Brevet FR3158733A1 — publié le 20250801

La présente divulgation concerne une composition, en particulier un biofertilisant ou un probiotique, comprenant une matrice polymère à base de chitosane et de polysaccharides anioniques, en particulier de carraghénane, et des microorganismes, ainsi que son procédé de préparation. Figure d’abrégé: Figure 2 BIOFERTILISANTS A BASE DE POLYMERES NATURELS DOMAINE DE L'INVENTION La présente invention concerne une composition, en particulier un biofertilisant ou un probiotique, comprenant une matrice polymère à base de chitosane et de polysaccharides anioniques, en particulier de carraghénane, et des microorganismes immobilisés par la matrice polymère, ainsi que son procédé de préparation. ETAT DE LA TECHNIQUE Au cours des dernières années, les biofertilisants ont été identifiés comme des alternatives viables aux engrais synthétiques, capables de favoriser la croissance des plantes sans effet dangereux pour l'environnement et les êtres humains. Les biofertilisants sont des intrants agricoles contenant des micro-organismes qui favorisent la croissance des plantes. Ils sont destinés à être appliqués aux semences, aux plantes ou aux sols. Les biofertilisants peuvent se présenter sous forme solide ou liquide. Dans les formes solides, les micro-organismes sont apportés associés à des matériaux. Le choix du matériau approprié pour transporter ces micro-organismes et la manière dont les bactéries sont associées au support sont essentiels pour assurer la survie et la libération de ces micro-organismes. L'alginate est connu pour être le polymère biodégradable le plus couramment testé en tant que support. Cependant, l'alginate de calcium n'est pas stable dans les sols et nécessite des étapes de traitement supplémentaires, comme l'enrobage, pour garantir la stabilité du produit 1 . Des mélanges comprenant du chitosane et de l’amidon ont également été proposés 2 . Cependant, pour fabriquer un support de type hydrogel à base de chitosane et d'amidon, l’emploi d’un réticulant ionique est nécessaire, le tripolyphosphate de sodium. Bien qu'il soit connu pour être généralement non toxique, la formation de formes complexes insolubles peut se produire dans les sols dans lesquels ce réticulant peut être piégé 3 . En outre, les réticulants induisent des processus de dégradation complexes et lents dans les sols et posent des difficultés pour un usage à grande échelle. Par ailleurs, la préparation de ce type de support requiert une étape de stérilisation à l'autoclave avant immobilisation des bactéries sur le support 2 . Cette étape supplémentaire permet de doubler la capacité de gonflement de l’hydrogel et donc d’augmenter le nombre de bactéries immobilisées mais s’avère contraignante pour une production à grande échelle. Ainsi, un besoin demeure pour la mise à disposition d’un biofertilisant stable, performant et respectueux de l’environnement, qui puisse être préparé selon un procédé simple et facilement transposable à l’échelle industrielle. La présente invention porte sur une composition comprenant : - une matrice polymère à base de chitosane et de polysaccharides anioniques; et - des microorganismes. La présente invention porte également sur deux procédés permettant la préparation d’une telle composition. Ainsi, la composition peut être préparée par un procédé comprenant les étapes suivantes : (a) préparation d’une solution aqueuse de chitosane à pH acide, la solution aqueuse de chitosane pouvant comprendre des ions potassium et des microorganismes ; (b) préparation d’une solution aqueuse de polysaccharides anioniques, en particulier de carraghénane, à pH allant de 5 à 8, la solution aqueuse de polysaccharides anioniques pouvant comprendre des ions potassium et des microorganismes ; au moins une des deux solutions comprenant des ions potassium et au moins une des deux solutions comprenant des microorganismes ; (c) introduction au goutte à goutte de la solution préparée en (a) dans la solution préparée en (b) ; (d) maturation des gels obtenus à l’issue de l’étape (c) pendant une durée d’au moins 15 h à une température de 25 à 30°C; (e) séchage du gel obtenu à l’issue de l’étape de maturation. La composition peut également être préparée par un procédé comprenant les étapes suivantes : (a’) préparation d’une solution aqueuse de chitosane à pH acide, la solution aqueuse de chitosane pouvant comprendre des ions potassium et des microorganismes ; (b’) préparation d’une solution aqueuse de polysaccharides anioniques, en particulier de carraghénane, à pH allant de 5 à 8, la solution aqueuse de polysaccharides anioniques pouvant comprendre des ions potassium et des microorganismes ; au moins une des deux solutions comprenant des ions potassium et au moins une des deux solutions comprenant des microorganismes ; (c’) introduction et mélange des solutions préparées aux étapes (a’) et (b’) dans une extrudeuse ; (d’) extrusion du gel formé ; (e’) découpage du gel extrudé ; (f’) optionnellement maturation du gel extrudé ; (g’) séchage des fragments de gel. Enfin, la présente invention porte sur un procédé de fertilisation d’un sol comprenant l’épandage sur et/ou dans le sol d’une composition selon l’invention ou l’utilisation de la composition pour la libération différée des microorganismes immobilisés par la matrice polymère. D’autres aspects de l’invention sont tels que décrits ci-après. DESCRIPTION DES FIGURES FIG. 1 Confirmation de l'immobilisation des bactéries par microscopie confocale (flèches indiquant les bactéries immobilisées). FIG. 2 Nombre moyen de bactéries libérées des granulés de biofertilisant séchés à l'air et chargés