Brevet FR3164020A1 — publié le 20260102

L’invention porte sur un procédé de détermination in vitro de la présence ou non d’au moins un type d’amplicon dans un échantillon biologique ayant subi une amplification en chaîne par polymérase, un amplicon comprenant deux brins, l’échantillon comprenant au moins un agent intercalant apte à être fluorescent lorsqu’il est intercalé dans un amplicon, le procédé comprenant la mise en œuvre de plusieurs étapes dont le traitement du modèle de courbe gaussienne de manière à déterminer la présence ou non du type d’amplicon dans l’échantillon biologique. Figure 1 Procédé de détermination in vitro de la présence ou non d’au moins un amplicon DOMAINE DE L’INVENTION La présente invention concerne le domaine de la détermination in vitro de la présence ou non d’au moins un type d’amplicon dans un échantillon biologique, plus précisément une fois que l’échantillon a subi une amplification en chaîne par polymérase (PCR). ETAT DE LA TECHNIQUE Pour détecter un type d’amplicon dans un échantillon biologique, il est connu de réaliser une amplification en chaîne par polymérase (PCR) puis de chauffer l’échantillon biologique de sorte que les amplicons du type d’amplicon que l’on cherche à détecter se déshybrident, i.e. que les brins des amplicons se séparent. Cette étape de chauffage est aussi nommée fusion ou « melt » en anglais. Durant cette étape de chauffage, on acquiert des mesures successives de la fluorescence de l’échantillon et on construit une courbe de fusion ou « melt curve » représentant l’évolution de la fluorescence en fonction de la température dans l’échantillon. On calcule ensuite la dérivée primaire négative de cette courbe qui représente l’évolution de la variation de la fluorescence en fonction de la température et on détermine la température correspondant au maximum de la variation de la fluorescence. Cette température est considérée comme étant la température de fusion ou « melt temperature » qui est spécifique à un type d’amplicon. En fonction de la température de fusion déterminée, on peut déterminer si le type d’amplicon que l’on cherche à détecter est bien présent dans l’échantillon biologique en comparant la température de fusion déterminée à la température de fusion spécifique au type d’amplicon. Si la température de fusion déterminée est proche de la température de fusion théorique, on considère que le type d’amplicon est présent dans l’échantillon. Cependant, cette technique présente des inconvénients. En effet, en fonction de la vitesse de chauffage de l’échantillon (et donc en fonction du gradient de température dans l’échantillon), la température de fusion déterminée varie. La température de fusion déterminée peut également varier en fonction d’autres facteurs tels que la géométrie du puits dans lequel l’échantillon biologique est disposé, le type de liquide qui contient l’échantillon biologique ou encore la configuration du système de détection. Par conséquent, en fonction de la vitesse de chauffage de l’échantillon, des systèmes de détection et d’autres facteurs, on détermine des températures de fusion différentes pour un même échantillon. Ceci peut entrainer des erreurs de détection d’un type d’amplicon, c’est-à-dire des faux positifs ou des faux négatifs. Un but de l’invention est de fournir une solution pour déterminer in vitro la présence ou non d’au moins un type d’amplicon dans un échantillon biologique qui soit plus fiable et facile à mettre en œuvre. Un autre but de l’invention est de fournir une solution pour contrôler rapidement, de manière fiable et efficace des systèmes pour déterminer in vitro la présence ou non d’au moins un type d’amplicon dans un échantillon biologique. A cet effet, l’invention porte sur un procédé de détermination in vitro de la présence ou non d’au moins un type d’amplicon dans un échantillon biologique ayant subi une amplification en chaîne par polymérase, un amplicon comprenant deux brins, l’échantillon comprenant au moins un agent intercalant apte à être fluorescent lorsqu’il est intercalé dans un amplicon, le procédé comprenant la mise en œuvre des étapes suivantes : - a) chauffage de l’échantillon biologique de sorte que les deux brins de chaque amplicon du type d’amplicon se séparent si un ou des amplicons du type d’amplicon sont présents dans l’échantillon biologique ; - b) mesure et d’acquisition au cours du chauffage, pour différentes températures, de la fluorescence de l’agent intercalant ; - c) calcul d’une évolution, en fonction de la température, d’une variation négative de la fluorescence mesurée par rapport à la température ; - d) détermination d’au moins un modèle d’une courbe gaussienne correspondant à l’évolution, en fonction de la température, de la variation négative de la fluorescence mesurée par rapport à la température calculée à l’étape c) ; - e) traitement du modèle de courbe gaussienne de manière à déterminer la présence ou non du type d’amplicon dans l’échantillon biologique. Selon des caractéristiques avantageuses et non limitatives, prises seules ou dans une quelconque combinaison : - l’étape e) comprend une étape e1) de détermination d’une température de fusion correspondant à la moyenne du modèle de la courbe gaussienne et la présence ou non du type d’’amplicon dans l’échantillon biologique est déterminée en fonction de la température de fusion ; - l’étape e) comprend une étape e2) de détermination de l’écart-type du modèle de la courbe gaussienne et une étape e3) de détermination de la présence du type d’amplicon dans l’échantillon biologique si un point d’une courbe étalon préétablie spécifique à l’amplicon présente une abscisse sensiblement égale à l’écart-type et une ordonnée sensiblement égale à la température de fusion, ladite courbe étalon représentant pour le type d’amplicon des températures de fusion obtenues pour différents modèles de courbes gaussiennes en fonction de l’écart-type des différents modèles de courbes