Brevet FR3164724A1 — publié le 20260123

L’invention concerne des cellules gustatives canines immortalisées et leurs cellules dérivées, ainsi que des procédés in vitro mettant en œuvre lesdites cellules. Figure 10 Immortalisation des cellules gustatives canines DOMAINE DE L’INVENTION La présente invention concerne des cellules gustatives canines nouvellement identifiées et immortalisées, lesquelles étant les cellules déposées sous le numéro CNCM I-6070 ou des cellules gustatives dérivées de celles-ci. L’invention concerne également l’utilisation de ces nouvelles lignées cellulaires gustatives canines dans la recherche, en tant que médicament ou encore dans des procédés in vitro de criblage de biomolécules impliquées dans la signalisation gustatives canines. En outre, l’invention concerne aussi des procédés in vitro pour analyser une réponse de signalisation de cellules gustatives canines à des molécules à tester ou des procédés in vitro pour identifier des molécules d’intérêt en vue de moduler les réponses de signalisation de cellules gustatives canines. ETAT DE LA TECHNIQUE Le goût est l'une des expériences sensorielles les plus fondamentales de la vie quotidienne de nombreuses espèces du règne animal, influençant l’appréciation des aliments et la relation à la nourriture. Le goût considéré en tant que modalité sensorielle permet notamment d'identifier et de consommer des nutriments tout en évitant les toxines et les matières indigestes. Parmi les espèces pour lesquelles cette modalité est la plus développée, le goût est souvent décrit comme une combinaison complexe de sensations perçues par les papilles gustatives, allant au-delà de la simple détection des saveurs de base que sont le sucré, le salé, l'acide, l'amer et l'umami (chacune apportant sa propre qualité distinctive aux aliments et plats consommés). En effet, le goût est également influencé par d’autres facteurs, tels que le gras (considéré par certains chercheurs comme la 6 e modalité gustative), le métallique ou encore la texture, la température, l'arôme des aliments. L’étude de la perception du goût, des modalités gustatives et des mécanismes cellulaires impliqués dans la signalisation gustative est essentielle pour au moins les raisons suivantes : la compréhension de l'alimentation et de la nutrition, l’identification des composés alimentaires, l’exploration de la diversité des saveurs et le développement d’applications médicales et industrielles. Concernant précisément cette dernière raison, une meilleure compréhension des mécanismes de signalisation gustative peut notamment permettre d’envisager le développement de thérapies pour les troubles liés à la détection du goût et de l'alimentation. De plus, dans l'industrie alimentaire, la connaissance des préférences gustatives des consommateurs peut être utilisée pour développer de nouveaux produits alimentaires et améliorer les formulations existantes. L’étude de certains systèmes gustatifs, tel que le système gustatif humain, a déjà fait l’objet de nombreuses recherches scientifiques. A l’inverse, les mécanismes impliqués lors de la perception orosensorielle des différentes modalités gustatives canines ne sont, à ce jour, pas décrits de façon précise dans la littérature scientifique. Par conséquent, le système gustatif canin demeure actuellement très peu connu, et ce, malgré le fait que certaines pathologies afférentes (telle que l’obésité) soient particulièrement prégnantes. En effet, en France, environ 39% des seraient en situation d’obésité et cette proportion augmente même jusqu’à 50% aux Etats-Unis et au Royaume-Uni. La caractérisation du système gustatif canin est donc essentielle pour, in fine , développer des médicaments et/ou des produits alimentaires adaptés à la situation physiologique ou pathophysiologique du chien. Cependant, il n’existe actuellement aucune lignée cellulaire gustative canine connue à ce jour, rendant ainsi particulièrement difficile l’étude du système gustatif canin et le développement de nouvelles molécules. En effet, les cellules gustatives, à l’instar de toute autre cellule, deviennent sénescentes et peuvent mourir plus l’âge de l’animal augmente. La mise à mort de ces animaux devient alors nécessaire afin de pouvoir procéder aux expériences nécessaires en vue de caractériser le système gustatif canin, ce qui pour des raisons éthiques évidentes n’est pas acceptable. En outre, dans le cadre du développement de nouvelles molécules (médicamenteuse ou alimentaire), les phases de test préliminaires et nécessaires à l’obtention d’autorisation de mise sur le marché par les organismes agréés impliquent des risques important d’intoxication pour les chiens sur lesquels ces nouvelles molécules sont testées. Là-encore, de telles pratiques contraires à l’éthique, nécessitent d’être remplacées par des alternatives plus respectueuses de la santé des chiens concernés. Il existe donc, à l’heure actuelle, un réel besoin d’identifier et développer des alternatives éthiques permettant la caractérisation du système gustatif canin en vue notamment de développer des médicaments et/ou des produits alimentaires adaptés. DESCRIPTION DE L’INVENTION Les inventeurs ont mis au point, de manière inattendue et surprenante, une lignée de cellules gustatives canines immortalisées, issue de papilles caliciformes de la langue de chien. Un objectif de la présente invention est de permettre l’étude et la caractérisation du système gustatif canin en vue de permettre le développement des médicaments et/ou des produits alimentaires adaptés. Ainsi, la présente invention concerne des cellules gustatives canines, lesdites cellules étant les cellules déposées sous le numéro CNCM I-6070 ou des cellules gustatives canines dérivées des cellules déposées sous le numéro CNCM I-6070. La présente invention présente donc divers avantages, notamment : - permettre de cultiver à long terme des cellules gustatives ayant une forte capacité de prolifération et ainsi proposer des lignées cellulaires continues qui ressemblent au phénotype mature des cellules gustatives canines responsables de la perception du goût in vivo , - permettre l’étude reproductible, sur le long terme, des mécanismes et réponses de signalisation complexes impliqués dans le système gustatif canin, et ce, d’une manière éthique et plus respectueuse de la santé des animaux concernés, - permettre le développement de molécules spécifiques, pouvant être de type agonistes ou antagonistes des récepteurs gustatifs, pour le traitement de pathologies ciblées, par exemple : l’obésité, le diabète, l’inflammation, le syndrome métabolique, etc. , - permettre d’approfondir l’étude des mécanismes impliqués dans la perception de différentes modalités gustatives canine en modifiant génétiquement ces cellules (surexpression ou expression conditionnelle d’un gène), - permettre la réalisation d’études de toxicité et/ou génotoxicité de nouvelles molécules ou médicaments qui ne pourraient pas être réalisées pour des raisons d’éthiques chez le chien. Dans le cadre de l’invention, l’expression « cellules gustatives canines » fait référence aux cellules sensorielles capables de détecter au moins une des molécules impliquées dans la signalisation gustative canine. De telles cellules résident dans les bourgeons gustatifs présents dans les différentes papilles gustatives (caliciformes, fongiformes et foliées) de la langue des chiens et sont des cellules du type I, II ou III. Les cellules de type I correspondent principalement aux cellules de soutien au sein des bourgeons gustatifs. Elles entourent et protègent les autres types de cellules gustatives. En plus de leur rôle de soutien, les cellules de type I participent activement à la dégradation des neurotransmetteurs libérés dans le bourgeon gustatif. Un rôle crucial des cellules de type I est leur implication dans la détection des goûts salés. Cette fonction est médiée par des canaux sodiques épithéliaux (ENaC) présents sur leur membrane, qui permettent l'entrée des ions sodium (Na+) lorsque des substances salées sont consommées. Cette entrée d'ions sodium conduit à une dépolarisation de la membrane cellulaire et à la transmission du signal gustatif aux neurones afférents. Les cellules de type II sont connues, notamment chez l’homme, pour être spécialisées dans la détection des goûts sucré, amer et umami, ainsi que la détection du gras. Elles expriment des récepteurs spécifiques couplés aux protéines G (GPCR) pour chaque type de goût qu'elles détectent. Contrairement aux cellules de type III, les cellules de type II ne forment pas de synapses classiques avec les fibres nerveuses. Au lieu de cela, elles libèrent des neurotransmetteurs, notamment l'adénosine triphosphate (ATP), qui activent les neurones gustatifs voisins en se liant à leurs récepteurs purinergiques. Cette libération d'ATP permet la transmission du signal gustatif de manière paracrine aux neurones sensoriels. Les cellules de type III sont principalement impliquées dans la détection des goûts acides. Elles peuvent également contribuer à la détection des goûts salés à des concentrations plus élevées. Les cellules de type III se distinguent par leur capacité à former des synapses classiques avec les fibres nerveuses gustatives. Elles libèrent des neurotransmetteurs tels que la sérotonine, qui activent directement les neurones gustatifs en se liant à leurs récepteurs postsynaptiques. Cette synapse directe permet une transmission rapide et efficace du signal gustatif au système nerveux central. Dans le cadre de l’invention, l’expression « cellules gustatives canines déposées sous le numéro d’accession de dépôt CNCM I-6070 » fait référence à toute cellule sensorielle capable de détecter au moins une des molécules impliquées dans la signalisation gustative canine, présente dans les cellules déposées auprès de la Collection Nationale de Cultures de Microorganismes (CNCM) de sous le numéro d’accession de dépôt CNCM I-6070. Dans le cadre de l’invention, l’expression « cellules gustatives canines dérivées des cellules déposées sous le numéro CNCM I-6070 » fait référence à toute cellule sensorielle capable de détecter au moins une des molécules impliquées dans la signalisation gustative canine qui est dérivée de l’une des cellules déposées sous le numéro CNCM I-6070. Dans le cadre de l’invention, l’expression « les cellules gustatives canines sont immortalisées » désigne un procédé par lequel les cellules gustatives isolées des bourgeons gustatifs de chiens sont modifiées pour acquérir la capacité de se diviser de manière indéfinie en culture. Ce processus inclut l'isolement des cellules gustatives, leur transfection avec des vecteurs géniques incorporant des gènes d'immortalisation et la sélection subséquente des cellules transfectées. Les cellules ainsi sélectionnées sont clonées pour obtenir des lignées cellulaires stables exprimant les gènes d'immortalisation. Ces lignées cellulaires immortalisées conservent les caractéristiques morphologiques et fonctionnelles des cellules gustatives primaires, incluant l'expression des marqueurs