Brevet FR3158968A1 — publié le 20250808

L’invention concerne un procédé in vitro de prédiction du caractère de progresseur précoce d’un sujet atteint d’un cancer lors d’un traitement d’immunothérapie. Ce procédé comprend la détermination, dans un échantillon de sang isolé du sujet, de la concentration totale d’ADN libre circulant et d’une concentration des fragments d’ADN libre circulant de grande taille, la combinaison de ces données dans une fonction mathématique de sorte à obtenir un score, et la comparaison de ce score à un valeur de référence prédéterminée. Il conclut que le sujet présente un caractère de progresseur précoce lors du traitement d’immunothérapie lorsque le score obtenu est inférieur ou égal à la valeur de référence. PROCÉDÉ DE PRÉDICTION DE LA RÉPONSE D’UN PATIENT ATTEINT DE CANCER À UN TRAITEMENT D’IMMUNOTHÉRAPIE La présente invention s’inscrit dans le domaine général de l’oncologie. Plus particulièrement, la présente invention concerne un procédé in vitro de prédiction du caractère de progresseur précoce et/ou du caractère de non-progresseur précoce d’un sujet atteint d’un cancer lors de l’administration d’un traitement d’immunothérapie. Le traitement des cancers constitue depuis des décennies l’objectif de nombreux travaux de recherche. Dans les dernières années, un effort particulier a été réalisé pour développer des stratégies thérapeutiques plus individualisées. L’approche visant non pas à s’attaquer directement à la tumeur, mais à stimuler le système immunitaire, dite immunothérapie, est aujourd’hui reconnue comme l’une des stratégies thérapeutiques les plus efficaces pour le traitement d’un grand nombre de types de cancers. Sur certains types de cancers, l’immunothérapie est utilisée en routine, avec des résultats spectaculaires, notamment pour ce qui concerne le cancer du poumon à petites cellules. Ainsi, une méta-analyse a révélé que 25 % des patients traités par immunothérapie présentaient une réponse au traitement prolongeant la survie. En analyse multivariée, il a également été montré que des réponses durables étaient plus fréquentes chez les patients traités par immunothérapie, c’est-à-dire que leur survie globale était améliorée (Pons-Tostivint et al., 2019, JCO Precision Oncology, 3(3): 1-10). Cependant, les traitements d’immunothérapie ne montrent pas une efficacité chez tous les patients. En outre, ils peuvent provoquer des effets indésirables sur certains. Pour ces patients, une chimiothérapie classique aurait été une meilleure option. On parle alors de patients non-répondeurs au traitement d’immunothérapie. Cette information est souvent obtenue tard, plusieurs semaines après le démarrage du traitement d’immunothérapie, semaines qui peuvent entrainer la dégradation de l’état de santé du patient et réduire notablement son espérance de vie. Identifier les patients chez lesquels une immunothérapie sera efficace est une nécessité aujourd’hui actée par l’ensemble de la communauté en immunothérapie. Aucune méthode ne permet actuellement, avant le démarrage d’un traitement d’immunothérapie, d’identifier / classifier les patients atteints de cancer qui seront répondeurs ou non-répondeurs à ce traitement, plus précisément d’identifier les patients pour lesquels ce traitement permettra, ou ne permettra pas, d’empêcher la progression de la tumeur. Un biomarqueur fiable, standardisé, pouvant être utilisé dans la pratique clinique pour prédire la réponse au traitement et en évaluer l'efficacité future n’a pas encore été identifié. Or, l’existence d’un tel marqueur prédictif améliorerait l’efficacité de la prise en charge des patients et son éthique sous-tendue, en évitant aux patients des pertes de chance de guérison et des effets indésirables inutiles. En outre, les nouveaux traitements d’immunothérapie sont vendus à des prix très élevés. Le coût d’un traitement par cellules CAR-T est d’environ 350 000 euros par patient, et celui d’un traitement par immunomodulateurs d’environ 75 000 euros par an. Ces coûts posent évidemment des problèmes d’accès et de prise en charge, d’autant plus que ces traitements ne sont efficaces que chez une fraction des patients et qu’ils n’apportent pas toujours un bénéfice majeur. A ce jour, deux marqueurs sont utilisés pour prédire le caractère répondeur des patients aux traitements d’immunothérapie, à titre indicatif seulement car le caractère prédictif de ces marqueurs est limité : - le score positif combiné (CPS, pour l’anglais Combined Positive Score), qui évalue l'expression de PD-L1 (« programmed death ligand-1 ») dans les cellules tumorales et les cellules immunitaires – ce score est égal au nombre total de cellules marquant PD-L1 x 100, divisé par le nombre de cellules tumorales viables ; - et le score de proportion tumorale (TPS, pour l’anglais Tumor Proportion Score), qui ne prend en compte que l’expression de PD-L1 par les cellules tumorales – ce score est égal au nombre de cellules tumorales marquant PD-L1) x 100, divisé par le nombre de cellules tumorales viables. Ces marqueurs CPS et TPS nécessitent néanmoins la mise en place de protocoles souvent particuliers à chaque centre de soin, et aucune normalisation n’est à ce jour réalisée, ce qui entraine des différences dans les valeurs des scores et seuils appliqués dans les différents centres de soin. La présente invention vise à proposer un procédé permettant de prédire, avec une haute précision, comment un patient atteint de cancer répondra, plus précisément si sa tumeur progressera précocement ou non, lorsqu’il sera soumis à d’un traitement d’immunothérapie, ceci avant le démarrage d’un tel traitement. Des objectifs supplémentaires de l’invention sont que ce procédé soit facile à mettre en œuvre, au moyen d’appareillages couramment disponibles dans les laboratoires d’analyse, et qu’il puisse s’appliquer au plus grand nombre possible, d’une part, de types de cancers, et d’autre part, de types de traitements d’immunothérapie. Visant à développer un tel procédé, les présents inventeurs se sont intéressés à l’acide désoxyribonucléique (ADN) libre circulant présent dans le sang des patients. Cet ADN libre circulant dans le plasma sanguin est actuellement l’enjeu d’une intense recherche clinique en oncologie, car on peut y retrouver des mutations de l’ADN génomique présentes dans les cellules tumorales, qui orientent la thérapie à administrer au patient. Par commodité, on désignera cet acide désoxyribonucléique libre circulant, dans la présente description, par « ADN libre circulant » ou encore ADNcf. Il est clairement établi que le sang véhicule une petite quantité d’ADN libre circulant provenant de la libération de matériel génétique par les tissus. Cet ADN libre circulant sans cellule est sous la forme d’ADN double-brin d’une taille moyenne de 150-180 paires de bases (pb), correspondant à l’enroulement de l’ADN dans un nucléosome. Sa durée de vie est de moins de deux heures, avant qu'il ne soit filtré et éliminé de la circulation sanguine par la rate, le foie et les reins. Toutes les études s’accordent en une détection quantitative moindre de l’ADN libre circulant chez les individus sains et en son augmentation liée à différentes situations cliniques telles que les accidents vasculaires cérébraux et infarctus myocardiques, les exercices musculaires intensifs, l’insuffisance rénale aiguë, la cytolyse hépatique, les traumatismes, la chirurgie, le cancer, la présence d’un fœtus lors de la gestation... Dans le cas du cancer, les progrès récents de la biologie moléculaire et du séquençage de l’ADN ont permis d’identifier de nombreuses mutations de gènes impliqués dans l’oncogénèse à partir d’un type particulier d’ADN circulant, l’ADN circulant tumoral (ADNct). Il a notamment été montré que le taux d’ADNct serait corrélé à la charge tumorale et au stade du cancer. D’une manière générale, les études réalisées portent sur l’utilisation de l’ADNct comme biomarqueur tumoral permettant de suivre l’évolution positive ou négative du patient lors de son traitement thérapeutique (immunothérapie ou autres). Des études corrélant l’ADN circulant avec l’évolution du patient au cours d’un traitement d’immunothérapie ont été décrites dans la littérature. La plupart de ces études portent sur le suivi post-traitement, en suivant le niveau de charge tumorale soit par mesure de l’ADNct par des techniques usuelles telles que la réaction de polymérisation en chaine (PCR) ou le séquençage, ou soit par un examen direct de la tumeur par imagerie. D’un point de vue plus général, les études réalisées sur l’ADN circulant portent sur les fragments d’ADN de petite taille, inférieure à 250 paires de bases, qui sont considérés comme portant la principale information, et plus précisément sur les tailles entre 70 et 