Brevet FR3161221A1 — publié le 20251017

Procédé de dissociation tissulaire et kit associé L’invention concerne un kit et son procédé (4) de dissociation tissulaire comprenant : une disposition d’un tissu biologique (3) dans un récipient clos (2) comprenant au moins une bille (24), un ajout d’un milieu liquide (22) comprenant au moins une enzyme (23) de dissociation tissulaire apte à être active pour la dissociation du tissu biologique (3) dans le récipient clos (2), au moins un cycle (42) de dissociation tissulaire, dans un appareil d’agitation par bille (1), dans lequel le récipient clos (2) est agité de façon à induire, par l’au moins une bille (24), un effet de cisaillement dans le volume du milieu liquide (22), de façon à obtenir une suspension (33) de cellules comprenant au moins 20 % de cellules viables et dissociées (31) du tissu biologique (3). Figure pour l’abrégé : Fig. 3B Procédé de dissociation tissulaire et kit associé La présente invention concerne le domaine de la dissociation tissulaire. Elle trouve pour application particulièrement avantageuse en recherche biopharmaceutique, les domaines de la thérapie cellulaire, médecine régénérative, développement des biomédicaments, élucidation de pathologies et ingénierie tissulaire. ETAT DE LA TECHNIQUE La dissociation tissulaire a pour objectif l’isolement des cellules primaires pour des nombreuses applications dans le domaine biomédical et thérapeutique. Pour accéder à des suspensions de cellules individuelles vivantes, les tissus sont traités d’une façon assez douce pour réussir à dissocier les cellules en préservant leur viabilité (capacité à être cultivées et préservation de leur activité physiologique). Une dissociation tissulaire efficace permet par exemple de caractériser la composition cellulaire pour les tissus hétérogènes et d’étudier le comportement de populations cellulaires individuelles dans les tissus sains et/ou malades. Cette étape de préparation (passage du tissu aux cellules isolées) peut être utilisée pour le diagnostic de maladies à partir du séquençage des cellules uniques, ainsi que pour l’étude de la prédiction de la réponse à la thérapie et la sélection d’un traitement. Il existe trois types de méthodes principales pour la dissociation des tissu, qui peuvent être combinées. Celles-ci incluent : la dissociation enzymatique, la dissociation chimique et la dissociation mécanique. La dissociation enzymatique est le processus d'utilisation d'enzymes de dissociation tissulaire configurées pour digérer des morceaux de tissu découpés, libérant ainsi les cellules du tissu. De nombreux types d'enzymes différents sont utilisés dans ce processus et ils peuvent également être utilisés en combinaison (Trypsine, Collagénase, etc.). Certaines enzymes sont plus efficaces avec certains tissus, il est donc préférable d’identifier l’enzyme ou combinaison d'enzymes pour chaque type de tissu spécifique. La dissociation chimique fonctionne sur le principe que les cations participent au maintien des liaisons inter cellulaires et de la matrice intracellulaire. En introduisant de l'EDTA ou de l'EGTA, qui lie ces cations, les liaisons intercellulaires sont rompues. Enfin, la dissociation mécanique permet de découper le tissu en petits morceaux et, couplé avec une agitation douce, complète la désagrégation tissulaire. La sélection d'une méthode de dissociation peut se faire en fonction du type de tissu, de l'origine du tissu et des méthodes qui se sont révélées les plus efficaces dans la littérature. L'objectif de la plupart des processus de dissociation tissulaire est d'obtenir la majeure quantité de cellules et les cellules les plus viables possibles, afin que le procédé ou système de dissociation n'ait pas un impact négatif sur la viabilité et/ou la fonction cellulaire. Le choix de la bonne méthode ou combinaison de méthodes reste complexe. De nombreux avis contradictoires existent dans la littérature scientifique. Il existe donc un besoin pour un protocole normalisé pour la dissociation des tissus, par exemple selon le type tissulaire. Il est connu un procédé de dissociation tissulaire basé sur la séparation des cellules par un système de rotation à l’intérieur d’un récipient clos. Les tubes plastiques qui contiennent l’échantillon comprennent un ensemble rotor qui, entrainé par le moteur de la machine, tourne et participe à la disruption du tissu en comprimant le tissu contre des protubérances disposées sur un stator. Par lamination selon un plan de cisaillement entre le rotor et le stator, le tissu est désintégré ce qui permet la récupération des cellules vivantes. Depuis plusieurs années, la technique automatisée qui fait référence est le système GentleMACS™ de la société Miltenyi Biotec™, par exemple décrit dans le document EP2540394 A1. Du fait de ce procédé de lamination, cette solution peut toutefois induire un échauffement important dans le plan de cisaillement entre le rotor et le stator. En outre, ce procédé nécessite l’acquisition d’un équipement spécifique à l’application de dissociation tissulaire. Un objet de la présente invention est donc de proposer une solution de dissociation tissulaire améliorée par rapport aux solutions existantes, et notamment permettant de palier au moins l’un des inconvénients précités. Les autres objets, caractéristiques et avantages de la présente invention apparaîtront à l'examen de la description suivante et des dessins d'accompagnement. Il est entendu que d'autres avantages peuvent être incorporés. RESUME Pour atteindre cet objectif, selon un premier aspect on prévoit un procédé de dissociation tissulaire comprenant : une disposition d’un tissu biologique dans un récipient clos comprenant au moins une bille, un ajout d’un milieu liquide comprenant au moins une enzyme de dissociation tissulaire apte à être active pour la dissociation du tissu biologique dans le récipient clos, au moins un cycle de dissociation tissulaire, dans un appareil d’agitation par bille, dans lequel le récipient clos est agité de façon à induire, par l’au moins une bille, un effet de cisaillement dans le volume du milieu liquide, de façon à obtenir une suspension de cellules comprenant au moins 20 %, et de préférence au moins 50 %, de cellules viables et dissociées du tissu biologique. Ainsi, le procédé utilise un appareil d’agitation par bille (s) ou de façon équivalente d’homogénéisation par bille(s), aussi désigné par le nom broyeur à bille(s), conventionnellement utilisé pour la préparation d’échantillons chimiques ou biologiques par broyage et destruction des cellules. L’appareil utilisé n’est ainsi pas dédié et optimisé spécifiquement pour la dissociation tissulaire, a contrario des solutions existantes. Cela évite par conséquent un investissement additionnel considérable pour les laboratoires et sociétés souhaitant faire de la dissociation tissulaire. L’invention permet d’utiliser un seul appareil pour faire à la fois du broyage/homogénéisation de tissus biologiques et de la dissociation tissulaire, en préservant la performance attendue avec les instruments de référence. De manière générale, les homogénéisateurs qui utilisent le principe de broyage par bille (aussi connu sous le terme anglais de bead-beating) pour broyer des échantillons biologiques sont utilisés de façon trop puissante pour pouvoir dissocier des cellules vivantes. Contrairement aux équipements de dissociation tissulaire conventionnels, les homogénéisateurs par bille ont été conçus pour générer une force de