Brevet FR3162989A1 — publié le 20251212

L’invention appartient au domaine des pathologies impactant le système nerveux central, notamment les pathologies cérébrales sévères, en particulier celles restreintes par la présence de la barrière hémato-encéphalique (BHE) : Gliomes, métastases cérébrales, maladies neurodégénératives (e.g., Alzheimer, Parkinson ou SLA), maladies génétiques (Huntington, myopathies, syndrome de Leigh, syndrome de Rett), mais aussi au domaine des cancers, des troubles musculo-squelettiques et immunologiques, des maladies vasculaires (thrombus) au niveau de nombreux organes (e.g., foie, rein ou muscle) et en combinaison avec de nombreuses approches thérapeutiques (e.g., chimiothérapie, immunothérapie, thérapie ciblée ou thérapie génique). L’invention concerne une microbulle comprenant un polymère ou copolymère fluoré et un gaz fluoré, son utilisation ainsi que les composés intermédiaires polymère ou copolymère. Figure abrégée : 0 MICROBULLE COMPRENANT UN POLYMERE OU COPOLYMERE FLUORE ET UN GAZ FLUORE L’invention appartient au domaine des pathologies impactant le système nerveux central, notamment les pathologies cérébrales sévères, en particulier celles restreintes par la présence de la barrière hémato-encéphalique (BHE) : Gliomes, métastases cérébrales, maladies neurodégénératives (e.g., Alzheimer, Parkinson ou SLA), maladies génétiques (e.g., Huntington, myopathies, syndrome de Leigh ou syndrome de Rett), mais aussi au domaine des cancers, des troubles musculo-squelettiques et immunologiques, des maladies vasculaires (thrombus) au niveau de nombreux organes (e.g., cerveau, foie, rein ou muscle) et en combinaison avec de nombreuses approches thérapeutiques (e.g., chimiothérapie, immunothérapie, thérapie ciblée ou thérapie génique). L’invention concerne une microbulle comprenant un polymère ou copolymère fluoré et un gaz fluoré, son utilisation pour le traitement des pathologies précitées, ainsi que les composés intermédiaires polymère ou copolymère compris dans la microbulle. Etat de la technique L’efficacité et l’émergence de traitements innovants contre les pathologies cérébrales sévères sont restreints par la présence de la barrière hémato-encéphalique (BHE) bloquant le passage de plus de 95% de molécules thérapeutiques du sang vers les cellules pathologiques. La BHE se compose de cellules endothéliales reliées entre-elles par des jonctions serrées bloquant la diffusion des agents thérapeutiques. Plusieurs études ont démontré que les ultrasons focalisés peuvent être utilisés à travers le crâne pour délivrer des molécules dans le cerveau. Combinés à l’injection de microbulles (agents ultrasonores) par voie intraveineuse, les ultrasons peuvent induire une ouverture localisée et réversible de la BHE par sono-perméabilisation. En effet, les oscillations des bulles induites par les ultrasons fragilisent les jonctions serrées présentes au niveau de l’endothélium vasculaire cérébral et favorisent le passage de molécules vers le tissu extravasculaire. La durée et l’efficacité de l’ouverture de la BHE peuvent être contrôlées en modifiant les paramètres ultrasonores. Typiquement, des ultrasons pulsés sont transmis au point focal pendant quelques minutes. Depuis 2015, plusieurs essais cliniques portant sur l’évaluation de l’innocuité et la validation du bénéfice de la sono-perméabilisation pour le traitement local (quelques cm 3 ) du cancer ou de maladies neurodégénératives sont menés. Néanmoins, dans le cas de pathologies diffuses dans le cerveau (e.g., métastases cancéreuses, Alzheimer, maladies génétiques), il devient nécessaire de perméabiliser la BHE sur de grands volumes, voire la globalité du parenchyme cérébral. Ce traitement généralisé constitue un enjeu clinique majeur. A ce jour, l’implant SonoCloud-9 (Carthera) propose un traitement clinique élargi en augmentant la surface des dispositifs ultrasonores. Cette approche invasive reste néanmoins limitée à la taille de l’implant thérapeutique. En transcrânien, les ultrasons peuvent être focalisés successivement en plusieurs points afin d’élargir la zone traitée. La durée du traitement est alors considérablement augmentée (plusieurs minutes par point) pouvant aller jusqu’à plusieurs heures. Cette option est incompatible avec la faible stabilité des bulles dans le sang (typiquement 5 min). Une des solutions envisagées consiste à réinjecter, de manière répétée (toutes les 3 à 5 min), des microbulles par voie intraveineuse. Toutefois, la durée et l’efficacité du traitement restent fortement limitées par le volume total d’agents ultrasonores injectables dans l’organisme. Un problème majeur en thérapie par ultrasons est la durée de vie limitée des microbulles dans l’organisme. Si cela ne pose pas de difficultés pour le traitement chez le rongeur (petit volume à traiter), la rapide dissolution des agents ultrasonores dans l’organisme devient problématique dès que le volume à traiter atteint quelques cm 3 . En effet, le gaz contenu dans l’agent ultrasonore (microbulle) s’échappe dès les premières secondes après administration, rendant l’agent instable et diminuant considérablement sa durée de vie dans le sang (demi-vie de l’ordre de quelques minutes). Il devient donc nécessaire de disposer d’un agent, suffisamment sensible aux ultrasons pour induire un effet biologique, conservant sa stabilité dans le sang par une diffusion lente du gaz au travers de la coque [1]. Il existe donc un besoin d’améliorer ces traitements, notamment en des agents ultrasonores, sous forme de microbulles, à la stabilité fortement améliorée, afin de favoriser la pénétration de médicaments dans le cerveau, ou dans d’autres organes, sur de larges volumes. Ce problème de stabilité des microbulles est également un frein en échographie moléculaire de contraste. Dans cette modalité d’imagerie, les agents fonctionnalisés injectés ciblent un récepteur spécifique vasculaire surexprimé lors d’une pathologie (e.g., cancer, inflammation). Il faut alors attendre un certain temps pour que les microbulles en circulation atteignent leurs cibles et se fixent aux récepteurs. Ce délai est généralement restreint à 10 min car au-delà de ce temps, les microbulles injectées sont entièrement dissoutes dans l’organisme. L’utilisation d’agents plus stables permettrait donc de favoriser la fixation des microbulles aux récepteurs ciblés et conduirait à un rehaussement du signal en imagerie moléculaire. L’invention propose une nouvelle formulation d’agents ultrasonores, sous forme de microbulles, lesdites microbulles comprenant un cœur de perfluorocarbure (PFC) et d’une coquille à base de polymères ou copolymères fluorés. Les agents ultrasonores, sous forme de microbulles, selon l’invention permettent de perméabiliser transitoirement la barrière hémato-encéphalique et de favoriser la pénétration de médicaments dans le cerveau sur de larges volumes. Les microbulles selon l’invention, sont des agents de contraste ultrasonores disposant d’une coque à base de polymères ou copolymères fluorés qui améliorent la stabilité de ces agents dans le sang et leur sensibilité aux ultrasons. Ces agents plus stables devraient permettre ainsi un traitement prolongé, offrant ainsi la