spécifiques des cellules gustatives et la capacité de répondre aux stimuli gustatifs. Les cellules gustatives canines de la présente invention sont des cellules immortalisées et capables de prolifération, c'est-à-dire qu'elles sont des cellules proliférantes (pouvant également désignées comme des "cellules auto-renouvelantes"). En conséquence, les cellules de la présente invention sont capables de passer par de nombreux cycles de division cellulaire (aussi appelés ci-après « génération ») et peuvent également être qualifié de "cellules proliférantes de manière stable". De préférence, les cellules gustatives canines proliférantes de la présente invention conservent leur phénotype en culture pendant au moins 10 générations, incluant ainsi : au moins 11 génération, au moins 12 générations, au moins 13 générations, au moins 14 générations, au moins 15 générations, au moins 16 générations, au moins 17 générations, au moins 18 générations, au moins 19 générations, au moins 20 générations, au moins 21 générations, au moins 22 générations, au moins 23 générations, au moins 24 générations, et de préférence au moins 25 générations. Plus préférablement, les cellules gustatives canines proliférantes de la présente invention conservent leur phénotype en culture pendant au moins 26 générations, au moins 27 générations, au moins 28 générations, au moins 29 générations et encore plus préférablement au moins 30 générations, au moins 35 générations, au moins 40 générations, au moins 45 générations, au moins 50 générations, au moins 55 générations, au moins 60 générations, au moins 65 générations, au moins 70 générations, au moins 75 générations, au moins 100 générations et encore plus préférablement au moins 150 générations. Avantageusement, les cellules gustatives canines proliférantes de la présente invention conservent leur phénotype en culture pour une durée illimitée. Dans le cadre de l’invention, l’expression « conservent leur phénotype en culture » se réfère à la capacité des cellules gustatives canines à maintenir, sur une période donnée, leurs caractéristiques morphologiques, fonctionnelles et moléculaires lorsqu'elles sont cultivées en laboratoire. Ces caractéristiques incluent l'expression de marqueurs spécifiques des cellules gustatives, tels que les récepteurs gustatifs, ainsi que la capacité à répondre aux stimuli gustatifs de manière similaire aux cellules gustatives primaires. Dans le cadre de l’invention, l’expression « réponse de signalisation » fait référence à la manière dont les cellules interprètent et répondent à des signaux provenant de leur environnement ou de l'intérieur de leur propre système. Dans les organismes multicellulaires, les cellules communiquent entre elles et avec leur environnement à travers des signaux chimiques, électriques ou mécaniques. Ces signaux peuvent être produits par d'autres cellules, des molécules libérées dans le milieu extracellulaire, ou même des changements physiques dans l'environnement cellulaire. Une fois qu'une cellule reçoit un signal, elle peut y répondre de différentes manières, notamment par des changements dans son activité métabolique, sa croissance, sa division, sa migration, ou par la production de molécules de signalisation supplémentaires. La réponse de signalisation peut être rapide et transitoire, ou elle peut déclencher des changements durables dans le comportement ou la fonction de la cellule. Dans le cadre de l'invention, l'expression « une réponse sensiblement identique » fait référence au type de réponse plutôt qu'à l'intensité de la réponse, par exemple, l’augmentation du taux de calcium libre intracellulaire qui est considérée comme l’événement précoce de l’activation d’un récepteur membranaire. Par conséquent, lorsqu’une molécule sapide connue provoque, par exemple, une augmentation des niveaux de calcium libre intracellulaire, une réponse sensiblement identique est obtenue lorsque le composé testé provoque également une augmentation des niveaux de calcium intracellulaire, indépendamment du fait que d'autres effets soient également provoqués. L'intensité du signal, par exemple l'augmentation relative du taux de calcium intracellulaire, ne doit pas nécessairement être identique. Il est néanmoins préférable que l'intensité du signal soit du même ordre de grandeur, c'est-à-dire qu'elle se situe à moins de 20 % de l'intensité du signal obtenu en utilisant la molécule connue, de préférence à moins de 10 %, et encore plus préférablement à moins de 5 % de l'intensité du signal obtenu en utilisant la molécule connue. Lorsque le type de la réponse de signalisation et l'intensité du signal sont les mêmes que lors de l'utilisation de la molécule connue, la réponse de signalisation est considérée comme identique. Dans le cadre de l’invention, l’expression « un activateur d’une réponse de signalisation de cellules gustatives canines » désigne toute substance ou agent (par exemple un agoniste) capable de déclencher la cascade de signaux intracellulaires au sein des cellules gustatives canines en réponse à un stimulus gustatif. Cet activateur interagit avec les récepteurs gustatifs spécifiques, couplés à la signalisation pour initier ou amplifier une réponse de signalisation, entraînant l'activation cellulaire gustative, la modulation de l'expression génique, et des changements physiologiques conduisant à la perception du goût. Les activateurs peuvent inclure des composés chimiques, des peptides, des protéines, des nutriments, des extraits naturels ou des analogues (par exemple des agonistes) synthétiques. Dans le cadre de l'invention, l'expression « un modulateur d’une réponse de signalisation de cellules gustatives canines » désigne toute substance ou agent capable d'altérer, de réguler ou d’amplifier la cascade de signaux intracellulaires au sein des cellules gustatives canines en réponse à un stimulus gustatif. Ce modulateur peut interagir avec les récepteurs gustatifs, les protéines (notamment les glycoprotéines) de signalisation ou d'autres composants des voies de signalisation pour ajuster l'intensité, la durée ou la nature de la réponse de signalisation. Les modulateurs peuvent inclure des composés chimiques, des peptides, des protéines, des nutriments, des extraits naturels des plantes ou des analogues synthétiques. Par conséquent, le modulateur n'est pas nécessairement une molécule directement impliquée dans la signalisation gustative, mais il interagit avec un domaine protéique sous-jasant du récepteur impliqué dans la signalisation gustative, modifiant ainsi son effet sur la cellule gustative. On parle alors de modulation allostérique positive ou négative. Cette interaction de type ligand-récepteur peut, par exemple, conduire à une inhibition d'une voie de signalisation gustative particulière ou à une amplification (c'est-à-dire une augmentation de la signalisation) d'une voie de signalisation spécifique. De plus, cette interaction peut entraîner un retard dans l'apparition de la réponse de signalisation ou une réponse de signalisation prolongée ou raccourcie, c'est-à-dire une réponse d'une durée plus longue ou plus courte par rapport au signal déclenché par la molécule connue impliquée dans la signalisation gustative en l'absence du composé testé. Dans le cadre de l’invention, l’expression « biomolécule cellulaire impliquée dans la signalisation gustative canine » désigne toute molécule produite par les cellules gustatives canines, jouant un rôle essentiel dans la détection et la transmission des signaux gustatifs, de la langue vers le cerveau. Ces biomolécules incluent, sans s'y limiter, les récepteurs gustatifs, les protéines de signalisation intracellulaire, les enzymes, les ions et les neurotransmetteurs. De préférence, la présente invention a pour objet des cellules gustatives canines présentant les caractéristiques techniques suivantes, prises seules ou en combinaison : - les cellules gustatives canines sont immortalisées et conservent leur phénotype en culture pendant au moins 10 générations, - les cellules gustatives dérivées des cellules déposées sous le numéro CNCM I-6070 sont des cellules génétiquement modifiées issues des cellules déposées sous le numéro CNCM I-6070, - les cellules génétiquement modifiées comprennent dans leur génome au moins une molécule d’acide nucléique ajoutée et choisie dans le groupe constitué d'une molécule d'acide nucléique codant pour un récepteur gustatif protéique, d'une molécule d'acide nucléique codant pour un récepteur hormonal, d'une molécule d'acide nucléique codant pour une molécule impliquée dans la signalisation gustative canine, d'une molécule d'acide nucléique codant pour un composé favorisant l'anti-sénescence et l'immortalisation, et d'une molécule d'acide nucléique codant pour un inhibiteur. L’invention a également pour objet un procédé d’analyse in vitro d’une réponse de signalisation de cellules gustatives canines à une molécule impliquée dans la signalisation gustative canine, le procédé comprenant les étapes suivantes : a) la mise en contact des cellules gustatives canines selon l’une quelconque des variantes précédentes et de ladite molécule impliquée dans la signalisation gustative, et b) la détermination de la réponse de signalisation déclenchée par ladite molécule dans les cellules gustatives canines. L’invention a également pour objet un procédé d’identification in vitro d’un activateur d’une réponse de signalisation de cellules gustatives canines, le procédé comprenant les étapes suivantes : a) la mise en contact des cellules gustatives canines selon l’une quelconque des variantes précédentes avec une molécule à tester, b) la mesure de la réponse de signalisation déclenchée, dans les cellules, à la suite de la mise en contact selon l’étape a), et c) la comparaison entre la réponse de signalisation mesurée à l’étape b) et une réponse de signalisation connue déclenchée dans lesdites cellules gustatives canines selon l’une quelconque des variantes précédentes par une ou plusieurs molécules connues, dans lequel une réponse de signalisation identique ou sensiblement identique entre les réponses de signalisation comparées à l’étape c) indique que la molécule testée est un activateur de la réponse de signalisation de cellules gustatives canines. L’invention a également pour objet un procédé d’identification in vitro d’un modulateur d’une réponse de signalisation de cellules gustatives canines, le procédé comprenant les étapes suivantes : a) la mise en contact des cellules gustatives canines selon l’une quelconque des variantes précédentes, d’une molécule connue et déclenchant une réponse de signalisation connue dans lesdites cellules gustatives canines et d’une molécule à tester, b) la mesure de la réponse de signalisation déclenchée, dans les cellules, à la suite de la mise en contact selon l’étape a), c) la comparaison de la réponse de signalisation mesurée à l’étape b) avec la réponse de signalisation connue, déclenchée par ladite molécule connue, dans lequel une différence entre les réponses de signalisation comparées à l’étape c) indique que la