Brevet FR3164727A1 — publié le 20260123

L’invention s’inscrit dans le domaine du diagnostic des maladies infectieuses, et se rapporte à une nouvelle méthode de purification d’ADN de microorganismes d’intérêt présents dans un échantillon biologique, comprenant au moins une double lyse différentielle, afin d’améliorer l’isolement et la détection de l’ADN de microorganismes d’intérêt. Il en résulte une amélioration de la limite de détection de ladite méthode de purification et d’isolement. Méthode de purification d’ADN par double lyse L’invention s’inscrit dans le domaine du diagnostic des maladies infectieuses, en particulier dans le diagnostic d’urgence. L’invention concerne ainsi une nouvelle méthode d’isolement et/ou de purification d’ADN de microorganismes d’intérêt dans un échantillon biologique, ledit échantillon est préférentiellement un échantillon biologique d’origine animale, notamment d’origine humaine. En particulier, la méthode comprend au moins une étape de double lyse différentielle, afin d’améliorer les performances du diagnostic, notamment la limite de détection et la sensibilité, d’une telle méthode d’isolement et/ou purification. Etat de l’art Dans le domaine du diagnostic des maladies infectieuses, de nombreuses méthodes de diagnostic et de kits les mettant en œuvre ont été développés. Aussi, il est connu des méthodes sérologiques, microbiologiques ou encore des méthodes de biologie moléculaire. Les méthodes de biologie moléculaire telles que l’amplification d’acides nucléiques (notamment l’Amplification en Chaîne par Polymérase, en Anglais « Polymerase Chain Reaction », dites PCR) ont permis de faire un gain notable dans le diagnostic des maladies infectieuses. En effet, ces méthodes sont rapides, sensibles et spécifiques. Néanmoins, leur sensibilité et spécificité peuvent être incompatibles avec une utilisation en routine ou en clinique, en particulier pour le diagnostic d’urgence. Parmi ces inconvénients, on peut citer la difficulté d’utiliser des volumes d’échantillon trop importants dans un délai restreint. Or, dans le contexte du diagnostic des maladies infectieuses, notamment d’urgence, il est d’intérêt d’utiliser des échantillons biologiques tels que, mais sans s’y limiter, le sang, le liquide céphalo-rachidien, les lavages broncho-alvéolaires, les urines, les biopsies ou encore les selles. Ceux-ci ont le point commun d’inclure de nombreux éléments biologiques en grande quantité, telles que des cellules, des protéines, ainsi que des micro-organismes, notamment des bactéries. Toutefois, le nombre de cellules microbiennes devant être recherché dans le cadre du diagnostic de certaines maladies infectieuses peut-être extrêmement faible. A titre d’exemple, une cellule bactérienne dans 10 mL d’échantillon. Le développement de test de diagnostic visant à détecter la présence de ces bactéries en très faible quantité, nécessite donc l’utilisation de grands volumes d’échantillon, de l’ordre de 10 mL ou plus afin d’augmenter les chances statistiques de la détection et de l’identification du pathogène. Dans ce contexte, les échantillons précités sont particulièrement d’intérêt. Pour mettre au point de tels méthodes de diagnostic, la saponine est communément utilisée. Naturellement produite par des plantes ou des animaux, la saponine est une molécule ayant des propriétés détergentes, capables d’induire une lyse différentielle des cellules animales, notamment humaines, à l’inverse des cellules microbiennes. En particulier, la saponine est sélective des cellules ayant du cholestérol, celui-ci composant et stabilisant la membrane cellulaire, en particulier la membrane des cellules animales. A l’inverse, les cellules bactériennes Gram-positive ou Gram-négative n’en comprennent pas. Cette propriété est donc particulièrement d’intérêt pour le développement de test de diagnostic car elle permet d’éliminer sélectivement les cellules animales sans endommager les cellules bactériennes d’intérêt. Par ailleurs, la lyse différentielle par une solution de saponine est très efficace sur des petits volumes d’échantillons biologiques traités, à l’inverse des grands volumes d’échantillons biologiques. L’efficacité est alors réduite et incomplète, entrainant une forte accumulation d’ADN animal lors des procédés d’extraction. Or, l’accumulation d’ADN animal a pour inconvénient d’entrer en compétition avec l’ADN microbien d’intérêt au cours des étapes de purification de l’ADN de l’échantillon biologique. Il en résulte que la limite de détection des tests de diagnostic est dégradée lorsque l’ADN animal est mal éliminé. Or, la limite de détection d’un tel kit est un paramètre important lorsque la bactérie recherchée est présente en très faible quantité dans l’échantillon biologique. Il existe donc un besoin pour développer une nouvelle méthode de diagnostic des maladies infectieuses basée sur les techniques de biologie moléculaire, notamment la PCR, permettant de surmonter les inconvénients précités. En particulier, pour pallier les inconvénients liés à l’utilisation des techniques de biologie moléculaire avec de grands volumes d’échantillon combinée à la détection et l’identification d’une bactérie d’intérêt présente en très faible quantité. Pour répondre à ce besoin, l’invention propose une méthode d’isolement et/ou de purification d’ADN de microorganisme d’intérêt présent dans un échantillon biologique, ladite méthode comprenant deux étapes de lyse différentielle successives, ce qui permet de lyser et d’éliminer très efficacement les cellules animales, en particulier les cellules humaines. En outre, l’élimination des cellules animales et de leur ADN permet d’éviter le phénomène de colmatage des colonnes de silice par l’ADN animal et permet ainsi d’améliorer la récupération sur la surface de silice de l’ADN microbien. L’élimination de l’ADN animal réduit également fortement la saturation des surfaces de silice utilisées pour la purification (par exemple, des colonnes de silice ou des billes magnétiques de silice). Or, celui-ci