Brevet FR3156652A1 — publié le 20250620

L’invention concerne un procédé de préparation d’un extrait de feuilles de Ginkgo biloba hautement concentré en proanthocyanidins, et pratiquement dépourvu de flavonoïdes et de trilactones terpéniques. L’invention concerne également l’utilisation de souches fongiques fromagères telles que Penicillium Roquefortii PA et Geotrichum Candidum Geo 15 , pour cataboliser les polymères de proanthocyanidins de haut poids moléculaire en petites molécules afin d’avoir des effets bénéfiques sur la santé Titre PROCÉDÉ DE PRÉPARATION D’UN EXTRAIT DE FEUILLES DE GINKGO BILOBA HAUTEMENT ENRICHI EN PROANTHOCYANIDINS DEPOURVU DE FLAVONOÏDES ET DE TRILACTONES TERPÉNIQUES L’invention concerne un procédé de préparation d’un extrait de feuilles de Ginkgo biloba hautement concentré en proanthocyanidins, pratiquement dépourvu de flavonoïdes et de trilactones terpéniques. L’invention concerne également l’utilisation de souches fongiques fromagères telles que Penicillium Roquefortii PA et/ou Geotrichum Candidum Geo 15 , pour cataboliser les polymères de proanthocyanidins de haut poids moléculaire en petites molécules afin d’avoir des effets bénéfiques sur la santé. L'extrait de feuille de Ginkgo biloba le plus connu, le plus utilisé et le plus étudié est l'EGb 761. Il s’agit d’un extrait standardisé bien défini de feuilles de Ginkgo biloba contenant environ 24 % de glycosides de flavone (quercétine prédorminante, kaempférol et isorhamnétine) et 6 % de trilactones terpéniques (ginkgolides A, B et C, et bilobalide). Il a été créé par le Dr Willmar Schwabe Pharmaceuticals. Le processus d'extraction impliquant plus de 20 étapes opérationnelles est décrit dans le brevet de 1990 de Schwabe EP0431535A1 Les principaux constituants bioactifs trouvés dans EGb761 sont les flavonoïdes et les trilactones terpéniques, d'où la spécification 24/6. Il s’agit de petites molécules d’une masse moléculaire de,par exemple,610 daltons pour la rutine et 440 daltons pour le ginkgolide C. Il existe une autre classe de composés présents dans EGb761 qui ont des masses moléculaires allant de 1 à plusieurs centaines de kilodaltons. Ce sont les proanthocyanidins, également connues sous le nom de tanins condensés. EGb761 contient 7% de proanthocyanidins. (Kulic,Planta Med 2022 ; 88 : 398-404). Les proanthocyanidins ne sont pas directement biodisponibles en raison de leur masse moléculaire élevée, mais elles sont catabolisées par la microflore colique humaine en acides phénoliques de faible masse moléculaire qui sont connus pour leurs propriétés antioxydantes ( De'prez , J. Nutr . 130 : 2733-2738, 2000. et al). Par conséquent, les proanthocyanidins sont un énorme réservoir de molécules antioxydantes. Cependant, les auteurs, De' prez et al. n'a pas identifié les microbes responsables de la dégradation Les proanthocyanidins obtenues par capture sélective et libérées sur Sephadex LH-20 ont été analysées comme contenant environ 4 % d'azote élémentaire. Les analyses par électrophorèse des proanthocyanidins sur des gels SDS-Page et révélées dans une solution de bleu de méthylène ont montré une strie continue entre les marqueurs moléculaires protéiques de 10 kilodaltons à plus de 250 kilodaltons sans bandes discrètes. Prises ensemble, ces deux observations indiquent la présence de peptides liés de manière covalente à l’intérieur du polymère de proanthocyanidins. Donc, le catabolisme de proanthocyanidins par la microflore colique peut également libérer ces petits peptides. L’invention a pour objet un extrait enrichi en proanthocyanidins de Ginkgo