand spécifique de la protéine, comme par exemple un anticorps, de préférence monoclonal, un fragment Fab, un scFv ou un nanocorps, spécifique de cette protéine ou encore une puce microfluidique, comme celle décrite dans la demande internationale WO2011/126249, cette puce contenant des ligands spécifiques de la protéine. On entend alternativement une séquence nucléotidique complémentaire de l’ARNm du gène et, de préférence, s'hybridant spécifiquement à l’ARNm du gène ou, un fragment de celle-ci, de préférence, s'hybridant spécifiquement à l’ARNm du gène, cette séquence ou ce fragment comprenant typiquement de 5 à 50 nucléotides, préférentiellement 10 à 20 nucléotides, ou un couple d’amorces et/ou une sonde de l’ARNm de ladite protéine, par exemple de 10 à 60 nucléotides, préférentiellement 15 à 30 nucléotides. Ainsi dans un mode de réalisation, le moyen pour la mesure du niveau d’expression, dans un échantillon de peau, du kit selon l’invention est un ligand spécifique de la protéine ou une séquence nucléotidique complémentaire de l’ARNm ou un fragment de celle-ci, un couple d’amorces ou une sonde spécifique de l’ARNm de ladite protéine. Selon un mode de réalisation de l’invention, le kit ne comprend pas d’autres ligand spécifique d’autres protéines ou d’autres séquences nucléotidiques complémentaires de l’ARNm d’autres gènes que de PI3 , et/ou de la CDSN , et/ou de SPRR3 . Le kit selon l’invention peut comprendre en outre une gamme étalon du niveau d’expression du gène. Cette gamme comprend au moins un échantillon comprenant une quantité ou une concentration connue de la protéine codée par ledit gène ou de l’ARNm dudit gène. Selon un mode de réalisation, le kit selon l’invention, comprend en outre un moyen de prélever l’échantillon de peau tel qu’un disque D-squame®, notamment dans le cas où le moyen de mesure à l’étape a. permet de mesurer le niveau d’expression de CDSN et/ou SPRR3. Selon un mode de réalisation, le kit selon l’invention, comprend en outre un tampon d’extraction de protéines. La présente invention concerne en outre l’utilisation d’un kit selon l’invention pour l’identification d’un composé permettant de prévenir et/ou de traiter les effets délétères de l’ozone sur la peau. Exemple: Matériel et méthode : 1-Système d’exposition à l’ozone in vitro Pour optimiser la maîtrise des concentrations en ozone utilisées lors des expositions, l’ensemble du matériel utilisé pour générer et distribuer l’air enrichi en ozone a été réalisé avec des matériaux réputés peu sensibles au pouvoir oxydant de l’ozone, comme le PTFE (exemple le téflon), le PMMA (exemple le plexiglas) et le PEEK. 1.1- Dispositif externe à l’incubateur : Pour mimer une pollution à l’ozone le laboratoire utilise un analyseur/générateur d’ozone MEGATEC 49i couplé à une pompe externe, et relié également à un incubateur de culture régulé à 37°C, 5% CO 2 et saturé en humidité (environ 95%). La pompe externe permet de prélever de l’air ambiant et d’alimenter l’analyseur/générateur d’ozone MEGATEC. L’air va alors passer devant la lampe UV de l’appareil (réglée à la longueur d’onde de 185nm) qui va transformer une partie des molécules d’oxygène (O 2 ) de l’air en molécules d’ozone (O 3 ). L’air est alors enrichi en ozone. Cet air enrichi en ozone va pouvoir alors être transféré dans l’incubateur contenant les plaques de culture avec le modèle de peau reconstruite T-Skin TM . L’analyseur/générateur MEGATEC permet de régler et de contrôler : Le débit d’air enrichi en ozone (alimentant l’incubateur) au moyen d’un détendeur placé en amont du circuit dans l’analyseur/générateur MEGATEC. La concentration en ozone généré en réglant la puissance de la lampe UV de l’analyseur/générateur MEGATEC. Par ailleurs l’analyseur/générateur MEGATEC possède une seconde pompe et un système d’analyse en interne qui permettent de mesurer la concentration réelle en ozone : soit en sortie d’appareil (concentration générée, en amont de l’exposition dans l’incubateur), soit dans l’incubateur (concentration résiduelle, en aval de l’exposition). 