150 paires de bases, qui sont enrichies en ADNct. L’ADNct est ainsi souvent proposé comme indicateur de l'évolution de la maladie. Il a maintenant été découvert par les présents inventeurs que l’analyse du profil de taille de l’ADN libre circulant total des sujets atteints d’un cancer permet de prédire leur réponse future aux traitements d’immunothérapie, plus précisément de déterminer si le sujet sera ou non progresseur précoce lorsqu’un tel traitement lui sera administré, ceci en amont de cette administration. On entend dans la présente description, par sujet non-progresseur précoce, ou sujet à caractère de non-progresseur précoce, de manière conventionnelle en elle-même dans le domaine médical, un sujet atteint de cancer pour lequel on observe, sur la première image de la tumeur acquise par imagerie médicale, en particulier par scanner aux rayons X, après le début du traitement d’immunothérapie, par rapport à l’image acquise par la même technique d’imagerie médicale avant le début de ce traitement, une augmentation de moins de 20 % des lésions tumorales repérées à l’imagerie, c’est-à-dire que les lésions tumorales ont diminué, sont restées stables ou ont augmenté de moins de 20 % (en surface). On parle alors plus couramment de progression de moins de 20 % de la tumeur cancéreuse à la première évaluation par imagerie après le début du traitement d’immunothérapie. Le moment de l’acquisition de la première image d’imagerie médicale après le début du traitement d’immunothérapie est déterminé selon le protocole conventionnel de prise en charge des malades atteints de cancer en vigueur dans le domaine, et dépend du type particulier de cancer concerné. Typiquement, ce moment est de 6 semaines après le début du traitement d’immunothérapie pour les cancers du poumon, et de 12 semaines pour les autres cancers. Par opposition, on entend, par sujet progresseur précoce, ou sujet à caractère de progresseur précoce, également de manière conventionnelle en elle-même dans le domaine médical, un sujet atteint de cancer pour lequel on observe, sur la première image de la tumeur acquise par imagerie médicale, en particulier par scanner aux rayons X, après le début du traitement d’immunothérapie, par rapport à l’image acquise par la même technique d’imagerie médicale avant le début de ce traitement, une augmentation de plus de 20 % des lésions tumorales repérées à l’imagerie, c’est-à-dire que les lésions tumorales ont augmenté de 20 % ou plus (en surface). On parle alors plus couramment de progression de plus de 20 % de la tumeur cancéreuse à la première évaluation par imagerie après le début du traitement d’immunothérapie. Comme indiqué ci-avant, on entend en outre, par ADN libre circulant, l’ADN extracellulaire présent dans le plasma sanguin du patient. Cet ADN libre circulant comprend l’ADN libre circulant tumoral et l’ADN libre circulant non-tumoral. Plus particulièrement, il a été découvert par les présents inventeurs que les patients à caractère de non-progresseur précoce, pour lesquels la tumeur ne progresse pas ou peu, ou même régresse, dans la période initiale d’un traitement d’immunothérapie, dans les premières semaines de ce traitement, présentent un plus fort taux de fragments d’ADN libre circulant de grande taille que les patients à caractère de progresseur précoce. Ainsi, la concentration, notamment la concentration relative, en fragments d’ADN libre circulant d’un patient atteint d’un cancer, dont la taille est supérieure à 500 paires de bases, constitue un paramètre qui peut être utilisé dans un procédé permettant de déterminer si ce patient sera progresseur précoce ou non-progresseur précoce lors de l’administration d’un traitement d’immunothérapie. Rien dans l’art antérieur, qui ne s’intéresse qu’aux fragments d’ADN libre circulant de petite taille, bien inférieure à 500 paires de bases, ne laissait présager un tel résultat. Ainsi, il est proposé selon la présente invention un procédé in vitro de prédiction du caractère de progresseur précoce et/ou du caractère de non-progresseur précoce d’un sujet atteint d’un cancer lors d’un traitement d’immunothérapie, c’est-à-dire lorsqu’un traitement d’immunothérapie lui sera administré. Ce procédé relève des procédés d’analyse statistique. Il comprend des étapes de : a/ détermination, dans un échantillon de sang isolé qui a été obtenu à partir dudit sujet, de préférence avant ledit traitement d’immunothérapie : - de la concentration totale d’acide désoxyribonucléique libre circulant dans ledit échantillon de sang, dite concentration d’ADNcf totale, - d’au moins une concentration, dans ledit échantillon de sang, des fragments d’acide désoxyribonucléique libre circulant dont la taille est incluse dans une plage de taille prédéterminée, ladite plage de taille prédéterminée, qui sera désignée dans la présente description par l’expression « plage de taille analytique », étant comprise dans les tailles supérieures à 500 paires de bases, la concentration ainsi déterminée étant appelée dans la présente description « concentration d’ADNcf de grande taille », b/ combinaison dans une fonction mathématique d’au moins ladite concentration d’ADNcf de grande taille, et de ladite concentration d’ADNcf totale, de sorte à obtenir un score, ce score reflétant la probabilité que le sujet présente ou non un caractère de progresseur précoce et/ou un caractère de non-progresseur précoce lors du traitement d’immunothérapie, et : c1/ comparaison de ce score à une première valeur de référence prédéterminée, et d1/ conclusion que le sujet présente un caractère de progresseur précoce lors du traitement d’immunothérapie lorsque ce score est inférieur ou égal à cette première valeur de référence, et/ou c2/ comparaison de ce score à une deuxième valeur de référence prédéterminée, et d2/ conclusion que le sujet présente un caractère de non-progresseur précoce lors du traitement d’immunothérapie lorsque le score est supérieur à cette deuxième valeur de référence. Dans des modes de mise en œuvre particuliers de l’invention, le procédé est un procédé in vitro de prédiction du caractère de progresseur précoce d’un sujet atteint d’un cancer lors d’un traitement d’immunothérapie, qui comprend des étapes de : a/ détermination, dans un échantillon de sang isolé qui a été obtenu à partir dudit sujet, de préférence avant ledit traitement d’immunothérapie : - de la concentration totale d’acide désoxyribonucléique libre circulant dans ledit échantillon de sang, dite concentration d’ADNcf totale, - d’au moins une concentration, dans ledit échantillon de sang, des fragments d’acide désoxyribonucléique libre circulant dont la taille est incluse dans une plage de taille prédéterminée, ladite plage de taille prédéterminée, qui sera désignée dans la présente description par l’expression « plage de taille analytique », étant comprise dans les tailles supérieures à 500 paires de bases, la concentration ainsi déterminée étant appelée dans la présente description « concentration d’ADNcf de grande taille », b/ combinaison dans une fonction mathématique d’au moins ladite concentration d’ADNcf de grande taille, et de ladite concentration d’ADNcf totale, de sorte à obtenir un score, ce score reflétant la probabilité que le sujet présente ou non un caractère de progresseur précoce lors du traitement d’immunothérapie, c1/ comparaison de ce score à une première valeur de référence prédéterminée, et d1/ conclusion que le sujet présente un caractère de progresseur précoce lors du traitement d’immunothérapie lorsque ce score est inférieur ou égal à cette première valeur de référence. Dans des modes de mise en œuvre particuliers de l’invention, le procédé est un procédé in vitro de prédiction du caractère de non-progresseur précoce d’un sujet atteint d’un cancer lors d’un traitement d’immunothérapie, qui comprend des étapes de : a/ détermination, dans un échantillon de sang isolé qui a été obtenu à partir dudit sujet, de préférence avant ledit traitement d’immunothérapie : - de la concentration totale d’acide désoxyribonucléique libre circulant dans ledit échantillon de sang, dite concentration d’ADNcf totale, - d’au moins une concentration, dans ledit échantillon de sang, des fragments d’acide désoxyribonucléique libre circulant dont la taille est incluse dans une plage de taille prédéterminée, ladite plage de taille prédéterminée, qui sera désignée dans la présente description par l’expression « plage de taille analytique », étant comprise dans les tailles supérieures à 500 paires de bases, la concentration ainsi déterminée étant appelée dans la présente description « concentration d’ADNcf de grande taille », b/ combinaison dans une fonction mathématique d’au moins ladite concentration d’ADNcf de grande taille, et de