biloba ( PEGb ), dépourvu de flavonoïdes et de trilactones terpéniques. L’extrait contient 30 à 70 % de proanthocyanidins, moins de 2 % de flavonoïdes et moins de 0,5 % de trilactones terpéniques. L’extrait contient préférentiellement 45 à 55 % de proanthocyanes, et pratiquement dépourvu de flavonoïdes et de trilactones terpéniques. L'invention a pour objet un procédé de préparation d'un extrait enrichi en proanthocyanidins de Ginkgo biloba ( PEGb ) dépourvu de flavonoïdes et de trilactones terpéniques telles que définies ci-dessus. Cette procédure comprend une extraction en 2 étapes des feuilles de Ginkgo biloba. Dans un premier temps, les feuilles séchées sont extraites de manière exhaustive avec 95% éthanol pour éliminer les chlorophylles, les flavonoïdes et les trilactones terpéniques. Dans la deuxième étape, les feuilles après extraction avec 95% éthanol sont soumises à une deuxième extraction exhaustive avec 50% éthanol ou juste avec de l’eau pour extraire les proanthocyanidins. L’extrait à 50% éthanol ou l’extrait aqueux sont ensuite évaporés à sec pour obtenir l’extrait enrichi en proanthocyanidins de Ginkgo biloba ( PEGb ) . La procédure est illustrée dans les exemples 1 et 2. EGb761 est utilisé pour le traitement des troubles cognitifs légers à modérés, des acouphènes et de la démence. Dans l’étude GuidAge, qui était un essai clinique randomisé en double aveugle de 5 ans de l’EGb 761 pour la prévention de la maladie d’Alzheimer chez les sujets âgés présentant des troubles de la mémoire, aucune conclusion définitive ne peut être tirée quant à l’efficacité du traitement. D’autres essais cliniques à l’appui de son utilisation sont souvent contradictoires, parfois positifs, parfois négatifs. Une explication possible peut être que les patients peuvent ou non avoir les champignons nécessaires dans le myobiote du côlon pour décomposer les proanthocyanidins. Ceux qui en ont bénéficient ; ceux qui n’ont pas, ne peuvent pas en bénéficier. Une recherche sur Google Scholar avec l’expression « Dégradation microbienne des tanins condensés » n’a donné qu’un seul résultat. Une souche de penicillium adametzi Zaleski a été isolée à partir de cultures d’enrichissement avec des tanins condensés comme seule source de carbone. (Grant, Science 193(4258), 1137-1139). De nombreux fromages français sont affiné avec des espèces de Penicillium, comme le Penicillium Roquerfortii dans le fromage Roquefort et le Penicillium Camamberti dans le fromage Camambert. La question est de savoir si ces espèces de Penicillium utilisées dans la raffinage du fromage peuvent également cataboliser les proanthocyanidins du Ginkgo biloba. L'invention a pour objet l'utilisation de la souche PA de Penicillium Roquefortii et/ou Geotrichum Candidum GEO 15 pour décomposer les proanthocyanidins de Ginkgo biloba comme illustré dans l'exemple 3 et FIG. 1 (photo) L'invention a pour objet l'utilisation de l'extrait enrichi en proanthocyanidins de Ginkgo biloba ( PEGb ) en association avec Penicillium Roquefortii PA et/ou Geotrichum Candidum GEO 15 incorporés ensemble dans des pilules ou des comprimés ou séparément avec les champignons lyophilisés en tant que probiotiques et pris ensemble afin d'avoir les effets bénéfiques sur la santé des produits de dégradation des proanthocyanidins L'invention a pour objet l'incorporation de l'extrait enrichi en proanthocyanidins de Ginkgo biloba ( PEGb ) dans la fabrication de fromages utilisant le Penicillium Roquefortii PA ou le Geotrichum Candidum GEO 15 pour l'affinage. Cela peut expliquer en partie les avantages pour la santé