Brevet FR3155830A1 — publié le 20250530

Procédé mise en culture de cellules, comportant : disposition, dans une enceinte, d’une quantité initiale de cellules, d’un milieu de culture, et de supports, l’enceinte s’étendant, à partir d’un fond, selon une hauteur ; incubation, durant une durée d’incubation, au cours de laquelle les cellules se développent sur les supports ; extraction des cellules des supports et récupération des cellules extraites ; le procédé étant caractérisé en ce que : chaque support s’étend entre deux faces opposées, selon une dimension caractéristique inférieure à 10 mm, la dimension caractéristique correspondant au plus grand diamètre ou à la plus grande diagonale d’une des deux faces ; chaque support s’étend selon une épaisseur, inférieure à la moitié de la dimension caractéristique; durant au moins 50% de la durée de l’incubation, au moins 50% des supports sont disposés au fond de l’enceinte. procédé de mise en culture de cellules Le domaine technique de l'invention est la culture de cellules avec des supports propices à la culture cellulaire. ART ANTERIEUR Certains procédés de culture biologique mettent en œuvre des supports de culture, portant des cellules. Les supports sont disposés en suspension, dans un milieu de culture, l'objectif étant de faire croître les cellules en dehors de leur milieu d'origine. Le milieu de culture est usuellement soumis à une agitation modérée. Cela permet d’homogénéiser le milieu de culture et mettre en suspension les supports. Les supports sont destinés à être placés en suspension dans un milieu de culture. Ils prennent souvent la forme de microbilles, réalisées en verre, ou en plastique ou en un composé organique, par exemple un polymère (par exemple polystyrène ou un polysaccharide). Généralement, les microbilles ont préalablement fait l'objet d'un traitement de surface, dit fonctionnalisation de surface, de façon à favoriser un greffage des cellules. Il s'agit de favoriser une accroche ou une adhérence de cellules. Les supports sont fréquemment utilisés pour la culture de cellules adhérentes. Les cellules peuvent se développer et se multiplier sur ces derniers. La demande WO2021140129 décrit un procédé permettant la fabrication de supports en sol-gel, présentant une surface plane ou aplatie par rapport à une surface sphérique. De tels supports se sont avérés propices à la culture cellulaire, en particulier une culture cellulaire monocouche, propice à une meilleure viabilité cellulaire des cellules cultivées et à une meilleure collecte de ces cellules. Les milieux de culture font usuellement l’objet d’une agitation, de façon à éviter une sédimentation des supports, et pour homogénéiser le milieu de culture. Cela suppose souvent le recours à un moyen d’agitation hydrodynamique, par exemple de type hélice ou bioréacteur à vague. Cependant, le recours à une hélice, dans un bioréacteur, présente certains inconvénients : l’agitation du milieu de culture peut ne pas être homogène. De plus, à proximité de l’hélice, l’agitation est importante, pouvant conduire à un stress hydrodynamique et mécanique. Les bioréacteurs à vague induisent également un stress hydrodynamique. Généralement, plus le volume de culture est important, plus il est nécessaire que l’agitation du milieu soit forte, de façon à mettre les supports en suspension dans la totalité du volume de culture. Cela augmente nécessairement les forces de cisaillement auxquelles les cellules sont exposés, ce qui ne constitue pas des conditions de culture favorables. Ainsi, pour des bioréacteurs de volume important, il est nécessaire de trouver un compromis entre la remise en suspension des supports et le stress hydrodynamique auquel les cellules sont soumises du fait des moyens mis en œuvre pour obtenir le maintien des supports en suspension. De plus, le recours à une hélice rend le bioréacteur dédié à une application spécifique, c’est-à-dire à un milieu de culture particulier et un type de cellule prédéterminé. En effet, si l’on souhaite changer l’application, il faut procéder à un nettoyage poussé de l’hélice, afin de limiter les risques de contamination. Cela n’est pas pratique et prend du temps. Certains bioréacteurs disposent d’hélices interchangeables, mais cela les rend plus complexes. Certains bioréacteurs sont également à usage unique. Après leur passage dans le bioréacteur, les cellules sont séparées des supports par décollage, généralement en