possibilité de traiter un volume plus important du cerveau. Il a notamment été permis d’obtenir des agents à la stabilité améliorée par l’utilisation de polymères ou copolymères amphiphiles portant des chaînons fluorés pour favoriser l’ancrage des polymères ou copolymères à l’interface fluor/sang. L’administration des microbulles à base de polymères ou copolymères fluorés selon l’invention, améliore substantiellement la durée du traitement ultrasonore, qui peut être appliqué au moins trois fois plus longtemps qu’avec les agents utilisés conventionnellement. La perméabilisation des barrières biologiques peut être obtenue en combinant des ultrasons avec l’administration de microbulles selon l’invention. Cette méthode permet notamment d’augmenter la délivrance de médicaments et améliorer l’effet thérapeutique. Une des applications premières des microbulles selon l’invention est ainsi l’ouverture de la barrière hémato-encéphalique pour la délivrance de médicaments dans le cerveau. Cette approche est polyvalente et peut aussi être utilisée pour traiter diverses pathologies aux niveaux de nombreux organes (e.g., foie, rein, muscle) et en combinaison avec de nombreuses approches thérapeutiques (e.g., chimiothérapie, immunothérapie, thérapie ciblée, thérapie génique). Les microbulles selon l’invention peuvent aussi être mise en œuvre comme agents de contraste ultrasonores dans le domaine de l’imagerie moléculaire. L’invention porte ainsi sur un agent de contraste ultrasonore, sous la forme d’une microbulle comprenant un polymère ou un copolymère fluoré, et un gaz fluoré, de préférence choisi parmi les perfluorocarbures et l’hexafluorure de soufre. On entend par « polymère ou un copolymère fluoré », un polymère ou copolymère comprenant au moins un groupe alkyle ou aryle fluoré. Avantageusement, la microbulle selon l’invention peut avoir un diamètre compris dans un intervalle allant de 1 à 10 micromètres, de préférence de 1 à 5 micromètres (mesuré par mesure optique ou granulométrique). Avantageusement, le perfluorocarbure peut être choisi parmi le perfluorobutane (decafluorobutane), le perfluoropropane (octafluoropropane), le perfluoroethane, le perfluoropentane, le perfluorohexane, et leurs mélanges, de préférence le perfluorobutane (decafluorobutane) et le perfluoropropane (octafluoropropane). Avantageusement, la microbulle selon l’invention peut comprendre en outre au moins un gaz supplémentaire. Le gaz supplémentaire peut être choisi parmi l’air, l’oxygène, l’azote, le monoxyde d'azote, et leurs mélanges. Avantageusement, le ratio volumique entre le gaz fluoré et le au moins un gaz supplémentaire, dans la microbulle selon l’invention, peut être compris dans un intervalle allant de 90:10 à 50:50, de préférence de 80:20 à 60:40. Avantageusement, dans la microbulle selon l’invention, le polymère ou copolymère fluoré peut être choisi parmi les copolymères de formules I : [Chem 1] Formule I dans laquelle , PEG représente un groupe polyéthylèneglycol dont la masse molaire est comprise dans un intervalle allant de 2000 à 50000 g/mol, de préférence de 2000 à 5000 g/mol, p est un entier compris dans un intervalle allant de 5 à 50, de préférence de 5 à 15, chaque R 1 représente indépendamment H ou CH 3 , chaque R 2 représente indépendamment soit un groupe alkyle fluoré en C2 à C20, linéaire ou ramifié, portant optionnellement un aryle en C5 à C7 fluoré, soit un groupe aryle fluoré en C5 à C7 ; R 3 et R 4 représentent indépendamment H ou CH 3 ; et X représente un groupe halogéné, de préférence choisi parmi Br, Cl et I. On entend par « groupe alkyle fluoré » ou « aryle fluoré », un groupe alkyle ou aryle, dans lequel tout ou partie des atomes d’hydrogène ont été remplacés par des atomes de fluor. A titre d’illustration, un groupe « éthyle fluoré » peut être représenté par exemple par -CH 2 CF 3 ou -CF 2 CF 3 et un « phényle fluoré » peut être représenté par exemple par -C 6 H 2 F 3 ou -C 6 F 5 . Avantageusement, la microbulle selon l’invention peut être une microbulle dans laquelle le polymère est de formule I, et dans laquelle le groupe R 2 peut être choisi parmi le 2,2,2-trifluoroéthyle, 2,2,3,3,3-pentafluoropropyle, 2,2,3,3,4,4,4-heptaafluorobutyle, 1H,1H,2H,2H-tridécafluoro-n-octyle, 1H,1H,2H,2H-heptadécafluorodecyle, 2,2,3,4,4,4-hexafluorobutyle, 2,2,3,3-tétrafluoropropyle, 1H,1H,2H,2H-nonafluorohexyle, 1H,1H,5H-octafluoropentyle, 2,2,3,3,4,4,5,5,6,6,7,7-dodécafluoroheptyle, hexafluoroisopropyle, pentafluorobenzyle et pentafluorophenyle. De préférence, le groupe R 2 est choisi parmi le 2,2,2-trifluoroéthyle, le 2,2,3,3,3-pentafluoropropyle, et l’hexafluoroisopropyle. Avantageusement, dans la microbulle selon l’invention, le polymère ou copolymère fluoré peut être choisi parmi les polymères de formules II : [Chem 2] Formule II dans laquelle, n et m sont des entiers positifs compris dans un intervalle allant de 10 à 100, y est un entier positif inférieur ou égal à n, z est un entier positif inférieur ou égal à m, chaque groupe R représente indépendamment un groupe alkyle fluoré en C2 à C20, linéaire ou ramifié, ou un groupe polyéthylèneglycol dont la masse molaire est comprise dans un intervalle allant de 500 à 2000 g/mol, au moins un des groupes R étant un groupe alkyle fluoré. On entend par taux de greffage de groupements fluorés, la proportion de groupes fluorés liés de façon covalente aux unités de poly(acide malique). Taux = nombre de moles de groupe fluoré lié/ nombre de moles total d’acide malique (x100 pour le pourcentage). Le taux de greffage est déterminé par RMN. Le nombre n représente le nombre d’unité alpha du PMA. Le nombre m représente le nombre d’unité beta du PMA. Le nombre y représente le nombre d’unités alpha du PMA substituées par un groupe fluoré. Le nombre z représente le nombre d’unités beta du PMA modifiées par un groupe fluoré. On entend par taux de greffage de groupements PEG, la proportion de groupes PEG liés de façon covalente aux unités de poly(acide malique). Taux = nombre de mole de groupe PEG lié/ nombre de mole total d’acide malique (x100 pour le pourcentage). Le taux de greffage est déterminé par RMN. Le nombre n représente le nombre d’unité alpha du PMA. Le nombre m représente le nombre d’unité beta du PMA. Le nombre y représente le nombre d’unités alpha du PMA substituées par un groupe PEG. Le nombre z représente le nombre d’unités beta du PMA modifiées par un groupe PEG. Avantageusement, lorsque le polymère est de formule II, le taux de greffage de groupes fluorés peut être compris dans un intervalle allant de 1 à 30%, de préférence de 5 à 25%. Avantageusement, lorsque le polymère est de formule II, le taux de greffage de groupes PEG peut être compris dans un intervalle allant de 0 à 50%, de préférence de 0 à 30%. Avantageusement, la microbulle selon l’invention peut être une microbulle dans laquelle le polymère est de formule II, et dans laquelle le groupe R peut être choisi parmi 1H,1H,2H,2H-heptadécafluoro-1-décyl, 2,2,3,3,4,4,4-heptafluoro-1-butyl, 2,2,2-trifluoroéthyl, 1H,1H-perfluoro-1-heptyl, 1H,1H-heptadécafluoro-1-nonyl, 1H,1H-perfluorododécan-1-ol, 1H,1H-perfluoro-1-tétradécyl, perfluoro-tert-butyl, hexafluoro-2-4-bis(trifluorométhyl)-1-pentyl. De