d’une alimentation de type méditerranéen caractérisée par la consommation de fromage et de vin. Le vin rouge est également une source de proanthocyanidines qui est différente des proanthocyanidins de Ginkgo et peut nécessiter différents champignons pour sa décomposition. Feuilles de Ginkgo : Le matériel d'extraction a été obtenu à partir de feuilles vertes de Ginkgo biloba, récoltées en août 2022 dans la commune de Gif-sur-Yvette,France, séchées au soleil (3 jours) et réduites en poudre à l'aide d'un moulin à café. Les feuilles séchées de Ginkgo biloba contenaient de 4 à 12 % de proanthocyanidins. (Qa'dan, Biologie pharmaceutique, 49 :5, 471-476) Champignons Fromagères : Voici la liste d’espèces/souches de champignons utilisées dans la l’affinage du fromage ont été achetés auprès Agrodirect.fr Penicillium Camemberti -SAM3 lyophilisé Penicillium Roqueforti PA -10dcu lyophilisé Penicillium Roqueforti PRB18 - 5DCU _suspension Penicillium Album _suspension Penicillium candidum Neige_ lyophilisé Geotrichum Candidum GEO 15 – lyophilisé Ferment ALPD 50 dcu Exemple 1 50 g de feuilles séchées de Ginkgo biloba ont été extraites 4 fois, à chaque fois avec 300 ml 95 % éthanol-eau pendant 1 heure à 50-70°C au bain-marie et filtrées à travers du coton. L’extrait de 95% éthanol-eau a été jeté. Les feuilles extraites, qui sont maintenant dépourvu de chlorophylle et de couleur beige sont ensuite extraites 4 fois de plus, à chaque fois avec 300 ml de 50% éthanol-eau pendant 1 heure à 50-70°C au bain-marie et filtrées à travers un filtre en papier. Les filtrats ont ensuite été évaporés jusqu’à ce qu’ils soient secs. 6,7 g d’extrait de PEGb ont été obtenus, soit un rendement de 13,4 % par rapport aux feuilles de départ. La quantité de proanthocyanidins trouvées dans le PEGb a été estimée à 51 %. Exemple 2 50 g de feuilles séchées de Ginkgo biloba ont été extraites 4 fois, à chaque fois avec 300 ml de 95%’éthanol pendant 1 heure à 50-70°C au bain-marie et filtrées à travers du coton. L’extrait de 95% éthanol a été jeté. Les feuilles extraites qui sont maintenant dépourvu de chlorophylle et de couleur beige sont ensuite extraites 4 fois de plus, à chaque fois avec 300mL de l’eau pendant 1 heure à 50-70°C au bain-marie et filtrées à travers un filtre en papier. Les filtrats aqueux ont ensuite été évaporés jusqu’à ce qu’ils soient secs. 5,7 g d’extrait de PEGb ont été obtenus, soit un rendement de 11,4 % par rapport aux feuilles de départ. La quantité de proanthocyanidins trouvées dans le PEGb a été estimée à 52 %. Exemple 3 50 g de feuilles séchées de Ginkgo biloba ont été extraites 4 fois, à chaque fois avec 300 ml de 95% éthanol pendant 1 heure à 50-70°C au bain-marie et filtrées à travers du coton. L’extrait de 95% éthanol a été jeté. Les feuilles extraites qui sont maintenant dépourvu des chlorophylles et de couleur beige sont ensuite extraites 4 fois de plus, à chaque fois avec 300mL de l’eau pendant 1 heure à 50-70°C au bain-marie et filtrées à travers un filtre en papier. Les filtrats aqueux ont ensuite été concentré à 250 ml pour obtenir une suspension aqueuse jaune pâle légèrement troublée. Des aliquotes de 10 ml de la suspension jaune pâle ont été pipetées dans chacun des huit tubes de culture d’une capacité de 20 ml. Ceux-ci ont ensuite été stérilisés dans un autocuiseur puis refroidis à température ambiante pour être inoculés avec des champignons fromagères, 1 à 2 mg de souches lyophilisées, 1 goutte de celles dans des suspensions liquides. Les tubes de culture nt été étiquetées O, A, B, C, D, E, F et G. La tube O est le témoin sans