utilisant une enzyme dite de décrochement. Les supports résultant de la séparation sont collectés par un filtre. Cependant, le filtre peut subir un colmatage par les supports . Pendant la culture, certaines cultures cellulaires sont effectuées en perfusion, ce qui consiste à régénérer le milieu de culture en continu. Une telle modalité permet d’effectuer des cultures à des concentrations élevées en cellules, mais nécessite une filtration et un renouvellement du milieu culture. Les supports peuvent colmater les filtres, ce qui complique la mise en œuvre des cultures sous perfusion. L'inventeur a développé un procédé, permettant d’éviter de recourir à une agitation, tout en permettant une culture cellulaire efficace et de bonne qualité. Un premier aspect de l’invention est un procédé mise en culture de cellules, le procédé comportant : disposition, dans une enceinte, d’une quantité initiale de cellules, d’un milieu de culture, et de supports, l’enceinte s’étendant entre un fond et une extrémité supérieure ; incubation, durant une durée d’incubation, au cours de laquelle les cellules se développent sur les supports de culture ; extraction des cellules des supports et récupération des cellules extraites ; le procédé étant caractérisé en ce que : chaque support s’étend entre deux faces opposées, selon une dimension caractéristique, de préférence inférieure à 20 mm ou à 10 mm, la dimension caractéristique correspondant au plus grand diamètre ou à la plus grande diagonale d’une des deux faces ; chaque support s’étend selon une épaisseur, entre les faces opposées, inférieure à la moitié de la dimension caractéristique; durant au moins 50% de la durée de l’incubation, au moins 50% des supports sont disposés, par gravité, au contact du fond de l’enceinte. Le procédé peut exclure la culture de cellules souches embryonnaires d’origine humaine, De préférence, durant au moins 80% ou 90%, voire 95% ou 99% de la durée de l’incubation, au moins 80%, voire au moins 90% des supports sont disposés, par gravité, au contact du fond de l’enceinte. De préférence, durant au moins 50% ou 80% ou 90% de la durée de l’incubation, le milieu de culture est statique. Au cours de l’étape b), des supports peuvent être déplacés spontanément et progressivement sous l’effet du développement des cellules, en se redressant vers une extrémité supérieure de l’enceinte, opposée au fond. De préférence, chaque support est tel qu’un ratio dimension caractéristique sur épaisseur est compris entre 5 et 100 et de préférence entre 5 et 50. Selon une possibilité, une desdites faces opposées est face plane. Selon une possibilité, chacune desdites faces opposées est plane. Selon une possibilité, au moins une desdites faces opposées est bombée. Selon une possibilité, chaque support est formé d’au moins un matériau minéral ou organique choisi parmi : matériau sol-gel, verre, polymère, plastique, céramique, silicium, métal. Pour chaque support, la dimension caractéristique peut être comprise entre 10 µm et 20 mm ou entre 10 µm et 500 µm. La densité de chaque support peut être inférieure à 3 g/cm 3 ou inférieure à 2.5 g/cm 2 . De préférence, lors de l’incubation, l’enceinte est configurée de façon que le fond est en dessous de l’extrémité supérieure, par rapport à un axe vertical. L'invention sera mieux comprise à la lecture de l'exposé des exemples de réalisation présentés, dans la suite de la description, en lien avec les figures listées ci-dessous. FIGURES La FIG. 1 représente un exemple de support selon l'invention. La FIG. 1 montre un autre exemple de support selon l'invention. La FIG. 2 schématise des supports introduits dans une enceinte. La FIG. 2 schématise les supports après que des cellules se sont développées sur leurs faces planes respectives. La FIG. 3 est une photographie d’une enceinte, comportant des supports sur lesquels se dont développées des cellules de type VERO. La FIG. 4 montre, pour différentes conditions de culture (diamètre et concentration des supports – axe des abscisses), une quantité de cellules récupérées suite à une incubation (axe des ordonnées). La FIG. 4 montre, pour les différentes conditions de culture (diamètre et concentration des supports – axe des abscisses), un pourcentage de cellules vivantes récupérées (axe des ordonnées). Les figures 5A et 5B sont des photographies d’une enceinte, comportant des supports sur lesquels se sont développées des cellules de type CSM (Cellules