préférence R est choisi parmi le 1H,1H,2H,2H-heptadécafluoro-1-décyl, l’ heptafluoro-1-butyl et le perfluoro-tert-butyl. Avantageusement, la microbulle selon l’invention peut comprendre en outre un lipide. On entend par « lipide », une molécule amphiphile comprenant une fraction hydrophile (par exemple, un groupe de tête polaire) et une fraction lipophile ou hydrophobe. La fraction lipophile ou hydrophobe peut comprendre au moins une fraction d'acide gras ramifiée ou linéaire, saturée ou insaturée, ou un dérivé ou un analogue de celle-ci (par exemple, un fluorocarbure). Une fraction d'acide gras consiste essentiellement en une fraction/chaîne d'hydrocarbures, en particulier une chaîne acyle. De préférence, la fraction d'acide gras ou son dérivé ou analogue a une longueur de 10 à 30, de préférence de 12 à 25, de préférence encore de 14 à 22 atomes de carbone. Si le lipide comprend plus d'un, par exemple deux ou trois, groupements d'acides gras ou leurs dérivés ou analogues, ces groupements d'acides gras ou leurs dérivés ou analogues peuvent être identiques ou différents. Le terme « lipide » comprend les lipides cationiques et les lipides non cationiques, c'est-à-dire les lipides neutres ou anioniques. Les lipides peuvent comprendre les phospholipides ou leurs dérivés, les glycérolipides ou leurs dérivés, les sphingolipides (par exemple, la sphingomyéline) ou leurs dérivés, ou les stérols lipides (par exemple, le cholestérol) ou leurs dérivés. Les glycérolipides sont composés de glycérols mono-, di- ou tri-substitués par des groupements d'acides gras. Les phospholipides, dont la partie hydrophile comprend un groupe phosphate, peuvent être des glycérophospholipides. Les lipides peuvent également être fonctionnalisés/modifiés, par exemple avec des (oligo)peptides, des polymères (par exemple, PEG) ou d'autres groupes fonctionnels. Dans un milieu aqueux, les lipides peuvent en outre être organisés de manière supramoléculaire, par exemple sous la forme de particules à base de lipides ou de phases lyotropes, telles que les liposomes, les phases lamellaires, les phases hexagonales et hexagonales inversées, les phases cubiques, les micelles et les micelles inversées composées de monocouches. L'effet de stabilisation selon la présente invention s'applique à tous les types d'organisation lipidique supramoléculaire. De préférence, les lipides utilisés dans l'invention sont pharmaceutiquement acceptables, c'est-à-dire qu'ils conviennent comme excipients, comme composants de formulations d'administration de médicaments. Avantageusement, la microbulle selon l’invention peut être une microbulle dans laquelle le lipide est choisi parmi 1,2-distéaroyl-sn-glycéro-3-phosphoglycérol (DPPG), 1,2-dipalmitoyl-sn-glycéro-3-phosphocholine (DPPC), 1,2-distéaroyl-sn-glycéro-3-phosphocholine (DSPC), 1,2-dimyristoyl-sn-glycéro-3-phosphocholine (DMPC), 1,2-dipalmitoyl-sn-glycéro-3-phosphoéthanolamine-N-[méthoxy(polyéthylène glycol)-5000 (DPPE-PEG5000), 1,2-dipalmitoyl-sn-glycéro-3-phosphoéthanolamine-N-[méthoxy(polyéthylène glycol)-2000 (DPPE-PEG2000), 1,2-dipalmitoyl-sn-glycéro-3-phosphoéthanolamine-N-[méthoxy(polyéthylène glycol)-1000 (DPPE-PEG1000), 1,2- distéaroyl -sn-glycéro-3-phosphoéthanolamine-N-[méthoxy(polyéthylène glycol)-5000 (DSPE-PEG5000), 1,2- distéaroyl -sn-glycéro-3-phosphoéthanolamine-N-[méthoxy(polyéthylène glycol)-2000 (DSPE-PEG2000), 1,2- distéaroyl -sn-glycéro-3-phosphoéthanolamine-N-[méthoxy(polyéthylène glycol)-1000 (DSPE-PEG1000), 1,2- dimyristoyl -sn-glycéro-3-phosphoéthanolamine-N-[méthoxy(polyéthylène glycol)-5000 (DMPE-PEG5000), 1,2- dimyristoyl -sn-glycéro-3-phosphoéthanolamine-N-[méthoxy(polyéthylène glycol)-2000 (DMPE-PEG2000), 1,2- dimyristoyl -sn-glycéro-3-phosphoéthanolamine-N-[méthoxy(polyéthylène glycol)-1000 (DMPE-PEG1000), 1,2- dimyristoyl -sn-glycéro-3-phosphate (DMPA), 1,2-dipalmitoyl-sn-glycéro-3-phosphate (DPPA), 1,2-distéaroyl-sn-glycéro-3-phosphate (DSPA), 1,2-dioléoyl-sn-glycéro-3-phosphocholine (DOPC), 1,2-dipalmitoyl-sn-glycéro-3-phospho-L-serine (sodium salt) (DPPS), 1,2-dimyristoyl-sn-glycéro-3-phosphoéthanolamine (DMPE), 1,2-dipalmitoyl-sn-glycéro-3-phosphoéthanolamine (DPPE), 1,2-distéaroyl-sn-glycéro-3-phosphoéthanolamine (DSPE), 1,2-dioléoyl-sn-glycéro-3-phosphoéthanolamine(DOPE), 1,dalmitoyl-2-oléoyl-sn-glycéro-3-phosphoglycérol (POPG), phosphatidylcholine d’œuf, phosphatidylcholine de soja et leurs mélanges. De préférence, le lipide est choisi parmi DSPC, DPPC, DMPC, DSPE-PEG2000, DPPE-PEG2000, DMPE-PEG2000 et leurs mélanges. Avantageusement, la microbulle selon l’invention peut être une microbulle dans laquelle le ratio massique lipide(s) / polymère ou copolymère fluoré est compris dans un intervalle allant de 0,1 à 0,9, de préférence de 0,5 à 0,9. L’invention porte également sur une composition comprenant des microbulles selon l’invention et une solution aqueuse. Avantageusement, la concentration en polymère ou copolymère dans la composition selon l’invention peut être comprise entre 0,01 et 10 mg/mL. Avantageusement, la solution aqueuse de la composition selon l’invention peut comprendre un tampon, du glucose et/ou du sérum physiologique. Avantageusement, la concentration en microbulles dans la composition selon l’invention peut être comprise entre 10 5 et 10 1 4 microbulles par mL de solution aqueuse, de préférence de 10 6 et 10 12 microbulles par mL. L’invention se rapporte également à une microbulle ou une composition selon l’invention pour son utilisation dans la perméabilisation de la barrière hémato-encéphalique. L’invention porte aussi sur une microbulle ou une composition selon l’invention pour son utilisation dans une thérapie par ultrasons. La thérapie par ultrasons peut être mise en œuvre dans le traitement de pathologies diffuses dans le cerveau, en chimiothérapie, en immunothérapie, en thérapie ciblée, pour l’activation de cellules gliales et en thérapie génique, de préférence choisies parmi les gliomes, les métastases cérébrales, les maladies neurodégénératives (e.g. Alzheimer, Parkinson, SLA), et les maladies génétiques (e.g. Huntington, Leigh, myopathies, syndrome de Leigh ou syndrome de Rett). L’invention se rapporte aussi à une microbulle ou une composition selon l’invention pour son utilisation dans une thérapie par ultrasons dans le traitement de pathologies aux niveaux des organes (e.g., foie, rein, muscle) telles que par exemple thrombus, ou des cancers de la prostate, du sein, du pancréas, de la vessie, mélanomes, ou du colon, et en combinaison dans une approche thérapeutique complémentaire. Ladite approche thérapeutique complémentaire peut être choisie parmi chimiothérapie, immunothérapie, thérapie ciblée, thérapie génique. L’invention se rapporte aussi à une microbulle ou une composition selon l’invention pour son utilisation comme agent de contraste ultrasonore dans l’imagerie moléculaire. Selon cette utilisation, un anticorps ou un peptide peut être lié à la bulle pour cibler un récepteur d’intérêt. L’invention porte sur un copolymère de formule I : [Chem 3] Formule I dans laquelle, PEG représente un groupe polyéthylèneglycol dont la masse molaire est comprise dans un intervalle allant de 2000 à 50000 g/mol, de préférence de 2000 à 