Brevet FR3158226A1 — publié le 20250718

Extrait hydrolysé de tourteau de graine de chanvre La présente invention concerne un extrait hydrolysé de tourteau de graine de chanvre déshuilé obtenu par hydrolyse alcaline à un pH supérieur ou égal à 11, ses fractions peptidiques, l’association de cet extrait ou de ses fractions peptidiques avec un extrait éthanolique de tourteau de graine de chanvre et une composition pharmaceutique le comprenant. Elle concerne de plus un procédé de fabrication de l’extrait hydrolysé selon l’invention. Elle concerne enfin l’extrait hydrolysé selon l’invention ou une de ses fractions peptidiques ou l’association ou la composition le comprenant pour son utilisation à titre de médicament. Extrait hydrolysé de tourteau de graine de chanvre L'invention est relative à un extrait hydrolysé de tourteau de graine de chanvre et à ses utilisations. Le tourteau de graine de chanvre est un sous-produit obtenu après extraction de l'huile qui ne contient pas de composés cannabinoïdes. Il est donc peu intéressant à l'heure actuelle et est essentiellement utilisé pour la nourriture des animaux. Il est connu dans l'article de Girgih et al. (J. Am. Oil Chem Soc (2011) 88 :381-389) que certaines fractions peptidiques d'hydrolysat de protéines de tourteau de graine de chanvre obtenus par hydrolyse enzymatique ont une activité antioxydante. Les fractions peptidiques de l’hydrolysat obtenu ont ainsi une masse moléculaire comprise entre L’article de Rodriguez-Martin et al. (Food Funct, 2019, 10, 6732-6739) suggère que certains hydrolysats de protéines de tourteau de graine de chanvre obtenu par hydrolyse enzymatique ont une activité neuroprotectrice par amélioration de l’état neuro-inflammatoire des cellules microgliales BV-2 stimulées par le LPS par le biais de la régulation négative de la voie NF-κB médiée par le TLR-4. Toutefois ce document enseigne également que c’est la présence de peptides de faible masse moléculaire (entre 300–400 Da et 1,45 kDa) dans ces hydrolysats qui permet l’obtention de cette activité. De plus, l’hydrolyse enzymatique est une hydrolyse basique conduite à pH 8 avec une première enzyme (alcalase), puis à pH 7 avec une seconde enzyme (flavourzyme), et enfin une cuisson globale à 85°C à pH 7 durant 15 minutes. Cette méthode ne permet pas de dissocier les éléments enzymatiques (composées eux-mêmes de peptides) des peptides de chanvre. Ainsi les activités décrites dans cet article sont imputables non pas à aux fractions peptidiques de l’hydrolysat mais à un complexe hydrolytique combinant de la protéine de chanvre avec des enzymes protéiques. En outre les tests réalisés ne sont pas suffisants pour prouver une réelle activité neuroprotectrice car ils ne correspondent pas à une voie d’action directe sur une voie métabolique impliquée dans le processus neurodégénératif lui-même. En effet, les cellules microgliales appartiennent au système immunitaire du cerveau et sont apparentées aux macrophages. La modulation de l'état inflammatoire de ces cellules agit donc bien de manière indirecte sur le stress du cerveau qui lui-même peut conduire à cautionner la dégénération des neurones ; c'est donc très clairement un effet indirect vis-à-vis de l'action neuroprotectrice. Les calpaïnes sont une famille de protéases solubles à cystéine intracellulaires dépendantes du Ca 2+ . Elles répondent aux signaux Ca 2+ en clivant de nombreuses protéines spécifiques, modifiant ainsi de manière irréversible leur(s) fonction(s). Elles sont impliquées dans divers processus cellulaires régulés par le Ca 2+ telles que la prolifération cellulaire, la différenciation cellulaire, la progression du cycle cellulaire, l’autophagie, l’apoptose ou encore l’activation plaquettaire. Les changements de niveau d’activation des calpaïnes sont impliqués dans divers phénomènes pathologiques, tels que les lésions ischémiques, la dystrophie musculaire, le diabète, l’endothéliopathie diabétique, la cataracte, l’athérosclérose, la maladie d’Alzheimer, la neuropathie induite par une commotion cérébrale répétée et le cancer. Les calpaïnes représentent des cibles thérapeutiques potentielles pour la découverte de médicaments. En particulier il existe deux isoformes de calpaïne omniprésentes dans le cerveau : la calpaïne-1 et la calpaïne-2. Les résultats obtenus au cours des 30 dernières années ont conduit à la conclusion que ces deux isoformes de calpaïne présentent des fonctions opposées dans le cerveau. L'activation de la calpaïne-1 est requise pour certaines formes de plasticité synaptique et l'apprentissage et la mémoire, tandis que l'activation de la calpaïne-2 limite l'étendue de la plasticité et de l'apprentissage. La calpaïne-1 est neuroprotectrice pendant le développement postnatal et à l'âge adulte, tandis que la calpaïne-2 est neurodégénérative. Plusieurs cibles protéiques clés participant à ces fonctions opposées ont été identifiées et liées à des voies connues impliquées dans la plasticité synaptique et la neuroprotection / neurodégénérescence (Wang et al., Cells 2020, 9, 2698, pages 1-16 – Wang et al. Journal of Neurotrauma 34 :1-13, 2017 ; Wang et al., Sci. Adv. 2020; 6 : eaba5547- 1 juillet 2020). Ainsi, la voie métabolique associée aux calpaïnes s’adresse directement aux neurones et plus particulièrement au niveau des synapses. Son action est donc directe et ciblée pour générer une activité neuroprotectrice. Par ailleurs la dérégulation de l’activité de la calpaïne a été impliquée dans la tumorogénèse ce qui suggère son impact sur le cancer et les métastases (Ivan Shapovalov et al., EXPERT OPINION ON THERAPEUTIC TARGETS, 2022, VOL. 26, NO. 3, 217–231). De plus, il a été démontré que l'activité de la calpaïne contribue au processus de nombreuses maladies associées à l'inflammation et dans la majorité des cas, l’inhibiteur de la calpaïne joue un rôle protecteur contre la maladie. Il a été conclu que la calpaïne est impliquée dans le processus d'inflammation via divers mécanismes, notamment la régulation des macrophages, des neutrophiles, la migration et l'apoptose des lymphocytes, la modulation de l'activation des médiateurs inflammatoires, la dégradation de certaines protéines associées, l’autophagie et l'induction de l'apoptose cellulaire. La calpaïne est ainsi associée à de nombreuses maladies inflammatoires telles que l’asthme, l’athérosclérose, l’arthrite rhumatoïde et la sclérose en plaques (JINGJING JI et al., BIOMEDICAL REPORTS 5: 647-652, 2016). Il est également connu que la suractivation pathologique des calpaïnes est impliquée dans certaines maladies fibrotiques, notamment la fibrose cardiaque et la fibrose pulmonaire idiopathique. La calpaïne régule positivement le facteur de croissance transformant béta 1 (TGF-béta1) à la fois aux niveaux transcriptionnel et post-traductionnel pour induire des activités profibrotiques. Par ailleurs il a été démontré que des inhibiteurs de la calpaïne permettaient de prévenir la formation de cicatrices hypertrophiques après des brûlures (Cheong Hoon Seo et al. Int. J. Mol. Sci. 2021, 22, 5771). En conséquence il serait intéressant de trouver de nouveaux produits permettant d’inhiber l’activité de la calpaïne. Les inventeurs ont découvert de façon surprenante qu’un extrait hydrolysé de tourteau de graine de chanvre déshuilé particulier, et plus particulièrement deux de ses fractions peptidiques, avait un fort pouvoir d’inhibition de l’activité de la calpaïne, en particulier du mélange des isoformes 1 et 2. En outre cet extrait a également une forte activité antioxydante, anti-inflammatoire et inhibitrice de la tyrosinase, sans présenter aucune cytotoxicité. La présente invention concerne donc un extrait hydrolysé de tourteau de graine de chanvre déshuilé obtenu par hydrolyse alcaline à un pH supérieur ou égal à 11, avantageusement supérieure ou égale à 12. Dans la présente demande, les expressions «entre ... et ... » et « de … à… », doivent s'entendre bornes incluses sauf mention explicite du contraire. On entend par «tourteau de graine de chanvre » le coproduit obtenu après extraction de l’huile des graines de chanvre, en particulier de Cannabis sativa L . L'extraction de l’huile à partir des graines de cannabis est réalisée par des techniques connues de l'homme du métier (tel que le pressage a froid) qui permet d'isoler la fraction huileuse du composé à extraire pour l'utiliser pour diverses applications. Le résidu de cette