Brevet FR3155837A1 — publié le 20250530

La présente invention concerne un procédé in vitro de prédiction d’un état ou d’une pathologie à partir d’un échantillon biologique prélevé dans l’appareil digestif et/ou dans les excrétions d’un sujet. Plus particulièrement, l’invention concerne un procédé in vitro de prédiction d’une pathologie de l’appareil digestif ou d’une pathologie extra-digestive d’un sujet à partir de l’analyse du microbiote présent dans un échantillon biologique prélevé dans l’appareil digestif et/ou dans les selles d’un. Encore plus particulièrement, l’invention concerne un procédé de diagnostic prédictif de l’entérocolite ulcéro-nécrosante (ECUN) du nouveau-né prématuré. Figure pour l’abrégé : Figure 1 Procédé de prédiction d’un état ou d’une pathologie Domaine technique de l’invention La présente invention concerne un procédé in vitro de prédiction d’un état ou d’une pathologie à partir d’un échantillon biologique prélevé dans l’appareil digestif et/ou dans les excrétions d’un sujet. Plus particulièrement, l’invention concerne un procédé in vitro de prédiction d’une pathologie de l’appareil digestif ou d’une pathologie extra-digestive d’un sujet à partir de l’analyse du microbiote présent dans un échantillon biologique prélevé dans l’appareil digestif et/ou dans les selles d’un sujet. Encore plus particulièrement, l’invention concerne un procédé de diagnostic prédictif de l’entérocolite ulcéro-nécrosante (ECUN) du nouveau-né prématuré. Le présent procédé se situe donc dans le domaine du diagnostic in vitro et de la médecine personnalisée. Etat de la technique L’entérocolite ulcéro-nécrosante (ECUN) est l'urgence gastro-intestinale potentiellement mortelle la plus courante rencontrée par les prématurés dans les unités de soins intensifs pour nouveau-nés. Elle est définie en tant qu’inflammation ulcéreuse de la paroi intestinale. La pratique clinique actuelle pour diagnostiquer l’ECUN se fonde sur les résultats cliniques, radiologiques et hématologiques constituant les critères de Bell, selon une revue récente (D'Angelo et al., 2018). Les signes cliniques d'un début d’ECUN sont souvent très discrets et peuvent d'abord se manifester par une intolérance alimentaire et des symptômes non spécifiques avant que les symptômes gastro-intestinaux ne deviennent évidents. Ceux-ci incluent une augmentation des résidus gastriques, des selles sanglantes et une distension abdominale ; celles-ci peuvent évoluer vers une hypotonie généralisée, une léthargie et une insuffisance cardio-respiratoire, qui peuvent également être des caractéristiques d'autres affections néonatales, notamment la septicémie et les infections intestinales virales. Si la maladie n'est pas diagnostiquée et traitée à un stade précoce, elle peut entraîner une septicémie grave, une perforation intestinale, ainsi qu'une morbidité et une mortalité importantes. A ce jour, les cliniciens n’ont aucun outil diagnostic fiable de prédiction de l’ECUN. La physiopathologie de l’ECUN reste mal comprise et des méthodes efficaces pour sa détection précoce doivent encore être établies. Par conséquent, les efforts actuels pour comprendre et prédire l’ECUN se concentrent sur l’étude de ses facteurs de risque. La naissance prématurée représente le facteur de risque le plus important pour le développement de l’ECUN. Chez les nouveau-nés ayant un très faible poids à la naissance ( La colonisation du microbiote intestinal a été largement considérée comme jouant un rôle dans le développement de l’ECUN chez les nouveau-nés prématurés, malgré l’absence constante d’identification d’un seul agent pathogène opportuniste ou d’une communauté microbienne pathogène comme cause de l’ECUN. Cet échec est principalement dû à l’établissement précoce et très dynamique du microbiote intestinal néonatal, influencé par de nombreux facteurs, notamment l’environnement, le sexe, l’âge gestationnel, le mode d’accouchement, le mode d’alimentation et les traitements antibiotiques. L'association entre la colonisation intestinale et le développement de l’Entérocolite Ulcéro-Nécrosante (ECUN) chez les nourrissons prématurés suscite un intérêt depuis longtemps. Cependant, malgré des recherches approfondies, il y a eu un manque d'identification cohérente d'un pathogène opportuniste spécifique ou d'une communauté microbienne pathogène pouvant être directement liée à l'apparition de l’ECUN. Par conséquent, il existe un besoin très important de disposer d’un procédé fiable et reproductible de diagnostic prédictif des pathologies affectant les nouveau-nés, notamment les nouveau-nés prématurés. Un tel diagnostic prédictif permettrait d’identifier les nouveau-nés à risque et d’anticiper la prise en charge de pathologies susceptibles de gravement affecter leur vie. Description de l’invention Les inventeurs ont maintenant développé et optimisé un réseau neuronal profond et un procédé permettant un diagnostic prédictif d’un état ou d’une pathologie chez un sujet, à l’aide d’une analyse précise du microbiome dudit sujet. Selon un mode particulier de réalisation, l’invention a pour objet un procédé de diagnostic prédictif d’une pathologie digestive ou d’une pathologie extra-digestive, à partir d’une analyse précise du microbiome intestinal, ou fécal, dudit sujet, en combinaison avec au moins une donnée clinique pertinente. Un procédé selon l’invention permet potentiellement de réaliser des interventions thérapeutiques précoces afin de prévenir le développement ou les pires complications d’une pathologie. Un procédé selon l’invention présente l’avantage d’être fiable, reproductible et relativement rapide à mettre en œuvre, il répond à un besoin clinique auparavant non satisfait. Dans un aspect particulier d’un procédé selon l’invention, ledit réseau neuronal profond basé sur le microbiote intestinal est combiné avec au moins une donnée clinique du sujet, pour prédire la présence, ou au contraire l’absence, d’un état pouvant conduire à une pathologie ou d’une pathologie à part entière chez un sujet. Un procédé selon l’invention comprend une étape de reconstruction d’au moins une partie, de préférence la majeure partie, de la séquence du gène exprimant l’ARNr 16S et/ou de la séquence du gène exprimant l’ARNr 18S des microorganismes présents dans l’échantillon biologique, suivie d’une étape de classification taxonomique desdits gènes reconstruits. L’analyse de la classification des gènes reconstruits exprimant l’ARNr 16S et/ou l’ARNr 18S desdits microorganismes permet l’identification précise, au niveau du genre et éventuellement de l’espèce, et les mesures d’abondances relatives d’une pluralité de microorganismes présents dans l’échantillon biologique. Un procédé selon l’invention utilise l’ensemble des données métagénomiques du microbiote qui permettent ensuite la reconstruction complète des ADNr 16S et/ou 18S et une affiliation précise des microorganismes de la communauté microbienne au niveau du genre ou de l’espèce, voire l’identification de nouveaux microorganismes. L’étude de l’art antérieur montre que plusieurs méthodes d’analyse du microbiote ont été développées et testées. Cependant, une méthode comprenant l’amplification de fragments d’une taille inférieure à 300 paires de bases du gène exprimant l’ARNr 16S présente plusieurs limites : les biais susceptibles d’être générés lors de l’étape d’amplification réalisée par PCR peuvent altérer la vision de la diversité réelle du microbiote, la faible longueur du fragment n’apporte qu’une faible résolution taxonomique. En revanche, un procédé selon l’invention permet de transmettre une information prédictive simple à un clinicien. Un procédé selon l’invention présente donc les avantages d’une grande précision dans la prédiction, associée à une grande rapidité et un haut débit possible. En outre, l’application optionnelle d'une stratégie de reclassification sur des échantillons longitudinaux acquis permet d’améliorer encore les performances d’un procédé selon l’invention. En ce qui concerne une pathologie aussi grave que l’ECUN du nourrisson par exemple, bien que l’efficacité d’un procédé selon l’invention soit supérieure à tout procédé de diagnostic connu de cette pathologie, la possibilité de disposer d’un gain supplémentaire d’efficacité dans le diagnostic prédictif représente un atout précieux pour les patients et pour les cliniciens. Les inventeurs ont en particulier développé une approche de diagnostic prédictif de l’ECUN basée sur une approche d’apprentissage utilisant des réseaux de neurones profonds. Le traitement des données de séquençage métagénomique issues des selles des prématurés collectées avant l’apparition de la pathologie par le chainage bio-informatique RiboTaxa de 2 études a permis de générer des données d’entrées de microbiote intestinal associées à des métadonnées pour effectuer un apprentissage par réseaux de neurones profonds permettant de distinguer des prématurés ayant développé une ECUN et les prématurés n’ayant pas développé cette pathologie digestive. Un modèle de prédiction de l’ECUN basé sur l'intelligence artificielle est donc très utile pour identifier les nouveau-nés prématurés à risque, renforcer la surveillance et permettre des réponses thérapeutiques rapides évitant d'éventuels problèmes de santé graves. En effet, un procédé selon l’invention permet de prédire précocement très efficacement l’ECUN et de distinguer tout aussi efficacement les nourrissons non affectés. En effet, un procédé selon l’invention, mis au point sur 1355 espèces microbiennes uniques et 5 données cliniques (sexe, âge gestationnel, jour de vie/jour du prélèvement, mode de naissance et poids de naissance), a démontré sa capacité à distinguer des interactions microbiennes interindividuelles complexes dans des échantillons non-ECUN et ECUN avec une précision de 94,6 % et un AUROC de 0,987 ± 0,01. Un tel degré de fiabilité est non-égalé à ce jour parmi les procédés de diagnostic prédictif d’ECUN, en particulier chez le nouveau-né prématuré. Les inventeurs ont clairement confirmé l'efficacité de la prédiction du modèle sur une nouvelle cohorte de nourrissons qui a été établie par les inventeurs après la mise au point du procédé, et qui n'avait pas été intégrée lors de l’entrainement du réseau neuronal profond. De plus, un procédé selon l’invention a permis aux inventeurs de constater l’association de plusieurs espèces de microorganismes à la présence de la pathologie, d’une part, et de constater l’association de plusieurs espèces de microorganismes à l’absence de la pathologie, d’autre part. En effet, les inventeurs ont constaté que plusieurs espèces de Lactobacillus étaient associées à des cas non-ECUN, tandis que plusieurs autres espèces bactériennes telles que : Enterobacter non classées, Enterobacteriaceae non classées, Enterococcus faecalis , Klebsiella non classées, Haemophilus parainfluenzae , Enterococcus durans et Enterobacter cancerogenus étaient associées aux cas d’ECUN. Ces résultats suggèrent que la prédiction du phénotype est fonction à la fois des taxons dominants, sous-dominants voire rares, soulignant qu'aucune espèce individuelle ou groupe taxonomique d'espèces n'est pas exclusivement responsable d'un risque accru d’ECUN. Au lieu de cela, il est probable que divers consortia microbiens puissent provoquer des cascades inflammatoires entraînant l’apparition de l’ECUN. Un procédé selon l’invention permet donc en outre de disposer d’une cartographie précise des microorganismes associés à la présence d’un état pouvant conduire à une pathologie ou d’une pathologie, et des microorganismes associés à l’absence d’un état conduisant à une pathologie ou d’une pathologie, d’autre part. Un procédé selon l’invention présente l’avantage, à partir d’un simple prélèvement de microbiote, par exemple dans les selles d’un sujet, et de son séquençage métagénomique direct, de déterminer avec une forte certitude un diagnostic prédictif d’une maladie de l’appareil digestif ou d’une maladie extra-digestive. Cette approche peut être utilisée dans le cadre de médecine personnalisée pour évaluer la pertinence d’un suivi clinique plus précis et/ou le recours à un traitement thérapeutique, le suivi et les méthodes de traitement sont bien connus. La recherche de signatures microbiennes pour le diagnostic prédictif de pathologies est particulièrement complexe du fait des très fortes variations