5000 g/mol, p est un entier compris dans un intervalle allant de 5 à 50, de préférence de 5 à 15, chaque R 1 représente indépendamment H ou CH 3 , chaque R 2 représente indépendamment soit un groupe alkyle fluoré en C2 à C20, linéaire ou ramifié, portant optionnellement un aryle en C5 à C7 fluoré, soit un groupe aryle fluoré en C5 à C7 R 3 et R 4 représentent indépendamment H ou CH 3 ; et X représente un groupe halogéné, de préférence choisi parmi Br, Cl et I. L’invention porte sur un polymère de formule II : [Chem 4] Formule II dans laquelle, n et m sont des entiers positifs compris dans un intervalle allant de 10 à 100, y est un entier positif inférieur ou égal à n, z est un entier positif inférieur ou égal à m, chaque groupe R représente indépendamment un groupe alkyle fluoré en C2 à C20, linéaire ou ramifié, ou un groupe polyéthylèneglycol dont la masse molaire est comprise dans un intervalle allant de 500 à 2000 g/mol, au moins un des groupes R étant un groupe alkyle fluoré. L’invention relève encore d’un procédé A de formation de microbulles selon l’invention, comprenant les étapes : A1) dissolution directe du polymère ou copolymère de formule I ou II dans une solution aqueuse à une concentration en polymère ou copolymère comprise dans un intervalle allant de 0,01 à 10 mg/mL de solution aqueuse ; A2) échange gazeux de la solution obtenue à l’étape A1) avec un gaz fluoré, sous agitation ; et obtention de microbulles ; ou d’un procédé B de formation de microbulles selon l’invention, comprenant les étapes : B1) formation d’un film mince par mise en contact d’un polymère ou copolymère de formule I ou II et optionnellement d’au moins un lipide dans un solvant organique, de préférence le chloroforme, B2) mise une solution aqueuse du film mince obtenu à l’étape B1), à une concentration en polymère ou copolymère comprise dans un intervalle allant de 0,01 à 10 mg/mL de solution aqueuse ; B3) échange gazeux de la solution obtenue à l’étape B2) avec un gaz fluoré, sous agitation ; et obtention de microbulles. Avantageusement, les étapes A1), A2), B1), B2) et B3) des procédés A ou B selon l’invention peuvent être réalisées à température ambiante (de 15 à 25°C). Brève description des figures FIG. 1 La FIG. 1 représente une observation par microscopie optique de microbulles micrométriques stabilisées par un polymère fluoré. FIG. 2 La FIG. 2 représente un schéma des différentes microbulles : SonoVue, lipidiques ou mélange lipides-copolymères fluorés ainsi que leur distribution de taille. FIG. 3 La FIG. 3 représente l’évolution des microbulles dans le temps. A : Distribution de la taille des microbulles au cours du temps. B : Concentration des microbulles en fonction du temps. FIG. 4 La FIG. 4 représente la réponse harmonique des microbulles. A : Réponse acoustique dans le domaine fréquentiel pour chaque type de bulle à une pression appliquée de 90 kPa. B : Mesure du deuxième harmonique tracé en fonction de la pression appliquée pour les SonoVue, les microbulles lipidiques LIP et les microbulles stabilisées par un polymères fluorés POL. FIG. 5 La FIG. 5 représente la réponse ultraharmonique des microbulles. A : Tracé de la réponse fréquentielle pour chaque type de bulles à une pression appliquée de 220 kPa. B : Mesure des ultraharmoniques tracé en fonction de la pression appliquée pour les SonoVue, les microbulles lipidiques LIP et les microbulles stabilisées par un polymères fluorés POL. FIG. 6 La FIG. 6 représente le protocole expérimental de perméabilisation de la barrière hémato-encéphalique par ultrasons. FIG. 7 La FIG. 7 représente la perméabilisation de la barrière hémato-encéphalique par ultrasons chez la souris à l'aide de microbulles. De gauche à droite, de haut en bas : Représentation schématique de la trajectoire et des paramètres du faisceau ultrasonore. Image IRM pondérée en T 1 du contrôle sans injection de microbulles. Images IRM pondérées en T 1 pour chaque type de microbulles utilisées (n=3 par condition). Images IRM pondérées en T 2 48h après traitement. FIG. 8 La FIG. 8 représente le délai d'efficacité des microbulles après leur injection pour l’ouverture de la BHE. SonoVue 5 min, les microbulles lipidiques LIP 7min30, et les microbulles stabilisées par un polymère fluoré POL 15min pour injection 2×10 7 bulles (n=3). Exemples Exemple 1 : Synthèse des polymères et copolymères fluorés et formulation des agents ultrasonores. 1.a. Synthèse copolymère 1 Le PEG-Br a été synthétisé par estérification de l'éther monométhylique de poly(éthylène glycol) (PEG-OCH3, Fluka Chemika) avec du bromure d'α-bromoisobutyryle (Sigma Aldrich) comme décrit dans la littérature [2]. Dans un second temps, le polymère a été obtenu par ATRP comme décrit dans la littérature [3]. On dépose dans un tube de Schlenk équipé d'un barreau magnétique du PEG 2000-Br (500 mg, 0,238 mmol), du bromure de cuivre (I) (CuBr), du N,N,N’,N’’,N’’-pentaméthyldiéthylènetriamine (PMDETA), et du méthacrylate de 2,2,2-trifluoroéthyle (TFEMA) à un ratio 1 :1 :1 :X avec X = 5 à 20. Le mélange est solubilisé dans THF anhydre puis dégazé. La polymérisation est réalisée à 90°C pendant 20 heures. Le produit est ensuite dilué avec du THF et passé à travers une colonne d'oxyde d'aluminium neutre pour éliminer le catalyseur (CuBr). Le solvant THF est éliminé sous vide, et la purification est faite par deux précipitations successives dans un mélange d'éther diéthylique / éther de pétrole (1/1, v/v). Le produit final est enfin séché sous vide. Schéma 1 : Synthèse du copolymère fluoré 1. 1.b. Synthèse copolymère 2 Etape 1 : synthèse de l’α-β-PMA (poly (acide malique)) L’α-β-PMA est synthétisé par polycondensation directe du L-acide malique comme décrit précédemment [4]. 10g d’acide L-malique sont placés dans un tube de Schlenk et chauffés à 110°C sous agitation pendant 72h sous 1-5 mmHg. Le polyester obtenu est dissous dans du tétrahydrofurane (THF) et précipité deux fois dans un mélange d’éther diéthylique : éther de pétrole puis lyophilisé. Etape 2 : greffage de chaines fluorées sur le PMA par estérification, PMA fluoré (fPMA) Différents taux de greffage en alcool fluorés ont été testés (10, 15 et 20). La synthèse est décrite pour un taux de greffage théorique de 15%. Dans un ballon, 1000 mg de PMA et 600 mg de 1H,1H,2H,2H-heptadécafluoro-1-décanol (ratio molaire : nf-OH=0,15 nMA) sont ajoutés, purgés sous un flux d’argon et dissous dans 10 mL de THF anhydre sous agitation magnétique. Dans un autre ballon, 400 mg de DCC (ratio molaire nDCC=1,5nf-OH) et 105 mg de DMAP (ratio molaire nDMAP=0,1nMA) sont purgés sous un flux d’argon et dissous dans 10 mL de THF anhydre sous agitation magnétique. Après dissolution complète, la solution de DCC : DMAP est ajoutée goutte à goutte à la solution de PMA : f-OH à 0°C pendant 30min. La réaction a duré une nuit à température ambiante, puis la solution a été filtrée et le produit condensé en évaporant le solvant. Le produit a été dissous dans du THF et purifié par précipitation dans un mélange d’éther diéthylique : éther de pétrole puis dialysé. Le polymère fluoré a finalement été lyophilisé. Schéma 2 : Stratégie de synthèse du polymère fluoré 2 (fPMA) A) polycondensation du L-(-)- acide malique