ladite concentration d’ADNcf totale, de sorte à obtenir un score, ce score reflétant la probabilité que le sujet présente ou non un caractère de non-progresseur précoce lors du traitement d’immunothérapie, c2/ comparaison de ce score à une deuxième valeur de référence prédéterminée, et d2/ conclusion que le sujet présente un caractère de non-progresseur précoce lors du traitement d’immunothérapie lorsque le score est supérieur à cette deuxième valeur de référence. Le procédé selon l’invention peut autrement être un procédé in vitro de prédiction du caractère de progresseur précoce et du caractère de non-progresseur précoce d’un sujet atteint d’un cancer lors d’un traitement d’immunothérapie. Il comprend alors, après l’étape d’obtention du score : - une étape c1/ de comparaison de ce score à la première valeur de référence prédéterminée, et une étape d1/ de conclusion que le sujet présente un caractère de progresseur précoce lors du traitement d’immunothérapie lorsque ce score est inférieur ou égal à cette première valeur de référence, et - une étape c2/ de comparaison de ce score à la deuxième valeur de référence prédéterminée, et une étape d2/ de conclusion que le sujet présente un caractère de non-progresseur précoce lors du traitement d’immunothérapie lorsque le score est supérieur à cette deuxième valeur de référence. Comme indiqué ci-avant, le procédé selon l’invention, qui prend en considération la teneur en ADNcf de grande taille contenu dans l’échantillon de sang issu du sujet, permet de prédire, avec une haute précision, le caractère de non-progresseur précoce et/ou le caractère de progresseur précoce vis-à-vis d’un traitement d’immunothérapie d’un patient atteint de cancer, ceci avant-même le démarrage d’un tel traitement. Un tel procédé s’avère particulièrement avantageux en ce qu’il permet par exemple d’éviter une administration du traitement d’immunothérapie aux patients qui ont été prédits comme progresseurs précoces et/ou qui n’ont pas été prédits comme non-progresseurs précoces, pour lesquels ce traitement ne présentera pas l’efficacité recherchée. La précision (ou justesse, pour l’anglais « accuracy ») de prédiction du procédé selon l’invention a notamment été vérifiée dans une étude observationnelle prospective menée sur une cohorte de 51 patients souffrant de différents types de cancers, et ayant été soumis à différents types de traitements d’immunothérapie (le procédé selon l’invention ayant été mis en œuvre sur des échantillons de sang prélevés des patients avant le début de ces traitements). De manière classique en elle-même, le terme précision désigne ici la proportion de patients ayant été correctement classés par le procédé selon l’invention. La performance des procédés de prédiction statistique est généralement évaluée en traçant une courbe de caractéristique de fonctionnement du récepteur (courbe ROC) et en mesurant l'aire sous la courbe (AUC). La courbe ROC est établie en traçant la sensibilité versus (1-spécificité) après classification des patients, en fonction des résultats obtenus par le procédé de prédiction. Plus la valeur de l'AUC est proche de 1, plus la sensibilité et la spécificité du procédé sont élevées, et plus le procédé est performant. Dans l'étude sur la cohorte de patients précitée, un procédé selon un mode de mise en œuvre de l'invention a permis de prédire un caractère de progresseur précoce des patients avec une AUC aussi élevée que 0,833, ce qui en démontre clairement la bonne performance. « Sensibilité » signifie ici, de manière classique, la probabilité du procédé d'identifier comme positifs les sujets progresseurs précoces (ou, selon les cas, non-progresseurs précoces), c'est-à-dire d'identifier les vrais positifs. « Spécificité » désigne la probabilité pour le procédé de ne pas identifier comme positifs les sujets non-progresseurs précoces (ou, selon les cas, progresseurs précoces), c'est-à-dire de ne pas identifier les vrais négatifs. De plus, on entend dans la présente description, par « valeur prédictive positive » (PPV), la probabilité pour un sujet d’être progresseur précoce (ou, selon les cas, non-progresseur précoce) lorsque le résultat du procédé le prédit comme tel. On entend, par « valeur prédictive négative » (NPV), la probabilité pour un sujet d’être non-progresseur précoce (ou, selon les cas, progresseur précoce) lorsque le résultat du procédé le prédit comme tel. Chacune des valeurs de référence utilisées dans le procédé selon l'invention est de préférence une valeur seuil, également couramment désignée par l’expression « valeur cut-off ». Il entre dans les compétences de l'homme du métier de savoir établir de telles valeurs de références, notamment de telles valeurs seuils, pour le procédé de prédiction selon l'invention, en fonction du niveau de sensibilité et de spécificité requis pour chaque prédiction. Une telle détermination peut être effectuée de manière soit empirique, soit théorique. Dans des modes de mise en œuvre particuliers de l’invention, ladite première valeur de référence et ladite deuxième valeur de référence sont identiques, et désignées par l’expression « valeur de référence commune ». Alors, le procédé comprend une étape de conclusion que : - si le score est inférieur ou égal à la valeur de référence commune, le sujet présente un caractère de progresseur précoce lors du traitement d’immunothérapie, et/ou - si le score est supérieur à la valeur de référence commune, le sujet présente un caractère de non-progresseur précoce lors du traitement d’immunothérapie. Dans des modes de mise en œuvre alternatifs de l’invention, la première valeur de référence et la deuxième valeur de référence sont différentes, la première valeur de référence étant inférieure à la deuxième valeur de référence. Le procédé peut alors comprendre une étape de conclusion que : - si le score est inférieur ou égal à la première valeur de référence, le sujet présente un caractère de progresseur précoce lors du traitement d’immunothérapie, - si le score est supérieur à la deuxième valeur de référence, le sujet présente un caractère de non-progresseur précoce lors du traitement d’immunothérapie, - si le score est supérieur à la première valeur de référence et inférieur ou égal à la deuxième valeur de référence, le procédé ne permet pas de prédire de manière satisfaisante la réponse du sujet au traitement d’immunothérapie. Le procédé de prédiction selon l’invention, dont les résultats sont basés sur une analyse statistique, permet notamment avantageusement : - une prédiction-stratification avant thérapie des patients non-progresseurs précoces et/ou des patients progresseurs précoces lors du traitement d’immunothérapie, permettant ainsi une prise en charge personnalisée ; - pour le patient, un gain de temps augmentant les chances de succès de sa thérapie, en évitant les effets secondaires ou induits ; - une simplicité et rapidité de mise en œuvre par analyse réalisée à partir d’un échantillon sanguin déjà prélevé du patient pour d’autres objectifs ; - une réduction des coûts très importants des traitements d’immunothérapie, qui peuvent être ciblés sur les seuls patients prédits comme non-progresseurs précoces par le procédé selon l’invention. L’échantillon de sang utilisé dans le procédé selon l’invention a de préférence été isolé du sujet par un prélèvement sanguin réalisé avant le début du traitement d’immunothérapie. L’invention n’exclut pas pour autant que ce prélèvement sanguin ait été réalisé au moment de l’administration de ce traitement, ou après, de préférence juste après, dans les quelques heures ou quelques jours suivants le début de l’administration du traitement. Le procédé selon l’invention est dépourvu en lui-même d’étape appliquée au corps du patient. Les étapes d’analyse qu’il implique sont réalisées à partir d’échantillons de sang total qui ont été prélevés du patient au préalable, de manière classique en elle-même. Le sujet auquel s'applique le procédé selon l'invention est de préférence un mammifère. Il s’agit de préférence d’un humain. Le procédé selon l’invention peut en outre répondre à l’une ou plusieurs des caractéristiques décrites ci-après, mises en œuvre isolément ou en chacune de leurs combinaisons techniquement opérantes. La fonction mathématique mise en œuvre dans le procédé selon l’invention peut être tout type de fonction multivariée. Outre les variables que sont la concentration d’ADNcf de grande taille et la concentration d’ADNcf totale, elle peut utiliser d’autres variables. Elle peut notamment utiliser, en tant que variables, plusieurs concentrations d’ADNcf de grande taille différentes, chacune correspondant à une plage de taille analytique prédéterminée et différente des autres. On rappelle qu’au sens de la