Brevet FR3160972A1 — publié le 20251010

La présente invention concerne la définition d’un vivier de peptides spermatiques antigéniques de haute spécificité d’espèce pour la régulation des populations de campagnol terrestre ( Arvicola terrestris scherman ) par une approche vaccinale. Figure 1 CARACTERISATION DE PEPTIDES ANTIGENIQUES / IMMUNOGENIQUES POUR LE DEVELOPPEMENT DE VACCINS CONTRACEPTIFS DANS LE BUT DE LIMITER LES PULLULATIONS DU RONGEUR ARVICOLA TERRESTRIS SCHERMAN Domaine technique de l’invention La présente invention concerne la régulation des populations de campagnol terrestre Arvicola terrestris scherman par une approche vaccinale. Dans la description ci-dessous, les références entre parenthèses [ ] renvoient à la liste des références présentée à la fin du texte. Etat de la technique Le campagnol terrestre Arvicola terrestris Scherman ( ATS ), est un rongeur endémique qui vit dans des galeries souterraines des régions de moyenne montagne situées généralement entre 400 et 1500 m d'altitude [1]. La prolifération de ce rongeur présente des variations cycliques sur une période d'environ 5 à 6 ans, avec des densités allant de 50-100 animaux/hectare à plus de 1000 lors des pics de pullulations [2,3]. La prolifération et l'expansion cycliques excessives des zones de colonisation d’ ATS , depuis les années 1970, dans les écosystèmes agronomiques et touristiques de moyenne montagne, constituent un problème de plus en plus important qui a de fortes répercussions environnementales et économiques [4-6]. À forte densité, l’ ATS affecte la composition botanique des prairies, provoquant la régression des légumineuses et l'augmentation des graminées de mauvaise qualité et des plantes indésirables. Sur les parcelles cultivées, l’ ATS peut endommager les cultures céréalières, les vergers, les potagers, les vignobles, les forêts et les jardins d'ornement [7,8]. L'une des conséquences de l'activité d’ ATS sur les prairies est la présence de monticules de terre (tumulus) issus de l’activité de fouissage qui facilitent l'ingestion de terre par les animaux en pâturage. Il en résulte une altération de la qualité du lait, caractérisée par une réduction de la teneur en protéines et une contamination par des bactéries butyriques. Les foyers d’ ATS constituent également un risque pour la santé publique car ils sont vecteurs de zoonoses. Il existe ainsi une forte relation entre la densité d’ ATS et le facteur de risque d'échinococcose alvéolaire [9]. L'échinococcose alvéolaire humaine est une maladie parasitaire grave causée par la larve d'un ver plat, Echinococcus multilocularis , qui se caractérise principalement par un développement hépatique sous forme tumoral, et pour laquelle il n'existe actuellement aucun traitement. Les stratégies actuelles de contrôle des populations d’ ATS sont dominées par des procédures létales, telles que le piégeage physique et l'empoisonnement chimique avec des appâts (blé, carotte) imbibés de l’anticoagulant bromadiolone, ou plus récemment du Ratron [10]. Bien que ces approches soient efficaces, elles ne sont plus viables économiquement (piégeage) ni acceptables d'un point de vue environnemental (lutte chimique). En effet, la nature non spécifique de la lutte chimique fait que les dommages collatéraux sur la faune non ciblée (animaux ayant un régime alimentaire similaire ou prédateurs d’ ATS , tels que sangliers, renards, hermines, belettes, oiseaux de proie, et même chats et chiens) sont importants [11,12]. De plus, bien que la lutte chimique soit effectuée de manière raisonnée (surveillance des foyers, traitement sur ordre administratif soumis à arrêté préfectoral, distribution contrôlée des appâts, abandon des traitements en période ou en zone de forte densité), la contamination des écosystèmes (nappes phréatiques, rivières, stations d'épuration, etc..) par la bromadiolone constitue un nouveau risque sanitaire pour la population et la faune sauvage [13]. Récemment, en France, l'Agence Nationale de Sécurité Sanitaire de l'alimentation, de l'environnement, et du travail (ANSES) a déclaré que l'utilisation de ce produit chimique n'excluait pas "un risque inacceptable pour les organismes aquatiques, les vertébrés terrestres et la contamination des eaux souterraines" (AMM n° 9800526). Cette situation incite à développer des stratégies alternatives pour lutter contre les pullulations