empêche les faibles quantités d’ADN microbiens de se fixer. Il en résulte que la saturation des colonnes entraine un très mauvais taux de récupération de ces ADN microbiens d’intérêt, à l’inverse de l’objectif de la présente invention. Les surfaces de silice, sous forme de colonne ou de billes, sont très communément utilisées dans les procédés de purification d’ADN dans le but de se servir de ces ADN avec des techniques classiques de biologie moléculaire telles que la PCR, qPCR ou le séquençage. Un colmatage ou une saturation desdites surfaces de silice conduit alors inévitablement à diminuer drastiquement la limite de détection de la méthode. A l’inverse, la méthode selon la présente invention augmente la limite de détection. Ainsi, l’invention concerne une méthode d’isolement et/ou de purification d’ADN de microorganisme d’intérêt présent dans un échantillon biologique, ladite méthode comprend les étapes suivantes : mettre en contact un échantillon biologique et une solution de saponine, pour lyser les cellules animales, notamment les cellules humaines, comprises dans ledit échantillon biologique, centrifuger le mélange de l’étape a), éliminer le surnageant et conserver le culot contenant les cellules de microorganismes d’intérêt, mettre en contact le culot et une solution de saponine afin de lyser les cellules animales ou humaines non lysées lors de l’étape a), éliminer l’ADN animal ou humain par traitement par au moins une nucléase, inactiver la nucléase, par tous moyens adaptés, afin de pouvoir lyser les cellules microbiennes. Préférentiellement, le volume de l’échantillon biologique est compris entre 0,1mL et 40mL, plus préférentiellement entre 5mL et 20mL, encore plus préférentiellement entre 8ml et 10ml. Un tel volume est particulièrement d’intérêt pour isoler des microorganismes présents en très faible quantité dans l’échantillon. Dans le contexte de l’invention, l’échantillon biologique est un échantillon comprenant des cellules animales, avantageusement des cellules humaines. Selon un autre objet préféré, lors de l’étape a), le ratio entre le volume d’échantillon biologique et le volume de la solution de saponine est compris entre 0,5:1 et 2:1, très préférentiellement le ratio est de 1,125:1. Selon un autre objet préféré, lors de l’étape c), le ratio entre le volume du culot et le volume de la solution de saponine est compris entre 1:1 et 1:5, très préférentiellement le ratio est compris entre 1:1 et 1:2. Selon un objet préféré de l’invention, l’échantillon biologique est un échantillon biologique frais d’origine animale, en particulier d’origine humaine, ledit échantillon biologique est très préférentiellement choisi parmi le sang, le liquide céphalo-rachidien, les lavages broncho-alvéolaires, les urines, les selles, les biopsies et leur mélange, très préférentiellement, celui-ci est un échantillon de sang total. Selon un autre objet préféré de la présente invention, la méthode comprend une étape d) d’élimination de l’ADN animal présent dans le mélange récupéré à l’étape c), ladite étape d) comprenant l’ajout de nucléases dans une quantité adaptée pour éliminer l’ADN animal présent dans le mélange, la quantité de nucléases étant très préférentiellement comprise entre 1*10^3 et 2*10^6 unités (U) par échantillon biologique, notamment le volume dudit échantillon biologique est compris entre 0,1 et 40mL. Selon un autre objet de la présente invention, la méthode comprend une étape e) d’inactivation des nucléases ajoutées à l’étape d), ladite étape e) d’inactivation étant réalisée, préférentiellement, par l’ajout de chélateur d’ions divalents (e.g. EDTA, EGTA etc.), et/ou l’ajout de guanidine et/ou le chauffage de l’échantillon et/ou la digestion des nucléases par des protéases. L’étape e) étant très préférentiellement réalisée par l’ajout d’EDTA à une concentration finale comprise entre 0,1 mM et 1000 mM, encore plus préférentiellement entre 100mM et 500mM. Selon un autre objet, la méthode comprend en outre une étape de lyse des cellules microbiennes présentes dans le mélange après l’étape e) d’inactivation de la nucléase. Celle-ci peut être réalisée au moyen d’une action mécanique avec des billes en présence ou non d’enzymes de lyse, ou par action d’enzymes de lyse seulement ou par action d’une solution d’hydroxyde ou par action de guanidine. Préférentiellement, les billes utilisées pour la lyse mécanique présentent un diamètre spécifique permettant ainsi de faciliter la récupération des liquides par pipetage et permettre de mettre en œuvre la présente méthode afin qu’elle soit compatible avec une automatisation. Ainsi, le diamètre des billes utilisée pour la lyse mécanique est très préférentiellement comprise entre 1 mm et 6mm. Afin d’optimiser et améliorer encore la limite de détection de la présente méthode, la solution de saponine est préférentiellement une solution sous forme fraîche ou congelée. Lorsqu’elle se présente sous forme congelée, la saponine a précédemment été conservée par congélation, plus préférentiellement à une température d’au moins -20°C. Selon un autre objet préféré, la méthode comprend une étape supplémentaire d’élimination des polypeptides présents dans l’échantillon biologique, cette étape comprend l’ajout d’une protéase thermorésistante suivi d’un traitement thermique. Cette étape est mise en œuvre après l’étape d’élimination de l’ADN animal par le traitement à la nucléase et son inactivation. En effet, la protéase peut détruire, ou endommager la paroi bactérienne, libérant de facto l’ADN microbien d’intérêt dans le mélange. La protéase permet ainsi de réduire la compétition entre les protéines et l’ADN lors de leur fixation sur les surfaces de silice. En outre, elle permet d’éliminer des inhibiteurs de PCR tel que l’hémoglobine. Aussi, dans le contexte de la présente invention, le traitement par la nucléase ne peut être mis en œuvre qu’avant le traitement par ladite protéase. Avantageusement, la quantité de protéase est compris entre 10 unités et 10^6 unités par