molécule testée est un modulateur de la réponse de signalisation de cellules gustatives canines. Avantageusement, pour les procédés selon l’invention, tels que précédemment décrits, la réponse de signalisation est choisie parmi : - la signalisation du calcium intracellulaire, - le potentiel membranaire cellulaire, - la libération de neurotransmetteurs et/ou d’hormones, - la phosphorylation de cascade de protéines kinases, telles que les MAP kinases, protéines kinase-C, préférentiellement en aval de l’activation d’un récepteur gustatif. L’invention a également pour objet un procédé d’identification in vitro d’une biomolécule cellulaire impliquée dans la signalisation gustative canine, le procédé comprenant l’étape de détection de ladite biomolécule cellulaire au sein des cellules gustatives canines selon l’une quelconque des variantes précédentes. Avantageusement, l’étape de détection de ladite biomolécule cellulaire est réalisée par immunofluorescence, par western-blot ou par transgénèse (en utilisant un gène rapporteur). L’invention a également pour objet un kit comprenant les cellules gustatives canines selon l’une quelconque des variantes précédentes. L’invention a également pour objet l’utilisation des cellules canines gustatives selon l’une quelconque des variantes précédentes pour utilisation comme médicament. L’invention a également pour objet l’utilisation des cellules canines gustatives selon l’une quelconque des variantes précédentes pour le criblage in vitro de molécule impliquée dans la signalisation gustative canine. FIG. 1 : représente une schématisation du protocole d’isolement des papilles gustatives. (1-3) Les papilles caliciformes sont dénombrées puis les langues sont maintenues dans du Tyrode complet contenant du calcium pendant 15 minutes. (4) Un mélange enzymatique d’élastase et de dispase est injecté sous l’épithélium gustatif puis les langues sont incubées dans du Tyrode complet sans calcium (5-6). (7-8a) Chaque papille est prélevée puis est cryoconservée dans de l’azote liquide. Les papilles destinées à l’études histologiques sont maintenues dans du formol (2) et celles destinées à l’isolement de cellules sont conservées dans un tube de 1.5 mL contenant du DMEM avec glucose complet (8b). FIG. 2 : représente un schéma de la préparation des lames d’immunofluorescence sur tissus. FIG. 3 : représente un schéma du protocole d’isolement des cellules gustatives canines et sublinguales. (1-3) Les papilles sont centrifugées afin de retirer le milieu de culture et sont maintenues dans un mélange enzymatique dont la digestion est facilitée par l’utilisation d’une paire de ciseaux. (4-5) Après incubation, les cellules ont sédimenté et le surnageant est transféré dans un nouveau pour être centrifugé. (6-7) Ensuite, le culot est repris dans du milieu de culture puis est incubé alors que le surnageant est remis dans l’ancien tube afin de poursuivre la digestion des tissus qui ont sédimenté. Cette dernière étape est répétée 2 à 3 fois et les tubes incubés sont filtrés et rassemblés dans un tube de 10 mL pour être centrifugés. (8) Le surnageant est éliminé et le culot repris dans du DMEM avec glucose complet contenant de la Primocin. (9) Les cellules sont ensemencées dans une plaque 12 ou 16 puits. FIG. 4 : représente une schématisation du processus de décongélation des cellules gustatives canines. (1a) les cellules sont décongelées dans un tube de 10 mL de DMEM avec glucose complet. (2-4) Elles sont ensuite centrifugées, le surnageant est jeté et le culot cellulaire repris dans 6 mL de DMEM. (5-7) Les cellules sont réparties dans 3 flasques T25 (2 mL/flasque) et incubées à 37°C/5%CO2. Dans le cas où le besoin en cellules est urgent, la décongélation peut se faire dans une seule flasque T25. Les cellules seront confluentes 24 à 48 heures après ensemencement. FIG. 5 : représente un schéma du déroulement d’une dose-réponse d’acide linoléique par étude de la libération du calcium intracellulaire dans des dTBC. (1-7) étapes principales de l’expérience en prenant comme exemple 50 et 100 µM d’acide linoléique. FIG. 6 : représente une schématisation du déroulement de la mesure de la libération de calcium intracellulaire dans des cellules gustatives canines à la suite d’une stimulation par de l’acide linoléique en présence d’inhibiteurs. Le tableau de gauche représente les 3 premières colonnes d’une plaque 24 puits. La frise de droite représente la chronologie des incubations et injections pour une colonne (LA : acide linoléique ; SSO : Sulfo-N-succinimidyl Oleate ; AH : AH-7614). FIG. 7 : représente un exemple de plan de plaque pour une stimulation des dTBC par 4 concentrations différentes d’acide linoléique. Les cellules sont stimulées de façon alternée par 50 et 100 (Plaque 1 à gauche) et par 200 et 400 µM (plaque 2 à droite) d’acide linoléique. FIG. 8 : représente un programme de qPCR utilisé selon les recommandations BioRad sur un système de PCR en temps réel QuantStudio 3, Applied Biosystems. La qPCR est effectuée dans un volume final de 20 µL pour une durée totale de 56 minutes. FIG. 9 : représente un graphique démontrant que le poids et l’âge semblent influencer le nombre de papilles chez les femelles beagles. Le test de corrélation de Spearman comparant le poids et l’âge avec le nombre de papilles caliciformes a été réalisé en utilisant GraphPad Prism version 9.0.0. FIG. 10 : représente la morphologie et identification des différentes papilles gustatives sur la langue de beagle. (A) est une représentation schématique de la langue de beagle. La photo (B) a été prise par un appareil photo et les images (C) et (D) par une loupe binoculaire. Les papilles caliciformes sont encerclées en noir (B) et les fongiformes en pointillés noirs (B) et (D). FIG. 11 : représente la différence entre une papille caliciforme simple et complexe. La photo de la papille simple (A) et de la papille complexe (B) a été prise par une loupe binoculaire. Le sillon primaire est indiqué par de pointillés. FIG. 12 : représente l’identification des papilles caliciformes et des bourgeons du goût par coloration HE. L’acquisition de la papille entière, simple (A) et complexe (B) a été effectuée en utilisant le microscope ZEISS Primovert couplé à une caméra Moticam (Moticam 1080 HDMI & USB) à un grossissement x2. Les bourgeons ont été observés en utilisant le microscope Zeiss Axio Image M2. Les images ont été traitées par le logiciel Zen 3. Les bourgeons sont encerclés par des pointillés à différentes résolutions x100 (C), x200 (D), x630 (E). Les flèches fines indiquent le fossé primaire et les épaisses, les sillons secondaires. FIG. 13 : représente la colocalisation des cellules de type I et III avec les cellules gustatives canines réceptrices dans les papilles caliciformes par immunofluorescence. Les noyaux ont été colorés avec de l’hoechst (A-C). Les zones en pointillé délimitent les bourgeons. Les images ont été prises en utilisant le microscope Zeiss Axio Imager MZ à un grossissement x400 et sont traitées par le logiciel Zen 3.8. FIG. 14 : représente des graphiques démontrant que les cellules gustatives et présynaptiques sont prédominantes dans les papilles caliciformes. L’expression des ARNm des marqueurs de type I (GLAST et ENTPD2) de type II (GNAT3, PLCB2, TRPM5) et de type III (SNAP25 et PKD2L1) a été mesurée par RT-qPCR dans les papilles caliciformes, fongiformes en comparaison à l’épithélium sublingual. Les résultats sont normalisés par la bêta actine (* (p FIG. 15 : représente l’identification des récepteurs gustatifs lipidiques et glutamiques dans les papilles caliciformes de beagles par immunofluorescence. Les récepteurs lipidiques (A), T1R1 et (B) T1R3, ainsi que le contrôle négatif IgG (B) ont été colorés. Les zones en pointillé délimitent les bourgeons. Les images ont été prises en utilisant le microscope Zeiss Axio Imager MZ à un grossissement x400 et sont traitées par le logiciel Zen 3.8. FIG. 16 : représente la colocalisation des récepteurs gustatifs lipidiques avec GNAT3. La sous-unité alpha de la gustducine est marquée d’une couleur tandis que CD36, GPR120 et GPR84 sont marqués d’une couleur différente. Les zones en pointillé délimitent les bourgeons. Les images ont été prises en utilisant le microscope Zeiss Axio Imager MZ à un grossissement x400 et sont traitées par le logiciel Zen 3.8. FIG. 17 : représente la colocalisation de GNAT3 et CD36 dans une papille caliciforme complexe. Un « tilescan » de la papille en grossissement x 10 est situé au centre de la figure. Les carrés délimitent les zones où les photos des bourgeons à gauche et de droite ont été prises en grossissement x 400. (A-E) correspondent au sillon secondaire de la structure complexe. Les images ont été prises en utilisant le microscope Zeiss Axio Imager MZ et sont traitées par le logiciel Zen 3.8. FIG. 18 : représente la colocalisation de CD36 avec GNAT3 et GPR120 en périphérie des papilles caliciformes. Colocalisation au niveau basal (A) médian (B)(D) et apical (E-G) d’un sillon primaire de papille caliciforme. Les pointillés délimitent les zones de fluorescence d’intérêt. Les images ont été prises en utilisant le microscope Zeiss Axio Imager MZ à un grossissement x100 (E) x200 (F) et x400 (A-E et G) et sont traitées par le logiciel Zen 3.8. FIG. 19 : représente des graphiques démontrant l’expression des ARNm des récepteurs lipidiques et des T1Rs. Celle-ci a été mesurée par RT-qPCR dans les papilles caliciformes, fongiformes en comparaison à l’épithélium sublingual. Les résultats sont normalisés par la bêta actine (* (p FIG. 20 : représente la Localisation de T1R1 en dehors de l’épithélium gustatif. (A) « Tilescan » de la lamina propria d’une papille caliciforme en grossissement x100. Les pointillés délimitent la zone de grossissement x200 (B). Les images ont été prises en utilisant le microscope Zeiss Axio Imager MZ et sont traitées par le logiciel Zen 3.8. FIG. 21 : représente des cellules primaires gustatives canines qui expriment CD36 et GNAT3 par immunofluorescence. Monomarquage de CD36 et de GNAT3 (A) et double marquage (B). Les images ont été prises en utilisant le microscope Zeiss Axio Imager MZ à un grossissement x200 et sont traitées par le logiciel Zen 3.8. FIG. 22 : représente des graphiques et images obtenues par fluorescence démontrant l’efficacité de l’immortalisation des cellules gustatives canines. Expression des ARNm des marqueurs d’immortalisation et musculaires par RT-qPCR dans les cellules gustatives et sublinguales en comparaison au tissu musculaire (TM). Les résultats sont normalisés par la bêta actine (A) (* (p FIG. 23 : représente la colocalisation des différents marqueurs cellulaires (Glial-like et présynaptiques) avec GNAT3. Monomarquage de TRPM5 dans les cellules immortalisées. Les échelles sont de 50 µm (B). Les images ont été prises en utilisant le microscope Zeiss Axio Imager MZ à un grossissement x200 et sont traitées par le logiciel Zen 3.8 FIG. 24 : représente la localisation des récepteurs gustatifs lipidiques et glutamiques dans les cellules gustatives canines dTBC par