gaussiennes. Avantageusement, le gradient thermique varie en augmentant la vitesse de transition thermique. - lesdits modèles de courbes gaussiennes à partir desquelles la courbe étalon est établie sont obtenus par mise en œuvre des étapes a) à d) du présent procédé, la vitesse de chauffage de l’échantillon biologique à l’étape a) étant différente pour l’obtention de chaque modèle de courbe gaussienne ; - on cherche à déterminer la présence ou non d’au moins deux types amplicons dans l’échantillon biologique et dans lequel, à l’étape d), on détermine au moins deux modèles de courbes gaussiennes correspondant à l’évolution, en fonction de la température, de la variation négative de la fluorescence mesurée par rapport à la température calculée à l’étape c) et dans lequel, à étape e), on détermine la présence ou non des types d’amplicons dans l’échantillon biologique en fonction des modèles ; L’invention a également pour objet un système de détermination in vitro de la présence ou non d’un type d’amplicon dans un échantillon biologique ayant subi une amplification en chaîne par polymérase, un amplicon comprenant deux brins, l’échantillon comprenant au moins un agent intercalant apte à être fluorescent lorsqu’il est intercalé dans un amplicon, le système comprenant : - un dispositif de chauffage adapté pour chauffer l’échantillon biologique de sorte que les deux brins de chaque amplicon du type d’amplicon se séparent si un ou des amplicons du type d’amplicon sont présents dans l’échantillon biologique ; - un fluorimètre adapté pour mesurer la fluorescence de l’agent intercalant ; - une unité de traitement configurée pour : - acquérir, au cours du chauffage, pour différentes températures, la fluorescence de l’agent intercalant ; - calculer une évolution, en fonction de la température, une variation négative de la fluorescence mesurée par rapport à la température ; - déterminer au moins un modèle d’une courbe gaussienne correspondant à l’évolution, en fonction de la température, la variation négative de la fluorescence mesurée par rapport à la température calculée ; - traiter le modèle de courbe gaussienne de manière à déterminer la présence ou non du type d’’amplicon dans l’échantillon biologique. Selon une caractéristique de l’invention, le dispositif de chauffage est un module Peltier. Selon une caractéristique de l’invention, l’échantillon biologique est disposé dans une chambre d’une carte d’analyse. Selon une caractéristique de l’invention, la ou les chambres réactionnelles présentent une épaisseur variable. Plus précisément, l’épaisseur varie par déformation plastique ou élastique, la déformation pouvant être causée par un actionneur ou tout autre moyen. Selon une caractéristique de l’invention, en faisant varier l’épaisseur de la chambre réactionnelle, le gradient thermique est directement lié à l’écart-type soit la largeur mi-hauteur de la courbe gaussienne. On obtient ainsi un pic de fusion plus étroit et la température est plus proche de la température réelle des amplicons. Pai ailleurs, cette configuration permet, si on utilise le procédé selon l'invention en multiplexage thermique (plusieurs sondes avec différentes températures de fusion dans un même réservoir), d’obtenir des pics de fusion moins étalés, plus étroits et donc plus facilement démodulables et séparables. L’invention a également pour objet un procédé de contrôle d’un système (100) comprenant la mise en œuvre des étapes du procédé selon l'invention pour déterminer in vitro la présence ou non d’au moins un type d’amplicon de contrôle dans un échantillon biologique de contrôle et la mise en œuvre d’une étape f) de caractérisation du fonctionnement du système (100) en fonction du résultat de l’étape de détermination de la présence ou non du type d’’amplicon de contrôle dans l’échantillon biologique de contrôle. Selon une caractéristique de l’invention, le procédé de contrôle comprend une étape g) de caractérisation du fonctionnement du dispositif de chauffage (101) en fonction d’un gradient de température dans l’échantillon biologique de contrôle déterminé à partir de l’écart-type du modèle de la courbe gaussienne. Enfin, l’invention a également pour objet une utilisation du procédé de détermination pour le traitement d’un signal de fusion. En effet, grâce au procédé de détermination selon l'invention il est ainsi possible d’optimiser le signal de fusion afin que ce dernier soit moins bruité voir sans bruit, ce qui permet d’améliorer la lecture des signaux et de simplifier la démodulation et la détermination du pic d'intérêt pour les amplicons. DESCRIPTION DES FIGURES D’autres caractéristiques et avantages de la présente invention apparaîtront à la lecture de la description qui va suivre d’un mode de réalisation préférentiel. Cette description sera donnée en référence aux figures annexées dont : FIG. 1 schématise un système de détermination in vitro de la présence ou non d’au moins un type d’amplicon dans un échantillon biologique ayant subi une amplification en chaîne par polymérase ; FIG. 2 représente un procédé de détermination in vitro de la présence ou non d’au moins un type d’amplicon dans un échantillon biologique ayant subi une amplification en chaîne par polymérase ; FIG. 3 illustre une courbe de l’évolution de la fluorescence d’un agent intercalant en fonction de la température dans l’échantillon ; FIG. 4 illustre une courbe de l’évolution de la variation négative de de la fluorescence d’un agent intercalant en fonction de la température dans l’échantillon ; FIG. 5 illustre une courbe de gauss obtenue par ajustement gaussien appliqué sur la courbe de la FIG. 3 ; FIG. 6 illustre, pour un même amplicon, des courbes de l’évolution de la variation négative de la fluorescence d’un agent intercalant en fonction de la température dans l’échantillon, chaque courbe étant obtenue en chauffant l’échantillon à une vitesse différente ; FIG. 7 illustre une courbe étalon représentant, pour un amplicon, la