Brevet FR3157435A1 — publié le 20250627

L’invention concerne un procédé de diagnostic in vitro ou ex vivo d’une infertilité masculine, résultant d’un dysfonctionnement du métabolisme lipidique des spermatozoïdes, chez un individu, ainsi qu’un kit et l’utilisation de marqueur(s) spécifique(s) pour ce diagnostic. Figure 1 PROCEDE POUR LE DIAGNOSTIC IN VITRO OU EX VIVO D’UNE INFERTILITE MASCULINE La présente invention s’inscrit dans le contexte de l’infertilité masculine et a pour objet un nouveau procédé permettant le diagnostic in vitro ou ex vivo de certaines causes d’infertilité masculine chez un individu. L’invention a également pour objets un kit et l’utilisation de marqueur(s) spécifique(s) pour un tel diagnostic. En France, l’infertilité touche actuellement un couple sur sept et constitue, à ce titre, une problématique majeure de santé publique aux enjeux médicaux et financiers importants. L’infertilité du couple est dans plus d’environ 50 % des cas, liée à des facteurs masculins (infertilité dite masculine), et principalement à des facteurs qui impactent le potentiel de fécondation des spermatozoïdes. Le potentiel de fécondation des spermatozoïdes repose sur leur production en quantité suffisante et leur progression efficace dans le tractus génital féminin pour atteindre et féconder l'ovocyte. Cette dernière propriété fondamentale est médiée par le flagelle qui fournit la force mécanique pour la propulsion et la mobilité des spermatozoïdes. Elle est également conditionnée par une production d’énergie suffisante et une adaptation du métabolisme énergétique des spermatozoïdes en fonction des nutriments disponibles tout au long de leur parcours depuis le tractus génital masculin jusqu’aux trompes de Fallope. Les facteurs impactant la fertilité masculine sont multiples et variés et conduisent à des pathologies spermatiques tout aussi variées, telles que l’azoospermie, l’oligozoospermie, l’asthénozoospermie, la tératozoospermie ou encore la nécrozoospermie. La pathologie la plus fréquemment retrouvée chez les hommes infertiles est l’asthénozoospermie, définie par la réduction ou l’absence de mobilité des spermatozoïdes. On peut distinguer deux catégories d’asthénozoospermie : l’asthénozoospermie dite structurelle résultant de défauts morphologiques et structuraux du flagelle spermatique et l’asthénozoospermie dite fonctionnelle résultant de dysfonctionnements de l’activité des spermatozoïdes. Au cours de la dernière décennie, des progrès majeurs ont été réalisés dans la découverte de gènes dont les mutations sont responsables chez l’homme d’anomalies du flagelle des spermatozoïdes conduisant à des infertilités par asthénozoospermie structurelle. Cependant, les conditions d’asthénozoospermie dite fonctionnelle ont été très peu étudiées et restent mal définies avec, à ce jour, seulement quelques gènes identifiés qui codent principalement pour des canaux et des transporteurs ioniques. De manière surprenante, alors que la production d’ATP semble cruciale pour la mobilité des spermatozoïdes, le déficit fonctionnel des voies métaboliques régulant la production d’énergie n’a jamais été formellement établi comme cause infertilité masculine. Par ailleurs, la bioénergétique des spermatozoïdes a surtout été étudiée au travers de la glycolyse et de la phosphorylation oxydative mitochondriale (OxPhos) (Ford, WCL. 2006 ; Ferramosca & Zara.2014 ; du Plessis et al 2015), alors que le métabolisme lipidique, notamment l’oxydation des acides gras, a été très peu étudié par la communauté scientifique. Dans ce contexte, les inventeurs ont mis en évidence une catégorie inédite de patients infertiles présentant un dysfonctionnement du métabolisme lipidique dans leurs spermatozoïdes. Ces patients présentent une asthénozoospermie associée à une nécrozoospermie. Bien que le diagnostic clinique et génétique des infertilités masculines se soit considérablement amélioré, il n’existe à ce jour aucun traitement capable de restaurer chez l’homme, une fertilité permettant la procréation naturelle ; les patients doivent recourir aux technologies d’assistance médicale à la procréation (AMP) et le plus souvent à la fécondation in vitro (FIV) par l'injection intra cytoplasmique de leurs spermatozoïdes (ICSI) dans les ovocytes de leurs conjointes. En France, l’AMP a un coût estimé à 300 millions d'euros par an, et implique pour les conjointes des hommes infertiles des actes médicaux invasifs : injections hormonales pour induire une super ovulation, anesthésie et ponction ovarienne pour recueillir les ovocytes, transfert d'embryons dans l'utérus. Il est important de noter qu’actuellement, dans plus de 50 % des cas, le parcours d’AMP se solde par un échec même après plusieurs tentatives. Il existe donc un réel besoin de mieux comprendre les causes des infertilités masculines pour pouvoir proposer des solutions curatives adaptées, offrant aux hommes la possibilité d’être actifs dans le traitement de leur pathologie et libérant ainsi leurs partenaires féminines de procédures médicales contraignantes et invasives, non dénuées d’effets secondaires et de risques. En ce sens, il existe un besoin de mieux comprendre les dysfonctionnements à l’origine des infertilités masculines, afin de permettre une classification plus fine des patients en fonction de leur type d’infertilité, et de permettre, le cas échéant, le développement de solutions thérapeutiques adaptées à chaque type d’infertilité. Dans ce contexte, les inventeurs ont développé une méthode inédite permettant de proposer des marqueurs capables de diagnostiquer spécifiquement une infertilité masculine résultant d’un dysfonctionnement du métabolisme lipidique des spermatozoïdes et conduisant à une asthénozoospermie ou une asthéno-nécro-zoospermie. En outre, ces anomalies pouvant être également combinées à une oligozoospermie définie par un nombre de spermatozoïdes réduit dans l’éjaculat et/ou à une tératozoospermie définie par un nombre de spermatozoïdes présentant des anomalies morphologiques augmenté dans l’éjaculat. Cette démarche diagnostique innovante et l’outil associé