d' Azospirillum baldaniorum Sp245 pOT1e( ppdC-egfp) par rapport aux bactéries libres. FIG. 3 Image de microscopie confocale d'un apex de blé inoculé avec des granules chargés d’ Azospirillum baldanorium Sp245 pOT1e( ppdC-egfp) (image de gauche ; flèches indiquant les zones colonisées par la bactérie) par rapport à des conditions expérimentales contrôle : apex de blé avec matrice non inoculée (image du centre) et apex de blé sans aucune particule (image de droite). FIG. 4 Module de stockage d'échantillons de chitosane-carraghénane tels qu'extrudés à différents rapports de charge isovolumique chitosane/carraghénane. DESCRIPTION DETAILLEE DE L'INVENTION Les inventeurs ont mis au point une composition à base de polymères naturels répondant aux besoins exprimés. La composition présente une bonne stabilité. Ainsi, elle peut se conserver plusieurs mois, par exemple jusqu’à 3 mois voire plus, au sec. Par ailleurs, de manière avantageuse, la composition permet la libération retardée de microorganismes sur plusieurs semaines voire plusieurs mois, par exemple de 8 semaines à 3 mois. La composition est tout particulièrement utile en tant que biofertilisant ou probiotique. La composition peut être préparée par des procédés respectueux des microorganismes et ne requérant pas l’usage d’un agent de réticulation. Ainsi, la présente invention porte sur une composition, en particulier un biofertilisant ou un probiotique, comprenant : - une matrice polymère à base de chitosane et de polysaccharides anioniques, en particulier de carraghénane ; et - des microorganismes. La composition se présente, de préférence, sous forme de granulés. Lorsque la composition est un biofertilisant, les granulés ont de préférence un diamètre moyen allant de 0,1 à 5 mm, de préférence de 100 microns à 300 microns, typiquement autour de 200 microns, lorsque les granulés se présentent sous forme sèche (aux environs de 400 microns sous forme hydratée). Lorsque la composition est un probiotique, les granulés ont de préférence un diamètre moyen allant de 100 microns à 1 mm (forme sèche). Le diamètre moyen des granulés peut être mesuré selon diverses méthodes connues de l'homme du métier. Dans le cadre de l'invention, il correspond au diamètre moyen obtenu par observation à la loupe binoculaire et traitement d’image. Matrice polymère à base de chitosane et de carraghénane La matrice polymère à base de chitosane et de polysaccharides anioniques, en particulier de carraghénane, permet d’immobiliser les microorganismes. L’association du chitosane et des polysaccharides anioniques, en particulier du carraghénane, forme un complexe de type polyélectrolyte. Un complexe de polyélectrolytes est un assemblage d’au moins deux polymères de charge opposée associés par des interactions électrostatiques attractives. Le complexe se forme de manière spontanée par mélange de solutions de polyélectrolytes de charges opposées et ce en absence d’agents de réticulation chimique ou physique. Le chitosane est un biopolymère biodégradable. Il s’agit d’un polysaccharide produit par désacétylation chimique (en milieu alcalin) ou enzymatique, totale ou partielle, de la chitine, un composant de l'exosquelette des arthropodes (crustacés), de la cuticule des insectes, de l'endosquelette des céphalopodes ou encore de la paroi des champignons. Le chitosane est composé d’unités D-glucosamine (unités désacétylées) et d’unités N-acétyl-D-glucosamine (unités acétylées), reliées entre elles par des liaisons glycosidiques ß-(1-4). Il peut en particulier être obtenu par extraction en laboratoire à partir de chitine issue des carapaces de crabes bleus ( Portunus pelagicus ) des Philippines. En milieu acide, le chitosane se trouve sous une forme polycationique, du fait de la protonation des groupements amine des unités glucosamine. Le chitosane utile dans le cadre de la présente invention présente typiquement un degré d’acétylation allant de 1 à 35%, de préférence de 15 à 25%. Le chitosane utile dans le cadre de la présente invention présente typiquement une masse molaire moyenne en poids allant de 50 à 600 kg/mol, de préférence de 100 à 400 kg/mol ou de 300 à 400 kg/mol. Les polysaccharides anioniques peuvent être des alginates, des carraghénanes, des dextranes sulfates, des polyacides galacturoniques, des ulvanes, de l’acide hyaluronique, du xanthane, de l’héparine ou encore du chondroïtine sulfate, de préférence des carraghénanes. Les carraghénanes sont des polysaccharides anioniques polysulfatés linéaires, généralement extraits d'algues rouges telles que Kappaphycus alvarezii, Eucheuma denticulatum et Kappaphycus cotonii . La chaîne principale des carraghénanes est composée d'unités de galactose et d'anhydrogalactose liées par des unités glycosidiques. Selon les méthodes d'extraction et les sources, il existe trois types de carraghénanes qui diffèrent principalement par le degré de substitution du groupe sulfate : le κ-carraghénane (kappa-carraghénane) ; le ι-carraghénane (iota-carraghénane) ; et le λ-carraghénane (lambda-carraghénane). Les trois types de carraghénanes peuvent être utilisés dans le cadre de la présente invention. Le κ-carraghénane utile dans le cadre de la présente invention présente typiquement une masse molaire moyenne en poids allant de 100 à 1 000 kg/mol, de préférence de 500 à 700 kg/mol. Le κ-carraghénane utile dans le cadre de la présente invention présente typiquement un degré de sulfatation allant de 50 à 80%, de préférence de 60 à 75%. Microorganismes Les microorganismes sont généralement des micro-organismes rhizosphériques ou endophytes favorisant la croissance des plantes. De tels microorganismes sont tout