Brevet FR3163664A1 — publié le 20251226

Procédé de détermination d’une concentration de fibrinogène dans un échantillon de sang, comportant du sang total, l’échantillon ayant fait l’objet d’un mélange avec un réactif, configuré pour entraîner une fibrinoformation, le procédé comportant : a) formation d’images ( ) de l’échantillon en différents instants ( ); b) établissement d’un indicateur de corrélation ( ) entre des images respectivement acquises en différents instants ( , ( )); c) détermination d’une évolution temporelle de l’indicateur de corrélation ; d) détection d’un instant de coagulation à partir de l’évolution temporelle ; e) en fonction de l’instant de coagulation, détermination de la concentration de fibrinogène dans le sang ; le procédé étant caractérisé en ce que : le réactif comporte de la batroxobine, la concentration de batroxobine, après mélange, étant comprise entre 25 et 1000 unité enzymatique par mL. Dispositif et procédé de détermination d’une concentration de fibrinogène dans du sang Le domaine technique de l’invention est la détermination d’une concentration de fibrinogène dans le sang, et plus précisément dans du sang total, éventuellement dilué. ART ANTERIEUR Le fibrinogène est une glycoprotéine dont la concentration plasmatique est usuellement comprise entre 2 et 4 g/l. Le fibrinogène, précurseur de la fibrine, est un élément essentiel de l’hémostase. Sous l’action de la thrombine, il permet une constitution d'un thrombus hémostatique solide. Des troubles de l'hémostase peuvent apparaître rapidement au cours d'un choc hémorragique, notamment dans les traumatismes graves. Ils sont susceptibles de favoriser l'entretien ou la reprise du saignement. Le diagnostic précoce d’une coagulopathie permet un traitement rapide et peut réduire les besoins transfusionnels et améliorer le pronostic. La détermination de concentration en fibrinogène est un élément important pour effectuer un tel diagnostic. En effet, une diminution de la concentration de fibrinogène est un élément clinique important dans la prise en charge d’une hémorragie. En chirurgie, il a été montré que l'abaissement de la fibrinogénémie peut être un facteur indépendant de risque hémorragique. On considère qu’un abaissement de la fibrinogénémie en dessous de 1 g/l est fréquent dans les chocs hémorragiques, et est un indicateur de la sévérité hémorragique. L'administration de concentrés de fibrinogène est peut être recommandée en cas de fibrinogénémie inférieure à 1,5 g/L. A l’heure actuelle, les dosages de fibrinogène plasmatique sont réalisés en laboratoire, à partir de plasma, ce qui impose un certain délai d’analyse, généralement supérieure à 30 minutes. La méthode de référence est la méthode de Clauss, basée sur une mesure du temps de coagulation du plasma après ajout de thrombine. Le dosage de fibrinogène dans le plasma peut être effectué en mettant en œuvre une enzyme hémostatique, par exemple la Batroxobine, comme décrit dans le brevet US20220120769 ou KR10-2154079. La batroxobine n’est pas affectée par la présence d’un anticoagulant, de type héparine, pouvant fausser une détermination du taux de fibrinogène. Le dosage de fibrinogène est établi à partir d’une durée de coagulation. Il s’agit d’un test chronométrique facile et automatisable décrivant la transformation du fibrinogène en fibrine. L’objectif de l’invention décrite par la suite est de déterminer une méthode simple et rapide permettant une détermination de la concentration de fibrinogène sans nécessiter une centrifugation pour obtenir le plasma. La méthode peut être utilisée à partir de sang total, ou dilué, comportant des globules rouges. La méthode est rapide, typiquement quelques dizaines de secondes, et peut être mise en œuvre à partir de quelques gouttes de sang, avec un dispositif simple. La méthode est particulièrement appropriée à une utilisation de type point of care, ou en bloc opératoire, sans nécessiter de moyens d’analyse coûteux. Un premier objet de l’invention est un procédé de détermination d’une concentration de fibrinogène dans un échantillon de sang, comportant du sang total, l’échantillon ayant fait l’objet d’un mélange avec un réactif, configuré pour entraîner une fibrinoformation, le procédé comportant : a) formation d’images de l’échantillon en différents instants; b) établissement d’un indicateur de corrélation entre des images respectivement acquises en différents instants; c) détermination d’une évolution temporelle de l’indicateur de corrélation ; d) détection d’un instant caractéristique, dit instant de coagulation, à partir de l’évolution temporelle ; e) en fonction de l’instant de coagulation, détermination de la concentration de fibrinogène dans le sang. Le réactif peut comporter de la batroxobine, la concentration de batroxobine étant, après mélange, comprise entre 25 et 1000 unité enzymatique par mL. De préférence, le réactif comporte de l’arginine. La concentration d’arginine peut être comprise entre 25 et 250 mM après mélange. Selon une possibilité, le réactif comporte une séquence de peptides comportant de l’arginine, ladite séquence ayant un effet inhibiteur de coagulation, la concentration d’arginine étant comprise entre 0.1 et 0.3 mM après mélange. Le réactif peut comporter un polymère non ionique, de masse molaire inférieure à 40000 g/mol, selon une concentration comprise entre 10 et 50 g/L après mélange. Le polymère non ionique peut comporter au moins un des polymères suivants : Dextran, polyéthylène glycol, polyvinylpyrrolidone, polyoxyethylène. Avantageusement, le réactif peut