innovant permettent une identification simple, rapide et efficace des patients présentant une infertilité causée par un dysfonctionnement du métabolisme lipidique des spermatozoïdes, dans le but de pouvoir leur proposer des solutions thérapeutiques spécifiques et adaptées. La présente invention a donc pour objet un procédé de diagnostic in vitro ou ex vivo d’une infertilité masculine résultant d’un dysfonctionnement du métabolisme lipidique des spermatozoïdes chez un individu, comprenant une étape de détection, dans au moins un échantillon biologique dudit individu, d’au moins un marqueur choisi parmi : une accumulation de gouttelettes lipidiques supérieure à une valeur de référence, une teneur en carnitine et/ou en dérivés de carnitine inférieure à une valeur de référence, une teneur en protéine ACSBG2 inférieure à une valeur de référence, une teneur en transcrits ACSBG2 inférieure à une valeur de référence, une altération de la séquence des transcrits ACSBG2 par rapport à une séquence de référence, et une altération de la séquence du gène ACSBG2. La détection dans un échantillon biologique d’un individu, d’au moins un de ces marqueurs permet d’identifier rapidement et simplement un patient présentant une infertilité résultant d’un dysfonctionnement du métabolisme lipidique des spermatozoïdes. Dès lors, il devient possible de déterminer de façon ciblée, des solutions thérapeutiques spécifiques et adaptées à chaque patient, afin de leur permettre, soit une restauration de la mobilité spermatique dans le but de procréer naturellement, soit une amélioration de la qualité de leurs spermatozoïdes, notamment de leur vitalité, ce qui faciliterait la réalisation de l’AMP par FIV/ICSI. La présente invention apporte donc une réelle contribution au diagnostic et à la prise charge de certaines infertilités masculines fonctionnelles caractérisées notamment par asthénozoospermie ou une asthéno-nécro-zoospermie résultant d’un dysfonctionnement du métabolisme lipidique des spermatozoïdes. Cette avancée diagnostique ouvre la voie au développement de traitements visant à restaurer ou améliorer le pouvoir fécondant des spermatozoïdes, en vue d’obtenir une grossesse naturelle ou par AMP. Dans le cadre de la présente invention : on entend par « dysfonctionnement du métabolisme lipidique des spermatozoïdes », une anomalie touchant les voies de signalisation et/ou les voies enzymatiques impliquées dans la biosynthèse et/ou la dégradation des lipides, et/ou les voies du métabolisme énergétique des lipides telles que l’oxydation mitochondriale des acides gras, on entend par « diagnostic in vitro » et « diagnostic ex vivo », des tests réalisés à l’extérieur d’un individu, après prélèvement de l’échantillon biologique sur ledit individu. Les tests réalisés sur les échantillons biologiques prélevés sur le(s) individu(s) et maintenus en laboratoire, généralement en conditions stériles, sans modifications sur une courte durée, s’inscrivent dans le cadre d’un diagnostic ex vivo selon l’invention. Les tests menés sur de tels échantillons et sur un temps plus long, s’inscrivent généralement dans le cadre d’un diagnostic in vitro selon l’invention, on entend par « détection d’au moins un marqueur choisi parmi » la détection d’un ou plusieurs marqueurs choisis indifféremment parmi la liste de marqueurs. Ainsi, dans tous les objets de l’invention décrits dans le présent texte, il pourra être détecté au moins un desdits marqueurs, au moins deux desdits marqueurs, au moins trois desdits marqueurs, et ainsi de suite jusqu’à la détection de la totalité des marqueurs envisagés, on entend par « asthénozoospermie » l’absence ou la réduction de la mobilité des spermatozoïdes avec un taux de moins de 42 % de spermatozoïdes mobiles et/ou un taux de moins de 30% de spermatozoïdes progressifs dans l’éjaculat selon les normes de l’OMS (WHO laboratory manual for the examination and processing of human semen - Sixth edition, 2021). Elle constitue l’anomalie prédominante retrouvée chez les hommes infertiles. L’asthénozoospermie peut être la résultante de défauts structuraux du flagelle des spermatozoïdes (ci-après « asthénozoospermie structurelle »). L’asthénozoospermie peut également être la résultante de dysfonctionnements de l’activité des spermatozoïdes par dérégulation, notamment des voies de signalisation membranaires et intracellulaires (ci-après « asthénozoospermie fonctionnelle »). Les patients atteints d’asthénozoospermie fonctionnelle présentent des spermatozoïdes sans anomalies sévères de la structure de leurs flagelles mais qui, pour autant, ne parviennent pas à se déplacer correctement, voire sont totalement immobiles, on entend par « nécrozoospermie » un taux de vitalité des spermatozoïdes présents dans l’éjaculat, inférieur à 54 %, selon les normes de l’OMS, on entend par « oligozoospermie » un nombre de spermatozoïdes présents dans le volume total de l’éjaculat, inférieur à 39 millions, selon les normes de l’OMS, on entend par « asthéno-nécro-zoospermie» l’absence ou la réduction de la mobilité des spermatozoïdes avec un taux de spermatozoïdes mobiles inférieur à 42% combinée à un taux de vitalité des spermatozoïdes inférieur à 54 %, selon les normes de l’OMS, on entend par « échantillon biologique », un tissu, un fluide, ainsi que des composants desdits tissu et fluide (par exemple les cellules). Selon le domaine d’application du procédé, et à titre d’exemples non exhaustifs, l’échantillon peut être du sperme ainsi que ses composantes telles que le liquide séminal, les spermatozoïdes, les cellules germinales immatures, ou du sang, de l’urine, de la salive, du tissu testiculaire prélevé par biopsie ou tout autre tissu biologique susceptible de contenir de l’ADN génomique, on entend par « valeur de référence », une valeur pour un paramètre donné, définie pour un individu « témoin » (aussi qualifié d’individu « contrôle ») n’ayant pas de problème de fertilité. La valeur de référence pour un paramètre donné correspond donc à celle définie pour le même paramètre pour un individu fertile. Une telle valeur peut être issue