de ce rongeur nuisible aux cultures et aux écosystèmes. Dans ce contexte, l'immunocontraception peut être une option intéressante pour limiter la reproduction d’ ATS . L'immunocontraception ou contraception vaccinale implique l'administration d'un antigène qui induit une réponse immunitaire adaptative, entraînant une sous-fécondité voire une stérilité. Des vaccins contraceptifs ont été utilisés et se sont avérés efficaces dans de nombreuses situations pour contrôler la fertilité de populations d'animaux sauvages ou domestiques captifs et/ou semi-captifs, notamment les chevaux [14], les cerfs [15,16], les écureuils [17], les marsupiaux [18] et les éléphants d'Afrique [19]. En bref, trois stratégies peuvent être utilisées pour obtenir une contraception vaccinale : une stratégie « post-fécondation » consistant à interférer avec l'implantation du fœtus par le biais d'un vaccin anti GnRH (hormone de libération de la gonadotrophine) et deux stratégies « pré-fécondation » visant à limiter l'interaction gamétique en interférant soit avec le gamète femelle, soit avec le gamète mâle. Les vaccins anti-GnRH et anti-ZP3, ZP3 étant l'une des protéines de la zone pellucide entourant l'ovocyte chez les mammifères, se sont avérés efficaces pour induire une contraception vaccinale [20,21]. Ces deux approches immunocontraceptives présentent cependant un écueil majeur dans le contexte qui nous intéresse, à savoir qu'elles ne permettent pas de spécificité d'espèce compte tenu de la bonne conservation de la séquence de l’hormone GnRH et de la protéine ZP3 chez les mammifères. Seule une stratégie vaccinale dirigée contre les antigènes spermatiques permet d'envisager un haut niveau de spécificité d'espèce en raison du grand nombre de cibles antigéniques spermatiques potentielles et du polymorphisme de séquence inter-espèces [22-24]. S'il est plutôt intuitif que les antigènes spermatiques puissent être reconnus comme du « non-soi » par le système immunitaire des animaux femelles, ils devraient théoriquement aussi provoquer la production d'anticorps anti-spermatozoïdes chez les mâles. En effet, les spermatozoïdes sont produits à la puberté, bien après que le répertoire du « soi » ait été établi. Ils sont donc considérés comme du « non-soi » même pour le mâle qui les produit. Le fait que les antigènes spermatiques soient de bons déclencheurs de réponses immunitaires a été clairement démontré par l'observation que 70% des hommes ayant subi une vasectomie (ligature des canaux déférents) développent des anticorps anti-spermatozoïdes ou ASA [25-27], ce qui compromet souvent la restauration de la fertilité dans le cas d'une vaso-vasostomie (réversion de vasectomie). Ces ASA résultent de la présentation d'antigènes spermatiques au système immunitaire de l'hôte en raison de la perméabilité accrue des barrières sang-testicule-épididyme, conséquence de la vasectomie [28]. Des ASA ont été identifiés dans certains cas d'infertilité chez l'homme [29,30], pour lesquels il a été démontré qu'ils causaient l'infertilité en inhibant la liaison spermatozoïdes/ovocytes, en réduisant la mobilité des spermatozoïdes, en réduisant la pénétration des spermatozoïdes dans le mucus cervical, et en altérant la capacitation et/ou la réaction acrosomique. Dans ce contexte, les études d'immunocontraception réalisées à ce jour, sur différents modèles, ont utilisé soit des spermatozoïdes entiers, soit des antigènes spermatiques sélectionnés et utilisés individuellement. A titre d’exemples, l'injection de spermatozoïdes entiers en tant qu'immunogènes a été réalisée chez le wallaby Tammar [31], la souris [32], le lapin [33,34] et le chien [35]. Cependant, dans ces études, la détermination des antigènes spermatiques conduisant au déclenchement de la réponse immunitaire (i.e. : l’apparition d’anticorps spécifiques anti-antigènes spermatiques) n'a pas été analysée. Seule la production d'anticorps et les effets sur la fertilité ont été décrits. Dans les modèles rongeurs, plusieurs antigènes spermatiques (protéines et/ou peptides) ont été étudiés séparément en tant que cibles potentielles pour l'immunocontraception. Des réponses immunitaires efficaces et une diminution de la fertilité ont par exemple été obtenues en utilisant les antigènes spermatiques FA1 [36], CRISP1 [37], SPAG9 [38] ou tNASP [39]. Récemment, les inventeurs ont utilisé une stratégie