correspondance entre la température de fusion déterminée et l’écart-type ; FIG. 8 illustre, pour un même type d’amplicon, des courbes de l’évolution de la variation négative de de la fluorescence d’un agent intercalant en fonction de la température dans l’échantillon, chaque courbe étant obtenue en chauffant l’échan0tillon à une vitesse différente, lesdites courbes étant utilisées pour construire une courbe étalon du type d’amplicon. FIG. 9 est une représentation graphique de la comparaison de courbes gaussiennes quand l’épaisseur de la chambre réactionnelle varie. FIG. 10 est une représentation graphique de la comparaison de courbes gaussiennes quand l’épaisseur de la chambre réactionnelle varie dans un cas de multiplexage. FIG. 11 est une représentation graphique faisant suite à la FIG. 10 . DESCRIPTION DETAILLEE DE L’INVENTION En référence à la FIG. 1 , il est proposé un système 100 de détermination in vitro de la présence ou non d’au moins un type amplicon dans un échantillon biologique E ayant subi une amplification en chaîne par polymérase (ACP ou, en anglais, PCR pour « polymerase chain reaction »). Comme illustré en FIG. 1 , l’échantillon biologique E ayant subi l’amplification en chaîne par polymérase est avantageusement contenu dans une chambre réactionnelle 11 d’une carte d’analyse 1. L’échantillon biologique peut comprendre des tissus et cellules issus d’un corps humain ou animal et leurs dérivés, des organes, du sang, ses composants ou ses produits dérivés. Comme l’échantillon biologique a subi une amplification en chaîne par polymérase, si l’échantillon biologique comprenait des amplicons d’un type d’amplicon avant l’amplification en chaîne par polymérase, l’échantillon biologique est supposé présenter une importante concentration de ce type d’amplicon. Un amplicon est un morceau d’ADN (acide désoxyribonucléique) ou d’ARN (acide ribonucléique). Un amplicon du type d’amplicon dont on cherche à détecter la présence dans l’échantillon est par exemple un morceau d’ADN d’un virus tels que les virus d'hépatites B, C et D. Un amplicon comprend deux brins. Par « détermination in vitro de la présence ou non d’au moins un type d’ amplicon », il est entendu que l’on cherche à déterminer la présence ou non d’au moins d’une espèce d’amplicon. Par conséquent, si l’on détermine la présence de deux types d’amplicons, il est entendu que l’on détermine la présence de deux espèces d’amplicons différentes. Deux types d’amplicons sont différents s’ils sont issus d’ADN ou d’ARN différents. En d’autres termes, deux types d’amplicons différents caractérisent, par exemple, deux virus différents. On verra par la suite que le système et le procédé présentés permettent de déterminer de manière fiable et simple la présence ou non de plusieurs types d’amplicons différents dans un échantillon biologique. En outre, si l’échantillon biologique comprend un certain type d’amplicon, il est entendu que l’échantillon biologique comprend une multitude d’amplicons de ce certain type d’amplicon. L’échantillon biologique comprend un agent intercalant apte à être fluorescent lorsqu’il est intercalé dans un amplicon. L’agent intercalant est capable de s’intercaler dans un amplicon, c’est-à-dire de s’insérer entre les brins d’un amplicon. L’agent intercalant émet de la fluorescence lorsqu’il intercalé dans un amplicon. En revanche, l’agent intercalant n’émet pas de fluorescence lorsqu’il n’est pas intercalé dans un amplicon. Par conséquent, si l’échantillon biologique ayant subi l’amplification en chaîne par polymérase ne contient pas d’amplicon, cet échantillon biologique (plus précisément l’agent intercalant) n’émet pas de fluorescence. La carte d’analyse 1 est avantageusement adaptée pour être le siège d’une amplification en chaîne par polymérase. La carte d’analyse 1 comprend par conséquent avantageusement une chambre adaptée pour recevoir un échantillon biologique (n’ayant pas encore subi d’amplification en chaîne par polymérase), des réservoirs (non représentés) adaptés pour contenir de l’acide nucléique et/ou des amorces spécifiques constituées d'oligonucléotides de synthèse et au moins une chambre réactionnelle 11 adaptée pour recevoir l’échantillon biologique ayant subi l’amplification en chaîne par polymérase. Les chambres et les réservoirs ont la forme de coques ou "blisters" en anglais. Alternativement, la ou les chambres réactionnelles peuvent être formées dans une plaque ou « array », définie généralement comme un élément de surface plane présentant une certaine épaisseur qui est toutefois très petite par rapport aux dimensions de sa surface plane. Par exemple, l’épaisseur est au moins 10 fois inférieure aux largeurs et longueurs des faces de la plaque. Avantageusement, la chambre est en communication fluidique avec au moins un réservoir via un conduit ou chemin fluidique. Un réservoir est en communication fluidique avec au moins un autre réservoir via un conduit ou chemin fluidique. Les chambres réactionnelles 11 sont en communication fluidique avec au moins un réservoir via un conduit ou chemin fluidique. Le système 100 comprend un dispositif de chauffage 101 adapté pour chauffer l’échantillon biologique ayant subi l’amplification en chaîne par polymérase qui sera nommé « échantillon biologique » dans la suite de la description dans un souci de simplification. Avantageusement, le dispositif de chauffage 101 est un module Peltier. Un module Peltier exploite l'effet Peltier, par lequel un courant électrique est converti en une différence de température. Le système 100 comprend un fluorimètre 102 adapté pour mesurer la fluorescence de l’agent intercalant dans l’échantillon biologique. Le système 100 comprend en outre une unité de traitement 103 telle qu’un processeur. L’unité de traitement 103 est configurée pour : - acquérir, au cours du chauffage de l’échantillon biologique par le dispositif de chauffage 101, pour différentes températures, la fluorescence de m’agent intercalant ; - calculer une évolution, en fonction de la température, d’une variation négative de la fluorescence mesurée par rapport à la température ; - déterminer au moins un modèle d’une courbe gaussienne correspondant à l’évolution, en fonction de la température, de la variation négative de la fluorescence mesurée par rapport à la température calculée ; - traiter le modèle de courbe gaussienne de manière à déterminer la présence ou non du type d’amplicon dans l’échantillon biologique. En référence à la FIG. 2 , il est proposé un procédé de détermination in vitro de la présence ou non d’au moins un type d’amplicon dans un échantillon biologique ayant subi une amplification en chaîne par polymérase. Comme expliqué précédemment, l’échantillon biologique peut comprendre un ou plusieurs types d’amplicon. En d’autres termes, l’échantillon biologique est susceptible de comprendre un ou plusieurs amplicons du type d’amplicon que l’on cherche à détecter. Si l’échantillon biologique comprend un ou des amplicons, l’échantillon biologique, en particulier l’agent intercalant intercalé entre les brins des amplicons, émet une fluorescence. Le procédé comprend une étape a) mise en œuvre au moyen du dispositif de chauffage 101 de chauffage de l’échantillon biologique de sorte que les deux brins de chaque amplicon du type d’amplicon se séparent (ce phénomène est nommé déshybridation) si un ou des amplicons du type d’amplicon que l’on cherche à détecter sont présents dans l’échantillon biologique. En effet, lorsqu’un amplicon est chauffé, les deux brins de l’amplicon se séparent lorsque l’amplicon atteint une température spécifique au type de l’amplicon, appelée température de fusion (ou température de « melt » en anglais). Cette température de fusion permet de déterminer le type de l’amplicon présent dans l’échantillon biologique. Lorsque les deux brins de l’amplicon se séparent, l’agent intercalant qui était inséré entre les deux brins est libéré et cesse d’émettre de la fluorescence. Par conséquent, la température de fusion correspond à la température à laquelle une diminution de la fluorescence est constatée. Il est donc nécessaire de superviser la fluorescence durant l’étape a) de chauffage. La température maximale de chauffage dépend du type d’amplicon que l’on cherche à détecter. L’échantillon biologique est avantageusement chauffé jusqu’à une température supérieure à la température spécifique au type d’amplicon. De préférence, l’échantillon biologique est chauffé jusqu’à une température supérieure de 10°C, encore de préférence supérieure de 15°C, à la température spécifique au type d’amplicon que l’on cherche à détecter. En règle générale, la vitesse de chauffage est inférieure à 5°C par seconde, voire inférieure à 2°C par seconde, voire inférieure à 1°C par seconde. En effet, plus la vitesse de chauffage est faible, moins le gradient de température dans l’échantillon est important ce qui facilite l’analyse des données de fluorescence et facilite la détection du type d’amplicon. Toutefois, on verra que le procédé présenté permet de déterminer la présence d’un type d’amplicon même si la vitesse de chauffage est importante, par exemple supérieure à 5°C par seconde voire supérieure à 10°C par seconde, et donc que le gradient de température dans l’échantillon est important. Le procédé comprend une étape b) de mesure et d’acquisition au cours du chauffage, pour différentes températures, de la fluorescence de l’agent intercalant. L’étape b) est donc mise en œuvre au moins partiellement simultanément à l’étape a) de chauffage. Le fluorimètre 102 mesure la fluorescence de l’agent intercalant durant le chauffage. De préférence, au moins une valeur de température par seconde est mesurée. L’unité de traitement 103 acquiert la fluorescence au cours du chauffage. En d’autres termes, l’unité de traitement 103 acquiert les mesures réalisées par le fluorimètre 102. Les mesures de fluorescence peuvent être représentées en fonction de la température. La FIG. 3 illustre un exemple d’évolution de la fluorescence mesurée en fonction de la température. Cette courbe est connue sous le nom de courbe de fusion ou « melt curve ». Comme on peut le constater, plus la température augmente, plus la fluorescence diminue car les brins des amplicons contenus dans l’échantillon biologique (qui peuvent être d’un même ou de différents types d’amplicons) se séparent et l’agent intercalant est libéré et donc cesse d’émettre de la fluorescence. Le procédé comprend une étape c), mise en œuvre par l’unité de traitement 103, de calcul d’une évolution, en fonction de la température, d’une variation négative de la fluorescence mesurée par rapport à la température. En d’autres termes, la dérivée négative de l’évolution de la fluorescence en fonction de la température (i.e. la dérivée négative de la courbe illustrée en FIG. 4 ) est calculée. L’étape c) peut être mise en œuvre après l’étape b) ou simultanément ou partiellement simultanément à la mise en œuvre de l’étape b) (donc potentiellement partiellement simultanément à l’étape a)). Avantageusement, pour calculer la dérivée négative, la dérivée de l’évolution de la fluorescence en fonction de la température est tout d’abord calculée. Pour calculer cette dérivée, il est possible de calculer la dérivée en chaque point de la courbe représentant l’évolution de la fluorescence en fonction de la température. La valeur dérivée d’un point correspond au coefficient directeur de la tangente de la courbe en ce point. Une autre manière de calculer la dérivée consiste à effectuer une approximation (telle qu’une régression ou une interpolation) de l’évolution de la fluorescence en fonction de la température en une fonction puis de calculer la dérivée de cette fonction. En tout état de cause, l’homme du métier sait calculer la dérivée d’un ensemble de points. Puis, pour obtenir la dérivée négative, il suffit d’inverser le signe de chaque point de la dérivée. La FIG. 4 illustre une