interindividuelles. A ce jour, plusieurs techniques d’analyse du microbiote existent. Cependant, les approches actuelles ne permettent pas une caractérisation précise des microbiotes. Il s’agit d’un enjeu majeur permettant de révéler des liens entre ces communautés de microorganismes et des pathologies. L’établissement de diagnostics prédictifs permettrait d’anticiper les prises en charge voire d’effectuer des traitements préventifs. L’approche d’apprentissage de données de séquençage métagénomique par réseaux de neurones profonds suite à un pré-traitement des données avec un logiciel tel que RiboTaxa permet d’obtenir des niveaux de prédiction sans équivalent jusqu’à présent. Une approche telle que décrite dans la présente demande de brevet est utile pour la détermination de diagnostics prédictifs dans de nombreux états ou pathologies, voire dans le cadre de médecine personnalisée. Cette approche peut non seulement être utilisée pour la détermination de diagnostics prédictifs mais aussi pour évaluer la réponse d’un sujet à un traitement thérapeutique et/ou pour suivre l’évolution dans le temps dudit état, de l’efficacité dudit traitement ou de ladite pathologie. En outre, un procédé selon l’invention peut permettre d’identifier des microorganismes qui seraient des acteurs clés de diverses situations saines ou pathologiques. Des microorganismes pourraient ainsi être identifiés comme pouvant jouer le rôle de probiotiques ou pour le développement de nouveaux traitements voire de nouveaux diagnostics. Description détaillée de l’invention La présente invention a pour premier objet un procédé in vitro de diagnostic prédictif d’un état ou d’une pathologie, à partir d’un échantillon biologique prélevé dans l’appareil digestif et/ou dans les excrétions d’un sujet, ledit procédé comprenant les étapes suivantes : a) fourniture de l’acide nucléique issu d’une pluralité de microorganismes présents dans ledit échantillon biologique, b) détermination par séquençage de la séquence nucléotidique d’au moins un acide nucléique choisi parmi : un fragment de gène exprimant l’ARNr 16S, un fragment de gène exprimant l’ARNr 18S, un fragment d’ARNr 16S et un fragment d’ARNr 18S, d’une pluralité de microorganismes, pour générer une pluralité de séquences nucléotidiques, c) organisation d’une pluralité de séquences nucléotidiques déterminées lors de l’étape b) pour reconstruire la séquence nucléotidique d’au moins un fragment de gène exprimant l’ARNr 16S, un fragment de gène exprimant l’ARNr 18S, un fragment d’ARNr 16S et un fragment d’ARNr 18S d’une pluralité de microorganismes, d) à partir des résultats de l’étape c), détermination de l’identité, de la classification taxonomique, et de l’abondance relative d’une pluralité de microorganismes présents dans ledit échantillon, et e) à partir des caractéristiques déterminées lors de l’étape d), détermination, par un modèle de classification préalablement entraîné, du diagnostic prédictif d’un état ou d’une pathologie. Selon un aspect particulier, un procédé in vitro de diagnostic prédictif d’un état ou d’une pathologie, à partir d’un échantillon biologique prélevé dans l’appareil digestif et/ou dans les excrétions d’un sujet, ledit procédé comprenant une étape préliminaire supplémentaire d’isolement de l’acide nucléique issu d’une pluralité de microorganismes présents dans ledit échantillon biologique. On entend par « acide nucléique » les molécules d’acides nucléiques présentes dans l’échantillon biologique, notamment l’acide déoxyribonucléique (ADN) et l’acide ribonucléique (ARN), en particulier l’ARN ribosomique (ARNr) et encore plus particulièrement l’ARNr 16S et l’ARNr 18S. Par « gène exprimant l’ARNr 16S » on entend la séquence nucléotidique d’ADN comprenant la séquence nucléotidique exprimant l’ARNr 16S. Un gène exprimant un ARNr 16S est également appelé « ADNr 16S ». Par « gène exprimant l’ARNr 18S » on entend la séquence nucléotidique d’ADN comprenant la séquence nucléotidique d’ADN codant l’ARNr 18S. Un gène exprimant un ARNr 18S est également appelé « ADNr 18S ». Selon un aspect particulier, un procédé selon l’invention comprend la détermination par séquençage de la séquence nucléotidique d’au moins un fragment de gènes exprimant l’ARN ribosomique (ARNr) 16S et/ou un fragment de gènes exprimant l’ARNr 18S. Selon un autre aspect particulier, un procédé selon l’invention comprend la détermination par séquençage de la séquence nucléotidique d’au moins un fragment d’ARNr 16S et/ou un fragment d’ARNr 18S. L’isolement des molécules d’acides nucléiques à partir de l’échantillon biologique est réalisé selon toute technique bien connue de la personne du métier. Les gènes exprimant la petite sous-unité de l’ARNr, c’est-à-dire les gènes appelés « ADNr 16S » pour les microorganismes procaryotes, tels que notamment les bactéries et les archées, et « ADNr 18S » pour les eucaryotes, incluant notamment les levures, sont utilisés pour permettre la description de la structure du microbiote (Chakoory et al., 2022). Selon un aspect particulier du procédé de l’invention, l’acide nucléique d’au moins 30 % du microbiote présent dans l’échantillon biologique est analysé dans un procédé selon l’invention. Plus particulièrement, l’acide nucléique d’au moins 40 %, d’au moins 50 %, d’au moins 60 %, au moins 70 %, au moins 80 %, au moins 90 %, au moins 95 %, au moins 96 %, au moins 97 %, au moins 98 %, au moins 99 % ou 100 % du microbiote présent dans l’échantillon biologique est analysé. Selon un autre aspect particulier, la séquence nucléotidique du gène exprimant l’ARNr 16S ou du gène exprimant l’ARNr 18S d’au moins 60 %, au moins 70 %, au moins 80 %, au moins 90 %, au moins 95 %, au moins 96 %, au moins 97 %, au moins 98 %, au moins 99 % ou 100 % du microbiote présent dans l’échantillon biologique est analysé. On entend par « séquençage » tout procédé connu destiné à déterminer la séquence nucléotidique d’un acide nucléique. Parmi ces procédés le séquençage métagénomique direct dit « shotgun » est préféré. L’utilisation des données de séquençage issues d’approches de capture de gènes par hybridation est aussi privilégiée. Les séquences nucléotidiques des gènes exprimant l’ARNr 16S de microorganismes et de gènes exprimant l’ARNr 18S de microorganismes sont au moins partiellement connues et sont répertoriées dans des bases de données spécialisées qui sont accessibles publiquement. Parmi ces bases de données, la base SILVA est accessible sur le site « arb-silva.de ». Un autre exemple de bases de données est la base « Greengenes ». La personne du métier peut aisément déterminer si une séquence nucléotidique donnée est issue d’un microorganisme connu ou inconnu, ou de l’hôte humain. Par « détermination de l’identité », on entend la détermination du genre d’un microorganisme présent dans l’échantillon et optionnellement la détermination de l’espèce d’un microorganisme présent dans l’échantillon. La détermination de l’identité d’un microorganisme est réalisée à partir de la séquence nucléotidique de l’ADNr 16S et/ou de l’ADNr 18S. Par « détermination de la classification taxonomique », on entend l’organisation d’une pluralité de microorganismes, à partir de la connaissance de l’identité desdits microorganismes, en catégories hiérarchisées, autrement dit en rangs taxonomiques, ces catégories consistent en l’appartenance au domaine du vivant (rang le moins précis) à la définition de l’espèce (rang le plus précis). La classification taxonomique est réalisée par comparaison des séquences d’ADNr 16S et/ou des séquences d’ADNr 18S déterminées avec, respectivement, des séquences d’ADNr 16S et/ou des séquences d’ADNr 18S contenues dans des bases de données. Parmi les bases de données utilisables, on peut notamment citer la base SILVA. Par « détermination de l’abondance relative », on entend la détermination pour chacun des microorganismes considérés pour le procédé selon l’invention, de l’abondance du microorganisme rapportée à l’abondance totale de microorganismes considérés pour le procédé selon l’invention. Plus particulièrement, un procédé selon l’invention comprend la détermination de la séquence nucléotidique d’au moins 20 % de l’ADNr 16S et/ou de l’ADNr 18S d’une pluralité de microorganismes issus de l’échantillon biologique. Encore plus particulièrement, un procédé selon l’invention comprend la détermination de la séquence nucléotidique d’au moins 20 % de l’ADNr 16S ou de l’ARNr 16S d’une pluralité de microorganismes issus de l’échantillon biologique et de la séquence nucléotidique d’au moins 20 % de l’ADNr 18S ou de l’ARNr 18S d’une pluralité de cellules eucaryotes issus de l’échantillon biologique. Par « un fragment d’au moins 20 % », on entend un fragment d’au moins 20 %, au moins 25 %, au moins 30 %, au moins 35 %, au moins 40 %, au moins 45 %, au moins 50 %, au moins 55 %, au moins 60 %, au moins 65 %, au moins 70 %, au moins 75 %, au moins 80 %, au moins 85 %, au moins 90 %, au moins 95 %, au moins 97 %, au moins 98 %, au moins 99 % ou 100 % de la séquence nucléotidique considérée. Plus particulièrement, dans un procédé selon la présente invention, lors de l’étape c) de reconstruction d’au moins une séquence nucléotidique, au moins 70 % de la longueur du gène exprimant l’ARNr 16S et/ou au moins 70 % de la longueur de l’ARNr 16S est reconstruite. La longueur d’un gène d’ADNr 16S étant d’environ 1500 paires de bases en moyenne, une séquence nucléotidique d’au moins 70 % de la longueur du gène comprend environ 1050 paires de bases, en moyenne. Selon un autre aspect particulier, un procédé selon l’invention comprend une étape supplémentaire consistant en la reclassification d’un échantillon biologique, à la suite d’une première classification de cet échantillon. Ce procédé est utilisé lorsque des prélèvements longitudinaux sont réalisés chez un sujet avant l’apparition de la pathologie et qu’au moins 3 échantillons prélevés sont analysés pour prédire le phénotype du sujet. Les sujets présentant une première classification incohérente entre les échantillons et pour lesquels on dispose d’au moins 3 échantillons sont identifiés. Ensuite, le nombre d'échantillons dans chacun des groupes phénotypiques (pathologie ou absence de pathologie) est calculé et l'échantillon (ou les échantillons) du groupe minoritaire est automatiquement reclassé dans le groupe phénotypique ayant le plus grand nombre d'échantillons rattaché à ce groupe phénotypique. Le phénotype prédit du sujet correspondra alors au groupe phénotypique ayant le plus grand nombre d’échantillons rattaché à ce phénotype. Par exemple, si parmi trois échantillons d’un sujet, deux échantillons N°1 et N° 2 sont considérés comme prédictifs de la pathologie et un échantillon N°3 est considéré comme prédictif de l’absence de pathologie, l’échantillon N°3 est reclassé comme prédictif de la pathologie, le sujet est donc reclassé parmi les sujets pour lesquels la pathologie est prédite. Par « reclassification » d’un échantillon on entend le réexamen de la prédiction de pathologie ou non pathologie pour un échantillon parmi les échantillons prélevés longitudinalement chez un sujet et utilisés pour prédire le phénotype du sujet. Par « sujet » on entend un individu, notamment un être humain ou un animal, de préférence un mammifère, et de préférence un sujet humain. Selon un mode de réalisation particulier d’un procédé selon l’invention, le sujet est choisi parmi : les adultes, les enfants, les enfants en période périnatale, les nouveau-nés et les nouveau-nés prématurés. Selon un aspect particulier du procédé de l’invention, le sujet est un nouveau-né humain. Un échantillon biologique utilisé dans un procédé selon l’invention est choisi parmi : un prélèvement d’un échantillon isolé à partir de l’appareil digestif et un prélèvement d’un échantillon isolé à partir des excrétions du sujet, en particulier un échantillon isolé à partir des selles du sujet. Ledit prélèvement est réalisé de manière conventionnelle et bien connue par une personne spécialiste. Un échantillon biologique donné comprend une communauté de microorganismes désignée par « microbiote ». Parmi les microbiotes hébergés par un sujet humain, on peut distinguer le microbiote cutané, le microbiote mucosal, le microbiote pulmonaire, le microbiote bucco-dentaire, le microbiote vaginal et les microbiotes de l’appareil digestif (microbiote buccal ou salivaire, microbiote