échantillon. Selon un autre objet préféré, la méthode comprend une étape supplémentaire d’ajout d’un agent réducteur capable de réduire les ponts disulfures des protéines afin d’améliorer la digestion et l’élimination des polypeptides présent dans l’échantillon biologique. Cette étape est très préférentiellement mise en œuvre avant, pendant ou après l’ajout de ladite protéase lors de d’élimination des polypeptides présents dans l’échantillon biologique. Par « avant ou après » l’ajout de ladite protéase, au sens de l’invention on entend l’étape obligatoirement juxtaposée à celle consistant en l’ajout d’une protéase, qu’elle soit pré ou post-ajout de ladite protéase. Très préférentiellement, la protéase thermorésistante est la papaïne. Selon un autre objet préféré, la température du traitement thermique est comprise entre 10°C et 100°C, plus préférentiellement 80°C. La durée de ladite étape d’élimination des polypeptides présents peut être comprise entre 1 et 30 minutes. Selon un autre objet préféré de l’invention, la méthode comprend une étape supplémentaire finale de purification de l’ADN de microorganismes au moyen d’un traitement thermique dudit ADN du microorganisme purifié. Cette étape est obligatoirement la dernière étape de la méthode de purification et d’isolement de l’ADN microbien. En effet, elle vise à éliminer toutes traces d’alcool (tel que l’isopropanol ou l’éthanol) et ainsi permettre l’utilisation de l’échantillon dans son intégralité afin de ne pas restreindre la capacité maximale de détection et donc d’obtenir la meilleure limite de détection. Cette étape finale de purification est mise en œuvre par traitement thermique, la température dudit traitement thermique est préférentiellement comprise entre 60°C et 100°C, plus préférentiellement 90°C. Encore plus préférentiellement, la durée dudit traitement thermique est comprise entre 1 et 30 min. Avantageusement, la méthode selon la présente invention permet ainsi d’obtenir une limite de détection de 20 CFU totales, plus préférentiellement 10 CFU totales. A titre d’exemple, pour 8mL de sang adulte, la limite est comprise entre 1,2 et 2,5 CFU/mL d'échantillon biologique. D’autres caractéristiques et avantages ressortiront de la description détaillée de l’invention, des exemples et des figures qui vont suivre. Brève description des Figures FIG. 1 représente les résultats de la double lyse effectuée sur un volume de sang frais de 9 mL comparés à une simple lyse. Les colonnes avec le sang traité par simple lyse ont colmaté (Panel A), seul une petite partie du lysat a pu traverser les colonnes. Pour récupérer suffisamment de lysat pour la suite du procédé, ces colonnes ont été centrifugées à haute vitesse pour forcer le passage du lysat à travers la colonne. Les bactéries présentent dans les échantillons de sang ne sont pas détectées par qPCR quand le sang est traité par simple lyse (panel B ; carrés formant une ligne horizontale), mais elles sont bien détectées quand le sang est traité par double lyse (panel B ; courbe avec cercles ouverts). Enfin, le dosage de l’ADN de cellules humaines détecté par qPCR montre qu’une plus grande quantité d’ADN humain est présent dans les échantillons purifiés sur colonne de silice après simple lyse (panel C ; ligne avec carrés ouverts) qu’après double lyse (panel C ; courbe avec cercles ouverts). FIG. 2 représente les résultats du traitement de l’ADN des cellules sanguines par différentes quantités élevées de nucléase pour différents temps. L’ADN des cellules humaines est purifié sur colonne de silice après un traitement de 15 minutes (panel A ; courbes avec carrés ouverts) ou de 120 minutes (panel A ; courbes avec ronds ouverts) avec une quantité élevée de nucléase (5000 unités). Les résultats démontrent que rallonger le temps d’incubation permet d’éliminer une quantité plus important d’ADN humains. Panel B : L’ADN des cellules humaines est purifié sur colonne de silice après un traitement de 15 minutes avec une grande quantité de nucléases de 5000 unités (panel B ; courbes avec carrés ouverts) ou après un traitement de 15 minutes avec une grand quantité de nucléases de 150 000 unités (panel B ; ronds ouverts formant une ligne horizontale). Les résultats démontrent qu’augmenter très fortement la quantité de nucléases dans la réaction permet d’éliminer totalement l’ADN humain. FIG. 3 représente la lyse des cellules bactériennes Gram-positive Staphylococcus aureus par des billes de verre d’un diamètre de 1 mm ou 3 mm en comparaison d’une méthode enzymatique de référence utilisant la lysostaphine. Les cellules bactériennes de Staphylococcus aureus inoculées dans du sang total sont lysées par une méthode enzymatique par incubation en présence d’une enzyme de lyse spécifique des Staphylococcus aureus , la lysostaphine (cercles ouverts et pleins), ou par une méthode mécanique avec des billes de verre de diamètre de 1 mm (carrés ouverts et pleins), ou de 3 mm (triangles ouverts et pleins). Les ADN bactériens sont ensuite purifiés et détectés par une qPCR spécifique de Staphylococcus aureus . Les 3 méthodes de lyse testées permettent de détecter Staphylococcus aureus à des Cq comparables. L’utilisation de billes de verre de diamètre 1 mm ou 3 mm permet donc une lyse des cellules d’une bactérie Gram-positive, Staphylococcus aureus , comparable à une lyse enzymatique spécifique de cette bactérie. FIG. 4 représente les résultats de la conservation par congélation d’une solution de saponine. Le culot de sang total après lyse des cellules sanguines par une solution de saponine stockée 1 heure à température ambiante (A), 20 jours à 4°C (B), ou 20 jours à -20°C (C). Seule la solution de saponine stockée à -20°C pendant 20 jours produit un culot de petit volume identique à la saponine stockée à température ambiante pendant 1 heure, indiquant des propriétés détergentes conservées de la solution de saponine stockée à -20°C et donc une bonne élimination des cellules sanguines. FIG. 5 représente les résultats d’élimination des polypeptides