courbe de l’évolution, en fonction de la température, de la variation négative de la fluorescence mesurée par rapport à la température, i.e. de la dérivée négative de l’évolution de la fluorescence en fonction de la température. Avantageusement, comme illustré sur la FIG. 4 , si l’échantillon biologique contient au moins un type d’amplicon, on distingue sur la courbe un pic correspondant à la séparation des brins du ou des amplicons de ce type d’amplicon. Le procédé comprend une étape d), mise en œuvre par l’unité de traitement 103, de détermination d’au moins un modèle d’une courbe gaussienne correspondant à l’évolution, en fonction de la température, de la variation négative de la fluorescence mesurée par rapport à la température calculée à l’étape c). En d’autres termes, on effectue un « fitting » gaussien, c’est-à-dire que l’on cherche un modèle de courbe gaussienne qui ressemble le plus possible à l’évolution, en fonction de la température, de la variation négative de la fluorescence mesurée par rapport à la température. Encore en d’autres termes, on cherche le modèle de courbe gaussienne qui se calque le mieux possible sur une courbe représentant l’évolution, en fonction de la température, de la variation négative de la fluorescence mesurée par rapport à la température. Comme illustré en FIG. 5 , le modèle de courbe gaussienne comprend un pic (telle une courbe gaussienne bien connue de l’homme du métier). L’étape d) présente l’avantage d’ôter le bruit présent dans les valeurs de l’évolution, en fonction de la température, de la variation négative de la fluorescence mesurée par rapport à la température. En d’autres termes, l’étape d) permet de nettoyer les données correspondant à l’évolution, en fonction de la température, de la variation négative de la fluorescence mesurée par rapport à la température. On obtient par conséquent un modèle de courbe gaussienne qui est plus fiable et facile à analyser. Selon un mode de réalisation particulier, on cherche à déterminer la présence ou non d’au moins deux types d’amplicons) dans l’échantillon biologique. Par conséquent, à l’étape d), on détermine au moins deux modèles de courbes gaussiennes correspondant à l’évolution, en fonction de la température, de la variation négative de la fluorescence mesurée par rapport à la température calculée à l’étape c). Pour cela, par exemple, un premier modèle de courbe gaussienne est déterminé en réalisant un fitting gaussien. Ce premier modèle de courbe gaussienne comprend le pic le plus grand de l’évolution, en fonction de la température, de la variation négative de la fluorescence mesurée par rapport à la température. Puis, avantageusement, ce premier modèle de courbe gaussienne est soustrait de l’évolution, en fonction de la température, de la variation négative de la fluorescence mesurée par rapport à la température. Un deuxième modèle de courbe gaussienne peut ensuite être déterminé en réalisant un fitting gaussien sur l’évolution, en fonction de la température, de la variation négative de la fluorescence mesurée par rapport à la température soustraite du premier modèle de courbe gaussienne. Ce deuxième modèle de courbe gaussienne comprend le deuxième pic le plus grand de l’évolution, en fonction de la température, de la variation négative de la fluorescence mesurée par rapport à la température. Si l’on cherche à déterminer la présence ou non d’un troisième (ou encore plus) type d’amplicon, les étapes de soustraction et de fitting peuvent être réitérées. Cette méthode permet, comme on le verra plus loin, de déterminer la présence ou non de plusieurs types d’amplicons dans un échantillon biologique de manière simple et fiable. Le procédé comprend une étape e) de traitement, par l’unité de traitement 103, du modèle de courbe gaussienne de manière à déterminer la présence ou non du type d’amplicon dans l’échantillon biologique. Le type d’amplicon dont on cherche à déterminer la présence ou non dans l’échantillon biologique est d’avance connu. En d’autres termes, on ne cherche pas à détecter la présence d’un amplicon dont on ne connaît pas le type. Encore en d’autres termes, on sait ce que l’on cherche. Par exemple, on peut chercher à déterminer la présence du type d’amplicon caractéristique du virus de l’hépatite B. Avantageusement, l’étape e) comprend une étape e1) de détermination d’une température de fusion à partir du modèle de courbe gaussienne. Plus précisément, on détermine la moyenne du modèle de la courbe gaussienne est déterminée et cette moyenne est considérée comme correspondant à la température de fusion spécifique au type d’amplicon contenu dans l’échantillon biologique. La moyenne d’un modèle de courbe gaussienne est connue de l’homme du métier et est notée µ. Cette moyenne est la température correspondant à la plus grande valeur d’ordonnée (i.e. la plus grande valeur de variation négative de la fluorescence mesurée par rapport à la température). La moyenne µ est schématisée en FIG. 5 . Selon un certain mode de réalisation, la présence ou non du type d’amplicon dans l’échantillon biologique est déterminée en fonction de la température de fusion. Pour cela, la température de fusion obtenue est comparée à la température de fusion théorique du type d’amplicon que l’on cherche à détecter. Si les températures de fusion sont sensiblement identiques, il est considéré que le type d’amplicon dans l’échantillon biologique correspond à celui que l’on cherche à détecter. Sinon, il est considéré que le type d’amplicon dans l’échantillon biologique ne correspond pas à celui que l’on cherche à détecter. Un mode de réalisation avantageux va être décrit, qui est particulièrement avantageux dans le cas où le modèle de courbe gaussien n’est pas fiable. Par exemple, le pic compris dans le modèle de courbe gaussienne peut être imprécis et étalé comme illustré en FIG. 6 . Ceci rend difficile la détermination d’une valeur de température de fusion exploitable. En effet, la température