particulièrement utiles pour la conception de biofertilisants. Les microorganismes peuvent être des bactéries ou des levures. De façon préférée, les microorganismes sont des bactéries. Les microorganismes sont de préférence des bactéries sélectionnées dans le groupe constitué des bactéries phytobénéfiques, biostimulatrices ou de biocontrôle, aussi qualifiées de PGPR ou PGPB (pour Plant Growth Promoting (Rhizo)Bacteria ). De préférence, les microorganismes sont des rhizobactéries, en particulier de la famille des Rhizobiaceae, Azospirillacaceae, Pseudomonadaceae ou des Bacillaceae , de préférence choisis parmi les genres Rhizobium, Azospirillum, Pseudomonas , et Bacillus, et de façon encore plus préférée parmi les Rhizobium leguminosarum , Azospirillum baldanorium, Azospirillum brasilense, les espèces du groupe des Pseudomonas fluorescents ou les Bacillus amyloliquefaciens, Bacillus pumilus, Bacillus velezensis, Bacillus subtilis . Les micro-organismes peuvent également être des bactéries de plusieurs genres : Lactobacillus spp. ( Lactobacillus rhamnosus, Lactobacillus casei, Lactobacillus acidophilus, Lactobacillus plantarum, Lactobacillus reuteri ) et Bifidobacterium spp ( Bifidobacterium longum, Bifidobacterium lactis, Bifidobacterium breve, Bifidobacterium bifidum ), ou les genres Streptococcus , Lactococcus . De tels microorganismes sont tout particulièrement utiles pour la conception de probiotiques. Les levures peuvent être sélectionnées dans le genre des Saccharomyces (par exemple Saccharomyces cerevisiae , Saccharomyces boulardii ). De telles levures sont tout particulièrement utiles pour la conception de probiotiques. La composition, en particulier le biofertilisant, comprend généralement de 2,5 x 10^8 à 3,1 x 10^8 UFC/g, de préférence de 2 x 10^8 à 5 x 10^8 UFC/g de bactéries par rapport au poids du biofertilisant. Procédé de préparation de la composition La composition de la présente invention peut être préparée selon deux procédés alternatifs. De manière avantageuse, les procédés selon l’invention ne requièrent pas l’usage d’un agent de réticulation. Procédé 1 Un premier procédé de préparation de la composition, en particulier du biofertilisant ou du probiotique, selon l’invention comprend les étapes suivantes : (a) préparation d’une solution aqueuse de chitosane à pH acide, la solution aqueuse de chitosane pouvant comprendre des ions potassium et des microorganismes ; (b) préparation d’une solution aqueuse de polysaccharides anioniques, en particulier de carraghénane, à pH allant de 5 à 8, de préférence de 6,5 à 7,5, la solution aqueuse de polysaccharides anioniques pouvant comprendre des ions potassium et des microorganismes ; au moins une des deux solutions comprenant des ions potassium et au moins une des deux solutions comprenant des microorganismes ; (c) introduction au goutte à goutte de la solution préparée en (a) dans la solution préparée en (b) ; (d) maturation des gels obtenus à l’issue de l’étape (c) pendant une durée d’au moins 15 h à une température de 25 à 30°C ; (e) séchage du gel obtenu à l’issue de l’étape de maturation. Etapes (a) et (b) La solution aqueuse de chitosane présente un pH acide, c’est-à-dire inférieur à 6,5. Typiquement, le pH de la solution aqueuse de chitosane varie de 2 à 6,5, de préférence de 5,20 à 6. La solution aqueuse de polysaccharides anioniques, en particulier de carraghénane, présente un pH allant de 5 à 8 de préférence allant de 6,5 à 7,5, de manière encore plus préférée allant de 6,9 à 7,3. Au moins, l’une des deux solutions aqueuses comprend des ions potassium. Dans certains modes de réalisation préférés, les deux solutions comprennent des ions potassium. Les ions potassium permettent d’écranter partiellement les interactions électrostatiques intra-chaines du chitosane et du polysaccharide anionique (carraghénane) ce qui permet de rendre ces derniers plus flexibles et ainsi favoriser la complexation. Les ions potassium contribuent également à renforcer les propriétés mécaniques des produits formés 4 . La concentration en ions potassium dans l’une ou l’autre des solutions varie généralement de 0 à 15 mM. Dans certains modes de réalisation, la solution aqueuse de chitosane comprend de 3 à 10 mM d’ions potassium, de préférence de 4 à 6 mM d’ions potassium. Dans certains modes de réalisation, la solution aqueuse de carraghénanes comprend de 3 à 10 mM d’ions potassium, de préférence de 4 à 6 mM d’ions potassium. Les ions potassium sont typiquement apportés sous forme d’acétate de potassium. La solution aqueuse de chitosane comprend typiquement de 3 à 20 g/L de chitosane, de préférence de 5 à 15 g/L de chitosane, par exemple aux environs de 10 g/L. La solution aqueuse de polysaccharides anioniques, en particulier de carraghénane, comprend typiquement de 3 à 10 g/L de polysaccharides anioniques, en particulier de carraghénane, de préférence de 3 à 8g/L de polysaccharides anioniques, en particulier de carraghénane, par exemple aux environs de 5 g/L. Dans certains modes de réalisation préférés, la solution aqueuse de chitosane comprend de 3 à 20 g/L, de préférence de 5 à 15 g/L de chitosane, et de 3 à 10 mM, de préférence de 4 à 6 mM, d’ions potassium et la solution aqueuse de polysaccharides anioniques, en particulier de carraghénane, comprend de 3 à 10 g/L, de préférence de 3 à 8 g/L, de polysaccharides anioniques, en particulier de carraghénane, et de 3 à 10 mM, de préférence de 4 à 6 mM d’ions potassium. Au moins, l’une des deux solutions aqueuses comprend des microorganismes. Dans certains modes de réalisation préférés, la solution aqueuse de polysaccharides anioniques, en particulier de