par un traitement à la chaleur avec une quantité inhabituellement élevée de protéase thermorésistante en présence de DTT à une concentration finale de 8,3 mM. Gel SDS-PAGE d’échantillons de sang total (0,2 µl) après une première lyse avec une solution de saponine (A), après une double lyse avec une solution de saponine (B), et après un traitement avec 60 000 unités de papaïne pendant 10 minutes à 80°C (C). Le traitement à la papaïne permet d’éliminer la totalité des polypeptides présents dans l’échantillon biologique après seulement 10 minutes de traitement. Description détaillée de l’invention Définition Par « microorganisme » ou « microbe », au sens de l’invention, on entend les bactéries, les virus, les levures, que l’on cherche à isoler et identifier en vue d’identifier et/ou confirmer la maladie chez un individu. Par « animal » au sens de l'invention, on entend tout être vivant classé « animal » dans la « classification scientifique des espèces » (également appelée « classification biologique »). Ainsi, par animal on entend notamment les mammifères, en particulier les êtres humains. Par « CFU totale » au sens de l'invention, on entend le nombre totale de CFU, CFU étant le terme anglais pour Colony Forming Unit ou Unité de Formation de Colonie. Une CFU correspond à un tout petit amas cellulaire dont la pousse sur milieu solide conduit à la formation d’une colonie. Dans sa forme la plus rudimentaire, une CFU peut correspondre à seulement une cellule microbienne unique. Par « solution fraîche » ou « solution de saponine fraiche » au sens de l’invention, on entend une solution de réactif qui a été préparée quelques minutes à une heure avant utilisation et stockée à température ambiante avant l’utilisation. Par « solution congelée » au sens de l’invention, on entend une solution de saponine fraîche ayant été conservée par congélation, préférentiellement à une température d’au moins -20°C. Procédé selon l’invention Dans le contexte de la présente invention, une lyse différentielle efficace est indispensable au développement d’un test de diagnostic. Or, dans certains cas, le microorganisme d’intérêt est susceptible d’être présent dans l’échantillon biologique dans une quantité très faible. Ceci nécessite alors d’utiliser de grands volumes d’échantillon biologique, pourtant incompatibles avec une lyse différentielle, qui est très efficace sur de petits volumes. Les inventeurs ont ainsi, développé une nouvelle méthode comprenant deux lyses différentielles successives surmontant les inconvénients de l’art antérieur. La présente invention a donc pour objet une méthode d’isolement et de purification d’ADN de microorganismes d’intérêt présents dans un échantillon biologique, ladite méthode comprenant les étapes suivantes : mettre en contact un échantillon biologique et une solution de saponine, afin de lyser les cellules animales comprises dans ledit échantillon biologique, centrifuger le mélange de l’étape a), éliminer le surnageant et conserver le culot contenant les cellules de microorganismes d’intérêt, mettre en contact le culot et une solution de saponine afin de lyser les cellules animales non lysées lors de l’étape a), éliminer l’ADN animal par traitement à une nucléase, Inactiver la nucléase. La double lyse successive permet ainsi d’éviter plusieurs inconvénients liés à l’utilisation d’un grand volume d’échantillon, notamment le phénomène de colmatage et de saturation des surfaces de silice (tel que des colonnes ou billes de silice) par l’ADN des cellules sanguines. Lesdites surfaces de silice, tels que des colonnes ou des billes, étant classiquement utilisées dans les procédés de purification d’ADN. Il en résulte que la méthode selon l’invention permet d’améliorer la récupération sur une surface de silice de l’ADN microbien (ou microorganismes) d’intérêt issu de l’échantillon biologique. Préférentiellement, le volume d’échantillon biologique est compris entre 0,1mL et 40mL, plus préférentiellement entre 5mL et 20mL, encore plus préférentiellement entre 8mL et 10mL. Un tel volume est particulièrement important pour pouvoir isoler un microorganisme d’intérêt présent en très faible quantité, aussi faible que 1 ou 2 bactéries par millilitre (mL), plus préférentiellement entre 1 bactérie par millilitre et 500 bactéries par millilitre. Selon un autre objet préféré, lors de l’étape a), le ratio entre le volume d’échantillon biologique et le volume de la solution de saponine est compris entre 0,5:1 et 2:1, très préférentiellement le ratio est de 1,125:1. D’autre part, l’échantillon biologique est préférentiellement un échantillon biologique d’origine animale, celui-ci comprenant des cellules animales, notamment des cellules humaines. Selon un autre objet préféré, l’échantillon est un échantillon biologique frais choisi parmi le sang, le liquide céphalo-rachidien, les lavages broncho-alvéolaires, les urines, les selles, les biopsies et leur mélange. Encore plus préférentiellement, l’échantillon biologique est un échantillon de sang total. Selon une variante de l’invention, la méthode d’isolement et de purification d’ADN de microorganismes d’intérêt présents dans un échantillon biologique, ladite méthode comprend les étapes suivantes : mettre en contact un échantillon biologique liquide et une solution de saponine, afin de lyser les cellules animales comprises dans ledit échantillon biologique, centrifuger le mélange de l’étape a), éliminer le surnageant et conserver le culot contenant les cellules de microorganismes d’intérêt, mettre en contact le culot et une solution de saponine afin de lyser les cellules animales non lysées lors de l’étape a), mettre en culture, le mélange de l’étape c) comprenant les cellules microbiennes, par exemple sur boite de Pétri. Une fois les cellules animales lysées et éliminées, la méthode comprend une étape d’ajout de nucléases permettant d’éliminer l’ADN animal. Il est bien connu de l’homme du métier de mettre en œuvre une telle étape afin d’éliminer l’ADN animal en utilisant toute