choc des billes sur les échantillons suffisamment puissante pour fragmenter les cellules et isoler le contenu intracellulaire. L’utilisation d’un homogénéisateur par bille pour faire de la dissociation tissulaire est donc parfaitement contre-intuitif. Ici, l’appareil d’agitation par bille est utilisé selon un principe de cisaillement par bille (pouvant être aussi désigné en anglais par le terme de bead-shearing). Faire de la dissociation tissulaire avec un agitateur à bille ou de façon équivalente homogénéisateur à bille est un défi technique qui a notamment pour avantages par rapport aux techniques conventionnelles : un gain de temps lié à la parallélisation, une reproductibilité améliorée car le procédé est plus homogène, une rapidité d’exécution car le procédé peut être plus efficace grâce au travail en volume (et donc une surface « apparente » potentiellement plus grande). Par ailleurs, par rapport aux solutions de dissociation tissulaire conventionnelles, la dissociation est ici faite dans le volume (et donc en trois dimensions) du milieu liquide du récipient clos, par le cisaillement en volume induit par le mouvement de la ou des bille(s). La dissociation résulte donc d’un procédé aléatoire et homogène dans le volume du milieu liquide. Ceci se distingue donc d’une dissociation en deux dimensions par phénomène de lamination, dans un plan de lamination entre un rotor et un stator. Une dissociation tissulaire par un cisaillement en volume permet d’avoir un milieu plus homogène facilitant la dispersion de chaleur créée localement par les forces de cisaillement. Par ailleurs, la durée de l’agitation mécanique et le niveau de stress provoqué sur les cellules sont ainsi réduits. La quantité de débris dans la suspension de cellules obtenues peut en outre être réduite. Un autre aspect concerne un kit de dissociation tissulaire pour la mise en œuvre du procédé selon l’une quelconque des revendications précédentes, comprenant : le récipient clos comprenant l’au moins une bille, l’au moins une enzyme de dissociation tissulaire. BREVE DESCRIPTION DES FIGURES Les buts, objets, ainsi que les caractéristiques et avantages de l’invention ressortiront mieux de la description détaillée d’un mode de réalisation de cette dernière qui est illustré par les dessins d’accompagnement suivants dans lesquels : FIG. 1 La FIG. 1 représente une vue schématique d’ensemble d’un homogénéisateur à bille selon un exemple de réalisation. FIG. 2 La FIG. 2 représente un récipient clos comprenant des billes, le tissu biologique et le milieu liquide comprenant une enzyme de dissociation cellulaire, selon un exemple de réalisation. FIG. 3 FIG. 3 Les figures 3A et 3B illustrent schématiquement le procédé de dissociation tissulaire, selon un exemple de réalisation. FIG. 4 FIG. 4 Les figures 4A et 4B représentent des schémas de principe respectivement pour : un exemple dans lequel le premier seuil de dissociation et le deuxième seuil de mortalité cellulaire délimitent une fenêtre de dissociation, et un exemple dans lequel le premier seuil de dissociation et le deuxième seuil de mortalité cellulaire sont tels que la fenêtre de dissociation n’existe pas. FIG. 5 FIG. 5 Les figures 5A et 5B représentent des schémas de principe illustrant les effets de cisaillement dans un cas de bead-shearing. FIG. 6 FIG. 6 Les figures 6A et 6B représentent des schémas de principe illustrant les effets de cisaillement dans un cas de bead-beating. FIG. 7 La FIG. 7 illustre le kit de dissociation selon un exemple de réalisation. Les dessins sont donnés à titre d'exemples et ne sont pas limitatifs de l’invention. Ils constituent des représentations schématiques de principe destinées à faciliter la compréhension de l’invention et ne sont pas nécessairement à l'échelle des applications pratiques. En particulier les dimensions relatives des éléments illustrés, et en particulier des cellules, des billes et du récipient ne sont pas représentatives de la réalité. DESCRIPTION DÉTAILLÉE Avant d’entamer une revue détaillée de modes de réalisation de l’invention, sont énoncées ci-après des caractéristiques optionnelles qui peuvent éventuellement être utilisées en association ou alternativement. Selon un exemple, durant l’au moins un cycle de dissociation tissulaire, le récipient clos est agité selon des paramètres d’agitation configurés pour se situer dans une fenêtre de dissociation, ladite fenêtre étant délimitée par un premier seuil de dissociation du tissu biologique en cellules dissociées, les paramètres d’agitation étant insuffisants en deçà du premier seuil pour induire une dissociation tissulaire, et par un deuxième seuil dit de mort cellulaire, les paramètres d’agitation étant trop intenses au-delà du deuxième seuil et résultant en une viabilité cellulaire inférieure à 50 % des cellules dissociées. Ainsi, les paramètres d’utilisation de l’homogénéisateur par bille sont choisis de façon à limiter la destruction cellulaire en définissant une plage de fonctionnement permettant l’obtention de la suspension de cellules comprenant au moins 50 % de cellules viables dissociées du tissu biologique. Plus particulièrement, la fréquence d’agitation, la vitesse d’agitation, et le cas échéant la durée d’agitation peuvent être choisis de façon à se placer dans la fenêtre de dissociation. Selon un exemple, durant l’au moins un cycle de dissociation tissulaire, le récipient clos est agité selon : une fréquence d’agitation F comprise entre 4 Hz et 45 Hz, de préférence entre 20 et 42 Hz, et une vitesse moyenne d’agitation v comprise entre 0,2 m/s et 2,5 m/s. Le récipient est ainsi agité selon un mouvement répété et avec une vitesse moyenne optimisant la dissociation tissulaire et la viabilité des cellules dans la fenêtre de dissociation. En deçà, la dissociation des cellules du tissu sera moins satisfaisante, et au-delà le risque d’une mortalité cellulaire importante est accru. Selon un exemple, pour chaque cycle de dissociation tissulaire, le récipient clos est agité sur une durée t 1 comprise entre 3 et 30 secondes , de préférence entre 5 et 10 secondes. Cette gamme de temps d’agitation permet d’optimiser la dissociation tissulaire et la viabilité des cellules dans la fenêtre de dissociation, et ce notamment en synergie avec la fréquence d’agitation et la vitesse moyenne ci-dessus. Selon un exemple, l’au moins une bille occupe une proportion volumique comprise entre 0,1 % et 10 % du volume du récipient clos. Cette proportion volumique permet de minimiser les probabilités de choc important entre bille(s) et paroi du récipient, tout en générant une force de cisaillement suffisante pour permettre la dissociation cellulaire. Selon un exemple, le récipient comprend entre 1 bille et 15 billes. Selon un exemple, l’au moins une bille présente une masse volumique comprise entre 0,5 g/cm 3 et 8 g/cm 3 . Cette gamme de masse volumique permet une mise en mouvement dans le fluide appropriée pour générer une force de cisaillement suffisante pour la dissociation cellulaire. Selon un exemple, l’au moins une bille est à base ou faite d’un matériau choisi parmi le groupe constitué de latex, verre, céramique, métal, et acier inoxydable. Ces matériaux sont particulièrement adaptés pour être au contact en solution avec la matière biologique. Selon un exemple, l’au moins une bille présente au moins une dimension, par exemple un diamètre, compris entre 0,1 mm et 5 mm, de préférence entre 1 mm et 5 mm, et plus préférentiellement encore entre 2 et 5 mm. La