immunofluorescence. L’intensité de fluorescence des protéines d’intérêt (A) a été comparée aux contrôles négatifs (B). Les images ont été prises en utilisant le microscope Zeiss Axio Imager MZ à un grossissement x400 et sont traitées par le logiciel Zen 3.8 FIG. 25 : représente la colocalisation des récepteurs gustatifs lipidiques dans les cellules gustatives. CD36 mouse est utilisé pour le double marquage avec GPR120 afin que l’hôte ne soit pas le même. Les échelles représentées par un trait blanc sur les images grossies sont de 20 µm. Les images ont été prises en utilisant le microscope Zeiss Axio Imager MZ à un grossissement x400 et sont traitées par le logiciel Zen 3.8 FIG. 26 : représente des graphiques démontrant l’expression des ARNm des marqueurs et récepteurs gustatifs dans les cellules gustatives canines dTBC par RT-qPCR. L’expression des ARNm des cellules glial-like, gustatives et présynaptiques est indiqué en (A), des récepteurs gustatifs lipidiques en (B) et des T1Rs en (C). Les résultats sont normalisés par la bêta actine (* (p FIG. 27 : représente des graphiques démontrant l’effet-dose de l’acide linoléique dans les cellules gustatives canines dTBC. L’intensité de fluorescence est rapportée à la surface cellulaire et multipliée par un facteur 1000 afin de réduire les décimales. La différence entre la fluorescence maximale et minimale (max-min) en fonction des concentrations d’acide linoléique est indiquée en (A) et la courbe d’EC50 (B). Les points de couleur différente permettent de distinguer les deux séries d’expérience réalisée en duplicata chacune. Les résultats sont normalisés par rapport au bruit de fond (ns (non significatif), * (p FIG. 28 : représente des graphiques et images obtenues par fluorescence présentant un exemple de réponses de l’effet dose de l’acide linoléique sur des cellules gustatives canines dTBC. La réponse quantitative est représentée sous forme de graphique à gauche tandis que les représentations qualitatives sont indiquées à droite (avant (t=0), après (image centrale) et à la fin de l’injection (t environ 5 minutes)). Les flèches indiquent le moment de l’injection et les cercles indiquent les cellules où la fluorescence a disparu. La réponse calcique est mesurée sur un minimum de 8 cellules par concentration. Les graphiques ont été réalisés par le logiciel GraphPad Prism 9.0.0. Les captures vidéos sont issues de l’enregistrement « live » des cellules par le logiciel NIS ELEMENT AR – Nikon. FIG. 29 : représente des graphiques et images obtenues par fluorescence présentant l’effet de SSO et AH-7614 sur des cellules gustatives canines dTBC (1e série). La réponse quantitative est représentée sous forme de graphique à gauche tandis que les représentations qualitatives sont indiquées à droite (avant (t=0), après (image centrale) et à la fin de l’injection (t environ 5 minutes)). Les flèches pointent le moment de l’injection. La réponse calcique est mesurée sur un minimum de 7 cellules par condition. Les captures vidéos sont issues de l’enregistrement « live » des cellules par le logiciel NIS ELEMENT AR – Nikon (A). L’intensité de fluorescence est rapportée à la surface cellulaire et multipliée par un facteur 1000 afin de réduire les décimales. La différence entre la fluorescence maximale et minimale (max-min) en fonction des conditions est indiquée en (B). Les graphiques et histogrammes ont été réalisés par le logiciel GraphPad Prism 9.0.0. FIG. 30 : représente des graphiques et images obtenues par fluorescence présentant un exemple de réponses de l’effet de SSO et AH-7614 sur des cellules gustatives canines dTBC (2e série). La réponse quantitative, est représentée sous forme de graphique à gauche tandis que les représentations qualitatives sont indiquées à droite (avant (t=0), après (image centrale) et à la fin de l’injection (t environ 5 minutes)). Les flèches pointent le moment de l’injection. La réponse calcique est mesurée sur un minimum de 10 cellules par condition. Les captures vidéos sont issues de l’enregistrement « live » des cellules par le logiciel NIS ELEMENT AR – Nikon (A). L’intensité de fluorescence est rapportée à la surface cellulaire et multipliée par un facteur 1000 afin de réduire les décimales. La différence entre la fluorescence maximale et minimale (max-min) en fonction des conditions est indiquée en (B). Les graphique et histogrammes ont été réalisés par le logiciel GraphPad Prism 9.0.0 FIG. 31 : représente un graphique présentant l’effet dose du glutamate monosodique (MSG) dans les cellules gustatives canines dTBC. L’intensité de fluorescence est normalisée par rapport au bruit de fond. La différence entre la fluorescence maximale et minimale (max-min) en fonction des concentrations de MSG est indiquée en (A) (ns (non significatif), * (p FIG. 32 : représente des graphiques et images obtenues par fluorescence présentant un exemple de réponses de l’effet dose du MSG sur cellules gustatives canines dTBC. La réponse quantitative, est représentée sous forme de graphique à gauche tandis que les représentations qualitatives sont indiquées à droite (avant (t=0), après (image centrale) et à la fin de l’injection (t environ 5-7 minutes)). Les flèches indiquent le moment de l’injection. La réponse calcique est mesurée sur un minimum de 16 cellules par concentration. Les graphiques ont été réalisés par le logiciel GraphPad Prism 9.0.0. Les captures vidéos sont issues de l’enregistrement « live » des cellules par le logiciel NIS ELEMENT AR – Nikon. La présente invention est illustrée de manière non limitative par les exemples suivants. EXEMPLES DE REALISATION Exemple 1 : matériels et méthodes Animaux et régimes Le modèle choisi, le beagle ( Canis Lupus Familiaris ) est couramment utilisé en laboratoire notamment dans l’étude de l’obésité (Xue et al. 2022; Manens et al. 2012). Il s’agit d’un chien de corpulence normale, docile et prédisposé à l’obésité. La langue et les autres tissus (foie, tissu musculaire et iléon) des Beagles, ont été prélevés par la clinique vétérinaire du département de Marshall Bioressources – Bio2M (Mézilles, France). Les animaux ont été euthanasiés pour des raisons éthiques (pathologies non contagieuses et compatibles avec la requête de prélèvement de langues, animaux présentant des problèmes comportementaux…). La procédure d’euthanasie a été effectuée dans le respect de la réglementation européenne (directive européenne 2010/63/UE). Dans un premier temps, elle consiste à effectuer une sédation profonde à l’aide d’un α2-agoniste (Médétomédine ou Xylasine) puis d’injecter en intraveineuse (IV) du pentobarbital (Doléthal ou Euthasol). Ces procédures ont été approuvées par le comité d’éthique interne de la société. Les chiens sont hébergés dans des box dont la superficie respecte les exigences réglementaires avec accès à l’extérieur. Ils ont un accès ad libitum à l’eau et aux croquettes Teklad Global Diets® 2025C (26,3% de protéines, 10.5% de lipides, 34.6% de glucides, 8% de cendres, 5.6 de minéraux, 3% de fibres brutes et 11.5% de fibres insolubles). Tous les animaux bénéficient d’un programme de soins, de prophylaxie standard. De plus, un programme d’enrichissement et de socialisation sont mis en place. 7 mâles et 34 femelles âgés de 2 à 8 ans et en bonne santé ont été obtenus. La prophylaxie interne et externe est antérieure à une semaine et l’antibiothérapie générale antérieure à 4 semaines avant le prélèvement des échantillons. Le prélèvement de la langue s’est fait à partir de l’épiglotte par des vétérinaires qualifiés de façon à conserver la partie caudale de la langue qui contient les papilles caliciformes. Une fois prélevés, les échantillons sont envoyés dans les 24 heures ou moins dans des bouteilles contenant du milieu de culture stérile (DMEM avec glucose). Étude « ex-vivo » Étude macroscopique de la langue de Beagle Les langues ont été observées dans un premier temps à l’œil nu afin d’identifier les différentes papilles puis dénombrer les papilles caliciformes. La répartition ainsi que la taille de papilles fongiformes ont été observées sous une loupe binoculaire. Isolement des papilles gustatives canines Le protocole d’isolement des papilles puis des cellules gustatives canines est basé sur les précédents travaux menés chez la souris et le rat ( Miyamoto et al. 1996; Ruiz et al. 2001 ). Après avoir observé les langues, elles sont incubées dans un tampon Tyrode avec calcium (120 mM NaCl, 5 mM KCl, 1 mM CaCl2, 1 mM MgCl2, 10 mM Hepes, pH 7.4) complété avec 10 mM de glucose et 10 mM de pyruvate de sodium à 4°C pendant 15 minutes environ. Le volume de Tyrode utilisé est d’environ 200 mL par langue de façon à immerger l’épithélium gustatif. Un mélange enzymatique contenant de l’élastase (8 mg/mL ; réf : LS002294 ; Wothington) et de la dispase (8 mg/mL ; réf: D4693-1G ; Worthington) dissout dans du Tyrode complet avec calcium a été utilisé afin de dissocier l’épithélium lingual de langue. L’injection a été effectuée en périphérie et dans le fossé extérieur de la papille caliciforme et de façon aléatoire sur le deuxième tiers caudal de la langue de façon à prélever le maximum de papilles fongiformes ( FIG. 1 - étape 4). Les langues sont ensuite incubées 1h30-1h45 à 37°C dans du Tyrode sans calcium (140 mM NaCl, 5 mM KCl, 10 mM Hepes, 2 mM EGTA, pH 7.4) complété avec 10 mM de glucose et 10 mM de pyruvate de sodium. Après incubation, l’épithélium gustatif contenant les papilles fongiformes est retiré délicatement avec des pinces plates et courbées, tandis que les papilles caliciformes sont prélevées au scalpel et maintenues dans du milieu de culture DMEM (réf : L0104-500 ; Dutcher) complet. En ce qui concerne l’épithélium sublingual, il est prélevé au scalpel sans injection, en veillant à ne pas prélever le tissus musculaire ( FIG. 1 – étape 7) À ce stade, les papilles sont soit utilisées pour l’isolement des cellules gustatives ou soit conservées à -80°C dans des tubes de 1.5 mL percé au niveau du capuchon. Histologie Les papilles caliciformes sont prélevées avec le tissu musculaire afin de faciliter leur inclusion dans un tampon contenant 10% de formaldéhyde (réf. BAF-6000-08A ; CellPath). Après le prélèvement des tissus, les lames sont préparées par la plateforme ImaFlow (faculté de médecine, Université de bourgogne, Dijon) jusqu’aux étapes de déparaffinage et de démasquage. Les échantillons sont ensuite inclus en paraffine dans des cassettes. Les coupes du bloc de paraffine sont réalisées avec un microtome permettant d’obtenir des tranches de 5 µm d’épaisseur. Une fois les tissus inclus et les lames déparaffinées dans des bains de toluène/xylène-éthanol pendant 30 minutes, elles sont soit colorées par de l’hématoxyline et de l’éosine (HE) ou utilisées pour l’immunofluorescence. Immunofluorescence - Choix des anticorps par bio-informatique La plupart des anticorps commercialisés sont majoritairement produits pour une utilisation chez le rongeur (souris, rat, hamster), l’Homme, la chèvre ou le lapin. On peut aussi retrouver des espèces un peu plus rares comme les grenouilles, les vaches