enzyme présentant une activité nucléase. Toutefois, la quantité d’enzymes ajouté classiquement, de l’ordre de quelques unités par réaction/échantillons est insuffisante pour une bonne élimination dans un temps réduit pour un test de diagnostic, notamment d’urgence. En effet, la quantité importante d’ADN animal va être d’autant plus excessive que le volume d’échantillon biologique à traiter sera grand, ce qui est le cas en l’espèce. A titre d’exemple, un test de diagnostic à partir d’un grand volume de sang, de l’ordre de 10mL, devra être capable de gérer une quantité d’ADN animal d’environ 70 µg, soient environ 10^8 copies de génome. Or, ces 70µg d’ADN animal auront l’inconvénient de colmater ou de saturer les surfaces de silice, impactant négativement la limite de détection des tests de diagnostic. Or, comme décrit précédemment, la quantité d’ADN microbien d’intérêt est très faible, de 5 à 500 fg soient 1 à 100 copies de génome bactérien. Aussi, afin de pallier cet inconvénient, lié au volume d’échantillon à traiter dans un temps réduit, les inventeurs ont ajouté une quantité de nucléase très élevée permettant ainsi de réduire le temps nécessaire à l’élimination de l’ADN animal à seulement quelques minutes. La combinaison des différentes étapes constituant la présente méthode selon l’invention permet ainsi la destruction de l’ADN animal sans éliminer l’ADN microbien d’intérêt, lorsque la quantité de nucléase est très élevée. Aussi, selon un objet particulier de l’invention, la méthode selon l’invention comprend également une étape d’élimination de l’ADN animal présent dans le mélange de l’étape c), au moyen de nucléases, la quantité de nucléases étant comprise préférentiellement entre 1*10^3 et 2*10^6 unités (U) par échantillon biologique. La nucléase peut également être inactivée par l’ajout d’un chélateur d’ions divalents tel que l’EDTA ou l’EGTA afin d’inactiver la nucléase utilisée pour éliminer l’ADN animal, avant l’étape de lyse des microorganismes cibles. Afin d’améliorer encore plus la limite de détection de la méthode selon la présente invention, et ainsi concilier le traitement d’un grand volume tout en conservant une bonne sensibilité et spécificité du test, la méthode selon la présente invention comprend, préférentiellement, une étape supplémentaire de lyse des cellules de microorganismes après l’étape d’élimination de l’ADN animal et d’inactivation de la nucléase. Cette étape de lyse est préférentiellement mise en œuvre par action mécanique et/ou par action enzymatique et/ou par action chimique. Très préférentiellement, l’action mécanique est réalisée au moyen, de billes en présence ou non d’enzymes de lyse. Selon un autre objet préféré, l’action enzymatique est réalisée au moyen d’enzymes adaptés et connus de l’homme du métier. Enfin, selon un autre objet préféré, l’action chimique est réalisée au moyen de l’ajout d’une solution d’hydroxyde ou de guanidine. Lorsque l’action mécanique est réalisée au moyen de billes, lesdites billes présentent préférentiellement un diamètre inhabituellement important afin de faciliter la récupération des liquides par pipetage, réduire le temps nécessaire au traitement de l’échantillon et rendre cette étape compatible avec l’automatisation. Aussi, plus préférentiellement, ces billes ont un diamètre moyen compris entre 1mm et 6mm. D’autre part, selon un autre objet préféré de l’invention, la solution de saponine est une solution fraîche ou conservée par congélation, préférentiellement à une température d’au moins -20°C. En d’autres termes, la solution de saponine utilisée lors de l’étape a) et c) afin de lyser les cellules animales comprises dans l’échantillon biologique, a été conservée à -20°C, puis décongelée et mise en contact avec l’échantillon à une température ambiante. En effet, les solutions de saponine conservées à température ambiante ou 4°C perdent leurs propriétés détergentes en quelques jours et ne sont plus capables de lyser les cellules animales de façon optimale. Pour garantir la conservation des propriétés de lyse d’une solution saponine dans le temps, et donc de son efficacité maximale, les inventeurs ont conservé ladite solution à une température d’au moins 20°C. Cette température atypique a permis de garantir la stabilité des propriétés détergentes de la solution de saponine, améliorant encore l’efficacité de la méthode selon l’invention. Dans le contexte de l’invention, un autre inconvénient lié à l’utilisation d’un grand volume d’échantillon est l’excès de polypeptides issus des cellules animales, susceptible de colmater ou de saturer les surfaces de silice et ainsi d’empêcher l’accrochage de l’ADN microbien présent dans l’échantillon. En outre, certains polypeptides issus d’échantillon biologique sont connus pour leurs effets inhibiteurs des réactions de PCR, pouvant empêcher la détection de l’ADN d’intérêt par cette méthode même lorsqu’ils sont présents en très faible quantité. Ceux-ci peuvent persister dans l’échantillon malgré la purification de l’ADN d’intérêt sur une surface de silice et il peut être nécessaire de les éliminer avant cette étape de purification. Il est connu d’ajouter des protéases pour pallier ces inconvénients. Toutefois, la quantité de protéases apportées classiquement n’est pas suffisante pour éliminer l’ensemble des polypeptides présents dans un grand échantillon biologique dans un temps réduit, ce qui réduit fortement la limite de détection de la méthode où l’ADN de microorganismes d’intérêt peut être, dans certains cas, présent en quantité très faible dans l’échantillon (5 à 500 fg soient 1 à 100 copies de génome bactérien). En outre, seule une faible quantité de la protéase apportée est réellement active. A titre d’exemple la Protéinase K a une faible activité par masse apportée, de l’ordre d’environ de 1 à 50 unités/mg. Aussi, l’incapacité des protéases utilisées pour éliminer efficacement les polypeptides de l’échantillon biologique a pour effet de réduire la capacité de l’ADN microbien à être capturé par les