comporter un sel de calcium ou de manganèse, ou plus généralement un sel de cation divalent. La concentration de sel de calcium et/ou du sel de manganèse peut être comprise entre 5 mMet 50 mM après mélange. De préférence, le pH de l’échantillon, mélangé au réactif, est compris entre 8 et 10 ou entre 8.5 et 10 ou entre 9 et 10. Selon une possibilité : l’étape d) comporte, une détection d’une rupture de pente de l’évolution temporelle en différents instants ; lors de l’étape e), l’instant de coagulation est sélectionné en fonction des instants auxquels une rupture de pente est détectée ; lors de l’étape e), la concentration de fibrinogène est déterminée par une fonction de calibration préalablement établie appliquée à l’instant de coagulation. L’étape e) peut comporter : e-i) sélection d’un instant auquel une rupture de pente est détectée en fonction de critères de sélection prédéterminés ; e-ii) application d’une régression linéaire, dite régression linéaire antérieure, de l’évolution temporelle, en prenant en compte une plage temporelle antérieure à l’instant sélectionné lors de e-i) ; e-iii) application d’une régression linéaire, dite régression linéaire postérieure, de l’évolution temporelle, en prenant en compte une plage temporelle postérieure à l’instant sélectionné lors de e-i) ; e-iv) détermination d’un instant correspondant à un intersection de la régression linéaire antérieure et de la régression linéaire postérieure, l’instant ainsi déterminé correspondant à l’instant de coagulation. Un deuxième objet de l’invention est une chambre fluidique, destinée à recevoir un échantillon sanguin, par capillarité, à partir d’une ouverture, la chambre fluidique comportant un réactif comprenant de la batroxobine et de l’arginine. La chambre fluidique peut s’étendre selon une épaisseur inférieure à 1 cm ou 5 mm ou 1 mm. Le réactif peut comporter également un sel de calcium ou de manganèse. Le réactif peut être configuré pour que, après mélange avec l’échantillon, la quantité de batroxobine soit comprise entre 25 et 1000 unité enzymatique par mL. Le réactif peut être configuré pour que, après mélange avec l’échantillon, la quantité d’arginine soit comprise entre 25 ou 250 mM. Le réactif peut comporter une séquence de peptides comportant de l’arginine, ladite séquence ayant un effet inhibiteur de coagulation. Le réactif est configuré pour que, après mélange avec l’échantillon, la concentration d’arginine est comprise entre 0.1 et 0.3 mM. Le réactif peut comporter un polymère non ionique, de masse molaire inférieure à 40000 g/mol. Le polymère non ionique peut comporter au moins un des polymères suivants : Dextran, polyéthylène glycol, polyvinylpyrrolidone, polyoxyethylène. Le réactif est configuré pour que, après mélange avec l’échantillon, la concentration de polymère non ionique est comprise entre 10 et 50 g/L. Le réactif peut comporter un sel de calcium ou de manganèse, ou plus généralement un sel de cation divalent. Le réactif peut être configuré pour que, après mélange avec l’échantillon, sel de calcium et/ou du sel de manganèse peut être comprise entre 5 mM et 50 mM. De préférence, le pH de l’échantillon, mélangé au réactif, est compris entre 8 et 10 ou entre 8.5 et 10 ou entre 9 et 10. Le réactif peut être présent, dans la chambre fluidique, à l’état liquide ou lyophilisé. Un troisième objet de l’invention est kit, destiné à une mise en œuvre d’un procédé selon le premier objet de l’invention, et comportant : une chambre fluidique selon le deuxième objet de l’invention ; un lecteur comportant une source de lumière, s’étendant face à un capteur d’image, le lecteur étant configuré pour recevoir la chambre fluidique entre la source de lumière et le capteur d’image ; une unité de traitement, configurée pour mettre en œuvre les étapes b) à e) d’un procédé selon le premier objet de l’invention à partir d’images acquises par le capteur d’image lorsque la chambre fluidique est disposée entre la source de lumière et le capteur d’image. La distance entre le capteur d’image et la chambre fluidique peut être inférieure à 1 cm ou 5 mm ou 1 mm. Un quatrième objet de l’invention est un procédé de détermination d’une concentration d’une espèce chimique ou biologique dans un échantillon liquide biologique, comportant des particules, l’échantillon ayant fait l’objet d’un mélange avec un réactif, configuré pour entraîner une coagulation du liquide biologique ou une agglutination des particules du liquide biologique, le procédé comportant : a) formation d’images de l’échantillon en différents instants; b) établissement d’un indicateur de corrélation entre des images respectivement acquises en différents instants; c) détermination d’une évolution temporelle de l’indicateur de corrélation ; d) détection d’un instant caractéristique, à partir de l’évolution temporelle ; e) en fonction de l’instant caractéristique, détermination de la concentration de l’espèce chimique ou biologique dans le liquide biologique. Selon une possibilité : l’étape d) comporte, une détection d’une rupture de pente de l’évolution temporelle en différents instants ; lors de l’étape e), l’instant caractéristique est sélectionné en fonction des instants auxquels une rupture de pente est détectée ; lors de l’étape e), la concentration de l’espèce chimique ou biologique est déterminée par une fonction de calibration préalablement établie appliquée à l’instant caractéristique. Le liquide biologique peut être du sang, en particulier du sang total pur ou dilué, les particules étant des globules rouges. L’instant caractéristique