B) estérification par un alcool fluoré (R-OH) des groupes carboxyliques pendants. Exemple 2 : Formulation des microbulles Les processus de formulation des bulles conventionnelles lipidiques et des bulles à bases de polymères fluorés sont légèrement différents. En effet, plusieurs modifications dans le protocole de formulation des microbulles ont été nécessaires : solvant de préparation, température du mélange (pour assurer une meilleure solubilisation du polymère) et suppression de l’étape de formation du film lipidique par évaporation. Microbulle contre-exemple (CE). Pour les formulations à coquille purement lipidique, hors invention, le 1,2-distéaroyl-sn-glycéro-3-phosphocholine (DSPC) et le 1,2-dimyristoyl-sn-glycéro-3-phosphoéthanolamine-N-[méthoxy(polyéthylène glycol)-2000] (DSPE-PEG2000) (rapport molaire 9:1) sont dissous dans de l'éthanol et le solvant est évaporé sous vide dans un évaporateur rotatif. La couche mince résultante est réhydratée avec du tampon HEPES (10mM, filtré à 0,2µm, pH 7,2) à température ambiante à une concentration de lipides de 5mg/mL (suspension lipidique). Le mélange résultant est ensuite aliquoté dans des flacons en verre de 3mL en ajoutant 1,5mL de suspension lipidique. Microbulles 1. Pour les formulations à coquille lipidique incorporant des polymères fluorés, selon l’invention, le 1,2-distéaroyl-sn-glycéro-3-phosphocholine (DSPC), le 1,2-dimyristoyl-sn-glycéro-3-phosphoéthanolamine-N-[méthoxy(polyéthylène glycol)-2000] (DSPE-PEG2000) et le polymère fluoré (Polymère 1) (rapport molaire 65:25:10) sont dissous dans du chloroforme. Un film mince est formé comme décrit précédemment et réhydraté avec de l’HEPES à 70°C avant d'aliquoter la solution à une concentration de lipides de 5mg/mL. La méthode d’hydratation de couche mince s’avère générer des bulles qui présentent une plus grande stabilité notamment dans leur réponse aux ultrasons que la dissolution directe des lipides/polymères dans une solution aqueuse. Microbulles 2. Pour les formulations à coquille purement polymérique incorporant des polymères fluorés, selon l’invention, les polymères f-PMA (Polymère 2) ont été dissous dans un tampon HEPES (10mM, 0,2µm filtré, pH 7,4) pour obtenir une concentration de 1mg/mL. Le mélange résultant est ensuite aliquoté dans des flacons en verre de 3 mL en ajoutant 1,5 mL de la solution de polymère. Avant leur utilisation, les flacons sont soumis à un échange gazeux : le flacon est placé sous vide (aspiration de l’air contenu dans le flacon) avant d'être rempli de PFC (C 3 F 8 ou C 4 F 10 ). Les microbulles sont ensuite formées par une technique d'agitation standard utilisant un agitateur Vialmix (Bristol-Myers-Squibb) pendant 45s à une fréquence d’agitation de 4500 tours/min. Exemple 3 : caractérisation des microbulles 3.a. Taille et concentration des microbulles Une fois les agents formés, la distribution de taille et la concentration des microbulles ont été déterminées par microscopie optique. Toutes les bulles présentées par la suite ont été formulées avec du C 4 F 10 . La distribution de taille et la concentration (nombre de microbulles par mL de solution aqueuse) des Microbulles 1 ont été caractérisées en utilisant la microscopie optique en champ clair ( FIG. 1 ). La suspension de microbulles est diluée dans de l’eau milli-Q, de manière à obtenir environ 1000 microbulles par image, après quoi 10µL de la dilution sont déposés sur une lame de chambre de comptage cellulaire (Thoma BRAND Blaubrand) qui est placée sous l'objectif du microscope. L'intensité lumineuse est ajustée selon des paramètres fixés suivants : 20X de grossissement et 10 ms d’exposition. Le microscope optique utilisé a pour limite de résolution 0,45 µm. Afin de caractériser de manière précise les microbulles, plusieurs positions sur la lame sont capturées pour chaque flacon (typiquement entre 10 et 20). Un seuil minimum de microbulles à compter a été déterminé afin d’assurer une caractérisation fiable. Trois formulations de microbulles polydisperses (SonoVue, commerciales ; LIP : microbulles CE à coque purement lipidiques, POL : microbulles 1 à coque lipidiques intégrant des polymères fluorés 1) ont été étudiées. La taille moyenne et la concentration moyenne des différentes microbulles sont présentées dans le tableau 1, la distribution de taille de chacun des flacons mesurés est présentée dans la FIG. 2 . Toutes les données de chaque formulation ont été regroupées pour tracer le graphique de fréquence cumulée en nombre ( FIG. 2 ) et calculer les premiers (d 10 ) et neuvièmes (d 90 ) percentiles ainsi que la médiane (d 90 ) et l'étendue de la distribution de taille (tableau 1). Les microbulles SonoVue et POL ont une concentration du même ordre de grandeur (environ 5×10 8 bulles/mL), tandis que les LIP sont environ 100 fois plus concentrées ((7,3 ± 2,3) × 10 10 bulles/mL). La taille moyenne des SonoVue et des POL est légèrement plus grande (environ 2,5-2,7 µm) que celle des LIP (1,9 µm). - moyenne ± ET (µm) d 10 (µm) d 50 (µm) d 90 (µm) étendue concentration ± ET (bulles/mL) SonoVue 2,7 ± 0,1 1,1 2,3 4,6 1,5 (4,5 ± 1,7) × 10 8 LIP 1,9 ± 0,1 0,8 1,9 3,0 1,2 (7,3 ± 2,3) × 10 10 POL* 2,5 ± 0,4 0,9 2,1 4,4 1,6 (6,6 ± 4,8) × 10 8 Tableau 1 : Informations sur la distribution de taille et la concentration des microbulles SonoVue, LIP et POL mesurées par microscopie optique. * : n=8 flacons pour POL et n =3 flacons pour LIP et SonoVue ; ET : écart-type entre les flacons ; d 10 : premier percentile ; d 50 : médiane ; d 90 : neuvième percentile ; d 10 , d 50 , d 90 et l'étendue (span en anglais) sont indiqués. 3.b. Stabilité de stockage des microbulles La stabilité de stockage des microbulles dans le temps a été évaluée pour les 3 formulations présentées ci-dessus. Après activation, les bulles sont stockées à 4°C entre chaque mesure. L'évolution de la taille moyenne des microbulles en fonction du temps est présentée dans la FIG. 3 -A. Dans l'ensemble, le volume des microbulles augmente avec le temps. L'écart interquartile des SonoVue et des LIP ne dépasse pas 6 µm sur 28 jours, alors que ce seuil est atteint pour les POL après 2 jours seulement. L'évolution de la concentration en fonction du temps des différents types de microbulles et la quantification de cette évolution sont représentées sur la FIG. 3 -B. La concentration des microbulles diminue rapidement pendant les premières heures voire les premiers jours après l'activation avant de se stabiliser. L'évolution de la concentration des SonoVue, des LIP et des POL en fonction du temps est linéaire pendant les premières 24h pour SonoVue ( r² = 1, la régression étant tracée pour 2 points uniquement), 72h pour LIP ( r² = 0,96) et 48h pour les POL ( r² = 0,9). En utilisant l'équation linéaire qui modélise cette évolution, nous avons déterminé la demi-vie en solution de ces microbulles qui est de 17h pour les SonoVue, 41h pour les LIP et de 24h pour les POL lorsqu’elles sont stockées à 4°C après leur activation. 