1.2- Dispositif interne à l’incubateur : Au sein de l’incubateur un système de fluidique développé au laboratoire permet de distribuer la même quantité d’ozone sur chaque insert de peau reconstruite. Ce système est semi-ouvert pour permettre à la fois : une distribution homogène de l’ozone sur le dessus des plaques, et une bonne régulation des conditions de culture des peaux reconstruites. Par ailleurs, le couvercle de chaque plaque de culture (généralement en polystyrène, matériel sensible à l’ozone) est remplacé par un couvercle spécifique pour l’exposition : il s’agit d’un couvercle en PTFE ou en PEEK percé au-dessus de chaque insert de peau reconstruite, et permettant ainsi une exposition directe de la surface des peaux reconstruites à l’air enrichi en ozone. De plus ce couvercle permet de protéger le milieu de culture pour éviter son oxydation par l’ozone, afin de ne réaliser qu’une exposition de la surface des peaux. 2-Exposition à l’ozone de peaux reconstruites in vitro , avec ou sans application de sébum 2.1- Réception et culture du modèle de peau reconstruite TSKIN Le modèle de peau reconstruite utilisé est le modèle de peau reconstruite T-Skin TM produit et commercialisé par la société EPISKIN SA (FR-69007, Lyon). Il s’agit d’un modèle de peau reconstruite composé : D’un derme reconstruit constitué d’une lattice de collagène 1, contenant des fibroblastes d’origine humaine extraits de plasties mammaires issues de donneurs sains adultes (déchet chirurgical obtenu avec le consentement des patientes lors d’interventions de chirurgie esthétique de réductions mammaires). D’un épiderme reconstruit réalisé à partir de kératinocytes d’origine humaine extraits de plasties mammaires issues de donneurs sains adultes (déchet chirurgical obtenu avec le consentement des patientes lors d’interventions de chirurgie esthétique de réductions mammaires). Ce modèle est cultivé dans un insert de culture de 4,5cm² qui permet de le suspendre au-dessus du milieu de culture et de le cultiver à l’interface air-liquide. Dans cet insert la lattice de collagène, ou équivalent dermique, recouvre une surface qui peut varier de 2 à 2,5 cm² au centre de l’insert. L’épiderme lui recouvre généralement l’ensemble des 4,5cm² de l’insert. Le modèle T-Skin TM est réceptionné au laboratoire après 12 jours de culture du derme (J12). L’épiderme lui est à 7 jours de culture et il est relativement immature (peu différencié). Durant le transport ces inserts sont posés sur un milieu de culture nutritif semi-solide adapté au transport. A réception, les inserts sont rapidement transférés dans des nouvelles plaques de culture 6 puits dites « deep well » permettant de mettre 8,5ml de milieu de culture liquide sous chaque insert (culture à l’interface air liquide). Ces plaques peuvent être les plaques de la marque Corning référence 355467. Le milieu de culture utilisé est celui commercialisé par la société EPISKIN pour les kits TSKIN : milieu dénommé « Culture medium for T-Skin » Les peaux reconstruites sont placées ensuite dans un incubateur de culture régulé à 37°C, 5% CO 2 et avec une humidité saturée (environ 95% d’humidité). Le milieu de culture est ensuite remplacé de la même manière à J13 et J15 (derme). Enfin à J18, les inserts sont placés dans des plaques de culture 6 puits standards au format SBS (type plaque de la marque COSTAR référence 3506) avec 2,5ml de milieu culture pour T-Skin TM sous chaque insert. Par la suite ces plaques sont remplacées avec le milieu de culture au minimum tous les jours. 