taille des billes impacte leur mise en mouvement dans le milieu liquide lors de l’agitation, et notamment leur vitesse de déplacement et les impacts résultant. Selon un exemple, le récipient clos présente un volume compris entre 2 et 50 mL, de préférence entre 2 mL et 15 mL. Le volume du tube impacte ses dimensions, et donc les collisions bille(s)-paroi du récipient pouvant avoir lieu. Ces volumes sont avantageux pour optimiser la dissociation tissulaire et la viabilité des cellules, tout en étant compatible avec les volumes de récipient communément employés dans les homogénéisateurs à bille. Selon un exemple, le milieu liquide occupe une fraction volumique du récipient clos comprise entre 0,3 et 0,7. La proportion de milieu liquide dans le récipient a un effet sur l’efficacité de dissociation. Moins de liquide favorise l’homogénéisation. Selon un exemple, durant l’au moins un cycle de dissociation tissulaire, le récipient clos est agité selon un mouvement de précession. Le récipient contenant le tissu biologique, typiquement sur un plateau support dans l’homogénéisateur, est ainsi agité selon un mouvement autour d’un axe central, l’axe décrivant un cône lors de ce mouvement. Un mouvement de précession induit un débattement du ou des récipients selon une direction perpendiculaire à ce mouvement. Certains homogénéisateurs à bille mettent en œuvre un mouvement oscillant de translation ou de rotation pour entrainer les récipients ou tubes contenant l’échantillon. Le mouvement de précession offre un avantage sur la direction de déplacement de la ou des billes. Leur mouvement peut être plus aléatoire dans le volume et non pas simplement unidirectionnel comme sur les autres homogénéisateurs. Selon un exemple, le procédé comprend, préalablement à chaque cycle de dissociation tissulaire, une incubation du tissu biologique en présence de l’au moins une enzyme de dissociation tissulaire, de préférence dans le récipient clos. L’action de l’enzyme, préalablement à l’action mécanique de la ou des bille(s), est ainsi favorisée. Cela facilite la dissociation tissulaire en synergie entre une action enzymatique et une action mécanique. Selon un exemple, le procédé comprend plusieurs cycles de dissociation tissulaire , ces cycles étant de préférence séparés par des phases de non-agitation. Cela permet de distribuer temporellement l’action mécanique sur l’échantillon. Cela favorise la dissipation thermique des échauffements locaux induits par les collisions entre bille(s) et paroi du récipient. La viabilité cellulaire est donc favorisée. Cela permet en outre de faciliter une action enzymatique sur le tissu biologique, en laissant agir l’au moins une enzyme entre plusieurs phases d’action mécanique, et donc entre plusieurs étapes de dégradation du tissu biologique. Selon un exemple le procédé comprend en outre, préalablement à l’ajout d’au moins une enzyme de dissociation tissulaire dans le récipient clos, une sélection de l’au moins une enzyme de dissociation tissulaire parmi une pluralité d’enzymes de dissociation tissulaire distinctes, et le cas échéant la préparation d’un mélange enzymatique à partir des enzymes de dissociation tissulaire sélectionnées. Selon un exemple, le kit comprend plusieurs enzymes de dissociation tissulaires différentes, de façon à pouvoir sélectionner l’au moins une enzyme de dissociation tissulaire à ajouter dans le procédé de dissociation tissulaire. La sélection de l’enzyme ou du mélange d’enzyme permet d’adapter le procédé au tissu biologique à dissocier. Le procédé et le kit peuvent ainsi être applicables à un grand nombre de tissus biologiques différents. Selon un exemple, l’au moins une enzyme de dissociation tissulaire est choisie parmi le groupe constitué de dispase, collagenase, DNase, trypsine, papaïne, hyaluronidase, élastase. Selon un exemple, le kit comprend l’appareil d’agitation ou de façon équivalente d’homogénéisation par bille. Dans la suite de la description, le terme « sur » ne signifie pas nécessairement « directement sur ». Ainsi, lorsque l’on indique qu’une pièce ou qu’un organe A est en appui « sur » une pièce ou un organe B, cela ne signifie pas que les pièces ou organes A et B soient nécessairement en contact direct avec l’autre. Ces pièces ou organes A et B peuvent être soit en contact direct soit être en appui l’une sur l’autre par l’intermédiaire d’une ou plusieurs autres pièces. Il en est de même pour d’autres expressions telles que par exemple l’expression « A agit sur B » qui peut signifier « A agit directement sur B » ou « A agit sur B par l’intermédiaire d’une ou plusieurs autres pièces». Aux fins de la présente divulgation, l'expression "A et/ou B" signifie (A), (B), ou (A et B). Aux fins de la présente divulgation, l'expression "A, B et/ou C" signifie (A), (B), (C), (A et B), (A et C), (B et C), ou (A et B et C). On entend par un paramètre « sensiblement égal/supérieur/inférieur à » une valeur donnée, que ce paramètre est égal/supérieur/inférieur à la valeur donnée, à plus ou moins 10 %, près de cette valeur. On entend par un paramètre « sensiblement compris entre » deux valeurs données que ce paramètre est au minimum égal à la plus petite valeur donnée, à plus ou moins 10 %, près de cette valeur, et au maximum égal à la plus grande valeur donnée, à plus ou moins 10 %, près de cette valeur. Le procédé 4 de dissociation tissulaire et le kit 5 associé sont maintenant décrits selon des exemples particuliers de réalisation. Le terme « broyeur » d’échantillons, ou de façon équivalente « homogénéisateur » ou encore « dispositif d’agitation », désigne au sens large tout type de dispositif translationnel, rotatif ou de précession qui traite des échantillons, y compris non seulement les broyeurs de type secoueur à haute puissance comme décrit dans le présent document, mais également d'autres équipements de laboratoire tels que les vortex, les secoueurs et les agitateurs. Comme illustré par la FIG. 1 à titre d’exemple, l’homogénéisateur 1 comprend de façon tout à fait classique un dispositif conçu pour porter un ou plusieurs récipient(s) clos 2, ou de façon équivalente un ou plusieurs tube(s) 2, contenant des échantillons. Les tubes 2 sont généralement disposés sur un support de maintien 10 entraîné en rotation, et plus particulièrement en précession, par un arbre 11 lui -même en rotation. Le support 10 est monté sur l’homogénéisateur 1 via l’arbre 11 lui-même monté sur un bâti 13. Le dispositif 1 et les tubes 2 peuvent être disposés sous un capot 12 pivotant entre une position ouverte et une position fermée. Lors du mouvement de précession, le support 10 est entrainé en rotation, et plus particulièrement en précession, autour d’un axe central A, l’axe décrivant un cône d’angle α lors de ce mouvement, induisant un débattement des tubes selon une direction perpendiculaire à ce mouvement. Les échantillons sont ainsi soumis à un mouvement de précession. Dans le procédé 4 de dissociation tissulaire, et comme illustré par exemple par la FIG. 2 , un tissu biologique 3 est disposé dans un milieu liquide 22 dans un tube 2. Le tube 2 est clos, et donc le tube 2 est étanche aux fluides. Le tube 2 est de préférence stérile. Le tube 2 peut comprendre une portion inférieure 20 présentant une ou plusieurs parois, et fermé par un bouchon 21. Le tube 2 comprend au moins une bille 24 configurée pour exercer des forces de cisaillement dans le milieu liquide 22, pour induire la dissociation tissulaire. Dans la suite, on considère à titre non