d'immunisation par spermatozoïdes entiers pour identifier via une approche sans a priori un ensemble d’antigènes spermatiques (sous la forme finale de peptides immunogéniques) avec la meilleure spécificité possible pour l’espèce ciblée ( ATS ) dans le but de constituer une banque d’épitopes antigéniques pour le développement de vaccins contraceptifs [40]. Parmi les quelques 120 antigènes spermatiques identifiés pouvant provoquer l’apparition d’anticorps anti-spermatozoïdes et susceptibles d’être utilisées pour provoquer une réponse immunitaire anti-spermatozoïdes homologue ( i.e . au sein de la même espèce), seuls 17 antigènes spermatiques (CHDH, ZPBP1, CRISP2, AKAP3, GK2, PGK2, CRISP4, PRSS21, CFAP44, INSL6, CATSPER1, ACR, GAPDHS, ZPBP2, NUP210L, IZUMO1, ZP3R) ont été retenus. La sélection a reposé sur un crible multi-critères portant sur : le niveau de la réponse anticorps d’ ATS après immunisation par chacun de ces antigènes ; la nature de la réponse anticorps (systémique et mucosale) ; la distribution tissulaire des antigènes concernés ; leur rôle dans la fonction de reproduction ; et enfin, la présence au sein de ces antigènes d’épitopes dont la séquence primaire présentait un niveau de spécificité d’espèce maximal. Description de l’invention La présente invention a consisté, à partir des antigènes spermatiques précédemment identifiés, en la caractérisation d’épitopes peptidiques immunogènes (= peptides spermatiques antigéniques) spécifiques du campagnol terrestre ( ATS ) dans l’objectif de les utiliser dans une stratégie vaccinale ciblant mâles et femelles de l’espèce pour limiter les pullulations anarchiques de ce rongeur nuisible dans les zones de moyenne montagne sans produire d’effet collatéral sur la faune non ciblée. Cette stratégie est proposée comme alternative ou en complément de la lutte chimique couramment utilisée ces 30 dernières années mais frappée d’une interdiction à l’échelle européenne en raison des dommages collatéraux infligés à la faune non cible et aux potentiels risques sanitaires associés pour la population humaine. Pour ce faire, les Inventeurs ont immunisé par voie parentérale des rongeurs ATS mâles et femelles avec des spermatozoïdes d’ ATS , et identifié par des techniques d’immunoprécipitation, de protéomique couplées à de la spectrométrie de masse et via des approches in silico, les protéines spermatiques (= antigènes) ayant provoqué l’apparition d’anticorps anti-spermatozoïdes dans la circulation sanguine (IgG sériques). Ceci a permis d’identifier 121 protéines au total, et un premier crible de ces cibles antigéniques spermatiques a été réalisé de façon à ne retenir que des antigènes présentant la plus grande spécificité de séquence pour l’espèce d’intérêt ( ATS ), en laissant de côté ceux pouvant être retrouvés chez d’autres mammifères ( en fonction des données de séquençage disponibles à ce jour chez les mammifères ). Cette approche a permis de réduire la liste de candidats potentiels à 17 protéines. A partir de la séquence peptidique de ces 17 protéines, en utilisant des outils informatiques classiques de prédiction antigénique et toujours en gardant la spécificité de l’espèce ATS , 33 peptides spermatiques potentiellement antigéniques ont été définis. Ces 33 peptides immunogéniques d’antigènes spermatiques d’ ATS concernent les 17 protéines suivantes : CHDH, ZPBP2, IZUMO1, ZP3R, NUP210L, INSL6, GSK2, PRSS21, PGK2, CFAP44, ACR, AKAP3, ZPBP1, GAPDHS, CRISP2, CRISP4, CATSPER1). Pour chacune de ces 17 protéines spermatiques ATS, un peptide spécifique de l’espèce a été retenu, synthétisé chimiquement et testé quant à sa capacité à provoquer une réponse immune humorale (IgG) et mucosale (IgA) chez ATS . Les mâles ont été immunisés par la voie parentérale (injections sous-cutanées) dans un premier temps afin de vérifier l’immunogénicité des 17 peptides sélectionnés. Ainsi, tous les peptides (17) ont été individuellement testés quant à leur capacité après immunisation à : - provoquer une réponse immune systémique et mucosale, - cibler les organes reproducteurs mâles dans lesquels sont stockés, transitent les spermatozoïdes ou sont en contact avec les sécrétions de ces organes dans le sperme (testicule, épididyme, vésicule séminale, prostate), - cibler les spermatozoïdes, - provoquer des effets physiologiques notables (en particulier une altération de la spermatogenèse, et/ou