2.2- Préparation d’une solution hydrolipidique de sébum pour application sur le modèle de peau reconstruite Un mélange sec lipidique correspondant à un sébum artificiel a été préparé selon le brevet L’Oréal FR3022783A1. Ce sébum contient environ : 25% d’acide gras libres (par exemple : acide palmitique, acide sapiénique, acide stéarique, acide oléique, acide linoléique) 15% de squalène 3% de cholestérol 2% d’esters de cholesterol (par exemple : cholesteryl oléate, cholesteryl palmitate, cholesteryl stéarate) 25% de cires (par exemple : palmityl palmitate, stéaryl stéarate, oleyl oléate, stéaryl palmitate) 30% de glycérides (par exemple : 1,3-dipalmityl glycérol, 1,3-stéaryl glycérol, 1,3-dioleyl glycérol, 1,3-dilinoleyl glycérol, tripalmitine, tristéarine, trisapiénine, trioléine, trilinoléine). A partir de ce sébum sec est reconstitué extemporanément un mélange hydrolipidique pour mimer un mélange sébum-sueur présent sur une peau grasse. Ainsi, la concentration finale appliquée représente 300µg de sébum/cm². 2.3- Préparation du mélange hydrolipidique à 50mg/ml dans du tampon phosphate sans calcium et sans magnésium : Le PBS est préchauffé quelques minutes au bain-marie à 45°C, Il est ensuite ajouté dans notre flacon avec du sébum artificiel sec pour obtention d’une solution à 50mg de sébum/ml de PBS Réalisation de passages successifs du mélange au vortex et au bain-marie à 45°C de manière à dissoudre le sébum. On obtient au final une émulsion d’apparence laiteuse. Lors de l’étalement sur T-Skin TM on applique 27µL de cette solution par insert, et cette solution est répartie sur l’ensemble des 4,5cm² de l’insert pour obtenir 300µg de solution hydrolipidique/ cm² d’insert. 2.3- Application de la solution de sébum en topique sur le modèle TSKIN : La solution de sébum est appliquée selon le protocole suivant : On dépose un volume de solution précis de 27µL au centre du modèle, On prend une tige en verre avec une extrémité ronde que l’on pré-mouille avec un petit volume de solution à étaler, On vient au contact de la goutte de solution placée au centre du modèle de peau, et on entraine la goutte dans un mouvement circulaire qui s’écarte progressivement du centre vers le bord de l’insert (4,5cm² de surface d’application). Lors de cette application, le contact entre la tige en verre et le modèle de peau doit être le plus faible possible pour ne pas engendrer un stress sur le modèle. 2.4- Expositions répétées du modèle TSKIN à l’ozone : Pour ce type d’exposition le générateur d’ozone est réglé sur des valeurs basses : Ozone généré en sortie d’appareil : environ 0,130ppm pour une concentration mesurée à l’intérieur de l’incubateur inférieure à 0,1ppm Le débit de sortie de l’air enrichi en ozone au-dessus de chaque peau reconstruite est d’environ 20 ml/min (à noter que les sorties d’ozone sont à plus de 10cm des peaux reconstruites à l’intérieur de l’incubateur pour éviter un stress direct du flux de sortie). Les expositions sont réalisées trois fois successivement : 18h entre J18 et J19, 18h entre J19 et J20, et 18h entre J20 et J21. Entre chaque exposition le modèle est à l’incubateur sans ozone pendant un peu moins de 6h. Pour mimer des peaux grasses, certains échantillons subissent, uniquement avant la première exposition à l’ozone à J18, l’application d’un mélange hydrolipidique de sébum à raison de 300µg/cm² (27µL d’une solution à 50mg/ml de sébum étalés sur 4,5cm²) préparé selon le protocole décrit plus haut. Une fois les peaux prêtes à être exposées, les couvercles standards en polystyrène sont remplacés par des couvercles percés en PEEK ou en PTFE. Une partie des échantillons sont traités sous ozone, et une autre partie, les témoins, sont préparés exactement de la même façon, mais incubés dans un incubateur classique sans ozone. A J21, les échantillons de peaux reconstruites ont été prélevés, l’épiderme a été séparé du derme, coupé en deux et congelé à -80°C pour l’analyse transcriptomique. AJ22, les échantillons de peaux reconstruites ont été prélevés, l’épiderme a été séparé du derme, coupé en deux et congelé à -80°C pour les analyses protéomique et par immunohistochimie. 