de l’estomac, microbiote de l’intestin grêle, microbiote colique, microbiote anal). Le microbiote présent dans les selles, ou microbiote fécal correspond à l’ensemble des microorganismes retrouvés dans les selles faisant suite au transit dans le système digestif d’un sujet, pouvant être le reflet du microbiote intestinal au sens large avec une plus forte proximité avec le microbiote colique. Des microorganismes transitoires peuvent aussi être retrouvés dans ce microbiote. On entend par « microbiome » l’ensemble des génomes portant les gènes hébergés par les microorganismes constituant le microbiote. Le microbiome peut aussi être considéré comme étant l’ensemble des microorganismes y compris leurs génomes dans un environnement biologique particulier comme par exemple le côlon. On entend par « sujet » un individu, notamment un être humain ou un animal, de préférence un mammifère. Par « appareil digestif » on entend l’ensemble des organes des animaux pluricellulaires qui prend la nourriture, la digère pour en extraire des nutriments et excrète les déchets sous forme de matière fécale. Parmi les organes de l’appareil digestif humain, on peut citer : la bouche, les glandes salivaires, le pharynx, l’œsophage, l’estomac, le pancréas, le foie, la vésicule biliaire, le canal cholédoque, l’intestin grêle et le gros intestin. Le gros intestin comprend le côlon ascendant, le colon transverse, le côlon sigmoïde et le rectum. Par « excrétion » on entend les déchets inutilisables ou toxiques qui sont rejetés par le sujet comme l’urine, les matières fécales ou selles, ou des produits de sécrétion comme la bile ou la salive. On entend par « pathologie » une maladie, un risque d’évènement indésirable, un déséquilibre biologique ou un inconfort. Par « état ou pathologie du système digestif », on entend un état ou une pathologie affectant au moins un organe choisi parmi : la bouche, les glandes salivaires, le pharynx, l’œsophage, l’estomac, le pancréas, le foie, la vésicule biliaire, le canal cholédoque, l’intestin grêle et le gros intestin. Le gros intestin comprend le côlon ascendant, le colon transverse, le côlon sigmoïde et le rectum. Selon un aspect particulier du procédé de l’invention, ladite pathologie est une pathologie intestinale. Selon un mode de réalisation particulier, l’invention a pour objet un procédé in vitro de diagnostic prédictif d’un état ou d’une pathologie digestive, à partir d’un échantillon biologique prélevé dans l’appareil digestif et/ou dans les excrétions d’un sujet. Encore plus particulièrement, parmi lesdits états et pathologies digestives on peut citer : les cancers digestifs, c’est-à-dire affectant au moins un des organes de l’appareil digestif, les maladies inflammatoires chroniques, telles que notamment la maladie de Crohn, la rectocolite hémorragique, le syndrome de l’intestin irritable et la maladie coeliaque. Selon un mode de réalisation particulier, l’invention a pour objet un procédé in vitro de diagnostic prédictif d’un état ou d’une pathologie extra-digestive, à partir d’un échantillon biologique prélevé dans l’appareil digestif et/ou dans les excrétions d’un sujet. Par « état ou pathologie extra-digestive », on entend un état ou une pathologie n’affectant pas directement un organe du système digestif mais dont l’une des conséquences est susceptible d’affecter directement ou indirectement le microbiote de l’appareil digestif et réciproquement. Parmi les états et pathologies extra-digestives, ou non-digestives, dont un diagnostic prédictif peut être réalisé par un procédé selon l’invention, on peut citer : le diabète, l’obésité, les maladies cardio-vasculaires, les maladies métaboliques, les maladies hépatiques, les maladies rénales, les maladies uro-génitales, les maladies pulmonaires, les maladies articulaires, les maladies musculaires, les maladies inflammatoires, l’asthme, les allergies, l’arthrite, les maladies neurodégénératives (Parkinson, Alzheimer…), les maladies psychiatriques, les maladies comportementales, tous types de cancers pour tous types d’organes. Selon un aspect particulier du procédé de l’invention, ladite pathologie est une pathologie digestive d’un sujet choisi parmi : les enfants, les nourrissons (les enfants au-delà de leur premier mois de vie et jusqu’à l’âge de 24 ou 30 mois) et les nouveau-nés (enfants de moins de 28 jours selon la définition de l’Organisation Mondiale de la Santé), lesdits nouveau-nés étant nés à terme, soit entre la 37 ème semaine et la fin de la 40 ème semaine d’aménorrhée, ou prématurés, c’est-à-dire nés avant la 37 ème semaine d’aménorrhée. Selon un aspect particulier du procédé de l’invention, ladite pathologie est une pathologie intestinale choisie parmi les entérocolites, ladite pathologie est plus particulièrement l’entérocolite ulcéro-nécrosante (ECUN). Par « entérocolite ulcéro-nécrosante » on entend une maladie caractérisée par l’inflammation et la nécrose de la muqueuse intestinale. Plus particulièrement, dans un procédé selon l’invention, ladite pathologie est l’entérocolite ulcéro-nécrosante du nourrisson. Encore plus particulièrement, dans un procédé selon l’invention, ladite pathologie est l’entérocolite ulcéro-nécrosante du nourrisson prématuré. Selon un aspect particulier du procédé de l’invention, l’étape e) est réalisée à partir des caractéristiques déterminées lors de l’étape d) et d’au moins une donnée clinique caractéristique du sujet. Par « au moins une donnée clinique » on entend une, deux, trois, quatre, cinq, six, sept, huit, neuf, dix ou plus de dix données cliniques caractéristiques du sujet. Parmi les données cliniques du sujet utilisables pour la mise œuvre d’un procédé selon l’invention de détermination d’un diagnostic prédictif d’une pathologie, en particulier une pathologie du nouveau-né, on peut citer des données cliniques du sujet lui-même et, dans le cas d’un nouveau-né, des données cliniques relatives à sa mère, parmi lesquels : - l’âge réel du sujet auquel le prélèvement a été effectué, en nombre de jours de vie (DOL pour Day of Life, en anglais) - le poids à la naissance, - l’âge gestationnel à la naissance, - le mode de naissance (voie basse ou césarienne), - le genre du sujet (masculin, féminin), - le dosage de composants ou marqueurs sanguins du sujet ou de la mère, - le dosage de composants ou marqueurs fécaux du sujet ou de la mère, - la présence d’au moins une autre pathologie, - l’administration d’un traitement médical, - l’ethnie de la mère du sujet, - l’alimentation de la mère du sujet, - le mode de vie de la mère du sujet (activité physique, consommation d’alcool, de tabac, de drogues), - la présence d’au moins une pathologie de la mère du sujet, - l’administration d’au moins un traitement médical à la mère du sujet, - une combinaison d’au moins deux de ces données cliniques. Dans un procédé selon l’invention, l’âge de la mère peut être défini en nombre d’années ou par son appartenance à une tranche d’âge. Plus particulièrement, l’âge de la mère peut être attribué à l’un des deux groupes suivants : « inférieur à 35 ans » et « égal ou supérieur à 35 ans ». Par « ethnie », on entend un groupe de personnes que rapprochent un certain nombre de caractères. Dans un procédé selon l’invention, la caractéristique « ethnie » est notamment choisie dans le groupe constitué par : « Africain-Américain », « Américain-Indien », « Noir », « Blanc », « Caucasien », « Hispanique », « Asiatique », « Multi-ethnie ». Les données cliniques sont encodées comme suit : les données catégorielles (comme par exemple le genre et le mode de naissance dans le cas des nouveaux-nés) sont converties en vecteurs en utilisant "un encodage 1 parmi n" (en anglais one hot encoding), c'est-à-dire que tous les éléments du vecteur sont convertis en 0 sauf la variable catégorique qui est convertie en 1. Les données à valeurs continues (âge réel, poids à la naissance et l’âge gestationnel dans le cas des nouveau-nés) sont transformées en une variable discrète en créant un ensemble d'intervalles contigus (« bin » en anglais) qui couvrent la plage des valeurs de la variable. La donnée clinique « jour de vie » est discrétisée en intervalles avec un pas croissant de 9 (de 0-à 99 jours) et 99 (100 à 499 jours). Un pas de temps de 1 pourrait aussi être considéré sur les 3 premières semaines de vie où apparait le plus fréquemment la pathologie. La donnée clinique « poids » est discrétisée en intervalles avec un pas croissant de 99 (de 500 à 2899 grammes). Le poids des enfants pourra aussi être suivi si nécessaire par intervalle de 9 tout au long des 3 premières semaines de vie jusqu’à l’apparition éventuelle de la pathologie. L'âge gestationnel à la naissance est converti en facteurs en raison du nombre limité de valeurs. La présente invention a plus particulièrement pour objet un procédé in vitro de diagnostic prédictif de l’entérocolite ulcéro-nécrosante d’un nouveau-né, à partir d’un échantillon biologique prélevé dans les selles dudit nouveau-né, ledit procédé comprenant les étapes suivantes : a) isolement de l’acide nucléique issu d’une pluralité de microorganismes présents dans ledit échantillon biologique, b) détermination par séquençage, plus particulièrement métagénomique, encore plus particulièrement par séquençage métagénomique direct, de la séquence nucléotidique d’au moins un fragment de gènes exprimant l’ARNr 16S et/ou un fragment de gènes exprimant l’ARNr 18S d’une pluralité de microorganismes pour générer une pluralité de séquences nucléotidiques, c) organisation d’une pluralité de séquences nucléotidiques déterminées lors de l’étape b) pour reconstruire la séquence nucléotidique d’au moins un fragment des gènes exprimant l’ARNr 16S et/ou un fragment des gènes exprimant l’ARNr 18S d’une pluralité de microorganismes, d) à partir des résultats de l’étape c), détermination de l’identité d’une pluralité de microorganismes présents dans l’échantillon, de la classification taxonomique, de la et de l’abondance relative d’une pluralité de microorganismes présents dans ledit échantillon, et détermination d’au moins une donnée clinique caractéristique dudit nouveau-né, et e) à partir des caractéristiques déterminées lors de l’étape d), détermination, par un modèle de classification préalablement entraîné, d’un diagnostic prédictif d’ECUN ou d’absence d’ECUN, ladite au moins une donnée clinique étant choisie parmi : l’âge en nombre de jours depuis la naissance, le poids à la naissance, l’âge gestationnel, le mode de naissance, le genre, l’ethnie de la mère, l’âge de la mère, l’alimentation de la mère son mode de vie, ses pathologies et traitements, le résultat du dosage de composants ou marqueurs sanguins voire fécaux de l’enfant voire de la mère, l’administration d’un traitement médical chez l’enfant voire chez la mère, la présence d’au moins une autre pathologie chez l’enfant ou une combinaison de plusieurs de ces caractéristiques. Selon un aspect particulier d’un procédé selon l’invention, l’étape e) de détermination d’un diagnostic prédictif d’un état ou d’une pathologie est réalisée au moyen d’un modèle de classification préalablement entraîné. Par « modèle de classification » on entend notamment un modèle de classification comprenant : - un réseau de neurones préalablement entrainé, en particulier lors d’un apprentissage supervisé, en particulier un réseau de neurones profonds, - un algorithme d’apprentissage automatique et - un jeu de données d’apprentissage. Le modèle de classification peut consister en un programme d’ordinateur. Le programme d’ordinateur peut être écrit en tout langage informatique, tel que par exemple : C, C++, JAVA, Python, etc… ledit modèle de classification exécute donc en puissance une fonction technique, consistant ici en des étapes du procédé de classification. L’exécution dudit programme par un ordinateur produit un objet numérique disposant de caractéristiques techniques. Par « préalablement entraîné » on entend un processus permettant au réseau de neurones d’apprendre à associer de manière pondérée un microorganisme ou un groupe de microorganismes et au moins une donnée clinique pertinente à un phénotype (pathologie ou non pathologie). Dans le cas d’un procédé relatif à une pathologie digestive, ladite au moins une donnée clinique pertinente est notamment relative à la pathologie considérée. Dans le cas d’un procédé relatif à un sujet