un phénotype au niveau du tractus génital mâle). En fonction du niveau de la réponse immunitaire obtenue (évalué par le titre en anticorps généré après immunisations d’ ATS mâles dans des conditions similaires de doses) les 17 peptides ont été catégorisés en « bons immunogéniques », « immunogéniques moyens » et « immunogéniques faibles » (cf. FIG. 1 ). A l’issue de cette évaluation, 12 peptides antigéniques (inclus dans les deux premières catégories « immunogéniques bons et moyens ») ont été retenus pour constituer le vivier de peptides immunogéniques ATS spermatiques. L’antigène CATSPER1 (ainsi que tous les peptides immunogéniques qui peuvent en découler) faisant déjà l’objet d’une protection pour son utilisation en tant qu’antigène à destination immunocontraceptive, a été exclu. La présente invention a donc pour objet une composition vaccinale à visée contraceptive comprenant au moins 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, ou 11 peptide(s) spermatiques immunogénique(s) choisi(s) parmi les peptides de séquences suivantes : CHDH (SEQ ID N O : 1 ; AWAVLGQSRYPCS) ; CRISP2 (SEQ ID N O : 2 ; MEWSVETTG) ; AKAP3 (SEQ ID N O : 3 ; SESKAQGVKEY) ; PGK2 (SEQ ID N O : 4 ; YNPAKVEAFR) ; ZPBP2 (SEQ ID N O : 5 ; YTLQGNRQINI) ; GK2 (SEQ ID N O : 6 ; YEVEKLAREV) ; CFAP44 (SEQ ID N O : 7 ; VYSQFIAEKIA) ; INSL6 (SEQ ID N O : 8 ; WEPWVPPDYQFEKSNLLPEKTEEFSSRDVHS) ; GAPDHS (SEQ ID N O : 9 ; DLEIQVYQWLGAP) ; NUP210L (SEQ ID N O : 10 ; KIMFQFLKY) ; ZP3R (SEQ ID N O : 11 ; YLPVLMEPQ); et un excipient pharmaceutiquement acceptable. Selon un mode de réalisation particulier de la présente invention, la composition vaccinale peut comprendre les 11 peptides immunogéniques de séquences SEQ ID NOs : 1-11, de préférence les 6 peptides de séquences SEQ ID NOs : 1-6 (pour des critères d’immunodominance et de recherche de spécificité maximale d’espèce), préférentiellement les 3 peptides de séquences SEQ ID NOs : 1, 8 et 10. Selon un mode de réalisation particulier de la présente invention, la composition vaccinale contraceptive comprend en outre un peptide antigénique de séquence en acides aminés AKFVAAWTLKAAA (SEQ ID NO : 12) en tant qu’activateur de réponse (activateur PADRE, [41]). La présente invention a également pour objet une composition vaccinale contraceptive selon la présente invention, pour une utilisation comme médicament. En particulier, ledit médicament est un contraceptif destiné à réguler les populations du campagnol terrestre. Par exemple, ledit médicament est destiné à une administration par voie orale ( e.g. sous forme de comprimés, de granulés, de gummies, etc.). La présente invention a également pour objet les peptides immunogéniques de séquences SEQ ID NOs : 1-11. BREVE DESCRIPTION DES FIGURES FIG. 1 représente la classification de l’immunogénicité des peptides spermatiques immunogéniques sélectionnés chez l’ ATS . FIG. 2 représente un schéma simplifié de la stratégie d’identification des protéines spermatiques antigéniques d’ ATS. FIG. 3 représente un schéma simplifié de la stratégie d’identification de peptides spermatiques antigéniques d’ ATS à forte spécificité d’espèce et à potentiel immunogénique. EXEMPLES EXEMPLE 1 : IDENTIFICATION DES PEPTIDES SPERMATIQUES IMMUNO GENIQUES ( cf. figures 1 et 2) Des ATS mâles et femelles ont été collectés en plein champ dans le département du Puy-de-Dôme (063, France) : Perpezat (45°68'33''Nord - 2°78'33''Est) ; Nébouzat (45°42'59''Nord - 2°54'19''Est) ; Saint-Julien-Puy-Lavèze (45°39'58''Nord - 2°40'25''Est). A proximité immédiate des taupinières fraîchement faites, des galeries ont été détectées à l'aide d'un sondeur et un piège a été placé à l'intérieur. Seuls les animaux en âge de se reproduire, c'est-à-dire d'un poids supérieur à 70 grammes, ont été gardés vivants et ramenés à l'animalerie où ils ont été logés dans un environnement contrôlé (23°C, 12 heures de lumière / 12 heures d'obscurité). Les animaux ont été nourris ad libitum avec des carottes. Toutes les procédures utilisées sur les ATS ont été approuvées par le Comité d'éthique de l'expérimentation animale d'Auvergne (C2E2A) et le Ministère français de la recherche (autorisation APAFIS # 10653-2017071016422159 v5). Quand nécessaire, les animaux ont été anesthésiés avec 4% d'isoflurane (Isovet) dans l'air inspiré pour réaliser les injections et les prélèvements sanguins. Ils ont