extraction est appelé « coproduit » au sens de la présente invention et contient l'ensemble des composés non extraits par ladite technique. Par coproduit, on entend donc le résidu obtenu après extraction de l’huile. Ainsi, le tourteau a donc une teneur en matière grasse inférieure à celle de la graine de chanvre. De façon avantageuse le tourteau selon l’invention comprend moins de 20 % en masse de matière grasse, avantageusement moins de 15 % en masse de matière grasse, encore plus avantageusement moins de 12 % en masse de matière grasse, en particulier entre 9 % et 12 % en masse de matière grasse, plus particulièrement 10,5 % en masse de matière grasse, par rapport à la masse totale du tourteau. Le tourteau de graine de chanvre selon l’invention comprend des protéines, avantageusement au moins 20 % en masse de protéines, plus avantageusement au moins 25 % en masse de protéines, encore plus avantageusement au moins 27 % en masse de protéines, en particulier entre 27 et 32 % en masse de protéines, plus particulièrement 30,70 % en masse de protéines, par rapport à la masse totale du tourteau. Le tourteau de graine de chanvre selon l’invention peut comprendre en outre des fibres, en particulier de la cellulose, avantageusement au moins 15 % en masse de fibres, plus avantageusement au moins 20 % en masse de fibres, encore plus avantageusement au moins 21 % en masse de fibres, en particulier entre 21 % et 28 % en masse de fibres, plus particulièrement 21,7 % en masse de fibres, avantageusement de cellulose, par rapport à la masse totale du tourteau. Le tourteau de graine de chanvre selon l’invention peut contenir en outre des sucres et des sels minéraux tels que du fer, du calcium, et du potassium. Avantageusement il est disponible commercialement auprès de la société Hemp Acres LLC ou de la société Ecoprod. De façon particulièrement avantageuse, le tourteau de graine de chanvre selon l’invention ne contient pas de cannabinoïdes, en particulier choisi dans le groupe constitué par le tétrahydrocannabinol (THC), le cannabidiol (CBD), le cannabinol (CBN), le cannabichromène (CBC), le cannabicyclol (CBL), le cannabivarol (CBV), la tétrahydrocannabivarine (THCV), la cannabidivarine (CBDV), la cannabichromevarine (CBCV), la cannabigerovarine (CBGV), le cannabigerol (CBGM) et leurs mélanges. Dans un mode de réalisation avantageux, avant d’être hydrolysé dans le cadre de la présente invention, le tourteau de graine de chanvre selon l’invention est extrait avec de l’éthanol, avantageusement à au moins 90 degrés, plus avantageusement à au moins 96 degrés, de façon à obtenir un extrait éthanolique de tourteau de graine de chanvre et un résidu déshuilé. Ce résidu déshuilé est également appelé « tourteau de graine de chanvre déshuilé » dans le cadre de la présente description. L’extraction avec l’éthanol selon l’invention peut être mise en œuvre par différentes méthodes d’extraction connues de l’homme du métier, telles que la macération, avec ou sans agitation, ou la décoction à chaud. Préférentiellement, l’extraction est réalisée par macération, en particulier avec agitation. L’extraction peut être conduite durant une période de 30 minutes à 24 heures, préférentiellement de 30 minutes à 12 heures, encore préférentiellement durant une période de 1 heure à 3 heures, et encore avantageusement durant une période de 2 heures. L’extraction pourra être conduite à une température comprise entre 15 et 35°C, avantageusement entre 20°C et 30°C, plus avantageusement à 25°C. L’extraction peut être mise en œuvre à partir d’une quantité de 0,1% à 30% en masse de matière fraîche ou sèche, préférentiellement sèche, avantageusement de 1% à 28 %, encore avantageusement de 10 % à 26 %, très avantageusement à partir d’une quantité de 25 % en masse de matière sèche, du tourteau de graine de chanvre, par rapport à la masse totale du tourteau de graine de chanvre et du solvant. Dans un mode particulièrement avantageux de réalisation de l’invention, le tourteau de graine de chanvre déshuilé selon l’invention est obtenu par extraction éthanolique comme suit : 25 % en masse de tourteau de graine de chanvre (par rapport à la masse total du tourteau + éthanol à 96 degrés) est mis à macérer sous agitation dans de l’éthanol à 96 degrés durant une période de 2 heures à une température de 25°C, en particulier dans les conditions telles que décrites dans l’exemple 1. De façon avantageuse le tourteau de graine de chanvre déshuilé selon l’invention comprend moins de 11 % en masse de matière grasse, avantageusement moins de 10 % en masse de matière grasse, encore plus avantageusement moins de 9 % en masse de matière grasse, en particulier entre 6 et 9 % en masse de matière grasse, plus particulièrement 6,8 % en masse de matière grasse, par rapport à la masse totale du tourteau. L’extrait hydrolysé de tourteau de graine de chanvre déshuilé selon l’invention également appelée hydrolysat de tourteau de graine de chanvre déshuilé dans le cadre de la présente description est donc obtenu par hydrolyse alcaline du tourteau de graine de chanvre déshuilé selon l’invention à un pH supérieur ou égal à 11, avantageusement supérieure ou égale à 12, avantageusement à l’aide d’une base choisie parmi l’hydroxyde de sodium, l’hydroxyde de magnésium, l’hydroxyde de calcium et l’hydroxyde de potassium, plus particulièrement l’hydroxyde de sodium, en particulier à 1M. De façon avantageuse la durée de l’hydrolyse est comprise entre 1 heure et 3 heures, plus particulièrement elle est de 2 heures. L’hydrolyse alcaline est avantageusement mise en œuvre dans de l’eau comme unique solvant Dans un mode de réalisation avantageux, l’hydrolyse est mise en œuvre à une température comprise entre 15°C et 35°C, avantageusement entre 20°C et 30°C, plus avantageusement à 25°C. L’hydrolyse alcaline est stoppée par neutralisation à l’aide d’un acide, en particulier d’un acide faible tel que l’acide citrique, de façon à obtenir un pH inférieur à 7, en particulier compris entre 4 et 5. De façon avantageuse, un conservateur tel que le benzoate de sodium ou le sorbate de potassium est ensuite ajouté dans l’hydrolysat. Ce conservateur permet d'éviter la contamination microbienne ou la fermentation de l’hydrolysat obtenu et par conséquent de le stabiliser durablement. L’hydrolysat obtenu peut ensuite être filtré en particulier par un filtre à 10 µm. Avantageusement, les protéines ne sont pas préalablement extraites du tourteau avant l’étape d’hydrolyse. La quantité en masse de tourteau de graine de chanvre déshuilé utilisée pour la mise en œuvre de l’hydrolyse alcaline est comprise entre 1% et 20%, avantageusement comprise entre 5% et 10%, encore avantageusement entre 8 % et 10 %, en masse par rapport à la masse totale du solvant et du tourteau. Dans un mode particulièrement avantageux de réalisation de l’invention, l’hydrolysat est obtenu par hydrolyse alcaline comme suit : 9 % en masse de tourteau de graine de chanvre déshuilé selon l’invention par rapport à la masse totale de tourteau et de l’eau sont soumis à une hydrolyse alcaline durant une période de 2 heures sous agitation à une température de 25°C, à pH 12, en présence hydroxyde de sodium 1M. La solution est ensuite neutralisée de façon à arrêter l’hydrolyse par ajout d’acide citrique monohydrate en une quantité nécessaire pour obtenir un pH de 4,8. Du benzoate de sodium est ensuite ajouté, le mélange est mis à décanter pendant 12 heures puis filtré (10 µm), dans les conditions telles que décrites dans l’exemple 1. Ainsi dans un mode de réalisation avantageux l’extrait hydrolysé selon l’invention est obtenu par le procédé comprenant les étapes suivantes : a- la délipidation du tourteau de graine de chanvre par extraction avec de l’éthanol, avantageusement à au moins 96 degrés ; b- l’hydrolyse alcaline à un pH supérieur ou égal à 11, en particulier supérieur ou égal à 12, du tourteau déshuilé obtenu à l’étape a), avantageusement à l’aide d’une base choisie parmi l’hydroxyde de sodium, l’hydroxyde de magnésium, l’hydroxyde de calcium et l’hydroxyde de potassium. Les étapes a) et b) correspondent donc à l’extraction avec l'éthanol et à l’hydrolyse tel que décrits ci-dessus. L’extrait hydrolysé selon l’invention comprend avantageusement : - une fraction peptidique de masse moléculaire comprise entre 9 et 12 kDa, avantageusement entre 10 et 12 kDa, plus particulièrement entre 10,5 et 11,5 kDa, en particulier de 