nouveau-né ou un nouveau-né prématuré, ladite au moins une donnée clinique pertinente est en lien avec les données cliniques du nouveau-né et éventuellement de sa mère, ou avec la prématurité. Pour la mise en œuvre d’un procédé selon l’invention, l’étape e) de détermination d’un diagnostic prédictif d’un état pouvant conduire à une pathologie ou d’une pathologie est réalisée au moyen d’un modèle de classification préalablement entraîné comprenant un algorithme, ledit algorithme étant choisi dans le groupe constitué par : un réseau de neurones (en anglais « neural network » ou NN), un arbre de décision, des K-plus proches voisins (en anglais « k-nearest neighbors » ou KNN), une forêt aléatoire (en anglais « random forest » ou RF), une classification naïve bayésienne (en anglais « naive bayes » ou NF), un algorithme « Boosting de gradient extrême» (en anglais Extreme gradient boosting ou XGBoost), une régression logistique et une machine à vecteur de support (en anglais « support-vector machine » ou SVM). Dans un mode de réalisation du procédé selon l’invention de détermination d’un diagnostic prédictif d’un état ou d’une pathologie, celui-ci comprend en outre une étape de détermination d’au moins un premier profil, également désigné par « signature », d’une pluralité de microorganismes, ledit au moins un premier profil étant caractéristique d’une prédiction de présence dudit état ou de ladite pathologie. Par « prédiction de présence dudit état ou de ladite pathologie », on entend une prédiction de présence dudit état ou de ladite pathologie supérieure à 50 %, de préférence une probabilité supérieure ou égale à 55 %, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % ou égale à 100 %. Selon ce mode de réalisation particulier, à partir des résultats de l’étape d) d’un procédé selon les inventions, au moins un premier profil d’une pluralité de microorganismes statistiquement associé à une prédiction de présence dudit état ou de ladite pathologie est déterminé. En d’autres termes, selon ce mode de réalisation particulier un procédé selon l’invention permet d’établir au moins une « signature » d’une pluralité de microorganismes statistiquement associé à une prédiction de présence dudit état ou de ladite pathologie. Un premier profil de microorganismes statistiquement associé à une prédiction d’apparition et de développement d’ECUN, obtenu par un procédé selon l’invention, se caractérise notamment par la présence de microorganismes du genre : - Enterobacter non classées, - Enterobacteriaceae non classées, - Enterococcus faecalis , - Klebsiella non classées, - Haemophilus parainfluenzae , - Enterococcus durans et - Enterobacter cancerogenus . En effet, ces microorganismes sont présents ou présents en plus grande quantité dans les échantillons biologiques statistiquement associés à la prédiction de présence d’ECUN. Dans un mode de réalisation du procédé selon l’invention de détermination d’un diagnostic prédictif d’un état ou d’une pathologie, ledit procédé comprend en outre une étape de détermination d’au moins un deuxième profil d’une pluralité de microorganismes caractéristique d’un diagnostic prédictif d’absence d’un état ou d’une pathologie. Par « prédiction d’absence dudit état ou de ladite pathologie », on entend une prédiction d’absence dudit état ou de ladite pathologie supérieure à 50 %, de préférence une probabilité supérieure ou égale à 55 %, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % ou égale à 100 %. Selon ce mode de réalisation particulier, à partir des résultats de l’étape d) d’un procédé selon l’invention, au moins un deuxième profil d’une pluralité de microorganismes statistiquement associé à une prédiction d’absence d’ECUN, est déterminé. Ledit au moins un deuxième profil d’une pluralité de microorganismes statistiquement associé à une prédiction d’absence d’ECUN, obtenu par un procédé selon l’invention, est caractérisé notamment par la présence de microorganismes de plusieurs espèces de Lactobacillus associées à des cas non-ECUN. En effet, ces microorganismes sont présents ou présents en plus grande quantité dans les échantillons biologiques statistiquement associés à une prédiction d’absence d’ECUN. D’autres microorganismes peuvent être cités, tels que : Bifidobacterium, Bifidobacterium longum, Bacteroides, Bacteroides fragilis, Lactobacillus casei. La présente invention a également pour objet un modèle de classification préalablement entraîné sur un jeu de données d’apprentissage pour déterminer, selon un procédé selon l’invention, un diagnostic prédictif d’un état ou une pathologie. Plus particulièrement, la présente invention a également pour objet un modèle de classification préalablement entraîné sur un jeu de données d’apprentissage pour déterminer, selon un procédé selon l’invention, un diagnostic prédictif de présence d’ECUN ou d’absence d’ECUN. Selon un troisième aspect, l’invention a pour objet l’utilisation d’un moyen de classification préalablement entraîné, selon l’invention, pour la détermination d’un état ou d’une pathologie. Selon un aspect particulier de ce troisième aspect, l’invention a pour objet l’utilisation d’un moyen de classification selon l’invention pour la détermination d’un diagnostic prédictif d’ECUN ou d’absence d’ECUN. Selon un quatrième aspect, l’invention a pour objet l’utilisation d’un outil informatique capable d’assurer la détermination précise des structures des communautés microbiennes. Ledit outil informatique permet notamment de déterminer l’identité des microorganismes et leur abondance relative, pour la détermination un diagnostic prédictif d’un état ou une pathologie. Un exemple d’un tel outil informatique est RiboTaxa (Chakoory et al ., 2022). Plus particulièrement, selon ce quatrième aspect, l’invention a pour objet l’utilisation d’un outil informatique capable d’assurer la détermination précise des structures des communautés microbiennes pour la détermination d’un diagnostic prédictif d’ECUN ou d’absence d’ECUN. L’invention a donc également pour objet un procédé in vitro de diagnostic prédictif d’un état ou d’une pathologie, à partir d’un échantillon biologique prélevé dans l’appareil digestif et/ou dans les excrétions d’un sujet, ledit procédé comprenant les étapes suivantes : a) isolement de l’acide nucléique issu d’une pluralité de microorganismes présents dans ledit échantillon biologique, b) détermination par séquençage de la séquence nucléotidique d’au moins un acide nucléique choisi parmi : un fragment de gène exprimant l’ARNr 16S, un fragment de gène exprimant l’ARNr 18S, un fragment d’ARNr 16S et un fragment d’ARNr 18S, d’une pluralité de microorganismes, pour générer une pluralité de séquences nucléotidiques, c) organisation d’une pluralité de séquences nucléotidiques déterminées lors de l’étape b) pour reconstruire la séquence nucléotidique d’au moins un fragment de gène exprimant l’ARNr 16S, un fragment de gène exprimant l’ARNr 18S, un fragment d’ARNr 16S et un fragment d’ARNr 18S d’une pluralité de microorganismes, d) à partir des résultats de l’étape c), détermination de l’identité, de la classification taxonomique, et de l’abondance relative d’une pluralité de microorganismes présents dans ledit échantillon à l’aide d’un outil informatique capable d’assurer la détermination précise des structures des communautés microbiennes, comme par exemple RiboTaxa, et e) à partir des caractéristiques déterminées lors de l’étape d), détermination, par un modèle de classification préalablement entraîné, du diagnostic prédictif d’un état ou d’une pathologie. La présente invention est expliquée davantage par les figures et les exemples ci-après. La FIG. 1 montre une vue d’ensemble des étapes suivies pour le procédé général de prédiction d’un état ou d’une pathologie, commençant par l’entraînement du réseau de neurones à partir des données de séquençage métagénomique d’une population mixte comprenant des sujets sains et des sujets présentant une pathologie, suivi par le procédé de prédiction du risque d’un état pathologique en utilisant le modèle entrainé et optimisé. La FIG. 2 représente la structure finale du modèle optimisé pour prédire l’ECUN. La FIG. 3 représente le taux de vrais positifs (en ordonnées) en fonction du taux de faux positifs (en abscisses), l’AUC est égale à 0,987. La FIG. 4 représente la précision (en ordonnées) en fonction de la sensibilité (en abscisses), l’AUC est égale à 0,992. La FIG. 5 illustre la reclassification d’échantillons suite à une première classification. Le cercle non étiqueté à gauche représente le phénotype réel du nourrisson. Les échantillons des nourrissons sans pathologie sont indiqués en gris foncé et les échantillons des nourrissons ECUN en gris clair. Chaque cercle étiqueté représente un échantillon collecté chez chacun des nourrissons et les nombres à l’intérieur des cercles correspondent au jour du prélèvement (en jours de vie). La couleur de ces cercles représente le phénotype prédit par le réseau de neurones selon le même code couleur que les cercles non étiquetés. Le carré simple représente les échantillons qui ont été reclassés dans le groupe « contrôle » et le double carré représente les échantillons qui ont été reclassés dans le groupe « ECUN ». La FIG. 6 représente les 20 caractéristiques d’entrée du réseau de neurones contribuant le plus à la prédiction des phénotypes ECUN ou non-ECUN. Exemples Exemple 1 : Diagnostic prédictif de l’ECUN à l’aide de réseaux de neurones profonds Matériel et méthodes Pour le recueil de données, une méta analyse a été réalisée au moyen des mots clés (en anglais) : « premature infants » ET (« stool microbiome » OU « intestinal microbiome ») ET « shotgun metagenomics » ET « necrotizing enterocolitis ». Cette recherche a conduit à un total de onze articles qui ont été soigneusement sélectionnés pour vérifier que la méthode de séquençage utilisée était la méthode « shotgun » mise en œuvre sur la plateforme Illumina et pour exclure les études appliquant uniquement la méthode de metabarcoding. En outre, les études devaient consister en des études prospectives ayant effectué des prélèvements longitudinaux de selles chez une population de nouveau-nés prématurés hébergés en unité de soins intensifs néonatals. Les études devaient inclure des échantillons longitudinaux de selles de nouveau-nés ayant développé l’ECUN, avant la survenue de la pathologie, désignés par « échantillons pré-ECUN », et des échantillons longitudinaux de selles de nouveau-nés prématurés n’ayant pas développé d’ECUN (contrôle). Les inventeurs ont également sélectionné des études incluant des informations cliniques telles que : mode de naissance (voie basse ou césarienne), genre (masculin-féminin), âge gestationnel (en semaines), âge réel (en jours de vie) et poids à la naissance (en grammes). Finalement deux études ont été retenues. Les données brutes et les métadonnées de Masi et al . (2021) ont été téléchargées à partir de European Nucleotide Archive (ENA) dans le cadre du BioProject PRJEB39610 (n = 524 ; 974,51 Go). En plus de sa propre cohorte, Olm et al. (2019a) ont également utilisé des données de séquençage provenant de différents ensembles de données précédemment publiées. Toutes les données brutes et métadonnées utilisées sur la cohorte Olm ont été téléchargées à partir de Sequence Read Archive (SRA) sous les projets BioProjects : PRJNA294605 (n = 141 ; 596,53 Go), PRJNA417343 (n = 184 ; 152,21 Go) PRJNA396794 (n = 295 ; 1,35). Tb), PRJNA376566 (n = 358 ; 905,22 Go) et étude SRA SRP052967 (n = 60 ; 114,21 Go). Les cohortes pré-existantes utilisées pour l’entraînement du réseau neuronal profond représentent un total de 524 et 1 038 données métagénomiques extraites de Masi et al. (2021) et Olm et al. (2019a), représentant respectivement 1 305 échantillons témoins (sur 160 nourrissons) et 257 échantillons ECUN (sur 48 nourrissons ECUN). Aucun échantillon collecté après l'apparition de l’ECUN n’a été analysé. Cinq caractéristiques de métadonnées cliniques ont été collectées et rapportées dans les deux études, telles que les phénotypes (contrôle, ECUN), le mode de naissance (vaginal, césarienne), le genre (garçon, fille), l'âge gestationnel à la naissance (en semaine), le jour de vie (en jours) et le poids à la naissance du nouveau-né (en grammes) et l'identification du nourrisson. Seuls Masi et al . (2021) ont indiqué que toute