carraghénane, comprend les microorganismes (la solution aqueuse de chitosane n’en comprend pas). En fonction de la sensibilité des microorganismes au pH, l’homme du métier sera en mesure de déterminer dans quelle solution ajouter les microorganismes (voire les deux). La concentration en microorganismes dans l’une ou l’autre des solutions varie généralement de 1 x 10^7 à 15 x 10^7 CFU/mL. Les solutions peuvent être stérilisées avant de passer aux étapes ultérieures, par exemple pendant 20 minutes à 121°C, 20 psi. Etapes (c) et (d) La solution aqueuse de chitosane est introduite au goutte à goutte dans la solution aqueuse comprenant le polysaccharide anionique, en particulier le carraghénane. Dans des modes de réalisation préférés, une solution aqueuse comprenant du chitosane et des ions potassium (pas de microorganisme) est introduite au goutte à goutte dans une solution aqueuse comprenant le polysaccharide anionique, en particulier le carraghénane, des ions potassium et des microorganismes. L’addition au goutte à goutte peut se faire par la technique de prilling. Le prilling permet la production de gouttes de taille calibrée. L’ensemble est maturé pendant une durée d’au moins d’au moins 15 h, de préférence allant de 19 à 24h, à une température de 20 à 40°C, de préférence de 25 à 30°C. Une agitation modérée, de l’ordre de 50 rpm, durant la maturation est typiquement opérée. L’introduction de la solution aqueuse de chitosane au goutte à goutte dans la solution aqueuse de polysaccharides anioniques, en présence d’ions potassium, forme un gel sous forme de capsule/bille. L’étape de maturation permet d’obtenir un gel stable. Une réorganisation du gel s’opère lors de cette étape conduisant à son renforcement. Le terme « gel » désigne un matériau semi-solide constitué d’une matrice polymère gonflée par une quantité de solvant. Lorsque le solvant est l’eau, le gel est un hydrogel. Etape (e) Le séchage du gel obtenu à l’issue de l’étape de maturation est typiquement réalisé à des températures modérées afin de préserver la survie des microorganismes. L’homme du métier saura adapter la température de séchage à la nature des microorganismes. Dans certains modes de réalisation, le séchage est réalisé à une température allant de 15 à 30°C, de préférence de 25 à 30°C. L’homme du métier sera également en mesure d’adapter la durée de séchage. Dans certains modes de réalisation, le séchage est réalisé pendant une durée allant de 48 heures à 4 jours. Dans certains modes de réalisation particuliers, le gel est séché à l’air, à une température allant de 25 à 30°C pendant une durée allant de 48 heures à 4 jours. La composition obtenue à l’issue du séchage se présente typiquement sous forme de billes/granulés. Les billes/granulés présentent généralement une structure cœur-écorce comprenant un cœur riche en chitosane, une enveloppe externe riche en polysaccharide anionique et une couche intermédiaire comprenant du chitosane et le polysaccharide anionique. Procédé 2 Un deuxième procédé de préparation de la composition selon l’invention, en particulier du biofertilisant ou du probiotique, comprend les étapes suivantes : (a’) préparation d’une solution aqueuse de chitosane à pH acide, la solution aqueuse de chitosane pouvant comprendre des ions potassium et des microorganismes ; (b’) préparation d’une solution aqueuse de polysaccharides anioniques, en particulier de carraghénane, à pH allant de 5 à 8, de préférence de 6,5 à 7,5, la solution aqueuse de polysaccharide anionique pouvant comprendre des ions potassium et des microorganismes ; au moins une des deux solutions comprenant des ions potassium et au moins une des deux solutions comprenant des microorganismes ; (c’) introduction et mélange des solutions préparées aux étapes (a’) et (b’) dans une extrudeuse, de préférence bivis ; (d’) extrusion du gel formé ; (e’) découpage du gel extrudé ; (f’) optionnellement maturation du gel extrudé ; (g’) séchage des fragments de gel. Ce deuxième procédé présente l’avantage d’être aisément applicable à l’échelle industrielle. Il permet une préparation de la composition à grande échelle. Les étapes (a’) et (b’) sont telles que décrites précédemment en relation avec le premier procédé (étapes (a) et (b)). Le mélange et l’extrusion peuvent être réalisées à température ambiante (15-20°C) ou en chauffant. L’homme du métier saura adapter la température de mélange et d’extrusion à la nature et à la sensibilité des microorganismes afin de les préserver tout en assurant de bonnes conditions de processabilité. Dans certains modes de réalisation, le mélange et l’extrusion sont réalisés à des températures allant de 20 à 40°C. Le temps de séjour dans l’extrudeuse varie typiquement de 20 à 30 minutes. Les solutions sont typiquement introduites dans l’extrudeuse à un débit allant de 0,5 à 1,5 kg/heure pour la solution de polysaccharides anioniques et de 0,7 à 1,5 kg/heure pour la solution de chitosane. Le découpage du gel peut être réalisé par tout moyen adapté et connu de l’homme du métier. La taille des fragments formé sera adapté aux usages du gel. Le séchage (étape (g’)) des fragments de gel obtenu à l’issue de l’étape (e’) ou (f’) est réalisé comme décrit précédemment en lien avec le premier procédé (étape (e)). Les fragments de gels peuvent être ensuite transformés sous forme de granulés, de poudre. Les granulés (obtenus par le procédé 1 ou 2) présentent généralement un poids moyen allant de 20 à 500 mg par granulé. Les compositions de la présente invention sont stables. En effet, il a été observé qu’après 3 mois de stockage à température ambiante (20-25°C ; humidité relative 35%), un nombre