directement de l’analyse d’un échantillon biologique d’un individu témoin fertile ou être la résultante de plusieurs valeurs issues de plusieurs échantillons biologiques d’un même individu fertile et/ou de plusieurs individus fertiles, on entend par « accumulation de gouttelettes lipidiques », la présence de gouttelettes renfermant des esters de lipides dans le cytoplasme des spermatozoïdes, principalement au niveau de la tête spermatique; ces gouttelettes sont visualisables, par exemple, par coloration cytologique spécifique telle que la coloration OilRedO (non fluorescente) ou Rouge du Nil (fluorescente et aussi appelée « Nile Red »), on entend par « teneur en carnitine ou en dérivés de carnitine », la quantité en 3-hydroxy-4-triméthylammonio-butanoate (ou la quantité de ses dérivés) présente dans l’échantillon biologique analysé, cette quantité pouvant être mesurée par toute technique connue de l’homme du métier, par exemple par chromatographie liquide couplée à la spectrométrie de masse. La carnitine est notamment connue pour ses propriétés de transport des chaînes acylées des acides gras vers la matrice mitochondriale. Parmi les dérivés de la carnitine, on retrouve notamment les dérivés de la carnitine lié à un groupement acyl, les acylcarnitines, ces dérivés pouvant contenir plusieurs chaines de carbones (C2, C3, C4, etc.), on entend par « teneur en protéine ACSBG2 », la quantité en enzyme Acyl-coenzyme A synthétase (identifiant UniProtKB : Q5FVE4) dans l’échantillon biologique analysé. Cette enzyme est issue de la traduction par les ribosomes de l’un des transcrits du gène ACSBG2 (Acyl-CoA Synthetase Bubblegum 2 - Gene ID: 81616 et Ensembl : ENSG00000130377). La protéine ACSBG2 est connue pour son rôle dans la modification des acides gras à longue chaine qui conditionne leur acheminement vers la matrice mitochondriale, on entend par « teneur en transcrits ACSBG2 », la quantité des transcrits résultant de la transcription du gène ACSBG2 (Acyl-CoA Synthetase Bubblegum 2 - Gene ID: 81616 et Ensembl : ENSG00000130377) dans l’échantillon biologique analysé, on entend par « altération de la séquence des transcrits ACSBG2 par rapport à une séquence de référence » au moins une différence dans ladite séquence des transcrits de sorte que leur épissage soit anormal ou que leur traduction par les ribosomes soit rendue impossible ou conduise à une absence de protéine ACSBG2 ou à des protéines ACSBG2 portant une altération de leur composition en acides aminés. La séquence de référence à laquelle peut être comparée la séquence altérée des transcrits est celle de l’un des transcrits du gène ACSBG2 (Acyl-CoA Synthetase Bubblegum 2 - Gene ID: 81616 et Ensembl : ENSG00000130377), en tenant compte de dégénérescence du code génétique, ledit gène ACSBG2 ayant pour séquence nucléotidique la séquence SEQ ID NO : 1 ou une séquence présentant au moins 65% voire 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% ou même 99% d’identité avec la séquence SEQ ID NO : 1, on entend par « altération de la séquence du gène ACSBG2 », au moins une différence de ladite séquence par rapport à la séquence connue du gène ACSBG2 (Acyl-CoA Synthetase Bubblegum 2) situé sur le chromosome 19 (Gene ID: 81616 et Ensembl : ENSG00000130377) et que cette différence : soit impacte négativement la transcription du gène de sorte que celui-ci ne puisse plus être transcrit, soit entraîne l’altération des transcrits ACSBG2, tel que définie au point précédent. Cette altération du gène peut être localisée dans la région codante (telles que les mutations faux sens ou non-sens), dans les jonctions exons/introns (telles que les mutations des sites d’épissage) ou dans les régions non codantes (telles que des délétions ou duplications). Ladite séquence connue du ACSBG2 a pour séquence nucléotidique la séquence SEQ ID NO : 1 ou une séquence présentant au moins 65% voire 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% ou même 99% d’identité avec la séquence SEQ ID NO : 1, on entend par « teneur en fructose », la quantité en fructose, sous toutes ses formes connues de l’Homme du métier, notamment ses formes β-D-Fructopyranose et β-D-fructofuranose, présente dans l’échantillon biologique analysé, on entend par « teneur en zinc », la quantité en zinc, sous toutes ses formes connues de l’Homme du métier, présente dans l’échantillon biologique analysé, on entend par « teneur en acide citrique », la quantité en acide 2-hydroxypropane-1,2,3-tricarboxylique ou toutes ses formes dérivées connues de l’Homme du métier, présente dans l’échantillon biologique analysé, on entend par « teneur en phosphatase acide prostatique », la quantité en isoenzyme-2 de la phosphate acide (PAC), essentiellement synthétisée dans la prostate, présente dans l’échantillon biologique analysé, on entend par « teneur en alpha-glucosidase neutre », la quantité en enzyme alpha-glucosidase neutre (N-a-G ou « Neutral α-glucosidase » d’après sa dénomination anglaise (EC 3.2.1.20)), présente dans l’échantillon biologique analysé. De préférence, la présente invention a pour objet un procédé de diagnostic in vitro ou ex vivo tel que définie précédemment dans lequel les caractéristiques suivantes sont choisies seules ou en combinaison : l’échantillon biologique dudit individu est un échantillon de sperme et ledit au moins un marqueur détecté est choisi parmi : l’accumulation de gouttelettes lipidiques, dans les spermatozoïdes et/ou le liquide séminal, supérieure à une valeur de référence, la teneur en carnitine et/ ou en dérivés de carnitine, dans le liquide séminal et/ou dans les spermatozoïdes, inférieure à une valeur de référence, la teneur en protéine ACSBG2, dans les spermatozoïdes, inférieure à une valeur de référence, la teneur en transcrits ACSBG2, dans les spermatozoïdes, inférieure à une valeur de référence, l’altération de la séquence des transcrits ACSBG2, dans les spermatozoïdes, par rapport à une séquence de référence, l’altération de la séquence du gène ACSBG2, dans les spermatozoïdes, l’échantillon biologique dudit individu est un échantillon de sperme, dans