leur cohorte avait reçu des probiotiques ( Lactobacillus acidophilus, Bifidobacterium infantis et B. bifidum ). Le prétraitement des données avec RiboTaxa (Chakoory et al., 2022) a été utilisé pour obtenir des profils taxonomiques à partir d'ensembles de données métagénomiques brutes grâce à la reconstruction des séquences d'ARNr 16S et 18S à l'aide de la base de données SILVA (Quast et al., 2013) SSU 138.1 NR99. Pour chaque cohorte, des lectures brutes ont été fournies comme entrée dans RiboTaxa. Les lectures ont été traitées pour supprimer les adaptateurs Illumina, les artefacts Illumina connus et pour couper les deux extrémités des lectures lorsque le score de qualité des bases se trouvaient en dessous de Q20. Les lectures résultantes contenant plus d'un « N », ou avec des scores de qualité inférieurs à 20 en moyenne sur la lecture, ou une longueur inférieure à 60 pb, ont été rejetées. Pour la reconstruction du gène exprimant l'ARNr 16S/18S, les paramètres par défaut ont été utilisés, à l'exception des paramètres suivants (cohorte Masi : --max_read_length = 151, --insert_mean = 144, --insert_stddev = 100 ; cohorte Olm : --max_read_length = 301, --insert_mean = 120, --insert_stddev = 100), qui dépendent exclusivement de la longueur de séquençage des données d'entrée. Pour chaque cohorte, les paramètres --max_read_length représentaient la taille de la lecture la plus longue des données d'entrée et --insert_mean et --insert_stddev ont été estimés à l'aide du script Mean_size.py (https://gist.github.com/timoast/af73c0e9fac00187ee49). Les séquences d’ADNr 16S/18S reconstruites ont ensuite été classées à différents niveaux taxonomiques, du domaine à l'espèce et après avoir écarté les séquences eucaryotes humaines, les abondances relatives ont été calculées par RiboTaxa. Tous les tableaux de taxonomie de sortie ont été regroupés en un seul tableau contenant tous les profils au niveau des espèces à l'aide du script RiboTaxa_group_taxonomy.sh de RiboTaxa. Pour chaque échantillon, les abondances relatives taxonomiques fournies par RiboTaxa ont été normalisées pour éviter l'influence de taxons très abondants en utilisant une échelle standard pour normaliser chaque valeur d’abondance via la transformation ci-dessous, appelée normalisation min-max : où : x est la donnée originale. x' est la donnée normalisée x min et x max sont respectivement les valeurs minimale et maximale de la valeur d'origine (abondance). L'équation ci-dessus est une transformation linéaire qui conserve tous les ratios d'abondance des données d'origine après normalisation. La discrétisation et la vectorisation des données ont été réalisées comme suit : Pour l’apprentissage du modèle, les profils d'abondance des espèces normalisés. De plus, les informations cliniques sur le phénotype (témoin, ECUN), le mode d'accouchement (vaginal, césarienne), le sexe (garçon, fille), l'âge gestationnel à la naissance (en semaines), le jour de vie (en nombre de jours, « Day of Life » ou « DOL » en anglais) et le poids à la naissance (en grammes) du nouveau-né constituaient les principales données du réseau neuronal profond. Hormis le phénotype, le mode de naissance et le sexe qui étaient des variables discrètes, les autres caractéristiques cliniques étaient des valeurs continues. Pour mieux gérer ces données de grande dimension, elles ont été transformées par discrétisation, qui est le processus de transformation d'une variable à valeur continue en une variable discrète en créant un ensemble d'intervalles (ou compartiments) contigus qui s'étendent sur la plage des valeurs de la variable. Le regroupement des caractéristiques numériques en groupes basés sur des intervalles est bénéfique pour la classification et peut améliorer considérablement les performances du modèle. Les métadonnées « DOL » ont été discrétisées en classes de 0 à 499 avec un pas croissant de 9 (0-99) et 99 (100-499). Le poids des nourrissons a été regroupé par tranches de 500 à 2 899 avec un pas croissant de 99. L'âge gestationnel a été converti en facteurs en raison du nombre limité de valeurs. L'étape suivante consistait à appliquer une technique d’encodage 1 parmi n (en anglais one hot encoding) sur les données catégorielles à l'aide de LabelEncoder de la bibliothèque scikit-learn (Pedregosa et al., 2011). Ainsi, les valeurs discrètes ont été vectorisées, c'est-à-dire que tous les éléments du vecteur sont convertis en 0 sauf la variable catégorielle, qui est convertie en 1. Après cette étape, un ensemble de données comprenant 47 valeurs catégorielles et 1 282 valeurs numériques (abondances microbiennes normalisées) pour chaque échantillon a été obtenu. Un modèle de réseau neuronal profond entièrement connecté a été implémenté en utilisant le langage de programmation Python et des bibliothèques dédiées telles que scikit-learn, Tensorflow (Abadi et al., 2016) et Keras (Keras, 2023). Pour l’entrainement et l’optimisation du réseau de neurones, la fonction d'activation d’unité linéaire rectifiée (ReLU) a été utilisée pour toutes les couches cachées. Les fonctions d'activation jouent un rôle important dans l’entraînement des réseaux de neurones. Ils apportent la non-linéarité nécessaire au modèle pour pouvoir apprendre des représentations complexes. La technique d'abandon des neurones sur chaque couche cachée (0,1-0,5) a également été employée afin d'atténuer le surapprentissage dans les réseaux de neurones. L'abandon des neurones (ou dropout en anglais) est une méthode d'apprentissage qui implique la suppression aléatoire de neurones pendant l’entrainement du modèle, les nœuds supprimés étant exclus des étapes suivantes. Pour l’entrainement et l’optimisation du réseau neuronal, la fonction d'activation de la couche de sortie utilise la fonction Softmax pour attribuer une valeur basée sur une probabilité comprise entre 0 et 1 à chaque classe (ECUN, contrôle). La fonction de perte l'entropie croisée entre la valeur cible et la valeur prédite a été utilisée, et cette perte a été optimisée au cours des epochs (nombre de fois où le jeu de données complet va être propagé dans le réseau de neurones) à l'aide de l'optimiseur Adam (Kingma et Ba, 2017) avec des taux d'apprentissage variables, allant de 0,0001 à 0,01. Le nombre de couches cachées a varié de 1 à 3, le nombre d'epochs de 1 à 40 et le nombre de neurones dans la première couche cachée de 32 à 512 avec un pas croissant de 32. Le nombre de neurones dans les couches cachées était défini à la moitié de celui de la couche précédente, à l’exception de la première couche cachée. Ces optimisations ont été implémentées à l'aide de Keras (https://github.com/keras-team/keras-tuner). Un total de 584 482 hyperparamètres a été testé. Le modèle optimal a été sélectionné sur la base d'une faible perte dans la valeur de validation, ce qui a permis d'identifier les meilleurs hyperparamètres du réseau neuronal profond ( FIG. 2 ). De plus, un critère d'arrêt selon lequel l’apprentissage était interrompu si la valeur de validation ne s'améliorait pas après 10 epochs a été utilisé. L’entraînement du modèle a été réalisé comme suit : un total de 1 562 échantillons a été divisé en ensembles d’apprentissage et test dans un rapport de 8 : 2 pour obtenir 80% de données d'apprentissage et 20 % de données test. Pour l’apprentissage, une validation croisée K-Fold a été appliquée avec les données d’apprentissage. Celles-ci sont divisées en K sous-ensembles de taille presque égale ; K-1 sous-ensembles étant utilisés pour l’entrainement du modèle et le sous-ensemble restant pour la validation du modèle produit. L’objectif était de construire et d'ajuster un modèle entraîné sur différents sous-ensembles de données d’apprentissage. De cette manière K modèles sont construits, avec à chaque fois une redistribution des K sous-ensembles et la définition de nouveaux hyperparamètres. La meilleure combinaison d'hyperparamètres pour chaque modèle est sélectionnée en faisant la moyenne de la métrique de précision des K modèles. Cette approche a non seulement permis une utilisation plus efficace des données d'entraînement disponibles, mais a également augmenté la fiabilité du modèle de prédiction. Une fois la meilleure combinaison d'hyperparamètres déterminée, un modèle de classification final a été entraîné en utilisant l'ensemble de données d’apprentissage, il a ensuite été testé sur l'ensemble de données test. Le tableau 1 suivant rassemble les caractéristiques du réseau neuronal profond ainsi obtenu. Les performances du modèle ont été estimées sur l'ensemble de données test en comparant le véritable phénotype de l'échantillon avec le phénotype prédit. Si le modèle classe correctement un échantillon ECUN, il est considéré comme un vrai positif (TP pour True Positive), sinon il s'agit d'un faux négatif (FN pour False Negative). En revanche, si le modèle classe correctement un échantillon non-ECUN (Contrôle), il est considéré comme un vrai négatif (TN pour True Negative), sinon il s'agit d'un faux positif (FP pour False Positive). Une évaluation par plusieurs métriques a été appliquée en raison du déséquilibre de classe pour mesurer les performances du modèle en utilisant la précision, le taux de vrais positifs (TPR pour True Positive Rate) et le taux de vrais négatifs (TNR pour True Negative Rate), l'aire sous la courbe (AUC pour Area Under the Curve) de la caractéristique de fonctionnement du récepteur (ROC pour Receiver Operating Characteristic) /AUROC, et AUC de précision-sensibilité (PR-AUC pour Precision-Recall AUC). La précision est le rapport entre le nombre de prédictions correctes et le nombre total de prédictions, elle est calculée comme suit : Le TPR, également appelé sensibilité, est le rapport des échantillons ECUN correctement classés (TVN-ECUN), il est calculé comme suit : Le TNR, également appelé spécificité, est le rapport échantillons contrôle/non-ECUN correctement classés (TNR-non-ECUN) et se calcule comme suit : Enfin, l’AUROC mesure le taux de faux positifs (FP) sur le TPR et PR-AUC mesure la sensibilité sur la précision (rapport des TP au nombre total de TP et FP). Les AUC ont été calculées en python à l'aide du package scikit-learn (Pedregosa et al., 2011) et tracées à l'aide de matplotlib (Hunter, 2007) (v3.1). Les intervalles de confiance (IC) à 95 % des AUC ont été estimés à l'aide de la méthode bootstrap (Efron et Tibshirani, 1994) avec 1 000 itérations. Les courbes ROC et le tracé de Sankey ont été générés respectivement à l'aide de matplotlib et de plotly (v5.15.0) pour comparer le modèle et évaluer les performances finales du modèle sur l'ensemble de données test. Le test U de Mann-Whitney a été utilisé pour déterminer les changements significatifs dans l'AUROC et le PR-AUC entre le modèle formé à partir des métadonnées et des données d’abondance relative des microorganismes du microbiote, et sans métadonnées (microbiote uniquement) ; une valeur p a été jugée significative lorsque La reclassification des échantillons basée sur un échantillonnage longitudinal de nourrissons a été réalisée comme suit : des données longitudinales intensives peuvent être utilisées pour explorer l’évolution du microbiote au cours du temps. Dans la présente étude, les inventeurs ont profité de l'échantillonnage longitudinal de nouveau-nés fourni par les cohortes Masi et Olm pour reclasser les échantillons mal classés par le réseau neuronal profond. Les nourrissons pour lesquels la prédiction du phénotype était incohérente selon les échantillons et qui avaient au moins 3 échantillons de selles dans l'ensemble de données test ont été identifiés. Le nombre d'échantillons dans chaque groupe phénotypique a été calculé et le ou les échantillons du groupe phénotypique mineur ont été automatiquement reclassés dans le groupe phénotypique ayant le plus grand nombre d'échantillons. Pour garantir que les échantillons étaient correctement reclassés, le véritable phénotype des nouveau-nés et les TPR-ECUN et TNR-non-ECUN ont été recalculés. Enfin, un tracé en sucette a été généré pour visualiser la reclassification des échantillons longitudinaux ( FIG. 5 ) à l'aide du package ggpubr (v0.4.0). SHAP : Les modèles peuvent être interprétés en calculant l'importance des données d’entrée liées aux performances de classification du modèle. Dans cette étude, l'importance des éléments d’entrée (métadonnées, microorganismes) a été calculée à l'aide