3- Analyse transcriptomique des peaux reconstruites exposées à l’ozone in vitro Pour l’analyse transcriptomique par séquençage haut-débit (RNA-sequencing), les peaux reconstruites ont été exposées 3 fois à 0,1 ppm d’ozone pendant 18h à J18, J19 et J20, avec ou sans application topique de sébum à J18. Les échantillons d’épidermes ont été prélevés à J21. Chaque condition a été réalisée en triplicat et deux expériences différentes ont été conduites. L'ARN total a été isolé à partir de ces échantillons avec le kit RNeasy Micro Kit (Qiagen, Hilden, Allemagne). La pureté et l'intégrité de l'ARN ont été évaluées sur le bioanalyseur Agilent 2100 avec le kit RNA 6000 NanoLabChip (Agilent, Palo Alto, Californie, États-Unis) et le spectrophotomètre Nanodrop. Tous les échantillons avaient des valeurs de RIN > 8,8. Pour la préparation des librairies et le séquençage de l'ARN, 200 ng d'ARN total ont été soumis à une transcription reverse en ADN complémentaire (ADNc) du premier brin d’ARN en utilisant un mélange d'amorces aléatoires et poly-dT, et en omettant l'étape de traitement par la DNase. La synthèse du second brin, à l'aide d'un analogue de nucléotide permettant sa rétention, a permis de générer l’ADNc double brin. Ce dernier a été fragmenté en morceaux de 200 à 400 bases. Ensuite, une réparation finale a été réalisée pour générer un ADNc double brin à extrémités franches, suivie par la ligature des adaptateurs d'indexation, une sélection de brin via une dégradation ciblée par un analogue de nucléotide et une réduction du contenu en ARN ribosomal. Enfin, des banques d’ADNc ont été créées par enrichissement PCR en 13 cycles. Des quantités équimolaires de chaque librairie ont été séquencées sur un NextSeq 2000 Illumina, pour un séquençage en ‘paired-end’ à 2x107 paires de bases. 4-Analyse protéomique des peaux reconstruites exposées à l’ozone in vitro 4.1- Exposition des peaux reconstruites à l’ozone : Pour l’analyse protéomique label free non ciblée, les peaux reconstruites ont été exposées 3 fois à 0,1 ppm d’ozone pendant 18h à J18, J19 et J20, avec ou sans application topique de sébum à J18. Les échantillons d’épidermes ont été prélevés à J22. Chaque condition a été réalisée en triplicat et deux expériences différentes ont été conduites. 4.2- Extraction des protéines et digestion : Les protéines totales ont été extraites dans un tampon d’extraction (0,5% deoxycholate de sodium / 50 mM bicarbonate d’ammonium / 50 mM DTT, 1 μM Pepstatine et cocktail d’inhibiteurs de protéases) suivi d’un vibrobroyage à 30 KHz pendant 2 minutes. L’ADN résiduel a été éliminé par sonication et les protéines ont été précipitées dans l’acétone puis diluées dans 50 µL de tampon 50mM bicarbonate d’ammonium / 1% deoxycholate de sodium. Les concentrations en protéines ont été déterminées par la méthode de Bradford. 20 µg de protéines ont ensuite été dénaturées (95°C pendant 5 minutes), puis réduites (30min à 37°C en présence de 0,2 mM DTT) et alkylées (30min à 37°C en présence de 0,8 mM Iodoacétamide). Finalement, 0,4 µg de trypsine a été ajouté et la digestion a été faite à 37°C pendant 16h. La digestion a été arrêtée par acidification (pH2) et les peptides ont été purifiés sur un Stage Tip (C18). Les peptides ont été séchés dans un concentrateur puis repris dans 11 µl d’une solution 2% ACN (Acétonitrile) / 0.05% TFA (Acide trifluoroacétique). Les peptides ont été quantifiés sur un NanoDrop2000 (ThermoFisher Scientific) à 205 nm. 4.3- Analyse par Nano LC-MS/MS L’analyse a été réalisée par une nanoLC-MS/MS, constituée d’une chaine de chromatographie liquide nanoRSLC U3000 (ThermoScientific, Dionex Softron GmbH, Germering, Germany) couplée à un spectromètre de masse Orbitrap Fusion Tribrid – ETD mass spectrometer (ThermoScientific, San Jose, CA, USA) piloté par le logiciel Orbitrap Fusion Tune Application 3.3.2782.34 et équipé d’une source Nanospray Flex. 1.5µg de peptide a été injecté sur une pré-colonne (300 mm i.d x 5 mm, C18 PepMap100, 5 mm, 100 Å ; (Thermo Fisher Scientific)) en 5 min à vitesse de 20 µL/min dans un solvent contenant 2% ACN / 0,05% TFA. Le flow a ensuite été redirigé de la pré-colonne sur la colonne de séparation (PepMap100 RSLC, C18 3 mm, 100 Å, 75 µm i.d. x 50 cm de long (Thermo Fisher Scientific)) et les peptides ont été élués dans un gradient linéaire composé de 5-40% de solvent B (A: 0,1% FA (Acide formique), B: 80% ACN / 0,1% FA) en 270 min à un débit de 300 nl/ml. Les spectres ont été acquis en utilisant le logiciel Thermo XCalibur software 4.3.73.11. Une calibration interne sur l’ion siloxane (m/z 445.12003) a été effectuée. L’acquisition des peptides a été faite par mode DDA (Data Dependent Acquisition). 