limitatif que le tube 2 contient plusieurs billes 24. Notons que sauf incompatibilité, les caractéristiques suivantes peuvent s’appliquer à l’exemple selon lequel le tube comprend une unique bille 24. Comme illustré par exemple par les figures 3A et 3B, une dissociation tissulaire efficace permet d’obtenir une suspension 33 de cellules 31 viables et fonctionnelles. De façon tout à fait classique, le tissu biologique 3 comprend des cellules 30 non dissociées entourées d’une matrice extracellulaire. Le tissu biologique 3 peut comprendre des cellules 30 de types variés, selon la nature du tissu biologique 3. Une dissociation tissulaire efficace correspond à : une concentration de cellules dissociées suffisante ; en-deçà la dissociation est partielle et insuffisante. Par exemple, une concentration suffisante peut être sensiblement supérieure ou égale à la valeur seuil permettant l’efficacité de l’analyse, selon l’application donnée. Cette valeur seuil peut être comprise entre 10 4 et 10 6 cellules par mL, un pourcentage de cellules dissociées vivantes suffisant : au-delà on considère que le tissu est homogénéisé (ou broyé de façon équivalente). Par exemple, un pourcentage de viabilité peut être sensiblement supérieur ou égal au seuil nécessaire pour garantir l’efficacité de l’analyse, selon l’application donnée. Ce seuil est de préférence supérieur ou égal à 50 % des cellules dissociées du tissu 3 (ce pourcentage ne comptant donc pas les éventuelles cellules 30 restant dans le tissu 3 à l’issue de la dissociation). Il s’agit donc, en synergie entre des billes 24 à l’intérieur du tube 2 et le mouvement d’agitation, et de préférence de précession, de générer un cisaillement fluide, avec un gradient de vitesse élevé mais pas trop, pour créer une suspension 33 de cellules viables et fonctionnelles 31 via bead-shearing et non bead-beating. Si les conditions d’agitation sont trop douces, alors la quantité de cellules dissociées 31 est trop faible, la suspension cellulaire 34 n’est alors pas adéquate. Si les conditions d’agitation sont trop fortes, alors la quantité de cellules dissociées 31 est importante, mais la mortalité trop élevée avec un nombre trop importantes de cellules lysées 32. La suspension cellulaire 35 n’est alors pas non plus adéquate. Pour cela, et comme illustré par exemple en FIG. 3 , le procédé 4 comprend l’ajout du tissu biologique 3 à dissocier dans le tube 2 comprenant les billes 24. Un milieu 22 liquide est ajouté, comprenant un ou plusieurs enzymes 23 de dissociation tissulaire. Dans le procédé 4, une action mécanique par les billes 24 est ainsi associée à une action enzymatique grâce à l’ajout d’une ou plusieurs enzymes 23 dans le milieu liquide. La viabilité cellulaire dépend également du milieu liquide 22 où elles se trouvent. Le milieu liquide 22 est donc à base ou fait d’un milieu de culture cellulaire. La ou les enzymes appropriées et un milieu de culture 22 sont de préférence utilisés pour faciliter la dissociation et préserver l’intégrité de cellules 31. Le milieu de culture approprié pour une tissu donné peut être identifié sans difficulté par l’homme du métier, par exemple à partir de la littérature ou de protocoles préétablis. Les enzymes de dissociation peuvent comprendre des enzymes configurées pour faciliter la dissociation des cellules 30 de la matrice extracellulaire. Ces enzymes peuvent comprendre des protéases, des collagénases, des dispases, des DNases, des trypsines, papaïnes, hyaluronidases et élastases. Ces enzymes peuvent être adaptées au type de tissu biologique 3. Pour cela, le procédé 4 peut comprendre une étape de sélection 40 de la ou du mélange d’enzymes à utiliser, en fonction du tissu biologique 3. Les enzymes 23 peuvent être ajoutées au milieu liquide 22 préalablement au tissu biologique 3 ou suite à son ajout dans le milieu liquide 22. Pour cela et comme illustré en FIG. 7 par exemple, le kit 5 peut comprendre le tube 2 comprenant les billes 24, et plusieurs enzymes 23. Le kit 5 peut ainsi être adapté à de nombreux tissus 3. Préalablement à au moins un et de préférence à chaque cycle de dissociation tissulaire 42, le procédé 4 peut comprendre une incubation 41 du tube 2 pour favoriser l’action enzymatique. Pour cela, le tube 2 peut être placé dans un incubateur à une température T définie (par exemple sensiblement égale à 37 °C) pendant une durée t 2 . La température T et la durée t 2 peuvent être adaptées en fonction du tissu biologique 3. Lors d’un cycle de dissociation tissulaire 42, le tube 2 est agité, de préférence selon un mouvement de précession, pendant une durée t 1 , à une fréquence d’agitation F et une vitesse moyenne v d’agitation. Le procédé 4 peut comprendre plusieurs cycles de dissociation tissulaire 42, de préférence séparés temporellement par des phases 43 de non-agitation. Par non-agitation, on entend que le tube 2 n’est pas agité dans l’homogénéisateur à bille 1. Une autre forme d’agitation, par exemple manuelle, est possible dans ces phases 43. De façon équivalente, on peut dire que les cycles de dissociation 42 successifs sont temporellement séparés. Des cycles de dissociation 42 successifs peuvent être séparés par des incubations 41, comme illustré à titre non -limitatif. Le procédé 4 peut ensuite comprendre une étape 44 ou un ensemble d’étapes 44 permettant la récupération et/ou l’analyse de la suspension cellulaire obtenue. Par exemple, les billes 24 peuvent être retirées de la suspension cellulaire 33 par une filtration. Cette étape de filtration initiale permettra en outre l’élimination de gros morceaux de tissus résiduels (non dissociés). Le procédé 4 peut en outre comprendre, et de préférence suite à la filtration, des étapes de centrifugation et/ou de rinçage pour récupérer des cellules isolées et vivantes 31. Le procédé peut comprendre en outre une évaluation de la viabilité cellulaire, par exemple par un comptage de cellules isolées et vivantes 31 par rapport au nombre de cellules mortes 32. Toute méthode d’évaluation de la viabilité cellulaire peut être envisagée, par exemple la méthode au bleu Trypan ou encore par cytométrie de flux. Les paramètres du procédé 4 peuvent être définis pour permettre une dissociation tissulaire efficace, et donc une suspension de cellules viables et fonctionnelles. La définition et l’optimisation d’un ensemble de paramètres (et par exemple composition, taille et quantité de billes, volume de tube, composition de la solution enzymatique et les programmes d’agitation – vitesse, fréquence et durée) peuvent permettre d’optimiser la dissociation tissulaire et la viabilité cellulaire. La dissociation tissulaire peut être régie par un ensemble de paramètres d’agitation et paramètres géométriques définissant une fenêtre de dissociation 422, permettant d’obtenir une suspension cellulaire 33 adéquate pour l’application visée. Comme illustré par exemple par la FIG. 4 , la fenêtre de dissociation 422 peut être d’une part délimitée par un premier seuil 420 de dissociation, en dessous duquel le tissu n’est pas dissocié 36 ou bien le nombre de cellules dissociées en suspension 34 n’est pas suffisant, comme décrit précédemment. La fenêtre de dissociation 422 peut être d’autre part délimitée par un deuxième seuil 421 de mortalité cellulaire, en dessus duquel une mortalité trop importante des cellules 32 est obtenues, dans une suspension 35 : il y a alors homogénéisation. Des paramètres d’agitation et paramètres géométriques inappropriés peuvent donner lieu à une