souches mésenchymateuses). La FIG. 6 résume les principales étapes d’un procédé selon l’invention. EXPOSE DE MODES DE REALISATION PARTICULIERS La FIG. 1 représente un support de culture 1 permettant une mise en œuvre de l’invention. Dans cet exemple, le support 1 comporte deux faces opposées planes, ou considérées comme telles. Ainsi, le support 1 présente une première face plane, ou sensiblement plane S 1 et une deuxième face plane, ou sensiblement plane, S 2 . La première face plane et la deuxième face plane sont parallèles l'une à l'autre, ou sensiblement parallèle l'une à l'autre. Par sensiblement parallèle, on entend parallèle en prenant en compte une tolérance angulaire, par exemple inférieure ou égale à ± 20°, et de préférence inférieure ou égale à ± 10°. Par face sensiblement plane, on entend plane, en admettant des éléments de surface présentant un défaut de planéité local, dans une limite de ± 10° par rapport au reste de la surface. La première face S 1 présente un diamètre Φ, de préférence inférieur ou égal à 20 mm, ou inférieur ou égale à 10 mm, ou inférieur ou égale à 1 mm. Il en est de même de la deuxième surface S 2 . Le diamètre Φ est de préférence supérieur à 5 µm ou à 10 µm. Le diamètre Φ est de préférence compris entre 10 µm et 10 mm ou 20 mm, et encore de préférence entre 10 µm et 1 mm, ou de préférence entre 10 µm et 500 µm. Par diamètre d’une face, on entend le diamètre selon lequel s’étend la face lorsque la face est de géométrie circulaire, ou du plus grand diamètre lorsqu’il s’agit d’une face ovale. La première face S 1 et la deuxième face S 2 s'étendent parallèlement à un plan principal P XY . Le support 1 comporte une face latérale S 3 , s'étendant entre la première face S 1 et la deuxième face S 2 . Par la suite, la face latérale des supports est désignée la tranche. Les faces opposées S 1 et S 2 sont espacées par une épaisseur e. Quelle que soit la configuration, l'épaisseur e du support 1 est de préférence inférieure à la moitié du diamètre ou au quart du diamètre, et de préférence inférieure au dixième du diamètre, voire au vingtième du diamètre. On considère qu’un ratio optimal diamètre sur épaisseur est compris entre 100 et 5, et de préférence entre 50 et 5. L’épaisseur e résulte généralement d’un compromis : elle est suffisante pour pouvoir assurer une certaine solidité au support, mais suffisamment faible pour permettre un déplacement du support sous l’effet du développement de cellules, comme décrit par la suite. La FIG. 1 correspond à un mode de réalisation, selon lequel le support 1 présente une géométrie de révolution. La première face S 1 et la deuxième face S 2 ont une forme circulaire ou elliptique, de révolution, la face latérale S 3 étant une bordure annulaire. D'autres configurations cylindriques sont possibles, par exemple un cylindre de base polygonale, par exemple en forme de quadrilatère, ou d’hexagone, ou un cylindre de base ovale. Des cylindres de base annulaires peuvent être envisagés, la base étant de type couronne ou anneau. La FIG. 1 représente un support cylindrique 1 de base polygonale, en l’occurrence un quadrilatère. Dans ce cas, la plus grande diagonale Δ est de préférence inférieure ou égale à 50 mm, ou inférieure ou égale à 20 mm ou 10 mm, ou inférieure ou égale à 1 mm. La plus grande diagonale Δ est de préférence comprise entre 10 µm et 10 mm, et encore de préférence entre 10 µm et 1 mm, ou de préférence entre 10 µm et 500 µm. D’une façon générale, chaque support présente une dimension caractéristique qui est soit un plus grand diamètre, lorsque le support est circulaire, ou une plus grande diagonale, lorsque le support présente une face polygonale. La dimension caractéristique peut s’étendre entre 10 µm et 10 mm, ou 20 mm, voire 50 mm. La plage préférée de la dimension caractéristique est 100 µm – 300 µm. Un ratio optimal dimension caractéristique sur épaisseur est compris entre 100 et 5, et de préférence entre 50 et 5. D’une façon générale, quelle que soit la configuration, le support se présente sous la forme de deux faces opposées S 1 et S 2 , s'étendant l'une face à l'autre, l'aire de la bordure latérale S 3 étant négligeable. Les deux faces opposées S 1 et S 2 peuvent notamment être planes ou sensiblement planes, ou bombées, et de préférence légèrement bombées. Par légèrement bombées on entend bombée selon un diamètre de courbure inférieure à la dimension caractéristique, et de préférence