présente invention, l’expression « plage de taille analytique » désigne toute plage de taille comprise dans les tailles supérieures à 500 paires de bases. Elle peut également ou autrement utiliser, en tant que variables, d’autres informations cliniques ou biologiques relatives au patient. Chacune des variables contenues dans la fonction mathématique selon l’invention peut y être pondérée par un coefficient qui lui est propre et qui peut être égal à 1, ou différent de 1. Dans des modes de mise en œuvre particuliers de l’invention, la fonction mathématique est le rapport entre au moins ladite concentration d’ADNcf de grande taille, et ladite concentration d’ADNcf totale. Il s’agit notamment du rapport entre une concentration d’ADNcf de grande taille et la concentration d’ADNcf totale. On peut alors qualifier cette fonction de concentration relative des fragments d’ADNcf dont la taille est comprise dans la plage de taille analytique prédéterminée, présente dans l’échantillon de sang du sujet étudié. Comme indiqué ci-avant, il a été découvert par les présents inventeurs qu’une telle concentration relative constitue un indicateur / biomarqueur permettant de prédire de manière performante la réponse (en termes de progression précoce ou non de la tumeur) d’un patient atteint de cancer lorsqu’il est soumis à un traitement d’immunothérapie. La fonction mathématique mise en œuvre selon l’invention peut autrement être égale à la somme de différentes concentrations d’ADNcf de grande taille, chacune étant associée à une plage de taille analytique prédéterminée, cette somme étant divisée par la concentration d’ADNcf totale. Elle peut autrement combiner les variables ci-dessus de toute autre façon, et notamment s’inscrire dans le cadre de la régression linéaire. Dans des modes de mise en œuvre particuliers de l’invention, chaque plage de taille prédéterminée, ou plage de taille analytique, est définie uniquement par sa valeur minimale, c’est-à-dire qu’il s’agit d’une plage définie comme incluant les tailles supérieures, ou supérieures ou égales, à une valeur minimale donnée. Ainsi, dans des modes de mise en œuvre particuliers de l’invention, au moins une plage de taille prédéterminée / plage de taille analytique est la plage de tailles supérieures à 500 paires de bases, de préférence la plage de tailles supérieures ou égales à 580 paires de bases, de préférence encore la plage de tailles supérieures ou égales à 600 paires de bases, et encore plus préférentiellement la plage de tailles supérieures ou égales à 1500 paires de bases. Préférentiellement, il s’agit de la plage de tailles supérieures ou égales à 1600 paires de bases, ou encore supérieures ou égales à 1650 paires de bases, ou même supérieures ou égales à 1700 paires de bases. Dans des modes de mise en œuvre particuliers alternatifs de l’invention, chaque plage de taille prédéterminée, ou plage de taille analytique, est définie par sa valeur minimale et sa valeur maximale, c’est-à-dire qu’il s’agit d’une plage définie comme incluant les tailles supérieures, ou supérieures ou égales, à une valeur minimale donnée, et inférieures, ou inférieures ou égales, à une valeur maximale donnée. Dans une telle configuration, les plages de taille plus élevées et/ou plus étendues sont plus particulièrement préférées dans le cadre de l’invention, par rapport aux plages de taille moins élevées et/ou moins étendues. Dans des modes de mise en œuvre particuliers de l’invention, au moins une plage de taille prédéterminée / plage de taille analytique est la plage de tailles comprises entre 580 et 1649 paires de bases. La fonction mathématique utilisée selon l’invention peut combiner toutes combinaisons des variables associées chacune à une plage de taille analytique qui lui est propre, qui sont mentionnées ci-avant. Parmi les plages de taille prédéterminées particulièrement préférées dans le cadre de l’invention, dans le contexte dans lequel la fonction mathématique mise en œuvre est le rapport entre une concentration d’ADNcf de grande taille (c’est-à-dire des fragments d’ADNcf dans la plage de taille prédéterminée) et la concentration d’ADNcf totale, on peut citer à titre d’exemples de plages de taille analytique la plage de tailles supérieures ou égales à 1650 paires de bases, et la plage de tailles de 580 à 1649 paires de bases. Le score obtenu par le procédé selon l’invention constitue avantageusement un indicateur générique du caractère de progresseur précoce et/ou du caractère de non-progresseur précoce d’un sujet étudié, indépendant tant du type de cancer dont le sujet est atteint, que du type de traitement d’immunothérapie qui pourrait lui être administré. En particulier, le procédé selon l’invention permet avantageusement de prédire le caractère de progresseur précoce et/ou le caractère de non-progresseur précoce d’un sujet atteint de tout type de cancer, et notamment, mais non limitativement, d’une pathologie tumorale métastatique, d’un mélanome, d’un cancer du rein, en particulier à cellules claires, d’un carcinome urothélial de la vessie, d’un carcinome épidermoïde de la tête et du cou, ou encore d’un cancer bronchique à petites cellules ou non, ou d’une pluralité de tels cancers. Le traitement d’immunothérapie pour lequel on vise à connaitre le caractère de progresseur précoce et/ou le caractère de non-progresseur précoce du sujet peut quant à lui être de tout type. Il peut notamment mettre en œuvre le nivolumab, l’ipilimumab, le pembrolizumab et/ou un ou plusieurs anticorps anti-PD-L1 tels que l’atézolizumab, l’avélumab et/ou le durvalumab. La prédiction par le procédé selon l’invention est en outre également performante pour ce qui concerne les configurations dans lesquelles le traitement d’immunothérapie est réalisé conjointement à d’autres méthodes de traitement thérapeutique, telles qu’un traitement de chimiothérapie et/ou une thérapie ciblée lorsqu’elle est possible. L’obtention de l’échantillon de sang du sujet, à partir duquel est appliqué le procédé selon l’invention, peut avoir été réalisée de toute manière classique en elle-même. Elle peut par exemple avoir été réalisée par prélèvement d’un échantillon sanguin du sujet dans des tubes contenant un tampon à base d’acide éthylènediaminetétraacétique (EDTA) ou dans des tubes spécifiques pour l’obtention d’ADN circulant, tels que les tubes commercialisés par Streck sous la dénomination Cell-Free DNA BCT® (Streck) ou par Roche Diagnostic sous la dénomination « Cell-free DNA collection tube », selon les recommandations du fournisseur. Dans des modes de mise en œuvre particuliers de l’invention, la détermination de ladite concentration d’ADNcf totale et la détermination de ladite au moins une concentration d’ADNcf de grande taille sont réalisées par analyse directe de l’échantillon de sang isolé du sujet, c’est-à-dire un échantillon de sang total. Dans des modes de réalisation préférentiels de l’invention, le procédé comprend une étape préalable d’obtention d’un échantillon de plasma à partir de cet échantillon de sang total. L’étape d’obtention sélective de l’échantillon de plasma à partir de l’échantillon de sang total isolé du patient par prélèvement sanguin est préférentiellement réalisée dans les quelques jours suivant la prise de sang, par exemple dans les 6 heures après la prise de sang si l’on utilise des tubes à tampon EDTA, et dans les 7 jours après la prise de sang si l’on utilise des tubes spécifiques pour l’obtention d’ADN libre circulant, tels que les tubes mentionnés ci-avant. Cette étape peut être réalisée de toute manière classique en elle-même, par exemple par centrifugation. Afin de limiter la libération d’ADN cellulaire contenu dans les cellules circulantes présentes dans l’échantillon de sang total, ce qui provoquerait la dilution de l’ADN libre circulant, un protocole incluant deux centrifugations est de préférence privilégié selon l’invention. Préférentiellement, l’étape d’obtention de l’échantillon de plasma, à partir d’un échantillon de sang complet obtenu du patient, du procédé selon l’invention comprend ainsi : - une première centrifugation douce, par exemple à une vitesse comprise entre 1200 et 1600 g, de préférence à température ambiante, c’est-à-dire à 20°C +/- 5°C ; - la récupération du plasma (surnageant), sans prélever la galette de cellules séparant le plasma et les hématies ; - une deuxième centrifugation à vitesse plus rapide, par exemple comprise entre 3000 et 16000 g, de préférence également à température ambiante ; - et la récupération du plasma (surnageant), par exemple par aspiration, sans prélever le culot formé. Quels que soient les tubes précités, l’échantillon de plasma ainsi obtenu peut typiquement être conservé à -20°C pour une durée inférieure ou égale à 1 mois, ou