lequel la teneur en carnitine, dans le liquide séminale, est inférieure à une valeur de référence et dans lequel au moins un des marqueurs suivants est détecté dans le liquide séminal : une teneur en fructose, une teneur en zinc, une teneur en acide citrique, une teneur en phosphatase acide prostatique ou une teneur en alpha-glucosidase neutre supérieure ou égale à une valeur de référence, la teneur en carnitine détectée dans du liquide séminal est inférieure à 390 nmol/éjaculat, la teneur en carnitine détectée, dans le liquide séminal et/ou dans les spermatozoïdes, est nulle, la teneur en protéine ACSBG2 détectée, dans les spermatozoïdes, est nulle, l’accumulation de gouttelettes lipidiques dans les spermatozoïdes et/ou le liquide séminale est détectée via une technique de coloration desdites gouttelettes lipidiques, de préférence via la technique Oil-RedO, l’échantillon biologique dudit individu est un échantillon de sang ou de salive dudit individu, l’au moins un marqueur détecté étant l’altération de la séquence du gène ACSBG2, l’étape de détection comprend la détection d’au moins deux desdits marqueurs, de préférence au moins trois desdits marqueurs, préférentiellement au moins quatre desdits marqueurs, encore plus préférentiellement au moins cinq desdits marqueurs et encore plus préférentiellement les six marqueurs, le procédé comprend une étape de détection supplémentaire d’un marqueur, ledit marqueur étant un taux de spermatozoïdes morts supérieur à 42%, de préférence le taux de spermatozoïdes morts détecté étant supérieur 70 %, le procédé est un procédé pour le diagnostic in vitro ou ex vivo de l’asthénozoospermie ou de l’asthéno-nécro-zoospermie. L’invention a également pour objet un kit pour le diagnostic in vitro ou ex vivo d’une infertilité masculine résultant d’un dysfonctionnement du métabolisme lipidique des spermatozoïdes chez un individu, comprenant des moyens de détection configurés pour la détection, dans un échantillon biologique dudit individu, d’au moins un marqueur choisi parmi : une accumulation de gouttelettes lipidiques supérieure à une valeur de référence, une teneur en carnitine ou en dérivés de carnitine inférieure à une valeur de référence, une teneur en protéine ACSBG2 inférieure à une valeur de référence, une teneur en transcrits ACSBG2 inférieure à une valeur de référence, une altération de la séquence des transcrits ACSBG2 par rapport à une séquence de référence, et une altération de la séquence du gène ACSBG2. De préférence, les moyens de détection comprennent des moyens de coloration desdites gouttelettes lipidiques dans les spermatozoïdes et/ou le liquide séminal, de préférence les moyens de colorations étant des moyens selon la technique Oil-RedO. Avantageusement, le kit selon l’invention comprend en outre des moyens de détection configurés pour la détection d’un taux de spermatozoïdes morts dans ledit échantillon biologique supérieur à une valeur de référence. L’invention se rapporte également à une utilisation d’au moins un marqueur choisi parmi : une accumulation de gouttelettes lipidiques supérieure à une valeur de référence, une teneur en carnitine ou en dérivés de carnitine inférieure à une valeur de référence, une teneur en protéine ACSBG2 inférieure à une valeur de référence, une teneur en transcrits ACSBG2 inférieure à une valeur de référence, une altération de la séquence des transcrits ACSBG2 par rapport à une séquence de référence, et une altération de la séquence du gène ACSBG2, pour le diagnostic in vitro ou ex vivo d’une infertilité masculine résultant d’un dysfonctionnement du métabolisme lipidique des spermatozoïdes chez un individu, ledit marqueur étant détecté dans un échantillon biologique dudit individu. De préférence, ledit au moins un marqueur détecté est choisi parmi : l’accumulation de gouttelettes lipidiques, dans les spermatozoïdes et/ou le liquide séminal, supérieure à une valeur de référence, la teneur en carnitine et/ ou en dérivés de carnitine, dans le liquide séminal du patient et/ou dans les spermatozoïdes, inférieure à une valeur de référence, la teneur en protéine ACSBG2, dans les spermatozoïdes, inférieure à une valeur de référence, la teneur en transcrits ACSBG2, dans les spermatozoïdes, inférieure à une valeur de référence, l’altération de séquence des transcrits ACSBG2, dans les spermatozoïdes, par rapport à une séquence de référence, l’altération de la séquence du gène ACSBG2, dans les spermatozoïdes, l’échantillon biologique dudit individu est un échantillon de sperme. Avantageusement, l’utilisation selon l’une des variantes précédentes est pour le diagnostic in vitro ou ex vivo de l’asthénozoospermie ou pour le diagnostic in vitro ou ex vivo de l’asthéno-nécro-zoospermie. La présente invention est illustrée dans l’exemple qui suit et à l’appui des figures selon lesquelles : FIG. 1 : représente l’altération de la séquence du gène ACSBG2 observée chez le patient P1 ; FIG. 2 : représente (A) l’analyse quantitative et qualitative des transcrits ACSBG2 détectés chez les patients P1 et P2 et (B) le séquençage desdits transcrits du patient P1 ; FIG. 3 : représente (A) la détection par immunofluorescence ou (B) par western blot de la protéine ACSBG2 chez les patients P1 et P2 ; FIG. 4 : représente (A) la détection de l’accumulation de gouttelettes lipidiques chez le patient P1 et (B) l’analyse quantitative desdites gouttelettes lipidiques chez les patients P1 et P2 ; FIG. 5 : représente (A) la détection de la carnitine et de l’acylcarnitine dans les spermatozoïdes des patients P1 et P2 et (B) la détection de la carnitine dans le liquide séminal des patients P1 et P2, au regard d’autres marqueurs associés normalement à la carnitine et présents dans liquide séminal. 1/ Exemple 1 – Matériel et méthode 1.1 - Autorisations éthiques L'étude a été menée conformément aux directives éthiques (Déclaration d'Helsinki). Le prélèvement et l'utilisation d'échantillons de sperme d'individus contrôles et de patients, ainsi que les analyses génétiques des patients, ont été autorisés par le Comité de Protection des Personnes CPP Ile de France III (CPP n° SC2748. A. Touré, E. Dulioust, AP- HP Cochin). Un consentement éclairé a été obtenu de tous les patients et individus contrôles avant leur inclusion dans l'étude. 