ou les chimpanzés. Cependant, peu d’anticorps sont produits dans le but de reconnaitre des épitopes canins. La stratégie adoptée a été d’effectuer un tri de tous les anticorps d’intérêt par bio-informatique en utilisant l’outil d’analyses de séquences blastp (protein-protein blast) La séquence de l’antigène de la protéine d’intérêt est comparée aux bases de données non redondantes (GenBank, Protein Data Bank, SwissProt, Protein Information Resource, Protein Research Foundation), en utilisant les critères suivants : Enter FASTA sequence(s) : Séquence de l’antigène Database : Non-redundant protein sequences (nr) Organism : Canis lupus familiaris (taxis : 9615). Les anticorps ont ensuite été sélectionnés en se basant sur différents facteurs : le Query-Cover qui correspond au score d’alignement, le pourcentage d’identité, et la description de la protéine d’intérêt qui doit correspondre à la séquence utilisée (Tableau 1). Exemple : une séquence CD36 à analyser ne doit proposer que des séquences CD36 parmi les premiers résultats. La séquence antigénique de T1R3 n’a pas été indiquée par le fournisseur. L’utilisation de cet anticorps est basée sur la fiche technique qui le recommande pour la détection de ce récepteur canin. Immunofluorescence - Protocole Etape de démasquage des antigènes : après l’étape de déparaffinage, les lames sont plongées dans un tampon citrate (réf.C9999-1000 mL, 10X, pH 6, Sigma-Aldrich) dilué au 1X, qui est chauffé à 95°C pendant 30 minutes. Lors de l’inclusion des tissus en paraffine, les étapes d’enrobage et de déshydratation, détériorent ou masquent l’épitope des antigènes. L’utilisation d’un tampon citrate et l’augmentation de la température permettent de faciliter la reconnaissance antigènes-anticorps en retirant l’excédent de paraffine (démasquage). Une fois refroidies à température ambiante les lames sont lavées avec le tampon salin Tris (TBS) 1X (0.137M de chlorure de sodium, 2.1 mM de chlorure de potassium et 0.025 M de Tris/tris-HCl) (3 fois 2 minutes). Les sites non spécifiques sont bloqués avec une solution de saturation composée de TBS 1X et de 10% de Sérum de Veau Fœtal (SVF) pendant 1h à température ambiante (RT : Room Temperature) sous agitation. Le contour des échantillons est séché afin d’utiliser un stylo hydrophobe (PAP Pen, réf. 49001, Dutscher) de façon à délimiter la zone de dépôt, réduire la quantité d’anticorps utilisée et de maximiser la liaison entre l’anticorps et l’antigène ( FIG. 2 ). Les lames sont ensuite incubées toute la nuit à 4°C sous agitation avec 100 µL d’anticorps primaires (Tableau 2 : Liste des anticorps primaires et secondaires utilisés pour l’immunofluorescence sur cellules et tissus (Tableau 2) dilués selon les recommandations du fournisseur dans une solution de TBS 1X/1%SVF. Le lendemain, les lames sont lavées au TBS 1X, et sont incubées 2 heures avec des anticorps secondaires (Tableau 2) dilués au 1/500 dans du TBS 1X/1% SVF, à RT dans le noir. Les lames sont rincées au TBS 1X et une contre coloration à l’HOECHST 33342 (réf. 66249, Thermo Scientific) pour colorer les noyaux est effectuée selon les recommandations du fournisseur. Les lames sont rincées puis montées et scellées avec du milieu de montage (Fluoromount-G™, réf : 00-4958-02 ; Invitrogen). Les coupes histologiques sont ensuite observées par microscopie à fluorescence (Zeiss Axio Imager M2) et analysées avec le logiciel Zen Lite. Approche In vitro Isolement des cellules gustatives et sublinguales canines Une fois isolées, les papilles caliciformes et l’épithélium sublingual sont centrifugées (600 g ; 1 min ; 4 °C) et le surnageant est éliminé. Les papilles sont transférées dans un tube de 1,5 mL contenant un mélange enzymatique (8 mg/mL d’élastase, 4 mg/mL de collagénase et 4 mg/mL d’inhibiteur de trypsine). Un découpage mécanique à l’aide d’une paire de ciseaux est effectué afin de faciliter la digestion enzymatique. Les cellules gustatives et sublinguales dissociées sont séparées du tissu non digéré par l’utilisation d’un filtre de 30 µM (pre-séparation filter 30 µm ; réf : 130-041-407 ; Miltenyi Biotec). Après une incubation de 10 minutes à 37°C et une filtration des cellules sur tamis, une centrifugation (2000 rpm ; 1 minute 30) permet de récupérer les cellules gustatives et sublinguales. Le culot cellulaire est repris dans du DMEM complet contenant de la Primocin® puis les cellules sont ensemencées en flasque T25 (25 cm²) à 37°C, 5% CO2. La Primocin® est un antibiotique à large spectre couramment utilisé en culture primaire afin d’éviter les contaminations microbiennes, notamment de mycoplasmes. Il est utilisé jusqu’au processus d’immortalisation. Entretien des cellules primaires Avant immortalisation, les cellules isolées sont cultivées dans des flasques T25 contenant du milieu DMEM (réf : L0104-500 ; Dutscher) et un mélange PSA (Pénicilline, streptomycine, amphotéricine B ; réf : P06-07300 ; PAN Biotech), de la Primocin® (réf : ant-pm-1 ; InvivoGen). Le milieu est complété avec du sérum bovin fœtal (SVF, réf : P30-3306 ; PAN Biotech) non décomplémenté. Les cellules adhèrent en formant des zones de confluence. Elles sont ensuite réparties uniformément dans une nouvelle flasque par repiquage. Le repiquage des cellules consiste à retirer le milieu de culture et éliminer le milieu résiduel en utilisant du 2x10 mL de PBS (réf : L0615-500 ; Dutscher). De la trypsine 1X (réf : X0930-100 ; Dutscher) est ajoutée (1 mL pour une T25 et 2 mL pour une T75) afin de rompre les liaisons entre les cellules et le support. La flasque est incubée pendant 5 minutes à 37°C/5% de CO2. L’enzyme est ensuite inactivée en complétant le volume à 10 mL avec du milieu de culture complet (avec SVF). Les cellules sont centrifugées 5 minutes à 2000 rpm. Le culot cellulaire est repris dans 10 mL de milieu et réparti dans différentes flasques. Cette étape est notée J0. Immortalisation de la primoculture À J1, les cellules sublinguales et gustatives ont adhéré et ont été transférées dans un laboratoire de niveau 2 (L2) permettant la manipulation d’agents pathogènes pour l’Homme. Les cellules sont immortalisées en utilisant des lentivirus codant pour le simien virus 40 (SV40) et le tert humain (h-TERT) (réf : CILV01 et CILV02 respectivement ; ALSTEM bio) selon les recommandations du fournisseur. L’utilisation de la sous-unité catalytique de la télomérase (tert) va permettre de restaure son activité au sein de la cellule et maintenir la longueur des télomères de façon à échapper à la sénescence cellulaire. L’avantage de cette méthode est la conservation du phénotype cellulaire (Gire 2005). L’antigène T du Simian Virus 40 est un oncogène qui va empêcher la mort cellulaire en inhibant le facteur de transcription p53 ( López et al. 2020 ). Ces agents sont solubilisés dans du Lubrol (Hexadimethrine bromide réf. H9268 ; Merck) (1 mg/mL) facilitant l’entrée des agents dans la cellule (4µL / 64µL de Lubrol/T25) en perméabilisant la membrane. Le milieu de culture est remplacé 24 h (J2) et 48 h (J3) après infection. À partir de J3, les cellules sont cultivées dans du milieu sans Primocin®. Lorsque les cellules atteignent 90% de confluence environ, elles sont repiquées dans une flasque de 75 cm² (T75) selon le protocole ( FIG. 3 ). Conservation des cellules Congélation : À la fin du repiquage cellulaire, lors de la dernière étape de centrifugation, le culot est homogénéisé dans du milieu de conservation contenant 90% de SVF et 10% de DMSO stérilisé au filtre de 0.2 µM. Les cryotubes sont préparés à une concentration minimale de 1 million de cellules/mL et sont placés à -80°C pour une utilisation à court et moyen terme soit quelques semaines jusqu’à 6 mois. Au-delà, une partie des tubes est transférée dans des boites maintenues à -195°C par de l’azote liquide. Décongélation : Les ampoules de cellules sont décongelées selon le protocole ( FIG. 4 ). Le choix de flasque après décongélation va dépendre de la taille du culot et du besoin expérimental. En effet, un culot de taille importante pourra être repris et réparti dans des flasques T75. Tandis qu’une T25 sera préférentiellement utilisée pour culot de faible taille (1 million de cellules). Immunofluorescence sur cellules Pendant l’étape de repiquage, les cellules sont comptées à l’aide d’une cellule de Malassez et ensemencées dans une plaque 24 puits transparente stérile à fond plat dans laquelle des lamelles de 12 mm de diamètre (réf. 10040, KNITTEL, Dutscher) ont été préalablement disposées et stérilisées à l’aide d’éthanol 95%. Les cellules sont incubées dans 1 mL de milieu DMEM complet par puits à 37°C/5% CO2. Le lendemain, la morphologie et la confluence des cellules sont vérifiées. Si elles ont adhéré et sont allongées, on poursuit avec l’étape de fixation sinon, on attend 24 heures supplémentaires. Les cellules sont lavées 3 fois au PBS 1X stérile puis fixées à l’aide de méthanol pur froid (conservé à -20°C) 20 min à -20°C, de façon à couvrir les lamelles. Elles sont lavées 3 fois au TBS 1X et sont incubées 1 heure à RT dans un tampon de saturation TBS 1X-10%SVF. Après l’étape de saturation, les lamelles sont transférées dans une chambre humide et environ 50 µL d’anticorps primaire sont déposés sur chaque lamelle. Les cellules sont incubées toute la nuit à 4°C. Le lendemain, les cellules sont remises en plaque 24 puis pour les lavages de 3 fois 5 min dans du TBS 1X et incubées 1h à température ambiante avec l’anticorps secondaire dilué au 1/500e. Dans le cas où l’on effectue un monomarquage, on procède directement à la coloration du noyau à l’HOECHST 33342 (réf. 66249, Thermo Scientific) (10 min à RT) et au montage lame et lamelle montage (Fluoromount-G™, réf : 00-4958-02 ; Invitrogen). Dans le cas d’un double marquage, il faut répéter les étapes d’incubation d’anticorps primaires et secondaires puis la coloration du noyau et le montage des coupes histologiques. Signalisation calcique - Préparation des tampons et réactifs - La sonde : Fluo-4 DirectTM (réf: F10471, Molecular Probes®, InvitrogenTM). La sonde est préparée au 2X selon les recommandations du fournisseur : la sonde de couleur rouge ou composé A (réactif Fluo-4 Direct) est solubilisée à l’aide d’un vortex (2 fois 30 secondes) dans 10 mL de tampon Fluo-4 Direct calcium assay. Elle est ensuite aliquotée selon un volume de 1 mL et conservée à -20°C. - Tampons calcium (pH 7.4) - Stimuli : Acide linoléique, Monosodium Glutamate (MSG) Le monosodium de glutamate est dissout et l’acide linoléique dilué dans du tampon 0% calcium. Des concentrations mères sont dans un premier temps préparées : 2 mM et 10 mM pour les faibles et fortes concentrations respectivement (LA), 4 M (MSG). Les solutions à injecter sont préparées 5 fois plus concentrés dans du tampon 0% calcium afin de prendre en compte le facteur de dilution (50 µL dans 200 µL). Une gamme de 0.78 à 800 µM d’acide linoléique et de 25 à 800 mM de monosodium glutamate est utilisée pour stimuler les cellules gustatives canines. - Préparation des inhibiteurs des récepteurs CD36 et GPR120 : SSO (réf. Sc-208408, Santa Cruz) et