de fusion que l’on obtient à partir d’un tel modèle de courbe gaussienne ne correspond pas à la température de fusion spécifique au type d’amplicon que l’on cherche à détecter. Avantageusement, l’étape e) comprend une étape e2) de détermination de l’écart-type du modèle de la courbe gaussienne. L’écart-type d’un modèle de courbe gaussienne est connu de l’homme du métier et est noté σ. L’écart-type est proportionnel à la largeur à mi-hauteur de la courbe gaussienne. En effet, on a : La largeur à mi-hauteur L est schématisée en FIG. 5 . L’écart-type caractérise le gradient de température, i.e. la distribution de températures, dans l’échantillon biologique. Plus l’écart-type est important, plus le gradient de température dans l’échantillon biologique est important ce qui peut témoigner d’un dysfonctionnement du dispositif de chauffage 101 (qui chauffe trop lentement) ou encore d’un mauvais positionnement de l’échantillon biologique par rapport au dispositif de chauffage 101. On verra que l’écart-type peut donc permettre de contrôler le bon fonctionnement du système 100 de détermination de la présence ou non d’un type d’amplicon dans l’échantillon biologique. Avantageusement, le procédé comprend une étape e3) de détermination de la présence du type d’amplicon dans l’échantillon biologique si un point d’une courbe étalon préétablie spécifique au type d’amplicon présente une abscisse sensiblement égale à l’écart-type et une ordonnée sensiblement égale à la température de fusion. En d’autres termes, on va utiliser à la fois l’écart-type et la moyenne, i.e. la température de fusion, du modèle de courbe gaussien pour déterminer la présence ou non du type d’amplicon. Pour cela, une courbe étalon est utilisée. Cette courbe étalon est utilisée de la même manière qu’une abaque. La courbe étalon représente, pour le type d’amplicon dont on cherche à déterminer la présence, des températures de fusion obtenues pour différents modèles de courbes gaussiennes en fonction de l’écart-type des différents modèles de courbes gaussiennes. Un exemple de courbe étalon est illustré en FIG. 7 . Une courbe étalon est associée à un certain type d’amplicon (i.e. le type d’amplicon dont on cherche à déterminer la présence dans l’échantillon biologique). La courbe étalon est spécifique au type d’amplicon. Les modèles de courbes gaussiennes à partir desquelles la courbe étalon est établie sont obtenus par mise en œuvre des étapes a) à d) du présent procédé à partir d’échantillons biologiques étalons contenant chacun le type d’amplicon dont on cherche à déterminer la présence ou non. Des modèles de courbes gaussiennes pour un type d’amplicon A sont illustrés en FIG. 8 . La courbe étalon est avantageusement spécifique au système 100. Par spécifique au système, il est entendu que la courbe étalon est de préférence spécifique à un certain modèle de système 100 (la courbe étalon est donc spécifique à tous les système 100 d’un même modèle), voire même, encore de préférence, spécifique à un unique système 100. En d’autres termes, la courbe étalon a été construite à partir de modèles de courbes gaussiennes obtenues par mise en en œuvre des étapes a) à d) du présent procédé au moyen du système 100. En effet, chaque système 100 peut présenter un paramétrage et/ou une configuration différents ce qui peut aboutir à des résultats différents en fonction des systèmes. Il est donc avantageux que la courbe étalon soit spécifique au système 100. La vitesse de chauffage de l’échantillon biologique à l’étape a) est différente pour l’obtention de chaque modèle de courbe gaussienne de sorte que le gradient de température est différent pour chaque échantillon biologique étalon. Ceci permet d’obtenir des modèles de courbes gaussiennes présentant des écarts-types différents de sorte que l’on peut obtenir la courbe étalon qui représente l’évolution de la température de fusion en fonction de l’écart-type pour le type d’amplicon dont on cherche à déterminer la présence ou non. La courbe étalon pour le type d’amplicon A est illustrée en FIG. 7 . En déterminant si la courbe étalon comprend un point dont l’abscisse correspond à l’écart-type obtenu pour l’échantillon biologique considéré et dont l’ordonnée correspond à la température de fusion obtenue pour l’échantillon biologique considéré, on peut conclure sur la présence ou non du type d’amplicon dans l’échantillon biologique. Si un tel point existe, il est déterminé que le type d’amplicon est présent dans l’échantillon. Par « correspond », il est entendu que l’on cherche un point dont l’abscisse correspond sensiblement à l’écart-type obtenu pour l’échantillon biologique considéré et dont l’ordonnée correspond sensiblement à la température de fusion obtenue pour l’échantillon biologique considéré. Selon un mode de réalisation où on cherche à déterminer la présence ou non de plusieurs types d’amplicons, on réalise l’étape e) indépendamment pour chaque modèle de courbe gaussienne obtenu. En d’autres termes, on détermine la présence ou non d’un premier type d’amplicon, puis d’un deuxième type d’amplicon, etc… Ainsi, le présent procédé permet de déterminer de manière simple et fiable la présence ou non d’un type d’amplicon dans l’échantillon biologique. Le présent procédé, notamment grâce au recours à une courbe étalon, présente l’avantage de permettre une détection fiable du type d’amplicon même si la vitesse de chauffage est élevée. Ainsi, l’étape de chauffage peut être accélérée sans que cela ne dégrade la fiabilité de la détection du type d’amplicon. Les étapes du procédé présenté peuvent être mises en œuvre successivement, partiellement simultanément ou simultanément. Il est proposé un procédé de contrôle du système 100 de détermination in vitro de la présence ou non d’au moins un type d’amplicon dans un échantillon biologique. Le procédé de contrôle vise à caractériser le fonctionnement du système 100. Le procédé de contrôle permet de manière simple et fiable des