de SHAP. La fonction DeepLIFT (Lundberg et Lee, 2017 ; Shrikumar et al., 2019), également connue sous le nom de DeepExplainer de SHAP, est une méthode permettant de décomposer la sortie d'un réseau neuronal (prédiction) en attribuant des valeurs de contributions à chaque donnée de l’entrée du réseau de neurones. Cette fonction permet de mettre en évidence les données d’entrée (métadonnées, microorganismes) ayant le plus de poids dans la prédiction d’un phénotype. Pour évaluer davantage les performances du modèle optimisé, une cohorte de 19 prématurés a été construite, dont 9 nouveau-nés ayant développé une ECUN, un total de 56 échantillons de selles a été collecté longitudinalement. Cette étude a été approuvée par le comité d'éthique du CPP-Sud-Est VI (code protocole 2021/CE 26, la date d'approbation est le 4 mai 2021). La cohorte CORTECs vise à traiter les facteurs de risque prénatals et postnatals d’ECUN. Tous les enfants nés prématurément hospitalisés dans l'unité de soins intensifs néonatals (USIN) du CHU de Clermont-Ferrand ont été proposés pour entrer dans la cohorte. Un consentement éclairé écrit a été obtenu des familles des participants à l'étude avant l'inscription. Les selles des nourrissons ont été collectées quotidiennement pendant leur séjour à l'USIN, entre mai 2021 et juin 2022. Les selles ont été collectées dans une couche à l'aide d'une oese stérile, puis distribuées dans un tampon eNAT (Copan) avant d’être maintenues brièvement à 4 ° C. Les échantillons ont été conservés à -80 ° C jusqu'à l'extraction de l'ADN. Les cas d’ECUN ont été identifiés par les médecins sur la base de signes systémiques et abdominaux et de caractéristiques radiographiques. Ils ont été stratifiés selon la gravité de la maladie selon les stades de Bell. Les cas d’ECUN ont été appariés à un nouveau-né témoin (deux pour un cas) qui n'a pas développé d’ECUN. L'appariement cas-témoins était basé sur l'âge gestationnel à l'accouchement, le mode d'accouchement, le sexe, le poids à la naissance et les antibiotiques pré et postnatals. Pour chaque nourrisson ECUN, les échantillons disponibles ont été sélectionnés dans une fenêtre d'une semaine avant le début de l’ECUN et les échantillons des cas témoins correspondants ont été appariés en fonction de l'âge du patient ECUN. L'ADN génomique a été extrait à l'aide du protocole opératoire standard pour les échantillons fécaux (protocole H) recommandé par les normes internationales du microbiome humain (IHMS SOP 07 V1). La qualité de l'ADN a été évaluée à l'aide du fluoromètre Nanodrop 2000 (Thermo Scientific) et du système Agilent 4150 TapeStation avec des ScreenTape ADN génomique (Agilent). La quantité d'ADN a été évaluée à l'aide du fluoromètre Qubit 3 (Invitrogen) avec le kit de test Qubit dsDNA High Sensitivity (Invitrogen). Capture par hybridation du gène exprimant l'ARNr 16S et traitement des données de séquençage : les sondes de capture ont été conçues pour cibler le gène exprimant l’ARNr 16S (Gasc et al., 2016). Des librairies de séquençage ont été produites pour chaque échantillon à l'aide du kit de préparation de librairies Nextera XT. L'expérience de capture de gènes a été réalisée selon le protocole décrit par Ribière et al. (2016) et Comtet-Marre et al. (2023). En bref, des sondes de capture ARN biotinylées ont été obtenues par transcription in vitro . 500 ng de librairies ont été mélangés avec 2,5 µg d'ADN de sperme de saumon et incubés avec 500 ng de sondes biotinylées dans un tampon d'hybridation pendant 24 h à 65°C. Les hétéroduplex sonde/cible ont été capturés à l'aide de 500 µg de billes paramagnétiques recouvertes de streptavidine (Dynabeads M-280 Streptavidin, Invitrogen). Les billes ont été collectées à l'aide d'un support magnétique (Ambion), lavées une fois avec 500 µL de tampon 1 x SSC/0,1 % SDS, puis trois fois avec 500 µL de tampon 0,1 x SSC/0,1 % SDS préchauffé à 65°C. Les fragments d'ADN capturés ont été élués avec 50 µL de NaOH 0,1 M et transférés dans un tube stérile contenant 70 µL de tampon Tris-HCl 1 M pH 7,5. L'ADN capturé a été amplifié par PCR avec 25 cycles en utilisant des amorces complémentaires aux adaptateurs Illumina. Pour augmenter l’efficacité de l’enrichissement, un deuxième cycle de capture a été effectué. L'ADN capturé a ensuite été séquencé sur la plate-forme Illumina MiSeq 2 × 300 pb. Les données brutes de séquençage ont été traitées à l'aide du pipeline RiboTaxa afin de reconstruire les gènes exprimant l'ARNr 16S, d'obtenir l'affiliation taxonomique des séquences reconstruites (jusqu'au niveau de l'espèce) et de déterminer les abondances relatives des espèces, comme décrit ci-dessus. Prédiction à l'aide du modèle optimisé : Avant la prédiction, les abondances des espèces ont été normalisées par une échelle min-max. Les variables continues des métadonnées ont été discrétisées et toutes les variables ont été codées à l'aide d'un encodage 1 parmi n (en anglais one hot encoding). Comme l'approche de capture de gènes par hybridation permet une description plus fine de la communauté microbienne par rapport à la métagénomique « shotgun », toutes les espèces qui n'ont pas été utilisées lors de l’apprentissage ont été exclues. Le modèle optimisé a ensuite été appelé. Le tableau d'abondance relative des microorganismes concaténé avec les données cliniques pertinentes a été saisi dans le modèle entraîné et sa valeur prédite a été consignée. Finalement, chaque prédiction a été comparée à la véritable valeur (contrôle ou ECUN) pour calculer le nombre de bonnes prédictions. Des tracés SHAP pour chaque prédiction ont également été générés à l'aide de matplotlib pour expliquer les différentes prédictions. Cette cohorte a également permis de reclasser des échantillons longitudinaux du même nourrisson en utilisant la même approche que celle décrite ci-dessus. Résultats Le séquençage direct (« shotgun ») a été sélectionné pour évaluer le microbiote à haute résolution (au niveau de l’espèce) afin d’améliorer l’identification de signatures microbiennes spécifiques associées à des états pathologiques spécifiques. 1 562 échantillons de selles métagénomiques ont été analysés à l'aide de RiboTaxa (Chakoory et al., 2022). Cette uniformité permet à un modèle unique de prendre en charge les données de divers protocoles d’étude. Les profils d'abondance relative contrôlés et de haute qualité au niveau des espèces ainsi que cinq données cliniques ont été utilisés pour entraînerun réseau neuronal profond permettant de prédire le risque d’ECUN. Pour faciliter la comparaison des métadonnées entre les cohortes « Masi » et « Olm » seules les métadonnées à l'intersection des deux études a été utilisée. Les données cliniques et démographiques des patients sont présentées dans le tableau 2. Pour uniformiser la caractérisation microbienne entre les deux cohortes indépendantes, toutes les données de séquençage métagénomiques ont été réanalysées à l'aide de RiboTaxa. Après avoir écarté les contaminants humains, il ne nous restait que des séquences d’ADNr 16S bactériennes et archéennes représentant le microbiote fécal de 208 nourrissons prématurés. Le profilage taxonomique des deux cohortes a conduit à l'identification d'un total de 1 282 espèces uniques : Masi : 1 237 espèces ; Olm : 1343 espèces. L’analyse de la diversité microbienne a révélé une plus grande diversité d'espèces dans les échantillons non-ECUN avec un total de 1 238 espèces identifiées par rapport aux échantillons ECUN (539 espèces). RiboTaxa a identifié 495 espèces communes entre les deux groupes et, fait intéressant, 743 espèces étaient uniques dans les échantillons non-ECUN, par rapport aux échantillons ECUN avec 44 espèces uniques dans ECUN. Des différences significatives (p Les Enterobacteriaceae non classées, Escherichia-Shigella non classées, Enterobacter non classées et Klebsiella non classées étaient globalement les espèces les plus abondantes. Bien que l'abondance de Klebsiella non classées et d'Escherichia-Shigella non classées ne diffère pas de manière significative (p > 0,05) entre les deux groupes, les abondances relatives moyennes d'Enterobacter non classées et d'entérobactéries non classées étaient significativement plus élevés dans les échantillons ECUN que dans les témoins prématurés (p De plus, l'abondance moyenne de Bifidobacterium breve , de Bifidobacterium non classées et de Citrobacter non classées étaient significativement plus élevés dans les échantillons témoins tandis que les Staphylococcus non classés étaient significativement plus abondants dans les échantillons ECUN (p L’ECUN se distingue souvent par une altération complexe de la composition et de la diversité du microbiome, englobant des interactions altérées entre des micro-organismes dominants et rares. Pour mieux différencier les interactions microbiennes complexes chez les nouveau-nés ECUN et non-ECUN, un réseau neuronal profond a été développé pour prédire le risque d’ECUN avant l'apparition de la maladie. Le réseau neuronal profond a été formé à l'aide de 1 402 caractéristiques différentes (1 355 espèces et 47 données cliniques : 10 groupes d'âge gestationnel, 18 groupes de poids, 15 DOL, 2 modes de naissance et 2 groupes de sexe). Il a été décidé de conserver toutes les espèces détectées dans tous les échantillons, au lieu d'appliquer une sélection de caractéristiques avant l'entraînement pour conserver les variations interindividuelles entre les nourrissons. L’objectif était d’obtenir un modèle performant tout en conservant l’inter-variabilité entre individus. Un système complet d'évaluation des performances qui sépare l'ensemble test (20 %) et l’ensemble d’apprentissage (80 %) a été réalisé pendant la phase d'optimisation des hyperparamètres en utilisant une validation croisée 10-fold. Un total de 584 482 paramètres entraînables ont été testés et le réglage optimal des hyperparamètres pour le modèle final avait 448 unités (neurones) dans la 1ère couche cachée et un total de 3 couches cachées avec le nombre d'unités fixé à la moitié de celui de la couche précédente. Le taux d'apprentissage optimal était de 0,01 et le modèle était mieux ajusté à l'époch 27. En raison du nombre relativement faible de fonctionnalités d'entrée, l’apprentissage du modèle a été réalisée sur : i86linux32, 4,0 Go de RAM × 8 cœurs (32,8 Go au total), sans GPU et s'est déroulée en 4 min 51 s. L'évaluation du modèle final a été réalisée sur l'ensemble test composé de 313 échantillons (140 nourrissons) associés aux cinq métadonnées (mode de naissance, sexe, âge gestationnel, poids à la naissance et DOL). Le modèle a identifié un total de 297 échantillons correctement prédits (125 nourrissons), ce qui donne une précision de 94,9 %. Parmi les 260 échantillons témoins prématurés (112 nourrissons), le modèle a prédit 249 échantillons non-ECUN (101 nourrissons) et a mal classé 11 échantillons en ECUN, produisant un score TNR-non-ECUN de 95,8 %. D'autre part, parmi 53 échantillons ECUN (28 nourrissons), le modèle a correctement identifié 48 échantillons ECUN (24 nourrissons) et a mal classé 5 échantillons en non-ECUN, ce qui a donné un TPR-ECUN de 90,6 %. Dans des essais répétés du réseau neuronal profond, nous avons démontré un AUROC de 0,987 ± 0,01 ( FIG. 3 ), suggérant un bon équilibre entre sensibilité et spécificité et une valeur PR-AUC de 0,992 ( FIG. 4 ). Dans cette étude, l'échantillonnage longitudinal des nouveau-nés fourni par Masi et al. (2021) et Olm et al. (2019a) a été utilisé pour appliquer une approche unique de reclassification des échantillons afin d'augmenter le taux de bonne prédiction phénotypique. Dans le cas où la prédiction de l'échantillon était incohérente parmi les échantillons en série (dans l'ensemble test) appartenant au même nourrisson, le nombre d'échantillons dans chaque groupe phénotypique a été calculé et le ou les échantillons du groupe phénotypique mineur ont été automatiquement reclassés dans le groupe phénotypique ayant le plus grand nombre d’échantillons. Dans cette étude, 16 échantillons (provenant de 16 nourrissons) sur 313 échantillons testés ont été mal classés par le réseau neuronal profond, parmi lesquels 6 échantillons appartenaient à 6 nourrissons (2 témoins et 4 ECUN) pour lesquels au moins trois échantillons en série étaient disponibles. Pour reclasser les 6 échantillons, 22 échantillons longitudinaux appartenant aux 6 nourrissons ont été