1.2 - Identification des patients Les patients P1 et P2 ont accepté de participer au programme de recherche des inventeurs, au cours de leur parcours de prise en charge de leur infertilité. Le patient P1 présentait une asthéno-nécrozoospermie sévère (moyenne mobilité 0% et viabilité 6% ; 3 spermogrammes) et a été identifié par séquençage d’exome comme porteur d’une mutation tronquante homozygote dans le gène ACSBG2. Les inventeurs ont caractérisé les conséquences de cette mutation et ont notamment mis en évidence une accumulation de gouttelettes lipidiques dans les spermatozoïdes du patient P1 par comparaison avec les spermatozoïdes de sujets contrôles. Suite à cette observation inédite, les inventeurs ont utilisé la technique de coloration des gouttelettes lipidiques sur les frottis de spermatozoïdes de 15 patients présentant une asthénozoospermie fonctionnelle et pour lesquels aucune information génétique n’était disponible. Le patient P2 a ainsi été identifié et présentait également une asthéno-nécrozoospermie sévère (moyenne mobilité 0% et viabilité 2% ; 3 spermogrammes) avec une accumulation similaire de gouttelettes lipidiques dans ses spermatozoïdes. La caractérisation des deux patients P1 et P2, présenté dans cette demande d’invention, a ensuite été réalisé en parallèle. Patient P1 Patient P2 Valeurs normales Volume (ml) 2.3 2.1 > 1.4 pH 7.7 7.7 > 7.2 Viscosité Elevée Elevée Numération (10 6 ) 63 301.6 > 39 [35-40] Mobilité totale 0 0.3 > 42 [40-43] Mobilité progressive 0 0 > 30 [29-31] Vitalité 6 2 > 54 [50-56] Formes typiques 17.7 19.3 > 23 [20-26] Paramètres spermatiques des patients P1 et P2 (moyenne de 3 spermogrammes) 1. 3 - Échantillons de sperme Les échantillons de sperme ont été obtenus par masturbation après 2 à 7 jours d'abstinence sexuelle. L'évaluation des paramètres du sperme a été réalisée conformément aux procédures établies l'Organisation mondiale de la santé (OMS). La viabilité des spermatozoïdes a été évaluée par coloration à l'éosine-nigrosine et la morphologie des spermatozoïdes a été analysée sur des frottis de sperme colorés par la méthode de Schorr, selon la classification de David ( Auger et al. 2016 ). Des échantillons de sperme d’individus dits « contrôles » (ci-après « individu(s) contrôle(s) ») ont été sélectionnés sur la base de valeurs normales de volume, de pH, de numération, de motilité, de viabilité et de morphologie, conformément aux critères de l'OMS. 1. 4 - Séquençage exomique Le séquençage de l'exome entier des patients a été réalisé sur l'ADN génomique extrait de sang à l'aide du kit d'extraction d'ADN Oragen (DNAgenotech®, Ottawa, Canada). Les régions codantes et les jonctions intron/exon ont été séquencées sur la plateforme Novogen basée en Chine (agilent v6, HiSeqX) après enrichissement avec des kits Agilent (Agilent Technologies, Wokingham, Royaume-Uni). Les données de séquençage ont été analysées par alignement avec le génome de référence GRCh38, à l'aide d’un pipeline bioinformatique précédemment publié ( Lorès et al. Am J hum genet 2019 ). Les variants ont été validés par séquençage Sanger sur l’équipement ABI 3130XL (Applied Biosystems). 1. 5 - Analyse des transcrits par RT-PCR L'ARN total (800 à 1 000 ng) a été extrait à partir de 5 à 10 millions de spermatozoïdes humains à l'aide d'un kit NucleoSpin RNA (Macherey-Nagel ; Düren, Allemagne) et traité à l'aide d'un kit de transcription inverse d'ADNc haute capacité (Applied Biosystems, Thermo Fisher Scientific ; Waltham, MA, USA) suivant le protocole du fabricant. Les réactions PCR ont été réalisées à partir de 50 ng d'ARNm rétrotranscrit avec l'ADN polymérase GoTaq (Promega) en utilisant des amorces spécifiques du gène ACSBG2 avec 40 cycles d'amplification (95°C, 30 s ; 55°C, 30 s ; 72°C, 1 min). Les amplicons ont été analysés par électrophorèse sur gel d’agarose ou purifiés à l'aide du kit d'extraction de gel GeneJET (Fermentas, Thermo Fisher Scientifics; Waltham, MA, USA) pour séquençage (Eurofins Scientific, France). Les résultats du séquençage ont été analysés à l'aide du logiciel BioEdit (Ibis Therapeutics ; Carlsbad, CA, USA). 1. 6 - Analyse des protéines par western blot 2 à 10 millions de spermatozoïdes ont été lavés avec du milieu M2 (Sigma-Aldrich) puis avec du tampon PBS par centrifugation à 10 000 x g à température ambiante pendant 10 min. Les culots de spermatozoïdes obtenus ont été remis en suspension et dénaturés dans un tampon Laemmli puis incubés à 95°C pendant 5 min. Après centrifugation à 13 000 x g à 4 °C pendant 10 min, le surnageant a été collecté et 5 % de β-mercaptoéthanol ont été ajoutés avant une nouvelle incubation à 95 °C pendant 5 min. Les échantillons de protéines dénaturées ont été chargés sur gel SDS-PAGE (8 % d'acrylamide/bisacrylamide [40 % 37,5 : 1]) et transférés sur des membranes de nitrocellulose. Les membranes ont été bloquées avec une solution de PBS-Tween 0,1 %- Lait à 5 % et l’analyse par immunoblot a été réalisée en utilisant les anticorps primaires ACSBG2 (Sigma-Aldrich) et Tubulin (Sigma-Aldrich). LA révélation a été faite par chimioluminescence (kit Millipore, Immobilion Forte Western HRP Substrate). 1. 7 - Analyse des protéines par immunofluorescence 10 µL d'échantillons de sperme ont été étalés sur une lame Superfrost Plus (Menzel Glasbearbeitungswerk, GmbH & Co. KG) et fixés par incubation dans une solution de PBS/4% PFA pendant 10 min. Les lames ont été incubées 20 minutes à 95°C dans un tampon citrate (H-3300, VectorLabs) puis traitées avec 0,2 % de Triton dans du tampon PBS pour la perméabilisation. Une étape de blocage a été réalisée par incubation dans une solution de PBS/1% BSA pendant 1 h. Les lames ont ensuite été incubées toute la nuit avec les anticorps primaires de lapin ACSBG2 (Sigma-Aldrich) et de souris Tubulin (Sigma-Aldrich) à 4°C. Après lavage en tampon PBS, les lames ont été incubées avec les anticorps secondaires anti-souris Alexa Fluor 488 (Invitrogen) et anti-lapin Alexa Fluor 568 (Invitrogen) pendant 1 h à température ambiante. Les lames ont été lavées dans du tampon PBS et montées dans du milieu Vectashield (Vector Laboratories) additionné de 0,5 µg/mL de DAPI. Les lames ont été analysées avec un microscope à épifluorescence Nikon Eclipse E600 (Nikon, Japon). Les images numériques ont été acquises avec une caméra à dispositif à couplage de charge (CCD) refroidi (Hamamatsu Co.) avec des paramètres d'instrument identiques, et à l’aide du logiciel MetaMorph (Molecular Devices). 