inférieure à 2 fois voire 5 fois ou 10 fois la dimension caractéristique. Les deux faces opposées peuvent être bombées. Une des faces opposées peut être bombée, tandis que l’autre est plane. Les supports selon l'invention peuvent être obtenus en mettant en œuvre un procédé de type sol-gel, abréviation de solution-gélification. Il s'agit d'un procédé chimique connu de l'homme du métier, permettant de fabriquer, à basse température, des verres ou des céramiques. Un tel procédé comporte l'utilisation d'une solution sol-gel, formée : d'un précurseur moléculaire de métal ou de métalloïde, par exemple un composé organométallique ou un sel métallique ; d'un solvant organique ; d'eau ; d'un catalyseur acide ou basique. Ainsi, les supports selon l’invention peuvent être obtenus en mettant en œuvre le procédé décrit dans WO2021140129. En présence d'eau, un réseau d'oxydes se forme, par le biais de réactions d'hydrolyse-condensation, emprisonnant le solvant organique, de façon à former un gel. Ce dernier subit ensuite un séchage, pour éliminer le solvant organique présent dans le gel. Le précurseur moléculaire peut par exemple être un composé organométallique de métal ou de métalloïde, par exemple un alcoxyde métallique de formule M(OR)n, où M est un métal ou un métalloïde, et R est un groupe organique. Le métal M peut être par exemple un métal de transition, un lanthanide : il peut s'agir de Ti, V, Cr, Mn, Fe, Co, Ni, Cu, Zn, Y, Zr, Nb, Mo, Ru, Rh, Pd, Ag, Cd, Hf, Ra, W, Re, Os, Ir, Pt, La, Ce, Pr, Nd, Sm, Eu, Gd, Tb, Dy, Er, Yb, Al, Ga, In, Ge, Sn, Pb. L'élément métalloïde peut être choisi parmi Si, Se, Te. R peut être un groupe alkyle, comportant par exemple entre 1 et 10 atomes de carbone, ou un groupe phényle. n est un entier naturel correspondant au nombre de ligands liés à M, qui correspond à la valence de M. Le précurseur moléculaire est placé dans une solution organique, par exemple une solution alcoolique. Le solvant organique peut être un mono alcool aliphatique ou aromatique, ou un diol. La solution sol-gel comporte de l’eau, et de préférence un catalyseur, et éventuellement des composés permettant d'agir sur la porosité, par exemple un tensioactif. Selon un mode de réalisation, la solution sol-gel comporte un composé de fonctionnalisation, notamment un composé organique, dont la fonction est de former un agent de greffage. Par agent de greffage, on entend une molécule ou un groupe fonctionnel apte à favoriser une accroche, par greffage, d'un élément chimique ou biologique à la surface du xérogel résultant de la mise en œuvre du procédé sol-gel. L'élément chimique ou biologique est prédéterminé. Il peut s'agir d'une molécule, d'une cellule, ou d'une protéine ou d'un autre composé organique, par exemple un facteur de croissance ou un anticorps. Pour les applications liées à la culture cellulaire, l'agent de greffage favorise un greffage d'une cellule, de type prédéterminé. L'agent de greffage peut alors être du collagène, ou de la polylysine, ou une protéine de lait. L’agent de greffage peut comporter une fonction époxy, propice à la formation de liaisons chimiques avec des fonctions amines, ces dernières étant présentes dans la plupart des membranes cellulaires. L'incorporation d'une fonction epoxy peut être effectuée par un composé de type glycidoxypropyltrimethoxysilane, usuellement désigné par l'acronyme GPTM. Selon une possibilité, la solution sol-gel comporte un précuseur de type 3-aminopropyltriethoxysilane usuellement désigné par l’acronyme APTES, ou 3-aminopropyltrimethoxysilane usuellement désigné par l’acronyme APTMS. La fonction amine du précurseur de tels précurseurs amènent des charges positives à la surface du support. Cela améliore l’adsorption et l’accrochage des cellules. La possibilité d'ajouter un composé de fonctionnalisation dans la solution sol-gel constitue un avantage intéressant, car cela évite de réaliser une fonctionnalisation post fabrication. Cela permet de fabriquer des supports spécifiques à une application prédéfinie, prenant en compte l'élément chimique ou biologique destiné à se fixer sur les supports, et/ou le milieu dans lequel le support est destiné à être disposé. Les supports 1 utilisés ont une densité de préférence inférieure à 2.5, et encore de préférence inférieure à 2, voire 1.8. Un avantage de supports obtenus par voie sol-gel est qu’il est possible d’obtenir une des supports de faible densité, en particulier par