peut être un instant de coagulation ou un instant correspondant à un certain niveau d’agglutination de particules du liquide biologique. L’étape e) peut comporter les sous-étapes e-i) à e-iv) décrites en lien avec le premier objet de l’invention. L'invention sera mieux comprise à la lecture de l'exposé des exemples de réalisation présentés, dans la suite de la description, en lien avec les figures listées ci-dessous. FIGURES La FIG. 1 schématise un dispositif permettant une mise en œuvre de l’invention. La FIG. 1 schématise une chambre fluidique. La FIG. 2 représente un exemple d’image d’un échantillon sanguin acquise Les figures 3A à 3D montrent des courbes représentant une évolution d’un indicateur de corrélation dans le temps dans différentes configurations, et pour différentes concentrations de fibrinogène. La FIG. 3 et la FIG. 3 représentent des courbes obtenues, pour différentes concentrations de fibrinogène, respectivement sans et en présence d’arginine dans le réactif. La FIG. 3 montre des courbes obtenues, pour différentes concentrations de fibrinogène, sans et en présence du lactate gluconate de calcium dans le réactif. La FIG. 3 représente des courbes de corrélation, pour différentes concentrations de fibrinogène, avec une formulation considérée comme avantageuse. La FIG. 4 montre différentes étapes de traitement d’images acquises par le capteur d’image. La FIG. 4 montre des détails d’une façon particulière de déterminer un temps de coagulation à partir d’une courbe de corrélation. Les figures 5A à 5E illustrent des étapes de détermination d’un temps de coagulation à partir de courbes de corrélation. EXPOSE DE MODES DE REALISATION PARTICULIERS La FIG. 1 schématise un dispositif 1 permettant une mise en œuvre de l’invention. Le dispositif comporte une chambre fluidique 15, destinée à recevoir l’échantillon de sang 10. La chambre fluidique 15 peut être telle que décrite dans US11027277. La chambre fluidique est destinée à être disposée face à une source de lumière 11 et un capteur d’image 12. La chambre fluidique est schématisée sur la FIG. 1 . La chambre fluidique comporte un canal fluidique 15 c s’étendant entre une ouverture 15 o et une chambre d’analyse 15 a . L’ouverture 15 o de la chambre fluidique est destinée à recueillir l’échantillon à analyser. Le canal fluidique 15 c est configuré pour drainer l’échantillon de sang, en particulier par capillarité, jusqu’à la chambre d’analyse 15 a . La chambre d’analyse 15 a est destinée à être disposée entre la source de lumière 11 et le capteur d’image12. L’épaisseur de la chambre d’analyse, entre la source de lumière et le capteur d’image, est de préférence inférieure à 1 mm. Elle est de préférence inférieure à 500 µm. Elle est de préférence supérieure à 50 µm ou 100 µm. L’épaisseur de la chambre fluidique est par exemple de 150 µm. Le volume d’échantillon occupant la chambre d’analyse est typiquement compris entre 1 et 10 µL, ou entre 1 et 5 µL, par exemple 2 µL ou 3 µL. La source de lumière 11 et le capteur d’image 12 peuvent être intégrés dans un lecteur 2 tel que décrit dans le brevet US10634585. La chambre fluidique 15 est alors insérée dans le lecteur. Après que la chambre fluidique a été insérée dans le lecteur, la distance entre la chambre fluidique et le capteur d’image est de préférence inférieure à 1 cm, voire 5 mm, voire 1 mm. La distance entre la source de lumière et le capteur d’image est de préférence telle que la source de lumière apparaisse ponctuelle par rapport à la chambre fluidique. De préférence, il n’a aucune optique de grossissement et/ou de formation d’image entre la chambre fluidique et le capteur d’image. Chaque image est acquise par le capteur d’image selon une configuration d’imagerie sans lentille, usuellement désigné par le terme « lensless ». Cela n’exclut pas la présence de microlentilles de focalisation au niveau de chaque pixel du capteur d’image. La distance entre la source de lumière et la chambre fluidique est de préférence supérieure à 1 cm ou 2 cm. Le dispositif comporte une unité de traitement 20, reliée au capteur d’image, et configurée pour effectuer des opérations de traitement d’images telles que décrites par la suite, en lien avec les figures 4A et 4B. L’unité de traitement peut comporter un microprocesseur. Il peut par exemple s’agir d’un ordinateur. L’unité de traitement peut être intégrée au lecteur ou séparée de ce dernier. L’échantillon de sang 10 est de préférence un échantillon de sang total, ou dilué, comportant des globules rouges. En effet, l’échantillon tire profit de la capacité de globules rouges à former un caillot sanguin, sous l’effet d’une protéine ajoutée. L’échantillon est constitué d’une ou plusieurs gouttes de sang total. Il est donc nécessaire que l’échantillon comporte une quantité suffisante de globules rouges, par exemple un taux d’hématocrite supérieur à 5%. L’échantillon de sang peut être du sang capillaire, directement introduit dans la chambre fluidique. Il peut également s’agir de sang veineux, éventuellement recueilli dans un tube citraté avant d’être introduit dans la chambre fluidique. L’invention met en œuvre des principes similaires à ceux décrits dans US9341636, basé sur une analyse d’images d’un échantillon de sang total, éventuellement dilué, comportant des globules rouges. Sous l’effet de la réaction de coagulation, les globules rouges forment un caillot, modifiant les images acquises. La formation du caillot est détecté par une analyse de la corrélation entre des images acquises à des instants différents. Le capteur