surfaces de silice d’extraction d’ADN et d’augmenter la quantité d’inhibiteurs de PCR dans l’échantillon. Il en résulte que la limite de détection du test sera, là encore, négativement impactée par la présence résiduelle de polypeptides dans l’échantillon. Pour améliorer encore la méthode selon la présente invention, les inventeurs ont donc ajouté une étape supplémentaire visant à ajouter au moins une protéase thermorésistante en très forte quantité. Avantageusement, la quantité de protéase est compris entre 10 unités et 10^6 unités par échantillon. Ainsi, selon un autre objet, la méthode comprend une étape supplémentaire d’élimination des polypeptides présents dans l’échantillon biologique ; ladite étape d’élimination des polypeptides comprenant l’ajout d’au moins une protéase thermorésistante combiné à un traitement thermique. Plus préférentiellement, la protéase thermorésistante est la papaïne. Celle-ci présente avantageusement une activité spécifique de l’ordre de 10 000 à 50 000 unités/mg. Par ailleurs, le couplage d’au moins une protéase thermorésistante avec une haute température d’incubation permet de démultiplier l’efficacité de l’enzyme, d’accélérer l’élimination des polypeptides et d’atteindre une élimination des polypeptides quasi-totale. Il en résulte une excellente élimination des polypeptides durant les procédés d’extraction d’ADN, ce qui conduit à des limites de détection des ADN recherchés très basse et donc plus sensibles. Préférentiellement, la température du traitement thermique est comprise entre 10°C et 100°C, plus préférentiellement 80°C. Très préférentiellement, l’étape d’élimination des polypeptides comprend l’ajout de papaïne combinée à un traitement thermique compris entre 10°C et 100°C, plus préférentiellement 80°C. Par ailleurs, l’élimination de certaines protéines peut nécessiter la réduction des ponts disulfures qui aident au maintien de leurs structures tridimensionnelles et donc de leurs fonctions et peuvent bloquer la capture d’ADN sur les surfaces de silice ou inhiber l’amplification des cibles d’acides nucléiques lors de la PCR. Ainsi, la présente méthode comprend avantageusement l’ajout d’au moins un agent réducteur lors de l’étape d’élimination des polypeptides. Ainsi, selon un objet préféré, au moins un agent réducteur est utilisé, celui-ci est choisi parmi le DTT, le DTE, le Béta-mercapto-éthanol, le TCEP, le gluthation, et le Thio glycérol, à une concentration comprise entre 0,1 mM et 100 mM. Enfin, la méthode comprend avantageusement une étape supplémentaire finale de purification de l’ADN de microorganismes, après la purification sur silice. Cette dernière étape vise à améliorer encore plus la sensibilité, au moyen d’un traitement thermique dudit ADN de microorganisme purifié. Préférentiellement, la température du traitement thermique de l’éluât contenant l’ADN purifié est comprise entre 60°C et 100°C, préférentiellement 90°C et pour une durée comprise entre 5 et 30 min. Celle-ci permet d’éliminer l’alcool (isopropanol ou éthanol) résiduel et couramment utilisé par l’homme du métier au cours d’un tel procédé de purification d’ADN. Par l’élimination de l’alcool résiduel, on maximise la quantité ADN microbien dans l’éluât pouvant être utilisé et donc obtenir une meilleure limite de détection. Selon un autre objet de l’invention, les étapes a) et b) sont répétées au moins une fois avant le traitement par les nucléases, préférentiellement au moins deux fois. Selon un autre objet de l’invention, après l’étape c., la méthode ne comprend pas d’étape de centrifugation afin de ne pas trop diluer l’échantillon. L’invention est à présent illustrée par des exemples non limitatifs de compositions selon l’invention et par des résultats. Exemples Exemple 1 : Comparaison des méthodes de simple et double lyse . Le but de cet essai est de démontrer l’efficacité améliorée de la méthode selon la présente invention par rapport à l’art antérieur. Le protocole d’essai est le suivant. A partir d’échantillons de 9 mL de sang total humain contenant entre 9 et 24 cellules bactériennes, lesdits échantillons sont mélangés à 8 mL de saponine, puis centrifugés 20 minutes à 24 000 g. Après l’élimination du surnageant, les 2 culots résultants d’une simple lyse sont directement traités par une nucléase et une protéase pour éliminer l’excès d’ADN et de polypeptides humains. Les échantillons sont ensuite chargés sur des colonnes de silice et l’ADN est purifié selon les recommandations du Kit Blood L de Macherey-Nagel. Afin d’obtenir des culots ayant subis une double lyse, les culots résultants d’une simple lyse sont à nouveau mélangés avec 400µL de saponine pour lyser les cellules humaines restantes avant d’être traités selon le même protocole que les culots de simple lyse. Les inventeurs ont alors observé que les colonnes des échantillons traités par simple lyse étaient colmatées et que l’échantillon ne pouvait passer que très partiellement au travers de la colonne, contrairement aux échantillons traités par double lyse ( FIG. 1 , Panel A). Afin de pouvoir récupérer suffisamment de lysat pour la suite de l’analyse, les échantillons ont été centrifugés à très haute vitesse pour optimiser le passage du lysat à travers les colonnes colmatées. Les échantillons ont ensuite été purifiés et analysés par qPCR pour mesurer le taux de récupération d’ADN microbien présent dans l’échantillon biologique de départ, et pour mesurer la quantité d’ADN de cellules humaines co-purifiés lors du passage sur colonne de silice. Les bactéries cibles présentes dans le sang total sont bien détectées lorsque les échantillons sont traités par double lyse, mais ne sont pas détectées quand les échantillons sont traités par simple lyse (cf. FIG. 1 , panel B et Tableau 1, ci-après ; N/D : non-détectés). La quantité restante d’ADN provenant des cellules humaines que l’on souhaite éliminer est plus faible pour les échantillons traités avec la double lyse comparativement à ceux traiter par simple lyse ( FIG. 1 , panel C et Tableau 1). Dans