11 kDa, et - une fraction peptidique de masse moléculaire comprise entre 16 et 18 kDa, avantageusement entre 16,5 et 17,5 kDa, en particulier de 17kDa, mesurées par la méthode séparative par électrophorèse sur gel dénaturant en SDS-PAGE, méthode bien connue de l’homme du métier. En particulier les gels utilisés dans cette méthode sont composés d’acrylamide-bisacrylamide. Plus particulièrement le gel de concentration contient 4,5% en masse d’acrylamide-bisacrylamide par rapport à la masse totale du gel de concentration et le gel de séparation contient 15% en masse d’acrylamide-bisacrylamide par rapport à la masse totale du gel de séparation. Encore plus particulièrement, les gels ont la composition suivante : - Gel de concentration (Tris-HCl 125mM, pH 6,8, SDS (Sodium Dodecyl Sulfate) 0,1%, acrylamide-bisacrylamide 4,5%, ammonium persulfate 0,1%, TEMED (N,N,N',N'-Tétraméthyléthylenediamine) 0,025%) et - Gel de séparation (Tris-HCl 375mM, pH 8,8, SDS 0,1%, acrylamide-bisacrylamide 15%, ammonium persulfate 0,01%, TEMED 0,001%) De façon avantageuse, les protéines sont diluées dans du tampon Laemmli (Tris-HCl 50mM pH6.8, SDS 2%, bromophénol blue 0,1%, glycérol 10%, 2-mercapoéthanol 3%) et la solution réservoir a la composition suivante : 25mM Tris-HCl, 0,25M glycine, pH 8,3, SDS 0,1%. En particulier la migration est réalisée à température ambiante à un voltage de 40V pendant 1h puis 2h à 100V. De façon avantageuse l'extrait hydrolysé selon l’invention présente en outre une teneur en matière sèche comprise entre 10,5 et 15 % en masse, plus avantageusement entre 12 et 14 % en masse, encore plus avantageusement entre 12,5 et 13 % en masse, par rapport à la masse totale de l’extrait hydrolysé. De façon avantageuse l'extrait hydrolysé selon l’invention présente de plus une teneur en protéines totales comprise entre 0,8 et 2,4 % en masse, plus avantageusement entre 1 et 2 %, encore plus avantageusement entre 1,2 et 1,6 % en poids, par rapport au poids total de l’extrait hydrolysé. L’extrait hydrolysé selon l’invention, en particulier tel que préparé dans l’exemple 1), se présente ainsi sous forme liquide. Optionnellement, l’extrait hydrolysé peut être ensuite séché par exemple par lyophilisation ou par atomisation, seul ou en présence d’un excipient. L’extrait hydrolysé se présente alors sous forme de poudre. La présente invention concerne en outre la fraction peptidique (ou peptide ou oligopeptide) de l’extrait hydrolysé selon l’invention ayant une masse moléculaire, mesurée par la méthode séparative par électrophorèse sur gel dénaturant en SDS-PAGE, comprise entre 9 et 12 kDa, avantageusement entre 10 et 12 kDa, plus particulièrement entre 10,5 et 11,5 kDa, en particulier de 11 kDa. Cette fraction peut être obtenue par purification de l’extrait hydrolysé selon l’invention par des méthodes bien connues de l’homme du métier. En particulier, il peut s’agir d’une centrifugation suivie d’une ultrafiltration avec des membranes avec un seuil de coupure pour des peptides de masse moléculaire compris entre 9 et 12 kDa. La présente invention concerne de plus la fraction peptidique (ou peptide ou oligopeptide) de l’extrait hydrolysé selon l’invention ayant une masse moléculaire, mesurée par la méthode séparative par électrophorèse sur gel dénaturant en SDS-PAGE, en particulier telle que décrite ci-dessus, comprise entre 16 et 18 kDa, avantageusement entre 16,5 et 17,5 kDa, en particulier de 17KDa. Cette fraction peut être obtenue par purification de l’extrait hydrolysé selon l’invention par des méthodes bien connues de l’homme du métier. En particulier, il peut s’agir d’une centrifugation suivie d’une ultrafiltration avec des membranes avec un seuil de coupure pour des peptides de masse moléculaire compris entre 16 et 18 kDa. La présente invention concerne en outre l'association de l’extrait hydrolysé selon la présente invention ou d'une ou plusieurs de ses fractions peptidiques selon la présente invention et d'un extrait éthanolique de tourteau de graine de chanvre, avantageusement obtenu à l’étape a) du procédé selon la présente invention. L’extrait éthanolique de tourteau de graine de chanvre selon l’invention est un extrait lipophile. Avantageusement, il contient des lipides polaires. En particulier, il comprend des phospholipides qui peuvent être présents en une teneur comprise entre 8 et 10 % en masse, par rapport à la masse totale de l’extrait sec sans solvant, avantageusement en une teneur de 9,38 % en masse, par rapport à la masse totale de l’extrait sec sans solvant. Parmi ces phospholipides, on peut retrouver de la phosphatidylsérine (avantageusement en une teneur comprise entre 0,8 et 1 % en masse par rapport à la masse totale de l’extrait), du phosphatidylinositol (avantageusement en une teneur comprise entre 1,9 et 2,2 % en masse par rapport à la masse totale de l’extrait), du phosphatidylglycerol (avantageusement en une teneur comprise entre 0,4 et 0,5 % en masse par rapport à la masse totale de l’extrait), de la phosphatidyléthanolamine (avantageusement en une teneur comprise entre 0,8 et 1 % en masse par rapport à la masse totale de l’extrait), de la phosphatidylcholine (avantageusement en une teneur comprise entre 3,5 et 4 % en masse par rapport à la masse totale de l’extrait) et de la phosphatidate (avantageusement en une teneur comprise entre 1 % et 1,2 % % en masse par rapport à la masse totale de l’extrait). Avantageusement la matière sèche (sans solvant) de l’extrait éthanolique selon l’invention comprend des céramides, en particulier en une teneur comprise entre 0,1 et 0,5% en masse, plus particulièrement de 0,33 % en masse, par rapport à la masse totale de l’extrait sec sans solvant. De façon avantageuse la matière sèche (sans solvant) de l’extrait éthanolique selon l’invention comprend des cardiolipines, en particulier en une teneur comprise entre 0,01 % et 0,07 % en masse, plus particulièrement de 0,04 % en masse, par rapport à la masse totale de l’extrait. Avantageusement la matière sèche (sans solvant) de l’extrait éthanolique selon l’invention comprend du diacylglycérol, en particulier en une teneur comprise entre 7 % et 13 % en masse, plus particulièrement de 10,82 % en masse, par rapport à la masse totale de l’extrait. De façon avantageuse la matière sèche (sans solvant) de l’extrait éthanolique selon l’invention comprend des triglycérides, en particulier en une teneur comprise entre 75 % et 82 % en masse, plus particulièrement de 79,41 % en masse, par rapport à la masse totale de l’extrait. La matière sèche (sans solvant) de l’extrait selon l'invention peut donc être obtenue par extraction avec de l'éthanol du tourteau de graine de chanvre par le procédé tel que décrit ci-dessus dans le cadre de la récupération du tourteau de graine de chanvre déshuilé, sauf que cette fois, c'est l'extrait éthanolique qui est récupéré et non le résidu déshuilé. L'extrait éthanolique peut être utilisé tel quel dans la composition selon l'invention ou il peut être concentré pour en augmenter matière sèche par évaporation du solvant, en particulier par évaporation du solvant à une température par exemple comprise entre 45°C et 48°C. L'extrait éthanolique sous forme liquide selon l'invention a une teneur en matière sèche comprise entre 0,5 % et 3% en masse, avantageusement entre 1 % et 2 % en masse, par rapport à la masse totale de l'extrait. L'extrait éthanolique concentré selon l'invention a une teneur en matière sèche comprise entre 65 % et 75 % en masse, avantageusement entre 67 % et 72 % en masse, par rapport à la masse totale de l'extrait. La présente invention concerne de plus une composition pharmaceutique comprenant l’extrait hydrolysé selon l'invention ou une ou plusieurs de ses fractions peptidiques selon l'invention ou l'association selon l'invention et un excipient pharmaceutiquement acceptable. Dans la présente invention, on entend désigner par « pharmaceutiquement acceptable » ce qui est utile dans la préparation d'une composition pharmaceutique qui est généralement sûre, non toxique et ni biologiquement ni autrement non souhaitable et qui est acceptable pour une utilisation vétérinaire de même que pharmaceutique humaine. Ainsi, ces compositions pharmaceutiques contiennent une dose efficace de l'extrait hydrolysé selon l'invention ou d'une ou plusieurs de ses fractions peptidiques selon l'invention ou encore de l'association selon l'invention (en tant