d’images est configuré pour acquérir des images selon une fréquence d’acquisition, par exemple comprise entre 1 Hz et 100 Hz, voire davantage. Le réglage de la fréquence d’acquisition influe sur la précision temporelle à laquelle on souhaite déterminer un temps de coagulation. Le temps de coagulation est corrélé à la concentration de fibrinogène dans l’échantillon. Après que le temps de coagulation a été établi, il est possible de déterminer la concentration de fibrinogène dans l’échantillon en appliquant une fonction de calibration prédéterminée. Au cours de la formation du caillot, les images successivement acquises tendent à être de plus en plus corrélées. Une façon de suivre la formation du caillot est de suivre l’évolution d’un indicateur de corrélation, représentant une corrélation entre deux images temporellement décalées et . Le décalage temporel peut être égal à 1 ou plusieurs incréments temporels, par exemple 5 incréments temporels, chaque incrément temporel étant l’inverse de la fréquence d’acquisition. La concentration de globules rouges dans l’échantillon est de préférence supérieure ou égale à 5% d’hématocrite. Idéalement, le taux d’hématocrite est compris entre 20% et 40%, par exemple 35%. Préalablement à l’acquisition des images, l’échantillon fait l’objet d’une adjonction d’un réactif comportant des principes actifs décrits ci-après. L’adjonction de réactif dans l’échantillon forme un mélange. Le réactif peut être présent, dans la chambre fluidique, à l’état lyophilisé ou à l’état liquide. Alternativement, le réactif peut être ajouté sous forme liquide à l’échantillon, par exemple avant l’introduction de ce dernier dans la chambre fluidique. Le réactif comporte une enzyme hémostatique. De préférence, l’enzyme hémostatique est la batroxobine, qu’il s’agisse d’une batroxobine native ou recombinante. Un intérêt de la batroxobine est qu’elle n’active pas d’autres facteurs de coagulation, comme la thrombine. La batroxobine clive le fibrinogène, de façon à former des monomères de fibrines, ce qui constitue une étape de la coagulation. La quantité de batroxobine dans le mélange est de préférence supérieure 25 U/mL. L’unité U désigne une unité enzymatique de la batroxobine. La quantité de batroxobine est de préférence supérieure à 100 U/mL, voire supérieure à 150 U/mL. La quantité de batroxobine est de préférence Inférieure à 1000 U/mL, voire inférieure à 900 U/mL, voire inférieure à 800 U/mL , voire inférieure à 700 U/mL, voire inférieure à 600 U/mL, voire inférieure à 500 U/mL. La plage de concentration préférée de batroxobine est de 130 U/mL à 400 U/mL ou 130 U/mL à 350 U/mL. Les inventeurs ont constaté qu’au-delà de 130 U/mL, la méthode permet d’obtenir une bonne sensibilité, généralement de l’ordre ou inférieure à 0.5g/L de fibrinogène. Un des objectifs de l’invention est d’effectuer une mesure d’un bas taux de fibrinogène, par exemple une concentration de fibrinogène inférieure à 0.5 g/L, et de préférence de l’ordre de 0.3 g/L ou 0.4 g/L. De préférence, un acide aminé est ajouté, de façon à moduler l’activité de la batroxobine. Il peut notamment s’agir d’arginine, ou d’une séquence peptidique comportant de l’arginine, en particulier de la L-arginine, qui ralentit l’activité de la batroxobine. La concentration d’arginine, apportée sous forme pure, dans l’échantillon peut être comprise entre 25 mM et 250 mM, et de préférence entre 70 et 250 mM. La concentration d’arginine peut être plus faible, notamment lorsque l’arginine est apportée dans une séquence peptidique ayant un effet inhibiteur sur la coagulation, par exemple sur le facteur XIII. Ainsi, l’arginine peut être introduite dans un composé, par exemple GPRP (Glycine Proline Arginine Proline) le GPR (Glycine Proline Arginine) ou AR (Alanine Arginine). La quantité d’arginine peut alors être plus faible, par exemple 0,1 à 0,3 mM. L’arginine peut inhiber la batroxobine par des liaisons à des sites actifs de la batroxobine. L’arginine peut agir comme un inhibiteur compétitif en se liant au site actif de la batroxobine, bloquant l’accès au fibrinogène. Il est nécessaire que le pH du réactif soit basique, préférentiellement compris entre 8 et 10 ou entre 8.5 et 10 ou entre 9 et 10. Il est considéré que le pH optimal de la batroxobine est de 8. Les inventeurs ont constaté que lorsque le pH est inférieur ou égal à 8, la batroxobine agit trop vite L’arginine a également une fonction protectrice lorsque les composés ajoutés sont lyophilisés. Des essais comparatifs, présentant l’avantage de la présence d’arginine dans le réactif, sont décrits par la suite en lien avec les figures 3A et 3B. De préférence, un sel d’un cation divalent est ajouté, de préférence du lactate gluconate de calcium ou un autre sel de calcium, par exemple le chlorure de calcium ou l’acétate de calcium De façon alternative, le sel ajouté est de l’acétate de manganèse, ou un autre sel de manganèse, par exemple du sulfate de manganèse ou du chlorure de manganèse ou du carbonate de manganèse. La concentration de sel de cation divalent ajouté dans le mélange est préférentiellement comprise entre 5 et 25 mM. Le recours à un tel sel permet de durcir et stabiliser le caillot formé au cours de la coagulation, ce qui est particulièrement approprié au traitement des images décrit par la suite. Le recours à un tel sel permet ainsi d’améliorer la sensibilité de la mesure. On estime que les cations divalents ont un effet sur l’activation du facteur XIII. Des essais comparatifs, présentant l’avantage du lactate gluconate de calcium dans le réactif, sont