cet exemple, l’amélioration de l’élimination de l’ADN humain apporté par la méthode de double lyse est d’environ un facteur 64. La méthode de double lyse des échantillons permet donc d’améliorer la détection des cibles bactériennes recherchées et une meilleure élimination de l’ADN des cellules humaines. Type de lyse Cq Klebsiella pneumoniae Cq ADN cellules sanguines Simple lyse #1 N/D 21,13 Simple lyse #2 N/D 20,11 Double lyse #3 35,14 26,26 Double lyse #4 36,98 25,03 Exemple 2 - Elimination rapide de l’ADN des cellules humaines par une quantité élevée de nucléase s Le but de cet essai est de démontrer l’efficacité amélioré de la méthode selon la présente invention lorsqu’elle comprend une étape d’ajout de nucléases dans une quantité élevée. Le protocole d’essai est le suivant. Chaque échantillon de 9 mL de sang total est mélangé à 8 mL de solution de saponine, puis centrifugé 20 minutes à 24 000 g. Le surnageant est éliminé, et les culots sont à nouveaux traités par 400 µL de solution de saponine. Ces échantillons sont ensuite traités par une nucléase pour éliminer l’excès d’ADN humain et par une protéase pour éliminer les polypeptides humains, puis les ADN microbiens sont purifiés sur colonnes de silice. La quantité d’ADN de cellules humaines purifié sur les colonnes de silice est mesurée dans différentes conditions. Les échantillons ont été traités avec une quantité élevée de nucléases (5000 unités) pendant 15 minutes ou 120 minutes avant la purification de l’échantillon sur colonne de silice. Les résultats sont présentés dans la FIG. 2 , panel A, ainsi que le tableau 2, ci-après. Temps de nucléase Cq ADN cellules sanguines 15 minutes #1 25,35 15 minutes #2 26,57 15 minutes #3 26,1 15 minutes #4 26,6 120 minutes #5 31,17 120 minutes #6 31,35 120 minutes #7 36,71 120 minutes #8 31,38 Les inventeurs ont alors observé que le traitement de 15 minutes avec 5000 unités est insuffisant pour éliminer l’ensemble de l’ADN humain. Une incubation plus longue permet de réduire la quantité d’ADN par plusieurs dizaines de fois, mais ne permet pas son élimination totale. En augmentant considérablement la quantité de nucléase utilisée pour le traitement de l’échantillon (150 000 unités), il est possible d’éliminer l’ensemble de l’ADN des cellules sanguines en seulement 15 minutes comparativement aux résultats obtenus avec une quantité de nucléase plus faible (5000 unités). Les résultats sont présentés dans la FIG. 2 , panel B, ainsi que le tableau 3, ci-après (N/D : non détectés). Quantité de nucléase Cq ADN cellules sanguines 5000 unités #1 27,02 5000 unités #2 32,48 150 000 unités #3 N/D 150 000 unités #4 N/D Ainsi, l’utilisation d’une très grande quantité de nucléases (150 000 unités) permet d’éliminer l’ensemble de l’ADN des cellules humaines en seulement 15 minutes. Exemple 3 - Lyse des cellules bactériennes par des billes de verre de large diamètre. Le but de cet essai est de démontrer l’efficacité de la méthode selon la présente invention lorsqu’elle utilise des billes de verre de large diamètre pour lyser une bactérie Gram-positive comparé à l’utilisation d’une enzyme de lyse spécifique de la bactérie Gram-positive Staphylococcus aureus . Le protocole d’essai est le suivant. Un échantillon de 9 mL de sang total humain contenant entre 31 et 115 cellules bactériennes de Staphylococcus aureus est lysé par 8 mL de solution de saponine, puis centrifugés 20 minutes à 24 000 g. Après l’élimination du surnageant, les culots sont traités par 400 µL d’une solution de saponine. Après traitement par une nucléase, 2 échantillons sont incubés avec une enzyme de lyse spécifique de Staphylococcus aureus , la lysostaphine. Les 2 échantillons suivants sont par la suite agités en présence de billes de verre de 1 mm de diamètre. Les 2 derniers échantillons sont agités en présence de billes de verre de 3 mm de diamètre. Dans le cas de la lyse mécanique par des billes de verre, le liquide est facilement récupéré par pipetage du fait du large diamètre des billes et transféré dans un nouveau tube. Tous les échantillons sont ensuite chargés sur des colonnes de silice et l’ADN est purifié selon les recommandations du Kit Blood L de Macherey-Nagel. Les échantillons sont ensuite purifiés et analysés par qPCR pour mesurer le taux de récupération d’ADN microbien relargué lors de la lyse des cellules bactériennes présentes dans l’échantillon biologique de départ. Les bactéries cibles sont bien détectées lorsqu’une enzyme de lyse spécifique de Staphylococcus aureus est utilisée. Elles sont également détectées lorsque des billes de large diamètre (1 mm et 3 mm) sont utilisées, et ceux à un niveau de détection comparable à la méthode enzymatique. Les résultats sont présentés dans le Tableau 4 ci-après ainsi que la FIG. 3 . Méthodes de traitement Cq Staphylococcus aureus Lysostaphine #1 34,28 Lysostaphine #2 35,00 Billes 1 mm #3 35,59 Billes 1 mm #4 34,69 Billes 3 mm #5 35,84 Billes 3 mm #6 36,90 Ainsi, le présent essai démontre l’efficacité de la méthode selon la présente invention lorsqu’elle utilise des billes de verre de large diamètre, permettant en outre, une récupération simple du lysat compatible avec les procédés de pipetage d’automatisation tout en conservant une efficacité de lyse comparable à la méthode enzymatique de référence. Exemple 4 - C omparaison de l’effet de différentes températures de stockage sur la conservation des propriétés de lyse de la saponine au cours du temps. Le but de cet essai est de démontrer l’efficacité améliorée de la méthode selon la présente invention lorsqu’elle utilise de la saponine congelée. Le protocole d’essai est le suivant. Des échantillons de 9 mL de sang total mélangés à 8 mL d’une solution de saponine stockée 1 heure à température ambiante (A), 20 jours à 4°C (B), ou 20 jours à -20°C (C) et centrifugés pendant 20 minutes à 24 000 g. Après élimination du surnageant, le culot contenant les cellules entières non lysées est collecté au fond du tube. Les résultats sont présentés en FIG. 4 . Le mélange