situation où la dissociation est insuffisante alors que le pourcentage de cellules vivantes est déjà en-deçà du deuxième seuil 421, comme illustré par exemple en FIG. 4 . Il n’y a alors pas de dissociation tissulaire. Avant de détailler des exemples de paramètres plus spécifiques, les phénomènes en solutions de part et d’autre du deuxième seuil 421 sont décrits à titre d’exemple, en référence aux figures 5A à 6B, pour mieux illustrer la différence entre un régime de dissociation par bead-shearing et un régime d’homogénéisation par bead-beating. Comme illustré par les figures 5A et 5B, l’agitation du tube 2 induit un mouvement des billes 24 dans le milieu liquide 22 qui à son tour crée une force de cisaillement fluide dans le milieu 22. La force de cisaillement fluide F cis peut être : avec : δ la distance entre billes, µ 1 la viscosité du milieu liquide 22 v b la vitesse de la bille pouvant être donnée par la relation suivante sur la force de trainée : avec : m b la masse de la bille, ρ f : masse volumique du fluide, S b la section de la bille, C x le coefficient de trainée de la bille. Lorsque la vitesse des billes 24 dépasse un certain seuil, cette force excède la résistance au cisaillement de la liaison entre cellule 30 et matrice extracellulaire dans le tissu 3, la cellule 30 se dissocie alors du tissu cellulaire 3. Ce seuil 420 est la limite de première dissociation, pouvant être déterminée au premier ordre par les paramètres d’agitation (et notamment fréquence d’agitation, vitesse et durée), ainsi que les caractéristiques de l’échantillon biologique et du cocktail enzymatique, au second ordre par les caractéristiques du tube 2, du milieu liquide 22 et des billes 24. A partir de ce seuil l’efficacité de dissociation peut être définie par un taux de dissociation par cycle. Une augmentation de la fréquence d’agitation et/ou de la durée d’agitation et/ou de la vitesse d’agitation augmente la concentration de cellules dissociées 31. Le taux de dissociation peut plus particulièrement être déterminé au premier ordre par les caractéristiques du tube 2, du milieu liquide 22 et des billes 24, au second ordre par la vitesse d’agitation. En régime d’homogénéisation, l’agitation du tube 2 et le mouvement des billes 24 dans le milieu liquide 22 en découlant induisent également des collisions entre billes 24 et tissu biologique 3, comme l’illustre par exemple la FIG. 6 . La force d’un impact mécanique F col se produisant sur un temps dt peut être : Lorsque la vitesse des billes 24 dépasse un certain seuil, la force de ces collisions excède la résistance à la rupture de la cellule 30 ou 31, la cellule est alors détruite 32. La force de cisaillement décrite plus haut peut également excéder cette résistance si la distance entre billes est suffisamment faible, conduisant à un effet similaire, comme l’illustre par exemple la FIG. 6 . Ce seuil 421 est la limite de mortalité cellulaire. Ce seuil peut être déterminé au premier ordre par la vitesse d’agitation et les caractéristiques de l’échantillon biologique, au second ordre par les caractéristiques du tube 2, du milieu liquide 22 et des billes 24. A partir de ce seuil 421, l’efficacité d’homogénéisation peut être définie par un taux d’homogénéisation par cycle. Une augmentation de la fréquence d’agitation et/ou de la vitesse d’agitation et/ou de la durée d’agitation réduit encore le pourcentage de cellules vivantes. Le taux d’homogénéisation peut plus particulièrement être déterminé au premier ordre par les caractéristiques du tube 2, du milieu liquide 22 et des billes 24, au second ordre par la vitesse d’agitation. L’agitation du tube 2 et le mouvement des billes 24 dans le milieu liquide 22 en découlant induisent également des collisions entre billes 24 et bille et paroi du tube 2. Ces collisions libèrent de l’énergie qui augmente la température du milieu liquide 22. La température du milieu liquide 22 peut augmenter avec les fréquence, vitesse et durée d’agitation et peut être dépendante des caractéristiques du tube 2, du milieu liquide 22 et des billes 24. Lorsque la température dépasse un certain seuil les cellules peuvent se dégrader et mourir. Ce seuil est principalement déterminé par les caractéristiques de l’échantillon biologique. Une augmentation de la durée d’agitation et/ou de la température du milieu 22 peuvent donc réduire le pourcentage de cellules vivantes et dissociées 31. De ce qui précède et de par les équations usuelles de mécanique des fluides, les paramètres suivants peuvent optimiser la dissociation tissulaire et la viabilité cellulaire. Ces paramètres sont regroupés sous forme de tableau et peuvent être utilisés séparément ou en combinaison tout ou partie les uns des autres. Type de paramètre Grandeur Désignation Unité Limite inférieure Limite supérieure Récipient Diamètre (D2) D t mm 5 25 Hauteur (H2) H t mm 30 50 Volume V t mL 2 15 Fluide Volume V f mL 1 10 Viscosité dynamique µ f (correspondant à µ 1 précédemment) mPa.s 0,25 1,5 Masse volumique ρ f g/cm 3 0,9 1,1 Bille(s) Proportion volumique dans le tube 2 p b % 0,1 10 Masse volumique ρ b g/cm 3 0,5 8 Diamètre (D1) D b mm 1 7, de préférence 5 Nombre N b - 1 15 Section S b mm² 0,5 20 Masse m b mg 1 600 Type de paramètre Grandeur Désignation Unité Limite inférieure Limite supérieure Homogénéisateur Fréquence d’agitation F Hz 4,0 45, de préférence 42 Vitesse d’agitation v m/s 0,2 2,5 Durée t 1 s 3 30 La fréquence d’agitation est définie comme le nombre de mouvements par seconde, le mouvement pouvant être une rotation, une translation, une précession, une combinaison de ces mouvements ou tout autre mouvement se répétant de façon cyclique. Elle est ici indiquée en Hz pour correspondre de façon générique à différents types d’homogénéisateur à bille. Selon un exemple, la fréquence d’agitation est comprise entre 1000 rpm et 5500 rpm (rotations par minute). La vitesse d’agitation, ou encore vitesse moyenne d’agitation, est définie comme la vitesse moyenne du tube 2 lors de son mouvement. Le mouvement étant cyclique, il se peut qu’il soit accéléré et décéléré de façon cyclique et donc que sa vitesse instantanée ne soit pas comprise dans la gamme décrite. C’est pour cela qu’on utilise une vitesse moyenne, prise sur la totalité du cycle du mouvement. La durée d’agitation considérée correspond à la durée sur l’ensemble des mouvements du tube, dans un cycle 42 de dissociation tissulaire. Ces paramètres peuvent, de façon tout à fait avantageuse, être utilisés en combinaison ensemble pour optimiser la dissociation tissulaire et la viabilité tissulaire pour un grand nombre de tissus biologiques 3 différents. Des exemples particuliers de dissociation tissulaire sont maintenant décrits. Dans les exemples qui suivent, suite au procédé de dissociation tissulaire, une filtration sur filtre de porosité 70 µm a été effectuée. Le filtre a ensuite été lavé au DMEM/F-12, HEPES à température ambiante. Le filtrat et la solution de lavage du filtre est ensuite centrifugé et resuspendu en DMEM/F-12, HEPES + 2% SVF. Du bleu Trypan est ensuite ajouté pour compter les cellules vivantes et dissociée 31 et les cellules mortes 32. La viabilité cellulaire est en outre analysée par cytométrie de flux. Identification de paramètres de billes Les premiers tests ci-dessous ont été réalisés sur des vers pinkies entiers. Les premiers tests ont permis d’identifier, sur la base d’une appréciation visuelle qualitative, quatre combinaisons des billes les plus prometteuses pour conserver un