rapport à des supports en verre, obtenus par moulage. De façon alternative, les supports 1 comprennent ou sont constitués de matériaux, de préférence biocompatibles, choisis parmi : verre, métal, polymère synthétique, polycaprolactone, acide polylactique, acide polyglycolique, polymère naturel, alginate, chitosan, dextran, ou oxydes métalliques (Ti0 2 , SiO 2 ). Selon une possibilité, les supports comprennent des particules sensibles à un champ magnétique, par exemple des particules d’un matériau ferromagnétique. Il peut s’agir de supports tels que décrits dans la demande de brevet FR2307600 déposée le 16/07/2023. Cela permet de faciliter la récupération des supports, en utilisant des aimants. Les supports 1 sont destinés à être disposés au contact d’un milieu de culture et de cellules, de façon que les cellules adhérent sur les faces planes des supports, puis se développent au niveau desdites faces planes. Le procédé objet de l’invention comporte le recours à une enceinte 10, dans laquelle les supports 1 sont introduits, de même que le milieu de culture 13 et une quantité initiale de cellules que l’on souhaite cultiver. L’enceinte est disposée dans un incubateur, dont la température est généralement contrôlée, et éventuellement d’autres paramètres environnementaux de type humidité, gaz ambiant…L’incubation correspond à la phase durant laquelle l’enceinte est disposée dans l’incubateur. L’enceinte 10 s’étend entre une paroi inférieure 11, formant un fond, et une extrémité supérieure 12, ouverte ou fermée. La distance h entre le fond 11 et l’extrémité supérieure 12 correspond à une hauteur h de l’enceinte. L’extrémité supérieure 12 forme une paroi supérieure, généralement perméable à certains gaz. L’enceinte peut être de type boite de pétri, puits d’une plaque à puits, flasque. Il a été constaté qu’en utilisant de tels supports, comportant au moins une face plane, ou légèrement bombée, et de préférence deux faces planes, ou légèrement bombées, opposées, il est possible d’effectuer une culture cellulaire sans nécessiter une agitation continue. Il a été constaté qu’une agitation n’était pas nécessaire dans au moins 50% de la durée de l’incubation, voire au moins 80%, ou au moins 90% voire 95% ou 99% de la durée de l’incubation. En effet, durant l’incubation, compte tenu de la géométrie des supports 1, en particulier le ratio épaisseur sur dimension caractéristique, et avantageusement la faible densité, le développement cellulaire s’accompagne d’un agencement des supports spontané et progressif, de façon à former une structure tridimensionnelle à partir du fond de l’enceinte. Sur la FIG. 2 , on a représenté une vue en coupe d’une enceinte 10, à un instant initial de l’incubation. Les supports 1 sont introduits et tendent à sédimenter contre le fond 11 de l’enceinte 10. Durant l’incubation, le développement cellulaire s’accompagne d’une structuration 3D des supports 1: ces derniers sont progressivement et spontanément agencés, de façon à former des édifices 3D, le long et contre le fond 11 de l’enceinte. La FIG. 2 schématise la formation de tels édifices. Par spontanément, on entend en l’absence d’un moyen d’agitation appliqué à l’enceinte. La structuration 3D désigne le fait que les supports sont déplacés et/ou orientés selon les 3 dimensions de l’espace. On assiste en particulier à un redressement spontané de certains supports, de façon que leur faces opposées se rapprochent de l’extrémité supérieure. Les faces opposées de certains supports d’étendent parallèlement, ou sensiblement parallèlement, à la hauteur de l’enceinte. Par sensiblement parallèlement à la hauteur de l’enceinte, on entend parallèle en prenant en compte une tolérance angulaire de ± 10° ou ± 20°. Lorsque le fond de l’enceinte a été traité par un agent propice à l’adhérence et à la prolifération de cellules, des cellules se développent au fond de l’enceinte, et contribuent à former des liaisons entre le fond de l’enceinte et les supports. Les inventeurs attribuent cet agencement progressif et spontané au développement des cellules au niveau des faces planes, combiné à la forme spécifique des supports, ainsi qu’à leurs dimensions, leur conférant une masse particulièrement faible et une bonne aptitude à un déplacement dans un liquide. Cet agencement permet d’obtenir une culture cellulaire tridimensionnelle : cela augmente la surface d’échange entre les faces planes des supports 1 et le milieu de culture 