décrits par la suite en lien la FIG. 3 . De préférence, un polymère non ionique de faible poids moléculaire peut être ajouté à l’échantillon. Par faible poids moléculaire, on entend inférieur à 40000 g/mol, et de préférence inférieur à 30000 g/mol ou 20000 g/mol. Un tel polymère peut par exemple être un tel que décrit dans la publication Armstrong J.K « The hydronynamics radii of macromolecules and their effect on red blood cell aggregation », Biophysical Journal, Vol. 87, december 2004. Il peut par exemple s’agir d’un polysaccharide, de type polymère de glucose, de faible taille. Il peut par exemple s’agir de Dextran de poids moléculaire inférieur à 40000 Da, par exemple un Dextran 10K (poids moléculaire moyen 10 000 Da). Un tel composé limite la formation de rouleaux érythrocytaires, sous l’effet de liaisons entre des globules rouges adjacents. D’autres polymères non ioniques peuvent être utilisés, de façon alternative ou complémentaire, par exemple des polyéthylène glycol (PEG), polyvinylpyrrolidone (PVP), Polysorbate (Tween 20 ou Tween 80), polyoxyethylène (POE). La concentration de polymère non ionique, de faible poids moléculaire, peut être comprise entre 10 g/L et 50 g/L, et de préférence entre 20g/L et 50 g/L, par exemple 35 g/L. Comme préalablement indiqué, les composés ajoutés au sang total, ou dilué, peuvent être ajoutés en étant présents, notamment sous forme de réactif lyophilisé, dans la chambre fluidique. Dans ce cas, comme précédemment évoqué, l’arginine peut avoir une fonction protectrice. Avant la lyophilisation, un agent stabilisant et protecteur, par exemple du D-tréhalose (dissacharide composé de deux molécules de glucose) peut être ajouté, sous forme de D-(+) Trehalose dihydrate, la concentration, dans le réactif, étant comprise entre 10 g/L et 30 g/L. Toujours à des fins de stabilisation, un détergent zwitterionique de type CHAPS (3-[(3-cholamidopropyl)dimethylammonio]-1-propanesulfonate) peut également être utilisé. La concentration de CHAPS dans le réactif peut être de 0.025 g/L. Encore à des fins de stabilisation , en cas de lyophilisation des réactifs destinés à être mélangés au sang analysé, de la BSA (Albumine Sérique Bovine) peut être utilisée, la concentration, dans le réactif, étant par exemple comprise entre 10 g/L et 40 g/L. Du sodium azide peut également être utilisé en tant qu’agent antimicrobien et conservateur, la concentration, dans le réactif, étant par exemple de 0.3 g/L. On retiendra que lorsque le réactif est destiné à être lyophilisé, avant d’être mélangé au sang, des agents stabilisants ou conservateurs, de type tréhalose, et/ou CHAPS et/ou sodium azide peuvent être incorporés avant la lyophilisation. Essais expérimentaux . On a préparé différents échantillons, comportant différentes concentrations de fibrinogène. Chaque échantillon a été constitué à partir de plasma défibriné. La défibrination consiste, à partir d’un plasma natif, à éliminer le fibrinogène, par centrifugation et/ou traitement thermique. Le plasma a subi un traitement thermique (56°C – 30 minutes), suivie d’une centrifugation (5 minutes – 10000 G), puis un autre traitement thermique (56°C – 30 minutes), puis une autre centrifugation (5 minutes – 10000 G). G désigne l’accélération équivalente à la gravité. Le plasma défibriné a été supplémenté avec une solution de fibrinogène produite à partir d’une poudre Clottafact 1.5g/100 mL (LFB), comportant du fibrinogène humain. La poudre a été solubilisée par de l’eau pour préparations injectables. Une purification par dialyse a été effectuée dans un tampon HBS (tampon salin HEPES), afin d’éliminer le citrate présent dans la poudre Clottafact. On a obtenu la solution de fibrinogène, utilisée pour supplémenter le plasma défibriné. On a constitué différents échantillons, respectivement avec différentes concentrations de fibrinogène. D’autre part, on a obtenu un concentré de globules rouges lavés, à partir d’un échantillon HEMA CQI (fournisseur Diagast), produit à partir d’hématies humaines de groupes et phénotypes connus. L’hématocrite était comprise entre 25% et 30%. Après homogénéisation, les échantillons HEMA ont été soumis à une centrifugation (7 minutes - 300 G), ce qui permet une élimination des globules blancs. Le plasma a ensuite été retiré, puis remplacé par du sérum physiologique. L’échantillon de globules rouges a ensuite été ensuite homogénéisé puis a subi une centrifugation (3 minutes – 2200 G), ainsi que trois lavages successifs avec du sérum physiologique. On a ainsi obtenu un culot de concentré de globules rouges. Les globules rouges ainsi obtenus ont été rajoutés au plasma, défibriné puis supplémenté, de façon à obtenir un taux d’hématocrite de 45%. Les concentrations de fibrinogène dans les échantillons ont été confirmés par une méthode de référence (méthode de Clauss), après extraction du plasma par centrifugation (15 minutes – 2500 G), puis dilution au 1/20 ième On a ensuite préparé un réactif, comportant différents principes actifs, afin de tester une méthode de détection du taux de fibrinogène basée sur une acquisition d’images successives d’un échantillon sanguin, représentatif de sang total. Les essais ont été réalisés en mettant en œuvre une chambre fluidique d’épaisseur 150 µm, comme décrite dans US11027277. Un volume de 2 µL de réactif a été introduit dans la chambre fluidique , puis lyophilisé avec un lyophilisateur « pilote de paillasse » cryotec. On a ensuite ajouté un volume d’environ 3 µL de sang total. La solution de réactif comportait : Batroxobine : 135 U/mL ; D-(+)-Tréhalose dihydrate : 10 g/L ; BSA : 19g/L Dextran (10 Kda) : 35 g/L Sodium azide : 0.3 g/L CHAPS (poids moléculaire 614.88) : 0.025 g/ Le pH du réactif était de 9.5 ± 0.5. Dans les essais reportés sur les figures 3B, 3C et 3D, le réactif comportait de l’arginine. Dans certains essais reportés sur la FIG. 3 , et dans les essais reportés sur la FIG. 3 , le réactif comportait du lactate gluconate de calcium. Des gouttes de sang, de différentes concentrations connues de fibrinogène, ont été introduites dans différentes chambres fluidiques. Des images de chaque chambre fluidique ont été acquises, comme décrit en lien avec la FIG. 1 , selon une fréquence d’acquisition de 10 Hz. La FIG. 2 est un exemple d’une image obtenue. Les figures 3A à 3D représentent, pour différentes concentrations de fibrinogène, une évolution d’un indicateur de corrélation de deux images (axe des ordonnées) en fonction du temps (axe des abscisses - unité 0.1 s). Dans cet exemple, = 700 ms. Les dimensions de la chambre fluidique 15 étaient de 6.5 mm * 3.5 mm (dans un plan parallèle au capteur d’image), l’épaisseur étant de 150 µm. Le volume d’échantillon analysé était d’environ 3 µL. La chambre fluidique a été introduite dans un dispositif de mesure tel que décrit dans US10634585. Après introduction, la chambre fluidique était disposée entre un capteur d’image de type CMOS monochrome 640 * 480 pixels et une source de lumière de type diode électroluminescente, longueur d’onde d’émission 670 nm. La distance entre la chambre fluidique et le capteur d’image était de l’ordre du mm. La distance entre la chambre fluidique et la source de lumière était de 5 cm . Dans chaque image, on a extrait une région d’intérêt . La position sur l’image de la région d’intérêt a été préalablement déterminée au cours d’essais expérimentaux. La taille de la région d’intérêt était de 100 pixels par 100 pixels. Chaque région d’intérêt a fait l’objet d’une normalisation, de façon que et . est matrice de moyennes locale : à chaque pixel est assigné une valeur moyenne des pixels dans un voisinage de 11*11, centré sur ledit pixel. Le voisinage est de 5 pixels dans chaque direction X et Y. La normalisation est optionnelle, mais préférée. désigne les coordonnées de chaque pixel. On a ensuite déterminé, pour chaque couple d’images , un indicateur de corrélation tel que : La FIG. 3 représente une évolution de l’indicateur de corrélation en fonction du temps. La survenue de la coagulation correspond à une rupture de la pente. Sur la FIG. 3 , les niveaux de gris représentent les concentrations en fibrinogène. Les concentrations de fibrinogène s’étendent entre 4.2 g/L (échantillons hauts « High model sample »), 3.0 g/L (échantillons normaux « Normal model sample »), 1.4 g/L (échantillons moyens « Medium model sample »), 0.6 g/L (échantillons bas « Low model sample »). La survenue de la coagulation entraîne une augmentation de l’indicateur de corrélation. On observe que la coagulation est toujours observable, quelle que soit la concentration de fibrinogène. La FIG. 3 a été obtenue avec des échantillons identiques que ceux utilisés sur la FIG. 3 . Cependant, le réactif comportait de l’arginine (148 mM). On observe une meilleure séparabilité et répétabilité de l’évolution temporelle de l’indicateur de corrélation en fonction de la concentration de fibrinogène. La FIG. 3 a été obtenue avec des échantillons dont la concentration en fibrinogène était de 1.4 g/L. Le réactif comportait de l’arginine (149 mM), ainsi que différentes concentrations de lactate gluconate de calcium, variant entre 0 et 25 mM. Sur la FIG. 3 , on a représenté différentes évolutions temporelles de l’indicateur de corrélation pour différentes concentrations de lactate gluconate de calcium : 0 mM, 5 mM, 10 mM, 25 mM. On observe que l’ajout de lactate gluconate de calcium permet de redresser la courbe représentant l’évolution de la corrélation en fonction du temps, c’est-à-dire d’en augmenter la pente. L’ajout de lactate gluconate de calcium, ou d’autres sels de cations divalents, semble pertinente pour augmenter la sensibilité de la méthode, en vue d’adresser de faibles concentrations de fibrinogène, typiquement inférieures à 1.4 g/L. La FIG. 3 a été obtenue avec des échantillons dont la concentration en fibrinogène variait entre 2.0 g/L, 1.3 g/L, 0.6 g/L, 0.3 g/L. Le réactif comportait de l’arginine (166 mM) ainsi que du lactate gluconate de calcium (4.5 mM). La composition du réactif semble particulièrement avantageuse, puisqu’elle permet une bonne séparation des courbes correspondant respectivement à différentes concentrations. Elle permet également d’adresser des faibles niveaux de concentrations de fibrinogène. La FIG. 4 résume les principales étapes d’un procédé selon l’invention : Etape 100 : introduction d’un échantillon de sang total, éventuellement dilué, dans la chambre fluidique. La chambre fluidique comporte les réactifs précédemment décrits, induisant la réaction de coagulation. Etape 110 : acquisition d’images à en différents instants t, et en particulier à partir d’un instant initial, à partir duquel l’échantillon pénètre dans la chambre fluidique. Etape 120 : sélection d’une région d’intérêt dans chaque image. Etape 130 : détermination d’un indicateur de corrélation entre les régions d’intérêt sélectionnées lors de chaque étape 120. Etape 140 : détermination d’un temps de coagulation à partir de l’évolution temporelle de l’indicateur de corrélation ; Etape 150 : à partir du temps de coagulation , défini relativement à l’instant initial, détermination d’une concentration de