pourcentage relatif élevé de cellules vivantes. Les billes CK28 (3 ou 7 billes d’oxyde de zirconium de 2,8 mm diamètre) dans 2.5 mL de PBS et un protocole de 1,4 m/s à 24,9 Hz x 10 secondes, Les billes CK50 (1 ou 3 billes d’oxyde de zirconium de 5,0 mm diamètre) dans 2.5 mL de PBS et un protocole de 1,4 m/s à 24,9 Hz x 5 secondes. Ces combinaisons ont montré une quantité considérable de cellules vivantes et avec peu de débris, particulièrement les billes CK50. Pour les billes CK28, les tests avec une quantité de billes supérieure à 15 ont montré un taux de mortalité de plus de 90%. Les billes CK14 (oxyde de zirconium de 1,4 mm de diamètre) n’ont pas réussi à broyer l’échantillon. Nous considérons qu’un cycle d’homogénéisation plus long entrainerait une augmentation dans le taux de mortalité des cellules. Ce type de billes est donc écarté pour la suite des tests. Test 1 Billes CK 28 avec 5 mL de PBS Nombre de billes Masse de l’échantillon (mg) qualité du broyat pour une durée d’agitation 3 secondes qualité du broyat pour une durée d’agitation 5 secondes Résultat de comptage (microscope) 67 43,4 moyen ok > 90 % de cellules mortes 30 44 moyen ok > 90 % de cellules mortes 15 37,5 peu broyé ok 7 40 très peu broyé peu broyé 3 35 Intact intact 1 48 Intact intact 2ème test - CK14, CK28 et CK50 avec 2.5 mL PBS Type de billes Nombre de billes Masse de l’échantillon (mg) qualité du broyat pour une durée d’agitation 10 secondes Résultat de comptage (microscope) CK14 7 51,2 intact 15 48,4 très peu broyé CK28 3 35,7 OK 7 41 OK CK50 1 28 OK 3 44,8 OK 3ème test - CK50 avec 2.5 mL PBS Type de billes Nombre de billes Masse de l’échantillon (mg) qualité du broyat pour une durée d’agitation 5 secondes Résultat de comptage (microscope) CK50 1 39 OK 3 50 OK La meilleure combinaison de billes a été testée pour plusieurs vitesses d’agitation. Les tests ont permis d’identifier, sur la base d’une appréciation visuelle quantitative, deux combinaisons des billes qui semblent les plus prometteuses pour conserver un pourcentage supérieur à 20% de cellules vivantes : les billes CK50 (1 bille) dans 2.5 mL de PBS et un protocole de 1,4 m/s à 24,9 Hz x 5 sec (25%) les billes CK50 (3 billes) dans 2.5 mL de PBS et un protocole de 1,4 m/s à 24,9 Hz x 5 sec (22%) Test CK 28 et CK 50 avec 2,5 mL PBS Type de billes Nombre de billes Masse de l’échantillon (mg) Résultat de comptage (microscope) Nombre de cellules vivantes Nombre de cellules mortes % Viabilité Qualité/débris Cellules vivantes par mL CK28 3 37 5 40 11 moyen 50000 7 34 3 20 13 bien 30000 CK50 1 34,1 5 15 25 très bien 50000 3 42,8 7 25 22 très bien 70000 Test comparatif GentleMACS™ avec 2.5 mL PBS Programme Masse de l’échantillon (mg) Résultat de comptage (microscope) Nombre de cellules vivantes Nombre de cellules mortes % Viabilité Qualité/débris Cellules vivantes par mL 0,2 m/s à 4,08 Hz – 10s 38,8 4 20 16 moyen 40000 1,1 m/s à 20,75 Hz – 10s 28 5 17 30 très bien 50000 0,6 m/s à 12,42 Hz – 10s 43 4 14 22 bien 40000 1,1 m/s à 20,75 Hz – 10s 29 3 22 12 moyen 30000 Une nouvelle série de tests a donc été réalisée pour valider le protocole avec un autre type de tissu (tissu musculaire de poisson zèbre). Les tests ont démontré que les résultats obtenus avec la préparation de 3 billes CK50 sur un homogénéisateur à bille à mouvement de précession (Precellys® Evolution, commercialisé par Bertin) sont similaires à ceux obtenus avec le GentleMACS™. En termes de viabilité cellulaire, les résultats obtenus avec les échantillons de poisson sont meilleurs (> 40% de viabilité, cf. tableau ci-dessous). Au niveau visuel, sous le microscope, les lysats obtenus avec le GentleMACS ont montré beaucoup plus de débris. Test CK50 avec 5 ml de tampon HEPES + Enzymes Type de billes Nombre de billes Masse de l’échantillon (mg) Résultat de comptage (microscope) Nombre de cellules vivantes Nombre de cellules mortes % Viabilité Qualité/débris Cellules vivantes par mL CK50 1 40,8 3 6 33,33 très bien 3.10 6 3 41,3 5 6 45,45 très bien 5.10 6 Test comparatif GentleMACS™ avec 2.5 mL PBS Programme Masse de l’échantillon (mg) Résultat de comptage (microscope) Nombre de cellules vivantes Nombre de cellules mortes % Viabilité Qualité/débris Cellules vivantes par mL mlung_01 et 02 41,6 5 7 41,66 moyen 5.10 6 Protocole de dissociation de poumon et foie Deux souris (Black-6) ont été sacrifiées et leurs organes prélevés par un technicien de laboratoire. Les organes ont été divisés en deux moitiés et immédiatement placées dans du PBS et mises sur glace. Echantillon Identification de l’animal Sexe Poids (g) Tissu Poids du tissue (mg) Test Precellys® (P) ou GentleMACS™ (G) 1 SPN 006008-23 n°45 Male 25,64 ½ foie 760,21 G 2 ½ foie 717,21 P 3 ½ poumon 70,67 G 4 ½ poumon 61.95 P 5 SPN 006007-23 n°44 Male 26,48 ½ foie 657,46 G 6 ½ foie 811,27 P 7 ½ poumon 80,15 G 8 ½ poumon 75,78 P Le mélange enzymatique pour Precellys® utilisé dans ces tests consiste en : 2437,5 μL d’Enzyme A + 2437,5 μL Enzyme B + 125 μl d’Enzyme C pour une préparation de 5 mL par échantillon. Ce mélange est un cocktail de collagénases, protéases et endonucléases. Une fois que les mélanges enzymatiques sont distribués dans les tubes correspondants, les échantillons ont été transférés dans les tubes de dissociation respectifs. Les programmes de dissociation utilisés dans chacune des machines sont détaillés dans le tableau ci-dessous. La durée d’agitation post-incubation sur le Precellys a été réduite de 10 sec à 3 sec, pour les deux types de tissus. Tissu Programme gentleMACS™ Programme Precellys® Poumon 37C_Multi_C 1 ère agitation : 3 secondes à 1,4 m/s à 24,9 Hz Incubation : 30 min à 37 °C 2ème agitation post-incubation : 3 secondes à 1,4 m/s à 24,9 Hz Foie 37C_Multi_C A la fin de chacun des programmes de dissociation, les échantillons de GentleMACS™ et du Precellys® ont été traités de la même façon. Après la dissociation mécanique/enzymatique des échantillons, un comptage des cellules (marquées au bleu de Trypan) au microscope a été réalisé pour déterminer la concentration cellulaire. L'analyse en cytométrie demande une concentration cellulaire inférieure à 10 6 par mL. La concentration moyenne des échantillons a donc été calculée afin de les diluer, si nécessaire. Tous les échantillons ont été dilués à la moitié avec du PBS. Les échantillons de foie étaient très denses et présentaient beaucoup de débris. Cette fois-ci, ce phénomène a été observé pour le GentleMACS™ et pour le Precellys®. Le comptage au microscope pour les échantillons de foie n’a pas été réalisé à cause de la mauvaise visibilité sous le microscope. Pour ce qui concerne les échantillons de poumon, les lysats étaient d’une très bonne qualité visuelle (clair et sans débris). Le comptage a été fait uniquement sur une des souris. Les résultats sont affichés dans le tableau ci-dessous. Comptage de cellules Poumon (Souris 1) Poumon (Souris 1) – correction par mg GentleMACS™ Precellys® GentleMACS™ Precellys® Cellules vivantes 155 174 0,20 0,24 Cellules mortes 12 18 0,02 0,02 Moyenne totale cellules 41,75 48 0,05 0,06 Concentration totale de cellules 83500 cellules par mL 960000 cellules par mL 1098 cellules par mg 1263 cellules par mg Cellules/mL ou mg 8,3.10 5 cellules per mL 9,6.10 5 cellules per mL 1,09.10 3 cellules per mg 1,2.10 3 cellules per mg La moyenne totale de cellules correspond à la quantité totale de cellules observées, multiplié par le facteur de dilution (10,000 cellules/mL) et divisées par la quantité de carrés analysés dans la puce