similaire de bactéries est libéré (voir exemples). Usages La composition de la présente invention peut être utilisée en tant que biofertilisant. Le biofertilisant de la présente invention peut être appliqué sur des semences, le sol ou la surface des végétaux. Il permet la libération différée des microorganismes immobilisés par la matrice polymère. De manière avantageuse, les microorganismes sont libérés de manière prolongée dans le temps. Le biofertilisant peut être tout particulièrement utile dans un procédé de fertilisation des sols. La présente invention porte ainsi également sur un procédé de fertilisation d’un sol comprenant l’épandage du biofertilisant de la présente invention sur et/ou dans le sol. La présente invention porte également sur l’utilisation d’un biofertilisant selon l’invention pour l’administration différée de microorganismes dans le domaine de l’agriculture, en particulier de la promotion de la croissance des plantes. La composition de la présente invention peut être utilisée en tant que probiotique pour la formulation de probiotiques contenant des bactéries (bifidobactéries, lactobacilles, lactocoques…), mais aussi des levures (saccharomycètes). La composition peut être administrable par voie orale. Elle permet ainsi la délivrance de micro-organismes dans l’intestin. L’origine des micro-organismes peut être une matière fécale (transplantation fécale). EXEMPLES Exemple 1 : préparation d’un biofertilisant selon l’invention Dans cet exemple, la rhizobactérie Azospirillum baldanorium Sp245 pOT1e(ppdC-egfp) , une souche non-sporulante, qui favorise la croissance des plantes, a été immobilisée avec succès dans une matrice à base de chitosane et de carraghénanes. Le chitosane a été préparé à partir de la chitine extraite en laboratoire des carapaces de crabes bleus des Philippines ( Portunus pelagicus ) 5 . Le carraghénane, extrait de l'algue Kappaphycus cotonii , a été acheté auprès de Marine Resources Development Corporation. Le procédé de préparation a été mis en œuvre comme suit. Une solution de chitosane à 1% massique comprenant 5 mM de potassium (acétate de potassium) a été ajoutée au goutte à goutte à une solution de carraghénane à 0,5% massique comprenant 5 mM de potassium (acétate de potassium) et la rhizobactérie Azospirillum baldanorium Sp245 pOT1e( ppdC-egfp) , 1,10 x 10^7 to 1,43 x 10^8 cellules/mL de solution. Ratio solution aqueuse de chitosane/solution aqueuse de carrraghénane (mL/mL): 2,5 à 100. Une structure opaque, semblable à un gel, est recueillie après une période de maturation d'une nuit (environ 12 heures). Des granules sous forme de billes sensiblement sphériques sont ensuite obtenus après séchage à 28°C pendant 2 à 4 jours, avec un poids moyen de 0,63 ± 0,02 mg/bille. Confirmation de l’immobilisation L'imagerie des granules de biofertilisant a été réalisée par microscopie confocale pour confirmer l'immobilisation des bactéries. La protéine de fluorescence de couleur verte, ou Enhanced Green Fluorescent protein (Egfp), est produite par la bactérie Azospirillum baldanorium Sp245 pOT1e( ppdC-egfp) . Elle permet de suivre par microscopie confocale l’inclusion dans les granules puis le relargage des bactéries à partir des granules. Des coupes minces des différents échantillons, à savoir humides et séchés à l'air, ont été préparées. L'échantillon humide est un granule de biofertilisant qui n'a pas subi de séchage et qui a été transféré dans une solution aqueuse de sulfate de magnésium, les échantillons de biofertilisant séchés à l'air et lyophilisés ont été réhydratés dans une solution aqueuse de sulfate de magnésium. Ces granules ont été soigneusement tranchés pour révéler leurs sections transversales respectives et ont ensuite été placés sur des lames de verre recouvertes d'une goutte de liquide de montage de type AquaPolymount et d'une lamelle couvre-objet. Les paramètres du microscope confocal utilisés comprennent les longueurs d'onde d'excitation et d'émission de 488 nm et 504-555 nm, respectivement, pour l’Egfp et de 650 nm d’émission et 646-700 nm d’excitation pour la matrice. La longueur d'onde d'excitation choisie dépendait de l'émission d'auto-fluorescence de la matrice porteuse du polymère ce qui donne une couleur rouge visible dans les images de la micrographie (apparait en gris clair dans les images en noir et blanc). Tous les échantillons ont fait l'objet d'une projection sur un plan et d'une construction en 3D (voir FIG. 1 ). Mesures de la concentration des bactéries libérées dans le temps Trois granulés du prototype de biofertilisant ont été immergés dans trois millilitres d'eau ultrapure stérilisée contenue dans des tubes stériles. Six répétitions de ces dispositifs expérimentaux ont été préparées. Cent cinquante microlitres d'échantillon ont été prélevés à chaque étape de prélèvements. À partir de ce volume d'échantillon, la quantification des bactéries a été réalisée à l'aide d’une méthode de dénombrements par dilution et dépôts de gouttes des suspensions sur milieu gélosé nutritif. Pour ce faire, sept dilutions en série ont été préparées, avec des dilutions en série de 10 en 10. Dans chaque dilution, 100 μL ont été ajoutés à 900 μL de MgSO 4 10 mM. Pour chaque dilution, cinq répétitions de 10 μL ont été déposées sous forme de gouttelettes sur chaque boite de Petri contenant du bouillon d'agar nutritif (NAB) avec de la gentamycine (à 15 μg/mL) comme antibiotique (marquage plasmidique pour la construction ppdC::egfp ). Les boîtes ont été incubées à 28°C pendant au moins deux jours, après quoi les colonies de chaque goutte ont été comptées et les UFC/mL ont été calculées. Les résultats sont