fibrinogène de l’échantillon, en utilisant une fonction de calibration préalablement établie. On décrit à présent une façon avantageuse de déterminer le temps de coagulation à partir d’une courbe représentant l’évolution temporelle de l’indicateur de corrélation (étape 140). Cela correspond aux sous-étapes 141 à 147 reportées sur la FIG. 4 . Ces étapes sont mises en œuvre par l’unité de traitement 20. Au cours de la sous-étape 141, on dispose d’une courbe brute (courbe a), telle que représentée sur la figure 5A, représentant l’évolution temporelle de l’indicateur de corrélation . De façon optionnelle, une étape de suppression d’artefacts peut être mise en œuvre, lorsque des points s’écartent de façon significative, par exemple 3 écarts-types, de la courbe. Au cours de la sous-étape 142, on effectue un calcul d’une dérivée dite lissée. Il s’agit d’effectuer une dérivée temporelle, en chaque instant, en prenant en compte une différence des moyenne des 37 dernières valeurs respectivement antérieures et postérieures. La FIG. 5 représente une telle dérivée lissée en fonction du temps. L’instant auquel la dérivée lissée est maximale est repéré. Au cours de la sous-étape 143, on effectue un lissage, par exemple par filtre de Butterworth. On obtient une courbe lissée telle que représenté sur la FIG. 5 (courbe b). A partir de la courbe brute ou de la courbe lissée, on peut définir un instant initial, qui correspond au remplissage de la chambre fluidique 15 par l’échantillon. L’instant initial peut notamment correspondre à une baisse significative de l’indicateur de corrélation. L’instant initial peut être également établi par une analyse des images acquises par le capteur d’image, du fait de l’absorption, par l’échantillon, de la lumière émise par la source de lumière. La sous-étape 144 consiste à mettre en œuvre une méthode de détection d’instants correspondant à des changements de pente. A cette fin, on met en œuvre un algorithme de détection bayésienne de points de changement, tel que décrit dans la publication Adams and MacKays « Bayesian online changepoint detection ». L’application de l’algorithme de rupture de pente conduit à une détermination d’instants, auxquels un changement de pente a été détecté. L’algorithme est appliqué à la courbe brute (courbe a de la FIG. 5 ), qui correspond à la courbe supérieure de la FIG. 5 . Sur la FIG. 5 , on a également représenté l’évolution d’une fonction temporelle (courbe inférieure) résultant de l’algorithme, dont chaque rupture correspond à une rupture de pente détectée sur la courbe supérieure. Chaque instant détecté à partir de la courbe inférieure a été reporté sur la courbe supérieure (lignes verticales). L’algorithme de détection bayésienne de points de changement est un algorithme sensible, permettant de définir un grand nombre de points de changements. Une opération de sélection est effectuée, afin de sélectionner les points de changements les plus significatifs. Cela fait l’objet de la sous-étape 145. La sélection est effectuée en fonction de critères de sélection. Les points de changements sélectionnés correspondent par exemple aux variations les plus importantes de la fonction temporelle résultant de l’algorithme (courbe inférieure de la FIG. 5 ). Ainsi, des critères de sélection sont appliqués à la fonction temporelle résultant de l’algorithme, afin de retenir que les changements de pente les plus significatifs. D’autres critères de sélection peuvent être mis en œuvre : on élimine les instants correspondant à des indicateurs de corrélation supérieurs à un seuil de corrélation prédéterminé, par exemple 0.45, ou correspondant à une durée d’analyse supérieure à un seuil de duré prédéterminé, par exemple 160s. Les instants sélectionnés à l’issue de la sous-étape 145 sont reportés sur la FIG. 5 . Parmi les instants sélectionnés, reportés sur la FIG. 5 , on utilise la courbe lissée (courbe b de la FIG. 5 ), pour déterminer, en chaque instant sélectionné suite à l’étape 145, un angle θ. L’angle est défini en appliquant une régression linéaire de la courbe lissée de part et d’autre de chaque instant sélectionné. On retient l’instant, dit instant caractéristique, pour lequel l’angle est le plus élevé. Cela correspond à l’instant entouré en pointillés sur la FIG. 5 . Sur la FIG. 5 , on a représenté l’angle θ. La sélection angulaire correspond à la sous-étape 146. L’algorithme peut être raffiné par un ajustement de l’instant caractéristique, faisant l’objet de la sous-étape 147, et schématisé sur la figure 5E. Avant et après l’instant caractéristique défini suite à l’étape 146, et représenté sur la figure 5E, la courbe fait l’objet de régressions linéaires sur la partie de la courbe lissée respectivement antérieurement ou postérieurement à l’instant caractéristique. S’agissant de la partie postérieure à l’instant caractéristique, la régression est par exemple établie entre l’instant caractéristique et l’instant correspondant au maximum de la dérivée lissée (cf. FIG. 5 ). On choisit la même durée s’agissant de la partie antérieure. L’instant caractéristique « affiné » correspond au croisement des deux régressions. Ainsi, l’instant de coagulation correspond soit à l’instant caractéristique résultant de l’étape 146, soit, et de préférence, à l’instant caractéristique affiné suite à l’étape 147. On a remarqué que l’instant de caractéristique affiné est décalé, de quelques incréments temporels, par rapport à l’instant résultant de la sélection décrite en lien avec la sous-étape 146. L’ajustement du temps de coagulation, par détermination