3.c. Caractérisation acoustique des microbulles Une étape de caractérisation acoustique est indispensable afin de vérifier la sensibilité aux ultrasons des microbulles selon l’invention (seuil d’activation, mode de vibration, stabilité acoustique). A partir de l’analyse de la réponse non linéaire, il est ainsi possible de déterminer le régime de cavitation des microbulles en fonction de la pression acoustique exercée. En effet, la signature acoustique des microbulles est principalement caractérisée par leurs réponses harmoniques et sub/ultraharmoniques. La présence de ce signal non linéaire intrinsèque aux microbulles est liée aux paramètres ultrasonores appliqués, et en particulier à la pression acoustique. En thérapie, et plus particulièrement dans le cerveau, la dose de cavitation doit être calculée afin de déterminer le régime de vibration des microbulles. L’indicateur dosimétrique in situ se doit d’être précis car l’écart entre dose efficace et dose lésionnelle est faible (de l’ordre d’une centaine de kPa). Par convention, la dose de cavitation stable est déterminée par le signal harmonique des microbulles : (n+1) f0 (avec n ∈ ℕ* et f0 la fréquence d’émission des ultrasons) alors que la dose de cavitation inertielle correspond à la mesure du signal émis à toutes les fréquences (signal large bande, hors des harmoniques). Des évènements indésirables (e.g., œdèmes, hémorragies) peuvent survenir lorsque les bulles sont en régime de cavitation inertielle. Des phénomènes physiques, localement violents, induits par la brusque implosion des microbulles sous l’effet des ultrasons peuvent conduire à la destruction irréversible de tissus ou vaisseaux. Il existe également un régime intermédiaire correspondant à une déstabilisation de la coque des microbulles (rayonnement sub-harmonique et ultra-harmonique). En effet, au cours du temps, le gaz contenu dans la microbulle se diffuse dans le milieu environnant résultant sur un état de flambage de son enveloppe (e.g., excès de lipide sur l’enveloppe de la bulle). Cet état est associé à l’apparition de fréquences spécifiques (sub-harmonique et ultra-harmonique : ((2n+1))/2 f0 avec n ∈ ℕ et f0 la fréquence d’émission des ultrasons). Cet état peut apparaître subitement au cours de l’excitation ultrasonore et peut mener à la cavitation inertielle. L’enjeu consiste donc à détecter immédiatement cette déstabilisation afin d’arrêter ou ajuster au plus vite la séquence ultrasonore avant tout risque pour le patient. 2×10 7 microbulles diluées dans 40 mL d'eau milli-Q dégazée sont agitées dans une cuve fabriquée sur mesure avec des parois en mylar. La cuve est fixée au milieu d'un plus grand réservoir d'eau milli-Q dégazée. Les microbulles sont excitées à f0 = 1 MHz (fréquence de répétition = 10 kHz ; durée d'impulsion de 40 cycles) à l'aide d'un transducteur ultrasonore focalisé (diamètre actif 25 mm, V302-SU, Olympus). La réponse acoustique des microbulles est enregistrée simultanément avec un transducteur ultrasonore de 2,25 MHz (diamètre actif 25 mm, V304-SU, Olympus) placé à 4,6 cm de la cuve contenant les microbulles, perpendiculairement au transducteur d'émission lui-même placé à 4,6 cm de cette cuve. Un matériau absorbant les ultrasons est placé sur le côté opposé du transducteur d'émission pour éviter les réflexions multiples. Le signal est ensuite enregistré et traité. Le signal observé sur un oscilloscope numérique est transféré sur un ordinateur pour l'analyse des données. L'aire sous la courbe (AUC – Area Under the Curve) du deuxième harmonique (2 f0), et du premier ultra-harmonique (1,5 f0) sont calculées. Les rapports AUC (AUCR – Area Under the Curve Ratio) entre le signal des microbulles et le signal émis par la cuve en mylar remplie uniquement d'eau (signal de référence) sont également calculés. Pour chaque type de microbulles, le signal est enregistré pour des pressions de raréfaction allant de 50 kPa à 400 kPa avec un bolus de microbulles fraîches pour chaque acquisition. Chaque mesure est répétée 3 fois et l'ensemble de l'expérience est reproduit pour 3 flacons différents de chaque formulation. On considère l'apparition du pic 1,5 f0 comme un marqueur du seuil de déstabilisation des microbulles. La FIG. 4 représente l'AUCR du second harmonique 2f0, indicateur de la cavitation stable des microbulles, en fonction de la pression de raréfaction appliquée pour chaque type de microbulles et fournit ainsi une quantification de l'intensité de la cavitation des microbulles. Comme attendu, la cavitation stable de chacune des formulations augmente avec la pression acoustique appliquée. La FIG. 5 représente l'AUCR de l'ultraharmonique 1,5f0 en fonction de la pression appliquée pour chaque type de microbulles ainsi que l’intervalle seuil de déstabilisation en fonction de l'index mécanique (pression de raréfaction/racine carrée de la fréquence) résultant de ces graphiques. L'objectif est de déterminer le seuil d'apparition des ultraharmoniques afin de déterminer le seuil de déstabilisation des microbulles. Le seuil d'apparition des ultraharmoniques a été fixé pour un AUCR de 5 dB car il correspond visuellement à l'apparition de ces pics sur le tracé de la Transformée de Fourier du signal. Cette valeur dépend du signal transmis ainsi que du niveau de bruit de la chaîne de mesure et notamment de la sensibilité du capteur. La déstabilisation des LIP intervient pour une pression plus faible (120 kPa) que pour les microbulles POL (150 kPa) selon l’invention et SonoVue (200 kPa). De plus, l’intervalle de déstabilisation est plus large pour les LIP ([120 kPa - 200 kPa]) que pour les SonoVue ([200 kPa - 250 kPa]) et les POL ([150 kPa - 200 kPa]). Ces résultats démontrent la sensibilité des bulles POL selon l’invention aux ultrasons, comparable aux autres formulations, et leur potentiel pour l’imagerie et la thérapie. Exemple 4 : Validation in vivo pour la perméabilisation de la barrière hémato-encéphalique 4.a. Protocole in vivo Les expériences ont été réalisées sur des souris C57BL/6 (17 à 49 g). Les animaux sont anesthésiés avec 1,5 % d'isoflurane dans un mélange O 2 /air (50/50, v/v). Un bolus contenant 100 µL de Dotarem® (Gd-DOTA, Guerbet) et 2×10 7 microbulles (SonoVue, LIP ou POL) est injecté par voie intraveineuse via la cavité rétro-orbitaire. Toutes les expérimentations animales ont été réalisées conformément aux recommandations de la Communauté européenne (2010/63/UE) et des comités nationaux français (loi 2013-118) pour le soin et l'utilisation des animaux de laboratoire. Le protocole expérimental a été approuvé par un comité d'éthique local pour l'expérimentation animale (Ile-de-France n°044) et par le ministère français de l'agriculture (APAFIS #34522-2022010412087915 v1). Les ultrasons ont été délivrés en utilisant un transducteur focalisé sphérique (diamètre actif 25 mm, profondeur focale 20 mm, résolution axiale 5 mm, résolution latérale 1 mm, Imasonic) centré sur 1,5 MHz et connecté à un générateur programmable monocanal (Image Guided Therapy). Le transducteur est monté sur une platine motorisée à axes XYZ, et positionné au-dessus de la tête de la souris maintenue sous anesthésie. Le dispositif est couplé à la tête de la souris à l'aide d'un ballon en latex (rempli d'eau milli-Q dégazée) et de gel échographique. La distance entre le transducteur et le crâne est ajustée afin de cibler le centre du cerveau à la distance focale (c'est-à-dire 20 mm). La séquence ultrasonore utilisée