récupérés et triés par jour d'échantillonnage. Grâce à cette technique, 2 échantillons ont été reclassés dans le groupe ECUN et 4 échantillons ont été reclassés dans le groupe contrôle. Pour garantir que tous les échantillons étaient correctement prédits, nous les avons comparés au véritable phénotype de chaque nourrisson et avons confirmé la bonne classification de tous les échantillons. Après ce processus, 131 nourrissons sur 140 ont été correctement classés, donnant respectivement un TPR-ECUN et un TNR-non-ECUN de 94,3 % et 97,3 %. Dans l'ensemble des données, l'échantillon contrôle le plus tardif a été obtenu à DOL 447 tandis que le dernier échantillon ECUN avant le début de la pathologie a été collecté à DOL 67. Par conséquent, afin de minimiser les variations microbiennes dans les échantillons de contrôle au-delà de DOL 67, tous les échantillons de contrôle collectés après ce moment ont été exclus. L'ensemble de données final contenait 1 172 échantillons contrôle (160 nourrissons) et 257 échantillons ECUN (42 nourrissons), englobant 1 394 caractéristiques d'entrée (1 355 espèces et 39 données cliniques : 10 groupes d'âge gestationnel, 18 groupes de poids, 7 DOL, 2 modes de naissance et 2 sexes groupes). Le modèle nouvellement développé a démontré un haut niveau de précision, atteignant 92,3 % et un AUROC de 0,960 ± 0,02. Le modèle a prédit avec précision 227 échantillons témoins (102 nourrissons) avec un TNR-non-ECUN de 97 %, tandis que 7 échantillons (7 nourrissons) ont été classés à tort comme ECUN. D'autre part, le modèle a correctement identifié 37 échantillons ECUN appartenant à 19 nourrissons, donnant un TPRECUN de 71,15 %, mais a mal classé 15 échantillons (9 nourrissons) comme témoins. De plus, lors de la reclassification des échantillons en série, 3 nourrissons (1 témoin et 2 ECUN) ont été reclassés avec précision, conduisant à un TPR-ECUN et un TNR-non-ECUN de 74 % et 97,4 % respectivement. Néanmoins, ces résultats suggèrent que la limitation du nombre d'échantillons contrôle avait un impact négatif sur la prédiction d’ECUN, tandis que l'utilisation de tous les échantillons (indépendamment du DOL) pendant l’apprentissage permettait au modèle de mieux différencier le contrôle et les sujets ECUN. Le modèle initial (précision = 94,9 %) a donc été conservé. Le réseau neuronal profond est également intéressant car il permet l’identification des espèces clés contribuant à la prédiction du modèle. Les 20 caractéristiques les plus importantes contribuant à la validation du modèle ont été résumées par l'explicateur SHAP et présentées dans la FIG. 6 . Les quatre contributeurs les plus importants étaient Lactobacillus spp. et leurs valeurs SHAP élevées étaient associées à des échantillons contrôles prématurés. Bien que la croissance des lactobacilles soit généralement favorisée par l'allaitement maternel, tous les prématurés ont reçu des probiotiques qui influencent directement l'abondance des Lactobacilles. De plus, RiboTaxa a détecté deux bactéries non classées, bacterium_129 et bacterium_ARb03, qui ont contribué à la prédiction des nourrissons non-ECUN. L'analyse phylogénétique a révélé que la bactérie_129 était potentiellement une nouvelle espèce de Lactobacillus partageant une identité de 96,32 % avec la souche Dwan5 de L. casei, tandis que la bactérie_ARb03 partageait une identité de 99,71 % avec la souche ADY07 de Bacillus cereus . En revanche, les espèces affiliées Enterobacte r non classé , Syntrophomonas non cultivé, Streptomyces vanillaeus, Enterobacteriaceae non classé et Enterococcus faecalis ont le plus contribué à la classification ECUN. Il est intéressant de noter que des espèces peu abondantes telles que Ruminococcus sp., Staphylococcus non cultivés, Streptococcus parasanguinis et Proteus spp . ont également été observés comme contribuant à la classification ECUN, tandis que les Bifidobacterium non classés étaient associés à des échantillons non ECUN. Les performances prédictives du modèle proviennent principalement de données sur le microbiome. L'exclusion de caractéristiques cliniques et démographiques (Tableau 1) lors de l’apprentissage a abouti à des valeurs de performance (AUROC = 0,931, PR-AUC = 0,956) qui n'étaient pas significativement différentes de celles du modèle incluant les métadonnées (p ≥ 0,05 pour le test U de Mann-Whitney entre ROC et courbes de précision-spécificité avec et sans métadonnées). Pour évaluer les performances du modèle sur des données extérieures à celles utilisées pour l’entrainement du modèle, les inventeurs ont construit leur propre cohorte avec un plus large éventail de données cliniques et démographiques. 56 échantillons fécaux provenant de 9 nourrissons prématurés ayant développé une ECUN et de 10 nourrissons prématurés sans ECUN inclus dans la cohorte CORTECS ont été analysés. Les cas et les témoins ont été appariés en fonction du sexe, du poids à la naissance, du mode d'accouchement, de l'âge gestationnel et de l'administration d'antibiotiques. Des métadonnées détaillées sur les patients sont fournies dans le tableau 3 suivant. Le profilage taxonomique a été réalisé à l'aide de RiboTaxa et les profils individuels au niveau des espèces ont été conservés. Cela a abouti à l'identification de 509 espèces uniques dans les deux groupes avec une diversité réduite de 349 espèces dans les échantillons ECUN par rapport à 420 espèces dans les échantillons témoins. RiboTaxa a mis en évidence 260 espèces communes entre les deux groupes tandis que 160 et 89 espèces uniques ont été détectées respectivement dans le groupe contrôle et ECUN. Dans cette cohorte particulière, la composition du microbiome intestinal de chaque nouveau-né prématuré subit des changements dynamiques, quelle que soit sa classification phénotypique. Cela peut être attribué aux événements cliniques qui surviennent au cours du traitement en unité de soins intensifs, ainsi qu'aux variations interindividuelles qui façonnent le microbiote. Les espèces de la famille des Enterobacteriaceae (Klebsiella non classifié, Escherichia-Shigella non classifié et Enterobacter spp.) qui sont couramment associées dans la pathogenèse de l’ECUN étaient présents dans les deux groupes et variaient en abondance relative d'un nourrisson à l'autre. En raison d'un nombre insuffisant d'échantillons (56), il n’a pas été possible d’effectuer d’apprentissage d’un modèle sur cet ensemble de données. Par conséquent, les profils d'abondance relative des espèces et leurs métadonnées associées (sexe, poids à la naissance, âge gestationnel, DOL et poids à la naissance) ont été utilisées pour prédire chaque le phénotype de chaque échantillon, en utilisant le réseau neuronal profond optimisé précédemment. Dans l'ensemble, le réseau neuronal profond a donné un TPR-ECUN de 82 % (22 sur 27 échantillons ECUN) et un TNR-non-ECUN de 76 % (22 sur 29 contrôles). Parmi les caractéristiques contribuant aux différentes prédictions, la prédiction des échantillons contrôle était principalement motivée par la présence d'une abondance plus élevée de Lactobacillus spp. dont L. rhamnosus, L. casei et Lactobacillus sp. En revanche, une prédiction ECUN a été faite lorsque l'échantillon présentait une abondance plus élevée d'Enterococcus faecalis, Veillonella ratti, Klebsiella non classé, Enterococcus durans, Enterobacter cancerogenus, Clostridium neonatale ou C. perfringens. Des espèces peu abondantes telles que Staphylococcus non cultivés, Haemophilus parainfluenzae et Staphylococcus epidermidis ont contribué à la prédiction de l’ECUN dans certains échantillons, confirmant que la prédiction du phénotype était influencée par les taxons dominants et peu abondants, qui présentaient une tendance à la co-variation. Cette observation suggère l’existence d’un réseau complexe d’interactions écologiques entre taxons abondants et rares. Contrairement aux caractéristiques microbiennes expliquant l’apprentissage du modèle, la prédiction des échantillons reposait à la fois sur les espèces microbiennes et sur les données cliniques. Un poids à la naissance 31 semaines étaient des caractéristiques des nourrissons non ECUN. Après prédiction du phénotype, une reclassification des échantillons a été effectuée sur la base d'au moins trois échantillons en série provenant des mêmes nourrissons. Cela a conduit à la reclassification de 7 échantillons en 3 contrôles et 4 cas ECUN, parmi lesquels 5 échantillons correspondaient au véritable phénotype, ce qui a entraîné une amélioration du TPR-ECUN (93%) et du TNR-non-ECUN (86%). Cependant, les deux échantillons mal reclassés (un de chaque phénotype appartenant à DI015control et HI125ECUN) impliquaient que tous les échantillons restants de nourrissons avaient également été mal classés par le modèle. Les caractéristiques expliquant la prédiction du contrôle DI015 comme ECUN étaient la forte abondance d'E. faecalis à 50 % et 61 % dans les échantillons collectés aux jours 10 et 13 respectivement. Conclusions Les résultats de cette étude sont fondés sur une recherche systématique et complète avec des critères spécifiques du microbiome intestinal basée sur la métagénomique shotgun, fusionnant deux études indépendantes totalisant 1 562 échantillons de selles prélevés en série et provenant de 160 témoins prématurés (n = 1 305) et de 48 nourrissons ECUN (avant l'apparition de l’ECUN, n =257). Toutes les données de séquençage ont été analysés avec le pipeline RiboTaxa (Chakoory et al., 2022), permettant la reconstruction de gènes ADNr 16S presque complets pour fournir une description précise du microbiote intestinal jusqu'au niveau de l'espèce, y compris l'identification des dominants ( >1%), sous-dominants ( Les différences significatives dans la diversité α et β ont en outre confirmé une composition microbienne distincte et dynamique au sein et entre les groupes de contrôle prématuré et ECUN. Le microbiote intestinal de deux nourrissons peut suivre des voies très différentes à mesure qu’ils progressent d’un état initial riche en microorganismes aérobies vers un état mature plus diversifié et anaérobie. Il est susceptible d'être influencé par des facteurs tels que le sexe, l'âge gestationnel, le poids à la naissance, le jour de vie, le mode d'accouchement, les infections virales, les changements alimentaires et l'administration d'antibiotiques. De nombreuses études ont examiné les selles néonatales pour discerner les modèles de colonisation bactérienne liés à l’ECUN. Ces recherches ont mis en lumière les corrélations entre les caractéristiques du microbiote et l’apparition de l’ECUN, sans toutefois congruence totale dans leurs résultats. Les résultats de la présente étude sont cohérents avec les études précédentes, car les inventeurs ont également mis en évidence la présence d'Enterobacteriaceae non classées, d'Escherichia Shigella non classées, d'Enterobacter non classées et de Klebsiella non classées à des abondances variables dans les échantillons de contrôle et ECUN. Bien que l'abondance de Klebsiella non classée et d'Escherichia Shigella non classée ne diffère pas de manière significative entre les deux groupes, l'abondance relative moyenne d'Enterobacter non classée et d'Entérobactéries non classées était significativement plus élevée dans les échantillons ECUN que dans les témoins prématurés. Ces espèces microbiennes mises en évidence, bien qu'elles fournissent des informations précieuses sur l'identification des facteurs de risque de ECUN, n'ont pas démontré une cohérence suffisante pour établir des caractéristiques définitives qui pourraient servir de cause nécessaire ou suffisante au développement de l’ECUN. Au lieu de cela, l’ECUN est décrite comme un modèle microbien de nature non linéaire, caractérisé par des modifications complexes de la composition et de la diversité du microbiome, y compris des interactions altérées entre les micro-organismes dominants et rares. Olm et al. ont appliqué une classification améliorée par gradient pour distinguer les nourrissons ECUN des témoins à l'aide de données taxonomiques et ont obtenu une précision de 64 % (Olm et al., 2019a). Dans cette étude, les inventeurs ont développé et optimisé un réseau neuronal profond pour prédire le risque d’ECUN avant l'apparition de la maladie à l'aide de profils de microbiome intestinal couplés à cinq métadonnées (sexe, poids à la naissance, âge gestationnel, DOL et mode de naissance), permettant