de comptage. La concentration cellulaire obtenue avec le Precellys® était supérieure à celle obtenue avec le GentleMACS™, avec un taux de viabilité très élevé (>90%) pour les deux procédés. Les résultats de viabilité obtenus avec le GentleMACS™ et le Precellys® sont similaires et très encourageants. Echantillon Débris (%) Cellules totals (%) Cellules mortes (%) Cellules vivantes (%) GentleMACS™ 3 48,8 22,1 6,6 93,3 4 63,7 12,8 6,54 93,4 Moyenne 56,25 17,45 6,57 93,35 Ecart-type 10,54 6,58 0,04 0,07 Precellys® 7 51,3 33,7 14,3 85,6 8 53,2 30,8 25,2 74,6 Moyenne 52,25 32,25 19,75 80,10 Ecart-type 1,34 2,05 7,71 7,78 Les résultats de cytométrie montrent que le pourcentage de viabilité est supérieur avec le GentleMACS™, malgré la quantité de débris légèrement supérieure. Cependant, la quantité totale de cellules est supérieure avec le Precellys®. Pour ce qui concerne le poumon, les résultats de viabilité sont similaires entre le Precellys® et le GentleMACS™, avec un taux de viabilité supérieur à 80%. La viabilité cellulaire est légèrement supérieure avec le GentleMACS™. Cependant, la quantité de cellules observés avec le Precellys® est supérieure à celle obtenue avec le GentleMACS™. Le protocole identifié sur le Precellys peut être retenu dans l’état. Un test d’optimisation serait envisageable avec une réduction du temps d’incubation à 37 °C ou l’élimination de la première agitation avant l’incubation. Protocole de dissociation de la rate et cœur Trois souris (L7-IRES) ont été sacrifiées et leurs organes prélevés par un technicien de laboratoire. Les organes ont été divisés en deux moitiés et immédiatement placées dans du PBS et mises sur glace. Echantillon Identification de l’animal Sexe Poids (g) Tissu Poids du tissue (mg) Test Precellys® (P) ou GentleMACS™ (G) 1 SPN 005240-23 n°32 L7-IRES Femelle 21,39 ½ rate 35,95 G 2 ½ rate 35,95 P 3 ½ coeur 43,18 G 4 ½ coeur 52,6 P 5 SPN 005722-23 n°36 L7-IRES Femelle 18,66 ½ rate 35,74 G 6 ½ rate 34,22 P 7 ½ coeur 44 G 8 ½ coeur 38,66 P 9 SPN 005241-23 n°33 L7-IRES Femelle 20,53 ½ rate 31,19 G 10 ½ rate 26,02 P 11 ½ coeur 37,02 G 12 ½ coeur 47,71 P Le mélange enzymatique utilisé consiste en : 2437,5 μL d’Enzyme A + 2437,5 μL Enzyme B + 125 μl d’Enzyme C pour une préparation de 5 mL par échantillon. Ce mélange est un cocktail de collagénases, protéases et endonucléases. Une fois que les mélanges enzymatiques sont distribués dans les tubes correspondants, les échantillons ont été transférés dans les tubes de dissociation respectifs. Les programmes de dissociation utilisés dans chaque machine sont détaillés dans le tableau ci-dessous. Cette fois-ci les échantillons ont été incubés à 37°C sans agitation préalable à l’incubation. Tissu Programme GentleMACS™ Programme Precellys® Rate 37C_m_SDK_1 Incubation : 15 min à 37 °C Agitation post-incubation : 2 x 5 secondes à 1,4 m/s à 24,9 Hz Tous les échantillons de rate ont été initialement traités de la même façon sur le Precellys® : 5 secondes d’agitation post-incubation. Cependant, après l’agitation, une vérification visuelle des échantillons a permis d’observer que les rates étaient encore intactes. Pour cette raison, une deuxième agitation de 5 secondes a été considérée comme nécessaire pour les échantillons de rate. A la fin de chaque des programmes de dissociation, les échantillons de GentleMACS™ et Precellys® ont été traités de la même façon. Après la dissociation mécanique/enzymatique des échantillons, un comptage des cellules (marquées au bleu de Trypan) au microscope a été réalisé pour déterminer la concentration cellulaire. L'analyse en cytométrie demande une concentration cellulaire inférieure à 10 6 par mL. La concentration moyenne des échantillons a donc été calculée afin de les diluer, si nécessaire. Tous les échantillons ont été dilués à la moitié avec du PBS. Pour ce qui concerne les échantillons de rate, les lysats étaient d’une très bonne qualité visuelle (clair et sans débris). Le comptage a été fait uniquement sur une des souris. Les résultats sont affichés dans le tableau ci-dessous. Comptage de cellules Rate (Souris 1) Rate (Souris 1) – correction par mg GentleMACS™ Precellys® GentleMACS™ Precellys® Cellules vivantes 1596 2051 44,39 57,05 Cellules mortes 16 19 0,45 0,53 Moyenne totale cellules 403 517,5 11,21 14,39 Concentration totale de cellules 8060000 cellules par mL 10350000 cellules par mL 224200 cellules par mg 287900 cellules par mg Cellules/mL ou mg 8,06.10 6 cellules par mL 1,03.10 7 cellules par mL 2,2.10 5 cellules par mg 2,8.10 5 cellules par mg La concentration cellulaire obtenue pour les échantillons de rate avec le Precellys® été supérieure à celle obtenue avec le GentleMACS™, avec un taux de viabilité très élevé (>95%) pour les deux procédés. Les résultats pour les échantillons de rate sont excellents pour les deux machines (>90%), avec un pourcentage de viabilité légèrement supérieur pour le Precellys®. De plus, la quantité de débris était inférieur à 20% pour le GentleMACS™ et le Precellys®. Echantillon Débris (%) Cellules totales (%) Cellules mortes (%) Cellules vivantes (%) GentleMACS™ 1 21,4 73,1 6,74 93,3 5 16,4 72,8 9,49 90,5 9 21,5 63,1 12,40 87,6 Moyenne 19,77 69,67 9,54 90,47 Ecart-type 2,92 5,69 2,83 2,95 Precellys® 2 15,7 74,1 5,02 95 6 25,8 58,5 4,79 95,3 10 12,9 72,4 5,02 95 Moyenne 18,13 68,33 4,94 95,10 Ecart-type 6,79 8,56 0,13 0,17 Pour tester l’effet de la lyse de globules rouges sur la viabilité cellulaire, une partie de l’échantillon de rate a été traité avec le tampon de lyse RBC. Les résultats obtenus montrent que la lyse de globules rouges augmente significativement la mortalité cellulaire, soit par la durée du temps de manipulation ou par la toxicité du tampon de lyse. Le taux de mortalité a augmenté à plus de 40% sur le Precellys® et plus de 60% pour le GentleMACS™, comme le montre le tableau ci-dessous. Echantillon Débris (%) Cellules totales (%) Cellules mortes (%) Cellules vivantes (%) GentleMACS™ 1 22,7 72,5 77,60 22,2 5 15 80,5 84 15,9 9 29,5 59,4 48 51,9 Moyenne 22,40 70,80 69,87 30 Ecart-type 7,25 10,65 19,21 19,23 Precellys® 2 16,7 75 32,6 67,4 6 14,1 80,6 60,5 39,5 10 22,6 65,1 36 64 Moyenne 17,80 73,57 43,03 56,97 Ecart-type 4,36 7,85 15,22 15,22 Pour ce qui concerne les échantillons de rate, les résultats sont excellents. Avec un taux de viabilité de 95% pour le Precellys® et de 90% pour le GentleMACS™. De plus, la quantité de débris observée est très faible ( Synthèse Les résultats obtenus lors des plusieurs journées des essais démontrent que, avec des protocoles optimisés, la performance du Precellys® peut être très similaire à celle de la méthode de référence, le GentleMACS™. En termes de rendement (concentration) et viabilité cellulaire, cette observation a été confirmée sur tous les types de tissu murin analysés à exception de la rate, pour laquelle le pourcentage de débris été plus élevée sur le Precellys, voir tableau ci-dessous. GentleMACS™ Precellys® Débris (%) Cellules vivantes (%) Concentration par mL Débris (%) Cellules vivantes (%) Concentration par mL Poumon 56,25 ± 10,54 93,35±0,07 8,3.10 5 52,25±1,34 80,10±7,78 9,6.10 5 Rate 19,77±2,92 90,47±2,85 8,06.10 6 18,13±9,79 95,10±0,17 1,03.10 7 Foie 49,75±3,75 90,20±3,11 1.45.10 7 62,20±3,68 87,35±9,12 1,04.10 7 Coeur 59,45±21,43 69,10±2,40 41,45±4,88 87,35±0,49 De manière générale, les échantillons traités avec le Precellys® montrent moins de débris et une quantité totale de cellules supérieure au GentleMACS™. Parfois cette différence dans la