ensuite été tués par dislocation cervicale avant le prélèvement des tissus. Des spermatozoïdes entiers d' ATS ont été utilisés pour immuniser les animaux et générer des anticorps anti-spermatozoïdes (15.10 7 spz / injection dans un volume total de 300 µL, correspondant à une dose immunogène basée sur la teneur en protéines, environ 100mg). Pour toutes les expériences, les spermatozoïdes ont été collectés par pression sur la queue de l'épididyme dans 500 µl de tampon Whitten's-HEPES (WH : 100 mM NaCl, 4,7 mM KCl, 1,2 mM KH2PO4, 1,2 mM MgSO4, 5,5 mM glucose, 1 mM acide pyruvique, 4,8 mM acide lactique, 20 mM HEPES, pH 7,4). Après 30 min à 37°C pour libérer un maximum de gamètes, les spermatozoïdes ont été récupérés. Une fraction aliquote a été diluée (1:50 dans du tampon WH) et comptée à l'aide d'un hémacytomètre de Malassez. Les suspensions cellulaires ont finalement été lavées trois fois par centrifugation dans du tampon PBS (500g, 5 min, température ambiante) et le culot final a été congelé et conservé à -20°C jusqu'à utilisation. Les immunisations ont été réalisées par voie sous-cutanée entre les deux omoplates d’animaux mâles et femelles. Avant l'injection des spermatozoïdes, une fraction de sang a été prélevée dans la veine caudale pour récupérer les sérums pré-immuns. Cinq mâles et six femelles ont été simultanément immunisés. La procédure d'immunisation a duré 6 semaines : le premier jour (primo-injection), les spermatozoïdes ont été injectés avec un volume égal d'adjuvant complet de Freund (Sigma). Après trois semaines, la même quantité de spermatozoïdes a été injectée (rappel), diluée dans un volume égal d'adjuvant de Freund incomplet (Sigma). La procédure d'immunisation a été arrêtée après six semaines et le sang a été prélevé par ponction intracardiaque sous anesthésie afin de récupérer les sérums immuns. Les animaux ont ensuite été sacrifiés. Les sera immuns (et pré-immuns utilisés comme sera contrôles) récupérés ont ensuite été utilisés pour identifier les protéines spermatiques (antigènes) ATS ayant provoqué une réponse immune chez les individus immunisés par une stratégie d’immunoprécipitation. En bref, des spermatozoïdes de queues d’épididymes d’ ATS ont été prélevés comme décrit précédemment, et 10 x 10 7 cellules ont été incubées dans 1,2 ml de tampon RIPA avec des inhibiteurs de protéase et de phosphatase (2h, température ambiante). Après sonication, les lysats ont été centrifugés (12 000g, 10 min, 4°C). Cent µL de surnageants ont été incubés avec des billes magnétiques de protéine A/G (30min, 4°C, Dynabeads Protein G, ThermoScientific, USA) pour un pré-clivage. Ensuite, ce surnageant a été incubé avec 25 µl de sérum immun ou pré-immun sous légère rotation (7 rpm) pendant une nuit à 4°C (pour limiter la protéolyse). Les surnageants (contenant maintenant les complexes anticorps-antigène) ont été incubés avec des billes magnétiques de protéine A/G (4,5 mg/mL, ThermoScientific) sous légère rotation (2h, température ambiante). Les complexes billes-anticorps-antigène ont été élués avec 35 µL de tampon d'élution (50 mM glycine, pH 2,8) pendant 20 min à température ambiante afin de détacher les billes des complexes Ac-Ag. Des billes magnétiques de protéine A/G (4,5 mg/mL) ont à nouveau été ajoutées pour séparer les anticorps et les antigènes. Les surnageants contenant les antigènes ont été mélangés avec du tampon Laemmli 4X et bouillis à 95°C pendant 10 minutes. Les billes magnétiques ont été lavées trois fois avec 200 µl de PBS et bouillies à 95°C pendant 10 minutes dans 25 µl de tampon Laemmli 4X avant de réaliser des western blots. Les protéines obtenues par immunoprécipitation ont migré dans un gel de polyacrylamide (12%) et les bandes 1D (protéine-gel) d'intérêt extraites du gel SDS-PAGE (fragments d'environ 5 mm de long) coloré au bleu G250 (ThermoScientific) ont été réduites avec 200 µl de 10 mM de dithiothréitol (Euromedex) dans un tampon de bicarbonate d'ammonium 50 mM (Sigma) à 56°C pendant 1 heure. Ensuite, l'alkylation a été réalisée avec 55 mM d'iodoacétamide (Sigma) dans le même tampon à température ambiante pendant 30 minutes dans l'obscurité. Les gels de protéines ont été alors décolorés avec 100 µL d'acétonitrile à 5% (15min), puis 50% (30min) successivement dans un tampon de bicarbonate d'ammonium 25 mM. Ils ont ensuite été déshydratés par incubation dans 200 μL