13. Il se crée ainsi spontanément des conditions particulièrement favorables au développement de cellules, et cela sans nécessiter une agitation du milieu de culture, avec les inconvénients que cela entraîne. Contrairement aux procédés mettant en œuvre une agitation, durant l’incubation, la plupart des des supports, c’est-à-dire plus de 50%, voire 80% ou 90% des supports, sont maintenus contre le fond de l’enceinte 11, sous l’effet de la gravité. Cependant, le contact avec le fond de l’enceinte peut être assuré au niveau de la tranche, du fait de l’agencement spontané décrit ci-dessus, et en particulier du redressement de supports vers l’extrémité supérieure de l’enceinte. Ainsi, durant l’incubation, les supports 1 ne sont pas répartis dans le volume de l’enceinte, par agitation. Ils sont maintenus contre le fond, selon différentes orientations. On ne peut exclure le fait que certains supports soient déplacés légèrement en dessus du fond, en s’appuyant sur un autre support disposé au contact du fond. D’une façon générale, au cours de l’incubation, les supports forment un édifice 3D, comportant des supports disposés au contact les uns des autres, selon différentes orientations, et reposant sur le fond de l’enceinte. La formation de l’édifice 3D permet une augmentation significative de la surface de culture, c’est-à-dire la surface des supports exposée au milieu de culture. On estime que la surface développée peut être comprise entre 2 fois et 30 fois la surface de l’enceinte exposée au milieu de culture. Essais expérimentaux. Une série d'essais a été réalisée, les conditions expérimentales étant décrites ci-après: Enceinte : plaque 24 puits Nunc TM traitée pour la culture cellulaire : traitement de surface pour favoriser l’adhérence et le développement de cellules. Cellules : cellules épithéliales de rein extrait chez le singe vert d’Afrique, usuellement désignées cellules Vero Milieu de culture : DMEM (Milieu d’Eagle modifié par Dulbecco), fournisseur GIBCO, supplémenté par 10% de sérum de veau fœtal (GIBCO) et 100 unités/mL et 100 µg/ mL de pénicilline et de streptomycine (GIBCO), respectivement. Supports : disques plans de différents diamètres (70, 100, 140, 180 µm) et d’environ 5 µm d’épaisseur, réalisés par voie sol-gel, selon les principes décrits dans la demande de brevet WO2021140129. Agent de décrochage des cellules : enzyme TrypLE TM select (Thermofisher) Hotte de culture : poste de sécurité microbiologique ESCO AC2. Environnement de culture cellulaire : Incubateur CellXpert® C170 (Eppendorf) réglé à 37°C en présence de 5% de CO 2 industriel (Air Liquide). Agent de comptage cellulaire : Bleu Trypan 0.4% (PAN Biotech). Matériel de comptage cellulaire : compteur automatisé LUNA II (Logos Biosystems). Sous une hotte de culture, on a intégré de manière stérile, des supports de même diamètre dans chaque puits d’une plaque à puits comportant 24 puits traitée pour la culture cellulaire. Pour chaque diamètre de supports, on a intégré respectivement une concentration de supports de 0, 1, 2, 4 et 8 mg/cm 2 . La surface exprimée en cm² correspond à la surface du fond de l’enceinte. La surface du fond de chaque puits étant de 2 cm², on a disposé respectivement des concentrations de 0, 2, 4, 8, 16 mg de supports par puits. On a par la suite ajouté délicatement 10 000 cellules par puits diluées dans 1 ml de milieu de culture. Afin de garantir une culture homogène, on a agité délicatement la plaque multi puits contenant les supports selon un axe horizontal X ou plusieurs axes horizontaux X, Y. Le fond 11 de chaque puits était horizontal. La plaque à puits a été incubée pendant 14 jours. Pendant toute la durée de la culture, et afin de garantir une présence suffisante de nutriments pour les cellules, on a changé régulièrement le milieu de culture. Pour cela, sous une hotte de culture, on a prélevé délicatement 500 µL de milieu de culture par puits, et ajouté délicatement 500 µL de milieu de culture frais dans chaque puits. Durant la durée de l’incubation, on considère que la durée cumulée durant laquelle la plaque à puits a été manipulée est inférieure à 1 heure, sur la durée totale de 14 jours. La culture a donc été effectuée de manière essentiellement statique. Après l’incubation, on a retiré délicatement le milieu de culture, et on a décroché les cellules par incubation pendant 10 minutes dans l’incubateur en présence de 500 µL par puits de TrypLE TM select. On