inoculation et les autres sont les suivantes : Tube O Control (Sans inoculation) Tube A Penicillium Camemberti – SAM 3 – Lyophilisé Tube B Penicillium Roquerforti PA – Lyophilisé Tube C Penicilium Roquerforti PRB18 – Suspension Tube D Penicillium Album – Suspension Tube E Penicillium candidum Neige – Lyophilisé Tube F Geotrichum Candidum GEO 15 – Lyophilisé Tube G Ferment ALDP Après l’inoculation, les tubes ont été vissés pour simuler des conditions anaérobies et laissés dans l’obscurité à température ambiante de 18 à 22°C pendant 3 mois. Les couleurs des tubes après 3 mois sont les suivantes : : (Voir FIG. 1 . Photographie) Tube O Control (Sans inoculation)__________Jaune Pâle Tube A Penicillium Camemberti – SAM 3 ___ Jaune Pâle Tube B Penicillium Roquerforti PA _________________ __Noir Tube C Penicilium Roquerforti PRB18 _______Jaune Pâle Tube D Penicillium Album – Suspension______Jaune Pâle Tube E Penicillium candidum Neige _________Jaune Pâle Tube F Geotrichum Candidum GEO 15 ________________Brun foncé Tube G Ferment ALDP___________________ Jaune Pâle Le tube B qui est devenu noir montre que la souche PA de Penicillium Roquefortii peut se proliférer dans le milieu riche en proanthocyanidins. Le tube C, qui est resté jaune pâle, montre que la souche PRB18 de Penicillium roquefortii n'a pas réussi à proliférer dans le milieu riche en proanthocyanidins. Par conséquent, on voit que non seulement l'espèce de Penicillium roquerfortii est importante, mais aussi la souche. Le tube F, qui est devenu brun foncé, montre que la souche Geotrichum Candidum GEO 15 peut aussi se proliférer dans le milieu riche en proanthocyanidins. Les tubes A, D, E et G qui sont restés jaune pâle montrent que les souches Penicillium Camemberti -SAM3, Penicillium Album, Penicillium candidum Neige et le ferment ALP D contenant les bactéries Lactococcus et Lactobacillus n’ont pas réussi à proliférer dans le milieu riche en proanthocyanidins Un extrait enrichi en proanthocyanidins de feuilles de Ginkgo biloba ( PEGb ) qui est pratiquement dépourvu de flavonoïdes et de trilactones terpéniques. L’extrait contient 30 à 70 % de proanthocyanidins, moins de 2 % de flavonoïdes et moins de 0,5 % de trilactones terpéniques. L’extrait contient préférentiellement 45 à 55 % de proanthocyanidins, et pratiquement dépourvu de flavonoïdes et de trilactones terpéniques. Procédé de préparation d'un extrait tel que défini dans la revendication 1, comprenant une extraction en 2 étapes des feuilles de Ginkgo biloba, une étape 1 d'extraction de plusieurs fois les feuilles de Ginkgo biloba avec 95 % éthanol pour éliminer les chlorophylles, les flavonoïdes et les trilactones terpéniques et l'étape 2, la réextraction exhaustive des feuilles de la première extraction avec 50% éthanol ou de l’eau pour extraire les proanthocyanidins L'utilisation pour la preparation de pilules ou de comprimes de l'extrait enrichi en proanthocyanidins de feuilles de Ginkgo biloba ( PEGb ) tel que défini dans la revendication 1 en association avec Penicillium Roquefortii PA et/ou Geotrichum Candidum GEO 15 incorporé ensemble dans des pilules ou des comprimés ou séparément avec les champignons fromagères lyophilisés en tant que probiotiques et pris ensemble afin d'avoir les effets bénéfiques sur la santé des produits de dégradation des proanthocyanidins L'incorporation de l'extrait enrichi en proanthocyanidins de feuilles de Ginkgo biloba ( PEGb ) tel que défini dans la revendication 1 dans la fabrication de fromages qui utilisent Penicillium Roquefortii PA ou Geotrichum Candidum GEO 15 pour l'affinage.