d'acétonitrile à 100% pendant 10 min. Le gel protéique a été digéré par une incubation d'une nuit avec 100 µL de solution de trypsine (10ng/µL, Promega) dans un tampon bicarbonate d'ammonium 25 mM à 37°C. Les mélanges de peptides résultants ont été extraits avec 50% d'acétonitrile dans un tampon de bicarbonate d'ammonium 20 mM. Enfin, les peptides ont été concentrés par dessication. Les volumes ont été ajustés à 15 µL avec une solution 98% H 2 O / 2% acétonitrile / 0,05% acide trifluoroacétique, si le volume était inférieur à 15 µL pour la suite de l'analyse par LC-MS/MS. Les protéines hydrolysées par la trypsine ont alors été soumises à une analyse LC-MS/MS. Six μL de chaque hydrolysat ont été injectés dans un nanoHPLC (Ultimate 3000, Dionex) sur une colonne de concentration afin de retenir les peptides et d'éliminer les contaminants qui pourraient perturber l'analyse par spectrométrie de masse. Les peptides ont alors été séparés selon leur hydrophobicité sur une colonne analytique (Acclaim 75µm, 15 cm pepmap C18, 2micro 100 A PN16453, SN10702989). La NanoHPLC a été couplée à une source nanoESI, un spectromètre de masse de type Q-Orbitrap HFX (ThermoScientific) qui fonctionne en mode dépendant des données. A la fin de l'analyse LC-MS/MS, les échantillons ont été analysés dans le logiciel PROGENESIS QI (v 4.0, Nonlinear Dynamics). Ce logiciel permet à la fois la détection et la quantification de tous les ions peptides détectés lors de l'analyse, puis les analyses MS/MS réalisées dans le spectromètre de masse sont interrogées dans la base de données Microtus ochrogaster (campagnol des prairies) en raison de sa proximité phylogénétique ( ATS n'ayant pas de banque de données disponible). Pour l’identification des protéines concernées les moteurs de recherche utilisés Mascot (V. 2.5.1, version sous licence interne) et Peaks (v10, version sous licence interne) ont été utilisés. L'abondance des protéines a été calculée à partir de la somme des abondances de la surface normalisée de chaque peptide pour une protéine spécifique pour chaque série. Les protéines présentant un degré de confiance élevé (FDR ATS de 121 antigènes protéiques spermatiques ayant provoqués l’apparition d’anticorps anti-spermatozoïdes secondairement aux immunisations. Ces expériences et analyses protéomiques ont été réalisées sur la Plateforme d'Exploration du Métabolisme, Composante Protéomique (PFEMcp, INRAE, Theix, France). En parallèle, la recherche d'antigènes spermatiques ATS a également été effectuée en utilisant une technique d'électrophorèse bidimensionnelle classique après iso-électrofocalisation, suivie d'une analyse par western-blot avec les sérums immuns comme anticorps primaire. Les spots correspondant aux protéines reconnues ont alors été prélevés sur des gels colorés au bleu de Coomassie et analysés par spectrométrie de masse comme décrit ci-dessus. Brièvement, la focalisation isoélectrique (IEF) a été réalisée sur des bandes IPG (Biorad) de 11 cm de long (pH 3-10) en utilisant 200 μg de protéines. L'IEF a été réalisée à l'aide d'une cellule PROTEAN IEF (Biorad) selon le schéma suivant : réhydratation passive (10 h), réhydratation active à 50V (12 h), et migration (250 V pendant 15min, 8000 V pendant 2h30, et une phase finale de 8000 V jusqu'à un maximum de 35 000 V/h). Après l'IEF, les bandes focalisées ont été mises en rotation dans 135 mM de dithiothréitol (Euromedex) dans un tampon d'équilibrage (6 M urée ; 2% SDS ; 0,375 M Tris-HCl pH 8,8 ; 20% glycérol, 10 mL pendant 15 min) et ensuite dans 135 mM d'iodoacétamide (Sigma) dans un tampon d'équilibrage (10 mL pendant 15 min). Des gels de deuxième dimension (1 mm d'épaisseur, gradient d'acrylamide 4-15%, Criterion TGX - IPG 11cm+1well gels precast, Biorad) ont été réalisés (5 h, 80 V) à l'aide de la cellule Criterion (Biorad). Les protéines ont ensuite été transférées sur des membranes PVDF activées et bloquées avec du TBS-T, 5% w/v BSA. Les membranes ont été hybridées avec du sérum pré-immun ou immun (1:1 000, nuit, 4°C), anti-bêta-Actine (1:2500, Sigma) ou anti-GAPDH (1:10000, Sigma) et les anticorps secondaires ont été appliqués après trois étapes de lavage dans du TBS-T : anticorps IgG anti- ATS de lapin conjugué à la HRP (1:1 000, 1 h, RT) ou anticorps IgG anti-lapin conjugué à la HRP (BI 2407, 1:1000 pour la bêta-actine et 1:5000 pour la GAPDH, Abliance). Les