qu’ingrédient actif), et un ou plusieurs excipients pharmaceutiques acceptables. Ces compositions peuvent être formulées pour l’administration aux mammifères, y compris l’Homme. La posologie varie selon le traitement et selon l’affection en cause. Lesdits excipients sont choisis selon la forme pharmaceutique et le mode d'administration souhaité. Dans les compositions pharmaceutiques de la présente invention pour l'administration orale, sublinguale, sous-cutanée, intramusculaire, intraveineuse, topique, intratrachéale, intranasale, transdermique, locale ou rectale, l'extrait hydrolysé selon l'invention ou une ou plusieurs de ses fractions peptidiques selon l'invention ou encore l'association selon l'invention peut être administrée sous forme unitaire d'administration, en mélange avec des excipients pharmaceutiques classiques, aux animaux et aux êtres humains. Les formes unitaires d'administration appropriées comprennent les formes par voie orale telles que les comprimés, les gélules, les poudres, les granules et les solutions ou suspensions orales, les formes d'administration sublinguale, buccale, intratrachéale, intranasale ou intraoculaire, les formes d'administration sous-cutanée, intramusculaire ou intraveineuse et les formes d'administration rectale. Pour l'application topique, on peut utiliser l'extrait hydrolysé selon l'invention ou une ou plusieurs de ses fractions peptidiques selon l'invention ou encore l'association selon l'invention dans des crèmes, pommades ou lotions. Selon la pratique habituelle, le dosage approprié à chaque patient est déterminé par le médecin selon le mode d’administration, la masse et la réponse dudit patient. Lorsqu'on prépare une composition solide sous forme de comprimés, on mélange l'ingrédient actif principal avec un excipient pharmaceutique, tel que la gélatine, l'amidon, le lactose, le stéarate de magnésium, le talc, la gomme arabique ou analogues. On peut enrober les comprimés de saccharose, d'un dérivé cellulosique, ou d'autres matières appropriées ou encore on peut les traiter de telle sorte qu’ils aient une activité prolongée ou retardée et qu’ils libèrent d’une façon continue une quantité prédéterminée de principe actif. Les comprimés peuvent être réalisés par différentes techniques, compression directe, granulation sèche, granulation humide ou fusion à chaud. On obtient une préparation en gélules en mélangeant l'ingrédient actif avec un diluant et en versant le mélange obtenu dans des gélules molles ou dures. Une préparation sous forme de sirop ou d’élixir peut contenir l’ingrédient actif conjointement avec un édulcorant, un antiseptique, ainsi qu’un agent donnant du goût et un colorant approprié. Les poudres ou les granules dispersibles dans l’eau peuvent contenir l’ingrédient actif en mélange avec des agents de dispersion ou des agents mouillants, ou des agents de mise en suspension, de même qu’avec des correcteurs du goût ou des édulcorants. Pour une administration parentérale intranasale ou intraoculaire, on peut utiliser des suspensions aqueuses, des solutions salines isotoniques ou des solutions stériles et injectables qui contiennent des agents de dispersion et/ou des mouillants pharmacologiquement compatibles, par exemple le propylèneglycol ou le butylèneglycol. Pour une administration rectale, on recourt à des suppositoires qui sont préparés avec des liants fondant à la température rectale, par exemple du beurre de cacao ou des polyéthylèneglycols. L’ingrédient actif peut être formulé également sous forme de microcapsules, éventuellement avec un ou plusieurs supports additifs. La présente invention concerne en outre le procédé de fabrication de l’extrait hydrolysé selon l'invention, caractérisé en ce qu’il comprend les étapes suivantes : a- la délipidation du tourteau de graine de chanvre par extraction avec de l’éthanol, avantageusement à au moins 96 degrés, b- l’hydrolyse alcaline à un pH supérieur ou égal à 11, en particulier supérieur ou égal à 12, du tourteau déshuilé obtenu à l’étape a), avantageusement à l’aide d’une base choisie parmi l’hydroxyde de sodium, l’hydroxyde de magnésium, l’hydroxyde de calcium et l’hydroxyde de potassium. Les étapes a) et b) sont telles que décrites précédemment en ce qui concerne l'obtention du tourteau de graine de chanvre déshuilé (étape a) et l'hydrolyse alcaline (étape b). La présente invention concerne enfin un extrait hydrolysé selon l'invention ou l'une ou plusieurs de ses fractions peptidiques selon l'invention ou l'association selon l'invention ou la composition pharmaceutique selon l'invention pour son utilisation à titre de médicament. Avantageusement la présente invention concerne un extrait hydrolysé selon l'invention ou l'une ou plusieurs de ses fractions peptidiques selon l'invention ou l'association selon l'invention ou la composition pharmaceutique selon l'invention pour son utilisation en tant qu’antioxydant et/ou dépigmentant et/ou anti-inflammatoire non stéroïdien et/ou anti neurodégénératif et/ou neuro protecteur et/ou anticancéreux et/ou cicatrisant et/ou antifibrotique, plus avantageusement pour le traitement ou la prévention ; - des maladies associées à la modulation des calpaïnes telle que les lésions ischémiques, la dystrophie musculaire, le diabète, l’endothéliopathie diabétique, la cataracte, l’athérosclérose, la dérégulation de l’autophagie, la neuropathie induite par une commotion cérébrale répétée, les maladies neurodégénératives (par exemple la maladie d’Alzheimer ou la maladie de Parkinson), les maladies inflammatoires telles que l’asthme, l’athérosclérose, l’arthrite rhumatoïde et la sclérose en plaques, les maladies fibrotiques, notamment la fibrose cardiaque, la fibrose pulmonaire idiopathique et les cicatrices hypertrophiques, en particulier après des brûlures, et le cancer, en particulier métastasique ; - des maladies associées à la modulation de l'enzyme phospholipase A2 et/ou à la modulation de l'enzyme lipoxygénase, telles que les maladies inflammatoires, les maladies broncho-pulmonaires et ORL (asthme, laryngite, sinusite, BPCO, etc.), les maladies rhumatologiques et neurologiques (polyarthrite rhumatoïde, maladie de Horton, sclérose en plaques, etc.), les maladies gastro-intestinales (maladie de Crohn, rectocolite hémorragique), les maladies dermatologiques (urticaire, eczéma) et les maladies rénales ; - des maladies liées à l'oxydation telles que les troubles du cycle de la bêta-oxydation pouvant conduire au développement d’un syndrome HELLP ou une acidémie glutarique de type II, des cardiomyopathies et une déficience musculaire. - des maladies associées à la modulation de la tyrosinase telles que l’hyperpigmentation de la peau (lentigo) et de la rétine. Plus avantageusement la présente invention concerne un extrait hydrolysé selon l'invention ou l'une ou plusieurs de ses fractions peptidiques selon l'invention ou l'association selon l'invention ou la composition pharmaceutique selon l'invention pour son utilisation dans le traitement ou la prévention des maladies neurodégénératives telles que la maladie d’Alzheimer ou la maladie de Parkinson. La présente invention sera mieux comprise à la lecture des exemples qui suivent qui sont donnés à titre indicatif non limitatifs. ExempleS Exemple 1 : préparation de l'extrait hydrolysé de tourteau de graine de chanvre déshuilé selon l'invention Étape a) : Délipidation du tourteau de graine de chanvre par extraction avec de l’éthanol Le tourteau de graine de chanvre utilisé pour l'extraction est commercialisé par la société EcoProd sous la dénomination « tourteau de chanvre bio ». Il contient 30,70 % en masse de protéines brutes, 21,70 % en masse de cellulose brute et 10,50 % en masse de matière grasse brute. Il s'agit du résidu obtenu après pressage à froid des graines de chanvre. L'étape a) consiste en le broyage et la macération sous agitation à température ambiante entre 20 et 25°C dans un mixeur avec une hélice 4 lames pendant 2 heures de 75 g de ce tourteau de graine de chanvre dans 225 g d'éthanol à 96 degrés puis en la filtration sur filtre plissé (seuil de coupure : 10 µm ) de façon à récupérer d'un côté le filtrât (167,5 g avec une masse sèche de 1,67 % en masse) qui correspond à l'extrait éthanolique et de l'autre le résidu solide (71,3 g) qui correspond au tourteau de graine de chanvre déshuilé. Cette étape permet de retirer 2,8 g de matière grasse sur les 75 g de tourteau, soit environ 3,7 % de la masse du tourteau. Le rendement de cette étape est de 55,8 %. 