potentiellement des interventions précoces afin de prévenir les pires complications de la maladie. Les 1 355 espèces des 1 562 échantillons ont été utilisées comme caractéristiques d'entrée pour obtenir un modèle de haute performance tout en conservant la variabilité interindividuelle qui est également responsable de la progression structurée dans l'établissement et l'évolution ultérieure du microbiote intestinal néonatal. Pour gérer les données du microbiome de grande dimension avec des échantillons de faible taille lors de la formation du modèle, un réseau neuronal profond a été compilé avec un nombre limité de couches cachées, allant de une à trois, et mis en œuvre une technique de régularisation par abandon des neurones sur les couches cachées. Pendant l'entraînement, certains neurones se voient attribuer au hasard une valeur de zéro, ou « abandonnés », pour empêcher les co-adaptations entre les neurones et réduire ainsi le risque de surapprentissage. De plus, un cadre de validation complet a été mis en œuvre, il isole l'ensemble de tests de l'optimisation des hyperparamètres grâce à un schéma de validation croisée 10 fois afin d'éliminer tout biais potentiel ou facteur de confusion pouvant survenir au cours du processus de comparaison de modèles. Les données souffraient également d'un déséquilibre de classe (1305 échantillons non-ECUN et 257 ECUN). Dans la présente étude, pour résoudre le problème des classes déséquilibrées, les inventeurs ont utilisé plusieurs mesures telles que AUROC, la précision, TPR-ECUN et TNRnon-ECUN pour estimer les performances du modèle afin de signaler tout biais lors de la classification de l'un ou l'autre phénotype. Ainsi, le modèle de réseau neuronal profond selon l’invention a donné de très bonnes performances sur l'ensemble de tests, avec un score AUROC de 0,987 ± 0,01, une précision de 94,6 %, un TPR-ECUN de 90,6 % et un TNRnon-ECUN de 95,8 %. De plus, cette approche a donné naissance à une nouvelle méthode permettant de reclasser des échantillons en série obtenus auprès d'un seul nourrisson dans le groupe phénotypique présentant le plus grand nombre d'échantillons, permettant ainsi la détermination du phénotype final du nourrisson. Ce faisant, les inventeurs ont augmenté le taux d'échantillons correctement classés de 4 % pour les cas ECUN et de 1 % pour les contrôles non affectés, conduisant à 97 % de bonnes classifications (302 sur 313). Dans la présente étude, le réseau neuronal profond optimisé ne s'est pas limité à la prédiction du phénotype de l'hôte, mais a également stratifié les échantillons grâce à la caractérisation des signatures microbiennes spécifiques au phénotype. Les quatre contributeurs les plus importants étaient des Lactobacillus spp. Qui étaient associés à la prédiction de l’échantillon de contrôle. La présente étude a également démontré les avantages de l’utilisation de gènes d’ARNr complets pour caractériser le microbiome intestinal des prématurés avec l’identification de deux nouvelles espèces, à savoir la bactérie_129 (une nouvelle espèce de lactobacille) qui partageait une identité de 96,62 % avec la souche Dwan5 de L. casei. et Enterococcus non classé (un nouveau Enterococcus sp.) qui partageait une identité de 96,53 % avec E. faecalis DSM 713-1. En revanche, Enterobacter non classé, Enterobacteriaceae et Enterococcus faecalis, également identifiés dans des études antérieures ont contribué à la classification ECUN. Le rôle écologique de composants mineurs de la population microbienne intestinale des nourrissons prématurés, tels que Staphylococcus non cultivé, Proteus spp. et des Bifidobacterium non classés ont également été révélés par SHAP. Pour évaluer les performances du réseau neuronal profond sur un tout nouvel ensemble de données provenant d'une autre USIN, les inventeurs ont construit leur propre cohorte de 56 échantillons de selles prélevées en série provenant de 19 nourrissons prématurés. Tous les échantillons ont été caractérisés par capture du gène exprimant l'ARNr 16S par hybridation, technique qui permet une description fine des communautés microbiennes (Gasc et Peyret, 2018). Dans cette cohorte, il a été observé des changements dynamiques dans la composition du microbiome intestinal pour chaque nourrisson prématuré indifférent à la classe phénotypique. Cela pourrait s’expliquer par des variations interindividuelles modulant le microbiote intestinal des nouveau-nés. La prédiction phénotypique (basée sur le modèle précédemment formé) de ces échantillons a abouti à un TPR-ECUN et un TNRnon-ECUN de 82 % et 77 % respectivement, qui ont augmenté à 93 % et 86 % après reclassification des échantillons en série. Grâce à ces résultats, les inventeurs ont réalisé un modèle très performant, capable de classer efficacement des échantillons provenant de différentes zones et pratiques de l'USIN malgré l'hétérogénéité du microbiome entre les cohortes. Outre les échantillons, une collection détaillée de données cliniques, notamment le régime alimentaire, les antibiotiques, la présence d'autres pathologies, les stades de Bell d’ECUN ou tout comportement incohérent de l'enfant ont également été notés. Le réseau neuronal profond a prédit avec succès les échantillons phénotypiques liés aux différents stades l’ECUN (1a et 2a) dans la cohorte française, soulignant la capacité exceptionnelle du réseau neuronal profond à distinguer les interactions microbiennes complexes entre les échantillons non-ECUN et ECUN. Par conséquent, le procédé selon l’invention démontre que la prédiction du phénotype est déterminée par les taxons dominants et peu abondants qui ont tendance à covarier. Cette observation suggère l'existence d'un réseau complexe de relations écologiques qui expliquent comment les espèces mineures contribuent à des effets étendus sur la communauté microbienne globale. En résumé, la présente étude a remis en question le concept selon lequel un ou plusieurs agents pathogènes seraient à l’origine d’une seule maladie. L'utilisation de gènes exprimant l’'ARNr SSU presque complets à l'aide de RiboTaxa pour caractériser des échantillons de selles chez des prématurés a confirmé une composition microbienne distincte et dynamique au sein et entre les groupes de contrôle prématuré et les groupes ECUN. Les données montrent la capacité du modèle à distinguer les interactions microbiennes interindividuelles complexes entre les échantillons non-ECUN et ECUN, fournissant ainsi des informations de haut niveau sur les changements dans la structure globale de la communauté intestinale du nouveau-né. Parmi les caractéristiques contribuant aux différentes prédictions, la prédiction des échantillons ECUN était principalement motivée par la présence d'une abondance plus élevée d'Enterococcus faecalis , Veillonella ratti, Klebsiella non classé, Enterococcus durans, Enterobacter cancerogenus, Clostridium neonatale ou C. perfringens. Ces résultats confirment que le risque d’ECUN n’était pas déterminé par une seule espèce ou un seul groupe d’espèces mais par la variabilité interindividuelle de la composition microbienne intestinale. Outre les espèces microbiennes, les données cliniques et démographiques influencent la prédiction des échantillons. Références bibliographiques Chakoory O. et al . “ RiboTaxa: combined approaches for rRNA genes taxonomic resolution down to the species level from metagenomics data revealing novelties .” NAR Genomics Bioinformatics. 4, lqac070 (2022). - D’Angelo, et al. 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Procédé in vitro de diagnostic prédictif d’un état ou d’une pathologie, à partir d’un échantillon biologique prélevé dans l’appareil digestif et/ou dans les excrétions d’un sujet, ledit procédé comprenant les étapes suivantes : a) fourniture de l’acide nucléique issu d’une pluralité de microorganismes présents dans ledit échantillon biologique, b) détermination par séquençage de la séquence nucléotidique d’au moins un acide nucléique choisi parmi : un fragment de gène exprimant l’ARNr 16S, un fragment de gène exprimant l’ARNr 18S, un fragment d’ARNr 16S et un fragment d’ARNr 18S, d’une pluralité de microorganismes, pour générer une pluralité de séquences nucléotidiques, c) organisation d’une pluralité de séquences nucléotidiques déterminées lors de l’étape b) pour reconstruire la séquence nucléotidique d’au moins un fragment de gène exprimant l’ARNr 16S, un fragment de gène exprimant l’ARNr 18S, un fragment d’ARNr 16S et un fragment d’ARNr 18S d’une pluralité de microorganismes, d) à partir des résultats de l’étape c), détermination de l’identité, de la classification taxonomique, et de l’abondance relative d’une pluralité de microorganismes présents dans ledit échantillon, et e) à partir des caractéristiques déterminées lors de l’étape d), détermination, par un modèle de classification préalablement entraîné, du diagnostic prédictif d’un état ou d’une pathologie. Procédé selon la revendication 1, dans lequel ledit sujet est un nouveau-né humain. Procédé selon l’une quelconque des revendications précédentes, dans lequel ladite pathologie est une pathologie intestinale. Procédé selon l’une quelconque des revendications précédentes, dans lequel ladite pathologie est l’Entérocolite ulcéro-nécrosante (ECUN) du nourrisson. Procédé selon l’une quelconque des revendications précédentes, dans lequel l’étape e) est réalisée à partir des caractéristiques déterminées lors de l’étape d) et d’au moins une donnée clinique caractéristique du sujet. Procédé selon la revendication 5, dans lequel ladite au moins une donnée clinique est choisie parmi : l’âge en nombre de jours depuis la naissance, le poids à la naissance, l’âge gestationnel, le mode de naissance, le genre, l’ethnie de la mère, l’alimentation de la mère, le résultat du dosage de composants ou marqueurs sanguins, l’administration d’un traitement médical, la présence d’au moins une autre pathologie ou une combinaison de plusieurs de ces caractéristiques. Procédé selon l’une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que le modèle de classification comprend : - un réseau de neurones préalablement entrainé, en particulier lors d’un apprentissage supervisé, - un algorithme d’apprentissage automatique, et - un jeu de données d’apprentissage. Procédé selon l’une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce qu’il comprend en outre une étape de détermination d’au moins un premier profil d’une pluralité de microorganismes, ledit premier profil étant caractéristique d’un diagnostic prédictif de la présence d’un état ou d’une pathologie de l’appareil digestif ou d’une pathologie extra-digestive définie. Procédé selon la revendication précédente, caractérisé en ce qu’il comprend en outre une étape de détermination d’au moins un deuxième profil d’une pluralité de microorganismes, ledit deuxième profil étant caractéristique d’un diagnostic prédictif de l’absence d’un état ou d’une pathologie de l’appareil digestif ou d’une pathologie extra-digestive définie. Procédé selon l’une quelconque des revendications précédentes, dans lequel la détermination de l’identité, de la classification taxonomique, et de l’abondance relative d’une pluralité de microorganismes présents dans ledit échantillon, est mise en œuvre à l’aide d’un outil informatique de détermination des structures de communauté microbienne. Utilisation d’un outil informatique de détermination des structures de communauté microbienne pour, à partir d’une séquence nucléotidique d’au moins un fragment de gène exprimant l’ARNr 16S, un fragment de gène exprimant l’ARNr 18S, un fragment d’ARNr 16S et un fragment d’ARNr 18S d’une pluralité de microorganismes, reconstruite par organisation d’une pluralité de séquences nucléotidiques, la pluralité de séquence de nucléotides étant générée à partir du résultat d’un séquençage de la séquence nucléotidique d’au moins un acide nucléique choisi parmi : un fragment de gène exprimant l’ARNr 16S, un fragment de gène exprimant l’ARNr 18S, un fragment d’ARNr 16S et un fragment d’ARNr 18S, d’une pluralité de microorganismes : déterminer une identité des microorganismes de la communauté microbienne ; déterminer une abondance relative des microorganismes de la communauté microbienne ; et déterminer un diagnostic prédictif d’un état ou d’une pathologie en fonction de l’identité et de l’abondance relative déterminées des microorganismes.