4.4- Identification et quantification des protéines Les données brutes issues de l’acquisition en DDA ont été recherchées contre la banque de données Humaine (UniProt Reference Proteome – Proteome ID UP000005640 – 97065 entries – 2020.09) en utilisant le logiciel MaxQuant version 2.0.2.0. 5-Analyse des protéines Elafine et SPRR3 par immunohistochimie (IHC) Pour l’analyse en immunohistochimie, les peaux reconstruites ont été exposées 3 fois à 0,1 ppm d’ozone pendant 18h à J18, J19 et J20, avec ou sans application topique de sébum à J18. Les échantillons d’épidermes ont été prélevés à J22. Chaque condition a été réalisée en triplicat et deux expériences différentes ont été conduites. Les échantillons de peau reconstruites fixés en formol ont été inclus en paraffine et des coupes de 4 µm préparées pour l'IHC. Toutes les IHC ont été réalisées sur un automate Roche Ventana Discovery Ultra. Après le déparaffinage, une étape de démasquage antigénique par la chaleur a été réalisée et les peroxydases endogènes ont été bloquées pendant 10 minutes en utilisant une solution de H 2 O 2 à 3 %. Un anticorps polyclonal anti-SPRR3 (Référence PA5-60721 de Thermo Fisher) et un anticorps monoclonal anti-ELAFIN (Référence SC-398075 de Santa Cruz Biotechnology) ont été utilisés pour marquer les protéines « small proline rich protein 3 » (SPRR3) and « peptidase inhibitor 3 or skin-derived antileukoprotease » (SKALP, ELAFIN), respectivement. Les anticorps ont été révélés à l'aide de polymères d'IgG ou liés à la HRP (OmniMap-HRP, Ventana). L'immunomarquage a été révélé à l'aide d'un système d'amplification utilisant la Tyramide (TSA) lié à un fluorochrome (FAM-Disc de Ventana). Les lames ont été contre-colorées avec du DAPI et recouvertes d'une lamelle. Pour attester de la spécificité des IHC, des anticorps contrôles isotypiques ont été utilisés dans les mêmes conditions conduisant à l'absence de détection de signal sur les échantillons positifs, confirmant la spécificité du signal. Toutes les lames ont été numérisées à l'aide du PathScanCombi d'Excilone à l'Objectif X20 avec des paramètres adaptés pour éviter la saturation du signal. Les mêmes paramètres ont été utilisés pour permettre une détection et une quantification homogènes du signal pour tous les échantillons de peau. Résultats Cornéodesmosine (CDSN), SPRR3, Elafine Les tableaux 1 et 2 montrent que l’expression des biomarqueurs élafine (gène PI3 ), Cornéodesmosine ( CDSN ) et SPRR3 augmentent suite à une exposition à l’ozone au niveau génique (analyse transcriptomique, tableau 1) et au niveau protéique (analyse protéomique, tableau 2). Les résultats sont similaires avec ou sans application topique de sébum avant la première exposition à l’ozone. Le tableau 3 montre que l’expression des biomarqueurs élafine et SPRR3 augmentent suite à une exposition à l’ozone, sans application topique de sébum, au niveau protéique par immunohistochimie. [Table au 1] Tableau 1 : Ratios d’expression des gènes quantifiés en unité arbitraire in vitro sur peaux reconstruites après 3 expositions à l’ozone à 0,1 ppm, avec ou sans application topique de sébum, entre les conditions avec et sans exposition à l’ozone. PI3 est le symbole du gène correspondant à la protéine Elafine. Analyse transcriptomique Gène Ratio valeur q Ratio valeur q PI3 Sébum + Ozone Vs Sébum 2,65 5,69E-05 Ozone Vs Non exposé 2,51 1,74E-04 CDSN 2,40 1,56E-05 2,19 9,99E-05 SPRR3 5,17 2,69E-05 5,85 4,53 E-06 [Table au 2] Tableau 2 : Ratio d’expression des protéines quantifiées en unité arbitraire in vitro sur peaux reconstruites après 3 expositions à l’ozone à 0,1 ppm, avec ou sans application topique de sébum, entre les conditions avec et sans exposition à l’ozone. Analyse protéomique Protéine Ratio valeur q Ratio valeur q Elafin e Sébum + Ozone Vs Sébum 1,96 0,02 Ozone Vs Non exposé 2,05 0,017 CDSN 1,85 0,15 2,32 