protéines ont finalement été révélées par la technique ECL (Clarity Western ECL Substrate, Biorad) sur un système ChemiDoc MP Imaging (Biorad). Le vivier de ces 121 antigènes protéiques spermatiques a alors été criblé afin de sélectionner un pool d’antigènes pertinents (voir schéma récapitulatif de la stratégie d’identification en FIG. 2 ). Les critères de sélection utilisés ont été : l’intensité de la réponse immune obtenue ; la fonction biologique de la protéine avec notamment son implication dans la fonction de reproduction ; la localisation tissulaire et cellulaire, voire la localisation subcellulaire de la protéine (membranaire, cytosolique, nucléaire) quand celles-ci étaient connues, notamment si possible sa restriction au tractus génital mâle, voire aux spermatozoïdes. Ce premier crible qui permet d’assurer une partie de la spécificité de ciblage (ciblage fonctionnel) a conduit à retenir 17/121 (14%) des antigènes spermatiques immunogéniques identifiés (cf. schéma récapitulatif de la stratégie d’identification en FIG. 3 ). Seize de ces antigènes protéiques spermatiques sont originaux dans le sens qu’ils n’ont pas à ce jour été décrits comme pouvant initier une réponse immunitaire anti-spermatozoïdes. Seul l’antigène CATSPER1 a été déjà décrit comme pouvant induire une réponse immunitaire anti-spermatozoïde et protégé dans cet objectif. Nous l’avons donc exclu du vivier d’antigènes protéiques spermatiques d’ ATS conduisant à la production d’anticorps anti-spermatozoïdes. Sur ces 16 antigènes protéiques spermatiques ATS identifiés et sélectionnés, a alors été menée une analyse in silico de prédiction d’épitopes immunogéniques (softwares : IEDB et SVMTrip) ciblée sur la recherche d’épitopes stimulant préférentiellement la réponse B (réponse anticorps) et sur l’accessibilité des épitopes au sein des protéines identifiées (favorisant la présentation antigénique). Dans le but de rechercher la meilleure spécificité d’espèce possible, ces séquences peptidiques spermatiques ATS sélectionnées ont alors été alignées (software : Blastp NCBI) avec toutes les séquences connues (i.e. présentes dans les banques de données) de protéines homologues dans des espèces non cibles. Un focus particulier a été fait sur les espèces partageant l’écosystème (prédateurs communs ; animaux domestiques et animaux de rente ; l’homme). Le ciblage peptidique s’est alors fait sur les peptides ATS présentant le moins d’identité de séquence primaire avec les protéines des espèces non-cibles. Confirmation du caractère immunogénique des peptides sélectionnés . Les épitopes peptidiques choisi via l’approche décrite ci-dessus ont été individuellement testés par immunisation parentérale (sous-cutanée) de mâles ATS dans les conditions décrites ci-dessus (1 primo injection de 300µg suivie d’un rappel à 2 semaines d’intervalle) afin de confirmer leur capacité à provoquer une réponse anticorps en accord avec celle obtenue chez l’animal avec la protéine spermatique entière correspondante. La présence d’anticorps sériques IgG et muqueux IgA post-immunisation a servi de confirmation du caractère immunogénique des épitopes choisis. Protocoles : Détection IgG : La détection des IgG sériques a été effectuée par une technique de slot-blot. Des quantités différentes du peptide utilisé pour l’immunisation (1,25 – 2,5 et 5µg) ou d’un peptide non relevant (contrôle négatif dans les mêmes quantités) ont été déposées sur une membrane de nitrocellulose préalablement hydratée dans du PBS. La membrane a ensuite été saturée par une incubation de 1h à température ambiante dans une solution de TBS-T- BSA 5%. La membrane a ensuite été incubée toute la nuit à 4°C avec le sérum d’un mâle immunisé contre le peptide concerné (après dilution au 1/250 ème dans du PBS). Après trois lavages de 5min à température ambiante dans du TBS-T, la membrane a été incubée avec un anticorps IgG anti- ATS de lapin conjugué à la HRP (1:10 000 dans du TBS-T-BSA 2%, 1 h, RT). La révélation a finalement été effectuée par la technique ECL (Clarity Western ECL Substrate, Biorad) sur un système ChemiDoc MP Imaging (Biorad). Détection IgA Détection des IgA sur les spermatozoïdes extraits de la queue de l’épididyme : Avant les expériences, les lames (Superfrost, Thermoscientific) ont été traitées à l'acétone (45 min, RT) et conservées dans de l'éthanol absolu (-20°C) jusqu'à leur