présentés à la FIG. 2 . Après réhydratation à l'eau des granulés chargés en bactéries, le nombre maximum de bactéries libérées est proche de 2,8 x 10^8 ± 0.3 x 10^8 CFU/g de biofertilisant ; une quantité comparable à des tests antérieurs montrant l'impact positif des bactéries libres sur la croissance des plantes (à partir de grains de blé et de riz) 6,7 . Après trois mois de stockage à température ambiante, un nombre similaire de bactéries libérées a encore été observé, 1,38 x 10^8 ± 0,62 x 10^8 CFU/g, ce qui montre que le biofertilisant conserve ses propriétés à long terme. Il est intéressant de noter que la libération des bactéries s'étend sur une longue période, et permet un apport bactérien différé aux plantes. Par exemple ; au 17ème jour, la libération de bactéries est encore de 5,8 x 10^7 ± 1,8 x 10^7 CFU/g de biofertilisant ; soit une diminution correspondante de 19% de la valeur du log 10 par rapport à celle après les 48 premières heures. La présence de bactéries non libérées et encore piégées dans le biofertilisant a également été observée par microscopie confocale. Toutefois, d'après une expérience menée sur le prototype de biofertilisant conservé dans l'eau pendant six mois, des bactéries ont encore été libérées après que le prototype ait été lavé plusieurs fois avec de l'eau et transféré dans un nouveau volume d'eau. Cette constatation a été confirmée par microscopie à épifluorescence, qui a révélé la présence de nombreuses bactéries dans le prototype de biofertilisant. C'est une bonne indication d'un support efficace car il peut permettre une survie plus longue des bactéries jusqu'à la dégradation du support polymère dans le sol. Exemple 2 : Essais in vitro (graines de blé) et serres L'étude de la croissance des plantes in vitro a été menée pour évaluer l'effet du prototype de biofertilisant sur la croissance des plantes de blé. Les cinq principales étapes expérimentales sont les suivantes (1) la production du prototype de biofertilisant, (2) la désinfection de la surface des graines et la prégermination des semences de blé, (3) l'inoculation du prototype de biofertilisant, (4) la croissance des plantes de blé pendant une semaine et (5) la récolte des plantes et l'analyse des biomasses des racines et des parties aériennes et des caractéristiques morphologiques des racines. Essais in vitro : les essais ont été réalisées dans des boîtes de Petri sur un milieu gélosé contenant uniquement de l’agar pour plante à 8 g/L. Essais en serre : les essais ont été réalisés dans un environnement semi-contrôlé en utilisant un mélange de sol non stérilisé et une température et une humidité relative déterminées. Les semences de blé ont été désinfectées par plusieurs lavages alternés de solutions d'hypochlorite de sodium et de thiosulfate de sodium et d'eau. Les graines désinfectées ont ensuite été prégermées dans des boîtes d'agar. Le jour suivant, les graines qui ont commencé à produire des germes ont été sélectionnées et utilisées pour l'étude de la croissance des plantes in vitro . Trois conditions expérimentales ont été préparées : (1) contrôle - seules les graines de blé prégermées ont été transférées dans des boîtes de gélose végétale, (2) matrice porteuse de polymère uniquement - graines de blé traitées avec la matrice uniquement, et (3) prototype de biofertilisant - graines de blé traitées avec le prototype de biofertilisant. Un total de 20, 14 et 19 graines ont été utilisées pour chacune de ces conditions expérimentales, respectivement, et ces expériences ont été réalisées en deux répétitions au total. Les prototypes de biofertilisants hydratés à l'eau, sous forme de granulés d'environ 0,2 cm de diamètre, ont été placés près de la radicule des graines prégermées. Dix granules ont été appliqués à chaque graine qui contenaient en moyenne 2,18 x 10^6 ± 0,99 x 10^6 nombre total de cellules/granule. Les boîtes ont été maintenues dans un Phytotron (Sanyo), avec une température de 20°C et une humidité relative de 60%. Les plantes ont ensuite été récoltées le septième jour en coupant les parties aériennes et en scannant les racines exemptes d'agar. Le poids frais des parties aériennes et des racines (sans la graine) a été mesuré, puis ces échantillons ont été placés dans une étuve à 105 °C pendant trois jours pour la détermination du poids sec. Pour les mesures des caractéristiques morphologiques des racines, le logiciel WinRhizo a été utilisé. Divers paramètres végétaux, y compris les biomasses des racines et des parties aériennes et les caractéristiques morphologiques des racines, ont été mesurés et évalués. Des diagrammes en boîte de toutes les données recueillies ont été construits. Des analyses statistiques ont également été effectuées. Le test de Shapiro-Wilk a été utilisé pour vérifier la distribution normale des données collectées, après quoi le test de signification a été évalué à l'aide de l'ANOVA et de tests non paramétriques post-hoc qui incluent Mann Whitney (comparaison entre 2 traitements) ou Kruskal-Wallis (comparaison entre 3 traitements), selon ce qui est applicable. Les résultats sont présentés dans le tableau 1. Caractéristiques morphologiques des racines dans les expériences de croissance végétale in vitro Biofertilisant vs. contrôle Biofertilisant vs. matrice Nombre de racines +33,2 +51,9 Poids sec des feuilles 0 +9,76 Poids sec des racines +11,2 +19,3 Biomasse totale +4,3 +13,5 Ratio poids secs racines sur celui des feuilles +12,7 +19,3 Longueur totale des racines +15,7 +61 Surface totale des racines +17,9 +19,9 Volume total des racines +14,8 +8,3 Tableau 1 : Taux d'augmentation (%) montrant une amélioration avec l'utilisation du