102,87 g du filtrât obtenu est concentré par évaporation totale de l'éthanol à une température de 45 à 48 °C ce qui permet d'obtenir 3,01 g d'extrait éthanolique concentré ayant un extrait sec de 69,91 % en masse. Étape b) : hydrolyse alcaline du tourteau de graine de chanvre déshuilé Une solution de soude 1M (1613 g d'eau + 67,2 g d’hydroxyde de sodium) est préparée de façon à obtenir un pH de 12. 160 g de tourteau de graine de chanvre déshuilé obtenu à l’étape a) est ajouté. Le mélange est agité à 25°C pendant 2 heures avec un mixeur à 4 lames. Puis 142,8 g d’acide citrique monohydrate est ajouté de façon neutraliser le mélange est d'obtenir un pH de 4,81. 8,4 g de benzoate de sodium est ensuite ajouté. Le pH obtenu est alors de 4,78. Le mélange est laissé à décanter pendant 12 heures avant d’être filtré sur filtre plissé avec un seuil de coupure à 10 µm. On obtient ainsi 1440 g de filtrât ce qui correspond donc un rendement de 71,98 % en masse. L'extrait sec du filtrât est de 12,5% en masse. Exemple 2 : caractérisation de l'extrait hydrolysé de tourteau de graine de chanvre déshuilé obtenu à l'exemple 1 L'extrait est caractérisé par ses bandes protéiques spécifiques selon la méthode séparative par électrophorèse sur gel dénaturant en SDS PAGE. On observe la présence de bandes caractéristiques de l'actif qui correspondent à des masses moléculaires de 17 kDa et de 11 kDa. La méthode par électrophorèse sur gel dénaturant en SDS PAGE utilisée est la suivante : - Préparation du gel : Les gels utilisés sont des gels d’épaisseur 1,5mm présentant 10 puits (8 cm x 7 cm) et formés d’un gel de concentration et d’un gel de séparation composés de 4,5 et 15% en masse d’acrylamide-bisacrylamide, respectivement, par rapport à la masse totale du gel. La composition des gels est la suivante : Gel de concentration (Tris-HCl 125mM, pH 6,8, SDS 0,1%, acrylamide-bisacrylamide 4,5%, ammonium persulfate 0,1%, TEMED 0,025%) ; Gel de séparation (Tris-HCl 375mM, pH 8,8, SDS 0,1%, acrylamide-bisacrylamide 15%, ammonium persulfate 0,01%, TEMED 0,001%) - Préparation des échantillons : Les protéines sont diluées dans du tampon Laemmli (Tris-HCl 50mM pH6,8, SDS 2%, bromophénol blue 0,1%, glycérol 10%, β-mercapoéthanol 3%). 40µL de chaque préparation est déposé dans les puits des gels préalablement placés dans une cuve contenant la solution réservoir (25mM Tris-HCl, 0,25M glycine, pH 8,3, SDS 0,1%). 5µL d’un marqueur de taille commercial est déposé dans le premier puit (BlueStar Prestained Protein Marker, Nippon Genetics ). - Conditions de migration : La migration est réalisée à température ambiante à un voltage de 40V pendant 1h puis 2h à 100V. A l’issue de la migration, les gels sont colorés au Bleu de Coomassie (Coomassie brillant blue R250 0,25%, éthanol/eau/acide acétique 45/45/10 en volume). L’excès de colorant est éliminé par des bains successifs d’un mélange éthanol/acide acétique/eau (50/10/40 en volume). Exemple 3 : séparation de la fraction peptidique à 11 kDa Les bandes de gel obtenues avec la méthode séparative par électrophorèse sur gel dénaturant en SDS PAGE telle que décrite dans l’exemple 2 sont découpées au niveau de la ligne correspondant à 11 kDa pour être éluées dans un milieu d’élution (50 mM Tris-HCl, 150 mM NaCl, 0,1 mM EDTA, pH 7,5). Exemple 4 : séparation de la fraction peptidique à 17 kDa Les bandes de gel obtenues avec la méthode séparative par électrophorèse sur gel dénaturant en SDS PAGE telle que décrite dans l’exemple 2 sont découpées au niveau de la ligne correspondant à 17 kDa pour être éluées dans un milieu d’élution (50 mM Tris-HCl, 150 mM NaCl, 0,1 mM EDTA, pH 7,5). Exemple 5 : préparation d'un hydrolysat comparatif de graine de chanvre selon l'article de Girgih et al. (HPI) 10 g de tourteau de graine de chanvre commercialisé par la société EcoProd sous la dénomination « tourteau de chanvre bio » est broyé puis est dispersé dans 200 g d'eau osmosée. Le pH initial de 6,36 est ajusté à 10,20 grâce à l'addition d'une solution de NaOH 2M. L'ensemble est agité à 37 °C pendant 2 heures. Puis le mélange est centrifugé pendant 60 minutes (7000 g à 4 °C) puis le surnageant est récupéré et filtré sur filtre plissé. Le pH est ensuite ajusté à 4,96 avec une solution de HCl à 2M de façon à précipiter les protéines. Le mélange est ensuite centrifugé (7000 g à 4 °C) pendant 40 minutes et on obtient 0,21 g de précipité. Ce précipité est ensuite redispersé dans 45,65 g d'eau osmosée puis le pH est ajusté à 7 par ajout de NaOH 2M. L’extrait est filtré sur filtre plissé et présente un taux de matière sèche de 0,12 %. Il est lyophilisé pour obtenir une poudre. Exemple 6 : test in vitro acellulaire d’évaluation de l’activité de la calpaïne. Le kit SensoLyte® 520 Calpain Assay d’ANASPEC fournit un test pratique pour l’évaluation de l’activité des calpaïnes (mélange des calpaïnes 1 et 2) permettant ainsi le dépistage des inhibiteurs enzymatiques ou le dosage continu de l’activité de la calpaïne à l’aide d’un substrat fluorogénique. Lors du clivage par la calpaïne, ce substrat génère le fluorophore 5-FAM (5-carboxyfluorescéine) avec une fluorescence qui peut être détectée aux longueurs d’onde d’excitation/émission=490 nm/520 nm. L’augmentation du signal de fluorescence est proportionnelle à l’activité de la calpaïne. La longueur d’onde de fluorescence plus grande de la calpaïne est moins impactée/perturbée par l’autofluorescence des constituants dans les échantillons biologiques et composés à tester. MATERIELS Les échantillons testés sont l’extrait hydrolysé de tourteau de graine de chanvre déshuilé selon l’invention (exemple 1), les fractions peptidiques selon l’invention à 11 kDa (exemple 3) et à 17 kDa (exemple 4), un mélange de ces fractions peptidiques (1:1, v : v) et l’hydrolysat comparatif (exemple 5). Les réactifs utilisés sont fournis dans le kit d’ANASPEC et sont les suivants : -composant A = 5-FAM/QXL™ Calpain Substrate (substrat) ; - composant C = Assay Buffer (tampon) ; - composant D = Calpaïne humaine ; -composant E = Inhibiteur de Calpaïne ; - composant F = DTT (DiThioThreitol). Le spectrophotomètre utilisé est le POLARSTAT OMEGA de BMG LABTECH et l’INCU-SHAKER MINI de BENCHMARK. METHODES Système d’essai Une solution tamponnée de Calpaïne réagit avec un substrat spécifique, le 5-FAM/QXL™ 520 FRET substrate, pour former un composé fluorogénique : 5-FAM. Les intensités de fluorescence sont collectées en utilisant un filtre à l’excitation laissant passer les longueurs d’ondes de 490 nm (filtre Exc485-12) et un filtre à l’émission laissant passer les longueurs d’ondes de 520 nm (filtre Em535-30). L’activité de la Calpaïne est ainsi évaluée. L’échantillon ou le produit de référence inhibiteur sont mis en contact avec la solution de Calpaïne en même temps que le substrat de l’enzyme. L’activité de la Calpaïne en présence/absence de l’échantillon, ou du produit de référence est alors évaluée. La modulation de cette activité est exprimée en pourcentage d’inhibition ou d’activation de l’activité de la Calpaïne en absence d’actif, c’est-à-dire uniquement en présence du substrat de l’enzyme. Protocole d’incubation Une solution de Calpaïne est incorporée dans son substrat, 5-FAM/QXL™ 520 FRET substrate. Une légère agitation pendant 30 secondes est réalisée puis le tout est incubé est à température ambiante pendant 60 minutes. Evaluation des effets A la fin de la période d’incubation, l’activité de la Calpaïne avec et sans produit à l’essai ou de référence a été évaluée par mesure des intensités de fluorescence (exprimées en RFU : unité de fluorescence relative). Pour chaque concentration testée, la modulation de l’activité de la Calpaïne par le produit à l’essai est calculée selon la formule suivante : Si le résultat est négatif, le pourcentage est exprimé en inhibition de l’enzyme ; si le résultat est positif, le pourcentage est exprimé en activation de l’enzyme. Résultats Les résultats sont présentés dans les tableaux 1 à 3 suivants : Echantillons Moyenne Intensité de fluorescence (RFU) Moyenne Intensité de fluorescence Echantillon – Fluorescence Blanc Activité enzymatique (%) Inhibition de l’activité enzymatique (%) Blanc 2835,33 0,000 0,00 100,00 T + (produit de référence) (enzyme + substrat sans inhibiteur) 52200,00 49364,67 100,00 0,00 T - (contrôle) (inhibiteur de référence du KIT de détection = calpastatin peptide B27-WT) 2797,67 -37,67 -0,08 100,08 Exemple 1 (extrait hydrolysé selon l’invention) à 5,0% en masse dans le milieu réactionnel 2029,33 1165,67 2,36 97,64 Exemple 1 (extrait hydrolysé selon l’invention) à 2,0% en masse dans le milieu réactionnel 13075,33 11555,33 23,41 76,59 Exemple 1 (extrait hydrolysé selon l’invention) à 0,5% en masse dans le milieu réactionnel 46925,00 44197,33 89,53 10,47 En présence de l’inhibiteur de référence T - (contrôle) l’activité de la Calpaïne est inhibée de 100%. Cette inhibition permet de valider le test d’essais. Aux concentrations testées de 5,0%, 2,0% et 0,5% en masse (dans le milieu réactionnel) une activité inhibitrice de la Calpaïne est observée pour l’extrait hydrolysé de tourteau de graine de chanvre déshuilé selon l’invention. Echantillons Moyenne Intensité de fluorescence (RFU) Moyenne Intensité de fluorescence Echantillon – Fluorescence Blanc Activité enzymatique (%) Inhibition de l’activité enzymatique (%) Blanc 1512,33 0,000 0,00 100,00 T + (produit de référence) (enzyme + substrat sans inhibiteur) 61093,33 59581,00 100,00 0,00 T - (contrôle) (inhibiteur de référence du KIT de détection = calpastatin peptide B27-WT) 1522,333 10,00 0,02 99,98 Exemple 3 (Eluat bande 11 kDa selon l’invention) à 10,0% en Masse dans le milieu réactionnel 1845,00 73,33 0,12 99,88 Exemple 4 (Eluat bande 17 kDa selon l’invention) 10,0% en Masse dans le milieu réactionnel 1886,00 172,67 0,29 99,71 Mélange de l’exemple 3 et de l’exemple 4 (1:1, v : v) à 10% en Masse dans le milieu réactionnel 1861,33 189,00 0,32 99,68 En présence de l’inhibiteur de référence T - (contrôle) l’activité de la Calpaïne est inhibée de 99,98%. Cette inhibition permet de valider le test d’essais. A la concentration testée de 10,0% de l’éluat de bande protéique 11 kDa en masse (dans le milieu réactionnel) une activité inhibitrice de la Calpaïne est observée avec 99,98% d’inhibition de l’activité. A la concentration testée de 10,0% de l’éluat de bande protéique 17 kDa en masse (dans le milieu réactionnel) une activité inhibitrice de la Calpaïne est observée avec 99,71% d’inhibition de l’activité. A la concentration testée de 10,0% du mélange 50/50 des éluats de bandes protéiques 11 et 17 kDa en masse (dans le milieu réactionnel) une activité inhibitrice de la Calpaïne est observée avec 99,68% d’inhibition de l’activité. Echantillons Moyenne Intensité de fluorescence (RFU) Moyenne Intensité de fluorescence Echantillon – Fluorescence Blanc Activité enzymatique (%) Inhibition de l’activité enzymatique (%) Blanc 1413,67 0,000 0,00 100,00 T + (produit de référence) (enzyme + substrat sans inhibiteur) 42990,00 41756,33 100,00 0,00 T - (contrôle) (enzyme + substrat sans inhibiteur) 1478,33 64,67 0,16 99,84 Exemple 5 (extrait HPI selon la publication Girgig) à 3,0% en Masse dans le milieu réactionnel 45316,67 43935,33 100,00 0,00 Exemple 5 (extrait HPI selon la publication Girgig) à 1,0% en Masse dans le milieu réactionnel 43501,00 42091,33 100,00 0,00 Exemple 5 (extrait HPI selon la publication Girgig) à 0,3% en Masse dans le milieu réactionnel 39602,00 38171,33 91,81 8,19 Exemple 5 (extrait HPI selon la publication Girgig) à 0,1% en Masse dans le milieu réactionnel 40769,33 39388,67 94,74 5,26 En présence de l’inhibiteur de référence T - (contrôle), l’activité de la Calpaïne est inhibée de 99,84%. Cette inhibition permet de valider le test d’essais. A toutes les concentrations testées de 3,0% à 0,1% en masse dans le milieu réactionnel, aucune une activité inhibitrice significative de la Calpaïne n’est observée pour l’hydrolysat comparatif. Exemple 7 : test in vitro acellulaire d’évaluation de l’activité antioxydante selon la méthode DPPH. L’objectif de cette étude est d’évaluer la modulation de l’activité antioxydante par un ou plusieurs échantillons dans un modèle colorimétrique In Vitro acellulaire faisant appel au radical DPPH, 2,2- Diphényl-1-picrylhydrazyl ainsi qu’à l’antioxydant de référence, l’acide ascorbique. MATERIELS L’échantillon testé est l’extrait hydrolysé de tourteau de graine de chanvre déshuilé selon l’invention (exemple 1). Le produit de référence utilisée est l’acide ascorbique fourni par SIGMA ALDRICH. Les réactifs utilisés sont le DPPH fournis par SIGMA ALDRICH et le DMSO fourni par FISHER BIOREAGENTS. Le spectrophotomètre utilisé est le POLARSTAT OMEGA de BMG LABTECH. METHODES Système d’essai La méthode utilisée est dite d’inhibition. En effet, elle est basée sur la dégradation du radical oxydant DPPH, de coloration violette absorbant à 540nm, par un antioxydant de référence, l’acide ascorbique. Cette réaction, qui nous servira de Témoin positif, conduit à la formation du composé 2,2-diphenyl-1-picrylhydrazine qui sera quant à lui incolore voir jaune clair. L’échantillon et le produit de référence « Acide Ascorbique » sont mis en contact avec la solution de DPPH pendant 30 minutes à 40°C. L’activité antioxydante est alors évaluée par mesure d’absorbance à 540nm. La modulation de cette activité est exprimée en pourcentage de stimulation de l’activité antioxydante par l’actif testé, avec pour référence l’activité antioxydante maximale obtenue en présence d’acide ascorbique (T + ). Protocole d’incubation Une solution de DPPH est incubée, pendant 30 minutes à 40°C, en absence (contrôle), en présence du produit de référence (T + ) et à des concentrations décroissantes de l’échantillon a testé. Evaluation des effets A la fin de la période d’incubation, l’activité antioxydante en présence du produit de référence et en présence ou en absence du produit à l’essai a été révélée par coloration après 30 minutes à 40°C. Elle a ainsi été évaluée par mesure d’absorbance du milieu réactionnel à 540 nm. Pour chaque concentration testée, la modulation de l’activité antioxydante par le produit à l’essai est calculée selon la formule suivante Si le résultat est négatif, le produit à tester sera considéré comme oxydant ; si le résultat est positif, le pourcentage est exprimé en stimulation de l’activité anti-radicalaire. Résultats Les résultats sont présentés dans le tableau 4 suivant : Echantillons Moyenne DO (nm) DO DPPH -DO Echantillon (nm) Pouvoir antioxydant (%) T+ (Acide ascorbique) 0,429 0,569 100,00 T- (DPPH) 0,998 0,000 0,00 Exemple 1 à 5,0% en Masse dans le milieu réactionnel 0,785 0,176 30,93 Exemple 1 à 2,0% en Masse dans le milieu réactionnel 0,866 0,096 16,81 Exemple 1 à 0,5% en Masse dans le milieu réactionnel 0,851 0,111 19,45 Dans les conditions expérimentales, l’extrait hydrolysé de tourteau de graine de chanvre déshuilé selon l’invention présente une activité antioxydante aux concentrations de 5,0%, 2,0% et 0,5% en Masse dans le milieu réactionnel. Exemple 8 : test in vitro acellulaire d’évaluation de l’activité anti-inflammatoire (apaisante) sur l’enzyme lipoxygénase. L’objectif de cette étude est d’évaluer la modulation de l’activité anti-inflammatoire de l’enzyme lipoxygénase par un ou plusieurs échantillons dans un modèle In Vitro acellulaire faisant appel au kit d’analyse « Lipoxygenase Inhibitor Screening Assay Kit » de la société CAYMAN/INTERCHIM. La Lipoxygénase est une enzyme clé en amont du processus inflammatoire qu’enclenche la cascade arachidonique. MATERIELS L’échantillon testé est l’extrait hydrolysé de tourteau de graine de chanvre déshuilé selon l’invention (exemple 1). Les réactifs utilisés sont fournis dans le kit de CAYMAN/INTERCHIM et sont les suivants : - tampon 0,1M, Tris-HCl ; - chromogène 1 ; - chromogène 2 ; - enzyme : 15–lipoxygénase ; - substrat : acide arachidonique - hydroxyde de potassium - inhibiteur NDGA (Nordihydroguaiaretic). Le spectrophotomètre utilisé est le POLARSTAT OMEGA de BMG LABTECH et l’INCU-SHAKER MINI de BENCHMARK. METHODES Système d’essai Une solution tamponnée de Lipoxygénase réagit avec un substrat spécifique, l’acide arachidonique, et le transforme pour former un composé qui se lie à un chromogène, sous agitation à température ambiante. L’activité de la Lipoxygénase peut ainsi être évaluée par mesure de l’absorbance à 500 nm. L’échantillon ou le produit de référence inhibiteur « Nordihydroguaiaretic » (NDGA) sont mis en contact avec la solution de Lipoxygénase en même temps que le substrat de l’enzyme. Le substrat transformé par l’enzyme est coloré à l’aide du chromogène par agitation à température ambiante. L’activité de la Lipoxygénase en présence/absence de l’échantillon, ou du produit