d’une intersection entre des régressions linéaires de part et d’autre de l’instant déterminé par l’algorithme Bayésien, permet de gagner en précision. La méthode est applicable sur sang total, éventuellement dilué, qu’il s’agisse de sang veineux ou de sang capillaire. Elle est utilisable au niveau du point de prélèvement (domicile, cabinet médical, bloc opératoire), et permet d’obtenir une quantification de la concentration de fibrinogène en une durée de l’ordre de la minute. Les sous-étapes 141 à 147 peuvent être mises en œuvre sur une courbe représentant un corrélation d’images entre deux instants séparés d’un décalage temporel, indépendamment de l’application particulière de détection de l’application particulière de la quantification de la concentration de fibrinogène, mais peut s’appliquer dans une détection d’une espèce chimique ou biologique dans le sang, en fonction de laquelle le temps de coagulation du sang est susceptible de varier. Plus généralement, les sous-étapes 141 à 147 peuvent être mises en œuvre pour détecter une corrélation d’images induite par une coagulation de sang ou d’une agglutination de particules dans un liquide biologique. Lorsque le liquide biologique est du sang, les particules peuvent être des globules rouges. Procédé de détermination d’une concentration de fibrinogène dans un échantillon de sang, comportant du sang total, l’échantillon ayant fait l’objet d’un mélange avec un réactif, configuré pour entraîner une fibrinoformation, le procédé comportant : a) formation d’images ( ) de l’échantillon en différents instants ( ); b) établissement d’un indicateur de corrélation ( ) entre des images respectivement acquises en différents instants ( , ( )); c) détermination d’une évolution temporelle de l’indicateur de corrélation ; d) détection d’un instant de coagulation à partir de l’évolution temporelle ; e) en fonction de l’instant de coagulation, détermination de la concentration de fibrinogène dans le sang ; le procédé étant caractérisé en ce que : le réactif comporte de la batroxobine, la concentration de batroxobine, après mélange, étant comprise entre 25 et 1000 unité enzymatique par mL. Procédé selon la revendication 1, dans lequel le réactif comporte de l’arginine. Procédé selon la revendication 2, dans lequel la concentration d’arginine, après mélange, est comprise entre 25 et 250 mM. Procédé selon l’une quelconque des revendications précédentes dans lequel le réactif comporte une séquence de peptides comportant de l’arginine, ladite séquence ayant un effet inhibiteur de coagulation, la concentration d’arginine étant, après mélange, comprise entre 0.1 et 0.3 mM. Procédé selon l’une quelconque des revendications 2 à 5, dans lequel le réactif comporte un polymère non ionique, de masse molaire inférieure à 40000 g/mol, la concentration étant, après mélange, comprise entre 10 et 50 g/L. Procédé selon la revendication 5, dans lequel le polymère non ionique comporte au moins un des polymères suivants : Dextran, polyéthylène glycol, polyvinylpyrrolidone, polyoxyethylène. Procédé selon l’une quelconque des revendications 2 à 6, dans lequel le réactif comporte un sel de calcium ou de manganèse. Procédé selon la revendication 7, dans lequel la concentration du sel de calcium et/ou du sel de manganèse, après mélange, est comprise entre 5 mM et 50 mM. Procédé selon l’une quelconque des revendications précédentes, dans lequel le pH de l’échantillon, mélangé au réactif, est compris entre 8 et 10 ou entre 8.5 et 10 ou entre 9 et 10. Procédé selon l’une quelconque des revendications précédente, dans lequel l’étape d) comporte, une détection d’une rupture de pente de l’évolution temporelle en différents instants ; lors de l’étape e), l’instant de coagulation est sélectionné en fonction des instants auxquels une rupture de pente est détectée ; lors de l’étape e), la concentration de fibrinogène est déterminée par une fonction de calibration préalablement établie appliquée à l’instant de coagulation. Procédé selon la revendication 10, dans lequel l’étape e) comporte : e-i) sélection d’un instant auquel une rupture de pente est détectée en fonction de critères de sélection prédéterminés ; e-ii) application d’une régression linéaire, dite régression linéaire antérieure, de l’évolution temporelle, en prenant en compte une plage temporelle antérieure à l’instant sélectionné lors de e-i) ; e-iii) application d’une régression linéaire, dite régression linéaire postérieure, de l’évolution temporelle, en prenant en compte une plage temporelle postérieure à l’instant sélectionné lors de e-i) ; e-iv) détermination d’un instant correspondant à un intersection de la régression linéaire antérieure et de la régression linéaire postérieure, l’instant ainsi déterminé correspondant à l’instant de coagulation. Kit, destiné à une mise en œuvre d’un procédé selon l’une quelconque des revendications 1 à 11, et comportant, une chambre fluidique (15); un lecteur (2), comportant une source de lumière, s’étendant face à un capteur d’image, le lecteur étant configuré pour recevoir la chambre fluidique entre la source de lumière et le capteur d’image ; une unité de traitement (20), configurée pour mettre en œuvre les étapes b) à e) d’un procédé selon l’une quelconque des revendications 1 à 11 à partir d’images acquises par le capteur d’image lorsque la chambre fluidique est disposée entre la source de lumière et le capteur d’image. Kit, selon la revendication 12, dans lequel la distance entre le capteur d’image et la chambre fluidique est inférieure à 1 cm ou 5 mm ou 1 mm.