prototype de biofertilisant dans les expériences de croissance végétale in vitro . L'étude in vivo sur la croissance des plantes en serre a été menée pour évaluer l'effet du prototype de biofertilisant sur la croissance des plantes de blé cultivées dans un sol non stérile, mais toujours dans des conditions environnementales contrôlées. Trois conditions expérimentales ont été préparées : (1) contrôle - seules des graines de blé ont été plantées, (2) matrice porteuse de polymère uniquement - graines de blé plantées avec la matrice uniquement, et (2) prototype de biofertilisant - graines de blé plantées avec le prototype de biofertilisant. Dix graines ont été plantées pour chacune de ces conditions expérimentales. Sept grandes étapes expérimentales ont été réalisées : (1) préparation du mélange de sol ; (2) préparation des pots de plantation et ajout d'eau ; (3) gonflement des semences et du biofertilisant ; (4) plantation et inoculation ; (5) croissance des plantes pendant trois semaines ; (6) période de récolte : nettoyage des racines et collecte de la biomasse ; et (7) analyses de la biomasse des racines et des pousses et des caractéristiques morphologiques des racines. Un mélange de sol composé de terre, de compost et de vermiculite (un conditionneur de sol) a été initialement préparé. Au moins trente pots contenant 1,4 L (poids moyen de 826 g) de mélange de sol ont été disposés et l'eau nécessaire a été ajoutée en fonction de la capacité de rétention d'eau du sol. Comme pour les expériences in vitro , des graines de blé ont également été utilisées pour l'expérience en serre. Cependant, les graines n'étaient plus prégermées. Les graines ont été trempées dans l'eau pendant quelques heures avant d'être plantées. De même, la matrice porteuse de polymère et le prototype de biofertilisant ont été réhydratés avec de l'eau avant d'être appliqués sur les graines de blé. Une graine a été déposée dans une petite cavité peu profonde située au centre supérieur de chaque pot de plantation. La matrice polymère réhydratée et le prototype de biofertilisant ont été appliqués directement sur la graine, séparément en fonction des conditions expérimentales de chaque pot. Lors de l'utilisation du prototype de biofertilisant, 11 granules ont été appliqués à chaque graine qui contient 7,32 x 10^5 ± 3,74 x 10^5 nombre total de cellules/granule, en moyenne. Une quantité équivalente de la matrice porteuse en polymère sans bactérie a également été utilisée pour ce type de traitement, c'est-à-dire 11 unités de la matrice. Les graines de blé ont été cultivées pendant trois semaines et arrosées tous les deux jours sauf le week-end. Le volume d'eau ajouté est en référence à la capacité de rétention d'eau du sol. Les plantes ont ensuite été récoltées, les pousses collectées et coupées, et les racines prudemment nettoyées des particules du mélange de sol dans une solution saline. Les racines ont ensuite été scannées en vue de l'analyse de leurs caractéristiques morphologiques à l'aide du logiciel WinRhizo. Le poids frais des pousses et des racines (sans les graines) a été mesuré, puis ces échantillons ont été placées dans une étuve à 105 °C pendant quatre à cinq jours pour la détermination du poids sec. Les analyses de données effectuées pour l'expérience en serre sont les mêmes que celles effectuées pour l'expérience in vitro . Les résultats sont présentés dans le tableau 2 : Caractéristiques morphologiques des racines dans les expériences de croissance des plantes en serre Biofertilisant vs. contrôle Biofertilisant vs. matrice Nombre de feuilles +5,9 +5,9 Poids sec des feuilles +12,2 -4,5 Poids sec des racines +42,1 +20,7 Biomasse totale +20,9 +2,8 Ratio poids secs racines sur celui des feuilles +26,7 +28,9 Longueur totale des racines +24,9 +9,7 Surface totale des racines +19,3 +2,3 Tableau 2 : Taux d'augmentation (%) montrant une amélioration avec l'utilisation du prototype de biofertilisant dans les expériences de croissance des plantes en serre. Conclusions Les expériences in vitro et en serre réalisées avec les granulés chargés de bactéries et appliqués directement sur les semences de blé ont montré une colonisation réussie des racines par les bactéries et un effet positif prometteur sur la croissance des plantes par l'analyse des biomasses des plantes et des caractéristiques des racines. Le prototype de biofertilisant s'avère donc capable de fournir aux racines des plantes des souches bactériennes phytobénéfiques, réputées sensibles comme les souches du genre Azospirillum , et d'améliorer de manière prometteuse la croissance des plantes. Example 3 : préparation d’une composition selon l’invention par extrusion Des solutions à des concentrations de 2% masse/masse (i.e. fraction massique dans la solution) de chitosane (disponible dans le commerce auprès de Mahtani Pvt. Ltd.) et 2% masse/masse de carraghénane contenant toutes deux 5 mM d'acétate de potassium ont été préparées. La complexation de ces solutions de polyélectrolytes a été effectuée dans une extrudeuse bi-vis co-rotative (modèle Leistriz ZSE18HPe-60D, diamètre 18 mm, L/D=60) à 40°C et à une vitesse de vis de 500 rpm. La solution de carraghénane est introduite dans l'extrudeuse par une pompe péristaltique dont l'injecteur a un diamètre de 0,5 mm. D'autre part, une pompe cyclique Roth Cyclo II est utilisée pour l'alimentation de la solution de chitosane avec un diamètre d'injecteur similaire. Un engrenage à contre-courant a également été incorporé dans le profil de la vis (c'est-à-dire GFA-15-15-L). Différents débits ont été utilisés pour obtenir différents types de rapport de charge chitosane/carraghénane, r, tels