à -80°C pour des durées supérieures à 1 mois, avant son analyse pour la détermination des différentes concentrations en ADNcf nécessaires à la mise en œuvre du procédé selon l’invention. La détermination de la concentration d’ADNcf totale et la détermination de la ou des concentration(s) d’ADNcf de grande taille dans l’échantillon de sang peuvent être réalisées par toute méthode classique en elle-même pour l’homme du métier. En fonction de la technique particulière mise en œuvre, elles peuvent être réalisées directement sur l’échantillon de sang total ou sur l’échantillon de plasma obtenu à partir de cet échantillon de sang, ou après une étape d’extraction de l’ADNcf de l’un ou l’autre de ces échantillons. Ainsi, dans des modes de mise en œuvre particuliers de l’invention, particulièrement avantageux sur le plan de la rapidité et simplicité de mise en œuvre du procédé selon l’invention, la détermination de ladite concentration d’ADNcf totale et la détermination de ladite au moins une concentration d’ADNcf de grande taille sont réalisées par analyse directe de l’échantillon de plasma obtenu à partir de l’échantillon de sang total isolé du sujet, c’est-à-dire qu’elle sont réalisées directement sur cet échantillon lui-même, sans étape d’extraction de l’ADN préalable. Dans des modes de mise en œuvre particuliers alternatifs de l’invention, le procédé comprend une étape d’extraction de l’acide désoxyribonucléique libre circulant de l’échantillon de sang, ou le cas échéant de l’échantillon de plasma obtenu à partir de cet échantillon de sang, de sorte à obtenir un extrait contenant l’acide désoxyribonucléique libre circulant qui y était contenu. La détermination de la concentration d’ADNcf totale et la détermination de ladite au moins une concentration d’ADNcf de grande taille sont alors réalisées par analyse de l’extrait d’acide désoxyribonucléique libre circulant ainsi obtenu. L’étape d’extraction de l’ADNcf de l’échantillon de sang, le cas échéant de l’échantillon de plasma, peut être réalisée de toute manière classique en elle-même, par exemple par une technologie mettant en œuvre des billes magnétiques, ou encore au moyen d’un kit commercialisé à cet effet, par les sociétés IDSolutions (Kit IDXtract), Promega (Kit Maxwell® RSC ccfDNA plasma) ou Qiagen (Kit QIAamp Circulating Nucleic Acid) par exemple. L’analyse de l’échantillon de sang, de l’échantillon de plasma, ou de l’extrait d’ADNcf obtenu selon l’invention, pour déterminer la concentration d’ADNcf totale et une ou plusieurs concentration(s) d’ADNcf de grande taille (chacune associée à une plage de taille analytique différente) peut être réalisée par toute technique connue de l’homme du métier à cet effet. Elle peut par exemple, être réalisée par réaction de polymérisation en chaine (PCR), ou par la technologie d’électrophorèse capillaire, au moyen d’un dispositif disponible commercialement, tel que le Fragment Analyseur et système 7100 CE d’Agilent Technologies, le QIAxcel proposé par la société Qiagen, ou encore du système GenomeLab de la société Sciex. Ces techniques nécessitent une extraction préalable de l’ADN libre circulant de l’échantillon de sang ou de l’échantillon de plasma. Préférentiellement, la détermination des différentes concentrations d’ADNcf est réalisée par une technique basée sur la technologie dite µLas, telle que décrite notamment dans les documents WO 2016/016470, WO 2014/020271, ou la publication de Ranchon et al., Lab Chip, 2016, 16(7): 1243-53. Schématiquement, la technologie µLas opère en deux étapes respectivement de concentration et de séparation réalisées en ligne. D'abord, l'ADN est concentré via un système de capillaires formé de la jonction d'un petit capillaire et d'un autre capillaire de plus grande section. La solution contenant l'ADN est amenée à s’écouler de façon laminaire dans le grand capillaire, et un champ électrique est utilisé pour ralentir la migration. À cause du cisaillement apporté par l’écoulement laminaire, cette contre-électrophorèse fait apparaître une force transverse, dépendante de la taille de l’ADN, qui pousse l’ADN vers les parois. Le changement de vitesse d'écoulement et de champ électrique au niveau de la constriction permet d'arrêter l'ADN et de le concentrer comme une galette. En effet, en amont de la constriction, l’écoulement et la contre-électrophorèse sont lents, provoquant une faible force transverse. L’ADN se trouve donc dans la masse de l’écoulement, et avance vers la constriction. En revanche, en aval de la constriction, l’écoulement et la contre-électrophorèse sont rapides, plaquant fortement l’ADN à la paroi où l’écoulement laminaire est très faible, et où la contre- électrophorèse domine. L’ADN recule alors vers la constriction, par contre-électrophorèse, le long de la paroi. Cette galette est ensuite libérée par la baisse progressive du champ électrique, ce qui permet également d'effectuer l'opération de séparation en fonction de la taille des fragments. L’analyse de l’échantillon de sang, de l’échantillon de plasma, ou de l’extrait d’ADNcf obtenu selon l’invention, pour déterminer la concentration d’ADNcf totale et une ou plusieurs concentration(s) d’ADNcf de grande taille (chacune associée à une plage de taille analytique différente) peut en particulier être réalisée par la méthode, basée sur la technologie µLas ci-dessus, telle que décrite dans le document FR 3128231 ou encore la publication de Boutonnet et al., Analytical Chemistry, 2023, 95(24): 9263-70. Cette méthode présente l’avantage de pouvoir être mise en œuvre directement sur un échantillon de plasma, sans extraction au préalable de l’ADN circulant qui y est contenu, et elle permet avantageusement de déterminer facilement et de façon économique la caractérisation du profil de taille de l’ADNcf avec une sensibilité accrue par rapport aux autres techniques d’analyse. Cette méthode peut notamment être mise en œuvre au moyen du dispositif décrit dans les documents WO 2017/009566 et Andriamanampisoa et al., Analytical Chemistry, 2018, 90(6): 3766-74, et commercialisé sous la dénomination Biabooster par Adelis Technologies. En substance, cette méthode comporte au moins une itération d’une alternance : - d’une étape d’écoulement laminaire de l’échantillon à analyser dans un capillaire dans un premier sens d’écoulement, le capillaire étant muni d’au moins une restriction locale de sa section et comportant un tampon d’analyse, pendant laquelle l’échantillon est soumis à une première différence de potentiel électrique dont l’action sur les molécules d’acides nucléiques est opposée au premier sens d’écoulement et provoque la retenue de molécules d’acides nucléiques dans le capillaire, - d’une étape d’écoulement laminaire de l’échantillon, dans un deuxième sens d’écoulement opposé au premier sens d’écoulement, et, après la dernière itération de l’alternance, une étape de séparation par écoulement laminaire de l’échantillon dans le capillaire dans le premier sens d’écoulement, pendant laquelle l’échantillon est soumis à une différence de potentiel électrique inférieure ou égale à la première différence de potentiel, dont l’action sur les molécules d’acides nucléiques est opposée au premier sens d’écoulement et provoque une retenue partielle de molécules d’acides nucléiques dans le capillaire. Cette méthode comprend en outre, pendant ou après l’étape de séparation, une étape de mesure d’un profil temporel de fluorescence des molécules fluorescentes d’acides nucléiques et une étape de conversion du profil temporel de fluorescence en un profil de concentration en molécules d’acides nucléiques de différentes longueurs, par la mise en œuvre d’un profil de fluorescence d’un échantillon étalon, dont on connaît la concentration pour chaque longueur de molécule fluorescente d’acides nucléiques présente dans l’échantillon. Les molécules d’acides nucléiques ont été rendues fluorescentes par une des techniques connues de l’homme du métier, par exemple par ajout dans le tampon d’analyse d’un fluorophore intercalant, c’est-à-dire d’une molécule qui fluoresce peu à l’état libre, et qui fluoresce beaucoup quand elle est intercalée entre les bases de l’ADN. L’incertitude technique garantie d’une telle méthode, basée sur technologie µLas, est avantageusement de 5 à 10%. La répétabilité en taille est meilleure que 1%. En particulier, cette méthode permet avantageusement de déterminer la concentration d’ADNcf totale et la ou les concentration(s) d’ADNcf de grande taille dans l’échantillon de plasma avec un très bon degré d’approximation. Il a en outre été découvert par les présents inventeurs que le score obtenu dans le cadre du procédé de prédiction selon l’invention constitue également un bon indicateur statistique du pronostic de survie