0,017 SPRR3 3,99 0,02 NA NA [Table au 3] Tableau 3 : Ratio d’expression de l’expression par immunomarquage des protéines quantifiées en unité arbitraire in vitro sur peaux reconstruites après 3 expositions à l’ozone à 0,1 ppm, sans application topique de sébum, entre les conditions avec et sans exposition à l’ozone. Analyse par immunohistochimie Protéine Ratio valeur p Elafin e Ozone Vs Non exposé 1,97 0,01 SPRR3 6,4 0,0001 Méthode de diagnostic d’une exposition à l’ozone de la peau, chez un sujet, ladite méthode comprenant l’étape suivante : a) mesurer le niveau d’expression de PI3, et/ou de la CDSN, et/ou de SPRR3 dans un échantillon de peau dudit sujet. Méthode d’identification d’un composé permettant de prévenir et/ou de traiter les effets délétères de l’ozone sur la peau, ladite méthode comprenant les étapes suivantes : mesurer le niveau d’expression de PI3, et/ou de la CDSN, et/ou de SPRR3 dans un échantillon de peau d’un sujet, ledit échantillon étant traité avec ledit composé; comparer ledit niveau d’expression mesuré à l’étape a) au niveau d’expression correspondant dans un échantillon de peau non traité avec ledit composé ; identifier ledit composé candidat comme un composé permettant de prévenir et/ou de traiter les effets délétères de l’ozone sur la peau lorsque le niveau d’expression détectée dans l’échantillon de peau qui a été traité avec ledit composé est inférieur au niveau d’expression dans l’échantillon de peau qui n’a pas été traité avec ledit composé. Méthode selon la revendication 2, dans laquelle lesdits échantillons de peau sont choisi parmi un explant de peau humaine, une biopsie cutanée, une microbiopsie et un échantillon de stratum corneum. Méthode d’identification d’un composé permettant de prévenir et/ou de traiter les effets délétères de l’ozone sur la peau, ladite méthode comprenant les étapes suivantes : effectuer un traitement d'un échantillon de peau choisi parmi un épiderme reconstruit et une peau reconstruite, par la mise en contact de l’échantillon de peau avec ledit composé; effectuer une exposition à l’ozone dudit échantillon de peau ; mesurer le niveau d’expression de PI3, et/ou de la CDSN, et/ou de SPRR3 dans un échantillon de peau traité avec ledit composé ; comparer ledit niveau d’expression mesuré à l’étape c) au niveau d’expression correspondant dans un échantillon de peau exposé à l’ozone et non traité avec ledit composé ; identifier ledit composé candidat comme un composé permettant de prévenir et/ou de traiter les effets délétères de l’ozone sur la peau lorsque le niveau d’expression détectée dans l’échantillon de peau qui a été traité avec ledit composé est inférieur au niveau d’expression dans l’échantillon de peau qui n’a pas été traité avec ledit composé ; étant entendu que l’étape b peut être réalisée après l’étape a et inversement, et que les étapes a. et b. peuvent être répétées au moins 2 fois. Méthode selon l’une des revendications 1 à 3, dans laquelle le ou les échantillons de peau sont prélevés en utilisant un disque D-squame®. Méthode selon l’une des revendications 1 à 5, dans laquelle le niveau d’expression est déterminé par le niveau d'expression en ARNm ou par la mesure du niveau d’expression de la protéine. Méthode selon la revendication 6, dans laquelle le niveau d’expression de la protéine est mesuré à l’aide d’un ligand spécifique de ladite protéine. Kit pour la mise en œuvre d’une méthode selon l’une quelconque des revendications précédentes, comprenant : un moyen pour la mesure, dans un échantillon de peau, du niveau d’expression de PI3, et/ou de la CDSN, et/ou de SPRR3, dans lequel le moyen pour la mesure du niveau d’expression est un ligand spécifique de la protéine ou une séquence nucléotidique complémentaire de l’ARNm ou un fragment de celle-ci, un couple d’amorces ou une sonde spécifique de l’ARNm de ladite protéine, et une notice d’instructions. Utilisation d’un kit selon la revendication 8 pour l’identification d’un composé permettant de prévenir et/ou de traiter les effets délétères de l’ozone sur la peau.