dessine les contours d'un carré de 5 mm de côté en transmettant les ultrasons en quasi-continu (91% de rapport cyclique). L’émission ultrasonore est en effet stoppée à chaque changement de direction des moteurs. Le schéma de la séquence est illustré sur la FIG. 6 . Une pression de raréfaction différente est transmise pour chaque côté du carré. Le tracé du carré est répété 52 fois pour une durée totale de séquence de 121sec. 3.b. Seuil d’ouverture, perméabilisation immédiate de la BHE et sécurité du protocole Cette expérience est menée pour valider la capacité de ces microbulles selon l’invention à perméabiliser la BHE et pour estimer le seuil d'ouverture pour chaque type de microbulles en fonction de la pression appliquée. Dans ces expériences, les ultrasons sont appliqués immédiatement après l’injection intraveineuse (délai FIG. 7 présente une image IRM de contraste T1 pour chaque type de microbulles ainsi que le contrôle sans injection de microbulles pour les pressions de raréfaction appliquées entre 100 et 600 kPa. Après l’injection de l’agent de contraste IRM, le rehaussement de contraste devient visible sur l’image IRM le long de la trajectoire du faisceau ultrasonore, si la BHE a bien été perméabilisée. Ces images IRM ne sont pas quantitatives. L’intensité du signal dépend de plusieurs paramètres expérimentaux (poids de la souris, qualité de l’injection, positionnement du transducteur thérapeutique) et sont difficilement comparables d’une souris à une autre. En revanche, sur une même souris, on peut discerner s’il y a eu perméabilisation ou non et détecter un seuil d’ouverture par une analyse qualitative. On observe une ouverture de la BHE à 400 kPa et 600 kPa et non à 200 kPa et 100 kPa pour l’ensemble des microbulles évaluées (n=3 par condition). Aucune ouverture n’a été observée pour la condition de contrôle après injection d’agents de contraste IRM. Sur la FIG. 7 , sont aussi présentées les images pondérées en T2 48h après l’application des ultrasons. Aucune hémorragie ni œdème n'ont été observés 48h après l'expérience sur ces images. 4.c. Estimation du seuil temporel d’efficacité des bulles pour la perméabilisation de la BHE L’objectif de ce protocole est d’estimer la stabilité des microbulles en circulation et d’évaluer leur capacité à perméabiliser la BHE à différents temps après injections. Cette notion est particulièrement importante en vue de la translation de la technologie vers de plus gros modèles et dans l’optique de traitements volumiques sur ces sujets. La FIG. 8 présente les résultats obtenus à différents temps d’application des ultrasons après injection des microbulles en bolus pour chaque formulation. Un exemple d’image obtenue à partir d’une séquence IRM pondérée en T1 est présenté. Après vérification des ouvertures à 0 min pour chacune des formulations (même protocole que précédemment), un délai de 10 min a été dans un premier temps appliqué entre l’administration des bulles par voie intraveineuse et l’application des ultrasons. L’expérience a été répétée 3 fois. Dans le cas où aucune ouverture n’est visible à ce temps, le délai est réduit de 2 min 30 jusqu’à trouver le seuil temporel d’ouverture (i.e., stabilité des bulles dans le sang). Au contraire, si l’ouverture est encore visible à 10 min post-injection, le délai est alors augmenté de 5 min afin de déterminer le temps maximum d’efficacité des microbulles. L’ensemble des expériences réalisées est résumé dans le Tableau 2 qui précise si pour chaque condition testée une perméabilisation de la BHE était visible sur les IRM pondérées en T1 ou non en fonction du temps entre l’injection des microbulles et le lancement de la séquence ultrasonore. Les bulles POL selon l’invention s’avèrent être 2 fois plus stables dans le temps que les LIP et 3 fois plus stables que les SonoVue. En effet, elles sont efficaces 15 minutes après leur injection, quand les LIP le sont 7 minutes 30 et les SonoVue le sont 5 minutes après injection. Pour toutes les souris traitées, lorsqu’une ouverture de la BHE était observée, la prise de contraste était visible pour les zones insonifiées à 400 kPa et 600 kPa à chaque fois et jamais pour 200 kPa et 100 kPa. - 0 min 5 min 7 min 30 10 min 15 min 20 min SonoVue oui (n=3) oui ( n=3 ) non ( n=2 ) non (n=3) - - LIP oui (n=3) - oui ( n=3 ) non ( n=3 ) - - POL oui (n=3) - - oui ( n=3 ) oui ( n=3 ) Très léger (n=1) Tableau 2 : Une perméabilisation de la BHE a-t-elle été observée ? Ensemble des expériences réalisées pour une injection de 2×10 7 bulles. Colonnes : temps entre l’injection des microbulles et le lancement de la séquence FUS. Lignes : expériences réalisées en fonction du type de bulles, oui : une perméabilisation de la BHE a été observée, non : pas de perméabilisation de la BHE visible sur les images IRM pondérées en T1. Au vu de ces résultats, il est évident que l’ajout de polymères fluorés dans la composition des microbulles selon l’invention contribue à améliorer leur stabilité dans le sang, tout en préservant leurs propriétés acoustiques et leur capacité à perméabiliser la BHE. Le polymère fluoré 2 a pu être synthétisé avec trois taux de greffage différents Polymère 2 Taux de greffage théorique (%) Taux de greffage expérimental (%) Mn (g/mol) RMN P10 10 % 4 1400 ± 300 P15 15 % 7,5 1600 ± 400 P20 20 % 12 1800 ± 400 Tableau 3 : Variation du taux de greffage du polymère fluoré 2. Ces polymères seuls ont été formulés en microbulles de C 4 F 10 à une concentration de 1 mg/mL avec les caractéristiques suivantes pour les microbulles. [Table 4] - C 4 F 10 - P10 P15 P20 Concentration (bulles/mL).10 8 4,3 ± 1.6 8,3 ± 2.0 6,4 ± 1.7 Taille (µm) 1,7 ± 0.9 1,7 ± 0.8 2,0 ± 1.3 Tableau 4 : Formulation du polymère fluoré 2 en microbulles. Après injection chez l’animal, il a été possible d’ouvrir la BHE en utilisant ces microbulles formulées à partir du polymère fluoré 2 pour des pressions de raréfaction supérieures à 300 kPa. Liste de références : [1] Ambre Dauba, Anthony Delalande, Hermes AS Kamimura, Allegra Conti, Benoit Larrat, Nicolas Tsapis, Anthony Novell. Recent advances on ultrasound contrast agents for blood-brain barrier opening with focused ultrasound. Pharmaceutics. 2020. doi: 10.3390/pharmaceutics12111125. [2] Changkui Fu, Shauna Herbst, Cheng Zhang, Andrew K. Whittaker Polymeric 19 F MRI agents responsive to reactive oxygen species, Polym. Chem., 2017; 8:4585 [3] Hong Li, Weiyin Gu, Le Li, Yongming Zhang, Thomas P. Russell, E. Bryan Coughlin, Synthesis of semicrystalline/fluorinated side-chain crystalline block copolymers and their bulk and thin film nanoordering, Macromolecules, 2013; 46:3737. [4] Simone Pinto Carneiro, Laurence Moine, Barbara Tessier, Valerie Nicolas, Orlando D.H. dos Santos, and Elias Fattal. 