globale sans progression du sujet atteint de cancer traité par immunothérapie, ainsi que de sa survie à 3 ans. Les caractéristiques et avantages de l’invention apparaîtront plus clairement à la lumière des exemples de mise en œuvre ci-après, fournis à simple titre illustratif et nullement limitatifs de l’invention, avec l’appui des figures 1 à 8, dans lesquelles : FIG. 1 La FIG. 1 montre une courbe représentant le profil d’intensité de fluorescence en fonction du temps, obtenu par analyse, par une méthode basée sur la technologie µLas, d’un échantillon de plasma d’un patient atteint de cancer contenant de l’ADNcf. FIG. 2 La FIG. 2 montre une courbe représentant le profil d’intensité de fluorescence en fonction du temps, obtenu par analyse, par une méthode basée sur la technologie µLas, d’un échantillon étalon contenant des fragments d’ADN de taille et concentration connues. FIG. 3 La FIG. 3 montre une courbe représentant le profil de concentration d’ADN libre circulant, exprimé en picogrammes par µl par paire de bases (pb), en fonction de la taille, obtenu à partir de la courbe de la FIG. 1 . FIG. 4 La FIG. 4 montre un histogramme représentant la répartition de la concentration d’ADN libre circulant pour différentes plages de taille, obtenu à partir de la courbe de la FIG. 3 . FIG. 5 La FIG. 5 représente des courbes ROC relatives à la prédiction du caractère de progresseur précoce d’un patient atteint de cancer lors d’un traitement d’immunothérapie, obtenues pour un indicateur selon l'invention, la concentration relative en fragments d’ADNcf de taille supérieure ou égale à 1650 pb dans un échantillon de plasma dudit patient, en a/ pour un lot d’apprentissage, en b/ pour un lot de test, et en c/ pour la cohorte totale ; pour chaque courbe, l’aire sous la courbe (« AUC ») est indiquée sur la figure. FIG. 6 La FIG. 6 représente des courbes ROC relatives à la prédiction du caractère de progresseur précoce d’un patient atteint de cancer lors d’un traitement d’immunothérapie, obtenues pour un indicateur selon l'invention, la concentration relative en fragments d’ADNcf de taille entre 580 et 1649 pb dans un échantillon de plasma dudit patient, en a/ pour un lot d’apprentissage, en b/ pour un lot de test, et en c/ pour la cohorte totale ; pour chaque courbe, l’aire sous la courbe (« AUC ») est indiquée sur la figure. FIG. 7 La FIG. 7 représente les boites à moustaches obtenues pour une cohorte de 51 patients pour deux indicateurs selon l'invention, en a/ la concentration relative en fragments d’ADNcf de taille supérieure ou égale à 1650 pb dans un échantillon de plasma dudit patient, en b/ la concentration relative en fragments d’ADNcf de taille entre 580 et 1649 pb dans cet échantillon de plasma. FIG. 8 La FIG. 8 montre un graphe représentant, en fonction du temps, la courbe de survie sans progression de patients atteints de cancer et ayant été soumis à un traitement d’immunothérapie, déterminée par la méthode de Kaplan-Meier, selon qu’ils aient un score supérieur (courbe claire) ou inférieur (courbe foncée) à la valeur seuil de 0,034, ce score étant prédit par un procédé selon l’invention prenant en compte la concentration relative en fragments d’ADNcf de taille supérieure ou égale à 1650 pb dans les échantillons de plasma des patients ; le nombre de patients (« individus à risque ») de la cohorte initiale inclus dans l’étude à chaque temps d’évaluation, respectivement à score inférieur à 0,034 (ligne du haut) et score supérieur à 0,034 (ligne du bas) est indiqué dans le tableau sous le graphe. Cette étude est basée sur une cohorte de 51 patients présentant 5 types de pathologies cancéreuses : mélanome (20%), ORL (carcinome à cellules squameuses de la tête et du cou) (20%), poumon (non à petites cellules) (21%), rein (18%), vessie (21%). La réponse au traitement d’immunothérapie des patients se réfère à la réponse aux traitements utilisés qui sont : le nivolumab, l’ipilimumab et/ou le pembrolizumab, ces traitements pouvant être combinés à une thérapie ciblée, l’administration d’anticorps anti-PD-L1 ou à un traitement de chimiothérapie. Les caractéristiques des patients de la cohorte au début de l’étude sont résumées dans le tableau 1. Caractéristiques Tous Vessie ORL Rein Mélanome Poumon Nombre de patients 51 11 10 9 10 11 Age moyen (ans) 65 68 60 64 66 66 Homme 39 8 8 7 7 9 Femme 12 3 2 2 3 2 Traitement réalisé Nivolumab 13 0 9 0 1 3 Pembrolizumab 13 9 0 2 0 2 Nivolumab + ipilimumab 10 0 0 1 9 0 Nivolumab + thérapie ciblée 2 1 1 0 0 0 Pembrolizumab + thérapie ciblée 6 1 0 5 0 0 Pembrolizumab + anti-PD-L1 1 0 0 1 0 0 Pembrolizumab + chimiothérapie 5 0 0 0 0 5 Pembrolizumab + chimiothérapie + thérapie ciblée 1 0 0 0 0 1 Nombre de métastases 0 12 1 6 0 2 3 1 12 4 2 4 1 1 2 16 4 1 4 5 2 3 6 1 1 1 1 2 4 3 1 0 0 0 2 6 1 0 0 0 0 1 7 1 0 0 0 1 0 Tableau 1 – Caractéristiques des patients de la cohorte L’évaluation de la progression ou non des patients au cours du traitement d’immunothérapie est réalisée par analyse des images de la tumeur acquises par scanner en appliquant la méthodologie standard iRECIST (« iRECIST: guidelines for response criteria for use in trials testing immunotherapeutics », Seymour et al., LANCET Oncology, vol 18, issue 3, e143-e152, 2017), 6 à 12 semaines après le début du traitement, en fonction du type de cancer (6 semaines pour le cancer du poumon, 12 semaines pour les autres cancers). Les données cliniques suivies sont : taux de lactate déshydrogénase (LDH) sérique, niveau de métastases, âge, sexe, fumeur ou non-fumeur, score de proportion tumorale (TPS). 1/ Préparation des échantillons de plasma Les échantillons utilisés selon l’invention sont préparés à partir de sang complet prélevé de l’individu. A cet effet, le sang total est collecté sur des tubes Cell-Free DNA Collection Tube selon les recommandations du fournisseur Roche Diagnostics. Chaque échantillon ainsi collecté est soumis à deux centrifugations successives : - une 1 ère centrifugation douce à 1600 g, à température ambiante (20°C +/- 5°C), pendant 10 min, cette 1 ère centrifugation étant réalisée dans une période de 7 jours maximum après le prélèvement ; le plasma (surnageant) est récupéré sans prélever la galette de cellules, - et une 2 ème centrifugation à vitesse plus rapide, à 4500 g, également à température ambiante (20°C +/- 5°C) et pendant 10 minutes ; le plasma est aspiré sans prélever le culot formé. Le plasma ainsi récupéré peut être utilisé immédiatement, ou il peut être conservé à -20°C pour une durée inférieure ou égale à 1 mois, ou -80°C pour des durées supérieures à 1 mois, avant son analyse. 2/ Analyse des échantillons de plasma pour les concentrations en ADN libre circulant dans différentes plages de taille La concentration totale en ADN libre circulant dans les échantillons de plasma, et les profils de concentration en fonction de la taille, sont déterminés par une méthode basée sur la technologie microfluidique µLas. Plus particulièrement, le protocole mis en œuvre est tel que décrit dans la publication de Boutonnet et al., Analytical Chemistry, 2023, 95(24): 9263-70. Le matériel utilisé est le suivant : - système d’électrophorèse Agilent G7100A CE équipé d’un capillaire intégrant la technologie µLAS, dont le diamètre est muni d’une restriction locale, - détecteur de fluorescence Picometrics, Zetalif® LED 480. Le protocole mis en œuvre est schématiquement le suivant. Les échantillons de plasma sont tout d’abord soumis à un prétraitement par protéinase K en présence de détergent, de sorte à libérer les acides nucléiques des vésicules et des complexes nucléoprotéiques dans lesquels ils sont le plus souvent emprisonnés. A cet effet, ils sont mis en présence d’une solution aqueuse de protéinase K (2 mg/ml) et de tensioactif non-ionique NP-40 (1%) à 56°C pendant 2 h sous agitation vigoureuse (900 tr/min), puis récupérés par centrifugation. Chaque échantillon de plasma est injecté dans le système d’électrophorèse, dont la température est maintenue à 25 °C. Les différents ingrédients et solutions mis en œuvre pour l’analyse sont les suivantes : - RNASE : RNase Away (Biolab), - Eau BSA : solution de BSA à 50 mg/ml dans l’eau purifiée, - HCl 0,1 M : solution d’acide chlorhydrique à 0,1 M dans l’eau, - PVA 2% : solution d’alcool polyvinylique dans l’eau (800 mg dans 40 ml d’eau), - Tampon TAE : Tris-Acétate-EDTA (TAE) 0,5X + albumine de sérum bovine (BSA) 0,5 mg/mL, pH 8, polyvinylpyrrolidone (PVP) 360kDa 5% (p/v), eau, - Tampon TAE + dye : Tampon TAE + SybrGreen 2X (Sigma), - Tampon PIPES : Bis-tris 30 mM, acide pipérazine-N,N′-bis(2-éthanesulfonique) (Pipes) 10 mM, pH 6,5, EDTA 1 mM, PVP 360KDa 5% (p/v), eau, - Tampon PIPES + dye : Tampon PIPES + SYBR Green 2X. Le programme exact mis en œuvre dans le système