dysfonctionnements du système 100. Le procédé de contrôle comprend la mise en œuvre des étapes du procédé de détermination présenté précédemment pour déterminer in vitro la présence ou non d’au moins un type d’amplicon de contrôle dans un échantillon biologique de contrôle. Par « échantillon biologique de contrôle », il est entendu un échantillon biologique pour lequel il est connu qu’il comprend un certain type d’amplicon, dit type d’amplicon de contrôle. En d’autres termes, on sait que l’échantillon biologique contient le type d’amplicon de contrôle, par exemple un type d’amplicon spécifique au virus de l’hépatite B. Par conséquent, on s’attend à ce que la mise en œuvre procédé de détermination pour déterminer in vitro la présence ou non du type d’amplicon de contrôle dans l’échantillon biologique de contrôle au moyen du système 100 aboutisse à la détermination de la présence du type d’amplicon de contrôle dans l’échantillon biologique de contrôle. Sinon, on peut conclure à un dysfonctionnement du système 100. Le procédé de contrôle comprend donc la mise en œuvre d’une étape f) de caractérisation du fonctionnement du système 100 en fonction du résultat de l’étape de détermination de la présence ou non du type d’amplicon de contrôle dans l’échantillon biologique de contrôle. L’étape f) peut être mise en œuvre par l’unité de traitement 103. Si la présence du type d’amplicon de contrôle est déterminée, le fonctionnement du système 100 est considéré comme bon. Si la présence du type d’amplicon de contrôle n'est pas déterminée (i.e. le type d’amplicon de contrôle n’est pas détecté), le fonctionnement du système 100 est considéré comme mauvais. En d’autres termes, le système 100 présente des dysfonctionnements. Dans ce cas, des mesures correctives peuvent être mises en œuvre. Le dysfonctionnement peut par exemple provenir d’un dysfonctionnement du fluorimètre 102. Par exemple, le fluorimètre 102 peut acquérir des données de fluorescence erronées. Dans ce cas, une mesure corrective peut consister à régler/paramétrer le fluorimètre 102 ou par remplacer le fluorimètre 102 par un fluorimètre ne présentant pas de dysfonctionnement. Le dysfonctionnement peut par exemple provenir d’un dysfonctionnement du dispositif de chauffage 101. Par exemple, le dispositif de chauffage 101 peut ne pas chauffer assez fort et/ou assez vite ou lentement. Alternativement ou en outre, l’échantillon biologique peut ne pas être positionné correctement sur le dispositif de chauffage 101 (par exemple par assez proche et/ou pas centré). Avantageusement, le procédé de contrôle comprend une étape g) de caractérisation du fonctionnement du dispositif de chauffage 101. L’étape g) peut être mise en œuvre par l’unité de traitement 103. Plus précisément, à l’étape g), le fonctionnement du dispositif de chauffage 101 est caractérisé en fonction d’un gradient de température dans l’échantillon biologique de contrôle déterminé à partir de l’écart-type du modèle de la courbe gaussienne. En effet, l’écart-type du modèle de la courbe gaussienne permet de caractériser le gradient de température dans l’échantillon biologique de contrôle . Plus l’écart-type est important, plus le gradient de température dans l’échantillon biologique de contrôle est important. Un gradient de température dans l’échantillon biologique trop important n’est pas souhaité dans la mesure où cela indique que la température de l’échantillon biologique n’est pas homogène. Par conséquent, les amplicons dans l’échantillon biologique ne vont pas se déshybrider au même moment en fonction de leur position dans l’échantillon biologique. Pourtant, à un instant t, une mesure de fluorescence sera acquise pour une unique valeur de température qui est par exemple celle communiquée par un thermocouple à l’unité de traitement 103 à cet instant t. Les données de fluorescence acquises peuvent donc ne pas permettre de déterminer la présence d’un type d’amplicon dans l’échantillon. A l’issue de l’étape g), il peut être détecté un dysfonctionnement du dispositif de chauffage 101. Par exemple, un dysfonctionnement peut être détecté si le gradient de température est supérieur à un seuil déterminé en fonction de l’instrument et des spécifications techniques de ce dernier. Dans ce cas, une mesure corrective peut être mise en œuvre telle que le réglage/paramétrage du dispositif de chauffage 101 ou son remplacement par un nouveau dispositif de chauffage. Alternativement ou en outre, l’échantillon biologique peut être repositionné correctement sur le dispositif de chauffage 101 (par exemple plus proche et/ou plus centré). Les Figures 9, 10 et 11 illustrent un mode de réalisation dans lequel la chambre réactionnelle varie en épaisseur, avec en ordonnée la hauteur de pic en RFU (Unité de fluorescence relative – « Relative Fluorescence Unit ») et en abscisse la température en degrés Celsius. Ainsi, en FIG. 9 , on voit une première courbe en pointillé représentant un pic de fusion lorsque la chambre réactionnelle présente une épaisseur déterminée e1 et une deuxième courbe en trait continu représentant un pic de fusion lorsque la chambre réactionnelle présente une épaisseur déterminée e2, e2 étant inférieure à e1. On remarque que le gradient thermique est plus haut lorsque la chambre réactionnelle est plus épaisse et que la largeur de pic de fusion est plus importante pour la chambre réactionnelle plus épaisse du fait du gradient thermique plus élevé. En figures 10 et 11, on observe une première courbe en pointillé représentant un pic de fusion lorsque la chambre réactionnelle présente une épaisseur déterminée e1, une deuxième courbe en pointillé discontinu avec un point représentant un pic de fusion lorsque la chambre réactionnelle présente une épaisseur déterminée e2, une troisième courbe en pointillé discontinu avec deux points représentant un pic de fusion lorsque la chambre réactionnelle présente une épaisseur déterminée e2 ; e1 étant supérieure à e2. En FIG. 11 , une