de référence est alors évaluée par mesure de l’absorbance à 500 nm. La modulation de cette activité est exprimée en pourcentage d’inhibition ou d’activation de l’activité de la Lipoxygénase en absence d’actif, c’est-à-dire uniquement en présence du substrat de l’enzyme (acide arachidonique). Protocole d’incubation Une solution d’enzyme Lipoxygénase est incubée dans son substrat, acide arachidonique, pendant 10 minutes, en absence ou présence de l’inhibiteur de référence et de l’échantillon testé puis le chromogène est incorporé avant une incubation de 35 minutes à température ambiante sur agitateur orbital. Evaluation des effets A la fin de la période d’incubation, l’activité de l’enzyme Lipoxygénase avec et sans produit à l’essai ou de référence a été évaluée par mesure de l’absorbance des milieux réactionnels à 500 nm. Pour chaque concentration testée, la modulation de l’activité de l’enzyme Lipoxygénase par le produit à l’essai est calculée selon la formule suivante : Si le résultat est négatif, le pourcentage est exprimé en inhibition de l’enzyme. Résultats Les résultats sont présentés dans le tableau 5 suivant : Echantillons Moyenne DO Moyenne DO Echantillon – DO Blanc % activité enzymatique % inhibition de l’activité enzymatique Blanc 0,251 0,000 0,00 100,00 T+ 0,398 0,147 100,00 0,00 T- 0,179 -0,073/0,000 0,00 149,55 Exemple 1 à 4,76% en Masse dans le milieu réactionnel 0,202 0,037 25,00 75,00 Exemple à 2,00% en Masse dans le milieu réactionnel 0,163 0,105 71,82 28,18 Aux concentrations testées de 2,00% et de 4,76% en masse dans le milieu réactionnel, une activité inhibitrice de l’enzyme clé de la cascade arachidonique, la lipoxygénase, est observée pour l’extrait hydrolysé de tourteau de graine de chanvre déshuilé selon l’invention. Exemple 9 : test in vitro acellulaire d’évaluation de l’activité anti-inflammatoire (apaisante) sur l’enzyme phospholipase A2. L’objectif de cette étude est d’évaluer la modulation de l’activité anti-inflammatoire de l’enzyme phospholipase A2 par un ou plusieurs échantillons dans un modèle In Vitro acellulaire faisant appel au kit d’analyse « SPLA2 (type V) Inhibitor Screening Assay Kit » de la société CAYMAN/INTERCHIM. La phospholipase A2 est une enzyme clé en amont du processus inflammatoire qu’enclenche la cascade arachidonique. MATERIELS L’échantillon testé est l’extrait hydrolysé de tourteau de graine de chanvre déshuilé selon l’invention (exemple 1). Les réactifs utilisés sont fournis dans le kit de CAYMAN/INTERCHIM et sont les suivants : - sPLA2 DTNB (2-nitrobenzoic acid) ; - sPLA2 Diheptanoyl thio-PC (substrat) ; - sPLA2 assay (humain type V) ; - Thioetheramide-PC 1mg dans 100μl Ethanol ; -substrat : acide arachidonique - sPLA2 assay buffer (10x). Le spectrophotomètre utilisé est le POLARSTAT OMEGA de BMG LABTECH et l’INCU-SHAKER MINI de BENCHMARK. METHODES Système d’essai Une solution tamponnée de Phospholipase A2 réagit avec un substrat spécifique, le diheptanoyl thio-PC, et le transforme pour former un composé qui se lie à un chromogène, le DTNB sous agitation à température ambiante. L’activité de la phospholipase A2 peut ainsi être évaluée par mesure de l’absorbance à 413 nm. L’échantillon ou le produit de référence inhibiteur « Thioetheramide-PC » sont mis en contact avec la solution de Phospholipase A2 en même temps que le substrat de l’enzyme. Le substrat transformé par l’enzyme est coloré à l’aide du chromogène DTNB par agitation à température ambiante. L’activité de la Phospholipase A2 en présence/absence de l’échantillon, ou du produit de référence est alors évaluée par mesure de l’absorbance à 413 nm. La modulation de cette activité est exprimée en pourcentage d’inhibition ou d’activation de l’activité de la Phospholipase A2 en absence d’actif, c’est-à-dire uniquement en présence du substrat de l’enzyme (diheptanoyl thio-PC). Protocole d’incubation Une solution d’enzyme phospholipase A2 est incubée dans son substrat, diheptanoyl thio-PC, en absence ou présence de l’inhibiteur de référence et de l’échantillon testé puis le chromogène DTNB est incorporé avant une incubation de 15 minutes à 25°C. Evaluation des effets A la fin de la période d’incubation, l’activité de l’enzyme phospholipase A2 avec et sans produit à l’essai ou de référence a été évaluée par mesure de l’absorbance des milieux réactionnels à 413 nm. Pour chaque concentration testée, la modulation de l’activité de l’enzyme phospholipase A2 par le produit à l’essai est calculée selon la formule suivante : Si le résultat est négatif, le pourcentage est exprimé en inhibition de l’enzyme. Résultats Les résultats sont présentés dans le tableau 6 suivant : Echantillons Moyenne DO Moyenne DO Echantillon – DO Blanc Activité enzymatique (%) Inhibition de l’activité enzymatique (%) Blanc 0,155 0,000 0,00 100,00 T + 1,508 1,353 100,00 0,00 T - 0,538 0,383 28,33 71,67 Exemple 1 à 4,35% en Masse dans le milieu réactionnel 0,890 0,510 37,69 62,31 Exemple 1 à 2,00% en Masse dans le milieu réactionnel 0,963 0,281 20,79 79,21 Exemple 1 à 0,50% en Masse dans le milieu réactionnel 1,066 0,806 59,55 40,45 Aux concentrations testées de 4,35%, 2,00 et 0,50% en Masse dans le milieu réactionnel, une activité inhibitrice de l’enzyme clé de la cascade arachidonique, Phospholipase A2 est observée pour l’extrait hydrolysé de tourteau de graine de chanvre déshuilé selon l’invention. Une activité dose dépendante en «Gaussienne» est observée pour l’extrait hydrolysé de tourteau de graine de chanvre déshuilé selon l’invention ce qui tend à démontrer une activité inhibitrice spécifique sur le site actif de l’enzyme. Exemple 10 : test in vitro acellulaire d’évaluation de l’activité de la tyrosinase. L’objectif de cette étude est d’évaluer la modulation de l’activité de l’enzyme tyrosinase par un échantillon dans un modèle In Vitro acellulaire faisant appel à la tyrosinase, la L-tyrosine et l’hydroquinone. MATERIELS L’échantillon testé est l’extrait hydrolysé de tourteau de graine de chanvre déshuilé selon l’invention (exemple 1). Les réactifs utilisés sont les suivants : - potassium phosphate monobasique fourni par SIGMA ; - l’hydroquinone fourni par SIGMA ALDRICH ; - L-tyrosine fourni par SIGMA ALDRICH ; - tyrosinase de champignon fourni par SIGMA ; - hydroxyde de potassium ; - acide citrique ; - NaOH. Le spectrophotomètre utilisé est le POLARSTAT OMEGA de BMG LABTECH. METHODES Système d’essai Une solution tamponnée de Tyrosinase est mis en contact avec le substrat L-tyrosine pour former un composé qui sera notre témoin positif. Pour le témoin d’inhibition, l’hydroquinone est l’inhibiteur de référence. Il est d’abord mis en contact avec la solution de tyrosinase puis avec le substrat L-tyrosine. En parallèle, l’échantillon est mis en contact avec la solution de Tyrosinase en même temps que le substrat de l’enzyme. Le tout est incubé à 23°C pendant 60 minutes. L’activité de la Tyrosinase conduit à transformer le substrat L-tyrosine en pigment mélanique, ce qui colore le mélange. L’activité de la tyrosinase est alors évaluée par mesure de l’absorbance à 475 nm. La modulation de cette activité est exprimée en pourcentage d’inhibition ou d’activation de l’activité de la Collagénase en absence d’actif, c’est-à-dire uniquement en présence du substrat de l’enzyme. Evaluation des effets Pour chaque concentration testée, la modulation de l’activité de l’enzyme Tyrosinase par le produit à l’essai est calculée selon la formule suivante : Si le résultat est négatif, le pourcentage est exprimé en inhibition de l’enzyme. Résultats Les résultats sont présentés dans le tableau 7 suivant : Echantillons Moyenne DO Moyenne DO Echantillon – DO Blanc % activité enzymatique % inhibition de l’activité enzymatique Blanc 0,021 0,000 0,00 100,00 T+ 0,205 0,184 100,00 0,00 T- 0,021 0,000 0,18 99,82 Exemple 1 à 5,0% en Masse dans le milieu réactionnel 0,071 0,013 6,90 93,10 Exemple 1 à 2,0% en Masse dans le milieu réactionnel 0,099 0,062 33,94 66,06 Exemple 1 à 0,5% en Masse dans le milieu réactionnel 0,179 0,151 82,40 17,60 Aux concentrations testées de 5,0%, 2,0% et 0,5% en Masse dans le milieu réactionnel, une activité inhibitrice de la Tyrosinase est observée pour l’extrait hydrolysé de tourteau de graine de chanvre déshuilé selon l’invention. Au vu des résultats, cette activité inhibitrice est dose-dépendante, ce qui tend à démontrer une action inhibitrice spécifique sur le site actif de l’enzyme. Exemple 