d’électrophorèse est détaillé dans les tableaux 2 à 4. Entrée Sortie Pression (bar) Voltage (kV) Durée (min) Pré-conditionnement Poubelle RNASE 10 0 4 RNASE Poubelle -9.9 0 4 EAU BSA Poubelle 10 0 4 HCl 0,1 M Poubelle 10 0 2 PVA 2% Poubelle 10 0 3 Tampon TAE Poubelle 10 0 6 Injection Echantillon Poubelle 5 0 1,33 (80s) Transfert Tampon Tampon TAE 5 0 0,17 (10s) Tableau 2 – programme du système d’électrophorèse – pré-conditionnement, injection et transfert Entrée Sortie Pression (bar) Voltage (kV) Durée (min) Concentration avec retours Tampon TAE + dye (pH 8) Tampon TAE (pH 8) 11 25 0 11 25 1 -11 0 1,01 -11 0 1,75 11 25 1,76 11 25 2,76 -11 0 2,77 -11 0 3,52 11 25 3,53 11 25 4,53 -11 0 4,54 -11 0 5,29 11 25 5,3 11 25 7,3 -11 0 7,31 -11 0 8,06 11 25 8,07 11 25 11,07 -11 0 11,08 -11 0 11,58 11 25 11,59 11 25 16 -11 0 16,01 -11 0 16,51 11 25 16,52 11 25 20,52 -11 0 20,53 -11 0 21,03 Tableau 3 – programme du système d’électrophorèse – Concentration avec retours Entrée Sortie Pression (bar) Voltage (kV) Durée (min) Changement de tampon et fin de concentration à 7 bars Tampon PIPES + dye Tampon PIPES 7 30 0 7 30 9 Séparation Tampon PIPES + dye Tampon PIPES 7 30 9 7 10 9,40 7 5 9,80 7 0,6 13 7 0,1 24 7 0 24,1 Tableau 4 – programme du système d’électrophorèse – changement de tampon et fin de concentration, séparation A l’issue de l’analyse, on obtient, pour chaque échantillon de plasma analysé, un profil d’intensité de fluorescence en fonction du temps. Un exemple de tel profil est montré sur la FIG. 1 . Le profil de fluorescence est ensuite converti en profil de concentration grâce au profil d’intensité de fluorescence d’un échantillon étalon comprenant des fragments d’ADN dont les tailles respectives, allant de 100 paires de bases (« pb ») à 1500 paires de bases, sont connues et dont on connaît, pour chaque taille de fragment d’ADN, le temps de migration, l’intensité de fluorescence et la concentration (permettant de connaitre le facteur de conversion de fluorescence en concentration pour chaque temps de migration des pics de l’échantillon étalon). Cet échantillon étalon présente la composition indiquée dans le tableau 5 : Taille ADN (pb) 100 150 200 300 400 500 600 700 800 1000 1500 Conc. (pg/µl) 9 3 5 4 3 1,7 1,4 0,7 1,4 1,4 1,4 Tableau 5 – composition de l’échantillon étalon (Conc. désigne la concentration) Le profil de migration de cet échantillon étalon dans le dispositif utilisé est montré sur la FIG. 2 . Ces données sont utilisées pour réaliser, d’une part, un étalonnage de la fluorescence, et, d’autre part, un étalonnage des temps de migration. Pour l’étalonnage de la fluorescence, l’aire de chaque pic de l’échantillon étalon est mesurée (en RFU.min), puis divisée par la concentration du fragment correspondant. Pour obtenir un facteur de conversion instantané, le résultat est divisé par l’unité de temps (1 min), et on obtient donc, pour chacun des pics de la FIG. 2 , une valeur de fluorescence par pg.µL pour chaque temps de migration de l’échantillon étalon. Des points virtuels peuvent être ajoutés en dehors de la courbe exprimant le facteur de conversion (RFU/pg/µL.min) en fonction du temps de migration ainsi obtenue, pour les courts et les longs temps de migration. Une interpolation linéaire est réalisée entre les points de cette courbe, de manière classique en elle-même, pour déterminer le facteur de conversion de fluorescence en concentration pour tous les temps de migration situés entre le premier et le dernier pic de l’échantillon étalon. Une légère extrapolation linéaire est faite de part et d’autre pour élargir légèrement la gamme de temps de migration dans laquelle le facteur de conversion est connu. Ici, l’extrapolation est faite entre 75 et 100 pb et entre 1500 et 1650 pb. On obtient alors une courbe composée de morceaux de droites, qui est lissée à l’aide de splines de degré 2, de manière classique en elle-même. Cette courbe lissée est utilisée pour convertir la valeur de fluorescence en valeur de concentration tout au long de l’analyse. Ainsi, la courbe de fluorescence en fonction du temps de chaque échantillon donné est convertie en courbe de concentration en fonction du temps. Pour l’étalonnage des temps de migration, les fragments de l’échantillon étalon donnent des couples « temps de migration / taille d’ADN ». Une interpolation linéaire est faite, de manière classique en elle-même, entre chaque point pour obtenir une conversion des temps de migration en taille d’ADN. Des points supplémentaires peuvent être ajoutés à la courbe représentant la taille de l’ADN en fonction du temps de migration ainsi obtenue, les temps de migration de ces points supplémentaires étant calculés par rapport aux fragments d’ADN expérimentaux les plus proches dans l’échantillon étalon, afin de gagner en précision sur l’étalonnage de la taille de l’ADN, sans avoir eu à augmenter le nombre de fragments d’ADN dans l’échantillon étalon. Après une nouvelle interpolation linéaire, on obtient une courbe représentant la taille de l’ADN en fonction du temps de migration. A l’aide de ces deux étalonnages, celui de la fluorescence versus la concentration, et celui du temps de migration versus taille d’ADN, on convertit, pour chaque échantillon de plasma analysé, la courbe de fluorescence en fonction du temps en une courbe de concentration en fonction de la taille. On obtient ainsi, pour chaque échantillon de plasma analysé, un profil d’intensité de concentration de l’ADNcf en fonction de la taille. Un exemple de tel profil est montré sur la FIG. 3 . Par cette méthode, les concentrations ne sont déterminées quantitativement qu’entre 75 et 1650 paires de bases. Ainsi, pour les fragments de taille inférieure à 75 paires de bases et les fragments de taille supérieure à 1650 paires de bases, une valeur relative de la concentration, en unités arbitraires, est calculée. Cette valeur relative est toutefois hautement représentative de la valeur réelle. Pour déterminer la concentration d’ADNcf dans chaque plage de taille souhaitée, les tailles minimale et maximale de l’intervalle sont converties en temps minimal et maximal selon l’étalonnage temps/taille, puis l’intégrale de la courbe temps/concentration est calculée entre ces temps minimal et maximal. Ceci donne la concentration absolue d’ADNcf dans chaque plage de taille souhaitée, exprimée en pg/µL. Pour chaque échantillon de plasma analysé, à partir des concentrations individuelles de chaque taille, on construit ainsi un histogramme des pourcentages des différentes plages de taille suivantes : taille inférieure à 75 pb, de 75 à 239 pb, de 240 à 369 pb, de 370 à 579 pb, de 580 à 1649 pb, supérieure ou égale à 1650 pb. Un exemple de tel histogramme est montré sur la FIG. 4 . Pour chaque échantillon de plasma analysé, on calcule en outre la concentration totale d’ADNcf. Dans cet exemple, cette concentration totale est approximée à la concentration d’ADN comprise entre les tailles 75 pb et 1650 pb, la valeur ainsi approximée étant très proche de la valeur réelle. Enfin, pour chaque échantillon de plasma analysé, on calcule la concentration relative d’ADN dans chacune des plages de taille ci-dessus, cette concentration relative étant égale à la concentration absolue d’ADN dans cette plage de taille, déterminée comme indiqué ci-avant, divisée par la concentration totale d’ADN. 3/ Analyse statistique Des tests statistiques préliminaires incluant une classification par régression logistique univariant, régression COX univariant et multivariant et une estimation Kaplan-Meier pour classifier les progresseurs précoces et non-progresseurs précoces sur un premier set de 25 patients ayant une répartition des pathologies équivalente à celle de l’ensemble de la cohorte des 51 patients ont tout d’abord été réalisés, pour les panels d’indicateurs potentiels suivants : concentrations relatives des fragments d’ADNcf dans le plasma, pour les plages de taille respectives suivantes : taille inférieure à 75 pb, de 75 à 239 pb, de 240 à 369 pb, de 370 à 579 pb, de 580 à 1649 pb, supérieure ou égale à 1650 pb. Les deux indicateurs qui caractérisent la réponse du patient (progresseurs précoces ou non-progresseurs précoces sous traitement d’immunothérapie) sont les concentrations relatives de fragments d’ADNc dans le plasma pour les plages de taille suivantes : taille supérieure ou égale à 1650 paires de bases, et taille entre 580 et 1649 paires de bases. Les fonctions mathématiques (indicateurs) utilisées pour l’analyse statistique, nommées P1 et P2, sont donc les suivantes : La cohorte de 51 patients est divisée en deux lots de données : un lot d’apprentissage (70% - 35 patients) et un lot de test (30% - 16 patients). Cette répartition entre lot d’apprentissage et lot de test est classique et