2019. Pyrazinoic Acid-Poly(Malic Acid) Biodegradable Nanoconjugate for Efficient Intracellular Delivery. Precision Nanomedicine 2 (3): 303–17. Microbulle comprenant un polymère ou copolymère fluoré et un gaz fluoré choisi parmi les perfluorocarbures et l’hexafluorure de soufre, le perfluorocarbure étant de préférence choisi parmi le perfluorobutane, le perfluoropropane, le perfluoroéthane, le perfluoropentane, le perfluorohexane et leurs mélanges. Microbulle selon la revendication 1, comprenant en outre un gaz supplémentaire choisi parmi l’air, l’oxygène, l’azote, le monoxyde d'azote et leurs mélanges. Microbulle selon la revendication précédente dans lequel le ratio volumique entre le gaz fluoré et le gaz supplémentaire est compris dans un intervalle allant de 90:10 à 50:50, de préférence de 80:20 à 60:40. Microbulle selon l’une quelconque des revendications précédentes, dans laquelle le polymère est choisi parmi les polymères ou copolymères de formules I ou II : [Chem 7] Formule I dans laquelle , PEG représente un groupe polyéthylène glycol dont la masse molaire est comprise dans un intervalle allant de 2000 à 50000 g/mol, de préférence de 2000 à 5000 g/mol, p est un entier compris dans un intervalle allant de 5 à 50, de préférence de 5 à 15, chaque R 1 représente indépendamment H ou CH 3 , chaque R 2 représente indépendamment soit un groupe alkyle fluoré en C2 à C20, linéaire ou ramifié, portant optionnellement un aryle en C5 à C7 fluoré, soit un groupe aryle fluoré en C5 à C7 ; R 3 et R 4 représentent indépendamment H ou CH 3 ; et X représente un groupe halogénée, de préférence choisi parmi Br, Cl et I ; [Chem 8] Formule II dans laquelle, n et m sont des entiers positifs compris dans un intervalle allant de 10 à 100, y est un entier positif inférieur ou égal à n, z est un entier positif inférieur ou égal à m, chaque groupe R représente indépendamment un groupe alkyle fluoré en C2 à C20, linéaire ou ramifié, ou un groupe polyéthylèneglycol dont la masse molaire est comprise dans un intervalle allant de 500 à 2000 g/mol, au moins un des groupes R étant un groupe alkyle fluoré. Microbulle selon l’une quelconque des revendications précédentes, dans laquelle le polymère est de formule I, et le groupe R 2 est choisi parmi le 2,2,2-trifluoroéthyl, 2,2,3,3,3-pentafluoropropyl, 2,2,3,3,4,4,4-heptaafluorobutyl, 1H,1H,2H,2H-tridécafluoro-n-octyl, 1H,1H,2H,2H-heptadécafluorodécyl, 2,2,3,4,4,4-hexafluorobutyl, 2,2,3,3-tétrafluoropropyl, , 1H,1H,2H,2H-nonafluorohexyl, 1H,1H,5H-octafluoropentyl, 2,2,3,3,4,4,5,5,6,6,7,7-dodécafluoroheptyl, hexafluoroisopropyl, pentafluorobenzyl et pentafluorophenyl. Microbulle selon la revendication 1 ou 2, dans laquelle le polymère est de formule II, et le groupe R est un groupe alkyle fluoré choisi parmi 1H,1H,2H,2H-heptadécafluoro-1-décyl, 2,2,3,3,4,4,4-heptafluoro-1-butyl, 2,2,2-trifluoroéthyl, 1H,1H-perfluoro-1-heptyl, 1H,1H-heptadécafluoro-1-nonyl, 1H,1H-perfluorododécan-1-ol, 1H,1H-perfluoro-1-tétradécyl, perfluoro-tert-butyl, hexafluoro-2,4-bis(trifluorométhyl)-1-pentyl. Microbulle selon l’une quelconque des revendications précédentes comprenant en outre un lipide, de préférence choisi parmi 1,2-distearoyl-sn-glycéro-3-phosphoglycérol, 1,2-dipalmitoyl-sn-glycéro-3-phosphocholine, 1,2-distéaroyl-sn-glycéro-3-phosphocholine, 1,2-dimyristoyl-sn-glycéro-3-phosphocholine, 1,2-dipalmitoyl-sn-glycéro-3-phosphoéthanolamine-N-[méthoxy(polyéthylène glycol)-5000, 1,2-dipalmitoyl-sn-glycéro-3-phosphoéthanolamine-N-[méthoxy(polyéthylène glycol)-2000, 1,2-dipalmitoyl-sn-glycéro-3-phosphoéthanolamine-N-[méthoxy(polyéthylène glycol)-1000, 1,2- distéaroyl -sn-glycéro-3-phosphoéthanolamine-N-[méthoxy(polyéthylène glycol)-5000, 1,2- distéaroyl -sn-glycéro-3-phosphoéthanolamine-N-[méthoxy(polyéthylène glycol)-2000, 1,2- distéaroyl -sn-glycéro-3-phosphoéthanolamine-N-[méthoxy(polyéthylène glycol)-1000, 1,2-dimyristoyl -sn-glycéro-3-phosphoéthanolamine-N-[méthoxy(polyéthylène glycol)-5000, 1,2-dimyristoyl -sn-glycéro-3-phosphoéthanolamine-N-[méthoxy(polyéthylène glycol)-2000, 1,2-dimyristoyl -sn-glycéro-3-phosphoéthanolamine-N-[méthoxy(polyéthylène glycol)-1000, 1,2-dimyristoyl -sn-glycéro-3-phosphate, 1,2-dipalmitoyl-sn-glycéro-3-phosphate, 1,2-distéaroyl-sn-glycéro-3-phosphate, 1,2-dioléoyl-sn-glycéro-3-phosphocholine, 1,2-dipalmitoyl-sn-glycéro-3-phospho-L-serine (sodium salt), 1,2-dimyristoyl-sn-glycéro-3-phosphoéthanolamine, 1,2-dipalmitoyl-sn-glycéro-3-phosphoéthanolamine, 1,2-distéaroyl-sn-glycéro-3-phosphoéthanolamine, 1,2-Dioléoyl-sn-glycéro-3-phosphoéthanolamine, 1-Palmitoyl-2-oléoyl-sn-glycéro-3-phosphoglycérol, phosphatidylcholine d’œuf, phosphatidylcholine de soja et leurs mélanges. Microbulle selon la revendication 7, dans laquelle le ratio massique lipide(s) / polymère ou copolymère fluoré est compris dans un intervalle allant de 0,1 à 0,9, de préférence de 0,5 à 0,9. Composition comprenant des microbulles selon l’une quelconque des revendications précédentes et une solution aqueuse. Microbulle selon l’une quelconque des revendications 1 à 8 ou composition selon la revendication 9, pour son utilisation dans la perméabilisation de la barrière hémato-encéphalique. Microbulle selon l’une quelconque des revendications 1 à 8 ou composition selon la revendication 9, pour son utilisation dans une thérapie par ultrasons. Microbulle pour son utilisation selon la revendication 1 à 8 ou composition selon la revendication 9, dans laquelle la thérapie par ultrasons est mise en œuvre dans le traitement de pathologies diffuses dans le cerveau, en chimiothérapie, en immunothérapie, en thérapie ciblée, pour l’activation de cellules gliales et en thérapie génique, de préférence choisies parmi les gliomes, les métastases cérébrales, les maladies neurodégénératives, et les maladies génétiques. Microbulle pour son utilisation selon la revendication 1 à 8 ou composition selon la revendication 9, pour son utilisation dans une thérapie par ultrasons dans le traitement de pathologies aux niveaux des organes, de préférence dans le traitement de thrombus, ou de cancers de la prostate, du sein, du pancréas, de la vessie, mélanomes, ou du colon, et optionnellement en combinaison une approche thérapeutique complémentaire, de préférence choisie parmi chimiothérapie, immunothérapie, thérapie ciblée, thérapie génique. Microbulle selon l’une quelconque des revendications 1 à 8 ou composition selon la revendication 9, pour son utilisation comme agent de contraste ultrasonore dans l’imagerie moléculaire. Polymère de formule I : [Chem 9] Formule I dans laquelle , PEG représente un groupe polyéthylèneglycol dont la masse molaire est comprise dans un intervalle allant de 2000 à 50000 g/mol, de préférence de 2000 à 5000 g/mol, p est un entier compris dans un intervalle allant de 5 à 50, de préférence de 5 à 15, chaque R 1 représente indépendamment H ou CH 3 , chaque R 2 représente indépendamment un groupe alkyle fluoré en C2 à C20, linéaire ou ramifié, portant optionnellement un aryle en C5 à C7 fluoré, ou un groupe aryle fluoré en C5 à C7 R 3 et R 4 représentent indépendamment H ou CH 3 ; et X représente un groupe halogéné, de préférence choisi parmi Br, Cl et I. Polymère de formule II : [Chem 10] Formule II dans laquelle, n et m sont des entiers positifs compris dans un intervalle allant de 10 à 100, y est un entier positif inférieur ou égal à n, z est un entier positif inférieur ou égal à m, chaque groupe R représente indépendamment un groupe alkyle fluoré en C2 à C20, linéaire ou ramifié, ou un groupe polyéthylène glycol dont la masse molaire est comprise dans un intervalle allant de 500 à 2000 g/mol, au moins un des groupes R étant un groupe alkyle fluoré.