a ensuite a ajouté 500 µL de milieu de culture frais par puits, et on a transféré délicatement, à la pipette, les cellules décrochées de chaque puits dans des tubes de 1,5 millilitre respectivement, en prenant soin de ne pas récupérer les supports. Après centrifugation des cellules pendant 5 minutes à 0.2 RCF (Relative Centrifuge Force, signifiant force centrifuge relative), on a retiré délicatement le milieu de culture, et suspendu les cellules dans 50 µL de Bleu Trypan dilué 2 fois dans du milieu de culture frais. La quantité et la viabilité des cellules présentes dans chaque puits a été quantifiée. Cela a permis de comparer les différentes conditions de culture, en particulier la dimension et la concentration des supports. Durant l’incubation, on a constaté le déplacement et la modification des supports. La FIG. 3 montre une photographie d’un puits, prise depuis l’ouverture supérieure du puits. La FIG. 4 montre, pour différents diamètres de supports, et pour différentes concentrations des supports dans un puits (axe des abscisses), une quantité de cellules dénombrées après l’incubation (axe des ordonnées). L’abscisse « 2D » correspond à une culture cellulaire directement effectuée sans support ajouté dans le puits : il s’agit d’une configuration selon l’art antérieur, selon laquelle le développement cellulaire s’effectue le long de la paroi interne de l’enceinte exposée au milieu de culture. On observe que, dans cet exemple : la présence de supports permet systématiquement un développement cellulaire ; une concentration de supports optimale est inférieure à 4 mg/cm². On estime que la plage optimale de concentration est comprise entre 0.5 mg/cm² et 3 mg/cm² ou 4 mg/cm². Dans cette plage, quelle que soit leur taille, les supports permettent d’obtenir une quantité de cellules supérieure à la configuration selon l’art antérieur. L’observation d’une plage de concentrations optimale est due au fait que lorsque la concentration de supports est trop élevée, leur agencement, tel que décrit en lien avec les figures 2B et 3, est rendu plus difficile. Les performances de culture diminuent. La plage de concentrations optimales peut varier selon les conditions de culture ou des types de cellules. La FIG. 4 montre, pour différents diamètres de supports, et pour différentes concentrations des supports dans un puits (axe des abscisses), un pourcentage de cellules vivantes (axe des ordonnées). On observe une performance, en matière de viabilité, comparable à l’art antérieur, voire légèrement supérieure dans la plage de concentration 0.5 mg/cm² - 3 mg/cm² ou 4 mg/cm². La concentration optimale peut être définie au cas par cas, en fonction de la taille des supports et des dimensions de l’enceinte. Cependant, il est considéré qu’en première approche, la plage de concentrations 0.5 mg/cm² - 3 mg/cm² ou 4 mg/cm² peut convenir lorsque la taille des supports est comprise entre 10 µm et 500 µm, voire 1 mm. Des essais similaires ont été effectués en utilisant des cellules de type CSM (Cellules souches mésenchymateuses). Les figures 5A et 5B sont des photographies, prises depuis l’ouverture supérieure d’un puits, montrant l’agencement spontané et progressif des supports, tel que décrit en lien avec les figures 2B et 3. La FIG. 6 schématise les principales étapes d’un procédé selon l’invention Etape 100 : disposition, dans une enceinte, d’une quantité initiale de cellules, d’un milieu de culture, et de supports tels que précédemment décrits Etape 110 : manutention éventuelle de l’enceinte, par exemple par légère agitation, de façon à homogénéiser la répartition initiale des supports et des cellules dans l’enceinte. Contrairement à l’art antérieur, il ne s’agit pas de maintenir les supports dispersés dans l’enceinte, en tirant profit de leur flottaison. Etape 120 : incubation, durant une durée d’incubation, de préférence dans des conditions environnementales maîtrisées, par exemple température et/ou taux d’humidité et/ou milieu gazeux ambiant. Au cours de l’incubation, les cellules se développent sur les supports. Durant au moins 50%, voire au moins 80% , voire au moins 90% ou 95% ou 99% de la durée d’incubation, au moins 50%, voire au moins 80% ou au moins 90% des supports sont disposés contre le fond de l’enceinte. De préférence, durant au moins 50%, voire au moins 80% , voire au moins 90% ou 95% ou 99% de la durée d’incubation, le milieu de culture est statique. Durant l’étape 