1. 8 - Détection des gouttelettes lipidiques 10 µL d'échantillons de sperme ont été étalés sur une lame Superfrost Plus (Menzel Glasbearbeitungswerk, GmbH & Co. KG) et fixés par incubation dans du tampon PBS/Paraformaldéhyde à 4 % pendant 10 min. Les lames ont ensuite été traitées avec une solution de NH4Cl/PBS 50 mM pendant 10 minutes. Après perméabilisation dans une solution de tritonX-100 0,5% pendant 4 minutes, les lames ont été incubées dans une solution à 60% d'Oil-red-O/Triéthylphosphate (Sigma Aldrich) pendant 45 minutes. Les noyaux ont été contre-colorés avec de l'hématoxyline Mayer et les lames ont été montées avec du milieu Vectashield (Vector Laboratories). Les images numériques ont été acquises avec une caméra à dispositif à couplage de charge (CCD) refroidi (Hamamatsu Co.) avec des paramètres d'instrument identiques, et à l’aide du logiciel MetaMorph (Molecular Devices). 1. 9 - Dosage de la carnitine et des acylcarnitines dans les spermatozoïdes Les lysats de spermatozoïdes ont été préparés par sonication dans de l'eau distillée. Des aliquotes de 20 μL ont été déposées sur des membranes filtrantes Whatman jusqu’à absorption totale. Les dépôts une fois séchés ont été traitées pour analyse par spectrométrie de masse en tandem comme décrit précédemment (REF : PMID9365395). Les données ont été acquises à l'aide d'un spectromètre Micromass Quattro Micro API équipé d'un module de chromatographie liquide haute performance 2795 et d'un système de données contrôlé par le système d'exploitation MassLynx 4.1 (Waters, Milford, MA). 1. 10 - Dosage de la carnitine dans le liquide séminal 500µL de sperme ont été centrifugés pendant 15 minutes à 3000g et le surnageant correspondant au liquide séminal a été utilisé pour les dosages biochimiques de fructose, zinc, acide citrique, phosphatase acide prostatique, carnitine et alpha-glucosidase neutre, en suivant les procédures établies par l’OMS. 2/ Exemple 2 – Résultats 2.1 - Altération de la séquence du gène ACSBG2 comme marqueur pour le diagnostic in vitro ou ex vivo d’une infertilité masculine liée à un dysfonctionnement du métabolisme lipidique des spermatozoïdes ( FIG. 1 ) La FIG. 1 met en évidence le variant homozygote c.1089-2A>G, touchant un résidu intronique de site accepteur d’épissage par séquençage de l’ADN génomique du patient P1 et sa comparaison avec la séquence de référence ACSBG2 (Acyl-CoA Synthetase Bubblegum 2; Gene ID: 81616). La comparaison de l’électrophorégramme du patient P1 avec celui d’un individu contrôle montre la substitution au niveau du site accepteur d’épissage du nucléotide Adénosine (A) par le nucléotide Guanosine (G) chez le patient P1. 2.2 - Réduction de la teneur et/ou altération de la séquence des transcrits ACSBG2 comme marqueur(s) pour le diagnostic in vitro ou ex vivo d’une infertilité masculine liée à un dysfonctionnement du métabolisme lipidique des spermatozoïdes ( FIG. 2 ) La FIG. 2 (A) met en évidence une teneur réduite en transcrits ACSBG2 dans les spermatozoïdes des patients P1 et P2 par comparaison aux spermatozoïdes d’individus contrôles. L’amplification des transcrits ACSBG2 a été réalisée par utilisation d’oligonucléotides ciblant spécifiquement différentes régions du transcrits ACSBG2 (exons 9-11 pour le patient P1 et exons 7-10 pour le patient P2). L’amplification des transcrits HPRT, réalisée à titre de contrôle de la qualité des transcrits, ne montre aucune différence entre les patients et les individus contrôles. En plus de la teneur réduite en transcrits, le patient P1 montre une taille d’amplicon anormale, indicative d’une altération de la séquence des transcrits. La FIG. 2 (B) met en évidence l’altération de la séquence des transcrits ACSBG2 du patient P1. La comparaison de l’électrophorégramme des transcrits amplifiés chez un individu contrôle avec celui des transcrits amplifiés chez le patient P1 indique l’absence d’exon 10, confirmant que le variant génique c.1089-2A>G conduit à un défaut d’épissage des transcrits chez le patient P1. 2.3 - Réduction de la teneur en protéine ACSBG2 comme marqueur pour le diagnostic in vitro ou ex vivo d’une infertilité masculine liée à un dysfonctionnement du métabolisme lipidique des spermatozoïdes ( FIG. 3 ) La FIG. 3 (A) met en évidence la réduction de la teneur en protéine ACSBG2 par immunofluorescence sur frottis de spermatozoïdes des patients P1 et P2 par comparaison avec les spermatozoïdes d’individus contrôles. La protéine ACSBG2 est détectée par utilisation d’anticorps spécifiques. Cette détection est significative et visible pour les spermatozoïdes des individus contrôles uniquement. A l’inverse, elle est très faiblement détectée chez les spermatozoïdes des patients P1 et P2, traduisant ainsi une réduction de la teneur en protéine ACSBG2 chez les spermatozoïdes des patients P1 et P2. La Tubuline est détectée à titre de contrôle qualitatif de l’analyse. La FIG. 3 (B) met en évidence la réduction de la teneur en protéine ACSBG2 par western blot sur des extraits protéiques de spermatozoïdes des patients P1 et P2 par comparaison avec les spermatozoïdes d’individus contrôles. En outre, des spermatozoïdes d’un patient asthénozoospermique (AST1), ne présentant pas d’altération de la séquence géniques ACSBG2, sont utilisés à titre de contrôle de l’analyse. Chez le patient AST1, la protéine ACSBG2 est bien détectée. La Tubuline est aussi analysée chez tous les individus (patients et individus contrôles) à titre de contrôle qualitatif et quantitatif de l’expérience. A l’instar de l’analyse par immunofluorescence, la détection par western blot révèle bien une réduction de la teneur en protéine ACSBG2 chez les spermatozoïdes des patients P1 et P2. 