11 : étude de la cytotoxicité sur cellules HELA Les cellules HeLa sont une lignée cellulaire cancéreuse humaine de référence internationale en biologie cellulaire. L’objectif de cette étude est d’évaluer la cytotoxicité d’un échantillon sur une culture de cellules HeLa9903 et de définir si possible une EC50 (concentration efficace médiane). MATERIELS L’échantillon testé est l’extrait hydrolysé de tourteau de graine de chanvre déshuilé selon l’invention (exemple 1). Les réactifs utilisés sont les suivants : - cellules HeLa9903 fourni par Ephyla ; - DMEM fourni par PanBiotech ; - FBS CS fourni par Dutscher ; - L-glutamine fourni par Dutscher ; - Geneticin fourni par Corning ; - Blasticidin S fourni par PanReac ; - Trypsine 0,25% EDTA 0,02% dans PBS fourni par PanBiotech ; - Acétone fourni par Carlo Erba ; - DMSO fourni par Fisher bioreagents ; - PBS 10X fourni par biosolve ; - Formaldéhyde 37% fourni par Carlo Erba ; - Cristal violet fourni par Carlo Erba ; - Na 2 HPO 4 fourni par Carlo Erba ; - Na 2 HPO 4 .H 2 O fourni par Carlo Erba ; - Acide acétique fourni par Carlo Erba . Le spectrophotomètre utilisé est le POLARSTAT OMEGA de BMG LABTECH. METHODES culture cellulaire Les cellules sont entretenues dans 15ml de DMEM supplémenté par 10% FBS-CS, 2mM L-Glutamine, 0,8mg/ml Geneticin, 16μg/ml Blasticidin S, dans un ballon de 75cm 2 puis incubées à 37°C sous atmosphère contenant 5% de CO 2 . A confluence, les cellules sont trypsinées et comptées sur cellule de Malassey. Une dilution des cellules est réalisée dans du DMEM supplémenté de façon à obtenir une suspension cellulaire à 105 cellules/ml. 100μl de cette suspension est ensemencée dans 60 des 96 puits de la plaque. Le nombre de cellules par puits est de 10 000. Le pourtour de la plaque (c’est à dire les lignes A et H et les colonnes 1 et 12) est rempli avec 100μL de PBS 1X. Les cellules sont incubées à 37°C dans une atmosphère contenant 5% de CO 2 pendant 24h (temps d'attachement des cellules au support). Après 24h d'incubation, le traitement des cellules est réalisé en triplicata par l'ajout de 1μL des différentes dilutions des échantillons à tester. Pour le témoin, 1μl de solvant de dilution est ajouté à la place de l’échantillon. Chaque plaque est réalisée en duplicata afin d'observer l'effet de 24h et de 48h de traitement sur la survie des cellules. Les cellules sont remises à incuber pendant 24h ou 48h. Marquage au cristal violet Le milieu de culture est retiré de chaque puits. Les cellules vivantes, attachées au fond de la plaque, sont rincées par 100μL de PBS puis fixées par l'ajout de 100μL d'une solution de formaldéhyde (10% dans PBS) pendant 10 min. Les cellules ainsi fixées sont rincées 3 fois avec de l'eau désionisée puis marquées par 50μL d'une solution de 1% de cristal violet dissout dans un tampon phosphate de sodium 200mM, pH 6 pendant 20 à 30min. Le cristal violet non fixé aux cellules est retiré par 3 immersions de la plaque dans de l'eau (robinet). La plaque est séchée puis le cristal violet incorporé dans les cellules est dissout dans 100μL une solution à 1% d'acide acétique pendant 20 à 30min sous agitation modérée. 80μL de la solution de cristal violet/acide acétique sont transférés dans une nouvelle plaque 96 puits afin de lire l'absorbance à 590nm. Evaluation des effets Pour chaque concentration testée, la viabilité des cellules HeLa est calculée selon la formule suivante : L’échantillon sera considéré comme toxique si le résultat est inférieur à 50%. Résultats Résultats à 24h Les résultats sont présentés dans le tableau 8 suivant : Echantillons Moyenne DO Viabilité cellules HeLa (%) Témoin 0,598 100,00 Exemple 1 à 1,00% en masse dans le milieu de culture 0,575 96,04 Exemple 1 à 0,75% en masse dans le milieu de culture 0,648 108,25 Exemple 1 à 0,50% en masse dans le milieu de culture 0,624 104,35 Résultats à 48h Les résultats sont présentés dans le tableau 9 suivant : Echantillons Moyenne DO Viabilité cellules HeLa (%) Témoin 1,024 100,00 Exemple 1 à 1,00% en Masse dans le milieu de culture 0,784 76,62 Exemple 1 à 0,75% en Masse dans le milieu de culture 0,966 94,37 Exemple 1 à 0,50% en Masse dans le milieu de culture 0,958 93,59 Au vu de l’homogénéité des résultats obtenus à 24h et 48h, dès 24h les valeurs sont considérées comme exploitables et représentatives. Dans les conditions expérimentales, l’extrait hydrolysé de tourteau de graine de chanvre déshuilé selon l’invention n’est pas cytotoxique sur les cellules HeLa aux concentrations de 0,50%, 0,75% et 1,00% en Masse dans le milieu de culture. Extrait hydrolysé de tourteau de graine de chanvre déshuilé obtenu par hydrolyse alcaline à un pH supérieur ou égal à 11, avantageusement supérieure ou égale à 12. Extrait hydrolysé selon la revendication 1, caractérisé en ce qu’il est obtenu par le procédé comprenant les étapes suivantes : a- la délipidation du tourteau de graine de chanvre par extraction avec de l’éthanol, avantageusement à au moins 96 degrés, b- l’hydrolyse alcaline à un pH supérieur ou égal à 11, en particulier supérieur ou égal à 12, du tourteau déshuilé obtenu à l’étape a), avantageusement à l’aide d’une base choisie parmi l’hydroxyde de sodium, l’hydroxyde de magnésium, l’hydroxyde de calcium et l’hydroxyde de potassium. Extrait hydrolysé selon l’une quelconque des revendications 1 ou 2, caractérisé en ce qu’il comprend une fraction peptidique de masse moléculaire comprise entre 9 et 12 KDa, avantageusement de 11KDa, et une fraction peptidique de masse moléculaire comprise entre 16 et 18 KDa, avantageusement de 17 kDa, mesurées par la méthode séparative par électrophorèse sur gel dénaturant en SDS-PAGE. Extrait hydrolysé selon l’une quelconque des revendications 1 à 3, caractérisé en ce que : - sa teneur en matière sèche est comprise entre 10,5 et 15 % en masse, par rapport à la masse totale de l’extrait hydrolysé ; - sa teneur en protéines totales est comprise entre 0,8 et 2,4 % en masse, avantageusement entre 1,2 et 1,6 % en masse, par rapport à la masse totale de l’extrait hydrolysé. Fraction peptidique de l’extrait hydrolysé selon l’une quelconque des revendications 1 à 4, caractérisée en ce que sa masse moléculaire mesurée par la méthode séparative par électrophorèse sur gel dénaturant en SDS-PAGE est comprise entre 9 et 12 KDa, avantageusement elle est de 11KDa. Fraction peptidique de l’extrait hydrolysé selon l’une quelconque des revendications 1 à 4, caractérisée en ce que sa masse moléculaire mesurée par la méthode séparative par électrophorèse sur gel dénaturant en SDS-PAGE est comprises entre 16 et 18 KDa, avantageusement elle est de 17KDa. Association de l’extrait hydrolysé selon l’une quelconque des revendications 1 à 4 ou d’une ou plusieurs de ses fractions peptidiques selon l’une quelconque des revendications 5 ou 6 et d'un extrait éthanolique de tourteau de graine de chanvre, avantageusement obtenu à l’étape a) du procédé de la revendication 2. Composition pharmaceutique comprenant l’extrait hydrolysé selon l’une quelconque des revendications 1 à 4 ou une ou plusieurs de ses fractions peptidiques selon l’une quelconque des revendications 5 ou 6 ou l'association selon la revendication 7 et un excipient pharmaceutiquement acceptable. Procédé de fabrication de l’extrait hydrolysé selon l’une quelconque des revendications 1 à 4, caractérisé en ce qu’il comprend les étapes suivantes : a- la délipidation du tourteau de graine de chanvre par extraction avec de l’éthanol, avantageusement à au moins 96 degrés ; b- l’hydrolyse alcaline à un pH supérieur ou égal à 11, en particulier supérieur ou égal à 12, du tourteau déshuilé obtenu à l’étape a), avantageusement à l’aide d’une base choisie parmi l’hydroxyde de sodium, l’hydroxyde de magnésium, l’hydroxyde de calcium et l’hydroxyde de potassium. Extrait hydrolysé selon l’une quelconque des revendications 1 à 4 ou fraction peptidique de l’extrait selon l’une quelconque des revendications 5 ou 6 ou association selon la revendication 7 ou composition selon la revendication 8 pour son utilisation à titre de médicament, avantageusement en tant qu’antioxydant et/ou dépigmentant et/ou anti-inflammatoire non stéroïdien et/ou anti-neurodégénératif et/ou neuroprotecteur et/ou anticancéreux et/ou cicatrisant et/ou antifibrotique, plus avantageusement pour le traitement ou la prévention des maladies neurodégénératives telles que la maladie d’Alzheimer ou la maladie de Parkinson.