120, le milieu de culture peut être renouvelé. Ainsi, la durée d’incubation peut être entre-coupée par des phases de modifications du milieu de culture. Cependant, la durée de telles phases est de préférence limitée à quelques % de la durée d’incubation statique. Etape 130 : extraction des cellules des supports et récupération des cellules extraites ; L’invention permet d’améliorer les performances de culture cellulaire par rapport à des configurations dans lesquelles la culture cellulaire est effectuée sur les parois de l’enceinte, tout en conférant un taux de viabilité équivalent, voire légèrement supérieur. L’invention est particulièrement appropriée à l’utilisation d’enceintes présentant un fond dont la surface est importante. Cela permet de tirer davantage profit de l’agencement 3D des supports contre le fond, certains d’entre eux se redressant en s’éloignant du fond. Un avantage de l’invention est que l’incubation peut être effectuée sans agitation du milieu de culture, ce qui évite les inconvénients liés à l’agitation, précédemment décrits, tout en permettant l’utilisation d’enceinte simples, sans moyen d’agitation. L’invention permet ainsi d’utiliser des enceintes présentant un fort ratio surface sur hauteur. Différentes enceintes, de faible hauteur, typiquement inférieures à 10 cm ou 5 cm, peuvent être empilées, une structuration 3D des supports se produisant au niveau du fond de chacune d’entre elles. Procédé mise en culture de cellules, à l’exclusion des cellules souches embryonnaires d’origine humaine, le procédé comportant : disposition, dans une enceinte (10), d’une quantité initiale de cellules, d’un milieu de culture, et de supports (1), l’enceinte s’étendant entre un fond et une extrémité supérieure ; incubation, durant une durée d’incubation, au cours de laquelle les cellules se développent sur les supports ; extraction des cellules des supports et récupération des cellules extraites ; le procédé étant caractérisé en ce que : chaque support s’étend entre deux faces opposées, selon une dimension caractéristique inférieure à 20 mm, la dimension caractéristique correspondant au plus grand diamètre ou à la plus grande diagonale d’une des deux faces ; chaque support s’étend selon une épaisseur, entre les faces opposées, inférieure à la moitié de la dimension caractéristique; durant au moins 50% de la durée de l’incubation, au moins 50% des supports sont disposés, par gravité, au contact du fond de l’enceinte. Procédé selon la revendication 1, dans lequel durant au moins 80% ou 90% de la durée de l’incubation, au moins 80% des supports sont disposés, par gravité, au contact du fond de l’enceinte. Procédé selon l’une quelconque des revendications précédentes, dans lequel durant au moins 50% ou 80% ou 90% de la durée de l’incubation, le milieu de culture est statique. Procédé selon l’une quelconque des revendications précédentes, dans lequel au cours de l’étape b), des supports sont déplacés spontanément et progressivement sous l’effet du développement des cellules, en se redressant vers l’extrémité supérieure de l’enceinte, opposée au fond. Procédé selon l’une quelconque des revendications précédentes, dans lequel chaque support est tel qu’un ratio dimension caractéristique sur épaisseur est compris entre 5 et 100 et de préférence entre 5 et 50. Procédé selon l’une quelconque des revendications précédentes, dans lequel une desdites faces opposées est face plane. Procédé selon la revendication 6, dans lequel dans chacune desdites faces opposées est plane. Procédé selon l’une quelconque des revendications 1 à 6, dans lequel au moins une desdites faces opposées est bombée. Procédé selon l’une quelconque des revendications précédentes, dans lequel chaque support est formé d’au moins un matériau minéral ou organique choisi parmi : matériau sol-gel, verre, polymère, plastique, céramique, silicium, métal. Procédé selon l’une quelconque des revendications précédentes, dans lequel pour chaque support, la dimension caractéristique est comprise entre 10 µm et 20 mm ou entre 10 µm et 500 µm. Procédé selon l’une quelconque des revendications précédentes, dans lequel la densité de chaque support est inférieure à 3 g/cm 3 ou inférieure à 2.5 g/cm 2 . Procédé selon l’une quelconque des revendications précédentes, dans lequel lors de l’incubation, l’enceinte est configurée de façon que le fond est en dessous de l’extrémité supérieure, par rapport à un axe vertical (Z).