2.4 - Accumulation de gouttelettes lipidiques dans les spermatozoïdes comme marqueur pour le diagnostic in vitro ou ex vivo d’une infertilité masculine liée à un dysfonctionnement du métabolisme lipidique des spermatozoïdes ( FIG. 4 ) La FIG. 4 (A) met en évidence l’accumulation de gouttelettes lipidiques dans un spermatozoïde du patient P1 par comparaison au spermatozoïde d’un individu contrôle, par coloration histologique OilRedO. On note une accumulation importante de gouttelettes lipidiques dans le spermatozoïde du patient P1 par rapport au spermatozoïde de l’individu « contrôle ». La FIG. 4 (B) met en évidence l’accumulation de gouttelettes lipidiques dans les spermatozoïdes des patients P1 et P2 par comptage de la présence ou l’absence de gouttelettes sur au moins 100 spermatozoïdes desdits patients et d’individus contrôles. Le ratio [nombre de spermatozoïdes contenant des gouttelettes chez les patients P1 et P2] / [nombre de spermatozoïdes contenant des gouttelettes chez les individus contrôles] indique le niveau d’accumulation et révèle ainsi un nombre de gouttelettes lipidiques plus de deux fois supérieur à la normale dans les spermatozoïdes du patient P2 et plus de trois fois supérieur à la normale dans les spermatozoïdes du patient P1. 2.5 - Réduction de la teneur en carnitine et/ou acylcarnitines dans les spermatozoïdes et/ou dans le liquide séminal comme marqueur(s) pour le diagnostic in vitro ou ex vivo d’une infertilité masculine liée à un dysfonctionnement du métabolisme lipidique des spermatozoïdes ( FIG. 5 ) La FIG. 5 (A) met en évidence la réduction de la teneur, quantifiée par la concentration (µM/L), en carnitine (C0) et en acylcarnitine (dérivé de la carnitine, illustré par les acylcanitines C2), dans les spermatozoïdes des patients P1 et P2, par comparaison aux spermatozoïdes d’individus contrôles et aux spermatozoïdes d’un patient asthénozoospermique (AST3). La comparaison avec le patient AST3 permet de mettre en évidence que les défauts lipidiques ne sont pas systématiquement retrouvés dans les situations d’asthénozoospermie, permettant ainsi d’identifier une nouvelle catégorie d’asthénozoospermie fonctionnelle. La FIG. 5 (B) met en évidence la réduction de la teneur en carnitine dans le liquide séminal des patients P1 et P2. La concentration des différents marqueurs biochimiques présents dans le liquide séminal et secrétés par les vésicules séminales (fructose), la prostate (zinc, acide citrique, phosphatase acide prostatique) et l’épididyme (carnitine, alpha-glucosidase neutre ) est représentée par rapport à des valeurs de références correspondant aux concentrations normales chez des individus « contrôles ». A titre d’exemple, ces valeurs de références peuvent être : 2.4 µmol/éjaculat pour le zinc, 47 µmol/éjaculat pour l’acide citrique, 1665 UI/éjaculat pour la phosphatase acide prostatique, 13 µmol/éjaculat pour le fructose, 390 nmol/éjaculat pour la carnitine et 20 mUI/éjaculat pour l’alpha-glucosidase neutre (UI (ou U) : unité correspondant à la quantité d'enzyme qui catalyse la transformation de 1 µmole de substrat par minute). Un ratio inférieur à 1 est indicatif d’une diminution de la teneur du marqueur analysé. On note que la carnitine présente une réduction importante de sa teneur dans le liquide séminal chez les deux patients P1 et P2. Cette tendance à la réduction n’est pas observée pour tous les autres marqueurs chez les patients P1 et P2. Les teneurs de ces autres marqueurs demeurent présents soit à des teneurs faiblement réduites ou équivalentes aux valeurs des individus « contrôles » (pour le patient P1), soit à des teneurs supérieures auxdites valeurs des individus « contrôles » (pour le patient P2). 2.6 – Conclusions Il ressort clairement de ces données expérimentales qu’un procédé, un kit et une utilisation selon l’invention permettent le diagnostic d’une nouvelle catégorie de patients infertiles dont la cause de l’infertilité résulte d’un dysfonctionnement du métabolisme lipidique des spermatozoïdes. Grâce à l’invention, il est donc possible d’identifier d’une manière simple, rapide et efficace de tels patients et de leur proposer des solutions thérapeutiques spécifiques et adaptées à ce dysfonctionnement. Cette invention permet d’ouvrir la voie à un traitement thérapeutique direct de ce type d’infertilité masculine. En d’autres termes, l’invention ouvre la voie à un traitement thérapeutique destiné uniquement aux patients masculins souffrant de ladite infertilité, et ne reposant, par conséquent, pas sur leurs conjointes féminines, comme cela est actuellement le cas pour l’AMP par FIV/ICSI. Il s’agit donc d’une réelle avancée en la matière, puisqu’à ce jour il n’existe aucun traitement thérapeutique de l’infertilité masculine, quel que soit le type de l’infertilité. Ces données expérimentales démontrent l’efficacité de l’invention pour chacun des marqueurs identifiés par les inventeurs. Bien entendu, ces marqueurs peuvent être combinés les uns avec les autres, selon toute combinaison envisageable, afin de renforcer et/ou consolider le diagnostic associé. Procédé de diagnostic in vitro ou ex vivo d’une infertilité masculine résultant d’un dysfonctionnement du métabolisme lipidique des spermatozoïdes chez un individu, comprenant une étape de détection, dans au moins un échantillon biologique dudit individu, d’au moins un marqueur choisi parmi : une accumulation de gouttelettes lipidiques supérieure à une valeur de référence, une teneur en carnitine et/ou en dérivés de carnitine inférieure à une valeur de référence, une teneur en protéine ACSBG2 inférieure à une valeur de référence, une teneur en transcrits ACSBG2 inférieure à une valeur de référence, une altération de la séquence des transcrits ACSBG2 par rapport à une séquence de référence, et une altération de la séquence du gène ACSBG2. Procédé selon la revendication précédente, dans lequel l’échantillon biologique dudit individu est un