utilisation. Les queues des épididymes d’ ATS immunisés et non immunisés ont été pressées avec une pince pour expulser les spermatozoïdes par le canal déférent, puis perforées avec une aiguille 26G dans du tampon WH et incubés 30 minutes à température ambiante. Les spermatozoïdes ont été récupérés par centrifugation (500g, 5 min), lavés trois fois avec du PBS, étalés sur les lames et laissés sécher à l'air (1h, RT). Les lames ont ensuite été lavées deux fois 5 minutes dans du PBS sans agitation. La saturation a été effectuée avec du PBS contenant 0,1% de BSA (1h, RT) et les lames ont été incubées avec un anticorps de chèvre anti-IgA de souris qui reconnait les IgA d’ ATS (Abcam ab97235 au 1:20, 1h RT) dans une solution de PBS-0,1% de BSA. Les lames ont été incubées avec un anticorps anti-IgA de chèvre couplé à l’AlexaFluor 555 (Invitrogen, 1:1 000, dans du PBS 0,1 % de BSA, 1h, RT). Après deux lavages, les noyaux ont été colorés avec du Hoechst 33342 (1µg/mL dans du PBS, 5min à l'obscurité, Invitrogen). Les lames ont finalement été montées dans une solution « anti-fading » Citifluor AF100 et Citifluor Tris-MWL 4-88 (ratio 1:9 respectivement, Electron Microscopy Sciences) et stockées à +4°C jusqu'à l'observation par microscopie à épifluorescence (Zeiss Imager M2 avec Apotome). Détection des IgA sur les tissus du tractus génital mâle : La recherche d’IgA sécrétoires sur ces tissus a été faîte sur des coupes de paraffine de 5µm d’épaisseur (testicules, épididymes) ou sur des cryocoupes de 7µm d’épaisseur (prostate et vésicules séminales). Les coupes de paraffine ont été déparaffinées et soumises à un démasquage des antigènes par immersion dans du tampon Tris-EDTA bouillant pendant 20min puis laissées refroidir pendant 30min à RT. Les lames ont ensuite été lavées 2x5min à RT dans de l’eau et 1x5min à RT dans du PBS. Les cryocoupes ont été décongelées puis séchées 30min à RT avant d’être fixées dans une solution de paraformaldéhyde 4% dans du PBS pendant 15min à RT, puis lavées 2x5min dans du PBS. Les deux types de lames ont ensuite été traitées selon le même protocole. Les peroxydases endogènes ont été inhibées par une incubation de 30min à RT dans une solution de 0,3% H 2 O 2 dans du PBS puis lavées par un passage 5min à RT dans du PBS. Les tissus ont ensuite été saturés dans une solution de PBS-2,5% de sérum de cheval (HS) pendant 1h à RT puis incubés avec l’anticorps anti-IgA sécrétoire couplé à la HRP (Abcam Ab17921, souris anti-humain à 1:100 dans du PBS-0,25% HS) pendant la nuit à 4°C. Après deux lavages de 5min à RT (Streptavidin and Alexa Fluor™ 555 Tyramide » selon les indications du fournisseur (Invitrogen™ Molecular Probes™). Les noyaux ont été colorés avec du Hoechst 33342 (1µg/mL dans du PBS, 5 min à l'obscurité, Invitrogen). Les lames ont finalement été montées dans une solution « anti-fading » Citifluor AF100 et Citifluor Tris-MWL 4-88 (ratio 1:9, respectivement, Electron Microscopy Sciences) et stockées à +4°C jusqu'à l'observation par microscopie à épifluorescence (Zeiss Imager M2 avec Apotome). Liste des références 1. Airoldi, J.P.; Altrocchi, R.; Meylan, A. Le comportement fouisseur du Campagnol terrestre Arvicola terrestris Scherman Shaw (Mammalia, Rodentia). Rev. 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Composition vaccinale contraceptive selon la revendication 1, comprenant les 11 peptides immunogéniques de séquences SEQ ID NOs : 1-11. Composition vaccinale contraceptive selon la revendication 1, comprenant les 3 peptides immunogéniques de séquences SEQ ID NOs : 1, 8 et 10. Composition vaccinale contraceptive selon l’une quelconque des revendications 1 à 3, comprenant en outre un peptide antigénique de séquence en acides aminés AKFVAAWTLKAAA (SEQ ID NO : 12) en tant qu’activateur de réponse. Composition vaccinale à visée contraceptive selon l’une quelconque des revendications 1 à 4, pour une utilisation comme médicament. Composition vaccinale contraceptive pour une utilisation selon la revendication 5, où ledit médicament est un contraceptif destiné à réguler les populations du campagnol terrestre Arvicola terrestris scherman . Composition vaccinale contraceptive pour une utilisation selon la revendication 5 ou 6, où ledit médicament est sous la forme de comprimés, de granulés, ou de gummies. Peptide immunogénique choisi parmi les peptides de séquences SEQ ID NOs : 1-11.