ligne continue représente le double pic avec la chambre réactionnelle d’épaisseur e2. La réduction d’épaisseur de la chambre réactionnelle permet d’obtenir des pics de fusion dont la largeur est plus étroite, ce qui permet une meilleure détermination sur des cas de pics de fusion multiple et une meilleure séparation de ces derniers. Procédé de détermination in vitro de la présence ou non d’au moins un type d’amplicon dans un échantillon biologique ayant subi une amplification en chaîne par polymérase, un amplicon comprenant deux brins, l’échantillon comprenant au moins un agent intercalant apte à être fluorescent lorsqu’il est intercalé dans un amplicon, le procédé comprenant la mise en œuvre des étapes suivantes : - a) chauffage de l’échantillon biologique de sorte que les deux brins de chaque amplicon du type d’amplicon se séparent si un ou des amplicons du type d’amplicon sont présents dans l’échantillon biologique ; - b) mesure et d’acquisition au cours du chauffage, pour différentes températures, de la fluorescence de l’agent intercalant ; - c) calcul d’une évolution, en fonction de la température, d’une variation négative de la fluorescence mesurée par rapport à la température ; - d) détermination d’au moins un modèle d’une courbe gaussienne correspondant à l’évolution, en fonction de la température, de la variation négative de la fluorescence mesurée par rapport à la température calculée à l’étape c) ; - e) traitement du modèle de courbe gaussienne de manière à déterminer la présence ou non du type d’amplicon dans l’échantillon biologique. Procédé selon la revendication 1, dans lequel l’étape e) comprend une étape e1) de détermination d’une température de fusion correspondant à la moyenne du modèle de la courbe gaussienne et la présence ou non du type d’’amplicon dans l’échantillon biologique est déterminée en fonction de la température de fusion. Procédé selon la revendication 2, dans lequel l’étape e) comprend une étape e2) de détermination de l’écart-type du modèle de la courbe gaussienne et une étape e3) de détermination de la présence du type d’amplicon dans l’échantillon biologique si un point d’une courbe étalon préétablie spécifique à l’amplicon présente une abscisse sensiblement égale à l’écart-type et une ordonnée sensiblement égale à la température de fusion, ladite courbe étalon représentant pour le type d’amplicon des températures de fusion obtenues pour différents modèles de courbes gaussiennes en fonction de l’écart-type des différents modèles de courbes gaussiennes. Procédé selon la revendication 3, dans lequel lesdits modèles de courbes gaussiennes à partir desquelles la courbe étalon est établie sont obtenus par mise en œuvre des étapes a) à d) du présent procédé, la vitesse de chauffage de l’échantillon biologique à l’étape a) étant différente pour l’obtention de chaque modèle de courbe gaussienne. Procédé selon l’une quelconque des revendications 1 à 4, dans lequel on cherche à déterminer la présence ou non d’au moins deux types amplicons dans l’échantillon biologique et dans lequel, à l’étape d), on détermine au moins deux modèles de courbes gaussiennes correspondant à l’évolution, en fonction de la température, de la variation négative de la fluorescence mesurée par rapport à la température calculée à l’étape c) et dans lequel, à étape e), on détermine la présence ou non des types d’amplicons dans l’échantillon biologique en fonction des modèles. Système (100) de détermination in vitro de la présence ou non d’un type d’amplicon dans un échantillon biologique ayant subi une amplification en chaîne par polymérase, un amplicon comprenant deux brins, l’échantillon comprenant au moins un agent intercalant apte à être fluorescent lorsqu’il est intercalé dans un amplicon, le système (100) comprenant : - un dispositif de chauffage (101) adapté pour chauffer l’échantillon biologique de sorte que les deux brins de chaque amplicon du type d’amplicon se séparent si un ou des amplicons du type d’amplicon sont présents dans l’échantillon biologique ; - un fluorimètre (102) adapté pour mesurer la fluorescence de l’agent intercalant ; - une unité de traitement (103) configurée pour : - acquérir, au cours du chauffage, pour différentes températures, la fluorescence de l’agent intercalant ; - calculer une évolution, en fonction de la température, une variation négative de la fluorescence mesurée par rapport à la température ; - déterminer au moins un modèle d’une courbe gaussienne correspondant à l’évolution, en fonction de la température, la variation négative de la fluorescence mesurée par rapport à la température calculée ; - traiter le modèle de courbe gaussienne de manière à déterminer la présence ou non du type d’amplicon dans l’échantillon biologique. 7. Système (100) selon la revendication 6, dans lequel le dispositif de chauffage (101) est un module Peltier. 8. Système (100) selon l’une quelconque des revendications 6 et 7, dans lequel l’échantillon biologique est disposé dans une chambre d’une carte d’analyse (1). Procédé de contrôle d’un système (100) selon les revendications 6 à 8, le procédé comprenant la mise en œuvre des étapes du procédé selon l’une quelconque des revendications 1 à 5 pour déterminer in vitro la présence ou non d’au moins un type d’amplicon de contrôle dans un échantillon biologique de contrôle et la mise en œuvre d’une étape f) de caractérisation du fonctionnement du système (100) en fonction du résultat de l’étape de détermination de la présence ou non du type d’’amplicon de contrôle dans l’échantillon biologique de contrôle. Procédé selon la revendication 9, comprenant une étape g) de caractérisation du fonctionnement du dispositif de chauffage (101) en fonction d’un gradient de température dans l’échantillon biologique de contrôle déterminé à partir de l’écart-type du modèle de la courbe gaussienne. Utilisation du procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 5 pour le traitement d’un signal de fusion.