AH-7614 (réf. 5256, Tocris, Biotechne®) respectivement. Les inhibiteurs sont dans un premier temps dissouts dans du DMSO à une concentration de 25,9 mM pour SSO et 25 mM pour AH-7614 selon les recommandations du fournisseur, puis à 50 µM finale dans du tampon 0% calcium lors de l’incubation des cellules. Signalisation calcique - Préparation des plaques À la fin de l’étape de repiquage, les cellules sont ensemencées et cultivées dans des plaques 24 puits à fond plat transparent et bords noirs (réf. 82426, Ibidi®) à une concentration de 10 000 cellules / puits. Le lendemain, la confluence et la morphologie des cellules sont vérifiées au microscope. Le milieu de culture est retiré et les cellules sont incubées pendant 1 heure à 37°C/5%CO2 avec 200 µL de sonde Fluo-4 1X diluée dans du milieu de culture DMEM complet. Après l’incubation, le milieu est retiré et les cellules sont lavées une fois avec 200 µL de tampon 100 % calcium et le puits stimulé est incubé dans du tampon 0% tandis que les autres puits sont maintenus dans du tampon 100% afin de limiter le stress cellulaire. Exemple d’une stimulation de 50 et 100 µM d’acide linoléique ( FIG. 5 ) : Après avoir retiré la sonde, tous les puits sont lavés avec 200 µL de tampon 100% calcium. Les puits B1, C1 et D1 sont ensuite maintenus en tampon 100 %, tandis que 200 µL de tampon 0% sont injectés dans le puits A1 ( FIG. 5 – étape 1). Les cellules sont stimulées au bout de 1 minute environ afin que le signal se stabilise. L’injection de 50 µL se fait à l’aide d'une pipette de 100 µL. Les enregistrements durent en moyenne 10 minutes, mais il est préférable que les paramètres du temps soient largement augmentés afin d’anticiper un éventuel délai de réponse et donc une perte du signal. À la fin de l’acquisition du premier puits, le tampon 100% calcium du puits B1 est remplacé par du 0% et l’injection se poursuit comme précédemment ( FIG. 5 – étape 2). C’est-à-dire que les cellules sont stimulées après une minute environ de stabilisation du signal. Cette succession d’étapes est répétée jusqu’au dernier puits ( FIG. 5 – étape 3-7). Signalisation calcique - Acquisition du signal La mesure de la libération du calcium intracellulaire s’effectue à l’aide du microscope Nikon Ti Eclipse en utilisant l’objectif à immersion à l’huile S-fluor 40X. Le microscope est paramétré selon les longueurs d’onde d’émission et d’excitation de la sonde Fluo-4 qui est similaire au FITC soit 494 nm d’excitation et 516 nm d’émission. Les signaux sont traités et enregistrés grâce au logiciel NIS-Element AR. Les cellules sont choisies de façon aléatoire en veillant néanmoins à ce qu’elles ne soient pas disposées en amas. L’enregistrement est ensuite figé à l’aide de l’icône « stop » du logiciel et 8 cellules au minimum sont sélectionnées en utilisant l’outil ROI (Region of Interest). L’espace intercellulaire est défini comme arrière-plan avec ce même outil. La mesure de l’intensité de fluorescence est effectuée avec le « time measurement » qui enregistre l’intensité de fluorescence en fonction du temps avec une exposition de 300 ms. Signalisation calcique - Acquisition du signal en présence d’inhibiteurs En ce qui concerne l’utilisation des inhibiteurs, l’expérience se déroule selon le protocole ( FIG. 6 ) : La première incubation du puits A1 dans le tampon 0% de calcium est nécessaire, car les inhibiteurs sont préparés dans le tampon 0% calcium. Afin d’uniquement observer l’effet de l’inhibiteur, il est nécessaire de procéder de cette façon. Signalisation calcique - Traitement des acquisitions Les résultats bruts sont enregistrés sous format Excel (.xls) et la différence d’intensités de fluorescence entre l’état basal avant injection et la réponse maximale (max-min) est exportée sur un fichier PowerPoint. Tous deux sont ensuite analysés par le logiciel GraphPad Prism 9.0. Une capture vidéo est aussi effectuée afin de mieux visualiser la libération du calcium intracellulaire en fonction des différentes concentrations utilisées. Deux concentrations d’agonistes sont testées deux fois par colonne de plaque 24 puits. En procédant de cette façon, l’écart de temps entre les concentrations pour les analyses est diminué. En effet, 8 minutes d’enregistrement maximum et 5 minutes d’exportation des données sont nécessaires pour chaque concentration. De ce fait, le puits suivant reste 10 minutes dans le tampon 100 % calcium et celui d’après 20 minutes. Bien que les cellules soient maintenues dans un tampon 100 % calcium avant injection, il serait plus difficile de comparer les premiers puits avec les suivants ( FIG. 7 ). RT-qPCR La RT-qPCR a été effectuée sur les cellules gustatives et sublinguales canines isolées et immortalisées précédemment. Le foie, l’iléon, et le tissu musculaire ont été fournis par les vétérinaires de la société Marshall. Environ 50 mg de tissus sont utilisés pour l’extraction de l’ARN. Ces tissus sont conservés à -80°C. Extraction d’ARN Lyse cellulaire : Lors des premières extractions, la lyse cellulaire a été réalisée après le repiquage des cellules, une partie du culot est solubilisée dans 500 µL de Trizol (réf. 15596018 ; ThermoFisher, USA). À cette étape, la lyse peut être arrêtée et les échantillons sont conservés à -80°C. Pour les extractions suivantes, les cellules ont été ensemencées en flasques T25 ou en plaques 6 puits jusqu’à ce qu’elles atteignent 100% de confluence. Après avoir retiré le milieu de culture, les cellules sont lavées au PBS et 500 µL de Trizol sont ajoutés par puits ou par flasque. Des grattoires (réf. 009902- Dutscher) sont utilisés afin de faciliter la lyse des cellules par le Trizol. Enfin, le lysat cellulaire est transféré dans des tubes de 1.5 mL (DNAse et RNAse free) à l’aide d’une micropipette de 1000 µL en faisant des vas et viens pour terminer la lyse cellulaire. Lyse tissulaire : La première étape consiste simplement à transférer les échantillons dans des tubes (réf : E1420-2330 + réf des bouchons : E1480-0100 ; StarLab) compatibles avec l’homogénéisateur Precellys® 24 touch (réf : P002391-P24T0-A.0 ; Bertin Technologies) en utilisant des billes de broyages (réf :11079110sc ; Biospec Products). Le programme utilisé pour lyser les échantillons est le suivant : 4 cycles de 15 secondes de broyage à 6000 rpm + 30 secondes de pause sur glace entre chaque cycle (2 cycles supplémentaires de 30 secondes peuvent être ajoutés pour le broyage des papilles caliciformes). Dans les deux types de lyses, le chloroforme (200 µL) est ajouté au lysat. Une fois centrifugées (12 000 g à 4°C) pendant 15 minutes, 3 phases distinctes sont obtenues : parmi lesquelles la phase supérieure (translucide) contenant l’ARN est prélevée et précipitée après centrifugation avec 500 µL d’isopropanol. Le culot d’ARN est lavé 3 fois avec de l’éthanol 70%. Les restes d’éthanol sont retirés à la pipette de 100 µL et les culots sont séchés 30 minutes sous hotte. Quantification L’ARN est quantifié à l’aide d’un nanophotomètre UV visible (NanoPhotometer™N50 touch ; Implen™). La qualité de l’acide ribonucléique est vérifiée en faisant le rapport des absorbances mesurées à 260 et 280 nm. Celui-ci est considéré de bonne qualité lorsque ce ratio est compris entre 1,8 et 2. Ensuite, une transcription inverse sur 0.3-1 µg est effectuée selon les recommandations du fabricant (High-Capacity RNA-to-cDNA™, réf : 4387406 ; Thermofisher). De manière générale, les transcriptions inverses ont été effectuées sur 1 µg d’ARN. La qPCR est réalisée avec une quantité d’ADNc de 10 ng/puis pour un volume final de 20 µL contenant 10 µL de SyberGreen (2X iTaq™ Universal SYBR® Green Supermix ; Biorad), 1 µL d’amorce 20X (PrimePCR™ SYBR® Green Assay ; Biorad), 7 µL d’eau sans RNAses et DNAses et 2 µL d’ADNc. Les amorces Bio-Rad sont créées par un algorithme et sont fournies sans détails. La séquence des amorces sens et antisens n’est pas mentionnée sur le tube. La spécificité des amorces a donc été vérifiée en utilisant l’outil d’alignement de séquence nucléotidique blastn (Tableau 4) Le query-cover et le pourcentage d’identité sont de 100% pour toutes les amorces sauf pour le facteur d’amplification transcriptionnelle TEAD1 (SV40). En effet, cette dernière n’est pas reconnue pour l’organisme canis lupus familiairis (taxid : 9615). [Tableau 4] T ableau 4 : Séquences nucléotidiques canines amplifiées par les amorces Bio-Rad. Le programme de qPCR a été exécuté de la façon suivante : une 1e étape d’activation enzymatique à 95°C pendant 2 minutes. Puis les étapes de dénaturation et d’hybridation ont été effectuées pendant 40 cycles, 5 secondes à 95°C et 30 secondes à 60°C respectivement ( FIG. 8 ). Analyses Statistiques Les résultats sont analysés par le logiciel GraphPad Prism 9.0.0. Les graphiques sont exprimés en moyenne seule (Signal calcique) et les histogrammes en moyenne ± SEM. Le test de corrélation de Spearman a été utilisé, car selon le test d’Agostino et Pearson, les échantillons ne suivent pas une distribution normale. Pour comparer l’expression d’ARNm dans les différents tissus (papilles caliciformes, fongiformes et épithélium sublingual), le test one-way ANOVA suivi du test de comparaison multiple de Dunn a été utilisé. En ce qui concerne les cellules immortalisées, le test de Mann-Whitney a été utilisé sur n=6 échantillons. Une p-value inférieure ou égale à 0.05 est considérée comme statistiquement significative. Pour toutes les analyses sauf les résultats préliminaires concernant l’effet dose du glutamate monosodique, les expériences ont été réalisées 3 fois. La moyenne de ces expériences indépendantes est utilisée pour l’analyse statistique. Exemple 2 : Résultats Caractérisation des papilles gustatives canines Identification des différents types de cellules du bourgeon du goût - Aucune corrélation n’est observée entre le nombre de papilles caliciforme et le genre, l’âge et le poids corporel Les tests de corrélation ont uniquement été effectués chez les femelles, car le nombre de mâles était insuffisant pour ce test. Parmi les femelles, une corrélation positive modérée est observée entre le nombre de papilles et le poids. De plus, il semblerait que le nombre de papilles diminue au fur et à mesure que le chien vieillit ( FIG. 9 ). Identification des différents types de cellules du bourgeon du goût - Morphologie et identification des différentes papilles gustatives dans la langue de Beagle Un schéma général de la langue de beagles a été réalisé en se basant sur la morphologie des différentes langues observées (Fig. 10A). Les papilles caliciformes sont localisées au niveau du premier tiers caudal de la langue de beagle (Fig. 10A). Des papilles coniques modifiées sont aussi présentes autour de la papille caliciforme (Figure 10C). Les papilles caliciformes simples sont composées d’un seul orifice situé au centre de la papille secondaire (Figure 11A) en comparaison aux papilles complexes qui en présente plusieurs (Figure 11B). Les papilles fongiformes sont entourées de plusieurs papilles filiformes qui sont facilement repérables grâce à leur forme d’aileron (Figure 