que r = 1 qui correspond à la complexation stœchiométrique du chitosane et du carraghénane et r > 1 qui alimente le chitosane en excès. Les résultats ont montré qu'à r =1, le module de stockage mesuré, G' = 17 298,40 Pa, dépassait celui du carraghénane, G ' = 14 796,7 Pa, ce qui indique qu'un gel a été extrudé ( FIG. 4 ). La complexation des solutions de chitosane et de carraghénane est donc réussie. L'ARES 2000ex a été utilisé pour mesurer les modules de stockage par le biais du test de balayage de fréquence en utilisant la plaque Peltier en aluminium de 25 mm, avec un cône de 4°. La procédure comprenait un conditionnement de l'échantillon à 25°C avec un temps de trempage de 60 secondes, et une fréquence d'oscillation à 25°C, une déformation de 0,10%, de 0,01 à 600 rad/s, et une oscillation continue. REFERENCES BIBLIOGRAPHIQUES 1 Saberi-Riseh R, Moradi-Pour M, Mohammadinejad R, Thakur VK. Biopolymers for Biological Control of Plant Pathogens: Advances in Microencapsulation of Beneficial Microorganisms. Polymers 2021; 13: 1938. 2 Perez JJ, Francois NJ, Maroniche GA, Borrajo MP, Pereyra MA, Creus CM. A novel, green, low-cost chitosan-starch hydrogel as potential delivery system for plant growth-promoting bacteria. Carbohydrate Polymers 2018; 202: 409–417. 3 HERA. Human & Environmental Risk Assessment on ingredients of European household cleaning products: Sodium tripolyphosphate (STPP) CAS: 7758-29-4. 2003.https://www.heraproject.com/files/13-f-04-%20hera%20stpp%20full%20web%20wd.pdf. 4 Hermansson A-M, Eriksson E, Jordansson E. Effects of potassium, sodium and calcium on the microstructure and rheological behavior of kappa-carrageenan gels. Carbohydrate Polymers 1991; 16: 297–230. 5 Ongkiko AGM, Fernando LAT, Diaz LJL. Continuous Extraction Process of Chitin from D. iscarded Shells of Philippine Blue Swimming Crab (Portunus pelagicus). g J 2016; : 15. 6 Bashan Y, de-Bashan LE, Prabhu SR, Hernandez J-P. Advances in plant growth-promoting bacterial inoculant technology: formulations and practical perspectives (1998–2013). Plant Soil 2014; 378: 1–33. 7 Díaz-Zorita M, Canigia MVF, Bravo OÁ, Berger A, Satorre EH. Field Evaluation of Extensive Crops Inoculated with Azospirillum sp. In: Cassán FD, Okon Y, Creus CM (eds). Handbook for Azospirillum. Springer International Publishing: Cham, 2015, pp 435–445. Composition comprenant : - une matrice polymère à base de chitosane et de polysaccharides anioniques; et - des microorganismes. Composition selon la revendication 1 dans laquelle le polysaccharide anionique est un carraghénane. Composition selon la revendication 1 ou 2, dans lequel les microorganismes sont des rhizobactéries, de préférence de la famille des Rhizobiaceae, Azospirillacaceae, Pseudomonadaceae ou des Bacillaceae. Composition selon la revendication 1 ou 2, dans lequel les microorganismes sont des levures du genre Saccharomyces , de préférence Saccharomyces cerevisiae ou Saccharomyces boulardii . Composition selon l’une des revendications précédentes dans lequel le chitosane présente une masse molaire moyenne en poids allant de 50 à 600 kg/mol, de préférence de 100 à 400 Kg/mol. Composition selon l’une des revendications précédentes se présentant sous forme de granulés. Procédé de préparation d’une composition selon l’une quelconque des revendications précédentes comprenant les étapes suivantes : (a) préparation d’une solution aqueuse de chitosane à pH acide, la solution aqueuse de chitosane pouvant comprendre des ions potassium et des microorganismes ; (b) préparation d’une solution aqueuse de polysaccharides anioniques, en particulier de carraghénane, à pH allant de 5 à 8, la solution aqueuse de polysaccharides anioniques pouvant comprendre des ions potassium et des microorganismes ; au moins une des deux solutions comprenant des ions potassium et au moins une des deux solutions comprenant des microorganismes ; (c) introduction au goutte à goutte de la solution préparée en (a) dans la solution préparée en (b) ; (d) maturation des gels obtenus à l’issue de l’étape (c) pendant une durée d’au moins 15 h à une température de 25 à 30°C; (e) séchage du gel obtenu à l’issue de l’étape de maturation. Procédé de préparation d’une composition selon l’une quelconque des revendications 1 à 6 comprenant les étapes suivantes : (a’) préparation d’une solution aqueuse de chitosane à pH acide, la solution aqueuse de chitosane pouvant comprendre des ions potassium et des microorganismes ; (b’) préparation d’une solution aqueuse de polysaccharides anioniques, en particulier de carraghénane, à pH allant de 5 à 8, la solution aqueuse de polysaccharides anioniques pouvant comprendre des ions potassium et des microorganismes ; au moins une des deux solutions comprenant des ions potassium et au moins une des deux solutions comprenant des microorganismes ; (c’) introduction et mélange des solutions préparées aux étapes (a’) et (b’) dans une extrudeuse ; (d’) extrusion du gel formé ; (e’) découpage du gel extrudé ; (f’) optionnellement maturation du gel extrudé ; (g’) séchage des fragments de gel. Procédé selon la revendication 7 ou 8 dans lequel la solution aqueuse comprenant du chitosane comprend en outre des ions potassium et la solution aqueuse comprenant les polysaccharides anioniques, en particulier le carraghénane, comprend en outre des ions potassium et des microorganismes. Procédé de fertilisation d’un sol comprenant l’épandage sur et/ou dans le sol d’une composition selon l’une des revendications 1 à 6. Utilisation d’une composition selon l’une des revendications 1 à 6 pour la libération différée des microorganismes immobilisés par la matrice polymère.