correspond à la méthodologie standard de ce type d’analyse statistique. Les deux lots (apprentissage et test) présentent une répartition équilibrée entre les patients en progression, pathologie et sexe. Les données statistiques sont établies par rapport aux données cliniques obtenues par la méthodologie iRECIST 6 à 12 semaines après le début du traitement d’immunothérapie, selon le type de cancer. Pour chaque indicateur, une courbe ROC est réalisée sur le lot d’apprentissage pour déterminer le seuil qui minimise la distance avec le point optimal (0,1). La méthode utilisée pour fixer la valeur seuil optimale est la méthode BOOTSTRAP. Pour 100 expériences les patients sont échantillonnés aléatoirement avec remise entre lot d’apprentissage (« in bag ») et lot de test (« out of bag »). Pour chaque indicateur, le seuil est optimisé et défini comme la médiane des 100 seuils obtenus par la méthode BOOTSTRAP. Ces seuils sont ensuite utilisés sur le lot de d’apprentissage et puis le lot de test, et les métriques suivantes sont déterminées : - aire sous la courbe (AUC, pour l’anglais « Area Under Curve »), - justesse de classement (en anglais, « accuracy »), - sensibilité, - spécificité, - valeur prédictive positive (PPV, pour l’anglais « Positive Predictive Value ») : probabilité que le patient prédit comme progresseur précoce soit progresseur précoce, - valeur prédictive négative (NPV, pour l’anglais « Negative Predictive Value ») : probabilité que le patient prédit comme non-progresseur précoce soit non-progresseur précoce. Les seuils déterminés par la méthode BOOTSTRAP sont en outre utilisés pour calculer un intervalle à 95% de confiance des valeurs seuil en extrayant les quantiles à 2,5% et 97,5%. Les courbes ROC obtenues pour chaque indicateur, respectivement pour le lot d’apprentissage de 35 patients, le lot de test de 16 patients et la cohorte totale, sont montrées sur la FIG. 5 pour l’indicateur P1 et sur la FIG. 6 pour l’indicateur P2. Les valeurs de l’aire sous la courbe (AUC) sont indiquées sur les figures pour chacune des courbes. On observe que cette valeur est élevée pour les 2 indicateurs, et est supérieure pour l’indicateur P1 ( FIG. 5 ) que pour l’indicateur P2 ( FIG. 6 ). A titre comparatif, par exemple, pour l’indicateur qu’est la concentration relative de fragments d’ADNcf dans la plage de tailles supérieures ou égales à 240 pb, on obtient pour la cohorte totale une AUC de 0,65 seulement. La FIG. 7 montre les boites à moustaches obtenues, pour chacun des indicateurs P1 et P2, pour l’ensemble de la cohorte. On observe que les résultats sont statistiquement différents entre les progresseurs précoces et les non-progresseurs précoces. L’ensemble des résultats obtenus, pour le lot d’apprentissage (« A ») et pour le lot test (« T ») sont résumés dans le tableau 6, pour chacun des indicateurs P1 et P2. Indicateur P1 P2 Seuil 0,034 0,072 Quantile 2,5% 0,028 0,062 Quantile 97,5% 0,043 0,122 AUC A 0,830 0,693 AUC T 0,833 0,817 Justesse A 0,800 0,771 Justesse T 0,875 0,812 Sensibilité A 0,733 0,533 Sensibilité T 0,833 0,500 Spécificité A 0,850 0,950 Spécificité T 0,900 1,000 PPV A 0,786 0,889 PPV T 0,833 1,000 NPV A 0,810 0,731 NPV T 0,900 0,769 Tableau 6 – Valeurs statistiques caractéristiques pour les indicateurs P1 et P2 Pour l’indicateur P1, on obtient une sensibilité de 0,833 et une spécificité de 0,900, pour un seuil (score au-dessous duquel le patient est considéré comme progresseur précoce) de 0,034 (intervalle de confiance de 0,028 à 0,043). L’indicateur P2 présente quant à lui une excellente spécificité de 1 en considérant un seuil de 0,072 (intervalle de confiance de 0,062 à 0,122). Cet indicateur a ainsi un bon pouvoir prédictif d’une progression ou non de la tumeur au premier examen : s’il est faible, alors il y aura très probablement (à mieux que 90 %) progression de la maladie au premier examen. En revanche, s’il est élevé, son pouvoir prédictif d’une absence de progression précoce est modéré, inférieur à celui du marqueur P1, qui présente le meilleur compromis entre sensibilité et spécificité. Pour le lot test, les courbes de survie sans progression et les probabilités de survie ont été estimées par la méthode de Kaplan-Meier, et comparées aux résultats de prédiction par l’indicateur P1 selon l’invention, avec la valeur seuil de 0,034. Les résultats sont montrés sur la FIG. 8 . On observe que les courbes sont bien corrélées et caractéristiques d’une réponse longue, et donc d’un bon pronostic de la survie sans progression. Ainsi, l’indicateur P1 constitue un marqueur permettant le pronostic de la survie sans progression. Procédé in vitro de prédiction du caractère de progresseur précoce et/ou du caractère de non-progresseur précoce lors d’un traitement d’immunothérapie d’un sujet atteint d’un cancer, comprenant des étapes de : a/ détermination, dans un échantillon de sang isolé obtenu à partir dudit sujet avant ledit traitement d’immunothérapie : - de la concentration totale d’acide désoxyribonucléique libre circulant dans ledit échantillon de sang, dite concentration d’ADNcf totale, - d’au moins une concentration, dans ledit échantillon de sang, des fragments d’acide désoxyribonucléique libre circulant dont la taille est incluse dans une plage de taille prédéterminée, ladite plage de taille prédéterminée étant comprise dans les tailles supérieures à 500 paires de bases, dite concentration d’ADNcf de grande taille, b/ combinaison dans une fonction mathématique d’au moins ladite concentration d’ADNcf de grande taille, et de ladite concentration d’ADNcf totale, de sorte à obtenir un score, et : c1/ comparaison dudit score à une première valeur de référence prédéterminée, et d1/ conclusion que ledit sujet présente un caractère de progresseur précoce lors dudit traitement d’immunothérapie lorsque ledit score est inférieur ou égal à ladite première valeur de référence, et/ou c2/ comparaison dudit score à une deuxième valeur de référence prédéterminée, et d2/ conclusion que ledit sujet présente un caractère de non-progresseur précoce lors dudit traitement d’immunothérapie lorsque ledit score est supérieur à ladite deuxième valeur de référence. Procédé selon la revendication 1, selon lequel ladite première valeur de référence et ladite deuxième valeur de référence sont identiques. Procédé selon la revendication 1, selon lequel ladite première valeur de référence est inférieure à ladite deuxième valeur de référence. Procédé selon l’une quelconque des revendications 1 à 3, selon lequel ladite fonction mathématique est le rapport entre au moins ladite concentration d’ADNcf de grande taille, et ladite concentration d’ADNcf totale. Procédé selon l’une quelconque des revendications 1 à 4, selon lequel ladite plage de taille prédéterminée est la plage de tailles supérieures à 500 paires de bases, de préférence supérieures ou égales à 600 paires de bases, et de préférence encore supérieures ou égales à 1500 paires de bases. Procédé selon l’une des revendications 1 à 4, selon lequel ladite plage de taille prédéterminée est la plage de tailles supérieures ou égales à 1650 paires de bases. Procédé selon l’une quelconque des revendications 1 à 4, selon lequel ladite plage de taille prédéterminée est la plage de tailles comprises entre 580 et 1649 paires de bases. Procédé selon l’une quelconque des revendications 1 à 7, comprenant une étape d’obtention d’un échantillon de plasma à partir dudit échantillon de sang. Procédé selon la revendication 8, selon lequel la détermination de ladite concentration d’ADNcf totale et la détermination de ladite au moins une concentration d’ADNcf de grande taille sont réalisées par analyse directe dudit échantillon de plasma. Procédé selon l’une quelconque des revendications 1 à 9, comprenant une étape d’extraction de l’acide désoxyribonucléique libre circulant dudit échantillon de sang, ou le cas échéant dudit échantillon de plasma, et selon lequel la détermination de ladite concentration d’ADNcf totale et la détermination de ladite au moins une concentration d’ADNcf de grande taille sont réalisées par analyse de l’extrait d’acide désoxyribonucléique libre circulant ainsi obtenu. Procédé selon l’une quelconque des revendications 1 à 10, selon lequel ledit sujet est un humain. Procédé selon l’une quelconque des revendications 1 à 11, selon lequel ledit cancer est une pathologie tumorale métastatique, un mélanome, un cancer du rein, un carcinome urothélial de la vessie, un carcinome épidermoïde de la tête et du cou, ou un cancer bronchique non à petites cellules. Procédé selon l’une quelconque des revendications 1 à 12, selon lequel ledit traitement d’immunothérapie met en œuvre le nivolumab, l’ipilimumab, le pembrolizumab, l’atézolizumab, l’avélumab et/ou le durvalumab.