10D). Identification des différents types de cellules du bourgeon du goût - Identification des papilles caliciformes et des bourgeons gustatifs Les papilles caliciformes sont identifiables grâce au sillon profond (flèche épaisse) et une invagination au centre de la papille (flèche fine) dû à la présence de la papille secondaire (Figure 12A B). Contrairement à une papille caliciforme de structure simple ( FIG. 12 A), plusieurs invaginations peuvent être observées dans une structure complexe ( FIG. 12 B). Les bourgeons du goût (pointillés) sont localisés dans l’épithélium gustatif et plus précisément dans le sillon primaire de la papille ( FIG. 12 C-E). Aucun bourgeon n’est présent dans l’épithélium gustatif de la structure secondaire de la papille caliciforme. Identification des différents types de cellules du bourgeon du goût - Différents types cellulaires sont observés dans les papilles caliciformes GNAT3 est localisé dans certaines cellules gustatives canines ( FIG. 13 insert). Il n’y a pas de colocalisation entre la sous-unité alpha de la gustducine et des marqueurs de type I, GLAST et ENTPD2. GLAST semble être exprimé dans le noyau ( FIG. 13 B) en comparaison à ENTPD2 qui semble être membranaire ( FIG. 13 C). En se basant sur la distribution de la fluorescence au sein des bourgeons, il semblerait que les cellules de type I sont plus nombreuses que les cellules de type II. Le marqueur de cellules de type III, SNAP25 est localisé de manière moins spécifique contrairement aux deux premiers marqueurs. En plus d’être présent dans les bourgeons du goût, SNAP25 est aussi localisé en périphérie de la papille. En effet, ce marqueur est présent dans l’épithélium gustatif, mais son expression n’est pas observée dans la lamina propria ( FIG. 13 D). Identification des différents types de cellules du bourgeon du goût - Les cellules gustatives et présynaptiques sont prédominantes dans les papilles caliciformes Aucune différence significative n’est observée dans l’expression des marqueurs de type I, GLAST et ENTPD2 entre les papilles caliciformes, fongiformes et l’épithélium sublingual. Cependant, les marqueurs de type II sont significativement plus exprimés dans les papilles caliciformes en comparaison aux deux autres tissus. C’est aussi le cas du marqueur des cellules présynaptique, SNAP25. PKD2L1 est fortement exprimé dans les papilles caliciformes en comparaison à l’épithélium sublingual. Cependant, aucune différence significative n’est observée entre les papilles caliciformes et fongiformes ( FIG. 14 ). Identification des récepteurs gustatifs lipidiques et glutamiques (umami) - Les récepteurs d’acide gras à longues et moyennes chaines et T1R1/T1R3 sont présents dans les papilles caliciformes CD36 est exprimé dans les bourgeons du goût en comparaison à GPR120 qui est exprimé en périphérie ( FIG. 15 A). L’absence de fluorescence au sein des bourgeons permet de facilement les identifier. De plus, l’intensité de fluorescence est plus importante du côté apical du bourgeon c’est-à-dire au niveau du sillon papillaire. À la différence de ces deux récepteurs, GPR84 est absent dans les bourgeons des papilles gustatives (Figure 15A). En ce qui concerne les récepteurs du goût umami, T1R1 est à la fois exprimé dans les bourgeons et dans l’épithélium gustatif. Cette expression est beaucoup moins visible pour T1R3 ( FIG. 15 B). Identification des récepteurs gustatifs lipidiques et glutamiques (umami) - Les cellules gustatives des papilles caliciformes de beagles expriment CD36 L’expression de CD36 semble être moins spécifique en comparaison au précédent marquage. CD36 et GNAT3 sont colocalisés au sein des bourgeons gustatifs. Il semblerait que 2 types de cellules supplémentaires soient présents dans les bourgeons : des cellules exprimant uniquement CD36 et uniquement GNAT3. La différence de localisation est plus définie en ce qui concerne GPR120 et GPR84. En effet, ces récepteurs sont exprimés en périphérie des bourgeons en comparaison à GNAT3. Une forte intensité de fluorescence au niveau de la lumière papillaire est aussi observée dans la condition GPR120/GNAT3 ( FIG. 16 ). Identification des récepteurs gustatifs lipidiques et glutamiques (umami) - D’autres types cellulaires sont identifiés en dehors des bourgeons gustatifs Le CD36 et la GNAT3 semblent être colocalisés au niveau de la fosse du sillon de la papille caliciforme ( FIG. 17 A-E) et en bordure de l’épithélium gustatif ( FIG. 18 A-G). Certaines cellules coexpriment ces deux récepteurs ( FIG. 17 , C-E) et d’autres sont uniquement gustatives ( FIG. 17 AB). Une zone de fluorescence correspondant à l’expression de GPR120 et de la colocalisation de CD36 et GPR120 respectivement, délimite la papille caliciforme ( FIG. 18 D-G). GPR120 est localisé tout au long de la papille tandis que CD36 est uniquement présent au niveau du premier tiers basal du bord de la papille. De plus, toutes les cellules exprimant CD36 sont colocalisées avec GPR120, cela se traduit par une fluorescence vive, mais certaines cellules expriment uniquement GPR120 ( FIG. 18 E-G). Identification des récepteurs gustatifs lipidiques et glutamiques (umami) - Expression des récepteurs T1Rs et d’acides gras à longue et moyenne chaine dans les papilles gustatives de beagles Les récepteurs d’acides gras à longues et moyennes chaines (cd36, gpr120 et gpr84), t1r1 et t1r2 sont plus exprimés dans les papilles caliciformes en comparaison à l’épithélium sublingual. Bien que la différence d’expression ne soit pas significative, gpr40, gpr43 et t1r3 semblent être plus exprimés dans les papilles caliciformes en comparaison aux deux autres tissus ( FIG. 19 ). De plus, aucune différence significative n’est observée entre les papilles caliciformes et fongiformes pour ces récepteurs hormis en ce qui concerne l’expression de cd36 et t1r2 ( FIG. 19 ). Identification des récepteurs gustatifs lipidiques et glutamiques (umami) - Localisation peu conventionnelle du récepteur T1R1 Lors du mono marquage de la papille caliciforme par le récepteur T1R1, une forte zone de fluorescence est observée dans la lamina propria, en dessous des sillons primaires des papilles. Ces structures aussi observées lors de la coloration des lames en hématoxyline et éosine ( FIG. 12 ) semblent correspondre à des glandes salivaires. De plus, cette intensité de fluorescence est plus importante dans ces glandes en comparaison aux bourgeons gustatifs ( FIG. 20 ). Caractérisation des cellules gustatives canines : développement de la lignée cellulaire dTBC (dog taste buds cells) Les cellules primaires gustatives canines expriment CD36 et GNAT3 Les cellules gustatives isolées et mises en culture sont composées de cellules gustatives et de cellules exprimant CD36 ( FIG. 21 A). De plus, elles expriment CD36 qui est majoritairement localisé au niveau de la membrane des cellules ( FIG. 21 B). Immortalisation et identification des récepteurs gustatifs dans les dTBCs - Efficacité d’immortalisation des cellules gustatives canines Lors de l’immortalisation, les cellules gustatives et sublinguales ont été infectées par deux lentivirus exprimant htert et sv40 . De plus, une contamination par du tissu musculaire lingual peut avoir lieu lors du prélèvement des papilles. La présence de marqueurs de cellules musculaires a donc été vérifiée et comparée au tissu musculaire. Ce tissu a aussi été utilisé comme contrôle négatif pour la vérification de l’infection des cellules. L’infection des cellules gustatives par htert a fonctionné de façon significative en comparaison à l’épithélium sublingual et au tissu musculaire. Cependant, sv40 n’est exprimé dans aucune des cellules infectées ( FIG. 22 A). Les marqueurs musculaires, myod1 , cd34 et pax7 ne sont pas exprimés dans les cellules sublinguales. En ce qui concerne la lignée cellulaire, l’expression de ces gènes est plus faible en comparaison au tissu musculaire, mais n’est pas significative. Par ailleurs, MYOD1 est absent dans les cellules gustatives de la lignée cellulaire ( FIG. 22 insert). Immortalisation et identification des récepteurs gustatifs dans les dTBCs - Les dTBCs sont composées de différents types cellulaires TRPM5 est exprimé au niveau cytoplasmique des dTBCs ( FIG. 23 A). Les cellules gustatives réceptrices semblent exprimer le marqueur de cellules de type I, GLAST au niveau nucléaire tandis que l’autre marqueur de type I, ENTPD2 est absent dans ces cellules. En ce qui concerne les cellules de type III, deux populations sont identifiables par immunofluorescence, des cellules gustatives exprimant SNAP25 au niveau membranaire et cytoplasmique et des cellules exprimant uniquement le marqueur de type III ( FIG. 23 B). Immortalisation et identification des récepteurs gustatifs dans les dTBCs - Les dTBCs expriment des récepteurs gustatifs lipidiques et glutamiques Le récepteur CD36 et les récepteurs glutamiques, T1R1 et T1R3 sont localisés au niveau membranaire, cytoplasmique et sont absents dans le noyau ( FIG. 24 A), en comparaison à GPR120 et GPR84 qui ne sont pas exprimés de façon spécifique au sein de la cellule. En effet, l’intensité de la fluorescence semble être similaire sur toute la surface de la cellule en comparaison à CD36, T1R1 et T1R3 où une plus forte intensité de fluorescence est observée au niveau membranaire. La localisation de ces récepteurs est spécifique en comparaison aux contrôles négatifs ( FIG. 24 B). Immortalisation et identification des récepteurs gustatifs dans les dTBCs - Colocalisation des récepteurs lipidiques dans les cellules gustatives canines (dTBCs) La colocalisation des récepteurs CD36, GPR120 et du marqueur de type II, GNAT3, permet de mettre en évidence différents types cellulaires. En effet, certaines cellules expriment à la fois les deux récepteurs ou l’un des deux. C’est le cas des cellules gustatives (exprimant GNAT3) qui peuvent exprimer à la fois CD36 au niveau membranaire et cytoplasmique ( FIG. 25 A) ou GPR120 au niveau nucléaire ( FIG. 25 B). Contrairement aux monomarquages, l’expression nucléaire de GPR120 est plus visible lors du double marquage avec GNAT3 ( FIG. 24 A et FIG. 25 C). Dans certaines cellules, GPR120 semblent être localisé au niveau membranaire des cellules exprimant CD36, ce qui se traduit par une zone de fluorescence de couleur vive ( FIG. 25 C). Immortalisation et identification des récepteurs gustatifs dans les dTBCs - Expression des marqueurs cellulaires et des récepteurs gustatifs lipidiques et glutamiques dans les dTBCs L’expression relative des mRNAs de la lignée cellulaire (dTBC) a été comparée avec les cellules sublinguales isolées et immortalisées. En comparaison à l’immunofluorescence, l’ARNm d’ entpd2 est significativement plus élevé dans les cellules gustatives en comparaison aux cellules sublinguales tandis que l’expression de glast semble être plus élevée dans ces cellules, mais pas de façon significative. Parmi les marqueurs de type II, plcb2 et trpm5 sont les seuls à être plus élevés dans les cellules gustatives. Snap25 est moins exprimé dans les dTBCs en comparaison aux cellules sublinguales tandis