échantillon de sperme et ledit au moins un marqueur détecté est choisi parmi : l’accumulation de gouttelettes lipidiques, dans les spermatozoïdes et/ou le liquide séminal, supérieure à une valeur de référence, la teneur en carnitine et/ ou en dérivés de carnitine, dans le liquide séminal et/ou dans les spermatozoïdes, inférieure à une valeur de référence, la teneur en protéine ACSBG2, dans les spermatozoïdes, inférieure à une valeur de référence, la teneur en transcrits ACSBG2, dans les spermatozoïdes, inférieure à une valeur de référence, l’altération de la séquence des transcrits ACSBG2, dans les spermatozoïdes, par rapport à une séquence de référence, l’altération de la séquence du gène ACSBG2, dans les spermatozoïdes. Procédé selon la revendication précédente, dans lequel l’échantillon biologique dudit individu est un échantillon de sperme, dans lequel la teneur en carnitine, dans le liquide séminale, est inférieure à une valeur de référence et dans lequel au moins un des marqueurs suivants est détecté dans le liquide séminal : une teneur en fructose, une teneur en zinc, une teneur en acide citrique, une teneur en phosphatase acide prostatique ou une teneur en alpha-glucosidase neutre supérieure ou égale à une valeur de référence. Procédé selon l’une quelconque des revendications 2 ou 3, dans lequel la teneur en carnitine détectée dans du liquide séminal est inférieure à 390 nmol/éjaculat. Procédé selon l’une quelconque des revendications 2 à 4, dans lequel la teneur en carnitine détectée, dans le liquide séminal et/ou dans les spermatozoïdes, est nulle. Procédé selon l’une quelconque des revendications 2 à 5, dans lequel la teneur en protéine ACSBG2 détectée, dans les spermatozoïdes, est nulle. Procédé selon l’une quelconque des revendications précédentes, dans lequel l’accumulation de gouttelettes lipidiques dans les spermatozoïdes et/ou le liquide séminale est détectée via une technique de coloration desdites gouttelettes lipidiques, de préférence via la technique Oil-RedO. Procédé selon la revendication 1, dans lequel l’échantillon biologique dudit individu est un échantillon de sang ou de salive dudit individu, l’au moins un marqueur détecté étant l’altération de la séquence du gène ACSBG2. Procédé selon l’une quelconque des revendications précédentes, dans lequel l’étape de détection comprend la détection d’au moins deux desdits marqueurs, de préférence au moins trois desdits marqueurs, préférentiellement au moins quatre desdits marqueurs, encore plus préférentiellement au moins cinq desdits marqueurs et encore plus préférentiellement les six marqueurs. Procédé selon l’une quelconque des revendications précédentes, comprenant une étape de détection supplémentaire d’un marqueur, ledit marqueur étant un taux de spermatozoïdes morts supérieur à 42%, de préférence le taux de spermatozoïdes morts détecté étant supérieur 70 %. Procédé selon l’une quelconque des revendications précédentes, pour le diagnostic in vitro ou ex vivo de l’asthénozoospermie ou de l’asthéno-nécro-zoospermie. Kit pour le diagnostic in vitro ou ex vivo d’une infertilité masculine résultant d’un dysfonctionnement du métabolisme lipidique des spermatozoïdes chez un individu, comprenant des moyens de détection configurés pour la détection, dans un échantillon biologique dudit individu, d’au moins un marqueur choisi parmi : une accumulation de gouttelettes lipidiques supérieure à une valeur de référence, une teneur en carnitine ou en dérivés de carnitine inférieure à une valeur de référence, une teneur en protéine ACSBG2 inférieure à une valeur de référence, une teneur en transcrits ACSBG2 inférieure à une valeur de référence, une altération de la séquence des transcrits ACSBG2 par rapport à une séquence de référence, et une altération de la séquence du gène ACSBG2. Kit selon la revendication précédente, dans lequel les moyens de détection comprennent des moyens de coloration desdites gouttelettes lipidiques dans les spermatozoïdes et/ou le liquide séminal, de préférence les moyens de colorations étant des moyens selon la technique Oil-RedO. Kit selon l’une quelconque des revendications 12 ou 13, comprenant en outre des moyens de détection configurés pour la détection d’un taux de spermatozoïdes morts dans ledit échantillon biologique supérieur à une valeur de référence. Utilisation d’au moins un marqueur choisi parmi : une accumulation de gouttelettes lipidiques supérieure à une valeur de référence, une teneur en carnitine ou en dérivés de carnitine inférieure à une valeur de référence, une teneur en protéine ACSBG2 inférieure à une valeur de référence, une teneur en transcrits ACSBG2 inférieure à une valeur de référence, une altération de la séquence des transcrits ACSBG2 par rapport à une séquence de référence, et une altération de la séquence du gène ACSBG2, pour le diagnostic in vitro ou ex vivo d’une infertilité masculine résultant d’un dysfonctionnement du métabolisme lipidique des spermatozoïdes chez un individu, ledit marqueur étant détecté dans un échantillon biologique dudit individu. Utilisation selon la revendication précédence, dans laquelle ledit au moins un marqueur détecté est choisi parmi : l’accumulation de gouttelettes lipidiques, dans les spermatozoïdes et/ou le liquide séminal, supérieure à une valeur de référence, la teneur en carnitine et/ ou en dérivés de carnitine, dans le liquide séminal du patient et/ou dans les spermatozoïdes, inférieure à une valeur de référence, la teneur en protéine ACSBG2, dans les spermatozoïdes, inférieure à une valeur de référence, la teneur en transcrits ACSBG2, dans les spermatozoïdes, inférieure à une valeur de référence, l’altération de séquence des transcrits ACSBG2, dans les spermatozoïdes, par rapport à une séquence de référence, l’altération de la séquence du gène ACSBG2, dans les spermatozoïdes, et dans lequel l’échantillon biologique dudit individu est un échantillon de sperme. Utilisation selon la revendication 15 ou 16, pour le diagnostic in vitro ou ex vivo de l’asthénozoospermie ou pour le diagnostic in vitro ou ex vivo de l’asthéno-nécro-zoospermie.