de sang total avec une solution de saponine stockée seulement 1 heure à température ambiante (A) ou 20 jours à -20°C (C) permet une élimination complète des cellules sanguines, ne laissant au fond du tube qu’un faible volume de cellules sanguines grâce aux propriétés détergentes de la solution de saponine. Le mélange de sang total avec une solution de saponine stockée 20 jours à 4°C (B) ne permet pas une élimination complète des cellules sanguines, laissant au fond du tube un grand volume de cellules sanguines non lysées car cette solution de saponine a perdu ses propriétés de lyse. Le culot est différent et est composé d’hématies non lysées, à l’inverse du tube avec une saponine préparée fraîchement (A). Le stockage à -20°C n’a aucun impact négatif sur la capacité à lyser des cellules humaines et permet de conserver la propriété de lyse de la saponine dans le temps. Exemple 5 – Elimination des polypeptides par un traitement thermique et une quantité élevée de protéase thermorésistante. Le but de cet essai est de démontrer l’efficacité améliorée de la méthode selon la présente invention lorsqu’elle comprend l’ajout d’une protéase thermorésistante couplée à un traitement thermique. Le protocole d’essai est le suivant. Un échantillon de 9 mL de sang total est traité par la méthode décrite précédemment de double lyse. Des échantillons de 9 mL de sang total sont lysés par 8 mL de solution de saponine, puis centrifugés 20 minutes à 24 000 g. Après élimination du surnageant, les culots sont traités par 400 µL d’une solution de saponine puis par une nucléase. Les polypeptides présents dans l’échantillon sont ensuite éliminés par un traitement de 10 minutes à 80°C avec une quantité inhabituellement très élevée de papaïne (60 000 unités), une protéase thermorésistante. Des échantillons de 0,2 µL de sang traité sont prélevés à différentes étapes du traitement, après la première lyse avec une solution de saponine (panel A), après la deuxième lyse avec une solution de saponine (panel B), et après le traitement de 10 minutes à 80°C avec 60 000 unités de papaïne (panel C) et sont analysés par SDS-PAGE pour évaluer leur contenu en polypeptides. La deuxième étape de lyse avec une solution de saponine permet de partiellement réduire la quantité de polypeptides présent dans l’échantillon. Les résultats sont présentés en FIG. 5 . Le traitement avec une grande quantité de papaïne à température élevée permet d’éliminer la totalité des polypeptides présents dans l’échantillon en seulement 10 minutes (panel C). Méthode de purification d’ADN de microorganismes d’intérêt présents dans un échantillon biologique, ladite méthode comprend les étapes suivantes : mettre en contact un échantillon biologique et une solution de saponine, pour lyser les cellules animales comprises dans ledit échantillon biologique, centrifuger le mélange de l’étape a), éliminer le surnageant et conserver le culot comprenant les cellules de microorganismes d’intérêt, mettre en contact le culot et une solution de saponine afin de lyser les cellules animales non lysées lors de l’étape a), éliminer l’ADN animal par traitement à la nucléase, Inactiver la nucléase. Méthode selon la précédente revendication, caractérisée en ce que le volume d’échantillon biologique est compris entre 0,1mL et 40mL. Méthode selon l’une des quelconques précédentes revendications, caractérisée en ce que l’échantillon biologique est un échantillon biologique frais choisi parmi le sang, le liquide céphalo-rachidien, les lavages broncho-alvéolaires, les urines, les selles, les biopsies et leur mélange. Méthode selon l’une des quelconques précédentes revendications, caractérisée en ce que l’échantillon biologique est un échantillon de sang total. Méthode selon l’une des quelconques précédentes revendications, caractérisée en ce que la quantité de nucléase est comprise entre 1*10^3 et 2*10^6 unités (U) par échantillon biologique. Méthode selon l’une des quelconques précédentes revendications, caractérisée en ce que la méthode comprend en outre une étape de lyse des cellules de microorganismes présentes, après les étapes d’élimination de l’ADN animal et d’inactivation de la nucléase. Méthode selon la précédente revendication, caractérisée en ce que la lyse est réalisée au moyen de billes. Méthode selon la précédente revendication, caractérisée en ce que le diamètre des billes est compris entre 1 mm et 6 mm. Méthode selon l’une des quelconques précédentes revendications, caractérisée en ce que la solution de saponine est une solution de saponine sous forme fraîche ou congelée. Méthode selon l’une des quelconques précédentes revendications, caractérisée en ce que la méthode comprend une étape supplémentaire d’élimination des polypeptides présents dans l’échantillon biologique, après l’étape d’élimination de l’ADN animal, ladite étape d’élimination des polypeptides comprenant l’ajout d’une protéase thermorésistante suivi d’un traitement thermique. Méthode selon la précédente revendication, caractérisée en ce que la protéase thermorésistante est la papaïne. Méthode selon l’une des revendications 10 ou 11, caractérisée en ce que la température du traitement thermique est comprise entre 10°C et 100°C. Méthode selon l’une des revendications 10 à 12, caractérisée en ce que l’étape d’élimination des polypeptides comprend, en outre, l’ajout d’au moins un agent réducteur choisi parmi le DTT, le DTE, le Béta-mercapto-éthanol, le TCEP, le glutathion, et le Thio glycérol. Méthode selon l’une des quelconques précédentes revendications, caractérisée en ce que la méthode comprend une étape finale de purification de l’ADN de microorganismes au moyen d’un traitement thermique. Méthode selon la revendication précédente, caractérisée en ce que la température du traitement thermique est comprise entre 60°C et 100°C, préférentiellement 90°C. Méthode selon l’une des quelconques précédentes revendications, caractérisée en ce que les étapes a) et b) sont répétées au moins une fois avant le traitement par les nucléases.