que l’autre marqueur de cellule de type III, pkd2l1 semble être plus élevé dans la lignée ( FIG. 26 A). Bien que cd36 ait été identifié par immunofluorescence dans la lignée cellulaire (Figures 16 et 17), l’expression de l’ARNm est significativement plus faible en comparaison aux cellules sublinguales. Par ailleurs, gpr120 , gpr40 et gpr84 sont plus exprimés dans les dTBC tandis que l’expression de gpr43 est plus élevée, mais pas de façon significative ( FIG. 26 B). Parmi les récepteurs T1Rs, seul t1r3 , qui est commun aux modalités gustatives sucrées et umami est statistiquement exprimé dans la lignée cellulaire. En effet, les deux autres récepteurs t1r1 et t1r2 semblent être plus exprimés, mais pas de façon significative ( FIG. 26 C). Etude de la fonctionnalité de la lignée cellulaire dTBC - Effet dose de l’acide linoléique dans les dTBCs Les cellules gustatives immortalisées répondent de façon très faible, mais pas significative à une stimulation par de l’acide linoléique à partir de 6.25 µM. Cette réponse devient statistique à partir de 25 µM jusqu’à 800 µM en comparaison à la réponse à 12.5 µM. Cependant, les différences ne sont pas significatives entre 25 et 800 µM d’acide linoléique. Les réponses des deux séries d’expériences réalisées de façon indépendante sont relativement homogènes ( FIG. 27 A). Bien que les réponses en dessous de 12.5 µM ne soient pas significatives, une efficacité de 50% est observée à 9 µM environ ( FIG. 27 B). Sans injection d’acide linoléique, c’est-à-dire une injection du tampon 0% de calcium uniquement, l’absence de réponse se traduit par un signal plat et une intensité de fluorescence inchangée entre les phases basales, post-injections et finales ( FIG. 28 ). Entre 0.78 µM et 3.25 µM le signal augmente après injection et reste stable. Cela se traduit par une augmentation de la fluorescence dans les cellules qui reste stable après injection. À partir de 6.25 µM la fluorescence diminue légèrement après que le pic de réponse ait été atteint. Dans certaines cellules, cette diminution est représentée par une perte de la fluorescence (cercles). À partir de 200 µM, l’intensité de fluorescence des cellules devient similaire voir inférieure à l’état basale environ 1 minute 30 à 2 minutes après injection. La perte de fluorescence des cellules est aussi plus importante. À 800 µM, le signal a été arrêté prématurément, ceci explique l’absence du début de plateau post-injection qui est néanmoins visible à 200 et 400 µM d’acide linoléique ( FIG. 28 ). Etude de la fonctionnalité de la lignée cellulaire dTBC - CD36 et GPR120 semblent ne pas être impliqués dans la libération du calcium intracellulaire en réponse à une injection d’acide linoléique Bien que l’EC50 ait permis d’identifier une concentration de 9 µM ( FIG. 27 B), l’utilisation des inhibiteurs a été effectuée en présence de 25 µM d’acide linoléique ( FIG. 29 ), car c’est à cette concentration que l’effet de l’acide gras et devenu significatif ( FIG. 27 A). Lors de la première série d’expériences en présence d’inhibiteurs, la réponse calcique semble être diminué par AH-7614 et de façon significative par SSO. De plus, en présence de l’inhibiteur de CD36, l’intensité de fluorescence est inchangée après injection ( FIG. 29 A). L’ajout des deux inhibiteurs augmente la réponse qui est significativement plus élevée en comparaison à SSO et AH-7614 seuls ( FIG. 29 B). Sans inhibiteurs, la réponse calcique diminue après injection alors qu’en présence des deux inhibiteurs et de AH-7614 seul, ce signal se stabilise ( FIG. 29 A). En ce qui concerne la deuxième expérience, l’ajout des inhibiteurs individuellement ou de façon combinée, ne modifie pas la réponse calcique en comparaison à la condition contrôle ( FIG. 30 B). La seule différence que l’on peut observer entre ces conditions est la présence d’un plateau après injection pour la condition contrôle et SSO en comparaison à AH-7614 et SSO+AH-7614 où le signal diminue jusqu’à l’extinction de la fluorescence dans certaines cellules ( FIG. 30 A). Etude de la fonctionnalité de la lignée cellulaire dTBC - Effet dose du glutamate monosodique dans les dTBCs L’étude de la libération du calcium intracellulaire dans les cellules gustatives canines immortalisées à la suite d’une stimulation de glutamate monosodique a été réalisée. Par ailleurs, les mesures ont été effectuées en duplicata, soit un minimum de 16 réponses par concentration au total. Entre 0 et 100 mM, le MSG ne déclenche aucune réponse dans les cellules. À partir de 200 mM jusqu’à 800 mM la réponse calcique augmente et de façon significative en comparaison à la concentration 100 mM. La libération du calcium intracellulaire semble être maximale à 800 mM mais n’est pas significative par rapport à 400 et 200 mM ( FIG. 31 ). Entre 25 et 100 mM le profil de réponse est similaire à celui de la condition contrôle (0 µM de LA). C’est-à-dire qu’aucune différence d’intensité de fluorescence n’est observée après injection ( FIG. 32 ). À 200 et 400 mM de glutamate monosodique, le signal se stabilise 3 à 4 minutes après injection, se traduisant par une intensité de fluorescence inchangée entre la phase post-injection et terminale. Tandis qu’à 800 mM, la réponse est immédiate et l’intensité de fluorescence est beaucoup plus importante en comparaison à l’état basal de la cellule. Cette intensité diminue environ 1 minute après injection ( FIG. 32 ). Exemple 3 : Conclusions L’ensemble des tests et résultats présentés indique les étapes de recherche ayant permis l’obtention, l’isolation et l’immortalisation des cellules gustatives canines selon l’invention. Ces tests et résultats démontrent également la capacité de ces cellules gustatifs canines à pouvoir être utilisées à la fois dans la recherche, en tant que médicament, dans des procédés in vitro de criblage de biomolécules impliquées dans la signalisation gustatives canines, dans des procédés in vitro pour analyser une réponse de signalisation de cellules gustatives canines à des molécules à tester, ainsi que dans des procédés in vitro pour identifier des molécules d’intérêt en vue de moduler les réponses de signalisation de cellules gustatives canines. Cellules gustatives canines, lesdites cellules étant les cellules déposées sous le numéro CNCM I-6070 ou des cellules gustatives canines dérivées des cellules déposées sous le numéro CNCM I-6070. Cellules gustatives canines selon la revendication 1, dans lesquelles les cellules gustatives canines sont immortalisées et conservent leur phénotype en culture pendant au moins 10 générations. Cellules gustatives canines selon la revendication 1 ou 2, dans lesquelles les cellules gustatives dérivées des cellules déposées sous le numéro CNCM I-6070 sont des cellules génétiquement modifiées issues des cellules déposées sous le numéro CNCM I-6070. Cellules gustatives canines selon la revendication 3, dans lesquelles les cellules génétiquement modifiées comprennent dans leur génome au moins une molécule d’acide nucléique ajoutée et choisie dans le groupe constitué d'une molécule d'acide nucléique codant pour un récepteur gustatif protéique, d'une molécule d'acide nucléique codant pour un récepteur hormonal, d'une molécule d'acide nucléique codant pour une molécule impliquée dans la signalisation gustative canine, d'une molécule d'acide nucléique codant pour un composé favorisant l'anti-sénescence et l'immortalisation, et d'une molécule d'acide nucléique codant pour un inhibiteur. Procédé d’analyse in vitro d’une réponse de signalisation de cellules gustatives canines à une molécule impliquée dans la signalisation gustative canine, le procédé comprenant les étapes suivantes : la mise en contact des cellules gustatives canines selon l’une quelconque des revendications 1 à 4 et de ladite molécule impliquée dans la signalisation gustative, et la détermination de la réponse de signalisation déclenchée par ladite molécule dans les cellules gustatives canines. Procédé d’identification in vitro d’un activateur d’une réponse de signalisation de cellules gustatives canines, le procédé comprenant les étapes suivantes : la mise en contact des cellules gustatives canines selon l’une quelconque des revendications 1 à 4 avec une molécule à tester, la mesure de la réponse de signalisation déclenchée, dans les cellules, à la suite de la mise en contact selon l’étape a), et la comparaison entre la réponse de signalisation mesurée à l’étape b) et une réponse de signalisation connue déclenchée dans lesdites cellules gustatives canines selon l’une quelconque des revendications 1 à 4 par une ou plusieurs molécules connues, dans lequel une réponse de signalisation identique ou sensiblement identique entre les réponses de signalisation comparées à l’étape c) indique que la molécule testée est un activateur de la réponse de signalisation de cellules gustatives canines. Procédé d’identification in vitro d’un modulateur d’une réponse de signalisation de cellules gustatives canines, le procédé comprenant les étapes suivantes : la mise en contact des cellules gustatives canines selon l’une quelconque des revendications 1 à 4, d’une molécule connue et déclenchant une réponse de signalisation connue dans lesdites cellules gustatives canines et d’une molécule à tester, la mesure de la réponse de signalisation déclenchée, dans les cellules, à la suite de la mise en contact selon l’étape a), la comparaison de la réponse de signalisation mesurée à l’étape b) avec la réponse de signalisation connue, déclenchée par ladite molécule connue, dans lequel une différence entre les réponses de signalisation comparées à l’étape c) indique que la molécule testée est un modulateur de la réponse de signalisation de cellules gustatives canines. Procédé selon l’une quelconque des revendications 5 à 7, dans lequel la réponse de signalisation est choisie parmi : la signalisation du calcium intracellulaire, le potentiel membranaire cellulaire, la libération de neurotransmetteurs et/ou d’hormones, la phosphorylation de cascade de protéines kinases, telles que les MAP kinases, protéines kinase-C, préférentiellement en aval de l’activation d’un récepteur gustatif. Procédé d’identification in vitro d’une biomolécule cellulaire impliquée dans une réponse de signalisation cellules gustatives canines, le procédé comprenant l’étape de détection de ladite biomolécule cellulaire au sein des cellules gustatives canines selon l’une quelconque des revendications 1 à 4. Procédé d’identification in vitro selon la revendication précédente, dans lequel l’étape de détection de ladite biomolécule cellulaire est réalisée par immunofluorescence, par western-blot ou par transgénèse (en utilisant un gène rapporteur). Kit comprenant les cellules gustatives canines selon l’une quelconque des revendications 1 à 4. Cellules gustatives canines selon l’une quelconque des revendications 1 à 4 pour utilisation comme médicament. Utilisation des cellules gustatives canines selon l’une quelconque des revendications 1 à 4 pour le criblage in vitro de molécule impliquée dans la signalisation gustative canine.