quantité de débris était observable à l’œil nu, spécialement pour les échantillons de cœur. Cependant, la variabilité inter-échantillon dans la concentration des cellules dissociées semble être supérieure avec le Precellys®. Il est possible que le mouvement aléatoire des billes à l’intérieur des tubes ait un impact sur la reproductibilité des résultats pour un même type de tissu. L’amplitude de cette variabilité n’a pas encore été quantifié, vue la quantité limitée des souris disponibles pour l’analyse. Ceci-dit, l’écart observé n’a jamais dépassé 12 % entre échantillon pour un même type de tissu (par exemple, le foie). A titre de comparaison, il est également possible de remarquer certaines similitudes avec des résultats publiés par d’autres industriels sur les mêmes types de tissu. Par exemple, le VIA Extractor™ tissue disaggregator consiste en un dispositif où les échantillons biologiques sont introduits dans une poche stérile et fermée de manière hermétique. La poche est ensuite mise dans un instrument où des grosses palettes (similaires à celles d’un défibrillateur) viennent « masser » doucement la poche et exercer la désagrégation de tissu par légères pressions. Dans une Note d’Application rédigé par Cytiva pour le VIA Extractor™ tissue disaggregator, la concentration de cellules observées à l’haemocytomètre et les pourcentages de viabilité obtenus sur des échantillons de foie sont similaires ou inférieurs à celles obtenus dans cette étude, comme l’illustre le tableau ci-dessous. Echantillon Méthode Viabilité (%) Haemocytomètre (cellules/mL) 1 GentleMACS™ 56 2,2.10 6 2 GentleMACS™ 49 2,9.10 6 3 GentleMACS™ 51 2,3.10 6 4 VIA Extractor™ 77 4,9.10 6 5 VIA Extractor™ 75 5,1.10 6 6 VIA Extractor™ 64 5,9.10 6 7 Precellys® 94 1,04.10 7 La stratégie de « gating » (sélection d’une zone sur le nuage de points généré au cours de l’analyse en flux qui décide quelles cellules on souhaite continuer à analyser. C’est une méthode de discrimination de populations cellulaires) utilisée pour l’identification des cellules d’intérêt dans l’analyse de cytométrie de flux est aussi similaire à celle employée pour la méthode de référence. Le pourcentage de lymphocytes isolées à partir des échantillons de poumon semble comparable (~30%) entre le GentleMACS™ et le Precellys®. L’invention n’est pas limitée aux modes de réalisations précédemment décrits et s’étend à tous les modes de réalisation couverts par l’invention. La présente invention ne se limite pas aux exemples précédemment décrits. Bien d’autres variantes de réalisation sont possibles, par exemple par combinaison de caractéristiques précédemment décrites, sans sortir du cadre de l’invention. En outre, les caractéristiques décrites relativement à un aspect de l’invention peuvent être combinées à un autre aspect de l’invention. Procédé (4) de dissociation tissulaire comprenant : une disposition d’un tissu biologique (3) dans un récipient clos (2) comprenant au moins une bille (24), un ajout d’un milieu liquide (22) comprenant au moins une enzyme (23) de dissociation tissulaire apte à être active pour la dissociation du tissu biologique (3) dans le récipient clos (2), au moins un cycle (42) de dissociation tissulaire, dans un appareil d’agitation par bille (1), dans lequel le récipient clos (2) est agité de façon à induire, par l’au moins une bille (24), un effet de cisaillement dans le volume du milieu liquide (22), de façon à obtenir une suspension (33) de cellules comprenant au moins 20 % de cellules viables et dissociées (31) du tissu biologique (3). Procédé (4) de dissociation tissulaire selon la revendication précédente, dans lequel, durant l’au moins un cycle (42) de dissociation tissulaire, le récipient clos (2) est agité selon des paramètres d’agitation configurés pour se situer dans une fenêtre de dissociation (422), ladite fenêtre étant délimitée par un premier seuil (420) de dissociation du tissu biologique (3) en cellules dissociées (31), les paramètres d’agitation étant insuffisants en deçà du premier seuil (420) pour induire une dissociation tissulaire, et par un deuxième seuil (421) dit de mort cellulaire, les paramètres d’agitation étant trop intenses au-delà du deuxième seuil (421) et résultant en une viabilité cellulaire inférieure à 50 % des cellules dissociées. Procédé (4) de dissociation tissulaire selon l’une quelconque des revendications précédentes, dans lequel, durant l’au moins un cycle (42) de dissociation tissulaire, le récipient clos (2) est agité selon : une fréquence d’agitation F comprise entre 4 Hz et 45 Hz, et une vitesse moyenne d’agitation v comprise entre 0,2 m/s et 2,5 m/s. Procédé (4) de dissociation tissulaire selon l’une quelconque des revendications précédentes, dans lequel, pour chaque cycle (42) de dissociation tissulaire, le récipient clos (2) est agité sur une durée t 1 comprise entre 3 et 30 secondes. Procédé (4) de dissociation tissulaire selon l’une quelconque des revendications précédentes, dans lequel l’au moins une bille (24) occupe une proportion volumique comprise entre 0,1 % et 10 % du volume du récipient clos (2). Procédé (4) de dissociation tissulaire selon l’une quelconque des revendications précédentes, dans lequel l’au moins une bille (24) présente une masse volumique comprise entre 0,5 g/cm 3 et 8 g/cm 3 . Procédé (4) de dissociation tissulaire selon l’une quelconque des revendications précédentes, dans lequel l’au moins une bille (24) présente au moins une dimension (D1), par exemple un diamètre, compris entre 0,1 mm et 5 mm, de préférence entre 1 mm et 5 mm. Procédé (4) de dissociation tissulaire selon l’une quelconque des revendications précédentes, dans lequel le récipient clos (2) présente un volume compris entre 2 et 50 mL. Procédé (4) de dissociation tissulaire selon l’une quelconque des revendications précédentes, dans lequel le milieu liquide (22) occupe une fraction volumique du récipient clos (2) comprise entre 0,3 et 0,7. Procédé (4) de dissociation tissulaire selon l’une quelconque des revendications précédentes, dans lequel, durant l’au moins un cycle (42) de dissociation tissulaire, le récipient clos (2) est agité selon un mouvement de précession. Procédé (4) de dissociation tissulaire selon l’une quelconque des revendications précédentes, comprenant, préalablement à chaque cycle (42) de dissociation tissulaire, une incubation (41) du tissu biologique (3) en présence de l’au moins une enzyme (23) de dissociation tissulaire. Procédé (4) de dissociation tissulaire selon l’une quelconque des revendications précédentes, comprenant plusieurs cycles (42) de dissociation tissulaire. Kit (5) de dissociation tissulaire pour la mise en œuvre du procédé (4) selon l’une quelconque des revendications précédentes, comprenant : le récipient clos (2) comprenant l’au moins une bille (24), l’au moins une enzyme (23) de dissociation tissulaire. Kit (5) selon la revendication précédente, comprenant plusieurs enzymes (23) de dissociation tissulaire différentes, de façon à pouvoir sélectionner l’au moins une enzyme (23) de dissociation tissulaire à ajouter dans le procédé (4) de dissociation tissulaire. Kit (5) selon l’une quelconque des deux revendications précédentes, dans lequel l’au moins une enzyme (23) de dissociation tissulaire est choisie parmi le groupe constitué de dispase, collagenase, DNase, trypsine, papaïne, hyaluronidase, élastase. Kit (5) selon l’une quelconque des trois revendications précédentes, le kit comprenant l’appareil d’agitation par bille (1).